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ES2990179T3 - Composiciones y métodos para proteger frente a patógenos e irritantes aéreos - Google Patents

Composiciones y métodos para proteger frente a patógenos e irritantes aéreos Download PDF

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ES2990179T3
ES2990179T3 ES18849807T ES18849807T ES2990179T3 ES 2990179 T3 ES2990179 T3 ES 2990179T3 ES 18849807 T ES18849807 T ES 18849807T ES 18849807 T ES18849807 T ES 18849807T ES 2990179 T3 ES2990179 T3 ES 2990179T3
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infection
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compositions
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Nazlie Latefi
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Applied Biological Laboratories Inc
Original Assignee
Applied Biological Laboratories Inc
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Abstract

La presente divulgación presenta métodos y composiciones para mejorar la capacidad de las membranas respiratorias para filtrar patógenos transmitidos por el aire y proteger a un sujeto de infecciones respiratorias que resultan de la inhalación o ingestión de dichos patógenos. En particular, la divulgación proporciona composiciones antimicrobianas que previenen y tratan infecciones respiratorias causadas por bacterias, hongos y virus. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

DESCRIPCIÓN
Composiciones y métodos para proteger frente a patógenos e irritantes aéreos
Campo técnico
La presente invención se refiere a composiciones farmacéuticas para su uso en profilaxis y/o tratamiento de infecciones por rinovirus humano (RVH) y virus influenza humano.
Antecedentes
Las infecciones respiratorias se producen normalmente cuando patógenos aéreos entran en contacto con membranas mucosas (por ejemplo, membranas nasales, vello nasal, membranas esofágicas, etc.) mediante gotitas de aerosol o líquido inhaladas o ingeridas. La inhalación o ingestión de patógenos a través de la nariz o la boca es una causa principal de enfermedad respiratoria y también puede provocar enfermedad sistémica tal como poliomielitis o fiebre aftosa. Los patógenos aéreos pueden entrar en los pulmones tras la inhalación o ingestión, o pueden unirse a receptores encontrados en membranas nasales y otras a lo largo de la totalidad de las vías respiratorias altas y bajas que sirven como puntos de entrada por los cuales pueden entrar patógenos, alérgenos o irritantes en el torrente sanguíneo y pueden provocar tipos respiratorios, al igual que otros tipos, de infección o reacción alérgica. Aunque se han notificado agentes y composiciones (por ejemplo documentos US 2016/144004 A1; WO 03/051282 A2; CN 1248603 C; KR 20120065654; US 2010/160245; US 2011/052727; Koenighoferet al.,Multidiscip Respir Med., 12 de noviembre de 2014; 9(1):57; Jefferson, Curr Infect Dis Rep., junio de 2002; 4(3):206-210; documento WO 95/27736 A1 y Wakabayashi, J Infect Chemother., noviembre de 2014; 20(11):666-71), desafortunadamente no hay ninguna manera eficaz y conveniente de minimizar o prevenir la infección o alergia por microorganismos inhalados 0 ingeridos. Por tanto, existe una necesidad urgente de desarrollar nuevas composiciones y métodos para proteger frente a patógenos aéreos, alérgenos e irritantes, y particularmente frente a virus, particularmente rinovirus humano (RVH), virus influenza humano o ambos.
Sumario
La presente invención se refiere a las realizaciones tal como se definen en las reivindicaciones. Específicamente, la presente invención se refiere a una composición farmacéutica para su uso en la profilaxis y/o el tratamiento de infección por rinovirus humano o infección por virus influenza humano, en la que dicha composición debe aplicarse a la mucosa nasal y/u oral, y composición que comprende un portador farmacéuticamente aceptable y
(i) lactoferrina e ICAM-1 soluble;
(ii) lisozima e ICAM-1 soluble;
(iii) lactoferrina, lisozima e ICAM-1 soluble;
(iv) lactoferrina y lisozima;
(v) lactoferrina, lisozima y ácido siálico;
(vi) lactoferrina, lisozima, ácido siálico e isoquercetina.
Según los objetivos anteriores y otros, la presente invención presenta composiciones para su uso, tales como pulverizaciones nasales, pulverizaciones bucales, enjuagues bucales, pastillas para chupar y similares. En particular, se proporcionan composiciones antimicrobianas que previenen y tratan infecciones respiratorias y alergias provocadas por irritantes, alérgenos, bacterias, hongos y virus. La composición farmacéutica para su uso de las presentes invenciones protege a un sujeto frente a rinovirus humano y/o virus influenza humano.
La composición para su uso de la presente invención puede comprender uno o más compuestos antimicrobianos o antivirales dispersados en un portador, normalmente, pero no necesariamente, un portador líquido. El portador líquido tiene de manera ideal, pero no necesariamente, una reología adecuada para pulverizarse como un aerosol o niebla fina. La composición para su uso de la presente invención puede comprender uno o más componentes seleccionados del grupo que consiste en un emoliente, un agente oclusivo, un humectante, un portador, un excipiente, un emulsionante y un aceite esencial. En algunas realizaciones, la composición para su uso de la presente invención puede comprender un principio activo que combate la infección frente a virus que se unen a molécula de adhesión intercelular 1 (ICAM- 1) y/o virus que se unen a ácido siálico (o porciones extracelulares de los mismos). La composición farmacéutica para prevenir o tratar infección respiratoria puede comprender un portador farmacéuticamente aceptable y al menos dos (por ejemplo, dos, tres, cuatro) agentes activos (por ejemplo, antimicrobianos y/o antivirales, etc.) seleccionados de lactoferrina (por ejemplo, apolactoferrina, etc.), lisozima, ICAM-1 (por ejemplo, ICAM-1 soluble, etc.), ácido siálico (por ejemplo, sialilactosa, etc.) y un inhibidor de neuraminidasa (por ejemplo, quercetina, etc.). En una implementación, la composición para su uso en profilaxis o tratamiento de un sujeto humano que padece, o corre el riesgo de padecer, infección de las vías respiratorias con rinovirus humano (RVH) comprende, en un portador líquido adecuado: (i) ICAM-1 soluble (“sICAM-1”); (ii) lisozima; y (iii) lactoferrina (por ejemplo, apolactoferrina, etc.). En otra implementación, la composición para su uso en profilaxis o tratamiento de un sujeto humano que padece, o corre el riesgo de padecer, infección de las vías respiratorias con virus influenza humano comprende, en un portador líquido adecuado: (i) ácido siálico (por ejemplo, sialilactosa, etc.); (ii) lisozima; (iii) lactoferrina; y (iv) opcionalmente, un inhibidor de neuraminidasa tal como, por ejemplo, quercetina. En aún otra implementación, la composición para su uso en profilaxis o tratamiento de un sujeto humano que padece, o corre el riesgo de padecer, infección de las vías respiratorias con rinovirus humano (RVH) y virus influenza humano comprende, en un portador líquido adecuado: (i) ICAM-1 soluble (sICAM-1); (ii) lisozima; (iii) lactoferrina, (iv) ácido siálico y/o un derivado del m ismo (por ejemplo, sialilactosa, etc.); y (v) opcionalmente, un inhibidor de neuraminidasa. Cualquiera de las composiciones para su uso según estas realizaciones, puede comprender además uno o más de peróxido de cinc, cobre y plata. Cualquiera de las composiciones para su uso según estas realizaciones, puede comprender además carragenanos. Cualquiera de las composiciones para su uso según estas realizaciones, puede comprender además una o más de IgA, IgG e IgM. Las composiciones pueden comprender además uno o más componentes seleccionados del grupo que consiste en extracto de malvavisco, extracto de caléndula, extracto de piel de cítricos, extracto de miel, extracto de romero, extracto de mirra, extracto deHelichrysum,extracto de arruruz, aceite de neem, vitamina C, vitamina E y extracto de semilla de pomelo. El portador puede ser acuoso y puede incluir uno o más excipientes farmacéuticamente aceptables, incluyendo, sin limitación, diluyentes, agentes tamponantes, agentes de ajuste del pH (por ejemplo, ácido cítrico, etc.), espesantes y agentes de suspensión (por ejemplo, goma arábiga, goma xantana, hidroxipropilmetilcelulosa, celulosa microcristalina, carboximetilcelulosa de sodio, etc.), modificadores de la reología, conservantes (por ejemplo, alcohol fenetílico, cloruro de benzalconio, EDTAde sodio, etc.), agentes de ajuste de la isotonicidad (por ejemplo, cloruro de sodio, polioles, sacarosa, etc.), humectantes (por ejemplo, glicerina, etc.), tensioactivos (por ejemplo, polisorbatos, tales como polisorbato 80, palmitato de sacarosa, estearato de glicerilo, estearato-citrato de glicerilo, glicérido vegetal hidrogenado acetilado, etc.), y modificadores del sabor, por nombrar unos pocos. Cualquier excipiente debe ser compatible con la mucosa y el epitelio humanos, y no debe provocar sequedad o irritación excesivas en la mucosa o el epitelio. Los excipientes también deben tener en cuenta el hecho de que el agua tenderá a evaporarse a la temperatura corporal y, como tal, puede incluirse un disolvente secundario para ayudar a mantener los componentes solubles en disolución. El portador puede incluir un poliol, tal como un poliol C<2>-C<8>, incluyendo, sin limitación, glicerina, propilenglicol, 1,3-propanodiol, butilenglicol, 1,4-butanodiol, eritritol, treitol, arabitol, xilitol, manitol, sorbitol, pentilenglicol, hexilenglicol, caprililglicol, hidrolizados de almidón hidrogenados, isomalt, maltitol y similares. Las composiciones pueden comprender una cantidad de un alcohol, tal como etanol, siempre que esté en una cantidad que no irrita o reseca la mucosa. En algunas realizaciones, las composiciones para su uso están libres de etanol. En una realización, el portador es un portador acuoso que incluye desde aproximadamente el 1-95% o desde aproximadamente el 5-50% o desde aproximadamente el 10-40% o desde aproximadamente el 15-35 % o desde aproximadamente el 20-30 % de 1,3-propanodiol, en una base en (v/v), (p/v) o (p/p). En algunas realizaciones, la composición para su uso puede tener una viscosidad cinemática que oscila desde aproximadamente 1-1.500 o desde aproximadamente 5-1.000 o desde aproximadamente 10-750 o desde aproximadamente 20-500 centiStoke (mm2/s). Las composiciones pueden tener una reología newtoniana o no newtoniana. Las composiciones pueden ser, por ejemplo, de dilución por cizallamiento y/o tixotrópicas, de tal manera que fluyen fácilmente a través de una boquilla de pulverización y forman una niebla de tamaño de gotitas adecuado al someterse a cizalladura, pero se espesanin situpara formar una película sobre la mucosa que es resistente al aclaramiento a partir de la cavidad nasal o bucal de tal manera que el principio activo permanece sobre la mucosa durante un tiempo suficiente para neutralizar patógenos en contacto con la mucosa. Normalmente, la composición tendrá una viscosidad adecuada para presentar un tiempo de residencia sobre la mucosa de las cavidades nasal o bucal de al menos 1 minuto, más preferiblemente, al menos 5, 10, 15, 20, 25 o 30 minutos tras la aplicación. La composición debe ser semipermeable con el fin de permitir que viriones y otros patógenos penetren en la película y entren en contacto con los principios activos, al tiempo que presentan una función de barrera suficiente para inhibir la evaporación de agua y disolventes volátiles con el fin de mantener los principios activos en disolución.
La composición farmacéutica para su uso de la presente invención puede comprender lactoferrina e ICAM-1 soluble. En algunas realizaciones, lactoferrina e ICAM-1 soluble son los únicos agentes activos. La lactoferrina (por ejemplo, apolactoferrina, etc.) puede estar presente en una cantidad de desde aproximadamente 0,5-5000 μg/ml y la ICAM-1 soluble puede estar presente en una cantidad de desde aproximadamente 0,01-2000 μg/ml. En realizaciones preferidas, la composición farmacéutica comprende un portador que es desde aproximadamente el 60-90 % (v/v) de agua y desde aproximadamente el 10-40 % (o desde el 20-30 %) (v/v) de un poliol (por ejemplo, 1,3-propanodiol, etc.). Pueden usarse composiciones farmacéuticas para el tratamiento o la profilaxis de una enfermedad respiratoria. En realizaciones preferidas, la composición puede usarse para el tratamiento de rinovirus.
La composición farmacéutica para su uso de la presente invención puede comprender lisozima e ICAM-1 soluble. En algunas realizaciones, lisozima e ICAM-1 soluble son los únicos agentes activos. La lisozima puede estar presente en una cantidad de desde aproximadamente 0,5-5000 μg/ml y la ICAM-1 soluble puede estar presente en una cantidad de desde aproximadamente 0,25-20000 μg/ml. En realizaciones preferidas, la composición farmacéutica para su uso comprende un portador que es desde aproximadamente el 60-90 % (v/v) de agua y desde aproximadamente el 10-40% (o desde el 20-30%) (v/v) de un poliol (por ejemplo, 1,3-propanodiol, etc.). Pueden usarse composiciones farmacéuticas para el tratamiento o la profilaxis de una enfermedad respiratoria. En realizaciones preferidas, la composición puede usarse para el tratamiento de rinovirus.
La composición farmacéutica para su uso de la presente invención puede comprender lactoferrina (por ejemplo, apolactoferrina, etc.), lisozima e ICAM-1 soluble. En algunas realizaciones, lactoferrina, lisozima e ICAM-1 soluble son los únicos agentes activos. La lactoferrina (por ejemplo, apolactoferrina, etc.) puede estar presente en una cantidad de desde aproximadamente 0,5-5000 μg/ml, la lisozima puede estar presente en una cantidad de desde aproximadamente 0,5-5000 μg/ml y la ICAM-1 soluble puede estar presente en una cantidad de desde aproximadamente 0,25-20000 μg/ml. En realizaciones preferidas, la composición farmacéutica para su uso comprende un portador que es desde aproximadamente el 60-90 % (v/v) de agua y desde aproximadamente el 10-40 % (o desde el 20-30 %) (v/v) de un poliol (por ejemplo, 1,3-propanodiol, etc.). Pueden usarse composiciones farmacéuticas para el tratamiento o la profilaxis de una enfermedad respiratoria. En realizaciones preferidas, la composición puede usarse para el tratamiento de rinovirus.
La composición farmacéutica para su uso de la presente invención puede comprender lactoferrina (por ejemplo, apolactoferrina, etc.) y lisozima. En algunas realizaciones, lisozima y lactoferrina son los únicos agentes activos. La lactoferrina (por ejemplo, apolactoferrina, etc.) puede estar presente en una cantidad de desde aproximadamente 0,5 5000 μg/ml y la lisozima puede estar presente en una cantidad de desde aproximadamente 0,5-5000 μg/ml. En realizaciones preferidas, la composición farmacéutica para su uso comprende un portador que es desde aproximadamente el 60-90 % (v/v) de agua y desde aproximadamente el 10-40 % (o desde el 20-30 %) (v/v) de un poliol (por ejemplo, 1,3-propanodiol). Pueden usarse composiciones farmacéuticas para el tratamiento o la profilaxis de una enfermedad respiratoria. En realizaciones preferidas, la composición puede usarse para el tratamiento de influenza.
La composición farmacéutica para su uso de la presente invención puede comprender lactoferrina (por ejemplo, apolactoferrina, etc.), lisozima y ácido siálico. En algunas realizaciones, lisozima y lactoferrina son los únicos agentes activos. La lactoferrina (por ejemplo, apolactoferrina, etc.) puede estar presente en una cantidad de desde aproximadamente 0,5-5000 μg/ml, la lisozima puede estar presente en una cantidad de desde aproximadamente 0,5 5000 μg/ml, y el ácido siálico puede estar presente en una cantidad de desde aproximadamente 0,01-2000 μg/ml (o desde aproximadamente 0,1-1000 μg/ml o desde aproximadamente 0,5-750 μg/ml) de ácido siálico (por ejemplo, sialilactosa, 6'-sialilactosa, 3-sialilactosa, 6'-sialilactosa y 3'-sialilactosa, etc.). En realizaciones preferidas, la composición farmacéutica para su uso puede comprender un portador que es desde aproximadamente el 60-90 % (v/v) de agua y desde aproximadamente el 10-40% (o desde el 20-30%) (v/v) de un poliol (por ejemplo, 1,3-propanodiol, etc.). Pueden usarse composiciones farmacéuticas para el tratamiento o la profilaxis de una enfermedad respiratoria. En realizaciones preferidas, la composición puede usarse para el tratamiento de influenza.
La composición farmacéutica para su uso de la presente invención puede comprender lactoferrina (por ejemplo, apolactoferrina, etc.), lisozima, isoquercetina y ácido siálico. En algunas realizaciones, lisozima, isoquercetina y lactoferrina son los únicos agentes activos. La lactoferrina (por ejemplo, apolactoferrina, etc.) puede estar presente en una cantidad de desde aproximadamente 0,5-5000 μg/ml, la lisozima puede estar presente en una cantidad de desde aproximadamente 0,5-5000 μg/ml, el inhibidor de neuraminidasa puede estar presente en una cantidad de desde aproximadamente 0,1-20 |iM (o desde 0,1-20 |iM o desde aproximadamente 0,1-5 |iM o desde aproximadamente 0,2 3 |iM) de inhibidor de neuraminidasa, y el ácido siálico puede estar presente en una cantidad de desde aproximadamente 0,01-2000 μg/ml (o desde aproximadamente 0,1-1000 μg/ml o desde aproximadamente 0,5-750 μg/ml) de ácido siálico (por ejemplo, sialilactosa, 6'-sialilactosa, 3-sialilactosa, 6'-sialilactosa y 3'-sialilactosa, etc.). En algunas realizaciones, la lactoferrina y el ácido siálico y la lisozima están presentes en una cantidad de tal manera que la citotoxicidad de una membrana mucosa afectada por virus influenza (por ejemplo, tal como se mide mediante liberación de LDH, etc.) no se aumenta cuando se aplica la composición a la membrana mucosa. En algunas realizaciones, la composición farmacéutica para su uso reduce la citotoxicidad de una membrana mucosa a la que se le aplica la composición farmacéutica, en comparación con una composición por lo demás idéntica que no comprende ácido siálico y/o lactoferrina y/o lisozima. En realizaciones preferidas, la composición farmacéutica para su uso puede comprender un portador que es desde aproximadamente el 60-90 % (v/v) de agua y desde aproximadamente el 10-40% (o desde el 20-30%) (v/v) de un poliol (por ejemplo, 1,3-propanodiol, etc.). Pueden usarse composiciones farmacéuticas para el tratamiento o la profilaxis de una enfermedad respiratoria. En realizaciones preferidas, la composición para su uso puede usarse para el tratamiento de influenza. Normalmente el inhibidor de neuraminidasa es isoquercetina.
En algunas realizaciones, la composición para su uso puede comprender:
(i) aproximadamente el 0,000001 %-1 % (o hasta aproximadamente el 0,1 %) en peso de ICAM-1 soluble; y/o
(ii) del 0 % (o desde aproximadamente el 0,000001 %) al aproximadamente 1 % (o hasta aproximadamente el 0,1 %) en peso de isoquercetina; y/o
(iii) de aproximadamente el 0,000001 % a aproximadamente el 0,001 % (o a aproximadamente el 0,01 %) en peso de ácido siálico (por ejemplo, sialilactosa, 2,3'-sialilactosa y/o 2,6'-sialilactosa); y/o
(iv) de aproximadamente el 0,0001% aaproximadamente el 5% (o aaproximadamente el 1 %) en peso de lisozima; y/o
(v) de aproximadamente el 0,00005 % a aproximadamente el 5 % (o a aproximadamente el 0,5 %) en peso de lactoferrina (por ejemplo, apolactoferrina, etc.);
un portador farmacéuticamente aceptable y, opcionalmente, uno o más excipientes.
En algunas realizaciones, la composición para su uso puede comprender:
(i) aproximadamente el 0,0005 %-0,05 % en peso de ICAM-1 soluble; y/o
(ii) del 0 % (o desde aproximadamente el 0,005 %) a aproximadamente el 0,05 % en peso de isoquercetina; y/o (iii) de aproximadamente el 0,000005% a aproximadamente el 0,05% en peso de ácido siálico (por ejemplo, sialilactosa, 2,3'-sialilactosa, y/o 2,6'-sialilactosa); y/o
(iv) de aproximadamente el 0,0025 % a aproximadamente el 0,25 % en peso de lisozima; y/o
(v) de aproximadamente el 0,00005 % a aproximadamente el 0,1% en peso de lactoferrina (por ejemplo, apolactoferrina, etc.);
un portador farmacéuticamente aceptable y, opcionalmente, uno o más excipientes.
La composición farmacéutica para su uso de la presente invención puede usarse en un método de prevención o tratamiento de infección respiratoria debida a rinovirus humano y/o virus influenza humano. En algunas realizaciones, una composición para su uso en la prevención o el tratamiento de infección respiratoria a partir de rinovirus humano (RVH) puede comprender:
(i) de aproximadamente el 0,00000001 % a aproximadamente el 10 % en peso de ICAM-1 soluble;
(ii) de aproximadamente el 0,000005 % a aproximadamente el 10 % en peso de lisozima; y
(iii) de aproximadamente el 0,00000025 % a aproximadamente el 10 % en peso de lactoferrina;
y un portador farmacéuticamente aceptable y, opcionalmente, uno o más excipientes.
En algunas realizaciones, una composición para su uso en la prevención o el tratamiento de infección respiratoria a partir de rinovirus humano (RVH) puede comprender:
(i) aproximadamente el 0,000001 %-1 % (o hasta aproximadamente el 0,1 %) en peso de ICAM-1 soluble;
(ii) de aproximadamente el 0,0001 % a aproximadamente el 5 % (o a aproximadamente el 1 %) en peso de lisozima; y
(iii) de aproximadamente el 0,00005 % a aproximadamente el 5 % (o a aproximadamente el 0,5 %) en peso de lactoferrina;
y un portador farmacéuticamente aceptable y, opcionalmente, uno o más excipientes.
En algunas realizaciones, una composición para su uso en la prevención o el tratamiento de infección respiratoria a partir de rinovirus humano (RVH) puede comprender:
(i) aproximadamente el 0,0005 %-0,05 % en peso de ICAM-1 soluble; y/o
(ii) de aproximadamente el 0,0025 % a aproximadamente el 0,25 % en peso de lisozima; y/o
(iii) de aproximadamente el 0,00005 % a aproximadamente el 0,1 % en peso de lactoferrina;
y un portador farmacéuticamente aceptable y, opcionalmente, uno o más excipientes.
En algunas realizaciones, una composición para su uso en la prevención o el tratamiento de infección respiratoria a partir de virus influenza humano puede comprender:
(i) de aproximadamente el 0,0000001 % a aproximadamente el 10 % en peso de dicho ácido siálico (por ejemplo, sialilactosa, etc.);
(ii) de aproximadamente el 0,00000001% aaproximadamente el 10%en peso de dicha lisozima;
(iii) de aproximadamente el 0,00000001 % a aproximadamente el 10 % en peso de dicha lactoferrina; y
(iv) del 0 % (o desde aproximadamente el 0,00000001 %) a aproximadamente el 10 % en peso de una isoquercetina; y un portador farmacéuticamente aceptable y, opcionalmente, uno o más excipientes.
En algunas realizaciones, una composición para su uso en la prevención o el tratamiento de infección respiratoria a partir de virus influenza humano puede comprender:
(i) de aproximadamente el 0,000005 % a aproximadamente el 0,05 % en peso de dicho ácido siálico (por ejemplo, sialilactosa, etc.);
(ii) de aproximadamente el 0,0001 % a aproximadamente el 5 % (o a aproximadamente el 1 %) en peso de dicha lisozima;
(iii) de aproximadamente el 0,00005 % a aproximadamente el 5 % (o a aproximadamente el 0,5 %) en peso de dicha lactoferrina; y
(v) del 0 % (o desde aproximadamente el 0,01 %) a aproximadamente el 10 % en peso de isoquercetina;
y un portador farmacéuticamente aceptable y, opcionalmente, uno o más excipientes.
En algunas realizaciones, una composición para su uso en la prevención o el tratamiento de infección respiratoria a partir de virus influenza humano puede comprender:
(i) de aproximadamente el 0,000005 % a aproximadamente el 0,05 % en peso de dicho ácido siálico (por ejemplo, sialilactosa, etc.); y/o
(ii) de aproximadamente el 0,0025 % a aproximadamente el 0,25 % en peso de dicha lisozima; y/o
(iii) de aproximadamente el 0,00005 % a aproximadamente el 0,1 % en peso de dicha lactoferrina; y/o
(vi) del 0 % (o desde aproximadamente el 0,000001 %) a aproximadamente el 1 % (o hasta aproximadamente el 0,1 %) en peso de una isoquercetina;
y un portador farmacéuticamente aceptable y, opcionalmente, uno o más excipientes.
En algunas realizaciones, las composiciones para su uso de la invención serán disoluciones o suspensiones acuosas que comprenden desde aproximadamente 0,5-5000 μg/ml (o desde aproximadamente 1-1000 μg/ml o desde aproximadamente 5-500 μg/ml) de lactoferrina (por ejemplo, apolactoferrina, etc.). En algunas realizaciones, las composiciones para su uso de la invención serán disoluciones o suspensiones acuosas que comprenden desde aproximadamente 0,25-20000 μg/ml (o desde aproximadamente 0,25- 10000 μg/ml o desde aproximadamente 1-5000 μg/ml o desde aproximadamente 25-2500 μg/ml o desde aproximadamente 1000-12000 μg/ml) de lisozima. En algunas realizaciones, las composiciones para su uso de la invención serán disoluciones o suspensiones acuosas que comprenden desde aproximadamente 0,01-2000 μg/ml (o aproximadamente 0,01-1000 μg/ml o desde aproximadamente 0,1-600 μg/ml o desde aproximadamente 0,1-100 μg/ml o desde aproximadamente 0,5-50 μg/ml) de ICAM-1 (por ejemplo, ICAM-1 soluble, etc.). En algunas realizaciones, las composiciones para su uso de la invención serán disoluciones o suspensiones acuosas que comprenden desde aproximadamente 0,01-2000 μg/ml (o desde aproximadamente 0,1-1000 μg/ml o desde aproximadamente 0,5-750 μg/ml) de ácido siálico (por ejemplo, sialilactosa, etc.). En algunas realizaciones, la composición para su uso comprende una concentración de 6'-sialilactosa de aproximadamente 0,01-2000 μg/ml (o desde aproximadamente 0,1-1000 μg/ml o desde aproximadamente 0,5-750 μg/ml) y una concentración de 3'-sialilactosa de aproximadamente 0,01-2000 μg/ml (o desde aproximadamente 0,1-1000 μg/ml o desde aproximadamente 0,5-750 μg/ml). En algunas realizaciones, las composiciones para su uso de la invención serán disoluciones o suspensiones acuosas que comprenden desde aproximadamente 0,005-1000 μg/ml (o desde aproximadamente 0,5-500 μg/ml o desde aproximadamente 0,25 375 μg/ml) de 3'-sialilactosa y/o desde aproximadamente 0,005-1000 μg/ml (o desde aproximadamente 0,5-500 μg/ml o desde aproximadamente 0,25-375 μg/ml) de 6'-sialilactosa. En algunas realizaciones, las composiciones para su uso comprenderán desde aproximadamente 0,1-20 |iM (o desde 0,1-20 |iM o desde aproximadamente 0,1-5 |iM o desde aproximadamente 0,2-3 |iM) de inhibidor de neuraminidasa. En algunas realizaciones, las composiciones para su uso comprenderán desde aproximadamente 0,1-20 |iM (o desde 0,1-20 |iM o desde aproximadamente 0,1-5 |iM o desde aproximadamente 0,2-3 |iM) de quercetina.
Las composiciones farmacéuticas para su uso según la invención pueden estar en forma de una pulverización nasal, gotas nasales, pulverización bucal, enjuague bucal o pastilla para chupar. El portador de la composición farmacéutica para su uso puede seleccionarse para proporcionar un tiempo de residencia de la composición sobre la mucosa nasal y/u oral de al menos 1 minuto, o al menos 5 minutos, o al menos 10 minutos, o al menos 15 minutos, o al menos 20 minutos, o al menos 25 minutos, o al menos 30 minutos tras la aplicación. En algunas realizaciones, la composición para su aplicación a la mucosa nasal u oral comprende uno o más agentes antivirales y/o antimicrobianos dispersados en un portador líquido que comprende desde aproximadamente el 1-99 % (v/v) de agua o desde aproximadamente el 60-90 % (v/v) de agua y desde aproximadamente el 10-40% (o desde el 20-30%) (v/v) de un poliol. En algunas realizaciones, el portador farmacéuticamente aceptable es una disolución acuosa que comprende desde aproximadamente el 5-50 % (v/v), o desde aproximadamente el 10-40 % (v/v), o desde aproximadamente el 15-35 % (v/v), o desde aproximadamente el 20-30 % (v/v) de 1,3-propanodiol. Es posible que la composición para su uso pueda pulverizarse o ingerirse sobre la mucosa, y está adaptada para permanecer sobre la mucosa durante al menos 5 minutos (o al menos 10 minutos, o al menos 15 minutos, o al menos 20 minutos, o al menos 25 minutos, o al menos 30 minutos) tras la aplicación sin irritar o secar sustancialmente la mucosa.
Se proporcionan métodos para la profilaxis y/o el tratamiento de infecciones por rinovirus humano y virus influenza humano. En algunas realizaciones, el método para la profilaxis y/o el tratamiento de infección por rinovirus humano, comprende aplicar cualquiera de las composiciones descritas en el presente documento a la mucosa nasal y/u oral de un individuo que lo necesita. En algunas realizaciones, la mucosa nasal y/u oral de individuos que lo necesitan tiene rinovirus humano en contacto con la misma.
En un aspecto, la invención proporciona una composición farmacéutica para su uso en la presente invención que comprende uno o más compuestos antimicrobianos o antivirales; y una mezcla de base que comprende uno o más componentes seleccionados del grupo que consiste en un portador, un emoliente, un agente oclusivo, un humectante, un poliol, un emulsionante, un conservante, un espesante o agente de suspensión, un tensioactivo, un agente de ajuste del pH, un agente de isotonicidad y un aceite esencial. En una realización, uno o más componentes se seleccionan del grupo que consiste en un extracto de malvavisco, un extracto de caléndula, un extracto de piel de cítricos, extractos de miel, extractos de romero, un extracto de mirra, un extracto deHelichrysum,un extracto de arruruz, un aceite de neem, un aceite de argán, una vitamina C, una vitamina E, un extracto de semilla de pomelo y combinaciones de los mismos.
Se da a conocer, pero no se reivindica, un método de profilaxis o tratamiento de infecciones respiratorias distintas de provocadas por rinovirus humano o virus influenza humano en sujetos que padecen, o corren el riesgo de padecer, infección respiratoria, que comprende: determinar que un sujeto padece, o corre el riesgo de padecer, una infección respiratoria; y administrar una composición que comprende uno o más compuestos antimicrobianos o antivirales y una mezcla de base que comprende uno o más componentes seleccionados del grupo que consiste en un portador, un emoliente, un agente oclusivo, un humectante, un emulsionante y un aceite esencial. El uno o más compuestos antimicrobianos o antivirales comprenden ICAM-1 soluble. El uno o más compuestos antimicrobianos o antivirales comprenden ácido siálico o un derivado del mismo (por ejemplo, sialilactosa, etc.).El uno o más compuestos antimicrobianos o antivirales comprenden lactoferrina (por ejemplo, apolactoferrina, etc.). El uno o más compuestos antimicrobianos o antivirales comprenden lisozima. El uno o más compuestos antimicrobianos o antivirales comprenden un inhibidor de neuraminidasa. El uno o más compuestos antimicrobianos o antivirales comprenden IgA, IgG y/o IgM. El uno o más compuestos antimicrobianos o antivirales comprenden peróxido de cinc (ZnO<2>), cobre y/o plata. Las composiciones pueden administrarse por cualquier vía adecuada, incluyendo por vía oral, tópica, nasal y combinaciones de las mismas. La composición se administra a membranas nasales. La composición se administra usando un dispositivo seleccionado del grupo que consiste en un atomizador, un inhalador, un nebulizador, una botella de pulverización y una bomba de pulverización. La composición puede incluir un propelente o puede estar libre de propelentes.
Estos y otros aspectos de la invención se entenderán mejor mediante referencia a la siguiente descripción detallada y reivindicaciones adjuntas.
Breve descripción de las figuras
La figura 1 ilustra el efecto del tratamiento con apolactoferrina a 500 μg/ml (RVH1-1), 50 μg/ml (RVH1-2) y 5 μg/ml (RVH1-3) sobre la integridad de tejido infectado con rinovirus A16. Se monitorizó la TEER 24 (D1) y 48 horas (D2) tras la inoculación en medios MucilAir™ 3D.
La figura 2 ilustra el efecto del tratamiento con lisozima a 2500 μg/ml (RVH2-1), 250 μg/ml (RVH2-2) y 25 μg/ml (RVH2-3) sobre la integridad de tejido infectado con rinovirus A16. Se monitorizó la TEER 24 (D1) y 48 horas (D2) tras la inoculación en medios MucilAir™ 3D.
La figura 3 ilustra el efecto del tratamiento con ICAM-1 soluble a 50 μg/ml (RVH3-1), 5 μg/ml (RVH3-2) y 0,5 μg/ml (RVH3-3) sobre la integridad de tejido infectado con rinovirus A16. Se monitorizó la TEER 24 (D1) y 48 horas (D2) tras la inoculación en medios MucilAir™ 3D.
La figura 4 ilustra el efecto del tratamiento con una combinación de apolactoferrina, lisozima e ICAM-1 soluble a las tres dosis diferentes mostradas en la tabla 5 (RVH4-1, RVH4-2 y RVH4-3), sobre la integridad de tejido infectado con rinovirus A16. Se monitorizó la TEER 24 (D1) y 48 horas (D2) tras la inoculación en medios MucilAir™ 3D.
La figura 5 ilustra el efecto del tratamiento con apolactoferrina a 500 μg/ml (RVH1-1), 50 μg/ml (RVH1-2) y 5 μg/ml (RVH1-3) sobre la liberación de LDH de células infectadas con rinovirus A16. Se monitorizó la citotoxicidad 24 (D1) y 48 (D2) horas tras la inoculación en medios MucilAir™ 3D.
La figura 6 ilustra el efecto del tratamiento con lisozima a 2500 μg/ml (RVH2-1), 250 μg/ml (RVH2-2) y 25 μg/ml (RVH2-3) sobre la liberación de LDH de células infectadas con rinovirus A16. Se monitorizó la citotoxicidad 24 (D1) y 48 (D2) horas tras la inoculación en medios MucilAir™ 3D.
La figura 7 ilustra el efecto del tratamiento con ICAM-1 soluble a 50 μg/ml (RVH3-1), 5 μg/ml (RVH3-2) y 0,5 μg/ml (RVH3-3) sobre la liberación de LDH de células infectadas con rinovirus A16. Se monitorizó la citotoxicidad 24 (D1) y 48 (D2) horas tras la inoculación en medios MucilAir™ 3D.
La figura 8 ilustra el efecto de una combinación de apolactoferrina, lisozima e ICAM-1 soluble a las tres dosis diferentes mostradas en la tabla 5 (RVH4-1, RVH4-2 y RVH4-3) sobre la liberación de LDH infectada con rinovirus A16. Se monitorizó la citotoxicidad 24 (D1) y 48 (D2) horas tras la inoculación en medios MucilAir™ 3D.
La figura 9 ilustra el efecto del tratamiento con apolactoferrina a 500 μg/ml (RVH1-1), 50 μg/ml (RVH1-2) y 5 μg/ml (RVH1-3) sobre el batido ciliar. Se monitorizó la frecuencia de batido ciliar 24 (D1) y 48 (D2) horas tras la inoculación en medios MucilAir™ 3D.
La figura 10 ilustra el efecto de la infección por rinovirus A16 sobre la frecuencia de batido ciliar de células epiteliales con tratamiento con lisozima a 2500 μg/ml (RVH2-1), 250 μg/ml (RVH2-2) y 25 μg/ml (RVH2-3). Se monitorizó la frecuencia de batido ciliar 24 (D1) y 48 (D2) horas tras la inoculación en medios MucilAir™ 3D.
La figura 11 ilustra el efecto de la infección por rinovirus A16 sobre la frecuencia de batido ciliar de células epiteliales con tratamiento con ICAM-1 soluble a 50 μg/ml (RVH3-1), 5 μg/ml (RVH3-2) y 0,5 μg/ml (RVH3-3). Se monitorizó la frecuencia de batido ciliar 24 (D1) y 48 (D2) horas tras la inoculación en medios MucilAir™ 3D.
La figura 12 ilustra el efecto de la infección por rinovirus A16 sobre la frecuencia de batido ciliar de células epiteliales con una combinación de apolactoferrina, lisozima e ICAM-1 soluble a las tres dosis diferentes mostradas en la tabla 5 (RVH4-1, RVH4-2 y RVH4-3). Se monitorizó la frecuencia de batido ciliar 24 (D1) y 48 (D2) horas tras la inoculación en medios MucilAir™ 3D.
La figura 13 ilustra el efecto de la infección por rinovirus A16 sobre el aclaramiento mucociliar de células epiteliales con tratamientos para RVH. Se monitorizó el aclaramiento mucociliar 48 (D2) horas tras la inoculación en medios MucilAir™ 3D.
La figura 14 ilustra el número de copias de genoma de infección por rinovirus A16 con tratamiento con apolactoferrina a 500 μg/ml (RVH1-1), 50 μg/ml (RVH1-2) y 5 μg/ml (RVH1-3). Se midió la carga viral a las 3, 5, 24 y 48 horas tras la inoculación en medios MucilAir™ 3D.
La figura 15 ilustra el número de copias de genoma de infección por rinovirus A16 con tratamiento con lisozima a 2500 μg/ml (RVH2-1), 250 μg/ml (RVH2-2) y 25 μg/ml (RVH2-3). Se midió la carga viral a las 3, 5, 24 y 48 horas tras la inoculación en medios MucilAir™ 3D.
La figura 16 ilustra el número de copias de genoma de infección por rinovirus A16 con tratamiento con ICAM-1 soluble a 50 μg/ml (RVH3-1), 5 μg/ml (RVH3-2) y 0,5 μg/ml (RVH3-3). Se midió la carga viral a las 3, 5, 24 y 48 horas tras la inoculación en medios MucilAir™ 3D.
La figura 17A ilustra el número de copias de genoma de infección por rinovirus A16 con una combinación de apolactoferrina, lisozima e ICAM-1 soluble a las tres dosis diferentes mostradas en la tabla 5 (RVH4-1, RVH4-2 y RVH4-3). Se midió la carga viral a las 3, 5, 24 y 48 horas tras la inoculación en medios MucilAir™ 3D. Las figuras 17B y 17C muestran el número de copias de genoma (Log™) de infección por rinovirus A16 con formulaciones de RVH4 que comprenden combinaciones de los principios activos tal como se detallan en la tabla 5 a las 24 horas pi y 48 horas pi, respectivamente. Se mide la significación estadística con respecto al control (vehículo (+)): *: p<0,05; **: p<0,01; ***: p<0,001.
La figura 18 ilustra la cantidad de mucina tal como se mide con un ensayo ELLA a partir del medio apical con tratamiento con apolactoferrina a 500 μg/ml (RVH1-1), 50 μg/ml (RVH1-2) y 5 μg/ml (RVH1-3) e infección por rinovirus A16 a las 24 (D1) y 48 horas (D2) tras la inoculación en medios MucilAir™ 3D.
La figura 19 ilustra la cantidad de mucina tal como se mide con un ensayo ELLA a partir del medio apical con tratamiento con lisozima a 2500 μg/ml (VIA2-1), 250 μg/ml (RVH2-2) y 25 μg/ml (RVH2-3) e infección por rinovirus A16 a las 24 (D1) y 48 horas (D2) tras la inoculación en medios MucilAir™ 3D.
La figura 20 ilustra la cantidad de mucina tal como se mide con un ensayo ELLA a partir del medio apical con tratamiento con ICAM-1 soluble a 50 μg/ml (RVH3-1), 5 μg/ml (RVH3-2) y 0,5 μg/ml (RVH3-3) e infección por rinovirus A16 a las 24 (D1) y 48 horas (D2) tras la inoculación en medios MucilAir™ 3D.
La figura 21 ilustra la cantidad de mucina tal como se mide con un ensayo ELLA a partir del medio apical con tratamiento con apolactoferrina a 500 μg/ml (RVH1-1), 50 μg/ml (RVH1-2) y 5 μg/ml (RVH1-3) e infección por rinovirus A16 a las 24 (D1) y 48 horas (D2) tras la inoculación en medios MucilAir™ 3D.
La figura 22 ilustra el efecto de la infección por virus influenza A H1N1 sobre la integridad tisular con tratamiento con apolactoferrina a 500 μg/ml (VIA1-1), 50 μg/ml (VIA1-2) y 5 μg/ml (VIA1-3). Se monitorizó la TEER 24 (D1) y 48 horas (D2) tras la inoculación en medios MucilAir™ 3D.
La figura 23 ilustra el efecto de la infección por virus influenza A H1N1 sobre la integridad tisular con tratamiento con lisozima a 2500 μg/ml (VIA2-1), 250 μg/ml (VIA2-2) y 25 μg/ml (VIA2-3). Se monitorizó la TEER 24 (D1) y 48 (D2) horas tras la inoculación en medios MucilAir™ 3D.
La figura 24 ilustra el efecto de la infección por virus influenza A H1N1 sobre la integridad tisular con una combinación de tratamiento con 3'-sialilactosa y 6'-sialilactosa cada una a 327 μg/ml (VIA3-1), 3,27 μg/ml (VIA3-2) y 0,327 μg/ml (VIA3-3). Se monitorizó la TEER 24 (D1) y 48 (D2) horas tras la inoculación en medios MucilAir™ 3D.
La figura 25 ilustra el efecto de la infección por virus influenza A H1N1 sobre la integridad tisular con una combinación de apolactoferrina, lisozima y sialilactosas a las tres dosis diferentes mostradas en la tabla 5 (VIA4-1, VIA4-2 y VIA4-3). Se monitorizó la TEER 24 (D1) y 48 (D2) horas tras la inoculación en medios MucilAir™ 3D.
La figura 26 ilustra el efecto de la infección por virus influenza A H1N1 sobre la liberación de LDH a partir de células epiteliales con tratamiento con apolactoferrina a 500 μg/ml (VIA1-1), 50 μg/ml (VIA1-2) y 5 μg/ml (VIA1-3). Se monitorizó la citotoxicidad 24 (D1) y 48 (D2) horas tras la inoculación en medios MucilAir™ 3D.
La figura 27 ilustra el efecto de la infección por virus influenza A H1N1 sobre la liberación de LDH a partir de células epiteliales con tratamiento con lisozima a 2500 μg/ml (VIA2-1), 250 μg/ml (VIA2-2) y 25 μg/ml (VIA2-3). Se monitorizó la citotoxicidad 24 (D1) y 48 (D2) horas tras la inoculación en medios MucilAir™ 3D.
La figura 28 ilustra el efecto de la infección por virus influenza A H1N1 sobre la liberación de LDH a partir de células epiteliales con una combinación de tratamiento con 3'-sialilactosa y 6'-sialilactosa cada una a 327 μg/ml (VIA3-1), 3,27 μg/ml (VIA3-2) y 0,327 μg/ml (VIA3-3). Se monitorizó la citotoxicidad 24 (D1) y 48 (D2) horas tras la inoculación en medios MucilAir™ 3D.
La figura 29 ilustra el efecto de la infección por virus influenza A H1N1 sobre la liberación de LDH a partir de células epiteliales con una combinación de apolactoferrina, lisozima y sialilactosas a las tres dosis diferentes mostradas en la tabla 5 (VIA4-1, VIA4-2 y VIA4-3). Se monitorizó la citotoxicidad 24 (D1) y 48 (D2) horas tras la inoculación en medios MucilAir™ 3D.
La figura 30 ilustra el efecto de la infección por virus influenza A H1N1 sobre la frecuencia de batido ciliar de células epiteliales con tratamiento con apolactoferrina a 500 μg/ml (VIA1-1), 50 μg/ml (VIA1-2) y 5 μg/ml (VIA1-3). Se monitorizó la frecuencia de batido ciliar 24 (D1) y 48 (D2) horas tras la inoculación en medios MucilAir™ 3D.
La figura 31 ilustra el efecto de la infección por virus influenza A H1N1 sobre la frecuencia de batido ciliar de células epiteliales con tratamiento con lisozima a 2500 μg/ml (VIA2-1), 250 μg/ml (VIA2-2) y 25 μg/ml (VIA2-3). Se monitorizó la frecuencia de batido ciliar 24 (D1) y 48 (D2) horas tras la inoculación en medios MucilAir™ 3D.
La figura 32 ilustra el efecto de la infección por virus influenza A H1N1 sobre la frecuencia de batido ciliar de células epiteliales con una combinación de tratamiento con 3'-sialilactosa y 6'-sialilactosa cada una a 327 μg/ml (VIA3-1), 3,27 μg/ml (VIA3-2) y 0,327 μg/ml (VIA3-3). Se monitorizó la frecuencia de batido ciliar 24 (D1) y 48 (D2) horas tras la inoculación en medios MucilAir™ 3D.
La figura 33 ilustra el efecto de la infección por virus influenza A H1N1 sobre la frecuencia de batido ciliar de células epiteliales con una combinación de apolactoferrina, lisozima y sialilactosas a las tres dosis diferentes mostradas en la tabla 5 (VIA4-1, VIA4-2 y VIA4-3). Se monitorizó la frecuencia de batido ciliar 24 (D1) y 48 (D2) horas tras la inoculación en medios MucilAir™ 3D.
La figura 34 ilustra el efecto de la infección por virus influenza A H1N1 sobre el aclaramiento mucociliar de células epiteliales con tratamientos para VIA. Se monitorizó el aclaramiento mucociliar 48 (D2) horas tras la inoculación en medios MucilAir™ 3D.
La figura 35 ilustra el número de copias de genoma de infección por virus influenza A H1N1 con tratamiento con apolactoferrina a 500 μg/ml (VIA1-1), 50 μg/ml (VIA1-2) y 5 μg/ml (VIA1-3). Se midió la carga viral a las 3, 5, 24 y 48 horas tras la inoculación en medios MucilAir™ 3D.
La figura 36 ilustra el número de copias de genoma de infección por virus influenza A H1N1 con tratamiento con lisozima a 2500 μg/ml (VIA2-1), 250 μg/ml (VIA2-2) y 25 μg/ml (VIA2-3). Se midió la carga viral a las 3, 5, 24 y 48 horas tras la inoculación en medios MucilAir™ 3D.
La figura 37 ilustra el número de copias de genoma de infección por virus influenza A H1N1 con una combinación de tratamiento con 3'-sialilactosa y 6'-sialilactosa cada una a 327 μg/ml (VIA3-1), 3,27 μg/ml (VIA3-2) y 0,327 μg/ml (VIA3-3). Se midió la carga viral a las 3, 5, 24 y 48 horas tras la inoculación en medios MucilAir™ 3D.
La figura 38 ilustra el número de copias de genoma de infección por virus influenza A H1N1 con una combinación de apolactoferrina, lisozima y sialilactosas a las tres dosis diferentes mostradas en la tabla 5 (VIA4-1, VIA4-2 y VIA4-3). Se midió la carga viral a las 3, 5, 24 y 48 horas tras la inoculación en medios MucilAir™ 3D.
La figura 39 ilustra la cantidad de mucina tal como se mide con un ensayo ELLA a partir del medio apical con tratamiento con apolactoferrina a 500 μg/ml (VIA1-1), 50 μg/ml (VIA1-2) y 5 μg/ml (VIA1-3) e infección por virus influenza A H1N1 a las 24 (D1) y 48 (D2) horas tras la inoculación en medios MucilAir™ 3D.
La figura 40 ilustra la cantidad de mucina tal como se mide con un ensayo ELLA a partir del medio apical con tratamiento con lisozima a 2500 μg/ml (VIA2-1), 250 μg/ml (VIA2-2) y 25 μg/ml (VIA2-3) e infección por virus influenza A H1N1 a las 24 (D1) y 48 (D2) horas tras la inoculación en medios MucilAir™ 3D.
La figura 41 ilustra la cantidad de mucina tal como se mide con un ensayo ELLA a partir del medio apical con una combinación de tratamiento con 3'-sialilactosa y 6'-sialilactosa cada una a 327 μg/ml (VIA3-1), 3,27 μg/ml (VIA3-2) y 0,327 μg/ml (VIA3-3) e infección por virus influenza A H1N1 a las 24 (D1) y 48 (D2) horas tras la inoculación en medios MucilAir™ 3D.
La figura 42 ilustra la cantidad de mucina tal como se mide con un ensayo ELLA a partir del medio apical con una combinación de apolactoferrina, lisozima y sialilactosas a las tres dosis diferentes mostradas en la tabla 5 (VIA4-1, VIA4-2 y VIA4-3) e infección por virus influenza A H1N1 a las 24 (D1) y 48 (D2) horas tras la inoculación en medios MucilAir™ 3D.
La figura 43 ilustra el número de copias de genoma de infección por rinovirus A16 con tratamiento con apolactoferrina (R1H y R1L), tratamiento con lisozima (R2H y R2L) e ICAM-1 soluble (R3 y R4). Se midió la carga viral a las 3, 5, 24 y 48 horas tras la inoculación en medios MucilAir™ 3D.
La figura 44 ilustra el número de copias de genoma de infección por rinovirus A16 con formulaciones que comprenden combinaciones de los principios activos mostrados en la figura 43. Se midió la carga viral a las 3, 5, 24 y 48 horas tras la inoculación en medios MucilAir™ 3D.
La figura 45 muestra el número de copias de genoma (Log™) de infección por rinovirus A16 con formulaciones que comprenden combinaciones de los principios activos tal como se detallan en la tabla 7 a las 24 horas pi (“D1”). Se mide la significación estadística con respecto al control (vehículo (+)): *: p<0,05; **: p<0,01; ***: p<0,001.
La figura 46 muestra el número de copias de genoma (Log™) de infección por rinovirus A16 con formulaciones que comprenden combinaciones de los principios activos tal como se detallan en la tabla 7 a las 48 horas pi (“D1”). Se mide la significación estadística con respecto al control (vehículo (+)): *: p<0,05; **: p<0,01; ***: p<0,001.
La figura 47A muestra el análisis de seguimiento de perlas en el medio para vehículo (-) usado para determinar el efecto de la infección por rinovirus A16 sobre el aclaramiento mucociliar a las 48 horas pi (“D2”). La figura 47B muestra el análisis de seguimiento para la formulación de apolactoferrina, lisozima e ICAM-1 soluble (R1L+R2L+R4) en D2. La barra de escala representa 100 |im, los círculos representan perlas individuales y las líneas representan la trayectoria de cada perla medida.
La figura 48 ilustra los resultados de las mediciones del MCC para cada formulación especificada en D2. La línea discontinua representa el valor de vehículo infectado para comparación.
La figura 49 ilustra la liberación de LDH para medio inoculado con cada formulación especificada en D1 y D2. La línea discontinua representa el umbral citotóxico.
La figura 50 ilustra el número de copias de genoma (linear) de infección por H1N1 como cambio en porcentaje con respecto al número de copias de genoma de vehículo (+) en D1 y D2. Se realizaron mediciones en lavados apicales de los medios en D1 y d 2. Las formulaciones que comprenden combinaciones de los principios activos tal como se detallan en la tabla 8 se aplicaron a los medios inoculados. Se mide la significación estadística con respecto al control (vehículo (+)) en el día especificado: *: p<0,05; **: p<0,01; ***: p<0,001.
La figura 51 ilustra el número de copias de genoma (linear) de infección por H1N1 como cambio en porcentaje con respecto al número de copias de genoma de vehículo (+) en D1 y D2. Se realizaron mediciones en medios basales recogidos en D1 y D2. Las formulaciones que comprenden combinaciones de los principios activos tal como se detallan en la tabla 8 se aplicaron a los medios inoculados. Se mide la significación estadística con respecto al control (vehículo (+)) en el día especificado: *: p<0,05; **: p<0,01; ***: p<0,001.
La figura 52 ilustra el efecto de la infección por virus influenza A H1N1 sobre la integridad tisular con diversas combinaciones de apolactoferrina, lisozima, sialilactosas y quercetina a las dosis mostradas en la tabla 8. Se monitorizó la TEER 24 (D1) y 48 (D2) horas tras la inoculación en medios MucilAir™ 3D. La línea discontinua representa vehículo (+) para comparación.
La figura 53 ilustra el efecto de la infección por virus influenza A H1N1 sobre la liberación de LDH a partir de células epiteliales con diversas combinaciones de apolactoferrina, lisozima, sialilactosas y quercetina tal como se muestra en la tabla 8. Se monitorizó la citotoxicidad 24 (D1) y 48 (D2) horas tras la inoculación en medios MucilAir™ 3D.
Descripción detallada
La presente divulgación puede entenderse más fácilmente mediante referencia a la siguiente descripción detallada y a los ejemplos incluidos en la misma. Antes de dar a conocer y describir los presentes métodos y técnicas, un experto en la técnica debe entender que esta divulgación no debe limitarse a los métodos analíticos o de síntesis específicos descritos en el presente documento. También debe entenderse que la terminología usada en el presente documento es únicamente con fines de describir realizaciones particulares y no se pretende que sea limitativa. A menos que se defina lo contrario, todos los términos técnicos y científicos usados en el presente documento tienen el significado entendido habitualmente por un experto habitual en la técnica a la que pertenece esta divulgación.
Por “agente” o “agente terapéutico” quiere decirse cualquier compuesto químico de molécula pequeña, anticuerpo, molécula de ácido nucleico o polipéptido o fragmentos del mismo. Por “agente terapéutico” quiere decirse cualquiera de las composiciones dedicadas a prevenir o tratar infecciones respiratorias descritas en el presente documento.
Por “mejorar” quiere decirse reducir, suprimir, atenuar, disminuir, detener o estabilizar el desarrollo o la progresión de una enfermedad respiratoria o un síntoma de la misma.
Por “análogo” quiere decirse una molécula que no es idéntica, pero tiene características funcionales o estructurales análogas. Por ejemplo, un análogo de polipéptido conserva la actividad biológica de un polipéptido correspondiente que se produce de manera natural, al tiempo que tiene ciertas modificaciones bioquímicas que potencian la función del análogo con respecto a un polipéptido que se produce de manera natural. Tales modificaciones bioquímicas pueden aumentar la resistencia a proteasa del análogo, permeabilidad de membrana o semivida, sin alterar, por ejemplo, la unión a ligando. Un análogo puede incluir un aminoácido no natural.
Tal como se usa en el presente documento “un ARN interferente” se refiere a cualquier secuencia de ARN bicatenario o monocatenario, que puede (o bien directamente o bien indirectamente (es decir, tras conversión)) inhibir o regular por disminución la expresión génica mediando en interferencia de ARN. El ARN interferente incluye, pero no se limita a, ARN interferente pequeño (“ARNip”) y ARN de horquilla pequeño (“ARNhp”). “ Interferencia de ARN” se refiere a la degradación selectiva de un transcrito de ARN mensajero de secuencia compatible.
Tal como se usa en el presente documento “un ARNhp” (ARN de horquilla pequeño) se refiere a una molécula de ARN que comprende una región antisentido, una porción de bucle y una región sentido, en la que la región sentido tiene nucleótidos complementarios que forman pares de bases con la región antisentido para formar un tallo en dúplex. Tras el procesamiento postranscripcional, el ARN de horquilla pequeño se convierte en un ARN interferente pequeño mediante un acontecimiento de escisión mediado por la enzima Dicer, que es un miembro de la familia de ARNasa III.
Tal como se usa en el presente documento “una iARN” (interferencia de ARN) se refiere a un mecanismo de silenciamiento postranscripcional iniciado mediante moléculas de ARN bicatenario pequeño que suprimen la expresión de genes con homología de secuencia.
Tal como se usa en el presente documento, “cambiado en comparación con una muestra o sujeto de control” se entiende como que tiene un nivel del indicador analítico o de diagnóstico o terapéutico que va a detectarse a un nivel que es estadísticamente diferente de una muestra de un sujeto o muestra normal, sin tratar o de control. Las muestras de control incluyen, por ejemplo, células en cultivo, uno o más animales de prueba de laboratorio, o uno o más sujetos humanos. Los métodos para seleccionar y someter a prueba muestras de control están dentro de las capacidades de los expertos en la técnica. Una sustancia analítica puede ser una sustancia que se produce de manera natural que se expresa o se produce de manera característica por la célula o el organismo (por ejemplo, anticuerpos, péptidos patógenos o partículas y similares) o una sustancia producida por un constructo indicador (por ejemplo, pgalactosidasa o luciferasa, etc.). Dependiendo del método de detección usado, la cantidad y la medición del cambio pueden variar. La determinación de significación estadística está dentro de las capacidades de los expertos en la técnica.
Tal como se usa en el presente documento, el término “administrar conjuntamente” o “administración conjunta” y similares se refiere a la acción de administrar dos o más agentes (por ejemplo, un agente antimicrobiano y un agente antiviral, etc.), compuestos, terapias o similares, al mismo tiempo o aproximadamente al mismo tiempo. El orden o la secuencia de administrar los diferentes agentes de la divulgación, por ejemplo, antibióticos, antivirales, antifúngicos o agentes inmunoterápicos, pueden variar y no están limitados a ninguna secuencia particular. La administración conjunta también puede referirse a la situación en la que se administran dos o más agentes en regiones diferentes del organismo o mediante esquemas de administración diferentes, por ejemplo, en la que un primer agente se administra por vía intranasal y un segundo agente se administra de manera sistémica, o viceversa. La administración conjunta también puede referirse a dos o más agentes administrados mediante el mismo esquema de administración, por ejemplo, en el que un primer agente se administra por vía intranasal y un segundo agente se administra por vía intranasal.
Tal como se usa en el presente documento, los términos “comprende”, “que comprende”, “que contiene” y “que tiene” y similares son abiertos y pueden significar “ incluye”, “que incluye” y similares. Los términos “que consiste esencialmente en” o “consiste esencialmente” también son abiertos, permitiendo la presencia de más de lo que se menciona siempre que las características básicas o novedosas de lo que se menciona no se cambien por la presencia de más de lo que se menciona, pero excluye realizaciones de la técnica anterior.
“Poner en contacto una célula” se entiende en el presente documento como proporcionar un agente a una célula (por ejemplo, una célula de la membrana nasal, etc.), de tal manera que el agente puede interaccionar con la célula (por ejemplo, célula de la membrana nasal que va a tratarse, etc.) y/o captarse por la célula, y tener un efecto sobre la célula. El agente (por ejemplo, un agente antimicrobiano o antiviral, etc.) puede suministrarse a la célula directamente (por ejemplo, mediante adición del agente a una formulación de gel o aerosol para administración nasal, etc.). Un experto habitual en la técnica entenderá fácilmente que la administración de un agente terapéutico a un sujeto implica poner en contacto el agente terapéutico con una célula o tejido del sujeto.
Tal como se usa en el presente documento, el término “acoplado”, tal como en referencia a dos o más agentes que están “acoplados” entre sí, se refiere a una asociación covalente o de otro modo estable entre los dos o más agentes. Por ejemplo, un agente terapéutico puede acoplarse con un agente antimicrobiano mediante un enlace covalente, un resto de unión anclado de manera covalente o de manera no covalente mediante interacciones iónicas o formación de enlaces de hidrógeno. Uno o más agentes que están acoplados entre sí conservan sustancialmente sus mismas funciones y características independientes. Por ejemplo, el agente terapéutico, cuando está acoplado a otro agente, puede conservar su misma actividad como si estuviera independiente.
Por “ciclo” o “ciclo de fármaco” quiere decirse la administración de dosificaciones repetitivas durante un periodo de tiempo definido, que puede oscilar desde minutos hasta horas hasta días hasta semanas hasta meses o incluso años.
Por “citocina” quiere decirse una hormona que actúa localmente y que modula la respuesta inmunitaria de un individuo.
Tal como se usa en el presente documento, se entiende que “detectar”, “detección” y similares incluyen un ensayo realizado para determinar una o más características de una muestra, por ejemplo identificar la presencia, ausencia o cantidad del analito que va a detectarse. Por ejemplo, la detección puede incluir la identificación de un analito específico en una muestra o una actividad de un agente en una muestra. La detección puede incluir la determinación de la presencia de ácido nucleico o proteína (por ejemplo, anticuerpo, citocina y similares) mediante PCR, inmunoensayo (por ejemplo, ELISA, ELLA, etc.), microscopía, exposición a patógeno y similares. La cantidad de analito o actividad detectada en la muestra puede ser nula o estar por debajo del nivel de detección del ensayo o método.
Por “enfermedad” quiere decirse cualquier estado o trastorno que daña o interfiere con la función normal de una célula, tejido u órgano. Una enfermedad a modo de ejemplo es una infección respiratoria.
Los términos “cantidad eficaz”, “cantidad terapéuticamente eficaz” o “cantidad farmacéuticamente eficaz” tal como se usan en el presente documento, se refieren a una cantidad de un agente o compuesto que es suficiente para prevenir o tratar un trastorno (por ejemplo, una infección respiratoria, una infección viral, etc.). En algunas realizaciones, el resultado es una reducción y/o alivio de los signos, síntomas o causas de un trastorno, o cualquier otra alteración deseada de un sistema biológico. Por ejemplo, una “cantidad eficaz” para terapia puede ser la cantidad de la composición que comprende un compuesto tal como se da a conocer el presente documento requerida para proporcionar una disminución clínicamente significativa de una enfermedad/trastorno (por ejemplo, una infección respiratoria, etc.). Una “cantidad eficaz” o cantidad terapéuticamente eficaz de un agente o combinación de agentes de la divulgación también puede ser la cantidad o dosis que es eficaz para reducir sustancialmente o eliminar una infección, o prevenir su aparición. Una cantidad “eficaz” apropiada en cualquier caso individual se determina usando cualquier técnica adecuada (por ejemplo, un estudio de aumento a escala de la dosis, etc.) y dependerá del criterio del profesional. Sin embargo, los intervalos de dosificación adecuados pueden determinarse fácilmente por un experto en la técnica.
Puede requerirse más de una dosis para proporcionar una dosis eficaz. Se entiende que una dosis eficaz en una población puede o no ser suficiente en todas las poblaciones. Por tanto, en relación con la administración de un agente terapéutico, el agente terapéutico puede ser “eficaz contra” una enfermedad o estado cuando la administración de una manera clínicamente apropiada da como resultado un efecto beneficioso para al menos una fracción estadísticamente significativa de sujetos, tal como una prevención de aparición de enfermedad, mejora de síntomas, una cura, una reducción de signos o síntomas de enfermedad, prolongación de la vida, mejora de la calidad de vida u otro efecto generalmente reconocido como positivo por médicos familiarizados con el tratamiento del tipo particular de enfermedad o estado.
Por “potencia” quiere decirse una alteración positiva de al menos el 10 %, el 25 %, el 50 %, el 75 %, 100 % o cualquier número entre los mismos.
Tal como se usa en el presente documento, un “ inmunoensayo” es un método de detección basado en la unión específica de al menos un anticuerpo a un antígeno, por ejemplo, ELISA, ELLA, RIA, inmunotransferencia de tipo Western y similares.
Tal como se usa en el presente documento, “inmunógeno”, “inmunogénico” y similares se refieren a sustancias que pueden fomentar una respuesta inmunitaria, por ejemplo, una respuesta inmunitaria basada en anticuerpos o mediada por células, en al menos un organismo.
Por “composición inmunogénica” quiere decirse una composición que comprende una molécula que puede inducir o modular una respuesta inmunitaria en un sujeto. Una respuesta inmunitaria de este tipo puede ser una respuesta inmunitaria profiláctica o terapéutica.
Tal como se usa en el presente documento, el término “agente inmunoterápico” se refiere a cualquier agente, compuesto o producto biológico que puede modular el sistema inmunitario del huésped. Por ejemplo, un agente inmunoterápico puede provocar una estimulación del sistema inmunitario frente a una infección respiratoria.
Tal como se usa en el presente documento, se pretende que “ inducir inmunidad” se refiera a cualquier respuesta inmunitaria generada frente a un antígeno. La inmunidad está mediada por anticuerpos frente a un agente infeccioso, que se muestra por un vertebrado (por ejemplo, un ser humano, etc.), que previene o mejora una infección o reduce al menos un síntoma de la misma. Las composiciones inmunogénicas de la divulgación pueden estimular la producción de anticuerpos que, por ejemplo, neutralizan patógenos aéreos/agentes infecciosos, bloquean que agentes infecciosos entren en células, bloquean la replicación de agentes infecciosos y/o protegen células huésped frente a infección y destrucción. El término también puede referirse a una respuesta inmunitaria que está mediada por linfocitos T y/u otros glóbulos blancos frente a un agente infeccioso, mostrada por un vertebrado (por ejemplo, un ser humano, etc.), que previene o mejora una infección o reduce al menos un síntoma de la misma.
El término “aislado”, tal como se usa en el presente documento, se refiere a cualquier composición, molécula o mezcla que se ha sometido a un procedimiento de purificación en laboratorio incluyendo, pero sin limitarse a, extracción, centrifugación, separación cromatográfica (es decir, por ejemplo, cromatografía de capa fina o cromatografía de líquidos de alto rendimiento). Habitualmente, un procedimiento de purificación de este tipo proporciona una composición, molécula o mezcla aislada basándose en propiedades físicas, químicas o de potencial eléctrico. Dependiendo de la elección de procedimiento, una composición, molécula o mezcla aislada puede contener otras composiciones, compuestos o mezclas que tienen propiedades químicas similares. Por ejemplo, una composición, molécula o mezcla aislada puede contener entre el 1-20 %, el 1-10 % o el 1-5 % de composiciones o mezclas que tienen propiedades químicas similares.
Tal como se usa en el presente documento, el término “local” o “de manera local”, tal como en administración o administración conjunta local de uno o más productos terapéuticos, se refiere a la administración de un agente terapéutico a un sitio corporal (por ejemplo, una membrana nasal, etc.) que está próximo o cercano al sitio de una infección, adyacente o inmediatamente cercano al sitio de la infección, en el perímetro de o en contacto con la infección, o dentro o en el interior del tejido infectado. La administración local excluye generalmente las vías de administración sistémica.
Tal como se usa en el presente documento, “ácido nucleico”, tal como en un ácido nucleico para su suministro a una célula, se entiende mediante su significado habitual en la técnica como un polinucleótido u oligonucleótido que se refiere a una cadena de al menos dos combinaciones de base-azúcar-fosfato. Los nucleótidos son las unidades monoméricas de polímeros de ácido nucleico. El término incluye ácido desoxirribonucleico (ADN) y ácido ribonucleico (ARN) en forma de un ARN mensajero oligonucleotídico, compuesto antisentido, ADN de plásmido, partes de un ADN de plásmido, material genético derivado de un virus y similares. Los polinucleótidos incluyen ácidos nucleicos de al menos dos monómeros. Los polinucleótidos antisentido son ácidos nucleicos que interfieren con la función de ADN o ARN. Un ARNip o un ARNhp es un ARN bicatenario que inhibe o perturba la actividad o traducción, por ejemplo fomentando la degradación de corte y empalme modificador o procesamiento del ácido nucleico celular, por ejemplo, ARNm, microARN y similares, al que se dirige. Tal como se usa en el presente documento, ARNip y ARNhp incluyen cualquier molécula de ARN bicatenario que puede modular la estabilidad, traducción o corte y empalme de un ARN con el que se hibrida al menos una cadena del ácido nucleico bicatenario. Los ARN se conocen bien en la técnica, véanse, por ejemplo, las solicitudes de patente WO/2002/044321, WO/2003/099298, US 20050277610, US 20050244858; y las patentes estadounidenses n.os 7.297.786, 7.560.438 y 7.056.704. Se entiende que ácido nucleico, tal como se usa en el presente documento, incluye nucleótidos no naturales (que no se producen en la naturaleza), por ejemplo: un derivado de nucleótidos naturales tales como fosfotionatos o ácidos nucleicos peptídicos (tales como los descritos en las patentes y solicitudes citadas justo anteriormente). Un ácido nucleico puede suministrarse a una célula con el fin de producir un cambio celular que es terapéutico o profiláctico. El ácido nucleico puede expresar una proteína o polipéptido, por ejemplo, una proteína que falta o no es funcional en la célula o sujeto. El ácido nucleico puede ser monocatenario o bicatenario, puede ser sentido o antisentido, y puede suministrarse a una célula como ADN desnudo, en combinación con agentes para fomentar la captación de ácido nucleico en una célula (por ejemplo, reactivos de transfección, etc.), en el contexto de un vector viral y similares. El ácido nucleico puede dirigirse a un ácido nucleico que es endógeno con respecto a la célula (ARNm o microARN), o un ácido nucleico heterólogo (por ejemplo, ácido nucleico a partir de un patógeno, tal como un gen viral, etc.). El suministro de un ácido nucleico significa transferir un ácido nucleico desde el exterior de un sujeto hasta el interior de la membrana celular externa de una célula en el sujeto.
“Obtener” se entiende en el presente documento como fabricar, adquirir, sintetizar, aislar, purificar o tomar de otro modo posesión de algo.
El término “farmacéuticamente aceptable”, tal como se usa en el presente documento, se refiere a un material (por ejemplo, un portador o diluyente, etc.) que no elimina la actividad biológica o propiedades de los compuestos descritos en el presente documento, y es relativamente no tóxico (es decir, el material se administra a un individuo sin provocar efectos biológicos no deseados o interaccionar de una manera perjudicial con ninguno de los componentes de la composición en la que está contenido).
La expresión “portador, excipiente o diluyente farmacéuticamente aceptable” se reconoce en la técnica e incluye un material, composición o vehículo farmacéuticamente aceptable, adecuado para administrar compuestos de la presente divulgación a mamíferos. Tal como se usa en el presente documento, el término “farmacéuticamente aceptable” significa estar aprobado por una agencia reguladora del gobierno federal o estatal o indicado en la farmacopea de los EE. UU., la farmacopea europea u otra farmacopea generalmente reconocida para su uso en mamíferos, por ejemplo, seres humanos.
Tal como se usa en el presente documento, el término “régimen farmacéuticamente eficaz” se refiere a un plan sistemático para la administración de uno o más agentes terapéuticos, que incluye aspectos tales como tipo de agente terapéutico, concentraciones de agente terapéutico y cualquier cambio en el mismo realizado durante el transcurso de la administración de fármaco, que, cuando se administra, es eficaz para tratar y/o prevenir una infección. Tales consideraciones dependen del criterio del profesional y pueden determinarse fácilmente por un experto en la técnica.
Un “polipéptido” o “péptido” tal como se usa en el presente documento se entiende como dos o más aminoácidos naturales o no naturales independientemente seleccionados unidos mediante un enlace covalente (por ejemplo, un enlace peptídico, etc.). Un péptido puede incluir 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20 o más aminoácidos naturales o no naturales unidos mediante enlaces peptídicos. Los polipéptidos, tal como se describen en el presente documento, incluyen proteínas de longitud completa (por ejemplo, proteínas completamente procesadas, etc.) así como secuencias de aminoácidos más cortas (por ejemplo, fragmentos de proteínas que se producen de manera natural o fragmentos de polipéptidos sintéticos, etc.).
Se entiende que los intervalos proporcionados en el presente documento son una abreviatura para todos los valores dentro del intervalo incluyendo los límites del intervalo. Por ejemplo, se entiende que un intervalo de 1 a 50 incluye cualquier número, combinación de números o intervalo secundario del grupo que consiste en 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15,16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41,42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49 o 50, así como todos los valores decimales intermedios entre los números enteros anteriormente mencionados tales como, por ejemplo, 1,1, 1,2, 1,3, 1,4, 1,5, 1,6, 1,7, 1,8 y 1,9. Con respecto a los intervalos secundarios, se contemplan específicamente “intervalos secundarios anidados” que se extienden desde cualquier punto de extremo del intervalo. Por ejemplo, un intervalo secundario anidado de un intervalo a modo de ejemplo de 1 a 50 puede comprender de 1a 10, de 1a 20, de 1a 30 y de 1a 40 en un sentido, o de 50 a 40, de 50 a 30, de 50 a 20 y de 50 a 10 en el otro sentido.
Por “reduce” quiere decirse una alteración negativa de al menos el 10 %, el 25 %, el 50 %, el 75 %, el 100 % o cualquier número entre los mismos.
Por “referencia” quiere decirse una condición convencional o de control.
Tal como se usa en el presente documento, el término “régimen” se refiere a los diversos parámetros que caracterizan cómo se administra un fármaco o agente, incluyendo el nivel de dosificación, tiempo e iteraciones, así como la razón de diferente fármacos o agentes unos con respecto a otros. El término “régimen farmacéuticamente eficaz” se refiere a un régimen particular que proporciona un resultado o efecto terapéutico deseado. El término “ iteraciones” se refiere al concepto general de repetir series de administración de uno o más agentes. Por ejemplo, una combinación de fármaco X y fármaco Y puede administrarse (administrarse conjuntamente al mismo tiempo o aproximadamente al mismo tiempo y en cualquier orden) a un paciente en un primer día a una dosis Z. Entonces pueden administrarse los fármacos X e Y (administrarse conjuntamente al mismo tiempo o aproximadamente al mismo tiempo y en cualquier orden) de nuevo a la dosis Z, o a otra dosis, en un segundo día. El tiempo entre el primer y segundo días puede ser de 1 día o cualquier punto hasta varios días, o una semana, o varias semanas, o meses. Las administraciones iterativas también pueden producirse en el mismo día, separadas por un número especificado de minutos (por ejemplo, 10 minutos, 20 minutos, 30 minutos o más) u horas (por ejemplo, 1 hora, 2 horas, 4 horas, 6 horas, 12 horas, etc.). Un régimen de dosificación eficaz puede determinarse por los expertos habituales en la técnica, por ejemplo, médico encargado, usando prácticas convencionales.
Una “muestra” tal como se usa en el presente documento se refiere a un material biológico que está aislado de su entorno (por ejemplo, sangre o tejido de un animal, células, o medios acondicionados de cultivo tisular). Se sospecha que la muestra contiene, o se sabe que contiene, un analito, tal como un agente infeccioso o una proteína de interés (por ejemplo, anticuerpo, citocina y similares). Una muestra también puede ser una fracción parcialmente purificada de un tejido o líquido corporal. Una muestra de referencia puede ser una muestra “normal”, líquido de un donante que no tiene la enfermedad o estado, o de un tejido normal en un sujeto que tiene la enfermedad o estado, o un sujeto sin tratar (por ejemplo, un sujeto no tratado con la vacuna, etc.). También puede tomarse una muestra de referencia en un “punto de tiempo cero” antes de poner la célula o el sujeto en contacto con el agente o intervención terapéutica que va a someterse a prueba.
Tal como se usa en el presente documento, el término “selectivamente” significa que tiende a producirse a una frecuencia mayor en una población que en otra población.
Por “se une específicamente” quiere decirse reconocimiento o unión a una diana (por ejemplo, polipéptido, célula y similares), mientras que no reconoce y/o se une sustancialmente a otras moléculas en una muestra, por ejemplo, una muestra biológica.
El término “sujeto”, tal como se usa en el presente documento, se refiere a cualquier organismo que puede experimentar una infección respiratoria. Tales organismos incluyen, pero no se limitan a, ser humano, perro, gato, caballo, vaca, oveja, cabra, ratón, rata, cobaya, mono, primate, primate no humano, ave, reptiles, etc.
Un sujeto “que padece o se sospecha que padece” una enfermedad, estado o síndrome específico (por ejemplo, una infección respiratoria, etc.) tiene un número suficiente de factores de riesgo o presenta un número suficiente o combinación de signos o síntomas de la enfermedad, estado o síndrome de tal manera que un individuo competente diagnosticará o sospechará que el sujeto padece la enfermedad, estado o síndrome. Los métodos para la identificación de sujetos que padecen o se sospecha que padecen infección respiratoria están dentro de las capacidades de los expertos en la técnica. Los sujetos que padecen, y se sospecha que padecen, una enfermedad, estado o síndrome específico no son necesariamente dos grupos diferenciados. La expresión “individuo que lo necesita” o “paciente que lo necesita” o “sujeto que lo necesita” designa un individuo que tiene una enfermedad o estado (por ejemplo, una infección respiratoria, etc.). En algunas implementaciones, el individuo que lo necesita es un paciente que tiene virus influenza o rinovirus.
El término “prevenir” o “profilaxis”, tal como se usa en el presente documento, incluye prevenir, disminuir el grado de, o retrasar la aparición o progresión de una enfermedad o manifestación fisiológica de enfermedad. “Profilaxis” o “prevenir” puede referirse a prevenir, disminuir el grado de, o retrasar la tasa de infección (por ejemplo, infección viral, etc.). El término “tratar” incluye reducir, disminuir, eliminar, mejorar, detener, ralentizar la progresión de, y/o retrasar la aparición de una enfermedad dada o manifestación fisiológica de la misma. Los ejemplos no limitativos incluyen seres humanos, otros mamíferos, bovinos, ratas, ratones, perros, monos, cabras, ovejas, vacas, ciervos y otros animales no mamíferos incluyendo aves En algunas realizaciones, un paciente es un ser humano.
Tal como se usa en el presente documento, “sensible a” o “propenso a” o “predispuesto a” una enfermedad o estado específico y similares se refiere a un individuo que, basándose en factores genéticos, ambientales, de salud y/u otros factores de riesgo, es más probable que desarrolle una enfermedad o estado que la población general. Un aumento en la probabilidad de desarrollar una enfermedad puede ser un aumento de aproximadamente el 10 %, el 20 %, el 50 %, el 100 %, el 150 %, el 200 % o más.
Tal como se usa en el presente documento, los términos “tratamiento”, “tratar” y similares, se refieren a obtener un efecto farmacológico y/o fisiológico deseado. El efecto puede ser profiláctico en cuanto a prevenir completa o parcialmente una enfermedad o síntoma de la misma y/o puede ser terapéutico en cuanto a una cura parcial o completa para una enfermedad y/o efecto adverso atribuible a la enfermedad.
El término “glicolípidos”, tal como se usa en el presente documento, se refiere a cualquier molécula con al menos una cadena de hidrato de carbono unida a una ceramida, una cadena de ácido graso o cualquier otro lípido. Alternativamente, un glicolípido puede denominarse glicoesfingolípido.
Tal como se usan en el presente documento y en las reivindicaciones adjuntas, las formas en singular “un”, “una” y “el/la” incluyen la referencia en plural a menos que el contexto indique claramente lo contrario. Por tanto, por ejemplo, la referencia a “un gen” es una referencia a uno o más genes e incluye equivalentes de los mismos conocidos por los expertos en la técnica, y así sucesivamente.
A menos que se mencione específicamente o resulte evidente a partir del contexto, tal como se usa en el presente documento, se entiende que el término “o” es inclusivo.
A menos que se mencione específicamente o resulte evidente a partir del contexto, tal como se usa en el presente documento, se entiende que el término “aproximadamente” está dentro de un intervalo de tolerancia normal en la técnica, por ejemplo dentro de 2 desviaciones estándar de la media. Puede entenderse aproximadamente como que está dentro del 10 %, el 9 %, el 8 %, el 7 %, el 6 %, el 5 %, el 4 %, el 3 %, el 2 %, el 1 %, el 0,5 %, el 0,1 %, el 0,05 % o el 0,01 % del valor mencionado. A menos que quede claro lo contrario a partir del contexto, todos los valores numéricos proporcionados en el presente documento pueden modificarse por el término aproximadamente.
A menos que se indique lo contrario, todas las referencias a concentraciones incluyen las cantidades indicadas en una base de peso en peso, peso en volumen o volumen en volumen. Se entenderá que cualquier referencia a una concentración en porcentaje se refiere a p/p, p/vol o p/vol. Aunque determinadas realizaciones pueden describirse mediante concentraciones como p/p o p/vol, debe entenderse que tales composiciones dan a conocer el mismo % en una base de p/p o p/vol. La densidad de cualquier forma de la invención puede ser entre 0,8 g/ml y 1,2 g/ml, por ejemplo entre 0,9 g/ml y 1,1 g/ml o entre 0,95 g/ml y 1,05 g/ml.
La mención de una lista de grupos químicos en cualquier definición de una variable en el presente documento incluye definiciones de esa variable como grupo individual o combinación de grupos indicados. La mención de una realización para una variable o aspecto en el presente documento incluye esa realización como cualquier realización individual o en combinación con cualquier otra realización o porción de la misma.
Los métodos y composiciones para potenciar las capacidades de filtración de las membranas nasales y proteger frente a patógenos aéreos pueden potenciar la salud de las membranas nasales y las capacidades de filtración de la mucosa nasal. Se proporcionan composiciones antimicrobianas, antivirales y antifúngicas que previenen y tratan infecciones respiratorias provocadas por bacterias, virus y hongos, incluyendo virus influenza y rinovirus (por ejemplo, virus que provocan la gripe y el resfriado común, respectivamente). La presente divulgación se basa, al menos en parte, en el descubrimiento de que pueden usarse composiciones que incluyen funcionalidades antimicrobianas, antivirales y/o antifúngicas para potenciar la salud y capacidades de filtrado de membranas nasales y proteger frente a patógenos aéreos. Al hacer esto, también deben mantener la salud fisiológica de las membranas, tal como manteniendo un pH y osmolaridad saludables y motivando la propagación de microflora saludable. La composición de filtrado antimicrobiana y antifúngica puede formularse para aplicación tópica a la parte anterior proximal de los orificios nasales o a la parte anterior interna de la membrana nasal, donde también pueden recubrir el vello nasal y potenciar las capacidades de filtrado de la nariz. Ventajosamente, la presente divulgación, tal como se describe en el presente documento, proporciona una composición de filtrado aplicada por vía tópica para aplicación nasal y/u oral que no afecta de manera adversa a las propiedades químicas de las membranas respiratorias o la mucosa (y potencia sus capacidades de filtrado naturales) y que seleccionará específicamente como diana y protegerá frente a varios microorganismos que provocan enfermedades.
Se proporcionan métodos para potenciar las propiedades de filtración naturales de las membranas respiratorias y reducir el número de microorganismos, alérgenos y odorantes que entran en el organismo a través de la nariz o que proliferan a lo largo de las membranas respiratorias. Este método incluye la aplicación de una disolución tópica o inhalada o ingerida de composición antimicrobiana, antiviral, antifúngica y/o neutralizadora del olor a la boca, la garganta, la abertura de los orificios nasales, el interior epitelial nasal de los orificios nasales y/o el vello nasal. La disolución antimicrobiana, antiviral y antifúngica puede estar en formas de gel, loción, pastilla para chupar, vapor o aerosol y puede tener una combinación de principios activos destinados a respaldar las capacidades de filtración naturales de la nariz en un medio de base que permite que los principios activos se toleren bien, en sus formas activas, al tiempo que se impide que tengan efectos no deseados. Las composiciones en el presente documento también pueden imitar las propiedades químicas de mucosa sana natural o saliva tales como, por ejemplo, pH y osmolaridad. Los componentes pueden estar equilibrados para crear un efecto sinérgico más fuerte que cualquiera de los componentes solos y también pueden estar equilibrados para mantener un pH y osmolaridad saludables en las membranas respiratorias dado que se ha mostrado que estos parámetros afectan a la probabilidad de transmisión de enfermedad y reacción alérgica. Los principios activos pueden incluir, pero no se limitan a, lactoferrina, lisozima, ICAM, péptidos catiónicos, péptidos glicosilados, ácido siálico, quercetina u otros bioflavonoides, recombinantes, derivados de manera natural o purificados, además de cualquier extracto vegetal que tenga propiedades antimicrobianas (incluyendo, pero sin limitarse a, extractos de piel de frutos y carragenanos), micropartículas de plata, cobre o cinc, y ácido láurico, que tienen propiedades antimicrobianas demostradas. Diversa realizaciones también pueden incluir uno o más de los siguientes componentes: bicarbonato de sodio, carbón activado, manteca de cacao, manteca de karité, cera de abejas, mantecas vegetales, glicerina, miel, alginatos o mucílago vegetal, y un conservante tal como vitamina C, vitamina E o ácido rosmarínico. Diversas realizaciones pueden incluir componentes que, cuando se mezclan con los principios activos anteriormente mencionados, crean una formulación que se tolera bien cuando se aplica a la abertura de los orificios nasales, los epitelios nasales dentro de los orificios nasales, o el vello nasal, y que permite que los principios activos se adhieran a las zonas de aplicación durante un periodo de tiempo suficiente como para prevenir la infección o alergia antes de una nueva aplicación.
Función respiratoria
Las infecciones respiratorias se encuentran entre el tipo más común de enfermedades comunicables en la actualidad a nivel mundial. Casi cada año, enfermedades nuevas y potencialmente mortales, tales como síndrome respiratorio de oriente medio (MERS) y gripes aviares y porcinas captan la atención y preocupación de todo el mundo. Continuamente están surgiendo cepas nuevas y poco habituales de virus influenza y pueden crear epidemias mundiales en cuestión de meses. Además, el estado actual de la tecnología de vacunas y antiviral no está bien equipado para abordar estos brotes de una manera oportuna. En el mejor de los casos, una vacuna dirigida para una nueva cepa viral está disponible en de seis meses a un año, momento en el cual la epidemia puede estar muy avanzada.
Cada día, se filtran aproximadamente 12.000 litros de aire por una nariz promedio. Los conductos nasales filtran el 95 % de las partículas de más de 15 |im de diámetro a partir del aire. Normalmente quedan atrapadas por la mucosa y después se ingieren. Los microorganismos y alérgenos son normalmente varios órdenes de magnitud más pequeños que este umbral y han evolucionado para evadir o superar las defensas mucosas naturales en la nariz, penetrar en las membranas nasales y/o entrar en las vías respiratorias bajas a través de la boca o la garganta. Según las técnicas en el presente documento, mejorar las membranas respiratorias y mucosa con agentes antimicrobianos y filtrantes puede permitir prevenir un número significativo de infecciones respiratorias y alergias de una manera sencilla, discreta y conveniente. Adicionalmente, muchas de las partículas no deseadas que entran en la nariz son odorantes que pueden suponer una molestia y que pueden filtrarse o neutralizarse por determinadas sustancias tales como, pero sin limitarse a, carbón activado o bicarbonato de sodio en suspensión en un portador antes de que puedan unirse a receptores odorantes.
La presente divulgación se refiere a una aplicación tópica antimicrobiana, antiviral, antifúngica, neutralizante del olor que simula ciertas propiedades químicas de mucosa nasal, no altera la salud o integridad de las membranas nasales, o afecta de manera adversa su microflora beneficiosa, y también sirve de filtro para prevenir que irritantes y patógenos aéreos penetren en las membranas nasales y/o entren en las vías respiratorias bajas. Al hacer esto, las composiciones en el presente documento previenen la infección de las vías respiratorias, al tiempo que también previenen irritación y/o reacciones alérgicas.
Además, las composiciones en el presente documento pueden ser isotónicas con respecto a epitelios nasales y membranas mucosas y contienen compuestos con propiedades que fomentan la salud. Se ha mostrado que una microflora beneficiosa y ciertas propiedades de la membrana nasal tales como osmolaridad y pH afectan a la probabilidad de infección. Se han identificado varios medicamentos y condiciones saludables que hacen que las personas sean más propensas a infección respiratoria. Por ejemplo, es probable que las personas diabéticas tengan membranas nasales secas y padezcan sinusitis fúngica. También se sabe que los anticonceptivos orales, las máquinas para apnea del sueño y las alergias hacen que las membranas nasales estén más secas y sean más propensas a infección.
Las composiciones para su uso de la presente invención pueden incluir principios activos específicos con propiedades antimicrobianas demostradas incluyendo, pero sin limitarse a, ICAM-1, inhibidores de ICAM-1, ácido siálico, inhibidores de neuraminidasa, lisozima, lactoferrina, aceites cítricos, extractos o derivados, mucílago vegetal, péptidos, glicopéptidos, aminoácidos, aceites antimicrobianos, extractos vegetales antimicrobianos o defensinas. La composición para su uso puede incluir compuestos neutralizantes del olor tales como, pero sin limitarse a, carbón activado o bicarbonato de sodio. La composición para su uso puede tener propiedades adhesivas y formularse específicamente para mantener principios activos y agentes antimicrobianos/antivirales en la superficie del epitelio nasal durante un periodo de tiempo prolongado. Para lograr esto, las composiciones para su uso en el presente documento pueden incluir sustancias de baja volatilidad, o sustancias oclusivas tales como, por ejemplo, polioles, manteca de karité u otras mantecas vegetales, aceite de coco, cera de abejas y sustancias bioadhesivas tales como mucílago, o alginatos.
Las formulaciones nasales descritas en el presente documento y sus principios activos están destinados a tolerarse bien, ejercer efecto beneficioso sobre la función ciliar, tener buenas propiedades de dispensación, un alto grado de adhesión y mantener las propiedades químicas de la mucosa. En algunas realizaciones, los componentes están equilibrados para crear efectos sinérgicos.
Según las técnicas en el presente documento, uno o más de los principios activos puede seleccionar específicamente como diana microorganismos y virus no deseados. Muchos patógenos aéreos tales como rinovirus y virus influenza lograr entrar en las células epiteliales nasales, mucosa nasal o células de las vías respiratorias bajas a través de dianas de superficie celular específicas. Décadas de investigación han identificado ICAM-1 (molécula de adhesión intracelular 1) como una diana de este tipo para la mayoría de los rinovirus y otra para virus influenza (Abraham y Colonno 1984). ICAM-1 es una molécula de adhesión intercelular expresada en la superficie celular de células epiteliales nasales, así como células de las vías respiratorias bajas. El dominio N-terminal de ICAM-1 se reconoce por receptores en ciertas cápsides de rinovirus. Tras unirse a ICAM-1, el virus desprende su cápside y se transporta al interior de la célula donde inicia la infección y una respuesta inflamatoria por el huésped. Los virus influenza muestran un mecanismo de infección similar: en seres humanos, la hemaglutinina (HA) en superficies virales se une a ácido siálico unido a galactosa (por ejemplo, mediante una unión alfa-2,6 (6'-sialilactosa) o mediante una unión alfa-2,3 (3'-sialilactosa), etc.), en la membrana celular huésped de eritrocitos y células de las vías respiratorias altas.
La técnica anterior tal como, por ejemplo, la patente estadounidense n.° 8.211.448, la patente estadounidense n.° 8.940.339 y la patente estadounidense n.° 8.211.448, da a conocer métodos de atrapamiento de partículas aéreas usando polímeros o compuestos fabricados. En claro contraste con estos métodos de la técnica anterior, la presente divulgación hace que las partículas aéreas se vuelvan inertes y mejora las capacidades de las membranas nasales para eliminar microorganismos que provocan enfermedades o alergia y otras partículas no deseadas. Además, realizaciones que usan más de un principio activo pueden proteger frente a más de un patógeno o irritante al mismo tiempo y de una manera mejorada. Esto difiere de métodos de la técnica anterior que sólo pueden seleccionar como diana un tipo de patógeno tan sólo de manera débil o moderada (por ejemplo, la patente estadounidense n.° 7.132.395; la patente estadounidense n.° 6.514.936; la patente estadounidense n.° 6.051.231; la patente estadounidense n.° 6.649.592; Turneret al.JAMA 281 (19). 1797-1804. (1999)). Esto es importante porque con frecuencia se desconoce la identidad específica de un microorganismo que provoca enfermedades o alergia en el momento de la exposición inicial a un sujeto. En algunas realizaciones de la presente divulgación, pueden suministrarse fármacos a la superficie de las membranas nasales sin absorción a través de la membrana y sin unirse de manera bioadhesiva a la misma (por ejemplo, la patente estadounidense n.° 6.391.452; la publicación estadounidense n.° 2001/0053359; la patente estadounidense n.° 8.679.484; la patente estadounidense n.° 6.456.26; la patente estadounidense n.° 7.087.245). En algunas realizaciones, las composiciones farmacéuticas para su uso pueden no conferir una capa protectora con propiedades antimicrobianas de base amplia tal como se da a conocer en la publicación estadounidense n.° 2007/0135377, la patente estadounidense n.° 7.166.435, la patente estadounidense n.° 8.658.775, la patente estadounidense n.° 8.658.775, la patente estadounidense n.° 7.083.814, la patente estadounidense n.° 7.807.656, la patente estadounidense n.° 9.045.855, la patente estadounidense n.° 6.649.592 y la patente estadounidense n.° 9.029.351.
Normalmente, las técnicas dadas a conocer en el presente documento administran compuestos antimicrobianos dirigidos en composiciones farmacéuticas que también conservan las propiedades fisiológicas y químicas específicas de las membranas o mucosas nasales tales como, por ejemplo, su pH y osmolaridad. Los métodos de tratamiento de infección respiratoria dados a conocer en el presente documento no comprenden compuestos antimicrobianos indiscriminados, no dirigidos, a las membranas nasales que pueden contener alcohol, peróxido u otros componentes severos. Normalmente usados en formulaciones (por ejemplo, la patente estadounidense n.° 8.999.406; la patente estadounidense n.° 8.778.415; la patente estadounidense n.° 7.638.147), estos componentes severos cambian el pH o la osmolaridad de las membranas nasales y tienen un impacto negativo sobre la microflora. En algunas realizaciones, la composición farmacéutica para su uso comprende menos del 10 % de componentes severos (por ejemplo, alcohol, peróxido, etc.) en peso de la composición o menos del 5 % de componentes severos en peso de la composición o menos del 1 % de componentes severos en peso de la composición o menos del 0,1 % de componentes severos en peso de la composición o menos del 0,01 % de componentes severos en peso de la composición. Normalmente, la aplicación de la composición farmacéutica a una membrana nasal alterará el pH de la membrana y/o mucosa en menos del 20 % o menos del 10 % o menos del 5 % o menos del 1 % o menos del 0,1 % del pH antes de la aplicación. En algunas realizaciones, la aplicación de la composición farmacéutica para su uso a una membrana nasal alterará la osmolaridad de la membrana y/o mucosa en menos del 20 % o menos del 10 % o menos del 5 % o menos del 1 % o menos del 0,1 %.
Composiciones antimicrobianas
Las composiciones antimicrobianas en el presente documento pueden incorporar uno o más principios activos antimicrobianos y antivirales dentro de una mezcla de base que comprende uno o más de agua, polioles, emolientes, agentes oclusivos, humectantes, emulsionantes, conservantes, espesantes y agentes de suspensión, agentes de ajuste del pH, agentes de isotonicidad y aceites esenciales que permiten que permanezca en o cerca del sitio de aplicación durante al menos 30 minutos (por ejemplo 30-60 minutos, 1-2 horas, 2-4 horas, 4-8 horas, 8-12 horas, 12 24 horas, 1-2 días, 2-7 días, una semana o más) antes de absorberse, y que tienen un pH y osmolaridad similares a la mucosa, y que no obstruyen los poros. El tiempo que tarda la composición antimicrobiana en absorberse puede determinarse mediante la prueba de sacarina u otras pruebas similares. En una realización, el principio activo puede ser ICAM-1 soluble, que comprende únicamente el dominio extracelular, u otro dominio de ICAM-1 expresado de manera recombinante en bacterias. En otras realizaciones, el principio activo puede ser ICAM-1 soluble expresado de manera recombinante enChlamydomonas reinhardtii.En otras realizaciones, el principio activo puede ser ICAM-1 soluble expresado de manera recombinante en otra especie de algas, u otro sistema vivo.
En otra realización, el principio activo es ácido siálico (por ejemplo, ácido neuramínico unido a una molécula de azúcar en una de varias conformaciones posibles, etc.). El ácido siálico puede purificarse a partir de una fuente natural o producirse mediante fermentación e ingeniería recombinante. En otra realización, el principio activo puede ser un inhibidor de neuraminidasa tal como quercetina, que es un bioflavanoide aislado a partir de pieles de cítricos u otras fuentes naturales. En otra realización, el principio activo es lactoferrina expresada de manera recombinante en bacterias. En otras realizaciones, el principio activo es lactoferrina expresada de manera recombinante enChlamydomonas reinhardtiiu otro sistema de expresión apropiado, por ejemplo algas, levadura o bacterias, o purificada a partir de una fuente natural. En otra realización, el principio activo puede ser lisozima expresada de manera recombinante enChlamydomonas reinhardtiiu otro sistema de expresión apropiado, por ejemplo algas, o purificada a partir de una fuente natural. Tal como se da a conocer el presente documento, pueden usarse principios activos antimicrobianos adicionales en las composiciones de la divulgación, o bien solos o bien en combinación.
En otra realización, el principio activo es un anticuerpo que se produce de manera natural o modificado por ingeniería genética tal como IgA, IgG o IgM, o cualquiera de sus dominios en una de varias conformaciones posibles. El anticuerpo puede purificarse a partir de una fuente natural o producirse mediante ingeniería recombinante en cualquier sistema de expresión apropiado y económicamente viable tal comoChlamydomonas reinhardtiiu otras algas, bacterias, levadura, o una célula de mamífero, o puede purificarse a partir de una fuente natural. En otra realización, el principio activo puede ser un inhibidor de neuraminidasa tal como quercetina, que es un bioflavanoide aislado a partir de pieles de cítricos u otras fuentes naturales.
Algas u otras son el sistema de expresión preferido porque las algas modificadas por ingeniería recombinante son mucho más económicas de hacer crecer y recoger que las células de mamífero o bacterias. Las algas se hacen crecer para su uso como complementos nutricionales en sí mismas y también se usan para modificar por bioingeniería determinados compuestos nutricionales para la producción comercial tal como ácidos grasos omega-3 y carotenoides (Gimpel JA, Henriquez V, y Mayfield SP Frontiers in Microbiology 2015). La mayoría de las estrategias de ingeniería metabólica se han dirigido hacia potenciar la producción comercial de estos compuestos y también para usar algas como biocombustibles. Ventajosamente, las algas pueden optimizarse para producir una gama de metabolitos diferentes que tienen determinadas características de una manera eficiente. Puede optimizarse la expresión de principios activos.
Se ha mostrado que las algas transgénicas soportan la expresión de proteínas recombinantes a partir de los genomas tanto de cloroplasto como nucleares (Rasal BAet al.,Plant Biotechnology J 2010). Originalmente sólo se usaban los genomas nucleares, pero el desarrollo de técnicas requeridas para expresar proteínas recombinantes en el genoma de cloroplasto añade versatilidad a la plataforma y hace que sea posible expresar proteínas que no pueden expresarse en el genoma nuclear o expresar las proteínas de manera más eficiente. La mayoría de las proteínas recombinantes producidas en la actualidad se producen principalmente en bacterias, levadura(S. cervisiae)o cultivo de células de mamífero. Otros sistemas en desarrollo para la producción a gran escala incluyen la levaduraP. pastoris,células de insecto y otros animales y plantas. Puede usarse cualquier sistema de expresión vegetal o animal viable pero, en primer lugar, se investigarán y buscarán los que es probable que sean los más rentables tales como los sistemas de expresión recombinante que no requerirán un alto grado de purificación. Esto hará que sea posible comercializar la realización sin receta sin necesidad de ensayos clínicos. Si se necesita, se usan otros sistemas de expresión recombinante que pueden requerir grados superiores de purificación.
Tal como se representa en la tabla 1, los agentes de la composición pueden estar presentes según los siguientes porcentajes en peso de la composición:
Tabla 1.
Tal como se indica en la tabla 1, un inhibidor de neuraminidasa es opcional pero puede ser deseable en algunas realizaciones, particularmente en las que la composición está destinada a la profilaxis o el tratamiento de infección por virus influenza humano. El ácido siálico puede estar en forma de ácido siálico libre, o puede ser el conjugado o aducto de ácido siálico con un sacárido tal como galactosa, lactosa, etc. El ácido siálico puede ser cualquier ácido siálico, por ejemplo ácidos dentro de la familia de ácido siálico que incluye al menos 43 derivados conjugados o aductos del ácido neuramínico con azúcar de nueve carbonos. Lo que es importante es que el ácido siálico, en cualquier forma, pueda unirse a los viriones de influenza. Además, la lactoferrina mostrada en la tabla 1 puede estar en cualquier forma de lactoferrina incluyendo lactoferrinas libres de quelación con hierro (apolactoferrina), lactoferrinas ricas en hierro (hololactoferrina) o combinaciones de las mismas. Tal como se usa en el presente documento, “ICAM-1” incluye cualquier forma de ICAM-1 incluyendo, sin limitación, las porciones de dominio extracelular de ICAM-1, y, en particular,
ICAM-1 soluble (“sICAM-1”). Se entenderá que, en cualquiera de las composiciones para su uso de la invención que requieren ICAM-1, puede incluirse de manera adecuada ICAM-1 soluble.
Tal como se representa en la tabla 1, pueden estar presentes componentes en un intervalo de porcentajes en peso de la composición. ICAM-1 (incluyendo ICAM-1 soluble) puede estar presente en una cantidad de desde aproximadamente el 0,00000001 % hasta el 10 % en peso de la composición. Más normalmente, ICAM-1 (incluyendo
ICAM-1 soluble) puede estar presente en una cantidad de desde el 0,0000001 % hasta el 0,1 % en peso de la composición. Más normalmente, ICAM-1 (incluyendo ICAM-1 soluble) puede estar presente en una cantidad de desde el 0,000001 % hasta el 0,01 % en peso de la composición. ICAM-1 puede estar presente en una cantidad de aproximadamente el 0,00000001 %, el 0,0000001 %, el 0,000001 %, el 0,00001 %, el 0,0001 %, el 0,001 %, el 0,01 %, el 0,05 %, el 1 %, el 0,1 %, el 0,15 %, el 0,2 %, el 0,25 %, el 0,3 %, el 0,35 %, el 0,4 %, el 0,45 %, el 0,5 %, el 0,55 %, el 0,6 %, el 0,65 %, el 0,7 %, el 0,75 %, el 0,8 %, el 0,85 %, el 0,9 %, el 0,95 %, el 1,0 %, el 1,05 %, el 1,1 %, el 1,15 %, el 1,2 %, el 1,25 %, el 1,3 %, el 1,35 %, el 1,4 %, el 1,45 %, el 1,5 %, el 1,55 %, el 1,6 %, el 1,65 %, el 1,7 %, el 1,76 %, el 1,8 %, el 1,85 %, el 1,9 %, el 1,95 %, el 2,0 %, el 2,5 %, el 3,0 %, el 3,5 %, el 4,0 %, el 4,5 %, el 5,0 %, el 5,5 %, el 6.0 %, el 6,5 %, el 7,0 %, el 7,5 %, el 8,0 %, el 8,5 %, el 9,0 %, el 9,5 % y el 10,0 % en peso de la composición. En algunas realizaciones, ICAM-1 puede estar presente a desde el 0,2 % hasta el 1,0 % en peso de la composición. En algunas realizaciones, ICAM-1 puede estar presente a desde aproximadamente el 0,000005 % hasta el 0,05 % en peso de la composición. En realizaciones preferidas, ICAM-1 puede estar presente a desde aproximadamente el 0,00005 % hasta el 0,005 % en peso de la composición.
Un inhibidor de neuraminidasa (por ejemplo, quercetina, isoformas de quercetina incluyendo isoquercetina, etc.) puede estar presente en una cantidad de desde aproximadamente el 0,00000001 % hasta el 10 % en peso de la composición.
Más normalmente, el inhibidor de neuraminidasa puede estar presente en una cantidad de desde el 0,0000001 % hasta el 0,1 % en peso de la composición. Más normalmente, un inhibidor de neuraminidasa puede estar presente en una cantidad de desde el 0,000001 % hasta el 0,01 % en peso de la composición. Un inhibidor de neuraminidasa puede estar presente en una cantidad de aproximadamente el 0,00000001 %, el 0,0000001 %, el 0,000001 %, el 0,00001 %, el 0,0001 %, el 0,001 %, el 0,01 %, el 0,05 %, el 1 %, el 0,1 %, el 0,15 %, el 0,2 %, el 0,25 %, el 0,3 %, el
0,35 %, el 0,4 %, el 0,45 %, el 0,5 %, el 0,55 %, el 0,6 %, el 0,65 %, el 0,7 %, el 0,75 %, el 0,8 %, el 0,85 %, el 0,9 %, el 0,95 %, el 1,0 %, el 1,05 %, el 1,1 %, el 1,15 %, el 1,2 %, el 1,25 %, el 1,3 %, el 1,35 %, el 1,4 %, el 1,45 %, el
1.5 %, el 1,55 %, el 1,6 %, el 1,65 %, el 1,7 %, el 1,76 %, el 1,8 %, el 1,85 %, el 1,9 %, el 1,95 %, el 2,0 %, el 2,5 %, el 3,0 %, el 3,5 %, el 4,0 %, el 4,5 %, el 5,0 %, el 5,5 %, el 6,0 %, el 6,5 %, el 7,0 %, el 7,5 %, el 8,0 %, el 8,5 %, el
9.0 %, el 9,5 % y el 10,0 % en peso de la composición. En algunas realizaciones, un inhibidor de neuraminidasa puede estar presente a desde el 0,2 % hasta el 1,0 % en peso de la composición. En algunas realizaciones, un inhibidor de neuraminidasa puede estar presente a desde aproximadamente el 0,000005 % hasta el 0,05 % en peso de la composición. En realizaciones preferidas, un inhibidor de neuraminidasa puede estar presente a desde aproximadamente el 0,00005 % hasta el 0,005 % en peso de la composición.
La lactoferrina puede estar presente a del 0,0000001 % al 10,0 % en peso de la composición. La lactoferrina puede estar presente al 0,00000025 %, el 0,0000003 %, el 0,0000004 %, el 0,0000005 %, el 0,0000006 %, el 0,0000007 %, el 0,00000075 %, el 0,0000008 %, el 0,0000009 %, el 0,000001 %, el 0,000002 %, el 0,000003 %, el 0,000004 %, el 0,000005 %, el 0,000006 %, el 0,000007 %, el 0,000008 %, el 0,000009 %, el 0,00001 %, el 0,00002 %, el 0,00003 %, el 0,00004 %, el 0,00005 %, el 0,00006 %, el 0,00007 %, el 0,00008 %, el 0,00009 %, el 0,0001 %, el 0,0002 %, el 0,0003%, el 0,0004 %, el 0,0005 %, el 0,0006%, el 0,0007 %, el 0,0008, el 0,0009 %, el 0,001 %, el 0,002 %, el 0,003 %, el 0,004 %, el 0,005 %, el 0,006 %, el 0,007 %, el 0,008 %, el 0,009 %, el 0,01 %, el 0,02 %, el 0,03 %, el
0,04 %, el 0,05 %, el 0,06 %, el 0,07 %, el 0,08 %, el 0,09 %, el 0,1 %, el 0,2 %, el 0,3 %, el 0,4 %, el 0,5 %, el 0,6 %, el 0,7 %, el 0,8 %, el 0,9 %, el 1,0 %, el 1,5 %, el 2,0 %, el 2,5 %, el 3,0 %, el 3,5 %, el 4,0 %, el 4,5 %, el 5,0 %, el
5.5 %, el 6,0 %, el 6,5 %, el 7,0 %, el 7,5 %, el 8,0 %, el 8,5 %, el 9,0 %, el 9,5 % y el 10,0 % en peso de la composición.
En realizaciones preferidas, la lactoferrina puede estar presente a desde el 0,0000001-1,0 % en peso de la composición.
La lisozima puede estar presente a del 0,000001 % al 10,0% en peso de la composición. La lisozima puede estar presente al 0,000005 %, el 0,000006 %, el 0,000007 %, el 0,000008 %, el 0,000009 %, el 0,00001 %, el 0,00002 %, el 0,00003 %, el 0,00004 %, el 0,00005 %, el 0,00006 %, el 0,00007 %, el 0,00008 %, el 0,00009 %, el 0,0001 %, el 0,0002 %, el 0,0003 %, el 0,0004 %, el 0,0005 %, el 0,0006 %, el 0,0007 %, el 0,0008, el 0,0009 %, el 0,001 %, el 0,002 %, el 0,003 %, el 0,004 %, el 0,005 %, el 0,006 %, el 0,007 %, el 0,008 %, el 0,009 %, el 0,01 %, el 0,02 %, el
0,03 %, el 0,04 %, el 0,05 %, el 0,06 %, el 0,07 %, el 0,08 %, el 0,09 %, el 0,1 %, el 0,2 %, el 0,3 %, el 0,4 %, el 0,5 %, el 0,6 %, el 0,7 %, el 0,8 %, el 0,9 %, el 1,0 %, el 1,5 %, el 2,0 %, el 2,5 %, el 3,0 %, el 3,5 %, el 4,0 %, el 4,5 %, el
5.0 %, el 5,5 %, el 6,0 %, el 6,5 %, el 7,0 %, el 7,5 %, el 8,0 %, el 8,5 %, el 9,0 %, el 9,5 % y el 10,0 % en peso de la composición. En realizaciones preferidas, la lisozima puede estar presente a desde el 0,000001-1,0 % en peso de la composición.
El ácido siálico puede estar presente a del 0,000000001 % al 10,0 % en peso de la composición. El ácido siálico puede estar presente al 0,000005 %, el 0,000006 %, el 0,000007 %, el 0,000008 %, el 0,000009 %, el 0,00001 %, el 0,00002 %, el 0,00003 %, el 0,00004 %, el 0,00005 %, el 0,00006 %, el 0,00007 %, el 0,00008 %, el 0,00009 %, el
0,0001 %, el 0,0002 %, el 0,0003 %, el 0,0004 %, el 0,0005 %, el 0,0006 %, el 0,0007 %, el 0,0008, el 0,0009 %, el
0,001 %, el 0,002 %, el 0,003 %, el 0,004 %, el 0,005 %, el 0,006 %, el 0,007 %, el 0,008 %, el 0,009 %, el 0,01 %, el
0,02 %, el 0,03 %, el 0,04 %, el 0,05 %, el 0,06 %, el 0,07 %, el 0,08 %, el 0,09 %, el 0,1 %, el 0,2 %, el 0,3 %, el
0,4 %, el 0,5 %, el 0,6 %, el 0,7 %, el 0,8 %, el 0,9 %, el 1,0 %, el 1,5 %, el 2,0 %, el 2,5 %, el 3,0 %, el 3,5 %, el 4,0 %, el 4,5 %, el 5,0 %, el 5,5 %, el 6,0 %, el 6,5 %, el 7,0 %, el 7,5 %, el 8,0 %, el 8,5 %, el 9,0 %, el 9,5 % y el 10,0 % en peso de la composición. En realizaciones preferidas, el ácido siálico puede estar presente a desde el 0,000001-1,0 %
en peso de la composición. El ácido siálico puede estar en forma de sialilactosa (por ejemplo, 3'-sialilactosa y/o 6'-sialilactosa, etc.).
En otra realización, una fórmula puede tener los componentes tal como se muestran en la tabla 2.
Tabla 2.
Los carragenanos pueden estar presentes a del 0,0000005 % al 10,0 % en peso de la composición. La lisozima puede estar presente al 0,0000005 %, el 0,0000006%, el 0,0000007 %, el 0,0000008 %, el 0,0000009 %, el 0,000001 %,0,000002 %, el 0,000003 %, el 0,000004 %, el 0,000005 %, el 0,000006 %, el 0,000007 %, el 0,000008 %,0,000009 %, el 0,00001 %, el 0,00002%, el 0,00003 %, el 0,00004%, el 0,00005 %, el 0,00006 %, el 0,00007 %, el 0,00008, el 0,00009 %, el 0,0001 %, el 0,0002 %, el 0,0003 %, el 0,0004 %, el 0,0005 %, el 0,0006 %, el 0,0007 %, el 0,0008 %, el 0,0009 %, el 0,001 %, el 0,002 %, el 0,003 %, el 0,004 %, el 0,005 %, el 0,006 %, el
0,007 %, el 0,008 %, el 0,009 %,0,01 %, el 0,02 %, el 0,03 %, el 0,04 %, el 0,05 %, el 0,06 %, el 0,07 %, el 0,08 %, el
0,09 %, el 0,1 %, el 0,2 %, el 0,3 %, el 0,4 %, el 0,5 %, el 0,6 %, el 0,7 %, el 0,8 %, el 0,9 %, el 1,0 %, el 1,5 %, el
2.0 %, el 2,5 %, el 3,0 %, el 3,5 %, el 4,0 %, el 4,5 %, el 5,0 %, el 5,5 %, el 6,0 %, el 6,5 %, el 7,0 %, el 7,5 %, el 8,0 %, el 8,5%, el 9,0%, el 9,5% y el 10,0% en peso de la composición. En realizaciones preferidas, los carragenanos pueden estar presentes a desde el 0,000001-4,0 % en peso de la composición.
El cinc (por ejemplo peróxido de cinc, etc.) puede estar presente a del 0,0000001 al 5 % en peso de la composición.
El cinc puede estar presente al 0,01 %, el 0,015 %, el 0,02 %, el 0,025 %, el 0,03 %, el 0,035 %, el 0,04 %, el 0,045 %, el 0,05 %, el 0,055 %, el 0,060 %, el 0,065 %, el 0,070 %, el 0,075 %, el 0,080 %, el 0,085 %, el 0,090 %, el 0,095 %, el 0,1 %, el 0,15 %, el 0,2 %, el 0,25 %, el 0,3 %, el 0,35 %, el 0,4 %, el 0,45 %, el 0,5 %, el 0,55 %, el 0,6 %, el 0,6 el 0,7 %, el 0,75 %, el 0,8 %, el 0,85 %, el 0,9 %, el 0,95 %, el 1,0 %, el 1,05 %, el 1,1 %, el 1,15 %, el 1,2 %, el 1,25 %, el 1,3 %, el 1,35 %, el 1,4 %, el 1,45 %, el 1,5 %, el 1,55 %, el 1,6 %, el 1,65 %, el 1,7 %, el 1,76 %, el 1,8 %, el 1,85 %, el 1,9 %, el 1,95 %, el 2,0 %, el 2,5 %, el 3,0 %, el 3,5 %, el 4,0 %, el 4,5 %, el 5,0 %, el 5,5 %, el 6,0 %, el 6,5 %, el
7.0 %, el 7,5 %, el 8,0 %, el 8,5 %, el 9,0 %, el 9,5 %, el 10,0 %, el 10,5 %, el 11,0 %, el 11,5 %, el 12,0 %, el 12,5 %, el 13,0 %, el 13,5 %, el 14,0 %, el 14,5 %, el 15,0 %, el 15,5 %, el 16,0 %, el 16,5 %, el 17,0 %, el 17,5 %, el 18,0 %, el 18,5 %, el 19,0 %, el 19,5 % y el 20,0 % en peso de la composición. En realizaciones preferidas, el peróxido de cinc
(ZnO<2>) puede estar presente a desde el 0,000001 % hasta el 5,0 % en peso de la composición.
El cobre puede estar presente a del 0,00000001 % al 5 % en peso de la composición. El cobre puede estar presente al 0,000005 %, el 0,000006 %, el 0,000007 %, el 0,000008 %, el 0,000009 %, el 0,00001 %, el 0,00002 %, el 0,00003%, el 0,00004 %, el 0,00005 %, el 0,00006 %, el 0,00007%, el 0,00008 %, el 0,00009 %, el 0,0001 %,0,0002 %, el 0,0003 %, el 0,0004 %, el 0,0005 %, el 0,0006 %, el 0,0007 %, el 0,0008, el 0,0009 %, el
0,001 %, el 0,002 %,0,003 %, el 0,004 %, el 0,005 %, el 0,006 %, el 0,007 %, el 0,008 %, el 0,009 %, el 0,01 %, el
0,02 %, el 0,03 %, el 0,04 %,0,05 %, el 0,06 %, el 0,07 %, el 0,08 %, el 0,09 %, el 0,1 %, el 0,2 %, el 0,3 %, el 0,4 %, el 0,5 %, el 0,6 %, el 0,7 %, el 0,8 %, el 0,9 %,1,0 %, el 1,5 %, el 2,0 %, el 2,5 %, el 3,0 %, el 3,5 %, el 4,0 %, el 4,5 %, el 5,0 %, el 5,5 %, el 6,0 %, el 6,5 %, el 7,0 %, el 7,5 %, el 8,0 %,8,5 %, el 9,0 %, el 9,5 %, el 10,0 %, el 10,5 %, el 11,0%, el 11,5%, el 12,0%, el 12,5%, el 13,0%, el 13,5%, el 14,0%, el 14,5%,15,0%, el 15,5%, el 16,0%, el 16,5%, el 17,0%, el 17,5%, el 18,0% 18,5%, el 19,0%, el 19,5% y el 20,0% en peso de la composición. En realizaciones preferidas, el cobre puede estar presente a desde el 0,00001-5,0 % en peso de la composición.
La plata puede estar presente a del 0,00000001 % al 5 % en peso de la composición. La plata puede estar presente al 0,000005 %, el 0,000006 %, el 0,000007 %, el 0,000008 %, el 0,000009 %, el 0,00001 %, el 0,00002 %, el 0,00003%, el 0,00004%, el 0,00005 %, el 0,00006 %, el 0,00007 %, el 0,00008 %, el 0,00009 %, el 0,0001 %, el 0,0002 %, el 0,0003 %, el 0,0004 %, el 0,0005 %, el 0,0006 %, el 0,0007 %, el 0,0008, el 0,0009 %, el 0,001 %, el
0,002 %, el 0,003 %, el 0,004 %, el 0,005 %, el 0,006 %, el 0,007 %, el 0,008 %, el 0,009 %, el 0,01 %, el 0,02 %, el
0,03 %, el 0,04 %, el 0,05 %, el 0,06 %, el 0,07 %, el 0,08 %, el 0,09 %, el 0,1 %, el 0,2 %, el 0,3 %, el 0,4 %, el 0,5 %, el 0,6 %, el 0,7 %, el 0,8 %, el 0,9 %, el 1,0 %, el 1,5 %, el 2,0 %, el 2,5 %, el 3,0 %, el 3,5 %, el 4,0 %, el 4,5 %, el 5,0 %, el 5,5 %, el 6,0 %, el 6,5 %, el 7,0 %, el 7,5 %, el 8,0 %, el 8,5 %, el 9,0 %, el 9,5 %, el 10,0 %, el 10,5 %, el 11,0%, el 11,5%, el 12,0%, el 12,5%, el 13,0%, el 13,5%, el 14,0%, el 14,5%, el 15,0%, el 15,5%, el 16,0%, el 16,5%, el 17,0%, el 17,5%, el 18,0% 18,5%, el 19,0%, el 19,5% y el 20,0% en peso de la composición. En realizaciones preferidas, la plata puede estar presente a desde el 0,00001-5,0 % en peso de la composición.
La composición también puede incluir compuestos neutralizantes del olor tales como carbón activado o bicarbonato de sodio solos o en combinación. Se contemplan otros compuestos neutralizantes del olor para su inclusión en la composición.
Tal como se representa en la tabla 3, una composición antimicrobiana a modo de ejemplo puede incluir además los siguientes componentes adicionales, o bien solos o bien en combinación: extracto de malvavisco, extracto de caléndula, extracto de piel de cítricos, miel, extractos de romero, extracto de mirra, extracto deHelichrysum,extracto de arruruz, aceite de neem, vitamina C, vitamina E y extracto de semilla de pomelo. Estos componentes adicionales pueden estar presentes según los siguientes pesos de la composición. Los disolventes de extracción y procedimientos de extracción se optimizarán para que la composición antimicrobiana sea lo más eficaz y tolerable.
Tabla 3: componentes adicionales.
Tal como se representa en la tabla 4, una composición antimicrobiana a modo de ejemplo puede incluir además los siguientes componentes de base adicionales o ben solos o bien en combinación: un poliol, un humectante (tal como, pero sin limitarse a, glicerina, aloe vera o butilenglicol), un emoliente (tal como, pero sin limitarse a, manteca de karité, aceite de ricino, aceite de coco, ácido caprílico, estearato de butilo o triglicérido), una sustancia oclusiva (tal como, pero sin limitarse a, vaselina, dimeticona, lanolina, manteca de cacao, manteca de karité, cera de abejas, mantecas vegetales o cera de carnauba). La adición y concentraciones exactas de estos componentes pueden optimizarse para lograr una función de barrera que no obstruye los poros, mantiene los principios activos en sus conformaciones bioactivas y en su sitio durante al menos 30 minutos, mantiene una osmolaridad y pH similares a la mucosa fisiológica, es tolerable y eficaz cuando se aplica.
Tabla 4: componentes de base adicionales.
A menos que se indique lo contrario, puede incluirse cualquier excipiente o aditivo en una cantidad suficiente para servir para su propósito funcional previsto sin dañar o irritar los tejidos respiratorios. A menos que se indique lo contrario, todos los excipientes pueden estar presentes en una cantidad de desde aproximadamente el 0,000001 % o el 0,01 % hasta aproximadamente el 1, el 5, el 10 o el 25 % en peso de la composición. El portador puede ser cualquier diluyente farmacéuticamente aceptable y puede ser sólido a temperatura ambiente o líquido a temperatura ambiente. Los portadores adecuados incluyen agua, alcohol (etanol), propilenglicol, isopropanol, propanodiol, glicerina, alcohol bencílico, isoesterato de isoestearilo, triglicérido caprílico/cáprico, oleato de oleilo, acetato de tocoferol, cocoato de decilo, escualeno, Span 40, caprilato/caprato de coco, Span 80, tocoferol, ácido esteárico, erucato de oleilo, Span 20, isoestearato de glicerilo y triglicérido caprílico/cáprico. El portador puede estar, por ejemplo, en forma de una disolución acuosa, una emulsión de agua en aceite o una emulsión de aceite en agua. El portador de emulsión comprenderá normalmente desde el 0,0001 % hasta aproximadamente el 10% en peso de un emulsionante adecuado para estabilizar la emulsión. En una realización, la composición está destinada para su uso oral y puede incluir uno o más de los siguientes componentes: jarabe de glucosa, lecitina de soja, alginatos, sucralosa, jarabe de maíz, gelatina, eritritol, lecitina, mucinas vegetales, carragenanos, extracto de raíz de achicoria, malitol y estevia. En formulaciones tanto orales como nasales, debe observarse que los excipientes no deben interferir con la actividad biológica de los principios activos y deben ser compatibles en disolución con los principios activos. Los excipientes tampoco deben penetrar en los epitelios (membranas respiratorias). Por consiguiente, es deseable tener una solubilidad superior de los principios activos en la composición de base para mantenerlos en disolución y prevenir la penetración de los principios activos en los epitelios. En formulaciones nasales, los excipientes deben servir para mantener la humedad en la mucosa y la película de composición sobre la misma, de tal manera que los principios activos no precipitan a partir de la disolución. En algunas realizaciones, el portador comprenderá agua, y un disolvente secundario de volatilidad inferior al agua en el que los principios activos también son solubles. De manera ideal, el portador y los excipientes se seleccionan de tal manera que tienen una polaridad que es más próxima a la polaridad de los principios activos que a la polaridad de los epitelios. El disolvente secundario puede servir para mantener los principios activos solubles tras haberse evaporado el agua. En formulaciones orales, la pérdida de humedad es menos importante y puede ser deseable para seleccionar excipientes para retardar la disolución de la composición en la saliva.
Los compuestos preparados se purifican usando métodos convencionales para obtener compuestos libres de impurezas. Los compuestos preparados son puros a >75 %, >80 %, >85 %, >90 %, >95 %, >96 %, >97 %, >98 %, >99 %, >99,5 %. Opcionalmente, los compuestos preferidos son puros a >99 %.
Molécula de adhesión intracelular (ICAM-1)
ICAM-1 es un miembro de la superfamilia de inmunoglobulinas de moléculas de adhesión. Es una proteína de membrana integral de 505 aminoácidos de longitud y tiene: i) cinco dominios extracelulares de tipo inmunoglobulina en el extremo amino-terminal (extracelular), ii) un dominio transmembrana hidrófobo (454-477); y iii) un dominio citoplasmático corto en el extremo carboxi-terminal (478-505). La mayoría de los rinovirus usan ICAM-1 expresada en membranas epiteliales nasales para lograr entrar en células. Hay tres tipos principales de rinovirus (RVH A, B y C). RVH A y B pueden subdividirse adicionalmente en aproximadamente 100 subtipos. El 85 % de los RVHA y el 100 % de los RVHB usan ICAM-1 para entrar en las células. RVH C pocas veces provoca enfermedad perceptible. Según las técnicas en el presente documento, la adición de formas solubles parcial o totalmente purificadas de ICAM-1, o cualquiera de sus dominios modificados por ingeniería recombinante, a las composiciones de la divulgación puede mantener la molécula en una forma estable mediante lo cual puede inhibir mediante competencia que las partículas de rinovirus interaccionen con ICAM-1 endógena en membranas celulares, evitando por tanto la primera etapa de infección.
En algunas realizaciones, las composiciones antimicrobianas/antivirales pueden comprender inhibidores de ICAM-1. Los inhibidores de ICAM-1 usados en las composiciones antimicrobianas incluyen, pero no se limitan a, un anticuerpo anti-ICAM-1, citocina, CD11a, ezrina (EZR), CD18, ácido glicirretínico pirrolidinditiocarbamato, inhibidor de activación de NFkB, tiazol heterocíclico, ácido lipoico, efalizumab, 4-[(4-metilfenil)tio]tieno[2,3-c]piridin-2-carboxamida, silibinina, estilbenos, (+)-epigaloil-catequina-galato [(+)-EGCG], extractos dePiper sarmentosumy combinaciones de los mismos. En algunas realizaciones, el anticuerpo anti-ICAM-1 es efalizumab (RAPTIVA).
Ácido siálico e inhibidores de neuraminidasa
Los oligosacáridos ricos en ácido siálico en células de las vías respiratorias altas ayudan normalmente a mantener agua en la superficie y crear una carga negativa. El ácido siálico es un término genérico para los derivados sustituidos en N u O de ácido neuramínico, un monosacárido con una estructura principal de nueve carbonos. También es el nombre del miembro más común de este grupo, ácido N-acetilneuramínico (Neu5Ac o NANA). Se sabe que virus influenza u otros virus se unen a residuos de ácido siálico mediante el receptor de hemaglutinina (HA) en su superficie tras lo cual comienzan a replicarse. Cuando se completa la replicación, una enzima viral, neuraminidasa, escinde las partículas virales de modo que están libres para unirse a, e infectar, otras células. Según las técnicas en el presente documento, el ácido siálico parcial o completamente purificado tal como, por ejemplo, ácido N-acetilneuramínico (Neu5Ac), o cualquier otro derivado de ácido neuramínico o cualquiera de sus dominios modificados por ingeniería recombinante, puede añadirse para mantener la molécula en una forma estable en la que puede inhibir mediante competencia que partículas de virus influenza interaccionen con ácido siálico en células respiratorias o eritrocitos. La familia de ácido siálico incluye 43 derivados del ácido neuramínico con azúcar de nueve carbonos. En la naturaleza, se encuentran habitualmente como componentes de cadenas de oligosacáridos de mucinas, glicoproteínas y glicolípidos. Se piensa que diversas especies sensibles a virus influenza tienen ligeras variaciones en sus uniones ácido siálico-galactosa. Se piensa que los virus influenza que infectan a una especie particular tienen afinidad específica por ácido siálico unido a galactosa en esa conformación específica de especie. Por ejemplo, en células epiteliales respiratorias humanas, el ácido siálico se une principalmente a galactosa mediante una unión alfa-2,6, de modo que los virus influenza que infectan a seres humanos se dirigen habitualmente de manera específica a esa conformación de ácido siálico. Las células epiteliales humanas también tienen otros tipos menos predominantes de uniones ácido siálico-galactosa tales como la unión alfa-2,3 que puede ser la conformación predominante en otra especie tal como cerdos. Como tal, una teoría de cómo puede propagarse el virus influenza de una especie a otra es teniendo especificidad por una conformación que se encuentra en más de una especie, o mutando para volverse específico para otra.
La mucosa nasal y otras secreciones exocrinas contienen ácido siálico en forma soluble que puede servir para una función protectora uniéndose a virus influenza y otros microorganismos e inmovilizándolos. Los virus influenza han evolucionado un método para escindirse del ácido siálico soluble usando una enzima denominada neuraminidasa. Varios fármacos antivirales tales como Tamiflu sirven como inhibidores de neuraminidasa. Con respecto a esto, mantienen el virus inmovilizado e incapaz de infectar células epiteliales. No existe ningún intento en la técnica anterior de usar inhibidores de neuraminidasa en una disolución tópica aplicada a los orificios nasales para prevenir la infección. Se administra principalmente de manera sistémica para curar la infección. La quercetina, un bioflavanoide encontrado en pieles de cítricos y muchos otros frutos y verduras, es un ejemplo de un inhibidor de neuraminidasa que se produce de manera natural.
En algunas realizaciones, las composiciones antimicrobianas incluyen inhibidores de neuraminidasa. Los inhibidores de neuraminidasa incluyen, pero no se limitan a, quercetina, oseltamivir, zanamivir, laninamivir, amantadina, peramivir y cualquiera de sus análogos.
Agentes antivirales
Los agentes antivirales de la presente invención pueden obtenerse mediante procedimientos naturales (por ejemplo, induciendo un animal, planta, hongos, bacterias, etc., para que produzcan un análogo de ICAM-1, o induciendo un animal para que produzca anticuerpos antiidiopáticos anti-ICAM-1 policlonales o monoclonales, etc.); métodos de síntesis (por ejemplo, usando el método de Merrifield para sintetizar polipéptidos de unos derivados funcionales de ICAM-1, etc.); tecnología recombinante (por ejemplo, para producir los derivados funcionales antivirales de ICAM-1 en diversos huéspedes (por ejemplo, levadura, bacterias, hongos, células de mamífero en cultivo, etc.)), vectores virales o plásmidos recombinantes, o proteolisis. La elección de qué método emplear depende de factores tales como conveniencia, rendimiento deseado, etc. No es necesario emplear tan sólo uno de los métodos, procedimientos o tecnologías anteriormente descritos para producir un agente antiviral particular; los procedimientos, métodos y tecnologías anteriormente descritos pueden combinarse con el fin de obtener un agente antiviral particular. Los componentes se equilibran para crear efectos sinérgicos.
Lactoferrina
La lactoferrina está presente de manera natural en secreciones exocrinas incluyendo la mucosa nasal y sirve para una función protectora frente a microorganismos. Es altamente catiónica, antibacteriana, antiviral y antifúngica. En las lágrimas, las concentraciones oscilan desde 1-3 mg/ml representando el 15-30 % de proteína total. La leche humana contiene 1 mg/ml y las secreciones bronquiales tienen hasta el 11,5 % de proteína total. Las concentraciones en la mucosa oscilan desde 1 μg/ml hasta 8 μg/ml con la exposición y desde aproximadamente el 1-3 % de proteína total (Raphaelet al1989). Se piensa que los niveles de lactoferrina en secreciones mucosas disminuyen con la edad, lo cual puede hacer que los adultos más ancianos sean más propensos a infección respiratoria.
La lactoferrina existe en formas monoméricas y tetraméricas y tiende a polimerizarse a altas concentraciones. Es una glicoproteína de aproximadamente 703 aminoácidos y aproximadamente 80 kD. A pesar de una homología del 69 % entre lactoferrina humana y lactoferrina bovina, en algunos estudios, se requirió lactoferrina bovina a 1/10 de la concentración de lactoferrina humana para un efecto antimicrobiano. Diferentes tipos de lactoferrina pueden ser más beneficiosos para determinadas mutaciones o tipos de organismos infecciosos que otros y pueden someterse a prueba para optimizarse en el caso de epidemias pendientes. En estudios de infección por virus del herpes simple (aplicación tópica) y hepatitis C, la lactoferrina fue protectora antes del contacto con el virus pero no después del mismo, haciendo que la aplicación al sitio de infección (tal como membranas nasales) sea más relevante que la aplicación sistémica.
Lisozima
La lisozima, tal como lactoferrina, está normalmente presente en secreciones exocrinas. También es altamente catiónica, antibacteriana, antiviral y antifúngica. Según un estudio (Atsushiet al1998), la concentración promedio en la mucosa es de 20-30 μg/ml. En las lágrimas, la concentración de lisozima es de aproximadamente 103 mg/ml según Raphaelet al1989. También se piensa que los niveles de lisozima en la mucosa disminuyen con la edad.
Anticuerpos mucosos
Las secreciones nasales contienen inmunoglobulinas que ofrecen defensa mediada por anticuerpos y la investigación indica que una mayoría de las mismas es la forma secretoria de IgA (sIgA) (Kirkebyet al.,2000). Los anticuerpos de s-IgA previenen la unión microbiana y la absorción de antígenos moleculares incluyendo alérgenos potenciales. Algunas bacterias producen IgA proteasas, mediante escisión de IgA, estas enzimas pueden interferir con la función de barrera de estos anticuerpos. La investigación indica que la escisión de IgA puede dar como resultado enfermedad atópica. Otros anticuerpos principalmente encontrados en secreciones nasales y que pueden servir para funciones protectoras son IgG e IgM (Kirkebyet al2000). Aumentando las cantidades de estos anticuerpos, la presente divulgación puede proteger frente a irritantes o patógenos no deseados.
Ingeniería recombinante
Existen varias fuentes posibles de los compuestos biológicos anteriormente mencionados, tales como secreciones exocrinas humanas o bovinas. Sin embargo, pueden encontrarse en un suministro limitado y suponer riesgos para la seguridad. La biofabricación recombinante es otra fuente posible de los compuestos. La biofabricación puede usar microorganismos modificados por ingeniería genética tales como bacterias, hongos, células animales, levadura o plantas (incluyendo algas). Con frecuencia, la expresión en líneas celulares de mamíferos, bacterias y levadura es costosa. Uno de los motivos para ello es la necesidad de purificación. Las algas ofrecen varias ventajas con respecto a otros métodos ya que con frecuencia no se requieren niveles muy altos de purificación. Se estima que la producción de proteínas en plantas puede ser hasta cuatro órdenes de magnitud menos cara que la producción en cultivo de células de mamífero por gramo de proteína no purificada. Además, el material vegetal, tal como algas, en su mayor parte “se considera generalmente seguro” al igual que sus homólogos genéticamente modificados. La producción a escala comercial parece viable dado que biorreactores de algas recombinantes para varias moléculas biológicas clásicamente caras han resultado prometedores (véase Rasalaet alPlant Biotech. 2010).
Métodos de tratamiento
En el presente documento se describen métodos y composiciones novedosos para potenciar las capacidades de filtrado de las membranas respiratorias y proteger frente a patógenos aéreos. Los métodos de administración maximizan la exposición de las vías respiratorias a composiciones antimicrobianas/antivirales para la protección frente a patógenos aéreos. Los métodos terapéuticos novedosos también pueden implicar la administración de una composición antimicrobiana como agente terapéutico.
El método puede reducir el crecimiento de una infección respiratoria, contraer la infección o erradicar la infección. La infección puede contraerse en el 5 %, el 10 %, el 25 %, el 50 %, el 75 %, el 85 %, el 90 %, el 95 % o el 99 % o más en comparación con su tamaño original.
Los métodos pueden implicar administrar el agente terapéutico múltiples veces al día. Los métodos pueden implicar administrar el agente terapéutico en un primer día y repetir la administración en uno o más días posteriores. El primer día y uno o más días posteriores están separados por entre 1 día y aproximadamente 3 semanas. El agente terapéutico y otro agente se administran conjuntamente. El agente terapéutico y otros agentes se administran en una razón de aproximadamente 1:2, 1:4, 1:10, 1:20, 1:25, 1:50, 1:100, 1:200 o cualquier razón entre las mismas (razón en peso de agente terapéutico:agente). Se contempla además dentro del alcance de la divulgación que el agente terapéutico puede administrarse a lo largo del transcurso de uno o más ciclos. El agente terapéutico y otro agente pueden administrarse simultáneamente.
El agente terapéutico puede ser cualquier composición antimicrobiana tal como se describe en el presente documento que se usa para prevenir o tratar una enfermedad respiratoria o trastorno. La enfermedad respiratoria o trastorno está provocado por patógenos aéreos. El agente terapéutico es un agente antimicrobiano/antiviral.
El agente antimicrobiano puede ser cualquier agente bien conocido en la técnica, incluyendo, pero sin limitarse a, los descritos en el presente documento.
El agente terapéutico puede ser un anticuerpo terapéutico. El anticuerpo terapéutico puede ser cualquier anticuerpo terapéutico bien conocido en la técnica, incluyendo, pero sin limitarse a, los descritos en el presente documento.
El agente terapéutico puede ser una molécula de ácido nucleico terapéutica. La molécula de ácido nucleico terapéutica puede ser cualquier molécula de ácido nucleico terapéutica bien conocida en la técnica.
El agente terapéutico puede ser un radioisótopo. El radioisótopo puede ser cualquier radioisótopo bien conocido en la técnica.
El agente terapéutico puede ser una combinación de dos o más compuestos farmacológicos.
Los métodos implican administrar una cantidad terapéuticamente eficaz de un agente inmunoterápico. El agente inmunoterápico puede ser cualquier medio adecuado mediante el cual desencadenar una respuesta inmunitaria adicional que selecciona como diana la destrucción de las células de la infección.
El agente inmunoterápico potencia los efectos inmunomoduladores del agente terapéutico. El agente inmunoterápico reduce adicionalmente el crecimiento de la infección o contrae adicionalmente la infección.
El agente inmunoterápico puede administrarse antes, durante o después de haberse administrado el agente terapéutico. El agente inmunoterápico se administra antes de la primera administración del agente terapéutico. El agente inmunoterápico se administra simultáneamente con la primera administración del agente terapéutico.
El agente terapéutico y el agente inmunoterápico pueden administrarse en una razón de aproximadamente 1:2, 1:4, 1:10, 1:25, 1:50, 1:100, 1:200 o cualquier razón entre las mismas (razón en peso de agente terapéutico:agente inmunoterápico).
El agente inmunoterápico puede administrarse por vía intranasal, local, regional o de manera sistémica (por ejemplo por vía intravenosa, etc.).
El agente terapéutico y el agente inmunoterápico pueden estar acoplados.
Agentes terapéuticos
La presente divulgación contempla cualquier agente terapéutico adecuado para su uso en los métodos descritos en el presente documento (por ejemplo, cualquier tipo de agente antimicrobiano/antiviral para tratar enfermedad respiratoria, etc.). Los agentes terapéuticos adecuados incluyen, pero no se limitan a, fármacos o compuestos farmacéuticos (es decir, fármacos de molécula pequeña), anticuerpos terapéuticos, proteínas o compuestos biológicos terapéuticos (por ejemplo, terapias hormonales, etc.) y moléculas de ácido nucleico (por ejemplo, ARNip, etc.).
El agente terapéutico es un agente que se ha mostrado que tiene propiedades antimicrobianas frente a organismos infecciosos. El agente terapéutico es un fármaco farmacéutico aprobado para su comercialización existente u otra composición aprobada para su comercialización para tratar infección usando un enfoque convencional.
El agente terapéutico es una composición antimicrobiana tal como se describe en el presente documento. Las composiciones antimicrobianas incluyen composiciones con propiedades antibacterianas, antivirales y/o antifúngicas. Las composiciones antimicrobianas incluyen, pero no se limitan a: un anticuerpo tal como IgA, IgG o IgM, una ICAM-1 soluble, un inhibidor de ICAM-1, ácido siálico, un inhibidor de neuraminidasa, lactoferrina, una lisozima, un compuesto de cinc, plata, compuestos de plata, cobre, compuestos de cobre y combinaciones de los mismos. Los inhibidores de neuraminidasa incluyen, pero no se limitan a: quercetina, oseltamivir, zanamivir, laninamivir y peramivir. Los inhibidores de ICAM-1 incluyen, pero no se limitan a: ICAM-1 soluble, un anticuerpo anti-ICAM-1, citocina, CD11a, ezrina (EZR), CD18, ácido glicirretínico, pirrolidinditiocarbamato, inhibidor de activación de NFkB, tiazol heterocíclico, ácido lipoico, efalizumab, 4-[(4-metilfenil)tio]tieno[2,3-c]piridin-2-carboxamida, silibinina, estilbenos, (+)-epigaloilcatequina-galato [(+)-EGCG] y combinaciones de los mismos. En algunas realizaciones, el anticuerpo anti-ICAM-1 es efalizumab (RAPTIVA).
Los anticuerpos terapéuticos contemplados por la presente divulgación pueden incluir cualquier isotipo (IgA, IgG, IgE, IgM o IgD) de un anticuerpo antimicrobiano o antiviral o fragmento o derivado activo inmunitario del mismo. Tales fragmentos pueden incluir, por ejemplo, fragmentos variables de cadena sencilla (scFv), fragmento de unión a antígeno (Fab), fragmento cristalizable (Fc) modificado para contener una región de unión a antígeno o epítopo, y anticuerpos de dominio. Las versiones derivatizadas de anticuerpos terapéuticos pueden incluir, por ejemplo, diacuerpos, nanocuerpos, anticuerpos biespecíficos y prácticamente cualquier estructura derivada de anticuerpo que contiene o se modifica por ingeniería para contener un sitio de unión a antígeno apropiado y eficaz.
Los ejemplos de terapias antimicrobianas basadas en anticuerpo que pueden usarse por la divulgación pueden incluir, por ejemplo, un anticuerpo específico para ICAM-1. En algunas realizaciones, el anticuerpo anti-ICAM-1 es efalizumab (RAPTIVA).
La divulgación también contempla que la prevención o el tratamiento de enfermedad respiratoria puede realizarse usando una molécula de ácido nucleico que selecciona como diana un “gen diana” especificado que tiene una función en la infección. El efecto de la molécula de ácido nucleico sobre el gen diana puede incluir silenciamiento génico, destrucción de ARNm o transcripción inhibida o similares, de tal manera que el nivel de expresión y/o conversión del gen diana para dar un polipéptido codificado operativo se ve sustancialmente afectado (por incremento o disminución) de tal manera que se inhibe y/o se destruye el cáncer por el agente. El término “gen diana” se refiere a secuencias de ácido nucleico (por ejemplo, ADN genómicos o ARNm, etc.) que codifican para una proteína, péptido o polipéptido diana, o que codifican para o son ácidos nucleicos reguladores (por ejemplo, un “gen diana” para el fin de la presente divulgación también puede ser un miARN o secuencia génica que codifica para miARN, etc.) que tienen una función en la infección. En determinadas realizaciones, también se pretende que el término “gen diana” incluya isoformas, mutantes, polimorfismos y variantes de corte y empalme de genes diana.
Cualquier agente basado en ácido nucleico bien conocido en la técnica puede ser adecuado para su uso en la divulgación. Los tipos a modo de ejemplo de agentes basados en ácido nucleico incluyen, pero no se limitan a, agentes de ácido ribonucleico monocatenario (por ejemplo, microARN, etc.), agentes de oligonucleótidos de tipo antisentido, agentes de ácido ribonucleico bicatenario y similares.
En la técnica se conocen bien métodos para construir ácidos nucleicos terapéuticos. Por ejemplo, puede ensamblarse ARN interferente a partir de dos oligonucleótidos independientes, en el que una cadena es la cadena sentido y la otra es la cadena antisentido, en el que las cadenas antisentido y sentido son autocomplementarias (es decir, cada cadena comprende una secuencia de nucleótidos que es complementaria a la secuencia de nucleótidos en la otra cadena; tal como en el que la cadena antisentido y la cadena sentido forman un dúplex o estructura bicatenaria); la cadena antisentido comprende una secuencia de nucleótidos que es complementaria a una secuencia de nucleótidos en una molécula de ácido nucleico diana o una porción de la misma y la cadena sentido comprende una secuencia de nucleótidos correspondiente a la secuencia de ácido nucleico diana o una porción de la misma.
Alternativamente, puede ensamblarse ARN interferente a partir de un único oligonucleótido, en el que las regiones sentido y antisentido autocomplementarias están unidas por medio de grupo(s) de unión basado(s) en ácido nucleico o no basado(s) en ácido nucleico. El ARN interferente puede ser un polinucleótido con una estructura secundaria de dúplex, dúplex asimétrico, horquilla u horquilla asimétrica, que tiene regiones sentido y antisentido autocomplementarias, en el que la región antisentido comprende una secuencia de nucleótidos que es complementaria a una secuencia de nucleótidos en una molécula de ácido nucleico diana independiente o una porción de la misma y la región sentido que tiene una secuencia de nucleótidos correspondiente a la secuencia de ácido nucleico diana o una porción de la misma. El ARN interferente puede ser un polinucleótido monocatenario circular que tiene dos o más estructuras de bucle y un tallo que comprende regiones sentido y antisentido autocomplementarias, en el que la región antisentido comprende una secuencia de nucleótidos que es complementaria a una secuencia de nucleótidos en una molécula de ácido nucleico diana o una porción de la misma y la región sentido que tiene una secuencia de nucleótidos correspondiente a la secuencia de ácido nucleico diana o una porción de la misma, y en el que el polinucleótido circular puede procesarse o bienin vivoo bienin vitropara generar una molécula de ARNip activa que puede mediar en la interferencia de ARN.
En la técnica se conocen bien métodos para administrar/suministrar ácidos nucleicos terapéuticos. Por ejemplo, puede administrarse moléculas de ácido nucleico terapéuticas en un vehículo de administración, tal como una vesícula lipídica u otro material portador polimérico conocido en la técnica. Ejemplos no limitativos de sistemas de portador basados en lípidos adicionales (que pueden prepararse con al menos un lípido catiónico modificado de la divulgación) adecuados para su uso en la presente divulgación incluyen lipoplejos (véase, por ejemplo, la publicación de patente estadounidense n.° 20030203865; y Zhanget al.,J. Control Release, 100:165-180 (2004)), lipoplejos sensibles al pH (véase, por ejemplo, la publicación de patente estadounidense n.° 2002/0192275), lipoplejos enmascarados de manera reversible (véase, por ejemplo, la publicación de patente estadounidense n.° 2003/0180950), composiciones basadas en lípidos catiónicos (véase, por ejemplo, la patente estadounidense n.° 6.756.054; y la publicación de patente estadounidense n.° 2005/0234232), liposomas catiónicos (véase, por ejemplo, la publicaciones de patente estadounidense n.os 2003/0229040, 2002/0160038 y 2002/0012998; la patente estadounidense n.° 5.908.635; y la publicación de PCT n.° WO 01/72283), liposomas aniónicos (véase, por ejemplo, la publicación de patente estadounidense n.° 2003/0026831), liposomas sensibles al pH (véase, por ejemplo, la publicación de patente estadounidense n.° 2002/0192274; y el documento AU 2003/210303), liposomas recubiertos con anticuerpo (véase, por ejemplo, la publicación de patente estadounidense n.° 2003/0108597; y la publicación de PCT n.°WO 00/50008), tipos de células específicos para liposomas (véase, por ejemplo, la publicación de patente estadounidense n.° 2003/0198664), liposomas que contienen ácido nucleico y péptidos (véase, por ejemplo, la patente estadounidense n.° 6.207.456), liposomas que contienen lípidos derivatizados con polímeros hidrófilos liberables (véase, por ejemplo, la publicación de patente estadounidense n.° 2003/0031704), ácido nucleico en lípidos (véase, por ejemplo, las publicaciones de P<c>T n.os WO 03/057190 y WO 03/059322), ácido nucleico encapsulado en lípidos (véase, por ejemplo, la publicación de patente estadounidense n.° 2003/0129221; y la patente estadounidense n.° 5.756.122), otras composiciones liposomales (véase, por ejemplo, las publicaciones de patente estadounidense n.os 2003/0035829 y 2003/0072794; y la patente estadounidense n.° 6.200.599), emulsiones y mezclas de liposomas estabilizadas (véase, por ejemplo, el documento EP1304160), composiciones de emulsiones (véase, por ejemplo, la patente estadounidense n.° 6.747.014) y microemulsiones de ácido nucleico (véase, por ejemplo, la publicación de patente estadounidense n.° 2005/0037086).
Si es adecuado, cualquiera de los agentes de la divulgación, incluyendo fármacos, compuestos biológicos y anticuerpos terapéuticos farmacéuticos, también pueden administrarse mediante los sistemas de portador anteriormente descritos. Todos los sistemas de portador pueden modificarse además con un resto de direccionamiento o similar con el fin de facilitar la administración de la composición a un sitio de infección en las vías respiratorias.
Se apreciará que con frecuencia los medios convencionales para administrar agentes activos están limitados en gran medida por barreras biológicas, químicas y físicas. Normalmente, estas barreras se imponen por el entorno a través del cual se produce la administración, el entorno de la diana para administración o la propia diana. Los agentes biológica o químicamente activos son particularmente vulnerables a tales barreras. En la administración a animales de agentes farmacológicos y terapéuticos biológicamente activos o químicamente activos, se imponen barreras físicas y químicas por el organismo. Ejemplos de barreras físicas son la piel y diversas membranas de órganos que se atraviesan antes de alcanzar una diana, y los ejemplos de barreras químicas incluyen, pero no se limitan a, variaciones de pH, bicapas lipídicas y enzimas degradantes. La membrana celular también representa una barrera importante que tiene un efecto significativo sobre la eficacia de la administración de fármaco.
Agentes inmunoterápicos
En otro aspecto, la divulgación emplea uno o más agentes inmunoterápicos que pueden potenciar adicionalmente los efectos de aclaramiento de infección respiratoria conferidos por el uso del agente terapéutico antimicrobiano/antiviral. Por ejemplo, el agente inmunoterápico puede administrarse después de haberse establecido los efectos del agente antimicrobiano, pero la divulgación no se limita a este concepto. La divulgación contempla cualquier régimen de administración que implique múltiples agentes siempre que puedan producirse los beneficios terapéuticos atribuibles a cada uno de los agentes. También se contempla dentro del alcance de la divulgación que la administración del uno o más agentes inmunoterápicos puede tener actividad inmunoestimulante que proporciona profilaxis frente a la recidiva adicional de una infección. Este efecto inmunoestimulante puede lograrse cuando el agente se administra por vía intranasal o de manera sistémica.
Los expertos en la técnica apreciarán que un agente inmunoterápico es un tratamiento que tiene como objetivo usar el propio sistema inmunitario de un individuo para luchar contra una infección o enfermedad. Esto puede lograrse reforzando el propio sistema inmunitario del individuo o proporcionando elementos complementarios de un sistema inmunitario por lo demás defectuoso o deficiente.
La inmunoterapia es una forma de terapia biológica que puede usarse en la presente divulgación para complementar y/o potenciar los efectos del tratamiento con el agente terapéutico. Generalmente hay dos formas reconocidas de inmunoterapia, que se denominan inmunoterapias activas e inmunoterapias pasivas. Las inmunoterapias activas estimulan el propio sistema inmunitario del organismo para luchar contra una enfermedad. Las inmunoterapias pasivas usan componentes del sistema inmunitario, tales como anticuerpos, preparados fuera del organismo, para potenciar el nivel de respuesta inmunitaria del organismo. Las inmunoterapias también pueden funcionar seleccionando como diana determinados tipos de células o antígenos (inmunoterapias específicas) o pueden funcionar estimulando de manera más general el sistema inmunitario (inmunoterapias no específicas, o algunas veces denominadas adyuvantes). Algunos ejemplos de inmunoterapias contempladas por la divulgación incluyen terapia con anticuerpos monoclonales, inmunoterapias no específicas y adyuvantes (sustancias que refuerzan la respuesta inmunitaria tales como interleucina 2 e interferón-alfa), fármacos inmunomoduladores (tales como talidomida y lenalidomida) y vacunas.
Por consiguiente, los agentes inmunoterápicos, que también pueden denominarse “ inmunomoduladores” pueden incluir, por ejemplo, interleucinas (por ejemplo, IL-2, IL-7 o IL-12, etc.), algunas otras citocinas (por ejemplo, interferones, factor estimulante de colonias de crecimiento (G-CSF), imiquimod, etc.), quimiocinas y otros tipos de agentes, que pueden incluir antígenos, epítopos, anticuerpos, anticuerpos monoclonales o incluso un vehículo de administración para administrar uno o más de estos compuestos, y también pueden incluir incluso células recombinantes del sistema inmunitario. Tales agentes inmunoterápicos pueden incluir formas recombinantes, formas sintéticas y preparaciones naturales (véase D'Alessandro, N.et al.,Cancer Therapy: Differentiation, Immunomodulation and Angiogenesis, Nueva York: Springer-Verlag, 1993).
El agente inmunoterápico aprovecha el sistema inmunitario innato del organismo y tiene el efecto cuando se introduce de desencadenar la respuesta inmunitaria innata frente a los patógenos no deseados.
La introducción de los agentes inmunoterápicos de la divulgación puede lograrse usando cualquier enfoque adecuado, incluyendo mediante administración local o regional del agente en, cerca o dentro de la infección respiratoria. El agente también puede administrarse, cuando sea adecuado, mediante terapia génica. Por ejemplo, el antígeno inductor de anticuerpos puede introducirse inyectando o administrando de otro modo directamente un vector genético u otra molécula de ácido nucleico que puede expresar el antígeno deseado. Los propios antígenos también pueden administrarse directamente en el tejido infectado diana.
Enfermedades respiratorias objetivo
La presente divulgación contempla tratar una amplia gama de enfermedades respiratorias, incluyendo infecciones de todos los tipos, ubicaciones, tamaños y características. Los métodos de la divulgación son adecuados para tratar influenza y rinovirus (el resfriado común).
Prácticamente cualquier tipo de infección relacionada con las vías respiratorias puede tratarse mediante la presente divulgación incluyendo, pero sin limitarse a, las siguientes infecciones respiratorias: amigdalitis, faringitis, laringitis, sinusitis, otitis media, determinados tipos de influenza, bronquitis, neumonía y el resfriado común.
Se contempla que las composiciones para su uso de la invención son adecuadas para la profilaxis y/o el tratamiento de infección a partir de cualquier serotipo de rinovirus humano (RVH). RVH puede incluir, sin limitación, las especies rinovirus A (incluyendo los serotipos RVH-A1, RVH-A2, RVH-A7, RVH-A8, RVH-A9, RVH-A10, RVH-A11, RVH-A12, RVH-A13, RVHA15, RVH-A16, RVH-A18, RVH-A19, RVH-A20, RVH-A21, RVH-A22, RVH-A23, RVH-A24, RVH-A25, RVH-A28, RVHA29, RVH-A30, RVH-A31, RVH-A32, RVH-A33, RVH-A34, RVH-A36, RVH-A38, RVH-A39, RVH-A40, RVH-A41, RVHA43, RVH-A44, RVH-A45, RVH-A46, RVH-A47, RVH-A49, RVH-A50, RVH-A51, RVH-A53, RVH-A54, RVH-A55, RVHA56, RVH-A57, RVH-A58, RVH-A59, RVH-A60, RVH-A61, RVH-A62, RVH-A63, RVH-A64, RVH-A65, RVH-A66, RVHA67, RVH-A68, RVH-A71, RVH-A73, RVH-A74, RVH-A75, RVH-A76, RVH-A77, RVH-A78, RVH-A80, RVH-A81, RVHA82, RVH-A85, RVH-A88, RVH-A89, RVH-A90, RVH-A94, RVH-A95, RVH-A96, RVH-A98, RVH-A100, RVH-A101, RVHA102 y RVH-A103), rinovirus B (incluyendo los serotipos RVH-B3, RVH-B4, RVH-B5, RVH-B6, RVHB14, RVHB17, RVH-B26, RVH-B27, RVH-B35, RVH-B37, RVH-B42, RVH-B48, RVH-B52, RVH-B69, RVH-B70, RVH-B72, RVHB79, RVH-B83, RVH-B84, RVH-B86, RVH-B91, RVH-B92, RVH-B93, RVH-B97 y RVH-B99) y rinovirus C (incluyendo, sin limitación, los serotipos RVH-C1, RVH-C2, RVH-C3, RVH-C4, RVH-C5, RVH-C6, RVH-C7, RVH-C8, RVH-C9, RVH-C10, RVH-C11, RVH-C12, RVH-C13, RVH-C14, RVH-C15, RVH-C16, RVH-C17, RVH-C18, RVH-C19, RVH-C20, RVH-C21, RVH-C22, RVH-C23, RVH-C24, RVH-C25, RVH-C26, RVH-C27, RVH-C28, RVH-C29, RVH-C30, RVH-C31, RVH-C32, RVH-C33, RVH-C34, RVH-C35, RVH-C36, RVH-C37, RVH-C38, RVH-C39, RVH-C40, RVH-C41, RVH-C42, RVH-C43, RVH-C44, RVH-C45, RVH-C46, RVH-C47, RVH-C48, RVH-C49, RVH-C50 y RVH-C51). Se contempla que las composiciones de la invención son útiles en la profilaxis o el tratamiento de infección viral a partir de cualquier rinovirus, en particular cualquier virus que se une a molécula de adhesión intercelular 1 (ICAM-1). También se contempla que las composiciones para su uso de la invención son adecuadas para la profilaxis y/o el tratamiento de infección a partir de cualquier serotipo de virus influenza humano, incluyendo, sin limitación, los de los géneros virus influenza A, virus influenza B y virus influenza B, incluyendo las especies virus influenza A (incluyendo, sin limitación, los serotipos H1N1, H2N2, H3N2, H5N1, H7N7, H1N2, H9N2, H7N2, H7N3, H10N7 y H7N9 por nombrar unos pocos), virus influenza B y virus influenza C. Se contempla que las composiciones de la invención son útiles en la profilaxis o el tratamiento de infección viral a partir de cualquier virus de unión a ácido siálico, incluyendo virus influenza, reovirus, adenovirus y/o rotavirus. Cuando se pulverizan en la cavidad nasal y/o la boca, las composiciones para su uso de la invención forman un depósito sobre la mucosa, que tiene de manera ideal un tiempo de residencia prolongado (por ejemplo, al menos 1 minuto, al menos 5 minutos, al menos 10 minutos, al menos 15 minutos, al menos 20 minutos, al menos 25 minutos, al menos 30 minutos, etc.) sobre la mucosa, pero de manera deseable no provocan una sequedad o irritación excesivas de la mucosa. Las composiciones para su uso según la invención se aplican a la mucosa nasal y/u oral para la profilaxis o el tratamiento de infección por rinovirus humano y virus influenza humano.
La presente divulgación puede tratar y/o prevenir de manera general todas las formas de las infecciones anteriores. Por ejemplo, el método de la divulgación puede tratar o prevenir ventajosamente infecciones que surgen en cualquier parte de las vías respiratorias incluyendo, pero sin limitarse a, las vías respiratorias altas (nariz, senos, laringe y faringe) y las vías respiratorias bajas (tráquea, bronquios primarios, tubos bronquiales, bronquiolos y pulmones).
La reducción de infección significa una reducción medible del crecimiento de la infección. Por ejemplo, y sin limitación, la infección puede reducirse en al menos aproximadamente un factor de 10 (por ejemplo 100, 1000 veces o más) o mediante reducción de al menos aproximadamente el 10 % (por ejemplo al menos aproximadamente el 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 95, 99 o 100 %) en comparación con el crecimiento medido a lo largo del tiempo antes del tratamiento tal como se define en el presente documento. La reducción de infección según la invención tiene de manera ideal un grado estadísticamente significativo en comparación con tejidos infectados por lo demás idénticos en ausencia de los principios activos contenidos la composición para su uso de la invención.
También puede lograrse una erradicación completa de la infección mediante métodos de la divulgación. La erradicación se refiere a la eliminación de la infección y organismos infecciosos. Se considera que la infección se elimina cuando ya no puede detectarse usando métodos de detección conocidos en la técnica.
Composiciones farmacéuticas
La divulgación proporciona composiciones farmacéuticas para su uso en cualquiera de los métodos descritos en el presente documento. Las composiciones farmacéuticas para su uso contienen un agente terapéutico antimicrobiano/antiviral y, opcionalmente, un agente inmunoterápico.
En realizaciones, las composiciones farmacéuticas para su uso pueden incluir un portador farmacéuticamente aceptable. El término “farmacéuticamente aceptable” significa aprobado por una agencia reguladora del gobierno federal o estatal o indicado en la farmacopea de los EE. UU. u otra farmacopea generalmente reconocida para su uso en animales, y más particularmente en seres humanos. El término “portador” se refiere a un diluyente, adyuvante, excipiente o vehículo con el que se administra el compuesto terapéutico. Tales portadores farmacéuticos pueden ser líquidos estériles, tales como agua y aceites, incluyendo los de origen de petróleo, animal, vegetal o sintético, tales como aceite de cacahuete, aceite de soja, aceite mineral, aceite de sésamo, aceite de oliva, gel (por ejemplo, hidrogel, etc.), aceite de ricino y similares. La solución salina es un portador preferido cuando la composición farmacéutica se administra por vía intravenosa. También pueden emplearse soluciones salinas y disoluciones acuosas de dextrosa y glicerol como portadores líquidos, particularmente para disoluciones inyectables.
El portador farmacéuticamente aceptable puede seleccionarse para proporcionar un tiempo de residencia especificado sobre la mucosa de un sujeto. En algunas realizaciones, el “tiempo de residencia” de las composiciones de la invención sobre la mucosa representa tiempos de residencia promedio a partir de estudios que implican múltiples aplicaciones (intranasales y/u orales) usando una muestra de múltiples individuos suficiente como para aproximarse a la población en su conjunto. En algunas realizaciones, al menos el 25 % (y preferiblemente, al menos el 30 %, o al menos el 40 % o al menos el 50 %, o al menos el 60 %, o al menos el 70 %, o al menos el 80 %, o al menos el 90 %) en peso de los principios activos inicialmente aplicados permanece sobre la mucosa tras la duración de tiempo especificada. En algunas realizaciones, el portador farmacéuticamente aceptable a 25°C tiene los parámetros de solubilidad de Hansen de energía a partir de la dispersión (8d), energía a partir de la fuerza intermolecular dipolar entre moléculas (8p), energía a partir de enlaces de hidrógeno (8h) de entre aproximadamente 15 y aproximadamente 18, aproximadamente 12 y aproximadamente 15, aproximadamente 21 y aproximadamente 25, respectivamente.
El portador farmacéuticamente aceptable puede ser acuoso. En algunas realizaciones, el portador farmacéuticamente aceptable está libre de conservantes de mercurio. El disolvente puede ser 1,2-propanodiol, 1,3-propanodiol y puede usarse una variedad de portadores acuosos, por ejemplo agua tamponada, solución salina al 0,9 por ciento, disoluciones acuosas de etanol tamponadas y similares. Combinaciones de cualquiera de estos portadores se encuentran dentro del alcance de la invención. Estas composiciones pueden esterilizarse mediante técnicas de esterilización convencionales bien conocidas o pueden esterilizarse por filtración. Las disoluciones resultantes pueden envasarse para su uso tal cual o mezclarse como adyuvante con otro medicamento. Una composición puede contener sustancias auxiliares farmacéuticamente aceptables tal como se requiere para aproximarse a condiciones fisiológicas, tales como agentes tamponantes y de ajuste del pH, agentes de ajuste de la tonicidad, modificadores del sabor, edulcorantes, agentes humectantes y similares, por ejemplo, acetato de sodio, lactato de sodio, cloruro de sodio, cloruro de potasio, cloruro de calcio, monolaurato de sorbitano, oleato de trietanolamina, etc. En algunas realizaciones, el portador farmacéuticamente aceptable es una mezcla de agua y un poliol. En algunas realizaciones, el portador farmacéuticamente aceptable es una mezcla de agua y propanodiol (por ejemplo, 1,2-propanodiol, 1,3-propanodiol, etc.). En algunas realizaciones, la composición farmacéutica para su uso es una mezcla de agua y glicerina. El portador farmacéuticamente aceptable puede ser disolución acuosa a aproximadamente el 1 % - aproximadamente el 35 % (por ejemplo aproximadamente el 5 % - aproximadamente el 30 %, etc.) de propanodiol o glicerina en peso del portador acuoso. Algunos portadores farmacéuticamente aceptables incluyen disolución acuosa al 20% de 1,3-propanodiol, disolución acuosa al 20 % de glicerina, disolución acuosa al 10 % de 1,3-propanodiol, disolución acuosa al 10 % de glicerina, disolución acuosa al 20 % de 1,3-propanodiol con el 1 % de aceite de girasol y el 5 % de polisorbato 80, disolución acuosa al 20 % de glicerina con el 1 % de aceite de girasol y el 5 % de polisorbato 80, disolución acuosa al 10 % de 1,3-propanodiol con el 1 % de aceite de girasol y el 5 % de polisorbato 80, disolución acuosa al 10 % de glicerina con el 1 % de aceite de girasol y el 5 % de polisorbato 80, el sistema de emulsionante polimérico Versaflex V-175 (es decir, palmitato de sacarosa, estearato de glicerilo, estearato-citrato de glicerilo, sacarosa, manano y goma xantana), el sistema de emulsionante polimérico Versaflex V-175 con el 3% de aceite de girasol, el sistema de emulsionante polimérico Versaflex V-175 con el 3% de aceite de girasol y de aproximadamente el 5 a aproximadamente el 30% de propanodiol o glicerina, el sistema de emulsionante Versaflex V-175 con el 3% de monoglicérido acetilado, y el sistema de emulsionante Versaflex V-175 con el 3 % de monoglicérido acetilado y de aproximadamente el 5 a aproximadamente el 30 % de propanodiol o glicerina.
Los excipientes farmacéuticos adecuados incluyen almidón, glucosa, lactosa, sacarosa, gelatina, malta, arroz, harina, creta, gel de sílice, estearato de sodio, monoestearato de glicerol, talco, cloruro de sodio, leche desnatada en polvo, glicerol, propileno, glicol, agua, etanol y similares. La composición, si se desea, también puede contener cantidades minoritarias de agentes humectantes o emulsionantes, o agentes tamponantes del pH. Estas composiciones pueden adoptar la forma de disoluciones, suspensiones, emulsión, comprimidos, pastillas, cápsulas, polvos, formulaciones de liberación sostenida y similares. La formulación oral puede incluir portadores convencionales tales como calidades farmacéuticas de manitol, lactosa, almidón, estearato de magnesio, sacarina de sodio, celulosa, carbonato de magnesio, etc. Se describen ejemplos de portadores farmacéuticos adecuados en “Remington's Pharmaceutical Sciences” de E. W. Martin, cuyo contenido se incorpora en el presente documento mediante referencia en su totalidad. Tales composiciones contendrán generalmente una cantidad terapéuticamente eficaz del agente terapéutico y/o el agente inmunoterápico, en forma purificada, junto con una cantidad adecuada de portador para proporcionar la forma para administración apropiada al paciente. La formulación debe adaptarse al modo de administración.
En realizaciones, el agente terapéutico y/o el agente inmunoterápico se administran de manera local como composición de liberación inmediata o de liberación controlada, por ejemplo mediante disolución y/o difusión controlada de la sustancia activa. La liberación controlada por disolución o difusión puede lograrse incorporando la sustancia activa en una matriz apropiada. Una matriz de liberación controlada puede incluir uno o más de goma laca, cera de abejas, Glycowax, cera de ricino, cera de carnauba, alcohol estearílico, monoestearato de glicerilo, diestearato de glicerilo, palmitoestearato de glicerol, etilcelulosa, resinas acrílicas, dl-poli(ácido láctico), acetato-butirato de celulosa, poli(cloruro de vinilo), poli(acetato de vinilo), vinilpirrolidona, polietileno, polimetacrilato, metacrilato de metilo, 2-hidroximetacrilato, hidrogeles de metacrilato, 1,3-butilenglicol, metacrilato de etilenglicol y/o polietilenglicoles. En una formulación de matriz de liberación controlada, el material de matriz también puede incluir, por ejemplo, metilcelulosa hidratada, cera de carnauba y alcohol estearílico, carbopol 934, silicona, triestearato de glicerilo, acrilato de metilometacrilato de metilo, poli(cloruro de vinilo), polietileno y/o fluorocarbono halogenado.
En realizaciones relacionadas, la matriz de liberación controlada es un hidrogel. Un hidrogel es una red polimérica tridimensional, hidrófila o anfífila, que puede captar grandes cantidades de agua. Las redes están compuestas por homopolímeros o copolímeros, que son insolubles debido a la presencia de reticulaciones químicas o físicas covalentes (por ejemplo, iónicas, interacciones hidrófobas, entrelazamientos, etc.). Las reticulaciones proporcionan la estructura de red e integridad física. Los hidrogeles muestran una compatibilidad termodinámica con agua que les permite hincharse en medios acuosos. Las cadenas de la red están conectadas de tal manera que existen poros y que una fracción sustancial de estos poros tienen dimensiones de entre 1 nm y 1000 nm.
Los hidrogeles pueden prepararse mediante reticulación de biopolímeros hidrófilos o polímeros sintéticos. Los ejemplos de los hidrogeles formados a partir de reticulación física o química de biopolímeros hidrófilos, incluyen, pero no se limitan a, hialuronanos, quitosanos, alginatos, colágeno, dextrano, pectina, carragenanos, polilisina, gelatina, agarosa, (met)acrilato-oligolactida-PEO-oligolactida-(met)acrilato, polietilenglicol (PEO), polipropilenglicol (PPO), copolímeros de PEO-PPO-PEO (Pluronics), polifosfaceno, polimetacrilatos, poli(N-vinilpirrolidona), copolímeros de PL(G)A-PEO-PL(G)A, polietilenimina y similares. Véase y van Nostrum, Adv. Drug Del. Rev. 54:13-36 (2002); Hoffman, Adv. Drug Del. Rev. 43:3-12 (2002); Cadeeet al.,J Control. Release 78:1-13 (2002); Suriniet al.,J. Control. Release 90:291-301 (2003); y la patente estadounidense n.° 7.968.085, cada uno de los cuales se incorpora como referencia en su totalidad. Estos materiales consisten en cadenas de estructura principal de alto peso molecular compuestas por polisacáridos o polipéptidos lineales o ramificados.
La cantidad de la composición farmacéutica de la divulgación que será eficaz en el tratamiento o la prevención de una infección respiratoria o alergia puede depender de la naturaleza del patógeno y puede determinarse mediante técnicas clínicas convencionales, incluyendo análisis de sangre y/o técnicas de obtención de imágenes. Además, opcionalmente pueden emplearse ensayosin vitropara ayudar a identificar intervalos de dosificación óptimos. La dosis precisa que va a emplearse en la formulación también puede depender de la vía de administración y la gravedad de la infección, y debe decidirse según el criterio del profesional y las circunstancias de cada paciente. Las dosis eficaces pueden extrapolarse a partir de curvas de dosis-respuesta derivadas a partir de sistemas de prueba de modeloin vitroo de animales.
Dosificaciones y regímenes de administración
Los agentes terapéuticos, agentes inmunoterápicos o composiciones que contienen estos agentes se administran de una manera compatible con la formulación de dosificación, y en una cantidad tal como para ser terapéuticamente eficaz, protector e inmunogénico.
Los agentes y/o las composiciones pueden administrarse mediante diferentes vías, incluyendo, pero sin limitarse a, nasal, aerosol, tópica, bucal y sublingual, oral, intradérmica, subcutánea y parenteral. El término parenteral tal como se usa en el presente documento incluye, por ejemplo, inyección intraocular, subcutánea, intraperitoneal, intracutánea, intravenosa, intramuscular, intraarticular, intraarterial, intrasinovial, intraesternal, intratecal, intralesional e intracraneal, u otras técnicas de infusión.
En algunas realizaciones, la administración de los agentes terapéuticos se administra de manera local o regional (por ejemplo, por vía intranasal, etc.). En algunas realizaciones, se usa un dispositivo para administrar la composición antimicrobiana para su uso a las vías respiratorias. La composición para su uso puede administrarse mediante uso de un inhalador, atomizador, nebulizador, botella de pulverización nasal, bomba de pulverización nasal, respirador, depósito de aire comprimido, aerosolizador y cánula nasal. La composición para su uso puede administrarse mediante insuflación, inhalación, ingestión oral, de manera sublingual y cualquier combinación de las mismas.
En realizaciones, los agentes y/o las composiciones formulados según la presente divulgación se formulan y administran de una manera para provocar una respuesta inmunitaria sistémica. Por tanto, en algunas realizaciones, las formulaciones se preparan poniendo en asociación de manera uniforme e íntima el principio activo con portadores líquidos. Las formulaciones adecuadas para administración incluyen disoluciones estériles acuosas y no acuosas, que pueden contener antioxidantes, tampones, bacteriostáticos y solutos que hacen que la formulación sea isotónica con la sangre del receptor previsto, y suspensiones estériles acuosas y no acuosas que pueden incluir agentes de suspensión y agentes espesantes. Las formulaciones pueden presentarse en recipientes de dosis unitaria o de múltiples dosis, por ejemplo, ampollas selladas y viales, y pueden almacenarse en un estado secado por congelación (liofilizado) que sólo requiere la adición del portador líquido estéril, por ejemplo, agua, inmediatamente antes del uso. Pueden prepararse disoluciones y suspensiones extemporáneas a partir de polvos estériles, gránulos y comprimidos habitualmente usados por un experto habitual en la técnica.
Los agentes y/o las composiciones pueden administrarse en diferentes formas, incluyendo, pero sin limitarse a, gases, disoluciones, emulsiones y suspensiones, geles, espumas, pulverizaciones, nieblas, lociones, microesferas, partículas, micropartículas, nanopartículas, liposomas y similares.
Los agentes y/o las composiciones se administran de una manera compatible con la formulación de dosificación, y en una cantidad tal como para ser terapéuticamente eficaces, inmunogénicos y protectores. La cantidad que va a administrarse depende del sujeto que va a tratarse, incluyendo, por ejemplo, el tamaño de la infección y la capacidad del sistema inmunitario del individuo para sintetizar anticuerpos y/o para producir una respuesta inmunitaria mediada por células. Las cantidades precisas de principios activos que se requiere administrar dependen del criterio del profesional. Sin embargo, un experto en la técnica puede determinar fácilmente intervalos de dosificación adecuados y pueden ser del orden de microgramos a miligramos del/de los principio(s) activo(s) por dosis. La dosificación también puede depender de la vía de administración y puede variar según el tamaño del huésped.
Los agentes y/o las composiciones deben administrarse a un sujeto en una cantidad eficaz para estimular una respuesta inmunitaria protectora en el sujeto. La dosificación y regímenes de tratamiento específicos para cualquier sujeto particular pueden depender de una variedad de factores, incluyendo la actividad del compuesto específico empleado, la edad, peso corporal, estado de salud general, sexo, dieta, tiempo de administración, tasa de excreción, combinación de fármacos, la gravedad y transcurso de la infección, estado o síntomas, la disposición del sujeto con respecto a la enfermedad, estado o síntomas, método de administración, y el criterio del médico encargado. Las dosificaciones reales pueden determinarse fácilmente por un experto habitual en la técnica.
Las formulaciones de dosificación unitaria a modo de ejemplo son aquellas que contienen una dosis o unidad, o una fracción apropiada de las mismas, del componente administrado. Debe entenderse que, además de los componentes mencionados en el presente documento, las formulaciones de la presente divulgación pueden incluir otros agentes habitualmente usados por un experto habitual en la técnica.
En la actualidad, la vía de aerosol o pulverización nasal u oral (por ejemplo, mediante inhalación) se usa lo más habitualmente para administrar agentes terapéuticos directamente a los pulmones y al sistema respiratorio. Sin embargo, la invención abarca la administración de la composición farmacéutica de la invención para su uso mediante cualquier vía apropiada teniendo en cuenta avances probables en la ciencia de administración de fármacos.
En algunas realizaciones, las preparaciones para administración inhalada o en aerosol comprenden una pluralidad de partículas. En algunas realizaciones, tales preparaciones tienen un tamaño de partícula medio de 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12 o 13 micrómetros. En algunas realizaciones, las preparaciones para administración inhalada o en aerosol se formulan como un polvo seco. En algunas realizaciones, las preparaciones para administración inhalada o en aerosol se formulan como un polvo húmedo, por ejemplo mediante inclusión de un agente humectante. En algunas realizaciones, el agente humectante se selecciona del grupo que consiste en agua, solución salina u otro líquido de pH fisiológico.
En algunas realizaciones, las composiciones de la invención para su uso deben administrarse como gotas a la cavidad nasal o bucal. En algunas realizaciones, una dosis puede comprender una pluralidad de gotas (por ejemplo, 1-100, 1 50, 1-20, 1-10, 1-5, etc.).
Normalmente, en tratamientos convencionales administrados de manera sistémica, una dosificación terapéuticamente eficaz debe producir una concentración en suero de compuesto de desde aproximadamente 0,1 ng/ml hasta aproximadamente 50-100 μg/ml. Las composiciones farmacéuticas proporcionan normalmente una dosificación de desde aproximadamente 0,001 mg hasta aproximadamente 2000 mg de compuesto por kilogramo de peso corporal al día. Por ejemplo, las dosificaciones para su administración a un paciente humano pueden oscilar desde 1-10 μg/kg, 20-80 μg/kg, 5-50 μg/kg, 75-150 μg/kg, 100-500 μg/kg, 250-750 μg/kg, 500-1000 μg/kg, 1-10 mg/kg, 5-50 mg/kg, 25 75 mg/kg, 50-100 mg/kg, 100-250 mg/kg, 50-100 mg/kg, 250-500 mg/kg, 500-750 mg/kg, 750-1000 mg/kg, 1000-1500 mg/kg, 1500-2000 mg/kg, 5 mg/kg, 20 mg/kg, 50 mg/kg, 100 mg/kg, 500 mg/kg, 1000 mg/kg, 1500 mg/kg o 2000 mg/kg. Las formas de dosificación farmacéuticas unitarias se preparan para proporcionar desde aproximadamente 1 mg hasta aproximadamente 5000 mg, por ejemplo desde aproximadamente 100 hasta aproximadamente 2500 mg del compuesto o una combinación de componentes esenciales por forma de dosificación unitaria.
En general, una cantidad terapéuticamente eficaz de los presentes compuestos en forma de dosificación oscila habitualmente desde ligeramente menos de aproximadamente 0,025 mg/kg/día hasta aproximadamente 2,5 g/kg/día, preferiblemente de aproximadamente 0,1 mg/kg/día a aproximadamente 100 mg/kg/día del paciente o considerablemente más, dependiendo del compuesto usado, el estado o infección tratado y la vía de administración, aunque pueden contemplarse excepciones a este intervalo de dosificación mediante la presente divulgación. En una realización a modo de ejemplo, pueden administrarse composiciones antimicrobianas/antivirales para su uso según la presente invención por vía intranasal en cantidades que oscilan desde aproximadamente 0,5 mg/ml de disolución de dosificación hasta aproximadamente 50 mg/ml. En otra realización a modo de ejemplo, pueden administrarse composiciones antimicrobianas para su uso según la presente invención por vía intranasal en cantidades que oscilan desde aproximadamente 10 mg/ml hasta aproximadamente 30 mg/ml. La dosificación de la(s) composición/composiciones antimicrobiana(s) puede depender del tipo de infección que está tratándose, el compuesto particular usado, el agente terapéutico, y otros factores clínicos y estados del paciente. Debe entenderse que la presente divulgación tiene aplicación tanto para uso en seres humanos como veterinario.
Los agentes y/o las composiciones pueden administrarse en una o más dosis según se requiera para alcanzar el efecto deseado. Por tanto, los agentes y/o las composiciones pueden administrarse en 1, 2, 3, 4, 5 o más dosis. Además, las dosis pueden estar separadas por cualquier periodo de tiempo, por ejemplo horas, días, semanas, meses y años.
Los agentes y/o las composiciones pueden formularse como líquidos o polvos secos, o en forma de microesferas.
Los agentes y/o las composiciones pueden almacenarse a temperaturas de desde aproximadamente -100°C hasta aproximadamente 25°C, dependiendo de la duración de almacenamiento. Los agentes y/o las composiciones también pueden almacenarse en un estado liofilizado a diferentes temperaturas incluyendo temperatura ambiente. Los agentes y/o las composiciones pueden esterilizarse mediante medios convencionales conocidos por un experto habitual en la técnica. Tales medios incluyen, pero no se limitan a, filtración.
La cantidad de principio activo que puede combinarse con materiales portadores para producir una forma de dosificación individual puede variar dependiendo del huésped tratado y el modo de administración particular. En realizaciones, una preparación puede contener desde aproximadamente el 0,1 % hasta aproximadamente el 95 % de compuesto activo (p/p), desde aproximadamente el 20 % hasta aproximadamente el 80 % de compuesto activo, o desde cualquier porcentaje entre los mismos.
En realizaciones, el pH de la formulación puede ajustarse con ácidos, bases o tampones farmacéuticamente aceptables para potenciar la estabilidad del compuesto formulado o su forma de administración.
En realizaciones, los portadores farmacéuticos pueden estar en forma de una preparación líquida estéril, por ejemplo, como suspensión acuosa u oleaginosa estéril.
Entre los vehículos y disolventes aceptables que pueden emplearse se encuentran manitol, agua, disolución de Ringer y disolución isotónica de cloruro de sodio.
Además, convencionalmente se emplean aceites fijos estériles como disolvente o medio de suspensión. Con este fin, puede emplearse cualquier aceite fijo insípido incluyendo de mono a diglicéridos sintéticos. Los ácidos grasos, tales como ácido oleico y sus derivados de glicéridos, son útiles en la preparación de compuestos inyectables, al igual que los aceites naturales farmacéuticamente aceptables, tales como aceite de oliva o aceite de ricino, especialmente en sus versiones polioxietiladas. Estas disoluciones o suspensiones de aceite también pueden contener diluyente o dispersante de alcohol de cadena larga, o carboximetilcelulosa o agentes dispersantes similares que se usan habitualmente en la formulación de formas de dosificación farmacéuticamente aceptables tales como emulsiones y o suspensiones.
Otros tensioactivos habitualmente usados tales como TWEEN® o SPAN® y/u otros agentes emulsionantes similares o potenciadores de la biodisponibilidad que se usan habitualmente en la preparación de formas de dosificación farmacéuticamente aceptables sólidas, líquidas u otras, también pueden usarse con fines de formulación.
En realizaciones, los agentes y/o las composiciones pueden administrarse en un sistema de administración exosomal. Los exosomas son pequeñas vesículas de membrana que se liberan en el entorno extracelular durante la fusión de cuerpos multivesiculares con la membrana plasmática. Los exosomas se secretan mediante diversos tipos de células incluyendo células hematopoyéticas, células epiteliales normales e incluso algunas células tumorales. Se sabe que los exosomas portan MHC de clase I, diversas moléculas coestimulantes y algunas tetraspaninas. Recientes estudios han mostrado el potencial de usar exosomas nativos como estimulantes inmunológicos.
La divulgación también completa la administración de los agentes y/o las composiciones usando nanopartículas. Por ejemplo, los agentes y/o las composiciones proporcionados en el presente documento pueden contener nanopartículas que tienen al menos uno o más agentes unidos a las mismas, por ejemplo, unidos a la superficie de la nanopartícula. Una composición incluye normalmente muchas nanopartículas, teniendo cada nanopartícula al menos uno o más agentes unidos a la misma. Las nanopartículas pueden ser metales coloidales. Un metal coloidal incluye cualquier partícula de metal insoluble en agua o compuesto metálico dispersado en agua líquida. Normalmente, un metal coloidal es una suspensión de partículas de metal en disolución acuosa. Puede usarse cualquier metal que pueda producirse en forma coloidal, incluyendo oro, plata, cobre, níquel, aluminio, cinc, calcio, platino, paladio y hierro. En algunos casos, se usan nanopartículas de oro, por ejemplo, preparadas a partir de HAuCU. Las nanopartículas pueden tener cualquier forma y su tamaño puede oscilar desde aproximadamente 1 nm hasta aproximadamente 10 nm de tamaño, por ejemplo, de aproximadamente 2 nm a aproximadamente 8 nm, de aproximadamente 4 a aproximadamente 6 nm, o aproximadamente 5 nm de tamaño. Los expertos habituales en la técnica conocen métodos para producir nanopartículas de metal coloidales, incluyendo nanopartículas coloidales de oro a partir de HAuCU. Por ejemplo, los métodos descritos en el presente documento así como los descritos en otras partes (por ejemplo, publicaciones de patente estadounidense n.os 2001/005581; 2003/0118657; y 2003/0053983, que se incorporan en el presente documento como referencia) son una orientación útil para producir nanopartículas.
En algunos casos, una nanopartícula puede tener dos, tres, cuatro, cinco, seis o más agentes activos unidos a su superficie. Normalmente, se unen muchas moléculas de agentes activos a la superficie de la nanopartícula en muchas ubicaciones. Por consiguiente, cuando se describe que una nanopartícula tiene, por ejemplo, dos agentes activos unidos a la misma, la nanopartícula tiene dos agentes activos, teniendo cada uno su propia estructura molecular única, unidos a su superficie. En algunos casos, una molécula de un agente activo puede unirse a la nanopartícula mediante un único sitio de unión o mediante múltiples sitios de unión. Un agente activo puede unirse directa o indirectamente a la superficie de una nanopartícula. Por ejemplo, el agente activo puede unirse directamente a la superficie de una nanopartícula o indirectamente a través de un grupo de unión intermedio.
Puede usarse cualquier tipo de molécula como grupo de unión. Por ejemplo, un grupo de unión puede ser una cadena alifática que incluye al menos dos átomos de carbono (por ejemplo, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 o más átomos de carbono), y puede estar sustituido con uno o más grupos funcionales incluyendo cetona, éter, éster, amida, alcohol, amina, urea, tiourea, sulfóxido, sulfona, sulfonamida y disulfuro a funcionalidades. En casos en los que la nanopartícula incluye oro, un grupo de unión puede ser cualquier molécula que contiene tiol. La reacción de un grupo tiol con el oro da como resultado un enlace disulfuro covalente (-S-). El diseño y la síntesis de grupos de unión se conocen bien en la técnica.
En realizaciones, la nanopartícula está unida a un agente/resto de direccionamiento. Una funcionalidad de direccionamiento puede permitir acumular nanopartículas en la diana target (por ejemplo, membrana nasal) a concentraciones superiores a otros tejidos. En general, una molécula de direccionamiento puede ser un miembro de un par de unión que muestra afinidad y especificidad por un segundo miembro de un par de unión. Por ejemplo, un agente terapéutico de anticuerpo o fragmento de anticuerpo puede dirigir una nanopartícula a una región o molécula particular del organismo (por ejemplo, la región o molécula para la que es específico el anticuerpo) al tiempo que también realiza una función terapéutica. En algunos casos, un receptor o fragmento de receptor puede dirigir una nanopartícula a una región particular del organismo, por ejemplo, la ubicación del miembro de su pareja de unión. Otros agentes terapéuticos tales como moléculas pequeñas pueden dirigir de manera similar una nanopartícula a un receptor, proteína u otro sitio de unión que tiene afinidad por el agente terapéutico.
Cuando las composiciones de esta divulgación comprenden uno o más agentes terapéuticos o profilácticos adicionales, el agente terapéutico/de potenciación/de inmunoterapia y el agente adicional deben estar presentes a niveles de dosificación de entre aproximadamente el 0,1 y el 100 %, o entre aproximadamente el 5 y el 95 % de la dosificación normalmente administrada en un régimen de monoterapia. Los agentes adicionales pueden administrarse por separado, como parte de un régimen de múltiples dosis, de los agentes de esta divulgación. Alternativamente, estos agentes adicionales pueden formar parte de una forma de dosificación individual, mezclados junto con los agentes de esta divulgación en una única composición.
La administración de los agentes y/o las composiciones de la divulgación provoca una respuesta inmunitaria frente a un patógeno. Normalmente, la dosis puede ajustarse dentro de este intervalo basándose, por ejemplo, en la edad del sujeto, la salud y estado físico del sujeto, la capacidad del sistema inmunitario del sujeto para producir una respuesta inmunitaria, el peso corporal del sujeto, el sexo del sujeto, la dieta, tiempo de administración, el grado de protección deseado y otros factores clínicos. Los expertos en la técnica también pueden abordar fácilmente parámetros tales como semivida biológica, biodisponibilidad, vía de administración y toxicidad cuando se formulan los agentes y/o las composiciones de la divulgación.
Los siguientes ejemplos demuestran adicionalmente varias realizaciones de esta divulgación. Aunque los ejemplos ilustran la divulgación, no se pretende que la limiten.
Ejemplos
Se pretende que las estructuras, materiales, composiciones y métodos descritos en el presente documento sean ejemplos representativos de la divulgación y se entenderá que el alcance de la divulgación no está limitado por el alcance de los ejemplos.
Ejemplo 1: administración de composiciones antimicrobianas en sujetos no humanos para prevenir la infección
Se administran concentraciones variables de composiciones antimicrobianas que contienen componentes de la tabla<1>por vía intranasal a un grupo de ratones sanos, no infectados, seleccionados con respecto a su edad, sexo y peso. Después de un periodo de tiempo adecuado para permitir que las composiciones surtan efecto, se inoculan los ratones por vía nasal con dosis variables de patógenos respiratorios (virus influenza, rinovirus, bacterias y hongos). En diferentes puntos de tiempo posteriores, se extraen muestras de los ratones y se analizan para detectar infección microbiana. La ausencia de infección indica que la composición antimicrobiana previene que los patógenos aéreos infecten a los ratones. La composición antimicrobiana potencia las capacidades de filtrado de la membrana nasal y protege frente a los patógenos aéreos.
Ejemplo 2: administración de composiciones antimicrobianas en sujetos no humanos para tratar la infección
Se inocula por vía nasal a un grupo de ratones sanos, no infectados, seleccionados con respecto a su edad, sexo y peso, dosis variables de patógenos respiratorios (virus influenza, rinovirus, bacterias y hongos). Tras permitir un tiempo adecuado para que los patógenos infecten a los ratones, se administran concentraciones variables de composiciones antimicrobianas que contienen componentes de la tabla<1>(como en el ejemplo<1>) por vía intranasal a los ratones infectados. Después de un periodo de tiempo adecuado para permitir que las composiciones surtan efecto, se extraen muestras de los ratones y se analizan para detectar infección microbiana. La ausencia de infección indica que la composición antimicrobiana trata las infecciones respiratorias dentro de los ratones. La composición antimicrobiana potencia las capacidades de filtrado de la membrana nasal y trata la infección provocada por patógenos aéreos.
Ejemplo 3: administración de composiciones antimicrobianas en sujetos humanos para tratar la infección
Un grupo de sujetos humanos que acuden sin infecciones por virus influenza o rinovirus preexistentes se seleccionan para su tratamiento y se extrae sangre de nivel inicial para examinar para detectar marcadores de infección respiratoria. Se administran composiciones antimicrobianas que contienen componentes de la tabla 1 (como en los ejemplos 1 y 2) por vía intranasal a los sujetos. Después de un periodo de tiempo adecuado para permitir que las composiciones surtan efecto, se exponen los sujetos a rinovirus o virus influenza aéreos. Después de un periodo de tiempo adecuado para determinar si se han infectado, se les vuelve a extraer sangre y se examina para detectar marcadores sistémicos de infección respiratoria y se observan y se les pregunta por evidencias visibles de infección respiratoria. La ausencia de infección indica que la composición antimicrobiana previene las infecciones respiratorias. La composición antimicrobiana potencia las capacidades de filtrado de la membrana nasal y previene que los virus provoquen infección respiratoria.
Ejemplo 4: mediciones de composiciones en modelo celular en 3D completamente diferenciado de los epitelios de vías respiratorias humanas inoculados con rinovirus A16
Se sometieron a prueba diversas composiciones para determinar su capacidad para proteger un modelo en 3D de epitelio de vías respiratorias humanas, constituido por células epiteliales humanas primarias recién aisladas de biopsias nasal, traqueales o bronquiales (MucilAir™). MucilAir™ está compuesto por células basales, células ciliadas y células mucosas a partir de las vías respiratorias. La proporción de estos diversos tipos de células se conserva en comparación con lo que se observain vivo(Huanget al.,Drug Discovery and Development-Present and Future, 8, 201). Además, los epitelios se empiezan a partir de células desdiferenciadas. Se reconstituyeron los epitelios (MucilAir™-Pool) con una mezcla de células aisladas de 14 donantes nasales normales diferentes y se cultivaron durante 41 días. Se aislaron de manera reciente células epiteliales a partir de biopsias (nariz y bronquios), después se sembraron sobre una membrana semiporosa (Costar Transwell, tamaño de poro de 0,4 |im). Después de aproximadamente 45 días de cultivo en interfaz de aire-líquido, los epitelios estaban completamente diferenciados, tanto morfológica como funcionalmente. Después de 45 días de cultivo, los epitelios estaban completamente ciliados, secretaban mucosa y eran eléctricamente estancos (TEER>200 Ω cm2). Se conserva la actividad de los canales iónicos epiteliales principales, tales como CFTR, EnaC, Na/K ATPasa, y se muestra que los epitelios responden de una manera regulada y vectorial al estímulo proinflamatorio, TNF-a (Huanget al.,2011 y Huanget al.,3R-Info-Bulletin No. 41, octubre de 2009).
Se prepararon composiciones con diversos principios activos tal como se muestra en la tabla 5. Cada composición se preparó en una solución salina tamponada (NaCl al 0,9 %, CaCl<2>1,25 mM, HEPES 10 mM). Tal como se usa en el presente documento, “RVH1” se refiere a composiciones que comprenden apolactoferrina (es decir, RVH1-1, RVH1-2 y RVH1-3) como único principio activo, “RVH2” se refiere a composiciones que comprenden lisozima (es decir, RVH2-1, RVH2-2 y RVH2-3) como único principio activo, y la referencia a “RVH3” se refiere a composiciones que comprenden ICAM-1 soluble (sICAM) (es decir, RVH3-1, RVH3-2, y RVH2-3) como único principio activo. La referencia a “RVH4” se refiere a composiciones que comprenden una combinación de apolactoferrina, lisozima e ICAM-1 soluble.
Tabla 5
Se aplicaron 20 μl de cada formulación de manera apical sobre epitelios MucilAir™-Pool independientes inmediatamente antes de la inoculación (tiempo = 0) con rinovirus humano A16. También se aplicaron 20 μl de cada una de las formulaciones a las 3,5 y 24 horas tras la inoculación (“pi”). La inoculación con rinovirus humano A16 se logró mediante la aplicación de 50 μl de rinovirus humano A16 2x106/ml (cepa clínica: QCHRV.16) en el lado apical del modelo en 3D durante 3 h a 34°C, CO<2>al 5 %. Se produjeron las disoluciones madre de virus en cultivos MucilAir™ y se diluyeron en medio de cultivo sin purificación o concentración.
Tras la inoculación (tiempo = 0), se lavaron los epitelios dos veces con medio de cultivo MucilAir™ con el fin de limpiar el inóculo. Se recogieron lavados apicales libres de células (20 minutos) con 200 μl de medios de cultivo MucilAir™ a las 3,5 horas tras la inoculación y después a las 24 y 48 horas pi y se almacenaron a -80°C.
A partir de los lavados apicales, se extrajo ARN viral con el kit de ARN viral QIAamp® (Qiagen). Se cuantificó el ARN viral mediante RT-PCR cuantitativa (QuantiTect Probe RT-PCR, Qiagen) con el dispositivo TaqMan ABI 7000. Usando una concentración conocida del ARN viral correspondiente para establecer una curva patrón, la cuantificación fue absoluta. Los datos se presentan como número de copias de genoma/ml en los gráficos que ilustran los resultados de replicación viral, a menos que se indique lo contrario. Los experimentos y datos con una designación “(+)” se refieren a experimentos realizados con medios inoculados, y los experimentos y datos con una designación “(-)” se refieren a experimentos realizados con medios no inoculados con virus. Para comparar dos conjuntos de datos, se usó una prueba de la t de Student para datos independientes. Para comparar medias de tres o más muestras, se realizó un análisis de varianza de un factor (ANOVA) con pruebas de comparaciones de datos múltiples de Dunnett (***=p<0,001, **=p<0,01, *=p<0,05). Como control negativo, se usaron cultivos no infectados y no tratados (simulados).
Para comparar los posibles efectos de compuestos de RVH, se incluyeron controles positivos. Para determinar el efecto tóxico, se trataron cultivos con 20 μl de Triton X-100 al 10 % en una solución salina tamponada (NaCl al 0,9 %, CaCl<2>1,25 mM, HEPES 10 mM). Para determinar el efecto anti-rinovirus, se añadieron 20 μl de rupintrivir 5 μM a medio basal. Se diluyó disolución madre de rupintrivir (Santa Cruz Biotechnologies) de 2 mM en DMSO (-20°C) hasta 5 |iM en medio MucilAir™ (concentración final de DMSO al 0,25 %).
Las barras de error en cualquier figura se refieren al error estándar de la media (EEM). Todas las comparación son frente a los datos de vehículo infectado (sin principio activo) y todos los datos notificados son mediciones individuales en tres insertos independientes (n=3). Todos los resultados notificados son estadísticamente significativos.
Mediciones de TEER
Se monitorizó la integridad tisular usando mediciones de resistencia eléctrica transepitelial (“TEER”). TEER es un parámetro dinámico que refleja el estado de epitelios que puede verse afectado por varios factores. Por ejemplo, si estaban presentes orificios o si la unión celular estaba rota, los valores de TEER serán generalmente de menos de 100 Ω cm2. En cambio, cuando los epitelios no están dañados, los valores de TEER son normalmente de más de 200 Ω cm2. Una disminución notable de los valores de TEER (pero > 100 Ω cm2) refleja generalmente una activación de los canales iónicos. Un aumento drástico del valor de TEER refleja un bloqueo de la actividad de canales iónicos o una destrucción de las células ciliadas. Cuando un epitelio está dañado, una disminución de TEER estará asociada con un aumento de la liberación de LDH o una disminución de la viabilidad celular. Se realizó la monitorización de TEER 24 (D1) y 48 (D2) horas tras la inoculación. El control de Triton X-100 corresponde a una pérdida de TEER (< 100 Ω cm2) tras el daño celular. Tras la adición de200 μl demedio MucilAir™ al compartimento apical de los cultivos MucilAir™, se midió la resistencia con un multímetro EVOMX (World Precision Instruments UK, Stevenage) para cada condición. Se convirtieron los valores de resistencia medidos (Ω) en TEER (Ω.cm2) con la resistencia de membrana (100 Ω) conectada en serie al epitelio. El epitelio tiene un área de superficie total de 0,33 cm2. La TEER puede calcularse mediante la siguiente fórmula:
TEER ( Ω cm2) = (valor de resistencia (Ω) - 100 (Ω)) x 0,33 (cm2)
Los resultados de mediciones de TEER se encuentran en las figuras 1-4. Tal como puede observarse, no se observó ningún cambio significativo en la TEER a las 24 (D1) horas pi o a las 48 (D2) horas pi para ninguna de las formulaciones de prueba de RVH.
Liberación de lactato deshidrogenasa
La lactato deshidrogenasa (“LDH”) es una enzima citoplasmática estable que se libera rápidamente en el medio de cultivo tras la ruptura de la membrana plasmática. Se incubaron 100 μl de medio basolateral recogido en cada punto de tiempo con la mezcla de reacción del kit de detección de la citotoxicidad KitPLUS, siguiendo las instrucciones del fabricante (Sigma, Roche, 11644793001). Después se cuantificó la cantidad de la LDH liberada midiendo la absorbancia de cada muestra a 490 nm con un lector de microplacas. Para determinar el porcentaje de citotoxicidad, se compara la diferencia de la absorbancia experimental (Aexp) con respecto a un control bajo con la diferencia entre los valores de absorbancia del control bajo (Abajo) y alto (Auto), usando la siguiente ecuación:
Citotoxicidad (%) = (Aexp — Abajo) / (Aalto — Abajo)
Un porcentaje por debajo del 5 % refleja una liberación fisiológica de LDH en el medio. Se realizaron mediciones de LDH a las 24 y 48 horas pi. Los resultados se muestran en las figuras 5-8. Tal como puede observarse, las formulaciones de fármaco no aumentan la liberación de LDH en los modelos en 3D.
Frecuencia de batido ciliar
Se midió la frecuencia de batido ciliar (“CBF”) mediante un sistema experimental que consistía en tres partes: una cámara (Sony XCD V60 Firewire), una tarjeta de PCI y un paquete específico de software. Se captaron 256 imágenes a alta tasa de frecuencia (125 fps) a temperatura ambiente y después se calculó la frecuencia de batido ciliar usando el software Epithelix. Los valores de CBF pueden estar sujetos a fluctuaciones debido a parámetros tales como temperatura, viscosidad de la mucosa o líquido (tal como una solución salina tamponada) aplicado sobre la superficie apical del modelo epitelial en 3D MucilAir™. Por tanto, se considera que los resultados son significativos cuando se alcanzó una razón >20 % entre el control de vehículo infectado y la composición de fármaco. Las figuras 9-12 ilustran los resultados de las mediciones de frecuencia de batido ciliar realizadas a las 24 y 48 horas pi. Tal como puede observarse, los tratamientos para RVH no mostraron ningún efecto significativo sobre la frecuencia de batido ciliar.
Aclaramiento mucociliar
Se monitorizó el aclaramiento mucociliar (“MCC”) usando una cámara Sony XCD-U100CR cámara conectada a un microscopio Olympus BX51 con un objetivo de 5x. Se añadieron microperlas de poliestireno de 30 |im de diámetro (Sigma, 84135) sobre la superficie apical de MucilAir™. Se siguieron los movimientos de las microperlas mediante vídeo a 2 fotogramas por segundo durante 30 imágenes a temperatura ambiente. Se grabaron tres vídeos por inserto. Se calculó la velocidad de movimiento de perlas promedio (Ωm/s) con el software ImageProPlus 6.0. Los valores de aclaramiento mucociliar de menos de 10 μm/s se consideran patológicos. La figura 13 ilustra el efecto de la infección por rinovirus A16 sobre el MCC con tratamiento con cada uno de los principios activos solos y en combinación medido a las 48 horas pi. Tal como puede observarse, el tratamiento de combinación demostró una respuesta superior y sistemática a lo largo de las dosis sometidas a prueba, en comparación con las demás formulaciones de prueba. MCC se redujo para concentraciones inferiores de formulaciones de RVH1 y la formulación de RVH3-3. Sin embargo, estos efectos negativos no se observaron con las formulaciones de RVH4 a ninguna concentración. Sorprendentemente, aunque la apolactoferrina por sí sola inhibió el movimiento ciliar a algunas dosis (véase, por ejemplo, RVH1-1 y RVH1-2), el efecto se mejoró completamente en la combinación de RVH a cada dosis.
Replicación de rinovirus apical
A partir de los lavados apicales de 200 μl, se usaron 20 μl para la extracción de ARN viral con el kit de ARN viral QlAamp® (Qiagen) dando como resultado un volumen de elución de ARN de 60 μl. Se cuantificó el ARN viral mediante RT-PCR cuantitativa (QuantiTect Probe RT-PCR, Qiagen) usando 5 μl de ARN viral, Mastermix, dos cebadores específicos de familia dePicomavirídaey uno para todos losPicornaviridae,y una sonda dePicornaviridaecon colorantes de indicador-extintor de FAM-TAMRA. Se incluyeron cuatro diluciones de concentración conocida de rinovirus A16 así como controles para la extracción de ARN y RT-PCR y se aplicaron las placas en un dispositivo TaqMan ABI 7000 de Applied Biosystems. Se notificaron los datos de recuento (“Ct”) en la curva patrón, se corrigieron con las diluciones y se presentaron como número de copias de genoma/ml. Las figuras 14-16 y 17A, 17B y 17C ilustran los resultados de la replicación de rinovirus A16. Tal como puede observarse, rinovirus mostró una replicación significativa que se inhibió mediante rupintrivir. No se logró ningún cambio significativo en la replicación de rinovirus usando las formulaciones de RVH1 y RVH2. La aplicación de formulaciones de RVH3 da como resultado una relación de dosis-respuesta similar a la de rupintrivir. Las formulaciones de RVH4 muestran una respuesta dependiente de la dosis sobre la replicación de rinovirus A16 en mayor grado que el tratamiento con rupintrivir.
Ensayo de lectina ligado a enzimas
Se cuantificó la secreción de mucina usando un protocolo de ensayo de lectina ligado a enzimas (“ELLA”) que detecta los grupos de hidrato de carbono de la mucosa recogida. Se recubrieron placas de 96 pocillos con lectina<6>μg/ml deTriticum vulgaris(trigo) (Sigma, L0636) en disolución tamponada con fosfato (“PBS”) ajustada a pH 6 ,<8>y se incubaron durante 1 hora a 37°C. Después de etapas de lavado con solución salina tamponada con fosfato de alto contenido en sal (PBS) (NaCl 0,5 M, Tween-20 al 0,1 % en PBS), se incubaron muestras y patrones (mucina de estómago porcino tipo II, Sigma, M2378) durante 30 minutos a 37°C. Tras lavar, se incubaron las placas durante 30 minutos a 37°C con una disolución de detección que contenía 1 μg/ml de lectina conjugada con peroxidasa deGlycine Max(soja) (Sigma, L2650), en el 0,1 % de BSA-PBS ajustado a pH 7,4. Después de las etapas de lavado finales, se añadió un reactivo de sustrato (TMB) y se incubó durante 10 minutos en la oscuridad a temperatura ambiente. Se detuvo la reacción con H<2>SO<4>2 N y se leyeron las placas a 450 nm. Las figuras 18-21 ilustran la cantidad de mucina a partir del medio apical a las 24 y 48 horas. Tal como puede observarse, las formulaciones de prueba de RVH no mostraron ningún efecto significativo sobre la secreción de mucina.
Ejemplo 5: mediciones de composiciones en modelo celular en 3D completamente diferenciado de los epitelios de vías respiratorias humanas inoculados con virus influenza A H1N1
Se reconstituyeron epitelios (MucilAir™-Pool) con una mezcla de células aisladas de 14 donantes nasales normales diferentes y se cultivaron durante 41 días. Se prepararon composiciones con diversos principios activos tal como se muestra en la tabla<6>. Cada composición se preparó en una solución salina tamponada (NaCl al 0,9 %, CaCl<2>1,25 mM, HEPES 10 mM). Tal como se usa en el presente documento, “VIA1” se refiere a composiciones que comprenden apolactoferrina (es decir, VIA1-1, VIA1-2 y VIA1-3), la referencia a “VIA2” se refiere a composiciones que comprenden lisozima (es decir, VIA2-1, VIA2-2 y VIA2-3), y la referencia a “VIA3” se refiere a composiciones que comprenden ICAM-1 soluble (es decir, VIA3-1, VIA3-2 y VIA2-3). La referencia a “VIA4” se refiere a composiciones de ejemplo que comprenden una combinación de apolactoferrina, lisozima, 3'-sialilactosa y 6'-sialilactosa. Estas diversas formulaciones de prueba se muestran a continuación en la tabla 6.
Tabla 6
Se aplicaron 20 μl de cada formulación de manera apical sobre epitelios MucilAir™-Pool independientes inmediatamente antes de la inoculación con virus influenza A H1N1. También se aplicaron 20 μl de cada formulación a las 3,5 y 24 horas tras la inoculación. La inoculación con virus influenza A H1N1 (t = 0) se logró mediante la aplicación de 50 μl de H1N1 2x106/ml (cepa clínica: A/California/7/09) en el lado apical de tejido MucilAir™ durante 3 h a 34°C, CO<2>al 5 %. Se produjeron las disoluciones madre de virus en cultivos MucilAir™ y se diluyeron en medio de cultivo sin purificación o concentración. Se realizaron mediciones sobre TEER, liberación de LDH, CBF, MCC y secreción de mucina de una manera por lo demás idéntica a la descrita anteriormente, excepto porque se usó oseltamivir<10>|iM en lugar de rupintrivir para la formulación de efecto antiviral. Para el efecto antiviral, se añadió oseltamivir 10 |iM a medio basal. Se diluyó disolución madre de ácido de oseltamivir (Carbosynth) de 4 mM en DMSO (-20°C) hasta 10 |iM en medio basolateral MucilAir™ (concentración final de DMS al 0,25 %).
Mediciones de TEER
Las figuras 22-25 ilustran los resultados de mediciones de TEER con virus influenza A H1N1. Tal como puede observarse, el efecto citopático del virus influenza provocó una disminución de la medida de resistencia de TEER. Las formulaciones de prueba de VIA3 y VIA4 parecen limitar la disminución de TEER a las 48 horas (D2) pi, siendo la mitigación de la pérdida de resistencia la más pronunciada en formulaciones que comprenden concentraciones superiores de principios activos (es decir, VIA4-2 y VIA4-1).
Liberación de lactato deshidrogenasa
Las figuras 26-29 ilustran los resultados de la liberación de LDH a partir de las células epiteliales. Tal como puede observarse, no se observó ningún efecto citotóxico para ninguna de las formulaciones de VIA.
Frecuencia de batido ciliar
Las figuras 30-33 ilustran los efectos de los diversos tratamientos sobre la CBF de células epiteliales con infección por virus influenza H1N1. Tal como puede observarse, VIA4 no mostró ningún efecto significativo sobre CBF.
Aclaramiento mucociliar
La figura 34 ilustra los resultados sobre el aclaramiento mucociliartras el tratamiento con las formulaciones de prueba especificadas. Tal como puede observarse, las formulaciones de VIA no mostraron ningún efecto significativo sobre el aclaramiento mucociliar.
Replicación de virus influenza apical
A partir de los lavados apicales de 200 μl, se usaron 20 μl para la extracción de ARN viral con el kit de ARN viral QIAamp® (Qiagen) dando como resultado un volumen de elución de ARN de 60 μl. Se cuantificó el ARN viral mediante RT-PCR cuantitativa (QuantiTect Probe RT-PCR, Qiagen) usando 5 μl de ARN viral, Mastermix, dos cebadores específicos de virus influenza A y sonda de virus influenza A con colorantes de indicador-extintor de FAM-BHQ1. Se incluyeron cuatro diluciones de concentración conocida de H1N1 así como controles para la extracción de ARN y RT-PCR y se aplicaron las placas en un dispositivo TaqMan ABI 7000 de Applied Biosystems. Se notificaron los datos de Ct en la curva patrón, se corrigieron con las diluciones y se presentaron como número de copias de genoma/ml. Las figuras 35-38 ilustran los resultados de la replicación de virus influenza A H1N1 en presencia de la formulación de prueba especificada. Tal como puede observarse, influenza mostró una replicación significativa que se inhibió mediante oseltamivir. No se logró ningún cambio significativo en la replicación de virus influenza A H1N1 usando formulaciones de VIA.
Ensayo de lectina ligado a enzimas
Las figuras 39-42 ilustran la cantidad de mucina a partir del medio apical a las 24 (D1) y 48 (D2) horas pi. Tal como puede observarse, VIA4 mostró una respuesta dependiente de la dosis en la secreción de mucina.
Tal como se muestra mediante mediciones de TEER, la infección por H1N1 da como resultado una pérdida de integridad tisular sobre epitelios de vías respiratorias humanas dando como resultado la descomposición de la función de barrera de las vías respiratorias. Esto da como resultado una infección e inflamación adicionales. Una disminución de la TEER es el parámetro más temprano y más sensible afectado por la infección por H1N1. Las formulaciones de combinación de VIA3 y VIA4 dieron como resultado la mitigación parcial de esta descomposición de la integridad tisular. Adicionalmente, estas formulaciones evitaron cualquier efecto negativo sobre la CBF que se observó en las formulaciones de VIA1 y VIA2.
Ejemplo 6: mediciones de composiciones en modelo celular en 3D completamente diferenciado de los epitelios de vías respiratorias humanas inoculados con rinovirus A16
Se reconstituyeron epitelios (MucilAir™-Pool) con una mezcla de células aisladas de 14 donantes nasales normales diferentes y se cultivaron durante 41 días. Se prepararon composiciones con diversos principios activos tal como se muestra en la tabla 7. Cada composición se preparó en una solución salina tamponada (NaCl al 3,6 %, CaCh 5,00 mM, HEPES 40 mM). Tal como se usa en el presente documento, los nombres de composiciones pueden indicar cada principio activo (separado por signos “+”), en los que cada principio activo individual se designa mediante “R1”, “R2”, “R3” o “R4”. Tal como se usa en el presente documento, las designaciones “L” y “H” en los nombres de composiciones, cuando están presentes, se refieren a concentraciones inferiores y superiores del componente indicado, respectivamente, una en comparación con la otra (es decir, [R1L] < [R1H]). Por ejemplo, se pretende que la composición identificada como “R1L+R2H” indique que la composición tiene principio activo R1 (es decir, apolactoferrina) y principio activo R2 (es decir, lisozima) a las concentraciones indicadas. Tal como se usa en el presente documento, “R1” en un nombre de composición se refiere a composiciones que comprenden apolactoferrina (es decir, R1L, R1H, R1H+R2H, R1H+R2L, R1H+R3H, R1L+R2L+R3H, R1L+R2L+R4H), la referencia a “R2” se refiere a composiciones que comprenden lisozima (es decir, R2L, R2H, R1H+R2H, R1L+R2L, R1H+R2L, R1L+R2H, R2H+R3H), la referencia a “R3” se refiere a composiciones que comprenden ICAM-1 soluble disponible de RnD Biosystems (es decir, R3, R1H+R3, y R1L+R2L+R3), y la referencia a “R4” se refiere a composiciones que comprenden ICAM-1 soluble disponible de Planet Biotechnology (es decir, R4, R1H+R4, y R1L+R2L+R4). Estas diversas formulaciones de prueba se muestran a continuación en la tabla 7.
Tabla 7
Para comparar los posibles efectos de las composiciones, se incluyeron controles positivos. Para un control del efecto tóxico (“vehículo (+)”), se trataron cultivos de virus con Triton X-100 al 10 % en una solución salina tamponada (NaCl al 0,9 %, CaCl<2>1,25 mM, HEPES 0 mM). Para el control antiviral, se añadió rupintrivir 5 |iM (“Rup”) a medio basal y vehículo al lado apical. Se diluyó disolución madre de rupintrivir (Santa Cruz Biotechnologies) de 2 mM en DMSO (-20°C) hasta 5 |iM en medio MucilAir™ (concentración final de DMSO al 0,25 %).
Se aplicaron 20 μl de cada formulación de manera apical sobre epitelios MucilAir™-Pool independientes inmediatamente antes de la inoculación (tiempo = 0) con rinovirus humano A16. También se aplicaron 20 μl de cada una de las formulaciones a las 3,5 y 24 horas tras la inoculación (“pi”) tras el lavado apical del medio en cada punto de tiempo tal como se describe a continuación. La inoculación con rinovirus humano A16 se logró mediante la aplicación de 50 μl de rinovirus humano A16 2x106/ml (cepa clínica: QCHRV.16) en el lado apical del modelo en 3D durante 3 h a 34°C, CO<2>al 5 %. Se produjeron las disoluciones madre de virus en cultivos MucilAir™ y se diluyeron en medio de cultivo sin purificación o concentración.
Tras la inoculación (tiempo = 0), se lavaron los epitelios tres veces con medio de cultivo MucilAir™ con el fin de limpiar el inóculo. Este lavado elimina todas las partículas virales que no se han procesado por el tejido para evitar cualquier contaminación durante la cuantificación adicional de producción de virus activo (siguiente medición a las 24 horas). La eficiencia de lavado puede caracterizarse mediante la medición de copias de genoma a las 3,5 horas (véanse las figuras 43 y 44). Se recogieron lavados apicales libres de células (20 minutos) con 200 μl de medios de cultivo MucilAir™ a las 3,5 horas tras la inoculación y después a las 24 y 48 horas pi y se almacenaron a -80°C para mediciones adicionales.
Replicación de rinovirus apical
A partir de los lavados apicales de 200 μl, se usaron 20 μl para la extracción de ARN viral con el kit de ARN viral QIAamp® (Qiagen) dando como resultado un volumen de elución de ARN de 60 μl. Se cuantificó el ARN viral mediante RT-PCR cuantitativa (QuantiTect Probe RT-PCR, Qiagen) usando 5 μl de ARN viral, Mastermix (dos cebadores específicos de familia dePicomavirídaey uno para todos losPicornaviridae,y una sonda dePicornaviridaecon colorantes de indicador-extintor de FAM-TAMRA). Se incluyeron cuatro diluciones de concentración conocida de rinovirus A16 así como controles para la extracción de ARN y RT-PCR y se aplicaron las placas en un dispositivo TaqMan ABI 7000 de Applied Biosystems. Se notificaron los datos de Ct en la curva patrón, se corrigieron con las diluciones y se presentaron como número de copias de genoma/ml. Las figuras 43-46 ilustran los resultados de replicación de rinovirus A16 en presencia de la formulación de prueba especificada. La concentración cuantificada de la inoculación de rinovirus A16 fue de 3,73x106/ml (planificado, 2x10<6>/ml). Tal como puede observarse, rinovirus mostró una replicación significativa que se inhibió mediante rupintrivir.
A las 24 horas pi (“D1”), ICAM-1 soluble ha inhibido la replicación de virus RVH-A16. Sin embargo, este efecto de las composiciones con ICAM-1 soluble como único agente antiviral (formulación R3 o formulación R4) parece haber disminuido a las 48 horas (“D2”). Cuando se mezcla ICAM-1 soluble con apolactoferrina (formulación R1H+R3), lisozima (formulación R2H+R3), o apolactoferrina y lisozima (formulación R1L+R2L+R3), el efecto inhibidor persiste en D2.
Aclaramiento mucociliar (MCC)
Se monitorizó el aclaramiento mucociliar usando una cámara MAKO G030B (Allied Vision) conectada a un microscopio Leica DMIRE2 con un objetivo de 5x. Se añadieron microperlas de poliestireno de 30 |im de diámetro (Sigma, n.° de cat. 84135) sobre la superficie apical del medio MucilAir™. Se siguieron los movimientos de las microperlas mediante vídeo a 2 fotogramas por segundo durante 30 imágenes a 34°C. En las figuras 47A y 47B se muestra una colección representativa de imágenes. La figura 47A muestra imágenes representativas de la posición sometida a seguimiento (representada por cada línea) de las microperlas para vehículo (-). La figura 47B muestra imágenes representativas del análisis de seguimiento para la formulación R1L+R2L+R4. La barra de escala representa 100 |im. Se grabaron tres vídeos por inserto. Se calculó la velocidad de movimiento de perlas promedio (|im/s) para cada formulación con el software ImageProPlus 6.0. Los resultados para cada formulación se muestran en la figura 48. Tal como puede observarse, las formulaciones no proporcionan un cambio significativo en el aclaramiento mucociliar medido.
Liberación de lactato deshidrogenasa (LDH)
La lactato deshidrogenasa es una enzima citoplasmática estable que se libera rápidamente en el medio de cultivo tras la ruptura de la membrana plasmática. Se recogen 100 μl de medio basolateral a las 24 y 48 hora pi y se incuban con la mezcla de reacción del kit de detección de la citotoxicidad KitPLUS, siguiendo las instrucciones del fabricante (Sigma, Roche, 11644793001). Se cuantificó la cantidad de la LDH liberada usando la absorbancia de cada muestra a 490 nm con un lector de microplacas. El valor de control alto se obtuvo mediante tratamiento con Triton X-100 al 10 % 24 horas antes del ensayo y corresponde al 100 % de citotoxicidad. Los controles negativos (simulado (-) y vehículo (-)) corresponden a una liberación fisiológica de LDH en MucilAir™. La figura 49 ilustra los resultados de la liberación de LDH a partir de las células epiteliales. Tal como puede observarse, no se observó ningún efecto citotóxico para ninguna de las formulaciones.
Ejemplo 7: mediciones de composiciones en modelo celular en 3D completamente diferenciado de los epitelios de vías respiratorias humanas inoculados con virus influenza H1N1
Se reconstituyeron epitelios (MucilAir™-Pool) con una mezcla de células aisladas de 14 donantes nasales normales diferentes y se cultivaron durante 41 días. Se prepararon composiciones con diversos principios activos tal como se muestra en la tabla<8>. Cada composición se preparó en un vehículo de solución salina tamponada (NaCl al 3,6 %, CaCl<2>5,00 mM, HEPES 40 mM). Tal como se usa en el presente documento, los nombres de composiciones pueden indicar cada principio activo (separado por signos “+”), en los que cada principio activo individual se designa mediante “11”, “ I<2>”, “ I<3>” o “I<4>”. Por ejemplo, se pretende que la composición identificada como “I1 I2” indique que la composición tiene principio activo I1 (es decir, apolactoferrina) y principio activo I2 (es decir, lisozima) a las concentraciones indicadas. Tal como se usa en el presente documento, “I<1>” en un nombre de composición se refiere a composiciones que comprenden apolactoferrina (es decir, I1, I1 I2, I1 I3, I1 I2+I3, I1 I2+I4, I1 I2+I3+I4), la referencia a “ I2” y se refiere a composiciones que comprenden lisozima (es decir, I2, I1 I2, I2+I3, I1 I2+I3, I1 I2+I4, I1 I2+I3+I4), la referencia a “ I3” se refiere a composiciones que comprenden ácido siálicos (es decir, I3, I1+I3, I2+I3, I1 I2+I3, I1 I3+I4, I2+I3+I4, I3+I4 e I1 I2+I3+I4), y la referencia a “ I4” se refiere a composiciones que comprenden un inhibidor de neuraminidasa (es decir, I4, |2+I4, I3+I4, I1 I2+I4, I1 I3+I4, I2+I3+I4, I1 I2+I3+I4). Estas diversas formulaciones de prueba se muestran a continuación en la tabla 7.
Tabla<8>
Para comparar los posibles efectos de las composiciones, se incluyeron controles positivos. Para un control del efecto tóxico (“vehículo (+)”), se trataron cultivos de virus con Triton X-100 al 10 % en una solución salina tamponada (NaCl al 0,9 %, CaCl<2>1,25 mM, HEPES 10 mM). Para el control antiviral, se añadió oseltamivir 14 |iM (“Oselt”) a medio basal y vehículo al lado apical. Se diluyó disolución madre de ácido de oseltamivir (Carbosynth) e 4 mM en DMSO (-20°C) hasta 10 |iM en medio basolateral MucilAir™ (concentración final de DMSO al 0,25 %).
Se aplicaron 22 μl de cada formulación de manera apical sobre epitelios MucilAir™-Pool independientes inmediatamente antes de la inoculación (tiempo = 0) con virus influenza H1N1. También se aplicaron 22 μl de cada una de las formulaciones a las 3,5 y 24 horas tras la inoculación (“pi”) tras el lavado apical del medio en cada punto de tiempo tal como se describe a continuación. La inoculación con virus influenza H1N1 se logró mediante la aplicación de 50 μl de virus influenza H1N1 2x106/ml (cepa clínica: A/California/7/09) en el lado apical del modelo en 3D durante 45 minutos a 34°C, CO<2>al 5 %. Se produjeron las disoluciones madre de virus en cultivos MucilAir™ y se diluyeron en medio de cultivo sin purificación o concentración.
Tras la inoculación (tiempo = 0), se lavaron los epitelios tres veces con medio de cultivo MucilAir™ con el fin de limpiar el inóculo. Este lavado elimina todas las partículas virales que no se han procesado por el tejido para evitar cualquier contaminación durante la cuantificación adicional de producción de virus activo (siguiente medición a las 24 horas). La eficiencia de lavado puede caracterizarse mediante la medición de copias de genoma a las 3,5 horas (véanse las figuras 43 y 44). Se recogieron lavados apicales libres de células (20 minutos) con 200 μl de medios de cultivo MucilAir™ a las 3,5 horas tras la inoculación y después a las 24 y 48 horas pi y se almacenaron a -80°C para mediciones adicionales.
Replicación de virus influenza apical
A partir de los lavados apicales de 200 μl, se usaron 20 μl para la extracción de ARN viral con el kit de ARN viral QIAamp® (Qiagen) dando como resultado un volumen de elución de ARN de 60 μl. Se cuantificó el ARN viral mediante RT-PCR cuantitativa (QuantiTect Probe RT-PCR, Qiagen). Se incluyeron cuatro diluciones de concentración conocida de H1N1 así como controles para la extracción de ARN y RT-PCR y se aplicaron las placas en un sistema de detección mediante PCR Chromo4 de Bio-Rad. Se notificaron los datos de Ct en la curva patrón, se corrigieron con las diluciones y se presentaron como número de copias de genoma/ml. La concentración cuantificada de la inoculación de rinovirus A16 fue de 7,93x105/ml (planificado, 2x10<6>/ml). La figura 50 ilustra la replicación de virus influenza H1N1 en presencia de la formulación de prueba especificada tal como se mide a partir de los lavados apicales. La figura 51 ilustra la replicación de virus influenza H1N1 en presencia de la formulación de prueba especificada tal como se mide a partir del medio basal. En las figuras 50 y 51, se muestra la significación estadística en relación con la medición de vehículo (+) en el punto de tiempo especificado. La concentración cuantificada de la inoculación de rinovirus A16 fue de 3,73x106/ml (planificado, 2 x 10<6>/ml).
Tal como puede observarse en la figura 50, las formulaciones de I1 I2 (apolactoferrina y lisozima), I1 I2+I3 (apolactoferrina, lisozima y ácido siálicos) e I1 I2+I3+I4 (apolactoferrina, lisozima, ácido siálicos e isoquercetina) inhiben estadísticamente la replicación de H1N1. Además, estos efectos inhibidores no están presentes en las formulaciones que comprenden cada componente individual por sí solo. Sin embargo, debido únicamente al título muy alto de H1N1 en los cultivos MucilAir™, este efecto inhibidor de las formulaciones se mitiga en D2. En la figura 51, el medio basal que tiene una liberación de H1N1 retrasada, se observan efectos inhibidores similares de estas formulaciones.
Mediciones de TEER
La figura 52 ilustra los resultados de mediciones de TEER con virus influenza A H1N1 y las formulaciones especificadas. Tal como puede observarse, el efecto citopático del virus influenza no parece provocar una disminución de TEER, posiblemente debido a la duración de inoculación. Sin embargo, las formulaciones que comprenden I4 (isoquercetina) muestran una ligera reducción de la resistencia en comparación con vehículo (+) en D2.
Liberación de lactato deshidrogenasa (LDH)
La figura 53 ilustra los resultados de la liberación de LDH a partir de las células epiteliales expuestas a virus influenza H1N1 y la formulación especificada. Tal como puede observarse, la reducción de TEER para varias formulaciones con isoquercetina se correlaciona con un aumento del efecto citotóxico en D2. Sin embargo, la formulación de combinación I1 I2+I3+I4 (apolactoferrina, lisozima, ácido siálicos, isoquercetina), previene el aumento inducido por H1N1 de la citotoxicidad más allá del límite umbral del 5 %. Este efecto no se observa en las otras formulaciones que comprenden isoquercetina.

Claims (9)

  1. REIVINDICACIONES
    i. Una composición farmacéutica para su uso en la profilaxis y/o el tratamiento de infección por rinovirus humano o infección por virus influenza humano, en la que dicha composición debe aplicarse a la mucosa nasal y/u oral, y composición que comprende un portador farmacéuticamente aceptable y
    (i) lactoferrina e ICAM-1 soluble;
    (ii) lisozima e ICAM-1 soluble;
    (iii) lactoferrina, lisozima e ICAM-1 soluble;
    (iv) lactoferrina y lisozima;
    (v) lactoferrina, lisozima y ácido siálico; o
    (vi) lactoferrina, lisozima, ácido siálico e isoquercetina.
  2. 2. La composición farmacéutica para su uso según la reivindicación 1, que comprende lactoferrina y lisozima.
  3. 3. La composición farmacéutica para su uso según la reivindicación 1 o 2, que comprende además
    (i) uno o más de peróxido de cinc, cobre y plata;
    (ii) carragenanos;
    (iii) uno o más componentes seleccionados del grupo que consiste en extracto de malvavisco, extracto de caléndula, extracto de piel de cítricos, extracto de miel, extracto de romero, extracto de mirra, extracto deHelichrysum,extracto de arruruz, aceite de neem, vitamina C, vitamina E y extracto de semilla de pomelo; o (iv) extracto de piel de cítricos.
  4. 4. La composición farmacéutica para su uso según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en la que dicha composición está en forma de una pulverización nasal, gotas nasales, pulverización bucal, enjuague bucal o pastilla para chupar.
  5. 5. La composición farmacéutica para su uso según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, uso que es en la profilaxis y/o el tratamiento de infección por rinovirus humano, en la que la mucosa nasal y/u oral tiene rinovirus humano en contacto con la misma.
  6. 6. La composición farmacéutica para su uso según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, uso que es en la profilaxis y/o el tratamiento de infección por virus influenza humano, en la que la mucosa nasal y/u oral tiene virus influenza humano en contacto con la misma.
  7. 7. La composición farmacéutica para su uso según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a<6>, que comprende lactoferrina desde aproximadamente 0,5-5000 μg/ml y lisozima desde aproximadamente 0,5-5000 μg/ml.
  8. 8. La composición farmacéutica para su uso según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a<6>, que comprende desde aproximadamente el 0,0025 % hasta aproximadamente el 0,25 % en peso de lisozima y desde aproximadamente el 0,00005 % hasta aproximadamente el 0,1 % en peso de lactoferrina.
  9. 9. La composición farmacéutica para su uso según la reivindicación 4, en la que dicho portador proporciona un tiempo de residencia de la composición sobre la mucosa nasal y/u oral de al menos<1>minuto.
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