CN101148658A - 动物血双水相提取超氧化物歧化酶方法 - Google Patents
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Abstract
本发明是从动物血中提取SOD新方法，属于生化技术领域。现有从血中提取SOD提取工艺存在着使用大量有机溶剂，有污染环境与不安全隐患，产品成本较高，生产周期较长，产率不高等一些不足之处。本发明采用双水相法工艺流程，在血中添加抗凝剂后添加1－2％的乳糖、0.2－1％β－环糊精、0.1－1％聚乙二醇6000作为保护剂；在15－22％PEG400，15－22％(NH4)2SO4溶液中，加入冷却的处理鲜血，搅拌、静置后，血液分层，取出上清液并加入20－50％的K2HPO4，搅拌均匀，静置30分钟，吸取上层液体经层析、冻干后制得超氧化物歧化酶，下层液体用于蒸馏回收PEG。适合有稳定新鲜血源的单位投资建厂。
Description
一、技术领域：
本发明专利：动物血双水相提取超氧化物歧化酶的方法属于生物化学领域
二、技术背景：
超氧化物歧化酶简称SOD，英文为Super Oxide Dismutase，广泛存在于各种生物体内，是一种酸性蛋白，在酶分子上通过共价键结合有金属辅基。按照金属辅基成分不同可分为三种，即CuZn-SOD、Mn-SOD和Fe-SOD。SOD是唯一能清除细胞中自由基的酶，自由基是带有不成对电子、原子或离子，其化学性质活泼，有极高的氧化性能，以夺取核酸、氨基酸等生物分子的电子，使这些物质性质演化成毒性更强的羟自由基，可导致机体的多种疾病。研究表明，机体的衰老、病变及辐射伤害都同自由基的形式有关，故SOD有抗衰老、抗辐射、消炎、抑制肿瘤和癌症的功能。研究还表明，SOD对胃病、气管炎、皮肤病、烧伤、脚气等都有独特疗效，对醒酒、亢奋精神、抗疲劳、恢复体力、减肥也有很好的效果，目前在化妆品、食品、保健品、医药、酒类、饮料等行业也已开始使用SOD，其发展前景十分广阔。我国在提取SOD方面做了大量研究，也取得了可喜的进步，但目前的提取工艺存在着使用大量有机溶剂，并难以回收、污染环境与安全，产品的成本较高，生产周期较长，产率不高等不足之处。针对以上不足之处，我们参考了有关文献，做了大量试验，发现新兴的双水相萃取技术对传统的工艺进行系统改进有着良好的效果。双水相是指某些高聚物之间或高聚物与无机盐之间在水中以一定的浓度混合而形成互不相溶的两相。由于溶质在两相间的分配系数的差异而进行萃取的方法即为双水相萃取。利用双水相萃取动物血液中SOD的工艺流程为：动物血液→防护→破碎→双水相萃取→二次萃取→柱层析→冻干→精品SOD。
三、发明内容：
(一)、超氧化物歧化酶双水相提取工艺流程为：
新鲜猪血——→验收——→计量——→冷却——→抗凝——→防护——→溶膜——→破碎血细胞—→冷却——→双水相萃取——→二次萃取——→层析——→冷冻干燥—→质检——→成品
(二)、主要设备：
水处理机、破碎机、离心分离机、夹层锅、萃取机、蒸馏回收罐、温控反应罐、层析柱、均质机、真空冻干设备等。
(三)、操作参数及操作说明
1、备料：收集屠宰场当天宰杀的经过动物检验检疫的健康动物的鲜血；
2、抗凝处理：在收集来的猪血中，按3.8g/kg猪血的比例加入柠檬酸三钠，并搅拌均匀；
3、防护处理：加入血液重量1.5％的乳糖、0.5％β-环糊精、0.25％聚乙二醇6000作为保护剂；
4、溶膜：加入血液重量0.3％的曲拉通X-100作为溶膜剂，搅拌均匀；
5、破碎细胞：将处理好的血液通过高压均质机进行细胞破碎；
6、冷却：将破碎好的血液通过换热器进行冷却；
7、萃取：将冷却后的血液通过由PEG-(NH4)2SO4组成的双水相系统，静置15分钟，血液自动分层，吸取上层清液备用；
8、二次萃取：按24kg K2HPO4/100L上清液加入K2HPO4进行二次萃取，吸取上清夜用于层析，下层PEG进行回收利用；
9、层析：将步骤8萃取得到的萃取液上DEAE Sephadex A-50层析柱进行层析。事先将已经处理好的DEAE Sephadex A-50装入层析柱(26×150cm)，用pH7.6的buffer(2.0mmol/L PBS+0.1mmol/L EDTA)平衡过夜，样品上柱后，用pH7.62.0～200mmol PBS(均加入0.1mmol/L EDTA)进行梯度洗脱，流速控制在5L/h。
10、干燥：洗脱液收集后冷冻干燥，得成品。
四、具体实施方式：
本发明的实施例如下：
实例(一)
1、取50kg的新鲜猪血，加入0.19kg100ml水溶解的柠檬酸三钠后，搅拌均匀；
2、在步骤1中搅拌的猪血中加入0.75kg乳糖、0.25kg β-环糊精、0.125kg聚乙二醇6000，并搅拌均匀；
3、在步骤2中搅拌后的血液中加入0.15kg曲拉通X-100，并搅拌均匀；
4、将步骤3搅拌好的血液通过高压均质机进行细胞破碎；
5、将步骤4中破碎好的通过换热器，冷却至5℃左右；
6、往50kg蒸馏水中加入11kg PEG 400，搅拌均匀，待用；
7、往50kg蒸馏水中加入8.5kg(NH4)2SO4，搅拌均匀，待用；
8、将步骤6、7得到的溶液混合均匀，静置10分钟；
9、将步骤5得到的破碎细胞倒入步骤8得到的溶液中，静置15分钟，然后取出上层液体；
10、往步骤9得到的上层液体中加入3kg K2HPO4·3H2O固体，搅拌均匀，静置20分钟，然后取出上层液体；
11、将步骤10萃取得到的萃取液上DEAE Sephadex A-50层析柱进行层析，得淡蓝色液体；
12、将步骤11层析得到的淡蓝色液体进行冻干，得淡蓝色固体，即成品5.8g。
实例(二)
1、取100kg的新鲜猪血，加入用200ml水溶解的0.38kg柠檬酸三钠后，搅拌均匀；
2、在步骤1中搅拌的猪血中加入1.5kg乳糖、0.5kg β-环糊精、0.25kg聚乙二醇6000，并搅拌均匀；
3、在步骤2中搅拌后的血液中加入0.3kg曲拉通X-100，并搅拌均匀；
4、将步骤3搅拌好的血液通过高压均质机进行细胞破碎；
5、将步骤4中破碎好的通过换热器，冷却至5℃左右；
6、往100kg蒸馏水中加入22kg PEG 400，搅拌均匀，待用；
7、往100kg蒸馏水中加入17kg(NH4)2SO4，搅拌均匀，待用；
8、将步骤6、7得到的溶液混合均匀，静置10分钟；
9、将步骤5得到的破碎细胞倒入步骤8得到的溶液中，静置15分钟，然后保留上层液体；
10、往步骤9得到的上层液体中加入6kg K2HPO4·3H2O固体，搅拌均匀，静置20分钟，然后取出上层液体；
11、将步骤10萃取得到的萃取液上DEAE Sephadex A-50层析柱进行层析，得淡蓝色液体；
12、将步骤11层析得到的淡蓝色液体进行冻干，得淡蓝色固体，即成品13.3g。
Claims (2)
1.在原料预处理中添加复合保护剂保存超氧化物歧化酶活性。其特征在于：新鲜血中加入用水溶解的柠檬酸三钠后，再加入血液重量1-2％的乳糖、0.2-1％β-环糊精、0.1-1％聚乙二醇6000作为保护剂，减少在后加工过程中酶活的降低。
2.在提取工序中采用双水相萃取法进行分离提取，即利用生化物质超氧化物歧化酶在互不相溶的二相中的分配系数不同而使目标分子浓缩在一相中从而达到纯化的目的。其特征在于：用蒸馏水或纯净水配制15-22％PEG400，15-22％(NH4)2SO4溶液，加入冷却、破膜后的处理鲜血，搅拌均匀，静置15-30分钟，血液自动分层，吸取上层清液备用(称为：一次水相萃取)；在上清液中加入上清液量的20-50％重量的K2HPO4，搅拌溶解均匀，静置20-40分钟，液体自动分为上下两层，吸取上层液体备用(称为：二次水相萃取)，下层液体用于蒸馏回收PEG。
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Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| C06 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| C10 | Entry into substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| C02 | Deemed withdrawal of patent application after publication (patent law 2001) | ||
| WD01 | Invention patent application deemed withdrawn after publication |
Open date: 20080326 |