CN115835875A

CN115835875A - 细菌在儿童发育评估和治疗中的应用

Info

Publication number: CN115835875A
Application number: CN202180042891.5A
Authority: CN
Inventors: 黄秀娟; 陈家亮; 徐之璐; 万亚婷
Original assignee: Chinese University of Hong Kong CUHK
Current assignee: Chinese University of Hong Kong CUHK
Priority date: 2020-06-15
Filing date: 2021-06-15
Publication date: 2023-03-21
Also published as: TW202214273A; WO2021254299A1; US20230226123A1

Abstract

本发明在于发现了与发育正常的儿童相比，在患有包括自闭症谱系障碍(ADS)在内的自闭症儿童的胃肠道中，某些细菌物种的存在和数量显著改变。在儿童发育的不同阶段中，还发现肠道细菌谱在儿童之间演变。因此，提供了用于评估儿童发育年龄和治疗有需要的儿童的方法。还提供了用于这些方法的试剂盒和组合物。

Description

细菌在儿童发育评估和治疗中的应用

相关申请

本申请要求2020年6月15日提交的美国临时专利申请第63/039,034号和2020年12月3日提交的美国临时专利申请第63/121,198号的优先权，以上所有的内容出于所有目的在此通过引用以其整体并入。

发明背景

自闭症谱系障碍(ASD)是一组复杂的发育障碍，其特征在于受损的社交互动和沟通以及重复行为。本研究的目的是确定患有自闭症的个体的细菌生物标志物，以及鉴定自闭症的益生菌/治疗性细菌。自闭症儿童与正常发育儿童之间的肠道细菌谱是不同的，并且该细菌谱也随着儿童的生长和发育而演变。肠道微生物群被认为是ASD发展的重要因素，也是儿童生长发育年龄的指标。目前没有诊断或治疗自闭症的有效方法，特别是没有使用微生物标志物来预测儿童中自闭症风险的现有模型，也没有使用微生物标志物来评估儿童发育年龄的任何模型。本发明提供了用于预测儿童中自闭症风险的新方法、通过微生物转移和/或补充来改善自闭症患者的行为症状的新方法以及基于儿童的肠道微生物分布来评估儿童发育年龄的新方法。

发明概述

本发明涉及用于治疗自闭症谱系障碍(ASD)的症状的新方法和组合物。特别地，本申请的发明人发现某些微生物物种，尤其是某些细菌，在处于患有ASD风险或患有ASD的儿童的胃肠(GI)道中处于改变的水平。可以通过调节患者肠道中相关微生物的水平，例如通过粪便微生物群移植(FMT)治疗或口服施用有益细菌物种或通过阻抑有害细菌物种的水平来实现健康益处，如改善行为症状和减轻有害影响。这些发现还提供了指示儿童中ASD存在或风险的新方法。因此，在第一方面，本发明提供了用于治疗ASD的新方法，其包括通过在罹患ASD的儿童的胃肠道中增加表1中指定的一种或多种细菌物种的水平来减轻ASD症状。

在一些实施方案中，引入步骤包括将包含有效量的所述一种或多种细菌物种的组合物经口服施用至所述对象。在一些实施方案中，引入步骤包括将包含有效量的所述一种或多种细菌物种的组合物递送至所述对象的小肠、回肠或大肠。在一些实施方案中，引入步骤包括粪便微生物移植(FMT)。在一些实施方案中，FMT包括向所述儿童施用包含经处理的供体粪便材料的组合物。一些实施方案中，口服施用所述组合物；或者所述组合物直接沉积到所述儿童的胃肠道。在一些实施方案中，在引入步骤之前从所述儿童获得的第一粪便样品和在引入步骤之后从所述儿童获得的第二粪便样品中确定所述一种或多种细菌物种的水平或者相对丰度。在一些实施方案中，通过聚合酶链式反应(PCR)，特别是定量PCR来确定所述一种或多种细菌物种的水平。

在第二方面，本发明提供了用于治疗ASD的方法，其包括通过在罹患ASD的儿童的胃肠道中降低表2中的一种或多种细菌物种的水平来减轻ASD症状。

在一些实施方案中，降低步骤包括FMT。在一些实施方案中，降低步骤包括用抗菌剂治疗所述对象。在一些实施方案中，在用所述抗菌剂治疗所述对象之后，将包含经处理的供体粪便材料的组合物引入所述对象的胃肠道。例如，口服施用所述组合物，或者所述组合物直接沉积到所述儿童的胃肠道。在一些实施方案中，在降低步骤之前从所述儿童获得的第一粪便样品和在降低步骤之后从所述儿童获得的第二粪便样品中确定所述一种或多种细菌物种的水平或者相对丰度。在一些实施方案中，通过PCR，尤其是通过定量PCR来确定一种或多种细菌物种的水平。

在相关方面，提供了用于治疗ASD症状的试剂盒。所述试剂盒包含第一容器和第二容器，所述第一容器含有第一组合物，所述第一组合物包含(i)有效量的表1所示的第一种细菌物种，或(ii)有效量的抗菌剂，所述抗菌剂阻抑表2所示的第一种细菌物种的生长，所述第二容器含有第二组合物，所述第二组合物包含(i)有效量的表1所示的第二种细菌物种，或(ii)有效量的抗菌剂，所述抗菌剂阻抑表2所示的第二种细菌物种的生长。

在一些实施方案中，第一组合物包含用于FMT的经处理的供体粪便材料，例如，该材料已被处理和配制用于口服施用，如干燥的、冷冻的或冻干的，并放置在适于口服摄入的胶囊中。在一些实施方案中，第二组合物被配制用于口服施用。在一些实施方案中，第一组合物和第二组合物均被配制用于口服施用。在一些情况下，试剂盒可以包含两种或更多种组合物，每种组合物包含有效量的表1所示的至少一种(可能两种或更多种)细菌物种，和/或(ii)有效量的抗菌剂，其阻抑表2所示的至少一种(可能两种或更多种)细菌物种的生长。试剂盒中的组合物可以各自包含生理上可接受的载体或赋形剂。

在第三方面，提供了用于确定人类儿童中自闭症谱系障碍(ASD)的风险的方法。所述方法包括以下这些步骤：(1)确定取自所述儿童的粪便样品中的表1或表2所示的任一种细菌物种的相对丰度；以及(2)检测来自步骤(1)的相对丰度不低于表1中的截止值或标准对照值或者低于表2中的截止值或标准对照值，并确定所述儿童不具有增加的ASD风险；或者检测来自步骤(1)的相对丰度低于表1中的截止值或标准对照值或者不低于表2中的截止值或标准对照值，并确定所述儿童具有增加的ASD风险。在一些实施方案中，通过PCR，例如定量PCR，确定儿童粪便样品中细菌物种的相对丰度。

在相关方面，提供了用于评估两个人类儿童中自闭症谱系障碍(ASD)的风险的方法。所述方法包括以下这些步骤：(1)确定来自所述两个儿童的每一个的粪便样品中的表1或表2所示的任一种细菌物种的相对丰度；以及(2)确定来自步骤(1)的表1所示的细菌物种的相对丰度在来自第一儿童的粪便样品中较高或者来自步骤(1)的表2所示的细菌物种的相对丰度在来自第一儿童的粪便样品中较低；以及(3)确定第二儿童具有比第一儿童更高的ASD风险。在一些实施方案中，通过PCR，例如定量PCR确定两个儿童粪便样品中细菌物种的相对丰度。

此外，提供了用于确定人类儿童中ASD风险的方法，其包括以下这些步骤：(1)在来自所述儿童的粪便样品中确定以下值：(a)Alistipes indistinctus(Ai)或人肠道厌氧棒状菌(Anaerotruncus colihominis)(Ac)的相对丰度，或者(b)三种细菌物种Ai、Ac和霍氏真杆菌(Eh)的水平的综合评分，所述综合评分通过I1+β1*Ai+β2*Eh+β3*Ac计算；以及(2)检测到所述值高于标准对照值，并确定所述个体具有增加的ASD风险。

类似地，提供了用于确定人类儿童中ASD风险的方法，其包括以下这些步骤：(1)确定来自所述儿童的粪便样品中的霍氏真杆菌(Eh)的相对丰度；以及(2)检测到来自步骤(1)的相对丰度低于标准对照值，并确定所述个体具有增加的ASD风险。

在第四方面，提供了用于评估人类儿童中自闭症谱系障碍(ASD)的风险的方法。所述方法包括以下这些步骤：(1)确定来自所述儿童的粪便样品中的表3所示的一种或多种细菌物种的水平或者相对丰度；(2)确定来自包括正常和ASD儿童的参考群组的粪便样品中相同细菌物种的水平或相对丰度；(3)使用从步骤(2)获得的数据通过随机森林模型生成决策树，并沿着所述决策树运行来自步骤(1)的一种或多种细菌物种的水平或者相对丰度以生成风险评分；以及(4)将风险评分大于0.5的儿童确定为具有增加的ASD风险，并且将风险评分不大于0.5的儿童确定为没有增加的ASD风险。

在一些实施方案中，所述一种或多种细菌物种包括Alistipes indistinctus或者由其组成。在一些实施方案中，所述一种或多种细菌物种包括Alistipes indistinctus、候选分裂TM7单细胞分离物(candidate division TM7 single-cell isolate)TM7c和嵴链球菌(Streptococcus cristatus)或者由其组成。在一些实施方案中，所述一种或多种细菌物种包括Alistipes indistinctus、候选分裂TM7单细胞分离物TM7c、嵴链球菌、粘液真杆菌和寡发酵链球菌(Streptococcus_oligofermentans)或者由其组成。

在相关方面，本发明提供了用于评估个体发展自闭症谱系障碍(ASD)的风险的试剂盒。所述试剂盒包含用于检测表1、表2或表3所示的一种或多种细菌物种的试剂。在一些实施方案中，所述试剂包含一组寡核苷酸引物，用于扩增来自表1、表2或表3所示的任一种细菌物种的多核苷酸序列。在一些实施方案中，所述扩增是PCR，例如定量PCR。

第五方面，本发明提供了用于确定儿童的生长或发育年龄的方法。所述方法包括以下这些步骤：(a)定量确定取自所述儿童的粪便样品中的选自表8或表9的一种或多种细菌物种的相对丰度；(b)定量确定取自由正常发育儿童组成的参考群组的粪便样品中的一种或多种细菌物种的相对丰度；(c)使用从步骤(b)获得的数据通过随机森林模型生成决策树；以及(d)沿着来自步骤(b)的决策树运行从步骤(a)获得的相对丰度，以生成所述儿童的发育年龄。在一些实施方案中，所述一种或多种细菌物种包括格氏链球菌(Streptococcusgordonii)、鸟肠球菌(Enterococcus avium)、真杆菌_3_1_31(Eubacterium_sp_3_1_31)、哈氏梭菌(Clostridium hathewayi)和坚硬棒杆菌(Corynebacterium durum)。在一些实施方案中，所述一种或多种细菌物种包括格氏链球菌、鸟肠球菌、真杆菌_3_1_31和哈氏梭菌。在一些实施方案中，所述一种或多种细菌物种包括格氏链球菌、鸟肠球菌和真杆菌_3_1_31。在一些实施方案中，所述一种或多种细菌物种包括格氏链球菌和鸟肠球菌。在一些实施方案中，所述一种或多种细菌物种包括格氏链球菌。在一些实施方案中，所述儿童为约3岁至约6岁。

在相关方面，提供了用于确定儿童生长或发育年龄的试剂盒。所述试剂盒包含第一容器和第二容器，所述第一容器含有用于检测表8或表9所示的第一细菌物种的第一试剂，所述第二容器含有用于检测表8或表9所示的第二不同细菌物种的第二试剂。在一些实施方案中，所述试剂盒包含三个或更多个容器，所述容器中的每一个含有用于检测表8或表9所示的不同细菌物种的试剂。在一些实施方案中，试剂盒包含两个或更多个容器，所述容器中的每一个含有用于检测不同细菌物种的试剂，所述细菌物种选自：(1)格氏链球菌、鸟肠球菌、真杆菌_3_1_31、哈氏梭菌和坚硬棒杆菌；(2)格氏链球菌、鸟肠球菌、真杆菌_3_1_31和哈氏梭菌；(3)格氏链球菌、鸟肠球菌和真杆菌_3_1_31；或者(4)格氏链球菌和鸟肠球菌。在一些实施方案中，所述试剂包含一组寡核苷酸引物，用于扩增来自表8或表9所示的任一种细菌物种的多核苷酸序列。在一些实施方案中，扩增是PCR，例如定量PCR(qPCR)。

在第六方面，本发明提供了促进儿童生长和发育的方法，其包括向所述儿童施用有效量的选自表8的一种或多种细菌物种。在一些实施方案中，所述儿童的生物学年龄为约3岁至约6岁。

在相关方面，提供了用于促进儿童生长和发育的试剂盒。所述试剂盒包括第一容器和第二容器，所述第一容器含有第一组合物，所述第一组合物包含(i)有效量的表8所示的一种细菌物种，所述第二容器含有第二组合物，所述第二组合物包含(i)有效量的表8所示的另一种不同的细菌物种。在一些实施方案中，所述第一组合物或第二组合物包含用于FMT的经处理的供体粪便材料。在一些实施方案中，所述第一组合物或第二组合物被配制用于口服施用。在一些实施方案中，所述第一组合物和第二组合物均被配制用于口服摄入。

附图简述

图1：自闭症谱系障碍儿童与正常发育儿童之间的细菌物种差异。绿色条代表正常发育儿童中富集的物种，而红色条代表ASD儿童中富集的物种。

图2：机器学习模型的接受者操作特性(ROC)曲线和曲线下面积(AUC)。使用前1种标志物(红色，底线)-Alistipes indistinctus，前3种标志物(绿色，中间的线)-Alistipesindistinctus、候选分裂TM7单细胞分离物TM7c和嵴链球菌，所有5种标志物(深蓝色，顶线)-Alistipes indistinctus、候选分裂TM7单细胞分离物TM7c、嵴链球菌、粘液真杆菌和寡发酵链球菌的随机森林模型的AUC。

图3：使用(a)5种标志物：Alistipes indistinctus、候选分裂TM7单细胞分离物TM7c、嵴链球菌、粘液真杆菌和寡发酵链球菌，(b)3种标志物：Alistipes indistinctus、候选分裂TM7单细胞分离物TM7c、嵴链球菌，3岁儿童与ASD儿童和正常发育儿童相比的风险评分。

图4：使用(a)5种标志物：Alistipes indistinctus、候选分裂TM7单细胞分离物TM7c、嵴链球菌、粘液真杆菌和寡发酵链球菌，(b)3种标志物：Alistipes indistinctus、候选分裂TM7单细胞分离物TM7c、嵴链球菌，20岁女性与ASD儿童和正常发育儿童相比的风险评分。

图5：机器学习模型的接受者操作特性(ROC)曲线和曲线下面积(AUC)。使用所有5种标志物-Alistipes indistinctus、候选分裂TM7单细胞分离物TM7c、嵴链球菌、粘液真杆菌和寡发酵链球菌的随机森林模型的AUC。

图6：显示原始群组(64名ASD对比64名TD儿童)和独立验证群组(8名ASD对比10名TD儿童)中的ASD和TD儿童的平均风险评分的箱形图。

图7：使用来自64名正常发育对象的粪便微生物作为训练群组，使用随机森林回归来鉴定用于确定生长和发育延迟的风险的细菌物种。变量重要性的点图由％IncMSE显示(均方误差增加(％))。红色框表示前5种最重要的细菌物种。

图8：使用5种细菌标志物，即格氏链球菌、鸟肠球菌、真杆菌_3_1_31、哈氏梭菌、坚硬棒杆菌，通过随机森林回归预测三岁儿童的生长发育年龄。红色三角形表示该3岁儿童的预测的生长发育年龄。蓝色点表示64名正常发育对象的预测的生长发育年龄。

图9：使用4种细菌标志物，即格氏链球菌、鸟肠球菌、真杆菌_3_1_31、哈氏梭菌通过随机森林回归预测三岁儿童的生长发育年龄。红色三角形表示该3岁儿童的预测的生长发育年龄。蓝色点表示64名正常发育对象的预测的生长发育年龄。

图10：使用3种细菌标志物，即格氏链球菌、鸟肠球菌、真杆菌_3_1_31，通过随机森林回归预测三岁儿童的生长发育年龄。红色三角形表示该3岁儿童的预测的生长发育年龄。蓝色点表示64名正常发育对象的预测的生长发育年龄。

图11：使用2种细菌标志物，即格氏链球菌、鸟肠球菌，通过随机森林回归预测三岁儿童的生长发育年龄。红色三角形表示该3岁儿童的预测的生长发育年龄。蓝色点表示64名正常发育对象的预测的生长发育年龄。

图12：使用1种细菌标志物，即格氏链球菌，通过随机森林回归预测三岁儿童的生长发育年龄。红色三角形表示该3岁儿童的预测的生长发育年龄。蓝色点表示64名正常发育对象的预测的生长发育年龄。

图13：宿主因素影响儿童的肠道微生物组。(a)宿主因素对儿童肠道细菌组变异的效应大小。经由PERMANOVA确定效应大小和统计显著性。仅显示了显著的宿主因素，*p<0.05，**p<0.01。(B-C)个体宿主因素与肠道细菌物种之间的相关性的热图。分别通过斯皮尔曼(Spearman)(B)和肯德尔(Kendall)(C)相关系数分析来计算相关系数。确定所有成对比较的统计显著性。仅绘制了绝对系数>0.2的统计显著相关性。底部条的颜色强度与相关系数成比例，其中蓝色表示正相关，黄色表示负相关。

图14：在患有ASD的中国儿童中肠道微生物组的改变。(A)ASD与TD之间粪便细菌丰富度的比较。对于箱形图，箱从第一四分位数延伸到第三四分位数(第25百分位数延伸到第75百分位数)，中位数用水平线描绘。通过t检验确定ASD与TD组之间的统计显著性，*p<0.05。(B)基于Bray-Curtis相异度的ASD与TD组中细菌群落组成的主坐标分析(PCOA)，通过t检验确定统计显著性，*p<0.05。(C)ASD与TD之间5种细菌物种的相对丰度的比较。通过随机森林和10倍交叉验证鉴定5种细菌物种标志物。(D)用于对ASD对比TD微生物组进行分类的随机森林分类器性能。，接受者操作特性(ROC)曲线描绘了当分类严格度变化时RF分类器真阳性率与假阳性率之间的权衡。以红色、蓝色和绿色给出所表示的训练集、测试集和验证集的AUC值。

图15：患有ASD的儿童对比TD儿童的肠道细菌-细菌生态网络。分别在ASD和TD中在物种水平上的细菌-细菌之间的相关性。通过斯皮尔曼相关分析计算分类群之间的相关性。确定所有成对比较的统计显著性。仅绘制了|相关系数|>0.5的统计上显著的相关性。相关网络通过Cytoscape(3.8.1)可视化。对应于单个微生物物种的节点的大小与显著的种间连接的数量成比例。节点的颜色指示相应微生物物种所属的门。连接线的颜色强度与相关系数成比例，其中蓝色线表示负相关，红色线表示正相关。

图16：ASD中肠道微生物组的功能改变。(A)在ASD对比TD中与神经递质生物合成相关的途径的丰度。通过t检验确定显著性，并表示为*p<0.05。分别在ASD和TD儿童的肠道微生物组中，物种对指示的微生物功能、芳香族氨基酸(B)和甘氨酸生物合成(C)的贡献。在每个功能模块中，生物合成由肠道中的物种(每个堆叠的条的块)混合物贡献，并且每个堆叠的条代表对象宏基因组之一。(D)宿主因素与肠道微生物功能途径的丰度之间的相关性。通过斯皮尔曼相关分析计算相关性。确定所有成对比较的统计显著性。仅绘制了绝对系数>0.2的统计显著相关性。颜色强度与相关系数成比例，其中蓝色表示正相关，黄色表示负相关。

图17：ASD中年龄有差别的分类群的发育不足。(A)在TD对象中，通过粪便细菌物种的相对丰度针对宿主实龄的随机森林回归，将26个物种鉴定为年龄有差别的细菌分类群。按其对模型精确度的重要性的降序排列年龄有差别的物种。当随机排列每个分类群的相对丰度值时，基于微生物群年龄预测的均方误差的增加百分比来确定重要性。插图显示5次10倍交叉验证误差作为输入细菌物种的数量的函数(蓝色线)。(B)在TD和ASD儿童中分别绘制的26个年龄有差别的细菌分类群的相对丰度针对实龄谱(月)的热图。(C)在ASD儿童对比TD儿童中，肠道微生物组的发育不足。在TD对象中建立作为生物学年龄的函数的微生物群年龄预测模型，然后针对ASD中实龄，将其用于预测微生物组年龄。

图18：宿主因素与肠道细菌组组成之间的相关性。(A)响应于ASD和TD中的元数据的微生物群组成的冗余分析(RDA)。RDA中的箭头表示宿主因素在塑造中国儿童肠道微生物组中的影响的大小和方向。(B)在ASD和TD对象中分别通过阴道分娩的儿童与剖腹产的儿童之间的粪副拟杆菌(Parabacteroides merdae)丰度的比较。通过Kruskal-Wallis检验进行统计检验，*P<0.05,**P<0.01。

图19：ASD与TD之间有差别的属以及ASD的预测模型。(A)属水平的有差别的细菌属。LDA评分表示TD与ASD之间的细菌丰度差异的效应大小(阈值LDA评分>2)。红色条表示ASD中富含的分类群，绿色条表示TD中富含的分类群。(B)分别对于发现集和验证集中的每个参与者的ASD的风险评分。风险评分代表被预测为ASD的随机生成的决策树的可能性。

图20：患有ASD的儿童中肠道微生物组功能改变。(A)通过LefSE鉴定的ASD和TD儿童中的有差别的微生物功能。效应大小显示为LDA评分。仅示出了LDA评分>1的物种。红色条表示在ASD中富集的功能，绿色条表示在TD中富集的功能。(B)在ASD对比TD儿童的肠道微生物组中，由普氏栖粪杆菌(Faecalibacterium prausnitzii)物种贡献的L-丝氨酸和甘氨酸生物合成途径的丰度。通过t检验进行统计检验，*P<0.05。(C)在ASD对比TD儿童的肠道微生物组中谷氨酸合成酶编码基因的丰度。通过t检验进行统计检验，*P<0.05。

图21：患有ASD的儿童与正常发育儿童之间三种细菌标志物的相对丰度的比较。ASD：自闭症谱系障碍；TD：正常发育儿童发育。

图22：细菌标志物在预测ASD风险中的诊断性能。在区分ASD和正常发育儿童中组合评分的接受者操作特性(ROC)曲线分析和诊断性能。

定义

术语“粪便微生物群移植(FMT)”或“粪便移植”是指这样的一种医疗程序，在该过程期间从健康个体获得的含有活的粪便微生物(细菌、真菌、病毒等)的粪便物质被转移到受体的胃肠道中以恢复已被各种医学病况中的任一种，例如自闭症谱系障碍(ASD)破坏或摧毁的健康肠道微生物区系。通常，来自健康供体的粪便物质首先被加工成用于移植的适当形式，所述移植可以通过直接沉积到下胃肠道中，如通过结肠镜检查、或通过鼻插管，或通过口服摄入含有经处理的(例如，干燥的和冷冻的或冻干的)粪便物质的封装材料来实现。

如本文所用的术语“抑制(inhibiting)”或“抑制(inhibition)”是指对目标生物过程如目标基因的RNA/蛋白表达、目标蛋白的生物活性、细胞信号转导、细胞增殖等的任何可检测的负作用。通常，抑制反映为当与对照相比时，目标过程(例如，某些种类的微生物，例如，表2中所示的一种或多种细菌的生长或增殖)，或者以上提及的下游参数中的任一个的至少10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或更多的减少。“抑制”还包括100％的减少，即目标生物过程或信号的完全的消除、预防或废除。其它相关术语，如“阻抑(suppressing)”、“阻抑(suppression)”、“减少(reducing)”、“减少(reduction)”、“降低(decrease)”、“降低(decreasing)”、“较低(lower)”和“较少(less)”在本公开中以类似的方式用于指不同水平的减少(例如，与对照水平(即抑制之前的水平)相比，至少10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或更多的减少)，直至完全清除目标生物过程或信号。另一方面，术语，如“激活(activate)”、“激活(activating)”、“激活(activation)”、“增加(increase)”、“增加(increasing)”、“促进(promote)”、“促进(promoting)”、“提高(enhance)”、“提高(enhancing)”、“提高(enhancement)”、“较高”和“更多”在本公开内容中用于涵盖目标过程或信号的不同水平的正变化(例如，与对照水平(活化之前)，例如表1中所示的一种或多种细菌物种的对照水平相比，至少10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％、200％或更大，如3倍、5倍、8倍、10倍、20倍的增加)。相比之下，术语“基本上相同”或“基本上没有变化”表示从比较基础(如标准对照值)的量几乎没有变化，通常在比较基础的±10％内，或者在比较基础的±5％、4％、3％、2％、1％内，或甚至更少的变化。

如本文所用的“标准对照”是指对应于从未患有ASD或发育延迟的个体获得的特定类型的样品(例如，粪便样品)中发现的预选细菌物种的平均水平，或者由取自此类个体的样品类型中发现的多种细菌物种的平均水平计算的综合评分的值。例如，为了检查儿童中ASD的风险的目的，建立“标准对照”值以提供截止值从而指示被检查的儿童是否具有升高的ASD风险。为了适当地建立“标准对照”，必须在对照组中包括足够数量的个体(例如，至少10个、12个、15个、20个、24个或更多个个体)，以提供用于确定一种或多种预选的细菌物种的平均水平或者由代表ASD风险的多种细菌物种的水平计算的综合评分的样品。

术语“抗菌剂”是指能够分别抑制、阻抑或防止细菌物种，尤其是表2中所示的那些的生长或增殖的任何物质。已知的具有抗菌活性的试剂包括通常阻抑广谱的细菌物种的增殖的各种抗生素以及能够抑制特定细菌物种的增殖的试剂，如反义寡核苷酸、小的抑制性RNA等。术语“抗菌剂”类似地定义为涵盖具有杀死几乎所有细菌物种的广谱活性的试剂，以及特异性地阻抑靶细菌物种的增殖的试剂。这种特异性抗菌剂可以是天然的短的多核苷酸(例如，小的抑制性RNA、微RNA、miniRNA、lncRNA或反义寡核苷酸)，其能够破坏靶细菌物种的生命周期中关键基因的表达，因此能够仅特异性地阻抑或消除该物种而不会显著影响其它密切相关的细菌物种。

“相对丰度百分比”，当在描述与同一环境中存在的所有细菌物种相关的特定细菌物种(例如，表1-11中任一个所示的那些中的任一种)存在的上下文中使用时，是指以百分比形式表示的所有细菌物种的量中的该细菌物种的相对量。例如，一种特定细菌物种的相对丰度百分比可以通过将一个给定样品中该物种特异的DNA的数量(例如通过定量聚合酶链式反应确定)与同一样品中的所有细菌DNA的数量(例如，通过定量聚合酶链式反应PCR和基于16s rRNA序列的测序确定)进行比较来确定。

“绝对丰度”，当在描述粪便中特定细菌物种(例如，表1-11中所示的那些中的任一种)存在的上下文中使用时，是指粪便样品中所有DNA的量中来自细菌物种的DNA的量。例如，一种细菌的绝对丰度可以通过将一个给定样品中该细菌物种特异的DNA的数量(例如，通过定量PCR确定)与同一样品中所有粪便DNA的数量进行比较来确定。

如本文所用，粪便样品的“总细菌负荷”是指粪便样品中所有DNA的量中各自所有细菌DNA的量。例如，可以通过将一个给定样品中细菌特异性DNA(例如，通过定量PCR确定的16srRNA)的数量与同一样品中所有粪便DNA的数量进行比较来确定细菌的绝对丰度。

如本文所用，术语“自闭症谱系障碍(ASD)”是指与大脑发育相关的病况，其影响一个人对他人的感知和社交，导致社交互动和沟通困难。ASD始于儿童早期，并最终导致患者不能在社会、学校和工作中正常发挥作用的问题。自闭症谱系障碍中的术语“谱系”是指广泛的症状和严重程度。ASD包括以前被认为是独立的病况，如自闭症、阿斯伯格综合征(Asperger's syndrome)、儿童崩解症和未指明形式的普遍发育障碍。该障碍还包括有限的和重复的行为模式。

本申请中使用的术语“治疗(treat)”或“治疗(treating)”描述了导致消除、减少、减轻、逆转、预防和/或延迟预定医学病况的任何症状的发作或复发的行为。换句话说，“治疗”病况涵盖针对该病况的治疗性和预防性干预，包括促进患者从病况中恢复。

如本文所用，术语“有效量”是指使用或施用物质(例如，抗菌剂)而产生期望效果(例如，对一种或多种有害细菌物种(例如，表2所示的细菌物种)的生长或增殖的抑制或阻抑作用)的该物质的量。效果包括防止、抑制或延迟细菌增殖期间任何相关的生物过程至任何可检测出的程度。确切的量将取决于物质(活性剂)的性质、使用/施用的方式以及应用的目的，并且将由本领域技术人员使用已知的技术以及本文描述的那些技术来确定。在另一种环境下，当将“有效量”的一种或多种有益或期望的细菌物种(例如，表1中列出的那些)人工引入旨在引入患者的胃肠道，例如待在FMT中使用的组合物时，这意味着所引入的相关细菌的量足以赋予接受者健康益处，如减少的恢复时间或对相关病症(如ASD)的治疗干预降低的需要，包括但不限于药物(如抗精神病药和抗抑郁药)和多种治疗中的任一种，如行为和沟通治疗、教育治疗、家庭治疗、言语或物理治疗等。

如本文所用，术语“生长/发育年龄”是指以时间单位表示并基于其胃肠道中存在的微生物的状态/分布评估的儿童的发育阶段。在儿童的生物学(出生)年龄与生长/发育年龄之间的比较反映了儿童的生长和发育是否与其出生或实龄或“适龄”一致。

如本文所用，术语“约”表示值的范围，其为指定值的+/-10％。例如，“约10”表示9至11(10+/-1)的值范围。

发明详述

I.引言

本发明提供了用于评估儿童发生自闭症谱系障碍(ASD)的风险，用于评估儿童的生长或发育年龄，以及用于治疗ASD症状的新方法。在他们的研究期间，本申请的发明人发现某些细菌物种的存在和相对丰度由于ASD而在患者的胃肠道中显著改变，特定物种的增加或减少与疾病严重程度相关。例如，发现如表2中所示的细菌物种的存在在ASD儿童的胃肠道中处于升高的水平，然而发现如表1中所示的那些的细菌物种的存在在ASD儿童的胃肠道中处于降低的水平。另一方面，已经观察到儿童粪便样品中某些细菌物种(如表3中所示的那些)的水平或相对丰度与儿童在随后时间发生ASD的可能性相关。最后，发明人发现，儿童胃肠道内微生物的存在和分布随着儿童的生长和发育过程的进展而演变。因此，这些最新发现的结果提供了用于以下的有用工具：用于治疗ASD症状，用于评估儿童中的ASD风险，用于指导已被鉴定为处于ASD高风险或表现出ASD症状的儿童的必要治疗，如本文描述的药物和/或疗法，以及用于评估儿童的生长发育年龄，以确定他是否适合与他的生物学或出生年龄相关的发育过程，然后，可以便于随后确定是否需要某些治疗，例如，出于促进他的生长发育的目的，对发现在该儿童的胃肠道中缺乏的某些细菌物种进行补充施用。

II.FMT供体/接受者的选择和准备

遭受破坏状态的胃肠道微生物区系的ASD儿童被认为是FMT治疗的接受者，以便恢复微生物的正常健康分布。如本申请的发明人所揭示的，ASD的存在或风险易于导致细菌物种，如表1中所示的那些的水平降低，粪便材料含有高于这些细菌物种中的一种或多种的平均水平的FMT供体特别有利于这一目的而受到青睐。例如，对于粪便样品中这些细菌物种中的每一种，期望的供体可以优选具有高于总细菌的约0.01％、0.02％、0.05％、0.10％、0.20％、0.40％、0.50％、0.60％、0.80％、1.0％、2.0％、3.0％、4.0％、5.0％、6.0％、7.0％、8.0％、8.5％、9.0％或更高的相对丰度。

另一方面，ASD儿童具有表2中列出的异常高水平的细菌物种。因此，为了恢复他们的正常和健康的胃肠道细菌谱，使用从健康的人捐赠的粪便材料进行FMT是适当的，所述健康的人的粪便样品中这些细菌物种(在表2中)的水平是天然低的或人工降低的，例如通过使用特异性杀死或阻抑某些目标细菌物种而不显著影响其它细菌物种的特定抗菌剂。优选地，在加工用于FMT之前，这些细菌物种中的每一种的相对丰度不超过总细菌的约0.01％、0.02％、0.05％、0.07％、0.08％、0.10％、0.13％、0.15％、0.20％、0.25％、0.30％、0.50％、0.70％或更高。

在FMT中使用的粪便物质从健康供体获得，然后加工成用于在即将进行的FMT程序中预期递送手段的适当形式。虽然来自同一家族或家庭的健康个体通常充当供体，但在实施本发明时，供体微生物谱是一个重要的考虑因素，并且可以反而倾向于选择不相关的供体。制备用于移植的供体材料的方法包括干燥、冷冻或冻干以及配制或包装的步骤，这取决于例如通过口服摄入或通过直肠沉积递送至接受者的精确递送途径。

在FMT治疗的准备中，预期的接受者，例如，已经被诊断患有ASD或被认为具有发生ASD的增加的风险但尚未表现出该疾病的任何明确症状(例如，具有ASD的家族史或其它已知的风险因素)的患者，可以在FMT之前首先接受阻抑其胃肠道中细菌水平的治疗。所述治疗可以包括施用抗菌剂(广谱抗生素或特定抗菌剂)，以消除或降低由于ASD的存在或风险而升高的不期望的细菌物种的水平，例如表2中指定的一种或多种细菌。

在文献中已经报道了用于确定样品中所有细菌物种的水平的各种方法，例如，利用通常共有的16S rRNA细菌序列中的序列相似性，进行细菌多核苷酸序列的扩增(例如，通过PCR)和测序。另一方面，任何给定细菌物种的水平可以通过其独特基因组序列的扩增和测序来确定。丰度百分比通常用作指示给定环境中细菌物种的相对水平的参数。

III.通过调节细菌水平的治疗方法

本申请发明人的发现揭示了ASD与ASD儿童肠道中某些细菌物种(例如表1或表2中所示的那些)的增加或减少之间的直接相关性。这一揭示使通过经由例如FMT程序调整或调节这些患者胃肠道中的这些细菌物种的水平，以将有效量的表1中所示的那些细菌物种中的一种或多种递送至患者的胃肠道，或者例如，通过递送抗菌剂以阻抑目标细菌物种来降低表2中列出的一种或多种细菌物种的水平而实现用于治疗ASD症状的不同方法，尤其是用于帮助ASD儿童从诸如药物和/或多种治疗的不同治疗方案中获益。

当提议的FMT供体的粪便经测试并且发现含有不足水平的一种或多种有益细菌物种，如表1中所示的那些(例如，每种都小于粪便样品中总细菌的约0.01％、0.05％、0.10％、0.20％、0.40％、0.50％、0.80％、1.0％、2.0％、3.0％、4.0％、5.0％，6.0％、7.0％或8.0％)时，提议的供体被认为是旨在治疗ASD症状或降低接受者(例如儿童)未来发生ASD的风险的FMT的不适合的供体，他可能被取消作为供体的资格，以支持粪便样品表现出更有利的细菌谱的另一名个体，并且他的粪便材料由于缺乏赋予此类有益健康效果的前景而不应立即用于FMT，除非粪便材料被适当地改变。鉴于本申请的发明人的发现，在这些预期缺乏FMT治疗的健康益处可以容易地改善的情况下，例如，可以将一种或多种细菌物种，如表1所示的那些从外源性来源引入供体粪便材料中，使得粪便材料中的细菌物种的水平增加(例如，达到粪便材料的总细菌中至少约0.01％、0.02％、0.05％、0.10％、0.20％、0.40％、0.50％、0.60％.0.80％、1.0％、2.0％、3.0％、4.0％、5.0％、6.0％、7.0％、8.0％、8.5％、9.0％或10％)，然后将其加工用于FMT以治疗ASD症状或用于降低儿童中的ASD风险。具有类似的预期目标的治疗前方案可以用于准备即将接受FMT治疗的患者，以便使他们获得诸如上文和本文所述的健康益处的潜力最大化。

作为替代方案，有益的细菌物种(表1中所示的那些中的一种或多种)可以从足够量的细菌培养物中获得，然后配制成合适的组合物，该组合物不含取自供体的任何粪便材料，用于递送到ASD患者的肠道中。与FMT类似，这种组合物可以通过口服、鼻腔或直肠施用而被引入到患者中。

另一方面，由于存在ASD或ASD的风险，发现某些细菌物种(例如，表2中的那些)的相对丰度升高。因此，治疗ASD患者或ASD高风险患者以降低这些细菌物种的水平，以便改善患者与疾病相关的症状。有几种选择可以降低这些细菌物种的水平：首先，可以给予患者特定的抗菌剂以特异性地杀死或阻抑目标细菌物种，从而降低这些细菌的异常高水平。

第二，可以首先给予患者抗菌剂，如用于杀死或阻抑所有细菌物种的广谱抗生素，或者特异性抗菌剂以特异性杀死或阻抑目标细菌物种；然后，可以将组合物施用至患者(例如，通过FMT)以将平衡良好的混合细菌培养物引入患者的胃肠道。

可以在一个组合步骤中执行这些选项中的每一个以实现第一和第二处理方法目标，即，使用一种单一组合物(如来自FMT供体的经处理的粪便材料)来增加某些细菌物种(如表1中所示的那些中的一种或多种)的水平，以及降低某些其它细菌物种(例如表2中列出的那些中的一种或多种)的水平，所述单一组合物含有彼此在适当比例范围内的相关细菌物种。

在完成将有效量的期望细菌物种引入患者的胃肠道的步骤(例如，经由FMT程序)和/或阻抑不期望的细菌水平的步骤之后，立即可以通过每天连续测试粪便样品中细菌物种的水平或相对丰度来进一步监测接受者，直至程序后5天，同时治疗ASD的临床症状以及监测患者的一般健康状况以便评估治疗结果和接受者胃肠道中相关细菌的相应水平：可以结合观察所实现的健康益处(如行为、语言或社交技能的改善)来监测细菌物种(表1中所示的那些中的一种或多种)的水平。

IV.评估疾病严重程度及相应的治疗

本申请的发明人还发现，某些细菌物种的改变水平可以指示ASD的存在或风险：他们揭示了人类儿童粪便样品中某些细菌物种(例如，表1中所示的那些)的降低水平与这些儿童中后来被诊断为ASD的可能性之间的相关性。类似地，已经确立了儿童胃肠道中某些其它细菌物种(例如，表2中所示的那些)的增加水平与儿童后来被诊断为ASD的可能性之间的相关性。此外，已经揭示了某些细菌物种(如表3中所示的一种或多种物种)的水平或相对丰度，以指示当使用某些特定的数学工具正确计算时对象后来发生ASD的风险。

例如，当从两名或更多名儿童中获取粪便样品时，可以例如通过PCR，尤其是定量PCR来确定样品中表1或2中细菌物种的水平或相对丰度。对于表1中列出的细菌物种，在儿童粪便样品中发现的较低水平指示儿童中存在ASD或ASD风险增加的可能性较高；相反，对于表2中列出的细菌物种，在儿童粪便样品中发现的较高水平指示儿童中存在ASD或ASD风险的可能性较高。在测量和比较多种物种的水平的情况下，基于来自所测量的大多数相关细菌物种的指示来进行风险测定。

一旦进行了ASD风险评估，例如，儿童被认为患有ASD或处于以后发生ASD的增加的风险中，可以采取适当的治疗步骤作为解决儿童增加的风险的措施。例如，可以向儿童给予药物，如抗精神病药和/或抗抑郁药，或者可以给予疗法，如专门设计用于解决行为问题和/或改善语言、沟通或社交技能的那些。

V.评估儿童的生长/发育年龄

另外，本申请的发明人揭示了存在于儿童胃肠道中的细菌物种的分布随着儿童作为正常生长过程的一部分继续发育而继续演变。因此，本文公开的结果还允许人们使用本文描述的方法，基于某些相关肠道细菌物种的水平，设计用于评估儿童发育年龄的有效且准确的手段。更具体地，首先从正在测试其生长或发育年龄的儿童中获取粪便样品。然后，使用在相关领域中已知的或本文描述的方法来定量确定多种预选的细菌物种(如表8或表9中所示的细菌物种)的水平或相对丰度。使用这些细菌物种的水平，人们可以随后使用本公开内容中具体描述的数学工具来计算儿童的发育年龄。

一旦使用本发明的方法确定了儿童的生长或发育年龄，出于促进其生长或发育的目的，如果需要，可以给予儿童适当的治疗。例如，如果发现儿童的发育年龄远远落后于其生物学年龄，例如，晚于其生物学年龄超过约6个月或9个月或12个月，或者晚于其生物学年龄超过约10％、20％、25％、33％或甚至50％，则可以通过施用有效量的表8或表9中指定的并且在其胃肠道中缺乏的一种或多种细菌物种给予治疗。一种治疗方法是FMT，例如，口服施用或直接沉积富含期望细菌物种的预处理材料。

VI.用于ASD治疗的试剂盒和组合物

本发明提供了新的试剂盒和组合物，其可以用于在ASD的治疗性和/或预防性治疗中减轻症状并赋予健康益处，包括通过设计用于治疗ASD的常规疗法促进患者改善。例如，提供了试剂盒，其包含第一容器和第二容器，所述第一容器含有第一组合物，所述第一组合物包含(i)有效量的表1或表14所示的一种或多种细菌物种，或者(ii)有效量的阻抑表2或表13所示的一种或多种细菌物种的生长的抗菌剂，所述第二容器含有第二组合物，所述第二组合物包含有效量的已知用于治疗ASD的药物(如抗精神病药或抗抑郁药)。在一些变型中，试剂盒可以含有两种或更多种组合物，所述组合物中的每一种包含有效量的(1)表1或表14中的一种或多种有益细菌物种，(2)抗菌剂以及(3)单独的或任意组合的用于治疗ASD的药物。

在一些情况下，第一组合物包含来自供体的粪便材料，所述粪便材料已经根据FMT程序中的递送手段被加工、配制和包装成适当的形式，其可以通过直接沉积在接受者的下胃肠道(例如，湿的或半湿的形式)或通过口服摄入(例如，冷冻、干燥/冷干、封装的)。可选地，第一组合物可以不含有任何供体粪便材料，而是人工混合物，其含有适当的比例和数量的优选细菌物种，如表1或表14所示的一种或多种细菌物种。此外，第一组合物可以含有适当量的抗菌剂，其阻抑表2或表13所示的一种或多种细菌物种的生长。在一些情况下，抗菌剂可以是广谱抗菌剂；或者在其它情况下，它可以是仅靶向特定细菌物种的特定抗菌剂(例如，表2或表13中的那些)：它可以是短的多核苷酸，例如小的抑制性RNA、微RNA、miniRNA、lncRNA或反义寡核苷酸，其能够特异性地靶向一种或多种预定的细菌物种而不显著影响其它密切相关的细菌物种。

在其它情况下，第一组合物可以是这样的组合物(例如，经处理的FMT供体粪便材料)，所述组合物包含适当的比例和数量的优选细菌物种(如，表1或表14所示的一种或多种细菌物种)以及仅靶向特定细菌物种的特定抗菌剂(例如，表2或表13中指定的那些)。第一组合物根据其对患者的预期递送手段，例如通过口服摄入、鼻腔递送或直肠沉积而进行配制和包装。

在一些情况下，第二组合物可以包含足够量或有效量的有效治疗ASD的治疗剂，例如抗精神病药或抗抑郁药。所述组合物被配制成用于益生元或治疗剂的预期递送方法，例如通过注射(静脉内、腹膜内、肌内或皮下注射)或通过口服/鼻腔施用或通过局部沉积(例如栓剂)。

第一组合物和第二组合物通常分别保存在试剂盒中的两个不同容器中。在一些情况下，可以将用于增加某些细菌物种(如表1或表14所示的一种或多种细菌物种)的水平的组合物以及用于阻抑其它细菌物种(例如表2或表13所示的一种或多种细菌物种)的组合物组合，以形成用于一起施用至患者的单一组合物，例如通过口服或局部递送。在一些情况下，第一组合物和第二组合物可以组合在单一组合物中，使得它们可以例如通过口服或局部递送同时施用至患者。

此外，提供了用于定量检测一种或多种细菌物种(如表1、表2、表13和表14所示的细菌物种)的试剂盒。试剂盒包含用于定量检测每种细菌物种的试剂，例如，此类试剂可以包含用于扩增(如PCR，尤其是定量PCR)多核苷酸序列的一组寡核苷酸引物，所述多核苷酸序列来源于相关细菌物种(如表1-3所示的任一种或多种细菌物种)，尤其是表1、表2、表13和表14中所示的那些中的每一种，并且优选为以上细菌物种所特有的。

另外，本发明提供了用于评估儿童的生长或发育年龄以及用于促进或增强儿童的生长或发育的试剂盒和组合物。通常，用于确定儿童发育年龄的试剂盒包含第一容器和第二容器，所述第一容器含用于检测表8或表9所示的第一细菌物种的第一试剂，所述第二容器含有用于检测表8或表9所示的第二细菌物种(不同于第一细菌物种)的第二试剂。例如，所述试剂盒可以包含三个或更多个容器，所述容器中的每一个含有用于检测表8或表9所示的不同细菌物种的试剂。作为另一个实例，所述试剂盒可以包含两个或更多个容器，所述容器中的每一个含有用于检测不同细菌物种的试剂，所述细菌物种选自以下组中的任一种：(1)格氏链球菌、鸟肠球菌、真杆菌_3_1_31、哈氏梭菌和坚硬棒杆菌；(2)格氏链球菌、鸟肠球菌、真杆菌_3_1_31和哈氏梭菌；(3)格氏链球菌、鸟肠球菌和真杆菌_3_1_31；或(4)格氏链球菌和鸟肠球菌。包含在用于检测预选的细菌物种的试剂盒中的试剂可以包含用于扩增多核苷酸序列的一组寡核苷酸引物，所述多核苷酸序列来自细菌物种(并且优选地是特有的)，例如表8或表9所示的任一种细菌物种。常用的扩增方法是PCR，如定量PCR(qPCR)。

用于通过向儿童施用有效量的选自表8的一种或多种细菌物种来促进儿童(例如，约3岁至约6岁的生物学或出生年龄的儿童)生长发育的试剂盒通常包含第一容器和第二容器，所述第一容器含有第一组合物，所述第一组合物包含(i)有效量的表8所示一种细菌物种，所述第二容器含有第二组合物，所述第二组合物包含(i)有效量的表8所示的另一种细菌(且与第一种不同)物种。在示例性实施方案中，第一和/或第二组合物可以是或包含用于FMT的经处理的供体粪便材料。第一组合物和第二组合物中的任一种或两种可以被配制用于口服施用，例如用于FMT过程中。除了活性组分之外，本文描述的所有组合物还可以含有一种或多种生理学上可接受的赋形剂或载体。

实施例

以下实施例仅通过说明的方式，而不是通过限制的方式提供。本领域技术人员将容易地认识到可以改变或修改多种非关键参数以产生基本相同或类似的结果。

实施例I：ADS和正常儿童中的肠道细菌谱

背景

本申请的发明人通过比较自闭症儿童的胃肠道中存在的细菌物种的分布与发育正常儿童的胃肠道中存在的细菌物种的分布，研究了由于自闭症谱系障碍(ASD)的存在或风险引起的肠道微生物群的变化。已经发现在自闭症儿童中以降低的水平或相对丰度存在的细菌物种(例如，表1所示的任一种)以及已经发现在自闭症儿童中以升高的水平或相对丰度存在的细菌物种(例如，表2所示的任一种)可以被定量地测量以评估个体以后发生ASD的风险。另一方面，可以对这些细菌物种的水平或相对丰度进行调节，以便通过减轻ASD症状中的一些来治疗ASD。

方法

群组描述和研究对象

总共招募了128名中国儿童(年龄为3-6岁)，包括64名患有自闭症谱系障碍的儿童和64名正常发育儿童。男性(83％)多于女性。大多数病例在大约3岁时被诊断为ASD。该研究由联合的中国香港中文大学新界东联网临床研究伦理委员会(The JointCUHK-NTEC CREC,CREC Ref.No:2016.607)批准。所有对象都同意捐赠粪便样品并进行问卷调查，其中获得了书面知情同意。来自研究对象的粪便样品储存在-80℃，用于下游微生物组分析。包括由儿科医生或临床心理学家根据第四版或第五版的《精神疾病诊断和统计手册》(DSM-IV或DSM-V)标准诊断患有ASD的儿童。没有ASD、没有运动和语言发育延迟以及没有由他们的父母报告的行为延迟的儿童和没有一级亲属患有ASD的儿童被包括作为正常发育儿童。

粪便DNA提取和DNA测序

通过经修改以提高DNA产量的

RSC PureFood GMO andAuthentication Kit(Promega)提取粪便细菌DNA。将来自每个粪便样品的约100mg进行预处理：将粪便样品悬浮在1ml ddH₂O中，并通过以13,000×g离心1min沉淀。向洗涤的样品中加入800ul TE缓冲液(PH 7.5)、16ulβ-巯基乙醇和250U裂解酶，充分混合并在37℃消化90分钟。以13,000×g离心3分钟进行沉淀。

预处理后，将沉淀物重悬在800μl CTAB缓冲液(

RSC PureFood GMOand Authentication Kit，按照制造商的说明)中并充分混合。将样品在95℃加热5分钟并冷却后，通过在2850rpm下用0.5mm和0.1mm珠粒涡旋15分钟从样品中释放核酸。随后，加入40ul蛋白酶K和20ul RNase A，并在70℃消化核酸10分钟。最后，在以13,000×g，离心5分钟后获得上清液，并将其置于用于DNA提取的

RSC仪器中。提取的粪便DNA经由Ilumina Novaseq6000(Novogene,Beijing,China)用于超深宏基因组测序。

原始序列的质量控制

首先通过Trimmomatic¹(v0.38)修剪原始序列读取，然后将非人类读取与污染物宿主读取分离。进行以下一些步骤获得干净的读取：1)去除适配子；2)用4碱基宽的滑动窗口扫描读取，当每碱基的平均质量降至20以下时去除读取；3)将读取长度降至50个碱基以下。通过KneadData(v0.7.2)将修剪的序列读取映射到人类基因组(参考数据库：GRCh38p12)以去除源自宿主的读数。将配对末端两个读取连接在一起。

细菌微生物组的分析

经由MetaPhlAn2(v2.7.5)²对宏基因组修剪的读取进行细菌群落组成的分析。通过Bowtie2(v2.3.4.3)³完成将读取映射到进化枝特异性标志物基因和物种泛基因组(pangenomes)的注释。输出表含有从界到菌株水平的不同水平的细菌物种及其相对丰度。使用tidyverse(v1.2.1)⁴、ggpubr(v0.2,网址:github.com/kassambara/ggpubr)和phyloseq(v1.24.2)⁵在R v3.6.1中分析所得数据。经由线性判别分析效应大小(LEfSe)分析⁶，比较患有自闭症谱系障碍(ASD)的儿童与正常发育儿童之间的人类肠道细菌组成并定义了有差别的细菌物种。

机器学习模型

使用粪便微生物(由于其具有利用二元特征进行分类的优越性能)，选择随机森林(RF)来建立ASD对比正常发育儿童预测模型。随机森林⁷是宏基因组数据分析中最流行的方法之一，以鉴定区别特征和构建预测模型。作为广泛使用的集成学习算法，随机森林由一系列分类和回归树(CART)组成，以形成强的分类器。从具有替换的原始数据集中随机抽样的数据的子集被称为自助抽样，用于构建树。当通过自助法绘制当前树的训练数据集时，从总体数据集中省略

观察。在无穷大的N的情况下，有36.8％的数据未出现在称为袋外(OOB)观察的训练样品中，这些数据将不会用于构造树。另外，当每个决策树基于从总体特征中选择的特征的随机子集分割节点时，将额外的随机性引入到随机森林。将具有最小基尼(基尼用于评价节点的纯度)的特征用于在每次迭代中分割节点以生成树。对于不同的数据和特征子集，该算法能够训练不同的树并通过对来自树模型的结果进行平均来获得最终分类。除了预测模型之外，随机森林还具有评估变量重要性的能力⁸。OOB观察用于估计森林中每个树的分类误差。为了测量给定变量的重要性，随机改变OOB数据中变量的值，然后改变的OOB数据被用于生成新的预测。将改变的与原始的OOB观察之间的误差率之差除以标准误差计算为变量的重要性。为了对新样品进行分类，将样品的特征向下传递到每个树以估计分类的概率。随机森林使用所有树的平均概率来确定分类的最终结果。

包括总计64名患有ASD患者的儿童和64名正常发育儿童作为用于建模的发现群组。通过递归特征消除来评价每个物种对分类模型的重要值。如果其与模型中任何已经存在的探针的皮尔森相关值<0.7，根据递减的重要值，将所选物种逐个添加到随机森林模型中。每次向模型添加新特征时，使用10倍交叉验证重新评价模型的性能。这些模型根据二元分类器与接受者操作特性(ROC)曲线中的曲线下面积(AUC)进行比较。当达到最佳精度和kappa时选择最终模型。使用R包randomForest v4.6-14⁷和pROC v1.15.3⁹进行这些分析。

结果

肠道细菌谱在自闭症谱系障碍儿童与正常发育儿童之间是不同的

利用LEfSe分析，发现与患有ASD的儿童相比，物种普氏栖粪杆菌、食葡糖罗斯拜瑞氏菌(Roseburia inulinivorans)、霍氏真杆菌(Eubacterium hallii)、Dorealongicatena、惰性真杆菌(Eubacterium siraeum)(图1，表1)以较高的相对丰度存在。相比之下，与正常发育儿童相比，在患有ASD的儿童中富集了物种Clostridium nexile、Dialister invisus、鲍氏梭菌(Clostridium bolteae)、共生梭菌(Clostridiumsymbiosum)、粘液真杆菌(Eubacterium limosum)、细菌梭菌_1_7_47FAA(Clostridialesbacterium_1_7_47FAA)、Slackia piriformis、韦荣球菌科细菌_6_1_45(Erysipelotrichaceae_bacterium_6_1_45)、多枝梭菌(Clostridium ramosum)、人肠道厌氧棒状菌、奇特龙梭菌(Clostridiumcitroniae)、Alistipes indistinctus(图1，表2)。

表1：与患有自闭症谱系障碍的儿童相比，在正常发育儿童中富集的细菌物种

细菌物种	NCBI:txid	截止值(相对丰度)
			普氏栖粪杆菌	853	8.38％
食葡糖罗斯拜瑞氏菌	360807	0.58％
			霍氏真杆菌	1263078	0.40％
Dorea longicatena	88431	0.01％
			惰性真杆菌	39492	0.01％

表2：与正常发育儿童相比，在患有自闭症谱系障碍的儿童中富集的细菌种

细菌物种	NCBI:txid	截止值(相对丰度)
			Clostridium nexile	1263069	0.13％
Dialister invisus	218538	0.01％
			鲍氏梭菌	997896	0.10％
共生梭菌	411472	0.07％
			粘液真杆菌	1736	0.01％
细菌梭菌_1_7_47FAA	457421	0.02％
			多枝梭菌	1547	0.01％
人肠道厌氧棒状菌	445972	0.01％
			奇特龙梭菌	358743	0.01％
Alistipes indistinctus	626932	0.01％

表1和表2中列出的细菌可以以不同的组合使用以确定ASD的风险。例如，可以使用一组qPCR引物或通过宏基因组测序来确定相对丰度，以计算风险。

此外，表1中列出的细菌可以施用至患有ASD或处于发展ASD风险的儿童，以改善ASD的症状或降低以后发生ASD的风险。相反地，在患有ASD或处于发生ASD风险的儿童中可以靶向表2中列出的细菌进行阻抑，以改善ASD的症状或降低以后发生ASD的风险。

用于预测ASD的机器学习模型

在机器学习模型中使用了五种细菌标志物，包括Alistipes indistinctus、候选分裂TM7单细胞分离物TM7c、嵴链球菌、粘液真杆菌、寡发酵链球菌(表3)。使用这5种标志物的最终模型在接受者操作特性(ROC)曲线中具有79.1％的曲线下面积(AUC)(图2)。

表3：包括在用于预测ASD的机器学习模型中的细菌物种

细菌物种	NCBI:txid
		Alistipes indistinctus	626932
候选分裂TM7单细胞分离物TM7c	447456
		嵴链球菌	45634
粘液真杆菌	1736
		寡发酵链球菌	45634

为了确定对象中ASD的风险，将进行以下步骤：

(1)通过确定选自表3的物种在正常发育儿童和患有ASD的患者的群组中的相对丰度来获得一组训练数据。

(2)确定这些物种在对象中的相对丰度，所述对象由于其ASD的风险而正在进行测试。

(3)使用随机森林模型将对象中这些物种的相对丰度与训练数据进行比较。

(4)决策树将由训练数据通过随机森林生成。相对丰度将沿着决策树运行并生成风险评分。如果模型中至少50％的树认为儿童患有自闭症，则被测试的儿童被认为具有增加的ASD风险。如果在模型中小于50％的树认为儿童正常发育，则被测试的儿童被认为不具有增加的ASD风险。

在执行以上步骤(1)时，选自表3的细菌物种应包括(a)Alistipes indistinctus(前1种物种；AUC：61.6％；图2)；(b)Alistipes indistinctus、候选分裂TM7单细胞分离物TM7c和嵴链球菌(前3种物种；AUC:74.4％；图2)；或(c)Alistipes indistinctus、候选分裂TM7单细胞分离物TM7c、嵴链球菌、粘液真杆菌和寡发酵链球菌(所有5种物种；AUC 79.1％；图2)。

研究1

通过如方法中所述的宏基因组测序和指定的分类法来确定来自64名患有ASD的儿童和64名正常发育儿童的表3中列出的5种物种的相对丰度(表4中列出的相对丰度)。决策树由表4中的数据通过随机森林生成，参数为：树＝801，mtry＝2。

确定3岁儿童的ASD风险。通过如方法中所述的宏基因组测序和指定的分类法确定表3中列出的5种物种在该儿童的粪便样品中的相对丰度(表5)。相对丰度沿着决策树运行，并生成风险评分。儿童的评分为0.78(图3a)，因此该儿童被认为处于ASD风险中。

研究2

通过如方法中所述的宏基因组测序和指定的分类法来确定来自64名患有ASD的儿童和64名正常发育儿童的选自表3的Alistipes indistinctus、候选分裂TM7单细胞分离物TM7c、嵴链球菌的相对丰度(表4中列出的相对丰度)。决策树由表4中的数据通过随机森林生成，参数为：树＝801，mtry＝2。

确定3岁儿童的ASD风险。通过如方法中所述的宏基因组测序和指定的分类法确定以上3种物种在该儿童的粪便样品中的相对丰度(表5)。相对丰度沿着决策树运行，并生成风险评分。儿童的评分为0.833(图3b)，因此该儿童被认为处于ASD风险中。

研究3

确定20岁女性对象的ASD风险。通过如方法中所述的宏基因组测序和指定的分类法确定表3中列出的5种物种在该儿童的粪便样品中的相对丰度(表6)。相对丰度沿着决策树运行，并生成风险评分。儿童的评分为0.77(图4a)，因此该对象被认为处于ASD风险中。该对象自2020年起被诊断患有ASD。

研究4

确定20岁女性的ASD风险。通过如方法中所述的宏基因组测序和指定的分类法确定以上3种物种在该儿童的粪便样品中的相对丰度(表6)。相对丰度沿着决策树运行，并生成风险评分。儿童的评分为0.79(图4b)，因此该对象被认为处于ASD风险中。该对象自2020年起被诊断患有ASD。

表4：表3中列出的物种在64名患有ASD的儿童和64名正常发育儿童中的相对丰度。

表5：表3中列出的物种在3岁儿童中的相对丰度

表6：表3中列出的物种在20岁女性对象中的相对丰度

参考文献

1 Bolger AM,Lohse M,Usadel B.Trimmomatic:a flexible trimmer forIllumina sequence data.Bioinformatics 2014；30:2114-20.

2 Truong DT,Franzosa EA,Tickle TL,Scholz M,Weingart G,Pasolli E,etal.MetaPhlAn2 for enhanced metagenomic taxonomic profiling.Nat Methods2015；12:902-3.

3 Langmead B,Salzberg SL.Fast gapped-read alignment with Bowtie 2.NatMethods 2012；9:357-9.

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7 Breiman L.Random Forests.Machine Learning 2001；45:5-32.

8 Cutler DR,Edwards Jr TC,Beard KH,Cutler A,Hess KT,Gibson J,etal.Random forests for classification in ecology.Ecology 2007；88:2783-92.

9 Robin X,Turck N,Hainard A,Tiberti N,Lisacek F,Sanchez JC,etal.pROC:an open-source package for R and S+to analyze and compare ROCcurves.BMC Bioinformatics 2011；12:77.

实施例II：微生物组确定的自闭症

方法

群组描述和研究对象

招募了ASD(n＝8)和正常发育(TD)儿童(n＝10)的独立验证群组以验证实施例1(第I部分)中描述的机器学习模型。如实施例1(第I部分)，使用表3中列出的5种物种生成机器学习模型。简而言之，通过如第I部分的方法中所述的宏基因组测序和指定的分类法来确定来自64名患有ASD的儿童和64名TD儿童的表3中列出的5种物种的相对丰度(所得相对丰度列于表4中)。决策树由表4中的数据通过随机森林生成，参数：树＝801，mtry＝2。

使用由64名ASD儿童和64名TD儿童生成的该机器学习模型来确定验证群组中18名儿童中的每一名儿童的ASD风险。通过如第I部分的方法中所述的宏基因组测序和指定的分类法确定5种物种在来自验证群组的粪便样品中的相对丰度。所得相对丰度列于表7中。这些相对丰度沿着决策树运行，并生成风险评分。该模型显示在验证群组中区分ASD和TD的AUC为0.762(图5)。ASD和TD儿童的平均风险评分分别为0.76和0.43(图6)。

表7：表3中列出的物种在8名患有ASD的儿童和10名正常发育儿童中的相对丰度

实施例III：微生物组确定的生长/发育年龄

方法

群组描述和研究对象

总共招募了64名正常发育儿童(年龄为3-6岁)。男性(84％)多于女性。该研究由联合的中国香港中文大学新界东联网临床研究伦理委员会(The Joint CUHK-NTEC CREC,CREC Ref.No:2016.607)批准。所有对象都同意捐赠粪便样品并进行问卷调查，其中获得了书面知情同意。来自研究对象的粪便样品储存在-80℃，用于下游微生物组分析。没有ASD、没有运动和语言发育延迟以及没有由他们的父母报告的行为延迟的儿童和没有一级亲属患有ASD的儿童被包括作为正常发育儿童。

粪便DNA提取和DNA测序

通过经修改以提高DNA产量的

预处理后，将沉淀物重悬在800μl CTAB缓冲液(

原始序列的质量控制

首先通过Trimmomatic¹(v0.38)修剪原始序列读取，然后将非人类读取与污染物宿主读取分离。获得干净的读取有以下一些步骤：1)去除适配子；2)用4碱基宽的滑动窗口扫描读取，当每碱基的平均质量降至20以下时去除读取；3)将读取长度降至50个碱基以下。通过KneadData(v0.7.2)将修剪的序列读取映射到人类基因组(参考数据库：GRCh38 p12)以去除源自宿主的读数。将配对末端两个读取连接在一起。

细菌微生物组的分析

经由MetaPhlAn2(v2.7.5)²对宏基因组修剪的读取进行细菌群落组成的分析。通过Bowtie2(v2.3.4.3)³完成将读取映射到进化枝特异性标志物基因和物种泛基因组(pangenomes)的注释。输出表含有从界到菌株水平的不同水平的细菌物种及其相对丰度。经由R中的psych包(1.9.12.31)进行通过斯皮尔曼相关分析进行的细菌物种与实龄相关性。

机器学习模型

使用来自64名正常发育儿童的粪便微生物，选择随机森林(RF)来建立微生物群年龄预测模型(由于其具有利用回归学习方法进行均值预测的优越性能)。随机森林⁷是宏基因组数据分析中最流行的方法之一，以鉴定区别特征和构建预测模型。作为广泛使用的集成学习算法，随机森林由一系列分类和回归树(CART)组成，以形成强的均值预测。从具有替换的原始数据集中随机抽样的数据的子集被称为自助抽样，用于构建树。在当前树的训练数据集由模型投票或求平均值绘制成单个集成模型(该模型最终胜过任何单独决策树的输出)时，自助法

观测从总体数据集中省略。在无穷大的N的情况下，有36.8％的数据未出现在称为袋外(OOB)观测的训练样品中，这些数据将不会用于构建树。另外，当每个决策树基于从总体特征中选择的特征的随机子集分割节点时，将额外的随机性引入到随机森林。具有较高％IncMSE(均方误差增加(％))的特征表示在预测模型中具有更大贡献的特征。对于不同的数据和特征子集，该算法能够训练不同的树并通过对来自树模型的结果进行平均来获得最终结果。除了预测模型之外，随机森林还具有评估变量重要性的能力⁸。为了获得单个OOB观测的单个预测，可以对这些预测的反应进行平均。为了测量给定变量的重要性，随机改变OOB数据中变量的值，然后改变的OOB数据被用于生成新的预测。将改变的与原始的OOB观测之间的误差率之差除以标准误差计算为％IncMSE(用袋外估计的)，即变量的重要性。为了预测新样品，将样品的特征向下传递到每个树以估计平均值。随机森林使用所有树的平均概率来确定最终结果。

包括总计64名正常发育儿童作为用于建模的发现群组(discovery cohort)。通过递归特征消除来评价每个物种对回归模型的重要值。根据递减的重要值，选择前5种细菌分类群来构建模型。使用R包randomForest v4.6-14⁷进行这些分析。

结果

肠道细菌物种与正常发育儿童的实龄相关

为了评估细菌物种与儿童实龄之间的相关性，计算这2种因素之间的斯皮尔曼相关系数。确定所有成对比较的统计显著性。存在正相关(相对丰度随年龄增加)和负相关(相对丰度随年龄减少)。在下表中仅显示了绝对系数>0.2的统计显著相关性。例如，随着儿童年龄的增长，物种多形拟杆菌(Bacteroides thetaiotaomicron)显著增加。当儿童具有丰富的富含碳水化合物的饮食时，多形拟杆菌能够帮助儿童代谢多种多样的多糖。

表8：细菌物种与儿童实龄显著相关

因此，表8中列出的细菌可以以不同的组合来构建评估模型，以确定儿童的生长发育年龄以及是否需要微生物组恢复治疗或补充。可以使用一组qPCR引物或通过宏基因组测序来确定相对丰度，以确定肠道微生物群的发育。

此外，表8中列出的具有正相关系数(斯皮尔曼相关系数)的细菌可以补充给儿童以支持儿童的生长发育。相对丰度应增加到高于或等于表8中列出的正常发育儿童的平均相对丰度的水平。

使用机器学习模型确定生长发育年龄

通过回归随机森林分析，发现物种格氏链球菌,鸟肠球菌,真杆菌_3_1_31,哈氏梭菌,坚硬棒杆菌(图7，表9)是正常发育儿童中前5种最重要的预测变量。5种细菌分类群用于建立机器学习模型以预测微生物群的年龄。从数据计算％IncMSE。在随机森林建模中使用的变量的重要性，其指示当随机排列给定变量时均方误差的增加。使用这5种标志物的最终模型具有r-squared(0.85)(图8)。

表9：包括在用于确定生长发育年龄的机器学习模型中的细菌物种

细菌物种	NCBI:txid
		格氏链球菌	1302
鸟肠球菌	33945
		真杆菌3_1_31	457402
哈氏梭菌	154046
		坚硬棒杆菌	61592

因此，为了确定儿童生长和发育延迟的风险，将进行以下步骤：

1.通过确定选自表9*的物种在正常发育儿童的群组中的相对丰度来获得一组训练数据。

2.确定这些物种在其生长发育延迟风险待被确定的儿童中的相对丰度。

3.使用随机森林模型将对象中这些物种的相对丰度与训练数据进行比较。

4.决策树将由训练数据通过随机森林生成。相对丰度将沿着决策树运行并生成对应于预测的生长发育年龄的均值预测。如果预测的生长发育年龄低于儿童的实龄，则儿童处于生长和发育延迟的风险中。

*选自表9的物种可以包括：

1.五种细菌物种(格氏链球菌、鸟肠球菌、真杆菌_3_1_31、哈氏梭菌、坚硬棒杆菌；图8)，

2.四种物种(格氏链球菌、鸟肠球菌、真杆菌_3_1_31、哈氏梭菌；图9)，

3.三种物种(格氏链球菌、鸟肠球菌、真杆菌_3_1_31；图10)，

4.两种物种(格氏链球菌和鸟肠球菌；图11)，或

5.一种物种(格氏链球菌；图12)。

研究1

通过如方法中所述的宏基因组测序和指定的分类法来确定来自64名正常发育儿童的表9中列出的5种物种(格氏链球菌,鸟肠球菌,Fubacterium_sp_3_1_31,哈氏梭菌,坚硬棒杆菌)。决策树由表10中的数据通过随机森林生成，参数为：ntree＝10000，接近性＝TRUE，重要性＝TRUE，nPerm＝10。

确定3岁儿童的生长发育延迟的风险。通过如方法中所述的宏基因组测序和指定的分类法来确定以上5种物种在该儿童的粪便样品中的相对丰度。相对丰度沿着决策树运行，并生成预测的生长发育年龄。该儿童的预测年龄为48.3个月(图8)。该儿童被认为具有低的生长发育延迟风险。

研究2

通过如方法中所述的宏基因组测序和指定的分类法来确定来自64名正常发育儿童的表9中列出的4种物种(格氏链球菌,鸟肠球菌,真杆菌_3_1_31,哈氏梭菌)。决策树由表10中的数据通过随机森林生成，参数为：ntree＝10000，接近性＝TRUE，重要性＝TRUE，nPerm＝10。

确定3岁儿童的生长发育延迟的风险。通过如方法中所述的宏基因组测序和指定的分类法来确定以上4种物种在该儿童的粪便样品中的相对丰度。相对丰度沿着决策树运行，并生成预测的生长发育年龄。该儿童中预测的微生物群年龄为48.3个月(图9)。该儿童被认为具有低的生长发育延迟风险。

研究3

通过如方法中所述的宏基因组测序和指定的分类法来确定来自64名正常发育儿童的表9中列出的3种物种(格氏链球菌、鸟肠球菌、真杆菌_3_1_31)。决策树由表10中的数据通过随机森林生成，参数为：ntree＝10000，接近性＝TRUE，重要性＝TRUE，nPerm＝10。

确定3岁儿童的生长发育延迟的风险。通过如方法中所述的宏基因组测序和指定的分类法来确定以上3种物种在该儿童的粪便样品中的相对丰度。相对丰度沿着决策树运行，并生成预测的生长发育年龄。该儿童的预测年龄为52.6个月(图10)。该儿童被认为具有低的生长发育延迟风险。

研究4

通过如方法中所述的宏基因组测序和指定的分类法来确定格氏链球菌和鸟肠球菌在64名正常发育儿童中的相对丰度(表10中所列的相对丰度)。决策树由表10中的数据通过随机森林生成，参数为：ntree＝10000，接近性＝TRUE，重要性＝TRUE，nPerm＝10。

确定3岁儿童的生长发育延迟的风险。通过如方法中所述的宏基因组测序和指定的分类法来确定以上2种物种在该儿童的粪便样品中的相对丰度。相对丰度沿着决策树运行，并生成预测的生长发育年龄。该儿童的预测年龄为53.2个月(图11)。该儿童被认为具有低的生长发育延迟风险。

研究5

通过如方法中所述的宏基因组测序和指定的分类法来确定格氏链球菌在64名正常发育儿童中的相对丰度(表10中所列的相对丰度)。决策树由表10中的数据通过随机森林生成，参数为：ntree＝10000，接近性＝TRUE，重要性＝TRUE，nPerm＝10。

确定3岁儿童的生长发育延迟的风险。通过如方法中所述的宏基因组测序和指定的分类法来确定上述1种物种在该儿童的粪便样品中的相对丰度。相对丰度沿着决策树运行，并生成预测的生长发育年龄。该儿童的预测年龄为64.9个月(图12)。该儿童被认为具有低的生长发育延迟风险。

表10：表9中列出的物种在64名正常发育儿童中的相对丰度

表11：表9中列出的物种在3岁儿童中的相对丰度

物种	格氏链球菌	鸟肠球菌	真杆菌3_1_31	哈氏梭菌	坚硬棒状杆菌
						3岁儿童	0.00119	0.09925	0	1.51249	0.0042

ASD和年龄对儿童肠道微生物组具有最显著的影响

在中国香港招募年龄为3-6岁的中国儿童(64名ASD儿童对比64名TD儿童)，并检查宿主因素对儿童粪便微生物组组态的影响。在检查的宿主因素中，ASD、实龄和身体质量指数(BMI)对根据效应大小排名的粪便微生物组显示出最显著的影响(图13A，PERMANOVA)。ASD和年龄对改变的肠道微生物组的影响独立于其它宿主因素(图18A)。为了进一步探索宿主因素如何影响微生物组组成，询问了单独宿主因素与细菌物种之间的相关性。鉴定了111种细菌物种与ASD、实龄、BMI、母乳喂养的持续时间、体重、身高、饮食评分(食物频率)、性别、胎龄和分娩方式显著相关(所有FDR调整P值<0.05，斯皮尔曼和肯德尔相关值>0.2或<-0.2，图13B-C)。物种普氏栖粪杆菌和解木聚糖拟杆菌的丰度与儿童的实龄正相关，而物种鸟肠球菌、格氏链球菌和前庭链球菌与儿童的实龄负相关(图13B)。物种Alistipesindistinctus、候选TM7b、TM7c、粘液真杆菌和嵴链球菌与ASD正相关(与TD儿童相比，ASD儿童中的丰度显著较高，图13C)。经由剖腹产分娩的儿童显示与粪副拟杆菌相关，与通过阴道分娩出生的儿童相比，经由剖腹产分娩的儿童中的粪副拟杆菌显著减少，并且在两种分娩模式中，在ASD中的分类群减少(图18B)。总之，这些数据表明，宿主因素在塑造儿童肠道微生物群中具有显著的影响；其中，ASD、实龄、BMI在微生物组变异中具有强的效应大小。

将粪便细菌物种鉴定为ASD的潜在生物标志物

与TD儿童相比，患有ASD的儿童的肠道微生物组组成在多种分类水平上发生改变。患有ASD的儿童中的微生物组丰富度高于年龄和BMI匹配的TD儿童(BMI：分别为15.31±1.87对比15.38±1.42)(t检验，p值＝0.021，图14A)。在患有ASD的儿童中，组内细菌丰富度的个体差异也更高(在ASD对比TD中，分别为54.0[47.0-59.3]对比51.0[46.8-54.0])。在组成水平上，患有ASD的儿童和TD儿童中的肠道微生物组结构显著不同，如通过在主坐标分析(PCoA)图中的不同聚类和分离所示(图14B，t-检验，p＝0.0390和0.0136，基于在两个PCoA轴上呈现的Bray-Curtis差异)。另外，患有ASD的儿童的肠道微生物组比TD儿童更混杂(图14B)。

在属水平上，梭菌属和粪芽孢菌属在患有ASD的儿童中大量富集(图19A，Kruskal-Wallis检验，p值分别为0.032和0.022)，然而与TD儿童相比，已知产生丁酸盐的粪杆菌属(Machiels等人,Gut63(8):1275-1283,2014)在患有ASD的儿童中显著降低(图19A，Kruskal-Wallis检验，p值＝0.013)。在种水平上，患有ASD的儿童和TD儿童之间有五种细菌物种不同，包括Alistipes indistinctus、候选分裂TM分离物TM7c、嵴链球菌、粘液真杆菌和寡发酵链球菌(通过随机森林经由十倍交叉验证而鉴定的，图14C)。基于五种潜在的物种标志物，随机森林模型显示在发现集中区分ASD与TD的曲线下面积(AUC)值为80.3％。在独立验证集(10名TD儿童和8名患有ASD的儿童)中，相同模型的AUC达到76.2％(图14D)。与TD相比，预测儿童患有ASD的随机生成的决策树的概率增加(图19B)。

肠道细菌-细菌生态网络在患有ASD的儿童中受损

接下来通过评价细菌物种之间的斯皮尔曼相关性来评估ASD与TD组的肠道中细菌-细菌的生态相互作用。ASD和TD儿童中的大多数细菌-细菌相关性为正相关(图15)。与TD儿童中的稀疏相关网络相比，在ASD组中观察到更强的相关网络，如通过两者数量(671对比368)所示，并且与TD相比，显著的细菌-细菌相关性的相关系数在ASD的肠道微生物群落中较高(图15，p值<0.05，|相关系数|>0.5)。在TD儿童中，来自厚壁菌门的细菌显示出最多的种间相互作用，然而来自拟细菌门的物种在ASD的生态网络中显示出稳健的细菌-细菌相关性(图15)。特别地，充当机会致病菌的不解糖卟啉单胞菌(Porphyromonasasaccharolytica)的相关性在ASD儿童中加强。肠道微生物组生态网络中的这种变化表明种间交流/相互作用在ASD儿童的肠道中显著改变。

与神经递质生物合成相关的途径在ASD的肠道微生物组中减少

为了理解与ASD的组成变化相关的肠道微生物组功能的变化，使用HUMAnN2对组成功能模块(基因家族)的基因丰度进行分析(Franzosa等人,Nature methods 15(11):962-968,2018)。在ASD儿童中，必需氨基酸生物合成(L-苏氨酸、L-异亮氨酸、L-亮氨酸、L-缬氨酸)、葡萄糖代谢、核苷酸生物合成和维生素B生物合成的途径显著减少(图20A)。重要的是，其中，与TD相比，与神经递质生物合成相关的途径在ASD的肠道微生物组中减少(图16A)。与TD组相比，在ASD组的肠道微生物组中，涉及分支酸(色氨酸生物合成的前体)生物合成的途径ARO-PWY和PWY-6163显著减少(FDR校正的p值<0.05，图16A)。伴随地，对应于芳香族氨基酸(包括L-色氨酸、L-苯丙氨酸、L-酪氨酸)的生物合成的COMPLETE-ARO-PWY功能也在ASD中降低(图16A)，所述生物合成全部从主要的共同前体分支酸开始(Pittard和Yang,EcoSalPlus 3(1),2008)。色氨酸是代谢物犬尿氨酸和血清素的关键前体，它们都是与对抗抑郁症和其它精神病症有关的关键神经递质(Vaswani等人,Progress in neuro-psychopharmacology and biological psychiatry 27(1):85-102,2003)。另外，在患有ASD的儿童的粪便微生物组中甘氨酸(抑制性神经递质)生物合成的途径被耗损(图16A)。总体而言，神经递质能够使信号传输穿过突触而到神经细胞，其中突触功能障碍被认为关键地促成ASD的病理生理(Zoghbi和Bear(2012),"Synaptic dysfunction inneurodevelopmental disorders associated with autism and intellectualdisabilities."Cold Spring Harbor perspectives in biology 4(3):a009886)。因此，ASD微生物组的功能中这些途径的变化，特别是色氨酸和甘氨酸的合成代谢/代谢的变化，可能导致异常的神经递质合成，从而传递给宿主。物种瘤胃球菌5_1_39BFAA(Ruminococcussp.5_1_39BFAA)、直肠真杆菌(Eubacterium rectale)和布氏瘤胃球菌(Ruminococcus bromii)、普氏栖粪杆菌分别是L-色氨酸和甘氨酸生物合成的主要贡献者(图16B-C)。值得注意的是，与TD儿童相比，在患有ASD的儿童中，普氏栖粪杆菌在丝氨酸-甘氨酸代谢途径的贡献显著降低(图20B)。总之，这些数据表明，与神经递质合成相关的微生物组功能在ASD儿童中显著降低，这可能对ASD中的精神异常具有深远的功能后果。

除此之外，与TD儿童相比，ASD儿童中编码谷氨酸合成酶的微生物基因的丰度也显著降低(图20C)。谷氨酸合成酶是一种生产谷氨酸的酶，谷氨酸是脊椎动物神经系统中最丰富的兴奋性神经递质(Zhou和Danbolt,Journal of neural transmission 121(8):799-817,2014)。谷氨酸合成酶编码基因丰度的紊乱可能对宿主精神反应具有有害作用。

基于研究对象的肠道微生物组功能特征和临床参数，发明人经由相关性分析探索微生物组功能模块的丰度与宿主因素之间的关系。发现年龄在塑造儿童肠道微生物组的功能中具有最深远的影响，如通过所检查的宿主因素中的儿童年龄与微生物功能模块的丰度之间最丰富的关联所示的(30个显著关联，P值<0.05，斯皮尔曼相关值>0.2或<-0.2，图16D)。在这些关联中，能量代谢相关的微生物功能途径(糖降解；羧酸盐降解)随年龄增加，然而嘌呤核苷酸生物合成途径随年龄减少(图16D)。总体而言，实龄对儿童中肠道微生物组的功能具有总体大的影响。

ASD中生长相关细菌发展的畸变

考虑到宿主实龄对肠道微生物组的组成和功能的影响，假设在健康儿童中观察到的年龄相关细菌可能在ASD儿童的肠道中异常发展。在TD儿童中鉴定年龄有差别的分类群，随后在ASD儿童中研究它们的丰度与年龄的关联。经由随机森林利用5次10倍交叉验证，粪便细菌物种的相对丰度针对在粪便样品收集时TD儿童的实龄回归。因此，识别出26种年龄有差别的细菌物种，作为儿童肠道微生物群随年龄“正常”发展的代表(图17A和图17B，左图)。与在TD儿童中观察到的具有儿童实龄的年龄有差别的细菌分类群的逐渐发展模式(图17B，左图)相反，这些年龄有差别的细菌分类群的丰度和模式在ASD儿童中基本上被破坏，变得与年龄无关(图17B，右图)。例如，在TD儿童中，物种粘液真杆菌和短双岐杆菌(Bifidobacterium breve)的相对丰度随年龄而减少，然而物种短真杆菌、副流感嗜血杆菌(Haemonphilus parainfluenzae)、解纤维素拟杆菌(Bacteroides cellulosilyticus)和毛螺菌科细菌3_1_46FAA的丰度随年龄而增加(图17B，左图)。与此结果一致，这些年龄有差别的细菌先前与儿童的健康生长相关(Wong等人,Nutrients 11(8):1724,2019)。然而，这些物种的年龄相关模式在患有ASD的儿童中丢失(图17B，右图)，表明与年龄匹配的同龄人相比，在ASD儿童的早期生命生长和发育期间肠道微生物群的异常发展。

为了验证他们的发现，发明人基于26种年龄有差别的物种的丰度开发了作为TD儿童中实龄的函数的稀疏微生物组-年龄预测模型(图17C)。在TD儿童中，预测的微生物组-年龄与儿童的实龄成线性增长，说明了具有儿童年龄的肠道微生物组的稳定发展前景。然而，当使用在TD儿童中开发的微生物组年龄模型来预测ASD儿童的微生物组年龄时，发明人发现ASD儿童的肠道微生物组在跟上宿主的实龄方面显示出发育不足，如针对ASD儿童的实龄模型，在微生物组-年龄中观察到的斜率比在TD儿童中观察到的斜率更平稳(线性模型的斜率：分别为0.10对比0.31，图17C)。这些数据共同表明，与同龄人相比，ASD儿童在童年生长过程中其肠道微生物组发育受损。肠道微生物组与儿童共同进化以形成互惠共生关系，童年时期的异常肠道微生物发展可能对宿主健康具有持久的影响。

参考文献

5 McMurdie PJ,Holmes S.phyloseq:an R package for reproducibleinteractive analysis and graphics of microbiome census data.PLoS One2013；8:e61217.

7 Breiman L.Random Forests.Machine Learning 2001；45:5-32.

实施例IV：自闭症的微生物标志物

自闭症谱系障碍(ASD)是一组复杂的发育障碍，其特征在于受损的社交互动和沟通以及重复行为。本研究的目的是确定患有自闭症的个体的细菌生物标志物，以及查明自闭症的益生菌/治疗性细菌。自闭症儿童与正常发育儿童之间的肠道细菌谱是不同的。肠道微生物群被认为是ASD发展的重要因素。该发现的实际应用包括预测儿童自闭症的风险以及微生物转移和/或补充作为改善自闭症个体的行为症状的潜在手段。

方法

群组描述和研究对象

总共招募了120名中国儿童(年龄为3-6岁)，61名自闭症谱系障碍儿童和59名正常发育儿童。群组招募的男性(83％)多于女性(17％)，大多数ASD儿童在大约3岁时被诊断为ASD。

该研究由联合的中国香港中文大学新界东联网临床研究伦理委员会(The JointCUHK-NTEC CREC,CREC Ref.No:2016.607)批准。所有对象都同意捐赠粪便样品并进行问卷调查，其中获得了书面知情同意。来自研究对象的粪便样品储存在-80℃，用于下游微生物组分析。

将包括由儿科医生或临床心理学家根据第四版或第五版的《精神疾病诊断和统计手册》(DSM-IV或DSM-V)标准诊断患有ASD的儿童的家庭。没有ASD、没有运动和语言发育延迟以及没有由他们的父母报告的行为延迟的儿童和没有一级亲属患有ASD的儿童被包括作为正常发育儿童。将65个具有中国血统的ASD儿童的家庭和65个具有正常发育儿童的家庭分为2组：病例组和对照组。

粪便DNA提取及DNA测序

通过经修改以提高DNA产量的

预处理后，将沉淀物重悬在800μl CTAB缓冲液(

RSC仪器中。提取的粪便DNA经由Ilumina Novoseq6000(Novogen,Beijing,China)用于超深宏基因组测序。

原始序列的质量控制

首先通过Trimmomatic¹(Trimmomatic-0.36)修剪原始序列读取，然后将非人类读取与污染物宿主读取分离。获得干净的读取有以下一些步骤：1)去除适配子；2)用4碱基宽的滑动窗口扫描读取，当每碱基的平均质量降至20以下时去除读取；3)将读取长度降至50个碱基以下。通过KneadData(参考数据库：GRCh38 p12)使用修剪的序列读取以将非人类读取与人类读取分开。将配对末端两个读取连接在一起。

细菌微生物组的分析

经由MetaPhlAn2(v2.7.5)²对宏基因组修剪的读取进行细菌群落组成的分析。通过Bowtie2(v2.3.4.3)³完成将读取映射到进化枝特异性标志物基因和物种泛基因组的注释。输出表含有从界到菌株水平的不同水平的细菌物种及其相对丰度。

引物和探针的设计

基于细菌16S rRNA基因中的保守片段手动设计用于内部对照的引物和探针序列，然后使用用于测定Tm、GC含量和可能的二级结构的工具PrimerExpress v3.0(AppliedBiosystems)对它们进行测试。在引物和探针中包括简并位点以增加目标覆盖率；简并位点不靠近引物的3’端和探针的5’端。扩增子靶标是相应大肠杆菌基因组的nt1063-1193。

选择通过先前的宏基因组测序鉴定的三种细菌标志物候选物用于qPCR定量，包括Alistipes indistinctus(Ai)、人肠道厌氧棒状菌(Ac)和霍氏真杆菌(Eh)。通过宏基因组研究中的AUC值排名来鉴定这些候选物。从MetaPhlAn2数据库中提取靶向基因标志物的引物和探针序列。在NCBI中使用Primer-BLAST设计引物，并手动设计探针。引物-探针组特异性地检测靶标而不是任何其它已知序列，如通过Blast搜索确认的。每个探针携带5’报告染料FAM(6-羧基荧光素)或VIC(4,7,20-三氯-70-苯基-6-羧基荧光素)和3’淬灭染料TAMRA(6-羧基四甲基罗丹明)。通过BGI合成引物和水解探针。下面列出了引物和探针的核苷酸序列。PCR扩增特异性通过PCR产物的直接Sanger测序确认。

表12：针对Ai、Ac和Eh的引物和探针的核苷酸序列

定量PCR

在用粘合剂封口的MicroAmp快速光学96孔反应板(Applied Biosystems)中，在含有0.3mmol/L的每种引物和0.2mmol/L的每种探针的TaqMan通用预混合物II(AppliedBiosystems)的20uL反应系统中进行定量PCR(qPCR)扩增。ABI PRISM 7900HT序列检测系统的热循环仪参数是95℃，10分钟以及(95℃ 15秒，60℃ 1分钟)x45个循环。在每个实验中包括阳性/参考对照和阴性对照(H2O作为模板)。对每个样品以一式两份进行测量。使用Sequence DetectionSoftware(Applied Biosystems)分析qPCR数据，其中对于所有临床样品，手动设置阈值＝0.05，以及3-15个循环的基线。如果实验的阴性对照Cq值<42，则实验不合格。数据分析是根据ΔCq方法进行的，其中ΔCq＝Cq_靶标-Cq_对照以及相对丰度＝POWER(2,-ΔCq)。

结果和发现

ASD儿童与正常发育儿童之间肠道细菌分布的差异

根据分类的性能，物种Alistipes indistinctus和人肠道厌氧棒状菌(表13)在患有ASD的儿童中显示出比正常发育儿童更高的相对丰度。相比之下，与正常发育儿童相比，物种霍氏真杆菌(表14)在患有ASD的儿童中被耗损。每个单独的标志物和组合的性能显示在表15中。图22显示了组合评分的ROC曲线。对于组合评分，使用逻辑回归模型计算(组合评分＝I1+β1*Ai+β2*Eh+β3*Ac)。在回归模型中，I代表截距，β代表回归系数，标志物代表相应的Cp值。

表13：与正常发育儿童相比，在自闭症谱系障碍儿童中富集的细菌种

细菌物种	NCBI:txid
		Alistipes indistinctus(Ai)	626932
人肠道厌氧棒状菌(Ac)	169435

表14：与正常发育儿童相比，在自闭症谱系障碍儿童中耗损的细菌物种

表15：在ASD分类中单独和与其它细菌组合的每种标志物的性能

	AUC	P值	灵敏度	特异性
					Alistipes indistinctus	0.706	<0.0001	52.46	88.14
霍氏真杆菌	0.626	0.0044	91.80	38.98
					人肠道厌氧棒状菌	0.614	0.0293	42.37	83.05
组合评分	0.754	<0.0001	50.8	91.50

这些细菌标志物可以单独使用或组合使用以确定对象中发生ASD的风险。可以建立标准对照值(在正常发育儿童中发现的细菌物种的相对丰度或其组合评分)以提供截止值，以指示被检查的对象是否具有升高的ASD风险。对于单一标志物和组合评分，截止值由使约登指数(J＝灵敏度+特异性-1)最大化的接收者操作特性(ROC)分析来确定。使用非参数方法针对每个方法/每种标志物进行ROC下面积(AUROC)的成对比较。

例如，该群组中的Ai和Ac的截止值分别为0.000000019和0.000000758。该群组中的组合评分的截止值为0.531(图22)。具有大于这些截止值的组合值的对象被认为具有较高的ASD风险。Eh的截止值为0.00129794。具有小于或等于该截止值的值的对象被认为具有较高的ASD风险。

在本申请中引用的所有专利、专利申请和其它出版物(包括GenBank登录号等)出于所有目的通过引用以其整体并入。

Claims

1.用于治疗人类儿童中自闭症谱系障碍(ASD)的症状的方法，其包括将有效量的一种或多种细菌物种引入儿童的胃肠道，所述细菌物种为普氏栖粪杆菌(Faecalibacteriumprausnitzi)、食葡糖罗斯拜瑞氏菌(Roseburia inulinivorans)、霍氏真杆菌(Eubacterium hallii)、Dorea longicatena或惰性真杆菌(Eubacteriumsiraeum)。

2.根据权利要求1所述的方法，其中所述引入步骤包括向所述对象口服施用包含有效量的所述一种或多种细菌物种的组合物。

3.根据权利要求1所述的方法，其中所述引入步骤包括将包含有效量的所述一种或多种细菌物种的组合物递送至所述对象的小肠、回肠或大肠。

4.根据权利要求1所述的方法，其中所述引入步骤包括粪便微生物群移植(FMT)。

5.根据权利要求4所述的方法，其中所述FMT包括向所述儿童施用包含经处理的供体粪便材料的组合物。

6.根据权利要求2所述的方法，其中口服施用所述组合物。

7.根据权利要求2所述的方法，其中所述组合物直接沉积到所述儿童的胃肠道。

8.根据权利要求1所述的方法，其中在所述引入步骤之前从所述儿童获得的第一粪便样品和在所述引入步骤之后从所述儿童获得的第二粪便样品中确定所述一种或多种细菌物种的水平或者相对丰度。

9.根据权利要求8所述的方法，其中通过定量聚合酶链式反应(PCR)确定所述一种或多种细菌物种的水平。

10.用于治疗人类儿童中自闭症谱系障碍(ASD)的症状的方法，其包括降低所述儿童的胃肠道中一种或多种细菌物种的水平或者相对丰度，所述细菌物种为Clostridiumnexile、Dialister invisus、鲍氏梭菌(Clostridium bolteae)、共生梭菌(Clostridiumsymbiosum)、粘液真杆菌(Eubacterium limosum)、细菌梭菌_1_7_47FAA(Clostridialesbacterium_1_7_47FAA)、多枝梭菌(Clostridium ramosum)、人肠道厌氧棒状菌(Anaerotruncus colihominis)、奇特龙梭菌(Clostridium citroniae)或Alistipesindistinctus。

11.根据权利要求10所述的方法，其中所述降低步骤包括FMT。

12.根据权利要求10所述的方法，其中所述降低步骤包括用抗菌剂治疗所述对象。

13.根据权利要求12所述的方法，其中在用所述抗菌剂治疗所述对象之后，将包含经处理的供体粪便材料的组合物引入所述对象的胃肠道。

14.根据权利要求13所述的方法，其中口服施用所述组合物。

15.根据权利要求13所述的方法，其中所述组合物直接沉积到所述儿童的胃肠道。

16.根据权利要求10所述的方法，其中在所述降低步骤之前从所述儿童获得的第一粪便样品和在所述降低步骤之后从所述儿童获得的第二粪便样品中确定所述一种或多种细菌物种的水平或者相对丰度。

17.根据权利要求16所述的方法，其中通过定量聚合酶链式反应(PCR)确定所述一种或多种细菌物种的水平。

18.用于治疗ASD的症状的试剂盒，其包含第一容器和第二容器，所述第一容器含有第一组合物，所述第一组合物包含(i)有效量的表1所示的一种细菌物种，或(ii)有效量的抗菌剂，所述抗菌剂阻抑表2所示的一种细菌物种的生长，所述第二容器含有第二组合物，所述第二组合物包含(i)有效量的表1所示的另一种细菌物种，或(ii)有效量的抗菌剂，所述抗菌剂阻抑表2所示的另一种细菌物种的生长。

19.根据权利要求18所述的试剂盒，其中所述第一组合物包含用于FMT的经处理的供体粪便材料。

20.根据权利要求18或19所述的试剂盒，其中所述第一组合物被配制用于口服施用。

21.根据权利要求18所述的试剂盒，其中所述第二组合物被配制用于口服施用。

22.根据权利要求19所述的试剂盒，其中所述第一组合物和第二组合物均被配制用于口服摄入。

23.用于确定人类儿童中自闭症谱系障碍(ASD)的风险的方法，其包括：

(1)确定来自所述儿童的粪便样品中的表1或表2所示的任一种细菌物种的相对丰度；以及

(2)检测到来自步骤(1)的相对丰度不低于表1中的截止值或标准对照值或者低于表2中的截止值或标准对照值，并确定所述儿童不具有增加的ASD风险；或者检测到来自步骤(1)的相对丰度低于表1中的截止值或标准对照值或者不低于表2中的截止值或标准对照值，并确定所述儿童具有增加的ASD风险。

24.用于评估两个人类儿童中自闭症谱系障碍(ASD)的风险的方法，其包括：

(1)确定来自所述两个儿童的每一个的粪便样品中的表1或表2所示的任一种细菌物种的相对丰度；

(2)确定来自步骤(1)的表1所示的细菌物种的相对丰度在来自第一儿童的粪便样品中较高或者来自步骤(1)的表2所示的细菌物种的相对丰度在来自第一儿童的粪便样品中较低；以及

(3)确定第二儿童具有比第一儿童更高的ASD风险。

25.用于确定人类儿童中自闭症谱系障碍(ASD)的风险的方法，其包括：

(1)在来自所述儿童的粪便样品中获得以下的值：(a)Alistipes indistinctus(Ai)或人肠道厌氧棒状菌(Ac)的相对丰度，或者(b)三种细菌物种Ai、Ac和霍氏真杆菌(Eh)的水平的综合评分，所述综合评分通过I1+β1*Ai+β2*Eh+β3*Ac计算；以及

(2)检测到所述值高于标准对照值，并确定所述个体具有增加的ASD风险。

26.用于确定人类儿童中自闭症谱系障碍(ASD)的风险的方法，其包括：

(1)获得来自所述儿童的粪便样品中的霍氏真杆菌(Eh)的相对丰度的值；以及

(2)检测到所述值低于标准对照值，并确定所述个体具有增加的ASD风险。

27.根据权利要求23-26中任一项所述的方法，其中通过定量PCR确定细菌物种的相对丰度。

28.用于评估人类儿童中自闭症谱系障碍(ASD)的风险的方法，其包括：

(1)确定来自所述儿童的粪便样品中的表3所示的一种或多种细菌物种的水平或者相对丰度；

(2)确定来自包括正常和ASD儿童的参考群组的粪便样品中相同细菌物种的水平或相对丰度；

(3)使用从步骤(2)获得的数据通过随机森林模型生成决策树，并沿着所述决策树运行来自步骤(1)的一种或多种细菌物种的水平或者相对丰度以生成风险评分；以及

(4)将风险评分大于0.5的儿童确定为具有增加的ASD风险，并且将风险评分不大于0.5的儿童确定为没有增加的ASD风险。

29.根据权利要求28所述的方法，其中所述一种或多种细菌物种包括Alistipesindistinctus。

30.根据权利要求28所述的方法，其中所述一种或多种细菌物种包括Alistipesindistinctus、候选分裂TM7单细胞分离物TM7c和嵴链球菌(Streptococcus cristatus)。

31.根据权利要求28所述的方法，其中所述一种或多种细菌物种包括Alistipesindistinctus、候选分裂TM7单细胞分离物TM7c、嵴链球菌、粘液真杆菌和寡发酵链球菌(Streptococcus_oligofermentans)。

32.用于评估自闭症谱系障碍(ASD)的风险的试剂盒，其包含用于检测表1、表2或表3所示的一种或多种细菌物种的试剂。

33.根据权利要求32所述的试剂盒，其中所述试剂包含一组寡核苷酸引物，其用于扩增来自表1、表2或表3所示的任一种细菌物种的多核苷酸序列。

34.根据权利要求33所述的试剂盒，其中所述扩增是PCR，优选定量PCR。

35.用于确定儿童发育年龄的方法，其包括以下步骤：

(a)定量确定取自所述儿童的粪便样品中的选自表8或表9的一种或多种细菌物种的相对丰度；

(b)定量确定取自由正常发育儿童组成的参考群组的粪便样品中的所述一种或多种细菌物种的相对丰度；

(c)使用从步骤(b)获得的数据通过随机森林模型生成决策树；以及

(d)沿着来自步骤(b)的决策树运行从步骤(a)获得的相对丰度，以生成所述儿童的发育年龄。

36.根据权利要求35所述的方法，其中所述一种或多种细菌物种包括格氏链球菌(Streptococcus gordonii)、鸟肠球菌(Enterococcus avium)、真杆菌_3_1_31(Eubacterium_sp_3_1_31)、哈氏梭菌(Clostridium hathewayi)和坚硬棒杆菌(Corynebacterium durum)。

37.根据权利要求35所述的方法，其中所述一种或多种细菌物种包括格氏链球菌、鸟肠球菌、真杆菌_3_1_31和哈氏梭菌。

38.根据权利要求35所述的方法，其中所述一种或多种细菌物种包括格氏链球菌、鸟肠球菌和真杆菌_3_1_31。

39.根据权利要求35所述的方法，其中所述一种或多种细菌物种包括格氏链球菌和鸟肠球菌。

40.根据权利要求35所述的方法，其中所述一种或多种细菌物种包括格氏链球菌。

41.根据权利要求35所述的方法，其中所述儿童为约3岁至约6岁。

42.用于确定儿童发育年龄的试剂盒，其包含第一容器和第二容器，所述第一容器含有用于检测表8或表9所示的第一细菌物种的第一试剂，所述第二容器含有用于检测表8或表9所示的第二细菌物种的第二试剂。

43.根据权利要求42所述的试剂盒，其包含三个或更多个容器，所述容器中的每一个含有用于检测表8或表9所示的不同细菌物种的试剂。

44.根据权利要求42所述的试剂盒，其包含两个或更多个容器，所述容器中的每一个含有用于检测不同细菌物种的试剂，所述细菌物种选自由以下组成的组：(1)格氏链球菌、鸟肠球菌、真杆菌_3_1_31、哈氏梭菌和坚硬棒杆菌；(2)格氏链球菌、鸟肠球菌、真杆菌_3_1_31和哈氏梭菌；(3)格氏链球菌、鸟肠球菌和真杆菌_3_1_31；或者(4)格氏链球菌和鸟肠球菌。

45.根据权利要求42所述的试剂盒，其中所述试剂包含一组寡核苷酸引物，其用于扩增来自表8或表9所示的任一种细菌物种的多核苷酸序列。

46.根据权利要求45所述的试剂盒，其中所述扩增是PCR。

47.根据权利要求46所述的试剂盒，其中所述PCR是定量PCR(qPCR)。

48.促进儿童生长和发育的方法，其包括向所述儿童施用有效量的选自表8的一种或多种细菌物种。

49.根据权利要求48所述的方法，其中所述儿童为约3岁至约6岁。

50.用于促进儿童生长和发育的试剂盒，其包含第一容器和第二容器，所述第一容器含有第一组合物，所述第一组合物包含(i)有效量的表8所示的一种细菌物种，所述第二容器含有第二组合物，所述第二组合物包含(i)有效量的表8所示的另一种细菌物种。

51.根据权利要求50所述的试剂盒，其中所述第一组合物或第二组合物包含用于FMT的经处理的供体粪便材料。

52.根据权利要求50或51所述的试剂盒，其中所述第一组合物被配制用于口服施用。

53.根据权利要求50或51所述的试剂盒，其中所述第二组合物被配制用于口服施用。

54.根据权利要求51所述的试剂盒，其中所述第一组合物和第二组合物均被配制用于口服摄入。