CN118599963A

CN118599963A - 细胞分子的原位组合标记

Info

Publication number: CN118599963A
Application number: CN202410677660.7A
Authority: CN
Inventors: G·希莉格; A·B·罗森伯格; C·若克
Original assignee: University of Washington
Current assignee: University of Washington
Priority date: 2017-09-22
Filing date: 2018-09-21
Publication date: 2024-09-06
Also published as: EP4421183A2; AU2024201002A1; JP2025087715A; US12371735B2; WO2019060771A2; JP2020534015A; US20230340567A1; ES2994431T3; JP2023145568A; FI3684949T3; JP7640120B2; US20230304073A1; EP3684949A4; US12234501B2; CN111386351A; WO2019060771A3; AU2018335876A1; US20240240232A1; EP3684949A2; US11680283B2

Abstract

提供了独特地标记或条形编码细胞核、多个细胞核、细胞、多个细胞和/或组织内的分子的方法。还提供了用于独特地标记或条形编码细胞核、多个细胞核、细胞、多个细胞和/或组织内的分子的试剂盒。待标记的分子可以包括但不限于RNA和/或cDNA。

Description

细胞分子的原位组合标记

本申请是2018年9月21日申请的PCT国际申请PCT/US2018/052283于2020年5月19日进入中国国家阶段的、申请号为201880074815.0且发明名称为“细胞分子的原位组合标记”的发明专利申请的分案申请。

相关申请的交叉引用

本申请要求2017年9月22日提交的第62/561,806号美国临时申请的权益，其全部内容通过引用在此并入。

技术领域

本发明总体上涉及独特地标记或条形编码细胞核、多个细胞核、细胞、多个细胞和/或组织内的分子的方法。本发明还涉及用于独特地标记细胞核、多个细胞核、细胞、多个细胞和/或组织内的分子的试剂盒。特别地，所述方法和试剂盒可以涉及RNA和/或cDNA的标记。

背景

新一代测序(NGS)可以用于识别和/或定量来自细胞样品的单一转录物。然而，这样的技术可能太复杂而无法在大样本中的单一细胞上进行。在这样的方法中，通常从裂解的细胞(即已破碎的细胞)纯化RNA转录物，然后使用逆转录将RNA转录物转化为互补DNA(cDNA)。然后可以使用NGS对cDNA序列测序。在这样的过程中，所有cDNA序列在测序前混合在一起，使得测量整个样品的RNA表达，并且单一序列不能回溯到单一细胞。

用于独特地标记或条形编码来自单一细胞的转录物的方法可以涉及将单一细胞手动分离到单独的反应容器中，并且可能需要专门的设备。一种供选择的对细胞中单一转录物测序的方法是使用显微术识别单一荧光碱基。然而，该技术可能难以实施，并且限于对少量细胞测序。

附图简述

结合附图，根据以下描述和所附权利要求，本文公开的实施方案将变得更加充分地显而易见。

图1描绘了连接核酸标签以形成标记或条形码。

图2是通过原位逆转录形成cDNA的示意图。图A描绘了固定和透化的细胞。图B描绘了聚(T)引物的添加，其可以模板化聚腺苷酸化的转录物的逆转录。图C描绘了随机六聚体的添加，其可以模板化基本上任何转录物的逆转录。图D描绘了引物的添加，所述引物被设计成靶向特异性转录物，使得仅转录物的子集可以被扩增。图E描绘了逆转录后的图A的细胞，示出了与RNA杂交的cDNA。

图3A描绘了单链衔接子与RNA片段的非模板化的连接。

图3B描绘了使用具有随机六聚体引物的部分双链体的单链衔接子的连接。

图4描绘了引物结合。

图5描绘了引物结合接着逆转录。

图6描绘了用于标记细胞蛋白的DNA标记的抗体。

图7描绘了用于标记细胞蛋白的适配子。

图8是根据本发明的实施方案分配、标记和合并细胞的示意图。如所描绘的，细胞可以在多个反应容器之间分配。突出显示一个细胞，以显示其通过所示过程的路径。

图9A描绘了根据本发明的实施方案的示例性工作流程。

图9B描绘了根据本发明的另一个实施方案的示例性工作流程。

图10描绘了根据本发明的实施方案的逆转录引物(BC_0055)。

图11描绘了根据本发明的实施方案的退火的第一轮条形码寡核苷酸。

图12描绘了根据本发明的实施方案的退火的第二轮条形码寡核苷酸。

图13描绘了根据本发明的实施方案的退火的第三轮条形码寡核苷酸。

图14描绘了根据本发明的实施方案的连接终止寡核苷酸。

图15描绘了根据本发明的实施方案的连接到cDNA的3′端的单链DNA衔接子寡核苷酸(BC_0047)。

图16描绘了在3′衔接子寡核苷酸(BC_0047)已经连接到条形编码的cDNA后，使用引物BC_0051和BC_0062以及3′衔接子寡核苷酸(BC_0047)形成的PCR产物。

图17描绘了BC_0027，其包含TRUSEQ^TM读数1引物的流动细胞结合序列和结合位点，以及描绘了BC_0063，其包括流动细胞结合序列和TruSeq多重读数2和索引结合序列。图17还示出了用于样品索引的区域，其在该实施方案中为GATCTG。

图18是散布图，其中针对每种独特的条形码组合，绘制了与人类基因组(x轴)和小鼠基因组(y轴)对齐的读数的数量。

图19示出了tagmentation之前和之后的cDNA的尺寸。

图20示出了实验，其中在单次实验中使用超过六百万个条形码组合对来自P2和P11小鼠脑和脊髓的超过150000个细胞核进行了分析。通过记录四个起始样品(P2脊柱、P2脑、P11脊柱或P11脊柱)中的哪一个被添加到每个孔中，第一轮条形码序列可用于识别哪个细胞/细胞核源自哪个样品。

图21显示了在三轮条形编码期间每个孔中的细胞核的数量。尽管手动吸移细胞，但大多数孔都包含大约相等数量的细胞核。P2脊髓的解离产生比其他样品更少的细胞，说明在相应的第一轮孔中的细胞核的数量较少。

图22描绘了P2/P11脑和脊髓单细胞核转录组在少突胶质细胞谱系内的分布。可以通过检查来自每个细胞/细胞核条形码组合的第一轮条形码来确定每个细胞核的样品(P2脊柱、P2脑、P11脊柱或P11脊柱)。

图23描绘了本文所提供的方案的概述。

图24描绘了本文所提供的方案的分子图。

详述

本发明总体上涉及独特地标记或条形编码细胞核、多个细胞核、细胞、多个细胞和/或组织内的分子的方法。本发明还涉及用于独特地标记或条形编码细胞核、多个细胞核、细胞、多个细胞和/或组织内的分子的试剂盒。待标记的分子可以包括但不限于RNA、cDNA、DNA、蛋白、肽和/或抗原。

将容易理解的是，如本文一般性描述的实施方案是示例性的。以下对各种实施方案的更详细描述并非旨在限制本发明的范围，而仅仅是各种实施方案的代表。此外，在不脱离本发明的范围的情况下，本领域技术人员可以改变本文公开的方法的步骤或动作的顺序。换句话说，除非特定的步骤或动作的顺序是实施方案的正确操作所需要的，否则可以改变特定步骤或动作的顺序或使用。

术语“结合”贯穿本发明被广泛使用，以指代连接或偶联两个或更多个组分、实体或物体的任何形式。例如，两个或更多个组分可以通过化学键、共价键、离子键、氢键、静电力、沃森-克里克杂交等相互结合。

本发明的一个方面涉及标记核酸的方法。在一些实施方案中，所述方法可以包括标记第一细胞中的核酸。所述方法可以包括：(a)通过使用包含5’突出端序列的逆转录引物逆转录RNA，在包括第一细胞的多个细胞内产生互补DNA(cDNA)；(b)将所述多个细胞分成一定数量(n)的等分试样；(c)向所述n个等分试样中的每一个提供多个核酸标签，其中向给定等分试样中提供的多个核酸标签的每个标记序列是相同的，并且其中向所述n个等分试样中的每一个中提供不同的标记序列；(d)使所述n个等分试样中的每一个中的cDNA中的至少一种结合于核酸标签；(e)合并所述n个等分试样；和(f)用所述合并的等分试样重复步骤(b)、(c)、(d)和(e)。在各种实施方案中，所述多个细胞可以选自真核细胞和原核细胞。在各种其他实施方案中，所述多个细胞可以选自但不限于哺乳动物细胞、酵母细胞和/或细菌细胞中的至少一种。

在某些实施方案中，每个核酸标签可以包含第一链，所述第一链包含从标记序列的3’端延伸的3’杂交序列，和从标记序列的5’端延伸的5’杂交序列。每个核酸标签还可以包含第二链，所述第二链包含突出端序列。所述突出端序列可以包含：(i)与5’杂交序列和5’突出端序列中的至少一个互补的第一部分，和(ii)与3’杂交序列互补的第二部分。在一些实施方案中，核酸标签(例如，最后的核酸标签)可以包含捕获剂，例如但不限于5’生物素。用包含5’生物素的核酸标签标记的cDNA可以使得或容许cDNA连接或偶联到链霉亲和素包被的磁珠。在一些其他实施方案中，可以用捕获链(即核酸序列)包被多个珠，所述捕获链被配置成与条形码的最终序列突出端杂交。在又一些其他实施方案中，可以通过使用市售试剂盒(例如，RNEASY^TM试剂盒)纯化或分离cDNA。

在各种实施方案中，可以重复步骤(f)(即步骤(b)、(c)、(d)和(e))足以在第一细胞中产生用于cDNA的独特系列标记序列的次数。换句话说，可以重复步骤(f)一定次数，使得第一细胞中的cDNA可以具有第一独特系列标记序列，第二细胞中的cDNA可以具有第二独特系列标记序列，第三细胞中的cDNA可以具有第三独特系列标记序列，依此类推。本发明的方法可以提供对具有独特条形码的来自单个细胞的cDNA序列的标记，其中所述独特条形码可以识别或帮助识别所述cDNA源自的细胞。换句话说，来自单个细胞的cDNA的部分、大部分或基本上全部可以具有相同的条形码，并且该条形码在源自样品中的一个或多个其他细胞(例如，来自第二细胞、第三细胞、第四细胞等)的cDNA中可以不重复。

在一些实施方案中，条形编码的cDNA可以混合在一起并测序(例如，使用NGS)，使得可以收集关于单个细胞水平的RNA表达的数据。例如，本发明的方法的某些实施方案可用于评估、分析或研究一个或多个单一细胞的转录组(即由给定细胞的基因组转录的不同RNA种类)。

如上所述，可以将细胞的等分试样或一组细胞分离到不同的反应容器(vessel)或器皿(container)中，并且可以将第一组核酸标签添加到多个cDNA转录物。容器或器皿在本文中也可以称为接受器、样品和孔。因此，术语容器、器皿、接受器、样品和孔在本文中可以互换使用。然后可以将细胞的等分试样重新分组、混合和再次分离，并且可以将第二组核酸标签添加到第一组核酸标签。在各种实施方案中，可以在单轮或给定轮的标记中将相同的核酸标签添加到细胞的多于一个的等分试样。然而，在重复多轮的分离、标记和再合并后，每个细胞的cDNA可以结合到形成条形码的核酸标签的独特组合或序列。在一些实施方案中，单个样品中的细胞可以分离到许多不同的反应容器中。例如，反应容器的数量可以包括四个1.5ml的微量离心管，96孔板的多个孔，或另一合适数量和类型的反应容器。

在某些实施方案中，可以重复步骤(f)(即步骤(b)、(c)、(d)和(e))一定次数，其中所述次数选自1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100次等。在某些其他实施方案中，可以重复步骤(f)足够的次数，使得每个细胞的cDNA都可能结合到独特的条形码。可以选择次数以提供大于50％的可能性、大于90％的可能性、大于95％的可能性、大于99％的可能性，或每个细胞中的cDNA与独特的条形码结合的其他概率。在又其他实施方案中，可以重复步骤(f)一些其他合适的次数。

在一些实施方案中，标记第一细胞中的核酸的方法可以包括在步骤(a)之前固定多个细胞。例如，细胞的组分可以被固定或交联，使得组分被固定或保持在适当的位置。可以以甲醛的磷酸盐缓冲盐水(PBS)溶液固定多个细胞。多个细胞可以固定在例如约1-4％的甲醛的PBS溶液中。在各种实施方案中，可在约-20℃或约25℃下使用甲醇(例如100％的甲醇)固定多个细胞。在各种其他实施方案中，可在约-20℃至约25℃下使用甲醇(例如100％的甲醇)固定多个细胞。在又各种其他实施方案中，可在约-20℃或室温下使用乙醇(例如，约70-100％的乙醇)固定多个细胞。在又各种其他实施方案中，可以在约-20℃至室温下使用乙醇(例如，约70-100％的乙醇)固定多个细胞。在再各种其他实施方案中，可以例如在约-20C下使用乙酸固定多个细胞。在再各种其他实施方案中，可以例如在约-20C下使用丙酮固定多个细胞。固定多个细胞的其他合适的方法也在本发明的范围内。

在某些实施方案中，标记第一细胞中的核酸的方法可以包括在步骤(a)之前透化多个细胞。例如，可以在多个细胞的外膜中形成孔或开口。可以将TRITON^TM X-100添加到多个细胞，然后任选地添加HCl以形成一个或多个孔。例如，可以将约0.2％TRITON^TM X-100添加到多个细胞，然后添加约0.1N HCl。在某些其他实施方案中，可以使用乙醇(例如，约70％的乙醇)、甲醇(例如，约100％的甲醇)、吐温20(例如，约0.2％的吐温20)和/或NP-40(例如，约0.1％的NP-40)透化多个细胞。在各种实施方案中，标记第一细胞中的核酸的方法可以包括在步骤(a)之前固定和透化多个细胞。

在一些实施方案中，细胞可以是粘附细胞(例如粘附哺乳动物细胞)。固定、透化和/或逆转录可以在粘附细胞上(例如，粘附于板的细胞上)进行或实施。例如，粘附细胞可以被固定、透化和/或经历逆转录，接着进行胰蛋白酶消化以使细胞与表面脱离。供选择地，可以在分离和/或标记步骤之前使粘附细胞脱离。在一些其他实施方案中，可以在固定和/或透化步骤之前用胰蛋白酶消化粘附细胞。

在一些实施方案中，标记第一细胞中的核酸的方法可以包括连接与cDNA结合的核酸标签中的至少两个。连接可以在裂解和/或cDNA纯化步骤之前或之后进行。连接可以包括将核酸标签上的5’磷酸酯序列与相邻链或核酸标签的3’端共价连接，以使单一标签形成结合到cDNA序列的3’端的连续或基本连续的条形码序列。在各种实施方案中，双链DNA或RNA连接酶可以与另外的接头链一起使用，该接头链被配置成将核酸标签与相邻核酸一起保持为“带切口的”双链构象。然后可以使用双链DNA或RNA连接酶密封“切口”。在各种其他实施方案中，可以使用单链DNA或RNA连接酶，而无另外的接头。在某些实施方案中，可以在多个细胞内进行连接。

图1示出了连接多个核酸标签以形成基本上连续的标记或条形码。例如，在多个核酸标签添加之后，每个cDNA转录物可以结合或连接到一系列核酸标签。连接酶的使用可以连接或共价连接核酸标签的一部分，以形成与cDNA转录物结合或连接的基本上连续的标记或条形码。

在某些其他实施方案中，所述方法可以包括例如在步骤(f)之后裂解多个细胞(即破坏细胞结构)，以从多个细胞内释放cDNA。在一些实施方案中，可以在裂解溶液(例如10mMTris-HCl(pH7.9)，50mM EDTA(pH7.9)，0.2M NaCl，2.2％SDS，0.5mg/ml抗RNA酶(蛋白核糖核酸酶抑制剂；)和1000mg/ml蛋白酶K)中裂解多个细胞，例如采用振摇(例如，剧烈振摇)在约55℃下持续约1-3小时。在一些其他实施方案中，可以使用超声和/或通过经过18-25号注射器针头至少一次来裂解多个细胞。在又一些其他实施方案中，可通过加热至约70-90℃来裂解多个细胞。例如，可以通过加热到约70-90℃持续约一小时或更多小时来裂解多个细胞。然后可以从裂解的细胞分离cDNA。在一些实施方案中，可以将RNA酶H添加到cDNA以去除RNA。所述方法还可以包括连接与释放的cDNA结合的核酸标签中的至少两个。在一些其他实施方案中，标记第一细胞中的核酸的方法可以包括连接与cDNA结合的核酸标签中的至少3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、30、35、40、45、50个等。

在各种实施方案中，标记第一细胞中的核酸的方法可以包括去除一个或多个未结合的核酸标签(例如，洗涤多个细胞)。例如，所述方法可以包括去除未结合的核酸标签的部分、大部分或基本上全部。可以去除未结合的核酸标签，使得公开的方法的另外多轮不被来自给定方法的前一轮的一个或多个未结合的核酸标签污染。在一些实施方案中，未结合的核酸标签可以通过离心去除。例如，可以将多个细胞离心，使得在离心管的底部形成细胞团。可以从离心的细胞去除上清液(即含有未结合的核酸标签的液体)。然后可以将细胞重悬在缓冲液(例如，新鲜的缓冲液，其不含或基本上不含未结合的核酸标签)中。在另一个实例中，多个细胞可以偶联或连接到磁珠，该磁珠被配置成结合细胞或核膜的抗体包被。然后可以使用磁体将多个细胞吸引到反应容器的一侧，使它们成团。在一些其他实施方案中，可将多个细胞置于细胞过滤器(例如，细胞过滤器)中，并用洗涤缓冲液洗涤。例如，当洗涤缓冲液通过细胞过滤器时，多个细胞可以保留在细胞过滤器中。洗涤缓冲液可以包含表面活性剂、洗涤剂和/或约5-60％的甲酰胺。

如上所述，多个细胞可以被重新合并，并且该方法可以重复任何次数，向cDNA添加更多标签，产生一组可以充当条形码的核酸标签。随着越来越多轮的添加，细胞可以采取的路径数量增加，因此可以创建的可能的条形码的数量也增加。在给定足够的轮次和分配的情况下，可能的条形码的数量将大大高于细胞的数量，导致每个细胞可以具有独特的条形码。例如，如果分配在96孔板中进行，则在4次分配之后，将有96⁴＝84934656个可能的条形码。

在一些实施方案中，逆转录引物可以配置成逆转录细胞中的所有或基本上所有RNA(例如，具有5’突出端的随机六聚体)。在一些其他实施方案中，逆转录引物可以配置成逆转录具有聚(A)尾的RNA(例如，聚(dT)引物，如dT(15)引物，具有5’突出端)。在又一些其他实施方案中，逆转录引物可以配置成逆转录预定RNA(例如，转录物特异性引物)。例如，逆转录引物可以配置成条形码特异性转录物，使得每个细胞可以分析更少的转录物，但是使得可以在更多数量的细胞中分析转录物中的每一个。

图2示出了通过原位逆转录形成cDNA。图A描绘了固定和透化的细胞。图B描绘了如上所述的聚(T)引物的添加，其可以模板化聚腺苷酸化的转录物的逆转录。图C描绘了如上所述的随机六聚体的添加，其可以模板化基本上任何转录物的逆转录。图D描绘了引物的添加，如上所述，所述引物被设计成靶向特异性转录物，使得仅一个转录物的子集可以被扩增。图E描绘了逆转录后的图A的细胞，示出了与RNA杂交的cDNA。

逆转录可以在多个细胞上进行或实施。在某些实施方案中，可以在固定和/或透化的多个细胞上进行逆转录。在一些实施方案中，M-MuLV逆转录酶的变体可以用于逆转录中。任何合适的逆转录方法都在本发明的范围内。例如，逆转录混合物可以包括包含5’突出端的逆转录引物，并且逆转录引物可以配置成引发逆转录和/或充当核酸标签的结合序列。在一些其他实施方案中，被配置成与RNA结合和/或引发逆转录的逆转录引物的部分可以包含以下一种或多种：随机六聚体、七聚体、八聚体、九聚体、十聚体、核苷酸的聚(T)片段和/或一种或多种基因特异性引物。

本发明的另一方面涉及独特地标记细胞内或多个细胞内的分子的方法。在一些实施方案中，所述方法可以包括：(a)使衔接子序列或通用衔接子与多个细胞内的分子结合；(b)将所述多个细胞分成至少两个初级等分试样，其中所述至少两个初级等分试样包括至少第一初级等分试样和第二初级等分试样；(c)向所述至少两个初级等分试样提供初级核酸标签，其中向所述第一初级等分试样提供的初级核酸标签不同于向所述第二初级等分试样提供的初级核酸标签；(d)使所述至少两个初级等分试样中的每一个内的衔接子序列与所提供的初级核酸标签结合；(e)合并所述至少两个初级等分试样；(f)将所述合并的初级等分试样分成至少两个次级等分试样，所述至少两个次级等分试样包括至少第一次级等分试样和第二次级等分试样；(g)向所述至少两个次级等分试样提供次级核酸标签，其中向所述第一次级等分试样提供的次级核酸标签不同于向所述第二次级等分试样提供的次级核酸标签；和(h)使所述至少两个次级等分试样中的每一个内的分子与所提供的次级核酸标签结合。

在某些实施方案中，所述方法还可以包括步骤(i)，即用随后的等分试样重复步骤(e)、(f)、(g)和(h)。步骤(i)可以重复足以在单个细胞中产生用于所述分子的独特系列核酸标签的次数。在各种实施方案中，所述次数可以选自1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100次等。在某些其他实施方案中，步骤(i)可以重复另一合适的次数。

在一些实施方案中，所述分子可以设置在细胞内或多个细胞内。在一些其他实施方案中，所述分子可以偶联到细胞或多个细胞。例如，所述分子可以是细胞表面分子。在又一些其他实施方案中，所述分子可以设置在细胞或多个细胞内和/或偶联到细胞或多个细胞。

如上所述，该方法可以包括在步骤(a)之前固定和/或透化多个细胞。在各种实施方案中，所述核酸标签中的每一个可包含第一链。第一链可以包含条形码序列，所述条形码序列包含3’端和5’端。第一链还可以包含分别在条形码序列的3’端和5’端侧翼的3’杂交序列和5’杂交序列。在一些实施方案中，所述核酸标签中的每一个可以包含第二链。第二链可以包含与5’杂交序列和衔接子序列中的至少一个互补的第一部分；和与3’杂交序列互补的第二部分。

在某些实施方案中，所述分子是大分子。在各种实施方案中，所述分子选自RNA、cDNA、DNA、蛋白、肽和/或抗原中的至少一种。

在一些实施方案中，所述分子是RNA，并且衔接子序列可以是单链的。此外，步骤(a)可以包括以下之一：使单链衔接子序列的5’端与RNA的3’端连接和/或使单链衔接子序列的3’端与RNA的5’端连接。在一些其他实施方案中，所述分子是RNA，并且步骤(a)可以包括将衔接子序列与RNA杂交。

涉及将衔接子序列与RNA结合或偶联的方法可以用于例如RNA转录组测序、核糖体分析、小RNA测序、非编码RNA测序和/或RNA结构分析。在一些实施方案中，可以固定和/或透化多个细胞。单链衔接子序列的5’端可以连接到RNA的3’端(参见图3A和3B)。在某些实施方案中，可以通过T4RNA连接酶1进行或实施连接。在某些其他实施方案中，可以通过T4RNA连接酶1进行与包含5’磷酸酯的单链衔接子序列的连接。在各种实施方案中，可以通过热稳定的5’APPDNA/RNA连接酶^TM(NEW ENGLAND)进行连接。在各种其他实施方案中，可以通过热稳定的5’APPDNA/RNA连接酶^TM进行与5’预腺苷酸化的单链衔接子序列的连接。其他合适的连接酶和衔接子序列也在本发明的范围内。

在一些实施方案中，使用杂交，例如通过沃森-克里克碱基配对，用衔接子序列标记RNA(参见图4)。如上所述，在标记步骤和/或细胞裂解之后，可以将衔接子序列配置为引发逆转录以形成或产生cDNA(参见图5)。

单链衔接子序列的3’端可以连接到RNA的5’端。在某些实施方案中，可以通过T4RNA连接酶1进行或实施连接。在某些其他实施方案中，可以通过T4 RNA连接酶1进行与包含5’磷酸酯的RNA的连接。在各种实施方案中，可以通过热稳定的5’APPDNA/RNA连接酶^TM(NEWENGLAND)进行连接。在各种其他实施方案中，可以通过热稳定的5’APPDNA/RNA连接酶^TM进行与5’预腺苷酸化的RNA的连接。如上所述，其他合适的连接酶和衔接子序列也在本发明的范围内。

在一些实施方案中，所述分子可以是cDNA。涉及将衔接子序列与cDNA结合或偶联的方法可用于例如RNA转录组测序。在某些实施方案中，可以固定和/或透化多个细胞。可以使用在5’端包含衔接子序列的引物对多个固定和/或透化的细胞进行逆转录。如上所述，引物的3’端可以是基因特异性随机六聚体或聚(T)序列。得到的cDNA可以在其5’端包含衔接子序列(参见图5)。

在其中所述分子是DNA(例如，基因组DNA)的一些实施方案中，所述方法还可以包括在步骤(a)之前用限制酶消化DNA。此外，步骤(a)可以包括将衔接子序列与消化的DNA连接。

涉及将衔接子序列与DNA结合或偶联的方法可以用于，例如，全基因组测序、靶向基因组测序、DNA酶-Seq，ChIP-测序和/或ATAC-seq。在某些实施方案中，可以使用一种或多种限制酶将DNA消化成平端片段和/或具有突出端序列的片段中的至少一种。可将具有单链通用衔接子或在一端突出的衔接子序列的部分双链序列与消化的基因组DNA连接。例如，可以将包含具有突出端的单链衔接子序列的部分双链序列连接到消化的基因组DNA，其中所述突出端与一种或多种限制酶产生的突出端相容。

在各种实施方案中，可以使用Tn5转座酶将衔接子序列整合(例如，直接整合)到基因组DNA中，并且可以通过添加十二烷基硫酸钠(SDS)释放转座酶以暴露衔接子序列。其他转座酶和将衔接子序列整合到基因组DNA中的方法也在本发明的范围内。

在某些实施方案中，所述分子是蛋白、肽和/或抗原，并且衔接子序列可以结合到与抗体偶联的独特标识序列(例如，包含核酸)。独特标识序列可以被配置成独特地识别所述独特标识序列所结合的抗体。此外，步骤(a)可以包括使包含衔接子序列和独特标识序列中的每一个的抗体与蛋白、肽和/或抗原结合。在某些其他实施方案中，所述分子是蛋白、肽和/或抗原，并且衔接子序列可以整合在适配子中。此外，步骤(a)可以包括使适配子与蛋白、肽和/或抗原结合。

涉及将衔接子序列与蛋白、肽和/或抗原结合或偶联的方法可以用于例如蛋白定量、肽定量和/或抗原定量。在各种实施方案中，衔接子序列可以连接(例如化学连接)到抗体。例如，可以使用技术人员已知的用于介导DNA-蛋白键的化学方法将衔接子序列连接到抗体。可以用核酸序列或链标记不同蛋白的抗体，所述核酸序列或链除了衔接子序列以外还包含独特标识序列。然后可以将抗体或抗体组用于免疫染色实验中，以标记固定和/或透化的细胞或组织中的蛋白或蛋白组(参见图6)。随后，所述细胞可以经历本文公开的标记或条形编码过程。

在一些实施方案中，可以从抗体和/或衔接子序列释放连接或结合到抗体的核酸序列(例如，DNA分子)。测序反应可以揭示与给定蛋白相关的独特标识序列以及与一个或多个独特细胞相关的标记或条形码。在某些实施方案中，这样的方法可以揭示或识别存在于一个或多个细胞中的蛋白的数量和/或类型。

在各种实施方案中，可以使用DNA适配子和/或RNA适配子代替如上所述的核酸修饰的(或DNA修饰的)抗体，或除了如上所述的核酸修饰的(或DNA修饰的)抗体以外还可以使用DNA适配子和/或RNA适配子(参见图7)。衔接子序列(和靶蛋白特异性抗体)可以整合(例如直接整合)到给定适配子的序列中。

本发明的另一方面涉及条形编码细胞内的核酸的方法。在一些实施方案中，条形编码细胞内的核酸的方法可以包括：(a)通过使用包含5’突出端序列的逆转录引物逆转录RNA，在多个细胞内产生cDNA；(b)将所述多个细胞分成至少两个等分试样；(c)向所述至少两个等分试样中的每个提供多个核酸标签，其中引入给定等分试样中的多个核酸标签中的每个条形码序列是相同的，并且其中将不同的条形码序列引入每个等分试样中；(d)使所述至少两个等分试样中的每一个中的cDNA中的至少一种与核酸标签结合；(e)合并所述至少两个等分试样；和(f)用合并的等分试样重复步骤(b)、(c)、(d)和(e)至少一次。

在某些实施方案中，每个核酸标签可以包含第一链，所述第一链包含从条形码序列的3’端延伸的3’杂交序列，和从条形码序列的5’端延伸的5’杂交序列。每个核酸标签还可以包含第二链，所述第二链包含突出端序列，所述突出端序列包含：(i)与5’杂交序列和5’突出端序列中的至少一个互补的第一部分，和(ii)与3’杂交序列互补的第二部分。

图8描绘了根据本发明的实施方案分配、标记和合并细胞。可以将已经逆转录的细胞在反应容器或孔之间分配。在图8中显示了4个孔。然而，如上所述，可以使用任何合适数量的反应容器或孔。突出显示一个细胞，以显示其通过所述过程的路径。如所示的，突出显示的细胞首先停留在孔“a”中，其中它是添加到其的第一个标签，该标签与所有cDNA转录物的突出端杂交(显示在框中)。所述标签携带独特的条形码区域“a”，识别细胞所在的孔。杂交后，洗涤所有细胞以去除过量的标签，重新分组，然后在相同数量的孔之间再次划分。然后，突出显示的细胞停留在“c”孔中，并具有添加到其的第二个标签，识别其所在的孔。在第二轮之后，所述细胞可能已采取4²＝16条可能的路径通过管。可以重复该过程，向cDNA转录物添加更多标签，并增加细胞可以采取的可能路径的数量。图9A和9B描绘了根据本发明的实施方案的两种示例性工作流程。

本发明的另一方面涉及用于标记至少第一细胞内的核酸的试剂盒。在一些实施方案中，所述试剂盒可以包含至少一种逆转录引物，其包含5’突出端序列。所述试剂盒还可以包含多个第一核酸标签。每个第一核酸标签可以包含第一链。第一链可以包含从第一标记序列的3’端延伸的3’杂交序列和从第一标记序列的5’端延伸的5’杂交序列。每个第一核酸标签还可以包含第二链。第二链可以包含突出端序列，其中所述突出端序列可以包含：(i)与逆转录引物的5’杂交序列和5’突出端序列中的至少一个互补的第一部分，和(ii)与3’杂交序列互补的第二部分。

所述试剂盒还可以包含多个第二核酸标签。每个第二核酸标签可以包含第一链。第一链可以包含从第二标记序列的3’端延伸的3’杂交序列，和从第二标记序列的5’端延伸的5’杂交序列。每个第二核酸标签还可以包含第二链。第二链可以包含突出端序列，其中所述突出端序列可以包含：(i)与逆转录引物的5’杂交序列和5’突出端序列中的至少一个互补的第一部分，和(ii)与3’杂交序列互补的第二部分。在一些实施方案中，第一标记序列可以不同于第二标记序列。

在一些实施方案中，所述试剂盒还可以包含一种或多种另外的多个核酸标签。所述一种或多种另外的多个核酸标签中的每个核酸标签可以包含第一链。第一链可以包含从标记序列的3’端延伸的3’杂交序列和从标记序列的5’端延伸的5’杂交序列。所述一种或多种另外的多个核酸标签中的每个核酸标签还可以包含第二链。第二链可以包含突出端序列，其中所述突出端序列包含：(i)与逆转录引物的5’杂交序列和5’突出端序列中的至少一个互补的第一部分，和(ii)与3’杂交序列互补的第二部分。在一些实施方案中，在每种给定的另外的多个核酸标签中，所述标记序列可以不同。

在各种实施方案中，所述试剂盒还可以包含逆转录酶、固定剂、透化剂、连接剂和/或裂解剂中的至少一种。

本发明的另一方面涉及用于标记至少第一细胞内的分子的试剂盒。例如，如上文公开的试剂盒可以适于标记至少第一细胞内的RNA、cDNA、DNA、蛋白、肽或抗原中的一种或多种。

本发明的另一方面涉及独特地标记多个细胞内的RNA分子的方法。所述方法可以包括：(a)在步骤(b)之前固定和透化第一多个细胞，其中在约8℃以下固定和透化第一多个细胞；(b)逆转录第一多个细胞内的RNA分子以在第一多个细胞内形成互补DNA(cDNA)分子，其中逆转录所述RNA分子包括将引物偶联到所述RNA分子，其中所述引物包含聚(T)序列或随机序列中的至少一种；(c)将包含cDNA分子的第一多个细胞分成至少两个初级等分试样，所述至少两个初级等分试样包括第一初级等分试样和第二初级等分试样；(d)向所述至少两个初级等分试样提供初级核酸标签，其中向所述第一初级等分试样提供的初级核酸标签不同于向所述第二初级等分试样提供的初级核酸标签；(e)将所述至少两个初级等分试样中的每一个内的cDNA分子与所提供的初级核酸标签偶联；(f)合并所述至少两个初级等分试样；(g)将所述合并的初级等分试样分成至少两个次级等分试样，所述至少两个次级等分试样包括第一次级等分试样和第二次级等分试样；(h)向所述至少两个次级等分试样提供次级核酸标签，其中向所述第一次级等分试样提供的次级核酸标签不同于向所述第二次级等分试样提供的次级核酸标签；(i)将所述至少两个次级等分试样中的每一个内的cDNA分子与所提供的次级核酸标签偶联；(j)用随后的等分试样重复步骤(f)、(g)、(h)和(i)，其中最后的核酸标签包含捕获剂；(k)合并最后的等分试样；(1)裂解第一多个细胞以从第一多个细胞内释放cDNA分子，以形成裂解物；和/或(m)向所述裂解物添加蛋白酶抑制剂和/或结合剂，以使所述cDNA分子结合结合剂。

所述方法还可以包括将合并的最后的等分试样分成至少两个最后的等分试样，所述至少两个最后的等分试样包括第一最后的等分试样和第二最后的等分试样。在一些实施方案中，可以在约8℃以下、在约7℃以下、在约6℃以下、在约5℃以下、在约4℃、在约4℃以下、在约3℃以下、在约2C以下、在约1℃以下或在另一合适的温度下固定和透化第一多个细胞。在某些实施方案中，所述方法包括划分细胞。例如，在最终一轮或最后一轮条形编码(通过连接)之后，可以在裂解之前合并细胞，然后可以将细胞划分成不同的裂解物等分试样。每个裂解物等分试样可以包括预定数量的细胞。

关于例如步骤(m)，蛋白酶抑制剂可以包括苯甲基磺酰氟(PMSF)、4-(2-氨基乙基)苯磺酰氟盐酸盐(AEBSF)、其组合和/或另一合适的蛋白酶抑制剂。关于例如步骤(j)、(k)、(l)和/或(m)，捕获剂可以包括生物素或另一合适的捕获剂。此外，结合剂可以包括亲和素(例如，链霉亲和素)或另一合适的粘合剂。

在某些实施方案中，独特地标记多个细胞内的RNA分子的方法(例如，在步骤(m)之后)还可以包括：(n)使用模板转换寡核苷酸对与结合剂结合的cDNA分子进行模板转换；(o)扩增cDNA分子以形成扩增的cDNA分子溶液；和/或(p)将固相可逆固定化(SPRI)珠溶液引入所述扩增的cDNA分子溶液，以去除小于约200个碱基对、小于约175个碱基对或小于约150个碱基对的多核苷酸(参见DeAngelis，MM等人.Nucleic Acids Research(1995)23(22)：4742)。换句话说，cDNA分子可以与裂解物中的链霉亲和素珠结合。可以进行与珠连接的cDNA分子的模板转换(例如，以向cDNA分子的3’端添加衔接子)。然后可以进行cDNA分子的PCR扩增，接着添加SPRI珠以去除小于约200个碱基对的多核苷酸。SPRI珠溶液与扩增的cDNA分子溶液之比可以为约0.9∶1至约0.7∶1，约0.875∶1至约0.775∶1，约0.85∶1至约0.75∶1，约0.825∶1至约0.725∶1，约0.8∶1，或另一合适的比例。此外，SPRI珠溶液可以包含约1 M至4M NaCl，约2M至3M NaCl，约2.25M至2.75M NaCl，约2.5M NaCl或另一合适量的NaCl。SPRI珠溶液还可以包含约15％w/v至25％w/v的聚乙二醇(PEG)，其中所述PEG的分子量为约7000g/mol至9000g/mol(PEG 8000)。在各种实施方案中，SPRI珠溶液可以包含约17％w/v至23％w/v的PEG 8000，约18％w/v至22％w/v的PEG 8000，约19％w/v至21％w/v的PEG 8000，约20％w/v的PEG 8000，或另一合适％w/v的PEG 8000。

独特地标记多个细胞内的RNA分子的方法还可以包括将共用衔接子序列添加到释放的cDNA分子的3’端。共用衔接子序列可以是对于cDNA分子中的每一种(即在给定实验中)相同或基本相同的衔接子序列。共用衔接子的添加可以在包含最多约10％w/v的PEG的溶液中进行或实施，其中所述PEG的分子量为约7000g/mol至9000g/mol。在某些实施方案中，可以通过模板转换将共用衔接子序列添加到释放的cDNA分子的3’端(参见Picelli，S等人.Nature Methods10，1096-1098(2013))。

可以重复步骤(j)足以在单个细胞中产生用于核酸的独特系列核酸标签的次数。例如，所述次数可以选自1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95和100次。

在各种实施方案中，步骤(b)的引物还可以包含第一特异性条形码。换句话说，可以预先确定添加到特定器皿、混合物、反应、接受器、样品、孔或容器中的cDNA分子的第一条形码(例如，对于给定器皿、混合物、反应、接受器、样品、孔或容器是特异性的)。例如，可以使用48组不同的孔特异性RT引物(例如，在48孔板中)。因此，如果有48个样品(例如细胞、组织等)，则每个样品都可以获得独特的孔特异性条形码。然而，如果只有四个样品，则每个样品可以具有12组不同的孔特异性RT引物。使用者可以知道哪12个对应每个样品，因此使用者可以重新获得样品身份。其他数量的第一特异性条形码(或孔特异性RT引物)也在本发明的范围内。这样的配置可以实现或提供如实施例16中进一步解释的方法的复用。

所述方法还可以包括：(q)逆转录第二多个细胞内的RNA分子以在第二多个细胞内形成cDNA分子，其中逆转录所述RNA分子包括将特异性引物偶联到所述RNA分子，其中所述引物包含第二特异性条形码和聚(T)序列或随机序列中的至少一种，其中第一特异性条形码不同于第二特异性条形码，使得可以与来自第二多个细胞的cDNA分子比较，识别来自第一多个细胞的cDNA分子；(r)将包含cDNA分子的第二多个细胞分成至少两个初级等分试样，所述至少两个初级等分试样包括第一初级等分试样和第二初级等分试样；(s)向所述至少两个初级等分试样提供初级核酸标签，其中向所述第一初级等分试样提供的初级核酸标签不同于向所述第二初级等分试样提供的初级核酸标签；(t)将所述至少两个初级等分试样中的每一个内的cDNA分子与所提供的初级核酸标签偶联；(u)合并所述至少两个初级等分试样；(v)将所述合并的初级等分试样分成至少两个次级等分试样，所述至少两个次级等分试样包括第一次级等分试样和第二次级等分试样；(w)向所述至少两个次级等分试样提供次级核酸标签，其中向所述第一次级等分试样提供的次级核酸标签不同于向所述第二次级等分试样提供的次级核酸标签；(x)将所述至少两个次级等分试样中的每一个内的cDNA分子与所提供的次级核酸标签偶联；和/或(y)用随后的等分试样重复步骤(u)、(v)、(w)和(x)，其中最后的核酸标签包含捕获剂。用于第一多个细胞的上述步骤(例如，步骤(k)、(1)和(m))也可以适用于第二多个细胞。

在各种实施方案中，核酸标签中的每一个可以包含第一链，其中所述第一链包含：(i)包含3’端和5’端的条形码序列，和(ii)分别在所述条形码序列的3’端和5’端侧翼的3’杂交序列和5’杂交序列。核酸标签中的每一个还可以包含第二链，其中所述第二链包含：(i)与5’杂交序列和衔接子序列中的至少一个互补的第一部分，和(ii)与3’杂交序列互补的第二部分。

独特地标记多个细胞内的RNA分子的方法还可以包括连接与cDNA分子结合的核酸标签中的至少两个(或更多个)。所述连接可以在第一多个细胞内进行。

所述方法还可以包括去除未结合的核酸标签。在一些实施方案中，所述方法可以包括连接与释放的cDNA分子结合的核酸标签中的至少两个。来自单个细胞的大多数核酸标签结合的cDNA分子可以包含相同系列结合的核酸标签。在各种实施方案中，多个细胞(例如，第一和第二多个细胞)可以选自哺乳动物细胞、酵母细胞和细菌细胞中的至少一种。

本发明的另一方面涉及标记第一细胞内的核酸的方法。在某些实施方案中，所述方法可以包括：(a)通过使用以下中的至少一种逆转录RNA，在包括第一细胞的多个细胞内产生cDNA分子：(i)第一逆转录引物，其包含5’突出端序列，其中所述第一逆转录引物被配置成逆转录具有聚(A)尾的RNA，和/或(ii)第二逆转录引物，其包含5’突出端序列和随机六聚体、随机七聚体、随机八聚体、随机九聚体和随机十聚体中的至少一种；(b)将所述多个细胞分成一定数量(n)的等分试样；(c)向所述n个等分试样中的每一个提供多个核酸标签；(d)使所述n个等分试样中的每一个中的cDNA分子中的至少一种结合于核酸标签；(e)合并所述n个等分试样；(f)用所述合并的等分试样重复步骤(b)、(c)、(d)和(e)；(g)合并最后的等分试样；(h)裂解所述包括第一细胞的多个细胞以从所述包括第一细胞的多个细胞内释放cDNA分子，以形成裂解物；和/或(i)向所述裂解物添加蛋白酶抑制剂和/或结合剂，以使所述cDNA分子结合结合剂。

关于例如步骤(c)，每个核酸标签可以包含第一链，所述第一链包含：(i)从标记序列的3’端延伸的3’杂交序列，和(ii)从标记序列的5’端延伸的5’杂交序列。每个核酸标签还可以包含第二链，所述第二链包含突出端序列，所述突出端序列包含：(i)与5’杂交序列和5’突出端序列中的至少一个互补的第一部分，和(ii)与3’杂交序列互补的第二部分。在一些实施方案中，提供到给定等分试样中的多个核酸标签的标记序列可以是相同的，并且可以向所述n个等分试样中的每一个中提供不同的标记序列。

在某些实施方案中，步骤(f)可以重复足以在第一细胞中产生独特的系列用于cDNA分子的标记序列的次数。例如，所述次数可以选自1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95和100次。

可以在等分试样(例如，反应混合物)中形成或产生cDNA分子。等分试样中的第一逆转录引物的浓度可以为约0.5μM至约10μM，约1μM至约7μM，约1.5μM至约4μM，约2μM至约3μM，约2.5μM，或另一合适的浓度。等分试样中的第二逆转录引物的浓度可以为约0.5μM至约10μM，约1μM至约7μM，约1.5μM至约4μM，约2μM至约3μM，约2.5μM，或另一合适的浓度。

在一些实施方案中，所述方法可以包括在步骤(a)之前固定多个细胞。可以在约8℃以下、在约7℃以下、在约6℃以下、在约5℃以下、在约4℃、在约4℃以下、在约3℃以下、在约2℃以下、在约1℃以下或在另一合适的温度下固定多个细胞。在某些实施方案中，所述方法可以包括在步骤(a)之前透化多个细胞。可以在约8℃以下、在约7℃以下、在约6℃以下、在约5℃以下、在约4℃、在约4℃以下、在约3℃以下、在约2℃以下、在约1℃以下或在另一合适的温度下透化多个细胞。

标记第一细胞内的核酸的方法还可以包括连接与cDNA分子结合的核酸标签中的至少两个。在各种实施方案中，所述连接可以在多个细胞内进行。所述方法可以包括去除未结合的核酸标签。此外，第一和第二逆转录引物中的至少一个可以逆转录预定的RNA或被配置成逆转录预定的RNA。

在各种实施方案中，最后的核酸标签可以包含捕获剂。此外，所述方法可以包括在步骤(f)之后裂解多个细胞以从多个细胞内释放cDNA分子，以形成裂解物。所述方法还可以包括向裂解物添加蛋白酶抑制剂和/或结合剂，以分离cDNA分子。如上所述，蛋白酶抑制剂可以包括PMSF、AEBSF、其组合和/或另一合适的蛋白酶抑制剂。捕获剂可以包括生物素或另一合适的捕获剂，并且结合剂可以包括亲和素(例如，链霉亲和素)或另一合适的结合剂。

标记第一细胞内的核酸的方法还可以包括：(j)对与结合剂结合的cDNA分子进行模板转换；(k)扩增所述cDNA分子以形成扩增的cDNA分子溶液；和(1)将SPRI珠溶液引入所述扩增的cDNA分子溶液，以去除小于约200个碱基对、小于约175个碱基对或小于约150个碱基对的多核苷酸。SPRI珠溶液与扩增的cDNA分子溶液之比可以为约0.9∶1至约0.7∶1，约0.875∶1至约0.775∶1，约0.85∶1至约0.75∶1，约0.825∶1至约0.725∶1，约0.8∶1，或另一合适的比例。

此外，SPRI珠溶液可以包含约1 M至4M NaCl，约2M至3M NaCl，约2.25M至2.75MNaCl，约2.5M NaCl或另一合适量的NaCl。SPRI珠溶液还可以包含约15％w/v至25％w/v的PEG，其中所述PEG的分子量为约7000g/mol至9000g/mol。在各种实施方案中，SPRI珠溶液可以包含约17％w/v至23％w/v的PEG 8000，约18％w/v至22％w/v的PEG 8000，约19％w/v至21％w/v的PEG 8000，约20％w/v的PEG 8000，或另一合适％w/v的PEG8000。

独特地标记多个细胞内的RNA分子的方法还可以包括将共用衔接子序列添加到释放的cDNA分子的3’端。如上所述，通用衔接子的添加可以在包含最多约10％w/v的PEG的溶液中进行，其中所述PEG的分子量为约7000g/mol至9000g/mol。在某些实施方案中，可以通过模板转换将共用衔接子序列添加到释放的cDNA分子的3’端。

在某些实施方案中，上述方法中的任一种可以适于标记细胞核或多个细胞核内的核酸分子。例如，所述方法可以包括独特地标记多个细胞核内的RNA分子或标记第一细胞核内的核酸。

本发明的另一方面涉及用于标记第一细胞内的核酸的试剂盒。所述试剂盒可以包括第一逆转录引物，所述第一逆转录引物包含5’突出端序列并且可以被配置成逆转录具有聚(A)尾的RNA。所述试剂盒还可以包括第二逆转录引物，所述第二逆转录引物包含5’突出端序列和随机六聚体、随机七聚体、随机八聚体、随机九聚体和/或随机十聚体中的至少一种。

在一些实施方案中，所述试剂盒可以包括多个第一核酸标签。如上所述，每个第一核酸标签可以包含第一链，所述第一链包含：(i)从第一标记序列的3’端延伸的3’杂交序列，和(ii)从第一标记序列的5’端延伸的5’杂交序列。每个第一核酸标签还可以包含第二链，所述第二链包含突出端序列。突出端序列可以包含：(i)与第一和第二逆转录引物的5’杂交序列和5’突出端序列中的至少一个互补的第一部分，和(ii)与3’杂交序列互补的第二部分。

在某些实施方案中，所述试剂盒还可以包括多个第二核酸标签。每个第二核酸标签可以包含第一链，所述第一链包含：(i)从第二标记序列的3’端延伸的3’杂交序列，和(ii)从第二标记序列的5’端延伸的5’杂交序列。每个第二核酸标签还可以包含第二链，所述第二链包含突出端序列。突出端序列可以包含：(i)与第一和第二逆转录引物的5’杂交序列和5’突出端序列中的至少一个互补的第一部分，和(ii)与3’杂交序列互补的第二部分。此外，第一标记序列可以不同于第二标记序列。

在各种实施方案中，所述试剂盒还可以包括多个最后的核酸标签。每个最后的核酸标签可以包含第一链，所述第一链包含：(i)从最后的标记序列的3’端延伸的3’杂交序列，和(ii)从最后的标记序列的5’端延伸的5’杂交序列。每个最后的核酸标签还可以包含第二链，所述第二链包含突出端序列。突出端序列可以包含：(i)与第一和第二逆转录引物的5’杂交序列和5’突出端序列中的至少一个互补的第一部分，和(ii)与3’杂交序列互补的第二部分。每个最后的核酸标签还可以包含捕获剂。此外，最后的标记序列可以不同于第一和第二标记序列(和/或任何其他标记序列)。在一些实施方案中，所述试剂盒还可以包括逆转录酶、固定剂、透化剂、连接剂、裂解剂、蛋白酶抑制剂和/或任何其他合适的组分中的至少一种。

如本领域普通技术人员将理解的，本文公开的每个实施方案可以包括其特别说明的要素、步骤、成分或组分，基本上由其组成，或由其组成。如本文所使用的，过渡术语“包含(comprise)”或“包含(comprises)”意指包括但不限于，并且允许包括未指定的要素、步骤、成分或组分，甚至包括大量未指定的要素、步骤、成分或组分。过渡短语“由……组成”排除未指定的任何要素、步骤、成分或组分。过渡短语“基本上由……组成”将实施方案的范围限制到指定的要素、步骤、成分或组分，以及不实质上影响实施方案的要素、步骤、成分或组分。

除非另外指明，在说明书和权利要求书中使用的所有表示成分的量，性质，如分子量、反应条件等的数值在任何情况下均应理解为由术语“约”修饰。因此，除非有相反的指示，否则说明书和所附权利要求书中列出的数值参数是近似值，其可以根据本发明试图获得的期望性质变化。至少并且不试图将等同原则的应用限制到权利要求的范围，每个数值参数应至少根据所报告的有效数字的数值并通过应用普通的舍入技术来解释。当需要进一步明晰时，术语“约”当与所述的数值或范围结合使用时具有本领域技术人员合理地赋予其的含义，即表示比所述的数值或范围略多或略少，至以下范围内：所述的数值的±20％；所述的数值的±19％；所述的数值的±18％；所述的数值的±17％；所述的数值的±16％；所述的数值的±15％；所述的数值的±14％；所述的数值的±13％；所述的数值的±12％；所述的数值的±11％；所述的数值的±10％；所述的数值的±9％；所述的数值的±8％；所述的数值的±7％；所述的数值的±6％；所述的数值的±5％；所述的数值的±4％；所述的数值的±3％；所述的数值的±2％或所述的数值的±1％。

尽管阐述本发明的宽范围的数值范围和参数是近似值，但是在具体示例中列出的数值被尽可能精确地报道。但是，任何数值都固有地包含必然由在其各自的测试测量中存在的标准偏差导致的某些误差。

在描述本发明的上下文中使用的术语“一(a)”、“一(an)”、“该(the)”和类似的指称(特别是在以下权利要求的上下文中)应解释为涵盖单数和复数两者，除非本文另外指明或与上下文明显矛盾。本文中数值范围的列举仅旨在充当单独指代落入该范围内的每个单独数值的简写方法。除非本文另外指明，否则每个单独数值都被并入说明书中，就如同它在本文中被单独列举一样。除非本文另外指明或除非另外与上下文明显矛盾，否则本文描述的所有方法可以以任何合适的顺序进行。本文提供的任何和所有实例或示例性语言(例如，“如”)的使用仅旨在更好地阐明本发明，并且不对以其他方式要求保护的本发明的范围构成限制。说明书中的语言不应被解释为表示对于实施本发明必不可少的任何未要求保护的要素。

本文公开的本发明的供选择的要素或实施方案的分组不应被解释为限制。每个组成员可以单独提及或要求保护，或可以与该组的其他成员或本文存在的其他要素任意组合。预期出于便利和/或可专利性的原因，组中的一个或多个成员可以包括在组中或从组删除。当发生任何这样的包括或删除时，说明书被认为包含经修改的组，从而实现所附权利要求中使用的所有马库什组的书面描述。

在任何未来的解释中旨在并意图以本发明中使用的定义和解释为准，除非在以下实施例中进行了清楚和毫无疑义的修改，或者当在术语的解释将使其无意义或基本无意义的情况下含义的应用使任何解释无意义或基本上无意义时，定义应取自韦氏词典第三版或本领域普通技术人员已知的词典，例如牛津生物化学和分子生物学词典(Anthony Smith编，Oxford University Press，Oxford，2004)。

实施例

以下实施例说明了所公开的方法和组合物。根据本发明，本领域技术人员将认识到，在没有过度实验的情况下，这些实施例和所公开的方法和组合物的其他实施例的变化将是可能的。

实施例1-固定和逆转录

NIH/3T3(小鼠)和Hela-S3(人)细胞可以在两个分开的10cm细胞培养板上生长到汇合。所述细胞可以用10ml 1X磷酸盐缓冲盐水(PBS)冲洗两次，可以将1ml的0.05％的胰蛋白酶添加到每个板，可以将板在37℃下孵育5分钟。可以通过将每个板以45°角倾斜来使细胞脱离，同时将胰蛋白酶吸移到整个板上，其可以连续进行，直到所有或基本上所有的细胞都脱离。可以将每个细胞系转移到其自己的15ml锥形离心管(FALCON^TM)中。可以将2ml的含10％胎牛血清(FBS)的杜氏改良伊格尔培养基(DMEM)添加到每个管。可以计算每个管中的细胞数量(例如，用血细胞计数器或在流式细胞仪上)。例如，可以从每个管将200μl的样品转移到单独的1.7ml微量离心管中，然后可以在ACCURI^TM流式细胞仪上运行100μl的样品以计算细胞浓度。

来自每个管的相同数量的细胞可以合并在新的单个15ml锥形离心管(FALCON^TM)中，并使用尽可能多的细胞。可以在15ml锥形离心管(FALCON^TM)中以500×g进行5分钟离心。使用桶式离心机可能有帮助，使得细胞在管的底部而不是在管的侧面成团。可以吸出液体而不破坏细胞团，并且可以将细胞重悬于500μl的4％甲醛中。然后可以将细胞在室温(即20-25℃)下放置10分钟。可以向管添加1.5ml的0.5％TRITON^TM X-100，并用移液器轻轻混合。可以将管以500×g离心5分钟。可以再次在不破坏细胞团的情况下吸出液体，并且可以用1ml PBS洗涤两次细胞团，而不重悬细胞团。如果洗涤破坏了细胞团，可以跳过第二次洗涤。然后可以将细胞团重悬于1ml 0.1N HCl中，并在室温下孵育5分钟。

可以将2ml的Tris-HCl(pH 8.0)添加到新的15ml锥形离心管(FALCON^TM)。可以将上述HCl中的固定的细胞与Tris-HCl一起转移到管，以中和HCl。然后可以如上所述(例如，使用血细胞计数器或在流式细胞仪上)计算管中的细胞的数量。可以将Tris-HCl中的固定的细胞以500×g离心沉降5分钟，并且可以吸出液体而不破坏细胞团。可以用1ml不含RNA酶的分子级水将细胞团洗涤两次，而不破坏细胞团。然后可以将细胞重悬至250万个细胞/ml的浓度(为此，可以使用在最后的离心步骤之前计算的浓度)。

可以制备逆转录混合物(55μl M-MuLV逆转录酶缓冲液55μlM-MuLV逆转录酶5.5μl dNTP(每种碱基25mM)，3.44μl RNA酶抑制剂(40单位/μ1)，210.4μl无核酸酶水和2.75μl RT引物(BC_0055，100μM))。在24孔细胞培养板的一个孔中，可以将300μl的逆转录混合物与200μl的固定的细胞(～500000个细胞)混合，并且通过吸移轻轻混合。然后可以将混合物在室温下孵育10分钟以使逆转录引物退火，然后可以将混合物在37℃下在潮湿的培养箱中孵育过夜(即～16小时)。

可用于逆转录的引物(BC_0055)描绘在图10中。这是一种锚定引物，被设计成结合信使RNA的聚(A)尾的起点。可以合成引物，其在3′端(N)具有所有4种碱基，并且在3′最末端倒数第二位(V)具有除T以外的每种碱基。所述引物还可以包含15个连续的dT。在一些实施方案中，所述引物可包含超过15个的dT。在一些其他实施方案中，所述引物可以包含少于15个的dT。在其中引物包含少于15个的dT的实施方案中，可以降低引物的解链温度。结构域s0可能不与信使RNA杂交，反而是可以提供接头寡核苷酸的可进入的结合结构域。所述引物还包括5′磷酸酯，其可以实现通过T4DNA连接酶将引物连接到另一个寡核苷酸。

实施例2-条形码的制备

在96孔板中以100μM的浓度排列条形码。每个条形码都用其相应的接头寡核苷酸退火(参见图10-12)。

图11描绘了退火的第一轮条形码寡核苷酸。使用在结构域i8a中具有独特序列的96个第一轮条形码寡核苷酸。在第一轮中，结构域i8a中的独特序列是用作条形码的序列的区域。通过改变8个核苷酸，有65536种可能的独特序列。在一些实施方案中，多于8个的核苷酸可以存在于结构域i8a中。在一些其他实施方案中，少于8个的核苷酸可以存在于结构域i8a中。通过结构域s1中的互补序列将第一轮条形码预退火至接头链(BC_0056)。所述接头链可以包含与逆转录引物(结构域s0)的部分互补的序列，所述序列可以允许其杂交并使第一轮条形码的3′端与逆转录引物的5′端紧密邻近。逆转录引物的磷酸酯随后可以通过T4DNA连接酶连接到第一轮条形码的3′端。结构域s2可以提供用于另一轮条形编码的接头寡核苷酸的可进入的结合结构域。第一轮条形码寡核苷酸可以包含5′磷酸酯，其可以实现通过T4 DNA连接酶连接到另一个寡核苷酸的3′端。

图12描绘了退火的第二轮条形码寡核苷酸。使用在结构域i8b中具有独特序列的96个第二轮条形码寡核苷酸。在第二轮中，结构域i8b中的独特序列是用作条形码的序列的区域。通过改变8个核苷酸，有65536种可能的独特序列。在一些实施方案中，多于8个的核苷酸可以存在于结构域i8b中。在一些其他实施方案中，少于8个的核苷酸可以存在于结构域i8b中。通过结构域s3中的互补序列将第二轮条形码预退火至接头链(BC_0058)。所述接头链可以包含与第一轮条形码寡核苷酸(结构域s2)的部分互补的序列，所述序列可以允许其杂交并使第一轮条形码的3′端与第二轮条形码寡核苷酸的5′端紧密邻近。第一轮条形码寡核苷酸的磷酸酯随后可以通过T4 DNA连接酶连接到第二轮条形码的3′端。结构域s4可以提供用于另一轮条形编码的接头寡核苷酸的可进入的结合结构域。第二轮条形码寡核苷酸可以包含5′磷酸酯，其可以实现通过T4 DNA连接酶连接到另一个寡核苷酸的3′端。

图13描绘了退火的第三轮条形码寡核苷酸。使用在结构域i8c中具有独特序列的96个第三轮条形码寡核苷酸。在第三轮中，结构域i8c中的独特序列是用作条形码的序列的区域。通过改变8个核苷酸，有65536种可能的独特序列。在一些实施方案中，多于8个的核苷酸可以存在于结构域i8c中。在一些其他实施方案中，少于8个的核苷酸可以存在于结构域i8c中。通过结构域s5中的互补序列将第三轮条形码预退火至接头链(BC_0060)。所述接头链可以包含与第二轮条形码寡核苷酸(结构域s4)的部分互补的序列，所述序列可以允许其杂交并使第二轮条形码的3′端与第三轮条形码寡核苷酸的5′端紧密邻近。第二轮条形码寡核苷酸的磷酸酯随后可以通过T4 DNA连接酶连接到第三轮条形码的3′端。可以使用由10个随机核苷酸(结构域UMI：NNNNNNNNNN)组成的独特分子标识(UMI；参见Islam等人，NatureMethods，2014)合成第三轮条形码寡核苷酸。由于PCR扩增的偏倚，可以由cDNA产生多个测序读数。使用UMI，每个cDNA只可计数一次。第三轮条形码还可以包含与TruSeq衔接子的部分相对应的结构域。可以合成在5′端具有生物素分子的第三轮条形码，以便可以用链霉亲和素包被的磁珠分离完全条形编码的cDNA。

从每种条形码寡核苷酸的100μM储备液开始(即在96孔板中，每轮一种)，将11μl的条形码寡核苷酸转移到96孔PCR板。对于具有第1轮条形码的板，向每个孔添加9μl的BC_0056(100μM储备液)。对于具有第2轮条形码的板，向每个孔添加9μl的BC_0058(100μM储备液)。对于具有第3轮条形码的板，向每个孔添加9的μl BC_0060(100μM储备液)。然后将每个板放入热循环仪中，按照以下程序，使用相应的接头寡核苷酸使条形码退火：加热至90℃，以0.1℃/秒降温，并在温度达到25℃时停止。从具有第1轮条形码的每个孔转移2.2μl到新的96孔板(称为板L1)中。从具有第2轮条形码的每个孔转移3.8μl至新的96孔板(称为板L2)中。从具有第3轮条形码的每个孔转移6.1μl到新的96孔板(称为板L3)中。

实施例3-连接终止寡核苷酸的制备

在每一轮连接之后，可以通过添加过量的与接头链互补的寡核苷酸来终止连接(参见图14)。为了终止每个条形码连接，可以添加与接头寡核苷酸完全互补的寡核苷酸链。这些寡核苷酸可以结合连接到未连接的条形码的接头链，并通过链置换反应置换未连接的条形码。然后，未连接的条形码可以是完全单链的。由于T4 DNA连接酶无法将单链DNA连接到其他单链DNA，因此连接反应将停止进行。为确保所有接头寡核苷酸均被互补寡核苷酸结合，添加摩尔过量的互补寡核苷酸(相对于接头寡核苷酸)。为了终止第一轮连接，添加BC_0064(与BC_0056互补)。为了终止第二轮连接，添加BC_0065(与BC_0058互补)。为了终止第三轮连接，添加BC_0066(与BC_0060互补)。

可以如下制备每种终止连接链(BC_0064，BC_0065，BC_0066)的稀释液：264μl终止连接链(BC_0064，BC_0065，BC_0066)，300μl 10X T4 DNA连接酶缓冲液和636μl不含核酸酶的水。

实施例4-将条形码连接到cDNA

可以将5μl 10％TRITON^TMX-100添加到上述24孔板中的逆转录反应物(至0.1％的终浓度)。可以将具有细胞的逆转录(RT)反应物转移到15ml锥形离心管(FALCON^TM)。可以在500×g下离心RT反应物10分钟，并将其重悬在2ml不含核酸酶的水中。细胞可以与连接酶混合物(一次性移液贮器(10m1)中的600μl 10X T4连接酶缓冲液、2040μl的不含核酸酶的水、所有重悬的细胞(2000μ1)、100μl的T4 DNA连接酶(NEW ENGLAND400000单位/m1)和60μl的10％TRITON^TM X-100)合并。可以通过轻轻地前后倾斜贮器数次来混合细胞和连接酶混合物。使用多通道移液器，可以将40μl的连接酶混合物中的细胞添加到退火的第1轮条形码的每个孔(板L1)。可以通过上下轻轻吸移2-3次来混合每个孔。连接酶混合物中的细胞可以在37℃下孵育60分钟。

可以向每个孔添加10μl的稀释的BC_0064，以终止连接。然后可以将样品在37℃下孵育30分钟。所有细胞都可以收集在新的一次性移液贮器中(10m1)。可使用1ml移液器使细胞通过40μM过滤器，进入新的一次性移液贮器(10m1)。可以将100μl的T4DNA连接酶(NEWENGLAND400000单位/ml)添加到贮库内的细胞。可以通过轻轻地前后倾斜贮器数次来混合细胞和连接酶混合物，并且使用多通道移液器，可以将40μl的连接酶混合物中的细胞添加到退火的第2轮条形码的每个孔(板L2)。可以通过上下轻轻吸移2-3次来混合每个孔，并且样品可以在37℃下孵育60分钟。

可以向每个孔添加10μl的稀释的BC_0065，以终止连接。可以将样品在37℃下孵育30分钟，然后将细胞收集在新的一次性移液贮器中(10m1)。可使用1ml移液器使细胞通过40μM过滤器，进入新的一次性移液贮器(10m1)。可以将100μl的T4 DNA连接酶(NEW ENGLAND400000单位/m1)添加到贮库内的细胞。可以通过轻轻地前后倾斜贮器数次来混合细胞和连接酶混合物。使用多通道移液器，可以将40μl的连接酶混合物中的细胞添加到退火的第3轮条形码的每个孔(板L3)。可以通过上下轻轻吸移2-3次来混合每个孔，并且样品可以在37℃下孵育60分钟。

可以将10μl的稀释的BC_0066添加到每个孔以终止连接。样品可以在37℃下孵育30分钟。所有细胞可以收集在新的一次性移液贮器(10ml)中。可以将细胞转移到15ml锥形离心管(FALCON^TM)，并且该管可以填充洗涤缓冲液(不含核酸酶的水，0.05％吐温20和25％甲酰胺)至15ml。样品可以在室温下孵育15分钟。然后可以在500×g下使细胞成团10分钟，并且可以去除液体而不破坏细胞团。可以将每管细胞重悬于100μl PBS中，并可以对细胞进行计数(例如，在血细胞计数器或流式细胞仪上)。在一个实例中，保留了57000个细胞。可以选择待测序的细胞数量。在一个实例中，将细胞划分成25个细胞、250个细胞、2500个细胞和25000个细胞的等分试样。可以将300μl的裂解缓冲液(10mM NaF，1mM Na₃VO₄，0.5％DOC缓冲液和0.5％TRITON^TM X-100)添加到每个细胞等分试样，并且每个细胞等分试样都可以通过25号针八次。

实施例5-使条形编码的cDNA与链霉亲和素包被的珠结合

首先，可以将MYONE^TM链霉亲和素C1珠重悬。可以将20μl的重悬的MYONE^TM链霉亲和素C1珠(对于细胞的每个等分试样)添加到1.7ml微量离心管可以用1X磷酸盐缓冲盐水吐温20(PBST)洗涤珠3次，并将其重悬于20μl PBST中。可以将900μl PBST添加到细胞等分试样，并且可以将20μl的洗涤的C1珠添加到裂解的细胞的等分试样。可以将样品在室温下放置在平缓的辊上15分钟，然后使用磁选管架用800μl PBST洗涤3次。然后可以将珠重悬于100μl PBS中。

实施例6-珠的RNA酶处理

可将包括样品的微量离心管抵靠磁选管架放置2分钟，然后可以将液体吸出。可以将珠重悬在RNA酶反应物(3μlRNA酶混合物(ROCHE^TM)，1μl RNA酶H(NEW ENGLAND)，5μl RNA酶H10X缓冲液(NEW ENGLAND)和41μl不含核酸酶的水)中。样品可以在37℃下孵育1小时，从37℃下移开，然后抵靠磁选管架放置2分钟。可以用750μl的不含核酸酶的水+0.01％吐温20(H₂O-T)洗涤样品，而不重悬珠并保持管抵靠磁选管架放置。然后可以吸出液体。可以用750μl H₂O-T洗涤样品，而不重悬珠，且同时保持管抵靠磁选管架放置。接下来，可以在保持管抵靠磁选管架放置的同时吸出液体。然后可以从磁选管架移开管，并将样品重悬于40μl的不含核酸酶的水中。

实施例7-3’衔接子连接

参考图15，为了促进PCR扩增，可以将单链DNA衔接子寡核苷酸(BC_0047)连接到cDNA的3′端。为了避免衔接子寡核苷酸的串联体，可以在衔接子寡核苷酸的3′端包括双脱氧胞苷(ddC)。产生在5′端具有磷酸酯，并且在3′端具有ddC的BC_0047。几种酶能够将单链寡核苷酸连接到单链DNA的3′端。在本文中，使用了T4 RNA连接酶1(NEW ENGLAND)。热稳定的5′AppDNA/RNA连接酶(NEW ENGLAND)也可以与预腺苷酸化的衔接子寡核苷酸一起使用。

具体地，可以将20μl的RNA酶处理的珠添加到单个PCR管。可以将80μl的连接酶混合物(5μl T4 RNA连接酶1(NEW ENGLAND)，10μl 10X T4 RNA连接酶缓冲液，5μl 50μM的BC_0047寡核苷酸，50μl50％PEG 8000和10μl 10mM ATP)添加到PCR管中的20μl的珠。可以将50μl的与珠混合的连接酶转移到新的PCR管中，以防止过多的珠沉淀到单个管的底部，并且样品可以在25℃下孵育16小时。

实施例8-产生相容性测序产物

来自两个PCR管的连接反应物可以合并到单个1.7ml微量离心管中。可以向每个样品添加750μl的H₂O-T。每个管可以放置在磁选管架上2分钟，可以吸出液体，并将样品重悬于40μl水中。样品可以转移到PCR管。可将60μl的PCR混合物添加到每个管(50μl 2XDNA聚合酶预混合物(THERMO FISHER^TMScientific)，5μl BC_0051(10μM)和5μl BC_0062(10μM))。可以运行10个PCR循环(98℃持续3分钟，重复10次(98℃持续10秒，65℃持续15秒，和72℃持续60秒)，和72℃持续5分钟)。图16描绘了PCR产物。在3′衔接子寡核苷酸(BC_0047)已经连接到条形编码的cDNA后，可以使用PCR扩增cDNA。如图16所示，使用了引物BC_0051和BC_0062。

可以获取来自前一步骤的PCR样品，并且可以用磁铁将磁珠转移至每个管的底部。可以将90μl的PCR反应物转移到新的1.7ml管，而不转移任何磁珠。可以向每个1.7ml管添加10μl的不含核酸酶的水，至100μl的总体积。可以将60μl的AMPURE^TM珠添加到100μl的PCR反应物(0.6X SPRI)并结合5分钟。可以将管抵靠磁铁放置2分钟，然后可以用200μl的70％乙醇洗涤样品(等待30秒)，而不重悬珠。可以用200μl的70％乙醇再次洗涤样品(等待30秒)，而不重悬珠，然后可以将样品风干5-10分钟，直到乙醇蒸发。

每个样品可以重悬于40μl的不含核酸酶的水中。可以将管抵靠磁力架放置2分钟。尽管微量离心管仍然抵靠磁力架放置，但可以将38μl的溶液转移到新的1.7ml管，而不转移珠。可以将62μl的不含核酸酶的水添加到样品，至总体积为100μl。然后可以将60μl的AMPURE^TM珠添加到100μl的PCR反应物(0.6X SPRI)并结合5分钟。可以将管抵靠磁铁放置2分钟，然后可以用200μl的70％乙醇洗涤样品(等待30秒)，而不重悬珠。可以再次用200μl 70％乙醇洗涤样品(等待30秒)，而不重悬珠，然后可以将样品风干5-10分钟，直到乙醇蒸发。

可以将样品重悬于40μl的不含核酸酶的水中，并且每个管可以抵靠磁力架放置2分钟。当管仍然抵靠磁力架放置时，将38μl的溶液转移至新的1.7ml管，而不转移任何珠。可以将38μl洗脱液中的20μl添加到光学PCR管。此外，可将PCR混合物添加到管(25μlDNA聚合酶预混合物(THERMO FISHER^TM Scientific)，2.5μl BC_0027(10μM)，2.5μl BC_0063(10μM)和2.5μl 20X(BIOTIUM^TM))。按照图16所描绘的PCR，可以通过另一轮PCR引入完整的衔接子序列。如图17所描绘的，BC_0027包含流动细胞结合序列和TRUSEQ^TM读数1引物的结合位点。BC_0063包含流动细胞结合序列和TruSeq多重读数2和索引结合序列。还有一个样品索引的区域，在此实施例中为GATCTG。

以上样品可以采用以下循环条件在qPCR仪器上运行：1)98℃持续3分钟，2)98℃持续10秒，3)65℃持续15秒，4)72℃持续60秒，和5)重复步骤2-4(例如，10-40次，取决于荧光停止时指数方式的增加)。可以将管转移到设置为72℃的热循环仪持续5分钟。可以在1.5％琼脂糖凝胶上运行qPCR反应40分钟，并可以去除450-550bp的条带并进行凝胶提取(凝胶提取试剂盒)。可以使用配对末端测序在MISEQ^TM上对产物测序。测序引物可以是标准的TRUSEQ^TM多重引物。读数1可以对cDNA序列进行测序，而读数2可以覆盖独特分子标识以及3个条形码序列(每个8个核苷酸)。索引读数1可用于对样品条形码测序，因此可以对多个样品一起测序。

实施例9-数据分析

测序读数按细胞条形码分组(三个条形码，每个八个核苷酸，总计96×96×96＝884736种组合)。每个条形码组合应对应于来自单个细胞的cDNA。仅保留具有有效条形码的读数。将每个条形码组合的测序读数与人类基因组和小鼠基因组二者比对。舍弃与两个基因组对齐的读数。具有相同的独特分子标识的多个读数计为单个读数。假定具有两个或更少错配的独特分子标识的读数是由测序错误产生的，并计为单个读数。对于每种独特的条形码组合，绘制了与人类基因组(x轴)和小鼠基因组(y轴)对齐的读数的数量(参见图18)。由于每个细胞是小鼠或人的，因此理想情况下应仅包含一种类型的RNA。因此，理想的绘图将具有沿x轴或y轴的每个点。图18的绘图中的大多数点在轴附近的事实表明该方法是可行的。

绘图中的每个点对应于具有相同条形码组合的cDNA，并且应代表来自单个细胞的cDNA。对于每个点，在y轴上绘制独特地映射到小鼠基因组的读数的数量，而在x轴上绘制独特地映射到人类基因组的读数的数量。如果具有特定条形码组合的cDNA来自单个细胞，则具有特定条形码组合的所有cDNA应该完全映射到人类基因组或完全映射到小鼠基因组。如上所述，大多数条形码组合映射接近x轴(人细胞)或y轴(小鼠细胞)的事实表明该方法确实可以产生单细胞RNA测序数据。

实施例10-独特地标记多个细胞的分子的方法

对于以下公开的方案，计划的实验时间为两(2)天。如下所示，可以将RNA酶抑制剂添加到缓冲液。因此，当任何缓冲液包含术语“+RI”时，这表明应添加RNA酶抑制剂至0.1U/μL的终浓度。离心步骤可以用摇摆斗转子来进行。在一些实施方案中，使用固定角度离心机可能导致更多的细胞损失。根据组织类型，可能需要更改离心速度以优化细胞保留(例如，更小的细胞＝更高的速度)。

为了产生DNA条形编码板，可能需要以下：i)来自的三个96孔板，逆转录条形码引物，连接第1轮和连接第2轮储备液DNA寡核苷酸板(100μM)；ii)两种接头寡核苷酸，BC_0215和BC_0060(注意：假定它们的储备液浓度为1mM，因此，如果要使用另一种储备液浓度(例如100μM储备液)，则校正体积)；和iii)六个96孔PCR板(例如，三(3)个储备液板，其至少可以持续10次实验，和用于第一次实验的三(3)个板)。注意，这可以为每个孔产生100μL的DNA条形码。每个实验通常只需要4μL/孔的逆转录引物溶液，其可以持续25次实验。每个实验通常只需要10μL/孔的条形码/接头溶液，因此这些板可以持续总共10次实验。

第1轮逆转录条形编码的引物(在48个孔中的每个中，终浓度为12.5μM随机六聚体和12.5μM 15dT引物)：1)使用多通道移液器，将12.5μL的逆转录条形码引物中的A-D行添加到BC储备液96孔PCR板的A-D行；2)使用多通道移液器，将12.5μL的逆转录条形码引物中的E-H行添加到BC储备液96孔PCR板的A-D行(此处将聚dT与随机六聚体引物混合)；3)将75μl的水添加到BC储备液96孔PCR板的A-D行。

第2轮连接轮(终浓度为12μM的条形码，11μM接头-BC_0215)：1)使用多通道移液器，将12μL的第2轮条形码添加到R1储备液96孔PCR板；2)将138.6μl的BC_0215(1mM)添加到池中的10.9494mL水(BC_0215_dil)中；和3)使用多通道移液器，将88μL BC_0215_dil添加到R2储备液96孔PCR板的每个孔。

第3连接轮(终浓度为14μM的条形码，13μM接头-BC_0060)：1)使用多通道移液器，将14μL的第3轮条形码添加到R3储备液96孔PCR板；2)将163.8μl的BC_0060(1mM)添加到池中的10.6722mL水(BC_0060_dil)；和3)使用多通道移液器，将86μL BC_0060添加到R3储备液96孔PCR板的每个孔。

对于每个连接板(R2和R3，不包含逆转录条形码)，采用以下热循环方案使条形码和接头寡核苷酸退火：1)加热至95℃持续两(2)分钟，和2)以0.1℃/s的速率降温至20℃；3)4℃。

将10μL的每个条形码/接头储备液板等分到三(3)个新的96孔PCR板中。这些是在方案中应当用于划分合并连接步骤中的DNA条形编码的板。

I.细胞核提取(任选的)：1)准备以下项目，a)将Dounce匀浆器保持在4℃下直至使用，b)15ml 1X PBS+37.5SUPERASE-IN^TM+19μlRNA酶抑制剂(保持在冰上)，和c)将离心机预冷至4℃。

2)制备NIM1缓冲液(表1)：

表1：NIM1缓冲液

试剂	储备液浓度	终浓度	体积(μL)
				蔗糖	1.5M	250mM	2500
KCl	1M	25mM	375
				MgCl₂	1M	5mM	75
Tris缓冲液，pH 8	1M	10mM	150
				水	NA	NA	11900
终体积			15000

3)制备匀浆缓冲液(表2)：

表2：匀浆缓冲液

4)Dounce匀浆器：a)将组织/细胞样品添加到Dounce匀浆器；如果是细胞，则重悬在700μl匀浆缓冲液中；b)添加匀浆缓冲液至～700μl；c)进行5次松杵(loose pestle)；d)进行10-15次紧杵(tight pestle)；e)添加匀浆缓冲液最多至1ml；和f)用5μl台盼蓝和5μl细胞在血细胞计数器上检查细胞裂解，以查看细胞核是否被释放。

5)用40μm过滤器将匀浆过滤到5ml EPPENDORF^TM管(或15mLFALCON^TM管)中。将过滤器倾斜45°，同时在管上过滤，可确保裂解物如预期那样通过。注意：此过滤过程与以下过滤过程不同。

6)在600×g(4℃)下离心4分钟，去除上清液(可以留下约20μL以避免吸出细胞团)。7)重悬于1ml的1X PBS+RI中。8)添加10μl BSA。9)在600×g下离心4分钟。10)重悬于200μl 1X PBS+RI中。

11)从来自步骤4的重悬细胞取出50μl，并添加150μl 1X PBS+RI。在血细胞计数器和/或流式细胞仪上对样品计数。来自步骤4的重悬细胞的体积可以基于使用者的考虑而改变。12)使细胞通过40μm过滤器，进入新的15mL FALCON^TM管中，并置于冰上(参见下文关于II.固定和透化的步骤4的注释)。13)在1mL 1X PBS+RI中重悬期望数量的细胞核(通常为2M)，并以以下固定和透化方案继续步骤5。

II.固定和透化：1)制备以下缓冲液(针对两次实验计算)：a)1.33％福尔马林(360μL的37％甲醛溶液+9.66ml PBS)溶液，并在4℃下储存；b)6mL的1X PBS+RI(15μL的SUPERASE-IN^TM和7.5μL的RNA酶抑制剂)；c)2mL的0.5X PBS+RI(5μL的SUPERASE-IN^TM和2.5μl的RNA酶抑制剂)；d)500μL的5％TRITON^TM X-100+RI(2μL的SUPERASE-IN^TM)；e)500μL的100mM Tris pH 8.0+2μL SUPERASE-IN^TM；和f)将离心机设置为4℃。

2)通过在4℃下以500×g离心3分钟来使细胞成团(某些细胞可能需要更快的离心)。3)将细胞重悬于1mL的冷PBS+RI中。在这些步骤之间，将细胞保持在冰上。4)使细胞通过40μm过滤器，进入新的15mL FALCON^TM管中，并置于冰上。注意：细胞重悬液不太可能被动通过过滤器，这可能导致细胞损失。相反，采用填充重悬液的1ml移液器，将管尖的端部直接压在过滤器上，并主动推动液体通过。该运动应耗费大约一(1)秒。5)添加3mL的冷的1.33％甲醛(终浓度为1％甲醛)。将细胞在冰上固定10分钟。6)向固定的细胞中添加160μL的5％TRITON^TMX-100+RI，并通过用1mL移液器轻轻上下吸移5次混合。在冰上透化细胞3分钟。7)在4℃下以500×g离心细胞3分钟。8)小心吸出，并将细胞重悬于500μL的冷PBS+RI中。9)添加500μL的冷的100mM Tris-HCl，pH 8.0。10)添加20μL的5％TRITON^TM X-100。11)在4℃下以500×g离心细胞3分钟。12)吸出细胞并将其重悬于300μl的冷的0.5X PBS+RI中。

13)使细胞通过40μM过滤器，进入新的1.7mL管中(参见上文关于II.固定和透化的步骤4的注释)。14)使用血细胞计数器或流式细胞仪对细胞计数，并将细胞悬液稀释至1000000个细胞/mL。在对细胞计数时，将细胞悬液保持在冰上。注意：该步骤将决定多少个细胞进入划分合并轮次。可能仅对进入划分合并轮次的细胞子集测序(可以在裂解步骤的子库生成过程中完成)。应该计算将要使用的条形码组合的总数，以确定可以在最少条形码冲突的情况下对最大数量的细胞测序。不受任何一种特定理论的束缚，将要处理的细胞数量不应超过总条形码组合的多于5％。通常，此处可以使用500k至1M个细胞/mL的稀释度(相当于4-8k个细胞进入每个孔用于逆转录条形编码轮次)。

III.逆转录：1)将4μL的RT条形码储备液板等分到新的96孔板的顶部四(4)行(48孔)中。用粘性板密封件覆盖该板，直到准备使用。

2)在冰上形成以下逆转录(RT)混合物(表3)：

表3：RT混合物

3)将8μL的RT混合物添加到顶部48个孔的每一个。现在，每个孔应包含12μL的体积。4)向顶部48个孔中的每一个添加8μL的在0.5X PBS+RI中的细胞。现在每个孔应包含20μL的体积。5)将板加入热循环仪中，按照以下方案：a)50℃持续10分钟；b)循环三(3)次，i)8℃持续12秒，ii)15℃持续45秒，iii)20℃持续45秒，和iv)30℃持续30秒，v)42℃持续2分钟，vi)50℃持续3分钟；c)50℃持续5分钟；和d)恒定在4℃。

6)将RT板放置在冰上。7)准备2mL的1X NEB缓冲液3.1，其具有20μL的RNA酶抑制剂。8)将每个RT反应物转移到15mLFALCON^TM管(也在冰上)。9)添加9.6μL的10％TRITON^TMX-100，得到0.1％的终浓度。10)以500×g离心合并的RT反应物3分钟。11)吸出上清液，重悬于2mL 1XNEB缓冲液3.1+20μLRNA酶抑制剂中。

IV.连接条形编码：1)在冰上制备以下连接预混合物(表4)：

表4：连接预混合物

注意：终浓度考虑了DNA条形码的添加的体积。该混合物的浓度不是条形编码时的终浓度。

2)将2mL的在NEB缓冲液3.1中的细胞添加到连接混合物。现在，混合物应具有4.04mL的体积。3)将混合物添加到池中。4)用多通道移液器将40μL的连接混合物(含细胞)添加到第1轮DNA条形码板的每个孔中。5)用粘性板密封件覆盖第1轮DNA条形码板，并在37℃下采用缓慢转动(50rpm)孵育30分钟。6)制备第1轮封闭溶液并将其添加到新的池(表5)。

表5：第1轮封闭溶液

试剂	储备液浓度	终浓度	体积(μL)
				BC_0216	100μM	26.4μM	316.8
10X连接酶缓冲液	10X	2.5X	300
				水	NA	NA	583.2
终体积			1200μL

7)从培养箱取出第1轮DNA条形编码板，并移去覆盖物。8)使用多通道移液器将10μL的第1轮封闭溶液添加到第1轮DNA条形编码板的96个孔中的每一个。9)用粘性板密封件覆盖第1轮DNA条形码板，并在37℃下采用缓慢转动(50rpm)下孵育30分钟。10)从培养箱取出第1轮DNA条形编码板，移去覆盖物，并将所有细胞合并到新的池中。11)使所有来自该池的细胞通过40μm过滤器进入另一个池中(参见上文关于固定和透化的步骤4的注释)。12)将100μL的T4 DNA连接酶添加到池，并通过吸移约20次混合。13)使用多通道移液器，将50μL的细胞/连接酶溶液添加至第2轮DNA条形码板的每个孔中。14)用粘性板密封件覆盖第2轮DNA条形码板，并在37℃下采用缓慢转动(50rpm)孵育30分钟。

15)制备第2轮封闭溶液并将其添加到新的池(表6)。

表6：第2轮封闭溶液

试剂	储备液浓度	终浓度	体积(μL)
				BC_0066	100μM	11.5μM	369
EDTA	0.5M	125mM	800
				水	NA	NA	2031
终体积			3200μL

16)从培养箱取出第2轮DNA条形编码板，并移去覆盖物。17)使用多通道移液器，将20μL的第2轮封闭和终止溶液添加到第2轮DNA条形编码板中的96个孔中的每一个。18)将所有细胞合并到新的池中(最后的封闭步骤不孵育)。19)使所有来自该池的细胞通过40μm过滤器进入15mLFALCON^TM管中(参见上文关于固定和透化的步骤4的注释)。19)在流式细胞仪上对细胞计数。在等分样品用于计数之前，确保细胞充分混合。

V.裂解：1)制备2X裂解缓冲液(表7)。

表7：2X裂解缓冲液

试剂	储备液浓度	终浓度(2X)	体积(mL)
				Tris，pH 8.0	1M	20mM	0.5
NaCl	5M	400mM	2
				EDTA，pH 8.0	0.5M	100mM	5
SDS	10％	4.4％	11
				水	NA	NA	6.5
终体积			25

2)如果出现白色沉淀，则在37℃下保温直至沉淀消失在溶液中(约10-15分钟)。

3)制备以下洗涤缓冲液(表8)。

表8：洗涤缓冲液

试剂	体积(μL)
		1X PBS	4000
10％TRITON^TM X-100	40
		SUPERASE-IN^TM RNA酶抑制剂	10
终体积	4050

4)向细胞添加70μl的10％TRITON^TM X-100(～0.1％终浓度)。5)在15ml管中以1000×g离心5分钟。注意：用于以下步骤的细胞团可以很小，而且它可能看不见。6)吸出上清液，留下约30μl，以避免移出细胞团；a)如果可能，用20μL移液器移出尽可能多的上清液。7)用4mL洗涤缓冲液重悬。8)以1000×g离心5分钟。9)吸出上清液并重悬于50μl1X PBS+RI中。

10)将5μl稀释到195μL的1X PBS中，并通过流式细胞术计数。或取5μl到5μl1X PBS中，并在血细胞计数器上计数(可能难以将碎片与细胞区分开)。11)确定多少子库要生成(子库的数量＝需要的管的数量)，以及这些子库中的每个将具有多少细胞。12)将每个子库期望数量的细胞等分到新的1.7mL管中。向每个管添加1X PBS至终体积为50μL。

13)向每个管添加50μL的2X裂解缓冲液。14)向每种裂解物添加10μL的蛋白酶K(20mg/mL)。15)在55℃下采用200rpm下的震摇孵育2小时。16)终止点(任选的)：在-80℃下冷冻(多种)裂解物。

VI.制备缓冲液.首先制备以下储备溶液(表9-11)。

表9：苯甲基磺酰氟(PMSF)

100mM PMSF

表10：2X B&W

2X B&W
		试剂	体积
1M Tris-HCl pH 8.0	500μL
		5M NaCl	20ml
EDTA，0.5M	100μl
		不含核酸酶的水	29.4ml
总计	50mL

表11：1X B&W-T

1X B&W-T
		试剂	体积
1M Tris-HCl pH 8.0	100μL
		5M NaCl	4ml
EDTA，0.5M	20μl
		吐温2010％	100μl
不含核酸酶的水	15.78ml
		总计	20mL

然后制备以下较小的等分试样(具有添加的RNA酶抑制剂；表12-14)：

表12：1X B&W-T+RI

表13：2X B&W+RI

表14：Tris-T+RI

VII.cDNA的纯化.注意：已经在带有1.7mL泡沫管架的涡旋振荡器上以低设定(2/10)实施搅拌步骤。

洗涤MYONE^TM C11)对于每份待处理的裂解物，将44μL的MYONE^TMC1添加到1.5mL管(例如，1份裂解物＝44μL，2份裂解物＝88μL，3份裂解物＝132μL等)。2)添加800μL的1X B&W-T缓冲液。3)将样品抵靠磁力架放置并等待，直到液体变澄清(1-2分钟)。4)除去上清液，然后将珠重悬于800μL的1X B&W-T缓冲液中。5)再重复步骤3-4两次，总共洗涤3次。6)将样品抵靠磁力架放置并等待，直到液体变澄清。7)将珠重悬于100μL(每个样品)2X B&W缓冲液+RI中。

样品与链霉亲和素的结合：1)向每个样品添加5μL的100μM PMSF，并在室温下放置10分钟。2)向每个管添加100μl的重悬的C1珠。3)为了使cDNA与C1珠结合，在室温下搅拌60分钟。4)将样品抵靠磁力架放置并等待，直到液体变澄清(1-2分钟)。5)除去上清液，并将珠重悬于250μL的1X B&W中。6)在室温下搅拌珠5分钟。7)重复步骤5和6。8)除去上清液并将珠重悬于250μL的10mM Tris+T中。9)在室温下搅拌珠5分钟。10)将珠置于冰上的最终洗涤溶液中。

模板转换.根据样品数量制备以下混合物(表15)。

表15：混合物

1)将样品抵靠磁力架放置并等待，直到液体变澄清。2)在样品仍在磁力架上的情况下，除去上清液，并用250μL的水洗涤(这次不重悬珠)。3)将样品重悬于200μl模板转换混合物中。4)在搅拌或滚动的情况下在室温下孵育30分钟。5)在搅拌或滚动的情况下在42℃下孵育90分钟(培养箱已在100rpm下振摇)。

6)潜在的终止点。如果终止，进行以下操作(否则跳至下个部分)：a)将样品抵靠磁力架放置并等待，直到液体变澄清，和b)重悬于250μL Tris-T中。

VIII.cDNA扩增.根据样品数量制备以下PCR混合物(表16)。

表16：PCR混合物

1)将样品抵靠磁力架放置并等待，直到液体变澄清。2)在样品抵靠磁体的情况下，用250μL的不含核酸酶的水洗涤(不重悬)。3)用220μL PCR混合物重悬样品，并平等划分到四(4)个不同的PCR管中。

4)运行以下热循环程序：a)95℃，3分钟；b)98℃，20秒；c)65℃，45秒；d)72℃，3分钟；e)重复(b-d)四次(5个总循环)；和f)4℃，保持。

5)将所有四(4)个反应物合并到单个1.7mL管中。在合并反应物之前，确保重悬任何可能粘在PCR管底部或侧面的珠。6)将样品抵靠磁力架放置并等待，直到液体变澄清。7)将200μL的上清液转移至四(4)个光学级qPCR管(每管中50μL)。8)向每个qPCR管添加2.5μL的20X9)运行以下qPCR程序(确保一旦信号开始离开指数期，去除样品以防止过度扩增)：a)95℃，3分钟；b)98℃，20秒；c)67℃，20秒；d)72℃，3分钟；e)重复(b-d)直到信号脱离指数扩增稳定；f)72℃，5分钟；和g)4℃，保持。

10)任选的：运行琼脂糖凝胶或对得到的qPCR进行生物分析。可能会存在cDNA和二聚体的组合。

SPRI尺寸选择(0.8X).1)将qPCR反应物合并到单个管中。2)取出180μL的合并的qPCR反应物，并放入新的1.7mL管中。3)向管添加144μL的KAPA^TM纯珠，并短暂涡旋振荡来混合。等待五(5)分钟以结合DNA。4)将管抵靠磁力架放置并等待，直到液体变澄清。5)除去上清液。6)在管仍在磁力架上的情况下，用750μL 85％乙醇洗涤。不重悬珠。7)重复步骤6。

8)除去乙醇并风干珠(～5分钟)。不要让珠过度干燥和破裂。9)将来自每个管的珠重悬于20μL的水中。一旦珠完全重悬于水中，将管在37℃下孵育10分钟。10)将管抵靠磁力架结合并等待，直到液体变澄清。11)将18.5μL的洗脱液转移到新的光学级PCR管中。12)针对10μL的洗脱液运行生物分析仪追踪(bioanalyzer trace)。

13)如果选择尺寸后不存在二聚体，则直接跳至下面的“Tagmentation和扩增子产生”部分。如果仍然存在二聚体，继续步骤14以进行第二次扩增和尺寸选择步骤。这对于具有低RNA含量的细胞可能是必需的，但对于具有高RNA含量的细胞(例如HeLa-S3、NIH/3T3等)则不应是必需的。

第二qPCR(任选的).14)根据样品数量制备以下qPCR混合物(表17)。

表17：qPCR混合物

15)将31.5μL的qPCR预混合物与先前的PCR样品一起添加到每个光学PCR管。通过轻弹温和混合，并在台式离心机中短暂离心管以除去气泡。16)运行以下qPCR程序(确保一旦信号开始离开指数期，移除样品以防止过度扩增)：a)95℃，3分钟；b)98℃，20秒；c)67℃，20秒；d)72℃，3分钟；e)重复(b-d)直到信号脱离指数扩增稳定；f)72℃，5分钟；和g)4℃，保持。

17)运行琼脂糖凝胶或对得到的qPCR进行生物分析。尽管可能仍然存在二聚体，但是扩增的cDNA应该在500bp至2500bp之间清晰可见(参见图19，左侧为预期的尺寸分布)。

第二SPRI尺寸选择(0.8X).18)将qPCR反应物合并到单个管中。19)取出40μL的qPCR反应物，并放入新的1.7mL管中。20)向每个管添加32μL的KAPA^TM纯珠，并短暂涡旋振荡来混合。等待5分钟以结合DNA。

21)将管抵靠磁力架放置并等待，直到液体变澄清。22)除去上清液。23)在管仍在磁力架上的情况下，用750μL 85％乙醇洗涤。24)重复步骤5。25)除去乙醇并风干珠(～5分钟)。不要让珠过度干燥和破裂。26)将来自每个管的珠重悬于20μL的水中，并等待5分钟。27)将管抵靠磁力架结合并等待，直到液体变澄清。28)将18.5μL的洗脱液转移到1.7mL管中。29)运行琼脂糖凝胶或对得到的qPCR进行生物分析。此时应该几乎没有二聚体。如果存在二聚体，进行另一轮qPCR，接着进行另一次0.8X SPRI尺寸选择。

IX.Tagmentation和扩增子产生.1)将Quibit扩增的cDNA稀释至0.12ng/μL。2)将热循环仪预热至55℃。3)对于每个样品，将600pg的纯化的cDNA与H₂O合并，总体积为5μl。4)向每个管添加10μl的NexteraTD缓冲液和5μl的扩增子Tagment酶(反应物总体积现在为20μl)。通过吸移约5次混合并离心沉降。5)在55℃下孵育5分钟。6)添加5μl的中和缓冲液。通过吸移约5次混合并离心沉降(气泡是正常的)。7)在室温下孵育5分钟。

8)按以下顺序向每个PCR管添加：i)15μl的Nextera PCR混合物；ii)8μl H₂O；iii)1μl的10M(N7索引引物，BC_0076-BC_0083中的一种)；和iv)1μl的10μM Nextera(BC_0118)N501寡核苷酸。9)运行以下热循环程：95℃，30秒；ii)12个循环：95℃，10秒；b)55℃，30秒；和c)72℃，30秒；和iii)然后，72℃，5分钟和恒定在4℃。

10)由50μL反应物转移出40μl至1.7mL管。11)添加28μL的KAPA^TM纯珠，以进行0.7X纯化。以20μl洗脱。12)在测序之前对所得样品进行生物分析和quibit(对于预期的尺寸分布，参见图19右侧)。

X.测序.1)使用以150bp试剂盒运行的配对末端测序。2)将读数1设置为66nt(转录序列)。3)将读数2设置为94nt(细胞特异性条形码和UMI)。4)包括6nt读数1索引以准备好子库索引。

实施例11-将细胞固定在冰上并将细胞保持在冰上用于透化

独特分子索引(UMI)是随机分子条形码，其在扩增前被添加到每个转录物/cDNA。由于PCR复制物具有相同的UMI序列，因此它们实现计算去除PCR复制物。因此，即使对多个PCR复制物进行测序，每个原始转录物也只会被计数一次。

每个细胞的UMI的量度指示每个细胞可以检测到多少独特的RNA分子，这直接与分子可以多有效地被条形编码并加工以实现通过新一代测序的检测有关。该量度通常是该领域的黄金标准，并且单细胞RNA测序领域的大多数研究人员根据用给定量的原始测序读数检测到的每个细胞有多少UMI(例如，在每个细胞有50000个测序读数的情况下，每个细胞有10000个UMI)来确定他们的实验效果有多好。

对于实施例11-16中的每一个，将相同表(即表18、表19、表20、表21和表22)内的所有条件都测序，达到相同的饱和水平，实现在条件之间的精确比较。每个条件与另一个条件相比，具有相同数量的原始测序读数，表明每个检测到的细胞在检测到的UMI方面的差异是由于条件的变化而不是测序深度所致。

在其他方案中(参见例如，Rosenberg，AB等人，BioRxiv(2017)：105163)，甲醛固定在室温下进行。在本文中，进行的实验显示在固定和透化过程中将细胞保持在冰上(例如，在4℃下)时显著的改善(参见表18)。

表18：室温与4℃的比较

实施例12-添加蛋白酶抑制剂(PMSF)并直接与链霉亲和素珠结合

在其他方案中(参见例如，Rosenberg，AB等人，BioRxiv(2017)：105163)，在使期望的核酸(包含5’生物素)结合于链霉亲和素珠之前，首先采用SPRI珠纯化从裂解溶液分离核酸。在本文中，发现向裂解物添加PMSF，然后直接添加链霉亲和素珠(从而跳过了核酸的第一SPRI分离)改善了每个细胞检测到的独特分子的数量(参见表19)。

表19：链霉亲和素选择和PMSF

实施例13-0.6X SPRI纯化与0.8X SPRI纯化的比较

在其他方案中(参见例如，Rosenberg，AB等人，BioRxiv(2017)：105163)，在cDNA扩增后，进行0.6X SPRI纯化。cDNA扩增后，可以使用SPRI纯化去除短产物(即约200个碱基对以下的产物)。在本文中，发现与先前的0.6∶1的SPRI与PCR产物之比相比，添加比率为0.8∶1的SPRI珠与PCR产物导致每个细胞检测到的独特RNA分子更多(参见表20)。

表20：0.6X SPRI纯化与0.8X SPRI纯化的比较

实施例14-随机六聚体和聚dT RT引物的浓度

在其他方案中(参见例如，Rosenberg，AB等人，BioRxiv(2017)：105163)，进行仅使用用于逆转录的聚dT引物的逆转录。在本文中，发现通过组合条形编码的随机六聚体引物并改变浓度导致UMI/细胞的显著增加。参照表21，方案2.1版使用4号条件(729个UMI/细胞)。在此继续参照表21，使用10号条件(1263个UMI/细胞)。因此，以特定的浓度将随机六聚体和聚dT逆转录引物组合在一起提高原位逆转录的效率。

表21

实施例15-使用第一轮条形码作为样品标识

使用条形编码的逆转录引物在cDNA分子中产生第一轮条形码。然后，采用如上所述的连接通过将条形码附加到5’端，进一步对这些cDNA分子进行条形编码。

概念性验证描述在Rosenberg，AB等人.(2018)Science，360(6385)；176-182中，其全部内容通过引用在此并入。如其中所述，实验包括四(4)个独特样品，并且通过观察第一条形码(通过RT掺入)基本上跟踪了哪个细胞属于哪个样品。这种样品识别可能需要知道每个孔对应的条形码序列以及将哪些样品放入哪个孔中。利用此信息，可以创建从第一轮条形码序列到样品ID的查找表。

图20和21显示了用于复用样品的实验设置。在这种特定情况下，将4个样品在96孔板的48孔中复用。可以看到如何在单个实验中将这样的相同的逻辑扩展以复用最多达96种样品。

参照图22，显示了在采用四个不同生物样品的实验中使用T分布随机邻近嵌入(t-SNE)对转录组的分析。每个点代表来自一个单一细胞的转录组。使用RT期间掺入的条形码的身份(具有条形编码的RT引物)，可以确定每个转录组的样品身份。

实施例16-掺入用于结合于磁珠的DNA/RNA的模板转换的PEG

使连接到逆转录的RNA(cDNA/RNA双链体)的生物素化的寡核苷酸与链霉亲和素包被的磁珠结合。然后，对该cDNA/RNA双链体进行模板转换，以便可以将单个共用衔接子序列掺入cDNA的3’端。如通过每个细胞的转录物检测所测量的，将最高达10％w/v PEG(分子量7000-9000)掺入模板转换反应物，其包含与链霉亲和素包被的磁珠结合的cDNA/RNA双链体，可以提高该步骤的效率(表22)。

表22：使用或不使用PEG 8000的模板转换

实施例18-独特标记RNA分子的示例性方法

图23的图A描绘了采用划分合并条形编码标记转录组。在每个划分合并轮次中，固定的细胞或细胞核可以随机分配到孔中，并且转录物可以用孔特异性条形码标记。条形编码的RT引物可在第一轮中使用。可以通过连接将第二和第三轮条形码附加到cDNA。可以在对文库制备测序的过程中通过PCR将第四个条形码添加到cDNA分子。底部方案显示了最终的条形编码的cDNA分子。

图23的图B显示使用从1758个全细胞制备的文库进行的物种混合实验。人UBC沿x轴水平延伸，小鼠UBC沿y轴垂直延伸，混合物种UBC置于人与小鼠UBC之间。估算的条形码冲突率是0.2％，而物种纯度>99％。

图23的图C显示来自采用新鲜和冷冻(在-80℃下储存2周)细胞和细胞核进行的混合实验的UMI计数。新鲜细胞的中位人UMI计数：15365；冷冻细胞的中位人UMI计数：15078；细胞核的中位人UMI计数：12113；冷冻细胞核的中位人UMI计数：13636。

图23的图D显示通过本文提供的方法测得的基因表达在冷冻细胞和立即处理的细胞之间高度相关(Pearson-r：0.987)。在两个不同的SPLiT-seq实验中处理冷冻和新鲜细胞。

如图24所示，可以将固定和透化的细胞随机划分到孔中，每个孔都包含带有孔特异性条形码的逆转录引物。原位逆转录将RNA转换为cDNA，同时附加了孔特异性条形码。然后可以合并细胞，并再次将其随机划分到第二组孔中，各自包含独特的孔特异性条形码。这些条形码可以杂交并连接到条形编码的逆转录引物的5’端，以添加第二轮条形编码。可以将细胞再合并在一起，并且可以进行随后的划分-连接-合并轮次。在最后一轮连接后，cDNA分子在5’端包含条形码、独特的分子标识和通用的PCR柄的细胞特异性组合。可以在文库制备的PCR步骤期间进行第四轮条形编码。

在以上实施例中使用了表23中列出的寡核苷酸。“rG”是RNA碱基，“+G”是锁定的核酸碱基。

表23：寡核苷酸

本文描述了本发明的某些实施方案，包括发明人已知的用于实施本发明的最佳方式。当然，在阅读了前面的描述之后，对这些描述的实施方案的变化对于本领域普通技术人员将变得显而易见。申请人预期技术人员适当地采用这样的变化，并且申请人意欲实施不同于本文具体描述的本发明的各种实施方案。因此，如所适用的法律允许的，本发明包括所附权利要求书中所述的主题的所有修改和等同方案。而且，除非本文另外指出或另外与上下文明显矛盾，否则本发明涵盖上述要素以其所有可能的变化的任何组合。

此外，在整个该说明书中，已经大量引用了专利和印刷出版物。以上引用的参考文献和印刷出版物中的每一个均通过引用以其全部内容单独地并入本文。

要理解的是，本发明的实施方案说明了本发明的原理。可以采用的其他修改在本发明的范围内。因此，作为示例而非限制，可以根据本文的教导来利用本发明的供选择的配置。因此，本发明不被精确地限制到所显示和描述的内容。

本文所示的细节仅作为示例，并且仅用于说明性地讨论本发明的优选实施方案，并且为了提供被认为是最有用和最容易理解的原理描述和本发明的各种实施方案的概念层面的内容而呈现。

对于本领域技术人员将显而易见的是，可以在不脱离本发明的基本原理的情况下对上述实施方案的细节进行许多改变。因此，本发明的范围应仅由以下权利要求书确定。

Claims

1.一种独特地标记多个细胞内的RNA分子的方法，所述方法包括：

(a)在步骤(b)之前固定和透化第一多个细胞，其中在约8℃以下固定和透化所述第一多个细胞；

(b)逆转录所述第一多个细胞内的RNA分子以在所述第一多个细胞内形成互补DNA(cDNA)分子，其中逆转录所述RNA分子包括将逆转录引物偶联到所述RNA分子，其中所述逆转录引物包含聚(T)序列或随机序列中的至少一种；

(c)将所述包含cDNA分子的第一多个细胞分成至少两个初级等分试样，所述至少两个初级等分试样包括第一初级等分试样和第二初级等分试样；

(d)向所述至少两个初级等分试样提供初级核酸标签，其中向所述第一初级等分试样提供的初级核酸标签不同于向所述第二初级等分试样提供的初级核酸标签；

(e)将所述至少两个初级等分试样中的每一个内的cDNA分子与所提供的初级核酸标签偶联；

(f)合并所述至少两个初级等分试样；

(g)将所述合并的初级等分试样分成至少两个次级等分试样，所述至少两个次级等分试样包括第一次级等分试样和第二次级等分试样；

(h)向所述至少两个次级等分试样提供次级核酸标签，其中向所述第一次级等分试样提供的次级核酸标签不同于向所述第二次级等分试样提供的次级核酸标签；

(i)将所述至少两个次级等分试样中的每一个内的cDNA分子与所提供的次级核酸标签偶联；

(j)合并所述至少两个次级等分试样；

(k)裂解所述第一多个细胞的所述合并的至少两个次级等分试样以从所述第一多个细胞内释放cDNA分子，以形成裂解物；和

(1)向所述裂解物添加蛋白酶抑制剂和结合剂，以使所述cDNA分子结合结合剂。

2.权利要求1所述的方法，其中在步骤(k)之前，所述方法还包括将所述合并的至少两个次级等分试样分成至少两个最后的等分试样，所述至少两个最后的等分试样包括第一最后的等分试样和第二最后的等分试样。

3.权利要求1或2所述的方法，其中所述蛋白酶抑制剂包含苯甲基磺酰氟(PMSF)或4-(2-氨基乙基)苯磺酰氟盐酸盐(AEBSF)。

4.权利要求1至3中任一项所述的方法，其还包括：

(m)对所述与结合剂结合的cDNA分子进行模板转换；

(n)扩增所述cDNA分子以形成扩增的cDNA分子溶液；和

(o)将固相可逆固定化(SPRI)珠溶液引入所述扩增的cDNA分子溶液中，其中SPRI珠溶液与扩增的cDNA分子溶液之比为约0.7：1或0.8：1。

5.权利要求4所述的方法，其中通过模板转换将共用衔接子序列添加到所述释放的cDNA分子的3’端。

6.权利要求1至5中任一项所述的方法，其中所述步骤(b)的逆转录引物还包含第一特异性条形码；所述方法还包括：

(p)逆转录第二多个细胞内的RNA分子以在所述第二多个细胞内形成cDNA分子，其中逆转录所述RNA分子包括将特异性引物偶联到来自所述第二多个细胞的所述RNA分子，其中所述特异性引物包含第二特异性条形码和聚(T)序列或随机序列中的至少一种，其中所述第一特异性条形码不同于所述第二特异性条形码，使得可以与来自所述第二多个细胞的cDNA分子比较，识别来自所述第一多个细胞的cDNA分子；

(q)将所述包含cDNA分子的第二多个细胞分成至少两个初级等分试样，所述至少两个初级等分试样包括第一初级等分试样和第二初级等分试样；

(r)向所述至少两个初级等分试样提供初级核酸标签，其中向所述第一初级等分试样提供的初级核酸标签不同于向所述第二初级等分试样提供的初级核酸标签；

(s)将所述至少两个初级等分试样中的每一个内的cDNA分子与所提供的初级核酸标签偶联；

(t)合并所述至少两个初级等分试样；

(u)将所述合并的初级等分试样分成至少两个次级等分试样，所述至少两个次级等分试样包括第一次级等分试样和第二次级等分试样；

(v)向所述至少两个次级等分试样提供次级核酸标签，其中向所述第一次级等分试样提供的次级核酸标签不同于向所述第二次级等分试样提供的次级核酸标签；和

(w)将所述至少两个次级等分试样中的每一个内的cDNA分子与所提供的次级核酸标签偶联。

7.权利要求1至6中任一项所述的方法，其中所述逆转录引物还包含5’突出端，所述5’突出端包含5’突出端序列，并且其中所述核酸标签中的每一个包含：

第一链，其包含：

包含3’端和5’端的条形码序列；和

分别在所述条形码序列的3’端和5’端侧翼的3’杂交序列和5’杂交序列；和

第二链，其包含：

与逆转录引物的5’突出端序列或与先前偶联的核酸标签的5’杂交序列互补的第一部分；和

与所述3’杂交序列互补的第二部分。

8.权利要求7所述的方法，其还包括：

连接所述与cDNA分子结合的核酸标签中的至少两个。

9.权利要求8所述的方法，其中所述连接在所述第一多个细胞内进行。

10.权利要求1至7中任一项所述的方法，其还包括：

连接与所述释放的cDNA分子结合的至少两个核酸标签。

11.权利要求1所述的方法，其中在约4℃或约4℃以下固定和透化所述第一多个细胞。