RU2548803C2 - ФАРМАЦЕВТИЧЕСКАЯ КОМПОЗИЦИЯ ДЛЯ ЛЕЧЕНИЯ ГЛАЗНЫХ ИНФЕКЦИЙ P. Aeruginosa, СОДЕРЖАЩАЯ РЕКОМБИНАНТНЫЙ ЛИЗОЦИМ - Google Patents
ФАРМАЦЕВТИЧЕСКАЯ КОМПОЗИЦИЯ ДЛЯ ЛЕЧЕНИЯ ГЛАЗНЫХ ИНФЕКЦИЙ P. Aeruginosa, СОДЕРЖАЩАЯ РЕКОМБИНАНТНЫЙ ЛИЗОЦИМ Download PDFInfo
- Publication number
- RU2548803C2 RU2548803C2 RU2011148108/10A RU2011148108A RU2548803C2 RU 2548803 C2 RU2548803 C2 RU 2548803C2 RU 2011148108/10 A RU2011148108/10 A RU 2011148108/10A RU 2011148108 A RU2011148108 A RU 2011148108A RU 2548803 C2 RU2548803 C2 RU 2548803C2
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- lysozyme
- pharmaceutical composition
- rabbits
- aeruginosa
- eye
- Prior art date
Links
- 235000010335 lysozyme Nutrition 0.000 title claims abstract description 31
- 108010062010 N-Acetylmuramoyl-L-alanine Amidase Proteins 0.000 title claims abstract description 30
- 108010014251 Muramidase Proteins 0.000 title claims abstract description 28
- 102000016943 Muramidase Human genes 0.000 title claims abstract description 25
- 229960000274 lysozyme Drugs 0.000 title claims abstract description 25
- 239000004325 lysozyme Substances 0.000 title claims abstract description 25
- 239000008194 pharmaceutical composition Substances 0.000 title claims abstract description 19
- 208000001860 Eye Infections Diseases 0.000 title claims description 6
- 208000011323 eye infectious disease Diseases 0.000 title claims description 6
- 241001515965 unidentified phage Species 0.000 claims abstract description 16
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 10
- 241000589517 Pseudomonas aeruginosa Species 0.000 claims abstract description 8
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 6
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 5
- 239000004615 ingredient Substances 0.000 claims 1
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 abstract description 18
- 239000003814 drug Substances 0.000 abstract description 7
- 230000000694 effects Effects 0.000 abstract description 6
- 239000000203 mixture Substances 0.000 abstract description 3
- 239000000126 substance Substances 0.000 abstract description 2
- 229940071106 ethylenediaminetetraacetate Drugs 0.000 abstract 2
- 230000009474 immediate action Effects 0.000 abstract 1
- 231100000957 no side effect Toxicity 0.000 abstract 1
- 241000283973 Oryctolagus cuniculus Species 0.000 description 34
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 9
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 9
- 241000589516 Pseudomonas Species 0.000 description 8
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 8
- 230000002101 lytic effect Effects 0.000 description 8
- 239000003242 anti bacterial agent Substances 0.000 description 7
- 230000003115 biocidal effect Effects 0.000 description 7
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 6
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 6
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 6
- 238000011161 development Methods 0.000 description 6
- 229940088598 enzyme Drugs 0.000 description 6
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 6
- 208000009344 Penetrating Wounds Diseases 0.000 description 5
- 229940088710 antibiotic agent Drugs 0.000 description 5
- 210000004087 cornea Anatomy 0.000 description 5
- 210000000416 exudates and transudate Anatomy 0.000 description 5
- 101710132698 Lysozyme 3 Proteins 0.000 description 4
- 230000009471 action Effects 0.000 description 4
- 210000002159 anterior chamber Anatomy 0.000 description 4
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 4
- 210000002421 cell wall Anatomy 0.000 description 4
- 230000004054 inflammatory process Effects 0.000 description 4
- 230000000144 pharmacologic effect Effects 0.000 description 4
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 4
- 210000005253 yeast cell Anatomy 0.000 description 4
- FHVDTGUDJYJELY-UHFFFAOYSA-N 6-{[2-carboxy-4,5-dihydroxy-6-(phosphanyloxy)oxan-3-yl]oxy}-4,5-dihydroxy-3-phosphanyloxane-2-carboxylic acid Chemical compound O1C(C(O)=O)C(P)C(O)C(O)C1OC1C(C(O)=O)OC(OP)C(O)C1O FHVDTGUDJYJELY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 208000027418 Wounds and injury Diseases 0.000 description 3
- 229940072056 alginate Drugs 0.000 description 3
- 229920000615 alginic acid Polymers 0.000 description 3
- 235000010443 alginic acid Nutrition 0.000 description 3
- 230000000844 anti-bacterial effect Effects 0.000 description 3
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 3
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 3
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 3
- 239000006166 lysate Substances 0.000 description 3
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 description 3
- 238000000034 method Methods 0.000 description 3
- 230000002906 microbiologic effect Effects 0.000 description 3
- 230000001717 pathogenic effect Effects 0.000 description 3
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 3
- 238000001356 surgical procedure Methods 0.000 description 3
- 210000002229 urogenital system Anatomy 0.000 description 3
- 208000031729 Bacteremia Diseases 0.000 description 2
- HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N Chloroform Chemical compound ClC(Cl)Cl HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 208000035473 Communicable disease Diseases 0.000 description 2
- 206010051625 Conjunctival hyperaemia Diseases 0.000 description 2
- 241000235058 Komagataella pastoris Species 0.000 description 2
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 2
- OVRNDRQMDRJTHS-UHFFFAOYSA-N N-acelyl-D-glucosamine Natural products CC(=O)NC1C(O)OC(CO)C(O)C1O OVRNDRQMDRJTHS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- MNLRQHMNZILYPY-MDMHTWEWSA-N N-acetyl-alpha-D-muramic acid Chemical compound OC(=O)[C@@H](C)O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@H](O)[C@@H]1NC(C)=O MNLRQHMNZILYPY-MDMHTWEWSA-N 0.000 description 2
- MBLBDJOUHNCFQT-LXGUWJNJSA-N N-acetylglucosamine Natural products CC(=O)N[C@@H](C=O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O)CO MBLBDJOUHNCFQT-LXGUWJNJSA-N 0.000 description 2
- 241000191963 Staphylococcus epidermidis Species 0.000 description 2
- 241000193996 Streptococcus pyogenes Species 0.000 description 2
- 206010052428 Wound Diseases 0.000 description 2
- 230000002924 anti-infective effect Effects 0.000 description 2
- 229960005475 antiinfective agent Drugs 0.000 description 2
- 239000004599 antimicrobial Substances 0.000 description 2
- 244000052616 bacterial pathogen Species 0.000 description 2
- 210000000795 conjunctiva Anatomy 0.000 description 2
- 239000012531 culture fluid Substances 0.000 description 2
- 230000009089 cytolysis Effects 0.000 description 2
- 231100000676 disease causative agent Toxicity 0.000 description 2
- 239000003937 drug carrier Substances 0.000 description 2
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 2
- 244000000010 microbial pathogen Species 0.000 description 2
- 210000004400 mucous membrane Anatomy 0.000 description 2
- 229950006780 n-acetylglucosamine Drugs 0.000 description 2
- 210000001331 nose Anatomy 0.000 description 2
- 230000035515 penetration Effects 0.000 description 2
- 210000003800 pharynx Anatomy 0.000 description 2
- 230000002265 prevention Effects 0.000 description 2
- 230000008569 process Effects 0.000 description 2
- 239000000047 product Substances 0.000 description 2
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 2
- 206010002091 Anaesthesia Diseases 0.000 description 1
- 102000044503 Antimicrobial Peptides Human genes 0.000 description 1
- 108700042778 Antimicrobial Peptides Proteins 0.000 description 1
- 241000193738 Bacillus anthracis Species 0.000 description 1
- 208000035143 Bacterial infection Diseases 0.000 description 1
- 206010051548 Burn infection Diseases 0.000 description 1
- 241000700112 Chinchilla Species 0.000 description 1
- 206010011033 Corneal oedema Diseases 0.000 description 1
- 206010011409 Cross infection Diseases 0.000 description 1
- 206010059866 Drug resistance Diseases 0.000 description 1
- 241000194032 Enterococcus faecalis Species 0.000 description 1
- 229920002444 Exopolysaccharide Polymers 0.000 description 1
- 101150094690 GAL1 gene Proteins 0.000 description 1
- 102100028501 Galanin peptides Human genes 0.000 description 1
- 208000008745 Healthcare-Associated Pneumonia Diseases 0.000 description 1
- 101100121078 Homo sapiens GAL gene Proteins 0.000 description 1
- 102000004157 Hydrolases Human genes 0.000 description 1
- 108090000604 Hydrolases Proteins 0.000 description 1
- 206010020565 Hyperaemia Diseases 0.000 description 1
- GSDSWSVVBLHKDQ-JTQLQIEISA-N Levofloxacin Chemical compound C([C@@H](N1C2=C(C(C(C(O)=O)=C1)=O)C=C1F)C)OC2=C1N1CCN(C)CC1 GSDSWSVVBLHKDQ-JTQLQIEISA-N 0.000 description 1
- RJQXTJLFIWVMTO-TYNCELHUSA-N Methicillin Chemical compound COC1=CC=CC(OC)=C1C(=O)N[C@@H]1C(=O)N2[C@@H](C(O)=O)C(C)(C)S[C@@H]21 RJQXTJLFIWVMTO-TYNCELHUSA-N 0.000 description 1
- MSFSPUZXLOGKHJ-UHFFFAOYSA-N Muraminsaeure Natural products OC(=O)C(C)OC1C(N)C(O)OC(CO)C1O MSFSPUZXLOGKHJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 1
- OVRNDRQMDRJTHS-FMDGEEDCSA-N N-acetyl-beta-D-glucosamine Chemical compound CC(=O)N[C@H]1[C@H](O)O[C@H](CO)[C@@H](O)[C@@H]1O OVRNDRQMDRJTHS-FMDGEEDCSA-N 0.000 description 1
- 206010030113 Oedema Diseases 0.000 description 1
- 108010013639 Peptidoglycan Proteins 0.000 description 1
- 206010035664 Pneumonia Diseases 0.000 description 1
- 244000071131 Salix caprea Species 0.000 description 1
- 206010040047 Sepsis Diseases 0.000 description 1
- 241000191940 Staphylococcus Species 0.000 description 1
- 241000201854 Staphylococcus chromogenes Species 0.000 description 1
- 241000192087 Staphylococcus hominis Species 0.000 description 1
- 241000239110 Staphylococcus virus K Species 0.000 description 1
- 201000005010 Streptococcus pneumonia Diseases 0.000 description 1
- 241000193998 Streptococcus pneumoniae Species 0.000 description 1
- 241001505901 Streptococcus sp. 'group A' Species 0.000 description 1
- 206010048038 Wound infection Diseases 0.000 description 1
- 230000001154 acute effect Effects 0.000 description 1
- 230000037005 anaesthesia Effects 0.000 description 1
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 1
- 229940065181 bacillus anthracis Drugs 0.000 description 1
- 208000022362 bacterial infectious disease Diseases 0.000 description 1
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 1
- 230000032770 biofilm formation Effects 0.000 description 1
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 1
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 1
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 1
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 1
- 201000004778 corneal edema Diseases 0.000 description 1
- 238000002316 cosmetic surgery Methods 0.000 description 1
- 239000006071 cream Substances 0.000 description 1
- 230000006378 damage Effects 0.000 description 1
- 230000034994 death Effects 0.000 description 1
- 239000003085 diluting agent Substances 0.000 description 1
- 125000000600 disaccharide group Chemical group 0.000 description 1
- 230000008034 disappearance Effects 0.000 description 1
- 239000012153 distilled water Substances 0.000 description 1
- 210000005069 ears Anatomy 0.000 description 1
- 239000000839 emulsion Substances 0.000 description 1
- 229940032049 enterococcus faecalis Drugs 0.000 description 1
- 210000000744 eyelid Anatomy 0.000 description 1
- 239000012467 final product Substances 0.000 description 1
- 230000004927 fusion Effects 0.000 description 1
- 229930182830 galactose Natural products 0.000 description 1
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 1
- 150000004676 glycans Chemical class 0.000 description 1
- 108010037896 heparin-binding hemagglutinin Proteins 0.000 description 1
- 229920000140 heteropolymer Polymers 0.000 description 1
- 230000006872 improvement Effects 0.000 description 1
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 1
- 230000002458 infectious effect Effects 0.000 description 1
- 208000014674 injury Diseases 0.000 description 1
- 230000002262 irrigation Effects 0.000 description 1
- 238000003973 irrigation Methods 0.000 description 1
- 230000003902 lesion Effects 0.000 description 1
- 229960003376 levofloxacin Drugs 0.000 description 1
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 1
- 238000009630 liquid culture Methods 0.000 description 1
- 230000007774 longterm Effects 0.000 description 1
- KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N lysine Chemical compound NCCCCC(N)C(O)=O KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 235000018977 lysine Nutrition 0.000 description 1
- 150000002669 lysines Chemical class 0.000 description 1
- 238000012423 maintenance Methods 0.000 description 1
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 1
- 230000010534 mechanism of action Effects 0.000 description 1
- 229960003085 meticillin Drugs 0.000 description 1
- 230000000813 microbial effect Effects 0.000 description 1
- 244000005700 microbiome Species 0.000 description 1
- 244000005706 microflora Species 0.000 description 1
- 230000036457 multidrug resistance Effects 0.000 description 1
- 239000002547 new drug Substances 0.000 description 1
- 239000003921 oil Substances 0.000 description 1
- 239000006072 paste Substances 0.000 description 1
- 244000052769 pathogen Species 0.000 description 1
- 230000007170 pathology Effects 0.000 description 1
- 230000037361 pathway Effects 0.000 description 1
- 239000000546 pharmaceutical excipient Substances 0.000 description 1
- 239000008363 phosphate buffer Substances 0.000 description 1
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 1
- 229920001282 polysaccharide Polymers 0.000 description 1
- 239000005017 polysaccharide Substances 0.000 description 1
- 230000008092 positive effect Effects 0.000 description 1
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 1
- 238000002278 reconstructive surgery Methods 0.000 description 1
- 238000011160 research Methods 0.000 description 1
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 1
- 239000007921 spray Substances 0.000 description 1
- 238000003860 storage Methods 0.000 description 1
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 1
- 230000008961 swelling Effects 0.000 description 1
- 208000024891 symptom Diseases 0.000 description 1
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 1
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 1
- 238000005303 weighing Methods 0.000 description 1
Landscapes
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
- Medicinal Preparation (AREA)
Abstract
Изобретение относится к области биотехнологии и медицины и касается фармацевтической композиции. Представленная композиция содержит рекомбинантный лизоцим бактериофага FMV Р. аeruginosa, ЭДТА и TrisHCl при следующем соотношении ингредиентов, мас.%:
Охарактеризованное изобретение может быть использовано для лечения инфекций, вызываемых Рseudomonas aeruginosa, и обладает быстрым действием и отсутствием побочных эффектов. 4 табл., 1 пр.
Description
Область техники, к которой относится изобретение
Изобретение относится к биотехнологии и медицине и касается разработки новых антимикробных препаратов, основанных на рекомбинантных лизоцимах бактериофагов, эффективных в отношении множественно устойчивых к антибиотикам штаммов микроорганизмов, в частности, изобретение касается фармацевтической композиции на основе рекомбинантного лизоцима бактериофага FMV P. Aeruginosa.
Уровень техники
Многолетнее использование антибиотиков привело к тому, что многие патогенные микроорганизмы приобрели множественную лекарственную устойчивость. Разработка нового антибиотика и его клинические испытания занимают многие годы, а их клиническое использование часто приводит к формированию бактерий, устойчивых к вновь синтезированным антибиотикам.
Проблема лекарственной устойчивости является острой для бактерий Pseudomonas aeruginosa, одним из основных возбудителей гнойно-воспалительных процессов, особенно в условиях стационара. Р. aeruginosa распространена повсеместно, существенное значение в циркуляции возбудителя имеет вода, в которой он может выживать до года (при 37°С), в том числе во многих растворах, применяемых в медицине (например, жидкость для хранения контактных линз). Р. aeruginosa является одним из основных возбудителей нозокомиальных пневмоний, поражений мочеполовой системы у урологических больных, раневых и ожоговых инфекций, вызывает 20-25% гнойных хирургических инфекций и первичных грамотрицательных бактериемий. Для заболеваний, вызываемых Pseudomonas aeruginosa, характерна чрезвычайно высокая устойчивость к действию антибиотиков в связи с множественной резистентностью, передаваемой R-плазмидами, и связанное с этим тяжелое течение заболеваний [Поздеев О.К. Медицинская микробиология / под редакцией В.И.Покровского. Москва: ГЭОТАР-МЕД, 2002, с.230].
Бактерии Pseudomonas aeruginosa способны к формированию биопленки, которая при некоторых инфекциях инкапсулируется в альгинатный матрикс. Известно, что бактерии, способные образовывать бактериальные колонии в форме биопленки, более устойчивы к лечению антибиотиками, чем в жидких культурах [Davies D. Understanding biofilm resistance to antibacterial agents. Nat. Rev. Drug Discov., 2003, v. 2, p.114-122]. Предполагают, что антибиотикоустойчивость бактерий в биопленках связана, в частности, с задержкой или ограниченным проникновением антимикробных агентов через экзополисахаридный матрикс биопленки. Лечение антибиотиками, в особенности в субингибирующих концентрациях, может способствовать образованию биопленок [Rachid S. et.al. Effect of subinhibitory antibiotic concentrations on polysaccharide intercellular adhesin expression in biofilm-forming S. epidermidis. Antimicrob. Agents Chemother., 2000, v. 44, p.3357-63; Otto M. Bacterial evasion of antimicrobial peptides by biofilm formation. Curr. Top Microbiol. Immunol., 2006, v. 306, p.251-258].
Таким образом, актуальной проблемой в успешном лечении заболеваний, вызываемых Pseudomonas aeruginosa, явлется поиск и создание препаратов на основе соединений, способных деградировать альгинатную пленку.
Относительно новый подход к терапии бактериальных инфекций состоит в использовании кодируемых фаговым геномом продуктов, обладающих бактерицидным действием [Fishetti V.A. Bacteriophage lytic enzymes:novel anti-infectives. TRENDS in Microbiology, 2005, v.l3, 491-496]. Повышенный интерес к использованию фаговых лизоцимов, ферментов класса гидролаз, способных расщеплять гликозидные связи в молекулах бактериальных пептидогликанов (представляющих гетерополимеры, состоящие из повторяющихся дисахаридных групп - N-ацетилглюкозамина и N-ацетилмурамовой кислоты, соединенных через р-гликозидные связи) и вызывать тем самым разрушение клеточных стенок и гибель бактерий, связан с увеличившимся распространением штаммов патогенных грамотрицательных бактерий, обладающих множественной устойчивостью к антибиотикам.
Фаги, развивающиеся по литическому пути, синтезируют литические ферменты (эндолизины или лизоцимы), разрушающие клеточную стенку. Расщепление бактериальной клеточной стенки необходимо для освобождения фагового потомства. Литические ферменты бактериофагов объединяют под общим термином пептидогликановые гидролазы, хотя химический механизм их действия может быть различен в зависимости от того, какой именно тип связи в мукополимере клеточной стенки они разрывают (в частности, лизоцим гидролизует пептидогликан, расщепляя гликозидные связи между N-ацетилглюкозамином и N-ацетилмурамовой кислотой). Более того, даже сходные по механизму действия литические ферменты разных видов фагов могут обладать разными физико-химическими свойствами, что может иметь критическое значение при изготовлении конечного продукта - лекарственного препарата (например, повышенную температурную устойчивость при хранении). Главное преимущество фаговых эндолизинов по сравнению с антибиотиками состоит в специфичности их действия в отношении патогенных бактерий и сохранении нормальной микрофлоры. Накопленные к настоящему времени немногочисленные экспериментальные данные свидетельствуют о том, что среди бактерий-мишеней не возникает устойчивость к лизинам фагов.
Эндолизины могут быть изолированы и частично очищены из культуральной жидкости лизатов бактерий, инфицированных соответствующими бактериофагами. Однако метод прямого получения белков из лизатов бактерий неудобен, прежде всего, из-за низкого титра фага и, как следствие, низкой концентрация эндолизинов в лизате. Низкое удельное содержание целевого белка делает трудновыполнимым, если не невозможным его очистку от продуктов фагового лизиса. По этой причине, единственным способом наработки очищенных эндолизинов бактериофагов является их микробиологический синтез.
Для очищенных фаговых лизоцимов была продемонстрирована литическая активность в отношении рада патогенных бактерий, таких как стрептококки группы A, Streptococcus pneumonia, Bacillus anthracis, Enterococcus faecalis, Staphylococcus aurens и др. [Courchesne N. M. D., Parisien A., Lan C. Q. Production and Application ofBacteriophage and Bacteriophage-Encoded Lysins. Recent Patents on Biotechnology, 2009, v. 3,37-45]. В экспериментах по колонизации in vivo, выполненных на модельных животных, была продемонстрирована способность фаговых лизоцимов элиминировать S. pyogenes, пневмококки и стрептококки группы В, а в экспериментах с инфицированными внутривенно S. pneumoniae мышами было показано, что фаговый лизоцим препятствует развитию бактеримии и сепсиса [Fishetti V.A., Bacteriophage lytic enzymes:novel anti-infectives. TRENDS in Microbiology, 2005, v.l3, 491-496].
Также была продемострирована способность рекомбинантного лизоцима бактериофага К лизировать как инактивированные, так и живые культуры S.aureus, S. epidermidis, S. saprophytics, S. chromogenes, S.captis, S. hominis, S. haemolyticus, S. caprea and S. hyicus, включая метициллин-резистентные штаммы S. aureus (MRSA), которые вызывают серьезные госпитальные инфекции по всему миру [WO/2008/001342].
На основе клонирования гена лизоцима KMV- подобного бактериофага FMV Pseudomonas aueruginosa в клетках дрожжей получен очищенный рекомбинантный лизоцим, который обладает антибактериальной активностью в отношении синегнойной палочки [Козлов Д.Г. и др. Клонирование и экспрессия гена лизоцима бактериофага FMV в клетках дрожжей S. cerevisiae и Р. pastoris., 2010, Генетика, т.46, стр.340-348]. Лизоцимную активность оценивали по образованию зон лизиса на газоне тест-культуры клеток бактерий. При тестировании лизоцимной активности тест-культуры предварительно обрабатывали парами хлороформа для обеспечения проникновения лизоцима через альгинатный матрикс.Таким образом, хотя и была продемонстрирована литическая активность рекомбинантного лизоцима фага FMV, возможная терапевтическая активность рекомбинантного лизоцима фага FMV в отношении инфекций, вызываемых Pseudomonas aueruginosa, не была описана.
Разработка новых препаратов на основе фаговых лизоцимов, эффективных в отношении множественно устойчивых к антибиотикам штаммов Pseudomonas aueruginosa, способных вызывать тяжелые формы заболеваний человека, является одной из важнейших проблем инфекционной патологии.
Раскрытие изобретения
Авторами настоящего изобретения впервые предложена фармацевтическая композиция на основе рекомбинантного эндолизина (лизоцима) бактериофага FMV Pseudomonas aueruginosa, являющаяся эффективным антибактериальным средством в отношении инфекций, вызываемых Pseudomonas aueruginosa.
Осуществление изобретения
Предложенное изобретение впервые обеспечивает фармацевтическую композицию для профилактики и лечения инфекций, вызываемых Pseudomonas aueruginosa.
Настоящее изобретение основано на неожиданном открытии, что рекомбинантный лизоцим бактериофага FMV Pseudomonas aueruginosa в комбинации с ЭДТА обладает антибактериальной активностью в отношении патогенных штаммов Pseudomonas aueruginosa, в частности, его применение в офтальмологии при инфекциях, вызываемых Р. aueruginosa, приводит к значительному улучшению симптомов или полному исчезновению воспалительного процесса глаз.
Фармацевтическая композиция согласно изобретению содержит рекомбинантный фаговый лизоцим, очищенный из культуральной жидкости S. cerevisiae, включающих структурный ген фага FMV, клонированный в составе вектора pPDX2-GALl-F12 под контролем сильного галактозо-индуцируемого промотора GAL1 в клетках дрожжей S. cerevisiae [Козлов Д.Г. и др. Клонирование и экспрессия гена лизоцима бактериофага FMV в клетках дрожжей S. cerevisiae и Р. pastoris., 2010, Генетика, т.46, стр.340-348], в комбинации с ЭДТА.
Предпочтительно, фармацевтическая композиция содержит рекомбинантный фаговый лизоцим в эффективном количестве и от 5 до 50 мкг/мл растворимого рекомбинантного лизоцима и от 0,029 до 0,049% ЭДТА. Наиболее предпочтительно фармацевтическая композиция содержит 10 мкг/мл растворимого рекомбинантного лизоцима и 0,049% ЭДТА.
Фармацевтическая композиция на основе рекомбинантного лизоцима бактериофага FMVv. ЭДТА согласно изобретению может быть использована для лечения различных заболеваний, вызываемых Р. aeruginosa, таких как гнойно-воспалительные процессы слизистых поверхностей ушей, носа и глотки, мочеполовой системы, гнойные хирургические инфекции. Предложенная фармацевтическая композиция может использоваться в виде спреев для орошения слизистых мембран при инфекционных заболеваниях носа и глотки, мочеполовой системы, в виде растворов, гелей, паст для обработки поверхностей инфицированных ран и ожогов, для профилактики и лечения инфекционных заболеваний глаз, а также в виде кремов в косметологии для обработки кожных покровов и слизистых оболочек.
Фармакологическая активность фармацевтической композиции в отношении офтальмологических заболеваний, вызываемых Р. aeruginosa, была изучена на модели глазных инфекций у кроликов (пример 2).
Для испытаний на кроликах фармацевтическую композицию получают, как описано в Примере 1.
Животные были прооперированы для получения проникающего ранения роговицы в верхнем сегменте. Затем каждый глаз через переднюю камеру был инфицирован Р. aeruginosa в количестве примерно 5,5×109, достаточном для развития воспалительного процесса.
Спустя 8 часов и в течение последующих 6-ти дней 3-м кроликам проведена инстилляция в инфицированный левый глаз фармацевтической композиции и другим 3-м кроликам проведена инстилляция офтаквикса (Офтаквикс ®, производство компании Alcon, Бельгия) в инфицированный левый глаз, правый глаз у всех кроликов был оставлен в качестве контроля.
Клиническая оценка степени воспалительного процесса представлена в табл.2-4 (Пример 2).
Отмечается значительное снижение воспалительного процесса при использовании фармацевтической композиции в соответствии с изобретением.
Таким образом, результаты исследования фармакологической активности композиции согласно изобретению в отношении офтальмологических заболеваний на модели глазных инфекций у кроликов демонстрируют ее высокую специфичность по отношению к Pseudomonas aeruginosa, быстроту действия и отсутствие побочных эффектов.
Фармацевтическая композиция согласно изобретению может содержать фармацевтически приемлемый носитель, растворитель или наполнитель. Фармацевтически приемлемый носители включают, но не ограничиваются, фосфатным буфером, дистиллированной водой, эмульсиями масло в воде и т.п.
Изобретение иллюстрируется следующими примерами, представленными для подтверждения, но не ограничения объема притязаний.
Примеры
Пример 1. Получение фармацевтической композиции.
Смешивают 50 мкл 13,6% р-ра Tris HCl (pH доводят до 7,5 с помощью 10% р-ра НСl), 3,9 мкл 12,7% р-ра ЭДТА и 7,7 мкл 0,13% р-ра рекомбинантного лизоцима с водой до 1 мл общего объема.
Пример 2. Фармакологическая активность рекомбинантного лизоцима в отношении офтальмологических заболеваний на модели глазных инфекций у кроликов.
Эксперимент по изучению эффективности лизоцима проводился на базе МНИИ ГБ им. Гельмгольца в отделе травматологии, реконструктивной и пластической хирургии. При оценке полученных результатов использовались данные микробиологического исследования, проводимого в микробиологической лаборатории Института. В качестве источника инфекции использовали штамм Р. aeruginosa, полученный из коллекции ГИСК (Государственная коллекция патогенных микроорганизмов) им. Тарасовича. В качестве модели использовали 6 кроликов породы шиншилла, массой 3,5-4 кг.
Кроликам было нанесено проникающее ранение роговицы с последующим инфицированием Р. aeruginosa. Операция по нанесению проникающего ранения роговицы кроликам была проведена после предварительной анестезии раствором алкаина (по 2 капли в каждый глаз). Проникающее ранение роговицы контролировалось под операционным микроскопом и сопровождалось выходом влаги из передней камеры (ПК) глаза. После этого всем кроликам в оба глаза (OU) вводилась жидкая суспензия бактерий Р. aeruginosa в концентрации 5,5×109.
Через 8 часов после операции кроликам №1, 2, 3 в левый глаз проведена инстилляция 5 капель лизоцима 3 раза с интервалом в 2 часа, правый глаз оставлен контрольным. Кроликам №4, 5, 6 в левый глаз проведена инстилляция 5 капель офтаквикса 3 раза с интервалом в 2 часа, правый глаз оставлен в качестве контроля.
Оценку клинических проявлений при проникающей ране роговицы проводили в условных баллах по следующим признакам:
| Таблица 1 | ||
| Отделяемое из | Отделяемого нет | 0 |
| конъюнктивальной | Незначительное отделяемое | 1 |
| полости (ОКП) | Умеренное отделяемое | 2 |
| Выраженное отделяемое | 3 | |
| Гиперемия | Сосуды не видны | 0 |
| Конъюнктивы (ГК) | Умеренная инъекция конъюнктивы | 1 |
| Выраженная инъекция конъюнктивы | 2 | |
| Отек роговицы(ОР) | Отека нет | 0 |
| Локальный отек в области краев раны | 1 | |
| До 1/4 площади роговицы | 2 | |
| От 1/4 до 1/2 площади роговицы | 3 | |
| Экссудативная | П/к равномерная, радужка спокойна | 0 |
| реакция передней | П/к равномерная, небольшое количество | 1 |
| камеры (ЭРПК) | экссудата | |
| П/к неравномерная, умеренное количество | 2 | |
| экссудата, сосуды радужки расширены. | ||
| П/к мелкая, значительное количество экссудата, | 3 | |
| радужка отечна |
На следующий день после операции при осмотре кроликов наблюдались следующие клинические проявления.
Кролики №1, 2, 3 - на правом глазу выраженные признаки гнойной инфекции, левый глаз практически спокойный.
Кролики №4, 5, 6 - на правом глазу выраженные признаки гнойной инфекции, левый глаз - выраженные признаки инфекции, отделяемое на конъюнктиве и веках, экссудат в передней камере.
| Таблица 2 | |||||
| Кролик | Глаз | Клинические признаки | |||
| ОКП | ГК | ОР | ЭРПК | ||
| 1 | OD | 3 | 2 | 2 | 2 |
| OS | 0 | 1 | 0 | 1 | |
| 2 | OD | 2 | 2 | 1 | 2 |
| OS | 0 | 1 | 0 | 1 | |
| 3 | OD | 3 | 2 | 2 | 3 |
| OS | 0 | 0 | 0 | 0 | |
| 4 | OD | 3 | 2 | 2 | 3 |
| OS | 2 | 1 | 1 | 2 | |
| 5 | OD | 3 | 2 | 2 | 2 |
| OS | 2 | 2 | 1 | 2 | |
| 6 | OD | 3 | 2 | 2 | 3 |
| OS | 2 | 1 | 1 | 2 |
Практическое отсутствие инфекции на левом глазу у кроликов №1, 2, 3 свидетельствует о высокой эффективности фармацевтической композиции согласно изобретению при инстилляции после травмы/операции.
Кроликам №1, 2, 3 в левый глаз проведена инстилляция 5 капель лизоцима 3 раза с интервалом в 2 часа, правый оставлен контрольным.
Кроликам №4, 5, 6 в левый глаз проведена инстилляция 5 капель офтаквикса 3 раза с интервалом в 2 часа, правый оставлен контрольным.
На 3-й день после операции при осмотре кроликов наблюдались следующие клинические проявления.
№1, 2, 3 кролики - на правом глазу выраженные признаки гнойной инфекции, левый глаз практически спокойный.
№4, 5, 6 кролики - на правом глазу выраженные признаки гнойной инфекции, левый глаз - умеренные признаки инфекции, небольшое отделяемое, экссудат в передней камере.
| Таблица 3 | |||||
| Кролик | Глаз | Клинические признаки | |||
| ОКП | ГК | ОР | ЭРПК | ||
| 1 | OD | 3 | 2 | 2 | 2 |
| OS | 0 | 1 | 0 | 1 | |
| 2 | OD | 2 | 2 | 1 | 2 |
| OS | 0 | 1 | 0 | 1 | |
| 3 | OD | 3 | 2 | 2 | 3 |
| OS | 0 | 0 | 0 | 0 | |
| 4 | OD | 3 | 2 | 2 | 3 |
| OS | 2 | 1 | 1 | 2 | |
| 5 | OD | 3 | 2 | 2 | 2 |
| OS | 2 | 1 | 1 | 2 | |
| 6 | OD | 3 | 2 | 2 | 3 |
| OS | 1 | 1 | 1 | 2 | |
Кроликам №1, 2, 3 в левый глаз проведена инстилляция 5 капель лизоцима 3 раза с интервалом в 2 часа, правый оставлен контрольным.
Кроликам №4, 5, 6 в левый глаз проведена инсталляция 5 капель офтаквикса 3 раза с интервалом в 2 часа, правый оставлен контрольным.
На 4-й день после операции при лечении кроликов офтаквиксом также отмечается положительный эффект.
| Таблица 4 | |||||
| Кролик | Глаз | Клинические признаки | |||
| ОКП | ГК | ОР | ЭРПК | ||
| 1 | OD | 3 | 2 | 2 | 2 |
| OS | 0 | 1 | 0 | 0 | |
| 2 | OD | 2 | 2 | 1 | 2 |
| OS | 0 | 1 | 0 | 1 | |
| 3 | OD | 3 | 2 | 2 | 3 |
| OS | 0 | 0 | 0 | 0 | |
| 4 | OD | 3 | 2 | 2 | 3 |
| OS | 2 | 1 | 1 | 2 | |
| 5 | OD | 3 | 2 | 2 | 2 |
| OS | 1 | 1 | 1 | 2 | |
| 6 | OD | 3 | 2 | 2 | 3 |
| OS | 1 | 1 | 1 | 1 | |
Кроликам №1, 2, 3 в левый глаз проведена инсталляция 5 капель лизоцима 3 раза с интервалом в 2 часа, правый оставлен контрольным.
Кроликам №4, 5, 6 в левый глаз проведена инсталляция 5 капель офтаквикса 3 раза с интервалом в 2 часа, правый оставлен контрольным.
На 7-й день после операции положительная симптоматика сохраняется на OS у всех 6 кроликах, расплавление роговицы на OD (контроль) началось у кроликов 1-3.
Таким образом, результаты исследования фармакологической активности композиции согласно изобретению в отношении офтальмологических заболеваний на модели глазных инфекций Р. aeruginosa у кроликов демонстрируют высокую специфичность фармацевтической композиции по отношению к Р. aeruginosa, быстроту действия и отсутствие побочных эффектов.
Claims (1)
- Фармацевтическая композиция для лечения глазных инфекций Рseudomonas aeruginosa, содержащая рекомбинантный лизоцим бактериофага FMV Р. аeruginosa, ЭДТА и TrisHCl при следующем соотношении ингредиентов, мас.%:
Лизоцим 0,001 TrisHCl 0,68 ЭДТА 0,049 Остальное вода
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2011148108/10A RU2548803C2 (ru) | 2011-11-28 | 2011-11-28 | ФАРМАЦЕВТИЧЕСКАЯ КОМПОЗИЦИЯ ДЛЯ ЛЕЧЕНИЯ ГЛАЗНЫХ ИНФЕКЦИЙ P. Aeruginosa, СОДЕРЖАЩАЯ РЕКОМБИНАНТНЫЙ ЛИЗОЦИМ |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2011148108/10A RU2548803C2 (ru) | 2011-11-28 | 2011-11-28 | ФАРМАЦЕВТИЧЕСКАЯ КОМПОЗИЦИЯ ДЛЯ ЛЕЧЕНИЯ ГЛАЗНЫХ ИНФЕКЦИЙ P. Aeruginosa, СОДЕРЖАЩАЯ РЕКОМБИНАНТНЫЙ ЛИЗОЦИМ |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| RU2011148108A RU2011148108A (ru) | 2013-06-10 |
| RU2548803C2 true RU2548803C2 (ru) | 2015-04-20 |
Family
ID=48784330
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| RU2011148108/10A RU2548803C2 (ru) | 2011-11-28 | 2011-11-28 | ФАРМАЦЕВТИЧЕСКАЯ КОМПОЗИЦИЯ ДЛЯ ЛЕЧЕНИЯ ГЛАЗНЫХ ИНФЕКЦИЙ P. Aeruginosa, СОДЕРЖАЩАЯ РЕКОМБИНАНТНЫЙ ЛИЗОЦИМ |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| RU (1) | RU2548803C2 (ru) |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US12447200B2 (en) | 2016-02-25 | 2025-10-21 | Applied Biological Laboratories, Inc. | Compositions and methods for protecting against airborne pathogens and irritants |
| US12447166B2 (en) | 2016-02-25 | 2025-10-21 | Applied Biological Laboratories, Inc. | Compositions and methods for protecting against airborne pathogens and irritants |
Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2092183C1 (ru) * | 1988-05-26 | 1997-10-10 | Ника Хелт Продактс Лимитед (Лихтенштейн) | Антивирусный или антибактериальный состав и способ его употребления |
| EP2099466A1 (en) * | 2006-12-01 | 2009-09-16 | Laclede, Inc. | Use of hydrolytic and oxidative enzymes to dissolve biofilm in ears |
-
2011
- 2011-11-28 RU RU2011148108/10A patent/RU2548803C2/ru not_active IP Right Cessation
Patent Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2092183C1 (ru) * | 1988-05-26 | 1997-10-10 | Ника Хелт Продактс Лимитед (Лихтенштейн) | Антивирусный или антибактериальный состав и способ его употребления |
| EP2099466A1 (en) * | 2006-12-01 | 2009-09-16 | Laclede, Inc. | Use of hydrolytic and oxidative enzymes to dissolve biofilm in ears |
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| Д.Г.КОЗЛОВ и др., Клонирование и экспрессия гена лизоцима бактериофага FMV в клетках дрожжей Saccharomyces cerevisiae и Pichia pastoris, генетикаб 2010б т.46б N3б стр.340-348. US 0005993809 A1, , 30.11.1999. * |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US12447200B2 (en) | 2016-02-25 | 2025-10-21 | Applied Biological Laboratories, Inc. | Compositions and methods for protecting against airborne pathogens and irritants |
| US12447166B2 (en) | 2016-02-25 | 2025-10-21 | Applied Biological Laboratories, Inc. | Compositions and methods for protecting against airborne pathogens and irritants |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| RU2011148108A (ru) | 2013-06-10 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| US11116824B2 (en) | Chimeric polypeptides and their use in bacterial decolonization | |
| US20240091332A1 (en) | Compounds and methods for biofilm disruption and prevention | |
| JP6735796B2 (ja) | グラム陽性細菌を検出および処置するためのＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓバクテリオファージリシン | |
| Schmelcher et al. | Bacteriophage endolysins as novel antimicrobials | |
| JP2014519485A (ja) | コンパニオン動物および家畜におけるグラム陽性細菌を処置するためのＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓバクテリオファージリシン | |
| KR102314731B1 (ko) | 황색포도상구균에 대한 높은 사멸 능력을 가진 재조합 엔도라이신 ClyC | |
| US20100291041A1 (en) | Bacteriophage preparation and use | |
| KR102068591B1 (ko) | 병원성 그람음성균에 항균 활성을 갖는 박테리오파지 유래 재조합 단백질 | |
| Zha et al. | Lysostaphin: engineering and potentiation toward better applications | |
| US10499655B2 (en) | Reagents and methods for inhibiting or disrupting biofilm | |
| RU2548803C2 (ru) | ФАРМАЦЕВТИЧЕСКАЯ КОМПОЗИЦИЯ ДЛЯ ЛЕЧЕНИЯ ГЛАЗНЫХ ИНФЕКЦИЙ P. Aeruginosa, СОДЕРЖАЩАЯ РЕКОМБИНАНТНЫЙ ЛИЗОЦИМ | |
| Shrivastava et al. | Enzymes in pharmaceutical industry | |
| CN111518187B (zh) | 抗菌肽dn6nh2及其应用 | |
| Kokai-Kun | Lysostaphin: a silver bullet for staph. | |
| CN100469391C (zh) | 人溶菌酶在制备治疗痤疮的药物中的应用 | |
| Veiga-Crespo et al. | Advantages and disadvantages in the use of antibiotics or phages as therapeutic agents | |
| Ramadhani et al. | Effects of Bacteriophage in Postoperative Endophthalmitis Caused by Staphylococcus aureus | |
| KR102818865B1 (ko) | 젖소유방염 치료용 항균단백질 조성물 | |
| Kratofil et al. | PNAG exopolysaccharide eradication gives neutrophils access to Staphylococcus aureus biofilm infections | |
| KR20240015756A (ko) | 젖소유방염 치료용 항균단백질 조성물 | |
| CN115851690A (zh) | 一种用于杀灭动物源病原菌的杂合抗生酶及其应用 | |
| HK1259718A1 (zh) | 用於革兰氏阳性菌检测和治疗的链球菌属细菌噬菌体溶素 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| MM4A | The patent is invalid due to non-payment of fees |
Effective date: 20151129 |