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ES2990113T3 - Conjugados de adyuvantes de anticuerpos - Google Patents

Conjugados de adyuvantes de anticuerpos Download PDF

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ES2990113T3
ES2990113T3 ES17825059T ES17825059T ES2990113T3 ES 2990113 T3 ES2990113 T3 ES 2990113T3 ES 17825059 T ES17825059 T ES 17825059T ES 17825059 T ES17825059 T ES 17825059T ES 2990113 T3 ES2990113 T3 ES 2990113T3
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ES
Spain
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rituximab
immunoconjugate
hours
unconjugated
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Active
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ES17825059T
Other languages
English (en)
Inventor
Michael Nathaniel Alonso
Edgar George Engleman
Shelley Erin Ackerman
Justin Kenkel
Arthur Lee
David Y Jackson
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Board Of Trustees Of Leland Stanfordjunior Univ
Bolt Biotherapeutics Inc
Original Assignee
Board Of Trustees Of Leland Stanfordjunior Univ
Bolt Biotherapeutics Inc
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
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Abstract

La invención proporciona un inmunoconjugado que comprende una construcción de anticuerpo que incluye un dominio de unión a antígeno y un dominio Fc, una fracción adyuvante y un enlazador, en donde cada fracción adyuvante está unida covalentemente al anticuerpo a través del enlazador. También se describen métodos para tratar el cáncer con los inmunoconjugados de la invención. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

DESCRIPCIÓN
Conjugados de adyuvantes de anticuerpos
Antecedentes de la invención
Actualmente es bien sabido que el crecimiento tumoral requiere la adquisición de mutaciones que faciliten la evasión inmunitaria. Aun así, la oncogénesis da como resultado la acumulación de antígenos mutados, o neoantígenos, que el sistema inmunitario del huésped reconoce fácilmente después de la estimulación ex vivo. Se está empezando a dilucidar por qué y cómo el sistema inmunitario no reconoce los neoantígenos. Estudios innovadores de Carmi et al.(Nature,521: 99-104 (2015)) han indicado que la ignorancia inmunitaria se puede superar administrando neoantígenos a las células dendríticas activadas por medio de complejos inmunitarios anticuerpo-tumor. En estos estudios, la administración simultánea de anticuerpos de unión a tumores y adyuvantes de células dendríticas mediante inyecciones intratumorales dio como resultado una sólida inmunidad antitumoral. Se necesitan nuevas composiciones y métodos para la administración de anticuerpos y adyuvantes de células dendríticas para llegar a tumores inaccesibles y ampliar las opciones de tratamiento para pacientes con cáncer y otros sujetos.
El documento WO 2015/103989 A1 describe compuestos de inmunoterapia dirigida. Se describe que los compuestos son útiles en el tratamiento de enfermedades tales como el cáncer. Robert Schwenk et al, PLOS ONE, vol. 9, núm. 10, páginas e111020-e111020, se refiere a "lgG2 Antibodies against a Clinical Grade Plasmodium falciparum CSP Vaccine Antigen Associate with Protection against Transgenic Sporozoite Challenge in Mice".
Breve compendio de la invención
En un primer aspecto, la invención proporciona un inmunoconjugado que comprende (a) un constructo de anticuerpo que comprende (i) un dominio de unión al antígeno y (ii) un dominio F<c>, (b) un adyuvante de fórmula:
en el que cada J independientemente es hidrógeno, OR4, o R4; cada R4 independientemente es hidrógeno, o un grupo alquilo, heteroalquilo, cicloalquilo, heterocicloalquilo, arilo, heteroarilo, arilalquilo<o>heteroarilalquilo que comprende de 1 a 8 unidades de carbono; cada U es independientemente CH<o>N en el que por lo menos una U es N; cada subíndice t independientemente es un número entero de 1 a 3; y Q está ausente, y la línea discontinua
' ''d e l adyuvante representa el punto de unión del adyuvante, y (c) un enlazador, en el que cada adyuvante está unido de forma covalente al constructo de anticuerpo por medio del enlazador.
Se definen otros aspectos y realizaciones de la invención en las reivindicaciones adjuntas.
Breve descripción de los dibujos
La invención se entenderá mejor a partir de la siguiente descripción detallada cuando se lea junto con los dibujos adjuntos. Según la práctica habitual, las diversas características de los dibujos no están a escala. Por el contrario, las dimensiones de las diversas características se amplían o reducen arbitrariamente para una mayor claridad.
La figura 1 muestra que el adyuvante funcionalizado es un potente inductor de la activación de las células mieloides. Se estimularon células presentadoras de antígenos (APC) de sangre periférica con diluciones seriadas 10 veces de R848, el compuesto 2 o un agonista de TLR de control a 370C. Después de 18 horas, las células se analizaron mediante citometría de flujo. Los datos se presentan como la intensidad de fluorescencia media de cada marcador indicado; n=3.
La figura 2 muestra que los adyuvantes funcionalizados mantienen la actividad agonista de TLR. Las células HEK293 se cotransfectaron con TLR7 o TLR8 humano (dos paneles superiores) o TLR7 murino (panel inferior) y un gen indicador de fosfatasa alcalina embrionaria secretada inducible bajo el control del promotor mínimo de IFNp fusionado a NF-kB y Ios sitios de unión de AP-1. Posteriormente, las células se incubaron con diluciones seriadas al doble del adyuvante indicado durante 12 horas a 37 °C. La actividad se midió mediante espectrofotometría (DO 650 nm) después de la adición de sustrato de fosfatasa alcalina.
La figura 3 muestra el análisis de compuestos enlazadores adyuvantes por medio de cromatografía de líquidosespectrometría de masas (LC-MS).
La figura 4 muestra que I<os>conjugados de anticuerpo y adyuvante son superiores a la hora de provocar la activación de APC, en comparación con el anticuerpo y el adyuvante no conjugados, como se indica con la expresión de CD40, CD86 y HLA-DR. Las APC humanas se estimularon con rituximab-SATA-SMCC-compuesto 1 (conjugado), rituximab solo (Ab), el compuesto 1 solo o rituximab compuesto 1 (mezcla) en presencia de células tumorales CD19+ marcadas con CFSE. Después de 18 horas, se analizaron las APC humanas CD19- mediante citometría de flujo; n=3. Valores de p < 0.05 representado por *, valores de p < 0.01 representado por **, valores de p < 0.001 representado por ***, valores de p < 0.0001 representado por ****.
La figura 5 muestra que I<os>conjugados de anticuerpo y adyuvante inducen niveles más bajos de expresión de PD-L1 en APC humanas, en comparación con el anticuerpo y el adyuvante no conjugados. Las APC humanas se estimularon con rituximab-SATA-SMCC-compuesto 1 (conjugado), rituximab solo (Ab), el compuesto 1 solo<o>rituximab compuesto 1 (mezcla) en presencia de células tumorales CD19+ marcadas con CFSE. Después de 18 horas, se analizaron las APC humanas CD19' mediante citometría de flujo; n=3. Valores de p < 0.05 representado por *, valores de p < 0.01 representado por **, valores de p < 0.001 representado por ***, valores de p < 0.0001 representado por ****
La figura 6 muestra que I<os>conjugados de anticuerpo y adyuvante provocan la diferenciación de DC. Las APC humanas que eran aproximadamente el ~95 % de monocitos se estimularon con diluciones seriadas al doble de rituximab-SATA-SMCC-compuesto 1 (conjugado), rituximab solo (Ab), el compuesto 1 solo<o>rituximab compuesto 1 (mezcla) en presencia de células tumorales marcadas con CFSE. Después de 18 horas, se analizaron las APC humanas CD19' mediante citometría de flujo; n=3. Valores de p < 0.05 representado por *, valores de p < 0.01 representado por **, valores de p < 0.001 representado por ***, valores de p < 0.0001 representado por
La figura 7 muestra que I<os>conjugados de anticuerpo y adyuvante son superiores a las mezclas de anticuerpo no conjugado y adyuvante a la hora de provocar la secreción de citocinas proinflamatorias de las APC humanas. Las APC humanas se estimularon con diluciones seriadas al doble de rituximab-SATA-SMCC-compuesto 1 (conjugado), rituximab solo (Ab), el compuesto 1 solo<o>rituximab compuesto 1 (mezcla) en presencia de células tumorales fijadas marcadas con CFSE. Después de 18 horas, se analizó la secreción de citocinas en Ios sobrenadantes libres de células mediante matrices de perlas de citocinas; n=3. Valores de p < 0.05 representado por *, valores de p < 0.01 representado por **, valores de p < 0.001 representado por ***, valores de p < 0.0001 representado por ****
La figura 8A muestra que I<os>inmunoconjugados con enlazadores escindibles provocan la activación de APC y la diferenciación de DC. Las APC humanas que eran aproximadamente el ~95 % de monocitos se estimularon con diluciones seriadas al doble de rituximab-SATA-SPDP-compuesto 1 (conjugado, escindible), rituximab solo (Ab), el compuesto 1 solo o rituximab compuesto 1 (mezcla) en presencia de células tumorales marcadas con CFSE. El inmunoconjugado (AAC - escindible) tenía una relación entre el fármaco y el anticuerpo (DAR) de 1.4, según se confirmó por Ma LDI-To F. Después de 18 horas, se analizaron las APC humanas CD19- (c D14 y CD123) mediante citometría de flujo; n=3.
La figura 8B muestra que I<os>inmunoconjugados (AAC) con enlazadores escindibles provocan la activación de APC y la diferenciación de DC. Las a Pc humanas que eran aproximadamente el ~95 % de monocitos se estimularon con diluciones seriadas al doble de rituximab-SATA-SPDP-compuesto 1 (conjugado, escindible), rituximab solo (Ab), el compuesto 1 solo<o>rituximab compuesto 1 (mezcla) en presencia de células tumorales marcadas con CFSE. L<os>inmunoconjugados (AAC - escindible) tenían una relación entre el fármaco y el anticuerpo (DAR) de 1.4, según se confirmó por MALDI-TOF. Después de 18 horas, se analizaron las Ap C humanas CD19- (<c>D16 y CD163) mediante citometría de flujo; n=3.
La figura 8C muestra que I<os>inmunoconjugados con enlazadores escindibles provocan la activación de APC y la diferenciación de DC. Las APC humanas que eran aproximadamente el ~95 % de monocitos se estimularon con diluciones seriadas al doble de rituximab-SATA-SPDP-compuesto 1 (conjugado, escindible), rituximab solo (Ab), el compuesto 1 solo<o>rituximab compuesto 1 (mezcla) en presencia de células tumorales marcadas con CFSE. Los inmunoconjugados (AAC - escindible) tenían una relación entre el fármaco y el anticuerpo (DAR) de 1.4, según se confirmó por MALDI-TOF. Después de 18 horas, se analizaron las APC humanas C<d>19- (C<d>40 y PDL1) mediante citometría de flujo; n=3.
La figura 9A muestra que I<os>conjugados de anticuerpo y adyuvante reducen I<os>tumoresin vivo.A ratones C57BL/6 con tumores B16F10 en el flanco derecho se les inyectó intratumoralmente PBS (sin tratar), ciGP75 compuesto 1 (mezcla)<o>aGP75-SATA-SMCC-compuesto 1 (<ci>GP75 inmunoconjugado).
La figura 9B muestra que el<q>GP75 inmunoconjugado reduce I<os>tumoresin vivocuando se administra mediante inyección intratumoral (IT) o intravenosa (IV).
La figura 10A muestra el análisis de ipilimumab mediante LC-MS.
La figura 10B muestra que los conjugados de ipilimumab-adyuvante (Ipilimumab Boltbody) son superiores a la hora de provocar la activación de APC, en comparación con ipilimumab no conjugado, como se indica con la expresión de HLA-DR.
La figura 10C muestra que los conjugados de ipilimumab-adyuvante (Ipilimumab Boltbody) son superiores a la hora de provocar la activación de APC, en comparación con ipilimumab no conjugado, como se indica con la expresión de CD14.
La figura 10D muestra que los conjugados de ipilimumab-adyuvante (Ipilimumab Boltbody) son superiores a la hora de provocar la activación de APC, en comparación con ipilimumab no conjugado, como se indica con la expresión de CD40.
La figura 10E muestra que los conjugados de ipilimumab-adyuvante (Ipilimumab Boltbody) son superiores a la hora de provocar la activación de APC, en comparación con ipilimumab no conjugado, como se indica con la expresión de CD86.
La figura 11A muestra el análisis de pembrolizumab mediante LC-MS.
La figura 11B muestra que los conjugados de pembrolizumab-adyuvante (Pembrolizumab Boltbody) son superiores a la hora de provocar la activación de APC, en comparación con pembrolizumab no conjugado, como se indica con la expresión de HLA-DR.
La figura 11C muestra que los conjugados de pembrolizumab-adyuvante (Pembrolizumab Boltbody) son superiores a la hora de provocar la activación de APC, en comparación con pembrolizumab no conjugado, como se indica con la expresión de CD14.
La figura 11D muestra que los conjugados de pembrolizumab-adyuvante (Pembrolizumab Boltbody) son superiores a la hora de provocar la activación de APC, en comparación con pembrolizumab no conjugado, como se indica con la expresión de CD40.
La figura 11E muestra que los conjugados de pembrolizumab-adyuvante (Pembrolizumab Boltbody) son superiores a la hora de provocar la activación de APC, en comparación con pembrolizumab no conjugado, como se indica con la expresión de CD86.
La figura 12A muestra el análisis de nivolumab mediante LC-MS.
La figura 12B muestra que los conjugados de nivolumab-adyuvante (Nivolumab Boltbody) son superiores a la hora de provocar la activación de APC, en comparación con nivolumab no conjugado, como se indica con la expresión de HLA-DR.
La figura 12C muestra que los conjugados de nivolumab-adyuvante (Nivolumab Boltbody) son superiores a la hora de provocar la activación de APC, en comparación con nivolumab no conjugado, como se indica con la expresión de CD14.
La figura 12D muestra que los conjugados de nivolumab-adyuvante (Nivolumab Boltbody) son superiores a la hora de provocar la activación de APC, en comparación con nivolumab no conjugado, como se indica con la expresión de CD40.
La figura 12E muestra que los conjugados de nivolumab-adyuvante (Nivolumab Boltbody) son superiores a la hora de provocar la activación de APC, en comparación con nivolumab no conjugado, como se indica con la expresión de CD86.
La figura 13A muestra el análisis de atezolizumab mediante LC-MS.
La figura 13B muestra que los conjugados de atezolizumab-adyuvante (Atezolizumab Boltbody) son superiores a la hora de provocar la activación de APC, en comparación con el atezolizumab no conjugado, como se indica con la expresión de HLA-DR.
La figura 13C muestra que los conjugados de atezolizumab-adyuvante (Atezolizumab Boltbody) son superiores a la hora de provocar la activación de APC, en comparación con el atezolizumab no conjugado, como se indica con la expresión de CD14.
La figura 13D muestra que los conjugados de atezolizumab-adyuvante (Atezolizumab Boltbody) son superiores a la hora de provocar la activación de APC, en comparación con el atezolizumab no conjugado, como se indica con la expresión de CD40.
La figura 13E muestra el nivel de activación de los conjugados de atezolizumab-adyuvante (Atezolizumab Boltbody), como se indica con la expresión de CD86.
La figura 14A muestra que las células diferenciadas con inmunoconjugado de atezolizumab (Atezolizumab IgGI NQ Boltbody) secretan mayores cantidades de TNFa que las células diferenciadas con atezolizumab.
La figura 14B muestra que las células diferenciadas con inmunoconjugado de atezolizumab (Atezolizumab IgGI NQ Boltbody) secretan mayores cantidades de IL-1 p que las células diferenciadas con atezolizumab.
La figura 15A muestra que las células diferenciadas con inmunoconjugado de nivolumab (Nivolumab lgG4 Boltbody) secretan mayores cantidades de TNFa que las células diferenciadas con nivolumab.
La figura 15B muestra que las células diferenciadas con inmunoconjugado de nivolumab (Nivolumab lgG4 Boltbody) secretan mayores cantidades de IL-1 p que las células diferenciadas con nivolumab.
La figura 16A muestra que las células diferenciadas con inmunoconjugado de pembrolizumab (Pembrolizumab Boltbody) secretan mayores cantidades de TNFa que las células diferenciadas con pembrolizumab.
La figura 16B muestra que las células diferenciadas con inmunoconjugado de pembrolizumab (Pembrolizumab Boltbody) secretan mayores cantidades de IL-1 p que las células diferenciadas con pembrolizumab.
La figura 17 muestra el análisis de conjugados de pembrolizumab-adyuvante mediante LC-MS.
La figura 18 muestra el análisis de conjugados de nivolumab-adyuvante mediante LC-MS.
La figura 19 muestra el análisis de conjugados de atezolizumab-adyuvante mediante LC-MS.
La figura 20 muestra que las células diferenciadas con inmunoconjugado de ipilimumab (Ipilimumab Boltbody) secretan mayores cantidades de TNFa que las células diferenciadas con ipilimumab.
La figura 21 muestra que las células diferenciadas con dectina 2 inmunoconjugado secretan mayores cantidades de TNFa, IL-6 e IL-12p70 que las células expuestas a cantidades equivalentes de los componentes no conjugados. La línea que está significativamente más alta que el eje x para cada citocina es el anti-dectina 2 inmunoconjugado (antidectina 2-comp1 (anticuerpo conjugado con el compuesto 1 adyuvante)). Existen tres líneas a lo largo del eje x , que no son visibles, que muestran que el anticuerpo antidectina 2 solo, y el compuesto 1 adyuvante solo, y la mezcla del anticuerpo antidectina 2 y el compuesto 1 adyuvante (mezcla de antidectina 2 comp1, no conjugado), no logró producir ninguna respuesta de las citocinass. La línea que está apenas por encima del eje<x>para IL-6 representa un anticuerpo de control, un ACC con el compuesto 1 como adyuvante y un anticuerpo de control de isotipo lgG2a de ratón (etiquetado como "Iso-Comp 1" en la figura 21). En los gráficos de TNFa e lL-12p70, la línea Iso-Comp 1 no es visible ya que está a lo largo del eje<x>.
La figura 22A muestra la estructura del adyuvante CL264 y el círculo indica una posición en el adyuvante donde podría conjugarse con el enlazador, específicamente, el ácido carboxílico terminal del adyuvante.
La figura 22B muestra la estructura del adyuvante CL401 y el círculo indica una posición en el adyuvante donde podría conjugarse con el enlazador, específicamente, la amina primaria del adyuvante.
La figura 22C muestra la estructura del adyuvante CL413 y el círculo indica una posición en el adyuvante donde podría conjugarse con el enlazador, específicamente, el primer residuo de lisina del adyuvante.
La figura 22D muestra la estructura del adyuvante CL413 y el círculo indica una posición en el adyuvante donde podría conjugarse con el enlazador, específicamente, el segundo residuo de lisina del adyuvante.
La figura 22E muestra la estructura del adyuvante CL413 y el círculo indica una posición en el adyuvante donde podría conjugarse con el enlazador, específicamente, el tercer residuo de lisina del adyuvante.
La figura 22F muestra la estructura del adyuvante CL413 y el círculo indica una posición en el adyuvante donde podría conjugarse con el enlazador, específicamente, el cuarto residuo de lisina del adyuvante.
La figura 22G muestra la estructura del adyuvante CL413 y el círculo indica una posición en el adyuvante donde podría conjugarse con el enlazador, específicamente, la amina primaria del adyuvante.
La figura 22H muestra la estructura del adyuvante CL419 y los círculos indican posiciones en el adyuvante donde podría conjugarse con el enlazador, específicamente, las aminas del adyuvante (amina terminal en la parte superior de la figura 22H y amina secundaria en la parte inferior de la figura 22H).
La figura 221 muestra la estructura del adyuvante CL553 y el círculo indica una posición en el adyuvante donde podría conjugarse con el enlazador, específicamente, una amina secundaria del adyuvante.
La figura 22J muestra la estructura del adyuvante CL553 y el círculo indica una posición en el adyuvante donde podría conjugarse con el enlazador, específicamente, otra amina secundaria del adyuvante.
La figura 22K muestra la estructura del adyuvante CL553 y el círculo indica una posición en el adyuvante donde podría conjugarse con el enlazador, específicamente, una amina primaria del adyuvante.
La figura 22L muestra la estructura del adyuvante CL553 y el círculo indica una posición en el adyuvante donde podría conjugarse con el enlazador, específicamente, otra amina secundaria del adyuvante.
La figura 22M muestra la estructura del adyuvante CL553 y el círculo indica una posición en el adyuvante donde podría conjugarse con el enlazador, específicamente, otra amina secundaria del adyuvante.
La figura 22N muestra la estructura del adyuvante CL553 y el círculo indica una posición en el adyuvante donde podría conjugarse con el enlazador, específicamente, otra amina secundaria del adyuvante.
La figura 220 muestra la estructura del adyuvante CL572 y los círculos indican posiciones en el adyuvante donde podría conjugarse con el enlazador, específicamente, la amina primaria (parte superior de la figura 220) y el carbonilo (parte inferior de la figura 220).
La figura 22P muestra la estructura del adyuvante Pam2CSK4 y el círculo indica una posición en el adyuvante donde podría conjugarse con el enlazador, específicamente, el ácido carboxílico terminal del adyuvante.
La figura 22Q muestra la estructura del adyuvante Pam2CSK4 y el círculo indica una posición en el adyuvante donde podría conjugarse con el enlazador, específicamente, el tiol terminal del adyuvante.
La figura 22R muestra la estructura del adyuvante Pam2CSK4 y el círculo indica una posición en el adyuvante donde podría conjugarse con el enlazador, específicamente, el segundo residuo de lisina del adyuvante.
La figura 22S muestra la estructura del adyuvante Pam2CSK4 y el círculo indica una posición en el adyuvante donde podría conjugarse con el enlazador, específicamente, el tercer residuo de lisina del adyuvante.
La figura 22T muestra la estructura del adyuvante Pam2CSK4 y el círculo indica una posición en el adyuvante donde podría conjugarse con el enlazador, específicamente, el residuo de lisina terminal del adyuvante.
La figura 22U muestra la estructura del adyuvante Pam3CSK4 y el círculo indica una posición en el adyuvante donde podría conjugarse con el enlazador, específicamente, el ácido carboxílico terminal del adyuvante.
La figura 22V muestra la estructura del adyuvante Pam3CSK4 y el círculo indica una posición en el adyuvante donde podría conjugarse con el enlazador, específicamente, el tiol terminal del adyuvante.
La figura 22W muestra la estructura del adyuvante Pam3CSK4 y el círculo indica una posición en el adyuvante donde podría conjugarse con el enlazador, específicamente, el segundo residuo de lisina del adyuvante.
La figura 22X muestra la estructura del adyuvante Pam3CSK4 y el círculo indica una posición en el adyuvante donde podría conjugarse con el enlazador, específicamente, el tercer residuo de lisina del adyuvante.
La figura 23A muestra que las células diferenciadas con ciCLEC5A inmunoconjugado secretan mayores cantidades de IL-6 que las células expuestas a cantidades equivalentes de los componentes no conjugados. La línea que es significativamente más alta que el eje<x>para cada citocina es el<o>CLEC5A inmunoconjugado (anticuerpo aCLEC5A conjugado con el compuesto 1 adyuvante). La línea que está a lo largo del eje x muestra que una mezcla del anticuerpo<ci>CLEC5A y el compuesto 1 adyuvante (no conjugado) no logró producir ninguna respuesta de las citocinas. La línea entre el eje x y la línea del aCLEC5A inmunoconjugado representa un conjugado de control, isotipo lgG2a de ratón conjugado con el compuesto 1.
La figura 23B muestra que las células diferenciadas con<ci>CLEC5A inmunoconjugado secretan mayores cantidades de IL-1 p2p4ü que las células expuestas a cantidades equivalentes de los componentes no conjugados. La línea que es significativamente más alta que el eje x para cada citocina es el oCLEC5A inmunoconjugado (oCLEC5A-comp1 AAC). La línea que está a lo largo del eje x muestra que una mezcla del anticuerpo aCLEC5A y el compuesto 1 adyuvante (no conjugado; mezcla aCLEC5A-comp1) no logró producir ninguna respuesta de las citocinas. La línea entre el eje<x>y la línea del aCLEC5A inmunoconjugado representa un conjugado de control, isotipo lgG2a de ratón conjugado con el compuesto 1.
La figura 23C muestra que las células diferenciadas con ciCLEC5A inmunoconjugado secretan mayores cantidades de IL-1 p2p7ü que las células expuestas a cantidades equivalentes de los componentes no conjugados. La línea que es significativamente más alta que el eje<x>para cada citocina es el<o>CLEC5A inmunoconjugado (anticuerpo ciCLEC5A conjugado con el compuesto 1 adyuvante). La línea que está a lo largo del eje x muestra que una mezcla del anticuerpo aCLEC5A y el compuesto 1 adyuvante (no conjugado) no logró producir ninguna respuesta de las citocinas. La línea entre el eje<x>y la línea del aCLEC5A inmunoconjugado representa un conjugado de control, isotipo lgG2a de ratón conjugado con el compuesto 1.
La figura 23D muestra que las células diferenciadas con<ci>CLEC5A inmunoconjugado secretan mayores cantidades de TNFa que las células expuestas a cantidades equivalentes de los componentes no conjugados. La línea que es significativamente más alta que el eje x para cada citocina es el aCLEC5A inmunoconjugado (anticuerpo<q>CLEC5A conjugado con el compuesto 1 adyuvante). La línea que está a lo largo del eje<x>muestra que una mezcla del anticuerpo oCLEC5A y el compuesto 1 adyuvante (no conjugado) no logró producir ninguna respuesta de las citocinas. La línea entre el eje<x>y la línea del<o>CLEC5A inmunoconjugado representa un conjugado de control, isotipo lgG2a de ratón conjugado con el compuesto 1.
La figura 23E muestra el análisis del<o>CLEC5A inmunoconjugado mediante LC-MS.
La figura 24 muestra una mayor diferenciación de células dendríticas con un conjugado adyuvante de anticuerpo anti-Her2 (aHer2 inmunoconjugado, círculos cerrados) unido al compuesto 1 agonista de TLR 7/8 en comparación con cuando se administran los mismos componentes de anticuerpo y adyuvante (aHer2 y compuesto 1, cuadrados cerrados) como una mezcla no ligada.
La figura 25 muestra una mayor diferenciación de células dendríticas con un conjugado adyuvante de anticuerpo anti-EGFR (inmunoconjugado de aEGFR, círculos cerrados) unido al compuesto 1 agonista de TLR 7/8 en comparación con cuando se administran los mismos componentes (aEGFR y compuesto 1, cuadrados cerrados) como una mezcla no ligada.
La figura 26 muestra que un anticuerpo anti-CD20 conjugado con un agonista de TLR 7/8 presenta una fuerte activación de células dendríticas, mientras que la activación se reduce significativamente en el conjugado desglicosilado.
La figura 27 compara los anticuerpos de rituximab y obinutuzumab conjugados con el compuesto 1. El obinutuzumab tiene un contenido reducido de fucosa en comparación con rituximab y muestra una mayor regulación por incremento de CD40.
La figura 28 ilustra la activación de células NK usando un inmunoconjugado de aEGFR unido al compuesto 1 agonista de TLR 7/8. El inmunoconjugado presenta una activación de células NK significativamente mayor en comparación con la mezcla no conjugada de aEGFR y compuesto 1.
La figura 29 ilustra la activación robusta de poblaciones de células dendríticas a partir de células mononucleares de sangre periférica aisladas de sujetos humanos con un inmunoconjugado de aEGFR.
La figura 30A muestra un análisis por cromatografía de líquidos-espectrometría de masas del inmunoconjugado BB-01 sintetizado usando el método SATA.
La figura 30B muestra un análisis por cromatografía de líquidos-espectrometría de masas del inmunoconjugado BB-01 sintetizado usando el método del éster.
La figura 31A muestra un análisis de cromatografía de exclusión por tamaño del inmunoconjugado BB01 sintetizado usando el método SATA.
La figura 31B muestra un análisis de cromatografía de exclusión por tamaño del inmunoconjugado BB-01 sintetizado usando el método del éster.
La figura 32 muestra un análisis por cromatografía de líquidos-espectrometría de masas del inmunoconjugado BB-14 sintetizado usando el método del éster.
La figura 33 muestra un análisis de cromatografía de exclusión por tamaño del inmunoconjugado BB-14 sintetizado usando el método del éster.
La figura 34 muestra un análisis por cromatografía de líquidos-espectrometría de masas del inmunoconjugado BB-15 sintetizado usando el método del éster.
La figura 35 muestra un análisis de cromatografía de exclusión por tamaño del inmunoconjugado BB-15 sintetizado usando el método del éster.
La figura 36 muestra un análisis por cromatografía de líquidos-espectrometría de masas del inmunoconjugado sintetizado usando el método del éster.
La figura 37 muestra un análisis por cromatografía de exclusión por tamaño del inmunoconjugado sintetizado usando el método del éster.
La figura 38A muestra que el BB-01 y BB-17 sintetizados usando el método del éster provoca la activación mieloide como se indica con la regulación por disminución de CD14 mientras que el control no lo hace. El CD20 es el anticuerpo monoclonal no conjugado utilizado como control.
La figura 38B muestra que el BB-01 y BB-17 sintetizados usando el método del éster provoca la activación mieloide como se indica con la regulación por disminución de CD16 mientras que el control no lo hace. El CD20 es el anticuerpo monoclonal no conjugado utilizado como control.
La figura 38C muestra que el BB-01 y BB-17 sintetizados usando el método del éster provoca la activación mieloide como se indica con la regulación por incremento de CD40 mientras que el control no lo hace. El CD20 es el anticuerpo monoclonal no conjugado utilizado como control.
La figura 38D muestra que el BB-01 y BB-17 sintetizados usando el método del éster provoca la activación mieloide como se indica con la regulación por incremento de CD86 mientras que el control no lo hace, El CD20 es el anticuerpo monoclonal no conjugado utilizado como control,
La figura 38E muestra que el BB-01 y BB-17 sintetizados usando el método del éster provoca la activación mieloide como se indica con la regulación por incremento de CD123 mientras que el control no lo hace, El CD20 es el anticuerpo monoclonal no conjugado utilizado como control,
La figura 38F muestra que el BB-01 y BB-17 sintetizados usando el método del éster provoca la activación mieloide como se indica con el antígeno leucocitario humano-antígeno D relacionado o "HLA-DR", mientras que el control no lo hace, El CD20 es el anticuerpo monoclonal no conjugado utilizado como control,
La figura 39A muestra que el BB-01 provoca la activación mieloide como se indica con la regulación por disminución de CD14, mientras que los inmunoconjugados comparativos IRM1 e IRM2 no lo hacen, El CD20 es el anticuerpo monoclonal no conjugado utilizado como control,
La figura 39B muestra que el BB-01 provoca la activación mieloide como se indica con la regulación por disminución de CD16, mientras que los inmunoconjugados comparativos IRM1 e IRM2 no lo hacen, El CD20 es el anticuerpo monoclonal no conjugado utilizado como control,
La figura 39C muestra que el BB-01 provoca la activación mieloide como se indica con la regulación por incremento de CD40, mientras que los inmunoconjugados comparativos IRM1 e IRM2 no lo hacen, El CD20 es el anticuerpo monoclonal no conjugado utilizado como control,
La figura 39D muestra que el BB-01 provoca la activación mieloide como se indica con la regulación por incremento de CD86, mientras que los inmunoconjugados comparativos IRM1 e IRM2 no lo hacen, El CD20 es el anticuerpo monoclonal no conjugado utilizado como control,
La figura 39E muestra que el BB-01 provoca la activación mieloide como se indica con la regulación por incremento de CD123, mientras que los inmunoconjugados comparativos IRM1 e IRM2 no lo hacen, El CD20 es el anticuerpo monoclonal no conjugado utilizado como control,
La figura 39F muestra que el BB-01 provoca la activación mieloide como se indica con la regulación por incremento de HLA-DR mientras que los inmunoconjugados comparativos IRM1 e IRM2 no lo hacen, El CD20 es el anticuerpo monoclonal no conjugado utilizado como control,
La figura 40A muestra que el BB-01 provoca la secreción de citocinas (IL-1 p) mientras que los inmunoconjugados comparativos IRM1 e IRM2 no lo hacen, El CD20 es el anticuerpo monoclonal no conjugado utilizado como control, La figura 40B muestra que el BB-01 provoca la secreción de citocinas (IL-6) mientras que los inmunoconjugados comparativos IRM1 e IRM2 no lo hacen, El CD20 es el anticuerpo monoclonal no conjugado utilizado como control, La figura 40C muestra que el BB-01 provoca la secreción de citocinas (TNFa) mientras que los inmunoconjugados comparativos IRM1 e IRM2 no lo hacen, El CD20 es el anticuerpo monoclonal no conjugado utilizado como control, La figura 41A muestra un análisis de cromatografía de exclusión por tamaño del inmunoconjugado BB-26 sintetizado usando el método del éster,
La figura 41B muestra un análisis por cromatografía de líquidos-espectrometría de masas del inmunoconjugado BB-26 sintetizado usando el método del éster,
La figura 42A muestra un análisis de cromatografía de exclusión por tamaño del inmunoconjugado BB-27 sintetizado usando el método del éster,
La figura 42B muestra un análisis por cromatografía de líquidos-espectrometría de masas del inmunoconjugado BB-27 sintetizado usando el método del éster,
La figura 43A muestra un análisis de cromatografía de exclusión por tamaño del inmunoconjugado BB-36 sintetizado usando el método del éster,
La figura 43B muestra un análisis por cromatografía de líquidos-espectrometría de masas del inmunoconjugado BB-36 sintetizado usando el método del éster,
La figura 44A muestra un análisis de cromatografía de exclusión por tamaño del conjugado comparativo IRM1. La figura 44B muestra un análisis de cromatografía de exclusión por tamaño del conjugado comparativo IRM2. La figura 44C muestra un análisis de cromatografía de exclusión por tamaño del BB-01,
La figura 45A muestra un análisis por cromatografía de líquidos-espectrometría de masas del conjugado IRM1 después de la desglicosilación durante la noche con PNGasa F.
La figura 45B muestra un análisis por cromatografía de líquidos-espectrometría de masas del conjugado BB-01 después de la desglicosilación durante la noche con PNGasa F.
La figura 46A muestra un análisis de cromatografía de exclusión por tamaño del inmunoconjugado BB-45 sintetizado usando el método del éster.
La figura 46B muestra un análisis por cromatografía de líquidos-espectrometría de masas del inmunoconjugado BB-45 sintetizado usando el método del éster.
La figura 47A muestra un análisis de cromatografía de exclusión por tamaño del inmunoconjugado BB-24 sintetizado usando el método del éster.
La figura 47B muestra un análisis por cromatografía de líquidos-espectrometría de masas del inmunoconjugado BB-24 sintetizado usando el método del éster.
La figura 48A muestra un análisis de cromatografía de exclusión por tamaño del inmunoconjugado BB-37 sintetizado usando el método del éster.
La figura 48B muestra un análisis por cromatografía de líquidos-espectrometría de masas del inmunoconjugado BB-37 sintetizado usando el método del éster.
La figura 49A muestra un análisis de cromatografía de exclusión por tamaño del inmunoconjugado BB-42 sintetizado usando el método del éster.
La figura 49B muestra un análisis por cromatografía de líquidos-espectrometría de masas del inmunoconjugado BB-42 sintetizado usando el método del éster.
La figura 50 muestra un análisis por cromatografía de líquidos-espectrometría de masas del inmunoconjugado BB-43 sintetizado usando el método del éster.
La figura 51 muestra un análisis por cromatografía de líquidos-espectrometría de masas del inmunoconjugado BB-44 sintetizado usando el método del éster.
La figura 52A muestra que el BB-14 provoca la activación mieloide como se indica con la regulación por disminución de CD14, mientras que el control no lo hace. El CD20 es el anticuerpo monoclonal no conjugado utilizado como control.
La figura 52B muestra que el BB-14 provoca la activación mieloide como se indica con la regulación por incremento de CD40 mientras que el control no lo hace. El CD20 es el anticuerpo monoclonal no conjugado utilizado como control.
La figura 52C muestra que el BB-14 provoca la activación mieloide como se indica con la regulación por incremento de CD86, mientras que el control no lo hace. El CD20 es el anticuerpo monoclonal no conjugado utilizado como control.
La figura 52D muestra que el BB-14 provoca la activación mieloide como se indica con la regulación por incremento de HLA-DR mientras que el control no lo hace. El CD20 es el anticuerpo monoclonal no conjugado utilizado como control.
La figura 53A muestra que el BB-15 provoca la activación mieloide como se indica con la regulación por disminución de CD14, mientras que el control no lo hace. El CD20 es el anticuerpo monoclonal no conjugado utilizado como control.
La figura 53B muestra que el BB-15 provoca la activación mieloide como se indica con la regulación por incremento de CD40 mientras que el control no lo hace. El CD20 es el anticuerpo monoclonal no conjugado utilizado como control.
La figura 53C muestra que el BB-15 provoca la activación mieloide como se indica con la regulación por incremento de CD86, mientras que el control no lo hace. El CD20 es el anticuerpo monoclonal no conjugado utilizado como control.
La figura 53D muestra que el BB-27 provoca la activación mieloide como se indica con la regulación por incremento de HLA-DR mientras que el control no lo hace. El CD20 es el anticuerpo monoclonal no conjugado utilizado como control.
La figura 54A muestra que el BB-27 provoca la activación mieloide como se indica con la regulación por disminución de CD14, mientras que el control no lo hace. El CD20 es el anticuerpo monoclonal no conjugado utilizado como control.
La figura 54B muestra que el BB-27 provoca la activación mieloide como se indica con la regulación por incremento de CD40 mientras que el control no lo hace. El CD20 es el anticuerpo monoclonal no conjugado utilizado como control.
La figura 54C muestra que el BB-27 provoca la activación mieloide como se indica con la regulación por incremento de CD86, mientras que el control no lo hace. El CD20 es el anticuerpo monoclonal no conjugado utilizado como control.
La figura 54D muestra que el BB-27 provoca la activación mieloide como se indica con la regulación por incremento de HLA-DR mientras que el control no lo hace. El CD20 es el anticuerpo monoclonal no conjugado utilizado como control.
La figura 55A muestra que el BB-45 provoca la activación mieloide como se indica con la regulación por disminución de CD14, mientras que el control no lo hace. El CD20 es el anticuerpo monoclonal no conjugado utilizado como control.
La figura 55B muestra que el BB-45 provoca la activación mieloide como se indica con la regulación por incremento de CD40 mientras que el control no lo hace. El CD20 es el anticuerpo monoclonal no conjugado utilizado como control.
La figura 55C muestra que el BB-45 provoca la activación mieloide como se indica con la regulación por incremento de CD86, mientras que el control no lo hace. El CD20 es el anticuerpo monoclonal no conjugado utilizado como control.
La figura 55D muestra que el BB-45 provoca la activación mieloide como se indica con la regulación por incremento de HLA-DR mientras que el control no lo hace. El CD20 es el anticuerpo monoclonal no conjugado utilizado como control.
La figura 56A muestra que el BB-24 provoca la activación mieloide como se indica con la regulación por disminución de CD14, mientras que el control no lo hace. El CD20 es el anticuerpo monoclonal no conjugado utilizado como control.
La figura 56B muestra que el BB-24 provoca la activación mieloide como se indica con la regulación por incremento de CD40 mientras que el control no lo hace. El CD20 es el anticuerpo monoclonal no conjugado utilizado como control.
La figura 56C muestra que el BB-24 provoca la activación mieloide como se indica con la regulación por incremento de CD86, mientras que el control no lo hace. El CD20 es el anticuerpo monoclonal no conjugado utilizado como control.
La figura 56D muestra que el BB-24 provoca la activación mieloide como se indica con la regulación por incremento de HLA-DR mientras que el control no lo hace. El CD20 es el anticuerpo monoclonal no conjugado utilizado como control.
La figura 57 muestra la unión de BB-01 a células CD20 Toledo, que son una línea celular utilizada como sistema modelo para estudiar linfomas no hodgkinianos. El BB-01 tenía una unión más fuerte que los anticuerpos rituximab o cetuximab.
La figura 58 muestra que el inmunoconjugado de aEGFR con el compuesto 1 (ciEGFR Boltbody) fue más eficaz que la mezcla de anticuerpo y adyuvante para activar las células NK. Las PBMC se activaron con el inmunoconjugado o la mezcla durante 18 horas. Las células NK se clasificaron según el linaje negativo (CD3, CD19, CD14 negativo) y CD56 positivo.
La figura 59 muestra el análisis de un inmunoconjugado comparativo mediante LC-MS (DG). Este conjugado comparativo se preparó con trastuzumab y un enlazador no escindible de maleimida PEG4 que contiene un grupo pentafluorofenilo con gardiquimod (véase el documento US 2017/015772, párrafo 0275, descripción del inmunoconjugado ATAC3).
La figura 60 muestra el análisis de un inmunoconjugado comparativo mediante LC-MS (cadena pesada). Este conjugado comparativo se preparó con trastuzumab y un enlazador no escindible de maleimida-PEG4 que contiene un grupo pentafluorofenilo con gardiquimod (véase el documento US 2017/015772, párrafo 0275, descripción del inmunoconjugado ATAC3).
La figura 61 muestra el análisis de un inmunoconjugado comparativo mediante LC-MS. Este conjugado comparativo se preparó con trastuzumab y un enlazador no escindible de maleimida-PEG4 que contiene un grupo pentafluorofenilo con gardiquimod (véase el documento US 2017/015772, párrafo 0275, descripción del inmunoconjugado ATAC3).
La figura 62 muestra el análisis de un inmunoconjugado comparativo mediante LC-MS (cadena ligera). Este conjugado comparativo se preparó con trastuzumab y un enlazador no escindible de maleimida-PEG4 que contiene un grupo pentafluorofenilo con gardiquimod (véase el documento US 2017/015772, párrafo 0275, descripción del inmunoconjugado ATAC3).
La figura 63 muestra el análisis de un inmunoconjugado comparativo mediante LC-MS (DG, cadena pesada). Este conjugado comparativo se preparó con trastuzumab y un enlazador no escindióle de maleimida-PEG4 que contiene un grupo pentafluorofenilo con gardiquimod (véase el documento US 2017/015772, párrafo 0275, descripción del inmunoconjugado ATAC3).
La figura 64 muestra el análisis de un inmunoconjugado comparativo mediante LC-MS (DG, cadena ligera). Este conjugado comparativo se preparó con trastuzumab y un enlazador no escindióle de maleimida-PEG4 que contiene un grupo pentafluorofenilo con gardiquimod (véase el documento US 2017/015772, párrafo 0275, descripción del inmunoconjugado ATAC3).
La figura 65 muestra el análisis de un inmunoconjugado comparativo mediante LC-MS (DG). Este conjugado comparativo se preparó con trastuzumab y un enlazador escindióle de valina-citrulina que contiene un grupo PABA con succinamida (véase el documento u S 2017/015772, párrafo 0275, descripción del inmunoconjugado ATAC2).
La figura 66 muestra el análisis de un inmunoconjugado comparativo mediante LC-MS. Este conjugado comparativo se preparó con trastuzumab y un enlazador escindióle de valina-citrulina que contiene un grupo PABA con succinamida (véase el documento<u>S 2017/015772, párrafo 0275, descripción del inmunoconjugado ATAC2).
La figura 67A muestra que el inmunoconjugado de rituximab producido según el método de BB-01 SATA (rituximab Boltbody) provoca una secreción superior de IL-1 p en las células mieloides en comparación con el rituximab no conjugado (Roche), así como concentraciones equimolares de conjugados comparativos preparados con rituximab y ya sea un enlazador de valina-citrulina-PABC<o>un enlazador de maleimida-PEG4, ambos que contienen un grupo pentafluorofenilo con gardiquimod (rituximab-ATAC2, rituximab-ATAC3 respectivamente; U<s>2017/015772) después de 18 horas de estimulación.
La figura 67B muestra que el inmunoconjugado de rituximab producido según el método de BB-01 SATA (rituximab Boltbody) provoca una secreción superior de TNFa en las células mieloides en comparación con el rituximab no conjugado (Roche), así como concentraciones equimolares de conjugados comparativos preparados con rituximab y ya sea un enlazador de valina-citrulina-PABC o un enlazador de maleimida-PEG4, ambos que contienen un grupo pentafluorofenilo con gardiquimod (rituximab-ATAC2, rituximab-ATAC3 respectivamente; Us 2017/015772) después de 18 horas de estimulación.
La figura 67C muestra un análisis por cromatografía de líquidos-espectrometría de masas de rituximab no conjugado (Roche) que se utilizó para producir el inmunoconjugado de rituximab según el método de conjugación de BB-01 o Ios inmunoconjugados de rituximab según los métodos descritos en el documento US 2017/015772 después de la desglicosilación durante la noche con PNGasa F.
La figura 67D muestra un análisis por cromatografía de líquidos-espectrometría de masas de rituximab no conjugado (Roche) que se utilizó para producir el inmunoconjugado de rituximab según el método de conjugación de BB-01<o>I<os>inmunoconjugados de rituximab según I<os>métodos descritos en el documento US 2017/015772.
La figura 67E muestra un análisis por cromatografía de líquidos-espectrometría de masas de la cadena pesadaligera ipsilateral del inmunoconjugado de rituximab producido usando un enlazador de valina-citrulina-PABC como se describe en el documento US 2017/015772 después de la desglicosilación durante la noche con PNGasa F.
La figura 67F muestra un análisis por cromatografía de líquidos-espectrometría de masas de la cadena ligera del inmunoconjugado de rituximab producido usando un enlazador de valina-citrulina-PABC como se describe en el documento US 2017/015772 después de la desglicosilación durante la noche con PNGasa F.
La figura 67G muestra que el inmunoconjugado de rituximab con enlazador de valina-citrulina-PABC producido según Ios métodos descritos en el documento US 2017/015772 (Ritux-ATAC2) no logra provocar la regulación por incremento de CD123 en las células mieloides después de 18 horas de estimulación. La figura 67G también muestra que el inmunoconjugado BB-01 producido según el método SATA [rituximab Boltbody (BB-01)] es superior a la hora de provocar la regulación por incremento de CD123 en comparación con Ritux-ATAC2 y concentraciones equimolares de rituximab no conjugado (Roche).
La figura 67H muestra que el inmunoconjugado de rituximab con enlazador de valina-citrulina-PABC producido según Ios métodos descritos en el documento US 2017/015772 (Ritux-ATAC2) no logra provocar la regulación por disminución de CD14 en las células mieloides después de 18 horas de estimulación. La figura 67H también muestra que el inmunoconjugado BB-01 producido según el método SATA [rituximab Boltbody (BB-01)] es superior a la hora de provocar la regulación por disminución de CD14 en comparación con Ritux-ATAC2 y concentraciones equimolares de rituximab no conjugado (Roche).
La figura 671 muestra que el inmunoconjugado BB-01 producido según el método SATA [rituximab Boltbody (BB-01)] es superior a la hora de provocar la regulación por disminución de CD16 en las células mieloides en comparación con el inmunoconjugado de rituximab con enlazador de valina-citrulina-PABC producido según I<os>métodos descritos en el documento US 2017/015772 (Ritux-ATAC2) y concentraciones equimolares de rituximab no conjugado (Roche),
La figura 67J muestra que el inmunoconjugado de rituximab con enlazador de valina-citrulina-PABC producido según los métodos descritos en el documento US 2017/015772 (Ritux-ATAC2) no logra provocar la regulación por incremento de CD40 en las células mieloides después de 18 horas de estimulación, La figura 67J también muestra que el inmunoconjugado BB-01 producido según el método SATA [rituximab Boltbody (BB-01)] es superior a la hora de provocar la regulación por incremento de CD40 en comparación con Ritux-ATAC2 y concentraciones equimolares de rituximab no conjugado (Roche),
La figura 67K muestra que el inmunoconjugado BB-01 producido según el método SATA [rituximab Boltbody (BB-01)] es superior a la hora de provocar la regulación por incremento de CD86 en las células mieloides en comparación con el inmunoconjugado de rituximab con enlazador de valina-citrulina-PABC producido según los métodos descritos en el documento US 2017/015772 (RituxATAC2) y concentraciones equimolares de rituximab no conjugado (Roche),
La figura 67L muestra la expresión de CD123 en las células mieloides después de 18 horas de estimulación con el inmunoconjugado de rituximab con enlazador de valina-citrulina-PABC producido según los métodos descritos en el documento US 2017/015772 (Ritux-ATAC2) en comparación con el rituximab no conjugado (Roche),
La figura 67M muestra la expresión de CD14 en las células mieloides después de 18 horas de estimulación con el inmunoconjugado de rituximab con enlazador de valina-citrulina-PABC producido según los métodos descritos en el documento US 2017/015772 (Ritux-ATAC2) en comparación con el rituximab no conjugado (Roche),
La figura 67N muestra la expresión de CD16 en las células mieloides después de 18 horas de estimulación con el inmunoconjugado de rituximab con enlazador de valina-citrulina-PABC producido según los métodos descritos en el documento US 2017/015772 (Ritux-ATAC2) en comparación con el rituximab no conjugado (Roche),
La figura 670 muestra la expresión de CD40 en las células mieloides después de 18 horas de estimulación con el inmunoconjugado de rituximab con enlazador de valina-citrulina-PABC producido según los métodos descritos en el documento US 2017/015772 (Ritux-ATAC2) en comparación con el rituximab no conjugado (Roche),
La figura 67P muestra la expresión de CD86 en las células mieloides después de 18 horas de estimulación con el inmunoconjugado de rituximab con enlazador de valina-citrulina-PABC producido según los métodos descritos en el documento US 2017/015772 (Ritux-ATAC2) en comparación con el rituximab no conjugado (Roche),
La figura 68A muestra que el inmunoconjugado de rituximab producido según el método de BB-01 SATA (rituximab Boltbody) provoca una secreción superior de IL-1 p en las células mieloides en comparación con el rituximab no conjugado (Roche), así como concentraciones equimolares de conjugados comparativos preparados con rituximab y ya sea un enlazador de valina-citrulina-PABC o un enlazador de maleimida-PEG4, ambos que contienen un grupo pentafluorofenilo con gardiquimod (rituximab-ATAC2, rituximab-ATAC3 respectivamente; U<s>2017/015772) después de 18 horas de estimulación,
La figura 68B muestra que el inmunoconjugado de rituximab producido según el método de BB-01 SATA (rituximab Boltbody) provoca una secreción superior de TNFa en las células mieloides en comparación con el rituximab no conjugado (Roche), así como concentraciones equimolares de conjugados comparativos preparados con rituximab y ya sea un enlazador de valina-citrulina-PABC<o>un enlazador de maleimida-PEG4, ambos que contienen un grupo pentafluorofenilo con gardiquimod (rituximab-ATAC2, rituximab-ATAC3 respectivamente; Us 2017/015772) después de 18 horas de estimulación,
La figura 68C muestra un análisis por cromatografía de líquidos-espectrometría de masas de rituximab no conjugado (Roche) que se utilizó para producir el inmunoconjugado de rituximab según el método de conjugación de BB-01 o Ios inmunoconjugados de rituximab según los métodos descritos en el documento US 2017/015772 después de la desglicosilación durante la noche con PNGasa F,
La figura 68D muestra un análisis por cromatografía de líquidos-espectrometría de masas de rituximab no conjugado (Roche) que se utilizó para producir el inmunoconjugado de rituximab según el método de conjugación de BB-01<o>I<os>inmunoconjugados de rituximab según I<os>métodos descritos en el documento US 2017/015772,
La figura 68E muestra un análisis por cromatografía de líquidos-espectrometría de masas de la cadena pesadaligera ipsilateral del inmunoconjugado de rituximab producido usando un enlazador de maleimida PEG4 como se describe en el documento US 2017/015772 después de la desglicosilación durante la noche con PNGasa F,
La figura 68F muestra un análisis por cromatografía de líquidos-espectrometría de masas de la cadena ligera del inmunoconjugado de rituximab producido usando un enlazador de maleimida-PEG4 como se describe en el documento US 2017/015772 después de la desglicosilación durante la noche con PNGasa F,
La figura 68G muestra que el inmunoconjugado de rituximab con enlazador de maleimida-PEG4 producido según I<os>métodos descritos en el documento US 2017/015772 (Ritux-ATAC3) no logra provocar la regulación por incremento de CD123 en las células mieloides después de 18 horas de estimulación, La figura 68G también muestra que el inmunoconjugado BB-01 producido según el método SATA [rituximab Boltbody (BB-01)] es superior a la hora de provocar la regulación por Incremento de CD123 en comparación con RIíux-ATAC3 y concentraciones equimolares de rituximab no conjugado (Roche).
La figura 68H muestra que el inmunoconjugado BB-01 producido según el método SATA [rituximab Boltbody (BB-01)] es superior a la hora de provocar la regulación por disminución de CD14 en las células mieloides en comparación con el inmunoconjugado de rituximab con enlazador de maleimida-PEG4 producido según los métodos descritos en US 2017/015772 (Ritux-ATAC3) y concentraciones equimolares de rituximab no conjugado (Roche) después de 18 horas de estimulación.
La figura 681 muestra que el inmunoconjugado de rituximab con enlazador de maleimida-PEG4 producido según los métodos descritos en el documento US 2017/015772 (Ritux-ATAC3) no logra provocar una regulación por disminución de CD16 en las células mieloides después de 18 horas de estimulación. La figura 681 también muestra que el inmunoconjugado BB-01 producido según el método SATA [rituximab Boltbody (BB-01)] es superior a la hora de provocar la regulación por incremento de CD40 en comparación con Ritux-ATAC2 y concentraciones equimolares de rituximab no conjugado (Roche).
La figura 68J muestra que el inmunoconjugado de rituximab con enlazador de maleimida-PEG4 producido según los métodos descritos en el documento US 2017/015772 (Ritux-ATAC3) no logra provocar la regulación por incremento de CD40 en las células mieloides después de 18 horas de estimulación. La figura 68J también muestra que el inmunoconjugado BB-01 producido según el método SATA [rituximab Boltbody (BB-01)] es superior a la hora de provocar la regulación por incremento de CD40 en comparación con Ritux-ATAC2 y concentraciones equimolares de rituximab no conjugado (Roche).
La figura 68K muestra que el inmunoconjugado de rituximab con enlazador de maleimida-PEG4 producido según los métodos descritos en el documento US 2017/015772 (Ritux-ATAC3) no logra provocar la regulación por incremento de CD86 en las células mieloides después de 18 horas de estimulación. La figura 68J también muestra que el inmunoconjugado BB-01 producido según el método SATA [rituximab Boltbody (BB-01)] es superior a la hora de provocar la regulación por incremento de CD86 en comparación con Ritux-ATAC2 y concentraciones equimolares de rituximab no conjugado (Roche).
La figura 68L muestra la expresión de CD123 en las células mieloides después de 18 horas de estimulación con el inmunoconjugado de rituximab con enlazador de maleimida-PEG4 producido según los métodos descritos en el documento US 2017/015772 (Ritux-ATAC3) en comparación con el rituximab no conjugado (Roche).
La figura 68M muestra la expresión de HLA-DR en las células mieloides después de 18 horas de estimulación con el inmunoconjugado de rituximab con enlazador de maleimida-PEG4 producido según los métodos descritos en el documento US 2017/015772 (Ritux-ATAC3) en comparación con el rituximab no conjugado (Roche).
La figura 68N muestra la expresión de CD14 en las células mieloides después de 18 horas de estimulación con el inmunoconjugado de rituximab con enlazador de maleimida-PEG4 producido según los métodos descritos en el documento US 2017/015772 (Ritux-ATAC3) en comparación con el rituximab no conjugado (Roche).
La figura 680 muestra la expresión de CD16 en las células mieloides después de 18 horas de estimulación con el inmunoconjugado de rituximab con enlazador de maleimida-PEG4 producido según los métodos descritos en el documento US 2017/015772 (Ritux-ATAC3) en comparación con el rituximab no conjugado (Roche).
La figura 68P muestra la expresión de CD40 en las células mieloides después de 18 horas de estimulación con el inmunoconjugado de rituximab con enlazador de maleimida-PEG4 producido según los métodos descritos en el documento US 2017/015772 (Ritux-ATAC3) en comparación con el rituximab no conjugado (Roche).
La figura 68Q muestra la expresión de CD86 en las células mieloides después de 18 horas de estimulación con el inmunoconjugado de rituximab con enlazador de maleimida-PEG4 producido según los métodos descritos en el documento US 2017/015772 (Ritux-ATAC3) en comparación con el rituximab no conjugado (Roche).
La figura 69A muestra que el inmunoconjugado de atezolizumab producido según el método de BB-01 (Atezolizumab lgG1 NQ Boltbody) provoca una secreción superior de IL-1 p en las células mieloides en comparación con concentraciones equimolares de atezolizumab no conjugado (Roche) después de 18 horas de estimulación.
La figura 69B muestra que el inmunoconjugado de atezolizumab producido según el método de BB-01 (Atezolizumab lgG1 NQ Boltbody) provoca una secreción superior de TNFa en las células mieloides en comparación con concentraciones equimolares de atezolizumab no conjugado (Roche) después de 18 horas de estimulación.
La figura 69C muestra un análisis por cromatografía de líquidos-espectrometría de masas del inmunoconjugado de atezolizumab producido según el método de conjugación de BB-01 después de la desglicosilación durante la noche con PNGasa F.
La figura 69D muestra un análisis por cromatografía de líquidos-espectrometría de masas de atezolizumab no conjugado (Roche) que se utilizó para producir el inmunoconjugado de atezolizumab según el método de conjugación de BB-01 después de la desglicosilación durante la noche con PNGasa F.
La figura 69E muestra un análisis por cromatografía de líquidos-espectrometría de masas de atezolizumab no conjugado (Roche) que se utilizó para producir el inmunoconjugado de atezolizumab según el método de BB-01.
La figura 69F muestra la expresión de CD123 en las células mieloides después de 18 horas de estimulación con el inmunoconjugado de atezolizumab producido según el método de BB-01 (Atezolizumab Boltbody) en comparación con el atezolizumab no conjugado (Roche).
La figura 69G muestra la expresión de HLA-DR en las células mieloides después de 18 horas de estimulación con el inmunoconjugado de atezolizumab producido según el método de BB-01 (Atezolizumab Boltbody) en comparación con el atezolizumab no conjugado (Roche).
La figura 69H muestra que el inmunoconjugado de atezolizumab producido según el método de BB-01 (Atezolizumab Boltbody) es superior a la hora de provocar la regulación por disminución de CD14 en las células mieloides en comparación con el atezolizumab no conjugado (Roche) después de 18 horas de estimulación.
La figura 691 muestra que el inmunoconjugado de atezolizumab producido según el método de BB-01 (Atezolizumab Boltbody) es superior a la hora de provocar la regulación por disminución de CD16 en las células mieloides en comparación con el atezolizumab no conjugado (Roche) después de 18 horas de estimulación.
La figura 69J muestra que el inmunoconjugado de atezolizumab producido según el método de BB-01 (Atezolizumab Boltbody) es superior a la hora de provocar la regulación por incremento de CD40 en las células mieloides en comparación con el atezolizumab no conjugado (Roche) después de 18 horas de estimulación.
La figura 69K muestra la expresión de CD86 en las células mieloides después de 18 horas de estimulación con el inmunoconjugado de atezolizumab producido según el método de BB-01 (Atezolizumab Boltbody) en comparación con el atezolizumab no conjugado (Roche).
La figura 70A muestra que el inmunoconjugado de bevacizumab producido según el método de BB-01 (Bevacizumab Boltbody) provoca una secreción superior de IL-1 p en las células mieloides en comparación con concentraciones equimolares de bevacizumab no conjugado (Roche) después de 18 horas de estimulación.
La figura 70B muestra que el inmunoconjugado de bevacizumab producido según el método de BB-01 (Bevacizumab Boltbody) provoca una secreción superior de TNFa en las células mieloides en comparación con concentraciones equimolares de bevacizumab no conjugado (Roche) después de 18 horas de estimulación.
La figura 70C muestra que el inmunoconjugado de bevacizumab producido según el método de BB-01 (Bevacizumab Boltbody) provoca una secreción superior de IL-1 p en las células mieloides en comparación con concentraciones equimolares de bevacizumab no conjugado (Roche) después de 36 horas de estimulación.
La figura 70D muestra que el inmunoconjugado de bevacizumab producido según el método de BB-01 (Bevacizumab Boltbody) provoca una secreción superior de TNFa en las células mieloides en comparación con concentraciones equimolares de bevacizumab no conjugado (Roche) después de 36 horas de estimulación.
La figura 70E muestra un análisis por cromatografía de líquidos-espectrometría de masas del inmunoconjugado de bevacizumab producido según el método de conjugación de BB-01 después de la desglicosilación durante la noche con PNGasa F.
La figura 70F muestra un análisis por cromatografía de líquidos-espectrometría de masas de bevacizumab no conjugado (Roche) que se utilizó para producir el inmunoconjugado de bevacizumab según el método de conjugación de BB-01 después de la desglicosilación durante la noche con PNGasa F.
La figura 70G muestra un análisis por cromatografía de líquidos-espectrometría de masas de bevacizumab no conjugado (Roche) que se utilizó para producir el inmunoconjugado de bevacizumab según el método de BB-01.
La figura 70H muestra que el inmunoconjugado de bevacizumab producido según el método de BB-01 (Bevacizumab Boltbody) es superior a la hora de provocar la regulación por incremento de CD123 en las células mieloides en comparación con el bevacizumab no conjugado (Roche) después de 18 horas de estimulación.
La figura 701 muestra la expresión de HLA-DR en las células mieloides después de 18 horas de estimulación con el inmunoconjugado de bevacizumab producido según el método de BB-01 (Bevacizumab Boltbody) en comparación con el bevacizumab no conjugado (Roche).
La figura 70J muestra que el inmunoconjugado de bevacizumab producido según el método de BB-01 (Bevacizumab Boltbody) es superior a la hora de provocar la regulación por disminución de CD14 en las células mieloides en comparación con el bevacizumab no conjugado (Roche) después de 18 horas de estimulación.
La figura 70K muestra que el inmunoconjugado de bevacizumab producido según el método de BB-01 (Bevacizumab Boltbody) es superior a la hora de provocar la regulación por disminución de CD16 en las células mieloides en comparación con el bevacizumab no conjugado (Roche) después de 18 horas de estimulación.
La figura 70L muestra que el ¡nmunoconjugado de bevacizumab producido según el método de BB-01 (Bevacizumab Boltbody) es superior a la hora de provocar la regulación por incremento de CD40 en las células mieloides en comparación con el bevacizumab no conjugado (Roche) después de 18 horas de estimulación.
La figura 70M muestra que el ¡nmunoconjugado de bevacizumab producido según el método de BB-01 (Bevacizumab Boltbody) es superior a la hora de provocar la regulación por incremento de CD86 en las células mieloides en comparación con el bevacizumab no conjugado (Roche) después de 18 horas de estimulación.
La figura 71A muestra un análisis por cromatografía de líquidos-espectrometría de masas del ¡nmunoconjugado de cetuximab producido según el método de conjugación de BB-01 a partir del biosimilar de cetuximab (Alphamab) después de la desglicosilación durante la noche con PNGasa F.
La figura 71B muestra un análisis por cromatografía de líquidos-espectrometría de masas del ¡nmunoconjugado de cetuximab producido según el método de conjugación de BB-01.
La figura 71C muestra un análisis por cromatografía de líquidos-espectrometría de masas del biosimilar de cetuximab no conjugado (Alphamab) que se utilizó para producir el ¡nmunoconjugado de cetuximab según el método de BB-01 después de la desglicosilación durante la noche con PNGasa F.
La figura 71D muestra un análisis por cromatografía de líquidos-espectrometría de masas del biosimilar de cetuximab no conjugado (Alphamab) que se utilizó para producir el ¡nmunoconjugado de cetuximab según el método de conjugación de BB-01.
La figura 71E muestra que los inmunoconjugados de rituximab producidos según el método de BB-01 a partir de biosimilares de rituximab (AmAb, Alphamab; JHL, JHL Biotech; LGM, LGM Pharma) provocan una regulación por incremento de CD123 comparable en las células mieloides después de 18 horas de estimulación. La línea discontinua indica el nivel de expresión en las células mieloides no estimuladas cultivadas durante 18 horas.
La figura 71F muestra que los inmunoconjugados de rituximab producidos según el método de BB-01 a partir de biosimilares de rituximab (AmAb, Alphamab; JHL, JHL Biotech; LGM, LGM Pharma) provocan una expresión de HLA-DR comparable en las células mieloides después de 18 horas de estimulación. La línea discontinua indica el nivel de expresión en las células mieloides no estimuladas cultivadas durante 18 horas.
La figura 71G muestra que los inmunoconjugados de rituximab producidos según el método de BB-01 a partir de biosimilares de rituximab (biosimilar 1, Alphamab; biosimilar 2, JHL Biotech; biosimilar 3, LGM Pharma) provocan una regulación por disminución comparable de CD14 en las células mieloides después de 18 horas de estimulación. La línea discontinua indica el nivel de expresión en las células mieloides no estimuladas cultivadas durante 18 horas.
La figura 71H muestra que los inmunoconjugados de rituximab producidos según el método de BB-01 a partir de biosimilares de rituximab (AmAb, Alphamab; JHL, JHL Biotech; LGM, LGM Pharma) provocan una regulación por disminución de CD16 comparable en las células mieloides después de 18 horas de estimulación. La línea discontinua indica el nivel de expresión en las células mieloides no estimuladas cultivadas durante 18 horas.
La figura 711 muestra que los inmunoconjugados de rituximab producidos según el método de BB-01 a partir de biosimilares de rituximab (AmAb, Alphamab; JHL, JHL Biotech; LGM, LGM Pharma) provocan una regulación por incremento de CD40 comparable en las células mieloides después de 18 horas de estimulación. La línea discontinua indica el nivel de expresión en las células mieloides no estimuladas cultivadas durante 18 horas.
La figura 71J muestra que los inmunoconjugados de rituximab producidos según el método de BB-01 a partir de biosimilares de rituximab (AmAb, Alphamab; JHL, JHL Biotech; LGM, LGM Pharma) provocan una regulación por incremento de CD86 comparable en las células mieloides después de 18 horas de estimulación. La línea discontinua indica el nivel de expresión en las células mieloides no estimuladas cultivadas durante 18 horas.
La figura 71K muestra un análisis por cromatografía de líquidos-espectrometría de masas del ¡nmunoconjugado de rituximab producido según el método de conjugación de BB-01 a partir del biosimilar de rituximab (Alphamab) después de la desglicosilación durante la noche con PNGasa F.
La figura 71L muestra un análisis por cromatografía de líquidos-espectrometría de masas del ¡nmunoconjugado de rituximab producido según el método de conjugación de BB-01 a partir del biosimilar de rituximab (Alphamab).
La figura 71M muestra un análisis por cromatografía de líquidos-espectrometría de masas de un biosimilar de rituximab no conjugado (Alphamab) que se utilizó para producir el ¡nmunoconjugado del biosimilar de rituximab según el método de BB-01 después de la desglicosilación durante la noche con PNGasa F.
La figura 71N muestra un análisis por cromatografía de líquidos-espectrometría de masas de un biosimilar de rituximab no conjugado (Alphamab) que se utilizó para producir el ¡nmunoconjugado del biosimilar de rituximab según el método de BB-01.
La figura 710 muestra que el ¡nmunoconjugado del biosimilar de rituximab producido según el método de BB-01 a partir de un biosimilar de rituximab [BB-01 (biosimilar 1)] es superior a la hora de provocar la regulación por incremento de CD123 en las células mieloides en comparación con el biosimilar de rituximab no conjugado correspondiente [(CD20 (biosimilar 1), Alphamab] después de 18 horas de estimulación.
La figura 71P muestra que el inmunoconjugado del biosimilar de rituximab producido según el método de BB-01 a partir de un biosimilar de rituximab [BB-01 (biosimilar 1)] es superior a la hora de provocar la regulación por incremento de HLA-DR en las células mieloides en comparación con el biosimilar de rituximab no conjugado correspondiente [(CD20 (biosimilar 1), Alphamab] después de 18 horas de estimulación.
La figura 71Q muestra que el inmunoconjugado del biosimilar de rituximab producido según el método de BB-01 a partir de un biosimilar de rituximab [BB-01 (biosimilar 1)] es superior a la hora de provocar la regulación por disminución de CD14 en las células mieloides en comparación con el biosimilar de rituximab no conjugado correspondiente [(CD20 (biosimilar 1), Alphamab] después de 18 horas de estimulación.
La figura 71R muestra que el inmunoconjugado del biosimilar de rituximab producido según el método de BB-01 a partir de un biosimilar de rituximab [BB-01 (biosimilar 1)] es superior a la hora de provocar la regulación por disminución de CD16 en las células mieloides en comparación con el biosimilar de rituximab no conjugado correspondiente [(CD20 (biosimilar 1), Alphamab] después de 18 horas de estimulación.
La figura 71S muestra que el inmunoconjugado del biosimilar de rituximab producido según el método de BB-01 a partir de un biosimilar de rituximab [BB-01 (biosimilar 1)] es superior a la hora de provocar la regulación por incremento de CD40 en las células mieloides en comparación con el biosimilar de rituximab no conjugado correspondiente [(CD20 (biosimilar 1), Alphamab] después de 18 horas de estimulación.
La figura 71T muestra que el inmunoconjugado del biosimilar de rituximab producido según el método de BB-01 a partir de un biosimilar de rituximab [BB-01 (biosimilar 1)] es superior a la hora de provocar la regulación por incremento de CD86 en las células mieloides en comparación con el biosimilar de rituximab no conjugado correspondiente [(CD20 (biosimilar 1), Alphamab] después de 18 horas de estimulación.
La figura 71U muestra un análisis por cromatografía de líquidos-espectrometría de masas del inmunoconjugado de rituximab producido según el método de conjugación de BB-01 a partir del biosimilar de rituximab (LGM Pharma) después de la desglicosilación durante la noche con PNGasa F.
La figura 71V muestra un análisis por cromatografía de líquidos-espectrometría de masas del inmunoconjugado de rituximab producido según el método de conjugación de BB-01 a partir del biosimilar de rituximab (LGM Pharma).
La figura 71W muestra un análisis por cromatografía de líquidos-espectrometría de masas de un biosimilar de rituximab no conjugado (LGM Pharma) que se utilizó para producir el inmunoconjugado del biosimilar de rituximab según el método de BB-01 después de la desglicosilación durante la noche con PNGasa F.
La figura 71X muestra un análisis por cromatografía de líquidos-espectrometría de masas de un biosimilar de rituximab no conjugado (LGM Pharma) que se utilizó para producir el inmunoconjugado del biosimilar de rituximab según el método de BB-01.
La figura 71Y muestra que el inmunoconjugado del biosimilar de rituximab producido según el método de BB-01 a partir de un biosimilar de rituximab (BB-01) es superior a la hora de provocar la regulación por incremento de CD123 en las células mieloides en comparación con el biosimilar de rituximab no conjugado correspondiente (CD20, LGM Pharma) después de 18 horas de estimulación.
La figura 71Z muestra que el inmunoconjugado del biosimilar de rituximab producido según el método de BB-01 a partir de un biosimilar de rituximab (BB-01) es superior a la hora de provocar la regulación por incremento de HLA-DR en las células mieloides en comparación con el biosimilar de rituximab no conjugado correspondiente (CD20, LGM Pharma) después de 18 horas de estimulación.
La figura 71AA muestra que el inmunoconjugado del biosimilar de rituximab producido según el método de BB-01 a partir de un biosimilar de rituximab (BB-01) es superior a la hora de provocar la regulación por disminución de c D14 en las células mieloides en comparación con el biosimilar de rituximab no conjugado correspondiente (CD20, LGM Pharma) después de 18 horas de estimulación.
La figura 71AB muestra que el inmunoconjugado del biosimilar de rituximab producido según el método de BB-01 a partir de un biosimilar de rituximab (BB-01) es superior a la hora de provocar la regulación por disminución de CD16 en las células mieloides en comparación con el biosimilar de rituximab no conjugado correspondiente (CD20, LGM Pharma) después de 18 horas de estimulación.
La figura 71AC muestra que el inmunoconjugado del biosimilar de rituximab producido según el método de BB-01 a partir de un biosimilar de rituximab (BB-01) es superior a la hora de provocar la regulación por incremento de c D40 en las células mieloides en comparación con el biosimilar de rituximab no conjugado correspondiente (CD20, LGM Pharma) después de 18 horas de estimulación.
La figura 71AD muestra que el ¡nmunoconjugado del biosimilar de rituximab producido según el método de BB-01 a partir de un biosimilar de rituximab (BB-01) es superior a la hora de provocar la regulación por incremento de c D86 en las células mieloides en comparación con el biosimilar de rituximab no conjugado correspondiente (CD20, LGM Pharma) después de 18 horas de estimulación.
La figura 71AE muestra un análisis por cromatografía de líquidos-espectrometría de masas del ¡nmunoconjugado de rituximab producido según el método de conjugación de BB-01 a partir del biosimilar de rituximab (JHL Biotech) después de la desglicosilación durante la noche con PNGasa F.
La figura 71AF muestra un análisis por cromatografía de líquidos-espectrometría de masas del ¡nmunoconjugado de rituximab producido según el método de conjugación de BB-01 a partir del biosimilar de rituximab (JHL Biotech).
La figura 71AG muestra un análisis por cromatografía de líquidos-espectrometría de masas de un biosimilar de rituximab no conjugado (JHL Biotech) que se utilizó para producir el ¡nmunoconjugado del biosimilar de rituximab según el método de BB-01 después de la desglicosilación durante la noche con PNGasa F.
La figura 71AH muestra un análisis por cromatografía de líquidos-espectrometría de masas de un biosimilar de rituximab no conjugado (JHL Biotech) que se utilizó para producir el ¡nmunoconjugado del biosimilar de rituximab según el método de BB-01.
La figura 71AI muestra que el ¡nmunoconjugado del biosimilar de rituximab producido según el método de BB-01 a partir de un biosimilar de rituximab [<b>B-01 (biosimilar 2)] es superior a la hora de provocar la regulación por incremento de CD123 en las células mieloides en comparación con el biosimilar de rituximab no conjugado correspondiente [(CD20 (biosimilar 2), JHL Biotech] después de 18 horas de estimulación.
La figura 71AJ muestra que el ¡nmunoconjugado del biosimilar de rituximab producido según el método de BB-01 a partir de un biosimilar de rituximab [BB-01 (biosimilar 2)] es superior a la hora de provocar la regulación por incremento de HLA-DR en las células mieloides en comparación con el biosimilar de rituximab no conjugado correspondiente [(CD20 (biosimilar 2), JHL Biotech] después de 18 horas de estimulación.
La figura 71AK muestra que el ¡nmunoconjugado del biosimilar de rituximab producido según el método de BB-01 a partir de un biosimilar de rituximab [BB-01 (biosimilar 2)] es superior a la hora de provocar la regulación por incremento de CD40 en las células mieloides en comparación con el biosimilar de rituximab no conjugado correspondiente [(CD20 (biosimilar 2), JHL Biotech] después de 18 horas de estimulación.
La figura 71AL muestra que el ¡nmunoconjugado del biosimilar de rituximab producido según el método de BB-01 a partir de un biosimilar de rituximab [BB-01 (biosimilar 2)] es superior a la hora de provocar la regulación por incremento de CD86 en las células mieloides en comparación con el biosimilar de rituximab no conjugado correspondiente [(CD20 (biosimilar 2), JHL Biotech] después de 18 horas de estimulación.
La figura 71AM muestra un análisis por cromatografía de líquidos-espectrometría de masas de rituximab no conjugado (Roche).
La figura 71AN muestra un análisis por cromatografía de líquidos-espectrometría de masas del ¡nmunoconjugado de trastuzumab producido según el método de conjugación de BB-01 a partir del biosimilar de trastuzumab (JHL Biotech) después de la desglicosilación durante la noche con PNGasa F.
La figura 71AO muestra un análisis por cromatografía de líquidos-espectrometría de masas del ¡nmunoconjugado de trastuzumab producido según el método de conjugación de BB-01 a partir del biosimilar de trastuzumab (JHL Biotech).
La figura 71AP muestra un análisis por cromatografía de líquidos-espectrometría de masas de un biosimilar de trastuzumab no conjugado (JHL Biotech) que se utilizó para producir el ¡nmunoconjugado del biosimilar de trastuzumab según el método de BB-01 después de la desglicosilación durante la noche con PNGasa F.
La figura 71AQ muestra un análisis por cromatografía de líquidos-espectrometría de masas de un biosimilar de trastuzumab no conjugado (JHL Biotech) que se utilizó para producir el ¡nmunoconjugado del biosimilar de trastuzumab según el método de BB-01.
La figura 71AR muestra que el ¡nmunoconjugado del biosimilar de trastuzumab producido según el método de BB-01 a partir de un biosimilar de trastuzumab (BB-40) es superior a la hora de provocar la regulación por incremento de<c>D123 en las células mieloides en comparación con el biosimilar de trastuzumab no conjugado correspondiente [Trastuzumab (JHL), JHL Biotech) después de 18 horas de estimulación.
La figura 71AS muestra que el ¡nmunoconjugado del biosimilar de trastuzumab producido según el método de BB-01 a partir de un biosimilar de trastuzumab (BB-40) es superior a la hora de provocar la regulación por incremento de HLA-DR en las células mieloides en comparación con el biosimilar de trastuzumab no conjugado correspondiente [Trastuzumab (JHL) , JHL Biotech) después de 18 horas de estimulación.
La figura 71AT muestra que el ¡nmunoconjugado del biosimilar de trastuzumab producido según el método de BB01 a partir de un biosimilar de trastuzumab (BB-40) es superior a la hora de provocar la regulación por disminución de CD14 en las células mieloides en comparación con el biosimilar de trastuzumab no conjugado correspondiente [Trastuzumab (JHL), JHL Biotech) después de 18 horas de estimulación.
La figura 71AU muestra que el inmunoconjugado del biosimilar de trastuzumab producido según el método de BB-01 a partir de un biosimilar de trastuzumab (BB-40) es superior a la hora de provocar la regulación por disminución de CD16 en las células mieloides en comparación con el biosimilar de trastuzumab no conjugado correspondiente [Trastuzumab (JHL), JHL Biotech) después de 18 horas de estimulación.
La figura 71AV muestra que el inmunoconjugado del biosimilar de trastuzumab producido según el método de BB-01 a partir de un biosimilar de trastuzumab (BB-40) es superior a la hora de provocar la regulación por incremento de CD40 en las células mieloides en comparación con el biosimilar de trastuzumab no conjugado correspondiente [Trastuzumab (JHL), JHL Biotech) después de 18 horas de estimulación.
La figura 71AW muestra que el inmunoconjugado del biosimilar de trastuzumab producido según el método de BB-01 a partir de un biosimilar de trastuzumab (BB-40) es superior a la hora de provocar la regulación por incremento de CD86 en las células mieloides en comparación con el biosimilar de trastuzumab no conjugado correspondiente [Trastuzumab (JHL), JHL Biotech) después de 18 horas de estimulación.
La figura 72A muestra que el inmunoconjugado de cetuximab producido según el método de BB-01 (Cetuximab Boltbody) provoca una secreción superior de IL-1 p en las células mieloides en comparación con concentraciones equimolares de cetuximab no conjugado (Imclone/Lilly) después de 18 horas de estimulación.
La figura 72B muestra que el inmunoconjugado de cetuximab producido según el método de BB-01 (Cetuximab Boltbody) provoca una secreción superior de TNFa en las células mieloides en comparación con concentraciones equimolares de cetuximab no conjugado (Imclone/Lilly) después de 18 horas de estimulación.
La figura 72C muestra un análisis por cromatografía de líquidos-espectrometría de masas de cetuximab no conjugado (Imclone/Lilly) que se utilizó para producir inmunoconjugado de cetuximab según el método de conjugación de BB-01 después de la desglicosilación durante la noche con PNGasa F.
La figura 72D muestra un análisis por cromatografía de líquidos-espectrometría de masas de cetuximab no conjugado (Imclone/Lilly) que se utilizó para producir el inmunoconjugado de cetuximab según el método de conjugación de BB-01.
La figura 72E muestra que el inmunoconjugado de cetuximab producido según el método de BB-01 (círculos cerrados, rojo) es superior a la hora de provocar la regulación por incremento de CD123 en las células mieloides en comparación con el cetuximab no conjugado (cuadrados cerrados, negro; Imclone/Lilly) después de 18 horas de estimulación.
La figura 72F muestra que el inmunoconjugado de cetuximab producido según el método de BB-01 (círculos cerrados, rojo) es superior a la hora de provocar la regulación por incremento de HLA-DR en las células mieloides en comparación con el cetuximab no conjugado (cuadrados cerrados, negro; Imclone/Lilly) después de 18 horas de estimulación.
La figura 72G muestra que el inmunoconjugado de cetuximab producido según el método de BB-01 (círculos cerrados, rojo) es superior a la hora de provocar la regulación por disminución de CD14 en las células mieloides en comparación con el cetuximab no conjugado (cuadrados cerrados, negro; Imclone/Lilly) después de 18 horas de estimulación.
La figura 72H muestra que el inmunoconjugado de cetuximab producido según el método de BB-01 (círculos cerrados, rojo) es superior a la hora de provocar la regulación por disminución de CD16 en las células mieloides en comparación con el cetuximab no conjugado (cuadrados cerrados, negro; Imclone/Lilly) después de 18 horas de estimulación.
La figura 721 muestra que el inmunoconjugado de cetuximab producido según el método de BB-01 (círculos cerrados, rojo) es superior a la hora de provocar la regulación por incremento de CD40 en las células mieloides en comparación con el cetuximab no conjugado (cuadrados cerrados, negro; Imclone/Lilly) después de 18 horas de estimulación.
La figura 72J muestra que el inmunoconjugado de cetuximab producido según el método de BB-01 (círculos cerrados, rojo) es superior a la hora de provocar la regulación por incremento de CD86 en las células mieloides en comparación con el cetuximab no conjugado (cuadrados cerrados, negro; Imclone/Lilly) después de 18 horas de estimulación.
La figura 73A muestra que el inmunoconjugado de daratumumab producido según el método de BB-01 (Daratumumab Boltbody) provoca una secreción superior de IL-1 p en las células mieloides en comparación con concentraciones equimolares de daratumumab no conjugado (Genmab/Janssen Biotech) después de 18 horas de estimulación.
La figura 73B muestra que el ¡nmunoconjugado de daratumumab producido según el método de BB-01 (Daratumumab Boltbody) provoca una secreción superior de TNFa en las células mieloides en comparación con concentraciones equimolares de daratumumab no conjugado (Genmab/Janssen Biotech) después de 18 horas de estimulación.
La figura 73C muestra que el ¡nmunoconjugado de daratumumab producido según el método de BB-01 (Daratuzumab [s¡c] Boltbody) provoca una secreción superior de TNFa en las células mieloides en comparación con concentraciones equimolares de daratumumab no conjugado (Daratuzumab [s¡c], Genmab/Janssen Biotech) después de 36 horas de estimulación.
La figura 73D muestra que el ¡nmunoconjugado de daratumumab producido según el método de BB-01 (Daratuzumab [<s>¡<c>] Boltbody) provoca una secreción superior de IL-1 p en las células mieloides en comparación con concentraciones equimolares de daratumumab no conjugado (Daratuzumab [s¡c], Genmab/Janssen Biotech) después de 36 horas de estimulación.
La figura 73E muestra un análisis por cromatografía de líquidos-espectrometría de masas de daratumumab no conjugado (Genmab/Janssen Biotech) que se utilizó para producir el ¡nmunoconjugado de daratumumab según el método de BB-01 después de la desglicosilación durante la noche con PNGasa F.
La figura 73F muestra un análisis por cromatografía de líquidos-espectrometría de masas del ¡nmunoconjugado de daratumumab producido según el método de BB-01 después de la desglicosilación durante la noche con PNGasa F.
La figura 73G muestra un análisis por cromatografía de líquidos-espectrometría de masas de daratumumab no conjugado (Genmab/Janssen Biotech) que se utilizó para producir el ¡nmunoconjugado de daratumumab según el método de BB-01.
La figura 73H muestra que el ¡nmunoconjugado de daratumumab producido según el método de BB-01 (Daratuzumab Boltbody) es superior a la hora de provocar la regulación por incremento de CD123 en las células mieloides en comparación con el daratumumab no conjugado (Daratuzumab |, Genmab/Janssen Biotech) después de 18 horas de estimulación.
La figura 731 muestra la expresión de HLA-DR en las células mieloides después de 18 horas de estimulación con el ¡nmunoconjugado de daratumumab producido según el método de BB-01 (Daratumumab Boltbody) en comparación con el daratumumab no conjugado (Genmab/Janssen Biotech).
La figura 73J muestra que el ¡nmunoconjugado de daratumumab producido según el método de BB-01 (Daratuzumab Boltbody) es superior a la hora de provocar la regulación por disminución de CD14 en las células mieloides en comparación con el daratumumab no conjugado (Daratuzumab |, Genmab/Janssen Biotech) después de 18 horas de estimulación.
La figura 73K muestra que el ¡nmunoconjugado de daratumumab producido según el método de BB-01 (Daratuzumab Boltbody) es superior a la hora de provocar la regulación por disminución de CD16 en las células mieloides en comparación con el daratumumab no conjugado (Daratuzumab, Genmab/Janssen Biotech) después de 18 horas de estimulación.
La figura 73L muestra que el ¡nmunoconjugado de daratumumab producido según el método de BB-01 (Daratuzumab Boltbody) es superior a la hora de provocar la regulación por incremento de CD40 en las células mieloides en comparación con el daratumumab no conjugado (Daratuzumab |, Genmab/Janssen Biotech) después de 18 horas de estimulación.
La figura 73M muestra que el ¡nmunoconjugado de daratumumab producido según el método de BB-01 (Daratuzumab Boltbody) es superior a la hora de provocar la regulación por incremento de CD86 en las células mieloides en comparación con el daratumumab no conjugado (Daratuzumab |, Genmab/Janssen Biotech) después de 18 horas de estimulación.
La figura 74A muestra que el ¡nmunoconjugado de elotuzumab producido según el método de BB-01 (Elotuzumab Boltbody) provoca una secreción superior de IL-1 p en las células mieloides en comparación con concentraciones equimolares de elotuzumab no conjugado (BMS) después de 36 horas de estimulación.
La figura 74B muestra que el ¡nmunoconjugado de elotuzumab producido según el método de BB-01 (Elotuzumab Boltbody) provoca una secreción superior de TNFa en las células mieloides en comparación con concentraciones equimolares de elotuzumab no conjugado (BMS) después de 36 horas de estimulación.
La figura 74C muestra un análisis por cromatografía de líquidos-espectrometría de masas del ¡nmunoconjugado de elotuzumab producido según el método de conjugación de BB-01 después de la desglicosilación durante la noche con PNGasa F.
La figura 74D muestra un análisis por cromatografía de líquidos-espectrometría de masas de elotuzumab no conjugado (BMS) que se utilizó para producir el ¡nmunoconjugado de elotuzumab según el método de conjugación de BB-01 después de la desglicosilación durante la noche con PNGasa F.
La figura 74E muestra un análisis por cromatografía de líquidos-espectrometría de masas de elotuzumab no conjugado (BMS) que se utilizó para producir el inmunoconjugado de elotuzumab según el método de BB-01.
La figura 74F muestra que el inmunoconjugado de elotuzumab producido según el método de BB-01 (Elotuzumab Boltbody) es superior a la hora de provocar la regulación por incremento de CD123 en las células mieloides en comparación con el elotuzumab no conjugado (BMS) después de 18 horas de estimulación.
La figura 74G muestra que el inmunoconjugado de elotuzumab producido según el método de BB-01 (Elotuzumab Boltbody) es superior a la hora de provocar la regulación por incremento de HLA-DR en las células mieloides en comparación con el elotuzumab no conjugado (BMS) después de 18 horas de estimulación.
La figura 74H muestra que el inmunoconjugado de elotuzumab producido según el método de BB-01 (Elotuzumab Boltbody) es superior a la hora de provocar la regulación por disminución de CD14 en las células mieloides en comparación con el elotuzumab no conjugado (BMS) después de 18 horas de estimulación.
La figura 741 muestra que el inmunoconjugado de elotuzumab producido según el método de BB-01 (Elotuzumab Boltbody) es superior a la hora de provocar la regulación por disminución de CD16 en las células mieloides en comparación con el elotuzumab no conjugado (BMS) después de 18 horas de estimulación.
La figura 74J muestra que el inmunoconjugado de elotuzumab producido según el método de BB-01 (Elotuzumab Boltbody) es superior a la hora de provocar la regulación por incremento de CD40 en las células mieloides en comparación con el elotuzumab no conjugado (BMS) después de 18 horas de estimulación.
La figura 74K muestra que el inmunoconjugado de elotuzumab producido según el método de BB-01 (Elotuzumab Boltbody) es superior a la hora de provocar la regulación por incremento de CD86 en las células mieloides en comparación con el elotuzumab no conjugado (BMS) después de 18 horas de estimulación.
La figura 75A muestra que el inmunoconjugado de ipilimumab producido según el método de BB-01 (Ipilimumab Boltbody) provoca una secreción superior de TNFa en las células mieloides en comparación con concentraciones equimolares de ipilimumab no conjugado (BMS) después de 36 horas de estimulación.
La figura 75B muestra que el inmunoconjugado de ipilimumab producido según el método de BB-01 (Ipilimumab Boltbody) provoca una secreción superior de IL-1 p en las células mieloides en comparación con concentraciones equimolares de ipilimumab no conjugado (BMS) después de 18 horas de estimulación.
La figura 75C muestra que el inmunoconjugado de ipilimumab producido según el método de BB-01 (Ipilimumab Boltbody) provoca una secreción superior de TNFa en las células mieloides en comparación con concentraciones equimolares de ipilimumab no conjugado (BMS) después de 18 horas de estimulación.
La figura 75D muestra un análisis por cromatografía de líquidos-espectrometría de masas de ipilimumab no conjugado (BMS) que se utilizó para producir el inmunoconjugado de ipilimumab según el método de conjugación de BB-01 después de la desglicosilación durante la noche con PNGasa F.
La figura 75E muestra un análisis por cromatografía de líquidos-espectrometría de masas de ipilimumab no conjugado (BMS) que se utilizó para producir el inmunoconjugado de ipilimumab según el método de BB-01.
La figura 75F muestra que el inmunoconjugado de ipilimumab producido según el método de BB-01 (Ipilimumab Boltbody) es superior a la hora de provocar la regulación por incremento de CD123 en las células mieloides en comparación con el ipilimumab no conjugado (BMS) después de 18 horas de estimulación.
La figura 75G muestra que el inmunoconjugado de ipilimumab producido según el método de BB-01 (Ipilimumab Boltbody) es superior a la hora de provocar la regulación por incremento de HLA-DR en las células mieloides en comparación con el ipilimumab no conjugado (BMS) después de 18 horas de estimulación.
La figura 75H muestra que el inmunoconjugado de ipilimumab producido según el método de BB-01 (Ipilimumab Boltbody) es superior a la hora de provocar la regulación por disminución de CD14 en las células mieloides en comparación con el ipilimumab no conjugado (BMS) después de 18 horas de estimulación.
La figura 751 muestra que el inmunoconjugado de ipilimumab producido según el método de BB-01 (Ipilimumab Boltbody) es superior a la hora de provocar la regulación por disminución de CD16 en las células mieloides en comparación con el ipilimumab no conjugado (BMS) después de 18 horas de estimulación.
La figura 75J muestra que el inmunoconjugado de ipilimumab producido según el método de BB-01 (Ipilimumab Boltbody) es superior a la hora de provocar la regulación por incremento de CD40 en las células mieloides en comparación con el ipilimumab no conjugado (BMS) después de 18 horas de estimulación.
La figura 75K muestra que el inmunoconjugado de ipilimumab producido según el método de BB-01 (Ipilimumab Boltbody) es superior a la hora de provocar la regulación por incremento de CD86 en las células mieloides en comparación con el ipilimumab no conjugado (BMS) después de 18 horas de estimulación.
La figura 76A muestra que el ¡nmunoconjugado de nivolumab producido según el método de BB-01 (Nivolumab lgG4 Boltbody) provoca una secreción superior de IL-1 p en las células mieloides en comparación con concentraciones equimolares de nivolumab no conjugado (Nivolumab lgG4, BMS) después de 18 horas de estimulación.
La figura 76B muestra que el ¡nmunoconjugado de nivolumab producido según el método de BB-01 (Nivolumab lgG4 Boltbody) provoca una secreción superior de TNFa en las células mieloides en comparación con concentraciones equimolares de nivolumab no conjugado (Nivolumab lgG4, BMS) después de 18 horas de estimulación.
La figura 76C muestra que el ¡nmunoconjugado de nivolumab producido según el método de BB-01 (Nivolumab lgG4 Boltbody) provoca una secreción superior de IL-1 p en las células mieloides en comparación con concentraciones equimolares de nivolumab no conjugado (Nivolumab lgG4, BMS) después de 36 horas de estimulación.
La figura 76D muestra que el ¡nmunoconjugado de nivolumab producido según el método de BB-01 (Nivolumab lgG4 Boltbody) provoca una secreción superior de TNFa en las células mieloides en comparación con concentraciones equimolares de nivolumab no conjugado (Nivolumab lgG4, BMS) después de 36 horas de estimulación.
La figura 76E muestra un análisis por cromatografía de líquidos-espectrometría de masas del ¡nmunoconjugado de nivolumab producido según el método de conjugación de BB-01 después de la desglicosilación durante la noche con PNGasa F.
La figura 76F muestra un análisis por cromatografía de líquidos-espectrometría de masas de nivolumab no conjugado (BMS) que se utilizó para producir el ¡nmunoconjugado de nivolumab según el método de conjugación de BB-01 después de la desglicosilación durante la noche con PNGasa F.
La figura 76G muestra un análisis por cromatografía de líquidos-espectrometría de masas de nivolumab no conjugado (BMS) que se utilizó para producir el ¡nmunoconjugado de nivolumab según el método de BB-01.
La figura 76H muestra que el ¡nmunoconjugado de nivolumab producido según el método de BB-01 (Nivolumab Boltbody) es superior a la hora de provocar la regulación por incremento de CD123 en las células mieloides en comparación con el nivolumab no conjugado (BMS) después de 18 horas de estimulación.
La figura 761 muestra la expresión de HLA-DR en las células mieloides después de 18 horas de estimulación con el ¡nmunoconjugado de nivolumab producido según el método de BB-01 (Nivolumab Boltbody) en comparación con nivolumab no conjugado (BMS).
La figura 76J muestra que el ¡nmunoconjugado de nivolumab producido según el método de BB-01 (Nivolumab Boltbody) es superior a la hora de provocar la regulación por disminución de CD14 en las células mieloides en comparación con el nivolumab no conjugado (BMS) después de 18 horas de estimulación.
La figura 76K muestra que el ¡nmunoconjugado de nivolumab producido según el método de BB-01 (Nivolumab Boltbody) es superior a la hora de provocar la regulación por disminución de CD16 en las células mieloides en comparación con el nivolumab no conjugado (BMS) después de 18 horas de estimulación.
La figura 76L muestra que el ¡nmunoconjugado de nivolumab producido según el método de BB-01 (Nivolumab Boltbody) es superior a la hora de provocar la regulación por incremento de CD40 en las células mieloides en comparación con el nivolumab no conjugado (BMS) después de 18 horas de estimulación.
La figura 76M muestra que el ¡nmunoconjugado de nivolumab producido según el método de BB-01 (Nivolumab Boltbody) es superior a la hora de provocar la regulación por incremento de CD86 en las células mieloides en comparación con el nivolumab no conjugado (BMS) después de 18 horas de estimulación.
La figura 77A muestra que el ¡nmunoconjugado de obinutuzumab producido según el método de BB-01 (Obinutuzumab Boltbody) provoca una secreción superior de IL-1 p en las células mieloides en comparación con concentraciones equimolares de obinutuzumab no conjugado (Roche) después de 36 horas de estimulación.
La figura 77B muestra que el ¡nmunoconjugado de obinutuzumab producido según el método de BB-01 (Obinutuzumab Boltbody) provoca una secreción superior de TNFa en las células mieloides en comparación con concentraciones equimolares de obinutuzumab no conjugado (Roche) después de 36 horas de estimulación.
La figura 77C muestra un análisis por cromatografía de líquidos-espectrometría de masas de obinutuzumab no conjugado (Roche) que se utilizó para producir el ¡nmunoconjugado de obinutuzumab según el método de conjugación de BB-01 después de la desglicosilación durante la noche con PNGasa F.
La figura 77D muestra un análisis por cromatografía de líquidos-espectrometría de masas de obinutuzumab no conjugado (Roche) que se utilizó para producir el ¡nmunoconjugado de obinutuzumab según el método de conjugación de BB-01.
La figura 77E muestra que el inmunoconjugado de obinutuzumab producido según el método de BB-01 (Obinutuzumab Boltbody) es superior a la hora de provocar la regulación por incremento de CD123 en las células mieloides en comparación con el mAb CD20 no conjugado (Roche) después de 18 horas de estimulación.
La figura 77F muestra la expresión de HLA-DR en las células mieloides después de 18 horas de estimulación con el inmunoconjugado de obinutuzumab producido según el método de BB-01 (Obinutuzumab Boltbody) en comparación con el mAb CD20 no conjugado (Roche).
La figura 77G muestra que el inmunoconjugado de obinutuzumab producido según el método de BB-01 (Obinutuzumab Boltbody) es superior a la hora de provocar la regulación por disminución de CD14 en las células mieloides en comparación con el mAb CD20 no conjugado (Roche) después de 18 horas de estimulación.
La figura 77H muestra que el inmunoconjugado de obinutuzumab producido según el método de BB-01 (Obinutuzumab Boltbody) es superior a la hora de provocar la regulación por disminución de CD16 en las células mieloides en comparación con el mAb CD20 no conjugado (Roche) después de 18 horas de estimulación.
La figura 771 muestra que el inmunoconjugado de obinutuzumab producido según el método de BB-01 (Obinutuzumab Boltbody) es superior a la hora de provocar la regulación por incremento de CD40 en las células mieloides en comparación con el mAb CD20 no conjugado (Roche) después de 18 horas de estimulación.
La figura 77J muestra que el inmunoconjugado de obinutuzumab producido según el método de BB-01 (Obinutuzumab Boltbody) es superior a la hora de provocar la regulación por incremento de CD86 en las células mieloides en comparación con el mAb CD20 no conjugado (Roche) después de 18 horas de estimulación.
La figura 78A muestra que el inmunoconjugado de olaratumab producido según el método de BB-01 (Olaratumab Boltbody) provoca una secreción superior de IL-1 p en las células mieloides en comparación con concentraciones equimolares de olaratumab no conjugado (Lilly) después de 36 horas de estimulación.
La figura 78B muestra que el inmunoconjugado de olaratumab producido según el método de BB-01 (Olaratumab Boltbody) provoca una secreción superior de TNFa en las células mieloides en comparación con concentraciones equimolares de olaratumab no conjugado (Lilly) después de 36 horas de estimulación.
La figura 78C muestra un análisis por cromatografía de líquidos-espectrometría de masas del inmunoconjugado de olaratumab producido según el método de conjugación de BB-0 1 después de la desglicosilación durante la noche con PNGasa F.
La figura 78D muestra un análisis por cromatografía de líquidos-espectrometría de masas de olaratumab no conjugado (Lilly) que se utilizó para producir el inmunoconjugado de olaratumab según el método de conjugación de BB-01 después de la desglicosilación durante la noche con PNGasa F.
La figura 78E muestra un análisis por cromatografía de líquidos-espectrometría de masas de olaratumab no conjugado (Lilly) que se utilizó para producir el inmunoconjugado de olaratumab según el método de conjugación de BB-01.
La figura 78F muestra que el inmunoconjugado de olaratumab producido según el método de BB-01 (Olaratumab Boltbody) es superior a la hora de provocar la regulación por incremento de CD123 en las células mieloides en comparación con el olaratumab no conjugado (Lilly) después de 18 horas de estimulación.
La figura 78G muestra que el inmunoconjugado de olaratumab producido según el método de BB-01 (Olaratumab Boltbody) es superior a la hora de provocar la regulación por incremento de HLA-DR en las células mieloides en comparación con el olaratumab no conjugado (Lilly) después de 18 horas de estimulación.
La figura 78H muestra que el inmunoconjugado de olaratumab producido según el método de BB-01 (Olaratumab Boltbody) es superior a la hora de provocar la regulación por disminución de CD14 en las células mieloides en comparación con el olaratumab no conjugado (Lilly) después de 18 horas de estimulación.
La figura 781 muestra que el inmunoconjugado de olaratumab producido según el método de BB-01 (Olaratumab Boltbody) es superior a la hora de provocar la regulación por disminución de CD16 en las células mieloides en comparación con el olaratumab no conjugado (Lilly) después de 18 horas de estimulación.
La figura 78J muestra que el inmunoconjugado de olaratumab producido según el método de BB-01 (Olaratumab Boltbody) es superior a la hora de provocar la regulación por incremento de CD40 en las células mieloides en comparación con el olaratumab no conjugado (Lilly) después de 18 horas de estimulación.
La figura 78K muestra que el inmunoconjugado de olaratumab producido según el método de BB-01 (Olaratumab Boltbody) es superior a la hora de provocar la regulación por incremento de CD86 en las células mieloides en comparación con el olaratumab no conjugado (Lilly) después de 18 horas de estimulación.
La figura 79A muestra que el inmunoconjugado de pembrolizumab producido según el método de BB-01 (Pembrolizumab Boltbody) provoca una secreción superior de IL-1 p en las células mieloides en comparación con concentraciones equimolares de pembrolizumab no conjugado (Merck) después de 36 horas de estimulación.
La figura 79B muestra que el ¡nmunoconjugado de pembrolizumab producido según el método de BB-01 (Pembrolizumab Boltbody) provoca una secreción superior de TNFa en las células mieloides en comparación con concentraciones equimolares de pembrolizumab no conjugado (Merck) después de 36 horas de estimulación.
La figura 79C muestra un análisis por cromatografía de líquidos-espectrometría de masas del ¡nmunoconjugado de pembrolizumab producido según el método de conjugación de<b>B-01 después de la desglicosilación durante la noche con PNGasa F.
La figura 79D muestra un análisis por cromatografía de líquidos-espectrometría de masas de pembrolizumab no conjugado (Merck) que se utilizó para producir el ¡nmunoconjugado de pembrolizumab según el método de conjugación de BB-01 después de la desglicosilación durante la noche con PNGasa F.
La figura 79E muestra un análisis por cromatografía de líquidos-espectrometría de masas de pembrolizumab no conjugado (Merck) que se utilizó para producir el ¡nmunoconjugado de pembrolizumab según el método de conjugación de BB-01.
La figura 79F muestra que el ¡nmunoconjugado de pembrolizumab producido según el método de BB-01 (Pembrolizumab Boltbody) es superior a la hora de provocar la regulación por incremento de CD123 en las células mieloides en comparación con el pembrolizumab no conjugado (Merck) después de 18 horas de estimulación.
La figura 79G muestra que el ¡nmunoconjugado de pembrolizumab producido según el método de BB-01 (Pembrolizumab Boltbody) es superior a la hora de provocar la regulación por incremento de HLA-DR en las células mieloides en comparación con el pembrolizumab no conjugado (Merck) después de 18 horas de estimulación.
La figura 79H muestra que el ¡nmunoconjugado de pembrolizumab producido según el método de BB-01 (Pembrolizumab Boltbody) es superior a la hora de provocar la regulación por disminución de CD14 en las células mieloides en comparación con el pembrolizumab no conjugado (Merck) después de 18 horas de estimulación.
La figura 791 muestra que el ¡nmunoconjugado de pembrolizumab producido según el método de BB-01 (Pembrolizumab Boltbody) es superior a la hora de provocar la regulación por disminución de CD16 en las células mieloides en comparación con el pembrolizumab no conjugado (Merck) después de 18 horas de estimulación.
La figura 79J muestra que el ¡nmunoconjugado de pembrolizumab producido según el método de BB-01 (Pembrolizumab Boltbody) es superior a la hora de provocar la regulación por incremento de CD40 en las células mieloides en comparación con el pembrolizumab no conjugado (Merck) después de 18 horas de estimulación.
La figura 79K muestra que el ¡nmunoconjugado de pembrolizumab producido según el método de BB-01 (Pembrolizumab Boltbody) es superior a la hora de provocar la regulación por incremento de CD86 en las células mieloides en comparación con el pembrolizumab no conjugado (Merck) después de 18 horas de estimulación.
La figura 80A muestra que el ¡nmunoconjugado de pertuzumab producido según el método de BB-01 (Pertuzumab Boltbody) provoca una secreción superior de IL-1 p en las células mieloides en comparación con concentraciones equimolares de pertuzumab no conjugado (Roche) después de 18 horas de estimulación.
La figura 80B muestra que el ¡nmunoconjugado de pertuzumab producido según el método de BB-01 (Pertuzumab Boltbody) provoca una secreción superior de TNFa en las células mieloides en comparación con concentraciones equimolares de pertuzumab no conjugado (Roche) después de 18 horas de estimulación.
La figura 80C muestra que el ¡nmunoconjugado de pertuzumab producido según el método de BB-01 (Pertuzumab Boltbody) provoca una secreción superior de IL-1 p en las células mieloides en comparación con concentraciones equimolares de pertuzumab no conjugado (Roche) después de 36 horas de estimulación.
La figura 80D muestra que el ¡nmunoconjugado de pertuzumab producido según el método de BB-01 (Pertuzumab Boltbody) provoca una secreción superior de TNFa en las células mieloides en comparación con concentraciones equimolares de pertuzumab no conjugado (Roche) después de 36 horas de estimulación.
La figura 80E muestra un análisis por cromatografía de líquidos-espectrometría de masas del ¡nmunoconjugado de pertuzumab producido según el método de conjugación de BB-01 después de la desglicosilación durante la noche con PNGasa F.
La figura 80F muestra un análisis por cromatografía de líquidos-espectrometría de masas de pertuzumab no conjugado (Roche) que se utilizó para producir el ¡nmunoconjugado de pertuzumab según el método de conjugación de BB-01 después de la desglicosilación durante la noche con PNGasa F.
La figura 80G muestra un análisis por cromatografía de líquidos-espectrometría de masas de pertuzumab no conjugado (Roche) que se utilizó para producir el ¡nmunoconjugado de pertuzumab según el método de conjugación de BB-01.
La figura 80H muestra que el ¡nmunoconjugado de pertuzumab producido según el método de BB-01 (Pertuzumab Boltbody) es superior a la hora de provocar la regulación por incremento de CD123 en las células mieloides en comparación con el pertuzumab no conjugado (Roche) después de 18 horas de estimulación.
La figura 801 muestra que el inmunoconjugado de pertuzumab producido según el método de BB-01 (Pertuzumab Boltbody) es superior a la hora de provocar la regulación por incremento de HLA-DR en las células mieloides en comparación con el pertuzumab no conjugado (Roche) después de 18 horas de estimulación.
La figura 80J muestra que el inmunoconjugado de pertuzumab producido según el método de BB-01 (Pertuzumab Boltbody) es superior a la hora de provocar la regulación por disminución de CD14 en las células mieloides en comparación con el pertuzumab no conjugado (Roche) después de 18 horas de estimulación.
La figura 80K muestra que el inmunoconjugado de pertuzumab producido según el método de BB-01 (Pertuzumab Boltbody) es superior a la hora de provocar la regulación por disminución de CD16 en las células mieloides en comparación con el pertuzumab no conjugado (Roche) después de 18 horas de estimulación.
La figura 80L muestra que el inmunoconjugado de pertuzumab producido según el método de BB-01 (Pertuzumab Boltbody) es superior a la hora de provocar una regulación por incremento de CD40 en las células mieloides en comparación con el pertuzumab no conjugado (Roche) después de 18 horas de estimulación.
La figura 80M muestra que el inmunoconjugado de pertuzumab producido según el método de BB-01 (Pertuzumab Boltbody) es superior a la hora de provocar la regulación por incremento de CD86 en las células mieloides en comparación con el pertuzumab no conjugado (Roche) después de 18 horas de estimulación.
La figura 81A muestra que el inmunoconjugado de rituximab producido según el método de BB-01 (rituximab Boltbody) provoca una secreción superior de IL-1 p en las células mieloides en comparación con concentraciones equimolares de rituximab no conjugado (Roche) después de 36 horas de estimulación.
La figura 81B muestra que el inmunoconjugado de rituximab producido según el método de BB-01 (rituximab Boltbody) provoca una secreción superior de TNFa en las células mieloides en comparación con concentraciones equimolares de rituximab no conjugado (Roche) después de 36 horas de estimulación.
La figura 81C muestra un análisis por cromatografía de líquidos-espectrometría de masas del inmunoconjugado de rituximab producido según el método de conjugación de BB-01 después de la desglicosilación durante la noche con PNGasa F.
La figura 81D muestra un análisis por cromatografía de líquidos-espectrometría de masas del inmunoconjugado de rituximab producido según el método de conjugación de BB-01 después de la desglicosilación durante la noche con PNGasa F.
La figura 81E muestra un análisis por cromatografía de líquidos-espectrometría de masas del inmunoconjugado de rituximab producido según el método de conjugación de BB-01.
La figura 81F muestra un análisis por cromatografía de líquidos-espectrometría de masas de rituximab no conjugado (Roche) que se utilizó para producir el inmunoconjugado de rituximab según el método de conjugación de BB-01 después de la desglicosilación durante la noche con PNGasa F.
La figura 81G muestra un análisis por cromatografía de líquidos-espectrometría de masas de rituximab no conjugado (Roche) que se utilizó para producir el inmunoconjugado de rituximab según el método de conjugación de BB-01.
La figura 81H muestra que el inmunoconjugado de rituximab producido según el método de BB-01 (BB-01) es superior a la hora de provocar la regulación por incremento de CD123 en las células mieloides en comparación con el rituximab no conjugado (CD20, Roche) después de 18 horas de estimulación.
La figura 811 muestra que el inmunoconjugado de rituximab producido según el método de BB-01 (BB-01) es superior a la hora de provocar la regulación por incremento de HLA-DR en las células mieloides en comparación con el rituximab no conjugado (CD20, Roche) después de 18 horas de estimulación.
La figura 81J muestra que el inmunoconjugado de rituximab producido según el método de BB-01 (BB-01) es superior a la hora de provocar la regulación por disminución de CD14 en las células mieloides en comparación con el rituximab no conjugado (CD20, Roche) después de 18 horas de estimulación.
La figura 81K muestra que el inmunoconjugado de rituximab producido según el método de BB-01 (BB-01) es superior a la hora de provocar la regulación por disminución de CD16 en las células mieloides en comparación con el rituximab no conjugado (CD20, Roche) después de 18 horas de estimulación.
La figura 81L muestra que el inmunoconjugado de rituximab producido según el método de BB-01 (BB-01) es superior a la hora de provocar la regulación por incremento de CD40 en las células mieloides en comparación con el rituximab no conjugado (CD20, Roche) después de 18 horas de estimulación.
La figura 81M muestra que el inmunoconjugado de rituximab producido según el método de BB-01 (BB-01) es superior a la hora de provocar la regulación por incremento de CD86 en las células mieloides en comparación con el rituximab no conjugado (CD20, Roche) después de 18 horas de estimulación.
La figura 82A muestra que el inmunoconjugado de trastuzumab producido según el método de BB-01 (Trastuzumab Boltbody) provoca una secreción superior de IL-1 p en las células mieloides en comparación con concentraciones equimolares de trastuzumab no conjugado (Roche) después de 36 horas de estimulación.
La figura 82B muestra que el inmunoconjugado de trastuzumab producido según el método de BB-01 (Trastuzumab Boltbody) provoca una secreción superior de TNFa en las células mieloides en comparación con concentraciones equimolares de trastuzumab no conjugado (Roche) después de 36 horas de estimulación.
La figura 82C muestra un análisis por cromatografía de líquidos-espectrometría de masas del inmunoconjugado de trastuzumab producido según el método de conjugación de BB-01 después de la desglicosilación durante la noche con PNGasa F.
La figura 82D muestra un análisis por cromatografía de líquidos-espectrometría de masas de trastuzumab no conjugado (Roche) que se utilizó para producir el inmunoconjugado de trastuzumab según el método de conjugación de BB-01 después de la desglicosilación durante la noche con PNGasa F.
La figura 82E muestra un análisis por cromatografía de líquidos-espectrometría de masas de trastuzumab no conjugado (Roche) que se utilizó para producir el inmunoconjugado de trastuzumab según el método de conjugación de BB-01.
La figura 82F muestra que el inmunoconjugado de trastuzumab producido según el método de BB-01 (círculos cerrados, rojo) es superior a la hora de provocar la regulación por incremento de CD123 en las células mieloides en comparación con el trastuzumab no conjugado (cuadrados cerrados, negro; Roche) después de 18 horas de estimulación.
La figura 82G muestra que el inmunoconjugado de trastuzumab producido según el método de BB-01 (círculos cerrados, rojo) es superior a la hora de provocar la regulación por incremento de HLA-DR en las células mieloides en comparación con el trastuzumab no conjugado (cuadrados cerrados, negro; Roche) después de 18 horas de estimulación.
La figura 82H muestra que el inmunoconjugado de trastuzumab producido según el método de BB-01 (círculos cerrados, rojo) es superior a la hora de provocar la regulación por disminución de CD14 en las células mieloides en comparación con el trastuzumab no conjugado (cuadrados cerrados, negro; Roche) después de 18 horas de estimulación.
La figura 821 muestra que el inmunoconjugado de trastuzumab producido según el método de BB-01 (círculos cerrados, rojo es superior a la hora de provocar la regulación por disminución de CD16 en las células mieloides en comparación con el trastuzumab no conjugado (cuadrados cerrados, negro; Roche) después de 18 horas de estimulación.
La figura 82J muestra que el inmunoconjugado de trastuzumab producido según el método de BB-01 (círculos cerrados, rojo) es superior a la hora de provocar la regulación por incremento de CD40 en las células mieloides en comparación con el trastuzumab no conjugado (cuadrados cerrados, negro; Roche) después de 18 horas de estimulación.
La figura 82K muestra que el inmunoconjugado de trastuzumab producido según el método de BB-01 (círculos cerrados, rojo) es superior a la hora de provocar la regulación por incremento de CD86 en las células mieloides en comparación con el trastuzumab no conjugado (cuadrados cerrados, negro; Roche) después de 18 horas de estimulación.
La figura 83A muestra que el inmunoconjugado de etanercept producido según el método de BB-01 (Etanercept Boltbody) provoca una secreción superior de IL-1 p en las células mieloides en comparación con concentraciones equimolares de etanercept no conjugado (Amgen) después de 36 horas de estimulación.
La figura 83B muestra que el inmunoconjugado de etanercept producido según el método de BB-01 (Etanercept Boltbody) provoca una secreción superior de TNFa en las células mieloides en comparación con concentraciones equimolares de etanercept no conjugado (Amgen) después de 36 horas de estimulación.
La figura 83C muestra que el inmunoconjugado de etanercept producido según el método de BB-01 (Etanercept Boltbody) es superior a la hora de provocar la regulación por disminución de CD14 en las células mieloides en comparación con el etanercept no conjugado (Amgen) después de 18 horas de estimulación.
La figura 83D muestra que el inmunoconjugado de etanercept producido según el método de BB-01 (Etanercept Boltbody) es superior a la hora de provocar la regulación por disminución de CD16 en las células mieloides en comparación con el etanercept no conjugado (Amgen) después de 18 horas de estimulación.
La figura 83E muestra que el inmunoconjugado de etanercept producido según el método de BB-01 (Etanercept Boltbody) es superior a la hora de provocar la regulación por incremento de CD40 en las células mieloides en comparación con el etanercept no conjugado (Amgen) después de 18 horas de estimulación.
La figura 83F muestra que el ¡nmunoconjugado de etanercept producido según el método de BB-01 (Etanercept Boltbody) es superior a la hora de provocar la regulación por incremento de CD86 en las células mieloides en comparación con el etanercept no conjugado (Amgen) después de 18 horas de estimulación.
La figura 83G muestra que el ¡nmunoconjugado de etanercept producido según el método de BB-01 (Etanercept Boltbody) es superior a la hora de provocar la regulación por incremento de CD123 en las células mieloides en comparación con el etanercept no conjugado (Amgen) después de 18 horas de estimulación.
La figura 83H muestra que el ¡nmunoconjugado de etanercept producido según el método de BB-01 (Etanercept Boltbody) es superior a la hora de provocar la regulación por incremento de HLA-DR en las células mieloides en comparación con el etanercept no conjugado (Amgen) después de 18 horas de estimulación.
La figura 84A muestra un análisis por cromatografía de líquidos-espectrometría de masas del ¡nmunoconjugado de rituximab producido según el método de conjugación de BB-01 a partir del biosimilar de rituximab (LGM Pharma). El DAR calculado es 0.7.
La figura 84B muestra un análisis por cromatografía de líquidos-espectrometría de masas del biosimilar de rituximab no conjugado (LGM Pharma) que se utilizó para producir el ¡nmunoconjugado de rituximab según el método de conjugación de BB-01 después de la desglicosilación durante la noche con PNGasa F.
La figura 84C muestra un análisis por cromatografía de líquidos-espectrometría de masas de rituximab no conjugado (LGM Pharma) que se utilizó para producir el ¡nmunoconjugado de rituximab según el método de conjugación de BB-01.
La figura 84D muestra la expresión de CD14 en las células mieloides después de 18 horas de estimulación con el ¡nmunoconjugado de rituximab producido según el método de BB-01 [BB-01 (DAR 0.7)]. La línea discontinua indica el nivel de expresión en las células mieloides no estimuladas cultivadas durante 18 horas.
La figura 84E muestra la expresión de CD16 en las células mieloides después de 18 horas de estimulación con el ¡nmunoconjugado de rituximab producido según el método de BB-01 [BB-01 (DAR 0.7)]. La línea discontinua indica el nivel de expresión en las células mieloides no estimuladas cultivadas durante 18 horas.
La figura 84F muestra la expresión de CD40 en las células mieloides después de 18 horas de estimulación con el ¡nmunoconjugado de rituximab producido según el método de BB-01 [BB-01 (DAR 0.7)]. La línea discontinua indica el nivel de expresión en las células mieloides no estimuladas cultivadas durante 18 horas.
La figura 84G muestra la expresión de CD86 en las células mieloides después de 18 horas de estimulación con el ¡nmunoconjugado de rituximab producido según el método de BB-01 [BB-01 (DAR 0.7)]. La línea discontinua indica el nivel de expresión en las células mieloides no estimuladas cultivadas durante 18 horas.
La figura 84H muestra la expresión de CD123 en las células mieloides después de 18 horas de estimulación con el ¡nmunoconjugado de rituximab producido según el método de BB-01 [BB-01 (DAR 0.7)]. La línea discontinua indica el nivel de expresión en las células mieloides no estimuladas cultivadas durante 18 horas.
La figura 841 muestra la expresión de HLA-DR en las células mieloides después de 18 horas de estimulación con el ¡nmunoconjugado de rituximab producido según el método de BB-01 [BB-01 (DAR 0.7)]. La línea discontinua indica el nivel de expresión en las células mieloides no estimuladas cultivadas durante 18 horas.
La figura 85A muestra un análisis por cromatografía de líquidos-espectrometría de masas del ¡nmunoconjugado de rituximab producido según el método de conjugación de BB-01 a partir del biosimilar de rituximab (LGM Pharma). El DAR calculado es 1.6.
La figura 85B muestra un análisis por cromatografía de líquidos-espectrometría de masas del biosimilar de rituximab no conjugado (LGM Pharma) que se utilizó para producir el ¡nmunoconjugado de rituximab según el método de conjugación de BB-01 después de la desglicosilación durante la noche con PNGasa F.
La figura 85C muestra un análisis por cromatografía de líquidos-espectrometría de masas de rituximab no conjugado (LGM Pharma) que se utilizó para producir el ¡nmunoconjugado de rituximab según el método de conjugación de BB-01.
La figura 85D muestra un análisis por cromatografía de líquidos-espectrometría de masas de rituximab no conjugado (LGM Pharma) que se utilizó para producir el ¡nmunoconjugado de rituximab según el método de conjugación de BB-01.
La figura 85E muestra la expresión de CD14 en las células mieloides después de 18 horas de estimulación con el ¡nmunoconjugado de rituximab producido según el método de BB-01 [BB-01 (DAR 1.6)]. La línea discontinua indica el nivel de expresión en las células mieloides no estimuladas cultivadas durante 18 horas.
La figura 85F muestra la expresión de CD16 en las células mieloides después de 18 horas de estimulación con el ¡nmunoconjugado de rituximab producido según el método de BB-01 [BB-01 (DAR 1.6)]. La línea discontinua indica el nivel de expresión en las células mieloides no estimuladas cultivadas durante 18 horas.
La figura 85G muestra la expresión de CD40 en las células mieloides después de 18 horas de estimulación con el inmunoconjugado de rituximab producido según el método de BB-01 [BB-01 (DAR 1.6)]. La línea discontinua indica el nivel de expresión en las células mieloides no estimuladas cultivadas durante 18 horas.
La figura 85H muestra la expresión de CD86 en las células mieloides después de 18 horas de estimulación con el inmunoconjugado de rituximab producido según el método de BB-01 [BB-01 (DAR 1.6)]. La línea discontinua indica el nivel de expresión en las células mieloides no estimuladas cultivadas durante 18 horas.
La figura 851 muestra la expresión de CD123 en las células mieloides después de 18 horas de estimulación con el inmunoconjugado de rituximab producido según el método de BB-01 [BB-01 (DAR 1.6)]. La línea discontinua indica el nivel de expresión en las células mieloides no estimuladas cultivadas durante 18 horas.
La figura 85J muestra la expresión de HLA-DR en las células mieloides después de 18 horas de estimulación con el inmunoconjugado de rituximab producido según el método de BB-01 [BB-01 (DAR 1.6)]. La línea discontinua indica el nivel de expresión en las células mieloides no estimuladas cultivadas durante 18 horas.
La figura 86A muestra un análisis por cromatografía de líquidos-espectrometría de masas del inmunoconjugado de rituximab producido según el método de conjugación de BB-01 a partir del biosimilar de rituximab (LGM Pharma). El DAR calculado es 2.5.
La figura 86B muestra un análisis por cromatografía de líquidos-espectrometría de masas del biosimilar de rituximab no conjugado (LGM Pharma) que se utilizó para producir el inmunoconjugado de rituximab según el método de conjugación de BB-01 después de la desglicosilación durante la noche con PNGasa F.
La figura 86C muestra un análisis por cromatografía de líquidos-espectrometría de masas de rituximab no conjugado (LGM Pharma) que se utilizó para producir el inmunoconjugado de rituximab según el método de conjugación de BB-01.
La figura 86D muestra un análisis por cromatografía de líquidos-espectrometría de masas del inmunoconjugado de rituximab producido según el método de conjugación de BB-01 a partir del biosimilar de rituximab (LGM Pharma). El DAR calculado es 2.5.
La figura 86E muestra la expresión de CD14 en las células mieloides después de 18 horas de estimulación con el inmunoconjugado de rituximab producido según el método de BB-01 [BB-01 (DAR 2.5)]. La línea discontinua indica el nivel de expresión en las células mieloides no estimuladas cultivadas durante 18 horas.
La figura 86F muestra la expresión de CD16 en las células mieloides después de 18 horas de estimulación con el inmunoconjugado de rituximab producido según el método de BB-01 [BB-01 (DAR 2.5)]. La línea discontinua indica el nivel de expresión en las células mieloides no estimuladas cultivadas durante 18 horas.
La figura 86G muestra la expresión de CD40 en las células mieloides después de 18 horas de estimulación con el inmunoconjugado de rituximab producido según el método de BB-01 [BB-01 (DAR 2.5)]. La línea discontinua indica el nivel de expresión en las células mieloides no estimuladas cultivadas durante 18 horas.
La figura 86H muestra la expresión de CD86 en las células mieloides después de 18 horas de estimulación con el inmunoconjugado de rituximab producido según el método de BB-01 [BB-01 (DAR 2.5)]. La línea discontinua indica el nivel de expresión en las células mieloides no estimuladas cultivadas durante 18 horas.
La figura 861 muestra la expresión de CD123 en las células mieloides después de 18 horas de estimulación con el inmunoconjugado de rituximab producido según el método de BB-01 [BB-01 (DAR 1.6)]. La línea discontinua indica el nivel de expresión en las células mieloides no estimuladas cultivadas durante 18 horas.
La figura 86J muestra la expresión de HLA-DR en las células mieloides después de 18 horas de estimulación con el inmunoconjugado de rituximab producido según el método de BB-01 [BB-01 (DAR 1.6)]. La línea discontinua indica el nivel de expresión en las células mieloides no estimuladas cultivadas durante 18 horas.
La figura 87A muestra que los inmunoconjugados de rituximab de DAR variable, todos producidos según el método de BB-01 a partir del biosimilar de rituximab (LGM Pharma), provocan una regulación por disminución de CD14 comparable en las células mieloides después de 18 horas de estimulación. La línea discontinua indica el nivel de expresión en las células mieloides no estimuladas cultivadas durante 18 horas.
La figura 87B muestra que los inmunoconjugados de rituximab de DAR variable, todos producidos según el método de BB-01 a partir del biosimilar de rituximab (LGM Pharma) provocan la regulación por disminución comparable de CD16 en las células mieloides después de 18 horas de estimulación. La línea discontinua indica el nivel de expresión en las células mieloides no estimuladas cultivadas durante 18 horas.
La figura 87C muestra que los inmunoconjugados de rituximab de DAR variable, todos producidos según el método de BB-01 a partir del biosimilar de rituximab (LGM Pharma), provocan una regulación por incremento de CD40 comparable en las células mieloides después de 18 horas de estimulación. La línea discontinua indica el nivel de expresión en las células mieloides no estimuladas cultivadas durante 18 horas.
La figura 87D muestra que Ios ¡nmunoconjugados de rituximab de DAR variable, todos producidos según el método de BB-01 a partir del biosimilar de rituximab (LGM Pharma), provocan una regulación por incremento de CD86 comparable en las células mieloides después de 18 horas de estimulación. La línea discontinua indica el nivel de expresión en las células mieloides no estimuladas cultivadas durante 18 horas.
La figura 87E muestra que I<os>¡nmunoconjugados de rituximab de DAR variable, todos producidos según el método de BB-01 a partir del biosimilar de rituximab (LGM Pharma), provocan una regulación por incremento de CD123 comparable en las células mieloides después de 18 horas de estimulación. La línea discontinua indica el nivel de expresión en las células mieloides no estimuladas cultivadas durante 18 horas.
La figura 87F muestra que Ios ¡nmunoconjugados de rituximab de DAR variable, todos producidos según el método de BB-01 a partir del biosimilar de rituximab (LGM Pharma), provocan una regulación por incremento de HLA-DR comparable en las células mieloides después de 18 horas de estimulación. La línea discontinua indica el nivel de expresión en las células mieloides no estimuladas cultivadas durante 18 horas.
La figura 88A muestra un análisis por cromatografía de líquidos-espectrometría de masas del rituximab lgA2 no conjugado (Invivogen, hcd20-mab7) que se utilizó para producir el inmunoconjugado de rituximab según el método de conjugación de BB-01 después de la desglicosilación durante la noche con PNGasa F.
La figura 88B muestra un análisis por cromatografía de líquidos-espectrometría de masas del inmunoconjugado de rituximab lgA2 producido según el método de conjugación de BB-01 después de la desglicosilación durante la noche con PNGasa F.
La figura 88C muestra que el inmunoconjugado de rituximab lgA2 producido según el método de BB-01 (CD20 lgA2 Boltbody) es superior a la hora de provocar la regulación por disminución de CD14 en las células mieloides en comparación con el rituximab no conjugado (CD20 lgA2; Invivogen, hcd20-mac7) después de 18 horas de estimulación.
La figura 88D muestra que el inmunoconjugado de rituximab lgA2 producido según el método de BB-01 (CD20 lgA2 Boltbody) es superior a la hora de provocar la regulación por disminución de CD16 en las células mieloides en comparación con el rituximab no conjugado (CD20 lgA2; Invivogen, hcd20-mac7) después de 18 horas de estimulación.
La figura 88E muestra que el inmunoconjugado de rituximab lgA2 producido según el método de BB-01 (CD20 lgA2 Boltbody) es superior a la hora de provocar la regulación por incremento de CD40 en las células mieloides en comparación con el rituximab no conjugado (CD20 lgA2; Invivogen, hcd20-mac7) después de 18 horas de estimulación.
La figura 88F muestra que el inmunoconjugado de rituximab lgA2 producido según el método de BB-01 (CD20 lgA2 Boltbody) es superior a la hora de provocar la regulación por incremento de CD86 en las células mieloides en comparación con el rituximab no conjugado (CD20 lgA2; Invivogen, hcd20-mac7) después de 18 horas de estimulación.
La figura 88G muestra que el inmunoconjugado de rituximab lgA2 producido según el método de BB-01 (CD20 lgA2 Boltbody) es superior a la hora de provocar la regulación por incremento de CD123 en las células mieloides en comparación con el rituximab no conjugado (CD20 lgA2; Invivogen, hcd20-mac7) después de 18 horas de estimulación.
La figura 88H muestra que el inmunoconjugado de rituximab lgA2 producido según el método de BB-01 (CD20 lgA2 Boltbody) es superior a la hora de provocar la regulación por incremento de HLA-DR en las células mieloides en comparación con el rituximab no conjugado (CD20 lgA2; Invivogen, hcd20-mac7) después de 18 horas de estimulación.
La figura 89A muestra que el inmunoconjugado de rituximab lgG1 producido según el método de BB-01 (lgG1 Boltbody) provoca una secreción superior de TNFa en las células mieloides en comparación con concentraciones equimolares (0.2|jM) de rituximab no conjugado (lgG1; Invivogen, hcd20-mab1) después de 36 horas de estimulación.
La figura 89B muestra un análisis por cromatografía de líquidos-espectrometría de masas del rituximab lgG1 no conjugado (Invivogen, hcd20-mab1) que se utilizó para producir el inmunoconjugado de rituximab según el método de conjugación de BB-01.
La figura 89C muestra un análisis por cromatografía de líquidos-espectrometría de masas del inmunoconjugado de rituximab lgG1 producido según el método de conjugación de BB-01.
La figura 89D muestra que el inmunoconjugado de rituximab lgG1 producido según el método de BB-01 (CD20 lgG1 Boltbody) es superior a la hora de provocar la regulación por disminución de CD14 en las células mieloides en comparación con el rituximab no conjugado (CD20 lgG1; Invivogen, hcd20-mab1) después de 18 horas de estimulación.
La figura 89E muestra que el ¡nmunoconjugado de rituximab IgGI producido según el método de BB-01 (CD20 lgG1 Boltbody) es superior a la hora de provocar la regulación por disminución de CD16 en las células mieloides en comparación con el rituximab no conjugado (CD20 lgG1; Invivogen, hcd20-mab1) después de 18 horas de estimulación.
La figura 89F muestra que el ¡nmunoconjugado de rituximab lgG1 producido según el método de BB-01 (CD20 lgG1 Boltbody) es superior a la hora de provocar la regulación por incremento de CD40 en las células mieloides en comparación con el rituximab no conjugado (CD20 lgG1; Invivogen, hcd20-mab1) después de 18 horas de estimulación.
La figura 89G muestra que el ¡nmunoconjugado de rituximab lgG1 producido según el método de BB-01 (CD20 lgG1 Boltbody) es superior a la hora de provocar la regulación por incremento de CD86 en las células mieloides en comparación con el rituximab no conjugado (CD20 lgG1; Invivogen, hcd20-mab1) después de 18 horas de estimulación.
La figura 89H muestra que el ¡nmunoconjugado de rituximab lgG1 producido según el método de BB-01 (CD20 lgG1 Boltbody) es superior a la hora de provocar la regulación por incremento de CD123 en las células mieloides en comparación con el rituximab no conjugado (CD20 lgG1; Invivogen, hcd20-mab1) después de 18 horas de estimulación.
La figura 891 muestra que el ¡nmunoconjugado de rituximab lgG1 producido según el método de BB-01 (CD20 lgG1 Boltbody) es superior a la hora de provocar la regulación por incremento de HLA-DR en las células mieloides en comparación con el rituximab no conjugado (CD20 lgG1; Invivogen, hcd20-mab1) después de 18 horas de estimulación.
La figura 90A muestra que el ¡nmunoconjugado de rituximab lgG1 afucosilado producido según el método de BB-01 (lgG1 AF Boltbody) provoca una secreción superior de TNFa en las células mieloides en comparación con concentraciones equimolares (0.2|jM) de rituximab no conjugado (lgG1 AF; Invivogen, hcd20-mab13) después de 18 horas de estimulación.
La figura 90B muestra un análisis por cromatografía de líquidos-espectrometría de masas del rituximab lgG1 no conjugado (Invivogen, hcd20-mab13) que se utilizó para producir el ¡nmunoconjugado de rituximab según el método de conjugación de BB-01.
La figura 90C muestra un análisis por cromatografía de líquidos-espectrometría de masas del ¡nmunoconjugado de rituximab lgG1 producido según el método de conjugación de BB-01.
La figura 90D muestra que el ¡nmunoconjugado de rituximab lgG1 AF producido según el método de BB-01 (lgG1 AF Boltbody) es superior a la hora de provocar la regulación por disminución de CD14 en las células mieloides en comparación con el rituximab no conjugado (lgG1 AF; Invivogen, hcd20-mab13) después de 18 horas de estimulación.
La figura 90E muestra que el ¡nmunoconjugado de rituximab lgG1 AF producido según el método de BB-01 (lgG1 AF Boltbody) es superior a la hora de provocar la regulación por disminución de CD16 en las células mieloides en comparación con el rituximab no conjugado (lgG1 AF; Invivogen, hcd20-mab13) después de 18 Horas de estimulación.
La figura 90F muestra que el ¡nmunoconjugado de rituximab lgG1 producido según el método de BB-01 (lgG1 AF Boltbody) es superior a la hora de provocar la regulación por incremento de CD40 en las células mieloides en comparación con el rituximab no conjugado (lgG1 AF; Invivogen, hcd20-mab13) después de 18 horas de estimulación.
La figura 90G muestra que el ¡nmunoconjugado de rituximab lgG1 producido según el método de BB-01 (lgG1 AF Boltbody) es superior a la hora de provocar la regulación por incremento de CD86 en las células mieloides en comparación con el rituximab no conjugado (lgG1 AF; Invivogen, hcd20-mab13) después de 18 horas de estimulación.
La figura 90H muestra que el ¡nmunoconjugado de rituximab lgG1 producido según el método de BB-01 (lgG1 AF Boltbody) es superior a la hora de provocar la regulación por incremento de CD123 en las células mieloides en comparación con el rituximab no conjugado (lgG1 AF; Invivogen, hcd20-mab13) después de 18 horas de estimulación.
La figura 901 muestra que el ¡nmunoconjugado de rituximab lgG1 producido según el método de BB-01 (lgG1 AF Boltbody) es superior a la hora de provocar la regulación por incremento de HLA-DR en las células mieloides en comparación con el rituximab no conjugado (lgG1 AF; Invivogen, hcd20-mab13) después de 18 horas de estimulación.
La figura 91A muestra que el ¡nmunoconjugado de rituximab lgG1 N297Q mutante producido según el método de BB-01 (lgG1 NQ Boltbody) provoca una secreción superior de TNFa en las células mieloides en comparación con concentraciones equimolares (0.2 j M) de rituximab no conjugado (lgG1 NQ; Invivogen, hcd20-mab12) después de 36 horas de estimulación.
La figura 91B muestra un análisis por cromatografía de líquidos-espectrometría de masas del rituximab IgGI no conjugado (Invivogen, hcd20-mab12) que se utilizó para producir el inmunoconjugado de rituximab según el método de conjugación de BB-01.
La figura 91C muestra un análisis por cromatografía de líquidos-espectrometría de masas del inmunoconjugado de rituximab lgG1 producido según el método de conjugación de BB-01,
La figura 91D muestra la expresión de CD14 en las células mieloides después de 18 horas de estimulación con el inmunoconjugado de rituximab lgG1 N297Q mutante producido según el método de BB-01 (lgG1 NQ Boltbody) en comparación con el rituximab lgG1 no conjugado (Invivogen, hcd20-mab12),
La figura 91E muestra la expresión de CD16 en las células mieloides después de 18 horas de estimulación con el inmunoconjugado de rituximab lgG1 N297Q mutante producido según el método de BB-01 (lgG1 NQ Boltbody) en comparación con el rituximab lgG1 no conjugado (Invivogen, hcd20-mab12),
La figura 91F muestra la expresión de CD40 en las células mieloides después de 18 horas de estimulación con el inmunoconjugado de rituximab lgG1 N297Q mutante producido según el método de BB-01 (lgG1 NQ Boltbody) en comparación con el rituximab lgG1 no conjugado (Invivogen, hcd20-mab12),
La figura 91G muestra la expresión de CD86 en las células mieloides después de 18 horas de estimulación con el inmunoconjugado de rituximab lgG1 N297Q mutante producido según el método de BB-01 (lgG1 NQ Boltbody) en comparación con el rituximab lgG1 no conjugado (Invivogen, hcd20-mab12),
La figura 91H muestra la expresión de CD123 en las células mieloides después de 18 horas de estimulación con el inmunoconjugado de rituximab lgG1 N297Q mutante producido según el método de BB-01 (lgG1 NQ Boltbody) en comparación con el rituximab lgG1 no conjugado (Invivogen, hcd20-mab12),
La figura 911 muestra la expresión de HLA-DR en las células mieloides después de 18 horas de estimulación con el inmunoconjugado de rituximab lgG1 N297Q mutante producido según el método de BB-01 (lgG1 NQ Boltbody) en comparación con el rituximab lgG1 no conjugado (Invivogen, hcd20-mab12),
La figura 92A muestra que el inmunoconjugado de rituximab lgG2 producido según el método de BB-01 (lgG2 Boltbody) provoca una secreción superior de TNFa en las células mieloides en comparación con concentraciones equimolares (0,2|jM) de rituximab no conjugado (lgG2; Invivogen, hcd20-mab2) después de 18 horas de estimulación,
La figura 92B muestra un análisis por cromatografía de líquidos-espectrometría de masas del rituximab lgG2 no conjugado (Invivogen, hcd20-mab2) que se utilizó para producir el inmunoconjugado de rituximab según el método de conjugación de BB-01,
La figura 92C muestra un análisis por cromatografía de líquidos-espectrometría de masas del inmunoconjugado de rituximab lgG2 producido según el método de conjugación de BB-01,
La figura 92D muestra que el inmunoconjugado de rituximab lgG2 producido según el método de BB-01 (lgG2 Boltbody) es superior a la hora de provocar la regulación por disminución de CD14 en las células mieloides en comparación con el rituximab no conjugado (lgG2; Invivogen, hcd20-mab2) después de 18 horas de estimulación,
La figura 92E muestra que el inmunoconjugado de rituximab lgG2 producido según el método de BB-01 (lgG2 Boltbody) es superior a la hora de provocar la regulación por disminución de CD16 en las células mieloides en comparación con el rituximab no conjugado (lgG2; Invivogen, hcd20-mab2) después de 18 horas de estimulación,
La figura 92F muestra que el inmunoconjugado de rituximab lgG2 producido según el método de BB-01 (lgG2 Boltbody) es superior a la hora de provocar la regulación por incremento de CD40 en las células mieloides en comparación con el rituximab no conjugado (lgG2; Invivogen, hcd20-mab2) después de 18 horas de estimulación,
La figura 92G muestra que el inmunoconjugado de rituximab lgG2 producido según el método de BB-01 (lgG2 Boltbody) es superior a la hora de provocar la regulación por incremento de CD86 en las células mieloides en comparación con el rituximab no conjugado (lgG2; Invivogen, hcd20-mab2) después de 18 horas de estimulación,
La figura 92H muestra que el inmunoconjugado de rituximab lgG2 producido según el método de BB-01 (lgG2 Boltbody) es superior a la hora de provocar la regulación por incremento de CD123 en las células mieloides en comparación con el rituximab no conjugado (lgG2; Invivogen, hcd20-mab2) después de 18 horas de estimulación,
La figura 92l muestra que el inmunoconjugado de rituximab lgG2 producido según el método de BB-01 (lgG2 Boltbody) es superior a la hora de provocar la regulación por incremento de HLA-DR en las células mieloides en comparación con el rituximab no conjugado (lgG2; Invivogen, hcd20-mab2) después de 18 horas de estimulación,
La figura 93A muestra que el inmunoconjugado de rituximab lgG3 producido según el método de BB-01 (lgG3 Boltbody) provoca una secreción superior de TNFa en las células mieloides en comparación con concentraciones equimolares (0.2 pM) de rituximab no conjugado (lgG3; Invivogen, hcd20-mab3) después de 18 horas de estimulación.
La figura 93B muestra un análisis por cromatografía de líquidos-espectrometría de masas del rituximab lgG3 no conjugado (Invivogen, hcd20-mab3) que se utilizó para producir el inmunoconjugado de rituximab según el método de conjugación de BB-01.
La figura 93C muestra un análisis por cromatografía de líquidos-espectrometría de masas del inmunoconjugado de rituximab lgG3 producido según el método de conjugación de BB-01.
La figura 93D muestra que el inmunoconjugado de rituximab lgG3 producido según el método de BB-01 (lgG3 Boltbody) es superior a la hora de provocar la regulación por disminución de CD14 en las células mieloides en comparación con el rituximab no conjugado (lgG3; Invivogen, hcd20-mab3) después de 18 horas de estimulación.
La figura 93E muestra que el inmunoconjugado de rituximab lgG3 producido según el método de BB-01 (lgG3 Boltbody) es superior a la hora de provocar la regulación por disminución de CD16 en las células mieloides en comparación con el rituximab no conjugado (lgG3; Invivogen, hcd20-mab3) después de 18 horas de estimulación.
La figura 93F muestra que el inmunoconjugado de rituximab lgG3 producido según el método de BB-01 (lgG3 Boltbody) es superior a la hora de provocar la regulación por incremento de CD40 en las células mieloides en comparación con el rituximab no conjugado (lgG3; Invivogen, hcd20-mab3) después de 18 horas de estimulación.
La figura 93G muestra que el inmunoconjugado de rituximab lgG3 producido según el método de BB-01 (lgG3 Boltbody) es superior a la hora de provocar la regulación por incremento de CD86 en las células mieloides en comparación con el rituximab no conjugado (lgG3; Invivogen, hcd20-mab3) después de 18 horas de estimulación.
La figura 93H muestra que el inmunoconjugado de rituximab lgG3 producido según el método de BB-01 (lgG3 Boltbody) es superior a la hora de provocar la regulación por incremento de CD123 en las células mieloides en comparación con el rituximab no conjugado (lgG3; Invivogen, hcd20-mab3) después de 18 horas de estimulación.
La figura 931 muestra que el inmunoconjugado de rituximab lgG3 producido según el método de BB-01 (lgG3 Boltbody) es superior a la hora de provocar la regulación por incremento de HLA-DR en las células mieloides en comparación con el rituximab no conjugado (lgG3; Invivogen, hcd20-mab3) después de 18 horas de estimulación.
La figura 94A muestra que el inmunoconjugado de rituximab lgG4 producido según el método de BB-01 (lgG4 Boltbody) provoca una secreción superior de TNFa en las células mieloides en comparación con concentraciones equimolares (0.2 pM) de rituximab no conjugado (lgG4; Invivogen, hcd20-mab4) después de 18 horas de estimulación.
La figura 94B muestra un análisis por cromatografía de líquidos-espectrometría de masas del rituximab lgG4 no conjugado (Invivogen, hcd20-mab4) que se utilizó para producir el inmunoconjugado de rituximab según el método de conjugación de BB-01.
La figura 94C muestra un análisis por cromatografía de líquidos-espectrometría de masas del inmunoconjugado de rituximab lgG4 producido según el método de conjugación de BB-01.
La figura 94D muestra que el inmunoconjugado de rituximab lgG4 producido según el método de BB-01 (lgG4 Boltbody) es superior a la hora de provocar la regulación por disminución de CD14 en las células mieloides en comparación con el rituximab no conjugado (lgG4; Invivogen, hcd20-mab4) después de 18 horas de estimulación.
La figura 94E muestra que el inmunoconjugado de rituximab lgG4 producido según el método de BB-01 (lgG4 Boltbody) es superior a la hora de provocar la regulación por disminución de CD16 en las células mieloides en comparación con el rituximab no conjugado (lgG4; Invivogen, hcd20-mab4) después de 18 horas de estimulación.
La figura 94F muestra que el inmunoconjugado de rituximab lgG4 producido según el método de BB-01 (lgG4 Boltbody) es superior a la hora de provocar la regulación por incremento de CD40 en las células mieloides en comparación con el rituximab no conjugado (lgG4; Invivogen, hcd20-mab4) después de 18 horas de estimulación.
La figura 94G muestra que el inmunoconjugado de rituximab lgG4 producido según el método de BB-01 (lgG4 Boltbody) es superior a la hora de provocar la regulación por incremento de CD86 en las células mieloides en comparación con el rituximab no conjugado (lgG4; Invivogen, hcd20-mab4) después de 18 horas de estimulación.
La figura 94H muestra que el inmunoconjugado de rituximab lgG4 producido según el método de BB-01 (lgG4 Boltbody) es superior a la hora de provocar la regulación por incremento de CD123 en las células mieloides en comparación con el rituximab no conjugado (lgG4; Invivogen, hcd20-mab4) después de 18 horas de estimulación.
La figura 941 muestra que el inmunoconjugado de rituximab lgG4 producido según el método de BB-01 (lgG4 Boltbody) es superior a la hora de provocar la regulación por incremento de HLA-DR en las células mieloides en comparación con el rituximab no conjugado (lgG4; Invivogen, hcd20-mab4) después de 18 horas de estimulación.
La figura 95 es una tabla que enumera los valores de EC50 y los cambios en veces de expresión de CD14, CD40 y CD86 para IgGI Boltbody (BB-lgG1), IgGI AF Boltbody (BB-lgG1 AF), lgG2 Boltbody (BB-lgG2), lgG3 Boltbody (BB-lgG3) y lgG4 Boltbody (BB-lgG4) a los que se hace referencia en las figuras 89, 90, 92, 93 y 94 respectivamente. L<os>valores de CE50 se calcularon en base a las curvas de dosis-respuesta generadas a partir de diluciones seriadas 5 veces. Todos los cambios en veces se calcularon en relación con el anticuerpo desnudo respectivo a la concentración indicada.
La figura 96A muestra un análisis por cromatografía de líquidos-espectrometría de masas de la variante del isotipo lgG1 de atezolizumab no conjugado (Invivogen, hpdl1-mab1) que se utilizó para producir el inmunoconjugado de atezolizumab según el método de conjugación de BB-01.
La figura 96B muestra un análisis por cromatografía de líquidos-espectrometría de masas del inmunoconjugado de la variante del isotipo lgG1 de atezolizumab producido según el método de conjugación de BB-01.
La figura 96C muestra la expresión de CD14 en las células mieloides después de 18 horas de estimulación con el inmunoconjugado de la variante del isotipo lgG1 de atezolizumab producido según el método de BB-01 (Atezolizumab - lgG1 Boltbody) en comparación con el atezolizumab no conjugado (Atezolizumab - lgG1; Invivogen, hpdl1-mab1).
La figura 96D muestra la expresión de CD16 en las células mieloides después de 18 horas de estimulación con el inmunoconjugado de la variante del isotipo lgG1 de atezolizumab producido según el método de BB-01 (Atezolizumab - lgG1 Boltbody) en comparación con el atezolizumab no conjugado (Atezolizumab - lgG1; Invivogen, hpdl1-mab1).
La figura 96E muestra la expresión de CD40 en las células mieloides después de 18 horas de estimulación con el inmunoconjugado de la variante del isotipo lgG1 de atezolizumab producido según el método de BB-01 (Atezolizumab - lgG1 Boltbody) en comparación con el atezolizumab no conjugado (Atezolizumab - lgG1; Invivogen, hpdl1-mab1).
La figura 96F muestra la expresión de CD86 en las células mieloides después de 18 horas de estimulación con el inmunoconjugado de la variante del isotipo lgG1 de atezolizumab producido según el método de BB-01 (Atezolizumab - lgG1 Boltbody) en comparación con el atezolizumab no conjugado (Atezolizumab - lgG1; Invivogen, hpdl1-mab1).
La figura 96G muestra la expresión de CD123 en las células mieloides después de 18 horas de estimulación con el inmunoconjugado de la variante del isotipo lgG1 de atezolizumab producido según el método de BB-01 (Atezolizumab - lgG1 Boltbody) en comparación con el atezolizumab no conjugado (Atezolizumab - lgG1; Invivogen, hpdl1-mab1).
La figura 96H muestra la expresión de HLA-DR en las células mieloides después de 18 horas de estimulación con el inmunoconjugado de la variante del isotipo lgG1 de atezolizumab producido según el método de BB-01 (Atezolizumab - lgG1 Boltbody) en comparación con el atezolizumab no conjugado (Atezolizumab - lgG1; Invivogen, hpdl1-mab1).
La figura 97A muestra un análisis por cromatografía de líquidos-espectrometría de masas de la variante del isotipo lgG1 de nivolumab no conjugado (Invivogen, hpd1ni-mab1) que se utilizó para producir el inmunoconjugado de nivolumab según el método de conjugación de BB-01.
La figura 97B muestra un análisis por cromatografía de líquidos-espectrometría de masas del inmunoconjugado de la variante del isotipo lgG1 de nivolumab producido según el método de conjugación de BB-01.
La figura 97C muestra la expresión de CD14 en las células mieloides después de 18 horas de estimulación con el inmunoconjugado de la variante del isotipo lgG1 de nivolumab producido según el método de BB-01 (Nivolumab -lgG1 Boltbody) en comparación con nivolumab no conjugado (Nivolumab - lgG1; Invivogen, hpd1ni-mab1).
La figura 97D muestra la expresión de CD16 en las células mieloides después de 18 horas de estimulación con el inmunoconjugado de la variante del isotipo lgG1 de nivolumab producido según el método de BB-01 (Nivolumab -lgG1 Boltbody) en comparación con nivolumab no conjugado (Nivolumab - lgG1; Invivogen, hpd1ni-mab1).
La figura 97E muestra la expresión de CD40 en las células mieloides después de 18 horas de estimulación con el inmunoconjugado de la variante del isotipo lgG1 de nivolumab producido según el método de BB-01 (Nivolumab -lgG1 Boltbody) en comparación con nivolumab no conjugado (Nivolumab - lgG1; Invivogen, hpd1ni-mab1).
La figura 97F muestra la expresión de CD86 en las células mieloides después de 18 horas de estimulación con el inmunoconjugado de la variante del isotipo lgG1 de nivolumab producido según el método de BB-01 (Nivolumab -lgG1 Boltbody) en comparación con nivolumab no conjugado (Nivolumab - lgG1; Invivogen, hpd1ni-mab1).
La figura 97G muestra la expresión de CD123 en las células mieloides después de 18 horas de estimulación con el inmunoconjugado de la variante del isotipo lgG1 de nivolumab producido según el método de BB-01 (Nivolumab - lgG1 Boltbody) en comparación con nivolumab no conjugado (Nivolumab - lgG1; Invivogen, hpd1ni-mab1).
La figura 97H muestra la expresión de HLA-DR en las células mieloides después de 18 horas de estimulación con el inmunoconjugado de la variante del isotipo lgG1 de nivolumab producido según el método de BB-01 (Nivolumab - lgG1 Boltbody) en comparación con nivolumab no conjugado (Nivolumab - lgG1; Invivogen, hpd1ni-mab1).
La figura 98A muestra un análisis por cromatografía de líquidos-espectrometría de masas de mAb anti-gp75 no conjugado (BioXcell, TA99-BE0151) que se utilizó para producir el inmunoconjugado de mAb anti-gp75 según el método de conjugación de BB-01 después de la desglicosilación durante la noche con PNGasa F.
La figura 98B muestra un análisis por cromatografía de líquidos-espectrometría de masas del inmunoconjugado de mAb anti-gp75 producido según el método de conjugación de BB-01 después de la desglicosilación durante la noche con PNGasa F.
La figura 98C muestra la expresión de CD14 en las células mieloides después de 18 horas de estimulación con el inmunoconjugado de mAb anti-gp75 producido según el método de BB-01 (GP75 Boltbody).
La figura 98D muestra la expresión de CD16 en las células mieloides después de 18 horas de estimulación con el inmunoconjugado de mAb anti-gp75 producido según el método de BB-01 (GP75 Boltbody).
La figura 98E muestra la expresión de CD40 en las células mieloides después de 18 horas de estimulación con el inmunoconjugado de mAb anti-gp75 producido según el método de BB-01 (GP75 Boltbody).
La figura 98F muestra la expresión de CD86 en las células mieloides después de 18 horas de estimulación con el inmunoconjugado de mAb anti-gp75 producido según el método de BB-01 (GP75 Boltbody).
La figura 98G muestra la expresión de HLA-DR en las células mieloides después de 18 horas de estimulación con el inmunoconjugado de mAb anti-gp75 producido según el método de BB-01 (GP75 Boltbody).
La figura 99A muestra un análisis por cromatografía de líquidos-espectrometría de masas del biosimilar de rituximab no conjugado (CD20, LGM Pharma) que se utilizó para producir el inmunoconjugado de rituximab según el método de conjugación de BB-03 después de la desglicosilación durante la noche con PNGasa F.
La figura 99B muestra un análisis por cromatografía de líquidos-espectrometría de masas del biosimilar de rituximab no conjugado (CD20, LGM Pharma) que se utilizó para producir el inmunoconjugado de rituximab según el método de conjugación de BB-03.
La figura 99C muestra un análisis por cromatografía de líquidos-espectrometría de masas del inmunoconjugado BB-03 producido según el método de conjugación de BB-03.
La figura 99D muestra que el inmunoconjugado BB-03 producido según el método BB-03 (BB-03) es superior a la hora de provocar la regulación por incremento de CD123 en las células mieloides en comparación con el biosimilar de rituximab no conjugado (CD20; LGM Pharma) después de 18 horas de estimulación.
La figura 99E muestra que el inmunoconjugado BB-03 producido según el método BB-03 (BB-03) es superior a la hora de provocar la regulación por incremento de HLA-DR en las células mieloides en comparación con el biosimilar de rituximab no conjugado (CD20; LGM Pharma) después de 18 horas de estimulación.
La figura 99F muestra que el inmunoconjugado BB-03 producido según el método BB-03 (BB-03) es superior a la hora de provocar la regulación por disminución de CD14 en las células mieloides en comparación con el biosimilar de rituximab no conjugado (CD20; LGM Pharma) después de 18 horas de estimulación.
La figura 99G muestra que el inmunoconjugado BB-03 producido según el método BB-03 (BB-03) es superior a la hora de provocar la regulación por disminución de CD<16>en las células mieloides en comparación con el biosimilar de rituximab no conjugado (CD20; LGM Pharma) después de 18 horas de estimulación.
La figura 99H muestra que el inmunoconjugado BB-03 producido según el método BB-03 (BB-03) es superior a la hora de provocar la regulación por incremento de CD40 en las células mieloides en comparación con el biosimilar de rituximab no conjugado (CD20; LGM Pharma) después de 18 horas de estimulación.
La figura 991 muestra que el inmunoconjugado BB-03 producido según el método BB-03 (BB-03) es superior a la hora de provocar la regulación por incremento de CD86 en las células mieloides en comparación con el biosimilar de rituximab no conjugado (CD20; LGM Pharma) después de 18 horas de estimulación.
La figura 100A muestra un análisis por cromatografía de líquidos-espectrometría de masas del biosimilar de rituximab no conjugado (CD20, LGM Pharma) que se utilizó para producir el inmunoconjugado de rituximab según el método de conjugación de BB-05 después de la desglicosilación durante la noche con PNGasa F.
La figura 100B muestra un análisis por cromatografía de líquidos-espectrometría de masas del inmunoconjugado BB-05 producido según el método de conjugación de BB-05 después de la desglicosilación durante la noche con PNGasa F.
La figura 100C muestra un análisis por cromatografía de líquidos-espectrometría de masas del biosimilar de rituximab no conjugado (CD20, LGM Pharma) que se utilizó para producir el inmunoconjugado de rituximab según el método de conjugación de BB-05.
La figura 100D muestra la expresión de CD123 en las células mieloides después de 18 horas de estimulación con el inmunoconjugado BB-05 producido según el método BB-05 (BB-05). La línea discontinua indica el nivel de expresión en las células mieloides no estimuladas cultivadas durante 18 horas.
La figura 100E muestra la expresión de HLA-DR en las células mieloides después de 18 horas de estimulación con el inmunoconjugado BB-05 producido según el método BB-05 (BB-05). La línea discontinua indica el nivel de expresión en las células mieloides no estimuladas cultivadas durante 18 horas.
La figura 100F muestra la expresión de CD14 en las células mieloides después de 18 horas de estimulación con el inmunoconjugado BB-05 producido según el método BB-05 (BB-05). La línea discontinua indica el nivel de expresión en las células mieloides no estimuladas cultivadas durante 18 horas.
La figura 100G muestra la expresión de CD16 en las células mieloides después de 18 horas de estimulación con el inmunoconjugado BB-05 producido según el método BB-05 (BB-05). La línea discontinua indica el nivel de expresión en las células mieloides no estimuladas cultivadas durante 18 horas.
La figura 100H muestra la expresión de CD40 en las células mieloides después de 18 horas de estimulación con el inmunoconjugado BB-05 producido según el método BB-05 (BB-05). La línea discontinua indica el nivel de expresión en las células mieloides no estimuladas cultivadas durante 18 horas.
La figura 1001 muestra la expresión de CD86 en las células mieloides después de 18 horas de estimulación con el inmunoconjugado BB-05 producido según el método BB-05 (BB-05). La línea discontinua indica el nivel de expresión en las células mieloides no estimuladas cultivadas durante 18 horas.
La figura 101A muestra un análisis por cromatografía de líquidos-espectrometría de masas del biosimilar de rituximab no conjugado (CD20, LGM Pharma) que se utilizó para producir el inmunoconjugado de rituximab según el método de conjugación de BB-06 después de la desglicosilación durante la noche con PNGasa F.
La figura 101B muestra un análisis por cromatografía de líquidos-espectrometría de masas del biosimilar de rituximab no conjugado (CD20, LGM Pharma) que se utilizó para producir el inmunoconjugado de rituximab según el método de conjugación de BB-06.
La figura 101C muestra un análisis por cromatografía de líquidos-espectrometría de masas del inmunoconjugado BB-06 producido según el método de conjugación de BB-06.
La figura 102A muestra un análisis por cromatografía de líquidos-espectrometría de masas del inmunoconjugado BB-07 producido según el método de conjugación de BB-07 después de la desglicosilación durante la noche con PNGasa F.
La figura 102B muestra un análisis por cromatografía de líquidos-espectrometría de masas del biosimilar de rituximab no conjugado (CD20, LGM Pharma) que se utilizó para producir el inmunoconjugado de rituximab según el método de conjugación de BB-07 después de la desglicosilación durante la noche con PNGasa F.
La figura 102C muestra un análisis por cromatografía de líquidos-espectrometría de masas del biosimilar de rituximab no conjugado (CD20, LGM Pharma) que se utilizó para producir el inmunoconjugado de rituximab según el método de conjugación de BB-07.
La figura 102D muestra la expresión de CD123 en las células mieloides después de 18 horas de estimulación con el inmunoconjugado BB-07 producido según el método BB-07 (BB-07). La línea discontinua indica el nivel de expresión en las células mieloides no estimuladas cultivadas durante 18 horas. La figura 102D también compara el BB-07 con el inmunoconjugado BB-01 producido según el método de conjugación de BB-01 (BB-01).
La figura 102E muestra la expresión de HLA-DR en las células mieloides después de 18 horas de estimulación con el inmunoconjugado BB-07 producido según el método BB-07 (BB-07). La línea discontinua indica el nivel de expresión en las células mieloides no estimuladas cultivadas durante 18 horas. La figura 102E también compara el BB-07 con el inmunoconjugado BB-01 producido según el método de conjugación de BB-01 (BB-01).
La figura 102F muestra la expresión de CD14 en las células mieloides después de 18 horas de estimulación con el inmunoconjugado BB-07 producido según el método BB-07 (BB-07). La línea discontinua indica el nivel de expresión en las células mieloides no estimuladas cultivadas durante 18 horas. La figura 102F también compara el BB-07 con el inmunoconjugado BB-01 producido según el método de conjugación de BB-01 (BB-01).
La figura 102G muestra la expresión de CD16 en las células mieloides después de 18 horas de estimulación con el inmunoconjugado BB-07 producido según el método BB-07 (BB-07). La línea discontinua indica el nivel de expresión en las células mieloides no estimuladas cultivadas durante 18 horas. La figura 102G también compara el BB-07 con el inmunoconjugado BB-01 producido según el método de conjugación de BB-01 (BB-01).
La figura 102H muestra la expresión de CD40 en las células mieloides después de 18 horas de estimulación con el inmunoconjugado BB-07 producido según el método BB-07 (BB-07). La línea discontinua Indica el nivel de expresión en las células mieloides no estimuladas cultivadas durante 18 horas. La figura 102H también compara el BB-07 con el inmunoconjugado BB-01 producido según el método de conjugación de BB-01 (BB-01).
La figura 1021 muestra la expresión de CD86 en las células mieloides después de 18 horas de estimulación con el inmunoconjugado BB-07 producido según el método BB-07 (BB-07). La línea discontinua indica el nivel de expresión en las células mieloides no estimuladas cultivadas durante 18 horas. La figura 1021 también compara el BB-07 con el inmunoconjugado BB-01 producido según el método de conjugación de BB-01 (BB-01).
La figura 102J muestra la expresión de CD123 en las células mieloides después de 18 horas de estimulación con el inmunoconjugado BB-07 producido según el método BB-07 (BB-07). La línea discontinua indica el nivel de expresión en las células mieloides no estimuladas cultivadas durante 18 horas.
La figura 102K muestra la expresión de CD14 en las células mieloides después de 18 horas de estimulación con el inmunoconjugado BB-07 producido según el método BB-07 (BB-07). La línea discontinua indica el nivel de expresión en las células mieloides no estimuladas cultivadas durante 18 horas.
La figura 102L muestra la expresión de CD16 en las células mieloides después de 18 horas de estimulación con el inmunoconjugado BB-07 producido según el método BB-07 (BB-07). La línea discontinua indica el nivel de expresión en las células mieloides no estimuladas cultivadas durante 18 horas.
La figura 102M muestra la expresión de CD40 en las células mieloides después de 18 horas de estimulación con el inmunoconjugado BB-07 producido según el método BB-07 (BB-07). La línea discontinua indica el nivel de expresión en las células mieloides no estimuladas cultivadas durante 18 horas. La figura 102M también compara el BB-07 con el inmunoconjugado BB-01 producido según el método de conjugación de BB-01 (BB-01).
La figura 102N muestra la expresión de CD86 en las células mieloides después de 18 horas de estimulación con el inmunoconjugado BB-07 producido según el método BB-07 (BB-07). La línea discontinua indica el nivel de expresión en las células mieloides no estimuladas cultivadas durante 18 horas.
La figura 103A muestra un análisis por cromatografía de líquidos-espectrometría de masas del biosimilar de rituximab no conjugado (CD20, LGM Pharma) que se utilizó para producir el inmunoconjugado de rituximab según el método de conjugación de BB-11 después de la desglicosilación durante la noche con PNGasa F.
La figura 103B muestra un análisis por cromatografía de líquidos-espectrometría de masas del biosimilar de rituximab no conjugado (CD20, LGM Pharma) que se utilizó para producir el inmunoconjugado de rituximab según el método de conjugación de BB-11.
La figura 103C muestra un análisis por cromatografía de líquidos-espectrometría de masas del inmunoconjugado BB-11 producido según el método de conjugación de BB-11 después de la desglicosilación durante la noche con PNGasa F.
La figura 103D muestra la expresión de CD123 en las células mieloides después de 18 horas de estimulación con el inmunoconjugado BB-11 producido según el método BB-11 (BB-11). La línea discontinua indica el nivel de expresión en las células mieloides no estimuladas cultivadas durante 18 horas.
La figura 103E muestra la expresión de HLA-DR en las células mieloides después de 18 horas de estimulación con el inmunoconjugado BB-11 producido según el método BB-11 (BB-11). La línea discontinua indica el nivel de expresión en las células mieloides no estimuladas cultivadas durante 18 horas.
La figura 103F muestra la expresión de CD14 en las células mieloides después de 18 horas de estimulación con el inmunoconjugado BB-11 producido según el método BB-11 (BB-11). La línea discontinua indica el nivel de expresión en las células mieloides no estimuladas cultivadas durante 18 horas.
La figura 103G muestra la expresión de CD16 en las células mieloides después de 18 horas de estimulación con el inmunoconjugado BB-11 producido según el método BB-11 (BB-11). La línea discontinua indica el nivel de expresión en las células mieloides no estimuladas cultivadas durante 18 horas.
La figura 103H muestra la expresión de CD40 en las células mieloides después de 18 horas de estimulación con el inmunoconjugado BB-11 producido según el método BB-11 (BB-11). La línea discontinua indica el nivel de expresión en las células mieloides no estimuladas cultivadas durante 18 horas.
La figura 1031 muestra la expresión de CD86 en las células mieloides después de 18 horas de estimulación con el inmunoconjugado BB-11 producido según el método BB-11 (BB-11). La línea discontinua indica el nivel de expresión en las células mieloides no estimuladas cultivadas durante 18 horas.
La figura 104A muestra un análisis por cromatografía de líquidos-espectrometría de masas del biosimilar de rituximab no conjugado (CD20, LGM Pharma) que se utilizó para producir el inmunoconjugado de rituximab según el método de conjugación de BB-14 PFP.
La figura 104B muestra un análisis por cromatografía de líquidos-espectrometría de masas del biosimilar de rituximab no conjugado (CD20, LGM Pharma) que se utilizó para producir el inmunoconjugado de rituximab según el método de conjugación de BB-14 PFP después de la desglicosilación durante la noche con PNGasa F.
La figura 104C muestra un análisis por cromatografía de líquidos-espectrometría de masas del inmunoconjugado BB-14 producido según el método de conjugación de BB-14 PFP.
La figura 104D muestra que el inmunoconjugado de rituximab producido según el método de conjugación de BB-14 PFP (BB-14) es superior a la hora de provocar la regulación por incremento de CD123 en las células mieloides en comparación con el rituximab no conjugado (CD20, LGM Pharma) después de 18 horas de estimulación.
La figura 104E muestra que el inmunoconjugado de rituximab producido según el método de conjugación de BB-14 PFP (BB-14) es superior a la hora de provocar la regulación por incremento de HLA-DR en las células mieloides en comparación con el rituximab no conjugado (CD20, LGM Pharma) después de 18 horas de estimulación.
La figura 104F muestra que el inmunoconjugado de rituximab producido según el método de conjugación de BB-14 PFP (BB-14) es superior a la hora de provocar la regulación por incremento de CD14 en las células mieloides en comparación con el rituximab no conjugado (CD20, LGM Pharma) después de 18 horas de estimulación.
La figura 104G muestra que el inmunoconjugado de rituximab producido según el método de conjugación de BB-14 PFP (BB-14) es superior a la hora de provocar la regulación por incremento de CD16 en las células mieloides en comparación con el rituximab no conjugado (CD20, LGM Pharma) después de 18 horas de estimulación.
La figura 104H muestra que el inmunoconjugado de rituximab producido según el método de conjugación de BB-14 PFP (BB-14) es superior a la hora de provocar la regulación por incremento de CD40 en las células mieloides en comparación con el rituximab no conjugado (CD20, LGM Pharma) después de 18 horas de estimulación.
La figura 1041 muestra que el inmunoconjugado de rituximab producido según el método de conjugación de BB-14 PFP (BB-14) es superior a la hora de provocar la regulación por incremento de CD86 en las células mieloides en comparación con el rituximab no conjugado (CD20, LGM Pharma) después de 18 horas de estimulación.
La figura 105A muestra un análisis por cromatografía de líquidos-espectrometría de masas del biosimilar de rituximab no conjugado (CD20, LGM Pharma) que se utilizó para producir el inmunoconjugado de rituximab según el método de conjugación de BB-15 NHS después de la desglicosilación durante la noche con PNGasa F.
La figura 105B muestra un análisis por cromatografía de líquidos-espectrometría de masas del biosimilar de rituximab no conjugado (CD20, LGM Pharma) que se utilizó para producir el inmunoconjugado de rituximab según el método de conjugación de BB-15 NHS.
La figura 105C muestra un análisis por cromatografía de líquidos-espectrometría de masas del inmunoconjugado BB-15 producido según el método de conjugación de BB-15 NHS.
La figura 105D muestra que el inmunoconjugado de rituximab producido según el método de conjugación de BB-15 NHS (BB-15) es superior a la hora de provocar la regulación por incremento de CD123 en las células mieloides en comparación con el rituximab no conjugado (CD20, LGM Pharma) después de 18 horas de estimulación.
La figura 105E muestra que el inmunoconjugado de rituximab producido según el método de conjugación de BB-15 NHS (BB-15) es superior a la hora de provocar la regulación por incremento de HLA-DR en las células mieloides en comparación con el rituximab no conjugado (CD20, LGM Pharma) después de 18 horas de estimulación.
La figura 105F muestra que el inmunoconjugado de rituximab producido según el método de conjugación de BB-15 NHS (BB-15) es superior a la hora de provocar la regulación por incremento de CD14 en las células mieloides en comparación con el rituximab no conjugado (CD20, LGM Pharma) después de 18 horas de estimulación.
La figura 105G muestra que el inmunoconjugado de rituximab producido según el método de conjugación de BB-15 NHS (BB-15) es superior a la hora de provocar la regulación por incremento de CD16 en las células mieloides en comparación con el rituximab no conjugado (CD20, LGM Pharma) después de 18 horas de estimulación.
La figura 105H muestra que el inmunoconjugado de rituximab producido según el método de conjugación de BB-15 NHS (BB-15) es superior a la hora de provocar la regulación por incremento de CD40 en las células mieloides en comparación con el rituximab no conjugado (CD20, LGM Pharma) después de 18 horas de estimulación.
La figura 1051 muestra que el inmunoconjugado de rituximab producido según el método de conjugación de BB-15 NHS (BB-15) es superior a la hora de provocar la regulación por incremento de CD86 en las células mieloides en comparación con el rituximab no conjugado (CD20, LGM Pharma) después de 18 horas de estimulación.
La figura 106A muestra un análisis por cromatografía de líquidos-espectrometría de masas del inmunoconjugado BB-17 producido según el método de conjugación de BB-17 TFP después de la desglicosilación durante la noche con PNGasa F.
La figura 106B muestra un análisis por cromatografía de líquidos-espectrometría de masas del biosimilar de rituximab no conjugado (CD20, LGM Pharma) que se utilizó para producir el inmunoconjugado de rituximab según el método de conjugación de BB-17 TFP después de la desglicosilación durante la noche con PNGasa F.
La figura 106C muestra un análisis por cromatografía de líquidos-espectrometría de masas del biosimilar de rituximab no conjugado (CD20, LGM Pharma) que se utilizó para producir el inmunoconjugado de rituximab según el método de conjugación de BB-17 TFP.
La figura 106D muestra que el inmunoconjugado de rituximab producido según el método de conjugación de BB-17 TFP (BB-17) es superior a la hora de provocar la regulación por incremento de CD123 en las células mieloides en comparación con el rituximab no conjugado (CD20, LGM Pharma) después de 18 horas de estimulación.
La figura 106E muestra que el inmunoconjugado de rituximab producido según el método de conjugación de BB-17 TFP (BB-17) es superior a la hora de provocar la regulación por incremento de HLA-DR en las células mieloides en comparación con el rituximab no conjugado (CD20, LGM Pharma) después de 18 horas de estimulación.
La figura 106F muestra que el inmunoconjugado de rituximab producido según el método de conjugación de BB-17 TFP (BB-17) es superior a la hora de provocar la regulación por incremento de CD14 en las células mieloides en comparación con el rituximab no conjugado (CD20, LGM Pharma) después de 18 horas de estimulación.
La figura 106G muestra que el inmunoconjugado de rituximab producido según el método de conjugación de BB-17 TFP (BB-17) es superior a la hora de provocar la regulación por incremento de CD16 en las células mieloides en comparación con el rituximab no conjugado (CD20, LGM Pharma) después de 18 horas de estimulación.
La figura 106H muestra que el inmunoconjugado de rituximab producido según el método de conjugación de BB-17 TFP (BB-17) es superior a la hora de provocar la regulación por incremento de CD40 en las células mieloides en comparación con el rituximab no conjugado (CD20, LGM Pharma) después de 18 horas de estimulación.
La figura 1061 muestra que el inmunoconjugado de rituximab producido según el método de conjugación de BB-17 TFP (BB-17) es superior a la hora de provocar la regulación por incremento de CD86 en las células mieloides en comparación con el rituximab no conjugado (CD20, LGM Pharma) después de 18 horas de estimulación.
La figura 107A muestra un análisis por cromatografía de líquidos-espectrometría de masas del biosimilar de rituximab no conjugado (CD20, LGM Pharma) que se utilizó para producir el inmunoconjugado de rituximab según el método de conjugación de BB-22 SATA después de la desglicosilación durante la noche con PNGasa F.
La figura 107B muestra un análisis por cromatografía de líquidos-espectrometría de masas del biosimilar de rituximab no conjugado (CD20, LGM Pharma) que se utilizó para producir el inmunoconjugado de rituximab según el método de conjugación de BB-22 SATA.
La figura 107C muestra un análisis por cromatografía de líquidos-espectrometría de masas del inmunoconjugado BB-22 producido según el método de conjugación de BB-22 SATA.
La figura 108A muestra un análisis por cromatografía de líquidos-espectrometría de masas del inmunoconjugado BB-24 producido según el método de conjugación de BB-24 TFP.
La figura 108B muestra un análisis por cromatografía de líquidos-espectrometría de masas del biosimilar de rituximab no conjugado (CD20, Alphamab) que se utilizó para producir el inmunoconjugado de rituximab según el método de conjugación de BB-24 TFP.
La figura 108C muestra un análisis por cromatografía de líquidos-espectrometría de masas del biosimilar de rituximab no conjugado (CD20, Alphamab) que se utilizó para producir el inmunoconjugado de rituximab según el método de conjugación de BB-24 TFP después de la desglicosilación durante la noche con PNGasa F.
La figura 108D muestra que el inmunoconjugado de rituximab producido según el método de conjugación de BB-24 TFP (BB-24) es superior a la hora de provocar la regulación por incremento de CD123 en las células mieloides en comparación con el rituximab no conjugado (CD20, Alphamab) después de 18 horas de estimulación.
La figura 108E muestra que el inmunoconjugado de rituximab producido según el método de conjugación de BB-24 TFP (BB-24) es superior a la hora de provocar la regulación por incremento de HLA-DR en las células mieloides en comparación con el rituximab no conjugado (CD20, Alphamab) después de 18 horas de estimulación.
La figura 108F muestra que el inmunoconjugado de rituximab producido según el método de conjugación de BB-24 TFP (BB-24) es superior a la hora de provocar la regulación por incremento de CD14 en las células mieloides en comparación con el rituximab no conjugado (CD20, Alphamab) después de 18 horas de estimulación.
La figura 108G muestra que el inmunoconjugado de rituximab producido según el método de conjugación de BB-24 TFP (BB-24) es superior a la hora de provocar la regulación por incremento de CD16 en las células mieloides en comparación con el rituximab no conjugado (CD20, Alphamab) después de 18 horas de estimulación.
La figura 108H muestra que el inmunoconjugado de rituximab producido según el método de conjugación de BB-24 TFP (BB-24) es superior a la hora de provocar la regulación por incremento de CD40 en las células mieloides en comparación con el rituximab no conjugado (CD20, Alphamab) después de 18 horas de estimulación.
La figura 1081 muestra que el ¡nmunoconjugado de rituximab producido según el método de conjugación de BB-24 TFP (BB-24) es superior a la hora de provocar la regulación por incremento de CD86 en las células mieloides en comparación con el rituximab no conjugado (CD20, Alphamab) después de 18 horas de estimulación.
La figura 109A muestra un análisis por cromatografía de líquidos-espectrometría de masas del ¡nmunoconjugado BB-26 producido según el método de conjugación de BB<- 2 6>TFP después de la desglicosilación durante la noche con PNGasa F.
La figura 109B muestra un análisis por cromatografía de líquidos-espectrometría de masas del biosimilar de rituximab no conjugado (CD20, LGM Pharma) que se utilizó para producir el ¡nmunoconjugado de rituximab según el método de conjugación de BB-26 TFP después de la desglicosilación durante la noche con PNGasa F.
La figura 109C muestra un análisis por cromatografía de líquidos-espectrometría de masas del biosimilar de rituximab no conjugado (CD20, LGM Pharma) que se utilizó para producir el ¡nmunoconjugado de rituximab según el método de conjugación de BB-26 TFP.
La figura 109D muestra que el ¡nmunoconjugado de rituximab producido según el método de conjugación de BB-26 TFP (BB-26) es superior a la hora de provocar la regulación por incremento de CD123 en las células mieloides en comparación con el rituximab no conjugado (CD20, LGM Pharma) después de 18 horas de estimulación.
La figura 109E muestra que el ¡nmunoconjugado de rituximab producido según el método de conjugación de BB-26 TFP (BB-26) es superior a la hora de provocar la regulación por incremento de HLA-DR en las células mieloides en comparación con el rituximab no conjugado (CD20, LGM Pharma) después de 18 horas de estimulación.
La figura 109F muestra que el ¡nmunoconjugado de rituximab producido según el método de conjugación de BB-26 TFP (BB-26) es superior a la hora de provocar la regulación por incremento de CD40 en las células mieloides en comparación con el rituximab no conjugado (CD20, LGM Pharma) después de 18 horas de estimulación.
La figura 109G muestra que el ¡nmunoconjugado de rituximab producido según el método de conjugación de BB-26 TFP (BB-26) es superior a la hora de provocar la regulación por incremento de CD86 en las células mieloides en comparación con el rituximab no conjugado (CD20, LGM Pharma) después de 18 horas de estimulación.
La figura 110A muestra que el ¡nmunoconjugado de rituximab producido según el método de conjugación de BB-27 TFP (BB-27) es superior a la hora de provocar la regulación por incremento de CD123 en las células mieloides en comparación con el rituximab no conjugado (CD20, LGM Pharma) después de 18 horas de estimulación.
La figura 110B muestra que el ¡nmunoconjugado de rituximab producido según el método de conjugación de BB-27 TFP (BB-27) es superior a la hora de provocar la regulación por incremento de HLA-DR en las células mieloides en comparación con el rituximab no conjugado (CD20, LGM Pharma) después de 18 horas de estimulación.
La figura 110C muestra que el ¡nmunoconjugado de rituximab producido según el método de conjugación de BB-27 TFP (BB-27) es superior a la hora de provocar la regulación por incremento de CD14 en las células mieloides en comparación con el rituximab no conjugado (CD20, LGM Pharma) después de 18 horas de estimulación.
La figura 110D muestra que el ¡nmunoconjugado de rituximab producido según el método de conjugación de BB-27 TFP (BB-27) es superior a la hora de provocar la regulación por incremento de CD16 en las células mieloides en comparación con el rituximab no conjugado (CD20, LGM Pharma) después de 18 horas de estimulación.
La figura 110E muestra que el ¡nmunoconjugado de rituximab producido según el método de conjugación de BB-27 TFP (BB-27) es superior a la hora de provocar la regulación por incremento de CD40 en las células mieloides en comparación con el rituximab no conjugado (CD20, LGM Pharma) después de 18 horas de estimulación.
La figura 110F muestra que el ¡nmunoconjugado de rituximab producido según el método de conjugación de BB-27 TFP (BB-27) es superior a la hora de provocar la regulación por incremento de CD86 en las células mieloides en comparación con el rituximab no conjugado (CD20, LGM Pharma) después de 18 horas de estimulación.
La figura 110G muestra un análisis por cromatografía de líquidos-espectrometría de masas del ¡nmunoconjugado BB-27 producido según el método de conjugación de BB-27 TFP después de la desglicosilación durante la noche con PNGasa F.
La figura 110H muestra un análisis por cromatografía de líquidos-espectrometría de masas del biosimilar de rituximab no conjugado (CD20, LGM Pharma) que se utilizó para producir el ¡nmunoconjugado de rituximab según el método de conjugación de BB-27 TFP después de la desglicosilación durante la noche con PNGasa F.
La figura 1101 muestra un análisis por cromatografía de líquidos-espectrometría de masas del biosimilar de rituximab no conjugado (CD20, LGM Pharma) que se utilizó para producir el ¡nmunoconjugado de rituximab según el método de conjugación de BB-27 TFP.
La figura 111A muestra un análisis por cromatografía de líquidos-espectrometría de masas del ¡nmunoconjugado BB-36 producido según el método de conjugación de BB-36 TFP después de la desglicosilación durante la noche con PNGasa F.
La figura 111B muestra un análisis por cromatografía de líquidos-espectrometría de masas del biosimilar de rituximab no conjugado (CD20, Alphamab) que se utilizó para producir el inmunoconjugado de rituximab según el método de conjugación de BB-36 TFP.
La figura 111C muestra un análisis por cromatografía de líquidos-espectrometría de masas del biosimilar de rituximab no conjugado (CD20, Alphamab) que se utilizó para producir el inmunoconjugado de rituximab según el método de conjugación de BB-36 TFP después de la desglicosilación durante la noche con PNGasa F.
La figura 111D muestra que el inmunoconjugado de rituximab producido según el método de conjugación de BB-36 TFP (BB-36) es superior a la hora de provocar la regulación por incremento de CD123 en las células mieloides en comparación con el rituximab no conjugado (CD20, Alphamab) después de 18 horas de estimulación.
La figura 111E muestra que el inmunoconjugado de rituximab producido según el método de conjugación de BB-36 TFP (BB-36) es superior a la hora de provocar la regulación por incremento de HLA-DR en las células mieloides en comparación con el rituximab no conjugado (CD20, Alphamab) después de 18 horas de estimulación.
La figura 111F muestra que el inmunoconjugado de rituximab producido según el método de conjugación de BB-36 TFP (BB-36) es superior a la hora de provocar la regulación por incremento de CD14 en las células mieloides en comparación con el rituximab no conjugado (CD20, Alphamab) después de 18 horas de estimulación.
La figura 111G muestra que el inmunoconjugado de rituximab producido según el método de conjugación de BB-36 TFP (BB-36) es superior a la hora de provocar la regulación por incremento de CD16 en las células mieloides en comparación con el rituximab no conjugado (CD20, Alphamab) después de 18 horas de estimulación.
La figura 111H muestra que el inmunoconjugado de rituximab producido según el método de conjugación de BB-36 TFP (BB-36) es superior a la hora de provocar la regulación por incremento de CD40 en las células mieloides en comparación con el rituximab no conjugado (CD20, Alphamab) después de 18 horas de estimulación.
La figura 1111 muestra que el inmunoconjugado de rituximab producido según el método de conjugación de BB-36 TFP (BB-36) es superior a la hora de provocar la regulación por incremento de CD86 en las células mieloides en comparación con el rituximab no conjugado (CD20, Alphamab) después de 18 horas de estimulación.
La figura 112A muestra un análisis por cromatografía de líquidos-espectrometría de masas del inmunoconjugado BB-37 producido según el método de conjugación de BB-37 TFP.
La figura 112B muestra un análisis por cromatografía de líquidos-espectrometría de masas del biosimilar de rituximab no conjugado (CD20, Alphamab) que se utilizó para producir el inmunoconjugado de rituximab según el método de conjugación de BB-37 TFP.
La figura 112C muestra un análisis por cromatografía de líquidos-espectrometría de masas del biosimilar de rituximab no conjugado (CD20, Alphamab) que se utilizó para producir el inmunoconjugado de rituximab según el método de conjugación de BB-37 TFP después de la desglicosilación durante la noche con PNGasa F.
La figura 112D muestra que el inmunoconjugado de rituximab producido según el método de conjugación de BB-37 TFP (BB-37) es superior a la hora de provocar la regulación por incremento de CD123 en las células mieloides en comparación con el rituximab no conjugado (CD20, Alphamab) después de 18 horas de estimulación.
La figura 112E muestra que el inmunoconjugado de rituximab producido según el método de conjugación de BB-37 TFP (BB-37) es superior a la hora de provocar la regulación por incremento de HLA-DR en las células mieloides en comparación con el rituximab no conjugado (CD20, Alphamab) después de 18 horas de estimulación.
La figura 112F muestra que el inmunoconjugado de rituximab producido según el método de conjugación de BB-37 TFP (BB-37) es superior a la hora de provocar la regulación por incremento de CD14 en las células mieloides en comparación con el rituximab no conjugado (CD20, Alphamab) después de 18 horas de estimulación.
La figura 112G muestra que el inmunoconjugado de rituximab producido según el método de conjugación de BB-37 TFP (BB-37) es superior a la hora de provocar la regulación por incremento de CD16 en las células mieloides en comparación con el rituximab no conjugado (CD20, Alphamab) después de 18 horas de estimulación.
La figura 112H muestra que el inmunoconjugado de rituximab producido según el método de conjugación de BB-37 TFP (BB-37) es superior a la hora de provocar la regulación por incremento de CD40 en las células mieloides en comparación con el rituximab no conjugado (CD20, Alphamab) después de 18 horas de estimulación.
La figura 1121 muestra que el inmunoconjugado de rituximab producido según el método de conjugación de BB-37 TFP (BB-37) es superior a la hora de provocar la regulación por incremento de CD86 en las células mieloides en comparación con el rituximab no conjugado (CD20, Alphamab) después de 18 horas de estimulación.
La figura 113A muestra un análisis por cromatografía de líquidos-espectrometría de masas del inmunoconjugado BB-45 producido según el método de conjugación de BB-45 TFP.
La figura 113B muestra un análisis por cromatografía de líquidos-espectrometría de masas del biosimilar de rituximab no conjugado (CD20, Alphamab) que se utilizó para producir el inmunoconjugado de rituximab según el método de conjugación de BB-45 TFP.
La figura 113C muestra un análisis por cromatografía de líquidos-espectrometría de masas del biosimilar de rituximab no conjugado (CD20, Alphamab) que se utilizó para producir el inmunoconjugado de rituximab según el método de conjugación de BB-45 TFP después de la desglicosilación durante la noche con PNGasa F.
La figura 113D muestra que el inmunoconjugado de rituximab producido según el método de conjugación de BB-45 TFP (BB-45) es superior a la hora de provocar la regulación por incremento de CD123 en las células mieloides en comparación con el rituximab no conjugado (CD20, Alphamab) después de 18 horas de estimulación.
La figura 113E muestra que el inmunoconjugado de rituximab producido según el método de conjugación de BB-45 TFP (BB-45) es superior a la hora de provocar la regulación por incremento de HLA-DR en las células mieloides en comparación con el rituximab no conjugado (CD20, Alphamab) después de 18 horas de estimulación.
La figura 113F muestra que el inmunoconjugado de rituximab producido según el método de conjugación de BB-45 TFP (BB-45) es superior a la hora de provocar la regulación por incremento de CD14 en las células mieloides en comparación con el rituximab no conjugado (CD20, Alphamab) después de 18 horas de estimulación.
La figura 113G muestra que el inmunoconjugado de rituximab producido según el método de conjugación de BB-45 TFP (BB-45) es superior a la hora de provocar la regulación por incremento de CD16 en las células mieloides en comparación con el rituximab no conjugado (CD20, Alphamab) después de 18 horas de estimulación.
La figura 113H muestra que el inmunoconjugado de rituximab producido según el método de conjugación de BB-45 TFP (BB-45) es superior a la hora de provocar la regulación por incremento de CD40 en las células mieloides en comparación con el rituximab no conjugado (CD20, Alphamab) después de 18 horas de estimulación.
La figura 1131 muestra que el inmunoconjugado de rituximab producido según el método de conjugación de BB-45 TFP (BB-45) es superior a la hora de provocar la regulación por incremento de CD86 en las células mieloides en comparación con el rituximab no conjugado (CD20, Alphamab) después de 18 horas de estimulación.
La figura 114A muestra un análisis por cromatografía de líquidos-espectrometría de masas de la cadena pesada de un anticuerpo monoclonal de CD40 no conjugado (Bioxcell, BE0016-2).
La figura 114B muestra un análisis por cromatografía de líquidos-espectrometría de masas de la cadena ligera de un anticuerpo monoclonal de CD40 no conjugado (Bioxcell, BE0016-2).
La figura 114C muestra un análisis por cromatografía de líquidos-espectrometría de masas de la cadena pesada de un inmunoconjugado de CD40 producido según el documento US 2017/0158772.
La figura 114D muestra un análisis por cromatografía de líquidos-espectrometría de masas de la cadena ligera de un inmunoconjugado de CD40 producido según el documento US 2017/0158772.
La figura 115A muestra un análisis por cromatografía de líquidos-espectrometría de masas de un anticuerpo monoclonal de CD40 no conjugado (Bioxcell, BE0016-2).
La figura 115B muestra un análisis por cromatografía de líquidos-espectrometría de masas de un inmunoconjugado de CD40 producido según el método de conjugación de BB-01.
La figura 116A muestra un análisis por cromatografía de líquidos-espectrometría de masas de un anticuerpo monoclonal de CLEC5a no conjugado (R&D Systems, mabl639).
La figura 116B muestra un análisis por cromatografía de líquidos-espectrometría de masas de un inmunoconjugado de CLEC5a producido según el método de conjugación de BB-01.
La figura 117A muestra un esquema de un inmunoconjugado de CL264 producido según el método de conjugación de BB-01.
La figura 117B muestra un esquema de un inmunoconjugado de CL264 producido según el método de síntesis de éster.
La figura 118A muestra que el inmunoconjugado de rituximab-CL307 producido según el método de conjugación de BB-01 regula por incremento el CD123 en las células mieloides de una manera dependiente de la dosis después de 18 horas de estimulación. La línea discontinua indica el nivel de expresión en células no estimuladas cultivadas durante 18 horas.
La figura 118B muestra que el inmunoconjugado de rituximab-CL307 producido según el método de conjugación de BB-01 regula por incremento el HLA-DR en las células mieloides de una manera dependiente de la dosis después de 18 horas de estimulación. La línea discontinua indica el nivel de expresión en células no estimuladas cultivadas durante 18 horas.
La figura 118C muestra que el ¡nmunoconjugado de ritux¡mab-CL307 producido según el método de conjugación de BB-01 regula por disminución el CD14 en las células mieloides de una manera dependiente de la dosis después de 18 horas de estimulación. La línea discontinua indica el nivel de expresión en células no estimuladas cultivadas durante 18 horas.
La figura 118D muestra que el ¡nmunoconjugado de rituximab-CL307 producido según el método de conjugación de BB-01 regula por disminución el CD16 en las células mieloides de una manera dependiente de la dosis después de 18 horas de estimulación. La línea discontinua indica el nivel de expresión en células no estimuladas cultivadas durante 18 horas.
La figura 118E muestra que el ¡nmunoconjugado de rituximab-CL307 producido según el método de conjugación de BB-01 regula por incremento el CD40 en las células mieloides de una manera dependiente de la dosis después de 18 horas de estimulación. La línea discontinua indica el nivel de expresión en células no estimuladas cultivadas durante 18 horas.
La figura 118F muestra que el ¡nmunoconjugado de rituximab-CL307 producido según el método de conjugación de BB-01 regula por incremento el CD86 en las células mieloides de una manera dependiente de la dosis después de 18 horas de estimulación. La línea discontinua indica el nivel de expresión en células no estimuladas cultivadas durante 18 horas.
La figura 118G muestra un análisis por cromatografía de líquidos-espectrometría de masas de rituximab no conjugado (Roche) que se utilizó para producir rituximab-CL307.
La figura 118H muestra un análisis por cromatografía de líquidos-espectrometría de masas de rituximab no conjugado (Roche) que se utilizó para producir rituximab-CL307 después de la desglicosilación durante la noche con PNGasa F.
La figura 1181 muestra que el ¡nmunoconjugado de rituximab-CL307 producido según el método de conjugación de BB-01 provoca la secreción de TNFa de una manera dependiente de la dosis después de 18 horas de estimulación.
La figura 118J muestra un análisis por cromatografía de líquidos-espectrometría de masas del ¡nmunoconjugado de ritux¡mab-CL307 producido según el método de conjugación de BB-01.
La figura 119A muestra que el ¡nmunoconjugado de rituximab-CL419 producido según el método de BB-01 (rituximab-CL419 Boltbody) es superior a la hora de provocar la secreción de IL-1 p en las células mieloides en comparación con el rituximab no conjugado (Roche) después de 36 horas de estimulación.
La figura 119B muestra que el ¡nmunoconjugado de rituximab-CL419 producido según el método de BB-01 (rituximab-CL419 Boltbody) es superior a la hora de provocar la secreción de TNFa en las células mieloides en comparación con el rituximab no conjugado (Roche) después de 36 horas de estimulación.
La figura 119C muestra un análisis por cromatografía de líquidos-espectrometría de masas de rituximab no conjugado (Roche) que se utilizó para producir rituximab-CL419 después de la desglicosilación durante la noche con PNGasa F.
La figura 119D muestra un análisis por cromatografía de líquidos-espectrometría de masas de rituximab no conjugado (Roche) que se utilizó para producir rituximab-CL419.
La figura 119E muestra un análisis por cromatografía de líquidos-espectrometría de masas del ¡nmunoconjugado de rituximab-CL419 producido según el método de conjugación de BB-01 después de la desglicosilación durante la noche con PNGasa F.
La figura 119F muestra que el ¡nmunoconjugado de rituximab-CL419 producido según el método de BB-01 (CL419 Boltbody) es superior a la hora de provocar la regulación por disminución de CD16 en las células mieloides en comparación con el rituximab no conjugado (CD20; Roche) después de 18 horas de estimulación.
La figura 119G muestra que el ¡nmunoconjugado de rituximab-CL419 producido según el método de BB-01 (CL419 Boltbody) es superior a la hora de provocar la regulación por incremento de CD40 en las células mieloides en comparación con el rituximab no conjugado (CD20; Roche) después de 18 horas de estimulación.
La figura 119H muestra que el ¡nmunoconjugado de rituximab-CL419 producido según el método de BB-01 (CL419 Boltbody) es superior a la hora de provocar la regulación por incremento de CD86 en las células mieloides en comparación con el rituximab no conjugado (CD20; Roche) después de 18 horas de estimulación.
La figura 1191 muestra que el ¡nmunoconjugado de rituximab-CL419 producido según el método de BB-01 (CL419 Boltbody) es superior a la hora de provocar la regulación por incremento de CD123 en las células mieloides en comparación con el rituximab no conjugado (CD20; Roche) después de 18 horas de estimulación.
La figura 120A muestra que el ¡nmunoconjugado de rituximab-CL572 producido según el método de BB-01 (rituximab-CL572 Boltbody) es superior a la hora de provocar la secreción de IL-1 p en las células mieloides en comparación con el rituximab no conjugado (Roche) después de 36 horas de estimulación.
La figura 120B muestra que el inmunoconjugado de rituximab-CL572 producido según el método de BB-01 (rituximab-CL572 Boltbody) es superior a la hora de provocar la secreción de TNFa en las células mieloides en comparación con el rituximab no conjugado (Roche) después de 36 horas de estimulación.
La figura 120C muestra un análisis por cromatografía de líquidos-espectrometría de masas de rituximab no conjugado (Roche) que se utilizó para producir rituximab-CL572 después de la desglicosilación durante la noche con PNGasa F.
La figura 120D muestra un análisis por cromatografía de líquidos-espectrometría de masas de rituximab no conjugado (Roche) que se utilizó para producir rituximab-CL572.
La figura 120E muestra un análisis por cromatografía de líquidos-espectrometría de masas del inmunoconjugado de rituximab-CL572 producido según el método de conjugación de BB-01 después de la desglicosilación durante la noche con PNGasa F.
La figura 120F muestra que el inmunoconjugado de rituximab-CL572 producido según el método de BB-01 (CL572 Boltbody) es superior a la hora de provocar la regulación por incremento de CD123 en las células mieloides en comparación con el rituximab no conjugado (CD20; Roche) después de 18 horas de estimulación.
La figura 120G muestra que el inmunoconjugado de rituximab-CL572 producido según el método de BB-01 (CL572 Boltbody) es superior a la hora de provocar la regulación por incremento de HLA-DR en las células mieloides en comparación con el rituximab no conjugado (CD20; Roche) después de 18 horas de estimulación.
La figura 120H muestra que el inmunoconjugado de rituximab-CL572 producido según el método de BB-01 (CL572 Boltbody) es superior a la hora de provocar la regulación por disminución de CD16 en las células mieloides en comparación con el rituximab no conjugado (CD20; Roche) después de 18 horas de estimulación.
La figura 1201 muestra que el inmunoconjugado de rituximab-CL572 producido según el método de BB-01 (CL572 Boltbody) es superior a la hora de provocar la regulación por incremento de CD40 en las células mieloides en comparación con el rituximab no conjugado (CD20; Roche) después de 18 horas de estimulación.
La figura 121A muestra que el inmunoconjugado de rituximab-Pam2CSK4 producido según el método de BB-01 (rituximab-Pam2CSK4 Boltbody) es superior a la hora de provocar la secreción de IL-1 p de células mieloides en comparación con el rituximab no conjugado (Roche) después de 36 horas de estimulación.
La figura 121B muestra que el inmunoconjugado de rituximab-Pam2CSK4 producido según el método de BB-01 (rituximab-Pam2CSK4 Boltbody) es superior a la hora de provocar la secreción de TNFa en las células mieloides en comparación con el rituximab no conjugado (Roche) después de 36 horas de estimulación.
La figura 121C muestra un análisis por cromatografía de líquidos-espectrometría de masas de rituximab no conjugado (Roche) que se utilizó para producir rituximab-Pam2CSK4 después de la desglicosilación durante la noche con PNGasa F.
La figura 121D muestra un análisis por cromatografía de líquidos-espectrometría de masas de rituximab no conjugado (Roche) que se utilizó para producir rituximab-Pam2CSK4.
La figura 121E muestra un análisis por cromatografía de líquidos-espectrometría de masas del inmunoconjugado de rituximab-Pam2CSK4 producido según el método de conjugación de BB-01 después de la desglicosilación durante la noche con PNGasa F.
La figura 121F muestra que el inmunoconjugado de rituximab-Pam2CSK4 producido según el método de BB-01 (Pam2CSK4 Boltbody) es superior a la hora de provocar la regulación por disminución de CD16 en las células mieloides en comparación con el rituximab no conjugado (CD20; Roche) después de 18 horas de estimulación.
La figura 121G muestra que el inmunoconjugado de rituximab-Pam2CSK4 producido según el método de BB-01 (Pam2CSK4 Boltbody) es superior a la hora de provocar la regulación por incremento de CD40 en las células mieloides en comparación con el rituximab no conjugado (CD20; Roche) después de 18 horas de estimulación.
La figura 121H muestra que el inmunoconjugado de rituximab-Pam2CSK4 producido según el método de BB-01 (Pam2CSK4 Boltbody) es superior a la hora de provocar la regulación por incremento de CD86 en las células mieloides en comparación con el rituximab no conjugado (CD20; Roche) después de 18 horas de estimulación.
La figura 122A muestra que el inmunoconjugado de rituximab-Pam3CSK4 producido según el método de BB-01 (rituximab-Pam3CSK4 Boltbody) es superior a la hora de provocar la secreción de IL-1 p en las células mieloides en comparación con el rituximab no conjugado (Roche) después de 36 horas de estimulación.
La figura 122B muestra que el inmunoconjugado de rituximab-Pam3CSK4 producido según el método de BB-01 (rituximab-Pam3CSK4 Boltbody) es superior a la hora de provocar la secreción de TNFa en las células mieloides en comparación con el rituximab no conjugado (Roche) después de 36 horas de estimulación.
La figura 122C muestra un análisis por cromatografía de líquidos-espectrometría de masas de rituximab no conjugado (Roche) que se utilizó para producir rituximab-Pam3CSK4 después de la desglicosilación durante la noche con PNGasa F.
La figura 122D muestra un análisis por cromatografía de líquidos-espectrometría de masas de rituximab no conjugado (Roche) que se utilizó para producir rituximab-Pam3CSK4.
La figura 122E muestra un análisis por cromatografía de líquidos-espectrometría de masas del inmunoconjugado de rituximab-Pam3CSK4 producido según el método de conjugación de BB-01 después de la desglicosilación durante la noche con PNGasa F.
La figura 122F muestra que el inmunoconjugado de rituximab-Pam3CSK4 producido según el método de BB-01 (Pam3CSK4 Boltbody) es superior a la hora de provocar la regulación por disminución de CD16 en las células mieloides en comparación con el rituximab no conjugado (CD20; Roche) después de 18 horas de estimulación. La figura 122G muestra que el inmunoconjugado de rituximab-Pam3CSK4 producido según el método de BB-01 (Pam3CSK4 Boltbody) es superior a la hora de provocar la regulación por incremento de CD40 en las células mieloides en comparación con el rituximab no conjugado (CD20; Roche) después de 18 horas de estimulación. La figura 122H muestra que el inmunoconjugado de rituximab-Pam3CSK4 producido según el método de BB-01 (Pam3CSK4 Boltbody) es superior a la hora de provocar la regulación por incremento de CD86 en las células mieloides en comparación con el rituximab no conjugado (CD20; Roche) después de 18 horas de estimulación. La figura 1221 muestra que el inmunoconjugado de rituximab-Pam3CSK4 producido según el método de BB-01 (Pam3CSK4 Boltbody) es superior a la hora de provocar la regulación por incremento de CD123 en las células mieloides en comparación con el rituximab no conjugado (CD20; Roche) después de 18 horas de estimulación. La figura 123A muestra un análisis por cromatografía de líquidos-espectrometría de masas del inmunoconjugado BB-43 producido según el método de conjugación de TFP.
La figura 123B muestra un análisis por cromatografía de líquidos-espectrometría de masas de un biosimilar de rituximab no conjugado (LGM Pharma) que se utilizó para producir b B-43 después de la desglicosilación durante la noche con PNGasa F.
La figura 123C muestra un análisis por cromatografía de líquidos-espectrometría de masas de un biosimilar de rituximab no conjugado (LGM Pharma) que se utilizó para producir BB-43.
La figura 123D muestra que el inmunoconjugado BB-43 producido según el método TFP es superior a la hora de provocar la regulación por incremento de CD123 en las células mieloides en comparación con un biosimilar de rituximab no conjugado (LGM Pharma) después de 18 horas de estimulación.
La figura 123E muestra que el inmunoconjugado BB-43 producido según el método TFP es superior a la hora de provocar la regulación por incremento de HLA-DR en las células mieloides en comparación con un biosimilar de rituximab no conjugado (LGM Pharma) después de 18 horas de estimulación.
La figura 123F muestra que el inmunoconjugado BB-43 producido según el método TFP es superior a la hora de provocar la regulación por disminución de CD14 en las células mieloides en comparación con un biosimilar de rituximab no conjugado (LGM Pharma) después de 18 horas de estimulación.
La figura 123G muestra que el inmunoconjugado BB-43 producido según el método TFP es superior a la hora de provocar la regulación por disminución de CD16 en las células mieloides en comparación con un biosimilar de rituximab no conjugado (LGM Pharma) después de 18 horas de estimulación.
La figura 123H muestra que el inmunoconjugado BB-43 producido según el método TFP es superior a la hora de provocar la regulación por incremento de CD40 en las células mieloides en comparación con un biosimilar de rituximab no conjugado (LGM Pharma) después de 18 horas de estimulación.
La figura 1231 muestra que el inmunoconjugado BB-43 producido según el método TFP es superior a la hora de provocar la regulación por incremento de CD86 en las células mieloides en comparación con un biosimilar de rituximab no conjugado (LGM Pharma) después de 18 horas de estimulación.
La figura 124A muestra que el inmunoconjugado de rituximab-SATA-T782 producido según el método de BB-01 (rituximab-SATA-T782 Boltbody) provoca la secreción de TNFa en las células mieloides de una manera dependiente de la dosis después de 18 horas de estimulación.
La figura 124B muestra un análisis por cromatografía de líquidos-espectrometría de masas de rituximab no conjugado (Roche) que se utilizó para producir rituximab-SATA-T782 después de la desglicosilación durante la noche con PNGasa F.
La figura 124C muestra un análisis por cromatografía de líquidos-espectrometría de masas de rituximab no conjugado (Roche) que se utilizó para producir rituximab-SATA-T782.
La figura 124D muestra un análisis por cromatografía de líquidos-espectrometría de masas del rituximab-SATA-T782 producido según el método de BB-01.
La figura 124E muestra que el inmunoconjugado de rituximab-SATA-T782 producido según el método de conjugación de BB-01 (rituximab-SATA-T782) regula por incremento el CD123 en las células mieloides de una manera dependiente de la dosis después de 18 horas de estimulación. La línea discontinua indica el nivel de expresión en las células mieloides no estimuladas cultivadas durante 18 horas.
La figura 124F muestra que el inmunoconjugado de rituximab-SATA-T782 producido según el método de conjugación de BB-01 (rituximab-SATA-T782) regula por incremento el HLA-DR en las células mieloides de una manera dependiente de la dosis después de 18 horas de estimulación. La línea discontinua indica el nivel de expresión en las células mieloides no estimuladas cultivadas durante 18 horas.
La figura 124G muestra que el inmunoconjugado de rituximab-SATA-T782 producido según el método de conjugación de BB-01 (rituximab-SATA-T782) regula por disminución el CD14 en las células mieloides de una manera dependiente de la dosis después de 18 horas de estimulación. La línea discontinua indica el nivel de expresión en las células mieloides no estimuladas cultivadas durante 18 horas.
La figura 124H muestra que el inmunoconjugado de rituximab-SATA-T782 producido según el método de conjugación de BB-01 (rituximab-SATA-T782) regula por disminución el CD16 en las células mieloides de una manera dependiente de la dosis después de 18 horas de estimulación. La línea discontinua indica el nivel de expresión en las células mieloides no estimuladas cultivadas durante 18 horas.
La figura 1241 muestra que el inmunoconjugado de rituximab-SATA-T782 producido según el método de conjugación de BB-01 (rituximab-SATA-T782) regula por incremento el CD40 en las células mieloides de una manera dependiente de la dosis después de 18 horas de estimulación. La línea discontinua indica el nivel de expresión en las células mieloides no estimuladas cultivadas durante 18 horas.
La figura 124J muestra que el inmunoconjugado de rituximab-SATA-T782 producido según el método de conjugación de BB-01 (rituximab-SATA-T782) regula por incremento el CD86 en las células mieloides de una manera dependiente de la dosis después de 18 horas de estimulación. La línea discontinua indica el nivel de expresión en las células mieloides no estimuladas cultivadas durante 18 horas.
La figura 125A muestra que el inmunoconjugado de rituximab-SATP-T782 producido según el método de BB-01 (rituximab-SATP-T782 Boltbody) provoca la secreción de TNFa en las células mieloides de una manera dependiente de la dosis después de 18 horas de estimulación.
La figura 125B muestra un análisis por cromatografía de líquidos-espectrometría de masas de rituximab no conjugado (Roche) que se utilizó para producir rituximab-SATP-T782 después de la desglicosilación durante la noche con PNGasa F.
La figura 125C muestra un análisis por cromatografía de líquidos-espectrometría de masas de rituximab no conjugado (Roche) que se utilizó para producir rituximab-SATP-T782.
La figura 125D muestra un análisis por cromatografía de líquidos-espectrometría de masas del rituximab-SATP-T782 producido según el método de BB-01.
La figura 125E muestra que el inmunoconjugado de rituximab-SATP-T782 producido según el método de conjugación de BB-01 (rituximab-SATP-T782) regula por incremento el CD123 en las células mieloides de una manera dependiente de la dosis después de 18 horas de estimulación. La línea discontinua indica el nivel de expresión en las células mieloides no estimuladas cultivadas durante 18 horas.
La figura 125F muestra que el inmunoconjugado de rituximab-SATP-T782 producido según el método de conjugación de BB-01 (rituximab-SATP-T782) regula por incremento el HLA-DR en las células mieloides de una manera dependiente de la dosis después de 18 horas de estimulación. La línea discontinua indica el nivel de expresión en las células mieloides no estimuladas cultivadas durante 18 horas.
La figura 125G muestra que el inmunoconjugado de rituximab-SATP-T782 producido según el método de conjugación de BB-01 (rituximab-SATP-T782) regula por disminución el CD14 en las células mieloides de una manera dependiente de la dosis después de 18 horas de estimulación. La línea discontinua indica el nivel de expresión en las células mieloides no estimuladas cultivadas durante 18 horas.
La figura 125H muestra que el inmunoconjugado de rituximab-SATP-T782 producido según el método de conjugación de BB-01 (rituximab-SATP-T782) regula por disminución el CD16 en las células mieloides de una manera dependiente de la dosis después de 18 horas de estimulación. La línea discontinua indica el nivel de expresión en las células mieloides no estimuladas cultivadas durante 18 horas.
La figura 1251 muestra que el inmunoconjugado de rituximab-SATP-T782 producido según el método de conjugación de BB-01 (rituximab-SATP-T782) regula por incremento el CD40 en las células mieloides de una manera dependiente de la dosis después de 18 horas de estimulación. La línea discontinua indica el nivel de expresión en las células mieloides no estimuladas cultivadas durante 18 horas.
La figura 125J muestra que el inmunoconjugado de rituximab-SATP-T782 producido según el método de conjugación de BB-01 (rituximab-SATP-T782) regula por incremento el CD86 en las células mieloides de una manera dependiente de la dosis después de 18 horas de estimulación, La línea discontinua indica el nivel de expresión en las células mieloides no estimuladas cultivadas durante 18 horas,
La figura 126A muestra un análisis por cromatografía de líquidos-espectrometría de masas del inmunoconjugado BB-12 producido según el método de conjugación de SATA después de la conjugación durante la noche con PNGasa F,
La figura 126B muestra un análisis por cromatografía de líquidos-espectrometría de masas de un biosimilar de rituximab no conjugado (LGM Pharma) que se utilizó para producir b B-12 después de la desglicosilación durante la noche con PNGasa F,
La figura 126C muestra un análisis por cromatografía de líquidos-espectrometría de masas de un biosimilar de rituximab no conjugado (LGM Pharma) que se utilizó para producir BB-12,
La figura 126D muestra que el inmunoconjugado BB-12 producido según el método SATA no logra provocar la regulación por incremento de CD123 después de 18 horas de estimulación, La figura 126D también muestra que el inmunoconjugado BB-11 producido según el método SATA es superior a la hora de provocar la regulación por incremento de CD123 en comparación con el BB-12 y concentraciones equimolares de la mezcla (CD20 IRM1). Cabe destacar que el BB-11 y el BB-12 se construyen con enlazadores idénticos, pero tienen adyuvantes distintos,
La figura 126E muestra que el inmunoconjugado BB-12 producido según el método SATA no logra provocar la regulación por incremento de HLA-DR después de 18 horas de estimulación, La figura 126E también muestra que el inmunoconjugado BB-11 producido según el método SATA es superior a la hora de provocar la regulación por incremento de HLA-DR en comparación con el BB-12 y concentraciones equimolares de la mezcla (CD20 IRM1). Cabe destacar que el BB-11 y el BB-12 se construyen con enlazadores idénticos, pero tienen adyuvantes distintos,
La figura 126F muestra que el inmunoconjugado BB-12 producido según el método SATA no logra provocar la regulación por disminución de CD14 después de 18 horas de estimulación en comparación con concentraciones equimolares de la mezcla (CD20 IRM1). La figura 126F también muestra que el inmunoconjugado BB-11 producido según el método SATA es superior a la hora de provocar una regulación por disminución de CD14 en comparación con el BB-12 y concentraciones equimolares de la mezcla (CD20 IRM1). Cabe destacar que el BB-11 y el BB-12 se construyen con enlazadores idénticos, pero tienen adyuvantes distintos,
La figura 126G también muestra que el inmunoconjugado BB-11 producido según el método SATA es superior a la hora de provocar una regulación por disminución de CD16 en comparación con el BB-12 y concentraciones equimolares de la mezcla (CD20 IRM1). Cabe destacar que el BB-11 y el BB-12 se construyen con enlazadores idénticos, pero tienen adyuvantes distintos,
La figura 126H muestra que el inmunoconjugado BB-12 producido según el método SATA no logra provocar la regulación por incremento de CD40 después de 18 horas de estimulación en comparación con concentraciones equimolares de la mezcla (CD20 IRM1). La figura 126H también muestra que el inmunoconjugado BB-11 producido según el método SATA es superior a la hora de provocar la regulación por incremento de CD40 en comparación con el BB-12 y concentraciones equimolares de la mezcla (CD20 IRM1). Cabe destacar que el BB-11 y el BB-12 se construyen con enlazadores idénticos, pero tienen adyuvantes distintos,
La figura 1261 muestra que el inmunoconjugado BB-12 producido según el método SATA no logra provocar la regulación por incremento de CD86 después de 18 horas de estimulación en comparación con concentraciones equimolares de la mezcla (CD20 IRM1). La figura 1261 también muestra que el inmunoconjugado BB-11 producido según el método SATA es superior a la hora de provocar la regulación por incremento de CD86 en comparación con el BB-12 y concentraciones equimolares de la mezcla (CD20 IRM1). Cabe destacar que el BB-11 y el BB-12 se construyen con enlazadores idénticos, pero tienen adyuvantes distintos,
La figura 126J muestra la expresión de CD123 después de 18 horas de estimulación con el BB-12, La línea discontinua indica el nivel de expresión de CD123 en células no estimuladas después de 18 horas de incubación,
La figura 126K muestra la expresión de HLA-DR después de 18 horas de estimulación con el BB-12, La línea discontinua indica el nivel de expresión de HLA-DR en células no estimuladas después de 18 horas de incubación,
La figura 126L muestra la expresión de CD14 después de 18 horas de estimulación con el BB-12, La línea discontinua indica el nivel de expresión de CD14 en células no estimuladas después de 18 horas de incubación,
La figura 126M muestra la expresión de CD16 después de 18 horas de estimulación con el BB-12, La línea discontinua indica el nivel de expresión de CD16 en células no estimuladas después de 18 horas de incubación,
La figura 126N muestra la expresión de CD40 después de 18 horas de estimulación con el BB-12, La línea discontinua indica el nivel de expresión de CD40 en células no estimuladas después de 18 horas de incubación, La figura 1260 muestra la expresión de CD86 después de 18 horas de estimulación con el BB-12. La línea discontinua indica el nivel de expresión de CD86 en células no estimuladas después de 18 horas de incubación.
La figura 127A muestra un análisis por cromatografía de líquidos-espectrometría de masas del inmunoconjugado BB-10 producido según el método de conjugación de SATA después de la desglicosilación durante la noche con PNGasa.
La figura 127B muestra un análisis por cromatografía de líquidos-espectrometría de masas de un biosimilar de rituximab no conjugado (LGM Pharma) que se utilizó para producir BB-10.
La figura 127C muestra un análisis por cromatografía de líquidos-espectrometría de masas de un biosimilar de rituximab no conjugado (LGM Pharma) que se utilizó para producir BB-10 después de la desglicosilación durante la noche con PNGasa F.
La figura 127D muestra que el inmunoconjugado BB-10 producido según el método SATA no logra provocar la regulación por incremento de CD123 después de 18 horas de estimulación. La figura 127D también muestra que el inmunoconjugado BB-05 producido según el método SATA es superior a la hora de provocar la regulación por incremento de CD123 en comparación con el BB-10 y concentraciones equimolares de la mezcla (CD20 IRM1). Cabe destacar que el BB-05 y el BB-10 se construyen con enlazadores idénticos, pero tienen adyuvantes distintos.
La figura 127E muestra que el inmunoconjugado BB-10 producido según el método SATA no logra provocar la regulación por incremento de HLA-DR después de 18 horas de estimulación. La figura 127E también muestra que el inmunoconjugado BB-05 producido según el método SATA es superior a la hora de provocar la regulación por incremento de HLA-DR en comparación con el BB-10 y concentraciones equimolares de la mezcla (CD20 IRM1). Cabe destacar que el BB-05 y el BB-10 se construyen con enlazadores idénticos, pero tienen adyuvantes distintos.
La figura 127F muestra que el inmunoconjugado BB-10 producido según el método SATA no logra provocar la regulación por disminución de CD14 después de 18 horas de estimulación en comparación con concentraciones equimolares de la mezcla (CD20 IRM1). La figura 127F también muestra que el inmunoconjugado BB-05 producido según el método SATA es superior a la hora de provocar la regulación por disminución de CD14 en comparación con el BB-10 y concentraciones equimolares de la mezcla (CD20 IRM1). Cabe destacar que el BB-05 y el BB-10 se construyen con enlazadores idénticos, pero tienen adyuvantes distintos.
La figura 127G muestra que el inmunoconjugado BB-05 producido según el método SATA es superior a la hora de provocar una regulación por disminución de CD16 en comparación con el BB-10 y concentraciones equimolares de la mezcla (CD20 IRM1). Cabe destacar que el BB-05 y el BB-10 se construyen con enlazadores idénticos, pero tienen adyuvantes distintos.
La figura 127H muestra que el inmunoconjugado BB-10 producido según el método SATA no logra provocar la regulación por incremento de CD40 después de 18 horas de estimulación en comparación con concentraciones equimolares de la mezcla (CD20 IRM1). La figura 127H también muestra que el inmunoconjugado BB-05 producido según el método SATA es superior a la hora de provocar la regulación por incremento de CD40 en comparación con el BB-10 y concentraciones equimolares de la mezcla (CD20 IRM1). Cabe destacar que el BB-05 y el BB-10 se construyen con enlazadores idénticos, pero tienen adyuvantes distintos.
La figura 1271 muestra que el inmunoconjugado BB-10 producido según el método SATA no logra provocar la regulación por incremento de CD86 después de 18 horas de estimulación en comparación con concentraciones equimolares de la mezcla (CD20 IRM1). La figura 1271 también muestra que el inmunoconjugado BB-05 producido según el método SATA es superior a la hora de provocar la regulación por incremento de CD86 en comparación con el BB-10 y concentraciones equimolares de la mezcla (CD20 IRM1). Cabe destacar que el BB-05 y el BB-10 se construyen con enlazadores idénticos, pero tienen adyuvantes distintos.
La figura 127J muestra la expresión de CD123 después de 18 horas de estimulación con el BB-10. La línea discontinua indica el nivel de expresión de CD123 en células no estimuladas después de 18 horas de incubación.
La figura 127K muestra la expresión de HLA-DR después de 18 horas de estimulación con el BB-10. La línea discontinua indica el nivel de expresión de HLA-DR en células no estimuladas después de 18 horas de incubación.
La figura 127L muestra la expresión de CD14 después de 18 horas de estimulación con el BB-10. La línea discontinua indica el nivel de expresión de CD14 en células no estimuladas después de 18 horas de incubación.
La figura 127M muestra la expresión de CD16 después de 18 horas de estimulación con el BB-10. La línea discontinua indica el nivel de expresión de CD16 en células no estimuladas después de 18 horas de incubación.
La figura 127N muestra la expresión de CD40 después de 18 horas de estimulación con el BB-10. La línea discontinua indica el nivel de expresión de CD40 en células no estimuladas después de 18 horas de incubación.
La figura 1270 muestra la expresión de CD86 después de 18 horas de estimulación con el BB-10. La línea discontinua indica el nivel de expresión de CD40 en células no estimuladas después de 18 horas de incubación.
La figura 128A muestra que el inmunoconjugado BB-01 producido según el método de BB-01 provoca una secreción superior de IL-1 p en las células mieloides en comparación con concentraciones equimolares de BB-19 producidas según los métodos descritos en la patente estadounidense 8.951.528 y el biosimilar de rituximab no conjugado (LGM Pharma) después de 18 horas de estimulación.
La figura 128B muestra que el inmunoconjugado BB-01 producido según el método de BB-01 provoca una secreción superior de TNFa en las células mieloides en comparación con concentraciones equimolares de BB-19 producidas según los métodos descritos en la patente estadounidense 8.951.528 y el biosimilar de rituximab no conjugado (LGM Pharma) después de 18 horas de estimulación.
La figura 128C muestra la secreción de IL-1 p de células mieloides después de una incubación de 18 horas con concentraciones equimolares de biosimilar de rituximab no conjugado (LGM Pharma)<o>BB-19 producido según métodos descritos en la patente estadounidense 8.951.528.
La figura 128D muestra la secreción de TNFa de células mieloides después de una incubación de 18 horas con concentraciones equimolares de biosimilar de rituximab no conjugado (LGM Pharma) o BB-19 producido según métodos descritos en la patente estadounidense 8.951.528.
La figura 128E muestra un análisis por cromatografía de líquidos-espectrometría de masas del BB-19 producido según los métodos descritos en la patente estadounidense 8.951.528 después de la desglicosilación durante la noche con PNGasa.
La figura 128F muestra un análisis por cromatografía de líquidos-espectrometría de masas de un biosimilar de rituximab no conjugado (LGM Pharma) que se utilizó para producir b B-19 después de la desglicosilación durante la noche con PNGasa.
La figura 128G muestra un análisis por cromatografía de líquidos-espectrometría de masas de un biosimilar de rituximab no conjugado (LGM Pharma) que se utilizó para producir BB-19.
La figura 128H muestra que el BB-01 producido según el método de BB-01 es superior a la hora de provocar la regulación por incremento de CD123 en las células mieloides en comparación con el inmunoconjugado BB-19 producido según los métodos descritos en la patente estadounidense 8.951.528 y el biosimilar de rituximab no conjugado (CD20; LGM Pharma) después de 18 horas de estimulación.
La figura 1281 muestra que el BB-01 producido según el método de BB-01 es superior a la hora de provocar la regulación por incremento de HLA-DR en las células mieloides en comparación con el inmunoconjugado BB-19 producido según los métodos descritos en la patente estadounidense 8.951.528 y el biosimilar de rituximab no conjugado (CD20; LGM Pharma) después de 18 horas de estimulación.
La figura 128J muestra que el BB-01 producido según el método de BB-01 es superior a la hora de provocar la regulación por disminución de CD14 en las células mieloides en comparación con el inmunoconjugado BB-19 producido según los métodos descritos en la patente estadounidense 8.951.528 y el biosimilar de rituximab no conjugado (CD20; LGM Pharma) después de 18 horas de estimulación.
La figura 128K muestra que el BB-01 producido según el método de BB-01 es superior a la hora de provocar una regulación por disminución de CD16 en las células mieloides en comparación con el inmunoconjugado BB-19 producido según los métodos descritos en la patente estadounidense 8.951.528 y el biosimilar de rituximab no conjugado (CD20; LGM Pharma) después de 18 horas de estimulación.
La figura 128L muestra que el inmunoconjugado BB-19 producido según los métodos descritos en la patente estadounidense 8.951.528 no logra provocar la regulación por incremento de CD40 después de 18 horas de estimulación. La figura 128L también muestra que el inmunoconjugado BB-01 producido según el método de BB-01 es superior a la hora de provocar la regulación por incremento de CD40 en comparación con el BB-19 y el biosimilar de rituximab no conjugado (CD20; LGM Pharma).
La figura 128M muestra que el BB-01 producido según el método de BB-01 es superior a la hora de provocar la regulación por incremento de CD86 en las células mieloides en comparación con el inmunoconjugado BB-19 producido según los métodos descritos en la patente estadounidense 8.951.528 y el biosimilar de rituximab no conjugado (CD20; LGM Pharma) después de 18 horas de estimulación.
La figura 128N muestra la expresión de CD123 en las células mieloides después de 18 horas de estimulación con el inmunoconjugado BB-19 producido según los métodos descritos en la patente estadounidense 8.951.528 o el biosimilar de rituximab no conjugado (CD20; LGM Pharma).
La figura 1280 muestra la expresión de HLA-DR en las células mieloides después de 18 horas de estimulación con el inmunoconjugado BB-19 producido según los métodos descritos en la patente estadounidense 8.951.528 o el biosimilar de rituximab no conjugado (CD20; LGM Pharma).
La figura 128P muestra la expresión de CD14 en las células mieloides después de 18 horas de estimulación con el inmunoconjugado BB-19 producido según los métodos descritos en la patente estadounidense 8.951.528 o el biosimilar de rituximab no conjugado (CD20; LGM Pharma),
La figura 128Q muestra la expresión de CD16 en las células mieloides después de 18 horas de estimulación con el inmunoconjugado BB-19 producido según los métodos descritos en la patente estadounidense 8.951.528 o el biosimilar de rituximab no conjugado (CD20; LGM Pharma).
La figura 128R muestra la expresión de CD40 en las células mieloides después de 18 horas de estimulación con el inmunoconjugado BB-19 producido según los métodos descritos en la patente estadounidense 8.951.528<o>el biosimilar de rituximab no conjugado (CD20; LGM Pharma).
La figura 128S muestra la expresión de CD86 en las células mieloides después de 18 horas de estimulación con el inmunoconjugado BB-19 producido según los métodos descritos en la patente estadounidense 8.951.528 o el biosimilar de rituximab no conjugado (CD20; LGM Pharma).
La figura 129A muestra que el inmunoconjugado BB-01 producido según el método de BB-01 provoca una secreción superior de IL-1 p en las células mieloides en comparación con concentraciones equimolares de BB-20 producidas según los métodos descritos en la patente estadounidense 8.951.528 y el biosimilar de rituximab no conjugado (LGM Pharma) después de 18 horas de estimulación.
La figura 129B muestra que el inmunoconjugado BB-01 producido según el método de BB-01 provoca una secreción superior de TNFa en las células mieloides en comparación con concentraciones equimolares de BB-20 producidas según los métodos descritos en la patente estadounidense 8.951.528 y el biosimilar de rituximab no conjugado (LGM Pharma) después de 18 horas de estimulación.
La figura 129C muestra la secreción de IL-1 p de células mieloides después de una incubación de 18 horas con concentraciones equimolares de biosimilar de rituximab no conjugado (LGM Pharma) o BB-20 producido según los métodos descritos en la patente estadounidense 8.951.528.
La figura 129D muestra la secreción de TNFa de células mieloides después de una incubación de 18 horas con concentraciones equimolares de biosimilar de rituximab no conjugado (LGM Pharma)<o>BB-20 producido según los métodos descritos en la patente estadounidense 8.951.528.
La figura 129E muestra un análisis por cromatografía de líquidos-espectrometría de masas del BB-20 producido según los métodos descritos en la patente estadounidense 8.951.528 después de la desglicosilación durante la noche con PNGasa.
La figura 129F muestra un análisis por cromatografía de líquidos-espectrometría de masas de un biosimilar de rituximab no conjugado (LGM Pharma) que se utilizó para producir b B-20 después de la desglicosilación durante la noche con PNGasa.
La figura 129G muestra un análisis por cromatografía de líquidos-espectrometría de masas de un biosimilar de rituximab no conjugado (LGM Pharma) que se utilizó para producir BB-20.
La figura 129H muestra que el BB-01 producido según el método de BB-01 es superior a la hora de provocar la regulación por incremento de CD123 en las células mieloides en comparación con el inmunoconjugado BB-20 producido según los métodos descritos en la patente estadounidense 8.951.528 y el biosimilar de rituximab no conjugado (CD20; LGM Pharma) después de 18 horas de estimulación.
La figura 1291 muestra que el BB-01 producido según el método de BB-01 es superior a la hora de provocar la regulación por incremento de HLA-DR en las células mieloides en comparación con el inmunoconjugado BB-20 producido según los métodos descritos en la patente estadounidense 8.951.528 y el biosimilar de rituximab no conjugado (CD20; LGM Pharma) después de 18 horas de estimulación.
La figura 129J muestra que el BB-01 producido según el método de BB-01 es superior a la hora de provocar la regulación por disminución de CD14 en las células mieloides en comparación con el inmunoconjugado BB-20 producido según los métodos descritos en la patente estadounidense 8.951.528 y el biosimilar de rituximab no conjugado (CD20; LGM Pharma) después de 18 horas de estimulación.
La figura 129K muestra que el BB-01 producido según el método de BB-01 es superior a la hora de provocar una regulación por disminución de CD16 en las células mieloides en comparación con el inmunoconjugado BB-20 producido según los métodos descritos en la patente estadounidense 8.951.528 y el biosimilar de rituximab no conjugado (CD20; LGM Pharma) después de 18 horas de estimulación.
La figura 129L muestra que el inmunoconjugado BB-20 producido según los métodos descritos en la patente estadounidense 8.951.528 no logra provocar la regulación por incremento de CD40 después de 18 horas de estimulación. La figura 129L también muestra que el inmunoconjugado BB-01 producido según el método de BB-01 es superior a la hora de provocar la regulación por incremento de CD40 en comparación con el BB-20 y el biosimilar de rituximab no conjugado (CD20; LGM Pharma).
La figura 129M muestra que el inmunoconjugado BB-20 producido según los métodos descritos en la patente estadounidense 8.951.528 no logra provocar la regulación por Incremento de CD86 después de 18 horas de estimulación. La figura 129M también muestra que el inmunoconjugado BB-01 producido según el método de BB-01 es superior a la hora de provocar la regulación por incremento de CD86 en comparación con el BB-20 y el biosimilar de rituximab no conjugado (CD20; LGM Pharma).
La figura 129N muestra la expresión de CD123 en las células mieloides después de 18 horas de estimulación con el inmunoconjugado BB-20 producido según los métodos descritos en la patente estadounidense 8.951.528 o el biosimilar de rituximab no conjugado (CD20; LGM Pharma).
La figura 1290 muestra la expresión de HLA-DR en las células mieloides después de 18 horas de estimulación con el inmunoconjugado BB-20 producido según los métodos descritos en la patente estadounidense 8.951.528 o el biosimilar de rituximab no conjugado (CD20; LGM Pharma).
La figura 129P muestra la expresión de CD14 en las células mieloides después de 18 horas de estimulación con el inmunoconjugado BB-20 producido según los métodos descritos en la patente estadounidense 8.951.528 o el biosimilar de rituximab no conjugado (CD20; LGM Pharma).
La figura 129Q muestra la expresión de CD16 en las células mieloides después de 18 horas de estimulación con el inmunoconjugado BB-20 producido según los métodos descritos en la patente estadounidense 8.951.528<o>el biosimilar de rituximab no conjugado (CD20; LGM Pharma).
La figura 129R muestra la expresión de CD40 en las células mieloides después de 18 horas de estimulación con el inmunoconjugado BB-20 producido según los métodos descritos en la patente estadounidense 8.951.528 o el biosimilar de rituximab no conjugado (CD20; LGM Pharma).
La figura 129S muestra la expresión de CD86 en las células mieloides después de 18 horas de estimulación con el inmunoconjugado BB-20 producido según los métodos descritos en la patente estadounidense 8.951.528<o>el biosimilar de rituximab no conjugado (CD20; LGM Pharma).
La figura 130A muestra la expresión de CD14 en las células mieloides después de 18 horas de estimulación con concentraciones equimolares de albúmina de suero bovino (BSA)<o>el inmunoconjugado de BSA (BSA-compuesto 1) producido según el método de BB-37 TFP.
La figura 130B muestra la expresión de CD16 en las células mieloides después de 18 horas de estimulación con concentraciones equimolares de albúmina de suero bovino (BSA)<o>el inmunoconjugado de BSA (BSA-compuesto 1) producido según el método de BB-37 TFP.
La figura 130C muestra la expresión de CD123 en las células mieloides después de 18 horas de estimulación con concentraciones equimolares de albúmina de suero bovino (BSA)<o>el inmunoconjugado de BSA (BSA-compuesto 1) producido según el método de BB-37 TFP.
La figura 130D muestra la expresión de CD40 en las células mieloides después de 18 horas de estimulación con concentraciones equimolares de albúmina de suero bovino (BSA) o el inmunoconjugado de BSA (BSA-compuesto 1) producido según el método de BB-37 TFP.
La figura 130E muestra la expresión de CD86 en las células mieloides después de 18 horas de estimulación con concentraciones equimolares de albúmina de suero bovino (BSA) o el inmunoconjugado de BSA (BSA-compuesto 1) producido según el método de BB-37 TFP.
La figura 130F muestra la expresión de HLR-DR en las células mieloides después de 18 horas de estimulación con concentraciones equimolares de albúmina de suero bovino (BSA)<o>el inmunoconjugado de BSA (BSA-compuesto 1) producido según el método de BB-37 TFP.
La figura 130G muestra la expresión de HLA-DR en las células mieloides después de 18 horas de estimulación con concentraciones equimolares de albúmina de suero bovino (BSA) o el inmunoconjugado de BSA (BSA-compuesto 1) producido según el método de BB-37 TFP.
La figura 130H muestra la LC-MS de BSA-M desnuda.
La figura 131A muestra la expresión de CD14 en las células mieloides después de 18 horas de estimulación con concentraciones equimolares de hemocianina de lapa californiana (KLH) o el inmunoconjugado de KLH (KLH-compuesto 1) producido según el método de BB-17 Tf P.
La figura 131B muestra la expresión de CD16 en las células mieloides después de 18 horas de estimulación con concentraciones equimolares de hemocianina de lapa californiana (KLH) o el inmunoconjugado de KLH (KLH-compuesto 1) producido según el método de BB-17 TFP.
La figura 131C muestra la expresión de CD123 en las células mieloides después de 18 horas de estimulación con concentraciones equimolares de hemocianina de lapa californiana (KLH) o el inmunoconjugado de KLH (KLH-compuesto 1) producido según el método de BB-17 Tf P.
La figura 131D muestra la expresión de CD40 en las células mieloides después de 18 horas de estimulación con concentraciones equimolares de hemocianina de lapa californiana (KLH)<o>el inmunoconjugado de KLH (KLH-compuesto 1) producido según el método de BB-17 TFP.
La figura 131E muestra la expresión de CD86 en las células mieloides después de 18 horas de estimulación con concentraciones equimolares de hemocianina de lapa californiana (KLH)<o>el inmunoconjugado de KLH (KLH-compuesto 1) producido según el método de BB-17 Tf P.
La figura 131F muestra la expresión de HLA-DR en las células mieloides después de 18 horas de estimulación con concentraciones equimolares de hemocianina de lapa californiana (KLH) o el inmunoconjugado de KLH (compuesto 1 de KLH) producido según el método de BB-17 TFP.
La figura 132A muestra que el Enbrel (Amgen) y el inmunoconjugado de Enbrel (BB-01 Enbrel), producidos usando el método de conjugación de BB-01, muestran una reactividad comparable con el anticuerpo de detección de IgG antihumana cuando se capturan en placas ELISA recubiertas con IgG antihumana.
La figura 132B muestra que el inmunoconjugado de Enbrel (BB-01 Enbrel), producido usando el método de conjugación de BB-01, pero no el Enbrel (Amgen), muestra una fuerte reactividad con el anticuerpo del anticompuesto 1 después de la captura en una placa ELISA recubierto con IgG antihumana.
La figura 132C muestra que el cetuximab (Imclone/Lilly) y el inmunoconjugado de cetuximab (BB-01 Cetuximab), producidos usando el método de conjugación de BB-01, muestran una reactividad comparable con el anticuerpo de detección de IgG antihumana cuando se capturan en placas ELISA recubiertas con IgG antihumana.
La figura 132D muestra que el inmunoconjugado de cetuximab (BB-01 Cetuximab), producido usando el método de conjugación de BB-01, pero no el cetuximab (Imclone/Lilly), muestra una fuerte reactividad con el anticuerpo del anticompuesto 1 después de la captura en una placa ELISa recubierta de IgG antihumana.
La figura 132E muestra que el ipilimumab (BMS) y el inmunoconjugado de ipilimumab (BB-01 Ipilimumab), producidos usando el método de conjugación de BB-01, muestran una reactividad comparable con el anticuerpo de detección de IgG antihumana cuando se capturan en placas ELISA recubiertas con IgG antihumana.
La figura 132F muestra que el inmunoconjugado de ipilimumab (BB-01 Ipilimumab), producido usando el método de conjugación de BB-01, pero no el ipilimumab (BMS), muestra una fuerte reactividad con el anticuerpo del anticompuesto 1 después de la captura en una placa ELISA recubierta con IgG antihumana.
La figura 132G muestra que el obinutuzumab (Roche) y el inmunoconjugado de obinutuzumab (Obinutuzumab BB-01), producido usando el método de conjugación de BB-01, muestran una reactividad comparable con el anticuerpo de detección de IgG antihumana cuando se capturan en placas ELISA recubiertas con IgG antihumana.
La figura 132H muestra que el inmunoconjugado de obinutuzumab (BB-01 Obinutuzumab), producido usando el método de conjugación de BB-0 1, pero no el obinutuzumab (Roche), muestra una fuerte reactividad con el anticuerpo del anticompuesto 1 después de la captura en una placa ELISA recubierta con IgG antihumana.
La figura 1321 muestra que el rituximab (Roche) y el inmunoconjugado de rituximab (BB-01 rituximab), producidos usando el método de conjugación de BB-01, muestran una reactividad comparable con el anticuerpo de detección de IgG antihumana cuando se capturan en placas ELISA recubiertas con IgG antihumana.
La figura 132J muestra que el inmunoconjugado de rituximab (BB-01 rituximab), producido usando el método de conjugación de BB-01, pero no el rituximab (Roche), muestra una fuerte reactividad con el anticuerpo del anticompuesto 1 después de la captura en una placa ELISA recubierta con IgG antihumana.
La figura 132K muestra que el anticuerpo antidectina 2 (Biorad MCA2415) y el inmunoconjugado de antidectina 2 (BB-01 antidectina 2), producidos usando el método de conjugación de BB-01, muestran una reactividad comparable con el anticuerpo de detección de IgG cuando se recubren sobre una placa ELISA.
La figura 132L muestra que el inmunoconjugado de antidectina 2 (BB-01 antidectina 2), producido usando el método de conjugación de BB-01, pero no el anticuerpo antidectina 2 (Biorad MCA2415), muestra una fuerte reactividad con el anticuerpo anticompuesto 1 mediante el ensayo ELISA.
La figura 133A muestra que los inmunoconjugados de rituximab (rituximab BB-01) conservan la actividad de unión para la CD16a. La unión se analizó mediante ELISA como se describe en el Ejemplo 29. L<os>compuestos mostrados son rituximab, rituximab glicosilado (Invivogen hcd20-mab12) o inmunoconjugados de rituximab (rituximab BB-01). Los niveles de DAR en los conjugados de rituximab fueron los siguientes: BB-01, 1.1; BB-14, 2.0; BB-36 DAR bajo, 1.4; BB36 DAR alto, 2.8; BB37 DAR bajo, 1.7; BB-37 DAR alto, 2.6. El eje Y muestra la fracción de señal de OD máxima en la concentración más alta para cada muestra. El mutante glicosilado de rituximab muestra una unión disminuida, lo que coincide con el papel de la glicosilación en la función efectora.
La figura 133B muestra que el rituximab (Roche) y los inmunoconjugados de rituximab (BB-01 rituximab), producidos usando el método de conjugación de BB-01, muestran una unión comparable a CD64 inmovilizado en placas ELISA. El rituximab que se había desglicosilado con PNGasa F muestra una unión deteriorada a CD64.
La figura 133C muestra que el rituximab y un inmunoconjugado de rituximab (rituximab BB-37) se unen a la proteína A. Se sometieron muestras duplicadas a la técnica de inmunoprecipitación usando proteína A sefarosa. No se detectó rituximab ni rituximab BB-37 libre en los sobrenadantes de la inmunoprecipitación. Existe una superposición considerable de los sitios de unión de proteína A y FcRN en la IgG. Por lo tanto, la conservación de la unión a la proteína A en el rituximab BB-37 sugiere la conservación de la unión a F<c>RN.
La figura 134A muestra la expresión de CD123 en las células mieloides después de 18 horas de estimulación con el inmunoconjugado BB-48 producido según el método de BB-48 o el biosimilar de rituximab no conjugado (CD20; Alphamab).
La figura 134B muestra la expresión de HLA-DR en las células mieloides después de 18 horas de estimulación con el inmunoconjugado BB-48 producido según el método de BB-48<o>el biosimilar de rituximab no conjugado (CD20; Alphamab).
La figura 134C muestra la expresión de CD14 en las células mieloides después de 18 horas de estimulación con el inmunoconjugado BB-48 producido según el método de BB-48 o el biosimilar de rituximab no conjugado (CD20; Alphamab).
La figura 134D muestra la expresión de CD16 en las células mieloides después de 18 horas de estimulación con el inmunoconjugado BB-48 producido según el método de BB-48<o>el biosimilar de rituximab no conjugado (CD20; Alphamab).
La figura 134E muestra la expresión de CD40 en las células mieloides después de 18 horas de estimulación con el inmunoconjugado BB-48 producido según el método de BB-48 o el biosimilar de rituximab no conjugado (CD20; Alphamab).
La figura 134F muestra la expresión de CD86 en las células mieloides después de 18 horas de estimulación con el inmunoconjugado BB-48 producido según el método de BB-48<o>el biosimilar de rituximab no conjugado (CD20; Alphamab).
La figura 134G muestra la LC-MS para el inmunoconjugado BB-48 producido según el método de BB-48.
La figura 135A muestra la expresión de CD123 en las células mieloides después de 18 horas de estimulación con el inmunoconjugado BB-49 producido según el método de BB-49<o>el biosimilar de rituximab no conjugado (CD20; Alphamab).
La figura 135B muestra la expresión de HLA-DR en las células mieloides después de 18 horas de estimulación con el inmunoconjugado BB-49 producido según el método de BB-49<o>el biosimilar de rituximab no conjugado (CD20; Alphamab).
La figura 135C muestra la expresión de CD14 en las células mieloides después de 18 horas de estimulación con el inmunoconjugado BB-49 producido según el método de BB-49<o>el biosimilar de rituximab no conjugado (CD20; Alphamab).
La figura 135D muestra la expresión de CD16 en las células mieloides después de 18 horas de estimulación con el inmunoconjugado BB-49 producido según el método de BB-49 o el biosimilar de rituximab no conjugado (CD20; Alphamab).
La figura 135E muestra la expresión de CD40 en las células mieloides después de 18 horas de estimulación con el inmunoconjugado BB-49 producido según el método de BB-49<o>el biosimilar de rituximab no conjugado (CD20; Alphamab).
La figura 135F muestra la expresión de CD86 en las células mieloides después de 18 horas de estimulación con el inmunoconjugado BB-49 producido según el método de BB-49 o el biosimilar de rituximab no conjugado (CD20; Alphamab).
La figura 135G muestra la LC-MS para el inmunoconjugado BB-49 producido según el método de BB-49.
La figura 136A muestra la expresión de CD123 en las células mieloides después de 18 horas de estimulación con el inmunoconjugado BB-50 producido según el método de BB-50 o el biosimilar de rituximab no conjugado (CD20; Alphamab).
La figura 136B muestra la expresión de HLA-DR en las células mieloides después de 18 horas de estimulación con el inmunoconjugado BB-50 producido según el método de BB-50 o el biosimilar de rituximab no conjugado (CD20; Alphamab).
La figura 136C muestra la expresión de CD14 en las células mieloides después de 18 horas de estimulación con el inmunoconjugado BB-50 producido según el método de BB-50 o el biosimilar de rituximab no conjugado (CD20; Alphamab).
La figura 136D muestra la expresión de CD16 en las células mieloides después de 18 horas de estimulación con el inmunoconjugado BB-50 producido según el método de BB-50<o>el biosimilar de rituximab no conjugado (CD20; Alphamab),
La figura 136E muestra la expresión de CD40 en las células mieloides después de 18 horas de estimulación con el inmunoconjugado BB-50 producido según el método de BB-50<o>el biosimilar de rituximab no conjugado (CD20; Alphamab).
La figura 136F muestra la expresión de CD86 en las células mieloides después de 18 horas de estimulación con el inmunoconjugado BB-50 producido según el método de BB-50 o el biosimilar de rituximab no conjugado (CD20; Alphamab).
La figura 136G muestra la LC-MS para el inmunoconjugado BB-50 producido según el método de BB-50.
La figura 137A muestra que el inmunoconjugado BB-01 producido según el método de BB-01 SATA (rituximab Boltbody) es superior a la hora de provocar la regulación por disminución de CD14 en las células mieloides en comparación con el inmunoconjugado de rituximab conjugado a través de los residuos de disulfuros entre cadenas después de la reducción con TCEP mediante SMCC-comp1 (rituximab-Cys-Comp1). L<os>datos se obtuvieron después de una incubación de 18 horas con rituximab Boltbody o rituximab-Cys-comp1.
La figura 137B muestra que el inmunoconjugado BB-01 producido según el método de BB-01 SATA (rituximab Boltbody) es superior a la hora de provocar la regulación por disminución de CD16 en las células mieloides en comparación con el inmunoconjugado de rituximab conjugado a través de los residuos de disulfuros entre cadenas después de la reducción con TCEP mediante SMCC-comp1 (rituximab-Cys-Comp1). L<os>datos se obtuvieron después de una incubación de 18 horas con rituximab Boltbody<o>rituximab-Cys-comp1.
La figura 137C muestra que el inmunoconjugado BB-01 producido según el método de BB-01 SATA (rituximab Boltbody) es superior a la hora de provocar la regulación por incremento de CD40 en las células mieloides en comparación con el inmunoconjugado de rituximab conjugado a través de los residuos de disulfuros entre cadenas después de la reducción con TCEP mediante SMCC-comp1 (rituximab-Cys-Comp1). L<os>datos se obtuvieron después de una incubación de 18 horas con rituximab Boltbody<o>rituximab-Cys-comp1.
La figura 137D muestra que el inmunoconjugado BB-01 producido según el método de BB-01 SATA (rituximab Boltbody) es superior a la hora de provocar la regulación por incremento de CD86 en las células mieloides en comparación con el inmunoconjugado de rituximab conjugado a través de los residuos de disulfuros entre cadenas después de la reducción con TCEP mediante SMCC-comp1 (rituximab-Cys-Comp1). Los datos se obtuvieron después de una incubación de 18 horas con rituximab Boltbody<o>rituximab-Cys-comp1.
La figura 137E muestra que el inmunoconjugado BB-01 producido según el método de BB-01 SATA (rituximab Boltbody) es superior a la hora de provocar la regulación por incremento de CD123 en las células mieloides en comparación con el inmunoconjugado de rituximab conjugado a través de los residuos de disulfuros entre cadenas después de la reducción con TCEP mediante SMCC-comp1 (rituximab-Cys-Comp1). L<os>datos se obtuvieron después de una incubación de 18 horas con rituximab Boltbody<o>rituximab-Cys-comp1.
La figura 137F muestra un análisis por cromatografía de líquidos-espectrometría de masas de rituximab no conjugado (Roche) después de la reducción con TCEP que se utilizó para producir el inmunoconjugado de rituximab-cys-comp1.
La figura 137G muestra un análisis por cromatografía de líquidos-espectrometría de masas de la cadena ligera de rituximab no conjugado (Roche) después de la reducción con TCEP que se utilizó para producir el inmunoconjugado de rituximab-cys-comp1.
La figura 137H muestra un análisis por cromatografía de líquidos-espectrometría de masas de la cadena pesada del inmunoconjugado de rituximab-cys-comp1.
La figura 1371 muestra un análisis por cromatografía de líquidos-espectrometría de masas de la cadena pesada del inmunoconjugado de rituximab-cys-comp1.
La figura 138A muestra la secuencia de ADN del vector que codifica la cadena pesada de rituximab de tipo silvestre.
La figura 138B muestra la secuencia de ADN del vector que codifica la cadena ligera Kappa de rituximab con la mutación V205C (indicada mediante la numeración de Kabat).
La figura 138C muestra el mapa de vectores del plásmido de clonación pFUSE-CHIg-hG1 (Invivogen, pfuse-hchg1) que codifica la cadena pesada de lgG1 de rituximab de tipo silvestre.
La figura 138D muestra el mapa de vectores del plásmido de clonación pFUSE2-CLIg-hK (Invivogen, pfuse2-hclk) genomanipulado para codificar la mutación V205C en la región constante de la cadena ligera Kappa de Ig rituximab.
La figura 138E muestra la estructura del inmunoconjugado de rituximab-V205C producido mediante enlace directo del compuesto 1-SMCC a los residuos de cisteína genomanipulados como se describe en la figura 138D.
La fig u ra 138F m ue s tra un an á lis is po r c ro m a to g ra fía de líq u id o s -e sp e c tro m e tría de m asa s de ritux im ab no co n ju g a d o que co n tie n e la m u tac ión V 205 C que se u tilizó para p ro d u c ir el in m u n o co n ju g a d o de ritux im ab -V 205 C . La fig u ra 138G m ue s tra un an á lis is po r c ro m a to g ra fía de líq u id o s -e sp e c tro m e tría de m asa s del in m u n o co n ju g a d o de r itu x im a b -V 205 C p ro d u c id o m ed ia n te en la ce d irec to de l co m p u e s to 1 -S M C C a los re s id u o s de c is te rna g e n o m a n ip u la d o s com o se de sc rib e en la fig u ra 138D.
Descripción detallada de la invención
General
La inven c ión p ro p o rc io n a in m u n o co n ju g a d o s de an ticu e rp o y a d yu va n te que tie n e n va ria s v e n ta ja s que inc luyen : a n ticu e rp o s que es tim u la n la c ito to x ic id a d c e lu la r d e p e n d ie n te de an ticue rpos , fa g o c ito s is c e lu la r d e p e n d ie n te de a n ticu e rp o s y a n ticu e rp o s que b loq uea n las acc io n e s de p ro te ín a s p ro du c ida s po r c á n c e r que ac tú an com o m o lécu las de pun to de con tro l inm un ita rio , a d yu va n te s que es tim u la n la a c tiva c ió n de cé lu la s d e n d rítica s y la p ro life ra c ió n de cé lu la s T, y en la ces co va le n te s e n tre an ticu e rp o y a d yu va n te que es tim u la n la e fica c ia an titum ora l. P o r e jem p lo , en a lgu nos caso s los m on oc ito s hu m an os se so m e te n a d ife re n c ia c ió n de DC d e sp u é s de una es tim u la c ió n d u ran te la noche con in m u n o co n ju g a d o s de la invenc ión , m ie n tras que los p ro to co los de d ife re n c ia c ió n de DC con e s tim u la n te s co n o c id o s (p. ej., G M -C S F e IL-4) req u ie ren pe río do s m ucho m ás largos. Las cé lu la s ac tiva da s po r in m u n o co n ju g a d o s exp resa n m ayo res c a n tid a d e s (p. ej., en a lgu nos caso s ca n tid a d e s va ria s ve ce s m a yo re s ) de m o lécu las co e s tim u la d o ra s y c ito c in a s in fla m a to ria s de lo que se puede lo g ra r con e s tim u la n te s conoc idos .
C o m o se d e m u e s tra en la p re sen te m em oria , los in m u n o co n ju g a d o s son cu a n tita tiva y cu a lita tiva m e n te m ás e fica ce s a la hora de p ro vo ca r la ac tiva c ió n in m u n ita ria que las m ezc las de a n ticu e rp o s y a d yu va n te s un idos de fo rm a no cova le n te . A d e m á s , com o se d e m u e s tra en la p re sen te m em oria , los in m u n o co n ju g a d o s de an ticu e rp o y a d yu va n te un id os según la p re sen te d ivu lg a c ió n son m ucho m ás e fica ces que o tros in m u n o co n ju g a d o s conoc idos . P o r e jem p lo , se d ivu lg an in m u n o co n ju g a d o s en la pa ten te e s ta d o u n id e n se 8.951.528. S in em bargo , es tos in m u n o co n ju g a d o s no log ran a c tiv a r e fica zm e n te las cé lu la s m ie lo ide s (véanse , po r e jem p lo , las fig u ra s 128A -129S). O tra pub licac ión , la pu b licac ión de pa ten te e s ta d o u n id e n se 2017 /0159772 , ta m b ié n de sc rib e in m u n o co n ju g a d o s . Los in m u n o co n ju g a d o s que a llí se d ivu lg an ta m p o co activan e fica zm e n te las cé lu la s m ie lo ide s com o se o b se rva en las fig u ra s 67 A -68 P . La p u b licac ión de so lic itud de pa ten te in te rna c ion a l W O 2015 /103987 A1 m ue s tra en la re iv ind ica c ión 1 un s itio de un ión de l in m u n o co n ju g a d o a un a d yu va n te (re s iq u im o d ) en una ub ica c ión que, m ed ia n te exp e rim e n ta c ió n , in ac tiva el a d yu va n te y da com o resu ltad o una a c tiva c ió n m ie lo ide in s ign ifica n te . La pu b licac ión ta m b ié n in d ica que la con ju g a c ió n del e n la za d o r-a d yu va n te con el an ticu e rp o se p ro du ce a tra vé s de res idu os de la b isag ra de c is te ín a (en la ces tio é te r) (W O 2015 /103987 , pá rra fos 0273 -0273 ) de sp u é s de la red ucc ión del an ticu e rp o con un exce so de DTT. M ed ia n te exp e rim e n ta c ió n , es te m odo de con ju g a c ió n im p ide que el in m u n o co n ju g a d o a c tive e fica zm e n te las cé lu la s m ie lo ide s (vé a n se las f ig u ra s 67 A -68 P y 137A -137 I). P o r el con tra rio , los in m u n o co n ju g a d o s de la in venc ión p ro po rc ion an una ac tiv ida d b io ló g ica s u p e rio r com o se observa , po r e jem p lo , en las f ig u ra s 67G -K , 128A -12M , 129E -129 y 137A -137 I.
F ina lm en te , la a d m in is tra c ió n s is té m ica de los c o n ju g a d o s a d yu va n te -a n ticu e rp o pe rm ite a ta c a r s im u ltá n e a m e n te el tu m o r p rim a rio y las m e tá s ta s is aso c ia d a s sin la neces idad de in ye cc io n e s in tra tu m o ra le s ni rese cc ió n qu irú rg ica . C o m o se d e m u e s tra en las fig u ra s 1-138G , se c rea ron y so m e tie ro n a e n sayo n u m e ro so s in m u n o co n ju g a d o s según la p re sen te d ivu lg a c ió n y o tras fuen tes.
Definiciones
T a l com o se usa en la p re sen te m em oria , el té rm in o "in m u n o co n ju g a d o " se re fie re a un co n s tru c to de an ticue rpo , o an ticue rpo , que está un ido de fo rm a co va le n te a un g ru po q u ím ico que no ex is te de m an e ra na tu ra l com o se de sc rib e en la p re sen te m em oria . Los té rm in o s "in m u n o co n ju g a d o ", " in m u n o co n ju g a d o de a n ticu e rp o -a d yu va n te ", "A A C " y "B o ltb o d y " se u tilizan in d is tin ta m e n te en la p re sen te m em oria .
T a l com o se usa en la p re sen te m em oria , la fra se "co n s tru c to de an ticu e rp o " se re fie re a un po lip é p tid o que c o m p re n d e un do m in io de un ión al an tíg e n o y un d o m in io Fc. U na co n s tru c to de an ticu e rp o pued e co m p re n d e r un an ticue rpo .
T a l com o se usa en la p re sen te m em oria , la frase "d o m in io de un ión al an tíg e n o " se re fie re a una p ro te ína , o una po rc ión de una p ro te ína , que se une e sp e c ífica m e n te a un an tíg e n o e sp e c ífico (p. ej., un pa ra topo). P o r e jem p lo , esa po rc ión de una p ro te ína de un ión a an tíg e n o que con tien e los res idu os de am in o á c id o s que in te rac túa n con un a n tíg e n o y con fie re n a la p ro te ína de un ión a a n tíg e n o su e sp e c ific id a d y a fin idad po r el an tígeno .
T a l com o se usa en la p re sen te m em oria , la frase "d o m in io Fc" se re fie re a la reg ión c ris ta liza b le de l fra g m e n to o la reg ión de la co la de un a n ticue rpo . El d o m in io Fc in te ra c tú a con los rece p to re s Fc en la su p e rfic ie de las cé lu las . T a l com o se usa en la p re sen te m em oria , la fra se "d o m in io de un ión e sp e c ífico " se re fie re a una p ro te ína , o una po rc ión de una p ro te ína , que se une e sp e c ífica m e n te a un se g u n d o an tíg e n o que es d is tin to de l a n tíg e n o un ido po r el do m in io de un ión al a n tíg e n o de los in m u n o co n ju g a d o s . El d o m in io de un ión esp e c ífico pu ede co n ju g a rse con el co n s tru c to de an ticu e rp o en un ex tre m o C -te rm in a l de l d o m in io Fc.
Tal como se usa en la presente memoria, el término "anticuerpo" se refiere a un pollpéptido que comprende una reglón de unión a antígeno (incluida la región determinante de la complementariedad (CD<r>)) de un gen de inmunoglobulina<o>fragmentos del mismo que se une específicamente a un antígeno y lo reconoce. L<os>genes de inmunoglobulina reconocidos incluyen los genes de región constante kappa, lambda, alfa, gamma, delta, épsilon y mu, así como numerosos genes de inmunoglobulina de región variable.
Una unidad estructural de inmunoglobulina (anticuerpo) ejemplar comprende un tetrámero. Cada tetrámero está compuesto por dos pares idénticos de cadenas polipéptidas, teniendo cada par una cadena "ligera" (aproximadamente 25 kD) y una cadena "pesada" (aproximadamente 50-70 kD). El extremo N de cada cadena define una región variable de aproximadamente 100 a 110<o>más aminoácidos principalmente responsables del reconocimiento de antígenos. Los términos cadena ligera variable (V<l>) y cadena pesada variable (V<h>) se refieren a estas cadenas ligeras y pesadas respectivamente. Las cadenas ligeras se clasifican en kappa o lambda. Las cadenas pesadas se clasifican en gamma, mu, alfa, delta o épsilon, que a su vez definen las clases de inmunoglobulinas, IgG, IgM, IgA, IgD e IgE, respectivamente.
Los anticuerpos IgG son moléculas grandes de aproximadamente 150 kDa compuestas por cuatro cadenas péptidas. Los anticuerpos IgG contienen dos cadenas pesadas idénticas de clase y de aproximadamente 50 kDa y dos cadenas ligeras idénticas de aproximadamente 25 kDa, por tanto, una estructura cuaternaria tetramérica. Las dos cadenas pesadas están unidas entre sí y a una cadena ligera cada una mediante uniones disulfuro. El tetrámero resultante tiene dos mitades idénticas, que juntas forman la forma de Y. Cada extremo de la horquilla contiene un sitio de unión a antígeno idéntico. Existen cuatro subclases de IgG (lgG1, 2, 3 y 4) en humanos, denominadas por orden de<su>abundancia en el suero (siendo lgG1 la más abundante). Típicamente, la región de unión al antígeno de un anticuerpo será más crítica en cuanto a especificidad y afinidad de unión.
Los anticuerpos IgA diméricos tienen alrededor de 320 KDa. La IgA tiene dos subclases (lgA1 e lgA2) y puede producirse tanto de forma monomérica como dimérica. La forma de IgA dimérica (secretora<o>slgA) es la más abundante.
Los anticuerpos existen, p. ej., como inmunoglobulinas intactas<o>como varios fragmentos bien caracterizados producidos por digestión con diversas peptidasas. A<sí>, por ejemplo, la pepsina digiere un anticuerpo debajo de los enlaces disulfuro en la región de la bisagra para producir F(ab)'2, un dímero de Fab que a su vez es una cadena ligera unida a V<h>-C<h>1 por una unión disulfuro. El F(ab)'2 puede reducirse en condiciones suaves para romper el enlace disulfuro en la región de la bisagra, lo que convierte el dímero F(ab)'2 en un monómero Fab'. El monómero Fab' es fundamentalmente Fab con parte de la región de la bisagra (véase,Fundamental Immunology(Paul ed., 7a ed. 2012). Si bien se definen diversos fragmentos de anticuerpos en términos de la digestión de un anticuerpo intacto, un experto apreciará que dichos fragmentos pueden sintetizarsede novoya sea químicamente<o>mediante el<uso>de metodología de ADN recombinante. Por tanto, el término anticuerpo, tal como se usa en la presente memoria, también incluye fragmentos de anticuerpos producidos mediante la modificación de anticuerpos completos o aquellos sintetizadosde novousando metodologías de ADN recombinante (p. ej., Fv de cadena única) o aquellas identificadas usando bibliotecas de presentación de fagos (véase, por ej., McCafferty et al.,Nature,348: 552-554 (1990)).
El término "anticuerpo" se usa en el sentido más amplio y cubre específicamente anticuerpos monoclonales (incluidos anticuerpos monoclonales de longitud completa), anticuerpos policlonales, anticuerpos multiespecíficos (p. ej., anticuerpos biespecíficos) y fragmentos de anticuerpos siempre y cuando presenten la actividad biológica deseada. "Fragmento de anticuerpo", y todas las variantes gramaticales del mismo, tal como se usa en la presente memoria, se define como una porción de un anticuerpo intacto que comprende el sitio de unión al antígeno<o>la región variable del anticuerpo intacto, en el que la porción está libre de los dominios constantes de la cadena pesada (es decir, CH2, CH3 y CH4, dependiendo del isotipo del anticuerpo) de la región Fc del anticuerpo intacto. Ejemplos de fragmentos de anticuerpos incluyen fragmentos Fab, Fab', Fab'-SH, F(ab')2 y Fv ; diacuerpos; cualquier fragmento de anticuerpo que es un polipéptido que tiene una estructura primaria que consiste en una secuencia ininterrumpida de residuos de aminoácidos contiguos (denominado en la presente memoria "fragmento de anticuerpo de cadena sencilla" o "polipéptido de cadena sencilla"), que incluye, sin limitación, (1) moléculas Fv de cadena sencilla (scFv); (2) polipéptidos de cadena sencilla que contienen solo un dominio variable de cadena ligera,<o>un fragmento del mismo que contiene las tres CDR del dominio variable de cadena ligera, sin un grupo de cadena pesada asociado; (3) polipéptidos de cadena sencilla que contienen solo una región variable de cadena pesada, o un fragmento de los mismos que contiene las tres c Dr de la región variable de cadena pesada, sin un grupo de cadena ligera asociado; (4) nanocuerpos que comprenden dominios Ig únicos de especies no humanas u otros módulos de unión de dominio único específicos; y (5) estructuras multiespecíficas o multivalentes formadas a partir de fragmentos de anticuerpos. En un fragmento de anticuerpo que comprende una<o>más cadenas pesadas, la(s) cadena(s) pesada(s) pueden contener cualquier secuencia de dominio constante (p. ej., CH1 en el isotipo de IgG) encontrada en una región no Fc de un anticuerpo intacto, y/o pueden contener cualquier secuencia de la región de la bisagra encontrada en un anticuerpo intacto, y/o puede contener una secuencia zipper de leucina fusionada o situada en la secuencia de la región de la bisagra o la secuencia del dominio constante de la(s) cadena(s) pesada(s).
Tal como se usa en la presente memoria, el término "biosimilar" en referencia a un producto biológico significa que el producto biológico es muy similar al producto de referencia a pesar de diferencias menores en los componentes clínicamente inactivos, y no existen diferencias clínicamente significativas entre el producto biológico y el producto de referencia en términos de seguridad, pureza y potencia del producto.
Tal como se usa en la presente memoria, el término "epítopo" significa cualquier determinante antigénico de un antígeno al que se une el sitio de unión al antígeno, también denominado paratopo, de un anticuerpo. Los determinantes epitópicos normalmente consisten en agrupaciones superficiales químicamente activas de moléculas, tales como aminoácidos o cadenas laterales de azúcar, y normalmente tienen características estructurales tridimensionales específicas, así como características de carga específicas.
Los términos "polipéptido", "péptido" y "proteína" se usan indistintamente en la presente memoria para referirse a un polímero de residuos de aminoácidos. Los términos también se aplican a polímeros de aminoácidos en los que uno<o>más residuos de aminoácidos son un mimético químico artificial de un aminoácido de origen natural correspondiente, así como a polímeros de aminoácidos de origen natural y a polímeros de aminoácidos que no existen de manera natural.
Tal como se usa en la presente memoria, el término "adyuvante" se refiere a una sustancia capaz de desencadenar una respuesta inmunitaria en un sujeto expuesto al adyuvante.
Tal como se usa en la presente memoria, el término "adyuvante" se refiere a un adyuvante que está unido de forma covalente a un anticuerpo como se describe en la presente memoria. El adyuvante puede desencadenar la respuesta inmunitaria mientras está unido al anticuerpo,<o>después de la escisión (p. ej., escisión enzimática) del anticuerpo después de la administración de un inmunoconjugado al sujeto.
Tal como se usan en la presente memoria, los términos "receptor de reconocimiento de patrones" y "PRR" se refieren a cualquier elemento de una clase de proteínas de mamíferos conservadas que reconocen patrones moleculares asociados a patógenos (PAMP) o patrones moleculares asociados a daños (DAMP) y actúan como elementos de señalización clave de la inmunidad innata. L<os>receptores de reconocimiento de patrones se dividen en PRR unidos a la membrana, PRR citoplasmáticos y PRR secretados. Ejemplos de PRR unidos a la membrana incluyen receptores de tipo Toll (TLR) y receptores de lectina de tipo C (CLR). Ejemplos de PRR citoplasmáticos incluyen receptores de tipo NOD (NLR) y receptores de tipo Rig-I (RLR).
Tal como se usa en la presente memoria, los términos "receptor de tipo Toll" y "TLR" se refieren a cualquier elemento de una familia de proteínas de mamíferos altamente conservadas que reconocen patrones moleculares asociados a patógenos y actúan como elementos de señalización clave de la inmunidad innata. Los polipéptidos TLR comparten una estructura característica que incluye un dominio extracelular que tiene repeticiones ricas en leucina, un dominio transmembrana y un dominio intracelular que participa en la señalización de TLR.
L<os>términos "receptor 1 de tipo Toll" y "TLR1" se refieren a ácidos nucleicos<o>polipéptidos que comparten por lo menos el 70 %; 80 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o más identidad de secuencia con una secuencia de TLR1 disponible públicamente, p. ej., el número de acceso de GenBank AAY85643 para el polipéptido TLR1 humano, o el número de acceso de GenBank AAG37302 para el polipéptido TLR1 murino.
Los términos "receptor 2 de tipo Toll" y "TLR2" se refieren a ácidos nucleicos o polipéptidos que comparten por lo menos el 70 %; 80 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 %<o>más identidad de secuencia con una secuencia de TLR2 disponible públicamente, p. ej., el número de acceso de GenBank AAY85648 para el polipéptido TLR2 humano, o el número de acceso de GenBank AAD49335 para el polipéptido TLR2 murino.
L<os>términos "receptor 3 tipo Toll" y "TLR3" se refieren a ácidos nucleicos<o>polipéptidos que comparten por lo menos el 70 %; 80 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o más identidad de secuencia con una secuencia de TLR3 disponible públicamente, p. ej., el número de acceso de GenBank AAC34134 para el polipéptido TLR3 humano, o el número de acceso de GenBank AAK26117 para el polipéptido TLR3 murino.
L<os>términos "receptor 4 tipo Toll" y "TLR4" se refieren a ácidos nucleicos<o>polipéptidos que comparten por lo menos el 70 %; 80 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o más identidad de secuencia con una secuencia de TLR4 disponible públicamente, p. ej., el número de acceso de GenBank AAY82270 para el polipéptido TLR4 humano,<o>el número de acceso de GenBank AAD29272 para el polipéptido TLR4 murino.
Los términos "receptor 5 tipo Toll" y "TLR5" se refieren a ácidos nucleicos o polipéptidos que comparten por lo menos el 70 %; 80 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 %<o>más identidad de secuencia con una secuencia de TLR5 disponible públicamente, p. ej., el número de acceso de GenBank ACM69034 para el polipéptido TLR5 humano, o el número de acceso de GenBank AAF65625 para el polipéptido TLR5 murino.
L<os>términos "receptor 6 tipo Toll" y "TLR6" se refieren a ácidos nucleicos<o>polipéptidos que comparten por lo menos el 70 %; 80 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o más identidad de secuencia con una secuencia de TLR6 disponible públicamente, p. ej., el número de acceso de GenBank ABY67133 para el polipéptido TLR6 humano, o el número de acceso de GenBank AAG38563 para el polipéptido TLR6 murino.
L<os>términos "receptor 7 tipo Toll" y "TLR7" se refieren a ácidos nucleicos<o>polipéptidos que comparten por lo menos el 70 %; 80 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 %<o>más identidad de secuencia con una secuencia de TLR7 disponible públicamente, p. ej., el número de acceso de GenBank AAZ99026 para el polipéptido TLR7 humano, o el número de acceso de GenBank AAK. 62676 para el pollpéptido TLR7 murlno.
Los términos "receptor 8 tipo Toll" y "TLR8" se refieren a ácidos nucleicos o polipéptidos que comparten por lo menos el 70 %; 80 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o más identidad de secuencia con una secuencia de TLR8 disponible públicamente, p. ej., el número de acceso de GenBank AAZ95441 para el polipéptido TLR8 humano,<o>el número de acceso de GenBank AAK. 62677 para el polipéptido TLR8 murino.
L<os>términos "receptor 7/8 de tipo Toll" y "TLR7/8" se refieren a ácidos nucleicos<o>polipéptidos que son tanto agonistas de TLR7 como agonistas de t LR8.
L<os>términos "receptor 9 de tipo Toll" y "TLR9" se refieren a ácidos nucleicos<o>polipéptidos que comparten por lo menos el 70 %; 80 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o más identidad de secuencia con una secuencia de TLR9 disponible públicamente, p. ej., el número de acceso de GenBank AAF78037 para el polipéptido TLR9 humano,<o>el número de acceso de GenBank AAK. 28488 para el polipéptido TLR9 murino.
Los términos "receptor 10 de tipo Toll" y "TLR10" se refieren a ácidos nucleicos o polipéptidos que comparten por lo menos el 70 %; 80 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o más identidad de secuencia con una secuencia de TLR10 disponible públicamente, p. ej., el número de acceso de GenBank AAK26744 para el polipéptido TLR10 humano.
L<os>términos "receptor 11 de tipo Toll" y "TLR11" se refieren a ácidos nucleicos<o>polipéptidos que comparten por lo menos el 70 %; 80 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 %<o>más identidad de secuencia con una secuencia de TLR11 disponible públicamente, p. ej., el número de acceso de GenBank AAS83531 para el polipéptido TLR11 murino.
Un "agonista de TLR" es una sustancia que se une, directa o indirectamente, a un TLR (p. ej., TLR7 y/o TLR8) para inducir la señalización de TLR. Cualquier diferencia detectable en la señalización de los TLR puede indicar que un agonista estimula<o>activa un TLR. Las diferencias en la señalización pueden manifestarse, por ejemplo, como cambios en la expresión de genes diana, en la fosforilación de componentes de transducción de señales, en la localización intracelular de elementos en dirección 3' tales como<n>K-<k>B, en la asociación de determinados componentes (como IRAK). con otras proteínas<o>estructuras intracelulares,<o>en la actividad bioquímica de componentes tales como las quinasas (tal como MAPK).
Tal como se usa en la presente memoria, el término "aminoácido" se refiere a cualquier unidad monomérica que pueda incorporarse en un péptido, polipéptido<o>proteína. L<os>aminoácidos incluyen a-aminoácidos que existen de manera natural y<sus>estereoisómeros, así como aminoácidos no naturales (que no existen de manera natural) y sus estereoisómeros. Los "estereoisómeros" de un aminoácido dado se refiere a isómeros que tienen la misma fórmula molecular y enlaces intramoleculares pero diferentes disposiciones tridimensionales de enlaces y átomos (p. ej., un L-aminoácido y el D-aminoácido correspondiente).
L<os>aminoácidos que existen de manera natural son aquellos codificados por el código genético, así como aquellos aminoácidos que luego se modifican, p. ej., hidroxiprolina, y-carboxlglutamato, y O-fosfoserina. L<os>a-aminoácidos que existen de manera natural incluyen, sin limitación, alanina (Ala), cisterna (Cys), ácido aspártico (Asp), ácido glutámico (GI<u>), fenilalanina (Phe), glicina (Gly), histidina (HI<s>), isoleucina (lle), arginina (Arg), lisina (Lys), leucina (Leu), metionina (Met), asparagina (Asn), praliné (Pro), glutamina (Gln), serina (Ser), treonina (Thr), valina (Val), triptófano (Trp), tirosina (Tyr) y combinaciones de Ios mismos. Los estereoisómeros de a-aminoácidos que existen de manera natural incluyen, sin limitación, D-alanina (D-Ala), D-cisteína (D-Cys), ácido D-aspártico (D-Asp), ácido D-glutámico (D-GIu), D-fenilalanina (D-Phe), D-histidina (D-HIs), D-Isoleuclna (D-lle), D-arglnlna (D-Arg), D-llslna (D-Lys), D-leuclna (D-Leu), D-metionina (D-Met), D-asparaglna (D-Asn), D-prollna (D-Pro), D-glutamlna (D-Gln), D-serlna (D-Ser), D-treonina (D-Thr), D-vallna (D-Val), D-trlptófano (D-Trp), D-tlroslna (D-Tyr) y combinaciones de I<os>mismos.
Los aminoácidos no naturales (que no se existen de manera natural) incluyen, sin limitación, análogos de aminoácidos, miméticos de aminoácidos, aminoácidos sintéticos, glicinas con sustituyentes en el nitrógeno, y N-metilaminoácidos en configuración L o D que funcionan de forma parecida a Ios aminoácidos que existen de manera natural. Por ejemplo, Ios "análogos de aminoácidos" pueden ser aminoácidos no naturales que tienen la misma estructura química básica que I<os>aminoácidos que existen de manera natural (es decir, un carbono que está unido a un hidrógeno, un grupo carboxilo, un grupo amino) pero que tienen grupos modificados en la cadena lateral o esqueletos péptidos modificados, p. ej., homoserina, norleucina, sulfóxido de metionina, metionina metilsulfonio. L<os>"miméticos de aminoácidos" se refieren a compuestos químicos que tienen una estructura que es diferente de la estructura química general de un aminoácido, pero que funciona de forma parecida a un aminoácido natural. En la presente memoria se puede hacer referencia a Ios aminoácidos mediante Ios símbolos habitualmente conocidos de tres letras<o>mediante I<os>símbolos de una letra recomendados por la Comisión de Nomenclatura Bioquímica de la lUPAC-lUB.
Tal como se usa en la presente memoria, el término "inhibidores de puntos de control inmunitario" se refiere a cualquier modulador que inhiba la actividad de la molécula de punto de control inmunitario. Los inhibidores de puntos de control inmunitario pueden incluir, pero no se limitan a, proteínas de unión a moléculas de puntos de control inmunitario, inhibidores de moléculas pequeñas, anticuerpos, derivados de anticuerpos (Incluidas fusiones Fc, fragmentos Fab y scFv), conjugados de anticuerpo-fármaco, oligonucleótidos antisentido, ARNip, aptámeros, péptidos y miméticos de péptidos.
Tal como se usa en la presente memoria, el término "grupo de enlace" se refiere a un grupo funcional que une de forma covalente dos o más grupos en un compuesto o material. Por ejemplo, el grupo de enlace puede servir para unir de forma covalente un adyuvante a un anticuerpo en un inmunoconjugado.
L<os>enlaces útiles para conectar grupos de enlace a proteínas y otros materiales incluyen, pero no se limitan a, amidas, aminas, ésteres, carbamatos, ureas, tioéteres, tiocarbamatos, tiocarbonatos y tioureas. Un grupo de enlace "divalente" contiene dos puntos de unión para unir dos grupos funcionales; los grupos de enlace polivalentes pueden tener otros puntos de unión para unir grupos funcionales adicionales. Por ejemplo, los grupos de enlace divalente incluyen polímeros divalentes tales como poli(etilenglicol) divalente, poli(propilenglicol) divalente y poli(alcohol vinílico) divalente.
Tal como se usa en la presente memoria, cuando el término "opcionalmente presente" se usa para referirse a una estructura química (p. ej., "R" o "Q"), si esa estructura química no está presente, el enlace originalmente hecho a la estructura química se realiza directamente al átomo adyacente.
Tal como se usa en la presente memoria, el término "enlazador" se refiere a un grupo funcional que une de forma covalente dos o más grupos en un compuesto o material. Por ejemplo, el enlazador puede servir para unir de forma covalente un adyuvante a un constructo de anticuerpo en un inmunoconjugado.
Tal como se usa en la presente memoria, el término "alquilo" se refiere a un radical alifático saturado, lineal o ramificado, que tiene el número de átomos de carbono indicado. El alquilo puede incluir un número cualquiera de carbonos, tal como C<i -2>, C<i>-3, C<i>-4, C<i>-5, C<i>-6, C<i>-7, C<i>-8, C<i>-9, C<i>-<io>, C<2-3>, C<2-4>, C<2-5>, C<2-6>, C<5-6>. Por ejemplo, el alquilo de C<i>-6 incluye, pero no se limita a, metilo, etilo, propilo, isopropilo, butilo, isobutilo, secbutilo, tert-butilo, pentilo, isopentilo, hexilo, etc. El alquilo también puede referirse a grupos alquilo que tienen hasta 30 átomos de carbono, tales como, entre otros, heptilo, octilo, nonilo, decilo, etc. Los grupos alquilo pueden estar sustituidos o no sustituidos. Los grupos "alquilo sustituidos" pueden estar sustituidos con uno o más grupos seleccionados entre halo, hidroxi, amino,<oxo>(=0), alquilamino, amido, acilo, nitro, ciano y alcoxi. El término "alquileno" se refiere a un radical alquilo divalente.
Tal como se usa en la presente memoria, el término "heteroalquilo" se refiere a un grupo alquilo como se describe en la presente memoria, en el que uno<o>más átomos de carbono se reemplazan opcional e independientemente con un heteroátomo seleccionado entre N, O y S. El término "heteroalquileno" se refiere a un radical heteroalquilo divalente.
Tal como se usa en la presente memoria, el término "carbociclo" se refiere a un conjunto de anillo saturado<o>parcialmente insaturado, monocíclico, bicíclico fusionado o policíclico con puente que contiene de 3 a 12 átomos en el anillo,<o>el número de átomos indicado. L<os>carbociclos pueden incluir un número cualquiera de carbonos, tal como C<3-6>, C<4-6>, C<5-6>, C<3-8>, C<4-8>, C<5-8>, C6-8, C<3-9>, C<3-10>, C<3-11>y C<3-12>. L<os>anillos carbocíclicos monocíclicos saturados incluyen, por ejemplo, ciclopropilo, ciclobutilo, ciclopentilo, ciciohexilo y ciclooctilo. L<os>anillos carbocíclicos bicíclicos y policíclicos saturados incluyen, por ejemplo, norbomano, [2.2.2]biciclooctano, decahidronaftaleno y adamantano. Los grupos carbocíclicos también pueden estar parcialmente insaturados y tener uno o más enlaces dobles o triples en el anillo. Los grupos carbocíclicos representativos que están parcialmente insaturados incluyen, pero no se limitan a, ciclobuteno, ciclopenteno, ciclohexeno, ciclohexadieno (isómeros 1,3 y 1,4), ciclohepteno, cicloheptadieno, cicloocteno, ciclooctadieno (isómeros 1,3, 1,4 y 1,5), norborneno y norbornadieno.
Los grupos carbocíclicos insaturados también incluyen grupos arilo. El término "arilo" se refiere a un sistema de anillos aromáticos que tiene un número cualquiera adecuado de átomos en el anillo y un número cualquiera adecuado de anillos. L<os>grupos arilo pueden incluir un número cualquiera adecuado de átomos en el anillo, tales como 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15 o 16 átomos en el anillo, así como de 6 a 10, 6 a 12, o de 6 a 14 elementos en el anillo. Los grupos arilo pueden ser monocíclicos, fusionados para formar grupos bicíclicos o tricíclicos, o unidos por un enlace para formar un grupo biarilo. L<os>grupos arilo representativos incluyen fenilo, naftilo y bifenilo.
Otros grupos arilo incluyen bencilo, que tiene un grupo de enlace de metileno. Algunos grupos arilo tienen de 6 a 12 elementos en el anillo, tales como fenilo, naftilo o bifenilo. Otros grupos arilo tienen de 6 a 10 elementos en el anillo, tales como, por ejemplo, fenilo o naftilo.
Un carbociclo "divalente" se refiere a un grupo carbocíclico que tiene dos puntos de unión para unir de forma covalente dos restos en una molécula o material. Los carbociclos pueden estar sustituidos o no sustituidos. Los "carbociclos sustituidos" pueden estar sustituidos con uno<o>más grupos seleccionados entre halo, hidroxi, amino, alquilamino, amido, acilo, nitro, ciano y alcoxi.
Tal como se usa en la presente memoria, el término "heterociclo" se refiere a grupos heterocicloalquilo y grupos heteroarilo. El "heteroarilo", por sí mismo o como parte de otro sustituyente, se refiere a un conjunto de anillo aromático monocíclico<o>bicíclico<o>tricíclico condensado que contiene de 5 a 16 átomos en el anillo, donde de 1 a 5 de los átomos del anillo son un heteroátomo tal como N, O o S. También pueden ser útiles otros heteroátomos que incluyen, pero no se limitan a, B, Al, Si y P. L<os>heteroátomos pueden oxidarse para formar restos tales como, entre otros, -S(O)- y -S(0)2-. Los grupos heteroarilo pueden incluir un número cualquiera de átomos en el anillo, tales como 3 a 6, 4 a 6, 5 a 6, 3 a 8, 4 a 8, 5 a 8, 6 a 8, 3 a 9, 3 a 10, 3 a 11,<o>de 3 a 12 elementos en el anillo. Se puede incluir un número cualquiera adecuado de heteroátomos en los grupos heteroarilo, tales como 1, 2, 3, 4<o>5,<o>1 a 2, 1 a 3, 1 a 4, 1 a 5, 2 a 3, 2 a 4, 2 a 5, 3 a 4<o>3 a 5. El grupo heteroarilo puede incluir grupos tales como pirrol, piridina, imidazol, pirazol, triazol, tetrazol, pirazina, pirimidina, piridazina, triazina (isómeros 1,2,3, 1,2,4 y 1,3,5), tiofeno, furano, tiazol, isotiazol, oxazol e isoxazol. Los grupos heteroarilo también pueden fusionarse a sistemas de anillos aromáticos, tales como un anillo de fenilo, para formar elementos que incluyen, pero no se limitan a, benzopirroles tales como indol e isoindol, benzopiridinas tales como quinolina e isoquinolina, benzopirazina (quinoxalina), benzopirimidina (quinazolina), benzopiridazinas tales como ftalazina y cinolina, benzotiofeno y benzofurano. Otros grupos heteroarilo incluyen anillos heteroarilo unidos por un enlace, tal como la bipiridina. L<os>grupos heteroarilo pueden estar sustituidos<o>no sustituidos. L<os>grupos "heteroarilo sustituidos" pueden estar sustituidos con uno o más grupos seleccionados entre halo, hidroxi, amino, oxo (=0), alquilamino, amido, acilo, nitro, ciano y alcoxi.
L<os>grupos heteroarilo se pueden unir por medio de cualquier posición en el anillo. Por ejemplo, el pirrol incluye 1 , 2- y 3-pirrol, la piridina incluye 2-, 3- y 4-piridina, el imidazol incluye 1-, 2-, 4- y 5-imidazol, el pirazol incluye 1-, 3 , 4- y 5-pirazol, el triazol incluye 1-, 4- y 5-triazol, el tetrazol incluye 1- y 5-tetrazol, la pirimidina incluye 2-, 4-, 5- y 6-pirimidina, la piridazina incluye 3- y 4- piridazina, 1,2,3-triazina incluye 4- y 5-triazina, 1,2,4-triazina incluye 3-, 5-y 6-triazina, 1,3,5-triazina incluye 2-triazina, tiofeno incluye 2 - y 3-tiofeno, el furano incluye 2 y 3-furano, el tiazol incluye 2-, 4- y 5-tiazol, el isotiazol incluye 3-, 4- y 5-isotiazol, el oxazol incluye 2-, 4- y 5-oxazol, el isoxazol incluye 3-, 4- y 5-isoxazol, el indol incluye 1-, 2- y 3 -indol, el isoindol incluye 1- y 2-isoindol, la quinolina incluye 2-, 3- y 4-quinolina, la isoquinolina incluye 1-, 3- y 4-isoquinolina, la quinazolina incluye 2- y 4-quinoazolina, la cinolina incluye 3- y 4-cinolina, el benzotiofeno incluye 2- y 3-benzotiofeno, y el benzofurano incluye 2- y 3-benzofurano.
El "heterociclilo", por sí mismo o como parte de otro sustituyente, se refiere a un sistema de anillo saturado que tiene de 3 a 12 elementos en el anillo y de 1 a 4 heteroátomos de N, O y S. También pueden ser útiles otros heteroátomos, que incluyen, pero no se limitan a, B, Al, Si y P. L<os>heteroátomos pueden oxidarse para formar restos tales como, entre otros, -S(O)- y -S(0)2-. Los grupos heterociclilo pueden incluir un número cualquiera de átomos en el anillo, tales como 3 a 6, 4 a 6, 5 a 6, 3 a 8, 4 a 8, 5 a 8, 6 a 8, 3 a 9, 3 a 10, 3. a 11, o de 3 a 12 elementos en el anillo. Se puede incluir un número cualquiera adecuado de heteroátomos en los grupos heterociclilo, tales como 1, 2, 3 o 4, o 1 a 2, 1 a 3, 1 a 4, 2 a 3, 2 a 4 o 3 a 4. El grupo heterociclilo puede incluir grupos tales como aziridina, azetidina, pirrolidina, piperidina, azepano, azocano, quinuclidina, pirazolidina, imidazolidina, piperazina (isómeros 1,2, 1,3 y 1,4), oxirano, oxetano, tetrahidrofurano, oxano (tetrahidropirano), oxepano, tiirano, tietano, tiolano (tetrahidrotiofeno), tiano (tetrahidrotiopirano), oxazolidina, isoxazolidina, tiazolidina, isotiazolidina, dioxolano, ditiolano, morfolina, tiomorfolina, dioxano o ditiano. Los grupos heterociclilo también pueden fusionarse a sistemas de anillos aromáticos<o>no aromáticos para formar elementos que incluyen, pero no se limitan a, indolina. L<os>grupos heterociclilo pueden estar sustituidos<o>no sustituidos. L<os>grupos "heterociclilo sustituidos" pueden estar sustituidos con uno o más grupos seleccionados entre halo, hidroxi, amino,<oxo>(=0), alquilamino, amido, acilo, nitro, ciano y alcoxi.
L<os>grupos heterociclilo se pueden unir por medio de cualquier posición en el anillo. Por ejemplo, la aziridina puede ser 1-<o>2-aziridina, la azetidina puede ser 1-<o>2-azetidina, la pirrolidina puede ser 1-, 2-<o>3-pirrolidina, la piperidina puede ser 1-, 2-, 3-<o>4- piperidina, la pirazolidina puede ser 1-, 2-, 3-<o>4-pirazolidina, la imidazolidina puede ser 1-, 2-, 3- o 4-imidazolidina, la piperazina puede ser 1-, 2-, 3- o 4-piperazina , el tetrahidrofurano puede ser 1- o 2-tetrahidrofurano, la oxazolidina puede ser 2-, 3-, 4-<o>5-oxazolidina, la isoxazolidina puede ser 2-, 3-, 4-<o>5-isoxazolidina, la tiazolidina puede ser 2-, 3 -, 4- o 5-tiazolidina, la isotiazolidina puede ser 2-, 3-, 4- o 5-isotiazolidina y la morfolina puede ser 2-, 3- o 4-morfolina.
Tal como se usa en la presente memoria, los términos "halo"<o>"halógeno", por<sí>mismos<o>como parte de otro sustituyente, significan, a menos que se indique lo contrario, un átomo monovalente de flúor, cloro, bromo o yodo.
Tal como se usa en la presente memoria, el término "carbonilo", por<sí>mismo<o>como parte de otro sustituyente, se refiere a -C(O)-, es decir, un átomo de carbono con doble enlace a oxígeno y unido a otros dos grupos en el resto que tiene el carbonilo.
Tal como se usa en la presente memoria, el término "amino" se refiere a un resto -NR<3>, en el que cada grupo R es H o alquilo. Una amina puede ionizarse para formar el catión de amonio correspondiente.
Tal como se usa en la presente memoria, el término "hidroxi" se refiere al resto -OH.
Tal como se usa en la presente memoria, el término "ciano" se refiere a un átomo de carbono con triple enlace a un átomo de nitrógeno (es decir, el resto C=N).
Tal como se usa en la presente memoria, el término "carboxi" se refiere al resto -C(0)0H. Un grupo carboxi puede ionizarse para formar el anión de carboxilato correspondiente.
Tal como se usa en la presente memoria, el término "amido" se refiere a un resto -NRC(0)R o -C(0)NR2, donde cada grupo R es H<o>alquilo.
Tal como se usa en la presente memoria, el término "nitro" se refiere al resto -NO<2>.
Tal como se usa en la presente memoria, el término "oxo" se refiere a un átomo de oxígeno que tiene un doble enlace a un compuesto (es decir, 0=).
Tal como se usa en la presente memoria, los términos "tratar" y "tratamiento" se refieren a cualquier indicio de éxito en el tratamiento o mejora de una lesión, patología, afección o síntoma (p. ej., deterioro cognitivo), incluido cualquier parámetro objetivo<o>subjetivo tal como la reducción; remisión; disminución de los síntomas<o>hacer que el síntoma, lesión, patología<o>afección sea más tolerable para el paciente; reducción de la tasa de progresión de los síntomas; disminución de la frecuencia o duración del síntoma o afección; o, en algunas situaciones, prevención de la aparición del síntoma. El tratamiento o mejora de los síntomas puede basarse en cualquier parámetro objetivo<o>subjetivo; incluido, p. ej., el resultado de una exploración física.
Tal como se usa en la presente memoria, el término "cáncer" se refiere a afecciones que incluyen cánceres sólidos, linfomas y leucemias. Ejemplos de diferentes tipos de cáncer incluyen, pero no se limitan a, cáncer de pulmón (p. ej., cáncer de pulmón no microcítico o NSCLC), cáncer de ovario, cáncer de próstata, cáncer colorrectal, cáncer de hígado (es decir, hepatocarcinoma), cáncer renal (es decir, carcinoma de células renales), cáncer de vejiga, cáncer de mama, cáncer de tiroides, cáncer pleural, cáncer de páncreas, cáncer de útero, cáncer de cuello uterino, cáncer testicular, cáncer anal, cáncer de vías biliares, tumores carcinoides gastrointestinales, cáncer de esófago, cáncer de vesícula biliar, cáncer de apéndice, cáncer de intestino delgado, cáncer de estómago (gástrico), cáncer del sistema nervioso central, cáncer de piel (p. ej., melanoma), coriocarcinoma, cáncer de cabeza y cuello, cáncer de sangre, sarcoma osteogénico, fibrosarcoma, neuroblastoma, glioma, melanoma, linfoma de células B, linfoma no hodgkiniano, linfoma de Burkitt, linfoma de células pequeñas, linfoma de células grandes, leucemia monocítica, leucemia mielógena, leucemia linfocítica aguda, leucemia mielocítica aguda y mieloma múltiple.
Tal como se usan en la presente memoria, los términos "cantidad eficaz" y "cantidad terapéuticamente eficaz" se refieren a una dosis de una sustancia tal como un inmunoconjugado que produce los efectos terapéuticos para los que se administra. La dosis exacta dependerá del propósito del tratamiento y podrá determinarla un experto en la materia utilizando técnicas conocidas (véase, por ej., Lieberman,Pharmaceutical Dosage Forms(<vo>I<s>.1-3, 1992); Lloyd,The Art, Science and Technology of Pharmaceutical Compounding(1999); Pickar,Dosage Calculations(1999);Goodman & Gilman's The Pharmacological Basis of Therapeutics,11.a edición, 2006, Brunton, Ed., McGraw-Hill; y Remington:The Science and Practice of Pharmacy,21a edición, 2005, Hendrickson, Ed., Lippincott, Williams & Wilkins).
Tal como se usa en la presente memoria, el término "sujeto" se refiere a animales tales como mamíferos, que incluyen, pero no se limitan a, primates (p. ej., humanos), vacas, ovejas, cabras, caballos, perros, gatos, conejos, ratas, ratones y similares. En determinadas realizaciones, el sujeto es un humano.
Tal como se usa en la presente memoria, el término "administrar" se refiere a la administración por vía parenteral, intravenosa, intraperitoneal, intramuscular, intratumoral, intralesional, intranasal<o>subcutánea, administración por vía oral, administración como supositorio, contacto tópico, administración intratecal<o>la implantación de un dispositivo de liberación lenta, p. ej., una minibomba osmótica, al sujeto.
Los términos "aproximadamente" y "alrededor de", tal como se usan en la presente memoria para modificar un valor numérico, indican un intervalo cercano que rodea ese valor explícito. Si "X" fuera el valor, "aproximadamente X" o "alrededor de X" indicaría un valor de 0.9X a 1.1X, p. ej., de 0.95X a 1.05X o de 0.99X a 1.01X. Cualquier referencia a "aproximadamente X" o "alrededor de X" indica específicamente por lo menos Ios valores X, 0.95X, 0.96X, 0.97X, 0.98X, 0.99X, 1.01X, 1.02X, 1.03X, 1.04X y 1.05X. A<sí>, "aproximadamente X" y "alrededor de X" pretenden enseñar y proporcionar respaldo en la descripción escrita para una limitación en la reivindicación de, p. ej., "0.98X".
Inmunoconjugados de adyuvantes de anticuerpos
La invención proporciona inmunoconjugados que contienen un constructo de anticuerpo que comprende un dominio de unión al antígeno y un dominio Fc, un adyuvante y un enlazador, como se define en las reivindicaciones, en Ios que cada adyuvante está unido de forma covalente al anticuerpo por medio del enlazador.
L<os>inmunoconjugados tal como se describen en la presente memoria pueden proporcionar una respuesta de activación inesperadamente aumentada de una célula presentadora de antígeno (APC). Esta mayor activación puede detectarsein vitro<o>in vivo.En algunos casos, se puede detectar una mayor activación de A<p>C en forma de un tiempo reducido para alcanzar un nivel específico de activación de APC. Por ejemplo, en un ensayoin vitro,el porcentaje de activación de APC se puede lograr con una dosis equivalente con un inmunoconjugado dentro del 1%, 10 %<o>50 % del tiempo requerido para recibir el mismo porcentaje<o>parecido de activación de APC con una mezcla de anticuerpo no conjugado y agonista de TLR. En algunos casos, un inmunoconjugado puede activar las APC (p. ej., células dendríticas) y/o las células NK en una cantidad de tiempo reducida. Por ejemplo, en algunos casos, una mezcla de anticuerpos agonistas de TLR puede activar las APC (p. ej., células dendríticas) y/o las células NK y/o inducir la diferenciación de células dendríticas después de la incubación con la mezcla durante 2, 3, 4, 5, 1-5, 2-5, 3-5<o>4-7 días; mientras que, por el contrario, I<os>inmunoconjugados descritos en la presente memoria pueden activar y/o inducir la diferenciación en 4 horas, 8 horas, 12 horas, 16 horas o 1 día. De forma alternativa, el aumento de la activación de APC se puede detectar en forma de una concentración reducida de inmunoconjugado requerida para alcanzar una cantidad (p. ej., porcentaje de APC), nivel (p. ej., medido por un nivel de regulación por incremento de un marcador adecuado) o tasa (p. ej., según lo detectado por un tiempo de incubación requerido para activar) de la activación de APC.
Los inmunoconjugados de la presente invención deben incluir una región Fc. Como se ilustra en las figuras 130A-131E, las proteínas que no se unen a F<c>R no activan las células mieloides cuando se conjugan con el compuesto 1.
En una realización, los inmunoconjugados de la presente invención proporcionan más del 5 % de aumento de la actividad en comparación con los inmunoconjugados de la técnica anterior (por ejemplo, los inmunoconjugados que se divulgan en la patente '528). En otra realización, los inmunoconjugados de la presente invención proporcionan más del 10 %, 15 %, 20 %, 25 %, 30 %, 35 %, 40 %, 45 %, 50 %, 55 %, 60 %,<6 5>%o un aumento del 70 % de la actividad en comparación con los inmunoconjugados de la técnica anterior. El aumento de la actividad puede evaluarse por cualquier medio conocido por un experto en la materia y puede incluir activación mieloide o evaluación mediante secreción de citocinas.
En una realización, los inmunoconjugados de la presente invención tienen una relación mejorada entre el fármaco y adyuvante. En algunas realizaciones, el número promedio de adyuvantes por inmunoconjugado oscila entre aproximadamente 1 y aproximadamente 10. Un experto en la materia puede determinar la relación deseable entre el fármaco y el adyuvante dependiendo del efecto deseado del tratamiento. Por ejemplo, puede desearse una relación entre fármaco y adyuvante superior a 1.2. En una realización, puede ser deseable una relación entre el fármaco y el adyuvante mayor que 0.2, 0.4, 0.6, 0.8, 1, 1.2, 1.4, 1.6, 1.8, 2.0, 2.2, 2.4, 2.6, 2.8, 3.0, 3.2, 3.4, 3.6, 3.8, 4.0, 5.0, 6.0, 7.0, 8.0 o 9.0. En otra realización, puede ser deseable una relación entre el fármaco y el adyuvante inferior a 10.0, 9.0, 8.0, 7.0, 6.0, 5.0, 4.0, 3.8, 3.6, 3.4, 3.2, 3.0, 2.8, 2.6, 2.4, 2.2, 2.0, 1.8, 1.6, 1.4, 1.2, 0.8, 0.6, 0.4<o>0.2. La relación entre el fármaco y el adyuvante se puede evaluar mediante cualquier medio conocido por un experto en la materia.
L<os>inmunoconjugados de la invención contienen grupos de enlace que unen de forma covalente los adyuvantes a los anticuerpos. En algunas realizaciones, el inmunoconjugado tiene una estructura según la fórmula I:
o una de sus sales farmacéuticamente aceptables, en la que Ab es un anticuerpo; A es una cadena lateral de aminoácidos no modificada en el anticuerpo<o>una cadena lateral de aminoácidos modificada en el anticuerpo; Z es un grupo de enlace; Ady es un adyuvante como se define en la reivindicación 1;
y el subíndice r es un número entero de 1 a 10 (es decir, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 o 10).
En determinadas realizaciones de los inmunoconjugados de la fórmula I, A es una cadena lateral de lisina modificada con tiol. En algunas realizaciones de los inmunoconjugados de la fórmula I, A es una cadena lateral de cisterna.
En algunas realizaciones, Z se selecciona de:
en el que el subíndice x es un número entero de 1 a 12 (es decir, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 o 12);
El subíndice y es un número entero del 1 al 30 (es decir, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 o 30); la línea discontinua v ' representa el punto de unión al adyuvante; y la línea ondulada v>representa el punto de unión a una cadena lateral de aminoácidos en el anticuerpo.
En algunas realizaciones, el inmunoconjugado tiene una estructura según la fórmula II:
o una de sus sales farmacéuticamente aceptables, en la que Ab es un anticuerpo; en la que A es una cadena lateral de aminoácidos no modificada en el anticuerpo<o>una cadena lateral de aminoácidos modificada en el anticuerpo; en el que Ady es un adyuvante como se define en la reivindicación 1;
en el que el subíndice r es un número entero de 1 a 10 (es decir, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9<o>10); y en el que:
Z1 se selecciona entre -C(O)-, -C(0)NH-, -CH<2>-;
Z2 y Z4 se seleccionan independientemente de un enlace, alquileno de C<1-30>y heteroalquileno de 3 a 30 elementos, en el que:
uno<o>más agrupamientos de átomos adyacentes en el alquileno de C<1-30>y heteroalquileno de 3 a 30 elementos se reemplazan opcional e independientemente por -C(O)-, -NRaC(O)-, o -C(O)NRa-, uno<o>más agrupamientos de átomos adyacentes en el alquileno de C<1-30>y heteroalquileno de 3 a 30 elementos se reemplazan opcional e independientemente por un carbociclo divalente de 4 a 8 elementos, uno<o>más agrupamientos de átomos adyacentes en el alquileno de C<1-30>y heteroalquileno de 3 a 30 elementos se reemplazan opcional e independientemente por un heterociclo divalente de 4 a 8 elementos que tiene de uno a cuatro heteroátomos seleccionados de O, S y N, y
cada Ra se selecciona independientemente entre H y alquilo de Ci -6;
Z3 se selecciona entre un enlace, un péptido divalente y un polímero divalente; y
Z5 está unido a la cadena lateral de una cadena lateral de aminoácido en el anticuerpo.
En determinadas realizaciones de los inmunoconjugados de la fórmula II, Z5 es un grupo unido a un tiol. En determinadas realizaciones de los inmunoconjugados de la fórmula II, Z5 es un grupo unido a un tiol y A es una cadena lateral de lisina modificada con tiol. En determinadas realizaciones de los inmunoconjugados de la fórmula II, Z5 es un grupo unido a un tiol y A es una cadena lateral de cisterna.
En determinadas realizaciones de los inmunoconjugados de la fórmula II, el grupo de enlace (es decir, los componentes estructurales entre el adyuvante ("Ady") y el aminoácido ("A")) incluye una estructura seleccionada entre:
anticuerpo.
En algunas realizaciones, Z3 es un péptido divalente. En algunas realizaciones, el péptido incluye un primer residuo seleccionado entre un residuo de alanina, un residuo de valina, un residuo de leucina, un residuo de isoleucina, un residuo de metionina, un residuo de fenilalanina, un residuo de triptófano y un residuo de praliné. En algunas de dichas realizaciones, el péptido incluye un segundo aminoácido seleccionado entre un residuo de lisina desprotegido, un residuo de lisina protegido, un residuo de arginina desprotegido, un residuo de arginina protegido, un residuo de histidina, un residuo de ornitina desprotegido, un residuo de ornitina protegido, un residuo de lisina y una citrulina. En algunas realizaciones, el péptido incluye un primer residuo seleccionado entre un residuo de fenilalanina y un residuo de valina. En algunas de dichas realizaciones, el péptido incluye un segundo residuo seleccionado entre un residuo de lisina y un residuo de citrulina. Típicamente, el péptido contendrá aproximadamente de 2 a 12 residuos de aminoácidos. Por ejemplo, el péptido puede contener de 2 a 8 residuos de aminoácidos, o de 2 a 4 residuos de aminoácidos. En algunas realizaciones, el péptido es un dipéptido. En algunas realizaciones, el péptido es un tetrapéptido.
En algunas realizaciones, el péptido se selecciona de Phe-Lys; Val-Lys; Phe-Phe-Lys; D-Phe-Phe-Lys; Gly-Phe-Lys; Ala-Lys; Val Cit; Val-Ala; Phe-Cit; Leu-Cit; Isla-Cit; Trp Cit; Phe-Ala; Gly-Phe-Leu-Gly; Ala-Leu-Ala-Leu; Phe-N9-tosilo-Arg; y Phe-N9-nitro-Arg. En algunas realizaciones, el péptido puede escindirse mediante una proteasa tal como catepsina B, catepsina C o catepsina D. Los péptidos sensibles a catepsina B pueden ser particularmente útiles como componentes enlazadores, porque la catepsina B está implicada en varias patologías y procesos oncogénicos. Si bien la expresión y actividad de la catepsina B está estrechamente regulada en tejidos y órganos sanos, la regulación puede alterarse en múltiples niveles en tumores y otras neoplasias malignas. Se ha observado sobreexpresión de catepsina B en diversos cánceres, incluidos el de cerebro, pulmón, próstata, mama y colorrectal. Véase, por ej., Gondi et al,,Expert Opin. Ther. Targets,2013; 17(3): 281-291. Por lo tanto, los enlazadores que contienen componentes peptídicos sensibles a la catepsina B, tales como los dipéptidos Phe-Lys y Val-Cit, pueden escindirse cuando un inmunoconjugado alcanza una diana maligna, tal como un tumor en un sujeto. Debido a que estos componentes peptídicos son en general insensibles a las enzimas del aparato circulatorio y de los tejidos sanos, los adyuvantes no se liberan antes de que el inmunoconjugado alcance la diana en el sujeto.
En algunas realizaciones, Z2 se selecciona entre el grupo que consisten en alquileno de C<1-30>y heteroalquileno de 3 a 30 elementos, en los que uno<o>más agolpamientos de átomos adyacentes se reemplazan opcional e independientemente por -C(O)-, -NHC(O)-<o>-C(0)NH-; y uno<o>más grupos de átomos adyacentes se reemplazan opcional e independientemente por un carbociclo divalente de 4 a 8 elementos. En algunas realizaciones, Z2 se selecciona entre:
el punto de unión a Z3
En determinadas realizaciones, -Z1-Z2- es:
en el que la línea discontinua representa el punto de unión al adyuvante y la línea ondulada '>representa el punto de unión a Z3. En algunas de dichas realizaciones, Z3 es un péptido divalente seleccionado entre Phe-Lys y Val-Cit.
En algunas realizaciones, Z4 es un alquileno de C<1-30>, en el que uno o más agolpamientos de átomos adyacentes se reemplazan opcional e independientemente por -C(O)-, -N<h>C(O)-<o>- C(0)NH-; y uno<o>más grupos de átomos adyacentes se reemplazan opcional e independientemente por un carbociclo divalente de 4 a 8 elementos. En algunas realizaciones, Z4 se selecciona entre:
el punto de unión a Z5. En algunas de dichas realizaciones, Z3 es un péptido divalente seleccionado entre Phe-Lys y Val-Cit.
Un experto en la materia apreciará que los adyuvantes en los conjugados se pueden unir de forma covalente a los anticuerpos usando diversas químicas para la modificación de proteínas, y que los grupos de enlace descritos anteriormente resultan de la reacción de grupos funcionales de proteínas (es decir, cadenas laterales de aminoácidos), con reactivos que tienen grupos enlazadores reactivos. En la técnica se conoce una amplia variedad de dichos reactivos. Ejemplos de dichos reactivos incluyen, pero no se limitan a, ésteres de N-hidroxisuccinimidilo (NHS) y ésteres de N-hidroxisulfosuccinimidilo (sulfo-NHS) (reactivos con aminas); carbodiimidas (reactivas con aminas y carboxilo); hidroximetilfosfinas (reactivas con aminas); maleimidas (reactivas con tiol); acetamidas halogenadas tales como N-yodoacetamidas (reactivas con tiol); arilazidas (reactivas con amina primaria); arilazidas fluoradas (reactivas mediante inserción de carbono-hidrógeno (CH)); ésteres de pentafluorofenilo (PFP) (reactivos con aminas); ásteres de tetrafluorofenilo (TFP) (reactivos con aminas); imidoésteres (reactivos con aminas); isocianatos (reactivos con hidroxilo); vinilsulfonas (reactivas con tiol, amina e hidroxilo); disulfuros de piridilo (reactivos con tiol); y derivados de benzofenona (reactivos mediante la inserción de enlaces C-H).
Otros reactivos incluyen, pero no se limitan a, los descritos en Hermanson,Bioconjugate Techniques2a edición, Academic Press, 2008.
L<os>enlazadores que contienen grupos maleimida, grupos vinilsulfona, grupos disulfuro de piridilo y grupos acetamida halogenados son particularmente útiles en enlaces covalentes a grupos tiol en un anticuerpo. Los grupos tiol de un anticuerpo en general se encuentran en las cadenas laterales de cisterna. Los grupos tiol libres pueden estar presentes en residuos de cisterna naturales y accesibles a disolventes en el anticuerpo. Los tioles libres también pueden estar presentes en residuos de cisterna genomanipulados, como se describe a continuación. Además, se pueden generar grupos tiol mediante la reducción total o parcial de los enlaces disulfuro entre las cadenas laterales de cisterna en un anticuerpo. También se pueden añadir grupos tiol a cadenas laterales de lisina usando métodos conocidos con reactivos que incluyen, pero no se limitan a, 2-iminotiolano (reactivo de Traut), N-succinimidil-S-acetiltioacetato (SATA) y SATP (N-succinimidil-S-acetiltiopropionato). Cuando el anticuerpo se modifica con reactivos acetilados como SATA y SATP, I<os>grupos acetilo se pueden eliminar mediante hidrólisis con hidroxilamina<o>reactivos parecidos para generar grupos tiol libres para una conjugación adicional. Véase, por ej., Traut et al.(Biochem.,12(17): 3266-3273 (1973)) y Duncan et al.(Anal. Biochem.,132(1): 68-73 (1983)).
El enlazador puede tener cualquier longitud adecuada de modo que cuando el enlazador se une de forma covalente al constructo de anticuerpo y al adyuvante, se mantenga la función del constructo del anticuerpo y el adyuvante. El enlazador puede tener una longitud de aproximadamente 3 A o más, por ejemplo, aproximadamente 4 Á o más, aproximadamente 5 A o más, aproximadamente 6 A o más, aproximadamente 7 A o más, aproximadamente 8 A o más, aproximadamente 9 A<o>más,<o>aproximadamente 10 A<o>más. De forma adicional<o>alternativa, el enlazador puede tener una longitud de aproximadamente 50 A o menos, por ejemplo, aproximadamente 45 A o menos, aproximadamente 40 A o menos, aproximadamente 35 A o menos, aproximadamente 30 A o menos, aproximadamente 25 A o menos, aproximadamente 20 A o menos, o aproximadamente 15 A o menos. Por tanto, el enlazador puede tener una longitud limitada por dos cualesquiera de Ios puntos finales mencionados anteriormente. El enlazador puede tener una longitud de aproximadamente 3 A a aproximadamente 50 A, por ejemplo, de aproximadamente 3 A a aproximadamente 45 A, de aproximadamente 3 A a aproximadamente 40 A, de aproximadamente 3 A a aproximadamente 35 A, de aproximadamente 3 A a aproximadamente 30 A, de aproximadamente 3 A a aproximadamente 25 A, de aproximadamente 3 A a aproximadamente 20 A, de aproximadamente 3 A a aproximadamente 15 A, de aproximadamente 5 A a aproximadamente 50 A, de aproximadamente 5 A a aproximadamente 25 A, de aproximadamente 5 A a aproximadamente 20 A, de aproximadamente 10 A a aproximadamente 50 A, de aproximadamente 10 A a aproximadamente 20 A, de aproximadamente 5 A a aproximadamente 30 A<o>de aproximadamente 5 A a aproximadamente 15 A. En realizaciones preferidas, el enlazador tiene una longitud de aproximadamente 3 A a aproximadamente 20 A.
Por consiguiente, la invención proporciona realizaciones en las que I<os>adyuvantes se unen de forma covalente al anticuerpo usando un reactivo (<o>reactivo de enlace covalente ("CBR")) seleccionado entre:
en el que X es halógeno (p. ej,, yodo, bromo o cloro); R' es H o sulfo; R" es arilo opclonalmente sustituido (p. ej.
3-carboxi-4-n¡trofenilo) o heteroarilo opcionalmente sustituido (p. ej., piridin-2-ilo); R'" es alquilo opcionalmente(<■<■sustituido (p. ej., metoxi);Z \Z2, Z3 y Z4 son como se describe anteriormente; y la línea discontinua '’representa el punto de unión al adyuvante.
En algunas realizaciones, el enlazador -Z1-Z2-Z3-Z4-Z5- es:
representa el punto de unión a una cadena lateral de aminoácidos del anticuerpo. En algunas de dichas realizaciones, la cadena lateral de aminoácido es una cadena lateral de cisterna o una cadena lateral de lisina modificada que contiene un grupo tiol.
En algunas realizaciones, el inmunoconjugado tiene una estructura según la fórmula III:
o una de sus sales farmacéuticamente aceptables, en el que Ab es un anticuerpo con por lo menos una cadena lateral de lisina, Ady es un adyuvante como se define en la reivindicación 1,
G es CH<2>, C=0, o un enlace, L es un enlazador y el subíndice r es un número entero de 1 a 10 (es decir, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 o 10). En determinadas realizaciones del inmunoconjugado de la fórmula III, ese anticuerpo no contiene una cadena lateral de lisina modificada con tiol.
En algunas realizaciones, L se selecciona de:
en la que R está o p c io n a lm e n te p re sen te y es una cad en a de a lqu ilo , he te roa lqu ilo , arilo o h e te roa rilo linea l o ram ificada , c íc lica o linea l, sa tu ra d a o in sa tu rada , que c o m p re n d e de 1 a 8 un id ade s de ca rbono ; a es un nú m ero e n te ro de 1 a 40; cada A se s e le cc io n a in d e p e n d ie n te m e n te en tre cu a lq u ie r am ino ác id o ; el su b ín d ice c es un
En a lg u n a s rea liza c io nes , el in m u n o co n ju g a d o tie n e una e s truc tu ra según la fó rm u la Illa:
o una de sus sa les fa rm a c é u tic a m e n te ace p tab le s , en el que A b es un a n ticu e rp o con po r lo m en os una cad en a la te ra l de lis ina; A d y es un a d yu va n te ta l com o se de fine en la re iv in d ica c ió n 1;
G es C H 2 , C = 0 , o un en lace ; R es tá o p c io n a lm e n te p re sen te y es una cad en a de a lqu ilo , he te roa lqu ilo , a rilo o he te roa rilo linea l o ram ificada , c íc lica o linea l, sa tu ra d a o in sa tu rada , que co m p re n d e de 1 a 8 un id ade s de carbono ; el su b ín d ice a es un nú m ero en te ro de 1 a 40; y el su b ín d ice r es un nú m ero en te ro de 1 a 10 (es decir, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 o 10).
En a lg u n a s rea liza c io nes , el in m u n o co n ju g a d o tie n e una e s truc tu ra según la fó rm u la Mib;
<o>una de<su s>sa les fa rm a c é u tic a m e n te ace p tab le s , en el que A b es un a n ticu e rp o con po r lo m en os una cad en a la te ra l de lis ina; A d y es un a d yu va n te ta l com o se de fine en la re iv in d ica c ió n 1;
G es C H 2 , C = 0 ,<o>un en lace ; el su b índ ice a es un nú m ero e n te ro de 1 a 40; y el su b ín d ice r es un n ú m ero en te ro de 1 a 10 (es decir, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9<o>10).
En a lg u n a s rea liza c io nes , el in m u n o co n ju g a d o tie n e una e s truc tu ra según la fó rm u la III<c>:
<o>una de<su s>sa les fa rm a c é u tic a m e n te ace p tab le s , en el que A b es un a n ticu e rp o con po r lo m en os una cad en a la te ra l de lis ina; A d y es un a d yu va n te ta l com o se de fine en la re iv in d ica c ió n 1;
G es C H 2 , C = 0 ,<o>un en lace ; R es tá o p c io n a lm e n te p re sen te y es una cad en a de a lqu ilo , he te roa lqu ilo , a rilo<o>he te roa rilo linea l<o>ram ificada , c íc lica<o>linea l, sa tu ra d a<o>in sa tu rada , que co m p re n d e de 1 a 8 un id ade s de carbono ; cad a A se se le cc io n a in d e p e n d ie n te m e n te en tre cu a lq u ie r am ino ác id o ; el su b índ ice<c>es un n ú m ero e n te ro de 1 a 20; y el su b ín d ice r es un n ú m ero e n te ro de 1 a 10 (es decir, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9<o>10).
En a lg u n a s rea liza c io nes , el in m u n o co n ju g a d o tie n e una e s truc tu ra según la fó rm u la llld :
<o>una de<su s>sa les fa rm a c é u tic a m e n te ace p tab le s , en el que A b es un a n ticu e rp o con po r lo m en os una cad en a la te ra l de lis ina; A d y es un a d yu va n te ta l com o se de fine en la re iv in d ica c ió n 1;
G es C H 2 , C = 0 ,<o>un en lace ; R es tá o p c io n a lm e n te p re sen te y es una cad en a de a lqu ilo , he te roa lqu ilo , a rilo<o>he te roa rilo linea l<o>ram ificada , c íc lica<o>linea l, sa tu ra d a<o>in sa tu rada , que co m p re n d e de 1 a 8 un id ade s de carbono ; el su b ín d ice<c>es un n ú m ero en te ro de 1 a 20; y el su b ín d ice r es un n ú m ero en te ro de 1 a 10 (es decir, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9<o>10).
En a lg u n a s rea liza c io nes , el in m u n o co n ju g a d o tie n e una e s truc tu ra según la fó rm u la lile:
o una de sus sa les fa rm a c é u tic a m e n te ace p tab le s , en el que A b es un a n ticu e rp o con po r lo m en os una cad en a la te ra l de lis ina; A d y es un a d yu va n te ta l com o se de fine en la re iv in d ica c ió n 1;
G es C H 2 , C = 0 , o un en lace ; R es tá o p c io n a lm e n te p re sen te y es una cad en a de a lqu ilo , he te roa lqu ilo , a rilo o he te roa rilo linea l o ram ificada , c íc lica o linea l, sa tu ra d a o in sa tu rada , que co m p re n d e de 1 a 8 un id ade s de carbono ; y el su b ín d ice r es un nú m ero e n te ro de 1 a 10 (es decir, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 o 10).
En a lg u n a s rea liza c io nes , el in m u n o co n ju g a d o tie n e una e s truc tu ra según la fó rm u la lllf:
o una de sus sa les fa rm a c é u tic a m e n te ace p tab le s , en el que A b es un a n ticu e rp o con po r lo m en os una cad en a la te ra l de lis ina; A d y es un a d yu va n te ta l com o se de fine en la re iv in d ica c ió n 1;
G es C H 2 , C = 0 , o un en lace ; R es tá o p c io n a lm e n te p re sen te y es una cad en a de a lqu ilo , he te roa lqu ilo , a rilo o he te roa rilo linea l o ram ificada , c íc lica o linea l, sa tu ra d a o in sa tu rada , que co m p re n d e de 1 a 8 un id ade s de carbono ; y el su b ín d ice r es un nú m ero e n te ro de 1 a 10 (es decir, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 o 10).
En a lg u n a s rea liza c io nes , el in m u n o co n ju g a d o tie n e una e s truc tu ra según la fó rm u la lllg:
o una de sus sa les fa rm a c é u tic a m e n te ace p tab le s , en el que A b es un a n ticu e rp o con po r lo m en os una cad en a la te ra l de lis ina; A d y es un a d yu va n te ta l com o se de fine en la re iv in d ica c ió n 1;
G es C H 2 , C = 0 , o un en lace ; R es tá o p c io n a lm e n te p re sen te y es una cad en a de a lqu ilo , he te roa lqu ilo , a rilo o he te roa rilo linea l o ram ificada , c íc lica o linea l, sa tu ra d a o in sa tu rada , que co m p re n d e de 1 a 8 un id ade s de carbono ; y el su b ín d ice r es un nú m ero e n te ro de 1 a 10 (es decir, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 o 10).
P o r con s ig u ie n te , el in m u n o co n ju g a d o puede te n e r una e s tru c tu ra seg ún la fó rm u la IVa - fó rm u la IVk;
o una de sus sa les fa rm a c é u tic a m e n te ace p tab le s , en el que A b es un a n ticu e rp o con po r lo m en os una cad en a la te ra l de lis ina ; A d y es un a d yu va n te ta l com o se de fine en la re iv in d ica c ió n 1; y el su b ín d ice r es un nú m ero en te ro de 1 a 10 (es decir, 1 ,2 , 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 o 10). En d e te rm in a d a s rea liza c io nes , el sub índ ice r es un nú m ero en te ro de 1 a 4 (es decir, 1 ,2 , 3 o 4).
En d e te rm in a d o s e je m p lo s de la p re sen te d ivu lg ac ión (no seg ún las re iv in d ica c io n e s ad jun tas), el inm unoconJugado tie n e una es tru c tu ra s e le cc io n a d a en tre :
Ċ
<o>una de<sus>sales farmacéuticamente aceptables, en el que Ab es un anticuerpo con por lo menos una cadena lateral de lisina y el subíndice r es un número entero de 1 a 10 (es decir, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9,<o>10).
En determinadas realizaciones, el ínmunoconjugado tiene una estructura de:
<o>una de<sus>sales farmacéuticamente aceptables, en el que Ab es un anticuerpo con por lo menos una cadena lateral de lisina y el subíndice r es un número entero de 1 a 10 (es decir, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, o 10).
En determinadas realizaciones, el subíndice r es un número entero de 1 a 4 (es decir, 1, 2, 3 o 4).
En determinados ejemplos de la presente divulgación (no según las reivindicaciones adjuntas), el inmunoconJugado tiene una estructura seleccionada entre:
Ċ
o una de sus sa les fa rm a c é u tic a m e n te ace p tab le s , en el que A b es un a n ticu e rp o con po r lo m en os una cad en a la te ra l de lis ina y el su b ín d ice r es un nú m ero e n te ro de 1 a 10 (es decir, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, o 10).
En d e te rm in a d a s rea liza c io nes , el su b ín d ice r es un n ú m ero e n te ro de 1 a 4 (es decir, 1, 2, 3 o 4).
La p re sen te d ivu lg a c ió n ta m b ié n de sc rib e un m é tod o m e jo rad o pa ra p ro d u c ir un in m u n o co n ju g a d o de la fó rm u la III a p a rtir de uno o m ás co m p u e s to s de la fó rm u la V y un an ticu e rp o de la fó rm u la VI, co m p re n d ie n d o el m é todo la e ta pa de:
en el que A d y es un adyuva n te ; G es C H 2 , C = 0 , o un en lace ; L es un en la zado r; E es un éste r; la fó rm u la VI es un an ticu e rp o con po r lo m en os una cad en a la te ra l de lis ina; y el su b ín d ice r es un nú m ero en te ro de 1 a 10 (es decir, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 o 10). En d e te rm in a d a s rea liza c io nes , el a d yu va n te ("A d y") es un ag on is ta de TLR .
P ue de usa rse cu a lq u ie r e n la z a d o r a d e cu a d o s ie m p re que pueda un irse al a n ticu e rp o (co m p u e s to de la fó rm u la V I) a tra vé s de un éste r. P o r e jem p lo , el e n la z a d o r ("L ") pued e te n e r la fó rm u la s ig u ie n te
, en el que R está opcionalmente presente y es una cadena de alquilo, heteroalquilo, arilo<o>heteroarilo lineal<o>ramificada, cíclica<o>lineal, saturada<o>insaturada que comprende de 1 a 8 (es decir, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7<u>8) unidades de carbono; el subíndice a es un número entero de 1 a 40; la líneadiscontinuaAvA7 representa el punto de unión a
el punto de unión a E. En algunas realizaciones, el subíndice a es un número entero de 1 a 20. En algunas realizaciones, el subíndice a es un número entero de 1 a 10. En algunas realizaciones, el subíndice a es un número entero de 1 a 5. En algunas realizaciones, el subíndice a es un número entero de 1 a 3. En determinadas realizaciones, R está presente y es una cadena de alquilo, heteroalquilo, arilo<o>heteroarilo lineal<o>ramificada, cíclica<o>lineal, saturada<o>insaturada, que comprende de 1 a 8 (es decir, 1,2, 3, 4, 5, 6, 7<u>8) unidades de carbono.
El enlazador ("L") puede tener la fórmula siguiente en el que el subíndice a es un
número entero de 1 a 40; la línea discontinua V / representa el punto de unión a y la línea (“ A ” )
ondulada v’representa el punto de unión a E.
En algunas realizaciones, el subíndice a es un número entero de 1 a 20. En algunas realizaciones, el subíndice a es un número entero de 1 a 10. En algunas realizaciones, el subíndice a es un número entero de 1 a 5. En algunas realizaciones, el subíndice a es un número entero de 1 a 3.
O
<H>
x
RA,' N 0 ^
El enlazador ("L") también puede tener la fórmula siguiente Lcí , en el que R está opcionalmente presente y es una cadena de alquilo, heteroalquilo, arilo<o>heteroarilo lineal<o>ramificada, cíclica<o>lineal, saturada o insaturada que comprende de 1 a 8 (es decir, 1,2, 3, 4, 5, 6, 7 , u 8) unidades de carbono; cada A se selecciona independientemente entre cualquier aminoácido; el subíndice c es un número entero de 1 a 20; la
el punto de unión a E. En algunas realizaciones, el subíndice c es un número entero de 1 a 10. En algunas realizaciones, el subíndice<c>es un número entero de 1 a 5. En algunas realizaciones, el subíndice<c>es un número entero de 1 a 2. En determinadas realizaciones, R está presente y es una cadena de alquilo, heteroalquilo, arilo o heteroarilo lineal o ramificada, cíclica o lineal, saturada o insaturada, que comprende de 1 a 8 (es decir, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 u 8) unidades de carbono.
El enlazador ("L") también puede tener la fórmula siguiente
opcionalmente presente y es una cadena de alquilo, heteroalquilo, arilo o heteroarilo lineal o ramificada, cíclica o lineal, saturada o insaturada, que comprende de 1 a 8 (es decir, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 u 8) unidades de carbono; el
subíndice c es un número entero de 1 a 20; la línea discontinuaA 'Arepresenta el punto de unión a
7 representa el punto de unión a E. En algunas realizaciones, el subíndice<c>es un número entero de 1 a 10. En algunas realizaciones,<c>es un número entero de 1 a 5. En determinadas realizaciones, R está presente y es una cadena de alquilo, heteroalquilo, arilo o heteroarilo lineal o ramificada, cíclica o lineal, saturada o insaturada, que comprende de 1 a 8 (es decir, 1,2, 3, 4, 5, 6, 7 u 8) unidades de carbono.
El enlazador ("L") también puede tener la fórmula siguiente
en la que R está opcionalmente presente y es una cadena de alquilo, heteroalquilo, arilo<o>heteroarilo lineal<o>ramificada, cíclica o lineal, saturada o insaturada, que comprende de 1 a 8 (es decir, 1,2, 3, 4, 5, 6, 7 u 8) unidades
de carbono; la línea discontinua representa el punto de unión a y la línea ondulada
v ' representa el punto de unión a E. En determinadas realizaciones, R está presente y es una cadena de alquilo, heteroalquilo, arilo o heteroarilo lineal o ramificada, cíclica o lineal, saturada o insaturada, que comprende de 1 a 8 (es decir, 1,2, 3, 4, 5, 6, 7 u 8) unidades de carbono.
El enlazador ("L") también puede tener la fórmula siguiente<I>, en el que R está opcionalmente presente y es una cadena de alquilo, heteroalquilo, arilo o heteroarilo lineal o ramificada, cíclica o lineal, saturada o insaturada que comprende de 1 a 8 (es decir, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 , u 8) unidades de carbono; la línea discontinua
representa el punto de unión a
; y la línea ondulada v’representa el punto de unión a E, En determinadas realizaciones, R está presente y es una cadena de alquilo, heteroalquilo, arilo<o>heteroarilo lineal o ramificada, cíclica o lineal, saturada o insaturada, que comprende de 1 a 8 (es decir, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 u 8) unidades de carbono,
El enlazador ("L") también puede tener la fórmula siguiente L7 , en el que R está opcionalmente presente y es una cadena de alquilo, heteroalquilo, arilo<o>heteroarilo lineal<o>ramificada, cíclica<o>lineal, saturada o insaturada que comprende de 1 a 8 (es decir, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 u 8) unidades de carbono; la línea discontinua
representa el punto de unión a y la línea ondulada ("/ ") representa el punto de unión a E, En determinadas realizaciones, R está presente y es una cadena de alquilo, heteroalquilo, arilo<o>heteroarilo lineal o ramificada, cíclica o lineal, saturada o insaturada, que comprende de 1 a 8 (es decir, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7<u>8) unidades de carbono,
En algunas realizaciones, el compuesto de la fórmula V se selecciona de:
en el que G es CH<2>, C=0,<o>un enlace; R está opclonalmente presente y es una cadena de alquilo, heteroalquilo, arilo o heteroarllo lineal o ramificada, cíclica o lineal, saturada o insaturada, que comprende de 1 a 8 unidades de carbono; el subíndice a es un número entero de 1 a 40; cada A se selecciona independientemente entre cualquier aminoácido; el subíndice c es un número entero de 1 a 20 y E es un éster.
Como se analiza previamente, existen muchas formas de formar un inmunoconjugado. Cada uno de los métodos de la técnica anterior tiene desventajas. El presente método incluye un proceso de una sola etapa que conjuga un adyuvante, modificado para incluir un enlazador, con la cadena lateral de lisina de un anticuerpo (compuesto de la fórmula VI). Este proceso es posible utilizando un éster. El éster puede ser cualquier éster adecuado capaz de enlazar el compuesto de la fórmula V a una cadena lateral de lisina de un anticuerpo (compuesto de la fórmula VI). Por ejemplo, el éster de la fórmula V puede ser un éster de N-hidroxisuccinimida ("NHS") de fórmula:
en el que la línea ondulada v>representa el punto de unión al enlazador ("L").
El éster de la fórmula V también puede ser un éster de sulfo-N-hidroxisuccinimida de fórmula:
ejemplo, el contraión catiónico ("M") puede ser un protón, amonio, una amina cuaternaria, un catión de un metal alcalino, un catión de un metal alcalinotérreo, un catión de un metal de transición, un catión de un metal de tierras raras, un catión de elemento del grupo principal,<o>una combinación de los mismos.
El éster de la fórmula V también puede ser un éster de fenol de fórmula:
en el que cada R<2>se selecciona independientemente entre hidrógeno o flúor y la línea ondulada v'representa el punto de unión al enlazador ("L").
El éster de la fórmula V también puede ser un éster de fenol de fórmula:
(p e n ta flu o ro fe n ilo ); en el que la línea on du lad a e n ta el pun to de un ión al e n la z a d o r ("L").
En a lg u n a s rea liza c io nes , el a n ticu e rp o de la fó rm u la VI y el é s te r de la fó rm u la V se com b in a n en cu a lq u ie r ta m p ó n a cu oso adecu ad o . U na lis ta e je m p la r de ta m p o n e s acu oso s a d e cu a d o s es so luc ió n sa lina ta m p o n a d a con fos fa to , so luc ió n sa lina ta m p o n a d a con bo ra to y so luc ió n sa lina ta m p o n a d a con tris.
El uso de te tra flu o ro fe n ilo ("T F P ") o p e n ta flu o ro fe n ilo ("P F P ") es e s p e c ia lm e n te e fica z en la s ín tes is de los in m u n o co n ju g a d o s de la p re sen te invenc ión .
P o r con s ig u ie n te , una lis ta e jem p la r, pero no lim itan te , de co m p u e s to s de la fó rm u la V es:
en el que Ady es un adyuvante como se define en la reivindicación 1;
y M es cu a lq u ie r ca tión . P o r e jem p lo , el con tra ió n ca tió n ico ("M ")
pued e s e r un pro tón , am on io , una am ina cua te rna ria , un ca tión de un m e ta l a lca lino , un ca tión de un m eta l a lca lino té rreo , un ca tión de un m e ta l de trans ic ió n , un ca tió n de un m eta l de tie rra s raras, un ca tión de e le m e n to de l g ru po p rinc ipa l, o una com b in ac ió n de los m ism os.
P o r con s ig u ie n te , el uno o m ás co m p u e s to s de la fó rm u la V y un a n ticu e rp o de la fó rm u la VI se pu ed en co m b in a r para fo rm a r un in m u n o co n ju g a d o de la fó rm u la 111. Una lis ta e jem p la r, pero no lim itan te , de in m u n o co n ju g a d o s de la fó rm u la III es:
<o>una de<sus>sales farmacéuticamente aceptables, en el que Ab es un anticuerpo con por lo menos una cadena lateral de lisina; Ady es un adyuvante tal como se define en la reivindicación 1;
G es CH<2>, C=0, o un enlace; R está opcionalmente presente y es una cadena de alquilo, heteroalquilo, arilo o heteroarilo lineal<o>ramificada, cíclica<o>lineal, saturada<o>insaturada, que comprende de 1 a 8 unidades de carbono; el subíndice a es un número entero de 1 a 40; cada A se selecciona independientemente entre cualquier aminoácido; el subíndice<c>es un número entero de 1 a 20; y el subíndice r es un número entero de 1 a 10 (es decir, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 o 10).
Adyuvantes
En algunas realizaciones, el adyuvante es un compuesto que provoca una respuesta inmunitaria. En algunas realizaciones, el adyuvante es un agonista del receptor de reconocimiento de patrones ("PRR"). Cualquier adyuvante capaz de activar un receptor de reconocimiento de patrones (PRR) puede instalarse en los inmunoconjugados de la invención. Tal como se usan en la presente memoria, los términos "receptor de reconocimiento de patrones" y "PRR" se refieren a cualquier elemento de una clase de proteínas de mamíferos conservadas que reconocen patrones moleculares asociados a patógenos ("PAMP") o patrones moleculares asociados a daños ("DAMP"), y actúan como elementos de señalización clave de la inmunidad innata. Los receptores de reconocimiento de patrones se dividen en PRR unidos a la membrana, PRR citoplasmáticos y PRR secretados. Ejemplos de PRR unidos a la membrana incluyen receptores de tipo Toll ("TLR") y receptores de lectina de tipo C ("CLR"). Ejemplos de PRR citoplasmáticos incluyen receptores de tipo NOD ("NLR") y receptores de tipo Rig-I ("RLR"). En algunas realizaciones, el inmunoconjugado puede tener más de un adyuvante de PRR distinto. En determinadas realizaciones, el adyuvante en un inmunoconjugado de la invención es un agonista de receptor de tipo Toll (TLR). L<os>agonistas de TLR adecuados incluyen TLR1, TLR2, TLR3, TLR4, TLR5, TLR6, TLR7, TLR8, Tl R9, TLR10, TLR11 o cualquier combinación de los mismos (p. ej., agonistas de TLR7/8). Cualquier adyuvante capaz de activar un receptor de tipo Toll (TLR) puede instalarse en los inmunoconjugados de la invención. Los receptores de tipo Toll (TLR) son proteínas transmembrana de tipo I responsables de la iniciación de respuestas inmunitarias innatas en los vertebrados. Los TLR reconocen una variedad de patrones moleculares asociados a patógenos de bacterias, virus y hongos y actúan como una primera línea de defensa contra patógenos invasores. Los TLR provocan respuestas biológicas superpuestas pero distintas debido a diferencias en la expresión celular y en las vías de señalización que inician. Una vez activados (p. ej., mediante un estímulo natural<o>un agonista de T<l>R sintético), los TLR inician una cascada de transducción de señales que produce la activación de NF-kB por medio del gen 88 de respuesta primaria de diferenciación mieloide de la proteína adaptadora (MyD88) y al reclutamiento del receptor de lL-1p de la quinasa asociada (IRAK). La fosforilación de IRAK conduce luego al reclutamiento del factor 6 asociado al receptor de TNF (TRAF6), lo que da como resultado la fosforilación del inhibidor de NF-<k>B, I-<k>B. Como resultado, NF-<k>B entra al núcleo celular e inicia la transcripción de genes cuyos promotores contienen sitios de unión de NF-kB, tales como las citocinas. Los modos adicionales de regulación para la señalización de TLR incluyen la inducción de TRAF6 dependiente de interferón (TRIF) que contiene el dominio TlR y la activación de vías independientes de MyD88 por medio de TRIF y TRAF3, lo que produce la fosforilación del factor de respuesta al interferón tres (IRF3). De forma parecida, la vía dependiente de MyD88 también activa varios elementos de la familia IRF, incluidos el IRF5 e IRF7, mientras que la vía dependiente de TRIF también activa la vía NF-kB.
Los ejemplos de agonistas de TLR3 incluyen poliinosina-ácido policitidílico (poli (l:C)), ácido poliadenílicopoliuridílico (poli (A:U) y poli(l)-poli(C12U).
Ejemplos de agonistas de TLR4 incluyen lipopolisacárido (LPS) y monofosforil lípido A (MPLA).
Un ejemplo de agonista de TLR5 incluye flagelina.
Ejemplos de agonistas de TLR9 incluyen oligodesoxinucleótidos CpG monocatenarios (ODN CpG), Se han identificado tres clases principales de o Dn CpG estimuladores en función de las características estructurales y la actividad en las células mononucleares de sangre periférica (PBMC) humanas, en particular las células B y las células dendríticas plasmocitoides (pDC). Estas tres clases son clase A (Tipo D), clase B (Tipo K) y clase C,
Ejemplos de agonistas del receptor de tipo Nod (NLR) incluyen derivado acilado de iE-DAP, D-gamma-Glu-mDAP, L-Ala-gamma-D-Glu-mDAP, muramildipéptido con una cadena de ácido graso C18, muramildipéptido, muramiltripéptido, y muramildipéptido N-glicolilado,
Ejemplos de agonistas del receptor de tipo RIG-I (RLR) incluyen 5'ppp-dsma (5'-pppGCAUGCGACCUCUGUUUGA-3' (SEQ ID NO: 6): 3'-CGUACGCUGGAGACAAACU-5' (SEQ ID NO: 7)), y ácido poli(desoxiadenílico-desoxitimidílico) (Poli(dA:dT))
El estimulador de genes de interferón ("STING"), que puede actuar como un sensor de ADN citosólico, puede reconocer otros compuestos inmunoestimulantes, tales como el ADN citosólico y ácidos nucleicos bacterianos únicos llamados dinucleótidos cíclicos, El ADU-SIOO puede ser un agonista de STING, Ejemplos no limitantes de agonistas de STING incluyen: [G(2',5')<p>A(2',5')<p>] (2'2'-<c>GAMP) cíclico, [G(2',5')<p>A(3',5')<p>] (2'3'-<c>GAMP) cíclico, [G(3',5')<p>A(3',5')<p>] (3'3'-<cg>A<m>P) cíclico, monofosfato de diadenilato cíclico (c-di-AMP), 2',5'-3',5'-c-diAMp (2'3'-<c>-di-AMP), monofosfato cíclico de diguanilato (c-di-GMP), 2',5'-3',-5'-c-diGMP (2'3'-c-di-GMP), monofosfato cíclico de diinosina (c-di-IMP), monofosfato cíclico de diuridina (c-di-UMP), Se pueden reconocer KIN700, KIN1148, KIN600, KIN500, KIN100, KIN101, KIN400, KIN2000 o SB-9200.
Cualquier adyuvante capaz de activar TLR7 y/o TLR8 puede instalarse en los inmunoconjugados de la invención, Ejemplos de agonistas de TLR7 y agonistas de TLR8 se describen, p, ej., por Vacchelli et al,(Oncolmmunology,2: 8, e25238, DOI: 10.4161/onci.25238 (2013)) y Carson et al, (publicación de la solicitud de patente estadounidense 2013/0165455), Tanto el TLR7 como TLR8 se expresan en monocitos y células dendríticas, En humanos, el TLR7 también se expresa en células dendríticas plasmocitoides (pDC) y células B, El TLR8 se expresa principalmente en células de origen mieloide, es decir, monocitos, granulocitos y células dendríticas mieloides, El TLR7 y TLR8 son capaces de detectar la presencia de ARN monocatenario "extraño" dentro de una célula, como un medio para responder a la invasión viral, El tratamiento de células que expresan TLR8 con agonistas de TLR8 puede dar como resultado la producción de niveles elevados de IL-12, IFN-y, IL-1, TNF-ci, IL-6 y otras citocinas inflamatorias, De forma parecida, la estimulación de células que expresan TLR7, tales como las pDC, con agonistas de TLR7 puede dar como resultado la producción de niveles elevados de IFN-a y otras citocinas inflamatorias, La interacción de TLR7/TLR8 y la producción de citocinas resultante pueden activar las células dendríticas y otras células presentadoras de antígenos, lo que estimula diversos mecanismos de respuesta inmunitaria innata y adquirida que provocan la destrucción del tumor.
Ejemplos de agonistas de TLR7, TLR8 o TLR7/8 incluyen, pero no se limitan a: Gardiquimod (1-(4-amino-2-etilaminometilimidazo[4,5-c]quinolin-1-il)-2-metilpropan-2-ol), imiquimod (R837) (agonista de TLR7), loxoribina (agonista de TLR7 ), IRM1 (1-(2-amino-2-metilpropil)-2-(etoximetil)-1H-imidazo-[4,5-c]quinolin-4-amina), IRM2 (2-metil-1-[2 -(3-piridin-3-ilpropoxi)etil]-1H-imidazo[4,5-c]quinolin-4-amina) (agonista de TLR8), IRM3 (N-(2-[2-[4-amino-2-(2-metoxietil)-1H-imidazo[4,5-c]quinolin-1-il]etoxi]etil)-N-metilciclohexanocarboxamida) (agonista de TLR8), CL097 (2-(etoximetil)-1H-imidazo [4,5-c]quinolin-4-amina) (agonista de TLR7/8), CL307 (agonista de TLR7), CL264 (agonista de T<l>R7), resiquimod (agonista de TL<r>7/8), 3M-052/MEDI9197 (agonista de TLR7/8), SD-101 (N-[(4S)-2,5-dioxo-4-imidazolidinil]-urea) (agonista de TLr 7/8), motolimod (2-amino-N,N-dipropil-8-[4-(pirrolidina-1-carbonil)fenil]-3H-1-benzazepina-4-carboxamida) (agonista de TLR8), CL075 (3M002, 2-propiltiazolo[4,5-c]quinolin-4-amina) (agonista de TLR7/8) y TL8-506 (ácido 3H-1-benzazepina-4-carboxílico, 2-amino-8-(3-cianofenil)-, éster etílico) (agonista de TLR8).
Los ejemplos de agonistas de TLR2 incluyen, entre pero no se limitan a, un agente que comprende W-a-palmitoil-S-[2,3-bis(palm¡to¡lox¡)-(2RS)-prop¡l]-L-c¡síeína, palmitoil-Cys((RS)-2,3-di(palmitoiloxi)-propil) ("Pam3Cys"), p, ej., Pam3Cys , Pam3Cys-Ser-(Lys)4 (también conocida como "Pam3Cys-SKKKK" y "PairteCS^"), triacil lípido A ("o M-174"), ácido lipoteicoico ("LTA"), peptidoglicano y CL419 (S-(2,3-bis(palmitoiloxi)-(2RS)propil)-(R)-cisteinil espermina),
Un ejemplo de agonista de TLR2/6 es Pam2CSK4 (S-[2,3-bis(palmitoiloxi)-(2RS)-propil]-[R]-cisteinil-[S]-seril-[S]-lisil-[S]-lisil-[S]-lisil-[S]-lisina x 3 CF3COOH).
Los ejemplos de agonista de TLR2/7 incluyen CL572 (S-(2-miristoiloxietil)-(R)-cisteinil 4-((6-amino-2-(butilamino)-8-hidroxi-9H-purin-9-il)metilo)anilina), CL413 (S(2,3-bis(palmitoiloxi)-(2RS)propil)-(R)-cisteinil-(S)-seril-(S)-lisil-(S)-lisil-(S)-lisil-(S)-lisil 4-((6-amino-2-(butilamino)-8-hidroxi-9H-purin-9-il)metil)anilina) y CL401 (S(2,3-bis(palmitoiloxi) -(2RS)propil)-(R)-cisteinil 4-((6-amino-2(butilamino)-8-hidroxi-9H-purin-9-il)metil)anilina).
Las figuras 22A-22X muestran dónde podrían unirse los agonistas de TLR CL264, CL401, CL413, CL419, CL553, CL572, Pam3CSK4y Pam2CSK4 a inmunoconjugados de la presente invención al mismo tiempo que mantienen su actividad adyuvante, Específicamente, la ubicación donde se debe unir el enlazador al adyuvante está rodeada por un círculo,
En algunas realizaciones, el adyuvante es un compuesto de imidazoquinolina. Ejemplos de compuestos de imidazoquinolina útiles incluyen los descritos en las patentes estadounidenses 5.389.64o; 6.069.149; y 7.968.562.
Según la invención, el adyuvante ("Ady") tiene la fórmula:
en el que cada J independientemente es hidrógeno, OR4 o R4; cada R4 independientemente es hidrógeno, o un grupo alquilo, heteroalquilo, cicloalquilo, heterocicloalquilo, arilo, heteroarilo, arilalquilo<o>heteroarilalquilo que comprende de 1 a 8 (es decir, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7<u>8) unidades de carbono; cada U es independientemente CH<o>N en el que por lo menos una U es N; cada subíndice t independientemente es un número entero de 1 a 3 (es decir,
1, 2 o 3); Q está ausente; y la línea discontinua ^ ^ representa el punto de unión del adyuvante.
En determinadas realizaciones, el adyuvante ("Ady") es:
en el que la línea discontinua representa el punto de unión del adyuvante.
En algunas realizaciones, el adyuvante no es un fluoróforo. En algunas realizaciones, el adyuvante no es un compuesto de radiodiagnóstico. En algunas realizaciones, el adyuvante no es un compuesto radioterapéutico. En algunas realizaciones, el adyuvante no es un inhibidor de tubulina. En algunas realizaciones, el adyuvante no es un reticulante/alquilador de A<d>N. En algunas realizaciones, el adyuvante no es un inhibidor de la topoisomerasa.
Anticuerpos
Los anticuerpos de los inmunoconjugados pueden ser anticuerpos alogénicos. Los términos "anticuerpo alogénico" o "aloanticuerpo" se refieren a un anticuerpo que no es del individuo en cuestión (p. ej., un individuo con un tumor y que busca tratamiento), pero es de la misma especie,<o>es de una especie diferente, pero se ha manipulado genéticamente para reducir, mitigar o evitar el reconocimiento como xenoanticuerpo (p. ej., no propio). Por ejemplo, el "anticuerpo alogénico" puede ser un anticuerpo humanizado. A menos que se indique específicamente lo contrario, "anticuerpo" y "anticuerpos alogénicos" tal como se usan en la presente memoria se refieren a inmunoglobulina G (igG) o inmunoglobulina A (IgA).
Si una célula cancerosa de un individuo humano se pone en contacto con un anticuerpo que no fue generado por esa misma persona (p. ej., el anticuerpo fue generado por un segundo individuo humano, el anticuerpo fue generado por otra especie como un ratón, el anticuerpo es un anticuerpo humanizado que fue generado por otra especie, etc,), entonces el anticuerpo se considera alogénico (en relación con el primer individuo). Un anticuerpo monoclonal de ratón humanizado que reconoce un antígeno humano (p, ej,, un antígeno específico del cáncer, un antígeno que está enriquecido en y/o sobre células cancerosas, etc,) se considera un "aloanticuerpo" (un anticuerpo alogénico),
En algunas realizaciones, el anticuerpo es un anticuerpo IgG alogénico policlonal, En algunas realizaciones, el anticuerpo está presente en una mezcla de anticuerpos IgG policlonales con una pluralidad de especificidades de unión, En algunos casos, los anticuerpos de la mezcla se unen específicamente a diferentes moléculas diana, y en algunos casos los anticuerpos de la mezcla se unen específicamente a diferentes epítopos de la misma molécula diana, Por tanto, una mezcla de anticuerpos puede incluir en algunos casos más de un inmunoconjugado de la invención (p, ej., los adyuvantes pueden unirse de forma covalente a anticuerpos de una mezcla, p, ej., una mezcla de anticuerpos IgG policlonales, dando como resultado una mezcla de conjugados de anticuerpo y adyuvante de la invención), Se puede combinar una mezcla de anticuerpos de 2 o más individuos (p, ej,, 3 o más individuos, 4 o más individuos, 5 o más individuos, 6 o más individuos, 7 o más individuos, 8 o más individuos, 9 o más individuos, 10<o>más individuos, etc,), En algunos casos, se utiliza suero combinado como fuente de aloanticuerpo, donde el suero puede provenir de un número cualquiera de individuos, ninguno de los cuales es el primer individuo (p, ej,, el suero puede combinarse de 2<o>más individuos, 3<o>más individuos, 4<o>más individuos, 5<o>más individuos, 6<o>más individuos, 7<o>más individuos, 8<o>más individuos, 9<o>más individuos, 10<o>más individuos, etc,), En algunos casos, los anticuerpos se aíslan<o>purifican del suero antes de<su uso>, La purificación se puede llevar a cabo antes<o>después de combinar los anticuerpos de diferentes individuos,
En algunos casos en los que los anticuerpos en los inmunoconjugados comprenden IgG del suero, se desconocerán los antígenos diana para algunos de los anticuerpos (p, ej,, más del 0 % pero menos del 50 %), la mitad de los anticuerpos, la mayoría de los anticuerpos (más del 50 % pero menos del 100 %), o incluso todos los anticuerpos (es decir, las IgG del suero), Sin embargo, hay muchas posibilidades de que por lo menos un anticuerpo en la mezcla reconozca el antígeno diana de interés porque dicha mezcla contiene una amplia variedad de anticuerpos específicos para una amplia variedad de antígenos diana,
En algunas realizaciones, el anticuerpo es un anticuerpo IgA alogénico policlonal, En algunas realizaciones, el anticuerpo está presente en una mezcla de anticuerpos IgA policlonales con una pluralidad de especificidades de unión, En algunos casos, los anticuerpos de la mezcla se unen específicamente a diferentes moléculas diana, y en algunos casos los anticuerpos de la mezcla se unen específicamente a diferentes epítopos de la misma molécula diana, Por tanto, una mezcla de anticuerpos puede incluir en algunos casos más de un inmunoconjugado de la invención (p, ej,, los adyuvantes pueden unirse de forma covalente a anticuerpos de una mezcla, p, ej,, una mezcla de anticuerpos IgA policlonales, dando como resultado una mezcla de conjugados de anticuerpo y adyuvante de la invención), Se puede combinar una mezcla de anticuerpos de 2 o más individuos (p, ej,, 3 o más individuos, 4<o>más individuos, 5<o>más individuos, 6<o>más individuos, 7<o>más individuos, 8<o>más individuos, 9<o>más individuos, 10<o>más individuos, etc,), En algunos casos, se utiliza suero combinado como fuente de aloanticuerpo, donde el suero puede provenir de un número cualquiera de individuos, ninguno de los cuales es el primer individuo (p, ej,, el suero puede combinarse de 2 o más individuos, 3 o más individuos, 4 o más individuos, 5 o más individuos, 6 o más individuos, 7 o más individuos, 8 o más individuos, 9 o más individuos, 10 o más individuos, etc,), En algunos casos, los anticuerpos se aíslan<o>purifican del suero antes de<su uso>, La purificación se puede llevar a cabo antes o después de combinar los anticuerpos de diferentes individuos,
En algunos casos en los que los anticuerpos en los inmunoconjugados comprenden IgA del suero, se desconocerán los antígenos diana para algunos de los anticuerpos (p, ej,, más del 0 % pero menos del 50 %), la mitad de los anticuerpos, la mayoría de los anticuerpos (más del 50 % pero menos del 100 %),<o>incluso todos los anticuerpos (es decir, las IgA del suero), Sin embargo, hay muchas posibilidades de que por lo menos un anticuerpo en la mezcla reconozca el antígeno diana de interés porque dicha mezcla contiene una amplia variedad de anticuerpos específicos para una amplia variedad de antígenos diana,
En algunos casos, el anticuerpo en los inmunoconjugados incluye inmunoglobulina intravenosa (IGIV) y/o anticuerpos de (p, ej,, enriquecidos con, purificados a partir de, p, ej,, purificados por afinidad) de IVIG. La IVIG es un producto sanguíneo que contiene IgG (inmunoglobulina G) obtenida del plasma (p, ej,, en algunos casos sin ninguna otra proteína) de muchos (p, ej,, a veces más de 1000 a 60000) donantes de sangre normales y sanos, La IVIG está disponible comercialmente, La IVIG contiene un alto porcentaje de IVIG monomérica humana nativa y tiene un bajo contenido de IgA, Cuando se administra por vía intravenosa, la IVIG mejora varias enfermedades, Por lo tanto, la Administración de Fármacos y Alimentos de los Estados Unidos (FDA) ha aprobado el<uso>de IVIG para varias enfermedades que incluyen (1) la enfermedad de Kawasaki; (2) trombocitopenia mediada por el sistema inmunitario; (3) inmunodeficiencias primarias; (4) trasplante de células madre hematopoyéticas (en mayores de 20 años); (5) leucemia linfocítica crónica de células B; y (6) infección pediátrica por VIH de tipo 1, En 2004, la FDA aprobó el protocolo Cedars-Sinai IVIG para receptores de trasplantes de riñón, de modo que dichos receptores pudieran aceptar un riñón de un donante vivo de cualquier donante sano, independientemente del tipo de sangre (ABO incompatible)<o>de la compatibilidad del tejido, Estos y otros aspectos de IVIG se describen, por ejemplo, en las publicaciones de solicitudes de patente estadounidenses 2010/0150942; 2004/0101909; 2013/0177574; 2013/0108619 y 2013/0011388,
En algunos casos, el anticuerpo es un anticuerpo monoclonal de una subclase definida (p, ej,, lgG<1>, lgG<2>, lgG3, lgG4, IgAi o lgA<2>). Si se usan combinaciones de anticuerpos, Ios anticuerpos pueden ser de la misma subclase o de subclases diferentes. Por ejemplo, I<os>anticuerpos pueden ser anticuerpos IgGI. L<os>expertos en la materia pueden obtener diversas combinaciones de diferentes subclases, en diferentes proporciones relativas. En algunos casos, una subclase específica<o>una combinación específica de diferentes subclases puede ser particularmente eficaz en el tratamiento del cáncer o en la reducción del tamaño del tumor. Por consiguiente, algunas realizaciones de la invención proporcionan inmunoconjugados en Ios que el anticuerpo es un anticuerpo monoclonal. En algunas realizaciones, el anticuerpo monoclonal está humanizado.
En algunas realizaciones, el anticuerpo se une a un antígeno de una célula cancerosa. Por ejemplo, el anticuerpo puede unirse a un antígeno diana que esté presente en una cantidad de por lo menos 10; 100; 1.000; 10000; 100000; 1000000; 2.5 x 106; 5x106; o 1 x 107 copias o más en la superficie de una célula cancerosa.
En algunas realizaciones, el anticuerpo se une a un antígeno en una célula inmunitaria o cancerosa con una afinidad mayor que un antígeno correspondiente en una célula no cancerosa. Por ejemplo, el anticuerpo puede reconocer preferiblemente un antígeno que contiene un polimorfismo que se encuentra en una célula cancerosa<o>inmunitaria en comparación con el reconocimiento de un antígeno de tipo silvestre correspondiente en la célula no cancerosa o no inmunitaria. En algunos casos, el anticuerpo se une a una célula cancerosa o inmunitaria con mayor avidez que a una célula no cancerosa o no inmunitaria. Por ejemplo, la célula cancerosa o inmunitaria puede expresar una mayor densidad de un antígeno, lo que proporciona una unión de mayor afinidad de un anticuerpo multivalente a la célula cancerosa<o>inmunitaria.
En algunos casos, el anticuerpo no se une significativamente a antígenos no cancerosos (p. ej., el anticuerpo se une a uno o más antígenos no cancerosos con por lo menos 10; 100; 1.000; 10000; 100000; o 1.000000 veces de menor afinidad (mayor Kd) que el antígeno canceroso diana). En algunos casos, el antígeno canceroso diana al que se une el anticuerpo se enriquece en la célula cancerosa. Por ejemplo, el antígeno canceroso diana puede estar presente en la superficie de la célula cancerosa a un nivel que sea por lo menos 2, 5, 10; 100; 1000; 10000; 100000;<o>1000000 de veces mayor que la de una célula no cancerosa correspondiente. En algunos casos, la célula no cancerosa correspondiente es una célula del mismo tejido<u>origen que no es hiperproliferativa ni cancerosa. En general, un anticuerpo IgG en cuestión que se une específicamente a un antígeno (un antígeno diana) de una célula cancerosa se une preferiblemente a ese antígeno concreto en relación con otros antígenos disponibles. Sin embargo, no es necesario que el antígeno diana sea específico de la célula cancerosa o incluso esté enriquecido en células cancerosas en relación con otras células (p. ej., el antígeno diana puede expresarse mediante otras células). Por tanto, en la frase "un anticuerpo que se une específicamente a un antígeno de una célula cancerosa", el término "específicamente" se refiere a la especificidad del anticuerpo y no a la singularidad del antígeno en ese tipo de célula concreta.
Región Fc modificada
En algunas realizaciones, Ios anticuerpos en Ios inmunoconjugados contienen una región Fc modificada, en el que la modificación modula la unión de la región F<c>a uno<o>más receptores F<c>.
Los términos "receptor Fc" o "FcR" se refieren a un receptor que se une a la región Fc de un anticuerpo. Existen tres clases principales de receptores F<c>: FcyR que se une a IgG, FcaR que se une a IgA y F<ce>R que se une a IgE. La familia FcyR incluye varios elementos, tales como Fcyl (CD64), FcyRlIA (CD32A), FcyRNB (CD32B), FcyRIIIA (CD16A), FcyRIIIB (CD16B). Los receptores Fcy difieren en su afinidad por la IgG y también tienen diferentes afinidades por las subclases de IgG (p. ej., lgG1, lgG2, lgG3, lgG4).
En algunas realizaciones, Ios anticuerpos en Ios inmunoconjugados (p. ej., anticuerpos conjugados con un agonista de TLR tal como un agonista de TLR7/8 por medio de un enlazador) contienen una<o>más modificaciones (p. ej., inserción, deleción y/o sustitución de aminoácidos) en la región Fc que da como resultado una unión modulada (p. ej., unión aumentada o unión disminuida) a uno o más receptores Fc (p. ej., FcyRI (CD64), FcyRIIA (CD32A), F<cy>RNB (CD32B), F<cy>RIIIA (CD16a) y/o F<cy>RIIIB (CD16b)) en comparación con el anticuerpo nativo que carece de la mutación en la región F<c>. En algunas realizaciones, I<os>anticuerpos en I<os>inmunoconjugados contienen una o más modificaciones (p. ej., inserción, deleción y/o sustitución de aminoácidos) en la región Fc que reducen la unión de la región F<c>del anticuerpo a F<cy>RNB. En algunas realizaciones, I<os>anticuerpos en I<os>inmunoconjugados contienen una<o>más modificaciones (p. ej., inserción, deleción y/o sustitución de aminoácidos) en la región F<c>del anticuerpo que reducen la unión del anticuerpo a FcyRNB mientras mantienen la misma unión o tienen una mayor unión a FcyRl (CD64), F<cy>RIIA (CD32A) y/o FcRylllA (CD16a) en comparación con el anticuerpo nativo que carece de la mutación en la región F<c>. En algunas realizaciones, I<os>anticuerpos en I<os>inmunoconjugados contienen una o más modificaciones en la región Fc que aumentan la unión de la región Fc del anticuerpo a FcyRNB.
En algunos casos, la unión modulada se proporciona mediante mutaciones en la región Fc del anticuerpo en relación con la región Fc nativa del anticuerpo. Las mutaciones pueden ser en un dominio CH2, un dominio CH3 o una combinación de Ios mismos. Una "región Fc nativa" es sinónimo de una "región Fc de tipo silvestre" y comprende una secuencia de aminoácidos que es idéntica a la secuencia de aminoácidos de una región F<c>que se encuentra en la naturaleza o idéntica a la secuencia de aminoácidos de la región Fc que se encuentra en el anticuerpo nativo (p. ej., rituximab). Las regiones F<c>humanas de secuencia nativa incluyen una región F<c>de lgG1 humana de secuencia nativa; región F<c>de lgG2 humana de secuencia nativa; región F<c>de lgG3 humana de secuencia nativa; y región Fc de lgG4 humana de secuencia nativa, así como variantes naturales de la misma. La secuencia Fc nativa incluye Ios diversos alotipos de Fc (véase, por ej,, Jefferis et al,,mAbs,1(4): 332-338 (2009)).
En algunas realizaciones, las mutaciones en la región Fc que dan como resultado la unión modulada a uno o más receptores Fc pueden incluir una o más de las mutaciones siguientes: SD (S239D), SDIE (S239D/1332E), SE (S267E), SELF (S267E/L328F), SDIE (S239D/1332E), SDIEAL (S239D/1332E/A330L), GA (G236A), ALIE (A330L/1332E), GASDALIE (G236A/S239D/A330L/1332E), V9 (G237D/P238D/P271G/A330R), y V11 (g 237D/P238D/H268D/P271G/A330R) y/o una o más mutaciones en Ios aminoácidos siguientes: E233, G237, P238, H268, P271, L328 y A330. Se describen modificaciones adicionales de la región Fc para modular la unión del receptor F<c>, p. ej., en la publicación de la solicitud de patente estadounidense 2016/0145350 y las patentes estadounidenses 7.416.726 y 5.624.821.
En algunas realizaciones, la región F<c>de I<os>anticuerpos de I<os>inmunoconjugados se modifica para tener un patrón de glicosilación alterado de la región Fc en comparación con la región Fc nativa no modificada.
La inmunoglobulina humana está glicosilada en el residuo Asn297 en el dominio Cy2 de cada cadena pesada. Este oligosacárido enlazado a través del nitrógeno está compuesto por un heptasacárido principal, N-acetilglucosamina4manosa3 (GlcNAc4Man3). Se sabe que la eliminación del heptasacárido con endoglicosidasa o PNGasa F produce cambios conformacionales en la región F<c>del anticuerpo, lo que puede reducir significativamente la afinidad de unión del anticuerpo para activar el FcyR y provocar una disminución de la función efectora. El heptasacárido principal a menudo está decorado con galactosa, que corta el GIcNAc, la fucosa o el ácido siálico, lo que afecta de manera diferencial a la unión del F<c>al FcyR activador e inhibidor. Además, se ha demostrado que la sialización a2,6 mejora la actividad antiinflamatoriain vivomientras que la defucosilación da lugar a una mejor unión de FcyRINa y a un aumento de 10 veces en la citotoxicidad celular dependiente de anticuerpos y en la fagocitosis dependiente de anticuerpos. Por lo tanto, pueden usarse patrones de glicosilación específicos para controlar las funciones efectoras inflamatorias.
En algunas realizaciones, la modificación para alterar el patrón de glicosilación es una mutación. Por ejemplo, una sustitución en Asn297. En algunas realizaciones, Asn297 está mutado a glutamina (N297Q). L<os>métodos para controlar la respuesta inmunitaria con anticuerpos que modulan la señalización regulada por FcyR se describen, por ejemplo, en las patentes estadounidenses n.07.416.726, así como Ios documentos Us 2007/0014795 y US 2008/0286819.
En algunas realizaciones, Ios anticuerpos de Ios inmunoconjugados se modifican para contener una región Fab genomanipulada con un patrón de glicosilación que no existe de manera natural. Por ejemplo, las hibridomas pueden manipularse genéticamente para secretar mAb afucosilado, mAb desialilado<o>F<c>desglicosilado con mutaciones específicas que permiten una mayor unión a FcRyllla y una mayor función efectora. En algunas realizaciones, I<os>anticuerpos de I<os>inmunoconjugados se manipulan genéticamente para que estén afucosilados (p. ej., rituximab afucosilado, disponible en Invivogen, hcd20-mab13).
En algunas realizaciones, la región Fc completa de un anticuerpo en Ios inmunoconjugados se intercambia con una región F<c>diferente, de modo que la región Fab del anticuerpo se conjuga con una región F<c>no nativa. Por ejemplo, la región Fab de rituximab, que normalmente comprende una región Fc de lgG1, se puede conjugar con lgG2, lgG3, lgG4<o>IgA,<o>la región Fab de nivolumab, que normalmente comprende una región F<c>de lgG4, se puede conjugar con lgG1, lgG2, lgG3, IgAl o lgG2. En algunas realizaciones, el anticuerpo modificado con Fc con un dominio F<c>no nativo también comprende una<o>más modificaciones de aminoácidos, tales como la mutación S228P dentro del Fc de lgG4, que modulan la estabilidad del dominio Fc descrito. En algunas realizaciones, el anticuerpo modificado con Fc con un dominio Fc no nativo también comprende una o más modificaciones de aminoácidos descritas en la presente memoria que modulan la unión de F<c>a F<c>R.
En algunas realizaciones, las modificaciones que modulan la unión de la región F<c>a F<c>R no alteran la unión de la región Fab del anticuerpo a<su>antígeno en comparación con el anticuerpo nativo no modificado. En otras realizaciones, las modificaciones que modulan la unión de la región Fc a FcR también aumentan la unión de la región Fab del anticuerpo a<su>antígeno en comparación con el anticuerpo nativo no modificado.
Dianas de anticuerpos
En algunas realizaciones, el anticuerpo es capaz de unirse a una o más dianas seleccionadas entre (p. ej., se une específicamente a una diana seleccionada entre) 5T4, ABL, ABCFI, ACVRI, ACVRIB, ACVR2, ACVR2B, ACVRLI, ADORA2A, agrecano, AGR2, AICDA, AIFI, AIGI, AKAPI, AKAP2, AMH, AMHR2, ANGPTI, ANGPT2, ANGPTL3, ANGPTL4, ANPEP, APC, APOC1, AR, aromatasa, ATX, AXI, AZGPI (zinc-a-glucoproteína), B7.1, B7.2, B7-H1, BAD, BAFF, BAG1, BAI1, BCR, BCL2, BCL6, BDNF, BLNK, BLRI (MDR15), BlyS, BMP1, BMP2, BMP3B (GDF10), BMP4, BMP6, BMP8, BMPRIA, BMPRIB, BMPR2, BPAGI (plectina), BRCA1, C19orf10 (IL27w), C3, C4A, CS, C5R1, CANT1, CAPRIN-1, CASP1, CASP4, CAV1, CCBP2 (D6/JAB61), CCL1 (1-309), CCLI1 (eotaxina), CCL13 (MCP-4), CCL15 (MIP-ld), CCL16 (HCC-4), CCL17 (TARC), CCL18 (PARC), CCL19 (MIP-3b), CCL2 (MCP-1), MCAF, CCL20 (MIP-3a), CCL21 (MEP-2), SLC, exodus-2, CCL22(MDC/STC-I), CCL27 (CTACK/ILC), CCL28, CCL3 (MIP-la), CCL4 (MlPlb), CCL5(RANTES), CCL7 (MCP-3), CCL8 (mcp-2), CCNAI, CCNA2, CCND1, CCNE1, CCNE2, CCR1 (CKR1/HM145), CCR2 (mcp-IRB/RA), CCR3 (CKR3/CMKBR3), CCR4, CCR5(CMKBR5/ChemR13), CCR6 (CMKBR6/CKR-L3/STRL22/DRY6), CCR7 (CKR7/EBI1), CCR8 (CMKBR8/TERI/CKR-L1), CCR9 (GPR-9-6), CCRL1 (VSHK1), CCRL2 (L-CCR), CD164, CD19, CDIC, CD2, CD20, CD21, CD200, CD-22, CD24, CD27, CD28, CD3, CD33, CD35, CD37, CD38, CD3E, CD3G, CD3Z, CD4, CD38, CD40, CD40L, CD44, CD45RB, CD47, CD52, CD69, CD72, CD74, CD79A, CD79B, CD8, CD80, CD81, CD83, CD86, CD137, CD152, CD274, CDH1 (E-cadherina), CDH10, CDH12, CDH13, CDH18, CDH19, CDH20, CDH5, CDH7, CDH8, CDH9, CDK2, CDK3, CDK4, CDK5, CDK6, CDK7, CDK9, CDKNIA (p21Wapl/Cip1), CDKN1B (p27Kip1), CDKN1C, CDKN2A (p16INK4a), CDKN2B, CDKN2C, CDKN3, CEBPB, CERI, CHGA, CHGB, quitinasa, CHST10, CKLFSF2, CKLFSF3, CKLFSF4, CKLFSF5, CKLFSF6, CKLFSF7, CKLFSF8, CLDN3, CLDN7 (claudina-7), CLN3, CLU (clusterina), CMKLR1, CMKOR1 (RDC1), CNR1, COL18A1, COLIA1, COL4A3, COL6A1, CR2, Cripto, CRP, CSF1 (M-CSF), CSF2 (GM-CSF), CSF3 (GCSF), CTL8, CTNNB1 (b-catenina), CTSB (catepsina B), CX3CL1 (SCYD1), CX3CR1 (V28), CXCL1 (GR01), CXCL10 (IP-IO), CXCLI1 (lTAC/IP-9), CXCL12 (SDF1), CXCL13, CXCL14, CXCL16, CXCL2 (GR02), CXCL3 (GR03), CXCL5 (ENA-78/LIX), CXCL6 (GCP-2), CXCL9 (MIG), CXCR3 (GPR9/CKR-L2), CXCR4, CXCR6 (TYMSTR/STRL33/B<onzo>), CYB5, CYC1, CYSLTR1, DAB2IP, DES, DKFZ<p>451J0118, DNCL1, DPP4, E2F1, Engel, Edge, Fennel, EFNA3, EFNB2, EGF, EGFR, ELAC2, ENG, Enola, EN02, EN03, EPHA1, EPHA2, EPHA3, EPHA4, EPHA5, EPHA6, EPHA7, EPHA8, EPHA9, EPHA10, EPHB1, EPHB2, EPHB3, EPHB4, EPHB5, EPHB6, EPHRIN-A1, EPHRIN-A2, EPHRINA3, EPHRIN-A4, EPHRIN-A5, EPHRIN-A6, EPHRIN-B1, EPHRIN-B2, EPHRIN-B3, EPHB4, EPG, ERBB2 (Her-2), EREG, ERK8, receptor de estrógeno, Earl, ESR2, F3 (TF), FADD, farnesiltransferasa, FasL, FASNf, FCER1A, FCER2, FCGR3A, FGF, FGF1 (aFGF), FGF10, FGF11, FGF12, FGF12B, FGF13, FGF14, FGF16, FGF17, FGF18, FGF19, FGF2 (bFGF), FGF20, FGF21, FGF22, FGF23, FGF3 (int-2), FGF4 (HST), FGF5, FGF6 (HST-2), FGF7 (KGF), FGF8, FGF9, FGFR3, FIGF (VEGFD), FIL1(EPSILON), FBL1 (<z e t a>), FLJ12584, FLJ25530, FLRT1 (fibronectina), FLT1, FLT-3, FOS, FOSL1(FRA-1), FY (DARC), GABRP (GABAa), GAGEB1, GAGEC1, GALNAC4S-6ST, GATA3, GD2, GDF5, GF11, GGT1, GM-CSF, GNAS1, GNRH1, GPR2 (CCR10), GPR31, GPR44, GPR81 (FKSG80), GRCC10 (C10), GRP, GSN (Gelsolin), GSTP1, HAVCR2, HDAC, HDAC4, HDAC5, HDAC7A, HDAC9, Hedgehog, HGF, HIF1A, HIP1, histamina y receptores de histamina, HLA-A, HLA-DRA, HLA-E, HM74, HMOXI, HSP90, HUMCYT2A, ICEBERG, ICOSL, ID2, IFN-a, IFNA1, IFNA2, IFNA4, IFNA5, EFNA6, BFNA7, IFNB1, IFNgamma, IFNW1, IGBP1, IGF1, IGFIR, IGF2, IGFBP2, IGFBP3, IGFBP6, DL-1, ILIO, ILIORA, ILIORB, IL-1, IL1R1 (CD121a), IL1R2(CD121b), IL-IRA, IL-2, IL2RA (CD25), IL2RB(CD122), IL2RG(CD132), IL-4, IL-4R(CD123), IL-5, IL5RA(CD125), IL3RB(CD131), IL-6, IL6RA, (CD126), IR6RB(CD130), IL-7, IL7RA(CD127), IL-8, CXCR1 (IL8RA), CXCR2, (IL8RB/CD128), IL-9, IL9R(CD129), IL-10, IL10RA(CD210), IL10RB(CDW210B), IL-11, IL11RA, IL-12, IL-12A, IL-12B, IL-12RB1, IL-12RB2, IL-13, IL13RA1, IL13RA2, IL14, IL15, IL15RA, IL16, IL17, IL17A, IL17B, IL17C, IL17R, IL18, IL18BP, IL18R1, IL18RAP, IL19, ILIA, ILIB, ILIF10, ILIF5, IL1F6, ILIF7, IL1F8, DL1F9, ILIHY1, ILIR1, IL1R2, ILIRAP, ILIRAPLI, ILIRAPL2, ILIRL1, IL1RL2, ILIRN, IL2, IL20, IL20RA, IL21R, IL22, IL22R, IL22RA2, IL23, DL24, IL25, IL26, IL27, IL28A, IL28B, IL29, IL2RA, IL2RB, IL2RG, IL3, IL30, IL3RA, IL4, 1L4, IL6ST (glucoproteína 130), ILK, INHA, INHBA, INSL3, INSL4, IRAK1, IRAK2, ITGA1, ITGA2, ITGA3, ITGA6 (integrina a6), ITGAV, ITGB3, ITGB4 (integrina p4), JAG1, JAK1, JAK3, JTB, JUN, K6HF, KAI1, KDR, KITLG, KLF5 (GC Box BP), KLF6, KLK10, KLK12, KLK13, KLK14, KLK15, KLK3, KLK4, KLK5, KLK6, KLK9, KRT1, KRT19 (queratina 19), KRT2A, KRTHB6 (queratina tipo II específica para el cabello), LAMAS, LEP (leptina), Lingo-p75, LingoTroy, LPS, L<t>A (TNF-b), LTB, LTB4R (GPR16), LTB4R2, LTBR, MACMARCKS, MAG<o>OMgp, MAP2K7 (c-Jun), MCP-1, MDK, MIB1, midkine, MIF, MISRII, MJP-2, MK, MKI67 (Ki-67), MMP2, MMP9, MS4A1, MSMB, MT3 (metalotionectina-UI), mTOR, MTSS1, MUC1 (mucina), MYC, MYD88, NCK2, neurocan, NFKBI, NFKB2, NGFB (NGF), NGFR, NgR-Lingo, NgRNogo66, (Nogo), NgR-p75, NgR-Troy, NMEI (NM23A), NOTCH, NOTCH1, NOX5, NPPB, NROB1, NROB2, NRID1, NRID2, NRIH2, NRIH3, NRIH4, NR112, NR113, NR2C1, NR2C2, NR2E1, NR2E3, NR2F1, NR2F2, NR2F6, NR3C1, NR3C2, NR4A1, NR4A2, NR4A3, NR5A1, NR5A2, NR6A1, NRP1, NRP2, NT5E, NTN4,<o d z>1,<o p r d i>, P2RX7,<p a p>,<p a r t>1,<p a t e>,<p a w r>,<p c a>3,<p c d g f>,<p c n a>,<p d g f a>,<p d g f b>,<p d g f r a>, PDGFRB, PECAMI, peg-asparaginasa, PF4 (CXCL4), PGF, PGR, fosfacano, PIAS2, PI3 quinasa, PIK3CG, PLAU (uPA), PLG, PLXDC1, PKC, PKC-beta, PPBP (CXCL7), PPID, PR1, PRKCQ, PRKD1, PRL, PROC, PROK2, PSAP, PSCA, PTAFR, PTEN, PTGS2 (COX-2), PTN, RAC2 (P21Rac2), RANK, ligando RANK, RARB, RGS1, RGS13, RGS3, RNF110 (ZNF144), Ron, R0B02, RXR, S100A2, SCGB 1D2 (lipofilina B), SCGB2A1 (mamaglobina 2), SCGB2A2 (mamaglobina 1), SCYE1 (citocina endotelial activadora de monocitos), Sd F2, SERPENA1, SERPINA3, SERPINB5 (maspin), SERPINEI (PAI-I), SERPINFI, SHIP-1, SHIP-2, SHB1, SHB2, SHBG, SfcAZ, SLC2A2, SLC33A1, SLC43A1, SLIT2, SPP1, SPRR1B (Spr1), ST6GAL1, STAB1, STATE, STEAP, STEAP2, TB4R2, t b x 21, t c p 1O, t d g f 1, t e k , t g f a , t g f b 1, t g f b 1I1, t g f b 2, t g f b 3, t g f b i, TGFBR1, TGFBR2, TGFBR3, THIL, THBS1 (trombospondina-1), THBS2, THBS4, THPO, TIE (Tie-1), TIMP3, factor tisular, TLR1, TLR2, TLR3, TLR4, TLR5, TLR6, TLR7, TLR8, TLR9, TLR10, TLR11, TNF, TNF-q, TNFAIP2 (B94), TNFAIP3, TNFRSFI1A, TNFRSF1A, TNFRSF1B, TNFRSF21, TNFRSF5, TNFRSF6 (Fas), TNFRSF7, TNFRSF8, TNFRSF9, TNFSF10 (TRAIL), TNFSF11 (t r a n c e ), TNFSF12 (AP03L), TNFSF13 (abril), TNFSF13B, TNFSF14 (HVEM-L), TNFRSF14 (HVEM), TNFSF15 (VEGI), TNFSF18, TNFSF4 (ligando 0X40), TNFSF5 ( ligando CD40), TNFSF6 (FasL), TNFSF7 (ligando CD27), TNFSF8 (ligando CD30), TNFSF9 (ligando 4-IBB), TOLLIP, Receptores de tipo T<o>II, T0P2A (topoisomerasa lia), TP53, TPMI, TPM2, TRADD, TRAF1, TRAF2, TRAF3, TRAF4, TRAPS, TRAF6, TRKA, TREM1, TREM2, TRPC6, TSLP, TWEAK, tirosinasa, uPAR, VEGF, VEGFB, VEGFC, versican, VHL C5, VLA-4, Wnt-1, XCL1 (linfotactina), XCL2 (SCM-lb), XCRl (GPR5/CCXCR1), YY1, ZFPM2, CLEC4C (BDCA-2, DLEC, CD303, CLECSF7), CLEC4D (MCL, CLECSF8), CLEC4E (Mincle), CLEC6A (dectina 2), CLECSA (MDL-1, CLECSF5), CLEC1B (CLEC-2), CLEC9A (DNGR-1), CLEC7A (dectina 1), PDGFRa, SLAMF7, GP6 (GPVI), LILRA1 (CD85I), LILRA2 (CD85H, ILT1), LILRA4 (CD85G, ILT7), LILRA5 (CD85F, ILT11), LILRA6 (CD85b, ILT8), NCR1 (CD335, LY94, NKp46), NCR3 (CD335, LY94, NKp46), NCR3 (CD337, NKp30), OSCAR, TARM1, CD300C, CD300E, CD300LB (CD300B), CD300LD (CD300D), KIR2DL4 (CD158D), KIR2DS, KLRC2 (CD159C, NKG2C), KLRK1 (CD314, NKG2D), NCR2 (CD336, NKp44), PILRB, SIGLEC1 (CD169, SN), SIGLEC14, SIGLEC15 (CD33L3), SIGLEC16, SIRPB1 (CD172B), TREM1 (CD354), TREM2 y KLRF1 (NKp80).
En algunas realizaciones, el anticuerpo se une a un receptor acoplado a FcRy. En algunas realizaciones, el receptor acoplado a F<c>R<y>se selecciona entre el grupo que consiste en GP6 (GPVI), LILRA1 (CD85I), LILRA2 (CD85H, ILT1), LILRA4 (CD85G, ILT7), LILRA5 (CD85F, ILT11), LILRA6 (CD85b, ILT8), NCR1 (CD335, LY94, NKp46), NCR3 (CD335, LY94, NKp46), NCR3 (CD337, NKp30), OSCAR y TARM1.
En algunas realizaciones, el anticuerpo se une a un receptor acoplado a DAP12. En algunas realizaciones, el receptor acoplado a DAP12 se selecciona entre el grupo que consiste en CD300C, CD300E, CD300LB (CD300B), CD300LD (CD300D), KIR2DL4 (CD158D), KIR2DS, KLRC2 (CD159C, NKG2C), KLRK1 (CD314, NKG2D), NCR2 (CD336, NKp44), PILRB, SIGLEC1 (CD169, SN), SIGLEC14, SIGLEC15 (CD33L3), SIGLEC16, SIRPB1 (CD172B), TREM1 (CD354) y TREM2.
En algunas realizaciones, el anticuerpo se une a un receptor que porta hemITAM. En algunas realizaciones, el receptor que porta hemITAM es KLr F1 (NKp80).
En algunas realizaciones, el anticuerpo es capaz de unirse a una o más dianas seleccionadas entre CLEC4C (BDCA-2, DLEC, CD303, CLECSF7), CLEC4D (MCL, CLECSF8), CLEC4E (Mincle), CLEC6A (dectina 2), CLEC5A (MDL-1, CLECSF5), CLEC1B (CLEC-2), CLEC9A (DNGR-1) y CLEC7A (dectina 1). En algunas realizaciones, el anticuerpo es capaz de unirse a CLEC6A (dectina 2) o CLEC5A. En algunas realizaciones, el anticuerpo es capaz de unirse a CLe C6A (dectina 2).
En algunas realizaciones, el anticuerpo es capaz de unirse a una o más dianas seleccionadas entre (p. ej., se une específicamente a una diana seleccionada entre): ATP5I (Q06185), OAT (P29758), AIFM1 (Q9Z0X1), AOFA (Q64133), MTDC (P18155), CMC1 (Q8BH59), PREP (Q8K411), YMEL1 (088967), LPPRC (Q6PB66), LONM (Q8CGK3), ACON (Q99KI0), 0D01 (Q60597), IDHP (P54071), ALDH2 (P47738), ATPB (P56480), AATM (P05202), TMM93 (Q9CQW0), ERGI3 (Q9CQE7), RTN4 (Q99P72), CL041 (Q8BQR4), ERLN2 (Q8BFZ9), TERA (Q01853), DAD1 (P61804), CALX (P35564), CALU (035887), VAPA (Q9WV55), MOGS (Q80UM7), GANAB (Q8BHN3), ER01A (Q8R180), UGGG1 (Q6P5E4), P4HA1 (Q60715), HYEP (Q9D379), CALR (P14211), AT2A2 (055143), PDIA4 (P08003), PDIA1 (P09103), PDIA3 (P27773), PDIA6 (Q922R8), CLH (Q68FD5), PPIB (P24369), TCPG (P80318), M0T4 (P57787), NICA (P57716), BASI (P18572), VAPA (Q9WV55), ENV2 (P11370), VAT1 (Q62465), 4F2 (P10852), ENOA (P17182), ILK (055222), GPNMB (Q99P91), ENV1 (P10404), ER01A (Q8R180), CLH (Q68FD5), DSG1A (Q61495), AT1A1 (Q8VDN2), HY0U1 (Q9JKR6), TRAP1 (Q9CQN1), GRP75 (P38647), ENPL (P08113), CH60 (P63038) y CH10 (Q64433). En la lista anterior, los números de acceso se muestran entre paréntesis.
En algunas realizaciones, el anticuerpo se une a un antígeno seleccionado entre CDH1, CD19, CD20, CD29, CD30, CD38, CD40, CD47, EpCAM, MUC1, MUC16, EGFR, Her2, SLAMF7 y gp75. En algunas realizaciones, el antígeno se selecciona entre CD19, CD20, CD47, EpCAM, MUC1, MUC16, EGFR y Her2. En algunas realizaciones, el anticuerpo se une a un antígeno seleccionado entre el antígeno Tn y el antígeno de Thomsen-Friedenreich.
En algunas realizaciones, el anticuerpo<o>proteína de fusión F<c>se selecciona entre: abagovomab, abatacept (también conocido como ORENCIAtm), abciximab (también conocido como RE0PR0™, c7E3 Fab), adalimumab (también conocido como HUMIRA™), adecatumumab, alemtuzumab (también conocido como CAMPATH™, MabCampath o Campath-IH), altumomab, afelimomab, anatumomab mafenatox, anetumumab, anrukizumab, apolizumab, arcitumomab, aselizumab, atlizumab, atorolimumab, bapineuzumab, basiliximab (también conocido como SIMULECT™), bavituximab, bectumomab (también conocido como LYMPHOSCAN™), belimumab (también conocido como LYMPHO-STAT-B™), bertilimumab, besilesomab, bevacizumab (también conocido como AVASTIN™), biciromab brallobarbital, bivatuzumab mertansina, campath, canakinumab (también conocido como ACZ885), cantuzumab mertansina, capromab (también conocido como PROSTASCINT™), catumaxomab (también conocido como REMOVAB™), cedelizumab (también conocido como CIMZIA™), certolizumab pegol, cetuximab (también conocido como ERBITUX™), clenoliximab, dacetuzumab, dacliximab, daclizumab (también conocido como ZENAPAX™), denosumab (también conocido como AMG 162), detumomab, dorlimomab aritox, dorlixizumab, duntumumab, durimulumab, durmulumab, ecromeximab, eculizumab (también conocido como SOLIRIS™), edobacomab, edrecolomab (también conocido como Mab17-1A, PANOR<e>X™), efalizumab (también conocido como RAPTIVA™), efungumab (también conocido como MYCOGRAB™), elsilimomab, enlimomab pegol, epitumomab cituxetan, efalizumab, epitumomab, epratuzumab, erlizumab, ertumaxomab (también conocido como REXOMUN™), etanercept (también conocido como ENBREL™), etaracizumab (también conocido como etaratuzumab, VIT<a>X<i>N™, ABE<g>R<i>N™), exbivirumab, fanolesomab (también conocido como NEUTROSPEC™), faralimomab, felvizumab, fontolizumab (también conocido como HUZAF™), galiximab, gantenerumab, gavilimomab (también conocido como ABXCBL™), gemtuzumab ozogamicina (también conocido como MYLOTARG™), golimumab (también conocido como CNTO 148), gomiliximab, ibalizumab (también conocido como TNX-355), ibritumomab tiuxetan (también conocido como ZEVALIN™), igovomab, imciromab, infliximab (también conocido como REMICADE™), inolimomab, inotuzumab ozogamicina, ipilimumab (también conocido como MDX-010, MDX-101), iratumumab, keliximab, labetuzumab, lemalesomab, lebrilizumab, lerdelimumab, lexatumumab (también conocido como HGSETR2, ETR2-ST01), lexitumumab, libivirumab, lintuzumab, lucatumumab, lumiliximab, mapatumumab (también conocido como HGSETR1, TRM-1), maslimomab, matuzumab (también conocido como EMD72000), mepolizumab (también conocido como BOSATRIA™), metelimumab, milatuzumab, minretumomab, mitumomab, morolimumab, motavizumab (también conocido como NUMAX™), muromonab (también conocido como OKT3), nacolomab tafenatox, naptumomab estafenatox, natalizumab (también conocido como TYSABRI™, ANTEGREN™), nebacumab, nerelimomab, nimotuzumab (también conocido como THERACIM hR3™, THERA-CIM-hR3™, THERALOC™), nofetumomab merpentan (también conocido como VERLUMA™), ocrelizumab, odulimomab, ofatumumab, omalizumab (también conocido como XOLAIR™), oregovomab (también conocido como OVAREX™), otelixizumab, pagibaximab, palivizumab (también conocido como SYNAGIS™), panitumumab (también conocido como ABX-Eg F, VECTIBIX™), pascolizumab, pemtumomab (también conocido como THERAGYNtm), pertuzumab (también conocido como 2C4, OMNITARG™), pexelizumab, pintumomab, priliximab, pritumumab, ranibizumab (también conocido como LUCENTIS™), raxibacumab, regavirumab, reslizumab, rituximab (también conocido como RITUXAN™, MabTHERA™), rovelizumab , ruplizumab, satumomab, sevirumab, sibrotuzumab, siplizumab (también conocido como MEDI-507), sontuzumab, stamulumab (también conocido como MYO-029), sulesomab (también conocido como LEUKOSCAN™), tacatuzumab tetraxetan, tadocizumab, talizumab, taplitumomab paptox, tefibazumab (también conocido como AUREXIS™), telimomab aritox, teneliximab, teplizumab, ticilimumab, tocilizumab (también conocido como ACTEMRA™), toralizumab, tositumomab, trastuzumab (también conocido como HERCEPTIN™), tremelimumab (también conocido como CP-675.206), tucotuzumab celmoleukin, tuvirumab, urtoxazumab, ustekinumab (también conocido como CNTO 1275), vapaliximab, veltuzumab, vepalimomab, visilizumab (también conocido como NUVION™), volociximab (también conocido como M200), votumumab (también conocido como HUMASPECT™), zalutumumab, zanolimumab (también conocido como H<u>MAXCD4), ziralimumab, zolimomab aritox, daratumumab, elotuxumab, obintunzumab, olaratumab, brentuximab vedotin, afibercept, abatacept, belatacept, afibercept, etanercept, romiplostim, SBT-040 (secuencias enumeradas en el documento US 2017/0158772). En algunas realizaciones, el anticuerpo es rituximab.
Inhibidores de puntos de control
Se contempla el uso de cualquier inhibidor de puntos de control inmunitario adecuado con los inmunoconjugados descritos en la presente memoria. En algunas realizaciones, el inhibidor de puntos de control inmunitario reduce la expresión<o>actividad de una<o>más proteínas de puntos de control inmunitario. En otra realización, el inhibidor de puntos de control inmunitario reduce la interacción entre una o más proteínas de puntos de control inmunitario y sus ligandos. En los métodos descritos en la presente memoria también se pueden usar ácidos nucleicos inhibidores que disminuyen la expresión y/o actividad de las moléculas de puntos de control inmunitario.
L<os>datos de la presente memoria muestran que el inhibidor del punto de control inmunitario Nivolumab, que normalmente es una lgG4, puede modificarse para incluir una Fc de lgG1 y posteriormente convertirse en un inmunoconjugado de la invención. Los datos indican que el inmunoconjugado nivolumab lgG1 sigue siendo muy potente. De forma parecida, cuando la lgG1 NQ Fc del atezolizumab de grado clínico se reemplazó por lgG1, se obtuvieron mejores resultados. (véanse las figuras 97A-97H).
La mayoría de los anticuerpos de punto de control están diseñados para no tener función efectora, ya que no intentan matar células, sino bloquear la señalización. Los inmunoconjugados de la presente invención pueden volver a añadir la "funcionalidad efectora" necesaria para activar la inmunidad mieloide. A<sí>pues, para la mayoría de los inhibidores de anticuerpos de punto de control, esta detección será fundamental.
En algunas realizaciones, el inhibidor del punto de control inmunitario es el antígeno 4 de linfocitos T citotóxicos (CTLA4, también conocido como CD152), un inmunorreceptor de células T con dominios Ig e ITIM (TIGIT), una proteína relacionada con TNFR inducida por glucocorticoides (GITR, también conocida como TNFRSF18), coestimulador de células T inducible (ICOS, también conocido como CD278), CD96, relacionado con el receptor de poliovirus 2 (PVRL2, también conocido como CD112R, proteína de muerte celular programada 1 (PD-1, también conocida como CD279), ligando 1 de muerte celular programada 1 (PD-L1, también conocido como B7-H3 y CD274), ligando 2 de muerte celular programada (<p>D-L2, también conocido como B7-DC y CD273), gen de activación de linfocitos 3 (LAG-3, también conocido como CD223), B7-H4, receptor de inmunoglobulina asesina (KIR), elemento 4 de la superfamilia del receptor del factor de necrosis tumoral (<t>N<f>RSF4, también conocido como 0X40 y CD134) y su ligando OX40L (CD252), indoleamina 2,3-dioxigenasa 1 (|Do -1), indoleamina 2,3-dioxigenasa 2 (ID0-2), molécula de adhesión celular relacionada con el antígeno carcinoembrionario 1 (CEACAM1), atenuador de linfocitos B y T (BTLA, también conocido como CD272), proteína de membrana de células T 3 (TIM3) , el receptor de adenosina A2A (A2Ar) y el supresor del dominio V de la Ig en la activación de células T (proteína VISTA). En algunas realizaciones, el inhibidor del punto de control inmunitario es un inhibidor de CTLA4, PD-1 o PD-L1.
En algunas realizaciones, el anticuerpo se selecciona de: ipilimumab (también conocido como Yervoy®) pembrolizumab (también conocido como Keytruda®), nivolumab (también conocido como Opdivo®), atezolizumab (también conocido como Tecentrig®), avelumab (también conocido como Bavencio®) y durvalumab (también conocido como Imfinzi™). En algunas realizaciones, el anticuerpo se selecciona de: ipilimumab (también conocido como Yervoy®), pembrolizumab (también conocido como Keytruda®), nivolumab (también conocido como Opdivo®) y atezolizumab (también conocido como Tecentrig®).
En algunas realizaciones, el inhibidor del punto de control inmunitario es un inhibidor de CTLA4. En algunas realizaciones, el inhibidor del punto de control inmunitario es un anticuerpo contra CTLA4. En algunas realizaciones, el inhibidor del punto de control inmunitario es un anticuerpo monoclonal contra CTLA4. En algunas realizaciones, el inhibidor del punto de control inmunitario es un anticuerpo humano o humanizado contra CTLA4.
En algunas realizaciones, el inhibidor de puntos de control inmunitario reduce la expresión o actividad de una o más proteínas de puntos de control inmunitario, tales como CTLA4.
En algunas realizaciones, el inhibidor del punto de control inmunitario es un inhibidor de PD-1. En algunas realizaciones, el inhibidor del punto de control inmunitario es un anticuerpo contra PD-1. En algunas realizaciones, el inhibidor del punto de control inmunitario es un anticuerpo monoclonal contra PD-1. En algunas realizaciones, el inhibidor del punto de control inmunitario es un anticuerpo humano<o>humanizado contra PD-1. En algunas realizaciones, el inhibidor de puntos de control inmunitario reduce la expresión o actividad de una o más proteínas de puntos de control inmunitario, tales como PD-1.
En algunas realizaciones, el inhibidor del punto de control inmunitario es un inhibidor de PD-L1. En algunas realizaciones, el inhibidor del punto de control inmunitario es un anticuerpo contra PD-L1. En algunas realizaciones, el inhibidor del punto de control inmunitario es un anticuerpo monoclonal contra PD-L1. En algunas realizaciones, el inhibidor del punto de control inmunitario es un anticuerpo humano<o>humanizado contra PD-L1. En algunas realizaciones, el inhibidor de puntos de control inmunitario reduce la expresión o actividad de una o más proteínas de puntos de control inmunitario, tales como PD-L1. En algunas realizaciones, el inhibidor del punto de control inmunitario reduce la interacción entre PD-1 y PD-L1.
En algunas realizaciones, el inhibidor del punto de control inmunitario es un inhibidor de PD-L2. En algunas realizaciones, el inhibidor del punto de control inmunitario es un anticuerpo contra PD-L2. En algunas realizaciones, el inhibidor del punto de control inmunitario es un anticuerpo monoclonal contra PD L2. En algunas realizaciones, el inhibidor del punto de control inmunitario es un anticuerpo humano<o>humanizado contra PD-L2. En algunas realizaciones, el inhibidor de puntos de control inmunitario reduce la expresión o actividad de una o más proteínas de puntos de control inmunitario, tales como PD-L2. En algunas realizaciones, el inhibidor del punto de control inmunitario reduce la interacción entre PD-1 y PD-L2.
En algunas realizaciones, el inhibidor del punto de control inmunitario es un inhibidor de LAG-3. En algunas realizaciones, el inhibidor del punto de control inmunitario es un anticuerpo contra LAG-3. En algunas realizaciones, el inhibidor del punto de control inmunitario es un anticuerpo monoclonal contra LAG-3. En algunas realizaciones, el inhibidor del punto de control inmunitario es un anticuerpo humano o humanizado contra LAG-3. En algunas realizaciones, el inhibidor de puntos de control inmunitario reduce la expresión<o>actividad de una<o>más proteínas de puntos de control inmunitario, tales como LAG-3.
En algunas realizaciones, el inhibidor del punto de control inmunitario es un inhibidor de B7-H4. En algunas realizaciones, el inhibidor del punto de control inmunitario es un anticuerpo contra B7-H4. En algunas realizaciones, el inhibidor del punto de control inmunitario es un anticuerpo monoclonal contra B7-H4. En algunas realizaciones, el inhibidor del punto de control inmunitario es un anticuerpo humano<o>humanizado contra B7-H4. En algunas realizaciones, el inhibidor de puntos de control inmunitario reduce la expresión<o>actividad de una<o>más proteínas de puntos de control inmunitario, tales como B7-H4.
En algunas realizaciones, el inhibidor del punto de control inmunitario es un inhibidor de KIR. En algunas realizaciones, el inhibidor del punto de control inmunitario es un anticuerpo contra KIR. En algunas realizaciones, el inhibidor del punto de control inmunitario es un anticuerpo monoclonal contra KIR. En algunas realizaciones, el inhibidor del punto de control inmunitario es un anticuerpo humano o humanizado contra KIR. En algunas realizaciones, el inhibidor de puntos de control inmunitario reduce la expresión<o>actividad de una<o>más proteínas de puntos de control inmunitario, tales como KIR.
En algunas realizaciones, el inhibidor del punto de control inmunitario es un inhibidor de TNFRSF4. En algunas realizaciones, el inhibidor del punto de control inmunitario es un anticuerpo contra TNFRSF4. En algunas realizaciones, el inhibidor del punto de control inmunitario es un anticuerpo monoclonal contra TNFRSF4. En algunas realizaciones, el inhibidor del punto de control inmunitario es un anticuerpo humano o humanizado contra TNFRSF4. En algunas realizaciones, el inhibidor de puntos de control inmunitario reduce la expresión<o>actividad de una o más proteínas de puntos de control inmunitario, tales como TNFRSF4.
En algunas realizaciones, el inhibidor del punto de control inmunitario es un inhibidor de OX40L. En algunas realizaciones, el inhibidor del punto de control inmunitario es un anticuerpo contra OX40L. En algunas realizaciones, el inhibidor del punto de control inmunitario es un anticuerpo monoclonal contra OX40L. En algunas realizaciones, el inhibidor del punto de control inmunitario es un anticuerpo humano<o>humanizado contra OX40L. En algunas realizaciones, el inhibidor de puntos de control inmunitario reduce la expresión o actividad de una o más proteínas de puntos de control inmunitario, tales como OX40L. En algunas realizaciones, el inhibidor del punto de control inmunitario reduce la interacción entre TNFRSF4 y OX40L.
En algunas realizaciones, el inhibidor del punto de control inmunitario es un inhibidor de IDO-1. En algunas realizaciones, el inhibidor del punto de control inmunitario es un anticuerpo contra IDO-1. En algunas realizaciones, el inhibidor del punto de control inmunitario es un anticuerpo monoclonal contra IDO-1. En algunas realizaciones, el inhibidor del punto de control inmunitario es un anticuerpo humano o humanizado contra IDO-1. En algunas realizaciones, el inhibidor de puntos de control inmunitario reduce la expresión<o>actividad de una<o>más proteínas de puntos de control inmunitario, tales como IDO-1.
En algunas realizaciones, el inhibidor del punto de control inmunitario es un inhibidor de IDO-2. En algunas realizaciones, el inhibidor del punto de control inmunitario es un anticuerpo contra IDO-2. En algunas realizaciones, el inhibidor del punto de control inmunitario es un anticuerpo monoclonal contra IDO-2. En algunas realizaciones, el inhibidor del punto de control inmunitario es un anticuerpo humano<o>humanizado contra IDO-2. En algunas realizaciones, el inhibidor de puntos de control inmunitario reduce la expresión o actividad de una o más proteínas de puntos de control inmunitario, tales como IDO-2.
En algunas realizaciones, el inhibidor del punto de control inmunitario es un inhibidor de CEACAM1. En algunas realizaciones, el inhibidor del punto de control inmunitario es un anticuerpo contra CEACAM1. En algunas realizaciones, el inhibidor del punto de control inmunitario es un anticuerpo monoclonal contra CEACAM1. En algunas realizaciones, el inhibidor del punto de control inmunitario es un anticuerpo humano o humanizado contra CEACAM1. En algunas realizaciones, el inhibidor de puntos de control inmunitario reduce la expresión o actividad de una<o>más proteínas de puntos de control inmunitario, tales como CEACAM1.
En algunas realizaciones, el inhibidor del punto de control inmunitario es un inhibidor de BTLA. En algunas realizaciones, el inhibidor del punto de control inmunitario es un anticuerpo contra BTLA. En algunas realizaciones, el inhibidor del punto de control inmunitario es un anticuerpo monoclonal contra BTLA. En algunas realizaciones, el inhibidor del punto de control inmunitario es un anticuerpo humano<o>humanizado contra BTLA. En algunas realizaciones, el inhibidor de puntos de control inmunitario reduce la expresión o actividad de una o más proteínas de puntos de control inmunitario, tales como BTLA.
En algunas realizaciones, el inhibidor del punto de control inmunitario es un inhibidor de TIM3. En algunas realizaciones, el inhibidor del punto de control inmunitario es un anticuerpo contra TIM3. En algunas realizaciones, el inhibidor del punto de control inmunitario es un anticuerpo monoclonal contra TIM3. En algunas realizaciones, el inhibidor del punto de control inmunitario es un anticuerpo humano<o>humanizado contra TIM3. En algunas realizaciones, el inhibidor de puntos de control inmunitario reduce la expresión o actividad de una o más proteínas de puntos de control inmunitario, tales como TIM3.
En algunas realizaciones, el inhibidor del punto de control inmunitario es un inhibidor de A2Ar. En algunas realizaciones, el inhibidor del punto de control inmunitario es un anticuerpo contra A2Ar. En algunas realizaciones, el inhibidor del punto de control inmunitario es un anticuerpo monoclonal contra A2Ar. En algunas realizaciones, el inhibidor del punto de control inmunitario es un anticuerpo humano o humanizado contra A2Ar. En algunas realizaciones, el inhibidor de puntos de control inmunitario reduce la expresión<o>actividad de una<o>más proteínas de puntos de control inmunitario, tales como A2Ar.
En algunas realizaciones, el inhibidor del punto de control inmunitario es un inhibidor de la proteína VISTA. En algunas realizaciones, el inhibidor del punto de control inmunitario es un anticuerpo contra la proteína VISTA. En algunas realizaciones, el inhibidor del punto de control inmunitario es un anticuerpo monoclonal contra la proteína VISTA. En algunas realizaciones, el inhibidor del punto de control inmunitario es un anticuerpo humano o humanizado contra la proteína VISTA. En algunas realizaciones, el inhibidor de puntos de control inmunitario reduce la expresión o actividad de una o más proteínas de puntos de control inmunitario, tales como la proteína v is t a .
Biosimilares
L<os>inmunoconjugados de la presente invención también son eficaces con constructos de anticuerpos que son muy similares,<o>biosimilares, a los constructos de anticuerpos "innovadores"<o>disponibles comercialmente. Por ejemplo, se usaron anticuerpos biosimilares contra cetuximab, rituximab y trastuzumab en varios inmunoconjugados satisfactorios como se describe en la presente memoria y se observa en las figuras 71A-71AQ. Los inmunoconjugados biosimilares desencadenaron la activación mieloide con la misma eficacia que los anticuerpos disponibles comercialmente. A partir de estos estudios, se espera que los inmunoconjugados biosimilares funcionen de forma parecida a los inmunoconjugados de los productos innovadores.
Proporciones de DAR
Los inmunoconjugados de la presente invención proporcionan proporciones de DAR que son deseables. Como se muestra en las figuras 84A-87C, Ios inmunoconjugados según se describen en la presente memoria tienen proporciones de DAR de 0.7, 1.6 y 2.5.
L<os>inmunoconjugados mostrados con proporciones de DAR variables fueron todos eficaces a la hora de activar las células mieloides y desencadenar la secreción de citocinas. L<os>datos indican que I<os>inmunoconjugados con proporciones de DAR variables fueron todos superiores a la hora de provocar la activación de APC, ya que la CD40, CD86 y HLA-DR se expresaron en niveles más altos en las APC estimuladas con inmunoconjugados en comparación con aquellas estimuladas solo con el anticuerpo. L<os>inmunoconjugados con diferentes DAR indujeron sistemáticamente la regulación por disminución de c D14 y CD16 y una mayor expresión de CD123, en comparación con el anticuerpo solo. A partir de estos estudios, se espera que todas las proporciones de DAR sean eficaces a la hora de provocar la activación de las células mieloides.
Modificación del isotipo
Los datos de la presente memoria muestran (véanse las figuras 88C-88H) que cuando la reglón Fc de IgGI del anticuerpo, tal como rituximab, se intercambia por IgGI AF, IgGI NQ, lgG2, lgG3, lgG4<o>lgA2, y luego se forma en un inmunoconjugado de la presente invención, la actividad del inmunoconjugado puede modularse y, a menudo, mejorarse, para la aplicación deseada.
Alrededor del 30 % de la IgG humana está glicosilada dentro de la región Fab, y el anticuerpo en los inmunoconjugados de la invención puede contener una región Fab genomanipulada con un patrón de glicosilación que no existe de manera natural. Por ejemplo, las hibridomas pueden manipularse genéticamente para secretar mAb afucosilado, mAb desialilado<o>F<c>desglicosilado con mutaciones específicas que permiten una mayor unión a FcRyllla y una mayor función efectora.
Los anticuerpos para formar inmunoconjugados pueden contener residuos de cisterna genomanipulados (es decir, que no existen de manera natural) caracterizados por una reactividad alterada (p. ej., mejorada) hacia los reactivos usados para unir de forma covalente los adyuvantes a los anticuerpos. En determinadas realizaciones, un residuo de cisterna genomanipulado tendrá un valor de reactividad del tiol en el intervalo de 0.6 a 1.0. En muchos casos, el anticuerpo genomanipulado será más reactivo que el anticuerpo original.
En general, los residuos genomanipulados son residuos "libres" de cisterna que no forman parte de puentes disulfuro. El término "valor de reactividad del tiol" es una caracterización cuantitativa de la reactividad de los aminoácidos libres de cisterna. Tal como se usa en la presente memoria, el término "valor de reactividad del tiol" se refiere al porcentaje de un aminoácido libre de cisterna en un anticuerpo genomanipulado que reacciona con un reactivo tiol-reactivo y se convierte a un valor máximo de 1. Por ejemplo, un residuo de cisterna en un anticuerpo genomanipulado que reacciona con un rendimiento del 100 % con un reactivo tiol-reactivo, como una maleimida, para formar un anticuerpo modificado tiene un valor de reactividad con tiol de 1.0. Otro residuo de cisterna modificado genéticamente en el mismo anticuerpo original<o>en uno diferente que reacciona con un rendimiento del 80 % con un reactivo tiol-reactivo tiene un valor de reactividad del tiol de 0.8. La determinación del valor de reactividad del tiol de un residuo de cisterna concreto se puede realizar mediante ensayo ELISA, espectroscopia de masas, cromatografía de líquidos, autorradiografia u otras pruebas analíticas cuantitativas.
Los residuos de cisterna genomanipulados pueden ubicarse en las cadenas pesadas del anticuerpo o en las cadenas ligeras del anticuerpo. En determinadas realizaciones, los residuos de cisterna genomanipulados se localizan en la región Fc de las cadenas pesadas. Por ejemplo, residuos de aminoácidos en las posiciones L-15, L-43, L-110, L-144, L-168 en las cadenas ligeras de un anticuerpo o H-40, H-88, H-119, H-121, H-122, H-175 y H-179 en las cadenas pesadas de un anticuerpo se pueden reemplazar por residuos de cisterna. Los intervalos alrededor de 5 residuos de aminoácidos a cada lado de estas posiciones también se pueden reemplazar por residuos de cisterna, es decir, L-10 a L-20; L-38 a L-48; L-105 a L-115; L-139 a L-149; L-163 a L-173; H-35 a H-45; H-83 a H-93; H-114 a H-127; y H-170 a H-184, asi como los intervalos en la región F<c>seleccionada de H-268 a H-291; H-319 a H-344; H-370 a H-380; y H-395 a H-405, obteniéndose anticuerpos con cisterna genomanipulados útiles para formar inmunoconjugados. Otros anticuerpos diseñados se describen, por ejemplo, en las patentes estadounidenses 7.855.275; 8.309.300 y 9.000.130.
Además de los anticuerpos, se pueden utilizar estructuras de proteínas alternativas como parte de los inmunoconjugados. El término "estructura de proteina alternativa" se refiere a una proteina o péptido no derivado de la inmunoglobulina. Dichas proteínas y péptidos en general son susceptibles a ser manipuladas genéticamente y pueden diseñarse para conferir monoespecificidad contra un antígeno determinado, biespecificidad o multiespecificidad. La manipulación genética de una estructura de proteina alternativa se puede llevar a cabo a partir de varios planteamientos. Se puede utilizar un planteamiento de injerto en bucle en el que se injertan secuencias de especificidad conocida en un bucle variable de una estructura. La aleatorización de secuencias y la mutagénesis se pueden utilizar para desarrollar una biblioteca de mutantes, que se pueden seleccionar utilizando diversas plataformas de presentación (p. ej., presentación en fagos) para identificar un nuevo aglutinante. La mutagénesis específica del sitio también se puede utilizar como parte de un planteamiento parecido. Existen estructuras de proteínas alternativas en una variedad de tamaños, que oscilan entre pequeños péptidos con una estructura secundaria mínima hasta proteínas grandes de tamaño parecido a un anticuerpo de tamaño completo. L<os>ejemplos de estructuras incluyen, pero no se limitan a, miniproteínas anudadas con cistina (también conocidas como knottinas), miniproteínas anudadas con cistina cíclica (también conocidas como ciclótidas), avímeros, aficuerpos, el décimo dominio tipo III de la fibronectina humana, DARPins (repeticiones de anquirina diseñadas) y anticalinas (también conocidas como lipocalinas). También se pueden manipular genéticamente ligandos que existen de manera natural con especificidad conocida para conferir una nueva especificidad contra una diana determinada. Ejemplos de ligandos que existen de manera natural que pueden manipularse genéticamente incluyen el ligando de EGF y el ligando de VEGF. Las proteínas genomanipuladas pueden producirse como proteínas monoméricas<o>como multímeros, dependiendo de la estrategia de unión y las especificidades deseadas. Se pueden utilizar estrategias de manipulación genética de proteínas para fusionar estructuras de proteínas alternativas a dominios F<c>.
Preparación de conjugados de adyuvantes de anticuerpos
Las reacciones para formar los inmunoconjugados de la invención se llevan a cabo en condiciones suficientes para unir de forma covalente el adyuvante al anticuerpo. En general, las reacciones se llevan a cabo poniendo en contacto un anticuerpo con un compuesto enlazador-adyuvante de modo que una cadena lateral de aminoácido en el anticuerpo reacciona con el compuesto enlazador-adyuvante. En algunas realizaciones, el compuesto enlazador-adyuvante y el anticuerpo se usan en cantidades aproximadamente equimolares al formar los inmunoconjugados. En algunas realizaciones, se usa un exceso del compuesto enlazador-adyuvante al formar los inmunoconjugados. Por ejemplo, una mezcla de reacción para formar un inmunoconjugado puede contener de aproximadamente 1.1 a aproximadamente 50 equivalentes molares del compuesto adyuvante-enlazador en relación con el anticuerpo.
Las reacciones se pueden llevar a cabo a cualquier temperatura adecuada. En general, las reacciones se llevan a cabo a una temperatura de aproximadamente 4 °C a aproximadamente 40 °C. Las reacciones se pueden llevar a cabo, por ejemplo, a aproximadamente 25 °C<o>aproximadamente 37 °C. Las reacciones se pueden llevar a cabo a cualquier pH adecuado. En general, las reacciones se llevan a cabo a un pH de aproximadamente 4.5 a aproximadamente 10. Las reacciones se pueden llevar a cabo, por ejemplo, a un pH de aproximadamente 5 a aproximadamente 9. En algunas realizaciones, la reacción se lleva a cabo a un pH casi neutro (es decir, alrededor de pH 7). En algunas realizaciones, la reacción se lleva a cabo a un pH que oscila entre 7.2 y 7.5. Las reacciones se pueden llevar a cabo durante cualquier período de tiempo adecuado. En general, las mezclas de reacción se incuban en las condiciones adecuadas durante entre aproximadamente 1 minuto y varias horas. Las reacciones se pueden llevar a cabo, por ejemplo, durante aproximadamente 1 minuto, o aproximadamente 5 minutos, o aproximadamente 10 minutos, o aproximadamente 30 minutos, o aproximadamente 1 hora, o aproximadamente 2 horas, o aproximadamente 4 horas, o aproximadamente 8 horas, o aproximadamente 12 horas, o aproximadamente 24 horas, o aproximadamente 48 horas, o aproximadamente 72 horas. Se pueden emplear otras condiciones de reacción en los métodos descritos en la presente memoria, dependiendo de la identidad del anticuerpo en el conjugado y el reactivo utilizado para instalar el adyuvante.
Las mezclas de reacción para formar los conjugados de adyuvante de anticuerpo pueden contener reactivos adicionales del tipo utilizado típicamente en reacciones de bioconjugación. Por ejemplo, en determinadas realizaciones, las mezclas de reacción pueden contener tampones (p. ej., ácido 2-(N-morfolino)etanosulfónico (MES), ácido 2-[4-(2-hidroxietil)piperazin-1il]etanosulfónico (HEPES), ácido 3-morfolinopropano-1-sulfónico (MOPS), fosfato de potasio, fosfato de sodio, solución salina tamponada con fosfato, citrato de sodio, acetato de sodio y borato de sodio), cosolventes (p. ej., dimetilsulfóxido, dimetilformamida, etanol, metanol, tetrahidrofurano, acetona y ácido acético), sales (p. ej., NaCl, KCl, CaCl<2>y sales de Mn2+ y Mg2+), detergentes/tensioactivos (p. ej., un tensioactivo no iónico tal como N,N-bis[3-(D-gluconamido)propil]colamida, polioxietileno (20) cetil éter, óxido de dimetildecilfosfina, octilfenoxi poli(etilenoxi)etanol ramificado, un copolímero de bloques de polioxietilenopolioxipropileno, t-octilfenoxipolietoxietanol, monooleato de polioxietileno (20) sorbitán y similares; un tensioactivo aniónico tal como colato de sodio, N-lauroilsarcosina, dodecilsulfato de sodio y similares; un tensioactivo catiónico tal como bromuro de hexadeciltrimetilamonio, bromuro de trimetil(tetradecil)amonio y similares; o un tensioactivo zwitteriónico tal como amidosulfobetaína, 3-[(3-colamidopropil)dimetil-amonio]-1-propanosulfonato y similares), quelantes (p. ej., etilenglicol-bis(2-aminoetiléter)-N,N,N', N'-ácido tetraacético (EGTA), ácido 2-({2-[bis(carboximetil)amino]etil} (carboximetil)amino)acético (EDTA) y ácido 1,2-bis(o-aminofenoxi)etano-N,N,N ',N '-tetraacético (BAPTA)) y agentes reductores (p. ej., ditiotreitol (DTT), p-mercaptoetanol (BME) y tris(2-carboxietil)fosfina (TCEP)). Se pueden usar tampones, codisolventes, sales, detergentes/tensioactivos, quelantes y agentes reductores en cualquier concentración adecuada, que un experto en la materia puede determinar fácilmente. En general, se incluyen tampones, codisolventes, sales, detergentes/tensioactivos, quelantes y agentes reductores en las mezclas de reacción en concentraciones que oscilan entre aproximadamente 1 pM y aproximadamente 1 M. Por ejemplo, se puede incluir un tampón, un codisolvente, una sal, un detergente/tensioactivo, un quelante<o>un agente reductor en una mezcla de reacción a una concentración de aproximadamente 1 pM, o aproximadamente 10 pM, o aproximadamente 100 pM, o aproximadamente 1 mM, o aproximadamente 10 mM, o aproximadamente 25 mM, o aproximadamente 50 mM, o aproximadamente 100 mM,<o>aproximadamente 250 mM,<o>aproximadamente 500 mM,<o>aproximadamente 1 M.
Formulación y administración de inmunoconjugados
En un aspecto relacionado, la invención proporciona una composición que comprende una pluralidad de inmunoconjugados como se define en las reivindicaciones adjuntas. En algunas realizaciones, el número promedio de adyuvantes por inmunoconjugado oscila entre aproximadamente 1 y aproximadamente 10. El número promedio de adyuvantes por inmunoconjugado puede oscilar, por ejemplo, de aproximadamente 1 a aproximadamente 10,<o>de aproximadamente 1 a aproximadamente 6,<o>de aproximadamente 1 a aproximadamente 4. El número promedio de adyuvantes por inmunoconjugado puede ser aproximadamente 0.8, 1, 1.2, 1.4, 1.6, 1.8, 2, 2.2, 2.4, 2.6, 2.8, 3, 3.2, 3.4, 3.6, 3.8, 4.0 o 4.2. En algunas realizaciones, el número promedio de adyuvantes por inmunoconjugado es de aproximadamente 4. En algunas realizaciones, el número promedio de adyuvantes por inmunoconjugado es de aproximadamente 2. En algunos casos, el anticuerpo está unido de forma covalente a un único adyuvante. En algunos casos, el anticuerpo está unido de forma covalente a 2 o más adyuvantes (p. ej., 3 o más, 4<o>más,<o>5<o>más adyuvantes). En algunos casos, el anticuerpo está unido de forma covalente a 1-10 adyuvantes (p. ej., 1-8, 1-5, 1-3, 2-10, 2-8, 2-5, 2-3 o 3-8 adyuvantes). En algunos casos, el anticuerpo está unido de forma covalente a 2-10 adyuvantes (p. ej., 2-8, 2-5, 2-3, o 3-10, o 3-8 adyuvantes). En algunos casos, en los que el anticuerpo está unido de forma covalente a más de un adyuvante, los adyuvantes unidos pueden ser iguales o diferentes. Por ejemplo, en algunos casos dos o más adyuvantes pueden ser iguales (p. ej., dos moléculas diferentes del mismo adyuvante pueden unirse cada una al anticuerpo en un sitio diferente del anticuerpo). En algunos casos, el anticuerpo está unido de forma covalente a 2<o>más adyuvantes diferentes (p. ej., 3<o>más, 4<o>más, o 5 o más adyuvantes diferentes). Por ejemplo, cuando se genera un inmunoconjugado de la invención, se pueden poner en contacto uno<o>más anticuerpos con una mezcla que incluye dos<o>más (p. ej., 3<o>más, 4<o>más,<o>5<o>más) compuestos enlazador-adyuvante diferentes de modo que las cadenas laterales de aminoácidos en el uno<o>más anticuerpos reaccionan con los compuestos enlazador-adyuvante, lo que da como resultado uno<o>más inmunoconjugados, cada uno de los cuales está unido de forma covalente a dos o más adyuvantes diferentes.
La conjugación de anticuerpos específicos del sitio permite la colocación exacta del adyuvante en el anticuerpo y un DAR homogéneo en comparación con el producto de conjugación heterogéneo resultante de la unión a residuos de lisina en el anticuerpo. Se pueden generar inmunoconjugados específicos del sitio mediante diversas modificaciones del anticuerpo. L<os>métodos para la conjugación específica del sitio incluyen los métodos siguientes, pero no se limitan a los métodos descritos en la presente memoria. Un método para la conjugación específica del sitio implica la incorporación de una secuencia que luego es reconocida por una enzima, lo que resulta en una modificación química. Por ejemplo, la enzima FGE reconoce la secuencia Cys-X-Pro-X-Arg. La coexpresión del anticuerpo modificado junto con FGE en cultivo de mamíferos genera un anticuerpo que contiene una etiqueta de aldehido en el(los) sitio(s) genomanipulado(s). Se pueden usar otras enzimas que reconozcan secuencias o residuos naturales para su conversión en grupos químicamente reactivos que permitan la conjugación específica del sitio. Las transglutaminasas bacterianas (BTG) pueden catalizar la formación de enlaces entre residuos de glutamina y aminas primarias; la enzima bacteriana sortasa A puede catalizar reacciones de transpeptidación a través de un motivo de reconocimiento. También se pueden incorporar aminoácidos no naturales en la secuencia del anticuerpo que luego se pueden hacer reaccionar para generar conjugados específicos del sitio. L<os>residuos naturales, tal como el aminoácido selenocisteina, pueden incorporarse al anticuerpo y posteriormente hacerse reaccionar con los grupos reactivos apropiados que incluyen, pero no se limitan a, maleimidas y yodoacetamidas para la conjugación específica del sitio. Otro método es la incorporación de residuos de cisteína genomanipulados que se añaden a la cadena pesada<o>ligera del constructo del anticuerpo. L<os>vectores que codifican las cadenas pesada y/o ligera se modifican para incorporar la secuencia de codones para un residuo de cisteína (secuencia del vector en las figuras 138A-138B y mapa de vectores en las figuras 138C-138D). La conjugación se realiza reduciendo primero el anticuerpo y luego reoxidándolo para regenerar las uniones disulfuro nativas del anticuerpo, lo que da como resultado el descubrimiento de un tiol reactivo. Una vez que reacciona con el adyuvante-enlazador, el producto resultante contiene una población homogénea de inmunoconjugado con un D<a r>definido por el número de residuos de cisteína genomanipulados en el anticuerpo (estructura que se muestra en la figura 138E). Por ejemplo, la incorporación de una mutación en la cadena ligera en la posición 205 de una valina a cisteína (mutación V205C) da como resultado un producto con el adyuvante conjugado en los sitios definidos (V205C; figuras 138F-138G).
En algunas realizaciones, la composición comprende además uno<o>más excipientes farmacéuticamente aceptables. Por ejemplo, los inmunoconjugados de la invención se pueden formular para la administración parenteral, tal como administración intravenosa (IV)<o>administración en una cavidad corporal<o>lumen de un órgano. De forma alternativa, los inmunoconjugados pueden inyectarse intratumoralmente. Las formulaciones para inyección comprenderán habitualmente una solución del inmunoconjugado disuelta en un vehículo farmacéuticamente aceptable. Entre los vehículos y disolventes aceptables que se pueden emplear se encuentran el agua y la solución de Ringer, un cloruro de sodio isotónico. Además, convencionalmente se pueden emplear aceites fijos estériles como disolvente<o>medio de suspensión. Con esta finalidad, se puede emplear cualquier aceite fijo suave, incluidos monoglicéridos o diglicéridos sintéticos. Además, también se pueden utilizar ácidos grasos tal como el ácido oleico en la preparación de inyectables. Estas soluciones son estériles y en general están libres de materias indeseables. Estas formulaciones pueden esterilizarse mediante técnicas de esterilización convencionales y bien conocidas. Las formulaciones pueden contener sustancias auxiliares farmacéuticamente aceptables según sea necesario para aproximarse a las condiciones fisiológicas tales como agentes reguladores y tamponadores del pH, agentes reguladores de la toxicidad, p. ej., acetato de sodio, cloruro de sodio, cloruro de potasio, cloruro de calcio, lactato de sodio y similares. La concentración del inmunoconjugado en estas formulaciones puede variar ampliamente y se seleccionará principalmente en función de los volúmenes de fluido, viscosidades, peso corporal y similares, según el modo particular de administración seleccionado y las necesidades del paciente. En determinadas realizaciones, la concentración de un inmunoconjugado en una formulación en solución para inyección oscilará entre aproximadamente el 0.1 % (p/p) y aproximadamente el 10 % (p/p).
En otro aspecto, la invención proporciona un inmunoconjugado como se define en las reivindicaciones adjuntas<o>una composición como se define en las reivindicaciones adjuntas para su uso en el tratamiento del cáncer. El tratamiento incluye comprender administrar una cantidad terapéuticamente eficaz del inmunoconjugado (p. ej., como una composición como se define en las reivindicaciones adjuntas) a un sujeto que lo necesita. Por ejemplo, el tratamiento puede incluir la administración del inmunoconjugado obteniéndose una dosis de aproximadamente 100 ng/kg a aproximadamente 50 mg/kg al sujeto. La dosis de inmunoconjugado puede oscilar entre aproximadamente 5 mg/kg y aproximadamente 50 mg/kg, entre aproximadamente 10 pg/kg y aproximadamente 5 mg/kg, o entre aproximadamente 100 pg/kg y aproximadamente 1 mg/kg. La dosis de inmunoconjugado puede ser de aproximadamente 100, 200, 300, 400 o 500 pg/kg. La dosis de inmunoconjugado puede ser de aproximadamente 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 o 10 mg/kg. La dosis de inmunoconjugado también puede estar fuera de estos intervalos, dependiendo del conjugado en particular así como del tipo y gravedad del cáncer que se está tratando. La frecuencia de administración puede oscilar desde una dosis única hasta múltiples dosis por semana<o>con más frecuencia. En algunas realizaciones, el inmunoconjugado se administra de aproximadamente una vez al mes a aproximadamente cinco veces por semana. En algunas realizaciones, el inmunoconjugado se administra una vez por semana.
Algunas realizaciones de la Invención proporcionan el inmunoconjugado o la composición para su uso en el tratamiento del cáncer como se describe anteriormente, en el que el cáncer es un cáncer de cabeza y cuello, El cáncer de cabeza y cuello (así como el carcinoma de células escamosas de cabeza y cuello) se refiere a una variedad de cánceres caracterizados por carcinomas de células escamosas de la cavidad oral, faringe y laringe, glándulas salivales, senos paranasales y cavidad nasal, así como de los ganglios linfáticos de la parte superior del cuello, Los cánceres de cabeza y cuello representan aproximadamente del 3 al 5 por ciento de todos los cánceres en los Estados Unidos, Estos cánceres son más comunes en hombres y en personas mayores de 50 años, El consumo de tabaco (incluido el tabaco sin humo) y alcohol son los factores de riesgo más importantes en el cáncer de cabeza y cuello, en particular los de cavidad oral, orofaringe, hipofaringe y laringe, El ochenta y cinco por ciento de los cánceres de cabeza y cuello están relacionados con el consumo de tabaco, En realizaciones de la invención, los inmunoconjugados se pueden usar para atacar varias células malignas, Por ejemplo, los inmunoconjugados pueden usarse para dirigirse a células epiteliales escamosas del labio, cavidad oral, faringe, laringe, cavidad nasal<o>senos paranasales, L<os>inmunoconjugados se pueden usar para atacar células de carcinoma mucoepidermoide, células de carcinoma adenoide quístico, células de adenocarcinoma, células cancerosas indiferenciadas de células pequeñas, células de estesioneuroblastoma, células de linfoma de Hodgkin y células de linfoma no hodgkiniano, En algunas realizaciones, los usos para tratar el cáncer de cabeza y cuello incluyen la administración de un inmunoconjugado que contiene un anticuerpo que es capaz de unirse a EGFR (p, ej,, cetuximab, panitumumab, matuzumab y zalutumumab), PD-1 (p, ej,, pembrolizumab) y/o MUC1.
Algunas realizaciones de la invención proporcionan el inmunoconjugado o la composición para su uso en el tratamiento del cáncer como se describe anteriormente, en el que el cáncer es cáncer de mama, El cáncer de mama puede originarse en diferentes áreas de la mama y se han caracterizado varios tipos diferentes de cáncer de mama, Por ejemplo, los inmunoconjugados de la invención se pueden usar para tratar el carcinoma ductalin situ;carcinoma ductal invasivo (p, ej,, carcinoma tubular; carcinoma medular; carcinoma mucinoso; carcinoma papilar;<o>carcinoma cribiforme de mama); carcinoma lobulillarin situ;carcinoma lobulillar invasivo; cáncer de mama inflamatorio; y otras formas de cáncer de mama, En algunas realizaciones, los usos para tratar el cáncer de mama incluyen la administración de un inmunoconjugado que contiene un anticuerpo que es capaz de unirse a HER2 (p, ej,, trastuzumab, margetuximab), glucoproteína n Mb (p, ej,, glembatumumab) y/o MUC1.
Ejemplos
Obsérvese que los inmunoconjugados que no se engloban en el alcance de las reivindicaciones no forman parte de la presente invención,
Ejemplo 1, Imidazoquinolinas para la conjugación de anticuerpos
Se sintetizaron compuestos de imidazoquinolina con un grupo amino libre (Compuesto 1) o un grupo maleimida (Compuesto 2) según el esquema 1, lo que permitió la evaluación rápida de la tecnología del enlazador y la eficacia del inmunoconjugado de anticuerpo-adyuvante,
Para determinar si la funcionalización del adyuvante afectaba a la capacidad del compuesto 2<o>del compuesto 1 a la hora de provocar la activación inmunitaria, se estimularon células presentadoras de antígeno humano con diluciones seriadas 10 veces de R848, el compuesto 2, el compuesto 1<o>un agonista de TLR de control, CL307, durante 18 horas antes del análisis mediante citometría de flujo, L<os>datos indicaron que el compuesto 2 y el compuesto 1 se comportaron de forma parecida al R848 en cada concentración analizada (figura 4; los datos del compuesto 1 no se muestran),
A continuación, se analizó directamente la capacidad de cada agonista de TLR funcionalizado para activar TLR7 o TLR8 humanos, Las células HEK293 se cotransfectaron con TLR7 o TLR8 humano o TLR7 murino y un gen indicador de fosfatasa alcalina embrionaria secretada inducible bajo el control del promotor mínimo de IFN-p fusionado a los sitios de unión de NF-kB y AP-1. Posteriormente, las células se incubaron con diluciones seriadas al doble de cada uno de los adyuvantes indicados durante 12 horas a 37 °C en presencia de un sustrato de fosfatasa alcalina, La actividad se midió mediante espectrofotometría (DO 650 nm), L<os>datos indican que el compuesto 1 activó tanto el TLR7 como el TLR8 humanos, mientras que el compuesto 2 era específico para la actividad de TLR7 (figura 2),
De forma parecida, tanto el compuesto 2 como el compuesto 1 activaron el TLR7 murino (figura 2),
Esquema 1
E je m p lo 2. P rep a ra c ión de c o n ju g a d o s de a d yu va n te s de an ticu e rp o s
El co m p u e s to 1 se m od ificó con un re ticu la n te no e sc ind ib le (S M C C , T h e rm o F is h e r S c ien tifie ) y un re ticu la n te e sc in d ib le (S P D P , T h e rm o F is h e r S c ie n tifie ) en la p re pa rac ió n pa ra la co n ju g a c ió n con ritu x im a b según el esq ue m a ge ne ra l de sc rito en el esq u e m a 2 A y el esq u e m a 2B.
E sq u e m a 2 A y 2B
Se conjugaron adyuvantes con una amina libre (R848, el compuesto 1, etc.) con SMCC, SPDP u otros enlazadores que contenían<n>H<s>haciendo reaccionar los compuestos en una relación molar de 1:1 en PBS<u>otros tampones adecuados a pH 7-7.5. Todas las reacciones se protegieron de la luz y se incubaron durante 30 minutos a temperatura ambiente. En la medida de lo posible, los conjugados de adyuvante-reticulante se purificaron mediante cromatografía de líquidos a alta presión (HPLC) de fase inversa. Los conjugados de adyuvante-reticulante se utilizaron de inmediato después de la conjugación, como se describe a continuación.
Se desalinizaron las combinaciones de adyuvante-enlazador y se intercambió el tampón en agua desionizada con columnas de desalación Zeba Spin (ThermoFisher Scientific). Posteriormente, las muestras se analizaron en un espectrómetro de masas con cromatógrafo de líquidos de cuadrupolo único Shimadzu LC/MS-2020. Para la detección de compuestos se utilizó un método con un gradiente que oscila entre 0 y el 100 % de acetonitrilo adecuado para la detección de moléculas pequeñas dentro de 100-1000 m/z.
La eficacia de la reacción se evaluó mediante LC-MS e indicó que la mayoría del SMCC libre había reaccionado con el compuesto 1 para formar el compuesto 1-SMCC, que tenía el peso molecular previsto de 531 (figura 3, panel inferior derecho). Se observaron eficacias de reacción parecidas con el compuesto 1-SPDP (no se muestran los datos).
Después de la conjugación satisfactoria del compuesto 1 con los reticulantes, los anticuerpos se modificaron con el reticulante SATA para convertir las aminas libres en el anticuerpo en grupos sulfuidrilo protegidos. Después de la conjugación de<s>A<t>A, I<os>grupos sulfuridrilo se desacetilaron con hidroxilamina y los tioles expuestos se hicieron reaccionar con el componente maleimida del compuesto adyuvante-SMCC como se muestra en el esquema 3.
Esquema 3
El anticuerpo se volvió a suspender en solución salina tamponada con fosfato (PBS) a 1-5 mg/ml y el reticulante SATA (ThermoFisher Scientific) se volvió a suspender a 70 mM en DMSO anhidro inmediatamente antes de<su>utilización. El anticuerpo se hizo reaccionar con un exceso molar de 10 veces de SATA a temperatura ambiente durante 30 minutos. El anticuerpo modificado con SATA se purificó del exceso de reactivo y subproductos con 3 lavados en PBS con unidades de filtro centrífugas Amicon Ultra equilibradas con membranas Ultracel-100 según las instrucciones del fabricante (EMD Millipore). El número de reticulantes SATA por anticuerpo se determinó mediante espectrometría de masas de desorción/ionización láser asistida por matriz (MALDI-TOF).
El anticuerpo modificado con SATA se desacetiló después de una incubación de 2 horas a temperatura ambiente en PBS a un pH entre 7.2 y 7.5 con hidroxilamina 0.05 M y 2.5 mM de EDTA. Posteriormente, el anticuerpo desacetilado modificado con SATA se purificó del exceso de reactivo y subproductos con 3 lavados en PBS que contenía 5 mM de EDTA con unidades de filtro centrífugas Amicon Ultra equilibradas con membranas Ultracel-100 según las instrucciones del fabricante (EMD Millipore). Posteriormente, el anticuerpo modificado con SATA desacetilado purificado reaccionó con un exceso molar de 5 a 40 veces de adyuvante-reticulante durante 30 minutos a una hora a temperatura ambiente. El exceso molar exacto fue 10 veces mayor que el número promedio de moléculas SATA por anticuerpo según lo determinado por MALDI-TOF. Después de la conjugación, el inmunoconjugado adyuvante de anticuerpo se purificó del exceso de reactivo y subproductos con 3 lavados en PBS con unidades de filtro centrífugas Amicon Ultra equilibradas con membranas Ultracel-100 según las instrucciones del fabricante (EMD Millipore).
La relación promedio entre el fármaco y el anticuerpo se determinó mediante MALDI-TOF. Las muestras se desalinizaron y se intercambió el tampón utilizando columnas de desalinización Zeba Spin (ThermoFisher Scientific) en agua desionizada. Primero se aplicó matriz (ácido sinapínico) en la placa objetivo de muestra MALDI y se dejó secar. A continuación, la muestra se mezcló en una relación 1:1 con y sin un estándar de albúmina de suero bovino (BSA) (BSA 0.25-1 pM) y se sembró sobre la placa con las muestras de matriz. Una vez secas tanto la matriz como la capa de muestra, las muestras se analizaron en un AB Sciex TOF/TOF 5800 (Universidad de Stanford, Canary Center). Un detector de alta masa (CovalX) con ionización negativa permitió una mayor sensibilidad y resolución de los tamaños de proteínas en el intervalo de un anticuerpo IgG completamente intacto (-150000 kDa).
Después de la conjugación satisfactoria del inmunoconjugado de anticuerpo-adyuvante (Ab-SATA-SMCC-Adyuvante se muestra en el esquema 3), la relación promedio entre el fármaco y el anticuerpo se determinó mediante espectrometría de masas MALDI-TOF (Tabla 1). La diferencia de masa entre el anticuerpo modificado con SATA y el no modificado se utilizó para determinar cuántos enlazadores estaban presentes por anticuerpo. La diferencia de masa entre el anticuerpo modificado con SATA y los inmunoconjugados se utilizó para determinar la relación promedio entre el fármaco y el anticuerpo (DAR).
Tabla 1. Determinación de la relación entre el fármaco y el anticuerpo basada en MALDI-TOF MS.
Ejemplo 3. Evaluación de la actividad de conjugados de adyuvantes de anticuerposin vitro
Aislamiento de células presentadoras de antígeno humano. Se seleccionaron negativamente células presentadoras de antígenos (APC) humanas a partir de células mononucleares de sangre periférica humana obtenidas a partir de donantes de sangre sanos (Stanford Blood Center) mediante centrifugación en gradiente de densidad usando un cóctel de enriquecimiento de monocitos humanos RosetteSep (Stem Cell Technologies) que contenía anticuerpos monoclonales contra CD2, CD3, CD8, CD19, CD56, CD66b y CD235a. Posteriormente, las APC inmaduras se purificaron con una pureza > 97 % mediante selección negativa utilizando un kit de enriquecimiento de monocitos humanos EasySep sin agotamiento de CD16 que contenía anticuerpos monoclonales contra CD2, CD3, CD19, CD20, CD56, CD66b, CD123 y CD235a.
Preparación de las células tumorales. Las células tumorales se volvieron a suspender en PBS con suero fetal bovino (FBS) al 0.1 % de 1 a 10 x 106 células/ml. Posteriormente, las células se incubaron con 2 pM de CFSE para producir una concentración final de 1 pM. La reacción finalizó después de 2 minutos mediante la adición de 10 mL de medio completo con FBS al 10 % y se lavó una vez con el medio completo. Las células se fijaron en paraformaldehído al 2 % y se lavaron tres veces con PBS<o>se dejaron sin fijar antes de congelar las células en DMSO al 10 %, FBS al 20 % y medio al 70 %.
Cocultivos de APC tumorales. 2 x 105 APC se incubaron con o sin 6.5 x 105 células tumorales autólogas o alogénicas marcadas con CFSE en placas de 96 pocilios (Corning) que contenían medio IMDM (Gibco) complementado con suero fetal bovino al 10 %, penicilina 100 U/ml, estreptomicina 100 pg/ml, L-glutamina 2 mM, piruvato de sodio , aminoácidos no esenciales, 2-ME 50 pM y, donde se indica, diversas concentraciones de anticuerpo antitumoral y los adyuvantes indicados. Las células y los sobrenadantes libres de células se analizaron después de 18 horas mediante citometría de flujo.
Resultados. Para determinar la capacidad de los inmunoconjugados a la hora de provocar la activación inmunitaria, se incubaron las APC humanas (~95 % de monocitos) obtenidas a partir de sangre fresca con células de linfoma de células B humanas marcadas con CFSE (Toledo, ATCC) en una relación de 3:1 y diluciones seriadas al doble del compuesto 1, rituximab (Ab), rituximab compuesto 1 (mezcla)<o>rituximab-SATA-SMCC-compuesto 1 (conjugado). En estos experimentos, el inmunoconjugado tenía un promedio de 2.1 moléculas del compuesto 1 por anticuerpo y las dosis del compuesto 1 se ajustaron en consecuencia para asegurar que se compararan cantidades equimolares del compuesto 1 en todas las condiciones. Después de 18 horas, se analizó la expresión de los marcadores de activación en las células mediante citometría de flujo. Los datos indican que los inmunoconjugados fueron muy superiores a la hora de provocar la activación de APC, ya que la CD40, CD86 y HLA-DR se expresaron a niveles varias veces mayores en las APC estimuladas con el inmunoconjugado en comparación con aquellas estimuladas con Ab solo, el compuesto 1 solo o la mezcla (figura 4).
Dado el alto nivel de marcadores de activación observado después de la activación del inmunoconjugado, se investigó la expresión de PD-L1, un marcador inhibidor que está altamente correlacionado con el grado de activación de Ap C. Sorprendentemente, los inmunoconjugados fueron mucho menos potentes a la hora de provocar la regulación por incremento de la expresión de PD-L1 en comparación con el adyuvante solo o la mezcla (figura 5). En particular, la expresión de p D-L1 fue insignificante con un inmunoconjugado de 0.1 pM, que corresponde a la concentración bioactiva máxima (figura 4, figura 5). Estos datos sugieren que el inmunoconjugado puede activar vías de señalización imprevistas en las APC humanas.
En apoyo de esta hipótesis, las células estimuladas con el inmunoconjugado desarrollaron inesperadamente dendritas y experimentaron cambios morfológicos coherentes con la diferenciación de los monocitos en las DC. Este hallazgo impulsó el análisis de las moléculas de superficie asociadas a DC. Coherente con su morfología, las APC estimuladas con el inmunoconjugado, pero no con la mezcla, regularon por disminución la expresión de CD14, CD16 y CD163 de una manera dependiente de la dosis (figura 6). La regulación por disminución de estas moléculas, que se expresan en monocitos y macrófagos, pero que disminuyen considerablemente en las DC derivadas de monocitos, indica que los monocitos humanos expuestos al inmunoconjugado se diferenciaron rápidamente en las DC. Coherente con estos datos, las APC estimuladas con el inmunoconjugado regularon positivamente la expresión de CD123, un marcador de CD inflamatorias humanas derivadas de monocitos (figura 6).
Si bien la expresión de moléculas estimuladoras de células T tales como CD40, CD86 y HLA-DR es necesaria para una activación eficaz de las células T, las APC también influyen en la naturaleza de la respuesta inmunitaria resultante a través de la secreción de citocinas. Por lo tanto, se investigó la capacidad de los inmunoconjugados a la hora de provocar la secreción de citocinas en APC humanas después de la estimulación como se describe anteriormente. Los datos indican que las células diferenciadas con inmunoconjugado secretaron cantidades de IL-1p y TNFa varias veces mayores, mientras que la secreción de la citocina antiinflamatoria IL-10 tendió a disminuir (figura 7).
También se han preparado inmunoconjugados construidos con enlazadores escindibles y se ha descubierto que provocan la activación de APC y la diferenciación de DCin vitro(figura 8). Las APC humanas que eran ~95 % de monocitos se estimularon con diluciones seriadas al doble de rituximab-SATA-SPDP-compuesto 1 (conjugado, escindible), rituximab solo (Ab), el compuesto 1 solo o rituximab compuesto 1 (mezcla) en presencia de células tumorales marcadas con CFSE. El inmunoconjugado - escindible tenía un DAR de 1.4 según lo confirmado por MALDI-TOF. Después de 18 horas, se analizaron las APC humanas CD19- mediante citometría de flujo; n=3.
Ejemplo 4. Evaluación de la eficacia de conjugados de adyuvantes de anticuerposin vivo
En los estudios de tumores, se inyectaron 2 x 105 células de melanoma B16F10 por vía subcutánea (sc) por encima del flanco derecho en ratones C57BL/6. Después de diez días, o cuando los tumores alcanzaron 25 mm2, a los ratones se les administraron inyecciones intravenosas de 400 pg del inmunoconjugado (anti-GP75-SATA-SMCC-compuesto 1) (DAR= 1.74) o se trataron intratumoralmente con 400 pg del inmunoconjugado (anti-GP75-SATA-SMCC-compuesto 1) o una mezcla de 1.5 pg de compuesto 1 y 400 pg de anti-GP75 (TA99). Los tratamientos posteriores se administraron los días 2 y 4 después del tratamiento inicial. El desarrollo del tumor se midió 2-3 veces por semana con calibradores.
L<os>ratones tratados con el inmunoconjugado, pero no con la mezcla, redujeron<sus>tumores (figura 9A). A continuación, se administraron dosis equivalentes de<ci>GP75 inmunoconjugado por vía intratumoral<o>intravenosa en ratones con tumores establecidos. Sorprendentemente, la administración intravenosa provocó la regresión del tumor, aunque se estima que menos del 10 % del inmunoconjugado alcanzó el tumor (figura 9B).
Los estudios descritos en la presente memoria demuestran que los inmunoconjugados son cuantitativa y cualitativamente más eficaces a la hora de provocar la activación inmunitaria e inmunidad antitumoral que cantidades equimolares de mezclas de anticuerpos y adyuvantes unidos de forma no covalente. Es poco probable que estos hallazgos sean el resultado de una simple extensión de la vida media sérica del adyuvante después de la conjugación de anticuerpos, porque se observaron profundas alteraciones fenotípicas y una biología novedosa durante cortos períodos de incubaciónin vitrocortos. Estos estudios indican que los monocitos de sangre periférica recién aislados de donantes humanos sanos se someten a una diferenciación de DC después de una estimulación durante la noche con inmunoconjugados, mientras que los protocolos de diferenciación de DC estándar con GM-CSF e IL-4 requieren seis días. Además, las APC humanas activadas por inmunoconjugado expresaron cantidades varias veces mayores de moléculas coestimuladoras y citocinas inflamatorias que las que se pueden lograr con dosis equivalentes de mezclas de anticuerpos y adyuvantes unidos de forma no covalente. Sin embargo, los inmunoconjugados provocan niveles mucho más bajos de moléculas co-estimuladoras negativas tales como PD-L1 y cantidades comparables de IL-10, lo que sugiere que los inmunoconjugados activan vías de señalización imprevistas. Sin quedar vinculado a ninguna teoría particular, se cree que la estimulación con inmunoconjugados se parece mucho a la inmunidad fisiológica mediada por anticuerpos mediante la cual las APC reconocen patógenos opsonizados (anticuerpos unidos a patógenos) con alta afinidad.
Ejemplo 5. Preparación y evaluación de la actividad de conjugados adicionales de adyuvantes de anticuerposin vitro
Preparación de conjugados adicionales de adyuvantes de anticuerpos Se prepararon conjugados de anticuerpo y adyuvante adicionales usando los métodos descritos en los ejemplos 1 y 2. Se utilizaron los anticuerpos pembrolizumab (PD-1), nivolumab (PD-1), atezolizumab (PD-L1) e ipilimumab (CTLA4) para crear los conjugados de anticuerpo y adyuvante con enlazadores SATA-SMCC (véase el esquema 3 anterior).
Después de la conjugación satisfactoria del inmunoconjugado, la relación promedio entre el fármaco y el anticuerpo se determinó mediante LC-MS. El inmunoconjugado primero se desglicosiló utilizando PNGasa F para eliminar los glicanos del anticuerpo y luego se intercambió el tampón del inmunoconjugado a agua desionizada. Los conjugados de adyuvantes de anticuerpos se procesaron en una columna C4 eluida con acetonitrilo/agua en un Waters Xevo G2-X<s>QTof/Tof. L<os>datos sin procesar de espectrometría de masas se desconvolucionaron para determinar las proporciones entre fármaco y anticuerpo (DAR). L<os>datos de LC-MS indicaron una conjugación satisfactoria y unas proporciones de DAR deseables.
Aislamiento de células presentadoras de antígeno humano. Se seleccionaron negativamente células presentadoras de antígenos (APC) humanas a partir de células mononucleares de sangre periférica humana obtenidas a partir de donantes de sangre sanos (Stanford Blood Center) mediante centrifugación en gradiente de densidad utilizando un cóctel de enriquecimiento de monocitos humanos RosetteSep (Stem Cell Technologies) que contenía anticuerpos monoclonales contra CD14, CD16, CD40, CD86, CD123 y HlA-DR. Posteriormente, las APC inmaduras se purificaron con una pureza > 97 % mediante selección negativa utilizando un kit de enriquecimiento de monocitos humanos EasySep sin agotamiento de CD16 que contenía anticuerpos monoclonales contra CD14, CD16, CD40, CD86, CD123 y HLA-DR.
Preparación de las células tumorales. Se prepararon células tumorales según el ejemplo 3 anterior.
Cocultivos de APC tumorales. 2<x>105 APC se incubaron con<o>sin 6.5<x>105 células tumorales autólogas<o>alogénicas marcadas con CFSE en placas de 96 pocilios (Corning) que contenían medio IMDM (Gibco) complementado con suero fetal bovino al 10 %, penicilina 100 U/ml, estreptomicina 100 pg/ml, L-glutamina 2 mM, piruvato de sodio , aminoácidos no esenciales, 2-ME 50 pM y, donde se indica, diversas concentraciones de anticuerpo. Las células y los sobrenadantes libres de células se analizaron después de 18 horas mediante citometría de flujo.
Resultados. Las APC humanas (~95 % de monocitos) obtenidas a partir de sangre fresca se incubaron con células de linfoma de células B humanas marcadas con CFSE (Toledo, ATCC) en una relación de 3:1 y diluciones seriadas al doble del anticuerpo solo o del anticuerpo-SATA- SMCC-compuesto 1 (conjugado). Después de 18 horas, se analizó la expresión de los marcadores de activación en las células mediante citometría de flujo. L<os>datos indican que los inmunoconjugados fueron superiores a la hora de provocar la activación de APC ya que la CD40, CD86 y HLA-DR tendían a expresarse a niveles más altos en las APC estimuladas con el inmunoconjugado en comparación con aquellas estimuladas con el anticuerpo solo (véanse las figuras 10D y 10E para ipilimumab, 11D y 11E para pembrolizumab, 12D y 12E para nivolumab y 13D y 13E para atezolizumab). Coherente con los resultados observados en el ejemplo 3, los inmunoconjugados regularon por disminución la CD14 (véanse las figuras 10C para ipilimumab, 11C para pembrolizumab, 12C para nivolumab y 13C para atezolizumab). L<os>resultados para estos inmunoconjugados fueron los previstos para CD16 y CD123 (no se muestran los datos) a partir de los resultados del ejemplo 3.
La capacidad de estos inmunoconjugados a la hora de provocar la secreción de citocinas en APC humanas después de la estimulación se investigó como se describe en el ejemplo 3 anterior. L<os>datos indican que las células diferenciadas con inmunoconjugado secretaron mayores cantidades de IL-1 p y TNFa (véanse las figuras 14A y 14B para atezolizumab, 15A y 15B para nivolumab, 16A y 16B para pembrolizumab y 20 para ipilimumab).
Ejemplo 6. Preparación y evaluación de la actividad de los conjugados de adyuvante de antidectina 2 invitroPreparación de conjugados adicionales de adyuvantes de anticuerpos Se preparó un conjugado de anticuerpo y adyuvante adicional usando los métodos descritos en los ejemplos 1 y 2. Se<usó>un anticuerpo antidectina 2 (<c>L<e>C6A) y un isotipo lgG2a de ratón para crear el conjugado adyuvante de anticuerpo con enlazadores SATA-SMCC (véase el esquema 3 anterior).
Se investigó la capacidad de este inmunoconjugado a la hora de provocar la secreción de citocinas en APC derivadas de monocitos murinos después de la estimulación como se describe en el ejemplo 3 anterior. Específicamente, la producción de citocinas se muestra en la figura 21 para monocitos pretratados con GM-CSP que se estimularon durante 18 horas con los inmunoconjugados<o>cantidades equivalentes de los componentes no conjugados. L<os>datos indican que las células diferenciadas con el inmunoconjugado secretaron mayores cantidades de TNFa, IL-6 e IL-12p70 (véase la figura 21) que cantidades equivalentes de los componentes (adyuvante solo, anticuerpo solo y conjugado de anticuerpo de control).
La dectina 2 y CLEC5A son receptores de lectina de tipo C que se asocian y envían señales a través de las proteínas adaptadoras FcRy (FCER1G) y DAP12 (TYROBP), respectivamente, después de la reticulación del receptor. Estas proteínas adaptadoras contienen motivos de activación basados en tirosina (ITAM) de inmunorreceptores que median la señalización en dirección 3' a través de una vía dependiente de Syk, lo que provoca la activación de las células inmunitarias (es decir, la producción de citocinas, expresión de moléculas coestimuladoras, presentación de antígenos, etc.). Como se muestra (figura 21 y figura 23), los inmunoconjugados dirigidos contra estos receptores presentan efectos inmunoestimuladores sinérgicos mediante la participación simultánea del receptor acoplado a ITAM (a través del dominio de unión al antígeno) y otras vías de señalización (a través del adyuvante, p. ej., TLR7/8). L<os>inmunoconjugados dirigidos a otros receptores que se asocian con FcRy y/o DAP12,<o>que contienen dominios de señalización parecidos (p. ej., hemITAM), pueden prepararse de manera similar y se espera que presenten efectos parecidos.
Ejemplo 7. Síntesis de un adyuvante TLR7/8
Se tomaron las etapas siguientes para preparar un adyuvante de TLR7/TLR8 (esquema 1, compuesto 1) adecuado para la conjugación con un anticuerpo para formar un inmunoconjugado como se describe en la presente memoria. Las masas de productos se confirmaron en un sistema UPL<c>(Waters Acquity) equipado con un detector espectrómetro Xevo XS QToF. Se inyectaron muestras disueltas en acetonitrilo:agua en una columna BEH200 C18 (2.1 mm de diámetro x 50 mm de longitud) eluida con un gradiente del 10-90 % de acetonitrilo:agua durante 5 minutos.
Esquema 4
Se añadió lentamente ácido nítrico enfriado (00C) (70 %, 160 mL) al quinolin-2,4-diol 1 (100 g, 621 mmol) en ácido acético glacial (600 mL) agitándolo en un baño de hielo. Se sacó la mezcla del baño de hielo y luego se calentó a temperatura ambiente. Se agitó a temperatura ambiente durante 30 min. Se calentó a 80 °C durante 1.5 horas y luego se enfrió la mezcla a 0 °C. Se añadió lentamente 1 L de agua a la mezcla para precipitar un sólido amarillo. Se agitó enérgicamente durante 15 minutos y luego se filtró. Se volvió a suspender el sólido en agua (1 litro) y se agitó enérgicamente durante 15 minutos y luego se filtró. Se repite con la etapa adicional de añadir lentamente NaHC03 sólido para llevar el pH a > 6 luego se filtró con succión durante la noche. Se volvió a suspender el sólido en éter etílico (750 mL) y se agitó enérgicamente para crear una suspensión fina. Se filtró y se repitió. Se filtró con succión durante la noche para secar. Rendimiento 112 g II (88 %) de sólido amarillo.
Esquema 5
A temperatura ambiente, se añadió lentamente disopropiletilamina (63 mL, 47 g, 0.36 mol, 2.5 eq.) a POCI<3>(300 mL). Mezcla calentada a 80 °C bajo una capa de Ar. Se añadió lentamente en porciones de 2 g nitrodiol II (30 g, 145 mmol, 1 eq.) durante 30 minutos manteniendo la temperatura por debajo de 95 °C. Una vez completada la adición, aumentar la temperatura a 110 °C y calentar durante 1 hora. Enfriar la reacción a 0 °C y luego verter lentamente en partes sobre hielo mientras se agita enérgicamente. Se añadió agua fría hasta el volumen final de 1.2 L y luego se agitó enérgicamente. Se decantó el licor madre acuoso y se añadió 1 L de agua al sólido oscuro, raspando el sólido pegajoso de las paredes del matraz para crear una suspensión. Se repite según sea necesario para obtener un sólido que pueda filtrarse. Se volvió a suspender el sólido en 1 L de agua y luego se añadió lentamente NaHC03 sólido hasta pH ><6>. El sólido se filtró y luego se disolvió en EtOAc (500 mL). Se filtró la solución de EtOAc a través de Celite para eliminar la impureza negra insoluble. Se lavó el filtrado con NaHC03 saturado, agua, salmuera y luego se separó y se secó la capa orgánica con Na2S04, se filtró y se concentró al vacío. El sólido marrón que se formó se trituró con hexanos/éter dietílico 3:1 (500 mL) y se filtró. El sólido tostado III (22 g, 30 mmol, 62 %) se usó tal cual en la reacción siguiente.
Esquema<6>
A una solución del compuesto de nitrodicloro III (22 g, 62 mmol, 1 eq.) y K<2>CO<3>sólido (17 g, 124 mmol, 2 eq.) en DMF (250 mL) a 0 °C se le añadió lentamente una solución de N-Boc-1,4-diarninobutano (12.8 g, 1.1 eq.) en DMF (60 mL) durante 30 minutos. Una vez completada la adición, la reacción se calentó a temperatura ambiente y se agitó durante 30 minutos más. Se añadió agua (800 mL) y la mezcla se agitó enérgicamente. Se vertió el sobrenadante y el sólido húmedo se disolvió en acetato de etilo (500 mL). La solución se lavó con agua, salmuera, se separó, se secó (Na2S04), se filtró y se concentró al vacío. El sólido marrón se trituró con hexanos/éter dietílico 1:1 (400 mL) y se filtró para obtener un sólido amarillo IV (17 g, 43 mmol, 69 %) que se usó tal cual en la reacción siguiente.
Esquema 7
A una solución del compuesto de nitroamino IV (17 g, 43 mmol, 1 eq.) en metanol (400 mL) y agua (60 mL) a 0 °C se le añadió N iCU H<2 0>(0.51 g, 2.2 mmol, 0.05 eq.). Se añadió borohidruro de sodio (pélets, 3.2 g,<86>mmol, 2 eq.) y la reacción se agitó durante 1 h a 0 °C, luego se calentó a temperatura ambiente y se dejó agitar durante otros 15 minutos. Se añadió ácido acético glacial en partes para neutralizar cualquier NaBH<4>que no hubiera reaccionado hasta que se obtuvo un pH de ~5. La solución se filtró a través de un lecho de Celite para eliminar el material negro insoluble. El disolvente se eliminó al vacío. El sólido marrón oscuro se trituró con éter y luego se filtró para obtener un sólido tostado V (13.3 g, 37 mmol, 85 %) que se usó tal cual en la reacción siguiente.
Esquema 8
A una solución del compuesto de diamino V (13.3 g, 37 mmol, 1 eq.) en DMF (250 mL) que contenía disopropiletilamina (7.17 g, 9.7 mL, 56 mmol, 1.5 eq.), agitado a temperatura ambiente, se le añadió cloruro de valeroílo puro (5.5 mL, 5.5 g, 42 mmol, 1.2 eq.). La mezcla se agitó durante 30 minutos, luego se añadió hielo y luego se añadió agua hasta un volumen final de 1 L. La mezcla se agitó enérgicamente hasta que se formó un sobrenadante transparente. Se vertió el sobrenadante y el sólido bruto se disolvió en acetato de etilo (400 mL) y se filtró a través de un lecho de Celite. El filtrado se lavó con agua (400 mL), salmuera (400 mL), se separó y luego se secó (Na2S04), se filtró y se concentró. El sólido se trituró con éter, se filtró y se secó con succión. El sólido marrón obtenido VI (13.9 g, 31 mmol, 84%) se usó tal cual en la reacción siguiente.
Esquema 9
En un matraz de fondo redondo de 500 mL equipado con un aparato Dean-Stark, se sometió a reflujo una mezcla de amida VI (13.9 g, 31 mmol, 1 eq.) y 2-clorobenzoico (2.4 g, 15.5 mmol. 0.5 eq.) en 150 mL de tolueno (temperatura del baño = 170 °C) durante 4 horas. Se retiraron el aparato Dean-Stark y el condensador hasta que se evaporó el 80-90 % del tolueno. Se añadió 2,4-dimetoxibencilamina (25 g, 150 mmol, 5 eq.) y la reacción se calentó de forma continua a 120 °C durante 1.25 horas. La reacción se enfrió y la mezcla cruda se diluyó con MeOH/agua (1 L) 1:1 y se agitó enérgicamente. Se decantó el sobrenadante (eliminando la mayor parte del exceso de 2,4-dimetoxibencilamina) y el producto bruto se repartió entre agua y acetato de etilo. Se añadió ácido acético hasta que la capa acuosa dio un pH de 5-6. La capa orgánica se lavó con agua, salmuera, se secó (Na2S04), se filtró y se concentró. El jarabe espeso de color marrón se disolvió en éter dietílico y se filtró para eliminar un sólido gris (no producto). El éter se eliminó obteniéndose un jarabe marrón (14.4 g, 26 mmol, 73 %) que se usó tal cual en la reacción siguiente.
Esquema 10
Al material Vil (14.4 g, 26 mmol, 1 eq.) se le añadió agua (60 mL) y lentamente, con agitación, HCI concentrado (60 mL). La mezcla se agitó enérgicamente a temperatura ambiente durante 30 minutos y después se calentó a reflujo durante 1 hora. La reacción se enfrió en un baño de hielo y se añadieron pélets de NaOH sólido (28 g, 700 mmol) en partes durante 30 minutos hasta que se alcanzó un pH básico. La solución se calentó hasta temperatura ambiente y se agitó enérgicamente. La solución se calentó hasta temperatura ambiente y se agitó enérgicamente. Esta capa acuosa se extrajo 3 veces con isopropanol/diclorometano al 10 % (400 mL). Las capas orgánicas combinadas se secaron (Na2S04), se filtraron y se concentraron obteniéndose un sólido marrón Vil i (6.8 g, 22 mmol, 79 %).
Ejemplo 8. Síntesis de inmunoconjugados
Esquema 11
Este ejemplo proporciona orientación sobre la síntesis de un inmunoconjugado utilizando el método del éster de TFP. Se disolvió el compuesto Vil i (311 mg, 1 mmol) en 10 mL de dimetilformamida (DMF) y después se añadieron 2 equivalentes molares de diisopropiletilamina (DIPEA). Se disolvió un enlazador SMCC (1.5 mmol) en 10 mL de diclorometano y se añadió en una porción a Vill. La reacción se agitó durante la noche a 20 °C y se concentró hasta la sequedad mediante evaporación rotatoria. El producto bruto IX se purificó sobre gel de sílice usando un sistema de cromatografía ultrarrápida Buchi cargado con un cartucho desechable de 12 g y eluido con un gradiente de metanol al 0-10 % durante 15 minutos. Las fracciones puras se combinaron y se evaporaron hasta la sequedad obteniéndose 160 mg de un sólido IX de color amarillo pálido.
Esquema 12
Se disolvió el compuesto IX (0.1 mmol, 53 mg) en 10 mL de diclorometano y luego se añadieron 2 equivalentes de ácido tioglicólioo a la vez. La mezcla se concentró hasta la sequedad al vacío y el residuo se lavó tres veces con 5 mL de éter dietílico.
Esquema 13
Se disolvió el compuesto X (6.2 mg, 0.01 mmol) en 2 mL de THF y luego se añadieron 5 mg de tetrafluorofenol. Luego se añadieron 5 mg de diciclohexilcarbodiimida (DCC). La mezcla se agitó durante la noche a temperatura ambiente y luego se concentró hasta la sequedad al vacío. El producto bruto XI se purificó mediante cromatografía ultrarrápida sobre gel de sílice (columna preempaquetada de 4 gramos) y se eluyó con MeOH al 0-10 % en diclorometano. Las fracciones puras se combinaron y se evaporaron obteniéndose 3.6 mg de XI puro (confirmado por LC/MS). Luego se usó el éster de TFP XI en la etapa siguiente de conjugación de anticuerpos.
Esquema 14
Se intercambió el tampón de un anticuerpo lgG1 (específicamente, el anticuerpo anti-CD20 rituxumab) a PBS con un pH de 7.2 y se diluyó a 10 mg/ml (66|jM). El adyuvante activado por TFP, XI, se añadió a DMSO y se añadieron 6 equivalentes molares (en relación con IgG) a 1 mL de la solución de anticuerpo (10 mg) en una porción. La mezcla se invirtió varias veces para mezclar y se incubó durante la noche a 20 °C. El inmunoconjugado resultante ("BB-01") se purificó mediante intercambio de tampón a PBS (pH 7.2) usando una columna PD10 (SephadexG25®) de cromatografía de exclusión por tamaño. Se reunieron las fracciones puras y se determinó la concentración midiendo la absorbancia a 280 nm en un espectrofotómetro de nanogotas. El rendimiento fue de 8 miligramos o aproximadamente el 80 % en base a la proteína recuperada. El producto inmunoconjugado se filtró de forma estéril a través de un filtro de jeringa de 0.2 jm y se almacenó a 4 °C hasta que se necesitó.
La caracterización de la relación entre el fármaco y el anticuerpo del inmunoconjugado resultante ("DAR") se realizó por medio del análisis de cromatografía de líquidos-espectrometría de masas ("LC/MS") en un sistema UPLC (Waters Aquity) equipado con un detector de espectrómetro de masas Xevo XS QToF. El análisis se realizó mediante inyección de 5 jg del inmunoconjugado en una columna BEH200 C4 (2.1 mm de diámetro x 50 mm de longitud) eluida con un gradiente de 10-90 % de acetonitrilo:agua durante 4 minutos.
El análisis indicó que los inmunoconjugados sintetizados mediante el método TFP demostraron un DAR más alto que el inmunoconjugado sintetizado mediante el método SATA. Además, el método TFP produjo inmunoconjugados con cantidades reducidas de anticuerpo no conjugado (solo aproximadamente el 5 %) en comparación con el método de síntesis SATA (aproximadamente el 20 %) (compárense las figuras 1A y 1B).
Se realizó un análisis por cromatografía de exclusión por tamaño ("SEC") de BB-01 para determinar la pureza monomérica. El análisis se realizó en una columna Se C BEH200 eluida con PBS (pH 7.2) y 0.2 mL/min. El inmunoconjugado BB-01 sintetizado utilizando el método del éster activo de TFP contenía menos del 2 % de alto peso molecular agregado (figura 2B).
Ejemplo 9. Síntesis del inmunoconjugado BB-14 con un éster de pentafluorofenilo ("PFP")
Esquema 15
Este ejemplo proporciona orientación sobre la síntesis de un inmunoconjugado utilizando el método del éster de PFP. La modificación del éster del adyuvante y la conjugación del adyuvante modificado con el anticuerpo se muestran arriba en el esquema 12. Se disolvió trans-1,4-dicarboxilato de ciclohexano (1 g) en 10 mL de dimetilformamida ("DMF") y se añadió hexafluorofosfato de 3-óxido de 1-[bis(dimetilamino)metileno]-1H-1,2,3-triazolo[4,5-b]piridinio ("HATu ") (1 mmol) seguido de 1 mL de W-etilo-W(propan-2-il)propan-2-amina ("DIPEA"). Se añadió el compuesto 1 (311 mg) y la mezcla se agitó durante la noche a 20 °C. La mezcla de reacción se diluyó con 50 mL de diclorometano ("DCM") y se lavó con 20 mL de HCl 1 N. La capa de DCM se evaporó hasta la sequedad y el producto se purificó sobre gel de sílice eluyendo con MeOH al 0-10 % en DCM que contenía ácido acético al 1 %. Las fracciones puras se concentraron obteniéndose 220 mg de ácido purificado II. Se disolvió el compuesto II (100 mg) en THF y se añadieron 100 mg de HATU seguido de 200 |jl de DIPEA. Se añadieron dos equivalentes de amino-PEG2-tert-butilcarboxilato y se agitaron durante una hora a 200C. La mezcla se concentró hasta la sequedad y se añadieron 10 mililitros de HCl 4N en dioxano. La mezcla se concentró hasta la sequedad y el producto bruto III se purificó mediante HPLC preparativa obteniéndose 40 mg del compuesto lll.
El compuesto lll se convirtió en éster de PFP IV como se describe a continuación. Se añadió el compuesto lll (35 mg) a 50 mg de PFP en 5 mL de THF y se añadieron 5 mL de DMF seguido de 20 mg de DCC. Se añadió DMAP (2-3 mg) y la solución se agitó durante la noche a 20 °C. La reacción se concentró y se purificó mediante cromatografía ultrarrápida (eluyendo con MeOH al 0-10 %) obteniéndose 17 mg de éster de PFP IV después de la liofilización en agua con acetonitrilo 1:2.
Se añadió éster de PFP IV (6 eq. molar en relación con IgG) a 20 mg de un anticuerpo IgG (específicamente, el anticuerpo anti-CD20 rituximab) (10 mg/ml en PBS) y se incubó a 37 °C durante la noche. El tampón del inmunoconjugado BB-14 resultante se intercambió a PBS (pH 7.2) eliminándose el exceso de reactivo de peso molecular pequeño y se determinó la concentración en la
nanogota. El rendimiento fue de 15 mg de inmunoconjugado (rendimiento del 75 %). El producto se almacenó a 4 oc. Se determinó un DAR de 2.2 mediante análisis Lc /MS. Además del DAR deseable y el alto rendimiento, el producto también tenía pocas impurezas según lo según lo determinado por el análisis SEC (véase las figuras 3 y 4).
Ejemplo 10. Síntesis del inmunoconjugado BB-15 con un éster de NHS
Esquema 16
La modificación del éster del adyuvante y la conjugación del adyuvante modificado con el anticuerpo se muestran arriba en el esquema 13. Se disolvió el compuesto Vil (150 mg) en 20 mL de tetrahidroflurano ("THF") y se añadieron 10 mL de bicarbonato de sodio acuoso saturado. A continuación, se añadieron 50 mg de anhídrido succínico en una porción y la mezcla se agitó durante una hora a temperatura ambiente. Se añadieron lentamente veinte mililitros de HCl 1 N y la mezcla se extrajo con 2 x 50 mL de diclorometano. Los extractos orgánicos combinados se evaporaron hasta la sequedad. El producto bruto (Suc-VII) se purificó en una columna de gel de sílice de 4 gramos eluida con MeOH al 0-15 % (1 % de ácido acético) durante 15 minutos. Las fracciones puras se combinaron y se evaporaron obteniéndose 190 mg de VII-Suc puro.
Se disolvió el compuesto VII-Suc (150 mg) en 10 mL de DMF y se añadió 1 equivalente de HATU seguido de 2 equivalentes de DIPEA. Se añadieron 1.5 equivalentes de glicina-OtBu y se agitaron durante la noche. Se evaporó el DMF y se trató el residuo con 5 mL de HCl 1 N en dioxano durante 30 minutos. El disolvente se evaporó y el Gly-Suc-Vll bruto se purificó instantáneamente en una columna de gel de sílice de 4 gramos eluida con MeOH al 0-10 % durante 10 minutos. La evaporación de las fracciones puras proporcionó 110 mg de Gly-Suc-Vll; el material puro se disolvió en DMF y se repitió el proceso anterior obteniéndose 60 mg de Gly2-Suc-Vll puro.
El Gly2-Suc-Vll puro (30 mg) se disolvió en 5 mL de DMF y se añadieron 1.5 equivalentes de NHS seguido de 5 mL de THF. Se añadió DCC (1.5 equivalentes) y la mezcla se agitó durante la noche a temperatura ambiente. El disolvente se evaporó y el éster de NHS bruto se purificó instantáneamente en un gel de sílice eluido con MeOH al 0-10 % en DCM durante 10 minutos. Las fracciones puras (determinadas por TLC) se combinaron y se evaporaron obteniéndose 1 mg de NHS-Gly2-Suc-Vll puro después de la liofilización en agua con acetonitrilo.
El éster de NHS puro se disolvió en DMSO para preparar una solución 20 mM y se añadieron 6 eq. a 2 mL de un anticuerpo IgG (específicamente, el anticuerpo anti-CD20 rituximab) (10 mg/ml en PBS). La reacción de conjugación se incubó a temperatura ambiente durante la noche y se intercambió el tampón a PBS fresco eliminándose el exceso de adyuvante. El inmunoconjugado BB-15 purificado se filtró de forma estéril y se almacenó a 40C. El rendimiento fue de aproximadamente 16 mg. Además de tener un alto rendimiento, el análisis LC/MS mostró altos niveles de pureza, bajos niveles de agregación y una relación DAR deseable (véase las figuras 5 y 6).
Ejemplo 11. Síntesis de inmunoconjugado con un éster de TFP
Esquema 17
Este ejemplo proporciona orientación sobre la síntesis de un inmunoconjugado con un enlazador diferente utilizando el método del éster de TFP. La modificación del éster del adyuvante y la conjugación del adyuvante modificado con el anticuerpo se muestran arriba en el esquema 14. Se disolvió el compuesto VII (311 mg, 1 mmol) en 10 mL de DMF y luego se añadieron 0.3 mL de DIPEA. El ácido NHS-PEGS (1.2 equivalentes) se disolvió en 5 mL de diclorometano y se añadió al compuesto VII en una porción. La mezcla se agitó durante la noche a temperatura ambiente y luego se concentró hasta la sequedad. El residuo bruto se purificó mediante cromatografía en gel de sílice en una columna de 4 gramos eluida con MeOH al 0-10 % en DCM que contenía ácido acético al 1 % durante 10 minutos obteniéndose 260 mg (rendimiento del 57 %) de PEGS-VII después de la concentración de las fracciones puras.
Se disolvió PEGS-VII (50 mg) en 10 mL de DMF y se añadió 1.5 eq. de PTF seguido de 1.2 eq. de DCC y 5 mg de DMAP. La reacción se agitó durante la noche, se concentró hasta la sequedad y se purificó en una columna de 4 gramos de gel de sílice eluida con MeOH al 0-10 % en DCM obteniéndose 35 mg de TFP-PEG5-VII puro después de la liofilización en agua con acetonitrilo 1:2.
El éster de TFP (TFP-PEG5-VII) se disolvió en DMSO para preparar 20 mM de una solución madre y se añadió a 20 mg de un anticuerpo IgG (específicamente, el anticuerpo anti-CD20 rituximab) en PBS a 10 mg/ml. Se dejó que la reacción de conjugación continuara durante la noche a temperatura ambiente. Se intercambió el tampón (G<e>, columna de desalinización PD10) del inmunoconjugado resultante a PBS con pH 7.4. El inmunoconjugado purificado se filtró de forma estéril utilizando un filtro de jeringa de 2 pm y se almacenó a 4 °C. El análisis LC/MS confirmó que el proceso obtuvo un DAR de 2.9 adyuvantes por anticuerpo (véase figura 7). El análisis SEC indicó cantidades mínimas de agregado (es decir, menos del 2 %) (véase la figura 8).
Ejemplo 12. Síntesis de otro adyuvante de TLR7/TLR8
Este ejemplo proporciona orientación sobre cómo sintetizar otro adyuvante de TLR7/8. El compuesto XIV se sintetizó a partir del compuesto VI del esquema 8 del ejemplo 3.
Esquema 18
Se disolvió el compuesto VI (2 g) en tolueno con ácido acético seco al 20 % y se calentó a 75 °C durante la noche. El disolvente se eliminó al vacío obteniéndose 2 gramos del compuesto Xl bruto. El compuesto XI se<usó>sin purificación adicional. Se disolvió el compuesto XI (2 g) en 20 mL de DMF y se añadieron lentamente 1.2 equivalentes de NaH (dispersión al 50 %) y la mezcla se agitó durante 30 minutos a temperatura ambiente. Se añadió yoduro de metilo (2 equivalentes) en una porción y la mezcla de reacción se agitó durante la noche a temperatura ambiente. La reacción se concentró hasta la sequedad y el producto se purificó mediante cromatografía ultrarrápida. El producto se eluyó con un gradiente de MeOH al 0-10 % en diclorometano durante 15 min. Se combinaron las fracciones puras y se concentraron para producir 1 g del compuesto XII (rendimiento del 50 % en 2 etapas).
Esquema 19
Se disolvió el compuesto XII (10 g) en 10 mL de dimetoxibencilamina pura ("DMBA") y se calentó a 1200C durante 3 horas. La mezcla de reacción se enfrió y se diluyó con 100 mL de acetato de etilo. La solución resultante se lavó dos veces con ácido cítrico al 10 % en agua y una vez con agua para eliminar el exceso de DMBA. La capa orgánica se secó sobre MgS04 y se concentró al vacío obteniéndose el compuesto XIII bruto como un aceite marrón. El derivado de DMB bruto, compuesto XIII, se disolvió en diclorometano y se añadieron 2 mL de HCl 4 N en dioxano. Después de 2 horas, la mezcla de reacción se concentró hasta la sequedad y el compuesto de sal de HCl bruto XIV se disolvió en 3 mL de metanol. Se añadió lentamente éter etílico (20 mL) con agitación a la solución bruta y se formó un precipitado blanco. La reacción se filtró y el producto sólido blanco se lavó dos veces con 10 mL de éter etílico y se secó al vacío obteniéndose 4 gramos del compuesto de sal de HCl XIV. El análisis LC/MS confirmó el peso molecular correcto (M/z = 326.5) y una pureza superior al 95 %.
Ejemplo 13. Síntesis del inmunoconjugado BB-26 con un éster de TFP
Esquema 20
Este ejemplo proporciona orientación sobre la síntesis de un inmunoconjugado que contiene un enlazador de arilamina terciaria utilizando el método del éster de TFP. Se disolvió el compuesto XIV (300 mg) del ejemplo 12 en THF (10 mL) y 1.2 eq. de NaH (dispersión al 50 %). La mezcla se agitó durante 15 minutos y se añadieron 2 equivalentes de ácido 4-bromometilfenilacético. La reacción se agitó durante la noche a temperatura ambiente y se concentró hasta la sequedad. Se añadió un mL de ácido acético y el producto se purificó mediante HPLC preparativa en una columna C-18 eluida con un gradiente de 10-90 % de acetonitrilo en agua (0.1 % de TFA) durante 20 minutos obteniéndose 165 mg de compuesto de ácido fenilacético purificado XV. Se disolvió el compuesto XV (50 mg) en diclorometano/dimetilformamida (5 mL, 1:1) y se añadieron 2 equivalentes de TFP seguido de 1.5 equivalentes de 1-etil-3-(3-dimetilaminopropil)carbodiimida ("EDCI"). La reacción se agitó durante la noche a temperatura ambiente y el producto se purificó mediante cromatografía ultrarrápida en una columna de gel de sílice de 4 gramos eluida con isopropanol al 0-10 % durante 10 minutos. Las fracciones puras se concentraron y liofilizaron en agua con acetonitrilo al 30 % obteniéndose 21 mg de compuesto de éster de TFP XVI purificado en forma de un sólido amarillo pálido. El peso molecular y la pureza se confirmaron mediante LC/MS (m/z = 621.7).
Conjugación con anticuerpo: El éster XVI de TFP se disolvió en DMSO anhidro para preparar 20 mM de una solución madre y se añadieron 6 equivalentes molares (en relación con el anticuerpo) a 20 mg de anticuerpo IgG (específicamente, el anticuerpo anti-CD20 rituximab) (10 mg/ml en PBS). La reacción de conjugación se incubó a 4 °C durante la noche. El tampón del inmunoconjugado resultante, BB-26, se intercambió a PBS (pH 7.2) eliminándose el exceso de reactivos de peso molecular pequeño. La concentración final se determinó midiendo el anticuerpo a 280 nm en el espectrofotómetro Nanodrop 1000. El rendimiento fue de 15 mg de BB-26,<o>el 75 % en base a la proteína recuperada. Como se observa en la figura 12A, se observó un agregado mínimo (menos del 1%) según se detectó mediante análisis SEC. Como se observa en la figura 12B, el producto tenía una relación DAR de 2.8 según se determinó mediante análisis LC/MS. Los inmunoconjugados BB-26 purificados se filtraron a través de un filtro estéril de 0.2 pM y se almacenaron a -20 °C.
Ejemplo 14. Síntesis de inmunoconjugado BB-27 con un éster de TFP
Esquema 21
Este ejemplo proporciona orientación sobre la síntesis de un inmunoconjugado que contiene un enlazador de alquilamina terciaria utilizando el método del éster de TFP. Se disolvió el compuesto XIV (200 mg) en metanol (20 mL) y se añadieron 3 equivalentes de heptanoato de 1 -formil-7-tert-butilo seguido de 1.1 equivalentes de NaCNBH4. La mezcla se agitó durante 1.5 horas a temperatura ambiente y se concentró hasta la sequedad. Se añadió TFA (5 ml) y la mezcla se agitó durante la noche a temperatura ambiente. El TFA se evaporó al vacío y el producto bruto se purificó mediante HPLC preparativa en una columna C-18. El producto se eluyó con un gradiente de acetonitrilo al 10-90 % en agua (TFA al 0.1 %) durante 20 minutos obteniéndose 110 mg del compuesto ácido XVII purificado (que se confirmó mediante LC/MS).
Se disolvió el compuesto XVII (50 mg) en diclorometano/dimetilformamida (5 mL, 1:1) y se añadieron 2 equivalentes de TFP seguido de 1.5 equivalentes de EDCI. La reacción se agitó durante la noche a temperatura ambiente. El producto de éster de TFP XVIII bruto se purificó mediante cromatografía ultrarrápida en una columna de gel de sílice de 4 gramos eluida con isopropanol al 0-10 % durante 10 minutos. Las fracciones puras se concentraron y el residuo se liofilizó en agua con acetonitrilo al 30 % obteniéndose 14 mg del compuesto de éster de TFP XVIII purificado en forma de un sólido blanco. El peso molecular y la pureza se confirmaron mediante LC/MS (m/z = 601.7).
Conjugación con anticuerpo: Se disolvió éster de TFP XVIII en DMSO anhidro para preparar 20 mM de una solución madre y se añadieron 8 equivalentes molares (en relación con el anticuerpo) a 20 mg de un anticuerpo IgG (específicamente, el anticuerpo anti-CD20 rituximab) (10 mg/ml en PBS). La reacción de conjugación se incubó a 4 °C durante la noche. El tampón del inmunoconjugado resultante, BB-27, se intercambió a PBS (pH 7.2) eliminándose el exceso de reactivos de peso molecular pequeño. La concentración final se determinó midiendo los anticuerpos a 280 nm en el espectrofotómetro Nanodrop 1000. El rendimiento fue de 16 mg de inmunoconjugado BB-27 (80 %).
Se observó un agregado mínimo (menos del 1 %) según se detectó mediante análisis SEC. El producto tenía una relación DAR de 2.5 según se determinó mediante análisis LC/MS. El BB-27 purificado se filtró a través de un filtro estéril de 0.2 pM y se almacenó a -20 °C.
Ejemplo 15. Síntesis del inmunoconjugado BB-36 con un éster de TFP
Esquema 22
Este ejemplo proporciona orientación sobre la síntesis de un inmunoconjugado que contiene un enlazador de amina terciaria<p>E<g>utilizando el método de TFP. Se disolvió el compuesto XIV (200 mg) en metanol (20 mL) y se añadieron 3 eq, de aldehido XIX seguido de 1.1 equivalentes de NaCNBH4. La mezcla se agitó durante 3 horas a temperatura ambiente y se concentró hasta la sequedad. Se añadió ácido trifluoroacético (TFA, 10 mL) y la reacción se agitó durante 2 horas a temperatura ambiente. El TFA se evaporó al vacio y el producto bruto se purificó mediante HPLC preparativa en una columna C-18. El producto se eluyó con un gradiente de acetonitrilo al 10-90 % en agua (0.1 % de TFA) durante 20 minutos obteniéndose 85 mg de ácido XX purificado después de la liofilización de las fracciones puras combinadas (confirmado por LC/MS).
Se disolvió el compuesto XX (80 mg) en diclorometano/dimetilformamida (5 mL, 1:1) y se añadieron 2 equivalentes de TFP seguido de 1.2 equivalentes de EDCI. La reacción se agitó durante la noche a temperatura ambiente. El producto éster de TFP XXI bruto se purificó mediante cromatografía ultrarrápida en una columna de gel de sílice de 4 gramos eluida isopropanol al 0-10 % durante 10 minutos. Las fracciones puras se concentraron y el residuo se liofilizó en agua con acetonitrilo al 30 % obteniéndose 45 mg de éster de TFP purificado del compuesto XXI en forma de un sólido beis. El peso molecular y la pureza se confirmaron mediante LC/MS (m/z = 647.7).
Conjugación con anticuerpo: El éster de TFP del compuesto XXI se disolvió en DMSO anhidro para preparar 20 mM de una solución madre y se añadieron 8 equivalentes molares (en relación con el anticuerpo) a un anticuerpo lgG1 (específicamente, el anticuerpo anti-CD20 rituxumab) (10 mg/ml en PBS). La reacción de conjugación se incubó a 4 °C durante la noche. El tampón del inmunoconjugado resultante, BB-36, se intercambió a PBS (pH 7.2) eliminándose el exceso de reactivos de peso molecular pequeño. La concentración final se determinó midiendo los anticuerpos a 280 nm en el espectrofotómetro Nanodrop 1000. El rendimiento fue de 15 mg de inmunoconjugado BB-36 (75 %) que se almacenó a 40C hasta<su uso>.
Se observó un agregado mínimo (menos del 1 %) según se detectó mediante análisis SEC. El producto tenia una relación DAR de 2.2 según se determinó mediante análisis LC/MS. El inmunoconjugado BB-36 purificado se filtró a través de un filtro estéril de 0.2 pM y se almacenó a -20 °C.
Ejemplo 16. Síntesis del inmunoconjugado BB-45 con un éster de TFP
Esquema 23
Este ejemplo proporciona orientación sobre la síntesis de un inmunoconjugado con un enlazador diferente utilizando el método del éster de TFP. Se disolvió el compuesto Vil (311 mg, 1 mmol) en 10 mL de DMF y se añadieron 0.3 mL de DIPEA. En un recipiente separado, se disolvieron 1.2 equivalentes de ácido 7-metoxi-7-oxoheptanoico en 5 mL de DMF y se añadieron 1.5 equivalentes de DIPEA seguido de HATU (1.2 equivalentes). La mezcla añadió al compuesto Vil se agitó durante la noche a temperatura ambiente. La mezcla de reacción se concentró hasta la sequedad al vacío y el residuo se disolvió en 10 mL de tetrahidrofurano:agua (1:1). Se añadió un mL de hidróxido de litio 2 M en agua y la reacción se agitó durante 2 horas a temperatura ambiente. El THF se eliminó mediante evaporación rotatoria y la solución acuosa se acidificó añadiendo 10 mL de ácido clorhídrico 1 M. La solución acuosa se extrajo 2 veces con diclorometano (20 mL) y la capa orgánica se combinó y se secó sobre sulfato de magnesio. La solución se filtró y el filtrado se concentró hasta la sequedad. El producto bruto 22 se purificó mediante cromatografía en gel de sílice en una columna de 4 gramos eluida con isopropanol al 0-10 % en DCM (p/1 % de ácido acético) durante 10 minutos. Las fracciones puras se combinaron y se concentraron obteniéndose 220 mg del producto 22 puro en forma de un sólido amarillo pálido.
Se disolvió el compuesto 22 (50 mg) en diclorometano/dimetilformamida (5 mL, 1:1) y se añadieron 2 equivalentes de TFP seguido de 1.5 equivalentes de EDCl. La reacción se agitó durante la noche a 22 °C y la reacción bruta se concentró hasta la sequedad. El producto se purificó mediante cromatografía ultrarrápida en una columna de gel de sílice de 4 gramos eluida con isopropanol al 0-10 % durante 10 minutos. Las fracciones puras se concentraron y el residuo se liofilizó en acetonitrilo al 30 % en agua obteniéndose 21 mg de éster de TFP 23 purificado en forma de un sólido amarillo pálido. El peso molecular y la pureza se confirmaron mediante LC/MS.
Conjugación con anticuerpo: Se disolvió el éster de TFP 23 en DMSO anhidro para preparar 20 mM de una solución madre y se añadieron 6 equivalentes molares (en relación con el anticuerpo) a 20 mg de un anticuerpo IgG (específicamente, el anticuerpo anti-CD20 rituximab) (10 mg/ml en PBS). La reacción de conjugación se incubó a 4 °C durante la noche. El tampón del inmunoconjugado resultante, BB-45, se intercambió a PBS (pH 7.2) eliminándose el exceso de impurezas de peso molecular pequeño. La concentración final se determinó midiendo la absorbancia a 280 nm en un espectrofotómetro Thermo Nanodrop 1000. El rendimiento fue de 14 mg de BB-45,<o>el 70 % en base a la proteína recuperada. Se detectó un agregado mínimo (menos del 1 %) mediante análisis SEC y se determinó un DAR de 2.8 mediante análisis LC/MS. El inmunoconjugado purificado se filtró a través de un filtro estéril de 0.2 pM y se almacenó a -20 °C.
Ejemplo 17. Síntesis del inmunoconjugado BB-24 con un éster de TFP
Esquema 24
Este ejemplo proporciona orientación sobre la síntesis de un inmunoconjugado con un enlazador diferente utilizando el método del éster de TFP. Se disolvió el compuesto Vil (150 mg) en 20 mL de THF y se añadieron 10 mL de bicarbonato de sodio acuoso saturado. Se añadió anhídrido succínico (50 mg) en una porción y la mezcla se agitó durante 1 hora a temperatura ambiente. Se añadieron lentamente 20 mL de HCl 1 N y la mezcla se extrajo con 2<x>50 mL de diclorometano y los extractos orgánicos combinados se evaporaron hasta la sequedad. El producto bruto 24 se purificó en una columna de gel de sílice de 4 gramos eluida con MeOH al 0-15 % (1 % de ácido acético) durante 15 minutos. Las fracciones puras se combinaron y se evaporaron obteniéndose 180 mg de 24 puro.
Se disolvieron ciento cincuenta mg de 24 en DMF (10 mL) y se añadió 1 equivalente de HATU seguido de 2 equivalentes de DIPEA. Se añadió un eq. y medio de glicinaOtBu y se agitó durante la noche. El DMF se evaporó y el residuo se trató con 5 mL de HCl 1 N en dioxano durante 30 minutos con agitación. El disolvente se evaporó y el residuo bruto se purificó instantáneamente en una columna de gel de sílice de 4 gramos eluida con isopropanol al 0-10 % durante 15 minutos. La evaporación de las fracciones puras proporcionó 110 mg de 25 puro.
Se disolvió el compuesto 25 (50 mg) en 10 mL de DMF y se añadió 1.5 eq. de PTF seguido de 1.2 eq. de DCC y 2 mg de DMAP. La reacción se agitó durante la noche, se concentró hasta la sequedad y se purificó sobre gel de sílice (columna de 4 g) eluida con IPA al 0-10 % en DCM obteniéndose 32 mg de éster de TFP puro, compuesto 26, después de la liofilización en agua con acetonitrilo 1:3.
Conjugación con anticuerpo: El éster de TFP, compuesto 26, se disolvió en DMSO anhidro para preparar 20 mM de solución madre y se añadieron 5 equivalentes molares (en relación con el anticuerpo) a 20 mg de anticuerpo a 10 mg/ml en PBS. La reacción de conjugación se incubó a 4 °C durante 6 horas. El tampón del inmunoconjugado resultante, BB-24, se intercambió a PBS (pH 7.4) eliminándose el exceso de impurezas de peso molecular pequeño. La concentración final de proteína se determinó midiendo la absorbancia a 280 nm en un espectrofotómetro Nanodrop 1000. El rendimiento fue de 15 mg (75 % en base a la proteína recuperada). El análisis SEC detectó un agregado mínimo de menos del 1 % y se determinó que el DAR era de 2.8 adyuvantes por anticuerpo mediante análisis LC/MS. El inmunoconjugado purificado se filtró a través de un filtro estéril de 0.2 pM y se almacenó a -20 °C hasta que se necesitó.
Ejemplo 18. Síntesis del inmunoconjugado BB-37 con un éster de TFP
Esquema 25
Este ejemplo proporciona orientación sobre la síntesis de un inmunoconjugado con un enlazador diferente utilizando el método de TFP. Se disolvió el compuesto Vil (155 mg, 0.5 mmol) en 10 mL de DMF y se añadieron 0.2 mL de DIPEA. En un recipiente separado, se disolvieron 1.2 equivalentes de PEG2-monoéster metílico de dicarboxilato en 5 mL de DMF y se añadieron 2 equivalentes de DIPEA seguido de HATU (1.2 equivalentes). La mezcla se añadió a Vil y se agitó durante 1 hora a temperatura ambiente. La reacción se concentró hasta la sequedad al vacío y el residuo se disolvió en THF (5 mL). Se añadió un volumen igual de agua seguido de 2 mL de LiOH acuoso 1 M. La mezcla se agitó durante la noche y luego se añadieron 10 mL de HCl 1 N. La mezcla acidificada se extrajo 2 veces con diclorometano, se secó sobre sulfato de sodio, se concentró hasta la sequedad y se purificó mediante cromatografía en gel de sílice. El producto se eluyó con metanol al 0-10 % durante 10 minutos. Las fracciones puras se combinaron y se concentraron obteniéndose 110 mg del compuesto 27 puro en forma de un sólido amarillo pálido.
Se disolvió el compuesto 27 (50 mg) en diclorometano/dimetilformamida (5 mL, 1:1) y se añadieron 2 equivalentes de TFP seguido de 1.5 equivalentes de EDCl. La reacción se agitó durante la noche a temperatura ambiente y la reacción se concentró hasta la sequedad. El éster de TFP 28 bruto se purificó mediante cromatografía ultrarrápida en una columna de gel de sílice de 4 gramos eluida con 0-10 % de isopropanol durante 10 minutos. Las fracciones puras se concentraron y el residuo se liofilizó en acetonitrilo al 30 % en agua obteniéndose 41 mg de éster de TFP 23 purificado en forma de un sólido blanco. El peso molecular y la pureza se confirmaron mediante LC/MS.
Conjugación con anticuerpo: El éster de TFP 28 se disolvió en DMSO anhidro para preparar 20 mM de una solución madre y se añadieron 8 equivalentes molares (en relación con el anticuerpo) a 20 mL de un anticuerpo IgG (específicamente, el anticuerpo anti-CD20 rituximab) (10 mg/ml en PBS). La reacción de conjugación se incubó a 4 °C durante la noche. El tampón del inmunoconjugado resultante, BB-37, se intercambió a PBS (pH 7.2) eliminándose el exceso de impurezas de peso molecular pequeño. La concentración final se determinó midiendo la absorbancia a 280 nm en un espectrofotómetro Thermo Nanodrop 1000. El rendimiento fue de 16 mg de inmunoconjugado BB-37, o el 70 % en base a la proteína recuperada. Se detectó un agregado mínimo (menos del 1 %) mediante análisis SEC y se determinó un DAR de 2.3 mediante análisis LC/MS. El inmunoconjugado purificado se filtró a través de un filtro estéril de 0.2 pM y se almacenó a -20 °C.
Ejemplo 19. Síntesis de otro adyuvante de TLR7/8
Esquema 26
Este ejemplo proporciona orientación sobre la síntesis de otro agonista de TLR. El compuesto 29 es un análogo del compuesto Vil que contiene una cadena lateral de piperizina para la unión con el enlazador. Se sintetizó usando los métodos descritos previamente para la síntesis del compuesto V il, excepto que se sustituyó el Bocdiaminobutano utilizado en la etapa 3 de la síntesis por un análogo de piperizina protegido con Boc. La ruta sintética general para el compuesto 29 se describe en el esquema 23. La adición de la cadena lateral de piperizina permite la síntesis de inmunoconjugados que previamente eran inaccesibles debido a la inestabilidad. Análogos parecidos del compuesto Vil que contienen enlazadores de succinato son propensos a la ciclación después de la activación de TFP y la piperizina impide la ciclación. Además, el grupo amino terciario dentro de la piperizina mantiene una carga positiva después de la unión y conjugación del enlazador. Las cargas positivas en esta ubicación son importantes para mejorar la potencia de TLR8. Posteriormente se<usó>el compuesto 29 para sintetizar inmunoconjugados como se describe a continuación en los ejemplos 19-21.
Ejemplo 20. Síntesis de inmunoconjugado BB-42 con un éster de TFP
Esquema 27
Este ejemplo proporciona orientación sobre la síntesis de un inmunoconjugado con un enlazador diferente utilizando el método del éster de TFP. Se disolvió el compuesto 29 (100 mg) en 10 mL de THF y se añadieron 2 mL de bicarbonato de sodio acuoso saturado seguido de 10 mL de agua. Se añadió anhídrido succínico (50 mg) en una porción y la mezcla se agitó a temperatura ambiente. Después de una hora, se añadieron lentamente 20 mL de HCl 1 N y la mezcla de reacción se extrajo con 2<x>50 mL de diclorometano ("DCM"). L<os>extractos orgánicos combinados se evaporaron hasta la sequedad. El producto bruto 30 se purificó en una columna de gel de sílice de 4 gramos eluida con isopropanol al 0-15 % en DCM (ácido acético al 1 %) durante 15 minutos. Las fracciones puras se combinaron y se evaporaron hasta la sequedad obteniéndose 80 mg de ácido puro 30.
Se disolvió el compuesto 30 (50 mg) en didorometano/dimetilformamida (5 mL, 1:1) y se añadieron 2 equivalentes de TFP seguido de 1.5 equivalentes de EDCI. La reacción se agitó durante la noche a temperatura ambiente y la reacción se concentró hasta la sequedad. El éster de TFP 31 bruto se purificó mediante cromatografía ultrarrápida y se eluyó con 0-10 % de isopropanol durante 10 minutos. Las fracciones puras se concentraron y el residuo se liofilizó en acetonitrilo al 30 % en agua obteniéndose 41 mg de éster de TFP 31 purificado en forma de un sólido blanco. El peso molecular y la pureza se confirmaron mediante LC/MS.
El éster de TFP 31 se conjugó con un anticuerpo lgG1 (específicamente, el anticuerpo anti-CD20 rituxumab) como se describe previamente para el BB-24 obteniéndose el BB-42. L<os>análisis SEC y LC/MS de BB-42 confirmaron el peso molecular, una alta pureza monomérica con menos del 2 % de agregado y un DAR de 1.7 (véanse las figuras 20A-B).
Ejemplo 21. Síntesis de inmunoconjugado BB-43 y BB-44 con un éster de TFP
Esquema 28
Este ejemplo proporciona orientación sobre la síntesis de inmunoconjugados con diferentes enlazadores utilizando el método del éster de TFP. El compuesto 30 (esquema 25) se acopló a enlazadores de polietilenglicol (PEG) que contenían 2<u>8 unidades de PEG para ampliar la distancia entre el adyuvante y el anticuerpo. La unión de las extensiones del enlazador PEG se realizó utilizando protocolos descritos previamente para la unión con el enlazador y la activación de TFP. Brevemente, se disolvieron 100 mg del compuesto 30 en 10 mL de DMF y se añadieron 0.2 mL de DIPEA seguido de HATU (1.2 equivalentes). Después de 1 hora, se añadió el enlazador amino PEG apropiado (n = 2<u>8) y se agitó durante 2 horas más a temperatura ambiente. La mezcla de reacción se concentró hasta la sequedad al vacío y el residuo se purificó mediante HPLC preparativa en una columna C-18 eluida con acetonitrilo al 10-90 % en agua durante 30 minutos. Las fracciones puras se combinaron y se liofilizaron obteniéndose 65 mg y 45 mg de los intermedios 31<o>32 en forma de una sustancia vitrea transparente.
L<os>compuestos 31 y 32 se convirtieron en los correspondientes ésteres de TFP 33 y 34 usando protocolos descritos previamente. Brevemente, el ácido libre 31<o>32 (50 mg) se disolvió en diclorometano/dimetilformamida (5 mL, 1:1) y se añadieron 2 equivalentes de TFP seguido de 1.5 equivalentes de EDCI. La mezcla se agitó durante la noche a temperatura ambiente y se concentró hasta la sequedad obteniéndose los ésteres de TFP brutos 33 y 34. L<os>ésteres de TFP brutos se purificaron mediante cromatografía ultrarrápida sobre gel de sílice y se eluyeron con isopropanol al 0-10 % durante 10 minutos. Las fracciones puras se concentraron y el residuo se liofilizó en acetonitrilo al 30 % en agua obteniéndose los ésteres de TFP 33 y 34 purificados como sólidos transparentes. El peso molecular y la pureza de los compuestos puros se confirmaron mediante LC/MS.
Conjugación con anticuerpo: L<os>ésteres de TFP 33 y 34 se conjugaron con un anticuerpo lgG1 (específicamente, el anticuerpo anti-CD20 rituxumab) utilizando los protocolos descritos previamente. L<os>ésteres de TFP se disolvieron en DMSO anhidro para preparar 20 mM de una solución madre y se añadieron 8 equivalentes molares (en relación con el anticuerpo) a 20 mg del anticuerpo IgG a 10 mg/ml en PBS. La reacción de conjugación se incubó a 4 °C durante 12 horas. El tampón del inmunoconjugado resultante, BB-43 y BB-44, se intercambió a PBS (pH 7.4) eliminándose el exceso de impurezas de peso molecular pequeño. La concentración final de proteina se determinó midiendo la absorbancia a 280 nm en un espectrofotómetro Nanodrop 1000. L<os>rendimientos fueron del 75 % en base a la proteina recuperada. El análisis S<e>C detectó que había un agregado mínimo y los DAR de 1.0 y 1.7 adyuvantes por anticuerpo se determinaron mediante análisis LC/MS. L<os>inmunoconjugados purificados se filtraron a través de un filtro estéril de 0.2 pM y se almacenaron a -20 °C hasta que se necesitaron.
Ejemplo 22. Evaluación de la actividad del inmunoconjugadoin vitro
Aislamiento de células presentadoras de antígeno humano. Se seleccionaron negativamente células presentadoras de antígenos (APC) humanas a partir de células mononucleares de sangre periférica humana obtenidas a partir de donantes de sangre sanos (Stanford Blood Center) mediante centrifugación en gradiente de densidad utilizando un cóctel de enriquecimiento de monocitos humanos RosetteSep (Stem Cell Technologies) que contenía anticuerpos monoclonales contra CD14, CD16, CD40, CD86, CD123 y H<l>A-DR. Posteriormente, las A<p>C inmaduras se purificaron con una pureza > 97 % mediante selección negativa utilizando un kit de enriquecimiento de monocitos humanos EasySep sin agotamiento de CD16 que contenía anticuerpos monoclonales contra CD14, CD16, CD40, CD86, CD123 y HLA-DR.
Preparación de las células tumorales. Las células tumorales se volvieron a suspender en PBS con suero fetal bovino (FBS) al 0.1 % de 1 a 10 x 106 células/ml. Posteriormente, las células se incubaron con 2 |jM de CFSE para producir una concentración final de 1<j>M. La reacción finalizó después de 2 minutos mediante la adición de 10 mL de medio completo con FBS al 10 % y se lavó una vez con el medio completo. Las células se fijaron en paraformaldehído al 2 % y se lavaron tres veces con PBS o se dejaron sin fijar antes de congelar las células en DMSO al 10 %, FBS al 20 % y medio al 70 %.
Cocultivos de APC tumorales. 2 x 105 APC se incubaron con o sin 6.5 x 105 células tumorales alogénicas marcadas con CFSE en placas de 96 pocilios (Corning) que contenían medio IMDM (Gibco) complementado con suero fetal bovino al 10 %, penicilina 100 U/ml, estreptomicina 100 jg/ml, L-glutamina 2 mM, piruvato de sodio, aminoácidos no esenciales y, donde se indica, se prepararon diversas concentraciones de anticuerpo CD20 no conjugado, e inmunoconjugados de la invención según los ejemplos anteriores. Las células y los sobrenadantes libres de células se analizaron después de 18 horas mediante citometría de flujo<o>ELISA.
L<os>resultados de este ensayo se muestran en las figuras 9A-9F para el BB-17 y BB-01. Específicamente, los gráficos muestran que el BB-17 y el BB-01 preparados según los esquemas 11 y 14 desencadenan la activación mieloide mientras que el anticuerpo CD20 no conjugado de control no lo hace. Además, las figuras 23A-D muestran que el BB-14 provoca la activación mieloide como se indica en CD14, CD20, CD86 y HLA-DR mientras que el control no lo hace. Las figuras 24A-D muestran que el BB-15 provoca la activación mieloide como se indica en CD14, CD20, CD86 y HLA-DR mientras que el control no lo hace. Las figuras 25A-D muestran que el BB-27 provoca la activación mieloide como se indica en CD14, CD20, CD86 y HLA-DR mientras que el control no lo hace. Las figuras 26A-D muestran que el BB-45 provoca la activación mieloide como se indica en CD14, CD20, CD86 y HLA-DR mientras que el control no lo hace. Las figuras 27A-D muestran que el BB-24 provoca la activación mieloide como se indica en CD14, CD20, CD86 y HLA-DR mientras que el control no lo hace.
Ejemplo 23. Comparación de BB-01 con el conjugado comparativo IRM1 y el conjugado comparativo IRM2
Como se explica previamente, los inmunoconjugados se describen en la patente estadounidense 8.951.528 ("la patente '528"). Este ejemplo muestra que los inmunoconjugados descritos en la presente memoria son superiores a los inmunoconjugados descritos en la patente '528. El BB-01 se sintetizó según el esquema 15. Se prepararon conjugados comparativos IRM1 e IRM2 usando los adyuvantes descritos en la patente '528 como adyuvantes IRM1 e lRM2. Específicamente, el IRM1 e IRM2 se conjugaron con un anticuerpo IgG (específicamente, el anticuerpo anti-CD20 rituxumab) con un enlazador amida.
Se analizó el BB-01 y los conjugados comparativos IRM1 e IRM2 usando el ensayo del ejemplo 9. L<os>resultados se muestran en las figuras 10A-10F y 11 A- 11C. Concretamente, las figuras 10A-10F muestran que el BB-01 preparado según el esquema 11 provoca la activación mieloide mientras que los conjugados comparativos IRM1 e lRM2 y el anticuerpo CD20 no conjugado de control no lo hacen. Además, las figuras 11A-11C muestran que BB-01 preparado según el esquema 11 provoca la secreción de citocinas mientras que los conjugados comparativos IRM1 e IRM2 y el anticuerpo CD20 no conjugado de control no lo hacen.
Los conjugados comparativos IRM1 e IRM2 tuvieron una agregación excesiva según lo según lo determinado por LC/MS. Las figuras 15A-C muestran los resultados de la cromatografía de exclusión por tamaño después de la filtración con un filtro de 0.2 j M. El conjugado comparativo IRM1 tuvo una agregación del 4 % y se indica mediante el primer pico a los 4.5 min. El conjugado comparativo IRM2 tuvo una agregación del 9.5 % y se indica mediante el primer pico a los 4.5 min. Por el contrario, el BB-01 tuvo una pequeña cantidad de agregación. Esta diferencia se debe en parte al intermedio tiolado que tienen IRM1 e IRM2, que no es necesario para la síntesis de BB-01.
También se analizó la estabilidad en almacenamiento de BB-01 y los conjugados comparativos IRM1 e IRM2. Después de la síntesis, los conjugados se almacenaron en tubos cónicos de 15 mL durante varias horas. Después del almacenamiento, el tubo que contenía el conjugado comparativo IRM2 tenía un gran agregado sólido blanco en el fondo del tubo. L<os>tubos que contenían BB-01 y el conjugado comparativo IRM1 contenían únicamente fluido transparente y no tenían sedimentos.
Ejemplo 24. Generación de anticuerpo del anticompuesto 1
Se conjugó KLH (ThermoFisher, producto n.° 77600) o albúmina de suero bovino (Thermo Fisher, producto n.° 29130) con el compuesto 1 usando química reactiva con amina.
Para producir anticuerpos de conejo, se inmunizaron conejos inyectando en la almohadilla plantar 200 ug de conjugado KLH-compuesto 1, formulado en adyuvante completo de Freund. Los animales recibieron un refuerzo con 100 ug adicionales de conjugado inmunógeno 14, 28 y 42 días después de la primera administración. Se recogió sangre los días 35 y 49 y se aisló el suero y se analizó mediante ELISA para detectar anticuerpos del anticompuesto 1. Las placas ELISA se recubrieron con conjugado BSA-compuesto 1 y Ios anticuerpos se detectaron con IgG anticonejo conjugada con peroxidasa (Jackson Immunoresearch, producto n.0111-035-144).
Para producir anticuerpos murinos, a ratones C57BL/6 se les inyectaron por vía intravenosa 100 ug de conjugado del compuesto 1, seguido de dosis repetidas Ios días 6, 12 y 24 después de la primera administración. Se recogió sangre 12 y 24 días después de la administración y se analizó el suero mediante ELISA para detectar anticuerpos del anticompuesto 1. Después de una detección suficiente de anticuerpos, se recogió sangre, bazo y ganglios linfáticos y se cosechó en una suspensión de células individuales. Posteriormente, las células B se aislaron mediante selección negativa y se clasificaron mediante FACS. Se recogieron células B que dieron resultado positivo en la tinción de IgG, dieron resultado negativo en la tinción de IgM e IgD y dieron resultado positivo en la tinción para la interacción con el compuesto 1, según se midió usando un conjugado BSA-compuesto 1 y estreptavidina marcada con fluorescencia. Las células B aisladas se lavaron dos veces en medio completo y luego se fusionaron con células de mieloma SP20 usando polietilenglicol 1500 (Roche, producto n.o 10 783 641 001) según las instrucciones del fabricante. Las células de mieloma SP20 se mantuvieron antes de la fusión en DMEM complementado con FBS al 10 %, glutamina y penicilina estreptomicina. Las células fusionadas se sembraron a aproximadamente 100000 células por pocilio en placas planas de 96 pocilios. Después de 1 a 2 días de incubación, se añadieron al medio el complemento HAT e IL-6 (producto ThermoFisher n.° 21060017 y producto Gibco n.° PHC0065). Se tomaron muestras del medio de 10 a 14 días después y se analizó mediante ELISA como se describe previamente para medir el anticuerpo del anticompuesto 1. Los clones positivos se expandieron, se subclonaron mediante dilución limitante y se analizaron adicionalmente para confirmar la producción de anticuerpos y, posteriormente, se criopreservaron las hibridomas. Las hibridomas se cultivaron en matraces tratados con cultivo de tejidos a 37 grados Celsius con CO<2>al 5 % en 10 % de medio completo e hibridoma-SFM al 90 % (Gibco, producto n.o 12045076). El medio se reemplazó con hibridoma-SFM al 100 % y las células se cultivaron durante 3 a 6 días más. Se recogió el medio y se filtró a través de un filtro de 0.22 pm. El anticuerpo se purificó utilizando columnas Hi-Trap Mabselect (GE Life Sciences, producto n.o 28-4082-53) y el tampón se intercambió a PBS estéril mediante diálisis<o>mediante columnas de desalinización.
Ejemplo 25: Detección de conjugación mediante ELISA
En cinco casos, el estado de conjugación de un constructo de anticuerpo no se pudo resolver mediante LC/MS a causa de la heterogeneidad del producto. Para determinar si la conjugación fue satisfactoria, se utilizó un ensayo ELISA. El anticuerpo utilizado para detectar la presencia de adyuvante en el anticuerpo fue el anticuerpo del anticompuesto 1 descrito en el ejemplo 18.
Las figuras X indican que las conjugaciones fueron satisfactorias para el inmunoconjugado de cetuximab, el anticuerpo desnudo de etanercept, el inmunoconjugado de etanercept, el inmunoconjugado de ipilimumbab y el inmunoconjugado de obinutuzumab.
Ejemplo 26. Detección ELISA del compuesto 1 acoplado a IgG humana de Ig-Fc humana
Se recubrieron placas ELISA Maxysorp (Fisher 44-2404-21) durante la noche con 1 ug/ml de IgG antihumana de cabra (Jackson Immunoresearch). Las placas se bloquearon con PBS que contenía BSA al 1% (Sigma A7030) y se incubaron con una titulación de Ios anticuerpos indicados o Ios conjugados de Boltbody (BB-01) correspondientes. L<os>anticuerpos unidos se detectaron con IgG antihumana de cabra conjugada con peroxidasa (Jackson),<o>un anticuerpo monoclonal de ratón contra el compuesto 1 seguido de IgG antirratón de cabra conjugada con peroxidasa (fragmento Fc específico). Se añadió Tm B a Ios pocilios y se midió la absorbancia a 450 nM después de detener la reacción con la solución de parada de TMB (Fisher NC1291012).
Ejemplo 27. Detección ELISA del compuesto 1 acoplado a antidectina 2 de ratón
Se recubrieron placas de ELISA Maxisorp (Fisher 44-2404-21) durante la noche con 1 ug/ml de antidectina 2 de ratón (Invivogen)<o>antidectina 2 de ratón BB-01. Las placas se bloquearon con PBS que contenía BSA al 1 % (Sigma A7030) y se incubaron con cantidades tituladas de anti-lgG de ratón de cabra conjugada con peroxidasa, específica de cadena pesada y ligera (Jackson 115-035-003) para la detección del total de IgG,<o>cantidades tituladas de antisuero de conejo del anticompuesto 1 para la detección de Boltbody. Se detectó el anticompuesto 1 de conejo con anti-lgG de conejo caprino conjugada con peroxidasa, reactividad cruzada mínima con proteínas séricas humanas, de ratón y de rata (Jackson 111-035-144). Se añadió TMB a I<os>pocilios y se midió la absorbancia a 450 nM después de detener la reacción con la solución de parada de TMB (Fisher NC1291012).
Aunque Ios párrafos anteriores se han descrito con bastante detalle a modo de ilustración y ejemplo con fines de claridad y comprensión, un experto en la materia apreciará que se pueden poner en práctica determinados cambios y modificaciones dentro del alcance de las reivindicaciones adjuntas.
Ejemplo 28. Método para determinar la actividad de unión a la proteína A.
Se incubaron muestras duplicadas de rituximab<o>rituximab BB-37 (100 ul, 50 ug/ml en PBS) con 12.5 ul de perlas de sefarosa de proteína A (Thermo Fisher 22810) con rotación durante la noche. Las perlas se sedimentaron mediante centrifugación, se eliminó el sobrenadante y el líquido residual se eliminó de las perlas usando una punta de pipeta fina. Se añadió a las perlas tampón de muestra de Laemmli no reductor (100<u>I). Las perlas y I<os>sobrenadantes se calentaron a 90 °C durante 5 minutos y se analizaron fracciones iguales mediante SDS-PAGE (gel NUPAGE al 4-12 %, tampón MOPS) seguido de tinción con Coomassie (GelCode™ Blue, ThermoFisher). El estándar de peso molecular es el marcador SeeBlue® Plus 2 (ThermoFisher LC5925). Como se observa en la figura 133C, la conservación de la unión a la proteína A en el rituximab BB-37 sugiere la conservación de la unión a FcRN.
Ejemplo 29. Método para determinar la actividad de unión a CD16a.
Se recubrieron placas de ELISA Maxysorp durante la noche con 1.5 ug/ml de proteína CD16a humana recombinante R&D Systems 4325-FC-050). Las placas se bloquearon con PBS que contenía BSA al 1 % y se incubaron con una titulación de anticuerpos o inmunoconjugados de anticuerpos. Los anticuerpos unidos se detectaron con peroxidasa conjugada AffiniPure F(ab') fragmento de IgG antihumana de cabra (Jackson 109-036 003). Se añadió TMB (Fisher Pl34028) a los pocilios y se midió la absorbancia a 450 nM después de detener la reacción con la solución de parada de TMB (Fisher n C1291012). Como se observa en la figura 133A, el mutante glicosilado de rituximab muestra una unión disminuida, coherente con el papel de la glicosilación en la función efectora.
Ejemplo 30. Método para la determinación de la actividad de unión a CD64.
Se recubrieron placas de ELISA Maxysorp durante la noche con 1.5 ug/ml de proteína CD64 humana recombinante (R&D Systems). Las placas se bloquearon con PBS que contenía BSA al 1 % y se incubaron con una titulación de rituximab o inmunoconjugados de rituximab (rituximab BB-01). Los anticuerpos unidos se detectaron con un fragmento F(ab') de IgG antihumano de cabra AffiniPure conjugado con peroxidasa utilizando el desarrollo de color de TMB y se midió la absorbancia a 450 nM después de detener la reacción. Como se observa en la figura 133B, el rituximab que se había desglicosilado con PNGasa F muestra una unión deteriorada a CD64.
El uso de los términos "un" y "una" y "el" y "por lo menos uno" y referentes parecidos en el contexto de la descripción de la invención (especialmente en el contexto de las reivindicaciones siguientes) deben interpretarse como que cubren tanto el singular como el plural, a menos que se indique lo contrario en la presente memoria<o>el contexto lo contradiga claramente. El<uso>del término "por lo menos uno" seguido de una lista de uno<o>más elementos (por ejemplo, "por lo menos uno de A y B") debe interpretarse en el sentido de un elemento seleccionado entre los elementos enumerados (A<o>B)<o>cualquier combinación de dos<o>más de los elementos enumerados (A y B), a menos que se indique lo contrario en la presente memoria<o>que el contexto lo contradiga claramente. L<os>términos "que comprende", "que tiene", "que incluye" y "que contiene" deben interpretarse como términos abiertos (es decir, que significan "que incluyen, pero no se limitan a"), a menos que se indique lo contrario. La enumeración de intervalos de valores en la presente memoria tiene la intención de servir meramente como un método abreviado de referirse individualmente a cada valor separado que se encuentra dentro del intervalo, a menos que se indique lo contrario en la presente memoria, y cada valor separado se incorpora a la memoria descriptiva como si se mencionara individualmente en la presente memoria. Todos los métodos descritos en la presente memoria se pueden realizar en cualquier orden adecuado a menos que se indique lo contrario en la presente memoria<o>que el contexto lo contradiga claramente. El uso de todos y cada uno de los ejemplos, o del lenguaje ejemplar (p. ej., "tales como") provisto en la presente memoria, tiene como objetivo meramente iluminar mejor la invención y no representa una limitación en el alcance de la invención a menos que se reivindique lo contrario. Ninguna expresión en la memoria descriptiva debe interpretarse en el sentido indicar que algún elemento no reivindicado es fundamental para la práctica de la invención.
En la presente memoria se describen realizaciones preferidas de la presente invención, incluido el mejor modo conocido por los autores de la invención para llevar a cabo la invención. Las variaciones de esas realizaciones preferidas pueden resultar evidentes para los expertos en la materia tras leer la descripción anterior.

Claims (22)

  1. REIVINDICACIONES 1. Un inmunoconjugado que comprende (a) un constructo de anticuerpo que comprende (i) un dominio de unión al antígeno y (ii) un dominio F<c>, (b) adyuvante de fórmula:
    en el que cada J independientemente es hidrógeno, OR4,<o>R4; cada R4 independientemente es hidrógeno,<o>un grupo alquilo, heteroalquilo, cicloalquilo, heterocicloalquilo, arilo, heteroarilo, arilalquilo<o>heteroarilalquilo que comprende de 1 a 8 unidades de carbono; cada U es independientemente CH o N en el que por lo menos una U es N; cada subíndice t independientemente es un número entero de 1 a 3; y Q está ausente, y la línea discontinua del adyuvante representa el punto de unión del adyuvante, y (c) un enlazador, en el que el adyuvante está unido de forma covalente al constructo de anticuerpo por medio del enlazador.
  2. 2. El inmunoconjugado de la reivindicación 1, en el que cada U es N.
  3. 3. El inmunoconjugado de la reivindicación 1, en el que cada subíndice t es 2.
  4. 4. El inmunoconjugado de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en el que el dominio de unión al antígeno se une a un antígeno seleccionado del grupo que consiste en CDH1, CD19, CD20, CD29, CD30, CD38, CD40, CD47, EpCAM, MUC1, MUC16, EGFR, VEGF, HER2, SLAMF7, PDGFRa, gp75, CTLA4, PD-1, PD-L1, PD-L2, LAG-3, B7-H4, KIR, TNFRSF4, OX40L, IDO-1, IDO-2, CEACAM1, BTLA, TIM3, A2Ar, VISTA, CLEC4C (BDCA-2, DLEC, CD303, CLECSF7), CLEC4D (MCL, CLECSF8), CLEC4E (Mincle), CLEC6A (dectina 2), CLEC5A (MDL-1, CLECSF5), CLEC1B (CLEC-2), CLEC9A (DNGR-1), y CLEC7A (dectina 1), y preferiblemente HER2, EGFR, PD-L1 y CD20.
  5. 5. El inmunoconjugado de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en el que el dominio de unión al antígeno se une a HER2 y en el que opcionalmente el anticuerpo es trastuzumab, un biosimilar de trastuzumab, pertuzumab o un biosimilar de pertuzumab.
  6. 6. El inmunoconjugado de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en el que el dominio de unión al antígeno se une a EGFR y en el que opcionalmente el anticuerpo es cetuximab o un biosimilar de cetuximab.
  7. 7. El inmunoconjugado de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en el que el dominio de unión al antígeno se une a PD-L1, y en el que opcionalmente el anticuerpo es atezolizumab, un biosimilar de atezolizumab, avelumab, un biosimilar de avelumab, durvalumab<o>un biosimilar de durvalumab.
  8. 8. El inmunoconjugado de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en el que el dominio de unión al antígeno se une a CD20 y en el que opcionalmente el anticuerpo es rituximab, un biosimilar de rituximab, obinutuzumab<o>un biosimilar de obinutuzumab.
  9. 9. El inmunoconjugado de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, en el que el adyuvante es
  10. 10. El inmunoconjugado de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, en el que el inmunoconjugado tiene una estructura según la fórmula I:
    o una de sus sales farmacéuticamente aceptables, en el que, Ab es el anticuerpo siendo un residuo de aminoácido del anticuerpo, en el que A es una cadena lateral modificada o no modificada del residuo de aminoácido, Z es el enlazador, Ady es el adyuvante, y el subíndice r es un número entero del 1 al 10.
  11. 11. El inmunoconjugado de la reivindicación 10, en el que el inmunoconjugado tiene una estructura según la fórmula II:
    <o>una de<sus>sales farmacéuticamente aceptables, en el que Ab es un anticuerpo en el que A es una cadena lateral de aminoácidos no modificada en el anticuerpo o una cadena lateral de aminoácidos modificada en el anticuerpo; Ady es el adyuvante, el subíndice r es un número entero del 1 al 10, Z1 se selecciona entre -C(O)-, -C(0)NH- y -CH<2>-, Z2 y Z4 cada uno se selecciona independientemente entre un enlace, alquileno de C<1-30>y heteroalquileno de 3 a 30 elementos, en el que uno o más agrupamientos de átomos adyacentes en el alquileno de Ci -30 y heteroalquileno de 3 a 30 elementos se reemplazan opcional e independientemente por -C(O)-, -NR<a>C(O)-, or -C(O)<n>R<a>-, en el que cada Ra se selecciona independientemente entre H y alquilo de Ci -6, uno o más agrupamientos de átomos adyacentes en el alquileno de C<1-30>y heteroalquileno de 3 a 30 elementos se reemplazan opcional e independientemente por un carbociclo divalente de 4 a 8 elementos, y uno<o>más agrupamientos de átomos adyacentes en el alquileno de C<1-30>y heteroalquileno de 3 a 30 elementos se reemplazan opcional e independientemente por un heterociclo divalente de 4 a 8 elementos que tiene de uno a cuatro heteroátomos seleccionados de O, S y N, Z3 es un enlace, un péptido divalente o un polímero divalente, y Z5 está unido a la cadena lateral de una cadena lateral de aminoácido en el anticuerpo.
  12. 12. El inmunoconjugado de la reivindicación 10, en el que el inmunoconjugado tiene una estructura según la fórmula III:
    Ab es el anticuerpo con siendo un residuo de lisina del anticuerpo, Ady es el adyuvante, G es CH<2>, C=0, o un enlace, L es un grupo de enlace, y el subíndice r es un número entero del 1 al 10.
  13. 13. El inmunoconjugado de la reivindicación 12, en el que L es
    en la que R está o p c io n a lm e n te p re sen te y es una cad en a de a lqu ilo , he te roa lqu ilo , arilo o h e te roa rilo linea l o ram ificada , c íc lica o linea l, sa tu ra d a o in sa tu rada , que c o m p re n d e de 1 a 8 un id ade s de ca rbono ; a es un nú m ero e n te ro de 1 a 40; cada A se s e le cc io n a in d e p e n d ie n te m e n te en tre cu a lq u ie r am ino ác id o ; el su b ín d ice c es un
    nú m ero en te ro de 1 a 20; la línea d iscon tinua e un ión a y la línea pun to de un ión
  14. 14. El in m u n o co n ju g a d o de la re iv in d ica c ió n 12 o 13, en el que L es: a es un nú m ero e n te ro de 1 a 40; la línea d isco n tin u a rep rese n ta el pun to de un ión línea o n d u la d a 're p re se n ta el pun to de un ión a , , en el que cad a a d yu va n te está un ido de fo rm a co va le n te al co n s tru c to de l an ticu e rp o po r m ed io de l en lazado r.
  15. 15. El in m u n o co n ju g a d o de una cu a lq u ie ra de las re iv in d ica c io n e s 12 a 14, en el que G es un en lace .
  16. 16. El in m u n o co n ju g a d o de una cu a lq u ie ra de las re iv in d ica c io n e s 13 a 14, en el que a es 1-10.
  17. 17. El in m u n o co n ju g a d o de una cu a lq u ie ra de las re iv in d ica c io n e s 10 a 12, en el que el su b ín d ice r es un núm ero e n te ro de 1 a 5.
  18. 18. El in m u n o co n ju g a d o de una cu a lq u ie ra de las re iv in d ica c io n e s 1 a 17, en el que el an ticu e rp o co m p re n d e una región F<c>modificada, opcionalmente en el que (<í>) la región F<c>modificada contiene por lo menos una inserción, deleción<o>sustitución de aminoácidos y/o (<í í>) la región F<c>modificada está desglicosilada<o>afucosílada.
  19. 19. Una composición que comprende una pluralidad de inmunoconjugados según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 18, que opcionalmente comprende además uno<o>más excipientes farmacéuticamente aceptables.
  20. 20. Un inmunoconjugado según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 18<o>una composición de la reivindicación 19 para<su uso>en el tratamiento del cáncer.
  21. 21. El inmunoconjugado<o>la composición para<su uso>según la reivindicación 20, en el que el dominio de unión al antígeno se une a HER2.
  22. 22. El inmunoconjugado<o>la composición para<su uso>según la reivindicación 20, en el que el cáncer es cáncer de mama, cáncer de cuello<o>cáncer de cabeza.
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