ES2991342T3 - Uso de cannabidivarina en el tratamiento de los síntomas negativos de la esquizofrenia - Google Patents

Abstract

La presente invención se refiere al uso de cannabidivarina (CBDV) en el tratamiento del trastorno del espectro autista (TEA) y trastornos asociados al TEA, tales como el síndrome del cromosoma X frágil (SXF), el síndrome de Rett (SR) o el síndrome de Angelman (SA). En otra realización, la invención se refiere al uso de CBDV en el tratamiento de la esquizofrenia. Se ha demostrado que el CBDV es particularmente eficaz para mejorar la disfunción cognitiva en modelos de roedores de TEA, SXF, SR, SA y esquizofrenia. El CBDV es preferiblemente sustancialmente puro. Puede adoptar la forma de un extracto altamente purificado de cannabis de modo que el CBDV esté presente en más del 95 % del extracto total (p/p) y los demás componentes del extracto estén caracterizados. Alternativamente, el CBDV se produce sintéticamente. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

DESCRIPCIÓN

Uso de cannabidivarina en el tratamiento de los síntomas negativos de la esquizofrenia

Campo de la invención

Se divulga en el presente documento el uso de cannabidivarina (CBDV) en el tratamiento del trastorno del espectro autista (ASD) y trastornos asociados a ASD como el síndrome del X frágil (FXS); Síndrome de Rett (RS); o síndrome de Angelman (AS). La invención se refiere al uso de CBDV en el tratamiento de los síntomas negativos en la esquizofrenia.

Se ha demostrado que la CBDV es particularmente eficaz para mejorar la disfunción cognitiva en modelos de roedores de ASD, FXS, RS, AS y esquizofrenia.

Preferiblemente, la CBDV es sustancialmente pura. Puede tomar la forma de un extracto de cannabis altamente purificado, de modo que la CBDV esté presente en más del 95 % del extracto total (p/p) y se caractericen los demás componentes del extracto. Alternativamente, la CBDV se produce sintéticamente.

Alternativamente, la CBDV puede usarse como una sustancia farmacéutica botánica (BDS) de una planta de cannabis en la que la CBDV es el cannabinoide predominante. La CBDV también puede estar presente en combinación con otros cannabinoides y componentes no cannabinoides como los terpenos.

En otra realización más, la CBDV puede estar presente con uno o más de otros cannabinoides tales como CBD y/o CBDA en proporciones definidas en las que la CBDV es el cannabinoide predominante.

En uso, la CBDV se puede usar concomitantemente con uno o más de otros medicamentos. La CBDV puede formularse para su administración por separado, secuencial o simultáneamente con uno o más medicamentos o la combinación puede proporcionarse en una única forma de dosificación. Cuando la CBDV se formula para su administración por separado, secuencial o simultáneamente, puede proporcionarse como un kit o junto con instrucciones para administrar el uno o más componentes de la manera indicada. También se puede utilizar como único medicamento, es decir, como monoterapia.

Antecedentes de la invención

El trastorno del espectro autista (ASD) es una afección que se presenta en niños generalmente antes de los tres años de edad y se caracteriza por una falta de interacción social, comunicación, intereses y problemas de comportamiento.

La afección es relativamente común ya que se estima que 1 de cada 100 niños tiene alguna forma de ASD. La afección es más frecuente en niños que en niñas.

En los niños menores de cuatro años, los signos y síntomas del ASD incluyen los del área del lenguaje hablado, tales como retraso en el desarrollo del habla (por ejemplo, hablar menos de 50 palabras diferentes a la edad de dos años) o no hablar en absoluto; repetición frecuente de palabras y frases establecidas; habla que suena muy monótona o plana y prefiere comunicarse usando palabras sueltas, a pesar de poder hablar en oraciones.

Cuando responden a otros, estos niños más pequeños a menudo no responden cuando se les llama por su nombre, a pesar de tener una audición normal; rechazar los abrazos iniciados por un padre; reaccionar de forma inusualmente negativa cuando otra persona le pide que haga algo.

Cuando interactúan con otros, los niños más pequeños muestran signos de no ser conscientes del espacio personal de otras personas o de ser inusualmente intolerantes con las personas que ingresan a su propio espacio personal; poco interés en interactuar con otras personas, incluidos niños de edad similar; no disfrutar de situaciones que gustan a la mayoría de los niños de su edad, como las fiestas de cumpleaños; preferir jugar solo, en lugar de pedir a otros que jueguen con ellos; rara vez usa gestos o expresiones faciales al comunicarse; y evita el contacto visual.

Los síntomas que involucran el comportamiento en los niños en edad preescolar incluyen: tener movimientos repetitivos, como aletear con las manos, mecerse hacia adelante y hacia atrás o hacer chasquidos con los dedos; jugar con juguetes de manera repetitiva y sin imaginación, como alinear bloques en orden de tamaño o color, en lugar de usarlos para construir algo; preferir tener una rutina familiar y molestarse mucho si hay cambios en esta rutina; tener un gusto o disgusto fuerte por ciertos alimentos basado en la textura o el color de los alimentos tanto como en el sabor; e intereses sensoriales inusuales, por ejemplo, los niños con ASD pueden olfatear juguetes, objetos o personas de manera inapropiada.

En los niños de edad escolar mayores, algunos de los signos y síntomas del ASD son similares a los experimentados por los niños más pequeños y también incluyen otros síntomas. Con el lenguaje hablado, un niño mayor con ASD a menudo prefiere evitar el uso del lenguaje hablado; tiene un habla que suena muy monótona o plana; puede hablar en frases previamente aprendidas, en lugar de juntar palabras individuales para formar nuevas oraciones; Puede parecer que habla “con” la gente, en lugar de compartir una conversación bidireccional.

Cuando responden a los demás, los niños en edad escolar con ASD a menudo toman el habla de las personas literalmente y son incapaces de comprender el sarcasmo, las metáforas o las Figuras retóricas; también pueden reaccionar de manera inusualmente negativa cuando otra persona les pide que hagan algo.

Cuando interactúan con otras personas, los niños en edad escolar con ASD pueden no ser conscientes del espacio personal de otras personas o son inusualmente intolerantes con las personas que ingresan a su propio espacio personal; muestran poco interés en interactuar con otras personas, incluidos niños de una edad similar, o tienen pocos amigos cercanos, a pesar de los intentos de entablar amistades; no entender cómo las personas normalmente interactúan socialmente, como saludar a las personas o desearles adiós; son incapaces de adaptar el tono y el contenido de su discurso a diferentes situaciones sociales, por ejemplo, hablando muy formalmente en una fiesta y luego hablando con extraños de una manera familiar; no disfrutar de situaciones y actividades que disfrutan la mayoría de los niños de su edad; rara vez usa gestos o expresiones faciales al comunicarse; y evite el contacto visual.

Con respecto a los problemas de comportamiento que experimentan los niños mayores con ASD, estos incluyen movimientos repetitivos, como batir las manos, mecerse hacia adelante y hacia atrás o chasquear los dedos; jugar de forma repetitiva y poco imaginativa, prefiriendo a menudo jugar con objetos en lugar de personas; desarrollar un interés muy específico en un tema o actividad en particular; prefieren tener una rutina familiar y se enojan mucho si hay cambios en su rutina normal; tener un gusto o disgusto fuerte por ciertos alimentos basado en la textura o el color de los alimentos tanto como en el sabor; intereses sensoriales inusuales, por ejemplo, los niños con ASD pueden olfatear juguetes, objetos o personas de manera inapropiada.

De acuerdo con el DSM-IV, el autismo se diagnostica con tres características centrales utilizando los siguientes criterios: Un total de seis (o más) elementos de las listas (1), (2) y (3), con al menos dos elementos de lista (1) y un elemento de cada una de las listas (2) y (3).

Enumere (1) el deterioro cualitativo en la interacción social, manifestado por al menos dos de los siguientes:

a. marcada deficiencia en el uso de múltiples conductas no verbales, como la mirada a los ojos, la expresión facial, las posturas corporales y los gestos para regular la interacción social;

b. incapacidad para desarrollar relaciones con los compañeros apropiadas al nivel de desarrollo;

c. una falta de búsqueda espontánea de compartir disfrute, intereses o logros con otras personas (por ejemplo, por la falta de mostrar, traer o señalar objetos de interés); y

d. falta de reciprocidad social o emocional.

Enumere (2) las deficiencias cualitativas en la comunicación, manifestadas por al menos uno de los siguientes:

a. retraso o falta total en el desarrollo del lenguaje hablado (no acompañado de un intento de compensar mediante modos alternativos de comunicación como el gesto o la mímica);

b. en personas con habla adecuada, marcada deficiencia en la capacidad para iniciar o mantener una conversación con otros;

c. uso estereotipado y repetitivo del lenguaje o lenguaje idiosincrásico; y

d. Falta de juego de fantasía variado y espontáneo o juego de imitación social apropiado para el nivel de desarrollo.

Enumere (3) patrones de comportamiento, intereses y actividades restringidos, repetitivos y estereotipados que se manifiestan por al menos uno de los siguientes:

a. abarca la preocupación por uno o más patrones de interés estereotipados y restringidos que son anormales en intensidad o enfoque;

b. adherencia aparentemente inflexible a rutinas o rituales específicos, no funcionales;

c. manierismos motores estereotipados y repetitivos (por ejemplo, aleteo o torsión de manos o dedos o movimientos complejos de todo el cuerpo); y

d. Preocupación persistente por partes de objetos.

De acuerdo con el DSM-V que se publicó en mayo de 2013, el nuevo criterio de diagnóstico para el trastorno del espectro autista es que el paciente debe cumplir actualmente, o por su historial, los criterios de A, B, C y D como se establece a continuación.

A. Déficits persistentes en la comunicación social y la interacción social en todos los contextos, que no se explican por retrasos generales del desarrollo y se manifiestan por los 3 siguientes:

1. Déficits en la reciprocidad socioemocional; que puede variar, por ejemplo, desde un enfoque social anormal y el fracaso de una conversación normal de ida y vuelta, hasta un menor intercambio de intereses, emociones o afecto, hasta el fracaso para iniciar o responder;

2. Deficiencias en los comportamientos comunicativos utilizados para la interacción social; que van, por ejemplo, desde una comunicación verbal y no verbal deficientemente integrada, hasta anomalías en el contacto visual y el lenguaje corporal o deficiencias en la comprensión y el uso de los gestos, hasta una falta total de expresiones faciales y no verbalización; y

3. Deficiencias en el desarrollo, mantenimiento y comprensión de las relaciones, que van desde, por ejemplo, dificultades para ajustar el comportamiento para adaptarse a varios contextos sociales, dificultades para compartir juegos imaginativos o hacer amigos, hasta la falta de interés en los compañeros.

B. Patrones de comportamiento, intereses o actividades restringidos y repetitivos, manifestados por al menos dos de los siguientes:

1. Movimientos motores estereotipados o repetitivos, uso de objetos o del habla (como estereotipias motoras simples, alinear juguetes o voltear platos, ecolalia, frases idiosincrásicas);

2. Insistencia en la igualdad, adherencia inflexible a las rutinas o patrones ritualizados de comportamiento verbal o no verbal (como angustia extrema ante pequeños cambios, dificultades con las transiciones, patrones rígidos de pensamiento, rituales de saludo, necesidad de tomar la misma ruta o comer lo mismo comida todos los días);

3. Intereses fijos y muy restringidos que son anormales en intensidad o enfoque (como un fuerte apego o preocupación por objetos inusuales, intereses excesivamente circunscritos o perseverantes); y

4. Hiperactividad o hipo-reactividad a la información sensorial o interés inusual en aspectos sensoriales del entorno (como indiferencia aparente al dolor/temperatura, respuesta adversa a sonidos o texturas específicos, oler o tocar objetos en exceso, fascinación visual por las luces o movimiento).

C. Los síntomas deben estar presentes en la primera infancia, pero es posible que no se manifiesten por completo hasta que las demandas sociales superen las capacidades limitadas.

D. Los síntomas juntos limitan y perjudican el funcionamiento diario.

En ciertos síndromes genéticos existe una fuerte prevalencia de ASD o características de ASD. Se puede decir que tales síndromes son trastornos asociados con el ASD. Dichos síndromes genéticos incluyen: complejo de esclerosis tuberosa, síndrome de X frágil, síndrome de Cornelia de Lange, síndrome de Down, síndrome de Angelman, síndrome de Coffin-Lowry, síndrome de Cohen Laurence-Moon-Biedel, síndrome de Marinesco-Sjogren, síndrome de Moebius, síndrome de Phelan-McDermid, CDKL5, Dup15q, síndrome de Potocki-Lupski, síndrome de Smith Lemli Optiz, síndrome de Timothy, síndrome de Prader-Willi, síndrome de Rett y síndrome de Williams.

Se ha sugerido que los genes subyacentes a aquellos síndromes en los que las características de ASD son muy comunes, conducen a diferencias comunes a nivel biológico y neurológico, que a su vez dan lugar a la presentación de características de ASD.

El síndrome de X frágil (FXS) coexiste con el autismo en muchos casos y es la causa más común de discapacidad de aprendizaje hereditaria, que se presenta en 1 de cada 3.600 hombres y 1 de cada 8.000 mujeres. El FXS es causado por la presencia de un sitio aparentemente inestable o “frágil” ubicado en el gen FMR1 en el cromosoma X. La inestabilidad es causada por un exceso de código genético en esta región. Los hombres con FXS suelen mostrar una discapacidad de aprendizaje de leve a grave, mientras que las mujeres con FXS suelen tener una discapacidad de aprendizaje leve.

Estudios recientes de individuos con FXS muestran un patrón bastante consistente de asociación con ASD. El porcentaje de personas con FXS que muestran características de ASD o cumplen con los criterios de ASD es de hasta el 50 %. El ASD grave es relativamente raro en el FXS y es más característica una presentación más leve de características similares al ASD.

Las deficiencias en la interacción social en FXS se caracterizan por ansiedad social, timidez extrema y evitación de la mirada. Estas características también se observan en personas con ASD. Las deficiencias sociales asociadas con el FXS a menudo aumentan a medida que el paciente envejece.

El síntoma principal de FXS es la discapacidad intelectual con un coeficiente intelectual promedio de 40 en hombres que tienen silenciamiento completo del gen FMR1. Las principales dificultades en las personas con FXS son la memoria de trabajo y a corto plazo, la función ejecutiva, la memoria visual, las relaciones visoespaciales y las matemáticas, y las habilidades verbales están relativamente a salvo.

Los que padecen FXS también presentan características prominentes que pueden incluir una cara alargada, orejas grandes o protuberantes, pies planos, testículos más grandes (macroorquidismo) y tono muscular bajo.

Los pacientes con FXS también padecen infección recurrente del oído medio y sinusitis. El habla puede resultar confusa o nerviosa. Las características de comportamiento pueden incluir movimientos estereotipados como aleteo de manos y desarrollo social atípico, particularmente timidez, contacto visual limitado, problemas de memoria y dificultad para codificar la cara. Estas características significan que las personas con FXS también cumplen con los criterios de diagnóstico del autismo. También se ha demostrado que los modelos genéticos de ratón de FXS tienen comportamientos del tipo autista.

El trastorno por déficit de atención con hiperactividad (ADHD) se encuentra en la mayoría de los hombres con FXS y en el 30 % de las mujeres, lo que lo convierte en el diagnóstico psiquiátrico más común en las personas con FXS. La hiperactividad y la conducta disruptiva alcanzan su punto máximo en los años preescolares y luego disminuyen gradualmente con la edad, aunque los síntomas de falta de atención generalmente duran toda la vida.

A partir de los 40 años, los varones con FXS comienzan a desarrollar problemas progresivamente más graves en la realización de tareas que requieren el ejecutivo central de la memoria de trabajo.

Actualmente no existe ningún tratamiento farmacológico que haya mostrado beneficios específicamente para FXS. Sin embargo, los medicamentos se usan comúnmente para tratar los síntomas de déficit de atención e hiperactividad, ansiedad y agresión.

El síndrome de Rett (RS) es un trastorno neurológico causado por una mutación en el cromosoma X. El RS afecta predominantemente a mujeres y ocurre en 1 de cada 15.000 a 22.800 nacimientos de mujeres vivas. Por lo general, el desarrollo parece ser normal en los primeros seis a dieciocho meses, pero a esto le sigue un período de regresión que da como resultado una pérdida del lenguaje y las habilidades motoras, lo que conduce a discapacidades físicas y de aprendizaje graves o profundas.

Los comportamientos de tipo autista se observaron en la primera descripción de RS en 1966. Desde entonces, los estudios han estimado que entre el 25 % y el 40 % de los individuos con RS muestran características de tipo ASD. El ASD es el diagnóstico erróneo más común en niños con RS, y muchas personas son diagnosticadas con ASD antes de recibir un diagnóstico de RS.

La RS está causada por una mutación en el gen MECP2 que se encuentra en el cromosoma X. El gen MECP2 codifica la proteína MeCP2 que es esencial para el desarrollo del cerebro. Sin esta proteína, se impide que las células nerviosas del cerebro se desarrollen adecuadamente.

Los síntomas asociados con el RS suelen pasar desapercibidos durante los primeros meses de vida de un niño. Luego, los síntomas tienden a progresar en varias etapas, como se describe a continuación.

La etapa uno consiste en signos tempranos y desarrollo lento, estos suelen aparecer en los primeros seis a doce meses de vida del niño. Los síntomas incluyen: lentitud general en el desarrollo; hipertonía; dificultad para alimentarse; movimientos anormales de la mano; falta de interés por los juguetes; y mala coordinación del tronco y las extremidades.

La etapa dos se conoce como etapa de regresión o destrucción rápida. Esta etapa generalmente comienza entre la edad de uno y cuatro años y puede durar semanas o meses. El niño desarrollará un deterioro cognitivo severo. Surgen problemas con la comunicación, el lenguaje, el aprendizaje, la coordinación y las funciones cerebrales. Los signos en esta etapa incluyen: movimientos repetitivos e incontrolables de la mano; períodos de angustia, irritabilidad y gritos; Retiro social; inestabilidad al caminar; respiración rápida o lenta; problemas para dormir; tamaño de cabeza pequeño; dificultad para comer y problemas gastrointestinales.

Muchos niños con RS también comienzan a sufrir ataques epilépticos en esta etapa; hasta el 80 % de los niños con el síndrome sufren de epilepsia en alguna etapa de su enfermedad.

La etapa tres se conoce como la etapa de meseta y generalmente comienza entre las edades de dos y diez años. Esta etapa puede durar años, de hecho, muchos pacientes con RS permanecerán en esta etapa durante la mayor parte de su vida. Los síntomas prominentes incluyen: flacidez de las extremidades e incapacidad para moverse; incapacidad para usar las manos para sostener, transportar o manipular objetos; movimientos repetitivos de la mano; rechinar los dientes; movimientos anormales de la lengua; y falta de aumento de peso corporal.

La etapa final se caracteriza por el deterioro del movimiento. Esta etapa puede volver a durar años o incluso décadas. Los principales problemas son causados por la escoliosis de la columna; espasticidad y pérdida de la capacidad para caminar.

La esperanza de vida de un niño que nace con RS generalmente se acorta a menudo debido a convulsiones o arritmias que amenazan la vida.

No existe cura para el RS; sin embargo, a menudo se prescriben medicamentos antiepilépticos para controlar las convulsiones junto con una dieta alta en calorías y fisioterapia para ayudar a controlar los síntomas.

El síndrome de Angelman (AS) ocurre en aproximadamente 1 de cada 12.000 a 15.000 individuos y está causado por anomalías en el cromosoma 15. Los individuos con AS suelen mostrar una discapacidad de aprendizaje de severa a profunda, dificultades significativas con la movilidad y la comunicación además de convulsiones.

Se ha sugerido que entre el 50 % y el 80 % de los individuos con AS cumplen los criterios de ASD.

Las características típicas del síndrome de Angelman incluyen: desarrollo retardado que normalmente se nota entre los 6 y 12 meses de edad; deterioro severo del lenguaje con poco o ningún habla; problemas de movimiento y equilibrio (ataxia); convulsiones frecuentes (epilepsia) en alrededor del 85 % de los casos; un tamaño de cabeza pequeño (microcefalia); comportamiento sociable con sonrisas frecuentes.

Una anomalía genética responsable de la AS que se produce por casualidad en el momento de la concepción. El gen UBE3A está ausente o funciona mal. Un niño generalmente hereda una copia del gen UBE3A de cada padre. Ambas copias están encendidas (activas) en la mayoría de los tejidos del cuerpo. Sin embargo, en ciertas áreas del cerebro, solo el gen heredado de la madre está activo. En la mayoría de los casos de AS (alrededor del 70 %), falta la copia materna del gen UBE3A del niño, lo que significa que no hay una copia activa del gen UBE3A en el cerebro del niño.

La esquizofrenia es un diagnóstico psiquiátrico que describe una enfermedad mental caracterizada por alteraciones en la percepción o expresión de la realidad, que se manifiestan más comúnmente como alucinaciones auditivas, delirios paranoides o extraños o habla y pensamiento desorganizados en el contexto de una disfunción social, ocupacional o cognitiva significativa.

La esquizofrenia se describe a menudo en términos de síntomas positivos y negativos. Los síntomas positivos incluyen delirios, alucinaciones auditivas y trastorno del pensamiento, y normalmente se consideran manifestaciones de psicosis. Los síntomas negativos se denominan así porque se considera que son la pérdida o ausencia de rasgos o habilidades normales, e incluyen características como afecto y emoción planos o embotados, pobreza del habla (alogia), anhedonia y falta de motivación (abulia). Un tercer grupo de síntomas, el síndrome de desorganización, incluye habla, pensamiento y comportamiento caóticos. También se cree que el trastorno afecta a la cognición, que también suele contribuir a problemas crónicos con el comportamiento y la emoción.

Los síntomas cognitivos se detectan a menudo cuando se realizan pruebas neuropsicológicas a pacientes con esquizofrenia. Incluyen lo siguiente: "funcionamiento ejecutivo" deficiente (la capacidad de absorber e interpretar información y tomar decisiones basadas en esa información); incapacidad para mantener la atención; y problemas con la "memoria de trabajo" (la capacidad de mantener en mente la información recientemente aprendida y utilizarla de inmediato). Dicha disfunción cognitiva a menudo interfiere con la capacidad del paciente para llevar una vida normal y ganarse la vida. Pueden causar una gran angustia emocional.

El tratamiento para los síntomas positivos de la esquizofrenia es generalmente con medicamentos antipsicóticos; sin embargo, los síntomas negativos y cognitivos permanecen en gran medida sin tratamiento.

Probar la eficacia de los compuestos sobre los signos y síntomas de ASD, trastornos asociados a ASD y esquizofrenia es un desafío dado que estos trastornos tienen tantos dominios de síntomas afectados diferentes.

El modelo de ácido valproico de roedor es un modelo ampliamente aceptado de ASD. Los fetos de rata se exponen al ácido valproico en el día 12.5 de gestación para producir ratas VPA. Las ratas VPA presentan aberraciones de comportamiento observadas en el autismo, como maduración tardía, menor peso corporal, desarrollo motor retrasado e integración atenuada de una serie coordinada de reflejos, respuesta retardada de búsqueda de nidos mediada por el sistema olfativo y geotaxis negativa normal.

Además, existen modelos animales particulares que pueden usarse para probar síndromes particulares que se presentan con características similares a ASD tales como FXS, RS y AS o trastornos asociados con ASD.

Los pacientes masculinos con FXS carecen de la proteína FMR1 debido al silenciamiento del gen FMR1 mediante la amplificación de una repetición CGG y la subsiguiente metilación de la región promotora. Un modelo de modificación para FXS en ratones es un modelo bien conocido que se utiliza para probar compuestos para determinar su efectividad en el tratamiento de FXS. Los ratones carecen de la proteína FMR1 normal y muestran macroorquidia, déficit de aprendizaje e hiperactividad.

El modelo de ratón modificado MeCP2 es capaz de evaluar la eficacia de un tratamiento de los síntomas que se presentan en el RS. Los ratones que carecen del gen MeCP2 muestran síntomas neurológicos graves aproximadamente a las seis semanas de edad. Después de varios meses, las hembras heterocigotas también muestran síntomas de comportamiento similares al autismo.

El modelo de ratón UBE3A se utiliza para evaluar la eficacia de los compuestos en el tratamiento de la AS. Se ha demostrado que este modelo recapitula muchas de las características fenotípicas de la AS, incluida la disfunción motora, el aumento de la susceptibilidad a las convulsiones y los déficits de memoria y aprendizaje dependientes del hipocampo en ratones con el gen modificado.

El modelo de fenciclidina (PCP) se usa para evaluar la eficacia de un compuesto sobre la disfunción cognitiva en la esquizofrenia. El PCP es un antagonista del receptor de N-metil-D-aspartato (NMDA) no competitivo y reproduce una psicosis similar a la esquizofrenia que incluye síntomas positivos, síntomas negativos y disfunción cognitiva. Los animales tratados con PCP exhiben hiperlocomoción como índice de síntomas positivos, y un déficit de comportamiento social en una prueba de interacción social y una mayor inmovilidad en una prueba de natación forzada como índices de síntomas negativos. También muestran un déficit de activación sensoriomotora y disfunciones cognitivas en varias pruebas de aprendizaje y memoria, como la prueba de Reconocimiento de Objetos Nuevos (NOR).

La prueba NOR se usa para evaluar la cognición, particularmente la memoria de reconocimiento, en modelos de roedores de trastornos del SNC, tales como ASD, trastornos asociados con ASD y esquizofrenia. La prueba se basa en la tendencia de los roedores a pasar más tiempo explorando un objeto nuevo que uno familiar. La elección de explorar el objeto novedoso refleja el uso de la memoria de aprendizaje y reconocimiento.

La prueba NOR se realiza en un campo abierto con dos tipos diferentes de objetos. Ambos objetos son generalmente consistentes en altura y volumen, pero son diferentes en forma y apariencia. Durante la habituación, a los animales se les permite explorar una arena vacía. Veinticuatro horas después de la habituación, los animales se exponen a la arena familiar con dos objetos idénticos colocados a la misma distancia. Al día siguiente, a los ratones se les permite explorar el campo abierto en presencia del objeto familiar y un objeto nuevo para probar la memoria de reconocimiento a corto y largo plazo. Se registra el tiempo dedicado a explorar cada objeto y el porcentaje del índice de discriminación. Esta prueba es útil para evaluar la disfunción cognitiva en modelos de roedores de ASD, FXS, RS, AS y esquizofrenia.

La Administración de Alimentos y Medicamentos (FDA) ha aprobado dos medicamentos para tratar la irritabilidad asociada con el autismo (risperidona y aripiprazol) que son ambos medicamentos antipsicóticos. Sin embargo, actualmente no hay ningún medicamento aprobado para tratar las características centrales del autismo. Los antipsicóticos pueden aliviar los síntomas centrales hasta cierto punto, por ejemplo, aliviar la irritabilidad a menudo mejora la sociabilidad, reduce las rabietas, los arrebatos agresivos y el comportamiento autolesivo. Las desventajas asociadas con los antipsicóticos son que se sabe que esta clase de medicamentos tiene efectos secundarios que incluyen un aumento de peso severo, rigidez y temblores. Por consiguiente, sería deseable proporcionar una medicación más eficaz capaz de tratar las características centrales del ASD y ofrecer un perfil de efectos secundarios mejorado.

El sistema endocannabinoide se ha relacionado con la progresión fisiológica de los trastornos del espectro autista, posiblemente implicando a los receptores CB1 y CB2.

Se sabe que los fitocannabinoides interactúan con el sistema endocannabinoide.

El fitocannabinoide tetrahidrocannabinol (THC) en forma de dronabinol, un agonista CB1, se ha utilizado para tratar a un niño autista (Kurz y Blass, 2010). Los problemas asociados con el uso de agonistas CB1 son psicoactividad, ansiedad y alucinaciones.

Las solicitudes de patente GB 2,492,487 y GB 2,434,312 describen el uso de cannabinoides en el tratamiento de enfermedades y trastornos neurodegenerativos. Además, la solicitud de patente WO 2006/017892 describe el uso de CBD en el tratamiento de la esquizofrenia.

La solicitud de patente WO 2014/146699 describe el uso de antagonistas del receptor CB1 en el tratamiento de enfermedades asociadas con anomalías dendríticas. Tales enfermedades incluyen AS y RS. La aplicación se ejemplifica mediante el uso de rimonabant en el modelo de ratón modificado FMR1 que es un modelo de FXS.

El documento WO2004/016246A1 divulga una formulación farmacéutica líquida que comprende cannabidivarina para su uso en el tratamiento de trastornos psicóticos.

El documento WO2006/017892A1 divulga el uso de CBDV para mejorar el funcionamiento cognitivo en un individuo que padece un trastorno neuropsiquiátrico.

Se ha demostrado que el antagonista de CB1, rimonabant, tiene efectos secundarios graves, como la ideación suicida, que limita su uso.

La presente solicitud se refiere al uso de un fitocannabinoide que no es ni agonista ni antagonista de CB1. Se sabe que la cannabidivarina (CBDV) tiene una baja afinidad por el receptor CB1. Hill et al. (2013) demostraron que un extracto de planta que comprende CBDV mostró mayor afinidad por los receptores de cannabinoides CB1 que la CBDV purificada tanto en el cerebro de ratón MF1 como en las membranas celulares de hCB1-CHO; sin embargo, ninguno se unió con una afinidad lo suficientemente alta como para ser descrito como agonista o antagonista.

Se ha demostrado que la CBDV es eficaz en modelos animales de convulsión (Hill et al., 2012) y WO 2011/121351.

Hasta la fecha no existen estudios sobre el uso de CBDV en el tratamiento de ASD o trastornos asociados a ASD tales como FXS, RS y AS o esquizofrenia. Los síntomas descritos anteriormente son difíciles de tratar, por lo tanto, muchos pacientes con<a>S<d>o trastornos asociados con ASD como FXS, RS y AS y esquizofrenia tienen necesidades insatisfechas con respecto al tratamiento de su enfermedad.

Breve resumen de la divulgación

La invención se define mediante las reivindicaciones adjuntas.

La invención proporciona cannabidivarina (CBDV) para uso en el tratamiento de los síntomas negativos de la esquizofrenia.

Se divulga en el presente documento Cannabidivarina (CBDV) para su uso en el tratamiento de uno o más síntomas o características de enfermedad asociadas con el trastorno del espectro autista (ASD) o trastornos asociados con ASD, como se define por DSM-IV, en el que los síntomas o características de la enfermedad son uno o más seleccionados del grupo que consiste en: (i) deterioro cualitativo en la interacción social; (ii) deterioro cualitativo en la comunicación; y (iii) patrones restringidos, repetitivos y estereotipados de intereses y actividades conductuales.

Los síntomas o las características de la enfermedad del deterioro cualitativo en la interacción social incluyen uno o más de: (a) un deterioro marcado en el uso de múltiples conductas no verbales, como la mirada a los ojos, la expresión facial, las posturas corporales y gestos para regular la interacción social; (b) incapacidad para desarrollar relaciones con los compañeros apropiadas al nivel de desarrollo; (c) una falta de búsqueda espontánea de compartir disfrute, intereses o logros con otras personas (por ejemplo, por la falta de mostrar, traer o señalar objetos de interés); y (d) falta de reciprocidad social o emocional.

Los síntomas o características de la enfermedad del deterioro cualitativo en la comunicación incluyen uno o más de: (a) retraso o falta total en el desarrollo del lenguaje hablado (no acompañado por un intento de compensar a través de modos alternativos de comunicación tales como gesto o mímica); (b) en individuos con habla adecuada, marcada deficiencia en la capacidad de iniciar o mantener una conversación con otros; (c) uso estereotipado y repetitivo del lenguaje o lenguaje idiosincrásico; y (d) falta de juego de fantasía variado y espontáneo o juego de imitación social apropiado para el nivel de desarrollo.

Los síntomas o características de enfermedad de patrones de interés y actividades de comportamiento estereotipados y repetitivos restringidos pueden incluir uno o más de: (a) preocupación que abarca uno o más patrones de interés estereotipados y restringidos que es anormal en intensidad o enfoque; (b) adherencia aparentemente inflexible a rutinas o rituales específicos, no funcionales; (c) manierismos motores estereotipados y repetitivos (por ejemplo, aleteo o torsión de manos o dedos o movimientos complejos de todo el cuerpo); y (d) preocupación persistente por partes de objetos.

Los síntomas o características asociados con el trastorno del espectro autista comprenden al menos dos síntomas asociados con el deterioro cualitativo en la interacción social; al menos un síntoma asociado con un deterioro cualitativo en la comunicación y al menos un síntoma asociado con patrones restringidos, repetitivos y estereotipados de actividades e intereses conductuales.

También se describe cannabidivarina (CBDV) para su uso en el tratamiento del trastorno del espectro autista (ASD) o trastornos asociados con el ASD según lo definido por el DSM-V, en el que los síntomas o características de la enfermedad es uno o más seleccionados del grupo que consiste en: (a) déficits persistentes en la comunicación social y la interacción social a través de contextos, no explicados por retrasos generales del desarrollo, y (b) patrones de comportamiento, intereses o actividades restringidos y repetitivos.

Los síntomas o características de la enfermedad de (a) déficits persistentes en la comunicación social y la interacción social a través de contextos, no tenidos en cuenta por retrasos generales del desarrollo pueden incluir uno o más de: (i) déficits en la reciprocidad socioemocional; (ii) deficiencias en los comportamientos comunicativos no verbales utilizados para la interacción social; y (iii) déficits en el desarrollo y mantenimiento de relaciones.

Los síntomas o características de la enfermedad de (b) patrones de comportamiento, intereses o actividades restringidos y repetitivos pueden incluir uno o más de: (i) habla estereotipada o repetitiva, movimientos motores o uso de objetos; adherencia excesiva a las rutinas, (ii) patrones ritualizados de comportamiento verbal o no verbal, o resistencia excesiva al cambio; (iii) intereses muy restringidos y fijos que son anormales en intensidad o enfoque; y (iv) hiper o hipo-reactividad a la entrada sensorial o interés inusual en los aspectos sensoriales del entorno.

Los síntomas o características de la enfermedad asociadas con el trastorno del espectro autista comprenden los tres síntomas asociados con (a) déficits persistentes en la comunicación social y la interacción social en todos los contextos, no tenidos en cuenta por retrasos generales del desarrollo junto con al menos dos de (b) patrones de comportamiento, intereses o actividades restringidos y repetitivos.

El tratamiento de ASD y trastornos asociados a ASD abarcan el tratamiento de la afección en su conjunto en oposición a los síntomas individuales. La presente invención no incluye CBDV para su uso en el tratamiento de convulsiones.

El trastorno asociado a ASD se puede tomar del grupo: síndrome del X frágil; Síndrome de Rett; o síndrome de Angelman.

De acuerdo con un primer aspecto de la presente invención, se proporciona cannabidivarina (CBDV) para su uso en el tratamiento de los síntomas negativos en la esquizofrenia.

En particular, la CBDV es particularmente útil en el tratamiento de los síntomas negativos asociados con el retiro social.

También se divulga cannabidivarina (CBDV) para su uso en el tratamiento de la disfunción cognitiva.

La disfunción cognitiva puede ocurrir en pacientes con ASD, trastornos asociados con ASD o esquizofrenia.

El tratamiento de la disfunción cognitiva puede estar asociado con el tratamiento de la memoria. El tratamiento puede ser de la memoria a corto plazo y/o de la memoria a largo plazo.

En una realización adicional, la CBDV se usa en combinación con uno o más medicamentos concomitantes que el paciente puede tomar para tratar la afección y/o uno o más síntomas asociados con la misma. Como, por ejemplo, la melatonina para los problemas de sueño, los SSRI para la depresión, los anticonvulsivos para la epilepsia, el metilfenidato para el ADHD o los antipsicóticos para la agresión o la conducta autolesiva. A este respecto, la CBDV de la presente invención no se usa para tratar convulsiones.

Preferiblemente, el uno o más medicamentos concomitantes es un fármaco antiepiléptico (AED). El AED puede ser el cannabinoide CBD y, como tal, se puede utilizar una combinación de CBDV y CBD.

En una realización adicional, la CBDV es sustancialmente pura. La CBDV puede estar presente como un extracto de cannabis altamente purificado que comprende al menos un 95 % (p/p) de CBDV. Preferiblemente, el extracto comprende menos del 0.15 % de THC.

En una realización alternativa, la CBDV está presente como un compuesto sintético.

Alternativamente, la CBDV puede usarse como una sustancia farmacéutica botánica (BDS) de una planta de cannabis en la que la CBDV es el cannabinoide predominante. La CBDV también puede estar presente en combinación con otros cannabinoides y componentes no cannabinoides como los terpenos.

En otra realización más, la CBDV puede estar presente con uno o más de otros cannabinoides tales como CBD y/o CBDA en proporciones definidas en las que la CBDV es el cannabinoide predominante. La determinación de una dosis eficaz en humanos dependerá, por ejemplo, del modo de administración (i.v. u oral), la formulación y la biodisponibilidad de la CBDV cuando se administra y podría oscilar entre 0.01 y 100 mg/kg/día. Además, el hecho de que los cannabinoides a menudo muestren curvas de respuesta a la dosis en forma de campana dificulta la determinación de la dosis de CBDV.

Preferiblemente, la dosis de CBDV es superior a 0.01 mg/kg/día. Por tanto, para un paciente de 15 kg se proporcionaría una dosis de más de 0.15 mg de CBDV por día. Dosis superiores a 0.1 mg/kg/día, como superiores a 1 mg/kg/día, como superiores a 5 mg/kg/día, superiores a 10 mg/kg/día, superiores a 15 mg/kg/día y también se prevé que sean eficaces más de 20 mg/kg/día.

En uso, la CBDV puede ser eficaz en una cantidad terapéutica de entre 1 y 30 mg/kg/día y también puede administrarse como una formulación oral.

Preferiblemente, la CBDV se proporciona durante un período prolongado; más preferiblemente, este período es de al menos siete días.

La CBDV puede utilizarse como complemento dietético o aditivo alimentario para mejorar los síntomas del ASD, las afecciones asociadas al ASD o la esquizofrenia.

Además, se proporciona un método para tratar uno o más síntomas o características de la enfermedad asociados con el trastorno del espectro autista (ASD) o trastornos asociados al ASD en un sujeto, según se define en el DSM-IV, en el que los síntomas o la característica de la enfermedad son uno o más seleccionados del grupo que consiste en: deterioro cualitativo en la interacción social; deterioro cualitativo en la comunicación; y patrones estereotipados y repetitivos restringidos de interés y actividades de comportamiento, que comprende administrar una cantidad eficaz de cannabidivarina (CBDV) al sujeto que lo necesite. Preferiblemente, el sujeto es un ser humano.

También se divulga un método para tratar uno o más síntomas o características de la enfermedad asociados con el trastorno del espectro autista (ASD) o trastornos asociados con el ASD en un sujeto, según se define en el DSM-V, en donde los síntomas o la característica de la enfermedad son uno o más seleccionados del grupo que consiste en: (a) déficits persistentes en la comunicación social y la interacción social en diferentes contextos, no explicados por retrasos generales del desarrollo, y (b) patrones restringidos y repetitivos de comportamiento, intereses o actividades, que comprende administrar una cantidad eficaz de cannabidivarina (CBDV) al sujeto que lo necesita.

El trastorno asociado con el ASD puede tomarse del grupo: síndrome del cromosoma X frágil; síndrome de Rett; o síndrome de Angelman.

También se divulga un método para tratar la esquizofrenia en un sujeto que comprende administrar una cantidad eficaz de cannabidivarina (CBDV) a un sujeto que lo necesita. Preferiblemente, el sujeto es un ser humano.

Además, se proporciona un método para tratar la disfunción cognitiva que comprende administrar cannabidivarina (CBDV) a un sujeto que lo necesite. Preferiblemente, el sujeto es un ser humano.

La dosis equivalente humana (HED) se puede estimar usando la siguiente fórmula:

Animal Km

HED = dosis para animal(mg/kg)multiplicado por—---------—

Humano Km

El Km para un ratón es 3, para una rata el Km es 6 y el Km para un humano es 37.

Definiciones

Las definiciones de algunos de los términos utilizados para describir la invención se detallan a continuación:

Los cannabinoides descritos en la presente solicitud se enumeran a continuación junto con sus abreviaturas estándar.

Tabla 1. Cannabinoides y sus abreviaturas

La tabla anterior no es exhaustiva y simplemente detalla los cannabinoides que se identifican en la presente solicitud como referencia. Hasta ahora se han identificado más de 60 cannabinoides diferentes y estos cannabinoides se pueden dividir en diferentes grupos de la siguiente manera: Fitocannabinoides; Endocannabinoides y cannabinoides sintéticos (que pueden ser nuevos cannabinoides o fitocannabinoides o endocannabinoides producidos sintéticamente).

Los “fitocannabinoides” son cannabinoides que se originan en la naturaleza y se pueden encontrar en la planta de cannabis. Los fitocannabinoides se pueden aislar de plantas para producir un extracto altamente purificado o se pueden reproducir sintéticamente.

“CBDV sustancialmente puro” se define como CBDV que tiene una pureza superior al 95 % (p/p). Más preferiblemente más del 96 % (p/p) hasta el 97 % (p/p) hasta el 98 % (p/p) hasta el 99 % (p/p) y más.

Los “extractos de cannabinoides altamente purificados” se definen como cannabinoides que se han extraído de la planta de cannabis y se han purificado en la medida en que otros cannabinoides y componentes no cannabinoides que se extraen conjuntamente con los cannabinoides se han eliminado sustancialmente, de modo que el cannabinoide altamente purificado es mayor o igual al 95 % (p/p) puro.

“Sustancia farmacéutica botánica” o “(BDS)” se define en la Guía para el borrador de la Guía de productos farmacéuticos botánicos de la industria, agosto de 2000, Departamento de Salud y Servicios Humanos de los EE. UU., Centro de la Administración de Alimentos y Medicamentos para la Evaluación e Investigación de Medicamentos como: “Medicamento derivado de una o más plantas, algas u hongos microscópicos. Se prepara a partir de materias primas botánicas mediante uno o más de los siguientes procesos: pulverización, decocción, expresión, extracción acuosa, extracción etanólica u otros procesos similares”. Una sustancia farmacéutica botánica no incluye una sustancia altamente purificada o modificada químicamente derivada de fuentes naturales. Por lo tanto, en el caso del cannabis, los BDS derivados de las plantas de cannabis no incluyen cannabinoides de grado farmacopeico altamente purificados. En un BDS que comprende cannabinoides, el cannabinoide estará presente en una cantidad inferior al 95 % (p/p).

Los “cannabinoides sintéticos” son compuestos que tienen una estructura cannabinoide o similar a cannabinoide y se fabrican utilizando medios químicos en lugar de la planta.

Los fitocannabinoides se pueden obtener en forma neutra (forma descarboxilada) o en forma de ácido carboxílico, dependiendo del método utilizado para extraer los cannabinoides. Por ejemplo, se sabe que calentar la forma de ácido carboxílico provocará que la mayor parte de la forma de ácido carboxílico se descarboxile a la forma neutra.

“Disfunción cognitiva” se define como la pérdida de funciones intelectuales como pensar, recordar y razonar con suficiente severidad para interferir con el funcionamiento diario. Los pacientes con disfunción cognitiva tienen problemas con la memoria verbal, la aritmética básica y la concentración.

Un trastorno asociado a ASD se define como síndromes genéticos en los que existe una fuerte prevalencia de ASD o características de ASD. Dichos síndromes genéticos incluyen: complejo de esclerosis tuberosa, síndrome de X frágil, síndrome de Cornelia de Lange, síndrome de Down, síndrome de Angelman, síndrome de Coffin-Lowry, síndrome de Cohen Laurence-Moon-Biedel, síndrome de Marinesco-Sjogren, síndrome de Moebius, síndrome de Phelan-McDermid, CDKL5, Dup15q, síndrome de Potocki-Lupski, síndrome de Smith Lemli Optiz, síndrome de Timothy, síndrome de Prader-Willi, síndrome de Rett y síndrome de Williams.

Un síntoma o característica de enfermedad asociada con ASD o trastornos asociados con ASD se define como los criterios de diagnóstico definidos por DSM-IV o DSM-V como se describe anteriormente (en la sección “Antecedentes de la invención”).

Breve descripción de los dibujos

Instancias de la divulgación se describen adicionalmente de aquí en adelante con referencia a los dibujos adjuntos, en los que

La Figura 1 A-B muestra el efecto de CBDV sobre los déficits de sociabilidad y reconocimiento social en el modelo VPA de rata de autismo general;

La Figura 2 A-D muestra el efecto de CBDV sobre comportamientos repetitivos, hiperactividad, déficits cognitivos y biomarcadores en el modelo VPA de rata de autismo general;

La Figura 3 A-B muestra el efecto de CBDV sobre el índice de discriminación después del tratamiento agudo y crónico en el modelo de ratón del síndrome de X frágil;

La Figura 4 A-B muestra el efecto de CBDV sobre el peso corporal en un modelo de ratón con síndrome de Rett;

La Figura 5 muestra el efecto de CBDV sobre la supervivencia en un modelo de ratón con síndrome de Rett; La Figura 6 A-D muestra el efecto de la CBDV sobre los síntomas en un modelo de ratón del síndrome de Rett; La Figura 7 A-B muestra el efecto de la CBDV sobre los síntomas en un modelo de ratón del síndrome de Rett; La Figura 8 muestra el efecto de CBDV sobre la puntuación total de síntomas en un modelo de ratón del síndrome de Rett;

La Figura 9 muestra el efecto de CBDV sobre la memoria a corto plazo en un modelo de ratón con síndrome de Rett;

La Figura 10 muestra el efecto de CBDV sobre la memoria a largo plazo en un modelo de ratón con síndrome de Rett;

La Figura 11 muestra el efecto de la CBDV sobre la duración del agarrotamiento en un modelo de ratón del síndrome de Angelman;

La Figura 12 muestra el efecto de CBDV en la prueba de varilla giratoria en un modelo de ratón con síndrome de Angelman;

La Figura 13 muestra el efecto de CBDV en la nueva prueba de reconocimiento de objetos en un modelo de ratón del síndrome de Angelman;

La Figura 14 muestra el efecto de CBDV en la prueba de suspensión de la cola en un modelo de ratón con síndrome de Angelman;

La Figura 15 muestra el efecto de la CBDV sobre las convulsiones audiogénicas en un modelo de ratón del síndrome de Angelman;

La Figura 16 muestra el efecto de CBDV en la nueva prueba de reconocimiento de objetos en un modelo de esquizofrenia en ratas;

La Figura 17 muestra el efecto de CBDV sobre el índice de discriminación en la prueba de reconocimiento de objetos novedosos en un modelo de esquizofrenia en ratas; los datos se expresan como ** P <0.01; Reducción significativa de DI en comparación con el vehículo, #P <0.05 -## P <0.01; Inversión significativa de la reducción de DI en comparación con PCP; y

La Figura 18 muestra el efecto de CBDV sobre la interacción social en un modelo de esquizofrenia en ratas. Para todas las Figuras, excepto la Figura 17, los datos se expresan como media ± S.E.M. * p <0.05, *** p <0.001 frente a vehículo WT; °° p <0.01, °°° p <0.001 frente al vehículo KO. ANOVA bidireccional seguido de la prueba post hoc de Bonferroni.

Descripción detallada

Ejemplo comparativo 1: uso de cannabidivarina (CBDV) en un modelo de ratón de trastorno del espectro autista

Se evaluó la cannabidivarina fitocannabinoide (CBDV) en un modelo de roedor de trastorno del espectro autista (ASD).

Se ha demostrado que la exposición en el útero de roedores al ácido valproico (VPA) induce un fenotipo con características de comportamiento similares a las observadas en el ASD y proporciona un modelo animal robusto para la comprensión del deterioro cognitivo social y una pantalla potencial para el desarrollo de nuevos terapéutica para esta condición (Foley et al. 2012).

Por tanto, la exposición en el útero a VPA se ha utilizado como un modelo fiable para aumentar la comprensión de los efectos conductuales evaluados por pruebas específicas como sociabilidad, preferencia social y comportamiento estereotipado, también observado en pacientes humanos (Schneider y Przewlocki, 2005).

El Ejemplo comparativo 1 describe el uso de exposición prenatal a VPA en ratas para evaluar la eficacia de la administración crónica de CBDV para revertir los comportamientos similares al autismo presentes en este modelo.

Materiales y métodos

Administración prenatal de VPA

Ratas Sprague-Dawley preñadas (Charles River, Calco, Italia) recibieron una única inyección intraperitoneal de 500 mg/kg de valproato de sodio a los 12.5 días después de la concepción, y las hembras de control se inyectaron con solución salina fisiológica al mismo tiempo. Se disolvió valproato de sodio (Sigma Aldrich, Milán, IT) en solución salina a una concentración de 250 mg/ml.

Las hembras se alojaron individualmente y se les permitió criar sus propias camadas. La cría fue destetada el día postnatal (PND) 21, separada por sexos y los animales se mantuvieron cuatro por jaula, con temperatura y condiciones de luz controladas. Las ratas tenían libre acceso a alimentos (gránulos de laboratorio estándar) y agua. Todos los experimentos se realizaron en la fase de luz entre las 09:00 y las 15:00.

Tratamiento con CBDV

Se disolvió CBDV en etanol, cremóforo y solución salina (1: 1: 18). Tratamiento sintomático con CBDV a dosis de 0.2, 2, 20 y 100 mg/kg/día i.p. se realizó desde el PND 34 (adolescencia temprana) hasta el 56 (edad adulta temprana), tanto en crías masculinas como femeninas de madres inyectadas con VPA 500 mg/kg (o vehículo) el día 12.5 después de la concepción. En el PND 56, se realizó una serie de pruebas de comportamiento para evaluar el efecto de la CBDV crónico sobre la sociabilidad, la novedad social, la memoria a corto plazo, la locomoción y los comportamientos estereotipados/repetitivos.

Estudios de comportamiento

Actividad locomotora y comportamientos repetitivos: la actividad locomotora se registró en una jaula de actividad durante 20 minutos con la ayuda del programa Anymaze (Ugo Basile, Italia). En este período, un observador cegado al grupo de tratamiento midió los comportamientos repetitivos (autoacicalado y excavación).

Sociabilidad y preferencia por la novedad social: Estos comportamientos fueron investigados en un aparato de 3 cámaras que permite medir el enfoque social y la preferencia social. En resumen, los animales se colocaron en una nueva arena (80 cm x 31.5 cm) compuesta por tres cámaras comunicantes separadas por paredes de Perspex con aberturas centrales que permitían el acceso a todas las cámaras durante 5 min.

Se evaluó la distancia recorrida (m) y el tiempo pasado (s) en los diversos compartimentos durante este tiempo para evaluar la actividad locomotora general y asegurarse de que los animales no tuvieran preferencia por un lado particular de la arena.

Después de este período de aclimatación, los animales se confinaron brevemente a la cámara central mientras se colocaba una rata no familiarizada confinada en una pequeña jaula de alambre en una de las cámaras exteriores. Se colocó una jaula de alambre vacía idéntica en la otra cámara. La rata no familiarizada fue asignada al azar a la cámara derecha o izquierda de la arena. A continuación, se dejó que el animal de prueba explorara la arena/cámaras durante 5 minutos más. Se evaluó el tiempo dedicado a la conducta investigadora con la rata con la ayuda del programa Anymaze (Ugo Basile, Italia) con el fin de examinar el enfoque social.

Para investigar la preferencia por la novedad social, se colocó a continuación una nueva rata no familiarizada en la jaula vacía y luego se dejó que el animal de prueba explorara la arena/cámaras durante 5 minutos más.

El tiempo dedicado a participar en la conducta investigadora con la nueva rata no familiarizada se evaluó con la ayuda del programa Anymaze (Ugo Basile, Italia) con el fin de examinar la preferencia por la novedad social.

Memoria a corto plazo: El aparato experimental utilizado para la prueba de reconocimiento de objetos fue una caja de campo abierto (43 x 43 x 32 cm) hecha de plexiglás, colocada en una habitación con iluminación tenue. El experimento se realizó y analizó como se describió anteriormente (Zamberletti et al, 2014). Los animales realizaron cada prueba individualmente.

Se colocó a cada animal en la arena y se le permitió explorar dos objetos idénticos nunca antes vistos durante 5 minutos (fase de familiarización). Después de un intervalo entre pruebas de 3 minutos, uno de los dos objetos familiares fue reemplazado por un objeto nuevo, nunca antes visto, y las ratas fueron devueltas a la arena para la fase de prueba de 5 minutos. Durante la fase de prueba, el tiempo dedicado a explorar el objeto familiar (Ef) y el nuevo objeto (En) fue grabado en vídeo y registrado por separado por dos observadores cegados a los grupos de tratamiento y el índice de discriminación se calculó de la siguiente manera: [(En-Ef)/(En Ef)] x 100.

Estudios de neuroinflamación

Al final del estudio, en el PND 59, las ratas macho tratadas con CBDV 20 mg/kg i.p. fueron sacrificadas y el hipocampo se recogió 24 horas después de la última inyección de CBDV y se almacenó a -80 °C para evaluar los cambios en la expresión de proteínas de los componentes del sistema endocannabinoide (receptores CB1 y CB2, las enzimas degradantes de endocannabinoides, FAAH y MAGL y el enzimas sintéticas, DAGLa y NAPE-PLD); marcadores neuroinflamatorios (GFAP (marcador astrocítico), Iba1 (marcador microglial), CD1lb (marcador microglial activado), TNF-a (citoquina proinflamatoria) e iNOS (mediador inflamatorio)); marcadores sinápticos (sinaptofisina (proteína de vesícula sináptica), PSD-95 (proteína de densidad postsináptica) y las neurotrofinas, BDNF e IGF por inmunotransferencia Western.

Análisis estadístico: los datos se expresaron como media ±. Los resultados se analizaron mediante la prueba t de Student para datos no apareados o ANOVA bidireccional, seguida de la prueba post hoc de Bonferroni. El nivel de significación estadística se estableció en p <0.05.

Resultados

La Figura 1A muestra el efecto de las diferentes dosis de tratamiento con CBDV sobre la preferencia de novedad social en la descendencia de ratas expuestas al VPA y al vehículo, medido a través del aparato de tres cámaras. Se demostró que la CBDV a 20 mg/kg tiene un efecto estadísticamente significativo (p <0.001 en machos y p <0.01 en hembras) sobre la restauración de la preferencia social por la novedad.

Durante la fase de habituación, no se observaron diferencias en el tiempo pasado en cada compartimento del laberinto, lo que sugiere que los animales no mostraron preferencia por un lado particular de la arena (datos no mostrados).

Durante la prueba de sociabilidad, el ANOVA bidireccional reveló efectos principales significativos de VPA y CBDV sobre la sociabilidad. Las ratas expuestas a VPA pasaron significativamente menos tiempo en la cámara que contenía la rata no familiarizada con respecto al tiempo que permanecieron en el compartimento vacío en comparación con los controles. El déficit de sociabilidad presente en las ratas tratadas con VPA fue confirmado por el índice de preferencia que mostró una reducción significativa de aproximadamente un 48 % en el porcentaje de tiempo dedicado a explorar la rata no familiarizada con respecto al compartimento vacío.

La Figura 1B muestra que el tratamiento con CBDV en todas las dosis redujo significativamente el deterioro de la sociabilidad observado en ratas VPA, reduciéndose el índice de preferencia solo en aproximadamente un 13 % en animales con VPA-CBDV en comparación con los controles.

La Figura 1C muestra el efecto del tratamiento con CBDV sobre la preferencia de novedad social en la descendencia de ratas expuestas al VPA y al vehículo, medido a través del aparato de tres cámaras.

Los ratones de control pasaron significativamente más tiempo explorando la nueva rata que la rata conocida (p <0.01). Por el contrario, los animales VPA pasaron un tiempo similar explorando los dos estímulos.

El tratamiento con CBDV a dosis de 20 mg/kg y 100 mg/kg revirtió el déficit en la preferencia social en ratas VPA, como lo demuestra el hecho de que las ratas VPA-CBDV pasaron significativamente más tiempo explorando las nuevas ratas con respecto a la familiar.

La Figura 2A muestra el efecto del tratamiento con CBDV sobre los comportamientos repetitivos (autoacicalado compulsivo), en la descendencia expuesta al VPA. La exposición prenatal al VPA aumentó significativamente el tiempo dedicado al autoacicalado compulsivo. La administración de CBDV a 20 mg/kg en machos y 2 y 100 mg/kg en hembras pudo normalizar significativamente este comportamiento.

La Figura 2B muestra el efecto del tratamiento con CBDV sobre la actividad locomotora en la descendencia de VPA. La administración de VPA aumentó significativamente la locomoción en aproximadamente un 70 % en comparación con el control y la administración de CBDV a 2, 20 y 100 mg/kg en machos pudo normalizar esto.

La Figura 2C muestra el efecto del tratamiento con CBDV sobre la memoria a corto plazo, evaluado mediante la nueva prueba de reconocimiento de objetos. La administración de VPA prenatal afectó significativamente la memoria a corto plazo, como lo demuestra una reducción significativa del índice de discriminación en aproximadamente un 59% con respecto a los controles. La CBDV a dosis de 2, 20 y 100 mg/kg revirtió completa y significativamente el déficit de memoria a corto plazo en ratas VPA machos y hembras, sin afectar la memoria de reconocimiento per se cuando se administró a ratas tratadas con vehículo (no VPA).

La Figura 2D muestra que hubo aumentos significativos en la expresión de GFAP y CD11b en el hipocampo, en paralelo con un aumento concomitante de los niveles de TNFa. Por el contrario, no se observaron cambios en los niveles de Iba1 e iNOS después de la exposición prenatal al VPA. La administración crónica de CBDV normalizó por completo la expresión de los marcadores inflamatorios que aumentaron cuando se administraron a ratas expuestas al VPA y no tuvieron ningún efecto en las ratas de control.

Conclusiones

Estos datos demuestran que la CBDV proporcionó un tratamiento eficaz sobre las alteraciones de la sociabilidad, la preferencia social por novedad, la memoria a corto plazo, los comportamientos repetitivos y la locomoción inducida por la descendencia con exposición prenatal al VPA.

La administración de CBDV no afecta per se a ninguno de los comportamientos que estaban bajo investigación.

Estos datos indican que la CBDV a dosis de 2, 20 y 100 mg/kg fue capaz de revertir el fenotipo similar al autismo en ratas expuestas al VPA y, por lo tanto, es una posible opción de tratamiento novedosa para el ASD.

Además, la CBDV pudo normalizar la sobreexpresión de biomarcadores inflamatorios particulares que se encontró que estaban aumentados en ratas tratadas con VPA. Estos datos sugieren que el tratamiento con CBDV fue capaz de modular los déficits que ocurren en el autismo, como los déficits cognitivos y conductuales a nivel celular.

Ejemplo comparativo 2: Uso de cannabidivarina (CBDV) en un modelo de ratón de síndrome x frágil

Se evaluó la cannabidivarina fitocannabinoide (CBDV) en un modelo de ratón del síndrome del X frágil (FXS). Dicho modelo evalúa el tratamiento de los déficits cognitivos y las convulsiones presentes en ratones modificados (KO) de Fmr1.

Materiales y métodos

Animales

Se obtuvieron ratones Fmr1 KO y ratones de tipo silvestre y se alojaron cuatro por jaula a una temperatura de 21 °C ± 1 °C y una humedad del 55 % ± 10 % en un ambiente controlado. Comida y agua estaban disponibles a voluntad. Todos los experimentos se realizaron durante la fase de luz de un ciclo de luz/oscuridad de 12 horas (08:00 a 20:00). Los animales se manipularon durante una semana antes del inicio de los experimentos. Todas las pruebas de comportamiento fueron realizadas por investigadores cegados a los diferentes grupos experimentales.

Tarea de reconocimiento de objetos novedosos

El día uno, los ratones se habituaron durante 10 minutos al laberinto en V vacío en el que se iba a realizar la tarea. El segundo día, los ratones regresaron al laberinto durante 10 minutos, que contenía dos objetos idénticos al final de cada corredor en el laberinto en V.

Al día siguiente, los ratones se colocaron de nuevo en el mismo laberinto durante 10 minutos más, pero uno de los objetos familiares se reemplazó por un objeto nuevo. Se registró el tiempo total dedicado a explorar la novedad y el objeto familiar. Se calculó un índice de discriminación como la diferencia entre el tiempo dedicado a explorar el objeto nuevo y familiar dividido por el tiempo total explorando los dos objetos. Se considera que un índice de discriminación alto (0.3-0.5) refleja la retención de la memoria del objeto familiar.

Susceptibilidad a las convulsiones

Este rasgo se evaluó en ratones PND21 después de la administración aguda de los compuestos o su vehículo, 30 min antes de iniciar el procedimiento. Para medir la sensibilidad a las convulsiones audiogénicas, los ratones se colocaron individualmente en un entorno nuevo, un cilindro de vidrio (40 cm de alto, 16 cm de diámetro) y se dejaron explorar durante 1 min. A continuación, se hizo sonar una campana (100 dB) durante 30 segundos y la actividad convulsiva se puntuó de acuerdo con la siguiente escala: sin respuesta, 0; carrera salvaje, 1; convulsión clónica, 2; convulsión tónica, 3; estado epiléptico/paro respiratorio/muerte, 4.

Protocolo experimental

Se trataron ratones adultos (10-15 semanas de edad) de forma aguda con una dosis de CBDV en el PND 21 o se trataron una vez al día con CBDV durante 7 días consecutivos. Los ratones se evaluaron en la nueva tarea de reconocimiento de objetos después del primer y sexto día de administración de CBDV. Las dosis de CBDV utilizadas fueron 2, 10, 20, 100 y 200 mg/kg.

Resultados

La Figura 3A muestra que el tratamiento agudo no tuvo ningún efecto sobre el índice de discriminación para ratones Fmr1 modificados en ninguna de las dosis administradas. A la dosis más baja de 2 mg/kg de CBDV hubo un aumento del índice de discriminación en los ratones modificados sobre el de los ratones tratados con vehículo, sin embargo, esto no fue significativo, ni alcanzó los valores considerados para reflejar la retención de la memoria.

La Figura 3B demuestra que después del tratamiento crónico (una vez al día durante 7 días) con CBDV a dosis de 20 y 100 mg/kg hubo un aumento estadísticamente significativo en el índice de discriminación en los ratones modificados sobre los ratones modificados tratados con vehículo.

El nivel de índice de discriminación está por encima de 0.3 y, como tal, se considera que representa que los ratones tratados con estas dosis de CBDV fueron capaces de retener la memoria de objetos familiares.

En el día 21 postnatal (PND21) se inyectaron ratones KO WT y Fmr1 con CBDV (2, 10, 20 o 100 mg/kg) o vehículo, 30 min antes de la exposición a un timbre (100 dB). Los ratones expuestos a este ruido durante 30 segundos dejaron de su comportamiento exploratorio normal y reaccionaron gradualmente a carrera descontrolada, convulsiones clónicas, convulsiones tónicas o muerte. La respuesta máxima se anotó para cada ratón como se detalla en la Tabla 2 a continuación. Se calculó una puntuación de acuerdo con la gravedad de los síntomas, como se explica en la sección Métodos.

Como puede verse, los ratones FXS que recibieron la dosis más alta de 100 mg/kg de CBDV permanecieron libres de convulsiones, mientras que los que recibieron las dosis más bajas experimentaron convulsiones de diversa gravedad.

Tabla 2. Susceptibilidad a convulsiones audiogénicas en ratones Fmr1 KO y WT (PND21) después de la administración aguda (30 min) de CBDV o vehículo

Conclusiones

Estos datos demuestran que el tratamiento de 20 y 100 mg/kg de CBDV una vez al día durante 7 días en ratones que eran deficientes en el gen Fmr1 y posteriormente sufrían déficits cognitivos similares a los de los individuos con FXS, fueron capaces de revertir estos déficits cognitivos.

Además, a la dosis más alta de CBDV (100 mg/kg), el compuesto fue capaz de eliminar completamente las convulsiones que ocurren en los ratones de tipo FXS.

Como tal, la CBDV se considera una opción de tratamiento viable para el FXS.

Ejemplo comparativo 3: Uso de cannabidivarina (CBDV) en un modelo de síndrome de Rett en ratónSe evaluó la cannabidivarina fitocannabinoide (CBDV) en un modelo de ratón del síndrome de Rett (RS). Dicho modelo evalúa el tratamiento sobre alteraciones motoras y déficits cognitivos presentes en ratones MeCP2 KO. Se administró CBDV diariamente a la dosis de 2, 20 y 200 mg/kg i.p. a partir del PND 28 y se puntuaron los siguientes signos día por medio: agarrotamiento de las patas traseras (indicación de desequilibrio motor), temblor, marcha (medida de coordinación), respiración, movilidad y estado general.

Además, se evaluó la eficacia de la CBDV para revertir/atenuar los déficits de memoria a corto y largo plazo presentes en estos ratones. La prueba de Reconocimiento de Objetos Nuevos (NOR) se realizó antes del inicio del tratamiento el Día 28 Post Natal (PND 28), en el PND 41 cuando aparecen los primeros síntomas motores y en el PND 56 y 66 cuando la enfermedad se manifiesta por completo.

Materiales y métodos

La CBDV se disolvió en etanol, cremóforo y solución salina (1: 1: 18).

A partir del PND 28, los ratones recibieron una inyección intraperitoneal diaria de CBDV (o vehículo) a la dosis de 2, 20 y 200 mg/kg. Luego, los animales se puntuaron cada dos días para evaluar el efecto del tratamiento con CBDV sobre los síntomas motores (agarrotamiento de las patas traseras, marcha, movilidad), así como los signos neurológicos y las condiciones generales (anomalías respiratorias, temblores y estado general) presentes en los ratones modificados (KO) de MeCP2.

Puntuación de síntomas

Cada uno de los seis síntomas se puntuó de 0 a 2 (0 corresponde a la ausencia del síntoma o el mismo que en el animal silvestre (WT); 1 cuando el síntoma estaba presente; 2 cuando el síntoma era severo).

Movilidad: el ratón se observa cuando se coloca en un banco, luego cuando se manipula con suavidad. 0 = como WT. 1 = movimiento reducido en comparación con WT: período de congelación prolongado cuando se coloca por primera vez en un banco y períodos más prolongados sin moverse. 2 = ningún movimiento espontáneo cuando se coloca en el banco; el ratón puede moverse en respuesta a una picana suave o una bolita de comida colocada cerca.

Trastorno de la marcha: 0 = como WT. 1 = las patas traseras están más abiertas que WT al caminar o correr con una elevación pélvica reducida, lo que resulta en un andar como un pato. 2 = anomalías más graves: temblor cuando se levantan las patas, se camina hacia atrás o “saltos de conejo” levantando ambas patas traseras a la vez.

Agarrotamiento de las patas traseras: se observa el ratón cuando se suspende sujetando la base de la cola. 0 = piernas extendidas hacia afuera. 1 = las patas traseras se acercan entre sí (sin tocarse) o una pierna se introduce en el cuerpo. 2 = ambas piernas están tiradas con fuerza, ya sea tocándose entre sí o tocando el cuerpo.

Temblor: ratón observado mientras está de pie sobre la palma plana de la mano. 0 = sin temblor. 1 = temblor leve intermitente. 2 = temblor continuo o temblor violento intermitente.

Respiración: movimiento de los flancos observado mientras el animal está parado. 0 = respiración normal. 1 = períodos de respiración regular intercalados con períodos cortos de respiración más rápida o con pausas en la respiración. 2 = respiración jadeante o jadeo muy irregular.

Estado general: ratón observado para indicadores de bienestar general tales como estado del pelaje, ojos y postura corporal. 0 = pelo limpio y brillante, ojos claros y postura normal. 1 = ojos opacos, pelaje opaco/descuidado y postura algo encorvada. 2 = ojos con costra o entrecerrados, piloerección y postura encorvada.

En los PND 28, 41, 56 y 66, se investigó el efecto de CBDV sobre los déficits de memoria a corto y largo plazo mediante la prueba de reconocimiento de objetos novedosos (NOR).

Prueba de Reconocimiento de Objetos Nuevos (NOR)

El experimento se realizó como se describió anteriormente (Zamberletti E. et al. 2014 y Kruk-Stomka M. et al.

2014).

El aparato experimental usado para la prueba de Reconocimiento de Objetos Nuevos fue una caja de campo abierto (43 x 43 x 32 cm) hecha de plexiglás, colocada en una habitación con iluminación tenue. Los animales realizaron cada prueba individualmente.

Brevemente, cada animal se colocó en la arena y se le permitió explorar dos objetos idénticos nunca antes vistos durante 10 minutos (fase de familiarización). Después de un intervalo entre pruebas de 30 minutos y 24 horas, uno de los dos objetos familiares fue reemplazado por un objeto nuevo, nunca antes visto, y los ratones fueron devueltos a la arena para la fase de prueba de 10 minutos.

Durante la fase de prueba, el tiempo dedicado a explorar el objeto familiar (Ef) y el nuevo objeto (En) fue registrado por separado por dos observadores cegados a los grupos y el índice de discriminación se calculó de la siguiente manera: [(En-Ef)/(En Ef)] x 100.

Resultados

La Figura 4A muestra el efecto de CBDV (2, 20 y 200 mg/kg) sobre la ganancia de peso corporal en animales KO y de tipo silvestre. El análisis del aumento de peso corporal medido durante todo el período de tratamiento (PND 28-66) reveló que los ratones KO tratados con vehículo eran más delgados que los controles.

El tratamiento con CBDV 2, 20 y 200 mg/kg pudo prevenir parcialmente la reducción del peso corporal presente en los ratones MeCP2 KO.

Esto fue evidente cuando se calculó el área bajo la curva (AUC) (Figura 4B), mostrando claramente que el peso corporal de los ratones KO tratados con vehículo era significativamente menor que el de los ratones WT y el tratamiento con CBDV rescató significativamente el peso corporal en los ratones KO sin afectar el peso corporal en los controles WT.

La Figura 5 muestra el porcentaje de supervivencia de ratones MeCP2 KO y WT tratados con tres dosis diferentes de CBDV (2, 20 y 200 mg/kg). Los resultados se muestran como porcentaje de supervivencia con respecto al tiempo (PND).

No se observó letalidad para los ratones WT tratados con vehículo o CBDV. Por el contrario, el análisis de supervivencia medido en el PND 67 reveló que la CBDV en las tres dosis probadas fue capaz de aumentar la supervivencia en ratones KO.

En particular, las tasas de supervivencia fueron del 62.5 % en los ratones KO tratados con CBDV 2 y 20 mg/kg y del 75 % en los tratados con 200 mg/kg, en comparación con el 25 % de los ratones KO tratados con vehículo.

Las Figuras 6 y 7 describen el efecto de la CBDV crónico (2, 20 y 200 mg/kg) sobre seis signos diferentes del fenotipo (Figura 6A temblor; 6B respiración; 6C agarrotamiento de las patas traseras; 6D marcha, 7A y 7B condición general de la Figura movilidad) en ratones KO en diferentes etapas de la enfermedad.

Las tres dosis de CBDV fueron efectivas para retrasar y reducir significativamente los temblores en ratones KO en las primeras etapas de la enfermedad (PND 45-49), mientras que solo la dosis de 200 mg/kg fue capaz de reducir los temblores en las etapas posteriores de la enfermedad (PND 55 y 63). La dosis más baja, 2 mg/kg, seguía siendo protectora en el momento posterior (PND 63).

De manera similar, la administración de CBDV pudo mejorar la respiración en ratones KO. Esta mejora fue más pronunciada en ratones KO tratados con CBDV 2 mg/kg. La CBDV 2 mg/kg mejora significativamente la respiración desde el PND 56 a 60, mientras que la CBDV 20 mg/kg mostró un efecto significativo en el PND 57 y la CBDV 200 mg/kg fue efectivo en el PND 57 y 60.

Las dosis más bajas de CBDV también fueron capaces de atenuar significativamente el agarrotamiento de las patas traseras en el PND 47 y 49, mientras que CBDV 200 mg/kg no afectó significativamente a este parámetro. Por el contrario, CBDV 200 mg/kg mejoró significativamente la marcha de PND 53 a 57.

Las condiciones generales de los ratones KO (condiciones del pelaje y los ojos) mejoraron significativamente después del tratamiento con CBDV 2 y 200 mg/kg (PND 52-64); mientras que la dosis de 20 mg/kg fue significativamente eficaz sólo en el momento anterior (PND 52). El efecto de la CBDV sobre la movilidad fue menos intenso, ya que alcanzó significación estadística solo en el PND 64.

Para analizar mejor el efecto de la CBDV crónico (2, 20 y 200 mg/kg) sobre la progresión de los signos en animales KO, las puntuaciones individuales se agruparon en una puntuación total de síntomas que se representa en la Figura 8.

La puntuación total de síntomas confirma la observación de que el tratamiento con CBDV en las tres dosis ensayadas es capaz de retrasar y atenuar la aparición del fenotipo en ratones KO en comparación con animales con vehículo KO.

La dosis de 2 mg/kg mejoró significativamente la puntuación total de los síntomas en cada momento (PND 45, 47, 49, 55, 56, 57, 58, 60 y 64). La dosis de 20 mg/kg tuvo un efecto similar, pero fue menos eficaz en el momento posterior (PND 64). La dosis de 200 mg/kg ejerció un efecto beneficioso en un momento posterior (PND 47) y su efecto protector fue evidente hasta el PND 58.

La Figura 9 muestra el efecto de CBDV (2, 20 y 200 mg/kg) sobre la memoria a corto plazo en la prueba NOR a diferentes edades.

En animales KO, se encontró un deterioro cognitivo significativo en la memoria a corto plazo en el PND 28, un momento en el que los síntomas motores no están presentes. Este deterioro todavía estaba presente y era significativo en los PND 41, 56 y 66, cuando la enfermedad se manifiesta por completo.

En cada punto de tiempo considerado, la administración de las tres dosis diferentes de CBDV revirtió significativamente el deterioro cognitivo en la memoria a corto plazo presente en ratones KO sin afectar la memoria de reconocimiento cuando se administraron a compañeros de camada WT.

La Figura 10 muestra el efecto de CBDV (2, 20 y 200 mg/kg) sobre la memoria a largo plazo en la prueba NOR a diferentes edades.

Similar a lo que se ha observado para la memoria a corto plazo; las tres dosis de CBDV administradas también pudieron contrarrestar significativamente el deterioro cognitivo en la memoria a largo plazo presente en los ratones KO sin afectar la memoria de reconocimiento cuando se administraron a los compañeros de camada WT.

Conclusiones

Estos datos demuestran que el tratamiento con CBDV fue eficaz para retrasar y atenuar el fenotipo de los ratones MeCP2 KO. El tratamiento con CBDV pudo recuperar significativamente los déficits en la memoria a corto y largo plazo presentes en esos animales.

Además, todas las dosis probadas tuvieron efectos beneficiosos similares en la atenuación del fenotipo y la reversión de los déficits cognitivos.

Además del efecto beneficioso en términos de aparición total de síntomas, hay que destacar la sorprendente recuperación de los déficits cognitivos inducidos por CBDV en ratones MeCP2 KO, que aún está presente y es significativa también en etapas muy tardías de la enfermedad (PND 66).

Es importante destacar que las tasas de supervivencia en ratones KO tratados con CBDV están en un rango entre 62.5 y 75 % con respecto al valor del 25 % en ratones KO tratados con vehículo.

Estos datos indican que CBDV ofrece una opción de tratamiento significativa en el tratamiento de RS.

Ejemplo comparativo 4: Uso de cannabidivarina (CBDV) en un modelo de ratón del síndrome de Angelman

Se probó el efecto de la CBDV en el tratamiento de convulsiones y trastornos neurológicos, del comportamiento y motores en un modelo de ratón transgénico del síndrome de Angelman.

Materiales y métodos

Animales

Se adquirieron ratones heterocigotos con deficiencia materna de Ube3A (Ube3am-/p ) y de tipo silvestre (Ube3am /p ) de The Jackson Laboratory (código Jackson: B6.129S7-Ube3a tm1Alb/J) y se mantuvieron en un C57BL/6 antecedentes.

Los animales se alojaron bajo iluminación controlada (ciclo de luz/oscuridad 12: 12 horas; luz encendida 6 horas) y condiciones ambientales (temperatura ambiente: 20 °C-22 °C, humedad: 55 % -60 %) con comida y el agua del grifo estaban disponibles ad libitum.

Fármacos y tratamiento

Los fármacos se disolvieron en etanol: cremofor: solución salina al 0.9% 1: 1: 18, para administración intraperitoneal (i.p.). El tratamiento farmacológico se realizó diariamente durante 35 días. La CBDV se administró a 20 mg/kg.

Para las pruebas de convulsiones audiogénicas, se administró CBDV a 20, 200 y 400 mg/kg.

Pruebas de comportamiento

Varilla giratoria: la prueba de varilla giratoria evalúa el equilibrio y la coordinación motora de los ratones. Se ha medido a los ratones el tiempo (en segundos) de equilibrio antes de caer sobre un cilindro rotatorio mediante un imán que, activado por la caída del ratón sobre el plato, permite registrar el tiempo de permanencia en el cilindro. Después de un período de adaptación de 30 s, la velocidad de centrifugado aumentó gradualmente de 3 a 30 rpm durante un tiempo máximo de 5 min. Los animales se analizaron mediante 2 ensayos separados en un intervalo de 1 h en el mismo día.

Agarrotamiento: La prueba de agarrotamiento evalúa la ataxia en ratones. Los ratones fueron suspendidos por la base de la cola y se registraron sus comportamientos durante 30 segundos. Se registró el tiempo durante el cual los ratones agarraron sus patas traseras. A continuación, se puntuó el tiempo de la siguiente manera: 4, 15-30 s, 3, 10-15 s, 2, 5-10 s, 1, 0-5 s y 0.0 s

Suspensión de la cola: la prueba de suspensión de la cola evalúa el comportamiento de tipo depresivo en ratones. Los ratones fueron suspendidos individualmente por la cola en una barra horizontal (50 cm del piso) usando cinta adhesiva colocada aproximadamente a 4 cm de la punta de la cola. La duración de la inmovilidad se registró en segundos durante un período de 6 minutos mediante un registrador de tiempo. El tiempo de inmovilidad se definió como la ausencia de un comportamiento orientado al escape.

Reconocimiento de objetos novedosos: el reconocimiento de objetos novedosos evalúa la memoria de reconocimiento en ratones. El experimento comenzó con el período de habituación, durante el cual se puede obtener los ratones explorar libremente durante 1 hora el aparato que consiste en una caja rectangular abierta (40 x 30 x 30 cm ancho x largo x alto) hecha de cloruro de polivinilo gris (PVC) iluminado por una luz tenue. El día después de que se dejara a cada ratón explorar dos objetos idénticos colocados en las esquinas traseras y derecha durante 5 minutos (adquisición). Una cámara de vídeo registró el tiempo dedicado a la exploración de cada objeto. En la prueba de prueba, que se llevó a cabo durante 2 horas después de la adquisición, uno de los dos objetos fue reemplazado por un nuevo objeto diferente. El tiempo dedicado a explorar el objeto fue el tiempo que pasó el ratón con la nariz dirigida y a menos de 1 cm del objeto. El comportamiento de los ratones fue analizado por un observador cegado al tratamiento. Los datos se expresan como porcentaje del índice de reconocimiento (IR%), que se calculó como el porcentaje del tiempo dedicado a explorar el objeto nuevo/tiempo dedicado a explorar el objeto nuevo tiempo dedicado a explorar el objeto familiar x 100.

Susceptibilidad a las convulsiones: se indujeron convulsiones audiogénicas raspando vigorosamente las tijeras a través de la rejilla metálica de la tapa de la jaula, lo que produce un ruido fuerte de alta frecuencia de 100DB. Esto se hizo durante 20 segundos. Esta prueba consta de 3 fases. En la fase 1, todos los ratones fueron analizados para detectar epilepsia. En la fase 2, a todos los ratones se les inyectó diariamente un vehículo o un fármaco durante 7 o 10 días. En la fase 3, se analizaron los ratones para detectar epilepsia (una hora después de la última inyección).

Análisis estadístico: los datos de comportamiento se representan como medias ± EEM y el análisis estadístico de estos datos se realizó mediante análisis de varianza de dos vías (ANOVA) para medidas repetidas seguido por Student Newman-Keuls para comparaciones múltiples para determinar la significación estadística entre diferentes grupos tratados de ratón. p <0.05 se consideró estadísticamente significativo.

Resultados

La Figura 11 muestra que los ratones AS tratados con vehículo mostraron una duración de agarrotamiento significativamente mayor a las 10 semanas de edad en comparación con los ratones WT tratados con vehículo. En ratones AS, el tratamiento crónico (30 días) con CBDV redujo significativamente la duración del agarrotamiento a las 10 semanas de edad en comparación con los ratones AS tratados con vehículo.

La Figura 12 demuestra que los ratones AS tratados con vehículo mostraron un deterioro motor significativo a las 10 semanas en comparación con los ratones WT tratados con vehículo. En los ratones AS, el tratamiento crónico (30 días) con CBDV redujo la latencia de caída en comparación con los ratones AS tratados con vehículo.

Los ratones se evaluaron a la edad de 7-8 semanas en la nueva prueba de reconocimiento de objetos. Los ratones AS tratados con vehículo mostraron una disminución significativa en el índice de discriminación en comparación con los ratones WT que recibieron el mismo tratamiento. La Figura 13 muestra que los ratones AS tratados con CBDV aumentaron significativamente el índice de discriminación en comparación con los ratones AS tratados con vehículo.

La Figura 14 muestra que en la prueba de suspensión de la cola el tiempo de inmovilidad fue significativamente mayor en los ratones As que recibieron vehículo en comparación con los ratones WT que recibieron el mismo tratamiento. En ratones A<s>, el tratamiento con CBDV redujo significativamente la duración del tiempo de inmovilidad en comparación con los ratones AS tratados con vehículo.

La Figura 15 demuestra que los ratones de tipo silvestre no eran susceptibles a ataques audiogénicos. La CBDV administrada a 20 mg/kg o 200 mg/kg no tuvo ningún efecto sobre la susceptibilidad a las convulsiones, ya que hubo muy pocos cambios en el número de ratones con convulsiones en comparación con el valor inicial después de 7 o 10 días de tratamiento. Sin embargo, en los ratones tratados con 400 mg/kg de CBDV hubo una disminución estadísticamente significativa en el número de ratones con convulsiones, por lo que después de 7 días de tratamiento, el número de ratones que experimentaron convulsiones disminuyó del 100 % al 60 % y después de 10 días de tratamiento este número había disminuido aún más al 30 %.

Conclusión

Estos datos demuestran que el tratamiento de 20 mg/kg de CBDV a ratones que eran deficientes en el gen Ube3A y posteriormente sufrían déficits cognitivos similares a los de los individuos con AS, fueron capaces de revertir estos déficits cognitivos.

Además, a una dosis más alta de 400 mg/kg, la CBDV pudo reducir la susceptibilidad a las convulsiones de los ratones Angelman en un 70 % después de 10 días de tratamiento.

Como tal, la CBDV se considera una opción de tratamiento viable para la AS.

Ejemplo 5: uso de cannabidivarina (cbdv) en un modelo de rata con esquizofrenia

El fitocannabinoide cannabidivarina (CBDV) se evaluó en un modelo de esquizofrenia en ratas.

Estos datos demuestran la capacidad de la CBDV (2, 10 y 20 mg/kg), en comparación con el control positivo risperidona, para atenuar la interrupción de una tarea cognitiva inducida por el tratamiento subcrónico con fenciclidina (PCP) en ratas.

Se cree que el efecto del PCP en la prueba de reconocimiento de objetos nuevos (NOR) modela déficits de memoria de reconocimiento visual similares a los observados en la esquizofrenia. Los antipsicóticos atípicos, clozapina y risperidona, pueden atenuar el déficit.

También se ha probado un modelo animal adicional para evaluar el dominio de abulia de los síntomas negativos de la esquizofrenia, la falta de comportamiento social, con CBDV utilizando la administración subcrónica de PCP a ratas. El PCP induce un déficit de conducta social en ratas en su interacción con una rata de control de peso equivalente tratada con vehículo.

Materiales y métodos

Animales

Rats were randomly assigned to two treatment groups and treated with vehicle, n=20 (distilled water, i.p.) or Phencyclidine hydrochloride (PCP), n=100 (2 mg/kg, i.p. twice daily for 7-days). PCP was dissolved in distilled water. This was followed by a 7-day wash out period before the rats were tested following acute treatment with CBDV, risperidone or vehicle.

Se utilizaron ratas Lister encapuchadas hembra para este experimento. Las ratas se alojaron en grupos de 5 en condiciones de laboratorio estándar bajo un ciclo de luz: oscuridad de 12 horas, con las luces encendidas a las 07:00 horas. La prueba se llevó a cabo en la fase de luz.

Tratamiento

Las ratas se asignaron aleatoriamente a dos grupos de tratamiento y se trataron con vehículo, n = 20 (agua destilada, i.p.) o clorhidrato de fenciclidina (PCP), n = 100 (2 mg/kg, i.p. dos veces al día durante 7 días). El PCP se disolvió en agua destilada. A esto le siguió un período de lavado de 7 días antes de que las ratas fueran evaluadas después del tratamiento agudo con CBDV, risperidona o vehículo.

Se disolvió risperidona (0,1 mg/kg) en un volumen mínimo de ácido acético, se completó con agua destilada y se ajustó el pH a 6 con NaOH 0,1 M y se administró por vía i.p. en un volumen de 1 ml/kg, 60 min antes de la prueba.

Se disolvió CBDV a 2, 10 o 20 mg/kg en 2:1:17 (etanol:Cremofor:solución salina al 0,9 %) y se administró por vía i.p. en un volumen de 5 ml/kg, 60 min antes de la prueba.

Prueba de reconocimiento de objetos nuevos

Habituación:

Se permitió que las ratas se habituaran a la caja de prueba vacía y al ambiente de la sala de prueba de comportamiento durante 1 hora el día 1. Antes de la prueba de comportamiento el día 2, las ratas recibieron 3 minutos más de habituación.

Prueba de comportamiento:

Después del período de habituación de 3 minutos, las ratas reciben dos ensayos de 3 minutos (T1 y T2) que están separados por un intervalo entre ensayos de 1 minuto en la jaula de la casa durante el cual se cambian los objetos. El comportamiento en todos los ensayos se grabó en vídeo para la puntuación ciega posterior. T1 = Ensayo 1, el ensayo de adquisición:

En este ensayo, se permite a los animales explorar dos objetos idénticos (A1 y A2) durante 3 minutos.

T2 = Ensayo 2, el ensayo de retención:

En este ensayo, los animales exploran un objeto familiar (A) de T1 y un objeto nuevo (B) durante 3 minutos. El objeto familiar presentado durante T2 es un duplicado del objeto presentado en T1 para evitar cualquier rastro olfativo.

Exploración de objetos:

La exploración de objetos se define por el hecho de que los animales lamen, huelen o tocan el objeto con las patas delanteras mientras huelen, pero sin apoyarse, darse la vuelta, pararse o sentarse sobre el objeto. El tiempo de exploración de cada objeto (A, B, familiar y nuevo) en cada ensayo se registra utilizando dos cronómetros y se calculan los siguientes factores:

Tiempo total de exploración de ambos objetos en los ensayos de adquisición.

Tiempo total de exploración de ambos objetos en los ensayos de retención.

La habituación a la actividad exploratoria incluye el tiempo de exploración, medido por el número de líneas cruzadas, para ambos ensayos.

Índice de discriminación (ID), que se calcula como se muestra a continuación:

(Time spent exploring novel object - time spent exploring familiar object)

Total time spent in exploring the objects

Prueba de interacción social

La prueba de interacción social se realiza en un campo abierto que comprende una caja cuadrada hecha de plexiglás (52 * 52 * 31 cm) colocada a 27 cm por encima del suelo sobre un carro móvil. El suelo de la caja es blanco con líneas de cuadrícula negras que forman 9 cuadrados idénticos sobre este. Todas las demás paredes son negras. Una cámara de vídeo conectada a una grabadora de vídeo y un monitor se coloca encima de la caja. El objeto utilizado para la prueba consiste en una estructura pesada hecha de metal que los animales no pueden desplazar. Se tiene cuidado de garantizar que estos objetos no tengan un significado natural para las ratas.

Las ratas se acostumbraron al entorno y la arena de prueba antes del día de la prueba. La habituación consiste en colocar todas las ratas de una jaula juntas en la arena de prueba vacía durante una hora durante tres días, incluido el día anterior al día de la prueba.

Se colocaron pares de ratas, de peso similar (15-20 g) y que no se conocían entre sí, que no recibieron tratamiento (n = 70 ratas "conespecíficas") o tratamientos diferentes (PCP y vehículo; n = 10 ratas "probadas" o P C P F árm aco ; n = 50 ra tas "p ro b a d a s ") en la a rena de p rueba ju n ta s du ra n te 10 m in u to s y se eva luó el c o m p o rta m ie n to com o se d e sc rib e a con tin ua c ió n .

También se coloca un objeto inanimado, como una lata de bebida sin abrir, en el centro de la arena para medir las diferencias en la interacción del animal de prueba con un animal desconocido en comparación con un objeto desconocido. Después de cada prueba de 10 minutos, el objeto y la arena se limpian con alcohol al 10 % en un intento de eliminar los rastros de cualquier señal olfativa. Todas las pruebas se llevan a cabo con niveles de iluminación de sala estándar (70 cd/m2).

El comportamiento en ambos ensayos se grabó en vídeo para su posterior puntuación a ciegas. Se utiliza un programa de software de puntuación del comportamiento (Hindsight, Scientific programming services) para puntuar los siguientes parámetros:

Comportamiento de olfateo de investigación: olfatear el hocico del congénere o partes del cuerpo, incluida la región anogenital;

Seguimiento: la rata se mueve detrás del congénere, es decir, una rata tratada con vehículo de la misma especie, alrededor de la arena;

Evitación: alejarse activamente cuando se acerca el animal congénere;

Investigación del objeto: exploración del objeto colocado en el centro de la arena; y

La actividad locomotora se registra contando el número total de sectores (es decir, líneas) cruzados por la rata de prueba.

Resultados

La Figura 16A muestra el tiempo empleado en investigar dos objetos idénticos en el Ensayo 1, como se puede ver, las ratas no muestran una preferencia real por los dos objetos idénticos, ya sea que hayan sido tratadas con CBDV, risperidona o vehículo.

La Figura 16B muestra el tiempo empleado en investigar los dos objetos cuando un objeto es familiar y otro es nuevo. En las ratas tratadas con PCP a las que no se les administró ni CBDV ni el control positivo risperidona, no hay diferencia entre el tiempo empleado en investigar ambos objetos. En las ratas tratadas con vehículo que no fueron tratadas con PCP y, como tales, no sufrieron disfunción cognitiva, hubo una diferencia estadísticamente significativa entre el tiempo empleado en investigar los objetos con una preferencia por el objeto nuevo. Esto, por lo tanto, muestra que los animales sin disfunción cognitiva fueron capaces de discriminar entre el objeto que les era familiar y el que era nuevo. En comparación, los ratones tratados con PCP mostraron que debido a la disfunción cognitiva no podían recordar el objeto con el que se habían familiarizado en el Ensayo 1.

La Figura 16B también muestra que a una dosis de 10 y 20 mg/kg, la CBDV pudo revertir la disfunción cognitiva provocada en las ratas tratadas con PCP, de modo que pudieron discriminar entre objetos familiares y nuevos. Este efecto también se mostró en el control positivo con risperidona.

La Figura 17 muestra el índice de discriminación (ID) para los tratamientos. De acuerdo con los datos que se muestran en la Figura 15B, las ratas tratadas con 10 y 20 mg/kg produjeron un aumento estadísticamente significativo en el ID en ratas con PCP.

Las Figuras 18 A a C describen los datos producidos en la prueba de interacción social. Como se puede ver, las ratas que fueron tratadas con PCP mostraron una disminución en el olfateo y seguimiento de la otra rata. Además, el tratamiento con PCP produjo un aumento en el tiempo dedicado a evitar a la otra rata. En conjunto, estos datos demuestran que el tratamiento con PCP produjo síntomas de retiro social en las ratas.

La CBDV fue capaz de revertir estos efectos de una manera estadísticamente significativa, al igual que el control positivo risperidona. La Figura 18A muestra que la CBDV en dosis de 10 y 20 mg/kg aumentó significativamente el tiempo dedicado a oler a la otra rata. La Figura 18B muestra que la CBDV en una dosis de 20 mg/kg también aumentó la cantidad de tiempo dedicado a seguir a la otra rata. Este efecto no se observó como significativo en el control positivo risperidona; sin embargo, la cantidad de tiempo aumentó con respecto al del grupo de PCP solo.

La Figura 18C demuestra que la CBDV a 20 mg/kg fue capaz de reducir la cantidad de tiempo que la rata de prueba pasó evitando a la otra rata.

Conclusión

Los datos descritos en este ejemplo demuestran que la administración de CBDV a ratas tratadas con PCP fue capaz de tratar tanto la disfunción cognitiva como los efectos negativos que se producen en estos animales.

Dichos datos demuestran que la CBDV es una opción de tratamiento adecuada para la esquizofrenia, en particular los síntomas de esquizofrenia asociados con la disfunción cognitiva y los síntomas negativos como el retiro social.

Conclusión general

Los ejemplos 1 a 5 anteriores describen el uso de CBDV en un modelo de ASD, tres modelos de trastornos asociados con ASD y un model de esquizofrenia. Inesperadamente, se ha demostrado que la CBDV produce una reversión estadísticamente significativa de los síntomas asociados con estos trastornos.

En particular, se ha demostrado que la CBDV produce resultados positivos en la prueba de Reconocimiento de Objetos Nuevos (NOR) en todos los modelos y, como tal, demuestra inequívocamente que este fitocannabinoide podría revertir la disfunción cognitiva en estos trastornos.

Además, otras pruebas en estos modelos respaldan que la CBDV podría usarse para tratar síntomas adicionales asociados con estos trastornos. La CBDV pudo reducir los comportamientos repetitivos, la hiperactividad y la sociabilidad en el modelo de ASD. La CBDV también pudo reducir la disminución del peso corporal y la supervivencia en un modelo de síndrome de Rett, además de mejorar el estado general y los síntomas en estos animales, como la movilidad y la respiración. Además, la CBDv pudo reducir los síntomas de ataxia y ansiedad en un modelo de síndrome de Angelman. Por último, el tratamiento con CBDV pudo reducir los síntomas negativos del retiro social en un modelo de esquizofrenia.

Tomados en conjunto, la CBDV es capaz de proporcionar una opción de tratamiento eficaz a los individuos que padecen ASD, trastornos asociados a ASD y esquizofrenia.

Referencias:

Hill T et al. (2012) Br J Pharmacol. Dec;167(8):1629-42. Cannabidivarin is anticonvulsant in mouse and rat.

Erica Zamberletti, Sarah Beggiato, Luca Steardo Jr., Pamela Prini, Tiziana Antonelli, Luca Ferraro, Tiziana Rubino, Daniela Parolaro. Neurobiology of Disease (2014), Volume 63, Pages 35-47. “Alterations of prefrontal cortex GABAergic transmission in the complex psychotic-like phenotype induced by adolescent delta-9-tetrahydrocannabinol exposure in rats.”

Kurz and Blass 2010 Use of dronabinol (delta-9-THC) in autism: A prospective single-case study with an early infantile autistic child. Cannabinoids, 5 (4) 4-6.

Marta Kruk-Stomka, Agnieszka Michalak, Barbara Budzyn'ska, Graz- yna Biaa. Pharmacological Reports 66 (2014), 638-646. “A comparison of mecamylamine and bupropion effects on memory-related responses induced by nicotine and scopolamine in the novel object recognition test in mice.”

Claims (11)

REIVINDICACIONES

1. Cannabidivarina (CBDV) para su uso en el tratamiento de los síntomas negativos en la esquizofrenia.

2. CBDV para su uso según la reivindicación 1, en la que los síntomas negativos en la esquizofrenia son el aislamiento social en la esquizofrenia.

3. CBDV para su uso según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en la que el CBDV se utiliza en combinación con uno o más medicamentos concomitantes.

4. CBDV para su uso según la reivindicación 3, en la que el uno o más medicamentos concomitantes son un fármaco antiepiléptico (FAE), un fármaco antipsicótico, melatonina, ISRS o metilfenidato.

5. CBDV para uso según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en la que la CBDV es sustancialmente pura.

6. CBDV para uso según la reivindicación 5, en la que la CBDV está presente como un extracto altamente purificado de cannabis que comprende al menos un 95 % (p/p) de CBDV.

7. CBDV para uso según la reivindicación 6, en la que el extracto comprende menos de un 0.15 % de THC.

8. CBDV para uso según la reivindicación 5, en la que la CBDV está presente como un compuesto sintético.

9. CBDV para uso según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en la que la dosis de CBDV es superior a 0.01 mg/kg/día.

10. CBDV para uso según la reivindicación 4, en la que la dosis de CBDV está entre 1 y 30 mg/kg/día.

11. CBDV para uso según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en la que la CBDV se administra como una formulación oral.