ES2983493T3 - Métodos y composiciones para identificar y tratar sujetos en riesgo de colitis asociada a la terapia de bloqueo de puntode regulación - Google Patents
Métodos y composiciones para identificar y tratar sujetos en riesgo de colitis asociada a la terapia de bloqueo de puntode regulación Download PDFInfo
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Abstract
La presente invención se refiere a métodos y composiciones para identificar sujetos tratados o considerados para el tratamiento con agentes terapéuticos de bloqueo de puntos de control que tienen un riesgo mayor o menor de desarrollar colitis asociada a la terapia de puntos de control, mediante el análisis del microbioma intestinal de esos sujetos. Se basa, al menos en parte, en el descubrimiento de que la abundancia de cierta microbiota intestinal de los filos Bacteroidetes, incluidas las bacterias de las familias Bacteroidaceae, Rikenellaceae y Barnesisllaceae, y/o un aumento o disminución de las vías genéticas microbianas implicadas en el transporte de poliaminas y/o la biosíntesis de vitamina B (por ejemplo, (riboflavina (B2), pantotenato (B5) y tiamina (B1)) están asociadas con la probabilidad de desarrollar colitis asociada a la terapia de puntos de control. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)
Description
DESCRIPCIÓN
Métodos y composiciones para identificar y tratar sujetos en riesgo de colitis asociada a la terapia de bloqueo de punto de regulación
1. Introducción
La presente invención se refiere a métodos para identificar sujetos tratados con agentes bloqueadores de puntos de regulación que tienen mayor o menor riesgo de desarrollar colitis asociada a la terapia de bloqueo de punto de regulación, mediante el análisis del microbioma intestinal de esos sujetos, y a composiciones terapéuticas y métodos relacionados para reducir el riesgo de colitis asociada a la terapia de bloqueo de punto de regulación. La invención se define en las reivindicaciones adjuntas.
2. Antecedentes de la invención
El intestino de los mamíferos está densamente colonizado por cientos de especies microbianas que coexisten simbióticamente con sus huéspedes. Los microbios, denominados colectivamente microbiota intestinal, forman el microbioma intestinal y contribuyen a numerosos aspectos de la salud del huésped, que incluyen el metabolismo de los nutrientes, la homeostasis de los tejidos intestinales, el desarrollo de respuestas inmunitarias innatas y adaptativas y, de manera más general, la defensa contra la infección intestinal. Los individuos sanos albergan distintas poblaciones microbianas en su tubo intestinal que varían notablemente en composición. La identificación de las especies microbianas que promueven la homeostasis u otros beneficios para la salud y aquellas que provocan inflamación o tienen otros efectos dañinos o perjudiciales sigue siendo difícil en el contexto clínico, particularmente en enfermedades inflamatorias crónicas tales como la enfermedad inflamatoria intestinal (IBD). Ciertas bacterias se expanden preferentemente tras la inflamación, lo que altera la composición de la microbiota intestinal. Por lo tanto, como la mayoría de los pacientes buscan atención médica después de que se ha desarrollado la inflamación, es difícil definir la composición de la microbiota del microbioma intestinal que antecede al desarrollo de la colitis.
Ipilimumab, un anticuerpo monoclonal que bloquea la molécula coinhibidora CTLA-4, es una terapia inmunomoduladora que actúa mediante inhibición/bloqueo de punto de regulación y proporciona un tratamiento eficaz contra el melanoma metastásico. La inhibición de la señalización de CTLA-4 amortigua la regulación negativa de las células T, de esta manera mejora las respuestas antitumorales porque las células T modulan las respuestas inmunitarias en el cuerpo. Al principio del tratamiento, muchos receptores de ipilimumab desarrollan inflamación intestinal como resultado de la desregulación inmunológica de las mucosas. Es beneficioso identificar a los sujetos con mayor riesgo, con relación a otros receptores de ipilimumab, de desarrollar inflamación intestinal y colitis asociada. El documento US2015/238544A1 describe composiciones de terapia de restablecimiento de la microbiota y métodos para fabricar, procesar y/o suministrar composiciones de terapia de restablecimiento de la microbiota. El documento WO2015/166492 A2 describe un método para determinar la tolerancia a un agente en un sujeto sano. Vetizou y otros (Science, 2015, 350:6264, p1079-1084) describe que los efectos antitumorales del bloqueo de CTLA-4 dependen de distintas especies de Bacteroides.
3. Resumen de la invención
En un aspecto, la invención proporciona un método para identificar a un sujeto con mayor o menor riesgo de desarrollar colitis asociada a la terapia de bloqueo de punto de regulación o que probablemente experimente colitis asociada a la terapia de bloqueo de punto de regulación más o menos grave, el método comprende:
determinar el nivel de una o más bacterias o esporas de las mismas de la familia Bacteroidaceae en una muestra obtenida del microbioma intestinal de un sujeto tratado con una terapia de bloqueo de punto de regulación que comprende un inhibidor de CTLA-4;
comparar el nivel de la una o más bacterias o esporas en la muestra con al menos un nivel de bacterias de referencia; en donde un nivel más bajo de la una o más bacterias o esporas de las mismas en la muestra en comparación con al menos un nivel de bacterias de referencia indica que el sujeto tiene un mayor riesgo de desarrollar colitis asociada a la terapia de bloqueo de punto de regulación o probablemente experimente colitis asociada a la terapia de bloqueo de punto de regulación más grave; y
en donde un mayor nivel de la una o más bacterias o esporas de las mismas en la muestra en comparación con al menos un nivel de bacterias de referencia indica que el sujeto tiene un menor riesgo de desarrollar colitis asociada a la terapia de bloqueo de punto de regulación o probablemente experimente colitis asociada a la terapia de bloqueo de punto de regulación menos grave.
En una modalidad, la determinación del nivel de una o más bacterias o esporas de las mismas de la familia Bacteroidaceae en el microbioma intestinal de un sujeto comprende la determinación en una muestra fecal del sujeto.
En una modalidad, la determinación del nivel de una o más bacterias o esporas de las mismas de la familia Bacteroidaceae en el microbioma intestinal de un sujeto comprende realizar una secuenciación metagenómica para identificar biomarcadores asociados con las bacterias o esporas de las mismas.
En una modalidad, el nivel de bacterias de referencia se basa en la abundancia relativa de las bacterias o esporas de las mismas en comparación con otras bacterias en el microbioma intestinal.
En una modalidad, el método comprende determinar el nivel de dos o más bacterias o esporas de las mismas de la familia Bacteroidaceae en el microbioma intestinal de un sujeto y comparar los niveles con dos niveles de bacterias de referencia para las respectivas bacterias o esporas.
En una modalidad, el inhibidor de CTLA-4 es un anticuerpo anti-CTLA-4 o un fragmento de anticuerpo del mismo. La presente invención se refiere a métodos para analizar el microbioma intestinal de sujetos tratados, o que se pretende tratar, con agentes terapéuticos de bloqueo de punto de regulación para identificar sujetos con mayor o menor riesgo de desarrollar colitis asociada a la terapia de bloqueo de punto de regulación. Se basa, al menos en parte, en los resultados de experimentos que utilizan secuenciación metagenómica de nueva generación para identificar biomarcadores asociados con la resistencia a la colitis inmunomediada de nueva aparición en el contexto de la terapia de bloqueo de punto de regulación, que incluyen los descubrimientos de que el aumento de la abundancia fecal del filo Bacteroidetes y tres de sus familias (Bacteroidaceae, Rikenellaceae y Barnesiellaceae), así como también las vías genéticas microbianas involucradas en el transporte de poliaminas y la biosíntesis de vitamina B (por ejemplo, riboflavina (B2), pantotenato (B5) y tiamina (B1)) se correlaciona positivamente con la resistencia al desarrollo de colitis después de la terapia de bloqueo de punto de regulación.
En la presente descripción se describe una composición farmacéutica que incluye una o más bacterias aisladas o esporas de las mismas, en donde las bacterias aisladas o esporas de las mismas son miembros de las Bacteriodetes, y que incluye además un portador farmacéutico biocompatible. Las bacterias aisladas o esporas de las mismas pueden ser un miembro de la familia Bacteroidaceae, un miembro de la familia Rikenellaceae y/o un miembro de la familia Barnesiellaceae.
En la presente descripción se describe además una composición farmacéutica que incluye una o más bacterias aisladas o esporas de las mismas, en donde las bacterias aisladas o esporas de las mismas incluyen al menos un módulo genético bacteriano para el transporte de poliaminas o la biosíntesis de vitamina B, y que incluye además un portador farmacéutico biocompatible. El al menos un módulo genético bacteriano para la biosíntesis de vitamina B puede ser para la biosíntesis de riboflavina, para la biosíntesis de pantotenato y/o para la biosíntesis de tiamina. Las bacterias aisladas o esporas de las mismas pueden incluir al menos dos, al menos tres o al menos cuatro módulos genéticos bacterianos para el transporte de poliaminas o la biosíntesis de vitamina B.
Cualquiera de las composiciones anteriores puede tener las siguientes características adicionales, que pueden combinarse entre sí y con otros aspectos de la descripción a menos que sean claramente excluyentes entre sí. La bacteria aislada puede ser una célula recombinante. La bacteria aislada o esporas de la misma pueden estar presentes en un conglomerado. La composición puede formularse para administración oral, nasogástrica o rectal. La composición puede ser un líquido, suspensión, polvo seco, comprimido, cápsula o producto alimenticio. La composición puede incluir además una bacteria probiótica, una levadura probiótica o una de sus combinaciones; un prebiótico; un posbiótico; un antibiótico; o una de sus combinaciones. La una o más bacterias aisladas o esporas de las mismas pueden estar presentes en una cantidad que puede reducir el riesgo o la gravedad de la colitis asociada a la terapia de bloqueo de punto de regulación en un sujeto al que se le administra la composición.
En la presente descripción se describe además un método para tratar la colitis asociada al bloqueo de punto de regulación en un sujeto mediante la administración al sujeto de una cantidad con eficacia terapéutica de cualquiera de las composiciones anteriores.
En la presente descripción se describe además el uso de cualquiera de las composiciones anteriores para el tratamiento de la colitis asociada al bloqueo de punto de regulación en un sujeto. El uso puede incluir administrar al sujeto una cantidad con eficacia terapéutica de la composición.
En la presente descripción se describe además un método para identificar sujetos con mayor o menor riesgo de desarrollar colitis asociada a la terapia de bloqueo de punto de regulación o que probablemente experimenten colitis asociada a la terapia de bloqueo de punto de regulación más o menos grave. El método incluye determinar el nivel de una o más bacterias o esporas de las mismas del filo Bacteriodetes o una o más bacterias o esporas de las mismas que incluyen al menos un módulo genético bacteriano para el transporte de poliaminas o la biosíntesis de vitamina B en el microbioma intestinal de un sujeto y comparar el nivel de la una o más bacterias o esporas en el mismo con al menos un nivel de bacterias de referencia. El método incluye además diagnosticar que el sujeto tiene un mayor riesgo de desarrollar colitis asociada a la terapia de bloqueo de punto de regulación o probablemente experimente colitis asociada a la terapia de bloqueo de punto de regulación más grave si el nivel de una o más bacterias o esporas de las mismas es menor que al menos un nivel de bacterias de referencia, o diagnosticar que el sujeto tiene un riesgo menor de desarrollar colitis asociada a la terapia de bloqueo de punto de regulación o que probablemente experimente colitis asociada a la terapia de bloqueo de punto de regulación menos grave si el nivel de una o más bacterias o esporas de las mismas es mayor que al menos un nivel de bacterias de referencia. La una o más bacterias o esporas de las mismas en el filo Bacteriodetes pueden incluir una o más bacterias o esporas de las mismas en la familia Bacteroidaceae, en la familia Rikenellaceae y/o en la familia Barnesiellaceae. El al menos un módulo genético bacteriano para la biosíntesis de vitamina B puede incluir un módulo genético bacteriano para la biosíntesis de riboflavina, para la biosíntesis de pantotenato y/o para la biosíntesis de tiamina.
Cualquiera de los métodos anteriores puede tener las siguientes características adicionales, que pueden combinarse entre sí y con otros aspectos de la descripción a menos que sean claramente excluyentes entre sí. La determinación del nivel de una o más bacterias o esporas de las mismas del filo Bacteriodetes o una o más bacterias o esporas de las mismas que incluyen al menos un módulo genético bacteriano para el transporte de poliaminas o la biosíntesis de vitamina B en el microbioma intestinal de un sujeto puede incluir la determinación en una muestra fecal del sujeto. La determinación del nivel de una o más bacterias o esporas de las mismas del filo Bacteriodetes o una o más bacterias o esporas de las mismas que incluyen al menos un módulo genético bacteriano para el transporte de poliaminas o la biosíntesis de vitamina B en el microbioma intestinal de un sujeto puede incluir realizar una secuenciación metagenómica para identificar biomarcadores asociados con las bacterias o esporas de las mismas. El nivel de bacterias de referencia puede basarse en la abundancia relativa de las bacterias o esporas de las mismas en comparación con otras bacterias en el microbioma intestinal. El método puede incluir determinar el nivel de dos o más bacterias o esporas de las mismas del filo Bacteriodetes o una o más bacterias o esporas de las mismas que incluyen al menos un módulo genético bacteriano para el transporte de poliaminas o la biosíntesis de vitamina B en el microbioma intestinal de un sujeto y comparar los niveles con dos niveles de bacterias de referencia para las respectivas bacterias o esporas.
En la presente descripción se describe además un método para identificar sujetos con mayor o menor riesgo de desarrollar colitis asociada a la terapia de bloqueo de punto de regulación o que probablemente experimenten colitis asociada a la terapia de bloqueo de punto de regulación más o menos grave. El método incluye determinar el nivel de al menos un módulo genético bacteriano para el transporte de poliaminas o la biosíntesis de vitamina B en el microbioma intestinal de un sujeto y comparar el nivel del al menos un módulo genético bacteriano con al menos un nivel de módulo genético de referencia. El método incluye además diagnosticar que el sujeto tiene un mayor riesgo de desarrollar colitis asociada a la terapia de bloqueo de punto de regulación o que probablemente experimente una colitis asociada a la terapia de bloqueo de punto de regulación más grave si el nivel del módulo genético bacteriano es menor que al menos un nivel de módulo genético bacteriano de referencia o diagnosticar que el sujeto tiene un menor riesgo de desarrollar colitis asociada a la terapia de bloqueo de punto de regulación o que probablemente experimente una colitis asociada a la terapia de bloqueo de punto de regulación menos grave si el nivel del módulo genético bacteriano es mayor que al menos un nivel de módulo genético bacteriano de referencia. El al menos un módulo genético bacteriano para la biosíntesis de vitamina B puede incluir un módulo genético bacteriano para la biosíntesis de riboflavina, para la biosíntesis de pantotenato y/o para la biosíntesis de tiamina. Determinación del nivel de al menos dos, tres o cuatro módulos genéticos bacterianos para el transporte de poliaminas o la biosíntesis de vitamina B en el microbioma intestinal de un sujeto y comparación de los niveles con dos, tres o cuatro niveles de módulos genéticos bacterianos de referencia para los módulos genéticos bacterianos respectivos.
En la presente descripción se describe además un método para tratar a un sujeto con o en riesgo de desarrollar colitis asociada a la terapia de bloqueo de punto de regulación mediante el diagnóstico de que el sujeto tiene un mayor riesgo de desarrollar colitis asociada a la terapia de bloqueo de punto de regulación o probablemente experimente una terapia de bloqueo de punto de regulación más grave mediante el uso de cualquiera de los métodos anteriores y la administración al sujeto de cualquiera de las composiciones anteriores.
Cualquiera de los métodos anteriores puede tener las siguientes características adicionales, que pueden combinarse entre sí y con otros aspectos de la descripción a menos que sean claramente excluyentes entre sí. La terapia de bloqueo de punto de regulación puede incluir una terapia seleccionada del grupo que consiste en anticuerpos anti-CTLA4, anticuerpos anti-PD-1 y anticuerpos anti-PD-L1, y fragmentos de los mismos, anticuerpos de cadena sencilla y proteínas de fusión que incluyen fragmentos de anticuerpos, un agente inmunoterapéutico oligonucleótido CpG y ciclofosfamida, y cualquiera de sus combinaciones. El sujeto puede padecer cáncer y al sujeto se le puede administrar simultáneamente o secuencialmente un agente adicional con actividad antineoplásica. El sujeto puede padecer una enfermedad infecciosa y al sujeto se le puede administrar simultáneamente o secuencialmente un agente adicional con actividad antiinfecciosa.
Un kit para identificar sujetos con mayor o menor riesgo de desarrollar colitis asociada a la terapia de bloqueo de punto de regulación o con probabilidad de experimentar colitis asociada a la terapia de bloqueo de punto de regulación más o menos grave, el kit incluye medios para detectar el nivel de una o más bacterias o esporas de las mismas del filo Bacteriodetes o una o más bacterias o esporas de las mismas que incluyen al menos un módulo genético bacteriano para el transporte de poliaminas o la biosíntesis de vitamina B en el microbioma intestinal de un sujeto o medios para detectar el nivel de al menos un módulo genético bacteriano para el transporte de poliaminas o la biosíntesis de vitamina B en el microbioma intestinal de un sujeto.
Cualquiera de los métodos anteriores puede tener las siguientes características adicionales, que pueden combinarse entre sí y con otros aspectos de la descripción a menos que sean claramente excluyentes entre sí. Los kits pueden usarse para implementar cualquiera de los métodos anteriores o etapas de diagnóstico descritas anteriormente, según corresponda. Los medios para la detección pueden incluir al menos un cebador de ácido nucleico, al menos una sonda de ácido nucleico, al menos un anticuerpo o cualquiera de sus combinaciones. El kit puede incluir cualquier composición descrita anteriormente, que se puede administrar en cualquier etapa de administración descrita anteriormente.
Se debe considerar que la sección de ejemplo y las figuras siguientes ilustran, pero no limitan, el alcance de la invención. Aunque ciertas modalidades se analizan a lo largo de esta solicitud, los elementos de diferentes modalidades son adecuados para combinarse entre sí, incluso cuando dicha combinación no se analiza expresamente, a menos que claramente dicha combinación no sea funcional ni posible.
4. Breve descripción de las figuras
La Figura 1 muestra las diferencias en las poblaciones microbianas en pacientes que reciben terapia de bloqueo de punto de regulación y que progresan a colitis y aquellos que no tienen colitis. La Figura 1A es un gráfico del estado de colitis (sin colitis (C-F) o que progresaron a colitis (PtC)) frente a los días después del inicio del tratamiento con ipilimumab. La Figura 1B es un diagrama de Venn de unidades taxonómicas operativas (OTU) en pacientes sin colitis (C-F) o que progresaron a colitis (PtC) y OTU compartidas. La Figura 1C es un gráfico de la abundancia relativa media de OTU en pacientes sin colitis (C-F) frente a pacientes que progresaron a colitis (PtC) y OTU compartidas. La Figura 1D es un gráfico de la abundancia total de OTU en pacientes sin colitis (C-F) o que progresaron a colitis (PtC) y OTU compartidas. La Figura 1E es un gráfico de la frecuencia de OTU en pacientes sin colitis (C-F) o que progresaron a colitis (PtC) y la frecuencia de OTU compartidas.
La Figura 2 muestra la diversidad de la microbiota intestinal en pacientes que recibieron terapia de bloqueo de punto de regulación que no tenían colitis (C-F) y aquellos que no tenían colitis (C-F). La altura de la barra representa la media, las barras de error representan la desviación estándar, n.s., no significativo. La Figura 2A es un gráfico de la diversidad de la microbiota intestinal determinada por el índice de Simpson inverso. La Figura 2B es un gráfico de la diversidad de la microbiota intestinal determinada por el estimador de Shannon. La Figura 2C es un gráfico de la diversidad de la microbiota intestinal determinada por el estimador de Chao. La Figura 2D es un gráfico de la diversidad de la microbiota intestinal determinada por curvas de rarefacción. Los datos de los pacientes que progresaron a colitis se muestran en el gráfico superior. Los datos de los pacientes que permanecieron sin colitis se muestran en el gráfico inferior.
La Figura 3 muestra la composición de la microbiota intestinal en pacientes tratados que recibieron terapia de bloqueo de punto de regulación que progresaron a colitis y aquellos que no tienen colitis. Las Figuras 3A-3J son un gráfico de la abundancia relativa de varios microbios a nivel taxonómico familiar en pacientes sin colitis y pacientes que progresaron a colitis. Se representan gráficamente familias con una abundancia promedio de 2,5 % o una abundancia máxima de 5 %. Cada barra representa la composición microbiana fecal de un paciente. La Figura 3A está marcada para mostrar un esquema del gráfico completo y las ubicaciones de las regiones del gráfico reproducidas en las Figuras 3B-3J. La Figura 3K es un gráfico de la abundancia relativa de varios microbios a nivel taxonómico de filo en pacientes sin colitis y que progresaron a colitis. Actino designa Actinobacterias; Bact designa Bacteroidetes; Firm designa Firmicutes; Proteo designa Proteobacterias; Verr designa verrucomicrobia.
La Figura 4 muestra la exactitud de la clasificación taxonómica bacteriana en pacientes que recibieron terapia de bloqueo de punto de regulación y que progresaron a colitis o no tenían colitis. La Figura 4A es un gráfico de clasificaciones taxonómicas por filo en pacientes en base a lecturas de secuenciación del 16s. La Figura 4B es un gráfico de abundancias relativas taxonómicas por filo basado en lecturas de secuenciación metagenómica aleatorias calculadas mediante el uso de MetaPhlAn.
La Figura 5 muestra la relación entre la abundancia de microbios intestinales del filo Bacteroidetes y ciertas familias taxonómicas y la protección contra la colitis en pacientes que reciben terapia de bloqueo de punto de regulación. La Figura 5A es un gráfico de la correlación de Spearman de OTU en pacientes sin colitis (C-F). Se representan gráficamente taxones con valores de p <0,05. La Figura 5B es un gráfico de la abundancia relativa del filo Bacteriodetes en pacientes sin colitis (C-F) o que progresaron a colitis (PtC). Para las Figuras 5C-5F, los valores de P se determinaron mediante la prueba de Mann-Whitney. La altura de la barra representa la media, las barras de error representan la desviación estándar, r, coeficiente Rho; p, valor de p. La Figura 5C es un gráfico del número de OTU de Bacteriodetes en pacientes sin colitis (C-F) o que progresaron a colitis (PtC). La Figura 5D es un gráfico de la abundancia relativa de Bacteroidacae en pacientes sin colitis (C-F) o que progresaron a colitis (PtC) y un gráfico de las respectivas puntuaciones de colitis. La Figura 5E es un gráfico de la abundancia relativa de Rikenellaceae en pacientes sin colitis (C-F) o que progresaron a colitis (PtC) y un gráfico de las respectivas puntuaciones de colitis. La Figura 5F es un gráfico de la abundancia relativa de Barnesiellaceae en pacientes sin colitis (C-F) o que progresaron a colitis (PtC) y un gráfico de las respectivas puntuaciones de colitis.
La Figura 6 es un gráfico de la abundancia relativa de Bacteroidetes en pacientes que recibieron terapia de bloqueo de punto de regulación frente a la edad del paciente. Las OTU con una abundancia promedio mayor que 0,01 % dentro de cualquier grupo de pacientes se agruparon por filo, r, coeficiente Rho; p, valor de p.
La Figura 7 muestra la relación entre las moléculas bacterianas involucradas en el transporte de poliaminas y la síntesis de vitamina B y la resistencia a la colitis en pacientes que recibieron terapia de bloqueo de punto de regulación. La Figura 7A es un gráfico de la abundancia relativa de moléculas de la Enciclopedia de Genes y Genomas de Kioto (KEGG) en pacientes sin colitis o que progresaron a colitis. La Figura 7B es un gráfico de análisis del análisis discriminante lineal con efecto del tamaño (LEfSe) para varios módulos genéticos en pacientes sin colitis (C-F) o que progresaron a colitis (PtC). Se representan gráficamente los módulos con puntuación LDA >3. La Figura 7C es un gráfico de la correlación de Spearman de varios módulos genéticos en pacientes sin colitis (C-F) o que progresaron a colitis (PtC). Se representan gráficamente los módulos con valores de p <0,05. La Figura 7D es un gráfico de la abundancia relativa de varios módulos genéticos en pacientes sin colitis (C-F) o que progresaron a colitis (PtC). La altura de la barra representa la media, las barras de error representan la desviación estándar. Los valores de p se determinaron mediante la prueba de Mann-Whitney.
La Figura 8 muestra la exactitud predictiva de los módulos genéticos bacterianos en la identificación de pacientes con terapia de bloqueo de punto de regulación que progresan a colitis. La Figura 8A es un gráfico de los resultados de un algoritmo de partición recursiva aplicado a pacientes sin colitis (C-F) o que progresaron a colitis (PtC). La Figura 8B presenta dos gráficos de resultados de probabilidad predicha de colitis por paciente (designada por el número de paciente en el eje x) para pacientes sin colitis (C-F) o pacientes que progresaron a colitis (PtC). Se representa un paciente por columna. Especificidad y sensibilidad calculadas en base a un umbral de probabilidad del 50 %. La Figura 8C es un gráfico de la sensibilidad y especificidad de varios módulos genéticos para predecir el estado de colitis de los pacientes. Poli, sistema de transporte de poliaminas; Tia, biosíntesis de tiamina; Ribo, biosíntesis de riboflavina; Panto, biosíntesis de pantotenato. La Figura 8D es un gráfico de la tasa de verdaderos positivos frente a la tasa de falsos positivos, denominada curva Característica Operativa del Receptor (ROC), para un análisis predictivo mediante el uso de cuatro módulos genéticos en pacientes sin colitis (línea continua) o que progresaron a colitis (línea discontinua).
La Figura 9 es un gráfico de la puntuación de colitis frente a la abundancia relativa del sistema de transporte de poliaminas en pacientes que recibieron terapia de bloqueo de punto de regulación.
5. Descripción detallada de la invención
La presente invención se refiere a métodos para identificar sujetos tratados con agentes terapéuticos de bloqueo de punto de regulación que tienen un riesgo mayor o menor de desarrollar colitis asociada a la terapia de bloqueo de punto de regulación, mediante el análisis del microbioma intestinal de esos sujetos, y a métodos terapéuticos y composiciones relacionadas para reducir el riesgo de colitis asociada a la terapia de bloqueo de punto de regulación. Esta descripción se refiere además a la identificación de biomarcadores que predicen el riesgo de desarrollar colitis, lo que puede ayudar a identificar pacientes que son particularmente susceptibles a ciertas formas de inflamación inducida por inmunoterapia, tal como con el bloqueo de CTLA-4, y puede facilitar tratamientos preventivos.
La invención se basa en parte en el descubrimiento de que ciertos módulos microbianos intestinales, que incluyen por ejemplo la microbiota del filo Bacteroidetes, predicen el desarrollo de colitis asociada al bloqueo de punto de regulación, particularmente de CTLA-4, y se correlacionan con la protección contra la colitis asociada al bloqueo de punto de regulación, particularmente de CTLA-4. El descubrimiento se basa en experimentos, que incluyen los de los Ejemplos en la presente descripción, en los que se caracterizó la microbiota intestinal de pacientes antes del desarrollo de colitis y se evaluaron varios parámetros de dicha microbiota intestinal.
Se descubrió que la microbiota del filo Bacteroidetes se encuentra enriquecido en los pacientes resistentes a la colitis. Los miembros del filo Bacteroidetes pueden limitar la inflamación al estimular la diferenciación de las células T reguladoras. Además, la presencia de módulos genéticos asociados a la microbiota para el sistema de transporte de poliaminas bacterianas puede identificar con exactitud el riesgo de desarrollo de colitis de un paciente después de una terapia de bloqueo de punto de regulación, tal como el bloqueo de CTLA-4. Las poliaminas, que son pequeñas aminas catiónicas que pueden exportarse desde las células bacterianas, desempeñan un papel antiinflamatorio al promover la proliferación de células epiteliales del colon (CEC) para mantener la barrera epitelial. La presencia de módulos genéticos asociados a la microbiota para la biosíntesis de tiamina, riboflavina y pantotenato también puede identificar con exactitud el riesgo de desarrollo de colitis de un paciente después de una terapia de bloqueo de punto de regulación, tal como el bloqueo de CTLA-4.
Para mayor claridad de la descripción y no a modo de limitación, esta sección se divide en las siguientes subsecciones:
(i) Métodos para determinar el riesgo de colitis;
(ii) Bacterias terapéuticas;
(iii) Células recombinantes;
(iv) Composiciones farmacéuticas;
(v) Métodos de tratamiento; y
(vi) Kits.
Los siguientes son términos relevantes para la presente invención:
Un "individuo" o "sujeto" o "paciente" en la presente descripción es un vertebrado, tal como un ser humano o un animal no humano, por ejemplo, un mamífero. Los mamíferos incluyen, pero no se limitan a, seres humanos, primates, animales de granja, animales deportivos, roedores y mascotas. Ejemplos no limitantes de sujetos animales no humanos incluyen roedores tales como ratones, ratas, hámsteres y cobayas; conejos; perros; gatos; ovejas; cerdos; cabras; ganado; caballos; y primates no humanos tales como simios y monos.
En ciertas modalidades no limitantes, el sujeto padece un cáncer o una enfermedad infecciosa, o ambas. El sujeto puede estar recibiendo o puede recibir terapia de bloqueo de punto de regulación. En cierta modalidad no limitante, el sujeto se trata simultáneamente o secuencialmente con un agente además del agente terapéutico de bloqueo de punto de regulación, cuyo agente adicional tiene actividad antineoplásica o antiinfecciosa.
La “terapia de bloqueo de punto de regulación” es la inhibición de una proteína o proceso que regula negativamente las células T mediante la administración a un paciente que recibe la terapia de un “agente terapéutico de bloqueo de punto de regulación”, tal como un inhibidor de CTLA-4, un inhibidor de PD-1, un inhibidor de PD-L1, que incluye anticuerpos anti-CTLA4, anticuerpos anti-PD-1 y anticuerpos anti-PD-L1 (que incluyen fragmentos de los mismos, anticuerpos de cadena sencilla, proteínas de fusión, etc.), que incluyen, pero sin limitarse a, ipilimumab, nivolumab y pembrolizumab o un agente inmunoterapéutico oligonucleótido CpG y ciclofosfamida.
La “colitis” es un trastorno caracterizado por la inflamación del colon. La colitis se puede evaluar mediante el uso de los Criterios de terminología común para eventos adversos (CTCAE), versión 4, a partir del 25 de noviembre de 2015, que define la colitis de Grado 1 como asintomática con observaciones clínicas o diagnósticas únicamente, la colitis de Grado 2 evidenciada por dolor abdominal y moco o sangre en las heces, colitis de Grado 3 evidenciada por dolor abdominal intenso, un cambio en los hábitos intestinales y signos peritoneales, colitis de Grado 4 evidenciada por consecuencias potencialmente mortales; y colitis de grado 5 evidenciada por la muerte.
La “colitis asociada a la terapia de bloqueo de punto de regulación” es una colitis indicada médicamente como causada al menos parcialmente por la terapia de bloqueo de punto de regulación. La colitis asociada a la terapia de bloqueo de punto de regulación” puede incluir la colitis que aparece por primera vez en un paciente que recibe terapia de bloqueo de punto de regulación o que ha recibido terapia de bloqueo de punto de regulación en el mes anterior a la aparición de la colitis.
Una "cantidad eficaz" de una sustancia, como se usa ese término en la presente descripción, es la cantidad suficiente para lograr resultados beneficiosos o deseados, que incluyen resultados clínicos y, como tal, una "cantidad eficaz" depende del contexto en el que se aplica. En el contexto de la administración de una composición para reducir el riesgo de colitis y/o la administración de una composición para reducir al menos un signo o síntoma de colitis, una cantidad eficaz de una composición descrita en la presente descripción es una cantidad suficiente para prevenir la aparición de la colitis, prevenir la progresión de la colitis al siguiente grado, tratar y/o mejorar la colitis, hacer retroceder el grado de colitis y/o reducir la probabilidad de aparición o progresión del grado de colitis, o aumentar la probabilidad de regresión del grado en un 10 %, 20 %, 30 %, 40 %, 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 90 %, 95 %, 98 % o 99 %.
Como se usa en la presente descripción, y como se entiende bien en la técnica, "tratamiento" es un enfoque para obtener resultados beneficiosos o deseados, incluidos los resultados clínicos. Para los fines de este objeto, los resultados clínicos beneficiosos o deseados incluyen, pero no se limitan a, alivio o mejora de uno o más signos o síntomas, disminución de la extensión de la enfermedad, estado estabilizado (es decir, sin empeoramiento) de la enfermedad, prevención de enfermedad, retraso o desaceleración de la progresión de la enfermedad, remisión de la enfermedad (por ejemplo, colitis) y/o mejora o paliación del estado de la enfermedad. La disminución puede ser al menos una disminución del 10 %, 20 %, 30 %, 40 %, 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 90 %, 95 %, 98 % o 99 % en la gravedad de las complicaciones, signos o síntomas o probabilidad de progresión a otro grado. Tratamiento” también puede referirse a disminuir la probabilidad de aparición o progresión de la colitis a un grado superior en al menos un 10 %, 20 %, 30 %, 40 %, 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 90 %, 95 %, 98 % o 99 %.
El término "vector de expresión" se usa para indicar una molécula de ácido nucleico que es lineal o circular, en la que se puede integrar otro fragmento de secuencia de ácido nucleico de tamaño apropiado. Dicho(s) fragmento(s) de ácido(s) nucleico(s) puede(n) incluir segmentos adicionales que proporcionan la transcripción de un gen codificado por el fragmento de secuencia de ácido nucleico. Los segmentos adicionales pueden incluir, pero no se limitan a: promotores, terminadores de la transcripción, potenciadores, sitios internos de entrada al ribosoma, regiones no traducidas, señales de poliadenilación, marcadores de selección, orígenes de replicación y similares, como se conoce en la técnica. Los vectores de expresión a menudo se derivan de plásmidos, cósmidos y vectores virales; los vectores son a menudo moléculas recombinantes que contienen secuencias de ácidos nucleicos de varias fuentes.
El término "unido operativamente", cuando se aplica a secuencias de ácidos nucleicos, por ejemplo en un vector de expresión, indica que las secuencias están dispuestas de manera que funcionen cooperativamente para lograr sus propósitos previstos, es decir, una secuencia promotora permite el inicio de la transcripción que avanza a través de una secuencia codificante unida hasta la señal de terminación.
Una “molécula de ácido nucleico” es una secuencia monocatenaria o bicatenaria de nucleótidos unidos covalentemente en la que los extremos 3' y 5' de cada nucleótido están unidos mediante enlaces fosfodiéster. El polinucleótido puede estar formado por bases desoxirribonucleotídicas o bases ribonucleotídicas. Los polinucleótidos incluyen ADN y ARN y pueden fabricarse por síntesis in vitro o aislarse de fuentes naturales.
El término "promotor", como se usa en la presente descripción, indica una región dentro de un gen a la que se pueden unir factores de transcripción y/o ARN polimerasa para controlar la expresión de una secuencia codificante asociada. Los promotores se ubican comúnmente, aunque no siempre, en las regiones 5' no codificantes de los genes, aguas arriba del codón de iniciación de la traducción. La región promotora de un gen puede incluir una o más secuencias consenso que actúan como sitios de unión reconocibles para dominios de unión a ácidos nucleicos específicos de secuencia de proteínas de unión a ácidos nucleicos. Sin embargo, tales sitios de unión también pueden ubicarse en regiones fuera del promotor, por ejemplo en regiones potenciadoras ubicadas en intrones o aguas abajo de la secuencia codificante.
Un "gen regulador" es un gen involucrado en el control de la expresión de uno o más genes adicionales.
Un "probiótico" es un microorganismo o grupo de microorganismos que proporciona beneficios para la salud, o que no es patógeno, a un sujeto cuando se consume, ingiere o se administra de cualquier otra manera a un sujeto, por ejemplo, una reducción en la probabilidad de recaída después del tratamiento del cáncer. Como se usa en la presente descripción, el término probiótico puede usarse para describir, por ejemplo, bacterias probióticas y puede incluir las bacterias descritas en la presente descripción así como también otras bacterias.
Un "prebiótico" es una sustancia que promueve el crecimiento, la proliferación y/o la supervivencia de una o más bacterias o levaduras. Como se usa en la presente descripción, el término prebiótico puede usarse para describir, por ejemplo, un suplemento nutricional que incluye fibra vegetal, o uno o más de carbohidratos complejos, oligosacáridos, fructanos de tipo inulina o arabinoxilanos mal absorbidos.
Un "posbiótico" es una sustancia derivada de un organismo probiótico. Como se usa en la presente descripción, el término posbiótico puede usarse para describir, por ejemplo, una proteína expresada por una o más bacterias, un producto metabólico de una o más bacterias o un medio de un cultivo de una o más cepas de bacterias.
5.1 Métodos para determinar el riesgo de colitis asociado al bloqueo de punto de regulación
En la presente descripción se describen métodos para determinar si un sujeto que recibe o potencialmente recibe terapia de bloqueo de punto de regulación tiene un riesgo mayor o reducido de desarrollar colitis asociada a la terapia de bloqueo de punto de regulación, que incluye el desarrollo de cualquier síntoma de colitis asociada a la terapia de bloqueo de punto de regulación, el desarrollo de colitis asociada a la terapia de bloqueo de punto de regulación más grave o síntomas asociados, experimentar una progresión más rápida de la colitis o los síntomas asociados a la terapia de bloqueo de punto de regulación, o experimentar una respuesta disminuida a otros tratamientos para la colitis después de recibir la terapia de bloqueo de punto de regulación.
Una abundancia aumentada o disminuida de bacterias o esporas de las mismas o de un módulo genético bacteriano se determina con respecto a un nivel de bacterias de referencia o un nivel de módulo genético bacteriano de referencia, que puede basarse en una abundancia relativa en el microbioma intestinal. Por ejemplo, el nivel de referencia puede representar un determinado porcentaje en el microbioma intestinal. El nivel de referencia también puede ser un número absoluto. El nivel de referencia puede basarse en una prueba anterior en el mismo paciente, o en niveles encontrados en una población de pacientes, tales como pacientes que son candidatos para una terapia de bloqueo de punto de regulación o pacientes con cáncer que no se han sometido a una terapia de bloqueo de punto de regulación.
La descripción proporciona métodos para identificar sujetos que tienen un riesgo reducido de desarrollar colitis asociada a la terapia de bloqueo de punto de regulación mediante la determinación de si las heces o el contenido intestinal de un sujeto contienen una mayor abundancia de bacterias del filo Bacteroidetes, que incluyen, pero sin limitarse a, bacterias de las familias Bacteroidaceae, Rikenellaceae y Barnesiellaceae, y/o aumento de las vías genéticas microbianas que involucran el transporte de poliaminas y/o la biosíntesis de vitamina B (por ejemplo, (riboflavina (B2), pantotenato (B5) y tiamina (B1)). Una mayor abundancia de dichas bacterias, un mayor transporte de poliaminas y/o una mayor biosíntesis de vitamina B indican que el sujeto tiene un riesgo reducido de desarrollar colitis asociada a la terapia de bloqueo de punto de regulación.
La descripción proporciona métodos para identificar sujetos que tienen un mayor riesgo de desarrollar colitis asociada a la terapia de bloqueo de punto de regulación, que incluyen determinar si las heces o el contenido intestinal de un sujeto contienen una disminución de la cantidad de bacterias del filo Bacteroidetes, que incluyen, pero sin limitarse a, bacterias de las familias Bacteroidaceae, Rikenellaceae y Barnesiellaceae, y/o disminución de las vías genéticas microbianas involucradas en el transporte de poliaminas y/o la biosíntesis de vitamina B (por ejemplo, (riboflavina (B2), pantotenato (B5) y tiamina (B1)). Una disminución de la cantidad de dichas bacterias, una disminución del transporte de poliaminas y/o una disminución de la biosíntesis de vitamina B indican que el sujeto tiene un mayor riesgo de desarrollar colitis asociada a la terapia de bloqueo de punto de regulación.
La muestra de microbiota puede ser una muestra fecal o una muestra de contenido intestinal, por ejemplo, un hisopo rectal.
En ciertas modalidades no limitantes, la cantidad y/o el tipo de bacteria presente en una muestra se determina por medición de la cantidad o presencia de ácido nucleico bacteriano específico para el tipo de bacteria, como el ARNr 16S.
En ciertas modalidades no limitantes, la cantidad y/o el tipo de bacterias presentes en una muestra se determina mediante secuenciación aleatoria de ADN bacteriano, amplificación por PCR de genes específicos que portan las bacterias, PCR cuantitativa de transcritos expresados específicamente por las bacterias, métodos de detección bacteriana basados en anticuerpos, detección metabolómica de metabolitos bacterianos, detección proteómica de proteínas bacterianas y/o mediante métodos de cultivo de la muestra de microbiota.
En ciertas modalidades no limitantes, la muestra de microbiota se recolecta del sujeto hasta 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31 o más días después de que el sujeto haya comenzado la terapia de bloqueo de punto de regulación. En ciertas modalidades no limitantes, la muestra de microbiota se recolecta del sujeto hasta 1, 2, 3, 4 o más semanas, o hasta 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12 o más meses, después de que el sujeto haya comenzado la terapia de bloqueo de punto de regulación. En ciertas modalidades no limitantes, la muestra de microbiota se recolecta del sujeto hasta 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 o más días, o hasta 1, 2, 3, 4 o más semanas, o hasta 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12 o más meses, antes de que el sujeto reciba la terapia de bloqueo de punto de regulación.
Un sujeto puede evaluarse e identificarse antes de comenzar la terapia de bloqueo de punto de regulación. Un sujeto identificado como con mayor riesgo de desarrollar colitis asociada a la terapia de bloqueo de punto de regulación puede recibir profilácticamente un agente terapéutico como se describe en la presente descripción o de cualquier otra manera eficaz en el tratamiento de la colitis, puede recibir un mayor monitoreo de la colitis durante o después de la terapia de bloqueo de punto de regulación, puede recibir una menor dosis o ciclo de la terapia de bloqueo de punto de regulación, o puede no recibir terapia de bloqueo de punto de regulación. Un sujeto identificado como con un menor riesgo de desarrollar colitis asociada a la terapia de bloqueo de punto de regulación puede recibir menos monitoreo para la colitis, particularmente monitoreo invasivo, durante y después de la terapia de bloqueo de punto de regulación, o puede recibir una terapia de bloqueo de punto de regulación preferentemente sobre otra terapia, en combinación con otra terapia en una mayor dosis o ciclo, o cuando se espera que la terapia de bloqueo de punto de regulación sea beneficiosa, pero no está indicada si es probable que se desarrolle colitis.
Se examina e identifica a un sujeto después de comenzar la terapia de bloqueo de punto de regulación. Un sujeto identificado como con mayor riesgo de desarrollar colitis asociada a la terapia de bloqueo de punto de regulación puede suspender la terapia de bloqueo de punto de regulación, puede recibir profilácticamente un agente terapéutico como se describe en la presente descripción o de cualquier otra manera eficaz en el tratamiento de la colitis, puede recibir un mayor monitoreo para la colitis durante la duración de la terapia de bloqueo de punto de regulación y después de dicha terapia, o puede recibir una menor dosis o ciclo de terapia de bloqueo de punto de regulación. Un sujeto identificado como con un menor riesgo de desarrollar colitis asociada a la terapia de bloqueo de punto de regulación puede recibir menos monitoreo para la colitis, particularmente monitoreo invasivo, durante la terapia de bloqueo de punto de regulación y después, o puede continuar la terapia de bloqueo de punto de regulación, particularmente mientras se suspende otra terapia, puede recibir una mayor dosis o ciclo de terapia de bloqueo de punto de regulación, o puede continuar la terapia de bloqueo de punto de regulación cuando no estaría indicado si es probable que se desarrolle colitis.
Un sujeto con colitis puede evaluarse e identificarse antes de comenzar la terapia de bloqueo de punto de regulación. Un sujeto identificado como con mayor riesgo de desarrollar colitis asociada a la terapia de bloqueo de punto de regulación puede recibir monitoreo para determinar si la colitis asociada a la terapia de bloqueo de punto de regulación ha contribuido a la colitis preexistente, puede recibir un mayor monitoreo para la progresión de la colitis, puede recibir profilácticamente un agente terapéutico como se describe en la presente descripción o de cualquier otra manera eficaz en el tratamiento de la colitis, puede recibir una menor dosis o ciclo de terapia de bloqueo de punto de regulación, o puede no recibir terapia de bloqueo de punto de regulación. Un sujeto identificado como con menor riesgo de desarrollar colitis asociada a la terapia de bloqueo de punto de regulación puede recibir monitoreo de colitis consistente con el diagnóstico preexistente o puede recibir monitoreo reducido para colitis, particularmente monitoreo invasivo, durante y después de la terapia de bloqueo de punto de regulación, recibir terapia de bloqueo de punto de regulación preferentemente sobre otra terapia o en combinación con otra terapia, particularmente otra terapia asociada con colitis, o puede recibir terapia de bloqueo de punto de regulación en una mayor dosis o ciclo, o cuando se espera que la terapia de bloqueo de punto de regulación sea beneficiosa, pero no está indicada si es probable que se desarrolle colitis. Tanto en sujetos con mayor riesgo o que desarrollan colitis asociada a la terapia de bloqueo de punto de regulación como en sujetos con menor riesgo, pueden usarse los métodos descritos en la presente descripción para determinar si es probable que alguna progresión de la colitis se atribuya a la terapia de bloqueo de punto de regulación u otra causa.
En ciertas modalidades no limitantes, un sujeto con colitis puede evaluarse e identificarse después de comenzar la terapia de bloqueo de punto de regulación. Un sujeto identificado como con mayor riesgo de desarrollar colitis asociada a la terapia de bloqueo de punto de regulación puede recibir monitoreo para determinar si la colitis asociada a la terapia de bloqueo de punto de regulación ha contribuido a la colitis preexistente, puede recibir un mayor monitoreo para la progresión de la colitis, puede recibir profilácticamente un agente terapéutico como se describe en este documento o de cualquier otra manera eficaz en el tratamiento de la colitis, puede recibir una menor dosis o ciclo de terapia de bloqueo de punto de regulación, o puede dejar de recibir la terapia de bloqueo de punto de regulación. Un sujeto identificado como con menor riesgo de desarrollar colitis asociada a la terapia de bloqueo de punto de regulación puede recibir monitoreo de colitis consistente con el diagnóstico preexistente o puede recibir menos monitoreo para la colitis, particularmente monitoreo invasivo, durante y después de la terapia de bloqueo de punto de regulación, recibir terapia de bloqueo de punto de regulación preferentemente sobre otra terapia o en combinación con otra terapia, particularmente otra terapia asociada con colitis, o puede recibir terapia de bloqueo de punto de regulación en una mayor dosis o ciclo, o puede continuar la terapia de bloqueo de punto de regulación cuando no estaría indicado si es probable que se desarrolle colitis. Tanto en sujetos con mayor riesgo o que desarrollan colitis asociada a la terapia de bloqueo de punto de regulación como en sujetos con menor riesgo, pueden usarse los métodos descritos en la presente descripción para determinar si es probable que cualquier progresión de la colitis después de comenzar la terapia de bloqueo de punto de regulación se atribuya a la terapia de bloqueo de punto de regulación u otra causa.
5.2 Bacterias terapéuticas
Las composiciones descritas en la presente descripción pueden incluir una o más bacterias terapéuticas, o esporas de las mismas, por ejemplo, un miembro del filo Bacteroidetes y tres de sus familias (Bacteroidaceae, Rikenellaceae y Barnesiellaceae), una de sus combinaciones, o un conglomerado que incluye una cualquiera o más de las bacterias anteriores.
Las bacterias terapéuticas pueden tener un módulo genético bacteriano para el transporte de poliaminas y/o la biosíntesis de vitamina B, particularmente la biosíntesis de riboflavina (vitamina B2), pantotenato (vitamina B5) y tiamina (vitamina B1). Dicho módulo genético bacteriano puede ser completamente nativo, o las bacterias terapéuticas pueden incluir células recombinantes como se describe más abajo.
Las bacterias se pueden administrar en estado vegetativo o latente, o como esporas, o una mezcla de los mismos. Las bacterias terapéuticas descritas en la presente descripción se pueden modificar, por ejemplo, mediante la introducción de uno o más ácidos nucleicos exógenos en las bacterias, de esta manera se producen bacterias recombinantes. Dichos ácidos nucleicos pueden incluir, por ejemplo, un gen de resistencia a antibiótico y/o un gen de susceptibilidad a antibiótico. Dichas bacterias recombinantes se pueden preparar como se describe en la presente descripción.
Las bacterias terapéuticas como se describen en la presente descripción, cualquiera de sus combinaciones, o un conglomerado que incluye una cualquiera o más de las bacterias terapéuticas, se pueden administrar en forma de bacterias o esporas purificadas u otros progenitores de las mismas, o alternativamente se pueden administrar como un constituyente en una mezcla de tipos de bacterias, que incluyen opcionalmente una o más especies o conglomerados de bacterias adicionales, por ejemplo, bacterias probióticas, una levadura probiótica, prebiótica, posbiótica y/o antibiótica.
En la presente descripción se describen composiciones farmacéuticas y usos terapéuticos de las mismas, como se describe en la presente descripción, que incluyen dichas formas de bacterias terapéuticas, una de sus combinaciones o un conglomerado que incluye una cualquiera o más de las bacterias terapéuticas, y que opcionalmente incluye una o más especies o conglomerados de bacterias terapéuticas adicionales, por ejemplo, bacterias probióticas, una levadura probiótica, prebiótica, posbiótica y/o antibiótica.
Las bacterias se pueden administrar en forma de un líquido, una suspensión, un polvo seco (por ejemplo, liofilizado), un comprimido, una cápsula o un supositorio, y se pueden administrar por vía oral, nasogástrica o rectal. Las bacterias se pueden administrar en un producto alimenticio, por ejemplo, un producto alimenticio de yogur. Un "producto alimenticio" puede significar un producto o composición destinado al consumo de un ser humano o un animal no humano. Dichos productos alimenticios incluyen cualquier alimento, pienso, refrigerio, suplemento alimenticio, líquido, bebida, golosina, juguete (juguetes masticables y/o consumibles), sustituto de comida o reemplazo de comida. En la presente descripción se describe una composición que incluye una bacteria terapéutica aislada, una combinación de cualquier bacteria terapéutica aislada entre sí, o un grupo que incluye una cualquiera o más de las bacterias terapéuticas aisladas. Las bacterias pueden estar en una formulación para administración a un sujeto.
La composición puede incluir uno, dos, tres, cuatro, cinco, seis, siete, ocho, nueve, diez, once, doce, trece, catorce, quince, dieciséis, diecisiete, dieciocho, diecinueve, veinte o entre veinte y cien tipos distintos de bacterias terapéuticas. En la presente descripción se describe una composición que incluye una bacteria terapéutica aislada.
Dichas bacterias pueden ser una o más de las bacterias terapéuticas descritas en la presente descripción, pero se pueden incluir bacterias alternativas o adicionales en las composiciones descritas en la presente descripción, por ejemplo, bacterias que pueden ser bacterias de origen natural que están en un conglomerado con una cualquiera o más de las bacterias terapéuticas.
5.3 Células recombinantes
En la presente descripción se describen composiciones terapéuticas, y usos terapéuticos de las mismas, que se basan en un módulo genético bacteriano de transporte de poliaminas y/o biosíntesis de vitamina B, particularmente biosíntesis de riboflavina (vitamina B2), pantotenato (vitamina B5) y tiamina (vitamina B1), que incluyen un módulo genético bacteriano de una bacteria del filo Bacteroidetes, que incluye, pero sin limitarse a, bacterias de las familias Bacteroidaceae, Rikenellaceae y Barnesiellaceae. Dichas composiciones terapéuticas pueden incluir, por ejemplo, bacterias terapéuticas, moléculas pequeñas, polipéptidos o moléculas de ácidos nucleicos.
Las composiciones terapéuticas pueden tratar la colitis asociada a la terapia de bloqueo de punto de regulación. La composición terapéutica puede incluir una bacteria terapéutica recombinante, una de sus combinaciones, o un conglomerado que incluye una o más de las bacterias terapéuticas, o progenie de las mismas.
La composición terapéutica puede incluir una célula recombinante, o una progenie de la misma, por ejemplo, una célula recombinante que expresa una o más proteínas recombinantes de un módulo genético bacteriano de transporte de poliaminas y/o biosíntesis de vitamina B, particularmente riboflavina (vitamina B2), pantotenato (vitamina B5) y biosíntesis de tiamina (vitamina B1), que incluyen bacterias del filo Bacteroidetes, que incluidas, pero sin limitarse a, bacterias de las familias Bacteroidaceae, Rikenellaceae y Barnesiellaceae.
El suministro de ácido nucleico a un sujeto o célula, por ejemplo, células bacterianas de la microbiota intestinal, puede ser directo, en cuyo caso el sujeto o la célula, por ejemplo, células bacterianas de la microbiota intestinal de un sujeto, se expone directamente al ácido nucleico o vectores portadores de ácidos nucleicos, o indirecto, en cuyo caso, primero se transforman las células, por ejemplo, una célula huésped, tal como células bacterianas aisladas de la microbiota intestinal, con los ácidos nucleicosin vitro,después se trasplantan al sujeto. Estos dos enfoques se conocen, respectivamente, como terapia génicain situoex vivo.
Para reseñas generales de los métodos de terapia génica, ver Kron y Kreppel, Curr Gene Ther 12(5):362-73 (2012); Yiy otrosCurr Gene Ther 11(3):218-28 (201 l);=Goldspiely otros,Clinical Pharmacy 12:488-505 (1993); Wu y Wu, Biotherapy 3:87-95 (1991); Tolstoshev, Ann. Rev. Pharmacol. Toxicol.32:573-596 (1993); Mulligan, Science 260:926-932 (1993); Morgan y Anderson, Ann. Rev. Biochem.62:191-217 (1993); y May, TIBTECH 11(5): 155-215 (1993). Los métodos comúnmente conocidos en la técnica de la tecnología de ADN recombinante que pueden usarse se describen en Ausubel y otros, (eds.), Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, NY (1993); y Kriegler, Gene Transfer and Expression, A Laboratory Manual, Stockton Press, NY (1990).
El ácido nucleico puede introducirse en células, por ejemplo, células huésped bacterianas, antes de la administraciónin vivode la célula recombinante resultante mediante cualquier método conocido en la técnica, que incluye, pero sin limitarse a, transfección, electroporación, microinyección, lipofección, transfección mediada por fosfato de calcio, infección con un vector viral o bacteriófago que contiene las secuencias de ácido nucleico, fusión celular, transferencia de genes mediada por cromosomas, transferencia de genes mediada por microcélulas, fusión de esferoplastos, etc. Se conocen numerosas técnicas en la técnica para la introducción de genes extraños en las células (ver,por ejemplo,Loeffler y Behr, Meth. Enzymol. 217:599-618 (1993); Coheny otros,Meth. Enzymol. 217:618-644 (1993); Cline, Pharmac. Ther.29:69-92m (1985)), y pueden usarse de acuerdo con la presente descripción, siempre y cuando no se alteren las funciones fisiológicas y de desarrollo necesarias de las células receptoras. Usualmente, el método de transferencia incluye la transferencia de un marcador de selección a las células huésped. Después, las células se colocan bajo la selección para aislar las células huésped que han captado y expresan el gen transferido. Esas células huésped se suministran después a un paciente.
Las células recombinantes resultantes, o progenie de las mismas, se pueden suministrar a un paciente por varios métodos conocidos en la técnica. La cantidad de células prevista para el uso depende del efecto deseado, estado del paciente, etc., y puede determinarse por una persona con experiencia en la técnica.
Los términos "vector" y "vector de expresión" pueden significar el vehículo mediante el cual se puede introducir una secuencia de ADN o ARN (por ejemplo, un gen extraño) en una célula huésped, para transformar el huésped y promover la expresión (por ejemplo, transcripción y traducción) de la secuencia introducida. Los vectores incluyen plásmidos, fagos, virus, etc. Un "vector terapéutico" como se usa en la presente descripción se refiere a un vector que es aceptable para la administración a un animal, y particularmente a un ser humano.
Típicamente los vectores incluyen el ADN de un agente transmisible, en el que se inserta ADN extraño. Una forma común de insertar un segmento de ADN en otro segmento de ADN involucra el uso de enzimas llamadas enzimas de restricción que escinden el ADN en sitios específicos (grupos específicos de nucleótidos) llamados sitios de restricción. Generalmente, el ADN extraño se inserta en uno o más sitios de restricción del ADN del vector y después el vector lo transporta a una célula huésped junto con el ADN del vector transmisible. Un segmento o secuencia de ADN que tiene ADN insertado o añadido, tal como un vector de expresión, también puede denominarse "construcción de ADN". Un tipo común de vector es un “plásmido”, que generalmente es una molécula autónoma de ADN de doble hebra, usualmente de origen bacteriano, que puede aceptar ADN adicional (extraño) y que puede introducirse en una célula huésped adecuada. Un vector plasmídico puede contener ADN codificante y ADN promotor y tiene uno o más sitios de restricción adecuados para insertar ADN extraño. El ADN codificante es una secuencia de ADN que codifica una secuencia de aminoácidos particular para una proteína o enzima particular. El ADN promotor es una secuencia de ADN que inicia, regula o de cualquier otra manera media o controla la expresión del ADN codificante. El ADN promotor y el ADN codificante pueden ser del mismo gen o de genes diferentes, y pueden ser del mismo organismo o de organismos diferentes. Se ha descrito una gran cantidad de vectores, que incluyen vectores plasmídicos y fúngicos, para su replicación y/o expresión en una variedad de huéspedes eucariotas y procariotas. Los ejemplos no limitantes incluyen plásmidos pKK (Clonetech), plásmidos pUC, plásmidos pET (Novagen, Inc., Madison, Wis), plásmidos pRSET (Invitrogen, San Diego, Calif.), plásmidos pCDNA3 (Invitrogen), plásmidos pREP (Invitrogen), o plásmidos pMAL (New England Biolabs, Beverly, Mass.), y muchas células huésped apropiadas, mediante el uso de métodos descritos o mencionados en la presente descripción o conocidos de cualquier otra manera por los expertos en la técnica en cuestión. Los vectores de clonación recombinantes a menudo incluirán uno o más sistemas de replicación para la clonación o expresión, uno o más marcadores para la selección en el huésped, por ejemplo, resistencia a antibióticos, y uno o más casetes de expresión.
Los vectores adecuados incluyen, por ejemplo, bacteriófagos, cósmidos, plásmidos, ADN desnudo, complejos de lípidos y ADN y otros vehículos de recombinación típicamente usados en la técnica que se han descrito para la expresión en una variedad de huéspedes eucariotas y procariotas, y que pueden usarse para terapia génica así como también para la simple expresión de proteínas.
5.4 Composiciones farmacéuticas
La presente descripción proporciona composiciones farmacéuticas y usos terapéuticos de las mismas como se describe en la presente descripción, que incluyen una composición terapéutica, como se describe en la presente descripción, tal como, por ejemplo, una bacteria terapéutica, como se describe en la presente descripción. Dichas composiciones farmacéuticas pueden incluir además al menos un agente adicional, tal como un compuesto estabilizante o un agente terapéutico adicional, por ejemplo, un probiótico, prebiótico, posbiótico y/o antibiótico, y se pueden administrar en cualquier portador farmacéutico biocompatible estéril, que incluye, pero sin limitarse a, solución salina, solución salina tamponada, dextrosa, glicerol, polietilenglicol y agua. La composición puede estar en forma líquida o liofilizada o secada por congelación. Una formulación puede incluir un diluyente (por ejemplo, un tampón tal como los tampones Tris, citrato, acetato o fosfato) que tenga valores de pH y fuerzas iónicas adecuados, un solubilizante tal como polisorbato(por ejemplo,Tween®), portadores tales como albúmina sérica humana o gelatina. En algunos casos, se puede incluir un conservante que no afecte la viabilidad de los organismos en la composición. Ejemplos de conservantes incluyen timerosal, parabenos, cloruro de bencilalconio o alcohol bencílico, antioxidantes tales como ácido ascórbico o metabisulfito de sodio y otros componentes tales como lisina o glicina. La selección de una composición particular dependerá de una serie de factores, que incluyen la afección en tratamiento, la vía de administración y los parámetros farmacocinéticos deseados. Un estudio más extenso de los componentes adecuados para composiciones farmacéuticas se encuentra en Remington's Pharmaceutical Sciences, 18va ed. A. R. Gennaro, ed. Mack, Easton, PA (1980).
Los métodos y composiciones de la presente descripción pueden encontrar uso en el tratamiento de la colitis asociada a la terapia de bloqueo de punto de regulación en un sujeto. Dichas bacterias terapéuticas se administran al paciente en un portador farmacéuticamente aceptable. La vía de administración finalmente elegida dependerá de una serie de factores y puede determinarla un experto en la técnica.
Las composiciones farmacéuticas de la presente descripción se pueden formular mediante el uso de portadores farmacéuticamente aceptables bien conocidos en la técnica en dosis adecuadas para la administración oral, nasogástrica o rectal. Dichos portadores permiten que las composiciones farmacéuticas se formulen como comprimidos, píldoras, cápsulas, líquidos, geles, jarabes, lechadas, suspensiones y similares, para la ingestión oral, rectal o nasal por parte de un paciente a tratar, la formulación puede incluir una cápsula o comprimido formulado para suministro gastrointestinal, por ejemplo, una cápsula o píldora con recubrimiento entérico.
Las composiciones farmacéuticas adecuadas para su uso en la presente descripción incluyen, como se describe en la presente descripción, composiciones donde los ingredientes activos están contenidos en una cantidad eficaz para lograr su propósito previsto. La cantidad variará de un individuo a otro y dependerá de una serie de factores, que incluyen la microbiota intestinal del sujeto, si el paciente ya ha comenzado o suspendido la terapia de bloqueo de punto de regulación, el tipo y la dosis de la terapia de bloqueo de punto de regulación, si el paciente tiene colitis distinta a la colitis asociada a la terapia de bloqueo de punto de regulación, si el paciente ya tiene colitis asociada a la terapia de bloqueo de punto de regulación, el grado o la gravedad de cualquier colitis, la necesidad médica del paciente de una terapia de bloqueo de punto de regulación, los resultados de cualquier método descrito en la presente descripción para evaluar el riesgo del paciente de desarrollar o experimentar un aumento en la gravedad o una colitis asociada a la terapia de bloqueo de punto de regulación más grave, y el estado físico general del paciente.
Las composiciones de la presente descripción se pueden administrar para tratamientos terapéuticos, que pueden incluir tratamientos profilácticos. Por ejemplo, las composiciones farmacéuticas de la presente descripción se administran en una cantidad suficiente para tratar, prevenir y/o mejorar la colitis asociada a la terapia de punto de regulación, por ejemplo, aparición de la colitis, aumento de la gravedad de la colitis preexistente, aparición de uno o más síntomas de colitis y/o aumento de la gravedad de uno o más síntomas de colitis. Como bien se conoce en las técnicas médicas, las dosis para cualquier paciente dependen de muchos factores, que incluyen la etapa de la enfermedad o afección, la gravedad de la enfermedad o afección, la talla del paciente, el área de superficie corporal, la edad, el compuesto en particular que se administrará, el género, el tiempo y la vía de administración, la salud general y otros fármacos que se administren simultáneamente.
En consecuencia, se puede administrar una bacteria terapéutica a un paciente sola, o en combinación con uno o más fármacos diferentes, particularmente un agente terapéutico de bloqueo de punto de regulación, secuencias de nucleótidos, cambios en el estilo de vida, etc. usados en el tratamiento y/o prevención de la colitis, particularmente la colitis asociada a la terapia de bloqueo de punto de regulación, y/o síntomas de la misma, y/o en composiciones farmacéuticas donde se mezcla con excipiente(s) u otros portadores farmacéuticamente aceptables.
Se pueden proporcionar administraciones únicas o múltiples de las formulaciones en dependencia de la dosis y la frecuencia, según lo requiera y tolere el paciente. Las formulaciones deben proporcionar una cantidad suficiente de agente activo para tratar, prevenir y/o mejorar eficazmente la colitis asociada a la terapia de bloqueo de punto de regulación, o síntomas o complicaciones de la misma como se describe en la presente descripción.
5.5 Métodos de tratamiento y uso de bacterias terapéuticas
En la presente descripción se describe un método para tratar la colitis asociada a la terapia de bloqueo de punto de regulación. El tratamiento, como se describe en la presente descripción, incluye prevenir la aparición de la colitis asociada a la terapia de bloqueo de punto de regulación y/o uno o más síntomas de la misma, prevenir un aumento en la gravedad de la colitis asociada a la terapia de bloqueo de punto de regulación y/o uno o más síntomas de la misma, lo que incluye prevenir la progresión de la colitis asociada a la terapia de bloqueo de punto de regulación o la colitis resultante, al menos parcialmente, de la terapia de bloqueo de punto de regulación a un grado superior, disminuir la gravedad de la colitis asociada a la terapia de bloqueo de punto de regulación y/o uno o más síntomas de la misma, lo que incluye causar la regresión de la colitis asociada a la terapia de bloqueo de punto de regulación o la colitis resultante, al menos parcialmente, de la terapia de bloqueo de punto de regulación a un grado inferior, y/o causar el cese de la colitis asociada a la terapia de bloqueo de punto de regulación y/o uno o más síntomas de la misma, lo que incluye el cese de la colitis resultante, al menos parcialmente, de la terapia de bloqueo de punto de regulación. Tratar, como se describe en la presente descripción, incluye administrar a un sujeto que necesita dicho tratamiento, una cantidad eficaz de una composición descrita en la presente descripción, por ejemplo, una o más bacterias terapéuticas, que incluyen, pero sin limitarse a, una o más bacterias terapéuticas recombinantes, o una composición que contiene una o muchas de tales bacterias terapéuticas.
Las composiciones descritas en la presente descripción pueden incluir uno o más miembros del filo Bacteroidetes y tres de sus familias (Bacteroidaceae, Rikenellaceae y Barnesiellaceae), una de sus combinaciones o un conglomerado que incluye una o más de las bacterias anteriores.
Las bacterias terapéuticas pueden tener un módulo genético bacteriano para el transporte de poliaminas y/o la biosíntesis de vitamina B, particularmente la biosíntesis de riboflavina (vitamina B2), pantotenato (vitamina B5) y tiamina (vitamina B1). Dicho módulo genético bacteriano puede ser completamente nativo, o las bacterias terapéuticas pueden incluir células recombinantes como se describe más abajo.
Los sujetos que necesitan dicho tratamiento o composiciones pueden incluir sujetos que están recibiendo o pueden recibir terapia de bloqueo de punto de regulación. Dichos sujetos típicamente incluyen pacientes con ciertos cánceres y enfermedades infecciosas. Los sujetos que necesitan dicho tratamiento o composiciones pueden tener colitis asociada a la terapia de bloqueo de punto de regulación, colitis asociada, al menos parcialmente, a la terapia de bloqueo de punto de regulación, o colitis no asociada a la terapia de bloqueo de punto de regulación. Los sujetos que necesitan dicho tratamiento o composiciones pueden tener un mayor riesgo de desarrollar colitis por terapia de bloqueo de punto de regulación y/o de experimentar colitis por terapia de bloqueo de punto de regulación más grave. En algunas modalidades no limitantes, dicho riesgo se evalúa mediante el uso de métodos y composiciones descritos en la presente descripción.
La presente descripción proporciona un método para tratar la colitis asociada a la terapia de bloqueo de punto de regulación mediante la administración, a un sujeto que necesita dicho tratamiento, de una cantidad eficaz de un probiótico que incluye al menos una bacteria terapéutica. El probiótico puede incluir flora endógena (por ejemplo, un trasplante autólogo de microbiota fecal) que se reintroduce en el sujeto.
La presente descripción proporciona un método para tratar la colitis asociada a la terapia de bloqueo de punto de regulación mediante la administración, a un sujeto que necesita dicho tratamiento, de una cantidad eficaz de un prebiótico que incluye una bacteria terapéutica. El prebiótico se puede administrar por separado de las bacterias terapéuticas. El prebiótico promueve el crecimiento, la proliferación y/o la supervivencia de al menos una bacteria terapéutica.
El prebiótico puede incluir uno o más agentes, por ejemplo, un suplemento nutricional, que aumenta el crecimiento y la supervivencia de al menos una bacteria terapéutica, el prebiótico puede incluir uno o más de carbohidratos complejos, oligosacáridos, fructanos de tipo inulina o arabinoxilanos mal absorbidos.
La presente descripción proporciona un método para tratar la colitis asociada a la terapia de bloqueo de punto de regulación mediante la administración, a un sujeto que necesita dicho tratamiento, de una cantidad eficaz de un posbiótico que incluye una bacteria terapéutica. El posbiótico se puede administrar por separado de las bacterias terapéuticas. El posbiótico puede incluir uno o más agentes, tales como una proteína, expresada por las bacterias terapéuticas; el posbiótico puede incluir metabolitos bacterianos que tratan o ayudan a tratar la colitis asociada a la terapia de bloqueo de punto de regulación.
La presente descripción proporciona un método para tratar la colitis asociada al bloqueo de punto de regulación que incluye determinar el riesgo asociado a la terapia de bloqueo de punto de regulación como se describe en la presente descripción. El método puede incluir además determinar cualquier cambio en el riesgo asociado a la terapia de bloqueo de punto de regulación a lo largo del tiempo en el sujeto. La presente descripción proporciona un método para tratar la colitis asociada al bloqueo de punto de regulación que incluye evaluar el grado o la gravedad de la colitis en el sujeto tratado.
La presente descripción proporciona el uso de cualquier composición descrita en la presente descripción, que incluye el uso de cualquier bacteria terapéutica descrita en la presente descripción para tratar la colitis asociada a la terapia de bloqueo de punto de regulación en un sujeto. El uso puede caracterizarse además por aspectos de los métodos descritos anteriormente y en otros lugares en la presente descripción.
5.6 Kits
La materia actualmente descrita proporciona kits para diagnosticar que un sujeto que recibe o potencialmente recibe terapia de bloqueo de punto de regulación tiene un riesgo mayor o reducido de desarrollar colitis asociada a la terapia de bloqueo de punto de regulación, que incluye el desarrollo de cualquier síntoma de colitis asociada a la terapia de bloqueo de punto de regulación, el desarrollo de una colitis asociada a la terapia de bloqueo de punto de regulación o síntomas asociados más graves, experimentar una progresión más rápida de la colitis asociada a la terapia de bloqueo de punto de regulación o síntomas asociados, o experimentar una respuesta disminuida a otros tratamientos contra la colitis después de recibir la terapia de bloqueo de punto de regulación.
El kit puede incluir un agente para determinar si las heces o el contenido intestinal de un sujeto contienen una mayor abundancia de bacterias del filo Bacteroidetes, que incluyen, pero sin limitarse a, bacterias de las familias Bacteroidaceae, Rikenellaceae y Barnesiellaceae, y/o un aumento de las vías genéticas microbianas que involucran el transporte de poliaminas y/o la biosíntesis de vitamina B (por ejemplo, (riboflavina (B2), pantotenato (B5) y tiamina (B1)).
El agente puede incluir cebadores de ácido nucleico específicos para dichas bacterias. Los cebadores de ácido nucleico son específicos para la secuenciación del ARNr 16S.
La materia actualmente descrita proporciona kits para tratar a un sujeto que ha recibido o puede recibir terapia de bloqueo de punto de regulación. En ciertas modalidades no limitantes, el kit incluye una o más composiciones o bacterias terapéuticas como se describe en la presente descripción.
El kit puede incluir instrucciones para administrar las composiciones o bacterias terapéuticas. Las instrucciones pueden incluir información sobre el uso de las composiciones o bacterias terapéuticas para tratar la colitis asociada a la terapia de bloqueo de punto de regulación. Las instrucciones pueden incluir al menos uno de los siguientes: descripción de la composición o bacteria terapéutica; pauta posológica y administración; precauciones; advertencias; indicaciones; contraindicaciones; información de sobredosis; reacciones adversas; farmacología animal; estudios clínicos; y/o referencias. Las instrucciones se pueden imprimir directamente en un contenedor (cuando esté presente) que contiene la composición o bacteria terapéutica, o como una etiqueta aplicada al contenedor, o como una hoja, folleto, tarjeta o carpeta separada suministrada en o con el contenedor.
El kit puede incluir ambos componentes para diagnosticar que un sujeto que recibe o potencialmente recibe terapia de bloqueo de punto de regulación tiene un riesgo mayor o reducido de desarrollar colitis asociada a la terapia de bloqueo de punto de regulación y componentes para tratar a un sujeto que ha recibido o puede recibir terapia de bloqueo de punto de regulación. El kit puede incluir instrucciones para administrar componentes para tratar al sujeto basándose en los resultados obtenidos mediante el uso de los componentes para diagnosticar al sujeto.
6. Ejemplos de trabajo
El tema actualmente descrito se entenderá mejor en referencia a los siguientes ejemplos, que se proporcionan como ilustración de la invención, y no a modo de limitación.
En estos ejemplos, puede hacerse referencia a la terapia de bloqueo de punto de regulación como “bloqueo de CTL4”.
6.1 Métodos—Preparación del espécimen de ADN, secuenciación y análisis estadísticos
Se usaron los siguientes métodos en relación con los ejemplos restantes.
6.1(a) Pacientes del estudio y recolección de especímenes de pacientes que reciben terapia de bloqueo de punto de regulación
Se recolectaron muestras fecales de 34 pacientes adultos diagnosticados con melanoma metastásico que recibieron terapia de bloqueo de punto de regulación con ipilimumab en el Memorial Sloan-Kettering Cancer Center (MSKCC). Para 30 pacientes, se recogieron muestras fecales de cada paciente antes de la primera administración de ipilimumab; para 2 pacientes que desarrollaron inflamación gastrointestinal y 2 que permanecieron sin inflamación, las muestras se recolectaron después de comenzar la administración de ipilimumab, pero antes de la aparición de la colitis. Las toxicidades se calificaron retrospectivamente por un único investigador basándose en la revisión del historial mediante el uso de CTCAE, versión 4.0 y calificación según los términos diarrea y colitis. A los pacientes se les asignó una puntuación de colitis basada en lo siguiente: sin diarrea (puntuación 0), diarrea de grado 1 (puntuación 1), diarrea de grado 2 (puntuación 2), diarrea de grado 2 y/o colitis de grado 2 (los 3 casos tenían diarrea de grado 2 y colitis de grado 2) (puntuación 3), diarrea de grado 3 y/o colitis de grado 3 (1 caso con diarrea de grado 3 y colitis de grado 3) (puntuación 4). Todos los participantes dieron su consentimiento por escrito para la recolección y análisis de especímenes según el protocolo del estudio aprobado por la Junta de Revisión Institucional de MSKCC.
Los sujetos no tenían antecedentes de colitis ni resección intestinal, y no habían recibido tratamiento con antibióticos en los 2 meses anteriores. Los pacientes se excluyeron del análisis si la primera muestra fecal se recolectó después de la aparición de la colitis, si el paciente no recibió ipilimumab o si se desconocía el estado de colitis. Se administró monoterapia con ipilimumab a una dosis de 3 mg/kg cada 3 semanas hasta un máximo de 4 dosis, con tres excepciones. Los pacientes #10 y #15 recibieron vemurafenib antes y durante el tratamiento con ipilimumab como parte de un ensayo clínico. El paciente #13 formó parte de un ensayo clínico con ocultación y recibió ipilimumab a dosis de 3 mg/kg o 10 mg/kg. Un pequeño número de pacientes (que progresaron a colitis, n=2; sin colitis, n=3) recibieron dosis adicionales de ipilimumab como parte del tratamiento de mantenimiento (cada 3 meses) en un estudio clínico o como parte de un segundo curso de ipilimumab; sin embargo, los casos de colitis documentados aquí se produjeron antes de que se administrara esta dosis adicional. El tratamiento sistémico del cáncer administrado antes (n=14) o durante (n=2) de la terapia con ipilimumab se determinó retrospectivamente tras la revisión del historial por parte de un único investigador (MKC).
6.1(b) Extracción del ADN
Cada muestra fecal se congeló inmediatamente a -80 ° C y subsecuentemente se sometió a batido con perlas y extracción con fenol cloroformo para la purificación del ADN. Las muestras se resuspendieron en 500 µl de un tampón de extracción (Tris 200 mM, pH 8,0/NaCl 200 mM/EDTA 20 mM), 200 µl de SDS al 20 %, 500 µl de fenol:cloroformo:alcohol isoamílico (24:24:1) y 500 µl de perlas de circonio/sílice de 0,1 mm de diámetro (BioSpec Products). Durante 2 minutos, las células se lisaron mediante ruptura mecánica mediante el uso de un batidor de perlas. El ADN se extrajo dos veces en una solución de fenol/cloroformo/isoamilo y se precipitó con etanol y acetato de sodio. El ADN se resuspendió en 200 µl de tampón TE que contenía 100 µg/ml de RNasa y se purificó adicionalmente mediante el uso de columnas QIAmp Mini Spin (Qiagen). Después de eluir la muestra en 100 µl de agua destilada, se cuantificó el ADN de doble hebra.
6.1(c) Amplificación del gen del ARNr 16S y secuenciación multiparalela
La región V4-V5 del gen del ARNr 16S se amplificó y secuenció en una plataforma MiSeq de Illumina. Para cada muestra fecal, se realizaron reacciones de PCR replicadas mediante el uso de cebadores bacterianos universales modificados diseñados para amplificar la región V4-V5 del ARNr 16S: 563F (59-nnnnnnnn-NNNNNNNNNNNN-AYTGGGYDTAAAGN G-39) (SEQ. ID. No.:1) y 926R (59- nnnnnnnn-NNNNNNNNNNNN-CCGTCAATTYHTTTR AGT-39) (SEQ. ID. No.:2). Cada reacción contenía 50 ng de ADN purificado, dNTP 0,2 mM, MgCl21,5 uM, 1,25 U de ADN polimerasa Taq Platinum, 2,5 µl de tampón de PCR 10x y 0,2 µM de cada cebador. Un código de barras Golay (Ns) único de 12 bases precedió a los cebadores para la identificación de muestras después de combinar los amplicones. Se añadieron de uno a ocho nucleótidos adicionales antes del código de barras para desplazar la secuenciación de los cebadores. Las condiciones de ciclos fueron las siguientes: 94 °C durante 3 min, seguido de 27 ciclos de 94 °C durante 50 s, 51 °C durante 30 s y 72 °C durante 1 min, donde la etapa de elongación final se realizó a 72 °C durante 5 min. Las PCR replicadas se combinaron y se purificaron subsecuentemente mediante el uso del kit de purificación de PCR Qiaquick (Qiagen) y el kit de purificación de PCR Qiagen MinElute (Qiagen). Mediante el uso del procedimiento de preparación de muestras de TruSeq de Illumina, los productos de PCR se cuantificaron y combinaron en cantidades equimolares antes de ligarlos a los códigos de barras y los adaptadores de Illumina. La biblioteca completa se secuenció en una plataforma Miseq de Ilumina de acuerdo con el protocolo recomendado por Illumina.
6.1(d) Números de acceso
Las secuencias del gen del ARNr 16S y las secuencias de secuenciación aleatoria (R1 directa, R2 inversa) analizadas en la presente descripción se han depositado en la base de datos del NCBI SRA con la ID de BioProject: PRJNA302832.
Los números de acceso de BioSamples asociados son los siguientes: SAMN04281019, SAMN04281020, SAMN04281021, SAMN04281022, SAMN04281023, SAMN04281024, SAMN04281025, SAMN04281026, SAMN04281027, SAMN04281028, SAMN04281029, SAMN04281030, SAMN04281031, SAMN04281032, SAMN04281033, SAMN04281034, SAMN04281035, SAMN04281036, SAMN04281037, SAMN04281038, SAMN04281039, SAMN04281040, SAMN04281041, SAMN04281042, SAMN04281043, SAMN04281044, SAMN04281045, SAMN04281046, SAMN04281047, SAMN04281048, SAMN04281049, SAMN04281050, SAMN04281051, SAMN04281052 || SAMN04281200, SAMN04281201, SAMN04281202, SAMN04281203, SAMN04281204, SAMN04281205, SAMN04281206, SAMN04281207, SAMN04281208, SAMN04281209, SAMN04281210, SAMN04281211, SAMN04281212, SAMN04281213, SAMN04281214, SAMN04281215, SAMN04281216, SAMN04281217, SAMN04281218, SAMN04281219, SAMN04281220, SAMN04281221, SAMN04281222, SAMN04281223, SAMN04281224, SAMN04281225, SAMN04281226, SAMN04281227, SAMN04281228, SAMN04281229, SAMN04281230, SAMN04281231, SAMN04281232, SAMN04281233, SAMN04281234, SAMN04281235, SAMN04281236, SAMN04281237, SAMN04281238, SAMN04281239, SAMN04281240, SAMN04281241, SAMN04281242, SAMN04281243.
6.1(e) Análisis de secuencias de ADN
Las secuencias de ADN se analizaron mediante el uso de la versión 1.31.1 de Mothur. Las secuencias se alinearon mediante el uso de la alineación de referencia de Silva como plantilla y las secuencias potencialmente quiméricas se eliminaron mediante el uso del algoritmo UChime. Se seleccionaron 5000 secuencias por paciente (media, 4974; SD, 150) y las secuencias con una similitud basada en la distancia del 97 % o más se agruparon en OTU mediante el uso del algoritmo del vecino más lejano. Las OTU se clasificaron mediante el uso de la base de datos de referencia de ARNr 16S de Greengenes.
La diversidad microbiana basada en OTU se estimó mediante el cálculo de dos índices de diversidad, Shannon y Simpson inverso. La riqueza basada en OTU se determinó mediante el cálculo de la estimación de riqueza de Chao y construcción de curvas de rarefacción.
Las OTU se agruparon en diferentes niveles de clasificación (filo, clase, orden, familia, género); en cada nivel, las OTU que no tenían una clasificación se agruparon según la resolución más alta disponible (por ejemplo, a nivel de género, una OTU clasificada como p_Bacteroidetes c_Bacteroidia_ o_Bacteroidales_ f_Barnesiellaceae_sin clasificar se agrupó como f_Barnesiellaceae_sin clasificar). La selección de características de la composición de microbios intestinales se realizó en OTU con una abundancia promedio mayor que 0,01 % en cualquiera de los grupos de pacientes (que progresaron a colitis o sin colitis) y se agruparon por filotipo.
6.1(f) Secuenciación aleatoria y reconstrucción de vías metabólicas
Se sometieron a secuenciación aleatoria muestras de heces de los 10 pacientes que progresaron a colitis (PtC) y de los 12 pacientes sin colitis (C-F). Se eligieron muestras de pacientes con C-F de modo que estuviera representado todo el espectro de abundancia del filo Bacteroidetes. Las bibliotecas se construyeron con códigos de barras Illumina del kit de preparación de muestras de ADN TruSeq (Illumina) y reactivos del kit de preparación de bibliotecas KAPA (Kapa Biosystems) y después se secuenciaron en una plataforma MiSeq de Illumina mediante el uso de una secuenciación de extremos pareados de 2 x 250 nucleótidos, de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Las lecturas de secuenciación se convirtieron en abundancias relativas de módulos metabólicos microbianos mediante el uso de HUMAnN, el proceso de reconstrucción metabólica del Proyecto del Microbioma Humano, y se asignaron a la Enciclopedia de Genes y Genomas de Kioto (KEGG). Las abundancias relativas de las especies se calcularon mediante el proceso MetaPhlAn.
6.1(g) Estadísticas
Los análisis estadísticos de las muestras de microbiota intestinal se realizaron mediante el uso de los paquetes de software R Statistical Language (v3.1.1) y GraphPad Prism (versión 6.0e). Se usó la prueba de suma de rangos de Mann-Whitney para datos independientes (bilateral) para comparar variables continuas entre dos grupos. Se usaron gráficos de barras para representar la media de los datos en los valores centrales, con barras de error para indicar la desviación estándar. Se usaron pruebas de correlación de rangos de Spearman (bilateral) para encontrar correlaciones significativas entre dos variables continuas. Se usó análisis discriminante lineal con efecto del tamaño (LEfSe) para identificar características diferencialmente abundantes entre clases de muestras. La partición recursiva para formar árboles de clasificación se realizó en R mediante el uso de los paquetes rpart. Se construyó un modelo lineal generalizado (mediante el uso de regresión probit y la función glm R) en todas las combinaciones de los siguientes cinco módulos genéticos asociados con pacientes sin colitis: Sistema de transporte de poliaminas (M299), Biosíntesis de riboflavina (M125), Biosíntesis de pantotenato (M119), Biosíntesis de tiamina (M127) y Biosíntesis de biotina (M123). Se usó una validación cruzada con exclusión de uno para calcular la sensibilidad y especificidad del modelo. Los valores de p no ajustados menores que 0,05 se consideraron significativos para la prueba de suma de rangos de Mann-Whitney y las pruebas de correlación de rangos de Spearman.
6.2 Desarrollo de colitis en pacientes que reciben terapia de bloqueo de punto de regulación
Los datos experimentales confirmaron que la presencia o ausencia de microbiota del filo Bacteroidetes y ciertos módulos genéticos bacterianos que a veces se encuentran en miembros de ese filo predicen el desarrollo de colitis asociada a la terapia de bloqueo de punto de regulación. Se descubrió que la microbiota del filo Bacteroidetes y ciertos módulos genéticos bacterianos que a veces se encuentran en miembros de ese filo se correlacionan con la protección contra la colitis asociada a la terapia de bloqueo de punto de regulación.
6.2(a) Desarrollo de colitis en pacientes después del bloqueo de CTLA-4
Para correlacionar la composición fecal previa a la colitis con el desarrollo subsecuente de colitis asociada al bloqueo de punto de regulación, se analizó la microbiota intestinal de 34 pacientes. Los pacientes que no desarrollaron inflamación gastrointestinal después del bloqueo de CTLA-4 se denominan en la presente descripción sin colitis (C-F), y los pacientes que experimentaron complicaciones inflamatorias después del bloqueo de CTLA-4 se denominan que progresaron a colitis (PtC).
A los pacientes se les asignó una puntuación de colitis mediante revisión retrospectiva del historial, que varió desde sin diarrea (puntuación 0) en pacientes C-F hasta colitis grave (puntuación 4) en pacientes PtC, como se describe en el Ejemplo 6.1. La edad del paciente se definió a partir de la primera dosis de ipilimumab y se redondeó hacia abajo al número entero más cercano. Los antecedentes de terapia antineoplásica sistémica de los pacientes se determinaron mediante una revisión retrospectiva del historial.
Los pacientes de este estudio tenían edades comprendidas entre 28 y 85 años y fueron diagnosticados con melanoma metastásico. El 40 % de los pacientes PtC y el 50 % de los pacientes C-F se trataron con terapia antineoplásica sistémica administrada antes (14/16) o antes y durante (2/16; ambos C-F) del ciclo de tratamiento con ipilimumab. En general, se obtuvieron muestras fecales de pacientes antes de la primera dosis de ipilimumab (30/34), aunque en pacientes que subsecuentemente desarrollaron inflamación y 2 pacientes que permanecieron sin inflamación, las muestras se obtuvieron después del inicio de ipilimumab pero antes de la aparición de la colitis. De los 34 pacientes, a 10 se les diagnosticó inflamación gastrointestinal entre 13 y 57 días después del inicio de ipilimumab.
La evaluación de los pacientes se presenta en la Tabla 1. El símbolo (+) indica tratamientos que se brindan simultáneamente, mientras que el símbolo (;) indica tratamientos administrados en diferentes momentos. El símbolo (*) indica el tratamiento antineoplásico sistémico administrado antes y durante la terapia con ipilimumab. Pacientes C-F, n=24; Pacientes PtC, n=10.
Tabla 1: Evaluación de colitis del aciente
Como lo muestran los datos de la Tabla 1, no hubo diferencias significativas en edad o género entre los pacientes C-F y PtC. La población de pacientes presentada en la Tabla 1 se usó en todos estos ejemplos.
6.2(b) Microflora intestinal en pacientes a los que se les administró bloqueo de CTLA-4.
En la Figura 1A, la recolección de muestras fecales (círculo) y la aparición de la colitis (triángulo) se muestran en los puntos de tiempo indicados durante el tratamiento con ipilimumab, un anticuerpo monoclonal que bloquea la señalización de CTLA-4. Las fechas son con relación a la primera dosis del tratamiento con ipilimumab. Se usó una abundancia promedio mayor que 0,01 % como umbral para considerar la presencia de una OTUs en las muestras fecales en cualquiera de los grupos de pacientes (OTUs, n=578); no se consideró que las OTUs con una abundancia del 0,01 % o menos estuvieran presentes en la microbiota de los pacientes.
Mediante el uso de esta definición, se calculó el número de OTUs presentes solo en pacientes C-F, solo en pacientes PtC o compartidas entre los grupos de pacientes. Los resultados se presentan en un diagrama de Venn a escala (Figura 1B). También se determinó la abundancia relativa media de OTUs (Figura 1C), la abundancia total de OTUs (Figura 1D) y la distribución de OTUs (Figura 1E) que están presentes solo en pacientes C-F, solo en pacientes PtC o compartidas entre los pacientes.
Los pacientes C-F y PtC albergaban microbiota intestinal con poblaciones microbianas igualmente complejas y compartían 239 de 578 OTUs (definidas con una similitud de secuencia del 97 %) (Figura 1B). Estas 239 OTUs compartidas representan el 79 % y el 83 % de la abundancia total de OTUs en los grupos de pacientes C-F y PtC, respectivamente (Figura 1C y Figura 1D), y muchas estaban presentes en 5 o más pacientes (Figura 1D). Por el contrario, las OTUs que se asociaron únicamente con pacientes C-F o PtC generalmente se detectaron en menos de 5 pacientes (Figura 1E).
Las OTUs que se comparten entre los grupos de pacientes C-F y PtC están distribuidas de manera más uniforme.
Aproximadamente el 20 % de las OTUs compartidas se encuentran en más de la mitad de todos los pacientes (Figura 1E).
La biodiversidad en cada muestra de pacientes se estimó mediante el índice de Simpson inverso (Figura 2A) y el índice de Shannon (Figura 2B). La riqueza se midió mediante el estimador de Chao (Figura 2C) y las curvas de rarefacción (Figura 2D) Se usaron pruebas de Mann-Whitney para comparar los parámetros de diversidad microbiana entre los grupos de pacientes. Estas diferencias en la distribución de OTUs entre los grupos de pacientes no tuvieron un impacto significativo en la biodiversidad general. Se encontró que la riqueza microbiana, que refleja el número de filotipos únicos dentro de una muestra determinada, era similar entre los pacientes que desarrollaron colitis asociada al bloqueo de CTLA-4 y aquellos que permanecieron sin colitis.
También se evaluó la composición de los microbiomas intestinales de los pacientes. Las OTUs con una abundancia promedio mayor que 0,01 % dentro de cualquier grupo de pacientes se clasificaron a nivel taxonómico familiar (Figuras 3A-3J). Las abundancias relativas de las 146 OTUs bacterianas en pacientes C-F y PtC representadas en un mapa de calor. Las OTUs representadas gráficamente estaban presentes en una abundancia media de 0,1 % o mayor (Figura 3K). Los pacientes C-F albergaban una mayor proporción de microbios dentro de la familia Bacteroidaceae), aunque los pacientes C-F y PtC compartían muchos taxones bacterianos que pertenecen al filo Firmicutes.
Para ilustrar la composición de la microbiota con una resolución más fina, se representaron gráficamente las abundancias relativas de 146 OTUs con una abundancia media de 0,1 % o mayor. Generalmente, se encontraron amplias franjas de microbiota con frecuencias similares entre los grupos de pacientes C-F y PtC. Sin embargo, como se muestra en la (Figura 3K), la microbiota dentro del filo Bacteroidetes está subrepresentada en pacientes que desarrollaron colitis inmunomediada de nueva aparición.
Para caracterizar mejor su microbiota intestinal, las muestras fecales de los sujetos se enviaron para realizar un perfil de microbiota bacteriana mediante el uso de secuenciación de ARNr 16S en la plataforma MiSeq de Illumina. Para examinar la estructura de la microbiota intestinal entre grupos de pacientes, se representaron gráficamente las frecuencias relativas de filotipos bacterianos a nivel taxonómico de familia para cada paciente. Las lecturas de secuenciación del 16s se agruparon en OTUs por homología de secuenciación del 97 % (Figura 4A). Las abundancias relativas de OTUs que cumplieron con nuestro umbral definido (de una abundancia promedio mayor que 0,01 % en cualquier grupo de pacientes) se representaron gráficamente por filo. Se construyeron gráficos de barras solo para aquellos pacientes cuyas muestras se sometieron a secuenciación metagenómica aleatoria. Las abundancias relativas de lecturas de secuenciación metagenómica aleatoria se calcularon mediante el uso de MetaPhlAn y se representaron gráficamente por filo (Figura 4B). Las clasificaciones taxonómicas usadas, basadas en datos de secuenciación del 16S, fueron similares a las encontradas al aplicar MetaPhlAn a los datos de secuenciación metagenómica aleatoria en un subconjunto de esta cohorte de pacientes, aunque las proporciones de algunos filos bacterianos varían entre los dos métodos.
6.2(c) Los miembros del filo Bacteroidetes están asociados con resistencia al desarrollo de colitis asociada al bloqueo de CTLA-4
Las OTU con una abundancia promedio mayor que 0,01 % dentro de cada grupo de pacientes se categorizaron en diferentes niveles de clasificación taxonómica (filo, clase, orden, familia, género). La correlación de los filotipos bacterianos con la puntuación de colitis basada en CTCAE se comparó mediante análisis de Spearman (Figura 5A). De acuerdo con este análisis, la microbiota dentro del filo Bacteroidetes es más prevalente en muestras de pacientes C-F, lo que se demostró mediante el análisis de la abundancia relativa de especies bacterianas agrupadas en diferentes niveles taxonómicos.
La abundancia relativa del filo Bacteriodetes en pacientes PtC y C-F también se evaluó mediante el mediante el uso de la prueba de Mann-Whitney (p<0,05) (Figura 5B). c) El número de OTUs asignadas al filo Bacteroidetes en cada grupo de pacientes. Abundancias relativas de las familias d) Bacteroidaceae, e) Rikenellaceae, f) Barnesiellaceae dentro del filo Bacteroidetes en pacientes PtC y C-F
La abundancia relativa de especies clasificadas como Bacteroidetes, así como también el número de OTUs asignadas al filo, fueron significativamente mayores en pacientes C-F (prueba de Mann-Whitney, p<0,05) (Figura 3B y Figura 3C). Dentro del filo Bacteroidetes, la prevalencia de Bacteroidaceae (Figura 3D), Rikenellaceae (Figura 3E) y Barnesiellaceae (Figura 3F) se correlacionó significativamente con la resistencia a la colitis asociada a ipilimumab (prueba de Mann-Whitney, p<0,01, p<0,05, p<0,05, respectivamente).
Para evaluar la relación entre miembros bacterianos específicos de la microbiota intestinal y el desarrollo de colitis asociada al bloqueo de CTLA-4, en primer lugar se estratificó a los sujetos según la gravedad de la inflamación. En segundo lugar, se realizó una prueba de correlación de rangos de Spearman a las abundancias relativas de especies bacterianas agrupadas en diferentes niveles taxonómicos. Si bien la composición de la microbiota intestinal puede variar a lo largo de la vida de un individuo, no hubo asociación entre la edad de un sujeto y la abundancia de Bacteroidetes (Figura 6).
6.2(d) Los módulos genéticos bacterianos involucrados en el transporte de poliaminas y la síntesis de vitamina B están asociados con la resistencia a la colitis.
Para evaluar las vías genéticas que pueden desempeñar un papel en el desarrollo de la colitis inmunomediada, se realizó una secuenciación metagenómica aleatoria a las muestras fecales de 10 pacientes PtC y 12 C-F. Las lecturas de secuenciación se procesaron mediante el uso de HUMAnN y se asignaron a módulos KEGG (Enciclopedia de genes y genomas de Kioto). Después se realizó una prueba univariante para determinar las asociaciones entre el estado de colitis y los 102 módulos microbianos mediante el uso de análisis discriminante lineal con efecto del tamaño (LEfSe).
En la Figura 7A se presenta la abundancia relativa de 102 módulos genéticos microbianos KEGG en pacientes C-F y PtC. Los módulos genéticos bacterianos de la microbiota intestinal de pacientes C-F y PtC eran muy similares. También se determinó la asociación de módulos genéticos con el estado de colitis mediante análisis discriminante lineal con efecto del tamaño (LEfSe) (Figura 7B). El sistema de transporte de poliaminas espermidina/putrescina y tres módulos involucrados en la biosíntesis de las vitaminas B (riboflavina (B2), pantotenato (B5) y tiamina (B1)) fueron más abundantes en los pacientes C-F.
También se representó gráficamente la correlación de los módulos genéticos con la puntuación de colitis mediante el análisis de Spearman (Figura 7C). Después de estratificar las muestras según el estado de colitis, el análisis de Spearman identificó que el sistema de transporte de poliaminas y los módulos de tiamina (B1) se correlacionaban con la resistencia al desarrollo de colitis.
Las abundancias relativas de las vías antes mencionadas se enriquecen significativamente en muestras de pacientes C-F (prueba de Mann-Whitney, p<0,05 para todos los módulos) (Figura 7D). Además, un módulo adicional involucrado en la biosíntesis de la biotina (vitamina B7) se encontró en mayor abundancia en pacientes C-F (prueba de Mann-Whitney, p<0,05) (Figura 7D).
6.2(e) Los sujetos con colitis se pueden identificar mediante el uso de módulos genéticos bacterianos.
La exactitud predictiva de los módulos genéticos bacterianos en la identificación de pacientes que desarrollan colitis asociada a la terapia de bloqueo de punto de regulación también se evaluó mediante el uso de análisis de regresión. Para este análisis de regresión, los cuatro módulos genéticos bacterianos seleccionados se asociaron con la resistencia a la colitis según lo identificado en los análisis de Spearman y LEfSe. Los cuatro módulos genéticos bacterianos son el módulo del sistema de transporte de poliaminas y los módulos involucrados en la biosíntesis de las vitaminas riboflavina (B2), pantotenato (B5) y tiamina (B1).
El algoritmo de partición recursiva se utilizó para construir un árbol de clasificación con 102 módulos genéticos bacterianos, basado en la abundancia del módulo de transporte de poliaminas (Figura 8A). Las muestras se clasificaron con éxito como de pacientes PtC o C-F mediante el uso únicamente de la abundancia relativa del módulo del sistema de transporte de poliaminas. Se logró una sensibilidad del 70 % y una especificidad del 100 % en el análisis de los sujetos PtC, en base a 7 muestras identificadas adecuadamente y 3 muestras clasificadas erróneamente como C-F.
El algoritmo de partición recursiva también se usó con éxito para estimar el estado de colitis de muestras de pacientes basándose únicamente en la abundancia del sistema de transporte de poliaminas. Este algoritmo clasificó las muestras con una abundancia de módulos del 1 % o más como sin colitis. (Figura 9).
Una validación cruzada con exclusión de uno del análisis de regresión probit pudo predecir la probabilidad de colitis mediante el uso de cuatro módulos genéticos bacterianos asociados con la resistencia a la colitis: sistema de transporte de poliaminas, biosíntesis de tiamina, biosíntesis de riboflavina y biosíntesis de pantotenato (Figura 8B). El estado de colitis se predijo correctamente en 10 de 12 pacientes C-F y en 7 de 10 pacientes PtC, con un umbral de probabilidad del 50 %. Este modelo da como resultado una sensibilidad del 70 % y una especificidad del 83 %. En la Figura 8C, la sensibilidad y especificidad de cada módulo genético bacteriano independiente para predecir el estado de colitis de los pacientes mediante sus muestras microbianas fecales se determinó mediante el uso de un umbral de probabilidad del 50 %, en comparación con el modelo de cuatro módulos presentado en la Figura 8B. Como se muestra en la Figura 8C, los cuatro módulos genéticos bacterianos fueron más predictivos en combinación en comparación con cualquier módulo individual.
Como se muestra en la Figura 8D, se creó una curva ROC del modelo de cuatro módulos que predice el riesgo de colitis mediante el cálculo de la tasa de verdaderos positivos y la tasa de falsos positivos para 10000 umbrales de la probabilidad predicha de colitis entre 0 y 1. La tasa de verdaderos positivos representa la sensibilidad de la prueba, calculada mediante: Verdaderos Positivos / (Verdaderos Positivos Falsos Negativos). La tasa de falsos positivos, que viene dada por 1 menos la especificidad de la prueba, se calcula mediante: Falsos Positivos / (Falsos Positivos Verdaderos Negativos).
En combinación, el análisis de cuatro módulos predice el riesgo de colitis con buena exactitud. En base a los modelos analíticos descritos en la presente descripción, los cuatro módulos seleccionados sirven como biomarcadores para pacientes con alto riesgo de desarrollar colitis asociada al bloqueo de CTLA-4 porque dichos modelos analíticos identifican vías bacterianas que pueden conferir resistencia a la colitis.
Claims (7)
1. Un método para identificar a un sujeto con mayor o menor riesgo de desarrollar colitis asociada a la terapia de bloqueo de punto de regulación o con probabilidad de experimentar colitis asociada a la terapia de bloqueo de punto de regulación más o menos grave, el método comprende:
determinar el nivel de una o más bacterias o esporas de las mismas de la familia Bacteroidaceae en una muestra obtenida del microbioma intestinal de un sujeto tratado con una terapia de bloqueo de punto de regulación que comprende un inhibidor de CTLA-4;
comparar el nivel de la una o más bacterias o esporas en la muestra con al menos un nivel de bacterias de referencia;
en donde un nivel más bajo de la una o más bacterias o esporas de las mismas en la muestra en comparación con al menos un nivel de bacterias de referencia indica que el sujeto tiene un mayor riesgo de desarrollar colitis asociada a la terapia de bloqueo de punto de regulación o probablemente experimente colitis asociada a la terapia de bloqueo de punto de regulación más grave; y
en donde un mayor nivel de la una o más bacterias o esporas de las mismas en la muestra en comparación con al menos un nivel de bacterias de referencia indica que el sujeto tiene un menor riesgo de desarrollar colitis asociada a la terapia de bloqueo de punto de regulación o probablemente experimente colitis asociada a la terapia de bloqueo de punto de regulación menos grave.
2. El método de la reivindicación 1, en donde determinar el nivel de una o más bacterias o esporas de las mismas de la familia Bacteroidaceae en el microbioma intestinal de un sujeto comprende determinarlo en una muestra fecal del sujeto.
3. El método de la reivindicación 1, en donde determinar el nivel de una o más bacterias o esporas de las mismas de la familia Bacteroidaceae en el microbioma intestinal de un sujeto comprende realizar una secuenciación metagenómica para identificar biomarcadores asociados con las bacterias o esporas de las mismas.
4. El método de cualquiera de las reivindicaciones 1-3, en donde el nivel de bacterias de referencia se basa en la abundancia relativa de las bacterias o esporas de las mismas en comparación con otras bacterias en el microbioma intestinal.
5. El método de cualquiera de las reivindicaciones 1-4, que comprende determinar el nivel de dos o más bacterias o esporas de las mismas de la familia Bacteroidaceae en el microbioma intestinal de un sujeto y comparar los niveles con dos niveles de bacterias de referencia para las respectivas bacterias o esporas.
6. El método de cualquiera de las reivindicaciones 1-5, en donde el inhibidor de CTLA-4 es un anticuerpo anti-CTLA-4 o un fragmento de anticuerpo del mismo.
7. El método de la reivindicación 6, en donde el anticuerpo anti-CTLA-4 es ipilimumab.
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