ES2842878T3 - Generación de células T específicas de antígeno - Google Patents
Generación de células T específicas de antígeno Download PDFInfo
- Publication number
- ES2842878T3 ES2842878T3 ES18161391T ES18161391T ES2842878T3 ES 2842878 T3 ES2842878 T3 ES 2842878T3 ES 18161391 T ES18161391 T ES 18161391T ES 18161391 T ES18161391 T ES 18161391T ES 2842878 T3 ES2842878 T3 ES 2842878T3
- Authority
- ES
- Spain
- Prior art keywords
- cells
- hla
- antigen
- cell
- mhc
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Active
Links
- 210000001744 T-lymphocyte Anatomy 0.000 title claims abstract description 208
- 239000000427 antigen Substances 0.000 title claims abstract description 85
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 title claims abstract description 82
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 title claims abstract description 82
- 210000004443 dendritic cell Anatomy 0.000 claims abstract description 121
- 238000000034 method Methods 0.000 claims abstract description 54
- 239000003446 ligand Substances 0.000 claims abstract description 51
- 210000000612 antigen-presenting cell Anatomy 0.000 claims abstract description 46
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 claims abstract description 30
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 claims abstract description 22
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 claims abstract description 20
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 claims abstract description 20
- 208000002250 Hematologic Neoplasms Diseases 0.000 claims abstract description 19
- 238000011282 treatment Methods 0.000 claims abstract description 15
- 210000005105 peripheral blood lymphocyte Anatomy 0.000 claims abstract description 13
- 101100005713 Homo sapiens CD4 gene Proteins 0.000 claims abstract description 12
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 claims abstract description 5
- 230000001235 sensitizing effect Effects 0.000 claims abstract description 5
- 108091008874 T cell receptors Proteins 0.000 claims description 71
- 102000016266 T-Cell Antigen Receptors Human genes 0.000 claims description 71
- 230000009261 transgenic effect Effects 0.000 claims description 13
- 239000008194 pharmaceutical composition Substances 0.000 claims description 12
- 239000013598 vector Substances 0.000 claims description 8
- 108700019146 Transgenes Proteins 0.000 claims description 5
- 238000010367 cloning Methods 0.000 claims description 5
- 238000002347 injection Methods 0.000 claims description 5
- 239000007924 injection Substances 0.000 claims description 5
- 238000001802 infusion Methods 0.000 claims description 4
- 108010010378 HLA-DP Antigens Proteins 0.000 claims description 3
- 102000015789 HLA-DP Antigens Human genes 0.000 claims description 3
- 108010062347 HLA-DQ Antigens Proteins 0.000 claims description 3
- 239000003937 drug carrier Substances 0.000 claims description 3
- 229960005486 vaccine Drugs 0.000 claims description 3
- 108010058597 HLA-DR Antigens Proteins 0.000 claims description 2
- 102000006354 HLA-DR Antigens Human genes 0.000 claims description 2
- 229920000314 poly p-methyl styrene Polymers 0.000 claims 2
- 206010063401 primary progressive multiple sclerosis Diseases 0.000 claims 2
- 102000018713 Histocompatibility Antigens Class II Human genes 0.000 abstract 1
- 108010027412 Histocompatibility Antigens Class II Proteins 0.000 abstract 1
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 246
- 108010074032 HLA-A2 Antigen Proteins 0.000 description 141
- 102000025850 HLA-A2 Antigen Human genes 0.000 description 138
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 89
- 102000003425 Tyrosinase Human genes 0.000 description 67
- 108060008724 Tyrosinase Proteins 0.000 description 67
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 60
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 description 39
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 28
- 102000004127 Cytokines Human genes 0.000 description 27
- 108090000695 Cytokines Proteins 0.000 description 27
- 230000000735 allogeneic effect Effects 0.000 description 27
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 27
- 210000004881 tumor cell Anatomy 0.000 description 27
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 26
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 26
- 238000004520 electroporation Methods 0.000 description 25
- 210000004698 lymphocyte Anatomy 0.000 description 24
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 23
- 210000001151 cytotoxic T lymphocyte Anatomy 0.000 description 21
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 20
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 20
- 102000008070 Interferon-gamma Human genes 0.000 description 19
- 108010074328 Interferon-gamma Proteins 0.000 description 19
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 19
- 230000027455 binding Effects 0.000 description 17
- 238000001943 fluorescence-activated cell sorting Methods 0.000 description 17
- 201000001441 melanoma Diseases 0.000 description 16
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 16
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 15
- 238000000684 flow cytometry Methods 0.000 description 14
- 229960003130 interferon gamma Drugs 0.000 description 14
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 description 14
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 14
- 241000282414 Homo sapiens Species 0.000 description 12
- 230000037452 priming Effects 0.000 description 12
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 12
- 230000008569 process Effects 0.000 description 11
- 230000028327 secretion Effects 0.000 description 11
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 11
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 11
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 10
- 239000012636 effector Substances 0.000 description 10
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 10
- 230000006870 function Effects 0.000 description 9
- 210000001616 monocyte Anatomy 0.000 description 9
- 210000003819 peripheral blood mononuclear cell Anatomy 0.000 description 9
- 108020003175 receptors Proteins 0.000 description 9
- 102000005962 receptors Human genes 0.000 description 9
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 8
- 102100039620 Granulocyte-macrophage colony-stimulating factor Human genes 0.000 description 8
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 8
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 8
- 230000003834 intracellular effect Effects 0.000 description 8
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 8
- 239000001397 quillaja saponaria molina bark Substances 0.000 description 8
- 239000013643 reference control Substances 0.000 description 8
- 229930182490 saponin Natural products 0.000 description 8
- 150000007949 saponins Chemical class 0.000 description 8
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 8
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 7
- 241000894007 species Species 0.000 description 7
- 230000000638 stimulation Effects 0.000 description 7
- 108010002350 Interleukin-2 Proteins 0.000 description 6
- 108010004729 Phycoerythrin Proteins 0.000 description 6
- 239000012980 RPMI-1640 medium Substances 0.000 description 6
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 6
- 230000003115 biocidal effect Effects 0.000 description 6
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 6
- 239000006285 cell suspension Substances 0.000 description 6
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 6
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 description 6
- 230000004936 stimulating effect Effects 0.000 description 6
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 5
- 208000009329 Graft vs Host Disease Diseases 0.000 description 5
- 102000008949 Histocompatibility Antigens Class I Human genes 0.000 description 5
- 102000004388 Interleukin-4 Human genes 0.000 description 5
- 108090000978 Interleukin-4 Proteins 0.000 description 5
- 238000011467 adoptive cell therapy Methods 0.000 description 5
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 5
- 239000011651 chromium Substances 0.000 description 5
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 5
- 238000010494 dissociation reaction Methods 0.000 description 5
- 230000005593 dissociations Effects 0.000 description 5
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 5
- 208000024908 graft versus host disease Diseases 0.000 description 5
- 230000028993 immune response Effects 0.000 description 5
- 229940028885 interleukin-4 Drugs 0.000 description 5
- 101150054032 lspA gene Proteins 0.000 description 5
- 239000000463 material Substances 0.000 description 5
- 230000035800 maturation Effects 0.000 description 5
- 244000052769 pathogen Species 0.000 description 5
- 239000011148 porous material Substances 0.000 description 5
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 5
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 5
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 5
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 5
- 108700028369 Alleles Proteins 0.000 description 4
- 102000019034 Chemokines Human genes 0.000 description 4
- 108010012236 Chemokines Proteins 0.000 description 4
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N Glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 108010002586 Interleukin-7 Proteins 0.000 description 4
- 108091054437 MHC class I family Proteins 0.000 description 4
- 208000006265 Renal cell carcinoma Diseases 0.000 description 4
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 4
- 230000000890 antigenic effect Effects 0.000 description 4
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 4
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 description 4
- 229940044627 gamma-interferon Drugs 0.000 description 4
- 230000012010 growth Effects 0.000 description 4
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 4
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 4
- 210000003289 regulatory T cell Anatomy 0.000 description 4
- DAEPDZWVDSPTHF-UHFFFAOYSA-M sodium pyruvate Chemical compound [Na+].CC(=O)C([O-])=O DAEPDZWVDSPTHF-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 4
- 210000001541 thymus gland Anatomy 0.000 description 4
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 4
- 210000003171 tumor-infiltrating lymphocyte Anatomy 0.000 description 4
- 102000040650 (ribonucleotides)n+m Human genes 0.000 description 3
- RDJLIBMVLWBMKX-UHFFFAOYSA-N 1-(3,4-dihydro-2h-chromen-2-ylmethyl)piperidine Chemical compound C1CC2=CC=CC=C2OC1CN1CCCCC1 RDJLIBMVLWBMKX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 102000011786 HLA-A Antigens Human genes 0.000 description 3
- 108010075704 HLA-A Antigens Proteins 0.000 description 3
- 108010088652 Histocompatibility Antigens Class I Proteins 0.000 description 3
- 108090000172 Interleukin-15 Proteins 0.000 description 3
- 229930040373 Paraformaldehyde Natural products 0.000 description 3
- 108091036407 Polyadenylation Proteins 0.000 description 3
- 230000004913 activation Effects 0.000 description 3
- 230000000961 alloantigen Effects 0.000 description 3
- 230000005809 anti-tumor immunity Effects 0.000 description 3
- 230000030741 antigen processing and presentation Effects 0.000 description 3
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 3
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 3
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 3
- 230000004186 co-expression Effects 0.000 description 3
- 230000000139 costimulatory effect Effects 0.000 description 3
- 238000011161 development Methods 0.000 description 3
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 3
- 230000004069 differentiation Effects 0.000 description 3
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 3
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 3
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 3
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 3
- 201000005787 hematologic cancer Diseases 0.000 description 3
- 208000024200 hematopoietic and lymphoid system neoplasm Diseases 0.000 description 3
- 230000003211 malignant effect Effects 0.000 description 3
- 229920002866 paraformaldehyde Polymers 0.000 description 3
- 239000013641 positive control Substances 0.000 description 3
- 230000000717 retained effect Effects 0.000 description 3
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 3
- 230000002269 spontaneous effect Effects 0.000 description 3
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 3
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N (+)-Biotin Chemical compound N1C(=O)N[C@@H]2[C@H](CCCCC(=O)O)SC[C@@H]21 YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N 0.000 description 2
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N Atomic nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108090001008 Avidin Proteins 0.000 description 2
- 101100400999 Caenorhabditis elegans mel-28 gene Proteins 0.000 description 2
- 108010022366 Carcinoembryonic Antigen Proteins 0.000 description 2
- 102100025475 Carcinoembryonic antigen-related cell adhesion molecule 5 Human genes 0.000 description 2
- 108010078791 Carrier Proteins Proteins 0.000 description 2
- 241000701022 Cytomegalovirus Species 0.000 description 2
- 241000255581 Drosophila <fruit fly, genus> Species 0.000 description 2
- 102100027286 Fanconi anemia group C protein Human genes 0.000 description 2
- 101000946889 Homo sapiens Monocyte differentiation antigen CD14 Proteins 0.000 description 2
- 108010001336 Horseradish Peroxidase Proteins 0.000 description 2
- ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N L-glutamine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N 0.000 description 2
- 229930182816 L-glutamine Natural products 0.000 description 2
- 239000006142 Luria-Bertani Agar Substances 0.000 description 2
- 102000043129 MHC class I family Human genes 0.000 description 2
- 102000043131 MHC class II family Human genes 0.000 description 2
- 108091054438 MHC class II family Proteins 0.000 description 2
- 102100035877 Monocyte differentiation antigen CD14 Human genes 0.000 description 2
- NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-N Phosphoric acid Chemical compound OP(O)(O)=O NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 206010070834 Sensitisation Diseases 0.000 description 2
- 230000006044 T cell activation Effects 0.000 description 2
- 230000037453 T cell priming Effects 0.000 description 2
- 230000001464 adherent effect Effects 0.000 description 2
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 2
- 230000033228 biological regulation Effects 0.000 description 2
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 2
- 210000000170 cell membrane Anatomy 0.000 description 2
- 230000008859 change Effects 0.000 description 2
- 238000001342 constant potential amperometry Methods 0.000 description 2
- 230000001276 controlling effect Effects 0.000 description 2
- 239000012228 culture supernatant Substances 0.000 description 2
- 230000009089 cytolysis Effects 0.000 description 2
- 230000007423 decrease Effects 0.000 description 2
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 2
- 230000005684 electric field Effects 0.000 description 2
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 2
- 239000012091 fetal bovine serum Substances 0.000 description 2
- 230000008014 freezing Effects 0.000 description 2
- 238000007710 freezing Methods 0.000 description 2
- 238000002825 functional assay Methods 0.000 description 2
- 235000011187 glycerol Nutrition 0.000 description 2
- 210000004408 hybridoma Anatomy 0.000 description 2
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 2
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 2
- 208000032839 leukemia Diseases 0.000 description 2
- 150000002632 lipids Chemical class 0.000 description 2
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 2
- 210000001165 lymph node Anatomy 0.000 description 2
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 2
- 210000002752 melanocyte Anatomy 0.000 description 2
- 230000008488 polyadenylation Effects 0.000 description 2
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 2
- 239000011541 reaction mixture Substances 0.000 description 2
- 230000004044 response Effects 0.000 description 2
- 230000008313 sensitization Effects 0.000 description 2
- 150000003384 small molecules Chemical class 0.000 description 2
- 229940054269 sodium pyruvate Drugs 0.000 description 2
- 239000011550 stock solution Substances 0.000 description 2
- 239000013589 supplement Substances 0.000 description 2
- 238000010257 thawing Methods 0.000 description 2
- 238000001890 transfection Methods 0.000 description 2
- BRZYSWJRSDMWLG-DJWUNRQOSA-N (2r,3r,4r,5r)-2-[(1s,2s,3r,4s,6r)-4,6-diamino-3-[(2s,3r,4r,5s,6r)-3-amino-4,5-dihydroxy-6-[(1r)-1-hydroxyethyl]oxan-2-yl]oxy-2-hydroxycyclohexyl]oxy-5-methyl-4-(methylamino)oxane-3,5-diol Chemical compound O1C[C@@](O)(C)[C@H](NC)[C@@H](O)[C@H]1O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O[C@@H]2[C@@H]([C@@H](O)[C@H](O)[C@@H]([C@@H](C)O)O2)N)[C@@H](N)C[C@H]1N BRZYSWJRSDMWLG-DJWUNRQOSA-N 0.000 description 1
- JKMHFZQWWAIEOD-UHFFFAOYSA-N 2-[4-(2-hydroxyethyl)piperazin-1-yl]ethanesulfonic acid Chemical compound OCC[NH+]1CCN(CCS([O-])(=O)=O)CC1 JKMHFZQWWAIEOD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- YRNWIFYIFSBPAU-UHFFFAOYSA-N 4-[4-(dimethylamino)phenyl]-n,n-dimethylaniline Chemical compound C1=CC(N(C)C)=CC=C1C1=CC=C(N(C)C)C=C1 YRNWIFYIFSBPAU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 206010000830 Acute leukaemia Diseases 0.000 description 1
- 229920001817 Agar Polymers 0.000 description 1
- 108010068307 Alpha-Globulins Proteins 0.000 description 1
- 244000153158 Ammi visnaga Species 0.000 description 1
- 235000010585 Ammi visnaga Nutrition 0.000 description 1
- 102000006306 Antigen Receptors Human genes 0.000 description 1
- 108010083359 Antigen Receptors Proteins 0.000 description 1
- 102100030346 Antigen peptide transporter 1 Human genes 0.000 description 1
- 102100030343 Antigen peptide transporter 2 Human genes 0.000 description 1
- 208000023275 Autoimmune disease Diseases 0.000 description 1
- 208000032791 BCR-ABL1 positive chronic myelogenous leukemia Diseases 0.000 description 1
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 1
- 206010006187 Breast cancer Diseases 0.000 description 1
- 208000026310 Breast neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 101150013553 CD40 gene Proteins 0.000 description 1
- 241000283707 Capra Species 0.000 description 1
- VYZAMTAEIAYCRO-UHFFFAOYSA-N Chromium Chemical compound [Cr] VYZAMTAEIAYCRO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 206010009944 Colon cancer Diseases 0.000 description 1
- 108010071942 Colony-Stimulating Factors Proteins 0.000 description 1
- 230000004568 DNA-binding Effects 0.000 description 1
- 241000725619 Dengue virus Species 0.000 description 1
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229920001917 Ficoll Polymers 0.000 description 1
- 239000007995 HEPES buffer Substances 0.000 description 1
- 102100028976 HLA class I histocompatibility antigen, B alpha chain Human genes 0.000 description 1
- 102100028971 HLA class I histocompatibility antigen, C alpha chain Human genes 0.000 description 1
- 102100028970 HLA class I histocompatibility antigen, alpha chain E Human genes 0.000 description 1
- 108010058607 HLA-B Antigens Proteins 0.000 description 1
- 108010091938 HLA-B7 Antigen Proteins 0.000 description 1
- 108010052199 HLA-C Antigens Proteins 0.000 description 1
- 101000986086 Homo sapiens HLA class I histocompatibility antigen, A alpha chain Proteins 0.000 description 1
- 101000986085 Homo sapiens HLA class I histocompatibility antigen, alpha chain E Proteins 0.000 description 1
- 101001057504 Homo sapiens Interferon-stimulated gene 20 kDa protein Proteins 0.000 description 1
- 101001055144 Homo sapiens Interleukin-2 receptor subunit alpha Proteins 0.000 description 1
- 101000927799 Homo sapiens Rho guanine nucleotide exchange factor 6 Proteins 0.000 description 1
- 101000914484 Homo sapiens T-lymphocyte activation antigen CD80 Proteins 0.000 description 1
- 241000701044 Human gammaherpesvirus 4 Species 0.000 description 1
- 241000725303 Human immunodeficiency virus Species 0.000 description 1
- 102000014150 Interferons Human genes 0.000 description 1
- 108010050904 Interferons Proteins 0.000 description 1
- 102100026878 Interleukin-2 receptor subunit alpha Human genes 0.000 description 1
- 206010024229 Leprosy Diseases 0.000 description 1
- 206010058467 Lung neoplasm malignant Diseases 0.000 description 1
- 206010025323 Lymphomas Diseases 0.000 description 1
- 201000005505 Measles Diseases 0.000 description 1
- 241000712079 Measles morbillivirus Species 0.000 description 1
- 108010023335 Member 2 Subfamily B ATP Binding Cassette Transporter Proteins 0.000 description 1
- 101150076359 Mhc gene Proteins 0.000 description 1
- 239000012570 Opti-MEM I medium Substances 0.000 description 1
- 241001631646 Papillomaviridae Species 0.000 description 1
- 102000003992 Peroxidases Human genes 0.000 description 1
- 208000037581 Persistent Infection Diseases 0.000 description 1
- 241000223960 Plasmodium falciparum Species 0.000 description 1
- 206010060862 Prostate cancer Diseases 0.000 description 1
- 108091034057 RNA (poly(A)) Proteins 0.000 description 1
- 238000002123 RNA extraction Methods 0.000 description 1
- 241000725643 Respiratory syncytial virus Species 0.000 description 1
- 102100033202 Rho guanine nucleotide exchange factor 6 Human genes 0.000 description 1
- 230000005867 T cell response Effects 0.000 description 1
- 102100027222 T-lymphocyte activation antigen CD80 Human genes 0.000 description 1
- 101710137500 T7 RNA polymerase Proteins 0.000 description 1
- 101800000849 Tachykinin-associated peptide 2 Proteins 0.000 description 1
- 108091036066 Three prime untranslated region Proteins 0.000 description 1
- 229940123384 Toll-like receptor (TLR) agonist Drugs 0.000 description 1
- 239000007983 Tris buffer Substances 0.000 description 1
- 102000004142 Trypsin Human genes 0.000 description 1
- 108090000631 Trypsin Proteins 0.000 description 1
- 108060008682 Tumor Necrosis Factor Proteins 0.000 description 1
- 102100040247 Tumor necrosis factor Human genes 0.000 description 1
- 102100040245 Tumor necrosis factor receptor superfamily member 5 Human genes 0.000 description 1
- 206010067584 Type 1 diabetes mellitus Diseases 0.000 description 1
- 206010047642 Vitiligo Diseases 0.000 description 1
- 108010084455 Zeocin Proteins 0.000 description 1
- 238000002835 absorbance Methods 0.000 description 1
- 230000003213 activating effect Effects 0.000 description 1
- 230000001154 acute effect Effects 0.000 description 1
- 239000008272 agar Substances 0.000 description 1
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 1
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 1
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 1
- 239000003242 anti bacterial agent Substances 0.000 description 1
- 230000001640 apoptogenic effect Effects 0.000 description 1
- 230000005784 autoimmunity Effects 0.000 description 1
- 210000003719 b-lymphocyte Anatomy 0.000 description 1
- 239000003012 bilayer membrane Substances 0.000 description 1
- 230000004071 biological effect Effects 0.000 description 1
- 229960002685 biotin Drugs 0.000 description 1
- 235000020958 biotin Nutrition 0.000 description 1
- 239000011616 biotin Substances 0.000 description 1
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 1
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 1
- 201000008275 breast carcinoma Diseases 0.000 description 1
- 239000012876 carrier material Substances 0.000 description 1
- 230000005859 cell recognition Effects 0.000 description 1
- 230000019522 cellular metabolic process Effects 0.000 description 1
- 230000033077 cellular process Effects 0.000 description 1
- 238000012512 characterization method Methods 0.000 description 1
- 229910052804 chromium Inorganic materials 0.000 description 1
- 230000002759 chromosomal effect Effects 0.000 description 1
- 238000003501 co-culture Methods 0.000 description 1
- 239000000470 constituent Substances 0.000 description 1
- 238000011109 contamination Methods 0.000 description 1
- 230000001461 cytolytic effect Effects 0.000 description 1
- 210000000805 cytoplasm Anatomy 0.000 description 1
- 238000002784 cytotoxicity assay Methods 0.000 description 1
- 231100000263 cytotoxicity test Toxicity 0.000 description 1
- 230000006378 damage Effects 0.000 description 1
- 230000002950 deficient Effects 0.000 description 1
- 230000008716 dendritic activation Effects 0.000 description 1
- 230000004041 dendritic cell maturation Effects 0.000 description 1
- 238000000432 density-gradient centrifugation Methods 0.000 description 1
- 230000007646 directional migration Effects 0.000 description 1
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 1
- 210000003162 effector t lymphocyte Anatomy 0.000 description 1
- 230000005611 electricity Effects 0.000 description 1
- 230000008030 elimination Effects 0.000 description 1
- 238000003379 elimination reaction Methods 0.000 description 1
- 230000012202 endocytosis Effects 0.000 description 1
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 1
- 238000006911 enzymatic reaction Methods 0.000 description 1
- 230000008029 eradication Effects 0.000 description 1
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 description 1
- 239000000945 filler Substances 0.000 description 1
- 239000007850 fluorescent dye Substances 0.000 description 1
- 238000009472 formulation Methods 0.000 description 1
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 1
- 239000012595 freezing medium Substances 0.000 description 1
- 239000012737 fresh medium Substances 0.000 description 1
- 238000011990 functional testing Methods 0.000 description 1
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 1
- 210000002443 helper t lymphocyte Anatomy 0.000 description 1
- 210000000777 hematopoietic system Anatomy 0.000 description 1
- 208000006454 hepatitis Diseases 0.000 description 1
- 231100000283 hepatitis Toxicity 0.000 description 1
- 210000002865 immune cell Anatomy 0.000 description 1
- 210000000987 immune system Anatomy 0.000 description 1
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 1
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 description 1
- 229940079322 interferon Drugs 0.000 description 1
- 238000011246 intracellular protein detection Methods 0.000 description 1
- 238000010212 intracellular staining Methods 0.000 description 1
- 238000007918 intramuscular administration Methods 0.000 description 1
- 238000007912 intraperitoneal administration Methods 0.000 description 1
- 238000007913 intrathecal administration Methods 0.000 description 1
- 230000002601 intratumoral effect Effects 0.000 description 1
- 238000001990 intravenous administration Methods 0.000 description 1
- 238000010253 intravenous injection Methods 0.000 description 1
- 238000007914 intraventricular administration Methods 0.000 description 1
- 238000011835 investigation Methods 0.000 description 1
- 230000031700 light absorption Effects 0.000 description 1
- 238000001638 lipofection Methods 0.000 description 1
- 238000011068 loading method Methods 0.000 description 1
- 201000005296 lung carcinoma Diseases 0.000 description 1
- 201000003866 lung sarcoma Diseases 0.000 description 1
- 210000001365 lymphatic vessel Anatomy 0.000 description 1
- 239000006166 lysate Substances 0.000 description 1
- 210000002540 macrophage Anatomy 0.000 description 1
- 230000034701 macropinocytosis Effects 0.000 description 1
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 1
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 description 1
- 230000008018 melting Effects 0.000 description 1
- 238000002844 melting Methods 0.000 description 1
- 230000005012 migration Effects 0.000 description 1
- 238000013508 migration Methods 0.000 description 1
- 239000007758 minimum essential medium Substances 0.000 description 1
- 230000009456 molecular mechanism Effects 0.000 description 1
- 210000005087 mononuclear cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000001400 myeloablative effect Effects 0.000 description 1
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 description 1
- 231100000252 nontoxic Toxicity 0.000 description 1
- 230000003000 nontoxic effect Effects 0.000 description 1
- 238000010899 nucleation Methods 0.000 description 1
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 1
- 102000044158 nucleic acid binding protein Human genes 0.000 description 1
- 108700020942 nucleic acid binding protein Proteins 0.000 description 1
- 238000013021 overheating Methods 0.000 description 1
- 244000045947 parasite Species 0.000 description 1
- 230000007170 pathology Effects 0.000 description 1
- 230000002093 peripheral effect Effects 0.000 description 1
- 230000035699 permeability Effects 0.000 description 1
- 230000008823 permeabilization Effects 0.000 description 1
- 108040007629 peroxidase activity proteins Proteins 0.000 description 1
- CWCMIVBLVUHDHK-ZSNHEYEWSA-N phleomycin D1 Chemical compound N([C@H](C(=O)N[C@H](C)[C@@H](O)[C@H](C)C(=O)N[C@@H]([C@H](O)C)C(=O)NCCC=1SC[C@@H](N=1)C=1SC=C(N=1)C(=O)NCCCCNC(N)=N)[C@@H](O[C@H]1[C@H]([C@@H](O)[C@H](O)[C@H](CO)O1)O[C@@H]1[C@H]([C@@H](OC(N)=O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1)O)C=1N=CNC=1)C(=O)C1=NC([C@H](CC(N)=O)NC[C@H](N)C(N)=O)=NC(N)=C1C CWCMIVBLVUHDHK-ZSNHEYEWSA-N 0.000 description 1
- 235000011007 phosphoric acid Nutrition 0.000 description 1
- 230000003389 potentiating effect Effects 0.000 description 1
- 239000002243 precursor Substances 0.000 description 1
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 1
- 239000000047 product Substances 0.000 description 1
- 230000002035 prolonged effect Effects 0.000 description 1
- 201000001514 prostate carcinoma Diseases 0.000 description 1
- 210000003370 receptor cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000011084 recovery Methods 0.000 description 1
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 1
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 1
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 1
- 230000001177 retroviral effect Effects 0.000 description 1
- 230000002441 reversible effect Effects 0.000 description 1
- 238000009738 saturating Methods 0.000 description 1
- 238000013207 serial dilution Methods 0.000 description 1
- 239000002904 solvent Substances 0.000 description 1
- 239000003381 stabilizer Substances 0.000 description 1
- 230000000087 stabilizing effect Effects 0.000 description 1
- 239000012086 standard solution Substances 0.000 description 1
- 238000011476 stem cell transplantation Methods 0.000 description 1
- 238000007920 subcutaneous administration Methods 0.000 description 1
- 230000000153 supplemental effect Effects 0.000 description 1
- 230000004083 survival effect Effects 0.000 description 1
- 230000002195 synergetic effect Effects 0.000 description 1
- 230000008685 targeting Effects 0.000 description 1
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 1
- AYEKOFBPNLCAJY-UHFFFAOYSA-O thiamine pyrophosphate Chemical compound CC1=C(CCOP(O)(=O)OP(O)(O)=O)SC=[N+]1CC1=CN=C(C)N=C1N AYEKOFBPNLCAJY-UHFFFAOYSA-O 0.000 description 1
- 239000003970 toll like receptor agonist Substances 0.000 description 1
- 238000003151 transfection method Methods 0.000 description 1
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 1
- 230000001052 transient effect Effects 0.000 description 1
- 230000010474 transient expression Effects 0.000 description 1
- 238000013519 translation Methods 0.000 description 1
- LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N tris Chemical compound OCC(N)(CO)CO LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000012588 trypsin Substances 0.000 description 1
- 201000008827 tuberculosis Diseases 0.000 description 1
- 230000004614 tumor growth Effects 0.000 description 1
- 241001529453 unidentified herpesvirus Species 0.000 description 1
- 241000712461 unidentified influenza virus Species 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K40/00—Cellular immunotherapy
- A61K40/10—Cellular immunotherapy characterised by the cell type used
- A61K40/11—T-cells, e.g. tumour infiltrating lymphocytes [TIL] or regulatory T [Treg] cells; Lymphokine-activated killer [LAK] cells
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K40/00—Cellular immunotherapy
- A61K40/10—Cellular immunotherapy characterised by the cell type used
- A61K40/19—Dendritic cells
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K40/00—Cellular immunotherapy
- A61K40/20—Cellular immunotherapy characterised by the effect or the function of the cells
- A61K40/24—Antigen-presenting cells [APC]
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K40/00—Cellular immunotherapy
- A61K40/40—Cellular immunotherapy characterised by antigens that are targeted or presented by cells of the immune system
- A61K40/41—Vertebrate antigens
- A61K40/42—Cancer antigens
- A61K40/4244—Enzymes
- A61K40/4245—Tyrosinase or tyrosinase related proteinases [TRP-1 or TRP-2]
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P35/00—Antineoplastic agents
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
- A61P37/02—Immunomodulators
- A61P37/04—Immunostimulants
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
- C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
- C12N5/0602—Vertebrate cells
- C12N5/0634—Cells from the blood or the immune system
- C12N5/0636—T lymphocytes
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
- C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
- C12N5/0602—Vertebrate cells
- C12N5/0634—Cells from the blood or the immune system
- C12N5/0639—Dendritic cells, e.g. Langherhans cells in the epidermis
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
- Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
- Y02A50/00—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE in human health protection, e.g. against extreme weather
- Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Immunology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Public Health (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Zoology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Hematology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Toxicology (AREA)
- Oncology (AREA)
- Communicable Diseases (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
- Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Immobilizing And Processing Of Enzymes And Microorganisms (AREA)
Abstract
Célula T CD4+ humana específica de antígeno alorrestringida, que puede obtenerse por un método que comprende las etapas de: a) proporcionar un ácido nucleico que codifica una molécula de MHC de clase II derivada del paciente y un antígeno o un ácido nucleico que codifica dicho antígeno, en donde el antígeno es un antígeno asociado a tumor seleccionado de neoplasias hematológicas; b) cotransfectar o introducir ambos compuestos como se han definido en a) en células presentadoras de antígenos (CPA) derivadas de un donante sano, en donde dichas CPA son células dendríticas maduras; c) sensibilizar linfocitos de sangre periférica (LSP) que son autólogos en vista de las CPA y que derivan del donante sano con dichas CPA; d) seleccionar células T CD4+ humanas que son específicas para el ligando MHC-antígeno para uso en un método para el tratamiento de neoplasias hematológicas.
Description
DESCRIPCIÓN
Generación de células T específicas de antígeno
La presente invención se dirige a una célula T CD4+ humana específica de antígeno alorrestringida para uso en un método para el tratamiento de neoplasias hematológicas como se define en las reivindicaciones. La presente invención se dirige además a una CMSP para uso en un método para el tratamiento de neoplasias hematológicas como se define en las reivindicaciones y una composición farmacéutica que comprende dichas células T CD4+ o la CMSP para uso en un método para el tratamiento de neoplasias hematológicas como se define en las reivindicaciones.
También se divulga un método de generar células T específicas de antígeno. Además, la divulgación se dirige a células T específicas de antígeno, receptores de células T (TCR) transgénicos aislados, composiciones farmacéuticas que contienen los mismos y su uso en terapia celular adoptiva. Se divulga además el uso de células que coexpresan moléculas de MHC alogénicas y antígenos para inducir células T específicas de péptidos a partir de repertorios de células T alogénicas no seleccionadas.
La transferencia adoptiva de linfocitos en el marco de trasplante de células madre (TCM) alogénicas ha demostrado el poder del sistema inmunitario para erradicar neoplasias malignas hematológicas (Kolb et al. 1995). Parece que el TCM también puede funcionar para eliminar tumores sólidos, tal como carcinomas de células renales (CCR) en algunos casos (revisado en Kolb et al. 2004 y Dudley y Rosenberg, 2003). En receptores de TCM, la eliminación de células malignas puede solo suceder después de varios meses hasta un año, debido al hecho de que las células T específicas se deben activar in vivo y después se deben expandir hasta números adecuados después del desarrollo del nuevo sistema hematopoyético en el receptor del trasplante. Alternativamente, después de un periodo de tiempo (aproximadamente 60 días) durante el que se establece la tolerancia en el receptor del TCM, se puede hacer una transferencia de linfocitos no separados, no sensibilizados para acelerar la generación de respuestas inmunitarias dirigidas contra células tumorales. Aquí de nuevo, los linfocitos específicos capaces de atacar células tumorales se deben activar y expandir a partir de los linfocitos precursores de baja frecuencia que están presentes entre la población no seleccionada de linfocitos que se transfieren. Las infusiones de linfocitos donantes (ILD) de poblaciones de linfocitos no seleccionadas después de TCM funcionan bien para la eliminación de leucemia mielógena crónica (LMC), que crece lentamente, pero son menos eficaces en la erradicación de leucemia aguda, en parte debido al hecho de que el crecimiento de las células malignas supera la capacidad de expansión de las células inmunitarias. Esta misma expansión diferencial también impacta en la mala eliminación inmunitaria de tumores sólidos de evolución rápida. Una segunda desventaja en el uso de poblaciones de linfocitos sin seleccionar en ILD es que también se pueden transferir células T que tienen la capacidad de atacar células y tejidos normales del receptor, produciendo enfermedad del injerto contra el huésped (EICH), una enfermedad con alta morbilidad y mortalidad.
Estudios recientes han demostrado que la transferencia adoptiva de células T seleccionadas con especificidades de péptidos definidas puede producir reducciones principales en la carga tumoral en un marco autólogo, particularmente si los pacientes se han pretratado con pautas no mieloablativas (Dudley et al. 2002, 2003). Esto elimina la necesidad de realizar TCM en el paciente tumoral, y por tanto también evita el problema de EICH. Se vieron respuestas inmunitarias eficaces en pacientes de melanoma pretratados que recibieron mezclas autólogas de linfocitos infiltrantes de tumores (TIL). Estas mezclas de células, que contienen células T tanto CD4 como CD8 positivas, parecen ser clínicamente más eficaces que la transferencia adoptiva de grandes números de un único clon de células T CD8 específico para un ligando MHC-antígeno asociado a tumor (AAT) particular. Un factor que contribuye a esta diferencia es el requisito para tener células T CD4 para mantener células T CD8 de larga vida. Además, las respuestas inmunitarias dirigidas contra ligandos únicos pueden llevar a la selección de variantes de células tumorales que han perdido la expresión del ligando correspondiente y por tanto pueden escapar la detección inmunitaria. Por una parte, la transferencia de mezclas complejas de células T, como están presentes entre linfocitos infiltrantes de tumores, puede superar estos problemas proporcionando células CD4 y CD8 con múltiples especificidades, pero también pueden producir autoinmunidad si las mezclas del TIL contienen células T que reconocen ligandos expresados por tejidos normales. Esto se demuestra, por ejemplo, por el ataque de melanocitos normales que produce vitiligo en pacientes de melanoma después de terapia celular adoptiva (TCA) usando células que reconocen antígenos de diferenciación de melanoma que también se expresan en melanocitos (Dudley et al. 2002).
Para extender la capacidad de usar TCA para tratar pacientes con tumores que crecen más rápidamente, es un fin transferir células T efectoras específicas de péptidos, enriquecidas (tanto células cooperadoras T CD4 como linfocitos T citotóxicos) que se han seleccionado por sus especificidades de ligandos para atacar eficazmente células tumorales mientras que se evita el ataque serio de tejidos normales. Estas células se tienen que expandir rápidamente a grandes números ex vivo y después usar para t Ca . Alternativamente, los receptores de células T (TCR) de tales células T específicas de ligando se pueden clonar y expresar como transgenes de TCR en linfocitos activados, usando o bien linfocitos de sangre periférica del receptor o clones de células T activadas con especificidades definidas que crecen bien y no tienen la capacidad de atacar tejidos normales del huésped.
Como ejemplos, un clon de células T aloespecífico expandido que es específico para una molécula de MHC no expresada por el receptor o un clon de células T expandido específico para un virus, tal como citomegalovirus o virus de Epstein-Barr, se podrían usar como células receptoras para el TCR transgénico. La disponibilidad de un panel de
vectores de TCR transgénicos, que reconocen diferentes ligandos MHC-péptido se podría usar para desarrollar grandes números de células T preactivadas tanto de los subtipos CD4 como CD8, permitiendo de esta manera que grandes números de linfocitos efectores se preparen y transfieran rápidamente a pacientes cuyos tumores expresan los correspondientes ligandos de TCR. Esto ahorraría tiempo en alcanzar los números de células T específicas requeridas para controlar el crecimiento tumoral, posiblemente produciendo una erradicación del tumor más eficaz de tumores que evolucionan rápidamente.
Puesto que los determinantes que reconocen las células T específicas en leucemias y linfomas, así como células de tumores sólidos, con frecuencia representan péptidos propios derivados de proteínas sobreexpresadas que son presentados por moléculas de MHC propias, la afinidad de sus receptores de células T (TCR) es baja, ya que las células T que tienen receptores de alta afinidad se han eliminado mediante el proceso de selección negativa que se aplica a los linfocitos durante su desarrollo en el timo. El reconocimiento de células tumorales más eficaz se produce si las células T se generan de poblaciones de linfocitos que no se han seleccionado negativamente frente a moléculas de MHC propias durante su desarrollo en el timo.
Por tanto, hay una importante necesidad para encontrar medios para generar rápidamente células T que lleven TCR con alta avidez funcional que tengan la capacidad de reconocer sus ligandos en células tumorales. Tales células T están presentes en el repertorio de un individuo alogénico que tiene malos emparejamientos de MHC con el potencial receptor de TCA.
Lai P.K., Int. J. Cancer, 1 de enero 1987 (01-01-1987), páginas 111-117 describe clones de células T cooperadoras autorrestringidas y alorestringidas hacia el virus de Epstein-Barr.
Jager D. et al., Journal of Clinical Pathology, 1 de septiembre 2001 (01-09-2001), páginas 669-674 se refiere a respuestas inmunitarias a antígenos tumorales e inmunoterapia específica de antígeno de cáncer.
El trabajo de Strauss y colaboradores (Gao et al., 1999, 2000) ha mostrado que células efectoras citotóxicas que se seleccionan para reconocer péptidos derivados del factor de transcripción WT-1, y presentados por moléculas de MHC de clase I alogénicas tienen TCR de alta afinidad y pueden eliminar eficazmente leucemia positiva para WT-1 sin dañar células madre normales. En el marco de un TCM con malos emparejamientos parciales, se puede establecer tolerancia por tales células T, permitiendo su transferencia adoptiva específica. Strauss resolvió el problema de obtener tales células T CD8 alorrestringidas usando la línea celular T2 pulsada con péptidos WT-1, como una fuente de células estimulantes. Las células T2 tienen deleciones génicas que alteran su capacidad para cargar péptidos endógenos en sus moléculas de MHC de clase I y debido a deleciones en el cromosoma 6, estas células tienen capacidad limitada de expresar moléculas HLA-A2. Cuando se proporcionan péptidos exógenamente a células T2 se pueden unir a las moléculas HLA-A2 vacías y formar complejos estables en la superficie celular. Estas células pulsadas con péptidos se pueden usar después para estimular linfocitos de sangre periférica de un individuo negativo para HLA-A2. En tales condiciones de sensibilización surge un número de poblaciones de linfocitos activados diferentes in vitro. Las células T que reconocen moléculas HLA-A2 se activan, una fracción de las cuales son específicas para el ligando WT-1/HLA-A2. Estas células T buscadas se deben separar de las células T que reconocen moléculas de HLA-A2 independiente de péptido. Desafortunadamente, el fallo de las células T2 para expresar un complemento normal de molécula de MHC de clase I, así como su capacidad inherente para activar células no restringidas por MHC, produce una activación paralela de células T NK y de tipo NK (Falk et al. 2002). Estas poblaciones con frecuencia dominan los cultivos y se requiere un trabajo tedioso para eliminar estas células y enriquecer las poblaciones de células T para las células alorreactivas deseadas. Esto ralentiza el proceso de generación de células T específicas y por tanto produce restricciones clínicas significativas. Además, los péptidos de los antígenos se deben conocer por adelantado ya que se deben pulsar en células T2 desde el exterior ya que las células T2 carecen del transportador asociado con los genes de procesamiento de antígeno (TAP) que permite a las células presentadoras de antígeno generar péptidos de proteínas expresadas dentro de la célula y presentarlos en su superficie en moléculas de MHC de clase I y clase II. Además, T2 solo expresa moléculas de HLA-A2 de clase I endógenas.
La solicitud de patente en EE UU 20020090362 divulga un método de tratar un paciente, el método comprende administrar al paciente una cantidad terapéuticamente eficaz de linfocitos T citotóxicos (LTC) que reconocen al menos parte de una molécula antigénica cuando está presentada por una molécula de HLA de clase I (o equivalente) en la superficie de una célula, en donde los linfocitos T citotóxicos no derivan del paciente. Esta solicitud describe el uso de células estimulantes que son alogénicas o incluso xenogénicas en vista del donante de los LTC. La solicitud de patente en EE UU 20020090362 divulga además células estimulantes que son preferiblemente incapaces de cargar una molécula seleccionada (péptido) y en particular el uso de células estimulantes deficientes en TAP.
El documento US 6.805.861 describe un método de hacer una población clonal de linfocitos T citotóxicos (LTC) reactivos contra una molécula seleccionada el método comprende la etapa de (a) cocultivar una muestra que contiene LTC derivados de un individuo sano (es decir, que no derivan del paciente) con una célula estimuladora que expresa moléculas de HLA de clase I (o equivalente) en su superficie y que presenta al menos parte de una molécula (antigénica) seleccionada en la superficie de dicha células estimuladora y (b) seleccionar un clon de LTC reactivo contra dicha molécula seleccionada cuando al menos una parte de dicha molécula está presentada por una molécula de HLA de clase I (o equivalente) en la superficie de una célula. Las consideraciones mencionadas para la solicitud
de patente en EE UU 20020090362 también aplican aquí.
Por tanto, es un problema que subyace a la presente invención generar células T que tienen TCR con alta avidez funcional que tienen la capacidad para reconocer sus ligandos MHC-péptido en agentes patógenos, como, por ejemplo, células tumorales. Es un problema adicional que subyace a la presente invención proporcionar un método para la generación rápida y eficaz de células T específicas de antígeno que se pueden usar en transferencia celular adoptiva. Además, es un problema que subyace a la presente invención proporcionar una composición farmacéutica basada en células T que se puede usar para tratar un paciente que padece una enfermedad sin riesgo de enfermedad del injerto contra el huésped (EICH).
Los inventores han desarrollado una estrategia alternativa para obtener células T específicas de péptido, alorrestringidas. Se usaron tecnologías bien conocidas para expresar proteínas en células dendríticas (CD), u otras células que pueden funcionar como células presentadoras de antígeno (CPA), mediante transferencia de ARN transcrito in vitro (Nair et al. 1998). Sin embargo, en lugar de expresar solo ARN que codifica fuentes de antígenos, como es común en el estado de la técnica, los inventores cotransfectaron ARN que codifica una molécula diana específica, tal como tirosinasa como un AAT modelo, y un ARN que codifica una molécula de MHC alogénica, por ejemplo, HLA-A2, en CD, u otras células derivadas de un donante negativo para HLA-A2.
Estas CD transfectadas se pueden usar después para sensibilizar LSP, por ejemplo, LSP autólogos. Los ligandos HLA-A2-antígeno representan alodeterminantes para los LSP del donante de CD negativas para HLA-A2 y por tanto se pueden obtener células T que tienen TCR de alta afinidad. Puesto que las CD expresan un complemento completo de moléculas de MHC propias, la aparición de poblaciones de linfocitos no restringidas a MHC se suprime mediante regulación de MHC negativa. Se puede usar un número de diferentes estrategias para enriquecer las células T específicas de péptido/alorrestringidas a HLA-A2 de las células T que reconocen HLA-A2 independientemente del péptido específico derivado del antígeno, incluyendo captura de citoquina, selección con tetrámeros o por clonación de células T individuales que posteriormente se expanden.
El presente enfoque ofrece un número de ventajas sobre el sistema T2 o células de Drosophila para obtener células T específicas de péptido alorrestringidas (como se describe por Strauss y colaboradores).
En primer lugar, se pueden desarrollar células T con alorrestricción para una variedad de moléculas de MHC ya que se puede utilizar ARN transcrito in vitro para cualquier alelo de MHC de clase I o clase II clonado. Por tanto, tal CPA se puede usar para generar células T tanto CD4 como CD8 específicas de péptido alorrestringidas a través de la presentación de los antígenos deseados mediante alelos de MHC de clase II alogénicos o alelos de MHC de clase I alogénicos transferidos, respectivamente. Se indica que el enfoque descrito en la solicitud de patente en EE UU 20020090362 solo es adecuado para generar células T CD8.
Segundo, no se está restringido a sensibilizar solo contra péptidos conocidos de AAT seleccionados ya que el antígeno entero está disponible para procesamiento y presentación en la CD. El antígeno se puede proporcionar en la forma de proteína o en la forma de ácido nucleico que se usará posteriormente como el molde para expresar la proteína correspondiente en la CPA. También aquí, las diferencias con los enfoques del estado de la técnica son llamativas: en la solicitud de patente en EE UU 20020090362 los péptidos se cargan en células estimuladoras (que no son CPA profesionales), ya que las células estimuladoras son incapaces de procesar y presentar antígenos. Por tanto, solo se pueden usar péptidos conocidos en este enfoque y no antígenos de estructura desconocida como es el caso en la presente invención.
Tercero, las secuencias de TCR de estas células T seleccionadas con alta avidez funcional se pueden usar para la expresión en CMSP autólogas para generar células T transgénicas de TCR con alta avidez funcional para tumores que tienen los respectivos ligandos de TCR. Se puede realizar TCA usando tales células T transgénicas para TCR como una alternativa a la transferencia adoptiva de linfocitos específicos que se deben aislar y expandir durante periodos de tiempo considerables in vitro. Esto permitiría el tratamiento de pacientes no sometidos a TCM, así como la aplicación en pacientes con otras neoplasias malignas no hematológicas que expresan los correspondientes ligandos MHC-péptido vistos por los TCR transgénicos.
En particular, la presente divulgación proporciona un método para la generación de células T específicas de antígeno en donde se usan CPA que derivan de un donante sano y que son autólogas respecto a los LSP que también derivan del mismo donante sano. La molécula de MHC transfectada en dichas CPA, sin embargo, deriva del paciente. En este contexto, derivada del paciente significa que las secuencias que codifican la misma se obtienen directamente del paciente o alternativamente derivan de otra fuente, por ejemplo, clones de ADNc o genómicos, que son idénticos a los alelos MHC del paciente que se va a tratar. Además, por primera vez, la presente invención usa el enfoque de cotransfectar la molécula de MHC y el antígeno en esas CPA en general para alcanzar las células T específicas de antígeno deseadas.
Las CPA transfectadas como se divulga en el presente documento se pueden usar para sensibilizar LSP que son autólogos en vista de las CPA. Los ligandos MHC-antígeno transfectados representan alo-determinantes para los LSP del donante de CPA, que no tiene el gen MHC correspondiente a dicha molécula de MHC que se transfiere en la CPA.
Por tanto, se pueden obtener células T que tienen TCR de alta afinidad. Puesto que las CPA expresan un complemento completo de moléculas de MHC propias, la aparición de poblaciones de linfocitos no restringidas a MHC se suprime mediante regulación de MHC negativa. El uso de CPA, y el uso de CD en particular, en esta invención es de importancia particular porque estas células pueden procesar y presentar péptidos de forma eficaz en sus moléculas de MHC de clase I y clase II. Además, las CPA se caracterizan por la expresión de moléculas coestimuladoras adicionales que las permiten señalizar a receptores adicionales en los linfocitos T que llevan a la óptima activación, expansión y supervivencia de células T. Además, las CPA y CD en particular tienen la capacidad de secretar una variedad de citoquinas y quimioquinas que afectan la función de los linfocitos sensibilizados. Dependiendo de los factores hechos por las CPA, los linfocitos que responden se pueden modificar con respecto a su subtipo, capacidad de migración dirigida y capacidades funcionales. Como ejemplo, se pueden usar CD maduras para activar células T que tienen la especificidad de antígeno deseada debido a las interacciones de su TCR con los ligandos MHC-péptido mostrados por las CD, pero también tienen funciones deseadas basadas en las citoquinas/quimioquinas secretadas por las CD particulares usadas como CPA. Se pueden generar CD que secretan diferentes citoquinas/quimioquinas in vitro y usar para estimular los tipos deseados de células T. Por tanto, las CD maduras que se generan en cultivo con mezclas de maduración que las llevan a secretar altas cantidades de la citoquina IL-12 tienen una buena capacidad para activar células T CD4 del tipo T cooperadora 1 que son particularmente importantes en inmunidad antitumoral (Napolitani et al. 2005). En contraste, las Cd inmaduras, que secretan IL-10, parecen ser particularmente potentes en activar células T reguladoras que pueden suprimir las actividades de otros linfocitos (Levings y Roncarola, 2005). Tales células T reguladoras pueden ser, por tanto, de beneficio clínico en controlar las células T autoagresivas en pacientes que padecen enfermedades autoinmunitarias tal como diabetes mellitus de tipo I o en controlar respuestas inmunitarias a patógenos que se vuelven demasiado predominantes y producen patología inmunitaria como, por ejemplo, en algunas formas de lepra.
Puesto que las CD tienen la capacidad de procesar y presentar antígenos que se expresan en varios compartimentos en la célula no es necesario saber los péptidos antigénicos exactos para generar células T con la especificidad antigénica deseada. Por ejemplo, cuando se proporcionan CD con antígenos proteicos enteros, o ARN que codifica tales proteínas, pueden procesar varios péptidos diferentes de la misma proteína y presentarlos en sus moléculas de MHC de clase I y clase II; estos varios ligandos MHC-péptido pueden a su vez sensibilizar diferentes poblaciones de células T CD4 y CD8. No hay razón por la que las CD no se puedan modificar para expresar una molécula de MHC de clase I alogénica y una molécula de MHC de clase II alogénica al mismo tiempo como se modifican para expresar antígeno, permitiendo de esta manera sensibilizar células T alorrestringidas tanto CD4 como CD8 en los mismos cultivos. Las interacciones de células T CD4 activadas con las CD pueden a su vez proporcionarlas con señales que las permitan activar óptimamente células T CD8 (Toes et al. 1998). Las CD se pueden además modificar para expresar varios antígenos diferentes simultáneamente; de hecho, las CD se pueden transfectar para expresar el contenido de ARN entero de una célula tumoral, que abarca muchos cientos de especies de ARN. Las CD son capaces de procesar y presentar múltiples ligandos de m Hc de clase I y clase II simultáneamente en su superficie, produciendo la activación de muchos tipos diferentes de células T (Gilboa y Viewig, 2004; Geiger et al. 2005; Schaft et al. 2005). No hay razón por la que esta misma propiedad no se pueda capturar para crear ligandos MHC-péptido alorrestringidos coexpresando moléculas de MHC de clase I y/o clase II alogénicas simultáneamente con las mezclas de ARN o proteínas para antígenos.
La presente invención está apoyada por los siguientes resultados experimentales:
1) Primero, los inventores mostraron que cuando ARN que codifica una molécula de MHC alogénica, tal como HLA-A2, se transfiere en células de un donante negativo para HLA-A2, se puede demostrar que las moléculas de HLA-A2 se expresan en la superficie celular, detectadas usando citometría de flujo después de tinción con anticuerpos monoclonales específicos para HLA-A2. Además, estas células pueden activar que un clon de células T aloespecífico de HLA-A2 (células JB4) secrete citoquina (EFN-gamma), lo que demuestra su capacidad funcional. La transferencia y expresión se puede alcanzar en CD, así como en otras células, tal como células K562.
2) Asimismo, cuando se transfiere ARN que codifica un antígeno asociado a tumor (AAT) tal como tirosinasa como un ejemplo de un AAT para melanoma, se puede detectar expresión de la proteína dentro de las células, puesto que esta es una proteína no de membrana. Esta expresión de proteína se puede demostrar usando citometría de flujo y tinción intracelular usando anticuerpos específicos de tirosinasa y anticuerpos secundarios marcados con fluorescencia para la detección. La transferencia y expresión se puede alcanzar en CD, así como en otras células, tal como células K562.
3) Cuando se transfieren ambas especies de ARN (HLA-A2 más tirosinasa) en las mismas células, entonces se puede detectar simultáneamente expresión de ambos tipos de proteínas en las células receptoras. Esto se puede alcanzar en CD, así como en otras células, tal como células K562.
4) Las CPA que coexpresan una molécula de MHC, tal como HLA-A2, y un AAT, tal como tirosinasa, generan complejos MHC-péptido y los muestran en su superficie de una manera en la que pueden interaccionar con células T que tienen TCR para el ligando correspondiente. Esto se demuestra por el hecho de tal CPA que coexpresa puede activar un clon de células T con la especificidad, medido por liberación de citoquinas. Esto se demostró usando o bien CD u otras células tal como K562 como CPA para un clon de células T CD8 específico de HLA-A2-péptido de tirosinasa
(células Tyr-F8).
En particular, la presente invención se dirige a los siguientes aspectos y formas de realización:
Según un primer aspecto, la presente invención se refiere a una célula T CD4+ humana específica de antígeno alorrestringida, que puede obtenerse por un método que comprende las etapas de:
a) proporcionar un ácido nucleico que codifica una molécula de MHC de clase II derivada del paciente y un antígeno o un ácido nucleico que codifica dicho antígeno, en donde el antígeno es un antígeno asociado a tumor seleccionado de neoplasias hematológicas;
b) cotransfectar o introducir ambos compuestos como se definen en a) en células presentadoras de antígenos (CPA) derivadas de un donante sano, en donde dichas CPA son células dendríticas maduras;
c) sensibilizar linfocitos de sangre periférica (LSP) que son autólogos en vista de las CPA y que derivan del donante sano con dichas CPA;
d) seleccionar células T CD4+ humanas que son específicas para el ligando MHC-antígeno para uso en un método para el tratamiento de neoplasias hematológicas.
Se prevé que el método usado para obtener la célula T CD4+ humana específica de antígeno alorrestringida para uso en un método para el tratamiento de tumores hematológicos según la presente invención comprende la etapa de e) clonar el receptor de células T (TCR) de las células T CD4+ aisladas, y opcionalmente comprende f) expresar los transgenes t Cr en CMSP. Preferiblemente, la molécula de MHC se selecciona de HLA-DP, HLA-DQ, o h La -DR. En otro aspecto, la presente invención se dirige a una CMSP, que se ha transformado con un vector que comprende un ácido nucleico que codifica un TCR transgénico obtenible por las etapas de método de:
a) proporcionar un ácido nucleico que codifica una molécula de MHC de clase II derivada del paciente y un antígeno o un ácido nucleico que codifica dicho antígeno, en donde el antígeno es un antígeno asociado a tumor seleccionado de neoplasias hematológicas;
b) cotransfectar o introducir ambos compuestos como se definen en a) en células presentadoras de antígenos (CPA) derivadas de un donante sano, en donde dichas CPA son células dendríticas maduras;
c) sensibilizar linfocitos de sangre periférica (LSP) que son autólogos en vista de las CPA y que derivan del donante sano con dichas CPA;
d) seleccionar células T CD4+ humanas que son específicas para el ligando MHC-antígeno para uso en un método para el tratamiento de neoplasias hematológicas, y
e) clonar el receptor de células T (TCR) de las células T CD4+ aisladas, y opcionalmente
f) expresar los transgenes TCR en CMSP
para uso en un método para el tratamiento de tumores hematológicos.
Según otro aspecto, la presente invención se refiere a una composición farmacéutica que comprende las células T CD4+ de la presente invención o las CMSP de la presente invención y un soporte farmacéuticamente aceptable para uso en un método para el tratamiento de tumores hematológicos. Preferiblemente, la composición farmacéutica es una infusión, inyección o una vacuna.
También se divulga un método para generar células T específicas de antígeno que comprende las etapas de a) proporcionar un ácido nucleico que codifica una molécula de MHC derivada del paciente y un antígeno o un ácido nucleico que codifica dicho antígeno;
b) cotransfectar o introducir ambos compuestos como se definen en a) en células presentadoras de antígeno (CPA) de un donante sano, preferiblemente de células dendríticas;
c) sensibilizar linfocitos de sangre periférica (LSP) derivados del donante sano con dichas CPA;
d) seleccionar esas células T que son específicas para el ligando MHC-antígeno.
Las CPA preferiblemente se seleccionan de células dendríticas, células B activadas, monocitos, macrófagos, células T activadas, neoplasias malignas hematológicas con capacidades presentadoras de antígenos y/o líneas celulares linfoblastoides transformadas con EBV.
Las células dendríticas (CD) son en particular preferidas. Las células dendríticas (CD) maduras expresan moléculas de MHC tanto de clase I como de clase II a altos niveles, junto con una amplia variedad de moléculas coestimuladoras, que las proporcionan con la capacidad completa de sensibilizar células T indiferenciadas que no han encontrado antígeno previamente. También tienen todos los genes/proteínas necesarias para permitirlas procesar y presentar antígenos de proteínas intracelulares en sus moléculas de MHC de clase I y clase II. Por tanto, son células presentadoras de antígeno (CPA) óptimas para usar como células estimuladoras para la inducción de respuestas de células T tanto CD4 como CD8. La expresión de ARN que codifica un AAT en CD autólogas permitió que células T específicas de antígeno tumoral con alta afinidad se sensibilizaran in vitro usando linfocitos de sangre periférica del mismo donante sano (Liao et al. 2004). Puesto que las CD expresan un complemento normal de moléculas de MHC de clase I autocodificadas pueden regular negativamente la actividad de células T NK y de tipo NK, en contraste con células T2 o células de otras especies, tal como células de Drosophila.
Según una forma de realización, la molécula de MHC y el antígeno se usan como una mezcla de antígeno y ácido nucleico que codifica la molécula de MHC. Como alternativa, el ácido nucleico que codifica una molécula de MHC alogénica y el antígeno se proporcionan como un ARN bicistrónico.
Los antígenos contra los que se deben generar las células T específicas se pueden seleccionar de agentes patógenos derivados de virus, bacterias, protozoos, y parásitos, así como células tumorales o antígenos asociados a células tumorales, autoantígenos o partes funcionales de los mismos.
Los virus divulgados en el presente documento se seleccionan del grupo que consiste en virus de la gripe, virus del sarampión y respiratorio sincitial, virus del dengue, virus de inmunodeficiencia humano, virus de la hepatitis humanos, virus del herpes, o virus del papiloma. Los protozoos pueden ser Plasmodium falciparum, las bacterias micobacterias causantes de tuberculosis.
El antígeno asociado a tumor divulgado en el presente documento se selecciona de neoplasias malignas hematológicas o tumores sólidos, más preferiblemente carcinoma de colon, carcinoma de mama, carcinoma de próstata, carcinoma de células renales (CCR), carcinoma de pulmón, sarcomas o células de melanoma.
La etapa de selección d) preferiblemente se realiza por medio de medir la liberación de citoquina de las células T u otras medidas de activación de células T. Por ejemplo, las células T activadas se pueden clonar como células individuales y después de la expansión, los clones de células T se pueden analizar para su especificidad MHC-péptido y esas con la especificidad deseada se pueden seleccionar para uso adicional (Schendel et al. 1979, 1997). Alternativamente, se pueden marcar ligandos MHC-péptidos solubles en varias formas, tal como tetrámeros, con un marcador fluorescente e incubar con las células T activadas. Esas células T que tienen TCR que interacciona con los tetrámeros se pueden detectar después por citometría de flujo y separar en base a su fluorescencia (Yee et al. 1999). Además, las células T se pueden estimular durante periodos de tiempo cortos con células tumorales contra las que deben reaccionar y detectar su secreción de interferón gamma por reactivos de captura, por ejemplo, como se ha publicado (Becker et al. 2001).
El método de la presente divulgación comprende además la etapa de expandir las células T seleccionadas en d) ex vivo. Esto se puede hacer cocultivando las células T seleccionadas con CPA generadas de la misma manera que la usada para su sensibilización inicial, añadiendo nuevas CPA a los cultivos de células T cada 7-10 días y proporcionando a las células medio de cultivo nuevo de forma regular que contiene citoquinas suplementarias, dependiendo del tipo de célula T que se expande, esto puede incluir IL-2, IL-4, IL-7 y/o IL-15, entre otras, como se ha descrito en (Schendel et al., 1997; Regn et al. 2001; Su et al. 2001, 2002).
Además, el método de la presente divulgación comprende adicionalmente la etapa de clonar el receptor de células T (TCR) de las células T aisladas y/o expresar los transgenes de TCR en CMSP. Esto se puede hacer según métodos establecidos tal como los descritos en Engels et al., 2005.
Es una ventaja principal del presente enfoque que no está restringido a una clase de MHC específica. Por tanto, la molécula de Mh C se puede seleccionar de Mh C de clase I, preferiblemente HLA-A, HLA-B, HLA-C o HLA-E, o MHC de clase II, preferiblemente, HLA-DP; HLA-DQ, HLA-DR, siempre que correspondan al tipo de MHC del paciente.
La presente divulgación también proporciona una célula T específica de antígeno, que puede obtenerse por el método como se ha definido anteriormente.
Dicha célula T preferiblemente es una célula T con características de célula efectora, más preferiblemente una célula T productora de citoquina, una célula T citotóxica o una célula T reguladora, preferiblemente, células T CD4+ o CD8+.
La presente divulgación también se dirige a un ácido nucleico que codifica un TCR transgénico, que puede obtenerse por el método como se ha explicado anteriormente.
Un aspecto adicional de la presente divulgación se dirige a un vector, que comprende el ácido nucleico que codifica
un TCR transgénico. Este vector es preferiblemente un vector de expresión que contiene un ácido nucleico según la invención y una o más secuencias reguladoras de ácido nucleico. Preferiblemente, este vector es un plásmido o un vector retrovírico.
La presente divulgación comprende además una CMSP, que se ha transformado con el vector como se ha definido anteriormente.
En un aspecto adicional, la presente invención proporciona una composición farmacéutica, que comprende las células T o CMSP como se define en las reivindicaciones para uso en un método para el tratamiento de neoplasias hematológicas como se ha explicado anteriormente y un soporte farmacéuticamente aceptable.
Esos componentes activos de la presente invención se usan preferiblemente en tal composición farmacéutica, en dosis mezcladas con un soporte o material soporte aceptable, que la enfermedad se puede tratar o al menos aliviar. Tal composición puede (además del componente activo y el soporte) incluir material de relleno, sales, tampón, estabilizantes, solubilizantes y otros materiales, que se conocen en el estado de la técnica.
El término “farmacéuticamente aceptable” define un material no tóxico, que no interfiere con la eficacia de la actividad biológica del componente activo. La elección del soporte depende de la aplicación.
La composición farmacéutica puede contener componentes adicionales que aumentan la actividad del componente activo o que suplementan el tratamiento. Tales componentes y/o factores adicionales pueden ser parte de la composición farmacéutica para alcanzar efectos sinérgicos o para minimizar efectos secundarios o indeseados. Las técnicas para la formulación o preparación y aplicación/medicación de componentes activos de la presente invención están publicados en “Remington's Pharmaceutical Sciences”, Mack Publishing Co., Easton, PA, última edición. Una aplicación apropiada es una aplicación parenteral, por ejemplo, inyecciones intramusculares, subcutáneas, intramedulares, así como inyecciones intratecales, intraventriculares directas, intravenosas, intranodales, intraperitoneales o intratumorales. La inyección intravenosa es el tratamiento preferido de un paciente. Según una forma de realización preferida, la composición farmacéutica es una infusión o una inyección o una vacuna. La presente divulgación se dirige al uso de células T específicas de antígeno o CMSP como se ha explicado anteriormente para la fabricación de un medicamento para terapia celular adoptiva y en particular para tratar neoplasias malignas hematológicas o tumores sólidos e infecciones agudas o crónicas (véase también anteriormente). La presente invención se ilustra mediante los ejemplos y figuras a continuación.
Las figuras muestran lo siguiente:
La figura 1 muestra la maduración de células dendríticas y la activación de células T citotóxicas específicas en la respuesta inmunitaria convencional contra célula malignas.
La figura 2 ilustra la sensibilización de novo de células T específicas de tumor indiferenciadas con células dendríticas pulsadas con ARN.
Las figuras 3-9 ilustran la introducción de ARN transcrito in vitro.
La figura 10 muestra la influencia de la concentración de ARN de reestimulación de células TyrF8 por CD que expresan ARN.
La figura 11 ilustra el protocolo de sensibilización de novo de células T indiferenciadas con células dendríticas pulsadas con ARN.
La figura 12 muestra la expresión de ligandos MHC-péptido en células dendríticas transfectadas con ARN.
La figura 13 representa la tinción con tetrámero de células T sensibilizadas de donantes positivos para HLA-A2 y negativos para HLA-A2.
La figura 14 muestra la evaluación de cultivos de células T en masa separados con tetrámero para especificidad y avidez por el receptor de células T.
La figura 15 representa la evaluación de clones de células T para especificidad, avidez por el receptor de células T y función.
Ejemplos:
Descripción de los experimentos y figuras
Figura 1. Fases inmadura y madura de células dendríticas
Se considera que las células dendríticas (CD) son las más “profesionales” de las células presentadoras de antígeno (CPA) debido a su capacidad de activar células T que nunca han encontrado un antígeno (células T indiferenciadas). Esto depende de varios factores que ya se han descubierto para las CD y también puede depender de características que aún se tienen que identificar. Hay varias formas de CD y sus características únicas están continuamente en el proceso de investigación. El tipo de CD que se usa más comúnmente para estudios clínicos es una CD mieloide que se puede diferenciar de monocitos sanguíneos positivos para CD14. Mediante cultivo in vitro de tales monocitos en presencia de las citoquinas, factor estimulante de colonias de granulocitos-monocitos (GM-CSF) e interleuquina-4 (IL-4), se genera una CD mieloide inmadura que se caracteriza por su alta capacidad para absorber materiales (incluyendo antígenos exógenos) de sus alrededores. Cuando la CD inmadura recibe una señal apropiada durante esta fase se activa para migrar a través de los vasos linfáticos a los ganglios linfáticos secundarios. Durante esta migración y tras alcanzar el ganglio linfático experimenta cambios adicionales que llevan a una fase de maduración completa. En la fase madura, la CD expresa altos niveles de moléculas de m Hc de clase I y clase II, lo que permite que presente antígenos en forma de péptidos derivados de proteínas intracelulares a células T CD8-positivas y CD4-positivas, respectivamente. Los antígenos que son presentados por ambos tipos de molécula de MHC y mostrados en la superficie de las CD se generan dentro de la CD en un proceso celular complicado que incluye varias etapas de procesamiento y presentación de antígeno. En el caso de péptidos (es decir, fragmentos de antígeno) que son presentados en la superficie celular de la CD en moléculas de MHC de clase I es necesario que la CPA exprese moléculas codificadas por el transportador asociado con genes de procesamiento de antígeno (t Ap ) TAP1 y TAP2.
Los ligandos MHC-péptido que son mostrados en la superficie de la CD interaccionan con receptores específicos de antígeno presentes en linfocitos T (es decir, receptores de células T). Esta interacción administra la primera señal (es decir, señal 1) a la célula T; puesto que esta señal se administra a través del TCR, que es único para cada célula T, determina la especificidad de antígeno de la respuesta resultante seleccionando las células T con TCR adecuados. Las CD maduras también expresan una amplia variedad de moléculas coestimuladoras, incluyendo CD40, CD80, CD86 por nombrar unas pocas, que interaccionan con receptores adicionales expresados por los linfocitos T y producen su activación adicional (es decir, señal 2). Además, las CD tienen la capacidad para secretar una variedad de moléculas solubles, incluyendo citoquinas y quimioquinas, que pueden atraer diferentes subtipos de linfocitos a su vecindad y pueden afectar la diferenciación de las células T que reciben la señal 1 y la señal 2. Después de la unión a un conjunto adicional de receptores expresados por los linfocitos estos factores pueden administrar aún otra señal a los linfocitos que puede influir su diferenciación y función final. Esta algunas veces se denomina señal 3.
Es posible generar CD inmaduras y maduras in vitro. Por ejemplo, se pueden obtener monocitos por varios procedimientos (selección positiva de células CD14-positivas usando kits comerciales para selección celular, por su propiedad de adherencia a material plástico, o por su tamaño y densidad usando el proceso de elutriación celular). Estos monocitos se cultivan después con GM-CSF e IL-4 para dar poblaciones de CD inmaduras. Se pueden usar diferentes combinaciones de reactivos para inducir la maduración de las CD y en paralelo alterar su secreción de mediadores solubles. Estas diferentes formas de CD inmaduras/maduras a su vez se pueden usar para activar células T que no solo tienen la especificidad de antígeno deseada debido a las interacciones de su TCR con los ligandos MHC-péptido mostrados por la CD, sino que también tienen las funciones deseadas basado en las citoquinas secretadas por las CD. Por tanto, las CD maduras que se generan para secretar altas cantidades de la citoquina IL-12 tienen una buena capacidad para activar células T CD4 del tipo T cooperador 1 que son particularmente importantes en inmunidad antitumoral.
Si se activan y seleccionan apropiadamente, las células T tienen la capacidad de reconocer y destruir células tumorales o células infectadas con varios patógenos. En el caso de células tumorales, los antígenos asociados a tumor (AAT) que se procesan y presentan por las CPA con frecuencia representan moléculas que son proteínas propias que se sobreexpresan en células tumorales. Puesto que la mayoría de las células T que tienen TCR que interacciona con ligandos MHC-péptido derivados de moléculas propias se eliminan en el timo en un proceso conocido como “selección negativa” hay pocas células T en el repertorio que tengan TCR con avidez suficiente para reconocer células tumorales que expresan tales ligandos de AAT.
Figura 2. Sensibilización de novo de células T específicas de tumor indiferenciadas con células dendríticas pulsadas con ARN
Para obtener células T que tengan mejor capacidad para reconocer ligandos MHC-péptido en células tumorales u otras células, tal como las infectadas con patógenos, se puede emplear un repertorio no seleccionado de células T de un individuo sano presentando péptidos derivados del antígeno/antígenos seleccionado(s) a través de moléculas de MHC alogénicas. Por ejemplo, las células T de un donante sano A, que no es HLA-A2, no se han expuesto a complejos HLA-A2-péptido en el timo, por tanto, hay células T disponibles entre las células mononucleares de sangre periférica (CMSP) de tal individuo que expresan t Cr capaces de interaccionar con complejos HLA-A2-péptido con alta avidez. Para estimular células T indiferenciadas que tienen tal TCR deseado, se generan CD de dicho donante A partir de monocitos y después se modifican para expresar una molécula de MHC de clase I o clase II alogénica. Aquí se
proporciona un ejemplo para HLA-A2. Esta molécula es una molécula de MHC alogénica para las células T del donante A, que no es HLA-A2. Introduciendo ARN que codifica HLA-A2 en las CD del donante A, es posible crear una población de CD que expresan moléculas de HLA-A2 en su superficie celular. Por este medio, la CD aún expresa su conjunto normal de moléculas de MHC propias que están codificadas por los genes de MHC cromosómicos del donante A, pero además expresa la molécula de MHC alogénica que se traduce del ARN introducido. Al mismo tiempo a la CD se la puede suministrar ARN que codifica un antígeno proteico del que se pueden procesar péptidos por la CD y presentar en la superficie celular por la molécula de HLA-A2 alogénica. Cuando se usan CD que expresan tales ligandos MHC-péptido alogénicos en su superficie como CPA para estimular células T indiferenciadas pueden activar células T con TCR que interacciona con los ligandos MHC-péptido alogénicos deseados. No todas las células T que reconocen las moléculas de MHC alogénicas tendrán la especificidad de péptido deseada, por tanto, las células con el TCR deseado se deben seleccionar de la población completa de células T activadas. Hay varios procedimientos que conocen bien los inmunólogos para alcanzar esta selección. Por ejemplo, las células T activadas se pueden clonar como células individuales y después de la expansión, los clones de células T se pueden analizar para su especificidad MHC-péptido y esas con la especificidad deseada seleccionar para uso adicional. Alternativamente, ligandos MHC-péptido solubles en varias formas, tal como tetrámeros, se pueden marcar con un marcador fluorescente e incubar con las células T activadas. Esas células T que tienen TCR que interacciona con los tetrámeros se pueden detectar después por citometría de flujo y separar en base a su fluorescencia.
Las células T que se seleccionan con la especificidad de TCR deseada se pueden expandir después in vitro para uso en terapias celulares adoptivas (TCA) de pacientes cuyos tumores o células infectadas expresan los correspondientes ligandos HLA-A2-péptido. Alternativamente, las secuencias del TCR se pueden aislar y determinar para tales células T y usar para generar construcciones de TCR que se pueden introducir en linfocitos u otras células para generar células con TCR transgénico que se pueden usar para TCA.
Figura 3. Introducción de ARN transcrito in vitro en células K562
Como un primer enfoque experimental para demostrar la viabilidad de esta estrategia se usó la línea celular K562 como una línea celular receptora para la expresión de una molécula de MHC HLA-A2 alogénica después de transferencia de ARN. Esta línea celular deriva de una leucemia eritromieloide y la conocen bien los inmunólogos celulares. Puesto que es una línea tumoral se puede hacer crecer a grandes números y es fácil de manejar experimentalmente. Además, no expresa ninguna molécula de MHC de clase I en su superficie, por tanto, la expresión de moléculas de MHC alogénicas se puede detectar fácilmente en la superficie celular de K562, después de la introducción de ácidos nucleicos que codifican moléculas de MHC de clase I.
En los experimentos resumidos en esta figura, el ARNm de HLA-A2, que se generó por transcripción in vitro de un ADNc que codifica HLA-A2, se introdujo en células K562 a través de electroporación. Las células transfectadas con ARN transitoriamente se compararon con una línea de células K562 que se transfectaron establemente con el gen que codifica HLA-A2, designadas como células K562-A2.
La expresión en superficie de moléculas de HLA-A2 se determinó por citometría de flujo después de la incubación de las células con un anticuerpo monoclonal específico para moléculas de HLA-A2 y los datos se presentan como porcentajes de células positivas (figura a mano izquierda). Como control de referencia las células K562 se electroporaron en una cubeta que contenía agua en lugar de ARNm de HLA-A2. En todos los puntos de tiempo posteriores a la electroporación, no se detectaron células positivas en el control de referencia. Se usaron tres cantidades diferentes de ARN de HLA-A2 para la electroporación del mismo número de células K562. El mayor porcentaje de células positivas para HLA-A2 se detectó usando la cantidad de 24 microgramos de ARN y el mayor porcentaje de células se vio a las 11 h después de la electroporación. Los porcentajes de células positivas que expresan moléculas de HLA-A2 después de la electroporación del ARN eran comparables a las 11 h y las 24 h a esas del control positivo de células K562-A2 que expresan establemente el gen HLA-A2. La expresión transitoria de HLA-A2 después de la introducción del ARNm de HLA-A2 se demuestra por la disminución en los porcentajes de células positivas a las 48 h y sin detección a las 120 h.
Para determinar si células T que tiene TCR que reconoce moléculas HLA-A2 como un aloantígeno se podrían activar por células que expresan el ARN de HLA-A2, se estudió un clon de células T designado como JB4. Este clon de células T secreta la citoquina interferón gamma cuando su TCR interacciona con ligandos HLA-A2-péptido. El/los péptido/s exacto/s requerido/s para este reconocimiento no se conocen, pero se expresa en células K562 y en CD y en la mayoría de otras células que se han ensayado, por tanto, parece derivar de una proteína ubicua. Cuando se cocultivan células JB4 con células K562 transfectadas de referencia, no se detecta liberación de interferón (figura a mano derecha). Se ve fuerte liberación con el control positivo de células K562-A2. Todas las células K562 transfectadas con varias cantidades de ARN de HLA-A2 pudieron inducir secreción de citoquina por células JB4, aunque a menores niveles que el control positivo. No obstante, estos son niveles sustanciales de liberación de citoquina. En cultivos de K562 o CD que no tuvieron la adición de células JB4, no se midió liberación de citoquina, lo que demuestra que las células estimuladoras no secretan interferón gamma ellas mismas. Un control final de células JB4 sin células estimuladoras no mostró liberación de citoquina y demostró que las células T se deben activar por el ligando MHC-péptido apropiado para secretar interferón gamma.
Estos estudios mostraron que la introducción de una molécula de MHC alogénica en células K562 a través de expresión transitoria de ARN produjo expresión en la superficie celular de moléculas de HLA-A2 y las células pudieron activar un clon de células T específico de aloantígeno HLA-A2.
Figura 4. Introducción de ARN transcrito in vitro en CD
Se usó un enfoque experimental similar al descrito en la figura 3 para evaluar la expresión en superficie de moléculas de HLA-A2 en Cd después de electroporación de ARNm de HLA-A2 y para evaluar su capacidad para estimular la secreción de citoquina de células JB4. Aquí se usó una cantidad de 24 microgramos de ARNm de HLA-A2 en todo momento, pero se compararon tres fuentes diferentes de ARNm. Estas incluían una fuente comercial de ARN transcrito in vitro en el que la 3' UTR del gen de la alfa globulina humana se añadió a la construcción del gen de HLA-A2, con la intención de estabilizar la expresión de ARN dentro de la CD. Este ARN se comparó con ARN de HLA-A2 poliadenilado generado usando un procedimiento y kit comercial de Ambion frente a un ARN similar generado usando un procedimiento y kit comercial de CureVac. El ARNm poliadenilado generado usando el procedimiento de Ambion e introducido por electroporación en CD cultivadas de un donante negativo para HLA-A2 mostró los mejores resultados. Los mayores porcentajes de células positivas para HLA-A2 se encontraron con este ARNm, la aparición de moléculas de HLA-A2 en la superficie de las CD se detectó antes (a las 6 h) y la expresión en las CD aún se encontró a las 120 h usando esta fuente de ARNm. Por tanto, todos los experimentos adicionales utilizaron esta fuente de ARNm.
Se estudiaron las CD para su capacidad para estimular la secreción de citoquina de células JB4 como se ha descrito en la figura 3. Las CD control de referencia (la columna más a la izquierda) indujeron solo niveles de fondo de liberación de citoquina. Se vieron niveles mayores usando CD que expresan las tres fuentes diferentes de ARNm, pero esas CD electroporadas con ARNm de Ambion eran superiores. Los cultivos de CD que no contenían células JB4 no tuvieron interferón gamma, lo que demuestra que solo se libera por las células JB4 después de estimulación con CD que expresan el ARN de h La -A2.
Figura 5. Introducción de ARN transcrito in vitro que codifica el antígeno asociado a tumor tirosinasa en células K562-A2
Se generó ARN usando el procedimiento de Ambion y específico para el antígeno tirosinasa. Se electroporó en células K562-A2 y la expresión en superficie de HLA-A2 se midió usando un anticuerpo monoclonal específico para moléculas de HLA-A2. Las curvas verdes representan la tinción con un anticuerpo control de isotipo y las curvas azules tinción con el anticuerpo específico para HLA-A2. Aquí la expresión en superficie de HLA-A2 se encontró en todos los puntos de tiempo ya que las células K562-A2 expresan constitutivamente el gen HLA-A2. Se advirtió una disminución en la expresión de HLA-A2 a las 12 h que puede estar relacionada con un impacto inducido por estrés como resultado de la electroporación. Las células recuperaron alta expresión de moléculas de HLA-A2 después de ello. La expresión de proteína de tirosinasa se midió después de la detección intracelular de proteína usando un anticuerpo monoclonal específico para tirosinasa. Las curvas naranjas representan la tinción del control de referencia y las curvas azules representan la proteína tirosinasa dentro de las células. Se pudo ver un ligero cambio en la tinción en varios puntos de tiempo lo que indica que la proteína se fabricaba después de la introducción del ARN de tirosinasa.
Figura 6. Expresión y función de tirosinasa en células K562-A2
Se electroporó el ARN de tirosinasa en células K562-A2 y los porcentajes de células positivas, así como la intensidad de tinción, designada como intensidad fluorescente media (IFM), se determinaron en varios puntos de tiempo (campo izquierdo superior). Las columnas rojas muestran la expresión constitutiva de HLA-A2 en células K562-A2, de nuevo con una caída en el nivel entre 11 y 24 h y recuperación después de ello. Las columnas azules muestran la tinción intracelular de la proteína tirosinasa con el pico a 6 h. El cambio en la tinción a las 6 h se ilustra en el campo derecho inferior en el que la tinción del control de referencia se muestra mediante la curva naranja y la tinción de tirosinasa se muestra por la curva azul. El aumento en veces en la expresión comparado con el control de referencia, a lo largo del tiempo, se muestra en el campo izquierdo inferior, que da un máximo a las 11 h. La secreción de interferón gamma de un clon de células T, Tyr-F8, que ve un péptido derivado de tirosinasa presentado por moléculas HLA-A2 se muestra en el campo derecho superior. Las células K562-A2 no inducen secreción de interferón gamma por células Tyr-F8, pero lo hacen después de electroporación con ARN de tirosinasa. Las células T solas no secretan citoquina, pero también pueden ser estimuladas por células K562-A2 cargadas con un péptido sintético de tirosinasa o por células de melanoma que coexpresan tirosinasa y HLA-A2 (células MEL-IL2).
Esto demuestra que la introducción de ARN para tirosinasa en células K562-A2 las permite procesar y presentar el ligando MHC-péptido apropiado que es visto por el TCR de las células Tyr-F8 y activa que las células T secreten interferón gamma. Las células transfectadas con ARN usadas 12 y 24 h después de la electroporación tuvieron capacidades estimuladoras comparables.
Figura 7. Introducción de ARN de tirosinasa transcrito in vitro en CD generadas de donantes positivos para HLA-A2
Se hizo un conjunto similar de experimentos a los descritos en la figura 6 excepto que se usaron CD de un donante
positivo para HLA-A2 en lugar de células K562-A2. La expresión de proteína tirosinasa intracelular se detectó en las CD en varios puntos de tiempo después de la electroporación de ARN (paneles superiores). La mayor expresión media en veces sobre el control de referencia se vio a las 3 h en las CD. Las CD solas no pudieron estimular la secreción de citoquina por células TyrF8, pero pudieron hacerlo después de la electroporación con ARN de tirosinasa. Las CD usadas 12 h o 24 h después de la electroporación tuvieron la capacidad para activar que células T Tyr-F8 secretaran interferón gamma.
Figura 8. Coexpresión de HLA-A2 y tirosinasa en células K562
Se electroporaron células K562 que no expresan ninguna molécula de HLA con ARN para HLA-A2 y tirosinasa. O bien cada especie de ARN se introdujo de forma individual o ambas en combinación. El panel derecho superior resume la expresión de proteína de HLA-A 2 sola a diferentes puntos de tiempo (conjunto de columnas más a la izquierda), tirosinasa sola, seguido por tinción de HLA-A2 en células electroporadas con ARN tanto de HLA-A2 como tirosinasa y la tinción de tirosinasa en células que recibieron ambas especies de ARN. La expresión óptima de ambas proteínas en células electroporadas con ambas especies de ARN se vio a las 24 h. Las células K562 que coexpresan ambos ARN pudieron estimular la secreción de interferón gamma de células TyrF8 12 h y 24 h después de la electroporación.
Figura 9. Coexpresión de HLA-A2 y tirosinasa en CD hechas de donantes negativos para HLA-A2
La coexpresión de la proteína HLA-A2 y la proteína tirosinasa en CD preparadas de un donante negativo para HLA-A2 se analizó como se describe en la figura 8. Se encontró coexpresión de ambas proteínas en CD en varios puntos de tiempo. Los niveles de expresión de HLA-A2 parecían estar reducidos en presencia del ARN de tirosinasa. No obstante, las CD que coexpresan ambos ARN pudieron estimular niveles significativos de interferón gamma por células TyrF8 por encima de esos en las células T solas o después de incubación con CD electroporadas con la especie única de ARN.
Figura 10. Influencia de la concentración de ARN de la reestimulación de células TyrF8 por CD que expresan ARN
Se analizó la capacidad de CD para estimular la secreción de citoquina de células TyrF8 usando CD preparadas de un donante negativo para HLA-A2 transfectadas con diferentes cantidades de ARN de HLA-A2 y tirosinasa. Las CD control de referencia (columna más a la izquierda) indujo solo niveles de fondo de liberación de citoquina. Las células T solas no secretan citoquina, pero también pueden ser estimuladas por células de melanoma que coexpresan tirosinasa y HLA-A2 (células MEL-IL2).
Todas las CD transfectadas con varias cantidades de ambos ARN pudieron inducir secreción de interferón gamma por células TyrF8, mientras que esas CD electroporadas con 24 |jg de HLA-A2 y 24 |jg de ARN de tirosinasa o 48 |jg de ARN de HLA-A2 y 24 jg de ARN de tirosinasa fueron superiores lo que indica que menos ARN para la reestimulación de células T puede ser mejor.
Figura 11. Protocolo de sensibilización de novo de células T indiferenciadas con células dendríticas pulsadas con ARN
Para analizar la capacidad de CD cargadas con ARN para sensibilizar células T indiferenciadas para convertirse en linfocitos específicos de tumor, se desarrolló un protocolo de sensibilización de tres fases. Ocho días antes del inicio de la sensibilización (día -8), se prepararon monocitos por adherencia a plástico de un donante positivo para HLA-A2 y un donante negativo para HLA-A2, como se describe. Estas poblaciones de monocitos purificados se usaron para preparar CD inmaduras que después se maduraron como se ha descrito. El primer día (día 0) del protocolo de sensibilización de células T, las CD se cargaron con ARN a través de electroporación, como se ha descrito. Las CD derivadas del donante positivo para HLA-A2 se cargaron con 24 jg de ARN de tirosinasa como un antígeno tumoral modelo. La proteína tirosinasa traducida del ARN en las CD se debe procesar y presentar como péptidos en asociación con las moléculas HLA-A2 codificadas propias en la superficie de las CD. Las CD derivadas del donante negativo para HLA-A2 se cargaron con ARN que codifica HLA-A2 (48 jg ) y tirosinasa (24 jg). Aquí las moléculas de HLA-A2 codificadas por el ARN transferido representan moléculas de MHC alogénicas. Los péptidos derivados de la proteína tirosinasa se deben procesar y presentar por las moléculas HLA-A2 que se traducen del ARN que codifica HLA-A2 transferido a las CD; estos complejos péptido-MHC representan ligandos peptídicos alorrestringidos. El día 0 del protocolo de sensibilización, se aislaron linfocitos T CD8+ autólogos de cada donante a través de selección negativa usando un kit comercial y las instrucciones del fabricante (kit de aislamiento de células T CD8+ (humana), Miltenyi, Bergisch Gladbach, Alemania) hasta >80% de pureza. Estas células T CD8+ autólogas sin tocar se añadieron a las CD maduras pulsadas con ARN 9 h después de la electroporación a una proporción de 10:1 en medio AimV (Gibco BRL, Karlsruhe, Alemania) que contenía IL-7 (10 ng/ml). Se añadió IL-2 (20 Ul/ml) después de 2 días y después cada 3er día posterior. Siete días (día 7) después de la 1a estimulación, se realizó la 2a estimulación de los cultivos de sensibilización usando las CD pulsadas con ARN preparadas de la misma manera que para la 1a estimulación y usando las mismas condiciones de cultivo que las usadas el día 0 de sensibilización. Después de 7 días adicionales (día 14), las células T específicas de tirosinasa restringidas por HLA-A2 se separaron con la ayuda de un tetrámero HLA-A*0201/péptido htyr369-377/p2m humano marcado con ficoeritrina (PE) (Wolfl et al., 2004; proporcionado por Prof. D.
Busch, Instituto de Microbiología Médica, Inmunología e Higiene, Universidad Técnica, Múnich, Alemania). Algunas de las células positivamente seleccionadas se sembraron a 1 célula/pocillo en placas con fondo en V de 96 pocillos (TPP, Trasadingen, Suiza). Los pocillos se alimentaron con medio Aim V que contenía IL-250 UI/ml (Chiron Behring, Marburgo, Alemania) cada tres días e IL-7 5 ng/ml (Promokine, Heidelberg, Alemania) e IL-15 10 ng/ml (PeproTech Inc., Nueva Jersey, Estados Unidos) cada siete días. Los clones seleccionados y las células T sin clonar seleccionadas con tetrámero restantes se mantuvieron en cultivo en medio Aim V con IL-2, IL-7, IL-15, como anteriormente, y se les suministraron células soporte, compuestas de células mononucleares de sangre periférica derivadas de un conjunto de cinco donantes que se irradió con 50 Gy. Las células T se estimularon no específicamente con anticuerpo anti-CD3 (0,1 |jg/ml; proporcionado por Dr. Elisabeth Kremmer, Instituto de Inmunología Molecular, GSF, Múnich, Alemania) cada dos semanas.
Figura 12. Expresión de ligandos MHC-péptido en células dendríticas transfectadas con ARN
Para demostrar que las CD usadas para la sensibilización de células T expresaban los ligandos MHC-péptido esperados, se determinó la expresión de moléculas de HLA-A2 en la superficie celular y la proteína tirosinasa intracelular usando citometría de flujo como se ha descrito previamente. La coexpresión de moléculas de HLA-A2 y proteína tirosinasa se detectó a altos niveles en CD derivadas de ambos donantes. Los niveles de proteína tirosinasa intracelular eran comparables en las CD preparadas tanto del donante positivo para HLA-A2 como negativo para HLA-A2. Los niveles de expresión en superficie de HLA-A2 en una mayoría de células eran mayores en las CD preparadas del donante positivo para HLA-A2 donde están codificadas por un gen endógeno. Mientras que los niveles de las moléculas de HLA-A2 transgénicas eran más variables en las CD preparadas del donante negativo para HLA-A2.
Se determinó la capacidad de tales CD, usando células preparadas según el mismo protocolo en experimentos independientes, para estimular células T usando un clon de células T alosensible a HLA-A2 que reconoce moléculas de HLA-A2 independientemente de los péptidos que porta (es decir, HLA-A2 péptidos xyz). Ambas poblaciones de CD fueron capaces de estimular este clon de células T (JB4) para secretar interferón gamma, medido en un ELISA estándar como se ha descrito previamente. No se vio liberación de citoquina de células T incubadas sin CD. La presencia de ligandos compuestos de moléculas de HLA-A2 que presentan un péptido derivado de tirosinasa se evaluó midiendo la liberación de interferón gamma por un clon de células T (Tyr-F8) específico para HLA-A2-péptido de tirosinasa. Las células T incubadas sin CD liberaron solo niveles de fondo de citoquina. En este experimento, a las CD positivas para HLA-A2 se suministraron 48 jg de tirosinasa, mientras que a las CD negativas para HLA-A2 se les suministraron 24 jg de tirosinasa.
Estos resultados demostraron que las moléculas de HLA-A2 transgénicas, proporcionadas por la transferencia de ARN en las CD derivadas del donante negativo para HLA-A2, se pudieron teñir en la superficie celular con un anticuerpo específico para HLA-A2 y ser reconocidas por un clon de células T aloespecífico de HLA (JB4). La transferencia de a Rn de tirosinasa produjo expresión de proteína intracelular en ambas poblaciones de CD. La cotransferencia de ARN de HLA-A2 y tirosinasa permitió que un clon de células T específico de HLA-A2-tirosinasa (Tyr F8) se activara, como lo hizo la transferencia de ARN de tirosinasa en CD que expresan moléculas de HLA-A2 codificadas endógenamente.
Figura 13. Tinción con tetrámero de células T sensibilizadas de donantes positivo para HLA-A2 y negativo para HLA-A2
Para seleccionar células T que portan receptores de células T específicos para ligandos HLA-A2 péptido de tirosinasa que están presentes entre los cultivos de células T sensibilizadas, las células T se tiñeron con un tetrámero HLA-A*0201/péptido htyr369-377/Hp2m y se analizaron por citometría de flujo. Células de cada uno de los dos cultivos de sensibilización diferentes que mostraron unión al tetrámero se seleccionaron (rectángulo negro, ) y se aislaron en un separador celular de alto rendimiento MoFlo™ (Dako, Fort Collins, CO, EE UU). La población de células T CD8+tetrámero+ del donante positivo para HLA-A2 mostró unión al tetrámero a solo una baja intensidad mientras que las células CD8+tetrámero+ del donante negativo para HLA-A2 se tiñeron a mayor intensidad. Las células T tetrámero+ seleccionadas se sembraron como célula individual y las células restantes se retuvieron en cultivos como cultivos en masa sin clonar.
Estos resultados demostraron que el protocolo de sensibilización dio células T que portaban TCR capaces de unirse a tetrámeros específicos de HLA-A2-tirosinasa. Más células T se unieron al tetrámero a mayor intensidad en los cultivos sensibilizados usando las CD derivadas del donante negativo para HLA-A2, lo que indica mejor estimulación por ligandos peptídicos, HLA-A2 alogénicos.
Figura 14. Evaluación de cultivos de células T en masa separados con tetrámero para especificidad y avidez del receptor de células T
Las células separadas que se retuvieron como cultivos en masa se volvieron a analizar para tinción con tetrámero después de 8 días. Como se esperaba, la mayoría de las células separadas eran CD8+ en los cultivos en masa separados derivados de ambos de los cultivos de sensibilización. Las células T tetrámero+ estaban presentes a una frecuencia de aproximadamente el 8% en los cultivos sensibilizados usando DC HLA-A2 positivas. Estas células tenían una intensidad intermedia de unión a tetrámero (IFM = 127,49), mientras que el 80% de las células T del cultivo en
masa del donante negativo para HLA-A2 se unieron al tetrámero con mucha mayor intensidad (IFM = 3248,77). La intensidad de unión al tetrámero es un parámetro usado para evaluar la avidez del receptor de células T (TCR) por un ligando MHC-péptido particular (Yee et al., 1999). Una mayor intensidad de unión a tetrámero indica una mejor interacción del ligando con el TCR. Un segundo parámetro de la avidez de TCR es la disociación del tetrámero (Palermo et al., 2005). Las células T se incuban con tetrámero y después se lavan e incuban en ausencia de tetrámero y presencia de anticuerpo específico para moléculas de HLA-A2. La presencia de este anticuerpo previene que tetrámeros que se han caído de la superficie de las células T se vuelvan a unir a la superficie celular. La intensidad de la tinción con tetrámero en las células T se determina en varios puntos de tiempo después de lavar: 0h, 1h, 2h. Si la tinción con tetrámero se pierde rápidamente, esto indica que el TCR solo tiene baja avidez por el ligando MHC-péptido del tetrámero. Si la unión al tetrámero es más estable a lo largo del tiempo, esto indica una mayor avidez de TCR por el ligando MHC-péptido. En la comparación de los dos cultivos en masa, se encontró que solo el 20% de las células que se unen a tetrámero originales (1,7% frente a 8,3%) eran todavía tetrámero+ después de 2 h en las células derivadas del donante positivo para HLA-A2. En contraste, el 75% de las células eran todavía tetrámero+ después de 2 h en las células derivadas del donante negativo para HLA-A2 (60,5% frente a 80,6%).
La especificidad de la unión al tetrámero se determinó usando un tetrámero compuesto de moléculas de HLA-B7 que presentan un péptido derivado de citomegalovirus (tetrámero B7-CMV, proporcionado por el Prof. D. Busch). Ambos cultivos de células T en masa mostraron solo niveles bajos de tinción (0,3-0,4%).
Además, también se usó un tetrámero HLA-A2-péptido de CMV. Solo el 0,4% de las células T del donante positivo para HLA-A2 se unieron a este tetrámero, mientras que el 12,7% de las células T en masa del segundo donante fueron positivas. Estas células T probablemente representan células T con TCR que reconoce moléculas de HLA-A2 como aloantígenos, independientemente de los péptidos que presentan. La intensidad de la unión del tetrámero era menor (IFM = 166,98) comparada con la intensidad de la unión al tetrámero HLA-A2-tirosinasa (IFM = 3248,77).
Estos resultados demuestran que las células T que portan TCR con mayor avidez definida por la intensidad de la tinción con tetrámero y disociación de tetrámero más lenta derivaban de los cultivos que usan CD negativas para HLA-A2, lo que demuestra la superioridad de inducir respuestas en repertorios de células T no negativamente seleccionadas, usando ligandos peptídicos alogénicos.
Figura 15. Evaluación de clones de células T para especificidad, avidez por el receptor de células T y función
De los experimentos de siembra de célula individual, se seleccionaron dos clones para caracterización adicional. Un clon (PS P4D11) derivaba del donante positivo para HLA-A2 y un clon (SW P12B10) derivaba del donante negativo para HLA-A2.
El clon PS P4D11, del donante positivo para HLA-A2, mostró una intensidad intermedia de tinción con tetrámero (IFM = 166,98) con una liberación rápida de tetrámero, medida a 1 h y 2 h. Este clon de células T no se pudo estimular para que secretara interferón gamma después de incubación con células T2 cargadas con péptido específico (células T2 proporcionadas por Peter Cresswell. Universidad de Yale, New Haven, CT) ni después de estimulación con células tumorales, que expresan HLA-A2 y tirosinasa (Mel 324.38 y Mel IL-2). Sin embargo, pudo destruir células tumorales de melanoma HLA-A2+tirosinasa+, pero no células tumorales HLA-A2+tirosinasa-, lo que demuestra su especificidad por los ligandos HLA-A2-tirosinasa.
El clon SW P12B10, derivado del donante negativo para HLA-A2, mostró una mayor intensidad de unión a tetrámero (IFM = 1009,04) y la estabilidad de la unión del tetrámero fue mayor con todas las células todavía positivas para tetrámero después de 2 h. Este clon mostró liberación específica de interferón gamma después de la estimulación con células T2 cargadas con péptido derivado de tirosinasa, pero no contra células T2 sin péptido, lo que demuestra especificidad de péptido. También se pudo estimular para liberar interferón gamma después de estimulación con células tumorales de melanoma HLA-A2+tirosinasa+, pero no contra células de melanoma positivas para tirosinasa, negativas para HLA-A2 (SK Mel 28) o contra células de melanoma negativas para tirosinasa, positivas para HLA-A2 (Mel A375). Este patrón demostró que el clon era específico para un HLA-A2-péptido de tirosinasa. Este clon también pudo destruir células tumorales de melanoma, positivas para HLA-A2, positivas para tirosinasa, pero no células tumorales positivas para HLA-A2, negativas para tirosinasa.
Estos resultados muestran que los clones de células T derivados de los dos cultivos de sensibilización diferentes mostraban diferencias con respecto a avidez por TCR, detectada por intensidad de unión a tetrámero y disociación de tetrámero, teniendo el clon de células T específico de péptido alorrestringido TCR de mayor avidez mediante esta definición. Además, este clon de células T mostró superioridad funcional ya que pudo destruir no solo células de melanoma específicamente, sino que pudo también ser activado para secretar interferón gamma después de la estimulación con péptido y después de la estimulación con células tumorales, de una manera específica de HLA-A2, tirosinasa.
Materiales y Métodos
Líneas celulares tumorales adherentes, Mel A375, Mel IL-2, Mel 624.38 y SK Mel 28
Estas líneas celulares de melanoma humanas se cultivaron en medio RPMI 1640 suplementado con suero bovino fetal al 12%, aminoácidos no esenciales 1x, L-glutamina 2 mM y piruvato de sodio 1 mM. El volumen del medio en una botella de cultivo de tamaño medio fue 10 ml. Aproximadamente cada 3-4 días las células crecieron a confluencia. Dependiendo de la velocidad de crecimiento de las líneas celulares individuales se pasaron de 1:2 a 1:10. El medio se eliminó, las células se lavaron una vez con PBS y después se incubaron con 2 ml de tripsina/EDTA 2x durante 3 min a temperatura ambiente. Las células separadas se resuspendieron en medio RPMI 1640 fresco más suplementos.
Clones de células T, JB4 y Tyr-F8
Los clones de células T se expandieron primero en cultivos de reestimulación estándar. Soluciones madre grandes se hicieron alícuotas y se congelaron. Cada vez que se necesitaron para un experimento, las células T se tomaron de la solución madre, se descongelaron, colocaron en los pocillos de una placa de 24 pocillos y se reestimularon según protocolos estandarizados.
Líneas celulares tumorales en suspensión, células T2, K562 y K562-A2
T2, K562 y K562-A2 se cultivaron en medio RPMI 1640 suplementado con SBF al 12%, MEM 1x, L-glutamina 2 mM y piruvato de sodio 1 mM. El volumen del medio era 10 ml en una botella de cultivo de tamaño medio. Aproximadamente cada 4 días, % de la suspensión celular se retiró y se añadió el mismo volumen de medio fresco. Para las células K562-A2, el medio se suplementó con 1 mg/ml del antibiótico de selección G418.
Generación y cultivo de CD
Se aislaron CMSP de un donante por centrifugación en gradiente de densidad en Ficoll. Las CMSP se resuspendieron en medio RPMI 1640 suplementado con plasma autólogo al 1% a 7,5x106 células por botella de cultivo T75. Las botellas se incubaron a 37°C y CO2 al 5% durante 1 h. Las células no adherentes se eliminaron por lavado cuidadosamente. Los monocitos adherentes se cultivaron en 10 ml por botella de medio de células dendríticas suplementado con plasma autólogo al 1%, GM-CSF 800 U/ml e IL-4 800 U/ml. Después de 3 días de cultivo, se añadieron de nuevo GM-CSF 800 U/ml e IL-4800 U/ml. El día 6 de cultivo, se añadieron GM-CSF 800 U/ml, IL-4500 U/ml, IL-1p 5 ng/ml, IL-69 ng/ml, TNF-a 9 ng/ml y PGE22 pM por 1 ml a las CD inmaduras para inducir la maduración. Las CD maduras se recogieron el día 8 de cultivo.
Citometría de flujo
Se usó citometría de flujo para medir la expresión celular de moléculas elegidas. Estas moléculas se tiñen específicamente con anticuerpos monoclonales unidos a colorantes fluorescentes. El análisis de citometría de flujo se realizó en el separador celular activado por fluorescencia (FACS™). En el FACSCalibur™, la suspensión de células teñidas se forzó a través de una boquilla, creando una corriente fina de líquido que contenía células espaciadas individualmente a intervalos. Según cada célula pasaba a través de un haz laser, dispersaba la luz laser y las moléculas fluorescentes asociadas con la célula se excitaron. Tubos fotomultiplicadores sensibles detectaron tanto la luz dispersada, que dio información sobre el tamaño y granularidad de la célula, como las emisiones de fluorescencia, que dieron información sobre la unión de los anticuerpos monoclonales marcados y, por tanto, la expresión de moléculas diana por cada célula. Para la separación de las células de interés, se usó un separador celular de alto rendimiento MoFlo™ (Dako, Fort Collins, CO, EE UU) con 25.000 sucesos/s y máx. 1 psi.
Tinción directa de moléculas de superficie celular
Para medir la expresión de moléculas de HLA-A2 en la superficie, se usaron el sobrenadante de hibridoma HB82 (ATCC; Bethesda MD) y un anticuerpo secundario anti-ratón de cabra conjugado con PE (ficoeritrina) para la tinción directa en la superficie celular. Aproximadamente 1*105 CD, células K562 o K562-A2 se lavaron una vez. Cada etapa de lavado incluía resuspensión de las células en 600 pl de tampón FACS™, centrifugación a 300*g durante 4 min y desechar el sobrenadante. Después de lavar, se añadieron 50 pl de HB82 por separado a los precipitados. Después de un periodo de incubación de 30 min en hielo, las células se lavaron una vez. A continuación, se añadieron 0,5 pl del anticuerpo secundario (dilución 1/100; 0,5 pl de anticuerpo en 50 pl de tampón FACS™) por separado a los precipitados. Después de un periodo de incubación de 30 min en hielo y en la oscuridad, las células se lavaron una vez. Por último, las células se resuspendieron en 200 pl de tampón FACs ™ y se realizó el análisis de citometría de flujo.
Tinción indirecta de moléculas intracelulares
Para medir la expresión de tirosinasa dentro de las CD transfectadas con ARN, las células primero se fijaron usando paraformaldehído al 1% en tampón FACS™. Después de la fijación, las células se permeabilizaron usando saponina al 0,1% y 0,25% en tampón FACs ™. Brevemente, aproximadamente, 3*105 células se lavaron una vez. Cada etapa de lavado incluía resuspensión de las células en 500 pl de tampón FACS™ o saponina al 0,1% en tampón FACS™, centrifugación a 300*g durante 4 min y desechar el sobrenadante. Después de lavar, se añadieron 500 pl de
paraformaldehído al 1% en tampón FACS™ (medio de fijación) al precipitado y se mezclaron suavemente. Después de un periodo de incubación de 30 min en hielo, las células se lavaron dos veces en tampón FACS™. Era posible almacenar las células en 500 j l de tampón FACS™ a 4°C hasta 7 días. Los precipitados se lavaron con 500 j l de saponina al 0,1% en tampón FACS™ una vez. Posteriormente, se añadieron 50 j l de saponina al 0,25% en tampón FACS™ (medio de permeabilización) y 5 j l de anticuerpo primario específico de tirosinasa al precipitado y se mezcló suavemente. Después de una incubación de 1 h a temperatura ambiente, las células se lavaron una vez con saponina al 0,1% en tampón FACS™ y después se añadieron 0,5 j l de anticuerpo secundario conjugado a Cy5 específico para el anticuerpo primario (dilución 1/100) en 50 j l de saponina al 0,25% en tampón FACS™ al precipitado y se mezcló suavemente. Después de una incubación de 30 min a temperatura ambiente en la oscuridad, las células se lavaron con 500 j l de saponina al 0,1% en tampón FACS™. Por último, las células precipitadas se resuspendieron en 200 j l de saponina al 0,1% en tampón FACS™ y se realizó el análisis de citometría de flujo.
Tinción con tetrámero y disociación de tetrámero
Para evaluar la avidez de células T CD8+ específicas de tirosinasa restringidas a HLA-A2 y para realizar una separación con el separador celular de alto rendimiento MoFlo™ (Dako, Fort Collins, CO, EE UU) estas células T se tiñeron con un tetrámero A*0201/péptido htyr369-377/Hp2m marcado con PE (proporcionado por Prof. D. Busch). Las células se lavaron dos veces. Cada etapa de lavado incluía la resuspensión de las células en PBS frío suero humano al 0,5%, centrifugación a 300xg durante 5 min y desechar el sobrenadante. El volumen de incubación depende del número de células. Hasta 106 células se incubaron en 50 j l 25 min con tetrámero marcado con PE en hielo en la oscuridad (dilución 1/25, 2 j l de tetrámero en 50 j l de PBS suero humano al 0,5%) Para la separación de células T CD8+ específicas de tirosinasa restringidas a HLA-A2 hasta 5 x 106 células se incubaron con 6 j l de tetrámero A2/péptido en 100 j l de PBS suero humano al 0,5%. A continuación, durante 25 min adicionales en una proporción de 1/50 se añadió anticuerpo CD8-APC (BD Pharmingen, Franklin Lakes, EE UU). Después de la tinción las células se lavaron dos veces y por último o bien se fijaron con paraformaldehído al 1% en tampón FACS™ y se analizaron por citometría de flujo FACSCalibur (Becton Dickinson, Mountain View, CA), o se diluyeron en PBS suero humano al 0,5% para separación de las células T tetrámero+CD8+ en el separador celular de alto rendimiento MoFlo™ (Dako, Fort Collins, CO, EE UU).
Para los ensayos de disociación de tetrámero, después de lavar se previno que el tetrámero separado se volviera a unir por la incubación con cantidades saturantes de sobrenadante de hibridoma HB82 (ATCC, Bethesda MD), que se une a HLA-A2 independientemente del péptido en complejo. Después de intervalos de tiempo crecientes, se tomaron muestras, se fijaron y analizaron por citometría de flujo para la intensidad de tinción con tetrámero.
Producción de ARNc de una sola especie
La producción de ARN transcrito in vitro de una sola especie, designado aquí como ARNc, incluía cuatro etapas: linealización del plásmido que contiene un inserto de ADNc, transcripción in vitro basada en la secuencia del promotor y el molde de ADNc en el plásmido linealizado, poliadenilación del ARNc sintetizado y purificación de ARNc. Puesto que se necesitaban cantidades sustanciales del molde de ADNc, es decir ADN de plásmido (ADNp), para las reacciones de transcripción in vitro, el plásmido se tuvo que amplificar en bacterias competentes.
Transformación de bacterias competentes con ADN de plásmido
Para obtener grandes cantidades de ADNp que se recibió de otros grupos como un generoso regalo, se tuvieron que transformar bacterias competentes con el ADNp en cuestión y expandir. Un vial de 50 j l de células competentes One Shot TOP10F' se descongeló lentamente en hielo fundiéndose, se añadió un pequeño volumen de ADNp y se mezcló con las bacterias golpeando suavemente. Las células se incubaron en hielo durante 30 min, después se calentaron a 42°C durante exactamente 30 seg y por último se colocaron en hielo para enfriar 2 min. Se añadió medio SOC rico, proporcionado junto con las células competentes, y las bacterias transformadas se sembraron en placas de medio LB agar con el antibiótico de selección apropiado. Las placas se colocaron en el incubador bacteriano durante la noche a 37°C. Puesto que el antibiótico zeocina es sensible a la luz y su actividad se inhibe por altas concentraciones de sal, las placas para las bacterias transformadas con pZeoSV2+/huTyr contenían medio LB agar con baja sal y se almacenaron en la oscuridad.
Selección y expansión de bacterias transformadas
Solo bacterias transformadas con ADNp, que codifica resistencia a un antibiótico, fueron capaces de crecer y formar colonias en placas de selección a pesar de la presencia del antibiótico correspondiente en el medio agar. Después del crecimiento durante la noche, las colonias se cogieron de las placas usando palillos estériles. Cada colonia individual se inoculó en 5 ml de medio LB que contenía el antibiótico apropiado en un tubo Falcon de 15 ml. Si bacterias transformadas previamente seleccionadas y congeladas se iban a expandir, los viales congelados se transfirieron del congelador de -80°C a hielo en descongelación. Aproximadamente 5 j l de la suspensión bacteriana parcialmente descongelada se transfirieron después a un tubo Falcon de 15 ml que contenía 5 ml de medio LB con el antibiótico apropiado. Los tubos se incubaron durante la noche (aproximadamente 12 horas) a 37°C con agitación vigorosa a 150 rpm para crecimiento eficaz de las bacterias transformadas.
Congelación de bacterias transformadas
Las bacterias se dañan menos por el proceso de congelación si el medio de congelación contiene el 15% de glicerina. Por tanto, 400 j l de la suspensión bacteriana de la noche se añadieron a 84 j l de glicerina al 87% autoclavada, se agitó con el vortex, se congeló rápidamente en nitrógeno líquido y se transfirió a -80°C.
Extracción de ADN de plásmido de bacterias transformadas
Después del cultivo durante la noche, las suspensiones bacterianas se centrifugaron a 5300*g y 4°C durante 10 min. La extracción del ADN de plásmido de las células bacterianas se realizó usando el kit QIAwell® 8 Ultra Plasmid, según las instrucciones del fabricante. Brevemente, las células precipitadas se lisaron. Las condiciones de sal y pH en los lisados aseguraron unión exclusiva de ADN a la membrana, mientras que el ARN degradado y las proteínas celulares no se retuvieron. La membrana se lavó después con un tampón que rompe cualquier interacción ADN-proteína lo que permite la eliminación de cualquier proteína que se une a ácidos nucleicos y otras contaminaciones residuales del ADNp. Etapas de lavado adicionales eliminaron las sales y otros constituyentes no ADN. El ADNp purificado se eluyó, por último, en tampón Tris. El rendimiento de ADNp extraído fue 4-8 jg por 5 ml de cultivo bacteriano durante la noche, dependiendo del plásmido.
Transcripción in vitro de ADNc de una sola especie en ARNc
Cada plásmido se linealizó con la enzima de restricción apropiada para producir un molde adecuado para transcripción in vitro. Puesto que todos los plásmidos contenían el promotor T7 en el extremo 5' del ADNc que codifica la proteína deseada, la transcripción se realizó usando la ARN polimerasa de T7 del kit mMESSAGE mMACHINE™ T7 según las instrucciones del fabricante. La estabilidad de una molécula de ARN y su uso eficaz como molde para la traducción en proteína depende de la presencia de una caperuza en su extremo 5' y una cola de poli(A) en el extremo 3'. Una cola de poli(A) siempre es parte de una molécula de ARNm sintetizada por una célula. Por tanto, el procedimiento de amplificación de ARNm celular total, descrito anteriormente, incluía solo la adición de un análogo de caperuza en la reacción de transcripción in vitro. Sin embargo, el ARNc de una sola especie producido usando ADNc en un plásmido puede o no contener una cola de poli(A), dependiendo de si la cola está codificada en la construcción o no. Además de integrar un análogo de caperuza en el extremo 5' en la reacción de transcripción in vitro, los ARNc de tirosinasa, HLA-A2 se poliadenilaron en el extremo 3' usando el kit Poly(A) Tailing. Ambas reacciones se realizaron en las condiciones sugeridas por el fabricante. Después de la transcripción in vitro y purificación de ARNc, el rendimiento medido de ARNc fue 60-70 jg por 100 j l de mezcla de reacción de poliadenilación.
Purificación de ARNc
La purificación de ARNc obtenido en reacciones de transcripción in vitro usando como molde ADNc celular total amplificado o ADNc de una sola especie en un plásmido, se realizó usando el kit RNeasy® Mini Kit según las instrucciones del fabricante. Para la purificación, el procedimiento empezó con la transferencia de la mezcla de la reacción de transcripción in vitro a una columna RNeasy®. El ARN se eluyó en agua DEPC y se almacenaron alícuotas a -80°C.
Transfección de ARN en CD
La membrana plasmática celular cumple la función vital de separar los contenidos moleculares de la célula de su medio externo. Las membranas están principalmente compuestas de lípidos anfifílicos que se autoensamblan en una bicapa muy aislante. En su búsqueda para capturar tanto antígeno como sea posible, se sabe bien que las CD inmaduras absorben varias estructuras (que varían de tamaño desde moléculas pequeñas a cuerpos apoptóticos) de sus alrededores, incluyendo ARN. Lo hacen mediante macropinocitosis y endocitosis. Incluso aunque se ha mostrado que la simple coincubación de CD con ARN logra la sensibilización de células T, métodos más agresivos tal como lipofección y electroporación han demostrado ser mejores métodos de transfección.
Electroporación
La electroporación induce la permeabilidad reversible de membranas plasmáticas cuando las células se exponen a pulsos cortos de campos eléctricos externos fuertes. La formación de poros hidrofílicos es un resultado de la reorientación de los lípidos en la membrana bicapa. El mecanismo molecular de este fenómeno todavía no se entiende bien. El número de poros y su diámetro aumenta con el producto de la amplitud del pulso y la duración del pulso. Mientras que las moléculas pequeñas simplemente difunden a través de los poros en el citoplasma, las moléculas más grandes, como los ácidos nucleicos, son dirigidos en la célula por fuerzas electroforéticas. También se ha mostrado que la presencia de ácidos nucleicos facilita la formación de poros. Los poros aparecen en un microsegundo de exposición al campo eléctrico, pero necesitan un minuto para volver a sellarse.
Primero, 2-3 *10® CD o células K562 se resuspendieron en al menos 170 j l de medio OptiMEM I, se pusieron en una cubeta de electroporación de 0,4 cm y se incubaron en hielo durante aproximadamente 3 min. Enfriar la suspensión
antes de la electroporación era ventajoso porque ralentizaba el metabolismo celular. Mediante ello, se previno el sobrecalentamiento debido a la electricidad. Además, el daño causado por el choque eléctrico y por moléculas liberadas de células muertas se minimizó. Posteriormente, se añadió ARN, resuspendido en no más de 100 pl de agua DEPC, dando un volumen total de suspensión de electroporación de 270 pl. La suspensión se mezcló brevemente pipeteando y después se electroporó rápidamente. La electroporación se realizó con 250 V y 150 pF. Inmediatamente después de la electroporación, las células se transfirieron a medio de células dendríticas suplementado con plasma autólogo al 2%, HEPES 10 mM, GM-CSF 800 U/ml e IL-4800 U/ml. Las células se contaron y la suspensión se hizo alícuotas rápidamente bien para análisis de FACS™, aislamiento de ARN o ensayos funcionales y se colocaron en el incubador a 37°C y CO2 al 5%.
Ensayo funcional
En el ensayo funcional, las CD o K562 transfectadas con ARN, CD pulsadas con péptido o células tumorales sirvieron como estimuladores. Clones de LTC específicos de antígeno sirvieron como efectores. Para medir las capacidades estimuladoras, las CD u otras células se coincubaron primero con las células T, que se recogieron y usaron en cultivos de coincubación 8-14 días después de descongelar y reestimulación. La cantidad de IFN-y secretada por las células T activadas se midió en el enzimoinmunoanálisis de adsorción (ELISA).
Coincubación de células T2 pulsadas con péptido con células T
Para la coincubación de células T2 con LTC, se tomaron números menores. Para el pulsado con péptido exógeno, 1^10® células T2 se incubaron con péptido de tirosinasa YMD 10 pg/ml (YMDGTMSQV, Gene Center, LMU, Múnich), y p2-microglobulina humana 10 pg/ml (Calbiochem, San Diego, Estados Unidos). Cada 20 minutos las suspensiones celulares se agitaron. Después de una incubación de 2 h a 37°C y CO2 al 5%, la suspensión celular se lavó una vez para eliminar el péptido sin unir. Se coincubaron 100 pl de la suspensión de T2 pulsadas con péptido (1*104 células en medio RPMI 1640 suplementado con SFT al 12%) con 100 pl de la suspensión de LTC (2*103 células en medio de LTC suplementado con suero humano al 15%), dando una proporción de estimulador respecto a efector de 5:1.
Después de una coincubación de 24 h de efectores y estimuladores, 150 pl de cada sobrenadante se recogieron y almacenaron a -20°C. El sobrenadante se analizó en el enzimoinmunoanálisis de adsorción (ELISA).
Coincubación de CD o K562 con células T
12 h o 24 h después de la electroporación, 100 pl de la suspensión de células T (2*104 células en medio de coincubación) se añadieron a 100 pl de la suspensión de células transfectadas (2*104 o 4*104 células en medio de células dendríticas suplementado con plasma autólogo al 2% y GM-CSF 800 U/ml e IL-4800 U/ml), dando un total de 200 pl por pocillo de una placa de 96 pocillos y proporciones de estimulador respecto a efector de 1:4, 1:2, 1:1, 2:1 o 4:1.
CD sin transfectar se pulsaron exógenamente con péptidos añadiendo 10 pl de la solución de péptido (100 pl/ml) a 100 pl de suspensión de CD (4*104 células en medio de células dendríticas suplementado con plasma autólogo al 2% y g M-CSF 800 U/ml e IL-4800 U/ml). Después de una incubación de 2 h a 37°C y CO2 al 5%, se añadieron 100 pl de la suspensión de LTC (2*104 células en medio de coincubación de LTC), dando una proporción de estimulador respecto a efector de 2:1. Después de una coincubación de 24 h de efectores y estimuladores, 150 pl de cada sobrenadante se recogieron y almacenaron a -20°C.
ELISA de interferón gamma (IFN-y)
La medida de IFN-y en los sobrenadantes de cocultivo se realizó en ELISA usando el OptEIA™ Human IFN-y Set según las instrucciones del fabricante. Brevemente, las placas de ELISA se recubrieron con un anticuerpo de captura anti-IFN-Y de ratón y después se bloquearon con una solución que contenía SBF. En algunos casos, los sobrenadantes se diluyeron 1:2,5 en el medio de coincubación. El mismo medio se usó para hacer diluciones en serie del estándar de IFN-y. Después de que el IFN-y de sobrenadantes de cultivo celular o soluciones estándar se uniera a los anticuerpos de captura en las placas, se añadió el anticuerpo de detección anti-IFN-Y de ratón biotinilado junto con avidina conjugada a peroxidasa de rábano. Para visualizar los complejos consistentes en el anticuerpo de captura, IFN-y, anticuerpo de detección, biotina, avidina y peroxidasa de rábano, se añadió H2O2 (un sustrato para peroxidasa) en combinación con tetrametilbencidina (reactivos sustrato A y B mezclados), cambiando el color de la solución a azul. La reacción enzimática se paró con ácido ortofosfórico 1 M. Mediante ello, el color de la solución se volvió amarillo, siendo su intensidad directamente proporcional a la cantidad de sustrato procesada, es decir, indirectamente proporcional a la cantidad de IFN-y capturado. La absorción de la luz en la solución de reacción se midió a 450 nm. Se calcularon las concentraciones desconocidas de IFN-y con la ayuda de una curva estándar que se dibujó basada en concentraciones conocidas del estándar de IFN-y y absorbancias medidas correspondientes.
Ensayo de citotoxicidad
La actividad citolítica de la línea celular en masa separada terámero+CD8+ y los clones de células T, respectivamente,
se analizó en un ensayo de liberación de cromo de 4 h estándar. Se usaron las dos líneas celulares de melanoma de HLA coincidente Mel A375 (positiva para HLA-A2, negativa para tirosinasa), y Mel IL-2 (positiva para HLA-A2, positiva para tirosinasa). Brevemente, 106 células de melanoma diana se marcaron con 200 pCi de 51Cr durante 1-1,5 h. Las células diana marcadas con 51Cr se cultivaron con células T en 100 pl/pocillo de RPMI 1640 con SFT al 12% en placas de cultivo de 96 pocillos de fondo en V (Greiner, Solingen, Alemania). Para evaluar la eficacia de la lisis mediada por LTC, las células T se diluyeron en serie y después se cocultivaron con 103 células diana/pocillo para proporcionar proporciones graduadas de células efectoras respecto a células diana (E:D). Después de 4 h de cocultivo a 37°C, se recogieron 50 pl de sobrenadante y se midió la radioactividad en un contador gamma. El porcentaje de lisis específica se calculó como: 100 x (liberación experimental - liberación espontánea)/(liberación máxima - liberación espontánea). La liberación espontánea se evaluó incubando células diana en ausencia de células efectoras y en general fue menor del 14%.
Referencias
Becker, C., Pohla, H., Frankenberger, B., Assenmacher, M., Schendel, D.J. y Th. Blankenstein. 2001. Adoptive tumor therapy with T lymphocytes enriched through an IFND capture assay. Nature Med. 7(10): 1159-1162.
Dudley, M. E., Wunderlich, J. R., Robbins, P. F., Yang, J. C., Hwu, P., Schwartzentruber, D. J., Topalian, S. L., Sherry, R., Restifo, N. P., Hubicki, A. M., Robinson, M. R., Raffeld, M., Duray, P., Seipp, C. A., Rogers-Freezer, L., Morton, K. E., Mavroukakis, S. A., White, D. E., Rosenberg, S. A. (2002). Cancer regression and autoimmunity in patients after clonal repopulation with antitumor lymphocytes. Science 298:850-854.
Dudley, M.E. y Rosenberg, S.A. (2003). Adoptive-cell-transfer therapy for the treatment of patients with cancer. Nature Reviews Cancer 3: 666-675.
Engels, B., Nossner, E., Frankenberger, B., Blankenstein, Th., Schendel, D.J., y W. Uckert. 2005. Redirecting human T lymphocytes towards renal cell carcinoma-specificity by retroviral transfer of T cell receptor genes. Human Gene Ther., 16(7):79.9-810
Falk, C. S. y Schendel, D. J. (2002). Allogeneic MHC class I ligands and their role in positive and negative regulation of human cytotoxic effector cells. Human Immunol. 63:8-19.
Gao, L., Bellantuono, I., Elsasser, A., Marley, S. B., Gordon, M. Y., Goldmann, J. M., Stauss, H. J. (2000). Selective elimination of leukemic CD34+ progenitor cells by cytotoxic T lymphocytes specific for WT1. Blood 95: 2198-2203.
Gao, L., Yang, T. H., Tourdot, S., Sadovnikova, E., Hasserjian, R. y Stauss H. J. (1999). Allo-major-histocompatibility complex restricted cytotoxic T lymphocytes engraft in bone marrow transplant recipients without causing graft-versushost disease. Blood 94: 2999-3006.
Geiger, C., Regn, S., Noessner, E., Wilde, S., Frankenberger, B., Papier, B., Pohla, H., y D.J. Schendel. 2005. Development of a generic RNA-pulsed dendritic cell vaccine for renal cell carcinoma, J. Translational Medicine en prensa.
Gilboa-E y J. Viewig. 2004. Cancer immunotherapy with mRNA-transfected dendritic cells. Immunol. Rev. 199:251-63.
Kolb, H. J., Schmid, C., Barrett, A. J. y Schendel, D. J. (2004). Graft-versus-leukemia reactions in allogeneic chimeras. Blood 103:767-776.
Kolb, H.J., Schattenberg, A., Goldman, J.M., Hertenstein, B., Jacobsen, H., Arcese W., Ljungman, P., Ferrant, A., Verdonck, L. Niederwieser, B. et al. 1995. Graft-versus-leukemia effect of donor lymphocyte transfusions in marrow grafted patients. Blood 86:2041.
Levings, M.K. y M.G. Roncarolo. 2005. Phenotypic and functional differences between human CD4+CD25+ and type 1 regulatory T cells. Curr. Top. Microbiol. Immunol. 293:303-326.
Liao, X., Yongging, L., Bonini, C., Nair, S., Gilboa, E., Greenberg, P. D., Yee, C. (2004). Transfection of RNA encoding tumor antigens following maturation of dendritic cells leads to prolonged presentation of antigen and the generation of high-affinity tumor-reactive cytotoxic T lymphocytes. Mol. Ther. 9: 757-764.
Nair, S.K., Boczkowski, D., Morse, M., Cumming, R.I., Lyerly, H.K. y Gilboa, E. (1998). Induction of primary carcinoembryonic antigen (CEA)-specific cytotoxic T lymphocytes in vitro using human dendritic cells transfected with RNA. Nat. Biotechnol. 16(4): 364-369.
Napolitani, G., Rinaldi, A., Bertoni, F., Salllusto, F. y A. Lanzavecchia. 2005. Selected Toll-like receptor agonist combinations synergistically trigger a T helper type-1 polarizing programme in dendritic cells. Nat. Immunol. 6(8): 769 76.
Regn, S., Chen, X., Schendel, D., Kolb, H.-J. y M.A. Roskrow. 2001. The generation of monospecific and bispecific anti-viral cytotoxic T lymphocytes (CTL) for the prophylaxis of patients receiving an allogeneic bone marrow transplant. Bone Marrow Transplant. 27: 53-64.
Schaft, N, Dorrie, J., Thuman, P., Beck, V.E., Muller, I., Schultz, E.S., Kampgen, E., Dieckmann, D. y Schuler, G. 2005. Generation of an optimized polyvalent monocyte-derived dendritic cell vaccine by transfecting defined RNA after rather than before maturation. J. Immunol. 174(5): 3087-97.
Schendel, D.J., Wank, R. y B. Dupont. 1979. Standardizaron of the human in vitro cell-mediated lympholysis technique. Tissue Antigens 13: 112-120.
Schendel, D.J., Maget, B., Falk, C.S. y R. Wank. Human CD8+ T lymphocytes. 1997. En: The Immunology Methods Manual. (I. Lefkovits, Ed.) págs. 670-690, Academic Press Ltd., Londres.
Su, Z., Peluso, M.V., Raffegerst, S.H., Schendel, D.J., y M.A. Roskrow. 2001. LMP2a-specific cytotoxic T lymphocytes for the treatment of patients with relapsed EBV-positive Hodgkin disease. Eur. J. Immunol. 31: 947-958.
Su, Z., Peluso, M.V., Raffergerst, S.H., Schendel, D.J. y Roskrow, M. 2002. Antigen presenting cells transfected with LMP2a RNA induce CD4+ LMP2a-specific cytotoxic T lymphocytes which kill via a Fas-independent mechanism. Leuk. Lymphoma 43(8): 1651-62.
Toes, R.E., Schoenberger, S.P., van der Voort, E.I., Offringa, R. y Melief, C.J. 1998. CD40-CD40Ligand interactions and their role in cytotoxic T lymphocyte priming and anti-tumor immunity. Semin. Immunol. 10(6): 443-8.
Yee, C., Savage, P.A., Lee, P.P., Davis, M.M. y P.D. Greenberg. 1999. Isolation of high avidity melanoma-reactive CTL from heterogenous populations using peptide-MHC-tetramers. J. Immunol. 162(4):2227-34.
Referencias adicionales
Belinda Palermo, Silvia Garbelli, Stefania Mantovani, Elisabetta Scoccia, Gian Antonio Da Prada, Paola Bernabei, M. Antonietta Avanzini, Valeria Brazzelli, Giovanni Borroni y Claudia Giachino (2005). Qualitative difference between the cytotoxic T lymphocyte responses to melanocyte antigens in melanoma and vitiligo. Eur. J. Immunol. 35: 3153-3162.
Cassian Yee, Peter A. Savage, Peter P. Lee, Mark M. Davis, y Philip D. Greenberg (1999). Isolation of High Avidity Melanoma-Reactive CTL from Heterogeneous Populations Using Peptide-MHC Tetramers. The Journal of Immunology: 2227-2234.
Matthias Wolfl, Stefan Schalk, Martin Hellmich, Katharina M. Huster, Dirk H. Busch, y Frank Berthold (2004). Quantitation of MHC Tetramer-Positive Cells From Whole Blood: Evaluation of a Single-Platform, Six-Parameter Flow Cytometric Method. Wiley-Liss, Inc. Cytometry Part A 57A:120-130.
Claims (6)
- REIVINDICACIONESi. Célula T CD4+ humana específica de antígeno alorrestringida, que puede obtenerse por un método que comprende las etapas de:a) proporcionar un ácido nucleico que codifica una molécula de MHC de clase II derivada del paciente y un antígeno o un ácido nucleico que codifica dicho antígeno, en donde el antígeno es un antígeno asociado a tumor seleccionado de neoplasias hematológicas;b) cotransfectar o introducir ambos compuestos como se han definido en a) en células presentadoras de antígenos (CPA) derivadas de un donante sano, en donde dichas CPA son células dendríticas maduras; c) sensibilizar linfocitos de sangre periférica (LSP) que son autólogos en vista de las CPA y que derivan del donante sano con dichas CPA;d) seleccionar células T CD4+ humanas que son específicas para el ligando MHC-antígeno para uso en un método para el tratamiento de neoplasias hematológicas.
- 2. Célula T CD4+ humana específica de antígeno alorrestringida para uso según la reivindicación 1, en donde el método comprende además la etapa de e) clonar el receptor de células T (TCR) de las células T CD4+ aisladas, y opcionalmente comprende f) expresar transgenes de TCR en CMSP.
- 3. Célula T CD4+ humana específica de antígeno alorrestringida para uso según la reivindicación 1 o 2, en donde la molécula de MHC se selecciona de HLA-DP, HLA-DQ o HLA-DR.
- 4. CMSP, que se ha transformado con un vector que comprende un ácido nucleico que codifica un TCR transgénico obtenible por las etapas de método a) a d) según la reivindicación 1 y e) y opcionalmente f) según la reivindicación 2 para uso en un método para el tratamiento de neoplasias hematológicas.
- 5. Composición farmacéutica, que comprende células T CD4+ según cualquiera de las reivindicaciones 1-3 o la CMSP según la reivindicación 4 y un soporte farmacéuticamente aceptable para uso en un método para el tratamiento de neoplasias hematológicas.
- 6. Composición farmacéutica para uso según la reivindicación 5, que es una infusión, inyección o una vacuna.
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| EP05017128 | 2005-08-05 | ||
| EP06007539 | 2006-04-10 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| ES2842878T3 true ES2842878T3 (es) | 2021-07-15 |
Family
ID=37598202
Family Applications (2)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| ES10179257T Active ES2672895T3 (es) | 2005-08-05 | 2006-08-04 | Generación de células T específicas de antígeno |
| ES18161391T Active ES2842878T3 (es) | 2005-08-05 | 2006-08-04 | Generación de células T específicas de antígeno |
Family Applications Before (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| ES10179257T Active ES2672895T3 (es) | 2005-08-05 | 2006-08-04 | Generación de células T específicas de antígeno |
Country Status (11)
| Country | Link |
|---|---|
| US (2) | US8486694B2 (es) |
| EP (3) | EP2327763B1 (es) |
| JP (3) | JP5079697B2 (es) |
| AT (1) | ATE484578T1 (es) |
| DE (1) | DE602006017556D1 (es) |
| DK (2) | DK2327763T3 (es) |
| ES (2) | ES2672895T3 (es) |
| HU (1) | HUE038833T2 (es) |
| PL (1) | PL2327763T3 (es) |
| PT (1) | PT2327763T (es) |
| WO (1) | WO2007017201A1 (es) |
Families Citing this family (58)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| DE10112851C1 (de) | 2001-03-16 | 2002-10-10 | Gsf Forschungszentrum Umwelt | Semi-allogene Antitumor-Vakzine mit HLA-haplo-identischen Antigen-präsentierenden Zellen |
| WO2006036445A2 (en) | 2004-09-24 | 2006-04-06 | Trustees Of Dartmouth College | Chimeric nk receptor and methods for treating cancer |
| EP2327763B1 (en) * | 2005-08-05 | 2018-03-14 | Helmholtz Zentrum München Deutsches Forschungszentrum für Gesundheit und Umwelt GmbH | Generation of antigen specific T cells |
| EP2098536A1 (en) | 2008-03-05 | 2009-09-09 | 4-Antibody AG | Isolation and identification of antigen- or ligand-specific binding proteins |
| CN102272153B (zh) | 2008-11-24 | 2015-04-15 | 德国慕尼黑亥姆霍兹研究中心健康和环境有限公司 | 高亲和力t细胞受体及其应用 |
| AU2010210083C1 (en) * | 2009-02-09 | 2015-11-26 | Helmholtz Zentrum Muenchen Deutsches Forschungszentrum Fuer Gesundheit Und Umwelt (Gmbh) | Repertoire of allo-restricted peptide-specific T cell receptor sequences and use thereof |
| WO2011059836A2 (en) | 2009-10-29 | 2011-05-19 | Trustees Of Dartmouth College | T cell receptor-deficient t cell compositions |
| US9273283B2 (en) | 2009-10-29 | 2016-03-01 | The Trustees Of Dartmouth College | Method of producing T cell receptor-deficient T cells expressing a chimeric receptor |
| US12492376B2 (en) | 2009-10-29 | 2025-12-09 | The Trustees Of Dartmouth College | T-cell receptor-deficient T cell compositions |
| US9586997B2 (en) * | 2010-09-20 | 2017-03-07 | Biontech Cell & Gene Therapies Gmbh | Antigen-specific T cell receptors and T cell epitopes |
| US9833476B2 (en) | 2011-08-31 | 2017-12-05 | The Trustees Of Dartmouth College | NKP30 receptor targeted therapeutics |
| EP3766896B1 (en) * | 2011-09-15 | 2025-11-05 | The United States of America, as represented by The Secretary, Department of Health and Human Services | T cell receptors recognizing hla-a1- or hla-cw7-restricted mage |
| CN110511278B (zh) | 2012-05-07 | 2024-08-09 | 达特茅斯大学理事会 | 抗b7-h6抗体、融合蛋白及其使用方法 |
| SG11201407819UA (en) * | 2012-06-11 | 2014-12-30 | Wolf Wilson Mfg Corp | Improved methods of cell culture for adoptive cell therapy |
| AU2013308409A1 (en) | 2012-08-31 | 2015-03-26 | University Of Birmingham | Target peptides for immunotherapy and diagnostics |
| AU2013312529A1 (en) | 2012-09-05 | 2015-04-16 | The University Of Birmingham | Target peptides for colorectal cancer therapy and diagnostics |
| GB2508414A (en) * | 2012-11-30 | 2014-06-04 | Max Delbrueck Centrum | Tumour specific T cell receptors (TCRs) |
| US10357515B2 (en) | 2013-11-22 | 2019-07-23 | Cellectis | Method for generating batches of allogeneic T-cells with averaged potency |
| AU2015231041B2 (en) | 2014-03-20 | 2020-07-16 | H. Lee Moffitt Cancer Center And Research Institute, Inc. | Tumor-infiltrating lymphocytes for adoptive cell therapy |
| AU2015247727A1 (en) | 2014-04-15 | 2016-11-03 | University Of Virginia Patent Foundation | Isolated T cell receptors and methods of use therefor |
| JP6599450B2 (ja) * | 2014-10-02 | 2019-10-30 | アメリカ合衆国 | がん特異的突然変異に対し抗原特異性を有するｔ細胞を単離する方法 |
| AU2014407539B2 (en) * | 2014-10-02 | 2020-10-22 | The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services | Methods of isolating T cell receptors having antigenic specificity for a cancer-specific mutation |
| EP3215164A1 (en) | 2014-11-03 | 2017-09-13 | Immures S.r.l. | T cell receptors |
| CA2964785A1 (en) * | 2014-11-05 | 2016-05-12 | Board Of Regents, The University Of Texas System | Gene modified immune effector cells and engineered cells for expansion of immune effector cells |
| ES2784261T3 (es) * | 2014-11-26 | 2020-09-23 | Us Health | Receptores de células T anti-KRAS mutado |
| SG11201707540QA (en) * | 2015-03-16 | 2017-10-30 | Max-Delbrück-Centrum Für Molekulare Medizin In Der Helmholtz-Gemeinschaft | Method of detecting new immunogenic t cell epitopes and isolating new antigen-specific t cell receptors by means of an mhc cell library |
| HK1253693A1 (zh) | 2015-06-01 | 2019-06-28 | Medigene Immunotherapies Gmbh | 产生抗t细胞受体的抗体的方法 |
| JP6568239B2 (ja) | 2015-06-01 | 2019-08-28 | メディジーン イミュノテラピーズ ゲーエムベーハー | Ｔ細胞受容体ライブラリ |
| WO2017023801A1 (en) | 2015-07-31 | 2017-02-09 | Regents Of The University Of Minnesota | Intracellular genomic transplant and methods of therapy |
| EP3901169A1 (en) * | 2015-09-15 | 2021-10-27 | The United States of America, as represented by the Secretary, Department of Health and Human Services | T cell receptors recognizing hla-cw8 restricted mutated kras |
| GB201520550D0 (en) | 2015-11-23 | 2016-01-06 | Immunocore Ltd & Adaptimmune Ltd | Peptides |
| JP6697562B2 (ja) | 2015-12-23 | 2020-05-20 | メディジーン イミュノテラピーズ ゲーエムベーハー | 樹状細胞組成物 |
| CN109310709A (zh) * | 2015-12-30 | 2019-02-05 | 细胞基因公司 | T淋巴细胞生产方法和由此产生的t淋巴细胞 |
| MA45491A (fr) * | 2016-06-27 | 2019-05-01 | Juno Therapeutics Inc | Épitopes à restriction cmh-e, molécules de liaison et procédés et utilisations associés |
| CN109996868A (zh) * | 2016-09-23 | 2019-07-09 | 弗雷德哈钦森癌症研究中心 | 特异性用于次要组织相容性(h)抗原ha-1的tcr及其用途 |
| EP4338799A3 (en) | 2016-10-18 | 2024-06-05 | Regents of the University of Minnesota | Tumor infiltrating lymphocytes and methods of therapy |
| EP3645021A4 (en) | 2017-06-30 | 2021-04-21 | Intima Bioscience, Inc. | ADENO-ASSOCIATED VIRAL VECTORS FOR GENE THERAPY |
| TWI837109B (zh) * | 2017-12-28 | 2024-04-01 | 美商磨石生物公司 | 靶向共有抗原之抗原結合蛋白 |
| JP7181517B2 (ja) * | 2018-01-23 | 2022-12-01 | 国立大学法人三重大学 | Ｔ細胞レセプター |
| US11267864B2 (en) | 2018-02-26 | 2022-03-08 | Medigene Immunotherapies Gmbh | Nyeso tcr |
| AU2019324162A1 (en) * | 2018-08-22 | 2021-03-04 | Fred Hutchinson Cancer Center | Immunotherapy targeting KRAS or Her2 antigens |
| JP2022500034A (ja) * | 2018-09-10 | 2022-01-04 | トルク セラピューティクス， インコーポレイテッド | 抗原特異的ｔリンパ球ならびに抗原特異的ｔリンパ球を作製および使用する方法 |
| WO2020069452A1 (en) * | 2018-09-27 | 2020-04-02 | Genocea Biosciences, Inc. | Treatment methods |
| EP3894544A4 (en) * | 2018-12-12 | 2023-03-29 | The Brigham & Women's Hospital, Inc. | Compositions and methods for immunosuppression |
| TWI850360B (zh) | 2019-04-04 | 2024-08-01 | 德商梅迪基因免疫治療公司 | 黑色素瘤相關抗原１（ｍａｇｅａ１）特異性ｔ細胞受體及其用途 |
| JP7340144B2 (ja) * | 2019-10-02 | 2023-09-07 | アメリカ合衆国 | がん特異的突然変異に対し抗原特異性を有するｔ細胞を単離する方法 |
| JP6878544B2 (ja) * | 2019-10-02 | 2021-05-26 | アメリカ合衆国 | がん特異的突然変異に対し抗原特異性を有するｔ細胞を単離する方法 |
| WO2021163434A1 (en) * | 2020-02-12 | 2021-08-19 | The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services | Hla class i-restricted t cell receptors against ras with g12d mutation |
| JP2020143057A (ja) * | 2020-04-01 | 2020-09-10 | アメリカ合衆国 | がん特異的突然変異に対し抗原特異性を有するｔ細胞受容体を単離する方法 |
| CN115397863A (zh) | 2020-04-01 | 2022-11-25 | 基因医疗免疫疗法有限责任公司 | Cd3融合蛋白及其用途 |
| TW202208617A (zh) * | 2020-05-04 | 2022-03-01 | 美商艾歐凡斯生物治療公司 | 用於產生腫瘤浸潤性淋巴球的過程及其在免疫療法中的用途 |
| WO2022038115A1 (en) | 2020-08-18 | 2022-02-24 | Medigene Immunotherapies Gmbh | ENRICHMENT OF T CELLS USING AN ANTI-Cß ANTIBODY |
| CA3193353A1 (en) | 2020-09-24 | 2022-03-31 | Carina WEHNER | Prame specific t-cell receptors and uses thereof |
| KR20230125204A (ko) * | 2020-11-25 | 2023-08-29 | 지니우스 바이오테크놀로지 인코포레이티드 | 항원 특이적인 t 세포 및 이의 제조 및 이용 방법 |
| EP4259206A4 (en) * | 2020-12-14 | 2025-07-09 | Biontech Us Inc | TISSUE-SPECIFIC ANTIGENS FOR CANCER IMMUNOTHERAPY |
| WO2023175069A1 (en) | 2022-03-16 | 2023-09-21 | Medigene Immunotherapies Gmbh | Tcr constant region pairing library for pramevld tcrs |
| EP4493583A1 (en) | 2022-03-16 | 2025-01-22 | Medigene Immunotherapies GmbH | Tcr constant region pairing library |
| GB2640828A (en) * | 2024-04-22 | 2025-11-12 | T Therapeutics Ltd | Methods and products for the generation and identification of T cells and TCRs |
Family Cites Families (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US6805861B2 (en) | 1996-01-17 | 2004-10-19 | Imperial College Innovations Limited | Immunotherapy using cytotoxic T lymphocytes (CTL) |
| ATE328279T1 (de) * | 2002-08-23 | 2006-06-15 | Deutsches Rheuma Forschungszen | Verfahren zum nachweis und zur isolierung von t- lymphozyten, die ein definiertes antigen erkennen |
| EP2327763B1 (en) * | 2005-08-05 | 2018-03-14 | Helmholtz Zentrum München Deutsches Forschungszentrum für Gesundheit und Umwelt GmbH | Generation of antigen specific T cells |
-
2006
- 2006-08-04 EP EP10179257.0A patent/EP2327763B1/en active Active
- 2006-08-04 ES ES10179257T patent/ES2672895T3/es active Active
- 2006-08-04 EP EP18161391.0A patent/EP3369812B1/en active Active
- 2006-08-04 DK DK10179257.0T patent/DK2327763T3/en active
- 2006-08-04 WO PCT/EP2006/007752 patent/WO2007017201A1/en not_active Ceased
- 2006-08-04 PT PT101792570T patent/PT2327763T/pt unknown
- 2006-08-04 AT AT06776623T patent/ATE484578T1/de active
- 2006-08-04 EP EP06776623A patent/EP1910521B1/en active Active
- 2006-08-04 US US11/990,054 patent/US8486694B2/en active Active
- 2006-08-04 DK DK06776623.8T patent/DK1910521T3/da active
- 2006-08-04 HU HUE10179257A patent/HUE038833T2/hu unknown
- 2006-08-04 ES ES18161391T patent/ES2842878T3/es active Active
- 2006-08-04 JP JP2008524450A patent/JP5079697B2/ja active Active
- 2006-08-04 DE DE602006017556T patent/DE602006017556D1/de active Active
- 2006-08-04 PL PL10179257T patent/PL2327763T3/pl unknown
-
2012
- 2012-07-10 JP JP2012154420A patent/JP2012213402A/ja active Pending
-
2013
- 2013-07-12 US US13/940,715 patent/US20140141026A1/en not_active Abandoned
-
2016
- 2016-02-05 JP JP2016020781A patent/JP2016135127A/ja active Pending
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JP2016135127A (ja) | 2016-07-28 |
| JP5079697B2 (ja) | 2012-11-21 |
| US20100189728A1 (en) | 2010-07-29 |
| EP1910521B1 (en) | 2010-10-13 |
| DK2327763T3 (en) | 2018-05-22 |
| WO2007017201A1 (en) | 2007-02-15 |
| EP3369812A1 (en) | 2018-09-05 |
| DK1910521T3 (da) | 2011-02-07 |
| EP2327763B1 (en) | 2018-03-14 |
| EP2327763A1 (en) | 2011-06-01 |
| ES2672895T3 (es) | 2018-06-18 |
| US20140141026A1 (en) | 2014-05-22 |
| PT2327763T (pt) | 2018-05-11 |
| US8486694B2 (en) | 2013-07-16 |
| EP3369812B1 (en) | 2020-10-07 |
| HUE038833T2 (hu) | 2018-11-28 |
| ATE484578T1 (de) | 2010-10-15 |
| DE602006017556D1 (de) | 2010-11-25 |
| JP2012213402A (ja) | 2012-11-08 |
| PL2327763T3 (pl) | 2018-08-31 |
| JP2009502185A (ja) | 2009-01-29 |
| EP1910521A1 (en) | 2008-04-16 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| ES2842878T3 (es) | Generación de células T específicas de antígeno | |
| JP7258364B2 (ja) | がんおよび関連悪性腫瘍の治療のためのγδＴ細胞を活性化、修飾、および増殖させる方法 | |
| TWI872076B (zh) | 病毒載體及其在授受性細胞療法之應用 | |
| ES2959443T3 (es) | Uso del dominio de señalización de CD2 en receptores de antígenos quiméricos de segunda generación | |
| US10072246B2 (en) | Enhanced generation of cytotoxic T lymphocytes by IL-21 mediated FoxP3 suppression | |
| JP7604000B2 (ja) | 改変ヒト初代血液樹状細胞株を生成するための方法 | |
| JP5156382B2 (ja) | Ｔ細胞集団の製造方法 | |
| AU2006323961A1 (en) | Methods for generating antigen-specific effector T cells | |
| EP3259284B1 (en) | A fully-human t cell receptor specific for the 369-377 epitope derived from the her2/neu (erbb2) receptor protein | |
| HUE034907T2 (hu) | Humán antigén-prezentáló sejtek T-sejteket stimuláló képességének a fokozására in vitro és in vivo, valamint azok alkalmazása vakcinázásra | |
| US8232101B2 (en) | Identification of antigenic peptides from multiple myeloma cells | |
| WO2012096376A1 (ja) | 制御性ｔ細胞の製造方法 | |
| WO2017189705A1 (en) | Dll4-expressing cells and vaccine using the same | |
| HK40037307A (en) | A fully-human t cell receptor specific for the 369-377 epitope derived from the her2/neu (erbb2) receptor protein | |
| HK40037307B (en) | A fully-human t cell receptor specific for the 369-377 epitope derived from the her2/neu (erbb2) receptor protein | |
| WO2007025554A1 (en) | Method for the generation of antigen-specific t-cells and uses thereof | |
| HK1247626B (en) | A fully-human t cell receptor specific for the 369-377 epitope derived from the her2/neu (erbb2) receptor protein |