ES2991677T3

ES2991677T3 - Procedimiento para la determinación de anticuerpos antifármaco contra un anticuerpo para fármaco humano o humanizado con función efectora suprimida

Info

Publication number: ES2991677T3
Application number: ES20169162T
Authority: ES
Inventors: Pablo Umaña; Uwe Wessels; Kay-Gunnar Stubenrauch
Original assignee: F Hoffmann La Roche AG
Current assignee: F Hoffmann La Roche AG
Priority date: 2014-11-05
Filing date: 2015-10-22
Publication date: 2024-12-04
Anticipated expiration: 2035-10-22
Also published as: RU2017117273A; EP3736575C0; BR112017004810A2; CA2960453A1; JP6739428B2; WO2016071119A1; MX2017005156A; CN107076761B; EP3215853A1; EP3215853B1; KR20170080590A; US20170343560A1; JP2017532570A; EP3736575B1; RU2017117273A3; JP2020170001A; CN107076761A; RU2719642C2; EP3736575A1; US11340234B2

Abstract

En este documento se describe un inmunoensayo de anticuerpos antidrogas para la determinación de la presencia de un anticuerpo antidrogas contra un anticuerpo antidrogas humano o humanizado con función efectora suprimida en una muestra que comprende la incubación de una muestra que comprende suero sanguíneo de mamífero con receptor Fcgamma I humano de longitud completa o un fragmento de unión a la región Fc del mismo de modo que se forme un complejo entre el anticuerpo antidrogas contra el anticuerpo antidrogas humano o humanizado con función efectora suprimida presente en la muestra y el receptor Fcgamma I humano o el fragmento de unión a la región Fc del mismo, mediante lo cual el receptor Fcgamma I humano de longitud completa o el fragmento de unión a la región Fc del mismo se conjuga con una etiqueta detectable, y la determinación del complejo formado por la etiqueta detectable. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

DESCRIPCIÓN

Procedimiento para la determinación de anticuerpos antifármaco contra un anticuerpo para fármaco humano o humanizado con función efectora suprimida

La presente invención se refiere a un procedimiento para la detección/determinación de anticuerpos antifármaco en una muestra que comprende suero de mamífero usando el receptor de Fc gamma I humano o un fragmento de unión a región Fc del mismo como reactivo de detección específico.

Antecedentes de la invención

Los inmunoanálisis en fase sólida estándar con anticuerpos implican la formación de un complejo entre un anticuerpo adsorbido/inmovilizado en una fase sólida (anticuerpo de captura), el antígeno, y un anticuerpo para otro epítopo del antígeno conjugado con una enzima o marcador detectable (anticuerpo de detección). En el ensayo, se forma un sándwich: fase sólida/anticuerpo de captura/antígeno/anticuerpo de detección. En la reacción catalizada por el sándwich, entre otras cosas, la actividad de la enzima conjugada con anticuerpo es proporcional a la concentración de antígeno en el medio de incubación. Los ensayos de anticuerpos antidiotípicos se mencionan, por ejemplo, en los documentos US 5.219.730; WO 87/002778;<e>P 0139389; y E<p>0170302. Wadhwa, M.,et al.(J. Immunol. Methods 278 (2003) 1-17) informan de estrategias para la detección, medición y caracterización de anticuerpos indeseados inducidos por productos biológicos terapéuticos. Se informa de un procedimiento para producir anticuerpos antidiotípicos en el documento EP 1917854.

Chen, Y.-P.,et al.(Clin. Vac. Immunol. 14 (2007) 720-725) informan de la detección rápida del antígeno de superficie del virus de la hepatitis B por un ensayo de aglutinación mediado por un diacuerpo biespecífico tanto contra eritrocitos humanos como contra el antígeno de superficie del virus de la hepatitis B. Porter, R.,et alinforman de un sistema electroactivo de inmunoanálisis (ensayo EASI) que utiliza electrodos modificados de monocapa autoensamblados (Biosensors Bioelec. 16 (2001) 9-12). Se informa del desarrollo de un inmunoanálisis enzimático para la medición del factor de necrosis tumoral alfa humano (hTNF-alfa) usando anticuerpos biespecíficos para hTNF-alfa y peroxidasa de rábano picante por Berkova, N.,et al.(Biotechnol. Appl. Biochem. 23 (1996) 163-171). En el documento EP 0962771, se informa de un aparato de detección y un procedimiento para el mismo. Reinhartz, H.W.,et al.(Analyst 121 (1996) 767-771) informan de anticuerpos multivalentes biespecíficos estudiados por análisis de interacción ultrarrápida para el desarrollo de un ensayo de inmunoadsorción enzimática de inhibición de antígeno. Se informa de la generación química de anticuerpos biespecíficos por Doppalapudi, V.R.,et al.(Proc. Natl. Acad. Sci. USA 107 (2010) 22611-22616).

En el documento EP 2492689 A1, se informa de la detección de anticuerpos usando un ELISA de complejo inmunitario (CI) mejorado. Se informa de procedimientos para detectar anticuerpos en el documento WO 2011/135024. En el documento WO 2009/077127 se informa de un ensayo distintivo. Se informa de un procedimiento para detectar anticuerpos antifármaco en el documento EP 2351792. En el documento WO 2012/130831 se informa de variantes de Fc de anticuerpo.

Sumario de la invención

En el presente documento se informa de un inmunoanálisis así como de un procedimiento y un uso en base a la unión específica del receptor de Fc gamma I humano a la región Fc de un anticuerpo antifármaco contra un anticuerpo para fármaco humano o humanizado con función efectora suprimida para la determinación de la presencia así como la cantidad del anticuerpo antifármaco.

Se ha descubierto que es ventajoso para la detección y cuantificación de anticuerpos antifármaco contra un anticuerpo para fármaco humano o humanizado con función efectora suprimida usar el receptor de Fc gamma I humano o un fragmento de unión a región Fc del mismo como un compuesto en un inmunoanálisis. Usando el receptor de Fc gamma I humano, se puede proporcionar una mejora en el inmunoanálisis, por ejemplo, en comparación con un inmunoanálisis de doble captura convencional. La mejora es, entre otras cosas, una mejora en la sensibilidad y/o robustez.

Los aspectos como se informa en el presente documento son especialmente útiles si el anticuerpo para fármaco es un anticuerpo para fármaco humano o humanizado con función efectora suprimida, es decir, si la región Fc del anticuerpo para fármaco (polipéptidos de región Fc) contiene mutaciones que reducen o incluso eliminan la unión del anticuerpo para fármaco al receptor de Fc gamma III humano.

El receptor de Fc gamma I humano se puede usar como compuesto de captura (cuando se inmoviliza en una superficie sólida) o un compuesto de detección (cuando se conjuga con un marcador detectable).

Un aspecto de acuerdo con la invención es un procedimiento para la determinación de la presencia de un anticuerpo antifármaco (ADA) contra un anticuerpo para fármaco humano o humanizado con función efectora suprimida (EFS-DA) en una muestra que comprende las siguientes etapas en el siguiente orden:

- incubar una muestra que comprende suero sanguíneo de mamífero con receptor de Fc gamma I humano de longitud completa o un fragmento de unión a región Fc del mismo de modo que se forma un complejo entre el ADA presente en la muestra y el receptor de Fc gamma I humano o el fragmento de unión a región Fc del mismo, con lo que el receptor de Fc gamma I humano de longitud completa o el fragmento de unión a región Fc del mismo se conjuga con un marcador detectable, y

- determinar el complejo formado en la etapa previa por el marcador detectable.

a) incubar una fase sólida en la que el EFS-DA o un FAB del mismo se ha inmovilizado con una muestra que comprende suero sanguíneo de mamífero,

b) incubar la fase sólida con el receptor de Fc gamma I humano de longitud completa o un fragmento de unión a región Fc del mismo, con lo que el receptor de Fc gamma I humano de longitud completa o el fragmento de unión a región Fc del mismo se conjuga con un marcador detectable, y

c) determinar la formación de un complejo unido a fase sólida en la etapa b) determinando la presencia del marcador detectable y determinando de este modo la presencia de un anticuerpo antifármaco contra un anticuerpo para fármaco humano o humanizado con función efectora suprimida en la muestra.

a) añadir exceso de EFS-DA a la muestra, en el que la muestra comprende suero sanguíneo de mamífero, b) incubar una fase sólida en la que el antígeno al que se une específicamente el EFS-DA se ha inmovilizado con la muestra obtenida en la etapa a),

c) incubar la fase sólida con el receptor de Fc gamma I humano de longitud completa o un fragmento de unión a región Fc del mismo, con lo que el receptor de Fc gamma I humano de longitud completa o el fragmento de unión a región Fc del mismo se conjuga con un marcador detectable, y

d) determinar la formación de un complejo unido a fase sólida en la etapa c) determinando la presencia del marcador detectable y determinando de este modo la presencia de un anticuerpo antifármaco contra un anticuerpo para fármaco humano o humanizado con función efectora suprimida en la muestra.

a) añadir exceso de EFS-DA a la muestra, en el que la muestra comprende suero sanguíneo de mamífero, b) incubar una fase sólida en la que el receptor de Fc gamma I humano de longitud completa o un fragmento de unión a región Fc del mismo se ha inmovilizado con la muestra obtenida en la etapa a),

c) incubar la fase sólida con el antígeno del EFS-DA, con lo que el antígeno se conjuga con un marcador detectable, y

a) añadir exceso de EFS-DA a la muestra, en el que la muestra comprende suero sanguíneo de mamífero, b) incubar una fase sólida en la que un ADA se ha inmovilizado con la muestra obtenida en la etapa a), c) incubar la fase sólida con el receptor de Fc gamma I humano de longitud completa o un fragmento de unión a región Fc del mismo, con lo que el receptor de Fc gamma I humano de longitud completa o el fragmento de unión a región Fc del mismo se conjuga con un marcador detectable, y

Un aspecto de acuerdo con la invención es el uso del receptor de Fc gamma I humano o un fragmento de unión a región Fc del mismo para la determinación de la presencia o cantidad de un anticuerpo antifármaco (ADA) contra un anticuerpo para fármaco humano o humanizado con función efectora suprimida (EFS-DA) en una muestra que comprende suero sanguíneo de mamífero.

Un aspecto de acuerdo con la invención es el uso del receptor de Fc gamma I humano o un fragmento de unión a región Fc del mismo para la determinación de la presencia de un anticuerpo antifármaco (ADA) contra un anticuerpo para fármaco humano o humanizado con función efectora suprimida (EFS-DA) en una muestra que comprende la

- incubación de una muestra que comprende suero sanguíneo de mamífero con receptor de Fc gamma I humano de longitud completa o un fragmento de unión a región Fc del mismo de modo que se forma un complejo entre el ADA presente en la muestra y el receptor de Fc gamma I humano o el fragmento de unión a región Fc del mismo, con lo que el receptor de Fc gamma I humano de longitud completa o el fragmento de unión a región Fc del mismo se conjuga con un marcador detectable, y

- la determinación del complejo formado en la etapa previa por el marcador detectable.

Un aspecto de acuerdo con la invención es el uso del receptor de Fc gamma I humano o un fragmento de unión a región Fc del mismo para la determinación de la presencia de un anticuerpo antifármaco (ADA) contra un anticuerpo para fármaco humano o humanizado con función efectora suprimida (EFS-DA) en una muestra que comprende la:

a) incubación de una fase sólida en la que el EFS-DA o un fragmento FAB del mismo se ha inmovilizado con una muestra que comprende suero sanguíneo de mamífero,

b) incubación de la fase sólida con el receptor de Fc gamma I humano de longitud completa o un fragmento de unión a región Fc del mismo, con lo que el receptor de Fc gamma I humano de longitud completa o el fragmento de unión a región Fc del mismo se conjuga con un marcador detectable, y

c) la determinación de la formación de un complejo unido a fase sólida en la etapa b) determinando la presencia del marcador detectable y determinando de este modo la presencia de un anticuerpo antifármaco contra un anticuerpo para fármaco humano o humanizado con función efectora suprimida en la muestra.

a) adición de exceso de EFS-DA a la muestra, en el que la muestra comprende suero sanguíneo de mamífero,

b) incubación de una fase sólida en la que el antígeno al que se une específicamente el EFS-DA se ha inmovilizado con la muestra obtenida en la etapa a),

c) incubación de la fase sólida con el receptor de Fc gamma I humano de longitud completa o un fragmento de unión a región Fc del mismo, con lo que el receptor de Fc gamma I humano de longitud completa o el fragmento de unión a región Fc del mismo se conjuga con un marcador detectable, y

d) determinación de la formación de un complejo unido a fase sólida en la etapa c) determinando la presencia del marcador detectable y determinando de este modo la presencia de un anticuerpo antifármaco contra un anticuerpo para fármaco humano o humanizado con función efectora suprimida en la muestra.

a) adición de exceso de EFS-DA a la muestra, en el que la muestra comprende suero sanguíneo de mamífero, b) incubación de una fase sólida en la que el receptor de Fc gamma I humano de longitud completa o un fragmento de unión a región Fc del mismo se ha inmovilizado con la muestra obtenida en la etapa a),

c) incubación de la fase sólida con el antígeno del EFS-DA, con lo que el antígeno se conjuga con un marcador detectable, y

b) incubación de una fase sólida en la que un ADA se ha inmovilizado con la muestra obtenida en la etapa a),

En un modo de realización de todos los aspectos como se informa en el presente documento el complejo entre el anticuerpo antifármaco contra el anticuerpo para fármaco humano o humanizado con función efectora suprimida presente en la muestra y el receptor de Fc gamma I humano o el fragmento de unión a región Fc del mismo es un complejo 1:1. Esto quiere decir que exactamente un anticuerpo antifármaco contra el anticuerpo para fármaco humano o humanizado con función efectora suprimida presente en la muestra y exactamente un receptor de Fc gamma I humano o fragmento de unión a región Fc está presente en el complejo formado.

En un modo de realización de todos los aspectos como se informa en el presente documento el complejo entre el anticuerpo antifármaco contra el anticuerpo para fármaco humano o humanizado con función efectora suprimida presente en la muestra y el receptor de Fc gamma I humano o el fragmento de unión a región Fc del mismo es un complejo monomérico. Esto quiere decir que ninguno de los compuestos en el complejo es un multímero. Esto quiere decir además que no se usan efectos de avidez en los aspectos como se informa en el presente documento.

En un modo de realización de todos los aspectos como se informa en el presente documento todos los complejos formados son complejos monoméricos.

En un modo de realización de todos los aspectos como se informa en el presente documento todos los complejos formados son un complejo 1:1 o 1:1:1. Esto quiere decir que solo una sola molécula de cada compuesto del que se forma el complejo está presente en el complejo, dependiendo del formato de complejo usado. En un modo de realización, el complejo comprende 1) exactamente una molécula del anticuerpo para fármaco humano o humanizado con función efectora suprimida, 2) exactamente una molécula del anticuerpo antifármaco contra el anticuerpo para fármaco humano o humanizado con función efectora suprimida, y 3) exactamente una molécula del receptor de Fc gamma I humano o el fragmento de unión a región Fc del mismo. En un modo de realización, el complejo comprende 1) exactamente una molécula del anticuerpo para fármaco humano o humanizado con función efectora suprimida, 2) exactamente una molécula del antígeno del anticuerpo para fármaco humano o humanizado con función efectora suprimida, y 3) exactamente una molécula del receptor de Fc gamma I humano o el fragmento de unión a región Fc del mismo. En un modo de realización, el complejo comprende 1) exactamente una molécula del anticuerpo para fármaco humano o humanizado con función efectora suprimida FAB, 2) exactamente una molécula del anticuerpo antifármaco contra el anticuerpo para fármaco humano o humanizado con función efectora suprimida, y 3) exactamente una molécula del receptor de Fc gamma I humano o el fragmento de unión a región Fc del mismo.

En un modo de realización de todos los aspectos como se informa en el presente documento cada etapa de incubación está seguida de la siguiente etapa:

- lavar la fase sólida para retirar los compuestos no unidos.

En un modo de realización de todos los aspectos como se informa en el presente documento el ensayo es para la determinación de la presencia y la cantidad de un anticuerpo antifármaco (ADA) contra un anticuerpo para fármaco humano o humanizado con función efectora suprimida (EFS-DA) en una muestra y comprende como etapas finales:

- determinar la formación de un complejo unido a fase sólida en la etapa previa determinando la presencia del marcador detectable y determinar la cantidad de un anticuerpo antifármaco contra un anticuerpo para fármaco humano o humanizado con función efectora suprimida en la muestra correlacionando la cantidad del marcador determinado con la cantidad del anticuerpo antifármaco usando una curva estándar.

En un modo de realización de todos los aspectos como se informa en el presente documento el anticuerpo para fármaco humano o humanizado con función efectora suprimida es de la subclase IgG1 o IgG4 humana.

En un modo de realización de todos los aspectos como se informa en el presente documento el anticuerpo para fármaco humano o humanizado con función efectora suprimida es de la subclase IgG1 humana y tiene las mutaciones L234A, L235A y P329G en ambos polipéptidos de región Fc o el anticuerpo para fármaco humano o humanizado con función efectora suprimida es de la subclase IgG4 humana y tiene las mutaciones S228P, L235E y P329G en ambos polipéptidos de región Fc (numeración de acuerdo con el sistema de numeración EU de acuerdo con Kabat).

En un modo de realización de todos los aspectos, el anticuerpo para fármaco humano o humanizado con función efectora suprimida es un anticuerpo biespecífico, o un anticuerpo triespecífico, o un anticuerpo tetraespecífico, o un anticuerpo pentaespecífico o un anticuerpo hexaespecífico. En un modo de realización, el anticuerpo humano o humanizado con función efectora suprimida es un anticuerpo biespecífico.

En un modo de realización de todos los aspectos como se informa en el presente documento el anticuerpo para fármaco humano o humanizado con función efectora suprimida no induce ADCC.

En un modo de realización de todos los aspectos como se informa en el presente documento el suero sanguíneo de mamífero es suero sanguíneo humano o suero sanguíneo de macaco cangrejero o suero sanguíneo de ratón.

En un modo de realización de todos los aspectos como se informa en el presente documento el suero sanguíneo de mamífero se ha obtenido de un mamífero al que se le había administrado el anticuerpo para fármaco humano o humanizado con función efectora suprimida. En un modo de realización, la muestra se obtiene al menos 2 días después de la primera administración del anticuerpo al mamífero.

En un modo de realización de todos los aspectos como se informa en el presente documento la muestra comprende de desde un 0,5 % (v/v) a un 8 % (v/v) de suero de mamífero, preferentemente, aproximadamente un 2 % (v/v) de suero de mamífero.

En un modo de realización de todos los aspectos como se informa en el presente documento el anticuerpo antifármaco contra un anticuerpo para fármaco humano o humanizado con función efectora suprimida es de la clase IgG.

En un modo de realización de todos los aspectos como se informa en el presente documento la presencia y/o cantidad del marcador se determina usando una reacción de color enzimática, resonancia de plasmón superficial, electroquimioluminiscencia o radioinmunoanálisis.

En un modo de realización de todos los aspectos como se informa en el presente documento el inmunoanálisis y/o el procedimiento y/o el uso es un inmunoanálisisin vitroy/o un procedimientoin vitroy/o un usoin vitro.

En un modo de realización de todos los aspectos como se informa en el presente documento la fase sólida se conjuga con un primer miembro de un par de unión y el compuesto que se va a inmovilizar en la fase sólida se conjuga con el segundo miembro de un par de unión.

Dicho par de unión (primer miembro/segundo miembro) en un modo de realización se selecciona de estreptavidina o avidina/biotina, anticuerpo/antígeno (véase, por ejemplo, Hermanson, G.T.,et al.,Bioconjugate Techniques, Academic Press (1996)), lectina/polisacárido, esteroide/proteína de unión a esteroide, hormona/receptor hormonal, enzima/sustrato, IgG/proteína A y/o G, etc.

En un modo de realización, el segundo compañero de unión se une (inmoviliza) por medio de un par de unión específico. Dicho par de unión (primer componente/segundo componente) en un modo de realización se selecciona de estreptavidina o avidina/biotina, anticuerpo/antígeno (véase, por ejemplo, Hermanson, G.T.,et al.,Bioconjugate Techniques, Academic Press (1996)) lectina/polisacárido, esteroide/proteína de unión a esteroide, hormona/receptor hormonal, enzima/sustrato, IgG/proteína A y/o G, etc. En un modo de realización el segundo par de unión se conjuga a biotina y la inmovilización se realiza por medio de avidina o estreptavidina inmovilizada.

En un modo de realización preferente, el primer miembro de un par de unión es estreptavidina y el segundo miembro de un par de unión es biotina.

En un modo de realización, la fase sólida se conjuga con estreptavidina y el compuesto que se va a inmovilizar en la fase sólida se biotinila.

En un modo de realización, la fase sólida es una microesfera paramagnética recubierta de estreptavidina o una microesfera de Sepharose recubierta de estreptavidina o un pocillo recubierto de estreptavidina de una placa multipocillo.

En un modo de realización, el compuesto que se conjugará con la fase sólida es una mezcla que comprende al menos dos compuestos que difieren en el sitio en el que se conjugan con biotina y de este modo después de esto se inmovilizan en la fase sólida.

En un modo de realización, el compuesto que se va a inmovilizar en la fase sólida se conjuga al segundo miembro del par de unión uniendo químicamente por medio de grupos N terminales y/o e-amino (lisina), grupos e-amino de diferentes lisinas, grupos funcionales carboxi, sulfhidrilo, hidroxilo y/o fenólico de la cadena principal aminoacídica del polipéptido y/o grupos alditol de la estructura glucídica del polipéptido.

Dicha conjugación por medio de diferentes grupos amino se puede realizar por acilación de una parte de los grupos e-amino con agentes protectores químicos, por ejemplo, por citraconilación, en una primera etapa. En una segunda etapa, la conjugación se realiza por medio de los grupos amino restantes. Posteriormente, se retira la citraconilación y se inmoviliza el compañero de unión en la fase sólida por medio de grupos amino libres restantes, es decir, se inmoviliza el compañero de unión obtenido en la fase sólida por medio de grupos amino que no se han protegido por citraconilación. Los agentes protectores químicos adecuados forman enlaces en aminas de cadena lateral no protegida y son menos estables y diferentes de los enlaces en el extremo N. Son conocidos muchos de dichos agentes protectores químicos (véase, por ejemplo, el documento EP 0651761). En un modo de realización, los agentes protectores químicos incluyen anhídridos de ácidos dicarboxílicos cíclicos como anhídrido de ácido maleico o citracónico.

Descripción detallada de la invención

Se ha descubierto que es ventajoso para la detección y cuantificación de anticuerpos antifármaco contra un anticuerpo para fármaco humano o humanizado con función efectora suprimida usar el receptor de Fc gamma I humano o un fragmento de unión a región Fc del mismo como un compuesto en un inmunoanálisis.

Usando el receptor de Fc gamma I humano, se puede proporcionar una mejora en el inmunoanálisis, por ejemplo, en comparación con un inmunoanálisis de doble captura convencional.

La mejora es sin limitación en sensibilidad y/o robustez.

En el ensayo como se informa en el presente documento, la interferencia diana se reduce y de este modo se reduce el número de resultados positivos falsos. Se reduce la interferencia de IgM (por ejemplo, que se origina a partir de una respuesta inmunitaria temprana y/o inespecífica).

Con el ensayo como se informa en el presente documento se pueden detectar anticuerpos antifármaco de baja afinidad.

El formato de ensayo de doble captura usado en general para la determinación de anticuerpos antifármaco requiere que el anticuerpo antifármaco se pueda unir a dos moléculas del anticuerpo para fármaco simultáneamente.

En el inmunoanálisis y procedimiento como se informa en el presente documento no se requiere que el anticuerpo antifármaco realice doble captura de dos copias del anticuerpo para fármaco. De hecho, el inmunoanálisis y el procedimiento como se informa en el presente documento usan diferentes sitios de unión de una manera secuencial.

Con más detalle, el inmunoanálisis como se informa en el presente documento se mejora entre otras cosas con respecto a sensibilidad, volumen de muestra requerido, modo de unión de los compuestos. Con ello, el número de anticuerpos antifármaco reconocidos en el inmunoanálisis de anticuerpo antifármaco es mayor que, por ejemplo, con un inmunoanálisis de doble captura convencional ya que también se detectan anticuerpos antifármaco sin doble captura.

Además, el inmunoanálisis como se informa en el presente documento tiene una mejora en las propiedades con respecto a la detección de anticuerpos antifármaco de la clase IgG (respuesta inmunitaria secundaria) sobre anticuerpos antifármaco de la clase IgM (respuesta inmunitaria primaria).

En el presente documento se informa de un inmunoanálisis de anticuerpo antifármaco para la determinación de la presencia de un anticuerpo antifármaco contra un anticuerpo para fármaco humano o humanizado con función efectora suprimida en una muestra que comprende las siguientes etapas en el siguiente orden:

- incubar una muestra que comprende suero sanguíneo de mamífero con receptor de Fc gamma I humano de longitud completa o un fragmento de unión a región Fc del mismo de modo que se forma un complejo entre el anticuerpo antifármaco contra el anticuerpo para fármaco humano o humanizado con función efectora suprimida presente en la muestra y el receptor de Fc gamma I humano o el fragmento de unión a región Fc del mismo, con lo que el receptor de Fc gamma I humano de longitud completa o el fragmento de unión a región Fc del mismo se conjuga con un marcador detectable, y

- determinar el complejo formado en la etapa previa por el marcador detectable.

El ensayo de acuerdo con la invención proporciona una mejora en el procedimiento para la detección de anticuerpos para fármaco terapéuticos con función efectora suprimida. Estos anticuerpos para fármaco humanos o humanizados con función efectora suprimida (estos son los únicos anticuerpos útiles para tratamiento de un paciente humano) no se unen a receptores de Fc gamma humanos o viceversa, los receptores de Fc gamma humanos no se unen a la región Fc de los anticuerpos para fármaco humanos o humanizados con función efectora suprimida, ya que el sitio de unión se ha modificado para suprimir la función efectora que está mediada por receptores de Fc gamma humanos.

El receptor de Fc gamma I humano (CD64) es un receptor de alta afinidad (con respecto a la región Fc humana), mientras que los receptores de Fc gamma II y III humanos (CD32 y CD16, respectivamente) son receptores de baja afinidad.

El término "anticuerpo" en el presente documento se usa en el sentido más amplio y engloba diversas estructuras de anticuerpo, incluyendo, pero sin limitarse a, anticuerpos monoclonales, anticuerpos policlonales, anticuerpos multiespecíficos (por ejemplo, anticuerpos biespecíficos) y fragmentos de anticuerpo siempre que presenten la actividad de unión a antígeno deseada.

En determinados modos de realización, el anticuerpo es un anticuerpo multiespecífico, por ejemplo, un anticuerpo biespecífico. Los anticuerpos multiespecíficos son anticuerpos monoclonales que tienen especificidades de unión por al menos dos sitios diferentes. En determinados modos de realización, una de las especificidades de unión es por un primer antígeno y la otra es por un segundo antígeno diferente. En determinados modos de realización, los anticuerpos biespecíficos se pueden unir a dos epítopos diferentes del mismo antígeno. Se pueden preparar anticuerpos biespecíficos como anticuerpos de longitud completa o fragmentos de anticuerpo. En un modo de realización, el anticuerpo es un anticuerpo biespecífico que se une específicamente a un primer y un segundo antígeno. En un modo de realización, el anticuerpo biespecífico tiene i) una primera especificidad de unión que se une específicamente a un primer antígeno o un primer epítopo en un antígeno y ii) una segunda especificidad de unión que se une específicamente a un segundo antígeno o un segundo epítopo en el mismo antígeno. En un modo de realización, el segundo epítopo en el mismo antígeno es un epítopo no solapante.

Se describen anticuerpos multiespecíficos en los documentos WO 2009/080251, WO 2009/080252, WO 2009/080253, WO 2009/080254, WO 2010/112193, WO 2010/115589, WO 2010/136172, WO 2010/145792 o WO 2010/145793.

Un "fragmento de anticuerpo" se refiere cualquier molécula distinta de un anticuerpo intacto que comprende una porción de un anticuerpo intacto que se une al antígeno al que se une el anticuerpo intacto. Los ejemplos de fragmentos de anticuerpo incluyen pero no se limitan a Fv, Fab, Fab', Fab'-SH, F(ab')2; diacuerpos; anticuerpos lineales; moléculas de anticuerpo monocatenario (por ejemplo, scFv); y anticuerpos multiespecíficos formados a partir de fragmentos de anticuerpo.

La "clase" de un anticuerpo se refiere al tipo de dominio constante o región constante poseído por su cadena pesada. Existen cinco clases principales de anticuerpos: IgA, IgD, IgE, IgG e IgM, y varios de estos se pueden dividir además en subclases (isotipos), por ejemplo, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1 e IgA2. Los dominios constantes de la cadena pesada que corresponden a las diferentes clases de inmunoglobulinas se llaman a, 5, e,<y>y M, respectivamente.

Las "funciones efectoras" se refieren a las actividades biológicas atribuibles a la región Fc de un anticuerpo, que varían con la clase de anticuerpo. Los ejemplos de funciones efectoras de anticuerpo incluyen: unión a C1q y citotoxicidad dependiente del complemento (CDC); unión al receptor de Fc; citotoxicidad celular dependiente de anticuerpos (ADCC); fagocitosis; regulación por disminución de receptores de superficie celular (por ejemplo, receptor de linfocitos B) y activación de linfocitos B.

El término "anticuerpo para fármaco humano o humanizado con función efectora suprimida" indica un anticuerpo que no provoca ADCc .

En un modo de realización, un anticuerpo con función efectora suprimida no se une al receptor de Fc gamma III humano.

En un modo de realización, el anticuerpo para fármaco humano o humanizado con función efectora suprimida es de la subclase IgG1 o la subclase IgG4. En un modo de realización, el anticuerpo humano o humanizado con función efectora suprimida de la subclase IgG1 comprende en la región constante de la cadena pesada en la posición 234 y posición 235 el residuo aminoacídico alanina (numeración de acuerdo con el índice EU de Kabat). En un modo de realización, el anticuerpo humano o humanizado con función efectora suprimida comprende en la región constante de la cadena pesada en la posición 234 y posición 235 el residuo aminoacídico alanina y en la posición 329 el residuo aminoacídico glicina (numeración de acuerdo con el índice EU de Kabat). En un modo de realización, el anticuerpo humano o humanizado con función efectora suprimida de la subclase IgG4 comprende en la región constante de la cadena pesada en la posición 235 el residuo aminoacídico alanina y en la posición 228 el residuo aminoacídico prolina (numeración de acuerdo con el índice EU de Kabat). En un modo de realización, el anticuerpo humano o humanizado con función efectora suprimida comprende en la región constante de la cadena pesada en la posición 235 el residuo aminoacídico alanina, en la posición 228 el residuo aminoacídico prolina y en la posición 329 el residuo aminoacídico glicina (numeración de acuerdo con el índice EU de Kabat).

El término "región Fc" en el presente documento se usa para definir una región C terminal de una cadena pesada de inmunoglobulina que contiene al menos una porción de la región constante. El término incluye regiones Fc de secuencia natural y regiones Fc variantes. En un modo de realización, una región Fc de la cadena pesada de IgG humana se extiende desde Cys226, o desde Pro230, al extremo carboxílico de la cadena pesada. Sin embargo, la lisina C terminal (Lys447) de la región Fc puede estar presente o no. A menos que se especifique de otro modo en el presente documento, la numeración de los residuos aminoacídicos en la región Fc o región constante se realiza de acuerdo con el sistema de numeración EU, también llamado índice EU, como se describe en Kabat, E.A.et al.,Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5.a ed., Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991), NIH Publication 91-3242.

"Región estructural" o "FR" se refiere a residuos del dominio variable distintos de los residuos de la región hipervariable (HVR). La FR de un dominio variable consiste en general en cuatro dominios de FR: FR1, FR2, FR3 y FR4. En consecuencia, las secuencias de HVR y FR aparecen en general en la siguiente secuencia en VH (o VL): FR1-H1(L1 )-FR2-H2(L2)-FR3-H3(L3)-FR4.

Un "anticuerpo humano" es uno que posee una secuencia de aminoácidos que corresponde a la de un anticuerpo producido por un humano o una célula humana o derivado de una fuente no humana que utiliza repertorios de anticuerpos humanos u otras secuencias que codifican anticuerpos humanos. Esta definición de un anticuerpo humano excluye específicamente un anticuerpo humanizado que comprende residuos de unión a antígeno no humanos.

Un anticuerpo "humanizado" se refiere a un anticuerpo quimérico que comprende residuos aminoacídicos de HVR no humanas y residuos aminoacídicos de FR humanas. En determinados modos de realización, un anticuerpo humanizado comprenderá sustancialmente todos de al menos uno, y típicamente dos, dominios variables, en los que todas o sustancialmente todas las HVR (por ejemplo, CDR) corresponden a las de un anticuerpo no humano, y todas o sustancialmente todas las FR corresponden a las de un anticuerpo humano. Un anticuerpo humanizado opcionalmente puede comprender al menos una porción de una región constante de anticuerpo derivada de un anticuerpo humano. Una "forma humanizada" de un anticuerpo, por ejemplo, un anticuerpo no humano, se refiere a un anticuerpo que se ha sometido a humanización.

El término "región hipervariable" o "HVR," como se usa en el presente documento, se refiere a cada una de las regiones de un dominio variable de anticuerpo que son hipervariables en secuencia y/o forman bucles estructuralmente definidos ("bucles hipervariables"). En general, los anticuerpos tetracatenarios naturales comprenden seis HVR; tres en el VH (H1, H2, H3) y tres en el VL (L1, L2, L3). Las HVR comprenden en general residuos aminoacídicos de los bucles hipervariables y/o de las "regiones determinantes de la complementariedad" (CDR), siendo las últimas las de la mayor variabilidad de secuencia y/o estando implicadas en el reconocimiento antigénico. Los bucles hipervariables ejemplares se producen en los residuos aminoacídicos 26-32 (L1), 50-52 (L2), 91-96 (L3), 26-32 (H1), 53-55 (H2) y 96-101 (H3) (Chothia, C. y Lesk, A.M., J. Mol. Biol. 196 (1987) 901-917). Las CDR ejemplares (CDR-L1, c Dr -L2, CDR-L3, CDR-H1, CDR-H2 y CDR-H3) se producen en los residuos aminoacídicos 24-34 de L1, 50-56 de L2, 89-97 de L3, 31-35B de H1, 50-65 de H2 y 95-102 de H3 (Kabat, E.A.et al.,Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5.a ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991), NIH Publication 91-3242). Con la excepción de CDR1 en VH, las CDR comprenden en general los residuos aminoacídicos que forman los bucles hipervariables. Las CDR también comprenden "residuos determinantes de la especificidad" o "SDR", que son los residuos que entran en contacto con el antígeno. Los SDR están contenidos dentro de regiones de las CDR llamadas CDR abreviadas o a-CDR. Las a-CDR ejemplares (a-CDR-L1, a-CDR-L2, a-CDR-L3, a-CDR-H1, a-CDR-H2 y a-CDR-H3) se producen en los residuos aminoacídicos 31-34 de L1, 50-55 de L2, 89-96 de L3, 31-35B de H1, 50-58 de H2 y 95-102 de H3 (Almagro, J.C. y Fransson, J., Front. Biosci. 13 (2008) 1619-1633). A menos que se indique de otro modo, los residuos de HVR y otros residuos en el dominio variable (por ejemplo, los residuos de FR) se numeran en el presente documento de acuerdo con Kabatet al., supra.

El término "anticuerpo monoclonal" como se usa en el presente documento se refiere a un anticuerpo obtenido de una población de anticuerpos sustancialmente homogéneos, es decir, los anticuerpos individuales que comprenden la población son idénticos y/o se unen al mismo epítopo, excepto por posibles anticuerpos variantes, por ejemplo, que contienen mutaciones naturales o que surgen durante la producción de una preparación de anticuerpos monoclonales, estando presentes dichas variantes en general en cantidades insignificantes. En contraste con las preparaciones de anticuerpos policlonales, que típicamente incluyen diferentes anticuerpos dirigidos contra diferentes determinantes (epítopos), cada anticuerpo monoclonal de una preparación de anticuerpos monoclonales se dirige contra un único determinante en un antígeno. Por tanto, el modificador "monoclonal" indica el carácter del anticuerpo como que se ha obtenido de una población sustancialmente homogénea de anticuerpos, y no se debe interpretar que requiera la producción del anticuerpo por ningún procedimiento particular. Por ejemplo, los anticuerpos monoclonales que se van a usar de acuerdo con la presente invención se pueden preparar por una variedad de técnicas, incluyendo, pero sin limitarse al procedimiento de hibridoma, procedimientos de ADN recombinante, procedimientos de presentación en fagos y procedimientos que utilizan animales transgénicos que contienen todos o parte de los locus de inmunoglobulina humana, describiéndose en el presente documento dichos procedimientos y otros procedimientos ejemplares para preparar anticuerpos monoclonales.

Un "polipéptido" es un polímero que consiste en aminoácidos unidos por enlaces peptídicos, ya se produzcan de forma natural o sintética. Los polipéptidos de menos de aproximadamente 20 residuos aminoacídicos se pueden denominar "péptidos", mientras que las moléculas que consisten en dos o más polipéptidos o que comprenden un polipéptido de más de 100 residuos aminoacídicos se pueden denominar "proteínas". Un polipéptido también puede comprender componentes no aminoacídicos, tales como grupos carbohidrato, iones metálicos o ésteres de ácidos carboxílicos. Los componentes no aminoacídicos se pueden añadir por la célula, en la que se expresa el polipéptido, y pueden variar con el tipo de célula. Los polipéptidos se definen en el presente documento en términos de su estructura de cadena principal aminoacídica o del ácido nucleico que codifica los mismos. Las adiciones, tales como grupos carbohidrato en general no se especifican, pero, no obstante, pueden estar presentes.

El término "región variable" o "dominio variable" se refiere al dominio de una cadena pesada o ligera de anticuerpo que está implicado en la unión del anticuerpo al antígeno. Los dominios variables de la cadena pesada y cadena ligera (VH y VL, respectivamente) de un anticuerpo natural en general tienen estructuras similares, comprendiendo cada dominio cuatro regiones estructurales conservadas (FR) y tres regiones hipervariables (HVR) (véase, por ejemplo, Kindt, T.J.,et al.,Kuby Immunology, 6.a ed., W.H. Freeman and Co., N.Y. (2007), página 91). Un dominio VH o VL único puede ser suficiente para conferir especificidad de unión a antígeno. Además, se pueden aislar anticuerpos que se unen a un antígeno particular usando un dominio VH o VL de un anticuerpo que se une al antígeno para cribar una colección de dominios VL o VH complementarios, respectivamente (véanse, por ejemplo, Portolano, S.,et al.,J. Immunol. 150 (1993) 880-887; Clackson, T.,et al.,Nature 352 (1991) 624-628).

El término "anticuerpo antidiotípico" indica un anticuerpo que se une específicamente a una especificidad de unión tal como un sitio de unión de un anticuerpo original, es decir, que se dirige, por ejemplo, contra un sitio de unión a antígeno de un anticuerpo original. En un modo de realización, el anticuerpo antidiotípico se une específicamente a una o más de las CDR del anticuerpo original. En un modo de realización, el anticuerpo original es un anticuerpo terapéutico. En un modo de realización, el anticuerpo original es un anticuerpo multiespecífico. En un modo de realización, el anticuerpo original es un anticuerpo biespecífico.

Los principios de diferentes inmunoanálisis se describen, por ejemplo, por Hage, D.S. (Anal. Chem. 71 (1999) 294R-304R). Lu, B.,et al.(Analyst 121 (1996) 29R-32R) informan de la inmovilización orientada de anticuerpos para el uso en inmunoanálisis. Se informa de inmunoanálisis mediados por avidina-biotina, por ejemplo, por Wilchek, M. y Bayer, E.A., en Methods Enzymol. 184 (1990) 467-469.

Los polipéptidos y anticuerpos monoclonales y sus dominios constantes contienen una serie de cadenas laterales de aminoácidos reactivos para conjugarse con un miembro de un par de unión, tal como un polipéptido/proteína, un polímero (por ejemplo, PEG, celulosa o poliestireno) o una enzima. Los grupos reactivos químicos de aminoácidos son, por ejemplo, grupos amino (lisinas, grupos alfa-amino), grupos tiol (cistinas, cisteínas y metioninas), grupos ácido carboxílico (ácidos aspárticos, ácidos glutámicos) y grupos alditol. Dichos procedimientos, por ejemplo, se describen por Aslam M. y Dent, A., en "Bioconjugation", MacMillan Ref. Ltd. 1999, páginas 50-100.

Uno de los grupos reactivos más comunes de polipéptidos y anticuerpos es la £-amina alifática del aminoácido lisina. En general, prácticamente todos los polipéptidos y anticuerpos contienen abundante lisina. Las aminas de lisina son nucleófilos razonablemente buenos por encima de pH 8,0 (pK<a>= 9,18) y por lo tanto reaccionan fácil y limpiamente con una variedad de reactivos para formar enlaces estables. Los compuestos reactivos con amina reaccionan principalmente con lisinas y los grupos a-amino de proteínas. Los ésteres reactivos, en particular ésteres de N-hidroxi-succinimida (NHS), están entre los reactivos empleados más comúnmente para la modificación de grupos amina. El pH óptimo para la reacción en un entorno acuoso es pH 8,0 a 9,0. Los isotiocianatos son reactivos de modificación de amina y forman enlaces tiourea con proteínas. Reaccionan con aminas proteicas en solución acuosa (óptimamente a pH de 9,0 a 9,5). Los aldehídos reaccionan en condiciones acuosas suaves con aminas alifáticas y aromáticas, hidracinas e hidracidas para formar un intermedio imina (base de Schiff). Se puede reducir selectivamente una base de Schiff con agentes reductores suaves o fuertes (tales como borohidruro de sodio o cianoborohidruro de sodio) para obtener un enlace de alquilamina estable. Otros reactivos que se han usado para modificar aminas son anhídridos de ácido. Por ejemplo, el anhídrido dietilentriaminopentaacético (DTPA) es un agente quelante bifuncional que contiene dos grupos anhídrido reactivos con amina. Puede reaccionar con grupos N terminales y £-amina de aminoácidos para formar enlaces amida. Los anillos de anhídrido se abren para crear brazos quelantes de metal multivalentes que se pueden unir firmemente a metales en un complejo de coordinación.

Otro grupo reactivo común en polipéptidos y anticuerpos es el residuo tiol del aminoácido que contiene azufre cistina y su producto de reducción cisteína (o media cistina). La cisteína contiene un grupo tiol libre, que es más nucleófilo que las aminas y en general es el grupo funcional más reactivo en una proteína. Los tioles son en general reactivos a pH neutro, y por lo tanto se pueden acoplar selectivamente a otras moléculas en presencia de aminas. Puesto que los grupos sulfhidrilo libres son relativamente reactivos, las proteínas con estos grupos a menudo existen con ellos en su forma oxidada como grupos disulfuro o enlaces disulfuro. En dichas proteínas, se requiere la reducción de los enlaces disulfuro con un reactivo tal como ditiotreitol (DTT) para generar el tiol libre reactivo. Los compuestos reactivos con tiol son los que se acoplarán a los grupos tiol en polipéptidos, formando productos acoplados con tioéter. Estos reactivos reaccionan rápidamente a pH ligeramente ácido a neutro y por lo tanto se pueden hacer reaccionar selectivamente en presencia de grupos amina. La bibliografía informa del uso de varios reactivos de reticulación tiolantes, tales como el reactivo de Traut (2-iminotiolano), (acetiltio)acetato de succinimidilo (SATA) y 6-[3-(2-piridilditio)propionamido]hexanoato de sulfosuccinimidilo (Sulfo-LC-SPDP) para proporcionar maneras eficaces de introducir múltiples grupos sulfhidrilo por medio de grupos amino reactivos. Los derivados de haloacetilo, por ejemplo, yodoacetamidas, forman enlaces tioéter y también son reactivos para la modificación con tiol. Otros reactivos útiles son las maleimidas. La reacción de maleimidas con reactivos reactivos con tiol es esencialmente la misma que con yodoacetamidas. Las maleimidas reaccionan rápidamente a pH de ligeramente ácido a neutro.

Otro grupo reactivo común en polipéptidos y anticuerpos son los ácidos carboxílicos. Los polipéptidos y anticuerpos contienen grupos ácido carboxílico en la posición C terminal y dentro de las cadenas laterales del ácido aspártico y ácido glutámico. La reactividad relativamente baja de ácidos carboxílicos en agua normalmente hace difícil el uso de estos grupos para modificar selectivamente polipéptidos y anticuerpos. Cuando se hace esto, el grupo ácido carboxílico normalmente se convierte en un éster reactivo por el uso de una carbodiimida soluble en agua y se hace reaccionar con un reactivo nucleófilo tal como una amina, hidracida o hidracina. El reactivo que contiene amina debe ser base débil para reaccionar selectivamente con el ácido carboxílico activado en presencia de las £-aminas más altamente básicas de lisina para formar un enlace amida estable. Se puede producir la reticulación proteica cuando el pH se eleva por encima de 8,0.

Se puede usar peryodato de sodio para oxidar la parte de alcohol de un glúcido dentro de un resto glucídico fijado a un anticuerpo a un aldehído. Se puede hacer reaccionar cada grupo aldehído con una amina, hidracida o hidracina como se describe para ácidos carboxílicos. Puesto que el resto glucídico se encuentra predominantemente en la región del fragmento cristalizable (Fc) de un anticuerpo, se puede lograr la conjugación a través de la modificación dirigida a sitio del carbohidrato lejos del sitio de unión a antígeno. Se forma un intermedio de base de Schiff, que se puede reducir a una alquilamina a través de la reducción del intermedio con agentes reductores solubles en agua de cianoborohidruro de sodio (suave y selectivo) o borohidruro de sodio (fuerte).

El término "muestra" incluye, pero no se limita a, cualquier cantidad de una sustancia de un ser vivo o ser vivo anterior. Dichos seres vivos incluyen, pero no están limitados a, seres humanos, ratones, monos, ratas, conejos y otros animales. En un modo de realización, la muestra se obtiene de un mono, especialmente un macaco cangrejero, o un conejo, o un ratón o rata, o un ser humano. Dichas sustancias incluyen, pero no se limitan a, en un modo de realización sangre entera o suero de un individuo, que son las fuentes de muestra más ampliamente usadas en la rutina clínica.

El término "fase sólida" indica una sustancia no fluida, e incluye partículas (incluyendo micropartículas y microesferas) preparadas a partir de materiales tales como polímero, metal (partículas paramagnéticas, ferromagnéticas), vidrio y cerámica; sustancias en gel tales como geles de sílice, alúmina y poliméricos; capilares, que se pueden preparar con polímero, metal, vidrio y/o cerámica; zeolitas y otras sustancias porosas; electrodos; placas de microvaloración; tiras sólidas; y cubetas, tubos u otros recipientes de muestra para espectrómetro. Un componente de fase sólida se distingue de las superficies sólidas inertes por que una "fase sólida" contiene al menos un resto en su superficie, que está destinado a interaccionar con una sustancia en una muestra. Una fase sólida puede ser un componente estacionario, tal como un tubo, tira, cubeta o placa de microvaloración, o pueden ser componentes no estacionarios, tales como microesferas y micropartículas. Se puede usar una variedad de micropartículas que permiten la fijación no covalente o bien covalente de proteínas y otras sustancias. Dichas partículas incluyen partículas poliméricas, tales como poliestireno y poli(metacrilato de metilo); partículas de oro, tales como nanopartículas de oro y coloides de oro; y partículas cerámicas, tales como partículas de sílice, vidrio y óxido de metal. Véase, por ejemplo, Martin, C.R.,et al.,Analytical Chemistry-News & Features, 70 (1998) 322A-327A, o Butler, J.E., Methods 22 (2000) 4-23.

De cromógenos (grupos fluorescentes o luminiscentes y tintes), enzimas, grupos activos por RMN, partículas de metal o haptenos, tales como digoxigenina, se selecciona el marcador detectable en un modo de realización. El marcador detectable también puede ser un grupo de reticulación fotoactivable, por ejemplo, un grupo acido o acirina. Los quelatos de metal que se pueden detectar por electroquimioluminiscencia también son en un modo de realización grupos emisores de señales, dándose particular preferencia a quelatos de rutenio, por ejemplo, un quelato de rutenio (bispiridilo)<32+>. Los grupos marcadores de rutenio adecuados se describen, por ejemplo, en los documentos EP 0580979, WO 90/05301, WO 90/11511 y WO 92/14138.

La presente invención se refiere a procedimientos para la determinación de la presencia y cantidad de un anticuerpo antifármaco contra un anticuerpo para fármaco humano o humanizado con función efectora suprimida en una muestra que comprende suero de mamífero usando el receptor de Fc gamma I humano.

El término "receptor de Fc gamma I humano" indica una proteína de dominio transmembranaria de SEQ ID NO: 01 (véase también la entrada UniProt P12341, FCGR1A). El receptor de Fc gamma I humano también se denomina grupo de diferenciación 64 (CD64). Se une a la región Fc de inmunoglobulinas gamma con alta afinidad. El receptor de Fc gamma I humano, que media la citotoxicidad celular dependiente de anticuerpos y la eliminación del complejo inmunitario, desempeña un papel importante en la inmunidad y en la resistencia a infecciones tanto en el hombre como en el ratón. El receptor de Fc gamma I humano usado en el inmunoanálisis y el procedimiento como se informa en el presente documento puede ser un fragmento de unión a región Fc del receptor de Fc gamma I humano de longitud completa, tal como, por ejemplo, en un modo de realización solo los tres dominios extracelulares. En un modo de realización, el receptor de Fc gamma humano tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 01. En un modo de realización, el receptor de Fc gamma humano tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 02. En un modo de realización preferente, el receptor de Fc gamma humano tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 03.

Un aspecto de acuerdo con la invención es un procedimiento para la determinación de la presencia de un anticuerpo antifármaco contra un anticuerpo para fármaco humano o humanizado con función efectora suprimida en una muestra que comprende las siguientes etapas en el siguiente orden:

- determinar el complejo formado en la etapa previa por el marcador detectable.

Un aspecto de acuerdo con la invención es el uso del receptor de Fc gamma I humano o un fragmento de unión a región Fc del mismo para la determinación de la presencia o cantidad de un anticuerpo antifármaco contra un anticuerpo para fármaco humano o humanizado con función efectora suprimida en una muestra que comprende suero sanguíneo de mamífero.

Algunos compuestos como se usan en el inmunoanálisis y el procedimiento como se informa en el presente documento se conjugan con un miembro de un par de unión. En un modo de realización, la conjugación se realiza por unión química por medio de grupos N terminales y/o £-amino (lisina), grupos £-amino de diferentes lisinas, grupos funcionales carboxi, sulfhidrilo, hidroxilo y/o fenólico de la cadena principal aminoacídica del compuesto y/o grupos alditol de la estructura glucídica del compuesto. En un modo de realización, el compuesto conjugado es una mezcla de al menos dos compuestos conjugados con un miembro de un par de unión, en el que los al menos dos compuestos en la mezcla difieren en el sitio en el que se conjugan con el miembro del par de unión. Por ejemplo, la mezcla puede comprender una conjugación por medio de un aminoácido de la cadena principal aminoacídica y una conjugación por medio de un grupo alditol de un carbohidrato. También, por ejemplo, la mezcla puede comprender compuestos conjugados con el miembro de un par de unión por medio de diferentes residuos aminoacídicos de la cadena principal aminoacídica. La expresión "residuo aminoacídico diferente" indica dos clases diferentes de aminoácidos, tales como, por ejemplo, lisina y ácido aspártico, o tirosina y ácido glutámico, o bien dos residuos aminoacídicos de la cadena principal aminoacídica que difieren en su posición en la secuencia aminoacídica del compuesto. En este último caso, el aminoácido puede ser de la misma clase o de diferente clase. La expresión "difieren en el sitio" indica una diferencia en la clase de sitio, por ejemplo, grupo aminoácido o alditol, o bien en el número del aminoácido de la cadena principal aminoacídica, por ejemplo, en que se conjuga el compuesto al miembro del par de unión.

Como se usa en el presente documento, las posiciones aminoacídicas de todas las regiones y dominios constantes de la cadena pesada y ligera se numeran de acuerdo con el sistema de numeración de Kabat descrito en Kabat,etal.,Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5.a ed., Public Health Service, National Institutes de Health, Bethesda, MD (1991) y se denomina "numeración de acuerdo con Kabat" en el presente documento. Específicamente el sistema de numeración de Kabat (véanse las páginas 647-660) de Kabat,et al.,Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5.a ed., Public Health Service, National Institutes de Health, Bethesda, MD (1991) se usa para el dominio constante de la cadena ligera CL del isotipo kappa y lambda y el sistema de numeración del índice EU de Kabat (véanse las páginas 661-723) se usa para los dominios de la cadena pesada constantes (CH1, bisagra, CH2 y CH3).

Modos de realización específicos de la invención

1. Un procedimiento para la determinación de la presencia de un anticuerpo antifármaco contra un anticuerpo para fármaco humano o humanizado con función efectora suprimida en una muestra que comprende las siguientes etapas en el siguiente orden:

- determinar el complejo formado en la etapa previa por el marcador detectable.

2. Un procedimiento para la determinación de la presencia de un anticuerpo antifármaco (ADA) contra un anticuerpo para fármaco humano o humanizado con función efectora suprimida (EFS-DA) en una muestra que comprende las siguientes etapas en el siguiente orden:

a) incubar una fase sólida en la que el anticuerpo para fármaco humano o humanizado con función efectora suprimida se ha inmovilizado con una muestra que comprende suero sanguíneo de mamífero (de modo que se forma un complejo anticuerpo para fármaco-anticuerpo antifármaco unido a fase sólida),

b) incubar la fase sólida (a la que se une el complejo anticuerpo para fármaco-anticuerpo antifármaco formado en la etapa a)) con el receptor de Fc gamma I humano de longitud completa o un fragmento de unión a región Fc del mismo, con lo que el receptor de Fc gamma I humano de longitud completa o el fragmento de unión a región Fc del mismo se conjuga con un marcador detectable, y

3. Un procedimiento para la determinación de la presencia de un anticuerpo antifármaco (ADA) contra un anticuerpo para fármaco humano o humanizado con función efectora suprimida (EFS-DA) en una muestra que comprende las siguientes etapas en el siguiente orden:

a) incubar una fase sólida en la que el FAB de un anticuerpo para fármaco humano o humanizado con función efectora suprimida se ha inmovilizado con una muestra que comprende suero sanguíneo de mamífero (de modo que se forma un complejo Fab-anticuerpo antifármaco unido a fase sólida),

b) incubar la fase sólida (a la que se une el complejo FAB-anticuerpo antifármaco formado en la etapa a)) con el receptor de Fc gamma I humano de longitud completa o un fragmento de unión a región Fc del mismo, con lo que el receptor de Fc gamma I humano de longitud completa o el fragmento de unión a región Fc del mismo se conjuga con un marcador detectable, y

c) determinar la formación de un complejo unido a fase sólida en la etapa b) determinando la presencia del marcador detectable y determinando de este modo la presencia de un anticuerpo antifármaco contra uno para humano con función efectora suprimida.

4. Un procedimiento para la determinación de la presencia de un anticuerpo antifármaco (ADA) contra un anticuerpo para fármaco humano o humanizado con función efectora suprimida (EFS-DA) en una muestra que comprende las siguientes etapas en el siguiente orden:

a) añadir exceso de anticuerpo de fármaco a la muestra (para transferir (cualquier) anticuerpo antifármaco presente en la muestra en un complejo anticuerpo para fármaco-anticuerpo antifármaco), en el que la muestra comprende suero sanguíneo de mamífero,

b) incubar una fase sólida en la que el antígeno al que se une específicamente el EFS-DA se ha inmovilizado con la muestra obtenida en la etapa a) (de modo que se forma un complejo antígeno-anticuerpo para fármaco-anticuerpo antifármaco unido a fase sólida),

c) incubar la fase sólida (a la que se une el complejo antígeno-anticuerpo para fármaco-anticuerpo antifármaco formado en la etapa b)) con el receptor de Fc gamma I humano de longitud completa o un fragmento de unión a región Fc del mismo, con lo que el receptor de Fc gamma I humano de longitud completa o el fragmento de unión a región Fc del mismo se conjuga con un marcador detectable, y

5. Un procedimiento para la determinación de la presencia de un anticuerpo antifármaco (ADA) contra un anticuerpo para fármaco humano o humanizado con función efectora suprimida (EFS-DA) en una muestra que comprende las siguientes etapas en el siguiente orden:

b) incubar una fase sólida en la que el receptor de Fc gamma I humano de longitud completa o un fragmento de unión a región Fc del mismo se ha inmovilizado con la muestra obtenida en la etapa a) (de modo que se forma un complejo receptor-anticuerpo para fármaco-anticuerpo anti-fármaco unido a fase sólida),

c) incubar la fase sólida (a la que se une el complejo receptor-anticuerpo para fármaco-anticuerpo antifármaco formado en la etapa b)) con el antígeno del anticuerpo para fármaco, con lo que el antígeno se conjuga con un marcador detectable, y

6. Un procedimiento para la determinación de la presencia de un anticuerpo antifármaco (ADA) contra un anticuerpo para fármaco humano o humanizado con función efectora suprimida (EFS-DA) en una muestra que comprende las siguientes etapas en el siguiente orden:

b) incubar una fase sólida en la que un anticuerpo antifármaco contra el anticuerpo para fármaco se ha inmovilizado con la muestra obtenida en la etapa a) (de modo que se forma un complejo anticuerpo antifármaco-anticuerpo para fármaco-anticuerpo antifármaco unido a fase sólida),

c) incubar la fase sólida (a la que se une el complejo anticuerpo antifármaco-anticuerpo para fármaco-anticuerpo antifármaco formado en la etapa b)) con el receptor de Fc gamma I humano de longitud completa o un fragmento de unión a región Fc del mismo, con lo que el receptor de Fc gamma I humano de longitud completa o el fragmento de unión a región Fc del mismo se conjuga con un marcador detectable, y

7. El procedimiento de acuerdo con uno cualquiera de los puntos 1 a 6, en el que cada etapa de incubación está seguida de la siguiente etapa:

- lavar la fase sólida para retirar los compuestos no unidos.

8. El procedimiento de acuerdo con uno cualquiera de los puntos 1 a 7, en el que el ensayo es para la determinación de la presencia y la cantidad de un anticuerpo antifármaco (ADA) contra un anticuerpo para fármaco humano o humanizado con función efectora suprimida (EFS-DA) en una muestra y comprende como etapas finales:

9. El procedimiento de acuerdo con uno cualquiera de los puntos 1 a 8, en el que el anticuerpo para fármaco humano o humanizado con función efectora suprimida es de la subclase humana IgG1 o IgG4.

10. El procedimiento de acuerdo con uno cualquiera de los puntos 1 a 9, en el que el anticuerpo para fármaco humano o humanizado con función efectora suprimida es de la subclase humana IgG1 y tiene las mutaciones L234A, L235A y P329G en ambos polipéptidos de región Fc o en el que el anticuerpo para fármaco humano o humanizado con función efectora suprimida es de la subclase humana IgG4 y tiene las mutaciones S228P, L235E y P329G en ambos polipéptidos de región Fc (numeración de acuerdo con el índice EU de Kabat).

11. El procedimiento de acuerdo con uno cualquiera de los puntos 1 a 10, en el que el anticuerpo para fármaco humano o humanizado con función efectora suprimida es un anticuerpo biespecífico.

12. El procedimiento de acuerdo con uno cualquiera de los puntos 1 a 11, en el que el anticuerpo para fármaco humano o humanizado con función efectora suprimida no induce ADCC.

13. El procedimiento de acuerdo con uno cualquiera de los puntos 1 a 12, en el que el suero sanguíneo de mamífero es suero sanguíneo humano o suero sanguíneo de macaco cangrejero.

14. El procedimiento de acuerdo con uno cualquiera de los puntos 1 a 13, en el que el suero sanguíneo de mamífero se ha obtenido de un mamífero al que se le había administrado el anticuerpo para fármaco humano o humanizado con la función efectora suprimida al menos 2 días antes de obtener la muestra.

15. El procedimiento de acuerdo con uno cualquiera de los puntos 1 a 14, en el que la muestra comprende de desde un 0,5 % (v/v) a un 8 % (v/v) de suero de mamífero, preferentemente, aproximadamente un 2 % (v/v) de suero de mamífero.

16. El procedimiento de acuerdo con uno cualquiera de los puntos 1 a 15, en el que el anticuerpo antifármaco contra un anticuerpo para fármaco humano o humanizado con la función efectora suprimida es de la clase IgG.

17. El procedimiento de acuerdo con uno cualquiera de los puntos 1 a 16, en el que la presencia y/o cantidad del marcador se determina usando una reacción de color enzimática, resonancia de plasmón superficial, electroquimioluminiscencia o radioinmunoanálisis.

18. Uso del receptor de Fc gamma I humano o un fragmento de unión a región Fc del mismo para la determinación de la presencia o cantidad de un anticuerpo antifármaco contra un anticuerpo para fármaco humano o humanizado con función efectora suprimida en una muestra que comprende suero sanguíneo de mamífero. 19. Uso del del receptor de Fc gamma I humano o un fragmento de unión a región Fc del mismo para la determinación de la presencia de un anticuerpo antifármaco contra un anticuerpo para fármaco humano o humanizado con función efectora suprimida en una muestra que comprende la

- incubación de una muestra que comprende suero sanguíneo de mamífero con receptor de Fc gamma I humano de longitud completa o un fragmento de unión a región Fc del mismo de modo que se forma un complejo entre el anticuerpo antifármaco contra el anticuerpo para fármaco humano o humanizado con función efectora suprimida presente en la muestra y el receptor de Fc gamma I humano o el fragmento de unión a región Fc del mismo, con lo que el receptor de Fc gamma I humano de longitud completa o el fragmento de unión a región Fc del mismo se conjuga con un marcador detectable, y

20. Uso del receptor de Fc gamma I humano o un fragmento de unión a región Fc del mismo para la determinación de la presencia de un anticuerpo antifármaco (ADA) contra un anticuerpo para fármaco humano o humanizado con función efectora suprimida (EFS-DA) en una muestra que comprende la:

a) incubación de una fase sólida en la que el anticuerpo para fármaco humano o humanizado con función efectora suprimida se ha inmovilizado con una muestra que comprende suero sanguíneo de mamífero (de modo que se forma un complejo anticuerpo para fármaco-anticuerpo antifármaco unido a fase sólida),

b) incubación de la fase sólida (a la que se une el complejo anticuerpo para fármaco-anticuerpo antifármaco formado en la etapa a)) con el receptor de Fc gamma I humano de longitud completa o un fragmento de unión a región Fc del mismo, con lo que el receptor de Fc gamma I humano de longitud completa o el fragmento de unión a región Fc del mismo se conjuga con un marcador detectable, y

21. Uso del receptor de Fc gamma I humano o un fragmento de unión a región Fc del mismo para la determinación de la presencia de un anticuerpo antifármaco (ADA) contra un anticuerpo para fármaco humano o humanizado con función efectora suprimida (EFS-DA) en una muestra que comprende la:

a) incubación de una fase sólida en la que el FAB de un anticuerpo para fármaco humano o humanizado con función efectora suprimida se ha inmovilizado con una muestra que comprende suero sanguíneo de mamífero (de modo que se forma un complejo Fab unido a fase sólida -anticuerpo antifármaco),

b) incubación de la fase sólida (a la que se une el complejo FAB-anticuerpo antifármaco formado en la etapa a)) con el receptor de Fc gamma I humano de longitud completa o un fragmento de unión a región Fc del mismo, con lo que el receptor de Fc gamma I humano de longitud completa o el fragmento de unión a región Fc del mismo se conjuga con un marcador detectable, y

c) determinación de la formación de un complejo unido a fase sólida en la etapa b) determinando la presencia del marcador detectable y determinando de este modo la presencia de un anticuerpo antifármaco contra uno para humano con función efectora suprimida.

22. Uso del receptor de Fc gamma I humano o un fragmento de unión a región Fc del mismo para la determinación de la presencia de un anticuerpo antifármaco (ADA) contra un anticuerpo para fármaco humano o humanizado con función efectora suprimida (EFS-DA) en una muestra que comprende la:

a) adición de exceso de anticuerpo de fármaco a la muestra (para transferir (cualquier) anticuerpo antifármaco presente en la muestra en un complejo anticuerpo para fármaco-anticuerpo antifármaco), en el que la muestra comprende suero sanguíneo de mamífero,

b) incubación de una fase sólida en la que el antígeno al que se une específicamente el EFS-DA se ha inmovilizado con la muestra obtenida en la etapa a) (de modo que se forma un complejo antígeno unido a fase sólida-anticuerpo para fármaco-anticuerpo antifármaco),

c) incubación de la fase sólida (a la que se une el complejo antígeno-anticuerpo para fármaco-anticuerpo antifármaco formado en la etapa b)) con el receptor de Fc gamma I humano de longitud completa o un fragmento de unión a región Fc del mismo, con lo que el receptor de Fc gamma I humano de longitud completa o el fragmento de unión a región Fc del mismo se conjuga con un marcador detectable, y

23. Uso del receptor de Fc gamma I humano o un fragmento de unión a región Fc del mismo para la determinación de la presencia de un anticuerpo antifármaco (ADA) contra un anticuerpo para fármaco humano o humanizado con función efectora suprimida (EFS-DA) en una muestra que comprende la:

b) incubación de una fase sólida en la que el receptor de Fc gamma I humano de longitud completa o un fragmento de unión a región Fc del mismo se ha inmovilizado con la muestra obtenida en la etapa a) (de modo que se forma un complejo receptor-anticuerpo para fármaco-anticuerpo anti-fármaco unido a fase sólida), c) incubación de la fase sólida (a la que se une el complejo receptor-anticuerpo para fármaco-anticuerpo antifármaco formado en la etapa b)) con el antígeno del anticuerpo para fármaco, con lo que el antígeno se conjuga con un marcador detectable, y

24. Uso del receptor de Fc gamma I humano o un fragmento de unión a región Fc del mismo para la determinación de la presencia de un anticuerpo antifármaco (ADA) contra un anticuerpo para fármaco humano o humanizado con función efectora suprimida (EFS-DA) en una muestra que comprende la:

b) incubación de una fase sólida en la que un anticuerpo antifármaco contra el anticuerpo para fármaco se ha inmovilizado con la muestra obtenida en la etapa a) (de modo que se forma un complejo anticuerpo antifármaco-anticuerpo para fármaco-anticuerpo antifármaco unido a fase sólida),

c) incubación de la fase sólida (a la que se une el complejo anticuerpo antifármaco-anticuerpo para fármaco-anticuerpo antifármaco formado en la etapa b)) con el receptor de Fc gamma I humano de longitud completa o un fragmento de unión a región Fc del mismo, con lo que el receptor de Fc gamma I humano de longitud completa o el fragmento de unión a región Fc del mismo se conjuga con un marcador detectable, y

25. El uso de acuerdo con uno cualquiera de los puntos 18 a 24, en el que cada incubación está seguida de

- lavado de la fase sólida para retirar los compuestos no unidos.

26. El uso de acuerdo con uno cualquiera de los puntos 18 a 25, en el que el uso es para la determinación de la presencia y la cantidad de un anticuerpo antifármaco (ADA) contra un anticuerpo para fármaco humano o humanizado con función efectora suprimida (EFS-DA) en una muestra y comprende como etapas finales:

- la determinación de la formación de un complejo unido a fase sólida en la etapa previa determinando la presencia del marcador detectable y la determinación de la cantidad de un anticuerpo antifármaco contra un anticuerpo para fármaco humano o humanizado con función efectora suprimida en la muestra correlacionando la cantidad del marcador determinado con la cantidad del anticuerpo antifármaco usando una curva estándar.

27. El uso de acuerdo con uno cualquiera de los puntos 18 a 26, en el que el anticuerpo para fármaco humano o humanizado con función efectora suprimida es de la subclase humana IgG1 o IgG4.

28. El uso de acuerdo con uno cualquiera de los puntos 18 a 27, en el que el anticuerpo para fármaco humano o humanizado con función efectora suprimida es de la subclase humana IgG1 y tiene las mutaciones L234A, L235A y P329G en ambos polipéptidos de región Fc o en el que el anticuerpo para fármaco humano o humanizado con función efectora suprimida es de la subclase humana IgG4 y tiene las mutaciones S228P, L235E y P329G en ambos polipéptidos de región Fc (numeración de acuerdo con el índice EU de Kabat).

29. El uso de acuerdo con uno cualquiera de los puntos 18 a 28, en el que el anticuerpo para fármaco humano o humanizado con función efectora suprimida es un anticuerpo biespecífico.

30. El uso de acuerdo con uno cualquiera de los puntos 18 a 29, en el que el anticuerpo para fármaco humano o humanizado con función efectora suprimida no induce ADCC.

31. El uso de acuerdo con uno cualquiera de los puntos 18 a 30, en el que el suero sanguíneo de mamífero es suero sanguíneo humano o suero sanguíneo de macaco cangrejero.

32. El uso de acuerdo con uno cualquiera de los puntos 18 a 31, en el que el suero sanguíneo de mamífero se ha obtenido de un mamífero al que se le había administrado el anticuerpo para fármaco humano o humanizado con la función efectora suprimida por esta primera vez al menos 2 días antes de obtener la muestra.

33. El uso de acuerdo con uno cualquiera de los puntos 18 a 32, en el que la muestra comprende de desde un 0,5 % (v/v) a un 8 % (v/v) de suero de mamífero, preferentemente, aproximadamente un 2 % (v/v) de suero de mamífero.

34. El uso de acuerdo con uno cualquiera de los puntos 18 a 33, en el que el anticuerpo antifármaco contra un anticuerpo para fármaco humano o humanizado con la función efectora suprimida es de la clase IgG.

35. El uso de acuerdo con uno cualquiera de los puntos 18 a 34, en el que la presencia y/o cantidad del marcador se determina usando una reacción de color enzimática, resonancia de plasmón superficial, electroquimioluminiscencia o radioinmunoanálisis.

36. El procedimiento o el uso de acuerdo con uno cualquiera de los puntos 1 a 35, en el que el receptor de Fc gamma I humano tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 01.

37. El procedimiento o el uso de acuerdo con uno cualquiera de los puntos 1 a 35, en el que el receptor de Fc gamma I humano tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 02.

Los siguientes ejemplos y figuras se proporcionan para ayudar al entendimiento de la presente invención, de la que su verdadero alcance se expone en las reivindicaciones adjuntas.

Descripción de las figuras

Figura 1Esquema de un ensayo de anticuerpo antifármaco usando FcyRI humano de acuerdo con la invención.

Figura 2Esquema de ensayo de anticuerpo antifármaco usando un formato de ensayo de doble captura convencional.

Figura 3Resultado del ensayo de anticuerpo antifármaco de trece muestras determinadas con el ensayo de anticuerpo antifármaco de acuerdo con la presente invención.

Figura 4Resultado de ensayo de anticuerpo antifármaco de trece muestras determinadas con un ensayo de anticuerpo antifármaco de doble captura.

Figura 5Esquema de un ensayo de anticuerpo antifármaco usando FcyRI humano de acuerdo con la invención.

Figura 6Resultado del ensayo de anticuerpo antifármaco de catorce muestras obtenidas de un animal experimental determinado con el ensayo de anticuerpo antifármaco de acuerdo con la presente invención (eje x: tiempo después de primera dosificación).

Figura 7Resultado de ensayo de anticuerpo antifármaco de catorce muestras obtenidas de un animal experimental determinado con un ensayo de anticuerpo antifármaco de doble captura convencional (eje x: tiempo después de primera dosificación).

Figura 8Evolución temporal de los resultados de ensayo de anticuerpo antifármaco determinados con un ensayo de acuerdo con la presente invención (1) y con un ensayo de doble captura convencional (2); 8a: animal 1; 8b: animal 2; 8c: animal 3.

Figura 9Esquema de un ensayo de anticuerpo antifármaco usando FcyRI humano de acuerdo con la invención.

Figura 10Esquema de un ensayo de anticuerpo antifármaco usando FcyRI humano de acuerdo con la invención.

Figura 11Resultado de ensayo de anticuerpo antifármaco de quince muestras determinadas con el ensayo de anticuerpo antifármaco de acuerdo con la presente invención; columna izquierda: sin fármaco añadido, columna derecha: con fármaco añadido (1 |jg/ml).

Figura 12Ensayo de anticuerpo antifármaco usando FcyRI humano de acuerdo con la invención.

Figura 13Comparación de los resultados obtenidos con un ensayo de acuerdo con el ejemplo 1 (1) y un ensayo de acuerdo con el ejemplo 10 (2).

Ejemplo 1

Ensayo de anticuerpo antifármaco usando detección de FcyRI humano y captura de anticuerpo para fármaco por medio de fármaco biotinilado

Se unió anticuerpo anti-ANG2/VEGF con función efectora inactiva biespecífico biotinilado a placas de microvaloración recubiertas de estreptavidina (SA-MTP) en la primera etapa. Se retiró el exceso de anticuerpo no unido por lavado. Se añadieron muestras/estándares, por ejemplo, anticuerpo anti-VEGF antidiotípico monoclonal M-1.17.5, enriquecido en suero de macaco cangrejero, a los pocillos de la SA-MTP recubierta con anticuerpo anti-ANG2/VEGF biotinilado y se incubó durante 1 hora. Después del lavado, los pocillos se incubaron con receptor de Fc gamma I humano digoxigenilado (FcyRI, FcyRI no digoxigenilado de R&D Systems, n.° cat: 1257-Fc ). Después del lavado, el FcyRI humano digoxigenilado unido se detectó con un anticuerpo anti-digoxigenina conjugado con peroxidasa de rábano picante (HRP). Después de otra etapa de lavado, se añadió sustrato ABTS. La señal se mide por un lector ELISA a una longitud de onda de 405 nm (longitud de onda de referencia: 490 nm). Los valores de absorbancia de cada muestra de suero se determinaron por duplicado. Un esquema del ensayo se representa en la figura 1.

La tolerancia al fármaco de este ensayo se determinó añadiendo diferentes concentraciones del anticuerpo anti-ANG2/VEGF biespecífico en una muestra y determinando la extinción resultante. Los resultados se muestran en la siguiente tabla (columnas: concentración de anticuerpo anti-ANG2/VEGF; filas: concentración de anticuerpo M-1.17.5). Para determinar el límite, se midieron 16 muestras de suero de macaco cangrejero en blanco no tratadas individuales diferentes en la misma placa. El límite se calculó como sigue: media de sueros individuales dos veces la desviación estándar. El límite se calculó como 0,1 UA para esta placa

Ejemplo 2 (ejemplo comparativo)

Ensayo de anticuerpo antifármaco de formato de doble captura

En una primera etapa, el anticuerpo anti-ANG2/VEGF biotinilado, anticuerpo de control positivo (PC; mezcla de los dos anticuerpos antidiotípicos contra VEGF y ANG2 mAb<Id<Ang2>M2.6.81-IgG y mAb<Id<VEGF>M-2.45.51 (de forma alternativa, se podría usar el anticuerpo antidiotípico policlonal contra el anticuerpo anti-ANG2/VEGF pAb<Id<Ang2/VEGF»Rb-IgG)) y muestra, respectivamente, así como el primer anticuerpos de detección (anticuerpo anti-ANG2/VEGF digoxigenilado) se preincubaron durante la noche a temperatura ambiente (TA) en un agitador de placa de microvaloración (MTP). En una segunda etapa, PC preincubada y las muestras se transfirieron a una MTP recubierta de estreptavidina (SA-MTP). El exceso de anticuerpo no unido se retiró por lavado tres veces con 300 |jl de tampón cada vez. Después del lavado, el anticuerpo anti-ANG2/VEGF digoxigenilado unido a complejo se detectó con un anticuerpo anti-digoxigenina conjugado con peroxidasa de rábano picante (incubación durante 1 hora a temperatura ambiente, agitación a 500 rpm). Después de otra etapa de lavado (tres veces 300 j l de tampón), se añadió sustrato ABTS. La señal se mide por un lector ELISA a una longitud de onda de 405 nm (longitud de onda de referencia: 490 nm). Los valores de absorbancia de cada muestra sérica se determinaron por triplicado. Un esquema del ensayo se representa en la figura 2.

La tolerancia al fármaco de este ensayo se determinó añadiendo diferentes concentraciones del anticuerpo anti-ANG2/VEGF biespecífico en una muestra y determinando la extinción resultante. Los resultados se muestran en la siguiente tabla (columnas: concentración de anticuerpo anti-ANG2/VEGF; filas: concentración de anticuerpo PC). Para determinar el límite, se midieron 16 muestras de suero de macaco cangrejero en blanco no tratadas individuales diferentes en la misma placa. El límite se calculó como sigue: media de sueros individuales dos veces la desviación estándar. El límite calculado fue de 0,045 UA para esta placa.

Ejemplo 3

Medición de muestras de estudio de macaco cangrejero: comparación del ensayo antifármaco de acuerdo con la invención y el ensayo de anticuerpo antifármaco de doble captura convencional

Se diluyeron trece muestras de diferentes animales hasta una cantidad sérica de un 2 % en tampón de bajo cruce (Candor Bioscience GmbH, Wangen, Alemania) y posteriormente se sometieron al ensayo como se describe en el ejemplo 1. Para determinar el límite, se midieron 16 muestras de suero de macaco cangrejero en blanco no tratadas individuales diferentes en la misma placa. El límite se calculó como sigue: media de sueros individuales dos veces la desviación estándar.

Los resultados se representan en la figura 3. Para ocho de las trece muestras, el ensayo de anticuerpo antifármaco de acuerdo con la presente invención dio como resultado una lectura de al menos el doble del límite. Se determinó que las muestras restantes eran negativas (lectura como máximo de un 50 % del límite).

Las mismas trece muestras se procesaron en el ensayo de doble captura de anticuerpo antifármaco como se describe en el ejemplo 2.

Los resultados se representan en la figura 4. Para una de las trece muestras, el ensayo de anticuerpo antifármaco de doble captura dio como resultado una lectura de aproximadamente el doble del límite y para cuatro de las trece muestras, el ensayo de anticuerpo antifármaco de doble captura dio como resultado una lectura entre el límite y el doble del límite. Se determinó que las muestras restantes eran negativas (lectura de más de un 50 % del límite).

Ejemplo 4

Ensayo de anticuerpo antifármaco con detección de FcyRI humano y captura de anticuerpo para fármaco por medio de fármaco biotinilado

El conjugado de IL2 de anticuerpo anti-cynoCEA efector inactivo biotinilado (<Cyno-CEA>PGLALA) se inmovilizó en placas de microvaloración recubiertas de estreptavidina (SA-MTP) en la primera etapa. Se retiró el exceso de anticuerpo no unido por lavado. Se añadieron muestras/estándares, por ejemplo, anticuerpo anti-CEA antidiotípico de conejo policlonal en suero de macaco cangrejero, a pocillos de una SA-MTP recubierta con el anticuerpo anti-cynoCEA efector inactivo biotinilado y se incubó durante una hora. Después del lavado, los pocillos se incubaron con FcyRI humano digoxigenilado. Después del lavado, el FcyRI humano digoxigenilado unido a complejo se detectó con un anticuerpo anti-digoxigenina conjugado con peroxidasa de rábano picante. Después de otra etapa de lavado, se añadió sustrato ABTS. La señal se mide por un lector ELISA a una longitud de onda de 405 nm (longitud de onda de referencia: 490 nm). Los valores de absorbancia de cada muestra sérica se determinaron por triplicado. Un esquema del ensayo se representa en la figura 5.

Ejemplo 5

Se diluyeron cuarenta y dos muestras de diferentes animales hasta una cantidad de suero de un 2%en tampón de bajo cruce (Candor Bioscience GmbH, Wangen, Alemania) y posteriormente se sometieron al ensayo como se describe en el ejemplo 4. Las muestras se midieron en dos placas. Para determinar el límite, se midieron 16 muestras de suero de macaco cangrejero individuales diferentes en cada placa. El límite específico de placa se calculó como sigue: media de sueros individuales dos veces la desviación estándar.

Los resultados ejemplares para catorce muestras del mismo animal en la primera placa se representan en la figura 6. Para ocho de las veinticuatro muestras de la primera placa, el ensayo de anticuerpo antifármaco de acuerdo con la presente invención dio como resultado una lectura significativamente positiva muy por encima del límite. Se determinó que las muestras restantes eran negativas (lectura significativamente por debajo del límite).

Las mismas veinte muestras se procesaron en el ensayo de doble captura de anticuerpo antifármaco como se describe en el ejemplo 2.

Los resultados para las mismas catorce muestras como se muestra en la figura 6 se representan en la figura 7. Para doce de las veinte muestras, el ensayo de anticuerpo antifármaco de doble captura dio como resultado un positivo. Se determinó que las muestras restantes eran negativas (lectura por debajo del límite).

La segunda placa incluyó veintitrés muestras de dos animales. Estas muestras también se analizaron en el ensayo de anticuerpo antifármaco de doble captura. Para doce de las veintitrés muestras, el ensayo de anticuerpo antifármaco de acuerdo con la presente invención dio como resultado una lectura positiva. Se determinó que las muestras restantes eran negativas (lectura por debajo del límite). La medición de estas veintitrés muestras en el ensayo de anticuerpo antifármaco de doble captura dio como resultado las mismas doce muestras positivas

Los resultados comparativos para tres animales diferentes obtenidos con el ensayo como se informa en el presente documento y un ensayo de doble captura convencional se muestran en las figuras 8a a 8c reducidas a la misma escala.

Para el primer animal, se analizaron una muestra de partida y catorce muestras tomadas en diferentes puntos temporales durante hasta cuatro semanas después de la administración del fármaco usando un ensayo de acuerdo con la invención y un ensayo de anticuerpo antifármaco de doble captura.

Se puede observar que con el ensayo de anticuerpo antifármaco de doble captura se determinó un máximo de respuesta para la muestra tomada a aproximadamente 100 h. Con el ensayo de anticuerpo antifármaco de acuerdo con la presente invención, se puede observar un incremento continuo en la lectura.

Para el segundo animal, se analizaron una muestra de partida y 10 muestras, tomadas en diferentes puntos temporales durante hasta tres semanas después de la administración del fármaco usando un ensayo de acuerdo con la invención y un ensayo de anticuerpo antifármaco de doble captura. Los resultados se muestran en la figura 8b. Se puede observar que ambos ensayos muestran el mismo incremento en la lectura a aproximadamente 200 h después de la dosificación. No se pueden observar diferencias significativas en la lectura entre los dos ensayos hasta 504 h después de la dosificación.

Para el tercer animal, se analizaron una muestra de partida y 11 muestras, tomadas en diferentes puntos temporales durante hasta cuatro semanas después de la administración del fármaco usando un ensayo de acuerdo con la invención y un ensayo de anticuerpo antifármaco de doble captura. Los resultados se muestran en la figura 8c. Se puede observar que ambos ensayos muestran el mismo incremento en la lectura a aproximadamente 72 h después de la dosificación. Sin embargo, con el ensayo de anticuerpo antifármaco de acuerdo con la presente invención, este incremento es mucho más fuerte. Se puede observar un segundo incremento para ambos ensayos a aproximadamente 162 h después de la dosificación, lo que lleva a aproximadamente las mismas lecturas para ambos ensayos.

Ejemplo 6

Ensayo de anticuerpo antifármaco con detección de FcyRI humano y captura de anticuerpo para fármaco por medio del antígeno

Se unión VEGF biotinilado a placas de microvaloración recubiertas de estreptavidina (SA-MTP) en la primera etapa. Se retiró el exceso de antígeno no unido por lavado. En paralelo, los estándares se prepararon por preincubación del anticuerpo anti-VEGF antiidiotípico monoclonal M-1.17.5 en una serie de diluciones con anticuerpo anti-Ang2/VEGF monoclonal enriquecido en suero de macaco cangrejero. Todas las muestras se prepararon dos veces. Las muestras se diluyeron 1:50 i) en tampón de bajo cruce y ii) en tampón de bajo cruce que contenía 1 |jg/ml de anticuerpo anti-Ang2/VEGF monoclonal. Se añadieron estándares y muestras a pocillos de la SA-MTP recubierta de VEGF y se incubó durante 1 hora. Después del lavado, los pocillos se incubaron con FcyRI humano digoxigenilado. Después del lavado, el FcyRI humano digoxigenilado unido a complejo se detectó con un anticuerpo anti-digoxigenina conjugado con peroxidasa de rábano picante (HRP). Después de otra etapa de lavado, se añadió el sustrato de HRP ABTS. La señal se mide por un lector ELISA a una longitud de onda de 405 nm (longitud de onda de referencia: 490 nm). Los valores de absorbancia de cada muestra sérica se determinaron por triplicado. Un esquema del ensayo se representa en la figura 9.

Ejemplo 7

Ensayo de anticuerpo antifármaco con detección de FcyRI humano y captura de anticuerpo para fármaco por medio de un anticuerpo antidiotípico

Se unió anticuerpo anti-VEGF antidiotípico monoclonal biotinilado a los pocillos de una placa de microvaloración recubierta de estreptavidina (SA-MTP) en la primera etapa. Se retiró el exceso de anticuerpo no unido por lavado. Los estándares se prepararon por preincubación del anticuerpo anti-VEGF antiidiotípico monoclonal M-1.17.5 en una serie de diluciones con anticuerpo anti-Ang2/VEGF monoclonal enriquecido en suero de macaco cangrejero. Todas las muestras se prepararon dos veces. Las muestras se diluyeron 1:50 i) en tampón de bajo cruce y ii) en tampón de bajo cruce que contenía 1 jg/m l de anticuerpo anti-Ang2/VEGF monoclonal. Se añadieron estándares y muestras a los pocillos de la SA-MTP recubierta de VEGF y se incubó durante 1 hora. Después del lavado, los pocillos se incubaron con FcyRI humano digoxigenilado. Después del lavado, el FcyRI humano digoxigenilado unido a complejo se detectó con un anticuerpo anti-digoxigenina conjugado con peroxidasa de rábano picante (HRP). Después de otra etapa de lavado, la h Rp de los conjugados anticuerpo-enzima cataliza la reacción de color del sustrato ABTS. La señal se mide por un lector ELISA a una longitud de onda de 405 nm (longitud de onda de referencia: 490 nm). Los valores de absorbancia de cada muestra sérica se determinaron por triplicado. Un esquema del ensayo se representa en la figura 10.

Ejemplo 8

Tolerancia al fármaco del ensayo de anticuerpo antifármaco con detección de FcyRI humano y captura de anticuerpo para fármaco por medio de un anticuerpo antidiotípico

La tolerancia al fármaco de este ensayo se determinó añadiendo diferentes concentraciones del anticuerpo anti-ANG2/VEGF biespecífico en una muestra y determinando la extinción resultante. Los resultados se muestran en la siguiente tabla (columnas: concentración de anticuerpo anti-ANG2/VEGF; filas: concentración de anticuerpo M-1.17.5). Para determinar el límite, se midieron 16 muestras de suero de macaco cangrejero en blanco no tratadas individuales diferentes en la misma placa. El límite se calculó como sigue: media de sueros individuales dos veces la desviación estándar. El límite calculado fue de 0,13 UA para esta placa.

Ejemplo 9

Medición de muestras de estudio de macaco cangrejero: determinación de anticuerpo antifármaco con un ensayo de acuerdo con la invención en presencia y ausencia de fármaco

Se diluyeron quince muestras de diferentes animales hasta una cantidad de suero de un 2 % en tampón de bajo cruce (Candor Bioscience GmbH, Wangen, Alemania). A partir de cada dilución, se prepararon cada una de las dos muestras. La primera muestra se sometió al ensayo como se describe en el ejemplo 7, la segunda muestra se enriqueció con 1 |jg/ml de anticuerpo anti-Ang2/VEGF monoclonal y después de esto se sometió al ensayo como se describe en el ejemplo 7. Para determinar el límite, se midieron 16 muestras de suero de macaco cangrejero individuales diferentes en la misma placa. El límite se calculó como sigue: media de sueros individuales dos veces la desviación estándar. Los resultados se representan en la figura 11.

Ejemplo 10

Ensayo de anticuerpo antifármaco usando detección de FcyRI humano y captura de anticuerpo para fármaco por medio por medio de fragmento F(ab')2biotinilado del fármaco

Se unió fragmento F(ab')2 biespecífico biotinilado de anticuerpo anti-ANG2/VEGF a placas de microvaloración recubiertas de estreptavidina (SA-MTP) en la primera etapa. Se retiró el exceso de anticuerpo no unido por lavado. Se añadieron muestras/estándares, por ejemplo, anticuerpo anti-VEGF antidiotípico monoclonal M-1.17.5, enriquecido en suero de reserva humano al 1o %, a los pocillos de una SA-MTP recubierto con fragmento F(ab')2 de anticuerpo anti-ANG2/VEGF biotinilado y se incubó durante una hora. Después del lavado, los pocillos se incubaron con FcyRI humano digoxigenilado. Después del lavado, el FcyRI humano digoxigenilado unido se detectó con un anticuerpo anti-digoxigenina conjugado con peroxidasa de rábano picante (HRP). Después de otra etapa de lavado, se añadió sustrato ABTS. La señal se mide por un lector ELISA a una longitud de onda de 405 nm (longitud de onda de referencia: 490 nm). Los valores de absorbancia de cada muestra de suero se determinaron por duplicado. Un esquema del ensayo se representa en la figura 12. La figura 13 muestra los resultados de ensayo en comparación con las mismas muestras medidas como se describe en el ejemplo 1.

Ejemplo 11

Determinación de la interferencia de la diana oligómera para el ensayo de ADA con detección de FcyRI y captura de fármaco por medio de fármaco biotinilado

El ensayo como se describe en el ejemplo 1,2 y 7 se sometió a prueba para determinar la interferencia de VEGF y ANG2 diana oligómeros. Se diluyeron las dianas de 100 ng/ml a 0,048 ng/ml en plasma de reserva de macaco cangrejero al 100 % y se sometido a prueba en el ensayo. Los resultados se muestran en las tablas a continuación.

Límite 0,05 0,059 0,108

Límite______________ |_______ 0,05_______ _______ 0,059_______ ________ 0,108

Ejemplo 12

Evaluación de unión/especificidad de huFcyRI por resonancia de plasmón superficial

Todas las mediciones se realizaron con el instrumento BIAcore® T100 usando un chip SA-CAP. A menos que se indique de otro modo, todas las incubaciones se realizaron en tampón HBS (HEPES, NaCl, pH 7,4) a 25 °C. El chip se recubrió con una cantidad de saturación de estreptavidina en la primera etapa por inyección de reactivo SA-CAP durante 300 s a 2 |jl/min. El recubrimiento del chip con receptor de Fc gamma I humano biotinilado (huFcyRI) se logró por inyección de una solución que comprendía 10 jg/m l de huFcyRI-Bi durante 60 s a 10 jl/min. Posteriormente, las diferentes muestras se inyectaron durante 60 s a un caudal de 30 jl/min. Las señales se midieron después de la inyección. Para eliminar la unión inespecífica, se usó una cubeta de lectura de referencia para medir las mismas muestras sin huFcyRI inmovilizado. Las señales de la cubeta de lectura de referencia se restaron de las señales de la cubeta de lectura de medición. Todos los sueros de animal se diluyeron 1:100 en tampón HBS-P. Las proteínas purificadas se diluyeron hasta una concentración de 10 jg/m l cada una. Usando el programa informático BIAevaluation de BIAcore® se calcularon las señales de respuesta con referencia restada después del final de inyección.

Claims

REIVINDICACIONES

1. Un procedimiento para la determinación de la presencia de un anticuerpo antifármaco (ADA) contra un anticuerpo para fármaco humano o humanizado con función efectora suprimida (EFS-DA) en una muestra que comprende las siguientes etapas en el siguiente orden:

- determinar el complejo formado en la etapa previa por el marcador detectable.

6. Uso del receptor de Fc gamma I humano o un fragmento de unión a región Fc del mismo para la determinación de la presencia o cantidad de un anticuerpo antifármaco (ADA) contra un anticuerpo para fármaco humano o humanizado con función efectora suprimida (EFS-DA) en una muestra que comprende suero sanguíneo de mamífero.

7. Uso del receptor de Fc gamma I humano o un fragmento de unión a región Fc del mismo para la determinación de la presencia de un anticuerpo antifármaco (ADA) contra un anticuerpo para fármaco humano o humanizado con función efectora suprimida (EFS-DA) en una muestra que comprende la

8. Uso del receptor de Fc gamma I humano o un fragmento de unión a región Fc del mismo para la determinación de la presencia de un anticuerpo antifármaco (ADA) contra un anticuerpo para fármaco humano o humanizado con función efectora suprimida (EFS-DA) en una muestra que comprende la:

9. Uso del receptor de Fc gamma I humano o un fragmento de unión a región Fc del mismo para la determinación de la presencia de un anticuerpo antifármaco (ADA) contra un anticuerpo para fármaco humano o humanizado con función efectora suprimida (EFS-DA) en una muestra que comprende la:

a) adición de exceso de EFS-DA a la muestra, en el que la muestra comprende suero sanguíneo de mamífero, b) incubación de una fase sólida en la que el antígeno al que se une específicamente el EFS-DA se ha inmovilizado con la muestra obtenida en la etapa a),

10. Uso del receptor de Fc gamma I humano o un fragmento de unión a región Fc del mismo para la determinación de la presencia de un anticuerpo antifármaco (ADA) contra un anticuerpo para fármaco humano o humanizado con función efectora suprimida (EFS-DA) en una muestra que comprende la:

11. Uso del receptor de Fc gamma I humano o un fragmento de unión a región Fc del mismo para la determinación de la presencia de un anticuerpo antifármaco (ADA) contra un anticuerpo para fármaco humano o humanizado con función efectora suprimida (EFS-DA) en una muestra que comprende la: