ES2982415T3

ES2982415T3 - Uso de linfocitos infiltrantes tumorales para el tratamiento de pacientes con NSCLC refractarios al anticuerpo anti-PD-1

Info

Publication number: ES2982415T3
Application number: ES19856433T
Authority: ES
Inventors: Maria Fardis; Arvind Natarajan
Original assignee: Iovance Biotherapeutics Inc
Current assignee: Iovance Biotherapeutics Inc
Priority date: 2018-08-31
Filing date: 2019-09-03
Publication date: 2024-10-16
Anticipated expiration: 2039-09-03
Also published as: US20240307450A1; EP4378530A3; EP4378530A2; AU2019377771A1; KR20210053922A; SG11202101792TA; BR112021003491A2; PL3843759T3; EP3843759B1; TW202031273A; HUE066849T2; CA3111210A1; MX2021002241A; WO2020096682A2; EP3843759B8; US20220118012A1; IL281022A; CN112955160A; JP2025074081A; DK3843759T3

Abstract

La presente invención proporciona procesos y métodos mejorados y/o acortados para preparar TIL con el fin de preparar poblaciones terapéuticas de TIL con mayor eficacia terapéutica para el tratamiento del carcinoma de pulmón de células no pequeñas (CPCNP), en donde el CPCNP es refractario al tratamiento con un anticuerpo anti-PD-1. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

DESCRIPCIÓN

Uso de linfocitos infiltrantes tumorales para el tratamiento de pacientes con NSCLC refractarios al anticuerpo anti-PD-1

Antecedentes de la invención

El tratamiento de cánceres voluminosos y refractarios mediante la transferencia adoptiva de linfocitos infiltrantes tumorales (TIL) representa un potente enfoque terapéutico para pacientes con mal pronóstico. Gattinoni, et al., Nat. Rev. Immunol. 2006, 6, 383-393. Para que la inmunoterapia tenga éxito se necesita un gran número de TIL y un proceso sólido y fiable para su comercialización. Esto ha sido un reto de conseguir debido a los problemas técnicos, logísticos y regulatorios de la expansión celular. La expansión de TIL basada en IL-2 seguida de un "proceso de expansión rápida" (REP) se ha convertido en el método preferido para la expansión de TIL por su rapidez y eficacia. Dudley, et al., Science 2002, 298, 850-54; Dudley, et al., J. Clin. Oncol. 2005, 23, 2346-57; Dudley, et al., J. Clin. Oncol. 2008, 26, 5233-39; Riddell, et al., Science 1992, 257, 238-41; Dudley, et al., J. Immunother. 2003, 26, 332-42. El REP puede dar lugar a una expansión de 1,000 veces de TIL en un periodo de 14 días, aunque requiere un gran exceso (por ejemplo, 200 veces) de células mononucleares de sangre periférica alogénicas irradiadas (PBMC, también conocidas como células mononucleares (MNC)), a menudo de múltiples donantes, como células alimentadoras, así como anticuerpo anti-CD3 (OKT3) y altas dosis de IL-2. Dudley, et al., J. Immunother. 2003, 26, 332-42. Los TIL que se han sometido a un procedimiento REP han producido una terapia celular adoptiva exitosa tras la inmunosupresión del huésped en pacientes con melanoma. Los parámetros actuales de aceptación de la infusión se basan en lecturas de la composición de los TIL (por ejemplo, positividad de CD28, CD8 o CD4) y las veces que se produce expansión y la viabilidad del producto de REP. El documento WO 2018/081473 divulga métodos para expandir y reestimular las poblaciones de TIL y métodos de ensayo de las poblaciones de TIL para determinar la idoneidad de infusiones más eficaces.

Los procesos actuales de fabricación y tratamiento de TIL están limitados por la duración, el coste, los problemas de esterilidad y otros factores descritos en el presente documento, de modo que el potencial para tratar a pacientes refractarios a los anti-PD1 y, como tales, se ha visto gravemente limitado. Existe una necesidad urgente de proporcionar procesos de fabricación de TIL y terapias basadas en dichos procesos que sean apropiados para su uso en el tratamiento de pacientes para los que quedan muy pocas o ninguna opción de tratamiento viable. La presente invención satisface esta necesidad proporcionando un proceso de fabricación abreviado para su uso en la generación de TIL que pueden emplearse posteriormente en el tratamiento de pacientes con carcinoma de pulmón de células no pequeñas (NSCLC) refractarios al tratamiento anti-PD-1.

Breve resumen de la invención

La presente invención proporciona métodos mejorados y/o abreviados para expandir los TIL y producir poblaciones terapéuticas de TIL para su uso en el tratamiento de pacientes con carcinoma de pulmón de células no pequeñas (NSCLC) refractarios al tratamiento anti-PD-1.

La invención se define en las reivindicaciones adjuntas.

En algunas realizaciones, la invención proporciona una población terapéutica de linfocitos infiltrantes tumorales (TIL) para su uso en un método de tratamiento de un sujeto con carcinoma de pulmón de células no pequeñas (NSCLC), en el que el cáncer es refractario al tratamiento con un anticuerpo anti-PD-1, comprendiendo el método el suministro de linfocitos infiltrantes tumorales (TIL) expandidos para su administración que comprenden:

(a) proporcionar una primera población de TIL obtenida y/o recibida de uno o más tumores extirpados de un sujeto mediante el procesamiento de uno o más tumores obtenidos del sujeto en múltiples fragmentos tumorales;

(b) añadir los fragmentos tumorales en un sistema cerrado;

(c) realizar una primera expansión cultivando la primera población de TIL en un medio de cultivo celular que comprenda IL-2 para producir una segunda población de TIL, en la que la primera expansión se realice en un contenedor cerrado que proporcione una primera área de superficie permeable al gas, donde la primera expansión se realice durante aproximadamente 3-11 días para obtener la segunda población de TIL, en la que la segunda población de TIL sea al menos 50 veces mayor en número que la primera población de TIL, y en la que la transición de la etapa (b) a la etapa (c) se produzca sin abrir el sistema;

(d) realizar una segunda expansión suplementando el medio de cultivo celular de la segunda población de TIL con IL-2, OKT-3 y células presentadoras de antígeno (APC) adicionales, para producir una tercera población de TIL, en la que la segunda expansión se realiza durante aproximadamente 7-11 días para obtener la tercera población de TIL, en la que la tercera población de TIL es una población terapéutica de TIL que comprende una subpoblación aumentada de células T efectoras y/o células T de memoria central en relación con la segunda población de TIL, en la que la segunda expansión se realiza en un recipiente cerrado que proporciona una segunda área de superficie permeable al gas, y en la que la transición de la etapa (c) a la etapa (d) se produce sin abrir el sistema;

(e) recolectar la población terapéutica de TIL obtenida de la etapa (d), en la que la transición de la etapa (d) a la etapa (e) se produce sin abrir el sistema; y

(f) transferir la población de TIL recolectada de la etapa (e) a una bolsa de infusión, en la que la transferencia de la etapa (e) al (f) se produce sin abrir el sistema;

(g) crioconservar la bolsa de infusión que contiene la población de TIL recolectada de la etapa (f) mediante un proceso de crioconservación; y

(h) proporcionar al sujeto una dosis terapéuticamente eficaz de la tercera población de TIL para su administración desde la bolsa de infusión en la etapa (g).

En algunas realizaciones, "obtener" indica que los TIL empleados en el método y/o proceso pueden derivarse directamente de la muestra (incluso de una extirpación quirúrgica, biopsia por punción, la biopsia con aguja gruesa, biopsia pequeña u otra muestra) como parte de las etapas del método y/o proceso. En algunas realizaciones, "recibir" indica que los TIL empleados en el método y/o proceso pueden derivarse indirectamente de la muestra (incluso de una extirpación quirúrgica, biopsia con aguja, la biopsia con aguja gruesa, biopsia pequeña u otra muestra) y luego emplearse en el método y/o proceso, (por ejemplo, cuando la etapa (a) comienza con TIL que ya se han derivado de la muestra mediante un proceso separado no incluido en la parte (a), dichos TIL podrían denominarse "recibidos"). En algunas realizaciones, la muestra tumoral se deriva de un método de muestreo multilesional.

En algunas realizaciones, el NSCLC refractario ha sido tratado previamente con un anticuerpo anti-PD-1 y/o anti-PD-LI.

En algunas realizaciones, el NSCLC refractario no ha sido tratado previamente con un anticuerpo anti-PD-1 y/o anti-PD-LI.

En algunas realizaciones, el NSCLC refractario ha sido tratado con un agente quimioterapéutico.

En algunas realizaciones, el NSCLC refractario se ha tratado previamente con un anticuerpo anti-PD-1 y/o anti-PD-L1 y se ha tratado previamente con un agente quimioterapéutico.

En algunas realizaciones, el NSCLC refractario no se ha tratado previamente con un anticuerpo anti-PD-1 y/o anti-PD-L1 y se ha tratado previamente con un agente quimioterapéutico.

En algunas realizaciones, el NSCLC refractario ha sido tratado con un agente quimioterapéutico, pero no está siendo tratado actualmente con un agente quimioterapéutico.

En algunas realizaciones, el NSCLC refractario tiene una expresión baja de PD-L1.

En algunas realizaciones, el NSCLC refractario ha sido tratado previamente con un anticuerpo anti-PD-1 y/o anti-PD-LI y tiene una expresión baja de PD-L1.

En algunas realizaciones, el NSCLC refractario no ha sido tratado previamente con un anticuerpo anti-PD-1 y/o anti-PD-LI y tiene una expresión baja de PD-L1.

En algunas realizaciones, el NSCLC refractario ha sido tratado con un agente quimioterapéutico y tiene una expresión baja de PD-L1.

En algunas realizaciones, el NSCLC refractario ha sido tratado con un agente quimioterapéutico, pero no está siendo tratado actualmente con un agente quimioterapéutico y tiene una expresión baja de PD-L1.

En algunas realizaciones, el NSCLC refractario no ha sido tratado previamente con un anticuerpo anti-PD-1 y/o anti-PD-L1 y presenta una enfermedad voluminosa al inicio.

En algunas realizaciones, el NSCLC refractario ha sido tratado previamente con un anticuerpo anti-PD-1 y/o anti-PD-L1 y presenta una enfermedad voluminosa al inicio.

En algunas realizaciones, el NSCLC refractario ha sido tratado con un agente quimioterapéutico y presenta una enfermedad voluminosa al inicio.

En algunas realizaciones, el NSCLC refractario ha sido tratado con un agente quimioterapéutico, pero no está siendo tratado actualmente con un agente quimioterapéutico y presenta una enfermedad voluminosa al inicio.

En algunas realizaciones, la enfermedad voluminosa está indicada cuando el diámetro máximo del tumor es superior a 7 cm medidos en el plano transversal o coronal o los ganglios linfáticos inflamados con un diámetro en el eje corto de 20 mm o superior.

En algunas realizaciones, el NSCLC refractario es refractario a al menos dos tratamientos sistémicos previos, sin incluir terapias neoadyuvantes o adyuvantes.

En algunas realizaciones, el NSCLC refractario es refractario a un anticuerpo anti-PD-1 seleccionado del grupo formado por nivolumab, pembrolizumab, ipilimumab, JS001, TSR-042, pidilizumab, (BGB-A317, SHR-1210, REGN2810, MDX-1106, PDR001, anti-PD-1 del clon: RMP1-14; y un anticuerpo anti-PD-1 divulgado en la Patente de los Estados Unidos No. 8,008,449, durvalumab, atezolizumab, avelumab, y fragmentos, derivados, variantes, así como biosimilares de los mismos.

En algunas realizaciones, el NSCLC refractario es refractario al pembrolizumab o a un biosimilar del mismo. En algunas realizaciones, el NSCLC refractario es refractario al nivolumab o a un biosimilar del mismo.

En algunas realizaciones, el NSCLC refractario es refractario al ipilimumab o a un biosimilar del mismo. En algunas realizaciones, el NSCLC refractario es refractario al ipilimumab o a un biosimilar del mismo y al pembrolizumab o a un biosimilar del mismo.

En algunas realizaciones, el NSCLC refractario es refractario al ipilimumab o a un biosimilar del mismo y al nivolumab o a un biosimilar del mismo.

En algunas realizaciones, el NSCLC refractario es refractario al durvalumab o a un biosimilar del mismo. En algunas realizaciones, el NSCLC refractario es refractario al atezolizumab o a un biosimilar del mismo. En algunas realizaciones, el NSCLC refractario es refractario al avelumab o a un biosimilar del mismo.

En algunas realizaciones, la expansión inicial se lleva a cabo durante un periodo de aproximadamente 11 días y la expansión rápida se lleva a cabo durante un periodo de aproximadamente 11 días.

En algunas realizaciones, la IL-2 está presente en una concentración inicial de entre 1000 UI/mL y 6000 UI/mL en el primer medio de cultivo celular.

En algunas realizaciones, la IL-2 está presente a una concentración inicial de entre 1000 UI/mL y 6000 UI/mL y el anticuerpo OKT-3 está presente a una concentración inicial de aproximadamente 30 ng/mL en el segundo medio de cultivo celular.

En algunas realizaciones, la expansión inicial se lleva a cabo utilizando un recipiente permeable al gas. En algunas realizaciones, la expansión rápida se lleva a cabo utilizando un recipiente permeable al gas. En algunas realizaciones, el primer medio de cultivo celular comprende además una citocina seleccionada del grupo que consiste en IL-4, IL-7, IL-15, IL-21 y combinaciones de las mismas.

En algunas realizaciones, el segundo medio de cultivo celular comprende además una citocina seleccionada del grupo que consiste en IL-4, IL-7, IL-15, IL-21 y combinaciones de las mismas.

En algunas realizaciones, el método comprende además la etapa de tratar al paciente con un régimen de linfodepleción no mieloablativo antes de administrar la tercera población de TIL al paciente.

En algunas realizaciones, el régimen de linfodepleción no mieloablativo comprende las etapas de administración de ciclofosfamida a una dosis de 60 mg/m2/día durante dos días seguida de la administración de fludarabina a una dosis de 25 mg/m2/día durante cinco días.

En algunas realizaciones, el método comprende además la etapa de tratar al paciente con un régimen de IL-2 a partir del día siguiente a la administración de la tercera población de TIL al paciente.

En algunas realizaciones, el régimen de IL-2 es un régimen de altas dosis de IL-2 que comprende 600,000 o 720,000 UI/kg de aldesleucina, o un biosimilar o variante del mismo, administrado como una infusión intravenosa en bolo de 15 minutos cada ocho horas hasta la tolerancia.

Otros temas

Se divulga en el presente documento, pero no se reivindica, un método de tratamiento del carcinoma de pulmón de células no pequeñas (NSCLC) con una población de linfocitos infiltrantes tumorales (TIL) que comprende las etapas de:

(a) obtención y/o recepción de una primera población de TIL a partir de una extirpación quirúrgica, biopsia con aguja, la biopsia con aguja gruesa, biopsia pequeña u otro medio para obtener una muestra que contenga una mezcla de células tumorales y TIL de un tumor de NSCLC de un paciente, incluso a partir de múltiples fragmentos tumorales o biopsias;

(c) poner en contacto los fragmentos tumorales con un primer medio de cultivo celular;

(d) realizar una expansión inicial de la primera población de TIL en el primer medio de cultivo celular para obtener una segunda población de TIL, en la que la segunda población de TIL es al menos 5 veces mayor en número que la primera población de TIL, en la que el primer medio de cultivo celular comprende IL-2;

(e) realizar una expansión rápida de la segunda población de TIL en un segundo medio de cultivo celular para obtener una tercera población de TIL, en la que la tercera población de TIL sea al menos 50 veces mayor en número que la segunda población de TIL tras 7 días desde el inicio de la expansión rápida; en la que el segundo medio de cultivo celular comprenda IL-2, OKT-3 (anticuerpo anti-CD3) y, opcionalmente, células mononucleares de sangre periférica (PBMC) alogénicas irradiadas; y en la que la expansión rápida se realice durante un periodo de 14 días o menos;

(f) la recolección de la tercera población de TIL; y

(g) administrar una porción terapéuticamente eficaz de la tercera población de TIL a un paciente con el NSCLC;

en el que el NSCLC es refractario al tratamiento con un anticuerpo anti-PD-1.

En los métodos divulgados en el presente documento, "obtención" indica que los TIL empleados en el método y/o proceso pueden derivarse directamente de la muestra (incluida una extirpación quirúrgica, una biopsia con aguja, una la biopsia con aguja gruesa, una biopsia pequeña u otra muestra) como parte de las etapas del método y/o proceso. En algunas realizaciones, "recibir" indica que los TIL empleados en el método y/o proceso pueden derivarse indirectamente de la muestra (incluso de una extirpación quirúrgica, biopsia con aguja, la biopsia con aguja gruesa, biopsia pequeña u otra muestra) y luego emplearse en el método y/o proceso, (por ejemplo, cuando la etapa (a) comienza con los TIL que ya se han derivado de la muestra mediante un proceso separado no incluido en la parte (a), dichos TIL podrían denominarse "recibidos").

En los métodos divulgados en el presente documento, la obtención de la primera población de TIL comprende un método de muestreo multilesional.

En los métodos divulgados en el presente documento, el NSCLC refractario ha sido tratado previamente con un anticuerpo anti-PD-1 y/o anti-PD-LI y/o anti-PD-L2.

En los métodos divulgados en el presente documento, el NSCLC refractario no ha sido tratado previamente con un anticuerpo anti-PD-1 y/o anti-PD-LI.

En los métodos divulgados en el presente documento, el NSCLC refractario ha sido tratado con un agente quimioterapéutico.

En los métodos divulgados en el presente documento, el NSCLC refractario ha sido tratado previamente con un anticuerpo anti-PD-1 y/o anti-PD-LI y ha sido tratado previamente con un agente quimioterapéutico.

En los métodos divulgados en el presente documento, el NSCLC refractario no ha sido tratado previamente con un anticuerpo anti-PD-1 y/o anti-PD-L1 y ha sido tratado previamente con un agente quimioterapéutico.

En los métodos divulgados en el presente documento, el NSCLC refractario ha sido tratado con un agente quimioterapéutico, pero no está siendo tratado actualmente con un agente quimioterapéutico.

En los métodos divulgados en el presente documento, el NSCLC refractario tiene una expresión baja de PD-L1.

En los métodos divulgados en el presente documento, el NSCLC refractario ha sido tratado previamente con un anticuerpo anti-PD-1 y/o anti-PD-L1 y tiene una expresión baja de PD-L1.

En los métodos divulgados en el presente documento, el NSCLC refractario no ha sido tratado previamente con un anticuerpo anti-PD-1 y/o anti-PD-L1 y tiene una expresión baja de PD-L1.

En los métodos divulgados en el presente documento, el NSCLC refractario ha sido tratado con un agente quimioterapéutico y tiene una expresión baja de PD-L1.

En los métodos divulgados en el presente documento, el NSCLC refractario ha sido tratado con un agente quimioterapéutico, pero no está siendo tratado actualmente con un agente quimioterapéutico y tiene una expresión baja de PD-L1

En los métodos divulgados en el presente documento, el NSCLC refractario no ha sido tratado previamente con un anticuerpo anti-PD-1 y/o anti-PD-L1 y presenta una enfermedad voluminosa al inicio.

En los métodos divulgados en el presente documento, el NSCLC refractario ha sido tratado previamente con un anticuerpo anti-PD-1 y/o anti-PD-L1 y presenta una enfermedad voluminosa al inicio.

En los métodos divulgados en el presente documento, el NSCLC refractario ha sido tratado con un agente quimioterapéutico y presenta una enfermedad voluminosa al inicio.

En los métodos divulgados en el presente documento, el NSCLC refractario ha sido tratado con un agente quimioterapéutico, pero no está siendo tratado actualmente con un agente quimioterapéutico y tiene una enfermedad voluminosa al inicio.

En los métodos divulgados en el presente documento, la enfermedad voluminosa se indica cuando el diámetro máximo del tumor es superior a 7 cm medidos en el plano transversal o coronal o los ganglios linfáticos inflamados con un diámetro en el eje corto de 20 mm o superior.

En los métodos divulgados en el presente documento, el NSCLC refractario es refractario a al menos dos tratamientos sistémicos previos, sin incluir terapias neoadyuvantes o adyuvantes.

En los métodos divulgados en el presente documento, el NSCLC refractario es refractario a un anticuerpo anti-PD-1 seleccionado del grupo que consiste en nivolumab, pembrolizumab, ipilimumab, JS001, t SR-042, pidilizumab, (BGB-A317, SHR-1210, REGN2810, MDX-1106, PDR001, anti-PD-1 del clon: RMP1-14; y un anticuerpo anti-PD-1 divulgado en la Patente de los Estados Unidos No. 8,008,449, durvalumab, atezolizumab, avelumab, y fragmentos, derivados, variantes, así como biosimilares de los mismos.

En los métodos divulgados en el presente documento, el NSCLC refractario es refractario al pembrolizumab o a un biosimilar del mismo.

En los métodos divulgados en el presente documento, el NSCLC refractario es refractario al nivolumab o a un biosimilar del mismo.

En los métodos divulgados en el presente documento, el NSCLC refractario es refractario al ipilimumab o a un biosimilar del mismo.

En los métodos divulgados en el presente documento, el NSCLC refractario es refractario al ipilimumab o a un biosimilar del mismo y al pembrolizumab o a un biosimilar del mismo.

En los métodos divulgados en el presente documento, el NSCLC refractario es refractario al ipilimumab o a un biosimilar del mismo y al nivolumab o a un biosimilar del mismo.

En los métodos divulgados en el presente documento, el NSCLC refractario es refractario al durvalumab o a un biosimilar del mismo.

En los métodos divulgados en el presente documento, el NSCLC refractario es refractario al atezolizumab o a un biosimilar del mismo.

En los métodos divulgados en el presente documento, el NSCLC refractario es refractario al avelumab o a un biosimilar del mismo.

En los métodos divulgados en el presente documento, la expansión inicial se realiza durante un período de 21 días o menos.

En los métodos divulgados en el presente documento, la expansión inicial se realiza durante un periodo de 14 días o menos.

En los métodos divulgados en el presente documento, la expansión inicial se realiza durante un periodo de aproximadamente 11 días y la expansión rápida se realiza durante un periodo de aproximadamente 11 días. En los métodos divulgados en el presente documento, la IL-2 está presente en una concentración inicial de entre 1000 UI/mL y 6000 UI/mL en el primer medio de cultivo celular.

En los métodos divulgados en el presente documento, la IL-2 está presente en una concentración inicial de entre 1000 UI/mL y 6000 UI/mL y el anticuerpo OKT-3 está presente en una concentración inicial de aproximadamente 30 ng/mL en el segundo medio de cultivo celular.

En los métodos divulgados en el presente documento, la expansión inicial se realiza utilizando un recipiente permeable al gas.

En los métodos divulgados en el presente documento, la expansión rápida se realiza utilizando un recipiente permeable al gas.

En los métodos divulgados en el presente documento, el primer medio de cultivo celular comprende además una citosina seleccionada del grupo que consiste en IL-4, IL-7, IL-15, IL-21 y combinaciones de las mismas. En los métodos divulgados en el presente documento, el segundo medio de cultivo celular comprende además una citosina seleccionada del grupo que consiste en IL-4, IL-7, IL-15, IL-21 y combinaciones de las mismas. En los métodos divulgados en el presente documento, el método comprende además la etapa de tratar al paciente con un régimen de linfodepleción no mieloablativo antes de administrar la tercera población de TIL al paciente.

En los métodos divulgados en el presente documento, el régimen de linfodepleción no mieloablativo comprende las etapas de administración de ciclofosfamida a una dosis de 60 mg/m2/día durante dos días seguida de la administración de fludarabina a una dosis de 25 mg/m2/día durante cinco días.

En los métodos divulgados en el presente documento, el método comprende además la etapa de tratar al paciente con un régimen de IL-2 a partir del día siguiente a la administración de la tercera población de TIL al paciente.

En los métodos divulgados en el presente documento, el régimen de IL-2 es un régimen de altas dosis de IL-2 que comprende 600,000 o 720,000 UI/kg de aldesleucina, o un biosimilar o variante de la misma, administrada como una infusión intravenosa en bolo de 15 minutos cada ocho horas hasta la tolerancia.

(a) extirpar uno o más tumores de un paciente, comprendiendo uno o más tumores una primera población de TIL;

(b) fragmentar uno o más tumores en fragmentos tumorales;

(f) recolectar la tercera población de TIL; y

(g) administrar una porción terapéuticamente eficaz de la tercera población de TIL a un paciente con el cáncer; en el que el cáncer es refractario al tratamiento con un anticuerpo anti-PD-1.

En los métodos divulgados en el presente documento, el NSCLC refractario ha sido tratado previamente con un anticuerpo anti-PD-1 y/o anti-PD-L1.

En los métodos divulgados en el presente documento, el NSCLC refractario no ha sido tratado previamente con un anticuerpo anti-PD-1 y/o anti-PD-L1.

En los métodos divulgados en el presente documento, el NSCLC refractario ha sido tratado previamente con un anticuerpo anti-PD-1 y/o anti-PD-L1 y ha sido tratado previamente con un agente quimioterapéutico. En los métodos divulgados en el presente documento, el NSCLC refractario no ha sido tratado previamente con un anticuerpo anti-PD-1 y/o anti-PD-L1 y ha sido tratado previamente con un agente quimioterapéutico. En los métodos divulgados en el presente documento, el NSCLC refractario ha sido tratado con un agente quimioterapéutico, pero no está siendo tratado actualmente con un agente quimioterapéutico.

En los métodos divulgados en el presente documento, el NSCLC refractario no ha sido tratado previamente con un anticuerpo anti-PD-1 y/o anti-PD-L1 y tiene enfermedad voluminosa al inicio.

En los métodos divulgados en el presente documento, el NSCLC refractario ha sido tratado previamente con un anticuerpo anti-PD-1 y/o anti-PD-L1 y presenta enfermedad voluminosa al inicio.

En los métodos divulgados en el presente documento, el NSCLC refractario es refractario a un anticuerpo anti-PD-1 seleccionado del grupo que consiste en nivolumab, pembrolizumab, ipilimumab, JS001,<t>SR-042, pidilizumab, (BGB-A317, SHR-1210, REGN2810, MDX-1106, PDR001, anti-PD-1 del clon: RMP1-14; y un anticuerpo anti-PD-1 divulgado en la Patente de los Estados Unidos No. 8,008,449, durvalumab, atezolizumab, avelumab, y fragmentos, derivados, variantes, así como biosimilares de los mismos.

En los métodos divulgados en el presente documento, la expansión inicial se realiza durante un periodo de aproximadamente 11 días y la expansión rápida se realiza durante un periodo de aproximadamente 11 días.

En los métodos divulgados en el presente documento, la IL-2 está presente en una concentración inicial de entre 1000 UI/mL y 6000 UI/mL en el primer medio de cultivo celular.

En los métodos divulgados en el presente documento, la IL-2 está presente a una concentración inicial de entre 1000 UI/mL y 6000 UI/mL y el anticuerpo OKT-3 está presente a una concentración inicial de aproximadamente 30 ng/mL en el segundo medio de cultivo celular.

En los métodos divulgados en el presente documento, el primer medio de cultivo celular comprende además una citocina seleccionada del grupo que consiste en IL-4, IL-7, IL-15, IL-21 y combinaciones de las mismas.

En los métodos divulgados en el presente documento, el segundo medio de cultivo celular comprende además una citosina seleccionada del grupo que consiste en IL-4, IL-7, IL-15, IL-21 y combinaciones de las mismas.

En los métodos divulgados en el presente documento, el método comprende además la etapa de tratar al paciente con un régimen de linfodepleción no mieloablativo antes de administrar la tercera población de TIL al paciente.

En los métodos divulgados en el presente documento, el régimen de IL-2 es un régimen de IL-2 de dosis alta que comprende 600,000 o 720,000 UI/kg de aldesleucina, o un biosimilar o variante de la misma, administrada como una infusión intravenosa en bolo de 15 minutos cada ocho horas hasta la tolerancia.

Breve descripción de los dibujos

Figura 1: Diagrama ejemplar del proceso 2A que ofrece una visión general de las etapas A a F.

Figura 2: Diagrama de flujo del proceso 2A.

Figura 3: Muestra un diagrama de una realización de un proceso de fabricación ejemplar de TIL crioconservada (~22 días).

Figura 4: Muestra un diagrama de una realización del proceso 2A, un proceso de 22 días para la fabricación de TIL.

Figura 5: Tabla comparativa de las etapas A a F de realizaciones ejemplares del proceso 1C y del proceso 2A.

Figura 6: Comparación detallada de una realización del proceso 1C y una realización del proceso 2A.

Figura 7: Diagramas de flujo del estudio para las cohortes combinadas: Cohorte 1A (MM), Cohorte 2A (HNSCC) y Cohorte 3A (NSCLC). Abreviaturas: Cy = ciclofosfamida; EOA = final de la evaluación; EOS = final del estudio; EOT = final del tratamiento; Flu = fludarabina; IL-2 = interleucina-2; NMA-LD = linfodepleción no mieloablativa; una vez cada tres semanas=cada 3 semanas; TIL = linfocitos infiltrantes del tumor. Los pacientes de las Cohortes 1A, 2A y 3A recibirán una única infusión de pembrolizumab tras la finalización de la extirpación de su tumor para la producción de TIL y exploraciones de referencia antes del inicio del régimen NMA-LD. Para este estudio particular, la siguiente dosis de pembrolizumab no se administró antes de la finalización de la IL-2 y continuará una vez cada tres semanas ± 3 días a partir de entonces durante < 2 años (24 meses) o hasta la progresión de la enfermedad o toxicidad inaceptable, lo que ocurra primero.

Figura 8: Diagrama de flujo del estudio para la Cohorte de agente único: Cohorte 3B (NSCLC). Abreviaturas: Cy = ciclofosfamida; EOA = final de la evaluación; EOS = final del estudio; EOT = final del tratamiento; Flu = fludarabina; IL-2 = interleucina-2; NMA-LD = linfodepleción no mieloablativa; TIL = linfocitos infiltrantes tumorales.

Figura 9: Muestra un diagrama de una realización del proceso 2A, un proceso de 22 días para la fabricación de TIL.

Figura 10: Proporciona las estructuras I-A e I-B, los cilindros se refieren a dominios individuales de unión a polipéptidos. Las estructuras I-A e I-B comprenden tres dominios de unión a TNFRSF linealmente enlazados derivados, por ejemplo, de 4-1BBL o un anticuerpo que se une al 4-1BB, que se pliegan para formar una proteína trivalente, que se une a continuación a una segunda proteína trivalente mediante IgG1-Fc (incluidos los dominios CH3 y CH2) se utiliza entonces para unir dos de las proteínas trivalentes mediante enlaces disulfuro (pequeños óvalos alargados), estabilizando la estructura y proporcionando un agonista capaz de reunir los dominios de señalización intracelular de los seis receptores y proteínas de señalización para formar un complejo de señalización. Los dominios de unión al TNFRSF denotados como cilindros pueden ser dominios scFv que comprenden, por ejemplo, una cadena VH y una VL conectadas por un enlazador que puede comprender residuos hidrófilos y secuencias de Gly y Ser para la flexibilidad, así como de Glu y Lys para la solubilidad.

Breve descripción del listado de secuencias

SEQ ID NO: 1 es la secuencia de aminoácidos de la cadena pesada de muromonab.

SEQ ID NO: 2 es la secuencia de aminoácidos de la cadena ligera de muromonab.

SEQ ID NO: 3 es la secuencia de aminoácidos de una proteína IL-2 humana recombinante.

SEQ ID NO: 4 es la secuencia de aminoácidos de la aldesleucina.

SEQ ID NO: 5 es la secuencia de aminoácidos de una proteína IL-4 humana recombinante.

SEQ ID NO: 6 es la secuencia de aminoácidos de una proteína IL-7 humana recombinante.

SEQ ID NO: 7 es la secuencia de aminoácidos de una proteína IL-15 humana recombinante.

SEQ ID NO: 8 es la secuencia de aminoácidos de una proteína IL-21 humana recombinante.

SEQ ID NO: 9 es la secuencia de aminoácidos del 4-1BB humano.

SEQ ID NO: 10 es la secuencia de aminoácidos del 4-1BB murino.

SEQ ID NO: 11 es la cadena pesada del anticuerpo monoclonal agonista de 4-1BB utomilumab (PF-05082566). SEQ ID NO: 12 es la cadena ligera del anticuerpo monoclonal agonista de 4-1BB utomilumab (PF-05082566). SEQ ID NO: 13 es la región variable de la cadena pesada (VH) del anticuerpo monoclonal agonista de 4-1BB utomilumab (PF-05082566).

SEQ ID NO: 14 es la región variable de la cadena ligera (VL) del anticuerpo monoclonal agonista de 4-1BB utomilumab (PF-05082566).

SEQ ID NO: 15 es la CDR1 de la cadena pesada del anticuerpo monoclonal agonista de 4-1BB utomilumab (PF-05082566).

SEQ ID NO: 16 es la CDR2 de cadena pesada del anticuerpo monoclonal agonista de 4-1BB utomilumab (PF-05082566).

SEQ ID NO: 17 es la CDR3 de cadena pesada del anticuerpo monoclonal agonista de 4-1BB utomilumab (PF-05082566).

SEQ ID NO: 18 es la CDR1 de la cadena ligera del anticuerpo monoclonal agonista de 4-1BB utomilumab (PF-05082566).

SEQ ID NO: 19 es la CDR2 de cadena ligera del anticuerpo monoclonal agonista de 4-1BB utomilumab (PF-05082566).

SEQ ID NO: 20 es la CDR3 de cadena ligera del anticuerpo monoclonal agonista de 4-1BB utomilumab (PF-05082566).

SEQ ID NO: 21 es la cadena pesada del anticuerpo monoclonal agonista de 4-1BB urelumab (BMS-663513). SEQ ID NO: 22 es la cadena ligera del anticuerpo monoclonal agonista de 4-1BB urelumab (BMS-663513).

SEQ ID NO: 23 es la región variable de la cadena pesada (VH) del anticuerpo monoclonal agonista de 4-1BB urelumab (BMS-663513).

SEQ ID NO: 24 es la región variable de la cadena ligera (VL) del anticuerpo monoclonal agonista de 4-1BB urelumab (BMS-663513).

SEQ ID NO: 25 es la CDR1 de la cadena pesada del anticuerpo monoclonal agonista de 4-1BB urelumab (BMS-663513).

SEQ ID NO: 26 es la CDR2 de cadena pesada del anticuerpo monoclonal agonista de 4-1BB urelumab (BMS-663513).

SEQ ID NO: 27 es la CDR3 de cadena pesada del anticuerpo monoclonal agonista de 4-1BB urelumab (BMS-663513).

SEQ ID NO: 28 es la CDR1 de la cadena ligera del anticuerpo monoclonal agonista de 4-1BB urelumab (BMS-663513).

SEQ ID NO: 29 es la CDR2 de cadena ligera del anticuerpo monoclonal agonista de 4-1BB urelumab (BMS-663513).

SEQ ID NO: 30 es la CDR3 de cadena ligera del anticuerpo monoclonal agonista de 4-1BB urelumab (BMS-663513).

SEQ ID NO: 31 es un dominio de Fc para una proteína de fusión agonista de TNFRSF.

SEQ ID NO: 32 es un enlazador para una proteína de fusión agonista de TNFRSF.

SEQ ID NO: 33 es un enlazador para una proteína de fusión agonista de TNFRSF.

SEQ ID NO: 34 es un enlazador para una proteína de fusión agonista de TNFRSF.

SEQ ID NO: 35 es un enlazador para una proteína de fusión agonista de TNFRSF.

SEQ ID NO: 36 es un enlazador para una proteína de fusión agonista de TNFRSF.

SEQ ID NO: 37 es un enlazador para una proteína de fusión agonista de TNFRSF.

SEQ ID NO: 38 es un enlazador para una proteína de fusión agonista de TNFRSF.

SEQ ID NO: 39 es un enlazador para una proteína de fusión agonista de TNFRSF.

SEQ ID NO: 40 es un enlazador para una proteína de fusión agonista de TNFRSF.

SEQ ID NO: 41 es un enlazador para una proteína de fusión agonista de TNFRSF.

SEQ ID NO: 42 es un dominio de Fc para una proteína de fusión agonista de TNFRSF.

SEQ ID NO: 43 es un enlazador para una proteína de fusión agonista de TNFRSF.

SEQ ID NO: 44 es un enlazador para una proteína de fusión agonista de TNFRSF.

SEQ ID NO: 45 es un enlazador para una proteína de fusión agonista de TNFRSF.

SEQ ID NO: 46 es una secuencia de aminoácidos del ligando 4-1BB (4-1BBL).

SEQ ID NO: 47 es una porción soluble del polipéptido 4-1BBL.

SEQ ID NO: 48 es una región variable de cadena pesada (VH) para el anticuerpo agonista de 4-1BB 4B4-1-1 versión 1.

SEQ ID NO: 49 es una región variable de cadena ligera (VL) para el anticuerpo agonista de 4-1BB 4B4-1-1 versión 1.

SEQ ID NO: 50 es una región variable de cadena pesada (VH) para el anticuerpo agonista de 4-1BB 4B4-1-1 versión 2.

SEQ ID NO: 51 es una región variable de cadena ligera (VL) para el anticuerpo agonista de 4-1BB 4B4-1-1 versión 2.

SEQ ID NO: 52 es una región variable de cadena pesada (VH) para el anticuerpo agonista de 4-1BB H39E3-2.

SEQ ID NO: 53 es una región variable de cadena ligera (VL) para el anticuerpo agonista de 4-1BB H39E3-2. SEQ ID NO: 54 es la secuencia de aminoácidos de OX40 humana.

SEQ ID NO: 55 es la secuencia de aminoácidos de OX40 murina.

SEQ ID NO: 56 es la cadena pesada del anticuerpo monoclonal agonista de OX40 tavolixizumab (MEDI-0562). SEQ ID NO: 57 es la cadena ligera del anticuerpo monoclonal agonista de OX40 tavolixizumab (MEDI-0562). SEQ ID NO: 58 es la región variable de la cadena pesada (VH) del anticuerpo monoclonal agonista de OX40 tavolixizumab (MEDI-0562).

SEQ ID NO: 59 es la región variable de la cadena ligera (VL) del anticuerpo monoclonal agonista de OX40 tavolixizumab (MEDI-0562).

SEQ ID NO: 60 es la CDR1 de la cadena pesada del anticuerpo monoclonal agonista de OX40 tavolixizumab (MEDI-0562).

SEQ ID NO: 61 es la CDR2 de cadena pesada del anticuerpo monoclonal agonista de OX40 tavolixizumab (MEDI-0562).

SEQ ID NO: 62 es la CDR3 de la cadena pesada del anticuerpo monoclonal agonista de OX40 tavolixizumab (MEDI-0562).

SEQ ID NO: 63 es la CDR1 de la cadena ligera del anticuerpo monoclonal agonista de OX40 tavolixizumab (MEDI-0562).

SEQ ID NO: 64 es la CDR2 de la cadena ligera del anticuerpo monoclonal agonista de OX40 tavolixizumab (MEDI-0562).

SEQ ID NO: 65 es la CDR3 de la cadena ligera del anticuerpo monoclonal agonista de OX40 tavolixizumab (MEDI-0562).

SEQ ID NO: 66 es la cadena pesada del anticuerpo monoclonal agonista de OX40 11D4.

SEQ ID NO: 67 es la cadena ligera del anticuerpo monoclonal agonista de OX40 11D4.

SEQ ID NO: 68 es la región variable de la cadena pesada (VH) del anticuerpo monoclonal agonista de OX40 11D4.

SEQ ID NO: 69 es la región variable de la cadena ligera (VL) del anticuerpo monoclonal agonista de OX40 11D4.

SEQ ID NO: 70 es la CDR1 de la cadena pesada del anticuerpo monoclonal agonista de OX40 11D4.

SEQ ID NO: 71 es la CDR2 de cadena pesada para el anticuerpo monoclonal agonista de OX40 11D4. SEQ ID NO: 72 es la CDR3 de cadena pesada para el anticuerpo monoclonal agonista de OX40 11D4. SEQ ID NO: 73 es la CDR1 de la cadena ligera del anticuerpo monoclonal agonista de OX40 11D4.

SEQ ID NO: 74 es la CDR2 de cadena ligera para el anticuerpo monoclonal agonista de OX40 11D4.

SEQ ID NO: 75 es la CDR3 de cadena ligera para el anticuerpo monoclonal agonista de OX40 11D4.

SEQ ID NO: 76 es la cadena pesada del anticuerpo monoclonal agonista de OX40 18D8.

SEQ ID NO: 77 es la cadena ligera del anticuerpo monoclonal agonista de OX40 18D8.

SEQ ID NO: 78 es la región variable de la cadena pesada (VH) del anticuerpo monoclonal agonista de OX40 18D8.

SEQ ID NO: 79 es la región variable de la cadena ligera (VL) del anticuerpo monoclonal agonista de OX40 18D8.

SEQ ID NO: 80 es la CDR1 de la cadena pesada del anticuerpo monoclonal agonista de OX40 18D8.

SEQ ID NO: 81 es la CDR2 de cadena pesada para el anticuerpo monoclonal agonista de OX40 18D8. SEQ ID NO: 82 es la CDR3 de la cadena pesada del anticuerpo monoclonal agonista de OX40 18D8.

SEQ ID NO: 83 es la CDR1 de la cadena ligera del anticuerpo monoclonal agonista de OX40 18D8.

SEQ ID NO: 99 es la CDR1 de la cadena ligera del anticuerpo monoclonal agonista de OX40 Hu106-222.

SEQ ID NO: 100 es la CDR2 de cadena ligera para el anticuerpo monoclonal agonista de OX40 Hu106-222.

SEQ ID NO: 101 es la CDR3 de cadena ligera para el anticuerpo monoclonal agonista de OX40 Hu106-222.

SEQ ID NO: 102 es una secuencia de aminoácidos del ligando OX40 (OX40L).

SEQ ID NO: 103 es una porción soluble del polipéptido OX40L.

SEQ ID NO: 104 es una porción soluble alternativa del polipéptido OX40L.

SEQ ID NO: 105 es la región variable de la cadena pesada (VH) del anticuerpo monoclonal agonista de OX40 008.

SEQ ID NO: 106 es la región variable de la cadena ligera (VL) del anticuerpo monoclonal agonista de OX40 008.

SEQ ID NO: 107 es la región variable de la cadena pesada (VH) del anticuerpo monoclonal agonista de OX40 011.

SEQ ID NO: 108 es la región variable de la cadena ligera (VL) del anticuerpo monoclonal agonista de OX40 011.

SEQ ID NO: 109 es la región variable de la cadena pesada (VH) para el anticuerpo monoclonal agonista de OX40 021.

SEQ ID NO: 110 es la región variable de la cadena ligera (VL) del anticuerpo monoclonal agonista de OX40 021.

SEQ ID NO: 111 es la región variable de la cadena pesada (VH) del anticuerpo monoclonal agonista de OX40 023.

SEQ ID NO: 112 es la región variable de la cadena ligera (VL) del anticuerpo monoclonal agonista de OX40 023.

SEQ ID NO: 113 es la región variable de la cadena pesada (VH) de un anticuerpo monoclonal agonista OX40.

SEQ ID NO: 114 es la región variable de la cadena ligera (VL) de un anticuerpo monoclonal agonista OX40.

SEQ ID NO: 115 es la región variable de la cadena pesada (VH) de un anticuerpo monoclonal agonista OX40.

SEQ ID NO: 116 es la región variable de la cadena ligera (VL) de un anticuerpo monoclonal agonista OX40.

SEQ ID NO: 117 es la región variable de la cadena pesada (VH) de un anticuerpo monoclonal agonista de

OX40 humanizado.

SEQ ID NO: 118 es la región variable de la cadena pesada (VH) de un anticuerpo monoclonal agonista de

OX40 humanizado.

SEQ ID NO: 119 es la región variable de la cadena ligera (VL) de un anticuerpo monoclonal agonista de OX40 humanizado.

SEQ ID NO: 120 es la región variable de la cadena ligera (VL) de un anticuerpo monoclonal agonista de OX40 humanizado.

SEQ ID NO: 121 es la región variable de la cadena pesada (VH) de un anticuerpo monoclonal agonista de

OX40 humanizado.

SEQ ID NO: 122 es la región variable de la cadena pesada (VH) de un anticuerpo monoclonal agonista de

OX40 humanizado.

SEQ ID NO: 123 es la región variable de la cadena ligera (VL) de un anticuerpo monoclonal agonista de OX40 humanizado.

SEQ ID NO: 124 es la región variable de la cadena ligera (VL) de un anticuerpo monoclonal agonista de OX40 humanizado.

SEQ ID NO: 125 es la región variable de la cadena pesada (VH) de un anticuerpo monoclonal agonista OX40.

SEQ ID NO: 126 es la región variable de la cadena ligera (VL) de un anticuerpo monoclonal agonista OX40.

SEQ ID NO: 127 es la secuencia de aminoácidos de la cadena pesada del inhibidor de PD-1 nivolumab.

SEQ ID NO: 128 es la secuencia de aminoácidos de la cadena ligera del inhibidor de PD-1 nivolumab.

SEQ ID NO: 129 es la secuencia de aminoácidos de la región variable de cadena pesada (V<h>) del inhibidor de

PD-1 nivolumab.

SEQ ID NO: 130 es la secuencia de aminoácidos de la región variable de la cadena ligera (V<l>) del inhibidor de

PD-1 nivolumab.

SEQ ID NO: 131 es la secuencia de aminoácidos de CDR1 de la cadena pesada del inhibidor de PD-1 nivolumab.

SEQ ID NO: 132 es la secuencia de aminoácidos de CDR2 de la cadena pesada del inhibidor de PD-1 nivolumab.

SEQ ID NO: 133 es la secuencia de aminoácidos de CDR3 de la cadena pesada del inhibidor de PD-1 nivolumab.

SEQ ID NO: 134 es la secuencia de aminoácidos de CDR1 de la cadena ligera del inhibidor de PD-1 nivolumab. SEQ ID NO: 135 es la secuencia de aminoácidos de CDR2 de la cadena ligera del inhibidor de PD-1 nivolumab. SEQ ID NO: 136 es la secuencia de aminoácidos de CDR3 de la cadena ligera del inhibidor de PD-1 nivolumab. SEQ ID NO: 137 es la secuencia de aminoácidos de la cadena pesada del inhibidor de PD-1 pembrolizumab.

SEQ ID NO: 138 es la secuencia de aminoácidos de la cadena ligera del inhibidor de PD-1 pembrolizumab.

SEQ ID NO: 139 es la secuencia de aminoácidos de la región variable de la cadena pesada (V<h>) del inhibidor de PD-1 pembrolizumab.

SEQ ID NO: 140 es la secuencia de aminoácidos de la región variable de la cadena ligera (V<l>) del inhibidor de

PD-1 pembrolizumab.

SEQ ID NO: 141 es la secuencia de aminoácidos de CDR1 de la cadena pesada del inhibidor de PD-1 pembrolizumab.

SEQ ID NO: 142 es la secuencia de aminoácidos de CDR2 de la cadena pesada del inhibidor de PD-1 pembrolizumab.

SEQ ID NO: 143 es la secuencia de aminoácidos de CDR3 de la cadena pesada del inhibidor de PD-1 pembrolizumab.

SEQ ID NO: 144 es la secuencia de aminoácidos de CDR1 de la cadena ligera del inhibidor de PD-1 pembrolizumab.

SEQ ID NO: 145 es la secuencia de aminoácidos de CDR2 de la cadena ligera del inhibidor de PD-1 pembrolizumab.

SEQ ID NO: 146 es la secuencia de aminoácidos de CDR3 de la cadena ligera del inhibidor de PD-1 pembrolizumab.

SEQ ID NO: 147 es la secuencia de aminoácidos de la cadena pesada del inhibidor de PD-L1 durvalumab. SEQ ID NO: 148 es la secuencia de aminoácidos de la cadena ligera del inhibidor de PD-L1 durvalumab. SEQ ID NO: 149 es la secuencia de aminoácidos de la región variable de la cadena pesada (V<h>) del inhibidor de PD-L1 durvalumab.

SEQ ID NO: 150 es la secuencia de aminoácidos de la región variable de la cadena ligera (V<l>) del inhibidor de PD-L1 durvalumab.

SEQ ID NO: 151 es la secuencia de aminoácidos de CDR1 de la cadena pesada del inhibidor de PD-L1 durvalumab.

SEQ ID NO: 152 es la secuencia de aminoácidos de CDR2 de la cadena pesada del inhibidor de PD-L1 durvalumab.

SEQ ID NO: 153 es la secuencia de aminoácidos de CDR3 de la cadena pesada del inhibidor de PD-L1 durvalumab.

SEQ ID NO: 154 es la secuencia de aminoácidos de CDR1 de la cadena ligera del inhibidor de PD-L1 durvalumab.

SEQ ID NO: 155 es la secuencia de aminoácidos de CDR2 de la cadena ligera del inhibidor de PD-L1 durvalumab.

SEQ ID NO: 156 es la secuencia de aminoácidos de CDR3 de la cadena ligera del inhibidor de PD-L1 durvalumab.

SEQ ID NO: 157 es la secuencia de aminoácidos de la cadena pesada del inhibidor de PD-L1 avelumab. SEQ ID NO: 158 es la secuencia de aminoácidos de la cadena ligera del inhibidor de PD-L1 avelumab.

SEQ ID NO: 159 es la secuencia de aminoácidos de la región variable de la cadena pesada (V<h>) del inhibidor de PD-L1 avelumab.

SEQ ID NO: 160 es la secuencia de aminoácidos de la región variable de la cadena ligera (V<l>) del inhibidor de PD-L1 avelumab.

SEQ ID NO: 161 es la secuencia de aminoácidos de CDR1 de la cadena pesada del inhibidor de PD-L1 avelumab.

SEQ ID NO: 162 es la secuencia de aminoácidos de CDR2 de la cadena pesada del inhibidor de PD-L1 avelumab.

SEQ ID NO: 163 es la secuencia de aminoácidos de CDR3 de la cadena pesada del inhibidor de PD-L1 avelumab.

SEQ ID NO: 164 es la secuencia de aminoácidos de CDR1 de la cadena ligera del inhibidor de PD-L1 avelumab. SEQ ID NO: 165 es la secuencia de aminoácidos de CDR2 de la cadena ligera del inhibidor de PD-L1 avelumab. SEQ ID NO: 166 es la secuencia de aminoácidos de CDR3 de la cadena ligera del inhibidor de PD-L1 avelumab.

SEQ ID NO: 167 es la secuencia de aminoácidos de la cadena pesada del inhibidor de PD-L1 atezolizumab.

SEQ ID NO: 168 es la secuencia de aminoácidos de la cadena ligera del inhibidor de PD-L1 atezolizumab.

SEQ ID NO: 169 es la secuencia de aminoácidos de la región variable de la cadena pesada (V<h>) del inhibidor de PD-L1 atezolizumab.

SEQ ID NO: 170 es la secuencia de aminoácidos de la región variable de la cadena ligera (V<l>) del inhibidor de PD-L1 atezolizumab.

SEQ ID NO: 171 es la secuencia de aminoácidos de CDR1 de la cadena pesada del inhibidor de PD-L1 atezolizumab.

SEQ ID NO: 172 es la secuencia de aminoácidos de CDR2 de la cadena pesada del inhibidor de PD-L1 atezolizumab.

SEQ ID NO: 173 es la secuencia de aminoácidos de CDR3 de la cadena pesada del inhibidor de PD-L1 atezolizumab.

SEQ ID NO: 174 es la secuencia de aminoácidos de CDR1 de la cadena ligera del inhibidor de PD-L1 atezolizumab.

SEQ ID NO: 175 es la secuencia de aminoácidos de CDR2 de la cadena ligera del inhibidor de PD-L1 atezolizumab.

SEQ ID NO: 176 es la secuencia de aminoácidos de CDR3 de la cadena ligera del inhibidor de PD-L1 atezolizumab.

Descripción detallada de la invención

I. Introducción

La terapia celular adoptiva que utiliza TIL cultivadosex vivomediante el Protocolo de Expansión Rápida (REP) ha producido una terapia celular adoptiva exitosa tras la inmunosupresión del huésped en pacientes con cáncer como el melanoma. Los parámetros actuales de aceptación de la infusión se basan en lecturas de la composición de los TIL (por ejemplo, positividad para CD28, CD8 o CD4) y en los pliegues numéricos de expansión y viabilidad del producto de REP.

Los protocolos actuales de REP ofrecen poca información sobre la salud de los TIL que se infundirán al paciente. Las células T experimentan un profundo cambio metabólico en el curso de su maduración de células T sin tratamiento previo a células T efectoras (véase Chang, et al., Nat. Immunol. 2016, 17, 364). Por ejemplo, las células T sin tratamiento previo dependen de la respiración mitocondrial para producir ATP, mientras que las células T efectoras maduras y sanas, como los TIL, son altamente glucolíticas y dependen de la glucólisis aeróbica para proporcionar los sustratos bioenergéticos que necesitan para la proliferación, migración, activación y eficacia antitumoral.

Los procesos actuales de fabricación y tratamiento de TIL están limitados por la duración, el coste, los problemas de esterilidad y otros factores descritos en el presente documento, de modo que el potencial para tratar a pacientes refractarios a los anti-PD1 y, como tales, se ha visto gravemente limitado. Existe una necesidad urgente de proporcionar procesos de fabricación de TIL y terapias basadas en dichos procesos que sean apropiados para su uso en el tratamiento de pacientes para los que quedan muy pocas o ninguna opción de tratamiento viable. La presente invención satisface esta necesidad proporcionando un proceso de fabricación abreviado para su uso en la generación de TIL que puedan emplearse posteriormente en el tratamiento de pacientes con carcinoma de pulmón de células no pequeñas (NSCLC) refractarios al tratamiento anti-PD-1.

Las referencias a métodos de tratamiento en los párrafos siguientes de esta descripción deben interpretarse como referencias a los compuestos, composiciones farmacéuticas y medicamentos de la presente invención para su uso en un método de tratamiento del cuerpo humano (o animal) mediante terapia (o diagnóstico).

II. Definiciones

A menos que se definan de otro modo, todos los términos técnicos y científicos utilizados en el presente documento tienen el mismo significado que comúnmente entiende una persona experta en la materia a la que pertenece esta invención.

Los términos "coadministración", "coadministrando", "administrado en combinación con", "administrando en combinación con", "simultáneo" y "concurrente", tal como se utilizan en el presente documento, abarcan la administración de dos o más principios farmacéuticos activos (en una realización preferida de la presente invención, por ejemplo, una pluralidad de TIL) a un sujeto de modo que ambos principios farmacéuticos activos y/o sus metabolitos estén presentes en el sujeto al mismo tiempo. La coadministración incluye la administración simultánea en composiciones separadas, la administración en momentos diferentes en composiciones separadas o la administración en una composición en la que estén presentes dos o más principios farmacéuticos activos. Se prefiere la administración simultánea en composiciones separadas y la administración en una composición en la que estén presentes ambos agentes.

El término"in vivo"se refiere a un evento que tiene lugar en el cuerpo de un sujeto.

El término"in vitro"se refiere a un evento que tiene lugar fuera del cuerpo de un sujeto. Los ensayosin vitroabarcan ensayos basados en células en los que se emplean células vivas o muertas y también pueden abarcar un ensayo sin células en el que no se emplean células intactas.

El término "exvivo"se refiere a un evento que implica tratar o realizar un procedimiento en una célula, tejido y/u órgano que ha sido extraído del cuerpo de un sujeto. Apropiadamente, la célula, el tejido y/o el órgano pueden devolverse al cuerpo del sujeto en un método de cirugía o tratamiento.

El término "expansión rápida" significa un aumento en el número de TIL específicos de antígeno de al menos 3 veces (o 4, 5, 6, 7, 8 o 9 veces) en un periodo de una semana, más preferiblemente de al menos 10 veces (o 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80 o 90 veces) en un periodo de una semana, o más preferiblemente de al menos 100 veces en un periodo de una semana. En el presente documento se describen varios protocolos de expansión rápida.

Por "linfocitos infiltrantes de tumores" o "TIL" se entiende en el presente documento una población de células obtenidas originalmente como glóbulos blancos que han abandonado el torrente sanguíneo de un sujeto y han migrado a un tumor. Los TIL incluyen, entre otros, células T citotóxicas (linfocitos) CD8+, células T Th1 y Th17 CD4+, células asesinas naturales, células dendríticas y macrófagos M1. Los TIL incluyen tanto TIL primarios como secundarios. Los "TIL primarios" son los que se obtienen a partir de muestras de tejido del paciente tal y como se describe en el presente documento (a veces denominados "recién recolectados"), y los "TIL secundarios" son cualquier población de células de TIL que se haya expandido o proliferado tal y como se describe en el presente documento, incluidos, entre otros, los TIL masivos y los TIL expandidos ("TIL REP" o "TIL post-REP"). Las poblaciones de células de TIL pueden incluir TIL modificados genéticamente.

Por "población de células" (incluidos los TIL) se entiende en el presente documento un número de células que comparten rasgos comunes. En general, las poblaciones suelen oscilar entre 1 X 106 y 1 X 1010 en número, con distintas poblaciones de TIL que comprenden números diferentes. Por ejemplo, el crecimiento inicial de los TIL primarios en presencia de IL-2 da como resultado una población de TIL a granel de aproximadamente 1 * 108 células. La expansión de REP se realiza generalmente para proporcionar poblaciones de 1.5 * 109 a 1.5 * 1010 células para infusión.

Por "TIL crioconservados" se entiende en el presente documento que los TIL, ya sean primarios, a granel o expandidos (TIL REP), se tratan y almacenan en un intervalo de aproximadamente -150 °C a -60 °C. Los métodos generales de crioconservación también se describen en otras partes del presente documento, incluidos los Ejemplos. Para mayor claridad, los "TIL crioconservados" se distinguen de las muestras de tejido congeladas que pueden utilizarse como fuente de TIL primarios.

Por "TIL crioconservados descongelados" se entiende en el presente documento una población de TIL que fue crioconservada previamente y luego tratada para que volviera a temperatura ambiente o superior, incluyendo, pero sin limitarse a temperaturas de cultivo celular o temperaturas en las que los TIL pueden administrarse a un paciente.

Por lo general, los TIL pueden definirse bioquímicamente, mediante marcadores de superficie celular, o funcionalmente, por su capacidad para infiltrarse en los tumores y efectuar el tratamiento. Los TIL pueden categorizarse generalmente por expresar uno o más de los siguientes biomarcadores: CD4, CD8, TCR ap, CD27, CD28, CD56, CCR7, CD45Ra, CD95, PD-1 y CD25. Adicional y alternativamente, los TIL pueden definirse funcionalmente por su capacidad para infiltrarse en tumores sólidos tras su reintroducción en un paciente.

El término "medios de crioconservación" o "medio de crioconservación" se refiere a cualquier medio que pueda utilizarse para la crioconservación de células. Dichos medios pueden incluir medios que contengan entre un 7 % y un 10 % de DMSO. Los medios ejemplares incluyen CryoStor CS10, Hyperthermasol, así como combinaciones de los mismos. El término "CS10" se refiere a un medio de crioconservación que se obtiene de Stemcell Technologies o de Biolife Solutions. El medio CS10 puede denominarse con el nombre comercial "CryoStor® CS10". El medio CS10 es un medio libre de suero y de componentes animales que comprende DMSO.

El término "célula T de memoria central" se refiere a un subconjunto de células T que en el ser humano son CD45R0+ y expresan constitutivamente CCR7 (CCR7alto) y CD62L (CD62alto). El fenotipo de superficie de las células T de memoria central también incluye TCR, CD3, CD127 (IL-7R) e IL-15R. Los factores de transcripción de las células T de memoria central incluyen BCL-6, BCL-6B, MBD2 y BMI1. Las células T de memoria central secretan principalmente IL-2 y CD40L como moléculas efectoras tras la activación del TCR. Las células T con memoria central predominan en el compartimento CD4 de la sangre y, en el ser humano, están proporcionalmente enriquecidas en los ganglios linfáticos y las amígdalas.

El término "células T efectoras de memoria" se refiere a un subconjunto de células T humanas o de mamíferos que, al igual que las células T de memoria central, son CD45R0+, pero han perdido la expresión constitutiva de CCR7 (CCR7bajo) y son heterogéneas o bajas para la expresión de CD62L (CD62Lbajo). El fenotipo de superficie de las células T de memoria central también incluye TCR, CD3, CD127 (IL-7R) e IL-15R. Los factores de transcripción de las células T de memoria central incluyen BLIMP1. Las células T de memoria efectoras secretan rápidamente altos niveles de citocinas inflamatorias tras la estimulación antigénica, entre las que se incluyen el interferón-Y, la IL-4 y la IL-5. Las células T de memoria efectoras predominan en el compartimento CD8 de la sangre y, en el ser humano, están proporcionalmente enriquecidas en el pulmón, el hígado y el intestino. Las células T de memoria efectoras CD8+ transportan grandes cantidades de perforina.

El término "sistema cerrado" se refiere a un sistema cerrado al entorno exterior. Cualquier sistema cerrado apropiado para los métodos de cultivo celular puede emplearse con los métodos de la presente invención. Los sistemas cerrados incluyen, por ejemplo, pero no se limitan a los contenedores G cerrados. Una vez que se añade un segmento tumoral al sistema cerrado, éste no se abre al entorno exterior hasta que los TIL estén listos para ser administrados al paciente.

Los términos "fragmentar", "fragmento" y "fragmentado", tal y como se utilizan en el presente documento para describir los procesos para romper un tumor, incluyen métodos de fragmentación mecánica como el aplastamiento, el corte en rodajas, la división y la morcelación del tejido tumoral, así como cualquier otro método para desorganizar la estructura física del tejido tumoral.

Los términos "células mononucleares de sangre periférica" y "PBMC" se refieren a una célula de sangre periférica que tiene un núcleo redondo, incluyendo linfocitos (células T, células B, células NK) y monocitos. Preferiblemente, las células mononucleares de sangre periférica son células mononucleares de sangre periférica alogénicas irradiadas. Las PBMC son un tipo de célula presentadora de antígenos.

El término "anticuerpo anti-CD3" se refiere a un anticuerpo o variante del mismo, por ejemplo, un anticuerpo monoclonal e incluye anticuerpos humanos, humanizados, quiméricos o murinos que se dirigen contra el receptor CD3 del receptor de antígenos de células T maduras. Los anticuerpos anti-CD3 incluyen el OKT-3, también conocido como muromonab. Los anticuerpos anti-CD3 también incluyen el clon UHCT1, también conocido como T3 y CD3<e>. Otros anticuerpos anti-CD3 incluyen, por ejemplo, otelixizumab, teplizumab y visilizumab.

El término "OKT-3" (también denominado en el presente documento "OKT3") se refiere a un anticuerpo monoclonal o biosimilar o variante del mismo, incluidos anticuerpos humanos, humanizados, quiméricos o murinos, dirigidos contra el receptor CD3 del receptor de antígenos de células T maduras, e incluye formas disponibles comercialmente como OKT-3 (30 ng/mL, MACS GMP CD3 pure, Miltenyi Biotech, Inc., San Diego, CA, EE.UU.) y muromonab o variantes, sustituciones conservadoras de aminoácidos, glicoformas o biosimilares de los mismos. Las secuencias de aminoácidos de las cadenas pesadas y ligeras del muromonab figuran en la Tabla 1 (SEQ ID NO: 1 y la SEQ ID NO: 2). Un hibridoma capaz de producir OKT-3 está depositado en la American Type Culture Collection y se le ha asignado el número de acceso ATCC CRL 8001. Un hibridoma capaz de producir OKT-3 también está depositado en European Collection of Authenticated Cell Cultures (ECACC) y se le ha asignado el número de catálogo 86022706.

Tabla 1. Secuencias de aminoácidos del muromonab.

El término "IL-2" (también denominado en el presente documento "IL2") se refiere al factor de crecimiento de células T conocido como interleucina-2, e incluye todas las formas de IL-2, incluidas las formas humanas y de mamíferos, las sustituciones conservadoras de aminoácidos, las glicoformas, los biosimilares y sus variantes. La IL-2 se describe, por ejemplo, en Nelson, J. Immunol. 2004, 172, 3983-88 y Malek, Annu. Rev. Immunol.

2008, 26, 453-79. La secuencia de aminoácidos de la IL-2 humana recombinante adecuada para su uso en la invención se indica en la Tabla 2 (SEQ ID NO: 3). Por ejemplo, el término IL-2 abarca las formas recombinantes humanas de IL-2 como la aldesleucina (PROLEUKIN, disponible comercialmente a través de múltiples proveedores en viales de un solo uso de 22 millones de UI), así como la forma de IL-2 recombinante suministrada comercialmente por CellGenix, Inc., Portsmouth, NH, EE.UU. (CELLGRO GMP) o ProSpec-Tany TechnoGene Ltd., East Brunswick, NJ, EE.UU. (No. de cat. CYT-209-b) y otros equivalentes comerciales de otros proveedores. La aldesleucina (IL-2 humana desalanil-1, serina-125) es una forma recombinante humana no glucosilada de IL-2 con un peso molecular de aproximadamente 15 kDa. La secuencia de aminoácidos de la aldesleucina adecuada para su uso en la invención se indica en la Tabla 2 (SEQ ID NO: 4). El término IL-2 también abarca las formas pegiladas de IL-2, como se describe en el presente documento, incluido el profármaco pegilado de IL2 NKTR-214, disponible a través de Nektar Therapeutics, South San Francisco, CA, EE.UU.. El NKTR-214 y la IL-2 pegilada adecuados para su uso en la invención se describen en la Publicación de la Solicitud de Patente de los Estados Unidos No. US 2014/0328791 A1 y en la Publicación de la Solicitud de Patente internacional No. WO 2012/065086 A1. Formas alternativas de iL-2 conjugada adecuadas para su uso en la invención se describen en las Patentes de los Estados Unidos No. 4,766,106, 5,206,344, 5,089,261 y 4,902,502. Las formulaciones de IL-2 adecuadas para su uso en la invención se describen en la Patente de los Estados Unidos No. 6,706,289.

Tabla 2. Secuencias de aminoácidos de las interleucinas.

El término "IL-4" (también denominado en el presente documento "IL4") se refiere a la citocina conocida como interleucina 4, que es producida por las células T Th2 y por los eosinófilos, basófilos y mastocitos. La IL-4 regula la diferenciación de las células T colaboradoras sin tratamiento previo (células Th0) a células T Th2. Steinke y Borish, Respir. Res. 2001, 2, 66-70. Tras la activación por la IL-4, las células T Th2 producen posteriormente IL-4 adicional en un bucle de retroalimentación positiva. La IL-4 también estimula la proliferación de las células B y la expresión del MHC de clase II, e induce el cambio de clase a la expresión de IgE e IgGi de las células B. La IL-4 humana recombinante adecuada para su uso en la invención está disponible comercialmente a través de múltiples proveedores, entre ellos ProSpec-Tany TechnoGene Ltd., East Brunswick, NJ, EE. UU. (No. de cat. CYT-211) y ThermoFisher Scientific, Inc., Waltham, MA, EE.UU. (proteína recombinante IL-15 humana, No. de cat. Gibco CTP0043). La secuencia de aminoácidos de la IL-4 humana recombinante adecuada para su uso en la invención figura en la Tabla 2 (SEQ ID NO: 5).

El término "IL-7" (también denominado en el presente documento "IL7") se refiere a una citocina glicosilada derivada de tejidos conocida como interleucina 7, que puede obtenerse de células estromales y epiteliales, así como de células dendríticas. Fry y Mackall, Blood 2002, 99, 3892-904. La IL-7 puede estimular el desarrollo de las células T. La IL-7 se une al receptor de la IL-7, un heterodímero formado por el receptor alfa de la IL-7 y el receptor común de la cadena gamma, que en una serie de señales importantes para el desarrollo de las células T dentro del timo y la supervivencia dentro de la periferia. La IL-7 humana recombinante adecuada para su uso en la invención está disponible comercialmente a través de múltiples proveedores, entre ellos ProSpec-Tany TechnoGene Ltd., East Brunswick, NJ, EE.UU. (No. de cat. CYT-254) y ThermoFisher Scientific, Inc., Waltham, MA, EE.UU. (proteína recombinante IL-15 humana, No. cat. Gibco PHC0071). La secuencia de aminoácidos de la IL-7 humana recombinante adecuada para su uso en la invención figura en la Tabla 2 (SEQ ID NO: 6).

El término "IL-15" (también denominado en el presente documento "IL15") se refiere al factor de crecimiento de células T conocido como interleucina-15, e incluye todas las formas de IL-2, incluidas las formas humanas y de mamíferos, las sustituciones conservadoras de aminoácidos, las glicoformas, los biosimilares y sus variantes. La IL-15 se describe, por ejemplo, en Fehniger y Caligiuri, Blood 2001, 97, 14-32. La IL-15 comparte las subunidades p y y del receptor de señalización con la IL-2. La IL-15 humana recombinante es una cadena polipeptídica única, no glicosilada, que contiene 114 aminoácidos (y una metionina en el terminal N) con una masa molecular de 12.8 kDa. La IL-15 humana recombinante está disponible comercialmente a través de múltiples proveedores, entre ellos ProSpec-Tany TechnoGene Ltd., East Brunswick, NJ, EE.UU. (No. cat. CYT-230-b) y ThermoFisher Scientific, Inc., Waltham, MA, EE.UU. (proteína recombinante IL-15 humana, No. cat.

34-8159-82). La secuencia de aminoácidos de la IL-15 humana recombinante adecuada para su uso en la invención figura en la Tabla 2 (SEQ ID NO: 7).

El término "IL-21" (también denominado en el presente documento "IL21") se refiere a la proteína citocina pleiotrópica conocida como interleucina-21, e incluye todas las formas de IL-21, incluidas las formas humanas y de mamíferos, las sustituciones conservadoras de aminoácidos, las glicoformas, los biosimilares y sus variantes. La IL-21 se describe, por ejemplo, en Spolski y Leonard, Nat. Rev. Drug. Disc. 2014, 13, 379-95. La IL-21 es producida principalmente por las células T asesinas naturales y las células T CD4+ humanas activadas. La IL-21 humana recombinante es una cadena polipeptídica única, no glicosilada, que contiene 132 aminoácidos con una masa molecular de 15.4 kDa. La IL-21 humana recombinante está disponible comercialmente a través de múltiples proveedores, entre ellos ProSpec-Tany TechnoGene Ltd., East Brunswick, NJ, EE.UU. (No. cat. CYT-408-b) y ThermoFisher Scientific, Inc., Waltham, MA, EE.UU. (proteína recombinante IL-21 humana, No. cat. 14-8219-80). La secuencia de aminoácidos de la IL-21 humana recombinante adecuada para su uso en la invención figura en la Tabla 2 (SEQ ID NO: 8).

Cuando se indica "una cantidad eficaz antitumoral", "una cantidad eficaz inhibidora de tumores" o "cantidad terapéutica", la cantidad precisa de las composiciones de la presente invención que debe administrarse puede determinarla un médico teniendo en cuenta las diferencias individuales de edad, peso, tamaño del tumor, extensión de la infección o metástasis y estado del paciente (sujeto). En general, puede afirmarse que una composición farmacéutica que comprenda los linfocitos infiltrantes tumorales (por ejemplo, TIL secundarios o linfocitos citotóxicos modificados genéticamente) descritos en el presente documento puede administrarse a una dosis de 104 a 1011 células/kg de peso corporal (por ejemplo, 105 a 106, 105 a 1010, 105 a 1011, 106 a 1010, 106 a 1011,107 a 1011, 107 a 1010, 108 a 1011, 108 a 1010, 109 a 1011, o 109 a 1010 células/kg de peso corporal), incluidos todos los valores enteros dentro de esos intervalos. Las composiciones de linfocitos infiltrantes de tumores (incluidos, en algunos casos, los linfocitos citotóxicos modificados genéticamente) también pueden administrarse varias veces a estas dosis. Los linfocitos infiltrantes de tumores (incluidos, en algunos casos, los genéticamente modificados) pueden administrarse mediante técnicas de infusión comúnmente conocidas en inmunoterapia (véase, por ejemplo, Rosenberg et al., New Eng. J. of Med. 319: 1676, 1988). La dosis y el régimen de tratamiento óptimos para un paciente concreto pueden determinarse fácilmente por un experto en el arte de la medicina mediante el seguimiento del paciente para detectar signos de enfermedad y ajustar el tratamiento en consecuencia.

El término "microambiente", tal como se utiliza en el presente documento, puede referirse al microambiente tumoral sólido o hematológico en su conjunto o a un subconjunto individual de células dentro del microambiente. El microambiente tumoral, tal y como se utiliza en el presente documento, se refiere a una mezcla compleja de "células, factores solubles, moléculas de señalización, matrices extracelulares y señales mecánicas que promueven la transformación neoplásica, apoyan el crecimiento y la invasión tumoral, protegen al tumor de la inmunidad del huésped, fomentan la resistencia terapéutica y proporcionan nichos para que prosperen las metástasis dominantes", tal y como se describe en Swartz, et al., Cancer Res., 2012, 72, 2473. Aunque los tumores expresan antígenos que deberían ser reconocidos por las células T, la eliminación del tumor por el sistema inmunitario es poco frecuente debido a la supresión inmunitaria por el microambiente.

En una realización, la invención incluye una población terapéutica de TIL para su uso en un método de tratamiento de un cáncer con una población de TIL, en el que un paciente se trata previamente con quimioterapia no mieloablativa antes de una infusión de TIL según la invención. En algunas realizaciones, la población de TIL puede proporcionarse en la que un paciente se trata previamente con quimioterapia no mieloablativa antes de una infusión de TIL según la presente invención. En una realización, la quimioterapia no mieloablativa es ciclofosfamida 60 mg/kg/d durante 2 días (días 27 y 26 antes de la infusión de TIL) y fludarabina 25 mg/m2/d durante 5 días (días 27 a 23 antes de la infusión de TIL). En una realización, tras la quimioterapia no mieloablativa y la infusión de TIL (en el día 0) según la invención, el paciente recibe una infusión intravenosa de IL-2 por vía intravenosa a razón de 720,000 UI/kg cada 8 horas hasta tolerancia fisiológica.

Los hallazgos experimentales indican que la linfodepleción previa a la transferencia adoptiva de linfocitos T específicos de tumor desempeña un papel clave en la mejora de la eficacia del tratamiento al eliminar las células T reguladoras y los elementos competidores del sistema inmunitario ("sumideros de citocinas"). En consecuencia, algunas realizaciones de la invención utilizan una etapa de linfodepleción (a veces también denominada "acondicionamiento inmunosupresor") en el paciente antes de la introducción de las rTIL de la invención.

El término "cantidad eficaz" o "cantidad terapéuticamente eficaz" se refiere a aquella cantidad de un compuesto o combinación de compuestos descritos en el presente documento que es suficiente para efectuar la aplicación prevista, incluido, entre otros, el tratamiento de la enfermedad. Una cantidad terapéuticamente eficaz puede variar en función de la aplicación prevista(in vitrooin vivo),o del sujeto y la enfermedad que se esté tratando (por ejemplo, el peso, la edad y el sexo del sujeto), la gravedad de la enfermedad o la forma de administración. El término también se aplica a una dosis que inducirá una respuesta particular en las células diana (por ejemplo, la reducción de la adhesión plaquetaria y/o la migración celular). La dosis específica variará en función de los compuestos concretos elegidos, el régimen de dosificación a seguir, si el compuesto se administra en combinación con otros compuestos, el momento de la administración, el tejido al que se administra y el sistema físico de administración en el que se transporta el compuesto.

Los términos "tratamiento", "que trata", "tratar" y similares se refieren a la obtención de un efecto farmacológico y/o fisiológico deseado. El efecto puede ser profiláctico en términos de prevención total o parcial de una enfermedad o síntoma de la misma y/o puede ser terapéutico en términos de curación parcial o completa de una enfermedad y/o efecto adverso atribuible a la enfermedad. "Tratamiento", tal como se utiliza en el presente documento, abarca cualquier tratamiento de una enfermedad en un mamífero, en particular en un ser humano, e incluye: (a) prevenir la aparición de la enfermedad en un sujeto que puede estar predispuesto a padecerla pero al que aún no se le ha diagnosticado; (b) inhibir la enfermedad, es decir, detener su desarrollo o progresión; y (c) aliviar la enfermedad, es decir, provocar la regresión de la enfermedad y/o aliviar uno o más síntomas de la enfermedad. Por "tratamiento" también se entiende la administración de un agente con el fin de proporcionar un efecto farmacológico, incluso en ausencia de una enfermedad o afección. Por ejemplo, "tratamiento" abarca la administración de una composición que puede provocar una respuesta inmunitaria o conferir inmunidad en ausencia de una afección, por ejemplo, en el caso de una vacuna.

El término "heterólogo" cuando se utiliza con referencia a porciones de un ácido nucleico o proteína indica que el ácido nucleico o proteína comprende dos o más subsecuencias que no se encuentran en la misma relación entre sí en la naturaleza. Por ejemplo, el ácido nucleico se produce típicamente de forma recombinante, teniendo dos o más secuencias de genes no relacionados dispuestas para elaborar un nuevo ácido nucleico funcional, por ejemplo, un promotor de una fuente y una región codificante de otra fuente, o regiones codificantes de diferentes fuentes. Del mismo modo, una proteína heteróloga indica que la proteína comprende dos o más subsecuencias que no se encuentran en la misma relación entre sí en la naturaleza (por ejemplo, una proteína de fusión).

Los términos "identidad de secuencia", "porcentaje de identidad" y "porcentaje de identidad de secuencia" (o sinónimos de los mismos, por ejemplo, "99 % idéntico") en el contexto de dos o más ácidos nucleicos o polipéptidos, se refieren a dos o más secuencias o subsecuencias que son iguales o tienen un porcentaje especificado de nucleótidos o residuos de aminoácidos que son iguales, cuando se comparan y alinean (introduciendo huecos, si es necesario) para obtener la máxima correspondencia, sin considerar ninguna sustitución conservadora de aminoácidos como parte de la identidad de secuencia. El porcentaje de identidad puede medirse utilizando software o algoritmos de comparación de secuencias o mediante inspección visual. Se conocen en la técnica diversos algoritmos y programas informáticos que pueden utilizarse para obtener alineaciones de secuencias de aminoácidos o nucleótidos. Entre los programas adecuados para determinar el porcentaje de identidad de secuencias se incluye, por ejemplo, el conjunto de programas BLAST disponible en el sitio web BLAST del Centro Nacional de Información Biotecnológica del Gobierno de e E.UU. Las comparaciones entre dos secuencias pueden realizarse utilizando el algoritmo BLASTN o BLASTP. BLASTN se utiliza para comparar secuencias de ácidos nucleicos, mientras que BLASTP se utiliza para comparar secuencias de aminoácidos. ALIGN, ALIGN-2 (Genentech, South San Francisco, California) o MegAlign, disponibles a través de DNASTAR, son otros programas informáticos de acceso público que pueden utilizarse para alinear secuencias. Un experto en la materia puede determinar los parámetros adecuados para una alineación máxima mediante un software de alineación concreto. En ciertas realizaciones, se utilizan los parámetros por defecto del software de alineación.

Tal como se utiliza en el presente documento, el término "variante" abarca, pero no se limita, a los anticuerpos o proteínas de fusión que comprenden una secuencia de aminoácidos que difiere de la secuencia de aminoácidos de un anticuerpo de referencia mediante una o más sustituciones, supresiones y/o adiciones en determinadas posiciones dentro de la secuencia de aminoácidos del anticuerpo de referencia o adyacentes a ella. La variante puede comprender una o más sustituciones conservadoras en su secuencia de aminoácidos en comparación con la secuencia de aminoácidos de un anticuerpo de referencia. Las sustituciones conservadoras pueden implicar, por ejemplo, la sustitución de aminoácidos cargados o no cargados de forma similar. La variante conserva la capacidad de unirse específicamente al antígeno del anticuerpo de referencia. El término variante también incluye anticuerpos o proteínas pegilados.

Por "linfocitos infiltrantes de tumores" o "TIL" se entiende en el presente documento una población de células obtenidas originalmente como glóbulos blancos que han abandonado el torrente sanguíneo de un sujeto y han migrado a un tumor. Los TIL incluyen, entre otros, células T citotóxicas CD8+ (linfocitos), células T Th1 y Th17 CD4+, células asesinas naturales, células dendríticas y macrófagos M1. Los TIL incluyen tanto TIL primarios como secundarios. Los "TIL primarios" son los que se obtienen a partir de muestras de tejido del paciente tal y como se describe en el presente documento (a veces denominados "recién recolectados"), y los "TIL secundarios" son cualquier población de células de TIL que se haya expandido o proliferado tal y como se describe en el presente documento, incluidos, entre otros, los TIL masivos, los TIL expandidos ("TIL REP"), así como los "TIL reREP" tal y como se describe en el presente documento. Los TIL reREP pueden incluir, por ejemplo, TIL de segunda expansión o TIL de segunda expansión adicional (como, por ejemplo, los descritos en la etapa D de la Figura 8, incluidos los TIL denominados TIL reREP).

Por lo general, los TIL pueden definirse bioquímicamente, utilizando marcadores de superficie celular, o funcionalmente, por su capacidad para infiltrarse en los tumores y efectuar el tratamiento. Los TIL pueden categorizarse generalmente por expresar uno o más de los siguientes biomarcadores: CD4, CD8, TCR ap, CD27, CD28, CD56, CCR7, CD45Ra, CD95, PD-1 y CD25. Además, y de forma alternativa, los TIL pueden definirse funcionalmente por su capacidad para infiltrarse en tumores sólidos tras su reintroducción en un paciente. Los TIL pueden caracterizarse además por su potencia; por ejemplo, los TIL pueden considerarse potentes si, por ejemplo, la liberación de interferón (IFN<y>) es superior a aproximadamente 50 pg/mL, superior a aproximadamente 100 pg/mL, superior a aproximadamente 150 pg/mL o superior a aproximadamente 200 pg/mL, superior a aproximadamente 300 pg/mL, superior a aproximadamente 400 pg/mL, superior a aproximadamente 500 pg/mL, superior a aproximadamente 600 pg/mL, superior a aproximadamente 700 pg/mL, superior a aproximadamente 800 pg/mL, superior a aproximadamente 900 pg/mL, superior a aproximadamente 1000 pg/mL.

El término "desoxirribonucleótido" abarca desoxirribonucleótidos naturales y sintéticos, no modificados y modificados. Las modificaciones incluyen cambios en la fracción de azúcar, en la fracción de base y/o en los enlaces entre desoxirribonucleótidos en el oligonucleótido.

El término "ARN" define una molécula que comprende al menos un residuo de ribonucleótido. El término "ribonucleótido" define un nucleótido con un grupo hidroxilo en la posición 2' de una fracción de b-D-ribofuranosa. El término ARN incluye el ARN bicatenario, el ARN monocatenario, el ARN aislado como el ARN parcialmente purificado, el ARN esencialmente puro, el ARN sintético, el ARN producido recombinantemente, así como el ARN alterado que difiere del ARN natural por la adición, supresión, sustitución y/o alteración de uno o más nucleótidos. Los nucleótidos de las moléculas de ARN descritas en el presente documento también pueden comprender nucleótidos no estándar, como nucleótidos que no se producen de forma natural o nucleótidos o desoxinucleótidos sintetizados químicamente. Estos ARN alterados pueden denominarse análogos o análogos de ARN de origen natural.

Los términos "portador farmacéuticamente aceptable" o "excipiente farmacéuticamente aceptable" pretenden incluir todos y cada uno de los disolventes, medios de dispersión, recubrimientos, agentes antibacterianos y antifúngicos, agentes isotónicos y retardadores de la absorción e ingredientes inertes. El uso de dichos portadores o excipientes farmacéuticamente aceptables para los principios activos farmacéuticos es bien conocido en la técnica. Salvo en la medida en que cualquier portador o excipiente farmacéuticamente aceptable convencional sea incompatible con el principio activo farmacéutico, se contempla su uso en las composiciones terapéuticas de la invención. También pueden incorporarse ingredientes farmacéuticos activos adicionales, como otros fármacos, a las composiciones y métodos descritos.

Los términos "aproximadamente" y "aproximadamente" significan dentro de un intervalo estadísticamente significativo de un valor. Dicho intervalo puede estar dentro de un orden de magnitud, preferiblemente dentro del 50 %, más preferiblemente dentro del 20 %, más preferiblemente aún dentro del 10 %, e incluso más preferiblemente dentro del 5 % de un valor o intervalo dado. La variación admisible englobada por los términos "aproximadamente" o "aproximadamente" depende del sistema concreto objeto de estudio, y puede ser apreciada fácilmente por una persona con conocimientos ordinarios en la materia. Además, tal como se utilizan en el presente documento, los términos " aproximadamente " y "aproximadamente" significan que las dimensiones, tamaños, formulaciones, parámetros, formas y otras cantidades y características no son ni tienen por qué ser exactas, sino que pueden ser aproximadas y/o mayores o menores, según se desee, reflejando tolerancias, factores de conversión, redondeos, errores de medición y similares, y otros factores conocidos por los expertos en la materia. En general, una dimensión, tamaño, formulación, parámetro, forma u otra cantidad o característica es "aproximadamente" o "aproximado", ya sea que se establezca o no expresamente como tal. Cabe señalar que las realizaciones de tamaños, formas y dimensiones muy diferentes pueden emplear las disposiciones descritas.

Los términos transitorios "que comprende", "que consiste esencialmente en" y "que consiste en", cuando se utilizan en las reivindicaciones anexas, en su forma original y modificada, definen el alcance de la reivindicación con respecto a qué elementos o etapas adicionales no citados de la reivindicación, si los hubiera, quedan excluidos del alcance de la reivindicación o reivindicaciones. El término "que comprende" pretende ser inclusivo o abierto y no excluye ningún elemento, método, etapa o material adicional no citado. El término "que consiste en" excluye cualquier elemento, etapa o material distinto de los especificados en la reivindicación y, en este último caso, las impurezas ordinarias asociadas al material o materiales especificados. El término "que consiste esencialmente en" limita el alcance de una reivindicación a los elementos, etapas o material(es) especificados y a aquellos que no afecten materialmente a la(s) característica(s) básica(s) y novedosa(s) de la invención reivindicada. Todas las composiciones, métodos y kits descritos en el presente documento que encarnan la presente invención pueden, en realizaciones alternativas, definirse más específicamente mediante cualquiera de los términos transitorios "que comprende", "que consiste esencialmente en" y "que consiste en".

Los términos "anticuerpo" y su forma plural "anticuerpos" se refieren a inmunoglobulinas enteras y a cualquier fragmento de unión a antígeno ("porción de unión a antígeno") o cadenas simples de las mismas. Un "anticuerpo" se refiere además a una glicoproteína que comprende al menos dos cadenas pesadas (H) y dos cadenas ligeras (L) interconectadas por enlaces disulfuro, o una porción de unión a antígeno de las mismas. Cada cadena pesada está compuesta por una región variable de cadena pesada (abreviada en el presente documento como V<h>) y una región constante de cadena pesada. La región constante de la cadena pesada se compone de tres dominios, CH1, CH2 y CH3. Cada cadena ligera se compone de una región variable de cadena ligera (abreviada en el presente documento como V<l>) y una región constante de cadena ligera. La región constante de la cadena ligera se compone de un dominio, C<l>. Las regiones V<h>y V<l>de un anticuerpo pueden subdividirse a su vez en regiones de hipervariabilidad, que se denominan regiones determinantes de la complementariedad (CDR) o regiones hipervariables (HVR), y que pueden intercalarse con regiones que están más conservadas, denominadas regiones marco (FR). Cada V<h>y V<l>se compone de tres CDR y cuatro FR, dispuestas del terminal amino al terminal carboxi en el siguiente orden: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4. Las regiones variables de las cadenas pesadas y ligeras contienen un dominio de unión que interactúa con un epítopo o epítopos del antígeno. Las regiones constantes de los anticuerpos pueden mediar la unión de la inmunoglobulina a tejidos o factores del huésped, incluidas varias células del sistema inmunitario (por ejemplo, células efectoras) y el primer componente (Clq) del sistema clásico del complemento.

El término "antígeno" se refiere a una sustancia que induce una respuesta inmunitaria. En algunas realizaciones, un antígeno es una molécula capaz de unirse a un anticuerpo o a un TCR si se presenta mediante moléculas del complejo principal de histocompatibilidad (MHC). El término "antígeno", tal y como se utiliza en el presente documento, también engloba los epítopos de células T. Además, un antígeno puede ser reconocido por el sistema inmunitario. En algunas realizaciones, un antígeno es capaz de inducir una respuesta inmunitaria humoral o una respuesta inmunitaria celular que conduzca a la activación de linfocitos B y/o linfocitos T. En algunos casos, esto puede requerir que el antígeno contenga o esté unido a un epítopo de células Th. Un antígeno también puede tener uno o más epítopos (por ejemplo, epítopos B y T). En algunas realizaciones, un antígeno reaccionará preferiblemente, por lo general de forma muy específica y selectiva, con su anticuerpo o TCR correspondiente y no con la multitud de otros anticuerpos o t Cr que pueden ser inducidos por otros antígenos.

Los términos "anticuerpo monoclonal", "mAb", "composición de anticuerpo monoclonal" o sus formas plurales se refieren a una preparación de moléculas de anticuerpo de composición molecular única. Una composición de anticuerpos monoclonales muestra una única especificidad de unión y afinidad por un epítopo concreto. Los anticuerpos monoclonales específicos para determinados receptores pueden fabricarse utilizando los conocimientos y la destreza en el arte de inyectar a los sujetos de prueba un antígeno adecuado y a continuación aislar hibridomas que expresen anticuerpos que tengan la secuencia o las características funcionales deseadas. El ADN que codifica los anticuerpos monoclonales se aísla y secuencia fácilmente mediante procedimientos convencionales (por ejemplo, utilizando sondas de oligonucleótidos capaces de unirse específicamente a los genes que codifican las cadenas pesadas y ligeras de los anticuerpos monoclonales). Las células de hibridoma constituyen una fuente preferente de dicho ADN. Una vez aislado, el ADN puede colocarse en vectores de expresión, que luego se transfectan en células huésped como célulasE. coli,células COS de simio, células de ovario de hámster chino (CHO) o células de mieloma que no producen proteínas inmunoglobulinas de otro modo, para obtener la síntesis de anticuerpos monoclonales en las células huésped recombinantes. La producción recombinante de anticuerpos se describirá con más detalle a continuación.

Los términos "porción de unión a antígeno" o "fragmento de unión a antígeno" de un anticuerpo (o simplemente "porción de anticuerpo" o "fragmento"), tal como se utilizan en el presente documento, se refieren a uno o más fragmentos de un anticuerpo que conservan la capacidad de unirse específicamente a un antígeno. Se ha demostrado que la función de unión al antígeno de un anticuerpo puede ser realizada por fragmentos de un anticuerpo de longitud completa. Entre los ejemplos de fragmentos de unión englobados dentro del término "porción de unión a antígeno" de un anticuerpo se incluyen (i) un fragmento Fab, un fragmento monovalente formado por los dominios de V<l>, V<h>, C<l>y CH1; (ii) un fragmento F(ab')2, un fragmento bivalente formado por dos fragmentos Fab unidos por un puente disulfuro en la región bisagra; (iii) un fragmento Fd formado por los dominios de V<h>y CH1; (iv) un fragmento Fv formado por los dominios de V<l>y V<h>de un solo brazo de un anticuerpo, (v) un fragmento de anticuerpo de dominio (dAb) (Ward, et al., Nature, 1989, 341, 544-546), que puede consistir en un dominio V<h>o V<l>; y (vi) una región aislada determinante de la complementariedad (CDR). Además, aunque los dos dominios del fragmento Fv, V<l>y V<h>, están codificados por genes separados, pueden unirse, utilizando métodos recombinantes, mediante un enlazador sintético que permite fabricarlos como una única cadena proteica en la que las regiones V<l>y V<h>se emparejan para formar moléculas monovalentes conocidas como Fv de cadena sencilla (scFv); véase, por ejemplo, Bird, et al., Science 1988, 242, 423-426; y Huston, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1988, 85, 5879-5883). Dichos anticuerpos scFv también pretenden englobarse dentro de los términos "porción de unión a antígeno" o "fragmento de unión a antígeno" de un anticuerpo. Estos fragmentos de anticuerpo se obtienen mediante técnicas convencionales conocidas por los expertos en la materia, y los fragmentos se analizan para determinar su utilidad del mismo modo que los anticuerpos intactos.

El término "anticuerpo humano", tal y como se utiliza en el presente documento, pretende incluir anticuerpos que tengan regiones variables en las que tanto el marco como las regiones CDR se deriven de secuencias de inmunoglobulina de línea germinal humana. Además, si el anticuerpo contiene una región constante, la región constante también se deriva de secuencias de inmunoglobulina de la línea germinal humana. Los anticuerpos humanos de la invención pueden incluir residuos de aminoácidos no codificados por secuencias de inmunoglobulina de línea germinal humana (por ejemplo, mutaciones introducidas por mutagénesis aleatoria o específica de sitioin vitroo por mutación somáticain vivo).El término "anticuerpo humano", tal y como se utiliza en el presente documento, no pretende incluir los anticuerpos en los que las secuencias de c Dr derivadas de la línea germinal de otra especie de mamífero, como el ratón, se han injertado en secuencias marco humanas.

El término "anticuerpo monoclonal humano" se refiere a los anticuerpos que muestran una única especificidad de unión y que tienen regiones variables en las que tanto las regiones marco como CDR se derivan de secuencias de inmunoglobulina de línea germinal humana. En una realización, los anticuerpos monoclonales humanos son producidos por un hibridoma que incluye una célula B obtenida de un animal no humano transgénico, por ejemplo, un ratón transgénico, que tiene un genoma que comprende un transgén de cadena pesada humana y un transgén de cadena ligera fusionado a una célula inmortalizada.

El término "anticuerpo humano recombinante", tal y como se utiliza en el presente documento, incluye todos los anticuerpos humanos que se preparan, expresan, crean o aíslan por medios recombinantes, como (a) anticuerpos aislados de un animal (como un ratón) transgénico o transcromosómico para genes de inmunoglobulina humana o un hibridoma preparado a partir del mismo (descrito más adelante), (b) anticuerpos aislados de una célula huésped transformada para expresar el anticuerpo humano, por ejemplo,apartir de un transfectoma, (c) anticuerpos aislados a partir de una biblioteca recombinante y combinatoria de anticuerpos humanos, y (d) anticuerpos preparados, expresados, creados o aislados por cualquier otro medio que implique el empalme de secuencias de genes de inmunoglobulina humana con otras secuencias de ADN. Tales anticuerpos humanos recombinantes tienen regiones variables en las que las regiones marco y CDR se derivan de secuencias de inmunoglobulina de la línea germinal humana. En ciertas realizaciones, sin embargo, dichos anticuerpos humanos recombinantes pueden someterse a mutagénesisin vitro(o, cuando se utiliza un animal transgénico para secuencias de Ig humanas, a mutagénesis somáticain vivo)y, por lo tanto, las secuencias de aminoácidos de las regiones V<h>y V<l>de los anticuerpos recombinantes son secuencias que, aunque derivadas de secuencias V<h>y V<l>de la línea germinal humana y relacionadas con ellas, pueden no existir de forma natural dentro del repertorio de la línea germinal de anticuerpos humanosin vivo.

Tal y como se utiliza en el presente documento, "isotipo" se refiere a la clase de anticuerpo (por ejemplo, IgM o IgG1) que está codificada por los genes de la región constante de la cadena pesada.

Las frases "un anticuerpo que reconoce un antígeno" y "un anticuerpo específico para un antígeno" se utilizan en el presente documento indistintamente con el término "un anticuerpo que se une específicamente a un antígeno".

El término "derivados de anticuerpos humanos" se refiere a cualquier forma modificada del anticuerpo humano, incluido un conjugado del anticuerpo y otro ingrediente farmacéutico activo o anticuerpo. Los términos "conjugado", "conjugado anticuerpo-fármaco", "ADC" o "inmunoconjugado" se refieren a un anticuerpo, o un fragmento del mismo, conjugado con otra fracción terapéutica, que puede conjugarse con los anticuerpos descritos en el presente documento mediante métodos disponibles en la técnica.

Los términos "anticuerpo humanizado", "anticuerpos humanizados" y "humanizados" se refieren a anticuerpos en los que secuencias de CDR derivadas de la línea germinal de otra especie de mamífero, como el ratón, se han injertado en secuencias marco humanas. Pueden realizarse modificaciones adicionales de la región marco dentro de las secuencias marco humanas. Las formas humanizadas de anticuerpos no humanos (por ejemplo, murinos) son anticuerpos quiméricos que contienen una secuencia mínima derivada de la inmunoglobulina no humana. En su mayor parte, los anticuerpos humanizados son inmunoglobulinas humanas (anticuerpo receptor) en las que los residuos de una región hipervariable del receptor se sustituyen por residuos de una región 15 hipervariable de una especie no humana (anticuerpo donante) como ratón, rata, conejo o primate no humano que tenga la especificidad, afinidad y capacidad deseadas. En algunos casos, los residuos de la región marco Fv (FR) de la inmunoglobulina humana se sustituyen por los residuos no humanos correspondientes. Además, los anticuerpos humanizados pueden incluir residuos que no se encuentran en el anticuerpo receptor ni en el anticuerpo donante. Estas modificaciones se realizan para refinar aún más el rendimiento del anticuerpo. En general, el anticuerpo humanizado comprenderá sustancialmente la totalidad de al menos uno, y típicamente dos, dominios variables, en los que todos o sustancialmente todos los bucles hipervariables corresponden a los de una inmunoglobulina no humana y todas o sustancialmente todas las regiones FR son las de una secuencia de inmunoglobulina humana. Opcionalmente, el anticuerpo humanizado también comprenderá al menos una porción de una región constante de inmunoglobulina (Fc), típicamente la de una inmunoglobulina humana. Para más detalles, véase Jones, et al., Nature 1986, 321, 522-525; Riechmann, et al., Nature 1988, 332, 323-329; y Presta, Curr. Op. Struct. Biol. 1992, 2, 593-596. Los anticuerpos descritos en el presente documento también pueden modificarse para emplear cualquier variante Fc que se sepa que imparte una mejora (por ejemplo, una reducción) en la función efectora y/o la unión a FcR. Las variantes Fc pueden incluir, por ejemplo, cualquiera de las sustituciones de aminoácidos divulgadas en las Publicaciones de Solicitud de Patente Internacional Nos. WO 1988/07089 A1, WO 1996/14339 A1, WO 1998/05787 A1, WO 1998/23289 A1, WO 1999/51642 A1, WO 99/58572 A1, WO 2000/09560 A2, WO 2000/32767 A1, WO 2000/42072 A2, WO 2002/44215 A2, WO 2002/060919 A2, WO 2003/074569 A2, WO 2004/016750 A2, WO 2004/029207 A2, WO 2004/035752 A2, WO 2004/063351 A2, WO 2004/074455 A2, WO 2004/099249 A2, WO 2005/040217 A2, WO 2005/070963 A1, WO 2005/077981 A2, WO 2005/092925 A2, WO 2005/123780 A2, WO 2006/019447 A1, WO 2006/047350 A2, y WO 2006/085967 A2; y las Patentes de los Estados Unidos Nos.

5,648,260; 5,739,277; 5,834,250; 5,869,046; 6,096,871; 6,121,022; 6,194,551; 6,242,195; 6,277,375; 6,528,624; 6,538,124; 6,737,056; 6,821,505; 6,998,253; y 7,083,784.

El término "anticuerpo quimérico" se refiere a los anticuerpos en los que las secuencias de la región variable se derivan de una especie y las secuencias de la región constante se derivan de otra especie, como un anticuerpo en el que las secuencias de la región variable se derivan de un anticuerpo de ratón y las secuencias de la región constante se derivan de un anticuerpo humano.

Un "diacuerpo" es un pequeño fragmento de anticuerpo con dos sitios de unión al antígeno. El fragmento comprende un dominio variable de cadena pesada (V<h>) conectado a un dominio variable de cadena ligera (V<l>) en la misma cadena polipeptídica (V<h>-V<l>o V<l>-V<h>). Al utilizar un enlazador demasiado corto para permitir el emparejamiento entre los dos dominios de la misma cadena, los dominios se ven obligados a emparejarse con los dominios complementarios de otra cadena y crear dos sitios de unión a antígenos. Los diacuerpos se describen con más detalle en, por ejemplo, la Patente Europea No. EP 404.097, la Publicación de Patente Internacional No. WO 93/11161; y Bolliger, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1993, 90, 6444-6448.

El término "glicosilación" se refiere a un derivado modificado de un anticuerpo. Un anticuerpo aglicosilado carece de glicosilación. La glicosilación puede alterarse para, por ejemplo, aumentar la afinidad del anticuerpo por el antígeno. Tales modificaciones de carbohidratos pueden lograrse, por ejemplo, alterando uno o más sitios de glicosilación dentro de la secuencia del anticuerpo. Por ejemplo, pueden realizarse una o más sustituciones de aminoácidos que den lugar a la eliminación de uno o más sitios de glicosilación del marco de la región variable para eliminar así la glicosilación en ese sitio. La aglicosilación puede aumentar la afinidad del anticuerpo por el antígeno, como se describe en la Patente de los Estados Unidos No. 5,714,350 y 6,350,861. Adicional o alternativamente, se puede fabricar un anticuerpo que tenga un tipo alterado de glicosilación, como un anticuerpo hipofucosilado que tenga cantidades reducidas de residuos de fucosilo o un anticuerpo que tenga estructuras GlcNac bisectantes aumentadas. Se ha demostrado que tales patrones de glicosilación alterados aumentan la capacidad de los anticuerpos. Tales modificaciones de los carbohidratos pueden lograrse, por ejemplo, expresando el anticuerpo en una célula huésped con una maquinaria de glicosilación alterada. Las células con maquinaria de glicosilación alterada se han descrito en la técnica y pueden utilizarse como células huésped en las que expresar anticuerpos recombinantes de la invención para así producir un anticuerpo con glicosilación alterada. Por ejemplo, las líneas celulares Ms704, Ms705 y Ms709 carecen del gen de la fucosiltransferasa, FUT8 (alfa (1,6) fucosiltransferasa), de manera que los anticuerpos expresados en las líneas celulares Ms704, Ms705 y Ms709 carecen de fucosa en sus carbohidratos. Las líneas celulares Ms704, Ms705 y Ms709 FUT8-/- se crearon mediante la interrupción dirigida del gen FUT8 en células CHO/DG44 utilizando dos vectores de sustitución (véase, por ejemplo, la Publicación de Patente de los Estados Unidos No.

2004/0110704 o Yamane-Ohnuki, et al., Biotechnol. Bioeng., 2004, 87, 614-622). Como otro ejemplo, la Patente Europea No. EP 1,176,195 describe una línea celular con un gen FUT8 funcionalmente alterado, que codifica una fucosil transferasa, de tal forma que los anticuerpos expresados en dicha línea celular presentan hipofucosilación al reducir o eliminar la enzima relacionada con el enlace alfa 1,6, y también describe líneas celulares que tienen una baja actividad enzimática para añadir fucosa a la N-acetilglucosamina que se une a la región Fc del anticuerpo o no tienen la actividad enzimática, por ejemplo la línea celular de mieloma de rata YB2/0 (ATCC CRL 1662). La Publicación de Patente Internacional WO 03/035835 describe una línea celular CHO variante, las células Lec 13, con una capacidad reducida para unir fucosa a carbohidratos enlazados con Asn(297), lo que también da lugar a la hipofucosilación de anticuerpos expresados en esa célula huésped (véase también Shields, et al., J. Biol. Chem. 2002, 277, 26733-26740. La Publicación de Patente Internacional WO 99/54342 describe líneas celulares modificadas para expresar glicosiltransferasas modificadoras de glicoproteínas (por ejemplo, beta(1,4)-N-acetilglucosaminiltransferasa III (GnTIII)) de forma que los anticuerpos expresados en las líneas celulares modificadas presenten estructuras GlcNac bisecantes aumentadas, lo que resulta en una mayor actividad de ADCC de los anticuerpos (véase también Umana, et al., Nat. Biotech. 1999, 17, 176-180). Alternativamente, los residuos de fucosa del anticuerpo pueden escindirse utilizando una enzima fucosidasa. Por ejemplo, la fucosidasa alfa-L-fucosidasa elimina los residuos de fucosilo de los anticuerpos como se describe en Tarentino, et al., Biochem. 1975, 14, 5516-5523.

La "PEGilación" se refiere a un anticuerpo modificado, o un fragmento del mismo, que típicamente se hace reaccionar con polietilenglicol (PEG), como un éster reactivo o un derivado aldehído del p Eg , en condiciones en las que uno o más grupos de PEG quedan unidos al anticuerpo o fragmento de anticuerpo. La PEGilación puede, por ejemplo, aumentar la semivida biológica (por ejemplo, en suero) del anticuerpo. Preferiblemente, la PEGilación se lleva a cabo mediante una reacción de acilación o una reacción de alquilación con una molécula reactiva de PEG (o un polímero reactivo hidrosoluble análogo). Tal como se utiliza en el presente documento, el término "polietilenglicol" pretende abarcar cualquiera de las formas de PEG que se han utilizado para derivatizar otras proteínas, como mono alcoxi (C1-C10) o ariloxi-polietilenglicol o polietilenglicol-maleimida. El anticuerpo a pegilar puede ser un anticuerpo aglicosilado. Los métodos de PEGilación son conocidos en la técnica y pueden aplicarse a los anticuerpos de la invención, como se describe, por ejemplo, en las Patentes Europeas Nos. EP 0154316 y EP 0401384 y la Patente de los Estados Unidos No. 5,824,778.

El término "biosimilar" se refiere a un producto biológico, incluido un anticuerpo monoclonal o una proteína, que es altamente similar a un producto biológico de referencia autorizado en los EE. UU., a pesar de pequeñas diferencias en los componentes clínicamente inactivos, y para el que no existen diferencias clínicamente significativas entre el producto biológico y el producto de referencia en términos de seguridad, pureza y potencia del producto. Además, un producto biológico medicinal similar o "biosimilar" es un producto biológico medicinal que es similar a otro producto biológico medicinal cuyo uso ya ha sido autorizado por la Agencia Europea de Medicamentos. El término "biosimilar" también es utilizado como sinónimo por otras agencias reguladoras nacionales y regionales. Los productos biológicos o medicamentos biológicos son medicamentos fabricados o derivados de una fuente biológica, como una bacteria o una levadura. Pueden consistir en moléculas relativamente pequeñas, como la insulina humana o la eritropoyetina, o moléculas complejas, como los anticuerpos monoclonales. Por ejemplo, si la proteína IL-2 de referencia es la aldesleucina (PROLEUKIN), una proteína aprobada por las autoridades reguladoras de medicamentos con referencia a la aldesleucina es un "biosimilar de" la aldesleucina o es un "biosimilar del mismo" de la aldesleucina. En Europa, un producto biológico medicinal similar o "biosimilar" es un producto biológico medicinal similar a otro producto biológico medicinal cuyo uso ya ha sido autorizado por la Agencia Europea de Medicamentos (EMA). La base jurídica pertinente para las solicitudes de biológicos similares en Europa es el artículo 6 del Reglamento (EC) No.

726/2004 y el artículo 10(4) de la Directiva 2001/83/EC, en su versión modificada y, por lo tanto, en Europa, el biosimilar puede ser autorizado, aprobado para su autorización u objeto de una solicitud de autorización en virtud del artículo 6 del Reglamento (EC) No. 726/2004 y el artículo 10(4) de la Directiva 2001/83/EC. El producto biológico medicinal original ya autorizado puede denominarse "producto medicinal de referencia" en Europa. Algunos de los requisitos para que un producto sea considerado biosimilar se describen en la Directriz del CHMP sobre Productos Medicinales Biológicos Similares. Además, la EMA proporciona directrices específicas para cada producto, incluidas las relativas a los biosimilares de anticuerpos monoclonales, y las publica en su página web. Un biosimilar, tal y como se describe en el presente documento, puede ser similar al producto medicinal de referencia por sus características de calidad, actividad biológica, mecanismo de acción, perfiles de seguridad y/o eficacia. Además, el biosimilar puede utilizarse o estar destinado a utilizarse para tratar las mismas afecciones que el producto medicinal de referencia. De este modo, puede considerarse que un biosimilar, tal y como se describe en el presente documento, tiene características de calidad similares o muy similares a las de un producto medicinal de referencia. Alternativamente, o, además, puede considerarse que un biosimilar como el descrito en el presente documento tiene una actividad biológica similar o muy similar a la de un producto medicinal de referencia. Como alternativa, o, además, puede considerarse que un biosimilar descrito en el presente documento tiene un perfil de seguridad similar o muy similar al de un producto medicinal de referencia. Como alternativa, o, además, puede considerarse que un biosimilar según se describe en el presente documento tiene una eficacia similar o muy similar a la de un producto medicinal de referencia. Como se describe en el presente documento, un biosimilar en Europa se compara con un producto medicinal de referencia que ha sido autorizado por la EMA. Sin embargo, en algunos casos, el biosimilar puede compararse con un producto medicinal biológico que haya sido autorizado fuera del Espacio Económico Europeo (un "comparador" autorizado fuera del EEE) en determinados estudios. Dichos estudios incluyen, por ejemplo, ciertos estudios clínicos ein vivono clínicos. Tal y como se utiliza en el presente documento, el término "biosimilar" también se refiere a un producto biológico medicinal que ha sido o puede ser comparado con un comparador autorizado fuera del e Ee . Algunos biosimilares son proteínas como anticuerpos, fragmentos de anticuerpos (por ejemplo, porciones de unión a antígenos) y proteínas de fusión. Un biosimilar proteínico puede tener una secuencia de aminoácidos que presente modificaciones menores en la estructura de los aminoácidos (incluyendo, por ejemplo, supresiones, adiciones y/o sustituciones de aminoácidos) que no afecten significativamente a la función del polipéptido. El biosimilar puede comprender una secuencia de aminoácidos que tenga una identidad de secuencia del 97 % o superior con la secuencia de aminoácidos de su producto medicinal de referencia, por ejemplo, 97 %, 98 %, 99 % o 100 %. El biosimilar puede comprender una o más modificaciones postraduccionales, por ejemplo, aunque sin limitarse a ellas, glicosilación, oxidación, desamidación y/o truncamiento que sean diferentes a las modificaciones postraduccionales del producto medicinal de referencia, siempre que las diferencias no den lugar a un cambio en la seguridad y/o eficacia del producto medicinal. El biosimilar puede tener un patrón de glicosilación idéntico o diferente al del producto medicinal de referencia. En particular, aunque no exclusivamente, el biosimilar puede tener un patrón de glicosilación diferente si las diferencias abordan o pretenden abordar problemas de seguridad asociados al producto medicinal de referencia. Además, el biosimilar puede desviarse del producto medicinal de referencia en, por ejemplo, su concentración, forma farmacéutica, formulación, excipientes y/o presentación, siempre que la seguridad y eficacia del producto medicinal no se vean comprometidas. El biosimilar puede presentar diferencias en, por ejemplo, los perfiles farmacocinético (PK) y/o farmacodinámico (PD) en comparación con el producto medicinal de referencia, pero aun así se considera suficientemente similar al producto medicinal de referencia como para ser autorizado o considerado apto para su autorización. En determinadas circunstancias, el biosimilar presenta características de unión diferentes en comparación con el producto medicinal de referencia, en las que una Autoridad Reguladora como la EMA considera que las características de unión diferentes no suponen un obstáculo para su autorización como producto biológico similar. El término "biosimilar" también es utilizado como sinónimo por otras agencias reguladoras nacionales y regionales.

III. Procesos de Fabricación de TIL

En la Figura 2 se representa un proceso de TIL ejemplar conocido como proceso 2A que contiene algunas de estas características, y algunas de las ventajas de esta realización de la presente invención sobre el proceso 1C se describen en las Figuras F y G. En la Figura 1 se muestra una realización del proceso 2A.

Como se expone en el presente documento, la presente invención puede incluir una etapa relativa a la reestimulación de los TIL crioconservados para aumentar su actividad metabólica y, por lo tanto, su salud relativa antes del trasplante a un paciente, y métodos para comprobar dicha salud metabólica. Como se describe en general en el presente documento, los TIL se toman generalmente de una muestra del paciente y se manipulan para aumentar su número antes del trasplante a un paciente. En algunas realizaciones, los TIL pueden manipularse genéticamente de forma opcional, como se expone a continuación.

En algunas realizaciones, los TIL pueden crioconservarse. Una vez descongelados, también pueden reestimularse para aumentar su metabolismo antes de la infusión en un paciente.

En los métodos divulgados en el presente documento, pero no reivindicados, la primera expansión (incluidos los procesos denominados preREP, así como los procesos mostrados en la Figura 1 como la Etapa A) se acorta de 3 a 14 días y la segunda expansión (incluidos los procesos denominados REP, así como los procesos mostrados en la Figura 1 como la Etapa B) se acorta de 7 a 14 días, como se detalla a continuación, así como en los ejemplos y las figuras. En algunas realizaciones, la primera expansión (por ejemplo, una expansión descrita como Etapa B en la Figura 1) se acorta a 11 días y la segunda expansión (por ejemplo, una expansión descrita como la descrita en la Etapa D en la Figura 1) se acorta a 11 días. En algunas realizaciones, la combinación de la primera expansión y la segunda expansión (por ejemplo, las expansiones descritas como Etapa B y Etapa D en la Figura 1) se acorta a 22 días, como se explica en detalle a continuación y en los ejemplos y figuras.

Las designaciones de las "Etapas" A, B, C, etc., que figuran a continuación se refieren a la Figura 1 y a determinadas realizaciones descritas en el presente documento. El orden de las Etapas a continuación y en la Figura 1 es ejemplar y cualquier combinación u orden de etapas, así como etapas adicionales, repetición de etapas y/u omisión de etapas está contemplada por la presente solicitud y los métodos divulgados en el presente documento.

A. Etapa A: Obtención de la muestra tumoral del paciente

En general, los TIL se obtienen inicialmente a partir de una muestra tumoral de un paciente ("TIL primarios") y luego se expanden en una población mayor para su posterior manipulación como se describe en el presente documento, opcionalmente se crioconservan, se vuelven a estimular como se describe en el presente documento y opcionalmente se evalúan para determinar el fenotipo y los parámetros metabólicos como indicación de la salud de TIL.

Una muestra del tumor del paciente puede obtenerse utilizando métodos conocidos en la técnica, generalmente mediante extirpación quirúrgica, biopsia con aguja, la biopsia con aguja gruesa, biopsia pequeña u otros medios para obtener una muestra que contenga una mezcla de células tumorales y células de TIL. En algunas realizaciones, se utiliza un muestreo multilesional. En algunas realizaciones, la extirpación quirúrgica, la biopsia con aguja, la biopsia con aguja gruesa, la biopsia pequeña u otros medios para obtener una muestra que contenga una mezcla de tumor y células de TIL incluyen el muestreo multilesional (es decir, la obtención de muestras de uno o más focos tumorales y/o localizaciones en el paciente, así como de uno o más tumores en la misma localización o muy próximos). En general, la muestra tumoral puede proceder de cualquier tumor sólido, incluidos tumores primarios, tumores invasivos o tumores metastásicos. La muestra tumoral también puede ser de un tumor líquido, como un tumor obtenido de una neoplasia hematológica. El tumor sólido puede ser de tejido pulmonar. En algunas realizaciones, los TIL útiles se obtienen a partir de un carcinoma de pulmón de células no pequeñas (NSCLC).

Una vez obtenida, la muestra tumoral se fragmenta generalmente mediante disección afilada en pequeños fragmentos de entre 1 y aproximadamente 8 mm3, siendo especialmente útiles los de aproximadamente 2-3 mm3 Los TIL se cultivan a partir de estos fragmentos utilizando digestos tumorales enzimáticas. Dichas digestos tumorales pueden producirse por incubación en medios enzimáticos (por ejemplo, tampón Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640, glutamato 2 mM, 10 mcg/mL de gentamicina, 30 unidades/mL de DNasa y 1.0 mg/mL de colagenasa) seguida de disociación mecánica (por ejemplo, utilizando un disociador tisular). Los digeridos tumorales pueden producirse colocando el tumor en un medio enzimático y disociando mecánicamente el tumor durante aproximadamente 1 minuto, seguido de incubación durante 30 minutos a 37 °C en 5 % de CO2, seguido de ciclos repetidos de disociación mecánica e incubación en las condiciones anteriores hasta que sólo queden pequeños trozos de tejido. Al final de este proceso, si la suspensión celular contiene un gran número de glóbulos rojos o células muertas, puede realizarse una separación en gradiente de densidad utilizando polisacárido hidrófilo ramificado FICOLL para eliminar estas células. Pueden utilizarse métodos alternativos conocidos en la técnica, como los descritos en la Publicación de la Solicitud de Patente de los Estados Unidos No. 2012/0244133 A1. Cualquiera de los métodos anteriores puede utilizarse en cualquiera de los métodos descritos en el presente documento de expansión de TIL o métodos de tratamiento de un cáncer.

En general, la suspensión celular recogida se denomina "población celular primaria" o población celular "recién recogida".

En algunas realizaciones, la fragmentación incluye la fragmentación física, incluyendo, por ejemplo, la disección, así como la digestión. En algunas realizaciones, la fragmentación es fragmentación física. En algunas realizaciones, la fragmentación es disección. En algunas realizaciones, la fragmentación es por digestión. En algunas realizaciones, los TIL pueden cultivarse inicialmente a partir de digestos enzimáticos tumorales y fragmentos de tumores obtenidos de pacientes. En una realización, los TIL pueden cultivarse inicialmente a partir de digestos tumorales enzimáticos y fragmentos tumorales obtenidos de pacientes.

En algunas realizaciones, cuando el tumor es un tumor sólido, el tumor se somete a una fragmentación física tras la obtención de la muestra tumoral en, por ejemplo, la etapa A (como se indica en la Figura 1). En algunas realizaciones, la fragmentación se produce antes de la crioconservación. En algunas realizaciones, la fragmentación se produce después de la crioconservación. En algunas realizaciones, la fragmentación se produce después de obtener el tumor y en ausencia de crioconservación. En algunas realizaciones, el tumor se fragmenta y se colocan 10, 20, 30, 40 o más fragmentos o piezas en cada recipiente para la primera expansión. En algunas realizaciones, el tumor está fragmentado y se colocan 30 o 40 fragmentos o piezas en cada contenedor para la primera expansión. En algunas realizaciones, el tumor está fragmentado y se colocan 40 fragmentos o piezas en cada contenedor para la primera expansión. En algunas realizaciones, los fragmentos múltiples comprenden de aproximadamente 4 a aproximadamente 50 fragmentos, en los que cada fragmento tiene un volumen de aproximadamente 27 mm3. En algunas realizaciones, los fragmentos múltiples comprenden de aproximadamente 30 a aproximadamente 60 fragmentos con un volumen total de aproximadamente 1300 mm3 a aproximadamente 1500 mm3. En algunas realizaciones, los fragmentos múltiples comprenden aproximadamente 50 fragmentos con un volumen total de aproximadamente 1350 mm3. En algunas realizaciones, los fragmentos múltiples comprenden aproximadamente 50 fragmentos con una masa total de aproximadamente 1 gramo y 1.5 gramos. En algunas realizaciones, los fragmentos múltiples comprenden aproximadamente 4 fragmentos.

En algunas realizaciones, los TIL se obtienen a partir de fragmentos tumorales. En algunas realizaciones, el fragmento tumoral se obtiene mediante disección cortante. En algunas realizaciones, el fragmento tumoral mide entre 1 mm3 y 10 mm3. En algunas realizaciones, el fragmento tumoral mide entre 1 mm3 y 8 mm3. En algunas realizaciones, el fragmento tumoral es de aproximadamente 1 mm3. En algunas realizaciones, el fragmento tumoral es de aproximadamente 2 mm3. En algunas realizaciones, el fragmento tumoral es de aproximadamente 3 mm3. En algunas realizaciones, el fragmento tumoral es de aproximadamente 4 mm3. En algunas realizaciones, el fragmento tumoral es de aproximadamente 5 mm3. En algunas realizaciones, el fragmento tumoral es de aproximadamente 6 mm3. En algunas realizaciones, el fragmento tumoral es de aproximadamente 7 mm3. En algunas realizaciones, el fragmento tumoral es de aproximadamente 8 mm3. En algunas realizaciones, el fragmento tumoral es de aproximadamente 9 mm3. En algunas realizaciones, el fragmento tumoral es de aproximadamente 10 mm3. En algunas realizaciones, los tumores miden 1-4 mm * 1 4 mm * 1-4 mm. En algunas realizaciones, los tumores son de 1 mm * 1 mm * 1 mm. En algunas realizaciones, los tumores son de 2 mm * 2 mm * 2 mm. En algunas realizaciones, los tumores son de 3 mm * 3 mm * 3 mm. En algunas realizaciones, los tumores son de 4 mm * 4 mm * 4 mm.

En algunas realizaciones, los tumores se extirpan con el fin de minimizar la cantidad de tejido hemorrágico, necrótico y/o graso en cada pieza. En algunas realizaciones, los tumores se extirpan con el fin de minimizar la cantidad de tejido hemorrágico en cada pieza. En algunas realizaciones, los tumores se extirpan para minimizar la cantidad de tejido necrótico en cada pieza. En algunas realizaciones, los tumores se extirpan con el fin de minimizar la cantidad de tejido adiposo en cada pieza.

En algunas realizaciones, la fragmentación del tumor se lleva a cabo para mantener la estructura interna del tumor. En algunas realizaciones, la fragmentación del tumor se lleva a cabo sin realizar previamente un movimiento de aserrado con un bisturí. En algunas realizaciones, los TIL se obtienen a partir de digestos tumorales. En algunas realizaciones, los digestos tumorales se generaron por incubación en medios enzimáticos, por ejemplo, pero no limitados a RPMI 1640, GlutaMAX2 mM, 10 mg/mL de gentamicina, 30 U/mL de DNasa y 1.0 mg/mL de colagenasa, seguido de disociación mecánica (GentleMACS, Miltenyi Biotec, Auburn, CA). Tras colocar el tumor en el medio enzimático, puede disociarse mecánicamente durante aproximadamente 1 minuto. A continuación, se puede incubar la solución durante 30 minutos a 37 °C en un 5 % de CO2 y después se vuelve a disociar mecánicamente durante aproximadamente 1 minuto. Tras incubarse de nuevo durante 30 minutos a 37 °C en 5 % de CO2, el tumor puede romperse mecánicamente una tercera vez durante aproximadamente 1 minuto. En algunas realizaciones, después del tercer rompimiento mecánico, si había trozos grandes de tejido, se aplicaron 1 o 2 disociaciones mecánicas adicionales a la muestra, con o sin 30 minutos adicionales de incubación a 37 °C en 5 % de CO2. En algunas realizaciones, al final de la incubación final, si la suspensión celular contenía un gran número de glóbulos rojos o células muertas, se puede realizar una separación en gradiente de densidad utilizando Ficoll para eliminar estas células.

En algunas realizaciones, la suspensión celular recogida antes de la primera etapa de expansión se denomina "población celular primaria" o población celular "recién recogida".

En algunas realizaciones, las células pueden congelarse opcionalmente tras la recogida de la muestra y almacenarse congeladas antes de entrar en la expansión descrita en la etapa B, que se describe con más detalle a continuación, así como se ejemplifica en la Figura 1.

B. Etapa B: Primera expansión

En algunas realizaciones, los presentes métodos permiten obtener TIL jóvenes, que son capaces de aumentar los ciclos de replicación tras su administración a un sujeto/paciente y, como tales, pueden proporcionar beneficios terapéuticos adicionales en comparación con los TIL más antiguos (es decir, TIL que se han sometido a más rondas de replicación antes de su administración a un sujeto/paciente). En la bibliografía se han descrito características de los TIL jóvenes, por ejemplo Donia, at al., Scandinavian Journal of Immunology, 75:157-167 (2012); Dudley et al., Clin Cancer Res, 16:6122-6131 (2010); Huang et al., J Immunother, 28(3):258-267 (2005); Besser et al., Clin Cancer Res, 19(17):OF1-Of 9 (2013); Besser et al., J Immunother 32:415-423 (2009); Robbins, et al., J Immunol 2004; 173:7125-7130; Shen et al., J Immunother, 30:123-129 (2007); Zhou, et al., J Immunother, 28:53-62 (2005); y Tran, et al., J Immunother, 31:742-751 (2008).

Los diversos receptores de antígenos de los linfocitos T y B se producen por recombinación somática de un número limitado, pero grande, de segmentos génicos. Estos segmentos génicos: V (variable), D (diversidad), J (unión) y C (constante), determinan la especificidad de unión y las aplicaciones posteriores de las inmunoglobulinas y los receptores de células T (TCR). La presente invención proporciona un método para generar TIL que exhiben y aumentan la diversidad del repertorio de células T. En algunas realizaciones, los TIL obtenidos por el presente método exhiben un aumento de la diversidad del repertorio de células T. En algunas realizaciones, los TIL obtenidos por el presente método muestran un aumento de la diversidad del repertorio de células T en comparación con los TIL recién recogidos y/o los TIL preparados mediante métodos distintos de los que se proporcionan en el presente documento, incluidos, por ejemplo, métodos distintos de los representados en la Figura 1. En algunas realizaciones, los TIL obtenidos por el presente método presentan un aumento de la diversidad del repertorio de células T en comparación con los TIL recién recolectados y/o los TIL preparados mediante métodos denominados proceso 1C, como se ejemplifica en la Figura 5 y/o la Figura 6. En algunas realizaciones, los TIL obtenidos en la primera expansión presentan un aumento de la diversidad del repertorio de células T. En algunas realizaciones, el aumento de la diversidad es un aumento de la diversidad de inmunoglobulinas y/o de la diversidad de receptores de células T. En algunas realizaciones, la diversidad está en la inmunoglobulina está en la cadena pesada de la inmunoglobulina. En algunas realizaciones, la diversidad está en la inmunoglobulina está en la cadena ligera de la inmunoglobulina. En algunas realizaciones, la diversidad está en el receptor de células T. En algunas realizaciones, la diversidad está en uno de los receptores de células T seleccionado del grupo que consiste en los receptores alfa, beta, gamma y delta. En algunas realizaciones, se produce un aumento de la expresión del receptor de células T (TCR) alfa y/o beta. En algunas realizaciones, se produce un aumento de la expresión del receptor de células T (TCR) alfa. En algunas realizaciones, se produce un aumento de la expresión del receptor de células T (TCR) beta. En algunas realizaciones, hay un aumento en la expresión de TCRab (es decir, TCRa/p).

Tras la disección o digestión de los fragmentos tumorales, por ejemplo, como se describe en la Etapa A de la Figura 1, las células resultantes se cultivan en suero que contiene IL-2 en condiciones que favorecen el crecimiento de los TIL frente a las células tumorales y de otro tipo. En algunas realizaciones, los digeridos tumorales se incuban en pocillos de 2 mL en medios que comprenden suero AB humano inactivado con 6000 UI/mL de IL-2. En los métodos divulgados en el presente documento, pero no reivindicados, esta población celular primaria se cultiva durante un periodo de días, generalmente de 3 a 14 días, dando lugar a una población de TIL a granel, generalmente de aproximadamente 1 * 108 células de TIL a granel. En los métodos divulgados en el presente documento, pero no reivindicados, esta población de células primarias se cultiva durante un periodo de 7 a 14 días, lo que da como resultado una población de TIL a granel, generalmente de aproximadamente 1 * 108 células de TIL a granel. En los métodos divulgados en el presente documento, pero no reivindicados, esta población de células primarias se cultiva durante un periodo de 10 a 14 días, lo que da como resultado una población de TIL a granel, generalmente de aproximadamente 1 * 108 células de TIL a granel. En algunas realizaciones, esta población de células primarias se cultiva durante un periodo de aproximadamente 11 días, lo que da como resultado una población de TIL a granel, generalmente aproximadamente 1 * 108 células de TIL a granel.

En una realización preferida, la expansión de los TIL puede realizarse utilizando una etapa inicial de expansión de TIL a granel (por ejemplo, como los descritos en la Etapa B de la Figura 1, que puede incluir procesos denominados pre-REP) como se describe a continuación y en el presente documento, seguido de una segunda expansión (Etapa D, que incluye procesos denominados etapas de protocolo de expansión rápida (REP)) como se describe a continuación en la Etapa D y en el presente documento, seguido de crioconservación, y seguido de una segunda Etapa D (que incluye procesos denominados etapas de re-estimulación REP) como se describe a continuación y en el presente documento. Los TIL obtenidos de este proceso pueden caracterizarse opcionalmente por características fenotípicas y parámetros metabólicos como se describe en el presente documento.

En las realizaciones en las que los cultivos de TIL se inician en placas de 24 pocillos, por ejemplo, utilizando el grupo de cultivo celular Costar de 24 pocillos, fondo plano (Corning Incorporated, Corning, NY), cada pocillo puede sembrarse con 1 * 106 células de digestión tumoral o un fragmento tumoral en 2 mL de medio completo (CM) con IL-2 (6000 UI/mL; Chiron Corp., Emeryville, CA). En algunas realizaciones, el fragmento tumoral mide entre 1 mm3 y 10 mm3 aproximadamente.

En algunas realizaciones, el primer medio de cultivo de expansión se denomina "CM", una abreviatura de medio de cultivo. En algunas realizaciones, el CM para la etapa B consiste en RPMI 1640 con GlutaMAX, suplementado con 10 % de suero AB humano, Hepes 25 mM y 10 mg/mL de gentamicina. En las realizaciones en las que los cultivos se inician en matraces permeables al gas con una capacidad de 40 mL y un fondo de silicona permeable al gas de 10 cm2 (por ejemplo, G-Rex10; Wilson Wolf Manufacturing, New Brighton, MN) (Fig. 1), cada matraz se cargó con 10-40 * 106 células viables de digestión tumoral o 5-30 fragmentos tumorales en 10-40 mL de CM con IL-2. Tanto las placas G-Rex10 como las de 24 pocillos se incubaron en una incubadora humidificada a 37 °C con un 5 % de CO2 y, 5 días después del inicio del cultivo, se retiró la mitad del medio y se sustituyó por CM e IL-2 frescos y, después del día 5, se cambió la mitad del medio cada 2-3 días.

Tras la preparación de los fragmentos tumorales, las células resultantes (es decir, los fragmentos) se cultivan en suero que contiene IL-2 en condiciones que favorecen el crecimiento de los TIL frente a las células tumorales y de otro tipo. En algunas realizaciones, los digestos tumorales se incuban en pocillos de 2 mL en medios que comprenden suero AB humano inactivado (o, en algunos casos, como se describe en el presente documento, en presencia de una población de células aAPC) con 6000 UI/mL de IL-2. Esta población celular primaria se cultiva durante un periodo de días, generalmente de 10 a 14 días, dando lugar a una población de TIL a granel, generalmente de aproximadamente 1*108 células de TIL a granel. En algunas realizaciones, el medio de crecimiento durante la primera expansión comprende IL-2 o una variante de la misma. En algunas realizaciones, la IL es IL-2 humana recombinante (rhIL-2). En algunas realizaciones, la solución patrón de IL-2 tiene una actividad específica de 20-30*106 UI/mg para un vial de 1 mg. En algunas realizaciones, la solución patrón de IL-2 tiene una actividad específica de 20*106 UI/mg para un vial de 1 mg. En algunas realizaciones, la solución patrón de IL-2 tiene una actividad específica de 25*106 UI/mg para un vial de 1 mg. En algunas realizaciones, la solución patrón de IL-2 tiene una actividad específica de 30*106 UI/mg para un vial de 1 mg. En algunas realizaciones, la solución patrón de IL-2 tiene una concentración final de 4-8*106 UI/mg de IL-2. En algunas realizaciones, la solución patrón de IL-2 tiene una concentración final de 5-7*106 UI/mg de IL-2. En algunas realizaciones, la solución patrón de IL-2 tiene una concentración final de 6*106 UI/mg de IL-2. En algunas realizaciones, la solución patrón de IL-2 se prepara como se describe en el Ejemplo 5. En algunas realizaciones, el primer medio de cultivo de expansión comprende unas 10,000 UI/mL de IL-2, aproximadamente 9,000 UI/mL de IL-2, aproximadamente 8,000 UI/mL de IL-2, aproximadamente 7,000 UI/mL de IL-2, aproximadamente 6,000 UI/mL de IL-2 o aproximadamente 5,000 UI/mL de IL-2. En algunas realizaciones, el primer medio de cultivo de expansión comprende desde unas 9,000 UI/mL de IL-2 hasta aproximadamente 5,000 UI/mL de IL-2. En algunas realizaciones, el primer medio de cultivo de expansión comprende aproximadamente 8,000 UI/mL de IL-2 a aproximadamente 6,000 UI/mL de IL-2. En algunas realizaciones, el primer medio de cultivo de expansión comprende aproximadamente 7,000 UI/mL de IL-2 a aproximadamente 6,000 UI/mL de IL-2. En algunas realizaciones, el primer medio de cultivo de expansión comprende aproximadamente 6,000 UI/mL de IL-2. En una realización, el medio de cultivo celular comprende además IL-2. En algunas realizaciones, el medio de cultivo celular comprende aproximadamente 3000 UI/mL de IL-2. En una realización, el medio de cultivo celular comprende además IL-2. En una realización preferida, el medio de cultivo celular comprende aproximadamente 3000 UI/mL de IL-2. En una realización, el medio de cultivo celular contiene aproximadamente 1000 UI/mL, aproximadamente 1500 UI/mL, aproximadamente 2000 UI/mL, aproximadamente 2500 UI/mL, aproximadamente 3000 UI/mL, aproximadamente 3500 UI/mL, aproximadamente 4000 UI/mL, aproximadamente 4500 UI/mL, aproximadamente 5000 UI/mL, aproximadamente 5500 UI/mL, aproximadamente 6000 UI/mL, aproximadamente 6500 UI/mL, aproximadamente 7000 UI/mL, aproximadamente 7500 UI/mL o aproximadamente 8000 UI/mL de IL-2. En una realización, el medio de cultivo celular comprende entre 1000 y 2000 UI/mL, entre 2000 y 3000 UI/mL, entre 3000 y 4000 UI/mL, entre 4000 y 5000 UI/mL, entre 5000 y 6000 UI/mL, entre 6000 y 7000 UI/mL, entre 7000 y 8000 UI/mL, o aproximadamente 8000 UI/mL de IL-2.

En algunas realizaciones, el primer medio de cultivo de expansión comprende aproximadamente 500 UI/mL de IL-15, aproximadamente 400 UI/mL de IL-15, aproximadamente 300 UI/mL de IL-15, aproximadamente 200 UI/mL de IL-15, aproximadamente 180 UI/mL de IL-15, aproximadamente 160 UI/mL de IL-15, aproximadamente 140 UI/mL de IL-15, aproximadamente 120 UI/mL de IL-15, o aproximadamente 100 UI/mL de IL-15. En algunas realizaciones, el primer medio de cultivo de expansión comprende aproximadamente 500 UI/mL de IL-15 a aproximadamente 100 UI/mL de IL-15. En algunas realizaciones, el primer medio de cultivo de expansión comprende aproximadamente 400 UI/mL de IL-15 a aproximadamente 100 UI/mL de IL-15. En algunas realizaciones, el primer medio de cultivo de expansión comprende aproximadamente 300 UI/mL de IL-15 a aproximadamente 100 UI/mL de IL-15. En algunas realizaciones, el primer medio de cultivo de expansión comprende aproximadamente 200 UI/mL de IL-15. En algunas realizaciones, el medio de cultivo celular comprende aproximadamente 180 UI/mL de IL-15. En una realización, el medio de cultivo celular comprende además IL-15. En una realización preferida, el medio de cultivo celular comprende aproximadamente 180 UI/mL de IL-15.

En algunas realizaciones, el primer medio de cultivo de expansión comprende aproximadamente 20 UI/mL de IL-21, aproximadamente 15 UI/mL de IL-21, aproximadamente 12 UI/mL de IL-21, aproximadamente 10 UI/mL de IL-21, aproximadamente 5 UI/mL de IL-21, aproximadamente 4 UI/mL de IL-21, aproximadamente 3 UI/mL de IL-21, aproximadamente 2 UI/mL de IL-21, aproximadamente 1 UI/mL de IL-21 o aproximadamente 0.5 UI/mL de IL-21. En algunas realizaciones, el primer medio de cultivo de expansión comprende desde aproximadamente 20 UI/mL de IL-21 hasta aproximadamente 0.5 UI/mL de IL-21. En algunas realizaciones, el primer medio de cultivo de expansión comprende aproximadamente 15 UI/mL de IL-21 a aproximadamente 0.5 UI/mL de IL-21. En algunas realizaciones, el primer medio de cultivo de expansión comprende aproximadamente de 12 UI/mL de IL-21 a aproximadamente 0.5 UI/mL de IL-21. En algunas realizaciones, el primer medio de cultivo de expansión comprende aproximadamente 10 UI/mL de IL-21 a aproximadamente 0.5 UI/mL de IL-21. En algunas realizaciones, el primer medio de cultivo de expansión comprende aproximadamente 5 UI/mL de IL-21 a aproximadamente 1 UI/mL de IL-21. En algunas realizaciones, el primer medio de cultivo de expansión comprende aproximadamente 2 UI/mL de IL-21. En algunas realizaciones, el medio de cultivo celular comprende aproximadamente 1 UI/mL de IL-21. En algunas realizaciones, el medio de cultivo celular comprende aproximadamente 0.5 UI/mL de IL-21. En una realización, el medio de cultivo celular comprende además IL-21. En una realización preferida, el medio de cultivo celular comprende aproximadamente 1 UI/mL de IL-21.

En una realización, el medio de cultivo celular comprende el anticuerpo OKT-3. En algunas realizaciones, el medio de cultivo celular comprende aproximadamente 30 ng/mL de anticuerpo OKT-3. En una realización, el medio de cultivo celular comprende aproximadamente 0.1 ng/mL, aproximadamente 0.5 ng/mL, aproximadamente 1 ng/mL, aproximadamente 2.5 ng/mL, aproximadamente 5 ng/mL, aproximadamente 7.5 ng/mL, aproximadamente 10 ng/mL, aproximadamente 15 ng/mL, aproximadamente 20 ng/mL, aproximadamente 25 ng/mL, aproximadamente 30 ng/mL, aproximadamente 35 ng/mL, aproximadamente 40 ng/mL, aproximadamente 50 ng/mL, aproximadamente 60 ng/mL, aproximadamente 70 ng/mL, aproximadamente 80 ng/mL, aproximadamente 90 ng/mL, aproximadamente 100 ng/mL, aproximadamente 200 ng/mL, aproximadamente 500 ng/mL, y aproximadamente 1 pg/mL de anticuerpo OKT-3. En una realización, el medio de cultivo celular comprende entre 0.1 ng/mL y 1 ng/mL, entre 1 ng/mL y 5 ng/mL, entre 5 ng/mL y 10 ng/mL, entre 10 ng/mL y 20 ng/mL, entre 20 ng/mL y 30 ng/mL, entre 30 ng/mL y 40 ng/mL, entre 40 ng/mL y 50 ng/mL, y entre 50 ng/mL y 100 ng/mL de anticuerpo OKT-3. En algunas realizaciones, el medio de cultivo celular no comprende anticuerpo OKT-3. En algunas realizaciones, el anticuerpo OKT-3 es muromonab.

Tabla 3: Secuencias de aminoácidos de muromonab anticuerpo OKT-3 eemplar

En algunas realizaciones, el medio de cultivo celular comprende uno o más agonistas de TNFRSF en un medio de cultivo celular. En algunas realizaciones, el agonista de TNFRSF comprende un agonista de 4-1BB. En algunas realizaciones, el agonista de TNFRSF es un agonista de 4-1BB, y el agonista de 4-1BB se selecciona del grupo que consiste en urelumab, utomilumab, EU-101, una proteína de fusión y fragmentos, derivados, variantes, biosimilares y combinaciones de los mismos. En algunas realizaciones, el agonista de TNFRSF se añade a una concentración suficiente para alcanzar una concentración en el medio de cultivo celular de entre 0.1 |jg/mL y 100 jg/mL. En algunas realizaciones, el agonista de TNFRSF se añade a una concentración suficiente para lograr una concentración en el medio de cultivo celular de entre 20 jg/m L y 40 jg/mL.

En algunas realizaciones, además de uno o más agonistas de TNFRSF, el medio de cultivo celular comprende además IL-2 a una concentración inicial de aproximadamente 3000 UI/mL y anticuerpo OKT-3 a una concentración inicial de aproximadamente 30 ng/mL, y en el que uno o más agonistas de TNFRSF comprende un agonista de 4-1BB.

En algunas realizaciones, el primer medio de cultivo de expansión se denomina "CM", una abreviatura de medio de cultivo. En algunas realizaciones, se denomina CM1 (medio de cultivo 1). En algunas realizaciones, el CM consiste en RPMI 1640 con GlutaMAX, suplementado con 10 % de suero AB humano, Hepes 25 mM y 10 mg/mL de gentamicina. En las realizaciones en las que los cultivos se inician en matraces permeables al gas con una capacidad de 40 mL y un fondo de silicona permeable al gas de 10 cm2 (por ejemplo, G-Rex10; Wilson Wolf Manufacturing, New Brighton, MN) (Fig. 1), cada matraz se cargó con 10-40*10® células viables de digestión tumoral o 5-30 fragmentos tumorales en 10-40 mL de CM con IL-2. Tanto las placas G-Rex10 como las de 24 pocillos se incubaron en una incubadora humidificada a 37 °C con un 5 % de CO2 y 5 días después del inicio del cultivo, se retiró la mitad del medio y se sustituyó por CM e IL-2 frescos y, después del día 5, se cambió la mitad del medio cada 2-3 días. En algunas realizaciones, el CM es el CM1 descrito en los Ejemplos, véase, el Ejemplo 1. En algunas realizaciones, la primera expansión se produce en un medio de cultivo celular inicial o en un primer medio de cultivo celular. En algunas realizaciones, el medio de cultivo celular inicial o el primer medio de cultivo celular comprende IL-2.

En los métodos divulgados en el presente documento, pero no reivindicados, el proceso de primera expansión (incluidos procesos como, por ejemplo, los descritos en la etapa B de la Figura 1, que pueden incluir los denominados a veces pre-REP) se acorta de 3-14 días, como se expone en los ejemplos y figuras. En los métodos divulgados en el presente documento, pero no reivindicados, la primera expansión (incluidos procesos como, por ejemplo, los descritos en la etapa B de la Figura 1, que pueden incluir los denominados a veces pre-REP) se acorta de 7 a 14 días, como se discute en los ejemplos y se muestra en las Figuras 4 y 5, además de incluir, por ejemplo, una expansión como la descrita en la etapa B de la Figura 1. En los métodos divulgados en el presente documento, pero no reivindicados, la primera expansión de la Etapa B se acorta a 10-14 días. En algunas realizaciones, la primera expansión se acorta a 11 días, como se discute en, por ejemplo, una expansión como la descrita en la Etapa B de la Figura 1.

En algunas realizaciones, la primera expansión de TIL puede proceder durante 3 días, 4 días, 5 días, 6 días, 7 días, 8 días, 9 días, 10 días u 11 días. En algunas realizaciones, la primera expansión de TIL puede proceder durante 3 días a 11 días. En algunas realizaciones, la primera expansión de TIL puede proceder durante 4 días a 11 días. En algunas realizaciones, la primera expansión de TIL puede proceder durante 5 días a 11 días. En algunas realizaciones, la primera expansión de TIL puede proceder durante 6 días a 11 días. En algunas realizaciones, la primera expansión de TIL puede proceder durante 7 días a 11 días. En algunas realizaciones, la primera expansión de TIL puede proceder durante 8 días a 11 días. En algunas realizaciones, la primera expansión de TIL puede proceder durante 9 días a 11 días. En algunas realizaciones, la primera expansión de TIL puede proceder durante 10 días a 11 días. En algunas realizaciones, la primera expansión de TIL puede proceder durante 11 días.

En algunas realizaciones, se emplea una combinación de IL-2, IL-7, IL-15 y/o IL-21 durante la primera expansión. En algunas realizaciones, la IL-2, la IL-7, la IL-15 y/o la IL-21, así como cualquier combinación de las mismas, pueden incluirse durante la primera expansión, incluyendo, por ejemplo, durante un proceso de la etapa B según la Figura 1, así como se describe en el presente documento. En algunas realizaciones, se emplea una combinación de IL-2, IL-15 e IL-21 durante la primera expansión. En algunas realizaciones, la IL-2, la IL-15 y la IL-21, así como cualquier combinación de las mismas, pueden incluirse durante los procesos de la Etapa B según la Figura 1 y según se describe en el presente documento.

En los métodos divulgados en el presente documento, pero no reivindicados, la primera expansión (incluidos los procesos denominados pre-REP; por ejemplo, la Etapa B según la Figura 1) se acorta de 3 a 14 días, como se explica en los ejemplos y las figuras. En los métodos divulgados en el presente documento, pero no reivindicados, la primera expansión de la etapa B se acorta de 7 a 14 días. En los métodos divulgados en el presente documento, pero no reivindicados, la primera expansión de la etapa B se acorta de 10 a 14 días. En algunas realizaciones, la primera expansión se acorta a 11 días.

En algunas realizaciones, la primera expansión, por ejemplo, la Etapa B según la Figura 1, se lleva a cabo en un biorreactor de sistema cerrado. En algunas realizaciones, se emplea un sistema cerrado para la expansión de TIL, como se describe en el presente documento. En algunas realizaciones, se emplea un único biorreactor. En algunas realizaciones, el biorreactor único empleado es, por ejemplo, un G-REX -10 o un G-REX -100. En algunas realizaciones, el biorreactor del sistema cerrado es un biorreactor único.

C. Etapa C: Transición de la primera expansión a la segunda expansión

En algunos casos, la población de TIL a granel obtenida de la primera expansión, incluida por ejemplo la población de TIL obtenida de, por ejemplo, la etapa B como se indica en la Figura 1, puede crioconservarse inmediatamente, utilizando los protocolos que se comentan a continuación. Alternativamente, la población de TIL obtenida de la primera expansión, denominada segunda población de TIL, puede someterse a una segunda expansión (que puede incluir expansiones denominadas a veces REP) y crioconservarse a continuación como se expone más adelante. Del mismo modo, en el caso de que los TIL modificados genéticamente vayan a utilizarse en terapia, la primera población de TIL (a veces denominada población de TIL a granel) o la segunda población de TIL (que en algunas realizaciones puede incluir poblaciones denominadas poblaciones de TIL REP) pueden someterse a modificaciones genéticas para tratamientos adecuados antes de la expansión o después de la primera expansión y antes de la segunda expansión.

En algunas realizaciones, los TIL obtenidos de la primera expansión (por ejemplo, de la Etapa B como se indica en la Figura 1) se almacenan hasta que se fenotipan para la selección. En algunas realizaciones, los TIL obtenidos de la primera expansión (por ejemplo, de la Etapa B como se indica en la Figura 1) no se almacenan y se procede directamente a la segunda expansión. En algunas realizaciones, los TIL obtenidos de la primera expansión no se crioconservan después de la primera expansión y antes de la segunda expansión. En algunas realizaciones, la transición de la primera expansión a la segunda expansión se produce aproximadamente a los 3 días, 4 días, 5 días, 6 días, 7 días, 8 días, 9 días, 10 días, 11 días, 12 días, 13 días o 14 días desde que se produce la fragmentación. En algunas realizaciones, la transición de la primera expansión a la segunda expansión se produce a aproximadamente 3 días a 14 días desde que se produce la fragmentación. En algunas realizaciones, la transición de la primera expansión a la segunda expansión se produce entre 4 días y 14 días después de que se produzca la fragmentación. En algunas realizaciones, la transición de la primera expansión a la segunda expansión se produce entre 4 días y 10 días después de que se produzca la fragmentación. En algunas realizaciones, la transición de la primera expansión a la segunda expansión se produce entre 7 y 14 días después de que se produzca la fragmentación. En algunas realizaciones, la transición de la primera expansión a la segunda expansión se produce a los 14 días aproximadamente de producirse la fragmentación.

En algunas realizaciones, la transición de la primera expansión a la segunda expansión se produce a 1 día, 2 días, 3 días, 4 días, 5 días, 6 días, 7 días, 8 días, 9 días, 10 días, 11 días, 12 días, 13 días o 14 días desde que se produce la fragmentación. En algunas realizaciones, la transición de la primera expansión a la segunda expansión se produce entre 1 día y 14 días desde que se produce la fragmentación. En algunas realizaciones, la primera expansión de TIL puede proceder de 2 días a 14 días. En algunas realizaciones, la transición de la primera expansión a la segunda expansión se produce de 3 días a 14 días desde que se produce la fragmentación. En algunas realizaciones, la transición de la primera expansión a la segunda expansión se produce de 4 días a 14 días desde que se produce la fragmentación. En algunas realizaciones, la transición de la primera expansión a la segunda expansión se produce de 5 días a 14 días desde que se produce la fragmentación. En algunas realizaciones, la transición de la primera expansión a la segunda expansión se produce de 6 días a 14 días desde que se produce la fragmentación. En algunas realizaciones, la transición de la primera expansión a la segunda expansión se produce de 7 días a 14 días desde que se produce la fragmentación. En algunas realizaciones, la transición de la primera expansión a la segunda expansión se produce de 8 días a 14 días desde que se produce la fragmentación. En algunas realizaciones, la transición de la primera expansión a la segunda expansión se produce de 9 días a 14 días desde que se produce la fragmentación. En algunas realizaciones, la transición de la primera expansión a la segunda expansión se produce de 10 días a 14 días desde que se produce la fragmentación. En algunas realizaciones, la transición de la primera expansión a la segunda expansión se produce de 11 días a 14 días desde que se produce la fragmentación. En algunas realizaciones, la transición de la primera expansión a la segunda expansión se produce de 12 días a 14 días desde que se produce la fragmentación. En algunas realizaciones, la transición de la primera expansión a la segunda expansión se produce de 13 días a 14 días desde que se produce la fragmentación. En algunas realizaciones, la transición de la primera expansión a la segunda expansión se produce a los 14 días de producirse la fragmentación. En algunas realizaciones, la transición de la primera expansión a la segunda expansión se produce de 1 día a 11 días desde que se produce la fragmentación. En algunas realizaciones, la transición de la primera expansión a la segunda expansión se produce de 2 días a 11 días desde que se produce la fragmentación. En algunas realizaciones, la transición de la primera expansión a la segunda expansión se produce de 3 días a 11 días desde que se produce la fragmentación. En algunas realizaciones, la transición de la primera expansión a la segunda expansión se produce de 4 días a 11 días desde que se produce la fragmentación. En algunas realizaciones, la transición de la primera expansión a la segunda expansión se produce de 5 días a 11 días desde que se produce la fragmentación. En algunas realizaciones, la transición de la primera expansión a la segunda expansión se produce de 6 días a 11 días desde que se produce la fragmentación. En algunas realizaciones, la transición de la primera expansión a la segunda expansión se produce de 7 días a 11 días desde que se produce la fragmentación. En algunas realizaciones, la transición de la primera expansión a la segunda expansión se produce de 8 días a 11 días desde que se produce la fragmentación. En algunas realizaciones, la transición de la primera expansión a la segunda expansión se produce de 9 días a 11 días desde que se produce la fragmentación. En algunas realizaciones, la transición de la primera expansión a la segunda expansión se produce de 10 días a 11 días desde que se produce la fragmentación. En algunas realizaciones, la transición de la primera expansión a la segunda expansión se produce a los 11 días de producirse la fragmentación.

En algunas realizaciones, los TIL no se almacenan después de la primera expansión y antes de la segunda expansión, y los TIL pasan directamente a la segunda expansión (por ejemplo, en algunas realizaciones, no hay almacenamiento durante la transición de la etapa B a la etapa D, como se muestra en la Figura 1). En algunas realizaciones, la transición se produce en un sistema cerrado, como se describe en el presente documento. En algunas realizaciones, los TIL de la primera expansión, la segunda población de TIL, procede directamente a la segunda expansión sin periodo de transición.

En algunas realizaciones, la transición de la primera expansión a la segunda expansión, por ejemplo, la Etapa C según la Figura 1, se lleva a cabo en un biorreactor de sistema cerrado. En algunas realizaciones, se emplea un sistema cerrado para la expansión de TIL, como se describe en el presente documento. En algunas realizaciones, se emplea un único biorreactor. En algunas realizaciones, el biorreactor único empleado es, por ejemplo, un G-REX -10 o un G-REX -100. En algunas realizaciones, el biorreactor del sistema cerrado es un biorreactor único.

1. Citocinas

Los métodos de expansión descritos en el presente documento utilizan generalmente medios de cultivo con altas dosis de una citocina, en particular IL-2, como es conocido en la técnica.

Alternativamente, también es posible utilizar combinaciones de citocinas para la expansión rápida y/o la segunda expansión de TIL, con combinaciones de dos o más de IL-2, IL-15 e IL-21, como se describe en general en la Publicación Internacional No. WO 2015/189356 y en la Publicación Internacional No. WO 2015/189357. De este modo, las combinaciones posibles incluyen IL-2 e IL-15, IL-2 e IL-21, IL-15 e IL-21 e IL-2, IL-15 e IL-21, encontrando esta última un uso particular en muchas realizaciones. El uso de combinaciones de citocinas favorece específicamente la generación de linfocitos y, en particular, de células T, tal y como se describe en ellas.

Tabla 4: Secuencias de aminoácidos de las interleucinas.

D. Etapa D: Segunda expansión

En algunas realizaciones, la población de células de TIL se expande en número tras la recolección y el procesamiento inicial a granel, por ejemplo, tras la Etapa A y la Etapa B, y la transición denominada Etapa C, como se indica en la Figura 1). Esta expansión adicional se denomina en el presente documento segunda expansión, que puede incluir procesos de expansión generalmente denominados en la técnica proceso de expansión rápida (REP; así como procesos como los indicados en la Etapa D de la Figura 1). La segunda expansión se realiza generalmente utilizando un medio de cultivo que comprende una serie de componentes, entre ellos células alimentadoras, una fuente de citocinas y un anticuerpo anti-CD3, en un recipiente permeable a los gases.

En algunas realizaciones, la segunda expansión o segunda expansión de TIL (que puede incluir expansiones a veces denominadas REP; así como procesos como los indicados en la Etapa D de la Figura 1) de TIL puede realizarse utilizando cualquier matraz o recipiente de TIL conocido por los expertos en la materia. En algunas realizaciones, la segunda expansión de TIL puede proceder durante 7 días, 8 días, 9 días, 10 días u 11 días.

En una realización, la segunda expansión puede llevarse a cabo en un recipiente permeable al gas utilizando los métodos de la presente divulgación (incluyendo, por ejemplo, las expansiones denominadas REP; así como los procesos indicados en la etapa D de la Figura 1). Por ejemplo, los TIL pueden expandirse rápidamente utilizando la estimulación no específica del receptor de células T en presencia de interleucina-2 (IL-2) o interleucina-15 (IL-15). El estímulo no específico del receptor de células T puede incluir, por ejemplo, un anticuerpo anti-CD3, tal como aproximadamente 30 ng/mL de OKT3, un anticuerpo monoclonal de ratón anti-CD3 (disponible comercialmente a través de Ortho-McNeil, Raritan, NJ o Miltenyi Biotech, Auburn, CA) o UHCT-1 (disponible comercialmente a través de BioLegend, San Diego, CA, EE. UU.). Los TIL pueden expandirse para inducir una mayor estimulación de los TILin vitromediante la inclusión de uno o más antígenos durante la segunda expansión, incluidas porciones antigénicas de los mismos, tal como epítopo(s), del cáncer, que pueden expresarse opcionalmente a partir de un vector, como un péptido de unión al antígeno leucocitario humano a 2 (HLA-A2), por ejemplo, m A r T-10.3 jM : 26-35 (27 L) o gpl 00: 209-217 (210 M), opcionalmente en presencia de un factor de crecimiento de células T, como 300 UI/mL de IL-2 o IL-15. Otros antígenos adecuados pueden incluir, por ejemplo, NY-ESO-1, TRP-1, TRP-2, antígeno del cáncer de tirosinasa, MAGE-A3, SSX-2 y VEGFR2, o porciones antigénicas de los mismos. Los TIL también pueden expandirse rápidamente mediante reestimulación con el mismo antígeno o antígenos del cáncer pulsados sobre células presentadoras de antígenos que expresen HLA-A2. Como alternativa, los TIL pueden reestimularse aún más con, por ejemplo, linfocitos autólogos irradiados o con linfocitos alogénicos HLA-A2+ irradiados e IL-2. En algunas realizaciones, la reestimulación se produce como parte de la segunda expansión. En algunas realizaciones, la segunda expansión se produce en presencia de linfocitos autólogos irradiados o con linfocitos alogénicos HLA-A2+ irradiados e IL-2.

En una realización, el medio de cultivo celular comprende además IL-2. En algunas realizaciones, el medio de cultivo celular comprende aproximadamente 3000 UI/mL de IL-2. En una realización, el medio de cultivo celular comprende aproximadamente 1000 UI/mL, aproximadamente 1500 UI/mL, aproximadamente 2000 UI/mL, aproximadamente 2500 UI/mL, aproximadamente 3000 UI/mL, aproximadamente 3500 UI/mL, aproximadamente 4000 UI/mL, aproximadamente 4500 UI/mL, aproximadamente 5000 UI/mL, aproximadamente 5500 UI/mL, aproximadamente 6000 UI/mL, aproximadamente 6500 UI/mL, aproximadamente 7000 UI/mL, aproximadamente 7500 UI/mL, o aproximadamente 8000 UI/mL de IL-2. En una realización, el medio de cultivo celular comprende entre 1000 y 2000 UI/mL, entre 2000 y 3000 UI/mL, entre 3000 y 4000 UI/mL, entre 4000 y 5000 UI/mL, entre 5000 y 6000 UI/mL, entre 6000 y 7000 UI/mL, entre 7000 y 8000 UI/mL, o entre 8000 UI/mL de IL-2.

En una realización, el medio de cultivo celular comprende el anticuerpo OKT-3. En algunas realizaciones, el medio de cultivo celular comprende aproximadamente 30 ng/mL de anticuerpo OKT-3. En una realización, el medio de cultivo celular comprende aproximadamente 0.1 ng/mL, aproximadamente 0.5 ng/mL, aproximadamente 1 ng/mL, aproximadamente 2.5 ng/mL, aproximadamente 5 ng/mL, aproximadamente 7.5 ng/mL, aproximadamente 10 ng/mL, aproximadamente 15 ng/mL, aproximadamente 20 ng/mL, aproximadamente 25 ng/mL, aproximadamente 30 ng/mL, aproximadamente 35 ng/mL, aproximadamente 40 ng/mL, aproximadamente 50 ng/mL, aproximadamente 60 ng/mL, aproximadamente 70 ng/mL, aproximadamente 80 ng/mL, aproximadamente 90 ng/mL, aproximadamente 100 ng/mL, aproximadamente 200 ng/mL, aproximadamente 500 ng/mL, y aproximadamente 1 jg/m L de anticuerpo OKT-3. En una realización, el medio de cultivo celular comprende entre 0.1 ng/mL y 1 ng/mL, entre 1 ng/mL y 5 ng/mL, entre 5 ng/mL y 10 ng/mL, entre 10 ng/mL y 20 ng/mL, entre 20 ng/mL y 30 ng/mL, entre 30 ng/mL y 40 ng/mL, entre 40 ng/mL y 50 ng/mL, y entre 50 ng/mL y 100 ng/mL de anticuerpo OKT-3. En algunas realizaciones, el medio de cultivo celular no comprende anticuerpo OKT-3. En algunas realizaciones, el anticuerpo OKT-3 es muromonab.

En algunas realizaciones, además de uno o más agonistas de TNFRSF, el medio de cultivo celular comprende además IL-2 a una concentración inicial de aproximadamente 3000 UI/mL y anticuerpo OKT-3 a una concentración inicial de aproximadamente 30 ng/mL, y en el que el uno o más agonistas de TNFRSF comprende un agonista de 4-1BB.

En algunas realizaciones, se emplea una combinación de IL-2, IL-7, IL-15 y/o IL-21 durante la segunda expansión. En algunas realizaciones, la IL-2, la IL-7, la IL-15, y/o la IL-21, así como cualquier combinación de las mismas, pueden incluirse durante la segunda expansión, incluyendo, por ejemplo, durante un proceso de la Etapa D según la Figura 1, así como se describe en el presente documento. En algunas realizaciones, se emplea una combinación de IL-2, IL-15 e IL-21 durante la segunda expansión. En algunas realizaciones, la IL-2, la IL-15 y la IL-21, así como cualquier combinación de las mismas, pueden incluirse durante los procesos de la Etapa D según la Figura 1 y según se describe en el presente documento.

En algunas realizaciones, la segunda expansión puede llevarse a cabo en un medio de cultivo celular suplementado que comprenda IL-2, OKT-3, células alimentadoras presentadoras de antígenos y, opcionalmente, un agonista de TNFRSF. En algunas realizaciones, la segunda expansión se produce en un medio de cultivo celular suplementado. En algunas realizaciones, el medio de cultivo celular suplementado comprende IL-2, OKT-3 y células alimentadoras presentadoras de antígeno. En algunas realizaciones, el segundo medio de cultivo celular comprende IL-2, OKT-3 y células presentadoras de antígenos (APC; también denominadas células alimentadoras presentadoras de antígenos). En algunas realizaciones, la segunda expansión se produce en un medio de cultivo celular que comprende IL-2, OKT-3 y células alimentadoras presentadoras de antígenos (es decir, células presentadoras de antígenos).

En algunas realizaciones, el segundo medio de cultivo de expansión comprende aproximadamente 500 UI/mL de IL-15, aproximadamente 400 UI/mL de IL-15, aproximadamente 300 UI/mL de IL-15, aproximadamente 200 UI/mL de IL-15, aproximadamente 180 UI/mL de IL-15, aproximadamente 160 UI/mL de IL-15, aproximadamente 140 UI/mL de IL-15, aproximadamente 120 UI/mL de IL-15 o aproximadamente 100 UI/mL de IL-15. En algunas realizaciones, el segundo medio de cultivo de expansión comprende aproximadamente 500 UI/mL de IL-15 a aproximadamente 100 UI/mL de IL-15. En algunas realizaciones, el segundo medio de cultivo de expansión comprende aproximadamente 400 UI/mL de IL-15 a aproximadamente 100 UI/mL de IL-15. En algunas realizaciones, el segundo medio de cultivo de expansión comprende aproximadamente 300 UI/mL de IL-15 a aproximadamente 100 UI/mL de IL-15. En algunas realizaciones, el segundo medio de cultivo de expansión comprende aproximadamente 200 UI/mL de IL-15. En algunas realizaciones, el medio de cultivo celular comprende aproximadamente 180 UI/mL de IL-15. En una realización, el medio de cultivo celular comprende además IL-15. En una realización preferida, el medio de cultivo celular comprende aproximadamente 180 UI/mL de IL-15.

En algunas realizaciones, el segundo medio de cultivo de expansión comprende aproximadamente 20 UI/mL de IL-21, aproximadamente 15 UI/mL de IL-21, aproximadamente 12 UI/mL de IL-21, aproximadamente 10 UI/mL de IL-21, aproximadamente 5 UI/mL de IL-21, aproximadamente 4 UI/mL de IL-21, aproximadamente 3 UI/mL de IL-21, aproximadamente 2 UI/mL de IL-21, aproximadamente 1 UI/mL de IL-21 o aproximadamente 0.5 UI/mL de IL-21. En algunas realizaciones, el segundo medio de cultivo de expansión comprende entre aproximadamente 20 UI/mL de IL-21 y aproximadamente 0.5 UI/mL de IL-21. En algunas realizaciones, el segundo medio de cultivo de expansión comprende aproximadamente 15 UI/mL de IL-21 a aproximadamente 0.5 UI/mL de IL-21. En algunas realizaciones, el segundo medio de cultivo de expansión comprende aproximadamente de 12 UI/mL de IL-21 a aproximadamente 0.5 UI/mL de IL-21. En algunas realizaciones, el segundo medio de cultivo de expansión comprende aproximadamente 10 UI/mL de IL-21 a aproximadamente 0.5 UI/mL de IL-21. En algunas realizaciones, el segundo medio de cultivo de expansión comprende aproximadamente 5 UI/mL de IL-21 a aproximadamente 1 UI/mL de IL-21. En algunas realizaciones, el segundo medio de cultivo de expansión comprende aproximadamente 2 UI/mL de IL-21. En algunas realizaciones, el medio de cultivo celular comprende aproximadamente 1 UI/mL de IL-21. En algunas realizaciones, el medio de cultivo celular comprende aproximadamente 0.5 UI/mL de IL-21. En una realización, el medio de cultivo celular comprende además IL-21. En una realización preferida, el medio de cultivo celular comprende aproximadamente 1 UI/mL de IL-21.

En algunas realizaciones, las células alimentadoras presentadoras de antígeno (APC) son PBMC. En una realización, la proporción de TIL respecto a PBMC y/o células presentadoras de antígeno en la expansión rápida y/o la segunda expansión es de aproximadamente 1 a 25, aproximadamente 1 a 50, aproximadamente 1 a 100, aproximadamente 1 a 125, aproximadamente 1 a 150, aproximadamente 1 a 175, aproximadamente 1 a 200, aproximadamente 1 a 225, aproximadamente 1 a 250, aproximadamente 1 a 275, aproximadamente 1 a 300, aproximadamente 1 a 325, aproximadamente 1 a 350, aproximadamente 1 a 375, aproximadamente 1 a 400, o aproximadamente 1 a 500. En una realización, la proporción de TIL respecto a PBMC en la expansión rápida y/o la segunda expansión es de entre 1 a 50 y 1 a 300. En una realización, la proporción de TIL respecto a PBMC en la expansión rápida y/o la segunda expansión está entre 1 a 100 y 1 a 200.

En una realización, la REP y/o la segunda expansión se llevan a cabo en matraces con los TIL a granel mezcladas con un exceso de 100 o 200 veces de células alimentadoras inactivadas, 30 mg/mL de anticuerpo OKT3 anti-CD3 y 3000 UI/mL de IL-2 en 150 mL de medio. Se realiza la reposición de los medios (generalmente 2/3 de reposición de los medios mediante respiración con medios frescos) hasta que las células se transfieren a una cámara de crecimiento alternativa. Entre las cámaras de crecimiento alternativas se incluyen los matraces G-REX y los contenedores permeables a los gases, como se explica con más detalle a continuación.

En los métodos divulgados en el presente documento, pero no reivindicados, la segunda expansión (que puede incluir procesos denominados como proceso REP) se acorta a 7-14 días, como se indica en los ejemplos y las figuras. En algunas realizaciones, la segunda expansión se acorta a 11 días.

En una realización, la REP y/o la segunda expansión pueden llevarse a cabo utilizando matraces T-175 y bolsas permeables al gas como se ha descrito previamente (Tran, et al., J. Immunother. 2008, 31, 742-51; Dudley, et al., J. Immunother. 2003, 26, 332-42) o material de cultivo permeable a los gases (matraces G-Rex). En algunas realizaciones, la segunda expansión (incluidas las expansiones denominadas expansiones rápidas) se lleva a cabo en matraces T-175, y pueden añadirse a cada matraz T-175 aproximadamente 1 * 106 TIL suspendidos en 150 mL de medio. Los TIL pueden cultivarse en una mezcla 1 a 1 de CM y medio AIM-V, suplementada con 3000 UI por mL de IL-2 y 30 ng por mL de anti-CD3. Los matraces T-175 pueden incubarse a 37 °C con un 5 % de CO2. La mitad del medio puede cambiarse el día 5 utilizando un medio 50/50 con 3000 UI por mL de IL-2. En algunas realizaciones, el día 7 las células de dos matraces T-175 pueden combinarse en una bolsa de 3 L y se añadieron 300 mL de AIM V con 5 % de suero AB humano y 3000 UI por mL de IL-2 a los 300 mL de suspensión de TIL. El número de células de cada bolsa se contó cada uno o dos días y se añadió medio fresco para mantener el recuento celular entre 0.5 y 2.0 * 106 células/mL.

En una realización, la segunda expansión (que puede incluir las expansiones denominadas REP, así como las referidas en la Etapa D de la Figura 1) puede llevarse a cabo en matraces permeables al gas de 500 mL de capacidad con fondos de silicona permeables al gas de 100 cm (G-Rex 100, disponible comercialmente a través de Wilson Wolf Manufacturing Corporation, New Brighton, MN, EE. UU.), pueden cultivarse 5 * 106 o 10 * 106 TIL con PBMC en 400 mL de medio 50/50, suplementado con 5 % de suero AB humano, 3000 UI por mL de IL-2 y 30 ng por mL de anti-CD3 (OKT3). Los matraces G-Rex 100 pueden incubarse a 37 °C en un 5 % de CO2. El día 5, pueden extraerse 250 mL de sobrenadante y colocarse en botellas de centrífuga y centrifugarse a 1500 rpm (491 * g) durante 10 minutos. Los sedimentos de TIL pueden volver a suspenderse con 150 mL de medio fresco con 5 % de suero AB humano, 3000 UI por mL de IL-2, y añadirse de nuevo a los matraces G-Rex 100 originales. Cuando los TIL se expanden en serie en matraces G-Rex 100, el día 7 los TIL de cada G-Rex 100 pueden suspenderse en los 300 mL de medio presentes en cada matraz y la suspensión celular puede dividirse en 3 alícuotas de 100 mL que pueden utilizarse para sembrar 3 matraces G-Rex 100. A continuación, pueden añadirse a cada matraz 150 mL de AIM-V con 5 % de suero AB humano y 3000 UI por mL de IL-2. Los matraces G-Rex 100 pueden incubarse a 37 °C en 5 % de CO2 y después de 4 días pueden añadirse 150 mL de AIM-V con 3000 Ui por mL de IL-2 a cada matraz G-REX 100. En un método divulgado en el presente documento, pero no reivindicado, las células pueden recolectarse en el día 14 de cultivo.

En una realización, la segunda expansión (incluidas las expansiones denominadas REP) se lleva a cabo en matraces con los TIL a granel mezcladas con un exceso de 100 o 200 veces de células alimentadoras inactivadas, 30 mg/mL de anticuerpo OKT3 anti-CD3 y 3000 UI/mL de IL-2 en 150 mL de medio. En algunas realizaciones, la sustitución de los medios se realiza hasta que las células se transfieren a una cámara de crecimiento alternativa. En algunas realizaciones, 2/3 de los medios se sustituyen por respiración con medios frescos. En algunas realizaciones, las cámaras de crecimiento alternativas incluyen matraces G-REX y recipientes permeables a los gases, como se explica con más detalle a continuación.

En una realización, la segunda expansión (incluidas las expansiones denominadas REP) se lleva a cabo y comprende además una etapa en la que los TIL se seleccionan para una reactividad tumoral superior. Puede utilizarse cualquier método de selección conocido en la técnica. Por ejemplo, pueden emplearse los métodos descritos en la Publicación de la Solicitud de Patente de los Estados Unidos No. 2016/0010058 A1 para la selección de TIL por reactividad tumoral superior.

Opcionalmente, puede realizarse un ensayo de viabilidad celular tras la segunda expansión (incluidas las expansiones denominadas REP), utilizando ensayos estándar conocidos en la técnica. Por ejemplo, puede realizarse un ensayo de exclusión con azul tripán en una muestra de los TIL a granel, que etiqueta selectivamente las células muertas y permite una evaluación de la viabilidad. En algunas realizaciones, las muestras de TIL pueden contarse y determinarse su viabilidad utilizando un contador celular automatizado Cellometer K2 (Nexcelom Bioscience, Lawrence, MA). En algunas realizaciones, la viabilidad se determina según el protocolo estándar del contador celular automático del citómetro de imagen Cellometer K2.

En algunas realizaciones, la segunda expansión (incluidas las expansiones denominadas REP) de TIL puede llevarse a cabo utilizando matraces T-175 y bolsas permeables al gas como se ha descrito anteriormente (Tran KQ, Zhou J, Durflinger KH, et al., 2008, J Immunother., 31:742-751, y Dudley ME, Wunderlich JR, Shelton TE, et al. 2003, J Immunother., 26: 332-342) o matraces G-Rex permeables al gas. En algunas realizaciones, la segunda expansión se lleva a cabo utilizando matraces. En algunas realizaciones, la segunda expansión se lleva a cabo utilizando matraces G-Rex permeables al gas. En algunas realizaciones, la segunda expansión se lleva a cabo en matraces T-175, y se suspenden aproximadamente 1 * 106 TIL en aproximadamente 150 mL de medio y se añade éste a cada matraz T-175. Los TIL se cultivan con PBMC alogénicas irradiadas (50 Gy) como células "alimentadoras" en una proporción de 1 a 100 y las células se cultivaron en una mezcla 1 a 1 de CM y medio AIM-V (medio 50/50), suplementado con 3000 UI/mL de IL-2 y 30 ng/mL de anti-CD3. Los matraces T-175 se incuban a 37 °C en un 5 % de CO2. En algunas realizaciones, la mitad del medio se cambia el día 5 utilizando un medio 50/50 con 3000 UI/mL de IL-2. En algunas realizaciones, el día 7, las células de 2 matraces T-175 se combinan en una bolsa de 3 L y se añaden 300 mL de AIM-V con 5 % de suero AB humano y 3000 UI/mL de IL-2 a los 300 mL de suspensión de TIL. El número de células de cada bolsa puede contarse cada uno o dos días y puede añadirse medio fresco para mantener el recuento celular entre aproximadamente 0.5 y aproximadamente 2.0 * 106 células/mL.

En algunas realizaciones, la segunda expansión (incluidas las expansiones denominadas REP) se lleva a cabo en matraces de 500 mL de capacidad con fondos de silicona permeables al gas de 100 cm2 (G-Rex 100, Wilson Wolf) (Fig. 1), se cultivan aproximadamente 5 * 106 o 10 * 106 TIL con PBMC alogénicas irradiadas en una proporción de 1 a 100 en 400 mL de medio 50/50, suplementado con 3000 UI/mL de IL-2 y 30 ng/mL de anti-CD3. Los matraces G-Rex 100 se incuban a 37 °C en un 5 % de CO2. En algunas realizaciones, el día 5, se extraen 250 mL de sobrenadante y se colocan en botellas de centrífuga y se centrifugan a 1500 rpm (491 g) durante 10 minutos. A continuación, los sedimentos de TIL pueden resuspenderse con 150 mL de medio 50/50 fresco con 3000 UI/mL de IL-2 y añadirse de nuevo a los matraces G-Rex 100 originales. En las realizaciones en las que los TIL se expanden en serie en matraces G-Rex 100, el día 7 los TIL de cada G-Rex 100 se suspenden en los 300 mL de medio presentes en cada matraz y la suspensión celular se dividió en tres alícuotas de 100 mL que se utilizan para sembrar 3 matraces G-Rex 100. A continuación, se añaden 150 mL de AIM-V con 5 % de suero AB humano y 3000 UI/mL de IL-2 a cada matraz. Los matraces G-Rex 100 se incuban a 37 °C en 5 % de CO2 y al cabo de 4 días se añaden 150 mL de AIM-V con 3000 UI/mL de IL-2 a cada matraz G-Rex 100. En un método divulgado en el presente documento, pero no reivindicado, las células se recolectan en el día 14 de cultivo.

Los diversos receptores de antígenos de los linfocitos T y B se producen por recombinación somática de un número limitado, pero grande, de segmentos génicos. Estos segmentos génicos: V (variable), D (diversidad), J (unión) y C (constante), determinan la especificidad de unión y las aplicaciones posteriores de las inmunoglobulinas y los receptores de células T (TCR). La presente invención proporciona un método para generar TIL que exhiben y aumentan la diversidad del repertorio de células T. En algunas realizaciones, los TIL obtenidos por el presente método exhiben un aumento de la diversidad del repertorio de células T. En algunas realizaciones, los TIL obtenidos en la segunda expansión exhiben un aumento de la diversidad del repertorio de células T. En algunas realizaciones, el aumento de la diversidad es un aumento de la diversidad de inmunoglobulinas y/o de la diversidad de receptores de células T. En algunas realizaciones, la diversidad está en la inmunoglobulina está en la cadena pesada de la inmunoglobulina. En algunas realizaciones, la diversidad está en la inmunoglobulina está en la cadena ligera de la inmunoglobulina. En algunas realizaciones, la diversidad está en el receptor de células T. En algunas realizaciones, la diversidad está en uno de los receptores de células T seleccionado del grupo que consiste en los receptores alfa, beta, gamma y delta. En algunas realizaciones, se produce un aumento de la expresión del receptor de células T (TCR) alfa y/o beta. En algunas realizaciones, se produce un aumento en la expresión del receptor de células T (TCR) alfa. En algunas realizaciones, se produce un aumento de la expresión del receptor de células T (TCR) beta. En algunas realizaciones, hay un aumento en la expresión de TCRab (es decir, TCRa/p).

En algunas realizaciones, el segundo medio de cultivo de expansión (por ejemplo, a veces denominado CM2 o segundo medio de cultivo celular), comprende IL-2, OKT-3, así como las células alimentadoras presentadoras de antígenos (APC), como se explica con más detalle a continuación.

En algunas realizaciones, la segunda expansión, por ejemplo, la etapa D según la Figura 1, se lleva a cabo en un biorreactor de sistema cerrado. En algunas realizaciones, se emplea un sistema cerrado para la expansión de TIL, como se describe en el presente documento. En algunas realizaciones, se emplea un único biorreactor.

En algunas realizaciones, el biorreactor único empleado es, por ejemplo, un G-REX-10 o un G-REX-100. En algunas realizaciones, el biorreactor del sistema cerrado es un biorreactor único.

1. Células alimentadoras y células presentadoras de antígeno

En una realización, los procedimientos de segunda expansión descritos en el presente documento (por ejemplo, incluyendo expansiones como las descritas en la Etapa D de la Figura 1, así como las denominadas REP) requieren un exceso de células alimentadoras durante la expansión de TIL de REP y/o durante la segunda expansión. En muchas realizaciones, las células alimentadoras son células mononucleares de sangre periférica (PBMC) obtenidas de unidades de sangre total estándar de donantes de sangre sanos. Las PBMC se obtienen utilizando métodos estándar como la separación en gradiente de Ficoll-Paque.

En general, las PBMC alogénicas se inactivan, ya sea mediante irradiación o tratamiento térmico, y se utilizan en los procedimientos REP, como se describe en los ejemplos, que proporcionan un protocolo ejemplar para evaluar la incompetencia de replicación de las PBMC alogénicas irradiadas.

En un método divulgado en el presente documento, pero no reivindicado, las PBMC se consideran incompetentes para la replicación y se aceptan para su uso en los procedimientos de expansión de TIL descritos en el presente documento si el número total de células viables en el día 14 es inferior al número inicial de células viables puestas en cultivo el día 0 del REP y/o el día 0 de la segunda expansión (es decir, el día de inicio de la segunda expansión).

En un método divulgado en el presente documento pero no reivindicado, las PBMC se consideran incompetentes para la replicación y se aceptan para su uso en los procedimientos de expansión de TIL descritos en el presente documento si el número total de células viables, cultivadas en presencia de OKT3 e IL-2, el día 7 y el día 14 no ha aumentado con respecto al número inicial de células viables puestas en cultivo el día 0 del REP y/o el día 0 de la segunda expansión (es decir, el día de inicio de la segunda expansión). En algunas realizaciones, las PBMC se cultivan en presencia de 30 ng/mL de anticuerpo OKT3 y 3000 UI/mL de IL-2.

En un método divulgado en el presente documento pero no reivindicado, las PBMC se consideran incompetentes para la replicación y se aceptan para su uso en los procedimientos de expansión de TIL descritos en el presente documento si el número total de células viables, cultivadas en presencia de OKT3 e IL-2, el día 7 y el día 14 no ha aumentado con respecto al número inicial de células viables puestas en cultivo el día 0 del r Ep y/o el día 0 de la segunda expansión (es decir, el día de inicio de la segunda expansión). En algunas realizaciones, las PBMC se cultivan en presencia de 5-60 ng/mL de anticuerpo OKT3 y de 1000-6000 UI/mL de IL-2. En algunas realizaciones, las PBMC se cultivan en presencia de 10-50 ng/mL de anticuerpo OKT3 y 2000-5000 UI/mL de IL-2. En algunas realizaciones, las PBMC se cultivan en presencia de 20-40 ng/mL de anticuerpo OKT3 y 2000-4000 UI/mL de IL-2. En algunas realizaciones, las PBMC se cultivan en presencia de 25-35 ng/mL de anticuerpo OKT3 y 2500-3500 UI/mL de IL-2.

En algunas realizaciones, las células alimentadoras presentadoras de antígeno son PBMC. En algunas realizaciones, las células alimentadoras presentadoras de antígeno son células alimentadoras presentadoras de antígeno artificiales. En una realización, la proporción entre TIL y células alimentadoras presentadoras de antígeno en la segunda expansión es de aproximadamente 1 a 25, aproximadamente 1 a 50, aproximadamente 1 a 100, aproximadamente 1 a 125, aproximadamente 1 a 150, aproximadamente 1 a 175, aproximadamente 1 a 200, aproximadamente 1 a 225, aproximadamente 1 a 250, aproximadamente 1 a 275, aproximadamente 1 a 300, aproximadamente 1 a 325, aproximadamente 1 a 350, aproximadamente 1 a 375, aproximadamente 1 a 400, o aproximadamente 1 a 500. En una realización, la proporción de TIL respecto a las células alimentadoras presentadoras de antígeno en la segunda expansión es de entre 1 a 50 y 1 a 300. En una realización, la proporción de TIL respecto a las células alimentadoras presentadoras de antígeno en la segunda expansión está entre 1 a 100 y 1 a 200.

En una realización, los segundos procedimientos de expansión descritos en el presente documento requieren una proporción de aproximadamente 2.5*109 células alimentadoras por aproximadamente 100*10® TIL. En otra realización, los segundos procedimientos de expansión descritos en el presente documento requieren una proporción de aproximadamente 2.5*109 células alimentadoras por aproximadamente 50*10® TIL. En otra realización, los segundos procedimientos de expansión descritos en el presente documento requieren aproximadamente 2.5*109 células alimentadoras por cada 25*10® TIL.

En una realización, los procedimientos de segunda expansión descritos en el presente documento requieren un exceso de células alimentadoras durante la segunda expansión. En muchas realizaciones, las células alimentadoras son células mononucleares de sangre periférica (PBMC) obtenidas de unidades de sangre total estándar de donantes de sangre sanos. Las PBM<c>se obtienen utilizando métodos estándar como la separación en gradiente de Ficoll-Paque. En una realización, se utilizan células artificiales presentadoras de antígeno (aAPC) en lugar de PBMC.

En general, las PBMC alogénicas se inactivan, ya sea mediante irradiación o tratamiento térmico, y se utilizan en los procedimientos de expansión de TIL descritos en el presente documento, incluidos los procedimientos ejemplares descritos en las figuras y ejemplos.

En una realización, las células presentadoras de antígeno artificiales se utilizan en la segunda expansión en sustitución de las PBMC o en combinación con ellas.

2. Citocinas

Como alternativa, también es posible utilizar combinaciones de citocinas para la expansión rápida y/o la segunda expansión de TILS, con combinaciones de dos o más de IL-2, IL-15 e IL-21, como se describe en general en la Publicación Internacional No. WO 2015/189356 y en la Publicación Internacional No. WO 2015/189357. De este modo, las combinaciones posibles incluyen IL-2 e IL-15, IL-2 e IL-21, IL-15 e IL-21 e IL-2, IL-15 e IL-21, encontrando esta última un uso particular en muchas realizaciones. El uso de combinaciones de citocinas favorece específicamente la generación de linfocitos y, en particular, de células T, tal y como se describe en ellas.

F. Etapa F: Recolección de TIL

Tras la segunda etapa de expansión, pueden recolectarse las células. En algunas realizaciones, los TIL se recolectan tras una, dos, tres, cuatro o más etapas de expansión, por ejemplo, como se indica en la Figura 1. En algunas realizaciones, los TIL se recolectan después de dos etapas de expansión, por ejemplo, como se indica en la Figura 1.

Los TIL pueden recolectarse de cualquier manera apropiada y estéril, incluyendo por ejemplo por centrifugación. Los métodos para la recolección de TIL son bien conocidos en el arte y cualquiera de estos métodos conocidos puede ser empleado con el presente proceso. En algunas realizaciones, los TIL se recolectan utilizando un sistema automatizado.

Los recolectores de células y/o los sistemas de procesamiento celular están disponibles comercialmente a través de diversas fuentes, incluyendo, por ejemplo, Fresenius Kabi, Tomtec Life Science, Perkin Elmer e Inotech Biosystems International, Inc. Cualquier recolector basado en células puede emplearse con los presentes métodos. En algunas realizaciones, el recolector de células y/o los sistemas de procesamiento celular son recolectores de células basados en membranas. En algunas realizaciones, la recolección de células se realiza mediante un sistema de procesamiento celular, como el sistema LOVO (fabricado por Fresenius Kabi). El término "sistema de procesamiento celular LOVO" también hace referencia a cualquier instrumento o dispositivo fabricado por cualquier proveedor que pueda bombear una solución que contenga células a través de una membrana o un filtro, como una membrana giratoria o un filtro giratorio, en un entorno estéril y/o de sistema cerrado, que permita un flujo continuo y el procesamiento celular para eliminar el sobrenadante o el medio de cultivo celular sin sedimentación. En algunas realizaciones, el recolector celular y/o el sistema de procesamiento celular pueden llevar a cabo la separación celular, el lavado, el intercambio de fluidos, la concentración y/u otras etapas de procesamiento celular en un sistema cerrado y estéril.

En algunas realizaciones, la recolección, por ejemplo, la Etapa E según la Figura 1, se realiza a partir de un biorreactor de sistema cerrado. En algunas realizaciones, se emplea un sistema cerrado para la expansión de los TIL, como se describe en el presente documento. En algunas realizaciones, se emplea un único biorreactor. En algunas realizaciones, el biorreactor único empleado es, por ejemplo, un G-REX -10 o un G-REX -100. En algunas realizaciones, el biorreactor del sistema cerrado es un biorreactor único.

En algunas realizaciones, la Etapa E según la Figura 1, se realiza según los procesos descritos en el Ejemplo G. En algunas realizaciones, se accede al sistema cerrado mediante jeringas en condiciones estériles para mantener la esterilidad y la naturaleza cerrada del sistema. En algunas realizaciones, se emplea un sistema cerrado como el descrito en el Ejemplo G.

En algunas realizaciones, los TIL se recolectan de acuerdo con los métodos descritos en el Ejemplo G. En algunas realizaciones, los TIL entre los días 1 y 11 se recolectan usando los métodos como se describe en la Sección 8.5 (referido como la recolección de TIL del día 11 en el Ejemplo G). En algunas realizaciones, los TIL entre los días 12 y 22 se recolectan utilizando los métodos descritos en la Sección 8.12 (denominada recolección de TIL del día 22 en el Ejemplo G).

F. Etapa F: Formulación final/ Transferencia a la bolsa de infusión

Una vez completadas las Etapas A a E, tal como se proporcionan en un orden ejemplar en la Figura 1 y como se detalló anteriormente y en el presente documento, las células se transfieren a un contenedor para su uso en la administración a un paciente. En algunas realizaciones, una vez obtenido un número terapéuticamente suficiente de TIL mediante los métodos de expansión descritos anteriormente, se transfieren a un recipiente para su uso en la administración a un paciente.

En una realización, los TIL expandidos utilizando APC de la presente divulgación se proporcionan para su administración a un paciente en forma de composición farmacéutica. En una realización, la composición farmacéutica es una suspensión de TIL en un tampón estéril. Los TIL expandidos utilizando PBMC de la presente divulgación pueden ser para administración por cualquier vía adecuada conocida en la técnica. En algunas realizaciones, las células T son para administración como una única infusión intraarterial o intravenosa, que preferiblemente dura aproximadamente de 30 a 60 minutos. Otras vías de administración adecuadas son la intraperitoneal, la intratecal y la intralinfática.

G. Componentes opcionales del medio celular

1. Anticuerpos anti-CD3

En algunas realizaciones, los medios de cultivo utilizados en los métodos de expansión descritos en el presente documento (incluidos los denominados REP, véase, por ejemplo, la Figura 1) también incluyen un anticuerpo anti-CD3. Un anticuerpo anti-CD3 en combinación con IL-2 induce la activación de las células T y la división celular en la población de TIL. Este efecto puede observarse tanto con anticuerpos de longitud completa como con fragmentos Fab y F(ab')2, prefiriéndose generalmente los primeros; véase, por ejemplo, Tsoukas et al., J. Immunol. 1985, 135, 1719.

Como apreciarán los entendidos en la materia, hay una serie de anticuerpos anti-CD3 humanos adecuados que encuentran uso en la invención, incluidos anticuerpos policlonales y monoclonales anti-CD3 humanos de diversos mamíferos, incluidos, entre otros, anticuerpos murinos, humanos, de primates, de ratas y caninos. En realizaciones particulares, se utiliza el anticuerpo anti-CD3 OKT3 (disponible comercialmente a través de Ortho-McNeil, Raritan, NJ o Miltenyi Biotech, Auburn, CA).

Tabla 5: Secuencias de aminoácidos de muromonab anticuerpo OKT-3 eemplar

2. Agonistas de 4-1BB (CD137)

En una realización, el agonista de TNFRSF es un agonista de 4-1BB (CD137). El agonista de 4-1BB puede ser cualquier molécula de unión al 4-1BB conocida en la técnica. La molécula de unión al 4-1BB puede ser un anticuerpo monoclonal o una proteína de fusión capaz de unirse al 4-1BB humano o de mamífero. Los agonistas de 4-1BB o las moléculas de unión al 4-1BB pueden comprender una cadena pesada de inmunoglobulina de cualquier isotipo (por ejemplo, IgG, IgE, IgM, IgD, IgA e IgY), clase (por ejemplo, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1 e IgA2) o subclase de molécula de inmunoglobulina. El agonista de 4-1BB o la molécula de unión al 4-1BB puede tener tanto una cadena pesada como una ligera. Tal y como se utiliza en el presente documento, el término molécula de unión también incluye anticuerpos (incluidos anticuerpos de longitud completa), anticuerpos monoclonales (incluidos anticuerpos monoclonales de longitud completa), anticuerpos policlonales, anticuerpos multiespecíficos (por ejemplo, anticuerpos biespecíficos), anticuerpos humanos, humanizados o quiméricos, y fragmentos de anticuerpos, por ejemplo, fragmentos Fab, fragmentos F(ab'), fragmentos producidos por una biblioteca de expresión de Fab, fragmentos de unión a epítopos de cualquiera de los anteriores, y formas modificadas de anticuerpos, por ejemplo, moléculas de scFv, que se unen al 4-1BB. En una realización, el agonista de 4-1BB es una proteína de unión a antígeno que es un anticuerpo totalmente humano. En una realización, el agonista de 4-1BB es una proteína de unión a antígeno que es un anticuerpo humanizado. En algunas realizaciones, los agonistas de 4-1BB para su uso en los métodos y composiciones divulgados actualmente incluyen anticuerpos anti-4-1BB, anticuerpos humanos anti-4-1BB, anticuerpos de ratón anti-4-1BB, anticuerpos de mamífero anti-4-1BB, anticuerpos monoclonales anti-4-1BB, anticuerpos policlonales anti-4-1BB, anticuerpos quiméricos anti-4-1BB, adnectinas anti-4-1BB, anticuerpos de dominio anti-4-1BB, fragmentos anti-4-1BB de cadena sencilla, fragmentos anti-4-1BB de cadena pesada, fragmentos a n t i-4 -1 B B d e c a d e n a lig e ra , p ro te ín a s d e fu s ió n a n t i-4 -1 B B , y fra g m e n to s , d e r iv a d o s , c o n ju g a d o s , v a r ia n te s o b io s im ila re s d e lo s m is m o s . S e s a b e q u e lo s a n t ic u e rp o s a g o n is ta s a n t i-4 -1 B B in d u c e n fu e r te s re s p u e s ta s in m u n ita r ia s . L e e , e t a l., P L O S O n e 2013 , 8, e 69677. E n u n a re a liz a c ió n p re fe r id a , e l a g o n is ta d e 4 -1 B B e s un a n t ic u e rp o m o n o c lo n a l a g o n is ta a n t i-4 -1 B B h u m a n iz a d o o to ta lm e n te h u m a n o (e s d e c ir , un a n t ic u e rp o d e r iv a d o d e u n a ú n ic a lín e a c e lu la r) . E n u n a re a liz a c ió n , e l a g o n is ta d e 4 -1 B B e s E U -101 (E u t ile x C o . L td .), u to m ilu m a b o u re lu m a b , o un fra g m e n to , d e r iv a d o , c o n ju g a d o , v a r ia n te o b io s im ila r d e l m is m o . E n u n a re a liz a c ió n p re fe r id a , e l a g o n is ta d e 4 -1 B B e s u to m ilu m a b o u re lu m a b , o un fra g m e n to , d e r iv a d o , c o n ju g a d o , v a r ia n te o b io s im ila r d e l m is m o .

E n u n a re a liz a c ió n p re fe r id a , e l a g o n is ta d e 4 -1 B B o la m o lé c u la d e u n ió n a l 4 -1 B B ta m b ié n p u e d e s e r u n a p ro te ín a d e fu s ió n . E n u n a re a liz a c ió n p re fe r id a , un a g o n is ta d e 4 -1 B B m u ltim é r ic o , c o m o un a g o n is ta d e 4 -1 B B tr im é r ic o o h e x a m é r ic o (c o n t re s o s e is d o m in io s d e u n ió n a l lig a n d o ), p u e d e in d u c ir u n a a g ru p a c ió n s u p e r io r d e l re c e p to r (4 -1 B B L ) y la fo rm a c ió n d e c o m p le jo s d e s e ñ a liz a c ió n c e lu la r in te rn a e n c o m p a ra c ió n co n un a n t ic u e rp o m o n o c lo n a l a g o n is ta , q u e n o rm a lm e n te p o s e e d o s d o m in io s d e u n ió n a l l ig a n d o . L a s p ro te ín a s d e fu s ió n t r im é r ic a s ( t r iv a le n te s ) o h e x a m é r ic a s (o h e x a v a le n te s ) o m a y o re s q u e c o m p re n d e n tre s d o m in io s d e u n ió n a l T N F R S F e Ig G 1 - F c y q u e o p c io n a lm e n te u n e n a d e m á s d o s o m á s d e e s ta s p ro te ín a s d e fu s ió n se d e s c r ib e n , p o r e je m p lo , e n G ie ffe rs , e t a l., M o l. C a n c e r T h e ra p e u t ic s 2013 , 12, 2735 -47.

S e s a b e q u e lo s a n t ic u e rp o s 4 -1 B B a g o n is ta s y las p ro te ín a s d e fu s ió n in d u c e n fu e r te s re s p u e s ta s in m u n ita r ia s . E n u n a re a liz a c ió n p re fe r id a , e l a g o n is ta d e 4 -1 B B e s un a n t ic u e rp o m o n o c lo n a l o u n a p ro te ín a d e fu s ió n q u e s e u n e e s p e c íf ic a m e n te a l a n tíg e n o 4 -1 B B d e m a n e ra s u f ic ie n te p a ra re d u c ir la to x ic id a d . E n a lg u n a s re a liz a c io n e s , e l a g o n is ta d e 4 -1 B B e s un a n t ic u e rp o m o n o c lo n a l 4 -1 B B a g o n is ta o u n a p ro te ín a d e fu s ió n q u e a n u la la to x ic id a d c e lu la r d e p e n d ie n te d e a n t ic u e rp o s (A D C C ), p o r e je m p lo , la c ito to x ic id a d d e la s c é lu la s N k . E n a lg u n a s re a liz a c io n e s , e l a g o n is ta d e 4 -1 B B e s un a n t ic u e rp o m o n o c lo n a l 4 -1 B B a g o n is ta o u n a p ro te ín a de fu s ió n q u e a b ro g a la fa g o c ito s is c e lu la r d e p e n d ie n te d e a n t ic u e rp o s (A D C P ). E n a lg u n a s re a liz a c io n e s , e l a g o n is ta d e 4 -1 B B e s un a n t ic u e rp o m o n o c lo n a l a g o n is ta d e 4 - 1 B b o u n a p ro te ín a d e fu s ió n q u e a b ro g a la c ito to x ic id a d d e p e n d ie n te d e l c o m p le m e n to (C D C ). E n a lg u n a s re a liz a c io n e s , e l a g o n is ta d e 4 -1 B B e s un a n t ic u e rp o m o n o c lo n a l a g o n is ta d e 4 -1 B B o u n a p ro te ín a d e fu s ió n q u e a b ro g a la fu n c io n a lid a d d e la re g ió n Fc.

E n a lg u n a s re a liz a c io n e s , lo s a g o n is ta s d e 4 -1 B B s e c a ra c te r iz a n p o r u n irs e a l 4 -1 B B h u m a n o (S E Q ID N O : 9 ) c o n a lta a f in id a d y a c t iv id a d a g o n ís t ic a . E n u n a re a liz a c ió n , e l a g o n is ta d e 4 -1 B B e s u n a m o lé c u la d e u n ió n q u e s e u n e a l 4 -1 B B h u m a n o (S E Q ID N O : 9). E n u n a re a liz a c ió n , e l a g o n is ta d e 4 -1 B B e s u n a m o lé c u la d e u n ió n q u e s e u n e a l 4 -1 B B m u r in o (S E Q ID N O : 10 ). L a s s e c u e n c ia s d e a m in o á c id o s d e l a n tíg e n o 4 -1 B B a la s q u e s e u n e un a g o n is ta d e 4 -1 B B o u n a m o lé c u la d e u n ió n s e re s u m e n e n la T a b la 6.

T a b la 6. S e c u e n c ia s d e a m in o á c id o s d e lo s a n tíg e n o s 4 -1 B B .

E n a lg u n a s re a liz a c io n e s , la s c o m p o s ic io n e s , p ro c e s o s y m é to d o s d e s c r ito s in c lu y e n un a g o n is ta d e 4 -1 B B q u e s e u n e a l 4 -1 B B h u m a n o o m u r in o c o n u n a K d d e a p ro x im a d a m e n te 100 pM o in fe r io r , q u e s e u n e a l 4 -1 B B h u m a n o o m u r in o c o n u n a K d d e a p ro x im a d a m e n te 90 pM o in fe r io r , q u e se u n e a l 4 -1 B B h u m a n o o m u r in o c o n u n a K d d e a p ro x im a d a m e n te 80 pM o in fe r io r , q u e se u n e a l 4 -1 B B h u m a n o o m u r in o co n u n a K d de a p ro x im a d a m e n te 70 pM o in fe rio r , q u e se u n e a l 4 - 1 B B h u m a n o o m u r in o c o n u n a K d d e a p ro x im a d a m e n te 60 pM o in fe r io r , q u e s e u n e a l 4 -1 B B h u m a n o o m u r in o c o n u n a K d d e a p ro x im a d a m e n te 50 pM o in fe r io r , q u e se u n e a l 4 -1 B B h u m a n o o m u r in o c o n u n a K d d e a p ro x im a d a m e n te 40 pM o in fe r io r , o s e u n e a l 4 -1 B B h u m a n o o m u r in o c o n u n a K d d e a p ro x im a d a m e n te 30 pM o in fe rio r.

E n a lg u n a s re a liz a c io n e s , la s c o m p o s ic io n e s , p ro c e s o s y m é to d o s d e s c r ito s in c lu y e n un a g o n is ta d e 4 -1 B B q u e s e u n e a l 4 -1 B B h u m a n o o m u r in o co n u n a kasociación d e a p ro x im a d a m e n te 7.5 * 105 1 / M s o m á s rá p id o , q u e s e u n e a l 4 -1 B B h u m a n o o m u r in o co n u n a kasociación d e a p ro x im a d a m e n te 7.5 * 105 1 /M s o m á s rá p id o , q u e s e u n e a l 4 -1 B B h u m a n o o m u r in o c o n u n a kasociación d e a p ro x im a d a m e n te 8 * 105 1 /M s o m á s rá p id o , q u e se u n e a l 4 -1 B B h u m a n o o m u r in o c o n u n a kasociación d e a p ro x im a d a m e n te 8.5 * 105 1 /M s o m á s rá p id o , q u e se u n e a l 4 -1 B B h u m a n o o m u r in o co n u n a kasociación d e a p ro x im a d a m e n te 9 * 105 1 /M s o m á s rá p id o , q u e se u n e al 4-1BB humano o murino con una kasociación de aproximadamente 9.5 * 1051/Ms o más rápido, o que se une

al 4-1BB humano o murino con una kasociación de aproximadamente 1 * 1061/M s o más rápido.

En algunas realizaciones, las composiciones, procesos y métodos descritos incluyen un agonista de 4-1BB que

se une al 4-1BB humano o murino con una kasociación de aproximadamente 2 * 10-51/s o más lento, que se une

al 4-1BB humano o murino con una kasociación de aproximadamente 2.1 * 10-51/s o más lento, que se une al 4-1BB humano o murino con una kdisociación de aproximadamente 2.2 * 10-51/s o más lento, que se une al 4-1BB humano o murino con una kdisociación de aproximadamente 2.3 * 10-5 1/s o más lento, que se une al 4-1BB humano o murino con una kdisociación de aproximadamente 2.4 * 10-5 1/s o más lento, que se une al 4-1BB humano o murino con una kdisociación de aproximadamente 2.5 * 10-5 1/s o más lento, que se une al 4-1BB humano o murino con una kdisociación de aproximadamente 2.6 * 10-51/s o más lento o se une al 4-1BB humano

o murino con una kdisociación de aproximadamente 2.7 * 10-51/s o más lento, que se une al 4-1BB humano o

murino con una kdisociaciónde aproximadamente 2.8 * 10-51/s o más lento, que se une al 4-1BB humano o murino

con una kdisociaciónde aproximadamente 2.9 * 10-51/s o más lento, o se une al 4-1BB humano o murino con una kdisociaciónde aproximadamente 3 * 10-51/s o más lento.

se une al 4-1BB humano o murino con una IC50 de aproximadamente 10 nM o inferior, que se une al 4-1BB humano o murino con una IC50 de aproximadamente 9 nM o inferior, que se une al 4-1BB humano o murino

con una IC50 de aproximadamente 8 nM o inferior, que se une al 4-1BB humano o murino con una IC50 de aproximadamente 7 nM o inferior, que se une al 4-1BB humano o murino con una IC50 de aproximadamente 6

nM o inferior, que se une al 4-1BB humano o murino con una IC50 de aproximadamente 5 nM o inferior, que se

une al 4-1BB humano o murino con una IC50 de aproximadamente 4 nM o inferior, que se une al 4-1BB humano

o murino con una IC50 de aproximadamente 3 nM o inferior, que se une al 4-1BB humano o murino con una

IC50 de aproximadamente 2 nM o inferior, o que se une al 4-1BB humano o murino con una IC50 de aproximadamente 1 nM o inferior.

En una realización preferida, el agonista de 4-1BB es utomilumab, también conocido como PF-05082566 o

MOR-7480, o un fragmento, derivado, variante o biosimilar del mismo. El utomilumab está disponible a través

de Pfizer, Inc. El utomilumab es un anticuerpo monoclonal de inmunoglobulina G2-lambda, anti-[TNFRSF9 de

Homo sapiens(miembro 9 de la superfamilia del receptor del factor de necrosis tumoral (TNFR), 4-1BB, antígeno de células T ILA, CD137)], anticuerpo monoclonal deHomo sapiens(totalmente humano). Las secuencias de aminoácidos del utomilumab se exponen en la tabla EE. El utomilumab comprende sitios de glicosilación en Asn59 y Asn292; puentes disulfuro entre cadenas pesada en las posiciones 22-96 (V<h>-V<l>), 143

199 (C<h>1-C<l>), 256-316 (C<h>2) y 362-420 (C<h>3); puentes disulfuro entre la cadena ligera en las posiciones 22'-87' (V<h>-V<l>) y 136'-195' (C<h>1-C<l>); puentes disulfuro cadena de pesada-cadena pesada dentro de cadenas en

las posiciones 218-218, 219-219, 222-222 y 225-225 de la isoforma IgG2A, en las posiciones 218-130, 219

219, 222-222 y 225-225 de la isoforma IgG2A/B y en las posiciones 219-130 (2), 222-222 y 225-225 de la isoforma IgG2B; y puentes disulfuro entre cadenas pesadas y cadenas ligeras en las posiciones 130-213' (2) de la isoforma IgG2A, en las posiciones 218-213' y 130-213' de la isoforma IgG2A/B, y en las posiciones 218

213' (2) de la isoforma IgG2B. La preparación y las propiedades del utomilumab y sus variantes y fragmentos

se describen en las Patentes de los Estados Unidos Nos. 8,821,867; 8,337,850; y 9,468,678, y en la Publicación

de la Solicitud de Patente internacional No. WO 2012/032433 A1. Las características preclínicas del utomilumab

se describen en Fisher, et al., Cancer Immunolog. & Immunother. 2012, 61, 1721-33. Los ensayos clínicos actuales de utomilumab en una variedad de indicaciones hematológicas y de tumores sólidos incluyen los identificadores NCT02444793, NCT01307267, NCT02315066 y NCT02554812 de los Institutos Nacionales de

Salud clinicaltrials.gov.

En una realización, un agonista de 4-1BB comprende una cadena pesada dada por la SEQ ID NO: 11 y una

cadena ligera dada por la SEQ ID NO: 12. En una realización, un agonista de 4-1BB comprende cadenas pesadas y ligeras que tienen las secuencias mostradas en la SEQ ID NO: 11 y la SEQ ID NO: 12, respectivamente, o fragmentos de unión a antígeno, fragmentos Fab, fragmentos variables de cadena sencilla

(scFv), variantes o conjugados de los mismos. En una realización, un agonista de 4-1BB comprende cadenas pesadas y ligeras que son cada una al menos un 99 % idénticas a las secuencias mostradas en la SEQ ID NO:

11 y la SEQ ID NO: 12, respectivamente. En una realización, un agonista de 4-1BB comprende cadenas pesadas y ligeras que son cada una al menos un 98 % idénticas a las secuencias mostradas en la SEQ ID NO:

11 y la SEQ ID NO: 12, respectivamente. En una realización, un agonista de 4-1BB comprende cadenas pesadas y ligeras que son cada una al menos un 97 % idénticas a las secuencias mostradas en la SEQ ID NO:

11 y la SEQ ID NO: 12, respectivamente. En una realización, un agonista de 4-1BB comprende cadenas pesadas y ligeras que son cada una al menos un 96 % idénticas a las secuencias mostradas en la SEQ ID NO:

11 y la SEQ ID NO: 12, respectivamente. En una realización, un agonista de 4-1BB comprende cadenas pesadas y ligeras que son cada una al menos un 95 % idénticas a las secuencias mostradas en la SEQ ID NO:

11 y la s Eq ID NO: 12, respectivamente.

En una realización, el agonista de 4-1BB comprende las CDR o regiones variables (VR) de las cadenas pesadas

y ligeras del utomilumab. En una realización, la región variable de la cadena pesada del agonista de 4-1BB (V<h>) comprende la secuencia mostrada en la SEQ ID NO: 13, y la región variable de la cadena ligera del agonista

de 4-1BB (V<l>) comprende la secuencia mostrada en la SEQ ID NO: 14, y sustituciones conservadoras de aminoácidos de la misma. En una realización, un agonista de 4-1BB comprende las regiones V<h>y V<l>que son cada una al menos un 99 % idénticas a las secuencias mostradas en la SEQ ID NO: 13 y la SEQ ID NO: 14, respectivamente. En una realización, un agonista de 4-1BB comprende regiones V<h>y V<l>que son cada una al menos un 98 % idénticas a las secuencias mostradas en la SEQ ID NO: 13 y la SEQ ID NO: 14, respectivamente. En una realización, un agonista de 4-1BB comprende regiones V<h>y V<l>que son cada una al menos un 97 % idénticas a las secuencias mostradas en la SEQ ID NO: 13 y la SEQ ID NO: 14, respectivamente. En una realización, un agonista de 4-1BB comprende regiones V<h>y V<l>que son cada una al menos un 96 % idénticas a las secuencias mostradas en la SEQ ID NO: 13 y la SEQ ID NO: 14, respectivamente. En una realización, un agonista de 4-1BB comprende regiones V<h>y V<l>que son cada una al menos un 95 % idénticas a las secuencias mostradas en la SEQ ID NO: 13 y la SEQ ID NO: 14, respectivamente. En una realización, un agonista de 4-1BB comprende un anticuerpo scFv que comprende regiones VH y VL que son cada una al menos un 99 % idénticas a las secuencias mostradas en la SEQ ID NO: 13 y la SEQ ID NO: 14.

En una realización, un agonista de 4-1BB comprende dominios CDR1, CDR2 y CDR3 de cadena pesada que tienen las secuencias establecidas en la SEQ ID NO: 15, la SEQ ID NO: 16 y la SEQ ID NO: 17, respectivamente, y sustituciones conservadoras de aminoácidos de las mismas, y dominios CDR1, CDR2 y CDR3 de cadena ligera que tienen las secuencias establecidas en la SEQ ID NO: 18, la SEQ ID NO: 19 y la SEQ ID NO: 20, respectivamente, y sustituciones conservadoras de aminoácidos de las mismas.

En una realización, el agonista de 4-1BB es un anticuerpo monoclonal biosimilar agonista de 4-1BB aprobado por las autoridades reguladoras de medicamentos con referencia al utomilumab. En una realización, el anticuerpo monoclonal biosimilar comprende un anticuerpo 4-1BB que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos un 97 % de identidad de secuencia, por ejemplo, 97 %, 98 %, 99 % o 100 % de identidad de secuencia, con la secuencia de aminoácidos de un producto medicinal de referencia o producto biológico de referencia y que comprende una o más modificaciones postraduccionales en comparación con el producto medicinal de referencia o producto biológico de referencia, en el que el producto medicinal de referencia o producto biológico de referencia es utomilumab. En algunas realizaciones, la una o más modificaciones postraduccionales se seleccionan entre una o más de las siguientes: glicosilación, oxidación, desamidación y truncamiento. En algunas realizaciones, el biosimilar es un anticuerpo agonista de 4-1BB autorizado o presentado para su autorización, en el que el anticuerpo agonista de 4-1BB se proporciona en una formulación que difiere de las formulaciones de un producto medicinal de referencia o producto biológico de referencia, en el que el producto medicinal de referencia o producto biológico de referencia es utomilumab. El anticuerpo agonista de 4-1BB puede estar autorizado por una autoridad reguladora de medicamentos como la FDA de los Estados Unidos y/o la EMA de la Unión Europea. En algunas realizaciones, el biosimilar se suministra como una composición que comprende además uno o más excipientes, donde el uno o más excipientes son iguales o diferentes a los excipientes comprendidos en un producto medicinal de referencia o producto biológico de referencia, donde el producto medicinal de referencia o producto biológico de referencia es utomilumab. En algunas realizaciones, el biosimilar se proporciona como una composición que comprende además uno o más excipientes, donde el uno o más excipientes son iguales o diferentes a los excipientes comprendidos en un producto medicinal de referencia o producto biológico de referencia, donde el producto medicinal de referencia o producto biológico de referencia es utomilumab.

Tabla 7. Secuencias de aminoácidos de los anticuerpos agonistas de 4-1BB relacionados con el utomilumab.

En una realización preferida, el agonista de 4-1BB es el anticuerpo monoclonal urelumab, también conocido como BMS-663513 y 20H4.9.h4a, o un fragmento, derivado, variante o biosimilar del mismo. El urelumab está disponible a través de Bristol-Myers Squibb, Inc. y Creative Biolabs, Inc. El urelumab es un anticuerpo monoclonal de inmunoglobulina G4-kappa, anti-[TNFRSF9 deHomo sapiens(miembro 9 de la superfamilia de receptores del factor de necrosis tumoral, 4-1BB, antígeno de células T ILA, CD137)], deHomo sapiens(totalmente humano). Las secuencias de aminoácidos del urelumab se exponen en la Tabla EE. El urelumab comprende sitios de N-glicosilación en las posiciones 298 (y 298"); puentes disulfuro entre cadenas de cadena pesada en las posiciones 22-95 (V<h>-V<l>), 148-204 (C<h>1-C<l>), 262-322 (C<h>2) y 368-426 (C<h>3) (y en las posiciones 22"-95", 148"-204", 262"-322", y 368"-426"); puentes disulfuro entre cadenas de cadena ligera en las posiciones 23'-88' (V<h>-V<l>) y 136'-196' (C<h>1-C<l>) (y en las posiciones 23m-88m y 136"'-196"'); puentes disulfuro dentro de cadenas pesada-cadena pesada en las posiciones 227-227" y 230-230"; y puentes disulfuro dentro de las cadenas de cadena pesada-cadena ligera en 135-216' y 135"-21S™. La preparación y las propiedades del urelumab y sus variantes y fragmentos se describen en las Patentes de los Estados Unidos Nos. 7,288,638 y 8,962,804. Las características preclínicas y clínicas del urelumab se describen en Segal, et al., Clin. Cancer Res. 2016, disponible en http:/dx.doi.org/10.1158/1078-0432.CCR-16-1272. Los ensayos clínicos actuales de urelumab en diversas indicaciones hematológicas y de tumores sólidos incluyen los identificadores NCT01775631, NCT02110082, NCT02253992 y NCT01471210 de los Institutos Nacionales de Salud clinicaltrials.gov.

En una realización, un agonista de 4-1BB comprende una cadena pesada dada por la SEQ ID NO: 21 y una cadena ligera dada por la SEQ ID NO: 22. En una realización, un agonista de 4-1BB comprende cadenas pesadas y ligeras que tienen las secuencias mostradas en la SEQ ID NO: 21 y la SEQ ID NO: 22, respectivamente, o fragmentos de unión a antígeno, fragmentos Fab, fragmentos variables de cadena sencilla (scFv), variantes o conjugados de los mismos. En una realización, un agonista de 4-1BB comprende cadenas pesadas y ligeras que son cada una al menos un 99 % idénticas a las secuencias mostradas en la SEQ ID NO: 21 y la SEQ ID NO: 22, respectivamente. En una realización, un agonista de 4-1BB comprende cadenas pesadas y ligeras que son cada una al menos un 98 % idénticas a las secuencias mostradas en la SEQ ID NO: 21 y la SEQ ID NO: 22, respectivamente. En una realización, un agonista de 4-1BB comprende cadenas pesadas y ligeras que son cada una al menos un 97 % idénticas a las secuencias mostradas en la SEQ ID NO: 21 y la SEQ ID NO: 22, respectivamente. En una realización, un agonista de 4-1BB comprende cadenas pesadas y ligeras que son cada una al menos un 96 % idénticas a las secuencias mostradas en la SEQ ID NO: 21 y la SEQ ID NO: 22, respectivamente. En una realización, un agonista de 4-1BB comprende cadenas pesadas y ligeras que son cada una al menos un 95%idénticas a las secuencias mostradas en la SEQ ID NO: 21 y la s Eq ID NO: 22, respectivamente.

En una realización, el agonista de 4-1BB comprende las CDR o regiones variables (VR) de las cadenas pesadas y ligeras del urelumab. En una realización, la región variable de la cadena pesada del agonista de 4-1BB (V<h>) comprende la secuencia mostrada en la SEQ ID NO: 23, y la región variable de la cadena ligera del agonista de 4-1BB (V<l>) comprende la secuencia mostrada en la SEQ ID NO: 24, y sustituciones conservadoras de aminoácidos de la misma. En una realización, un agonista de 4-1BB comprende las regiones V<h>y V<l>que son cada una al menos un 99 % idénticas a las secuencias mostradas en la SEQ ID NO: 23 y la SEQ ID NO: 24, respectivamente. En una realización, un agonista de 4-1BB comprende regiones V<h>y V<l>que son cada una al menos un 98 % idénticas a las secuencias mostradas en la SEQ ID NO: 23 y la SEQ ID NO: 24, respectivamente. En una realización, un agonista de 4-1BB comprende regiones V<h>y V<l>que son cada una al menos un 97 % idénticas a las secuencias mostradas en la SEQ ID NO: 23 y la SEQ ID NO: 24, respectivamente. En una realización, un agonista de 4-1BB comprende regiones V<h>y V<l>que son cada una al menos un 96 % idénticas a las secuencias mostradas en la SEQ ID NO: 23 y la SEQ ID NO: 24, respectivamente. En una realización, un agonista de 4-1BB comprende regiones V<h>y V<l>que son cada una al menos un 95 % idénticas a las secuencias mostradas en la SEQ ID NO: 23 y la SEQ ID NO: 24, respectivamente. En una realización, un agonista de 4-1BB comprende un anticuerpo scFv que comprende regiones VH y VL que son cada una al menos un 99 % idénticas a las secuencias mostradas en la SEQ ID NO: 23 y la SEQ ID NO: 24.

En una realización, un agonista de 4-1BB comprende dominios CDR1, CDR2 y CDR3 de cadena pesada que tienen las secuencias establecidas en la SEQ ID NO: 25, la SEQ ID NO: 26 y la SEQ ID NO: 27, respectivamente, y sustituciones conservadoras de aminoácidos de las mismas, y dominios CDR1, CDR2 y CDR3 de cadena ligera que tienen las secuencias establecidas en la SEQ ID NO: 28, la SEQ ID NO: 29 y la SEQ ID NO: 30, respectivamente, y sustituciones conservadoras de aminoácidos de las mismas.

En una realización, el agonista de 4-1BB es un anticuerpo monoclonal biosimilar agonista de 4-1BB aprobado por las autoridades reguladoras de medicamentos con referencia al urelumab. En una realización, el anticuerpo monoclonal biosimilar comprende un anticuerpo 4-1BB que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos un 97 % de identidad de secuencia, por ejemplo, 97 %, 98 %, 99 % o 100 % de identidad de secuencia, con la secuencia de aminoácidos de un medicamento o producto biológico de referencia y que comprende una o más modificaciones postraduccionales en comparación con el medicamento o producto biológico de referencia, en el que el medicamento o producto biológico de referencia es urelumab. En algunas realizaciones, la una o más modificaciones postraduccionales se seleccionan entre una o más de las siguientes: glicosilación, oxidación, desamidación y truncamiento. En algunas realizaciones, el biosimilar es un anticuerpo agonista de 4-1BB autorizado o presentado para su autorización, en el que el anticuerpo agonista de 4-1BB se proporciona en una formulación que difiere de las formulaciones de un producto medicinal de referencia o producto biológico de referencia, en el que el producto medicinal de referencia o producto biológico de referencia es urelumab. El anticuerpo agonista de 4-1BB puede estar autorizado por una autoridad reguladora de medicamentos como la FDA de EE. UU. y/o la EMA de la Unión Europea. En algunas realizaciones, el biosimilar se proporciona como una composición que comprende además uno o más excipientes, en la que el uno o más excipientes son iguales o diferentes a los excipientes comprendidos en un producto medicinal de referencia o producto biológico de referencia, en el que el producto medicinal de referencia o producto biológico de referencia es urelumab. En algunas realizaciones, el biosimilar se proporciona como una composición que comprende además uno o más excipientes, donde el uno o más excipientes son iguales o diferentes a los excipientes comprendidos en un producto medicinal de referencia o producto biológico de referencia, donde el producto medicinal de referencia o producto biológico de referencia es urelumab.

Tabla 8: Secuencias de aminoácidos de los anticuerpos a onistas de 4-1BB relacionados con el urelumab.

E n u n a re a liz a c ió n , e l a g o n is ta d e 4 -1 B B s e s e le c c io n a d e l g ru p o q u e c o n s is te e n 1 D 8 , 3 E lo r , 4 B 4 (B io L e g e n d 309809 ) , H 4 -1 B B -M 127 (B D P h a rm in g e n 552532 ) , B B K 2 (T h e rm o F is h e r M S 621 P A B X ) , 145501 (L e in c o T e c h n o lo g ie s B 591 ), e l a n t ic u e rp o p ro d u c id o p o r la lín e a c e lu la r d e p o s ita d a c o m o A T C C N o . H B -11248 y d iv u lg a d a en la P a te n te d e lo s E s ta d o s U n id o s N o . 6 ,974 ,863 , 5 F 4 (B io L e g e n d 31 1503 ), C 65 -485 ( b D P h a rm in g e n 559446 ), a n t ic u e rp o s d iv u lg a d o s e n la P u b lic a c ió n d e la S o lic itu d d e P a te n te d e los E s ta d o s U n id o s N o . U S 2005 /0095244 , a n t ic u e rp o s d iv u lg a d o s en la P a te n te d e lo s E s ta d o s U n id o s N o . 7 ,288 ,638 (c o m o 20 H 4.9 - Ig G l (B M S -663031 )) , a n t ic u e rp o s d iv u lg a d o s e n la P a te n te d e lo s E s ta d o s U n id o s N o. 6 ,887 ,673 (c o m o 4 E 9 o B M S -554271 ) , a n t ic u e rp o s d iv u lg a d o s e n la P a te n te d e lo s E s ta d o s U n id o s N o. 7 ,214 ,493 , a n t ic u e rp o s d iv u lg a d o s en la P a te n te d e lo s E s ta d o s U n id o s N o . 6 ,303 ,121 , a n t ic u e rp o s d iv u lg a d o s en la P a te n te d e los E s ta d o s U n id o s N o. 6 ,569 ,997 , a n t ic u e rp o s d iv u lg a d o s e n la P a te n te d e lo s E s ta d o s U n id o s N o. 6 ,905 ,685 (c o m o 4 E 9 o B M S -554271 ) , a n t ic u e rp o s d iv u lg a d o s e n la P a te n te d e lo s E s ta d o s U n id o s N o. 6 ,362 ,325 (c o m o 1 d 8 o B M S -469492 ; 3 H 3 o B M S -469497 ; o 3 E l) , a n t ic u e rp o s d iv u lg a d o s e n la P a te n te d e lo s E s ta d o s U n id o s N o . 6 ,974 ,863 (c o m o 53 A 2 ); a n t ic u e rp o s d iv u lg a d o s e n la P a te n te d e los E s ta d o s U n id o s N o . 6 ,210 ,669 (c o m o 1 D 8 , 3 B 8 o 3 E l) , a n t ic u e rp o s d e s c r ito s en la P a te n te d e lo s E s ta d o s U n id o s N o. 5 ,928 ,893 , a n t ic u e rp o s d iv u lg a d o s en la P a te n te d e lo s E s ta d o s U n id o s N o . 6 ,303 ,121 , a n t ic u e rp o s d iv u lg a d o s en la P a te n te d e los E s ta d o s U n id o s N o. 6 ,569 ,997 , a n t ic u e rp o s d iv u lg a d o s e n las P u b lic a c io n e s d e la s S o lic itu d e s d e P a te n te In te rn a c io n a l N o s . W O 2012 /177788 , W O 2015 /119923 , y W O 2010 /042433 , y f ra g m e n to s , d e r iv a d o s , c o n ju g a d o s , v a r ia n te s o b io s im ila re s d e lo s m is m o s .

E n u n a re a liz a c ió n , e l a g o n is ta d e 4 -1 B B e s u n a p ro te ín a d e fu s ió n a g o n is ta d e 4 -1 B B d e s c r ita en las P u b lic a c io n e s d e la s S o lic itu d e s d e P a te n te In te rn a c io n a l N o s . W O 2008 /025516 A 1 , W O 2009 /007120 A 1 , W O 2010 /003766 A 1 , W O 2010 /010051 A 1 , y W O 2010 /078966 A 1 ; la s P u b lic a c io n e s d e P a te n te d e lo s E s ta d o s U n id o s N o s . U S 2011 /0027218 A 1 , U S 2015 /0126709 A 1 , U S 2011 /0111494 A 1 , U S 2015 /0110734 A 1 , y U S 2015 /0126710 A 1 ; y la s P a te n te s d e lo s E s ta d o s U n id o s N o s . 9 ,359 ,420 , 9 ,340 ,599 , 8 ,921 ,519 , y 8 ,450 ,460.

E n u n a re a liz a c ió n , e l a g o n is ta d e 4 -1 B B e s u n a p ro te ín a d e fu s ió n a g o n is ta d e 4 -1 B B c o m o s e re p re s e n ta en la E s tru c tu ra I-A (p ro te ín a d e fu s ió n d e l f ra g m e n to d e a n t ic u e rp o F c d e l te rm in a l C ) o e n la E s tru c tu ra I-B (p ro te ín a d e fu s ió n d e l f ra g m e n to d e a n t ic u e rp o F c d e l te rm in a l N ), o un fra g m e n to , d e r iv a d o , c o n ju g a d o , v a r ia n te o b io s im ila r d e la m is m a , c o m o s e p ro p o rc io n a e n la F ig u ra 10.

E n la s e s tru c tu ra s I-A e I-B , lo s c ilin d ro s se re f ie re n a d o m in io s d e u n ió n a p o lip é p tid o s in d iv id u a le s . L a s e s tru c tu ra s I-A e I-B c o m p re n d e n t re s d o m in io s d e u n ió n a T N F R S F lin e a lm e n te e n la z a d o s d e r iv a d o s d e , p o r e je m p lo , 4 -1 B B L o un a n t ic u e rp o q u e s e u n e a l 4 -1 B B , q u e se p lie g a n p a ra fo rm a r u n a p ro te ín a tr iv a le n te , q u e s e u n e a c o n t in u a c ió n a u n a s e g u n d a p ro te ín a tr iv a le n te a t ra v é s d e Ig G 1 -F c ( in c lu id o s lo s d o m in io s C h3 y C h2 ) s e u t iliz a a c o n t in u a c ió n p a ra u n ir d o s d e la s p ro te ín a s t r iv a le n te s a t ra v é s d e e n la c e s d is u lfu ro (p e q u e ñ o s ó v a lo s a la rg a d o s ) , e s ta b i l iz a n d o la e s tru c tu ra y p ro p o rc io n a n d o un a g o n is ta c a p a z d e re u n ir lo s d o m in io s de s e ñ a liz a c ió n in tra c e lu la r d e lo s s e is re c e p to re s y p ro te ín a s d e s e ñ a liz a c ió n p a ra fo rm a r un c o m p le jo de s e ñ a liz a c ió n . L o s d o m in io s d e u n ió n a l T N F R S F d e n o ta d o s c o m o c il in d ro s p u e d e n s e r d o m in io s s c F v q u e c o m p re n d e n , p o r e je m p lo , u n a c a d e n a V h y u n a c a d e n a V l c o n e c ta d a s p o r un e n la z a d o r q u e p u e d e c o m p re n d e r re s id u o s h id ró f ilo s y s e c u e n c ia s d e G ly y S e r p a ra la f le x ib il id a d , a s í c o m o G lu y L ys p a ra la s o lu b il id a d . P u e d e u t il iz a rs e c u a lq u ie r d is e ñ o d e d o m in io d e s c F v , c o m o lo s d e s c r ito s e n d e M a rc o , M ic ro b ia l C e ll F a c to r ie s , 2011 , 10, 44 ; A h m a d , e t a l., C lin . & D e v . Im m u n o l. 2012 , 980250 ; M o n n ie r , e t a l., A n t ib o d ie s , 2013 , 2, 193 -208. L a s e s tru c tu ra s d e p ro te ín a s d e fu s ió n d e e s ta fo rm a se d e s c r ib e n en la s P a te n te s d e los E s ta d o s U n id o s N o s . 9 ,359 ,420 , 9 ,340 ,599 , 8 ,921 ,519 , y 8 ,450 ,460.

L a s s e c u e n c ia s d e a m in o á c id o s p a ra lo s o tro s d o m in io s p o lip e p tíd ic o s d e la e s tru c tu ra I-A se in d ic a n e n la T a b la G G . E l d o m in io d e F c c o m p re n d e p re fe re n te m e n te un d o m in io c o n s ta n te c o m p le to (a m in o á c id o s 17 -230 d e la S E Q ID N O : 31 ) e l d o m in io b is a g ra c o m p le to (a m in o á c id o s 1 -16 d e la S E Q ID N O : 31 ) o u n a p o rc ió n d e l d o m in io b is a g ra (p o r e je m p lo , a m in o á c id o s 4 -16 d e la S E Q ID N O : 31 ). L o s e n la z a d o re s p re fe r id o s p a ra c o n e c ta r un a n t ic u e rp o F c d e l te rm in a l C p u e d e n s e le c c io n a rs e e n tre la s re a liz a c io n e s d a d a s en la S E Q ID N O : 32 a la S E Q ID N O : 41 , in c lu y e n d o e n la z a d o re s a d e c u a d o s p a ra la fu s ió n d e p o lip é p tid o s a d ic io n a le s .

T a b la 9: S e c u e n c ia s d e a m in o á c id o s p a ra la s p ro te ín a s d e fu s ió n T N F R S F , in c lu id a s la s p ro te ín a s d e fu s ió n 4 -1 B B , c o n d is e ñ o d e p ro te ín a d e fu s ió n d e l f ra g m e n to d e a n t ic u e rp o F c d e l te rm in a l C (e s tru c tu ra I-A ).

L a s s e c u e n c ia s d e a m in o á c id o s p a ra lo s o tro s d o m in io s p o lip e p tíd ic o s d e la e s tru c tu ra I-B se in d ic a n e n la T a b la H H . S i s e fu s io n a un fra g m e n to d e a n t ic u e rp o F c co n e l te rm in a l N d e u n a p ro te ín a d e fu s ió n T N R F S F c o m o e n la e s tru c tu ra I-B , la s e c u e n c ia d e l m ó d u lo F c e s p re fe r ib le m e n te la q u e se m u e s tra e n la S E Q ID N O : 42 , y la s s e c u e n c ia s e n la z a d o ra s s e s e le c c io n a n p re fe r ib le m e n te e n tre la s re a liz a c io n e s e x p u e s ta s e n la S E Q ID N O : 43 a la S E Q ID N O : 45.

T a b la 10: S e c u e n c ia s d e a m in o á c id o s p a ra p ro te ín a s d e fu s ió n T N F R S F , in c lu id a s la s p ro te ín a s d e fu s ió n 4 -1B B , c o n d is e ñ o d e p ro te ín a d e fu s ió n d e l f ra g m e n to d e a n t ic u e rp o F c d e l te rm in a l N (e s tru c tu ra I-B ).

E n u n a re a liz a c ió n , u n a p ro te ín a d e fu s ió n a g o n is ta d e 4 -1 B B s e g ú n la s e s tru c tu ra s I-A o I-B c o m p re n d e u n o o m á s d o m in io s d e u n ió n a 4 -1 B B s e le c c io n a d o s d e l g ru p o q u e c o n s is te en u n a c a d e n a p e s a d a v a r ia b le y u n a c a d e n a lig e ra v a r ia b le d e u to m ilu m a b , u n a c a d e n a p e s a d a v a r ia b le y u n a c a d e n a lig e ra v a r ia b le d e u re lu m a b , u n a c a d e n a p e s a d a v a r ia b le y u n a c a d e n a lig e ra v a r ia b le d e u to m ilu m a b , u n a c a d e n a p e s a d a v a r ia b le y u n a c a d e n a lig e ra v a r ia b le s e le c c io n a d a s e n tre la s c a d e n a s p e s a d a s v a r ia b le s y la s c a d e n a s lig e ra s v a r ia b le s d e s c r ita s e n la ta b la G G , c u a lq u ie r c o m b in a c ió n d e u n a c a d e n a p e s a d a v a r ia b le y u n a c a d e n a lig e ra v a r ia b le d e la s a n te r io re s , y f ra g m e n to s , d e r iv a d o s , c o n ju g a d o s , v a r ia n te s y b io s im ila re s d e la s m is m a s .

E n u n a re a liz a c ió n , u n a p ro te ín a d e fu s ió n a g o n is ta d e 4 -1 B B s e g ú n la s e s tru c tu ra s I-A o I-B c o m p re n d e u n o o m á s d o m in io s d e u n ió n a 4 -1 B B q u e c o m p re n d e n u n a s e c u e n c ia d e 4 -1 B B L . E n u n a re a liz a c ió n , u n a p ro te ín a d e fu s ió n a g o n is ta d e 4 -1 B B s e g ú n la s e s tru c tu ra s I-A o I-B c o m p re n d e u n o o m á s d o m in io s d e u n ió n a 4 -1 B B q u e c o m p re n d e n u n a s e c u e n c ia s e g ú n la S E Q ID N O : 46. E n u n a re a liz a c ió n , u n a p ro te ín a d e fu s ió n a g o n is ta d e 4 -1 B B s e g ú n la s e s t ru c tu ra s I-A o I-B c o m p re n d e u n o o m á s d o m in io s d e u n ió n a 4 -1 B B q u e c o m p re n d e n u n a s e c u e n c ia s o lu b le d e 4 -1 B B L . E n u n a re a liz a c ió n , u n a p ro te ín a d e fu s ió n a g o n is ta d e 4 -1 B B s e g ú n las e s tru c tu ra s I-A o I-B c o m p re n d e u n o o m á s d o m in io s d e u n ió n a 4 -1 B B q u e c o m p re n d e n u n a s e c u e n c ia s e g ú n la S E Q ID N O : 47.

E n u n a re a liz a c ió n , u n a p ro te ín a d e fu s ió n a g o n is ta d e 4 -1 B B s e g ú n la s e s tru c tu ra s I-A o I-B c o m p re n d e u n o o m á s d o m in io s d e u n ió n a 4 -1 B B q u e e s un d o m in io d e s c F v q u e c o m p re n d e re g io n e s V h y V l q u e s o n c a d a u n a a l m e n o s un 95 % id é n tic a s a la s s e c u e n c ia s m o s tra d a s en la S E Q ID N O : 13 y la S E Q ID N O : 14, re s p e c t iv a m e n te , e n la s q u e lo s d o m in io s d e V h y V l e s tá n c o n e c ta d o s p o r un e n la z a d o r . E n u n a re a liz a c ió n , u n a p ro te ín a d e fu s ió n a g o n is ta d e 4 -1 B B s e g ú n la s e s tru c tu ra s I-A o I-B c o m p re n d e u n o o m á s d o m in io s de u n ió n a 4 -1 B B q u e e s un d o m in io d e s c F v q u e c o m p re n d e re g io n e s V h y V l q u e s o n c a d a u n a a l m e n o s un 95 % id é n tic a s a la s s e c u e n c ia s m o s tra d a s e n la S E Q ID N O : 23 y la S E Q ID N O : 24 , re s p e c t iv a m e n te , e n la s q u e lo s d o m in io s d e V h y V l e s tá n c o n e c ta d o s p o r un e n la z a d o r . En u n a re a liz a c ió n , u n a p ro te ín a d e fu s ió n a g o n is ta d e 4 -1 B B s e g ú n la s e s tru c tu ra s I-A o I-B c o m p re n d e u n o o m á s d o m in io s d e u n ió n a 4 -1 B B q u e e s un d o m in io d e s c F v q u e c o m p re n d e la s re g io n e s V h y V l q u e s o n c a d a u n a a l m e n o s un 95 % id é n tic a s a la s s e c u e n c ia s d e V h y V l q u e f ig u ra n e n la T a b la 11, e n la q u e lo s d o m in io s d e V h y V l e s tá n c o n e c ta d o s p o r un e n la z a d o r .

T a b la 11: D o m in io s p o lip e p tíd ic o s a d ic io n a le s ú t ile s c o m o d o m in io s d e u n ió n a 4 -1 B B e n p ro te ín a s d e fu s ió n o c o m o a n t ic u e rp o s a g o n is ta s 4 -1 B B d e s cF v .

E n u n a re a liz a c ió n , e l a g o n is ta d e 4 -1 B B e s un p o lip é p tid o d e fu s ió n d e c a d e n a s e n c il la a g o n is ta d e 4 -1 B B q u e c o m p re n d e ( i) un p r im e r d o m in io s o lu b le d e u n ió n a 4 -1 B B , ( ii) un p r im e r e n la z a d o r p e p tíd ic o , ( iii) un s e g u n d o d o m in io s o lu b le d e u n ió n a 4 -1 B B , ( iv ) un s e g u n d o e n la z a d o r p e p tíd ic o , y (v ) un te rc e r d o m in io s o lu b le d e u n ió n a 4 -1 B B , q u e c o m p re n d e a d e m á s un d o m in io a d ic io n a l e n e l e x tre m o te rm in a l N y /o te rm in a l C, y e n e l q u e e l d o m in io a d ic io n a l e s un d o m in io d e f ra g m e n to F a b o Fc. E n u n a re a liz a c ió n , e l a g o n is ta d e 4 -1 B B e s un p o lip é p tid o d e fu s ió n d e c a d e n a s e n c il la a g o n is ta d e 4 -1 B B q u e c o m p re n d e ( i) un p r im e r d o m in io s o lu b le de u n ió n a 4 -1 B B , ( ii) un p r im e r e n la z a d o r p e p tíd ic o , ( iii) un s e g u n d o d o m in io s o lu b le d e u n ió n a 4 -1 B B , ( iv ) un s e g u n d o e n la z a d o r p e p tíd ic o , y (v ) un te rc e r d o m in io s o lu b le d e u n ió n a 4 -1 B B , q u e c o m p re n d e a d e m á s un d o m in io a d ic io n a l en e l e x tre m o te rm in a l N y /o te rm in a l C, e n e l q u e e l d o m in io a d ic io n a l e s un d o m in io de fra g m e n to F a b o Fc, e n e l q u e c a d a u n o d e lo s d o m in io s s o lu b le s d e 4 -1 B B c a re c e d e u n a re g ió n d e l ta llo (q u e c o n tr ib u y e a la t r im e r iz a c ió n y p ro p o rc io n a u n a c ie r ta d is ta n c ia a la m e m b ra n a c e lu la r, p e ro no fo rm a p a rte d e l d o m in io d e u n ió n a 4 -1 B B ) y e l p r im e r y e l s e g u n d o e n la z a d o r p e p tíd ic o t ie n e n in d e p e n d ie n te m e n te u n a lo n g itu d d e 3 -8 a m in o á c id o s .

E n u n a re a liz a c ió n , e l a g o n is ta d e 4 -1 B B e s un p o lip é p tid o d e fu s ió n d e c a d e n a s e n c il la a g o n is ta d e 4 -1 B B q u e c o m p re n d e (i) un p r im e r d o m in io d e c ito c in a d e la s u p e r fa m ilia d e l fa c to r d e n e c ro s is tu m o ra l (T N F ) s o lu b le , ( ii) un p r im e r e n la z a d o r p e p tíd ic o , ( iii) un s e g u n d o d o m in io d e c ito c in a d e la s u p e r fa m il ia d e l T N F s o lu b le , ( iv ) un s e g u n d o e n la z a d o r p e p tíd ic o , y (v ) un te rc e r d o m in io s o lu b le d e c ito c in a d e la s u p e r fa m il ia d e l T N F , e n e l q u e c a d a u n o d e lo s d o m in io s s o lu b le s d e c ito c in a d e la s u p e r fa m ilia d e l T N F c a re c e d e u n a re g ió n d e l ta llo y el p r im e r y e l s e g u n d o e n la z a d o r p e p tíd ic o t ie n e n in d e p e n d ie n te m e n te u n a lo n g itu d d e 3 -8 a m in o á c id o s , y e n e l q u e c a d a d o m in io d e c ito c in a d e la s u p e r fa m ilia d e l T N F e s un d o m in io d e u n ió n a 4 -1 B B .

E n u n a re a liz a c ió n , e l a g o n is ta d e 4 -1 B B e s un a n t ic u e rp o s c F v a g o n is ta d e 4 -1 B B q u e c o m p re n d e c u a lq u ie ra d e lo s d o m in io s d e V h a n te r io re s u n id o a c u a lq u ie ra d e lo s d o m in io s d e V l a n te r io re s .

E n u n a re a liz a c ió n , e l a g o n is ta d e 4 -1 B B e s e l a n tic u e rp o a g o n is ta d e 4 -1 B B d e B P S B io s c ie n c e N o . d e c a tá lo g o 79097 -2 , d is p o n ib le c o m e rc ia lm e n te a t ra v é s d e B P S B io s c ie n c e , S a n D ie g o , C A , E E . U U . E n u n a re a liz a c ió n , e l a g o n is ta d e 4 -1 B B e s e l a n t ic u e rp o a g o n is ta d e 4 -1 B B d e C re a t iv e B io la b s N o. d e c a tá lo g o M O M -18179 , d is p o n ib le c o m e rc ia lm e n te a t ra v é s d e C re a t iv e B io la b s , S h ir le y , N Y , E E .U U .

3. A g o n is ta s d e O X 40 (C D 134 )

E n u n a re a liz a c ió n , e l a g o n is ta d e T N F R S F e s un a g o n is ta d e O X 40 (C D 134 ) . E l a g o n is ta d e O X 40 p u e d e s e r c u a lq u ie r m o lé c u la d e u n ió n a O X 40 c o n o c id a en la té c n ic a . La m o lé c u la d e u n ió n a O X 40 p u e d e s e r un a n t ic u e rp o m o n o c lo n a l o u n a p ro te ín a d e fu s ió n c a p a z d e u n irs e a O X 40 h u m a n o o d e m a m ífe ro . L o s a g o n is ta s d e O X 40 o la s m o lé c u la s d e u n ió n a O X 40 p u e d e n c o m p re n d e r u n a c a d e n a p e s a d a d e in m u n o g lo b u lin a de c u a lq u ie r is o t ip o (p o r e je m p lo , IgG , IgE , Ig M , IgD , Ig A e Ig Y ), c la s e (p o r e je m p lo , Ig G 1 , Ig G 2 , Ig G 3 , Ig G 4 , IgA1 e Ig A 2 ) o s u b c la s e d e m o lé c u la d e in m u n o g lo b u lin a . El a g o n is ta d e O X 40 o la m o lé c u la d e u n ió n a O X 40 p u e d e n te n e r ta n to u n a c a d e n a p e s a d a c o m o u n a lig e ra . T a l y c o m o s e u tiliz a e n e l p re s e n te d o c u m e n to , e l té rm in o m o lé c u la d e u n ió n ta m b ié n in c lu y e a n t ic u e rp o s ( in c lu id o s a n t ic u e rp o s d e lo n g itu d c o m p le ta ) , a n t ic u e rp o s m o n o c lo n a le s ( in c lu id o s a n t ic u e rp o s m o n o c lo n a le s d e lo n g itu d c o m p le ta ) , a n t ic u e rp o s p o lic lo n a le s , a n t ic u e rp o s m u lt ie s p e c íf ic o s (p o r e je m p lo , a n t ic u e rp o s b ie s p e c íf ic o s ) , a n t ic u e rp o s h u m a n o s , h u m a n iz a d o s o q u im é r ic o s , y f ra g m e n to s d e a n tic u e rp o s , p o r e je m p lo , f r a g m e n to s F ab , f ra g m e n to s F (a b ') , f ra g m e n to s p ro d u c id o s p o r u n a b ib lio te c a d e e x p re s ió n d e F a b , f ra g m e n to s d e u n ió n a e p íto p o s d e c u a lq u ie ra d e los a n te r io re s , y fo rm a s m o d if ic a d a s d e a n tic u e rp o s , p o r e je m p lo , m o lé c u la s d e s c F v , q u e se u n e n a O X 40. E n u n a re a liz a c ió n , e l a g o n is ta d e O X 40 e s u n a p ro te ín a d e u n ió n a a n tíg e n o q u e e s un a n t ic u e rp o to ta lm e n te h u m a n o . E n u n a re a liz a c ió n , e l a g o n is ta d e O X 40 e s u n a p ro te ín a d e u n ió n a a n tíg e n o q u e e s un a n t ic u e rp o h u m a n iz a d o . E n a lg u n a s re a liz a c io n e s , lo s a g o n is ta s d e O X 40 p a ra su u so e n lo s m é to d o s y c o m p o s ic io n e s d iv u lg a d o s a c tu a lm e n te in c lu y e n a n t ic u e rp o s a n ti-O X 40 , a n t ic u e rp o s a n t i-O X 40 h u m a n o s , a n t ic u e rp o s a n t i-O X 40 d e ra tó n , a n t ic u e rp o s a n t i-O X 40 d e m a m ífe ro , a n t ic u e rp o s m o n o c lo n a le s a n ti-O X 40 , a n t ic u e rp o s p o lic lo n a le s a n ti-O X 40 , a n t ic u e rp o s q u im é r ic o s a n ti-O X 40 , a d n e c t in a s a n ti-O X 40 , a n t ic u e rp o s d e d o m in io a n t i-O X 40 , f ra g m e n to s a n ti-O X 40 d e c a d e n a s e n c illa , f ra g m e n to s a n t i-O X 40 d e c a d e n a p e s a d a , f ra g m e n to s a n t i-O X 40 d e c a d e n a lig e ra , p ro te ín a s d e fu s ió n a n t i-O X 40 y f ra g m e n to s , d e r iv a d o s , c o n ju g a d o s , v a r ia n te s o b io s im ila re s d e lo s m is m o s . E n u n a re a liz a c ió n p re fe r id a , e l a g o n is ta d e O X 40 e s un a n t ic u e rp o m o n o c lo n a l a g o n is ta , a n t i-O X 40 h u m a n iz a d o o to ta lm e n te h u m a n o (e s d e c ir , un a n t ic u e rp o d e r iv a d o d e u n a ú n ic a lín e a c e lu la r) .

E n u n a re a liz a c ió n p re fe r id a , e l a g o n is ta d e O X 40 o la m o lé c u la d e u n ió n a O X 40 ta m b ié n p u e d e s e r u n a p ro te ín a d e fu s ió n . L a s p ro te ín a s d e fu s ió n O X 40 q u e c o m p re n d e n un d o m in io d e F c fu s io n a d o a O X 40 L se d e s c r ib e n , p o r e je m p lo , e n S a d u n , e t a l., J. Im m u n o th e r . 2009 , 182 , 1481 -89. E n u n a re a liz a c ió n p re fe r id a , un a g o n is ta d e O X 40 m u ltim é r ic o , c o m o un a g o n is ta d e O X 40 tr im é r ic o o h e x a m é r ic o (c o n t re s o s e is d o m in io s de u n ió n a l l ig a n d o ), p u e d e in d u c ir u n a a g ru p a c ió n s u p e r io r d e l re c e p to r (O X 40 L ) y la fo rm a c ió n d e c o m p le jo s d e s e ñ a liz a c ió n c e lu la r in te rn a e n c o m p a ra c ió n c o n un a n t ic u e rp o m o n o c lo n a l a g o n is ta , q u e n o rm a lm e n te p o s e e d o s d o m in io s d e u n ió n a l l ig a n d o . L a s p ro te ín a s d e fu s ió n t r im é r ic a s ( t r iv a le n te s ) o h e x a m é r ic a s (o h e x a v a le n te s ) o m a y o re s q u e c o m p re n d e n tre s d o m in io s d e u n ió n a l T N F R S F e Ig G 1 - F c y q u e o p c io n a lm e n te u n e n a d e m á s d o s o m á s d e e s ta s p ro te ín a s d e fu s ió n se d e s c r ib e n , p o r e je m p lo , e n G ie ffe rs , e t a l., M o l. C a n c e r T h e ra p e u t ic s 2013 , 12, 2735 -47.

S e s a b e q u e lo s a n t ic u e rp o s O X 40 a g o n is ta s y las p ro te ín a s d e fu s ió n in d u c e n fu e r te s re s p u e s ta s in m u n ita r ia s . C u rti, e t a l., C a n c e r R e s . 2013 , 73 , 7189 -98. E n u n a re a liz a c ió n p re fe r id a , e l a g o n is ta d e O X 40 e s un a n t ic u e rp o m o n o c lo n a l o u n a p ro te ín a d e fu s ió n q u e s e u n e e s p e c íf ic a m e n te a l a n tíg e n o O X 40 d e m a n e ra s u f ic ie n te p a ra re d u c ir la to x ic id a d . E n a lg u n a s re a liz a c io n e s , e l a g o n is ta d e O X 40 e s un a n t ic u e rp o m o n o c lo n a l a g o n is ta de O X 40 o u n a p ro te ín a d e fu s ió n q u e a n u la la to x ic id a d c e lu la r d e p e n d ie n te d e a n t ic u e rp o s (A D C C ), p o r e je m p lo , la c ito to x ic id a d d e la s c é lu la s N K . E n a lg u n a s re a liz a c io n e s , e l a g o n is ta d e O X 40 e s un a n t ic u e rp o m o n o c lo n a l O X 40 a g o n is ta o u n a p ro te ín a d e fu s ió n q u e a n u la la fa g o c ito s is c e lu la r d e p e n d ie n te d e a n t ic u e rp o s (A D C P ). E n a lg u n a s re a liz a c io n e s , e l a g o n is ta d e O X 40 e s un a n t ic u e rp o m o n o c lo n a l O X 40 a g o n is ta o u n a p ro te ín a d e fu s ió n q u e a n u la la c ito to x ic id a d d e p e n d ie n te d e l c o m p le m e n to (C D C ). E n a lg u n a s re a liz a c io n e s , e l a g o n is ta d e O X 40 e s un a n t ic u e rp o m o n o c lo n a l O X 40 a g o n is ta o u n a p ro te ín a d e fu s ió n q u e a n u la la fu n c io n a lid a d d e la re g ió n Fc.

E n a lg u n a s re a liz a c io n e s , lo s a g o n is ta s d e O X 40 s e c a ra c te r iz a n p o r u n irs e a l O X 40 h u m a n o (S E Q ID N O : 54 ) c o n a lta a f in id a d y a c t iv id a d a g o n is ta . E n u n a re a liz a c ió n , e l a g o n is ta d e O X 40 e s u n a m o lé c u la d e u n ió n q u e s e u n e a la O X 40 h u m a n o (S E Q ID N O : 54 ). E n u n a re a liz a c ió n , e l a g o n is ta d e O X 40 e s u n a m o lé c u la d e u n ió n q u e s e u n e a O X 40 m u r in o (S E Q ID N O : 55 ). L a s s e c u e n c ia s d e a m in o á c id o s d e l a n tíg e n o O X 40 a lo s q u e se u n e un a g o n is ta d e O X 40 o u n a m o lé c u la d e u n ió n s e re s u m e n e n la T a b la 12.

T a b la 12: S e c u e n c ia s d e a m in o á c id o s d e lo s a n tíg e n o s O X 40.

E n a lg u n a s re a liz a c io n e s , la s c o m p o s ic io n e s , lo s p ro c e s o s y lo s m é to d o s d e s c r ito s in c lu y e n un a g o n is ta de O X 40 q u e se u n e a O X 40 h u m a n o o m u r in o co n u n a K d d e a p ro x im a d a m e n te 100 pM o in fe rio r, se u n e a O X 40 h u m a n o o m u r in o co n u n a K d d e a p ro x im a d a m e n te 90 pM o in fe r io r , s e u n e a O X 40 h u m a n o o m u r in o co n u n a K d d e a p ro x im a d a m e n te 80 p M o in fe r io r , s e u n e a O X 40 h u m a n o o m u r in o co n u n a K d d e a p ro x im a d a m e n te 70 pM o in fe r io r , s e u n e a O X 40 h u m a n o o m u r in o c o n u n a K d d e a p ro x im a d a m e n te 60 pM o in fe r io r , s e u n e a O X 40 h u m a n o o m u r in o c o n u n a K d d e a p ro x im a d a m e n te 50 pM o in fe r io r , s e u n e a O X 40 h u m a n o o m u r in o c o n u n a K d d e a p ro x im a d a m e n te 40 pM o in fe r io r , o se u n e a O X 40 h u m a n o o m u r in o co n u n a K d de a p ro x im a d a m e n te 30 pM o in fe rio r .

E n a lg u n a s re a liz a c io n e s , la s c o m p o s ic io n e s , lo s p ro c e s o s y lo s m é to d o s d e s c r ito s in c lu y e n un a g o n is ta de O X 40 q u e se u n e a O X 40 h u m a n o o m u r in o c o n u n a kasociación d e a p ro x im a d a m e n te 7.5 * 105 1 / M s o m á s rá p id o , se u n e a O X 40 h u m a n o o m u r in o co n u n a kasociación d e a p ro x im a d a m e n te 7.5 * 105 1 /M s o m á s rá p id o , s e u n e a O X 40 h u m a n o o m u r in o c o n u n a kasociación d e a p ro x im a d a m e n te 8 * 105 1 /M s o m á s rá p id o , se u n e a O X 40 h u m a n o o m u r in o c o n u n a kasociación d e a p ro x im a d a m e n te 8.5 * 105 1 /M s o m á s rá p id o , s e u n e a l O X 40 h u m a n o o m u r in o co n u n a kasociación d e a p ro x im a d a m e n te 9 * 105 1 /M s o m á s rá p id o , s e u n e a l O X 40 h u m a n o o m u r in o co n u n a kasociación d e a p ro x im a d a m e n te 9.5 * 105 1 /M s o m á s rá p id o , o se u n e a l O X 40 h u m a n o o m u r in o c o n u n a kasociación d e a p ro x im a d a m e n te 1 * 106 1 /M s o m á s rá p id o .

E n a lg u n a s re a liz a c io n e s , la s c o m p o s ic io n e s , p ro c e s o s y m é to d o s d e s c r ito s in c lu y e n un a g o n is ta d e O X 40 q u e s e u n e a O X 40 h u m a n o o m u r in o co n u n a kasociación d e a p ro x im a d a m e n te 2 * 10 '5 1 /s o m á s le n to , se u n e a O X 40 h u m a n o o m u r in o c o n u n a kasociación d e a p ro x im a d a m e n te 2.1 * 10 '5 1 /s o m á s le n to , se u n e a O X 40 h u m a n o o m u r in o co n u n a kdisociación d e a p ro x im a d a m e n te 2.2 * 10 '5 1 /s o m á s le n to , s e u n e a O X 40 h u m a n o o m u r in o c o n u n a kdisociación d e a p ro x im a d a m e n te 2.3 * 10 '5 1 /s o m á s le n to , se u n e a O X 40 h u m a n o o m u r in o co n una kdisociaciónde aproximadamente 2.4 * 10-51/s o más lento, se une a OX40 humano o murino con una kdisociación de aproximadamente 2.5 * 10-51/s o más lento, se une a OX40 humano o murino con una kdisociación de aproximadamente 2.6 * 10-5 1/s o más lento o se une a OX40 humano o murino con una kdisociación de aproximadamente 2.7 * 10 1/s o más lento, se une a OX40 humano o murino con una kdisociación de aproximadamente 2.8 * 10-5 1/s o más lento, se une a OX40 humano o murino con una kdisociación de aproximadamente 2.9 * 10-5 1/s o más lento, o se une a OX40 humano o murino con una kdisociación de aproximadamente 3 * 10-51/s o más lento.

En algunas realizaciones, las composiciones, procesos y métodos descritos incluyen un agonista de OX40 que se une a OX40 humano o murino con una IC50 de aproximadamente 10 nM o inferior, se une a OX40 humano o murino con una IC50 de aproximadamente 9 nM o inferior, se une a OX40 humano o murino con una IC50 de aproximadamente 8 nM o inferior, se une a OX40 humano o murino con una IC50 de aproximadamente 7 nM o inferior, se une a OX40 humano o murino con una IC50 de aproximadamente 6 nM o inferior, se une a OX40 humano o murino con una IC50 de aproximadamente 5 nM o inferior, se une a OX40 humano o murino con una IC50 de aproximadamente 4 nM o inferior, se une a OX40 humano o murino con una IC50 de aproximadamente 3 nM o inferior, se une a OX40 humano o murino con una IC50 de aproximadamente 2 nM o inferior, o se une a OX40 humano o murino con una IC50 de aproximadamente 1 nM o inferior.

En algunas realizaciones, el agonista de OX40 es tavolixizumab, también conocido como MEDI0562 o MEDI-0562. El tavolixizumab está disponible a través de la filial MedImmune de AstraZeneca, Inc. El tavolixizumab es una inmunoglobulina G1-kappa, anti-[TNFRSF4 deHomo sapiens(miembro 4 de la superfamilia del receptor del factor de necrosis tumoral (TNFR), OX40, CD134)], anticuerpo monoclonal humanizado y quimérico. Las secuencias de aminoácidos del tavolixizumab se exponen en la tabla KK. El tavolixizumab comprende sitios de N-glicosilación en las posiciones 301 y 301", con glicanos complejos fucosilados biantenarios de tipo CHO; puentes disulfuro entre cadenas de cadena pesada en las posiciones 22-95 (V<h>-V<l>), 148-204 (C<h>1-C<l>), 265 325 (C<h>2) y 371-429 (C<h>3) (y en las posiciones 22"-95", 148"-204", 265"-325" y 371"-429"); puentes disulfuro entre cadenas de cadena ligera en las posiciones 23'-88' (V<h>-V<l>) y 134'-194' (C<h>1-C<l>) (y en las posiciones 23m-88m y 134m-194m); puentes disulfuro entre cadenas de cadena pesada-cadena pesada en las posiciones 230 230" y 233-233"; y puentes disulfuro entre cadenas de cadena pesada-cadena ligera en las posiciones 224 214' y 224"-214"'. Los ensayos clínicos actuales de tavolixizumab en diversas indicaciones de tumores sólidos incluyen los identificadores NCT02318394 y NCT02705482 de los Institutos Nacionales de Salud clinicaltrials.gov.

En una realización, un agonista de OX40 comprende una cadena pesada dada por la SEQ ID NO: 56 y una cadena ligera dada por la SEQ ID NO: 57. En una realización, un agonista de OX40 comprende cadenas pesadas y ligeras que tienen las secuencias mostradas en la SEQ ID NO: 56 y la SEQ ID NO: 57, respectivamente, o fragmentos de unión a antígeno, fragmentos Fab, fragmentos variables de cadena sencilla (scFv), variantes o conjugados de los mismos. En una realización, un agonista de OX40 comprende cadenas pesadas y ligeras que son cada una al menos un 99 % idénticas a las secuencias mostradas en la SEQ ID NO: 56 y la SEQ ID NO: 57, respectivamente. En una realización, un agonista de OX40 comprende cadenas pesadas y ligeras que son cada una al menos un 98 % idénticas a las secuencias mostradas en la SEQ ID NO: 56 y la SEQ ID NO: 57, respectivamente. En una realización, un agonista de OX40 comprende cadenas pesadas y ligeras que son cada una al menos un 97 % idénticas a las secuencias mostradas en la SEQ ID NO: 56 y la SEQ ID NO: 57, respectivamente. En una realización, un agonista de OX40 comprende cadenas pesadas y ligeras que son cada una al menos un 96 % idénticas a las secuencias mostradas en la SEQ ID NO: 56 y la SEQ ID NO: 57, respectivamente. En una realización, un agonista de OX40 comprende cadenas pesadas y ligeras que son cada una al menos un 95 % idénticas a las secuencias mostradas en la SEQ ID NO: 56 y la s Eq ID NO: 57, respectivamente.

En una realización, el agonista de OX40 comprende las CDR o regiones variables (VR) de las cadenas pesadas y ligeras del tavolixizumab. En una realización, la región variable de la cadena pesada del agonista de OX40 (V<h>) comprende la secuencia que se muestra en la SEQ ID NO: 58, y la región variable de la cadena ligera del agonista de OX40 (V<l>) comprende la secuencia que se muestra en la SEQ ID NO: 59, y sustituciones conservadoras de aminoácidos de la misma. En una realización, un agonista de OX40 comprende las regiones V<h>y V<l>que son cada una al menos un 99 % idénticas a las secuencias mostradas en la SEQ ID NO: 58 y la SEQ ID NO: 59, respectivamente. En una realización, un agonista de OX40 comprende regiones V<h>y V<l>que son cada una al menos un 98 % idénticas a las secuencias mostradas en la SEQ ID NO: 58 y la SEQ ID NO: 59, respectivamente. En una realización, un agonista de OX40 comprende regiones V<h>y V<l>que son cada una al menos un 97 % idénticas a las secuencias mostradas en la SEQ ID NO: 58 y la SEQ ID NO: 59, respectivamente. En una realización, un agonista de OX40 comprende regiones V<h>y V<l>que son cada una al menos un 96 % idénticas a las secuencias mostradas en la SEQ ID NO: 58 y la SEQ ID NO: 59, respectivamente. En una realización, un agonista de OX40 comprende regiones V<h>y V<l>que son cada una al menos un 95 % idénticas a las secuencias mostradas en la SEQ ID NO: 58 y la SEQ ID NO: 59, respectivamente. En una realización, un agonista de OX40 comprende un anticuerpo scFv que comprende regiones V<h>y V<l>que son cada una al menos un 99 % idénticas a las secuencias mostradas en la SEQ ID NO: 58 y la SEQ ID NO: 59.

En una realización, un agonista de OX40 comprende dominios CDR1, CDR2 y CDR3 de cadena pesada que tienen las secuencias establecidas en la SEQ ID NO: 60, la SEQ ID NO: 61 y la SEQ ID NO: 62, respectivamente, y sustituciones conservadoras de aminoácidos de las mismas, y dominios CDR1, CDR2 y CDR3 de cadena ligera que tienen las secuencias establecidas en la SEQ ID NO: 63, la SEQ ID NO: 64 y la SEQ ID NO: 65, respectivamente, y sustituciones conservadoras de aminoácidos de las mismas.

En una realización, el agonista de OX40 es un anticuerpo monoclonal biosimilar al agonista de OX40 aprobado por las autoridades reguladoras de medicamentos con referencia al tavolixizumab. En una realización, el anticuerpo monoclonal biosimilar comprende un anticuerpo OX40 que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos un 97 % de identidad de secuencia, por ejemplo, 97 %, 98 %, 99 % o 100 % de identidad de secuencia, con la secuencia de aminoácidos de un producto medicinal de referencia o producto biológico de referencia y que comprende una o más modificaciones postraduccionales en comparación con el producto medicinal de referencia o producto biológico de referencia, en el que el producto medicinal de referencia o producto biológico de referencia es el tavolixizumab. En algunas realizaciones, la una o más modificaciones postraduccionales se seleccionan entre una o más de las siguientes: glicosilación, oxidación, desamidación y truncamiento. En algunas realizaciones, el biosimilar es un anticuerpo agonista de OX40 autorizado o presentado para su autorización, en el que el anticuerpo agonista de OX40 se proporciona en una formulación que difiere de las formulaciones de un producto medicinal de referencia o producto biológico de referencia, en el que el producto medicinal de referencia o producto biológico de referencia es tavolixizumab. El anticuerpo agonista de OX40 puede estar autorizado por una autoridad reguladora de medicamentos como la FDA de los Estados Unidos y/o la EMA de la Unión Europea. En algunas realizaciones, el biosimilar se suministra como una composición que comprende además uno o más excipientes, en el que el uno o más excipientes son iguales o diferentes a los excipientes comprendidos en un producto medicinal de referencia o producto biológico de referencia, en el que el producto medicinal de referencia o producto biológico de referencia es tavolixizumab. En algunas realizaciones, el biosimilar se proporciona como una composición que comprende además uno o más excipientes, en el que el uno o más excipientes son iguales o diferentes a los excipientes comprendidos en un producto medicinal de referencia o producto biológico de referencia, en el que el producto medicinal de referencia o producto biológico de referencia es tavolixizumab.

Tabla 13: Secuencias de aminoácidos de los anticuerpos agonistas de OX40 relacionados con el tavolixizumab.

En algunas realizaciones, el agonista de OX40 es el 11D4, que es un anticuerpo totalmente humano disponible a través de Pfizer, Inc. La preparación y las propiedades del 11D4 se describen en las Patentes de los Estados Unidos Nos. 7,960,515; 8,236,930; y 9,028,824. Las secuencias de aminoácidos del 11D4 se exponen en la Tabla LL.

En una realización, un agonista de OX40 comprende una cadena pesada dada por la SEQ ID NO: 66 y una cadena ligera dada por la SEQ ID NO: 67. En una realización, un agonista de OX40 comprende cadenas pesadas y ligeras que tienen las secuencias mostradas en la SEQ ID NO: 66 y la SEQ ID NO: 67, respectivamente, o fragmentos de unión a antígeno, fragmentos Fab, fragmentos variables de cadena sencilla (scFv), variantes o conjugados de los mismos. En una realización, un agonista de OX40 comprende cadenas pesadas y ligeras que son cada una al menos un 99 % idénticas a las secuencias mostradas en la SEQ ID NO: 66 y la SEQ ID NO: 67, respectivamente. En una realización, un agonista de OX40 comprende cadenas pesadas y ligeras que son cada una al menos un 98 % idénticas a las secuencias mostradas en la SEQ ID NO: 66 y la SEQ ID NO: 67, respectivamente. En una realización, un agonista de OX40 comprende cadenas pesadas y ligeras que son cada una al menos un 97 % idénticas a las secuencias mostradas en la SEQ ID NO: 66 y la SEQ ID NO: 67, respectivamente. En una realización, un agonista de OX40 comprende cadenas pesadas y ligeras que son cada una al menos un 96 % idénticas a las secuencias mostradas en la SEQ ID NO: 66 y la SEQ ID NO: 67, respectivamente. En una realización, un agonista de OX40 comprende cadenas pesadas y ligeras que son cada una al menos un 95 % idénticas a las secuencias mostradas en la SEQ ID NO: 66 y la s Eq ID NO: 67, respectivamente.

En una realización, el agonista de OX40 comprende las CDR o regiones variables (VR) de las cadenas pesadas y ligeras del 11D4. En una realización, la región variable de la cadena pesada del agonista de OX40 (V<h>) comprende la secuencia mostrada en la SEQ ID NO: 68, y la región variable de la cadena ligera del agonista de OX40 (V<l>) comprende la secuencia mostrada en la SEQ ID NO: 69, y sustituciones conservadoras de aminoácidos de la misma. En una realización, un agonista de OX40 comprende las regiones V<h>y V<l>que son cada una al menos un 99 % idénticas a las secuencias mostradas en la SEQ ID NO: 68 y la SEQ ID NO: 69, respectivamente. En una realización, un agonista de OX40 comprende regiones V<h>y V<l>que son cada una al menos un 98 % idénticas a las secuencias mostradas en la SEQ ID NO: 68 y la SEQ ID NO: 69, respectivamente. En una realización, un agonista de OX40 comprende regiones V<h>y V<l>que son cada una al menos un 97 % idénticas a las secuencias mostradas en la SEQ ID NO: 68 y la SEQ ID NO: 69, respectivamente. En una realización, un agonista de OX40 comprende regiones V<h>y V<l>que son cada una al menos un 96 % idénticas a las secuencias mostradas en la SEQ ID NO: 68 y la SEQ ID NO: 69, respectivamente. En una realización, un agonista de OX40 comprende regiones V<h>y V<l>que son cada una al menos un 95 % idénticas a las secuencias mostradas en la SEQ ID NO: 68 y la SEQ ID NO: 69, respectivamente.

En una realización, un agonista de OX40 comprende dominios CDR1, CDR2 y CDR3 de cadena pesada que tienen las secuencias establecidas en la SEQ ID NO: 70, la SEQ ID NO: 71 y la SEQ ID NO: 72, respectivamente, y sustituciones conservadoras de aminoácidos de las mismas, y dominios CDR1, CDR2 y CDR3 de cadena ligera que tienen las secuencias establecidas en la SEQ ID NO: 73, la SEQ ID NO: 74 y la SEQ ID NO: 75, respectivamente, y sustituciones conservadoras de aminoácidos de las mismas.

En una realización, el agonista de OX40 es un anticuerpo monoclonal biosimilar agonista de OX40 aprobado por las autoridades reguladoras de medicamentos con referencia al 11D4. En una realización, el anticuerpo monoclonal biosimilar comprende un anticuerpo OX40 que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos un 97%de identidad de secuencia, por ejemplo, 97 %, 98 %, 99%o 100%de identidad de secuencia, con la secuencia de aminoácidos de un producto medicinal de referencia o un producto biológico de referencia y que comprende una o más modificaciones postraduccionales en comparación con el producto medicinal de referencia o el producto biológico de referencia, en el que el producto medicinal de referencia o el producto biológico de referencia es el 11D4. En algunas realizaciones, la una o más modificaciones postraduccionales se seleccionan entre una o más de las siguientes: glicosilación, oxidación, desamidación y truncamiento. En algunas realizaciones, el biosimilar es un anticuerpo agonista de OX40 autorizado o presentado para su autorización, en el que el anticuerpo agonista de OX40 se proporciona en una formulación que difiere de las formulaciones de un producto medicinal de referencia o producto biológico de referencia, en el que el producto medicinal de referencia o producto biológico de referencia es el 11D4. El anticuerpo agonista de OX40 puede estar autorizado por una autoridad reguladora de medicamentos como la FDA de los Estados Unidos y/o la EMA de la Unión Europea. En algunas realizaciones, el biosimilar se suministra como una composición que comprende además uno o más excipientes, en la que el uno o más excipientes son iguales o diferentes a los excipientes comprendidos en un producto medicinal de referencia o producto biológico de referencia, en la que el producto medicinal de referencia o producto biológico de referencia es 11D4. En algunas realizaciones, el biosimilar se proporciona como una composición que comprende además uno o más excipientes, en la que el uno o más excipientes son iguales o diferentes a los excipientes comprendidos en un producto medicinal de referencia o producto biológico de referencia, en la que el producto medicinal de referencia o producto biológico de referencia es 11D4.

Tabla 14: Secuencias de aminoácidos para los anticuerpos a onistas de OX40 relacionados con el 11D4.

VPS60 FPP120 TLT180

En algunas realizaciones, el agonista de OX40 es el 18D8, que es un anticuerpo totalmente humano disponible a través de Pfizer, Inc. La preparación y las propiedades del 18D8 se describen en las Patentes de los Estados Unidos Nos. 7,960,515; 8,236,930; y 9,028,824. Las secuencias de aminoácidos del 18D8 se exponen en la Tabla MM.

En una realización, un agonista de OX40 comprende una cadena pesada dada por la SEQ ID NO: 76 y una cadena ligera dada por la SEQ ID NO: 77. En una realización, un agonista de OX40 comprende cadenas pesadas y ligeras que tienen las secuencias mostradas en la SEQ ID NO: 76 y la SEQ ID NO: 77, respectivamente, o fragmentos de unión a antígeno, fragmentos Fab, fragmentos variables de cadena sencilla (scFv), variantes o conjugados de los mismos. En una realización, un agonista de OX40 comprende cadenas pesadas y ligeras que son cada una al menos un 99 % idénticas a las secuencias mostradas en la SEQ ID NO: 76 y la SEQ ID NO: 77, respectivamente. En una realización, un agonista de OX40 comprende cadenas pesadas y ligeras que son cada una al menos un 98 % idénticas a las secuencias mostradas en la SEQ ID NO: 76 y la SEQ ID NO: 77, respectivamente. En una realización, un agonista de OX40 comprende cadenas pesadas y ligeras que son cada una al menos un 97 % idénticas a las secuencias mostradas en la SEQ ID NO: 76 y la SEQ ID NO: 77, respectivamente. En una realización, un agonista de OX40 comprende cadenas pesadas y ligeras que son cada una al menos un 96 % idénticas a las secuencias mostradas en la SEQ ID NO: 76 y la SEQ ID NO: 77, respectivamente. En una realización, un agonista de OX40 comprende cadenas pesadas y ligeras que son cada una al menos un 95 % idénticas a las secuencias mostradas en la SEQ ID NO: 76 y la<s>E<q>ID NO: 77, respectivamente.

En una realización, el agonista de OX40 comprende las CDR o regiones variables (VR) de las cadenas pesadas y ligeras del 18D8. En una realización, la región variable de la cadena pesada del agonista de OX40 (V<h>) comprende la secuencia mostrada en la SEQ ID NO: 78, y la región variable de la cadena ligera del agonista de OX40 (V<l>) comprende la secuencia mostrada en la SEQ ID NO: 79, y sustituciones conservadoras de aminoácidos de la misma. En una realización, un agonista de OX40 comprende las regiones V<h>y V<l>que son cada una al menos un 99 % idénticas a las secuencias mostradas en la SEQ ID NO: 78 y la SEQ ID NO: 79, respectivamente. En una realización, un agonista de OX40 comprende regiones V<h>y V<l>que son cada una al menos un 98 % idénticas a las secuencias mostradas en la SEQ ID NO: 78 y la SEQ ID NO: 79, respectivamente. En una realización, un agonista de OX40 comprende regiones V<h>y V<l>que son cada una al menos un 97 % idénticas a las secuencias mostradas en la SEQ ID NO: 78 y la SEQ ID NO: 79, respectivamente. En una realización, un agonista de OX40 comprende regiones V<h>y V<l>que son cada una al menos un 96 % idénticas a las secuencias mostradas en la SEQ ID NO: 78 y la SEQ ID NO: 79, respectivamente. En una realización, un agonista de OX40 comprende regiones V<h>y V<l>que son cada una al menos un 95 % idénticas a las secuencias mostradas en la SEQ ID NO: 78 y la SEQ ID NO: 79, respectivamente.

En una realización, un agonista de OX40 comprende dominios CDR1, CDR2 y CDR3 de cadena pesada que tienen las secuencias establecidas en la SEQ ID NO: 80, la SEQ ID NO: 81 y la SEQ ID NO: 82, respectivamente, y sustituciones conservadoras de aminoácidos de las mismas, y dominios CDR1, CDR2 y CDR3 de cadena ligera que tienen las secuencias establecidas en la SEQ ID NO: 83, la SEQ ID NO: 84 y la SEQ ID NO: 85, respectivamente, y sustituciones conservadoras de aminoácidos de las mismas.

En una realización, el agonista de OX40 es un anticuerpo monoclonal biosimilar agonista de OX40 aprobado por las autoridades reguladoras de medicamentos con referencia al 18D8. En una realización, el anticuerpo monoclonal biosimilar comprende un anticuerpo OX40 que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos un 97 % de identidad de secuencia, por ejemplo, 97 %, 98 %, 99 % o 100 % de identidad de secuencia, con la secuencia de aminoácidos de un producto medicinal de referencia o producto biológico de referencia y que comprende una o más modificaciones postraduccionales en comparación con el producto medicinal de referencia o producto biológico de referencia, en el que el producto medicinal de referencia o producto biológico de referencia es el 18D8. En algunas realizaciones, la una o más modificaciones postraduccionales se seleccionan entre una o más de las siguientes: glicosilación, oxidación, desamidación y truncamiento. En algunas realizaciones, el biosimilar es un anticuerpo agonista de OX40 autorizado o presentado para su autorización, en el que el anticuerpo agonista de OX40 se proporciona en una formulación que difiere de las formulaciones de un producto medicinal de referencia o producto biológico de referencia, en el que el producto medicinal de referencia o producto biológico de referencia es el 18D8. El anticuerpo agonista de OX40 puede estar autorizado por una autoridad reguladora de medicamentos como la FDA de los Estados Unidos y/o la EMA de la Unión Europea. En algunas realizaciones, el biosimilar se proporciona como una composición que comprende además uno o más excipientes, en los que el uno o más excipientes son iguales o diferentes a los excipientes comprendidos en un producto medicinal de referencia o producto biológico de referencia, en los que el producto medicinal de referencia o producto biológico de referencia es 18D8. En algunas realizaciones, el biosimilar se proporciona como una composición que comprende además uno o más excipientes, en la que el uno o más excipientes son iguales o diferentes a los excipientes comprendidos en un producto medicinal de referencia o producto biológico de referencia, en el que el producto medicinal de referencia o producto biológico de referencia es 18D8.

Tabla 15: Secuencias de aminoácidos para los anticuerpos agonistas de OX40 relacionados con el 18D8.

En algunas realizaciones, el agonista de OX40 es Hu119-122, que es un anticuerpo humanizado disponible a través de GlaxoSmithKline plc. La preparación y las propiedades de Hu119-122 se describen en las Patentes de los Estados Unidos Nos. 9,006,399 y 9,163,085, y en la Publicación de Patente Internacional No. WO 2012/027328. Las secuencias de aminoácidos de Hu119-122 se exponen en la tabla NN.

En una realización, el agonista de OX40 comprende las CDR o regiones variables (VR) de las cadenas pesadas y ligeras de Hu119-122. En una realización, la región variable de la cadena pesada del agonista de OX40 (V<h>) comprende la secuencia mostrada en la SEQ ID NO: 86, y la región variable de la cadena ligera del agonista de OX40 (V<l>) comprende la secuencia mostrada en la SEQ ID NO: 87, y sustituciones conservadoras de aminoácidos de la misma. En una realización, un agonista de OX40 comprende las regiones V<h>y V<l>que son cada una al menos un 99 % idénticas a las secuencias mostradas en la SEQ ID NO: 86 y la SEQ ID NO: 87, respectivamente. En una realización, un agonista de OX40 comprende regiones V<h>y V<l>que son cada una al menos un 98 % idénticas a las secuencias mostradas en la SEQ ID NO: 86 y la SEQ ID NO: 87, respectivamente. En una realización, un agonista de OX40 comprende regiones V<h>y V<l>que son cada una al menos un 97 % idénticas a las secuencias mostradas en la SEQ ID NO: 86 y la SEQ ID NO: 87, respectivamente. En una realización, un agonista de OX40 comprende regiones V<h>y V<l>que son cada una al menos un 96 % idénticas a las secuencias mostradas en la SEQ ID NO: 86 y la SEQ ID NO: 87, respectivamente. En una realización, un agonista de OX40 comprende regiones V<h>y V<l>que son cada una al menos un 95 % idénticas a las secuencias mostradas en la SEQ ID NO: 86 y la SEQ ID NO: 87, respectivamente.

En una realización, un agonista de OX40 comprende dominios CDR1, CDR2 y CDR3 de cadena pesada que tienen las secuencias establecidas en la SEQ ID NO: 88, la SEQ ID NO: 89 y la SEQ ID NO: 90, respectivamente, y sustituciones conservadoras de aminoácidos de las mismas, y dominios CDR1, CDR2 y CDR3 de cadena ligera que tienen las secuencias establecidas en la SEQ ID NO: 91, la SEQ ID NO: 92 y la SEQ ID NO: 93, respectivamente, y sustituciones conservadoras de aminoácidos de las mismas.

En una realización, el agonista de OX40 es un anticuerpo monoclonal biosimilar agonista de OX40 aprobado por las autoridades reguladoras de fármacos con referencia a Hu119-122. En una realización, el anticuerpo monoclonal biosimilar comprende un anticuerpo OX40 que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos un 97 % de identidad de secuencia, por ejemplo, 97 %, 98 %, 99 % o 100 % de identidad de secuencia, con la secuencia de aminoácidos de un producto medicinal de referencia o un producto biológico de referencia y que comprende una o más modificaciones postraduccionales en comparación con el producto medicinal de referencia o el producto biológico de referencia, en el que el producto medicinal de referencia o el producto biológico de referencia es Hu119-122. En algunas realizaciones, la una o más modificaciones postraduccionales se seleccionan entre una o más de las siguientes: glicosilación, oxidación, desamidación y truncamiento. En algunas realizaciones, el biosimilar es un anticuerpo agonista de OX40 autorizado o presentado para su autorización, en el que el anticuerpo agonista de OX40 se proporciona en una formulación que difiere de las formulaciones de un producto medicinal de referencia o producto biológico de referencia, en el que el producto medicinal de referencia o producto biológico de referencia es Hu119-122. El anticuerpo agonista de OX40 puede estar autorizado por una autoridad reguladora de medicamentos como la FDA de los Estados Unidos y/o la EMA de la Unión Europea. En algunas realizaciones, el biosimilar se proporciona como una composición que comprende además uno o más excipientes, en los que el uno o más excipientes son iguales o diferentes a los excipientes comprendidos en un producto medicinal de referencia o producto biológico de referencia, en los que el producto medicinal de referencia o producto biológico de referencia es Hu119-122. En algunas realizaciones, el biosimilar se proporciona como una composición que comprende además uno o más excipientes, en la que el uno o más excipientes son iguales o diferentes a los excipientes comprendidos en un producto medicinal de referencia o producto biológico de referencia, en el que el producto medicinal de referencia o producto biológico de referencia es Hu119-122.

Tabla 16: Secuencias de aminoácidos para los anticuerpos a onistas de OX40 relacionados con Hu119-122.

En algunas realizaciones, el agonista de OX40 es Hu106-222, que es un anticuerpo humanizado disponible a través de GlaxoSmithKline plc. La preparación y las propiedades del Hu106-222 se describen en las Patentes de los Estados Unidos Nos. 9,006,399 y 9,163,085, y en la Publicación de Patente Internacional No. WO 2012/027328. Las secuencias de aminoácidos de Hu106-222 se exponen en la Tabla OO.

En una realización, el agonista de OX40 comprende las CDR o regiones variables (VR) de las cadenas pesadas y ligeras del Hu106-222. En una realización, la región variable de la cadena pesada del agonista de OX40 (V<h>) comprende la secuencia mostrada en la SEQ ID NO: 94, y la región variable de la cadena ligera del agonista de OX40 (V<l>) comprende la secuencia mostrada en la SEQ ID NO: 95, y sustituciones conservadoras de aminoácidos de la misma. En una realización, un agonista de OX40 comprende las regiones V<h>y V<l>que son cada una al menos un 99 % idénticas a las secuencias mostradas en la SEQ ID NO: 94 y la SEQ ID NO: 95, respectivamente. En una realización, un agonista de OX40 comprende regiones V<h>y V<l>que son cada una al menos un 98 % idénticas a las secuencias mostradas en la SEQ ID NO: 94 y la SEQ ID NO: 95, respectivamente. En una realización, un agonista de OX40 comprende regiones V<h>y V<l>que son cada una al menos un 97 % idénticas a las secuencias mostradas en la SEQ ID NO: 94 y la SEQ ID NO: 95, respectivamente. En una realización, un agonista de OX40 comprende regiones V<h>y V<l>que son cada una al menos un 96 % idénticas a las secuencias mostradas en la SEQ ID NO: 94 y la SEQ ID NO: 95, respectivamente. En una realización, un agonista de OX40 comprende regiones V<h>y V<l>que son cada una al menos un 95 % idénticas a las secuencias mostradas en la SEQ ID NO: 94 y la SEQ ID NO: 95, respectivamente.

En una realización, un agonista de OX40 comprende dominios CDR1, CDR2 y CDR3 de cadena pesada que tienen las secuencias establecidas en la SEQ ID NO: 96, la SEQ ID NO: 97 y la SEQ ID NO: 98, respectivamente, y sustituciones conservadoras de aminoácidos de las mismas, y dominios CDR1, CDR2 y CDR3 de cadena ligera que tienen las secuencias establecidas en la SEQ ID NO: 99, la SEQ ID NO: 100 y la SEQ ID NO: 101, respectivamente, y sustituciones conservadoras de aminoácidos de las mismas.

En una realización, el agonista de OX40 es un anticuerpo monoclonal biosimilar agonista de OX40 aprobado por las autoridades reguladoras de medicamentos con referencia al Hu106-222. En una realización, el anticuerpo monoclonal biosimilar comprende un anticuerpo OX40 que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos un 97 % de identidad de secuencia, por ejemplo, 97 %, 98 %, 99 % o 100 % de identidad de secuencia, con la secuencia de aminoácidos de un producto medicinal de referencia o un producto biológico de referencia y que comprende una o más modificaciones postraduccionales en comparación con el producto medicinal de referencia o el producto biológico de referencia, en el que el producto medicinal de referencia o el producto biológico de referencia es Hu106-222. En algunas realizaciones, la una o más modificaciones postraduccionales se seleccionan entre una o más de las siguientes: glicosilación, oxidación, desamidación y truncamiento. En algunas realizaciones, el biosimilar es un anticuerpo agonista de OX40 autorizado o presentado para su autorización, en el que el anticuerpo agonista de OX40 se proporciona en una formulación que difiere de las formulaciones de un producto medicinal de referencia o producto biológico de referencia, en el que el producto medicinal de referencia o producto biológico de referencia es Hu106-222. El anticuerpo agonista de OX40 puede estar autorizado por una autoridad reguladora de medicamentos como la FDA de los Estados Unidos y/o la EMA de la Unión Europea. En algunas realizaciones, el biosimilar se proporciona como una composición que comprende además uno o más excipientes, en los que el uno o más excipientes son iguales o diferentes a los excipientes comprendidos en un producto medicinal de referencia o producto biológico de referencia, en los que el producto medicinal de referencia o producto biológico de referencia es Hu106-222. En algunas realizaciones, el biosimilar se proporciona como una composición que comprende además uno o más excipientes, en la que el uno o más excipientes son iguales o diferentes a los excipientes comprendidos en un producto medicinal de referencia o producto biológico de referencia, en el que el producto medicinal de referencia o producto biológico de referencia es Hu106-222.

Tabla 17: Secuencias de aminoácidos para los anticuerpos a onistas de OX40 relacionados con Hu106-222.

En algunas realizaciones, el anticuerpo agonista de OX40 es MEDI6469 (también denominado 9B12). El MEDI6469 es un anticuerpo monoclonal murino. Weinberg, et al., J. Immunother. 2006, 29, 575-585. En algunas realizaciones, el agonista de OX40 es un anticuerpo producido por el hibridoma 9B12, depositado en Biovest Inc. (Malvern, MA, EE.UU.), como se describe en Weinberg, et al., J. Immunother. 2006, 29, 575-585. En algunas realizaciones, el anticuerpo comprende las secuencias de CDR de MEDI6469. En algunas realizaciones, el anticuerpo comprende una secuencia de la región variable de cadena pesada y/o una secuencia de la región variable de cadena ligera de MEDI6469.

En una realización, el agonista de OX40 es el L106 BD (Producto de Pharmingen #340420). En algunas realizaciones, el agonista de OX40 comprende las CDR del anticuerpo L106 (BD Pharmingen Producto #340420). En algunas realizaciones, el agonista de OX40 comprende una secuencia de región variable de cadena pesada y/o una secuencia de región variable de cadena ligera del anticuerpo L106 (producto de BD Pharmingen No. 340420). En una realización, el agonista de OX40 es ACT35 (Santa Cruz Biotechnology, Catálogo #20073). En algunas realizaciones, el agonista de OX40 comprende las CDR del anticuerpo ACT35 (Santa Cruz Biotechnology, Catálogo #20073). En algunas realizaciones, el agonista de OX40 comprende una secuencia de región variable de cadena pesada y/o una secuencia de región variable de cadena ligera del anticuerpo ACT35 (Santa Cruz Biotechnology, Catálogo #20073). En una realización, el agonista de OX40 es el anticuerpo monoclonal murino anti-mCD134/mOX40 (clon OX86), disponible comercialmente a través de InVivoMAb, BioXcell Inc., West Lebanon, NH.

En una realización, el agonista de OX40 se selecciona de entre los agonistas de OX40 descritos en las Publicaciones de Solicitud de Patente Internacional Nos. WO 95/12673, WO 95/21925, WO 2006/121810, WO 2012/027328, WO 2013/028231, WO 2013/038191, y WO 2014/148895; solicitud de Patente Europea EP 0672141; Publicaciones de Solicitudes de Patente de los Estados Unidos Nos. US 2010/136030, US 2014/377284, US 2015/190506, y US 2015/132288 (incluidos los clones 20E5 y 12H3); y las Patentes de los Estados Unidos Nos. 7,504,101, 7,550,140, 7,622,444, 7,696,175, 7,960,515, 7,961,515, 8,133,983, 9,006,399, y 9,163,085.

En una realización, el agonista de OX40 es una proteína de fusión agonista de OX40 como se representa en la estructura I-A (proteína de fusión de fragmento Fc-anticuerpo del terminal C) o en la estructura I-B (proteína de fusión de fragmento Fc-anticuerpo del terminal N), o un fragmento, derivado, conjugado, variante o biosimilar d e la m is m a . L a s p ro p ie d a d e s d e la s e s tru c tu ra s I-A e I-B se d e s c r ib e n m á s a rr ib a y en la s P a te n te s d e los E s ta d o s U n id o s N o s . 9 ,359 ,420 , 9 ,340 ,599 , 8 ,921 ,519 , y 8 ,450 ,460. L a s s e c u e n c ia s d e a m in o á c id o s p a ra los d o m in io s p o lip e p tíd ic o s d e la e s tru c tu ra I-A se in d ic a n en la T a b la G G . El d o m in io d e F c c o m p re n d e p re fe re n te m e n te un d o m in io c o n s ta n te c o m p le to (a m in o á c id o s 17 -230 d e la S E Q ID N O : 31 ) e l d o m in io b is a g ra c o m p le to (a m in o á c id o s 1 -16 d e la S E Q ID N O : 31 ) o u n a p o rc ió n d e l d o m in io b is a g ra (p o r e je m p lo , a m in o á c id o s 4 -16 d e la S E Q ID N O : 31 ). L o s e n la z a d o re s p re fe r id o s p a ra c o n e c ta r un F c -a n t ic u e rp o d e l te rm in a l C p u e d e n s e le c c io n a rs e e n tre la s re a liz a c io n e s d a d a s e n la S E Q ID N O : 32 a la S E Q ID N O : 41 , in c lu y e n d o e n la z a d o re s a d e c u a d o s p a ra la fu s ió n d e p o lip é p tid o s a d ic io n a le s . A s im is m o , la s s e c u e n c ia s d e a m in o á c id o s p a ra los d o m in io s p o lip e p tíd ic o s d e la e s t ru c tu ra I-B s e d a n e n la T a b la H H . S i s e fu s io n a un fra g m e n to d e a n t ic u e rp o F c c o n e l te rm in a l N d e u n a p ro te ín a d e fu s ió n T N R F S F c o m o e n la e s tru c tu ra I-B , la s e c u e n c ia d e l m ó d u lo F c e s p re fe r ib le m e n te la q u e se m u e s tra en la S E Q ID N O : 42 , y la s s e c u e n c ia s e n la z a d o ra s se s e le c c io n a n p re fe r ib le m e n te d e e n tre la s q u e se e x p o n e n e n la S E D ID N O :43 a la S E Q ID N O : 45.

E n u n a re a liz a c ió n , u n a p ro te ín a d e fu s ió n a g o n is ta d e O X 40 s e g ú n la s e s tru c tu ra s I-A o I-B c o m p re n d e u n o o m á s d o m in io s d e u n ió n a O X 40 s e le c c io n a d o s d e l g ru p o q u e c o n s is te e n u n a c a d e n a p e s a d a v a r ia b le y u n a c a d e n a lig e ra v a r ia b le d e ta v o lix iz u m a b , u n a c a d e n a p e s a d a v a r ia b le y u n a c a d e n a lig e ra v a r ia b le d e 11 D 4 , u n a c a d e n a p e s a d a v a r ia b le y u n a c a d e n a lig e ra v a r ia b le d e 18 D 8 , u n a c a d e n a p e s a d a v a r ia b le y u n a c a d e n a lig e ra v a r ia b le d e H u 119 -122 , u n a c a d e n a p e s a d a v a r ia b le y u n a c a d e n a lig e ra v a r ia b le d e H u 106 -222 , u n a c a d e n a p e s a d a v a r ia b le y u n a c a d e n a lig e ra v a r ia b le s e le c c io n a d a s e n tre la s c a d e n a s p e s a d a s v a r ia b le s y las c a d e n a s lig e ra s v a r ia b le s d e s c r ita s en la T a b la O O , c u a lq u ie r c o m b in a c ió n d e u n a c a d e n a p e s a d a v a r ia b le y u n a c a d e n a lig e ra v a r ia b le d e la s a n te r io re s , y fra g m e n to s , d e r iv a d o s , c o n ju g a d o s , v a r ia n te s y b io s im ila re s d e la s m is m a s .

E n u n a re a liz a c ió n , u n a p ro te ín a d e fu s ió n a g o n is ta d e O X 40 s e g ú n la s e s tru c tu ra s I-A o I-B c o m p re n d e u n o o m á s d o m in io s d e u n ió n a O X 40 q u e c o m p re n d e n u n a s e c u e n c ia d e O X 40 L . E n u n a re a liz a c ió n , u n a p ro te ín a d e fu s ió n a g o n is ta d e O X 40 s e g ú n la s e s t ru c tu ra s I-A o I-B c o m p re n d e u n o o m á s d o m in io s d e u n ió n a O X 40 q u e c o m p re n d e n u n a s e c u e n c ia s e g ú n la S E Q ID N O : 102. E n u n a re a liz a c ió n , u n a p ro te ín a d e fu s ió n a g o n is ta d e O X 40 s e g ú n la s e s t ru c tu ra s I-A o I-B c o m p re n d e u n o o m á s d o m in io s d e u n ió n a O X 40 q u e c o m p re n d e n u n a s e c u e n c ia d e O X 40 L s o lu b le . E n u n a re a liz a c ió n , u n a p ro te ín a d e fu s ió n a g o n is ta d e O X 40 s e g ú n las e s t ru c tu ra s I-A o I-B c o m p re n d e u n o o m á s d o m in io s d e u n ió n a O X 40 q u e c o m p re n d e n u n a s e c u e n c ia s e g ú n la S E Q ID N O : 103. E n u n a re a liz a c ió n , u n a p ro te ín a d e fu s ió n a g o n is ta d e O X 40 s e g ú n la s e s t ru c tu ra s I-A o I B c o m p re n d e u n o o m á s d o m in io s d e u n ió n a O X 40 q u e c o m p re n d e n u n a s e c u e n c ia s e g ú n la S E Q ID N O : 104.

E n u n a re a liz a c ió n , u n a p ro te ín a d e fu s ió n a g o n is ta d e O X 40 s e g ú n la s e s tru c tu ra s I-A o I-B c o m p re n d e u n o o m á s d o m in io s d e u n ió n a O X 40 q u e e s un d o m in io d e s c F v q u e c o m p re n d e re g io n e s V h y V l q u e so n c a d a u n a a l m e n o s un 95 % id é n tic a s a la s s e c u e n c ia s m o s tra d a s e n la S E Q ID N O : 58 y la S E Q ID N O : 59, re s p e c t iv a m e n te , e n la s q u e lo s d o m in io s d e V h y V l e s tá n c o n e c ta d o s p o r un e n la z a d o r . E n u n a re a liz a c ió n , u n a p ro te ín a d e fu s ió n a g o n is ta d e O X 40 s e g ú n la s e s tru c tu ra s I-A o I-B c o m p re n d e u n o o m á s d o m in io s de u n ió n a O X 40 q u e e s un d o m in io d e s c F v q u e c o m p re n d e re g io n e s V h y V l q u e s o n c a d a u n a a l m e n o s un 95 % id é n tic a s a la s s e c u e n c ia s m o s tra d a s e n la S E Q ID N O : 68 y la S E Q ID N O : 69 , re s p e c t iv a m e n te , e n la s q u e lo s d o m in io s d e V h y V l e s tá n c o n e c ta d o s p o r un e n la z a d o r . En u n a re a liz a c ió n , u n a p ro te ín a d e fu s ió n a g o n is ta d e O X 40 s e g ú n la s e s t ru c tu ra s I-A o I-B c o m p re n d e u n o o m á s d o m in io s d e u n ió n a O X 40 q u e e s un d o m in io d e s c F v q u e c o m p re n d e re g io n e s V h y V l q u e so n c a d a u n a a l m e n o s un 95 % id é n tic a s a la s s e c u e n c ia s m o s tra d a s en la S E Q ID N O : 78 y la S E Q ID N O : 79 , re s p e c tiv a m e n te , e n las q u e lo s d o m in io s d e V h y V l e s tá n c o n e c ta d o s p o r un e n la z a d o r . E n u n a re a liz a c ió n , u n a p ro te ín a d e fu s ió n a g o n is ta d e O X 40 s e g ú n las e s tru c tu ra s I-A o I-B c o m p re n d e u n o o m á s d o m in io s d e u n ió n a O X 40 q u e e s un d o m in io d e s c F v q u e c o m p re n d e re g io n e s V h y V l q u e s o n c a d a u n a a l m e n o s un 95 % id é n t ic a s a la s s e c u e n c ia s m o s tra d a s en la S E Q ID N O : 86 y la S E Q ID N O : 87 , re s p e c t iv a m e n te , en la s q u e lo s d o m in io s d e V h y V l e s tá n c o n e c ta d o s p o r un e n la z a d o r . E n u n a re a liz a c ió n , u n a p ro te ín a d e fu s ió n a g o n is ta d e O X 40 s e g ú n la s e s t ru c tu ra s I-A o I-B c o m p re n d e u n o o m á s d o m in io s d e u n ió n a O X 40 q u e e s un d o m in io d e s c F v q u e c o m p re n d e re g io n e s V h y V l q u e s o n c a d a u n a a l m e n o s un 95 % id é n t ic a s a la s s e c u e n c ia s m o s tra d a s en la S E Q ID N O : 94 y la S E Q ID N O : 95 , re s p e c t iv a m e n te , en la s q u e lo s d o m in io s d e V h y V l e s tá n c o n e c ta d o s p o r un e n la z a d o r . En u n a re a liz a c ió n , u n a p ro te ín a d e fu s ió n a g o n is ta d e O X 40 s e g ú n la s e s t ru c tu ra s I-A o I-B c o m p re n d e u n o o m á s d o m in io s d e u n ió n a O X 40 q u e e s un d o m in io d e s c F v q u e c o m p re n d e re g io n e s V h y V l q u e s o n c a d a u n a a l m e n o s id é n t ic a s e n un 95 % a la s s e c u e n c ia s d e V h y V l q u e f ig u ra n e n la T a b la 18, e n la s q u e lo s d o m in io s d e V h y V l e s tá n c o n e c ta d o s p o r un e n la z a d o r .

T a b la 18: D o m in io s p o lip e p tíd ic o s a d ic io n a le s ú tile s c o m o d o m in io s d e u n ió n a O X 40 e n p ro te ín a s d e fu s ió n (p o r e je m p lo , e s tru c tu ra s I-A e I-B ) o c o m o a n t ic u e rp o s a g o n is ta s d e O X 40 d e s cF v .

E n u n a re a liz a c ió n , e l a g o n is ta d e O X 40 e s un p o lip é p tid o d e fu s ió n d e c a d e n a s e n c il la a g o n is ta d e O X 40 q u e c o m p re n d e ( i) un p r im e r d o m in io s o lu b le d e u n ió n a O X 40 , ( ii) un p r im e r e n la z a d o r p e p tíd ic o , ( iii) un s e g u n d o d o m in io s o lu b le d e u n ió n a O X 40 , ( iv ) un s e g u n d o e n la z a d o r p e p tíd ic o , y (v ) un te rc e r d o m in io s o lu b le d e u n ió n a O X 40 , q u e c o m p re n d e a d e m á s un d o m in io a d ic io n a l e n e l e x tre m o d e l te rm in a l N y /o te rm in a l C, y e n e l q u e e l d o m in io a d ic io n a l e s un d o m in io d e f ra g m e n to F a b o Fc. E n u n a re a liz a c ió n , e l a g o n is ta d e O X 40 e s un p o lip é p tid o d e fu s ió n d e c a d e n a s e n c il la a g o n is ta d e O X 40 q u e c o m p re n d e ( i) un p r im e r d o m in io s o lu b le de u n ió n a O X 40 , ( ii) un p r im e r e n la z a d o r p e p tíd ic o , ( iii) un s e g u n d o d o m in io s o lu b le d e u n ió n a O X 40 , ( iv ) un s e g u n d o e n la z a d o r p e p tíd ic o , y (v ) un te r c e r d o m in io s o lu b le d e u n ió n a O X 40 , q u e c o m p re n d e a d e m á s un d o m in io a d ic io n a l e n e l e x tre m o d e l te rm in a l N y /o te rm in a l C, e n e l q u e e l d o m in io a d ic io n a l e s un d o m in io d e f ra g m e n to F a b o F c en e l q u e c a d a u n o d e lo s d o m in io s s o lu b le s d e u n ió n a O X 40 c a re c e d e u n a re g ió n d e l ta llo (q u e c o n tr ib u y e a la t r im e r iz a c ió n y p ro p o rc io n a u n a c ie r ta d is ta n c ia a la m e m b ra n a c e lu la r, p e ro no fo rm a p a rte d e l d o m in io d e u n ió n a O X 40 ) y e l p r im e r y e l s e g u n d o e n la z a d o r p e p tíd ic o t ie n e n in d e p e n d ie n te m e n te u n a lo n g itu d d e 3 -8 a m in o á c id o s .

E n u n a re a liz a c ió n , e l a g o n is ta d e O X 40 e s un p o lip é p tid o d e fu s ió n d e c a d e n a s e n c il la a g o n is ta d e O X 40 q u e c o m p re n d e (i) un p r im e r d o m in io d e c ito c in a d e la s u p e r fa m ilia d e l fa c to r d e n e c ro s is tu m o ra l (T N F ) s o lu b le , (ii) un p r im e r e n la z a d o r p e p tíd ic o , ( iii) un s e g u n d o d o m in io d e c ito c in a d e la s u p e r fa m il ia d e l T N F s o lu b le , ( iv ) un s e g u n d o e n la z a d o r p e p tíd ic o , y (v ) un te rc e r d o m in io s o lu b le d e c ito c in a d e la s u p e r fa m il ia d e l T N F , e n e l q u e c a d a u n o d e lo s d o m in io s s o lu b le s d e c ito c in a d e la s u p e r fa m ilia d e l T N F c a re c e d e u n a re g ió n d e l ta llo y el p r im e r y e l s e g u n d o e n la z a d o r p e p tíd ic o t ie n e n in d e p e n d ie n te m e n te u n a lo n g itu d d e 3 -8 a m in o á c id o s , y e n e l q u e e l d o m in io d e c ito c in a d e la s u p e r fa m ilia d e l T N F e s un d o m in io d e u n ió n a O X 40.

E n a lg u n a s re a liz a c io n e s , e l a g o n is ta d e O X 40 e s M E D I6383. M E D I6383 e s u n a p ro te ín a d e fu s ió n a g o n is ta d e O X 40 y p u e d e p re p a ra rs e c o m o s e d e s c r ib e e n la P a te n te d e lo s E s ta d o s U n id o s N o. 6 ,312 ,700.

E n u n a re a liz a c ió n , e l a g o n is ta d e O X 40 e s un a n tic u e rp o d e s c F v a g o n is ta d e O X 40 q u e c o m p re n d e c u a lq u ie ra d e lo s d o m in io s d e V h a n te r io re s u n id o a c u a lq u ie ra d e lo s d o m in io s d e V l a n te r io re s .

E n u n a re a liz a c ió n , e l a g o n is ta d e O X 40 e s e l a n t ic u e rp o m o n o c lo n a l a g o n is ta d e O X 40 d e C re a t iv e B io la b s M O M -18455 , d is p o n ib le c o m e rc ia lm e n te a t ra v é s d e C re a t iv e B io la b s , Inc ., S h ir le y , N Y , E E . U U .

E n u n a re a liz a c ió n , e l a g o n is ta d e O X 40 e s e l a n t ic u e rp o a g o n is ta d e O X 40 c lo n B e r -A C T 35 d is p o n ib le c o m e rc ia lm e n te a t ra v é s d e B io L e g e n d , Inc ., S a n D ie g o , C A , E E . U U .

H. A n á lis is o p c io n a le s d e v ia b il id a d c e lu la r

O p c io n a lm e n te , p u e d e re a liz a rs e un e n s a y o d e v ia b il id a d c e lu la r t ra s la p r im e ra e x p a n s ió n (a v e c e s d e n o m in a d a e x p a n s ió n in ic ia l a g ra n e l) , u t i l iz a n d o e n s a y o s e s tá n d a r c o n o c id o s en la té c n ic a . P o r e je m p lo , p u e d e re a liz a rs e un e n s a y o d e e x c lu s ió n c o n a z u l t r ip á n en u n a m u e s tra d e lo s T IL a g ra n e l, q u e e t iq u e ta s e le c t iv a m e n te la s c é lu la s m u e r ta s y p e rm ite u n a e v a lu a c ió n d e la v ia b il id a d . O tro s e n s a y o s p a ra su u s o e n la c o m p ro b a c ió n d e la v ia b il id a d p u e d e n in c lu ir , e n tre o tro s , e l e n s a y o d e a z u l A la m a r ; y e l e n s a y o M T T .

1. Recuento de células, viabilidad, citometría de flujo

En algunas realizaciones, se mide el recuento celular y/o la viabilidad. La expresión de marcadores como, entre otros, CD3, CD4, CD8 y CD56, así como cualquier otro divulgado o descrito en el presente documento, puede medirse mediante citometría de flujo con anticuerpos, por ejemplo, entre otros, los disponibles comercialmente a través de BD Bio-sciences (BD Biosciences, San Jose, c A) utilizando un citómetro de flujo FACSCanto™ (BD Biosciences). Las células pueden contarse manualmente utilizando un hemocitómetro con c-chip desechable (VWR, Batavia, IL) y la viabilidad puede evaluarse utilizando cualquier método conocido en la técnica, incluyendo, pero sin limitarse a la tinción con azul tripán. La viabilidad celular también puede ensayarse basándose en USSN 15/863,634.

En algunos casos, la población a granel de TIL puede crioconservarse inmediatamente, utilizando los protocolos que se comentan a continuación. Alternativamente, la población de TIL a granel puede someterse a REP y luego crioconservarse como se discute más adelante. Del mismo modo, en el caso de que los TIL modificados genéticamente vayan a utilizarse en terapia, las poblaciones de TIL a granel o<r>Epueden someterse a modificaciones genéticas para tratamientos adecuados.

Se divulga en el presente documento, pero no se reivindica, un método para ensayar los TIL para determinar su viabilidad y/o su uso posterior en la administración a un sujeto. Se describe en el presente documento, pero no se reivindica, un método para analizar los linfocitos infiltrantes de tumores (TIL) que comprende:

(i) la obtención de una primera población de TIL;

(ii) realizar una primera expansión cultivando la primera población de TIL en un medio de cultivo celular que comprenda IL-2, y opcionalmente OKT-3, para producir una segunda población de TIL; y

(iii) realizar una segunda expansión suplementando el medio de cultivo celular de la segunda población de TIL con IL-2, OKT-3 y células presentadoras de antígeno (APC) adicionales, para producir una tercera población de TIL, en la que la tercera población de TIL es al menos 50 veces mayor en número que la segunda población de TIL;

(iv) la recolección, lavado y crioconservación de la tercera población de TIL;

(v) almacenar las TIL crioconservadas a una temperatura criogénica;

(vi) descongelar la tercera población de TIL para proporcionar una tercera población descongelada de TIL; y

(vii) realizar una segunda expansión adicional de una parte de la tercera población descongelada de TIL suplementando el medio de cultivo celular de la tercera población con IL-2, OKT-3 y APC durante un periodo de expansión adicional (a veces denominado periodo de reREP) de al menos 3 días, en el que la tercera expansión se realiza para obtener una cuarta población de TIL, en la que el número de TIL de la cuarta población de TIL se compara con el número de TIL de la tercera población de TIL para obtener una proporción;

(viii) determinar basándose en la proporción de la etapa (vii) si la población descongelada de TIL es adecuada para su administración a un paciente;

(ix) administrar al paciente una dosis terapéuticamente eficaz de la tercera población descongelada de TIL cuando se determine que la proporción entre el número de TIL de la cuarta población de TIL y el número de TIL de la tercera población de TIL es superior a 5:1 en la etapa (viii).

Se puede ensayar la viabilidad de los TIL tras la etapa (vii).

La presente divulgación también proporciona otros métodos para ensayar TIL. La divulgación puede proporcionar un método para ensayar TIL que comprende:

(i) obtención de una porción de una primera población de TIL crioconservados;

(ii) descongelar la porción de la primera población de TIL crioconservados;

(iii) realizar una primera expansión cultivando la porción de la primera población de TIL en un medio de cultivo celular que comprenda iL-2, OKT-3 y células presentadoras de antígeno (APC) durante un periodo de expansión adicional (a veces denominado periodo de reREP) de al menos 3 días, para producir una segunda población de TIL, en la que la porción de la primera población de TIL se compara con la segunda población de TIL para obtener una proporción del número de TIL, en la que la proporción del número de TIL en la segunda población de TIL con respecto al número de TIL en la porción de la primera población de TIL es superior a 5:1;

(iv) determinar, basándose en la proporción de la etapa (iii), si la primera población de TIL es adecuada para su uso en la administración terapéutica a un paciente;

(v) determinar que la primera población de TIL es adecuada para su uso en la administración terapéutica cuando se determina que la proporción entre el número de TIL de la segunda población de TIL y el número de TIL de la primera población de TIL es superior a 5:1 en la etapa (iv).

La relación entre el número de TIL en la segunda población de TIL y el número de TIL en la porción de la primera población de TIL puede ser superior a 50:1.

El método puede comprender además realizar la expansión de toda la primera población de TIL crioconservadas de la etapa (i) según los métodos descritos en el presente documento.

El método puede comprender además la administración al paciente de toda la primera población de TIL crioconservadas de la etapa (i).

2. Cultivos celulares

En una realización, un método para expandir TIL, incluyendo los discutidos anteriormente, así como ejemplificados en la Figura 1, puede incluir el uso de aproximadamente 5,000 mL a aproximadamente 25,000 mL de medio celular, aproximadamente 5,000 mL a aproximadamente 10,000 mL de medio celular, o aproximadamente 5,800 mL a aproximadamente 8,700 mL de medio celular. En algunas realizaciones, el medio es un medio libre de suero. En algunas realizaciones, el medio de la primera expansión está libre de suero. En algunas realizaciones, el medio de la segunda expansión está libre de suero. En algunas realizaciones, los medios de la primera y de la segunda expansión están ambos libres de suero. En una realización, la expansión del número de TIL no utiliza más de un tipo de medio de cultivo celular. Puede utilizarse cualquier medio de cultivo celular adecuado, por ejemplo, medio celular AIM-V (L-glutamina, sulfato de estreptomicina 50 pM y sulfato de gentamicina 10 pM) medio de cultivo celular (Invitrogen, Carlsbad CA). En este sentido, los métodos inventivos reducen ventajosamente la cantidad de medio y el número de tipos de medio necesarios para ampliar el número de TIL. En una realización, la expansión del número de TIL puede comprender la alimentación de las células con una frecuencia no superior a cada tercer o cuarto día. La expansión del número de células en un recipiente permeable al gas simplifica los procedimientos necesarios para expandir el número de células al reducir la frecuencia de alimentación necesaria para expandir las células.

En una realización, el medio celular del primer y/o segundo recipiente permeable a los gases no está filtrado. El uso de un medio celular sin filtrar puede simplificar los procedimientos necesarios para expandir el número de células. En una realización, el medio celular del primer y/o segundo contenedor permeable a los gases carece de beta-mercaptoetanol (BME).

En un método divulgado en el presente documento pero no reivindicado, la duración del método comprende la obtención de una muestra de tejido tumoral del mamífero; el cultivo de la muestra de tejido tumoral en un primer recipiente permeable al gas que contiene medio celular en su interior; la obtención de TIL a partir de la muestra de tejido tumoral; la expansión del número de TIL en un segundo recipiente permeable al gas que contiene medio celular durante una duración de aproximadamente 7 a 14 días, por ejemplo, aproximadamente 11 días. En algunas realizaciones, la pre-REP es de aproximadamente 7 a 14 días, por ejemplo, aproximadamente 11 días. En algunas realizaciones, REP es de aproximadamente 7 a 14 días, por ejemplo, aproximadamente 11 días.

En una realización, los TIL se expanden en recipientes permeables al gas. Los recipientes permeables al gas se han utilizado para expandir TIL utilizando PBM<c>mediante métodos, composiciones y dispositivos conocidos en la técnica, incluidos los descritos en la Publicación de la Solicitud de Patente de los Estados Unidos No.

2005/0106717 A1. En una realización, los TIL se expanden en bolsas permeables al gas. En una realización, los TIL se expanden utilizando un sistema de expansión celular que expande los TIL en bolsas permeables al gas, como el Sistema de Expansión Celular Xuri W25 (GE Healthcare). En una realización, los TIL se expanden utilizando un sistema de expansión celular que expande los TIL en bolsas permeables al gas, como el sistema de biorreactor WAVE, también conocido como sistema de expansión celular Xuri W5 (GE Healthcare). En una realización, el sistema de expansión celular incluye una bolsa celular permeable al gas con un volumen seleccionado del grupo que consiste en aproximadamente 100 mL, aproximadamente 200 mL, aproximadamente 300 mL, aproximadamente 400 mL, aproximadamente 500 mL, aproximadamente 600 mL, aproximadamente 700 mL, aproximadamente 800 mL, aproximadamente 900 mL, aproximadamente 1 L, aproximadamente 2 L, aproximadamente 3 L, aproximadamente 4 L, aproximadamente 5 L, aproximadamente 6 L, aproximadamente 7 L, aproximadamente 8 L, aproximadamente 9 L y aproximadamente 10 L.

En una realización, los TIL pueden expandirse en matraces G-Rex (disponibles comercialmente a través de Wilson Wolf Manufacturing). Tales realizaciones permiten que las poblaciones celulares se expandan desde aproximadamente 5*105 células/cm2 hasta entre 10*10® y 30*10® células/cm2. En una realización, esto es sin alimentación. En una realización, esto es sin alimentación siempre que el medio resida a una altura de aproximadamente 10 cm en el matraz G-Rex. En una realización esto es sin alimentación, pero con la adición de una o más citocinas. En una realización, la citocina puede añadirse como bolo sin necesidad de mezclar la citocina con el medio. Tales recipientes, dispositivos y métodos son conocidos en la técnica y se han utilizado para expandir los TIL, e incluyen los descritos en la Publicación de la Solicitud de Patente de los Estados Unidos No. US 2014/0377739A1, la Publicación Internacional No. WO 2014/210036 A1, la Publicación de la Solicitud de Patente de los Estados Unidos No. US 2013/0115617 A1, la Publicación Internacional No. WO 2013/188427 A1, la Publicación de la Solicitud de Patente de los Estados Unidos No. US 2011/0136228 A1, la patente de los Estados Unidos No. US 8,809,050 B2, la Publicación internacional No. WO 2011/072088 A2, la Publicación de la Solicitud de Patente de los Estados Unidos No. US 2016/0208216 A1, la Publicación de la Solicitud de Patente de los Estados Unidos No. US 2012/0244133 A1, la Publicación Internacional No. WO 2012/129201 A1, la Publicación de la Solicitud de Patente de los Estados Unidos No. US 2013/0102075 A1, la Publicación de la Solicitud de Patente de los Estados Unidos No. US 8,956,860 B2, la Publicación Internacional No. WO 2013/173835 A1, la Publicación de la Solicitud de Patente de los Estados Unidos No. US 2015/0175966 A1. Dichos procesos también se describen en Jin et al., J. Immunotherapy, 2012, 35:283-292.

I. Modificación genética opcional de los TIL

En algunas realizaciones, los TIL están opcionalmente modificados genéticamente para incluir funcionalidades adicionales, incluyendo, pero sin limitarse a, un receptor de células T (TCR) de alta afinidad, por ejemplo, un TCR dirigido a un antígeno asociado al tumor como MAGE-1, HER2 o NY-ESO-1, o un receptor de antígeno quimérico (CAR) que se une a una molécula de superficie celular asociada al tumor (por ejemplo, mesotelina) o a una molécula de superficie celular restringida al linaje (por ejemplo, CD19).

J. Crioconservación opcional de los TIL

Como se ha discutido anteriormente, y ejemplificado en los Etapas A a E proporcionadas en la Figura 1, la crioconservación puede ocurrir en numerosos puntos a lo largo del proceso de expansión de TIL. En algunas realizaciones, la población expandida de TIL tras la segunda expansión (como se proporciona, por ejemplo, según la Etapa D de la Figura 1) puede crioconservarse. La crioconservación puede realizarse generalmente colocando la población de TIL en una solución de congelación, por ejemplo, 85 % de suero AB inactivado del complemento y 15 % de dimetilsulfóxido (DMSO). Las células en solución se colocan en viales criogénicos y se almacenan durante 24 horas a -80 °C, con transferencia opcional a congeladores de nitrógeno gaseoso para su crioconservación. Véase, Sadeghi, et al., Acta Oncológica 2013, 52, 978-986. En algunas realizaciones, los TIL se crioconservan en DMSO al 5 %. En algunas realizaciones, los TIL se crioconservan en medios de cultivo celular más DMSO al 5 %. En algunas realizaciones, los TIL se crioconservan según los métodos proporcionados en los Ejemplos F y G.

Cuando proceda, las células se sacan del congelador y se descongelan en un baño de agua a 37 °C hasta que se hayan descongelado aproximadamente 4/5 de la solución. Las células se resuspenden generalmente en medio completo y se lavan opcionalmente una o más veces. En algunas realizaciones, los TIL descongelados pueden contarse y evaluarse para determinar su viabilidad como se conoce en la técnica.

K. Sistemas cerrados para la fabricación de TIL

La presente invención prevé el uso de sistemas cerrados durante el proceso de cultivo de TIL. Tales sistemas cerrados permiten prevenir y/o reducir la contaminación microbiana, permiten el uso de menos matraces y permiten reducir costes. En algunas realizaciones, el sistema cerrado utiliza dos recipientes.

Tales sistemas cerrados son bien conocidos en la técnica y pueden encontrarse, por ejemplo, en http://www.fda.gov/cber/guidelines.htm y https://www.fda.gov/BiologicsBloodVaccines/GuidanceCompliance RegulatoryInformation/Guidances/Blood/ucm076779.htm.

Los dispositivos de conexión estériles (STCD) producen soldaduras estériles entre dos piezas de tubos compatibles. Este procedimiento permite la conexión estéril de una gran variedad de recipientes y diámetros de tubo. En algunas realizaciones, los sistemas cerrados incluyen sistemas luer lock y termosellados como los descritos, por ejemplo, en el ejemplo G. En algunas realizaciones, se accede al sistema cerrado mediante jeringas en condiciones estériles para mantener la esterilidad y la naturaleza cerrada del sistema. En algunas realizaciones, se emplea un sistema cerrado como el descrito en el Ejemplo G. En algunas realizaciones, los TIL se formulan en un recipiente de formulación final del producto según el método descrito en el Ejemplo G, sección "Formulación final y llenado".

En algunas realizaciones, el sistema cerrado utiliza un contenedor desde el momento en que se obtienen los fragmentos tumorales hasta que los TIL están listos para su administración al paciente o su crioconservación. En algunas realizaciones, cuando se utilizan dos contenedores, el primer contenedor es un contenedor G cerrado y la población de TIL se centrifuga y se transfiere a una bolsa de infusión sin abrir el primer contenedor G cerrado. En algunas realizaciones, cuando se utilizan dos contenedores, la bolsa de infusión es una bolsa de infusión que contiene HypoThermosol. Un sistema cerrado o un sistema cerrado de cultivo de células de TIL se caracteriza porque, una vez añadida la muestra tumoral y/o los fragmentos tumorales, el sistema se sella herméticamente desde el exterior para formar un entorno cerrado libre de la invasión de bacterias, hongos y/o cualquier otra contaminación microbiana.

En algunas realizaciones, la reducción de la contaminación microbiana se sitúa entre aproximadamente 5%y aproximadamente 100 %. En algunas realizaciones, la reducción de la contaminación microbiana se sitúa entre aproximadamente 5 % y aproximadamente 95 %. En algunas realizaciones, la reducción de la contaminación microbiana se sitúa entre aproximadamente 5 % y aproximadamente 90 %. En algunas realizaciones, la reducción de la contaminación microbiana se sitúa entre aproximadamente 10 % y aproximadamente 90 %. En algunas realizaciones, la reducción de la contaminación microbiana se sitúa entre aproximadamente 15 % y aproximadamente 85 %. En algunas realizaciones, la reducción de la contaminación microbiana es de aproximadamente el 5 %, aproximadamente el 10 %, aproximadamente el 15 %, aproximadamente el 20 %, aproximadamente el 25 %, aproximadamente el 30 %, aproximadamente el 35 %, aproximadamente el 40 %, aproximadamente el 45 %, aproximadamente el 50 %, aproximadamente el 55 %, aproximadamente el 60 %, aproximadamente el 65 %, aproximadamente el 70 %, aproximadamente el 75 %, aproximadamente el 80 %, aproximadamente el 85 %, aproximadamente el 90 %, aproximadamente el 95 %, aproximadamente el 97 %, aproximadamente el 98 %, aproximadamente el 99 % o aproximadamente el 100 %.

El sistema cerrado permite el crecimiento de TIL en ausencia y/o con una reducción significativa de la contaminación microbiana.

Además, el pH, la presión parcial de dióxido de carbono y la presión parcial de oxígeno del medio de cultivo de células de TIL varían a medida que se cultivan las células. En consecuencia, aunque se haga circular un medio apropiado para el cultivo celular, el entorno cerrado debe mantenerse constantemente como un entorno óptimo para la proliferación de TIL. Para ello, es deseable que los factores físicos de pH, presión parcial de dióxido de carbono y presión parcial de oxígeno dentro del líquido de cultivo del medio cerrado se controlen mediante un sensor, cuya señal se utilice para controlar un intercambiador de gases instalado a la entrada del medio de cultivo, y que la presión parcial de gas del medio cerrado se ajuste en tiempo real en función de los cambios en el líquido de cultivo para optimizar el entorno de cultivo celular. En algunas realizaciones, la presente invención proporciona un sistema cerrado de cultivo celular que incorpora a la entrada del medio cerrado un intercambiador de gas equipado con un dispositivo de monitorización que mide el pH, la presión parcial de dióxido de carbono y la presión parcial de oxígeno del medio cerrado, y optimiza el entorno de cultivo celular ajustando automáticamente las concentraciones de gas en función de las señales del dispositivo de monitorización.

En algunas realizaciones, la presión dentro del medio cerrado se controla de forma continua o intermitente. Es decir, la presión en el entorno cerrado puede variarse mediante un dispositivo de mantenimiento de la presión, por ejemplo, asegurando así que el espacio sea adecuado para el crecimiento de los TIL en un estado de presión positiva, o promoviendo la exudación de líquido en un estado de presión negativa y promoviendo así la proliferación celular. Además, aplicando presión negativa de forma intermitente, es posible sustituir de forma uniforme y eficaz el líquido circulante en el medio cerrado mediante una contracción temporal del volumen del medio cerrado.

En algunas realizaciones, pueden sustituirse o añadirse componentes de cultivo óptimos para la proliferación de los TIL, e incluir factores como IL-2 y/u OKT3, así como una combinación.

L. Crioconservación opcional de TIL

Tanto la población de TIL a granel como la población expandida de TIL pueden crioconservarse opcionalmente. En algunas realizaciones, la crioconservación se produce en la población de TIL terapéutica. En algunas realizaciones, la crioconservación tiene lugar en los TIL recogidos tras la segunda expansión. En algunas realizaciones, la crioconservación se produce en los TIL en la etapa F ejemplar de la Figura 1. En algunas realizaciones, los TIL se crioconservan en la bolsa de infusión. En algunas realizaciones, los TIL se crioconservan antes de colocarlos en la bolsa de infusión. En algunas realizaciones, los TIL se crioconservan y no se colocan en una bolsa de infusión. En algunas realizaciones, la crioconservación se lleva a cabo utilizando un medio de crioconservación. En algunas realizaciones, el medio de crioconservación contiene dimetilsulfóxido (DMSO). Esto se consigue generalmente poniendo la población de TIL en una solución de congelación, por ejemplo 85 % de suero AB inactivado del complemento y 15 % de dimetilsulfóxido (DMSO). Las células en solución se colocan en viales criogénicos y se almacenan durante 24 horas a -80 °C, con transferencia opcional a congeladores de nitrógeno gaseoso para su crioconservación. Véase, Sadeghi, et al., Acta Oncologica 2013, 52, 978-986.

En una realización preferida, una población de TIL se crioconserva utilizando un medio de crioconservación CS10 (CryoStor 10, BioLife Solutions). En una realización preferida, una población de TIL se crioconserva utilizando un medio de crioconservación que contiene dimetilsulfóxido (DMSO). En una realización preferida, una población de TIL se crioconserva utilizando una proporción 1:1 (vol:vol) de CS10 y medio de cultivo celular.

En una realización preferida, una población de TIL se crioconserva utilizando aproximadamente una proporción 1:1 (vol:vol) de CS 10 y medios de cultivo celular, comprendiendo además IL-2 adicional.

Como se discutió anteriormente en las Etapas A a E, la crioconservación puede ocurrir en numerosos puntos a lo largo del proceso de expansión de TIL. En algunas realizaciones, la población a granel de TIL tras la primera expansión según la Etapa B o la población expandida de TIL tras la una o más segundas expansiones según la Etapa D pueden crioconservarse. La crioconservación puede realizarse generalmente colocando la población de TIL en una solución de congelación, por ejemplo, 85 % de suero AB inactivado del complemento y 15 % de dimetilsulfóxido (DMSO). Las células en solución se colocan en viales criogénicos y se almacenan durante 24 horas a -80 °C, con transferencia opcional a congeladores de nitrógeno gaseoso para su crioconservación. Véase Sadeghi, et al., Acta Oncologica 2013, 52, 978-986.

Cuando proceda, las células se sacan del congelador y se descongelan en un baño de agua a 37 °C hasta que se hayan descongelado aproximadamente 4/5 de la solución. Las células se resuspenden generalmente en medio completo y se lavan opcionalmente una o más veces. En algunas realizaciones, las TIL descongeladas pueden contarse y evaluarse para determinar su viabilidad como se conoce en la técnica.

En algunos casos, la población de TIL de la Etapa B puede crioconservarse inmediatamente, utilizando los protocolos que se comentan a continuación. Como alternativa, la población de TIL a granel puede someterse a la Etapa C y a la Etapa D y crioconservarse después de la Etapa D. De forma similar, en el caso de que se vayan a utilizar TIL modificados genéticamente en la terapia, las poblaciones de TIL de la Etapa B o de la Etapa D pueden someterse a modificaciones genéticas para tratamientos adecuados.

IV. Composiciones farmacéuticas, dosis y regímenes de dosificación

En una realización, los TIL expandidos mediante los métodos de la presente divulgación se proporcionan para su administración a un paciente en forma de composición farmacéutica. En una realización, la composición farmacéutica es una suspensión de TIL en un tampón estéril. Los TIL expandidos utilizando PBMC de la presente divulgación pueden ser para administración por cualquier vía adecuada conocida en la técnica. En algunas realizaciones, las células T son para administración como una única infusión intraarterial o intravenosa, que preferiblemente dura aproximadamente de 30 a 60 minutos. Otras vías de administración adecuadas incluyen la administración intraperitoneal, intratecal e intralinfática.

Puede proporcionarse cualquier dosis adecuada de TIL para su administración. En algunas realizaciones, se proporcionan para su administración desde aproximadamente 2.3*1010 hasta aproximadamente 13.7*1010 de TIL, con una media de aproximadamente 7.8*101° de TIL, en particular si el cáncer es NSCLC. En una realización, se proporcionan para su administración aproximadamente 1.2*101° y aproximadamente 4.3*101° de TIL. En algunas realizaciones, se proporcionan para su administración aproximadamente 3*1010 y aproximadamente 12*1010 de TIL. En algunas realizaciones, se proporcionan para su administración aproximadamente 4*1010 y aproximadamente 10*101° de TIL. En algunas realizaciones, se proporcionan para su administración aproximadamente 5^1010 y aproximadamente 8^1010 de TIL. En algunas realizaciones, se proporcionan para su administración aproximadamente 6^1010 y aproximadamente 8^1010 de TIL. En algunas realizaciones, se proporcionan para su administración aproximadamente 7^1010y aproximadamente 8^1010de TIL. En algunas realizaciones, la dosis terapéuticamente eficaz es de aproximadamente 2.3^1010 a aproximadamente 13.7^1010. En algunas realizaciones, la dosis terapéuticamente eficaz es de aproximadamente 7.8^1010 de TIL, en particular si el cáncer es NSCLC. En algunas realizaciones, la dosis terapéuticamente eficaz es de aproximadamente 1.2^1010 a aproximadamente 4.3^1010 de TIL. En algunas realizaciones, la dosis terapéuticamente eficaz es de aproximadamente 3^1010 a aproximadamente 12^1010 de TIL. En algunas realizaciones, la dosis terapéuticamente eficaz es de aproximadamente 4^1010 a aproximadamente 10x1010 de TIL. En algunas realizaciones, la dosis terapéuticamente eficaz es de aproximadamente 5^1010 a aproximadamente 8^1010 de TIL. En algunas realizaciones, la dosis terapéuticamente eficaz es de aproximadamente 6^1010 a aproximadamente 8^1010 de TIL. En algunas realizaciones, la dosis terapéuticamente eficaz es de aproximadamente 7^1010 a aproximadamente 8^1010 de TIL.

En algunas realizaciones, la administración es de aproximadamente 1*109 a aproximadamente 150*109 de TIL, en particular si el cáncer es NSCLC. En algunas realizaciones, la dosis terapéuticamente eficaz es de aproximadamente 1*109 a aproximadamente 150*109 de TIL. En algunas realizaciones, la dosis terapéuticamente eficaz es de aproximadamente 1*109 a aproximadamente 140*109 de TIL. En algunas realizaciones, la dosis terapéuticamente eficaz es de aproximadamente 1*109a aproximadamente 130*109 de TIL. En algunas realizaciones, la dosis terapéuticamente eficaz es de aproximadamente 1*109 a aproximadamente 120*109 de TIL. En algunas realizaciones, la dosis terapéuticamente eficaz es de aproximadamente 1*109 a aproximadamente 110*109 de TIL. En algunas realizaciones, la dosis terapéuticamente eficaz es de aproximadamente 1*109 a aproximadamente 100*109 de TIL. En algunas realizaciones, la dosis terapéuticamente eficaz es de aproximadamente 1*109 a aproximadamente 90*109TIL. En algunas realizaciones, la dosis terapéuticamente eficaz es de aproximadamente 1*109 a aproximadamente 80*109 de TIL. En algunas realizaciones, la dosis terapéuticamente eficaz es de aproximadamente 1*109 a aproximadamente 70*109 de TIL. En algunas realizaciones, la dosis terapéuticamente eficaz es de aproximadamente 1*109 a aproximadamente ®0*109 de TIL. En algunas realizaciones, la dosis terapéuticamente eficaz es de aproximadamente 1*109 a aproximadamente 50*109 de TIL. En algunas realizaciones, la dosis terapéuticamente eficaz es de aproximadamente 1*109 a aproximadamente 40*109 de

TIL. En algunas realizaciones, la dosis terapéuticamente eficaz es de aproximadamente 1*109 a aproximadamente 30*109 de TIL. En algunas realizaciones, la dosis terapéuticamente eficaz es de aproximadamente 1*109 a aproximadamente 20*109 de TIL. En algunas realizaciones, la dosis terapéuticamente eficaz es de aproximadamente 1*109 a aproximadamente 10*109 de TIL. En algunas realizaciones, la dosis terapéuticamente eficaz es de aproximadamente 1*109 a aproximadamente 5*109 de

TIL.

En algunas realizaciones, el número de los TIL proporcionados en las composiciones farmacéuticas de la

invención es de aproximadamente 1*10®, 2*10®, 3*10®, 4*10®, 5*10®, 6*10®, 7*10®, 8*10®, 9*10®, 1x107,

2*107, 3*107, 4*107, 5*107, ®*107, 7*107, 8*107, 9*107, 1*108, 2*108, 3*108, 4*108, 5*108, ®*108, 7*108,

8*108, 9*108, 1*109, 2*109, 3*109, 4*109, 5*109, ®*109, 7*109, 8*109, 9*109, 1*1010, 2*1010, 3*1010, 4* 5*1010, ®*1010, 7*1010, 8*1010, 9*1010, 1*1011, 2*1011, 3*1011, 4*1011, 5*1011, ®*1011, 7*1011, 8*1011, 9*1011,

1*1012, 2*1012, 3*1012, 4*1012, 5*1012, ®*1012, 7*1012, 8*1012, 9*1012, 1*1013, 2*1013, 3*1013, 4*1013, 5*1013,

®*1013, 7*1013, 8*1013, y 9*1013. En una realización, el número de los TIL proporcionados en las composiciones farmacéuticas de la invención está en el intervalo de 1*10® a 5*10®, 5*10® a 1*107, 1*107 a 5*107, 5*107 a

1*108, 1*108 a 5*108, 5*108 a 1*109, 1*109a 5*109, 5*109a 1*1010, 1*1010a 5*1010, 5*1010a 1*1011, 5*1011

a 1*1012, 1*1012 a 5*1012, y 5*1012a 1*1013.

En algunas realizaciones, la concentración de los TIL proporcionados en las composiciones farmacéuticas de

la invención es inferior, por ejemplo, al 100 %, 90 %, 80 %, 70 %, ®0 %, 50 %, 40 %, 30 %, 20 %, 19 %, 18 %,

17 %, 1® %, 15 %, 14 %, 13 %, 12 %, 11 %, 10 %, 9 %, 8 %, 7 %, ® %, 5 %, 4 %, 3 %, 2 %, 1 %, 0.5 %, 0.4 %,

0.3 %, 0.2 %, 0.1 %, 0.09 %, 0.08 %, 0.07 %, 0.0® %, 0.05 %, 0.04 %, 0.03 %, 0.02 %, 0.01 %, 0.009 %, 0.008

%, 0.007 %, 0.00® %, 0.005 %, 0.004 %, 0.003 %, 0.002 %, 0.001 %, 0.0009 %, 0.0008 %, 0.0007 %, 0.000®

%, 0.0005 %, 0.0004 %, 0.0003 %, 0.0002 % o 0.0001 % p/p, p/v o v/v de la composición farmacéutica.

la invención es superior al 90 %, 80 %, 70 %, ®0 %, 50 %, 40 %, 30 %, 20 %, 19.75 %, 19.50 %, 19.25 % 19

%, 18.75 %, 18.50 %, 18.25 %, 18 %, 17.75 %, 17.50 %, 17.25 % 17 %, 1®.75 %, 1®.50 %, 1®.25 % 1® %,

15.75 %, 15.50 %, 15.25 % 15 %, 14.75 %, 14.50 %, 14.25 % 14 %, 13.75 %, 13.50 %, 13.25 % 13 %, 12.75

%, 12.50 %, 12.25 % 12 %, 11.75 %, 11.50 %, 11.25 % 11 %, 10.75 %, 10.50 %, 10.25 % 10 %, 9.75 %, 9.50

%, 9.25 % 9 %, 8.75 %, 8.50 %, 8.25 %, 8 %, 7.75 %, 7.50 %, 7.25 %, 7 %, ®.75 %, ®.50 %, ®.25 %, ® %, 5.75

%, 5.50 %, 5.25 %, 5 %, 4.75 %, 4.50 %, 4.25 %, 4 %, 3.75 %, 3.50 %, 3.25 %, 3 %, 2.75 %, 2.50 %, 2.25 %,

2 %, 1.75 %, 1.50 %, 1.25 %, 1 %, 0.5 %, 0.4 %, 0.3 %, 0.2 %, 0.1 %, 0.09 %, 0.08 %, 0.07 %, 0.0® %, 0.05 %,

0.04 %, 0.03 %, 0.02 %, 0.01 %, 0.009 %, 0.008 %, 0.007 %, 0.00® %, 0.005 %, 0.004 %, 0.003 %, 0.002 %,

0.001 %, 0.0009 %, 0.0008 %, 0.0007 %, 0.000® %, 0.0005 %, 0.0004 %, 0.0003 %, 0.0002 % o 0.0001 % p/p,

p/v, o v/v de la composición farmacéutica.

la invención se encuentra en el intervalo de aproximadamente 0.0001 % a aproximadamente 50 %, aproximadamente 0.001 % a aproximadamente 40 %, aproximadamente 0.01 % a aproximadamente 30 %, aproximadamente 0.02 % a aproximadamente 29 %, aproximadamente 0.03 % a aproximadamente 28 %, aproximadamente 0.04 % a aproximadamente 27 %, aproximadamente 0.05 % a aproximadamente 2® %, aproximadamente 0.0® % a aproximadamente 25 %, aproximadamente 0.07 % a 24 %, 0.08 % a 23 %, 0.09 %

a 22 %, 0.1 % a 21 %, 0.2 % a 20 %, 0.3 % a 19 %, 0.4 % a 18 %, 0.5 % a 17 %, 0.® % a 1® %, 0.7 % a 15 %,

0.8 % a 14 %, 0.9 % a 12 % o 1 % a 10 % p/p, p/v o v/v de la composición farmacéutica.

la invención está en el intervalo de aproximadamente 0.001 % a aproximadamente 10 %, aproximadamente

0.01 % a aproximadamente 5 %, aproximadamente 0.02 % a aproximadamente 4.5 %, aproximadamente 0.03

% a aproximadamente 4 %, aproximadamente 0.04 % a aproximadamente 3.5 %, aproximadamente 0.05 % a aproximadamente 3 %, aproximadamente 0.0® % a aproximadamente 2.5 %, aproximadamente 0.07 % a aproximadamente 2 %, aproximadamente 0.08 % a aproximadamente 1.5 %, aproximadamente 0.09 % a aproximadamente 1 %, aproximadamente 0.1 % a aproximadamente 0.9 % p/p, p/v o v/v de la composición farmacéutica.

En algunas realizaciones, la cantidad de los TIL proporcionados en las composiciones farmacéuticas de la

invención es igual o inferior a 10 g, 9.5 g, 9.0 g, 8.5 g, 8.0 g, 7.5 g, 7.0 g, ®.5 g, ®.0 g, 5.5 g, 5.0 g, 4.5 g, 4.0 g,

3.5 g, 3.0 g, 2.5 g, 2.0 g, 1.5 g, 1.0 g, 0.95 g, 0.9 g, 0.85 g, 0.8 g, 0.75 g, 0.7 g, 0.®5 g, 0.® g, 0.55 g, 0.5 g, 0.45

g, 0.4 g, 0.35 g, 0.3 g, 0.25 g, 0.2 g, 0.15 g, 0.1 g, 0.09 g, 0.08 g, 0.07 g, 0.0® g, 0.05 g, 0.04 g, 0.03 g, 0.02 g,

0.01 g, 0.009 g, 0.008 g, 0.007 g, 0.00® g, 0.005 g, 0.004 g, 0.003 g, 0.002 g, 0.001 g, 0.0009 g, 0.0008 g,

0.0007 g, 0.000® g, 0.0005 g, 0.0004 g, 0.0003 g, 0.0002 g o 0.0001 g.

®9

En algunas realizaciones, la cantidad de TIL proporcionada en las composiciones farmacéuticas de la invención es superior a 0.0001 g, 0.0002 g, 0.0003 g, 0.0004 g, 0.0005 g, 0.0006 g, 0.0007 g, 0.0008 g, 0.0009 g, 0.001 g, 0.0015 g, 0.002 g, 0.0025 g, 0.003 g, 0.0035 g, 0.004 g, 0.0045 g, 0.005 g, 0.0055 g, 0.006 g, 0.0065 g, 0.007 g, 0.0075 g, 0.008 g, 0.0085 g, 0.009 g, 0.0095 g, 0.01 g, 0.015 g, 0.02 g, 0.025 g, 0.03 g, 0.035 g, 0.04 g, 0.045 g, 0.05 g, 0.055 g, 0.06 g, 0.065 g, 0.07 g, 0.075 g, 0.08 g, 0.085 g, 0.09 g, 0.095 g, 0.1 g, 0.15 g, 0.2 g, 0.25 g, 0.3 g, 0.35 g, 0.4 g, 0.45 g, 0.5 g, 0.55 g, 0.6 g, 0.65 g, 0.7 g, 0.75 g, 0.8 g, 0.85 g, 0.9 g, 0.95 g, 1 g, 1.5 g, 2 g, 2.5, 3 g, 3.5, 4 g, 4.5 g, 5 g, 5.5 g, 6 g, 6.5 g, 7 g, 7.5 g, 8 g, 8.5 g, 9 g, 9.5 g, o 10 g.

Los TIL proporcionados en las composiciones farmacéuticas de la invención son eficaces en un amplio intervalo de dosis. La dosificación exacta dependerá de la vía de administración, la forma en que se vaya a administrar el compuesto, el sexo y la edad del sujeto a tratar, el peso corporal del sujeto a tratar y la preferencia y experiencia del médico que lo atienda. También pueden utilizarse, si procede, las dosis clínicamente establecidas de los TIL. Las cantidades de las composiciones farmacéuticas previstas para su administración mediante los métodos descritos en el presente documento, como las dosis de los TIL, dependerán del ser humano o mamífero a tratar, de la gravedad del trastorno o afección, del ritmo de administración, de la disposición de los ingredientes farmacéuticos activos y de la discreción del médico prescriptor.

En algunas realizaciones, los TIL pueden proporcionarse para su administración en una dosis única. Dicha administración puede ser por inyección, por ejemplo, intravenosa. En algunas realizaciones, los TIL pueden proporcionarse para su administración en dosis múltiples. La dosificación puede ser una, dos, tres, cuatro, cinco, seis o más de seis veces al año. La dosificación puede ser una vez al mes, una vez cada dos semanas, una vez a la semana o una vez cada dos días. La administración de los TIL puede continuar tanto tiempo como sea necesario.

En algunas realizaciones, una dosis eficaz de TIL es de aproximadamente 1*106, 2*106, 3*106, 4*106, 5*106, 6*106, 7*106, 8*106, 9*106, 1x107, 2*1073*1074*1075*107, 6*1077*107, 8*107, 9*107, 1*108, 2*108, 3*108, 4*108, 5*108, 6*108, 7*108, 8*108, 9*108, 1*109, 2*109, 3*109, 4*109, 5*109, 6*109, 7*109, 8*109, 9*109, 1x101°, 2x101°, 3x101°, 4x101°, 5x101°, 6x101°, 7x101°, 8x101°, 9x101°, 1x1011, 2x1011, 3x1011, 4x1011, 5x1011, 6x1011, 7x1011, 8x1011, 9x1011, 1*1012, 2*1012, 3x1012, 4x1012, 5x1012, 6x1012, 7x1012, 8x1012, 9x1012, 1*1013, 2*1013, 3*1013, 4*1013, 5*1013, 6*1013, 7*1013, 8*1013, y 9*1013. En algunas realizaciones, una dosis eficaz de TIL se encuentra en el intervalo de 1*106 a 5*106, 5*106 a 1*107, 1x107 a 5*107, 5*107 a 1*108, 1x108 a 5X108, 5X108 a 1x109, 1x109 a 5X109, 5X109 a 1x101°, 1x101° a 5X101°, 5X101° a 1x1011, 5X1011 a 1x1012, 1X1012 a 5x1012y 5x1012a 1x1013.

En algunas realizaciones, una dosis eficaz de TIL está en el intervalo de aproximadamente 0.01 mg/kg a aproximadamente 4.3 mg/kg, de aproximadamente 0.15 mg/kg a aproximadamente 3.6 mg/kg, de aproximadamente 0.3 mg/kg a aproximadamente 3.2 mg/kg, de aproximadamente 0.35 mg/kg a aproximadamente 2.85 mg/kg, de aproximadamente 0.15 mg/kg a aproximadamente 2.85 mg/kg, de aproximadamente 0.3 mg/kg a aproximadamente 2.15 mg/kg, de aproximadamente 0.45 mg/kg a aproximadamente 1.7 mg/kg, de aproximadamente 0.15 mg/kg a aproximadamente 1.3 mg/kg, de aproximadamente 0.3 mg/kg a aproximadamente 1.15 mg/kg, de aproximadamente 0.45 mg/kg a aproximadamente 1 mg/kg, de aproximadamente 0.55 mg/kg a aproximadamente 0.85 mg/kg, de aproximadamente 0.65 mg/kg a aproximadamente 0.8 mg/kg, de aproximadamente 0.7 mg/kg a aproximadamente 0.75 mg/kg, de aproximadamente 0.7 mg/kg a aproximadamente 2.15 mg/kg, de aproximadamente 0.85 mg/kg a aproximadamente 2 mg/kg, de aproximadamente 1 mg/kg a aproximadamente 1.85 mg/kg, de aproximadamente 1.15 mg/kg a aproximadamente 1.7 mg/kg, de aproximadamente 1.3 mg/kg mg a aproximadamente 1.6 mg/kg, de aproximadamente de 1.35 mg/kg a aproximadamente 1.5 mg/kg, de aproximadamente 2.15 mg/kg a aproximadamente 3.6 mg/kg, de aproximadamente 2.3 mg/kg a aproximadamente 3.4 mg/kg, de aproximadamente 2.4 mg/kg a aproximadamente 3.3 mg/kg, de aproximadamente 2.6 mg/kg a aproximadamente 3.15 mg/kg, de aproximadamente 2.7 mg/kg a aproximadamente 3 mg/kg, de aproximadamente 2.8 mg/kg a aproximadamente 3 mg/kg o de aproximadamente 2.85 mg/kg a aproximadamente 2.95 mg/kg.

En algunas realizaciones, una dosis eficaz de TIL se encuentra en el intervalo de aproximadamente 1 mg a aproximadamente 500 mg, de aproximadamente 10 mg a aproximadamente 300 mg, de aproximadamente 20 mg a aproximadamente 250 mg, de aproximadamente 25 mg a aproximadamente 200 mg, de aproximadamente 1 mg a aproximadamente 50 mg, de aproximadamente 5 mg a aproximadamente 45 mg, de aproximadamente 10 mg a aproximadamente 40 mg, de aproximadamente 15 mg a aproximadamente 35 mg, de aproximadamente 20 mg a aproximadamente 30 mg, de aproximadamente 23 mg a aproximadamente 28 mg, de aproximadamente 50 mg a aproximadamente 150 mg, de aproximadamente 60 mg a aproximadamente 140 mg, de aproximadamente 70 mg a aproximadamente 130 mg, de aproximadamente 80 mg a aproximadamente 120 mg, de aproximadamente 90 mg a aproximadamente 11° mg, o de aproximadamente 95 mg a aproximadamente 105 mg, de aproximadamente 98 mg a aproximadamente 102 mg, de aproximadamente 150 mg a aproximadamente 250 mg, de aproximadamente 160 mg a aproximadamente 240 mg, de aproximadamente 170 mg a aproximadamente 230 mg, de aproximadamente 180 mg a aproximadamente 220 mg, de aproximadamente 190 mg a aproximadamente 210 mg, de aproximadamente 195 mg a aproximadamente 205 mg, o de aproximadamente 198 mg a aproximadamente 207 mg.

Una cantidad eficaz de los TIL puede administrarse en dosis únicas o múltiples por cualquiera de los modos aceptados de administración de agentes con utilidades similares, incluidas las vías intranasal y transdérmica, por inyección intraarterial, intravenosa, intraperitoneal, parenteral, intramuscular, subcutánea, tópica, por trasplante o por inhalación.

V. Métodos de tratamiento de los pacientes

Los métodos de tratamiento comienzan con la recogida inicial de TIL y el cultivo de TIL. Tales métodos han sido descritos en la técnica por, por ejemplo, Jin et al., J. Immunotherapy, 2012, 35(3):283-292. Los métodos de tratamiento se describen (pero no se reivindican) a lo largo de las secciones siguientes, incluidos los Ejemplos.

Los TIL expandidos producidos según los métodos descritos en el presente documento, incluyendo por ejemplo como se describe en las Etapas A a F anteriores o según las Etapas A a F anteriores (también como se muestra, por ejemplo, en la Figura 1) encuentran un uso particular en el tratamiento de pacientes con cáncer (por ejemplo, como se describe en Goff, et al., J. Clinical Oncology, 2016, 34(20): 2389-239, así como el contenido suplementario). El tumor fresco puede diseccionarse en condiciones estériles. Puede recogerse una muestra representativa para el análisis patológico formal. Pueden utilizarse fragmentos individuales de 2 mm3 a 3 mm3. En algunas realizaciones, se obtienen 5, 10, 15, 20, 25 o 30 muestras por paciente. En algunas realizaciones, se obtienen 20, 25 o 30 muestras por paciente. En algunas realizaciones, se obtienen 20, 22, 24, 26 o 28 muestras por paciente. En algunas realizaciones, se obtienen 24 muestras por paciente. Las muestras pueden colocarse en pocillos individuales de una placa de 24 pocillos, mantenerse en medios de crecimiento con altas dosis de IL-2 (6,000 UI/mL) y monitorizarse para detectar la destrucción del tumor y/o la proliferación de TIL. Cualquier tumor con células viables restantes tras el procesamiento puede digerirse enzimáticamente en una suspensión unicelular y crioconservarse, como se describe en el presente documento.

En algunas realizaciones, los TIL cultivados con éxito pueden muestrearse para el análisis del fenotipo (CD3, CD4, CD8 y CD56) y probarse contra el tumor autólogo cuando esté disponible. Los TIL pueden considerarse reactivos si el cocultivo de una noche produce niveles de interferón-gamma (IFN-y) > 200 pg/mL y dos veces el valor inicial (Goff, et al., J Immunother., 2010, 33:840-847). En algunas realizaciones, los cultivos con evidencia de reactividad autóloga o patrones de crecimiento suficientes pueden seleccionarse para una segunda expansión (por ejemplo, una segunda expansión como la proporcionada según la Etapa D de la Figura 1), incluyendo segundas expansiones que a veces se denominan expansión rápida (RE). En algunas realizaciones, los TIL expandidos con alta reactividad autóloga (por ejemplo, alta proliferación durante una segunda expansión), se seleccionan para una segunda expansión adicional. En algunas realizaciones, los TIL con alta reactividad autóloga (por ejemplo, alta proliferación durante una segunda expansión según la etapa D de la Figura 1), se seleccionan para una segunda expansión adicional según la etapa D de la Figura 1.

Los fenotipos celulares de las muestras crioconservadas de TIL de bolsa de infusión pueden analizarse mediante citometría de flujo (por ejemplo, FlowJo) para los marcadores de superficie CD3, CD4, CD8, CCR7 y CD45RA (BD BioSciences), así como mediante cualquiera de los métodos descritos en el presente documento. Las citocinas séricas se midieron mediante técnicas estándar de ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas. Un aumento del IFN-g sérico se definió como >100 pg/mL y superior a 43 niveles basales.

En algunas realizaciones, los TIL producidos por los métodos proporcionados en el presente documento, por ejemplo, los ejemplificados en la Figura 1, proporcionan una mejora sorprendente de la eficacia clínica de los TIL. En algunas realizaciones, los TIL producidos por los métodos proporcionados en el presente documento, por ejemplo, los ejemplificados en la Figura 1, presentan una mayor eficacia clínica en comparación con los TIL producidos por métodos distintos de los que se proporcionan en el presente documento, incluyendo, por ejemplo, métodos distintos de los ejemplificados en la Figura 1. En algunas realizaciones, los métodos distintos de los que se proporcionan en el presente documento incluyen métodos denominados proceso 1C y/o Generación 1 (Gen 1). En algunas realizaciones, el aumento de la eficacia se mide por DCR, ORR y/u otras respuestas clínicas. En algunas realizaciones, los TIL producidos por los métodos proporcionados en el presente documento, por ejemplo, los ejemplificados en la Figura 1, presentan un tiempo de respuesta y un perfil de seguridad similares en comparación con los TIL producidos por métodos distintos de los que se proporcionan en el presente documento, incluyendo, por ejemplo, métodos distintos de los ejemplificados en la Figura 1, por ejemplo, el proceso Gen 1.

En algunas realizaciones, el IFN-gamma (IFN-<y>) es indicativo de la eficacia del tratamiento y/o de una mayor eficacia clínica. En algunas realizaciones, el IFN-y en la sangre de sujetos tratados con TIL es indicativo de TIL activos. En algunas realizaciones, se emplea un ensayo de potencia para la producción de IFN-y. La producción de IFN-<y>es otra medida del potencial citotóxico. La producción de IFN-<y>puede medirse determinando los niveles de la citocina IFN-y en la sangre, el suero o los TILex vivode un sujeto tratado con TIL preparados por los métodos de la presente invención, incluidos los descritos, por ejemplo, en la Figura 1. En algunas realizaciones, un aumento del IFN-y es indicativo de la eficacia del tratamiento en un paciente tratado con los TIL producidos por los métodos de la presente invención. En algunas realizaciones, el IFN-y se multiplica por uno, por dos, por tres, por cuatro o por cinco o más en comparación con un paciente no tratado y/o en comparación con un paciente tratado con TIL preparados con métodos distintos de los que se proporcionan en el presente documento, incluidos, por ejemplo, métodos distintos de los representados en la Figura 1. En algunas realizaciones, la secreción de IFN-y se multiplica por uno en comparación con un paciente no tratado y/o en comparación con un paciente tratado con TIL preparados mediante métodos distintos de los que se proporcionan en el presente documento, incluidos, por ejemplo, métodos distintos de los representados en la Figura 1. En algunas realizaciones, la secreción de IFN-<y>se multiplica por dos en comparación con un paciente no tratado y/o en comparación con un paciente tratado con TIL preparados mediante métodos distintos de los que se proporcionan en el presente documento, incluidos, por ejemplo, métodos distintos de los que se muestran en la Figura 1. En algunas realizaciones, la secreción deFN-<y>se multiplica por tres en comparación con un paciente no tratado y/o en comparación con un paciente tratado con TIL preparados mediante métodos distintos de los que se proporcionan en el presente documento, incluidos, por ejemplo, métodos distintos de los representados en la Figura 1. En algunas realizaciones, la secreción de IFN-<y>se multiplica por cuatro en comparación con un paciente no tratado y/o en comparación con un paciente tratado con TIL preparados mediante métodos distintos de los que se proporcionan en el presente documento, incluidos, por ejemplo, métodos distintos de los representados en la Figura 1. En algunas realizaciones, la secreción de iFN-y se multiplica por cinco en comparación con un paciente no tratado y/o en comparación con un paciente tratado con TIL preparados con métodos distintos de los que se proporcionan en el presente documento, incluidos, por ejemplo, métodos distintos de los representados en la Figura 1. En algunas realizaciones, el IFN-y se mide utilizando un kit ELISA Quantikine. En algunas realizaciones, el IFN-y se mide en los TILex vivode un sujeto tratado con TIL preparados por los métodos de la presente invención, incluidos los descritos por ejemplo en la Figura 1. En algunas realizaciones, el IFN-y se mide en la sangre de un sujeto tratado con TIL preparados por los métodos de la presente invención, incluidos los descritos por ejemplo en la Figura 1. En algunas realizaciones, el IFN-<y>se mide en el suero de los TIL de un sujeto tratado con TIL preparados por los métodos de la presente invención, incluidos los descritos por ejemplo en la Figura 1.

En algunas realizaciones, los TIL preparados por los métodos de la presente invención, incluidos los descritos por ejemplo en la Figura 1, muestran una mayor policlonalidad en comparación con los TIL producidos por otros métodos, incluidos los no ejemplificados en la Figura 1, como por ejemplo los métodos denominados métodos del proceso 1C. En algunas realizaciones, la policlonalidad significativamente mejorada y/o la policlonalidad aumentada son indicativas de la eficacia del tratamiento y/o de una mayor eficacia clínica. En algunas realizaciones, la policlonalidad se refiere a la diversidad del repertorio de células T. En algunas realizaciones, un aumento de la policlonalidad puede ser indicativo de la eficacia del tratamiento con respecto a la administración de los TIL producidos por los métodos de la presente invención. En algunas realizaciones, la policlonalidad aumenta una vez, dos veces, diez veces, cien veces, quinientas veces o mil veces en comparación con los TIL preparados mediante métodos distintos de los que se proporcionan en el presente documento, incluidos, por ejemplo, métodos distintos de los representados en la Figura 1. En algunas realizaciones, la policlonalidad se multiplica por uno en comparación con un paciente no tratado y/o en comparación con un paciente tratado con TIL preparados con métodos distintos de los que se proporcionan en el presente documento, incluidos, por ejemplo, métodos distintos de los representados en la Figura 1. En algunas realizaciones, la policlonalidad se multiplica por dos en comparación con un paciente no tratado y/o en comparación con un paciente tratado con TIL preparados mediante otros métodos distintos de los que se proporcionan en el presente documento, incluidos, por ejemplo, métodos distintos de los representados en la Figura 1. En algunas realizaciones, la policlonalidad se multiplica por diez en comparación con un paciente no tratado y/o en comparación con un paciente tratado con TIL preparados mediante otros métodos distintos de los que se proporcionan en el presente documento, incluidos, por ejemplo, métodos distintos de los representados en la Figura 1. En algunas realizaciones, la policlonalidad se multiplica por 100 en comparación con un paciente no tratado y/o en comparación con un paciente tratado con TIL preparados mediante otros métodos distintos de los que se proporcionan en el presente documento, incluidos, por ejemplo, otros métodos distintos de los representados en la Figura 1. En algunas realizaciones, la policlonalidad se multiplica por 500 en comparación con un paciente no tratado y/o en comparación con un paciente tratado con TlL preparados mediante métodos distintos de los que se proporcionan en el presente documento, incluidos, por ejemplo, métodos distintos de los representados en la Figura 1. En algunas realizaciones, la policlonalidad se multiplica por 1000 en comparación con un paciente no tratado y/o en comparación con un paciente tratado con TlL preparados con métodos distintos de los que se proporcionan en el presente documento, incluidos, por ejemplo, métodos distintos de los de la Figura 1.

Las medidas de eficacia pueden incluir la tasa de control de la enfermedad (DCR), así como la tasa de respuesta global (ORR), tal y como se conoce en la técnica y se describe en el presente documento.

1. Métodos de tratamiento del NSCLC

Las composiciones y los métodos descritos en el presente documento pueden utilizarse en un método para tratar el cáncer de pulmón de células no pequeñas (NSCLC), en el que el NSCLC es refractario al tratamiento con un anticuerpo anti-PD-1. En algunas realizaciones, el anticuerpo anti-PD-1 incluye, por ejemplo, entre otros, nivolumab (BMS-936558, Bristol-Myers Squibb; Opdivo®), pembrolizumab (lambrolizumab, MK03475 o MK-3475, Merck; Keytruda®), ipilimumab (Yervoy®), anticuerpo anti-PD-1 humanizado JS001 (ShangHai JunShi), anticuerpo monoclonal anti-PD-1 Ts R-042 (Tesaro, Inc.), Pidilizumab (mAb anti-PD-1 c T-011, Medivation), anticuerpo monoclonal anti-PD-1 BGB-A317 (BeiGene), y/o anticuerpo anti-PD-1 SHR-1210 (ShangHai HengRui), anticuerpo monoclonal humano REGN2810 (Regeneron), anticuerpo monoclonal humano MDX-1106 (Bristol-Myers Squibb), y/o anticuerpo IgG4 humanizado anti-PD-1 PDR001 (Novartis). En algunas realizaciones, el anticuerpo PD-1 es del clon: RMP1-14 (IgG de rata) - BioXcell cat# BP0146. Otros anticuerpos adecuados para su uso en métodos de coadministración con TIL producidos según los Etapas A a F descritos en el presente documento son los anticuerpos anti-PD-1 divulgados en la Patente de los Estados Unidos No.

8,008,449. En algunas realizaciones, el anticuerpo o la porción de unión a antígeno del mismo se une específicamente a PD-L1 e inhibe su interacción con PD-1, aumentando así la actividad inmunitaria. Se incluye cualquier anticuerpo conocido en la técnica que se una a PD-L1 e interrumpa la interacción entre PD-1 y PD-L1, y estimule una respuesta inmunitaria antitumoral. Por ejemplo, los anticuerpos que se dirigen a PD-L1 y están en ensayos clínicos, incluyen BMS-936559 (Bristol-Myers Squibb) y MPDL3280A (Genentech). Otros anticuerpos adecuados dirigidos contra PD-L1 se describen en la Patente de los Estados Unidos No. 7,943,743. Un experto comprenderá que se incluye cualquier anticuerpo que se una a PD-1 o PD-L1, interrumpa la interacción PD-1/PD-L1 y estimule una respuesta inmunitaria antitumoral.

En algunas realizaciones, el NSCLC ha sido tratado con un anticuerpo anti-PD-1. En algunas realizaciones, el NSCLC ha sido tratado con un anticuerpo anti-PD-L1. En algunas realizaciones, el sujeto con NSCLC no ha recibido tratamiento. En algunas realizaciones, el NSCLC no ha sido tratado con un anticuerpo anti-PD-1. En algunas realizaciones, el NSCLC no ha sido tratado con un anticuerpo anti-PD-L1. En algunas realizaciones, el NSCLC ha sido tratado previamente con un agente quimioterapéutico. En algunas realizaciones, el NSCLC ha sido tratado previamente con un agente quimioterapéutico, pero ya no está siendo tratado con el agente quimioterapéutico. En algunas realizaciones, el paciente con NSCLC no ha sido tratado con anti-PD-1/PD-L1. En algunas realizaciones, el sujeto con NSCLC tiene una expresión baja de PD-L1. En algunas realizaciones, el sujeto con NSCLC tiene NSCLC no tratado o es tratado después de la quimioterapia, pero no ha sido tratado con anti-PD-1/PD-L1. En algunas realizaciones, el sujeto con NSCLC tiene NSCLc no tratado o es tratado después de la quimioterapia, pero no ha sido tratado con anti-PD-1/PD-L1 y tiene baja expresión de PD-L1. En algunas realizaciones, el sujeto con NSCLC tiene una enfermedad voluminosa al inicio del estudio. En algunas realizaciones, el sujeto presenta una enfermedad voluminosa al inicio del estudio y tiene una expresión baja de PD-L1. En algunas realizaciones, el sujeto con NSCLC tiene NSCLC no tratado o es tratado después de la quimioterapia, pero no ha sido tratado con anti-PD-1/PD-L1que tiene baja expresión de PD-L1 y/o tiene enfermedad voluminosa al inicio. En algunas realizaciones, la enfermedad voluminosa se indica cuando el diámetro tumoral máximo es superior a 7 cm medidos en el plano transversal o coronal. En algunas realizaciones, la enfermedad voluminosa está indicada cuando hay ganglios linfáticos inflamados con un diámetro en el eje corto de 20 mm o superior. En algunas realizaciones, el compuesto quimioterapéutico incluye un compuesto terapéutico estándar para el tratamiento del NSCLC.

En algunas realizaciones, los TIL preparados por los métodos de la presente invención, incluidos los descritos por ejemplo en la Figura 1, muestran una mayor policlonalidad en comparación con los TIL producidos por otros métodos, incluidos los no ejemplificados en la Figura 1, como por ejemplo los métodos denominados métodos del proceso 1C. En algunas realizaciones, la policlonalidad significativamente mejorada y/o la policlonalidad aumentada es indicativa de la eficacia del tratamiento y/o de una mayor eficacia clínica para el tratamiento del cáncer. En algunas realizaciones, la policlonalidad se refiere a la diversidad del repertorio de células T. En algunas realizaciones, un aumento de la policlonalidad puede ser indicativo de la eficacia del tratamiento con respecto a la administración de los TIL producidos por los métodos de la presente invención. En algunas realizaciones, la policlonalidad aumenta una vez, dos veces, diez veces, 100 veces, 500 veces o 1000 veces en comparación con los TIL preparados mediante métodos distintos de los que se proporcionan en el presente documento, incluidos, por ejemplo, métodos distintos de los representados en la Figura 1. En algunas realizaciones, la policlonalidad se multiplica por uno en comparación con un paciente no tratado y/o en comparación con un paciente tratado con TIL preparados con métodos distintos de los que se proporcionan en el presente documento, incluidos, por ejemplo, métodos distintos de los representados en la Figura 1. En algunas realizaciones, la policlonalidad se multiplica por dos en comparación con un paciente no tratado y/o en comparación con un paciente tratado con TIL preparados mediante otros métodos distintos de los que se proporcionan en el presente documento, incluidos, por ejemplo, métodos distintos de los representados en la Figura 1. En algunas realizaciones, la policlonalidad se multiplica por diez en comparación con un paciente no tratado y/o en comparación con un paciente tratado con TIL preparados mediante otros métodos distintos de los que se proporcionan en el presente documento, incluidos, por ejemplo, métodos distintos de los representados en la Figura 1. En algunas realizaciones, la policlonalidad se multiplica por 100 en comparación con un paciente no tratado y/o en comparación con un paciente tratado con TIL preparados mediante otros métodos distintos de los que se proporcionan en el presente documento, incluidos, por ejemplo, otros métodos distintos de los representados en la Figura 1. En algunas realizaciones, la policlonalidad se multiplica por 500 en comparación con un paciente no tratado y/o en comparación con un paciente tratado con TIL preparados mediante métodos distintos de los que se proporcionan en el presente documento, incluidos, por ejemplo, métodos distintos de los representados en la Figura 1. En algunas realizaciones, la policlonalidad se multiplica por 1000 en comparación con un paciente no tratado y/o en comparación con un paciente tratado con TIL preparados con métodos distintos de los que se proporcionan en el presente documento, incluidos, por ejemplo, métodos distintos de los de la Figura 1.

En algunas realizaciones, el sujeto a tratar tiene un NSCLC en estadio III o IV (escamoso, adenocarcinoma, carcinoma de células grandes). En algunas realizaciones, el sujeto a tratar tiene un NSCLC en estadio III (escamoso, adenocarcinoma, carcinoma de células grandes). En algunas realizaciones, el sujeto a tratar tiene un NSCLC en estadio IV (escamoso, adenocarcinoma, carcinoma de células grandes). En algunas realizaciones, el sujeto a tratar tiene un tumor impulsado por un oncogén y había sido tratado con al menos una terapia direccionada en forma eficaz dirigida hacia el oncogén.

En algunas realizaciones, el sujeto a tratar tiene un NSCLC en estadio III o estadio IV (escamoso, adenocarcinoma, carcinoma de células grandes) y fue tratado previamente con, por ejemplo, un inhibidor de PD-1 o un inhibidor de PD-L1, como, por ejemplo, anti-PD-1 y/o anti-PD-L1. En algunas realizaciones, el sujeto a tratar tiene un NSCLC en estadio III (escamoso, adenocarcinoma, carcinoma de células grandes) y fue tratado previamente con una terapia sistémica que incluye, por ejemplo, anti-PD-1 y/o anti-PD-L1. En algunas realizaciones, el sujeto a tratar tiene un NSCLC en estadio IV (escamoso, adenocarcinoma, carcinoma de células grandes) y fue tratado previamente con terapia sistémica que incluye, por ejemplo, anti-PD-1 y/o anti-PD-L1. En algunas realizaciones, el sujeto a tratar tiene un NSCLC en estadio III (escamoso, adenocarcinoma, carcinoma de células grandes) y fue tratado previamente con terapia sistémica que incluye anti-PD-1. En algunas realizaciones, el sujeto a tratar tiene un NSCLC en estadio IV (escamoso, adenocarcinoma, carcinoma de células grandes) y fue tratado previamente con terapia sistémica que incluía anti-PD-1. En algunas realizaciones, el sujeto a tratar tiene un NSCLC en estadio III (escamoso, adenocarcinoma, carcinoma de células grandes) y fue tratado previamente con terapia sistémica que incluía anti-PD-L1. En algunas realizaciones, el sujeto a tratar tiene un NSCLC en estadio IV (escamoso, adenocarcinoma, carcinoma de células grandes) y fue tratado previamente con terapia sistémica que incluía anti-PD-L1. En algunas realizaciones, el sujeto a tratar tiene un tumor impulsado por un oncogén y había sido tratado con al menos una terapia direccionada en forma eficaz dirigida contra el oncogén.

En algunas realizaciones, el sujeto a tratar tiene un diagnóstico confirmado histológica o patológicamente de NSCLC en estadio III o estadio IV (escamoso, no escamoso, adenocarcinoma, carcinoma de células grandes).

En algunas realizaciones, el sujeto a tratar no ha sido tratado con inmunoterapia. En algunas realizaciones, el sujeto a tratar puede haber recibido hasta 3 terapias sistémicas previas contra el cáncer incluyendo, por ejemplo, terapia sistémica en el entorno adyuvante o neoadyuvante, o como parte de la quimiorradioterapia definitiva. En algunas realizaciones, el sujeto a tratar tiene mutaciones oncogénicas, incluyendo por ejemplo mutaciones en EGFR, ALK, y/o ROS.

En algunas realizaciones, el sujeto a tratar había recibido previamente terapia sistémica con, por ejemplo, un inhibidor de PD-1 o un inhibidor de PD-L1, como, por ejemplo, anti-PD-1 y/o anti-PD-LI, como parte de < 3 líneas previas de terapia sistémica. En algunas realizaciones, el sujeto a tratar tiene mutaciones oncogénicas, como por ejemplo mutaciones en EGFR, ALK y/o ROS.

En algunas realizaciones, el sujeto a tratar tiene al menos 1 lesión extirpable (o lesiones agregadas) de al menos aproximadamente 1.5 cm de diámetro tras la extirpación para su uso en la preparación de TIL.

En algunas realizaciones, el sujeto a tratar tuvo un periodo de lavado de una o más terapias anticancerígenas previas de una duración mínima, antes del primer tratamiento del estudio (es decir, el inicio de la linfodepleción no mieloablativa (NMA-LD) o del pembrolizumab).

En algunas realizaciones, el sujeto a tratar había recibido previamente una terapia dirigida con un receptor del factor de crecimiento epidérmico (EGFR), MEK, BRAF, ALK, ROS1 y/u otros agentes dirigidos (incluidos, por ejemplo, erlotinib, afatinib, dacomitinib, osimertinib, crizotinib, ceritinib y/o lorlatinib) y un lavado mínimo del tratamiento previo de al menos 14 días antes del inicio del tratamiento con TIL.

En algunas realizaciones, el sujeto a tratar ha recibido quimioterapia adyuvante, neoadyuvante o definitiva y/o quimiorradiación y un lavado mínimo del tratamiento previo de al menos 21 días antes del inicio del tratamiento.

En algunas realizaciones, el sujeto a tratar había recibido previamente una terapia dirigida a puntos de control con, por ejemplo, un inhibidor de PD-1 o un inhibidor de PD-L1, como, por ejemplo, un anti-PD-1, y anti-PD-L1, otros mAb, y/o vacunas y un periodo de lavado mínimo mayor o igual a 21 días antes del inicio de la linfodepleción no mieloablativa (NMA-LD).

a. Inhibidores de PD-1 y PD-L1

La muerte programada 1 (PD-1) es una proteína receptora de punto de control inmunitario transmembrana de 288 aminoácidos expresada por células T, células B, células T asesinas naturales (NK), monocitos activados y células dendríticas. La PD-1, también conocida como CD279, pertenece a la familia CD28 y en los humanos está codificada por el genPdcdldel cromosoma 2. La PD-1 consta de un dominio de la superfamilia de las inmunoglobulinas (Ig), una región transmembrana y un dominio intracelular que contiene un motivo inhibidor inmunorreceptor basado en tirosina (ITIM) y un motivo interruptor inmunorreceptor basado en tirosina (ITSM). Se sabe que la PD-1 y sus ligandos (PD-L1 y PD-L2) desempeñan un papel clave en la tolerancia inmunitaria, como se describe en Keir, et al., Annu. Rev. Immunol. 2008, 26, 677-704. PD-1 proporciona señales inhibitorias que regulan negativamente las respuestas inmunitarias de las células T. PD-L1 (también conocida como B7-H1 o CD274) y PD-L2 (también conocida como B7-DC o CD273) se expresan en las células tumorales y las células estromales, que pueden ser encontradas por las células T activadas que expresan PD-1, lo que conduce a la inmunosupresión de las células T. PD-L1 es una proteína transmembrana de 290 aminoácidos codificada por el genCd274del cromosoma 9 humano. El bloqueo de la interacción entre la PD-1 y sus ligandos PD-L1 y PD-L2 mediante el uso de un inhibidor de la PD-1, un inhibidor de la PD-L1 y/o un inhibidor de la PD-L2 puede superar la resistencia inmunitaria, como se ha demostrado en estudios clínicos recientes, como el descrito en Topalian, et al., N. Eng. J. Med. 2012, 366, 2443-54. PD-L1 se expresa en muchas líneas celulares tumorales, mientras que la PD-L2 se expresa sobre todo en las células dendríticas y en unas pocas líneas tumorales. Además de las células T (que expresan PD-1 de forma inducida tras su activación), PD-1 también se expresa en células B, células asesinas naturales, macrófagos, monocitos activados y células dendríticas.

El inhibidor de PD-1 puede ser cualquier inhibidor de PD-1 o bloqueador de PD-1 conocido en la técnica. En particular, se trata de uno de los inhibidores o bloqueadores de PD-1 descritos con más detalle en los párrafos siguientes. Los términos "inhibidor", "antagonista" y "bloqueador" se utilizan indistintamente en el presente documento en referencia a los inhibidores de PD-1. Para evitar dudas, las referencias en el presente documento a un inhibidor de PD-1 que sea un anticuerpo pueden referirse a un compuesto o fragmentos de unión a antígeno, variantes, conjugados o biosimilares del mismo. Para evitar dudas, las referencias en el presente documento a un inhibidor de la PD-1 también pueden referirse a un compuesto de molécula pequeña o a una sal, éster, solvato, hidrato, cocristal o profármaco farmacéuticamente aceptable del mismo.

En algunas realizaciones de la invención, el inhibidor de PD-1 es un anticuerpo (es decir, un anticuerpo anti-PD-1), un fragmento del mismo, incluidos fragmentos Fab, o un fragmento variable de cadena sencilla (scFv) del mismo. En algunas realizaciones, el inhibidor de PD-1 es un anticuerpo policlonal. En una realización preferida, el inhibidor de PD-1 es un anticuerpo monoclonal. En algunas realizaciones, el inhibidor de PD-1 compite por unirse a PD-1, y/o se une a un epítopo de PD-1. En una realización, el anticuerpo compite por la unión con PD-1, y/o se une a un epítopo en PD-1.

En algunas realizaciones, el inhibidor de PD-1 es uno que se une a PD-1 humana con una Kd de aproximadamente 100 pM o inferior, se une a PD-1 humana con una K<d>de aproximadamente 90 pM o inferior, se une a PD-1 humana con una Kd de aproximadamente 80 pM o inferior, se une a PD-1 humana con una Kd de aproximadamente 70 pM o inferior, se une a PD-1 humana con una Kd de aproximadamente 60 pM o inferior, se une a PD-1 humana con una Kd de aproximadamente 50 pM o inferior, se une a PD-1 humana con una Kd de aproximadamente 40 pM o inferior, se une a PD-1 humana con una Kd de aproximadamente 30 pM o inferior, se une a PD-1 humana con una Kd de aproximadamente 20 pM o inferior, se une a PD-1 humana con una Kd de aproximadamente 10 pM o inferior, o se une a PD-1 humana con una K<d>de aproximadamente 1 pM o inferior.

En algunas realizaciones, el inhibidor de PD-1 es uno que se une a la PD-1 humana con una kasociación de aproximadamente 7.5 * 105 1/Ms o más rápido, se une a la PD-1 humana con una kasociación de aproximadamente 7.5 * 105 1/M s o más rápido, se une a la PD-1 humana con una kasociación de aproximadamente 8 * 1051/M s o más rápido, se une a la PD-1 humana con una kasociación de aproximadamente 8.5 * 1051/M s o más rápido, se une a la PD-1 humana con una kasociación de aproximadamente 9 * 1051/M s o más rápido, se une a la PD-1 humana con una kasociación de aproximadamente 9.5 * 1051/M s o más rápido, o se une a la PD-1 humana con una kasociación de aproximadamente 1 * 1061/M s o más rápido.

En algunas realizaciones, el inhibidor de la PD-1 es uno que se une a la PD-1 humana con una kasociación de aproximadamente 2 * 10'51/s o más lento, se une a la PD-1 humana con una kasociación de aproximadamente 2.1 * 10'51/s o más lento, se une a la PD-1 humana con una kasociación de aproximadamente 2.2 * 10'51/s o más lento, se une a la PD-1 humana con una kasociación de aproximadamente 2.3 * 10'51/s o más lento, se une a la PD-1 humana con una kasociación de aproximadamente 2.4 * 10'51/s o más lento, se une a la PD-1 humana con una kasociación de aproximadamente 2.5 * 10'51/s o más lento, se une a la PD-1 humana con una kasociación de aproximadamente 2.6 * 10'5 1/s o más lento o se une a la PD-1 humana con una kdisociación de aproximadamente 2.7 * 10'51/s o más lento, se une a la PD-1 humana con una kdisociación de aproximadamente 2.8 * 10'51/s o más lento, se une a la PD-1 humana con una kdisociación de aproximadamente 2.9 * 10'51/s o más lento, o se une a la PD-1 humana con una kdisociación de aproximadamente 3 * 10'51/s o más lento.

En algunas realizaciones, el inhibidor de PD-1 es uno que bloquea o inhibe la unión de PD-L1 humana o PD-L2 humana a PD-1 humana con una IC50 de aproximadamente 10 nM o inferior, bloquea o inhibe la unión de PD-L1 humana o PD-L2 humana a PD-1 humana con una IC50 de aproximadamente 9 nM o inferior, bloquea o inhibe la unión de PD-L1 humana o PD-L2 humana a PD-1 humana con una IC50 de aproximadamente 8 nM o inferior, bloquea o inhibe la unión de PD-L1 humana o PD-L2 humana a PD-1 humana con una IC50 de aproximadamente 7 nM o inferior, bloquea o inhibe la unión de PD-L1 humana o PD-L2 humana a PD-1 humana con una IC50 de aproximadamente 6 nM o inferior, bloquea o inhibe la unión de PD-L1 humana o PD-L2 humana a PD-1 humana con una IC50 de aproximadamente 5 nM o inferior, bloquea o inhibe la unión de PD-L1 humana o PD-L2 humana a PD-1 humana con una IC50 de aproximadamente 4 nM o inferior, bloquea o inhibe la unión de PD-L1 humana o PD-L2 humana a PD-1 humana con una IC50 de aproximadamente 3 nM o inferior, bloquea o inhibe la unión de PD-L1 o PD-L2 humana a PD-1 humana con una IC50 de aproximadamente 2 nM o inferior, o bloquea o inhibe la unión de PD-L1 o PD-L2 humana a PD-1 humana con una IC50 de aproximadamente 1 nM o inferior.

En una realización, el inhibidor de PD-1 es nivolumab (disponible comercialmente como OPDIVO de Bristol-Myers Squibb Co.), o biosimilares, fragmentos de unión a antígeno, conjugados o variantes de los mismos. El nivolumab es un anticuerpo IgG4 totalmente humano que bloquea el receptor de PD-1. En una realización, el anticuerpo anti-PD-1 es un anticuerpo de inmunoglobulina G4 kappa, anti-(CD274 humano). Al nivolumab se le ha asignado el número de registro 946414-94-4 del Chemical Abstracts Service (CAS) y también se le conoce como 5C4, BMS-936558, MDX-1106 y ONO-4538. La preparación y las propiedades del nivolumab se describen en la Patente de los Estados Unidos No. 8,008,449 y en la Publicación de Patente Internacional No. WO 2006/121168. La seguridad y eficacia clínicas del nivolumab en diversas formas de cáncer se han descrito en Wang, et al., Cancer Immunol Res. 2014, 2, 846-56; Page, et al., Ann. Rev. Med., 2014, 65, 185-202; y Weber, et al., J. Clin. Oncology, 2013, 31, 4311-4318. Las secuencias de aminoácidos del nivolumab se exponen en la Tabla 48. El nivolumab tiene enlaces disulfuro entre cadenas pesada en 22-96,140-196, 254 314, 360-418, 22"-96", 140"-196", 254"-314", y 360"-418"; enlaces disulfuro entre cadenas ligeras en 23'-88', 134'-194', 23m-88m, y 134m-194m; enlaces disulfuro entre cadenas pesadas y ligeras en 127-214', 127"-214"', enlaces disulfuro entre cadenas pesadas - pesadas en 219-219" y 222-222"; y sitios de N-glicosilación (H CH2 84.4) en 290, 290".

En una realización, un inhibidor de la PD-1 comprende una cadena pesada dada por la SEQ ID NO: 463 y una cadena ligera dada por la SEQ ID NO: 128. En una realización, un inhibidor de PD-1 comprende cadenas pesadas y ligeras que tienen las secuencias mostradas en la SEQ ID NO: 463 y la SEQ ID NO: 128, respectivamente, o fragmentos de unión a antígeno, fragmentos Fab, fragmentos variables de cadena sencilla (scFv), variantes o conjugados de los mismos. En una realización, un inhibidor de PD-1 comprende cadenas pesadas y ligeras que son cada una al menos un 99 % idénticas a las secuencias mostradas en la SEQ ID NO: 463 y la SEQ ID NO: 128, respectivamente. En una realización, un inhibidor de PD-1 comprende cadenas pesadas y ligeras que son cada una al menos un 98 % idénticas a las secuencias mostradas en la SEQ ID NO: 463 y la SEQ ID NO: 128, respectivamente. En una realización, un inhibidor de PD-1 comprende cadenas pesadas y ligeras que son cada una al menos un 97 % idénticas a las secuencias mostradas en la SEQ ID NO: 463 y la SEQ ID NO: 128, respectivamente. En una realización, un inhibidor de PD-1 comprende cadenas pesadas y ligeras que son cada una al menos un 96 % idénticas a las secuencias mostradas en la SEQ ID NO: 463 y la SEQ ID NO: 128, respectivamente. En una realización, un inhibidor de PD-1 comprende cadenas pesadas y ligeras que son cada una al menos un 95 % idénticas a las secuencias mostradas en la SEQ ID NO: 463 y la S<e>Q ID NO: 128, respectivamente.

En una realización, el inhibidor de PD-1 comprende las CDR de cadena pesada y ligera o las regiones variables (VR) del nivolumab. En una realización, la región variable de la cadena pesada del inhibidor de la PD-1 (V<h>) comprende la secuencia mostrada en la SEQ ID NO: 129, y la región variable de la cadena ligera del inhibidor de la PD-1 (V<l>) comprende la secuencia mostrada en la SEQ ID NO: 130, y sustituciones conservadoras de aminoácidos de la misma. En una realización, un inhibidor de PD-1 comprende las regiones V<h>y V<l>que son cada una al menos un 99 % idénticas a las secuencias mostradas en la SEQ ID NO: 129 y la SEQ ID NO: 130, respectivamente. En una realización, un inhibidor de PD-1 comprende regiones V<h>y V<l>que son cada una al menos un 98 % idénticas a las secuencias mostradas en la SEQ ID NO: 129 y la SEQ ID NO: 130 respectivamente. En una realización, un inhibidor de PD-1 comprende regiones V<h>y V<l>que son cada una al menos un 97 % idénticas a las secuencias mostradas en la SEQ ID NO: 129 y la SEQ ID NO: 130 respectivamente. En una realización, un inhibidor de PD-1 comprende regiones V<h>y V<l>que son cada una al menos un 96 % idénticas a las secuencias mostradas en la SEQ ID NO: 129 y la SEQ ID NO: 130 respectivamente. En una realización, un inhibidor de PD-1 comprende regiones V<h>y V<l>que son cada una al menos un 95 % idénticas a las secuencias mostradas en la SEQ ID NO: 129 y la SEQ ID NO: 130 respectivamente.

En una realización, un inhibidor de PD-1 comprende dominios CDR1, CDR2 y CDR3 de cadena pesada que tienen las secuencias establecidas en la<s>E<q>ID NO: 131, la SEQ ID<n>O: 132 y la SEQD NO: 133, respectivamente, y sustituciones conservadoras de aminoácidos de las mismas, y dominios CDR1, CDR2 y CDR3 de cadena ligera que tienen las secuencias establecidas en la SEQ ID NO: 134, la SEQ ID NO: 135 y la SEQ ID NO: 136, respectivamente, y sustituciones conservadoras de aminoácidos de las mismas. En una realización, el anticuerpo compite por la unión con, y/o se une al mismo epítopo en PD-1 que cualquiera de los anticuerpos antes mencionados.

En una realización, el inhibidor de PD-1 es un anticuerpo monoclonal biosimilar anti-PD-1 aprobado por las autoridades reguladoras de medicamentos con referencia al nivolumab. En una realización, el biosimilar comprende un anticuerpo anti-PD-1 que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos un 97 % de identidad de secuencia, por ejemplo, 97 %, 98 %, 99 % o 100 % de identidad de secuencia, con la secuencia de aminoácidos de un producto medicinal de referencia o producto biológico de referencia y que comprende una o más modificaciones postraduccionales en comparación con el producto medicinal de referencia o producto biológico de referencia, en el que el producto medicinal de referencia o producto biológico de referencia es nivolumab. En algunas realizaciones, la una o más modificaciones postraduccionales se seleccionan entre una o más de las siguientes: glicosilación, oxidación, desamidación y truncamiento. En algunas realizaciones, el biosimilar es un anticuerpo anti-PD-1 autorizado o presentado para su autorización, en el que el anticuerpo anti-PD-1 se proporciona en una formulación que difiere de las formulaciones de un producto medicinal de referencia o producto biológico de referencia, en el que el producto medicinal de referencia o producto biológico de referencia es nivolumab. El anticuerpo anti-PD-1 puede estar autorizado por una autoridad reguladora de medicamentos como la FDA de los Estados Unidos y/o la EMA de la Unión Europea. En algunas realizaciones, el biosimilar se proporciona como una composición que comprende además uno o más excipientes, en la que el uno o más excipientes son iguales o diferentes a los excipientes comprendidos en un producto medicinal de referencia o producto biológico de referencia, en el que el producto medicinal de referencia o producto biológico de referencia es nivolumab. En algunas realizaciones, el biosimilar se proporciona como una composición que comprende además uno o más excipientes, en la que el uno o más excipientes son iguales o diferentes a los excipientes comprendidos en un producto medicinal de referencia o producto biológico de referencia, en el que el producto medicinal de referencia o producto biológico de referencia es nivolumab.

Tabla 19. Secuencias de aminoácidos de los inhibidores de PD-1 relacionados con el nivolumab.

En otra realización, el inhibidor de PD-1 comprende pembrolizumab (disponible comercialmente como KEYTRUDA de Merck & Co., Inc., Kenilworth, NJ, EE. UU.), o fragmentos de unión a antígeno, conjugados o variantes del mismo. El pembrolizumab tiene asignado el número de registro CAS 1374853-91-4 y también se conoce como lambrolizumab, MK-3475 y SCH-900475. El pembrolizumab tiene una estructura de dímero de inmunoglobulina G4, anti-(proteína humana PDCD1 (muerte celular programada 1)) (cadena pesada monoclonal humana-Mus musculus), disulfuro con cadena ligera monoclonal humana-Mus musculus. La estructura del pembrolizumab también puede describirse como inmunoglobulina G4, anti-(muerte celular programada humana 1); disulfuro de cadena pesada monoclonal de ratón humanizado [228-L-prolina(H10-S>P)]y4 (134-218') con bisdisulfuro del dinero de cadena ligera<k>monoclonal de ratón humanizado (226-226":229-229"). Las propiedades, los usos y la preparación del pembrolizumab se describen en la Publicación de Patente Internacional No. WO 2008/156712 A1, la Patente de los Estados Unidos No. 8,354,509 y las Publicaciones de las Solicitudes de Patente de los Estados Unidos Nos. US 2010/0266617 A1, US 2013/0108651 A1, y US 2013/0109843 A2. La seguridad y eficacia clínicas del pembrolizumab en diversas formas de cáncer se describen en Fuerst, Oncology Times, 2014, 36, 35-36; Robert, et al., Lancet, 2014, 384, 1109-17; y Thomas, et al., Exp. Opin. Biol. Ther., 2014, 14, 1061-1064. Las secuencias de aminoácidos del pembrolizumab se exponen en la Tabla 49. El pembrolizumab incluye los siguientes puentes disulfuro: 22-96, 22"-96", 23'-92', 23'"-92'", 134-218', 134"-218"', 138'-198', 138m-198m, 147-203, 147"-203", 226-226", 229-229", 261-321, 261"-321", 367-425, y 367"-425", y los siguientes sitios de glicosilación (N): Asn-297 y Asn-297". El pembrolizumab es un isotipo IgG4/kappa con una mutación estabilizadora S228P en la región Fc; la inserción de esta mutación en la región bisagra de IgG4 impide la formación de medias moléculas típicamente observadas en los anticuerpos IgG4. El pembrolizumab está heterogéneamente glicosilado en Asn297 dentro del dominio de Fc de cada cadena pesada, lo que produce un peso molecular de aproximadamente 149 kDa para el anticuerpo intacto. La glicoforma dominante del pembrolizumab es la forma de glicano agalacto diantenario fucosilado (G0F).

En una realización, un inhibidor de PD-1 comprende una cadena pesada dada por la SEQ ID NO: 137 y una cadena ligera dada por la SEQ ID NO: 138. En una realización, un inhibidor de PD-1 comprende cadenas pesadas y ligeras que tienen las secuencias mostradas en la SEQ ID NO: 137 y la SEQ ID NO: 138, respectivamente, o fragmentos de unión a antígeno, fragmentos Fab, fragmentos variables de cadena sencilla (scFv), variantes o conjugados de los mismos. En una realización, un inhibidor de PD-1 comprende cadenas pesadas y ligeras que son cada una al menos un 99 % idénticas a las secuencias mostradas en la SEQ ID NO: 137 y la SEQ ID NO: 138, respectivamente. En una realización, un inhibidor de PD-1 comprende cadenas pesadas y ligeras que son cada una al menos un 98 % idénticas a las secuencias mostradas en la SEQ ID NO: 137 y la SEQ ID NO: 138, respectivamente. En una realización, un inhibidor de PD-1 comprende cadenas pesadas y ligeras que son cada una al menos un 97 % idénticas a las secuencias mostradas en la SEQ ID NO: 137 y la SEQ ID NO: 138, respectivamente. En una realización, un inhibidor de PD-1 comprende cadenas pesadas y ligeras que son cada una al menos un 96 % idénticas a las secuencias mostradas en la SEQ ID NO: 137 y la SEQ ID NO: 138, respectivamente. En una realización, un inhibidor de PD-1 comprende cadenas pesadas y ligeras que son cada una al menos un 95 % idénticas a las secuencias mostradas en la SEQ ID NO: 137 y la S<e>Q ID NO: 138, respectivamente.

En una realización, el inhibidor de PD-1 comprende las CDR de cadena pesada y ligera o las regiones variables (VR) del pembrolizumab. En una realización, la región variable de la cadena pesada del inhibidor de la PD-1 (V<h>) comprende la secuencia mostrada en la SEQ ID NO: 139, y la región variable de la cadena ligera del inhibidor de la PD-1 (V<l>) comprende la secuencia mostrada en la SEQ ID NO: 140 y sustituciones conservadoras de aminoácidos de la misma. En una realización, un inhibidor de PD-1 comprende las regiones V<h>y V<l>que son cada una al menos un 99 % idénticas a las secuencias mostradas en la SEQ ID NO: 139 y la SEQ ID NO: 140, respectivamente. En una realización, un inhibidor de PD-1 comprende regiones V<h>y V<l>que son cada una al menos un 98 % idénticas a las secuencias mostradas en la SEQ ID NO: 139 y la SEQ ID NO: 140 respectivamente. En una realización, un inhibidor de PD-1 comprende regiones V<h>y V<l>que son cada una al menos un 97 % idénticas a las secuencias mostradas en la SEQ ID NO: 139 y la SEQ ID NO: 140 respectivamente. En una realización, un inhibidor de PD-1 comprende regiones V<h>y V<l>que son cada una al menos un 96 % idénticas a las secuencias mostradas en la SEQ ID NO: 139 y la SEQ ID NO: 140, respectivamente. En una realización, un inhibidor de PD-1 comprende regiones V<h>y V<l>que son cada una al menos un 95 % idénticas a las secuencias mostradas en la SEQ ID NO: 139 y la SEQ ID NO: 140, respectivamente.

En una realización, un inhibidor de PD-1 comprende los dominios CDR1, CDR2 y CDR3 de cadena pesada que tienen las secuencias establecidas en la SEQ ID NO: 141, la SEQ ID NO: 142 y la SEQ ID NO: 143, respectivamente, y sustituciones conservadoras de aminoácidos de las mismas, y dominios CDR1, CDR2 y CDR3 de cadena ligera que tienen las secuencias establecidas en la SEQ ID NO: 144, la SEQ ID NO: 145 y la SEQ ID NO: 146, respectivamente, y sustituciones conservadoras de aminoácidos de las mismas. En una realización, el anticuerpo compite por la unión con, y/o se une al mismo epítopo en PD-1 que cualquiera de los anticuerpos antes mencionados.

En una realización, el inhibidor de PD-1 es un anticuerpo monoclonal biosimilar anti-PD-1 aprobado por las autoridades reguladoras de medicamentos con referencia al pembrolizumab. En una realización, el biosimilar comprende un anticuerpo anti-PD-1 que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos un 97 % de identidad de secuencia, por ejemplo, 97 %, 98 %, 99 % o 100 % de identidad de secuencia, con la secuencia de aminoácidos de un producto medicinal de referencia o producto biológico de referencia y que comprende una o más modificaciones postraduccionales en comparación con el producto medicinal de referencia o producto biológico de referencia, en el que el producto medicinal de referencia o producto biológico de referencia es pembrolizumab. En algunas realizaciones, la una o más modificaciones postraduccionales se seleccionan de una o más de: glicosilación, oxidación, desamidación y truncamiento. En algunas realizaciones, el biosimilar es un anticuerpo anti-PD-1 autorizado o presentado para su autorización, en el que el anticuerpo anti-PD-1 se proporciona en una formulación que difiere de las formulaciones de un producto medicinal de referencia o producto biológico de referencia, en el que el producto medicinal de referencia o producto biológico de referencia es el pembrolizumab. El anticuerpo anti-PD-1 puede estar autorizado por una autoridad reguladora de medicamentos como la FDA de los Estados Unidos y/o la EMA de la Unión Europea. En algunas realizaciones, el biosimilar se proporciona como una composición que comprende además uno o más excipientes, en la que el uno o más excipientes son iguales o diferentes a los excipientes comprendidos en un producto medicinal de referencia o producto biológico de referencia, en el que el producto medicinal de referencia o producto biológico de referencia es pembrolizumab. En algunas realizaciones, el biosimilar se proporciona como una composición que comprende además uno o más excipientes, en la que el uno o más excipientes son iguales o diferentes a los excipientes comprendidos en un producto medicinal de referencia o producto biológico de referencia, en el que el producto medicinal de referencia o producto biológico de referencia es pembrolizumab.

Tabla 20. Secuencias de aminoácidos para los inhibidores de PD-1 relacionados con el pembrolizumab.

En una realización, el inhibidor de PD-1 es un anticuerpo monoclonal anti-PD-1 disponible comercialmente, como los clones anti-m-PD-1 J43 (Cat # BE0033-2) y RMP1-14 (Cat # BE0146) (Bio X Cell, Inc., West Lebanon, NH, EE.UU.). Una serie de anticuerpos anti-PD-1 disponibles comercialmente son conocidos por una persona con conocimientos ordinarios en la materia.

En una realización, el inhibidor de PD-1 es un anticuerpo descrito en la Patente de los Estados Unidos No.

8,354,509 o las Solicitudes de Patente de los Estados Unidos Nos. 2010/0266617 A1, 2013/0108651 A1, 2013/0109843 A2. En una realización, el inhibidor de PD-1 es un anticuerpo anti-PD-1 descrito en las Patentes de los Estados Unidos Nos. 8,287,856, 8,580,247, y 8,168,757 y en las Publicaciones de Solicitudes de Patente de los Estados Unidos Nos. 2009/0028857 A1, 2010/0285013 A1, 2013/0022600 A1, y 2011/0008369 A1. En otra realización, el inhibidor de PD-1 es un anticuerpo anti-PD-1 divulgado en la Patente de los Estados Unidos No. 8,735,553 B1. En una realización, el inhibidor de PD-1 es pidilizumab, también conocido como CT-011, que se describe en la Patente de los Estados Unidos No. 8,686,119.

En una realización divulgada pero no reivindicada, el inhibidor de PD-1 puede ser una molécula pequeña o un péptido, o un derivado peptídico, como los descritos en las Patentes de los Estados Unidos Nos. 8,907,053; 9,096,642; y 9,044,442 y la Publicación de la Solicitud de Patente de los Estados Unidos No. US 2015/0087581; compuestos de 1,2,4-oxadiazol y derivados como los descritos en la Publicación de la Solicitud de Patente de los Estados Unidos No. 2015/0073024; compuestos peptidomiméticos cíclicos y derivados como los descritos en la Publicación de la Solicitud de Patente de los Estados Unidos No. US 2015/0073042; compuestos cíclicos y derivados como los descritos en la Publicación de la Solicitud de Patente de los Estados Unidos No. US 2015/0125491; compuestos de 1,3,4-oxadiazol y 1,3,4-tiadiazol y derivados como los descritos en la Publicación de la Solicitud de Patente Internacional No. WO 2015/033301; compuestos y derivados a base de péptidos como los descritos en la Publicación de las Solicitudes de Patente Internacional Nos. WO 2015/036927 y WO 2015/04490, o compuestos y derivados a base de péptidos macrocíclicos como los descritos en la Publicación de la Solicitud de Patente de los Estados Unidos No. US 2014/0294898.

En una realización, el inhibidor de PD-L1 o un inhibidor de PD-L2 puede ser cualquier inhibidor, antagonista o bloqueador de PD-L1 o PD-L2 conocido en la técnica. En particular, se trata de uno de los inhibidores, antagonistas o bloqueadores de PD-L1 o PD-L2 descritos con más detalle en los párrafos siguientes. Los términos "inhibidor", "antagonista" y "bloqueador" se utilizan en el presente documento indistintamente en referencia a los inhibidores de PD-L1 y PD-L2. Para evitar dudas, las referencias en el presente documento a un inhibidor de PD-L1 o PD-L2 que sea un anticuerpo pueden referirse a un compuesto o fragmentos de unión a antígeno, variantes, conjugados o biosimilares de los mismos. Para evitar dudas, las referencias en el presente documento a un inhibidor de PD-L1 o PD-L2 pueden referirse a un compuesto o a una sal, éster, solvato, hidrato, cocristal o profármaco farmacéuticamente aceptable del mismo.

En algunas realizaciones, las composiciones, los procesos y los métodos descritos en el presente documento incluyen un inhibidor de PD-L1 o PD-L2. En algunas realizaciones, el inhibidor de PD-L1 o PD-L2 es una molécula pequeña. En una realización preferida, el inhibidor de PD-L1 o PD-L2 es un anticuerpo (es decir, un anticuerpo anti-PD-1), un fragmento del mismo, incluidos fragmentos Fab, o un fragmento variable de cadena sencilla (scFv) del mismo. En algunas realizaciones, el inhibidor de PD-L1 o PD-L2 es un anticuerpo policlonal. En una realización preferida, el inhibidor de PD-L1 o PD-L2 es un anticuerpo monoclonal. En algunas realizaciones, el inhibidor de PD-L1 o PD-L2 compite por unirse a PD-L1 o PD-L2, y/o se une a un epítopo en PD-L1 o PD-L2. En una realización, el anticuerpo compite por unirse a PD-L1 o PD-L2, y/o se une a un epítopo en PD-L1 o PD-L2.

En algunas realizaciones, los inhibidores de PD-L1 proporcionados en el presente documento son selectivos para PD-L1, en el sentido de que los compuestos se unen o interactúan con PD-L1 a concentraciones sustancialmente menores que las que se unen o interactúan con otros receptores, incluido el receptor de PD-L2. En determinadas realizaciones, los compuestos se unen al receptor de PD-L1 con una constante de unión que es al menos aproximadamente de una concentración 2 veces mayor, de una concentración aproximadamente 3 veces mayor, de una concentración aproximadamente 5 veces mayor, de una concentración aproximadamente 10 veces mayor, de una concentración aproximadamente 20 veces mayor, de una concentración aproximadamente 30 veces mayor, de una concentración aproximadamente 50 veces m a y o r , d e u n a c o n c e n tra c ió n a p ro x im a d a m e n te 100 v e c e s m a y o r, d e u n a c o n c e n tra c ió n a p ro x im a d a m e n te 200 v e c e s m a y o r, d e u n a c o n c e n tra c ió n a p ro x im a d a m e n te 300 v e c e s m a y o r o d e u n a c o n c e n tra c ió n a p ro x im a d a m e n te 500 v e c e s m a y o r q u e la d e l re c e p to r d e P D -L 2.

E n a lg u n a s re a liz a c io n e s , lo s in h ib id o re s d e P D -L 2 p ro p o rc io n a d o s en e l p re s e n te d o c u m e n to so n s e le c t iv o s p a ra P D -L 2 , e n e l s e n t id o d e q u e lo s c o m p u e s to s se u n e n o in te ra c tú a n c o n P D -L 2 a c o n c e n tra c io n e s s u s ta n c ia lm e n te m e n o re s q u e la s q u e s e u n e n o in te ra c tú a n c o n o tro s re c e p to re s , in c lu id o e l re c e p to r d e P D -L1. E n d e te rm in a d a s re a liz a c io n e s , lo s c o m p u e s to s s e u n e n a l re c e p to r d e P D -L 2 c o n u n a c o n s ta n te d e u n ió n q u e e s a l m e n o s d e u n a c o n c e n tra c ió n a p ro x im a d a m e n te 2 v e c e s m a y o r, d e u n a c o n c e n tra c ió n a p ro x im a d a m e n te 3 v e c e s m a y o r, d e u n a c o n c e n tra c ió n a p ro x im a d a m e n te 5 v e c e s m a y o r, d e u n a c o n c e n tra c ió n a p ro x im a d a m e n te 10 v e c e s m a y o r, d e u n a c o n c e n tra c ió n a p ro x im a d a m e n te 20 v e c e s m a y o r, de u n a c o n c e n tra c ió n a p ro x im a d a m e n te 30 v e c e s m a y o r, d e u n a c o n c e n tra c ió n a p ro x im a d a m e n te 50 v e c e s m a y o r , d e u n a c o n c e n tra c ió n a p ro x im a d a m e n te 100 v e c e s m a y o r, d e u n a c o n c e n tra c ió n a p ro x im a d a m e n te 200 v e c e s m a y o r, d e u n a c o n c e n tra c ió n a p ro x im a d a m e n te 300 v e c e s m a y o r o d e u n a c o n c e n tra c ió n a p ro x im a d a m e n te 500 v e c e s m a y o r q u e la d e l re c e p to r d e P D -L 1.

S in e s ta r l im ita d o p o r n in g u n a te o r ía , se c re e q u e la s c é lu la s tu m o ra le s e x p re s a n P D -L 1 , y q u e la s c é lu la s T e x p re s a n P D -1. S in e m b a rg o , la e x p re s ió n d e P D -L 1 p o r la s c é lu la s tu m o ra le s no e s n e c e s a r ia p a ra la e f ic a c ia d e lo s in h ib id o re s o b lo q u e a d o re s d e P D -1 o P D -L 1. E n u n a re a liz a c ió n , la s c é lu la s tu m o ra le s e x p re s a n P D -L1. E n o tra re a liz a c ió n , la s c é lu la s tu m o ra le s no e x p re s a n P D -L 1. E n a lg u n a s re a liz a c io n e s , lo s m é to d o s p u e d e n in c lu ir u n a c o m b in a c ió n d e un a n t ic u e rp o P D -1 y un a n t ic u e rp o P D -L 1 , c o m o lo s d e s c r ito s en el p re s e n te d o c u m e n to , e n c o m b in a c ió n c o n un T IL . L a a d m in is tra c ió n d e u n a c o m b in a c ió n d e un a n t ic u e rp o P D -1 y un a n t ic u e rp o P D -L 1 y un T IL p u e d e s e r s im u ltá n e a o s e c u e n c ia l.

E n a lg u n a s re a liz a c io n e s , e l in h ib id o r d e P D -L 1 y /o P D -L 2 e s u n o q u e se u n e a P D -L 1 y /o P D -L 2 h u m a n a s co n u n a K d d e a p ro x im a d a m e n te 100 pM o in fe r io r , s e u n e a P D -L 1 y /o P D -L 2 h u m a n a s c o n u n a K d d e a p ro x im a d a m e n te 90 pM o in fe r io r , s e u n e a P D -L 1 y /o P D -L 2 h u m a n a s c o n u n a K d d e a p ro x im a d a m e n te 80 pM o in fe r io r , s e u n e a P D -L 1 y /o P D -L 2 h u m a n a s co n u n a K d d e a p ro x im a d a m e n te 70 pM o in fe r io r , s e u n e a P D -L 1 y /o P D -L 2 h u m a n a s co n u n a K d d e a p ro x im a d a m e n te 60 pM o in fe r io r , u n a K d d e a p ro x im a d a m e n te 50 pM o in fe r io r , s e u n e a P D -L 1 y /o P D -L 2 h u m a n a s co n u n a K d d e a p ro x im a d a m e n te 40 pM o in fe r io r , o s e u n e a P D -L 1 y /o P D -L 2 h u m a n a s co n u n a K D d e a p ro x im a d a m e n te 30 pM o in fe rio r ,

E n a lg u n a s re a liz a c io n e s , e l in h ib id o r d e P D -L 1 y /o P D -L 2 e s u n o q u e s e u n e a P D -L 1 y /o P D -L 2 h u m a n a co nasociación<d e a p ro x im a d a m e n te 7.5 * 105 1 / M s o m á s rá p id o , s e u n e a P D -L1 y /o P D -L 2 h u m a n a co n u n a k>asociación<d e a p ro x im a d a m e n te 8 * 105 1 /M s o m á s rá p id o , se u n e a P D -L 1 y /o P D -L 2 h u m a n a co n u n a k>asociación<d e a p ro x im a d a m e n te 8.5 * 105 1 /M s o m á s rá p id o , s e u n e a P D -L 1 y /o P D -L 2 h u m a n a s c o n u n a k>asociación<de a p ro x im a d a m e n te 9 * 105 1 /M s o m á s rá p id o , se u n e a P D -L 1 y /o P D -L 2 h u m a n a s co n u n a k>asociación<de a p ro x im a d a m e n te 9.5 * 105 1 /M s y /o m á s rá p id o , o s e u n e a P D -L 1 y /o P D -L 2 h u m a n a s c o n u n a k>asociación<de>a p ro x im a d a m e n te 1 * 106 1 /M s o m á s rá p id o .

E n a lg u n a s re a liz a c io n e s , e l in h ib id o r d e P D -L 1 y /o P D -L 2 e s u n o q u e se u n e a P D -L 1 o P D -L 2 h u m a n a co ndisociación<d e a p ro x im a d a m e n te 2 * 10 '5 1 /s o m á s le n to , se u n e a P D -1 h u m a n a co n u n a k>asociación<de a p ro x im a d a m e n te 2.1 * 10 '5 1 /s o m á s le n to , se u n e a P D -1 h u m a n a co n u n a k>disociación<d e a p ro x im a d a m e n te 2.2 * 10 '5 1 /s o m á s le n to , s e u n e a P D -1 h u m a n a c o n u n a k>disociación<d e a p ro x im a d a m e n te 2.3 * 10 '5 1 /s o m á s le n to , s e u n e a la P D -1 h u m a n a c o n u n a k>disociación<d e a p ro x im a d a m e n te 2.4 * 10 '5 1 /s o m á s le n to , s e u n e a la P D -1 h u m a n a co n u n a k>disociación<d e a p ro x im a d a m e n te 2.5 * 10 '5 1 /s o m á s le n to , s e u n e a la P D -1 h u m a n a co n u n a k>disociación<d e a p ro x im a d a m e n te 2.6 * 10 '5 1 /s o m á s le n to , s e u n e a P D -L 1 o P D -L 2 h u m a n a s c o n u n a k>disociación<d e a p ro x im a d a m e n te 2.7 * 10 '5 1 /s o m á s le n to , o se u n e a P D -L 1 o P D -L 2 h u m a n a s co n u n a k>disociación d e a p ro x im a d a m e n te 3 * 10 '5 1 /s o m á s le n to .

E n a lg u n a s re a liz a c io n e s , e l in h ib id o r d e P D -L 1 y /o P D -L 2 e s u n o q u e b lo q u e a o in h ib e la u n ió n d e P D -L1<h u m a n a o P D -L 2 h u m a n a a P D -1 h u m a n a c o n u n a IC>50<d e a p ro x im a d a m e n te 10 nM o in fe rio r ; b lo q u e a o in h ib e la u n ió n d e P D -L 1 h u m a n a o P D -L 2 h u m a n a a P D -1 h u m a n a c o n u n a IC>50<d e a p ro x im a d a m e n te 9 nM o in fe rio r; b lo q u e a o in h ib e la u n ió n d e P D -L 1 h u m a n a o P D -L 2 h u m a n a a P D -1 h u m a n a co n u n a IC>50<de>a p ro x im a d a m e n te 8 nM o in fe rio r; b lo q u e a o in h ib e la u n ió n d e P D -L 1 h u m a n a o P D -L 2 h u m a n a a P D -1 h u m a n a<c o n u n a IC>50<d e a p ro x im a d a m e n te 7 nM o in fe rio r; b lo q u e a o in h ib e la u n ió n d e P D -L 1 h u m a n a o P D -L 2 h u m a n a a P D -1 h u m a n a co n u n a IC>50<d e a p ro x im a d a m e n te 6 nM o in fe rio r; b lo q u e a o in h ib e la u n ió n d e P D -L 1 h u m a n a o P D -L 2 h u m a n a a P D -1 h u m a n a c o n u n a IC>50<d e a p ro x im a d a m e n te 5 nM o in fe r io r ; b lo q u e a o in h ib e la u n ió n d e P D -L 1 h u m a n a o P D -L 2 h u m a n a a P D -1 h u m a n a co n u n a IC>50<d e a p ro x im a d a m e n te 4 nM o in fe rio r; b lo q u e a o in h ib e la u n ió n d e P D -L 1 h u m a n a o P D -L 2 h u m a n a a P D -1 h u m a n a c o n u n a IC>50<d e a p ro x im a d a m e n te 3 nM o in fe r io r ; b lo q u e a o in h ib e la u n ió n d e P D -L 1 h u m a n a o P D -L 2 h u m a n a a P D -1 h u m a n a c o n u n a IC>50<de>a p ro x im a d a m e n te 2 nM o in fe r io r ; o b lo q u e a P D -1 h u m a n a , o b lo q u e a la u n ió n d e P D -L 1 h u m a n a o P D -L 2<h u m a n a a P D -1 h u m a n a c o n u n a IC>50<d e a p ro x im a d a m e n te 1 nM o in fe rio r .>

E n u n a re a liz a c ió n , e l in h ib id o r d e P D -L 1 e s d u rv a lu m a b , ta m b ié n c o n o c id o c o m o M E D I4736 (d is p o n ib le c o m e rc ia lm e n te a t ra v é s d e M e d im m u n e , L L C , G a ith e rs b u rg , M a ry la n d , f ilia l d e A s tra Z e n e c a p lc .), o f ra g m e n to s d e u n ió n a a n tíg e n o , c o n ju g a d o s o v a r ia n te s d e l m is m o . E n u n a re a liz a c ió n , e l in h ib id o r d e P D -L 1 e s un anticuerpo divulgado en la Patente de los Estados Unidos No. 8,779,108 o Publicación de Solicitud de Patente de los Estados Unidos No. 2013/0034559. La eficacia clínica del durvalumab se ha descrito en Page, et al., Ann. Rev. Med., 2014, 65, 185-202; Brahmer, et al., J. Clin. Oncol. 2014, 32, 5s (suplemento, resumen 8021); y McDermott, et al., Cancer Treatment Rev., 2014, 40, 1056-64. La preparación y las propiedades del durvalumab se describen en la Patente de los Estados Unidos No. 8,779,108. Las secuencias de aminoácidos del durvalumab se exponen en la Tabla 50. El anticuerpo monoclonal durvalumab incluye enlaces disulfuro en 22-96, 22"-96", 23'-89', 23m-89m, 135'-195', 135m-195m, 148-204, 148"-204", 215'-224, 215m-224", 230-230", 233 233", 265-325, 265"-325", 371-429, y 371"-429'; y sitios de N-glicosilación en Asn-301 y Asn-301".

En una realización, un inhibidor de PD-L1 comprende una cadena pesada dada por la SEQ ID NO: 147 y una cadena ligera dada por la SEQ ID NO: 148. En una realización, un inhibidor de PD-L1 comprende cadenas pesadas y ligeras que tienen las secuencias mostradas en la SEQ ID NO: 147 y la SEQ ID NO: 148, respectivamente, o fragmentos de unión a antígeno, fragmentos Fab, fragmentos variables de cadena sencilla (scFv), variantes o conjugados de los mismos. En una realización, un inhibidor de PD-L1 comprende cadenas pesadas y ligeras que son cada una al menos un 99 % idénticas a las secuencias mostradas en la SEQ ID NO: 147 y la SEQ ID NO: 148, respectivamente. En una realización, un inhibidor de PD-L1 comprende cadenas pesadas y ligeras que son cada una al menos un 98 % idénticas a las secuencias mostradas en la SEQ ID NO: 147 y la SEQ ID NO: 148, respectivamente. En una realización, un inhibidor de PD-L1 comprende cadenas pesadas y ligeras que son cada una al menos un 97 % idénticas a las secuencias mostradas en la SEQ ID NO: 147 y la SEQ ID NO: 148, respectivamente. En una realización, un inhibidor de PD-L1 comprende cadenas pesadas y ligeras que son cada una al menos un 96 % idénticas a las secuencias mostradas en la SEQ ID NO: 147 y la SEQ ID NO: 148, respectivamente. En una realización, un inhibidor de PD-L1 comprende cadenas pesadas y ligeras que son cada una al menos un 95 % idénticas a las secuencias mostradas en la SEQ ID NO: 147 y la S<e>Q ID NO: 148, respectivamente.

En una realización, el inhibidor de PD-L1 comprende las CDR o regiones variables (VR) de las cadenas pesadas y ligeras del durvalumab. En una realización, la región variable de la cadena pesada del inhibidor de PD-L1 (V<h>) comprende la secuencia mostrada en la SEQ ID NO: 149, y la región variable de la cadena ligera del inhibidor de PD-L1 (V<l>) comprende la secuencia mostrada en la SEQ ID NO: 150 y sustituciones conservadoras de aminoácidos de la misma. En una realización, un inhibidor de PD-L1 comprende las regiones V<h>y V<l>que son cada una al menos un 99 % idénticas a las secuencias mostradas en la SEQ ID NO: 149 y la SEQ ID NO: 150, respectivamente. En una realización, un inhibidor de PD-L1 comprende regiones V<h>y V<l>que son cada una al menos un 98 % idénticas a las secuencias mostradas en la SEQ ID NO: 149 y la SEQ ID NO: 150 respectivamente. En una realización, un inhibidor de PD-L1 comprende regiones V<h>y V<l>que son cada una al menos un 97 % idénticas a las secuencias mostradas en la SEQ ID NO: 149 y la SEQ ID NO: 150, respectivamente. En una realización, un inhibidor de PD-L1 comprende regiones V<h>y V<l>que son cada una al menos un 96 % idénticas a las secuencias mostradas en la SEQ ID NO: 149 y la SEQ ID NO: 150, respectivamente. En una realización, un inhibidor de PD-L1 comprende regiones V<h>y V<l>que son cada una al menos un 95 % idénticas a las secuencias mostradas en la SEQ ID NO: 149 y la SEQ ID NO: 150, respectivamente.

En una realización, un inhibidor de PD-L1 comprende dominios CDR1, CDR2 y CDR3 de cadena pesada que tienen las secuencias establecidas en la SEQ ID NO: 151, la SEQ ID<n>O: 152 y la SEQD NO: 153, respectivamente, y sustituciones conservadoras de aminoácidos de las mismas, y dominios CDR1, CDR2 y CDR3 de cadena ligera que tienen las secuencias establecidas en la SEQ ID NO: 154, la SEQ ID NO: 155 y la SEQ ID NO: 156, respectivamente, y sustituciones conservadoras de aminoácidos de las mismas. En una realización, el anticuerpo compite por la unión con, y/o se une al mismo epítopo en PD-L1 que cualquiera de los anticuerpos antes mencionados.

En una realización, el inhibidor de PD-L1 es un anticuerpo monoclonal biosimilar anti-PD-L1 aprobado por las autoridades reguladoras de medicamentos con referencia al durvalumab. En una realización, el biosimilar comprende un anticuerpo anti-PD-L1 que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos un 97 % de identidad de secuencia, por ejemplo, 97 %, 98 %, 99 % o 100 % de identidad de secuencia, con la secuencia de aminoácidos de un producto medicinal de referencia o producto biológico de referencia y que comprende una o más modificaciones postraduccionales en comparación con el producto medicinal de referencia o producto biológico de referencia, en el que el producto medicinal de referencia o producto biológico de referencia es durvalumab. En algunas realizaciones, la una o más modificaciones postraduccionales se seleccionan entre una o más de las siguientes: glicosilación, oxidación, desamidación y truncamiento. En algunas realizaciones, el biosimilar es un anticuerpo anti-PD-L1 autorizado o presentado para su autorización, en el que el anticuerpo anti-PD-L1 se proporciona en una formulación que difiere de las formulaciones de un producto medicinal de referencia o producto biológico de referencia, en el que el producto medicinal de referencia o producto biológico de referencia es durvalumab. El anticuerpo anti-PD-L1 puede estar autorizado por una autoridad reguladora de medicamentos como la FDA de los Estados Unidos y/o la EMA de la Unión Europea. En algunas realizaciones, el biosimilar se proporciona como una composición que comprende además uno o más excipientes, en los que el uno o más excipientes son iguales o diferentes a los excipientes comprendidos en un producto medicinal de referencia o producto biológico de referencia, en los que el producto medicinal de referencia o producto biológico de referencia es durvalumab. En algunas realizaciones, el biosimilar se proporciona como una composición que comprende además uno o más excipientes, donde el uno o más excipientes son iguales o diferentes a los excipientes comprendidos en un producto medicinal de referencia o producto biológico de referencia, donde el producto medicinal de referencia o producto biológico de referencia es durvalumab.

Tabla 21. Secuencias de aminoácidos para inhibidores de PD-L1 relacionados con durvalumab.

En una realización, el inhibidor de PD-L1 es avelumab, también conocido como MSB0010718C (disponible comercialmente a través de Merck KGaA/EMD Serono), o fragmentos de unión a antígeno, conjugados o variantes del mismo. La preparación y las propiedades del avelumab se describen en la Publicación de la Solicitud de Patente de los Estados Unidos No. US 2014/0341917 A1. Las secuencias de aminoácidos del avelumab se exponen en la Tabla 51. El avelumab tiene enlaces disulfuro entre cadenas de cadena pesada (C23-C104) en 22-96, 147-203, 264-324, 370-428, 22"-96", 147"-203", 264"-324", y 370"-428"; enlaces disulfuro entre cadenas ligeras (C23-C104) en 22'-90', 138'-197', 22"'-90"', y 138m-197m; enlaces disulfuro entre cadenas pesada-ligera (h 5-CL 126) en 223-215' y 223"-215m; enlaces disulfuro entre cadenas pesada-pesada (h 11, h 14) en 229-229" y 232-232"; sitios de N-glicosilación (H CH2 N84.4) en 300, 300"; glicanos bi-antenarios complejos fucosilados de tipo CHO; y recorte de lisina del terminal C H CHS K2 en 450 y 450'.

En una realización, un inhibidor de PD-L1 comprende una cadena pesada dada por la SEQ ID NO: 157 y una cadena ligera dada por la SEQ ID NO: 158. En una realización, un inhibidor de PD-L1 comprende cadenas pesadas y ligeras que tienen las secuencias mostradas en la SEQ ID NO: 157 y la SEQ ID NO: 158, respectivamente, o fragmentos de unión a antígeno, fragmentos Fab, fragmentos variables de cadena sencilla (scFv), variantes o conjugados de los mismos. En una realización, un inhibidor de PD-L1 comprende cadenas pesadas y ligeras que son cada una al menos un 99 % idénticas a las secuencias mostradas en la SEQ ID NO: 157 y la SEQ ID NO: 158, respectivamente. En una realización, un inhibidor de PD-L1 comprende cadenas pesadas y ligeras que son cada una al menos un 98 % idénticas a las secuencias mostradas en la SEQ ID NO: 157 y la SEQ ID NO: 158, respectivamente. En una realización, un inhibidor de PD-L1 comprende cadenas pesadas y ligeras que son cada una al menos un 97 % idénticas a las secuencias mostradas en la SEQ ID NO: 157 y la SEQ ID NO: 158, respectivamente. En una realización, un inhibidor de PD-L1 comprende cadenas pesadas y ligeras que son cada una al menos un 96 % idénticas a las secuencias mostradas en la SEQ ID NO: 157 y la SEQ ID NO: 158, respectivamente. En una realización, un inhibidor de PD-L1 comprende cadenas pesadas y ligeras que son cada una al menos un 95 % idénticas a las secuencias mostradas en la SEQ ID NO: 157 y la S<e>Q ID NO: 158, respectivamente.

En una realización, el inhibidor de PD-L1 comprende las CDR o regiones variables (VR) de las cadenas pesadas y ligeras del avelumab. En una realización, la región variable de la cadena pesada del inhibidor de PD-L1 (V<h>) comprende la secuencia mostrada en la SEQ ID NO: 159, y la región variable de la cadena ligera del inhibidor de PD-L1 (V<l>) comprende la secuencia mostrada en la SEQ ID NO: 160 y sustituciones conservadoras de aminoácidos de la misma. En una realización, un inhibidor de PD-L1 comprende las regiones V<h>y V<l>que son cada una al menos un 99 % idénticas a las secuencias mostradas en la SEQ ID NO: 159 y la SEQ ID NO: 160, respectivamente. En una realización, un inhibidor de PD-L1 comprende regiones V<h>y V<l>que son cada una al menos un 98 % idénticas a las secuencias mostradas en la SEQ ID NO: 159 y la SEQ ID NO: 160, respectivamente. En una realización, un inhibidor de PD-L1 comprende regiones V<h>y V<l>que son cada una al menos un 97 % idénticas a las secuencias mostradas en la SEQ ID NO: 159 y la SEQ ID NO: 160, respectivamente. En una realización, un inhibidor de PD-L1 comprende regiones V<h>y V<l>que son cada una al menos un 96 % idénticas a las secuencias mostradas en la SEQ ID NO: 159 y la SEQ ID NO: 160, respectivamente. En una realización, un inhibidor de PD-L1 comprende regiones V<h>y V<l>que son cada una al menos un 95 % idénticas a las secuencias mostradas en la SEQ ID NO: 159 y la SEQ ID NO: 160, respectivamente.

En una realización, un inhibidor de PD-L1 comprende dominios CDR1, CDR2 y CDR3 de cadena pesada que tienen las secuencias establecidas en la SEQ ID NO: 161, la SEQ ID n O: 162 y la SEQ iD NO: 163, respectivamente, y sustituciones conservadoras de aminoácidos de las mismas, y dominios CDR1, CDR2 y CDR3 de cadena ligera que tienen las secuencias establecidas en la SEQ ID NO: 164, la SEQ ID NO: 165 y la SEQ ID NO: 166, respectivamente, y sustituciones conservadoras de aminoácidos de las mismas. En una realización, el anticuerpo compite por la unión con, y/o se une al mismo epítopo en PD-L1 que cualquiera de los anticuerpos antes mencionados.

En una realización, el inhibidor de PD-L1 es un anticuerpo monoclonal biosimilar anti-PD-L1 aprobado por las autoridades reguladoras de medicamentos con referencia al avelumab. En una realización, el biosimilar comprende un anticuerpo anti-PD-L1 que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos un 97 % de identidad de secuencia, por ejemplo, 97 %, 98 %, 99 % o 100 % de identidad de secuencia, con la secuencia de aminoácidos de un producto medicinal de referencia o producto biológico de referencia y que comprende una o más modificaciones postraduccionales en comparación con el producto medicinal de referencia o producto biológico de referencia, en el que el producto medicinal de referencia o producto biológico de referencia es avelumab. En algunas realizaciones, la una o más modificaciones postraduccionales se seleccionan entre una o más de las siguientes: glicosilación, oxidación, desamidación y truncamiento. En algunas realizaciones, el biosimilar es un anticuerpo anti-PD-L1 autorizado o presentado para su autorización, en el que el anticuerpo anti-PD-L1 se proporciona en una formulación que difiere de las formulaciones de un producto medicinal de referencia o producto biológico de referencia, en el que el producto medicinal de referencia o producto biológico de referencia es avelumab. El anticuerpo anti-PD-L1 puede estar autorizado por una autoridad reguladora de medicamentos como la FDA de los Estados Unidos y/o la EMA de la Unión Europea. En algunas realizaciones, el biosimilar se proporciona como una composición que comprende además uno o más excipientes, en los que el uno o más excipientes son iguales o diferentes a los excipientes comprendidos en un producto medicinal de referencia o producto biológico de referencia, en los que el producto medicinal de referencia o producto biológico de referencia es avelumab. En algunas realizaciones, el biosimilar se proporciona como una composición que comprende además uno o más excipientes, en los que el uno o más excipientes son iguales o diferentes a los excipientes comprendidos en un producto medicinal de referencia o producto biológico de referencia, en el que el producto medicinal de referencia o producto biológico de referencia es avelumab.

Tabla 22. Secuencias de aminoácidos de los inhibidores de PD-L1 relacionados con el avelumab.

En una realización, el inhibidor de PD-L1 es atezolizumab, también conocido como MPDL3280A o RG7446 (disponible comercialmente como TECENTRIQ de Genentech, Inc., una filial de Roche Holding AG, Basilea, Suiza), o fragmentos de unión a antígeno, conjugados o variantes del mismo. En una realización, el inhibidor de PD-L1 es un anticuerpo descrito en la Patente de los Estados Unidos No. 8,217,149. En una realización, el inhibidor de PD-L1 es un anticuerpo divulgado en las Publicaciones de las Solicitudes de Patente de los Estados Unidos Nos. 2010/0203056 A 1 ,2013/0045200 A1, 2013/0045201 A1, 2013/0045202 A1, o 2014/0065135 A1. La preparación y las propiedades del atezolizumab se describen en la Patente de los Estados Unidos No.

8,217,149. Las secuencias de aminoácidos del atezolizumab se exponen en la Tabla 52. El atezolizumab tiene enlaces disulfuro entre cadenas pesadas (C23-C104) en 22-96, 145-201, 262-322, 368-426, 22"-96", 145"-201", 262"-322", y 368"-426"; enlaces disulfuro entre cadenas ligeras (C23-C104) en 23'-88', 134'-194', 23"'-88'", y 134m-194m; enlaces disulfuro entre cadenas pesada-ligera (h 5-CL 126) en 221-214' y 221"-214m; enlaces disulfuro entre cadenas pesada-pesada (h 11, h 14) en 227-227" y 230-230"; y sitios de N-glicosilación (H CH2 N84.4>A) en 298 y 298'.

En una realización, un inhibidor de PD-L1 comprende una cadena pesada dada por la SEQ ID NO: 167 y una cadena ligera dada por la SEQ ID NO: 168. En una realización, un inhibidor de PD-L1 comprende cadenas pesadas y ligeras que tienen las secuencias mostradas en la SEQ ID NO: 167 y la SEQ ID NO: 168, respectivamente, o fragmentos de unión a antígeno, fragmentos Fab, fragmentos variables de cadena sencilla (scFv), variantes o conjugados de los mismos. En una realización, un inhibidor de PD-L1 comprende cadenas pesadas y ligeras que son cada una al menos un 99 % idénticas a las secuencias mostradas en la SEQ ID NO: 167 y la SEQ ID NO: 168, respectivamente. En una realización, un inhibidor de PD-L1 comprende cadenas pesadas y ligeras que son cada una al menos un 98 % idénticas a las secuencias mostradas en la SEQ ID NO: 167 y la SEQ ID NO: 168, respectivamente. En una realización, un inhibidor de PD-L1 comprende cadenas pesadas y ligeras que son cada una al menos un 97 % idénticas a las secuencias mostradas en la SEQ ID NO: 167 y la SEQ ID NO: 168, respectivamente. En una realización, un inhibidor de PD-L1 comprende cadenas pesadas y ligeras que son cada una al menos un 96 % idénticas a las secuencias mostradas en la SEQ ID NO: 167 y la SEQ ID NO: 168, respectivamente. En una realización, un inhibidor de PD-L1 comprende cadenas pesadas y ligeras que son cada una al menos un 95 % idénticas a las secuencias mostradas en la SEQ ID NO: 167 y la Se Q ID NO: 168, respectivamente.

En una realización, el inhibidor de PD-L1 comprende las CDR de cadena pesada y ligera o las regiones variables (VR) del atezolizumab. En una realización, la región variable de la cadena pesada del inhibidor de PD-L1 (V<h>) comprende la secuencia que se muestra en la SEQ ID NO: 169, y la región variable de la cadena ligera del inhibidor de PD-L1 (V<l>) comprende la secuencia que se muestra en la SEQ ID NO: 170 y sustituciones conservadoras de aminoácidos de la misma. En una realización, un inhibidor de PD-L1 comprende las regiones V<h>y V<l>que son cada una al menos un 99 % idénticas a las secuencias mostradas en la SEQ ID NO: 169 y la SEQ ID NO: 170, respectivamente. En una realización, un inhibidor de PD-L1 comprende regiones V<h>y V<l>que son cada una al menos un 98 % idénticas a las secuencias mostradas en la SEQ ID NO: 169 y la SEQ ID NO: 170, respectivamente. En una realización, un inhibidor de PD-L1 comprende regiones V<h>y V<l>que son cada una al menos un 97 % idénticas a las secuencias mostradas en la SEQ ID NO: 169 y la SEQ ID NO: 170, respectivamente. En una realización, un inhibidor de PD-L1 comprende regiones V<h>y V<l>que son cada una al menos un 96 % idénticas a las secuencias mostradas en la SEQ ID NO: 169 y la SEQ ID NO: 170, respectivamente. En una realización, un inhibidor de PD-L1 comprende regiones V<h>y V<l>que son cada una al menos un 95 % idénticas a las secuencias mostradas en la SEQ ID NO: 169 y la SEQ ID NO: 170, respectivamente.

En una realización, un inhibidor de PD-L1 comprende dominios CDR1, CDR2 y CDR3 de cadena pesada que tienen las secuencias establecidas en la SEQ ID NO: 171, la SEQ ID n O: 172 y la SEQ iD NO: 173, respectivamente, y sustituciones conservadoras de aminoácidos de las mismas, y dominios CDR1, CDR2 y CDR3 de cadena ligera que tienen las secuencias establecidas en la SEQ ID NO: 174, la SEQ ID NO: 175 y la SEQ ID NO: 176, respectivamente, y sustituciones conservadoras de aminoácidos de las mismas. En una realización, el anticuerpo compite por la unión con, y/o se une al mismo epítopo en PD-L1 que cualquiera de los anticuerpos antes mencionados.

En una realización, el anticuerpo anti-PD-L1 es un anticuerpo monoclonal biosimilar anti-PD-L1 aprobado por las autoridades reguladoras de medicamentos con referencia al atezolizumab. En una realización, el biosimilar comprende un anticuerpo anti-PD-L1 que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos un 97 % de identidad de secuencia, por ejemplo, 97 %, 98 %, 99 % o 100 % de identidad de secuencia, con la secuencia de aminoácidos de un producto medicinal de referencia o un producto biológico de referencia y que comprende una o más modificaciones postraduccionales en comparación con el producto medicinal de referencia o el producto biológico de referencia, en el que el producto medicinal de referencia o el producto biológico de referencia es el atezolizumab. En algunas realizaciones, la una o más modificaciones postraduccionales se seleccionan entre una o más de las siguientes: glicosilación, oxidación, desamidación y truncamiento. En algunas realizaciones, el biosimilar es un anticuerpo anti-PD-L1 autorizado o presentado para su autorización, en el que el anticuerpo anti-PD-L1 se proporciona en una formulación que difiere de las formulaciones de un producto medicinal de referencia o producto biológico de referencia, en el que el producto medicinal de referencia o producto biológico de referencia es el atezolizumab. El anticuerpo anti-PD-L1 puede estar autorizado por una autoridad reguladora de medicamentos como la FDA de los Estados Unidos y/o la EMA de la Unión Europea. En algunas realizaciones, el biosimilar se proporciona como una composición que comprende además uno o más excipientes, en los que el uno o más excipientes son iguales o diferentes a los excipientes comprendidos en un producto medicinal de referencia o producto biológico de referencia, en los que el producto medicinal de referencia o producto biológico de referencia es el atezolizumab. En algunas realizaciones, el biosimilar se proporciona como una composición que comprende además uno o más excipientes, donde el uno o más excipientes son iguales o diferentes a los excipientes comprendidos en un producto medicinal de referencia o producto biológico de referencia, donde el producto medicinal de referencia o producto biológico de referencia es atezolizumab.

Tabla 23. Secuencias de aminoácidos de los inhibidores de PD-L1 relacionados con el atezolizumab.

En una realización, los inhibidores de PD-L1 incluyen los anticuerpos descritos en la Publicación de la Solicitud de Patente de los Estados Unidos No. US 2014/0341917 A1. En otra realización, también se incluyen anticuerpos que compiten con cualquiera de estos anticuerpos para unirse a PD-L1. En una realización, el anticuerpo anti-PD-L1 es MDX-1105, también conocido como b MS-935559, que se divulga en la patente de los Estados Unidos No. US 7,943,743. En una realización, el anticuerpo anti-PD-L1 se selecciona entre los anticuerpos anti-PD-L1 divulgados en la patente de los Estados Unidos No. US 7,943,743.

En una realización, el inhibidor de PD-L1 es un anticuerpo monoclonal disponible comercialmente, como INVIVOMAB anti-m-PD-L1 clon 10F.9G2 (Catálogo # BE0101, Bio X Cell, Inc., West Lebanon, NH, EE. UU.). En una realización, el anticuerpo anti-PD-L1 es un anticuerpo monoclonal disponible comercialmente, como AFFYMETRIX EBIOSCIENCE (MIH1). Una serie de anticuerpos anti-PD-L1 disponibles en el mercado son conocidos por una persona con conocimientos ordinarios en la materia.

En una realización, el inhibidor de PD-L2 es un anticuerpo monoclonal disponible comercialmente, como BIOLEGEND 24F.10C12 IgG2a de ratón, isotipo<k>(catálogo # 329602 Biolegend, Inc., San Diego, CA), el anticuerpo SIGMA anti-PD-L2 (No. de catálogo SAB3500395, Sigma-Aldrich Co., St. Louis, MO), u otros anticuerpos anti-PD-L2 disponibles en el mercado y conocidos por alguien con conocimientos ordinarios en la materia.

2. Acondicionamiento previo opcional de los pacientes por linfodepleción

En una realización, la invención incluye una población de TIL para su uso en un método de tratamiento de un cáncer, en el que un paciente es tratado previamente con quimioterapia no mieloablativa antes de una infusión de TIL según la presente divulgación. En una realización, la invención incluye una población de TIL para su uso en el tratamiento del cáncer en un paciente que ha sido tratado previamente con quimioterapia no mieloablativa. En una realización, la población de TIL es para administración por infusión. En una realización, la quimioterapia no mieloablativa es ciclofosfamida a razón de 60 mg/kg/d durante 2 días (días 27 y 26 antes de la infusión de TIL) y fludarabina a razón de 25 mg/m2/d durante 5 días (días 27 a 23 antes de la infusión de TIL). En una realización, tras la quimioterapia no mieloablativa y la infusión de TIL (en el día 0) según la presente divulgación, el paciente recibe una infusión intravenosa de IL-2 (aldesleucina, disponible comercialmente como PROLEUKIN) por vía intravenosa a razón de 720,000 UI/kg cada 8 horas hasta tolerancia fisiológica. En ciertas realizaciones, la población de TIL es para su uso en el tratamiento del cáncer en combinación con IL-2, en la que la IL-2 se administra después de la población de TIL.

Los hallazgos experimentales indican que la linfodepleción previa a la transferencia adoptiva de linfocitos T específicos de tumor desempeña un papel clave en la mejora de la eficacia del tratamiento al eliminar las células T reguladoras y los elementos competidores del sistema inmunitario ("sumideros de citocinas"). En consecuencia, algunas realizaciones de la invención utilizan una etapa de linfodepleción (a veces también denominada "acondicionamiento inmunosupresor") en el paciente antes de la introducción de los TIL de la invención.

En general, la linfodepleción se consigue mediante la administración de fludarabina o ciclofosfamida (la forma activa se denomina mafosfamida) y sus combinaciones. Tales métodos se describen en Gassner, et al., Cancer Immunol. Immunother. 2011, 60, 75-85, Muranski, et al., Nat. Clin. Pract. Oncol., 2006, 3, 668-681, Dudley, et al., J. Clin. Oncol. 2008, 26, 5233-5239, y Dudley, et al., J. Clin. Oncol. 2005, 23, 2346-2357.

En algunas realizaciones, la fludarabina se administra a una concentración de 0.5 pg/mL -10 pg/mL de fludarabina. En algunas realizaciones, la fludarabina se administra a una concentración de 1 pg/mL de fludarabina. En algunas realizaciones, el tratamiento con fludarabina se administra durante 1 día, 2 días, 3 días, 4 días, 5 días, 6 días o 7 días o más. En algunas realizaciones, la fludarabina se administra a una dosis de 10 mg/kg/día, 15 mg/kg/día, 20 mg/kg/día, 25 mg/kg/día, 30 mg/kg/día, 35 mg/kg/día, 40 mg/kg/día o 45 mg/kg/día. En algunas realizaciones, el tratamiento con fludarabina se administra durante 2-7 días a razón de 35 mg/kg/día. En algunas realizaciones, el tratamiento con fludarabina se administra durante 4-5 días a razón de 35 mg/kg/día. En algunas realizaciones, el tratamiento con fludarabina se administra durante 4-5 días a razón de 25 mg/kg/día.

En algunas realizaciones, la mafosfamida, la forma activa de la ciclofosfamida, se obtiene a una concentración de 0.5 pg/mL -10 pg/mL mediante la administración de ciclofosfamida. En algunas realizaciones, la mafosfamida, la forma activa de la ciclofosfamida, se obtiene a una concentración de 1 pg/mL por administración de ciclofosfamida. En algunas realizaciones, el tratamiento con ciclofosfamida se administra durante 1 día, 2 días, 3 días, 4 días, 5 días, 6 días o 7 días o más. En algunas realizaciones, la ciclofosfamida se administra a una dosis de 100 mg/m2/día, 150 mg/m2/día, 175 mg/m2/día, 200 mg/m2/día, 225 mg/m2/día, 250 mg/m2/día, 275 mg/m2/día, o 300 mg/m2/día. En algunas realizaciones, la ciclofosfamida se administra por vía intravenosa (es decir, i.v.). En algunas realizaciones, el tratamiento con ciclofosfamida se administra durante 2-7 días a razón de 35 mg/kg/día. En algunas realizaciones, el tratamiento con ciclofosfamida se administra durante 4-5 días a razón de 250 mg/m2/día i.v. En algunas realizaciones, el tratamiento con ciclofosfamida se administra durante 4 días a razón de 250 mg/m2/día i.v.

En algunas realizaciones, la linfodepleción se lleva a cabo administrando conjuntamente la fludarabina y la ciclofosfamida a un paciente. En algunas realizaciones, la fludarabina se administra a razón de 25 mg/m2/día i.v. y la ciclofosfamida se administra a razón de 250 mg/m2/día i.v. durante 4 días.

En una realización, la linfodepleción se lleva a cabo mediante la administración de ciclofosfamida a una dosis de 60 mg/m2/día durante dos días seguida de la administración de fludarabina a una dosis de 25 mg/m2/día durante cinco días.

3. Regímenes de IL-2

En una realización, el régimen de IL-2 comprende un régimen de IL-2 de dosis alta, en el que el régimen de IL-2 de dosis alta comprende aldesleucina, o un biosimilar o variante de la misma, administrada por vía intravenosa a partir del día siguiente a la administración de una porción terapéuticamente eficaz de la población terapéutica de TIL, en la que la aldesleucina o un biosimilar o variante de la misma se administra a una dosis de 0.037 mg/kg o 0.044 mg/kg UI/kg (masa corporal del paciente) mediante infusiones intravenosas en bolo de 15 minutos cada ocho horas hasta la tolerancia, para un máximo de 14 dosis. Tras 9 días de descanso, este esquema puede repetirse para otras 14 dosis, hasta un máximo de 28 dosis en total. En algunas realizaciones, la IL-2 se administra en 1, 2, 3, 4, 5 o 6 dosis. En algunas realizaciones, la IL-2 se administra en una dosis máxima de hasta 6 dosis.

En una realización, el régimen de IL-2 comprende un régimen de IL-2 decreciente. Los regímenes de IL-2 decrecientes se han descrito en O'Day, et al., J. Clin. Oncol. 1999, 17, 2752-61 y Eton, et al., Cancer 2000, 88, 1703-9. En una realización, un régimen de IL-2 decreciente comprende 18 * 106 UI/m2 administrado por vía intravenosa durante 6 horas, seguidas de 18 * 106 UI/m2 administrado por vía intravenosa durante 12 horas, seguidas de 18 * 106 UI/m2 administrado por vía intravenosa durante 24 horas, seguidas de 4.5 * 106 UI/m2 administrado por vía intravenosa durante 72 horas. Este ciclo de tratamiento puede repetirse cada 28 días durante un máximo de cuatro ciclos. En una realización, un régimen de IL-2 decreciente comprende 18,000,000 UI/m2 el día 1, 9,000,000 UI/m2 el día 2, y 4,500,000 UI/m2 los días 3 y 4.

En una realización, el régimen de IL-2 comprende la administración de IL-2 pegilada cada 1, 2, 4, 6, 7, 14 o 21 días a una dosis de 0.10 mg/día hasta 50 mg/día.

Ejemplos

Las realizaciones abarcadas en el presente documento se describen ahora con referencia a los ejemplos siguientes. Estos ejemplos se proporcionan únicamente con fines ilustrativos y la divulgación comprendida en el presente documento no debe interpretarse en modo alguno como limitada a estos ejemplos, sino que debe interpretarse que abarca todas y cada una de las variaciones que se hagan evidentes como resultado de las enseñanzas proporcionadas en el presente documento.

Ejemplo 1: Preparación de los medios para los procesos pre-REP y REP

Este Ejemplo describe el procedimiento para la preparación de medios de cultivo tisular para su uso en protocolos que implican el cultivo de linfocitos infiltrantes de tumores (TIL) derivados de varios tipos de tumores, incluido el carcinoma de pulmón de células no pequeñas (NSCLC). Este medio puede utilizarse para la preparación de cualquiera de los TIL descritos en la presente solicitud y en los Ejemplos.

Preparación de CM1

Se retiraron los siguientes reactivos de la cámara frigorífica y se calentaron en un baño de agua a 37 °C: (RPMI1640, suero AB humano, L-glutamina 200 mM). Se preparó el medio CM1 según la Tabla 18 siguiente añadiendo cada uno de los ingredientes en la sección superior de una unidad de filtrado de 0.2 pm adecuada al volumen a filtrar. Se almacenó a 4 °C.

Tabla 24: Preparación de CM1

El día de uso, precaliente la cantidad necesaria de CM1 en un baño de agua a 37 °C y añada 6000 UI/mL de IL-2.

Suplementación adicional - según sea necesario de acuerdo con la Tabla 25.

Tabla 25: Su lementación adicional de CM1 se ún sea necesario.

Preparación del CM2

Se retiró el CM1 preparado del refrigerador o preparar CM1 fresco según la sección 7.3 anterior. Se retiró el AIM-V® del refrigerador y preparó la cantidad de CM2 necesaria mezclando el CM1 preparado con un volumen igual de AIM-V® en un matraz de medio estéril. Se añadieron 3000 UI/mL de IL-2 al medio CM2 el día de su uso. Se preparó una cantidad suficiente de CM2 con 3000 UI/mL de IL-2 el día de uso. Se etiquetó el matraz de medio CM2 con su nombre, las iniciales del preparador, la fecha en que se filtró/preparó, la fecha de caducidad de dos semanas y guardó a 4 °C hasta que se necesite para el cultivo de tejidos.

Preparación del CM3

Se preparó el CM3 el día que se requiere para su uso. El CM3 era el mismo que el medio AIM-V®, suplementado con 3000 IL/nil de IL-2 el día de su uso. Se preparó una cantidad de CM3 suficiente para las necesidades experimentales añadiendo la solución patrón de IL-2 directamente a la botella o bolsa de AIM-V. Se mezcló bien agitando suavemente. Se etiquetó la botella con "3000 UI/mLde IL-2" inmediatamente después de añadirla al AIM-V. Si hubiera exceso de CM3, se guardó en matraces a 4 °C etiquetados con el nombre del medio, las iniciales del preparador, la fecha en que se preparó el medio y su fecha de caducidad (7 días después de la preparación). Se desecharon los medios suplementados con iL-2 tras 7 días de almacenamiento a 4 °C.

Preparación del CM4

CM4 fue igual que CM3, con el suplemento adicional de GlutaMAX™ 2 mM (concentración final). Por cada 1 L de CM3, se añaden 10 mL de GlutaMAX™ 200 mM. Se preparó una cantidad de CM4 suficiente para las necesidades experimentales añadiendo la solución patrón de IL-2 y la solución patrón de GlutaMAX™ directamente a la botella o bolsa de AIM-V. Se mezcló bien agitando suavemente. Se etiquetó la botella con "3000 UI/mL de IL-2 y G1 utaMAX" inmediatamente después de añadirla al AIM-V. Si había exceso de CM4, se almacenó en botellas a 4 °C etiquetadas con el nombre del medio, "G1utaMAX", y su fecha de caducidad (7 días después de la preparación). Se desecharon los medios suplementados con IL-2 tras 7 días de almacenamiento a 4 °C.

Ejemplo 2: uso del cóctel de citocinas IL-2, IL-15 e IL-21

Este ejemplo describe el uso de las citocinas IL-2, IL-15 e IL-21, que sirven como factores adicionales de crecimiento de células T, en combinación con el proceso de TIL de los Ejemplos A a G.

Utilizando los procesos descritos en el presente documento, los TIL pueden cultivarse a partir de tumores de carcinoma de pulmón de células no pequeñas (NSCLC) en presencia de IL-2 en un brazo del experimento y, en lugar de IL-2, una combinación deL-2, IL-15 e IL-21 en otro brazo al inicio del cultivo. Al finalizar el pre-REP, se evaluaron los cultivos en cuanto a expansión, fenotipo, función (CD107a+ e IFN-y) y repertorio de TCR Vp. La IL-15 y la IL-21 se describen en el presente documento y en Gruijl, et al., IL-21 promotes the expansion of CD27+CD28+ tumor infiltrating lymphocytes with high cytotoxic potential and low collateral expansion of regulatory T cells, Santegoets, S. J., J Transl Med., 2013, 11:37 (disponible en la web en ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC3626797/).

Los resultados pueden mostrar que se observó una mayor expansión de TIL (>20 %), tanto en células CD4+ como CD8+ en las condiciones tratadas con IL-2, IL-15 e IL-21 en relación con las condiciones de IL-2 solamente. Hubo una inclinación hacia una población predominantemente de CD8+ con un repertorio de TCR Vp sesgado en los TIL obtenidos de los cultivos tratados con IL-2, IL-15 e IL-21 en relación con los cultivos sólo con IL-2. El IFN-<y>y el CD107a fueron elevados en los TIL tratados con IL-2, IL-15 e IL-21, en comparación con los TIL tratados únicamente con IL-2.

Ejemplo 3: calificación de lotes individuales de células mononucleares periféricas irradiadas con rayos gamma

Este Ejemplo describe un novedoso procedimiento abreviado para calificar lotes individuales de células mononucleares periféricas irradiadas con rayos gamma (PBMC, también conocidas como MNC) para su uso como células alimentadoras alogénicas en los métodos ejemplares descritos en el presente documento.

Cada lote alimentador de MNC irradiadas se preparó a partir de un donante individual. Cada lote o donante se examinó individualmente para comprobar su capacidad de expandir TIL en la REP en presencia de anticuerpo anti-CD3 purificado (clon OKT3) e interleucina-2 (IL-2). Además, cada lote de células alimentadoras se probó sin la adición de TIL para verificar que la dosis recibida de radiación gamma era suficiente para hacerlas incompetentes para la replicación.

Antecedentes

Se necesitaron células alimentadoras MNC irradiadas con rayos gamma y de crecimiento detenido para la REP de TIL. Los receptores de membrana de las MNC alimentadoras se unen al anticuerpo anti-CD3 (clon OKT3) y se entrecruzan con los TIL en el matraz de REP, estimulando la expansión de los TIL. Los lotes alimentadores se prepararon a partir de la leucaféresis de sangre completa extraída de donantes individuales. El producto de la leucaféresis se sometió a centrifugación sobre Ficoll-Hypaque, se lavó, se irradió y se crioconservó en condiciones de GMP.

Es importante que a los pacientes que recibieron terapia con TIL no se les infundan células alimentadoras viables, ya que esto puede provocar una enfermedad de injerto contra huésped (GVHD). Por lo tanto, se detiene el crecimiento de las células alimentadoras dosificando las células con irradiación gamma, lo que provoca roturas de ADN de doble cadena y la pérdida de viabilidad celular de las células MNC al cultivarlas nuevamente.

Criterios de evaluación y montaje experimental

Los lotes alimentadores se evaluaron según dos criterios: 1) su capacidad para expandir los TIL en co-cultivo > 100 veces y 2) su incompetencia de replicación.

Los lotes alimentadores se probaron en formato mini-REP utilizando dos líneas primarias de TIL pre-REP cultivadas en matraces de cultivo de tejidos T25 verticales. Los lotes alimentadores se probaron contra dos líneas TIL distintas, ya que cada línea TIL es única en su capacidad de proliferar en respuesta a la activación en un REP. Como control, un lote de células alimentadoras MNC irradiadas, que históricamente ha demostrado cumplir los criterios anteriores, se analizó junto con los lotes de prueba.

Para garantizar que todos los lotes probados en un mismo experimento reciban pruebas equivalentes, se dispuso de existencias suficientes de las mismas líneas TIL pre-REP para probar todas las condiciones y todos los lotes alimentadores.

Para cada lote de células alimentadoras probado, había un total de seis matraces T25: TIL Pre-REP línea #1 (2 matraces); TIL Pre-REP línea #2 (2 matraces); y control alimentador (2 matraces). Los matraces que contenían las líneas TIL #1 y #2 evaluaron la capacidad del lote alimentador para expandir los TIL. Los matraces de control alimentador evaluaron la incompetencia de replicación del lote alimentador.

Protocolo experimental

Día -2/3, descongelación de las líneas de TIL

Se preparó el medio CM2. Se calentó CM2 en un baño de agua a 37 °C. Se prepararon 40 mL de CM2 suplementado con 3000 UI/mL de IL-2. Se mantuvo caliente hasta su uso. Se colocaron 20 mL de CM2 precalentado sin IL-2 en cada uno de los dos tubos cónicos de 50 mL etiquetados con los nombres de las líneas TIL utilizadas. Se retiraron las dos líneas TIL pre-REP designadas del almacenamiento de LN2 y transfirieron los viales a la sala de cultivo de tejidos. Se descongelaron los viales colocándolos dentro de una bolsa de almacenamiento con cremallera sellada en un baño de agua a 37 °C hasta que quedó una pequeña cantidad de hielo.

Usando una pipeta de transferencia estéril, se transfirió inmediatamente el contenido del vial a los 20 mL de CM2 en el tubo cónico de 50mL preparado y etiquetado. Se llevó a 40 mL usando CM2 sin IL-2 para lavar las células. Se centrifugó a 400 * CF durante 5 minutos. Se aspiró el sobrenadante y resuspendió en 5 mL de CM2 caliente suplementado con 3000 UI/mL de IL-2.

Se extrajo una pequeña alícuota (20 j L) por duplicado para el recuento celular utilizando un contador celular automatizado. Se registraron los recuentos. Mientras se realizaba el recuento, se colocó el tubo cónico de 50 mL con células de TIL en una incubadora humidificada a 37 °C, 5 % de CO2, con el tapón aflojado para permitir el intercambio de gases. Se determinó la concentración celular y diluyeron los TIL hasta 1 * 106 células/mL en CM2 suplementado con IL-2 a razón de 3000 UI/mL.

Se cultivaron en 2 mL/pocillo de una placa de cultivo tisular de 24 pocillos en tantos pocillos como fuera necesario en una incubadora humidificada a 37 °C hasta el día 0 del mini-REP. Se cultivaron las diferentes líneas de TIL en placas de cultivo tisular de 24 pocillos separadas para evitar confusiones y posibles contaminaciones cruzadas.

Día 0, iniciar mini-REP

Se preparó suficiente medio CM2 para el número de lotes alimentadores a probar (por ejemplo, para probar 4 lotes alimentadores a la vez, preparar 800 mL de medio CM2). Se tomaron alícuotas de una porción del CM2 preparado anteriormente y compleméntelo con 3000 UI/mL de IL-2 para el cultivo de las células (por ejemplo, para probar 4 lotes alimentadores a la vez, se prepararon 500 mL de medio CM2 con 3000 UI/mL de IL-2).

Trabajando con cada línea de TIL por separado para evitar la contaminación cruzada, se retiró la placa de 24 pocillos con el cultivo de TIL de la incubadora y transfirió al BSC.

Utilizando una pipeta de transferencia estéril o un pipeteador y una punta de 100-1000<j>L, se extrajo aproximadamente 1 mL de medio de cada pocillo de TIL que vaya a utilizar y se colocó en un pocillo no utilizado de la placa de cultivo tisular de 24 pocillos.

Utilizando una pipeta de transferencia estéril nueva o un pipeteador y una punta de 100-1000 j L, se mezcló el medio restante con el TIL en los pocillos para resuspender las células y, a continuación, se transfirió la suspensión celular a un tubo cónico de 50 mL etiquetado con el nombre del TIL y registró el volumen.

Se lavaron los pocillos con el medio reservado y se transfirió ese volumen al mismo tubo cónico de 50 mL. Se centrifugó las células a 400 * CF para recoger el sedimento celular. Se aspiró el sobrenadante del medio y resuspendió el sedimento celular en 2-5 mL de medio CM2 que contenía 3000 UI/mL de IL-2, volumen que se utilizará en función del número de pocillos recogidos y del tamaño del sedimento - el volumen debe ser suficiente para garantizar una concentración de >1.3 * 106 células/mL.

Utilizando una pipeta serológica, se mezcló bien la suspensión celular y registró el volumen. Se extrajeron 200<j>L para realizar un recuento celular utilizando un contador celular automatizado. Mientras se realizaba el recuento, se colocó el tubo cónico de 50 mL con células de TIL en una incubadora humidificada, con un 5%de CO2, a 37 °C, con el tapón aflojado para permitir el intercambio de gases. Se registraron los recuentos. Se retiraron el tubo cónico de 50 mL que contenía las células de TIL de la incubadora y resuspendieron las células a una concentración de 1.3 *106 células/mL en CM2 caliente suplementado con 3000 UI/mL de IL-2. Se devolvió el tubo cónico de 50 mL a la incubadora con el tapón aflojado.

Se repitieron las etapas anteriores para la segunda línea de TIL.

Justo antes de sembrar los TIL en los matraces T25 para el experimento, los TIL se diluyeron 1:10 para una concentración final de 1.3 * 105 células/mL según se indica a continuación.

Se preparó la solución de trabajo MACS GMP CD3 pura (OKT3)

Se extrajo la solución patrón de OKT3 (1mg/mL) del refrigerador a 4 °C y se colocó en el BSC. Se utilizó una concentración final de 30 ng/mL de OKT3 en el medio del mini-REP.

Se necesitaron 600 ng de OKT3 para 20 mL en cada matraz T25 del experimento; esto equivalía a 60 pL de una solución de 10 pg/mL para cada 20 mL, o 360 pL para los 6 matraces probados para cada lote alimentador. Para cada lote alimentador probado, se prepararon 400 pL de una dilución 1:100 de 1 mg/mL de OKT3 para una concentración de trabajo de 10 pg/mL (por ejemplo, para probar 4 lotes alimentadores a la vez, se prepararon 1600 pL de una dilución 1:100 de 1 mg/mL de OKT3: 16 pL de 1 mg/mL de OKT3 1.584 mL de medio CM2 con 3000 UI/mL de IL-2).

Preparar matraces T25

Se etiquetó cada matraz y llenó el matraz con medio CM2 antes de preparar las células alimentadoras. Se colocaron los matraces en la incubadora a 37 °C humidificada con 5 % de CO2 para mantener el medio caliente mientras se espera para añadir los componentes restantes. Una vez preparadas las células alimentadoras, se añadirán los componentes al CM2 en cada matraz.

Tabla 26: Soluciones

Preparar las células alimentadoras

Se necesitó un mínimo de 78 * 106 células alimentadoras por lote probado para este protocolo. Cada vial de 1 mL congelado por SDBB tenía 100 * 106 células viables tras la congelación. Suponiendo una recuperación del 50 % al descongelarse del almacenamiento en LN2, se recomendó descongelar al menos dos viales de 1 mL de células alimentadoras por lote, lo que da una estimación de 100 * 106 células viables para cada REP. Alternativamente, si se suministraban en viales de 1.8 mL, un solo vial proporcionaba suficientes células alimentadoras.

Antes de descongelar las células alimentadoras, se precalentaron aproximadamente 50 mL de CM2 sin IL-2 para cada lote alimentador que se iba a analizar. Se retiraron los viales del lote alimentador designado del almacenamiento en LN2, y se colocaron en una bolsa de almacenamiento con cremallera y se pusieron en hielo. Se descongelaron los viales dentro de la bolsa de almacenamiento con cremallera cerrada sumergiéndolos en un baño de agua a 37 °C. Se retiraron los viales de la bolsa con cremallera, se rociaron o limpiaron con EtOH al 70 % y se transfirieron los viales al BSC.

Utilizando una pipeta de transferencia, se transfirió inmediatamente el contenido de los viales alimentadores a 30 mL de CM2 caliente en un tubo cónico de 50 mL. Se lavó el vial con un pequeño volumen de CM2 para eliminar cualquier célula residual en el vial. Se centrifugó a 400 * CF durante 5 minutos. Se aspiró el sobrenadante y resuspendió en 4 mL de CM2 caliente más 3000 UI/mL de IL-2. Se retiraron 200 pL para el recuento celular utilizando el contador celular automatizado. Se registraron los recuentos.

Se resuspendieron las células a razón de 1.3 * 107 células/mL en CM2 caliente más 3000 UI/mL de IL-2. Se diluyeron las células de TIL de 1.3 * 106 células/mL a 1.3 * 105 células/mL.

Establecimiento del cocultivo

Se diluyeron las células de TIL de 1.3 * 106 células/mL a 1.3 * 105 células/mL. Se añadieron 4.5 mL de medio CM2 a un tubo cónico de 15 mL. Se retiraron las células de TIL de la incubadora y se resuspendieron bien utilizando una pipeta serológica de 10 mL. Se retiraron 0.5 mL de células de la suspensión de 1.3 * 106 células/mL de TlL y añadieron a los 4.5 mL de medio del tubo cónico de 15 mL. Se devolvió el vial de patrón de TIL a la incubadora. Se mezcló bien. Se repitió la operación para la segunda línea de TIL.

Se transfirieron los matraces con medio precalentado para un único lote alimentador de la incubadora al BSC. Se mezclaron las células alimentadoras pipeteando arriba y abajo varias veces con una punta de pipeta de 1 mL y se transfirió 1 mL (1.3 * 107 células) a cada matraz para ese lote alimentador. Se añadieron 60 pL de patrón de trabajo de OKT3 (10 pg/mL) a cada matraz. Se devolvieron los dos matraces de control a la incubadora.

Se transfirió 1 mL (1.3 * 105) de cada lote de TIL al matraz T25 etiquetado correspondiente. Se devolvieron los matraces a la incubadora e incubaron en posición vertical. No se perturbó hasta el día 5.

Se repitió para todos los lotes alimentadores probados.

día 5, cambio de medio

Se preparó CM2 con 3000 UI/mL de IL-2. Se necesitaron 10 mL para cada matraz. Con una pipeta de 10 mL, se transfirieron 10 mL de CM2 caliente con 3000 UI/mL de IL-2 a cada matraz. Se devolvieron los matraces a la incubadora e incubaron en posición vertical hasta el día 7. Se repitió esta operación para todos los lotes alimentadores probados.

día 7, recolección

Se retiraron los matraces de la incubadora y se transfirieron al BSC, con cuidado de no perturbar la capa celular del fondo del matraz. Sin perturbar las células que crecen en el fondo de los matraces, se retiraron 10 mL de medio de cada matraz de prueba y 15 mL de medio de cada uno de los matraces de control.

Utilizando una pipeta serológica de 10 mL, se resuspendieron las células en el medio restante y se mezclaron bien para deshacer cualquier grumo de células. Tras mezclar bien la suspensión celular mediante pipeteo, se extrajeron 200 pL para el recuento celular. Se contaron los TIL utilizando el procedimiento operativo estándar adecuado junto con el equipo contador automático de células. Se registraron los recuentos en el día 7.

Se repitió para todos los lotes alimentadores probados.

Los matraces de control alimentadores se evaluaron para determinar la incompetencia de replicación y los matraces que contenían TIL se evaluaron para determinar la expansión en pliegues desde el día 0 según la Tabla TT siguiente.

día 7, continuación de los matraces de control de alimentación hasta el día 14

Tras completar los recuentos del día 7 de los matraces de control alimentadores, se añadieron 15 mL de medio CM2 fresco que contenía 3000 UI/mL de IL-2 a cada uno de los matraces de control. Se devolvieron los matraces de control a la incubadora e incubaron en posición vertical hasta el día 14.

día 14, sin proliferación extendida de matraces de control alimentadores

Se retiraron los matraces de la incubadora y transfirieron al BSC, teniendo cuidado de no perturbar la capa celular del fondo del matraz. Sin perturbar las células que crecían en el fondo de los matraces, se retiraron aproximadamente 17 mL de medio de cada matraz de control. Se utilizó una pipeta serológica de 5 mL, se resuspendieron las células en el medio restante y mezclaron bien para deshacer cualquier grumo de células. Se registraron los volúmenes de cada matraz.

Tras mezclar bien la suspensión celular mediante pipeteo, se retiraron 200 pL para el recuento celular. Se hizo el recuento de los TIL utilizando el procedimiento operativo estándar adecuado junto con el equipo contador automático de células. Se registraron los recuentos.

Se repitió para todos los lotes alimentadores probados.

Resultados y criterios de aceptación

Resultados

La dosis de irradiación gamma fue suficiente para hacer que las células alimentadoras fueran incompetentes para la replicación. Todos los lotes cumplieron los criterios de evaluación y también demostraron una reducción del número total viable de células alimentadoras restantes en el día 7 del cultivo REP en comparación con el día 0.

Se esperaba que todos los lotes alimentadores cumplieran los criterios de evaluación de multiplicar por 100 el crecimiento de TIL en el día 7 del cultivo REP.

Se esperaba que los recuentos del día 14 de los matraces de control alimentadores continuaran la tendencia no proliferativa observada el día 7.

Criterios de aceptación

Se cumplieron los siguientes criterios de aceptación para cada línea TIL replicada probada para cada lote de células alimentadoras

La aceptación fue doble, como se indica a continuación (en la Tabla 27).

Tabla 27: Criterios de aceptación

Se evaluó si la dosis de radiación era suficiente para hacer que las células alimentadoras MNC fueran incompetentes para la replicación cuando se cultivaban en presencia de 30 ng/mL de anticuerpo OKT3 y 3000 UI/mL de IL-2. La incompetencia de replicación se evaluó mediante el recuento total de células viables (TVC) determinado por recuento celular automatizado el día 7 y el día 14 del REP.

El criterio de aceptación fue "Sin crecimiento", lo que significa que el número total de células viables no ha aumentado el día 7 y el día 14 con respecto al número inicial de células viables puestas en cultivo el día 0 del REP.

Se evaluó la capacidad de las células alimentadoras para soportar la expansión de TIL. El crecimiento de TIL se midió en términos de las veces que se expanden las células viables desde el inicio del cultivo en el día 0 del REP hasta el día 7 del REP. En el día 7, los cultivos de TIL alcanzaron una expansión mínima de 100 veces, (es decir, superior a 100 veces el número de células de TIL viables totales puestas en cultivo el día 0 del REP), según se evaluó mediante recuento celular automatizado.

Pruebas de contingencia de los lotes alimentadores de MNC que no cumplían los criterios de aceptación

En el caso de que un lote alimentador de MNC no cumpliera alguno de los criterios de aceptación descritos anteriormente, se tomarán las siguientes medidas para volver a probar el lote y descartar como causa un simple error del experimentador.

Si quedan dos o más viales de pruebas satélite del lote, entonces se volvió a analizar el lote. Si hubiera uno o ningún vial de prueba satélite restante del lote, entonces el lote fue reprobado de acuerdo con los criterios de aceptación enumerados anteriormente.

Para ser calificado, el lote en cuestión y el lote de control debían alcanzar los criterios de aceptación arriba mencionados. Una vez cumplidos estos criterios, el lote se liberaba para su uso.

Ejemplo 4: Calificación de lotes individuales de células mononucleares de sangre periférica irradiadas con rayos gamma

Este ejemplo describe un procedimiento abreviado novedoso para calificar lotes individuales de células mononucleares de sangre periférica (PBMC) irradiadas con rayos gamma para su uso como células alimentadoras alogénicas en los métodos ejemplares descritos en el presente documento. Este ejemplo proporciona un protocolo para la evaluación de lotes de células PBMC irradiadas para su uso en la producción de lotes clínicos de TIL. Cada lote de PBMC irradiadas se preparó a partir de un donante individual. A lo largo de más de 100 protocolos de calificación, se demostró que, en todos los casos, los lotes de PBMC irradiadas procedentes del SDBB (Banco de Sangre de San Diego) expanden los TIL >100 veces en el día 7 de un REP. Este protocolo de cualificación modificado debía aplicarse a los lotes de PBMC irradiadas de donantes procedentes del SDBB, que se sometieron a pruebas adicionales para verificar que la dosis recibida de radiación gamma era suficiente para hacerlas incompetentes para la replicación. Una vez demostrado que mantenían la incompetencia de replicación en el transcurso de 14 días, los lotes de PBMC donantes se consideraron "calificados" para su uso en la producción de lotes clínicos de TIL.

Antecedentes

Se necesitaron PBMC irradiadas con rayos gamma y de crecimiento detenido para la REP estándar actual de TIL. Los receptores de membrana de las PBMC se unen al anticuerpo anti-CD3 (clon OKT3) y se entrecruzan con los TIL en cultivo, estimulando la expansión de los TIL. Los lotes de PBMC se prepararon a partir de la leucaféresis de sangre completa extraída de donantes individuales. El producto de la leucaféresis se sometió a centrifugación sobre Ficoll-Hypaque, se lavó, se irradió y se crioconservó en condiciones de GMP.

Es importante que a los pacientes que recibieron la terapia con TIL no se les infundan PBMC viables, ya que esto podría provocar una enfermedad injerto contra huésped (GVHD). Por lo tanto, las PBMC del donante se detienen en su crecimiento dosificando las células con irradiación gamma, lo que provoca roturas de ADN de doble cadena y la pérdida de viabilidad celular de las PBMC tras el nuevo cultivo.

Criterios de evaluación

7.2.1 El criterio de evaluación de los lotes de PBMC irradiados fue su incompetencia de replicación.

Montaje experimental

Los lotes alimentadores se probaron en formato mini-REP como si fueran a cultivarse juntamente con TIL, utilizando matraces de cultivo de tejidos T25 verticales. Lote de control: Un lote de PBMC irradiadas, que históricamente había demostrado cumplir el criterio de 7.2.1, se utilizó junto con los lotes experimentales como control. Para cada lote de PBMC de donante irradiado probado, se probaron matraces por duplicado.

Protocolo experimental

día 0

Se preparan ~90 mL de medio CM2 para cada lote de PBMC del donante que se iba a analizar. Mantener caliente CM2 en un baño de agua a 37 °C. Descongelar una alícuota de 6 * 106 UI/mL de IL-2. Devolver el medio CM2 al BSC, limpiándolo con EtOH al 70 % antes de colocarlo en la campana. Para cada lote de PBMC analizado, retirar aproximadamente 60 mL de CM2 a una botella estéril separada. Añadir IL-2 de la solución patrón descongelada de 6 * 106 UI/mL a este medio para una concentración final de 3000 UI/mL. Se etiquetó esta botella como "CM2/IL2" (o similar) para distinguirla de la CM2 sin suplementar.

Preparación de OKT3

Se extrajo la solución patrón de anti-CD3 (OKT3) del refrigerador a 4 °C y se colocó en el BSC. Se utilizó una concentración final de 30 ng/mL de OKT3 en el medio del mini-REP. Se preparó una solución de trabajo de 10 |jg/mL de anti-CD3 (OKT3) a partir de la solución patrón de 1 mg/mL. Se colocó en el frigorífico hasta que se necesitara.

Para cada lote de PBMC probado, preparar 150 jL de una dilución 1:100 del patrón de anti-CD3 (OKT3). Por ejemplo, para probar 4 lotes de PBMC a la vez, preparar 600 jL de 10 jg/m L de anti-CD3 (OKT3) añadiendo 6 jL de la solución patrón de 1mg/mL a 594 jL de CM2 suplementada con 3000 UI/mL de IL-2.

Preparación de los matraces

Se añadieron 19 mL por matraz de CM2/IL-2 a los matraces T25 etiquetados y se colocaron los matraces en una incubadora a 37 °C, humidificada y con un 5 % de CO2 mientras se preparaban las células.

Preparación de las PBMC irradiadas

Se recuperaron los viales de los lotes de PBMC a analizar del almacenamiento en LN2. Estos se colocaron a -80 °C o se mantuvieron en hielo seco antes de la descongelación. Se colocaron 30 mL de CM2 (sin suplemento de IL-2) en tubos cónicos de 50 mL para cada lote que se iba a descongelar. Se etiquetó cada tubo con los diferentes números de lote de las PBMC a descongelar. Se taparon bien los tubos y colocaron en un baño de agua a 37 °C antes de utilizarlos. Si fuera necesario, devuelva los tubos cónicos de 50 mL al BSC, limpiándolos con EtOH al 70 % antes de colocarlos en la campana.

Se retiró un vial de PBMC del almacenamiento en frío y colocó en una gradilla para tubos flotantes en un baño de agua a 37 °C para descongelar. Se dejó descongelar hasta que quede una pequeña cantidad de hielo en el vial. Utilizando una pipeta de transferencia estéril, se transfirió inmediatamente el contenido del vial a los 30 mL de CM2 del tubo cónico de 50 mL. Se extrajo aproximadamente 1 mL de medio del tubo para enjuagar el vial; se repitió el enjuague al tubo cónico de 50 mL. Se tapó herméticamente y agitó suavemente para lavar las células.

Se centrifugó a 400 * g durante 5 minutos a temperatura ambiente. Se aspiró el sobrenadante y resuspendió el sedimento celular en 1 mL de CM2/IL-2 caliente utilizando una punta de pipeta de 1000 jL . Alternativamente, antes de añadir el medio, se resuspendió el sedimento celular arrastrando el tubo tapado por una gradilla vacía. Tras resuspender el sedimento celular, se llevó el volumen a 4 mL utilizando medio CM2/IL-2. Se registró el volumen.

Se retiró una pequeña alícuota (por ejemplo, 100<j>L) para el recuento celular utilizando un contador celular automatizado. Se realizaron los recuentos por duplicado de acuerdo con el contador celular automatizado particular SOP. Lo más probable es que fuera necesario realizar una dilución de las PBMC antes de realizar los recuentos celulares. Una dilución inicial recomendada era de 1:10 pero esto variaba en función del tipo de contador celular utilizado. Se registraron los recuentos.

Se ajustó la concentración de PBMC a 1.3 * 107 células/mL utilizando el medio CM2/IL-2. Se mezcló bien agitando suavemente o aspirando suavemente de arriba abajo con una pipeta serológica.

Preparación de los matraces de cultivo

Se devolvieron dos matraces T25 etiquetados al BSC desde la incubadora de cultivo de tejidos. Se devolvió el vial de 10 jg/m L de anti-CD3/OKT3 al BSC. Se añadió 1mL de la suspensión de células PBMC de 1.3 * 107 a cada matraz. Se añadieron 60 jL del anti-CD3/OKT3 de 10 jg/m L a cada matraz. Se devolvieron los matraces tapados a las incubadoras de cultivo de tejidos durante 14 días de crecimiento sin perturbaciones. Se colocaron los viales anti-CD3/OKT3 nuevamente en el frigorífico hasta que se necesitaran para el siguiente lote. Se repitió para cada lote de PBMC a evaluar.

día 14, medición de la no proliferación de PBMC

Se devolvieron los matraces T25 duplicados al BSC. Para cada matraz, utilizando una pipeta serológica nueva de 10 mL, se retiraron ~17 mL de cada uno de los matraces y, a continuación, se extrajo con cuidado el medio restante para medir el volumen que quedaba en los matraces. Se registró el volumen.

Se mezcló bien la muestra pipeteando arriba y abajo con la misma pipeta serológica.

Se extrajo una muestra de 200 jL de cada matraz para el recuento. Se contaron las células utilizando un contador de células automatizado. Se repitieron las etapas 7.4.26 - 7.4.31 para cada lote de PBMC evaluado. Resultados y criterio de aceptación

Resultados

Se esperaba que la dosis de irradiación gamma fuera suficiente para hacer que las células alimentadoras fueran incompetentes para la replicación. Se esperaba que todos los lotes cumplieran el criterio de evaluación, demostrando una reducción del número total viable de células alimentadoras restantes el día 14 del cultivo del REP en comparación con el día 0.

Criterio de aceptación

Se cumplieron los siguientes criterios de aceptación para cada lote irradiado de PBMC del donante probado: "Sin crecimiento" - significaba que el número total de células viables en el día 14 era inferior al número inicial de células viables puestas en cultivo en el día 0 del REP.

Pruebas de contingencia de los lotes de PBMC que no cumplan el criterio de aceptación.

En el caso de que un lote irradiado de PBMC del donante no cumpliera el criterio de aceptación anterior, se tomaron las siguientes medidas para volver a probar el lote y descartar un simple error del experimentador como causa de su fracaso. Si quedaban dos o más viales satélite del lote, se volvía a probar el lote. Si quedaba uno o ningún vial satélite del lote, entonces el lote fracasó según el criterio de aceptación anterior.

Para ser calificado, un lote de PBMC que pasaba por pruebas de contingencia tenía que alcanzar el criterio de aceptación tanto el lote de control como ambas réplicas del lote en cuestión. Una vez cumplido este criterio, el lote se liberaba para su uso.

Ejemplo 5: Preparación de la solución patrón de il-2 (CellGenix)

Este Ejemplo describe el proceso de disolución de interleucina-2 humana recombinante purificada y liofilizada en muestras patrón adecuadas para su uso en otros protocolos de cultivo de tejidos, incluidos todos los descritos en la presente solicitud y en los Ejemplos, incluidos los que implican el uso de rhIL-2.

Procedimiento

Se preparó una solución de ácido acético (HAc) al 0.2 %. Se transfirieron 29 mL de agua estéril a un tubo cónico de 50 mL. Se añadió 1 mL de ácido acético 1N al tubo cónico de 50 mL. Se mezcló bien invirtiendo el tubo 2-3 veces. Se esterilizó la solución de HAc por filtración utilizando un filtro Steriflip

Preparación de HSA al 1%en PBS. Se añadieron 4 mL de solución patrón de HSA al 25% a96 mL de PBS en una unidad de filtración estéril de 150 mL. Se filtró la solución. Se almacenó a 4 °C. Para cada vial de rhIL-2 preparado, se rellenaron los formularios.

Se preparó una solución patrón de rhIL-2 (6 * 106 UI/mL de concentración final). Cada lote de rhIL-2 era diferente y requería la información que se encuentra en el Certificado de Análisis (COA) del fabricante, como por ejemplo 1) Masa de rhIL-2 por vial (mg), 2) Actividad específica de rhIL-2 (Ul/mg) y 3) Volumen de reconstitución de HAc al 0.2 % recomendado (mL).

Se calculó el volumen de HSA al 1 % necesario para el lote de rhIL-2 mediante la ecuación siguiente:

Por ejemplo, según el lote 10200121 COA de rhIL-2 de CellGenix, la actividad específica para el vial de lmg es de 25 * 106 UI/mg. Se recomienda reconstituir la rhIL-2 en 2 mL de HAc al 0.2 %.

Se limpió el tapón de goma del vial de IL-2 con una toallita con alcohol. Utilizando una aguja 16G conectada a una jeringa de 3 mL, se inyectó el volumen recomendado de HAc al 0.2 % en el vial. Se tuvo cuidado de no desalojar el tapón al retirar la aguja. Se invirtió el vial 3 veces y se agitó hasta que se disolvió todo el polvo. Se retiró con cuidado el tapón y se dejó sobre una toallita con alcohol. Se añadió al vial el volumen calculado de HSA al 1 %.

Almacenamiento de la solución de rhIL-2. Para almacenamiento a corto plazo (<72 h), se almacenó el vial a 4 °C. Para almacenamiento a largo plazo (>72 h), se tomaron alícuotas del vial en volúmenes más pequeños y se almacenaron en crioviales a -20 °C hasta que estuvo listo para su uso. Se evitaron los ciclos de congelación/descongelación. Caducó 6 meses después de la fecha de preparación. Las etiquetas de Rh-IL-2 incluían el número de proveedor y de catálogo, el número de lote, la fecha de caducidad, las iniciales del operador, la concentración y el volumen de la alícuota.

Ejemplo 6: Proceso de crioconservación

Este ejemplo describe el método del proceso de crioconservación para los TIL preparados con el procedimiento abreviado y cerrado descrito en el Ejemplo G utilizando el congelador CryoMed de velocidad controlada, Modelo 7454 (Thermo Scientific).

El equipo utilizado fue el siguiente: soporte de aluminio para casetes (compatible con las bolsas de congelación CS750), casetes de crioconservación para bolsas de 750 mL, depósito de nitrógeno líquido a baja presión (22 psi), frigorífico, sensor termopar (tipo cinta para las bolsas) y bolsas de congelación CryoStore CS750 (OriGen Scientific).

El proceso de congelación prevé una velocidad de 0.5 °C desde la nucleación hasta -20 °C y una velocidad de enfriamiento de 1 °C por minuto hasta -80 °C de temperatura final. Los parámetros del programa son los siguientes: Etapa 1 - esperara 4 °C; Etapa2: 1.0 °C/min (temperatura de la muestra) hasta -4 °C; Etapa 3: 20.0 °C/min (temperatura de la cámara) hasta -45 °C; Etapa 4: 10.0 °C/min (temperatura de la cámara) hasta -10.0 °C; Etapa 5: 0.5 °C/min (temperatura de la cámara) hasta -20 °C; y Etapa 6: 1.0 °C/min (temperatura de la muestra) hasta -80 °C.

Ejemplo 7: Tratamiento de NSCLC con anticuerpos anti-PD-1

Población de pacientes:

NSCLC sin tratamiento o después de quimioterapia, pero esquemas de tratamiento sin anti-PD-1/PD-L1:

Fragmento tumoral, tratar con hasta 4 dosis de anti-PD-1/PD-L1, tratar a los pacientes refractarios primarios con producto de TIL crioconservado y listo para su uso en caso de progresión inmediata. Los pacientes refractarios primarios pueden haber progresado después de 2 dosis.

Los pacientes con recaída también pueden ser tratados tras la progresión (el momento puede variar de meses a años después).

IL-2 de concentración completa hasta 6 dosis.

Poblaciones de pacientes para seguir considerando con las mismas permutaciones de fabricación señaladas anteriormente:

• NSCLC sin tratamiento o posterior a la quimioterapia, pero sin anti-PD-1/PD-L1.

• NSCLC sin tratamiento o posterior a la quimioterapia, pero sin anti-PD-1/PD-L1 que tengan una baja expresión de PD-L1.

• NSCLC sin tratamiento o posterior a la quimioterapia pero sin anti-PD-1/PD-L1 que tienen una expresión baja de PD-L1 y/o presentan enfermedad voluminosa al inicio (por ejemplo, se indica enfermedad voluminosa cuando el diámetro máximo del tumor es superior a 7 cm medido en el plano transversal o coronal o se definieron como voluminosos los ganglios linfáticos inflamados con un diámetro en el eje corto de 20 mm o superior en la TC; véase, por ejemplo, Samejima, J., Japanese Journal of Clinical Oncology, 45(11): 1050 10541 2015).

Ejemplo 8: Estudio multicéntrico de fase 2 de linfocitos autólogos infiltrantes de tumores en pacientes con tumores sólidos

Diseño del estudio

Visión general

En este ejemplo se describe un estudio de fase 2 prospectivo, abierto, de cohortes múltiples, no aleatorizado y multicéntrico que evalúa el ACT utilizando TIL en combinación con pembrolizumab o TIL como terapia única, utilizando TIL preparados como se describe en la presente solicitud, así como en este ejemplo.

Objetivos:

Primario:

Evaluar la eficacia de TIL autólogo en combinación con pembrolizumab en pacientes con MM, HNSCC o NSCLC o de TIL como terapia única en pacientes con NSCLC en recaída o refractario (r/r), que habían progresado previamente en o después del tratamiento con CPI, según lo determinado por la tasa de respuesta objetiva (ORR), utilizando los criterios de evaluación de la respuesta en tumores sólidos (RECIST 1.1), según la evaluación del investigador.

Caracterizar el perfil de seguridad de TIL en combinación con pembrolizumab en pacientes con MM, HNSCC y NSCLC o de TIL como tratamiento único en pacientes con NSCLC r/r, medido por la incidencia de acontecimientos adversos emergentes del tratamiento (TEAE) de grado > 3.

Secundario:

Evaluar más a fondo la eficacia de TIL autólogo en combinación con pembrolizumab en pacientes con MM, HNSCC y NSCLC o TIL como terapia única en pacientes con NSCLC r/r utilizando la tasa de respuesta completa (CR), la duración de la respuesta (DOR), la tasa de control de la enfermedad (DCR), la supervivencia libre de progresión (PFS) utilizando RECIST 1.1, según la evaluación del investigador, y la supervivencia global (OS).

Cohortes:

Cohorte 1A: terapia con TIL en combinación con pembrolizumab en pacientes con estadio IIIC o estadio IV irresecable o MM con < 3 líneas previas de terapia sistémica excluida la inmunoterapia. Si han sido tratados previamente, los pacientes deben haber tenido una progresión radiográficamente documentada en la terapia más reciente o después de ella.

Cohorte 2A: terapia con TIL en combinación con pembrolizumab en pacientes con HNSCC avanzado, recurrente o metastásico (por ejemplo, estadios T1N1-N2B, T2-4N0-N2b) con < 3 líneas previas de terapia sistémica, excluida la inmunoterapia. Si han sido tratados previamente, los pacientes deben haber tenido una progresión radiográficamente documentada en o después de la terapia más reciente.

Cohorte 3A: Terapia con TIL en combinación con pembrolizumab en pacientes con NSCLC localmente avanzado o metastásico (estadio III-IV) con <3 líneas previas de terapia sistémica, excluida la inmunoterapia. Si han sido tratados previamente, los pacientes deben haber tenido una progresión radiográficamente documentada en la terapia más reciente o después de ella.

Cohorte 3B: terapia con TIL como agente único en pacientes con NSCLC en estadio III o estadio IV que hayan recibido previamente terapia sistémica con CPI (por ejemplo, anti-PD-1/anti-PD-L1) como parte de < 3 líneas previas de terapia sistémica. Si han sido tratados previamente, los pacientes deben haber tenido una progresión radiográficamente documentada en la terapia más reciente o después de ella.

Los pacientes de las Cohortes 3A y 3B (NSCLC) con tumores impulsados por oncogenes con terapia dirigida eficaz disponible deben haber recibido al menos una línea de terapia dirigida.

Todos los pacientes recibieron terapia autóloga con TIL crioconservados (con o sin pembrolizumab, según la asignación a la Cohorte), precedida de un régimen de acondicionamiento previo de linfodepleción no mieloablativa (NMA-LD) consistente en ciclofosfamida y fludarabina. Tras la infusión de TIL, se administraron hasta 6 dosis intravenosas de interleucina-2 (IL-2) como máximo.

Los siguientes periodos generales de estudio tuvieron lugar en las 4 cohortes, a menos que se especifique lo contrario.

Cribado y extirpación del tumor: hasta 4 semanas (28 días) desde la entrada en el estudio; fabricación del producto de TlL: aproximadamente <22 días desde la extirpación del tumor; y periodo de tratamiento, como se comenta a continuación.

Periodo de tratamiento (Cohortes 1A, 2A y 3A): hasta 2 años, incluyendo NMA-LD (7 días), infusión de TIL (1 día) seguida de administraciones de lL-2 (1 a 4 días). Los pacientes reciben una única infusión de pembrolizumab tras la finalización de la extirpación de su tumor para la producción de TIL y las exploraciones de referencia, pero antes del inicio del régimen de NMA-LD. La siguiente dosis de pembrolizumab no será antes de la finalización de la IL-2 y continuará una vez cada tres semanas ± 3 días a partir de entonces durante < 2 años (24 meses) o hasta la progresión de la enfermedad o toxicidad inaceptable, lo que ocurra primero. La visita de fin de tratamiento (EOT) tuvo lugar en los 30 días siguientes a la última dosis de pembrolizumab. La visita podía combinarse con la visita de fin de evaluación (EOA) si procedía (por ejemplo, la interrupción del pembrolizumab se produjo en el momento de la progresión de la enfermedad o al inicio de un nuevo tratamiento contra el cáncer).

Periodo de tratamiento (Cohorte 3B): hasta 12 días, incluyendo NMA-LD (7 días), TIL, infusión (1 día) seguida de administraciones de IL-2 (de 1 a 4 días). La visita de<e>O<t>tuvo lugar una vez que el paciente recibió la última dosis de IL-2. La visita de EOT se realizó dentro de los 30 días siguientes a la interrupción del tratamiento y puede combinarse con cualquier visita programada que se produzca dentro de este intervalo durante el periodo de evaluación.

Período de evaluación: comenzó tras la infusión de TIL el día 0 y finaliza con la progresión de la enfermedad, con el inicio de una nueva terapia anticancerosa, con la retirada parcial del consentimiento para las evaluaciones del estudio o a los 5 años (mes 60), lo que ocurra primero. Se realizó una visita de fin de evaluación (EOA) una vez que el paciente alcanzó la progresión de la enfermedad o inició una nueva terapia anticancerosa.

La terapia autóloga TIL con los TIL preparados como se describe en el presente documento constó de las siguientes etapas:

1. Resección del tumor para proporcionar el tejido autólogo que sirve como fuente del producto celular de TIL; 2. Producto de TIL producido en una instalación central de Buenas Prácticas de Fabricación (GMP);

3. Un régimen de acondicionamiento previo de NMA-LD de 7 días;

4. Cohortes 1A, 2A y 3A: Los pacientes reciben una única infusión de pembrolizumab tras la finalización de la extirpación de su tumor para la producción de TIL y las exploraciones de referencia, pero antes del inicio del régimen de NMA-LD. La siguiente dosis de pembrolizumab no será antes de la finalización de la IL-2 y continuará una vez cada tres semanas ± 3 días a partir de entonces.

5. Infusión del producto de TIL autólogo (día 0); y

6. Administraciones IV de IL-2 hasta un máximo de 6 dosis.

En las Cohortes 1A, 2A y 3A, la siguiente dosis de pembrolizumab no fue antes de la finalización de la IL-2 y continuó una vez cada tres semanas ± 3 días a partir de entonces durante < 2 años (24 meses), o hasta la progresión de la enfermedad o toxicidad inaceptable, lo que ocurriera primero.

Los diagramas de flujo de las Cohortes 1A, 2A y 3A se pueden encontrar en la Figura 7. El diagrama de flujo para la Cohorte 3B puede encontrarse en la Figura 8. Los pacientes fueron asignados a la Cohorte apropiada por indicación tumoral.

Terapia con TIL pembrolizumab (Cohortes 1A, 2A y 3A)

Se examinó a los pacientes y se programó una intervención quirúrgica para la extirpación del tumor. A continuación, a los pacientes se les extirparon una o más lesiones tumorales, que se enviaron a una planta de fabricación central para la producción de TIL.

A continuación, se imitó el régimen de NMA-LD, que consistía en 2 días de ciclofosfamida IV (60 mg/kg) con mesna (según la norma de tratamiento del centro o USPI/SmPC) los días -7 y -6, seguidos de 5 días de fludarabina IV (25 mg/m2: del día -5 al día -1).

Los pacientes de las Cohortes 1A, 2A y 3A recibieron una única infusión de pembrolizumab tras la finalización de la extirpación de su tumor para la producción de TIL y las exploraciones de referencia y antes del inicio del régimen de NMA-LD. Las administraciones de IL-2 a una dosis de 600,000 UI/kg IV comenzaron tan pronto como 3 horas después, pero no más tarde de 24 horas después, de la finalización de la infusión de TIL el día 0. Se proporcionarán administraciones adicionales de IL-2 aproximadamente cada 8 a 12 horas hasta un máximo de 6 dosis. La segunda dosis de pembrolizumab no se administrará antes de la finalización de la IL-2. Los pacientes deberán haberse recuperado de todas las toxicidades relacionadas con la IL-2 (Grado <2), antes de la segunda administración de pembrolizumab. Pembrolizumab continuará una vez cada tres semanas ± 3 días a partir de entonces durante < 2 años (24 meses) o hasta la progresión de la enfermedad o toxicidad inaceptable, lo que ocurra primero.

Terapia con TIL como agente único (Cohorte 3B)

Se seleccionó a los pacientes y se les programó una intervención quirúrgica para la extirpación del tumor. A continuación, a los pacientes se les extirparon una o más lesiones tumorales, que se enviaban a una planta de fabricación central para la producción de TIL.

A continuación, el régimen de NMA-LD consistió en 2 días de ciclofosfamida IV (60 mg/kg) con mesna (según la norma de atención del centro o USPI/SmPC) el día -7 y el día -6, seguidos de 5 días de fludarabina IV (25 mg/m2: día -5 a día -1).

La infusión del producto de TIL autólogo derivado del tumor se produjo no antes de 24 horas después de la última dosis de fludarabina. Las administraciones de IL-2 a una dosis de 600,000 UI/kg IV pudieron comenzar tan pronto como 3 horas después, pero no más tarde de 24 horas después, de la finalización de la infusión de TIL.

Se proporcionaron administraciones adicionales de IL-2 aproximadamente cada 8 a 12 horas hasta un máximo de 6 dosis.

Producción y expansión de linfocitos infiltrantes del tumor

El producto celular autólogo TIL estaba compuesto por linfocitos T citotóxicos viables derivados del tumor/lesión de un paciente, que se fabrican ex vivo en una instalación central con GMP. En la Figura 9, por ejemplo, se proporciona un diagrama de flujo ejemplar que representa el proceso de producción de TIL.

El proceso de fabricación de TIL comenzó en el centro clínico tras la escisión quirúrgica de una lesión o lesiones tumorales metastásicas primarias o secundarias de >1.5 cm de diámetro en cada paciente individual. Pueden extirparse múltiples lesiones tumorales de diversas localizaciones anatómicas para compilar un agregado total de tejido tumoral; sin embargo, el agregado no debe superar los 4.0 cm de diámetro ni los 10 g de peso, debido a la cantidad limitada del medio de bioconservación presente en la botella de transporte.

Una vez que la(s) lesión(es) tumoral(es) fue(ron) colocada(s) en la botella de transporte para bioconservación, se envió a una temperatura de entre 2 °C y 8 °C mediante un servicio de mensajería urgente a una instalación central de fabricación con GMP. A su llegada, la(s) muestra(s) tumoral(es) se diseccionó(aron) en fragmentos, que luego se cultivaron en un protocolo previo de expansión rápida (Pre-REP) con IL-2 recombinante humana durante ~11 días.

A continuación, estas células pre-REP se expandieron aún más utilizando un protocolo de expansión rápida (REP) durante 11 días en presencia de IL-2, OKT3 (un anticuerpo monoclonal murino para CD3 humano, también conocido como [muromonab-CD3]) y células mononucleares de sangre periférica (PBMC) alogénicas irradiadas como células alimentadoras.

A continuación, las células expandidas se recolectaron, lavaron, formularon, crioconservaron y enviaron al centro clínico a través de un servicio de mensajería urgente. La forma de dosificación del producto celular de TIL era una "suspensión de células vivas" autóloga crioconservada que estaba lista para la infusión en el paciente del que procedían los TIL. Los pacientes debían recibir la dosis completa del producto fabricado y liberado, que contenía entre 1 * 109 y 150 * 109 células viables según la especificación del producto. La experiencia clínica indicó que se lograron respuestas tumorales objetivas en este intervalo de dosis, que también ha demostrado ser seguro (Radvanyi L.G., et al., Clin Cancer Res. 2012;18(24):6758-70). La dosis completa de producto se suministró en hasta cuatro bolsas de infusión.

Preparación de los pacientes para recibir el producto celular de TIL

El régimen de acondicionamiento previo de NMA-LD utilizado en este estudio (es decir, 2 días de ciclofosfamida más mesna, seguidos de 5 días de fludarabina) se basó en el método desarrollado y probado por el Instituto Nacional del Cáncer (Rosenberg S.A., et al., Clin Cancer Res. 2011;1 7(13): 4550-7; Radvanyi L.G., et al., Clin Cancer Res. 2012; 18(24): 6758-70; Dudley M.E., et al., J Clin Oncol. 2008; 26(32): 5233-9; Pilon-Thomas S, et al., J Immunother. 2012; 35(8): 615-20; Dudley M.E., et al., J Clin Oncol. 2005; 23(10): 2346-57; y Dudley M.E., et al., Science. 2002; 298(5594): 850-4). Tras el régimen de acondicionamiento previo de 7 días, se infundió al paciente el producto celular de TIL.

La infusión de TIL fue seguida por la administración de IL-2 IV (600,000 UI/kg) cada 8 a 12 horas, con la primera dosis administrada entre 3 y 24 horas después de la finalización de la infusión de TIL y continuando hasta un máximo de 6 dosis. Según las normas institucionales, las dosis de IL-2 pueden calcularse en función del peso real.

Selección de poblaciones de pacientes

Cohorte 1A;

Los pacientes tenían un diagnóstico confirmado de MM irresecable (estadio IIIC o estadio IV, confirmado histológicamente según el sistema de estadificación del Comité Conjunto Americano sobre el Cáncer [AJCC]). Se excluyeron los pacientes con melanoma ocular. Los pacientes no debían haber recibido previamente agentes inmuno-oncológicos dirigidos. Si la mutación BRAF era positiva, el paciente podía haber recibido una terapia previa dirigida a BRAF/MEK.

Cohorte 2A:

Los pacientes tenían un HNSCC avanzado, recurrente y/o metastásico y pueden no haber recibido tratamiento; se requiere el diagnóstico histológico del tumor primario a través del informe de patología. Los pacientes no deben haber recibido regímenes de inmunoterapia previos.

Cohorte 3A:

Los pacientes tenían un diagnóstico confirmado de NSCLC en estadio III o estadio IV (escamoso, adenocarcinoma, carcinoma de células grandes). Los pacientes con tumores impulsados por oncogenes con terapia dirigida eficaz disponible habían recibido al menos una línea de terapia dirigida.

Cohorte 3B:

Los pacientes tenían un diagnóstico confirmado de NSCLC en estadio III o estadio IV (escamoso, adenocarcinoma, carcinoma de células grandes) y habían recibido previamente terapia sistémica con CPI (por ejemplo, anti-PD-1/anti-PD-L1). Los pacientes con tumores impulsados por oncogenes con terapia dirigida eficaz disponible habían recibido al menos una línea de terapia dirigida.

Todos los pacientes habían recibido hasta 3 terapias anticancerosas sistémicas previas (véase, criterios de inclusión más adelante), excluida la inmunoterapia para las Cohortes 1A, 2A y 3A. Si habían recibido tratamiento previo, los pacientes tenían una progresión confirmada radiográficamente en la terapia más reciente o después de ella.

Criterios de inclusión

Los pacientes deben cumplir TODOS los criterios de inclusión siguientes para participar en el estudio:

1. Todos los pacientes tenían un diagnóstico confirmado histológica o patológicamente de neoplasia maligna de sus respectivas histologías:

° Melanoma irresecable o metastásico (Cohorte 1A)

° Carcinoma de células escamosas avanzado, recurrente o metastásico de cabeza y cuello (Cohorte 2A) ° NSCLC en estadio III o estadio IV (escamoso, no escamoso, adenocarcinoma, carcinoma de células grandes) (Cohortes 3A y 3B).

2. Sólo cohortes 1A, 2A y 3A: Los pacientes no habían recibido inmunoterapia. Si habían recibido tratamiento previo, los pacientes habían progresado en la terapia más reciente o después de ella. Las Cohortes 1A, 2A y 3A podían haber recibido hasta 3 terapias anticancerosas sistémicas previas, en concreto:

° En la Cohorte 1A: pacientes con melanoma irresecable o metastásico (estadio IIIC o estadio IV); si la mutación BRAF es positiva, los pacientes podrían haber recibido un inhibidor de BRAF.

° En la Cohorte 2A: pacientes con HNSCC irresecable o metastásico. Se permitieron aquellos que habían recibido quimio-radioterapia inicial.

° En la Cohorte 3A: Pacientes con NSCLC en estadio III o estadio IV (escamoso, no escamoso, adenocarcinoma o carcinoma de células grandes) y que no habían recibido inmunoterapia y habían progresado tras <3 líneas de terapia sistémica previa en el contexto localmente avanzado o metastásico. Los pacientes que recibieron terapia sistémica en el entorno adyuvante o neoadyuvante, o como parte de la quimiorradioterapia definitiva, fueron elegibles y se consideró que habían recibido una línea de terapia si la enfermedad había progresado en los 12 meses siguientes a la finalización de la terapia sistémica previa. Los pacientes con impulsores oncogénicos conocidos (por ejemplo, EGFR, ALK, ROS) que presentaban mutaciones sensibles a las terapias dirigidas debían haber progresado tras al menos 1 línea de terapia dirigida.

3. Sólo Cohorte 3B: Pacientes con NSCLC en estadio III o estadio IV (escamoso, no escamoso, adenocarcinoma o carcinoma de células grandes) que habían recibido previamente terapia sistémica con CPI (por ejemplo, anti-PD-1/anti-PD-L1) como parte de < 3 líneas previas de terapia sistémica.

° Los pacientes tenían una progresión confirmada radiográficamente en la terapia más reciente o después de ella.

° Los pacientes que recibieron terapia sistémica en el contexto adyuvante o neoadyuvante, o como parte de la quimiorradioterapia definitiva, fueron elegibles y se consideró que habían recibido 1 línea de terapia si la enfermedad había progresado en los 12 meses siguientes a la finalización de la terapia sistémica previa.

° Los pacientes con impulsores oncogénicos conocidos (por ejemplo, EGFR, ALK, ROS) que presentaban mutaciones sensibles a las terapias dirigidas deben haber progresado tras al menos 1 línea de terapia dirigida.

4. Los pacientes tenían al menos 1 lesión resecable (o lesiones agregadas) de un mínimo de 1.5 cm de diámetro tras la extirpación para la producción del producto en investigación de TIL. Se alentó la obtención de tejido tumoral de lesiones metastásicas múltiples y diversas, siempre que la extirpación quirúrgica no supusiera riesgos adicionales para el paciente.

° Si la lesión considerada para la extirpación para la generación de TIL se encuentra dentro de un campo previamente irradiado, la lesión debe haber demostrado progresión radiográfica antes de la extirpación.

° Los pacientes deben tener una muestra histopatológica adecuada para las pruebas requeridas por el protocolo.

5. Los pacientes tenían enfermedad medible remanente según la definición de las directrices RECIST 1.1 estándar y bien conocidas (véase, por ejemplo, Eisenhauer, European Journal of Cancer 45: 228-247 (2009), también disponible en la Web en project.eortc.org/recist/wpcontent/uploads/sites/4/2015/03/RECISTGuidelines.pdf) tras la extirpación del tumor para la fabricación de TIL:

° Las lesiones en zonas previamente irradiadas no se seleccionaron como lesiones diana a menos que se hubiera demostrado una progresión de la enfermedad en dichas lesiones;

° Las lesiones que se extirparon parcialmente para la generación de TIL que seguían siendo mensurables según RECIST pueden seleccionarse como lesiones no diana, pero no podrían servir como lesión diana para la evaluación de la respuesta.

6. Los pacientes tenían > 18 años en el momento del consentimiento.

7. Los pacientes tenían un estado de rendimiento del Eastern Cooperative Oncology Group (ECOG) de 0 o 1, y una esperanza de vida estimada de >3 meses.

8. Los pacientes en edad fértil o con parejas en edad fértil debían estar dispuestos a practicar un método anticonceptivo aprobado de alta eficacia durante el tratamiento y continuar durante 12 meses después de recibir toda la terapia relacionada con el protocolo (Nota: Las mujeres en edad fértil debían utilizar métodos anticonceptivos eficaces durante el tratamiento y durante 12 meses después de su última dosis de IL-2, o 4 meses después de su última dosis de pembrolizumab, lo que ocurriera más tarde). Los varones no podían donar esperma durante el estudio ni durante los 12 meses posteriores a la interrupción del tratamiento, lo que ocurriera más tarde.

9. Los pacientes presentaban los siguientes parámetros hematológicos:

° Recuento absoluto de neutrófilos (ANC) >1000/mm3;

° Hemoglobina >9.0 g/dL;

° Recuento de plaquetas >100,000/mm3.

10. Los pacientes tenían una función orgánica adecuada:

° Alanina aminotransferasa sérica (ALT)/transaminasa glutámico-pirúvica sérica (SGPT) y aspartato aminotransferasa (AST)/SGOT <3 veces el límite superior de la normalidad (ULN), pacientes con metástasis hepática <5 veces ULN.

° Una eliminación estimada de creatinina >40 mL/min mediante la fórmula de Cockcroft Gault en el momento del cribado.

° Bilirrubina total <2 mg/dL.

° Los pacientes con síndrome de Gilbert deben tener una bilirrubina total <3 mg/dL.

11. Los pacientes eran seronegativos para el virus de la inmunodeficiencia humana (VIH1 y VIH2). Los pacientes con serología positiva para el antígeno de superficie del virus de la hepatitis B (HBsAg), el anticuerpo central de la hepatitis B (anti HBc) o el virus de la hepatitis C (anti VHC) que indicaban una infección aguda o crónica se inscribieron en función de la carga vírica basada en la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) y la prevalencia local de determinadas exposiciones virales.

12. Los pacientes tuvieron un periodo de lavado de la(s) terapia(s) anticancerosa(s) previa(s) de una duración mínima, como se detalla a continuación antes del primer tratamiento del estudio (es decir, el inicio de la NMA-LD o del pembrolizumab):

° Terapia dirigida: se permitió la terapia dirigida previa con un receptor del factor de crecimiento epidérmico (EGFR), MEK, BRAF, ALK, ROS1 u otros agentes dirigidos (por ejemplo, erlotinib, afatinib, dacomitinib, osimertinib, crizotinib, ceritinib, lorlatinib) siempre que el lavado sea de un mínimo de 14 días antes del inicio del tratamiento.

° Quimioterapia: se permitió la quimioterapia/quimiorradiación adyuvante, neoadyuvante o definitiva siempre que el lavado sea de un mínimo de 21 días antes del inicio del tratamiento.

° Inmunoterapia sólo para la Cohorte 3B, se permitió una terapia previa dirigida al punto de control con un anti-PD-1, otros mAb o vacunas con un periodo de lavado de > 21 días antes del inicio de NMA-LD.

° Radioterapia paliativa: se permitió la radiación previa con haz externo siempre que todas las toxicidades relacionadas con la radiación se resolvieran a grado 1 o al nivel basal, excluyendo la alopecia, el cambio de pigmentación de la piel u otros acontecimientos clínicamente insignificantes, por ejemplo, dermatitis por radiación en áreas pequeñas o urgencia rectal o urinaria.

° La(s) lesión(es) tumoral(es) evaluada(s) como diana de respuesta mediante RECIST 1.1 se encontraba(n) fuera del portal de radiación; sin embargo, si se encontraba(n) dentro del portal, debía(n) haber demostrado progresión (véase el criterio de inclusión más arriba).

° Cirugía/procedimiento planificado previamente: se permitió la realización de procedimiento(s) quirúrgico(s) previo(s) siempre que se hubiera producido la cicatrización de la herida, se hubieran resuelto todas las complicaciones y hubieran transcurrido al menos 14 días (en el caso de procedimientos quirúrgicos mayores) antes de la extirpación del tumor.

13. Los pacientes se habían recuperado de todos los acontecimientos adversos previos relacionados con el tratamiento anticanceroso (TRAE) hasta el grado <1 (según los Criterios Terminológicos Comunes para los Acontecimientos Adversos [CTCAE]), excepto para la alopecia o el vitíligo, antes de la asignación a la cohorte.

14. Los pacientes con toxicidad estable de grado >2 de una terapia anticancerosa previa se consideraron caso por caso tras consultar con el monitor médico.

15. Los pacientes de las Cohortes 1A, 2A y 3A con toxicidad irreversible que no se esperaba razonablemente que se viera exacerbada por el tratamiento con pembrolizumab se incluyeron únicamente tras consultar con el monitor médico. Sólo en el caso de los pacientes de la Cohorte 3B, los pacientes con diarrea o colitis documentada de grado >2 o superior como resultado de un tratamiento previo con CPI(s) inhibidor(es) de puntos de control inmunitarios debían haber estado asintomáticos durante al menos 6 meses o haber tenido una colonoscopia normal por evaluación visual postratamiento antes de la extirpación del tumor.

16. Los pacientes deben haber dado su autorización por escrito para el uso y la divulgación de información sanitaria protegida.

Criterios de exclusión

Los pacientes que cumplían CUALQUIERA de los siguientes criterios fueron excluidos del estudio:

1. Pacientes con melanoma de origen uveal/ocular

2. Pacientes que hubieran recibido un aloinjerto de órgano o una terapia de transferencia celular previa que incluyera un régimen de quimioterapia no mieloablativo o mieloablativo en los últimos 20 años. (Nota: Este criterio era aplicable a los pacientes sometidos a retratamiento con TIL, con la excepción de que hubieran recibido un régimen previo de NMA-LD con su tratamiento previo con TIL).

3. Pacientes con metástasis cerebrales sintomáticas y/o no tratadas.

° - Se tendrá en cuenta para la inscripción a los pacientes con metástasis cerebrales tratadas definitivamente.

previa discusión con el monitor médico; si, antes del inicio del tratamiento el paciente está clínicamente estable durante >2 semanas, no hay nuevas lesiones cerebrales mediante resonancia magnética (MRI) tras el tratamiento, y el paciente no requiere tratamiento continuo con corticosteroides.

4. Pacientes con terapia sistémica con esteroides en los 21 días anteriores a la inscripción.

5. Pacientes embarazadas o en periodo de lactancia.

6. Pacientes con enfermedad(es) médica(s) activa(s) que, en opinión del investigador, suponga(n) un mayor riesgo para la participación en el estudio; como infecciones sistémicas (por ejemplo, sífilis o cualquier otra infección que requiera antibióticos), trastornos de la coagulación u otras enfermedades médicas importantes activas de los sistemas cardiovascular, respiratorio o inmunológico.

7. Los pacientes no pueden tener trastornos autoinmunes o inflamatorios activos o documentados con anterioridad (incluyendo neumonitis, enfermedad inflamatoria intestinal [por ejemplo, colitis o enfermedad de Crohn], diverticulitis [a excepción de la diverticulosis], lupus eritematoso sistémico, síndrome de sarcoidosis o síndrome de Wegener [granulomatosis con poliangeítis, enfermedad de Graves, artritis reumatoide, hipofisitis, uveítis, etc.]). Las siguientes fueron excepciones a este criterio:

° Pacientes con vitíligo o alopecia.

° Pacientes con hipotiroidismo (por ejemplo, tras el síndrome de Hashimoto) estables en

° Sustitución hormonal.

° Cualquier afección cutánea crónica que no requiriera terapia sistémica.

° Pacientes con enfermedad celíaca controlada sólo con dieta.

8. Pacientes que hayan recibido una vacuna viva o atenuada en los 28 días anteriores al inicio del tratamiento.

9. Pacientes que presentaban cualquier forma de inmunodeficiencia primaria (como la enfermedad de inmunodeficiencia combinada grave [SCID] y el síndrome de inmunodeficiencia adquirida [SIDA]).

10. Pacientes con antecedentes de hipersensibilidad a cualquier componente de los fármacos del estudio. Los TIL no se administraron a pacientes con una hipersensibilidad conocida a cualquier componente de la formulación del producto de TlL incluyendo, pero sin limitarse a, cualquiera de los siguientes:

° - NMA-LD (ciclofosfamida, mesna y fludarabina)

° - Proleucina®, aldesleucina, IL-2

° - Antibióticos del grupo de los aminoglucósidos (es decir, estreptomicina, gentamicina [excluidos los que den negativo en la prueba cutánea de hipersensibilidad a la gentamicina]).

° - Cualquier componente de la formulación del producto de TIL, incluido el dimetilsulfóxido.

o [DMSO], HSA, IL-2 y dextrano-40

° - Pembrolizumab

11. Pacientes con una fracción de eyección ventricular izquierda (LVEF) <45 % o que pertenezcan a la clase II o superior de la New York Heart Association. Una prueba de esfuerzo cardiaco que demuestre cualquier anomalía irreversible del movimiento de la pared en cualquier paciente >60 años o en pacientes que tengan antecedentes de cardiopatía isquémica, dolor torácico o arritmias auriculares y/o ventriculares clínicamente significativas.

o Los pacientes con una prueba de esfuerzo cardiaco anormal podrían ser inscritos si tuvieran una fracción de eyección adecuada y el visto bueno de cardiología con la aprobación del Monitor Médico del Patrocinador.

12. Pacientes que tenían una enfermedad pulmonar obstructiva o restrictiva y tienen un FEV1 documentado (volumen espiratorio forzado en 1 segundo) de <60 % de lo normal previsto.

o - Si un paciente no podía realizar una espirometría fiable debido a una anatomía anormal de las vías respiratorias superiores (es decir, traqueotomía), se utilizó una prueba de marcha de 6 minutos para evaluar la función pulmonar. Se excluyó a los pacientes que no fueron capaces de caminar una distancia de al menos el 80 % previsto para su edad y sexo o que mostraron indicios de hipoxia en cualquier momento de la prueba (SpO2<90 %).

13. Pacientes que hayan padecido otra neoplasia maligna primaria en los 3 años anteriores (excepto los que no requirieron tratamiento o habían sido tratados curativamente hace más de 1 año y, a juicio del investigador, no suponían un riesgo significativo de recidiva, incluidos, entre otros, el cáncer de piel no melanoma, DCIS, LCIS, el cáncer de próstata con puntuación de Gleason <6 o el cáncer de vejiga).

14. Participación en otro estudio clínico con un producto en investigación en los 21 días siguientes al inicio del tratamiento.

Criterios de valoración del estudio y análisis previstos

Los criterios de valoración primarios y secundarios se analizaron por separado por cohorte.

Criterios de valoración primarios:

La ORR se definió como la proporción de pacientes que lograron una PR o una CR confirmada como mejor respuesta de acuerdo con la evaluación de los investigadores según RECIST 1.1 entre el conjunto de análisis de eficacia.

La respuesta objetiva se evaluó por cada valoración de la enfermedad y la ORR se expresó como una proporción binomial con el correspondiente CI del 90 % de 2 lados. El análisis primario para cada cohorte se produjo cuando todos los pacientes tratados por cohorte tuvieron la oportunidad de ser seguidos durante 12 meses, a menos que progresaran/expiraran o se interrumpiera su tratamiento antes del periodo de evaluación.

El criterio de valoración primario de seguridad se midió por cualquier tasa de incidencia de TEAE de Grado 3 o superior dentro de cada cohorte expresada como proporciones binomiales con el correspondiente CI del 90 % de 2 lados.

Criterios de valoración secundarios:

Eficacia:

Los criterios secundarios de valoración de la eficacia se definieron como sigue:

La tasa de CR se basó en los respondedores que lograron una CR confirmada según la evaluación de los investigadores. La DCR se derivó como la suma del número de pacientes que lograron PR/CR confirmada o SD sostenida (al menos 6 semanas) dividida por el número de pacientes en el conjunto de análisis de eficacia x 100 %. La tasa de CR y la DCR se resumieron mediante una estimación puntual y su CI del 90 % de dos lados.

La DOR se definió entre los pacientes que lograron una respuesta objetiva. Se midió desde la primera vez que se cumplieron los criterios de respuesta (PR/CR) hasta la primera fecha en que se documentó objetivamente una enfermedad recurrente o progresiva, o la recepción de una terapia anticancerosa posterior o el fallecimiento del paciente (lo que se registre primero). A los pacientes que no experimenten PD o que no hayan fallecido antes del momento del corte de datos o del bloqueo final de la base de datos se les censuraron los tiempos de los acontecimientos en la última fecha en que se realice una evaluación adecuada del estado del tumor.

La PFS se definió como el tiempo (en meses) transcurrido desde el momento de la linfodepleción hasta la PD o la muerte por cualquier causa, lo que ocurriera antes. A los pacientes que no experimentaron PD o que no habían fallecido en el momento del corte de datos o del bloqueo final de la base de datos se les censuraron los tiempos de los acontecimientos en la última fecha en que se realizó una evaluación adecuada del estado del tumor.

La OS se definió como el tiempo (en meses) transcurrido desde el momento de la linfodepleción hasta la muerte por cualquier causa. A los pacientes que no habían fallecido en el momento del corte de datos o del bloqueo final de la base de datos se les censuraron los tiempos de los acontecimientos en la última fecha de su estado de supervivencia conocido.

La DOR, la PFS y la OS se sometieron a censura derecha. Se utilizará el método de Kaplan-Meier para resumir los criterios de valoración de la eficacia en función del tiempo transcurrido hasta el acontecimiento. Los datos de referencia para la evaluación del tumor fueron el último escáner antes de la linfodepleción para todas las cohortes.

Los parámetros de eficacia anteriores se estimarán para la cohorte aplicable para los subconjuntos definidos por las características basales de la enfermedad; estado BRAF (sólo Cohorte 1A), estado HPV (sólo Cohorte 2A), enfermedad pulmonar escamosa o no escamosa (sólo Cohortes 3A y 3B) y estado anti-PD-L1.

Claims

REIVINDICACIONES

1. Una población terapéutica de linfocitos infiltrantes tumorales (TIL) para su uso en un método de tratamiento de un sujeto con carcinoma de pulmón de células no pequeñas (NSCLC), en el que el cáncer es refractario al tratamiento con un anticuerpo anti-PD-1, comprendiendo el método proporcionar linfocitos infiltrantes tumorales (TIL) expandidos para su administración, y que comprende, además:

(b) añadir los fragmentos tumorales en un sistema cerrado;

(c) realizar una primera expansión cultivando la primera población de TIL en un medio de cultivo celular que comprenda IL-2 para producir una segunda población de TIL, en la que la primera expansión se realice en un recipiente cerrado que proporcione una primera área de superficie permeable al gas, en la que la primera expansión se realice durante aproximadamente 3-11 días para obtener la segunda población de TIL, en la que la segunda población de TIL sea al menos 50 veces mayor en número que la primera población de TIL, y en la que la transición de la etapa (b) a la etapa (c) se produzca sin abrir el sistema;

(f) transferir la población de TIL recogida de la etapa (e) a una bolsa de infusión, en la que la transferencia de la etapa (e) a la (f) se produce sin abrir el sistema;

2. Una población terapéutica de TIL para su uso según la reivindicación 1, en la que la muestra tumoral se deriva de un método de muestreo multilesional.

3. Una población terapéutica de TIL para uso según la reivindicación 1, en la que (i) el NSCLC refractario ha sido tratado previamente con un anticuerpo anti-PD-1 y/o anti-PD-L1; o en la que (ii) el NSCLC refractario ha sido tratado con un agente quimioterapéutica; o en la que (iii) el NSCLC refractario ha sido tratado previamente con un anticuerpo anti-PD-1 y/o anti-PD-L1 y ha sido tratado previamente con un agente quimioterapéutico, en la que opcionalmente el NSCLC refractario ha sido tratado con un agente quimioterapéutico pero no está siendo tratado actualmente con un agente quimioterapéutico.

4. Una población terapéutica de TIL para uso según la reivindicación 1, en la que (i) el NSCLC refractario no ha sido tratado previamente con un anticuerpo anti-PD-1 y/o anti-PD-L1; o en la que (ii) el NSCLC refractario no ha sido tratado previamente con un anticuerpo anti-PD-1 y/o anti-PD-L1 y ha sido tratado previamente con un agente quimioterapéutico, en la que opcionalmente el NSCLC refractario ha sido tratado con un agente quimioterapéutico pero no está siendo tratado actualmente con un agente quimioterapéutico.

5. Una población terapéutica de TIL para su uso según la reivindicación 1, en la que el NSCLC refractario

(i) tiene una baja expresión de PD-L1;

(ii) ha sido tratado previamente con un anticuerpo anti-PD-1 y/o anti-PD-L1 y tiene una baja expresión de PD-L1;

(iii) no ha sido tratado previamente con un anticuerpo anti-PD-1 y/o anti-PD-L1 y tiene una baja expresión de PD-L1;

(iv) ha sido tratada con un agente quimioterapéutico y tiene una expresión baja de PD-L1; o

(v) ha sido tratada con un agente quimioterapéutico, pero no está siendo tratado actualmente con un agente quimioterapéutico y tiene una baja expresión de PD-L1.

6. Una población terapéutica de TIL para su uso según la reivindicación 1, en la que el NSCLC refractario (i) no ha sido tratado previamente con un anticuerpo anti-PD-1 y/o anti-PD-L1 y tiene enfermedad voluminosa al inicio;

(ii) ha sido tratado previamente con un anticuerpo anti-PD-1 y/o anti-PD-L1 y presenta enfermedad voluminosa al inicio del tratamiento;

(iii) ha sido tratado con un agente quimioterapéutico y presenta una enfermedad voluminosa al inicio; o (iv) ha sido tratado con un agente quimioterapéutico, pero no está siendo tratada actualmente con un agente quimioterapéutico y tiene una enfermedad voluminosa al inicio.

7. Una población terapéutica de TIL para su uso según la reivindicación 6, en la que la enfermedad voluminosa está indicada cuando el diámetro tumoral máximo es superior a 7 cm medido en el plano transversal o coronal 0 ganglios linfáticos inflamados con un diámetro en el eje corto de 20 mm o superior.

8. Una población terapéutica de TIL para su uso según la reivindicación 1, en la que el NSCLC refractario es refractario a al menos dos cursos de tratamiento sistémico previo, sin incluir terapias neoadyuvantes o adyuvantes.

9. Una población terapéutica de TIL para uso según la reivindicación 1, en la que el NSCLC refractario es refractario a un anticuerpo anti-PD-1 seleccionado del grupo que consiste en nivolumab, pembrolizumab, ipilimumab, JS001, TSR-042, pidilizumab, (BGB-A317, SHR-1210, REGN2810, MDX-1106, PDR001, anti-PD-1 del clon: RMP1-14; y un anticuerpo anti-PD-1 divulgado en la patente de los Estados Unidos No. 8,008,449, durvalumab, atezolizumab, avelumab, y fragmentos, derivados, variantes, así como biosimilares de los mismos.

10. Una población terapéutica de TIL para su uso según la reivindicación 1, en la que el NSCLC refractario es refractario a:

(i) pembrolizumab o un biosimilar del mismo,

(ii) nivolumab o un biosimilar del mismo,

(iii) ipilimumab o un biosimilar del mismo,

(vi) ipilimumab o un biosimilar del mismo y pembrolizumab o un biosimilar del mismo,

(v) ipilimumab o un biosimilar del mismo y nivolumab o un biosimilar del mismo,

(vi) durvalumab o un biosimilar del mismo,

(vii) atezolizumab o un biosimilar del mismo, o

(viii) avelumab o un biosimilar del mismo.

11. Una población terapéutica de TIL para uso según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10, en la que la expansión inicial se realiza durante un periodo de aproximadamente 11 días y la expansión rápida se realiza durante un periodo de aproximadamente 11 días.

12. Una población terapéutica de TIL para su uso según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11, en la que la IL-2 está presente a una concentración inicial de entre 1000 UI/mL y 6000 UI/mL en el primer medio de cultivo celular, opcionalmente en la que la IL-2 está presente a una concentración inicial de entre 1000 UI/mL y 6000 UI/mL y el anticuerpo OKT-3 está presente a una concentración inicial de aproximadamente 30 ng/mL en el segundo medio de cultivo celular.

13. Una población terapéutica de TIL para su uso según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 12, en la que la expansión inicial y/o la expansión rápida se realizan utilizando un recipiente permeable al gas, y/o en la que el primer medio de cultivo celular y/o el segundo medio de cultivo celular comprenden además una citocina seleccionada del grupo que consiste en IL-4, IL-7, IL-15, IL-21, y combinaciones de las mismas.

14. Una población terapéutica de TIL para uso según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 13, en la que el método comprende además una etapa de tratar al paciente con un régimen de linfodepleción no mieloablativo antes de administrar la tercera población de TIL al paciente, opcionalmente, en la que el régimen de linfodepleción no mieloablativo comprende las etapas de administración de ciclofosfamida a una dosis de 60 mg/m2/día durante dos días seguido de la administración de fludarabina a una dosis de 25 mg/m2/día durante cinco días.

15. Una población terapéutica de TIL para su uso según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 14, en la que el método comprende además una etapa de tratar al paciente con un régimen de IL-2 que comienza el día después de la administración de la tercera población de TIL al paciente, opcionalmente en el que el régimen de IL-2 es un régimen de IL-2 de dosis alta que comprende 600,000 o 720,000 UI/kg de aldesleucina, o un biosimilar o variante de la misma, administrado como una infusión intravenosa en bolo de 15 minutos cada ocho horas hasta tolerancia.