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ES2989113T3 - Compuestos deuterados y usos de los mismos - Google Patents

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ES2989113T3
ES2989113T3 ES16839942T ES16839942T ES2989113T3 ES 2989113 T3 ES2989113 T3 ES 2989113T3 ES 16839942 T ES16839942 T ES 16839942T ES 16839942 T ES16839942 T ES 16839942T ES 2989113 T3 ES2989113 T3 ES 2989113T3
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radioligand
agonist
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human
hydrogen peroxide
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ES16839942T
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English (en)
Inventor
Todd Brady
Scott Young
William Kinney
Susan Macdonald
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Aldeyra Therapeutics Inc
Original Assignee
Aldeyra Therapeutics Inc
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Abstract

La presente invención proporciona el tratamiento, prevención y/o reducción de un riesgo de una enfermedad, trastorno o afección en la que la toxicidad de los aldehídos está implicada en la patogénesis, incluidos trastornos oculares, trastornos de la piel, afecciones asociadas con efectos nocivos de agentes ampollosos y enfermedades autoinmunes, inflamatorias, neurológicas y cardiovasculares mediante el uso de una amina primaria para eliminar aldehídos tóxicos, tales como MDA y HNE. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

DESCRIPCIÓN
Compuestos deuterados y usos de los mismos
Antecedentes de la invención
Los procesos metabólicos e inflamatorios en células generan aldehidos tóxicos, tal como malondialdehído (MDA) y 4-hidroxil-2-nonenal (HNE o 4HNE). Estos aldehídos son muy reactivos hacia proteínas, hidratos de carbono, lípidos y ADN, produciendo moléculas biológicas químicamente modificadas, activación de mediadores inflamatorios tal como NF-kappaB, y daños en diversos órganos. Por ejemplo, el retinaldehído puede reaccionar con fosfatidiletanolamina (PE) para formar un compuesto muy tóxico llamado A2E, que es un componente de lipofuscina que se cree está implicada en el desarrollo y evolución de degeneración macular senil (AMD). Muchos mecanismos de defensa corporal funcionan para eliminar o disminuir los niveles de aldehídos tóxicos. Se pueden usar agentes terapéuticos de molécula pequeña novedosos para captar retinaldehído “escapado” en la retina, reduciendo de esta manera la formación de A2E y disminuyendo el riesgo de AMD (Jordanet al.(2006)).
Los aldehídos están implicados en diversas afecciones patológicas tal como ojo seco, cataratas, queratocono, distrofia endotelial de Fuch en la córnea, uveítis, conjuntivitis alérgica, penfigoide cicatricial ocular, afecciones asociadas con cicatrización de queratectomía fotorreactiva (PKR) u otra cicatrización corneal, afecciones asociadas con degradación de lípido de las lágrimas o disfunción de la glándula lacrimal, afecciones oculares inflamatorias tal como rosácea ocular (con o sin disfunción de la glándula meibomiana) y trastornos o afecciones no oculares tal como cáncer de piel, psoriasis, dermatitis de contacto, dermatitis atópica, acné vulgar, síndrome de Sjogren-Larsson, lesión isquémicareperfusión, inflamación, diabetes, neurodegeneración (por ejemplo, enfermedad de Parkinson), esclerodermia, esclerosis lateral amiotrófica, trastornos autoinmunitarios (por ejemplo, lupus), trastornos cardiovasculares (por ejemplo, ateroesclerosis) y afecciones asociadas con los efectos lesivos de agentes vesicantes (Negre-Salvagreet al.(2008), Nakamuraet al.(2007), Batistaet al.(2012), Kenneyet al.(2003), Int J Dermatol 43: 494 (2004), Invest Ophthalmol Vis Sci 48: 1552 (2007), Graefe's Clin Exp Ophthalmol 233: 694 (1994), Molecular Vision 18: 194 (2012)). Disminuir o eliminar los aldehídos debe, por tanto, mejorar los síntomas y ralentizar la evolución de estos estados patológicos.
MDA, HNE y otros aldehídos tóxicos se generan por una miríada de mecanismos metabólicos que implican alcoholes grasos, esfingolípidos, glucolípidos, fitol, ácidos grasos, metabolismo del ácido araquidónico (Rizzo (2007)), metabolismo de poliaminas (Woodet al.(2006)), peroxidación de lípidos, metabolismo oxidativo (Buddiet al.(2002), Zhouet al.(2005)), y metabolismo de glucosa (Pozziet al.(2009)). Los aldehídos se pueden entrecruzar con grupos amino primarios y otras fracciones químicas en proteínas, fosfolípidos, hidratos de carbono, y ADN, produciendo en muchos casos consecuencias tóxicas, tal como mutagénesis y carcinogénesis (Marnett (2002)). MDA se asocia con córneas enfermas en afecciones tales como, queratocono, queratopatía bullosa y otras, y distrofia endotelial de Fuch (Buddiet al.(2002)). Además, trastornos de la piel, por ejemplo, síndrome de Sjogren-Larsson, probablemente están conectados con la acumulación de aldehídos grasos tal como octadecanal y hexadecanal (Rizzoet al.(2010)). Además, la peroxidación de lípidos aumentada y la generación de aldehídos resultante están asociadas con los efectos tóxicos de agentes vesicantes (Sciutoet al.(2004) y Palet al.(2009)).
El documento WO 2017/035082 describe compuestos y métodos de uso de los mismos para el tratamiento, prevención y/o reducción de un riesgo de una enfermedad, trastorno, o afección en la que la toxicidad de aldehídos está implicada en la patogénesis, incluyendo trastornos oculares, trastornos de la piel, afecciones asociadas con efectos lesivos de agentes vesicantes, y enfermedades autoinmunitarias, inflamatorias, neurológicas y cardiovasculares mediante el uso de una amina primaria para captar aldehídos tóxicos, tal como MDA y HNE.
El documento WO 2014/116836 describe el tratamiento, prevención y/o reducción de un riesgo de una enfermedad, trastornos o afección en la que la toxicidad de aldehídos está implicada en la patogénesis, incluyendo trastornos oculares, trastornos de la piel, afecciones asociadas con efectos lesivos de agentes vesicantes, y enfermedades autoinmunitarias, inflamatorias, neurológicas y cardiovasculares mediante el uso de una amina primaria para captar aldehídos tóxicos tal como MDA y HNE.
LoPachin et al., 2014, Chem. Res. Toxicol. 27:1081-1091 describe mecanismos moleculares de toxicidad de aldehídos.
El documento WO 2006/127945 describe composiciones y métodos para tratar degeneración macular y otras formas de enfermedad retiniana cuya etiología implica la acumulación de a 2e y/o lipofuscina, y, más específicamente, para prevenir la formación y/o acumulación de A2E.
No ha habido sugerencias en la técnica para tratar las varias afecciones asociadas con aldehídos tóxicos mediante la administración de agentes terapéuticos de molécula pequeña que actúan como un captador para aldehídos, tal como MDA y/o HNE. Por tanto, hay una necesidad para tratar, prevenir, y/o reducir un riesgo de una enfermedad o trastorno en el que la toxicad de aldehídos está implicada en la patogénesis. La presente invención aborda tal necesidad.
Según esto, permanece una necesidad para tratar, prevenir, y/o reducir un riesgo de una enfermedad, trastorno, o afección en la que la toxicad de aldehídos está implicada en la patogénesis.
Compendio de la invención
Todas las formas de realización en los párrafos posteriores que no están dentro del ámbito de las reivindicaciones se proporcionan para contexto/referencia. La invención se expone en el conjunto adjunto de reivindicaciones.
Las referencias a métodos de tratamiento en los párrafos posteriores de esta descripción se deben interpretar como referencias a los compuestos, composiciones farmacéuticas y medicamentos de la presente invención para uso en un método para el cuerpo humano (o animal) mediante terapia (o para diagnóstico).
Se ha encontrado ahora que los compuestos de la presente invención, y composiciones de los mismos, son útiles para tratar, prevenir, y/o reducir un riesgo de una enfermedad, trastorno, o afección en la que la toxicad de aldehídos está implicada en la patogénesis. Tales compuestos tienen la fórmula generalI:
o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, en donde cada uno de R1, R2, R3, R4, R5, R6, R7, y R8 es como se reivindica.
Los compuestos de la presente invención, y composiciones farmacéuticamente aceptables de los mismos, son útiles para tratar una variedad de enfermedades, trastornos o afecciones, asociadas con aldehídos tóxicos. Tales enfermedades, trastornos o afecciones incluyen las descritas en el presente documento.
Los compuestos proporcionados por esta invención también son útiles para el estudio de ciertos aldehídos en biología y fenómenos patológicos.
Los compuestos que se divulgan en el presente documento, pero no están cubiertos por las reivindicaciones son compuestos de referencia y sirven para ilustrar la presente invención.
Breve descripción de las figuras
Lafigura 1muestra superposiciones de EIC (cromatogramas iónicos extraídos) de los perfiles de metabolitos de NS2 a 0 min y 120 min en hepatocitos humanos comparados con una referencia (hepatocitos blanco). Como muestran las superposiciones, después de 120 min NS2 se metaboliza a M1, M7, M8, y una baja cantidad de M9, permaneciendo algo de NS2 sin cambiar.
Lafigura 2muestra superposiciones de EIC de los perfiles de metabolitos de NS2 a 0 min y 120 min en hepatocitos de mono comparados con una referencia (hepatocitos blanco). Como muestran las superposiciones, después de 120 min NS2 se metaboliza a M1, M3, M4, M7, M8, y una baja cantidad de M9, permaneciendo algo de NS2 sin cambiar. Lafigura 3muestra superposiciones de EIC de los perfiles de metabolitos de NS2 a 0 min y 120 min en hepatocitos de perro comparados con una referencia (hepatocitos blanco). Como muestran las superposiciones, después de 120 min NS2 se metaboliza a M1, M2, M5, y M6, permaneciendo algo de NS2 sin cambiar.
Lafigura 4muestra superposiciones de EIC de los perfiles de metabolitos de NS2 a 0 min y 120 min en hepatocitos de rata comparados con una referencia (hepatocitos blanco). Como muestran las superposiciones, después de 120 min NS2 se metaboliza a M1, M7, y M8, permaneciendo algo de NS2 sin cambiar.
Lafigura 5muestra superposiciones de EIC de los perfiles de metabolitos de NS2 deuterado (NS2-D6; compuestoI-1) a 0 min y 120 min en hepatocitos humanos comparados con una referencia (hepatocitos blanco). Como muestran las superposiciones, después de 120 min NS2-D6 se metaboliza a una pequeña cantidad de M1, permaneciendo la mayoría de NS2-D6 sin cambiar.
Lafigura 6muestra un análisis espectral de masa de NS2 (m/z = 237).
Lafigura 7muestra un análisis espectral de masa del metabolito M1 (m/z = 253; RT = 2,1 min).
Lafigura 8muestra un análisis espectral de masa del metabolito M2 (m/z = 253; RT = 2,9 min).
Lafigura 9muestra un análisis espectral de masa del metabolito M3 (m/z = 429; RT = 3,0 min).
Lafigura 10muestra un análisis espectral de masa del metabolito M4 (m/z = 429; RT = 3,2 min).
Lafigura 11muestra un análisis espectral de masa del metabolito M5 (m/z = 542; RT = 3,5 min).
Lafigura 12muestra un análisis espectral de masa del metabolito M6 (m/z = 542; RT = 3,7 min). Nota: m/z de 413 representa una pérdida neutra (NL) de 129, indicativo de patrón de fragmentación de GSH.
Lafigura 13muestra un análisis espectral de masa del metabolito M7 (m/z = 429; RT = 3,7 min).
Lafigura 14muestra un análisis espectral de masa del metabolito M8 (m/z = 413; RT = 3,9 min).
Lafigura 15muestra un análisis espectral de masa del metabolito M9 (m/z = 429; RT = 3,9 min).
Lafigura 16muestra un análisis espectral de masa de NS2-D6 (compuestoI-1; m/z = 243).
Lafigura 17muestra un análisis espectral de masa del metabolito 1 de NS2-D6 (m/z = 259).
Lafigura 18muestra el efecto de NS2 (CoreRx) sobre la viabilidad neuronal después de cotratamiento con peróxido de hidrógeno 10 pM durante 5 horas.
Lafigura 19muestra un gráfico que ajusta los datos de CFDA (en unidades de fluorescencia relativa) a concentraciones variables de NS2 (CoreRx; en Captisol®) a una curva de la que se deriva el valor de CE50.
Lafigura 20muestra el efecto de NS2 (CoreRx) sobre la muerte celular en cultivos de hipocampo después de cotratamiento con peróxido de hidrógeno 10 pM durante 5 horas. * indica puntos de datos que son significativamente diferentes del tratamiento de HP solo.
Lafigura 21muestra un gráfico que ajusta los datos de yoduro de propidio (en unidades de fluorescencia relativa) a concentraciones variables de NS2 (CoreRx; en Captisol®) a una curva de la que se deriva el valor de CE50.
Lafigura 22muestra el efecto de NS2 (CoreRx; en DMSO) sobre la viabilidad neuronal después de cotratamiento con peróxido de hidrógeno 10 mM durante 5 horas. * indica puntos de datos que son significativamente diferentes del tratamiento de HP solo.
Lafigura 23muestra un gráfico que ajusta los datos de CFDA (en unidades de fluorescencia relativa) a concentraciones variables de NS2 (CoreRx; en DMSO) a una curva de la que se deriva el valor de CE50.
Lafigura 24muestra el efecto de NS2 (CoreRx; en DMSO) sobre la muerte celular en cultivos de hipocampo después de cotratamiento con peróxido de hidrógeno 10 pM. * indica puntos de datos que son significativamente diferentes del tratamiento de HP solo.
Lafigura 25muestra un gráfico que ajusta los datos de yoduro de propidio (en unidades de fluorescencia relativa) a concentraciones variables de NS2 (CoreRx; en DMSO) a una curva de la que se deriva el valor de CE50.
Lafigura 26muestra datos de respuesta a la dosis para NS2 no molido (J-Star) en Captisol® que demuestra el efecto sobre la viabilidad neuronal después de cotratamiento con peróxido de hidrógeno 10 pM. * indica puntos de datos que son significativamente diferentes del tratamiento de HP solo.
Lafigura 27muestra un gráfico que ajusta los datos de CFDA (en unidades de fluorescencia relativa) a concentraciones variables de NS2 (J-Star; en DMSO) a una curva de la que se deriva el valor de CE50.
Lafigura 28muestra datos de respuesta a la dosis para NS2 no molido (J-Star) en Captisol® que demuestra el efecto sobre la muerte celular en cultivos de hipocampo después de cotratamiento con peróxido de hidrógeno 10 pM. * indica puntos de datos que son significativamente diferentes del tratamiento de HP solo.
Lafigura 29muestra un gráfico que ajusta los datos de yoduro de propidio (en unidades de fluorescencia relativa) a concentraciones variables de NS2 (no molido (J-Star) en Captisol®) a una curva de la que se deriva el valor de CE50. Lafigura 30muestra datos de respuesta a la dosis para NS2 no molido (J-Star) en DMSO que demuestra el efecto sobre la viabilidad neuronal después de cotratamiento con peróxido de hidrógeno 10 pM. * indica puntos de datos que son significativamente diferentes del tratamiento de HP solo.
Lafigura 31muestra un gráfico que ajusta los datos de CFDA (en unidades de fluorescencia relativa) a concentraciones variables de NS2 no molido ((J-Star) en DMSO) a una curva de la que se deriva el valor de CE50. Lafigura 32muestra datos de respuesta a la dosis para NS2 no molido (J-Star) en DMSO que demuestra el efecto sobre la muerte celular en cultivos de hipocampo después de cotratamiento con peróxido de hidrógeno 10 pM. * indica puntos de datos que son significativamente diferentes del tratamiento de HP solo.
Lafigura 33muestra un gráfico que ajusta los datos de yoduro de propidio (en unidades de fluorescencia relativa) a concentraciones variables de NS2 no molido ((J-Star) en DMSO) a una curva de la que se deriva el valor de CE50. Lafigura 34muestra datos de respuesta a la dosis para los vehículos de formulación sobre la viabilidad celular neuronal después del cotratamiento con peróxido de hidrógeno 10 pM.
Lafigura 35muestra datos de respuesta a la dosis para los vehículos de formulación sobre la muerte celular después del cotratamiento con peróxido de hidrógeno 10 pM.
Lafigura 36muestra el efecto de ALD-6 (compuestoI-1) sobre viabilidad neuronal en cultivos de hipocampo tratados con peróxido de hidrógeno 10 pM. * indica puntos de datos que son significativamente diferentes del tratamiento de HP solo.
Lafigura 37muestra la curva logística calculada y el valor de CE50 para el ensayo de viabilidad neuronal usando cultivos de hipocampo tratados con ALD-6.
Lafigura 38muestra el efecto de respuesta a la dosis de ALD-6 sobre la muerte celular después de cotratamiento con peróxido de hidrógeno 10 pM. * indica puntos de datos que son significativamente diferentes del tratamiento de HP solo.
Lafigura 39muestra la curva logística calculada y el valor de CE50 para el ensayo de muerte celular usando cultivos de hipocampo tratados con ALD-6.
Lafigura 40muestra el efecto de respuesta a la dosis de ALD-5 sobre la viabilidad neuronal después de cotratamiento con peróxido de hidrógeno 10 pM.
Lafigura 41muestra el efecto de respuesta a la dosis de ALD-5 sobre la muerte celular después de cotratamiento con peróxido de hidrógeno 10 pM.
Lafigura 42muestra el efecto de respuesta a la dosis de ALD-2 sobre la viabilidad neuronal después de cotratamiento con peróxido de hidrógeno 10 pM.
Lafigura 43muestra el efecto de respuesta a la dosis de ALD-2 sobre la muerte celular después de cotratamiento con peróxido de hidrógeno 10 pM.
Lasfiguras 44-46muestran un histograma de resultados de unión específica para NS2-D6 expresado como un porcentaje de la unión específica de cada compuesto control.
Lafigura 47muestra un histograma de resultados de farmacologíain vitroen ensayos enzimáticos y de absorción para NS2-D6.
Descripción detallada de la invención
1. Descripción general de ciertos aspectos de la invención
En ciertas formas de realización, la presente invención proporciona compuestos, composiciones, y métodos para el tratamiento, prevención y/o reducción de un riesgo de enfermedades, trastornos o afecciones en las que la toxicidad de aldehídos está implicada en la patogénesis. En algunas formas de realización, tales compuestos incluyen esos de las fórmulas reivindicadas, o una sal farmacéuticamente aceptable de los mismos, en donde cada variable es como se reivindica. También se describe un compuesto de fórmulaI:
o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, en donde:
R1 se selecciona de -N H 2, -NHD, o -N D 2;
R2 se selecciona de hidrógeno o deuterio;
R3 y R4 se seleccionan independientemente de -C H 3, -CH2D, -CHD2, o -C D 3; y
R5, R6, R7, y R8 se seleccionan cada uno independientemente de hidrógeno o deuterio;
siempre que al menos uno de R1, R2, R3, R4, R5, R6, R7, o R8 sea o contenga deuterio.
2. Definiciones
Los compuestos de esta invención incluyen los reivindicados, y se ilustran además por las clases, subclases y especies divulgadas en el presente documento. Como se usa en el presente documento, las siguientes definiciones aplicarán a menos que se indique otra cosa. Para los fines de esta invención, los elementos químicos se identifican según la tabla periódica de los elementos, versión CAS, Handbook of Chemistry and Physics, 75a Ed. Además, los principios generales de química orgánica se describen en “Organic Chemistry”, Thomas Sorrell, University Science Books, Sausalito: 1999, y “March's Advanced Organic Chemistry”, 5a Ed., Ed.: Smith, M.B. y March, J., John Wiley & Sons, Nueva York: 2001.
Como se usa en el presente documento, el término “sal farmacéuticamente aceptable” se refiere a esas sales que son, dentro de ámbito de juicio médico racional, adecuadas para uso en contacto con los tejidos de seres humanos y animales inferiores sin excesiva toxicidad, irritación, respuesta alérgica, y similares, y son proporcionales con una relación beneficio/riesgo razonable. Las sales farmacéuticamente aceptables se conocen bien en la técnica. Por ejemplo, S. M. Berge et al., describen sales farmacéuticamente aceptables en detalle en J. Pharmaceutical Sciences, 1977, 66, 1-19. Las sales farmacéuticamente aceptables de los compuestos de esta invención incluyen las derivadas de ácidos y bases inorgánicos y orgánicos adecuados. Los ejemplos de sales de adición de ácidos no tóxicos, farmacéuticamente aceptables son sales de un grupo amino formadas con ácidos inorgánicos tal como ácido clorhídrico, ácido bromhídrico, ácido fosfórico, ácido sulfúrico y ácido perclórico o con ácidos orgánicos tal como ácido acético, ácido oxálico, ácido maleico, ácido tartárico, ácido cítrico, ácido succínico o ácido malonico o usando otros métodos usados en la técnica tal como intercambio iónico. Otras sales farmacéuticamente aceptables incluyen sales adipato, alginato, ascorbato, aspartato, bencenesulfonato, benzoato, bisulfato, borato, butirato, canforato, canforsulfonato, citrato, ciclopentanopropionato, digluconato, dodecilsulfato, etanosulfonato, formiato, fumarato, glucoheptonato, glicerofosfato, gluconato, hemisulfato, heptanoato, hexanoato, yodhidrato, 2-hidroxi-etanosulfonato, lactobionato, lactato, laurato, laurilsulfato, malato, maleato, malonato, metanosulfonato, 2-naftalenosulfonato, nicotinato, nitrato, oleato, oxalato, palmitato, pamoato, pectinato, persulfato, 3-fenilpropionato, fosfato, pivalato, propionato, estearato, succinato, sulfato, tartrato, tiocianato, p-toluenosulfonato, undecanoato, valerato, y similares.
Las sales derivadas de bases apropiadas incluyen sales de metales alcalinos, metales alcalinotérreos, amonio y N+(alquilo de C1-4). Las sales de metales alcalinos o alcalinotérreos representativas incluyen sodio, litio, potasio, calcio, magnesio, y similares. Las sales farmacéuticamente aceptables adicionales incluyen, cuando sea apropiado, amonio no tóxico, amonio cuaternario, y cationes de aminas formadas usando contraiones tales como haluro, hidróxido, carboxilato, sulfato, fosfato, nitrato, alquilo inferior sulfonato y aril sulfonato.
A menos que se indique otra cosa, las estructuras representadas en el presente documento también se pretende que incluyan todas las formas isoméricas (por ejemplo, enantioméricas, diastereoméricas, y geométricas (o conformacionales)) de la estructura; por ejemplo, las configuraciones R y S para cada centro asimétrico, isómeros de doble enlace Z y E, e isómeros conformacionales Z y E. Por tanto, los isómeros estereoquímicos individuales, así como las mezclas enantioméricas, diastereoméricas y geométricas (o conformacionales) de los presentes compuestos están dentro del ámbito de la invención. A menos que se indique otra cosa, todas las formas tautoméricas de los compuestos de la invención están dentro del ámbito de la invención.
La “retina” es una región del sistema nervioso central con aproximadamente 150 millones de neuronas. Está localizada al fondo del ojo donde reposa sobre un tejido epitelial especializado llamado epitelio pigmentario retinal (RPE). La retina inicia la primera fase del procesamiento visual transducciendo estímulos visuales a neuronas especializadas llamadas “fotorreceptores”. Sus salidas sinápticas se procesan por redes neurales elaboradas en la retina y después se transmiten al cerebro. La retina ha evolucionado dos clases especializadas de fotorreceptores para operar en una amplia gama de condiciones de luz. Los fotorreceptores “bastones” transducen imágenes visuales en condiciones de baja luz y median la visión acromática. Los fotorreceptores “conos” transducen imágenes visuales en condiciones de luz de oscura a brillante y median tanto visión de color como visión de alta agudeza.
Cada fortorreceptor está compartimentalizado en dos regiones llamadas el segmento “externo” e “interno”. El segmento interno es el cuerpo celular neuronal que contiene el núcleo celular. El segmento interno sobrevive durante una vida en ausencia de enfermedad retinal. El segmento externo es la región donde las moléculas de pigmento visuales sensibles a la luz están concentradas en una formación densa de estructuras de membranas apiladas. Parte del segmento externo se desprende rutinariamente y vuelve a crecer en un proceso diurno llamado renovación del segmento externo. Los segmentos externos desprendidos son ingeridos y metabolizados por células RPE.
La “mácula” es la región central de la retina que contiene la fóvea donde las imágenes visuales se procesan por conos delgados largos en alto detalle espacial (“agudeza visual”). La “degeneración macular” es una forma de neurodegeneración retinal que ataca la mácula y destruye la visión de alta agudeza en el centro del campo visual. La degeneración macular senil (AMD) empieza en una “forma seca” caracterizada por gránulos lisosómicos residuales llamados lipofuscina en células RPE, y por depósitos extracelulares llamados “drusas”. Las drusas contienen productos de desecho celulares excretados por las células RPE. Se pueden detectar “lipofuscina” y drusas clínicamente por oftalmólogos y cuantificar usando técnicas fluorescentes. Pueden ser los primeros signos clínicos de la degeneración macular.
La lipofuscina contiene agregaciones de A2E. La lipofuscina se acumula en células RPE y las envenena por múltiples mecanismos conocidos. Según se envenenan las células RPE, sus actividades bioquímicas declinan y los fotorreceptores empiezan a degenerar. Las drusas extracelulares pueden además comprometer las células RPE interfiriendo con su suministro de nutrientes vasculares. Las drusas también desencadenan procesos inflamatorios, que producen invasiones neovasculares coroideas de la mácula en un paciente en diez que evolucionan a la forma húmeda de AMD. Tanto la forma seca como la húmeda evolucionan a ceguera.
“ERG” es un acrónimo para electrorretinograma, que es la medida del potencial de campo eléctrico emitido por las neuronas de la retina durante su respuesta a un estímulo de luz experimentalmente definido. ERG es una medida no invasora que se puede realizar o bien en sujetos vivos (ser humano o animal) o un ojo hemiseccionado en solución que se ha retirado quirúrgicamente de un animal vivo.
Como se usa en el presente documento, el término “RAL” significa retinaldehído. El término “RAL-trap” significa un compuesto terapéutico que se une a RAL libre y mediante ello previene a RAL de una condensación con base de Schiff con fosfotidiletanolamina (PE) de membrana. “RAL libre” se define como RAL que no está unido a una proteína del ciclo visual. Los términos “trans-RAL” y “all-trans-RAL” se usan de forma intercambiable y significan todotrans-retinaldehído.
A2E es un subproducto de reacción de una ruta bioquímica compleja llamada el “ciclo visual” que opera colaborativamente tanto en células RPE como segmentos externos de fotorreceptores. El ciclo visual recicla un cromóforo aldehído fotorreactivo llamado “retinaldehído” que deriva de la vitamina A y es esencial para la visión. En términos simplificados, el ciclo visual tiene cuatro etapas principales: 1) convierte la vitamina A en las RPE en un cromóforo aldehído con un doble enlace forzado fotorreactivo (11-cis-RAL); 2) transporta 11-cis-RAL a la retina donde se une a una proteína fotorreceptora especializada llamada opsina; 3) la luz fotoisomeriza el 11-cis-RAL unido atransRAL, que inicia la liberación de RAL unido del sitio de unión de la opsina; y 4) convierte trans-RAL (un aldehído) a vitamina A (un alcohol) y transporta la vitamina A de vuelta a las RPE donde el ciclo comienza de nuevo.
El grupo aldehído de RAL ayuda a unir la molécula a opsina formando un enlace químico reversible con una cadena lateral de aminoácido en el sitio de unión de la opsina. Mientras el grupo aldehído de RAL es esencial para anclar la molécula al sitio de unión de opsina, es de otra forma peligroso debido a su propensión a formar bases de Schiff con otras aminas biológicas. Las primeras tres reacciones tienen lugar en los segmentos externos de fotorreceptores y producen un producto intermedio llamado A2PE. Una vez formado, A2PE se reparte en la fase lipídica y se acumula en las membranas de segmentos externos de fotorreceptores. Cuando las células RPE ingieren segmentos externos descartados, su A2PE acumulado se dirige a sus lisosomas.
Como se ha descrito anteriormente, la degeneración macular y otras formas de enfermedad retinal cuya etiología implica la acumulación de A2E y/o lipofuscina se pueden tratar o prevenir disminuyendo la cantidad de<a>2<e>formado. Los compuestos útiles para hacerlo incluyen RAL-traps. Los RAL-traps disminuyen la cantidad de A2E formado, por ejemplo, formando un enlace covalente con RAL que ha escapado el secuestro. RAL que ha reaccionado con el compuesto RAL-trap está por tanto indisponible para reaccionar con fosfatidiletanolamina.
La presente invención también se dirige al uso de un compuesto descrito en el presente documento en la fabricación de un medicamento para el tratamiento, prevención y/o reducción de un riesgo de una enfermedad, trastorno o afección en la que la toxicidad de aldehídos está implicada en la patogénesis. Más específicamente, este aspecto de la invención se dirige al uso de un compuesto descrito en el presente documento en la fabricación de un medicamento para el tratamiento, prevención y/o reducción de un riesgo de (1) una enfermedad, trastorno o afección ocular, incluyendo, pero no limitado a, una enfermedad corneal (por ejemplo, síndrome de ojo seco, cataratas, queratocono, queratopatía bullosa y otras, y distrofia endotelial de Fuch), otros trastornos o afecciones oculares (por ejemplo, conjuntivitis alérgica, penfigoide cicatricial ocular, afecciones asociadas con cicatrización de PRK y otras cicatrizaciones corneales, y afecciones asociadas con degradación de los lípidos de las lágrimas o disfunción de la glándula lacrimal), y otras afecciones oculares asociadas con altos niveles de aldehídos como resultado de inflamación (por ejemplo, uveítis, escleritis, síndrome de Stevens-Johnson ocular y rosácea ocular (con o sin disfunción de la glándula meibomiana)), (2) un trastorno o afección de la piel o una indicación cosmética. Por ejemplo, el trastorno o afección de la piel incluye, pero no está limitado a, psoriasis, lupus tópico (discoide), dermatitis de contacto, dermatitis atópica, dermatitis alérgica, dermatitis de radiación, acné vulgar, y síndrome de Sjogren-Larsson y otras ictiosis, elastosis solar/arrugas, firmeza del tono de la piel, hinchazón, eccema, cambios en la piel inducidos por tabaco o irritantes, incisión dérmica, una afección de la piel asociada a quemadura y/o herida, (3) una afección asociada con los efectos tóxicos de agentes vesicantes o quemaduras de agentes alcalinos, o (4) una enfermedad autoinmunitaria, mediada por inmunidad, inflamatoria, cardiovascular o neurológica (por ejemplo, lupus, esclerodermia, asma, enfermedad pulmonar obstructiva crónica (EPOC), artritis reumatoide, enfermedad intestinal inflamatoria, septicemia, ateroesclerosis, lesión isquémica-reperfusión, enfermedad de Parkinson, enfermedad de Alzheimer, esclerosis múltiples, esclerosis lateral amiotrófica, diabetes, síndrome metabólico, y enfermedades fibróticas).
La presente invención también se dirige al uso de un compuesto descrito en el presente documento en tratar, prevenir y/o reducir un riesgo de una enfermedad, trastorno o afección en la que la toxicidad de aldehídos está implicada en la patogénesis. Más específicamente, este aspecto de la invención se dirige al uso de un compuesto descrito en el presente documento en tratar, prevenir y/o reducir un riesgo de (1) una enfermedad, trastorno o afección ocular, incluyendo, pero no limitado a, una enfermedad corneal (por ejemplo, síndrome de ojo seco, cataratas, queratocono, queratopatía bullosa y otras, y distrofia endotelial de Fuch), otros trastornos o afecciones oculares (por ejemplo, conjuntivitis alérgica, penfigoide cicatricial ocular, afecciones asociadas con cicatrización de PRK y otras cicatrizaciones corneales, y afecciones asociadas con degradación de los lípidos de las lágrimas o disfunción de la glándula lacrimal), y otras afecciones oculares asociadas con altos niveles de aldehídos como resultado de inflamación (por ejemplo, uveítis, escleritis, síndrome de Stevens-Johnson ocular, rosácea ocular (con o sin disfunción de la glándula meibomiana)), (2) un trastorno o afección de la piel o una indicación cosmética. Por ejemplo, la enfermedad, trastorno o afección incluye, pero no está limitado a, psoriasis, lupus tópico (discoide), dermatitis de contacto, dermatitis atópica, dermatitis alérgica, dermatitis de radiación, acné vulgar, y síndrome de Sjogren-Larsson y otras ictiosis, elastosis solar/arrugas, firmeza del tono de la piel, hinchazón, eccema, cambios en la piel inducidos por tabaco o irritantes, incisión dérmica, una afección de la piel asociada a quemadura y herida, (3) una afección asociada con los efectos tóxicos de agentes vesicantes o quemaduras de agentes alcalinos, o (4) una enfermedad autoinmunitaria, mediada por inmunidad, inflamatoria, cardiovascular o neurológica (por ejemplo, lupus, esclerodermia, asma, enfermedad pulmonar obstructiva crónica (EPOC), artritis reumatoide, enfermedad intestinal inflamatoria, septicemia, ateroesclerosis, lesión isquémica-reperfusión, enfermedad de Parkinson, enfermedad de Alzheimer, esclerosis múltiples, esclerosis lateral amiotrófica, diabetes, síndrome metabólico, y enfermedades fibróticas).
Los compuestos descritos en el presente documento también se pueden administrar por vía tópica, tal como directamente al ojo, por ejemplo, como un colirio o pomada oftálmica. Las gotas para los ojos típicamente comprenden una cantidad eficaz de al menos un compuesto descrito en el presente documento y un soporte capaz de ser aplicado de forma segura a un ojo. Por ejemplo, las gotas para los ojos están en forma de una solución isotónica, y el pH de la solución se ajusta de modo que no haya irritación del ojo. En muchos casos, la barrera epitelial interfiere con la penetración de moléculas en el ojo. Por tanto, los fármacos oftálmicos más actualmente usados se suplementan con alguna forma de potenciador de penetración. Estos potenciadores de penetración funcionan aflojando las uniones estrechas de las células epiteliales más superiores (Burstein, Trans Ophthalmol Soc UK 104: 402 (1985); Ashtonet al.,J Pharmacol Exp Ther 259: 719 (1991); Greenet al.,Am J Ophthalmol 72: 897 (1971)). El potenciador de penetración más comúnmente usado es cloruro de benzalconio (Tanget al.,J Pharm Sci 83: 85 (1994); Bursteinet al,Invest Ophthalmol Vis Sci 19: 308 (1980)), que también funciona como un conservante contra contaminación microbiana.
La administración tópica puede ser en forma de una crema, suspensión, emulsión, pomada, gotas, aceite, loción, parche, cinta, inhalante, espray, o formulaciones tópicas de liberación controlada incluyendo geles, películas, parches, y adhesivos. La administración intraocular puede tomar la forma de inyecciones, depósitos o implantes subconjuntivos, en la cápsula subtenón, retrobulbar o intravítrea. Los compuestos administrados por estas rutas pueden estar en forma de solución o suspensión. La administración de compuestos por inyección de depósito puede contener soportes o excipientes farmacéuticamente aceptables; estos pueden ser naturales o sintéticos y pueden ser biodegradables o no biodegradables y facilitar la liberación de fármaco de una manera controlada. Los implantes usados para la liberación controlada de un compuesto pueden estar compuestos de materiales naturales o sintéticos, biodegradables o no biodegradables. El soporte es aceptable en que es compatible con los otros componentes de la composición y no el lesivo para el paciente. Algunos ejemplos de soportes incluyen (1) azúcares tal como lactosa, glucosa y sacarosa, (2) almidones tal como almidón de maíz y fécula de patata, (3) celulosa y (4) ciclodextrinas. Una formulación tópica útil se describe en la publicación PCT WO 2011/072141.
Las formulaciones para la administración tópica a la piel pueden incluir, por ejemplo, pomadas, cremas, geles y pastas que comprenden el compuesto de amina primaria en un soporte farmacéuticamente aceptable. La formulación del compuesto de amina primaria para uso tópico incluye la preparación de bases de pomada oleaginosas o solubles en agua, como saben bien los expertos en la materia. Por ejemplo, estas formulaciones pueden incluir aceites vegetales, grasas animales, y, por ejemplo, hidrocarburos semisólidos obtenidos de petróleo. Los componentes particulares usados pueden incluir pomada blanca, pomada amarilla, cera de ésteres cetílicos, ácido oleico, aceite de oliva, parafina, vaselina, vaselina blanca, espermaceti, glicerito de almidón, cera blanca, cera amarilla, lanolina, lanolina anhidra y monoestearato de glicerilo. También se pueden usar varias bases de pomada solubles en agua, incluyendo éteres de glicol y derivados, polietilenglicoles, estearato de polioxil 40 y polisorbatos.
Las formulaciones para la administración tópica pueden contener el compuesto usado en la presente solicitud a una concentración en el intervalo del 0,001-10%, 0,05-10%, 0,1-10%, 0,2-10%, 0,5-10%, 1-10%, 2-10%, 3-10%, 4-10%, 5-10%, o 7-10% (peso/peso), o en el intervalo del 0,001-2,0%, 0,001-1,5%, o 0,001-1,0%, (peso/volumen), o en el intervalo del 0,05-2,0%, 0,05-1,5%, o 0,05-1,0%, (peso/volumen), o en el intervalo del 0,1 -5,0%, 0,1-2,0%, 0,1-1,5%, o 0,1-1,0% (peso/volumen), o en el intervalo del 0,5-5,0%, 0,5-2,0%, 0,5-1,5%, o 0,5-1,0% (peso/volumen), o en el intervalo del 1-5,0%, 1-2,0%, o 1-1,5% (peso/volumen). Las formulaciones para la administración tópica también pueden contener el compuesto usado en la presente solicitud a una concentración en el intervalo del 0,001-2,5%, 0,01-2,5%, 0,05-2,0%, 0,1-2,0%, 0,2-2,0%, 0,5-2,0%, o 1-2,0% (peso/peso), o en el intervalo del 0,001-2,0%, 0,001-1,5%, 0,001-1,0%, o 0,001-5% (peso/peso).
En una formulación de colirio la composición puede contener el compuesto activo a una concentración del 0,01-20%, 0,02-15%, 0,04-10%, 0,06-5%, 0,08-1%, o 0,09-0,5% (peso/volumen) con o sin ajuste de pH y/u osmótico a la solución. Más en particular, la formulación de colirio puede contener un compuesto descrito en el presente documento a una concentración del 0,09-0,5% (peso/volumen), tal como el 0,1%.
En una ejemplificación, las composiciones farmacéuticas abarcan una composición hecha mezclando una cantidad terapéuticamente eficaz de un compuesto descrito en el presente documento con un soporte oligomérico o polimérico tal como una ciclodextrina, o ciclodextrina químicamente modificada, incluyendo trimetil-p-ciclodextrina, 2-hidroxietilp-ciclodextrina, 2-hidroxipropil-p-ciclodextrina, 3-hidroxipropil-p-ciclodextrina, y éter sulfobutílico de p-ciclodextrina sal sódica (o sal de potasio). Ejemplificando un soporte oligomérico o polimérico es una sal sódica de éter sulfobutílico de p-ciclodextrina. La cantidad de sal sódica de éter sulfobutílico de p-ciclodextrina en la composición puede variar desde aproximadamente el 0,01% al 30% peso/volumen. En una ilustración, la concentración de sal sódica de éter sulfobutílico de p-ciclodextrina es el 5-25% peso/volumen. Ilustración adicional de la concentración de sal sódica de éter sulfobutílico de p-ciclodextrina es el 6-20% peso/volumen. En una ejemplificación, la concentración de sal sódica de éter sulfobutílico de p-ciclodextrina es el 6-12% peso/volumen. Ejemplificación adicional de la concentración de sal sódica de éter sulfobutílico de p-ciclodextrina es el 9-10% peso/volumen, incluyendo el 9,5% peso/volumen. La cantidad del compuesto descrito en el presente documento puede variar del 0,01-20%, 0,02-15%, 0,04-10%, 0,06-5%, 0,08-1%, o 0,09-0,5% (peso/volumen). Más en particular, la composición puede contener un compuesto descrito en el presente documento a una concentración del 0,09-0,5% (peso/volumen), tal como el 0,1%.
Los compuestos descritos en el presente documento se pueden administrar por vía oral y como tal las composiciones farmacéuticas que contienen el ingrediente activo pueden estar en forma adecuada para uso oral, por ejemplo, como comprimidos, pastillas, grajeas, suspensiones acuosas u oleaginosas, polvos o gránulos dispersables, emulsiones, cápsulas duras o blandas, o jarabes o elixires. Las composiciones destinadas para uso oral se pueden preparar según cualquier método conocido en la técnica para la fabricación de composiciones farmacéuticas y tales composiciones pueden contener uno o más agentes seleccionados del grupo que consiste en agentes edulcorantes, agentes saborizantes, agentes colorantes y agentes conservantes con el fin de proporcionar preparaciones farmacéuticamente elegantes y sabrosas.
Para la administración oral en forma de un comprimido o cápsula (por ejemplo, cápsula de gelatina), el componente de fármaco activo se puede combinar con un soporte oral, no tóxico farmacéuticamente aceptable inerte tal como etanol, glicerol, agua y similares. Además, cuando se deseada o es necesario, también se pueden incorporar aglutinantes, lubricantes, agentes disgregantes y agentes colorantes adecuados a la mezcla. Los aglutinantes adecuados incluyen almidón, silicato de magnesio y aluminio, pasta de almidón, gelatina, metilcelulosa, carboximetilcelulosa de sodio y/o polivinilpirrolidona, azúcares naturales tal como glucosa, beta-lactosa, edulcorantes de maíz, gomas naturales y sintéticas tal como goma arábiga, tragacanto o alginato de sodio, polietilenglicol, ceras y similares. Los liubricantes usados en estas formas posológicas incluyen oleato de sodio, estearato de sodio, estearato de magnesio, benzoato de sodio, acetato de sodio, cloruro de sodio, sílice, talco, ácido esteárico, su sal de magnesio o calcio y/o polietilenglicol y similares. Los disgregantes incluyen, sin limitación, almidón, metilcelulosa, agar, bentonita, almidones de goma xantana, agar, ácido algínico o su sal de sodio, o mezclas efervescentes, croscarmelosa o su sal de sodio, y similares. Los diluyentes incluyen, por ejemplo, lactosa, dextrosa, sacarosa, manitol, sorbitol, celulosa y/o glicina.
Los comprimidos contienen el ingrediente activo en mezcla con excipientes farmacéuticamente aceptables no tóxicos que son adecuados para la fabricación de comprimidos. Estos excipientes pueden ser, por ejemplo, diluyentes inertes, tal como carbonato de calcio, carbonato de sodio, lactosa, fosfato de calcio o fosfato de sodio; agentes granuladores y disgregantes, por ejemplo, almidón de maíz, o ácido algínico; agentes aglutinantes, por ejemplo, almidón, gelatina o goma arábiga, y agentes lubricantes, por ejemplo, estearato de magnesio, ácido esteárico o talco. Los comprimidos pueden estar sin recubrir o pueden estar recubiertos por técnicas conocidas para retrasar la disgregación y absorción en el aparato digestivo y mediante ello proporcionar una acción sostenida durante un periodo más largo.
Una dosis terapéuticamente eficaz, de un compuesto descrito en el presente documento en una formulación oral, puede variar de 0,01 mg/kg a 50 mg/kg de peso corporal de paciente al día, más en particular de 0,01 mg/kg a 10 mg/kg, que se puede administrar en una dosis única o múltiples al día. Para la administración oral el fármaco se puede administrar en forma de comprimidos o cápsulas que contienen de 1 mg a 500 mg del ingrediente activo específicamente 1 mg, 5 mg, 10 mg, 20 mg, 50 mg, 100 mg, 250 mg y 500 mg, o en formas de comprimidos o cápsulas que contienen al menos el 1%, 2%, 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 40%, 50% (p/p) del ingrediente activo. Por ejemplo, las cápsulas pueden contener 50 mg del ingrediente activo, o el 5-10% (p/p) del ingrediente activo. Por ejemplo, los comprimidos pueden comprender 100 mg del ingrediente activo, o el 20-50% (p/p) del ingrediente activo. Por ejemplo, el comprimido puede contener, además del ingrediente activo, un disgregante (por ejemplo, croscarmelosa o su sal de sodio y metilcelulosa), un diluyente (por ejemplo, celulosa mcirocristalina), y un lubricante (por ejemplo, estearato de sodio y estearato de magnesio). El fármaco se puede administrar en una base diaria ya sea una vez, dos veces o más al día.
Para la administración por inhalación, los compuestos se administran en forma de un espray aerosol de un envase o dispensador presurizado, que contiene un propelante adecuado, por ejemplo, un gas tal como dióxido de carbono, o un nebulizador.
Para la administración transmucosa o transdérmica, se usan penetrantes adecuados para la barrera que se va a permear en la formulación. Tales penetrantes en general se conocen en la técnica, e incluyen, por ejemplo, para la administración transmucosa, detergentes, sales biliares, y derivados de ácido fusídico. La administración transmucoda se puede lograr mediante el uso de espráis nasales o supositorios. Para la administración transdérmica, los compuestos activos se formulan en pomadas, bálsamos, geles o cremas como se sabe en general en la técnica.
Las formulaciones parenterales que comprenden un compuesto descrito en el presente documento se pueden preparar en soluciones o suspensiones isotónicas acuosas, y los supositorios se preparan ventajosamente de emulsiones o suspensiones grasas. Las formulaciones se pueden esterilizar y/o contener adyuvantes, tal como agentes conservantes, estabilizantes, humectantes o emulsionantes, promotores de solución, sales para regular la presión osmótica y/o tampones. Además, también pueden contener otras sustancias terapéuticamente valiosas. Las composiciones se preparan según métodos convencionales, y pueden contener aproximadamente del 0,1 al 75%, preferiblemente aproximadamente del 1 al 50% de un compuesto descrito en el presente documento.
Las frases “administración parenteral” y “administrado por vía parenteral” son términos reconocidos en la técnica, e incluyen modos de administración diferentes de la administración entérica y tópica, tal como inyecciones, e incluyen, sin limitación inyección e infusión intravenosa, intramuscular, intrapleural, intravascular, intrapericárdica, intraarterial, intratecal, intracapsular, intraorbital, intracardiaca, intradérmica, intraperitoneal, transtraqueal, subcutánea, suncuticular, intraarticular, subcapsular, subaracnoidea, intraespinal e intracisternal.
3. Descripción de compuestos ejemplares
El deuterio (D o 2H) es un isótopo estable no radioactivo de hidrógeno y tiene un peso atómico de 2,0144. El hidrógeno se produce de forma natural como una mezcla de isótopos 1H (hidrógeno o protio), D (2H o deuterio), y T (3H o tritio). Un experto en la materia aprecia que la designación “hidrógeno” en compuestos químicos que contienen hidrógeno realmente representa una mezcla de hidrógeno y aproximadamente el 0,015% de deuterio.
La deuteración completa, o deuteración al 100%, en cualquier sitio puede ser difícil de alcanzar en el laboratorio. Cuando se indica un átomo de deuterio en un sitio determinado en cualquier compuesto descrito en el presente documento, se entiende que un pequeño porcentaje de hidrógeno puede aun estar presente. Se dice que tales compuestos están enriquecidos con deuterio. Los compuestos enriquecidos con deuterio se preparan mediante síntesis utilizando materiales de partida apropiadamente enriquecidos. Como se usa en el presente documento, los términos “enriquecido con deuterio” o “enriquecimiento con deuterio” se refieren a un compuesto, o un sitio particular de dicho compuesto, que comprende deuterio en una cantidad que es mayor que su abundancia isotópica natural (0,015%). Según esto, en algunas formas de realización, la presente invención proporciona compuestos que comprenden deuterio en un sitio determinado, en donde el porcentaje o nivel de incorporación de deuterio es mayor que su abundancia isotópica natural.
Según un aspecto, la presente invención proporciona un compuesto de fórmula I como se reivindica. También se describe un compuesto de fórmula I:
o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, en donde
R1 se selecciona de -N H 2, -NHD, o -N D 2;
R2 se selecciona de hidrógeno o deuterio;
R3 y R4 se seleccionan independientemente de -C H 3, -CH2D, -CHD2, o -C D 3; y
R5, R6, R7, y R8 se seleccionan cada uno independientemente de hidrógeno o deuterio;
siempre que al menos uno de R1, R2, R3, R4, R5, R6, R7, o R8 sea o contenga deuterio.
También se describe un compuesto de fórmulaI-A:
o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, en donde
R1 se selecciona de -N H 2, -NHD, o -N D 2;
R2 se selecciona de hidrógeno o deuterio;
R3 y R4 se seleccionan independientemente de -C H 3, -CH2D, -CHD2, o -C D 3; y
R5, R6, R7, y R8 se seleccionan cada uno independientemente de hidrógeno o deuterio;
siempre que al menos uno de R1, R2, R3, R4, R5, R6, R7, o R8 sea o contenga deuterio.
También se describe un compuesto de fórmulaII-AoII-B:
o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, en donde
R1 se selecciona de -N H 2, -NHD, o -N D 2;
R2 se selecciona de hidrógeno o deuterio;
R3 y R4 se seleccionan independientemente de -C H 3, -CH2D, -CHD2, o -C D 3; y
R5, R6, R7, y R8 se seleccionan cada uno independientemente de hidrógeno o deuterio;
siempre que al menos uno de R1, R2, R3, R4, R5, R6, R7, o R8 fórmulaII-Asea o conteng
También se describe un compuesto de fórmula III-A, III-B o III-C:
o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, en donde
R1 se selecciona de -N H 2, -NHD, o -N D 2;
R2 se selecciona de hidrógeno o deuterio;
R3 y R4 se seleccionan independientemente de -C H 3, -CH2D, -CHD2, o -C D 3; y
R5, R6, R7, y R8 se seleccionan cada uno independientemente de hidrógeno o deuterio;
siempre que al menos uno de R1, R2, R3, R4, R5, R6, R7, o R8 sea o contenga deuterio.
También se describe un compuesto de fórmula IV:
o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, en donde
R1 se selecciona de -N H 2, -NHD, o -N D 2;
R2 se selecciona de hidrógeno o deuterio;
R3 y R4 se seleccionan independientemente de -C H 3, -CH2D, -CHD2, o -C D 3; y
R5, R6, R7, y R8 se seleccionan cada uno independientemente de hidrógeno o deuterio;
siempre que al menos uno de R1, R2, R3, R4, R5, R6, R7, o R8 sea o contenga deuterio.
También se describe un compuesto de fórmula V:
o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, en donde
R1 se selecciona de -N H 2, -NHD, o -N D 2;
R2 se selecciona de hidrógeno o deuterio;
R3 y R4 se seleccionan independientemente de -C H 3, -CH2D, -CHD2, o -C D 3; y
R5, R6, R7, y R8 se seleccionan cada uno independientemente de hidrógeno o deuterio;
siempre que al menos uno de R1, R2, R3, R4, R5, R6, R7, o R8 sea o contenga deuterio.
También se describe un compuesto de fórmula VI-A o VI-B:
o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, en donde:
cada A es independientemente hidrógeno o deuterio;
R1 se selecciona de -N H 2, -NHD, o -N D 2;
R2 se selecciona de hidrógeno o deuterio; y
R5, R6, R7, y R8 se seleccionan cada uno independientemente de hidrógeno o deuterio; siempre que al menos uno de A, R1, R2, R5, R6, R7, o R8 sea o contenga deuterio.
También se describe un compuesto de fórmulaVII-AoVII-B:
o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, en donde:
cada A es independientemente hidrógeno o deuterio;
R1 se selecciona de -N H 2, -NHD, o -N D 2;
R2 se selecciona de hidrógeno o deuterio;
R3 y R4 se seleccionan independientemente de -C H 3, -CH2D, -CHD2, o -C D 3; y
R8 se selecciona de hidrógeno o deuterio;
siempre que al menos uno de R1, R2, R3, R4, A, o R8 sea o contenga deuterio.
También se describe un compuesto de fórmulaVIII-AoVIII-B:
o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, en donde:
cada A es independientemente hidrógeno o deuterio;
R1 se selecciona de -N H 2, -NHD, o -N D 2;
R2 se selecciona de hidrógeno o deuterio;
R3 y R4 se seleccionan independientemente de -C H 3, -CH2D, -CHD2, o -C D 3; y
R5 y R8 se seleccionan cada uno independientemente de hidrógeno o deuterio;
siempre que al menos uno de A, R1, R2, R3, R4, R5, o R8 sea o contenga deuterio.
También se describe un compuesto de fórmulaIX-AoIX-B:
o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, en donde:
R1 se selecciona de -N H 2, -NHD, o -N D 2;
R2 se selecciona de hidrógeno o deuterio;
R3 y R4 se seleccionan independientemente de -C H 3, -CH2D, -CHD2, o -C D 3; y
R5, R6, R7, y R8 se seleccionan cada uno independientemente de hidrógeno o deuterio;
siempre que al menos uno de R1, R2, R3, R4, R5, R6, R7, o R8 sea o contenga deuterio.
También se describe un compuesto de fórmula X:
o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, en donde:
R1 se selecciona de -N H 2, -NHD, o -N D 2;
R2 se selecciona de hidrógeno o deuterio;
R3 y R4 se seleccionan independientemente de -C H 3, -CH2D, -CHD2, o -C D 3; y
R5 y R6 se seleccionan cada uno independientemente de hidrógeno o deuterio;
siempre que al menos uno de R1, R2, R3, R4, R5, o R6 sea o contenga deuterio.
Las siguientes formas de realización son aplicables a cada una de las fórmulas precedentes.
Como se ha definido anteriormente y se describe en el presente documento, R1 se selecciona de -N H 2, -NHD, o -ND2.
En algunas formas de realización, R1 es -N H 2. En algunas formas de realización, R1 es -N H 2 y al menos uno de R2, R3, R4, R5, R6, R7, o R8 es o contiene deuterio.
En algunas formas de realización, R1 es -NHD. En algunas formas de realización, R1 es -NHD y al menos uno de R2, R3, R4, R5, R6, R7, o R8 es o contiene deuterio.
En algunas formas de realización, R1 es -N D 2. En algunas formas de realización, R1 es -N D 2 y al menos uno de R2, R3, R4, R5, R6, R7, o R8 es o contiene deuterio.
Como se ha definido anteriormente y se describe en el presente documento, A se selecciona de hidrógeno o deuterio.
En algunos casos, A es hidrógeno. En algunos casos, A es hidrógeno y al menos uno de R1, R2, R3, R4, R5, R6, R7, o R8 es o contiene deuterio. En algunos casos, A es deuterio. En algunos casos, A es deuterio y al menos uno de R1, R2, R3, R4, R5, R6, R7, o R8es o contiene deuterio.
Como se ha definido anteriormente y se describe en el presente documento, R2 se selecciona de hidrógeno o deuterio.
En algunas formas de realización, R2 es hidrógeno. En algunas formas de realización, R2 es hidrógeno y al menos uno de R1, R3, R4, R5, R6, R7, o R8 es o contiene deuterio. En algunas formas de realización, R2 es deuterio. En algunas formas de realización, R2 es deuterio y al menos uno de R1, R3, R4, R5, R6, R7, o R8es o contiene deuterio.
Como se ha definido anteriormente y se describe en el presente documento, R3 se selecciona de -C H 3, -CH2D, -CHD2, o —CD3.
En algunos casos R3 es -C H 3. En algunos casos R3 es -CH 3 y al menos uno d R2, R4, R5, contiene deuterio.
En algunos casos R3 es -CH2D. En algunos casos R3 es -CH2D y al menos uno de R1, R2, R4, R5, R6, contiene deuterio.
En algunos casos R3 es -CHD2. En algunos casos R3 es -CHD2 y al menos uno de R1, R2, R4, R5, R6, contiene deuterio.
En algunas formas de realización R3 es -C D 3. En algunos casos R3 es -C D 3 y al menos uno de R1, R2, R4, R5, R6, R7, o R8 es o contiene deuterio.
Como se ha definido anteriormente y se describe en el presente documento, R4 se selecciona de -C H 3, -CH2D, -CHD2, o —CD3.
En algunos casos R4 es -C H 3. En algunos casos R3 es -CH 3 y al menos uno de R2, R3, R5, contiene deuterio.
En algunos casos R4 es -CH2D. En algunos casos R3 es -CH2D y al menos uno de R1, R2, R5, R6, R7, contiene deuterio.
En algunos casos R4 es -CHD2. En algunos casos R3 es -CHD2 y al menos uno de R1, R2, R5, R6, R7, contiene deuterio.
En algunas formas de realización R4 es -C D 3. En algunos casos R3 es -C D 3 y al menos uno de R1, R2, R3, R5, o R8 es o contiene deuterio.
Como se ha definido anteriormente y se describe en el presente documento, R5 se selecciona de hidrógeno o deuterio.
En algunas formas de realización, R5 es hidrógeno. En algunas formas de realización, R5 es hidrógeno y al menos uno de R1, R2, R3, R4, R6, R7, o R8 es o contiene deuterio. En algunas formas de realización, R5 es deuterio. En algunas formas de realización, R5 es deuterio y al menos uno de R1, R2, R3, R4, R6, R7, o R8 es o contiene deuterio.
Como se ha definido anteriormente y se describe en el presente documento, R6 se selecciona de hidrógeno o deuterio.
En algunas formas de realización, R6 es hidrógeno. En algunas formas de realización, R6 es hidrógeno y al menos uno de R1, R2, R3, R4, R5, R7, o R8 es o contiene deuterio. En algunas formas de realización, R6 es deuterio. En algunas formas de realización, R6 es deuterio y al menos uno de R1, R2, R3, R4, R5, R7, o R8 es o contiene deuterio.
Como se ha definido anteriormente y se describe en el presente documento, R7 se selecciona de hidrógeno o deuterio.
En algunas formas de realización, R7 es hidrógeno. En algunas formas de realización, R7 es hidrógeno y al menos uno de R1, R2, R3, R4, R5, R6, o R8 es o contiene deuterio. En algunas formas de realización, R7 es deuterio. En algunas formas de realización, R7 es deuterio y al menos uno de R1, R2, R3, R4, R5, R6, o R8 es o contiene deuterio.
Como se ha definido anteriormente y se describe en el presente documento, R8 se selecciona de hidrógeno o deuterio.
En algunas formas de realización, R8 es hidrógeno. En algunas formas de realización, R8 es hidrógeno y al menos uno de R1, R2, R3, R4, R5, R6, o R7 es o contiene deuterio. En algunas formas de realización, R8 es deuterio. En algunas formas de realización, R8 es deuterio y al menos uno de R1, R2, R3, R4, R5, R6, o R7 es o contiene deuterio.
En algunas formas de realización, la presente invención proporciona un compuestos de fórmulasI,I-A,II-A,II-B,III-A,III-B,III-C,IVoVcomo se reivindica, en donde cada uno de R3, R4, R5, R6, R7 y R8 es como se han definido anteriormente y se describe en el presente documento, y en donde cada uno de R1 y R2 es como se define en una entrada mostrada en la tabla 1a, a continuación
Tabla 1a.
En algunas formas de realización, la presente invención proporciona un compuestos de fórmulasI,I-A,II-A,II-B,III-A,III-B,III-C,IVoVcomo se reivindica, en donde cada uno de R1, R2, R5, R6, R7 y R8 es como se han definido anteriormente y se describe en el presente documento, y en donde cada uno de R3 y R4 es como se define en una entrada mostrada en la tabla 1b, a continuación
Tabla 1b.
En algunas formas de realización, la presente invención proporciona un compuestos de fórmulasI,I-A,II-A,II-B,III-A,III-B,III-C,IVoVcomo se reivindica, en donde cada uno de R1, R2, R3 y R4 es como se han definido anteriormente y se describe en el presente documento, y en donde cada uno de R5, R6, R7 y R8 es como se define en una entrada mostrada en la tabla 1c, a continuación
Tabla 1c.
En algunas formas de realización, la presente invención proporciona un compuestos de fórmulasI,I-A,II-A,II-B,III-A,III-B,III-C,IVoVcomo se reivindica, en donde cada uno de R1 y R2 es como se ha definido en una entrada mostrada en la tabla 1a, anteriormente, cada uno de R3 y R4 es como se define en una entrada mostrada en la tabla 1b, anteriormente, y donde cada uno de R5, R6, R7 y R8 es como se define en una entrada mostrada en la tabla 1c, anteriormente.
En algunas formas de realización, la presente invención proporciona un compuesto como se reivindica seleccionado de los enumerados en cualquiera de la tabla 1a, tabla 1b, o tabla 1c, o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo.
En algunas formas de realización, la presente invención proporciona un compuesto de fórmulaIcomo se reivindica y seleccionado de los representados en la tabla 2, a continuación.
Tabla 2. Compuestos representativos de fórmula I
��
1-31
En algunas formas de realización, la presente invención proporciona un compuesto representado en la tabla 2, anteriormente, y como se reivindica o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo.
También se describe un análogo enriquecido con deuterio de un compuesto representado en la tabla 2A, a continuación, o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, en la que deuterio está enriquecido en cualquier hidrógeno disponible.
Tabla 2A.
En algunas formas de realización, la presente invención proporciona cualquier compuesto según se reivindica que comprende uno, dos, tres, cuatro, cinco, seis, siete, ocho, nueve, diez, once, doce, o trece átomos de deuterio.
En algunas formas de realización, los compuestos proporcionados comprenden deuterio en una cantidad de aproximadamente el 5%, aproximadamente el 10%, aproximadamente el 15%, aproximadamente el 20% aproximadamente el 25%, aproximadamente el 30%, aproximadamente el 35%, aproximadamente el 40% aproximadamente el 45%, aproximadamente el 50%, aproximadamente el 55%, aproximadamente el 60% aproximadamente el 65%, aproximadamente el 70%, aproximadamente el 75%, aproximadamente el 80% aproximadamente el 85%, aproximadamente el 90%, aproximadamente el 95%, o aproximadamente el 100%. Como se usa en el presente documento en el, contexto de enriquecimiento con deuterio, el término “aproximadamente” significa ±2%.
En ciertas formas de realización, la presente invención proporciona cualquier compuesto como se reivindica, o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo.
En ciertas formas de realización, la presente invención proporciona cualquier compuesto como se reivindica en forma aislada.
4. Usos de compuestos y composiciones farmacéuticamente aceptables de los mismos
Se encuentra que ciertos compuestos descritos en el presente documento son útiles en captar aldehídos tóxicos, tales como MDA y HNE. Los compuestos descritos en el presente documento experimentan una condensación de base de Schiff con MDA, HNE u otros aldehídos tóxicos, y forman un complejo con los aldehídos en una reacción energéticamente favorable, disminuyendo o eliminando de esta manera aldehídos disponibles para reacción con una proteína, lípido, hidrato de carbono o ADN. De forma importante, los compuestos descritos en el presente documento pueden reaccionar con aldehídos para formar un compuesto que tiene una estructura de anillo cerrado que contiene los aldehídos, atrapando así los aldehídos y previniendo que los aldehídos se liberen de vuelta al medio celular.
Como se usa en el presente documento, los términos “tratamiento”, “tratar”, y “que trata” se refieren a revertir, aliviar, retrasar el inicio de, o inhibir la evolución de una enfermedad o trastorno, o uno o más síntomas de la misma, como se describe en el presente documento. En algunas formas de realización, el tratamiento se administra después de que uno o más síntomas se hayan desarrollado. En otras formas de realización, el tratamiento se administra en ausencia de síntomas. Por ejemplo, el tratamiento se administra a un individuo susceptible antes del inicio de los síntomas (por ejemplo, a la luz de unos antecedentes de síntomas y/o a la luz de factores de susceptibilidad genéticos u otros). El tratamiento también sigue después de que los síntomas se hayan resuelto, por ejemplo, para prevenir, retrasar o minimizar la gravedad de su recurrencia.
La invención se refiere a compuestos descritos en el presente documento para el tratamiento, prevención, y/o reducción de un riesgo de enfermedades, trastornos, o afecciones en las que la toxicidad de aldehídos está implicada en la patogénesis.
Los ejemplos de las enfermedades, trastornos, o afecciones en las que la toxicidad de aldehídos está implicada incluyen una enfermedad, trastorno o afección ocular, incluyendo, pero no limitado a, una enfermedad corneal (por ejemplo, síndrome de ojo seco, cataratas, queratocono, queratopatía bullosa y otras, y distrofia endotelial de Fuch), otros trastornos o afecciones oculares (por ejemplo, conjuntivitis alérgica, penfigoide cicatricial ocular, afecciones asociadas con cicatrización de PRK y otras cicatrizaciones corneales, y afecciones asociadas con degradación de los lípidos de las lágrimas o disfunción de la glándula lacrimal), y otras afecciones oculares asociadas con altos niveles de aldehidos como resultado de inflamación (por ejemplo, uveítis, escleritis, síndrome de Stevens-Johnson ocular, rosácea ocular (con o sin disfunción de la glándula meibomiana)). En un ejemplo, la enfermedad, trastorno o afección ocular no es degeneración macular, tal como degeneración macular senil (“AMD”), o enfermedad de Stargardt. En un ejemplo adicional, la enfermedad, trastorno o afección ocular es síndrome de ojo seco, rosácea ocular o uveítis.
Los ejemplos de las enfermedades, trastornos, afecciones o indicaciones en las que la toxicidad de aldehídos está implicada también incluyen trastornos no oculares, incluyendo psoriasis, lupus tópico (discoide), dermatitis de contacto, dermatitis atópica, dermatitis alérgica, dermatitis de radiación, acné vulgar, síndrome de Sjogren-Larsson y otras ictiosis, elastosis solar/arrugas, firmeza del tono de la piel, hinchazón, eccema, cambios en la piel inducidos por tabaco o irritantes, incisión dérmica, una afección de la piel asociada a quemadura y/o herida, lupus, esclerodermia, asma, enfermedad pulmonar obstructiva crónica (EPOC), artritis reumatoide, enfermedad intestinal inflamatoria, septicemia, ateroesclerosis, lesión isquémica-reperfusión, enfermedad de Parkinson, enfermedad de Alzheimer, deficiencia en semialdehído succínico deshidrogenasa, esclerosis múltiple, esclerosis lateral amiotrófica, diabetes, síndrome metabólico, trastornos seniles, y enfermedades fibróticas. En un ejemplo adicional, el trastorno no ocular es una enfermedad, trastorno, o afección de la piel seleccionada de dermatitis de contacto, dermatitis atópica, dermatitis alérgica, y dermatitis de radiación. En otro ejemplo, el trastorno no ocular es una enfermedad, trastorno, o afección de la piel seleccionada de síndrome de Sjogren-Larsson y una indicación cosmética asociada con quemadura y/o herida.
En un ejemplo adicional, las enfermedades, trastornos, o afecciones en las que la toxicidad de aldehídos está implicada es un trastorno senil. Los ejemplos de enfermedades, trastornos o afecciones seniles incluyen arrugas, sequedad y pigmentación de la piel.
Los ejemplos de las enfermedades, trastornos o afecciones en las que la toxicidad de aldehídos está implicada además incluyen afecciones asociadas con los ejemplos tóxicos de agentes vesicantes, o quemaduras de agentes alcalinos. Los compuestos descritos en el presente documento disminuyen o eliminan los aldehídos tóxicos y de esta manera tratan, previenen y/o reducen un riesgo de estas enfermedades o trastornos.
En una forma de realización, la invención se refiere al tratamiento, prevención y/o reducción de un riesgo de una enfermedad, trastorno o afección ocular en la que la toxicidad de aldehídos está implicada en la patogénesis, que comprende administrar a un sujeto en necesidad de ello un compuesto descrito en el presente documento. La enfermedad, trastorno, o afección ocular incluye, pero no está limitada a, una enfermedad corneal (por ejemplo, síndrome de ojo seco, cataratas, queratocono, queratopatía bullosa y otras, y distrofia endotelial de Fuch), otros trastornos o afecciones oculares (por ejemplo, conjuntivitis alérgica, penfigoide cicatricial ocular, afecciones asociadas con cicatrización de PRK y otras cicatrizaciones corneales, y afecciones asociadas con degradación de los lípidos de las lágrimas o disfunción de la glándula lacrimal), y otras afecciones oculares donde la inflamación produce altos niveles de aldehídos (por ejemplo, uveítis, escleritis, síndrome de Stevens-Johnson ocular, rosácea ocular (con o sin disfunción de la glándula meibomiana)). La enfermedad, trastorno o afección ocular no incluye degeneración macular, tal como AMD, o enfermedad de Stargardt. En una ilustración, en la enfermedad, trastorno o afección ocular la cantidad o concentración de MDA o HNE está aumentada en los tejidos o células oculares. Por ejemplo, la cantidad o concentración de aldehídos (por ejemplo, MDA o HNE) está aumentada en al menos 1,1 veces, 1,2 veces, 1,3 veces, 1,4 veces, 1,5 veces, 2 veces, 2,5 veces, 5 veces, 10 veces comparada con esa en tejidos o células oculares normales. Los compuestos descritos en el presente documento, tal como el compuesto 9, disminuyen la concentración de aldehídos (por ejemplo, MDA y HNE) de una manera dependiente del tiempo. La cantidad o concentración de aldehídos (por ejemplo, MDA o HNE) se puede medir por método o técnicas conocidos en la materia, tal como las descritas en Tukozkanet al.,Furat Tip Dergisi 11: 88-92 (2006).
En una clase, la enfermedad, trastorno o afección ocular es síndrome de ojo seco. En una segunda clase, la enfermedad, trastorno o afección ocular es una afección asociada con cicatrización de PRK y otra cicatrización corneal. Por ejemplo, la invención se dirige a avanzar la cicatrización de PRK u otra cicatrización corneal, que comprende administrar a un sujeto en necesidad de ello un compuesto descrito en el presente documento. En una tercera clase, la enfermedad, trastorno o afección ocular es una afección ocular asociada con altos niveles de aldehídos como resultado de inflamación (por ejemplo, uveítis, escleritis, síndrome de Stevens-Johnson ocular, y rosácea ocular (con o sin disfunción de la glándula meibomiana). En una cuarta clase, la enfermedad, trastorno o afección ocular es queratocono, cataratas, queratopatía bullosa y otra, distrofia endotelial de Fuch, penfigoide cicatricial ocular o conjuntivitis alérgica. El compuesto descrito en el presente documento se puede administrar por vía tópica o sistémica, como se describe en el presente documento posteriormente.
En una segunda forma de realización, la invención se refiere al tratamiento, prevención, y/o reducción de un riesgo de un trastorno o afección de la piel o una indicación cosmética, en la que la toxicidad de aldehídos está implicada en la patogénesis, que comprende administrar a un sujeto en necesidad de ello un compuesto descrito en el presente documento. El trastorno o afección de la piel incluye, pero no está limitado a, psoriasis, esclerodermia, lupus tópico (discoide), dermatitis de contacto, dermatitis atópica, dermatitis alérgica, dermatitis de radiación, acné vulgar, y síndrome de Sjogren-Larsson y otras ictiosis, y la indicación cosmética es elastosis solar/arrugas, firmeza del tono de la piel, hinchazón, eccema, cambios en la piel inducidos por tabaco o irritantes, incisión dérmica, o una afección de la piel asociada a quemadura y/o herida. En algunas formas de realización, la invención se refiere a enfermedades, trastornos, o afecciones seniles de la piel, como se describe en el presente documento.
Varios trastornos o afecciones de la piel, tal como dermatitis atópica, lupus tópico (discoide), psoriasis y esclerodermia, se caracterizan por altos niveles de MDA y HNE (Br J Dermatol 149: 248 (2003); j Ea DV 26: 833 (2012); Clin Rheumatol 25: 320 (2006)). Además, la ictiosis característica del síndrome de Sjogren-Larsson (SLS) se origina de la acumulación de aldehídos grasos, que perturba la función normal y la secreción de cuerpos lamelares (LB), y produce depósitos de lípidos intercelulares en al estrato córneo (SC) y una barrera de agua defectuosa en la capa de la piel (W.B. Rizzoet al.(2010)). La enzima, aldehído graso deshidrogenasa, que metaboliza los aldehídos es disfuncional en pacientes de SLS. Por tanto, los compuestos que reducen o eliminan los aldehídos, tal como los compuestos descritos en el presente documento, se pueden usar para tratar, prevenir, y/o reducir un riesgo de trastornos o afecciones de la piel en las que la toxicidad de los aldehídos está implicada en la patogénesis, tal como las descritas en el presente documento. Además, con una mejora respecto a la barrera de agua y la prevención de inflamación mediada por aldehídos (incluyendo fibrosis y elastosis (Chairpottoet al.(2005)), muchas indicaciones cosméticas, tal como elastosis solar/arrugas, tono de piel, firmeza (hinchazón), eccema, cambios en la piel inducidos por tabaco o irritantes y cosmesis de incisión dérmica, y afecciones de la piel asociadas con quemadura y/o herida se pueden tratar usando el método de la invención.
En una clase, la enfermedad, trastorno o afección de la piel es psoriasis, esclerodermia, lupus tópico (discoide), dermatitis de contacto, dermatitis atópica, dermatitis alérgica, dermatitis de radiación, acné vulgar, o síndrome de Sjogren-Larsson y otras ictiosis. En una ejemplificación, la enfermedad, trastorno o afección de la piel es dermatitis de contacto, dermatitis atópica, dermatitis alérgica, dermatitis de radiación, o síndrome de Sjogren-Larsson y otras ictiosis. En una segunda clase, la indicación cosmética es elastosis solar/arrugas, firmeza del tono de la piel, hinchazón, eccema, cambios en la piel inducidos por tabaco o irritantes, incisión dérmica, o una afección de la piel asociada a quemadura y/o herida.
En una tercera forma de realización, la invención se refiere al tratamiento, prevención, y/o reducción de un riesgo de una afección asociada con los efectos tóxicos de agentes vesicantes o quemaduras de agentes alcalinos en las que la toxicidad de aldehídos está implicada en la patogénesis, que comprende administrar a un sujeto en necesidad de ello un compuesto descrito en el presente documento.
Los agentes vesicantes incluyen, pero no están limitados a, mostaza de azufre, mostaza de nitrógeno, y oxima de fosgeno. Los efectos tóxicos o lesivos de agentes vesicantes incluyen dolor, irritación, y/o desgarro en la piel, ojo y/o mucosa, y conjuntivitis y/o daño corneal al ojo. La mostaza de azufre es el compuesto sulfuro de bis(2-cloroetilo). La mostaza de nitrógeno incluye los compuestos bis(2-cloroetil)etilamina, bis(2-cloroetil)metilamina, y tris(2-cloroetil)amina. La mostaza de azufre o sus análogos pueden causar un aumento en el estrés oxidativo, y en particular los niveles de HNE, y al agotar el sistema de defensa antioxidante y por tanto aumentar la peroxidación de lípidos, puede inducir una respuesta de estrés oxidativo y por tanto aumentar los niveles de aldehído (Jafariet al.(2010); Palet al.(2009)). Los antioxidantes, tal como silibinina, cuando se aplican por vía tópica, atenúan la lesión en la piel inducida de la exposición a mostaza de azufre o sus análogos, y las actividades aumentadas de las enzimas antioxidantes pueden ser una respuesta compensatoria a especies de oxígeno reactivo generadas por la mostaza de azufre. (Jafariet al.(2010); Tewari-Singhet al.(2012)). Además, la intervención para reducir las especies de radicales libres era un tratamiento eficaz, post-exposición, para lesión pulmonar inducida por fosgeno (Sciutoet al.(2004)). Por tanto, los compuestos que disminuyen o eliminan aldehídos, tal como los compuestos descritos en el presente documento, se pueden usar para tratar, prevenir, y/o reducir el riesgo de una afección asociada con los efectos tóxicos de agentes vesicantes, tal como mostaza de azufre, mostaza de nitrógeno, y oxima de fosgeno.
Los agentes alcalinos incluyen, pero no están limitados a, cal, lejía, amoniaco, y desatascadores. Los compuestos que reducen o eliminan aldehídos, tal como los compuestos descritos en el presente documento, se pueden usar para tratar, prevenir, y/o reducir el riesgo de una afección asociada con quemaduras de un agente alcalino.
En una cuarta forma de realización, la invención se refiere al tratamiento, prevención, y/o reducción de un riesgo de una enfermedad, trastorno o afección autoinmunitaria, mediada por inmunidad, inflamatoria, cardiovascular o neurológica, o síndrome metabólico, o diabetes, en la que la toxicidad de aldehídos está implicada en la patogénesis, que comprende administrar a un sujeto en necesidad de ello un compuesto descrito en el presente documento. La enfermedad, trastorno o afección autoinmunitaria o mediada por inmunidad incluye, pero no está limitada a, lupus, esclerodermia, asma, enfermedad pulmonar obstructiva crónica (EPOC), y artritis reumatoide. La enfermedad, trastorno o afección inflamatoria incluye, pero no está limitada a, artritis reumatoide, enfermedad intestinal inflamatoria (por ejemplo, enfermedad de Crohn y colitis ulcerosa), septicemia, y fibrosis (por ejemplo, fibrosis renal, hepática, pulmonar y cardiaca). La enfermedad, trastorno o afección cardiovascular incluye, pero no está limitada a, ateroesclerosis y lesión isquémica-reperfusión. La enfermedad, trastorno o afección neurológica incluye, pero no está limitada a, enfermedad de Parkinson, enfermedad de Alzheimer, deficiencia en semialdehído succínico deshidrogenasa, esclerosis múltiple, esclerosis lateral amiotrófica, y los aspectos neurológicos del síndrome de Sjogren-Larsson (retraso cognitivo y espasticidad).
Un experto en la materia entendería que la enfermedad, trastorno o afección enumerada en el presente documento puede implicar más de un mecanismo patológico. Por ejemplo, una enfermedad, trastorno o afección enumerada en el presente documento puede implicar disregulación en la respuesta inmunológica y respuesta inflamatoria. Por tanto, la categorización anterior de una enfermedad, trastorno o afección no es absoluta, y la enfermedad, trastorno o afección se puede considerar una enfermedad, trastorno o afección inmunológica, inflamatoria, cardiovascular, neurológica, y/o metabólica.
Se encontró que los individuos con deficiencias en la aldehído deshidrogenasa tienen altos niveles de aldehídos y riesgo aumentado de enfermedad de Parkinson (PNAS 110:636 (2013)) y enfermedad de Alzheimer (BioChem Biophys Res Commun. 273:192 (2000)). En la enfermedad de Parkinson, los aldehídos específicamente interfieren con la fisiología de la dopamina (Free Radic Biol Med, 51: 1302 (2011); Mol Aspects Med, 24: 293 (2003); Brain Res, 1145: 150 (2007)). Además, los niveles de aldehídos están elevados en esclerosis múltiple, esclerosis lateral amiotrófica, enfermedades autoinmunitarias tales como lupus, artritis reumatoide, lupus, psoriasis, esclerodermia, y enfermedades fibróticas, y niveles aumentados de HNE y m Da están implicados en la evolución de aterosclerosis y diabetes (J. Cell. Mol. Med., 15: 1339 (2011); Arthritis Rheum 62: 2064 (2010); Clin Exp Immunol, 101: 233 (1995); Int J Rheum Dis, 14: 325 (2011); JEADV 26: 833 (2012); Clin Rheumatol 25: 320 (2006); Gut 54: 987 (2005); J Am Soc Nephrol 20: 2119 (2009)). MDA además está implicado en la formación aumentada de células de espuma que producen aterosclerosis (Leibundgutet al.,Current Opinion in Pharmacology 13: 168 (2013)). Además, la toxicidad relacionada con aldehídos desempeña un papel importante en la patogénesis de muchas enfermedades pulmonares inflamatorias, tal como asma y enfermedad pulmonar obstructiva crónica (EPOC) (Bartoliet al.,Mediators of Inflammation 2011, Artículo 891752). Por tanto, los compuestos que disminuyen o eliminan aldehídos, tal como los compuestos descritos en el presente documento, se pueden usar para tratar, prevenir y/o reducir un riesgo de una enfermedad, trastorno o afección autoinmunitaria, mediada por inmunidad, inflamatoria, cardiovascular o neurológica, o síndrome metabólico, o diabetes. Por ejemplo, los compuestos descritos en el presente documento previenen la muerte celular mediada por aldehídos en neuronas. Además, los compuestos descritos en el presente documento disminuyen un amplio espectro de citoquinas proinflamatorias y/o aumentan las citoquinas antiinflamatorias, que indica que los compuestos descritos en el presente documento son útiles en tratar enfermedades inflamatorias, tal como esclerosis múltiple y esclerosis lateral amiotrófica.
Como se ha discutido anteriormente, una composición divulgada se puede administrar a un sujeto con el fin de tratar o prevenir degeneración macular y otras formas de enfermedad retiniana cuya etiología implica la acumulación de A2E y/o lipofuscina. Otras enfermedades, trastornos, o afecciones caracterizadas por la acumulación de A2E se pueden tratar de forma similar.
En una forma de realización, un compuesto que reduce la formación de A2E se administra a un sujeto. Por ejemplo, el compuesto puede competir con PE para la reacción contrans-RAL,reduciendo de esta manera la cantidad de A2E formado. En otra forma de realización, un compuesto que previene la acumulación de A2E se administra a un sujeto. Por ejemplo, el compuesto compite con tanto éxito con PE para la reacción con trans-RAL, no se forma A2E.
Los individuos que se van a tratar están en tres grupos: (1) los que están clínicamente diagnosticados con degeneración macular u otras formas de enfermedad retiniana, cuya etiología implica la acumulación de A2E y/o lipofuscina en la base de deficiencias visuales (incluyendo, pero no limitado a, adaptación a la oscuridad, sensibilidad de contraste y agudeza) determinado por examen visual y/o electrorretinografía, y/o salud retiniana indicada por examen fundoscópico del tejido retiniano y RPE para acumulaciones de drusas, atrofia de tejido y/o fluorescencia de lipofuscina; (2) los que son presintomáticos para enfermedad degenerativa macular, pero se piensa que están en riesgo basado en resultados anómalos de cualquiera o todas de las mismas medidas; y (3) los que son presintomáticos, pero se piensa que están en riesgo genéticamente basado en antecedentes familiares de enfermedad degenerativa macular y/o resultados de genotipado que muestran uno o más alelos o polimorfismos asociados con la enfermedad. Las composiciones se administran por vía tópica o sistémica una o más veces al mes, semana o día. Las dosis se pueden seleccionar para evitar efectos secundarios, si hay alguno, sobre el rendimiento visual en la adaptación a la oscuridad. El tratamiento se sigue durante un periodo de al menos uno, tres, seis, o doce o más meses. Los pacientes se pueden ensayar a intervalos de uno, tres, seis, o doce meses o más largos para evaluar la seguridad y eficacia. La eficacia se mide por examen de rendimiento visual y salud retiniana como se ha descrito anteriormente.
En una forma de realización, un sujeto se diagnostica como que tiene síntomas de degeneración macular, y después se administra un compuesto divulgado. En otra forma de realización, se puede identificar un sujeto como que está en riesgo de desarrollar degeneración macular (los factores de riesgo incluyen antecedentes de fumar, edad, género femenino, y antecedentes familiares), y después se administra un compuesto divulgado. En otra forma de realización, un sujeto puede tener AMD seca en ambos ojos, y después se administra un compuesto divulgado. En otra forma de realización, un sujeto puede tener AMD húmeda en un ojo, pero AMD seca en el otro ojo, y después se administra un compuesto divulgado. En aun otra forma de realización, un sujeto se puede diagnosticar como que tiene enfermedad de Stargardt y después se administra un compuesto divulgado. En otra forma de realización, un sujeto se diagnostica como que tiene síntomas de otras formas de enfermedad retiniana en la que la etiología implica la acumulación de A2E y/o lipofuscina, y después se administra el compuesto. En otra forma de realización, un sujeto se puede identificar como que está en riesgo para desarrollar otras formas de enfermedad retiniana en la que la etiología implica la acumulación de A2E y/o lipofuscina, y después se administra el compuesto divulgado. En algunas formas de realización, un compuesto se administra profilácticamente. En algunas formas de realización, un sujeto ha sido diagnosticado como que tiene la enfermedad antes de que el daño retiniano sea aparente. Por ejemplo, se encuentra que un sujeto porta una mutación génica para ABCA4 y se diagnostica que está en riesgo para enfermedad de Stargardt antes de que se manifieste cualquier signo oftalmológico, o se encuentra que un sujeto tiene cambios maculares tempranos indicativos de degeneración macular antes de que el sujeto sea consciente de cualquier efecto sobre la visión. En algunas formas de realización, un sujeto humano puede saber que está en necesidad de tratamiento o prevención de degeneración macular.
En algunas formas de realización, un sujeto se puede seguir durante la duración de la degeneración macular. Un sujeto se puede seguir en una variedad de maneras, tal como examen ocular, examen del ojo dilatado, examen fundoscópico, prueba de agudeza visual, y/o biopsia. El seguimiento se puede realizar en una variedad de momentos. Por ejemplo, un sujeto se puede seguir después de que se administre un compuesto. El seguimiento se puede producir, por ejemplo, un día, una semana, dos semanas, un mes, dos meses, seis meses, un año, dos años, cinco años o cualquier otro periodo de tiempo después de la primera administración del compuesto. Un sujeto se puede seguir repetidamente. En algunas formas de realización, la dosis de un compuesto se puede alterar en respuesta al seguimiento.
En algunas formas de realización, los métodos divulgados se pueden combinar con otros métodos para tratar o prevenir la degeneración macular u otras formas de enfermedad retiniana en la que la etiología implica la acumulación de A2E y/o lipofuscina, tal como terapia fotodinámica. Por ejemplo, un paciente se puede tratar con más de una terapia para una o más enfermedades o trastornos. Por ejemplo, un paciente puede tener un ojo afectado con una forma seca de DME, que se trata con un compuesto de la invención, y el otro ojo afectado con una forma húmeda de DME, que se trata con, por ejemplo, terapia fotodinámica.
En algunas formas de realización, un compuesto para tratar o prevenir la degeneración macular u otras formas de enfermedad retiniana cuya etiología implica la acumulación de<a>2<e>y/o lipofuscina se puede administrar crónicamente. El compuesto se puede administrar a diario, más de una vez al día, dos veces a la semana, tres veces a la semana, semanalmente, bisemanalmente, mensualmente, bimensualmente, semianualmente, anualmente, y/o bianualmente.
La esfingosina 1-fosfato, una molécula de señalización bioactiva con diversas funciones celulares, es degradada irreversiblemente por la enzima del retículo endoplásmico esfingosina 1-fosfato liasa, generando trans-2-hexadecenal y fosfoetanolamina. Se ha demostrado que el trans-2-hexadecenal produce reorganización del citoesqueleto, separación y apoptosis en múltiples tipos celulares a través de la ruta dependiente de JNK. Véase, Biochem Biophys Res Commun. 20 Jul 2012;424(1):1821. Estos hallazgos y la química conocida de aldehídos a,p-insaturados relacionados aumenta la posibilidad de quetrans-2-hexadecenal interaccione con componentes celulares adicionales. Se mostró que reacciona fácilmente con desoxiguanosina y ADN para producir los aductos de 1,N(2)-desoxiguanosina diastereoméricos cíclicos 3-(2-desoxi-p-d-eritro-pentofuranosil)-5,6,7,8-tetrahidro-8R-hidroxi-6R-tridecilpirimido[1,2-a]purina-10(3H)ona y 3-(2-desoxi-p-d-eritro-pentofuranosil)-5,6,7,8-tetrahidro-8S-hidroxi-6S-tridecilpirimido[1,2-a]purina-10(3H)ona. Estos hallazgos demuestran que el trans-2-hexadecenal producido endógenamente por esfingosina 1-fosfato liasa reacciona directamente con ADN, formando aductos de ADN derivados de aldehído con consecuencias potencialmente mutagénicas.
La deficiencia en semialdehído succínico deshidrogenasa (SSADHD), también conocida como aciduria 4-hidroxibutírica o aciduria gamma-hidroxibutírica, es el trastorno autosómico recesivamente heredado más prevalente del metabolismo de GABA (Vogelet al.2013), manifiesta un fenotipo de retraso del desarrollo e hipotonía en la primera infancia, y deterioro del lenguaje expresivo grave y trastorno obsesivo-compulsivo en la adolescencia y edad adulta. Se produce epilepsia en la mitad de los pacientes, habitualmente como convulsiones tónicas-clónicas generalizadas, aunque algunas veces se producen convulsiones de ausencia y mioclónicas (Pearlet al.2014). Más de dos tercios de los pacientes manifiestan problemas neuropsiquiátricos (es decir, TDAH, TOC y agresión) en la adolescencia y edad adulta, que puede ser discapacitante. Metabólicamente, hay una acumulación del neurotransmisor inhibidor principal, GABA, y gamma-hidroxibutirato (GHB), un ácido monocarboxílico neuromodulador (Snead y Gibson 2005). Además, varios otros intermedios específicos a este trastorno se han detectado tanto en pacientes como en el modelo murino correspondiente. La vigabatrina (VGB, Y-vinil-GABA), un inhibidor irreversible de GABA-transaminasa, es una elección lógica para el tratamiento de la deficiencia en SSADH porque prevendrá la conversión de GABA a GHB. Los resultados han sido mixtos, y en pacientes seleccionados el tratamiento ha producido deterioro (Good 2011; Pellock 2011; Escaleraet al.2010; Casaranoet al.2011; Maternet al.1996; Al-Essa et al.2000). La terapia dirigida para la deficiencia en SSADH permanece elusiva y las intervenciones paliativas.
5. Composiciones farmacéuticamente aceptables
Los compuestos y composiciones, según el método de la presente invención, se administran usando cualquier cantidad y cualquier ruta de administración eficaz para tratar o disminuir la gravedad de un trastorno proporcionado anteriormente. La cantidad exacta requerida variará de sujeto a sujeto, dependiendo de la especie, edad, y estado general del sujeto, la gravedad de la infección, el agente particular, su modo de administración, y similares. Los compuestos de la invención, preferiblemente se formulan en una forma posológica unitaria para facilidad de administración y uniformidad de la dosis. La expresión “forma posológica unitaria” como se usa en el presente documento se refiere a una unidad físicamente discreta de agente apropiado para el paciente que se va a tratar. Se entenderá, sin embargo, que el uso diario total de los compuestos y composiciones de la presente invención los decidirá el médico dentro del ámbito del juicio médico racional. El nivel de dosis eficaz específico para cualquier paciente u organismo particular dependerá de una variedad de factores incluyendo el trastorno que se trata y la gravedad del trastorno; la actividad del compuesto específico empleado; la composición específica empleada; la edad, peso corporal, salud general, sexo y dieta del paciente; el tiempo de administración, ruta de administración, y la velocidad de excreción del compuesto específico empleado; la duración del tratamiento; fármacos usados en combinación o coincidentes con el compuesto específico empleado; y factores similares bien conocidos en las técnicas médicas.
Las composiciones farmacéuticamente aceptables de esta invención se pueden administrar a seres humanos u otros animales por vía oral, rectal, parenteral, intracisternal, intravaginal, intraperitoneal, tópica (como mediante polvos, pomadas o gotas), yugal, como un espray oral o nasal, o similares, dependiendo de la gravedad de la infección que se trata. En ciertas formas de realización, los compuestos de la invención se administran por vía oral o parenteral a niveles posológicos desde aproximadamente 0,01 mg/kg hasta aproximadamente 50 mg/kg y preferiblemente desde aproximadamente 1 mg/kg hasta aproximadamente 25 mg/kg, de peso corporal de sujeto al día, una o más veces al día, para obtener el efecto terapéutico deseado.
Las formas posológicas líquidas para la administración oral incluyen, pero no están limitadas a, emulsiones, microemulsiones, soluciones, suspensiones, jarabes y elixires farmacéuticamente aceptables. Además de los compuestos activos, las formas posológicas líquidas pueden contener diluyentes inertes comúnmente usados en la técnica tal como, por ejemplo, agua u otros solventes, agentes solubilizantes y emulsionantes tal como alcohol etílico, alcohol isopropílico, carbonato de etilo, acetato de etilo, alcohol bencílico, benzoato de bencilo, propilenglicol, 1,3-butilenglicol, dimetilformamida, aceites (en particular, aceites de semilla de algodón, cacahuete, maíz, germen, oliva, ricino, y sésamo), glicerol, alcohol tetrahidrofurfurílico, polietilenglicoles y ésteres de ácidos grasos de sorbitano, y mezclas de los mismos. Además de diluyentes inertes, las composiciones orales también pueden incluir adyuvantes tal como agentes humectantes, agentes emulsionantes y de suspensión, agentes edulcorantes, saborizantes y perfumantes.
Las preparaciones inyectables, por ejemplo, suspensiones acuosas u oleaginosas inyectables estériles se pueden formular según la técnica conocida usando agentes dispersantes o humectantes y agentes de suspensión adecuados. La preparación inyectable estéril también puede ser una solución, suspensión o emulsión inyectable estéril en un diluyente o solvente no tóxico parenteralmente aceptable, por ejemplo, como una solución en 1,3-butanodiol. Entre los vehículos y solventes aceptables que se pueden emplear están agua, solución de Ringer, solución de cloruro de sodio U.S.P. e isotónica. Además, aceites no volátiles estériles se emplean convencionalmente como un solvente o medio de suspensión. Para este fin, cualquier aceite no volátil blando se puede emplear incluyendo mono- y diglicéridos sintéticos. Además, ácidos grasos tal como ácido oleico se usan en la preparación de inyectables.
Las formulaciones inyectables se pueden esterilizar, por ejemplo, por filtración a través de un filtro que retiene bacterias, o incorporando agentes esterilizantes en forma de composiciones sólidas estériles que se pueden disolver o dispersar en agua estéril u otro medio inyectable estéril antes del uso.
Con el fin de prolongar el efecto de un compuesto de la presente invención, con frecuencia es deseable ralentizar la absorción del compuesto de inyección subcutánea o intramuscular. Esto se puede lograr mediante el uso de una suspensión líquida de un material cristalino o amorfo con mala solubilidad en agua. La velocidad de absorción del compuesto después depende de su velocidad de disolución que, a su vez, puede depender del tamaño del cristal y la forma cristalina. Alternativamente, la absorción retrasada de una forma compuesto administrado por vía parenteral se logra disolviendo o suspendiendo el compuesto en un vehículo oleaginoso. Las formas de depósito inyectables se hacen formando matrices de microcápsulas del compuesto en polímeros biodegradables tal como polilactidapoliglicolida. Dependiendo de la proporción de compuesto respecto a polímero y la naturaleza del polímero particular empleado, la velocidad de liberación del compuesto se puede controlar. Los ejemplos de otros polímeros biodegradables incluyen poli(ortoésteres) y poli(anhídridos). Las formulaciones inyectables en depósito también se preparan atrapando el compuesto en liposomas o microemulsiones que son compatibles con tejidos corporales.
Las composiciones para administración rectal o vaginal son preferiblemente supositorios que se pueden preparar mezclando los compuestos de esta invención con excipientes o soportes no irritantes adecuados tal como manteca de cacao, polietilenglicol o una cera de supositorio que son sólidos a temperatura ambiente, pero líquidos a la temperatura corporal y por tanto se funden en el recto o la cavidad vaginal y liberan el compuesto activo.
Las formas posológicas sólidas para la administración oral incluyen cápsulas, comprimidos, píldoras, polvos y gránulos. En tales formas posológicas sólidas, el compuesto activo se mezcla con al menos un excipiente o soporte inerte, farmacéuticamente aceptable tal como citrato de sodio o fosfato dicálcico y/o a) rellenos o extensores tal como almidones, lactosa, sacarosa, glucosa, manitol, y ácido silícico, b) aglutinantes tal como, por ejemplo, carboximetilcelulosa, alginatos, gelatina, polivinilpirrolidinona, sacarosa, y goma arábiga, c) humectantes tal como glicerol, d) agentes disgregantes tal como agar-agar, carbonato de calcio, fécula de patata o tapioca, ácido algínico, ciertos silicatos, y carbonato de sodio, e) agentes retardantes de solución tal como parafina, f) aceleradores de absorción tal como compuestos de amonio cuaternario, g) agentes humidificadores tal como, por ejemplo, alcohol cetílico y monoestearato de glicerol, h) absorbentes tal como caolín y arcilla bentonita, e i) lubricantes tal como talco, estearato de calcio, estearato de magnesio, polietilenglicoles sólidos, lauril sulfato de sodio, y mezclas de los mismos. En el caso de cápsulas, comprimidos y píldoras, la forma posológica también puede contener agentes tamponantes.
También se pueden emplear composiciones sólidas de un tipo similar como rellenos en cápsulas de gelatina blandas y duras rellenas que usan tales excipientes como lactosa o azúcar de la leche, así como polietilenglicoles de alto peso molecular y similares. Las formas posológicas sólidas de comprimidos, grajeas, cápsulas, píldoras y gránulos se pueden preparar con recubrimientos y revestimientos tal como recubrimientos entéricos y otros recubrimientos bien conocidos en el arte de la formulación farmacéutica. Opcionalmente pueden contener agentes opacificantes y también pueden ser de una composición que liberan el/los principio(s) activo(s) solo, o preferentemente, en una cierta parte del aparato digestivo, opcionalmente, de una manera retrasada. Los ejemplos de composiciones que embeben que se pueden usar incluyen sustancias poliméricas y ceras. También se pueden emplear composiciones sólidas de un tipo similar como rellenos en cápsulas de gelatina blandas y duras rellenas que usan tales excipientes como lactosa o azúcar de la leche, así como polietilenglicoles de alto peso molecular y similares.
Los compuestos activos también pueden estar en forma microencapsulada con uno o más excipientes indicados anteriormente. Las formas posológicas sólidas de comprimidos, grajeas, cápsulas, píldoras y gránulos se pueden preparar con recubrimientos y revestimientos tal como recubrimientos entéricos, recubrimientos que controlan la liberación y otros recubrimientos bien conocidos en el arte de la formulación farmacéutica. En tales formas posológicas sólidas el compuesto activo se puede mezclar con al menos un diluyente inerte tal como sacarosa, lactosa o almidón. Tales formas posológicas también pueden comprender, como es práctica normal, sustancias adicionales diferentes de diluyentes inertes, por ejemplo, lubricantes de compresión y otras ayudas de compresión tal como estearato de magnesio y celulosa microcristalina. En el caso de cápsulas, comprimidos y píldoras, las formas posológicas también pueden contener agentes tamponantes. Opcionalmente pueden contener agentes opacificantes y también pueden ser de una composición que liberan el/los principio(s) activo(s) solo, o preferentemente, en una cierta parte del aparato digestivo, opcionalmente, de una manera retrasada. Los ejemplos de composiciones que embeben que se pueden usar incluyen sustancias poliméricas y ceras.
Las formas posológicas para la administración tópica o transdérmica de un compuesto de esta invención incluyen pomadas, pastas, cremas, lociones, geles, polvos, soluciones, espráis, inhalantes o parches. El componente activo se mezcla en condiciones estériles con un soporte farmacéuticamente aceptable y cualquier conservante o tampón necesario como se pueda requerir. También se contempla que una formulación oftálmica, gotas para los oídos, gotas para los ojos están dentro del ámbito de esta invención. Además, la presente invención contempla el uso de parches transdérmicos, que tienen la ventaja añadida de proporcionar administración controlada de un compuesto al cuerpo. Tales formas posológicas se pueden hacer disolviendo o dispensando el compuesto en el medio apropiado. También se pueden usar potenciadores de absorción para aumentar el flujo del compuesto a través de la piel. La velocidad se puede controlar o bien proporcionando una membrana de control de la velocidad o dispersando el compuesto en un matriz polimérica o gel.
Los compuestos de la invención también se pueden administrar por vía tópica, tal como directamente al ojo, por ejemplo, como un colirio o pomada oftálmica. Las gotas para los ojos típicamente comprenden una cantidad eficaz de al menos un compuesto de la invención y un soporte capaz de aplicarse con seguridad a un ojo. Por ejemplo, las gotas para los ojos están en forma de una solución isotónica, y el pH de la solución se ajusta de modo que no hay irritación del ojo. En muchos casos, la barrera epitelial interfiere con la penetración de moléculas en el ojo. Por tanto, los fármacos oftálmicos más actualmente usados se suplementan con alguna forma de potenciador de penetración. Estos potenciadores de penetración funcionan aflojando las uniones estrechas de las células endoteliales más superiores (Burstein, 1985, Trans Ophthalmol Soc U K 104(Pt 4): 402-9; Ashtonet al.,1991, J Pharmacol Exp Ther 259(2): 719-24; Greenet al.,1971, Am J Ophthalmol 72(5): 897-905). El potenciador de penetración más comúnmente usado es cloruro de benzalconio (Tanget al.,1994, J Pharm Sci 83(1): 85-90; Burstein et al., 1980, Invest Ophthalmol Vis Sci 19(3): 308-13), que también funciona como conservante contra la contaminación microbiana. Típicamente se añade a una concentración final del 0,01-0,05%.
El término “muestra biológica”, como se usa en el presente documento incluye, sin limitación, cultivos celulares o extractos de los mismos; material de biopsia obtenido de un mamífero o extractos del mismo; y sangre, saliva, orina, heces, semen, lágrimas, u otros fluidos corporales o extractos de los mismos.
Todas las características de cada uno de los aspectos de la invención aplican a todos los otros aspectosmutatis mutandis.
Con el fin de que la invención descrita en el presente documento se entienda más completamente, se exponen los siguientes ejemplos.
Ejemplificación
Como se representa en los ejemplos posteriores, en ciertas formas de realización ejemplares, los compuestos se preparan según los siguientes procedimientos generales. Se apreciará que, aunque los métodos generales representan la síntesis de ciertos compuestos de la presente invención, los siguientes métodos generales, y otros métodos que conoce el experto en la materia, se pueden aplicar a todos los compuestos y subclases y especies de cada uno de estos compuestos, como se describe en el presente documento.
Ejemplo 1. Secuencia de reacción general para compuestos
Los agentes de captura de aldehídos marcados con deuterio se hicieron como se describe en la publicación de la solicitud de patente en EE UU US 2013/0190500, publicada el 23 de julio, 2013, opcionalmente usando intermedios marcados con deuterio en los sitios indicados en el esquema 1. Los métodos ejemplares se describen más adelante.
Esquema 1
Bromuro de 1-(3-etoxi-2,3-dioxopropil)piridin-1-io. A un matraz de 2 l de fondo redondo se cargó etanol (220 ml) y piridina (31 g, 392 mmol), y la solución resultante se agitó a velocidad moderada de agitación en nitrógeno. A esta solución se añadió bromopiruvato de etilo (76,6 g, 354 mmol) en una corriente lenta, continua. La mezcla de reacción se dejó agitar a 65 ± 5°C durante 2 horas.
Ejemplo 3: Síntesis de A-2a
Bromuro de 1 -(6-cloro-2-etoxicarbonil)quinolin-3-il)piridin-1-io. Tras la terminación del tiempo de agitación de 2 horas en el ejemplo 2, la mezcla de reacción se enfrió lentamente a 18-22°C. El matraz se purgó con vacío tres veces momento en el que se añadió 2-amino-5-cloro-benzaldehído (ACB) (50,0 g, 321 mmol) directamente al matraz de reacción como un sólido usando un embudo de plástico largo. Se añadió piridina (64,0 g, 809 mmol) seguido por un enjuague de EtOH (10 ml) y la mezcla de reacción se calentó a 80 ± 3°C en nitrógeno durante aproximadamente 16 horas (durante la noche) momento en que el análisis de HPLC indicado en la reacción se completó de forma eficaz.
Ejemplo 4: Síntesis de A-2b
Bromuro de 1-(6-doro-2-etoxicarbonN)quinolin-3-N-4-d)piridin-1-io. El compuesto A-2b se prepara de una manera similar a A-2a (véase el ejemplo 3), sustituyendo 2-amino-5-cloro-benzaldehído (ACB) por 2-amino-5-clorobanzaldehído-d.
Ejemplo 5: Síntesis de A-3a
3-Amino-6-cloroquinolina-2-carboxilato de etilo. La mezcla de reacción del ejemplo 3 se enfrió a aproximadamente 70°C y se añadió morfolina (76,0 g, 873 mmol) al matraz de reacción de 2 l usando un embudo de adición. La mezcla de reacción se calentó a 80 ± 2°C durante aproximadamente 2,5 horas momento en el que la reacción se consideró completa por análisis de HPLC (el % de área de A-3a deja de aumentar). La mezcla de reacción en enfrió a 10-15°C para la extinción, finalización y aislamiento.
Al matraz de reacción de 2 l se cargó agua (600 g) usando el embudo de adición durante 30-60 minutos, manteniendo la temperatura por debajo de 15°C ajustando la velocidad de adición y usando un baño refrigerador. La mezcla de reacción se agitó durante 45 minutos adicionales a 10-15°C después A-3a crudo se aisló por filtración usando un embudo Buchner. La torta se lavó con agua (100 ml x 4) dejando cada vez percolar el agua a través de la torta antes de aplicar un vacío. La torta se secó al aire para proporcionar A-3a crudo como un sólido marrón casi seco. La torta se devolvió al matraz de reacción de 2 l y se añadieron heptano (350 ml) y EtOH (170 ml), y la mezcla se calentó a 70 ± 3°C durante 30-60 minutos. La suspensión se enfrió a 0-5°C y se aisló por filtración a vacío. El A-3a se secó en un horno de secado de vacío al vacío y 35 ± 3°C durante la noche (16-18 horas) para proporcionar A-3a como un sólido verde oscuro.
Ejemplo 6 : Síntesis de A-3b
3-Amino-6-cloroquinolina-2-carboxilato-4-d de etilo. El compuesto A-3b se prepara de una manera similar al compuesto A-3a (véase el ejemplo 5), sustituyendo la mezcla de reacción de A-2a por la de A-2b.
Ejemplo 7: Síntesis de NS2
2-(3-Amino-6-cloroquinolin-2-il)propan-2-ol. A un matraz de fondo redondo de 2 l se cargó cloruro de magnesio (200 ml de una solución 3,0 M en THF, 600 mmol). La solución se enfrió a 0-5°C usando un baño de hielo.
Un matraz de 500 ml (agitación magnética) se cargó con 22,8 gramos de A-3a del ejemplo 5 y THF (365 ml), se agitó para disolver, y después se transfirió a un embudo de adición en el matraz de reacción de 2 l. La solución de A-3a se añadió gota a gota al matraz de reacción durante 5,75 horas, manteniendo la temperatura del matraz de reacción entre 0-5°C a lo largo de la adición. Al final de la adición los contenidos del matraz se agitaron durante 15 minutos adicionales a 0-5°C después el baño refrigerador se retiró y la reacción se dejó agitar durante la noche a temperatura ambiente.
El matraz se enfrió en un baño de hielo y la mezcla de reacción se extinguió cuidadosamente añadiendo EtOH (39,5 g, 857 mmol) gota a gota a la mezcla de reacción, manteniendo la temperatura de la mezcla de reacción por debajo de 15°C durante el curso de la adición. Una solución acuosa de NH4Cl (84,7 g de NH4Cl en 415 ml de agua) se añadió después cuidadosamente y la mezcla se agitó con agitación moderada durante aproximadamente 30 minutos después se transfirió a un embudo separador para dejar que las fases se separaran. Los sólidos estaban presentes en la fase acuosa por tanto se añadió HOAc (12,5 g) y los contenidos se dieron vueltas suavemente para obtener una fase acuosa inferior casi homogénea. La fase acuosa inferior se transfirió de vuelta al matraz de reacción de 2 l y se agitó con agitación moderada con 2-metilTHF (50 ml) durante aproximadamente 15 minutos. La fase orgánica superior original se redujo en volumen a aproximadamente 40 ml usando un evaporador giratorio a < 40°C y vacío según fuera necesario. Las fases en el embudo separador se separaron y la fase de 2-metilTHF superior combinada con el residuo del producto, se transfirió a un matraz de 500 ml, y se destiló al vacío a un volumen aproximado de 25 ml. A este residuo se añadió 2-MeTHF (50 ml) y se destiló a un volumen aproximado de 50 ml. La solución del compuesto crudo NS2 se diluyó con 2-MeTHF (125 ml), se enfrió a 5-10°C, y se añadió lentamente H2SO42 M (250 ml) y la mezcla se agitó durante 30 minutos según se dejaba que la temperatura volviera a ambiente. Se cargó heptano (40 ml) y la mezcla de reacción se agitó durante 15 minutos adicionales después se transfirió a un embudo separador, y las fases se dejaron separar. La fase de producto acuosa inferior se extrajo con heptano adicional (35 ml), después la fase acuosa inferior se transfirió a un matraz de reacción de 1 l equipado con un agitador mecánico, y la mezcla se enfrió a 5-10°C. Las fases orgánicas combinadas se desecharon. Una solución de NaOH (ac.) al 25% se preparó (NaOH, 47 g, agua, 200 ml) y se añadió lentamente al matraz de reacción de 1 l para llevar el pH a un intervalo de 6,5-8,5.
Se añadió EtOAc (250 ml) y la mezcla se agitó durante la noche. La mezcla se transfirió a un embudo separador y la fase inferior se desechó. La fase orgánica superior se lavó con salmuera (25 ml), después la fase de producto orgánico superior se redujo en volumen en un evaporador rotatorio para obtener el compuesto crudo NS2 como un aceite oscuro que solidificó en unos pocos minutos. El compuesto crudo NS2 se disolvió en EtOAc (20 ml) y se filtró a través de un tapón de gel de sílice (23 g) eluyendo con heptano/EtOAc 3/1 hasta que todo el compuesto NS2 se eluyó (aproximadamente 420 ml requeridos) para retirar la mayoría del color oscuro del compuesto NS2. El solvente se eliminó al vacío para proporcionar 14,7 g de compuesto NS2 como un sólido oscuro. El compuesto NS2 se absorbió en EtOAc (25 ml) y se eluyó a través de una columna de gel de sílice (72 g) usando un gradiente de fase móvil de heptano/EtOAc 7/1 a heptano/EtOAc 3/1 (1400 ml en total). Las fracciones de solvente que contenían compuesto NS2 se lavaron. El compuesto NS2 se diluyó con EtOAc (120 ml) y se agitó en un matraz con carbono decolorizante Darco G-60 (4,0 g) durante aproximadamente 1 hora. La mezcla se filtró a través de celite usando un embudo encajado, enjuagando la torta con EtOAc (3 x 15 ml). Los filtrados combinados se lavaron en un evaporador rotatorio y el compuesto NS2 se disolvió en heptano (160 ml)/EtOAc (16 ml) a 76°C. La solución homogénea se enfrió lentamente a 0-5°C, se mantuvo durante 2 horas, después el compuesto NS2 se aisló por filtración. Después de secar en un horno de vacío durante 5 horas a 35°C al mejor vacío, el compuesto NS2 se obtuvo como un sólido blanco. Pureza por HPLC: 100% (AUC); HPLC (usando condiciones estándar): A-2: 7,2 min; A-3: 11,6 min.
Ejemplo 8: Síntesis de I-1
2-(6-cloroquinolin-2-il)propan-1,1,1,3,3,3-d6-2-ol. El compuesto I-1 se preparó de una manera similar al compuesto NS2 (véase el ejemplo 7), sustituyendo el cloruro de metilmagnesio con yoduro de metil-d3-magnesio (99% atom de D). La reacción de A-3a con 5,3 mol equiv de yoduro de metil-d3-magnesio (99% atom de D) en éter/THF dio un rendimiento del 20% de I-1-. MS (ESI): m/z 242,9 (M+1). 1H RMN (CDCla, 300 MHz) 6: 7,80 (d, J =6 Hz, 1H), 7,51 (d, J = 2 Hz, 1H), 7,33 (dd, J = 2 y 2 Hz, 1H), 7,07 (s, 1H), 4,68 (br s, 2H), 3,83 (br s, 1H); 13C RMN (CDCla, 75 MHz) 6: 154,3, 139,5, 139,1, 132,4, 130,6, 130,0, 126,3, 123,7, 116,4, 76,8, 74,9.
Ejemplo 9: Síntesis de I-2
2-(6-cloroquinolin-2-il-4-d)propan-2-ol. El compuesto I-2 se prepara de una manera similar al compuesto NS2 (véase el ejemplo 7), sustituyendo A-3a por A-3b.
Preparación de ACB
Después de establecer una atmósfera de N2 y que una ligera corriente de N2 fluyera a través del recipiente, platino, sulfurado, al 5% en peso sobre carbono, reducido, seco (9,04 g, 3,0% en peso frente al sustrato nitro) se añadió a un recipiente de presión con paredes pesadas de 5 l equipado con un gran agitador magnético de barra y un termopar. Se añadieron MeOH (1,50 l), 5-cloro-2-nitrobenzaldehído (302,1 g, 1,63 mol), más MeOH (1,50 l) y Na2CO3 (2,42 g, 22,8 mmol, 0,014 equiv). El matraz se selló y se inició la agitación a 450 rpm. La solución se evacuó y represurizó con N2 (35 psi) 2x. El matraz se evacuó y represurizó con H2 hasta 35 psi. La temperatura de la solución alcanzó 30°C en 20 min. La solución se enfrió después con un baño de agua. Se añadió hielo al baño de agua para mantener una temperatura por debajo de 35°C. Cada 2 h, la reacción se siguió evacuando y represurizando con N2 (35 psi), 2x antes de abrir. El progreso de la reacción se pudo seguir por TLC: 5-cloro-2-nitrobenzaldehído (Rf = 0,60, CH2O 2, UV) y los intermedios (Rf = 0,51, CH2CI2, UV y Rf = 0,14, CH2CI2, UV) se consumieron para dar ACB (Rf = 0,43, CH2CI2, UV). A las 5 h, la reacción había llegado al 98% de compleción (GC), y se consideró completa. A un embudo sinterizado medio de 3 l se añadió celite (aprox. 80 g). Esto se asentó con MeOH (aprox. 200 ml) y se secó con vacío. La solución reducida se transfirió a través de una cánula al embudo mientras se usaba vacío suave para arrastrar la solución a través del tapón de celite. Esto fue seguido con MeOH (150 ml x4). La solución se transfirió a un matraz de fondo redondo de tres cuellos de 5 l. A 30°C en un rotavapor, el solvente (aprox. 2 l) se eliminó a presión reducida. Se aplicó una manta de N2. La solución se transfirió a un matraz de fondo redondo de cuatro cuellos de 5 l equipado con agitación mecánica y un embudo adicional. Se añadió agua (2,5 l) gota a gota a la solución en agitación vigorosa durante 4 h. La suspensión se filtró con una cantidad mínima de vacío. El sólido recogido se lavó con agua (1,5 l 2x), 2-propanol (160 ml) después hexanos (450 ml 2x). El sólido recogido (un sólido granular amarillo canario) se transfirió a una placa de recristalización de 150 X 75. El sólido se secó después a presión reducida (26-28 en Hg) a 40°C durante la noche en un horno de vacío. ACB (> 99% A por HPLC) se almacenó en una atmósfera de N2 a 5°C.
Ejemplo 10: Ensayosin vitro
Ensayo de citotoxicidad de LDH
Se colocaron cultivos corticales de rata primarios en un incubador durante 24 o 48 horas y se trataron con varias concentraciones de los compuestos divulgados. Después 20 pl del medio de cultivo se retiran para un ensayo de LDH como se describe en Bergmeyeret al.,Methods of Enzymatic Analysis, 3a ed. (1983).
Ensayo ELISA para determinar la cantidad de citoquinas circulantes
Ratones C57Bl/6 macho se dosifican con compuestos divulgados 30 minutos antes de que se expongan a LPS (20 mg/kg). Dos horas después de la exposición a LPS, se recoge sangre de los ratones y se realiza un ELISA para determinar la cantidad de citoquinas circulantes. El tratamiento con los compuestos divulgados produce una reducción en citoquinas proinflamatorias, tal como IL-5 e IL-1p, IL-17 y TNF. Además, el tratamiento con los compuestos divulgados produjo citoquinas antiinflamatorias elevadas, tal como IL-10. Además, varias otras quimioquinas, tal como eotaxina, IL-12, IP-10, L iF, MCP-1, MIG, MIP y RANTES, también disminuyen por el tratamiento con los compuestos divulgados.
Ensayo para evaluar la eficacia en tratar dermatitis de contacto
Para determinar la eficacia de los compuestos divulgados en tratar dermatitis de contacto, miristato acetato de forbol (“PMA”) se aplica por vía tópica (2,5 pg en 20 pl) tanto a las porciones anteriores como posteriores del pabellón auricular derecho de ratones (N = 10 por grupo). Como control, el pabellón auricular izquierdo recibe 20 pl de etanol (excipiente de PMA) tanto en las porciones anteriores como posteriores. Seis horas después de la aplicación de PMA, se determina el espesor del pabellón auricular tanto derecho como izquierdo. Las medidas se determinan al menos dos veces de la misma región de ambas orejas, teniendo cuidado de no incluir pelo o pabellón auricular plegado.
Ensayo para evaluar la eficacia en tratar dermatitis alérgica
Para medir la eficacia compuestos divulgados en tratar dermatitis alérgica, se aplica oxazolona (“OXL”) (1,5%, 100 pl en acetona) a los abdómenes afeitados de ratones. Siete días después, el espesor del pabellón auricular de los ratones tratados con OXL se determina. Después los compuestos divulgados (100 mg/kg) o el vehículo (es decir, Captisol) se administra por vía intraperitoneal a ratones seguido por aplicación tópica de OXL (1%, 20 pl) 30 min después tanto a las pociones anterior como posterior del pabellón auricular derecho. Como control, el pabellón auricular izquierdo recibe 20 pl de acetona (excipiente de<o>X<l>) a las porciones tanto anterior cono posterior. El espesor del pabellón auricular de ambas orejas se mide otra vez 24 horas después. N = 10 por grupo.
Ensayo para medir la captura de aldehído
A viales de reacción separados se añade cada compuesto divulgado (0,064 mmol), sal MDA (22,7% de MDA, 0,064 mmol), y trioleato de glicerilo (600 mg). A la mezcla se añade Captisol al 20% en peso en PBS acuoso (~2,5 ml), seguido por ácido linoleico (600 mg). La mezcla de reacción se agita vigorosamente a temperatura ambiente y se sigue por LC/MS. Los compeustos divulgados rápidamente reaccionan con MDA para formar aductos de MDA.
Confirmación de base de Schiff
Se usa espectroscopía UV/VIS para seguir la condensación de base de Schiff de RAL con la amina primaria de un compuesto de la invención. El análisisin vitrodel producto de condensación de base de Schiff con RAL se realiza para los compuestos divulgados.
En el análisis en fase solución, el valor de Amax tanto del compuesto libre como del producto de condensación de RAL base de Schiff (RAL-SBC) se mide junto con el valor para tau de RAL-SBC. Como se usa en el presente documento, “RAL-SBC” significa el producto de condensación de la base de Sciff de RAL y un compuesto<r>A<l>. El análisis en fase solución se realiza usando una mezcla 100:1 del compuesto y RAL usando protocolos conocidos en la técnica. Se ensayaron varios sistemas solventes incluyendo acuoso, etanol, octanol y cloroformo:metanol (varios, por ejemplo 2:1). La cinética de la solución se mide y se encuentra que es muy dependiente de las condiciones del solvente.
El análisis en fase sólida de la condensación de base de Schiff también se realiza usando una mezcla 1:1 del compuesto respecto a RAL. El análisis en fase sólida se realizamusando protocolos conocidos en la técnica. La mezcla se seca en nitrógeno y la reacción de condensación se produce a terminación.
El análisis de fase lipídica se realiza usando protocolos conocidos en la técnica y se miden Amax, tau (RAL-SBC frente a APE/A2PE), e inhibición competitiva. Las condiciones de los liposomas son más cercanas a las condicionesin situ.
Análisis por ERG de adaptación a la oscuridad
La adaptación a la oscuridad es la recuperación de sensibilidad visual después de exposición a la luz. La adaptación a la oscuridad tiene múltiples componentes incluyendo tanto procesos rápidos (neuronales) como un proceso lento (fotoquímico). La regeneración del pigmento visual está relacionada con el proceso fotoquímico lento. Las velocidades de adaptación a la oscuridad se miden por varias razones. La ceguera nocturna resulta de un fallo a adaptarse a la oscuridad (pérdida de sensibilidad visual a la luz). Es posible encontrar una dosis segura para la visión nocturna midiendo el efecto del fármaco en la sensibilidad a la luz visual adaptada a la oscuridad.
Un electrorretinograma (ERG) se usa para medir la adaptación a la oscuridad en condiciones normales frente a fármaco. El ERG es la medida del potencial de campo eléctrico emitido por las neuronas retinales durante si respuesta a un estímulo de luz experimentalmente definido. Más específicamente, ERG mide los potenciales de campo retinales en la córnea después de un flash de luz (por ejemplo, 50 ms). Las intensidades de campo son de 102 a 103 microvoltios, originándose en las células de la retina.
ERG es una medida no invasiva que se puede realizar o bien en sujetos vivos (humano o animal) o un ojo hemisectado en solución que se ha retirado quirúrgicamente de un animal vivo. El ERG requiere anestesia general que disminuye la adaptación a la oscuridad y debe ser considerado en el diseño experimental.
En un análisis de ERG típico de un experimento de adaptación a la oscuridad, cada rata se adapta a la oscuridad durante horas hasta alcanzar un estado consistente de sensibilidad a la luz. La rata después se “fotoblanquea”, es decir, se expone brevemente a luz lo suficientemente fuerte para agotar transitoriamente la retina de 11-cis-RAL libre (por ejemplo, 2 min a 300 lux). La rata después se devuelve a la oscuridad inmediatamente para iniciar la adaptación a la oscuridad, es decir, la recuperación de la sensibilidad a la luz debido a la regeneración del pigmento visual. Se usa ERG para medir cómo de rápidamente se adapta la rata a la oscuridad y recupera la sensibilidad a la luz. Específicamente, se define una variable de respuesta de criterio para la sensibilidad a la luz.
La medida de ERG se toma después de una duración específica de recuperación a la oscuridad postblanqueo (por ejemplo, 30 min) determinada previamente por análisis cinético. Se usa un ajuste de curva para calcular el valor para la variable de sensibilidad y muestra recuperación con anestesia en la misma rata incluyendo cinética de adaptación a la oscuridad para Y50 y o. La adaptación más lenta se observa con menos sensibilidad a la luz donde Y50 alcanza -4,0 y tau = 22,6 min. La adaptación más rápida se observa con más sensibilidad a la luz donde Y50 alcanza -5,5 y tau = 9,2 min.
Se sigue el mismo paradigma que se ha descrito anteriormente para variación de dosis. En el protocolo de variación de dosis de ERG, los compuestos i.p. disminuyen la sensibilidad a la luz de ratas adaptadas a la oscuridad de una manera dependiente de la dosis. El efecto sobre la visión disminuye después de 3 horas.
Análisis de RMN de reacción de RAL
Se usa espectroscopía de RMN para seguir la condensación de base Schiff y formación de anillo de RAL con la amina primaria de un compuesto de la invención.
Inhibición de la formación de A2E
Este experimento se diseña para establecer prueba de concepto que la inyección i.p. crónica de un compuesto RAL-trap disminuye la velocidad de acumulación de A2E en ratas Sprague Dawley de tipo salvaje. Estos experimentos comparan la eficacia de tratamiento de compuestos RAL-trap a la de los compuestos control y la falta de tratamiento.
Materiales y métodos
El estudio se realiza con ratas Sprague Dawley de tipo salvaje. Los grupos de tratamiento de las ratas incluyen, por ejemplo, 8 ratas de género mezclado por condición de tratamiento. Cada animal se trata con una de las siguientes condiciones:
• Controles: (1) ácido 13-cis retinoico para inhibir los sitios de unión a retinoide de las proteínas del ciclo visual como un control de protocolo, en que tal tratamiento reduce la cantidad de trans-RAL libre que se libera y por tanto está disponible para formar A2E, pero con efectos secundarios indeseable de ceguera nocturna, y (2) un compuesto comercialmente disponible que se sabe que modula clínicamente la función retianana en seres humanos y se sabe experimentalmente que forma un aducto de base de Schiff con RAL libre, tantoin vitrocomo en modelos animalesin vivo.
•Vehículo
• Compuesto
• Sin tratar
Los compuestos divulgados se ensayan a través de un intervalo de dosis que incluye 1, 5, 15, y 50 mg/kg. El tratamiento se administra a diario durante 8 semanas por inyección i.p.
Química:
Los experimentos usan una variedad de servicios químicos. Por ejemplo, estos experimentos usan compuestos comercialmente disponibles con hojas de especificación analítica para caracterizar impurezas. También se sintetizan compuestos. Los compuestos se preparan en cantidades suficientes para la dosificación requerida. Las formulaciones del compuesto son adecuadas para uso en estudios de seguridad animal iniciales que implican inyección intraperitoneal (i.p.). Se determinan los siguientes tres atributos del producto de reacción de base de Schiff de trans RAL con compuestos de la invención:
• estabilidad con respecto a velocidades de reacción
• propiedades de absorción, específicamente máximos de absorción de uv-vis y coerficientes de extinción (véase, por ejemplo, la figura 5 en Rapp y Basinger, Vision Res. 22:1097, 1982) o análisis espectral de RMN de cinética de reacciones
• valores de solubilidad log P y log D, por ejemplo, calculados
Biología y bioquímica:
Los experimentos descritos en el presente documento usan una variedad de servicios de biología y bioquímica. Una dosis de “nivel de no efecto” (NOEL) de compuestos de la invención para tratamiento diario con una formación de colirio se establece, por ejemplo, en conejo con un protocolo de irritación ocular y en roedores con medida ERG de adaptación a la oscuridad en respuestas visuales a la estimulación lumínica. Después del tratamiento y antes de la enucleación del ojo, se realizan los siguientes ensayos no invasivos en animales, por ejemplo, conejos:
• Degeneración de células del RPE y fotorrecpetoras, evidente por retinografía (Karan,et al.2005, PNAS 102:4164) • Drusas extracelulares y lipofuscina intracelular medida por retinografía fluorescente (Karan,et al.2005)
Las respuestas a la luz se caracterizan por ERG (Weng,et al.,Cell 98:13, 1999). La concentración de A2E intracelular de extractos de células del RPE retinal se mide en todos los animales tratados tras la conclusión del protocolo de tratamiento usando un método analítico tal como los descritos por Karanet al.,2005; Raduet al.,2003; and Parishet al.,PNAS 95:14609, 1998. Por ejemplo, en una muestra de animales tratados, un ojo se ensaya, y el otro ojo se salva para análisis histológico (como se describe posteriormente). En los animales restantes, ambos ojos se ensayan por separado para la formación de A2E.
En los ojos postratamiento reservados para histología (como se describe anteriormente), la morfología de tejido retinal y de RPE se ensaya con técnicas de histología de microscopía óptica (Karan,et al.2005, con la excepción de que no se usa microscopía electrónica en los experimentos descritos en el presente documento).
La seguridad de la pauta de tratamiento se evalúa, por ejemplo, usando una combinación de:
• Observación documentada diaria del comportamiento animal y hábitos de alimentación a lo largo del periodo de tratamiento
• Resultados visuales medidos por ERG al final del periodo de tratamiento
a. Histología ocular al final del tratamiento
Ejemplo 11: Prueba de perfil de metabolito entre especies de NS2 deuterado (NS2-D6; compuesto I-1)
Fin:
Una vez administradas a un animal, las moléculas pequeñas pueden experimentar una variedad de reacciones para producir un conjunto de metabolitos. Los metabolitos exactos producidos dependen de muchos factores tal como el animal, la estructura molecular, y la distribución tisular de la molécula. El metabolismo de las moléculas pequeñas puede servir el fin de aumentar la solubilidad en agua para ayudar en la excreción de la molécula en la orina o heces, o puede simplemente ser el resultado de reacciones catalizadas por enzimas accidentales. Los metabolitos ejemplares incluyen productos de oxidación y glucuronidación. Con frecuencia es imposible predecir la distribución y cantidad de metabolitos producidos. Un fin de este estudio era realizar un perfil de metabolitos en especies cruzadas del artículo de prueba NS2 en hepatocitos primarios crioconservados. Como se describe posteriormente, una variedad de metabolitos de NS2 se produjeron y la distribución de metabolitos varió significativamente a través de diferentes especies. Con frecuencia es deseable disminuir el número y cantidad de metabolitos de fármacos de molécula pequeña, por ejemplo, para aumentar la semivida del fármaco en el cuerpo y/o prevenir la conversión a metabolitos tóxicos o inactivos. Con este conocimiento, la deuteración de NS2 se exploró como una posible ruta para disminuir el número y cantidad de metabolitos. La deuteración de una molécula (es decir, la sustitución de uno o más átomos de hidrógeno con deuterio) con frecuencia tiene efectos significativos en las velocidades de producción de metabolitos; sin embargo, los efectos de la deuteración en una molécula determinada son casi imposibles de predecir en la mayoría de los casos. Por tanto, se realizo el perfil de metabolitos para NS2 deuterado en hepatocitos humanos.
Condiciones del estudio:
Este estudio se realizó en condiciones no GLP. Todo el trabajo se realizó con aprobación de las regulaciones de salud locales y éticas apropiadas.
Diseño experimental:
Análisis de muestras
Las muestras se analizaron por LC-MS/MS usando un espectrómetro de masas SCIEX QTrap 5500 acoplado con un HPLC Agilent 1290 serie Infinity, un automuestreador enfriado CTC PAL, todos controlados por software Analyst. Después de la separación en una columna de HPLC de fase inversa C18 (Acquity UPLC HSS T3, 1,8, 2,1 x 50 mm) usando un sistema en gradiente de acetonitrilo-agua, los picos se analizaron por espectrometría de masas (MS) usando ionización ESI en modo barrido Q1. Las condiciones de la LC se muestran en la tabla 3 a continuación.
Tabla 3: Gradiente de LC
Solución A: H2O con ácido fórmico al 0,1%; Solución B: acetonitrilo con ácido fórmico al 0,1%
La tabla 4 muestra los parámetros experimentales para realización del perfil de metabolitos
T l 4: D rmin i n l rfil m li n h i : n i i n x rim n l
Procedimiento experimental
El artículo de prueba se incubó en duplicado con hepatocitos primarios, crioconservados a 37°C. Las células se descongelaron, se contaron las células viables, y se equilibraron según las direcciones del suministrador. Después de 30 min de equilibración a 37°C con agitación suave, el compuesto de prueba se añadió a las células para dar la concentración final deseada de 3 pM. La suspensión celular se incubó a 37°C como se describe anteriormente. En los tiempos indicados, se retiraron muestras y se mezclaron con un volumen igual de solución de parada (metanol) helada.
En paralelo, una muestra de hepatocitos blanco en ausencia de agente de prueba se incubó durante 120 min y se usó como control para mostrar la presencia de picos derivados de los hepatocitos. Las reacciones paradas se incubaron al menos diez minutos en hielo, y se añadió un volumen adicional de agua. Las muestras se centrifugación para eliminar proteína precipitada, y los sobrenadantes se analizaron por LC-MS/MS.
Un espectro de masa de barrido completo (100-800 m/z) en modos de ionización tanto positivo como negativo se corrió a través del gradiente para buscar la presencia de potenciales metabolitos (masas novedosas y metabolitos de fase I y II conocidos tal como: oxidación, sulfatación, dioxidación, deshidrogenación, sulfatación oxidación, glucuronidación, oxidación glucuronidación, y conjugación con glutatión). El método de espectrometría d emasas se muestra a continuación en la tabla 5.
Tabla 5: Desarrollo del método de es ectrometría de masas
Resultados
Se encontró sorprendentemente que la deuteración de NS2 redujo mucho el número y cantidades de metabolitos en hepatocitos humanos. Como se resume en las tablas 6A y 6B a continuación, la proteo- (no enriquecida con deuterio) forma de NS2 se metabolizaba significativamente durante el curso de solo 120 min por hepatocitos de rata, pero, mono y humanos. Por ejemplo, los hepatocitos de perro metabolizaron NS2 a dos productos de monooxidación diferentes (M1 y M2) y dos conjugados de glutatión (GSH) diferentes (M5 y M6), evaluado por tiempos de retención de LC y datos de espectrometría de masas (véase la figura 3). Los hepatocitos de mono cino metabolizaron NS2 a un metabolito de monooxidación (M1), cuatro metabolitos de oxidación glucuronidación (M3, M4, M7 y M9), y un metabolito de glucuronidación (M8) (véase la figura 2). Los hepatocitos humanos metabolizaron NS2 a un metabolito de monooxidación (M1), dos metabolitos de oxidación glucuronidación (M7 y M9), y un metabolito de glucuronidación (M8) (véase la figura 1).
Tabla 6A: Perfil de metabolitos de NS2 en he atocitos: Resumen de datos
m/z: proporción masa a carga del analito
NA = no aplicable
El grado relativo de formación de metabolito observada se indica por “+” siendo +++ el metabolito más abundante (asumiendo que el potencial de ionización del parental es similar al de los metabolitos).
Tabla 6B: Áreas de pico de metabolitos observados
Ár i
El análisis espectral de masas de NS2, cada metabolito M1-M9, NS2 deuterado, y el metabolito producido en hepatocitos humanos de NS2 deuterado se muestra en las figuras 6-17.
En contraste a NS2 no enriquecido con deuterio, la exposición de NS2 enriquecido con deuterio (es decir, el compuesto I-1, o NS2-D6 en la tabla 7) a hepatocitos humanos durante 120 min produjo el metabolito de monooxidación M1 como el único metabolito detectable (véase la tabla 7 y las figuras 5 y 17). La cantidad de M1 producido también se redujo mucho relativo al del producido cuando NS2 no deuterado se expuso a hepatocitos humanos (compárese las figuras 1 y 5). Tal reducción drástica en la producción de metabolitos no s epodría haber predicho con antelación.
Tabla 7: Perfil de metabolitos de NS2 deuterado en he atocitos humanos: resumen de datos
m/z: proporción de masa carga del analito
NA = no aplicable
El grado relativo de formación se metabolito observada se indica por “+” siendo +++ el metabolito más abundante (asumiendo que el potencial de ionización del parental es similar al de los metabolitos).
Nota. Basado en el número de metabolitos observados, el NS2 deuterado mostró menos metabolismo sobre el curso de 2 horas relativo a la molécula de NS2 no deuterado.
Los resultados mostrados en la tabla 7 también son sorprendentes en que la reducción en el número y cantidad de metabolitos puede no ser debida simplemente a la incorporación de deuterio que hace una etapa determinante de velocidad enzimáticamente catalizada más difícil. Más bien, la m/z observada de 259 es consistente con que los seis átomos de deuterio se retengan en el producto de monooxidación. Sin querer estar vinculado por la teoría, esto puede indicar que el enriquecimiento con deuterio influye el metabolismo en una localización remota en la molécula, y tal vez no simplemente a través, por ejemplo, de un efecto de isotipo en cinética primaria.
Referencias: 1) McGinnity, D.F. et al. (2004). “Evaluation of fresh and cryopreserved hepatocytes as in vitro drug metabolism tools for the prediction of metabolic clearance.”Drug Metab. Dispos.32(11):1247-1253. 2) Sahi, J. et al. (2010). “Hepatocytes as a tool in drug metabolism, transport and safety evaluations in drug discovery.”Current Drug Discov. Technol.7(3):188-198.
Ejemplo 12: Evaluación de las respuestas a la dosis para actividad fotoprotectora de la toxicidad de peróxido de hidrógeno en cultivos de hipocampo disociados para NS2 (es decir, NS2 no deuterado)
Plan experimental para evaluación de la respuesta a la dosis de NS2 para protección de toxicidad de peróxido de hidrógeno:
A. Agente de prueba: NS2 FW: 236
1. Fuente 1: CoreRx lote 093-FOR CNS2; cantidad usada; 6,4 mg; muestra micromolida (el tamaño de partícula medio es aproximadamente 16 micrómetros); derivado de J-Star Lote BR-NS2-11-01
2. Fuente 2: J-Star lote BR-NS2-1; cantidad usada; 6 mg; muestra no molida
B. Formulaciones y preparación de soluciones madre
Se compararon dos tipos de formulaciones; dimetilsulfóxido (DMSO) y Captisol®.
1. Formulación de Captisol®: se disolvió Captisol® a 5 mg/ml (es decir, al 0,5%) en solución tamponada en fosfato de Dulbecco (DPBS). Se preparó una solución madre de NS2 de 10 mM (solución madre A) disolviendo 1 mg (4,24 pmol) en 0,42 ml de la solución de Captisol® para dar una solución madre inicial de 10 pmol/ml o 10 mM (es decir, 2,38 mg/ml). La solución madre era transparente después de mezclar con el vortex.
2. Formulación de DMSO: Se usó DMSO como un comparador para Captisol®. Se disolvieron cinco mg (21,12 pmol) de NS2 en 0,2 ml de DMSO para una solución madre de 100 mM (es decir, 23,8 mg/ml). La formulación en DMS<o>de NS2 100 mM era transparente. Se hicieron diluciones logarítmicas con DPBS. Tras la dilución 1:10 a 10 mM con DPBS, la solución se volvió turbia, pero se aclaró después de mezclado con el vortex extenso. En general, nuestro fin de concentración de referencia para DMSO en cultivos neuronales primarios es menos del 0,1% para evitar acciones farmacológicas de DMSO. Nótese que se usó DMSO al 1% para la concentración de prueba 1 mM de NS2. No se observó toxicidad aparente en el ensayo en la prueba de 5 h (véase los resultados del experimento 9 posteriormente).
C. Detalles sobre la preparación de las soluciones madre
NS2 en Captisol®
1. La solución madre A era NS2 10 mM en Captisol® al 0,5%. Añadir 10 |jl en 100 |jl para una concentración final de NS2 1 mM, en Captisol® al 0,05%, en cada pocillo.
2. La solución madre B se preparó añadiendo 50 j l de la solución madre A a 450 j l de DPBS para dar una solución 1 mM de NS2. Añadir 10 j l en 100 j l de DPBS para una concentración final de Ns 2100 jM en Captisol® al 0,005%.
3. La solución madre C se preparó añadiendo 50 j l de la solución madre B a 450 j l de DPBS para dar una solución 100 jM de NS2. Añadir 10 j l en 100 j l de DPBS para una concentración final de NS210 jM en Captisol® al 0,0005%.
4. La solución madre D se preparó añadiendo 50 j l de la solución madre C a 450 j l de DPBS para dar una solución 10 jM de NS2. Añadir 10 j l en 100 j l de DPBS para una concentración final de NS2 1 jM en Captisol® al 0,00005%.
5. La solución madre E se preparó añadiendo 50 j l de la solución madre D a 450 j l de DPBS para dar una solución 1 jM de NS2. Añadir 10 j l en 100 j l de DPBS para una concentración final de NS20,1 jM en Captisol® al 0,000005%. NS2 en DMSO
1. La solución madre A era NS2 10 mM en DMSO al 100%.
2. La solución madre B se preparó añadiendo 50 j l de la solución madre A a 450 j l de DPBS para una concentración final de NS2 10 mM. Añadir 10 j l en 100 j l de<d>P<b>S para una concentración final de NS2 1 mM en DMSO al 1%. 3. La solución madre C se preparó añadiendo 50 j l de la solución madre B a 450 j l de DPBS para una concentración final de NS2 1 mM. Añadir 10 j l en 100 j l de D<p>B<s>para una concentración final de NS2 100 jM en DMSO al 0,1%.
4. La solución madre D se preparó añadiendo 50 j l de la solución madre C a 450 j l de DPBS para una concentración final de NS2 100 jM . Añadir 10 j l en 100 j l de<d>P<b>S para una concentración final de NS2 10 jM en DMSO al 0,01%.
5. La solución madre E se preparó añadiendo 50 j l de la solución madre D a 450 j l de DPBS para una concentración final de NS2 10 jM . Añadir 10 j l en 100 j l de DPBS para una concentración final de NS2 1 jM en DMSO al 0,001%.
6. La solución madre F se preparó añadiendo 50 j l de la solución madre E a 450 j l de DPBS para una concentración final de NS2 1 jM . Añadir 10 j l en 100 j l de DPb S para una concentración final de NS20,1 jM en DMSO al 0,0001%. En todos los casos, 10 j l de la dilución apropiada se añadieron a 100 j l para un volumen total de 110 j l en el pocillo. D. Condiciones de cultivo diseñadas para detectar neuroprotección mediada por NS2 de estrés oxidativo asociado con peróxido de hidrógeno
1. Se prepararon cultivos de hipocampo de ratas como se ha descrito previamente (Brenneman DE, Smith GR, Zhang Y, Du Y, Kondaveeti SK, Zdilla MJ, Reitz AB. (2012) J. Molecular Neuroscience, 47:368-379). En estas condiciones, los cultivos son al menos el 90% neuronales. Las células no neuronales más abundantes son astrocitos.
2. Todos los cultivos se prepararon en un formato de 96 pocillos a una densidad de siembra de 10K células por pocillo. Los cultivos se trataron entre el día 10 y el día 21 después de la disociación de tejido de hipocampo E18. Para estos experimentos, todas las placas se trataron el día 13. En todos los experimentos, el peróxido de hidrógeno se añadió a los cultivos 10 minutos después del tratamiento con NS2 o cannabidiol (CBD). Para cada condición de tratamiento, el número de replicados fue cinco.
3. Todos los cultivos se sembraron en medio B27/basal neural. El día del tratamiento, a todos los cultivos se les dio un cambio completo de medio a medio B27/basal neural sin antioxidantes.
4. Como se ha determinado previamente (Brenneman et al., 2012) se usó peróxido de hidrógeno 10 jM para producir toxicidad y estrés oxidativo. Como se ha descrito previamente [Jarrett, SG, Liang, L-P, Hellier, JL, Staley, KJ y Patel, M. (2008) Neurobiol. Dis 30(1): 130-138], se ha observado que el peróxido de hidrógeno 10 jM en el hipocampo de ratas con un modelo kainato de estado epiléptico.
5. El control positivo usado en todos los estudios fue cannabidiol (CBD) 10 jM , un agente antioxidante conocido [Hampson et al. (1998), Proc.Nat.Acad. Sci 95:8268-8273] que es protector contra el estrés oxidativo en neuronas primarias [Brenneman, DE, Petkanas, D y Kinney, W.A. (2014) Annual Symposium on the Cannabinoids, página 129].
6. Ni los pocillos de control negativo, ni los pocillos de peróxido de hidrógeno, ni los pocillos de control positivo contenían ningún vehículo de fármaco.
E. Ensayos
Ambos ensayos usados en este estudio se han descrito en detalle [Brenneman DE, Smith GR, Zhang Y, Du Y, Kondaveeti SK, Zdilla MJ, Reitz AB. (2012) J. Molecular Neuroscience, 47:368-379].
1. El ensayo de viabilidad neuronal CFDA. En este ensayo, el colorante CFDA es absorbido por todas las células vivas, y cortado por esterasas para liberar fluoresceína. La especificidad neuronal se alcanza porque las neuronas no pueden eliminar este colorante, mientras la salida del colorante de células neuronales se puede producir a lo largo del tiempo. Después de lavar el colorante extracelular, los cultivos se leyeron en un fluorímetro, la intensidad de colorante intracelular es proporcional a la población neuronal viva. Referencia original: Petroski, RE y Geller HM. (1994) Selective labeling of embryonic neurons cultures on astrocyte monolayers with 5(6)-carboxyfluorescein diacetate (CFDA) J. Neurosci. Methods 52:23.32. El nivel control medio para cada experimento se muestra como una línea de referencia discontinua de trazo largo.
2. Un ensayo de muerte celular, usando yoduro de propidio, se realizó simultáneamente con el ensayo de CFDA en el mismo pocillo. Este colorante es excluido de células vivas y se une al ADN de células muertas. El ensayo detecta muerte celular tanto necrótica como apoptótica; no distingue entre muerte celular neuronal y muerte celular no neuronal. Véase, Sarafian TA, Kouyoumjian S, Tashkin D, Roth MD. (2002) Tox. Letters. 133: 171-179. El nivel control medio para cada experimento se muestra como una línea de referencia discontinua de trazo medio.
3. Reactivos usados:
a. Solución de peróxido de hidrógeno, 30% en peso; Sigma-Aldrich (216736-100 ml, lote MKBV382V) b. Captisol® (lote 17CX01-HQ-00088) proporcionado por Alderya Therapeutics
c. Dimetilsulfóxido; Sigma-Aldrich (472301-100 ml) lote 21096JK
d. Yoduro de propidio Sigma-Aldrich (P4864-10 ml; solución 1 mg/ml en agua)
e. CFDA [diacetato de 5-(6)-carboxifluoresceína] Sigma-Aldrich número de producto: 21879-100 mg-F f. Solución de cannabidiol, 10 mg/ml en etanol; Sigma-Aldrich número de producto: 90899-1 ml
g. Solución salina tamponada con fosfato de Dulbecco. Gibco (14190-144) lote 1165767
4. Análisis de datos
a. Adquisición de datos: Los datos se almacenaron en ordenadores Advanced Neural Dynamics para análisis. La adquisición de datos se realizó en un fluorímetro Cytofluor y se transfirió a una hoja de cálculo Excel para análisis con Sigma Plot 11.
b. Análisis estadístico: Todos los datos se analizaron estadísticamente mediante un análisis de varianza con el método de comparaciones múltiples frente a grupo control (Holm-Sidak). Se tomó la significancia estadística al nivel P < 0,05. En todos los casos, las comparaciones se hicieron al contol negativo (tratamiento con peróxido de hidrógeno 10 j M).
c. Metodología para la determinación de CE50:
i. Se eligió un amplio intervalo de concentración para cribar NS2 en un análisis de potencia de CE50. Se usó una serie de concentraciones logarítmicas desde 0,1<j>M a 1 mM, reconociendo que análisis adicional que implica concentración semilogarírmica puede ser necesario para evaluar CE50.
ii. Se usó un análisis de regresión no lineal para determinar la ecuación de la línea que ajusta mejor los datos (curva logística de cuatro parámetros)
iii. Basado en la ecuación logística siguiente, las CE50 para neuroprotección se calcularon y representaron por SigmaPlot 11 para determinar la concentración requerida para producir respuestas semimáximas para ambos ensayos. Se usaron líneas verticales para mostrar las intersecciones de los ejes que determinan la CE50.
Ecuación logística de cuatro parámetros
max —m i n
J v =min --------/----y----\----p-e-n-d -t i.—e n,t e.de Hill
1+ (cE5C¡)
Esto produce una curva de dosis y respuesta típica con un parámetro de pendiente variable. Algunas veces se abrevia como 4PL. Los cuatro parámetros son: min (parte inferior de la curva), max (parte superior de la curva), CE50 = concentración de ligando que produjo el 50% de la respuesta eficaz máxima.
5. Resumen de resultados
La tabla 8 muestra un resumen de los estudios de protección para NS2 (es decir, NS2 no deuterado) en cultivos de hipocampo de rata.
Tabla 8: Resumen de los estudios de protección para NS2 en cultivos de hipocampo de rata
* Debido a la naturaleza inclinada de la curva logística observada para estos conjuntos de datos, puede ser necesario análisis adicional usando concentraciones semilogarítmicas para determinar la CE50en estas condiciones. Los valores expuestos se deben considerar estimaciones.
** La concentración del agente de prueba que muestra niveles de respuesta en el ensayo no significativamente diferente de la de los controles sin tratamiento.
6. Análisis gráficos de los hallazgos experimentales de datos sin procesar
a. Experimento 1: Respuesta a la dosis a NS2 micromolido (CoreRx) en Captisol®. Efecto sobre la viabilidad neuronal después del cotratamiento con peróxido de hidrógeno 10 pM.
i. Fuente de NS2: CoreRx, micromolido
ii. Formulación: la solución madre inicial se formuló en Captisol® al 0,5%
iii. Ensayo: CFDA
iv. Toxina: peróxido de hidrógeno 10 pM
v. Duración del tratamiento: 5 horas
vi. Medio de crecimiento: medio B27/neurobasal sin antioxidantes
vii. Matriz de cultivo: poli-L-lisina
viii. Conclusiones: la CE50 se observó a 6,8 pM; la eficacia completa relativa a los controles (CBD HP y control sin tratamiento) se observó a 100 pM de NS2.
NS2 es completamente neuroprotector contra toxicidad de peróxido de hidrógeno a 10 pM en este ensayo. Los resultados se muestran en la tabla 9 y las figuras 18 y 19.
T l . Ef r l vi ili n r n l r mi n n r xi hi r n 1 M
* Significativamente diferente del tratamiento con peróxido de hidrógeno a 10 pM solo
N.S.: No significativamente diferente del tratamiento con peróxido de hidrógeno a 10 pM solo
b. Experimento 2: Respuesta a la dosis a NS2 micromolido (CoreRx) en Captisol®. Efecto sobre la muerte celular después del cotratamiento con peróxido de hidrógeno 10 pM.
i. Fuente de NS2: CoreRx (micromolido)
ii. Formulación: la solución madre inicial se formuló en Captisol® al 0,5%
iii. Ensayo: Yoduro de propidio
iv. Toxina: peróxido de hidrógeno 10 pM
v. Duración del tratamiento: 5 horas
vi. Medio de crecimiento: medio B27/neurobasal sin antioxidantes
vii. Matriz de cultivo: poli-L-lisina
viii. Conclusiones: la CE50 se observó a 1,3 pM; la eficacia completa relativa a los controles (CBD HP y control sin tratamiento) se observó a 10 pM de NS2.
NS2 es completamente neuroprotector contra toxicidad de peróxido de hidrógeno con este ensayo. Estos datos sugieren que el efecto protector contra la muerte celular puede ser ligeramente más potente que el observado para la viabilidad neuronal. Los resultados se muestran en la tabla 10 y las figuras 20 y 21.
Tabla 10. Efecto de NS2 (CoreRx) sobre la muerte celular en cultivos de hipocampo después de cotratamiento con
* Significativamente diferente del tratamiento con peróxido de hidrógeno a 10 j M solo
N.S.: No significativamente diferente del tratamiento con peróxido de hidrógeno a 10 j M solo.
c. Experimento 3: Respuesta a la dosis a NS2 micromolido (CoreRx) en DMSO. Efecto sobre la viabilidad neuronal después del cotratamiento con peróxido de hidrógeno 10 j M.
i. Fuente de NS2: CoreRx (micromolido)
ii. Formulación: la solución madre inicial se formuló en DMSO al 100%
iii. Ensayo: CFDA
iv. Toxina: peróxido de hidrógeno 10 j M
v. Duración del tratamiento: 5 horas
vi. Medio de crecimiento: medio B27/neurobasal sin antioxidantes
vii. Matriz de cultivo: poli-L-lisina
viii. Conclusiones: la CE50 se observó a 9,8 j M; la eficacia completa relativa a los controles (CBD HP y control sin tratamiento) se observó a 100 j M de NS2.
El uso de DMSO como una formulación produjo una CE50 que era muy similar a la observada con Captisol®. NS2 es completamente neuroprotector contra toxicidad de peróxido de hidrógeno a 10 j M en este ensayo. Los resultados se muestran en la tabla 11 y las figuras 22 y 23.
Tabla 11: Efecto de NS2 (CoreRx; en DMSO) sobre la viabilidad neuronal después de cotratamiento con peróxido de hi r n 1 M^ r n h r
* Significativamente diferente del tratamiento con peróxido de hidrógeno a 10<j>M solo.
N.S.: No significativamente diferente del tratamiento con peróxido de hidrógeno a 10 j M solo.
d. Experimento 4: Respuesta a la dosis a NS2 micromolido (CoreRx) en DMSO. Efecto sobre la muerte celular después del cotratamiento con peróxido de hidrógeno 10<j>M.
i. Fuente de NS2: CoreRx (micromolido)
ii. Formulación: la solución madre inicial se formuló en DMSO al 100%
iii. Ensayo: Yoduro de propidio
iv. Toxina: peróxido de hidrógeno 10<j>M
v. Duración del tratamiento: 5 horas
vi. Medio de crecimiento: medio B27/neurobasal sin antioxidantes
vii. Matriz de cultivo: poli-L-lisina
viii. Conclusiones: la CE50 se observó a 1,3 j M; la eficacia completa relativa a los controles (CBD HP y control sin tratamiento) se observó a 10<j>M de NS2.
NS2 es completamente neuroprotector contra toxicidad de peróxido de hidrógeno con este ensayo. Estos datos sugieren que el efecto protector contra la muerte celular puede ser ligeramente más potente que el observado para la viabilidad neuronal. Los resultados se muestran en la tabla 12 y las figuras 24 y 25.
Tabla 12. Efecto de NS2 (CoreRx en DMSO) sobre la muerte celular en cultivos de hipocampo después de r mi n n r xi hi r n 1 M
* Significativamente diferente del tratamiento con peróxido de hidrógeno a 10<j>M solo
N.S.: No significativamente diferente del tratamiento con peróxido de hidrógeno a 10 j M solo.
e. Experimento 5: Respuesta a la dosis a NS2 no molido (J-Star) en Captisol®. Efecto sobre la viabilidad neuronal después del cotratamiento con peróxido de hidrógeno 10<j>M.
i. Fuente de NS2: J-Star (no molido)
ii. Formulación: la solución madre inicial se formuló en Captisol® al 0,5%
iii. Ensayo: CFDA
iv. Toxina: peróxido de hidrógeno 10<j>M
v. Duración del tratamiento: 5 horas
vi. Medio de crecimiento: medio B27/neurobasal sin antioxidantes
vii. Matriz de cultivo: poli-L-lisina
viii. Conclusiones: la CE50 se observó a 9,1 j M; la eficacia completa relativa a los controles (CBD HP y control sin tratamiento) se observó a 100 j M de NS2.
NS2 es completamente neuroprotector contra toxicidad de peróxido de hidrógeno en este ensayo. Los resultados se muestran en la tabla 13 y las figuras 26 y 27.
Tabla 13. Datos de respuesta a la dosis para NS2 no molido (J-Star) en Captisol® que muestran efecto sobre la vi ili n r n l ^ r mi n n r xi hi r n 1 M
* Significativamente diferente del tratamiento con peróxido de hidrógeno a 10<j>M solo
N.S.: No significativamente diferente del tratamiento con peróxido de hidrógeno a 10 j M solo.
f. Experimento 6: Respuesta a la dosis a NS2 no molido (J-Star) en Captisol®. Efecto sobre la muerte celular después del cotratamiento con peróxido de hidrógeno 10<j>M.
i. Fuente de NS2: J-Star (no molido)
ii. Formulación: la solución madre inicial se formuló en Captisol® al 0,5%
iii. Ensayo: Yoduro de propidio
iv. Toxina: peróxido de hidrógeno 10 j M
v. Duración del tratamiento: 5 horas
vi. Medio de crecimiento: medio B27/neurobasal sin antioxidantes
vii. Matriz de cultivo: poli-L-lisina
viii. Conclusiones: la CE50 se observó a 2,8 j M; la eficacia completa relativa a los controles (CBD HP y control sin tratamiento) se observó a 10 j M de NS2.
NS2 es completamente neuroprotector contra toxicidad de peróxido de hidrógeno con este ensayo. Estos datos sugieren que el efecto protector contra la muerte celular puede ser ligeramente más potente que el observado para la viabilidad neuronal. Los resultados se muestran en la tabla 14 y las figuras 28 y 29.
Tabla 14. Datos de respuesta a la dosis para NS2 no molido (J-Star) en Captisol® que muestran efecto sobre la muerte
* Significativamente diferente del tratamiento con peróxido de hidrógeno a 10 pM solo
N.S.: No significativamente diferente del tratamiento con peróxido de hidrógeno a 10 pM solo.
g. Experimento 7: Respuesta a la dosis a NS2 no molido (J-Star) en DMSO. Efecto sobre la viabilidad neuronal después del cotratamiento con peróxido de hidrógeno 10 pM.
i. Fuente de NS2: J-Star (no molido)
ii. Formulación: la solución madre inicial se formuló en DMSO al 100%
iii. Ensayo: CFDA
iv. Toxina: peróxido de hidrógeno 10 pM
v. Duración del tratamiento: 5 horas
vi. Medio de crecimiento: medio B27/neurobasal sin antioxidantes
vii. Matriz de cultivo: poli-L-lisina
viii. Conclusiones: la CE50 se observó a 2,6 pM; la eficacia completa relativa a los controles (CBD HP y control sin tratamiento) se observó a 100 pM de NS2.
NS2 es completamente neuroprotector contra toxicidad de peróxido de hidrógeno en este ensayo. Los resultados se muestran en la tabla 15 y las figuras 30 y 31.
Tabla 15. Datos de respuesta a la dosis para NS2 no molido (J-Star) en Captisol® que muestran efecto sobre la vi ili n r n l r mi n n r xi hi r n 1 M
* Significativamente diferente del tratamiento con peróxido de hidrógeno a 10 pM solo
N.S.: No significativamente diferente del tratamiento con peróxido de hidrógeno a 10 pM solo.
h. Experimento 8: Respuesta a la dosis a NS2 no molido (J-Star) en DMSO. Efecto sobre la muerte celular después del cotratamiento con peróxido de hidrógeno 10 pM.
i. Fuente de NS2: J-Star (no molido)
ii. Formulación: la solución madre inicial se formuló en DMSO al 100%
iii. Ensayo: Yoduro de propidio
iv. Toxina: peróxido de hidrógeno 10 pM
v. Duración del tratamiento: 5 horas
vi. Medio de crecimiento: medio B27/neurobasal sin antioxidantes
vii. Matriz de cultivo: poli-L-lisina
viii. Conclusiones: la CE50 se observó a 1,1 pM; la eficacia completa relativa a los controles (CBD HP y control sin tratamiento) se observó a 10 pM de NS2.
NS2 es completamente neuroprotector contra toxicidad de peróxido de hidrógeno con este ensayo. Estos datos sugieren que el efecto protector contra la muerte celular puede ser ligeramente más potente que el observado para la viabilidad neuronal. Los resultados se muestran en la tabla 16 y las figuras 32 y 33.
Tabla 16. Datos de respuesta a la dosis para NS2 no molido (J-Star) en DMSO que muestran efecto sobre la muerte l l r r mi n n r xi hi r n 1 M
* Significativamente diferente del tratamiento con peróxido de hidrógeno a 10 pM solo
N.S.: No significativamente diferente del tratamiento con peróxido de hidrógeno a 10 pM solo.
i. Experimento 9: Respuesta a la dosis a vehículos de formulación. Efecto sobre la viabilidad neuronal después del cotratamiento con peróxido de hidrógeno 10 pM.
i. Agentes de prueba: Captisol® [Cap; (5 mg/ml, es decir, el 0,5%)] y DMSO al 1% (abreviado a DM; el 1% fue la concentración más alta usada). Las cantidades usadas para las formulaciones se igualaron a las usadas en los estudios de NS2.
ii. Ensayo: CFDA
iii. Toxina: peróxido de hidrógeno 10 pM
iv. Duración del tratamiento: 5 horas
v. Medio de crecimiento: medio B27/neurobasal sin antioxidantes
vi. Matriz de cultivo: poli-L-lisina
vii. Conclusiones: No hubo efecto detectable sobre la viabilidad neuronal de Captisol® o DMSO cuando se ensayaron en las mismas condiciones que para NS2. Los resultados se muestran en las tablas 17 y 18 y la figura 34.
Tabla 17. Datos de respuesta a la dosis para vehículos de formulación que muestran efecto sobre la viabilidad neuronal
Análisis CBD HP Cap HP Cap HP Cap H Cap HP Cap HP Estadíst Control 10 pM 500 pg/ml 50 pg/ 5 pg/ml 500 pg/ml 50 pg/ 10 pM 52563 52563 24629 26471 23833 23228 27627 24629 34496 34496 29230 24629 25171 28219 23833 26094 49934 42719 20687 27627 23833 25171 24718 23228 38422 42719 31107 26188 27627 26471 26094 21889 45016 45216 29746 23228 29230 23572 26094 27627 Media 44086* 43543* 27080 25629 25939 25332 25673 24693 Error St 3398 2893 1934 767 1076 927 651 1014 Valor p* <0,001 <0,001 N.S. N.S. N.S. N.S. N.S. N.S. % del control 100 ± 8 99 ± 7 61 ± 4 58 ± 2 59 ± 2 57 ± 2 58 ±2 56 ± 2 * Significativamente diferente del tratamiento con peróxido de hidrógeno a 10 pM solo
N.S.: No significativamente diferente del tratamiento con peróxido de hidrógeno a 10 pM solo.
Tabla 18. Datos de respuesta a la dosis para vehículos de formulación que muestran efecto sobre la viabilidad neuronal
Análisis CBD HP DM H DM H DM H DM H DM H HP Estadíst Control 10 pM 1% 0,1% 0,01% 0,001% 0,001% 10 pM 52563 52563 24629 31665 24629 21003 23228 22218 34496 34496 24629 25171 26094 32661 28219 23428 49934 42719 24629 32886 24629 29230 19685 24899 38422 42719 27627 22089 26094 18215 19385 21889 45016 45216 27627 29333 24629 18215 21971 26482 Media 44086* 43543* 25828 28229 25215 23865 22498 23783 Error St 3398 2893 734 2022 359 2985 1599 857 Valor p* <0,001 <0,001 N.S. N.S. N.S. N.S. N.S. N.S. % del control 100 ± 8 99 ± 7 59 ± 2 64 ± 5 57 ± 1 54 ± 7 51 ± 4 54 ± 2 * Significativamente diferente del tratamiento con peróxido de hidrógeno a 10 pM solo
N.S.: No significativamente diferente del tratamiento con peróxido de hidrógeno a 10 pM solo.
j. Experimento 10: Respuesta a la dosis a vehículos de formulación. Efecto sobre la muerte celular después del cotratamiento con peróxido de hidrógeno 10 pM.
i. Agentes de prueba: Captisol® [Cap; (5 mg/ml, es decir, el 0,5%)] y DMSO al 1% (abreviado a DM; el 1% fue la concentración más alta usada).
ii. Ensayo: Yoduro de propidio
iii. Toxina: peróxido de hidrógeno 10 pM
iv. Duración del tratamiento: 5 horas
v. Medio de crecimiento: medio B27/neurobasal sin antioxidantes
vi. Matriz de cultivo: poli-L-lisina
vii. Conclusiones: No hubo efecto detectable sobre la muerte celular de Captisol® o DMSO cuando se ensayaron en las mismas condiciones que para NS2. Los resultados se muestran en las tablas 19 y 20 y la figura 35.
Tabla 19. Datos de respuesta a la dosis para vehículos de formulación que muestran efecto sobre la muerte celular
Cap = vehículo Captisol®
* Significativamente diferente del tratamiento con peróxido de hidrógeno a 10 pM solo
N.S.: No significativamente diferente del tratamiento con peróxido de hidrógeno a 10 pM solo.
Tabla 20. Datos de respuesta a la dosis para vehículos de formulación que muestran efecto sobre la muerte después de cotratamiento con peróxido de hidrógeno 10 pM __________ __________ __________ __________ ________ Análisis CBD HP DM DM HP DM HP DM HP DM HP HP Estadíst Contro 10 pM 1% 0,1% 0,01 0,001 0,001 10 pM 125 140 250 297 276 267 246 267 144 133 246 297 267 259 246 254 117 180 315 276 246 246 184 246 180 184 230 192 250 246 267 246 144 156 267 276 246 246 225 246 Media 142* 159* 262 268 257 253 234 252 Error St 11 10 15 19 6 4 14 4 Valor p* <0,001 <0,003 N.S. N.S. N.S. N.S. N.S. N.S. % del contro 100 ± 112 ± 185 ± 189 ± 181 ± 178 ± 165 ± 177 ± 3 DM = vehículo DMSO
* Significativamente diferente del tratamiento con peróxido de hidrógeno a 10 pM solo
N.S.: No significativamente diferente del tratamiento con peróxido de hidrógeno a 10 pM solo.
7. Resumen de las observaciones y conclusiones
A. NS2 mostró actividad neuroprotectora contra la toxicidad de peróxido de hidrógeno en el ensayo de CFDA, con ambas formulaciones (DMSO y Captisol®) y con ambos lotes de compuesto (CoreRx y J-Star, molido y no molido, respectivamente).
B. El efecto neuroprotector de NS2 en el ensayo de CFDA fue igual al control (sin tratamiento de HP) y control positivo (CBD), lo que indica protección completa.
C. La protección completa relativa a los controles se observó con ambas formulaciones de NS2 y lotes de NS2 a 100 pM de NS2 en el ensayo de viabilidad neuronal de CFDA, mientras la concentración de no efecto para ambas formulaciones y lotes fue 1 pM.
D. La curva no lineal que ajusta los análisis logísticos indica que las CE50 de NS2 en el ensayo de viabilidad neuronal de CFDA variaban de 3 a 10 pM. La mejor estimación de CE50 disponible es del NS2 CoreRx (molido) formulado en Captisol®, que mostró una CE50 de 7 ± 4 pM. Todas las CE50 de las diferentes formulaciones de NS2 para el ensayo de CFDA están en este intervalo. Nuestra conclusión es que los dos lotes del compuesto y las dos formulaciones se caracterizan por su sustancial similitud.
E. NS2 mostró efecto protector contra la toxicidad de peróxido de hidrógeno en el ensayo de yoduro de propidio (PI). Esto se observó con ambas formulaciones y con ambos lotes de compuesto.
F. El efecto protector de NS2 en el ensayo de PI fue igual al control (sin tratamiento de HP) y control positivo (CBD), lo que indica protección completa.
G. La protección completa relativa a los controles sin tratamiento se observó con ambas formulaciones de NS2 y lotes de NS2 a 10 pM de NS2 en el ensayo de PI, mientras la concentración de no efecto para ambas formulaciones y lotes fue 1 pM. Era un hallazgo consistente que la respuesta de NS2 en el ensayo de muerte celular mostrara mayor potencia para la protección completa que en el ensayo de CFDA. Se debe reconocer que el ensayo de muerte celular no es específico para neuronas y puede implicar células no neuronales que están presentes en este modelo del SNC.
H. El ajuste de curva logística no lineal indica que las CE50 de NS2 en el ensayo de viabilidad neuronal de PI variaba de 1,1 a 2,8 pM. Sin embargo, la naturaleza inclinada de la curva logística hace las estimaciones difíciles sin la medida de respuestas a concentraciones semilogarítmicas para ayudar a definir el punto de inflexión de las curvas. La mejor estimación disponible es el valor medio para todos los datos de PI, que es 2 ± 1 pM. Nuestra conclusión es que los dos lotes de compuestos y las dos formulaciones se caracterizaban por su sustancial similitud. Debido a los estrechos intervalos de respuesta en el ensayo de PI, se pueden requerir análisis adicionales para refinar la estimación de la CE50. Estos datos sugieren que NS2 puede ser más potente en prevenir la muerte celular que en aumentar la viabilidad neuronal contra la toxicidad de peróxido de hidrógeno.
I. La señal tóxica producida por peróxido de hidrógeno 10 pM era típica de una amplia variedad de estresantes oxidativos (etanol, metales pesados, acetato de amonio, y glutamato) que se han ensayado en el pasado, con disminuciones del control que varían desde el 30 al 50%.
J. El control positivo (cannabidiol 10 pM) era activo en cada placa de prueba, lo que indica que el sistema modelo respondía de una manera típica.
Ejemplo 13: Respuestas a la dosis para tres compuestos deuterados que evalúan la actividad protectora de toxicidad de peróxido de hidrógeno en cultivos de hipocampo disociado
A. Plan experimental para la evaluación de respuesta a la dosis para protección de toxicidad de peróxido de hidrógeno
1. Agentes de prueba:
a. ALD-6 lote 1 (Legacy ID: NS2-D6 o compuesto I-1); cantidad usada: 5,0 mg; MW = 242,734.
b. ALD-5 - lote 1 (Legacy ID: D3); cantidad usada: 6,1 mg; MW = 203,34; estructura:
c. ALD-2 - lote 1 (Legacy ID: D2); cantidad usada: 5,6 mg; MW = 203,24; estructura:
2. Formulación y preparación de solución madre
a. Se usó dimetilsulfóxido (DMSO) al 100% para todas las muestras.
b. Observaciones:
i. ALD-6: (5 mg, 20,6 pmol) de ALD-6 se disolvió en 0,206 ml de DMSO para una solución madre 100 mM. La solución ALD-6/DMSO 100 mM era transparente. Se hicieron diluciones logarítmicas con DPBS. Tras la dilución de 1:10 a 10 mM con DPBS, la solución se volvió turbia, pero se volvió transparente después de mezclar con el vortex. En general, el objetivo de concentración de referencia para DMSO en cultivos neuronales primarios es menos del 0,1%, para evitar efectos farmacológicos del DMSO. Nótese que se usó DMSO al 0,3% para la concentración de prueba 300 pM de todas las muestras. No se observó toxicidad aparente en los ensayos después de 5 h de prueba.
ii. ALD-5: la solución madre 100 mM de ALD-5 se preparó disolviendo 6,1 mg (30 pmol) en 0,3 ml de DMSO. La mezcla ALD-5/DMSO era una solución amarilla transparente. Se hicieron diluciones logarítmicas con DPBS. Tras la dilución de 1:10 a 10 mM con DPBS, la solución permaneció una solución amarilla transparente.
iii. ALD-2: la solución madre 100 mM de ALD-2 se preparó disolviendo 5,6 mg (27,55 pmol) en 0,275 ml de DMSO. La mezcla ALD-2/DMSO era una solución ámbar transparente. Se hicieron diluciones logarítmicas con DPBS. Tras la dilución de 1:10 a 10 mM con DPBS, la solución permaneció una solución ámbar transparente.
c. Detalles sobre la preparación de soluciones madre: Dilución del compuesto en DMSO/DPBS
i. La solución madre A era 100 mM de compuesto en DMSO al 100%.
ii. La solución madre B se preparó añadiendo 50 pl de solución madre A a 450 pl de DPBS para una concentración final de 10 mM. Añadir 3,3 pl en 100 pl de DPBS para dar una concentración final de 3100 pM en DMSO al 0,3%.
iii. La solución madre C se preparó añadiendo 50 |jl de solución madre B a 450 |jl de DPBS para una concentración final de 1 mM. Añadir 10 j l en 100 j l de DPBS para dar una concentración final de 100 jM en DMSO al 0,1%. iv. La solución madre D se preparó añadiendo 50 j l de solución madre C a 450 j l de DPBS para una concentración final de 100 jM . Añadir 10 j l en 100 j l de DPBS para dar una concentración final de 10 jM en DMSO al 0,01%. v. La solución madre E se preparó añadiendo 50 j l de solución madre D a 450 j l de DPBS para una concentración final de 10 jM . Añadir 10 j l en 100 j l de DPBS para dar una concentración final de 1 jM en Dm SO al 0,001%. vi. La solución madre F se preparó añadiendo 50 j l de solución madre E a 450 j l de DPBS para una concentración final de 1 jM . Añadir 10 j l en 100 j l de DPBS para dar una concentración final de 0,1 jM en DMSO al 0,0001%. vii. Se añadieron 10 j l de la dilución apropiada a 90 j l para un volumen total de 100 j l en el pocillo.
3. Condiciones de cultivo diseñadas para detectar neuroprotección de estrés oxidativo asociado con peróxido de hidrógeno:
a. Los cultivos de hipocampo de rata se prepararon como se ha descrito previamente (Brenneman DE, Smith GR, Zhang Y, Du Y, Kondaveeti SK, Zdilla M<j>, Reitz AB. (2012)J. Molecular Neuroscience,47:368-379). En estas condiciones, los cultivos son al menos el 90% neuronales. Las células no neuronales más abundantes son astrocitos. Se compró tejido de hipocampo de rata E18 se compró de Brain Bits, LLC (Springfield IL). El tejido se alamcenó en medio Hibernate E para transporte.
b. Todos los cultivos se prepararon en un formato de 96 pocillos a una densidad de siembra de 10K células por pocillo. Los cultivos se trataron entre el día 10 y el día 21 después de la disociación de tejido de hipocampo E18. Para estos experimentos, todas las placas se trataron el día 13. En todos los experimentos, el peróxido de hidrógeno se añadió a los cultivos 10 minutos después del tratamiento con el agente de prueba o control positivo (cannabidiol). Para cada condición de tratamiento, el número de replicados fue cinco.
c. Todos los cultivos se sembraron en medio B27/basal neural. El día del tratamiento, a todos los cultivos se les dio un cambio completo de medio a B27/medio basal neural sin antioxidantes.
d. Como se ha determinado previamente (Brenneman et al., 2012) se usó peróxido de hidrógeno 10 jM para producir toxicidad y estrés oxidativo. Como se ha descrito previamente (Jarrett, SG, Liang, L-P, Hellier, JL, Staley, KJ y Patel, M. (2008) Neurobiol. Dis 30(1): 130-138), se ha observado que el peróxido de hidrógeno 10 jM en el hipocampo de ratas con un modelo kainato de estado epiléptico.
e. El control positivo usado en todos los estudios fue cannabidiol 10 jM , un agente antioxidante conocido (Hampson et al. (1998), Proc.Nat.Acad. Sci 95:8268-8273) que es protector contra el estrés oxidativo en neuronas primarias (Brenneman, DE, Petkanas, D y Kinney, W.A. (2014) Annual Symposium on the Cannabinoids, página 129).
f. Ni los pocillos de control negativo, ni los pocillos de peróxido de hidrógeno, ni los pocillos de control positivo contenían ningún vehículo de fármaco.
4. Ensayos
Ambos ensayos usados en este estudio se han descrito en detalle (Brenneman DE, Smith GR, Zhang Y, Du Y, Kondaveeti SK, Zdilla MJ, Reitz AB. (2012) J. Molecular Neuroscience, 47:368-379).
a. El ensayo de viabilidad neuronal CFDA: En este ensayo, el colorante CFDA es absorbido por todas las células vivas, y cortado por esterasas para liberar fluoresceína. La especificidad neuronal se alcanza porque las neuronas no pueden eliminar este colorante, mientras la salida del colorante de células neuronales se puede producir a lo largo del tiempo. Después de lavar el colorante extracelular, los cultivos se leyeron en un fluorímetro, la intensidad de colorante intracelular es proporcional a la población neuronal viva. Referencia original: Petroski, RE y Geller HM. (1994) Selective labeling of embryonic neurons cultures on astrocyte monolayers with 5(6)-carboxyfluorescein diacetate (CFDA) J. Neurosci. Methods 52:23.32. El nivel control medio para cada experimento se muestra como una línea de referencia discontinua de trazo largo.
b. Un ensayo de muerte celular, usando yoduro de propidio, se realizó simultáneamente con el ensayo de CFDA en el mismo pocillo. Este colorante es excluido de células vivas y se une al ADN de células muertas. El ensayo detecta muerta celular tanto necrótica como apoptótica; no distingue entre muerte celular neuronal y muerte celular no neuronal. Véase, Sarafian TA, Kouyoumjian S, Tashkin D, Roth MD. (2002) Tox. Letters. 133: 171-179. El nivel control medio para cada experimento se muestra como una línea de referencia discontinua de trazo medio.
c. Reactivos usados:
i. Solución de peróxido de hidrógeno, 30% en peso; Sigma-Aldrich (216736-100 ml, lote MKBV382V) ii. Dimetilsulfóxido; Sigma-Aldrich (472301-100 ml) lote 21096JK
iii. Yoduro de propidio; Sigma-Aldrich (P4864-10 ml; solución 1 mg/ml en agua)
iv. CFDA [diacetato de 5-(6)-carboxifluoresceína] Sigma-Aldrich número de producto: 21879-100 mg-F v. Solución de cannabidiol, 10 mg/ml en etanol; Sigma-Aldrich número de producto: 90899-1 ml
vi. Solución salina tamponada con fosfato de Dulbecco. Gibco (14190-144) lote 1165767
5. Análisis de datos
a. Adquisición de datos: Los datos se almacenaron en ordenadores Advanced Neural Dynamics para análisis. La adquisición de datos se realizó en un fluorímetro Cytofluor y se transfirió a una hoja de cálculo Excel para análisis con Sigma PLot 11.
b. Análisis estadístico: Todos los datos se analizaron estadísticamente mediante un análisis de varianza con el método de comparaciones múltiples frente a grupo control (Holm-Sidak). Se tomó la significancia estadística al nivel P < 0,05. En todos los casos, las comparaciones se hicieron al contol negativo (tratamiento con peróxido de hidrógeno 10<j>M).
c. Metodología para la determinación de CE50
i. Se eligió un amplio intervalo de concentración para cribar los compuestos en un análisis de potencia de CE50. Se usó una serie de concentraciones logarítmicas desde 0,1 j M a 300 j M.
ii. Se usó un análisis de regresión no lineal para determinar la ecuación de la línea que ajusta mejor los datos (curva logística de cuatro parámetros)
iii. Basado en la ecuación logística siguiente, las CE50 para neuroprotección se calcularon y representaron por SigmaPlot 11 para determinar la concentración requerida para producir respuestas semimáximas para ambos ensayos. Se usaron líneas verticales para mostrar las intersecciones de los ejes que determinan la CE50.
B. Resumen de los estudios de protección para compuestos de Aldeyra en cultivos de hipocampo de rata.
T l 21: R m n l i r i n r
* La concentración del agente de prueba que muestra niveles de respuesta en el ensayo no significativamente diferente de la de los controles sin tratamiento.
C. Análisis gráficos de los hallazgos experimentales de datos sin procesar
1. Experimento 1: Respuesta a la dosis de ALD-6. Efecto sobre la viabilidad neuronal después del cotratamiento con peróxido de hidrógeno 10 j M.
a. Formulación: DMSO
b. Ensayo: CFDA
c. Toxina: peróxido de hidrógeno 10<j>M
d. Duración del tratamiento: 5 horas
e. Medio de crecimiento: medio B27/neurobasal sin antioxidantes
f. Matriz de cultivo: poli-L-lisina
g. Conclusiones: la CE50 se observó a 6,8 ± 1,2 j M; la eficacia completa relativa a los controles (CBD HP y control sin tratamiento) se observó a 100<j>M de ALD-6. ALD-6 es completamente neuroprotector contra la toxicidad de peróxido de hidrógeno a 100 j M en este ensayo. Los resultados se muestran en la tabla 22 y las figuras 36 y 37.
Tabla 22: Datos de respuesta a la dosis para ALD-6 que muestra efecto sobre la viabilidad neuronal después de r mi n n r xi hi r n 1 M
* Significativamente diferente del tratamiento con peróxido de hidrógeno a 10 pM solo.
N.S.: No significativamente diferente del tratamiento con peróxido de hidrógeno a 10 pM solo.
2. Experimento 2: Efecto de respuesta a la dosis de ALD-6 sobre la muerte celular después del cotratamiento con peróxido de hidrógeno 10 pM.
a. Formulación: DMSO
b. Ensayo: Yoduro de propidio
c. Toxina: peróxido de hidrógeno 10 pM
d. Duración del tratamiento: 5 horas
e. Medio de crecimiento: medio B27/neurobasal sin antioxidantes
f. Matriz de cultivo: poli-L-lisina
g. Conclusiones: la CE50 se observó a 0,32 ± 0,03 pM; la eficacia completa relativa a los controles (CBD HP y control sin tratamiento) se observó a 10 pM de ALD-6. ALD-6 es completamente neuroprotector contra la toxicidad de peróxido de hidrógeno en este ensayo. Estos datos sugieren que el efecto protector contra la muerte celular es más potente que el observado para la viabilidad neuronal. Los resultados se muestran en la tabla 23 y las figuras 38 y 39.
Tabla 23: Datos de respuesta a la dosis para ALD-6 que muestra efecto sobre la viabilidad neuronal después de r mi n n r xi hi r n 1 M
* Significativamente diferente del tratamiento con peróxido de hidrógeno a 10 pM solo.
N.S.: No significativamente diferente del tratamiento con peróxido de hidrógeno a 10 pM solo.
3. Experimento 3: Respuesta a la dosis de ALD-5 en DMSO. Efecto sobre la viabilidad neuronal después del cotratamiento con peróxido de hidrógeno 10 pM.
a. Formulación: DMSO
b. Ensayo: CFDA
c. Toxina: peróxido de hidrógeno 10 pM
d. Duración del tratamiento: 5 horas
e. Medio de crecimiento: medio B27/neurobasal sin antioxidantes
f. Matriz de cultivo: poli-L-lisina
g. Conclusiones: No hubo actividad neuroprotectora estadísticamente significativa de ALD-5 contra la toxicidad de peróxido de hidrógeno desde 0,1 a 300 pM. Los resultados se muestran en la tabla 24 y la figura 40.
Tabla 24: Datos de respuesta a la dosis para ALD-5 que muestra efecto sobre la viabilidad neuronal después de r mi n n r xi hi r n 1 M
% del control 100 2 101 3 74 1 66 4 65 3 66 3 66 ±3 * Significativamente diferente del tratamiento con peróxido de hidrógeno a 10 pM solo.
N.S.: No significativamente diferente del tratamiento con peróxido de hidrógeno a 10 pM solo.
4. Experimento 4: Respuesta a la dosis de ALD-5. Efecto sobre la muerte celular después del cotratamiento con peróxido de hidrógeno 10 pM.
a. Formulación: DMSO
b. Ensayo: Yoduro de propidio
c. Toxina: peróxido de hidrógeno 10 pM
d. Duración del tratamiento: 5 horas
e. Medio de crecimiento: medio B27/neurobasal sin antioxidantes
f. Matriz de cultivo: poli-L-lisina
g. Conclusiones: No hubo actividad estadísticamente significativa de protección de la muerte celular desde 0,1 a 300 pM de ALD-5. Los resultados se muestran en la tabla 25 y la figura 41.
Tabla 25: Datos de respuesta a la dosis para ALD-5 que muestra efecto sobre la muerte celular después de r mi n n r xi hi r n 1 M
* Significativamente diferente del tratamiento con peróxido de hidrógeno a 10 pM solo.
N.S.: No significativamente diferente del tratamiento con peróxido de hidrógeno a 10 pM solo.
5. Experimento 5: Respuesta a la dosis de ALD-2. Efecto sobre la viabilidad neuronal después del cotratamiento con peróxido de hidrógeno 10 pM.
a. Formulación: DMSO
b. Ensayo: CFDA
c. Toxina: peróxido de hidrógeno 10 pM
d. Duración del tratamiento: 5 horas
e. Medio de crecimiento: medio B27/neurobasal sin antioxidantes
f. Matriz de cultivo: poli-L-lisina
g. Conclusiones: a LD-2 no tuvo neuroprotección estadísticamente significativa de descensos en la viabilidad neuronal en cultivos tratados con peróxido de hidrógeno. Los resultados se muestran en la tabla 26 y la figura 42.
Tabla 26: Datos de respuesta a la dosis para ALD-2 que muestran efecto sobre la viabilidad neuronal después de r mi n n r xi hi r n 1 M
* Significativamente diferente del tratamiento con peróxido de hidrógeno a 10 pM solo.
N.S.: No significativamente diferente del tratamiento con peróxido de hidrógeno a 10 pM solo.
6. Experimento 6: Respuesta a la dosis de ALD-2. Efecto sobre la muerte celular después del cotratamiento con peróxido de hidrógeno 10 pM.
a. Formulación: DMSO
b. Ensayo: Yoduro de propidio
c. Toxina: peróxido de hidrógeno 10 pM
d. Duración del tratamiento: 5 horas
e. Medio de crecimiento: medio B27/neurobasal sin antioxidantes
f. Matriz de cultivo: poli-L-lisina
g. Conclusiones: No hubo protección estadísticamente significativa de la muerte celular por peróxido de hidrógeno después del tratamiento con ALD-2. Los resultados se muestran en la tabla 27 y la figura 43.
Tabla 27: Datos de respuesta a la dosis para ALD-2 que muestran efecto sobre la muerte celular después de r mi n n r xi hi r n 1 M
* Significativamente diferente del tratamiento con peróxido de hidrógeno a 10 j M solo.
N.S.: No significativamente diferente del tratamiento con peróxido de hidrógeno a 10 j M solo.
7. Resumen de observaciones y conclusiones.
a. ALD-6 mostró actividad neuroprotectora contra la toxicidad de peróxido de hidrógeno en el ensayo de CFDA. b. El efecto neuroprotector de ALD-6 en el ensayo de CFDA no era estadísticamente diferente de los valores del control (sin tratamiento con HP) y control positivo (CBD), lo que indica protección completa.
c. La protección completa relativa a los controles se observó a 100 j M de ALD-6 en el ensayo de viabilidad neuronal de CFDA. La concentración de no efecto para ALD-6 en el ensayo de CFDA fue 1 j M.
d. Los análisis logísticos de ajuste de curva no lineal indicaron que la CE50 de ALD-6 en el ensayo de viabilidad neuronal de CFDA era 6,8 ± 1,2<j>M.
e. ALD-6 mostró actividad protectora de la muerte celular del tratamiento con peróxido de hidrógeno en el ensayo de yoduro de propidio (PI).
f. El efecto protector de ALD-6 de la muerte celular en el ensayo de PI no era estadísticamente diferente de los valores del control (sin tratamiento con HP) y control positivo (CBD), lo que indica protección completa.
g. La protección completa relativa a los valores de control sin tratamiento se observó con ALD-6 a 10<j>M en el ensayo de PI, mientras la concentración de no efecto fue 0,1<j>M. La respuesta a ALD-6 en el ensayo de muerte celular mostró mayor potencia que en el ensayo de CFDA. Se debe reconocer que el ensayo de muerte celular no es específico para neuronas y puede implicar células no neuronales que están presentes en este sistema de SNC modelo.
h. El ajuste de curva logística no lineal indicaba que la la CE50 para ALD-6 en el ensayo de PI era 0,32 ± 0,03 j M. i. El tratamiento con ALD-5 o ALD-2 desde 0,1 a 300<j>M no produjo neuroprotección estadísticamente significativa del tratamiento con peróxido de hidrógeno solo como se evalúa por el ensayo de CFDA.
j. El tratamiento con ALD-5 o ALD-2 desde 0,1 a 300<j>M no produjo protección estadísticamente significativa de muerte celular producida por tratamiento con peróxido de hidrógeno como se evalúa por el ensayo de PI.
k. La señal tóxica producida por peróxido de hidrógeno 10<j>M era típica de una amplia variedad de estresantes oxidativos (etanol, metales pesados, acetato de amonio, y glutamato) que se han ensayado en el pasado, con disminuciones desde el control que varían desde el 30 al 50%.
l. El control positivo (cannabidiol 10<j>M) era activo en cada placa de prueba, lo que indica que el sistema modelo respondía de una manera protectora típica.
Ejemplo 14: Farmacologíain vivode NS2-D6 (compuesto I-1)
Se ensayó NS2-D6 (compuesto ID 100029054-1; número de lote 1603356191) en ensayos de unión y absorción de enzimas. La unión del compuesto se calculó como un % de inhibición de la unión de un ligando marcado con radioactividad específico para cada diana. El efecto de inhibición enzimática del compuesto se calculó como un % de inhibición de una actividad enzimática control. Se considera que los resultados que muestran una inhibición o estimulación mayor del 50% representan efectos significativos de los compuestos de prueba. Tales efectos se observaron aquí y se enumeran en las siguientes tablas.
Compuestos de referencia.
En cada experimento y si es aplicable, el compuesto de referencia respectivo se ensayó al mismo tiempo que NS2-D6, y los datos se compararon con valores históricos determinados en la misma instalación de investigación. El experimento se realizó según procedimientos de operación estándar en la industria.
Resultados
La tabla 28 resume los resultados de inhibición enzimática
Tabla 28: Resumen de los resultados de inhibición enzimática Ensayo___________________________________________________________________________1,0E-05 M 5-HT2B (h) (radioligando agonista) 62,5% acetilcolinesterasa (h) 52,9%
MAO-A (radioligando antagonista) 68,5%
MT3 (ML2) (radioligando agonista) 71,1%
PR (h) (radioligando agonista) 60,9%
Los resultados de los compuestos de prueba se muestran en las figuras 44-46. La Tabla 29 muestra resultados de unión específica para NS-2-D6
Tabla 29: Resultados de compuestos de prueba
Compuesto I.D. Compuesto cliente I.D. Concentración % de inhibición de unión específica de prueba control
1a 2a Media A<1>(h) (radioligando agonista)
100029054-1 NS2-d6 1,0E-05 M 3,5 5,3 4,4 A<2 A>(h) (radioligando agonista)
100029054-1 NS2-d6 1,0E-05 M -11,2 -15,0 -13,1 A<2 B>(h) (radioligando antagonista)
100029054-1 NS2-d6 1,0E-05 M 13,2 4,3 8,7 A<3>(h) (radioligando agonista)
100029054-1 NS2-d6 1,0E-05 M 17,3 15,1 16,2 a-<iA>(h) (radioligando antagonista)
100029054-1 NS2-d6 1,0E-05 M 6,1 -3,3 1,4 a<1 B>(h) (radioligando antagonista)
100029054-1 NS2-d6 1,0E-05 M -1,8 1,0 -0,4 a<2 A>(h) (radioligando antagonista)
100029054-1 NS2-d6 1,0E-05 M 3,2 10,0 6,6 a<2 B>(h) (radioligando antagonista)
100029054-1 NS2-d6 1,0E-05 M 15,9 20,8 18,4 a<2 c>(h) (radioligando antagonista)
100029054-1 NS2-d6 1,0E-05 M -8,0 6,2 -0,9 P<1>(h) (radioligando agonista)
100029054-1 9,7 11,0 10,3
^<2>(h) (radioligando agonista)
100029054-1 -0,6 5,8 2,6
Adrenérgico beta3 100029054-1 NS2-d6 1,0E-05 M 16,2 3,0 9,6 AT<1>(h) (radioligando antagonista)
100029054-1 NS2-d6 1,0E-05 M 10,7 -3,3 3,7 AT<2>(h) (radioligando agonista)
100029054-1 NS2-d6 1,0E-05 M -3,5 -5,6 -4,6 APJ (apelina) (radioligando agonista)
100029054-1 NS2-d6 1,0E-05 M 0,8 2,2 1,5 BZD (central) (radioligando agonista)
100029054-1 NS2-d6 1,0E-05 M -17,2 -16,6 -16,9 BB<3>(h) (radioligando agonista)
100029054-1 NS2-d6 1,0E-05 M -17,1 4,6 -6,3 B<2>(h) (radioligando agonista)
100029054-1 NS2-d6 1,0E-05 M -4,50,1-2,2 CB<1>(h) (radioligando agonista)
100029054-1 NS2-d6 1,0E-05 M 21,9 20,7 21,3 CB<2>(h) (radioligando agonista)
100029054-1 NS2-d6 1,0E-05 M 16,6 5,0 10,8 CCK<i>(CCK<a>)(h)(radioligando agonista)
100029054-1 NS2-d6 1,0E-05 M -10,0 11,9 0,9 CCK<2>(CCK<b>) (h) (radioligando agonista)
100029054-1 NS2-d6 1,0E-05 M -3,6 -14,6 -9,1 CRF<1>(h) (radioligando agonista)
100029054-1 NS2-d6 1,0E-05 M 6,7 5,7 6,2 D<1>(h) (radioligando antagonista)
100029054-1 NS2-d6 1,0E-05 M 0,8 6,6 3,7 D<2 S>(h) (radioligando agonista)
100029054-1 NS2-d6 1,0E-05 M 15,2 14,4 14,8 D<3>(h) (radioligando antagonista)
100029054-1 NS2-d6 1,0E-05 M 6,2 -4,1 1,1 ET<a>(h) (radioligando agonista)
100029054-1 NS2-d6 1,0E-05 M -0,8 -5,8 -3,3 ET<b>(h) (radioligando agonista)
100029054-1 NS2-d6 1,0E-05 M 7,6 -5,4 1,1 GABA<a 1>(h) (a, P2, y2) (radioligando agonista)
100029054-1 NS2-d6 1,0E-05 M -45,9 -21,1 -33,5 GABA<B (1b)>(h) (radioligando antagonista)
100029054-1 NS2-d6 1,0E-05 M -7,2 5,2 -1,0 glucagón (h) (radioligando agonista)
100029054-1 NS2-d6 1,0E-05 M -4,2 -6,9 -5,6 AMPA (radioligando agonista)
100029054-1 NS2-d6 1,0E-05 M -5,9 5,1 -0,4 kainato (radioligando agonista)
100029054-1 NS2-d6 1,0E-05 M 17,5 12,1 14,8 NMDA (radioligando antagonista)
100029054-1 NS2-d6 1,0E-05 M 5,5 14,6 10,1 Glicina (insensible a estricnina) (radioligando antagonista)
100029054-1 NS2-d6 -7,7 16,2 4,2 TNF-a (h) (radioligando agonista) 100029054-1 -6,5 -0,9 -3,7
CCR2 (h) (radioligando agonista)
100029054-1 NS2-d6 1,0E-05 M -12,4 6,2 -3,1 H<1>(h) (radioligando antagonista)
100029054-1 NS2-d6 1,0E-05 M -8,6 19,9 5,6 H<2>(h) (radioligando antagonista)
100029054-1 NS2-d6 1,0E-05 M 1,1 -0,5 0,3 H<3>(h) (radioligando agonista)
100029054-1 NS2-d6 1,0E-05 M 15,3 13,9 14,6 H<4>(h) (radioligando agonista)
100029054-1 NS2-d6 1,0E-05 M 9,8 -3,3 3,2 BLT<1>(LTB<4>) (h) (radioligando agonista)
100029054-1 NS2-d6 1,0E-05 M 9,6 7,0 8,3 CysLT (LTD<4>) (h) (radioligando agonista)
100029054-1 NS2-d6 1,0E-05 M -3,6 -17,1 -10,4 MCH<1>(h) (radioligando agonista)
100029054-1 NS2-d6 1,0E-05 M -3,7 -9,3 -6,5 MC<1>(radioligando agonista)
100029054-1 NS2-d6 1,0E-05 M -10,5 -5,7 -8,1 MC<3>(h) (radioligando agonista)
100029054-1 NS2-d6 1,0E-05 M -1,4 0,6 -0,4 MC<4>(h) (radioligando agonista)
100029054-1 NS2-d6 1,0E-05 M -2,8 -3,0 -2,9 MT<1>(ML<1A>) (h) (radioligando agonista)
100029054-1 NS2-d6 1,0E-05 M 30,0 37,7 33,9 MT<3>(ML<2>) (radioligando agonista)
<100029054-1 NS2-d6 1,0E-05 M 69,0 73,3>71,1 MAO-A (radioligando antagonista)
<100029054-1 NS2-d6 1,0E-05 M 66,4 70,7>68,5 motilina (h) (radioligando agonista)
100029054-1 NS2-d6 1,0E-05 M -12,2 -3,9 -8,0 M<1>(h) (radioligando antagonista)
100029054-1 NS2-d6 1,0E-05 M -2,6 0,5 -1,1 M<2>(h) (radioligando antagonista)
100029054-1 NS2-d6 1,0E-05 M -4,2 -0,4 -2,3 M<3>(h) (radioligando antagonista)
100029054-1 NS2-d6 1,0E-05 M 4,6 13,6 9,1 M<4>(h) (radioligando antagonista)
100029054-1 NS2-d6 1,0E-05 M -1,0 9,2 4,1 NK<i (h)>(radioligando agonista)
100029054-1 NS2-d6 1,0E-05 M 4,2 4,1 4,2 NK<2>(h) (radioligando agonista)
100029054-1 NS2-d6 1,0E-05 M 18,6 -4,5 7,0 Y<1>(h) (radioligando agonista)
100029054-1 NS2-d6 1,0E-05 M -8,7 7,5 -0,6 N neuronal a4P2 (h) (radioligando agonista)
100029054-1 NS2-d6 1,0E-05 M -5,7 -6,7 -6,2 N de tipo muscular (h) (radioligando antagonista)
100029054-1 NS2-d6 1,0E-05 M -16,8 0,7 -8,1 5 (DOP) (h) (radioligando agonista)
100029054-1 NS2-d6 1,0E-05 M 3,8 -1,4 1,2 k (KOP) (h) (radioligando agonista)
100029054-1 NS2-d6 1,0E-05 M 13,3 16,2 14,8 g (MOP) (h) (radioligando agonista)
100029054-1 NS2-d6 1,0E-05 M 3,0 6,8 4,9 NOP (ORL1) (h) (radioligando agonista)
100029054-1 NS2-d6 1,0E-05 M 10,8 18,7 14,8 PPARv (h) (radioligando agonista)
100029054-1 NS2-d6 1,0E-05 M 13,1 23,6 18,3 PAF (h) (radioligando agonista)
100029054-1 NS2-d6 1,0E-05 M -10,1 7,4 -1,3 PCP (h) (radioligando antagonista)
100029054-1 NS2-d6 1,0E-05 M 2,1 6,5 4,3 EP<2>(h) (radioligando agonista)
100029054-1 NS2-d6 1,0E-05 M 18,1 41,5 29,8 FP (h) (radioligando agonista)
100029054-1 NS2-d6 1,0E-05 M 10,7 -4,5 3,1 IP (PGI<2>) (h) (radioligando agonista)
100029054-1 5,0 -9,1 -2,0
LXRP (h) (radioligando agonista)
100029054-1 -10,5 -3,9 -7,2
<5>-HT<1A>(h) (radioligando agonista)
100029054-1 NS2-d6 1,0E-05 M 5,4 -1,8 1,8<5>-HT<1 B>(h) (radioligando antagonista)
100029054-1 NS2-d6 1,0E-05 M -16,3 0,5 -7,9<5>-HT<1D>(h) (radioligando agonista)
100029054-1 NS2-d6 1,0E-05 M -3,4 -5,1 -4,2<5>-HT<2 A>(h) (radioligando agonista)
100029054-1 NS2-d6 1,0E-05 M 5,4 17,8 11,6<5>-HT<2 B>(h) (radioligando agonista)
<100029054-1 NS2-d6 1,0E-05 M 60,8 64,2>62,5 5-HT<2 c>(h) (radioligando agonista)
100029054-1 NS2-d6 1,0E-05 M -3,1 10,0 3,4<5>-HT<3>(h) (radioligando antagonista)
100029054-1 NS2-d6 1,0E-05 M -3,0 2,2 -0,4<5>-HT<4 e>(h) (radioligando antagonista)
100029054-1 NS2-d6 1,0E-05 M -5,5 -2,6 -4,1 5-HT<5 a>(h) (radioligando agonista)
100029054-1 NS2-d6 1,0E-05 M 3,8 17,3 10,6 5-HT<6>(h) (radioligando agonista)
100029054-1 NS2-d6 1,0E-05 M 1,1 17,7 9,4<5>-HT<7>(h) (radioligando agonista)
100029054-1 NS2-d6 1,0E-05 M 2,3 -5,6 -1,7 sigma (no selectivo) (h) (radioligando agonista)
100029054-1 NS2-d6 1,0E-05 M 16,3 13,5 14,9 sst<1>(h) (radioligando agonista)
100029054-1 NS2-d6 1,0E-05 M -5,1 5,0 -0,1 sst<4>(h) (radioligando agonista)
100029054-1 NS2-d6 1,0E-05 M 3,1 -5,9 -1,4 GR (h) (radioligando agonista)
100029054-1 NS2-d6 1,0E-05 M -6,7 4,1 -1,3 Estrógeno ER alfa (h) (radioligando agonista)
100029054-1 NS2-d6 1,0E-05 M 15,8 4,3 10,1 PR (h) (radioligando agonista)
<100029054-1 NS2-d6 1,0E-05 M 58,7 63,1>60,9 AR (h) (radioligando agonista)
100029054-1 NS2-d6 1,0E-05 M 41,4 44,3 42,8 Hormona tiroidea
100029054-1 NS2-d6 1,0E-05 M -7,9 -5,9 -6,9 UT (h) (radioligando agonista)
100029054-1 NS2-d6 1,0E-05 M 3,1 4,9 4,0 VPAC<1>(VIP<1>) (h) (radioligando agonista)
100029054-1 NS2-d6 1,0E-05 M 0,2 1,9 1,1 V<1 a>(h) (radioligando agonista)
100029054-1 NS2-d6 1,0E-05 M 2,1 -1,2 0,5 V<2>(h) (radioligando agonista)
100029054-1 NS2-d6 1,0E-05 M 0,4 2,9 1,7 Canal de Ca<2>(L, sitio de dihidropiridina) (radioligando antagonista)
100029054-1 NS2-d6 1,0E-05 M 5,9 3,8 4,9 Canal de Ca2+ (L, sitio de diltiazem) (benzotiacepinas) (radioligando antagonista)
100029054-1_________________________ NS2-d6_______________ 1,0E-05 M______ 14,8________13,3________14,0 Canal de Ca2+ (L, sitio de verapamil) (fenilalquilamina) (radioligando antagonista)___________________________________ 100029054-1_________________________ NS2-d6_______________ 1,0E-05 M______ -6,5_______ -11,8_______ -9,1 Canal de Ca2+ (N) (radioligando antagonista)______________________________________________________________ 100029054-1_________________________ NS<2>-d<6>_______________ 1,0E-05 M_______<4 ,6>_________<8>J_________6,3 Canal de potasio hERG (humano-[3H1 Dofetilida____________________________________________________________ 100029054-1_________________________ NS2-d6_______________ 1,0E-05 M_______8,0________ -2,8________ 2,6 Canal SKCa (radioligando antagonista)___________________________________________________________________ 100029054-1_________________________ NS2-d6_______________ 1,0E-05 M______ -10,8_______ -4,5________ -7,7 Canal de Na+ (sitio 2) (radioligando antagonista)____________________________________________________________ 100029054-1_________________________ NS2-d6_______________ 1,0E-05 M______ -2,7________ 6,2_________1,8 Canal de Cl- (operado por GABA) (radioligando antagonista)___________________________________________________ 100029054-1_________________________ NS2-d6_______________ 1,0E-05 M______ 33,9________<42 ,6>________38,2 transportador de norepinefrina(h)(radioligando antagonista)__________________________________________________ 100029054-1_________________________ NS2-d6_______________ 1,0E-05 M______ 33,9________291________31,5 transportador de dopamina (h) (radioligando antagonista)_____________________________________________________ 100029054-1_________________________ NS2-d6_______________ 1,0E-05 M______ 19,9________2ZJ________23,6 transportador de GABA (radioligando antagonista)__________________________________________________________ 100029054-1_________________________ NS2-d6_______________ 1,0E-05 M______ -<6>J________ -4,5________ -5,3 transportador de colina (CHT1) (h) (radioligando antagonista)__________________________________________________ 100029054-1________________________ NS2-d6_______________ 1,0E-05 M______ -17,9_______ -13J_______ -15,5 transportador de 5-HT (h) (radioligando antagonista)_________________________________________________________ 100029054-1________________________ NS2-d6_______________ 1,0E-05 M______ 2,9________ 5,2________ 49_
La tabla 30 muestra valores de CI50, Ki y nH para varios compuesto de referencia que se compararon con NS2-D6.
Tabla 30: Resultados de compuestos de referencia
Compuesto I.D. CI<50>(M) K<i>(M) nH A<1>(h) (radioligando agonista)
CPA 3,3E-09 M 1,3E-09 M 1,2 A<2 A>(h) (radioligando agonista)
NECA 3,7E-08 M 3,1E-08 M 0,8 A<2 B>(h) (radioligando antagonista)
NECA 5,5E-07 M 5,1E-07 M 0,9 A<3>(h) (radioligando agonista)
IB-MECA 2,8E-10 M 1,6E-10 M 0,8 a-<iA>(h) (radioligando antagonista)
WB 4101 2,5E-10 M 1,2E-10 M 1,1 a<1 B>(h) (radioligando antagonista)
prazosina 2,5E-10 M 6,7E-11 M 1,2 a<2 A>(h) (radioligando antagonista)
yohimbina 7,5E-09 M 3,3E-09 M 1,3 a<2 B>(h) (radioligando antagonista)
yohimbina 7,6E-09 M 5,0E-09 M 1,0 a<2 c>(h) (radioligando antagonista)
yohimbina 4,3E-09 M 1,3<31>(h) (radioligando agonista) atenolol 0,9<32>(h) (radioligando agonista) ICI 118551 1,3E-09 M 4,5E-10 M 1,8 Adrenérgico beta3
alprenolol 1,4E-07 M 1,0E-07 M 0,6 AT<1>(h) (radioligando antagonista)
saralasina 1,4E-09 M 6,9E-10 M 1,1 AT<2>(h) (radioligando agonista)
angiotensina-II 1,2E-10 M 5,9E-11 M 0,8 APJ (apelina) (radioligando agonista)
apelina-13, TFA 2,7E-10 M 2,5E-10 M 1,0 BZD (central) (radioligando agonista)
diazepam 7,4E-09 M 6,2E-09 M 0,9 BB<3 (h)>(radioligando agonista)
Bn(6-14) 9,8E-09 M 6,0E-09 M 1,0 B<2>(h) (radioligando agonista)
NPC 567 2,4E-08 M 1,2E-08 M 1,0 CB<1>(h) (radioligando agonista)
CP 55940 1,1E-09 M 1,2
CB<2>(h) (radioligando agonista) WIN 55212-2 1,0 CCK<1>(CCK<a>) (h) (radioligando agonista)
CCK-8s 1,1E-10 M 8,3E-11 M 0,9 CCK<2>(CCK<b>) (h) (radioligando agonista)
CCK-8s 1,1E-10 M 4,6E-11 M 1,0 CRF<1>(h) (radioligando agonista)
sauvagina 5,5E-10 M 3,4E-10 M 1,0 D<1>(h) (radioligando agonista)
SCH 23390 2,1E-10 M 8,4E-11 M 0,7 D<2 S>(h) (radioligando agonista)
7-OH-DPAT 1,2E-09 M 4,8E-10 M 0,7 D<3>(h) (radioligando antagonista)
(+)butaclamol 1,5E-09 M 3,2E-10 M 1,0 ET<a>(h) (radioligando agonista)
endotelina-1 5,4E-11 M 2,7E-11 M 1,0 ET<b>(h) (radioligando agonista)
endotelina-3 2,5E-11 M 1,4E-11 M 0,9 GABA<a i>(h) (a, P2, y2) (radioligando agonista)
muscinol 7,0E-08 M 4,7E-08 M 0,8 GABA<b ( i b )>(h) (radioligando antagonista)
CGP 54626 2,9E-09 M 1,5E-09 M 0,7 glucagón (h) (radioligando agonista)
glucagón 1,5E-09 M 1,1E-09 M 0,6 AMPA (radioligando agonista)
L-glutamato 2,8E-07 M 2,6E-07 M 0,9 kainato (radioligando agonista)
ácido kaínico 2,3E-08 M 1,8E-08 M 0,9 NMDA (radioligando antagonista)
CGS 19755 2,1E-07 M 1,7E-07 M 0,9 glicina (insensible a estricnina) (radioligando antagonista)
glicina 1,4E-07 M 1,3E-07 M 1,0 TNF-a (h) (radioligando agonista)
TNF-alfa 6,9E-11 M 2,3E-11 M 1,3 CCR2 (h) (radioligando agonista)
MCP-1 2,9E-11 M 1,6
H<1>(h) (radioligando antagonista) pirilamina 2,5E-09 M 1,3 H<2>(h) (radioligando antagonista) cimetidina 6,5E-07 M 6,3E-07 M 0,8 H<3>(h) (radioligando agonista)
(R)a-Me-histamina 1,9E-09 M 4,7E-10 M 1,4 H<4>(h) (radioligando agonista)
imetita 4,4E-09 M 1,9E-09 M 0,9 BLT<1>(LTB<4>) (h) (radioligando agonista)
LTB<4>4,2E-10 M 2,1E-10 M 0,8 CysLT<1>(LTD<4>) (h) (radioligando agonista)
LTD<4>7,0E-10 M 3,1E-10 M 1,0 MCH<1>(h) (radioligando agonista)
MCH humano 4,9E-11 M 4,5E-11 M 1,0 MC<1>(radioligando agonista)
NDP-a-MSH 1,8E-10 M 8,9E-11 M 1,0 MC<3>(h) (radioligando agonista)
NDP-a-MSH 2,0E-10 M 1,7E-10 M 1,2 MC<4>(h) (radioligando agonista)
NDP-a-MSH 4,8E-10 M 4,4E-10 M 0,7 MT<1>(ML<1A>) (h) (radioligando agonista)
melatonina 2,0E-10 M 1,6E-10 M 1,6 MT<3>(ML<2>) (radioligando agonista)
melatonina 7,2E-08 M 7,1 E-08 M 0,8 MAO-A (radioligando antagonista)
clorgilina 1,7E-09 M 1,0E-09 M 1,7 motilina (h) (radioligando agonista)
[Nleu<13>]-motilina 2,0E-09 M 1,7E-09 M 1,1 M<i>(h) (radioligando antagonista)
pirencepina 2,2E-08 M 1,9E-08 M 1,0 M<2>(h) (radioligando antagonista)
metoctramina 4,9E-08 M 3,4E-08 M 0,8 M<3>(h) (radioligando antagonista)
4-DAMP 1,8E-09 M 1,3E-09 M 1,3 M<4>(h) (radioligando antagonista)
4-DAMP 1,5E-09 M 9,5E-10 M 1,2 NK<1>(h) (radioligando agonista)
[Sar<9>,Met(O)<2>)<11>]-SP 4,9E-10 M 1,6 NK<2>(h) (radioligando agonista) [Nleu<10>]-NKA (4-10) 3,1E-09 M 0,8 Y<1>(h) (radioligando agonista) NPY 9,4E-11 M 6,7E-11 M 1,3 N neuronal a2P4 (h) (radioligando agonista)
nicotina 4,5E-09 M 1,5E-09 M 0,9 N tipo muscular (h) (radioligando antagonista)
a-bungarotoxina 2,3E-09 M 2,1E-09 M 1,2 5 (DOP) (h) (radioligando agonista)
DPDPE 2,7E-09 M 1,6E-09 M 0,9 k (KOP) (h) (radioligando agonista)
U 50488 9,3E-10 M 6,2E-10 M 1,0 g (MOP) (h) (radioligando agonista)
DAMGO 2,8E-10 M 1,2E-10 M 0,7 NOP (ORL1) (h) (radioligando agonista)
nociceptina 8,4E-10 M 1,1E-10 M 1,1 PPARv (h) (radioligando agonista)
rosiglitazona 1,2E-08 M 6,1E-09 M 0,9 PAF (h) (radioligando agonista)
C<16>-PAF 5,8E-09 M 2,9E-09 M 1,8 PCP (h) (radioligando antagonista)
MK 801 9,2E-09 M 5,2E-09 M 1,3 EP<2>(h) (radioligando agonista)
PGE<2>3,4E-09 M 1,7E-09 M 1,1 FP (h) (radioligando agonista)
PGE2alfa 1,9E-09 M 1,2E-09 M 0,9 IP (PGI<2>) (h) (radioligando agonista)
iloprost 1,8E-08 M 1,0E-08 M 0,9 LXR3 (h) (radioligando agonista)
22-(R)-hidroxicolesterol 4,0E-06 M 2,7E-06 M 1,1<5>-HT<1A>(h) (radioligando agonista)
8-OH-DPAT 5,8E-10 M 3,6E-10 M 0,8<5>-HT<1 B>(h) (radioligando antagonista)
serotonina 4,9E-09 M 3,0E-09 M 0,9<5>-HT<1D>(h) (radioligando agonista)
serotonina 2,4E-09 M 1,2<5>-HT<2 A>(h) (radioligando agonista)
(±)DOI 3,4E-10 M 2,5E-10 M 0,7<5>-HT<2 B>(h) (radioligando agonista)
(±)DOI 6,9E-09 M 3,4E-09 M 0,9<5>-HT<2 C>(h) (radioligando agonista)
(±)DOI 5,3E-10 M 4,7E-10 M 1,1<5>-HT<3>(h) (radioligando antagonista)
MDL 72222 6,9E-09 M 4,8E-09 M 0,9<5>-HT<4 e>(h) (radioligando antagonista)
serotonina 2,7E-07 M 8,9E-08 M 0,7 5-HT<5 a>(h) (radioligando agonista)
serotonina 1,5E-07 M 7,5E-08 M 1,0 5-HT<6>(h) (radioligando agonista)
serotonina 2,0E-07 M 9,3E-08 M 1,1<5>-HT<7>(h) (radioligando agonista)
serotonina 3,4E-10 M 1,3E-10 M 1,0 sigma (no selectivo (h) (radioligando agonista)
haloperidol 6,3E-08 M 5,1E-08 M 0,7 sst<1>(h) (radioligando agonista)
somatostantina-28 2,0E-10 M 1,9E-10 M 0,8 sst<4>(h) (radioligando agonista)
somatostatina-14 9,1E-10 M 8,9E-10 M 0,9 GR (h) (radioligando agonista)
dexametasona 4,9E-09 M 2,4E-09 M 1,2 Estrógeno ER alfa (h) (radioligando agonista)
dimetilestilbestrol 3,7E-10 M 1,0E-10 M 1,9 PR (h) (radioligando agonista)
progesterona 4,7E-10 M 3,8E-10 M 1,6 AR (h) (radioligando agonista)
mibolerona 1,6E-09 M 6,9E-10 M 1,2 Hormona tiroidea
triyodotironina 4,2E-11 M 2,3E-11 M 1,1 UT (h) (radioligando agonista)
urotensina-II 1,1 VPAC<1>(VIP<1>) (h) (radioligando agonista)
VIP 1,9
V<1 a>(h) (radioligando agonista)
[d(CH<2>)<51>,Tyr(Me)<2>]-AVP 1,4E-09 M 8,8E-10 M 1,0 V<2>(h) (radioligando agonista)
AVP 4,3E-10 M 3,1E-10 M 0,7 Canal de Ca<2>(L, sitio de dihidropiridina) (radioligando antagonista)
dintrendipina 3,0E-10 M 1,9E-10 M 1,1 Canal de Ca<2>(L, sitio de diltiazem) (benzotiacepinas) (radioligando antagonista)
dilitiazem 6,8E-08 M 5,3E-08 M 1,1 Canal de Ca<2>(L, sitio de verapamil) (fenilalquilamina) (radioligando antagonista)
D 600 2,7E-08 M 1,3E-08 M 0,5 Canal de Ca<2>(N) (radioligando antagonista)
w-conotoxina GVIA 1,7E-12 M 6,8E-13 M 0,8 Canal de potasio hERG (humano-[3H] Dofetilida
Terfenadina 3,4E-08 M 2,3E-08 M 0,8 Canal SK<C a>(radioligando antagonista)
apamina 8,8E-12 M 4,4E-12 M1,0Canal de Na<+>(sitio 2) (radioligando antagonista)
veratridina 3,9E-06 M 3,5E-06 M 0,8 Canal de Cl- (operado por GABA) (radioligando antagonista)
picrotoxinina 2,8E-07 M 2,4E-07 M 1,0 transportador de norepinefrina (h) (radioligando antagonista)
protriptilina 2,8E-09 M 2,1E-09 M 1,0 transportador de dopamina (h) (radioligando antagonista)
BTCP 9,5E-09 M 5,0E-09 M 1,1 transportador de GABA (radioligando antagonista)
ácido nipecótico 2,5E-06 M 2,5E-06 M 0,8 transportador de colina (CHT1) (h) (radioligando antagonista)
hemicolinio-3 7,5E-09 M 4,2E-09 M 1,0 transportador de 5-HT (h) (radioligando antagonista)
imipramina 2,7E-09 M 1,3E-09 M 1,3
La figura 47 muestra un histograma de los resultados de farmacologíain vitroen ensayos de unión y absorción de enzimas para NS2-D6.
La tabla 31 muestra el % de inhibición de valores control para NS2-D6.
Tabla 31: Resultados de compuestos de prueba
Compuesto I.D. Compuesto Concentración % de inhibición de valores control Indicadores cliente I.D. de prueba 1° 2° media 1° 2° COX1 (h)
100029054-1 NS2-d6 1,0E-05 M 20,1 -2,6 8,8
COX2 (h)
100029054-1 12,8 3,0 7,9
5-lipoxigenasa (h)
100029054-1 23,5 24,8 24,2
12-lipoxigenasa (h)
100029054-1 -9,4 -4,1 -6,7
NOS inducible
100029054-1 NS2-d6 1,0E-05 M 2,8 -2,0 0,4
PDE2A1 (h)
100029054-1 NS2-d6 1,0E-05 M 17,1 -24,5 -3,7
PDE3B (h)
100029054-1 NS2-d6 1,0E-05 M 0,9 -4,5 -1,8
PDE4D2 (h)
100029054-1 NS2-d6 1,0E-05 M 15,9 16,9 16,4
PDE5 (h) (no selectivo)
100029054-1 NS2-d6 1,0E-05 M -8,6 -2,9 -5,7
PDE6 (no selectivo)
100029054-1 NS2-d6 1,0E-05 M 4,1 18,9 11,5
ACE (h)
<100029054-1 NS2-d6 1,0E-05 M 127,6 131,0>129,3<INTER INTER>ACE-2 (h)
100029054-1 NS2-d6 1,0E-05 M 23,8 26,2 25,0 INTER INTER BACE-1 (h) (P-secretasa)
100029054-1 NS2-d6 1,0E-05 M -4,1 -5,7 -4,9 INTER INTER caspasa-3 (h)
100029054-1 NS2-d6 1,0E-05 M -2,0 2,5 0,2
caspasa-8 (h)
100029054-1 NS2-d6 1,0E-05 M 14,7 16,4 15,6
Proteasa de VIH-1
100029054-1 NS2-d6 1,0E-05 M 16,6 4,8 10,7
MMP-1 (h)
100029054-1 NS2-d6 1,0E-05 M 45,3 10,7 28,0 INTER INTER MMP-2 (h)
100029054-1 NS2-d6 1,0E-05 M 4,9 -2,4 1,3
MMP-9 (h)
100029054-1 NS2-d6 1,0E-05 M 4,5 4,4 4,4 INTER INTER Quinasa Abl (h)
100029054-1 NS2-d6 1,0E-05 M -4,8 -11,6 -8,2
CaMK2a (h)
100029054-1 NS2-d6 1,0E-05 M 0,2 -6,5 -3,1
CDK2 (h) (cicA)
100029054-1 NS2-d6 1,0E-05 M 1,2 -5,1 -1,9
ERK<2>(h) (P42<m apk>)
100029054-1 NS2-d6 1,0E-05 M -6,3 -1,3 -3,8
Quinasa FLT-1 (h) (VEGFR1)
100029054-1 -15,5 -18,8 -17,2
Quinasa Fyn (h)
100029054-1 -8,6 -0,3 -4,5
IRK (h) (InsR)
100029054-1 NS2-d6 1,0E-05 M -15,1 -7,9 -11,5
Quinasa Lyn A (h)
100029054-1 NS2-d6 1,0E-05 M -17,7 -35,7 -26,7
Quinasa p38a (h)
100029054-1 NS2-d6 1,0E-05 M -3,2 -3,1 -3,2
Quinasa ZAP70 (h)
100029054-1 NS2-d6 1,0E-05 M 0,4 1,5 1,0 acetilcolinesterasa (h)
<100029054-1 NS2-d6 1,0E-05 M 45,8 60,1>52,9
COMT (catecol-O-metil transferasa)
100029054-1 NS2-d6 1,0E-05 M 5,8 14,7 10,3 INTER INTER MAO-B (h) enzima recombinante
100029054-1 NS2-d6 1,0E-05 M -3,1 -3,7 -3,4
xantina oxidasa/captador de<0 2 '>superóxido
100029054-1 NS2-d6 1,0E-05 M -3,1 15,6 6,3
ATPasa (Na<+>/K<+>)
100029054-1 NS2-d6 1,0E-05 M 5,2 -0,4 2,4
Peptidasa, metaloproteínasa, endopeptidasa neutra
100029054-1 NS2-d6 1,0E-05 M 0,3 3,0 1,7
INTER: el compuesto de prueba interfiere con el método de detección del ensayo.
La tabla 32 muestra los valores de CI50 y nH para compuestos de referencia.
________________________Tabla 32: Valores de CI50 y nH de compuestos de referencia
Compuesto I.D. CI<50>(M) nH COX1 (h)
Diclofenaco 5,7E-09 M 1,6 COX2 (h)
NS398 6,8E-08 M 1,3 5-lipoxigenasa (h)
NDGA 2,3E-07 M 1,6 12-lipoxigenasa (h)
NDGA 5,1E-07 M 1,2 NOS inducible
1400W 4,0E-08 M 1,4 PDE2A1 (h)
EHNA 1,1E-06 M 0,8 PDE3B (h)
milrinona 1,0E-06 M 0,9 PDE4D2 (h)
Ro 20-1724 8,2E-07 M 1,0 PDE5 (h) (no selectivo)
dipiridamol 1,8E-06 M 1,1 PDE6 (no selectivo)
zaprinast 1,8E-07 M 1,0 ACE (h)
captopril 5,7E-10 M 1,2 ACE-2 (h)
Ac-GG-26NH<2>2,9E-07 M 2,4 BACE-1 (h) (P-secretasa)
OM 99-2 1,2E-07 M 1,4 caspasa-3 (h)
Ac-DEVD-CHO 2,0E-09 M 1,1 caspasa-8 (h)
Ac-IETD-CHO 2,8E-08 M 0,8 Proteasa de VIH-1
pepstatina A 2,2E-06 M 1,9 MMP-1 (h)
GM6001 1,6E-09 M 1,3 MMP-2 (h)
GM6001 1,5E-09 M 1,3 MMP-9 (h)
GM6001 5,4E-10 M 0,9 Quinasa Abl (h)
estaurosporina 2,6E-07 M 1,4 CAMK2a (h)
AIP 1,1
CDK2 (h) (cicA) estaurosporina 1,0 ERK<2>(h) (P42<m apk>) estaurosporina 6,9E-07 M 1,0 Quinasa FLT-1 (h) (VEGFR1)
estaurosporina 7,0E-09 M 0,7 Quinasa Fyn (h)
PP1 1,0E-07 M >3 IRK (h) (InsR)
estaurosporina 1,6E-08 M 0,9 Quinasa Lyn A (h)
estaurosporina 1,2E-08 M 1,9 Quinasa p38a (h)
SB202190 3,0E-08 M 1,0 Quinasa ZAP70 (h)
estaurosporina 1,1E-07 M 1,4 acetilcolinesterasa (h)
galantamina 7,6E-07 M 1,0 COMT (catecol-O-metil transferasa)
Ro 41-0960 3,0E-08 M 1,7 MAO-B (h) enzima recombinante
deprenilo 3,5E-08 M 1,4 xantina oxidasa/captador de O<2 '>superóxido
alopurinol 2,0E-06 M 1,3 ATPasa (Na<+>/K<+>)
ouabaína 1,0E-06 M 1,3 Peptidasa, metaloproteínasa, endopeptidasa neutra
fosforamidón 1,6E-08 M 0,9
La tabla 33 muestra resultados de compuestos de prueba de NS2-D6 en guanilil ciclasa
Tabla 33: Resultados de resultados de compuestos de prueba con guanillil ciclasa Compuesto I.D. Compuesto cliente I.D. Concentración % de valores control de prueba 1a 2a Media guanillil ciclasa (h) (efecto activador)
100029054-1 NS2-d6 1,0E-05 M 0,2 0,3 0,2
La tabla 34 muestra los resultados de CE50 de compuesto de referencia sobre gianilil ciclasa.
Tabla 34: Resultados de resultados de compuestos de referencia con guanillil ciclasa Compuesto I.D. CE<50>(M) nH guanillil ciclasa (h) (efecto activador)
nitroprusiato de sodio 3,5E-06 M 2,2
Se considera que los resultados que muestran una inhibición (o estimulación para ensayos corridos en condiciones basales) mayor que el 50% representan efectos significativos de los compuestos de prueba. El 50% es el valor límite más común para investigación adicional (determinación de los valores CI50 o CE50 de curvas de concentración y respuesta). Los resultados que muestran una inhibición (o estimulación) entre el 25% y el 50% son indicativos de efectos débiles o moderados (en la mayoría de los ensayos, se deben confirmar por pruebas adicionales ya que están en el intervalo donde se puede producir más variabilidad interexprimental). Los resultados que muestran una inhibición (o estimulación) menor del 25% se no consideran significativos y en la mayor parte atribuible a variabilidad de la señal alrededor del nivel control.
Los valores negativos de bajos a moderados no tienen significado real y son atribuibles a la variabilidad de la señal alrededor del nivel control. Los valores negativos altos (>50%) que algunas veces se obtienen con altas concentraciones de los compuestos de prueba en general son atribuibles a efectos no específicos de los compuestos de prueba en los ensayos. En raras ocasiones podrían sugerir un efecto alostérico de los compuestos de prueba.
Condiciones experimentales
La tabla 35 resume las condiciones del ensayo de unión
_______________________________ Tabla 35: Condiciones del ensayo de unión_______________________________ Ensayo Fuente Ligando Conc. Kd No específico Incubación Método de Bibl.
detección Receptores
A<i>(h) Humano [<3>H]CCPA i nM 0,7 nM CPA (i0 |jM) 60 min RT Conteo de i98 (radioligando recombinante centelleo agonista) (células CHO)
A<2A>(h) Humano [<3>H]CGS 6 nM 27 nM NECA (i0 jM) i20 min Conteo de i4 i (radioligando recombinante 2i680 RT centelleo agonista) (células HEK-293)
A<2 B>(h) Humano [<3>H]CPX 5 nM 65 nM NECA (i00 60 min RT Conteo de 229 (radioligando recombinante JM) centelleo antagonista) (células HEK-293)
A<3>(h) Humano [<i 2 5>I]AB-MECA 0,i5 0,22 IB-MECA (i i20 min Conteo de 206 (radioligando recombinante nM nM JM) RT centelleo agonista) (células HEK-293)
a<i A>(h) Humano [<3>H]prazosina 0,i nM 0,i nM epinefrina (0,i 60 min RT Conteo de 897 (radioligando recombinante mM) centelleo antagonista) (células CHO)
a<i B>(h) Humano [<3>H]prazosina 0,i5 0,055 fentolamina 60 min RT Conteo de 70i (radioligando recombinante nM nM (i0 jM) centelleo antagonista) (células CHO)
a<2A>(h) Humano [<3>H]RX i nM 0,8 nM (-) epinefrina 60 min RT Conteo de 542 (radioligando recombinante 82i002 (i00 jM) centelleo antagonista) (células CHO)
a<2 B>(h) Humano [<3>H]RX 2,5 nM 5 nM (-) epinefrina 60 min RT Conteo de 56 (radioligando recombinante 82i002 (i00 jM) centelleo antagonista) (células CHO)
a<2 c>(h) Humano [<3>H]RX 2 nM 0,95 (-) epinefrina 60 min RT Conteo de 56 (radioligando recombinante 82i002 nM (i00 jM) centelleo antagonista) (células CHO)
P<i>(h) Humano [<3>H]CGP 0,3 nM 0,39 alprenolol (50 60 min RT Conteo de 548 (radioligando recombinante i2i77 nM JM) centelleo agonista) (células HEK-293)
P<2>(h) Humano [<3>H]CGP 0,3 nM 0,i5 alprenolol (50 i20 min Conteo de 794 (radioligando recombinante i2i77 nM JM) RT centelleo agonista) (células CHO)
Adrenérgico Humano [<i 2 5>I] 0,5 nM i,5 nM alprenolol 90 min Conteo de i277 beta3 recombinante cianopindolol (i000,0 jM) 25°C centelleo
(células HEK-293)
AT<i>(h) Humano [<i 2 5>I][Sar<i>-Ile<8>]- 0,05 0,05 angiotensina-II i20 min Conteo de 776 (radioligando recombinante AT-II nM nM (i0<j>M) 37°C centelleo antagonista) (células HEK-293)
AT<2>(h) Humano [<i 2 5>I]CGP 0,0i 0,0i angiotensina-II 4 h 37°C Conteo de 248 (radioligando recombinante 42ii2A nM nM (i jM) centelleo agonista) (células HEK-293)
APJ (apelina) Humano [<i 2 5>I](Glp<65>,Nle<7>0,03 0,06 apelina-13 (i 120 min Conteo de 846 (radioligando recombinante<5>,Tyr<77>)- nM nM MM) RT centelleo agonista) (células CHO) apelina-13
BB<3>(h) Humano [<i 2 5>I]Bn(6-14) 0,1 nM 0,16 Bn(6-14) (i 60 min RT Conteo de 287 (radioligando recombinante nM MM) centelleo agonista) (células CHO)
B<2>(h) Humano [<3>H] 0,3 nM 0,32 Bradiquinina 60 min RT Conteo de 346 (radioligando recombinante bradiquinina nM (i mM) centelleo agonista) (células CHO)
CB<i>(h) Humano [<3>H]CP 55940 0,5 nM 3,5 nM WIN 55212-2 120 min Conteo de 657 (radioligando recombinante (10 mM) 37°C centelleo agonista) (células CHO)
CB<2>(h) Humano [<3>H]WIN 0,8 nM 1,5 nM WIN 55212-2 120 min Conteo de 165 (radioligando recombinante 55212-2 (5 mM) 37°C centelleo agonista) (células CHO)
CCK<i>(CCK<a>) Humano [<3>H]CCK-8s 0,08 0,24 CCK-8s (i 60 min RT Conteo de 562 (h) recombinante nM nM MM) centelleo (radioligando (células CHO)
agonista)
CCK (CCB<a>) Humano [<3>H]CCK-8s 0,08 0,054 CCK-8s (i 60 min RT Conteo de 134 (h) recombinante nM nM MM) centelleo (radioligando (células CHO)
agonista)
CRF<i>(h) Humano [<i 2 5>I]sauvagina 0,075 0,12 Sauvagina 120 min Conteo de 557 (radioligando recombinante nM nM (0,5 MM) RT centelleo agonista) (células CHO)
D<i>(h) Humano [<3>H]SCH 0,3 nM 0,2 nM SCH 23390 (i 60 min RT Conteo de 281 (radioligando recombinante 23390 MM) centelleo agonista) (células CHO)
Ü<2 S>(h) Humano [<3>H]7-OH- i nM 0,68 butaclamol (10 60 min RT Conteo de 87 (radioligando recombinante DPAT nM MM) centelleo agonista) (células HEK-293)
Ü<3>(h) Humano [<3>H]metil- 0,3 nM 0,085 (+)butaclamol 60 min RT Conteo de 145 (radioligando recombinante espiperona nM (10 mM) centelleo antagonista) (células CHO)
ET<a>(h) Humano [<i 2 5>I]endotelina 0,03 0,03 endotelina-1 120 min Conteo de 30 (radioligando recombinante -i nM nM (100 nM) 37°C centelleo agonista) (células CHO)
ET<b>(h) Humano [<i 2 5>I]endotelina 0,03 0,04 endotelina-1 120 min Conteo de 541 (radioligando recombinante -i nM nM (0,1<m>M) 37°C centelleo agonista) (células CHO)
GABA<a 1>(h) Humano [<3>H]muscinol 15 nM 30 nM muscinol (10 120 min Conteo de 109 (a, P<2>, y2) recombinante MM) RT centelleo (radioligando (células CHO)
agonista)
GABA<b ( i b )>(h) Humano [<i 2 5>I]CGP i nM i nM CGP 54632 120 min Conteo de 508 (radioligando recombinante 54626 (100<m>M) RT centelleo antagonista) (células CHO)
glucagón (h) Humano [<i 2 5>I]glucagón 0,025 0,069 glucagón (i 120 min Conteo de 624 (radioligando recombinante nM nM MM) RT centelleo agonista) (células CHO)
TNF-a (h) células U-937 [<i 2 5>I]TNF-a 0,1 nM 0,05 TNF-a (10 nM) 120 min Conteo de 26 (radioligando nM 4°C centelleo agonista)
CCR2 (h) Humano [<i 2 5>I]MCP-1 0,01 0,007 MCP-1 (10 60 min RT Conteo de 13 (radioligando recombinante nM nM nM) centelleo agonista) (células HEK-293)
H<i>(h) Humano [<3>H]pirilamina i nM 1,7 nM pirilamina (i 60 min RT Conteo de 492 (radioligando recombinante MM) centelleo antagonista) (células HEK-293)
H<2>(h) Humano [<i 2 5>I]APT 0,075 2,9 nM tiotidina (100 120 min Conteo de 540 (radioligando recombinante nM MM) RT centelleo antagonista) (células CHO)
H<3>(h) Humano [<3>H]N<a>-Me- i nM 0,32 (R)-a-Me- 60 min RT Conteo de 563 (radioligando recombinante histamina nM histamina (i centelleo agonista) (células CHO) MM)
H<4>(h) Humano [<3>H]histamina 10 nM 7,6 nM imetita (i<m>M) 60 min RT Conteo de 631 (radioligando recombinante centelleo agonista) (células HEK-293)
BLT<i>(LTB<4>) Humano [<3>H]LTB<4>0,2 nM 0,2 nM LTB<4>(0,2 mM) 60 min RT Conteo de 616 (h) recombinante centelleo (radioligando (células CHO)
agonista)
CysLT<i>Humano [<3>H]LTD<4>0,3 nM LTD<4>(i jM) 60 min RT Conteo de 6i8 (LTD<4>)(h)recombinante centelleo (radioligando (células CHO)
agonista)
MCH<i>(h) Humano [<i 2 5>I] 0,i nM i nM MCH humana 60 min RT Conteo de 526 (radioligando recombinante [Phe<i 3>,Tyr<i 9>]- (0,i jM) centelleo agonista) (células CHO) MCH
MC<i>células Bi6-Fi [<i 2 5>I]NDP-a- 0,05 0,05 NDP-a-MSH 90 min RT Conteo de 390 (radioligando (endógeno) MSH nM nM (i jM) centelleo agonista)
MC<3>(h) Humano [<i 2 5>I]NDP-a- 0,075 0,4 nM NDP-a-MSH 60 min Conteo de 2 ii (radioligando recombinante MSH nM (i jM) 37°C centelleo agonista) (células CHO)
MC<4>(h) Humano [<i 2 5>I]NDP-a- 0,05 0,54 NDP-a-MSH i20 min Conteo de 2 ii (radioligando recombinante MSH nM nM (i jM) 37°C centelleo agonista) (células CHO)
MT<i>(ML<i a>) Humano [<i 2 5>I]2- 0,0i 0,04 melatonina (i 60 min RT Conteo de 639 (h) recombinante yodomelatonin nM nM jM) centelleo (radioligando (células CHO) a
agonista)
MT<3>(ML<2>) cerebro de [<i 2 5>I]2- 0,i nM 4,8 nM melatonina (30 60 min Conteo de i86 (radioligando hámster yodomelatonin jM) 4°C centelleo agonista) a
motilina (h) Humano [<i 2 5>I]motilina 0,05 0,26 [Nleu<i 3>]- i20 min Conteo de 285 (radioligando recombinante nM nM motilina (i RT centelleo agonista) (células CHO) jM)
M<i>(h) Humano [<3>H] 2 nM i3 nM atropina (i 60 min RT Conteo de 59 (radioligando recombinante pirencepina jM) centelleo antagonista) (células CHO)
M<2>(h) Humano [<3>H]AF-DX 384 2 nM 4,6 nM atropina (i 60 min RT Conteo de 59 (radioligando recombinante jM) centelleo antagonista) (células CHO)
M<3>(h) Humano [<3>H]4-DMAP 0,2 nM 0,5 nM atropina (i 60 min RT Conteo de 546 (radioligando recombinante jM) centelleo antagonista) (células CHO)
M<4>(h) Humano [<3>H]4-DMAP 0,2 nM 0,32 atropina (i 60 min RT Conteo de 59 (radioligando recombinante nM jM) centelleo antagonista) (células CHO)
NK<i>(h) U373MG uppsala [<i 2 5>I]-sustancia 0,05 0,04 [Sar^Mê O<y>30 min RT Conteo de i04 (radioligando P LYS3 nM nM ]SP (i jM) centelleo agonista)
NK<2>(h) Humano [<i 2 5>I]NKA 0,i nM 0,i2 [Nleu<i 0>]-NKA 60 min RT Conteo de 3 (radioligando recombinante nM (4-i0) (300 centelleo agonista) (células CHO) nM)
Y<i>(h) células SK-N-MC [<i 2 5>I]péptido 0,025 0,06 NPY (i jM) i20 min Conteo de 39i (radioligando (endógeno) YY nM nM 37°C centelleo agonista)
N neuronal células SH-SY5Y [<3>H]citisina 0,6 nM 0,3 nM nicotina (i0 i20 min Conteo de i084 a4p2 (h) (humano jM) 4°C centelleo (radioligando recombinante)
agonista)
N de tipo células TE67i [<i 2 5>I]a- 0,5 nM 5 nM a- i20 min Conteo de 524 muscular (h) (endógeno) bungarotoxina bungarotoxina RT centelleo (radioligando (5 jM)
antagonista)
5 (DOP) (h) Humano [<3>H]DADLE 0,5 nM 0,73 naltrexona (i0 i20 min Conteo de 50i (radioligando recombinante nM jM) RT centelleo agonista) (células CHO)
k (KOP) (h) recombinante de [<3>H]U 69593 i nM 2 nM naloxona (i0 60 min RT Conteo de 77i (radioligando rata (células CHO) jM) centelleo agonista)
j (MOP) (h) Humano [<3>H]DAMGO 0,5 nM 0,35 naloxona (i0 i20 min Conteo de 260 (radioligando recombinante nM jM) RT centelleo agonista) (células HEK-293)
NOP (ORLi) Humano [<3>H] 0,2 nM 0,4 nM nociceptina (i 60 min RT Conteo de 7 (h) recombinante nociceptina jM) centelleo (radioligando (células HEK-293)
agonista)
PPARy (h) Humano [<3>H] 5 nM 5,7 nM rosiglitazona i20 min Conteo de 567 (radioligando recombinante(E.rosiglitazona (i0 jM) 4°C centelleo agonista)coli)
PAF(h)Humano [<3>H]C<16>-PAF 1,5 nM 1,5 nM WEB 2086 (10 60 min RT Conteo de 531 (radioligando recombinante UM) centelleo agonista) (células CHO)
EP<2>(h) Humano [<3>H]PGE<2>3 nM 3 nM PGE<2>(10 uM) 120 min Conteo de 781 (radioligando recombinante RT centelleo agonista) (células HEK-293)
FP (h) Humano [<3>H]PGE<2 a>2 nM 3,83 cicloprostenol 60 min RT Conteo de 781 (radioligando recombinante nM (10 uM) centelleo agonista) (células HEK-293)
IP (PGI<2>) (h) Humano [<3>H]iloprost 6 nM 8 nM iloprost (10 60 min RT Conteo de 781 (radioligando recombinante UM) centelleo agonista) (células HEK-293)
LXRp (h) Humano [<3>H]hidroxicole 25 nM 55 nM 22(R)- 60 min RT Conteo de 856 (radioligando recombinante sterol hidroxicolester centelleo agonista) (células ol (30 UM)
BL31/DE3)
5-HT<i a>(h) Humano [<3>H]8-OH- 0,3 nM 0,5 nM 8-OH-DPAT 60 min RT Conteo de 164 (radioligando recombinante DPAT (10 uM) centelleo agonista) (células CHO)
5-HT<i b>(h) corteza cerebral [<125>I]CYP (+ 0,1 nM 0,16 serotonina (10 120 min Conteo de 111 (radioligando de rata isproterenol 30 nM UM) 37°C centelleo antagonista) UM)
5-HT<i d>(h) recombinante de [<3>H]serotonina 1 nM 0,5 nM serotonina (10 60 min RT Conteo de 777 (radioligando rata (células CHO) UM) centelleo agonista)
5-HT<2A>(h) Humano [<125>I](±)DOI 0,1 nM 0,3 nM (±)DOI (1 uM) 60 min RT Conteo de 288 (radioligando recombinante centelleo agonista) (células HEK-293)
5-HT<2 B>(h) Humano [<125>I](±)DOI 0,2 nM 0,2 nM (±)DOI (1<u>M) 60 min RT Conteo de 571 (radioligando recombinante centelleo agonista) (células CHO)
5-HT<2 c>(h) Humano [<125>I](±)DOI 0,1 nM 0,9 nM (±)DOI (10 60 min Conteo de 288 (radioligando recombinante UM) 37°C centelleo agonista) (células HEK-293)
5-HT<4 e>(h) Humano [<3>H]GR 0,3 nM 0,15 serotonina 60 min Conteo de 309 (radioligando recombinante 113808 nM (100 uM) 37°C centelleo antagonista) (células CHO)
5-HT<5 a>(h) Humano [<3>H]LSD 1,5 nM 1,5 nM serotonina 120 min Conteo de 193 (radioligando recombinante (100 uM) 37°C centelleo agonista) (células HEK-293)
5-HT<a>(h) Humano [<3>H]LSD 2 nM 1,8 nM serotonina 120 min Conteo de 161 (radioligando recombinante (100 uM) 37°C centelleo agonista) (células CHO)
<5>-HT<7>(h) Humano [<3>H]LSD 4 nM 2,3 nM serotonina (10 120 min Conteo de 217 (radioligando recombinante UM) RT centelleo agonista) (células CHO)
sigma (no células Jurkat [<3>H]DTG 10 nM 41 nM Haloperiodol 120 min Conteo de 1136 selectivo (h) (endógeno) (10 uM) RT centelleo (radioligando
agonista)
sst<1>(h) Humano [<125>I]Tyr<11>- 0,1 nM 1 nM somatostatina- 180 min Conteo de 761 (radioligando recombinante somatostatina- 28 (1 uM) 37°C centelleo agonista) (células CHO) 14
sst<4>(h) Humano [<125>I]Tyr<11>- 0,1 nM 5,9 nM somatostatina- 120 min Conteo de 296 (radioligando recombinante somatostatina- 14 (1 uM) RT centelleo agonista) (células CHO) 14
GR (h) Células IM-9 [<3>H] 1,5 nM 1,5 nM triamcinolona 6 h 4°C Conteo de 283 (radioligando (citosol) dexametasona (10 uM) centelleo agonista)
Estrógeno ER Humano [<3>H]estradiol 0,5 nM 0,20 Dimetilestilbes 120 min Conteo de 1280 alfa (h) recombinante nM trol (1 uM) RT centelleo (radioligando (células sf9)
agonista)
PR (h) Células T47D [<3>H] 0,5 nM 2 nM progesterona 20 h 4°C Conteo de 930 (radioligando (citosol) progesterona (1 uM) centelleo agonista)
AR (h) Células LNCaP [<3>H] 1 nM 0,8 nM mibolerona (1 24 h 4°C Conteo de 498 (radioligando (citosol) metiltrienolona uM) centelleo agonista)
Hormona Hígado de rata[125 I]0,03 0,034 Triyodotironina 1080 min Conteo de 1289 tiroidea triyodotironina nM nM (1,0 uM) 4°C centelleo UT (h) Humano [125I]urotensina 0,1 nM 0,29 urotensina-II 120 min Conteo de 622 (radioligando recombinante -II nM (3 |jM) RT centelleo agonista) (células CHO)
VPAC1 (VIP1) Humano [125I]VIP 0,04 0,05 VIP (1<j>M) 60 min RT Conteo de 50 (h) recombinante nM nM centelleo (radioligando (células CHO)
agonista)
V1 a (h) Humano [3H]AVP 0,3 nM 0,5 nM AVP (1 jM) 60 min RT Conteo de 343 (radioligando recombinante centelleo agonista) (células CHO)
V2 (h) Humano [3H]AVP 0,3 nM 0,76 AVP (1 jM) 120 min Conteo de 343 (radioligando recombinante nM RT centelleo agonista) (células CHO)
Canales iónicos
BZD (central) corteza cerebral [3H] 0,4 nM 2,1 nM diazepam (3 60 min Conteo de 227 (radioligando de rata flunitrazepam JM) 4°C centelleo agonista)
AMPA corteza cerebral [3H]AMPA 8 nM 82 nM L-glutamato (1 60 min Conteo de 166 (radioligando de rata mM) 4°C centelleo agonista)
kainato corteza cerebral [3H]ácido 5 nM 19 nM L-glutamato (1 60 min Conteo de 160 (radioligando de rata kaínico mM) 4°C centelleo agonista)
NMDA corteza cerebral [3H]CGP 5 nM 23 nM L-glutamato 60 min Conteo de 221 (radioligando de rata 39553 (100 jM) 4°C centelleo antagonista)
glicina corteza cerebral [3H]MDL 0,5 nM 5 nM glicina (1 mM) 45 min Conteo de 219 (insensible a de rata 105,519 0°C centelleo estricnina)
(radioligando
antagonista)
PCP (h) corteza cerebral [3H]TCP 10 nM 13 nM MK 801 (10 120 min Conteo de 257 (radioligando de rata JM) 37°C centelleo antagonista)
5-HT3 (h) Humano [3H]BRL 0,5 nM 1,15 MDL 72222 120 min Conteo de 109 (radioligando recombinante 43694 nM (10<j>M) RT centelleo antagonista) (células CHO)
Canal de Ca2+ corteza cerebral [3H] 0,1 nM 0,18 nitrendipina (1 90 min RT Conteo de 996 (L, sitio de de rata nitrendipina nM JM) centelleo dihidropiridina
) (radioligando
antagonista)
Canal de Ca2+ corteza cerebral [3H]diltiazem 15 nM 52 nM diltiazem (10 120 min Conteo de 212 (L, sitio de de rata JM) RT centelleo diltiazem)
(benzotiacepi
nas)
(radioligando
antagonista)
Canal de Ca2+ corteza cerebral [3H]D888 3 nM 3 nM D 600 (10<j>M) 120 min Conteo de 194 (L, sitio de de rata RT centelleo verapamil)
(fenilalquilami
na)
(radioligando
antagonista)
Canal de Ca2+ corteza cerebral [125I]w- 0,001 0,0007 w-conotoxina 30 min RT Conteo de 259 (N) de rata conotoxina nM nM GVIA (10 nM) centelleo (radioligando GVIA
antagonista)
Canal de Humano [3H]dofetilida 3 nM 6,6 nM Terfenadina 60 min RT Conteo de 1398 potasio hERG recombinante (25 jM) centelleo (humano-[3H] (células HEK-293)
Dofetilida
Canal SKCa corteza cerebral [125I]apamina 0,007 0,007 apamina (100 60 min Conteo de 112 (radioligando de rata nM nM nM) 4°C centelleo antagonista)
Canal de Na+ corteza cerebral [3H] 10 nM 91 nM veratridina 60 min Conteo de 28 (sitio 2) de rata batrachotoxini (300<j>M) 37°C centelleo (radioligando na
antagonista)
Canal de Cl" corteza cerebral [35S]TBPS 3 nM 14,6 picrotoxinina 120 min Conteo de 136 (operado por de rata nM (20 jM) RT centelleo GABA)
(radioligando
antagonista)
Transportadores
transportador Humano [3H]nisoxetina 1 nM 2,9 nM desipramina (1 120 min Conteo de 180 de recombinante MM) 4°C centelleo norepinefrina (células CHO)
(h)
(radioligando
antagonista)
transportador Humano [3H]BTCP 4 nM 4,5 nM BTCP (10 mM) 120 min Conteo de 190 de dopamina recombinante 4°C centelleo (h) (células CHO)
(radioligando
antagonista)
transportador corteza cerebral [3H]GABA (+ 10 nM 4600 GABA (1 mM) 30 min RT Conteo de 214 de GABA de rata isoguvacina nM centelleo (radioligando 10<m>M) (+
antagonista) baclofeno 10
MM)
transportador Humano [3H] 3 nM 3,9 nM hemicolinio-3 60 min RT Conteo de 648 de colina recombinante hemicolinio-3 (10<m>M) centelleo (CHT1) (h) (células CHO)
(radioligando
antagonista)
transportador Humano [3H]imipramina 2 nM 1,7 nM imipramina (10 60 min RT Conteo de 566 de 5-HT (h) recombinante MM) centelleo (radioligando (células CHO)
antagonista)
Otras enzimas
MAO-A corteza cerebral [3H]Ro 41- 10 nM 14 nM clorgilina (1 60 min Conteo de 36 (radioligando de rata 1049 MM) 37°C centelleo antagonista)____________________________________________________
La tabla 36 muestra las condiciones de ensayo enzimático y de absorción
Tabla 36: Condiciones de ensayo enzimático y de absorción
Ensayo Fuente Sustrato/ Incubación Componente medido Método de Bibl.
estímulo/trazador detección Qunasas
Quinasa Abl (h) Humano ATP péptido Ulight- 60 min RT fosfo-péptido Ulight- LANCE 556 recombinante TK (100 nM) TK
(células de
insecto)
CAMK2a (h) Humano ATP Ulight- 30 min RT fosfo- Ulight- LANCE 647 recombinante CGSGSGRPRTSS CGSGSGRPRTSS
AEG (50 nM) AEG
CDK2 (h) (cicA) Humano ATP Ulight- 30 min RT fosfo- Ulight- LANCE 469 recombinante CFFKNIVTPRTPPP CFFKNIVTPRTPPP
SQGK-amida (50 SQGK-amida
nM)
ERK2 (h) (P42mapk) Humano ATP Ulight- 15 min RT fosfo- Ulight- LANCE 671 recombinante CFFKNIVTPRTPPP CFFKNIVTPRTPPP
(E. coli)SQGK-amida (100 SQGK-amida
nM)
Quinasa FLT-1 (h) Humano ATP péptido Ulight- 15 min RT fosfo-péptido Ulight- LANCE 650 (VEGFR1) recombinante TK (100 nM) TK
(células Sf9)
Quinasa Fyn (h) Humano ATP biotinil-pApAp 60 min RT fosfo-biotinil-pApAp HTRF 626 recombinante AYQAEENTYDEYEN AYQAEENTYDEYEN (células de (2 MM)
insecto)
IRK (h) (InsR) Humano ATP Ulight-poli 10 min RT fosfo- Ulight-Poli LANCE 467 recombinante GAT[EAY (1:1:1)]n GAT[EAY (1:1:1)]n
(50 nM)
Quinasa Lyn A (h) Humano ATP biotinil-pApAp 120 min RT fosfo-biotinil-pApAp HTRF 41 recombinante AKVEKIGEGTYGVV AKVEKIGEGTYGVV (células de YK (400 nM) YK
insecto)
Quinasa p38a (h) Humano ATP Ulight- 60 min RT fosfo- Ulight- LANCE 620 recombinante CFFKNIVTPRTPPP CFFKNIVTPRTPPP
(E. coli)SQGK-amida
SQGK-amida (100
nM)
Quinasa ZAP70 Humano ATP biotinil-pApAp 15 min RT fosfo-biotinil-pApAp HTRF 556 (h) recombinante ADEEEYFIPP (2 |jM) ADEEEYFIPP
(células de
insecto)
Otras enzimas
COX1 (h) Humano Ácido araquidónico 3 min RT Resofurina (ADPH fluorimetría 1480 recombinante (3 jM) ADHP (25 oxidado)
JM)
COX2 (h) Humano Ácido araquidónico 5 min RT Resofurina (ADPH fluorimetría 1480 recombinante (2 jM) ADHP (25 oxidado)
(células Sf9) JM)
5-lipoxigenasa (h) Humano Ácido araquidónico 20 min RT Rodamina 123 fluorimetría 1068 recombinante (25 jM)
(células Sf9)
(citosol)
12-lipoxigenasa Plaquetas Ácido araquidónico 5 min RT Oxidación férrica de Fotometría 472 (h) humanas (4 jM) naranja xilenol
NOS inducible recombinante de L-arginina (100<j>M) 120 min NO2' Fotometría 236 ratón(E. coli)37°C
PDE2A1 (h) Humano [3H]-AMPc AMPc 20 min RT [3H]5'AMP Conteo de 1399 recombinante (2 JM) centelleo (células Sf9)
PDE3B (h) Humano [3H]-AMPc AMPc 20 min RT [3H]5'AMP Conteo de 1399 recombinante (0,5 jM) centelleo (células Sf9)
PDE4D2 (h) Humano [3H]-AMPc AMPc 20 min RT [3H]5'AMP Conteo de 1399 recombinante (0,5 jM) centelleo (células Sf9)
PDE5 (h) (no Plaquetas [3H]GMPc GMPc (1 60 min RT [3H]5'-GMP Conteo de 263 selectivo) humanas JM) centelleo PDE6 (h) (no Retina bovina [3H]GMPc GMPc (2 60 min RT [3H]5'-GMP Conteo de 306 selectivo) JM) centelleo ACE (h) Humano Abz-FRK(Dnp)-P-OH 30 min Abz-Phe-Arg fluorimetría 1128 recombinante (15 jM) 37°C
ACE-2 (h) Humano Mca-Tyr-Val-Ala- 20 min RT Péptidos Mca fluorimetría 802 recombinante Asp-Pro-Ala-Lys-(células (DNP)-OH (10 jM)
murinas)
BACE-1 (h) (P- Humano Mca-S-E-V-N-L-D-A- 60 min RT Mca-S-E-V-N-L-NH<2>fluorimetría 462 secretasa) recombinante E-F-R-K(Dnp)-R-R-(células NH<2>(6 jM)
murinas)
caspasa-3 (h) Humano benzoilcarbonil-Asp- 60 min RT AFC fluorimetría 476 recombinante Glu-Val-Asp-AFC
(E. coli)(3,6 jM)
caspasa-8 (h) Humano benzoilcarbonil-Ile- 45 min AFC fluorimetría 408 recombinante Glu-Thr-Asp-AFC (10 37°C
(E. coli)JM)
Proteasa de VIH-1 Proteína vírica Antranilil-VIH (75 jM) 40 min Tripéptido N-terminal fluorimetría 244 recombinante 37°C
(E. coli)
MMP-1 (h) Humano DNP-Pro-Cha-Gly- 40 min Cys(Me)-His-Ala- fluorimetría 342 recombinante Cys(Me)-His-Ala- 37°C Lys(n-Me-Abz)-NH<2>
(E. coli) Lys(n-Me-Abz)-NH<2>
(10 jM)
MMP-2 (h) Humano NFF-2 (10 jM) 90 min Mca-Arg-Pro-Lys- fluorimetría 297 recombinante 37°C Pro-Tyr-Ala
MMP-9 (h) Humano NFF-2 (10 jM) 90 min Mca-Arg-Pro-Lys- fluorimetría 297 recombinante 37°C Pro-Tyr-Ala
Guanilil ciclasa (h) Humano GTP (10 jM) (SNP 10 min RT GMPc HTRF 1076 (efecto activador) recombinante 100<j>M para control)
acetilcolinesterasa Humano Acetilcolina (400 jM) 30 min RT ácido 5-tio-2- fotometría 63 (h) recombinante nitrobenzoico
(células HEK-293)
COMT (catecol-O- Hígado porcino Esculetina (1 jM) 30 min escopoletina fluorimetría 519 metil transferasa) 37°C
MAO-B (h) Humano Derivado de D- 60 min éster metílico de luminiscencia 1134 enzima recombinante luciferina (4 jM) 37°C luciferina
recombinante
xantina xantina oxidasa Hipoxantina (10 pM) 10 min RT O<2->+ ácido úrico fotometría 153 oxidasa/captador purificada de
de O<2->leche bovina
supoeróxido
ATPasa (Na<+>/K<+>) corteza cerebral ATP (2 mM) 60 min Pi fotometría 71 porcina 37°C
Peptidasa, Células Raji Glutaril-Ala-Ala-Phe- 30 min Glutaril-Ala-Ala-Phe- fotometría 1352, metaloproteínasa, humanas 4-metoxi-2- 37°C 4-metoxi-2- 1353 endopeptidasa naftilamida naftilamida ^4-neutra metoxi-2-naftilamida
Análisis y expresión de los resultados
Farmacologíain vitro: Ensayos de unión
Los resultados se expresan como un porcentaje de la unión específica control: (unión específica medida/unión específica control) x 100; y como un porcentaje de inhibición de la unión específica control: 100 - ((unión específica medida/unión específica control) x 100) obtenido en presencia de NS2-D6.
Los valores CI50 (concentración que produce una inhibición semimáxima de unión específica control) y los coeficientes de Hill (nH) se determinaron por análisis de regresión no lineal de las curvas de competición generadas con valores replicados medios usando el ajuste de la curva de la ecuación de Hill:
donde Y = unión específica, A = asíntota izquierda de la curva, D = asíntota derecha de la curva, C = concentración del compuesto, C50 = CI50, y nH = factor de pendiente. Este análisis se realizó usando software desarrollado en Cerep (software Hill) y validado por comparación con datos generados por el software comercial SigmaPlot® 4.0 para Windows® (© 1997 by SPSS Inc.). Las constantes de inhibición (Ki) se calcularon usando la ecuación de Cheng Prusoff:
donde L = concentración de radioligando en el ensayo, y KD = afinidad del radioligando por el receptor. Se usa un gráfico de scatchard para determinar la KD.
Farmacologíain vitro: Ensayos enzimáticos y de absorción
Los resultados se expresan como un porcentaje de la actividad específica control: (actividad específica medida/actividad específica control) x 100; y como un porcentaje de inhibición de la actividad específica control: 100 - ((actividad específica medida/actividad específica control) x 100) obtenido en presencia de NS2-D6.
Los valores CI50 (concentración que produce una inhibición semimáxima de actividad específica control), los valores CE50 (concentración que produce un aumento semimáximo en la actividad basal control)y los coeficientes de Hill (nH) se determinaron por análisis de regresión no lineal de las curvas de competición generadas con valores replicados medios usando el ajuste de la curva de la ecuación de Hill:
donde Y = actividad específica, A = asíntota izquierda de la curva, D = asíntota derecha de la curva, C = concentración del compuesto, C50 = CI50 o CE50, y nH = factor de pendiente. Este análisis se realizó usando software desarrollado en Cerep (software Hill) y validado por comparación con datos generados por el software comercial SigmaPlot® 4.0 para Windows® (© 1997 by SPSS Inc.).
Bibliografía
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Claims (6)

  1. REIVINDICACIONES 1. Un compuesto de fórmula I:
    o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, en donde: R1 se selecciona de -NH2, -NHD, o -ND2; R2 se selecciona de hidrógeno o deuterio; R3 y R4 son -CD3; y R5, R6, R7, y R8 se seleccionan cada uno independientemente de hidrógeno o deuterio.
  2. 2. El compuesto según la reivindicación 1, en donde R1 es -NH2, o: en donde R1 es -NHD; o: en donde R1 es -ND2.
  3. 3. El compuesto según la reivindicación 1 o la reivindicación 2, en donde R2 es hidrógeno; o: en donde R2 es deuterio.
  4. 4. El compuesto según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en donde cada uno de R5, R6, R7, y R8 es hidrógeno; o: en donde uno de R5, R6, R7, y R8 es deuterio; o: en donde dos de R5, R6, R7, y R8 es deuterio; o: en donde tres de R5, R6, R7, y R8 es deuterio; o: en donde cada uno de R5, R6, R7, y R8 es deuterio.
  5. 5. El compuesto según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en donde cada uno de R5, R6, R7, y R8 son como se definen en una de las siguientes entradas:
  6. 6. El compuesto de la reivindicación 1, seleccionado de cualquiera de las siguientes estructuras:
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