ES2991437T3 - Composiciones para la regulación de la hemólisis y la coagulación y la estabilización de vesículas extracelulares - Google Patents

Abstract

Composición y método de uso de la misma, en la que la composición comprende uno o más componentes capaces de liberar un aldehído, uno o más anticoagulantes o agentes quelantes y uno o más polisacáridos. La composición tiene un pH de aproximadamente 4 a aproximadamente 6. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

DESCRIPCION

Composiciones para la regulación de la hemólisis y la coagulación y la estabilización de vesículas extracelulares

Referencia cruzada a solicitud relacionada

Esta solicitud reivindica el beneficio de la solicitud provisional de Estados Unidos Núm. 62/574,515, presentada el 19 de octubre de 2017.

Campo

La presente descripción se refiere a una composición de regulación de muestras de sangre. Más particularmente, la presente descripción se refiere a una composición para regular los mecanismos en una muestra de sangre de modo que los componentes de la muestra de sangre mantengan una integridad suficiente para un análisis posterior de una variedad de indicadores de diagnóstico.

Antecedentes

La llegada de la biopsia líquida (p. ej., el análisis de sangre u otras muestras líquidas del cuerpo) ha revolucionado la medicina prenatal y el diagnóstico del cáncer. En la actualidad, es posible aislar y analizar ADN circulante (ADNlc o ADN libre circulante) (p. ej., fetal o canceroso), ARN libre circulante y células tumorales circulantes con respecto a una muestra de sangre de un paciente. A medida que avanzan las capacidades analíticas, una necesidad de los ensayos de biopsia líquida es considerar las variables preanalíticas asociadas para maximizar los resultados posteriores en términos de sensibilidad y especificidad. Una de las variables preanalíticas más críticas relacionadas con la recolección de muestras de biopsia líquida es la estabilización celular y de ácidos nucleicos, especialmente si se tiene en cuenta el importante tiempo de demora asociado con la llegada de estas muestras al laboratorio de referencia. Las muestras de sangre entera son las muestras de paciente más eficientes para los estudios de biopsia líquida, sin embargo, están limitadas por múltiples factores de tiempo de demora. Los más importantes son la fragilidad de los glóbulos blancos y los eritrocitos/reticulocitos. De manera específica, el almacenamiento de sangre resulta en la liberación con el tiempo de ADN genómico desde los glóbulos blancos apoptóticos y de ARN celular tanto desde los glóbulos blancos como desde los reticulocitos deteriorados. En los ensayos de biopsia líquida en base a PCR, los aumentos inespecíficos de ARN y ADN libre circulante pueden suponer el riesgo de diluir los transcritos objetivo (p. ej., ADN de oncogén mutado, ADN fetal, etc.).

Si bien existen múltiples opciones comerciales para la estabilización de los ácidos nucleicos en la sangre entera, las mismas están destinadas a estabilizar el ADN o el ARN, aunque no ambos simultáneamente. Los tubos de recolección específicos para estabilizar el ADN libre circulante incluyen CELL-FREE DNA BCT® (Streck), ccfDNA PAXgene (Qiagen), LBGard (Biomatrica) y Cell-Free DNA (Roche). Se describe que estos tubos evitan la liberación de ADN desde los glóbulos blancos apoptóticos y, por lo tanto, mantienen los niveles de ADN libre circulante del plasma como en el momento de la extracción hasta 7-14 días después de la recolección. Los tubos de recolección destinados al análisis de ARN incluyen PAXgene Blood RNA (Qiagen), RNAGard (Biomatrica) y Tempus Blood RNA (Thermo Sci.). Un inconveniente de los tubos de ARN disponibles es el hecho de que se basan en la lisis completa de la muestra de sangre recolectada y, por lo tanto, un exceso abrumador resultante de transcritos específicos de glóbulos rojos (p. ej., ARNm de Globina a y P). Por lo tanto, se requieren tratamientos de muestra posteriores para agotar el ARN de globina y ribosómico y enriquecer el conjunto de ARNm objetivo informativo. El único tubo de recolección de sangre de ARN sin lisis en el mercado es CELL-FREE RNA BCT® de Streck. Este tubo requiere un rango de uso de temperatura estricto y, más importante, está diseñado solo para la estabilización del ARN. Aún no se ha descrito un tubo de recolección de sangre que estabilice de manera eficiente tanto el ARN como el ADN circulantes. El documento US 20110027771 A1 describe composiciones que estabilizan las células frágiles. El documento US 20100209930 A1 describe métodos para conservar y procesar ácidos nucleicos libres circulantes ubicados dentro de una muestra de sangre.

Sería deseable dar a conocer un dispositivo de recolección y una composición ubicada en el mismo que se base en una formulación anticoagulante que evite la coagulación de la sangre y mantenga el volumen corpuscular medio (MCV) de eritrocitos en un esfuerzo por minimizar la hemólisis. La composición estabilizaría preferiblemente el componente de glóbulos blancos, bloqueando de este modo la liberación y la acumulación excesiva de ADN en el plasma. La composición actuaría además como un protector de eritrocitos que mantiene la integridad estructural de los glóbulos rojos y evita la liberación de vesículas de membrana en función del tiempo de almacenamiento. Esto es fundamental, ya que el ARN circulante o libre circulante está encapsulado en las vesículas de membrana, incluyendo las microvesículas y las vesículas extracelulares (incluyendo, aunque no de forma limitativa, los exosomas). Una composición deseable mantendría la estabilidad e integridad de la muestra durante un mínimo de 6 días en un amplio rango de temperaturas. Idealmente, las concentraciones plasmáticas de ADNlc y vesículas de membrana y, por lo tanto, de ARNlc, se mantendrían sustancialmente como las mismas concentraciones que en el momento de la extracción.

Resumen

La presente descripción da a conocer una composición que mantiene el MCV de eritrocitos, evita sustancialmente la lisis de glóbulos blancos y evita sustancialmente la liberación de vesículas extracelulares de membrana (p. ej., exosomas, ectosomas y similares). Los métodos que se dan a conocer en la presente memoria están destinados a estabilizar los glóbulos blancos y los eritrocitos, evitando de este modo sustancialmente la liberación de ácidos nucleicos y vesículas de membrana desde las células de una muestra biológica. La composición de la presente descripción es particularmente adecuada para su uso como agente de estabilización y regulación de muestras biológicas para el análisis posterior mediante inmunoensayo, reacción en cadena de polimerasa, secuenciación de próxima generación y/u otros.

La composición comprende uno o más componentes capaces de liberar un aldehído, uno o más anticoagulantes o agentes quelantes y uno o más polisacáridos. La composición puede tener un pH de alrededor de 4 a alrededor de 6.

La composición puede incluir una o más aminas. La composición puede incluir una composición de citrato de sodio. La composición puede incluir uno o más donantes de formaldehído. La composición puede incluir ácido etilendiaminotetraacético o una sal del mismo. La composición puede incluir un inhibidor de transcripción. La composición puede incluir una o cualquier combinación de actinomicina D, alfa-amanitina, flavopiridol, DRP (5,6-dicloro-1-|3-D-ribofuranosiMH-bencimidazol) y triptolida. La composición puede incluir formaldehído. La composición puede estar sustancialmente libre de cualquier formaldehído añadido por separado. La composición puede estar sustancialmente libre de ácido etilendiaminotetraacético. La composición puede estar sustancialmente libre de heparina sódica. El polisacárido puede seleccionarse de almidón, celulosa, glucógeno o cualquier combinación de los mismos.

La composición comprende imidazolidinilurea. Otros componentes capaces de liberar un aldehído pueden seleccionarse de diazolidinilurea, 1,3,5-tris(hidroxietil)-s-triazina, oxazolidina, 1,3-bis(hidroximetil)-5,5-dimetilimidazolidin-2,4-diona, cuaternio-15, hidantoína DMDM, 2-bromo-2-nitropropano-1,3-diol, 5-bromo-5-nitro-1,3-dioxano, tris(hidroximetil) nitrometano, hidroximetilglicinato, policuaternio o combinaciones de los mismos. La composición puede incluir imidazolidinilurea y puede estar sustancialmente libre de cualquier otro componente capaz de liberar un aldehído. La composición puede incluir diazolidinilurea. La composición puede incluir tanto imidazolidinilurea como diazolidinilurea. La composición puede incluir 2-bromo-2-nitropropano-1,3-diol.

La composición puede incluir de alrededor del 0,1 % en volumen a alrededor del 1 % en volumen del uno o más polisacáridos. La cantidad de formaldehído presente después de la recolección de la muestra puede ser de alrededor de 10 ppm a alrededor de 10000 ppm.

La amina, si está presente, puede neutralizar el aldehído libre disponible. La estabilidad de la muestra se puede mantener durante un mínimo de 6 días en un rango de temperaturas de alrededor de 4 °C a alrededor de 50 °C. En otras realizaciones, la estabilidad de la muestra se mantiene durante un mínimo de 6 días en un rango de temperaturas de alrededor de 2 °C a alrededor de 50 °C, o de alrededor de 2 °C a alrededor de 37 °C. Las concentraciones plasmáticas de ADNlc y vesículas extracelulares y ARNlc son sustancialmente similares a las concentraciones en el momento de extracción. Es posible mantener el MCV de eritrocitos, se puede evitar sustancialmente la lisis de glóbulos blancos y se puede evitar sustancialmente la liberación de vesículas extracelulares (p. ej., exosomas). Los glóbulos blancos pueden estabilizarse sustancialmente, de modo que el número de exosomas recuperados el día 4 y el día 6, y posiblemente más allá, después de la extracción de sangre es sustancialmente similar a la población de exosomas presentes en el momento de la extracción de sangre. La morfología celular y la expresión de antígeno de superficie pueden mantenerse de modo que se permita el inmunofenotipado de los glóbulos blancos mediante citometría de flujo.

También se puede facilitar la estabilización y el aislamiento de las células tumorales circulantes (CTC) y los restos tumorales. También se facilita el análisis de múltiples componentes dentro de una muestra biológica, especialmente cuando se puede analizar más de un componente sanguíneo para identificar indicadores de la presencia de una afección o enfermedad, la gravedad de una enfermedad o el éxito o el fracaso de un tratamiento para una enfermedad.

La descripción de la presente memoria también da a conocer un método de uso de la composición descrita en la presente memoria para estabilizar los glóbulos blancos y los eritrocitos para evitar sustancialmente la liberación de ácidos nucleicos y vesículas extracelulares desde el interior de las células en una muestra biológica.

La descripción de la presente memoria también da a conocer un método de uso de la composición descrita en la presente memoria, incluyendo como agente de estabilización y regulación de muestras biológicas para el análisis posterior mediante inmunoensayo, reacción en cadena de polimerasa, secuenciación de próxima generación y/u otros. Los métodos descritos en la presente memoria también pueden incluir tratar una única muestra de sangre con la composición y aislar más de uno de ADN, ARN, vesículas extracelulares, células tumorales circulantes, células raras circulantes y proteínas de la muestra.

La descripción de la presente memoria también da a conocer el uso de la composición descrita en la presente memoria para aislar tanto el ADN como el ARN de una muestra de sangre. La descripción de la presente memoria también da a conocer el uso de la composición descrita en la presente memoria para aislar las vesículas extracelulares de una muestra de sangre. La descripción de la presente memoria también da a conocer el uso de la composición descrita en la presente memoria para aislar células tumorales circulantes/restos tumorales.

La invención se refiere a una composición que comprende: (i) un componente capaz de liberar un aldehído; (ii) un anticoagulante que comprende ácido cítrico, citrato trisódico y dextrosa; y (iii) a-ciclodextrina o un derivado funcionalizado de la misma, en donde el componente capaz de liberar un aldehído es imidazolidinilurea. En otras realizaciones, el componente capaz de liberar un aldehído comprende imidazolidinilurea y diazolidinilurea. Según la invención, el anticoagulante es un anticoagulante a base de citrato que comprende citrato y dextrosa. En otras realizaciones, el anticoagulante a base de citrato es anticoagulante citrato dextrosa A (ACD-A), anticoagulante citrato dextrosa B (ACD-B) o citrato-fosfato-dextrosa-adenina (CPDA). En algunas realizaciones, el anticoagulante a base de citrato está presente en una concentración de alrededor del 0,75 % a alrededor del 4 %. En algunas realizaciones, la dextrosa está presente en una concentración de alrededor del 2 % a alrededor del 20 %. En otras realizaciones, la concentración de iones citrato es de alrededor de 200 mM a alrededor de 500 mM. En algunas realizaciones, el ácido cítrico está presente en una concentración de alrededor del 0,5 % a alrededor del 4 %. En otras realizaciones, el citrato trisódico está presente en una concentración de alrededor del 3 % a alrededor del 15 %.

En algunas realizaciones, el componente capaz de liberar un aldehído está presente en una concentración de alrededor del 10 % a alrededor del 40 %. En otras realizaciones, la ciclodextrina es a-ciclodextrina o un derivado funcionalizado de la misma. En algunas realizaciones, la a-ciclodextrina está presente en una concentración de alrededor del 0,75 % a alrededor del 4 %.

En algunas realizaciones, la composición comprende además formaldehído. En otras realizaciones, la composición está libre de formaldehído añadido por separado.

En otras realizaciones, la estabilidad de la muestra se mantiene durante un mínimo de 1 día en un rango de temperaturas de alrededor de 2 °C a alrededor de 37 °C. En algunas realizaciones, la estabilidad de la muestra se mantiene desde alrededor de 1 y hasta 8 días en un rango de temperaturas de alrededor de 2 °C a alrededor de 37 °C.

En algunos aspectos, la descripción da a conocer un método ex vivo para inhibir la lisis de una célula que comprende poner en contacto la célula con una composición de la descripción, en donde la inhibición evita la liberación de ácido nucleico y/o una vesícula extracelular desde la célula. En algunas realizaciones, la célula es un glóbulo blanco. En otras realizaciones, la célula es un glóbulo rojo. En algunas realizaciones, el ácido nucleico es ARN libre circulante (ARNlc), ADN libre circulante (ADNlc), ARN celular o ADN celular. En algunas realizaciones, la lisis se inhibe durante al menos alrededor de 24 horas. En otras realizaciones, la lisis se inhibe durante al menos 2 días, o al menos 3 días, o al menos 4 días. En otras realizaciones adicionales, un método de la descripción comprende además mantener la célula durante al menos alrededor de 24 horas y luego aislar el ácido nucleico de la célula. En algunas realizaciones, la célula se mantiene a temperatura ambiente.

En algunos aspectos, la descripción da a conocer una composición según la descripción para el uso en la estabilización de una célula ex vivo, caracterizada porque el uso comprende poner en contacto la célula con la composición, en donde el contacto evita la liberación de ácido nucleico y/o una vesícula extracelular desde la célula. En algunas realizaciones, la célula es un glóbulo blanco. En otras realizaciones, la célula es un glóbulo rojo. En otras realizaciones adicionales, el ácido nucleico es ARN libre circulante (ARNlc), ADN libre circulante (ADNlc), ARN celular o ADN celular.

Breve descripción de las figuras

La Figura 1 es un gráfico que representa la hemólisis en función del tiempo de almacenamiento de sangre utilizando tres formulaciones distintas a tres temperaturas de almacenamiento diferentes.

La Figura 2 es un gráfico que representa la liberación de exosomas durante el uso de varios anticoagulantes.

La Figura 3 es un gráfico que representa la concentración de ADN en plasma en función del porcentaje de conservante.

La Figura 4A es un gráfico que representa la concentración de ARN en plasma en función del porcentaje de conservante.

La Figura 4B es un gráfico que representa la concentración de ARN en plasma en función del porcentaje de acidodextrina.

La Figura 5A es un gráfico que representa el número de copias de ARNm de ubiquitina B en función del porcentaje de a-cidodextrina.

La Figura 5B es un gráfico que representa el número de copias de ARNm de hemoglobina A en función del porcentaje de a-cidodextrina.

La Figura 6 muestra la concentración total de ARN libre circulante (ARNlc) en función del tiempo de almacenamiento de sangre entera. Se aisló el plasma y se extrajo el ARNlc usando un kit disponible en el mercado (Qiagen, QlAamp Circulating Nucleic Acid Isolation Kit). El ARNlc resultante se cuantificó usando el ensayo Qubit RNA HS (Invitrogen). Los resultados son la media con desviación estándar de 3 donantes sanos.

La Figura 7 muestra el aumento de veces de la concentración de transcrito específico de glóbulos rojos (específico de RBC) Globina A1/2 en función del tiempo de almacenamiento de sangre entera. El ARNlc se aisló como se indica en la descripción de la Figura 6 y más adelante en la presente memoria, se transcribió de forma inversa (Bio-Rad iScript) y se usó en reacciones de PCR digital en gotículas (configuración Bio-Rad QX200) con cebador/sondas disponibles en el mercado (Thermo-Fisher). Los resultados son la media con desviación estándar de 3 donantes sanos.

La Figura 8 muestra el aumento de veces de la concentración de transcrito de Ubiquitina B (expresado por todas las células) en función del tiempo de almacenamiento de sangre entera. El ARNlc se aisló como se indica en la descripción de la Figura 6 y más adelante en la presente memoria, se transcribió de forma inversa (Bio-Rad iScript) y se usó en reacciones de PCR digital en gotículas (configuración Bio-Rad QX200) con cebador/sondas disponibles en el mercado (Thermo-Fisher). Los resultados son la media con desviación estándar de 3 donantes sanos.

Descripción detallada

Las explicaciones e ilustraciones mostradas en la presente memoria están destinadas a familiarizar a otros expertos en la técnica con la descripción, sus principios y su aplicación práctica. Los expertos en la técnica pueden adaptar y aplicar la descripción en sus numerosas formas, según se adapte mejor a los requisitos de un uso particular. El alcance de la descripción debe determinarse con referencia a las reivindicaciones adjuntas, junto con el alcance total de los equivalentes comprendidos en dichas reivindicaciones.

La descripción de la presente memoria se refiere a composiciones para la regulación y la estabilización celular de muestras de sangre que son capaces de mantener niveles basales de las vesículas extracelulares; incluyendo exosomas, microvesículas y cuerpos apoptóticos (en adelante, denominados colectivamente exosomas o vesículas extracelulares). Los niveles basales de exosomas se refieren a la cantidad o concentración de exosomas en una muestra de sangre inmediatamente después de la extracción de sangre. Las vesículas extracelulares transportan ácidos nucleicos, actuando por lo tanto como una envoltura protectora para los ácidos nucleicos libres circulantes. Las cantidades de vesículas extracelulares y los ácidos nucleicos en una muestra de sangre aumentan con el tiempo después de la extracción de sangre debido a la liberación de vesículas tanto desde los glóbulos blancos como los rojos. Las composiciones tratadas en la presente memoria pretenden conservar los componentes individuales, incluyendo las vesículas extracelulares y los ácidos nucleicos, y evitar la lisis celular que hace que el material intracelular salga de las células y contamine cualquier material extracelular presente tras la extracción de sangre. Las composiciones descritas en la presente memoria pueden estabilizar sustancialmente las células sanguíneas, de modo que el número de vesículas extracelulares recuperadas el día 4 y el día 6, y posiblemente más allá, después de la extracción de sangre es sustancialmente similar al de la población de vesículas extracelulares presentes en el momento de la extracción de sangre. Por consiguiente, la concentración de ARN libre circulante (ARNlc), ADN libre circulante (ADNlc), proteínas y otra materia celular ubicada dentro de las vesículas extracelulares (además de algo de materia libre circulante fuera de las vesículas extracelulares), permanece igual el día 4, el día 6, y posiblemente más allá, que en la extracción de sangre. Por lo tanto, las composiciones de la descripción facilitan la estabilización del ARNlc, el ADNlc, las proteínas y otra materia celular ubicada dentro de las vesículas extracelulares, ADN y ARN genómicos y otras especies de ARN (p. ej., ARNm, miARN, ARNpi, ARNip, ARNhc y otros), lo que permite aislar y analizar posteriormente tanto la materia libre circulante como la materia celular (p. ej., el ADN y el ARN del interior de los glóbulos blancos, las células tumorales circulantes (CTC), las células fetales circulantes u otras células circulantes raras). En otras realizaciones, las composiciones de la descripción son útiles para el análisis directo e indirecto de vesículas extracelulares. El análisis de vesículas extracelulares se realiza, por ejemplo, y sin limitación, mediante análisis de citometría de flujo.

Habitualmente, se usan varios componentes químicos en las etapas de recolección de muestras biológicas, tratamiento de muestras biológicas y análisis de muestras biológicas. Sin embargo, muchos de estos componentes conocidos son perjudiciales para los glóbulos blancos, los glóbulos rojos, las células circulantes raras, los ácidos nucleicos, las proteínas o las vesículas extracelulares. Además, muchos de estos componentes pueden combinarse con otros componentes para provocar efectos perjudiciales en los glóbulos blancos, los glóbulos rojos, los ácidos nucleicos, las proteínas, las vesículas extracelulares, las células tumorales circulantes, las células endoteliales circulantes, las células progenitoras circulantes o las células fetales circulantes. Además, adicionalmente, ciertos componentes son beneficiosos en ciertas concentraciones, pero problemáticos en otras por una serie de razones que incluyen el aumento del MCV, la inducción de apoptosis de los glóbulos blancos y el volumen necesario para la eficacia. Como resultado, puede ser extremadamente difícil identificar una combinación de componentes químicos que estabilizarán eficazmente los componentes de la muestra expuestos anteriormente sin efectos perjudiciales.

Los componentes químicos que sirven y/o funcionan como compuestos estabilizantes son sólidos en solución, por lo que su utilidad está limitada por la solubilidad y por la cantidad de dilución que es aceptable para el análisis posterior. Para que muchos componentes químicos se utilicen como estabilizadores eficaces, deberían estar presentes en una cantidad suficiente para estabilizar la muestra. Además, para producir un tubo de extracción directa de sangre, la composición estabilizante debe estar presente en una cantidad muy pequeña, de modo que la mayor parte del tubo se llene con la muestra. Por lo tanto, la cantidad de composición en el tubo es idealmente de alrededor de 0,02 a alrededor de 2 ml. La cantidad de composición en un tubo puede ser de al menos alrededor de 0,5 ml, o incluso de al menos alrededor de 1 ml. La cantidad de composición en un tubo puede ser inferior a alrededor de 3,0 ml, o incluso inferior a alrededor de 2,0 ml.

Con frecuencia, para que un componente químico en particular sea eficaz, debe estar presente en una concentración lo suficientemente alta para ser eficaz. Desafortunadamente, la alta concentración de muchos componentes químicos puede provocar la agregación y/o ruptura de los eritrocitos (como solo un ejemplo), aumentando de este modo el MCV y creando un aumento de la hemólisis, entre otros problemas.

En un esfuerzo por equilibrar estas cuestiones, es necesario identificar los componentes químicos que: (1) pueden ser eficaces en bajas concentraciones para tener en cuenta la necesidad de una cantidad relativamente pequeña de composición; y (2) no reaccionan con otros componentes de manera que dañen los glóbulos blancos, los eritrocitos, otras células circulantes raras, tales como las células tumorales y fetales, los ácidos nucleicos, los exosomas o las proteínas.

Además, las composiciones según la descripción de la presente memoria pueden facilitar el inmunofenotipado de los glóbulos blancos mediante citometría de flujo, ya que la morfología celular y la expresión de antígeno de superficie se mantienen en virtud de las composiciones descritas en la presente memoria. La estabilización y el aislamiento de las células tumorales circulantes y otras células/material circulantes raros (p. ej., células endoteliales circulantes, células progenitoras circulantes, ácidos nucleicos fetales circulantes en la sangre materna) también pueden facilitarse utilizando las composiciones según la presente descripción. También es posible que las composiciones descritas en la presente memoria puedan facilitar el análisis de múltiples componentes dentro de una muestra biológica, especialmente cuando se puede analizar más de un componente sanguíneo para identificar los indicadores de la presencia de una afección o enfermedad, la gravedad de una enfermedad o el éxito o el fracaso de un tratamiento para una enfermedad. A título de ejemplo no limitativo, puede ser posible aislar las CTC estabilizadas con las composiciones descritas en la presente memoria usando aislamiento mecánico. Este proceso puede ir seguido de centrifugación de cualquier muestra restante para recolectar plasma y, posteriormente, aislar los exosomas (que pueden incluir ARN) y/o el ADN libre circulante de la muestra. Alternativamente, se puede aislar primero el plasma, seguido del aislamiento de las CTC y los WBC de la capa leucocitaria. A partir de la muestra celular restante, se pueden aislar y analizar las proteínas, el ADN y el ARN obtenidos a partir de la población restante de glóbulos blancos o a partir de otras poblaciones de células raras, incluidas las CTC. El análisis proteómico también puede facilitarse en muestras tratadas con las composiciones descritas en la presente memoria. Por lo tanto, las composiciones descritas en la presente memoria pueden facilitar la capacidad de análisis usando una única muestra, lo que va mucho más allá de lo que se entiende como posible en la actualidad. La capacidad de las composiciones de la presente memoria de evitar sustancialmente la hemólisis, estabilizar los exosomas y el ARN libre circulante asociado, estabilizar el ADN libre circulante y estabilizar las proteínas hace posible dicho análisis en múltiples etapas.

La hemólisis es un problema común, específicamente en lo que respecta a las muestras de sangre. La hemólisis puede ocurrir durante uno o más de los siguientes: la recolección de muestras, el transporte de muestras, el almacenamiento de muestras y también durante cualquier tratamiento posterior de la muestra. La lisis de los eritrocitos (p. ej., la hemólisis) puede provocar una serie de desafíos en el análisis de los componentes celulares y, por lo tanto, la calidad del análisis mejora a medida que se reduce la hemólisis. Muchos tubos de recolección de sangre comprenden ácido etilendiaminotetraacético (EDTA). Si bien se ha descubierto que el EDTA reduce la hemólisis en cierta medida, los resultados de las pruebas que se identifican en la presente memoria (véase, por ejemplo, la Figura 1) demuestran que la cantidad de hemólisis realmente puede reducirse mediante una selección cuidadosa del anticoagulante correcto. Existen muchos anticoagulantes que incluyen, aunque no de forma limitativa, los basados en EDTA, los basados en heparina, los basados en oxalato y los basados en citrato. Las composiciones de la presente memoria, en diversos aspectos, se basan en un tipo específico de anticoagulante a base de citrato (p. ej., el anticoagulante citrato dextrosa A o ACD-A) debido a su doble capacidad de presentar una hemólisis reducida y estabilizar la membrana de los glóbulos rojos. El volumen corpuscular medio (MCV) de eritrocitos puede reducirse o estabilizarse con ciertos anticoagulantes a base de citrato, específicamente, ACD-A y ACD-B. Tanto el ACD-A como el ACD-B comprenden ácido cítrico, citrato trisódico y dextrosa. El ACD en la solución A se concentra en 8,5 mililitros de sangre, mientras que el ACD en la solución B se concentra en 6 mililitros de sangre. La molaridad del citrato utilizado para las composiciones de la presente memoria es preferiblemente de alrededor de 0,05 M a alrededor de 0,2 M. La molaridad del citrato utilizado para las composiciones de la presente memoria puede ser de aproximadamente 0,11 M. Las composiciones restantes para formar las composiciones descritas en la presente memoria pueden diluirse para tener una molaridad final de alrededor de 0,0025 M a alrededor de 0,1 M.

El deseo de reducir la hemólisis también puede requerir la identificación de un agente conservante que no conduzca a (o minimice) la lisis de las células eritrocíticas. Es posible que ciertos agentes conservantes puedan aumentar la aparición de la lisis de los eritrocitos y, por lo tanto, pueden no ser los conservantes preferidos para su inclusión en las composiciones descritas en la presente memoria.

La concentración del agente conservante se puede seleccionar de modo que se minimice la lisis de los glóbulos blancos. La lisis de los glóbulos blancos depende del tiempo, y la mayoría de las muestras eventualmente experimentarán alguna lisis de los glóbulos blancos, de modo que la cantidad de agente conservante debería ser suficiente para minimizar, si no eliminar, la lisis de los glóbulos blancos durante el período de tiempo entre la extracción de la sangre y el momento en que las muestras se tratan para aislar los componentes de la muestra (p. ej., de 24 horas a una semana, y posiblemente más allá). Por lo tanto, la concentración del conservante en la composición (antes de la extracción de la sangre) puede ser de alrededor del 0,25 % a alrededor del 2 %. La concentración puede ser de alrededor del 2,5 % a alrededor del 10 %. La concentración puede ser de alrededor del 4 % a alrededor del 7 %. La concentración puede ser de alrededor del 2,5 % a alrededor del 50 %. La concentración puede ser de alrededor del 2 % a alrededor del 100 %.

La concentración de cualquier amina, si está presente, es probable que dependa directamente de la concentración del agente conservante. En esencia, la presencia de la amina puede actuar para unirse químicamente a un componente molecular dentro del agente conservante. Por lo tanto, puede ser preferible que exista una presencia suficiente de amina en la composición para que todo el componente de agente conservante que está libre y es reactivo con la amina reaccione suficientemente y, por lo tanto, se vuelva no reactivo dentro de la muestra. Dicha actividad de unión molecular puede reducir la presencia del componente (que puede ser formaldehído), reduciendo así cualquier efecto perjudicial que el formaldehído libre reactivo pueda tener sobre los componentes de la muestra que deben aislarse y analizarse. Por lo tanto, la concentración de la amina en la composición (antes de la extracción de sangre) puede ser de alrededor del 0,01 % a alrededor del 0,2 %. La concentración puede ser de alrededor del 0,03 % a alrededor del 0,1 %. La concentración puede ser de alrededor del 0,05 % a alrededor del 0,09 %. La concentración puede ser de alrededor del 0,75 % a alrededor del 3,75 %.

En un esfuerzo por estabilizar y/o proteger la concentración de exosomas y, al mismo tiempo, minimizar la lisis de los glóbulos blancos y la lisis de los eritrocitos, muchas sustancias químicas usadas tradicionalmente en la recolección y el análisis de muestras biológicas interactuarán con una muestra de manera que se dañarán los exosomas, aumentará la lisis de los glóbulos blancos o aumentará la lisis de los eritrocitos. Muchos productos químicos tradicionales interfieren con el aislamiento real de los exosomas y los ácidos nucleicos, mientras que otros conducen a un aumento de la hemólisis. Además, las concentraciones de algunos productos químicos tienen diferentes efectos a diferentes niveles. Por ejemplo, es conocido que ciertos polisacáridos que se utilizan en las composiciones descritas en la presente memoria aumentan la hemólisis; sin embargo, se descubrió que, en ciertas concentraciones más bajas, los mismos actúan para reducir la lisis de los eritrocitos.

Las composiciones de la presente memoria también pueden incluir uno o más inhibidores de transcripción. Normalmente, las composiciones para estabilizar muestras biológicas incluyen inhibidores de nucleasa, metabólicos y/o de proteasa para bloquear la degradación de los ácidos nucleicos y/o los cambios en sus concentraciones relativas (p. ej., la expresión génica). Sin embargo, la descripción de la presente memoria, al menos en parte, se enfoca en incorporar el uso de inhibidores de transcripción, ya que la intención de la formulación es conservar los niveles basales de ARN. Los glóbulos blancos (y otras células circulantes raras) se someterán a una señalización celular después de la extracción de sangre, alterando el perfil de expresión génica del ARN. En tan solo 2 horas después de la extracción, se altera el perfil de ARN. Para obtener resultados significativos, es necesario mantener los perfiles de ARN basales (en el momento de la extracción o cerca del mismo) para identificar objetivos viables. Para ello, no solo es necesario bloquear la degradación del ARN, sino que es fundamental inhibir los nuevos transcritos de ARN (incluyendo ARNm, microARN, ARNInc, ARNpi, ARNY, ARNcirc y otros ARNnc).

Es posible que, en un esfuerzo por evitar la lisis de los eritrocitos, las composiciones según la descripción de la presente memoria puedan ayudar a evitar sustancialmente cualquier cambio en el tamaño de los eritrocitos. También es posible que esto sea aplicable en el caso de los glóbulos blancos. La capacidad de las composiciones descritas en la presente memoria de mantener el tamaño de los glóbulos rojos y blancos puede contribuir a la capacidad de evitar sustancialmente la lisis de los glóbulos rojos y blancos, evitando así la hemólisis y evitando la liberación de ácidos nucleicos genómicos de fondo en la muestra después de la extracción de sangre.

Las composiciones descritas en la presente memoria pueden actuar además para conservar los ácidos nucleicos independientemente del origen. Como ejemplo, las composiciones descritas en la presente memoria pueden ser capaces de estabilizar el ARN de origen plaquetario. Las plaquetas contienen cantidades significativas de especies importantes de ARN, tales como ARNm, miARN y ARNcirc, y cada vez hay más pruebas de que los patrones de expresión del ARNm de plaquetas se alteran en las enfermedades humanas. Por lo tanto, una ventaja de las composiciones descritas en la presente memoria es que el ARNm de origen plaquetario puede analizarse por aislamiento con ARN de otros orígenes.

Es posible que uno o más componentes de las composiciones descritas en la presente memoria sean eficaces con más de una faceta de la estabilización de la muestra. A título de ejemplo, es posible que el polisacárido descrito en la presente memoria pueda actuar para conservar la integridad de las vesículas extracelulares (y, por lo tanto, del ARN ubicado en las mismas) y también pueda actuar para reducir la lisis de los eritrocitos. Se consideraron ciertos componentes (incluyendo una variedad de disacáridos), pero causaron o no permitieron mitigar la hemólisis de manera eficaz.

La presente descripción se refiere en general a un método para conservar una muestra biológica que contiene sangre u otro material biológico. Las composiciones descritas en la presente memoria pueden contener uno o más agentes conservantes, uno o más anticoagulantes o agentes quelantes, uno o más polisacáridos, una o más aminas y uno o más inhibidores de transcripción y uno o más inhibidores de ribonucleasa. Es posible que la composición incluya dos o más, tres o más, cuatro o más o incluso todos estos componentes.

El componente conservante capaz de liberar un aldehído usado en las composiciones según la invención es la imidazolidinilurea. Otros agentes conservantes pueden seleccionarse de diazolidinilurea, 1,3,5-tris(hidroxietil)-striazina, oxazolidina, 1,3-bis(hidroximetil)-5,5-dimetilimidazolidin-2,4-diona, cuaternio-15, hidantoína DMDM, 2-bromo-2-nitropropano-1,3-diol, 5-bromo-5-nitro-1,3-dioxano, tris(hidroximetil) nitrometano, hidroximetilglicinato, policuaternio o combinaciones de los mismos. El conservante puede incluir una mezcla de imidazolidinilurea y diazolidinilurea. El conservante puede incluir imidazolidinilurea y puede estar libre de cualquier otro agente conservante. El conservante puede incluir oxazolidina. El conservante puede incluir una mezcla de compuestos de oxazolidina. El conservante puede incluir una composición de oxazolidinas bicíclicas. El conservante puede incluir triazina.

El conservante puede seleccionarse de modo que al menos una porción de un aldehído (que puede ser formaldehído) se vuelva reactiva cuando se pone en contacto con una muestra biológica. Sin embargo, la cantidad de formaldehído presente (antes o después de la recolección de la muestra) debe ser lo suficientemente baja para evitar dañar cualquier ácido nucleico, vesícula extracelular o proteína presente en la muestra biológica. La liberación de formaldehído puede provocar un aumento del pH de la composición y/o la composición y la muestra combinadas. En un esfuerzo por controlar el pH de la composición y/o la combinación de composición y muestra, el formaldehído puede liberarse de manera controlada. La composición y/o la muestra pueden ponerse en contacto con un componente para provocar la liberación de formaldehído a lo largo del tiempo de una manera predeterminada. El formaldehído puede encapsularse como se describe en la presente memoria para permitir la liberación y/o la liberación controlada del formaldehído. También es posible que la composición y/o la composición y la muestra combinadas se expongan a una temperatura elevada (p. ej., una temperatura por encima de la temperatura ambiente), de tal modo que el aumento de temperatura provoque la liberación o el aumento de la liberación de formaldehído (y, por lo tanto, un aumento del pH). Alternativamente, el formaldehído puede liberarse inmediatamente tras el contacto de un liberador de formaldehído con la composición. El formaldehído puede liberarse tras el contacto de la composición con una muestra. El liberador de formaldehído puede seleccionarse de tal modo que el formaldehído se libere inherentemente con el tiempo, sin necesidad de encapsular el formaldehído o tratar la composición de alguna manera para permitir una liberación controlada.

La composición y/o la muestra y la composición pueden incluir además uno o más subproductos de los componentes incluidos dentro de un tubo estabilizante según la descripción de la presente memoria. Uno o más de estos subproductos pueden incluir un aldehído. Uno o más de los subproductos pueden incluir una urea. Se pueden seleccionar uno o más subproductos entre alantoína, (4-hidroximetil-2,5-dioxo-imidazolidin-4-il)-urea, (3,4-bishidroximetil-2,5-dioxo-imidazolidin-4-il)-urea y (3-hidroximetil-2,5-dioxo-imidazolidin-4-il)-urea.

Cualquier aldehído presente antes o después de la recolección de muestras puede estar en una cantidad inferior a 40 000 ppm, inferior a 30000 ppm, inferior a 20000 ppm o incluso inferior a 10000 ppm. Teniendo esto en cuenta, es posible la presencia de algo de formaldehído para reticular y estabilizar eficazmente uno o más de los glóbulos blancos y/o eritrocitos. Por lo tanto, el formaldehído puede estar presente en una cantidad de al menos 2000 ppm, al menos 5000 ppm o incluso al menos 10 000 ppm. Es posible que la cantidad de formaldehído libre en la composición antes del contacto con una muestra sea de hasta alrededor del 0,5 por ciento en peso, hasta alrededor del 1,0 por ciento en peso, hasta alrededor del 2 por ciento en peso o incluso hasta alrededor del 3 por ciento en peso de la composición. La composición puede contener menos de alrededor de 20 partes por millón (ppm) de un aldehído. La composición puede contener menos de alrededor de 15 ppm de un aldehído. La composición puede contener menos de alrededor de 10 ppm de un aldehído. La composición puede contener menos de alrededor de 5 ppm de un aldehído. La composición puede contener al menos alrededor de 0,1 ppm a alrededor de 20 ppm de un aldehído. La composición puede contener al menos alrededor de 0,5 ppm a alrededor de 15 ppm de un aldehído. La composición puede contener al menos alrededor de 1 ppm a alrededor de 10 ppm de un aldehído.

El conservante puede tener un pH de al menos alrededor de 4, al menos alrededor de 5 o incluso al menos alrededor de 6. El conservante puede tener un pH inferior a 8, inferior a 7 o inferior a 6. El conservante puede tener un pH de alrededor de 4 a alrededor de 6. El conservante puede tener un peso molecular de al menos alrededor de 20 g/mol, al menos alrededor de 50 g/mol o incluso al menos alrededor de 80 g/mol. El conservante puede tener un peso molecular inferior a alrededor de 500 g/mol, inferior a alrededor de 400 g/mol o inferior a alrededor de 300 g/mol.

El uno o más agentes conservantes pueden estar presentes en la composición en una concentración de alrededor del 0,5 % a alrededor del 5,0 % en volumen. El uno o más agentes conservantes pueden estar presentes en la composición en una concentración de alrededor del 0,5 % a alrededor del 1,0 % en volumen. El uno o más agentes conservantes pueden estar presentes en la composición en una concentración de alrededor del 5 % en volumen. El uno o más agentes conservantes pueden estar presentes en la composición en una concentración de alrededor del 2,5 % en volumen.

El pH de la composición puede variar antes del contacto con una muestra y después del contacto con una muestra. La composición puede incluir uno o más ingredientes para hacer que el pH de la composición varíe (antes del contacto con la muestra) desde al menos alrededor de 3, al menos alrededor de 4, al menos alrededor de 5, hasta por debajo de alrededor de 11, por debajo de alrededor de 10 o incluso por debajo de alrededor de 9. Por ejemplo, el pH de la composición antes del contacto con una muestra puede ser de 3 a alrededor de 6. La composición puede incluir uno o más agentes que son responsables de provocar la liberación de un compuesto ácido al entrar en contacto con una muestra. El pH de la muestra y la composición combinadas puede ser de al menos alrededor de 5, al menos alrededor de 6 o incluso al menos alrededor de 7. El pH de la muestra y la composición combinadas puede estar por debajo de alrededor de 10, por debajo de alrededor de 9 o incluso por debajo de alrededor de 8.

La una o más aminas pueden seleccionarse de una o más de triptófano, tirosina, fenilalanina, glicina, ornitina y S-adenosilmetionina, aspartato, glutamina, alanina, arginina, cisteína, ácido glutámico, glutamina, histidina, leucina, lisina, prolina, serina, treonina o combinaciones de las mismas. La una o más aminas se pueden seleccionar en función de sus capacidades reactivas. A título de ejemplo no limitativo, es posible que la una o más aminas sean agentes reactivos de aldehído. Por ejemplo, el agente reactivo de aldehído puede seleccionarse de uno o cualquier combinación de tris, lisina, glicina, urea o un derivado (p. ej., una sal y/o un éster) de uno o ambos. El agente reactivo de aldehído se puede seleccionar para que reaccione con cualquier formaldehído libre que pueda estar presente antes o después de la recolección de la muestra. La concentración de las aminas en la composición (antes de la extracción de la sangre) puede ser de alrededor del 0,25 % a alrededor del 1,5 %. La concentración puede ser de alrededor del 0,3 % a alrededor del 0,8 %. La concentración puede ser de alrededor del 0,4 % a alrededor del 0,7 %.

El anticoagulante usado en las composiciones según la invención comprende ácido cítrico, citrato trisódico y dextrosa. Otros anticoagulantes o agentes quelantes pueden seleccionarse del grupo que consiste en ácido etilendiaminotetraacético (EDTA) y sus sales, ácido etilenglicoltetraacético (EGTA) y sus sales, hirudina, heparina, sales de ácido cítrico, ácido oxálico, sales de ácido oxálico, ácido citrato dextrosa (ACD), citrato, citrato-teofilinaadenosina-dipuridamol (CTAD), citrato-piridoxalfosfato-tris, heparina-p-hidroxietil-teofilina, polianetol sulfonato, fluoruro de sodio, heparina sódica, trombina y PPACK (D-fenilalanil-L-prolil-L-arginina clorometil cetona y cualquier combinación de los mismos. Por lo tanto, la concentración del anticoagulante en la composición (antes de la extracción de sangre) puede ser de alrededor del 2,5 % a alrededor del 10 %. La concentración puede ser de alrededor del 3 % a alrededor del 8 %. La concentración puede ser de alrededor del 4 % a alrededor del 7 %.

El polisacárido usado en las composiciones según la invención es la a-ciclodextrina. Es posible seleccionar polisacáridos adicionales de almidón, celulosa, glucógeno o combinaciones de los mismos. El uno o más polisacáridos pueden actuar como agentes protectores de eritrocitos. El uno o más polisacáridos pueden ayudar a estabilizar las membranas de los eritrocitos, de tal modo que la lisis celular se ralentice, minimice, se evite sustancialmente o alguna combinación de lo anteriormente descrito. La concentración de los polisacáridos en la composición (antes de la extracción de sangre) puede ser de alrededor del 0,001 % a alrededor del 5,0 %. La concentración puede ser de alrededor del 0,02 % a alrededor del 3,0 %. La concentración puede ser de alrededor del 0,5 % a alrededor del 2,0 %.

El uno o más inhibidores de transcripción pueden seleccionarse para promover la estabilidad de uno o más componentes dentro de una muestra. El uno o más inhibidores de transcripción pueden seleccionarse de actinomicina D, a-amanitina, triptólido, 5,6-dicloro-1-p-D-ribofuranosilbencimidazol (DRB), flavopiridol o cualquier combinación de los mismos. La concentración puede ser de alrededor de 0,5 |jM a alrededor de 500 |jM.

El tubo de recolección de sangre de muestra puede incluir uno o más inhibidores enzimáticos. El uno o más inhibidores enzimáticos pueden seleccionarse del grupo que consiste en: pirocarbonato de dietilo, etanol, ácido aurintricarboxílico (ATA), gliceraldehídos, fluoruro de sodio, ácido etilendiaminotetraacético (EDTA), formamida, complejos de vanadil-ribonucleósidos, macaloide, heparina, hidroxilamina-oxígeno-ion cúprico, bentonita, sulfato de amonio, ditiotreitol (DTT), beta-mercaptoetanol, cisteína, ditioeritritol, clorhidrato de tris(2-carboxietil) fosfeno, un catión divalente, tal como Mg+2, Mn+2, Zn+2, Fe+2, Ca+2, Cu+2 y cualquier combinación de los mismos.

El tubo de recolección de sangre de muestra puede incluir uno o más inhibidores metabólicos. El uno o más inhibidores metabólicos pueden seleccionarse del grupo que consiste en: gliceraldehído, fosfato de dihidroxiacetona, gliceraldehído 3-fosfato, 1,3-bisfosfoglicerato, 3-fosfoglicerato, 2-fosfoglicerato, fosfoenolpiruvato, dihidroxiacetato de piruvato y glicerato, fluoruro de sodio, K2C2O4 y cualquier combinación de los mismos.

El tubo de recolección de sangre de muestra puede incluir uno o más inhibidores de proteasa. El uno o más inhibidores de proteasa pueden seleccionarse del grupo que consiste en: analgésico, aprotinina, quimostatina, elastatinal, fluoruro de fenilmetilsulfonilo (PMSF), APMS<f>, TLCK, TPCK, leupeptina, inhibidor de tripsina de soja, ácido indoleacético (IAA), E-64, pepstatina, VdLPFFVdL, EDTA, 1,10-fenantrolina, fosforamodón, amastatina, bestatina, diprotina A, diprotina B, alfa-2-macroglobulina, inhibidor de tripsina de frijol de lima, inhibidor de proteasa pancreática, ovostatina de clara de huevo, cistatina de clara de huevo, doxiciclina, sulfasalazina, curcumina, homocisteína, ácido 6-aminocaproico, doxiciclina, minaciclina HCl, nicotinamida, quitosano, lisina, gliceraldehído, ácido fítico, b-sitoserol, C-AMP, polilisina de MW bajo, biochanina A, sulfasalazina, demeclociclina, clortetraciclina, oxitetraciclina, ciclohexamida, rifampicina, leche de soja, suramina, ácido N-butírico, penicilamina, N-acetil cisteína, benzamidina, AEBSF y cualquier combinación de los mismos. El agente protector puede incluir un inhibidor de fosfatasa seleccionado del grupo que consiste en: caliculina A, nodularina, NIPP-1, microcistina LR, tautomicina, ácido okadaico, cantaridina, microcistina LR, ácido okadaico, fostriecina, tautomicina, cantaridina, endotal, nodularina, ciclosporina A, FK 506/complejos de inmunofilina, cipermetrina, deltametrina, fenvalerato, bpV(fen), defostatina, mPV(pic) DMHV, ortovanadato de sodio y cualquier combinación de los mismos.

El tubo de recolección de sangre de muestra puede incluir uno o más inhibidores de nucleasa. El uno o más inhibidores de nucleasa pueden seleccionarse del grupo que consiste en: pirocarbonato de dietilo, etanol, ácido aurintricarboxílico (ATA), formamida, complejos de vanadil-ribonucleósido, macaloide, ácido etilendiaminotetraacético (EDTA), proteinasa K, heparina, hidroxilamina-oxígeno-ion cúprico, bentonita, sulfato de amonio, ditiotreitol (DTT), beta-mercaptoetanol, cisteína, ditioeritritol, clorhidrato de tris(2-carboxietil) fosfeno, un catión divalente, tal como Mg+2, Mn+2, Zn+2, Fe+2, Ca+2, Cu+2 y cualquier combinación de los mismos.

El tubo de recolección de sangre de muestra puede incluir uno o más inhibidores de fosfatasa. El uno o más inhibidores de fosfatasa pueden seleccionarse del grupo que consiste en: caliculina A, nodularina, NIPP-1, microcistina LR, tautomicina, ácido okadaico, cantaridina, imidazol, microcistina LR, ácido okadaico, fostriecina, tautomicina, cantaridina, endotal, nodularina, ciclosporina A, FK 506/complejos de inmunofilina, cipermetrina, deltametrina, fenvalerato, bpV(fen), defostatina, mpV(pic) DMHV, ortovanadato de sodio y cualesquiera combinaciones de los mismos.

El tubo de recolección de sangre de muestra puede incluir oxazolidinas bicíclicas, hidantoína DMDM, hidroximetilglicinato de sodio, cloruro de cloroalilo de hexametilentetramina, biocidas, una sal de zinc soluble en agua o cualquier combinación de los mismos. El tubo de recolección de sangre de muestra puede incluir un ácido poliacrílico o un ácido adecuado que tenga un pH que oscile de alrededor de uno a alrededor de siete. El tubo de recolección de sangre de muestra puede incluir aminas, aminoácidos, alquilaminas, poliaminas, aminas primarias, aminas secundarias, sales de amonio o cualquier combinación de los mismos. El tubo de recolección de sangre de muestra puede incluir una o más aminas primarias. El tubo de recolección de sangre de muestra puede incluir una o más amidas (p. ej., butanamida). El tubo de recolección de muestras puede incluir uno más inhibidores de apoptosis. El tubo de recolección de muestras puede incluir uno o más inhibidores de caspasa.

El tubo de recolección de sangre de muestra puede incluir uno o más ingredientes poliméricos. Los polímeros pueden incluir, aunque no de forma limitativa, lo siguiente: polivinilpirrolidona (PVP), polietilenglicol (PEG) y ciclodextrina.

Las composiciones descritas en la presente memoria también pueden incluir componentes adicionales, que incluyen uno o más de lo siguiente: doxiciclina, polietilenglicol, sulfasalazina, polivinilpirrolidona, curcumina, gluconato de magnesio, homocisteína, metilcelulosa (MC), ácido 6-aminocaproico, etilcelulosa, aprotinina, hidroxietilcelulosa, doxiciclina, hidroxipropilcelulosa, minociclina HCl, dextrina, nicotinamida, dextrano, quitosano, óxido de polietileno, lisina, polietil oxazolina, gliceraldehído, Ficolls, ácido fítico, a-ciclodextrina, b-sitoserol, p-ciclodextrina, C-AMP, Y-ciclodextrina, polilisina, gelatinas, biochanina A, azúcares (p. ej., sacarosa, manitol, lactosa, trehalosa), sulfasalazina, hidroxipropilmetilcelulosa, demeclociclina, hidroxietilmetilcelulosa, clortetraciclina, oxitetraciclina, ciclohexamida, rifampicina, leche de soja, inhibidor de proteasa a base de soja, suramina, ácido N-butírico, penicilamina, N-acetilcisteína, benzamidina, AEBSF, alfa-2 macroglobulina o combinaciones de los mismos. Se contempla que uno o más de los compuestos anteriores puedan sustituirse por ciclodextrina en una composición de la descripción.

El tubo de recolección de muestras puede incluir uno o más agentes tensoactivos. El uno o más agentes tensoactivos son DMSO (dimetilsulfóxido), etilenglicol, polietilenglicol, glicerina, Cellosolves (éter dimetílico de etilenglicol) (fenoxietanol), Triton X 100, Triton X 705 (detergentes no iónicos), 1 -metil-2-pirrolidinona, Tween 20, Tween 40 (no iónico), Brij 35 (detergente), éter de polioxietileno (Polyox), colato de sodio, polímeros de óxido de etileno, monensina, monactina, pentaclorofenol, 2,4 dinitrofenol, saponina, SDS (dodecilsulfato de sodio) o una combinación de los mismos. En la presente memoria se contempla que los efectos de los agentes tensoactivos anteriores dependan de la concentración. Por ejemplo, y sin limitación, se contempla que, en algunas realizaciones, concentraciones más bajas de los agentes tensoactivos anteriores sean útiles para inhibir la lisis de una célula al poner en contacto la célula con una composición de la descripción, en donde la inhibición evita la liberación de ácido nucleico y/o una vesícula extracelular desde la célula.

El tubo de recolección de muestras puede incluir proteínas, tales como: biotina, albúminas (huevo, bovina), gelatina y compuestos de este tipo similares. El tubo de recolección de muestras puede incluir inhibidores de ARNasa, tales como: inhibidor de ARNasa derivado de placenta humana y compuestos de este tipo similares. El tubo de recolección de muestras puede incluir estabilizadores de ácidos nucleicos, tales como: clorhidrato de guanidinio, policationes, tales como polietilenimina, y compuestos de este tipo similares. El tubo de recolección de muestras puede incluir aminoácidos/polipéptidos, tales como: ácido glutámico, glicina, ácido aspártico, y compuestos de este tipo similares. El tubo de recolección de muestras puede incluir fijadores, tales como: aldehídos (formaldehído y glutaraldehído), alcoholes (etanol, metanol) y compuestos de este tipo similares. El tubo de recolección de muestras puede incluir anticoagulantes, tales como: EDTA (ácido etilendiaminotetraacético) y compuestos de este tipo similares. El tubo de recolección de muestras puede incluir ACD (ácido citrato dextrosa), heparina y compuestos de este tipo similares. El tubo de recolección de muestras puede incluir inhibidores de proteasa, tales como: EDTA, PMSF (fluoruro de fenilmetilsulfonilo), AEBSF (fluoruro de 2-aminoetil bencenosulfonilo) y compuestos de este tipo similares. El tubo de recolección de muestras puede incluir agentes antioxidantes/reductores, tales como: Trolox, atocoferol, B-mercaptoetanol y compuestos de este tipo similares. El tubo de recolección de muestras puede incluir colorantes de ácidos nucleicos, tales como: DAPI (diamidino 2-fenilindol), yoduro de propidio, diacetato de fluoresceína y compuestos de este tipo similares. El tubo de recolección de muestras puede incluir carbohidratos, tales como: azúcares (sacarosa), celulosa y compuestos de este tipo similares. Debe apreciarse que los anteriores compuestos específicos pueden contener una medida de superposición, que reconoce la función en ocasiones superpuesta de ciertos compuestos específicos. Un experto en la técnica debe entender y apreciar este aspecto de la descripción.

El agente reactivo de aldehído puede estar presente en una relación (en peso) con respecto al conservante de alrededor de 1:20 a alrededor de 1:1. El agente reactivo de aldehído puede estar presente en una relación (en peso) con respecto al anticoagulante de alrededor de 1:25 a alrededor de 5:1. El conservante puede estar presente en una relación (en peso) con respecto al anticoagulante de alrededor de 1:10 a alrededor de 15:1.

Uno o más de los componentes de la composición pueden ser en forma de gel, en forma líquida, en forma sólida o en alguna combinación de las mismas. Uno o más de los componentes de la composición pueden ser en partículas y/o pueden formar una película en una pared de un recipiente de recolección de muestras y/o un recipiente de análisis de muestras. Uno o más de los componentes pueden liofilizarse y luego pulverizarse en una o más partes del recipiente de recolección de muestras. Uno o más de los componentes dentro de la composición pueden encapsularse dentro de un encapsulante. El encapsulante puede seleccionarse para descomponerse o exponer de otro modo el material encapsulado al entrar en contacto con una muestra, suministrando así el material dentro del encapsulante a la muestra. La composición puede incluir un componente inactivo, tal como un tampón o agua.

El uno o más agentes conservantes pueden estar presentes en la composición en una concentración de alrededor del 0,5 % a alrededor del 5,0 % en volumen. El uno o más agentes conservantes pueden estar presentes en la composición en una concentración de alrededor del 0,5 % a alrededor del 1,0 % en volumen. El uno o más agentes conservantes pueden estar presentes en la composición en una concentración de alrededor del 0,5 % en volumen. El uno o más agentes conservantes pueden estar presentes en la composición en una concentración de alrededor del 0,75 % en volumen. El uno o más agentes conservantes pueden estar presentes en la composición en una concentración de alrededor del 1 % en volumen. El uno o más agentes conservantes pueden estar presentes en la composición en una concentración de alrededor del 2,5 % en volumen. El uno o más agentes conservantes pueden estar presentes en la composición en una concentración de alrededor del 5 % en volumen.

La composición puede estar sustancialmente libre de detergentes y agentes caotrópicos y de cualquiera o más sustancias que provocan la lisis de RBC, WBC, plaquetas y otras células circulantes raras. La composición puede estar sustancialmente libre de cualquiera o más de las sustancias que provocan la activación celular y la posterior liberación de vesículas de membrana, incluyendo ionóforos de calcio y fármacos quimioterapéuticos. La composición puede estar sustancialmente libre de cualquiera o más de las sustancias que provocan la hemólisis de r Bc y un aumento de MCV de RBC, incluyendo fármacos contra la malaria, nitritos y metales pesados. La composición puede estar sustancialmente libre de cualquiera o más de las sustancias que provocan una inhibición de PCR posterior, incluyendo heparina anticoagulante, iones de calcio, hemo y hemoglobina. La composición puede estar sustancialmente libre de cualquiera o más de las sustancias que provocan coagulación, incluyendo trombina, iones de calcio, sílice y celita. La composición también puede estar sustancialmente libre de uno o más de tampón tris, albúmina de suero bovino, polisorbato 20, azida sódica, cloruro sódico, separador de suero, activador de coágulos y gentamicina.

La muestra biológica puede estabilizarse durante un período de al menos tres días. La muestra biológica puede estabilizarse durante un período de al menos cinco días. La muestra biológica puede estabilizarse durante un período de al menos siete días. Preferiblemente, la degradación de la hemoglobina de una muestra biológica que incluye material sanguíneo se estabiliza durante un período de al menos 5 días.

Las composiciones descritas en la presente memoria pueden utilizarse en un método ex vivo que puede incluir una etapa de manipular la muestra biológica, mientras permanece suspendida en la composición, para su suministro a una ubicación remota en donde se realizará un análisis del material sanguíneo. El método puede incluir el transporte (p. ej., el envío) de la muestra biológica, mientras permanece suspendida en la composición, para su suministro a una ubicación en donde se realizará un análisis del material sanguíneo. El método puede incluir exponer la muestra durante la manipulación y/o el transporte a fluctuaciones de temperatura. Por ejemplo, dicha exposición puede ser a temperaturas de alrededor de 4 °C a alrededor de 37 °C, o de alrededor de 2 °C a alrededor de 37 °C. El método puede incluir exponer la muestra durante la manipulación y/o el transporte a temperaturas de hasta 37 °C. La ubicación remota puede ser una ubicación en donde se va a realizar cualquier análisis posterior del material sanguíneo. La ubicación puede ser una ubicación en donde se va a realizar un inmunoensayo o un análisis de ácidos nucleicos del material sanguíneo.

La composición y/o la muestra pueden ubicarse en un recipiente para muestras. El recipiente para muestras puede contener la composición o la composición combinada con una muestra en una cantidad de al menos 0,5 ml, al menos 1 ml, al menos 3 ml, al menos 5 ml, al menos 10 ml o incluso al menos 20 ml. El recipiente para muestras puede contener la composición o la composición combinada con una muestra en una cantidad inferior a 150 ml, inferior a 100 ml, inferior a 50 ml o incluso inferior a 20 ml. Las composiciones descritas en la presente memoria pueden estar presentes en un tubo de extracción directa de sangre. Las composiciones descritas en la presente memoria pueden ubicarse en cualquier dispositivo para recolectar una muestra biológica. Las composiciones descritas en la presente memoria pueden ubicarse en un recipiente receptor de muestras antes de la adición de la muestra o pueden agregarse a la muestra después de la recolección.

El recipiente para muestras puede ser un tubo. El recipiente para muestras puede ser cilíndrico. El recipiente para muestras puede ser de vidrio o puede ser polimérico. El recipiente para muestras puede tener un revestimiento de barrera que puede ser un revestimiento por deposición de vapor de plasma mejorado químicamente, tal como se muestra en las solicitudes provisionales de Estados Unidos Núm. 62/454,451 y 62/454,460, ambas presentadas el 13 de febrero de 2017, y en la publicación de patente PCT Núm. WO2017/031354.

El recipiente para muestras puede formar parte de un kit. El kit puede incluir una tapa o cubierta para el recipiente para muestras, de modo que la muestra permanezca dentro del recipiente para muestras, incluso en el caso de que la muestra se envíe a una instalación de prueba en el recipiente para muestras.

El recipiente para muestras, después de la extracción de sangre, puede contener una combinación de una muestra de sangre y formaldehído. El recipiente para muestras puede contener una combinación de una muestra de sangre, anticoagulante y formaldehído. El recipiente para muestras puede contener una combinación de una muestra de sangre, formaldehído, anticoagulante y polisacárido. El recipiente para muestras puede contener una combinación de una muestra de sangre, formaldehído, anticoagulante, polisacárido e inhibidor de transcripción. El recipiente para muestras puede contener una combinación de una muestra de sangre, formaldehído, anticoagulante, polisacárido, inhibidor de transcripción y aminoácido.

El método puede incluir analizar la muestra biológica en busca de uno o más indicadores de una patología. La muestra biológica puede ser una muestra biológica anormal. Por ejemplo, los resultados anormales pueden incluir ADN alterado, ARN alterado y/o proteínas alteradas y/o células circulantes raras, incluyendo CTC, células endoteliales circulantes, células progenitoras circulantes y células fetales circulantes. También se puede entender que las células circulantes incluyen componentes de células circulantes, incluyendo ácidos nucleicos.

El método puede incluir el análisis de la muestra biológica estabilizada, incluyendo material sanguíneo. El análisis puede incluir uno o más métodos de prueba. El método puede incluir un inmunoensayo del material sanguíneo y/o uno o más componentes dentro del material sanguíneo (p. ej., células sanguíneas, células raras, ácidos nucleicos, células/fragmentos tumorales circulantes, células endoteliales circulantes, células progenitoras circulantes, células fetales en sangre materna, vesículas extracelulares). El inmunoensayo puede seleccionarse del grupo que consiste en un ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas (ELISA), un inmunoensayo enzimático (EIA), radioinmunoensayo (RIA), inmunoensayo de recuento (CIA), fluoroinmunoensayo (FIA), quimioluminiscencia (CLIA) y citometría de flujo. El método puede incluir el análisis de ácidos nucleicos del material sanguíneo. El análisis de ácidos nucleicos se puede seleccionar del grupo que consiste en secuenciación genética, reacción en cadena de polimerasa y secuenciación de próxima generación.

El tubo de recolección de muestras de la presente descripción puede resistirse a la adherencia del contenido de la muestra biomédica recolectada a las paredes del tubo de recolección de muestras. Por ejemplo, la superficie interior del tubo de recolección de sangre puede resistirse a la adherencia a las células sanguíneas de la muestra de sangre extraída. El tubo de recolección de sangre puede resistirse a la adherencia de los ácidos nucleicos (p. ej., el ADN) de la muestra de sangre extraída a las paredes del tubo.

El tubo de recolección de muestras de la presente descripción puede incluir un tubo que tiene una base cerrada, una pared lateral alargada coextensiva que se extiende desde la base y termina en un extremo abierto, y que define una cámara hueca que tiene una pared interior, estando configurada la cámara hueca para recolectar una muestra de sangre, estando hecha al menos la pared lateral alargada del tubo de un material que incluye un material polimérico termoplástico que tiene una barrera contra la humedad y una baja tasa de absorción de humedad, transparencia óptica para permitir la visualización de una muestra dentro del tubo y resistencia química; y, opcionalmente, un revestimiento transparente que contiene silicio en la mayor parte de la pared lateral del tubo; y un tapón elastomérico. Antes de recolectar una muestra de sangre, la cámara hueca del tubo está en un estado evacuado con respecto a la presión ambiente, y la cámara hueca se llena parcialmente con una composición según la invención en un estado inicial seleccionado de sólido, líquido o gel, incluyendo la composición un anticoagulante y una composición conservante para estabilizar las células sanguíneas de la muestra de sangre para permitir el aislamiento de un ácido nucleico o una célula rara circulante en la muestra de sangre y/o una prueba de citometría de flujo de la muestra de sangre. La composición es capaz de conservar su estado inicial durante un período de al menos un mes en un rango de temperaturas de alrededor de 2 °C a alrededor de 30 °C. La composición puede incluir, o el tubo puede adaptarse para recibir, uno o más materiales para permitir el aislamiento de un componente celular o libre circulante de una muestra de sangre. Tales materiales pueden incluir una proteasa o un aminoácido que puede incluir, aunque no de forma limitativa, proteinasa K.

El tubo de recolección de muestras de sangre puede ser un tubo de un solo uso. El tubo de recolección de muestras de sangre puede ser no pirogénico o estar libre de endotoxinas. El tubo de recolección de muestras de sangre se puede usar para recolectar muestras de sangre con fines analíticos.

El tubo de recolección de muestras de sangre es un tubo de recolección de extracción directa de sangre evacuado que se usa para estabilización y conservación. Los tubos de recolección de muestras de sangre pueden usarse para la estabilización y conservación de los ácidos nucleicos. Por ejemplo, los tubos de recolección de sangre de la presente descripción pueden usarse para pruebas prenatales no invasivas (NIPT) que analizan el ADN fetal libre circulante que circula en la sangre materna. Las pruebas prenatales pueden incluir la determinación del sexo fetal, la detección genética de una o más afecciones cromosómicas (p. ej., trisomía) y pruebas prenatales de paternidad de ADN. El tubo puede formar parte de un kit adaptado para una prueba no invasiva de una muestra de sangre materna de una mujer embarazada. Los tubos de recolección de muestras de sangre pueden usarse para la estabilización y conservación de las células tumorales circulantes y/o el ADN tumoral. Los tubos de recolección de muestras de sangre pueden usarse para pruebas y análisis de citometría de flujo. El tubo puede formar parte de un kit para detectar células tumorales circulantes. El tubo puede formar parte de un kit para detectar el cáncer que indica la actividad de ácidos nucleicos en ARN y/o ADN. El tubo puede formar parte de un kit para determinar la eficacia de un tratamiento para una patología. El tubo puede formar parte de un kit para analizar la presencia de biomarcadores o la presencia de una enfermedad cardíaca. El tubo puede formar parte de un kit para analizar la idoneidad para un trasplante.

Los tubos de recolección de sangre evacuados suelen tener una fecha de caducidad. Un tubo caducado puede presentar un vacío reducido, lo que resulta en una extracción de sangre escasa y en una relación sangre/composición inadecuada. Por lo tanto, es importante que un tubo de recolección de sangre pueda mantener el vacío durante un período de tiempo prolongado. El tubo de recolección de sangre de la presente descripción puede comprender un tubo de recolección de sangre evacuado que mantenga el vacío durante un período de tiempo prolongado (p. ej., al menos 24 meses). Además, la tolerancia de extracción del tubo de recolección de sangre debe ser exacta (p. ej., /-10 % de ml del volumen de recolección indicado). También es importante que la estructura del tubo, incluyendo su mecanismo de cierre, favorezca el mantenimiento de la presión necesaria dentro del tubo, a pesar de las fluctuaciones del entorno durante el transporte del tubo. Tales fluctuaciones pueden incluir cambios en la temperatura, cambios en la presión del aire, cambios en la humedad y otros factores ambientales. Más específicamente, el tubo debe permanecer cerrado de forma segura a pesar de la disminución de la humedad y la presión del aire que pueden producirse a mayores altitudes. Por ejemplo, el tubo debe permanecer sellado y mantener la presión interna requerida cuando la presión barométrica ambiental oscila entre 400 mmHg y 800 mmHg.

El tubo de recolección de sangre puede adaptarse para su uso con un tapón. El tapón puede incluir un material elastomérico. El tapón puede incluir un derivado de caucho butílico. El tapón puede incluir un butilo halogenado. El tapón puede incluir caucho de bromobutilo. El tapón puede incluir caucho de bromobutilo farmacéutico. El tapón se puede utilizar con lubricante para tapones. El tapón puede estar revestido. El tapón puede estar parcialmente revestido. Por ejemplo, el revestimiento puede incluir silicona. El tapón del tubo puede incluir un revestimiento de aceite de silicona sobre al menos una parte de su superficie exterior que entra en contacto con la pared interior del tubo.

La presente descripción contempla un conjunto de tubo de recolección de sangre que incluye el tubo de recolección de sangre de la presente descripción y un tapón. Se contempla que el sello o interfaz de la pared exterior de la tapa y la pared interior del tubo sea tal que la tasa de transmisión de humedad se reduzca sustancialmente. Se contempla que el sello o interfaz de la pared exterior del tapón y la pared interior del tubo sea tal que la tasa de transmisión de oxígeno se reduzca sustancialmente. Un sello eficaz debe formar tanto una barrera contra la humedad como una barrera contra los gases. La presente descripción da a conocer un conjunto de tubo de recolección de sangre en donde el tapón se resiste a su extracción de la abertura del tubo. La presente descripción da a conocer un conjunto de recolección de sangre que forma tanto una barrera contra la transmisión de humedad eficaz, evitando de este modo que la humedad se escape desde el interior de un tubo lleno de composición, como una barrera contra la transmisión de oxígeno eficaz, evitando de este modo la penetración de oxígeno en el tubo.

Las composiciones descritas en la presente memoria pueden ser capaces de conservar su estado inicial durante un período de al menos un mes en un rango de temperaturas de alrededor de 2 °C a alrededor de 30 °C cuando el tubo se somete a una humedad relativa de hasta alrededor de al menos alrededor del 50 %. La composición puede ser capaz de conservar su estado inicial durante un período de al menos un mes en un rango de temperaturas de alrededor de 2 °C a alrededor de 30 °C cuando el tubo se somete a una humedad relativa de hasta alrededor del 75 %.

Las dimensiones del tubo de recolección de muestras pueden ser de alrededor de 13 mm x 75 mm. El tubo puede tener una dimensión de diámetro exterior, medido en la pared lateral alargada coextensiva adyacente al extremo abierto, con respecto a longitud (D x L) de alrededor de 13 mm x 75 mm. Las dimensiones del tubo de recolección de muestras pueden ser de alrededor de 16 mm x 100 mm. El tubo puede tener una dimensión de diámetro exterior, medida en la pared lateral alargada coextensiva adyacente al extremo abierto, con respecto a longitud (D x L) de alrededor de 16 mm x 100 mm. Los tubos de recolección de muestras de sangre pueden ser adecuados para la recolección de alrededor de 2 ml a alrededor de 10 ml de sangre. Por ejemplo, un tubo de recolección de sangre pequeño puede ser adecuado para la recolección de alrededor de 2 ml de muestra de sangre. Por ejemplo, un tubo de recolección de sangre grande puede ser adecuado para la recolección de alrededor de 10 ml de muestra de sangre.

El tubo de recolección de sangre puede incluir un volumen de tolerancia de llenado de composición de alrededor de 50 |jl a alrededor de 70 |jl. El tubo de recolección de sangre puede incluir un volumen de tolerancia de llenado de composición de alrededor de 54 j l a alrededor de 66 jl. El tubo de recolección de sangre puede incluir un volumen de tolerancia de llenado de composición de alrededor de 60 jl. El tubo puede incluir un volumen de tolerancia de llenado de composición de alrededor de 160 j l a alrededor de 220 jl. El tubo puede incluir un volumen de tolerancia de llenado de composición de alrededor de 180 jl. El tubo puede incluir un volumen de tolerancia de llenado de composición de alrededor de 200 jl. El tubo puede incluir un volumen de tolerancia de llenado de composición de alrededor de 200 j l a alrededor de 1000 jl. El tubo puede incluir un volumen de tolerancia de llenado de composición de alrededor de 750 jl. El tubo puede incluir un llenado de composición en peso de alrededor de 0,0600 g a alrededor de 0,0800 g. El tubo puede incluir un llenado de composición en peso de alrededor de 0,0700 g. El tubo puede incluir un llenado de composición en peso de más o menos el 10 % de 0,0650 g. El tubo puede incluir un llenado de composición en peso de más o menos el 10 % de 0,0700 g. El tubo puede incluir un llenado de composición en peso de más o menos el 10 % de 0,0750 g. El tubo puede incluir un llenado de composición en peso de alrededor de 0,200 g a alrededor de 0,300 g. El tubo puede incluir un llenado de composición en peso de alrededor de 0,250 g. El tubo puede incluir un llenado de composición en peso de más o menos el 10 % de 0,225 g. El tubo puede incluir un llenado de composición en peso de más o menos el 10 % de 0,250 g. El tubo puede incluir un llenado de composición en peso de más o menos el 10 % de 0,275 g.

El tubo de recolección de sangre puede incluir una tolerancia de extracción de alrededor de 3 ml a alrededor de 5 ml. El tubo de recolección de sangre puede incluir una tolerancia de extracción de alrededor de 4 ml. El tubo de recolección de sangre puede incluir una tolerancia de extracción de alrededor de 7 ml a alrededor de 13 ml. El tubo de recolección de sangre puede incluir una tolerancia de extracción de alrededor de 10 ml. El tubo de recolección de sangre puede incluir un volumen de llenado de composición de alrededor de 200 jl. El tubo de recolección de sangre puede incluir un volumen de llenado de composición de alrededor de 750 jl. El tubo de recolección de sangre puede incluir un volumen de llenado de composición de alrededor de 200 j l a alrededor de 750 jl. El tubo de recolección de sangre puede incluir un volumen de llenado de composición de alrededor de 500 jl. El tubo de recolección de sangre puede incluir un volumen de llenado de composición de alrededor de 500 j l a alrededor de 750 jl. El tubo de recolección de sangre puede incluir un volumen de llenado de composición de alrededor de 1 ml. El tubo de recolección de sangre puede incluir un volumen de llenado de composición de alrededor de 500 j l a alrededor de 1 ml. El tubo de recolección de sangre puede incluir un volumen de llenado de composición de alrededor de 200 j l a alrededor de 1 ml. El tubo de recolección de sangre puede incluir un volumen de llenado de composición de alrededor de 2 ml. El tubo de recolección de sangre puede incluir un volumen de llenado de composición de alrededor de 1 ml a alrededor de 2 ml. Por ejemplo, un tubo de recolección de sangre de 10 ml puede incluir un volumen de llenado de composición de alrededor de 1 ml a alrededor de 2 ml. Por ejemplo, un tubo de recolección de sangre de 4 ml puede incluir un volumen de llenado de composición de alrededor de 1 ml a alrededor de 2 ml.

El material polimérico del tubo descrito en la presente memoria para contener la composición puede caracterizarse por tener uno o más de lo siguiente: una barrera contra la humedad y una tasa de absorción de humedad reducida, pureza, transparencia, resistencia química, resistencia al calor y resistencia. El material polimérico puede tener uno o más de los siguientes atributos: baja densidad, alta transparencia, baja birrefringencia, absorción de agua extremadamente baja, excelentes propiedades de barrera contra el vapor de agua, propiedades de deflexión térmica variables, alta rigidez, resistencia y dureza, muy buena compatibilidad con la sangre, excelente biocompatibilidad, muy buena resistencia a ácidos y álcalis, muy buenas propiedades de aislamiento eléctrico y muy buena procesabilidad/fluidez.

El material polimérico puede incluir una olefina cíclica. El material polimérico puede incluir un copolímero de olefina cíclica (COC). El material polimérico puede incluir un homopolímero o copolímero que incluye polietileno, polipropileno o ambos. El material polimérico puede incluir un resto cíclico. El material polimérico puede incluir un poliéster. El material polimérico puede incluir tereftalatos de poliéster o tereftalato de polietileno. El material polimérico puede incluir policarbonatos. El material polimérico puede incluir poli(metacrilato de metilo).

El material polimérico puede tener excelentes propiedades de barrera contra el vapor de agua. El material polimérico puede tener una tasa de transmisión de vapor de humedad (MVTR) o una tasa de transmisión de vapor de agua (WVTR) reducidas. La tasa de transmisión del vapor de humedad se puede determinar según métodos de prueba convencionales, tales como DIN 53 122. El material polimérico puede tener una tasa de transmisión de vapor de humedad de alrededor de 0,023 gmm/m2 d a alrededor de 0,045 gmm/m2 d a 23 °C y una humedad relativa del 85 %, según medición mediante la norma DIN 53 122. El material polimérico puede tener una tasa de transmisión de vapor de humedad de alrededor de 0,023 gmm/m2 d a 23 °C y una humedad relativa del 85 %. El material polimérico puede tener una tasa de transmisión de vapor de humedad inferior a alrededor de 0,023 gmm/m2 d a 23 °C y una humedad relativa del 85 %.

El tubo de recolección de muestras puede incluir un revestimiento. El tubo de recolección de muestras puede no estar revestido. El tubo de recolección de muestras puede ser un tubo de recolección de sangre con un revestimiento en la pared interior del tubo. El revestimiento puede incluir una o más capas. El revestimiento puede ser generalmente transparente. El revestimiento puede incluir un material que contiene silicio.

El revestimiento puede cumplir una o más funciones. El revestimiento del tubo de recolección de sangre puede ser tal que altere una o más características de la superficie interior del tubo de recolección de sangre. Por ejemplo, el revestimiento puede alterar la energía superficial de las paredes interiores del tubo. El revestimiento puede ayudar a evitar la adherencia de los ácidos nucleicos a las paredes del tubo.

El revestimiento, que incluye una o más capas, puede depositarse en la pared interior del tubo mediante cualquier mecanismo adecuado. Por ejemplo, el revestimiento puede depositarse sobre el sustrato polimérico mediante un método de deposición por plasma, pulverización y/o pulverización catódica. Se puede aplicar mediante un método de deposición por vapor. Se puede aplicar mediante un método de deposición química. Se puede aplicar mediante un método de deposición física.

La presente descripción da a conocer un tubo de recolección de sangre que no permite que una composición o composiciones pierdan humedad con el tiempo. La pérdida de humedad puede hacer que la composición estabilizante se concentre, lo que puede dañar potencialmente la integridad de todas las células, incluyendo la lisis de los glóbulos rojos, y producir una hemólisis excesiva.

El tubo de recolección de sangre de la presente descripción puede incluir una composición. El tubo puede incluir una composición con uno o más ingredientes. La proporción entre uno o más ingredientes de la composición puede ser de alrededor de 5:1 a alrededor de 15:1 (p. ej., 10:1). La composición puede ser sólida. La composición puede ser sustancialmente sólida. La composición puede ser un líquido. La composición puede ser un gel. La composición puede ser una película. La composición puede incluir una sustancia acuosa. La composición puede incluir uno o más agentes en la composición. Los disolventes adecuados pueden incluir agua, solución salina, dimetilsulfóxido, alcohol y cualquier mezcla de los mismos.

El tubo de recolección de sangre puede incluir un volumen de extracción de sangre de alrededor de 4 ml a alrededor de 10 ml. El tubo de recolección de sangre puede incluir un volumen de composición de alrededor de 0,05 ml a alrededor de 1 ml. El tubo de recolección de sangre puede incluir un volumen de composición de alrededor de 0,20 ml a alrededor de 0,90 ml. El tubo de recolección de sangre puede incluir de alrededor de 0,20 ml a alrededor de 0,30 ml de composición para un volumen de extracción de sangre de alrededor de 8 ml a alrededor de 10 ml. El tubo de recolección de sangre puede incluir de alrededor de 0,60 ml a alrededor de 0,90 ml de composición para un volumen de extracción de sangre de alrededor de 4 ml a alrededor de 6 ml.

Los tubos de recolección de muestras de sangre pueden usarse para la estabilización y conservación de uno o más de lo siguiente: proteínas (p. ej., priones), enzimas, anticuerpos y materiales biológicos que pueden contener o no ácidos nucleicos, incluidos aquellos con y sin modificaciones postraduccionales. Por ejemplo, los tubos pueden recolectar muestras para su análisis mediante uno o más de lo siguiente: citometría de flujo superficial, citometría intracelular, ensayos basados en ELISA y espectrometría de masas. Los tubos de recolección de muestras de sangre pueden usarse para la estabilización y conservación de vesículas extracelulares, exosomas, ectosomas y/o microvesículas. Los tubos de recolección de muestras de sangre pueden usarse para la estabilización y conservación de virus. Esto puede incluir la inactivación viral y la cuantificación de carga viral. El virus puede incluir cualquiera de lo siguiente: ADN/ARN, monocatenario o bicatenario, y con envoltura/sin envoltura. Los tubos de recolección de muestras de sangre pueden usarse para la estabilización y conservación de microorganismos, tales como bacterias, mohos y levaduras. Los tubos de recolección de muestras de sangre pueden usarse para la estabilización y conservación de parásitos extracelulares y/o parásitos intracelulares. Los tubos de recolección de muestras de sangre pueden usarse para la estabilización y conservación de exosomas, células tumorales circulantes, otras células circulantes raras y ADN tumoral.

La composición puede ser adecuada para almacenar una muestra de sangre durante un período de al menos alrededor de 3 días. La composición puede ser adecuada para almacenar una muestra de sangre durante un período de al menos alrededor de 7 días. La composición puede ser adecuada para almacenar una muestra de sangre durante un período de al menos alrededor de 14 días. La composición puede ser adecuada para almacenar una muestra de sangre durante un período de al menos alrededor de 30 días. La composición puede ser adecuada para almacenar una muestra de sangre durante un período de al menos alrededor de 60 días. La composición puede ser adecuada para almacenar una muestra de sangre durante un período de al menos alrededor de 90 días.

Sinergia entre los componentes de las composiciones de la descripción

La relación entre los diversos componentes de las composiciones de la descripción y su impacto en diversas células de la sangre es compleja. Para estabilizar el ARNlc, es necesaria la estabilización tanto de los WBC como de los RBC, ya que cada uno de ellos contiene ARN que contaminaría la fracción libre circulante. Por ejemplo, y sin limitación, con una cantidad demasiado pequeña del componente capaz de liberar un aldehído (p. ej., IDU) en la composición, no se produce ningún efecto en la estabilización de los WBC, pero con una cantidad demasiado grande del componente capaz de liberar un aldehído (p. ej., IDU), entonces comienza a producirse una desestabilización de los RBC. La a-ciclodextrina es útil para estabilizar los WBC, pero puede dañar los RBC.

Por consiguiente, en la presente memoria se describe que varios componentes de las composiciones de la descripción producen efectos sinérgicos con respecto a la estabilización de, p. ej., el ácido nucleico en una célula. En consecuencia, en cualquiera de las realizaciones de los aspectos de la descripción, un polímero y un componente capaz de liberar un aldehído proporcionan efectos sinérgicos con respecto a la estabilización de, p. ej., el ácido nucleico en una célula. Por lo tanto, la a-ciclodextrina y la IDU actúan sinérgicamente para estabilizar, p. ej., el ácido nucleico en una célula.

Las composiciones de la descripción facilitan la estabilización del ARNlc, el ADNlc, las proteínas y otra materia celular ubicada dentro de las vesículas extracelulares, ADN y ARN genómicos y otras especies de ARN (p. ej., ARNm, miARN, ARNpi, ARNip, ARNhc y otros), lo que permite aislar y analizar posteriormente tanto la materia libre circulante como la materia celular (p. ej., el ADN y el ARN del interior de los glóbulos blancos, las células tumorales circulantes (CTC), las células fetales circulantes u otras células circulantes raras). En otras realizaciones, las composiciones de la descripción son útiles para el análisis directo e indirecto de vesículas extracelulares.

En algunas realizaciones, la célula es una célula sanguínea. En otras realizaciones, la célula sanguínea es un glóbulo blanco (WBC) o un glóbulo rojo (RBC). Según la invención, el componente capaz de liberar un aldehído es la imidazolidinilurea (IDU).

Según la invención, el polímero es a-cidodextrina.

Las concentraciones/cantidades de cada componente de las composiciones de la descripción se contemplan de la siguiente manera. Se contempla que el componente capaz de liberar un aldehído esté presente en la composición en una concentración de alrededor del 10 % a alrededor del 40 %. Se contempla que la a-ciclodextrina o un derivado funcionalizado de la misma esté presente en la composición en una concentración de alrededor del 0,75 % a alrededor del 4 %. Los derivados funcionalizados de la ciclodextrina son conocidos en la técnica (véase, p. ej., Hanessian y col., J. Org. Chem. 60(15): 4786-4797 (1995) y Zhou y col., Polymer Chemistry 1: 1552-1559 (2010), incorporándose cada uno de dichos documentos como referencia en la presente memoria en su totalidad).

Con respecto al anticoagulante, se contempla que un anticoagulante a base de citrato (p. ej., ACD-A, ACD-B o CPDA) esté presente en una concentración de alrededor del 0,75 % a alrededor del 4 %. En una realización no reivindicada, un anticoagulante no a base de citrato (p. ej., EDTA) está presente en la composición en una concentración de alrededor del 0,05 % a alrededor del 2 %.

Como se usa en la presente memoria, una concentración o cantidad de un componente determinado se describe en términos de la concentración o cantidad del componente que está en la composición antes de la adición de una muestra biológica (p. ej., sangre). Por consiguiente, se espera que la concentración o cantidad de cada componente tal como se describe en la presente memoria después de que se haya añadido la muestra biológica sea alrededor de 20 veces inferior. A modo de ejemplo, la cantidad de IDU que está presente en una composición dentro de un recipiente (p. ej., un tubo de sangre) antes de la adición de una muestra biológica puede oscilar entre alrededor del 10 % y alrededor del 40 % en volumen. Sin embargo, después de la adición de la muestra biológica, se espera que la concentración de IDU en el recipiente sea de alrededor del 0,5 % a alrededor del 2 % en volumen. Por lo tanto, si el volumen de la composición en el recipiente antes de la adición de la muestra biológica es de 0,2 ml, entonces la cantidad de IDU en el recipiente es de alrededor de 20 |jl a alrededor de 80 |jl; después de la adición de la muestra biológica, la cantidad de IDU en el recipiente es de alrededor de 1 j l a alrededor de 4 jl.

Ejemplos

Las figuras mostradas en la presente memoria demuestran datos de prueba que ayudan a identificar los componentes de la composición para minimizar la lisis de los glóbulos blancos, minimizar la lisis de los eritrocitos y mantener la estabilidad del ADN libre circulante, las vesículas extracelulares (y el ARN ubicado en las mismas) y las proteínas.

La Figura 1 es un gráfico que representa el cambio en el MCV de los eritrocitos usando varios anticoagulantes. Un aumento en el volumen corpuscular medio de los eritrocitos demuestra un aumento (o la expectativa de un aumento) en la lisis celular de los eritrocitos. El gráfico muestra los resultados a tres temperaturas de almacenamiento diferentes de tres donantes diferentes. Por lo tanto, se prefieren anticoagulantes que demuestren la capacidad de mantener el volumen corpuscular medio de modo que permanezca similar al volumen corpuscular medio en la recolección de una muestra.

La Figura 2 es un gráfico que representa la liberación de exosomas durante el uso de varios anticoagulantes. De manera similar a la liberación del ADN genómico, la liberación de vesículas extracelulares puede suponer un reto en el aislamiento eficaz del ARN. Como resultado, se prefiere un anticoagulante que mantenga la liberación de exosomas de manera que sea similar a la del momento de la recolección de la muestra.

La Figura 3 es un gráfico que representa la concentración de ADN en plasma en función del porcentaje de conservante. Un aumento en la concentración de ADN demuestra un aumento en la cantidad de ADN genómico y, por lo tanto, representa un aumento en la lisis de los glóbulos blancos. Por lo tanto, una cantidad deseable de conservante mantiene la concentración de ADN al tiempo que evita una conservación excesiva y una reticulación, que pueden dañar el ADN, las vesículas extracelulares o las proteínas.

La Figura 4A es un gráfico que representa la concentración de ARN en plasma en función del porcentaje de conservante. Un aumento en la concentración de ARN demuestra un aumento en la cantidad de exosomas liberados. Por lo tanto, una cantidad deseable de conservante mantiene la concentración de ARN al tiempo que evita una conservación excesiva y una reticulación, que pueden dañar el ADN, las vesículas extracelulares o las proteínas.

La Figura 4B es un gráfico que representa la concentración de ARN en plasma en función del porcentaje de acidodextrina. Un aumento en la concentración de ARN demuestra un aumento en la cantidad de exosomas liberados. Por lo tanto, una cantidad deseable de polisacárido mantiene la concentración de ARN al tiempo que evita la hemólisis.

La Figura 5A es un gráfico que representa el número de copias de ARNm de ubiquitina B en función del porcentaje de a-cidodextrina. Un aumento en la concentración de ARN demuestra un aumento en la cantidad de exosomas liberados. Por lo tanto, una cantidad deseable de polisacárido mantiene la concentración de ARN al tiempo que evita la hemólisis.

La Figura 5B es un gráfico que representa el número de copias de ARNm de hemoglobina A en función del porcentaje de a-cidodextrina. Un aumento en la concentración de ARN demuestra un aumento en la cantidad de exosomas liberados. Por lo tanto, una cantidad deseable de polisacárido mantiene la concentración de ARN al tiempo que evita la hemólisis.

Efectos sinérgicos de los componentes de las composiciones de la descripción

La hipótesis de trabajo para el recipiente (p. ej., un tubo de recolección de sangre), que comprende una composición de la descripción, fue que el ARN libre circulante (ARNlc), incluido ARN mensajero, microARN, ARN no codificante, etc., es estable en el plasma sanguíneo mediante encapsulación dentro de vesículas extracelulares (EV). Por lo tanto, dado que algunos aspectos de la descripción se refieren a estabilizar las concentraciones de ARNlc en el momento de la extracción, el objetivo fue mantener la concentración inicial de EV. Los experimentos representados en las figuras 6, 7 y 8 demostraron que ARNx BCT estabilizó las concentraciones en el momento de la extracción de EV y ARNlc asociado hasta 7 días después de la extracción de sangre. En los experimentos, los componentes funcionales de ARNx BCT son los conservantes imidazolidinilurea (IDU) y a-cidodextrina. Los experimentos se diseñaron para probar si cada uno de los componentes anteriores actuaba individualmente (efecto aditivo) o si la combinación proporcionaba un resultado inesperado y más pronunciado (efecto sinérgico). Como se describe a continuación, y como se muestra en las figuras 6-8, la combinación mostró un efecto sinérgico inesperado.

En el contexto del anticoagulante basal, ACD-A, cada uno de los conservantes (es decir, IDU y a-ciclodextrina) se añadieron individualmente (en la misma concentración utilizada en ARNx BCT) o en combinación. Se recolectaron muestras en cada tubo que contenía la formulación y el plasma se aisló inmediatamente (día 0) o después de siete días de almacenamiento a temperatura ambiente (día7).El ARN libre circulante se purificó a partir de muestras de plasma utilizando el kit comercial QIAamp Circulating Nucleic Acid Isolation Kit con una digestión de DNasa1 en columna, todo ello según las recomendaciones del fabricante (Qiagen). El ARNlc purificado se usó luego en el análisis fluorométrico del ARNlc total según las recomendaciones del fabricante (ensayo Qubit HS RNA, Thermo-Fisher) o en PCR digital en gotículas (ddPCR, flujo de trabajo Bio-Rad QX200) usando conjuntos de cebador/sondas disponibles en el mercado para la expresión de ARN específico de transcrito.

Como se muestra en la Figura 6, el ARNlc total medido mediante análisis fluorométrico aumentó casi 60 veces en el transcurso de 7 días en las muestras de ACD-A no estabilizadas (n = 3 donantes independientes). La adición de IDU por sí sola no evitó los aumentos de ARNlc, mientras que la a-ciclodextrina por sí sola limitó los aumentos de los niveles de ARNlc. Sin embargo, la combinación de IDU y a-ciclodextrina redujo significativamente los aumentos en los niveles totales de ARNlc (se observaron aumentos de solo 2 a 4 veces).

Para determinar la potencial preferencia de los conservantes IDU o a-ciclodextrina para diferentes poblaciones celulares, se utilizó ddPCR para determinar cambios específicos de transcrito en niveles de ARNlc. La hemoglobina alfa 1 y alfa 2 (HbA1/2) se expresan en eritrocitos y los niveles totales de estos transcritos reflejan los de ARNlc total (Figura 7). Esto era de esperar, dado que los transcritos de globina son los transcritos predominantes que se encuentran en el plasma sanguíneo. A continuación, se determinaron los niveles de ubiquitina B, un gen expresado por todas las células. A este respecto, se observó un efecto de la IDU por sí misma; sin embargo, la combinación de IDU y a-ciclodextrina fue necesaria para la estabilización casi completa de la concentración de ubiquitina B (Figura 8).

En conjunto, estos datos demostraron un efecto sinérgico inesperado entre el componente capaz de liberar un aldehído (p. ej., IDU) y la a-ciclodextrina para estabilizar la concentración de ARNlc en el momento de la extracción.

Tal como se usa en la presente memoria, salvo que se indique lo contrario, la descripción prevé que cualquier miembro de un género (lista) pueda excluirse del género; y/o cualquier miembro de una agrupación Markush pueda excluirse de la agrupación.

Salvo que se indique lo contrario, cualquier valor numérico mencionado en la presente memoria incluye todos los valores desde el valor inferior al valor superior en incrementos de una unidad, siempre que exista una separación de al menos 2 unidades entre cualquier valor inferior y cualquier valor superior. Como ejemplo, si se indica que la cantidad de un componente, una propiedad o un valor de una variable de proceso, tal como, por ejemplo, temperatura, presión, tiempo y similares, es, por ejemplo, de 1 a 90, preferiblemente de 20 a 80, más preferiblemente de 30 a 70, se pretende que los valores de rango intermedio, tales como (por ejemplo, 15 a 85, 22 a 68, 43 a 51, 30 a 32, etc.) estén dentro la descripción de esta memoria descriptiva. Del mismo modo, los valores intermedios individuales también están dentro de la presente descripción. Para valores inferiores a uno, se considera que una unidad es 0,0001, 0,001, 0,01 o 0,1, según corresponda. Estos son solo ejemplos de lo que se pretende específicamente, y se debe considerar que todas las combinaciones posibles de valores numéricos entre el valor más bajo y el valor más alto enumerados se indican expresamente en esta solicitud de manera similar. Tal como puede observarse, la descripción comparativa de las cantidades expresadas como porcentaje en peso/volumen para dos o más ingredientes también abarca las proporciones de peso relativo de los dos o más ingredientes entre sí, incluso si no se indica expresamente. Por ejemplo, si una descripción recita un 2%de A y un 5%de B, entonces la descripción también abarca una relación de peso A:B de 2:5. Salvo que se indique lo contrario, todos los rangos incluyen ambos puntos extremos y todos los números entre los puntos extremos. El uso de “alrededor de” o “aproximadamente” en relación con un rango se aplica en ambos extremos del rango. Por lo tanto, se pretende que “alrededor de 20 a 30” abarque “alrededor de 20 a alrededor de 30”, incluidos al menos los puntos extremos especificados.

El término “que consiste esencialmente en para describir una combinación incluirá los elementos, ingredientes, componentes o etapas identificados, y cualesquiera otros elementos, ingredientes, componentes o etapas de este tipo que no afecten materialmente a las características básicas y novedosas de la combinación. El uso de los términos “que comprende” o “que incluye” para describir combinaciones de elementos, ingredientes, componentes o etapas en la presente memoria también contempla realizaciones que consisten esencialmente en (es decir, la presencia de) cualquier elemento, ingrediente, componente o etapa adicional, sin afectar materialmente a las propiedades y/o beneficios derivados de la descripción; o que incluso consisten en los elementos, ingredientes, componentes o etapas.

Una pluralidad de elementos, ingredientes, componentes o etapas puede proporcionarse mediante un único elemento, ingrediente, componente o etapa integrado. Alternativamente, un único elemento, ingrediente, componente o etapa integrado puede dividirse en una pluralidad de elementos, ingredientes o especificaciones separados. Del mismo modo, los valores intermedios individuales también están dentro de la presente descripción. Para valores inferiores a uno, se considera que una unidad es 0,0001, 0,001, 0,01 o 0,1, según corresponda. Estos son solo ejemplos de lo que se pretende específicamente, y se debe considerar que todas las combinaciones posibles de valores numéricos entre el valor más bajo y el valor más alto enumerados se indican expresamente en esta solicitud de manera similar. Tal como puede observarse, la descripción comparativa de las cantidades expresadas como porcentaje en peso/volumen para dos o más ingredientes también abarca las proporciones de peso relativo de los dos o más ingredientes entre sí, incluso si no se indica expresamente. Por ejemplo, si una descripción recita un 2 % de A y un 5 % de B, entonces la descripción también abarca una relación de peso A:B de 2:5. Salvo que se indique lo contrario, todos los rangos incluyen ambos puntos extremos y todos los números entre los puntos extremos. El uso de “alrededor de” o “aproximadamente” en relación con un rango se aplica en ambos extremos del rango. Por lo tanto, se pretende que “alrededor de 20 a 30” abarque “alrededor de 20 a alrededor de 30”, incluidos al menos los puntos extremos especificados.

El término “que consiste esencialmente en para describir una combinación incluirá los elementos, ingredientes, componentes o etapas identificados, y cualesquiera otros elementos, ingredientes, componentes o etapas de este tipo que no afecten materialmente a las características básicas y novedosas de la combinación. El uso de los términos “que comprende” o “que incluye” para describir combinaciones de elementos, ingredientes, componentes o etapas en la presente memoria también contempla realizaciones que consisten esencialmente en (es decir, la presencia de cualesquiera elementos, ingredientes, componentes o etapas adicionales, sin afectar materialmente a las propiedades y/o beneficios derivados de la descripción); o que incluso consisten en los elementos, ingredientes, componentes o etapas.

Una pluralidad de elementos, ingredientes, componentes o etapas puede proporcionarse mediante un único elemento, ingrediente, componente o etapa integrado. Alternativamente, un único elemento, ingrediente, componente o etapa integrado puede dividirse en una pluralidad de elementos, ingredientes, componentes o etapas separados. La descripción de “un” o “uno” para describir un elemento, ingrediente, componente o etapa no pretende excluir elementos, ingredientes, componentes o etapas adicionales. Todas las referencias en la presente memoria a elementos o metales que pertenecen a un determinado grupo se refieren a la Tabla periódica de elementos publicada y registrada por CRC Press, Inc., 1989. Cualquier referencia al grupo o grupos se hará al grupo o grupos tal como se refleja en esta Tabla periódica de elementos, usando el sistema IUPAC para numerar los grupos.

Claims (11)

REIVINDICACIONES

1. Una composición que comprende:

(i) un componente capaz de liberar un aldehido;

(ii) un anticoagulante que comprende ácido cítrico, citrato trisódico y dextrosa; y

(iii) a-ciclodextrina,

en donde el componente capaz de liberar un aldehido es imidazolidinilurea.

2. La composición de la reivindicación 1, en donde el anticoagulante es un anticoagulante a base de citrato que comprende citrato y dextrosa, en donde el anticoagulante a base de citrato es anticoagulante citrato dextrosa A (ACD-A), anticoagulante citrato dextrosa B (ACD-B) o citrato-fosfato-dextrosa-adenina (CPDA).

3. La composición de la reivindicación 1 o la reivindicación 2, en donde la dextrosa está presente en una concentración de alrededor del 2 % a alrededor del 20 %, y/o en donde la concentración de iones citrato es de alrededor de 200 mM a alrededor de 500 mM.

4. La composición de una cualquiera de las reivindicaciones 1-3, en donde el ácido cítrico está presente en una concentración de alrededor del 0,5 % a alrededor del 4 %, y/o en donde el citrato trisódico está presente en una concentración de alrededor del 3 % a alrededor del 15 %.

5. La composición de una cualquiera de las reivindicaciones 1-4, en donde el componente capaz de liberar un aldehido está presente en una concentración de alrededor del 10 % a alrededor del 40 %.

6. La composición de una cualquiera de las reivindicaciones 1-5, en donde la a-ciclodextrina está presente en una concentración de alrededor del 0,75 % a alrededor del 4 %.

7. Un método ex vivo para tratar una única muestra de sangre con la composición de una cualquiera de las reivindicaciones 1-6, que comprende poner en contacto la muestra con la composición y aislar uno o más de ADN, ARN, vesículas extracelulares, células tumorales circulantes, células raras circulantes o proteínas de la muestra.

8. Uso de la composición de una cualquiera de las reivindicaciones 1-6 para aislar tanto ADN como ARN ex vivo de una muestra de sangre, o para aislar vesículas extracelulares de una muestra de sangre, o para aislar células tumorales circulantes o restos tumorales.

9. Un método ex vivo para inhibir la lisis de una célula que comprende poner en contacto la célula con una composición de una cualquiera de las reivindicaciones 1-6, en donde la inhibición evita la liberación de ácido nucleico y/o una vesícula extracelular desde la célula.

10. El método de la reivindicación 9, en donde la célula es un glóbulo blanco, o en donde la célula es un glóbulo rojo, y/o

en donde el ácido nucleico es ARN libre circulante (ARNlc), ADN libre circulante (ADNlc), ARN celular o ADN celular.

11. Uso de una composición según una cualquiera de las reivindicaciones 1-6 para estabilizar una célula ex vivo, caracterizado porque el uso comprende poner en contacto la célula con la composición, en donde el contacto evita la liberación de ácido nucleico y/o una vesícula extracelular desde la célula.