[go: up one dir, main page]

ES2994006T3 - Compositions and methods for producing circular polyribonucleotides - Google Patents

Compositions and methods for producing circular polyribonucleotides Download PDF

Info

Publication number
ES2994006T3
ES2994006T3 ES22786641T ES22786641T ES2994006T3 ES 2994006 T3 ES2994006 T3 ES 2994006T3 ES 22786641 T ES22786641 T ES 22786641T ES 22786641 T ES22786641 T ES 22786641T ES 2994006 T3 ES2994006 T3 ES 2994006T3
Authority
ES
Spain
Prior art keywords
sequence
region
polyribonucleotide
fragment
nucleotides
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Active
Application number
ES22786641T
Other languages
English (en)
Inventor
Vadim Dudkin
Ki Paek
Boer Alexandra De
Jennifer Nelson
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Flagship Pioneering Innovations VI Inc
Original Assignee
Flagship Pioneering Innovations VI Inc
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Flagship Pioneering Innovations VI Inc filed Critical Flagship Pioneering Innovations VI Inc
Application granted granted Critical
Publication of ES2994006T3 publication Critical patent/ES2994006T3/es
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K48/00—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy
    • A61K48/005—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy characterised by an aspect of the 'active' part of the composition delivered, i.e. the nucleic acid delivered
    • A61K48/0066—Manipulation of the nucleic acid to modify its expression pattern, e.g. enhance its duration of expression, achieved by the presence of particular introns in the delivered nucleic acid
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/67—General methods for enhancing the expression
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/74—Vectors or expression systems specially adapted for prokaryotic hosts other than E. coli, e.g. Lactobacillus, Micromonospora
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N7/00—Viruses; Bacteriophages; Compositions thereof; Preparation or purification thereof
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/0004—Oxidoreductases (1.)
    • C12N9/0069—Oxidoreductases (1.) acting on single donors with incorporation of molecular oxygen, i.e. oxygenases (1.13)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P19/00—Preparation of compounds containing saccharide radicals
    • C12P19/26—Preparation of nitrogen-containing carbohydrates
    • C12P19/28—N-glycosides
    • C12P19/30—Nucleotides
    • C12P19/34—Polynucleotides, e.g. nucleic acids, oligoribonucleotides
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y113/00—Oxidoreductases acting on single donors with incorporation of molecular oxygen (oxygenases) (1.13)
    • C12Y113/12—Oxidoreductases acting on single donors with incorporation of molecular oxygen (oxygenases) (1.13) with incorporation of one atom of oxygen (internal monooxygenases or internal mixed function oxidases)(1.13.12)
    • C12Y113/12005—Renilla-luciferin 2-monooxygenase (1.13.12.5), i.e. renilla-luciferase
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/50—Physical structure
    • C12N2310/53—Physical structure partially self-complementary or closed
    • C12N2310/532—Closed or circular
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2770/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses positive-sense
    • C12N2770/00011—Details
    • C12N2770/20011—Coronaviridae
    • C12N2770/20022—New viral proteins or individual genes, new structural or functional aspects of known viral proteins or genes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2770/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses positive-sense
    • C12N2770/00011—Details
    • C12N2770/20011—Coronaviridae
    • C12N2770/20051—Methods of production or purification of viral material
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2830/00—Vector systems having a special element relevant for transcription
    • C12N2830/50—Vector systems having a special element relevant for transcription regulating RNA stability, not being an intron, e.g. poly A signal
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2840/00—Vectors comprising a special translation-regulating system
    • C12N2840/20—Vectors comprising a special translation-regulating system translation of more than one cistron
    • C12N2840/203—Vectors comprising a special translation-regulating system translation of more than one cistron having an IRES
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2840/00—Vectors comprising a special translation-regulating system
    • C12N2840/44—Vectors comprising a special translation-regulating system being a specific part of the splice mechanism, e.g. donor, acceptor

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Virology (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Saccharide Compounds (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Enzymes And Modification Thereof (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)

Abstract

La presente divulgación se refiere, en general, a composiciones y métodos para producir, purificar y utilizar ARN circular. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

DESCRIPCIÓN
Composiciones y métodos para producir polirribonucleótidos circulares
Antecedentes
Hay una necesidad de métodos para producir, purificar y usar polirribonucleótidos circulares.
Sumario de la invención
La divulgación proporciona composiciones y métodos para producir, purificar y usar ARN circular.
En un aspecto, la invención presenta un polirribonucleótido lineal que tiene la fórmula 5'-(A)-(B)-(C)-(D)-(E)-(F)-(G)-3'. El polirribonucleótido lineal incluye, de 5' a 3', (A) una mitad 3' de fragmento de intrón catalítico del Grupo I; (B) un sitio de corte y empalme 3'; (C) un fragmento de exón 3'; (D) una carga de polirribonucleótido; (E) un fragmento de exón 5'; (F) un sitio de corte y empalme 5'; y (G) una mitad 5' de fragmento de intrón catalítico del Grupo I. El polirribonucleótido incluye una primera región de apareamiento que tiene de 2 a 50, por ejemplo, de 5 a 50, por ejemplo, de 6 a 50, por ejemplo, de 7 a 50, por ejemplo, de 8 a 50 (por ejemplo, de 10 a 30, de 10 a 20, o de 10 a 15, por ejemplo, por lo menos 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, o 50) ribonucleótidos y está presente dentro de (A) la mitad 3' del fragmento del intrón catalítico del Grupo I; (B) el sitio de corte y empalme 3'; o (C) el fragmento de exón 3'. El polirribonucleótido también incluye una segunda región de apareamiento que tiene de 2 a 50, por ejemplo, de 5 a 50, por ejemplo, de 6 a 50, por ejemplo, de 7 a 50, por ejemplo, de 8 a 50 (por ejemplo, de 10 a 30, de 10 a 20, o de 10 a 15, por ejemplo, por lo menos 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41,42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, o 50) ribonucleótidos y está presente dentro de (E) el fragmento de exón 5'; (F) el sitio de corte y empalme 5'; o (G) la mitad 5' del fragmento del intrón catalítico del Grupo I. La primera región de apareamiento tiene del 80% al 100% (por ejemplo, del 85% al 100%, por ejemplo, del 90% al 100%, por ejemplo, el 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 99%, o 100%) de complementariedad con la segunda región de apareamiento o tiene de cero a 10 (por ejemplo, 0, 1,2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, o 10), pares de bases mal apareadas.
En otro aspecto, la invención presenta un polirribonucleótido lineal que tiene la fórmula 5'-(A)-(B)-(C)-(D)-(E)-(F)-(G)-3'. El polirribonucleótido lineal incluye, de 5' a 3', (A) una mitad 3' del fragmento intrón catalítico del Grupo I; (B) un sitio de corte y empalme 3'; (C) un fragmento de exón 3'; (D) una carga de polirribonucleótido; (E) un fragmento de exón 5'; (F) un sitio de corte y empalme 5'; y (G) una mitad 5' del fragmento de intrón catalítico del Grupo I, en donde la mitad 3' del fragmento de intrón catalítico del Grupo I de (A) y la mitad 5' del fragmento de intrón catalítico del Grupo I de (G) son de un gen pre-ARNt-Leu de Cyanobacterium Anabaena. El polirribonucleótido incluye una primera región de apareamiento que tiene de 5 a 50, por ejemplo, de 6 a 50 (por ejemplo, de 10 a 30, de 10 a 20, o de 10 a 15, por ejemplo, por lo menos 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41,42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, o 50) ribonucleótidos y está presente dentro de (A) la mitad 3' del fragmento de intrón catalítico del Grupo I; (B) el sitio de corte y empalme 3'; o (C) el fragmento de exón 3'. El polirribonucleótido también incluye una segunda región de apareamiento que tiene de 5 a 50, por ejemplo, de 6 a 50 (por ejemplo, de 10 a 30, de 10 a 20, o de 10 a 15, por ejemplo, por lo menos 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, o 50) ribonucleótidos y está presente dentro de (E) el fragmento de exón 5'; (F) el sitio de corte y empalme 5'; o (G) la mitad 5' del fragmento de intrón catalítico del Grupo I. La primera región de apareamiento tiene del 80% al 100% (por ejemplo, del 85% al 100%, por ejemplo, del 90% al 100%, por ejemplo, el 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 99%, o 100%) de complementariedad con la segunda región de apareamiento o tiene de cero a 10 por ejemplo, (0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, o 10) pares de bases mal apareadas.
En otro aspecto, la invención presenta un polirribonucleótido lineal que tiene la fórmula 5'-(A)-(B)-(C)-(D)-(E)-(F)-(G)-3'. El polirribonucleótido lineal incluye, de 5' a 3', (A) una mitad 3' del fragmento intrón catalítico del Grupo I; (B) un sitio de corte y empalme 3'; (C) un fragmento de exón 3'; (D) una carga de polirribonucleótido; (E) un fragmento de exón 5'; (F) un sitio de corte y empalme 5'; y (G) una mitad 5' del fragmento de intrón catalítico del Grupo I, en donde la mitad 3' del fragmento de intrón catalítico del Grupo I de (A) y la mitad 5' del fragmento de intrón catalítico del Grupo I de (G) proceden de un pre-ARNr de Tetrahymena. El polirribonucleótido incluye una primera región de apareamiento que tiene de 6 a 50, por ejemplo, de 7 a 50 (por ejemplo, de 10 a 30, de 10 a 20, o de 10 a 15, por ejemplo, por lo menos 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, o 50) ribonucleótidos y está presente dentro de (A) la mitad 3' del fragmento del intrón catalítico del Grupo I; (B) el sitio de corte y empalme 3'; o (C) el fragmento de exón 3'. El polirribonucleótido también incluye una segunda región de apareamiento que tiene de 6 a 50, por ejemplo, de 7 a 50 (por ejemplo, de 10 a 30, de 10 a 20, o de 10 a 15, por ejemplo, por lo menos 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, o 50) ribonucleótidos y está presente dentro de (E) el fragmento de exón 5'; (F) el sitio de corte y empalme 5'; o (G) la mitad 5' del fragmento del intrón catalítico del Grupo I. La primera región de apareamiento tiene del 80% al 100% (por ejemplo, del 85% al 100%, por ejemplo, del 90% al 100%, por ejemplo, el 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 99%, o 100%) de complementariedad con la segunda región de apareamiento o tiene de cero a 10 por ejemplo, (0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, o 10) pares de bases mal apareadas.
En algunas realizaciones, (A) o (C) incluye la primera región de apareamiento y (E) o (G) incluye la segunda región de apareamiento.
En algunas realizaciones, el fragmento de exón 3' de (C) incluye la primera región de apareamiento y el fragmento de exón 5' de (E) incluye la segunda región de apareamiento.
En algunas realizaciones, el fragmento de exón 3' de (C) incluye la primera región de apareamiento y la mitad 5' del fragmento intrón catalítico del Grupo I de (G) incluye la segunda región de apareamiento.
En algunas realizaciones, la mitad 3' del fragmento de intrón catalítico del Grupo I de (A) incluye la primera región de apareamiento y el fragmento de exón 5' de (E) incluye la segunda región de apareamiento.
En algunas realizaciones, la primera región de apareamiento y la segunda región de apareamiento incluyen cero o un par de bases mal apareadas.
En algunas realizaciones, la primera región de apareamiento y la segunda región de apareamiento son 100% complementarias.
En algunas realizaciones, la mitad 3' del fragmento del intrón catalítico del grupo I de (A) y la mitad 5' del fragmento del intrón catalítico del grupo I de (G) proceden de un gen pre-ARNt-Leu de la cianobacteria Anabaena, un pre-ARNt de Tetrahymena o un gen td del fago T4.
En algunas realizaciones, la mitad 3' del fragmento de intrón catalítico del Grupo I de (A) y la mitad 5' del fragmento de intrón catalítico del Grupo I de (G) proceden de un gen de pre-ARNt-Leu de Cyanobacterium Anabaena, y el fragmento de exón 3' de (C) incluye la primera región de apareamiento y el fragmento de exón 5' de (E) incluye la segunda región de apareamiento. La primera región de apareamiento puede incluir, por ejemplo, de 5 a 50, por ejemplo, de 10 a 15 (por ejemplo, 10, 11, 12, 13, 14, o 15) ribonucleótidos y la segunda región de apareamiento puede incluir, por ejemplo, de 5 a 50, por ejemplo, de 10 a 15 (por ejemplo, 10, 11, 12, 13, 14, o 15) ribonucleótidos.
En algunas realizaciones, la mitad 3' del fragmento de intrón catalítico del Grupo I de (A) y la mitad 5' del fragmento de intrón catalítico del Grupo I de (G) son de un pre-ARNr de Tetrahymena, y la mitad 3' del fragmento de intrón catalítico del Grupo I de (A) incluye la primera región de apareamiento y el fragmento de exón 5' de (E) incluye la segunda región de apareamiento. En algunas realizaciones, el fragmento de exón 3' de (C) incluye la primera región de apareamiento y la mitad 5' del fragmento de intrón catalítico del Grupo I de (G) incluye la segunda región de apareamiento. La primera región de apareamiento puede incluir, por ejemplo, de 6 a 50, por ejemplo, de 10 a 16 (por ejemplo, 10, 11, 12, 13, 14, 15, o 16) ribonucleótidos, y la segunda región de apareamiento puede incluir, por ejemplo, de 6 a 50, por ejemplo, de 10 a 16 (por ejemplo, 10, 11, 12, 13, 14, 15, o 16) ribonucleótidos.
En algunas realizaciones, la mitad 3' del fragmento del intrón catalítico del Grupo I de (A) y la mitad 5' del fragmento del intrón catalítico del Grupo I de (G) son de un gen td de fago T4. El fragmento de exón 3' de (C) puede incluir la primera región de apareamiento y la mitad 5' del fragmento de intrón catalítico del Grupo I de (G) puede incluir la segunda región de apareamiento. La primera región de apareamiento puede incluir, por ejemplo, de 2 a 16, por ejemplo, de 10 a 16 (por ejemplo, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, o 16) ribonucleótidos, y la segunda región de apareamiento puede incluir, por ejemplo, de 2 a 16, por ejemplo, de 10 a 16 (por ejemplo, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, o 16) ribonucleótidos.
En algunas realizaciones, la mitad 3' del fragmento del intrón catalítico del Grupo I de (A) es el extremo terminal 5' del polinucleótido lineal.
En algunas realizaciones, la mitad 5' del fragmento intrón catalítico del Grupo I de (G) es el extremo terminal 3' del polirribonucleótido lineal.
En algunas realizaciones, el polirribonucleótido lineal no incluye una región de apareamiento adicional.
En algunas realizaciones, el polirribonucleótido lineal no incluye una región de apareamiento 3' para (A) que incluye complementariedad de ácido nucleico parcial o completa con una región de apareamiento 5' para (G).
En algunas realizaciones, la carga de polirribonucleótido de (D) incluye una secuencia de expresión, una secuencia no codificante, o una secuencia de expresión y una secuencia no codificante.
En algunas realizaciones, la carga de polirribonucleótido de (D) incluye una secuencia de expresión que codifica un polipéptido.
En algunas realizaciones, la carga de polirribonucleótido de (D) incluye un IRES enlazado operativamente con una secuencia de expresión que codifica un polipéptido.
En algunas realizaciones, el IRES está situado en sentido ascendente de la secuencia de expresión. En algunas realizaciones, el IRES está situado en sentido descendente de la secuencia de expresión.
En algunas realizaciones, la carga de polirribonucleótido de (D) incluye una secuencia de expresión que codifica un polipéptido que tiene un efecto biológico en un sujeto.
En algunas realizaciones, el polirribonucleótido lineal incluye además una primera región espaciadora entre el fragmento de exón 3' de (C) y la carga de polirribonucleótido de (D). La primera región espaciadora puede tener, por ejemplo, por lo menos 5 (por ejemplo, por lo menos 10, por lo menos 15, por lo menos 20) ribonucleótidos de longitud. En algunas realizaciones, el polirribonucleótido lineal incluye además una segunda región espaciadora entre la carga de polirribonucleótido de (D) y el fragmento de exón 5' de (E). La segunda región espaciadora puede tener, por ejemplo, por lo menos 5 (por ejemplo, por lo menos 10, por lo menos 15, por lo menos 20) ribonucleótidos de longitud. En algunas realizaciones, cada región espaciadora puede tener por lo menos 5 (por ejemplo, por lo menos 10, por lo menos 15, por lo menos 20) ribonucleótidos de longitud. Cada región espaciadora tiene, por ejemplo, de 5 a 500 (por ejemplo, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450 o 500) ribonucleótidos de longitud. La primera región espaciadora, la segunda región espaciadora, o la primera región espaciadora y la segunda región espaciadora pueden incluir una secuencia poliA. La primera región espaciadora, la segunda región espaciadora, o la primera región espaciadora y la segunda región espaciadora pueden incluir una secuencia poliA-C. La primera región espaciadora, la segunda región espaciadora, o la primera región espaciadora y la segunda región espaciadora pueden incluir una secuencia poliA-G. La primera región espaciadora, la segunda región espaciadora, o la primera región espaciadora y la segunda región espaciadora pueden incluir una secuencia poliA-T. La primera región espaciadora, la segunda región espaciadora, o la primera región espaciadora y la segunda región espaciadora pueden incluir una secuencia aleatoria.
En algunas realizaciones, el polirribonucleótido lineal tiene de 50 a 20.000, por ejemplo, de 100 a 20.000, por ejemplo, de 200 a 20.000, por ejemplo, de 300 a 20.000 (por ejemplo, 50, 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 1.000, 1,100, 1,200, 1,300, 1,400, 1,500, 1,600, 1,700, 1,800, 1,900, 2,000, 2,500, 3,000, 3,500, 4,000, 5.000, 6.000, 7.000, 8.000, 9.000, 10.000, 11.000, 12.000, 13.000, 14.000, 15.000, 16.000, 17.000, 18.000, 19.000 o 20.000) ribonucleótidos de longitud. En algunas realizaciones, el polirribonucleótido lineal tiene, por ejemplo, por lo menos 50, por lo menos 100, por lo menos 200, por lo menos 300, por lo menos 400, por lo menos 500, por lo menos 1.000, por lo menos 2.000, por lo menos 3.000, por lo menos 4.000 o por lo menos 5.000 ribonucleótidos de longitud.
En otro aspecto, la invención presenta un vector de ADN que incluye un promotor de ARN polimerasa enlazado operativamente a una secuencia de ADN que codifica el polirribonucleótido lineal de cualquiera de las realizaciones descritas en la presente.
En otro aspecto, la invención presenta un polirribonucleótido circular (por ejemplo, un polirribonucleótido circular cerrado covalentemente) producido a partir del polirribonucleótido lineal o el vector de ADN de cualquiera de las realizaciones descritas en la presente.
En otro aspecto, la invención presenta un polirribonucleótido circular (por ejemplo, un polirribonucleótido circular cerrado covalentemente) que tiene una unión de corte y empalme que une un fragmento de exón 5' y un fragmento de exón 3'. El fragmento de exón 3' incluye una primera región de apareamiento que incluye de 2 a 50, por ejemplo, de 5 a 50, por ejemplo, de 6 a 50, por ejemplo, de 7 a 50, por ejemplo, de 8 a 50 (por ejemplo, de 10 a 30, de 10 a 20, o de 10 a 15, por ejemplo, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20,21,22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, o 50) ribonucleótidos, y el fragmento de exón 5' incluye una segunda región de apareamiento que incluye de 2 a 50, por ejemplo, de 5 a 50, por ejemplo, de 6 a 50, por ejemplo, de 7 a 50, por ejemplo, de 8 a 50 (por ejemplo, de 10 a 30, de 10 a 20, o de 10 a 15, por ejemplo, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, o 50) ribonucleótidos. La primera región de apareamiento y la segunda región de apareamiento pueden incluir una complementariedad del 80% al 100% (por ejemplo, del 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 99% o 100%). La primera región de apareamiento y la segunda región de apareamiento incluyen de cero a 10 (por ejemplo, 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, o 10) pares de bases (pb) mal apareadas. En algunas realizaciones, el polinucleótido circular incluye además una carga de polirribonucleótido. En algunas realizaciones, la carga de polirribonucleótido incluye una secuencia de expresión (o codificante), una secuencia no codificante, o una combinación de una secuencia de expresión (o codificante) y una secuencia no codificante. En algunas realizaciones, la carga de polirribonucleótido incluye una secuencia de expresión (codificante) que codifica un polipéptido. En algunas realizaciones, el polirribonucleótido incluye un IRES enlazado operativamente con una secuencia de expresión que codifica un polipéptido. En algunas realizaciones, el polirribonucleótido circular incluye además una región espaciadora entre el IRE<s>y el fragmento de exón 3' o el fragmento de exón 5'. La región espaciadora puede tener, por ejemplo, por lo menos 5 (por ejemplo, por lo menos 10, por lo menos 15, por lo menos 20) ribonucleótidos de longitud. La región espadadora puede tener, por ejemplo, de 5 a 500 (por ejemplo, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450, o 500) ribonucleótidos. En algunas realizaciones, la región espadadora incluye una secuencia poliA. En algunas realizaciones, la región espadadora incluye una secuencia poliA-C. En algunas realizaciones, la región espadadora incluye una secuencia poliA-G. En algunas realizaciones, la región espadadora incluye una secuencia poliA-T. En algunas realizaciones, la región espaciadora incluye una secuencia aleatoria.
En algunas realizaciones, el polirribonucleótido circular tiene de 50 a 20.000, por ejemplo, de 100 a 20.000, por ejemplo, de 200 a 20.000, por ejemplo, de 300 a 20.000 (por ejemplo, 50, 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 1.000, 1.100, 1.200, 1.300, 1.400, 1.500, 1.600, 1.700, 1.800, 1.900, 2.000, 2.500, 3.000, 3.500, 4.000, 5.000, 6.000, 7.000, 8.000, 9.000, 10.000, 11.000, 12.000, 13.000, 14.000, 15.000, 16.000, 17.000, 18.000, 19.000 o 20.000) ribonucleótidos de longitud. En algunas realizaciones, el polirribonucleótido circular tiene, por ejemplo, por lo menos 500, por lo menos 1.000, por lo menos 2.000, por lo menos 3.000, por lo menos 4.000 o por lo menos 5.000 ribonucleótidos de longitud.
En algunas realizaciones, el polirribonucleótido circular se produce a partir de un polirribonucleótido lineal o vector como se describe en la presente.
En otro aspecto, la invención presenta un método para expresar un polipéptido en una célula proporcionando a la célula un polirribonucleótido lineal, un vector de ADN o un polirribonucleótido circular como se describe en la presente. El método incluye además permitir que la maquinaria celular exprese el polipéptido a partir del polirribonucleótido.
En otro aspecto, la invención presenta un método para producir un polirribonucleótido circular como se describe en la presente proporcionando un polirribonucleótido lineal como se describe en la presente en condiciones adecuadas para el auto-corte y empalme del polirribonucleótido lineal para producir el polirribonucleótido circular.
Definiciones
Para facilitar la comprensión de la presente divulgación, a continuación se definen una serie de términos. Los términos definidos en la presente tienen el significado entendido comúnmente por una persona experta en las áreas relevantes para la divulgación. No se pretende que términos como "un", "uno" y "el" se refieran únicamente a una entidad singular, sino que incluyen la clase general de la que puede usarse un ejemplo específico a modo de ilustración. El término "o" se usa para referirse a "y/o" a menos que se indique explícitamente que se refiere sólo a alternativas o que las alternativas sean mutuamente excluyentes, aunque la divulgación admite una definición que se refiere sólo a alternativas y a "y/o". La terminología empleada en la presente se usa para describir realizaciones específicas, pero su uso no debe considerarse limitativo, excepto en los casos indicados en las reivindicaciones.
Como se usa en la presente, cualquier valor proporcionado en un intervalo de valores incluye los límites superior e inferior, y cualquier valor contenido dentro de los límites superior e inferior.
Como se usa en la presente, el término "aproximadamente" se refiere a un valor que está dentro de ± 10% de un valor enumerado.
Como se usa en la presente, el término "portador" es un compuesto, composición, reactivo o molécula que facilita el transporte o la entrega de una composición (por ejemplo, un polirribonucleótido circular) en una célula mediante una modificación covalente del polirribonucleótido circular, a través de un agente parcial o completamente encapsulante, o una combinación de los mismos. Ejemplos no limitativos de portadores incluyen portadores de carbohidratos (por ejemplo, un fitoglicógeno modificado con anhídrido o un material de tipo glucógeno), nanopartículas (por ejemplo, una nanopartícula que encapsula o está enlazada covalentemente al polirribonucleótido circular), liposomas, fusosomas, reticulocitos diferenciados ex vivo, exosomas, portadores proteicos (por ejemplo, una proteína enlazada covalentemente al polirribonucleótido circular), o portadores catiónicos (por ejemplo, un lipopolímero catiónico o un reactivo de transfección).
Como se usa en la presente, los términos "polirribonucleótido circular" y "ARN circular" se usan indistintamente y se refieren a una molécula de polirribonucleótido que tiene una estructura que no tiene extremos libres (es decir, sin extremos 3' o 5' libres), por ejemplo, una molécula de polirribonucleótido que forma una estructura circular o sin extremos mediante enlaces covalentes o no covalentes. El polirribonucleótido circular puede ser, por ejemplo, un polirribonucleótido cerrado covalentemente.
Como se usa en la presente, el término "eficiencia de circularización" es una medida del polirribonucleótido circular resultante frente a su material de partida no circular.
Como se usan en la presente, los términos "enfermedad", "trastorno" y "afección" se refieren a un estado de salud subóptimo, por ejemplo, un estado que es o sería típicamente diagnosticado o tratado por un profesional médico.
Por "heterólogo" se entiende que se produce en un contexto distinto al natural (nativo). Una secuencia de polinucleótidos "heteróloga" indica que la secuencia de polinucleótidos se usa de una manera distinta a la que se encuentra en el genoma nativo de esa secuencia. Por ejemplo, un "promotor heterólogo" se usa para impulsar la transcripción de una secuencia que no es una que se transcribe de manera nativa por ese promotor; por lo tanto, una secuencia de "promotor heterólogo" se incluye a menudo en un constructo de expresión por medio de técnicas de ácido nucleico recombinante. El término "heterólogo" también se usa para referirse a una secuencia dada que se coloca en una relación no natural con otra secuencia; por ejemplo, una secuencia de nucleótidos codificante o no codificante heteróloga se inserta comúnmente en un genoma mediante técnicas de transformación genómica, dando como resultado un genoma modificado genéticamente o recombinante.
Como se usa en la presente, "aumentar la aptitud" o "promover la aptitud" de un sujeto se refiere a cualquier alteración favorable en la fisiología, o de cualquier actividad llevada a cabo por un organismo sujeto, como consecuencia de la administración de un péptido o polipéptido descrito en la presente, incluyendo, pero no limitado a, uno o más de los siguientes efectos deseados: (1) aumento de la tolerancia al estrés biótico o abiótico en aproximadamente un 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 99%, 100% o más; (2) aumento del rendimiento o la biomasa en aproximadamente un 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 99%, 100% o más; (3) modificación del tiempo de floración en aproximadamente un 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 99%, 100% o más; (4) aumento de la resistencia a plagas o patógenos en aproximadamente un 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 99%, 100% o más; (4) aumento de la resistencia a herbicidas en aproximadamente un 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 99%, 100% o más; (5) aumentar la población de un organismo sujeto (por ejemplo, un insecto de importancia agrícola) en aproximadamente un 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 99%, 100% o más; (6) aumentar la tasa reproductiva de un organismo sujeto (por ejemplo, un insecto, por ejemplo, una abeja o un gusano de seda) en aproximadamente un 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 99%, 100% o más; (7) aumentar la movilidad de un organismo sujeto (por ejemplo, un insecto, por ejemplo, abeja o gusano de seda) en aproximadamente un 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 99%, 100% o más; (8) aumentar el peso corporal de un organismo sujeto (por ejemplo, un insecto, por ejemplo, una abeja o gusano de seda) en aproximadamente un 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 99%, 100% o más; (9) aumentar la tasa metabólica o la actividad de un organismo sujeto (por ejemplo, un insecto, por ejemplo, abeja o gusano de seda) en aproximadamente un 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 99%, 100% o más; (10) aumentar la polinización (por ejemplo, el número de plantas polinizadas en un periodo de tiempo determinado) por un organismo sujeto (por ejemplo, un insecto, por ejemplo, una abeja o gusano de seda) en aproximadamente un 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 99%, 100% o más; (11) aumentar la producción de un organismo sujeto (por ejemplo, insecto, por ejemplo, abeja o gusano de seda) en aproximadamente un 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 99%, 100% o más; (12) aumentar el contenido de nutrientes del organismo sujeto (por ejemplo, insecto) (por ejemplo, proteínas, ácidos grasos o aminoácidos) en aproximadamente un 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 99%, 100% o más; o (13) aumentar la resistencia de un organismo sujeto a pesticidas (por ejemplo, un neonicotinoide (por ejemplo, imidacloprid) o un insecticida de organofósforo (por ejemplo, un fosforotioato, por ejemplo, fenitrotión)) en aproximadamente un 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 99%, 100% o más, (14) aumentar la salud o reducir la enfermedad de un organismo sujeto, como un animal humano o no humano. Un aumento de la aptitud del huésped puede determinarse en comparación con un organismo sujeto al que no se ha administrado el agente modulador. Por el contrario, "disminuir la aptitud" de un sujeto se refiere a cualquier alteración desfavorable de la fisiología, o de cualquier actividad llevada a cabo por un organismo sujeto, como consecuencia de la administración de un péptido o polipéptido descrito en la presente, incluyendo, pero no limitado a, uno o más de los siguientes efectos previstos: (1) disminución de la tolerancia al estrés biótico o abiótico en aproximadamente un 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 99%, 100% o más; (2) disminución del rendimiento o la biomasa en aproximadamente un 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 99%, 100% o más; (3) modificación del tiempo de floración en aproximadamente un 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 99%, 100% o más; (4) disminución de la resistencia a plagas o patógenos en aproximadamente un 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 99%, 100% o más; (4) disminución de la resistencia a herbicidas en aproximadamente un 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 99%, 100% o más; (5) disminución de una población de un organismo sujeto (por ejemplo, un insecto de importancia agrícola) en aproximadamente un 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 99%, 100% o más; (6) disminución de la tasa reproductiva de un organismo sujeto (por ejemplo, un insecto, por ejemplo, una abeja o un gusano de seda) en aproximadamente un 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 99%, 100% o más; (7) disminución de la movilidad de un organismo sujeto (por ejemplo, un insecto, por ejemplo, abeja o gusano de seda) en aproximadamente un 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 99%, 100% o más; (8) disminución del peso corporal de un organismo sujeto (por ejemplo, insecto, por ejemplo, abeja o gusano de seda) en aproximadamente un 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 99%, 100% o más; (9) disminución de la tasa o actividad metabólica de un organismo sujeto (por ejemplo, insecto, por ejemplo, abeja o gusano de seda) en aproximadamente un 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 99%, 100% o más; (10) disminución de la polinización (por ejemplo, número de plantas polinizadas en un período de tiempo determinado) por un organismo sujeto (por ejemplo, insecto, por ejemplo, abeja o gusano de seda) en aproximadamente un 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 99%, 100% o más; (11) disminución de la producción del organismo sujeto (por ejemplo, insecto, por ejemplo, abeja o gusano de seda) en aproximadamente un 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 99%, 100% o más; (12) disminución del contenido de nutrientes del organismo sujeto (por ejemplo, insecto) (por ejemplo, proteínas, ácidos grasos o aminoácidos) en aproximadamente un 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 99%, 100% o más; o (13) disminución de la resistencia de un organismo sujeto a pesticidas (por ejemplo, un neonicotinoide (por ejemplo, imidacloprid) o un insecticida organofosforado (por ejemplo, un fosforotioato, por ejemplo, fenitrotión)) en aproximadamente un 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 99%, 100% o más, (14) disminución de la salud o reducción de la enfermedad de un organismo sujeto, como un animal humano o no humano. Una disminución de la aptitud del huésped puede determinarse en comparación con un organismo sujeto al que no se ha administrado el agente modulador. Para los expertos en la técnica será evidente que ciertos cambios en la fisiología, fenotipo o actividad de un sujeto, por ejemplo, la modificación del tiempo de floración en una planta, pueden considerarse un aumento de la aptitud del sujeto o una disminución de la aptitud del sujeto, dependiendo del contexto (por ejemplo, para adaptarse a un cambio en el clima u otras condiciones ambientales). Por ejemplo, un retraso en el tiempo de floración (por ejemplo, de aproximadamente un 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 99%, 100% menos plantas en una población que florece en una fecha determinada) puede ser una adaptación beneficiosa a primaveras más tardías o frías y, por lo tanto, puede considerarse que aumenta la aptitud de una planta; por el contrario, en el contexto de primaveras más tempranas o cálidas puede considerarse que el mismo retraso en el tiempo de floración disminuye la aptitud de una planta.
Como se usa en la presente, los términos "ARN lineal" o "polirribonucleótido lineal" o "molécula de polirribonucleótido lineal" se usan indistintamente y significan molécula de polirribonucleótido que tiene un extremo 5' y 3'. Uno o ambos extremos 5' y 3' pueden ser extremos libres o unidos a otra fracción. El ARN lineal incluye el ARN que no se ha sometido a circularización (por ejemplo, que está precircularizado) y que puede usarse como material de partida para la circularización.
Como se usa en la presente, el término "ribonucleótido modificado" significa un nucleótido con por lo menos una modificación en el azúcar, la nucleobase o el enlace internucleosídico.
Como se usa en la presente, el término "administración desnuda" es una formulación para la administración a una célula sin la ayuda de un portador y sin modificación covalente de una fracción que ayude a la administración a una célula. Una formulación de liberación desnuda está libre de reactivos de transfección, portadores catiónicos, portadores de carbohidratos, portadores de nanopartículas ni portadores de proteínas. Por ejemplo, una formulación de liberación desnuda de un polirribonucleótido circular es una formulación que comprende un polirribonucleótido circular sin modificación covalente y está libre de un portador.
Se pretende que el término "composición farmacéutica" divulgue también que el polirribonucleótido circular o lineal incluido dentro de una composición farmacéutica puede usarse para el tratamiento del cuerpo humano o animal mediante terapia.
El término "polinucleótido", como se usa en la presente, significa una molécula que incluye una o más subunidades de ácido nucleico, o nucleótidos, y puede usarse indistintamente con "ácido nucleico" u "oligonucleótido". Un polinucleótido puede incluir uno o más nucleótidos seleccionados entre adenosina (A), citosina (C), guanina (G), timina (T) y uracilo (U), o variantes de los mismos. Un nucleótido puede incluir un nucleósido y por lo menos 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 o más grupos fosfato (PO3). Un nucleótido puede incluir una nucleobase, un azúcar de cinco carbonos (ribosa o desoxirribosa) y uno o más grupos fosfato. Los ribonucleótidos son nucleótidos en los que el azúcar es ribosa. Los polirribonucleótidos o ácidos ribonucleicos, o ARN, pueden referirse a macromoléculas que incluyen múltiples ribonucleótidos polimerizados mediante enlaces fosfodiéster. Los desoxirribonucleótidos son nucleótidos en los que el azúcar es desoxirribosa. Como se usa en la presente, se entiende que una secuencia de polirribonucleótidos que enumera timina (T) representa uracilo (U).
Como se usa en la presente, el término "carga de polirribonucleótido" en la presente incluye cualquier secuencia que incluya por lo menos un polirribonucleótido. En algunas realizaciones, la carga de polirribonucleótido incluye una o varias secuencias de expresión, en donde cada secuencia de expresión codifica un polipéptido. En algunas realizaciones, la carga de polirribonucleótido incluye una o varias secuencias no codificantes, como un polirribonucleótido que tiene funciones reguladoras o catalíticas. En algunas realizaciones, la carga de polirribonucleótido incluye una combinación de secuencias de expresión y no codificantes. En algunas realizaciones, la carga de polirribonucleótido incluye una o más secuencias de polirribonucleótidos descritas en la presente, como uno o varios elementos reguladores, elementos del sitio de entrada ribosómica interna (IRES) o secuencias espaciadoras.
Como se usan indistintamente en la presente, los términos "poliA" o "secuencia poliA" se refieren a una región contigua no traducida de una molécula de ácido nucleico de por lo menos 5 nucleótidos de longitud y que consiste en residuos de adenosina. En algunas realizaciones, una secuencia poliA tiene por lo menos 10, por lo menos 15, por lo menos 20, por lo menos 30, por lo menos 40 o por lo menos 50 nucleótidos de longitud. En algunas realizaciones, una secuencia poliA está situada 3' a (por ejemplo, en sentido descendente de) un marco de lectura abierto (por ejemplo, un marco de lectura abierto que codifica un polipéptido), y la secuencia poliA está 3' a un elemento de terminación (por ejemplo, un codón de parada) de tal manera que el poliA no se traduce. En algunas realizaciones, una secuencia poliA está situada 3' a un elemento de terminación y a una región no traducida 3'.
Como se usa en la presente, los elementos de un ácido nucleico están "conectados operativamente" si están colocados en el vector de tal manera que puedan transcribirse para formar un ARN lineal que, a continuación, pueda circularizarse en un ARN circular usando los métodos proporcionados en la presente.
Los polideoxirribonucleótidos o ácidos desoxirribonucleicos, o ADN, son macromoléculas que incluyen múltiples desoxirribonucleótidos que están polimerizados mediante enlaces fosfodiéster. Un nucleótido puede ser un nucleósido monofosfato o un nucleósido polifosfato. Un nucleótido es un desoxirribonucleósido polifosfato, como por ejemplo un desoxirribonucleósido trifosfato (dNTP), que puede seleccionarse entre desoxiadenosina trifosfato (dATP), desoxicitidina trifosfato (dCTP), desoxiguanosina trifosfato (dGTP), uridina trifosfato (dUTP) y desoxitimidina trifosfato (dTTP) dNTPs, que incluyen etiquetas detectables, como etiquetas o marcadores luminiscentes (por ejemplo, fluoróforos). Un nucleótido puede incluir cualquier subunidad que pueda incorporarse a una cadena de ácido nucleico en crecimiento. Dicha subunidad puede ser una A, C, G, T o U, o cualquier otra subunidad que sea específica de una o más A, C, G, T o U complementarias, o complementaria de una purina (es decir, A o G, o variante de las mismas) o una pirimidina (es decir, C, T o U, o variante de las mismas). En algunos ejemplos, un polinucleótido es ácido desoxirribonucleico (ADN), ácido ribonucleico (ARN), o derivados o variantes de los mismos. En algunos casos, un polinucleótido es un ARN de interferencia corto (ARNip), un microARN (miARN), un ADN plasmídico (ADNp), un ARN de horquilla corta (ARNhc), un ARN nuclear pequeño (ARNnp), un ARN mensajero (ARNm), un ARNm precursor (ARNpre-m), ARN antisentido (ARNas), por nombrar algunos, y abarca tanto la secuencia nucleotídica como cualquier realización estructural de la misma, como de cadena sencilla, de cadena doble, de cadena triple, helicoidal, en horquilla, etc. En algunos casos, una molécula de polinucleótido es circular. Un polinucleótido puede tener varias longitudes. Una molécula de ácido nucleico puede tener una longitud de por lo menos aproximadamente 10 bases, 20 bases, 30 bases, 40 bases, 50 bases, 100 bases, 200 bases, 300 bases, 400 bases, 500 bases, 1 kilobase (kb), 2 kb, 3, kb, 4 kb, 5 kb, 10 kb, 50 kb, o más. Un polinucleótido puede aislarse de una célula o un tejido. Las realizaciones de polinucleótidos incluyen moléculas de ADN/ARN aisladas y purificadas, moléculas de ADN/ARN sintéticas y análogos sintéticos de ADN/ARN.
Las realizaciones de polinucleótidos, por ejemplo, polirribonucleótidos o polidesoxirribonucleótidos, incluyen polinucleótidos que contienen una o más variantes de nucleótidos, incluyendo nucleótidos no estándar, nucleótidos no naturales, análogos de nucleótidos o nucleótidos modificados. Ejemplos de nucleótidos modificados incluyen, entre otros, diaminopurina, 5-fluorouracilo, 5-bromouracilo, 5-clorouracilo, 5-yodouracilo, hipoxantina, xantina, 4-acetilcitosina, 5-(carboxihidroximetil)uracilo, 5-carboximetilaminometil-2-tiouridina, 5-carboximetilaminometiluracilo, dihidrouracilo, beta-D-galactosilqueosina, inosina, N6-isopenteniladenina, 1-metilguanina, 1-metilinosina, 2,2-dimetilguanina, 2-metiladenina, 2-metilguanina, 3-metilcitosina, 5-metilcitosina, N6-adenina, 7-metilguanina, 5-metilaminometiluracilo, 5-metoxiaminometil-2-tiouracilo, beta-D-manosilqueosina, 5'-metoxicarboximetiluracilo, 5-metoxiuracilo, 2-metiltio-D46-isopenteniladenina, ácido uracilo-5-oxiacético (v), wibutoxosina, pseudouracilo, queosina, 2-tiocitosina, 5-metil-2-tiouracilo, 2-tiouracilo, 4-tiouracilo, 5-metiluracilo, metiléster del ácido uracilo-5-oxiacético, ácido uracilo-5-oxiacético(v), 5-metil-2-tiouracilo, 3-(3-amino-3- N-2-carboxipropil) uracilo, (acp3)w, 2,6-diaminopurina y similares. En algunos casos, los nucleótidos incluyen modificaciones en sus fracciones de fosfato, incluyendo modificaciones en una fracción de trifosfato. Ejemplos no limitativos de tales modificaciones incluyen cadenas de fosfato de mayor longitud (por ejemplo, una cadena de fosfato que tenga, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 o más moléculas de fosfato) y modificaciones con moléculas de tiol (por ejemplo, alfa-tiotrifosfato y beta-tiotrifosfatos). En algunas realizaciones, las moléculas de ácido nucleico se modifican en la fracción de base (por ejemplo, en uno o más átomos que típicamente están disponibles para formar un enlace de hidrógeno con un nucleótido complementario o en uno o más átomos que típicamente no son capaces de formar un enlace de hidrógeno con un nucleótido complementario), en la fracción de azúcar o en la estructura principal de fosfato. En algunas realizaciones, las moléculas de ácido nucleico contienen grupos modificados con aminas, como aminoalil 1-dUTP (aa-dUTP) y aminohexilacrilamida-dCTP (aha-dCTP) para permitir la unión covalente de fracciones reactivas con aminas, como ésteres de N-hidroxisuccinimida (NHS). Las alternativas a los pares de bases de ADN o los pares de bases de ARN estándar en los oligonucleótidos de la presente divulgación pueden proporcionar una mayor densidad en bits por mm cúbico, una mayor seguridad (resistente a la síntesis accidental o intencionada de toxinas naturales), una discriminación más fácil en polimerasasfotoprogramadas, o una estructura secundaria más baja. Tales pares de bases alternativos compatibles con polimerasas naturales y mutantes para síntesis de novo o de amplificación se describen en Betz K, Malyshev DA, Lavergne T, Welte W, Diederichs K, Dwyer TJ, Ordoukhanian P, Romesberg FE, Marx A. Nat. Chem. Biol. julio 2012;8(7):612-4.
Como se usa en la presente, "polipéptido" significa un polímero de residuos de aminoácidos (naturales o no naturales) enlazados entre sí la mayoría de las veces por enlaces peptídicos. El término, como se usa en la presente, se refiere a proteínas, polipéptidos y péptidos de cualquier tamaño, estructura o función. Los polipéptidos pueden incluir productos génicos, polipéptidos de origen natural, polipéptidos sintéticos, homólogos, ortólogos, paralogos, fragmentos y otros equivalentes, variantes y análogos de los anteriores. Un polipéptido puede ser una molécula individual o un complejo multimolecular como un dímero, trímero o tetrámero. También pueden incluir polipéptidos de cadena sencilla o multicadena, como los anticuerpos o la insulina, y pueden estar asociados o enlazados. Lo más habitual es encontrar enlaces disulfuro en los polipéptidos multicadena. El término polipéptido también puede aplicarse a polímeros de aminoácidos en los que uno o más residuos de aminoácidos son un análogo químico artificial de un aminoácido de origen natural correspondiente.
Como se usa en la presente, el término "polipéptido modificador de plantas" se refiere a un polipéptido que puede alterar las propiedades genéticas (por ejemplo, aumentar la expresión génica, disminuir la expresión génica o alterar de otro modo la secuencia de nucleótidos del ADN o ARN), las propiedades epigenéticas o las propiedades bioquímicas o fisiológicas de una planta de tal manera que se produzca un cambio en la fisiología o el fenotipo de la planta, por ejemplo, un aumento o una disminución de la aptitud de la planta.
Como se usa en la presente, el término "elemento regulador" es una fracción, como una secuencia de ácido nucleico, que modifica la expresión de una secuencia de expresión dentro del polirribonucleótido circular o lineal.
Como se usa en la presente, un "espaciador" se refiere a cualquier secuencia contigua de nucleótidos (por ejemplo, de uno o más nucleótidos) que proporciona distancia o flexibilidad entre dos regiones de polinucleótidos adyacentes.
Como se usa en la presente, el término "identidad de secuencia" se determina mediante el alineamiento de dos secuencias peptídicas o dos secuencias nucleotídicas usando un algoritmo de alineamiento global o local. Las secuencias se denominan "sustancialmente idénticas" o "esencialmente similares" cuando comparten por lo menos un determinado porcentaje mínimo de identidad de secuencia cuando se alinean óptimamente (por ejemplo, cuando se alinean mediante programas como GAP o BESTFIT usando los parámetros predeterminados). El GAP usa el algoritmo de alineamiento global de Needleman y Wunsch para alinear dos secuencias en toda su longitud, maximizando el número de coincidencias y minimizando el número de huecos. En general, se usan los parámetros predeterminados de GAP, con una penalización por creación de huecos = 50 (nucleótidos) / 8 (proteínas) y una penalización por extensión de huecos = 3 (nucleótidos) / 2 (proteínas). Para los nucleótidos la matriz de puntuación predeterminada usada es nwsgapdna, y para las proteínas la matriz de puntuación predeterminada es Blosum62 (Henikoff & Henikoff, 1992, PNAS 89, 915-919). Los alineamientos de secuencias y las puntuaciones para el porcentaje de identidad de secuencias se determinan, por ejemplo, usando programas informáticos, como el GCG Wisconsin Package, Version 10.3, disponible de Accelrys Inc., 9685 Scranton Road, San Diego, CA 92121-3752 USA, o EmbossWin versión 2.10.0 (usando el programa "needle"). Alternativa o adicionalmente, el porcentaje de identidad se determina mediante la búsqueda en bases de datos, por ejemplo, usando algoritmos como FASTA, BLAST, etc. La identidad de secuencia se refiere a la identidad de secuencia en toda la longitud de la secuencia.
Como se usa en la presente, "estructurado" con respecto al ARN se refiere a una secuencia de ARN que el software RNAFold o herramientas de predicción similares predicen que formará una estructura (por ejemplo, un bucle de horquilla) consigo misma o con otras secuencias de la misma molécula de ARN.
Como se usa en la presente, el término "sujeto" se refiere a un organismo, como un animal, una planta o un microbio. En algunas realizaciones, el sujeto es un animal vertebrado (por ejemplo, mamífero, ave, pez, reptil o anfibio). En algunas realizaciones, el sujeto es un humano. En algunas realizaciones, el sujeto es un mamífero no humano. En algunas realizaciones, el sujeto es un mamífero no humano, como un primate no humano (por ejemplo, monos, simios), un ungulado (por ejemplo, vacuno, búfalo, bisonte, oveja, cabra, cerdo, camello, llama, alpaca, ciervo, caballo, burro), carnívoro (por ejemplo, perro, gato), roedor (por ejemplo, rata, ratón) o lagomorfo (por ejemplo, conejo). En algunas realizaciones, el sujeto es un ave, como un miembro de los taxones aviares Galliformes (por ejemplo, pollos, pavos, faisanes, codornices), Anseriformes (por ejemplo, patos, gansos), Paleaognathae (por ejemplo, avestruces, emúes), Columbiformes (por ejemplo, palomos, palomas) o Psittaciformes (por ejemplo, loros). En algunas realizaciones, el sujeto es un invertebrado, como un artrópodo (por ejemplo, insectos, arácnidos, crustáceos), un nematodo, un anélido, un helminto o un molusco. En algunas realizaciones, el sujeto es una plaga agrícola invertebrada o un invertebrado parásito de un huésped invertebrado o vertebrado. En algunas realizaciones, el sujeto es una planta, como una planta angiosperma (que puede ser dicotiledónea o monocotiledónea) o una planta gimnosperma (por ejemplo, una conífera, una cicadácea, un gnetófito, un Ginkgo), un helecho, una cola de caballo, un musgo o un briofito. En algunas realizaciones, el sujeto es un alga eucariota (unicelular o pluricelular). En algunas realizaciones, el sujeto es una planta de importancia agrícola u hortícola, como plantas de cultivo en hilera, plantas y árboles frutales, hortalizas, árboles y plantas ornamentales, incluyendo flores ornamentales, arbustos, árboles, plantas tapizantes y céspedes.
Como se usa en la presente, el término "tratar" o "tratamiento" se refiere a un tratamiento profiláctico o terapéutico de una enfermedad o trastorno (por ejemplo, una enfermedad infecciosa, un cáncer, una toxicidad o una reacción alérgica) en un sujeto. El efecto del tratamiento puede incluir la reversión, el alivio, la reducción de la gravedad, la curación, la inhibición de la progresión, la reducción de la probabilidad de recurrencia de la enfermedad o de uno o más síntomas o manifestaciones de la enfermedad o trastorno, la estabilización (es decir, el no empeoramiento) del estado de la enfermedad o trastorno, o la prevención de la propagación de la enfermedad o trastorno en comparación con el estado o la condición de la enfermedad o trastorno en ausencia del tratamiento terapéutico. Las realizaciones incluyen el tratamiento de plantas para controlar una enfermedad o condición adversa provocada por o asociada con una plaga invertebrada o un patógeno microbiano (por ejemplo, bacteriano, fúngico, oomiceto o viral). Las realizaciones incluyen el tratamiento de una planta para aumentar la defensa innata de la planta o la capacidad inmune para tolerar la presión de plagas o patógenos.
Como se usa en la presente, el término "elemento de terminación" es una fracción, como una secuencia de ácido nucleico, que termina la traducción de la secuencia de expresión en el polirribonucleótido circular o lineal.
Como se usa en la presente, el término "eficiencia de traducción" es una tasa o cantidad de producción de proteínas o péptidos a partir de un transcrito de ribonucleótido. En algunas realizaciones, la eficiencia de traducción puede expresarse como la cantidad de proteína o péptido producida por una cantidad dada de transcrito que codifica para la proteína o péptido, por ejemplo, en un periodo de tiempo dado, por ejemplo, en un sistema de traducción dado, por ejemplo, un sistema de traducción libre de células como el lisado de reticulocitos de conejo.
Como se usa en la presente, el término "secuencia de inicio de la traducción" es una secuencia de ácido nucleico que inicia la traducción de una secuencia de expresión en el polirribonucleótido circular o lineal.
Como se usa en la presente, el término "polipéptido terapéutico" se refiere a un polipéptido que, cuando se administra o se expresa en un sujeto, proporciona algún beneficio terapéutico. En algunas realizaciones, un polipéptido terapéutico se usa para tratar o prevenir una enfermedad, trastorno o afección en un sujeto mediante la administración del péptido terapéutico a un sujeto o mediante la expresión en un sujeto del polipéptido terapéutico. En realizaciones alternativas, un polipéptido terapéutico se expresa en una célula y la célula se administra a un sujeto para proporcionar un beneficio terapéutico.
Como se usa en la presente, un "vector" es un fragmento de ADN que está sintetizado (por ejemplo, usando PCR) o tomado de un virus, plásmido o célula de un organismo superior en el que puede insertarse o se ha insertado un fragmento de ADN extraño con propósitos de clonación o expresión. En algunas realizaciones, un vector puede mantenerse de forma estable en un organismo. Un vector puede incluir, por ejemplo, un origen de replicación, un marcador seleccionable o gen reportero, como resistencia a antibióticos o GFP, o un sitio de clonación múltiple (MCS). El término incluye fragmentos lineales de ADN (por ejemplo, productos de PCR, fragmentos de plásmidos linealizados), vectores plasmídicos, vectores virales, cósmidos, cromosomas artificiales bacterianos (BAC), cromosomas artificiales de levadura (YAC) y similares. En una realización, los vectores proporcionados en la presente incluyen un sitio de clonación múltiple (MCS). En otra realización, los vectores aquí proporcionados no incluyen un MCS.
Breve descripción de los dibujos
LasFIGS. 1Ay1Bson dibujos esquemáticos que muestran un intrón-exón permutado ejemplar de Anabaena con una región de apareamiento de 5 nucleótidos (FIG. 1A) y un intrón-exón permutado ejemplar de Anabaena con una región de apareamiento ampliada (FIG. 1B).
LasFIG. 2Ay2Bson dibujos esquemáticos que muestran las estructuras de un intrón-exón permutado ejemplar de Anabaena con una región de apareamiento de 5 nucleótidos (FIG. 2A) y un intrón-exón permutado ejemplar de Anabaena con una región de apareamiento ampliada (FIG. 2B).
LasFIG.3Ay3Bson gráficos que muestran la eficiencia de circularización del intrón-exón permutado de Anabaena con una región de apareamiento de 5 nucleótidos (Anabaena 1), el intrón-exón permutado de Anabaena con una región de apareamiento ampliada (Anabaena 2) y Anabaena 3 con un ARN de 1,2 Kb (FIG. 3A) o un ARN de 4,5 Kb (FIG. 3B).
LaFIG. 4es un gráfico que muestra la expresión relativa de Gluc a partir de ARN circular generado con intrónexón permutado de Anabaena con una región de apareamiento de 5 nucleótidos (Anabaena 1), intrón-exón permutado de Anabaena con una región de apareamiento ampliada (Anabaena 2), o Anabaena 3 en tres puntos temporales diferentes.
LaFIG. 5es un gráfico que muestra la expresión relativa de la proteína espiga del SARS-CoV-2 a partir de ARN circular generado con intrón-exón permutado de Anabaena con una región de apareamiento de 5 nucleótidos (Anabaena 1), intrón-exón permutado de Anabaena con una región de apareamiento ampliada (Anabaena 2), o Anabaena 3 en tres puntos temporales diferentes.
LaFIG. 6es un dibujo esquemático que muestra diseños ejemplares de intrón-exón permutado de Anabaena con varias regiones de apareamiento extendidas entre E2 y E1.
LaFIG.7es un gráfico que muestra la eficiencia de circularización con el intrón-exón permutado de Anabaena con una región de apareamiento ampliada (Anabaena 2), y el intrón-exón permutado de Anabaena con extensiones adicionales de 5, 10 o 15 nucleótidos de la región de apareamiento.
LaFIG. 8es un gráfico que muestra la expresión con el intrón-exón permutado de Anabaena con una región de apareamiento ampliada (Anabaena 2), y el intrón-exón permutado de Anabaena con extensiones adicionales de 5, 10 o 15 nucleótidos de la región de apareamiento en tres puntos temporales diferentes.
LasFIGS. 9Ay9Bson dibujos esquemáticos que muestran un intrón-exón permutado ejemplar de Tetrahymena con una región de apareamiento de 6 nucleótidos (FIG. 9A) y un intrón-exón permutado ejemplar de Tetrahymena con una región de apareamiento ampliada (FIG. 9B).
LasFIG. 10Ay10Bson dibujos esquemáticos que muestran las estructuras de un intrón-exón permutado ejemplar de Tetrahymena con una región de apareamiento de 6 nucleótidos (FIG. 9A) y un intrón-exón permutado ejemplar de Tetrahymena con una región de apareamiento ampliada (FIG. 9B).
LaFIG. l1es un gráfico que muestra la eficacia de circularización del intrón-exón permutado de Tetrahymena con una región de apareamiento de 6 nucleótidos (Tetrahymena 1) y del intrón-exón permutado de Tetrahymena con una región de apareamiento ampliada (Tetrahymena 2).
LasFIGS. 12Ay12Bson dibujos esquemáticos que muestran un intrón-exón permutado ejemplar de fago T4 con una región de apareamiento de 2 nucleótidos (FIG. 12A) y un intrón-exón permutado ejemplar de fago T4 con una región de apareamiento ampliada (FIG. 12B).
LaFIG. 13es un gráfico que muestra la eficiencia de circularización del intrón-exón permutado de fago T4 con una región de apareamiento de 2 nucleótidos (fago T4 1) y el intrón-exón permutado de fago T4 con una región de apareamiento ampliada (fago T42).
LasFIGS. 14Ay14Bson dibujos esquemáticos que muestran un intrón-exón permutado ejemplar con una región de apareamiento (FIG. 14A) y un intrón-exón permutado ejemplar con una región de apareamiento ampliada (FIG.
14B).
LasFIGS. 15Ay15Bson dibujos esquemáticos que muestran las estructuras de un intrón-exón permutado ejemplar de Synechococcus con una región de apareamiento de 7 nucleótidos (FIG. 15A) y un intrón-exón permutado ejemplar de Synechococcus con una región de apareamiento modificada y ampliada (FIG. 15B). LasFIGS. 16Ay16Bson dibujos esquemáticos que muestran las estructuras de un intrón-exón permutado ejemplar de Anabaena azollae con una región de apareamiento de 5 nucleótidos (FIG. 16A) y un intrón-exón permutado ejemplar de Anabaena azollae con una región de apareamiento modificada y ampliada (FIG. 16B). LasFIGS. 17Ay17Bson dibujos esquemáticos que muestran las estructuras de una Anabaena cylindrica ejemplar con una región de apareamiento de 5 nucleótidos (FIG. 17A) y un intrón-exón permutado ejemplar de Anabaena cylindrica con una región de apareamiento modificada y ampliada (FIG. 17B).
LasFIGS. 18Ay18Bson dibujos esquemáticos que muestran las estructuras de un intrón-exón permutado ejemplar de Scytonema con una región de apareamiento de 5 nucleótidos (FIG. 18A) y un intrón-exón permutado ejemplar de Scytonema con una región de apareamiento modificada y ampliada (FIG. 18B).
LaFIG. 19es una tabla que muestra modificaciones ejemplares para varios intrones-exones permutados con una región de apareamiento. La negrita identifica la región de apareamiento original; la cursiva y el subrayado identifican modificaciones ejemplares para el apareamiento ampliado.
LaFIG. 20es un gráfico que muestra el aumento de veces de circularización de varios intrón-exón permutados modificados con un ARN de 4,5 Kb con respecto al intrón-exón permutado no modificado (original) con un ARN de 4,5 Kb. Se observa una mayor eficiencia de circularización con intrones del grupo I con intrón-exón permutado con región de apareamiento E2-E1 ampliada.
LaFIG. 21Aes un dibujo esquemático que muestra la estructura secundaria del intrón de auto-corte y empalme de Anabaena. La región de permutación en P6b está resaltada. LaFIG. 21Bson dibujos esquemáticos que muestran las estructuras de diseños ejemplares de intrón-exón permutado de Anabaena con un tallo P6b ampliado (Anabaena 4) o con cambio de protuberancia de P6b a tallo (Anabaena 5).
LaFIG. 22es un gráfico que muestra la eficiencia de circularización con el intrón-exón permutado de Anabaena con una región de apareamiento ampliada (Anabaena 2), el intrón-exón permutado de Anabaena con una región de apareamiento de 5 nucleótidos (Anabaena 1), Anabaena 4 y Anabaena 5.
Descripción detallada
La presente invención presenta composiciones y métodos para producir un polirribonucleótido circular (ARN circular). Los polirribonucleótidos circulares descritos en la presente son particularmente útiles para administrar una carga de polinucleótidos (por ejemplo, la codificación de un gen o una proteína) a una célula diana.
Un polirribonucleótido circular puede producirse a partir de un polirribonucleótido lineal en el que los extremos se auto-cortan y empalman juntos, formando de este modo el polirribonucleótido circular. Las moléculas de ARN lineales descritas en la presente incluyen, de 5' a 3', (A) una mitad 3' de fragmento de intrón catalítico del Grupo I; (B) un sitio de corte y empalme 3'; (C) un fragmento de exón 3'; (D) una carga de polirribonucleótido; (E) un fragmento de exón 5'; (F) un sitio de corte y empalme 5'; y (G) una mitad 5' de fragmento de intrón catalítico del Grupo I. El polirribonucleótido incluye una primera región de apareamiento que tiene de 2 a 50, por ejemplo, de 8 a 50 ribonucleótidos y está presente dentro de (A) la mitad 3' del fragmento de intrón catalítico del Grupo I; (B) el sitio de corte y empalme 3'; o (C) el fragmento de exón 3'. El polirribonucleótido también incluye una segunda región de apareamiento que tiene de 2 a 50, por ejemplo, de 8 a 50 ribonucleótidos y está presente dentro de (E) el fragmento de exón 5'; (F) el sitio de corte y empalme 5'; o (G) la mitad 5' del fragmento de intrón catalítico del Grupo I. La primera región de apareamiento tiene una complementariedad del 80% al 100% con la segunda región de apareamiento o tiene de cero a 10 pares de bases mal apareadas. Estas características permiten que la primera región de apareamiento hibride con la segunda región de apareamiento, acercando de este modo los sitios de corte y empalme cerca de los extremos 5' y 3' del polirribonucleótido lineal. Una vez que los sitios de corte y empalme están cerca, el polirribonucleótido es capaz de auto-cortar y empalmar los sitios de corte y empalme 3' y 5', formando de este modo el polirribonucleótido circular.
Al incluir la primera región de apareamiento dentro de, por ejemplo, (A) la mitad 3' del fragmento de intrón catalítico del Grupo I; (B) el sitio de corte y empalme 3'; o (C) el fragmento de exón 3', y la segunda región de apareamiento dentro de, por ejemplo, (E) el fragmento de exón 5'; (F) el sitio de corte y empalme 5'; o (G) la mitad 5' del fragmento de intrón catalítico del Grupo I, la molécula lineal presenta una mayor eficiencia de circularización y fidelidad de corte y empalme en comparación con otros constructos de polirribonucleótidos que carecen de estas características. Además, al utilizar un intrón de auto-corte y empalme catalítico, la molécula lineal no necesita ser tratada con una enzima exógena, como una ligasa, para producir el polirribonucleótido circular. Esto es particularmente ventajoso para producir un producto circular en una única reacción. A continuación se describen con más detalle las moléculas, los métodos de producción y los usos de las mismas.
Polinucleótidos
La divulgación presenta composiciones de polirribonucleótidos circulares y métodos para elaborar polirribonucleótidos circulares. En algunas realizaciones, un polirribonucleótido circular se produce a partir de un polirribonucleótido lineal (por ejemplo, por auto-corte y empalme de extremos compatibles del polirribonucleótido lineal). En algunas realizaciones, un polirribonucleótido lineal se transcribe a partir de una plantilla de desoxirribonucleótido (por ejemplo, un vector, un vector linealizado o un ADNc). Por consiguiente, la divulgación presenta desoxirribonucleótidos, polirribonucleótidos lineales y polirribonucleótidos circulares y composiciones de los mismos útiles en la producción de polirribonucleótidos circulares.
Desoxirribonucleótidos plantilla
La presente invención presenta un desoxirribonucleótido plantilla para elaborar ARN circular. El desoxirribonucleótido incluye lo siguiente, enlazado operativamente en una orientación de 5' a 3': (A) una mitad 3' del fragmento de intrón catalítico del Grupo I; (B) un sitio de corte y empalme 3'; (C) un fragmento de exón 3'; (D) una carga de polirribonucleótido; (E) un fragmento de exón 5'; (F) un sitio de corte y empalme 5'; y (G) una mitad 5' del fragmento de intrón catalítico del Grupo I. En algunas realizaciones, el desoxirribonucleótido incluye elementos adicionales, por ejemplo, fuera de o entre cualquiera de los elementos (A), (B), (C), (D), (E), (F), o (G). En algunas realizaciones, cualquiera de los elementos (A), (B), (C), (D), (E), (F), o (G) está separado entre sí por una secuencia espaciadora, como se describe en la presente.
En algunas realizaciones, el desoxirribonucleótido es, por ejemplo, un vector de ADN circular, un vector de ADN linealizado o un ADN lineal (por ejemplo, un ADNc, por ejemplo, producido a partir de un vector de ADN).
En algunas realizaciones, el desoxirribonucleótido incluye además un promotor de ARN polimerasa enlazado operativamente con una secuencia que codifica un ARN lineal descrito en la presente. En algunas realizaciones, el promotor de la ARN polimerasa es heterólogo a la secuencia que codifica el ARN lineal. En algunas realizaciones, el promotor de la ARN polimerasa es un promotor T7, un promotor T6, un promotor T4, un promotor T3, un promotor del virus SP6 o un promotor SP3.
En algunas realizaciones, el desoxirribonucleótido incluye un sitio de clonación múltiple (MCS).
En algunas realizaciones, el desoxirribonucleótido se usa para producir ARN circular con un intervalo de tamaño de aproximadamente 100 a aproximadamente 20.000 nucleótidos. En algunas realizaciones, el ARN circular tiene por lo menos 100, 500, 550, 600, 650, 700, 750, 800, 850, 900, 950, 1.000, 1.100, 1.200, 1.300, 1.400, 1.500, 1.600, 1.700, 1.800, 1.900, 2.000, 2.500, 3.000, 3.500, 4.000, 4.500 o 5.000 nucleótidos. En algunas realizaciones, el ARN circular no tiene más de 20.000, 15.000, 10.000, 9.000, 8.000, 7.000, 6.000, 5.000 o 4.000 nucleótidos.
Polirribonucleótidos lineales
La presente invención también presenta polirribonucleótidos lineales que incluyen lo siguiente, enlazados operativamente en una orientación de 5' a 3': (A) una mitad 3' del fragmento de intrón catalítico del Grupo I; (B) un sitio de corte y empalme 3'; (C) un fragmento de exón 3'; (D) una carga de polirribonucleótido; (E) un fragmento de exón 5'; (F) un sitio de corte y empalme 5'; y (G) una mitad 5' del fragmento de intrón catalítico del Grupo I. En realizaciones, el polirribonucleótido lineal incluye elementos adicionales, por ejemplo, fuera de o entre cualquiera de los elementos (a ), (B), (C), (D), (E), (F), o (G). Por ejemplo, cualquiera de los elementos (A), (B), (C), (D), (E), (F) o (G) puede estar separado por una secuencia espaciadora, como se describe en la presente.
En ciertas realizaciones, se proporciona en la presente un método para generar ARN lineal realizando la transcripción en un sistema libre de células (por ejemplo, transcripción in vitro) usando un desoxirribonucleótido (por ejemplo, un vector, vector linealizado o ADNc) proporcionado en la presente como plantilla (por ejemplo, un vector, vector linealizado o ADNc proporcionado en la presente con un promotor de ARN polimerasa situado en sentido ascendente de la región que codifica para el ARN lineal).
En algunas realizaciones, se transcribe una plantilla de desoxirribonucleótidos para producir un ARN lineal que contenga los componentes descritos en la presente. Tras la expresión, el polirribonucleótido lineal produce un polirribonucleótido compatible con el corte y empalme, que puede auto-cortarse y empalmarse para producir un polirribonucleótido circular.
En algunas realizaciones, el polirribonucleótido lineal tiene de 50 a 20.000, de 100 a 20.000, de 200 a 20.000, de 300 a 20.000 (por ejemplo, 50, 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 1,000, 1,100, 1,200, 1,300, 1,400, 1,500, 1,600, 1,700, 1,800, 1,900, 2,000, 2,500, 3,000, 3,500, 4,000, 5.000, 6.000, 7.000, 8.000, 9.000, 10.000, 11.000, 12.000, 13.000, 14.000, 15.000, 16.000, 17.000, 18.000, 19.000 o 20.000) ribonucleótidos de longitud. En algunas realizaciones, el polirribonucleótido lineal tiene, por ejemplo, por lo menos 500, por lo menos 1.000, por lo menos 2.000, por lo menos 3.000, por lo menos 4.000 o por lo menos 5.000 ribonucleótidos de longitud.
Polimbonudeótidos circulares
En algunas realizaciones, la invención presenta un polirribonucleótido circular (por ejemplo, un polirribonucleótido circular cerrado covalentemente). En algunas realizaciones, el polirribonucleótido circular incluye una unión de corte y empalme que une un fragmento de exón 5' y un fragmento de exón 3'. En algunas realizaciones, el fragmento de exón 3' incluye la primera región de apareamiento que tiene de 2 a 50, por ejemplo, de 8 a 50 (por ejemplo, de 10 a 30, de 10 a 20, o de 10 a 15, por ejemplo, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41,42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, o 50) ribonucleótidos, y el fragmento de exón 5' incluye la segunda región de apareamiento que tiene de 2 a 50, por ejemplo, de 8 a 50 (por ejemplo, de 10 a 30, de 10 a 20, o de 10 a 15, por ejemplo, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41,42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, o 50) ribonucleótidos. En algunas realizaciones, la primera región de apareamiento y la segunda región de apareamiento incluyen una complementariedad del 80% al 100% (por ejemplo, del 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 99% o 100%). En algunas realizaciones, la primera región de apareamiento y la segunda región de apareamiento incluyen de cero a 10 (por ejemplo, 0, 1,2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 o 10) pares de bases mal apareadas.
En algunas realizaciones, el polinucleótido circular incluye además una carga de polirribonucleótido. En algunas realizaciones, la carga de polirribonucleótido incluye una secuencia de expresión (o codificante), una secuencia no codificante, o una combinación de una secuencia de expresión (codificante) y una secuencia no codificante. En algunas realizaciones, la carga de polirribonucleótido incluye una secuencia de expresión (codificante) que codifica un polipéptido. En algunas realizaciones, el polirribonucleótido incluye un IRES enlazado operativamente a una secuencia de expresión que codifica un polipéptido. En algunas realizaciones, el IRES está situado en sentido ascendente de la secuencia de expresión. En algunas realizaciones, el IRES está situado en sentido descendente de la secuencia de expresión. En algunas realizaciones, el polirribonucleótido circular incluye además una región espaciadora entre el IRES y el fragmento de exón 3' o el fragmento de exón 5'. La región espaciadora puede tener, por ejemplo, por lo menos 5 (por ejemplo, por lo menos 10, por lo menos 15, por lo menos 20) ribonucleótidos de longitud. La región espaciadora puede tener, por ejemplo, de 5 a 500 (por ejemplo, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450, o 500) ribonucleótidos. En algunas realizaciones, la región espaciadora incluye una secuencia poliA. En algunas realizaciones, la región espaciadora incluye una secuencia poliA-C. En algunas realizaciones, la región espaciadora incluye una secuencia poliA-G. En algunas realizaciones, la región espaciadora incluye una secuencia poliA-T. En algunas realizaciones, la región espaciadora incluye una secuencia aleatoria. En algunas realizaciones, la primera región de apareamiento y la segunda región de apareamiento se unen, formando de este modo un polirribonucleótido circular.
En algunas realizaciones, el ARN circular se produce mediante una plantilla de desoxirribonucleótidos o un ARN lineal descrito en la presente. En algunas realizaciones, el ARN circular se produce mediante cualquiera de los métodos descritos en la presente.
En algunas realizaciones, el polirribonucleótido circular tiene por lo menos aproximadamente 20 nucleótidos, por lo menos aproximadamente 30 nucleótidos, por lo menos aproximadamente 40 nucleótidos, por lo menos aproximadamente 50 nucleótidos, por lo menos aproximadamente 75 nucleótidos, por lo menos aproximadamente 100 nucleótidos, por lo menos aproximadamente 200 nucleótidos, por lo menos aproximadamente 300 nucleótidos, por lo menos aproximadamente 400 nucleótidos, por lo menos aproximadamente 500 nucleótidos, por lo menos aproximadamente 1.000 nucleótidos, por lo menos aproximadamente 2.000 nucleótidos, por lo menos aproximadamente 5.000 nucleótidos, por lo menos aproximadamente 6.000 nucleótidos, por lo menos aproximadamente 7.000 nucleótidos, por lo menos aproximadamente 8.000 nucleótidos, por lo menos aproximadamente 9.000 nucleótidos, por lo menos aproximadamente 10.000 nucleótidos, por lo menos aproximadamente 12.000 nucleótidos, por lo menos aproximadamente 14,000 nucleótidos, por lo menos aproximadamente 15.000 nucleótidos, por lo menos aproximadamente 16.000 nucleótidos, por lo menos aproximadamente 17.000 nucleótidos, por lo menos aproximadamente 18.000 nucleótidos, por lo menos aproximadamente 19.000 nucleótidos o por lo menos aproximadamente 20.000 nucleótidos.
En algunas realizaciones, el polirribonucleótido circulartiene un tamaño suficiente para alojar un sitio de unión para un ribosoma. En algunas realizaciones, el tamaño de un polirribonucleótido circular es una longitud suficiente para codificar polipéptidos útiles, por ejemplo, pueden producirse por lo menos 20.000 nucleótidos, por lo menos 15.000 nucleótidos, por lo menos 10.000 nucleótidos, por lo menos 7.500 nucleótidos, por lo menos 5.000 nucleótidos, por lo menos 4.000 nucleótidos, por lo menos 3.000 nucleótidos, por lo menos 2.000 nucleótidos, por lo menos 1.000 nucleótidos, por lo menos 500 nucleótidos, por lo menos 1.400 nucleótidos, por lo menos 300 nucleótidos, por lo menos 200 nucleótidos o por lo menos 100 nucleótidos.
En algunas realizaciones, el polirribonucleótido circular incluye uno o más elementos descritos en otra parte de la presente. En algunas realizaciones, los elementos están separados entre sí por una secuencia espaciadora. En algunas realizaciones, los elementos están separados entre sí por 1 ribonucleótido, 2 nucleótidos, aproximadamente 5 nucleótidos, aproximadamente 10 nucleótidos, aproximadamente 15 nucleótidos, aproximadamente 20 nucleótidos, aproximadamente 30 nucleótidos, aproximadamente 40 nucleótidos, aproximadamente 50 nucleótidos, aproximadamente 60 nucleótidos, aproximadamente 80 nucleótidos, aproximadamente 100 nucleótidos, aproximadamente 150 nucleótidos, aproximadamente 200 nucleótidos, aproximadamente 250 nucleótidos, aproximadamente 300 nucleótidos, aproximadamente 400 nucleótidos, aproximadamente 500 nucleótidos, aproximadamente 600 nucleótidos, aproximadamente 700 nucleótidos, aproximadamente 800 nucleótidos, aproximadamente 900 nucleótidos, aproximadamente 1000 nucleótidos, hasta aproximadamente 1 kb, por lo menos aproximadamente 1000 nucleótidos, o cualquier cantidad de nucleótidos intermedia. En algunas realizaciones, uno o más elementos son contiguos entre sí, por ejemplo, carecen de un elemento espaciador.
En algunas realizaciones, el polirribonucleótido circular incluye uno o más elementos repetitivos descritos en otra parte de la presente. En algunas realizaciones, el polirribonucleótido circular incluye una o más modificaciones descritas en otra parte de la presente. En una realización, el ARN circular contiene por lo menos una modificación nucleosídica. En una realización, hasta el 100% de los nucleósidos del ARN circular están modificados. En una realización, por lo menos una modificación de nucleósido es una modificación de uridina o una modificación de adenosina.
Como resultado de su circularización, el polirribonucleótido circular puede incluir ciertas características que lo distinguen del ARN lineal. Por ejemplo, el polirribonucleótido circular es menos susceptible a la degradación por la exonucleasa en comparación con el ARN lineal. Como tal, el polirribonucleótido circular es más estable que un ARN lineal, especialmente cuando se incuba en presencia de una exonucleasa. La estabilidad aumentada del polirribonucleótido circular en comparación con el ARN lineal hace que el polirribonucleótido circular sea más útil como reactivo de transformación celular para producir polipéptidos y pueda almacenarse más fácilmente y durante más tiempo que el ARN lineal. La estabilidad del polirribonucleótido circular tratado con exonucleasa puede comprobarse usando métodos estándar de la técnica que determinan si se ha producido la degradación del ARN (por ejemplo, mediante electroforesis en gel). Además, a diferencia del ARN lineal, el polirribonucleótido circular es menos susceptible a la desfosforilación cuando el polirribonucleótido circular se incuba con fosfatasa, como la fosfatasa de intestino de ternera.
Regiones de apareamiento
Las composiciones de polinucleótidos descritas en la presente pueden incluir dos o más regiones de apareamiento, por ejemplo, dos o más regiones de apareamiento descritas en la presente. Una región de apareamiento, o un par de regiones de apareamiento, son aquellas que contienen una porción con un alto grado de complementariedad que promueve la hibridación en condiciones adecuadas.
Una región de apareamiento incluye por lo menos una región de complementariedad como se describe en la presente. El alto grado de complementariedad de la región complementaria promueve la asociación de pares de regiones de apareamiento. Cuando una primera región de apareamiento (por ejemplo, una región de apareamiento 5') está localizada en o cerca del extremo 5' de un ARN lineal y una segunda región de apareamiento (por ejemplo, una región de apareamiento 3') está localizada en o cerca del extremo 3' de un ARN lineal, la asociación de las regiones de apareamiento acerca los fragmentos 5' y 3' y los fragmentos de intrón correspondientes. En algunas realizaciones, esto favorece la circularización del ARN lineal por corte y empalme de los sitios de corte y empalme 3' y 5'. En algunas realizaciones, las regiones de apareamiento descritas en la presente refuerzan las regiones de apareamiento que se producen de manera natural, por ejemplo, para favorecer el auto-corte y empalme.
Una región de apareamiento puede alterarse introduciendo una o más (por ejemplo, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, o más) mutaciones en la secuencia de polirribonucleótidos. Por ejemplo, una región de apareamiento puede ampliarse introduciendo una o más mutaciones puntuales en una primera región de apareamiento y/o una segunda región de apareamiento para aumentar la longitud de complementariedad entre la primera y la segunda regiones de apareamiento. La región de apareamiento también puede alterarse insertando uno o más (por ejemplo, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, o más) nucleótidos en el polirribonucleótido. En algunas realizaciones, una región de apareamiento se amplía insertando uno o más nucleótidos en una primera región de apareamiento y/o una segunda región de apareamiento para aumentar la longitud de complementariedad entre la primera y la segunda regiones de apareamiento. En algunas realizaciones, la región de apareamiento se amplía introduciendo una o más mutaciones puntuales en una primera región de apareamiento y/o una segunda región e insertando uno o más nucleótidos en la primera región de apareamiento y/o la segunda región de apareamiento para aumentar la longitud de complementariedad. La alteración de la región de apareamiento puede alterar la estructura secundaria del polirribonudeótido favoreciendo una protuberancia o región mal apareada con la secuencia original para formar preferentemente una estructura de tallo o bucle de tallo con la secuencia alterada.
El polirribonucleótido incluye una primera región de apareamiento que tiene de 2 a 50, de 5 a 50, de 6 a 50, de 7 a 50, o de 8 a 50 (por ejemplo, de 10 a 30, de 10 a 20, o de 10 a 15, por ejemplo, por lo menos 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, o 50) ribonucleótidos y está presente dentro de (A) la mitad 3' del fragmento de intrón catalítico del Grupo I; (B) el sitio de corte y empalme 3'; o (C) el fragmento de exón 3'. El polirribonucleótido también incluye una segunda región de apareamiento que tiene de 2 a 50, de 5 a 50, de 6 a 50, de 7 a 50, o de 8 a 50 (por ejemplo, de 10 a 30, de 10 a 20, o de 10 a 15, por ejemplo, por lo menos 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, o 50) ribonucleótidos y está presente dentro de (E) el fragmento de exón 5'; (F) el sitio de corte y empalme 5'; o (G) la mitad 5' del fragmento del intrón catalítico del Grupo I. La primera región de apareamiento tiene del 80% al 100% (por ejemplo, del 85% al 100%, por ejemplo, del 90% al 100%, por ejemplo, el 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 99%, o 100%) de complementariedad con la segunda región de apareamiento o tiene de cero a 10 por ejemplo, (0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, o 10) pares de bases mal apareadas.
En algunas realizaciones, la primera región de apareamiento y la segunda región de apareamiento son 100% complementarias.
En algunas realizaciones, la primera región de apareamiento tiene por lo menos un 80% (por ejemplo, por lo menos un 85%, 90%, 95%, 97%, 99% o 100%) de identidad de secuencia con la secuencia de 5'- TCCGT -3' (<s>E<q>ID NO: 1), y la segunda región de apareamiento tiene por lo menos un 80% (por ejemplo, por lo menos un 85%, 90%, 95%, 97%, 99% o 100%) de identidad de secuencia con la secuencia de 5'- ACGGA -3' (S<e>Q ID NO: 2).
En algunas realizaciones, la primera región de apareamiento tiene por lo menos un 80% (por ejemplo, por lo menos un 85%, 90%, 95%, 97%, 99% o 100%) de identidad de secuencia con la secuencia de 5'- TC<c>G<t>AG<c>G<t>CT -3' (SEQ ID NO: 5), y la segunda región de apareamiento tiene por lo menos un 80% (por ejemplo, por lo menos 85%, 90%, 95%, 97%, 99% o 100%) de identidad de secuencia con la secuencia 5' - AGAc Gc TACGGA-3' (SEQ ID NO: 6).
En algunas realizaciones, la primera región de apareamiento tiene por lo menos un 80% (por ejemplo, por lo menos un 85%, 90%, 95%, 97%, 99% o 100%) de identidad de secuencia con la secuencia de 5'-TCCGTAGCGTCTAAACG -3' (SEQ ID NO: 22), y la segunda región de apareamiento tiene por lo menos un 80% (por ejemplo, por lo menos 85%, 90%, 95%, 97%, 99% o 100%) de identidad de secuencia con la secuencia 5'-CGTTTAGACGCTACGGA-3' (SEQ ID NO: 23).
En algunas realizaciones, la primera región de apareamiento tiene por lo menos un 80% (por ejemplo, por lo menos un 85%, 90%, 95%, 97%, 99% o 100%) de identidad de secuencia con la secuencia de 5'-TCCGTAGCGTCTAAACGGTCGT -3' (SEQ ID NO: 24), y la segunda región de apareamiento tiene por lo menos un 80% (por ejemplo, por lo menos 85%, 90%, 95%, 97%, 99% o 100%) de identidad de secuencia con la secuencia 5'-ACGACCGTTTAGACGCTACGGA-3' (SEQ ID NO: 25).
En algunas realizaciones, la primera región de apareamiento tiene por lo menos un 80% (por ejemplo, por lo menos un 85%, 90%, 95%, 97%, 99% o 100%) de identidad de secuencia con la secuencia de 5'-TCCGTAGCGTCTAAACGGTCGTGTGG -3' (SEQ ID<n>O: 26), y la segunda región de apareamiento tiene por lo menos un 80% (por ejemplo, por lo menos 85%, 90%, 95%, 97%, 99% o 100%) de identidad de secuencia con la secuencia 5'- CCCACACGACCGTTTAGACGCTACGGA-3' (SEQ ID NO: 27).
En algunas realizaciones, la primera región de apareamiento tiene por lo menos un 80% (por ejemplo, por lo menos un 85%, 90%, 95%, 97%, 99% o 100%) de identidad de secuencia con la secuencia de 5' - AAGGt A -3' (SEQ ID NO: 13), y la segunda región de apareamiento tiene por lo menos un 80% (por ejemplo, por lo menos un 85%, 90%, 95%, 97%, 99% o 100%) de identidad de secuencia con la secuencia de 5'- Ta CCTT -3' (Se Q ID NO: 14).
En algunas realizaciones, la primera región de apareamiento tiene por lo menos un 80% (por ejemplo, por lo menos un 85%, 90%, 95%, 97%, 99% o 100%) de identidad de secuencia con la secuencia de 5' - A<a g>G<t a>A<a>TATT -3' (SEQ ID NO: 16), y la segunda región de apareamiento tiene por lo menos un 80% (por ejemplo, por lo menos un 85%, 90%, 95%, 97%, 99% o 100%) de identidad de secuencia con la secuencia de 5' - AAt At t Ta CCTT -3' (SEQ ID NO: 17).
En algunas realizaciones, la primera región de apareamiento tiene la secuencia 5'- CT -3', y la segunda región de apareamiento tiene la secuencia 5'- AG -3'.
En algunas realizaciones, la primera región de apareamiento tiene por lo menos un 80% (por ejemplo, por lo menos un 85%, 90%, 95%, 97%, 99% o 100%) de identidad de secuencia con la secuencia de 5'- C<t>CAA<t>T -3' (SEQ ID NO: 20), y la segunda región de apareamiento tiene por lo menos un 80% (por ejemplo, por lo menos un 85%, 90%, 95%, 97%, 99% o 100%) de identidad de secuencia con la secuencia de 5'- Aa TTGa G -3' (SEQ ID NO: 21).
En algunas realizaciones, (A) o (C) incluye la primera región de apareamiento y (E) o (G) incluye la segunda región de apareamiento.
En algunas realizaciones, el fragmento de exón 3' de (C) incluye la primera región de apareamiento y el fragmento de exón 5' de (E) incluye la segunda región de apareamiento.
En algunas realizaciones, la mitad 3' del fragmento de intrón catalítico del Grupo I de (A) incluye la primera región de apareamiento y el fragmento de exón 5' de (E) incluye la segunda región de apareamiento.
En algunas realizaciones, el fragmento de exón 3' de (C) incluye la primera región de apareamiento y la mitad 5' del fragmento intrón catalítico del Grupo I incluye la segunda región de apareamiento.
En algunas realizaciones, la primera región de apareamiento y la segunda región de apareamiento incluyen ninguna o un par de bases mal apareadas.
En algunas realizaciones, una región de apareamiento incluye además una región no complementaria como se describe a continuación. Una región no complementaria puede añadirse a la región complementaria para permitir que los extremos del ARN permanezcan flexibles, no estructurados o menos estructurados que la región complementaria.
En algunas realizaciones, cada región de apareamiento incluye de 2 a 100, de 5 a 100, o de 6 a 100 ribonucleótidos (por ejemplo, de 6 a 80, de 6 a 50, de 6 a 30, de 6 a 20, de 10 a 100, de 10 a 80, de 10 a 50, o de 10 a 30 ribonucleótidos). En algunas realizaciones, una región de apareamiento 5' incluye de 2 a 100, de 5 a 100, de 6 a 100 ribonucleótidos (por ejemplo, de 6 a 80, de 6 a 50, de 6 a 30, de 6 a 20, de 10 a 100, de 10 a 80, de 10 a 50, o de 10 a 30 ribonucleótidos). En algunas realizaciones, una región de apareamiento 3' incluye de 6 a 100 ribonucleótidos (por ejemplo, de 6 a 80, de 6 a 50, de 6 a 30, de 6 a 20, de 10 a 100, de 10 a 80, de 10 a 50, o de 10 a 30 ribonucleótidos).
En algunas realizaciones, el polirribonucleótido no incluye una región de apareamiento 3' para (A) que incluya complementariedad de ácido nucleico parcial o completa con una región de apareamiento 5' para (G).
En algunas realizaciones, el polirribonucleótido no incluye una región de apareamiento adicional, por ejemplo, además de la primera región de apareamiento y la segunda región de apareamiento.
Regiones complementarias
Una región complementaria es una región que favorece la asociación con una región complementaria correspondiente, en condiciones adecuadas. Por ejemplo, un par de regiones complementarias puede compartir un alto grado de complementariedad de secuencia (por ejemplo, una primera región complementaria es el complemento inverso de una segunda región complementaria, por lo menos en parte). Cuando dos regiones complementarias se asocian (por ejemplo, se hibridan), pueden formar una estructura secundaria altamente estructurada, como un tallo o un bucle de tallo.
En algunas realizaciones, el polirribonucleótido incluye una región complementaria 5' y una región complementaria 3'. En algunas realizaciones, la región complementaria 5' tiene de 2 a 50, por ejemplo, de 5 a 50 ribonucleótidos (por ejemplo, 5-40, 5-30, 5-20, 5-10, 10-50, 10-40, 10-30, 10-20, o 20-50, por ejemplo, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, o 50 ribonucleótidos). En algunas realizaciones, la región complementaria 3 'tiene de 2 a 50, por ejemplo, de 5 a 50 ribonucleótidos (por ejemplo, 5-40, 5-30, 5-20, 5-10, 10-50, 10-40, 10-30, 10-20, o 20-50, por ejemplo, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, o 50 ribonucleótidos).
En algunas realizaciones, la región complementaria 5' y la región complementaria 3' tienen de un 50% a un 100% de complementariedad de secuencia (por ejemplo, de un 60% a un 100%, de un 70% a un 100%, de un 80% a un 100%, de un 90% a un 100% o un 100%, por ejemplo, un 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 99% o 100% de complementariedad de secuencia).
En algunas realizaciones, la región complementaria 5' y la región complementaria 3' tienen una energía libre de unión de menos de -5 kcal/mol (por ejemplo, de menos de -10 kcal/mol, de menos de -20 kcal/mol o de menos de -30 kcal/mol).
En algunas realizaciones, la región complementaria 5' y la región complementaria 3' tienen una Tm de unión de por lo menos 10°C, por lo menos 15°C, por lo menos 20°C, por lo menos 30°C, por lo menos 40°C, por lo menos 50°C, por lo menos 60°C, por lo menos 70°C, por lo menos 80°C, o por lo menos 90°C.
En algunas realizaciones, la región complementaria 5' y la región complementaria 3' incluyen por lo menos uno pero no más de 10 mal apareamientos, por ejemplo, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, o 2 mal apareamientos, o 1 mal apareamiento (es decir, cuando la región complementaria 5' y la región complementaria 3' hibridan entre sí). Un mal apareamiento puede ser, por ejemplo, un nucleótido en la región complementaria 5' y un nucleótido en la región complementaria 3' que son opuestos entre sí (es decir, cuando la región complementaria 5' y la región complementaria 3' se hibridan) pero que no forman un par de bases Watson-Crick. Un mal apareamiento puede ser, por ejemplo, un nucleótido no apareado que forma un pliegue o protuberancia en la región complementaria 5' o en la región complementaria 3'. En algunas realizaciones, la región complementaria 5' y la región complementaria 3' no incluyen ningún mal apareamiento.
Regiones no complementarias
Una región no complementaria es una región que desfavorece la asociación con una región no complementaria correspondiente, en condiciones adecuadas. Por ejemplo, un par de regiones no complementarias puede compartir un bajo grado de complementariedad de secuencia (por ejemplo, una primera región no complementaria no es un complemento inverso de una segunda región no complementaria). Cuando dos regiones no complementarias están próximas, no forman una estructura secundaria altamente estructurada, como un tallo o un bucle de tallo.
En algunas realizaciones, el polirribonucleótido incluye una región no complementaria 5' y una región no complementaria 3'. En algunas realizaciones, la región no complementaria 5' tiene de 5 a 50 ribonucleótidos (por ejemplo, 5-40, 5-30, 5-20, 5-10, 10-50, 10-40, 10-30, 10-20, o 20-50 ribonucleótidos). En algunas realizaciones, la región no complementaria 3' tiene de 5 a 50 ribonucleótidos (por ejemplo, 5-40, 5-30, 5-20, 5-10, 10-50, 10-40, 10-30, 10-20, o 20-50 ribonucleótidos).
En algunas realizaciones, la región no complementaria 5' está situada 5' a la región complementaria 5' (por ejemplo, entre el fragmento de intrón catalítico 5' y la región complementaria 5'). En algunas realizaciones, la región no complementaria 3' está situada 3' a la región complementaria 3' (por ejemplo, entre la región complementaria 3' y el fragmento de intrón catalítico 3').
En algunas realizaciones, la región no complementaria 5' y la región no complementaria 3' tienen del 0% al 50% de complementariedad de secuencia (por ejemplo, del 0%-40%, 0%-30%, 0%-20%, 0%-10%, o un 0% de complementariedad de secuencia).
En algunas realizaciones, la región no complementaria 5' y la región no complementaria 3' tienen una energía libre de unión de más de -5 kcal/mol.
En algunas realizaciones, la región complementaria 5' y la región complementaria 3' tienen una Tm de unión de menos de 10°C.
En algunas realizaciones, la región no complementaria 5' y la región no complementaria 3' incluyen por lo menos 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 o 10 mal apareamientos.
Intrones catalíticos
Los polirribonucleótidos descritos en la presente incluyen fragmentos de intrones catalíticos, como (A) un fragmento de intrón catalítico de la mitad 3' del Grupo I y (G) un fragmento de intrón catalítico de la mitad 5' del Grupo I. La primera y la segunda regiones de apareamiento pueden situarse dentro de los fragmentos de intrón catalítico. Los intrones catalíticos del Grupo I son ribozimas de auto-corte y empalme que catalizan su propia escisión a partir de precursores de ARNm, ARNt y ARNr mediante un mecanismo de transferencia de forforilo de dos iones metálicos. Es importante destacar que el propio ARN autocataliza la eliminación del intrón sin necesidad de una enzima exógena, como una ligasa.
En algunas realizaciones, la mitad 3' del fragmento del intrón catalítico del Grupo I de (A) y la mitad 5' del fragmento del intrón catalítico del Grupo I de (G) proceden de un gen pre-ARNt-Leu de la cianobacteria Anabaena, o de un pre-ARNt de Tetrahymena.
En algunas realizaciones, la mitad 3' del fragmento de intrón catalítico del Grupo I de (A) y la mitad 5' del fragmento de intrón catalítico del Grupo I de (G) proceden de un gen de pre-ARNt-Leu de Cyanobacterium Anabaena, y el fragmento de exón 3' de (C) incluye la primera región de apareamiento y el fragmento de exón 5' de (E) incluye la segunda región de apareamiento. La primera región de apareamiento puede incluir, por ejemplo, de 5 a 50, por ejemplo, de 10 a 15 (por ejemplo, 10, 11, 12, 13, 14, o 15) ribonucleótidos y la segunda región de apareamiento puede incluir, por ejemplo, de 5 a 50, por ejemplo, de 10 a 15 (por ejemplo, 10, 11, 12, 13, 14, o 15) ribonucleótidos.
En algunas realizaciones, la mitad 3' del fragmento de intrón catalítico del Grupo I de (A) y la mitad 5' del fragmento de intrón catalítico del Grupo I de (G) proceden de un pre-ARNr de Tetrahymena, y la mitad 3' del fragmento de intrón catalítico del Grupo I de (A) incluye la primera región de apareamiento y el fragmento de exón 5' de (E) incluye la segunda región de apareamiento. En algunas realizaciones, el exón 3' de (B) incluye la primera región de apareamiento y la mitad 5' del fragmento de intrón catalítico del Grupo I de (G) incluye la segunda región de apareamiento. La primera región de apareamiento puede incluir, por ejemplo, de 6 a 50, por ejemplo, de 10 a 16 (por ejemplo, 10, 11, 12, 13, 14, 15, o 16) ribonucleótidos, y la segunda región de apareamiento puede incluir, por ejemplo, de 6 a 50, por ejemplo, de 10 a 16 (por ejemplo, 10, 11, 12, 13, 14, 15, o 16) ribonucleótidos.
En algunas realizaciones, la mitad 3' del fragmento del intrón catalítico del grupo I de (A) y la mitad 5' del fragmento del intrón catalítico del grupo I de (G) proceden de un gen pre-ARNt-Leu de la cianobacteria Anabaena, un pre-ARNt de Tetrahymena o un gen td del fago T4.
En algunas realizaciones, la mitad 3' del fragmento del intrón catalítico del Grupo I de (A) y la mitad 5' del fragmento del intrón catalítico del Grupo I de (G) proceden de un gen td de fago T4. El fragmento de exón 3' de (C) puede incluir la primera región de apareamiento y la mitad 5' del fragmento de intrón catalítico del Grupo I de (G) puede incluir la segunda región de apareamiento. La primera región de apareamiento puede incluir, por ejemplo, de 2 a 16, por ejemplo, de 10 a 16 (por ejemplo, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, o 16) ribonucleótidos, y la segunda región de apareamiento puede incluir, por ejemplo, de 2 a 16, por ejemplo, de 10 a 16 (por ejemplo, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, o 16) ribonucleótidos.
En algunas realizaciones, la mitad 3' del fragmento del intrón catalítico del Grupo I de (A) es el extremo terminal 5' del polinucleótido lineal.
En algunas realizaciones, la mitad 5' del fragmento intrón catalítico del Grupo I de (G) es el extremo terminal 3' del polirribonucleótido lineal.
En algunas realizaciones, la mitad 3' del fragmento de intrón catalítico del Grupo I de (A) tiene por lo menos un 80% (por ejemplo, por lo menos 85%, 90%, 95%, 97%, 99%, o 100%) de identidad de secuencia con la secuencia de 5'-AACAACAGATAACTTACAGCTAGTCGGAAGGTGCAGAGACTCGACGGGAGCTACCCTAACGTCAAG ACGAGGGTAAAGAGTCCAATTCAAAGCCAATAGGCAGTAGCGAAAGCTGCGGGAGAATG-3' (SEQ ID NO: 28).
En algunas realizaciones, la mitad 5' del fragmento del intrón catalítico del Grupo I de (G) tiene por lo menos un 80% (por ejemplo, por lo menos 85%, 90%, 95%, 97%, 99% o 100%) de identidad de secuencia con la secuencia de 5'-AAATAATTGAGCCTTAGAGAAGAAATTCTTTAAGTGGATGCTCTCAAACTCAGGGAAACCTAAATCTAGACAAGCA ATCCTGAGCCAAGCCGAAGTAGTAATTAGTAAGTT-3' (SEQ ID NO: 29).
En algunas realizaciones, la mitad 3' del fragmento del intrón catalítico del Grupo I de (A) tiene la secuencia de la SEQ ID NO: 28 y la mitad 5' del fragmento del intrón catalítico del Grupo I de (G) tiene la secuencia de la SEQ ID NO: 29.
En algunas realizaciones, la mitad 3' del fragmento de intrón catalítico del Grupo I de (A) tiene por lo menos un 80% (por ejemplo, por lo menos un 85%, 90%, 95%, 97%, 99%, o 100%) de identidad de secuencia con la secuencia 5'-.CTTCTGTTGATATGGATGCAGTTCACAGACTAAATGTCGGTCGGGGAAGATGTATTCTTCATAAGA TATAGTCGGACCTCCTTAATGGGAGCTAGCGGATGAAGTGATGCAACACTGGAGCCGCTGGGAA CTAATTTGTATGCGAAAGTATATTGATTAGTTGGAGTACTCG-3' (SEQ ID NO: 30).
En algunas realizaciones, la mitad 5' del fragmento de intrón catalítico del Grupo I de (G) tiene por lo menos un 80% (por ejemplo, por lo menos un 85%, 90%, 95%, 97%, 99%, o 100%) de identidad de secuencia con la secuencia 5'-.AAATAGCAATATTTACCTTTGGAGGGAAAAGTTATCAGGCATGCACCTGGTAGCTAGTCTTTAAACCA ATAGATTGCATCGGTTTAAAAGGCAAGACCGTCAAATTGCGGGAAAGGGGTCAACAGCCGTTCAGTA CCAAGTCTCAGGGGAAACTTTGAGATGGCCTTGCAAAGGGTATGGTAATAAGCTGACGGACATGGT CCTAACCACGCAGCCAAGTCCTAAGTCAACAGAT-.3' (SEQ ID NO: 31).
En algunas realizaciones, la mitad 3' del fragmento del intrón catalítico del grupo I de (A) tiene la secuencia de la SEQ ID NO: 30 y la mitad 5' del fragmento del intrón catalítico del grupo I de (G) tiene la secuencia de la SEQ ID NO: 31.
En algunas realizaciones, la mitad 3' del fragmento de intrón catalítico del Grupo I de (A) tiene por lo menos un 80% (por ejemplo, por lo menos un 85%, 90%, 95%, 97%, 99%, o 100%) de identidad de secuencia con la secuencia de 5'-GGTTCTACATAAATGCCTAACGACTATCCCTTTGGGGGAGTAGGGTCAAGTGACTCGAAACGATAGAC AACTTGCTTTAACAAGTTGGAGATATAGTCTGCTGCATGGTACATGCAGCTGGATAATTCCGG GGTAAGATTAACGACCTTCTGAACATAATG-3' (SEQ ID NO: 32).
En algunas realizaciones, la mitad 5' del fragmento de intrón catalítico del Grupo I de (G) tiene por lo menos un 80% (por ejemplo, por lo menos un 85%, 90%, 95%, 97%, 99% o 100%) de identidad de secuencia con la secuencia de 5'-TAATTGAGGCCTGAGTATAAGGTGACTTATACTTGTAATCTATCTAAACGGGAACCTCTCTAGTAGA CAATCCCGTGCTAAATTGTAGGACT-3' (SEQ ID NO: 33).
En algunas realizaciones, la mitad 3' del fragmento del intrón catalítico del grupo I de (A) tiene la secuencia de la SEQ ID NO: 32 y la mitad 5' del fragmento del intrón catalítico del grupo I de (G) tiene la secuencia de la SEQ ID NO: 33.
En algunas realizaciones, la mitad 3' del fragmento de intrón catalítico del Grupo I de (A) tiene por lo menos un 80% (por ejemplo, por lo menos un 85%, 90%, 95%, 97%, 99%, o 100%) de identidad de secuencia con la secuencia 5'-.TAAACAACTAACAGCTTTAGAAGGTGCAGACTAGACGGGAGCTACCCTAACGGATTCAGCCGAG GGTAAAGGGATAGTCCAATTCAACATCGCGATTGTTGATGGCAGCGAAAGTTGCAGAGAATGA AAATCCGCTGACTGTAAAGGTCGTGTGAGGGTTCGAGTCCCTCCGCCCCCCCCCCCA-3' (SEQ ID NO: 80).
En algunas realizaciones, la mitad 5' del fragmento del intrón catalítico del Grupo I de (G) tiene por lo menos un 80% (por ejemplo, por lo menos 85%, 90%, 95%, 97%, 99%, o 100%) de identidad de secuencia con la secuencia de 5'-ACGGTAGACGCAGCGGACTTAGAAAACTGGGGCCTCGATCGCGAAAGGGATCGAGTGGCAGCTCTCA AACTCAGGGAAACCTAAAACTTTAAACATTMAAGTCATGGCAATCCTGAGCCAAGCTAAAGC-3' (SEQ ID NO: 81).
En algunas realizaciones, la mitad 3' del fragmento de intrón catalítico del Grupo I de (A) tiene la secuencia de la SEQ ID NO: 80 y la mitad 5' del fragmento de intrón catalítico del Grupo I de (G) tiene la secuencia de la SEQ ID NO: 81.
En algunas realizaciones, la mitad 3' del fragmento de intrón catalítico del Grupo I de (A) tiene por lo menos un 80% (por ejemplo, por lo menos un 85%, 90%, 95%, 97%, 99%, o 100%) de identidad de secuencia con la secuencia 5'-.TTAAACTCAAAATTTAAAATCCCAAATTCAAAATTCCGGGAAGGTGCAGAGACTCGACGGGAGCTAC CCTAACGTAAAGCCGAGGGTAAAGGGAGTCCAATTCTCAAAGCCTGAAGTTGCTGAAGCAACAA GGCAGTAGTGAAAGCTGCGAGAGAATGAAAATCCGTTGACTGTAAAAAGTCGTGGGGGTTCAAGTC CCCCCACCCCCCCCC-3' (SEQ ID NO: 82).
En algunas realizaciones, la mitad 5' del fragmento del intrón catalítico del Grupo I de (G) tiene por lo menos un 80% (por ejemplo, por lo menos un 85%, 90%, 95%, 97%, 99%, o 100%) de identidad de secuencia con la secuencia de 5'-ATGGTAGACGCTACGGACTTAGAAAACTGAGCCTTGATAGAGAAATCTTTTAAGTGGAAGCTCTCAAA TTCAGGGAAACCTAAATCTGAATACAGATATGGCAATCCTGAGCCAAGCAAGCCCAGAATTTAGACTTGA GATTTGATTTTGGAG-3' (SEQ ID NO: 83).
En algunas realizaciones, la mitad 3' del fragmento del intrón catalítico del grupo I de (A) tiene la secuencia de la SEQ ID NO: 82 y la mitad 5' del fragmento del intrón catalítico del grupo I de (G) tiene la secuencia de la SEQ ID NO: 83.
En algunas realizaciones, la mitad 3' del fragmento de intrón catalítico del Grupo I de (A) tiene por lo menos un 80% (por ejemplo, por lo menos un 85%, 90%, 95%, 97%, 99%, o 100%) de identidad de secuencia con la secuencia 5'-.GGCTTTCAATTTGAAATCAGAAATTCAAAATTCAGGGAAGGTGCAGAGACTCGACGGGAGCTACCCT AACGTAAAGGCGAGGGTAAAGGGAGTCCAATTTAAAGCCTGAAGTTGTGCAAGCAACAAGGC AACAGTGAAAGCTGTGGAAGAATGAAAATCCGTTGACCTTAAACGGTCGTGGGTTCAAGTCCCCC CACCCCC-3' (SEQ ID NO: 84).
En algunas realizaciones, la mitad 5' del fragmento del intrón catalítico del Grupo I de (G) tiene por lo menos un 80% (por ejemplo, por lo menos un 85%, 90%, 95%, 97%, 99% o 100%) de identidad de secuencia con la secuencia de 5'-ATGGTAGACGCTACGGACTTAGAAAACTGAGCCTTGATAGAGAAATCTTTCAAGTGGAAGCTCAA ATTCAGGGAAACCTAAATCTGAATACAGATATGGCAATCCTGAGCAAGCCCGGAAATTTTAGAATCA AGATTTTATTTT-3' (SEQ ID NO: 85).
En algunas realizaciones, la mitad 3' del fragmento de intrón catalítico del grupo I de (A) tiene la secuencia de la SEQ ID NO: 84 y la mitad 5' del fragmento de intrón catalítico del grupo I de (G) tiene la secuencia de la SEQ ID NO: 85.
En algunas realizaciones, la mitad 3' del fragmento de intrón catalítico del Grupo I de (A) tiene por lo menos un 80% (por ejemplo, por lo menos un 85%, 90%, 95%, 97%, 99%, o 100%) de identidad de secuencia con la secuencia de 5'-AGAAATGGAGAAGGTGTAGAGACTGGAAGGCAGGCACCCTAACGTGTTAAAGGCAGGGTGA CAGTCCAGACCACAAACCAGCAAATCTGGGCAGCGAAAGCTGTAGGGTAAGCAACCCGAAGG TCAGTGGTTCAAATCCCCACCAAATTAAAAAAACAATAA-3' (SEQ ID NO: 86).
En algunas realizaciones, la mitad 5' del fragmento de intrón catalítico del Grupo I de (G) tiene por lo menos un 80% (por ejemplo, por lo menos un 85%, 90%, 95%, 97%, 99%, o 100%) de identidad de secuencia con la secuencia de 5'-AGAAATGGAGAAGGTGTAGAGACTGGAAGGCAGGCACCCTAACGTGTTAAAGGCAGGGTGA CAGTCCAGACCACAAACCAGCAAATCTGGGCAGCGAAAGCTGTAGGGTAAGCAACCCGAAGG TCAGTGGTTCAAATCCCCACCAAATTAAAAAAACAATAA-3' (SEQ ID NO: 87).
En algunas realizaciones, la mitad 3' del fragmento del intrón catalítico del grupo I de (A) tiene la secuencia de la SEQ ID NO: 86 y la mitad 5' del fragmento del intrón catalítico del grupo I de (G) tiene la secuencia de la SEQ ID NO: 87.
En algunas realizaciones, la mitad 3' del fragmento de intrón catalítico del Grupo I de (A) tiene por lo menos un 80% (por ejemplo, por lo menos un 85%, 90%, 95%, 97%, 99%, o 100%) de identidad de secuencia con la secuencia 5'-ACAACAGATAACTTACTAACTTACAGCTAGTCGGAAGGTGCAGAGACTCGACGGGAGCTACCCTAAC GTCAAGACGAGTAAAGAGTCCAATTCTCAAAGCCAATAGGCAGTAGCGAAAGCTGCGGGA GAATGAAAATCCGTAGCGTCTAAACGGTCGTGTGGGTTCAAGTCCCTCCACCCCCCCCA-3' (SEQ ID NO: 88).
En algunas realizaciones, la mitad 5' del fragmento del intrón catalítico del Grupo I de (G) tiene por lo menos un 80% (por ejemplo, por lo menos 85%, 90%, 95%, 97%, 99% o 100%) de identidad de secuencia con la secuencia de 5'-AGACGCTACGGACTTAAATAATTGAGCCTTAGAGAAGAAATTCTCTTTAAGTGGATGCTCAAACTCAG GGAAACCTAAATCTAGCTATAGACAAGGCAATCCTGAGCCAAGCCGAAGTAGATTAGTAAGTTAG TAAGTT-3' (SEQ ID NO: 89).
En algunas realizaciones, la mitad 3' del fragmento de intrón catalítico del grupo I de (A) tiene la secuencia de la SEQ ID NO: 88 y la mitad 5' del fragmento de intrón catalítico del grupo I de (G) tiene la secuencia de la SEQ ID NO: 89.
En algunas realizaciones, la mitad 3' del fragmento de intrón catalítico del Grupo I de (A) tiene por lo menos un 80% (por ejemplo, por lo menos un 85%, 90%, 95%, 97%, 99%, o 100%) de identidad de secuencia con la secuencia 5'-AACAACAGATAACTTACTAGTTACTAGTCGGAAGGTGCAGACTCGACGGGAGCTACTACCCTAACGTC AAGACGAGGGTAAAGAGAGTCCAATTCTCAAAGCCAATAGGCAGTAGCGAAAGCTGCGGGAGAA TGAAAATCCGTAGCGTCTAAACGGTCGTGTGGGTTCAAGTCCCTCCACCCCCCCA-3' (SEQ ID NO: 90).
En algunas realizaciones, la mitad 5' del fragmento del intrón catalítico del Grupo I de (G) tiene por lo menos un 80% (por ejemplo, por lo menos un 85%, 90%, 95%, 97%, 99% o 100%) de identidad de secuencia con la secuencia 5'-AGACGCTACGGACTTAAATAATTGAGCCTTAGAGAAGAAATTCTCTTTAAGTGGATGCTCAAACTCAG GGAAACCTAAATCTAGCTATAGACAAGGCAATCCTGAGCCAAGCCGAAGTAGTAATTAGTAAGTT-3' (SEQ ID NO: 91).
En algunas realizaciones, la mitad 3' del fragmento del intrón catalítico del grupo I de (A) tiene la secuencia de la SEQ ID NO: 90 y la mitad 5' del fragmento del intrón catalítico del grupo I de (G) tiene la secuencia de la SEQ ID NO: 91.
Sitios de corte y empalme
Los polirribonucleótidos descritos en la presente incluyen sitios de corte y empalme, como (B) un sitio de corte y empalme 3'; y (F) un sitio de corte y empalme 5'. El sitio de corte y empalme puede ser de un gen pre-ARNt-Leu de la cianobacteria Anabaena, un pre-ARNt de Tetrahymena, o un gen td del fago T4.
En algunas realizaciones, el sitio de corte y empalme 3' (por ejemplo, entre la mitad 3' del fragmento del intrón catalítico del Grupo I y el fragmento del exón 3' tiene la secuencia deAGAATGj AAAATC (SEQ ID NO: 34) donde la flecha denota el sitio de corte. En algunas realizaciones, el sitio de corte y empalme 5' (por ejemplo, entre el fragmento de exón 5' y la mitad 5' del fragmento de intrón catalítico del Grupo I tiene la secuencia de GGACTT jAAATAA(SEQ ID NO: 35) donde la flecha denota el sitio de corte.
En algunas realizaciones, el sitio de corte y empalme 3' (por ejemplo, entre la mitad 3' del fragmento del intrón catalítico del Grupo I y el fragmento del exón 3' tiene la secuenciat Ac Tc Gj TAAGGT (SEQ ID NO: 36) donde la flecha denota el sitio de corte. En algunas realizaciones, el sitio de corte y empalme 5' (por ejemplo, entre el fragmento de exón 5' y la mitad 5' del fragmento de intrón catalítico del Grupo I tiene la secuencia CTCTCT jAAATAG(SEQ ID NO: 37) donde la flecha denota el sitio de corte.
En algunas realizaciones, el sitio de corte y empalme 3' (por ejemplo, entre la mitad 3' del fragmento del intrón catalítico del Grupo I y el fragmento del exón 3' tiene la secuencia deAt Aa TGj CTACCG (SEQ ID NO: 38) donde la flecha denota el sitio de corte. En algunas realizaciones, el sitio de corte y empalme 5' (por ejemplo, entre el fragmento de exón 5' y la mitad 5' del fragmento de intrón catalítico del Grupo I tiene la secuencia de TTGGGT jTAATTG(SEQ ID NO: 39) donde la flecha denota el sitio de corte.
Fragmentos de exón
Los polirribonudeótidos descritos en la presente incluyen un fragmento de exón, como (C) un fragmento de exón 3'; y (E) un fragmento de exón 5'.
En algunas realizaciones, el fragmento de exón 3' de (C) tiene por lo menos un 80% (por ejemplo, por lo menos un 85%, 90%, 95%, 97%, 99% o 100%) de identidad de secuencia con la secuencia de 5'-AAAATCCGTTGACCTTAAACGGTCGTGTGGTTCAAGTCCCTCCACCCCCA-3' (SEQ ID NO: 40).
En algunas realizaciones, el fragmento de exón 3' de (C) tiene por lo menos un 80% (por ejemplo, por lo menos un 85%, 90%, 95%, 97%, 99% o 100%) de identidad de secuencia con la secuencia de 5'-AAAATCCGTAGCGTCTAAACGGTCGTGTGGTTCAAGTCCCTCCACCCCCA-3' (SEQ ID NO: 41).
En algunas realizaciones, el fragmento de exón 5' de (E) tiene por lo menos un 80% (por ejemplo, por lo menos un 85%, 90%, 95%, 97%, 99% o 100%) de identidad de secuencia con la secuencia de 5'-AGACGCTACGGACTT-3' (SEQ ID NO: 42).
En algunas realizaciones, el fragmento de exón 5' de (E) tiene por lo menos un 80% (por ejemplo, por lo menos un 85%, 90%, 95%, 97%, 99% o 100%) de identidad de secuencia con la secuencia de 5'-CGTTTAGACGCTACGGACTT-3' (SEQ ID NO: 43).
En algunas realizaciones, el fragmento de exón 5' de (E) tiene por lo menos un 80% (por ejemplo, por lo menos un 85%, 90%, 95%, 97%, 99% o 100%) de identidad de secuencia con la secuencia de 5'-ACGACCGTTTAGACGCTACGGACTT-3' (SEQ ID NO: 44).
En algunas realizaciones, el fragmento de exón 5' de (E) tiene por lo menos un 80% (por ejemplo, por lo menos un 85%, 90%, 95%, 97%, 99% o 100%) de identidad de secuencia con la secuencia de 5'-CCCACACGACCGTTTAGACGCTACGGACTT-3' (SEQ ID NO: 45).
En algunas realizaciones, el fragmento de exón 3' de (C) tiene por lo menos un 80% (por ejemplo, por lo menos un 85%, 90%, 95%, 97%, 99% o 100%) de identidad de secuencia con la secuencia de 5'- t AÁGGTÁGC-3' (SEQ ID NO: 46).
En algunas realizaciones, el fragmento de exón 3' de (C) tiene por lo menos un 80% (por ejemplo, por lo menos un 85%, 90%, 95%, 97%, 99% o 100%) de identidad de secuencia con la secuencia de 5'-TAAGGTAAATATTGC-3' (SEQ ID NO: 47).
En algunas realizaciones, el fragmento de exón 5' de (E) tiene por lo menos un 80% (por ejemplo, por lo menos un 85%, 90%, 95%, 97%, 99% o 100%) de identidad de secuencia con la secuencia de 5'- A<t>G<á>CTCTCT-3' (SEQ ID NO: 48).
En algunas realizaciones, el fragmento de exón 3' de (C) tiene por lo menos un 80% (por ejemplo, por lo menos un 85%, 90%, 95%, 97%, 99% o 100%) de identidad de secuencia con la secuencia de 5'-CTACCGTTTAATATT-3' (SEQ ID NO: 49).
En algunas realizaciones, el fragmento de exón 3' de (C) tiene por lo menos un 80% (por ejemplo, por lo menos un 85%, 90%, 95%, 97%, 99% o 100%) de identidad de secuencia con la secuencia de 5'-CTCAATTTTAATATT-3' (SEQ ID NO: 50).
En algunas realizaciones, el fragmento de exón 5' de (E) tiene por lo menos un 80% (por ejemplo, por lo menos un 85%, 90%, 95%, 97%, 99% o 100%) de identidad de secuencia con la secuencia de 5'-ATGTTTTCTTGGGT-3' (SEQ ID NO: 51).
Carga de polirribonucleótido
Una carga de polirribonucleótido descrita en la presente incluye cualquier secuencia que incluya por lo menos un polirribonucleótido. En algunas realizaciones, la carga de polirribonucleótido de (D) incluye una secuencia de expresión, una secuencia no codificante, o una secuencia de expresión y una secuencia no codificante. En algunas realizaciones, la carga de polirribonucleótido de (D) incluye una secuencia de expresión que codifica un polipéptido. En algunas realizaciones, la carga de polirribonucleótido de (D) incluye un IRE<s>enlazado operativamente a una secuencia de expresión que codifica un polipéptido. En algunas realizaciones, la carga de polirribonucleótido de (D) incluye una secuencia de expresión que codifica un polipéptido que tiene un efecto biológico en un sujeto.
Una carga de polirribonucleótido puede, por ejemplo, incluir por lo menos aproximadamente 40 nucleótidos, por lo menos aproximadamente 50 nucleótidos, por lo menos aproximadamente 75 nucleótidos, por lo menos aproximadamente 100 nucleótidos, por lo menos aproximadamente 200 nucleótidos, por lo menos aproximadamente 300 nucleótidos, por lo menos aproximadamente 400 nucleótidos, por lo menos aproximadamente 500 nucleótidos, por lo menos aproximadamente 1.000 nucleótidos, por lo menos aproximadamente 2.000 nucleótidos, por lo menos aproximadamente 5.000 nucleótidos, por lo menos aproximadamente 6,000 nucleótidos, por lo menos aproximadamente 7.000 nucleótidos, por lo menos aproximadamente 8.000 nucleótidos, por lo menos aproximadamente 9.000 nucleótidos, por lo menos aproximadamente 10.000 nucleótidos, por lo menos aproximadamente 12.000 nucleótidos, por lo menos aproximadamente 14.000 nucleótidos, por lo menos aproximadamente 15.000 nucleótidos, por lo menos aproximadamente 16.000 nucleótidos, por lo menos aproximadamente 17.000 nucleótidos, por lo menos aproximadamente 18.000 nucleótidos, por lo menos aproximadamente 19.000 nucleótidos, o por lo menos aproximadamente 20.000 nucleótidos. En algunas realizaciones, la carga de polirribonucleótido incluye de 1-20.000 nucleótidos, 1-10.000 nucleótidos, 1-5.000 nucleótidos, 100-20.000 nucleótidos, 100-10.000 nucleótidos, 100-5.000 nucleótidos, 500-20.000 nucleótidos, 500-10.000 nucleótidos, 500 5.000 nucleótidos, 1.000-20.000 nucleótidos, 1.000-10.000 nucleótidos o 1.000-5.000 nucleótidos.
En algunas realizaciones, la carga de polirribonucleótido incluye una o múltiples secuencias de expresión (o codificantes), en donde cada secuencia de expresión (o codificante) codifica un polipéptido. En algunas realizaciones, la carga de polirribonucleótido incluye una o varias secuencias no codificantes. En algunas realizaciones, la carga de polirribonucleótido consiste enteramente en secuencia o secuencias no codificantes. En algunas realizaciones, la carga de polirribonucleótido incluye una combinación de secuencias de expresión (o codificantes) y no codificantes.
En algunas realizaciones, los polirribonucleótidos elaborados como se describe en la presente se usan como efectores en terapia o agricultura. Por ejemplo, un polirribonucleótido circular elaborado por los métodos descritos en la presente (por ejemplo, los métodos sin células descritos en la presente) puede administrarse a un sujeto (por ejemplo, en una composición farmacéutica, veterinaria o agrícola). En otro ejemplo, un polirribonucleótido circular elaborado por los métodos descritos en la presente (por ejemplo, los métodos sin células descritos en la presente) puede administrarse a una célula.
En algunas realizaciones, el polirribonucleótido incluye cualquier característica, o cualquier combinación de características según se divulga en la Publicación de Patente Internacional N° WO2019/118919.
Secuencias de expresión de polipéptidos
En algunas realizaciones, el polirribonucleótido descrito en la presente (por ejemplo, la carga de polirribonucleótido del polirribonucleótido circular) incluye una o más secuencias de expresión (o codificación), en donde cada secuencia de expresión codifica un polipéptido. En algunas realizaciones, el polirribonucleótido circular incluye dos, tres, cuatro, cinco, seis, siete, ocho, nueve, diez o más secuencias de expresión (o codificación).
Cada polipéptido codificado puede ser lineal o ramificado. En diversas realizaciones, el polipéptido tiene una longitud de aproximadamente 5 a aproximadamente 40.000 aminoácidos, de aproximadamente 15 a aproximadamente 35.000 aminoácidos, de aproximadamente 20 a aproximadamente 30.000 aminoácidos, de aproximadamente 25 a aproximadamente 25.000 aminoácidos, de aproximadamente 50 a aproximadamente 20.000 aminoácidos, de aproximadamente 100 a aproximadamente 15.000 aminoácidos, de aproximadamente 200 a aproximadamente 10.000 aminoácidos, de aproximadamente 500 a aproximadamente 5.000 aminoácidos, de aproximadamente 1.000 a aproximadamente 2.500 aminoácidos, o cualquier intervalo entre los mismos. En algunas realizaciones, el polipéptido tiene una longitud de menos de aproximadamente 40.000 aminoácidos, menos de aproximadamente 35.000 aminoácidos, menos de aproximadamente 30.000 aminoácidos, menos de aproximadamente 25.000 aminoácidos, menos de aproximadamente 20.000 aminoácidos, menos de aproximadamente 15.000 aminoácidos, menos de aproximadamente 10.000 aminoácidos, menos de aproximadamente 9.000 aminoácidos, menos de aproximadamente 8.000 aminoácidos, menos de aproximadamente 7.000 aminoácidos, menos de aproximadamente 6.000 aminoácidos, menos de aproximadamente 5.000 aminoácidos, menos de aproximadamente 4.000 aminoácidos, menos de aproximadamente 3.000 aminoácidos, menos de aproximadamente 2.500 aminoácidos, menos de aproximadamente 2.000 aminoácidos, menos de aproximadamente 1.500 aminoácidos, menos de aproximadamente 1.000 aminoácidos, menos de aproximadamente 900 aminoácidos, menos de aproximadamente 800 aminoácidos, menos de aproximadamente 700 aminoácidos, menos de aproximadamente 600 aminoácidos, menos de aproximadamente 500 aminoácidos, menos de aproximadamente 400 aminoácidos, menos de aproximadamente 300 aminoácidos, o menos pueden ser útiles.
Los polipéptidos incluidos en la presente pueden ser polipéptidos de origen natural o polipéptidos de origen no natural. En algunas realizaciones, el polipéptido es o incluye un fragmento o variante funcional de un polipéptido de referencia (por ejemplo, un fragmento o variante enzimáticamente activo de una enzima). Por ejemplo, el polipéptido puede ser una variante funcionalmente activa de cualquiera de los polipéptidos descritos en la presente con por lo menos un 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, o 99% de identidad, por ejemplo, en una región específica o en toda la secuencia, con una secuencia de un polipéptido descrito en la presente o un polipéptido de origen natural. En algunos casos, el polipéptido puede tener por lo menos un 50% (por ejemplo, por lo menos un 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 97%, 99% o más) de identidad con una proteína de interés.
Algunos ejemplos de polipéptido incluyen, entre otros, una etiqueta o marcador fluorescente, un antígeno, un polipéptido terapéutico o un polipéptido para aplicaciones agrícolas.
Un polipéptido terapéutico puede ser una hormona, un neurotransmisor, un factor de crecimiento, una enzima (por ejemplo, oxidorreductasa, enzima metabólica, enzima mitocondrial, oxigenasa, deshidrogenasa, enzima independiente de ATP, enzima lisosomal, desaturasa), una citoquina, un polipéptido de unión a antígeno (por ejemplo, anticuerpo de unión a antígeno o fragmentos similares a anticuerpos, como anticuerpos de cadena sencilla, nanocuerpos u otros polipéptidos que contienen cadena pesada o ligera de Ig), una proteína de fusión Fc, un anticoagulante, un factor sanguíneo, una proteína morfogenética ósea, un interferón, una interleucina y un trombolítico.
Un polipéptido para aplicaciones agrícolas puede ser una bacteriocina, una lisina, un polipéptido antimicrobiano, un polipéptido antifúngico, un péptido rico en C de nódulos, un péptido regulador de bacteriocitos, una toxina peptídica, un polipéptido pesticida (por ejemplo, un polipéptido insecticida o un polipéptido nematocida), un polipéptido de unión a antígeno (por ejemplo, anticuerpo de unión a antígeno o fragmentos similares a anticuerpos, como anticuerpos de cadena sencilla, nanocuerpos u otros polipéptidos que contienen cadenas pesadas o ligeras de Ig), una enzima (por ejemplo, nucleasa, amilasa, celulasa, peptidasa, lipasa, quitinasa), una feromona peptídica y un factor de transcripción.
En algunos casos, el polirribonucleótido circular expresa una proteína no humana.
En algunas realizaciones, el polirribonucleótido circular expresa un anticuerpo, por ejemplo, un fragmento de anticuerpo, o una porción del mismo. En algunas realizaciones, el anticuerpo expresado por el polirribonucleótido circular puede ser de cualquier isotipo, como IgA, IgD, IgE, IgG, IgM. En algunas realizaciones, el polirribonucleótido circular expresa una porción de un anticuerpo, como una cadena ligera, una cadena pesada, un fragmento Fc, una CDR (región determinante de la complementariedad), un fragmento Fv, o un fragmento Fab, otra porción del mismo. En algunas realizaciones, el polirribonucleótido circular expresa una o más porciones de un anticuerpo. Por ejemplo, el polirribonucleótido circular puede incluir más de una secuencia de expresión (o codificante), cada una de las cuales expresa una porción de un anticuerpo, y la suma de las cuales puede constituir el anticuerpo. En algunos casos, el polirribonucleótido circular incluye una secuencia de expresión que codifica la cadena pesada de un anticuerpo, y otra secuencia de expresión que codifica la cadena ligera del anticuerpo. En algunos casos, cuando el polirribonucleótido circular se expresa en una célula o en un entorno libre de células, la cadena ligera y la cadena pesada pueden someterse a una modificación, plegamiento u otra modificación postraducción apropiados para formar un anticuerpo funcional.
En algunas realizaciones, los polipéptidos incluyen múltiples polipéptidos, por ejemplo, múltiples copias de una secuencia polipeptídica, o múltiples secuencias polipeptídicas diferentes. En algunas realizaciones, los polipéptidos múltiples están conectados por aminoácidos conectores o aminoácidos espaciadores.
En algunas realizaciones, la carga de polinucleótidos incluye una secuencia que codifica un péptido señal. Se han descrito muchas secuencias de péptidos señal, por ejemplo, la secuencia señal Tat (translocación de argininas gemelas es típicamente una secuencia de péptido N-terminal que contiene un motivo consenso SRRxFLK "arginina gemela", que sirve para translocar una proteína plegada que contiene tal péptido señal Tat a través de una bicapa lipídica. Véase también, por ejemplo, la base de datos de péptidos señal disponible públicamente en www[dot]signalpeptide[dot]de. Los péptidos señal también son útiles para dirigir una proteína a orgánulos específicos; véanse, por ejemplo, los péptidos señal determinados experimentalmente y predichos computacionalmente divulgados en la base de datos de péptidos señal Spdb, disponible públicamente en proline[dot]bic[dot]nus[dot]edu[dot]sg/spdb.
En algunas realizaciones, la carga de polinucleótidos incluye una secuencia que codifica un péptido penetrante de células (CPP). Se han descrito cientos de secuencias de CPP; véase, por ejemplo, la base de datos de péptidos penetrantes de células, CPPsite, disponible públicamente en crdd[dot]osdd[dot]net/raghava/cppsite/. Un ejemplo de secuencia CPP usada comúnmente es una secuencia de poli-arginina, por ejemplo, octoarginina o nonoarginina, que puede fusionarse con el extremo C-terminal del péptido CGI.
En algunas realizaciones, la carga de polinucleótidos incluye una secuencia que codifica un péptido autoensamblable; véase, por ejemplo, Miki et al. (2021) Nature Communications, 21:3412, DOI: 10.1038/s41467-021-23794-6.
En algunas realizaciones, la secuencia de expresión (o codificante) incluye una secuencia poli-A (por ejemplo, en el extremo 3' de una secuencia de expresión). En algunas realizaciones, la longitud de una secuencia poli-A tiene más de 10 nucleótidos de longitud. En una realización, la secuencia poli-A tiene más de 15 nucleótidos de longitud (por ejemplo, por lo menos o más de aproximadamente 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 70, 80, 90, 100, 120, 140, 160, 180, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 600, 700, 800, 900, 1.000, 1.100, 1.200, 1.300, 1.400, 1.500, 1.600, 1.700, 1.800, 1.900, 2.000, 2.500 y 3.000 nucleótidos). En algunas realizaciones, la secuencia poli-A se diseña de acuerdo con las descripciones de la secuencia poli-A en [0202]-[0204] de la Publicación de Patente Internacional N° WO2019/118919A1. En algunas realizaciones, la secuencia de expresión carece de una secuencia poli-A (por ejemplo, en el extremo 3' de una secuencia de expresión).
En algunas realizaciones, un polirribonucleótido circular incluye un poliA, carece de un poliA o tiene un poliA modificado para modular una o más características del polirribonucleótido circular. En algunas realizaciones, el polirribonucleótido circular que carece de un poliA o que tiene un poliA modificado mejora una o más características funcionales, por ejemplo, la inmunogenicidad (por ejemplo, el nivel de uno o más marcadores de una respuesta inmunitaria o inflamatoria), la semivida y/o la eficacia de expresión.
Polipéptidos terapéuticos
En algunas realizaciones, el polirribonucleótido circular descrito en la presente (por ejemplo, la carga de polirribonucleótido del polirribonucleótido circular) incluye por lo menos una secuencia de expresión que codifica un polipéptido terapéutico. Un polipéptido terapéutico es un polipéptido que cuando se administra a un sujeto o se expresa en un sujeto proporciona algún beneficio terapéutico. La administración a un sujeto o la expresión en un sujeto de un polipéptido terapéutico puede usarse para tratar o prevenir una enfermedad, trastorno o afección o un síntoma de los mismos. En algunas realizaciones, el polirribonucleótido circular codifica dos, tres, cuatro, cinco, seis, siete, ocho, nueve, diez o más polipéptidos terapéuticos.
En algunas realizaciones, el polirribonucleótido circular incluye una secuencia de expresión que codifica una proteína terapéutica. La proteína puede tratar la enfermedad en el sujeto que la necesita. En algunas realizaciones, la proteína terapéutica puede compensar una proteína mutada, infraexpresada o ausente en el sujeto que la necesita. En algunas realizaciones, la proteína terapéutica puede dirigirse, interactuar o unirse a una célula, tejido o virus en el sujeto que la necesita.
Un polipéptido terapéutico puede ser un polipéptido que puede ser secretado por una célula, o estar localizado en el citoplasma, núcleo o compartimento de membrana de una célula.
Un polipéptido terapéutico puede ser una hormona, un neurotransmisor, un factor de crecimiento, una enzima (por ejemplo, oxidorreductasa, enzima metabólica, enzima mitocondrial, oxigenasa, deshidrogenasa, enzima independiente de ATP, enzima lisosomal, desaturasa), una citoquina, un factor de transcripción, un polipéptido de unión a antígeno (por ejemplo, anticuerpo de unión a antígeno o fragmentos similares a anticuerpos, como anticuerpos de cadena sencilla, nanocuerpos u otros polipéptidos que contienen cadenas pesadas o ligeras de Ig), una proteína de fusión Fc, un anticoagulante, un factor sanguíneo, una proteína morfogenética ósea, un interferón, una interleucina, un trombolítico, un antígeno (por ejemplo, un antígeno tumoral, vírico o bacteriano), una nucleasa (por ejemplo, una endonucleasa como una proteína Cas, por ejemplo, Cas9), una proteína de membrana (por ejemplo, un receptor de antígeno quimérico (CAR), un receptor transmembrana, un receptor acoplado a proteína G (GPCR), un receptor de tirosina quinasa (RTK), un receptor de antígeno, un canal iónico o un transportador de membrana), una proteína secretada, una proteína de edición de genes (por ejemplo, una CRISPR-Cas, TALEN o dedo de zinc) o una proteína de escritura de genes (véase, por ejemplo, la Publicación de Patente Internacional N° WO2020/047124).
En algunas realizaciones, el polipéptido terapéutico es un anticuerpo, por ejemplo, un anticuerpo de longitud completa, un fragmento de anticuerpo o una porción del mismo. En algunas realizaciones, el anticuerpo expresado por el polirribonucleótido circular puede ser de cualquier isotipo, como de IgA, IgD, IgE, IgG, IgM. En algunas realizaciones, el polirribonucleótido circular expresa una porción de un anticuerpo, como una cadena ligera, una cadena pesada, un fragmento Fc, una CDR (región determinante de la complementariedad), un fragmento Fv, o un fragmento Fab, una porción adicional del mismo. En algunas realizaciones, el polirribonucleótido circular expresa una o más porciones de un anticuerpo. Por ejemplo, el polirribonucleótido circular puede incluir más de una secuencia de expresión, cada una de las cuales expresa una porción de un anticuerpo, y la suma de las cuales puede constituir el anticuerpo. En algunos casos, el polirribonucleótido circular incluye una secuencia de expresión que codifica la cadena pesada de un anticuerpo, y otra secuencia de expresión que codifica la cadena ligera del anticuerpo. Cuando el polirribonucleótido circular se expresa en una célula, la cadena ligera y la cadena pesada pueden someterse a una modificación, plegamiento u otra modificación postraducción apropiados para formar un anticuerpo funcional.
En algunas realizaciones, los polirribonucleótidos circulares elaborados como se describe en la presente se usan como efectores en terapia o agricultura. Por ejemplo, un polirribonucleótido circular elaborado por los métodos descritos en la presente (por ejemplo, los métodos libres de células descritos en la presente) puede administrarse a un sujeto (por ejemplo, en una composición farmacéutica, veterinaria o agrícola). En algunas realizaciones, el sujeto es un animal vertebrado (por ejemplo, mamífero, ave, pez, reptil o anfibio). En algunas realizaciones, el sujeto es un ser humano. En algunas realizaciones, el sujeto del método es un mamífero no humano. En algunas realizaciones, el sujeto es un mamífero no humano, como un primate no humano (por ejemplo, monos, simios), un ungulado (por ejemplo, vacuno, búfalo, oveja, cabra, cerdo, camello, llama, alpaca, ciervo, caballo, burro), carnívoro (por ejemplo, perro, gato), roedor (por ejemplo, rata, ratón) o lagomorfo (por ejemplo, conejo). En algunas realizaciones, el sujeto es un ave, como un miembro de los taxones aviares Galliformes (por ejemplo, pollos, pavos, faisanes, codornices), Anseriformes (por ejemplo, patos, gansos), Paleaognathae (por ejemplo, avestruces, emúes), Columbiformes (por ejemplo, palomos, palomas) o Psittaciformes (por ejemplo, loros). En algunas realizaciones, el sujeto es un invertebrado, como un artrópodo (por ejemplo, insectos, arácnidos, crustáceos), un nematodo, un anélido, un helminto o un molusco. En algunas realizaciones, el sujeto es una plaga agrícola invertebrada o un invertebrado parásito de un huésped invertebrado o vertebrado. En algunas realizaciones, el sujeto es una planta, como una planta angiosperma (que puede ser dicotiledónea o monocotiledónea) o una planta gimnosperma (por ejemplo, una conífera, una cicadácea, un gnetófito, un Ginkgo), un helecho, una cola de caballo, un musgo o un briofito. En algunas realizaciones, el sujeto es un alga eucariota (unicelular o pluricelular). En algunas realizaciones, el sujeto es una planta de importancia agrícola u hortícola, como plantas de cultivo en hilera, plantas y árboles frutales, hortalizas, árboles y plantas ornamentales, incluyendo flores ornamentales, arbustos, árboles, plantas tapizantes y céspedes.
Efectores polipeptídicos secretados
En algunas realizaciones, el polirribonucleótido circular descrito en la presente (por ejemplo, la carga de polirribonucleótido del polirribonucleótido circular) incluye por lo menos una secuencia codificante que codifica un efector polipeptídico secretado. Los efectores polipeptídicos secretados o proteínas ejemplares que pueden expresarse incluyen, por ejemplo, citoquinas y receptores de citoquinas, hormonas polipeptídicas y receptores, factores de crecimiento, factores de coagulación, enzimas terapéuticas de sustitución y efectores terapéuticos no enzimáticos, factores de regeneración, reparación y fibrosis, factores de transformación y proteínas que estimulan la regeneración celular, ejemplos no limitativos de los cuales se describen en la presente, por ejemplo, en las tablas siguientes.
Citoquinas y receptores de citoquinas
En algunas realizaciones, un efector descrito en la presente comprende una citoquina de la Tabla 1, o una variante funcional o fragmento de la misma, por ejemplo, una proteína que tiene por lo menos un 80%, 85%, 90%, 95%, 967%, 98%, 99% de identidad con una secuencia de proteína descrita en la Tabla 1 por referencia a su ID de UniProt. En algunas realizaciones, la variante funcional se une al receptor de citoquina correspondiente con una Kd de no más del 10%, 20%, 30%, 40% o 50% mayor o menor que la Kd de la citoquina de tipo salvaje correspondiente para el mismo receptor en las mismas condiciones. En algunas realizaciones, el efector comprende una proteína de fusión que comprende una primera región (por ejemplo, un polipéptido de citoquina de la Tabla 1 o una variante funcional o fragmento del mismo) y una segunda región heteróloga. En algunas realizaciones, la primera región es un primer polipéptido de citoquina de la Tabla 1. En algunas realizaciones, la segunda región es un segundo polipéptido de citoquina de la Tabla 1, en donde el primer y el segundo polipéptidos de citoquina forman un heterodímero de citoquina entre ellos en una célula de tipo salvaje. En algunas realizaciones, el polipéptido de la Tabla 1 o variante funcional del mismo comprende una secuencia señal, por ejemplo, una secuencia señal que es endógena al efector, o una secuencia señal heteróloga.
En algunas realizaciones, un efector descrito en la presente comprende un anticuerpo o fragmento del mismo que se une a una citoquina de la Tabla 1. En algunas realizaciones, la molécula de anticuerpo comprende una secuencia señal.
T l 1. i in r r i in m l r
continuación
Hormonas polipeptídicas y receptores
En algunas realizaciones, un efector descrito en la presente comprende una hormona de la Tabla 2, o una variante funcional de la misma, por ejemplo, una proteína que tiene por lo menos un 80%, 85%, 90%, 95%, 967%, 98%, 99% de identidad con una secuencia de proteína divulgada en la Tabla 2 por referencia a su ID de UniProt. En algunas realizaciones, la variante funcional se une al receptor correspondiente con una Kd de no más del 10%, 20%, 30%, 40% o 50% mayor que la Kd de la hormona de tipo salvaje correspondiente para el mismo receptor en las mismas condiciones. En algunas realizaciones, el polipéptido de la Tabla 2 o la variante funcional del mismo comprende una secuencia señal, por ejemplo, una secuencia señal que es endógena al efector, o una secuencia señal heteróloga.
En algunas realizaciones, un efector descrito en la presente comprende una molécula de anticuerpo (por ejemplo, un scFv) que se une a una hormona de la Tabla 2. En algunas realizaciones, un efector descrito en la presente comprende una molécula de anticuerpo (por ejemplo, un scFv) que se une a un receptor hormonal de la Tabla 2. En algunas realizaciones, la molécula de anticuerpo comprende una secuencia señal.
Factores de crecimiento
En algunas realizaciones, un efector descrito en la presente comprende un factor de crecimiento de la Tabla 3, o una variante funcional del mismo, por ejemplo, una proteína que tiene por lo menos un 80%, 85%, 90%, 95%, 967%, 98%, 99% de identidad con una secuencia de proteína divulgada en la Tabla 3 por referencia a su ID de UniProt. En algunas realizaciones, la variante funcional se une al receptor correspondiente con una Kd de no más del 10%, 20%, 30%, 40% o 50% mayor que la Kd del factor de crecimiento de tipo salvaje correspondiente para el mismo receptor en las mismas condiciones. En algunas realizaciones, el polipéptido de la Tabla 3 o la variante funcional del mismo comprende una secuencia señal, por ejemplo, una secuencia señal que es endógena al efector, o una secuencia señal heteróloga.
En algunas realizaciones, un efector descrito en la presente comprende un anticuerpo o fragmento del mismo que se une a un factor de crecimiento de la Tabla 3. En algunas realizaciones, un efector descrito en la presente comprende una molécula de anticuerpo (por ejemplo, un scFv) que se une a un receptor de factor de crecimiento de la Tabla 3. En algunas realizaciones, la molécula de anticuerpo comprende una secuencia señal.
T l . F r r imi n m l r
continuación
Factores de coagulación
En algunas realizaciones, un efector descrito en la presente comprende un polipéptido de la Tabla 4, o una variante funcional del mismo, por ejemplo, una proteína que tiene por lo menos un 80%, 85%, 90%, 95%, 967%, 98%, 99% de identidad con una secuencia de proteína divulgada en la Tabla 4 por referencia a su ID de UniProt. En algunas realizaciones, la variante funcional cataliza la misma reacción que la proteína de tipo salvaje correspondiente, por ejemplo, a una velocidad de no menos del 10%, 20%, 30%, 40% o 50% menor o superior a la de la proteína de tipo salvaje. En algunas realizaciones, el polipéptido de la Tabla 4 o variante funcional del mismo comprende una secuencia señal, por ejemplo, una secuencia señal que es endógena al efector, o una secuencia señal heteróloga.
Tabla 4. Factores asociados a la coa ulación
Enzimas terapéuticas de sustitución
En algunas realizaciones, un efector descrito en la presente comprende una enzima de la Tabla 5, o una variante funcional de la misma, por ejemplo, una proteína que tiene por lo menos un 80%, 85%, 90%, 95%, 967%, 98%, 99% de identidad con una secuencia de proteína divulgada en la Tabla 5 por referencia a su ID de UniProt. En algunas realizaciones, la variante funcional cataliza la misma reacción que la proteína de tipo salvaje correspondiente, por ejemplo, a una velocidad de no menos o no más del 10%, 20%, 30%, 40% o 50% menor a la de la proteína de tipo salvaje.
continuación
continuación
continuación
Otros efectores no enzimáticos
En algunas realizaciones, un polipéptido terapéutico descrito en la presente comprende un polipéptido de la Tabla 6, o una variante funcional del mismo, por ejemplo, una proteína que tiene por lo menos un 80%, 85%, 90%, 95%, 967%, 98%, 99% de identidad con una secuencia de proteína divulgada en la Tabla 6 por referencia a su ID de UniProt.
T l . Ef r n nzim i m l r in i i n rr n i n
continuación
Factores de regeneración, reparación y fibrosis
Los polipéptidos terapéuticos descritos en la presente también incluyen factores de crecimiento, por ejemplo, como se divulga en la Tabla 7, o variantes funcionales de los mismos, por ejemplo, una proteína que tenga por lo menos un 80%, 85%, 90%, 95%, 967%, 98%, 99% de identidad con una secuencia de proteína divulgada en la Tabla 7 por referencia a su número de acceso de proteína NCBI. También se incluyen anticuerpos o fragmentos de los mismos contra dichos factores de crecimiento, o miARN que promueven la regeneración y reparación.
Tabla 7. Factores eem lares de re eneración re aración fibrosis
. . .
1 Secuencia disponible en el sitio web "ncbi.nlm.nih.gov/gene" (Maglott D, et al. Gene: a gene-centered information resource at Nc Bi. Nucleic Acids Res.2014. Pii: gku1055.)
<2 Secuencia disponible en el sitio de internet de la red mundial "ncbi.nlm.nih.gov/protein>r
Factores de transformación
Los polipéptidos terapéuticos descritos en la presente también incluyen factores de transformación, por ejemplo, factores proteicos que transforman los fibroblastos en células diferenciadas, por ejemplo, factores divulgados en la Tabla 8 o variantes funcionales de los mismos, por ejemplo, una proteína que tenga por lo menos un 80%, 85%, 90%, 95%, 967%, 98%, 99% de identidad con una secuencia proteica divulgada en la Tabla 8 por referencia a su ID de UniProt.
T l : P li i in i r l r r i n r n m i n l r n f rm i n fi r l
Proteínas que estimulan la regeneración celular
Los polipéptidos terapéuticos descritos en la presente también incluyen proteínas que estimulan la regeneración celular, por ejemplo, proteínas divulgadas en la Tabla 9 o variantes funcionales de las mismas, por ejemplo, una proteína que tenga por lo menos un 80%, 85%, 90%, 95%, 967%, 98%, 99% de identidad con una secuencia proteica divulgada en la Tabla 9 por referencia a su ID de UniProt.
c o n t in u a c ió n ____________________________
a l. G e n e : a g e n e -c e n te re
<g o v /p ro te in>r________
E n a lg u n a s re a liz a c io n e s , e l p o lir r ib o n u c le ó tid o c ir c u la r c o m p re n d e u n a o m á s s e c u e n c ia s d e e x p re s ió n<( s e c u e n c ia s c o d if ic a n te s ) y e s tá c o n f ig u ra d o p a ra la e x p re s ió n p e rs is te n te e n u n a c é lu la d e un s u je to>in vivo.<En>a lg u n a s re a liz a c io n e s , e l p o lir r ib o n u c le ó tid o c ir c u la r e s tá c o n f ig u ra d o p a ra q u e la e x p re s ió n d e u n a o m á s s e c u e n c ia s d e e x p re s ió n e n la c é lu la e n un m o m e n to p o s te r io r s e a ig u a l o m a y o r q u e e n un m o m e n to a n te r io r . E n ta le s re a liz a c io n e s , la e x p re s ió n d e la u n a o m á s s e c u e n c ia s d e e x p re s ió n p u e d e m a n te n e rs e a un n iv e l re la t iv a m e n te e s ta b le o p u e d e a u m e n ta r c o n e l t ie m p o . L a e x p re s ió n d e la s s e c u e n c ia s d e e x p re s ió n p u e d e s e r re la t iv a m e n te e s ta b le d u ra n te un p e r io d o d e t ie m p o p ro lo n g a d o . P o r e je m p lo , e n a lg u n o s c a s o s , la e x p re s ió n d e la u n a o m á s s e c u e n c ia s d e e x p re s ió n e n la c é lu la d u ra n te un p e r io d o d e t ie m p o d e p o r lo m e n o s 7, 8, 9, 10, 12, 14, 16, 18, 20 , 22 , 23 o m á s d ía s n o d is m in u y e e n un 50 % , 45 % , 40 % , 35 % , 30 % , 25 % , 20 % , 15 % , 10 % o 5 % . E n a lg u n o s c a s o s , e n a lg u n o s c a s o s , la e x p re s ió n d e la u n a o m á s s e c u e n c ia s d e e x p re s ió n e n la c é lu la s e m a n t ie n e a un n iv e l q u e n o v a r ía e n m á s d e l 50 % , 45 % , 40 % , 35 % , 30 % , 25 % , 20 % , 15 % , 10% , o 5 % d u ra n te p o r lo m e n o s 7, 8, 9, 10, 12, 14, 16, 18, 20 , 22 , 23 o m á s d ía s .
Polipéptidos modificadores de plantas
E n a lg u n a s re a liz a c io n e s , e l p o lir r ib o n u c le ó tid o d e s c r ito en la p re s e n te (p o r e je m p lo , la c a rg a de p o lir r ib o n u c le ó tid o d e l p o lir r ib o n u c le ó tid o ) in c lu y e p o r lo m e n o s u n a s e c u e n c ia d e e x p re s ió n q u e c o d if ic a un p o lip é p tid o m o d if ic a d o r d e p la n ta s . U n p o lip é p tid o m o d if ic a d o r d e p la n ta s s e re f ie re a un p o lip é p tid o q u e p u e d e a lte ra r las p ro p ie d a d e s g e n é t ic a s (p o r e je m p lo , a u m e n ta r la e x p re s ió n g é n ic a , d is m in u ir la e x p re s ió n g é n ic a , o a lte ra r d e o tro m o d o la s e c u e n c ia n u c le o tíd ic a d e A D N o A R N ), la s p ro p ie d a d e s e p ig e n é t ic a s , o la s p ro p ie d a d e s f is io ló g ic a s o b io q u ím ic a s d e u n a p la n ta d e m a n e ra q u e s e p ro d u z c a un c a m b io e n la f is io lo g ía o fe n o t ip o d e la p la n ta , p o r e je m p lo , un a u m e n to o d is m in u c ió n d e la a p t itu d d e la p la n ta . E n a lg u n a s re a liz a c io n e s , e l p o lir r ib o n u c le ó tid o c o d if ic a d o s , tre s , c u a tro , c in c o , se is , s ie te , o c h o , n u e v e , d ie z o m á s p o lip é p tid o s m o d if ic a d o re s d e p la n ta s d ife re n te s , o m ú lt ip le s c o p ia s d e u n o o m á s p o lip é p tid o s m o d if ic a d o re s d e p la n ta s . U n p o lip é p tid o m o d if ic a d o r d e p la n ta s p u e d e c a m b ia r la f is io lo g ía o e l fe n o tip o , o a u m e n ta r o d is m in u ir la a p t itu d d e u n a v a r ie d a d d e p la n ta s , o p u e d e s e r u n o q u e e fe c tú e d ic h o c a m b io o c a m b io s e n u n a o m á s p la n ta s e s p e c íf ic a s (p o r e je m p lo , u n a e s p e c ie o g é n e ro e s p e c íf ic o d e p la n ta s ) .
E je m p lo s d e p o lip é p tid o s q u e p u e d e n u s a rs e en la p re s e n te p u e d e n in c lu ir u n a e n z im a (p o r e je m p lo , u n a re c o m b in a s a m e ta b ó lic a , u n a h e lic a s a , u n a in te g ra s a , u n a A R N a s a , u n a A D N a s a o u n a p ro te ín a d e u b iq u it in a c ió n ) , u n a p ro te ín a fo rm a d o ra d e p o ro s , un lig a n d o d e s e ñ a liz a c ió n , un p é p tid o d e p e n e tra c ió n c e lu la r, un fa c to r d e tra n s c r ip c ió n , un re c e p to r , un a n t ic u e rp o , un n a n o c u e rp o , u n a p ro te ín a d e e d ic ió n d e g e n e s (p o r e je m p lo , C R IS P R -C a s , T A L E N o d e d o d e z in c ) , u n a r ib o p ro te ín a , un a p tá m e ro p ro te ic o o u n a c h a p e ro n a .
Polipéptidos agrícolas
E n a lg u n a s re a liz a c io n e s , e l p o lir r ib o n u c le ó tid o d e s c r ito en la p re s e n te (p o r e je m p lo , la c a rg a de p o lir r ib o n u c le ó tid o d e l p o lir r ib o n u c le ó tid o ) in c lu y e p o r lo m e n o s u n a s e c u e n c ia d e e x p re s ió n q u e c o d if ic a un p o lip é p tid o a g ríc o la . U n p o lip é p tid o a g r íc o la e s un p o lip é p tid o a d e c u a d o p a ra un u s o a g ríc o la . En a lg u n a s re a liz a c io n e s , un p o lip é p tid o a g r íc o la s e a p lic a a u n a p la n ta o s e m illa (p o r e je m p lo , m e d ia n te p u lv e r iz a c ió n fo lia r , e s p o lv o re a d o , in y e c c ió n o re c u b r im ie n to d e s e m illa s ) o a l e n to rn o d e la p la n ta (p o r e je m p lo , m e d ia n te e m p a p a d o d e l s u e lo o a p lic a c ió n g ra n u la r a l s u e lo ), d a n d o c o m o re s u lta d o u n a a lte ra c ió n d e la f is io lo g ía , fe n o t ip o o a p t itu d d e la p la n ta . L a s re a liz a c io n e s d e un p o lip é p tid o a g r íc o la in c lu y e n p o lip é p tid o s q u e a lte ra n un n ive l, la a c t iv id a d o e l m e ta b o lis m o d e u n o o m á s m ic ro o rg a n is m o s re s id e n te s e n o s o b re u n a p la n ta o a n im a l n o h u m a n o h u é s p e d , a lte ra c ió n q u e re s u lta en un a u m e n to d e la a p t itu d d e l h u é s p e d . E n a lg u n a s re a liz a c io n e s , e l p o lip é p tid o a g r íc o la e s un p o lip é p tid o v e g e ta l. En a lg u n a s re a liz a c io n e s , e l p o lip é p tid o a g r íc o la e s un p o lip é p tid o d e in s e c to . E n a lg u n a s re a liz a c io n e s , e l p o lip é p tid o a g r íc o la t ie n e un e fe c to b io ló g ic o c u a n d o e n tra e n c o n ta c to co n un a n im a l v e r te b ra d o n o h u m a n o , un a n im a l in v e r te b ra d o , un m ic ro b io o u n a c é lu la v e g e ta l.
E n a lg u n a s re a liz a c io n e s , e l p o lir r ib o n u c le ó tid o c o d if ic a d o s , t re s , c u a tro , c in c o , s e is , s ie te , o c h o , n u e v e , d ie z o m á s p o lip é p tid o s a g ríc o la s , o m ú lt ip le s c o p ia s d e u n o o m á s p o lip é p tid o s a g ríc o la s .
L a s re a liz a c io n e s d e p o lip é p tid o s ú tile s e n a p lic a c io n e s a g ríc o la s in c lu y e n , p o r e je m p lo , b a c te r io c in a s , lis in a s , p é p tid o s a n t im ic ro b ia n o s , p é p tid o s r ic o s e n n ó d u lo s C y p é p tid o s re g u la d o re s d e b a c te r io c ito s . T a le s p o lip é p tid o s p u e d e n u s a rs e p a ra a lte ra r e l n ive l, la a c t iv id a d o e l m e ta b o lis m o d e m ic ro o rg a n is m o s d ia n a p a ra a u m e n ta r la a p titu d d e lo s in s e c to s , c o m o la s a b e ja s y lo s g u s a n o s d e s e d a . L a s re a liz a c io n e s d e p o lip é p tid o s ú tile s p a ra la a g r ic u ltu ra in c lu y e n to x in a s p e p tíd ic a s , c o m o la s p ro d u c id a s d e m a n e ra n a tu ra l p o r b a c te r ia s e n to m o p a tó g e n a s (p o r e je m p lo , B a c il lu s th u r in g ie n s is , P h o to rh a b d u s lu m in e s c e n s , S e r ra t ia e n to m o p h ila o X e n o rh a b d u s n e m a to p h ila ) , c o m o s e c o n o c e e n la té c n ic a . L a s re a liz a c io n e s d e p o lip é p tid o s d e u t ilid a d a g r íc o la in c lu y e n p o lip é p tid o s ( in c lu y e n d o p é p tid o s p e q u e ñ o s c o m o c ic lo d ip é p t id o s o d ik e to p ip e ra z in a s ) p a ra c o n tro la r p la g a s o p a tó g e n o s d e im p o r ta n c ia a g r íc o la , p o r ejemplo polipéptidos antimicrobianos o polipéptidos antifúngicos para controlar enfermedades en plantas, o polipéptidos pesticidas (por ejemplo, polipéptidos insecticidas o polipéptidos nematicidas) para controlar plagas de invertebrados como insectos o nematodos. Las realizaciones de polipéptidos de utilidad agrícola incluyen anticuerpos, nanocuerpos y fragmentos de los mismos, por ejemplo, fragmentos de anticuerpos o nanocuerpos que retienen por lo menos parte (por ejemplo, por lo menos el 10%) de la actividad de unión específica del anticuerpo o nanocuerpo intacto. Las realizaciones de polipéptidos de utilidad agrícola incluyen factores de transcripción, por ejemplo, factores de transcripción de plantas; véase, por ejemplo, la base de datos "AtTFDB" que enumera las familias de factores de transcripción identificadas en la planta modelo Arabidopsis thaliana), disponible públicamente en agrisknowledgebase[dot]org/AtTFDB/. Las realizaciones de polipéptidos de utilidad agrícola incluyen nucleasas, por ejemplo, exonucleasas o endonucleasas (por ejemplo, nucleasas Cas como Cas9 o Cas12a). Las realizaciones de polipéptidos de utilidad agrícola incluyen además péptidos de penetración celular, enzimas (por ejemplo, amilasas, celulasas, peptidasas, lipasas, quitinasas), feromonas peptídicas (por ejemplo, feromonas de apareamiento de levaduras, feromonas de señalización reproductiva y larvaria de invertebrados, véase, por ejemplo, Altstein (2004) Peptides, 25:1373-1376).
Sitios de entrada ribosómica interna
En algunas realizaciones, el polirribonucleótido descrito en la presente (por ejemplo, la carga de polirribonucleótido del polirribonucleótido) incluye uno o más elementos de sitio de entrada de ribosoma interno (IRES).
En algunas realizaciones, el IRES está enlazado operativamente a una o más secuencias de expresión (por ejemplo, cada IRES está enlazado operativamente a una o más secuencias de expresión). En algunas realizaciones, el IRES está situado entre un promotor heterólogo y el extremo 5' de una secuencia codificante.
Un elemento IRES adecuado para incluir en un polirribonucleótido incluye una secuencia de ARN capaz de acoplarse con un ribosoma eucariota. En algunas realizaciones, el elemento IRES tiene por lo menos aproximadamente 5 nt, por lo menos aproximadamente 8 nt, por lo menos aproximadamente 9 nt, por lo m aproximadamente 10 nt, por lo menos aproximadamente 15 nt, por lo menos aproximadamente 20 nt, por lo menos aproximadamente 25 nt, por lo menos aproximadamente 30 nt, por lo menos aproximadamente 40 nt, por lo menos aproximadamente 50 nt, por lo menos aproximadamente 100 nt, por lo menos aproximadamente 200 nt, por lo menos aproximadamente 250 nt, por lo menos aproximadamente 350 nt, o por lo menos aproximadamente 500 nt.
En algunas realizaciones, el elemento IRES se deriva del ADN de un organismo que incluye, entre otros, un virus, un mamífero y una Drosophila. Dicho ADN viral puede derivarse de, pero no se limita a, ADN complementario (ADNc) de picornavirus, con ADNc de virus de la encefalomiocarditis (EMCV) y ADNc de poliovirus. En una realización, el ADN de Drosophila del que se deriva un elemento IRES incluye, pero no se limita a, un gen Antennapedia de Drosophila melanogaster.
En algunas realizaciones, si la hay, la secuencia IRES es una secuencia IRES del virus del síndrome de Taura, del virus Triatoma, del virus de la encefalomielitis de Theiler, del virus simio 40, del virus Solenopsis invicta 1, del virus Rhopalosiphum padi, del virus de la reticuloendoteliosis, del poliovirus fumano 1, del virus del intestino de Plautia stall, virus de la abeja de Cachemira, rinovirus humano 2, virus Homalodisca coagulata 1, virus de la inmunodeficiencia humana tipo 1, virus Homalodisca coagulata-1, virus Himetobi P, virus de la hepatitis C, virus de la hepatitis A, virus de la hepatitis GB, virus de la fiebre aftosa, enterovirus humano 71, virus de la rinitis equina, virus similar al picorna de Ectropis obliqua, virus de la encefalomiocarditis (EMCV), virus C de Drosophila, virus del tóbamo de las crucíferas, virus de la parálisis del grillo, virus de la diarrea vírica bovina 1, virus de la célula reina negra, virus de la parálisis letal de los pulgones, virus de la encefalomielitis aviar, virus de la parálisis aguda de las abejas, virus de la mancha anular clorótica del hibisco, virus de la peste porcina clásica, FGF2 humano, SFTPA1 humano, AML1/RUNX1 humano, antennapedia de Drosophila, AQP4 humano, AT1R humano, BAG-I humano, BCL2 humano,
BiP humano, c-IAPI humano, c-myc humano, eIF4G humano, NDST4L de ratón, LEF1 humano, HIF1 alfa de ratón, n.myc humano, Gtx de ratón, p27kipl humano, PDGF2/c-sis humano, p53 humano, Pim-I humano, Rbm3 de ratón, Drosophila reaper, Scamper canino, Drosophila Ubx, UNR humano, UtrA de ratón, VEGF-A humano, XIAP humano, Salivirus, Cosavirus, Parechovirus, Drosophila hairless, TFIID de S. cerevisiae, YAP1 de S. cerevisiae, c-src humano,
FGF-I humano, picomavirus de simios, virus de la arruga del nabo, un aptámero para eIF4G, Coxsackievirus B3 (CVB3) o Coxsackievirus A (CVB1/2). En otra realización más, el IRES es una secuencia IRES de Coxsackievirus B3 (CVB3).
En una realización adicional, el IRES es una secuencia IRES del virus de la encefalomiocarditis.
En algunas realizaciones, el polirribonucleótido incluye por lo menos un IRES que flanquea por lo menos una
(por ejemplo, 2, 3, 4, 5 o más) secuencia de expresión. En algunas realizaciones, el IRES flanquea ambos lados de por lo menos una (por ejemplo, 2, 3, 4, 5 o más) secuencia de expresión. En algunas realizaciones, el polirribonucleótido incluye una o más secuencias IRES a uno o ambos lados de cada secuencia de expresión, lo que lleva a la separación del péptido o péptidos y/o polipéptido o polipéptidos resultantes.
En algunas realizaciones, la carga de polirribonucleótido incluye un IRES. Por ejemplo, la carga de polirribonucleótido puede incluir un IRES de ARN circular, por ejemplo, como se describe en Chen et al. Mol. Cell 81:1-19, 2021.
Elementos reguladores
En algunas realizaciones, el polirribonucleótido descrito en la presente (por ejemplo, la carga de polirribonucleótido del polirribonucleótido) incluye uno o más elementos reguladores. En algunas realizaciones, el polirribonucleótido incluye un elemento regulador, por ejemplo, una secuencia que modifica la expresión de una secuencia de expresión dentro del polirribonucleótido.
Un elemento regulador puede incluir una secuencia adyacente a una secuencia de expresión que codifica un producto de expresión. Un elemento regulador puede estar enlazado operativamente a la secuencia adyacente. Un elemento regulador puede aumentar la cantidad de producto expresado en comparación con la cantidad de producto expresado cuando no existe ningún elemento regulador. Además, un elemento regulador puede aumentar la cantidad de productos expresados para múltiples secuencias de expresión unidas en tándem. Por lo tanto, un elemento regulador puede aumentar la expresión de una o más secuencias de expresión. Los elementos reguladores múltiples son bien conocidos por los expertos en la técnica.
En algunas realizaciones, el elemento regulador es un modulador de la traducción. Un modulador de la traducción puede modular la traducción de la secuencia de expresión en el polirribonucleótido. Un modulador de la traducción puede ser un potenciador o supresor de la traducción. En algunas realizaciones, el polirribonucleótido incluye por lo menos un modulador de la traducción adyacente a por lo menos una secuencia de expresión. En algunas realizaciones, el polirribonucleótido incluye un modulador de la traducción adyacente a cada secuencia de expresión. En algunas realizaciones, el modulador de la traducción está presente en uno o ambos lados de cada secuencia de expresión, lo que lleva a la separación de los productos de expresión, por ejemplo, péptido o péptidos y/o polipéptido o polipéptidos.
En algunas realizaciones, el elemento regulador es un microARN (miARN) o un sitio de unión a miARN.
Otros ejemplos de elementos reguladores se describen, por ejemplo, en los párrafos [0154] - [0161] de la Publicación de Patente Internacional N° WO2019/118919.
Secuencias de inicio de la traducción
En algunas realizaciones, el polirribonucleótido descrito en la presente (por ejemplo, la carga de polirribonucleótido del polirribonucleótido) incluye por lo menos una secuencia de inicio de la traducción. En algunas realizaciones, el polirribonucleótido incluye una secuencia de inicio de la traducción enlazada operativamente a una secuencia de expresión.
En algunas realizaciones, el polirribonucleótido codifica un polipéptido y puede incluir una secuencia de inicio de la traducción, por ejemplo, un codón de inicio. En algunas realizaciones, la secuencia de inicio de la traducción incluye una secuencia Kozak o Shine-Dalgamo. En algunas realizaciones, el polirribonucleótido incluye la secuencia de inicio de la traducción, por ejemplo, la secuencia de Kozak, adyacente a una secuencia de expresión. En algunas realizaciones, la secuencia de inicio de la traducción es un codón de inicio no codificante. En algunas realizaciones, la secuencia de inicio de la traducción, por ejemplo, la secuencia de Kozak, está presente en uno o ambos lados de cada secuencia de expresión, lo que lleva a la separación de los productos de expresión. En algunas realizaciones, el polirribonucleótido incluye por lo menos una secuencia de inicio de la traducción adyacente a una secuencia de expresión. En algunas realizaciones, la secuencia de inicio de la traducción proporciona flexibilidad conformacional al polirribonucleótido. En algunas realizaciones, la secuencia de inicio de la traducción se encuentra dentro de una región sustancialmente de cadena sencilla del polirribonucleótido. Ejemplos adicionales de secuencias de inicio de la traducción se describen en los párrafos [0163] - [0165] de la Publicación de Patente Internacional N° WO2019/118919.
El polirribonucleótido puede incluir más de 1 codón de inicio como, pero no limitado a, por lo menos 2, por lo menos 3, por lo menos 4, por lo menos 5, por lo menos 6, por lo menos 7, por lo menos 8, por lo menos 9, por lo menos 10, por lo menos 11, por lo menos 12, por lo menos 13, por lo menos 14, por lo menos 15, por lo menos 16, por lo menos 17, por lo menos 18, por lo menos 19, por lo menos 20, por lo menos 25, por lo menos 30, por lo menos 35, por lo menos 40, por lo menos 50, por lo menos 60 o más de 60 codones de inicio. La traducción puede iniciarse en el primer codón de inicio o puede iniciarse en sentido descendente del primer codón de inicio.
En algunas realizaciones, el polirribonucleótido puede iniciarse en un codón que no es el primer codón de inicio, por ejemplo, AUG. La traducción del polirribonucleótido puede iniciarse en una secuencia de inicio de la traducción alternativa, como, por ejemplo, ACG, AGG, AAG, C<t>G/CUG (SEQ ID NO: 74), GTG/GUG (SEQ ID NO: 75), ATA/AUA (SEQ ID NO: 76), ATT/AUU (SEQ ID NO: 77), TTG/UUG (SEQ ID NO: 78). En algunas realizaciones, la traducción comienza en una secuencia alternativa de inicio de la traducción en condiciones selectivas, por ejemplo, condiciones inducidas por estrés. Como ejemplo no limitativo, la traducción del polirribonucleótido puede comenzaren una secuencia de inicio de traducción alternativa, como ACG. Como otro ejemplo no limitativo, la traducción del polirribonucleótido puede comenzar en la secuencia de inicio de traducción alternativa, CTG/CUG (SEQ ID NO: 74).
Como otro ejemplo no limitativo, la traducción del polirribonucleótido puede comenzar en la secuencia de inicio de traducción alternativa, GTG/GUG (SEQ ID NO: 75). Como otro ejemplo no limitativo, el polirribonucleótido puede comenzar la traducción en una secuencia no-AUG asociada a repetición (RAN), tal como una secuencia de inicio de traducción alternativa que incluye tramos cortos de ARN repetitivo, por ejemplo, CGG, GGGGCC (SEQ DI NO: 79), CAG, CTG.
Elementos de terminación
En algunas realizaciones, el polirribonucleótido descrito en la presente (por ejemplo, la carga de polirribonucleótido del polirribonucleótido) incluye por lo menos un elemento de terminación. En algunas realizaciones, el polirribonucleótido incluye un elemento de terminación enlazado operativamente a una secuencia de expresión. En algunas realizaciones, el polinucleótido carece de un elemento determinación.
En algunas realizaciones, el polirribonucleótido incluye una o más secuencias de expresión, y cada secuencia de expresión puede tener o no un elemento de terminación. En algunas realizaciones, el polirribonucleótido incluye una o más secuencias de expresión, y las secuencias de expresión carecen de un elemento de terminación, de tal manera que el polirribonucleótido se traduce continuamente. La exclusión de un elemento de terminación puede dar como resultado la traducción en círculo rodante o a la expresión continua del producto de expresión.
En algunas realizaciones, el polirribonucleótido circular incluye una o más secuencias de expresión, y cada secuencia de expresión puede tener o no un elemento de terminación. En algunas realizaciones, el polirribonucleótido circular incluye una o más secuencias de expresión, y las secuencias de expresión carecen de un elemento de terminación, de tal manera que el polirribonucleótido circular se traduce continuamente. La exclusión de un elemento de terminación puede dar como resultado la traducción en círculo rodante o a la expresión continua del producto de expresión, por ejemplo, péptidos o polipéptidos, debido a la falta de estancamiento o caída del ribosoma. En tal realización, la traducción en círculo rodante expresa un producto de expresión continuo a través de cada secuencia de expresión. En otras realizaciones, un elemento de terminación de una secuencia de expresión puede formar parte de un elemento de escalonamiento. En algunas realizaciones, una o más secuencias de expresión en el polirribonucleótido circular comprenden un elemento de terminación. Sin embargo, se lleva a cabo la traducción del círculo rodante o la expresión de una secuencia de expresión sucesiva (por ejemplo, segunda, tercera, cuarta, quinta, etc.) en el polirribonucleótido circular. En tales casos, el producto de expresión puede caerse del ribosoma cuando éste encuentra el elemento de terminación, por ejemplo, un codón de parada, y termina la traducción. En algunas realizaciones, la traducción se termina mientras el ribosoma, por ejemplo, por lo menos una subunidad del ribosoma, permanece en contacto con el polirribonucleótido circular.
En algunas realizaciones, el polirribonucleótido circular incluye un elemento de terminación al final de una o más secuencias de expresión. En algunas realizaciones, una o más secuencias de expresión comprenden dos o más elementos de terminación en sucesión. En tales realizaciones, se termina la traducción y se termina la traducción del círculo rodante. En algunas realizaciones, el ribosoma se desacopla completamente del polirribonucleótido circular. En algunas de tales realizaciones, la producción de una secuencia de expresión sucesiva (por ejemplo, segunda, tercera, cuarta, quinta, etc.) en el polirribonucleótido circular puede requerir que el ribosoma vuelva a acoplarse con el polirribonucleótido circular antes del inicio de la traducción. Generalmente, los elementos de terminación incluyen un triplete de nucleótidos en el marco que señala la terminación de la traducción, por ejemplo, UAA, UGA,<u>A<g>. En algunas realizaciones, uno o más elementos de terminación en el polirribonucleótido circular son elementos de terminación desplazados de marco como, pero no limitados a, marcos de lectura desplazados fuera de marco o -1 y 1 (por ejemplo, parada oculta) que pueden terminar la traducción. Los elementos de terminación desplazados de marco incluyen los tripletes de nucleótidos TAA, TAG y TGA que aparecen en el segundo y tercer marco de lectura de una secuencia de expresión. Los elementos de terminación desplazados de marco pueden ser importantes para evitar lecturas erróneas del ARNm, que a menudo son perjudiciales para la célula. En algunas realizaciones, el elemento de terminación es un codón de parada.
Ejemplos adicionales de elementos de terminación se describen en los párrafos [0169] - [0170] de la Publicación de Patente Internacional N° WO2019/118919.
Regiones no traducidas
En algunas realizaciones, un polirribonucleótido circular incluye regiones no traducidas (UTR). Las UTR de una región genómica que incluye un gen pueden transcribirse pero no traducirse. En algunas realizaciones, una UTR puede incluirse en sentido ascendente de la secuencia de inicio de la traducción de una secuencia de expresión descrita en la presente. En algunas realizaciones, una UTR puede incluirse en sentido descendente de una secuencia de expresión descrita en la presente. En algunas realizaciones, una UTR para la primera secuencia de expresión es la misma que o continua con o está solapada con otra UTR para una segunda secuencia de expresión. En algunas realizaciones, el intrón es un intrón humano. En algunas realizaciones, el intrón es un intrón humano de longitud completa, por ejemplo, ZKSCAN1.
Regiones no traducidas ejemplares se describen en los párrafos [0197] - [201] de la Publicación de Patente Internacional N° WO2019/118919.
En algunas realizaciones, un polirribonucleótido circular incluye una secuencia poli-A. Las secuencias poli-A ejemplares se describen en los párrafos [0202] - [0205] de la Publicación de Patente Internacional N° WO2019/118919. En algunas realizaciones, un polirribonucleótido circular carece de una secuencia poli-A.
En algunas realizaciones, un polirribonucleótido circular incluye una UTR con uno o más tramos de Adenosinas y Uridinas incorporados en su interior. Estas firmas ricas en A<u>pueden aumentar las tasas de recambio del producto de expresión.
La introducción, eliminación o modificación de elementos ricos en AU (ARE) de la UTR puede ser útil para modular la estabilidad o inmunogenicidad (por ejemplo, el nivel de uno o más marcadores de una respuesta inmunitaria o inflamatoria) del polirribonucleótido circular. Cuando se manipulan polirribonucleótidos circulares específicos, en el polirribonucleótido circular pueden introducirse una o más copias de un ARE y las copias de un ARE pueden modular la traducción y/o la producción de un producto de expresión. De igual manera, los ARE pueden ser identificados y eliminados o manipulados en el polirribonucleótido circular para modular la estabilidad intracelular y afectar por tanto a la traducción y producción de la proteína resultante.
Debe entenderse que puede incorporarse cualquier UTR de cualquier gen en las regiones flanqueantes respectivas del polirribonucleótido circular.
En algunas realizaciones, un polirribonucleótido circular carece de una 5'-UTR y es competente para la expresión de proteínas a partir de su una o más secuencias de expresión. En algunas realizaciones, el polirribonucleótido circular carece de una 3'-UTR y es competente para la expresión de proteínas a partir de su una o más secuencias de expresión. En algunas realizaciones, el polirribonucleótido circular carece de una secuencia poli-A y es competente para la expresión de proteínas a partir de su una o más secuencias de expresión. En algunas realizaciones, el polirribonucleótido circular carece de un elemento de terminación y es competente para la expresión de proteínas a partir de su una o más secuencias de expresión. En algunas realizaciones, el polirribonucleótido circular carece de un sitio de entrada ribosómico interno y es competente para la expresión de proteínas a partir de su una o más secuencias de expresión. En algunas realizaciones, el polirribonucleótido circular carece de una caperuza y es competente para la expresión de proteínas a partir de su una o más secuencias de expresión. En algunas realizaciones, el polirribonucleótido circular carece de una 5'-UTR, una 3'-UTR y un IRES, y es competente para la expresión de proteínas a partir de su una o más secuencias de expresión. En algunas realizaciones, el polirribonucleótido circular incluye una o más de las siguientes secuencias: una secuencia que codifica uno o más miARN, una secuencia que codifica una o más proteínas de replicación, una secuencia que codifica un gen exógeno, una secuencia que codifica un terapéutico, un elemento regulador (por ejemplo, modulador de la traducción, por ejemplo, potenciador o supresor de la traducción), una secuencia de inicio de la traducción, uno o más ácidos nucleicos reguladores dirigidos a genes endógenos (por ejemplo, ARNip, ARNInc, ARNhc), y una secuencia que codifica un ARNm o proteína terapéuticos.
En algunas realizaciones, un polirribonucleótido circular carece de una 5'-UTR. En algunas realizaciones, el polirribonucleótido circular carece de una 3'-UTR. En algunas realizaciones, el polirribonucleótido circular carece de una secuencia poli-A. En algunas realizaciones, el polirribonucleótido circular carece de un elemento de terminación. En algunas realizaciones, el polirribonucleótido circular carece de un sitio de entrada ribosómico interno. En algunas realizaciones, el polirribonucleótido circular carece de susceptibilidad a la degradación por exonucleasas. En algunas realizaciones, el hecho de que el polirribonucleótido circular carezca de susceptibilidad a la degradación puede significar que el polirribonucleótido circular no se degrada por una exonucleasa, o sólo se degrada en presencia de una exonucleasa en una medida limitada, por ejemplo, que es comparable o similar a en ausencia de exonucleasa. En algunas realizaciones, el polirribonucleótido circular no es degradado por exonucleasas. En algunas realizaciones, el polirribonucleótido circular tiene una degradación reducida cuando se expone a la exonucleasa. En algunas realizaciones, el polirribonucleótido circular carece de unión a una proteína de unión a caperuza. En algunas realizaciones, el polirribonucleótido circular carece de caperuza 5'.
Elementos de escalonamiento
En algunas realizaciones, el polirribonucleótido circular incluye por lo menos un elemento de escalonamiento adyacente a una secuencia de expresión. En algunas realizaciones, el polirribonucleótido circular incluye un elemento de escalonamiento adyacente a cada secuencia de expresión. En algunas realizaciones, el elemento de escalonamiento está presente en uno o ambos lados de cada secuencia de expresión, lo que lleva a la separación de los productos de expresión, por ejemplo, péptido o péptidos y/o polipéptido o polipéptidos. En algunas realizaciones, el elemento de escalonamiento es una porción de una o más secuencias de expresión. En algunas realizaciones, el polirribonucleótido circular comprende una o más secuencias de expresión, y cada una de las una o más secuencias de expresión está separada de una secuencia de expresión sucesiva por un elemento de escalonamiento en el polirribonucleótido circular. En algunas realizaciones, el elemento de escalonamiento impide la generación de un único polipéptido (a) a partir de dos rondas de traducción de una única secuencia de expresión o (b) a partir de una o más rondas de traducción de dos o más secuencias de expresión. En algunas realizaciones, el elemento de escalonamiento es una secuencia separada de una o más secuencias de expresión. En algunas realizaciones, el elemento de escalonamiento comprende una porción de una secuencia de expresión de la una o más secuencias de expresión.
En algunas realizaciones, el polirribonucleótido circular incluye un elemento de escalonamiento. Para evitar la producción de un producto de expresión continua, por ejemplo, un péptido o polipéptido, mientras se mantiene la traducción del círculo rodante, puede incluirse un elemento de escalonamiento para inducir la pausa ribosómica durante la traducción. En algunas realizaciones, el elemento de escalonamiento se encuentra en el extremo 3' de por lo menos una de las una o más secuencias de expresión. El elemento de escalonamiento puede configurarse para detener un ribosoma durante la traducción en círculo rodante del polirribonucleótido circular. El elemento de escalonamiento puede incluir, pero no se limita a una secuencia tipo 2A, o CHYSEL (SEQ ID NO: 71) (elemento hidrolasa de acción cis). En algunas realizaciones, el elemento de escalonamiento codifica una secuencia con una secuencia consenso C-terminal que es X1X2X3EX5NPGP (SEQ ID NO: 72), donde X1 está ausente o es G o H, X2 está ausente o es D o G, X3 es D o V o I o S o M, y X5 es cualquier aminoácido. En algunas realizaciones, esta secuencia comprende una secuencia no conservada de aminoácidos con una fuerte propensión alfa-helicoidal seguida de la secuencia consenso -D(V/I)EXNPGP (SEQ ID NO: 73), donde x= cualquier aminoácido. Algunos ejemplos no limitativos de elementos de escalonamiento incluyen GDVESNPGP (SEQ ID NO: 52), GDIEENPGP (SEQ ID No : 53), VEPNPGP (SEQ ID NO: 54), IETNPGP (SEQ ID NO: 55), GDIESNPGP (SEQ ID NO: 56), GDVELNPGP (SEQ ID NO: 57), GDIETNPGP (SEQ ID NO: 58), GDVENPGP (SEQ ID NO: 59), GDVEENPGP (SEQ ID NO: 60), GDVEQNPGP (SEQ ID NO: 61), IESNPGP (SEQ ID NO: 62), GDIELNPGP (SEQ ID NO: 63), HDIETNPGP (SEQ ID NO: 64), HDVETNPGP (SEQ ID NO: 65), HDVEMNPGP (SEQ ID NO: 66), GDMESNPGP (SEQ ID NO: 67), GDVETNPGP (SEQ ID NO: 68) GDIEQNPGP (SEQ ID NO: 69), y DSEFNPGP (SEQ ID NO: 70).
En algunas realizaciones, el elemento de escalonamiento descrito en la presente escinde un producto de expresión, como entre G y P de la secuencia consenso descrita en la presente. Como ejemplo no limitativo, el polirribonucleótido circular incluye por lo menos un elemento de escalonamiento para escindir el producto de expresión. En algunas realizaciones, el polirribonucleótido circular incluye un elemento de escalonamiento adyacente a por lo menos una secuencia de expresión. En algunas realizaciones, el polirribonucleótido circular incluye un elemento de escalonamiento después de cada secuencia de expresión. En algunas realizaciones, el polirribonucleótido circular incluye un elemento de escalonamiento presente en uno o ambos lados de cada secuencia de expresión, lo que lleva a la traducción de péptido o péptidos y/o polipéptido o polipéptidos individuales a partir de cada secuencia de expresión.
En algunas realizaciones, un elemento de escalonamiento comprende uno o más nucleótidos modificados o nucleótidos no naturales que inducen la pausa ribosómica durante la traducción. Los nucleótidos no naturales pueden incluir ácido nucleico peptídico (PNA), Morfolino y ácido nucleico bloqueado (LNA), así como ácido nucleico glicólico (GNA) y ácido nucleico de treosa (TNA). Ejemplos como éstos se distinguen del ADN o ARN de origen natural por los cambios en la estructura principal de la molécula. Las modificaciones ejemplares pueden incluir cualquier modificación del azúcar, la nucleobase, el enlace internucleosídico (por ejemplo, a un fosfato de enlace / a un enlace fosfodiéster/ a la estructura principal de fosfodiéster), y cualquier combinación de los mismos que pueda inducir la pausa ribosómica durante la traducción. Algunas de las modificaciones ejemplares proporcionadas en la presente se describen en otra parte de la presente.
En algunas realizaciones, el elemento de escalonamiento está presente en el polirribonucleótido circular de otras formas. Por ejemplo, en algunos polirribonucleótidos circulares ejemplares, un elemento de escalonamiento comprende un elemento de terminación de una primera secuencia de expresión en el polirribonucleótido circular, y una secuencia espaciadora de nucleótidos que separa el elemento de terminación de una primera secuencia de inicio de la traducción de una expresión que sucede a la primera secuencia de expresión. En algunos ejemplos, el primer elemento de escalonamiento de la primera secuencia de expresión está en sentido ascendente de (5' a) una primera secuencia de inicio de la traducción de la expresión que sucede a la primera secuencia de expresión en el polirribonucleótido circular. En algunos casos, la primera secuencia de expresión y la secuencia de expresión que sucede a la primera secuencia de expresión son dos secuencias de expresión separadas en el polirribonucleótido circular. La distancia entre el primer elemento de escalonamiento y la primera secuencia de inicio de la traducción puede permitir la traducción continua de la primera secuencia de expresión y su secuencia de expresión sucesiva.
En algunas realizaciones, el primer elemento de escalonamiento comprende un elemento de terminación y separa un producto de expresión de la primera secuencia de expresión de un producto de expresión de sus secuencias de expresión sucesivas, creando de este modo productos de expresión discretos. En algunos casos, el polirribonucleótido circular que comprende el primer elemento de escalonamiento en sentido ascendente de la primera secuencia de inicio de la traducción de la secuencia sucesora en el polirribonucleótido circular se traduce continuamente, mientras que un polirribonucleótido circular correspondiente que comprende un elemento de escalonamiento de una segunda secuencia de expresión que está en sentido ascendente de una segunda secuencia de inicio de la traducción de una secuencia de expresión que sucede a la segunda secuencia de expresión no se traduce continuamente. En algunos casos, sólo hay una secuencia de expresión en el polirribonucleótido circular, y la primera secuencia de expresión y su secuencia de expresión sucesiva son la misma secuencia de expresión. En algunos polirribonucleótidos circulares ejemplares, un elemento de escalonamiento comprende un primer elemento de terminación de una primera secuencia de expresión en el polirribonucleótido circular, y una secuencia espadadora de nucleótidos que separa el elemento de terminación de una secuencia de inicio de traducción en sentido descendente. En algunos de tales ejemplos, el primer elemento de escalonamiento se encuentra en sentido ascendente (5' a) de una primera secuencia de inicio de la traducción de la primera secuencia de expresión en el polirribonucleótido circular. En algunos casos, la distancia entre el primer elemento de escalonamiento y la primera secuencia de inicio de la traducción permite la traducción continua de la primera secuencia de expresión y de cualquier secuencia de expresión posterior.
En algunas realizaciones, el primer elemento de escalonamiento separa un producto de expresión de una ronda de la primera secuencia de expresión del siguiente producto de expresión de una ronda de las primeras secuencias de expresión, creando de este modo productos de expresión discretos. En algunos casos, el polirribonucleótido circular que comprende el primer elemento de escalonamiento en sentido ascendente de la primera secuencia de inicio de la traducción de la primera secuencia de expresión en el polirribonucleótido circular se traduce continuamente, mientras que un polirribonucleótido circular correspondiente que comprende un elemento de escalonamiento en sentido ascendente de una segunda secuencia de inicio de la traducción de una segunda secuencia de expresión en el polirribonucleótido circular correspondiente no se traduce continuamente. En algunos casos, la distancia entre el segundo elemento de escalonamiento y la segunda secuencia de inicio de traducción es por lo menos 2x, 3x, 4x, 5x, 6x, 7x, 8x, 9x, o 10x mayor en el polirribonucleótido circular correspondiente que una distancia entre el primer elemento de escalonamiento y la primera iniciación de traducción en el polirribonucleótido circular. En algunos casos, la distancia entre el primer elemento de escalonamiento y el primer inicio de traducción es de por lo menos 2 nt, 3 nt, 4 nt, 5 nt, 6 nt, 7 nt, 8 nt, 9 nt, 10 nt, 11 nt, 12 nt, 13 nt, 14 nt, 15 nt, 16 nt, 17 nt, 18 nt, 19 nt, 20 nt, 25 nt, 30 nt, 35 nt, 40 nt, 45 nt, 50 nt, 55 nt, 60 nt, 65 nt, 70 nt, 75 nt, o mayor. En algunas realizaciones, la distancia entre el segundo elemento de escalonamiento y el segundo inicio de traducción es de por lo menos 2 nt, 3 nt, 4 nt, 5 nt, 6 nt, 7 nt, 8 nt, 9 nt, 10 nt, 11 nt, 12 nt, 13 nt, 14 nt, 15 nt, 16 nt, 17 nt, 18 nt, 19 nt, 20 nt, 25 nt, 30 nt, 35 nt, 40 nt, 45 nt, 50 nt, 55 nt, 60 nt, 65 nt, 70 nt, 75 nt, o mayor que la distancia entre el primer elemento de escalonamiento y el primer inicio de traducción. En algunas realizaciones, el polirribonucleótido circular comprende más de una secuencia de expresión.
Ejemplos de elementos de escalonamiento se describen en los párrafos [0172] - [0175] de la Publicación de Patente Internacional N° WO2019/118919.
Secuencias no codificantes
En algunas realizaciones, el polirribonucleótido descrito en la presente (por ejemplo, la carga de polirribonucleótido del polirribonucleótido) incluye una o más secuencias no codificantes, por ejemplo, una secuencia que no codifica la expresión del polipéptido. En algunas realizaciones, el polirribonucleótido incluye dos, tres, cuatro, cinco, seis, siete, ocho, nueve, diez o más de diez secuencias no codificantes. En algunas realizaciones, el polirribonucleótido no codifica una secuencia de expresión de polipéptido.
Las secuencias no codificantes pueden ser secuencias naturales o sintéticas. En algunas realizaciones, una secuencia no codificante puede alterar el comportamiento celular, como por ejemplo, el comportamiento de los linfocitos. En algunas realizaciones, las secuencias no codificantes son antisentido de las secuencias de ARN celular.
En algunas realizaciones, el polirribonucleótido incluye ácidos nucleicos reguladores que son ARN o estructuras similares al ARN típicamente de aproximadamente 5-500 pares de bases (bp) (dependiendo de la estructura de ARN específica (por ejemplo, miARN 5-30 bp, ARNc 200-500 bp) y pueden tener una secuencia de nucleobases idéntica (complementaria) o casi idéntica (sustancialmente complementaria) a una secuencia codificante en un gen diana expresado dentro de la célula. En algunas realizaciones, el polirribonucleótido circular incluye ácidos nucleicos reguladores que codifican un precursor de ARN que puede procesarse a un ARN más pequeño, por ejemplo, un precursor de miARN, que puede tener de aproximadamente 50 a aproximadamente 1000 bp, que puede procesarse a un miARN intermedio más pequeño o a un miARN maduro.
Los ARN no codificantes largos (ARNncL) se definen como transcritos no codificantes de proteínas de más de 100 nucleótidos. Muchos de ellos se caracterizan por ser específicos de un tejido. Los ARNncL divergentes que se transcriben en dirección opuesta a los genes codificantes de proteínas cercanos incluyen una proporción significativa (por ejemplo, aproximadamente el 20% del total de ARNncL en genomas de mamíferos) y posiblemente regulan la transcripción del gen cercano. En una realización, el polirribonucleótido proporcionado en la presente incluye una cadena de sentido de un ARNncL. En una realización, el polirribonucleótido proporcionado en la presente incluye una cadena antisentido de un ARNncL.
En algunas realizaciones, el polirribonucleótido codifica un ácido nucleico regulador que es sustancialmente complementario, o completamente complementario, a todo o por lo menos un fragmento de un gen endógeno o producto génico (por ejemplo, ARNm). En algunas realizaciones, los ácidos nucleicos reguladores complementan secuencias en el límite entre intrones y exones, entre exones o adyacentes a un exón, para impedir la maduración de transcritos de ARN nuclear recién generados de genes específicos en ARNm para su transcripción. Los ácidos nucleicos reguladores que son complementarios a genes específicos pueden hibridar con el ARNm de ese gen e impedir su traducción. El ácido nucleico regulador antisentido puede ser ADN, ARN o un derivado o híbrido de los mismos. En algunas realizaciones, el ácido nucleico regulador incluye un sitio de unión a proteínas que puede unirse a una proteína que participa en la regulación de la expresión de un gen endógeno o un gen exógeno.
En algunas realizaciones, el polirribonucleótido codifica un ARN regulador que hibrida con un transcrito de interés en donde el ARN regulador tiene una longitud de aproximadamente 5 a 30 nucleótidos, de aproximadamente 10 a 30 nucleótidos, o de aproximadamente 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30 o más de 30 nucleótidos. En algunas realizaciones, el grado de identidad de secuencia del ARN regulador con el transcrito diana es de por lo menos el 75%, por lo menos el 80%, por lo menos el 85%, por lo menos el 90% o por lo menos el 95%.
En algunas realizaciones, el polirribonucleótido codifica una molécula de microARN (miARN) idéntica a de aproximadamente 5 a aproximadamente 25 nucleótidos contiguos de un gen diana o codifica un precursor de ese miARN. En algunas realizaciones, el miARN tiene una secuencia que le permite reconocer y unirse a un ARNm diana específico. En algunas realizaciones, la secuencia de miARN comienza con el dinucleótido AA, incluye un contenido de GC de aproximadamente el 30-70% (aproximadamente el 30-60%, aproximadamente el 40-60%, o aproximadamente el 45%-55%), y no tiene un alto porcentaje de identidad con ninguna secuencia de nucleótidos distinta de la diana en el genoma del sujeto (por ejemplo, un mamífero) en el que se va a introducir, por ejemplo, según lo determinado por una búsqueda BLAST estándar.
En algunas realizaciones, el polirribonucleótido incluye por lo menos un miARN (o precursor de miARN), por ejemplo, 2, 3, 4, 5, 6, o más miARN o precursores de miARN. En algunas realizaciones, el polirribonucleótido incluye una secuencia que codifica un miARN (o su precursor) que tiene por lo menos aproximadamente un 75%, 80%, 85%, 90% 95%, 96%, 97%, 98%, o 99% o 100% de complementariedad de secuencia de nucleótidos con una secuencia diana.
Los ARNip y los ARNhc se asemejan a productos intermedios en la vía de procesamiento de los genes de microARN (miARN) endógenos. En algunas realizaciones, los ARNip pueden funcionar como miARN y viceversa. Los microARN, al igual que los ARNip, usan RISC para regular por disminución los genes diana, pero a diferencia de los ARNip, la mayoría de los miARN animales no escinden el ARNm. En su lugar, los miARN reducen la producción de proteínas mediante la supresión de la traducción o la eliminación de poliA y la degradación del ARNm. Los sitios de unión de miARN conocidos se encuentran dentro de las UTR 3' del ARNm; los miARN parecen dirigirse a sitios con una complementariedad casi perfecta con los nucleótidos 2-8 del extremo 5' del miARN. Esta región se conoce como región semilla. Como los ARNip maduros y los miARN son intercambiables, los ARNip exógenos regulan por diminución los ARNm con complementariedad de semilla con el ARNip.
Listas de secuencias de miARN conocidas pueden encontrarse en bases de datos mantenidas por organizaciones de investigación, como el Wellcome Trust Sanger Institute, el Penn Center for Bioinformatics, el Memorial Sloan Kettering Cancer Center y el European Molecule Biology Laboratory, entre otros. Las secuencias de ARNip eficaces conocidas y los sitios de unión afines también están bien representados en la bibliografía relevante. Las moléculas de ARNi se diseñan y producen fácilmente mediante tecnologías conocidas en la técnica. Además, existen herramientas computacionales que aumentan las posibilidades de encontrar motivos de secuencia eficaces y específicos.
Secuencias de unión a proteínas
En algunas realizaciones, un polirribonucleótido circular incluye uno o más sitios de unión a proteínas que permiten que una proteína, por ejemplo, un ribosoma, se una a un sitio interno de la secuencia de ARN. Mediante la manipulación de sitios de unión a proteínas, por ejemplo, sitios de unión a ribosomas, en el polirribonucleótido circular, el polirribonucleótido circular puede evadir o tener una detección reducida por parte del sistema inmunitario del huésped, tener una degradación modulada, o traducción moduladla, enmascarando el polirribonucleótido circular de los componentes del sistema inmunitario del huésped.
En algunas realizaciones, un polirribonucleótido circular incluye por lo menos un sitio de unión a inmunoproteínas, por ejemplo, para evadir respuestas inmunitarias, por ejemplo, respuestas de CTL (linfocitos T citotóxicos). En algunas realizaciones, el sitio de unión a inmunoproteínas es una secuencia de nucleótidos que se une a una inmunoproteína y ayuda a enmascarar el polirribonucleótido circular como exógeno. En algunas realizaciones, el sitio de unión a inmunoproteína es una secuencia de nucleótidos que se une a una inmunoproteína y ayuda a ocultar el polirribonucleótido circular como exógeno o extraño.
Los mecanismos tradicionales de acoplamiento del ribosoma al ARN lineal implican la unión del ribosoma al extremo 5' con caperuza de un ARN. Desde el extremo 5', el ribosoma migra a un codón de inicio, donde se forma el primer enlace peptídico. De acuerdo con la presente divulgación, el inicio interno (es decir, independiente de la caperuza) de la traducción del polirribonucleótido circular no requiere un extremo libre o un extremo con caperuza. En su lugar, un ribosoma se une a un sitio interno sin caperuza, por lo que el ribosoma comienza la elongación del polipéptido en un codón de inicio. En algunas realizaciones, el polirribonucleótido circular incluye una o más secuencias de ARN que incluyen un sitio de unión al ribosoma, por ejemplo, un codón de inicio.
Las UTR 5' naturales presentan características que desempeñan un papel en el inicio de la traducción. Albergan firmas como las secuencias Kozak, que se sabe que están implicadas en el proceso por el que el ribosoma inicia la traducción de muchos genes. Las secuencias Kozak tienen el consenso CCR(A/G)CCAUGG (SEQ ID NO: 79), donde R es una purina (adenina o guanina) tres bases en sentido ascendente del codón de inicio (AUG), que va seguido de otra 'G'. También se sabe que las'UTR 5 forman estructuras secundarias que intervienen en la unión del factor de elongación.
En algunas realizaciones, un polirribonucleótido circular codifica una secuencia de unión a proteínas que se une a una proteína. En algunas realizaciones, la secuencia de unión a proteínas dirige o localiza el polirribonucleótido circular a una diana específica. En algunas realizaciones, la secuencia de unión a proteínas se une específicamente a una región rica en arginina de una proteína.
En algunas realizaciones, el sitio de unión a la proteína incluye, pero no se limita a, un sitio de unión a la proteína como ACIN1, AGO, APOBEC3F, APOBEC3G, ATXN2, AUH, BCCIP, CAPRIN1, CELF2, CPSF1, CPSF2, CPSF6, CPSF7, CSTF2, CSTF2T, CTCF, DDX21, DDX3, DDX3X, DDX42, DGCR8, EIF3A, EIF4A3, EIF4G2, ELAVL1, ELAVL3, FAM120A, FBL, FIP1L1, FKBP4, FMR1, FUS, FXR1, FXR2, GNL3, GTF2F1, HNRNPA1, HNRNPA2B1, HNRNPC, HNRNPK, HNRNPL, HNRNPM, HNRNPU, HNRNPUL1, IGF2BP1, IGF2BP2, IGF2BP3, ILF3, KHDRBS1, LARP7, LIN28A, LIN28B, m6A, MBNL2, METTL3, MOV10, MSI1, MSI2, NONO, NONO-, NOP58, NPM1, NUDT21, PCBP2, POLR2A, PRPF8, PTBP1, RBFOX2, RBM10, RBM22, RBM27, RBM47, RNPS1, SAFB2, SBDS, SF3A3, SF3B4, SIRT7, SLBP, SLTM, SMNDC1, SND1, SRRM4, SRSF1, SRSF3, SRSF7, SRSF9, TAF15, TARDBP, TIA1, TNRC6A, TOP3B, TRA2A, TRA2B, U2AF1, U2AF2, UNK, UPF1, WDR33, XRN2, YBX1, YTHDC1, YTHDF1, YTHDF2, YWHAG, ZC3H7B, PDK1, AKT1, y cualquier otra proteína que se una al ARN.
Secuencias espadadoras
En algunas realizaciones, el polirribonucleótido descrito en la presente incluye una o más secuencias espaciadoras. Un espaciador se refiere a cualquier secuencia contigua de nucleótidos (por ejemplo, de uno o más nucleótidos) que proporciona distancia o flexibilidad entre dos regiones polinucleotídicas adyacentes. Los espaciadores pueden estar presentes entre cualquiera de los elementos de ácido nucleico descritos en la presente. Los espaciadores también pueden estar presentes dentro de un elemento de ácido nucleico descrito en la presente.
Por ejemplo, en donde un ácido nucleico incluye dos o más de los siguientes elementos: (A) la mitad 3' de un fragmento de intrón catalítico del Grupo I; (B) un sitio de corte y empalme 3'; (C) un fragmento de exón 3'; (D) una carga de polirribonucleótido; (E) un fragmento de exón 5'; (F) un sitio de corte y empalme 5'; y (G) la mitad 5' de un fragmento de intrón catalítico del Grupo I; puede haber una región espaciadora entre uno cualquiera o más de los elementos. Cualquiera de los elementos (A), (B), (C), (D), (E), (F) o (G) puede estar separado por una secuencia espaciadora, tal como se describe en la presente. Por ejemplo, puede haber un espaciador entre (A) y (B), entre (B) y (C), entre (C) y (D), entre (D) y (E), entre (E) y (F), o entre (F) y (G).
En algunas realizaciones, el polirribonucleótido incluye además una primera región espaciadora entre el fragmento de exón 5' de (C) y la carga de polirribonucleótido de (D). El espaciador puede tener, por ejemplo, por lo menos 5 (por ejemplo, por lo menos 10, por lo menos 15, por lo menos 20) ribonucleótidos de longitud. En algunas realizaciones, el polirribonucleótido incluye además una segunda región espaciadora entre la carga de polirribonucleótido de (D) y el fragmento de exón 5' de (E). El espaciador puede tener, por ejemplo, por lo menos 5 (por ejemplo, por lo menos 10, por lo menos 15, por lo menos 20) ribonucleótidos de longitud. En algunas realizaciones, cada región espaciadora tiene por lo menos 5 (por ejemplo, por lo menos 10, por lo menos 15, por lo menos 20) ribonucleótidos de longitud. Cada región espaciadora puede tener, por ejemplo, de 5 a 500 (por ejemplo, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450 o 500) ribonucleótidos de longitud. La primera región espaciadora, la segunda región espaciadora, o la primera región espaciadora y la segunda región espaciadora pueden incluir una secuencia poliA. La primera región espaciadora, la segunda región espaciadora, o la primera región espaciadora y la segunda región espaciadora pueden incluir una secuencia poliA-C. En algunas realizaciones, la primera región espaciadora, la segunda región espaciadora, o la primera región espaciadora y la segunda región espaciadora incluyen una secuencia poliA-G. En algunas realizaciones, la primera región espaciadora, la segunda región espaciadora, o la primera región espaciadora y la segunda región espaciadora incluyen una secuencia poliA-T. En algunas realizaciones, la primera región espaciadora, la segunda región espaciadora, o la primera región espaciadora y la segunda región espaciadora incluyen una secuencia aleatoria.
Los espaciadores también pueden estar presentes dentro de una región de ácido nucleico descrita en la presente. Por ejemplo, una región de carga de polinucleótidos puede incluir uno o múltiples espaciadores. Los espaciadores pueden separar regiones dentro de la carga de polinucleótidos.
En algunas realizaciones, la secuencia espadadora puede tener, por ejemplo, por lo menos 10 nucleótidos de longitud, por lo menos 15 nucleótidos de longitud o por lo menos 30 nucleótidos de longitud. En algunas realizaciones, la secuencia espaciadora tiene por lo menos 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 25 o 30 nucleótidos de longitud. En algunas realizaciones, la secuencia espaciadora no tiene más de 100, 90, 80, 70, 60, 50, 45, 40, 35 o 30 nucleótidos de longitud. En algunas realizaciones, la secuencia espaciadora tiene de 20 a 50 nucleótidos de longitud. En ciertas realizaciones, la secuencia espaciadora tiene 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49 o 50 nucleótidos de longitud.
Las secuencias espaciadoras pueden ser secuencias poliA, secuencias poliA-C, secuencias poliC o secuencias poli-U.
En algunas realizaciones, las secuencias espaciadoras pueden ser poliA-T, poliA-C, poliA-G, o una secuencia aleatoria.
Una secuencia espaciadora puede usarse para separar un IRES de los elementos estructurales adyacentes para mantener la estructura y la función del IRES o del elemento adyacente. Un espaciador puede manipularse específicamente dependiendo del IRES. En algunas realizaciones, puede utilizarse un programa informático de plegamiento de ARN, como RNAFold, para guiar los diseños de los varios elementos del vector, incluyendo los espaciadores.
En algunas realizaciones, el polirribonucleótido incluye una secuencia espaciadora 5' (por ejemplo, entre la región de apareamiento 5' y la carga de polirribonucleótido). En algunas realizaciones, la secuencia espaciadora 5' tiene por lo menos 10 nucleótidos de longitud. En otra realización, la secuencia espaciadora 5' tiene por lo menos 15 nucleótidos de longitud. En una realización adicional, la secuencia espaciadora 5' tiene por lo menos 30 nucleótidos de longitud. En algunas realizaciones, la secuencia espaciadora 5 'tiene por lo menos 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 25 o 30 nucleótidos de longitud. En algunas realizaciones, la secuencia espaciadora 5' no tiene más de 100, 90, 80, 70, 60, 50, 45, 40, 35 o 30 nucleótidos de longitud. En algunas realizaciones, la secuencia espaciadora 5' tiene entre 20 y 50 nucleótidos de longitud. En ciertas realizaciones, la secuencia espaciadora 5' tiene 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 3637, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49 o 50 nucleótidos de longitud. En una realización, la secuencia espaciadora 5' es una secuencia poliA. En otra realización, la secuencia espaciadora 5' es una secuencia poliA-C. En algunas realizaciones, la secuencia espaciadora 5' incluye una secuencia poliA-G. En algunas realizaciones, la secuencia espaciadora 5' incluye una secuencia poliA-T. En algunas realizaciones, la secuencia espaciadora 5' incluye una secuencia aleatoria.
En algunas realizaciones, el polirribonucleótido incluye una secuencia espaciadora 3' (por ejemplo, entre la región de apareamiento 3' y la carga de polirribonucleótido). En algunas realizaciones, la secuencia espaciadora 3' tiene por lo menos 10 nucleótidos de longitud. En otra realización, la secuencia espaciadora 3' tiene por lo menos 15 nucleótidos de longitud. En una realización adicional, la secuencia espaciadora 3' tiene por lo menos 30 nucleótidos de longitud. En algunas realizaciones, la secuencia espaciadora 3 'tiene por lo menos 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 25 o 30 nucleótidos de longitud. En algunas realizaciones, la secuencia espaciadora 3' no tiene más de 100, 90, 80, 70, 60, 50, 45, 40, 35 o 30 nucleótidos de longitud. En algunas realizaciones, la secuencia espaciadora 3' tiene de 20 a 50 nucleótidos de longitud. En ciertas realizaciones, la secuencia espaciadora 3' tiene 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49 o 50 nucleótidos de longitud. En una realización, la secuencia espaciadora 3' es una secuencia poliA. En otra realización, la secuencia espaciadora 5' es una secuencia poliA-C. En algunas realizaciones, la secuencia espaciadora 5' incluye una secuencia poliA-G. En algunas realizaciones, la secuencia espaciadora 5' incluye una secuencia poliA-T. En algunas realizaciones, la secuencia espaciadora 5' incluye una secuencia aleatoria.
En una realización, el polirribonucleótido incluye una secuencia espaciadora 5', pero no una secuencia espaciadora 3'. En otra realización, el polirribonucleótido incluye una secuencia espaciadora 3', pero no una secuencia espaciadora 5'. En otra realización, el polirribonucleótido no incluye ni una secuencia espaciadora 5' ni una secuencia espaciadora 3'. En otra realización, el polirribonucleótido no incluye una secuencia IRES. En otra realización, el polirribonucleótido no incluye una secuencia IRES, una secuencia espaciadora 5' ni una secuencia espaciadora 3'.
En algunas realizaciones, la secuencia espaciadora incluye por lo menos 3 ribonucleótidos, por lo menos 4 ribonucleótidos, por lo menos 5 ribonucleótidos, por lo menos aproximadamente 8 ribonucleótidos, por lo menos aproximadamente 10 ribonucleótidos, por lo menos aproximadamente 12 ribonucleótidos, por lo menos aproximadamente 15 ribonucleótidos, por lo menos aproximadamente 20 ribonucleótidos, por lo menos aproximadamente 25 ribonucleótidos, por lo menos aproximadamente 30 ribonucleótidos, por lo menos aproximadamente 40 ribonucleótidos, por lo menos aproximadamente 50 ribonucleótidos, por lo menos aproximadamente 60 ribonucleótidos, por lo menos aproximadamente 70 ribonucleótidos, por lo menos aproximadamente 80 ribonucleótidos, por lo menos aproximadamente 90 ribonucleótidos, por lo menos aproximadamente 100 ribonucleótidos, por lo menos aproximadamente 120 ribonucleótidos, por lo menos aproximadamente 150 ribonucleótidos, por lo menos aproximadamente 200 ribonucleótidos, por lo menos aproximadamente 250 ribonucleótidos, por lo menos aproximadamente 300 ribonucleótidos, por lo menos aproximadamente 400 ribonucleótidos, por lo menos aproximadamente 500 ribonucleótidos, por lo menos aproximadamente 600 ribonucleótidos, por lo menos aproximadamente 700 ribonucleótidos, por lo menos aproximadamente 800 ribonucleótidos, por lo menos aproximadamente 900 ribonucleótidos, o por lo menos aproximadamente 100 ribonucleótidos.
Métodos de producción
Métodos de producción en un sistema libre de células
La divulgación también proporciona métodos para producir un ARN circular. Por ejemplo, una plantilla de desoxirribonudeótido puede transcribirse en un sistema libre de células (por ejemplo, mediante transcripción in vitro) para producir un ARN lineal. El polirribonucleótido lineal produce un polirribonucleótido compatible con el corte y empalme, que puede auto-cortarse y empalmarse para producir un polirribonucleótido circular.
En algunas realizaciones, la divulgación proporciona un método para producir un polirribonucleótido circular (por ejemplo, en un sistema libre de células) proporcionando un polirribonucleótido lineal; y auto-cortando y empalmando el polirribonucleótido lineal en condiciones adecuadas para el corte y empalme de los sitios de corte y empalme 3' y 5' del polirribonucleótido lineal; produciendo de este modo un polirribonucleótido circular.
En algunas realizaciones, la divulgación proporciona un método para producir un polirribonucleótido circular proporcionando un desoxirribonucleótido que codifica el polirribonucleótido lineal; transcribiendo el desoxirribonucleótido en un sistema libre de células para producir el polirribonucleótido lineal; opcionalmente, purificando el polirribonucleótido lineal compatible con el corte y empalme; y auto-cortando y empalmando el polirribonucleótido lineal en condiciones adecuadas para el corte y empalme de los sitios de corte y empalme 3' y 5' del polirribonucleótido lineal, produciendo de este modo un polirribonucleótido circular.
En algunas realizaciones, la divulgación proporciona un método para producir un polirribonucleótido circular proporcionando un desoxirribonucleótido que codifica un polirribonucleótido lineal; transcribiendo el desoxirribonucleótido en un sistema libre de células para producir el polirribonucleótido lineal, en donde la transcripción se produce en una solución en condiciones adecuadas para el corte y empalme de los sitios de corte y empalme 3' y 5' del polirribonucleótido lineal, produciendo de este modo un polirribonucleótido circular. En algunas realizaciones, el polirribonucleótido lineal comprende un intrón dividido 5' y un intrón dividido 3' (por ejemplo, un constructo de autocorte y empalme para producir un polirribonucleótido circular). En algunas realizaciones, el polirribonucleótido lineal comprende una región de apareamiento 5' y una región de apareamiento 3'.
Las condiciones adecuadas para la transcripción y/o auto-corte y empalme in vitro pueden incluir cualquier condición (por ejemplo, una solución o un tampón, como un tampón o solución acuosa) que imite las condiciones fisiológicas en uno o más aspectos. En algunas realizaciones, las condiciones adecuadas incluyen entre 0,1-100mM de iones Mg2+ o una sal de los mismos (por ejemplo, 1-100mM, 1-50mM, 1-20mM, 5-50mM, 5-20 mM, o 5-15mM). En algunas realizaciones, las condiciones adecuadas incluyen entre 1-1000mM de iones K+ o una sal de los mismos como KCI (por ejemplo, 1-1000mM, 1-500mM, 1-200mM, 50- 500mM, 100-500mM, o 100-300mM). En algunas realizaciones, las condiciones adecuadas incluyen entre 1-1000mM de iones Cl- o una sal de los mismos como KCI (por ejemplo, 1-1000mM, 1-500mM, 1-200mM, 50- 500mM, 100-500mM, o 100-300mM). En algunas realizaciones, las condiciones adecuadas incluyen entre 0,1-100mM de iones Mn2+ o una sal de los mismos como MnCl2 (por ejemplo, 0,1-100mM, 0,1-50mM, 0,1-20mM, 0,1-10mM, 0,1-5mM, 0,1-2mM, 0,5-50mM, 0,5-20 mM, 0,5-15mM, 0,5-5mM, 0,5-2mM, o 0,1-10mM). En algunas realizaciones, las condiciones adecuadas incluyen ditiotreitol (DTT) (por ejemplo, 1-1000 pM, 1-500 pM, 1-200pM, 50- 500pM, 100-500pM, 100-300pM, 0,1-100mM, 0,1-50mM, 0,1-20mM, 0,1-10mM, 0,1-5mM, 0,1-2mM, 0,5-50mM, 0,5-20 mM, 0,5-15mM, 0,5-5mM, 0,5-2mM, o 0,1-10mM). En algunas realizaciones, las condiciones adecuadas incluyen entre 0,1mM y 100mM de ribonucleósido trifosfato (NTP) (por ejemplo, 0,1-100 mM, 0,1-50mM, 0,1-10mM, 1- 100mM, 1-50mM, o 1-10mM). En algunas realizaciones, las condiciones adecuadas incluyen un pH de 4 a 10 (por ejemplo, pH de 5 a 9, pH de 6 a 9, o pH de 6,5 a 8,5). En algunas realizaciones, las condiciones adecuadas incluyen una temperatura de 4°C a 50°C (por ejemplo, de 10°C a 40°C, de 15°C a 40°C, de 20°C a 40°C, o de 30°C a 40°C),
En algunas realizaciones, el polirribonucleótido lineal se produce a partir de un ácido desoxirribonucleico, por ejemplo, un ácido desoxirribonucleico descrito en la presente, como un vector de ADN, un vector de ADN linealizado o un ADNc. En algunas realizaciones, el polirribonucleótido lineal se transcribe a partir del ácido desoxirribonucleico por transcripción en un sistema libre de células (por ejemplo, transcripción in vitro).
Métodos de producción en célula
La divulgación también proporciona métodos para producir un ARN circular en una célula, por ejemplo, una célula procariota o una célula eucariota. En algunas realizaciones, se proporciona un polirribonucleótido exógeno a una célula (por ejemplo, un polirribonucleótido lineal descrito en la presente o una molécula de ADN que codifica para la transcripción de un polirribonucleótido lineal descrito en la presente). Los polirribonucleótidos lineales pueden transcribirse en la célula a partir de una molécula de ADN exógena proporcionada a la célula. El polirribonucleótido lineal puede transcribirse en la célula a partir de una molécula de ADN recombinante exógena proporcionada transitoriamente a la célula. En algunas realizaciones, la molécula de ADN exógena no se integra en el genoma de la célula. En algunas realizaciones, el polirribonucleótido lineal se transcribe en la célula a partir de una molécula de ADN recombinante que se incorpora al genoma de la célula.
En algunas realizaciones, la célula es una célula procariota. En algunas realizaciones, la célula procariota que incluye los polirribonucleótidos descritos en la presente puede ser una célula bacteriana o una célula arquea. Por ejemplo, la célula procariota que incluye los polirribonucleótidos descritos en la presente puede ser E coli, arqueas halófilas (por ejemplo, Haloferax volcaniii), Sphingomonas, cianobacterias (por ejemplo, Synechococcus elongatus, Spirulina (Arthrospira) spp. y Synechocystis spp.), Streptomyces, actinomicetos (por ejemplo, Nonomuraea, Kitasatospora o Thermobifida), Bacillus spp. (por ejemplo, Bacillus subtilis, Bacillus anthracis o Bacillus cereus), betaproteobacterias (por ejemplo, Burkholderia), alfaproteobacterias (por ejemplo, Agrobacterium), Pseudomonas (por ejemplo, Pseudomonas putida) y enterobacterias. Las células procariotas pueden cultivarse en un medio de cultivo. Las células procariotas pueden estar contenidas en un biorreactor.
En algunas realizaciones, la célula es una célula eucariota. En algunas realizaciones, la célula eucariota que incluye los polirribonucleótidos descritos en la presente es una célula eucariota unicelular. En algunas realizaciones, la célula eucariota unicelular es una célula fúngica unicelular como una célula de levadura (por ejemplo, Saccharomyces cerevisiae y otras Saccharomyces spp., Brettanomyces spp., Schizosaccharomyces spp., Torulaspora spp. y Pichia spp.). En algunas realizaciones, la célula eucariota unicelulares una célula animal unicelular. Una célula animal unicelular puede ser una célula aislada de un animal multicelular y cultivada, o las células hijas de la misma. En algunas realizaciones, la célula animal unicelular puede estar desdiferenciada. En algunas realizaciones, la célula eucariota unicelular es una célula vegetal unicelular. Una célula vegetal unicelular puede ser una célula aislada de una planta multicelular y cultivada, o las células hijas de la misma. En algunas realizaciones, la célula vegetal unicelular puede estar desdiferenciada. En algunas realizaciones, la célula vegetal unicelular procede de un callo vegetal. En algunas realizaciones, la célula unicelular es un protoplasto de célula vegetal. En algunas realizaciones, la célula eucariota unicelular es una célula de alga eucariota unicelular, como un alga verde unicelular, una diatomea, un euglénido o un dinoflagelado. Ejemplos no limitativos de algas eucariotas unicelulares de interés incluyen Dunaliella salina, Chlorella vulgaris, Chlorella zofingiensis, Haematococcus pluvialis, Neochloris oleoabundans y otras Neochloris spp, Protosiphon botryoides, Botryococcus braunii, Cryptococcus spp., Chlamydomonas reinhardtii y otras Chlamydomonas spp. En algunas realizaciones, la célula eucariota unicelular es una célula protista. En algunas realizaciones, la célula eucariota unicelular es una célula protozoaria.
En algunas realizaciones, la célula eucariota es una célula de un eucariota multicelular. Por ejemplo, el eucariota multicelular puede seleccionarse del grupo formado por un animal vertebrado, un animal invertebrado, un hongo multicelular, un alga multicelular y una planta multicelular. En algunas realizaciones, el organismo eucariota es un humano. En algunas realizaciones, el organismo eucariota es un animal vertebrado no humano. En algunas realizaciones, el organismo eucariota es un animal invertebrado. En algunas realizaciones, el organismo eucariota es un hongo multicelular. En algunas realizaciones, el organismo eucariota es una planta multicelular. En algunas realizaciones, la célula eucariota es una célula humana o una célula de un mamífero no humano como un primate no humano (por ejemplo, monos, simios), ungulados (por ejemplo, bóvidos, incluyendo vacas, búfalos, bisontes, ovejas, cabras y bueyes almizcleros; cerdos; camélidos, incluyendo camellos, llamas y alpacas; ciervos, antílopes; y équidos, incluyendo caballos y asnos), carnívoros (por ejemplo, perros y gatos), roedores (por ejemplo, ratas, ratones, cobayas, hámsteres, ardillas) o lagomorfos (por ejemplo, conejos y liebres). En algunas realizaciones, la célula eucariota es una célula de ave, como un miembro de los taxones aviares Galliformes (por ejemplo, pollos, pavos, faisanes, codornices), Anseriformes (por ejemplo, patos, gansos), Paleaognathae (por ejemplo, avestruces, emúes), Columbiformes (por ejemplo, palomos, palomas) o Psittaciformes (por ejemplo, loros). En algunas realizaciones, la célula eucariota es una célula de un artrópodo (por ejemplo, insectos, arácnidos, crustáceos), un nematodo, un anélido, un helminto o un molusco. En algunas realizaciones, la célula eucariota es una célula de una planta pluricelular, como una planta angiosperma (que puede ser dicotiledónea o monocotiledónea) o una planta gimnosperma (por ejemplo, una conífera, una cicadácea, una gnetófita, un Ginkgo), un helecho, una cola de caballo, un musgo o una briofita. En algunas realizaciones, la célula eucariota es una célula de un alga multicelular eucariota.
Las células eucariotas pueden cultivarse en un medio de cultivo. Las células eucariotas pueden estar contenidas en un biorreactor.
Métodos de purificación
En los métodos descritos en la presente pueden incluirse uno o más pasos de purificación. Por ejemplo, en algunas realizaciones, el polirribonucleótido lineal está sustancialmente enriquecido o puro (por ejemplo, purificado) antes del auto-corte y empalme del polirribonucleótido lineal. En otras realizaciones, el polirribonucleótido lineal no se purifica antes del auto-corte y empalme del polirribonucleótido lineal. En algunas realizaciones, se purifica el ARN circular resultante.
La purificación puede incluir la separación o el enriquecimiento del producto de reacción deseado de uno o más componentes no deseados, como cualquier material de reacción que no haya reaccionado, subproductos, enzimas u otros componentes de reacción. Por ejemplo, la purificación del polirribonucleótido lineal después de la transcripción en un sistema libre de células (por ejemplo, transcripción in vitro) puede incluir la separación o el enriquecimiento a partir de la plantilla de ADN antes del auto-corte y empalme del polirribonucleótido lineal. La purificación del producto de ARN circular después del corte y empalme puede usarse para separar o enriquecer el ARN circular de su ARN lineal correspondiente. Los métodos de purificación del ARN son conocidos por los expertos en la técnica e incluyen la purificación enzimática o por cromatografía.
En algunas realizaciones, los métodos de purificación dan como resultado un polirribonucleótido circular que tiene menos del 50% (por ejemplo, menos del 40%, 30%, 20%, 10%, 5%, 4%, 3%, 2% o 1%) de polirribonucleótidos lineales.
Biorreactores
En algunas realizaciones, cualquier método de producción de un polirribonucleótido circular descrito en la presente puede llevarse a cabo en un biorreactor. Un biorreactor se refiere a cualquier recipiente en el que se lleve a cabo un proceso químico o biológico que implique organismos o sustancias bioquímicamente activas derivadas de tales organismos. Los biorreactores pueden ser compatibles con los métodos libres de células para la producción del ARN circular descrito en la presente. Un recipiente para un biorreactor puede incluir un matraz de cultivo, un plato o una bolsa que puede ser de un solo uso (desechable), esterilizable en autoclave o esterilizable. Un biorreactor puede ser de vidrio, de polímero o de otros materiales.
Los ejemplos de biorreactores incluyen, sin limitación, biorreactores de tanque agitado (por ejemplo, bien mezclados) y biorreactores tubulares (por ejemplo, de flujo de tapón), biorreactores airlift, tanques agitados de membrana, tanques agitados con filtro de giro, vibromezcladores, reactores de lecho fluidizado y biorreactores de membrana. El modo de funcionamiento del biorreactor puede ser por lotes o continuo. Un biorreactor es continuo cuando las corrientes de reactivo y producto se alimentan y retiran continuamente del sistema. Un biorreactor por lotes puede tener un flujo de recirculación continuo, pero sin alimentación continua de reactivos o recogida de producto.
Algunos métodos de la presente divulgación están dirigidos a la producción a gran escala de polirribonucleótidos circulares. Para los métodos de producción a gran escala, el método puede realizarse en un volumen de 1 litro (L) a 50 L, o más (por ejemplo, 5 L, 10 L, 15 L, 20 L, 25 L, 30 L, 35 L, 40 L, 45 L, 50 L, o más). En algunas realizaciones, el método puede llevarse a cabo en un volumen de 5 L a 10 L, 5 L a 15 L, 5 L a 20 L, 5 L a 25 L, 5 L a 30 L, 5 L a 35 L, 5 L a 40 L, 5 L a 45 L, 10 L a 15 L, 10 L a 20 L, 10 L a 25 L, 20 L a 30 L, 10 L a 35 L, 10 L a 40 L, 10 L a 45 L, 10 L a 50 L, 15 L a 20 L, 15 L a 25 L, 15 L a 30 L, 15 L a 35 L, 15 L a 40 L, 15 L a 45 L, o 15 a 50 L.
En algunas realizaciones, un biorreactor puede producir por lo menos 1 g de ARN circular. En algunas realizaciones, un biorreactor puede producir 1-200g de ARN circular (por ejemplo, 1-10g, 1-20g, 1-50g, 10-50g, 10-100g, 50-100g, de 50-200g de ARN circular). En algunas realizaciones, la cantidad producida se mide por litro (por ejemplo, 1-200 g por litro), por lote o reacción (por ejemplo, 1-200 g por lote o reacción), o por unidad de tiempo (por ejemplo, 1-200 g por hora o por día).
En algunas realizaciones, puede utilizarse más de un biorreactor en serie para aumentar la capacidad de producción (por ejemplo, pueden utilizarse uno, dos, tres, cuatro, cinco, seis, siete, ocho o nueve biorreactores en serie).
Métodos de uso
En algunas realizaciones, los polirribonucleótidos circulares elaborados como se describe en la presente se usan como efectores en terapia o agricultura.
Por ejemplo, un polirribonucleótido circular elaborado mediante los métodos descritos en la presente puede administrarse a un sujeto (por ejemplo, en una composición farmacéutica, veterinaria o agrícola). En algunas realizaciones, el sujeto es un animal vertebrado (por ejemplo, mamífero, ave, pez, reptil o anfibio). En algunas realizaciones, el sujeto es un ser humano. En algunas realizaciones, el sujeto es un mamífero no humano. En algunas realizaciones, el sujeto es un mamífero no humano, como un primate no humano (por ejemplo, monos, simios), un ungulado (por ejemplo, vacuno, búfalo, oveja, cabra, cerdo, camello, llama, alpaca, ciervo, caballo, burro), carnívoro (por ejemplo, perro, gato), roedor (por ejemplo, rata, ratón) o lagomorfo (por ejemplo, conejo). En algunas realizaciones, el sujeto es un ave, como un miembro de los taxones aviares Galliformes (por ejemplo, pollos, pavos, faisanes, codornices), Anseriformes (por ejemplo, patos, gansos), Paleaognathae (por ejemplo, avestruces, emúes), Columbiformes (por ejemplo, palomos, palomas) o Psittaciformes (por ejemplo, loros). En algunas realizaciones, el sujeto es un invertebrado, como un artrópodo (por ejemplo, insectos, arácnidos, crustáceos), un nematodo, un anélido, un helminto o un molusco. En algunas realizaciones, el sujeto es una plaga agrícola invertebrada o un invertebrado parásito de un huésped invertebrado o vertebrado. En algunas realizaciones, el sujeto es una planta, como una planta angiosperma (que puede ser dicotiledónea o monocotiledónea) o una planta gimnosperma (por ejemplo, una conífera, una cicadácea, un gnetófito, un Ginkgo), un helecho, una cola de caballo, un musgo o un briofito. En algunas realizaciones, el sujeto es un alga eucariota (unicelular o pluricelular). En algunas realizaciones, el sujeto es una planta de importancia agrícola u hortícola, como plantas de cultivo en hilera, plantas y árboles frutales, hortalizas, árboles y plantas ornamentales, incluidas flores ornamentales, arbustos, árboles, plantas tapizantes y céspedes.
En algunas realizaciones, la divulgación proporciona un método de modificación de un sujeto proporcionando al sujeto una composición o formulación descrita en la presente. En algunas realizaciones, la composición o formulación es o incluye una molécula de ácido nucleico (por ejemplo, una molécula de ADN o una molécula de ARN descrita en la presente), y el polinucleótido se proporciona a un sujeto eucariota. En algunas realizaciones, la composición o formulación es o incluye o una célula eucariota o procariota que incluye un ácido nucleico descrito en la presente.
En algunas realizaciones, la divulgación proporciona un método para tratar una afección en un sujeto con necesidad de ello, proporcionando al sujeto una composición o formulación descrita en la presente. En algunas realizaciones, la composición o formulación es o incluye una molécula de ácido nucleico (por ejemplo, una molécula de ADN o una molécula de ARN descrita en la presente), y el polinucleótido se proporciona a un sujeto eucariota. En algunas realizaciones, la composición o formulación es o incluye una célula eucariota o procariota que incluye un ácido nucleico descrito en la presente.
En algunas realizaciones, la divulgación proporciona un método para proporcionar un polirribonucleótido circular a un sujeto proporcionando una célula eucariota o procariota que incluye un polinucleótido descrito en la presente al sujeto.
Formulaciones
En algunas realizaciones de la presente divulgación, un polirribonucleótido circular descrito en la presente puede formularse en una composición, por ejemplo, una composición para su administración a una célula, una planta, un animal invertebrado, un animal vertebrado no humano o un sujeto humano, por ejemplo, una composición agrícola, veterinaria o farmacéutica. En algunas realizaciones, el polirribonucleótido circular se formula en una composición farmacéutica. En algunas realizaciones, una composición incluye un polirribonucleótido circular y un diluyente, un portador, un adyuvante o una combinación de los mismos. En una realización particular, una composición incluye un polirribonucleótido circular descrito en la presente y un portador o un diluyente libre de cualquier portador. En algunas realizaciones, una composición que incluye un polirribonucleótido circular con un diluyente libre de cualquier portador se usa para la administración desnuda del polirribonucleótido circular a un sujeto.
Sales
En algunos casos, una composición o composición farmacéutica proporcionada en la presente comprende una o más sales. Para controlar la tonicidad, en una composición proporcionada en la presente puede incluirse una sal fisiológica como la sal de sodio. Otras sales pueden comprender cloruro de potasio, dihidrógeno fosfato de potasio, fosfato disódico, y/o cloruro de magnesio, o similares. En algunos casos, la composición se formula con una o más sales farmacéuticamente aceptables. La una o más sales farmacéuticamente aceptables pueden comprender las de los iones inorgánicos como, por ejemplo, iones de sodio, potasio, calcio, magnesio, y similares. Tales sales pueden comprender sales con ácidos inorgánicos u orgánicos como ácido clorhídrico, ácido bromhídrico, ácido fosfórico, ácido nítrico, ácido sulfúrico, ácido metanosulfónico, ácido p-toluenosulfónico, ácido acético, ácido fumárico, ácido succínico, ácido láctico, ácido mandélico, ácido málico, ácido cítrico, ácido tartárico o ácido maleico. El polirribonucleótido puede estar presente en forma lineal o circular.
Tampones/pH
Una composición o composición farmacéutica proporcionada en la presente puede comprender uno o más tampones, como un tampón Tris; un tampón borato; un tampón succinato; un tampón histidina (por ejemplo, con un adyuvante de hidróxido de aluminio); o un tampón citrato. Los tampones, en algunos casos, se incluyen en el intervalo de 5-20 mM.
Una composición o composición farmacéutica proporcionada en la presente puede tener un pH entre aproximadamente 5,0 y aproximadamente 8,5, entre aproximadamente 6,0 y aproximadamente 8,0, entre aproximadamente 6,5 y aproximadamente 7,5, o entre aproximadamente 7,0 y aproximadamente 7,8. La composición o composición farmacéutica puede tener un pH de aproximadamente 7. El polirribonucleótido puede estar presente o en forma lineal o circular.
Detergentes/surfactantes
Una composición o composición farmacéutica proporcionada en la presente puede comprender uno o más detergentes y/o surfactantes, dependiendo de la vía de administración prevista, por ejemplo, surfactantes de ésteres de sorbitán polioxietilenado (comúnmente denominados "Tweens"), por ejemplo, polisorbato 20 y polisorbato 80; copolímeros de óxido de etileno (EO), óxido de propileno (PO) y/u óxido de butileno (BO), vendidos bajo la marca DOWFAX™, como copolímeros en bloque lineales E<o>/PO; octoxinoles, que pueden variar en el número de grupos etoxi (oxi-I,2-etanodiil) repetidos, por ejemplo, octoxinol-9 (Triton X-100, o t-octilfenoxipolietoxietanol); (octilfenoxi)polietoxietanol (IGEPAL CA-630/NP-40); fosfolípidos como la fosfatidilcolina (lecitina); etoxilatos de nonilfenol, como la serie Tergitol™ NP; éteres grasos de polioxietileno derivados de los alcoholes laurílico, cetílico, estearílico y oleílico (conocidos como surfactantes Brij), como el éter monolaurílico de trietilenglicol (Brij 30); y ésteres de sorbitán (comúnmente conocidos como "SPAN"), como trioleato de sorbitán (Span 85) y monolaurato de sorbitán, un octoxinol (como octoxinol-9 (Triton X-100) o t-octilfenoxipolietoxietanol), un bromuro de cetil trimetil amonio ("CTAB"), o desoxicolato sódico. El uno o más detergentes y/o surfactantes pueden estar presentes sólo en cantidades traza. En algunos casos, la composición puede incluir menos de 1 mg/ml de cada uno de octoxinol-10 y polisorbato 80. En la presente pueden usarse surfactantes no iónicos. Los surfactantes pueden clasificarse por su "HLB" (equilibrio hidrófilo/lipófilo). En algunos casos, los surfactantes tienen un HLB de por lo menos 10, por lo menos 15 y/o por lo menos 16. El polirribonucleótido puede estar presente en forma lineal o circular.
Diluyentes
En algunas realizaciones, una composición de la divulgación incluye un polirribonucleótido circular y un diluyente. En algunas realizaciones, una composición de la divulgación incluye un polirribonucleótido lineal y un diluyente.
Un diluyente puede ser un excipiente no portador. Un excipiente no portador sirve como vehículo o medio para una composición, como un polirribonucleótido circular como se describe en la presente. Un excipiente no portador sirve como vehículo o medio para una composición, como un polirribonucleótido lineal como se describe en la presente. Ejemplos no limitativos de un excipiente no portador incluyen solventes, solventes acuosos, solventes no acuosos, medios de dispersión, diluyentes, dispersiones, auxiliares de suspensión, agentes surfactantes, agentes isotónicos, agentes espesantes, agentes emulsionantes, conservantes, polímeros, péptidos, proteínas, células, hialuronidasas, agentes dispersantes, agentes granulantes, agentes disgregantes, agentes aglutinantes, agentes tamponantes (por ejemplo, solución salina tamponada con fosfato (PBS)), agentes lubricantes, aceites y mezclas de los mismos. Un excipiente no portador puede ser cualquiera de los ingredientes inactivos aprobados por la Administración de Alimentos y Medicamentos de los Estados Unidos (FDA) y enumerados en la Base de Datos de Ingredientes Inactivos que no presente un efecto de penetración celular. Un excipiente no portador puede ser cualquier ingrediente inactivo adecuado para la administración a un animal no humano, por ejemplo, adecuado para uso veterinario. La modificación de composiciones adecuadas para la administración a humanos para hacer que las composiciones sean adecuadas para la administración a varios animales es bien conocida, y el farmacólogo veterinario con conocimientos normales puede diseñar y/o realizar dicha modificación con una experimentación meramente ordinaria, si la hubiese.
En algunas realizaciones, el polirribonucleótido circular puede administrarse como una formulación de administración desnuda, por ejemplo, que incluya un diluyente. Una formulación de administración desnuda administra un polirribonucleótido circular a una célula sin la ayuda de un portador y sin modificación o encapsulación parcial o completa del polirribonucleótido circular, polirribonucleótido con caperuza o complejo del mismo.
Una formulación de administración desnuda es una formulación que no contiene un portador y en donde el polirribonucleótido circular no tiene una modificación covalente que se une a una fracción que ayuda a la administración a una célula o sin encapsulación parcial o completa del polirribonucleótido circular. En algunas realizaciones, un polirribonucleótido circular sin una modificación covalente que se une a una fracción que ayuda a la administración a una célula es un polirribonucleótido que no está unido covalentemente a una proteína, molécula pequeña, partícula, polímero o biopolímero. Un polirribonucleótido circular sin modificación covalente que se une a una fracción que ayuda a la administración a una célula no contiene un grupo fosfato modificado. Por ejemplo, un polirribonucleótido circular sin una modificación covalente que se une a una fracción que ayuda a la administración a una célula no contiene fosforotioato, fosforoselenatos, boranofosfatos, ésteres de boranofosfato, fosfonatos de hidrógeno, fosforamidatos, fosforodiamidatos, fosfonatos de alquilo o arilo, o fosfotriesteres.
En algunas realizaciones, una formulación de administración desnuda está libre de alguno o todos de los siguientes: reactivos de transfección, portadores catiónicos, portadores de carbohidratos, portadores de nanopartículas o portadores de proteínas. En algunas realizaciones, una formulación de administración desnuda no contiene ftoglicógeno octenil succinato, fitoglicógeno beta-dextrina, fitoglicógeno beta-dextrina modificado con anhídrido, lipofectamina, polietilenimina, poli(trimetilenimina), poli(tetrametilenimina), polipropilenimina, aminoglucósido-poliamina, dideoxi-diamino-b-ciclodextrina, espermina, espermidina, polimetacrilato de 2-(dimetilamino)etilo, poli(lisina), poli(histidina), poli(arginina), gelatina cationizada, dendrímeros, quitosano, 1,2-dioleoil-3-trimetilamonio-propano (DOTAP), cloruro de N-[1-(2,3-dioleoiloxi)propil]-N,N,N-trimetilamonio (DOTMA), cloruro de 1- [2-(oleooiloxi)etil]-2-oleil-3-(2- hidroxietil)imidazolinio (DOTIM), trifluoroacetato de 2,3-dioleiloxi-N-[2(esperminecarboxamido)etil]-N,N-dimetil-I-propanaminio (DOSPA), Clorhidrato de 3B-[N-(N\N'-Dimetilaminoetano)-carbamoil]colesterol (DC-Colesterol HC1), diheptadecilamidoglicilo espermidina (DOGS), bromuro de N,N-distearil-N,N-dimetilamonio (DDAB), bromuro de N-(1,2-dimiristiloxiprop-3-il)-N,N-dimetil-N-hidroxietilamonio (DMRIE), cloruro de N,N-dioleil-N,N-dimetilamonio (DODAC), albúmina sérica humana (HSA), lipoproteína de baja densidad (LDL), lipoproteína de alta densidad (HDL) o globulina.
En ciertas realizaciones, una formulación de administración desnuda incluye un excipiente no portador. En algunas realizaciones, un excipiente no portador incluye un ingrediente inactivo que no presenta un efecto de penetración celular. En algunas realizaciones, un excipiente no portador incluye un tampón, por ejemplo PBS. En algunas realizaciones, un excipiente no portador es un solvente, un solvente no acuoso, un diluyente, un auxiliar de suspensión, un agente surfactante, un agente isotónico, un agente espesante, un agente emulsionante, un conservante, un polímero, un péptido, una proteína, una célula, una hialuronidasa, un agente dispersante, un agente de granulación, un agente disgregador, un agente aglutinante, un agente tampón, un agente lubricante o un aceite.
En algunas realizaciones, una formulación de administración desnuda incluye un diluyente. El diluyente puede ser líquido o sólido. En algunas realizaciones, un diluyente es un agente solubilizante de ARN, un tampón o un agente isotónico. Los ejemplos de un agente solubilizante de ARN incluyen agua, etanol, metanol, acetona, formamida y 2-propanol. Los ejemplos de tampón incluyen el ácido 2-(N-morfolino)etanosulfónico (MES), Bis-Tris, ácido 2-[(2-amino-2- oxoetil)-(carboximetil)amino]acético (ADA), ácido N-(2-acetamido)-2-aminoetanosulfónico (ACES), piperazina-N,N'-bis(ácido 2-etanosulfónico) (PIPES), ácido 2-[[1,3-dihidroxi-2-(hidroximetil)propan-2-il]amino]etanosulfónico (TES), ácido 3-(N-morfolino)propanesulfónico (MOPS), ácido 4-(2-hidroxietil)-1-piperazinaetanosulfónico (HEPES), Tris, Tricina, Gly-Gly, Bicina o fosfato. Algunos ejemplos de agentes isotónicos son la glicerina, el manitol, el polietilenglicol, el propilenglicol, la trehalosa o la sacarosa.
Portadores
En algunas realizaciones, una composición de la divulgación incluye un polirribonucleótido circular y un portador. En algunas realizaciones, una composición de la divulgación incluye un polirribonucleótido lineal y un portador.
En ciertas realizaciones, una composición incluye un polirribonucleótido circular como se describe en la presente en una vesícula u otro portador basado en membrana. En ciertas realizaciones, una composición incluye un polirribonucleótido lineal como se describe en la presente en una vesícula u otro portador basado en membrana.
En otras realizaciones, una composición incluye el polirribonucleótido circular en o a través de una célula, vesícula u otro portador basado en membrana. En otras realizaciones, una composición incluye el polirribonucleótido lineal en o a través de una célula, vesícula u otro portador basado en membrana. En una realización, una composición incluye el polirribonucleótido circular en liposomas u otras vesículas similares. En una realización, una composición incluye el polirribonucleótido lineal en liposomas u otras vesículas similares. Los liposomas son estructuras vesiculares esféricas compuestas por una bicapa lipídica uni- o multilaminar que rodea compartimentos acuosos internos y una bicapa fosfolipídica lipófila externa relativamente impermeable. Los liposomas pueden ser aniónicos, neutros o catiónicos. Los liposomas son biocompatibles, no tóxicos, pueden administrar moléculas de fármacos tanto hidrófilas como lipófilas, proteger su carga de la degradación por enzimas plasmáticas y transportar su carga a través de membranas biológicas y de la barrera hematoencefálica (BBB) (véase, por ejemplo, una revisión de Spuch y Navarro, Journal of Drug Delivery, vol. 2011).
Las vesículas pueden elaborarse a partir de distintos tipos de lípidos; sin embargo, los fosfolípidos son los más usados para generar liposomas como portadores de fármacos. Los métodos para la preparación de lípidos vesiculares multilamelares son conocidos en la técnica (véase, por ejemplo, la Patente de Estados Unidos N° 6.693.086). Aunque la formación de vesículas puede ser espontánea cuando se mezcla una película lipídica con una solución acuosa, también puede acelerarse aplicando fuerza en forma de agitación usando un homogeneizador, un sonicador o un aparato de extrusión (véase, por ejemplo, Spuch y Navarro, Journal of Drug Delivery, vol. 2011, Identificación del artículo 469679, 12 páginas, 2011. doi:10.1155/2011/469679 para su revisión). Los lípidos extruidos pueden prepararse extruyendo a través de filtros de tamaño decreciente, como se describe en Templeton et al., Nature Biotech, 15:647-652, 1997.
En ciertas realizaciones, una composición de la divulgación incluye un polirribonucleótido circular y nanopartículas lipídicas, por ejemplo nanopartículas lipídicas descritas en la presente. En ciertas realizaciones, una composición de la divulgación incluye un polirribonucleótido lineal y nanopartículas lipídicas. Las nanopartículas lipídicas son otro ejemplo de portador que proporciona un sistema de administración biocompatible y biodegradable para una molécula de polirribonucleótido circular como se describe en la presente. Las nanopartículas lipídicas son otro ejemplo de portador que proporciona un sistema de administración biocompatible y biodegradable para una molécula de polirribonucleótido lineal como se describe en la presente. Los portadores lipídicos nanoestructurados (NLC) son nanopartículas lipídicas sólidas (SLN) modificadas que conservan las características de la SLN, mejoran la estabilidad del fármaco y la capacidad de carga, y evitan la fuga del fármaco. Las nanopartículas poliméricas (PNP) son un componente importante de la administración de fármacos. Estas nanopartículas pueden dirigir eficazmente la administración de fármacos a dianas específicas y mejorar la estabilidad y la liberación controlada de fármacos. También pueden emplearse nanopartículas lipídico-poliméricas (PLN), un nuevo tipo de portador que combina liposomas y polímeros. Estas nanopartículas poseen las ventajas complementarias de las PNP y los liposomas. Una PLN se compone de una estructura de núcleo-cubierta; el núcleo de polímero proporciona una estructura estable, y la cubierta de fosfolípido ofrece una buena biocompatibilidad. Como tales, los dos componentes aumentan la tasa de eficacia de la encapsulación del fármaco, facilitan la modificación de la superficie y evitan la fuga de fármacos solubles en agua. Para una revisión, véase, por ejemplo, Li et al. 2017, Nanomaterials 7, 122; doi:10.3390/nano7060122.
Ejemplos adicionales no limitativos de portadores son los portadores de carbohidratos (por ejemplo, un fitoglicógeno modificado con anhídrido o un material de tipo glucógeno), los portadores de proteínas (por ejemplo, una proteína enlazada covalentemente al polirribonucleótido circular o una proteína enlazada covalentemente al polirribonucleótido lineal) o los portadores catiónicos (por ejemplo, un lipopolímero catiónico o un reactivo de transfección). Los ejemplos no limitativos de portadores carbohidratos incluyen el octenil succinato de ftoglicógeno, la beta-dextrina de fitoglicógeno y la beta-dextrina de fitoglicógeno modificada con anhídrido. Los ejemplos no limitativos de portadores catiónicos incluyen lipofectamina, polietilenimina, poli(trimetilenimina), poli(tetrametilenimina), polipropilenimina, aminoglucósido-poliamina, dideoxi-diamino-b-ciclodextrina, espermina, espermidina, polimetacrilato de 2-(dimetilamino)etilo, poli(lisina), poli(histidina), poli(arginina), gelatina cationizada, dendrímeros, quitosano, I,2-Dioleoil-3- Trimetilamonio-Propano(DOTAP), cloruro de N-[1-(2,3-dioleoiloxi)propyl]-N,N,N-trimetilamonio (DOTMA), cloruro de I-[2-(oleooiloxi)etil]-2-oleil-3-(2-hidroxietil)imidazolinio (DOTIM), trifluoroacetato de 2,3-dioleiloxi-N-[2(esperminecarboxamido)etil]-N,N-dimetil-I-propanaminio (DOSPA), clorhidrato de 3B-[N-(N\N'-Dimetilaminoetano)-carbamoil]colesterol (DC-Colesterol HC1), diheptadecilamidoglil espermidina (DOGS), bromuro de N,N-distearil-N,N-dimetilamonio (DDAB), bromuro de N-(I,2-dimiristiloxiprop-3-il)-N,N-dimetil-N-hidroxietil amonio (DMRIE) y cloruro de N,N-dioleil-N,N-dimetilamonio (DODAC). Ejemplos no limitativos de portadores proteicos son la albúmina sérica humana (HSA), la lipoproteína de baja densidad (LDL), la lipoproteína de alta densidad (HDL) o la globulina.
Como vehículos de administración de fármacos para una composición o preparación de ARN circular descrita en la presente también pueden usarse exosomas. Los exosomas pueden usarse como vehículos de administración de fármacos para una composición o preparación de polirribonucleótidos lineales descrita en la presente. Para una revisión, véase Ha et al. Julio de 2016. Acta Pharmaceutica.
Como portador de una composición o preparación de ARN circular descrita en la presente también pueden usarse los glóbulos rojos diferenciados ex vivo. Los glóbulos rojos diferenciados ex vivo también pueden usarse como portadores de una composición o preparación de polirribonucleótidos lineales descrita en la presente. Véanse, por ejemplo, las Publicaciones de Patente Internacional N° WO2015/073587; WO2017/123646; WO2017/123644; WO2018/102740; WO2016/183482; WO2015/153102; WO2018/151829; WO2018/009838; Shi et al. 2014. Proc Natl Acad Sci USA. 111(28): 10131-10136; Patente de Estados Unidos 9.644.180; Huang et al. 2017. Nature Communications 8: 423; Shi et al. 2014. Proc Natl Acad Sci USA. 111(28): 10131-10136.
Como portadores para administrar una molécula de polirribonucleótido circular descrita en la presente también pueden usarse las composiciones fusosómicas, por ejemplo, como se describe en la Publicación de Patente Internacional N° WO2018/208728. Como portadores para administrar una molécula de polirribonucleótido lineal descrita en la presente también pueden usarse las composiciones fusosómicas, por ejemplo, como se describe en la WO2018/208728,.
Como portadores para administrar a las células diana una molécula de polirribonucleótidos circular descrita en la presente también pueden usarse los virosomas y las partículas similares a virus (VLP). Los virosomas y las partículas similares a virus (VLP) también pueden usarse como portadores para administrar a las células diana una molécula de polirribonucleótido lineal descrita en la presente.
Como portadores para administrar la composición o preparación de ARN circular descrita en la presente también pueden usarse las nanovesículas vegetales y los paquetes mensajeros vegetales (PMP), por ejemplo, como se describen en las Publicaciones de Patente Internacional N° WO2011/097480, WO2013/070324, WO2017/004526, o WO2020/041784. Las nanovesículas vegetales y los paquetes mensajeros vegetales (PMP) también pueden usarse como portadores para administrar una composición o preparación de polirribonucleótidos lineales descrita en la presente.
Como portadores para administrar una molécula de polirribonucleótido circular descrita en la presente también pueden usarse las microburbujas. Las microburbujas también pueden usarse como portadores para administrar una molécula de polirribonucleótido lineal descrita en la presente. Véase, por ejemplo, US7115583; Beeri, R. et al., Circulation. 2002; Bez, M. et al., Nat Protoc. abril de 2019; 14(4): 1015-1026; Hernot, S. et al., Adv Drug Deliv Rev. 2008; Rychak, J.J. et al., Adv Drug Deliv Rev. junio de 2014; 72: 82-93. En algunas realizaciones, las microburbujas son microburbujas de perfluorocarbono recubiertas de albúmina.
El portador que incluye los polirribonucleótidos circulares descritos en la presente puede incluir una pluralidad de partículas. Las partículas pueden tener un tamaño mediano de artículo de 30 a 700 nanómetros (por ejemplo, de 30 a 50, de 50 a 100, de 100 a 200, de 200 a 300, de 300 a 400, de 400 a 500, de 500 a 600, de 600 a 700, de 100 a 500, de 50 a 500, o de 200 a 700 nanómetros). El tamaño de la partícula puede optimizarse para favorecer el depósito de la carga útil, incluido el polirribonucleótido circular, en una célula. El depósito del polirribonucleótido circular en ciertos tipos de células puede favorecer diferentes tamaños de partícula. Por ejemplo, el tamaño de la partícula puede optimizarse para el depósito del polirribonucleótido circular en células presentadoras de antígeno. El tamaño de partícula puede optimizarse para el depósito del polirribonucleótido circular en células dendríticas. Además, el tamaño de las partículas puede optimizarse para depositar el polirribonucleótido circular en las células de los ganglios linfáticos de drenaje.
Nanopartículas lipídicas
Las composiciones, métodos y sistemas de administración proporcionados por la presente divulgación pueden emplear cualquier portador o modalidad de administración adecuados descritos en la presente, incluyendo, en ciertas realizaciones, nanopartículas lipídicas (LNP). Las nanopartículas lipídicas, en algunas realizaciones, comprenden uno o más lípidos iónicos, como lípidos no catiónicos (por ejemplo, lípidos neutros o aniónicos, o zwitteriónicos); uno o más lípidos conjugados (como los lípidos conjugados con PEG o los lípidos conjugados con polímeros descritos en la Tabla 5 de la WO2019217941); uno o más esteroles (por ejemplo, colesterol).
Los lípidos que pueden usarse en formaciones de nanopartículas (por ejemplo, nanopartículas lipídicas) incluyen, por ejemplo, los descritos en la Tabla 4 de la WO2019217941 -por ejemplo, una nanopartícula que contiene lípidos puede comprender uno o más de los lípidos de la Tabla 4 de la WO2019217941. Las nanopartículas lipídicas pueden incluir elementos adicionales, como polímeros, como los polímeros descritos en la Tabla 5 de la WO2019217941.
En algunas realizaciones, los lípidos conjugados, cuando los hay, pueden incluir uno o más de PEG-diacilglicerol (DAG) (como I-(monometoxi-polietilenglicol)-2,3-dimiristoilglicerol (PEG-DMG)), PEG-dialquiloxipropilo (DAA), PEG-fosfolípido, PEG-ceramida (Cer), una fosfatidiletanoloamina pegilada (PEG-PE), PEG succinato de diacilglicerol (PEGS-DAG) (como 4-0-(2',3'-di(tetradecanoiloxi)propil-I-0-(w-metoxi(polietoxi)etil)butanodioato (PEG-S-DMG)), PEG dialcoxipropilcarbam, sal sódica de N-(carbonil-metoxi-poli etilenglicol 2000)-1,2-distearoil-sn-glicero-3-fosfoetanolamina, y los descritos en la Tabla 2 de la WO2019051289, y combinaciones de los anteriores.
En algunas realizaciones, los esteroles que pueden incorporarse en nanopartículas lipídicas incluyen uno o más de colesterol o derivados del colesterol, como los de la WO2009/127060 o la US2010/0130588. Esteroles adicionales ejemplares incluyen los fitoesteroles, incluyendo los descritos en Eygeris et al. (2020), dx.doi.org/10.1021/acs.nanolett.0c01386.
En algunas realizaciones, la partícula lipídica comprende un lípido ionizable, un lípido no catiónico, un lípido conjugado que inhibe la agregación de partículas y un esterol. Las cantidades de estos componentes pueden variarse independientemente y para lograr las propiedades deseadas. Por ejemplo, en algunas realizaciones, la nanopartícula lipídica comprende un lípido ionizable en una cantidad de aproximadamente el 20% molar a aproximadamente el 90% molar de los lípidos totales (en otras realizaciones puede ser del 20-70% (molar), 30-60% (molar) o 40-50% (molar); de aproximadamente el 50% molar a aproximadamente el 90% molar del total de lípidos presentes en la nanopartícula lipídica), un lípido no catiónico en una cantidad de aproximadamente el 5% molar a aproximadamente el 30% molar del total de lípidos, un lípido conjugado en una cantidad de aproximadamente el 0,5% molar a aproximadamente el 20% molar del total de lípidos, y un esterol en una cantidad de aproximadamente el 20% molar a aproximadamente el 50% molar de los lípidos totales. La proporción entre lípidos totales y ácido nucleico puede variar según se desee. Por ejemplo, la proporción lípido total/ácido nucleico (masa o peso) puede ser de aproximadamente 10:1 a aproximadamente 30:1.
En algunas realizaciones, la proporción lípido/ácido nucleico (proporción masa/masa; proporción p/p) puede estar en el intervalo de aproximadamente 1:1a aproximadamente 25:1, de aproximadamente 10:1a aproximadamente 14:1, de aproximadamente 3:1 a aproximadamente 15:1, de aproximadamente 4:1 a aproximadamente 10:1, de aproximadamente 5:1a aproximadamente 9:1, o de aproximadamente 6:1a aproximadamente 9:1. Las cantidades de lípidos y ácido nucleico pueden ajustarse para proporcionar la proporción N/P deseada, por ejemplo, proporción N/P de 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 o superior. En general, el contenido total de lípidos de la formulación de nanopartículas lipídicas puede variar de aproximadamente 5 mg/ml ya aproximadamente 30 mg/ml.
Algunos ejemplos no limitativos de compuestos lipídicos que pueden usarse (por ejemplo, en combinación con otros componentes lipídicos) para formar nanopartículas lipídicas para la administración de las composiciones descritas en la presente, por ejemplo, ácido nucleico (por ejemplo, ARN (por ejemplo, polirribonucleótido circular, polirribonucleótido lineal)) descritas en la presente incluyen,
En algunas realizaciones, para administrar a las células una composición de polirribonucleótidos (por ejemplo, un polirribonucleótido circular, un polirribonucleótido lineal) descrita en la presente se usa una LNP que comprende la Fórmula (i).
En algunas realizaciones, ara administrar a las células una composición de polirribonucleótidos (por ejemplo, un polirribonucleótido circular, un polirribonucleótido lineal) descrita en la presente se usa una LNP que comprende la Fórmula (ii) p.
En algunas realizaciones, para administrar a las células una composición de polirribonucleótidos (por ejemplo, un polirribonucleótido circular, un polirribonucleótido lineal) descrita en la presente se usa una LNP que comprende la Fórmula (iii).
En algunas realizaciones, para administrar a las células una composición de polirribonucleótidos (por ejemplo, un polirribonucleótido circular, un polirribonucleótido lineal) descrita en la presente se usa una LNP que comprende Fórmula (v).
En algunas realizaciones, para administrar a las células una composición de polirribonudeótidos (por ejemplo, un polirribonudeótido circular, un polirribonudeótido lineal) descrita en la presente se usa una LNP que comprende la Fórmula (vi).
En algunas realizaciones, para administrar a las células una composición de polirribonucleótidos (por ejemplo, un polirribonudeótido circular, un polirribonudeótido lineal) descrita en la presente se usa una LNP que comprende la Fórmula (viii).
En algunas realizaciones, para administrar a las células una composición de polirribonucleótidos (por ejemplo, un polirribonudeótido circular, un polirribonudeótido lineal) descrita en la presente se usa una LNP que comprende la Fórmula (ix).
en donde
X1 es O, NR1, o un enlace directo, X2 es alquileno C2-5, X3 es C(=O) o un enlace directo, R1 es H o Me, R3 es alquilo C1-3, R2 es alquilo C1-3, o R2 junto con el átomo de nitrógeno al que está unido y 1-3 átomos de carbono de X2 forman un anillo de 4, 5 o 6 miembros, o X1 es NR1, R1 y R2 junto con los átomos de nitrógeno a los que están unidos forman un anillo de 5 o 6 miembros, o R2 junto con R3 y el átomo de nitrógeno al que están unidos forman un anillo de 5, 6 o 7 miembros, Y1 es alquileno C2-12, Y2 se selecciona entre
(en cualquier orientación), (en cualquier orientación), (en cualquier orientación),
n es de 0 a 3, R4 es alquilo C1-15, Z1 es alquileno C1-6 o un enlace directo,
(en cualquier orientación) o está ausente, siempre que si Z1 es un enlace directo, Z2 esté ausente;
R5 es alquilo C5-9 o alcoxi C6-10, R6 es alquilo C5-9 o alcoxi C6-10, W es metileno o un enlace directo, y R7 es H o Me, o una sal de los mismos, siempre que si R3 y R2 son alquilos C2, X1 sea O, X2 sea alquileno lineal C3,
X3 es C(=0), Y1 es alquileno Ce lineal, (Y2)n-R4 es
, R4 es alquilo lineal C5, Z1 es alquileno C2, Z2 está ausente, W es metileno y R7 es H, entonces R5 y R6 no son alcoxi Cx.
En algunas realizaciones, para administrar a las células una composición de polirribonucleótidos (por ejemplo, un polirribonucleótido circular, un polirribonucleótido lineal) descrita en la presente se usa una LNP que comprende la Fórmula (xii).
En algunas realizaciones, para administrar a las células una composición de polirribonucleótidos (por ejemplo, un polirribonucleótido circular, un polirribonucleótido lineal) descrita en la presente se usa una LNP que comprende la Fórmula (xi).
donde R=
En algunas realizaciones, una LNP comprende un compuesto de Formula (xiii) y un compuesto de Formula (xiv).
En algunas realizaciones, para administrar a las células una composición de polirribonucleótidos (por ejemplo, un polirribonucleótido circular, un polirribonucleótido lineal) descrita en la presente se usa una LNP que comprende la Fórmula (xv).
En algunas realizaciones, para administrar a las células una composición de polirribonucleótidos (por ejemplo, un polirribonucleótido circular, un polirribonucleótido lineal) descrita en la presente se usa una LNP que comprende una formulación de Fórmula (xvi).
donde X=
En algunas realizaciones, un compuesto lipidico usado para formar nanoparticulas lipidicas para la administración de composiciones descritas en la presente, por ejemplo, ácido nucleico (por ejemplo, ARN (por ejemplo, polirribonucleótido circular, polirribonucleótido lineal)) descrito en la presente se realiza mediante una de las siguientes reacciones:
En algunas realizaciones, para administrar a las células una composición de polirribonucleótidos (por ejemplo, un polirribonucleótido circular, un polirribonucleótido lineal) descrita en la presente se usa una LNP que comprende la Fórmula (xxi). En algunas realizaciones, la LNP de Fórmula (xxi) es una LNP descrita por la WO2021113777 (por ejemplo, un lípido de Fórmula (1) como un lípido de la Tabla 1 de la WO2021113777).
en donde
cada n es independientemente un número entero comprendido entre 2-15; Li y L3 son cada uno independientemente -OC(O)-* o - C(O)O-*, en donde "*" indica el punto de unión a R1o R3;
R1 y R3 son cada uno independientemente un alquenilo C9-C20 o un alquilo C9-C20 lineal o ramificado, opcionalmente sustituido por uno o más sustituyentes seleccionados de un grupo que consiste en oxo, halo, hidroxi, ciano, alquilo, alquenilo, aldehido, heterocicloalquilo, hidroxialquilo, dihidroxialquilo, hidroxialquilaminoalquilo, aminoalquilo, alquilaminoalquilo, dialquilaminoalquilo, (heterociclilo)(alquilo)aminoalquilo, heterociclilo, heteroarilo, alquilheteroarilo, alquinilo, alcoxi, amino, dialquilamino, aminoalquilcarbonilamino, aminocarbonilalquilamino, (aminocarbonilalquil)(alquil)amino, alquenilcarbonilamino, hidroxicarbonilo, alquiloxicarbonilo, aminocarbonilo, aminoalquilaminocarbonilo, alquilaminoalquilaminocarbonilo, dialquilaminoalquilaminocarbonilo, heterociclilalquilaminocarbonilo, (alquilaminoalquil)(alquil)aminocarbonilo, alquilaminoalquilcarbonilo, dialquilaminoalquilcarbonilo, heterociclilcarbonilo, alquenilcarbonilo, alquinilcarbonilo, alquilsulfóxido, alquilsulfoxidoalquilo, alquilsulfonil y alquilsulfonilalquilo; y
R2 se selecciona del grupo que consiste en:
En algunas realizaciones, para administrar a las células una composición de polirribonucleótidos (por ejemplo, un polirribonucleótido circular, un polirribonucleótido lineal) descrita en la presente se usa una LNP que comprende la Fórmula (xxii). En algunas realizaciones, la LNP de Fórmula (xxii) es una LNP descrita por la WO2021113777 (por ejemplo, un lípido de Fórmula (2) como un lípido de la Tabla 2 de la WO2021113777).
en donde
cada n es independientemente un número entero de 1-15;
Ri y R2 se seleccionan cada uno independientemente de un grupo que consiste en:
R3 se selecciona del grupo que consiste en:
En algunas realizaciones, para administrar a las células una composición de polirribonucleótidos (por ejemplo, un polirribonucleótido circular, un polirribonucleótido lineal) descrita en la presente se usa una LNP que comprende la Fórmula (xxiii). En algunas realizaciones, la LNP de Fórmula (xxiii) es una LNP descrita por la WO2021113777 (por ejemplo, un lípido de Fórmula (3) como un lípido de la Tabla 3 de la WO2021113777).
en donde
X se selecciona entre -O-, -S-, o -OC(O)-*, en donde * indica el punto de unión a R i;
Ri se selecciona del grupo que consiste en:
y R2 se selecciona del grupo que consiste en
En algunas realizaciones, una composición descrita en la presente (por ejemplo, un ácido nucleico (por ejemplo, un polirribonucleótido circular, un polirribonucleótido lineal) o una proteína) se proporciona en una LNP que comprende un lípido ionizable. En algunas realizaciones, el lípido ionizable es heptadecan-9-il 8-((2-hidroxietil)(6-oxo-6-(undeciloxi)hexil)amino)octanoato (SM-102); por ejemplo, como se describe en el Ejemplo 1 de la US9,867,888. En algunas realizaciones, el lípido ionizable es 9Z,12Z)-3-((4,4-bis(octiloxi)butanoil)oxi)-2-((((3-(dietilamino)propoxi)carbonil)oxi)metil)propil octadeca-9,12-dienoato (LP01), por ejemplo, como se sintetiza en el Ejemplo 13 de la WO2015/095340. En algunas realizaciones, el lípido ionizable es Di((Z)-non-2-en-1-il) 9-((4-dimetilamino)butanoil)oxi)heptadecanedioato (L319), por ejemplo, como se sintetizó en el Ejemplo 7, 8 o 9 de la US2012/0027803. En algunas realizaciones, el lípido ionizable es 1,1'-((2-(4-(2-((2-(Bis(2-hidroxidodecil)amino)etil)(2hidroxidodecil) amino)etil)piperazin-1-il)etil)azanediil)bis(dodecan-2-ol) (C12-200), por ejemplo, como se sintetiza en los Ejemplos 14 y 16 de la WO2010/053572. En algunas realizaciones, el lípido ionizable es el lípido éster de colesterol de imidazol (ICE) (3S, 10R, 13R, 17R)-10, 13-dimetil-17- ((R)-6-metilheptano-2-il)-2, 3, 4, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17-tetradecahidro-IH-ciclopenta[a]fenantren-3-il 3-(1H-imidazol-4-il)propanoato, por ejemplo, la Estructura (I) de la WO2020/106946.
En algunas realizaciones, un lípido ionizable puede ser un lípido catiónico, un lípido catiónico ionizable, por ejemplo, un lípido catiónico que puede existir en una forma cargada positivamente o neutra dependiendo del pH, o un lípido que contiene amina que puede protonarse fácilmente. En algunas realizaciones, el lípido catiónico es un lípido capaz de estar cargado positivamente, por ejemplo, en condiciones fisiológicas. Los lípidos catiónicos ejemplares incluyen uno o más grupos aminas que lleven carga positiva. En algunas realizaciones, la partícula lipídica comprende un lípido catiónico en formulación con uno o más de los lípidos neutros, lípidos ionizables que contienen amina, lípidos alquino biodegradables, esteroides, fosfolípidos incluyendo lípidos poliinsaturados, lípidos estructurales (por ejemplo, esteroles), PEG, colesterol y lípidos conjugados con polímeros. En algunas realizaciones, el lípido catiónico puede ser un lípido catiónico ionizable. Un lípido catiónico ejemplar como se describe en la presente puede tener un pKa efectivo superior a 6,0. En algunas realizaciones, una nanopartícula lipídica puede comprender un segundo lípido catiónico que tenga un pKa efectivo diferente (por ejemplo, mayor que el primer pKa efectivo) que el primer lípido catiónico. Una nanopartícula lipídica puede comprender entre el 40 y el 60 por ciento en moles de un lípido catiónico, un lípido neutro, un esteroide, un lípido conjugado con polímero, y un agente terapéutico, por ejemplo, un ácido nucleico (por ejemplo, ARN (por ejemplo, un polirribonucleótido circular, un polirribonucleótido lineal)) descrito en la presente, encapsulado dentro o asociado con la nanopartícula lipídica. En algunas realizaciones, el ácido nucleico está coformulado con el lípido catiónico. El ácido nucleico puede adsorberse a la superficie de una LNP, por ejemplo, una LNP que comprende un lípido catiónico. En algunas realizaciones, el ácido nucleico puede estar encapsulado en una LNP, por ejemplo, una LNP que comprende un lípido catiónico. En algunas realizaciones, la nanopartícula lipídica puede comprender una fracción diana, por ejemplo, recubierta con un agente diana. En algunas realizaciones, la formulación de la LNP es biodegradable. En algunas realizaciones, una nanopartícula lipídica que comprende uno o más lípidos descritos en la presente, por ejemplo, Fórmula (i), (ii), (ii), (vii) y/o (ix) encapsula por lo menos el 1%, por lo menos el 5%, por lo menos el 10%, por lo menos el 20%, por lo menos el 30%, por lo menos el 40%, por lo menos el 50%, por lo menos el 60%, por lo menos el 70%, por lo menos el 80%, por lo menos el 90%, por lo menos el 92%, por lo menos el 95%, por lo menos el 97%, por lo menos el 98% o el 100% de una molécula de ARN.
Los lípidos ionizables ejemplares que pueden usarse en formulaciones de nanopartículas lipídicas incluyen, sin limitación, los enumerados en la Tabla 1 del documento WO2019051289. Lípidos ejemplares adicionales incluyen, sin limitación, una o más de las siguientes fórmulas: X del documento US2016/0311759; I del documento US20150376115 o in US2016/0376224; I, II o III del documento US20160151284; I, IA, II, o IIA del documento US20170210967; I-c del documento US20150140070; A del documento US2013/0178541; I del documento US2013/0303587 o US2013/0123338; I del documento US2015/0141678; II, III, IV, o V del documento US2015/0239926; I del documento US2017/0119904; I o II del documento WO2017/117528; A del documento US2012/0149894; A del documento US2015/0057373; A del documento WO2013/116126; A del documento US2013/0090372; A del documento US2013/0274523; A del documento US2013/0274504; A del documento US2013/0053572; A del documento WO2013/016058; A del documento WO2012/162210; I del documento US2008/042973; I, II, III, o IV del documento US2012/01287670; I o II del documento US2014/0200257; I, II, o III del documento US2015/0203446; I o III del documento US2015/0005363; I, IA, IB, IC, ID, II, IIA, IIB, IIC, IID, o III-XXIV del documento US2014/0308304; del documento US2013/0338210; I, II, III, o IV del documento WO2009/132131; A del documento US2012/01011478; I o XXXV del documento US2012/0027796; XIV o XVII del documento US2012/0058144; del documento US2013/0323269; I del documento US2011/0117125; I, II, o III del documento US2011/0256175; I, II, III, IV, V, VI, VII, VIII, IX, X, XI, XII del documento US2012/0202871; I, II, III, IV, V, VI, VII, VIII, X, XII, XIII, XIV, XV, o XVI del documento US2011/0076335; I o II del documento US2006/008378; I del documento US2013/0123338; I o X-A-Y-Z del documento US2015/0064242; XVI, XVII, o XVIII del documento US2013/0022649; I, II, o III del documento US2013/0116307; I, II, o III del documento US2013/0116307; I o II del documento US2010/0062967; I-X del documento US2013/0189351; I del documento US2014/0039032; V del documento US2018/0028664; I del documento US2016/0317458; I del documento US2013/0195920; 5, 6, o 10 del documento US10,221,127; III-3 del documento WO2018/081480; I-5 o I-8 del documento WO2020/081938; 18o 25 del documento US9,867,888; A del documento US2019/0136231; II del documento WO2020/219876; 1 del documento US2012/0027803; OF-02 del documento US2019/0240349; 23 del documento US10,086,013; cKK-E12/A6 de Miao et al (2020); C12-200 del documento WO2010/053572; 7C1 de Dahlman et al (2017); 304-013 o 503-013 del documento Whitehead et al; TS-P4C2 del documento US9,708,628; I del documento WO2020/106946; I del documento WO2020/106946; and (1), (2), (3), o (4) del documento WO2021/113777.
Los lípidos ejemplares incluyen además un lípido de cualquiera de las Tablas 1-16 del documento WO2021/113777.
En algunas realizaciones, el lípido ionizable es MC3 (6Z,9Z,28Z,3 IZ)-heptatriaconta- 6,9,28,3 I-tetraen-I9-il-4-(dimetilamino) butanoato (DLin-MC3-DMA o MC3), por ejemplo, como se describe en el Ejemplo 9 del documento WO2019051289A9. En algunas realizaciones, el lípido ionizable es el lípido ATX-002, por ejemplo, como se describe en el Ejemplo 10 del documento WO2019051289A9. En algunas realizaciones, el lípido ionizable es (I3Z,I6Z)-A,A-dimetil-3-nonildocosa-I3,I6-dien-I-amina (Compuesto 32), por ejemplo, como se describe en el Ejemplo 11 del documento WO2019051289A9. En algunas realizaciones, el lípido ionizable es el Compuesto 6 o el Compuesto 22, por ejemplo, como se describe en el Ejemplo 12 del documento WO2019051289A9.
Los lípidos no catiónicos ejemplares incluyen, pero no se limitan a, distearoil-sn-glicero-fosfoetanolamina, distearoilfosfatidilcolina (DSPC), dioleoilfosfatidilcolina (DOPC), dipalmitoilfosfatidilcolina (DPPC), dioleoilfosfatidilglicerol (DOPG), dipalmitoilfosfatidilglicerol (DPPG), dioleoil-fosfatidiletanolamina (DOPE), palmitoilooilfosfatidilcolina (POPC), palmitoiloiletilfosfatidiletanolamina (POPE), 4-(N-maleimidometil)-ciclohexano-1-carboxilato de dioleoil-fosfatidiletanolamina (DOPE-mal), dipalmitoilfosfatidiletanolamina (DPPE), dimiristoilfosfoetanolamina (DMPE), distearoil-fosfatidiletanolamina (DSPE), monometil-fosfatidiletanolamina (como 16-O-monometil PE), dimetilfosfatidiletanolamina (como 16-O-dimetil PE), I8-I-trans PE, I-estearoil-2-oleoilfosfatidiletanolamina (SOPE), fosfatidilcolina de soja hidrogenada (HSPC), fosfatidilcolina de huevo (EPC), dioleoilfosfatidilserina (DOPS), esfingomielina (SM), dimiristoilfosfatidilcolina (DMPC), dimiristoilfosfatidilglicerol (DMPG), distearoilfosfatidilglicerol (DSPG), dierucoilfosfatidilcolina (DEPC), palmitoilolfosfatidilglicerol (POPG), dielaidoil-fosfatidiletanolamina (DEPE), lecitina, fosfatidiletanolamina, lisolecitina, lisofosfatidiletanolamina, fosfatidilserina, fosfatidilinositol, esfingomielina, esfingomielina de huevo (ESM), cefalina, cardiolipina, fosfatidicacido, cerebrósidos, dicotilfosfato, lisofosfatidilcolina, dilinoleoilfosfatidilcolina, o mezclas de los mismos. Se entiende que también pueden usarse otros fosfolípidos de diacilfosfatidilcolina y diacilfosfatidiletanolamina. Los grupos acilo de estos lípidos son preferiblemente grupos acilo derivados de ácidos grasos con cadenas de carbono C10-C24, por ejemplo, lauroilo, miristoilo, paimitoilo, estearoilo u olearoilo. Otros lípidos ejemplares, en ciertas realizaciones, incluyen, sin limitación, los descritos en Kim et al. (2020) dx.doi.org/10.1021/acs.nanolett.0c01386. Tales lípidos incluyen, en algunas realizaciones, lípidos vegetales que se ha descubierto que mejoran la transfección hepática con ARNm (por ejemplo, DGTS).
Otros ejemplos de lípidos no catiónicos adecuados para su uso en las nanopartículas lipídicas incluyen, sin limitación, lípidos no fosforados como, por ejemplo, estearilamina, dodeeilamina, hexadecilamina, palmitato de acetilo, ricinoleato de glicerol, estereato de hexadecilo, miristato de isopropilo, polímeros acrílicos anfotéricos, trietanolaminalauril sulfato, amidas de ácidos grasos polietiloxilados de alquil-aril sulfato, bromuro de diocadecil dimetil amonio, ceramida, esfingomielina y similares. Otros lípidos no catiónicos se describen en el documento WO2017/099823 o en la publicación de patente de Estados Unidos US2018/0028664.
En algunas realizaciones, el lípido no catiónico es ácido oleico o un compuesto de Fórmula I, II o IV del documento US2018/0028664. El lípido no catiónico puede comprender, por ejemplo, un 0-30% (mol) del lípido total presente en la nanopartícula lipídica. En algunas realizaciones, el contenido de lípido no catiónico es del 5-20% (mol) o del 10-15% (mol) del lípido total presente en la nanopartícula lipídica. En algunas realizaciones, la relación molar entre el lípido ionizable y el lípido neutro varía entre aproximadamente 2:1 y aproximadamente 8:1 (por ejemplo, aproximadamente 2:1, 3:1, 4:1, 5:1, 6:1, 7:1 u 8:1).
En algunas realizaciones, las nanopartículas lipídicas no comprenden ningún fosfolípido.
En algunos aspectos, la nanopartícula lipídica puede comprender además un componente, como un esterol, para proporcionar integridad a la membrana. Un esterol ejemplar que puede usarse en la nanopartícula lipídica es el colesterol y los derivados del mismo. Ejemplos no limitativos de derivados del colesterol incluyen análogos polares como 5a-colestanol, 53-coprostanol, éter colesteril-(2'-hidroxi)-etílico, éter colesteril-(4'-hidroxi)-butílico y 6-cetocolestanol; análogos no polares como 5a-colestano, colestenona, 5a-colestanona, 5p-colestanona y decanoato de colesterilo; y mezclas de los mismos. En algunas realizaciones, el derivado de colesterol es un análogo polar, por ejemplo, colesteril-(4'-hidroxi)-butil éter. Algunos ejemplos de derivados del colesterol se describen en la publicación de p Ct WO2009/127060 y en la publicación de patente de Estados Unidos US2010/0130588.
En algunas realizaciones, el componente que proporciona integridad a la membrana, como un esterol, puede comprender un 0-50% (mol) (por ejemplo, 0-10%, 10-20%, 20-30%, 30-40% o 40-50%) del lípido total presente en la nanopartícula lipídica. En algunas realizaciones, dicho componente es 20-50% (mol) 30-40% (mol) del contenido lipídico total de la nanopartícula lipídica.
En algunas realizaciones, la nanopartícula lipídica puede comprender un polietilenglicol (PEG) o una molécula lipídica conjugada. Generalmente, estos se usan para inhibir la agregación de nanopartículas lipídicas y/o proporcionar estabilización estérica. Los lípidos conjugados ejemplares incluyen, pero no se limitan a, conjugados PEG-lípido, conjugados polioxazolina (POZ)-lípido, conjugados poliamida-lípido (como los conjugados ATTA-lípido), conjugados lípido-polímero catiónico (CPL) y mezclas de los mismos. En algunas realizaciones, la molécula lipídica conjugada es un conjugado PEG-lípido, por ejemplo, un lípido conjugado con (metoxipolietilenglicol).
Los conjugados PEG-lípido ejemplares incluyen, entre otros, PEG-diacilglicerol (DAG) (como I-(monometoxipolietilenglicol)-2,3-dimiristoilglicerol (Pe G-DMG)), pEG-dialquiloxipropilo (DAA), PEG-fosfolípido, PEG-ceramida (Cer), una fosfatidiletanoloamina pegilada (PEG-PE), PEG succinato de diacilglicerol (PEGS-DAG) (como 4-0-(2',3'-di(tetradecanoiloxi)propil-1-0-(w-metoxi(polietoxi)etil) butanodioato (PEG-S-DMG)), PEG dialcoxipropilcarbam, sal sódica de N-(carbonil-metoxipolietilenglicol 2000)-I,2-distearoil-sn-glicero-3-fosfoetanolamina, o una mezcla de los mismos. Conjugados de PEG-lípido ejemplares adicionales se describen, por ejemplo, en los documentos US5,885,613, US6,287,591, US2003/0077829, US2003/0077829, US2005/0175682, US2008/0020058, US2011/0117125, US2010/0130588, US2016/0376224, US2017/0119904, y US/099823. En algunas realizaciones, un PEG-lípido es un compuesto de fórmula III, III-a-I, III-a-2, III-b-1, MI-b-2 o V del documento US2018/0028664. En algunas realizaciones, un PEG-lípido es de Fórmula II del documento US20150376115 o del US2016/0376224. En algunas realizaciones, el conjugado PEG-DAA puede ser, por ejemplo, PEG-dilauriloxipropilo, PEG-dimiristiloxipropilo, PEG-dipalmitiloxipropilo, o PEG-diesteariloxipropilo. El PEG-lípido puede ser uno o más de PEG-DMG, PEG-dilaurilglicerol, PEG-dipalmitoilglicerol, PEG-disterilglicerol, PEG-dilaurilglicamida, PEG-dimiristoilglicamida, PEG-dipalmitoilglicamida, PEG-disterilglicamida, PEG-colesterol (I-[8'-(Colest-5-en-3[beta]-oxi)carboxamido-3',6'-dioxaoctanil]carbamoil-[omega]-metil-poli(etilenglicol), PEG-DMB (3,4-Ditetradecoxilbencil-[omega]-metilpoli(etilenglicol) éter), y 1,2- dimiristoil-sn-glicero-3-fosfoetanolamina-N-[metoxi(polietilenglicol)-2000]. En algunas realizaciones, el PEG-lípido comprende PEG-DMG, 1,2-dimiristoil-sn-glicero-3-fosfoetanolamina-N-[metoxi(polietilenglicol)-2000]. En algunas realizaciones, el PEG-lípido comprende una estructura seleccionada entre:
En algunas realizaciones, también pueden usarse lípidos conjugados con una molécula distinta de un PEG en lugar de PEG-lípido. Por ejemplo, pueden usarse los conjugados de polioxazolina (POZ)-lípido, los conjugados de poliamida-lípido (como los conjugados de ATTA-lípido) y los conjugados de lípido catiónico-polímero (GPL) en lugar o además del PEG-lípido.
Los lípidos conjugados ejemplares, es decir, los PEG-lípidos, los conjugados (POZ)-lípido, los conjugados ATTA-lípido y los polímero catiónico-lípidos se describen en las solicitudes de patentes PCT y LIS enumeradas en la Tabla 2 del documento WO2019051289A9.
En algunas realizaciones, el PEG o el lípido conjugado pueden comprender el 0-20% (mol) del lípido total presente en la nanopartícula lipídica. En algunas realizaciones, el contenido de PEG o del lípido conjugado es del 0,5-10% o del 2-5% (mol) del lípido total presente en la nanopartícula lipídica. Las proporciones molares del lípido ionizable, el lípido no catiónico, el esterol y el PEG/lípido conjugado pueden variar según sea necesario. Por ejemplo, la partícula lipídica puede comprender un 30-70% de lípido ionizable en moles o en peso total de la composición, un 0-60% de colesterol en moles o en peso total de la composición, un 0-30% de lípido no catiónico en moles o en peso total de la composición y un 1-10% de lípido conjugado en moles o en peso total de la composición. Preferiblemente, la composición comprende un 30-40% de lípidos ionizables en moles o en peso total de la composición, un 40-50% de colesterol en moles o en peso total de la composición y un 10-20% de lípidos no catiónicos en moles o en peso total de la composición. En algunas otras realizaciones, la composición contiene un 50-75% de lípidos ionizables en moles o en peso total de la composición, un 20-40% de colesterol en moles o en peso total de la composición, y un 510 % d e líp id o s n o c a t ió n ic o s e n m o le s o e n p e s o to ta l d e la c o m p o s ic ió n y un 1 -10 % d e líp id o s c o n ju g a d o s e n m o le s o en p e s o to ta l d e la c o m p o s ic ió n . L a c o m p o s ic ió n p u e d e c o n te n e r un 60 -70 % d e líp id o s io n iz a b le s en m o le s o en p e s o to ta l d e la c o m p o s ic ió n , un 25 -35 % d e c o le s te ro l en m o le s o en p e s o to ta l d e la c o m p o s ic ió n , y un 5 -10 % d e líp id o s n o c a t ió n ic o s en m o le s o en p e s o to ta l d e la c o m p o s ic ió n . L a c o m p o s ic ió n ta m b ié n p u e d e c o n te n e r h a s ta un 90 % d e líp id o s io n iz a b le s e n m o le s o e n p e s o to ta l d e la c o m p o s ic ió n y e n tre un 2 y un 15 % d e líp id o s n o c a t ió n ic o s e n m o le s o en p e s o to ta l d e la c o m p o s ic ió n . L a fo rm u la c ió n ta m b ié n p u e d e s e r u n a fo rm u la c ió n d e n a n o p a r t íc u la s lip íd ic a s , p o r e je m p lo , q u e c o m p re n d a un 8 -30 % d e líp id o s io n iz a b le s e n m o le s o e n p e s o to ta l d e la c o m p o s ic ió n , un 5 -30 % d e líp id o s n o c a t ió n ic o s e n m o le s o e n p e s o to ta l d e la c o m p o s ic ió n , y un 0 -20 % d e c o le s te ro l e n m o le s o e n p e s o to ta l d e la c o m p o s ic ió n ; un 4 -25 % d e líp id o io n iz a b le e n m o le s o e n p e s o to ta l d e la c o m p o s ic ió n , un 4 -25 % de líp id o n o c a t ió n ic o e n m o le s o e n p e s o to ta l d e la c o m p o s ic ió n , un 2 -25 % d e c o le s te ro l e n m o le s o e n p e s o to ta l d e la c o m p o s ic ió n , un 10 -35 % d e líp id o c o n ju g a d o en m o le s o en p e s o to ta l d e la c o m p o s ic ió n , y un 5 % d e c o le s te ro l en m o le s o e n p e s o to ta l d e la c o m p o s ic ió n ; o un 2 -30 % d e líp id o s io n iz a b le s e n m o le s o en p e s o to ta l d e la c o m p o s ic ió n , un 2 -30 % d e líp id o s no c a t ió n ic o s en m o le s o en p e s o to ta l d e la c o m p o s ic ió n , d e un 1 a un 15 % d e c o le s te ro l en m o le s o e n p e s o to ta l d e la c o m p o s ic ió n , d e un 2 a un 35 % d e líp id o s c o n ju g a d o s en m o le s o en p e s o to ta l d e la c o m p o s ic ió n , y d e un 1 a un 20 % d e c o le s te ro l e n m o le s o en p e s o to ta l d e la c o m p o s ic ió n ; o in c lu s o h a s ta un 90 % d e líp id o s io n iz a b le s e n m o le s o en p e s o to ta l d e la c o m p o s ic ió n y un 2 -10 % d e líp id o s n o c a t ió n ic o s e n m o le s o e n p e s o to ta l d e la c o m p o s ic ió n , o in c lu s o un 100 % d e líp id o s c a t ió n ic o s en m o le s o en p e s o to ta l d e la c o m p o s ic ió n . E n a lg u n a s re a liz a c io n e s , la fo rm u la c ió n d e p a r t íc u la s lip íd ic a s c o m p re n d e líp id o io n iz a b le , fo s fo líp id o , c o le s te ro l y un líp id o P E G -ila d o e n u n a p ro p o rc ió n m o la r d e 50 : 10 :38 ,5 : 1 ,5. En a lg u n a s o tra s re a liz a c io n e s , la fo rm u la c ió n d e p a r t íc u la s lip íd ic a s c o m p re n d e líp id o io n iz a b le , c o le s te ro l y un líp id o P E G - ila d o en u n a p ro p o rc ió n m o la r d e 60 :38 ,5 : 1 ,5.
E n a lg u n a s re a liz a c io n e s , la p a r t íc u la l ip íd ic a c o m p re n d e líp id o io n iz a b le , líp id o n o c a t ió n ic o (p o r e je m p lo , fo s fo líp id o ) , un e s te ro l (p o r e je m p lo , (p o r e je m p lo , c o le s te ro l) y un líp id o P E G -ila d o , d o n d e la re la c ió n m o la r d e líp id o s v a r ía d e l 20 a l 70 p o r c ie n to m o la r p a ra e l líp id o io n iz a b le , co n un o b je t iv o d e 40 -60 , e l p o c e n ta je e n m o le s d e líp id o n o c a t ió n ic o v a r ía d e 0 a 30 , co n un o b je t iv o d e 0 a 15, e l p o rc e n ta je m o la r d e e s te ro l v a r ía d e 20 a 70 , c o n un o b je t iv o d e 30 a 50 , y e l p o rc e n ta je m o la r d e líp id o P E G -ila d o v a r ía d e 1 a 6, c o n un o b je t iv o d e 2 a 5.
E n a lg u n a s re a liz a c io n e s , la p a r t íc u la l ip íd ic a c o m p re n d e líp id o io n iz a b le / líp id o n o c a t ió n ic o / e s te ro l / líp id o c o n ju g a d o e n u n a p ro p o rc ió n m o la r d e 50 :10 :38 ,5 : 1 ,5.
L a d iv u lg a c ió n p ro p o rc io n a u n a fo rm u la c ió n d e n a n o p a r t íc u la s lip íd ic a s q u e c o m p re n d e fo s fo líp id o s , le c it in a , fo s fa t id i lc o l in a y fo s fa t id ile ta n o la m in a .
E n a lg u n a s re a liz a c io n e s , ta m b ié n p u e d e n in c lu irs e u n o o m á s c o m p u e s to s a d ic io n a le s . E s o s c o m p u e s to s p u e d e n a d m in is tra rs e p o r s e p a ra d o , o lo s c o m p u e s to s a d ic io n a le s p u e d e n in c lu irs e e n la s n a n o p a r t íc u la s lip íd ic a s . En o tra s p a la b ra s , la s n a n o p a r t íc u la s lip íd ic a s p u e d e n c o n te n e r o tro s c o m p u e s to s a d e m á s d e l á c id o n u c le ic o o p o r lo m e n o s un s e g u n d o á c id o n u c le ic o , d ife re n te d e l p r im e ro . S in l im ita c io n e s , o tro s c o m p u e s to s a d ic io n a le s p u e d e n s e le c c io n a rs e d e l g ru p o q u e c o n s is te e n m o lé c u la s o rg á n ic a s o in o rg á n ic a s p e q u e ñ a s o g ra n d e s , m o n o s a c á r id o s , d is a c á r id o s , t r is a c á r id o s , o lig o s a c á r id o s , p o lis a c á r id o s , p é p tid o s , p ro te ín a s , a n á lo g o s d e p é p tid o s y d e r iv a d o s d e los m is m o s , p e p tid o m im é tic o s , á c id o s n u c le ic o s , a n á lo g o s d e á c id o s n u c le ic o s y d e r iv a d o s , un e x tra c to h e c h o d e m a te r ia le s b io ló g ic o s , o c u a lq u ie r c o m b in a c ió n d e lo s m is m o s .
E n a lg u n a s re a liz a c io n e s , la s L N P c o m p re n d e n líp id o s b io d e g ra d a b le s io n iz a b le s . E n a lg u n a s re a liz a c io n e s , la s L N P c o m p re n d e n (9 Z , I2 Z ) -3 - ( (4 ,4 -b is (o c t i lo x i)b u ta n o il)o x i) -2 - ( ( ( (3 - (d ie t i la m in o )p ro p o x i)c a rb o n il)o x i)m e t i l )p ro p il o c ta d e c a -9 ,I2 -d ie n o a to , ta m b ié n lla m a d o 3 - ( (4 ,4 -b is (o c t i lo x i)b u ta n o il)o x i) -2 - ( ( ( (3 -(d ie t i la m in o )p ro p o x i)c a rb o n il)o x i)m e t i l) p ro p il (9 Z ,I2 Z ) -o c ta d e c a -9 ,12 -d ie n o a to ) u o tro líp id o io n iz a b le . V é a n s e , p o r e je m p lo , lo s líp id o s d e lo s d o c u m e n to s W O 2019 /067992 , W O /2017 /173054 , W O 2015 /095340 , y W O 2014 /136086 , a s í c o m o la s re fe re n c ia s p ro p o rc io n a d a s e n lo s m is m o s . E n a lg u n a s re a liz a c io n e s , lo s té rm in o s c a t ió n ic o e io n iz a b le en e l c o n te x to d e lo s líp id o s d e L N P s o n in te rc a m b ia b le s , p o r e je m p lo , en d o n d e lo s líp id o s io n iz a b le s s o n c a t ió n ic o s d e p e n d ie n d o d e l pH .
E n a lg u n a s re a liz a c io n e s , e l d iá m e tro m e d io d e la L N P d e la fo rm u la c ió n d e L N P p u e d e e s ta r e n tre 10 s d e n m y 100 s d e nm , p o r e je m p lo , m e d id o p o r d is p e rs ió n d in á m ic a d e lu z (D L S ). E n a lg u n a s re a liz a c io n e s , e l d iá m e tro m e d io d e la L N P d e la fo rm u la c ió n d e L N P p u e d e s e r d e a p ro x im a d a m e n te 40 n m a a p ro x im a d a m e n te 150 nm , c o m o d e a p ro x im a d a m e n te 40 nm , 45 nm , 50 nm , 55 nm , 60 nm , 65 nm , 70 nm , 75 nm , 80 nm , 85 nm , 90 nm , 95 nm , 100 n m , 105 nm , 110 nm , 115 nm , 120 nm , 125 nm , 130 nm , 135 nm , 140 nm , 145 nm , o 150 nm . E n a lg u n a s re a liz a c io n e s , e l d iá m e tro m e d io d e la L N P d e la fo rm u la c ió n d e L N P p u e d e s e r d e a p ro x im a d a m e n te 50 n m a a p ro x im a d a m e n te 100 nm , d e a p ro x im a d a m e n te 50 n m a a p ro x im a d a m e n te 90 n m , d e a p ro x im a d a m e n te 50 n m a a p ro x im a d a m e n te 80 n m , d e a p ro x im a d a m e n te 50 n m a a p ro x im a d a m e n te 70 nm , d e a p ro x im a d a m e n te 50 n m a a p ro x im a d a m e n te 60 nm , d e a p ro x im a d a m e n te 60 n m a a p ro x im a d a m e n te 100 nm , d e a p ro x im a d a m e n te 60 n m a a p ro x im a d a m e n te 90 nm , d e a p ro x im a d a m e n te 60 n m a a p ro x im a d a m e n te 80 nm , d e a p ro x im a d a m e n te 60 n m a a p ro x im a d a m e n te 70 nm , d e a p ro x im a d a m e n te 70 n m a a p ro x im a d a m e n te 100 nm , d e a p ro x im a d a m e n te 70 n m a a p ro x im a d a m e n te 90 nm , d e a p ro x im a d a m e n te 70 n m a a p ro x im a d a m e n te 80 nm , d e a p ro x im a d a m e n te 80 n m a a p ro x im a d a m e n te 100 nm , d e a p ro x im a d a m e n te 80 n m a a p ro x im a d a m e n te 90 nm , o d e a p ro x im a d a m e n te 90 n m a a p ro x im a d a m e n te 100 nm . En a lg u n a s re a liz a c io n e s , e l d iá m e tro m e d io d e la L N P d e la fo rm u la c ió n d e L N P p u e d e s e r d e a p ro x im a d a m e n te 70 n m a a p ro x im a d a m e n te 100 nm . E n u n a re a liz a c ió n p a rt ic u la r , e l d iá m e tro m e d io d e L N P d e la fo rm u la c ió n d e L N P p u e d e s e r d e a p ro x im a d a m e n te 80 nm . E n a lg u n a s re a liz a c io n e s , e l d iá m e tro m e d io d e L N P d e la fo rm u la c ió n d e L N P p u e d e s e r d e a p ro x im a d a m e n te 100 nm . E n a lg u n a s re a liz a c io n e s , e l d iá m e tro m e d io d e L N P d e la fo rm u la c ió n d e L N P v a r ía d e a p ro x im a d a m e n te I m m a a p ro x im a d a m e n te 500 m m , d e a p ro x im a d a m e n te 5 m m a a p ro x im a d a m e n te 200 m m , d e a p ro x im a d a m e n te 10 m m a a p ro x im a d a m e n te 100 m m , d e a p ro x im a d a m e n te 20 m m a a p ro x im a d a m e n te 80 m m , de a p ro x im a d a m e n te 25 m m a a p ro x im a d a m e n te 60 m m , d e a p ro x im a d a m e n te 30 m m a a p ro x im a d a m e n te 55 m m , d e a p ro x im a d a m e n te 35 m m a a p ro x im a d a m e n te 50 m m , o d e a p ro x im a d a m e n te 38 m m a a p ro x im a d a m e n te 42 m m .
E n a lg u n o s c a s o s , u n a L N P p u e d e s e r re la t iv a m e n te h o m o g é n e a . P u e d e u s a rs e un ín d ic e d e p o lid is p e rs id a d p a ra in d ic a r la h o m o g e n e id a d d e u n a L N P , p o r e je m p lo , la d is tr ib u c ió n d e l ta m a ñ o d e p a rt íc u la d e la s n a n o p a r t íc u la s lip íd ic a s . U n ín d ic e d e p o lid is p e rs id a d p e q u e ñ o (p o r e je m p lo , d e m e n o s d e 0 ,3 ) in d ic a g e n e ra lm e n te u n a d is tr ib u c ió n e s tre c h a d e l ta m a ñ o d e la s p a r tíc u la s . U n a L N P p u e d e te n e r un ín d ic e d e p o lid is p e rs id a d d e a p ro x im a d a m e n te 0 a a p ro x im a d a m e n te 0 ,25 , c o m o d e 0 ,01 , 0 ,02 , 0 ,03 , 0 ,04 , 0 ,05 , 0 ,06 , 0 ,07 , 0 ,08 , 0 ,09 , 0 ,10 , 0 ,11 , 0 ,12 , 0 ,13 , 0 ,14 , 0 ,15 , 0 ,16 , 0 ,17 , 0 ,18 , 0 ,19 , 0 ,20 , 0 ,21 , 0 ,22 , 0 ,23 , 0 ,24 , o 0 ,25. En a lg u n a s re a liz a c io n e s , e l ín d ic e d e p o lid is p e rs id a d de u n a L N P p u e d e s e r d e 0 ,10 a 0 ,20 a p ro x im a d a m e n te .
E l p o te n c ia l z e ta d e u n a L N P p u e d e u s a rs e p a ra in d ic a r e l p o te n c ia l e le c t ro c in é t ic o d e la c o m p o s ic ió n . En a lg u n a s re a liz a c io n e s , e l p o te n c ia l z e ta p u e d e d e s c r ib ir la c a rg a s u p e r f ic ia l d e u n a L N P . G e n e ra lm e n te s e d e s e a n las n a n o p a r t íc u la s lip íd ic a s c o n c a rg a s re la t iv a m e n te b a ja s , p o s it iv a s o n e g a tiv a s , y a q u e la s e s p e c ie s m á s c a rg a d a s p u e d e n in te ra c tu a r d e m a n e ra in d e s e a b le c o n c é lu la s , te j id o s y o tro s e le m e n to s d e l c u e rp o . En a lg u n a s re a liz a c io n e s , e l p o te n c ia l z e ta d e u n a L N P p u e d e s e r d e a p ro x im a d a m e n te -10 m V a a p ro x im a d a m e n te 20 m V , de a p ro x im a d a m e n te -10 m V a a p ro x im a d a m e n te 15 m V , d e a p ro x im a d a m e n te -10 m V a a p ro x im a d a m e n te 10 m V , de a p ro x im a d a m e n te -10 m V a a p ro x im a d a m e n te 5 m V , d e a p ro x im a d a m e n te -10 m V a a p ro x im a d a m e n te 0 m V , de a p ro x im a d a m e n te -10 m V a a p ro x im a d a m e n te -5 m V , d e a p ro x im a d a m e n te -5 m V a a p ro x im a d a m e n te 20 m V , de a p ro x im a d a m e n te -5 m V a a p ro x im a d a m e n te 15 m V , d e a p ro x im a d a m e n te -5 m V a a p ro x im a d a m e n te 10 m V , de a p ro x im a d a m e n te -5 m V a a p ro x im a d a m e n te 5 m V , d e a p ro x im a d a m e n te -5 m V a a p ro x im a d a m e n te 0 m V , d e a p ro x im a d a m e n te 0 m V a a p ro x im a d a m e n te 20 m V , d e a p ro x im a d a m e n te 0 m V a a p ro x im a d a m e n te 15 m V , de a p ro x im a d a m e n te 0 m V a a p ro x im a d a m e n te 10 m V , d e a p ro x im a d a m e n te 0 m V a a p ro x im a d a m e n te 5 m V , d e a p ro x im a d a m e n te 5 m V a a p ro x im a d a m e n te 20 m V , d e a p ro x im a d a m e n te 5 m V a a p ro x im a d a m e n te 15 m V , o d e a p ro x im a d a m e n te 5 m V a a p ro x im a d a m e n te 10 m V
L a e f ic ie n c ia d e e n c a p s u la c ió n d e u n a p ro te ín a y /o á c id o n u c le ic o , d e s c r ib e la c a n t id a d d e p ro te ín a y /o á c id o n u c le ic o q u e se e n c a p s u la o se a s o c ia d e o tro m o d o c o n u n a L N P d e s p u é s d e la p re p a ra c ió n , co n re s p e c to a la c a n t id a d in ic ia l p ro p o rc io n a d a . L a e f ic ie n c ia d e e n c a p s u la c ió n e s d e s e a b le m e n te a lta (p o r e je m p lo , c e rc a n a a l 100 % ). L a e f ic ie n c ia d e e n c a p s u la c ió n p u e d e m e d irs e , p o r e je m p lo , c o m p a ra n d o la c a n t id a d d e p ro te ín a o á c id o n u c le ic o en u n a s o lu c ió n q u e c o n t ie n e la n a n o p a r t íc u la l ip íd ic a a n te s y d e s p u é s d e ro m p e r la n a n o p a r t íc u la l ip íd ic a c o n u n o o m á s s o lv e n te s o d e te rg e n te s o rg á n ic o s . P a ra m e d ir la c a n t id a d d e p ro te ín a o á c id o n u c le ic o lib re (p o r e je m p lo , A R N ) en u n a s o lu c ió n p u e d e u s a rs e u n a re s in a d e in te rc a m b io a n ió n ic o . P a ra m e d ir la c a n t id a d d e p ro te ín a lib re y /o á c id o n u c le ic o (p o r e je m p lo , A R N ) e n u n a s o lu c ió n p u e d e u s a rs e f lu o re s c e n c ia . P a ra la s n a n o p a r t íc u la s lip íd ic a s d e s c r ita s e n la p re s e n te , la e f ic a c ia d e e n c a p s u la c ió n d e u n a p ro te ín a y /o á c id o n u c le ic o p u e d e s e r d e p o r lo m e n o s e l 50 % , p o r e je m p lo e l 50 % , 55 % , 60 % , 65 % , 70 % , 75 % , 80 % , 85 % , 90 % , 91 % , 92 % , 93 % , 94 % , 95 % , 96 % , 97 % , 98 % , 99 % o 100 % . E n a lg u n a s re a liz a c io n e s , la e f ic a c ia d e e n c a p s u la c ió n p u e d e s e r d e p o r lo m e n o s e l 80 % . En a lg u n a s re a liz a c io n e s , la e f ic a c ia d e e n c a p s u la c ió n p u e d e s e r d e p o r lo m e n o s e l 90 % . E n a lg u n a s re a liz a c io n e s , la e f ic a c ia d e e n c a p s u la c ió n p u e d e s e r d e p o r lo m e n o s e l 95 % .
U n a L N P p u e d e c o m p re n d e r o p c io n a lm e n te u n o o m á s re c u b r im ie n to s . En a lg u n a s re a liz a c io n e s , u n a L N P p u e d e fo rm u la rs e e n u n a c á p s u la , p e líc u la o c o m p r im id o q u e te n g a un re c u b r im ie n to . U n a c á p s u la , p e líc u la o c o m p r im id o q u e in c lu y a u n a c o m p o s ic ió n d e s c r ita en la p re s e n te p u e d e te n e r c u a lq u ie r ta m a ñ o útil, r e s is te n c ia a la t ra c c ió n , d u re z a o d e n s id a d .
E n lo s d o c u m e n to s W O 2020 /061457 y W O 2021 /113777 s e e n s e ñ a n e je m p lo s d e líp id o s , fo rm u la c io n e s , m é to d o s y c a ra c te r iz a c ió n d e L N P a d ic io n a le s . E je m p lo s d e líp id o s , fo rm u la c io n e s , m é to d o s y c a ra c te r iz a c ió n d e L N P a d ic io n a le s s e e n s e ñ a n e n H o u e t a l. L ip id n a n o p a r t ic le s fo r m R N A d e liv e ry . N a t R e v M a te r (2021 ). d o i.o rg /10.1038 /s 41578 -021 -00358 -0 (v é a n s e , p o r e je m p lo , lo s líp id o s y d e r iv a d o s lip íd ic o s e je m p la re s d e la F ig u ra 2 d e H o u e t a l.)
E n a lg u n a s re a liz a c io n e s , se lle v a n a c a b o l ip o fe c c io n e s c e lu la re s in v it ro o e x v iv o u s z a n d o L ip o fe c ta m in e M e s s e n g e rM a x (T h e rm o F is h e r) o T ra n s lT -m R N A T ra n s fe c t io n R e a g e n t (M iru s B io ). E n c ie r ta s re a liz a c io n e s , la s L N P s e fo rm u la n u s a n d o la m e z c la l ip íd ic a io n iz a b le G e n V o y _ IL M (P re c is io n N a n o S y s te m s ) . E n c ie r ta s re a liz a c io n e s , las L N P s e fo rm u la n u s a n d o 2 ,2 -d il in o le i l-4 -d im e t i la m in o e t i l- [1 ,3 ] -d io x o la n o (D L in -K C 2 -D M A ) o d i l in o le ilm e ti l-4 -d im e t i la m in o b u t ira to (D L in -M C 3 -D M A o M C 3 ), c u y a fo rm u la c ió n y u s o in v iv o s e e n s e ñ a n e n J a y a ra m a n e t a l. A n g e w C h e m In t Ed E n g l 51 (34 ) :8529 -8533 (2012 ).
E n lo s d o c u m e n to s W O 2019067992 y W O 2019067910 s e d e s c r ib e n fo rm u la c io n e s d e L N P o p t im iz a d a s p a ra la a d m in is t ra c ió n d e s is te m a s C R IS P R -C a s , p o r e je m p lo , R N P C a s 9 -A R N g , A R N g , A R N m C a s 9 , q u e s o n ú t ile s p a ra la a d m in is tra c ió n d e p o lir r ib o n u c le ó tid o s c irc u la re s y p o lir r ib o n u c le ó tid o s lin e a le s d e s c r ito s e n la p re s e n te .
E n lo s d o c u m e n to s U S 8158601 y U S 8168775 , q u e in c lu y e n fo rm u la c io n e s u s a d a s e n p a tis ira n , c o m e rc ia l iz a d a s c o n e l n o m b re d e O N P A T T R o , s e d e s c r ib e n fo rm u la c io n e s e s p e c íf ic a s a d ic io n a le s d e L N P ú tile s p a ra la a d m in is tra c ió n d e á c id o s n u c le ic o s (p o r e je m p lo , p o lir r ib o n u c le ó tid o s c irc u la re s , p o lir r ib o n u c le ó tid o s lin e a le s ).
L a d o s if ic a c ió n e je m p la r d e L N P d e p o lir r ib o n u c le ó tid o s (p o r e je m p lo , un p o lir r ib o n u c le ó tid o c irc u la r, un p o lir r ib o n u c le ó tid o lin e a l) p u e d e in c lu ir a p ro x im a d a m e n te 0 ,1 , 0 ,25 , 0 ,3 , 0 ,5 , 1, 2, 3, 4, 5, 6 , 8, 10 o 100 m g /k g (A R N ). L a d o s if ic a c ió n e je m p la r d e A A V q u e c o m p re n d e un p o lir r ib o n u c le ó tid o (p o r e je m p lo , un p o lir r ib o n u c le ó tid o c irc u la r, un p o lir r ib o n u c le ó tid o lin e a l) p u e d e in c lu ir u n a M O I d e a p ro x im a d a m e n te 1011, 1012, 1013, y 1014v g /k g .
Ejemplos
L o s s ig u ie n te s e je m p lo s se p re s e n ta n p a ra p ro p o rc io n a r a lo s e x p e r to s en la té c n ic a u n a d e s c r ip c ió n d e c ó m o p u e d e n u s a rs e , e la b o ra rs e y e v a lu a rs e la s c o m p o s ic io n e s y m é to d o s d e s c r ito s e n la p re s e n te , y se p re te n d e q u e s e a n m e ra m e n te e je m p la re s d e la d iv u lg a c ió n y n o se p re te n d e q u e lim ite n e l a lc a n c e d e lo q u e los in v e n to re s c o n s id e ra n su in v e n c ió n .
Ejemplo 1: Diseño de un constructo de intrón-exón permutado (PIE) de auto-corte y empalme de Anabaena con región de apareamiento ampliada
E s te e je m p lo d e s c r ib e e l d is e ñ o d e s e c u e n c ia s p e rm u ta d a s in t ró n -e x ó n (P IE ) d e a u to -c o r te y e m p a lm e d e A n a b a e n a c o n u n a re g ió n d e a p a re a m ie n to a m p lia d a p a ra p ro p o rc io n a r u n a m e jo r e f ic ie n c ia d e c irc u la r iz a c ió n .
E n la s F IG . 1 A y F IG . 1B s e p ro p o rc io n a n e s q u e m a s q u e re p re s e n ta n d is e ñ o s e je m p la re s d e c o n s tru c to s de A D N . E n e s te e je m p lo , lo s c o n s tru c to s in c lu y e n , d e 5 ' a 3': u n a m ita d 3 ' d e l f ra g m e n to d e in tró n c a ta lí t ic o d e l g ru p o I (m e d io in tró n 3 ' d e A n a b a e n a ) , un s it io d e c o r te y e m p a lm e 3', un f ra g m e n to d e e x ó n 3 ' (E 2 d e A n a b a e n a ) , un e le m e n to e s p a c ia d o r , u n a c a rg a d e p o lin u c le ó t id o s , un f ra g m e n to d e e x ó n 5 ' (E 1 d e A n a b a e n a ) , un s it io d e c o r te y e m p a lm e 5', y u n a m ita d 5 ' d e l f ra g m e n to d e in tró n c a ta lí t ic o d e l g ru p o I (m e d io in tró n 5 ' d e A n a b a e n a ) . E 2 t ie n e u n a s e c u e n c ia c o m p le m e n ta r ia d e 5 n u c le ó tid o s (5 '-T C C G T -3 ') (S E Q ID N O : 1) a E1 (5 '-A C G G A -3 ') (S E Q ID N O : 2 ) (F IG S . 1 A y 1B, lín e a s n e g ra s e n E 2 y E 1 ). P a ra g e n e ra r un c o n s tru c to q u e te n g a u n a re g ió n d e a p a re a m ie n to a m p lia d a e n tre E 2 y E 1 , s e m u ta ro n 5 n u c le ó tid o s d e E 2 p a ra q u e tu v ie s e n u n a re g ió n d e a p a re a m ie n to a m p lia d a d e 7 n u c le ó tid o s c o n E1 (T G A C C T T (S E Q ID N O : 3 ) ^ A G c G t C T (S E Q ID N O : 4 ), e l c a rá c te r e n n e g r ita re p re s e n ta la s s e c u e n c ia s m u ta d a s ) (F IG . 1B, lín e a g r is en E 2 y E1, lo s a s te r is c o s e n E 2 re p re s e n ta n la m u ta c ió n e n la s e c u e n c ia ) . La re g ió n d e a p a re a m ie n to to ta l d e l in tró n -e x ó n p e rm u ta d o (P IE ) d e A n a b a e n a c o n u n a re g ió n d e a p a re a m ie n to a m p lia d a e s d e 12 n u c le ó tid o s (E 2 ; 5 '-T C C G T A G C G T C T -3 ' (S E Q ID N O : 5), E 1 ; 5 '-A G A C G C T A C G G A -3 ' (S E Q ID N O : 6 )) (F IG . 1B).
L a e s tru c tu ra d e l A R N s e e s t im ó m e d ia n te la h e r ra m ie n ta d e p re d ic c ió n d e la e s tru c tu ra d e l A R N , R N A fo ld ( rn a .tb i.u n iv ie .a c .a t /c g i-b in /R N A W e b S u ite /R N A fo ld .c g i) . L a e x te n s ió n d e la in te ra c c ió n E 2 -E 1 s e g e n e ró m o d if ic a n d o lo s re s u lta d o s d e la s e c u e n c ia e n la in te ra c c ió n E 2 -E 1 a d e c u a d a y la e s tru c tu ra c o n d e n s a d a d e l in tró n d e a u to -c o r te y e m p a lm e (F IG S . 2 A y 2 B ).
S e d is e ñ a ro n c o n s tru c to s q u e t ie n e n la P IE d e A n a b a e n a c o n u n a re g ió n d e a p a re a m ie n to d e 5 n u c le ó tid o s (A n a b a e n a 1) y s e c u e n c ia s d e a p a re a m ie n to c o n u n a re g ió n d e a p a re a m ie n to a m p lia d a (A n a b a e n a 2 ) p a ra c o m p a ra r la e f ic ie n c ia d e c irc u la r iz a c ió n . T a m b ié n se u s a ro n p a ra la c o m p a ra c ió n lo s c o n s tru c to s d e P IE d e A n a b a e n a d e s c r ito s e n W e s s e lh o e ft , e t a l. 2018 (N a t. C o m m u n . 9 :2629 ) (A n a b a e n a 3). E n e s te e je m p lo , lo s c o n s tru c to s s e d is e ñ a ro n p a ra q u e in c lu y e s e n p o liA 50 c o m o e le m e n to e s p a c ia d o r , y u n a c o m b in a c ió n d e un s it io d e e n tra d a d e l r ib o s o m a in te rn o ( IR E S ) d e E M C V y un O R F c o m o c a rg a d e p o lin u c le ó t id o s . S e p ro b a ro n d o s O R F d ife re n te s : un O R F d e lu c ife ra s a d e G a u s s ia (G lu c ) (558 n u c le ó tid o s ) y un O R F d e p ro te ín a d e p ic o d e S A R S -C o V -2 (3822 n ts ) . E l ta m a ñ o d e l A R N c irc u la r fu e d e 1 ,2 K b c o n e l O R F d e la G lu c y d e 4 ,5 K b co n e l O R F d e la p ro te ín a e s p ig a d e l S A R S -C o V -2.
<E l A R N lin e a l n o m o d if ic a d o s e s in te t iz ó m e d ia n te tra n s c r ip c ió n>in vitro<u s a n d o A R N p o lim e ra s a T 7 a p a rt ir>d e u n a p la n t il la d e A D N e n p re s e n c ia d e 7 ,5 m M d e N T P . E l A D N p la n tilla s e e lim in ó tra tá n d o lo c o n D N a s a d u ra n te 20 m in u to s . E l A R N lin e a l s in te t iz a d o s e p u r if ic ó co n un k it d e lim p ie z a d e A R N (N e w E n g la n d B io la b s , T 2050 ) . E l a u to -c o r te y e m p a lm e s e p ro d u jo d u ra n te la t ra n s c r ip c ió n ; n o s e re q u ir ió n in g u n a re a c c ió n a d ic io n a l. P a ra m o n ito r iz a r la<e f ic a c ia d e l a u to -c o r te y e m p a lm e , s e m e z c la ro n 200 ng d e A R N t ra n s c r ito>in vitro<p u r if ic a d o e n c o lu m n a c o n ta m p ó n>d e c a rg a d e g e l II (T h e rm o F is h e r, A M 8546 G ) y s e c a le n ta ro n a 95 ° C d u ra n te 3 m in u to s , in c u b á n d o lo s lu e g o e n h ie lo d u ra n te 3 m in u to s . A c o n t in u a c ió n , la s m u e s tra s s e s e p a ra ro n m e d ia n te e le c tro fo re s is e n g e l d e p o lia c r i la m id a co n u re a a l 6 % (U re a P A G E ), y la b a n d a d e A R N s e t iñ ó c o n t in c ió n d e g e l y s e v is u a liz ó u s a n d o un s is te m a d e im a g e n o lo g ía .
L a a m p lia c ió n d e la s e c u e n c ia d e a p a re a m ie n to d e 5 n u c le ó tid o s a 12 n u c le ó tid o s a u m e n tó la e f ic ie n c ia d e c ir c u la r iz a c ió n h a s ta d o s v e c e s y m o s tró u n a e f ic ie n c ia d e c ir c u la r iz a c ió n s im ila r c o n A n a b a e n a 3 e n e l c a s o d e l A R N c ir c u la r d e 1 ,2 K b (F IG . 3 A ). E n e l c a s o d e l A R N c ir c u la r d e 4 ,5 K b , la P IE d e A n a b a e n a c o n u n a re g ió n d e a p a re a m ie n to a m p lia d a (A n a b a e n a 2 ) m o s tró u n a e f ic ie n c ia d e c ir c u la r iz a c ió n un 40 % m e jo r q u e la d e A n a b a e n a 3 y t re s v e c e s m a y o r q u e la P IE d e A n a b a e n a c o n u n a re g ió n d e a p a re a m ie n to d e 5 n u c le ó tid o s (A n a b a e n a 1) (F IG . 3 B ).
L a P IE d e A n a b a e n a d is e ñ a d a p a ra q u e tu v ie s e u n a s e c u e n c ia d e a p a re a m ie n to E 2 -E 1 a m p lia d a (A n a b a e n a 2 ) m o s tró u n a e f ic ie n c ia d e c ir c u la r iz a c ió n 2 -3 v e c e s m e jo r q u e la P IE d e A n a b a e n a c o n u n a re g ió n d e a p a re a m ie n to d e 5 n u c le ó tid o s , in d e p e n d ie n te m e n te d e l ta m a ñ o d e l A R N c ir c u la r (A n a b a e n a 1). E s to m u e s tra u n a e f ic ie n c ia d e c ir c u la r iz a c ió n s im ila r p a ra la c o n s tru c c ió n d e 1 ,2 Kb, m á s fá c il d e c irc u la r iz a r , y u n a e f ic ie n c ia d e c ir c u la r iz a c ió n un 40 % m e jo r p a ra e l c o n s tru c to d if íc il d e 4 ,5 Kb.
Ejemplo 2: Expresión de proteínas a partir de ARN circular generado por PIE de auto-corte y empalme de Anabaena con una región de apareamiento ampliada
E s te e je m p lo d e m u e s tra la e x p re s ió n d e p ro te ín a s a p a r t ir d e A R N c ir c u la r g e n e ra d o p o r P IE d e a u to -c o r te y e m p a lm e d e A n a b a e n a c o n u n a re g ió n d e a p a re a m ie n to a m p lia d a .
E n e s te e je m p lo , s e d is e ñ a ro n c o n s tru c to s q u e te n ía n P IE d e A n a b a e n a co n u n a re g ió n d e a p a re a m ie n to d e 5 n u c le ó tid o s (A n a b a e n a 1) y s e c u e n c ia s d e a p a re a m ie n to a m p lia d a s (A n a b a e n a 2 ) c o m o s e d e s c r ib e e n e l E je m p lo 1 p a ra c o m p a ra r la e x p re s ió n d e p ro te ín a s . E n e s te e je m p lo , lo s c o n s tru c to s s e d is e ñ a ro n p a ra q u e in c lu y e s e n p o liA 50 c o m o e le m e n to e s p a c ia d o r , y u n a c o m b in a c ió n d e un IR E S E M C V y un O R F c o m o c a rg a d e p o lin u c le ó t id o s . S e p ro b a ro n d o s O R F d ife re n te s : G lu c (558 n ts ) y p ro te ín a e s p ig a d e S A R S -C o V -2 (3822 n ts ) . T a m b ié n s e p ro b ó p o r c o m p a ra c ió n A n a b a e n a 3, c o m o s e d e s c r ib e e n e l E je m p lo 1,.
<E l A R N lin e a l s e s in te t iz ó m e d ia n te tra n s c r ip c ió n>in vitro<u s a n d o A R N p o lim e ra s a T 7 en p re s e n c ia d e 7 ,5 m M d e N T P .>E l A D N p la n tilla s e e lim in ó tra ta n d o c o n D N a s a d u ra n te 20 m in u to s . E l A R N lin e a l s in te t iz a d o s e p u r if ic ó co n un k it d e lim p ie z a d e A R N (N e w E n g la n d B io la b s , T 2050 ) . E l A R N c irc u la r q u e c o d if ic a G lu c s e p u r if ic ó m e d ia n te U re a P A G E , s e e lu y ó e n un ta m p ó n (0 ,5 M d e a c e ta to s ó d ic o , 0 ,1 % d e S D S , 1 m M d e E D T A ), s e p re c ip itó c o n e ta n o l y s e v o lv ió a s u s p e n d e r e n a g u a lib re d e A R N a s a . E l A R N c ir c u la r q u e c o d if ic a la p ro te ín a e s p ig a d e l S A R S -C o V -2 s e p u r if ic ó m e d ia n te c ro m a to g ra fía en fa s e in v e rs a y la s f ra c c io n e s s e in te rc a m b ia ro n e n ta m p ó n c o n c it ra to s ó d ic o y lu e g o en a g u a m e d ia n te u lt ra f i lt ra c ió n u s a n d o f i lt ro s c e n tr í fu g o s A m ic o n U ltra (S ig m a A ld r ic h ) .
P a ra c o m p a ra r la e x p re s ió n d e l A R N c ir c u la r q u e c o d if ic a G lu c , s e p re p a ró A R N c ir c u la r g e n e ra d o p o r A n a b a e n a 1 y A n a b a e n a 2. P o r c o m p a ra c ió n , ta m b ié n s e p re p a ró A R N c ir c u la r p ro d u c id o p o r A n a b a e n a 3. S e tra n s fe c ta ro n c é lu la s H e L a (10.000 c é lu la s p o r p o c illo e n u n a p la c a d e 96 p o c il lo s ) co n 0,1 p m o le s d e A R N c irc u la r p u r if ic a d o u s a n d o e l re a c t iv o d e t ra n s fe c c ió n L iP O F E C T A M IN e ® M e s s e n g e rM A X ( In v it ro g e n ) d e a c u e rd o c o n e l p ro to c o lo d e l fa b r ic a n te . S e re c o g ie ro n lo s m e d io s d e c u lt iv o c e lu la r y s e s u s t itu y e ro n p o r m e d io s fre s c o s a la s 24 , 48 y 72 h o ra s p a ra m e d ir la a c t iv id a d d e G lu c . P a ra m e d ir la a c t iv id a d d e G lu c , se tra n s f ir ie ro n 10 p l d e m e d io c e lu la r re c o g id o a u n a p la c a b la n c a d e 96 p o c illo s y s e u só un s is te m a d e e n s a y o d e re p o r te ro b io lu m in is c e n te d e a c u e rd o c o n las in s tru c c io n e s d e l fa b r ic a n te (P ie rc e G a u s s ia L u c ife ra s e F la s h A s s a y K it, 16158 , T h e rm o S c ie n tif ic ) . L a p la c a s e le y ó e n un lu m in ó m e tro (P ro m e g a ).
P a ra c o m p a ra r la e x p re s ió n d e l A R N c ir c u la r q u e c o d if ic a la p ro te ín a e s p ig a d e l S A R S -C o V -2 , s e p re p a ró A R N c ir c u la r g e n e ra d o p o r P IE d e A n a b a e n a co n u n a re g ió n d e a p a re a m ie n to d e 5 n u c le ó tid o s (A n a b a e n a 1) y P IE d e A n a b a e n a c o n u n a re g ió n d e a p a re a m ie n to a m p lia d a (A n a b a e n a 2 ). P o r c o m p a ra c ió n , ta m b ié n s e p re p a ró A R N c ir c u la r p ro d u c id o p o r A n a b a e n a 3. S e t r a n s fe c ta ro n c é lu la s H e L a (1 ,2 m illo n e s d e c é lu la s p o r p o c illo e n u n a p la c a d e 6 p o c il lo s ) c o n 4 p m o l d e A R N c ir c u la r p u r if ic a d o u s a n d o e l a g e n te d e t ra n s fe c c ió n L IP O F E C T A M IN E ® M e s s e n g e rM A X ( In v it ro g e n ) s ig u ie n d o la s in s tru c c io n e s d e l fa b r ic a n te . D e s p u é s d e 48 h o ra s d e t ra n s fe c c ió n , las c é lu la s se re c o g ie ro n p o r t r ip s in iz a c ió n y s e v o lv ie ro n a s u s p e n d e r e n m e d io lib re d e s u e ro fr ío . L a s c é lu la s s e t iñ e ro n c o n e l a n t ic u e rp o a n t i-S A R S -C o V -2 R B D d u ra n te u n a h o ra y p o s te r io rm e n te s e in c u b a ro n c o n e l a n t ic u e rp o a n ti- Ig G 1 d e ra tó n A F 647 d u ra n te 30 m in u to s . La p o b la c ió n te ñ id a s e m id ió p o r c ito m e tr ía d e flu jo .
E l A R N c ir c u la r g e n e ra d o p o r P IE d e A n a b a e n a c o n u n a re g ió n d e a p a re a m ie n to a m p lia d a (A n a b a e n a 2 ) m o s tró u n a e x p re s ió n s im ila r c o n e l A R N c ir c u la r g e n e ra d o p o r P IE d e A n a b a e n a c o n u n a re g ió n d e a p a re a m ie n to d e 5 n u c le ó tid o s (A n a b a e n a 1) y e l A R N c ir c u la r p ro d u c id o p o r A n a b a e n a 3 c u a n d o c o d if ic a b a G lu c c o m o c a rg a de p o lin u c le ó t id o s (F IG . 4 ). E n e l c a s o d e l A R N c ir c u la r q u e c o d if ic a la p ro te ín a e s p ig a d e l S A R S -C o V -2 , e l A R N c irc u la r g e n e ra d o p o r A n a b a e n a 2 m o s tró u n a e x p re s ió n a p ro x im a d a m e n te t re s v e c e s m e jo r q u e e l A R N c ir c u la r p ro d u c id o p o r A n a b a e n a 3 y un 50 % m á s d e e x p re s ió n q u e e l A R N c ir c u la r g e n e ra d o p o r A n a b a e n a 1 (F IG . 5).
Ejemplo 3: El efecto de la longitud de la región de apareamiento sobre la eficiencia de circularización en el PIE de auto-corte y empalme de Anabaena.
E s te e je m p lo d e m u e s tra e l e fe c to d e la lo n g itu d d e la re g ió n d e a p a re a m ie n to s o b re la e f ic ie n c ia d e c ir c u la r iz a c ió n e n e l P IE d e a u to -c o r te y e m p a lm e d e A n a b a e n a .
E n e l E je m p lo 1 a n te r io r , d e m o s tra m o s q u e la a m p lia c ió n d e la re g ió n d e a p a re a m ie n to d e 5 n u c le ó tid o s a 12 n u c le ó tid o s m e d ia n te la m u ta c ió n d e la s e c u e n c ia E 2 a u m e n ta la e f ic ie n c ia d e c ir c u la r iz a c ió n d e la P IE d e A n a b a e n a . P a ra e x a m in a r e l e fe c to d e la lo n g itu d d e la re g ió n d e a p a re a m ie n to e n la e f ic ie n c ia d e c irc u la r iz a c ió n , s e d is e ñ a ro n t r e s c o n s tru c to s a d ic io n a le s p a ra q u e tu v ie s e n u n a re g ió n d e a p a re a m ie n to a m p lia d a a d ic io n a l e n tre E 2 y E1 m e d ia n te la in c lu s ió n d e s e c u e n c ia s a d ic io n a le s en e l e x tre m o 5 ' d e E1 q u e so n c o m p le m e n ta r ia s a E2: (1 ) e x te n s ió n d e 5<n u c le ó tid o s (5 '-C G T T T -3 ') (S E Q ID N O :>7), (2)<e x te n s ió n d e 10 n u c le ó tid o s (5 '- A C G A C C G T T T -3 ') (S E Q ID N O : 8), y>(3 ) e x te n s ió n d e 15 n u c le ó tid o s (5 '- C C c A c a C g A C C G T T T -3 ') (S E Q ID N O : 9). La s e c u e n c ia c o m p le m e n ta r ia e n e 2 t ie n e u n a e x te n s ió n d e 5 n u c le ó tid o s (5 '- A A A C G -3 ') (S E Q ID N O : 10 ), u n a e x te n s ió n d e 10 n u c le ó tid o s (5 '-A A A C G G T C G T -3 ') (S E Q ID N O : 11 ), o u n a e x te n s ió n d e 15 n u c le ó tid o s (5 '- A A A C G G T C G T G G G -3 ') (S E Q ID N O : 12 ), re s p e c t iv a m e n te . L a s e c u e n c ia to ta l d e a p a re a m ie n to t ie n e 17 n u c le ó tid o s , 22 n u c le ó tid o s o 27 n u c le ó tid o s , re s p e c t iv a m e n te . E n la F IG . 6 se p ro p o rc io n a un e s q u e m a q u e re p re s e n ta d is e ñ o s e je m p la re s d e c o n s tru c to s d e A D N c o n re g io n e s d e a p a re a m ie n to a m p lia d a s e n tre E 2 y E1.
P a ra c o m p a ra r la e f ic ie n c ia d e c ir c u la r iz a c ió n s e d is e ñ a ro n c o n s tru c to s c o n s e c u e n c ia s d e a p a re a m ie n to a m p lia d a s (A n a b a e n a 2 ) y re g ió n d e a p a re a m ie n to a m p lia d a (e x te n s ió n d e 5 n u c le ó tid o s , e x te n s ió n d e 10 n u c le ó tid o s y e x te n s ió n d e 15 n u c le ó tid o s ) . E n e s te e je m p lo , lo s c o n s tru c to s s e d is e ñ a ro n p a ra q u e in c lu y e s e n p o liA 50 c o m o e le m e n to e s p a c ia d o r , y u n a c o m b in a c ió n d e un IR E S E M C V y G lu c c o m o c a rg a d e p o lin u c le ó tid o s .
<E l A R N lin e a l s e s in te t iz ó m e d ia n te tra n s c r ip c ió n>in vitro<u s a n d o A R N p o lim e ra s a T 7 e n p re s e n c ia d e 7 ,5 m M d e N T P .>E l A D N p la n t il la s e e lim in ó tra tá n d o lo c o n D N a s a d u ra n te 20 m in u to s . E l A R N lin e a l s in te t iz a d o s e p u r if ic ó c o n un k it d e lim p ie z a d e A R N (N e w E n g la n d B io la b s , T 2050 ) .
E l a u to -c o r te y e m p a lm e s e p ro d u jo d u ra n te la tra n s c r ip c ió n ; n o s e re q u ir ió n in g u n a re a c c ió n a d ic io n a l. P a ra<m o n ito r iz a r la e f ic a c ia d e l a u to -c o r te y e m p a lm e , se m e z c la ro n 200 ng d e A R N tra n s c r ito>in vitro<p u r if ic a d o e n c o lu m n a>c o n ta m p ó n d e c a rg a d e g e l II (T h e rm o F is h e r, A M 8546 G ) y s e c a le n ta ro n a 95 ° C d u ra n te 3 m in u to s , in c u b á n d o s e d e s p u é s e n h ie lo d u ra n te 3 m in u to s . A c o n tin u a c ió n , la s m u e s tra s s e s e p a ra ro n m e d ia n te P A G E co n u re a a l 6 % , y la b a n d a d e A R N s e t iñ ó c o n t in c ió n d e g e l y s e v is u a liz ó m e d ia n te un s is te m a d e im a g e n o lo g ía .
U n a a m p lia c ió n a d ic io n a l d e la re g ió n d e a p a re a m ie n to e n tre E 2 y E1 (e x te n s ió n d e 5 n ts , e x te n s ió n d e 10 n ts o e x te n s ió n d e 15 n ts ) m o s tró u n a e f ic ie n c ia d e c ir c u la r iz a c ió n c o m p a ra b le co n P IE d e A n a b a e n a c o n u n a re g ió n d e a p a re a m ie n to a m p lia d a (A n a b a e n a 2 ) (F IG . 7). U n a e x te n s ió n d e 15 n u c le ó tid o s d e la re g ió n d e a p a re a m ie n to m o s tró un 30 % m á s d e e f ic ie n c ia d e c ir c u la r iz a c ió n e n c o m p a ra c ió n c o n A n a b a e n a 2 (F IG . 7). E s to s d a to s in d ic a n q u e la in te ra c c ió n E 2 -E 1 e s im p o r ta n te p a ra u n a c ir c u la r iz a c ió n e f ic ie n te y u n a m a y o r e x te n s ió n d e la re g ió n d e a p a re a m ie n to p u e d e a u m e n ta r la e f ic ie n c ia d e c ir c u la r iz a c ió n .
Ejemplo 4: Expresión de proteínas a partir de ARN circular generado por PIE de auto-corte y empalme de Anabaena con secuencia de apareamiento ampliada
E s te e je m p lo d e m u e s tra la e x p re s ió n d e p ro te ín a s a p a r t ir d e A R N c ir c u la r g e n e ra d o p o r P IE d e a u to -c o r te y e m p a lm e d e A n a b a e n a c o n s e c u e n c ia d e a p a re a m ie n to e x te n d id a .
E n e s te e je m p lo , s e d is e ñ a ro n c o n s tru c to s c o n s e c u e n c ia s d e a p a re a m ie n to a m p lia d a s (A n a b a e n a 2 ) y re g ió n d e a p a re a m ie n to a m p lia d a (e x te n s ió n d e 5 n u c le ó tid o s , e x te n s ió n d e 10 n u c le ó tid o s y e x te n s ió n d e 15 n u c le ó tid o s ) c o m o s e d e s c r ib e e n e l E je m p lo 3 p a ra c o m p a ra r la e x p re s ió n d e p ro te ín a s . E n e s te e je m p lo , lo s c o n s tru c to s se d is e ñ a ro n p a ra q u e in c lu y e s e n p o liA 50 c o m o e le m e n to e s p a c ia d o r , y u n a c o m b in a c ió n d e un IR E S E M C V y G lu c c o m o c a rg a d e p o lin u c le ó t id o s .
<E l A R N lin e a l s e s in te t iz ó m e d ia n te tra n s c r ip c ió n>in vitro<u s a n d o A R N p o lim e ra s a T 7 e n p re s e n c ia d e 7 ,5 m M>d e N T P . E l A D N p la n tilla s e e lim in ó t r a tá n d o lo c o n D N a s a d u ra n te 20 m in u to s . E l A R N lin e a l s in te t iz a d o s e p u r if ic ó c o n un k it d e lim p ie z a d e A R N (N e w E n g la n d B io la b s , T 2050 ) . E l A R N c ir c u la r q u e c o d if ic a G lu c s e p u r if ic ó m e d ia n te U re a P A G E , s e e lu y ó en un ta m p ó n (0 ,5 M d e a c e ta to s ó d ic o , 0 ,1 % d e S D S , 1 m M d e E D T A ), s e p re c ip itó c o n e ta n o l y s e v o lv ió a s u s p e n d e r e n a g u a lib re d e A R N a s a .
P a ra c o m p a ra r la e x p re s ió n d e l A R N c ir c u la r q u e c o d if ic a G lu c , s e p re p a ra ro n A R N c irc u la re s g e n e ra d o s p o r A n a b a e n a 2 y P IE A n a b a e n a c o n u n a re g ió n d e a p a re a m ie n to a m p lia d a a d ic io n a lm e n te (e x te n s ió n d e 5 n u c le ó tid o s , e x te n s ió n d e 10 n u c le ó tid o s o e x te n s ió n d e 15 n u c le ó tid o s ) c o m o s e d e s c r ib e e n e l E je m p lo 3. L a s c é lu la s H e L a (10.000 c é lu la s p o r p o c illo e n u n a p la c a d e 96 p o c il lo s ) s e t ra n s fe c ta ro n c o n 0,1 p m o le s d e a R n c ir c u la re s p u r if ic a d o s u s a n d o e l a g e n te d e t ra n s fe c c ió n L IP O F E C T A M IN E ® M e s s e n g e rM A X ( In v it ro g e n ) d e a c u e rd o c o n la s in s tru c c io n e s d e l fa b r ic a n te . S e p re p a ra ro n t ra n s fe c ta n te s p a ra c a d a p u n to te m p o ra l p o r s e p a ra d o . S e re c o g ie ro n lo s m e d io s d e c u lt iv o a las 6 , 24 y 48 h o ra s . P a ra m e d ir la a c t iv id a d d e G lu c , s e t ra n s f ir ie ro n 10 p l d e l m e d io c e lu la r re c o g id o a u n a p la c a b la n c a d e 96 p o c il lo s y se u só un s is te m a d e e n s a y o d e re p o r te ro b io lu m in is c e n te d e a c u e rd o c o n las in s t ru c c io n e s d e l fa b r ic a n te (P ie rc e G a u s s ia L u c ife ra s e F la s h A s s a y K it, 16158 , T h e rm o S c ie n tif ic ) . L a p la c a se le yó e n un lu m in ó m e tro (P ro m e g a ).
E l A R N c ir c u la r g e n e ra d o p o r P IE d e A n a b a e n a c o n u n a re g ió n d e a p a re a m ie n to a m p lia d a a d ic io n a l (e x te n s ió n d e 5 n ts , e x te n s ió n d e 10 n ts o e x te n s ió n d e 15 n ts ) m o s tró u n a e x p re s ió n s im ila r o m e jo r q u e la d e l A R N c ir c u la r g e n e ra d o p o r A n a b a e n a 2 (F IG . 8). P o r e je m p lo , e l A R N c ir c u la r g e n e ra d o p o r P IE d e A n a b a e n a c o n u n a e x te n s ió n d e 15 n u c le ó tid o s (27 n u c le ó tid o s e n to ta l) m o s tró u n a e x p re s ió n t re s v e c e s m a y o r q u e P IE d e A n a b a e n a c o n u n a re g ió n d e a p a re a m ie n to a m p lia d a d e 12 n u c le ó tid o s (A n a b a e n a 2 ). E s to s d a to s in d ic a n q u e la e x te n s ió n d e la re g ió n d e a p a re a m ie n to e s im p o r ta n te n o s ó lo p a ra la e f ic a c ia d e la c irc u la r iz a c ió n , s in o ta m b ié n p a ra la e x p re s ió n .
Ejemplo 5: Diseño de un intrón-exón permutado (PIE) de auto-corte y empalme de Tetrahymena con una regiónde apareamiento ampliada
E s te e je m p lo d e s c r ib e e l d is e ñ o d e un in tró n -e x ó n p e rm u ta d o (P IE ) d e a u to -c o r te y e m p a lm e d e T e tra h y m e n a c o n u n a re g ió n d e a p a re a m ie n to a m p lia d a .
E n la s F IG . 9 A y F IG . 9 B s e p ro p o rc io n a n e s q u e m a s d e d is e ñ o s e je m p la re s d e c o n s tru c to s d e A D N .
E n e s te e je m p lo , lo s c o n s tru c to s in c lu y e n , d e 5 ' a 3 ': u n a m ita d 3 ' d e l f ra g m e n to d e l in tró n c a ta lí t ic o d e l g ru p o I (T e tra h y m e n a m ita d 3 '-), un s it io d e c o r te y e m p a lm e 3', un f ra g m e n to d e l e x ó n 3 ' (T e tra h y m e n a E 2 ), un e le m e n to e s p a c ia d o r , u n a c a rg a d e p o lin u c le ó t id o s , un f ra g m e n to d e l e x ó n 5 ' (T e tra h y m e n a E 1 ), un s it io d e c o r te y e m p a lm e 5', y u n a m ita d 5 ' d e l f ra g m e n to d e l in tró n c a ta lí t ic o d e l g ru p o I (T e tra h y m e n a m ita d 5 '- in tró n ) . E 2 t ie n e u n a s e c u e n c ia c o m p le m e n ta r ia d e 6 n u c le ó tid o s (5 '- A A G G T A -3 ') (S E Q ID N O : 13 ) a l m e d io in tró n 5 ' (5 '- T A C C T T -3 ') (S E Q ID N O : 14 ) q u e fo rm a la h é lic e P 10 (F IG . 9, lín e a s n e g ra s s o b re E1 y m e d io in tró n 5 '). P a ra g e n e ra r un c o n s tru c to q u e te n g a u n a re g ió n d e a p a re a m ie n to a m p lia d a e n tre E 2 y la m ita d 5 '- in tró n , s e a ñ a d ie ro n 6 n u c le ó tid o s a l e x tre m o 3 ' d e la re g ió n d e a p a re a m ie n to e n E 2 (5 '-A A T A T T -3 ' (S E Q ID N O : 15), re c u a d ro g r is e n E 2 e n la s F IG S . 9 A y 9 B ). L a re g ió n d e a p a re a m ie n to to ta l d e la P IE d e a u to -c o r te y e m p a lm e d e T e tra h y m e n a c o n re g ió n d e a p a re a m ie n to a m p lia d a es d e 12 n u c le ó tid o s (E 2 ; 5 '-A A G G T A A A T A T T -3 ' (S E Q ID N O : 16 ), in tró n 5'; 5 ' - A A T A T T T A C C T T -3 ' (S E Q ID N O : 17), lo s c a ra c te re s e n n e g r ita re p re s e n ta n la re g ió n d e a p a re a m ie n to a m p lia d a ) (F IG . 9 B ).
L a e s tru c tu ra d e l A R N s e e s t im ó m e d ia n te la h e r ra m ie n ta d e p re d ic c ió n d e la e s tru c tu ra d e l A R N , R N A fo ld ( rn a .tb i.u n iv ie .a c .a t /c g i-b in /R N A W e b S u ite /R N A fo ld .c g i) . L a e x te n s ió n d e la in te ra c c ió n E 2 -m ita d 5 '- in tró n m e d ia n te u n a s e c u e n c ia a d ic io n a l d io c o m o re s u lta d o la fo rm a c ió n a d e c u a d a d e la h é lic e P 10 y a la e s tru c tu ra c o n d e n s a d a d e l in tró n d e a u to -c o r te y e m p a lm e (F IG S . 10 A y 10B ).
S e d is e ñ a ro n c o n s tru c to s q u e t ie n e n un in tró n -e x ó n p e rm u ta d o d e T e tra h y m e n a c o n u n a re g ió n d e a p a re a m ie n to d e 6 n u c le ó tid o s (T e tra h y m e n a 1) y s e c u e n c ia s d e a p a re a m ie n to a m p lia d a s (T e tra h y m e n a 2 ) p a ra c o m p a ra r la e f ic ie n c ia d e c ir c u la r iz a c ió n . E n e s te e je m p lo , los c o n s tru c to s s e d is e ñ a ro n p a ra q u e in c lu y e s e n p o liA 50 c o m o e le m e n to e s p a c ia d o r y u n a c o m b in a c ió n d e un IR E S d e E M C V y un O R F d e h E P O c o m o c a rg a de p o lin u c le ó t id o s . E l ta m a ñ o d e l A R N c ir c u la r e ra d e 1 ,2 Kb.
<E l A R N lin e a l s e s in te t iz ó m e d ia n te tra n s c r ip c ió n>in vitro<u s a n d o A R N p o lim e ra s a T 7 e n p re s e n c ia d e 7 ,5 m M>d e N T P . E l A D N p la n tilla s e e lim in ó t r a tá n d o lo c o n D N a s a d u ra n te 20 m in u to s . E l A R N lin e a l s in te t iz a d o s e p u r if ic ó c o n un k it d e lim p ie z a d e A R N (N e w E n g la n d B io la b s , T 2050 ) .
E l a u to -c o r te y e m p a lm e se p ro d u jo d u ra n te la t ra n s c r ip c ió n ; n o s e re q u ir ió n in g u n a re a c c ió n a d ic io n a l. P a ra m o n ito r iz a r la e f ic a c ia d e la c irc u la r iz a c ió n , s e m e z c la ro n<200 ng d e A R N t ra n s c r ito>in vitro<p u r if ic a d o e n c o lu m n a co n ta m p ó n d e c a rg a d e g e l II (T h e rm o F is h e r, A M 8546 G ) y>s e c a le n ta ro n a 95 ° C d u ra n te 3 m in u to s , d e s p u é s s e in c u b a ro n e n h ie lo d u ra n te 3 m in u to s . A c o n tin u a c ió n , las m u e s tra s s e s e p a ra ro n m e d ia n te u re a P A G E a l 6 % , y la b a n d a d e A R N s e t iñ ó c o n t in c ió n d e g e l y s e v is u a liz ó m e d ia n te un s is te m a d e im a g e n o lo g ía . L a a m p lia c ió n d e la s e c u e n c ia d e a p a re a m ie n to d e 6 n u c le ó tid o s a 12 n u c le ó tid o s (T e tra h y m e n a 2 ) m o s tró u n a e f ic ie n c ia d e c ir c u la r iz a c ió n s im ila r c o n u n a P IE d e a u to -c o r te y e m p a lm e d e T e tra h y m e n a c o n u n a re g ió n d e a p a re a m ie n to d e 6 n u c le ó tid o s (T e tra h y m e n a 1) (F IG . 11 ). E s to s d a to s in d ic a n q u e la c ir c u la r iz a c ió n n o s e v io in te r ru m p id a p o r la e x te n s ió n d e la s e c u e n c ia d e a p a re a m ie n to e n la P IE d e a u to -c o r te y e m p a lm e d e T e tra h y m e n a .
Ejemplo 6: Expresión de proteínas a partir de ARN circular generado por PIE de Tetrahymena con una región de apareamiento ampliada
E s te e je m p lo d e s c r ib e la e x p re s ió n d e p ro te ín a s a p a rt ir d e A R N c ir c u la r g e n e ra d o p o r P IE d e a u to -c o r te y e m p a lm e d e T e tra h y m e n a c o n u n a re g ió n d e a p a re a m ie n to a m p lia d a .
P a ra c o m p a ra r la e x p re s ió n d e p ro te ín a s , s e d is e ñ a n c o n s tru c to s d e A D N q u e t ie n e n un P IE d e a u to -c o r te y e m p a lm e d e T e tra h y m e n a c o n u n a re g ió n d e a p a re a m ie n to d e 6 n u c le ó tid o s (T e tra h y m e n a 1) y s e c u e n c ia s d e a p a re a m ie n to a m p lia d a s (T e tra h y m e n a 2 ), ta l c o m o s e d e s c r ib e e n e l E je m p lo 5. L o s c o n s tru c to s e s tá n d is e ñ a d o s p a ra in c lu ir un p o liA 50 c o m o e le m e n to e s p a c ia d o r , y u n a c o m b in a c ió n d e un E M C V IR E S , y G lu c O R F c o m o c a rg a d e p o lin u c le ó t id o s .
<E l A R N lin e a l s e s in te t iz a m e d ia n te tra n s c r ip c ió n>in vitro<u s a n d o A R N p o lim e ra s a T 7 e n p re s e n c ia d e 7 ,5 m M>d e N T P . E l A D N p la n tilla s e e lim in a tra tá n d o lo co n D N a s a . E l A R N lin e a l s in te t iz a d o s e p u r if ic a c o n un k it d e lim p ie z a d e A R N (N e w E n g la n d B io la b s , T 2050 ) . E l A R N c ir c u la r q u e c o d if ic a G lu c s e p u r if ic a m e d ia n te U re a P A G E , s e e lu y e e n un ta m p ó n (0 ,5 M d e a c e ta to s ó d ic o , 0 ,1 % d e S D S , 1 m M d e E D T A ), s e p re c ip ita c o n e ta n o l y s e v u e lv e a s u s p e n d e r e n a g u a lib re d e A R N a s a .
P a ra c o m p a ra r la e x p re s ió n d e l A R N c ir c u la r q u e c o d if ic a G lu c , s e p re p a ra n A R N c irc u la re s g e n e ra d o s p o r P IE d e T e tra h y m e n a c o n u n a re g ió n d e a p a re a m ie n to d e 6 n u c le ó tid o s (T e tra h y m e n a 1) y P IE d e T e tra h y m e n a co n u n a re g ió n d e a p a re a m ie n to a m p lia d a (T e tra h y m e n a 2 ), c o m o s e h a d e s c r ito a n te r io rm e n te . L a s c é lu la s H e L a (10.000 c é lu la s p o r p o c illo e n u n a p la c a d e 96 p o c il lo s ) s e tra n s fe c ta n c o n 0,1 p m o le s d e A R N c ir c u la r p u r if ic a d o u s a n d o el a g e n te d e t ra n s fe c c ió n L IP O F E C T A M IN E ® M e s s e n g e rM A X ( In v it r o g e n ) s ig u ie n d o la s in s tru c c io n e s d e l fa b r ic a n te . L o s t r a n s fe c ta n te s s e p re p a ra n p a ra c a d a p u n to te m p o ra l p o r s e p a ra d o . L o s m e d io s d e c u lt iv o s e re c o g e n a la s 6, 24 y 48 h o ra s . P a ra m e d ir la a c t iv id a d d e G lu c , e l m e d io c e lu la r re c o g id o s e tra n s f ie re a u n a p la c a b la n c a d e 96 p o c il lo s y se u s a un s is te m a d e e n s a y o d e re p o r te ro b io lu m in is c e n te d e a c u e rd o c o n la s in s tru c c io n e s d e l fa b r ic a n te . L a p la c a se le e e n un lu m in ó m e tro .
Ejemplo 7: Diseño de un intrón-exón permutado (PIE) de auto-corte y empalme de fago T4 con región de apareamiento ampliada
E s te e je m p lo d e s c r ib e e l d is e ñ o d e la P IE d e a u to -c o r te y e m p a lm e d e l fa g o T 4 c o n re g ió n d e a p a re a m ie n to a m p lia d a .
E n la s F IG . 12 A y F IG . 12 B se m u e s tra n e s q u e m a s q u e re p re s e n ta n d is e ñ o s e je m p la re s d e c o n s tru c to s de A D N . E l c o n s tru c to in c lu y e , d e 5 ' a 3 ': u n a m ita d 3 ' d e l f ra g m e n to d e in tró n c a ta lí t ic o d e l g ru p o I (m ita d 3 '- in tró n d e l fa g o T 4 ), un s it io d e c o r te y e m p a lm e 3', un f ra g m e n to d e e x ó n 3 ' ( fa g o T 4 E 2 ), un e le m e n to e s p a c ia d o r , u n a c a rg a d e p o lin u c le ó t id o s , un f ra g m e n to d e e x ó n 5 ' ( fa g o T 4 E 1), un s it io d e c o r te y e m p a lm e 5', y u n a m ita d 5 ' d e l f ra g m e n to d e in tró n c a ta lí t ic o d e l g ru p o I (m ita d 5 '- in tró n d e l fa g o T 4 ). E 2 t ie n e u n a s e c u e n c ia c o m p le m e n ta r ia d e 2 n u c le ó tid o s (5 '-C T -3 ') a la m ita d 5 '- in tró n (5 '- A G -3 ') q u e fo rm a la h é lic e P 10 (F IG S . 12 A y 12 B , lín e a s n e g ra s s o b re E 2 y m ita d 5 '-in tró n ) . P a ra g e n e ra r un c o n s tru c to q u e te n g a u n a re g ió n d e a p a re a m ie n to a m p lia d a e n tre E 2 y la m ita d 5 '- in tró n , se m u ta ro n 4 n u c le ó tid o s d e E 2 p a ra te n e r u n a re g ió n d e a p a re a m ie n to a m p lia d a d e 5 n u c le ó tid o s co n la m ita d 5 '- in tró n<(5 '>-ACCGT-3<' (S E Q ID N O : 18 ) ^ 5 '>-CAATT-3<' (S E Q i D N O : 19), lo s c a ra c te re s en n e g r ita re p re s e n ta n s e c u e n c ia s>m u ta d a s ) . L a re g ió n d e a p a re a m ie n to to ta l d e l fa g o T 4 P IE c o n u n a re g ió n d e a p a re a m ie n to a m p lia d a e s d e 7<n u c le ó tid o s (E 2 ; 5 '>-CTCAATT-3<' (S E Q ID N O : 20 ), m ita d 5 '- in tró n ; 5 '>-AATTGAG<-3 ' (S E Q ID N O : 21 ), lo s c a ra c te re s>e n n e g r ita re p re s e n ta n s e c u e n c ia s d e a p a re a m ie n to e x te n d id a s ) (F IG S . 12 A y 12 B ).
P a ra c o m p a ra r la e f ic ie n c ia d e c irc u la r iz a c ió n , s e d is e ñ a ro n c o n s tru c to s q u e t ie n e n P IE d e fa g o T 4 c o n u n a re g ió n de a p a re a m ie n to d e 2 n u c le ó tid o s ( fa g o T 4 1) y s e c u e n c ia s d e a p a re a m ie n to a m p lia d a s ( fa g o T 4 2 ). E n e s te e je m p lo , los c o n s tru c to s s e d is e ñ a ro n p a ra q u e in c lu y e s e n p o liA 50 c o m o e le m e n to e s p a c ia d o r , u n a c o m b in a c ió n d e un E M C V IR E S y G lu c O R F c o m o c a rg a d e p o lin u c le ó t id o s . E l ta m a ñ o d e l A R N c ir c u la r e ra d e 1 ,2 K. E l A R N lin e a l s e s in te t iz ó<m e d ia n te tra n s c r ip c ió n>in vitro<u s a n d o A R N p o lim e ra s a T 7 e n p re s e n c ia d e 7 ,5 m M d e N T P . E l A D N p la n t il la s e e lim in ó>t r a tá n d o lo c o n D N a s a . E l A R N lin e a l s in te t iz a d o s e p u r if ic ó c o n un k it d e lim p ie z a d e A R N (N e w E n g la n d B io la b s , T 2050 ) .
E l a u to -c o r te y e m p a lm e s e p ro d u jo d u ra n te la t ra n s c r ip c ió n ; n o s e re q u ie re n in g u n a re a c c ió n a d ic io n a l. P a ra m o n ito r iz a r la e f ic a c ia d e la c irc u la r iz a c ió n , se m e z c la ro n 200 ng d e A R N t ra n s c r ito in v it ro p u r if ic a d o e n c o lu m n a co n ta m p ó n d e c a rg a d e g e l II (T h e rm o F is h e r, A M 8546 G ) y s e c a le n ta ro n a 95 ° C d u ra n te 3 m in u to s , in c u b á n d o s e d e s p u é s e n h ie lo d u ra n te 3 m in u to s . A c o n tin u a c ió n , la s m u e s tra s s e s e p a ra ro n m e d ia n te u re a P A G E a l 6 % , y la b a n d a d e A R N s e t iñ ó co n t in c ió n d e g e l y s e v is u a liz ó u s a n d o un s is te m a d e im a g e n o lo g ía .
L a a m p lia c ió n d e la s e c u e n c ia d e a p a re a m ie n to ( fa g o T 4 2 ) m o s tró u n a e f ic a c ia d e c ir c u la r iz a c ió n s im ila r a la d e un P IE d e a u to -c o r te y e m p a lm e d e fa g o T 4 c o n u n a re g ió n d e a p a re a m ie n to d e 6 n u c le ó tid o s ( fa g o T 4 1) (F IG .
13 ). E s to s d a to s in d ic a n q u e la c ir c u la r iz a c ió n n o s e v io a lte ra d a p o r la e x te n s ió n d e la s e c u e n c ia d e a p a re a m ie n to en la P IE d e a u to -c o r te y e m p a lm e d e l fa g o T 4.
Ejemplo 8: Expresión de proteínas a partir de ARN circular generado por PIE de auto-corte y empalme de fago T4 con una región de apareamiento ampliada
E s te e je m p lo d e s c r ib e la e x p re s ió n d e A R N c ir c u la r g e n e ra d o p o r e l P IE d e a u to -c o r te y e m p a lm e d e l fa g o T 4 c o n u n a re g ió n d e a p a re a m ie n to a m p lia d a .
P a ra c o m p a ra r la e x p re s ió n d e p ro te ín a s , s e d is e ñ a n c o n s tru c to s d e A D N c o n P IE d e fa g o T 4 co n u n a re g ió n d e a p a re a m ie n to d e 2 n u c le ó tid o s ( fa g o T 4 1) y s e c u e n c ia s d e a p a re a m ie n to e x te n d id a s ( fa g o T 4 2 ), c o m o s e d e s c r ib e e n e l E je m p lo 7. E n e s te e je m p lo , lo s c o n s tru c to s s e d is e ñ a n p a ra q u e in c lu y a n p o liA 50 c o m o e le m e n to e s p a c ia d o r , y u n a c o m b in a c ió n d e un E M C V IR E S y G lu c O R F c o m o c a rg a d e p o lin u c le ó tid o s .
<E l A R N lin e a l s e s in te t iz a m e d ia n te tra n s c r ip c ió n>in vitro<u s a n d o A R N p o lim e ra s a T 7 e n p re s e n c ia d e 7 ,5 m M>d e N T P . E l A D N p la n tilla s e e lim in a tra tá n d o lo co n D N a s a . E l A R N lin e a l s in te t iz a d o s e p u r if ic a c o n un k it d e lim p ie z a d e A R N (N e w E n g la n d B io la b s , T 2050 ) . E l A R N c ir c u la r q u e c o d if ic a G lu c s e p u r if ic a m e d ia n te U re a P A G E , s e e lu y e e n un ta m p ó n (0 ,5 M d e a c e ta to s ó d ic o , 0 ,1 % d e S D S , 1 m M d e E D T A ), s e p re c ip ita c o n e ta n o l y s e v u e lv e a s u s p e n d e r e n a g u a lib re d e A R N a s a .
P a ra c o m p a ra r la e x p re s ió n d e l A R N c ir c u la r q u e c o d if ic a G lu c , se p re p a ra n A R N c irc u la re s g e n e ra d o s p o r e l P IE d e l fa g o T 4 c o n u n a re g ió n d e a p a re a m ie n to d e 2 n u c le ó tid o s ( fa g o T 4 1) y e l P IE d e l fa g o T 4 co n u n a re g ió n d e a p a re a m ie n to a m p lia d a ( fa g o T 4 2 ), c o m o s e h a d e s c r ito a n te r io rm e n te . L a s c é lu la s H e L a (10.000 c é lu la s p o r p o c illo e n u n a p la c a d e 96 p o c illo s ) s e t r a n s fe c ta n co n 0,1 p m o le s d e A R N c irc u la re s p u r if ic a d o s u s a n d o e l a g e n te d e t ra n s fe c c ió n L IP O F E C T A M IN E ® M e s s e n g e rM A X ( In v it ro g e n ) d e a c u e rd o c o n la s in s tru c c io n e s d e l fa b r ic a n te . L o s t r a n s fe c ta n te s se p re p a ra n p a ra c a d a p u n to te m p o ra l p o r s e p a ra d o . S e re c o g e n los m e d io s d e c u lt iv o a la s 6, 24 y 48 h o ra s . P a ra m e d ir la a c t iv id a d d e G lu c , e l m e d io c e lu la r re c o g id o s e tra n s f ie re a u n a p la c a b la n c a d e 96 p o c il lo s y se u s a un s is te m a d e e n s a y o re p o r te ro b io lu m in is c e n te d e a c u e rd o c o n la s in s tru c c io n e s d e l fa b r ic a n te . La p la c a se lee e n un lu m in ó m e tro .
Ejemplo 9: Diseño de un constructo de intrón-exón permutado (PIE) de auto-corte y empalme con región de apareamiento ampliada
E s te e je m p lo d e s c r ib e e l d is e ñ o d e v a r ia s s e c u e n c ia s d e in tró n -e x ó n p e rm u ta d o (P IE ) d e a u to -c o r te y e m p a lm e c o n re g ió n d e a p a re a m ie n to a m p lia d a p a ra p ro p o rc io n a r u n a m e jo r e f ic ie n c ia d e c ir c u la r iz a c ió n .
E n la s F IG S . 14 A y F IG . 14 B se p ro p o rc io n a n e s q u e m a s q u e re p re s e n ta n d is e ñ o s e je m p la re s d e c o n s tru c to s d e A D N . E n e s te e je m p lo , lo s c o n s tru c to s in c lu y e n , d e 5 ' a 3': u n a m ita d 3 ' d e l f ra g m e n to d e in tró n c a ta lí t ic o d e l g ru p o I (m ita d 3 '- in tró n ) , un s it io d e c o rte y e m p a lm e 3', un f ra g m e n to d e e x ó n 3 ' (E 2 ), un e le m e n to e s p a c ia d o r , u n a c a rg a d e p o lin u c le ó t id o s , un fra g m e n to d e e x ó n 5 ' (E 1 ), un s it io d e c o r te y e m p a lm e 5 ', y u n a m ita d 5 ' d e l f ra g m e n to d e in tró n c a ta lí t ic o d e l g ru p o I (m ita d 5 '- in tró n ) .
L o s d ife re n te s in tro n e s d e l g ru p o I t ie n e n d ife re n te s lo n g itu d e s d e s e c u e n c ia c o m p le m e n ta r ia (F IG . 19 ). P o r e je m p lo , E 2 d e S y n e c h o c o c c u s e lo n g a tu s P C C 6301 t ie n e u n a s e c u e n c ia c o m p le m e n ta r ia d e 7 n u c le ó tid o s p a ra E1 d e S y n e c h o c o c c u s e lo n g a tu s P C C 6301 ; E 2 d e A n a b a e n a a z o lla e , A n a b a e n a c y lin d r ic a , y S c y to n e m a h o fm a n n i t ie n e n 5 n u c le ó tid o s d e s e c u e n c ia s c o m p le m e n ta r ia s p a ra E1 d e A n a b a e n a a z o lla e , A n a b a e n a c y lin d r ic a , y S c y to n e m a h o fm a n n i, re s p e c t iv a m e n te . P a ra g e n e ra r un c o n s tru c to q u e te n g a u n a re g ió n d e a p a re a m ie n to a m p lia d a e n tre E 2 y E 1 , se m u ta ro n s e c u e n c ia s e n E 2 p a ra te n e r u n a re g ió n d e a p a re a m ie n to a m p lia d a c o n E1 c o m o s e d e s c r ib e e n la F IG . 19. L a re g ió n d e a p a re a m ie n to to ta l d e l in tró n -e x ó n p e rm u ta d o (P IE ) d e l g ru p o I c o n u n a re g ió n d e a p a re a m ie n to a m p lia d a t ie n e 17 n u c le ó tid o s .
L a s re g io n e s d e a p a re a m ie n to o r ig in a l (1 ) y a m p lia d a (2 ) d e la F IG . 19 s o n la s s ig u ie n te s :
S y n e c h o c o c c u s 1 T C C G C T G A C T G T A A A G G (S E Q ID N O : 92 )
S y n e c h o c o c c u s 2 T C C G C T G C G T C T A C C G T (S E Q ID N O : 93 )
A n a b a e n a a z o lla e 1 T C C G T T G A C T G T A A A A A (S E Q ID N O : 94 )
A n a b a e n a a z o lla e 2 T C C G T A G C G T C T A C C A T (S E Q ID N O : 95 )
A n a b a e n a c y lin d r ic a 1 T C C G T T G A C C T T A A A C G (S E Q ID N O : 96 )
A n a b a e n a c y lin d r ic a 2 T C C G T A G C G T C T A C C A T (S E Q ID N O : 97 )
S c y to n e m a 1 C C C G A A G G T C A G T G G T T (S E Q ID N O : 98 )
S c y to n e m a 2 C C C G A C G A G C T A C C A G G (S E Q ID N O : 99 )
L a s e s tru c tu ra s d e A R N s e e s t im a ro n m e d ia n te la h e r ra m ie n ta d e p re d ic c ió n d e e s tru c tu ra s d e A R N , R N A fo ld ( rn a .tb i.u n iv ie .a c .a t /c g i-b in /R N A W e b S u ite /R N A fo ld .c g i) . L a a m p lia c ió n d e la in te ra c c ió n E 2 -E 1 se g e n e ró m o d if ic a n d o lo s re s u lta d o s d e la s e c u e n c ia e n la in te ra c c ió n a d e c u a d a E 2 -E 1 y la e s tru c tu ra c o n d e n s a d a d e l in tró n d e a u to -c o r te y e m p a lm e (F IG S . 15 A -15 B , 16 A -16 B , 17 A -17 B , y 18 A -18 B ).
S e d is e ñ a ro n c o n s tru c to s q u e t ie n e n la P IE c o n u n a re g ió n d e a p a re a m ie n to o r ig in a l y s e c u e n c ia s de a p a re a m ie n to c o n u n a re g ió n d e a p a re a m ie n to a m p lia d a p a ra c o m p a ra r la e f ic a c ia d e la c irc u la r iz a c ió n . P a ra la c o m p a ra c ió n , ta m b ié n s e u s a ro n lo s c o n s tru c to s A n a b a e n a 1 y A n a b a e n a 2. En e s te e je m p lo , lo s c o n s tru c to s se d is e ñ a ro n p a ra q u e in c lu y e s e n un e le m e n to e s p a c ia d o r y u n a c o m b in a c ió n d e un IR E S E M C V y un O R F d e 3822 n u c le ó tid o s c o m o c a rg a d e p o lin u c le ó t id o s . E l ta m a ñ o d e l A R N c ir c u la r e ra d e 4 ,5 Kb.
E l A R N lin e a l n o m o d if ic a d o se s in te t iz ó m e d ia n te t ra n s c r ip c ió n in v it ro u s a n d o la A R N p o lim e ra s a T 7 a p a rt ir d e u n a p la n til la d e A D N e n p re s e n c ia d e 12 ,5 m M d e N T P . E l A D N p la n t il la s e e lim in ó tra tá n d o lo c o n D N a s a d u ra n te 20 m in u to s . E l A R N lin e a l s in te t iz a d o s e p u r if ic ó co n un k it d e lim p ie z a d e A R N (N e w E n g la n d B io la b s , T 2050 ) . E l a u to -c o r te y e m p a lm e s e p ro d u jo d u ra n te la t ra n s c r ip c ió n ; n o se re q u ir ió n in g u n a re a c c ió n a d ic io n a l. P a ra c o n tro la r la<e f ic a c ia d e l a u to -c o r te y e m p a lm e , e l A R N tra n s c r ito>in vitro<p u r if ic a d o e n c o lu m n a s e s e p a ró e n u n a c o lu m n a d e>in te rc a m b io a n ió n ic o (A E X ) m e d ia n te H P L C . S e m id ió e l p o rc e n ta je d e p ic o s lin e a le s y c irc u la re s , y la e f ic ie n c ia d e c ir c u la r iz a c ió n s e n o rm a liz ó co n la d e los c o n s tru c to s q u e t ie n e n e l P IE c o n la re g ió n d e a p a re a m ie n to o r ig in a l.
L a a m p lia c ió n d e la s e c u e n c ia d e a p a re a m ie n to a u m e n tó la e f ic ie n c ia d e c ir c u la r iz a c ió n h a s ta c in c o v e c e s p a ra A n a b a e n a (A n a b a e n a 2 ), S y n e c h o c o c c u s e lo n g a tu s P C C 6301 (S y n e c h o c o c c u s 2 ), y A n a b a e n a c y lin d r ic a (A n a b a e n a c y c lin d r ic a 2 ), y h a s ta d ie z v e c e s p a ra A n a b a e n a a z o lla e (A n a b a e n a a z o lla e 2 ), p e ro no s e o b s e rv ó n in g ú n a u m e n to e n la e f ic ie n c ia d e c ir c u la r iz a c ió n p a ra S c y to n e m a h o fm a n n i (S c y to n e m a 2 ) (F IG . 20 ). E s to d e m u e s tra q u e la e f ic ie n c ia d e c ir c u la r iz a c ió n p u e d e a u m e n ta rs e m o d if ic a n d o o tro s in tro n e s d e l g ru p o I u s a n d o la m is m a e s tra te g ia o u n a s im ila r a la d e s c r ita e n la p re s e n te p a ra e l in tró n d e A n a b a e n a .
Ejemplo 10: Diseño de un constructo de intrón-exón permutado (PIE) de auto-corte y empalme de Anabaena con una región madre ampliada para mejorar la interacción extremo a extremo.
E s te e je m p lo d e s c r ib e e l d is e ñ o d e s e c u e n c ia s d e in tró n -e x ó n p e rm u ta d o (P IE ) d e a u to -c o r te y e m p a lm e d e A n a b a e n a c o n re g ió n m a d re a m p lia id a p a ra p ro p o rc io n a r u n a m e jo r e f ic ie n c ia d e c ir c u la r iz a c ió n m e d ia n te la m e jo ra d e la in te ra c c ió n e x tre m o a e x tre m o .
E n la F IG . 21 B s e p ro p o rc io n a n e s q u e m a s q u e re p re s e n ta n d is e ñ o s e je m p la re s d e c o n s tru c to s d e A D N . E n e s te e je m p lo , lo s c o n s tru c to s in c lu y e n , d e 5 ' a 3': u n a m ita d 3 ' d e l f ra g m e n to d e in tró n c a ta lí t ic o d e l g ru p o I (m ita d 3 '-in tró n 3 ' d e A n a b a e n a ) , un s it io d e c o r te y e m p a lm e 3', un f ra g m e n to d e e x ó n 3 ' (E 2 d e A n a b a e n a ) , un e le m e n to e s p a c ia d o r , u n a c a rg a d e p o lin u c le ó t id o s , un f r a g m e n to d e e x ó n 5 ' (E 1 d e A n a b a e n a ) , un s it io d e c o r te y e m p a lm e 5', y u n a m ita d 5 ' d e l f ra g m e n to d e in tró n c a ta lí t ic o d e l g ru p o I (m ita d 5 '- in tró n d e A n a b a e n a ) . S e d is e ñ a ro n d o s v e rs io n e s d e c o n s tru c to s q u e t ie n e n u n a re g ió n m a d re a m p lia d a . P a ra e l d is e ñ o d e A n a b a e n a 4, s e c o lo c ó u n a re g ió n m a d re a d ic io n a l (5 '-G U A A G U U -3 ') u n a a l la d o d e la o tra . P a ra e l d is e ñ o d e A n a b a e n a 5, s e re l le n ó u n a re g ió n a b u lta d a en P 6 b p a ra fo rm a r u n ta llo .
<E l A R N lin e a l no m o d if ic a d o s e s in te t iz ó m e d ia n te t ra n s c r ip c ió n>in vitro<u s a n d o A R N p o lim e ra s a T 7 a p a rt ir>d e u n a p la n t il la d e A D N en p re s e n c ia d e 12 ,5 m M d e N T P . E l A D N p la n t il la s e e lim in ó t ra tá n d o lo c o n D N a s a d u ra n te 20 m in u to s . El A R N lin e a l s in te t iz a d o s e p u r if ic ó c o n un k it d e lim p ie z a d e A R N (N e w E n g la n d B io la b s , T 2050 ) . E l a u to -c o r te y e m p a lm e s e p ro d u jo d u ra n te la t ra n s c r ip c ió n ; n o s e re q u ir ió n in g u n a re a c c ió n a d ic io n a l. P a ra m o n ito r iz a r la<e f ic a c ia d e l a u to -c o r te y e m p a lm e , e l A R N t ra n s c r ito>in vitro<p u r if ic a d o e n c o lu m n a s e s e p a ró e n u n a c o lu m n a d e>in te rc a m b io a n ió n ic o (A E X ) m e d ia n te H P L C . S e m id ió e l p o rc e n ta je d e p ic o s lin e a le s y c ir c u la re s y s e n o rm a liz ó la e f ic ie n c ia d e c ir c u la r iz a c ió n c o n la d e lo s c o n s tru c to s o r ig in a le s c o r re s p o n d ie n te s .
L o s c o n s tru c to s c o n u n a re g ió n m a d re a m p lia d a m o s tra ro n u n a e f ic ie n c ia d e c ir c u la r iz a c ió n c o m p a ra b le co n lo s c o n s tru c to s q u e t ie n e n e l P IE d e A n a b a e n a c o n u n a re g ió n d e a p a re a m ie n to a m p lia d a (A n a b a e n a 2 ) y lo s c o n s tru c to s q u e t ie n e n e l P IE d e A n a b a e n a c o n u n a re g ió n d e a p a re a m ie n to d e 5 n u c le ó tid o s (A n a b a e n a 1) (F IG .22 ).
S y n e c h o c o c c u s e lo n a tu s P C C 6301 : m ita d 3 '- in tró n E 2
T AAACAACT AACAGCTTT AG AAG GT G CAG AG ACTAG ACG G G AGCTACCCTAACGG ATTCAG CCG AG
GGTAAAGGGATAGTCCAATTCTCAACATCGCGATTGTTGATGGCAGCGAAAGTTGCAGAGAGAATGA
AAATCCGCTGACTGTAAAGGTCGTGAGGGTTCGAGTCCCTCCGCCCCCA (SEQ ID NO: 80)
S y n e c h o c o c c u s e lo n g a tu s P C C 6301 : E1 m ita d 5 '- in tró n
ACGGTAGACGCAGCGGACTTAGAAAACTGGGCCTCGATCGCGAAAGGGATCGAGTGGCAGCTCTCA
AACTCAGGGAAACCTAAAACTTTAAACATTMAAGTCATGGCAATCCTGAGCCAAGCTAAAGC (SEQ ID
NO: 81)
A n a b a e n a a z o lla e : m ita d 3 '- in tró n E 2
TTAAACTCAAAATTTAAAATCCCAAATTCAAAATTCCGGGAAGGTGCAGAGACTCGACGGGAGCTAC
CCTAACGTAAAG CCG AG GGTAAAG G G AG AGTCCAATTCTCAAAG CCTG AAGTTGCTG AAG CAACAA
GGCAGTAGTGAAAGCTGCGAGAGAATGAAAATCCGTTGACTGTAAAAAGTCGTGGGGGTTCAAGTC
CCCCCACCCCC (SEQ ID NO: 82)
A n a b a e n a a z o lla e : E1 m ita d 5 '- in tró n
ATGGTAGACGCTACGGACTTAGAAAACTGAGCCTTGATAGAGAAATCTTTTAAGTGGAAGCTCTCAAA
TT CAG GG AAACCT AAAT CT G AAT ACAG AT AT G GCAATCCT GAGCCAAG CCC AG AAAATTT AG ACTT G A
GATTTGATTTTGGAG (SEQ ID NO: 83)
A n a b a e n a c y lin d r ic a : m ita d 3 '- in tró n E 2
G GCTTTCAATTTG AAATCAG AAATTCAAAATTCAGG G AAG GTG CAG AG ACTCG ACG GG AG CTACCCT
AACGTAAAGGCGAGGGTAAAGGGAGAGTCCAATTCTTAAAGCCTGAAGTTGTGCAAGCAACAAGGC
AACAGTGAAAGCTGTGGAAGAATGAAAATCCGTTGACCTTAAACGGTCGTGGGGGTTCAAGTCCCCC
CACCCCC (SEQ ID NO: 84)
A n a b a e n a c y lin d r ic a : E1 m ita d 5 - in t r ó n
ATGGTAGACGCTACGGACTTAGAAAACTGAGCCTTGATAGAGAAATCTTTCAAGTGGAAGCTCTCAA ATTCAGGGAAACCTAAATCTGAATACAGATATGGCAATCCTGAGCCAAGCCCGGAAATTTTAGAATCA AGATTTTATTTT (SEQ ID NO: 85)
S c y to n e m a h o fm a n n i: m ita d 3 '- in tró n E 2
AGAAATGGAGAAGGTGTAGAGACTGGAAGGCAGGCACCCTAACGTTAAAGGCGAGGGTGAAGGGA CAGTCCAGACCACAAACCAGTAAATCTGGGCAGCGAAAGCTGTAGATGGTAAGCATAACCCGAAGG TCAGTGGTTCAAATCCACTTCCCGCCACCAAATTAAAAAAACAATAA (SEQ ID NO: 86)
S c y to n e m a h o fm a n n i: E1 m ita d 5 '- in tró n
AGAAATGGAGAAGGTGTAGAGACTGGAAGGCAGGCACCCTAACGTTAAAGGCGAGGGTGAAGGGA CAGTCCAGACCACAAACCAGTAAATCTGGGCAGCGAAAGCTGTAGATGGTAAGCATAACCCGAAGG T CAGTGGTT CAAATCCACTTCCCG CCACCAAATT AAAAAAACAAT AA (SEQ ID NO: 87)
A n a b a e n a 4: m ita d 3 '- in tró n E 2
AACAACAGATAACTTACTAACTTACAGCTAGTCGGAAGGTGCAGAGACTCGACGGGAGCTACCCTAA CGTCAAGACGAGGGTAAAGAGAGAGTCCAATTCTCAAAGCCAATAGGCAGTAGCGAAAGCTGCGGG AGAATGAAAATCCGTAGCGTCTAAACGGTCGTGTGGGTTCAAGTCCCTCCACCCCCA (SEQ ID NO: 88<)>
A n a b a e n a 4: E1 m ita d 5 '- in tró n
AG ACG CT ACG G ACTT AAAT AATT G AG CCTT AG AG AAG AAATT CTTT AAGTGG ATGCT CT CAAACT CAG G G AAACCT AAAT CT AG CT AT AG ACAAGG CAATCCT G AG CCAAGCCG AAGTAGTAATT AGT AAGTT AG TAAGTT (SEQ ID NO: 89)
A n a b a e n a 5: m ita d 3 '- in tró n E 2
AACAACAGATAACTTACTAGTTACTAGTCGGAAGGTGCAGAGACTGGACGGGAGCTACCCTAACGTC AAGACGAGGGTAAAGAGAGAGTCCAATTCTCAAAGCCAATAGGCAGTAGCGAAAGCTGCGGGAGAA TGAAAATCCGTAGCGTCTAAACGGTCGTGTGGGTTCAAGTCCCTCCACCCCCA (SEQ ID NO: 90)
A n a b a e n a 5: E1 m ita d 5 '- in tró n
AG ACG CT ACG G ACTT AAAT AATT G AG CCTT AGAG AAG AAATT CTTT AAGTGG ATGCT CT CAAACT CAG GGAAACCTAAATCTAGCTATAGACAAGGCAATCCTGAGCCAAGCCGAAGTAGTAATTAGTAAGTT
(SEQ ID NO: 91)

Claims (15)

  1. REIVINDICACIONES 1. U n p o lir r ib o n u c le ó tid o lin e a l q u e t ie n e la fó rm u la 5 '- (A ) - (B ) - (C ) - (D ) - (E ) - (F ) - (G ) -3 ', e n d o n d e : (A ) c o m p re n d e u n a m ita d 3 ' d e l f ra g m e n to d e l in tró n c a ta lí t ic o d e l G ru p o I; (B ) c o m p re n d e un s it io d e c o r te y e m p a lm e 3'; (C ) c o m p re n d e un f ra g m e n to d e e x ó n 3'; (D ) c o m p re n d e u n a c a rg a d e p o lir r ib o n u c le ó tid o ; (E ) c o m p re n d e un f ra g m e n to d e e x ó n 5'; (F ) c o m p re n d e un s it io d e c o r te y e m p a lm e 5'; y (G ) c o m p re n d e la m ita d 5 ' d e l f ra g m e n to d e l in tró n c a ta lí t ic o d e l G ru p o I; y e n d o n d e (A ), (B ) o (C ) c o m p re n d e u n a p r im e ra re g ió n d e a p a re a m ie n to q u e c o m p re n d e d e 8 a 50 r ib o n u c le ó t id o s y (E ), (F ) o (G ) c o m p re n d e u n a s e g u n d a re g ió n d e a p a re a m ie n to q u e c o m p re n d e d e 8 a 50 r ib o n u c le ó t id o s , e n d o n d e la p r im e ra re g ió n d e a p a re a m ie n to y la s e g u n d a re g ió n d e a p a re a m ie n to t ie n e n u n a c o m p le m e n ta r ie d a d d e l 80 % a l 100 % , o la p r im e ra re g ió n d e a p a re a m ie n to y la s e g u n d a re g ió n d e a p a re a m ie n to c o m p re n d e n d e c e ro a 10 p a re s d e b a s e s m a l a p a re a d a s .
  2. 2. E l p o lir r ib o n u c le ó tid o lin e a l d e la re iv in d ic a c ió n 1, e n d o n d e :
  3. 3. E l p o lir r ib o n u c le ó tid o lin e a l d e la re iv in d ic a c ió n 1 o 2, e n d o n d e la p r im e ra re g ió n d e a p a re a m ie n to y la s e g u n d a re g ió n d e a p a re a m ie n to : i) t ie n e u n a c o m p le m e n ta r ie d a d d e l 90 % a l 100 % ; o ii) c o m p re n d e n d e c e ro o un p a r d e b a s e s m a l a p a re a d a s ; y /o iii) s o n 100 % c o m p le m e n ta r ia s .
  4. 4. E l p o lir r ib o n u c le ó tid o lin e a l d e la re iv in d ic a c ió n 1: i) e n d o n d e la m ita d 3 ' d e l f ra g m e n to d e l in tró n c a ta lí t ic o d e l g ru p o I d e (A ) y la m ita d 5 ' d e l f ra g m e n to d e l in tró n c a ta lí t ic o d e l g ru p o I d e (G ) p ro c e d e n d e un g e n d e p re -A R N t-L e u d e C y a n o b a c te r iu m A n a b a e n a , y e n d o n d e e l f ra g m e n to d e e x ó n 3 ' d e (C ) c o m p re n d e la p r im e ra re g ió n d e a p a re a m ie n to y e l f ra g m e n to de e x ó n 5 ' d e (E ) c o m p re n d e la s e g u n d a re g ió n d e a p a re a m ie n to ; o p c io n a lm e n te , e n d o n d e la p r im e ra re g ió n d e a p a re a m ie n to c o m p re n d e d e 10 a 15 r ib o n u c le ó t id o s y la s e g u n d a re g ió n d e a p a re a m ie n to c o m p re n d e d e 10 a 15 r ib o n u c le ó t id o s ; o ii) e n d o n d e la m ita d 3 ' d e l f ra g m e n to d e l in tró n c a ta lí t ic o d e l g ru p o I d e (A ) y la m ita d 5 ' d e l f ra g m e n to d e l in tró n c a ta lí t ic o d e l g ru p o I d e (G ) p ro c e d e n d e un p re -A R N r d e T e tra h y m e n a , y e n d o n d e la m ita d 3 ' d e l f ra g m e n to d e l in tró n c a ta lí t ic o d e l g ru p o I d e (A ) c o m p re n d e la p r im e ra re g ió n d e a p a re a m ie n to y e l f ra g m e n to d e l e x ó n 5 ' d e (E ) c o m p re n d e la s e g u n d a re g ió n d e a p a re a m ie n to ; o p c io n a lm e n te , e n d o n d e la p r im e ra re g ió n d e a p a re a m ie n to c o m p re n d e d e 10 a 16 r ib o n u c le ó t id o s y la s e g u n d a re g ió n d e a p a re a m ie n to c o m p re n d e d e 10 a 16 r ib o n u c le ó t id o s ; o iii) e n d o n d e la m ita d 3 ' d e l f ra g m e n to d e in tró n c a ta lí t ic o d e l g ru p o I d e (A ) y la m ita d 5 ' d e l f ra g m e n to d e in tró n c a ta lí t ic o d e l g ru p o I d e (G ) p ro c e d e n d e un g e n td d e fa g o T 4 , y en d o n d e e l f ra g m e n to d e e x ó n 3 ' d e (C ) c o m p re n d e la p r im e ra re g ió n d e a p a re a m ie n to y la m ita d 5 ' d e l f ra g m e n to d e in tró n c a ta lí t ic o d e l g ru p o I d e (G ) c o m p re n d e la s e g u n d a re g ió n d e a p a re a m ie n to ; o p c io n a lm e n te , e n d o n d e la p r im e ra re g ió n d e a p a re a m ie n to c o m p re n d e d e 2 a 16 r ib o n u c le ó t id o s y la s e g u n d a re g ió n d e a p a re a m ie n to c o m p re n d e d e 2 a 16 r ib o n u c le ó t id o s .
  5. 5. E l p o lir r ib o n u c le ó tid o lin e a l d e c u a lq u ie ra d e la s re iv in d ic a c io n e s 1 -4 , e n d o n d e :
  6. 6. E l p o lir r ib o n u c le ó tid o lin e a l d e c u a lq u ie ra d e las re iv in d ic a c io n e s 1-5, e n d o n d e e l p o lir r ib o n u c le ó tid o lin e a l c o m p re n d e a d e m á s : i) u n a p r im e ra re g ió n e s p a c ia d o ra e n tre e l f ra g m e n to d e e x ó n 3 ' d e (C ) y la c a rg a d e p o lir r ib o n u c le ó tid o d e (D ); y /o ii) u n a s e g u n d a re g ió n e s p a c ia d o ra e n tre la c a rg a d e p o lir r ib o n u c le ó tid o d e (D ) y e l f ra g m e n to d e e x ó n 5 ' d e (E ); p re fe r ib le m e n te , e n d o n d e c a d a re g ió n e s p a c ia d o ra t ie n e u n a lo n g itu d d e p o r lo m e n o s 5 r ib o n u c le ó t id o s ; y m á s p re fe r ib le m e n te , e n d o n d e c a d a re g ió n e s p a c ia d o ra t ie n e u n a lo n g itu d d e e n tre 5 y 500 r ib o n u c le ó t id o s .
  7. 7. E l p o lir r ib o n u c le ó tid o lin e a l d e c u a lq u ie ra d e las re iv in d ic a c io n e s 6, e n d o n d e la p r im e ra re g ió n e s p a c ia d o ra , la s e g u n d a re g ió n e s p a c ia d o ra , o la p r im e ra re g ió n e s p a c ia d o ra y la s e g u n d a re g ió n e s p a c ia d o ra c o m p re n d e n u n a s e c u e n c ia p o liA ; o u n a s e c u e n c ia p o liA -C .
  8. 8. E l p o lir r ib o n u c le ó tid o lin e a l d e c u a lq u ie ra d e la s re iv in d ic a c io n e s 1 -7 , e n d o n d e : i) e l p o lir r ib o n u c le ó tid o lin e a l t ie n e u n a lo n g itu d d e 300 a 20.000 r ib o n u c le ó t id o s ; y /o ii) e l p o lir r ib o n u c le ó tid o lin e a l t ie n e p o r lo m e n o s 1.000 r ib o n u c le ó t id o s d e lo n g itu d ; o p c io n a lm e n te , e n d o n d e el p o lir r ib o n u c le ó tid o lin e a l t ie n e p o r lo m e n o s 3.000 r ib o n u c le ó t id o s d e lo n g itu d .
  9. 9. U n v e c to r d e A D N q u e c o m p re n d e un p ro m o to r d e A R N p o lim e ra s a e n la z a d o o p e ra t iv a m e n te c o n u n a s e c u e n c ia d e A D N q u e c o d if ic a e l p o lir r ib o n u c le ó tid o lin e a l d e c u a lq u ie ra d e la s re iv in d ic a c io n e s 1-8.
  10. 10. U n p o lir r ib o n u c le ó tid o c ir c u la r p ro d u c id o a p a r t ir d e l p o lir r ib o n u c le ó tid o lin e a l d e c u a lq u ie ra d e la s re iv in d ic a c io n e s 1 -8 i) o d e l v e c to r d e A D N d e la re iv in d ic a c ió n 9.
  11. 11. U n p o lir r ib o n u c le ó tid o c ir c u la r q u e c o m p re n d e u n a u n ió n d e c o r te y e m p a lm e q u e u n e un f ra g m e n to d e e x ó n 5 ' y un f ra g m e n to d e e x ó n 3', e n d o n d e e l f ra g m e n to d e e x ó n 3 ' c o m p re n d e u n a p r im e ra re g ió n d e a p a re a m ie n to q u e c o m p re n d e d e 8 a 50 r ib o n u c le ó t id o s , y e l f ra g m e n to d e e x ó n 5 ' c o m p re n d e u n a s e g u n d a re g ió n d e a p a re a m ie n to q u e c o m p re n d e d e 8 a 50 r ib o n u c le ó t id o s , y e n d o n d e la p r im e ra re g ió n d e a p a re a m ie n to y la s e g u n d a re g ió n d e a p a re a m ie n to c o m p re n d e n u n a c o m p le m e n ta r ie d a d d e l 80 % a l 100 % , o la p r im e ra re g ió n d e a p a re a m ie n to y la s e g u n d a re g ió n d e a p a re a m ie n to c o m p re n d e n d e c e ro a 10 p a re s d e b a s e s m a l a p a re a d a s .
  12. 12. E l p o lir r ib o n u c le ó tid o c ir c u la r d e la re iv in d ic a c ió n 11, e n d o n d e e l p o lir r ib o n u c le ó tid o c ir c u la r c o m p re n d e a d e m á s u n a c a rg a d e p o lir r ib o n u c le ó tid o ; i) p re fe r ib le m e n te , e n d o n d e la c a rg a d e p o lir r ib o n u c le ó tid o c o m p re n d e u n a s e c u e n c ia d e e x p re s ió n , u n a s e c u e n c ia n o c o d if ic a n te o u n a c o m b in a c ió n d e u n a s e c u e n c ia d e e x p re s ió n y u n a s e c u e n c ia n o c o d if ic a n te ; y ii) m á s p re fe r ib le m e n te , e n d o n d e la c a rg a d e p o lir r ib o n u c le ó tid o c o m p re n d e u n a s e c u e n c ia d e e x p re s ió n q u e c o d if ic a un p o lip é p tid o ; y iii) m á s p re fe r ib le m e n te , e n d o n d e e l p o lir r ib o n u c le ó tid o c o m p re n d e un IR E S e n la z a d o o p e ra t iv a m e n te a u n a s e c u e n c ia d e e x p re s ió n q u e c o d if ic a un p o lip é p tid o ; y iv ) m á s p re fe r ib le m e n te , e n d o n d e e l p o lir r ib o n u c le ó tid o c irc u la r c o m p re n d e a d e m á s u n a re g ió n e s p a c ia d o ra e n tre e l IR E S y e l f ra g m e n to d e e x ó n 3 ' o e l f ra g m e n to d e e x ó n 5'; y v ) m á s p re fe r ib le m e n te , e n d o n d e la re g ió n e s p a c ia d o ra t ie n e p o r lo m e n o s 5 r ib o n u c le ó t id o s d e lo n g itu d ; y v i) m á s p re fe r ib le m e n te , la re g ió n e s p a c ia d o ra t ie n e u n a lo n g itu d d e 5 a 500 r ib o n u c le ó t id o s .
  13. 13. E l p o lir r ib o n u c le ó tid o c ir c u la r d e c u a lq u ie ra d e la s re iv in d ic a c io n e s 12 ( iv ) - (v i) , e n d o n d e la re g ió n e s p a c ia d o ra c o m p re n d e u n a s e c u e n c ia p o liA ; o u n a s e c u e n c ia p o liA -C .
  14. 14. E l p o lir r ib o n u c le ó tid o c ir c u la r d e c u a lq u ie ra d e la s re iv in d ic a c io n e s 11 -13 : i) e n d o n d e e l p o lir r ib o n u c le ó tid o c ir c u la r t ie n e p o r lo m e n o s 500 r ib o n u c le ó t id o s d e lo n g itu d , o p c io n a lm e n te en d o n d e e l p o lir r ib o n u c le ó tid o c ir c u la r t ie n e d e 500 a 20.000 r ib o n u c le ó t id o s d e lo n g itu d ; y /o ii) e s tá p ro d u c id o a p a r t ir d e l p o lir r ib o n u c le ó tid o lin e a l d e c u a lq u ie ra d e la s re iv in d ic a c io n e s 1 -8 o d e l v e c to r d e la re iv in d ic a c ió n 9.
  15. 15. U n m é to d o : i) p a ra e x p re s a r un p o lip é p tid o e n u n a c é lu la , e l m é to d o c o m p re n d ie n d o p ro p o rc io n a r a la c é lu la e l p o lir r ib o n u c le ó tid o lin e a l d e c u a lq u ie ra d e la s re iv in d ic a c io n e s 1 -8 , e l v e c to r d e A D N d e la re iv in d ic a c ió n 9, o e l p o lir r ib o n u c le ó tid o c ir c u la r d e c u a lq u ie ra d e la s re iv in d ic a c io n e s 10 -14 ; o ii) p a ra p ro d u c ir un p o lir r ib o n u c le ó tid o c ir c u la r a p a r t ir d e l p o lir r ib o n u c le ó tid o lin e a l d e c u a lq u ie ra d e las re iv in d ic a c io n e s 1 -8 , e l m é to d o c o m p re n d ie n d o p ro p o rc io n a r e l p o lir r ib o n u c le ó tid o lin e a l en c o n d ic io n e s a d e c u a d a s p a ra e l a u to -c o r te y e m p a lm e d e l p o lir r ib o n u c le ó tid o lin e a l.
ES22786641T 2021-09-17 2022-09-16 Compositions and methods for producing circular polyribonucleotides Active ES2994006T3 (en)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US202163245354P 2021-09-17 2021-09-17
PCT/US2022/043808 WO2023044006A1 (en) 2021-09-17 2022-09-16 Compositions and methods for producing circular polyribonucleotides

Publications (1)

Publication Number Publication Date
ES2994006T3 true ES2994006T3 (en) 2025-01-16

Family

ID=83688860

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
ES22786641T Active ES2994006T3 (en) 2021-09-17 2022-09-16 Compositions and methods for producing circular polyribonucleotides

Country Status (15)

Country Link
US (2) US12338474B2 (es)
EP (2) EP4271818B1 (es)
JP (1) JP2024534428A (es)
KR (1) KR20240099185A (es)
CN (1) CN118234867A (es)
AR (1) AR127073A1 (es)
AU (1) AU2022346861A1 (es)
CA (1) CA3232635A1 (es)
DK (1) DK4271818T3 (es)
ES (1) ES2994006T3 (es)
IL (1) IL311450A (es)
MX (1) MX2024003262A (es)
TW (1) TW202330916A (es)
WO (1) WO2023044006A1 (es)
ZA (1) ZA202402511B (es)

Families Citing this family (19)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2021236952A1 (en) * 2020-05-20 2021-11-25 Flagship Pioneering, Inc. Compositions and methods for producing human polyclonal antibodies
EP4615465A1 (en) * 2022-11-08 2025-09-17 Flagship Pioneering Innovations VI, LLC Compositions and methods for producing circular polyribonucleotides
TW202438673A (zh) 2023-01-09 2024-10-01 美商旗艦先鋒創新有限責任（Ｖｉｉ）公司 疫苗及相關方法
TW202438515A (zh) 2023-02-06 2024-10-01 美商旗艦先鋒創新有限責任（Ｖｉｉ）公司 免疫調節組合物及相關方法
KR20250162610A (ko) * 2023-03-15 2025-11-18 플래그쉽 파이어니어링 이노베이션스 브이아이, 엘엘씨 폴리리보뉴클레오티드를 포함하는 조성물 및 이의 용도
WO2024220625A1 (en) 2023-04-19 2024-10-24 Sail Biomedicines, Inc. Delivery of polynucleotides from lipid nanoparticles comprising rna and ionizable lipids
WO2024220712A2 (en) 2023-04-19 2024-10-24 Sail Biomedicines, Inc. Vaccine compositions
WO2024220752A2 (en) 2023-04-19 2024-10-24 Sail Biomedicines, Inc. Rna therapeutic compositions
WO2024233308A2 (en) * 2023-05-05 2024-11-14 Orna Therapeutics, Inc. Circular rna compositions and methods
GB202308675D0 (en) * 2023-06-09 2023-07-26 Res & Innovation Uk Circular rnas and methods for making the same
CN117603988A (zh) * 2023-11-08 2024-02-27 国际竹藤中心 金镶玉竹环状RNA PacircCNGC及其应用
WO2025106915A1 (en) 2023-11-17 2025-05-22 Sail Biomedicines, Inc. Circular polyribonucleotides encoding glucagon-like peptide 1 (glp-1) and uses thereof
WO2025106930A1 (en) 2023-11-17 2025-05-22 Sail Biomedicines, Inc. Circular polyribonucleotides encoding glucagon-like peptide 2 (glp-2) and uses thereof
WO2025108432A1 (en) * 2023-11-23 2025-05-30 Therorna Shanghai Co., Ltd. Circular rna encoding fgf21 and the use thereof
WO2025147583A1 (en) 2024-01-05 2025-07-10 Sail Biomedicines, Inc. Engineered pd-1 ligands
US20250375499A1 (en) 2024-01-26 2025-12-11 Flagship Pioneering Innovations Vii, Llc Immunoreceptor inhibitory proteins and related methods
WO2025179198A1 (en) 2024-02-23 2025-08-28 Sail Biomedicines, Inc. Circular polyribonucleotides and unmodified linear rnas with reduced immunogenicity
US20250353881A1 (en) 2024-05-16 2025-11-20 Flagship Pioneering Innovations Vii, Llc Immunoreceptor inhibitory proteins and related methods
WO2025245111A1 (en) 2024-05-22 2025-11-27 Flagship Pioneering Innovations Vii, Llc Immunoreceptor targeting proteins and related methods

Family Cites Families (122)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US99823A (en) 1870-02-15 Improved indigo soap
US5885613A (en) 1994-09-30 1999-03-23 The University Of British Columbia Bilayer stabilizing components and their use in forming programmable fusogenic liposomes
US5766903A (en) 1995-08-23 1998-06-16 University Technology Corporation Circular RNA and uses thereof
US5849727A (en) 1996-06-28 1998-12-15 Board Of Regents Of The University Of Nebraska Compositions and methods for altering the biodistribution of biological agents
DE69841002D1 (de) 1997-05-14 2009-09-03 Univ British Columbia Hochwirksame verkapselung von nukleinsäuren in lipidvesikeln
US6693086B1 (en) 1998-06-25 2004-02-17 National Jewish Medical And Research Center Systemic immune activation method using nucleic acid-lipid complexes
WO2002087541A1 (en) 2001-04-30 2002-11-07 Protiva Biotherapeutics Inc. Lipid-based formulations for gene transfer
EP1664316B1 (en) 2003-09-15 2012-08-29 Protiva Biotherapeutics Inc. Polyethyleneglycol-modified lipid compounds and uses thereof
JP4380411B2 (ja) 2004-04-30 2009-12-09 澁谷工業株式会社 滅菌方法
WO2006069782A2 (en) 2004-12-27 2006-07-06 Silence Therapeutics Ag. Lipid complexes coated with peg and their use
US7404969B2 (en) 2005-02-14 2008-07-29 Sirna Therapeutics, Inc. Lipid nanoparticle based compositions and methods for the delivery of biologically active molecules
US7451428B2 (en) 2005-02-24 2008-11-11 Texas Instruments Incorporated Merging sub-resolution assist features of a photolithographic mask through the use of a merge bar
JP2009534690A (ja) 2006-07-10 2009-09-24 メムシック，インコーポレイテッド 磁場センサーを用いて偏揺れを感知するためのシステム、および、前記システムを用いた携帯用の電子装置
US20110117125A1 (en) 2008-01-02 2011-05-19 Tekmira Pharmaceuticals Corporation Compositions and methods for the delivery of nucleic acids
US8058069B2 (en) 2008-04-15 2011-11-15 Protiva Biotherapeutics, Inc. Lipid formulations for nucleic acid delivery
WO2009132131A1 (en) 2008-04-22 2009-10-29 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Amino lipid based improved lipid formulation
EP2285361A2 (en) 2008-05-01 2011-02-23 Nod Pharmaceuticals, Inc. Therapeutic calcium phosphate particles and methods of making and using same
WO2010042877A1 (en) 2008-10-09 2010-04-15 Tekmira Pharmaceuticals Corporation Improved amino lipids and methods for the delivery of nucleic acids
HRP20150796T1 (hr) 2008-10-20 2015-09-11 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Pripravci i postupci za inhibiciju ekspresije transtiretina
MX353900B (es) 2008-11-07 2018-02-01 Massachusetts Inst Technology Lipidoides de aminoalcohol y usos de los mismos.
WO2010054384A1 (en) 2008-11-10 2010-05-14 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Lipids and compositions for the delivery of therapeutics
CN105152939A (zh) 2008-11-10 2015-12-16 阿尔尼拉姆医药品有限公司 用于递送治疗剂的脂质和组合物
WO2010084371A1 (en) * 2009-01-26 2010-07-29 Mitoprod Novel circular interfering rna molecules
KR20230098713A (ko) 2009-06-10 2023-07-04 알닐람 파마슈티칼스 인코포레이티드 향상된 지질 조성물
US8569256B2 (en) 2009-07-01 2013-10-29 Protiva Biotherapeutics, Inc. Cationic lipids and methods for the delivery of therapeutic agents
EP2449114B9 (en) 2009-07-01 2017-04-19 Protiva Biotherapeutics Inc. Novel lipid formulations for delivery of therapeutic agents to solid tumors
US9181295B2 (en) 2009-08-20 2015-11-10 Sirna Therapeutics, Inc. Cationic lipids with various head groups for oligonucleotide delivery
EP2506879A4 (en) 2009-12-01 2014-03-19 Protiva Biotherapeutics Inc PREPARATIONS OF SNALP CONTAINING ANTIOXIDANTS
US9687550B2 (en) 2009-12-07 2017-06-27 Arbutus Biopharma Corporation Compositions for nucleic acid delivery
EP2525781A1 (en) 2010-01-22 2012-11-28 Schering Corporation Novel cationic lipids for oligonucleotide delivery
US20120315324A1 (en) 2010-02-05 2012-12-13 University Of Louisville Research Foundation, Inc. Exosomal compositions and methods for the treatment of disease
US10077232B2 (en) 2010-05-12 2018-09-18 Arbutus Biopharma Corporation Cyclic cationic lipids and methods of use
US20130123338A1 (en) 2010-05-12 2013-05-16 Protiva Biotherapeutics, Inc. Novel cationic lipids and methods of use thereof
NZ605079A (en) 2010-06-03 2015-08-28 Alnylam Pharmaceuticals Inc Biodegradable lipids for the delivery of active agents
EP2575767B1 (en) 2010-06-04 2017-01-04 Sirna Therapeutics, Inc. Novel low molecular weight cationic lipids for oligonucleotide delivery
WO2012000104A1 (en) 2010-06-30 2012-01-05 Protiva Biotherapeutics, Inc. Non-liposomal systems for nucleic acid delivery
US20130323269A1 (en) 2010-07-30 2013-12-05 Muthiah Manoharan Methods and compositions for delivery of active agents
JP5908477B2 (ja) 2010-08-31 2016-04-26 ノバルティス アーゲー タンパク質をコードするｒｎａのリポソームによる送達に適した脂質
MX349088B (es) 2010-09-20 2017-07-10 Merck Sharp & Dohme Lípidos catiónicos novedosos de bajo peso molecular para la entrega de oligonucleótidos.
JP2013545723A (ja) 2010-09-30 2013-12-26 メルク・シャープ・エンド・ドーム・コーポレイション オリゴヌクレオチドの送達のための低分子量カチオン性脂質
US20120101478A1 (en) 2010-10-21 2012-04-26 Allergan, Inc. Dual Cartridge Mixer Syringe
JP2013545727A (ja) 2010-10-21 2013-12-26 メルク・シャープ・アンド・ドーム・コーポレーション オリゴヌクレオチド送達用の新規低分子量カチオン性脂質
SG190784A1 (en) 2010-11-09 2013-07-31 Fujian Haixi Pharmaceuticals Inc Compound for increasing kinase active and application thereof
US9617461B2 (en) 2010-12-06 2017-04-11 Schlumberger Technology Corporation Compositions and methods for well completions
AU2012207606B2 (en) 2011-01-11 2017-02-23 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Pegylated lipids and their use for drug delivery
WO2012162210A1 (en) 2011-05-26 2012-11-29 Merck Sharp & Dohme Corp. Ring constrained cationic lipids for oligonucleotide delivery
WO2013016058A1 (en) 2011-07-22 2013-01-31 Merck Sharp & Dohme Corp. Novel bis-nitrogen containing cationic lipids for oligonucleotide delivery
EP3456317B1 (en) 2011-09-27 2025-09-24 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Di-aliphatic substituted pegylated lipids
PE20181541A1 (es) 2011-10-27 2018-09-26 Massachusetts Inst Technology Derivados de aminoacidos funcionalizados en la terminal n capaces de formar microesferas encapsuladoras de farmaco
US20140308212A1 (en) 2011-11-07 2014-10-16 University Of Louisville Research Foundation, Inc. Edible plant-derived microvesicle compositions for diagnosis and treatment of disease
CN103930398B (zh) 2011-11-18 2016-08-24 日油株式会社 具有改进的细胞内动力学的阳离子脂质
WO2013086373A1 (en) 2011-12-07 2013-06-13 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Lipids for the delivery of active agents
JP6305343B2 (ja) 2011-12-07 2018-04-04 アルニラム・ファーマシューティカルズ・インコーポレーテッド 活性薬剤の送達のための分岐アルキルおよびシクロアルキルを末端とする生分解性脂質
CA2856742A1 (en) 2011-12-07 2013-06-13 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Biodegradable lipids for the delivery of active agents
TWI594767B (zh) 2011-12-12 2017-08-11 協和醱酵麒麟有限公司 含有陽離子性脂質之藥物傳遞系統用脂質奈米粒子
WO2013116126A1 (en) 2012-02-01 2013-08-08 Merck Sharp & Dohme Corp. Novel low molecular weight, biodegradable cationic lipids for oligonucleotide delivery
WO2013126803A1 (en) 2012-02-24 2013-08-29 Protiva Biotherapeutics Inc. Trialkyl cationic lipids and methods of use thereof
WO2013148541A1 (en) 2012-03-27 2013-10-03 Merck Sharp & Dohme Corp. DIETHER BASED BIODEGRADABLE CATIONIC LIPIDS FOR siRNA DELIVERY
CN107879960B (zh) 2013-03-08 2021-06-22 诺华股份有限公司 用于传递活性成分的脂质和脂质组合物
EP2996697B1 (en) * 2013-05-15 2019-06-26 Robert Kruse Intracellular translation of circular rna
JP6620093B2 (ja) 2013-07-23 2019-12-11 アービュートゥス バイオファーマ コーポレイションＡｒｂｕｔｕｓ Ｂｉｏｐｈａｒｍａ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ メッセンジャーｒｎａを送達するための組成物及び方法
US20160194368A1 (en) 2013-09-03 2016-07-07 Moderna Therapeutics, Inc. Circular polynucleotides
MX2016005238A (es) 2013-10-22 2016-08-12 Shire Human Genetic Therapies Formulaciones de lipidos para la administracion de acido ribonucleico mensajero.
JP6702866B2 (ja) 2013-11-18 2020-06-03 ルビウス セラピューティクス， インコーポレイテッド 合成膜−レシーバー複合体
CN105873902B (zh) 2013-11-18 2019-03-08 阿克丘勒斯治疗公司 用于rna递送的可电离的阳离子脂质
US9365610B2 (en) 2013-11-18 2016-06-14 Arcturus Therapeutics, Inc. Asymmetric ionizable cationic lipid for RNA delivery
WO2015095346A1 (en) 2013-12-19 2015-06-25 Novartis Ag Lipids and lipid compositions for the delivery of active agents
PT3083556T (pt) 2013-12-19 2020-03-05 Novartis Ag Lípidos e composições lipídicas para a entrega de agentes ativos
WO2015153102A1 (en) 2014-04-01 2015-10-08 Rubius Therapeutics, Inc. Methods and compositions for immunomodulation
HRP20221536T1 (hr) 2014-06-25 2023-02-17 Acuitas Therapeutics Inc. Novi lipidi i formulacije lipidnih nanočestica za isporuku nukleinskih kiselina
WO2016011222A2 (en) 2014-07-16 2016-01-21 Moderna Therapeutics, Inc. Circular polynucleotides
WO2016183482A1 (en) 2015-05-13 2016-11-17 Rubius Therapeutics, Inc. Membrane-receiver complex therapeutics
US11000547B2 (en) 2015-06-05 2021-05-11 Dana-Farber Cancer Institute, Inc. Compositions related to rna in circularized form
RS64331B1 (sr) 2015-06-19 2023-08-31 Massachusetts Inst Technology Alkenil supstituisani 2,5-piperazindioni i njihova primena u sastavima za isporuku agensa u organizam ili ćeliju subjekta
CA2990202A1 (en) 2015-06-29 2017-01-05 Acuitas Therapeutics Inc. Lipids and lipid nanoparticle formulations for delivery of nucleic acids
WO2017004526A1 (en) 2015-07-02 2017-01-05 University Of Louisville Research Foundation, Inc. EDIBLE PLANT-DERIVED MICROVESICLE COMPOSITIONS FOR DELIVERY OF miRNA AND METHODS FOR TREATMENT OF CANCER
DK3350157T3 (da) 2015-09-17 2022-02-14 Modernatx Inc Forbindelser og sammensætninger til intracellulær afgivelse af terapeutiske midler
PT3368507T (pt) 2015-10-28 2023-02-07 Acuitas Therapeutics Inc Novos lípidos e formulações de nanopartículas lipídicas para distribuição de ácidos nucleicos
WO2018081480A1 (en) 2016-10-26 2018-05-03 Acuitas Therapeutics, Inc. Lipid nanoparticle formulations
MD3386484T2 (ro) 2015-12-10 2022-11-30 Modernatx Inc Compoziții și metode de livrare a unor agenți terapeutici
US20190022247A1 (en) 2015-12-30 2019-01-24 Acuitas Therapeutics, Inc. Lipids and lipid nanoparticle formulations for delivery of nucleic acids
SG10202007639SA (en) 2016-01-11 2020-09-29 Rubius Therapeutics Inc Compositions and methods related to multimodal therapeutic cell systems for immune indications
LT3436077T (lt) 2016-03-30 2025-06-25 Intellia Therapeutics, Inc. Lipidų nanodalelių vaisto formos, skirtos crispr/cas komponentams
KR20190026819A (ko) 2016-07-07 2019-03-13 루비우스 테라퓨틱스, 아이엔씨. 외인성 rna를 발현하는 치료용 세포 시스템과 관련된 조성물 및 방법
US20180153989A1 (en) 2016-12-02 2018-06-07 Rubius Therapeutics, Inc. Compositions and methods related to cell systems for penetrating solid tumors
AU2018221227A1 (en) 2017-02-17 2019-08-15 Rubius Therapeutics, Inc. Functionalized erythroid cells
US11576872B2 (en) 2017-05-08 2023-02-14 Flagship Pioneering Innovations V, Inc. Compositions for facilitating membrane fusion and uses thereof
EP3679148A4 (en) 2017-09-08 2021-06-09 Generation Bio Co. LIPID NANOPARTICLE FORMULATIONS FROM NONVIRAL, CAPSID-FREE DNA VECTORS
SG11202002562QA (en) 2017-09-29 2020-04-29 Intellia Therapeutics Inc Polynucleotides, compositions, and methods for genome editing
MY204993A (en) 2017-09-29 2024-09-26 Intellia Therapeutics Inc Formulations
US12357653B2 (en) 2017-12-15 2025-07-15 Flagship Pioneering Innovations Vi, Llc Compositions comprising circular polyribonucleotides and uses thereof
JP7558929B2 (ja) 2018-05-11 2024-10-01 ビーム セラピューティクス インク． プログラム可能塩基エディターシステムを用いて病原性変異を抑制する方法
BR112020024292A2 (pt) 2018-06-06 2021-03-02 Massachusetts Institute Of Technology rna circular para translação em células eucarióticas
AU2019312269A1 (en) 2018-07-24 2021-03-04 Flagship Pioneering Innovations Vi, Llc Compositions comprising circular polyribonucleotides and uses thereof
AR116016A1 (es) 2018-08-24 2021-03-25 Flagship Pioneering Innovations Vi Llc Métodos para fabricar paquetes mensajeros vegetales
KR20210049859A (ko) 2018-08-28 2021-05-06 플래그쉽 파이어니어링 이노베이션스 브이아이, 엘엘씨 게놈을 조절하는 방법 및 조성물
US12090235B2 (en) 2018-09-20 2024-09-17 Modernatx, Inc. Preparation of lipid nanoparticles and methods of administration thereof
AU2019361129A1 (en) 2018-10-18 2021-05-20 Acuitas Therapeutics, Inc. Lipids for lipid nanoparticle delivery of active agents
AU2019384557B2 (en) 2018-11-21 2025-07-17 Translate Bio, Inc. Treatment of cystic fibrosis by delivery of nebulized mRNA encoding CFTR
KR20210134716A (ko) 2019-03-01 2021-11-10 플래그쉽 파이어니어링 이노베이션스 브이아이, 엘엘씨 폴리리보뉴클레오티드의 전달을 위한 조성물, 방법, 및 키트
AU2020232238B2 (en) 2019-03-01 2025-10-30 Flagship Pioneering Innovations Vi, Llc Polyribonucleotides and cosmetic uses thereof
EP3935162A1 (en) * 2019-03-04 2022-01-12 Flagship Pioneering Innovations VI, LLC Circular polyribonucleotides and pharmaceutical compositions thereof
CN115806976A (zh) 2019-03-20 2023-03-17 中国科学院上海营养与健康研究所 利用环形rna进行蛋白翻译及其应用
WO2020198403A2 (en) * 2019-03-25 2020-10-01 Flagship Pioneering Innovations Vi, Llc Compositions comprising modified circular polyribonucleotides and uses thereof
NZ781026A (en) 2019-04-25 2025-07-25 Intellia Therapeutics Inc Ionizable amine lipids and lipid nanoparticles
IL288284B2 (en) 2019-05-22 2024-06-01 Massachusetts Inst Technology Circular rna compositions and methods
WO2020252436A1 (en) 2019-06-14 2020-12-17 Flagship Pioneering Innovations Vi, Llc Circular rnas for cellular therapy
US20220305128A1 (en) 2019-06-19 2022-09-29 Flagship Pioneering Innovations Vi, Llc Compositions comprising circular polyribonucleotides for protein modulation and uses thereof
JP2022536951A (ja) 2019-06-19 2022-08-22 フラッグシップ パイオニアリング イノベーションズ シックス，エルエルシー 環状ポリリボヌクレオチドを投与する方法
WO2021041541A1 (en) 2019-08-28 2021-03-04 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Modified circular rnas and methods of use thereof
JP2023504568A (ja) 2019-12-04 2023-02-03 オルナ セラピューティクス インコーポレイテッド 環状ｒｎａ組成物及び方法
EP4100523A4 (en) 2020-02-04 2024-03-06 Duke University COMPOSITIONS AND METHODS FOR CIRCULAR RNA EXPRESSION
JP2023527309A (ja) 2020-05-19 2023-06-28 オルナ セラピューティクス インコーポレイテッド 環状ｒｎａ組成物及び方法
IL298362A (en) 2020-05-20 2023-01-01 Flagship Pioneering Innovations Vi Llc Coronavirus antigen compositions and their uses
AU2021275213A1 (en) 2020-05-20 2023-02-02 Flagship Pioneering Innovations Vi, Llc Immunogenic compositions and uses thereof
WO2022037692A1 (en) 2020-08-21 2022-02-24 Peking University Circular rna vaccines and methods of use thereof
WO2022051629A1 (en) 2020-09-03 2022-03-10 Flagship Pioneering Innovations Vi, Llc Immunogenic compositions and uses thereof
EP4341424A1 (en) 2021-05-18 2024-03-27 Flagship Pioneering Innovations VI, LLC Methods of enriching for circular polyribonucleotides
JP2024523054A (ja) 2021-05-18 2024-06-26 フラッグシップ パイオニアリング イノベーションズ シックス，エルエルシー 環状ポリリボヌクレオチドを濃縮する方法
CN115404240A (zh) 2021-05-28 2022-11-29 上海环码生物医药有限公司 制备环形rna的构建体、方法及其用途
TW202317767A (zh) 2021-06-10 2023-05-01 美商歐納醫療公司 環狀rna組合物及方法
KR20240047986A (ko) 2021-07-27 2024-04-12 플래그쉽 파이어니어링 이노베이션스 브이아이, 엘엘씨 가공을 위한 디바이스, 시스템 및 방법

Also Published As

Publication number Publication date
EP4464783A2 (en) 2024-11-20
AU2022346861A1 (en) 2024-03-28
WO2023044006A8 (en) 2023-04-27
JP2024534428A (ja) 2024-09-20
ZA202402511B (en) 2024-12-18
EP4271818A1 (en) 2023-11-08
EP4271818B1 (en) 2024-07-31
US20230212629A1 (en) 2023-07-06
US12338474B2 (en) 2025-06-24
KR20240099185A (ko) 2024-06-28
AR127073A1 (es) 2023-12-13
EP4464783A3 (en) 2025-01-22
MX2024003262A (es) 2024-06-19
WO2023044006A1 (en) 2023-03-23
CA3232635A1 (en) 2023-03-23
US20250277224A1 (en) 2025-09-04
DK4271818T3 (da) 2024-11-04
IL311450A (en) 2024-05-01
CN118234867A (zh) 2024-06-21
TW202330916A (zh) 2023-08-01

Similar Documents

Publication Publication Date Title
ES2994006T3 (en) Compositions and methods for producing circular polyribonucleotides
AU2022420620A1 (en) Circular polyribonucleotides encoding antifusogenic polypeptides
KR20250162610A (ko) 폴리리보뉴클레오티드를 포함하는 조성물 및 이의 용도
US20250051386A1 (en) Compositions and methods for purifying polyribonucleotides
US20240417714A1 (en) Compositions and methods for purifying polyribonucleotides
WO2024102799A1 (en) Compositions and methods for producing circular polyribonucleotides
HK40101085A (en) Compositions and methods for producing circular polyribonucleotides
HK40101085B (en) Compositions and methods for producing circular polyribonucleotides
WO2025006684A1 (en) Circular polyribonucleotides encoding antifusogenic polypeptides
HK40118625A (en) Compositions and methods for producing circular polyribonucleotides
WO2025171319A1 (en) Photoreactive compositions and methods for producing circular polyribonucleotides
WO2024097664A1 (en) Compositions and methods for purifying polyribonucleotides