ES2983771T3 - TCR de NY-ESO - Google Patents

Abstract

La presente invención se refiere a un receptor de células T (TCR) aislado específico para NY-ESO-1/LAGE-1 y a un polipéptido que comprende una porción funcional del TCR. También se incluyen un complejo de TCR multivalente, un ácido nucleico que codifica un TCR, una célula que expresa el TCR y una composición farmacéutica que comprende el TCR. La invención también se refiere al TCR para su uso como medicamento, en particular al TCR para su uso en el tratamiento del cáncer. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

DESCRIPCIÓN

TCR de NY-ESO

CAMPO DE LA INVENCIÓN

La presente invención se refiere a un receptor de células T (TCR) aislado específico para NY-ESO-1/LAGE-1 ya un polipéptido que comprende una porción funcional del TCR. Se incluyen además un complejo de TCR multivalente, un ácido nucleico que codifica para un TCR, una célula que expresa el TCR y una composición farmacéutica que comprende el TCR. La invención también se refiere al<t>C<r>para su uso como medicamento, en particular al TCR para su uso en el tratamiento de cáncer.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN

Los linfocitos T (o células T) que forman parte del sistema inmunitario mediado por células desempeñan un papel principal en la erradicación de patógenos. Las células T se desarrollan en el timo y expresan moléculas de receptor de células T en su superficie que permite el reconocimiento de péptidos presentados en moléculas de complejo mayor de histocompatibilidad (MHC) que se expresan en células nucleadas (conocido como presentación de antígenos). Los antígenos derivados de patógenos, es decir antígenos foráneos presentados por moléculas de MHC, provocarán una potente respuesta de células T, mientras que los auto-antígenos habitualmente no conducen a una respuesta de células T debido a una selección negativa de células T específicas de auto-antígenos en el tipo durante el desarrollo de tales células T. Por tanto, el sistema inmunitario puede distinguir entre células nucleadas que presentan antígenos foráneos o auto-antígenos y seleccionar específicamente como diana, y erradicar, células infectadas mediante una potente liberación de citocinas y mecanismos de citotoxicidad celular de las células T. Se ha reconocido la potencia del sistema inmunitario como herramienta prometedora para futuras terapias contra el cáncer. En la última década, se ha comenzado a investigar para aprovechar las propiedades únicas de células T usando transferencia celular adoptiva (ACT), que implica la administración de linfocitos derivados de paciente, expandidosex vivo.ACT es un concepto atractivo para el tratamiento de cáncer porque no requiere inmunocompetencia de pacientes, y la especificidad de los linfocitos transferidos puede dirigirse contra antígenos tumorales no mutados y, por tanto, poco inmunogénicos que normalmente no logran desencadenar eficazmente respuestas de células T autólogas. Aunque se h amostrado que ACT es un tratamiento prometedor para diversos tipos de cáncer, su amplia aplicación como tratamiento clínico se ha visto dificultada por la necesidad de aislamiento y caracterización personalizados de células T específicas de tumor a partir de cada paciente, un procedimiento que no sólo puede ser difícil y requerir mucho tiempo, sino que además con frecuencia no logra proporcionar células T de alta avidez (Xueet al.Clin. Exp. Immunol., febrero de 2005; 139(2): 167-172; Schmittet al.,Hum. Gene Ther., noviembre de 2009; 20(11): 1240-1248).

Purbhooet al.describen la cuantificación y obtención de imágenes de epítopos derivados de NY-ESO-1/LAGE-1 en células tumorales usando receptores de células T de alta afinidad (J. Immunol. 2006, 176(12): 7308- 7316). McCormacket al.notifican que TCR - anticuerpo anti-CD3 biespecífico redirigió la selección como diana por células T de tumores positivos para NY-ESO-1 y LAGE-1 (Cancer Immunol Immunother. 2013, 62: 773-785). Rapaportet al.notifican que células T modificadas por ingeniería con TCR específico para NY-ESO-1 median en efectos antitumorales específicos de antígeno sostenidos en mieloma (Nat. Med. 2015, 21(8): 914-921). Liddyet al.describen la destrucción de células tumorales redirigidas por TCR monoclonal (Nat. Med. 2012, 18(6): 980-987). El documento WO 2017/109496 A1 se refiere a receptores de células T específicos para el complejo de antígeno tumoral de NY-ESO-1 - HLA-A*02.

La transferencia genética de receptores de células T (TCR) específicos de antígeno tumoral a células T primarias puede superar algunas de las limitaciones actuales de ACT, ya que permite la rápida generación de linfocitos T reactivos frente a tumor con especificidad de antígeno definida incluso en pacientes inmunocomprometidos. Sin embargo, la identificación de clones de células T adecuados que portan TCR que reconocen específicamente antígenos tumorales y muestran los efectos antitumorales deseadosin vivotodavía es cuestión de investigación continua. Teniendo en cuenta que en 2012 se produjeron aproximadamente 14,1 millones de nuevos casos de cáncer a nivel mundial y que el cáncer es actualmente la causa de aproximadamente el 14,6% de todas las muertes de personas a nivel mundial, se necesitan urgentemente opciones de tratamiento novedosas y eficientes. El objetivo de la presente invención es cumplir con las necesidades anteriormente expuestas.

NY-ESO-1 y LAGE-1 son antígenos de diana inmunoterapéutica importantes que pertenecen a la familia de antígenos de cáncer/testículos. Los antígenos de cáncer/testículos se expresan en diversos tumores malignos y células germinales de los testículos, pero no en otros tejidos de adulto.

Por tanto, es particularmente deseable proporcionar TCR o derivados de los mismos específicos para NY-ESO-1/LAGE-1.

OBJETIVOS Y RESUMEN DE LA INVENCIÓN

Para cumplir estas necesidades, un objetivo de la invención es proporcionar un receptor de células T (TCR) aislado específico para NY-ESO-1/LAGE-1, en el que el TCR comprende

- una cadena de TCR a que comprende una CDR1 que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 4, una CDR2 que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 5 y una CDR3 que tiene la secuencia de SEQ ID NO: 6; y

- una cadena de TCR p que comprende una CDR1 que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 7, una CDR2 que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 8 y una CDR3 que tiene la secuencia de SEQ ID NO: 9.

El TCR reconoce específicamente la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 1 o un fragmento de la misma. Más particularmente, el t Cr reconoce específicamente la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 2 o un fragmento de la misma. Incluso más particularmente, el TCR reconoce específicamente la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 3 o un fragmento de la misma.

En particular, el TCR de la invención reconoce la diana antigénica NY-ESO-1/LAGE-1 cuando se presenta en una molécula de MHC de una célula diana, específicamente una molécula de MHC-I, y en particular una molécula de HLA-A, preferiblemente HLA-A*02 y específicamente moléculas de HLA-A2 codificadas por el alelo HLA-A*02:01 (se dice que la célula T o el TCR está “restringido” a una molécula de MHC particular). También puede concebirse que el TCR de la invención reconoce la diana antigénica presentada en otros alelos de HLA-A*02.

En una realización específica, el TCR reconoce la forma unida a HLA-A*02 de la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2 y/o SEQ ID NO: 3. En realizaciones específicas, el TCR reconoce específicamente la forma unida a HLA-A*02:01 de la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2 y/o SEQ ID NO: 3. Este TCR es altamente específico para NY-ESO y muestra baja reactividad cruzada frente a otros péptidos.

Incluso más específicamente, la invención se refiere a un TCR aislado que comprende una región de TCRavariable que tiene una secuencia de aminoácidos que es idéntica en al menos el 80 % a SEQ ID NO: 10 y una región de TCR p variable que tiene una secuencia de aminoácidos que es idéntica en al menos el 80% a SEQ ID NO: 11. En particular, el TCR puede comprender una región de TCR a variable que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 10 y una región de TCR p variable que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 11.

El TCR aislado puede comprender una cadena de TCR a que tiene una secuencia de aminoácidos que es idéntica en al menos el 80 % a SEQ ID NO: 12 y una cadena de TCR p que tiene una secuencia de aminoácidos que es idéntica en al menos el 80% a SEQ ID NO: 13. Más específicamente, el TCR aislado puede comprender una cadena de TCRaque tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 12 y una cadena de TCR p que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 13.

El TCR según la invención está aislado y/o purificado y puede ser soluble o estar unido a membrana.

En algunas realizaciones, la secuencia de aminoácidos del TCR puede comprender una o más sustituciones fenotípicamente silenciosas. Además, los TCR de la invención pueden estar marcados. En la técnica se conocen marcadores útiles y pueden acoplarse al TCR o variante de TCR usando métodos rutinarios, opcionalmente mediante ligadores de diversas longitudes. El término “marcador” o “grupo de marcaje” se refiere a cualquier marcador detectable. Adicional o alternativamente, la secuencia de aminoácidos puede estar modificada para comprender un agente terapéutico o resto de modificación de la farmacocinética. El agente terapéutico puede seleccionarse del grupo que consiste en una molécula efectora inmunitaria, un agente citotóxico y un radionúclido. La molécula efectora inmunitaria puede ser, por ejemplo, una citocina. El resto de modificación de la farmacocinética puede ser al menos una unidad de repetición de polietilenglicol, al menos un glicol grupo, al menos un grupo sialilo o una combinación de los mismos.

El TCR, en particular una forma soluble del TCR según la invención, puede modificarse uniendo restos funcionales adicionales, por ejemplo, para reducir la inmunogenicidad, aumentar el tamaño hidrodinámico (tamaño en disolución), solubilidad y/o estabilidad (por ejemplo, mediante protección potenciada frente a degradación proteolítica) y/o extender la semivida en suero. Otros restos funcionales y modificaciones útiles incluyen “interruptores de seguridad” o de “suicidio” que pueden usarse para desactivar o activar células huésped efectoras que portan un TCR de la invención en el cuerpo de un paciente.

En el presente documento también se prevén TCR con un patrón de glicosilación alterado.

También es concebible añadir un fármaco o un resto terapéutico, tal como un compuesto de molécula pequeña, al TCR, en particular a una forma soluble del TCR de la invención.

El TCR, en particular una forma soluble del TCR de la invención, puede modificarse adicionalmente para introducir dominios adicionales que ayudan en la identificación, seguimiento, purificación y/o aislamiento de la molécula respectiva (etiquetas).

En algunas realizaciones, el TCR es de tipo de cadena sencilla, en el que la cadena de TCR a y la cadena de TCR p están unidas mediante una secuencia de ligador.

Otro aspecto de la invención se refiere a un polipéptido que comprende una porción funcional del TCR tal como se describe en el presente documento, en el que la porción funcional comprende la cadena variable de TCRay/o la cadena variable de TCR p.

Realizaciones específicas se refieren a un complejo de TCR multivalente que comprende al menos dos TCR tal como se describen en el presente documento. En una realización más específica, al menos uno de dichos TCR está asociado con un agente terapéutico.

Algunas realizaciones se refieren al TCR de la invención expresado en una célula efectora, especialmente en una célula efectora inmunitaria como polipéptido funcional o polipéptido multivalente funcional, en el que se induce la secreción de IFN-y en la célula efectora anteriormente mencionada que expresa el TCR tras la unión a una forma unida a HLA-A*02 de la secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 1 a 3. La secreción de IFN-y inducida tras la unión del TCR de la invención expresado en una célula efectora a una forma unida a HLA-A*02 de la secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 1 a 3 puede ser de más de 3 ng/ml, tal como más de 4 ng/ml, más de 5 ng/ml, más preferiblemente más de 6 ng/ml, lo más preferiblemente incluso más de 7 ng/ml. La secreción de IFN-y puede ser al menos 4 veces superior cuando se une a una forma unida a HLA-A*02 de la secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 1 a 3 en comparación con la unión a una forma unida a HLA-A*02 de un péptido irrelevante (por ejemplo, SEQ ID NO: 15 ó 16).

Algunas realizaciones se refieren al TCR aislado, polipéptido o complejo de TCR multivalente según la invención, en las que la secreción de MIP-1a y MIP-1 p inducida por la unión del TCR de la invención expresado en una célula efectora a la forma unida a HLA-A*02 de la secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 1 a 3 está por debajo de un umbral predefinido.

La secreción de MIP-1a inducida mediante unión del TCR de la invención expresado en una célula efectora a la forma unida a HLA-A*02 de secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 1 a 3 puede ser de menos de 1 ng/ml, preferiblemente menos de 0,8 ng/ml, más preferiblemente menos de 0,7 ng/ml. La secreción de MIP-1 p inducida mediante unión del TCR de la invención expresado en una célula efectora a la forma unida a HLA-A*02 de secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 1 a 3 puede ser de menos de 3 ng/ml, preferiblemente menos de 2,8 ng/ml, más preferiblemente menos de 2,5 ng/ml. Niveles de secreción de MIP-1a y MIP-1 p bajos son ventajosos, ya que se sabe que quimiocinas tales como MIP-1a y MIP-1 p, también denominadas CLL3 y CLL4 respectivamente, en particular MIP-1a , fomentan la progresión tumoral (Liaoet al.Oncotarget, 7(4): 4310-4325 (2015); Silvaet al.Oncotarget 8 (11): 51024-51036 (2017)).

La liberación de citocinas y quimiocinas, tal como la secreción de IFN-y y la secreción de MIP-1a y MIP-1 p, puede medirse usando perlas magnéticas con anticuerpo frente a células T inmovilizado mediante un ensayoin vitroen el que células T2 (Greineret al.2006, Blood., 15 de diciembre de 2006; 108(13): 4109-17) transfectadas con ARNtiv que codifica para una de las secuencias de aminoácidos seleccionadas del grupo que consiste en SEQ ID NO: 1 a 3, preferiblemente SEQ ID NO: 3, se incuban con PBMC enriquecidas en CD8<+>y/o no enriquecidas en CD8<+>que expresan el TCR que va a investigarse o en un ensayoin vitroque usa células T2 cargadas o bien con el péptido NY-ESO-1/LAGE-1-<I57-165>(SLL) (SEQ ID NO: 3) o bien con un péptido irrelevante derivado de NY-ESO-1 (por ejemplo SEQ ID NO: 15 ó 16).

Otro aspecto de la invención se refiere a un ácido nucleico que codifica para un TCR tal como se describe en el presente documento o que codifica para el polipéptido tal como se describió anteriormente.

Un aspecto adicional de la invención se refiere a un plásmido o vector que comprende el ácido nucleico de la presente solicitud tal como se describió anteriormente. Preferiblemente, el vector es un vector de expresión o un vector adecuado para la transducción o transfección de células, especialmente células eucariotas. El vector puede ser, por ejemplo, un vector retroviral, por ejemplo, un vector gamma-retroviral o lentiviral.

Otro aspecto de la invención se refiere a una célula que expresa el TCR tal como se describe en el presente documento. La célula puede aislarse o producirse de manera no natural.

Otro aspecto de la invención se refiere a una célula que comprende el ácido nucleico tal como se describió anteriormente o el plásmido o vector tal como se describió anteriormente. Más específicamente, la célula puede comprender:

a) un vector de expresión que comprende al menos un ácido nucleico tal como se describió anteriormente, o b) un primer vector de expresión que comprende un ácido nucleico que codifica para la cadena alfa del TCR tal como se describe en el presente documento, y un segundo vector de expresión que comprende un ácido nucleico que codifica para la cadena beta de un TCR tal como se describe en el presente documento.

La célula puede ser un linfocito de sangre periférica (PBL) o una célula mononuclear de sangre periférica (PBMC). Normalmente, la célula es una célula efectora inmunitaria, especialmente una célula T. Otros tipos de células adecuados incluyen células T gamma-delta y células T de tipo NK.

Otro aspecto de la invención se refiere a una composición farmacéutica que comprende el TCR tal como se describe en el presente documento, el polipéptido tal como se describe en el presente documento, el complejo de TCR multivalente tal como se describe en el presente documento, el ácido nucleico tal como se describe en el presente documento, el vector tal como se describe en el presente documento o la célula tal como se describe en el presente documento.

Normalmente, la composición farmacéutica comprende al menos un portador farmacéuticamente aceptable.

Otro aspecto de la invención se refiere a TCR tal como se describe en el presente documento, al polipéptido tal como se describe en el presente documento, al complejo de TCR multivalente tal como se describe en el presente documento, al ácido nucleico tal como se describe en el presente documento, al vector tal como se describe en el presente documento o a la célula tal como se describe en el presente documento, para su uso como medicamento, en particular para su uso en el tratamiento de cáncer. El cáncer puede ser un cáncer hematológico o un tumor sólido. El cáncer puede seleccionarse del grupo que consiste en sarcoma, cáncer de próstata, cáncer uterino, cáncer de tiroides, cáncer testicular, cáncer renal, cáncer pancreático, cáncer de ovarios, cáncer esofágico, cáncer de pulmón de células no pequeñas, linfoma no Hodgkin, mieloma múltiple, melanoma, carcinoma hepatocelular, cáncer de cabeza y cuello, cáncer gástrico, cáncer endometrial, cáncer colorrectal, colangiocarcinoma, cáncer de mama, cáncer de vejiga, leucemia mieloide y leucemia linfoblástica aguda. Preferiblemente, el cáncer es sarcoma u osteosarcoma.

LEYENDAS DE FIGURAS

La figura 1 muestra la secreción de IFN-y del clon de célula T específico para NY-ESO-1157-165, T11.8-10-17, tras la estimulación con o bien línea de células tumorales transfectadas con ARNtiv para CTAG1B, K562-A2 (línea celular K562 transducida con HLA-A*02:01 estable, K562_A2+NY-ESO), en la que CTAG1B designa la copia de gen humano de NY-ESO-1 (CTAG1B-001, ID de gen ENST0000359887), o bien células T2 cargadas con péptido NY-ESO-1157-16510'5 M (T2 SLL), se usaron células K562-A2 sometidas a electroporación con agua (K562_<a>2+H2O) o T2 cargadas con péptidos derivados de NY-ESO-1 10'5 M (RLLEFYLAM: T2 RLL y FTVSGNILTI: T2 FTV) como controles negativos. Se detectó la liberación de IFN-y [pg/ml] usando ELISA convencional.

Las figuras 2a y 2b muestran la destrucción de líneas de células tumorales positivas para HLA-A*02 positivas para NY-ESO-1/LAGE-1 Mel624.38 (figura 2a) y MM415 (figura 2b) mediante P<b>M<c>enriquecidas en CD8+ que expresan el TCR específico para NY-eSo -1/LAGE-1-<i>57-165, T11.8-10-17 (CD8-T11.8-10-17) en comparación con células T transducidas con TCR de referencia (CD8_benchmarkTCR) (figura 2a). Como control negativo, se usaron PBMC enriquecidas en CD8+ no transducidas como células efectoras (CD8_UT) o se usó la línea de células tumorales positivas para HLA-A*02, negativas para NY-ESO-1/LAGE-1, SK-Mel23, como línea celular diana. Se sometió a prueba un aumento de células diana fluorescentes rojas (intensidad integrada total en GCU x |im2/imagen), que indica la inducción de apoptosis de células diana (anexina V, rojo), cada cuatro horas a lo largo de un periodo de tiempo total de 67 horas mediante obtención de imágenes de células vivas (IncuCyte® ZOOM).

La figura 3 muestra la liberación de IFN-y específica de PBMC enriquecidas en CD8+ específicas para NY-ESO-1/LAGE-1157-165 que expresan el TCR específico NY-ESO-1/LAGE-1-I57-165, T11.8-10-17 (CD8_T11.8-10-17) en cocultivo o bien con células tumorales positivas para HLA-A*02:01 que expresaban NY-ESO-1/LAGE-1 (Mel624.38, FM6, FM3,29, MM415, SAOS2, U266) o bien con células T2 cargadas con péptido NY-ESO-1/lAg E-1-<i>57-165 (T2+SLL). Las células T CD8+ no transducidas (CD8_ut) no mostraron liberación de IFN-y tras cocultivo con ninguna línea de células tumorales o células T2. Como control negativo, células T CD8+ transgénicas para T11.8-10-17 (CD8_T11.8-10-17) o células T CD8+ no transducidas (CD8_ut) cocultivadas o bien con células tumorales positivas para HLA-A*02:01 que eran negativas para ARNm de NY-ESO-1/LAGE-1 (SK-Mel23, SKM1) o bien con células T2 cargadas con FTVSGNILTI (péptido irrelevante) (T2+FTV) que no mostraban ninguna liberación de IFN-y. Como control adicional, se sometió a prueba la secreción de IFN-y para células presentadoras de antígeno (APC) cultivadas sin células efectoras T. Se midió la activación de células T CD8<+>transgénicas para T11.8-10-17 usando ELISA convencional que medía la liberación de IFN-y en [pg/ml].

La figura 4 muestra la secreción de IFN-y de célula T CD8<+>o bien de referencia específicas para NY-ESO-1/LAGE-1<157-165>o bien transducidas con TCR T11.8-10-17 tras la estimulación con células T2 cargadas con péptido (10<‘ 5>M). Se identificaron péptidos sometidos a prueba mediante un análisis de búsqueda Expitope® informático para detectar péptidos (véase la tabla 1) que son homólogos en al menos el 56 % (hasta 4 coincidencias erróneas) con respecto a la secuencia de péptido SLL. Como control negativo, se usaron PBMC enriquecidas en CD8<+>no transducidas como células efectoras o se estimularon células T transgénicas para TCR con células T2 cargadas con péptido irrelevante (irr.; FTVSGNILTI). Como control positivo, se activaron células T mediante células T2 cargadas con péptido SLL. Se midió la secreción de IFN-y mediante ELISA convencional.

La figura 5 muestra la liberación de IFN-y específica de PBMC enriquecidas en CD8<+>que expresan el TCR específico para NY-ESO-1/LAGE-1<157-165>, T11.8-10-17 (CD8_T11.8-10-17) o el TCR de referencia específico para NY-ESO-1/LAGE-1<157-165>(CD8_benchmark-TCR) en cocultivo o bien con células K562 transgénicas para HLA-A*02:01 cargadas con péptido (K562-A2+irr, K562-A2+SLL) o bien con K562-A2 transgénicas para h La -A*02:01 transfectadas con ARNtiv diana (K562-A2+NYESO, K562-A2+eGFP). Como control positivo, se estimularon células T con células K562 transgénicas para HLA-A*02:01 cargadas o bien con el péptido SLL (K562-A2+SLL) o bien con ARNtiv que codifica para NY-ESO-1 (K562-A2+NYESO). Como control negativo, se cargaron K562 transgénicas para HLA-A*02:01 o bien con péptido irrelevante (K562-A2+irr., FTV) o bien con ARNtiv que codifica para eGFP (K562-A2+eGFP). Además, se transfectaron células K562 transgénicas para HLA-A*02:01 con ARNtiv que codifica para eGFP en combinación con péptidos largos (procesándose por tanto de manera interna por la célula) derivados a partir de antígenos respectivos que comprenden epítopos reconocidos de manera cruzada (K562-A2+#3, K562-A2+#6, K562-A2+#11, K562-A2+#32, K562-A2+#34, K562-A2+#51) mediante células T transgénicas que expresan o bien el TCR T11.8-10-17 de la invención (CD8_T11.8-10-17) o bien el TCR de referencia (CD8_benchmark-TCR).

Las figuras 6a y 6b muestran la liberación específica de citocinas (IFN-y, TNF-a ) y granzima B, medida en [ng/ml] de PBMC enriquecidas en CD8<+>de dos donantes sanos diferentes (figura 6a: donante 1; figura 6b: donante 2) que expresan el TCR específico para NY-ESO-1/LAGE-1<157-165>, T11.8-10-17 (CD8_T11.8-10-17) o TCR de referencia específico para NY-ESO-1/LAGE-1<157-165>(CD8_benchmark-TCR) tras la estimulación con células T2 positivas para HLA-A*02:01 cargadas o bien con el péptido NY-ESO-1/LAGE-1<157-165>(T2(SLL)) o bien con un péptido irrelevante derivado de NY-ESO-1 (T2(FTV)). Ambos TCR transgénicos condujeron a cantidades comparables de secreción de IFN-y, TNF -a y granzima B mediante las células T respectivas y muestran un perfil de citocinas preferible en cuanto a la función efectora. Como control negativo, se estimularon células T CD8<+>transgénicas para T11.8-10-17 o para referencia con células T2 cargadas con FTV positivas para HLA-A*02:01 (T2(FTV)) o se cocultivaron PBMC enriquecidas en CD8<+>no transducidas (CD8_ut) con células T2 cargadas con péptido. No se mide ninguna liberación de citocinas significativa para ninguno de los controles negativos. Además, las células T2 o células T cultivadas solas no mostraron ninguna liberación de citocinas de fondo. Se determinó la secreción de IFN-y, TNF-a y granzima B mediante células T CD8<+>transgénicas o bien para T11.8-10-17 o bien para referencia mediante ensayo de múltiplex usando el kit Milliplex MAP y se analizó mediante analizador MagPix.

Las figuras 7a y 7b muestran la liberación específica de quimiocinas (MIP-1a y MIP-1P) de PBMC enriquecidas en CD8<+>(figura 7a: donante 1, o figura 7b: donante 2) que expresan el TCR específico para NY-ESO- 1/LAGE-P<57-165>, T1.8-10-17 (CD8_T11.8-10-17) o el TCR de referencia específico para NY-ESO-1/LAGE1<157-165>(CD8_benchmark-TCR) tras la estimulación con células T2 positivas para HLA-A*02:01 cargadas o bien con el péptido NY-ESO-1/LAGE-1<157-165>(SLL) (T2(SLL)) o bien con un péptido irrelevante derivado de NY-ESO-1 (FTV) (T2(FTV)). Las células T transgénicas para TCR de referencia secretaron cantidades superiores de MIP-1a y cantidades notablemente superiores de MIP-1 P en comparación con células T transgénicas para TCR T11.8-10-17 tras la estimulación con células T2 cargadas con péptido SLL.

Como control negativo, se estimularon células T CD8<+>transgénicas para T11.8-10-17 o para referencia con células T2 cargadas con FTV positivas para HLA-A*02:01 o se cocultivaron PBMC enriquecidas en CD8<+>no transducidas (CD8_ut) con células T2 cargadas con péptido. Se mide una liberación de quimiocinas despreciable para todos los controles negativos. Además, las células T2 o células T cultivadas solas no muestran ninguna liberación de quimiocinas. Se determinó la secreción de MIP-1a y MIP-1 P mediante células T CD8<+>transgénicas o bien para T11.8-10-17 o bien para referencia mediante ensayo de múltiplex usando el kit Milliplex MAP y se analizó mediante analizador MagPix.

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN

Antes de describirse en detalle la invención con respecto a algunas de sus realizaciones preferidas, se proporcionan las siguientes definiciones generales.

La presente invención tal como se describe de manera ilustrativa a continuación puede ponerse en práctica de manera adecuada en ausencia de cualquier elemento o elementos, limitación o limitaciones, no dados a conocer específicamente en el presente documento.

Ahora se describirá la presente invención con respecto a realizaciones particulares y con referencia a determinadas figuras, pero la invención no se limita a las mismas sino tan sólo por las reivindicaciones.

Cuando se usa el término “que comprende” en la presente descripción y reivindicaciones, no excluye otros elementos. Para los fines de la presente invención, se considera que el término “que consiste en” es una realización preferida del término “que comprende”. Si a continuación en el presente documento se define que un grupo comprende al menos un determinado número de realizaciones, se entiende que esto también da a conocer un grupo que preferiblemente consiste únicamente en esas realizaciones.

Para los fines de la presente invención, se considera que el término “obtenido” es una realización preferida del término “obtenible”. Si a continuación en el presente documento, por ejemplo, se define que un anticuerpo es obtenible a partir de una fuente específica, se entiende que esto también da a conocer un anticuerpo que se obtiene a partir de esta fuente.

Cuando se usa un artículo definido o indefinido cuando se hace referencia a un sustantivo singular, por ejemplo “un”, “una” o “el/la”, esto incluye un plural de ese sustantivo a menos que se mencione específicamente lo contrario. Los términos “alrededor de” o “aproximadamente”, en el contexto de la presente invención, designan un intervalo de precisión que entenderá el experto en la técnica que todavía garantiza el efecto técnico de la característica en cuestión. El término indica normalmente una desviación con respecto al valor numérico indicado de ±10%, y preferiblemente de ±5 %.

Los términos técnicos se usan con su sentido o significado habitual para el experto en la técnica. Si se transmite un significado específico mediante determinados términos, se proporcionarán definiciones de los términos a continuación en el contexto en el que se usan los términos.

Antecedentes sobre TCR

Un TCR está compuesto por dos cadenas de proteínas diferentes e independientes, concretamente la cadena de TCR alfa (a ) y TCR beta (P). La cadena de TCR a comprende regiones variables (V), de unión (J) y constantes (C). La cadena de TCR P comprende regiones variables (V), de diversidad (D), de unión (J) y constantes (C). Las regiones V(D)J reordenadas de la cadena tanto de TCRacomo de TCR P contienen regiones hipervariables (CDR, regiones determinantes de la complementariedad), entre las cuales la región CDR3 determina el reconocimiento de epítopos específicos. En la región C-terminal, tanto la cadena de TCRacomo la cadena de TCR P contienen un dominio transmembrana hidrófobo y terminan en una cola citoplasmática corta.

Normalmente, el TCR es un heterodímero de una cadenaay una cadena p. Este heterodímero puede unirse a moléculas de MHC que presentan un péptido.

El término “región de TCRavariable” o “cadena variable de TCR a ” o “dominio variable” en el contexto de la invención se refiere a la región variable de una cadena de TCR a . El término “región de TCR p variable” o “cadena variable de TCR p” en el contexto de la invención se refiere a la región variable de una cadena de TCR p.

Los loci y genes de TCR se denominan usando la nomenclatura de TCR del sistema de inmunogenética internacional (IMGT) (base de datos de IMGT, www.IMGT.org; Giudicelli, V.,et al.,IMGT/LIGM-DB, the IMGT® comprehensive database of immunoglobulin and T cell receptor nucleotide sequences, Nucl. Acids Res., 34, D781-D784 (2006). PMID: 16381979; T cell Receptor Factsbook, LeFranc and LeFranc, Academic Press ISBN 0-12 441352-8).

Diana

Un primer aspecto de la invención se refiere a un receptor de células T (TCR) aislado específico para NY-ESO-1/LAGE-1.

NY-ESO-1/LAGE-1 pertenece al grupo de los denominados antígenos de cáncer/testículos.

Los antígenos de cáncer/testículos se expresan en diversos tumores malignos y células germinales, pero no en otros tejidos de adulto. Por tanto, NY-ESO-1/LAGE-1 es un antígeno de diana inmunoterapéutica interesante. El gen humano que codifica para NY-ESO-1 se denomina CTAG1A (ENSGT00000268651), que tiene dos isoformas denominadas CTAG1A-002 y CTAG1A-201 (ENST00000599837 y ENST00000593606) con una copia denominada CTAG1B (ENSG0000184033), que tiene dos isoformas denominadas CTAG1B-001 y CTAG1B-002 (ENST00000359887 y ENST00000328435). El gen humano que codifica para LAGE-1 se denomina CTAG2.1 (ENSG0000126890) que tiene una isoterma denominada CATG2.1 y una isoterma denominada CATG2.2 (ENST0000247306 y ENST0000369585).

En particular, el TCR reconoce específicamente la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 1 (LLMWI) o un fragmento de la misma. Más particularmente, el TCR reconoce específicamente la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 2 (SLLMWI) o un fragmento de la misma. Incluso más particularmente, el TCR reconoce específicamente la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 3 (SLLMWITQC) o un fragmento de la misma. SEQ ID NO: 1 a 3 son parte de NY-ESO-1 así como LAGE-1.

Normalmente, el TCR reconoce el fragmento peptídico del antígeno cuando se presenta mediante una molécula de complejo mayor de histocompatibilidad (MHC).

El sistema o complejo de antígeno leucocitario humano (HLA) es un complejo génico que codifica para las proteínas del complejo mayor de histocompatibilidad (MHC) en seres humanos. h LA-A*02 es un grupo de alelos de complejo mayor de histocompatibilidad (MHC) de clase I particular en el locus de HLA-A. HLA-A*02:01 es un alelo de H<l>A-A*02 específico.

Por tanto, en una realización específica, el TCR reconoce específicamente la forma unida a HLA-A*02 de la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2 y/o s Eq ID NO: 3.

En una realización incluso más específica, el TCR reconoce específicamente la forma unida a HLA-A*02:01 de la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2 y/o SEQ ID NO: 3.

El TCR es altamente específico para NY-ESO y muestra baja reactividad cruzada frente a otros péptidos, tales como péptidos tal como se exponen en SEQ ID NO: 17-22, en particular cuando se procesan de manera interna. En una realización, el TCR no muestra sustancialmente ninguna reactividad cruzada frente al péptido de SEQ ID NO: 17, en particular cuando se procesa de manera interna. En algunas realizaciones, el TCR no muestra sustancialmente ninguna reactividad cruzada frente a al menos uno de los péptidos expuestos en SEQ ID NO: 17-22, en particular cuando se procesan de manera interna. La reactividad cruzada puede medirse mediante secreción de INFy tal como se describe en el presente documento.

Secuencia específica de TCR

Realizaciones específicas se refieren a un TCR aislado que comprende:

- una cadena de TCR a que comprende una CDR1 que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 4, una CDR2 que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 5 y una CDR3 que tiene la secuencia de SEQ ID NO: 6.

- una cadena de TCR p que comprende una CDR1 que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 7, una CDR2 que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 8 y una CDR3 que tiene la secuencia de SEQ ID NO: 9.

En algunas realizaciones, el TCR comprende una región de TCRavariable que tiene una secuencia de aminoácidos que es idéntica en al menos el 80 %, al menos el 85 %, al menos el 90 %, al menos el 95 %, al menos el 96 %, al menos el 97 %, al menos el 98 %, al menos el 99 % a SEQ ID NO: 10 y una región de TCR p variable que tiene una secuencia de aminoácidos que es idéntica en al menos el 80 %, al menos el 85 %, al menos el 90 %, al menos el 95 %, al menos el 96 %, al menos el 97 %, al menos el 98 %, al menos el 99 % a SEQ ID NO: 11.

Una realización preferida se refiere a un TCR que comprende una región de TCRavariable que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 10 y una región de TCR p variable que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 11.

En particular, el TCR de la invención comprende una región de TCR a variable que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 10 y una región de TCR p variable que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 11.

Tal como puede observarse a partir de los ejemplos, los TCR según la invención son específicos para NY-ESO-1/LAGE-1 y sólo muestran una reactividad cruzada muy baja frente a otros epítopos o antígenos.

Otras realizaciones se refieren a un TCR aislado que comprende una cadena de TCRaque tiene una secuencia de aminoácidos que es idéntica en al menos el 80 %, al menos el 85 %, al menos el 90 %, al menos el 95 %, al menos el 96 %, al menos el 97 %, al menos el 98 %, al menos el 99 % a SEQ ID NO: 12 y una cadena de TCR p que tiene una secuencia de aminoácidos que es idéntica en al menos el 80 %, al menos el 85 %, al menos el 90 %, al menos el 95 %, al menos el 96 %, al menos el 97 %, al menos el 98 %, al menos el 99 % a SEQ ID NO: 13.

Realizaciones específicas se refieren a un TCR que comprende una cadena de TCR a que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 12 y una cadena de TCR p que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 13. Por tanto, el TCR descrito en el presente documento que es específico para el complejo de HLA-A*02:01 con el péptido NY-ESO-1/LAGE-1 de SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2 o SEQ ID NO: 3 comprende una cadena Va codificada por el gen de TRAV12-2 y un gen Vp codificado por el gen de TRBV12-4.

La determinación de la identidad en porcentaje entre múltiples secuencias se logra preferiblemente usando la aplicación AlignX del programa Vector NTI Advance™ 10 (Invitrogen Corporation, Carlsbad CA, EE.UU.). Este programa usa un algoritmo Clustal W modificado (Thompsonet al.,1994. Nucl Acids Res. 22: págs. 4673-4680; Invitrogen Corporation; Vector NTI Advance™ 10 DNA and protein sequence analysis software. User's Manual, 2004, págs. 389-662). La determinación de la identidad en porcentaje se realiza con los parámetros convencionales de la aplicación AlignX.

El TCR según la invención está aislado o purificado. “Aislado” en el contexto de la invención significa que el TCR no está presente en el contexto en el que se produjo originalmente en la naturaleza. “Purificado” en el contexto de la invención significa, por ejemplo, que el TCR está libre o sustancialmente libre de otras proteínas y partes distintas de proteínas de la célula de la que procede originalmente.

En algunas realizaciones, la secuencia de aminoácidos del TCR puede comprender una o más sustituciones fenotípicamente silenciosas.

Las “sustituciones fenotípicamente silenciosas” también se denominan “sustituciones de aminoácidos conservativas”. El experto en la técnica entiende el concepto de “sustituciones de aminoácidos conservativas”, y significa preferiblemente que codones que codifican para residuos con carga positiva (H, K, y R) se sustituyen por codones que codifican para residuos con carga positiva, codones que codifican para residuos con carga negativa (D y E) se sustituyen por codones que codifican para residuos con carga negativa, codones que codifican para residuos polares neutros (C, G, N, Q, S, T e Y) se sustituyen por codones que codifican para residuos polares neutros, y codones que codifican para residuos no polares neutros (A, F, I, L, M, P, V y W) se sustituyen por codones que codifican para residuos no polares neutros. Estas variaciones pueden producirse de manera espontánea, introducirse mediante mutagénesis al azar o pueden introducirse mediante mutagénesis dirigida. Estos cambios pueden realizarse sin destruir las características esenciales de estos polipéptidos. El experto habitual en la técnica puede examinar fácilmente y de manera rutinaria aminoácidos variantes y/o los ácidos nucleicos que codifican para los mismos para determinar si estas variaciones reducen o destruyen sustancialmente la capacidad de unión a ligando mediante métodos conocidos en la técnica.

El experto entiende que también puede modificarse el ácido nucleico que codifica para el TCR. Las modificaciones útiles en la secuencia de ácido nucleico global incluyen optimización de codones de la secuencia. Pueden realizarse alteraciones que conducen a sustituciones conservativas dentro de la secuencia de aminoácidos expresada. Estas variaciones pueden realizarse en regiones determinantes de la complementariedad y no determinantes de la complementariedad de la secuencia de aminoácidos de la cadena de TCR que no afectan a la función. Habitualmente, no deben realizarse adiciones y deleciones en la región CDR3.

Según algunas realizaciones de la invención, la secuencia de aminoácidos del TCR se modifica para comprender un marcador detectable, un agente terapéutico o resto de modificación de la farmacocinética.

Ejemplos no limitativos para marcadores detectables son radiomarcadores, marcadores fluorescentes, sondas de ácido nucleico, enzimas y reactivos de contraste. Los agentes terapéuticos que pueden asociarse con los TCR incluyen compuestos radiactivos, inmunomoduladores, enzimas o agentes quimioterápicos. Los agentes terapéuticos pueden estar encerrados por un liposoma unido a TCR de modo que el compuesto puede liberarse lentamente en el sitio diana. Esto evitará el daño durante el transporte en el cuerpo y garantizará que el agente terapéutico, por ejemplo, toxina, tiene un efecto máximo tras la unión del TCR a las células presentadoras de antígeno relevantes. Otros ejemplos de agentes terapéuticos son: citotoxinas peptídicas, es decir proteínas o péptidos con la capacidad para destruir células de mamífero, tales como ricina, toxina diftérica, exotoxina A bacteriana de Pseudomonas, ADNasa y ARNasa.

Agentes citotóxicos de molécula pequeña, es decir compuestos con la capacidad para destruir células de mamífero que tienen un peso molecular de menos de 700 Dalton. Tales compuestos pueden contener metales tóxicos que pueden tener un efecto citotóxico. Además, debe entenderse que estos agentes citotóxicos de molécula pequeña también incluyen profármacos, es decir compuestos que se degradan o se convierten en condiciones fisiológicas para liberar agentes citotóxicos. Tales agentes pueden incluir, por ejemplo, docetaxel, gemcitabina, cisplatino, derivados de maitansina, raquelmicina, calicheamicina, etopósido, ifosfamida, irinotecán, porfímero sódico Photofrin II, temozolomida, topotecán, trimetrexato glucoronato, mitoxantrona, auristatina E, vincristina y doxorrubicina; radionúclidos, tales como, yodo 131, renio 186, indio 111, itrio 90, bismuto 210 y 213, actinio 225 y astato 213. La asociación de los radionúclidos con los TCR o derivados de los mismos puede llevarse a cabo, por ejemplo, mediante agentes quelantes; inmunoestimuladores, también conocidos como inmunoestimulantes, es decir moléculas efectoras inmunitarias que estimulan la respuesta inmunitaria. Inmunoestimulantes a modo de ejemplo son citocinas tales como IL-2 e IFN-y, anticuerpos o fragmentos de los mismos, incluyendo anticuerpos anti determinantes de células T o de células NK (por ejemplo, anti-CD3, anti-CD28 o anti-CD16); estructuras de proteína alternativas con características de unión de tipo anticuerpo; superantígenos, es decir antígenos que provocan la activación no específica de células T dando como resultado la activación de célula T policlonales y liberación masiva de citocinas, y mutantes de los mismos; quimiocinas tales como IL-8, factor de plaquetas 4, proteína estimulante de crecimiento de melanoma, etc., activadores del complemento; dominios de proteínas xenogénicas, dominios de proteínas alogénicas, dominios de proteínas virales/bacterianas, péptidos virales/bacterianos.

Las moléculas de receptor de antígeno (moléculas de receptor de células T) en linfocitos T humanos se asocian de manera no covalente con el complejo molecular CD3 (T3) en la superficie celular. La perturbación de este complejo con anticuerpos monoclonales anti-CD3 induce la activación de células T. Por tanto, algunas realizaciones se refieren a un TCR tal como se describe en el presente documento asociado (habitualmente mediante fusión a un extremo N o C-terminal de la cadena alfa o beta) con un anticuerpo anti-CD3, o un fragmento o variante funcional de dicho anticuerpo anti-CD3. Los fragmentos y variantes/análogos de anticuerpo que son adecuados para su uso en las composiciones y métodos descritos en el presente documento incluyen minicuerpos, fragmentos Fab, fragmentos F(ab<‘>)2, fragmentos dsFv y scFv, Nanobodies™ (Ablynx (Bélgica), moléculas que comprenden un dominio de cadena pesada variable de inmunoglobulina individual sintético derivado de un anticuerpo de camélido (por ejemplo, camello o llama)) y anticuerpos frente a dominio (que comprenden un dominio de cadena ligera variable de inmunoglobulina o dominio de cadena pesada variable de inmunoglobulina individual madurado por afinidad (Domantis (Bégica)) o estructuras de proteína alternativas que muestran características de unión de tipo anticuerpo tales como aficuerpos (que comprenden la estructura de proteína A modificada por ingeniería Affibody (Suecia)) o anticalinas (que comprenden anticalinas modificadas por ingeniería Pieris (Alemania)).

El agente terapéutico puede seleccionarse preferiblemente del grupo que consiste en una molécula efectora inmunitaria, un agente citotóxico y un radionúclido. Preferiblemente, la molécula efectora inmunitaria es una citocina.

El resto de modificación de la farmacocinética puede ser, por ejemplo, al menos una unidad de repetición de polietilenglicol, al menos un grupo glicol, al menos un grupo sialilo o una combinación de los mismos. La asociación de al menos una unidad de repetición de polietilenglicol, al menos un grupo glicol, al menos un grupo sialilo puede realizarse de varias maneras conocidas por los expertos en la técnica. En una realización preferida, las unidades se unen de manera covalente al TCR. Los TCR según la invención pueden modificarse mediante uno o varios restos de modificación de la farmacocinética. En particular, la forma soluble del TCR se modifica mediante uno o varios restos de modificación de la farmacocinética. El resto de modificación de la farmacocinética puede lograr cambios beneficiosos en el perfil farmacocinético del producto terapéutico, por ejemplo, semivida en plasma mejorada, inmunogenicidad reducida o potenciada y solubilidad mejorada.

El TCR según la invención puede ser soluble o estar unido a membrana. El término “soluble” se refiere a un TCR que está en forma soluble (es decir, que no tiene ningún dominio transmembrana o citoplasmático), por ejemplo, para su uso como agente de direccionamiento para suministrar agentes terapéuticos a la célula presentadora de antígeno. Para estabilidad, los TCR heterodiméricos ap solubles tienen preferiblemente un enlace disulfuro introducido entre residuos de los dominios constantes respectivos, tal como se describe, por ejemplo, en el documento WO 03/020763. Uno o ambos de los dominios constantes presentes en un heterodímero ap de la invención pueden estar truncados en el extremo C-terminal o los extremos C-terminales, por ejemplo, en hasta 15 o hasta 10 o hasta 8 o menos aminoácidos. Para su uso en terapia adoptiva, un TCR heterodimérico ap puede transfectarse, por ejemplo, como cadenas de longitud completa que tienen dominios tanto citoplasmáticos como transmembrana. Los TCR pueden contener un enlace disulfuro correspondiente al encontrado en la naturaleza entre los dominios constantes alfa y beta respectivos, adicional o alternativamente puede estar presente un enlace disulfuro no nativo.

Por tanto, el TCR, en particular una forma soluble del TCR según la invención, puede modificarse uniendo restos funcionales adicionales, por ejemplo, para reducir la inmunogenicidad, aumentar el tamaño hidrodinámico (tamaño en disolución), solubilidad y/o estabilidad (por ejemplo, mediante protección potenciada frente a degradación proteolítica) y/o prolongando la semivida en suero.

Otros restos funcionales y modificaciones útiles incluyen “interruptores de seguridad” o de “suicidio” que pueden usarse para desactivar células huésped efectoras que portan un TCR de la invención en el cuerpo de un paciente. Un ejemplo es el “interruptor de seguridad” de caspasa 9 inducible (iCasp9) descrito por Gargett y Brown Front Pharmacol. 2014; 5: 235. En resumen, se modifican células huésped efectoras mediante métodos bien conocidos para expresar un dominio de caspasa 9 cuya dimerización depende de un fármaco de dimerización de molécula pequeña tal como AP1903/CIP, y da como resultado una rápida inducción de apoptosis en las células efectoras modificadas. El sistema se describe, por ejemplo, en el documento EP2173869 (A2). En la técnica se conocen ejemplos de otros “interruptores de seguridad” de “suicidio”, por ejemplo, timidina cinasa del virus del herpes simple (HSV-TK), expresión de CD20 y posterior agotamiento usando anticuerpo anti-CD20 o etiquetas de myc (Kiebacket al,Proc Natl Acad Sci USA, 15 de enero de 2008; 105(2):623-8).

En el presente documento también se prevén TCR con un patrón de glicosilación alterado. Tal como se conoce en la técnica, los patrones de glicosilación pueden depender de la secuencia de aminoácidos (por ejemplo, la presencia o ausencia de residuos de aminoácido de glicosilación particulares, comentados a continuación) y/o la célula u organismo huésped en el que se produce la proteína. La glicosilación de polipéptidos está normalmente o bien unida a N o bien unida a O. Unido a N se refiere a la unión del resto de hidrato de carbono a la cadena lateral de un residuo de asparagina. La adición de sitios de glicosilación unida a N a la molécula de unión se logra de manera conveniente alterando la secuencia de aminoácidos de tal manera que contiene una o más secuencias tripeptídicas seleccionadas de asparagina-X-serina y asparagina-X-treonina (donde X es cualquier aminoácido excepto prolina). Pueden introducirse sitios de glicosilación unida a O mediante la adición de, o sustitución por, uno o más residuos de serina o treonina en la secuencia de partida.

Otros medios de glicosilación de TCR son mediante acoplamiento químico o enzimático de glicósidos a la proteína. Dependiendo del modo de acoplamiento usado, el/los azúcar(es) puede(n) unirse a (a) arginina e histidina, (b) grupos carboxilo libres, (c) grupos sulfhidrilo libres tales como los de cisteína, (d) grupos hidroxilo libres tales como los de serina, treonina o hidroxiprolina, (e) residuos aromáticos tales como los de fenilalanina, tirosina otriptófano, o (f) el grupo amida de glutamina. De manera similar, la desglicosilación (es decir, eliminación de restos de hidrato de carbono presentes en la molécula de unión) puede lograrse de manera química, por ejemplo, exponiendo los TCR a ácido trifluorometanosulfónico, o de manera enzimática empleando endo y exo-glicosidasas.

También puede concebirse añadir un fármaco tal como un compuesto de molécula pequeña al TCR, en particular una forma soluble del TCR de la invención. La unión puede lograrse mediante enlaces covalentes, o interacciones no covalentes tal como mediante fuerzas electrostáticas. Pueden emplearse diversos ligadores, conocidos en la técnica, con el fin de formar conjugados de fármacos.

El TCR, en particular una forma soluble del TCR de la invención, puede modificarse adicionalmente para introducir dominios adicionales que ayudan a la identificación, seguimiento, purificación y/o aislamiento de la molécula respectiva (etiquetas). Por tanto, en algunas realizaciones, la cadena de TCR a o la cadena de TCR p puede modificarse para comprender una etiqueta de epítopo.

Las etiquetas de epítopo son ejemplos útiles de etiquetas que pueden incorporarse en el TCR de la invención. Las etiquetas de epítopo son tramos cortos de aminoácidos que permiten la unión de un anticuerpo específico y, por tanto, permiten la identificación y el seguimiento de la unión y el movimiento de TCR solubles o células huésped dentro del cuerpo del paciente o células (huésped). La detección de la etiqueta de epítopo y, por tanto, del TCR marcado con etiqueta, puede lograrse usando varias técnicas diferentes.

Pueden emplearse etiquetas además para la estimulación y expansión de células huésped que portan un TCR de la invención cultivando las células en presencia de moléculas de unión (anticuerpos) específicos para dicha etiqueta. En general, el TCR puede modificarse en algunos casos con diversas mutaciones que modifican la afinidad y la disociación del TCR con el antígeno diana. En particular, las mutaciones pueden aumentar la afinidad y/o reducir la disociación. Por tanto, el TCR puede mutarse en al menos una CDR y la región de entramado de dominio variable del mismo.

Sin embargo, en una realización preferida, las regiones CDR del TCR no se modifican ni se someten a maduración por afinidadin vitrotal como para los receptores de TCR en los ejemplos. Esto significa que las regiones CDR tienen secuencias que se producen de manera natural. Esto puede resultar ventajoso, ya que la maduración por afinidadin vitropuede conducir a inmunogenicidad frente a la molécula de TCR. Esto puede conducir a la producción de anticuerpos anti-fármaco que reducen o inactivan el efecto terapéutico y el tratamiento y/o inducen efectos adversos. La mutación puede ser una o más sustitución/sustituciones, deleción/deleciones o inserción/inserciones. Estas mutaciones pueden introducirse mediante cualquier método adecuado conocido en la técnica, tal como reacción en cadena de la polimerasa, clonación basada en enzimas de restricción, procedimientos de clonación independiente de ligamiento, que se describen, por ejemplo, en Sambrook, Molecular Cloning - 4a edición (2012) Cold Spring Harbor Laboratory Press.

En teoría, puede producirse especificidad de TCR impredecible con el riesgo de reactividad cruzada debido a apareamiento erróneo entre cadenas de TCR endógenas y exógenas. Para evitar el apareamiento erróneo de secuencias de TCR, la secuencia de TCR recombinante puede modificarse para contener regiones Ca y Cp murinizadas mínimas, una tecnología que se ha mostrado que potencia de manera eficiente el emparejamiento correcto de varias cadenas de TCR transducidas diferentes. La murinización de TCR (es decir, intercambio de las regiones constantes humanas en la cadena alfa y beta por sus homólogos murinos) es una técnica que se aplica habitualmente con el fin de mejorar la expresión en superficie celular de TCR en células huésped. Sin desear limitarse a ninguna teoría específica, se piensa que los TCR murinizados se asocian más eficazmente con correceptores de CD3; y/o que se emparejan preferiblemente entre sí y son menos propensos a formar TCR mixtos en células T humanas genéticamente modificadasex vivopara expresar los TCR con especificidad antigénica deseada, pero que todavía conservan y expresan sus TCR “originales”.

Se han identificado nueve aminoácidos responsables de la expresión mejorada de TCR murinizados (Sommermeyer y Uckert, J Immunol., 1 de junio de 2010; 184(11): 6223-31) y se prevé sustituir uno o la totalidad de los residuos de aminoácido en la región constante de cadena alfa y/o beta de TCR por sus residuos homólogos murinos. Esta técnica también se denomina “murinización mínima” y ofrece la ventaja de potenciar la expresión de superficie celular mientras que, al mismo tiempo, se reduce el número de residuos de aminoácido “foráneos” en la secuencia de aminoácidos y, de ese modo, el riesgo de inmunogenicidad.

Algunas realizaciones se refieren a un TCR aislado tal como se describe en el presente documento, en el que el TCR es de tipo de cadena sencilla, en el que la cadena de TCR a y la cadena de TCR p están unidas mediante una secuencia de ligador.

Una forma de TCR de cadena sencilla adecuada comprende un primer segmento constituido por una secuencia de aminoácidos correspondiente a una región de TCRavariable, un segundo segmento constituido por una secuencia de aminoácidos correspondiente a una región de TCR p variable fusionada al extremo N-terminal de una secuencia de aminoácidos correspondiente a una secuencia extracelular de región constante de TCR p, y una secuencia de ligador que une el extremo C-terminal del primer segmento al extremo N-terminal del segundo segmento. Alternativamente, el primer segmento puede estar constituido por una secuencia de aminoácidos correspondiente a una región variable de cadena de TCR p, el segundo segmento puede estar constituido por una secuencia de aminoácidos correspondiente a una secuencia de región variable de cadena de TCR a fusionada al extremo N-terminal de una secuencia de aminoácidos correspondiente a una secuencia extracelular de región constante de cadena de TCR a . Los TCR de cadena sencilla anteriores pueden comprender además un enlace disulfuro entre la primera y segunda cadenas, y en los que la longitud de la secuencia de ligador y la posición del enlace disulfuro son de tal manera que las secuencias de dominio variable del primer y segundo segmentos están mutuamente orientadas sustancialmente como en receptores de células T nativos. Más específicamente, el primer segmento puede estar constituido por una secuencia de aminoácidos correspondiente a una secuencia de región variable de cadena de TCRafusionada al extremo N-terminal de una secuencia de aminoácidos correspondiente a una secuencia extracelular de región constante de cadena de TCR a , el segundo segmento puede estar constituido por una secuencia de aminoácidos correspondiente a una región variable de cadena de TCR p fusionada al extremo N-terminal de una secuencia de aminoácidos correspondiente a una secuencia extracelular de región constante de cadena de TCR p, y puede proporcionarse un enlace disulfuro entre la primera y segunda cadenas. La secuencia de ligador puede ser cualquier secuencia que no altera la función del TCR.

En el contexto de la presente invención, una proteína de fusión de cadenaay/o p de TCR “funcional” significará un TCR o variante de TCR, por ejemplo, modificado mediante adición, deleción o sustitución de aminoácidos, que mantiene al menos actividad biológica sustancial. En el caso de la cadenaay/o p de un TCR, esto significará que ambas cadenas siguen pudiendo formar un receptor de células T (o bien con una cadenaay/o p no modificada o bien con otra cadenaay/o p de proteína de fusión de la invención) que ejerce su función biológica, en particular unión al complejo de péptido específico-MHC de dicho TCR, y/o transducción de señales funcionales tras interacción con péptido específico:MHC.

En realizaciones específicas, el TCR puede modificarse, para ser una proteína de fusión de cadenaay/o p de receptor de células T funcional (TCR), en el que dicha etiqueta de epítopo tiene una longitud de entre 6 y 15 aminoácidos, preferiblemente de 9 a 11 aminoácidos. En otra realización, el TCR puede modificarse para ser una proteína de fusión de cadenaay/o p de receptor de células T (TCR) funcional en el que dicha proteína de fusión de cadenaay/o p de receptor de células T (TCR) comprende dos o más etiquetas de epítopo, o bien separadas o bien directamente en tándem. Realizaciones de la proteína de fusión pueden contener 2, 3, 4, 5 o incluso más etiquetas de epítopo, siempre que la proteína de fusión mantenga su actividad/actividades biológicas (“funcional”).

Se prefiere una proteína de fusión de cadenaay/o p de receptor de células T (TCR) funcional según la presente invención, en la que dicha etiqueta de epítopo se selecciona de, pero no se limita a, etiquetas CD20 o Her2/neu, u otras etiquetas convencionales tales como una etiqueta de myc, etiqueta de FLAG, etiqueta de T7, etiqueta de HA (hemaglutinina), etiqueta de His, etiqueta de S, etiqueta de GST o etiqueta de GFP. Las etiquetas de myc, T7, GST, GFP son epítopos derivados de moléculas existentes. En cambio, FLAG es una etiqueta de epítopo sintética diseñada para una alta antigenicidad (véanse, por ejemplo, las patentes estadounidenses n.os 4.703.004 y 4.851.341). La etiqueta de myc puede usarse preferiblemente porque están disponibles reactivos de alta calidad para usarse para su detección. Evidentemente, las etiquetas de epítopo pueden tener una o más funciones adicionales, más allá del reconocimiento por un anticuerpo. Las secuencias de estas etiquetas se describen en la bibliografía y las conoce bien el experto en la técnica.

Variantes de TCR

Otro aspecto de la invención se refiere a un polipéptido que comprende una porción funcional del TCR tal como se describe en el presente documento, en el que la porción funcional comprende la cadena variable de TCR a expuesta en SEQ ID NO: 10 y/o la cadena variable de TCR p expuesta en SEQ ID NO: 11.

La porción funcional puede mediar en la unión del TCR al antígeno, en particular al complejo de antígeno-MHC. En una realización, la porción funcional comprende la cadena variable de TCRay/o la cadena variable de TCR p tal como se describe en el presente documento.

La molécula de variante de TCR puede tener las propiedades de unión del receptor TCR pero puede estar combinada con dominios de señalización de células efectoras (distintas de células T), en particular con dominios de señalización de células NK. Por tanto, algunas realizaciones se refieren a una proteína que comprende una porción funcional del TCR tal como se describe en el presente documento en combinación con los dominios de señalización de una célula efectora, tal como una célula n K.

Otro aspecto de la invención se refiere a un complejo de TCR multivalente que comprende al menos dos TCR tal como se describen en el presente documento. En una realización de este aspecto, al menos dos moléculas de TCR están unidas mediante restos de ligador para formar complejos multivalentes. Preferiblemente, los complejos son solubles en agua, de modo que el resto de ligador debe seleccionarse en consecuencia. Es preferible que el resto de ligador pueda unirse a posiciones definidas en las moléculas de TCR, de modo que se minimiza la diversidad estructural de los complejos formados. Una realización del presente aspecto se proporciona mediante un complejo de TCR de la invención en el que la cadena de polímero o secuencia de ligador peptídica se extiende entre residuos de aminoácido de cada TCR que no están ubicados en una secuencia de región variable del TCR. Dado que los complejos de la invención pueden ser para su uso en medicina, los restos de ligador deben elegirse teniendo en cuenta su idoneidad farmacéutica, por ejemplo, su inmunogenicidad. En la técnica se conocen ejemplos de restos de ligador que cumplen los criterios deseables anteriores, por ejemplo, la técnica de unir fragmentos de anticuerpo. Ejemplos de ligadores son polímeros hidrófilos y ligadores peptídicos. Un ejemplo de polímeros hidrófilos son polialquilenglicoles. Los más habitualmente usados de esta clase se basan en polietilenglicol o PEG. Sin embargo, otros se basan en otros polialquilenglicoles adecuados, opcionalmente sustituidos, que incluyen polipropilenglicol, y copolímeros de etilenglicol y propilenglicol. Los ligadores peptídicos están compuestos por cadenas de aminoácidos, y funcionan para producir ligadores simples o dominios de multimerización a los que pueden unirse moléculas de TCR.

Una realización se refiere a un complejo de TCR multivalente, en el que al menos uno de dichos TCR está asociado con un agente terapéutico.

Liberación de citocinas y quimiocinas

Algunas realizaciones se refieren al TCR aislado tal como se describe en el presente documento, al polipéptido tal como se describe en el presente documento, al complejo de TCR multivalente tal como se describe en el presente documento, en los que se induce la secreción de IFN-y mediante unión del TCR de la invención expresado en una célula efectora a la forma unida a HLA-A*02 de la secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 1 a 3.

La secreción de IFN-y inducida mediante unión del TCR de la invención expresado en una célula efectora a la forma unida a HLA-A*02 de la secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 1 a 3 puede ser de más de 3 ng/ml, tal como más de 4 ng/ml, más de 5 ng/ml, más preferiblemente más de 6 ng/ml, lo más preferiblemente incluso más de 7 ng/ml. La secreción de IFN-y puede ser al menos 4 veces superior cuando se une a la forma unida a HLA-A*02 de la secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 1 a 3 en comparación con la unión a la forma unida a HLA-A*02 de un péptido irrelevante (por ejemplo, SEQ ID NO: 15 ó 16).

La liberación de citocinas y quimiocinas, tal como la secreción de IFN-y y la secreción de MIP-1a y MIP-1 p, puede medirse mediante un ensayoin vitroen el que células T2 transfectadas con ARNtiv que codifica para una de las secuencias de aminoácidos seleccionadas del grupo que consiste en SEQ ID NO: 1 a 3, preferiblemente SEQ ID NO: 3, se incuban con PBMC enriquecidas en CD8<+>que expresan el TCR que va a investigarse o usando células T2 cargadas o bien con el péptido de NY-ESO-1/LAGE-1-<I57-165>(SLL) o bien con un péptido irrelevante derivado de NY-ESO-1.

Algunas realizaciones se refieren a un TCR aislado tal como se describe en el presente documento, un polipéptido tal como se describe en el presente documento o un complejo de TCR multivalente tal como se describe en el presente documento, en los que la secreción de MIP-1a y MIP-1 p inducida mediante unión del TCR de la invención expresado en una célula efectora a la secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 1 a 3 o la forma unida a HLA-A*02 de la misma está por debajo de un umbral predefinido. El umbral puede determinarse usando una razón de efector con respecto a diana específica de al menos 1:1.

La secreción de MIP-1ain vitroinducida mediante unión del TCR de la invención expresado en una célula efectora a la forma unida a HLA-A*02 de secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 1 a 3 puede ser de menos de 1 ng/ml, preferiblemente menos de 0,8 ng/ml, más preferiblemente menos de 0,7 ng/ml a una razón de célula efectora TCR+ transgénica con respecto a célula diana de al menos 1:1 usando 10.000 células cada una. La secreción de MIP-1 p inducida mediante unión a la forma unida a HLA-A*02 de secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 1 a 3 puede ser de menos de 3 ng/ml, preferiblemente menos de 2,8 ng/ml, más preferiblemente menos de 2,5 ng/ml a una razón de efector TCR+ transgénico con respecto a diana de al menos 1:1 usando 10,000 células cada uno.

La “célula efectora” puede ser un linfocito de sangre periférica (PBL) o una célula mononuclear de sangre periférica (PBMC). Normalmente, la célula efectora es una célula efectora inmunitaria, especialmente una célula T. Otros tipos de células adecuados incluyen células T gamma-delta y células T de tipo NK.

La secreción MIP-1a puede ser como máximo 15 veces superior, preferiblemente como máximo 10 veces superior cuando se une a la forma unida a HLA-A*02 de la secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 1 a 3 en comparación con la unión a la forma unida a HLA-A*02 de un péptido irrelevante (por ejemplo SEQ ID NO: 15 ó 16). La secreción de MIP-1 p puede ser como máximo 30 veces superior, preferiblemente como máximo 25 veces superior cuando se une a la forma unida a HLA-A*02 de la secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 1 a 3 en comparación con la unión a la forma unida a HLA-A*02 de un péptido irrelevante (por ejemplo, SEQ ID NO: 15 ó 16).

La invención también se refiere a métodos para identificar un TCR o un fragmento del mismo que se une a las secuencias de aminoácidos diana seleccionadas de SEQ ID NO: 1 a 3 o la forma unida a HLA-A*02, preferiblemente a HLA-A*02:01, de las mismas, en los que el método comprende poner en contacto el TCR candidato o fragmento del mismo con las secuencias de aminoácidos seleccionadas de SEQ ID NO: 1 a 3 o la forma unida a HLA-A*02, preferiblemente a HLA-A*02:01, de las mismas y determinar si el TCR candidato o fragmento del mismo se une a la diana y/o media en una respuesta inmunitaria.

Puede determinarse si el TCR candidato o fragmento del mismo media en una respuesta inmunitaria, por ejemplo, mediante la medición de secreción de citocinas, tal como secreción de IFN-y. Tal como se describió anteriormente, la secreción de citocinas puede medirse mediante un ensayoin vitroen el que células K562 (u otras APC) transfectadas con ARNtiv que codifica para una de las secuencias de aminoácidos seleccionadas del grupo que consiste en SEQ ID NO: 1 a 3, preferiblemente SEQ ID NO: 3, se incuban con PBMC enriquecidas en CD8+ que expresan el TCR o una molécula que comprende un fragmento del TCR que va a investigarse.

Ácidos nucleicos, vectores

Otro aspecto de la invención se refiere a un ácido nucleico que codifica para un TCR tal como se describe en el presente documento o que codifica para el polinucleótido que codifica para un TCR tal como se describe en el presente documento.

En una realización, el polipéptido aislado comprende una porción funcional del TCR según una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que la porción funcional comprende la cadena variable de TCR a expuesta en SEQ ID NO: 10 y/o la cadena variable de TCR p expuesta en SEQ ID NO: 11.

“Molécula de ácido nucleico” significa de manera general un polímero de ADN o ARN, que puede ser de cadena simple o de cadena doble, sintetizado u obtenido (por ejemplo, aislado y/o purificado) a partir de fuentes naturales, que puede contener nucleótidos naturales, no naturales o alterados, y que puede contener una unión entre nucleótidos natural, no natural o alterada, tal como una unión fosforoamidato o una unión fosforotioato, en lugar del fosfodiéster encontrado entre los nucleótidos de un oligonucleótido no modificado. Preferiblemente, los ácidos nucleicos descritos en el presente documento son recombinantes. Tal como se usa en el presente documento, el término “recombinante” se refiere a (i) moléculas que se construyen fuera de células vivas mediante unión de segmentos de ácido nucleico naturales o sintéticos a moléculas de ácido nucleico que pueden replicarse en una célula viva, o (ii) moléculas que resultan de la replicación de las descritas en el punto (i) anterior. Para los fines en el presente documento, la replicación puede ser replicaciónin vitroo replicaciónin vivo.Los ácidos nucleicos pueden construirse basándose en síntesis química y/o reacciones de ligamiento enzimáticas usando procedimientos conocidos en la técnica o comercialmente disponibles (por ejemplo, de Genscript, Thermo Fisher y empresas similares). Véase, por ejemplo, Sambrooket al.,por ejemplo, puede sintetizarse químicamente un ácido nucleico usando nucleótidos que se producen de manera natural o nucleótidos modificados de diversas maneras diseñados para aumentar la estabilidad biológica de las moléculas o para aumentar la estabilidad física del dúplex formado tras la hibridación (por ejemplo, derivados de fosforotioato y nucleótidos sustituidos con acridina). El ácido nucleico puede comprender cualquier secuencia de nucleótidos que codifica para cualquiera de los TCR recombinantes, polipéptidos o proteínas, o porciones funcionales o variantes funcionales de los mismos.

La presente divulgación también proporciona variantes de los ácidos nucleicos aislados o purificados en las que los ácidos nucleicos variantes comprenden una secuencia de nucleótidos que es idéntica en al menos el 75 %, el 80 %, el 81 %, el 82 %, el 83 %, el 84 %, el 85 %, el 86 %, el 87 %, el 88 %, el 89 %, el 90 %, el 91 %, el 92 %, el 93 %, el 94 %, el 95 %, el 96 %, el 97 %, el 98 % o el 99 % a la secuencia de nucleótidos que codifica para el TCR descrito en el presente documento. Tal secuencia de nucleótidos variante codifica para un TCR funcional que reconoce específicamente NY-ESO1/LAGE-1.

La divulgación también proporciona un ácido nucleico aislado o purificado que comprende una secuencia de nucleótidos que es complementaria a la secuencia de nucleótidos de cualquiera de los ácidos nucleicos descritos en el presente documento o una secuencia de nucleótidos que se hibrida en condiciones rigurosas con la secuencia de nucleótidos de cualquiera de los ácidos nucleicos descritos en el presente documento.

La secuencia de nucleótidos que se hibrida en condiciones rigurosas se hibrida preferiblemente en condiciones de alta rigurosidad. Por “condiciones de alta rigurosidad” quiere decirse que la secuencia de nucleótidos se hibrida específicamente con una secuencia diana (la secuencia de nucleótidos de cualquiera de los ácidos nucleicos descritos en el presente documento) en una cantidad que es más intensa, de manera detectable, que la hibridación no específica. Las condiciones de alta rigurosidad incluyen condiciones que distinguirán un polinucleótido con una secuencia complementaria exacta, o uno que tan sólo contiene unas pocas coincidencias erróneas dispersadas, con respecto a una secuencia aleatoria que sucede que tiene unas pocas regiones pequeñas (por ejemplo, 3-10 bases) que coinciden con la secuencia de nucleótidos. Tales regiones pequeñas de complementariedad se funden más fácilmente que un complemento de longitud completa de 14-17 o más bases, y la hibridación de alta rigurosidad hace que puedan distinguirse fácilmente. Las condiciones de rigurosidad relativamente alta incluirán, por ejemplo, condiciones de bajo contenido en sal y/o alta temperatura, tal como se proporciona mediante NaCl a aproximadamente 0,02-0,1 M o equivalente, a temperaturas de aproximadamente 50-70 °C. Tales condiciones de alta rigurosidad toleran pocas coincidencias erróneas, si es que toleran alguna, entre la secuencia de nucleótidos y la cadena diana o molde, y son particularmente adecuadas para detectar la expresión de cualquiera de los TCR descritos en el presente documento. Generalmente se aprecia que las condiciones pueden volverse más rigurosas mediante la adición de cantidades crecientes de formamida.

Tal como ya se describió en otra parte en el presente documento, el ácido nucleico que codifica para el TCR puede modificarse. Las modificaciones útiles en la secuencia de ácido nucleico global pueden ser optimización de codones. Pueden realizarse alteraciones que conducen a sustituciones conservativas dentro de la secuencia de aminoácidos expresada. Estas variaciones pueden realizarse en regiones determinantes de la complementariedad y no determinantes de la complementariedad de la secuencia de aminoácidos de la cadena de TCR que no afectan a la función. Habitualmente, no deben realizarse adiciones y deleciones en la región CDR3.

Otra realización se refiere a un vector que comprende el ácido nucleico que codifica para el TCR tal como se describe en el presente documento.

El vector es preferiblemente un plásmido, vector lanzadera, fagémido, cósmido, vector de expresión, vector retroviral, vector adenoviral o partícula y/o vector que va a usarse en terapia génica.

Un “vector” es cualquier molécula o composición que tiene la capacidad para portar una secuencia de ácido nucleico al interior de una célula huésped adecuada en la que puede tener lugar la síntesis del polipéptido codificado. Normalmente, y de manera preferible, un vector es un ácido nucleico que se ha modificado por ingeniería, usando técnicas de<a>D<n>recombinante que se conocen en la técnica, para incorporar una secuencia de ácido nucleico deseada (por ejemplo, un ácido nucleico de la invención). El vector puede comprender ADN o ARN y/o comprender liposomas. El vector puede ser un plásmido, vector lanzadera, fagémido, cósmido, vector de expresión, vector retroviral, vector lentiviral, vector adenoviral o partícula y/o vector que va a usarse en terapia génica. Un vector puede incluir secuencias de ácido nucleico que permiten replicarlo en una célula huésped, tales como un origen de replicación. Un vector también puede incluir uno o más genes de marcador seleccionable y otros elementos genéticos conocidos por los expertos habituales en la técnica. Un vector es preferiblemente un vector de expresión que incluye un ácido nucleico según la presente invención operativamente unido a secuencias que permiten la expresión de dicho ácido nucleico.

Preferiblemente, el vector es un vector de expresión. Más preferiblemente, el vector es un vector retroviral, más específicamente uno gamma-retroviral o lentiviral.

Células, líneas celulares

Otro aspecto de la invención se refiere a una célula que expresa el TCR tal como se describe en el presente documento.

En algunas realizaciones, la célula se aísla o se produce de manera no natural.

En realizaciones específicas, la célula puede comprender el ácido nucleico que codifica para el TCR tal como se describe en el presente documento o el vector que comprende dicho ácido nucleico.

En la célula, puede introducirse el vector anteriormente descrito que comprende una secuencia de ácido nucleico que codifica para el TCR anteriormente descrito o puede introducirse ARNtiv que codifica para dicho TCR. La célula puede ser un linfocito de sangre periférica tal como una célula T. El método de clonación y expresión exógena del TCR se describe, por ejemplo, en Engelset al.(Relapse or eradication of cancer is predicted by peptide-major histocompatibility complex affinity. Cancer Cell, 23(4), 516-26. 2013). La transducción de células T humanas primarias con un vector lentiviral se describe, por ejemplo, en Cribbs “Simplified production and concentration of lentiviral vectors to achieve high transduction in primary human T cells”, BMC Biotechnol. 2013; 13: 98.

Los términos “transfección” y “transducción” son intercambiables y se refieren al procedimiento mediante el cual se introduce una secuencia de ácido nucleico exógena en una célula huésped, por ejemplo, en una célula huésped eucariota. Se indica que la introducción o transferencia de secuencias de ácido nucleico no se limita a los métodos mencionados, sino que puede lograrse mediante cualquiera de varios medios incluyendo electroporación, microinyección, administración por pistola génica, lipofección, superfección y la infección mencionada por retrovirus u otros virus adecuados para la transducción o transfección.

Algunas realizaciones se refieren a una célula que comprende:

a) un vector de expresión que comprende al menos un ácido nucleico tal como se describe en el presente documento, o

b) un primer vector de expresión que comprende un ácido nucleico que codifica para la cadena alfa del TCR tal como se describe en el presente documento, y un segundo vector de expresión que comprende un ácido nucleico que codifica para la cadena beta de un TCR tal como se describe en el presente documento.

En algunas realizaciones, la célula es un linfocito de sangre periférica (PBL) o una célula mononuclear de sangre periférica (PBMC). La célula puede ser un linfocito citolítico natural o una célula T.

Preferiblemente, la célula es una célula T. La célula T puede ser una célula T CD4+ o CD8+.

En algunas realizaciones, la célula es una célula madre tal como célula T de memoria.

Las células T de memoria de tipo célula madre (TSUM) son una subpoblación menos diferenciada de células T CD8+, que están caracterizadas por la capacidad de autorrenovación y para persistir a largo plazo. Una vez que estas células encuentran su antígenoin vivo,se diferencian adicionalmente para dar células T de memoria centrales (TAM), células T de memoria efectoras (TEM) y células T de memoria efectoras diferenciadas de manera terminal (TAMRA), permaneciendo algunas TSCM quiescentes (Flynnet al.,Clinical & Translational Immunology (2014)). Estas células TSUM restantes muestran la capacidad para producir una memoria inmunológica duraderain vivoy, por tanto, se considera que son una subpoblación importante de células T para la terapia con células T adoptiva (Lugliet al.,Nature Protocols 8, 33-42 (2013) Gattisonet al.,Nat. Med., octubre de 2011; 17(10): 1290-1297). Puede usarse selección inmuno-magnética con el fin de restringir la combinación de células T al subtipo de células T de memoria de células madre (véase Riddellet al.2014, Cancer Journal 20(2): 141-44).

Composiciones farmacéuticas, tratamientos médicos y kits

Otro aspecto de la invención se refiere una composición farmacéutica que comprende el TCR tal como se describe en el presente documento, el polipéptido que comprende una porción funcional de dicho TCR, el complejo de TCR multivalente tal como se describe en el presente documento, el ácido nucleico que codifica para el TCR, el vector que comprende dicho ácido nucleico o la célula que comprende dicho TCR tal como se describe en el presente documento.

Esos componentes activos de la presente invención se usan preferiblemente en una composición farmacéutica, en dosis mezcladas con un portador o material portador aceptable, de tal manera que puede tratarse o al menos aliviarse la enfermedad. Una composición de este tipo puede incluir (además del componente activo y el portador), material de carga, sales, tampón, estabilizantes, solubilizantes y otros materiales, que constituyen estado de la técnica conocido.

El término “farmacéuticamente aceptable” define un material no tóxico, que no interfiere con la eficacia de la actividad biológica del componente activo. La elección del portador depende de la aplicación.

La composición farmacéutica puede contener componentes adicionales que potencian la actividad del componente activo o que complementan el tratamiento. Tales componentes y/o factores adicionales pueden formar parte de la composición farmacéutica para lograr efectos sinérgicos o minimizar efectos adversos o no deseados.

Técnicas para la formulación o preparación y aplicación/medicación de componentes activos de la presente invención están publicadas en “Remington's Pharmaceutical Sciences”, Mack Publishing Co., Easton, PA, última edición. Una aplicación apropiada es una aplicación parenteral, por ejemplo, inyecciones intramuscular, subcutánea, intramedular, así como inyecciones intratecal, intraventricular directa, intravenosa, intranodal, intraperitoneal o intratumoral. La inyección intravenosa es el tratamiento preferido de un paciente.

Según una realización preferida, la composición farmacéutica es una infusión o una inyección.

Una composición inyectable es una composición líquida farmacéuticamente aceptable que comprende al menos un principio activo, por ejemplo, una población de células T expandida (por ejemplo, autóloga o alogénica con respecto al paciente que va a tratarse) que expresan un TCR. El principio activo se disuelve o suspende habitualmente en un portador fisiológicamente aceptable, y la composición puede comprender adicionalmente cantidades minoritarias de una o más sustancias auxiliares no tóxicas, tales como agentes emulsionantes, conservantes y agentes tamponantes del pH y similares. Tales composiciones inyectables que son útiles para su uso con las proteínas de fusión de esta divulgación son convencionales; los expertos habituales en la técnica conocen bien formulaciones apropiadas.

Normalmente, la composición farmacéutica comprende al menos un portador farmacéuticamente aceptable.

Por consiguiente, otro aspecto de la invención se refiere al TCR tal como se describe en el presente documento, al polipéptido que comprende una porción funcional de dicho TCR, al complejo de TCR multivalente tal como se describe en el presente documento, al ácido nucleico que codifica para dicho TCR, al vector que comprende dicho ácido nucleico o a la célula que comprende dicho TCR tal como se describe en el presente documento para su uso como medicamento.

Algunas realizaciones se refieren al TCR tal como se describe en el presente documento, al polipéptido que comprende una porción funcional de dicho TCR, al complejo de TCR multivalente tal como se describe en el presente documento, al ácido nucleico que codifica para dicho TCR, al vector que comprende dicho ácido nucleico, a la célula que comprende dicho TCR para su uso en el tratamiento de cáncer.

En una realización, el cáncer es un cáncer hematológico o un tumor sólido.

Los cánceres hematológicos también se denominan cánceres de la sangre que no forman tumores sólidos y, por tanto, se dispersan en el cuerpo. Ejemplos de cánceres hematológicos son leucemia, linfoma o mieloma múltiple. Hay dos tipos principales de tumores sólidos, sarcomas y carcinomas. Los sarcomas son, por ejemplo, tumores del vaso sanguíneo, hueso, tejido graso, ligamento, vaso linfático, músculo y tendón.

En una realización, el cáncer se selecciona del grupo que consiste en sarcoma, cáncer de próstata, cáncer uterino, cáncer de tiroides, cáncer testicular, cáncer renal, cáncer pancreático, cáncer de ovarios, cáncer esofágico, cáncer de pulmón de células no pequeñas, linfoma no Hodgkin, mieloma múltiple, melanoma, carcinoma hepatocelular, cáncer de cabeza y cuello, cáncer gástrico, cáncer endometrial, cáncer colorrectal, colangiocarcinoma, cáncer de mama, cáncer de vejiga, leucemia mieloide y leucemia linfoblástica aguda. Preferiblemente, el cáncer es sarcoma u osteosarcoma.

Los TCR reconocen particularmente bien osteosarcoma y melanoma, tal como la línea celular de osteosarcoma SAOS-2 y las líneas celulares de melanoma MM415 y Mel624.38.

También se contemplan en el presente documento composiciones farmacéuticas y kits que contienen uno o más de (i) un TCR aislado tal como se describe en el presente documento; (ii) partículas virales que comprenden un ácido nucleico que codifica para un TCR recombinante; (iii) células inmunitarias, tales como células T o células NK, modificadas para expresar un TCR recombinante tal como se describe en el presente documento; (iv) ácidos nucleicos que codifican para el TCR recombinante tal como se describe en el presente documento. En algunas realizaciones, la presente divulgación proporciona composiciones que comprenden partículas de vector lentiviral que comprenden una secuencia de nucleótidos que codifica para un TCR recombinante descrito en el presente documento (o células T que se han modificado usando las partículas de vector descritas en el presente documento para expresar un TCR recombinante). Tales composiciones pueden administrarse a sujetos en los métodos de la presente divulgación, tal como se describe adicionalmente en el presente documento.

Pueden usarse composiciones que comprenden las células T modificadas tal como se describe en el presente documento en métodos y composiciones para inmunoterapia adoptiva según técnicas conocidas, o variaciones de las mismas que resultarán evidentes para los expertos en la técnica basándose en la presente divulgación.

En algunas realizaciones, las células se formulan recogiéndolas en primer lugar a partir de su medio de cultivo, y después lavando y concentrando las células en un medio y sistema de recipiente adecuado para la administración (un portador “farmacéuticamente aceptable”) en una cantidad eficaz para el tratamiento. Un medio de infusión adecuado puede ser cualquier formulación en medio isotónico, normalmente solución salina normal, Normosol R (Abbott) o Plasma-Lyte A (Baxter), pero también puede usarse disolución de dextrosa al 5 % en agua o disolución lactato de Ringer. El medio de infusión puede complementarse con albúmina sérica humana.

El número de células para un tratamiento eficaz en la composición es normalmente mayo de 10 células y hasta 106, hasta e incluyendo 108 ó 109 células y puede ser de más de 1010 células. El número de células dependerá del uso final para el que está destinada la composición al igual que el tipo de células incluidas en la misma. Por ejemplo, si se desean células que son específicas para un antígeno particular, entonces la población contendrá más del 70 %, generalmente más del 80 %, el 85 % y el 90-95 % de tales células. Para usos proporcionados en el presente documento, las células están generalmente en un volumen de un litro o menos, puede ser de 500 ml o menos, incluso 250 ml o 100 ml o menos. Por tanto, la densidad de las células deseadas es normalmente mayor de 106 células/ml y generalmente es mayor de 107 células/ml, generalmente de 108 células/ml o más. El número clínicamente relevante de células inmunitarias puede distribuirse en múltiples infusiones que de manera acumulativa son iguales a, o superan, 109, 1010 ó 1011 células. Las composiciones farmacéuticas proporcionadas en el presente documento pueden estar en diversas formas, por ejemplo, en forma sólida, líquida, de polvo, acuosa o liofilizada. En la técnica se conocen ejemplos de portadores farmacéuticos adecuados. Tales portadores y/o aditivos pueden formularse mediante métodos convencionales y pueden administrarse al sujeto a una dosis adecuada. Agentes estabilizantes, tales como lípidos, inhibidores de nucleasa, polímeros y agentes quelantes pueden conservar las composiciones frente a la degradación dentro del cuerpo. En una composición destinada a administrarse mediante inyección, puede incluirse uno o más de un tensioactivo, conservante, agente humectante, agente dispersante, agente de suspensión, tampón, estabilizante y agente isotónico.

Los TCR recombinantes tal como se describen en el presente documento, o las partículas de vector viral que comprenden una secuencia de nucleótidos que codifica para un TCR recombinante proporcionado en el presente documento, pueden condicionarse como kits. Los kits pueden incluir opcionalmente uno o más componentes tales como instrucciones de uso, dispositivos y reactivos adicionales, y componentes, tales como tubos, recipientes y jeringas para la puesta en práctica de los métodos. Los kits a modo de ejemplo pueden incluir los ácidos nucleicos que codifican para los TCR recombinantes, los polipéptidos de TCR recombinante o virus proporcionados en el presente documento, y pueden incluir opcionalmente instrucciones de uso, un dispositivo para detectar un virus en un sujeto y un dispositivo para administrar las composiciones a un sujeto.

También se contemplan los kits que comprenden polinucleótidos que codifican para un gen de interés (por ejemplo, un TCR recombinante) en el presente documento. También se contemplan kits que comprenden un vector viral que codifica para una secuencia de interés (por ejemplo, un TCR recombinante) y, opcionalmente, una secuencia de polinucleótido que codifica para un inhibidor de punto de comprobación inmunitario, en el presente documento.

Los kits contemplados en el presente documento también incluyen kits para llevar a cabo los métodos para detectar la presencia de polinucleótidos que codifican para uno cualquiera o más de los TCR dados a conocer en el presente documento. En particular, tales kits de diagnóstico pueden incluir conjuntos de cebadores de amplificación y detección apropiados y otros reactivos asociados para realizar secuenciación profunda para detectar los polinucleótidos que codifican para TCR dados a conocer en el presente documento. En realizaciones adicionales, los kits en el presente documento pueden comprender reactivos para detectar los TCR dados a conocer en el presente documento, tales como anticuerpos u otras moléculas de unión. Los kits de diagnóstico también pueden contener instrucciones para determinar la presencia de los polinucleótidos que codifican para los TCR dados a conocer en el presente documento o para determinar la presencia de los TCR dados a conocer en el presente documento. Un kit también puede contener instrucciones. Las instrucciones incluyen normalmente una expresión tangible que describe los componentes incluidos en el kit, y métodos para la administración, incluyendo métodos para determinar el estado apropiado del sujeto, la cantidad de dosificación apropiada y el método de administración apropiado. Las instrucciones también pueden incluir indicaciones para monitorizar al sujeto a lo largo de la duración del tiempo de tratamiento.

Los kits proporcionados en el presente documento también pueden incluir un dispositivo para administrar una composición descrita en el presente documento a un sujeto. Cualquiera de una variedad de dispositivos conocidos en la técnica para administrar medicamentos o vacunas puede incluirse en los kits proporcionados en el presente documento. Los dispositivos a modo de ejemplo incluyen, pero no se limitan a, una aguja hipodérmica, una aguja intravenosa, un catéter, un dispositivo de inyección sin aguja, un inhalador y un dispensador de líquido, tal como una pipeta. Normalmente, el dispositivo para administrar un virus del kit será compatible con el virus del kit; por ejemplo, puede incluirse un dispositivo de inyección sin aguja tal como un dispositivo de inyección a alta presión en kits con virus que no resultan dañados por la inyección a alta presión, pero normalmente no se incluye en kits con virus que resultan dañados por la inyección a alta presión.

Los kits proporcionados en el presente documento también pueden incluir un dispositivo para administrar un compuesto, tal como un activador o estimulador de células T, o un agonista de TLR, tal como un agonista de TLR4 a un sujeto. Cualquiera de una variedad de dispositivos conocidos en la técnica para administrar medicamentos a un sujeto puede incluirse en los kits proporcionados en el presente documento. Los dispositivos a modo de ejemplo incluyen una aguja hipodérmica, una aguja intravenosa, un catéter, una inyección sin aguja, pero no se limitan a, una aguja hipodérmica, una aguja intravenosa, un catéter, un dispositivo de inyección sin aguja, un inhalador y un dispensador de líquido tal como una pipeta. Normalmente, el dispositivo para administrar el compuesto del kit será compatible con el método de administración deseado del compuesto.

EXPERIMENTOS EJEMPLOS:

Ejemplo 1: aislamiento de clon de célula T específico de NY-ESO-1/LAGE-1

Se usó un enfoque de cebadoin vitropara aislar clones de células T con cualquier especificidad de antígenos y restricción de m Hc deseada. El sistema de cebado usa células dendríticas maduras (mDC) de un donante negativo para HLA-A*02:01 como células presentadoras de antígeno y células T enriquecidas en CD8+ autólogas como células respondedoras. ARN transcritoin vitro(ARNtiv) que codifica para la secuencia de aminoácidos de CTAG1A/B humana de longitud completa, tal como se indica como referencia en SEQ ID NO: 14, sirve como fuente de antígeno específico. Simultáneamente, se usa ARNtiv que codifica para HLA-A*02:01 humano como fuente de elemento de restricción transfectado en mDC para establecer un cebado alogénico en cuanto a este alelo de HLA dedicado (tal como se describe en el documento WO2007/017201). Tras electroporación en las mDC, se traduce el ARNtiv que codifica para CTAG1 para dar proteína de longitud completa, que posteriormente se procesa y se presenta como péptidos mediante moléculas de HLA-A*02:01 transgénicas que se expresan mediante mDC transfectadas. Cocultivosin vitrode células T con las mDC transfectadas con ARNtiv del mismo donante condujeron a la inducciónde novode células T específicas de antígeno que sirvieron como fuente de TCR correspondientes. Las células T específicas de antígeno pueden enriquecerse mediante una variedad de métodos y se clonan mediante dilución limitante o clasificación de células individuales basada en FACS.

Ejemplo 1.1: enfoque de cebado alogénico usando células dendríticas maduras transfectadas con ARNtiv que codifica para HLA-A*02:01.

El cebado con células dendríticas de células T con TCR de alta afinidad se logró usando presentación de péptidos mediante moléculas de HLA-A*02:01 alogénicas según el siguiente protocolo:

Cebado de HLA-A*02:01/CTAG1

Se produjeron células dendríticas maduras (mDC de 8 días) usando cócteles de maduración adecuados según Jonuleitet al.para DC (Jonuleitet al.1997, Eur. J. Immunol. 1997, 27:3135-3142).

Se derivaron células presentadoras de antígeno (mDC maduradas de 8 días) a partir de rom donantes sanos y se sometieron a electroporación con 20 |ig de ARNtiv que codificaba para el antígeno deseado y molécula de HLA (HLA-A*02:01). Posteriormente se cocultivaron las mDC preparadas con PBMC enriquecidas en CD8+ de un donante sano en una razón de 1:10 durante aproximadamente 14 días en un medio celular adecuado complementado con IL-2 (50 unidades/ml cada dos días) a 37 °C (CO<2>al 6%). Posteriormente, se identificaron células específicas para Ny -ESO-1/LAGE-1-<i>57-165 usando multímeros de HLA-A*02:01 y NY-ESO-1/LAGE-1<157-165>(Prolmmune) y posteriormente se separaron mediante clasificación de células individuales usando tecnología de FACS.

Ejemplo 2: análisis de función / especificidad

Tras la identificación de un TCR candidato (T11.8-10-17) que se une al epítopo de NY-ESO-1/LAGE-1 deseado (NY-ESO-1/LA G E -W<165>) en HLA-A2, se llevó a cabo una caracterización completa referente a la función y especificidad. Los análisis confirmaron la especificidad del clon de célula T T11.8-10-17 para NY-ESO-1, más precisamente NY-ESO-1/LAGE-1-<i>57-165 (figura 1), la capacidad de células T enriquecidas en CD8+ transducidas con T11.8-10-17 para provocar específicamente la lisis de líneas de células tumorales cargadas con péptido NY-ESO-1/LAGE-1<157-165>positivas para HLA-A2 (figura 2) y el reconocimiento de célula tumorales de células T enriquecidas en CD8+ transducidas con T11.8-10-17 en cocultivo con diversas líneas de células tumorales humanas (figura 3).

Ejemplo 2.1: análisis del clon de célula T original T11.8-10-17

Ejemplo 2.1.1: especificidad de antígeno

Disposición experimental: estimulación mediante células K562 cargadas con ARNtiv o T2 cargadas con péptido Se confirmó la especificidad de NY-ESO-1/LAGE-1<157-165>según el siguiente protocolo: se realizó un análisis de ELISA de tipo sándwich convencional, detectando IFN-y (conjunto de ELISA de IFN-y humano de BD).

Como células diana, se cargaron células T2 (HLA-A*02<pos>) con cantidades saturantes (10<-5>M) de péptido NY-ESO-1/LAGE-1<157-165>(“péptido SLL”; SEQ ID NO: 3) o péptido irrelevante derivado de NY-eSo -1 (“péptido FTV”; SEQ ID NO. 15), es decir péptido FTVSGNILTI (“péptido FTV”) o péptido RLLEFYLAM (“péptido RLL”, SEQ ID NO. 16). Además, se transfectaron células K562 (transducidas con HLA-A*02:01; “K562-A2”) con 20 |i g de ARNtiv que codificaba para NY-ESO-1/LAGE-1<157-165>o se sometieron a electroporación con agua como control. Se cocultivó cada línea celular diana con el clon de célula T T11.8-10-17 a una razón de aproximadamente 2:1 usando 20.000 células diana y 10.000 células T. Se detectó IFN-y mediante ELISA de tipo sándwich convencional (conjunto de ELISA de IFN-y humano de BD).

Resultados

El clon candidato secretó IFN-y únicamente tras la estimulación con células K562-A2 que expresaban NY-ESO-1 o células T2 cargadas con péptido SLL, pero no en combinación con células K562-A2 o T2 sometidas a electroporación en agua cargadas con péptidos irrelevantes (FVT o RLL) (figura 1).

Ejemplo 2.2: reconocimiento de células tumorales

Disposición experimental: destrucción de células tumorales

Se evaluó la capacidad de destrucción de células T CD8+ transducidas con T11.8-10-17 o TCR de referencia (CD8-T11.8-10-17 o CD8_benchmark-TCR) mediante cocultivo con la línea de células tumorales positivas para HLA-A*02 y positivas para NY-ESO-1/LAGE-1 Mel624.38 (figura 2a). Además, también se sometió a prueba la destrucción de<c>D8-T11.8-10-17 con la línea de células tumorales positivas para HLA-A*02 y positivas para NY-ESO-1/LAGE-1 MM415 (figura 2b). Como control negativo, se usaron PBMC enriquecidas en CD8+ no transducidas como células efectoras (CD8_UT) o se usó la línea de células tumorales positivas para HLA-A*02 pero negativas para NY-ESO-1/LAGE-1 SK-Mel23 como células diana. Se configuraron los cocultivos a una razón de efector con respecto a diana de aproximadamente 4:1, es decir se sembraron 10.000 células tumorales adherentes un día antes del cocultivo y posteriormente se añadieron 40.000 células T TCR+ transgénicas. Se midió un aumento de células diana fluorescentes rojas (intensidad integrada total en GCU x |im2/imagen), que indica la inducción de apoptosis de células diana (anexina V, rojo), cada cuatro horas a lo largo de un periodo de tiempo total de 67 horas usando monitorización de células vivas (IncuCyte® ZOOM).

Resultados

Las células T CD8+ transducidas con T11.8-10-17 o TCR de referencia mostraron la destrucción tan solo de la línea de células tumorales positivas para NY-ESO-1/LAGE-1 y positivas para HLA-A2 Mel624.38 (figura 2a) o MM415 (figura 2b) representado mediante un aumento de la fluorescencia roja (anexina V IncuCyte®) empezando ya después de 10 horas. En cambio, en caso de células tumorales cultivadas sin células efectoras o en caso de la línea de células tumorales negativas para NY-ESO-1/LAGE-1 y positivas para HLA-A2 SK-Mel23 cultivadas con células T CD8+ transducidas con T11.8-10-17, no se observó ningún aumento de la fluorescencia roja indicando ausencia de destrucción de células diana. Las células T CD8+ no transducidas no mostraron ninguna lisis de ninguna línea de células tumorales.

Ejemplo 2.3: reconocimiento de células tumorales

Disposición experimental: estimulación mediante líneas de células tumorales

Se usó ELISA de IFN-y para evaluar la secreción de citocinas tras la estimulación de células T transducidas con T11.8-10-17 (CD8_T11.8-10-17) con un panel de líneas de células tumorales humanas positivas para HLA-A*02:01, positivas para NY-ESO-1/LAGE-1 (Mel624.38, FM6, FM3,29, MM415, SAOS2, U266). Se detectó la expresión de NY-ESO-1/LAGE-1 en las células diana mediante análisis de NanoString nCounter®. Como control positivo para células T transducidas con T11.8-10-17, se cargaron células T2 con péptido SLL (10‘5 M). Como controles negativos para la función efectora, se cocultivaron células T transducidas con T11.8-10-17 con células T2 cargadas con péptido irrelevante (FTV) (10‘5 M), SK-Mel23 (HLA-A2pos, NY-ESO-1/LAGE-1neg) o SKM1 (HLA-A2pos, NY-ESO-1/LAGE-1neg), o se cocultivaron células T no transducidas con células tumorales o células T2 cargadas con péptido. El cultivo de células diana sin células efectoras sirvió como control negativo adicional. Se cocultivaron las células diana con células T a una razón de 2:1 usando 40.000 células T transducidas con T11.8-10-17 y 20.000 células diana (figura 3).

Resultados

Las células T CD8+ transgénicas para T11.8-10-17 muestran altas cantidades de secreción de IFN-y en cocultivo con líneas de células tumorales NY-ESO-1/LAGE-1pos, HLA-A*02pos Mel624.38, FM6, FM3,29, MM415, SAOS2 y U266 o células T Cargadas con NY-ESO-1/LAGE-1-I57-165. En cambio, no se detectó ningún reconocimiento de las líneas de células tumorales positivas para HLA-A*02, negativas para NY-ESO-1/LAGE-1 SK-Mel23 y SKM1 o células T2 cargadas con péptido irrelevante mediante células T CD8+ transgénicas para T11.8-10-17. Las células T no transducidas cocultivadas con cualquier célula diana o células diana sin células T efectoras no mostraron ninguna secreción de IFN-y (figura 3).

Ejemplo 2.4: reconocimiento de epítopos de coincidencia errónea

Disposición experimental 2.4.1: reconocimiento de epítopos cargados con péptido

Se sometió a prueba la secreción de IFN-y de células T CD8+ o bien transducidas con TCR de referencia específico para NY-ESO-1/LAGE-1-I57-165 (CD8-benchmark-TCR) o bien con T11.8-10-17 (CD8_T11-10-17) para determinar el reconocimiento de péptidos (secreción de IFN-y) con células T2 cargadas con péptido (10‘5 M). Mediante análisis Expitope® informático (Expitope® 2.0; Jaravineet al.BMC Cancer 2017) de todas las bases de datos implementadas y retirando el umbral de puntuación combinada (establecido a 0), se sometieron a prueba 75 péptidos que eran homólogos en al menos el 56 % (hasta 4 coincidencias erróneas) con respecto a la secuencia de péptido SLL (9 meros) y tienen una puntuación de unión a MHC (CI50) inferior a 20.000 nM. Como control negativo, se usaron PBMC enriquecidas en CD8+ no transducidas (CD8_UT) como células efectoras o se estimularon células T transgénicas para TCR con células T2 cargadas con péptido irrelevante (irr.; FTVSGNILTI) (10‘5 M). También se sometió a prueba la secreción de IFN-y de fondo de células diana (sólo dianas). Como control positivo se activaron células T mediante células T2 cargadas con péptido SLL (#10*) (10‘5 M). Se cocultivaron células diana con células T a una razón de 1:1 usando 20.000 células diana y 20.000 células T transducidas con T11.8-10-17 o TCR de referencia o no transducidas. Se midió la secreción de IFN-y mediante ELISA convencional en [pg/ml]. Se muestran los seis péptidos reconocidos (figura 4).

Tabla 1

La tabla 1 muestra las secuencias peptídicas de seis péptidos de 75 péptidos sometidos a prueba que se reconocieron por células T CD8+ transducidas con TCR T11.8-10-17 (CD8_t 11-10-17).

Resultados

Se muestran péptidos reconocidos de manera cruzada por células T CD8+ transgénicas para TCR T11.8-10-17 y de referencia (las secuencias peptídicas se resumen en la tabla 1). Las células T transgénicas reconocieron el péptido de control positivo (SLL, SLLMWITQC) pero no el péptido irrelevante (irr.; FTVSGNILTI) y, por tanto, demostraron funcionalidad de las células T transgénicas. Además, ambas células T transgénicas reconocieron de manera cruzada péptido #3 y las células T transgénicas para T11.8-10-17 también se activaron ligeramente mediante células T2 cargadas con péptido #6, #11, #32, #34 y #51. No se observó ningún reconocimiento de ninguna célula T2 mediante células T no transducidas. Las células T o células diana T2 cultivadas por separado no secretaron IFN-y (figura 4).

Disposición experimental 2.4.2: reconocimiento de epítopos con coincidencia errónea de ARNtiv

Se sometió a prueba la liberación de IFN-y de PBMC enriquecidas en CD8+ que expresaban el TCR específico para NY-ESO-1/LAGEW165 T11.8-10-17 (CD8_T11.8-10-17) o el TCR de referencia (CD8_benchmark-TCR) en cocultivo o bien con células K562 transgénicas para HLA-A*02:01 cargadas con péptido (K562-A2+irr., K562-A2+SLL) o bien con K562 transgénicas para HLA-A2 transfectadas con ARNtiv (K562-A2+NY-ESO-1, K562-A2+eGFP) a las 16 horas tras establecer el cocultivo. Para este experimento, se sometieron 3x106 células K562 en 300 |i l de medio RPMI1640 a electroporación con 20 |i g o bien de NY-ESO-1 o bien de ARNtiv para eGFP (300 voltios y 300 |iF; pulso exponencial). Como control positivo, se estimularon células T con células K562 transgénicas para HLA-A*02:01 cargadas o bien con el péptido SLL (10-5 M) (K562-A2+SLL) o bien con 20 |ig de ARNtiv que codificaba para NY-ESO-1 (K562-A2+NY-ESO-1). Como control negativo se cargaron células K562 transgénicas para HLA-A*02:01 o bien con péptido irrelevante (10-5 M; K562-A2+FTV) o bien con 20 |ig de ARNtiv que codifica para eGFP (K562-A2+eGFP). Además, se transfectaron células K562 positivas para HLA-A*02:01 con 20 |ig de ARNtiv que codifica para eGFP en combinación con péptidos largos que comprenden epítopos reconocidos de manera cruzada y secuencias flanqueantes (K562-A2+#3, K562- A2+#6, K562-A2+#11, K562-A2+#32, K562-A2+#34, K562-A2+#51) mediante células T transgénicas que expresan o bien el TCR T11.8-10-17 de la invención (CD8_T11.8-10-17) o bien el TCR de referencia (CD8_benchmark-TCR). Se cocultivaron células diana con células T a una razón de 2:1 usando 40.000 células diana y 20.000 células T transducidas con T11.8-10-17 o TCR de referencia. Se midió la secreción de IFN-y mediante ELISA convencional en [pg/ml] (figura 5).

Resultados

Las células T CD8+ transgénicas para T11.8-10-17 y TCR de referencia reconocieron los controles positivos, es decir o bien células positivas para K562-HLA-A*02:01 cargadas con péptido SLL (K562-A2+SLL) o bien células positivas para K562-H<l>A-A*02:01 transfectadas con ARNtiv para NY-ESO-1 (K562-A2+NYESO), pero no reconocieron células positivas para K562-HLA-A*02:01 cargadas de manera irrelevante (K562-A2+irr. y K562-A2+eGFP) demostrando la especificidad y funcionalidad de las células T transgénicas. Aunque las células T transgénicas para TCR de referencia todavía podían reconocer el péptido #3 cuando se procesaron de manera intracelular y se presentaron en células positivas para K562-HLA-A*02:01, T11.8-10-17 ya no mostró ningún reconocimiento cruzado de ningún péptido procesado de manera interna (#3, #6, #11, #32, #34 y #51). Esto conduce a la conclusión de que las células T transgénicas para T11.8-10-17 no reconocen de manera cruzada ninguno de los péptidos sometidos a prueba si se procesan de manera interna en comparación con el TCR de referencia.

Ejemplo 3: perfil de citocinas

Disposición experimental 3.1: secreción de IFN-<y>. TNF-a y granzima B

Se evaluó la liberación de citocinas específicas (IFN-<y>, TNF-a y granzima B medidas en [ng/ml]) de PBMC enriquecidas en TCR, transgénicas, CD8+, de dos donantes sanos diferentes (figura 6a: donante 1; figura 6b: donante 2) genéticamente modificadas para expresar el TCR específico para NY-ESO-1/LAGE1-I57-165 T11.8-10-17 (CD8_T11.8-10-17) o TCR de referencia (CD8_benchmark-TCR) tras la estimulación con células T2 positivas para HLA-A*02:01 cargadas o bien con 10'5 M del péptido NY-ESO-1/LAGE-1-I57-165 (T2(SLL)) o 10'5 M de un péptido irrelevante derivado de NY-ESO-1 (T2(FTV)).

Como control negativo, se estimularon células T CD8+ transgénicas para T11.8-10-17 o referencia con células T2 cargadas con FTV positivas para HLA-A*02:01 (T2(FTV)) o se cultivaron PBMC enriquecidas en CD8+ no transducidas (CD8_ut) con células T2 cargadas con péptido. Además, se cultivaron células T2 o células T por separado.

Se cocultivaron células diana y células T a una razón de 1:1 usando 10.000 células diana y 10.000 células T transducidas con T11.8-10-17 o TCR de referencia. Se determinó la secreción de IFN-<y>, TNF-a y granzima B mediante células T CD8+ transgénicas o bien para T11.8-10-17 o bien para referencia 18 horas tras establecer el cocultivo mediante ensayo de múltiplex usando el kit Milliplex MAP y se analizó mediante el analizador MagPix.

Resultados

No se mide ninguna liberación de citocinas significativa para todos los controles negativos. Ambos TCR transgénicos condujeron a cantidades comparables de secreción de IFN-<y>, TNF-a y granzima B mediante las células T respectivas y muestran un perfil de citocinas preferible en cuanto a la función efectora.

Disposición experimental 3.2: secreción de MIP-1a y MIP-1B

Liberación de quimiocinas específica (MIP-1a y MIP-1P) de PBMC enriquecidas en CD8+ (figura 7a: donante 1, o figura 7b: donante 2) que expresan el TCR específico para NY-ESO-1/La GE-1-<i>57-165 T11.8-10-17 (CD8_T11.8-10-17) o TCR de referencia (CD8_benchmark-TCR) tras la estimulación con células T2 positivas para HLA-A*02:01 cargadas o bien con 10'5 M del péptido NY-ESO-1/LAGE-1-I57-165 (SLL) (T2(SLL)) o bien con 10'5 M de un péptido irrelevante derivado de NY-ESO-1 (FTV) (T2(FTV)). Las células T transgénicas para TCR de referencia secretaron cantidades superiores de MIP-1a y MIP-1P en comparación con células T transgénicas para TCR T11.8-10-17 tras la estimulación con células T2 cargadas con péptido SLL.

Como control negativo, se estimularon células T CD8+ transgénicas para T11.8-10-17 o referencia con células T2 cargadas con FTV positivas para HLA-A*02:01 o se cocultivaron PBMC enriquecidas en CD8+ no transducidas (CD8_ut) con células T2 cargadas con péptido. Además, se cultivaron células T2 o células T por separado.

Se cocultivaron células diana y células T a una razón de 1:1 usando 10.000 células diana y 10.000 células T transducidas con T11.8-10-17 o TCR de referencia. Se determinó la secreción de MIP-1a y MIP-1 p mediante células T CD8+ transgénicas o bien para T11.8-10-17 o bien para referencia 18 horas tras establecer el cocultivo mediante ensayo de múltiplex usando el kit Milliplex MAP y se analizó mediante el analizador MagPix.

Resultados

Se mide una liberación de quimiocinas despreciable para todos los controles negativos. Además, las células T2 o células T cultivadas por separado no muestran ninguna liberación de quimiocinas. Las células T transducidas para T11.8-10-17 liberaron cantidades notablemente inferiores de MIP-1a y MIP-1 p en comparación con células T transgénicas para TCR de referencia. Dado que se sabe que quimiocinas tales como MIP-1a y MIP-1 p, también denominadas CCL3 y CLC4 respectivamente, en particular MIP-1a , fomentan la progresión tumoral (Liaoet al.Oncotarget, 7(4): 4310-4325 (2015); Silvaet al.Oncotarget 8 (11): 51024-51036 (2017), Yu Wuet al.J. lmmunol., 1 de noviembre; 181(9):6384- 93 (2008)), niveles de secreción de MIP-1a y MIP-1 p inferiores resultan ventajosos.

Claims (16)

1. REIVINDICACIONES

   i. TCR aislado, en el que el TCR comprende

   - una cadena de TCR a que comprende una CDR1 que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 4, una CDR2 que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 5 y una CDR3 que tiene la secuencia de SEQ ID NO: 6; y

   - una cadena de TCR p que comprende una CDR1 que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 7, una CDR2 que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 8 y una CDR3 que tiene la secuencia de SEQ ID NO: 9.
2. 2. TCR aislado según la reivindicación 1, en el que su secuencia de aminoácidos está modificada para comprender un marcador detectable, un agente terapéutico o resto de modificación de la farmacocinética.
3. 3. TCR aislado según una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que el TCR es de tipo de cadena sencilla, en el que la cadena de TCR a y la cadena de TCR p están unidas mediante una secuencia de ligador.
4. 4. TCR aislado según una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que la cadena de TCR a o la cadena de TCR p está modificada para comprender una etiqueta de epítopo.
5. 5. Polipéptido aislado que comprende una porción funcional del TCR según una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que la porción funcional comprende la cadena variable de TCR a expuesta en SEQ ID NO: 10 y/o la cadena variable de TCR p expuesta en SEQ ID NO: 11.
6. 6. Complejo de TCR multivalente, que comprende al menos dos TCR según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4.
7. 7. Ácido nucleico que codifica para un TCR según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4 o que codifica para el polipéptido según la reivindicación 5.
8. 8. Vector que comprende el ácido nucleico según la reivindicación 7.
9. 9. Célula que expresa el TCR según las reivindicaciones 1 a 4.
10. 10. Célula que comprende el ácido nucleico según la reivindicación 7 o el vector según la reivindicación 8. 11. Célula según la reivindicación 9, en la que la célula comprende:
11. a) un vector de expresión que comprende al menos un ácido nucleico según la reivindicación 7; o b) un primer vector de expresión que comprende un ácido nucleico que codifica para la cadena alfa del TCR según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, y un segundo vector de expresión que comprende un ácido nucleico que codifica para la cadena beta de un TCR según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4.
12. 12. Composición farmacéutica que comprende el TCR aislado según las reivindicaciones 1 a 4, el polipéptido según la reivindicación 5, el complejo de TCR multivalente según la reivindicación 6, el ácido nucleico según la reivindicación 7, el vector según la reivindicación 8 o la célula según una cualquiera de las reivindicaciones 9 a 11.
13. 13. TCR aislado según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, polipéptido según la reivindicación 5, complejo de TCR multivalente según la reivindicación 6, ácido nucleico según la reivindicación 7, vector según la reivindicación 8 o célula según una cualquiera de las reivindicaciones 9 a 11, para su uso como medicamento.
14. 14. TCR aislado según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, polipéptido según la reivindicación 5, complejo de TCR multivalente según reivindicación 6, ácido nucleico según la reivindicación 7 o célula según una cualquiera de las reivindicaciones 9 a 11, para su uso en el tratamiento de cáncer.
15. 15. TCR, polipéptido, complejo de TCR multivalente, ácido nucleico o célula para su uso según la reivindicación 14, en los que el cáncer es un cáncer hematológico o un tumor sólido.
16. 16. TCR, polipéptido, complejo de TCR multivalente, ácido nucleico o célula para su uso según las reivindicaciones 14 y 15, en los que el cáncer se selecciona del grupo que consiste en sarcoma, cáncer de próstata, cáncer uterino, cáncer de tiroides, cáncer testicular, cáncer renal, cáncer pancreático, cáncer de ovarios, cáncer esofágico, cáncer de pulmón de células no pequeñas, linfoma no Hodgkin, mieloma múltiple, melanoma, carcinoma hepatocelular, cáncer de cabeza y cuello, cáncer gástrico, cáncer endometrial, cáncer colorrectal, colangiocarcinoma, cáncer de mama, cáncer de vejiga, leucemia mieloide y leucemia linfoblástica aguda.