ES2979088T3

ES2979088T3 - Proteínas de fusión inmunomoduladoras y usos de las mismas

Info

Publication number: ES2979088T3
Application number: ES16711081T
Authority: ES
Inventors: Shannon Oda; Philip Greenberg; Thomas Schmitt
Original assignee: Fred Hutchinson Cancer Center
Current assignee: Fred Hutchinson Cancer Center
Priority date: 2015-03-05
Filing date: 2016-03-04
Publication date: 2024-09-24
Anticipated expiration: 2036-03-04
Also published as: RU2017133637A; EP3265481A1; EP4406604A3; US20180044404A1; US20250109180A1; JP2021184771A; CA2978186A1; IL254165A0; MX2022006006A; WO2016141357A1; MX2022006004A; JP2018508219A; CA3177938A1; JP6917896B2; MX2017011201A; RU2755227C2; MX2022006002A; AU2016226022A1; EP3265481B1; CN107531805A

Abstract

La presente divulgación se refiere a proteínas de fusión inmunomoduladoras que contienen un dominio de unión extracelular y un dominio de señalización intracelular, en donde la unión de un objetivo puede generar una señal moduladora en una célula huésped, tal como una célula T. La presente divulgación también se refiere a usos de células inmunes que expresan dichas proteínas de fusión inmunomoduladoras para tratar ciertas enfermedades, tales como cáncer o enfermedades infecciosas. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

DESCRIPCIÓN

Proteínas de fusión inmunomoduladoras y usos de las mismas

Antecedentes

Las inmunoterapias basadas en células T comenzaron a desarrollarse cuando se encontraron células T reactivas a tumores entre una población de linfocitos infiltrantes de tumores (TIL) (Clarket al.,Cancer Res. 29:705, 1969). Una estrategia, conocida como transferencia adoptiva de células T, en algunos contextos implica el aislamiento de linfocitos infiltrantes de tumores preseleccionados para la reactividad tumoral, la expansión clonal de las células T reactivas a tumores inducida por anticuerpos anti-CD3 y anti-CD28 en presencia de IL-2, y finalmente la infusión de la población de células expandidas nuevamente al paciente que porta el tumor (junto con quimioterapia y administración repetitiva deL-2) (Dudleyet al.,Science 298:850, 2002). Esta forma de terapia adoptiva de células T con linfocitos infiltrantes de tumores puede ser técnicamente engorrosa y conduce a la remisión completa sólo en una pequeña fracción de pacientes con melanoma y rara vez es eficaz en otros cánceres (Besseret al.,Clin. Res. Cancer. 16:2646, 2010).

El aislamiento de clones de células T reactivas a tumores condujo al desarrollo de otro enfoque inmunoterápico: la generación de receptores de células T recombinantes (TCR) específicos de antígenos particulares, que pueden introducirse en las células T, por ejemplo, usando un sistema de administración de vectores, para conferir especificidad para una diana deseada, tal como un péptido asociado a un tumor presentado por una molécula del complejo mayor de histocompatibilidad (CMH) expresada en una célula tumoral (conocida como molécula de antígeno leucocitario humano (HLA) en humanos). Otro enfoque introduce un receptor sintético, denominado receptor de antígeno quimérico (CAR), que generalmente contiene un dominio de unión a antígeno que, por ejemplo, en el contexto de la terapia antitumoral puede unirse a un antígeno asociado o específico de un tumor, ligado a uno o más componentes intracelulares que comprenden dominios efectores, tales como un dominio de señalización primario tal como un dominio de señalización de TCR o, en algunos contextos, dominios de señalización coestimuladores. A diferencia de la administración de TIL, el procedimiento básico para la inmunoterapia con células T TCR o CAR modificadas por ingeniería es generalmente la modificación genética de células T humanas con un transgén que codifica para un resto que se dirige a un tumor, la expansiónex vivode las células T recombinantes y la transfusión de las células T recombinantes expandidas nuevamente a los pacientes.

Se ha demostrado que la terapia adoptiva de células T que usa células T que expresan TCR recombinantes tiene un beneficio clínico prometedor, especialmente en determinados cánceres de células B. Sin embargo, la activación eficaz de las células T a menudo requiere o se potencia mediante una señal coestimuladora concurrente (Chen y Flies, Nat. Rev. Immunol. 13: 227-242, 2013). En el microambiente tumoral, las moléculas coestimuladoras generalmente están reguladas por disminución. Como resultado, normalmente se necesita un estímulo exógeno a través de IL-2 para las células T que expresan TCR recombinantes específicos de antígenos cancerosos.

La activación de las células T se inicia cuando el TCR se une a un péptido específico presentado en el CMH en una célula presentadora de antígeno (APC) (Rossyet al.,Frontiers in Immunol. 3: 1-12, 2012). El punto de interacción de la célula T y la APC se convierte en la sinapsis inmunitaria, que está compuesta por tres agrupamientos de activación supramoleculares concéntricos (SMAC), incluyendo el cSMAC central, el pSMAC periférico y el dSMAC distal (Rossyet al.,Frontiers in Immunol. 3: 1-12, 2012). Dentro del cSMAC, los receptores coestimuladores pueden reclutar moléculas de señalización para amplificar la señal del TCR. Tales receptores coestimuladores pueden incluir CD28 y, en algunos contextos, formar microagrupamientos con el TCR para reducir el umbral de activación (Chen y Flies, Nat. Rev. Immunol. 13: 227-242, 2013). El acceso al cSMAC por parte de proteínas transmembrana expresadas por células T puede estar restringido por el tamaño del dominio extracelular. Por ejemplo, CD45 tiene un ectodominio grande y generalmente está excluido de la sinapsis inmunitaria, lo que impide su capacidad para inhibir la señalización de t Cr (James y Vale, Nature 487:64-69, 2012).

El documento WO 2013/123061 A1 divulga un receptor de antígeno quimérico biespecífico que comprende al menos dos regiones de direccionamiento específicas de antígeno, un dominio espaciador extracelular, un dominio transmembrana, al menos un dominio coestimulador y un dominio de señalización intracelular, en el que cada región de direccionamiento específica de antígeno comprende un fragmento Fv de cadena sencilla (scFv) específico de antígeno y se une a un antígeno diferente, y en el que el receptor de antígeno quimérico biespecífico se expresa conjuntamente con un control terapéutico.

Kharfan-Dabajaet al.,2014. Leukemia. 28(3):507-17 proporcionan una revisión sobre el tratamiento de la leucemia linfocítica crónica mediante inmunoterapia.

Kono, 2014. J Stem Cells Regen Med. 10(1):8-13 proporciona una revisión sobre los avances en la inmunoterapia contra el cáncer con especial atención en la vacuna contra el cáncer y el bloqueo de los puntos de control inmunitarios.

Mauset al.,2014. Blood. 123(17):2625-35 proporcionan una revisión sobre ensayos clínicos informados en los que los cánceres hemáticos se tratan con células T redirigidas a dianas de antígenos específicos con receptores de antígenos quiméricos modificados por ingeniería.

Sigue existiendo la necesidad en el campo de la inmunoterapia de composiciones y métodos alternativos que proporcionen señales inmunomoduladoras a las células huésped para tratar diversas enfermedades, tales como cáncer o infecciones. Las realizaciones actualmente divulgadas abordan estas necesidades y proporcionan otras ventajas relacionadas.

Breve sumario

La invención se expone en las reivindicaciones adjuntas.

En determinados aspectos, la longitud de un complejo proteína de fusión::diana abarca una distancia similar a una distancia entre membranas en una sinapsis inmunitaria.

En algunas realizaciones, una longitud o distancia espacial de un complejo formado entre la proteína de fusión y la diana o una porción de tal complejo proteína de fusión::diana (generalmente la porción extracelular de tal complejo) es o abarca una distancia particular, por ejemplo, en algunas realizaciones, es una distancia que es de menos de una determinada distancia o de menos de aproximadamente una determinada distancia. En algunos aspectos, una distancia del complejo proteína de fusión::diana (o, normalmente, la porción extracelular del mismo) es de menos de 50 nm o de menos de aproximadamente 50 nm, de menos de 40 nm o de menos de aproximadamente 40 nm, de menos de 30 nm o de menos de aproximadamente 30 nm, o de menos de 20 nm o de menos de aproximadamente 20 nm, o igual a 15 nm o de menos de 15 nm o de menos de aproximadamente 15 nm. En algunas realizaciones, es de 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 ó 20 nm o de aproximadamente 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 ó 20 nm, tal como de 14 ó 15 nm o de aproximadamente 14 ó 15 nm. En algunos aspectos, la distancia es una que es similar a una distancia entre membranas en una sinapsis inmunitaria o es una distancia que es igual, aproximadamente igual o sustancialmente igual, que una distancia entre la porción más proximal a la membrana, por ejemplo, residuo, del dominio extracelular de un TCR y la porción más proximal a la membrana, por ejemplo, residuo, de una molécula de CMH (por ejemplo, HLA, tal como CMH I o CMH II), con respecto a un complejo t CR-péptido/CMH o la distancia abarcada por las porciones extracelulares de un complejo de este tipo (o la distancia espacial abarcada por la porción extracelular que se sabe que está contenida dentro de una sinapsis, tal como un complejo que contiene CD8, CD4, CD28 y la respectiva pareja de unión o ligando del mismo). En algunas realizaciones, las distancias espaciales de complejos se refieren a una distancia entre membranas de dos células diferentes, en las que una primera célula y una segunda célula expresan cada una sobre su superficie una pareja de unión que puede formar un complejo entre las membranas cuando las células están próximas entre sí. En algunos aspectos, la distancia es una distancia que es igual, aproximadamente igual o sustancialmente igual, que una distancia abarcada por las porciones extracelulares de un complejo formado entre un TCR y una interacción relacionada con una molécula de CMH. En algunos aspectos, tal como cuando una proteína de fusión comprende un dominio de unión de una molécula normalmente capaz de entrar en una sinapsis inmunitaria o colocalizarse con un receptor de antígeno, la distancia es similar o igual a la distancia abarcada por un complejo formado entre la molécula (que tiene el dominio de unión usado en la proteína de fusión) y una pareja de unión natural de la misma. En algunos aspectos, la distancia es diferente, por ejemplo, de menos de o sustancialmente de menos de la distancia abarcada por un complejo formado entre la molécula (que tiene el dominio de unión o porción funcional del mismo usado en la proteína de fusión) y una pareja de unión natural de la misma.

En algunos aspectos, una proteína de fusión no incluye un dominio de señalización primario tal como un dominio de señalización de CD3^ u otro dominio capaz de proporcionar una señal primaria a una célula T.

En algunas realizaciones, el componente extracelular incluye además una o más regiones o dominios adicionales. El uno o más dominios extracelulares adicionales pueden incluir una región espaciadora, tal como una de una molécula de inmunoglobulina, que puede contener la totalidad o una porción de un dominio bisagra o región constante tal como un dominio CH2 o CH3, o de otra molécula de la superficie celular tal como un receptor coestimulador, tal como CD28. El/los dominio(s) extracelular(es) adicional(es) puede(n) incluir, en algunos aspectos, un dominio de multimerización, por ejemplo, un dominio o secuencia de dimerización que puede promover la homo o heterodimerización con otra molécula, tal como la multimerización de dos o más de las proteínas de fusión. En algunas realizaciones, un dominio de este tipo incluye una porción de un dominio extracelular de una molécula de CD28 que incluye al menos la cisteína más proximal transmembrana y, generalmente, una porción extracelular entre tal cisteína y la membrana, o una variante modificada de la misma. En algunos aspectos, un dominio de este tipo incluye una secuencia de aminoácidos tal como se expone en SEQ ID NO: 32, o una porción de la misma, o variante de la misma tal que tiene al menos el 90 %, el 95 % o el 99 % de identidad con la misma. En algunos aspectos, un dominio de este tipo puede incluirse para facilitar o promover la multimerización. En algunas realizaciones, una proteína de fusión contiene una porción extracelular de CD200R que tiene una secuencia de aminoácidos tal como se expone en SEQ ID NO: 25 o codificada por una molécula de ácido nucleico tal como se expone en SEQ ID NO: 2, o una porción de unión a CD200 de la misma o variante de la misma o porción de unión de la misma. En algunos aspectos de tales realizaciones, la porción extracelular de la proteína de fusión incluye además una porción de una región extracelular de CD28, tal como hasta de aproximadamente 9 a aproximadamente 12 aminoácidos de la misma (por ejemplo, 9 aminoácidos o 12 aminoácidos), y en algunos aspectos incluye un residuo de cisteína más proximal a la membrana de una región extracelular CD28. En algunas de tales realizaciones, la longitud de la porción de CD200R de la región extracelular se reduce en longitud correspondiente al número de residuos adicionales en la porción derivada de CD28, tal como en de aproximadamente 9 a aproximadamente 12 aminoácidos (por ejemplo, 9 aminoácidos o 12 aminoácidos), o en un número suficiente de aminoácidos que la distancia abarcada por la porción extracelular de un complejo entre la proteína de fusión y una molécula de CD200 sea similar a, sustancialmente similar a o igual que la abarcada por la porción extracelular de un complejo entre un CD200R humano, por ejemplo, un CD200R, y CD200; o la abarcada por la porción extracelular de un complejo entre un TCR en interacción relacionada con una molécula de CMH (por ejemplo, CMH I o CMH II) en unión a un complejo péptido-CMH relacionado; o la de una sinapsis inmunitaria. En algunos aspectos, la proteína de fusión incluye además un dominio transmembrana, tal como un dominio transmembrana de CD28, tal como un dominio transmembrana codificado por la secuencia expuesta como SEQ ID NO: 4 o una porción de la misma, o una versión modificada de la misma, tal como una variante modificada para contener regiones o residuos cargados adicionales o residuos hidrófilos para facilitar las interacciones intermoleculares. En algunas realizaciones, el dominio de señalización intracelular de CD28 es capaz de reclutar una o más moléculas adaptadoras a un CD28 en respuesta al ligamiento. En algunos aspectos, el dominio intracelular CD28 incluye o es una secuencia codificada por la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 5 o una porción o variante funcional de la misma.

En algunas realizaciones, la presente divulgación se refiere a una proteína de fusión que comprende un componente extracelular compuesto por un dominio de unión que se une específicamente a una diana, un componente intracelular compuesto por un dominio de señalización intracelular y un componente hidrófobo que conecta los componentes extracelular e intracelular, siempre que la longitud de un complejo proteína de fusión:diana abarque una distancia similar a una distancia entre membranas en una sinapsis inmunitaria, en la que (a) el componente extracelular comprende una porción extracelular de un CD200R, (b) el componente hidrófobo comprende un dominio transmembrana de un CD28, y (c) el componente intracelular comprende un dominio de señalización intracelular de un CD28.

En algunas realizaciones, la presente divulgación se refiere a una proteína de fusión que comprende un componente extracelular compuesto por un dominio de unión que se une específicamente a una diana, un componente intracelular compuesto por un dominio de señalización intracelular y un componente hidrófobo que conecta los componentes extracelular e intracelular, siempre que la longitud de un complejo proteína de fusión:diana abarque una distancia similar a una distancia entre membranas en una sinapsis inmunitaria, en la que (a) el componente extracelular comprende una porción extracelular de un CD200R, (b) el componente hidrófobo comprende un dominio transmembrana de un CD28, y (c) el componente intracelular comprende un dominio de señalización intracelular de un CD28 y un dominio de señalización intracelular de un CD137 (4-1BB).

En determinados aspectos, la presente divulgación se refiere a una molécula de ácido nucleico que codifica para una proteína de fusión tal como se describe en el presente documento.

En determinados aspectos, la presente divulgación se refiere a un vector que comprende una molécula nucleica que codifica para una proteína de fusión tal como se describe en el presente documento.

En otros determinados aspectos, la presente divulgación se refiere a una célula huésped que comprende una proteína de fusión, un ácido nucleico o un vector tal como se describe en el presente documento.

En otros determinados aspectos, la presente invención proporciona una célula huésped tal como se describe en el presente documento para su uso en un método para tratar una enfermedad. En algunas realizaciones, el método aumenta la actividad de una célula inmunitaria y comprende la administración de una cantidad eficaz de la célula huésped a un sujeto que necesita una actividad de células inmunitarias aumentada. En otros aspectos, el método potencia o prolonga una respuesta inmunitaria y comprende la administración de una cantidad eficaz de la célula huésped a un sujeto que necesita una actividad celular inmunitaria potenciada o prolongada. En todavía otros aspectos, el método estimula una respuesta de células T específica de antígeno y comprende la administración de una cantidad eficaz de la célula huésped a un sujeto que necesita una actividad de células inmunitarias aumentada. En otros aspectos, el método inhibe una ruta de señalización inmunosupresora y comprende la administración de una cantidad eficaz de la célula huésped a un sujeto que lo necesita. En otros aspectos, la enfermedad es cáncer y el método comprende la administración de una cantidad terapéuticamente eficaz de la célula huésped a un sujeto que tiene cáncer. En otros aspectos, el método inhibe la resistencia inmunitaria de las células cancerosas y comprende la administración de una cantidad eficaz de la célula huésped a un sujeto que lo necesita.

En todavía otros aspectos, la célula huésped tal como se describe en el presente documento se usa en un método para tratar un tumor, que comprende la administración de una cantidad terapéuticamente eficaz de la célula huésped a un sujeto que tiene un tumor, en la que la célula huésped administrada es capaz de proliferar en un microambiente tumoral inmunosupresor.

La presente divulgación también proporciona la célula huésped tal como se describe en el presente documento para su uso en un método para tratar una infección, que comprende la administración de una cantidad terapéuticamente eficaz de una célula huésped a un sujeto que tiene la infección.

Estos y otros aspectos de la presente invención resultarán evidentes haciendo referencia a la siguiente descripción detallada y a los dibujos adjuntos.

Breve descripción de los dibujos

Las figuras 1A y 1B muestran constructos CD200R-CD28 expresados a niveles altos en células T CD8+ murinas primarias. (A) Representación esquemática de constructos CD200R-CD28 a modo de ejemplo. El constructo “I” contiene los dominios extracelular (“EC”) y transmembrana (“TM”) de CD200R y un dominio de señalización intracelular (“ IC”) de CD28 (CD200Rtm-CD28). El constructo “ II” contiene el dominio extracelular de CD200R y los dominios transmembrana e intracelular de CD28 (CD200R-CD28tm). Los constructos “III-V” también incorporan una porción del dominio extracelular de CD28 a la cisteína proximal transmembrana para promover la multimerización y potenciar la señalización de CD28. Para tener en cuenta cualquier aminoácido extracelular (por ejemplo, de desde uno hasta aproximadamente 50 aminoácidos; tales como los constructos murinos a modo de ejemplo divulgados en el presente documento que contienen nueve (9) aminoácidos adicionales y los constructos humanos a modo de ejemplo divulgados en el presente documento que contienen doce (12) aminoácidos), algunos constructos tienen una porción truncada de un dominio extracelular o intracelular (por ejemplo, un CD200R que conserva un sitio de glicosilación ligado a N). Por ejemplo, el constructo IV tiene una porción truncada de CD200R que está truncada en 3 aminoácidos. El constructo V tiene una porción truncada de CD200R que está truncada en 9 aminoácidos. Los constructos “I”, “ II” y “V” mantienen la corta distancia espacial entre las células (por ejemplo, entre una célula T y una célula presentadora de antígeno) y pueden colocalizarse con el TCR dentro del cSMAC y proporcionar una fuerte señal coestimuladora. (B) Expresión transgénica de constructos CD200R-CD28 murinos en células T TCRgag tal como se detecta mediante el anticuerpo anti-CD200R. El vector de control contiene proteína verde fluorescente (GFP).

Las figuras 2A a 2G muestran que los constructos CD200R-CD28 promueven la proliferación, acumulación y función efectora en respuesta a células diana tumorales CD200+in vitroy se acumulan en la sinapsis inmunitaria. Se estimularonin vitroesplenocitos de ratones TCRgag no sometidos previamente a experimentación con anticuerpos anti-CD3, anti-CD28 e IL-2 humana recombinante (100 U/ml) y se transdujeron con sobrenadante retroviral durante 2 días. Las células se reestimularon cada 7 días con FBL y esplenocitos irradiados y se cultivaron con rhlL-2 (50 U/ml) hasta tres estimulaciones. Se usaron células T para los ensayos 5-7 días después de la última estimulación. (A) Proliferación de células T TCRgag de control con GFP y CD200R-CD28 tal como se mide mediante dilución CellTrace Violet. Las células T se estimularon con FBL CD200- (paneles superiores) o FBL CD200+ (paneles inferiores) durante 3 días. (B) Expansión/supervivencia preferencial de células T TCRgag transducidas durante el cocultivo con células T TCRgag no transducidas durante ciclos semanales de estimulación con FBL CD200+ y esplenocitos irradiados. (C) Enriquecimiento de células T transducidas. La reestimulación repetida con células tumorales CD200+ irradiadas enriqueció las células transducidas con CD200R-9aas-CD28Cys en comparación con las células T de tipo natural transducidas con un vector de control con GFP vacío. (D) Intensidad de la señal de CD200R y CD200 aumentada en la sinapsis de células T:FBL. Las balsas lipídicas aumentan en la sinapsis inmunitaria (I). Proteínas de fusión CD200R-9aas-CD28Cys colocalizadas con balsas lipídicas, lo que indica que las proteínas de fusión se concentran dentro de la sinapsis inmunitaria (III, IV). (E) Las células T CD8+ CD200R-CD28+ muestran una capacidad potenciada para lisar células FBL CD200+in vitro.Las células tumorales diana se marcaron con diferentes diluciones del colorante fluorescente éster succinimidílico de diacetato de 5,6-carboxifluoresceína (CFSE), tal como se indica. Se incubaron células T TCRgag efectoras transducidas con la proteína de fusión CD200R-CD28 indicada o un control de vector vacío a la razón efector-diana indicada con una mezcla 1:1 de FBL CD200+ (CFSEhi) y dianas de control EL4 inespecíficas (CFSElD) durante 5 horas. El porcentaje de FBL de la suma de FBL y células tumorales de control se determinó mediante citometría de flujo. El porcentaje de lisis se determinó dividiendo el porcentaje de FBL incubadas con células T entre el porcentaje de FBL incubadas sin células T. (F) Células tumorales diana para el ensayo de CFSE en (G). Las células tumorales diana se marcaron con diferentes diluciones de los colorantes fluorescentes CellTrace Violet (CTV) o CFSE. Se generó una mezcla 1:1:1 de células EL4 (CTV+), FBL CD200+ (CFSEhi) y dianas de control EL4 inespecíficas (CFSElD). (G) Ensayo de citotoxicidad de CfSe . Las células T TCRgag se transdujeron con el receptor de CD200R-CD28 o el vector de control con GFP. Las células T TCRgag efectoras se incubaron en la razón indicada de efector con respecto a diana con una mezcla 1:1 de FBL CD200' o FBL CD200+ y dianas de control EL4 inespecíficas durante 4 horas. El porcentaje de FBL de la suma de FBL y células tumorales de control se determinó mediante citometría de flujo. El porcentaje de lisis se determinó dividiendo el porcentaje de FBL incubadas con células T entre el porcentaje de FBL incubadas sin células T.

Las figuras 3A a 3D muestran que las células T transducidas con CD200R-9aas-CD28Cys se acumulan preferentemente en respuesta a la exposición tumoralin vivoy expresan proteínas de superficie coherentes con un fenotipo efector después de la inyección en ratones portadores de FBL tratados con Cytoxan. Se generaron células T TCRgag transducidas tal como se describe en el ejemplo 2. (A) Esquema experimental. A ratones C57BL/6 se les inyectaron 4 * 10® células FBL CD200+. Cinco días después, se inyectaron conjuntamente células T TCRgag de control con eGFP (Thy1.1 heterocigotas) y CD200R-9aas-CD28Cys (Thy1.1 homocigotas) en ratones B6 portadores de FBL tratados con Cytoxan a 4 * 10® células/ratón. Se administróL-2 cada 2 días (2 * 104U/dosis). El día 8 tras la transferencia de células T, los ratones se sacrificaron y se extrajeron los bazos y los ganglios linfáticos inguinales.

(B) Las células T TCR<gag>CD200R-9aas-CD28Cys se acumulan en el bazo en respuesta a FBL. (LN=ganglio linfático; Spl=bazo). (C) Comparación de proteínas de superficie 3 días tras la transferencia para células T transducidas para expresar CD200R-9aas-CD28Cys, células T transducidas con un vector vacío y células T endógenas. Las células T TCR<gag>CD200R-9aas-CD28Cys expresaron CD62L reducido en comparación con las células T TCR<gag>de control, lo que sugiere un fenotipo de células T efectoras. (D) Comparación de proteínas de superficie 15 días tras la transferencia para células transducidas para expresar células T CD200R-9aas-CD28Cys<+>, células T transducidas con un vector vacío y células T endógenas. Las células T TCR<gag>CD200R-9aas-CD28Cys expresan niveles similares de proteínas de la superficie celular en comparación con las células T TCR<gag>de control.

Las figuras 4A a 4D muestran que la inmunoterapia adoptiva de células T transducidas con CD200R-CD28 puede erradicar la leucemia diseminada. (A) Esquema del experimento. A ratones C57BL/6 se les inyectaron 4 * 10<6>células FBL CD200<+>. Cinco días después, se inyectaron por vía i.p. células T TCR<gag>CD200R-CD28tm, CD200R-CD28Cys, CD200R-9aas-CD28Cys o eGFP en ratones portadores de FBL tratados con Cy a 10<5>células/ratón. Se administró IL-2 cada 2 días (2 * 10<4>U/dosis) en una cohorte de ratones tal como se indica. (B) Ejemplo representativo de expresión de proteínas de la superficie celular en células T transducidas con CD200R-CD28tm y células T no transducidas el día de la inyección con IL-2, tal como se determina mediante citometría de flujo. (C) Supervivencia de ratones tratados en presencia de inyecciones de IL-2. (D) Supervivencia de ratones tratados en ausencia de inyecciones de IL-2. La transferencia de células T TCR<gag>CD200R-9aas-CD28Cys mejoró significativamente la supervivencia en ausencia de inyecciones de IL-2 (p <0,05, prueba de Mantel-Cox de intervalos logarítmicos).

Las figuras 5A a 5C muestran que las células T que expresan CD200R-9aas-CD28Cys no inducen daño hepático autoinmunitario detectable ni infiltran tejidos normales. (A) Esquema del experimento. A ratones Alb/Gag tratados con Cytoxan se les inyectaron 4 * 10<6>células FBL CD200<+>. Cinco días después, se inyectaron por vía i.p. células T TCR<gag>CD200R-9aas-CD28Cys y eGFP en los ratones portadores de FBL tratados con Cytoxan a 10<5>células/ratón. Se administró IL-2 cada 2 días (2 * 10<4>U/dosis) en una cohorte de ratones tal como se indica. Tres y 7 días tras la transferencia, el daño hepático se evaluó mediante la cuantificación de los niveles séricos de las enzimas hepáticas aspartato aminotransferasa (AST) y alanina aminotransferasa (ALT). (B) Los niveles de AST y ALT medidos a los 3 y 7 días tras la transferencia para ratones que no recibieron células T, células T de control que expresan GFP o células T que expresan CD200R-9aas-CD28Cys no variaron según el tratamiento. (C) Evaluación de la infiltración de células T en tejido normal. Se observó una presencia limitada de células T en el tejido hepático usando anticuerpos específicos del marcador de células T CD3 (panel izquierdo), sin diferencias significativas entre los receptores de células T TCR<gag>CD200R-9aas-CD28Cys o TCR<gag>de control (panel derecho).

Las figuras 6A a 6D muestran que los dominios de señalización coestimuladores de 4-1BB promueven la acumulación y la función efectora de células T transducidasin vitroy promueven la supervivencia de receptores portadores de tumores de células T transducidas en respuesta a células diana tumorales CD200<+>. (A) Representación esquemática de los constructos CD200R-CD28 (“V”), CD200R-4-1BB (“VI”) y CD200R-CD28-4-1BB (“VII”). (B) Expansión de células T TCR<gag>transducidas en relación con células T TCR<gag>no transducidas después de la estimulación semanal con FBL CD200<+>y esplenocitos irradiados. CD200R-4-1BB y CD200R-CD28-4-1BB también promueven la acumulación de células T transducidasin vitro.(C) Las células T CD200R-9aas-4-1BB<+>CD8<+>mostraron una capacidad potenciada para lisar células FBL CD200<+>in vitroen relación con los controles, usando un ensayo de citotoxicidad convencional basado en CFSE. El porcentaje de FBL de la suma de FBL y células tumorales de control se determinó mediante citometría de flujo. El porcentaje de lisis se determinó dividiendo el porcentaje de FBL incubadas con células T entre el porcentaje de FBL incubadas sin células T. (D) Las células T transducidas con CD200R-41BB también promueven la supervivencia en relación con los controles. A ratones C57BL/6 se les inyectaron 4 * 10<6>células FBL CD200<+>. Cinco días después, se inyectaron por vía i.p. células T TCR<gag>CD200R-9aas-CD28, CD200R-9aas-4-1BB, CD200R-9aas-CD28-4-1BB o eGFP en ratones portadores de FBL tratados con Cytoxan a 10<5>células/ratón.

Las figuras 7A a 7D muestran que las células T primarias humanas transducidas para expresar un TCR específico de WT1 y una proteína de fusión CD200Rtm-CD28 muestran una proliferación potenciada con respecto a células diana que expresan CD200 y una producción de citocinas aumentada en respuesta a células tumorales que expresan CD200. (A) Expresión de t Cr , C4 y CD200Rtm-CD28 específicos de WT1-<I26>. (B) Expresión de CD200 en células T2 y K562. Las células T2 muestran una expresión endógena de CD200 de bajo nivel. (C) Proliferación de células T tal como se indica mediante CFSE. Las células que proliferan en respuesta al antígeno muestran una intensidad de fluorescencia CFSE reducida. Las células T transducidas tanto con C4 como con IFP muestran una proliferación potenciada con respecto a células diana que expresan niveles bajos de CD200 en relación con las células T transducidas sólo con C4. (D) Producción de citocinas en respuesta a la exposición a células tumorales CD200dim, tal como se mide mediante citometría de flujo. En relación con las células T de control transducidas con TCR-C4 solo, las células T transducidas tanto con C4 como con IFP CD200Rtm-CD28 muestran una producción de citocinas aumentada.

Las figuras 8A a 8E muestran que las proteínas de fusión que comprenden componentes extracelulares de SIRPa y dominios de señalización coestimuladores de CD28 promueven la acumulación y proliferación de células T transducidasin vitro.(A) Representación esquemática de constructos SIRPa-CD28 a modo de ejemplo. El constructo “I” contiene dominios de SIRPa extracelular (“EC”) y transmembrana (“TM”) y un dominio de señalización intracelular de CD28 (“IC”) (SIRPatm-CD28). El constructo “II” contiene el dominio extracelular de SIRPa y los dominios transmembrana e intracelular de CD28 (SIRPa-CD28tm). Los constructos “III-VI” también incorporan una porción del dominio extracelular de CD28 a la cisteína proximal transmembrana para promover la multimerización y potenciar la señalización de CD28. Para tener en cuenta los aminoácidos extracelulares (por ejemplo, nueve (9) aminoácidos adicionales para constructos murinos o doce (12) aminoácidos para constructos humanos), algunos constructos tienen una porción truncada de un dominio extracelular o intracelular (por ejemplo, un SIRPa que conserva un sitio de glicosilación ligado a N). El constructo IV tiene una porción truncada de SIRPa que está truncada en 6 aminoácidos para conservar un sitio de glicosilación ligado a N. El constructo V tiene una porción truncada de SIRPa que está truncada en 9 aminoácidos. El constructo VI tiene una porción truncada de SIRPa que está truncada en 23 aminoácidos. Los constructos “I”, “II” y “V” mantienen la corta distancia espacial entre las células (por ejemplo, entre una célula T y una célula presentadora de antígeno) y pueden colocalizarse con el TCR dentro del cSMAC y proporcionar una fuerte señal coestimuladora. (B) Expansión de células T TCR<gag>transducidas en relación con células T TCR<gag>no transducidas después de la estimulación semanal con FBL SIRPa<+>y esplenocitos irradiados. Los constructos SIRPa-CD28 promueven la acumulación de células T transducidasin vitro,y SIRPa-9aas-CD28Cys muestra una acumulación potenciada. (C) Proliferación de células T transducidas con constructos SIRPa-CD28 en un ensayo de proliferación por dilución CellTrace Violet (CTV). Las células T que expresan constructos SIRPa-CD28 modificadas por ingeniería para mantener la distancia entre células T y células tumorales mostraron una proliferación potenciada en relación con las células T no transducidas. (D) Las células tumorales CD47<+>se destruyeron después del cocultivo con células T SIRPa-CD28<+>transducidas para expresar constructos SIRPatm-CD28 o SIRPa-9aas-CD28Cys. Por el contrario, las células tumorales no se erradicaron cuando se cultivaron con células T que recibieron un vector vacío o un SIRPa truncado que carecía de su dominio intracelular. (E) Resultados de un ensayo IncuCyte usado para cuantificar la destrucción de células tumorales CD47<+>. Se transdujeron células tumorales FBL CD47<+>con mCherry. La pérdida de la señal roja indica la destrucción de células tumorales. La destrucción de células tumorales se sometió a prueba a razones efector:diana de 10:1, 2:1 y 0,4:1. Las células T SIRPa-CD28<+>destruyeron las células tumorales CD47<+>, incluso a la razón efector con respecto a diana más baja sometida a prueba.

Las figuras 9A y 9B muestran que las proteínas de fusión que comprenden componentes extracelulares de PD-1 y dominios de señalización coestimuladores de CD28 promueven la producción de citocinasin vitro.(A) Representación esquemática de constructos PD-1-CD28 a modo de ejemplo. El constructo “ I” contiene los dominios extracelular (“EC”) y transmembrana (“TM”) de PD-1 y un dominio de señalización intracelular (“IC”) de CD28 (PD1tm-CD28). El constructo “II” contiene el dominio extracelular de PD-1 y los dominios transmembrana e intracelular de CD28 (PD1-CD28tm). Los constructos “III-VII” también incorporan una porción del dominio extracelular de CD28 adyacente a la cisteína proximal transmembrana para promover la multimerización y potenciar la señalización de CD28. Para tener en cuenta los aminoácidos extracelulares (por ejemplo, nueve (9) aminoácidos adicionales para constructos murinos o doce (12) aminoácidos para constructos humanos), los constructos IV-VII tienen una porción truncada de PD-1. El constructo IV tiene una porción truncada de PD-1 que está truncada en 9 aminoácidos. El constructo V tiene una porción truncada de PD-1 que está truncada en 12 aminoácidos. El constructo VI tiene una porción truncada de PD-1 que está truncada en 15 aminoácidos. El constructo VII tiene una porción truncada de PD-1 que está truncada en 21 aminoácidos. Los constructos “I”, “ II” y “V” mantienen la corta distancia espacial entre las células (por ejemplo, entre una célula T y una célula presentadora de antígeno) y pueden colocalizarse con el TCR dentro del cSMAC y proporcionar una fuerte señal coestimuladora. (B) Las células T PD1-CD28<+>mostraron una producción de citocinas aumentada en respuesta a la estimulación durante 5 horas en presencia de brefeldina A con células FBL que expresan endógenamente los ligandos PD-1, PD-L1 y PD-L2. Se evaluó la expresión intracelular de las citocinas efectoras, IFNy y TNFa, en las células T estimuladas mediante citometría de flujo.

La figura 10 muestra la expresión conjunta del TCR-C4 y una PD-1-IFP (PD1-12aas-CD28Cys, PD1-1Saas-CD28Cys o PD1-21aas-CD28Cys). Las células T transducidas con C4 y PD1-12aas-CD28Cys o PD1-15aas-CD28Cys mostraron altas eficiencias de transducción y expresión de ambas proteínas.

Las figuras 11A a 11C muestran que las proteínas de fusión que comprenden componentes extracelulares de Fas y dominios de señalización coestimuladores de CD28 se acumulanin vitrotras la estimulación con células FBL irradiadas. (A) Representación esquemática de constructos Fas-CD28 a modo de ejemplo. El constructo “I” contiene los dominios extracelular (“EC”) y transmembrana (“TM”) de Fas y un dominio de señalización intracelular (“IC”) de CD28 (Fastm-CD28). El constructo “II” contiene el dominio extracelular de Fas y los dominios transmembrana e intracelular de CD28 (Fas-CD28tm). Los constructos “III” y “IV” también incorporan una porción del dominio extracelular de CD28 adyacente a la cisteína proximal transmembrana para promover la multimerización y potenciar la señalización de CD28. Para tener en cuenta los aminoácidos extracelulares (por ejemplo, nueve (9) aminoácidos adicionales para constructos murinos o doce (12) aminoácidos para constructos humanos), el constructo IV tiene una porción truncada de Fas, en la que el dominio extracelular de Fas está truncado en 9 aminoácidos. Los constructos “I”, “II” y “IV” mantienen la corta distancia espacial entre las células (por ejemplo, entre una célula T y una célula presentadora de antígeno) y pueden colocalizarse con el TCR dentro del cSMAC y proporcionar una fuerte señal coestimuladora. (B) Acumulación de células T TCR<gag>transducidas con constructos Fas sobre múltiples estimulaciones con células FBL irradiadas. Todos los constructos promovieron la acumulación de células T con respecto a las células T de control. (C) La expresión de constructos Fas-CD28, pero no Fas de longitud completa (FL), promovió la supervivencia o expansión de las células T tras múltiples estimulacionesin vitro.

Las figuras 12A y 12B muestran la estructura y expresión de proteínas de fusión que comprenden componentes extracelulares de LAG3 y dominios de señalización coestimuladores de CD28. (A) Representación esquemática de constructos LAG3-CD28 a modo de ejemplo. El constructo “I” contiene los dominios extracelular (“EC”) y transmembrana (“TM”) de LAG3 y un dominio de señalización intracelular (“IC”) de CD28 (LAG3tm-CD28). El constructo “II” contiene el dominio extracelular de LAG3 y los dominios transmembrana e intracelular de CD28 (LAG3-CD28tm). Los constructos “III” y “IV” también incorporan una porción del dominio extracelular de CD28 adyacente a la cisteína proximal transmembrana para promover la multimerización y potenciar la señalización de CD28. Para tener en cuenta los aminoácidos extracelulares (por ejemplo, nueve (9) aminoácidos adicionales para constructos murinos o doce (12) aminoácidos para constructos humanos), el constructo IV tiene una porción truncada de LAG3, en la que el dominio extracelular de LAG3 está truncado en 9 aminoácidos. Los constructos “I”, “ II” y “IV” mantienen la corta distancia espacial entre las células (por ejemplo, entre una célula T y una célula presentadora de antígeno) y pueden colocalizarse con el TCR dentro del cSMAC y proporcionar una fuerte señal coestimuladora. (B) Expresión de constructos LAG3-CD28 por células T CD8+ murinas, tal como se determina mediante tinción con anticuerpo anti-LAG3 y citometría de flujo. Las células T transducidas para expresar constructos LAG3-CD28 (LAG3tm-CD28; LAG3-CD28tm; LAG3-CD28Cys; LAG3-9aas-CD28Cys) mostraron expresión de los constructos, en contraste con las células T de control que recibieron el vector vacío.

Las figuras 13A y 13B muestran la estructura y expresión de proteínas de fusión que comprenden componentes extracelulares de TIM3 y dominios de señalización coestimuladores de CD28. (A) Representación esquemática de constructos TIM3-CD28 a modo de ejemplo. El constructo “I” contiene los dominios extracelular (“EC”) y transmembrana (“TM”) de TIM3 y un dominio de señalización intracelular (“IC”) de CD28 (TIM3tm-CD28). El constructo “ II” contiene el dominio extracelular de TIM3 y los dominios transmembrana e intracelular de CD28 (TIM3-CD28tm). Los constructos “III” y “IV” también incorporan una porción del dominio extracelular de CD28 adyacente a la cisteína proximal transmembrana para promover la multimerización y potenciar la señalización de CD28. Para tener en cuenta los aminoácidos extracelulares (por ejemplo, nueve (9) aminoácidos adicionales para constructos murinos o doce (12) aminoácidos para constructos humanos), el constructo IV tiene una porción truncada de TIM3, en la que el dominio extracelular de TIM3 está truncado en 9 aminoácidos. Los constructos “I”, “ II” y “IV” mantienen la corta distancia espacial entre las células (por ejemplo, entre una célula T y una célula presentadora de antígeno) y pueden colocalizarse con el TCR dentro del cSMAC y proporcionar una fuerte señal coestimuladora. (B) Expresión de constructos TIM3-CD28 por células T CD8+ murinas, tal como se determina mediante tinción con anticuerpo anti-TIM3 y citometría de flujo. Las células T transducidas para expresar constructos TIM3-CD28 (TIM3tm-CD28; TIM3-CD28tm; TIM3-CD28Cys; TIM3-9aas-CD28Cys) normalmente mostraron expresión de los constructos, en contraste con las células T de control que recibieron el vector vacío.

Descripción detallada

La presente divulgación proporciona proteínas de fusión que modulan la señalización en una célula huésped, tal como una célula inmunitaria. Por ejemplo, las proteínas de fusión de esta divulgación pueden proporcionar una señal de activación o coestimuladora en una célula T humana, en las que la célula T puede opcionalmente modificarse por ingeniería para que tenga un TCR específico de antígeno preferido. Estas proteínas de fusión inmunomoduladoras (IFP) pueden interaccionar con dianas expresadas de manera ubicua o con dianas que habitualmente están reguladas por incremento o sobreexpresadas en células no normales (por ejemplo, una célula cancerosa). Tales IFP tienen un dominio de unión extracelular y un dominio de señalización intracelular. Al transducir células T con TCR modificados por ingeniería (por ejemplo, TCR de alta afinidad) y proteínas de fusión de esta divulgación que generan señales de activación, es posible que determinadas realizaciones de células T ya no requieran coestimulación exógena tras la interacción con, por ejemplo, una célula tumoral.

En determinados aspectos, la presente divulgación proporciona células huésped (por ejemplo, células inmunitarias tales como células T, células dendríticas, células NK o similares) que comprenden una IFP, vectores que codifican para IFP y métodos de activación de células T que comprenden una IFP para diversas aplicaciones terapéuticas, incluyendo el tratamiento de una enfermedad en el sujeto (por ejemplo, cáncer, enfermedad infecciosa).

Antes de exponer esta divulgación con más detalle, puede ser útil para comprenderla proporcionar definiciones de determinados términos que van a usarse en el presente documento. A lo largo de esta divulgación se exponen definiciones adicionales.

En la presente descripción, debe entenderse que cualquier intervalo de concentración, intervalo de porcentaje, intervalo de razón o intervalo de números enteros incluye el valor de cualquier número entero dentro del intervalo citado y, cuando sea apropiado, fracciones de los mismos (tales como una décima y una centésima de un número entero), a menos que se indique lo contrario. Además, debe entenderse que cualquier intervalo de números mencionado en el presente documento relacionado con cualquier característica física, tal como subunidades, tamaño o grosor del polímero, incluye cualquier número entero dentro del intervalo mencionado, a menos que se indique lo contrario. Tal como se usa en el presente documento, el término “aproximadamente” significa ± 20%del intervalo, valor o estructura indicados, a menos que se indique lo contrario. Debe entenderse que los términos “un” y “una” tal como se usan en el presente documento se refieren a “uno o más” de los componentes enumerados. Debe entenderse que el uso de la alternativa (por ejemplo, “o”) significa una, ambas o cualquier combinación de las alternativas. Tal como se usan en el presente documento, los términos “incluyen”, “tienen” y “comprenden” se usan como sinónimos, términos y variantes de los mismos que pretenden ser interpretados como no limitativos.

El término “que consiste esencialmente en” limita el alcance de una reivindicación a los materiales o etapas especificados, o a aquellos que no afectan materialmente las características básicas de una invención reivindicada. Por ejemplo, un dominio, región o módulo de proteína (por ejemplo, un dominio de unión, región bisagra, módulo ligador) o una proteína (que puede tener uno o más dominios, regiones o módulos) “consiste esencialmente en” una secuencia de aminoácidos particular cuando la secuencia de aminoácidos de un dominio, región, módulo o proteína incluye extensiones, deleciones, mutaciones o cualquier combinación de las mismas (por ejemplo, aminoácidos en el extremo amino o carboxilo o entre dominios) que, en combinación, contribuyen hasta como máximo el 20 % (por ejemplo, como máximo el 15 %, el 10 %, el 8 %, el 6 %, el 5 %, el 4 %, el 3 %, el 2 % o el 1 %) de la longitud de un dominio, región o módulo o proteína y no afecta sustancialmente (es decir, no reduce la actividad en más del 50 %, como no más del 40 %, del 30 %, del 25 %, del 20 %, del 15 %, del 10 %, del 5 % o del 1 %) la actividad del/de los dominio(s), región/regiones, módulo(s) o proteína (por ejemplo, la afinidad de unión a la diana de una proteína de unión).

Tal como se usa en el presente documento, “heterólogo” o “no endógeno” o “exógeno” se refiere a cualquier gen, proteína, compuesto, molécula o actividad que no es nativo de una célula huésped o de un sujeto, o es cualquier gen, proteína, compuesto, molécula o actividad nativa de un huésped o célula huésped que se ha alterado o mutado de manera que la estructura, actividad o ambas son diferentes entre las moléculas nativas y mutadas. En determinadas realizaciones, las moléculas heterólogas, no endógenas o exógenas (por ejemplo, receptores, ligandos) pueden no ser endógenas para una célula huésped o un sujeto, sino que pueden haberse añadido ácidos nucleicos que codifican para tales moléculas a una célula huésped mediante conjugación, transformación, transfección, electroporación o similares, en los que la molécula de ácido nucleico añadida puede integrarse en el genoma de una célula huésped o puede existir como material genético extracromosómico (por ejemplo, como un plásmido u otro vector autorreplicante). El término “homólogo” se refiere a una molécula o actividad encontrada en o derivada de una célula, especie o cepa huésped. Por ejemplo, una molécula o gen heterólogo o exógeno que codifica para la molécula puede ser homólogo a una molécula o gen huésped nativo o de célula huésped que codifica para la molécula, respectivamente, pero puede tener una estructura, secuencia, nivel de expresión alterados o combinaciones de los mismos. Una molécula no endógena puede ser de la misma especie, de una especie diferente o de una combinación de las mismas.

Tal como se usa en el presente documento, el término “endógeno” o “nativo” se refiere a un gen, proteína, compuesto, molécula o actividad que normalmente está presente en un huésped o célula huésped y no tiene alteraciones modificadas por ingeniería.

Un “dominio de unión” (también denominado “región de unión” o “resto de unión”), tal como se usa en el presente documento, se refiere a una molécula, tal como un péptido, oligopéptido, polipéptido o proteína, que posee la capacidad de asociarse, unirse o combinarse, de forma específica y no covalente, con una molécula diana (por ejemplo, CD200, CD47, CD19, CD20, CD22, ROR1, mesotelina, PD-L1, PD-L2, PSMA, WT-1, ciclina-A1). Un dominio de unión incluye cualquier pareja de unión que se produce de manera natural, sintética, semisintética o está producida de manera recombinante para una molécula biológica u otra diana de interés o proteína de unión de la misma. Los dominios de unión a modo de ejemplo incluyen ectodominios de receptor (por ejemplo, los de CD200R, PD-1, CTLA4, BTLA, CD2, Fas) o porciones de unión de los mismos, ligandos (por ejemplo, citocinas tales como IL35, quimiocinas) o porciones de unión de los mismos, regiones variables de anticuerpos de cadena sencilla (por ejemplo, anticuerpos de dominio, sFv, scFv, Fab) o porciones de unión de las mismas, regiones de unión a antígeno de receptores de células T (TCR), tales como TCR de cadena sencilla (scTCR), o polipéptidos sintéticos seleccionados por su capacidad específica para unirse a una molécula biológica.

En algunas realizaciones, “se une específicamente” se refiere a una asociación o unión de un dominio de unión, o una proteína de fusión del mismo, a una molécula diana con una afinidad o K<a>(es decir, una constante de asociación en equilibrio de una interacción de unión particular con unidades de 1/M) igual o mayor de 10<5>M<-1>, o se une a tal molécula diana sin asociarse ni unirse significativamente con ninguna otra molécula o componente en una muestra. Los dominios de unión (o proteínas de fusión de los mismos) pueden clasificarse como dominios de unión (o proteínas de fusión de los mismos) de “alta afinidad” o dominios de unión (o proteínas de fusión de los mismos) de “baja afinidad”. Los dominios de unión de “alta afinidad” se refieren a aquellos dominios de unión con una K<a>de al menos 10<7>M<-1>, al menos 10<8>M<-1>, al menos 10<9>M<-1>, al menos 10<10>M<-1>, al menos 10<11>M<-1>, al menos 10<12>M<-1>o al menos 10<13>M<-1>. Los dominios de unión de “baja afinidad” se refieren a aquellos dominios de unión con una K<a>de hasta 10<7>M<-1>, hasta 10<6>M<-1>, hasta 10<5>M<-1>. Alternativamente, la afinidad puede definirse como una constante de disociación en equilibrio (K<d>) de una interacción de unión particular con unidades de M (por ejemplo, de 10<-5>M a 10<-13>M). En determinadas realizaciones, un dominio de unión puede tener “afinidad potenciada”, que se refiere a un dominio de unión seleccionado o modificado por ingeniería con una unión más fuerte a un antígeno diana que un dominio de unión de tipo natural (u original). Por ejemplo, la afinidad potenciada puede deberse a una Ka (constante de asociación en equilibrio) para el antígeno diana que es mayor que la del dominio de unión de tipo natural, o debido a una Kd (constante de disociación) para el antígeno diana que es menor que la del dominio de unión de tipo natural o debido a una tasa de desactivación (Koff) para el antígeno diana que es menor que la del dominio de unión de tipo natural. Se conoce una variedad de ensayos para identificar dominios de unión de la presente divulgación que se unen específicamente a una diana particular, así como para determinar el dominio de unión o las afinidades de las proteínas de fusión, tales como análisis de inmunotransferencia de tipo Western, ELISA y Biacore® (véase también, por ejemplo, Scatchardet al.,Ann. N.Y. Acad. Sci. 51:660, 1949; y las patentes estadounidenses n.os 5.283.173, 5.468.614 o equivalentes).

Tal como se usa en el presente documento, una “proteína de fusión” se refiere a un polipéptido que, en una cadena sencilla, tiene al menos dos dominios distintos, en la que los dominios no se encuentran naturalmente juntos en una proteína. Puede construirse una molécula de ácido nucleico que codifica para una proteína de fusión usando PCR, ingeniería recombinante o similar, o tales proteínas de fusión pueden prepararse usando métodos de síntesis de proteínas. Una proteína de fusión puede contener además otros componentes (por ejemplo, unidos covalentemente), tales como una etiqueta o una molécula bioactiva. En determinadas realizaciones, una proteína de fusión expresada o producida por una célula huésped (por ejemplo, célula T) está ubicada en la superficie celular, donde la proteína de fusión está anclada a la membrana celular con una porción de la proteína de fusión (por ejemplo, que contiene un dominio de unión) ubicada extracelularmente y una porción de la proteína de fusión (por ejemplo, que contiene un dominio de señalización) ubicada intracelularmente.

Un “componente hidrófobo”, tal como se usa en el presente documento, significa cualquier secuencia de aminoácidos que tiene una estructura tridimensional que es termodinámicamente estable en una membrana celular y generalmente oscila en longitud desde aproximadamente 15 aminoácidos hasta aproximadamente 30 aminoácidos. La estructura de un componente hidrófobo puede comprender una hélice alfa, un cilindro beta, una lámina beta, una hélice beta o cualquier combinación de los mismos. En determinadas realizaciones, un componente hidrófobo está compuesto por un “dominio transmembrana” de una proteína transmembrana conocida, que es una porción de una proteína transmembrana que puede insertarse en o abarcar una membrana celular. Además, el componente hidrófobo puede modificarse para contener regiones cargadas o residuos hidrófilos para facilitar las interacciones intermoleculares.

Tal como se usa en el presente documento, un “dominio de señalización intracelular” es una porción intracelular de una molécula, tal como una usada en una proteína de fusión de esta divulgación, que puede promover directa o indirectamente una respuesta tal como una respuesta biológica o fisiológica coestimuladora, positiva o activadora en una célula al recibir la señal adecuada. Un dominio de señalización intracelular puede promover directamente una respuesta celular cuando contiene uno o más dominios o motivos de señalización, tales como un motivo de activación basado en tirosina de inmunorreceptor (ITAM), un dominio cinasa, un dominio coestimulador o similares. Un dominio de señalización intracelular puede promover indirectamente una respuesta celular asociándose con una o más proteínas que a su vez promueven directamente una respuesta celular. Un dominio de señalización intracelular o fragmento funcional del mismo puede ser de CD3e, CD38, CD3^, CD25, CD27, CD28, CD40, CD47, CD79A, CD79B, CD134 (OX40), CD137 (4 1BB), CD150 (SLAMF1), CD278 (ICOS), CD357 (GITR), CARD11, DAP10, DAP12, FcRa, FcRp, FcRy, Fyn, Lck, LAT, LRP, NKG2D, NOTCH1, NOTCH2, NOTCH3, NOTCH4, ROR2, Ryk, Slp76, pTa, TCRa, TCRp, TRIM, Zap70, PTCH2 o cualquier combinación de los mismos. En la presente invención, el dominio de señalización intracelular comprende un dominio de señalización intracelular de CD28. En algunas realizaciones, un dominio de señalización intracelular o un fragmento funcional del mismo no comprende un CD3C.

Un “dominio de multimerización”, tal como se usa en el presente documento, se refiere a una molécula o región de polipéptido que interacciona o se asocia preferentemente con otra molécula o región de polipéptido, directa o indirectamente, en donde la interacción de los dominios de multimerización contribuye sustancialmente o promueve eficientemente la multimerización (es decir, la formación de un dímero, trímero, tetrámero o multímeros de orden superior, que pueden ser un homodímero, heterodímero, homotrímero, heterotrímero, homomultímero, heteromultímero o similares). Por ejemplo, la multimerización puede deberse a uno o más tipos de fuerzas moleculares, incluyendo enlaces covalentes (por ejemplo, enlaces o puentes disulfuro), enlaces iónicos, enlaces metálicos, interacciones electrostáticas, puentes salinos, fuerzas dipolo-dipolo, enlaces de hidrógeno, fuerzas de Van der de Waals, interacciones hidrófobas o cualquier combinación de los mismos. Un multímero es estable en condiciones apropiadas (por ejemplo, condiciones fisiológicas, en una disolución acuosa adecuada para expresar, purificar o almacenar proteínas recombinantes o modificadas por ingeniería, o en condiciones para electroforesis no desnaturalizante o no reductora). Los dominios de multimerización a modo de ejemplo pueden comprender uno o más enlaces disulfuro, un motivo de dedos de zinc, un motivo de cremallera de leucina, hélice-giro-hélice, hélicebucle-hélice o similares.

En determinadas realizaciones, una proteína de fusión puede contener un “ligador”, que puede proporcionar una función espaciadora para facilitar la interacción de dos proteínas de fusión de cadena sencilla, o el posicionamiento de uno o más dominios de unión, de modo que la estructura polipeptídica resultante mantenga una afinidad de unión específica a una molécula diana o mantenga la actividad de señalización (por ejemplo, actividad del dominio efector) o ambas. Los ligadores a modo de ejemplo incluyen de desde una hasta aproximadamente diez repeticiones de Gly<x>Ser<y>, en la que x e y son independientemente un número entero de desde 1 hasta 5.

“Aminoácidos de unión” o “residuos de aminoácidos de unión” se refieren a uno o más (por ejemplo, aproximadamente 2-20) residuos de aminoácidos entre dos motivos, regiones o dominios adyacentes de una proteína de fusión, tal como entre un dominio de unión y un componente hidrófobo adyacente, o en uno o ambos extremos de un componente hidrófobo. Los aminoácidos de unión pueden resultar del diseño del constructo de una proteína de fusión (por ejemplo, residuos de aminoácidos resultantes del uso de un sitio de enzima de restricción durante la construcción de una molécula de ácido nucleico que codifica para una proteína de fusión). En determinadas realizaciones, los aminoácidos de unión forman un ligador, tal como aquellos que tienen de desde una hasta aproximadamente diez repeticiones de Gly<x>Ser<y>, en la que x e y son independientemente un número entero de desde 1 hasta 5.

Tal como se usa en el presente documento, una “célula del sistema inmunitario” significa cualquier célula del sistema inmunitario que se origina a partir de una célula madre hematopoyética en la médula ósea, que da origen a dos linajes principales, una célula progenitora mieloide (que da origen a células mieloides tales como monocitos, macrófagos, células dendríticas, megacariocitos y granulocitos) y una célula progenitora linfoide (que da lugar a células linfoides tales como células T, células B y células linfocíticas naturales (NK)). Las células del sistema inmunitario a modo de ejemplo incluyen una célula T CD4+, una célula T CD8+, una célula T CD4- CD8- doble negativa, una célula T y8, una célula T reguladora, una célula linfocítica natural y una célula dendrítica. Los macrófagos y las células dendríticas pueden denominarse “células presentadoras de antígenos” o “APC”, que son células especializadas que pueden activar las células T cuando un receptor del complejo mayor de histocompatibilidad (CMH) en la superficie de la APC, que forma un complejo con un péptido, interacciona con un TCR en la superficie de una célula T.

Una “célula T” es una célula del sistema inmunitario que madura en el timo y produce receptores de células T (TCR). Las células T pueden estar indiferenciadas (no expuestas al antígeno; expresión aumentada de CD62L, CCR7, CD28, CD3, CD127 y CD45RA y expresión disminuida de CD45RO en comparación con T<cm>), células T de memoria (T<m>) (expuestas a antígenos y de larga duración) y células efectoras (expuestas a antígenos, citotóxicas). T<m>puede dividirse adicionalmente en subconjuntos de células T de memoria central (T<cm>, expresión aumentada de CD62L, CCR7, CD28, CD127, CD45RO y CD95 y expresión disminuida de CD54RA en comparación con las células T indiferenciadas) y células T de memoria efectoras (T, expresión disminuida de CD62L, CCR7, CD28, CD45RA y expresión aumentada de CD127 en comparación con células T indiferenciadas o T<cm>). Las células T efectoras (T<e>) se refieren a linfocitos T citotóxicos CD8+ expuestos a antígenos que tienen una expresión disminuida de CD62L, CCR7, CD28 y son positivos para granzima y perforina en comparación con T<cm>. Otras células T a modo de ejemplo incluyen células T reguladoras, tales como células T reguladoras CD4+, CD25+ (Foxp3+) y células Treg17, así como células T restringidas Tr1, Th3, CD8+, CD28- y Qa-1.

“Receptor de células T” (TCR) se refiere a una molécula que se encuentra en la superficie de las células T (o linfocitos T) que, en asociación con CD3, es generalmente responsable de reconocer antígenos unidos a moléculas del complejo mayor de histocompatibilidad (CMH). El TCR tiene un heterodímero unido por disulfuro de las cadenas a y p altamente variables (también conocidas como TCRa y TCRp, respectivamente) en la mayoría de las células T. En un pequeño subconjunto de células T, el TCR está formado por un heterodímero de cadenas variables y y 8 (también conocidas como TCRy y TCR8, respectivamente). Cada cadena del TCR es miembro de la superfamilia de inmunoglobulinas y posee un dominio variable de inmunoglobulina N-terminal, un dominio constante de inmunoglobulina, una región transmembrana y una cola citoplasmática corta en el extremo C-terminal (véase Janewayet al.,Immunobiology): The Immune System in Health and Disease, 3.a ed., Current Biology Publications, pág. 4:33, 1997). El TCR, tal como se usa en la presente divulgación, puede ser de diversas especies animales, incluyendo humanos, ratones, ratas, gatos, perros, cabras, caballos u otros mamíferos. Los TCR pueden estar unidos a células (es decir, tener una región o dominio transmembrana) o en forma soluble.

“Moléculas del complejo mayor de histocompatibilidad” (moléculas de CMH), que se usan indistintamente y se entiende que también se refieren al antígeno leucocitario humano (moléculas de HLA) homólogo humano, se refieren a glicoproteínas que transportan antígenos peptídicos a una superficie celular. Las moléculas de CMH de clase I son heterodímeros que consisten en una cadena a que atraviesa la membrana (con tres dominios a) y una microglobulina p2 asociada no covalentemente. Las moléculas de CMH de clase II se componen de dos glicoproteínas transmembrana, a y p, ambas de las cuales atraviesan la membrana. Cada cadena tiene dos dominios. Las moléculas de CMH (HLA) de clase I transportan péptidos que se originan en el citosol a la superficie celular, donde el complejo péptido:CMH (o péptido:HLA en humanos) es reconocido por las células T CD8<+>. Las moléculas de CMH (HLA) de clase II transportan péptidos que se originan en el sistema vesicular a la superficie celular, donde son reconocidos por las células T CD4<+>. Una molécula de CMH puede ser de diversas especies animales, incluyendo humanos, ratones, ratas u otros mamíferos.

“Molécula de ácido nucleico” o polinucleótido, puede estar en forma de ARN o ADN, que incluye ADNc, ADN genómico y ADN sintético. Una molécula de ácido nucleico puede ser bicatenaria o monocatenaria y, si es monocatenaria, puede ser la hebra codificante o no codificante (hebra antisentido). Una molécula codificante puede tener una secuencia codificante idéntica a una secuencia codificante conocida en la técnica o puede tener una secuencia codificante diferente que, como resultado de la redundancia o degeneración del código genético, o mediante corte y empalme, puede codificar para el mismo polipéptido.

También se contemplan variantes de las moléculas de ácido nucleico o polinucleótidos de esta divulgación. Los polinucleótidos variantes son al menos el 90 % y preferiblemente el 95 %, el 99 % o el 99,9 % idénticos a uno de los polinucleótidos de secuencia definida tal como se describe en el presente documento, o que se hibrida con uno de esos polinucleótidos de secuencia definida en condiciones de hibridación rigurosas de cloruro de sodio 0,015 M, citrato de sodio 0,0015 M a aproximadamente 65-68 °C o cloruro de sodio 0,015 M, citrato de sodio 0,0015 M y formamida al 50 % a aproximadamente 42 °C. Las variantes de polinucleótidos conservan la capacidad de codificar para un dominio de unión o una proteína de fusión del mismo que tiene la funcionalidad descrita en el presente documento.

El término “riguroso” se usa para referirse a condiciones que habitualmente se entienden en la técnica como rigurosas. La rigurosidad de la hibridación está determinada principalmente por la temperatura, la fuerza iónica y la concentración de agentes desnaturalizantes tales como la formamida. Ejemplos de condiciones rigurosas para la hibridación y el lavado son cloruro de sodio 0,015 M, citrato de sodio 0,0015 M a aproximadamente 65-68 °C o cloruro de sodio 0,015 M, citrato de sodio 0,0015 M y formamida al 50 % a aproximadamente 42 °C (véase Sambrooket al.,Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2.a edición, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, Nueva York, 1989).

También pueden usarse condiciones más rigurosas (tales como temperatura más alta, fuerza iónica más baja, formamida más alta u otro agente desnaturalizante); sin embargo, la tasa de hibridación se verá afectada. En los casos en los que se refiere a la hibridación de desoxioligonucleótidos, las condiciones de hibridación rigurosas a modo de ejemplo adicionales incluyen lavado en 6x SSC, pirofosfato de sodio al 0,05 % a 37 °C (para oligonucleótidos de 14 bases), 48 °C (para oligonucleótidos de 17 bases), 55 °C (para oligonucleótidos de 20 bases) y 60°C (para oligonucleótidos de 23 bases).

Un “vector” es una molécula de ácido nucleico que es capaz de transportar otro ácido nucleico. Los vectores pueden ser, por ejemplo, plásmidos, cósmidos, virus o fagos. Un “vector de expresión” es un vector que es capaz de dirigir la expresión de una proteína codificada por uno o más genes que porta el vector cuando está presente en el entorno apropiado.

“Retrovirus” son virus que tienen un genoma de ARN. “Gammaretrovirus” se refiere a un género de la familia Retroviridae. Los gammaretrovirus a modo de ejemplo incluyen virus de células madre de ratón, virus de leucemia murina, virus de leucemia felina, virus del sarcoma felino y virus de la reticuloendoteliosis aviar.

“Lentivirus” se refiere a un género de retrovirus que son capaces de infectar células en división y no en división. Varios ejemplos de lentivirus incluyen VIH (virus de inmunodeficiencia humana: incluyendo VIH de tipo 1 y VIH de tipo 2); virus de la anemia infecciosa equina; virus de inmunodeficiencia felina (VIF); virus de la inmunodeficiencia bovina (VIB) y virus de la inmunodeficiencia símica (VIS).

Los términos “idéntico” o “porcentaje de identidad”, en el contexto de dos o más secuencias de polipéptidos o moléculas de ácido nucleico, significan dos o más secuencias o subsecuencias que son iguales o tienen un porcentaje específico de residuos de aminoácidos o nucleótidos que son iguales en una región específica (por ejemplo, el 60 %, el 65 %, el 70 %, el 75 %, el 80 %, el 85 %, el 90 %, el 91 %, el 92 %, el 93 %, el 94 %, el 95 %, el 96 %, el 97 %, el 98 %, el 99 % o el 100 % de identidad), cuando se compara y se alinea para una correspondencia máxima con respecto a una ventana de comparación, o región designada, tal como se mide usando métodos conocidos en la técnica, tales como un algoritmo de comparación de secuencias, mediante alineación manual o mediante inspección visual. Por ejemplo, los algoritmos preferidos adecuados para determinar el porcentaje de identidad de secuencia y la similitud de secuencia son los algoritmos BLAST y BLAST 2.0, que se describen en Altschulet al.(1977) Nucleic Acids Res. 25:3389 y Altschulet al.(1990) J. Mol. Biol. 215:403, respectivamente. “Tratar” o “tratamiento” o “mejorar” se refiere al abordaje médico de una enfermedad, trastorno o afección de un sujeto (por ejemplo, un mamífero humano o no humano, tal como un primate, caballo, perro, ratón o rata). En general, se administra una dosis o régimen de tratamiento apropiado que comprende una célula huésped que expresa una proteína de fusión de esta divulgación, y opcionalmente un adyuvante o terapia complementaria, en una cantidad suficiente para provocar un beneficio terapéutico o profiláctico. El beneficio terapéutico o profiláctico/preventivo incluye un desenlace clínico mejorado; reducción o alivio de los síntomas asociados con una enfermedad; aparición disminuida de síntomas; calidad de vida mejorada; estado libre de enfermedad más largo; disminución de la extensión de la enfermedad, estabilización del estado patológico; retraso de la evolución de la enfermedad; remisión; supervivencia; supervivencia prolongada; o cualquier combinación de los mismos.

Una “cantidad terapéuticamente eficaz” o “cantidad eficaz” de una proteína de fusión o célula que expresa una proteína de fusión de esta divulgación (por ejemplo, CD200R-CD28, CD200R-CD28-41BB u otras proteínas de fusión de este tipo), en el contexto de una enfermedad o afección que está tratándose, se refiere a esa cantidad de proteína de fusión o número de células suficiente para dar como resultado la mejora de uno o más síntomas de la enfermedad que está tratándose de una manera estadísticamente significativa (por ejemplo, reduciendo la infección, reduciendo el tamaño del tumor, inhibiendo el crecimiento del cáncer o similares).

Proteínas de fusión inmunomoduladoras (IFP)

En determinados aspectos, las proteínas de fusión son capaces de proporcionar una señal positiva o coestimuladora en respuesta a un acontecimiento de unión que en un entorno natural daría como resultado una señal inhibidora.

En algunas realizaciones, la proteína de fusión es tal que se logra una distancia particular. Por ejemplo, en algunas realizaciones, un complejo proteína de fusión::diana (tal como uno compuesto por una porción extracelular de un complejo formado entre la proteína de fusión y la diana mediante unión específica a la misma) tiene una longitud particular o abarca una distancia particular, tal como una distancia de hasta una distancia entre membranas en una sinapsis inmunitaria, o la distancia abarcada por la porción extracelular de un complejo relacionado entre un TCR y una molécula de CMH, por ejemplo, tras el reconocimiento específico de la misma por un TCR, o la distancia abarcada por la porción extracelular de un complejo formado entre la molécula natural y su pareja de unión natural. En algunas realizaciones, la distancia o longitud es suficiente para promover la colocalización de una proteína de fusión con un receptor de antígeno u otra molécula de señalización cuando se expresa en una célula inmunitaria, tal como una célula T o la entrada en una sinapsis inmunitaria.

A modo de antecedentes, una sinapsis inmunitaria es una interfaz entre células, que puede formarse entre una variedad de células, tal como entre células inmunitarias (Rossyet al.,Frontiers in Immunol. 3: 1-12, 2012; Hatherleyet al.,Structure 21:820, 2013). Por ejemplo, en el caso de que una célula T entre en contacto con una célula presentadora de antígeno (APC), puede formarse una sinapsis inmunitaria mediante la unión de un TCR (que se encuentra en la superficie de una célula T) con un complejo HLA-péptido (CMH-péptido para no humanos) (que se encuentra en la superficie de, por ejemplo, APC; las moléculas de HLA de clase I pueden encontrarse en la superficie de todas las células nucleadas, mientras que el HLA de clase II puede expresarse condicionalmente en todos los tipos de células, pero se encuentran regularmente en APC). Además, una sinapsis inmunitaria puede organizarse en agrupamientos de activación supramoleculares (SMAC), que pueden afectar la activación de los linfocitos, dirigir la presentación del complejo antígeno-HLA (o antígeno-CMH) a los linfocitos y dirigir la secreción de citocinas o gránulos líticos entre las células. Un SMAC puede estar compuesto por tres estructuras dispuestas en círculos concéntricos: una región central (cSMAC) que contiene un alto número de TCR, así como moléculas coestimuladoras e inhibidoras, una región periférica (pSMAC) en la que se agrupan LFA-1 y talinas, y una región distal (dSMAC) que está enriquecida en moléculas CD43 y CD45. En determinadas realizaciones, una sinapsis inmunitaria abarcará desde aproximadamente 10 nm hasta aproximadamente 15 nm. Por ejemplo, las interacciones de proteínas que se encuentran dentro de la sinapsis inmunitaria, tales como la interacción TCR::HLA-péptido o una interacción proteína de fusión-diana, generalmente abarcan aproximadamente 14 nm entre membranas. En determinadas realizaciones, la anchura de un SMAC en una sinapsis inmunitaria no supera los 15 nm.

En algunas realizaciones, la extensión extracelular de un complejo proteína de fusión::diana es tal que puede localizarse en un compartimento particular de una sinapsis inmunitaria. Algunos complejos que se cree que se localizan en diversos compartimentos de la sinapsis inmunitaria están bien caracterizados con respecto a la longitud de su extensión extracelular. Por ejemplo, se cree que el complejo CMH-TCR tiene una extensión extracelular de aproximadamente 10-15 nm y se cree que más complejos basados en integrinas tienen extensiones extracelulares del orden de aproximadamente 40 nm (Alakoskelaet al.,Biophys J 100: 2865, 2011). Los complejos a modo de ejemplo adicionales incluyen el complejo CD2-CD48, que se cree que tiene una extensión extracelular de aproximadamente 12,8 nm (Milsteinet al.,J Biol Chem 283:34414, 2008). Además, las moléculas de unión a ligando a modo de ejemplo que se cree que se localizan en el cSMAC incluyen los complejos TCR y CMH, CD2, CD4, CD8, CD28 y ligandos de los mismos (Dustinet al.,CSH Perspectives in Biology 2:a002311, 2010); por tanto, se contempla que estas moléculas, que forman complejos con sus ligandos naturales, tengan un tamaño apropiado para localizarse en el cSMAC.

En algunos aspectos, puede determinarse o modelarse mediante métodos conocidos la longitud o distancia o la longitud o distancia aproximada de un constructo particular o porción extracelular modificada por ingeniería de la misma tal como una porción extracelular de una proteína de fusión o complejo de cualquiera de los anteriores, tal como con una pareja de unión de la misma. En algunos modelos a modo de ejemplo, la estructura terciaria, los dominios de unión y otras características de una proteína pueden aproximarse usando una secuencia de aminoácidos o de ácidos nucleicos de entrada. La estructura terciaria de una proteína puede usarse para aproximar el tamaño de la porción extracelular, la flexibilidad y otras características útiles para determinar la longitud aproximada de la porción extracelular de la proteína o complejo de la misma. En general, se conocen métodos para modelar o aproximar la longitud de la porción extracelular de una proteína. Por ejemplo, molbiol-tools.ca y Swiss-Model contienen múltiples herramientas útiles para predecir la estructura de proteínas (véase también Schwede, T., Structure 21:1531, 2013).

En determinadas realizaciones, una proteína de fusión de esta divulgación que forma complejos, está asociada o que interacciona con una diana es capaz de residir dentro de una sinapsis inmunitaria. En algunas realizaciones, la porción extracelular de un complejo proteína de fusión::diana abarca una sinapsis inmunitaria. En otras realizaciones, un complejo proteína de fusión::diana se localiza en un agolpamiento de activación supramolecular (SMAC), tal como un cSMAC. En realizaciones adicionales, la porción extracelular de un complejo proteína de fusión::diana abarca una sinapsis inmunitaria definida por la porción extracelular de una interacción TCR::HLA-péptido. En realizaciones todavía adicionales, la longitud de la porción extracelular de un complejo proteína de fusión::diana es de aproximadamente 12 nm a aproximadamente 15 nm o es de aproximadamente 14 nm.

La distancia entre las membranas celulares de las células que interaccionan en una sinapsis inmunitaria puede medirse mediante cualquier método conocido en la técnica. Por ejemplo, en realizaciones particulares, la distancia puede medirse mediante un método de resolución de subdifracción o microscopía electrónica (James y Vale, Nature 487:64-69, 2012).

En realizaciones particulares, una proteína de fusión tal como se describe en el presente documento comprende una porción extracelular que se extiende menos de 40 nm desde la membrana celular. En algunas realizaciones, una proteína de fusión tal como se divulga en el presente documento comprende una porción extracelular que se extiende menos de 30 nm desde la membrana celular. En algunas realizaciones, una proteína de fusión tal como se divulga en el presente documento comprende una porción extracelular que se extiende menos de 20 nm desde la membrana celular. En algunas realizaciones, una proteína de fusión tal como se divulga en el presente documento comprende una porción extracelular que se extiende menos de 15 nm desde la membrana celular.

En algunas realizaciones, las proteínas de fusión proporcionadas proporcionan la ventaja de tener una longitud extracelular o distancia espacial en comparación con la distancia entre la(s) membrana(s) celular(es) que permite la entrada en una sinapsis o colocalización con el receptor de antígeno, o que imita una distancia o longitud presente en las proteínas naturales. En algunas realizaciones, cuando la porción extracelular de la proteína de fusión incluye dominio(s) de una molécula adicional, que es/son de una molécula diferente de la que se obtiene un dominio de unión, la longitud del componente extracelular que contiene el dominio de unión se reduce, por ejemplo, se trunca, en comparación con la región extracelular de la molécula natural, para proporcionar una longitud o distancia similar. En algunas realizaciones, una proteína de fusión tal como se describe en el presente documento comprende un componente extracelular que comprende un dominio extracelular de un receptor de la superficie celular y un segundo dominio (por ejemplo, un ligador o un dominio extracelular de un segundo receptor de la superficie celular). En algunas de estas realizaciones, para mantener un componente extracelular capaz de residir dentro de una sinapsis inmunitaria o abarcar una sinapsis inmunitaria cuando forma complejo con una molécula diana, pueden truncarse uno o más dominios del componente extracelular.

En algunas enfermedades (por ejemplo, cáncer), la amplitud y la calidad de una respuesta de células T resultante del reconocimiento de antígeno por un receptor de células T (TCR) pueden desregularse (por ejemplo, reducirse) debido a un desequilibrio entre las señales coestimuladoras e inhibidoras, lo que puede dar como resultado resistencia inmunitaria. Una ventaja de determinadas proteínas de fusión de la presente divulgación es que una primera señal puede convertirse en una segunda señal cualitativamente diferente. Por ejemplo, en algunas realizaciones, las proteínas de fusión son tales que una señal negativa o inhibidora puede convertirse efectivamente en una señal positiva o coestimuladora para aliviar o minimizar de ese modo la resistencia inmunitaria asociada con una enfermedad, tal como el cáncer. Por ejemplo, al unirse a una diana que, si se uniera por su pareja de unión natural, daría como resultado la inhibición o la provisión de una señal negativa, una proteína de fusión tal como se proporciona en el presente documento, en algunas realizaciones, es capaz de, en cambio, proporcionar una señal positiva, por ejemplo, señal coestimuladora, a una célula en la que se expresa, tal como en una célula T. En determinadas realizaciones, una proteína de fusión de esta divulgación comprende un componente extracelular asociado con una señal negativa y un componente intracelular asociado con una señal positiva.

Las proteínas de fusión de la presente divulgación pueden bloquear o reducir el número de señales inhibidoras recibidas por una célula inmunitaria. Por ejemplo, en algunas realizaciones, una proteína de fusión tal como se divulga en el presente documento convierte una señal inhibidora en una señal positiva, reduciendo así el número total de señales inhibidoras recibidas por una célula inmunitaria o convirtiendo una señal normalmente negativa o inhibidora en una positiva. En otras realizaciones, una proteína de fusión tal como se divulga en el presente documento bloquea la señalización de un receptor de tipo natural. Por ejemplo, las proteínas de fusión negativas dominantes se incluyen dentro del alcance de la divulgación. En algunas realizaciones, una proteína de fusión tal como se divulga en el presente documento se une a un receptor de tipo natural y bloquea la señalización del receptor de tipo natural formando un oligómero con el receptor de tipo natural.

Aún otra ventaja de determinadas proteínas de fusión de la presente divulgación es que una célula puede expresar más de una de tales proteínas de fusión, proporcionando múltiples señales estimuladoras. Se ha observado que los TCR recombinantes que poseen múltiples dominios coestimuladores pueden no producir una señalización coestimuladora adecuada. La expresión conjunta de múltiples proteínas de fusión inmunomoduladoras, especialmente aquellas capaces de residir dentro de una sinapsis inmunitaria, puede proporcionar la señalización coestimuladora necesaria para que las células T eviten la anergia y proliferen.

En algunas realizaciones, una proteína de fusión de la presente divulgación actúa entranscon respecto a un TCR o un receptor de antígeno quimérico (CAR) u otro receptor de antígeno. En algunas realizaciones, una proteína de fusión tal como se describe en el presente documento actúa fuera de la sinapsis inmunitaria.

En aún otro aspecto, una proteína de fusión de la presente divulgación permite el enriquecimiento de células T transducidas mediante reestimulación con células tumorales que expresan un ligando que se une a la proteína de fusión, sin necesidad de clasificación.

En una realización a modo de ejemplo, se proporciona una proteína de fusión que comprende (a) una porción extracelular de un CD200R, (b) un dominio transmembrana de un CD28 y (c) un dominio de señalización intracelular de un CD28. En algunas realizaciones, la porción extracelular comprende además una porción extracelular de un CD28 que se extiende desde el dominio transmembrana de<c>D28. En realizaciones adicionales, la porción extracelular del CD200R comprende al menos aproximadamente 231 aminoácidos del extremo N-terminal del CD200R. En realizaciones todavía adicionales, la proteína de fusión comprende además un dominio de señalización intracelular de un CD137 (4-1BB).

Las partes de componentes de las proteínas de fusión de la presente divulgación se describen con más detalle en el presente documento.

Componente extracelular

Tal como se describe en el presente documento, una proteína de fusión de la presente divulgación generalmente comprende un componente extracelular que comprende un dominio de unión que se une específicamente a una diana. La unión de una diana mediante el dominio de unión a la proteína de fusión puede (1) bloquear la interacción de la diana con otra molécula (por ejemplo, bloquear o interferir con una interacción receptor-ligando), (2) interferir, reducir o eliminar determinadas funciones de la diana (por ejemplo, transducción de señales inhibidoras), (3) inducir determinadas rutas biológicas que normalmente no se inducen cuando la diana está unida (por ejemplo, convertir una señal inhibidora o negativa en una señal estimuladora o positiva), tal como en una célula en la que la proteína de fusión está expresada, o cualquier combinación de los mismos.

Los dominios de unión que comprenden un ectodominio de CD200R se encuentran dentro del alcance de esta divulgación. Tal como se usa en el presente documento, un “ectodominio” de un receptor o ligando de la superficie celular incluye un dominio extracelular completo o un fragmento funcional (de unión) del mismo. En determinadas realizaciones, un ectodominio comprende un dominio extracelular mutado o un fragmento funcional (de unión) del mismo que tiene una mayor avidez por la diana en comparación con una proteína de tipo natural o de referencia. En determinadas realizaciones, un ectodominio comprende un dominio de tipo variable o una CDR de un dominio de tipo variable.

Una proteína de fusión de la invención contiene un componente extracelular que comprende un ectodominio de CD200R o una porción de unión a CD200 del mismo. A modo de antecedentes, CD200R es un receptor que se une a CD200, una proteína de membrana de tipo 1 de la superfamilia de las inmunoglobulinas (Tonkset al.,Leukemia 21:566-568, 2007). Se ha informado que CD200 está regulada por incremento en diversas neoplasias malignas, incluyendo leucemias, mieloma múltiple y diversos tumores sólidos (por ejemplo, melanoma, carcinoma de mama y carcinoma de células escamosas). De hecho, altos niveles de expresión de CD200 se han relacionado con un mal pronóstico para la leucemia mieloide aguda (LMA), y se ha demostrado que la señalización de CD200R tiene un efecto inhibidor sobre las células T (Coleset al.,Leukemia 26: 2148-2151, 2012). En determinadas realizaciones, un ectodominio de CD200R incluye una porción extracelular de longitud completa de una proteína CD200R, una porción extracelular madura de longitud completa de una proteína CD200R, un fragmento de unión de una porción extracelular de una proteína CD200R, o un fragmento de unión de una porción extracelular de una proteína CD200R junto con una porción del dominio transmembrana de CD200R, o cualquier combinación de los mismos.

En realizaciones adicionales, un CD200R está codificado por una molécula de ácido nucleico tal como se expone en SEQ ID NO: 2. En determinadas otras realizaciones, un ectodominio de CD200R comprende al menos 200 aminoácidos del extremo N-terminal de CD200R. En algunas otras realizaciones, un CD200R está codificado por una molécula de ácido nucleico tal como se expone en SEQ ID NO: 11. En realizaciones todavía adicionales, una porción extracelular del CD200R comprende al menos 180, 190, 200, 210, 220, 230, 231, 234 ó 243 aminoácidos del extremo N-terminal del CD200R. Por ejemplo, en determinadas realizaciones, un CD200R está codificado por la molécula de ácido nucleico tal como se expone en SEQ ID NO: 8. En cualquiera de las realizaciones mencionadas anteriormente, un CD200R, un ectodominio de CD200R o cualquier fragmento de CD200R del mismo usado en una proteína de fusión de esta divulgación es un CD200R humano. En realizaciones adicionales, se proporcionan ectodominios de CD200R que tienen una secuencia que es al menos el 80 %, al menos el 85 %, al menos el 90 %, al menos el 91 %, al menos el 92 %, al menos el 93 %, al menos el 94 %, al menos el 95 %, al menos el 96 %, al menos el 97 %, al menos el 98 %, al menos el 99 %, al menos el 99,5 % o al menos el 100 % idéntica a un ectodominio de una molécula que tiene una secuencia de aminoácidos codificada por un molécula de ácido nucleico tal como se expone en SEQ ID NO: 2.

En algunas realizaciones, un CD200R comprende una secuencia de aminoácidos tal como se expone en SEQ ID NO: 25. En algunas realizaciones, un CD200R comprende una secuencia de aminoácidos tal como se expone en SEQ ID NO: 34. En determinadas realizaciones, un CD200R comprende una secuencia de aminoácidos tal como se expone en SEQ ID NO: 31. En cualquiera de las realizaciones mencionadas anteriormente, un CD200R, un ectodominio de CD200R o cualquier fragmento de CD200R del mismo usado en una proteína de fusión de esta divulgación es un CD200R humano. En realizaciones adicionales, se proporcionan ectodominios de CD200R que tienen una secuencia que es al menos el 80 %, al menos el 85 %, al menos el 90 %, al menos el 91 %, al menos el 92 %, al menos el 93 %, al menos el 94 %, al menos el 95 %, al menos el 96 %, al menos el 97 %, al menos el 98 %, al menos 9 el 9 %, al menos el 99,5 % o al menos el 100 % idéntica a un ectodominio de una molécula que tiene una secuencia de aminoácidos tal como se expone en SEQ ID NO: 25.

En determinados aspectos, una proteína de fusión según la presente divulgación tiene un componente extracelular compuesto por una porción extracelular de un CD200R, en el que el componente extracelular incluye opcionalmente uno o más otros subcomponentes o dominios funcionales, tales como un dominio de multimerización, un ligador, aminoácidos de unión, o cualquier combinación de los mismos.

En determinadas realizaciones, una proteína de fusión divulgada en el presente documento comprende además una región extracelular adicional, tal como un espaciador o un dominio de multimerización. Por ejemplo, en algunos aspectos un dominio de multimerización está contenido en o forma parte del componente extracelular de la proteína de fusión. Por ejemplo, puede crearse un dominio de multimerización alterando (por ejemplo, mutando) el componente extracelular, o puede crearse un dominio de multimerización añadiendo de 1 a aproximadamente 50 residuos de aminoácidos al componente extracelular. Puede ubicarse un dominio de multimerización entre el dominio de unión del componente extracelular y el componente hidrófobo de una proteína de fusión de esta divulgación. En determinadas realizaciones, una proteína de fusión expresada en una superficie celular comprende un dominio de multimerización dentro del componente extracelular y está próxima a la membrana celular, dentro de uno a 50 aminoácidos del componente hidrófobo. Por ejemplo, un dominio de multimerización de proteínas de fusión puede comprender uno o más residuos de cisteína ubicados dentro de 30, 25, 20, 15, 14, 13, 12, 11, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2, 1 ó 0 aminoácidos del componente hidrófobo de la proteína de fusión, en el que uno o más residuos de cisteína de este tipo de una proteína de fusión pueden formar uno o más puentes disulfuro con una o más proteínas de fusión diferentes. En algunas realizaciones, la porción extracelular adicional deriva de la misma molécula a partir de la que deriva una región transmembrana o estimuladora de la proteína de fusión.

En realizaciones adicionales, la(s) interacción/interacciones entre dominios de multimerización de dos o más proteínas de fusión contribuyen sustancialmente a o promueven eficazmente la transducción de señales (por ejemplo, estimulación o activación de células inmunitarias) en comparación con un monómero de proteína de fusión. En determinadas realizaciones, la multimerización de proteínas de fusión promueve la transducción de señales en una célula huésped de manera estadísticamente significativa con respecto a los monómeros de proteínas de fusión. En realizaciones adicionales, la multimerización de proteínas de fusión que promueve o potencia la transducción de señales en una célula huésped se realiza a través de un puente disulfuro.

Un multímero a modo de ejemplo es un “dímero”, que se refiere a una entidad biológica que contiene dos moléculas, tales como dos proteínas de fusión, asociadas entre sí. Un dímero de este tipo se considera un “homodímero” cuando las dos proteínas de fusión asociadas tienen secuencias de aminoácidos sustancialmente similares o idénticas. De manera similar, la multimerización de tres proteínas de fusión sustancial o totalmente idénticas se denomina “homotrímero”. En algunas realizaciones, un dominio de multimerización comprende al menos un residuo de cisteína, en el que un residuo de cisteína del dominio de multimerización de una primera proteína de fusión puede formar un puente disulfuro con un residuo de cisteína del dominio de multimerización de una segunda proteína de fusión. En determinadas realizaciones, se forma un dímero de proteína de fusión mediante un puente disulfuro. En otras realizaciones, se forma un trímero de proteína de fusión mediante dos o más puentes disulfuro. Alternativamente, un dímero, homodímero, trímero u homotrímero puede multimerizarse mediante un motivo de dedos de zinc o un motivo de cremallera de leucina. En realizaciones todavía adicionales, una proteína de fusión comprende una pluralidad de dominios de multimerización, que pueden ubicarse extracelularmente, intracelularmente o ambos.

En algunas realizaciones, un dominio de multimerización contenido en el componente extracelular de una proteína de fusión comprende una porción extracelular que se extiende desde el componente hidrófobo. Por ejemplo, en algunas realizaciones, un dominio de multimerización contenido en el componente extracelular de una proteína de fusión comprende una porción extracelular de un CD28 que se extiende desde un dominio transmembrana de CD28. En algunas realizaciones, una porción extracelular de CD28 comprende aproximadamente 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15 o hasta aproximadamente 25 aminoácidos adyacentes al dominio transmembrana. En algunas realizaciones, la porción extracelular del CD28 comprende 9 aminoácidos o 12 aminoácidos adyacentes al dominio transmembrana. En algunas realizaciones, la porción extracelular de un CD28 comprende la secuencia de aminoácidos codificada por una molécula de ácido nucleico tal como se expone en SEQ ID NO: 9. En algunas realizaciones, la porción extracelular de un CD28 comprende la secuencia de aminoácidos tal como se expone en SEQ ID NO: 32. En aún otra realización a modo de ejemplo, un dominio de multimerización contenido en el componente extracelular de una proteína de fusión comprende una porción extracelular de un CD137 (4-1BB) (por ejemplo, que oscila desde uno hasta aproximadamente 50 aminoácidos) que se extiende desde un domino transmembrana de CD137 (4-1BB). En determinadas realizaciones, el dominio de multimerización y el componente hidrófobo son de proteínas diferentes. Por ejemplo, un dominio de multimerización contenido en el componente extracelular de una proteína de fusión comprende una porción extracelular de un CD28 que se extiende desde un dominio transmembrana de CD137, o comprende una porción extracelular de un CD137 que se extiende desde un dominio transmembrana de CD28. En cualquiera de las realizaciones mencionadas anteriormente, un dominio de multimerización puede comprender además un sitio de glicosilación.

En algunas realizaciones, una proteína de fusión puede contener un ligador o aminoácidos de unión que conectan, por ejemplo, un componente extracelular con un dominio de multimerización o conectan un componente extracelular con un componente hidrófobo o conectan un componente hidrófobo con un componente intracelular. En algunas realizaciones, el ligador es GlyxSery, en la que x e y son independientemente un número entero de 1 a 5.

Una molécula diana, que está unida específicamente por un dominio de unión contenido en una proteína de fusión de la presente divulgación, puede encontrarse en o estar asociada con una célula de interés (“célula diana”). Las células diana a modo de ejemplo incluyen una célula inmunitaria, una célula cancerosa, una célula asociada con una enfermedad o trastorno autoinmunitario o con una enfermedad o trastorno inflamatorio, o cualquier célula que presente un antígeno formando complejo con un CMH o un antígeno leucocitario humano (HLA). La diana es CD200.

Componente intracelular

Un componente intracelular contenido en una proteína de fusión de la presente divulgación tendrá un dominio de señalización intracelular capaz de transmitir señales funcionales a una célula. En determinadas realizaciones, un dominio de señalización intracelular promoverá indirectamente una respuesta celular asociándose con una o más proteínas que promueven directamente una respuesta celular. Un dominio de señalización intracelular puede incluir uno, dos, tres o más dominios de señalización del receptor, dominios coestimuladores o combinaciones de los mismos.

Tal como se usa en el presente documento, un “dominio de señalización intracelular” de un receptor o ligando de la superficie celular incluye un dominio intracelular completo, una porción que comprende un dominio de señalización intracelular o un fragmento funcional (de señalización) del mismo. En determinadas realizaciones, un dominio de señalización intracelular comprende un dominio intracelular mutado o un fragmento funcional (de señalización) del mismo que tiene una actividad de señalización aumentada en comparación con un dominio de señalización intracelular de tipo natural o de referencia.

Una “molécula coestimuladora”, tal como se usa en el presente documento, se refiere a un receptor o molécula de la superficie celular que puede transducir señales a células T para modular positivamente la activación de las células T (Chen y Flies, Nat. Rev. Immunol. 13: 227-242, 2013). A modo de antecedentes, la activación y la proliferación de células T requieren dos señales mediadas por la participación del receptor específico de antígeno (TCR) de las células T y una señal coestimuladora, más normalmente la unión de CD28 por CD80 y CD86 (Ledbetteret al.,Blood 75:1531, 1990).

El dominio de señalización intracelular comprende un dominio de señalización intracelular de CD28. Un dominio de señalización intracelular adicional o fragmento funcional del mismo útil en las proteínas de fusión de esta divulgación puede ser de CD3e, CD38, CD3C, CD25, CD27, CD40, CD47, CD79A, CD79B, CD134 (OX40), CD137 (4-1BB), CD150 (SLAMF1), CD278 (ICOS), CD357 (GITR), CARD11, DAP10, DAP12, FcRa, FcRp, FcRy, Fyn, Lck, LAT, LRP, NKG2D, NOTCH1, NOTCH2, NOTCH3, NOTCH4, ROR2, Ryk, Slp76, pTa, TCRa, TCRp, TRIM, Zap70, PTCH2 o cualquier combinación de los mismos. En algunas realizaciones, un dominio de señalización intracelular o fragmento funcional del mismo no comprende una señal primaria. En algunas realizaciones, un dominio de señalización intracelular no comprende un CD3^.

El dominio de señalización intracelular de una proteína de fusión de esta divulgación comprende un CD28. La señalización de CD28 promueve la proliferación de células T estimuladas a través del TCR (Chen y Flies, Nat. Rev. Immunol. 13: 227-242, 2013). CD28 forma homodímeros ligados por enlaces disulfuro, como resultado del residuo de cisteína proximal al dominio transmembrana (Lazar-Molnaret al.,Cell Immunol. 244: 125-129, 2006). En determinadas realizaciones, un dominio de señalización de CD28 incluye una porción intracelular de longitud completa de una proteína CD28, una porción intracelular madura de longitud completa de una proteína CD28, un fragmento de señalización de una porción intracelular de una proteína CD28 y un fragmento de señalización de una porción intracelular de una proteína CD28 junto con un dominio transmembrana o fragmento del mismo de CD28, o cualquier combinación de los mismos.

CD137 es una molécula coestimuladora, en la que la unión de CD137 a su ligando (4-1BBL o CD137L) está asociada con la activación y la proliferación de células T (Cheuket al.,Cancer Gene Therapy 11: 215-226, 2004). En determinadas realizaciones, un dominio de señalización de CD137 incluye una porción intracelular de longitud completa de una proteína CD137, una porción intracelular madura de longitud completa de una proteína CD137, un fragmento de señalización de una porción intracelular de una proteína CD137 y un fragmento de señalización de una porción intracelular de una proteína CD137 junto con un dominio transmembrana o fragmento del mismo de CD137, o cualquier combinación de los mismos.

En determinadas realizaciones, un dominio de señalización intracelular comprende un dominio de señalización del receptor de linfocitos o comprende secuencias de aminoácidos que tienen uno o una pluralidad de motivos de activación basados en tirosina (ITAM) de inmunorreceptores. En realizaciones todavía adicionales, un dominio de señalización intracelular comprende una porción citoplasmática que se asocia con una proteína de señalización citoplasmática, en donde la proteína de señalización citoplasmática es un receptor de linfocitos o un dominio de señalización del mismo, una proteína que comprende una pluralidad de ITAM, un factor coestimulador o cualquier combinación del mismo.

En algunas realizaciones a modo de ejemplo, la presente divulgación proporciona una proteína de fusión que tiene un componente extracelular que comprende una porción extracelular de un CD200R que se une específicamente a CD200, un componente intracelular que comprende una porción intracelular de CD28 y un componente hidrófobo que conecta los componentes extracelular e intracelular, siempre que un complejo proteína de fusión::diana abarca una distancia similar a la distancia entre membranas en una sinapsis inmunitaria.

En realizaciones particulares, un componente intracelular de una proteína de fusión de la presente divulgación comprende un dominio de señalización intracelular de CD28 y un dominio de señalización intracelular de CD137 (4-1BB). En algunas realizaciones, un componente intracelular comprende una secuencia de aminoácidos codificada por una molécula de ácido nucleico tal como se expone en SEQ ID NO: 5 y la secuencia de aminoácidos codificada por la secuencia de nucleótidos tal como se expone en SEQ ID NO: 13.

Componente hidrófobo

Una porción hidrófoba contenida en una proteína de fusión de cadena sencilla de la presente divulgación permitirá que una proteína de fusión de esta divulgación se asocie con una membrana celular de manera que una porción de la proteína de fusión se ubicará extracelularmente y una porción se ubicará intracelularmente (por ejemplo, dominio de señalización intracelular). Generalmente se dispondrá un componente hidrófobo dentro de la bicapa de fosfolípidos de la membrana celular. En determinadas realizaciones, pueden disponerse uno o más aminoácidos de unión entre y conectando una porción hidrófoba con un dominio de señalización intracelular.

En determinadas realizaciones, un dominio hidrófobo es un dominio transmembrana, tal como uno derivado de una proteína integral de membrana (por ejemplo, receptor, molécula de agrupamiento de diferenciación (CD), enzima, transportador, molécula de adhesión celular o similares). En algunas realizaciones, el dominio hidrófobo comprende un dominio transmembrana que se encuentra en o deriva de una proteína integral de membrana, en el que el dominio transmembrana se ha modificado mediante la adición, eliminación o reemplazo de uno o más aminoácidos con al menos un aminoácido diferente o cualquier combinación de los mismos, tales como residuos cargados o hidrófilos que faciliten las interacciones intermoleculares. Por tanto, el término “dominio hidrófobo” incluye dominios transmembrana que tienen, por ejemplo, modificaciones que pueden reducir la hidrofobicidad.

En algunas realizaciones, el componente hidrófobo comprende un dominio transmembrana de CD2, CD3e, CD38, CD3C, CD25, CD27, CD28, CD40, CD47, CD79A, CD79B, CD80, CD86, CD95 (Fas), CD134 (OX40), CD137 (4-1BB), CD150 (SLAMF1), CD152 (CTLA4), CD200R, CD223 (LAG3), CD270 (HVEM), CD272 (BTLA), CD273 (PD-L2), CD274 (PD-L1), CD278 (ICOS), CD279 (PD-1), TIM3, CD300, CD357 (GITR), A2aR, DAP10, FcRa, FcRp, FcRy, Fyn, GAL9, KIR, Lck, LAT, LPA5, LRP, NKG2D, NOTCH1, NOTCH2, NOTCH3, NOTCH4, PTCH2, ROR2, Ryk, Slp76, SIRPa, pTa, TCRa, TCRp, TIM3, TRIM o Zap70. En realizaciones particulares, una porción hidrófoba es un dominio transmembrana de CD28, CD4, CD8, CD27 o CD137 (4-1BB). En determinadas realizaciones, un dominio transmembrana es un dominio transmembrana de CD28 que tiene una secuencia de aminoácidos codificada por una molécula de ácido nucleico tal como se expone en SEQ ID NO: 4. En determinadas otras realizaciones, un dominio transmembrana es un dominio transmembrana de CD200R que tiene una secuencia de aminoácidos codificada por una molécula de ácido nucleico tal como se expone en SEQ ID NO: 3. En todavía otras realizaciones, un dominio transmembrana es un dominio transmembrana de SIRPa que tiene una secuencia de aminoácidos codificada por una molécula de ácido nucleico tal como se expone en SEQ ID NO: 18. En realizaciones adicionales, un dominio transmembrana es un dominio transmembrana de CD2 que tiene una secuencia de aminoácidos codificada por una molécula de ácido nucleico tal como se expone en SEQ ID NO: 63. En realizaciones todavía adicionales, un dominio transmembrana es un dominio transmembrana de Fas que tiene una secuencia de aminoácidos codificada por una molécula de ácido nucleico tal como se expone en SEQ ID NO: 77. En realizaciones todavía adicionales, un dominio transmembrana es un dominio transmembrana de TIM3. En realizaciones todavía adicionales, un dominio transmembrana es un dominio transmembrana de TIM3 que tiene una secuencia de aminoácidos codificada por una molécula de ácido nucleico tal como se expone en SEQ ID NO: 169. En realizaciones todavía adicionales, un dominio transmembrana es un dominio transmembrana de LAG3. En algunas realizaciones, un dominio transmembrana es un dominio transmembrana de LAG3 que tiene una secuencia de aminoácidos codificada por una molécula de ácido nucleico tal como se expone en SEQ ID NO: 155.

Ácidos nucleicos y células huésped

En determinados aspectos, la presente divulgación proporciona moléculas de ácido nucleico que codifican para una cualquiera o más de las proteínas de fusión descritas en el presente documento, que pueden ser proteínas de fusión inmunomoduladoras (IFP). Tales moléculas de ácido nucleico pueden insertarse en un vector apropiado (por ejemplo, un vector viral o un vector plásmido no viral) para su introducción en una célula huésped de interés (por ejemplo, célula progenitora hematopoyética, célula T).

Tal como se usa en el presente documento, el término “recombinante” o “no natural” se refiere a un organismo, microorganismo, célula, molécula de ácido nucleico o vector que incluye al menos una alteración genética o que se ha modificado mediante la introducción de una molécula de ácido nucleico exógena, en el que tales alteraciones o modificaciones se introducen mediante ingeniería genética. Las alteraciones genéticas incluyen, por ejemplo, modificaciones que introducen moléculas de ácido nucleico expresables que codifican para proteínas, proteínas de fusión o enzimas, u otras adiciones, deleciones, sustituciones de moléculas de ácido nucleico u otras alteraciones funcionales del material genético de una célula. Las modificaciones adicionales incluyen, por ejemplo, regiones reguladoras no codificantes en las que las modificaciones alteran la expresión de un gen u operón. En determinadas realizaciones, una célula, tal como una célula T, obtenida de un sujeto puede convertirse en una célula no natural o recombinante (por ejemplo, una célula T no natural o recombinante) mediante la introducción de un ácido nucleico que codifica para una proteína de fusión tal como se describe en el presente documento y mediante el cual la célula expresa una proteína de fusión.

En determinadas realizaciones, las moléculas de ácido nucleico que codifican para proteínas de fusión pueden someterse a optimización de codones para potenciar o maximizar la expresión en determinados tipos de células, tales como células T (Scholtenet al.,Clin. Immunol. 119: 135-145, 2006).

En una realización a modo de ejemplo, la presente divulgación proporciona una molécula de ácido nucleico que codifica para un constructo CD200R-CD28 (huCD200Rtm-CD28), en la que el componente extracelular comprende un ectodominio de CD200R, el componente hidrófobo comprende el dominio transmembrana de un CD200R y el componente intracelular comprende el dominio de señalización intracelular de un CD28. Por ejemplo, en una realización, se proporciona una molécula de ácido nucleico tal como se expone en SEQ ID NO: 1.

En otra realización a modo de ejemplo, la presente divulgación proporciona una molécula de ácido nucleico que codifica para un constructo CD200R-CD28 (huCD200R-CD28tm), en la que el componente hidrófobo comprende el dominio transmembrana de un CD28. Por ejemplo, en una realización, la divulgación proporciona una molécula de ácido nucleico tal como se expone en SEQ ID NO: 6.

En otras realizaciones a modo de ejemplo, la presente divulgación proporciona una molécula de ácido nucleico que codifica para un constructo CD200R-CD28, en la que el componente extracelular comprende un dominio extracelular truncado de CD200R y una porción extracelular de CD28. Por ejemplo, el dominio extracelular de CD200R puede truncarse en 9 aminoácidos (por ejemplo, huCD200R-9aas-CD28Cys, SEQ ID NO: 7) o en 12 aminoácidos (por ejemplo, huCD200R-12aas-CD28Cys, SEQ ID NO: 10).

En otra realización a modo de ejemplo, la presente divulgación proporciona una molécula de ácido nucleico que codifica para un constructo CD200R-CD28-4-1BB (huCD200R-9aas-CD28Cys tm ic 41BBic o huCD200R-12aas-CD28Cys tm ic-41BBic), en la que el componente intracelular comprende el dominio de señalización intracelular de CD28 y de CD137 (4-1BB). En una realización, por ejemplo, el ácido nucleico de la presente divulgación tiene la secuencia de nucleótidos tal como se expone en SEQ ID NO: 9 o SEQ ID NO: 15.

Un vector que codifica para un virus central se denomina en el presente documento “vector viral”. Hay una gran cantidad de vectores virales disponibles adecuados para su uso con las composiciones de la presente divulgación, incluyendo aquellos identificados para aplicaciones de terapia génica humana (véase Pfeifer y Verma, Ann. Rev. Genomics Hum. Genet. 2 : 177, 2001). Los vectores virales adecuados incluyen vectores basados en virus de ARN, tales como vectores derivados de retrovirus, por ejemplo, vectores derivados del virus de la leucemia murina de Moloney (MLV), e incluyen vectores derivados de retrovirus más complejos, por ejemplo, vectores derivados de lentivirus. Los vectores derivados de VIH-1 pertenecen a esta categoría. Otros ejemplos incluyen vectores lentivirus derivados de VIH-2, VIF, virus de la anemia infecciosa equina, VIS y virus Maedi-Visna (lentivirus ovino). Los métodos de uso de vectores virales retrovirales y lentivirales y células empaquetadoras para transducir células huésped de mamíferos con partículas virales que contienen transgenes de receptores de antígenos quiméricos se conocen en la técnica y se han descrito previamente, por ejemplo, en la patente estadounidense 8.119.772; Walchliet al.,PLoS One 6:327930, 2011; Zhaoet al.,J. Immunol. 174:4415, 2005; Engelset al.,Hum. Gene Ther. 14:1155, 2003; Frechaet al.,Mol. Ther. 18:1748, 2010; Verhoeyenet al.,Methods Mol. Biol. 506:97, 2009. También están disponibles comercialmente constructos de vectores retrovirales y lentivirales y sistemas de expresión.

En determinadas realizaciones, se usa un vector viral para introducir una secuencia de ácido nucleico no endógena que codifica para una proteína de fusión o una secuencia de ácido nucleico no endógena que codifica para una proteína de fusión específica de una diana. Un vector viral puede ser un vector retroviral o un vector lentiviral. Un vector viral también puede incluir secuencias de ácido nucleico que codifican para un marcador para la transducción. Los marcadores de transducción para vectores virales se conocen en la técnica e incluyen marcadores de selección, que pueden conferir resistencia a fármacos, o marcadores detectables, tales como marcadores fluorescentes o proteínas de la superficie celular que pueden detectarse mediante métodos tales como citometría de flujo. En realizaciones particulares, un vector viral comprende además un marcador genético para la transducción que comprende proteína verde fluorescente (GFP), un dominio extracelular de CD2 humano o un EGFR humano truncado (huEGFRt; véase Wanget al.,Blood 118:1155, 2011). Cuando un genoma de vector viral comprende una pluralidad de secuencias de ácido nucleico que van a expresarse en una célula huésped como transcritos separados, el vector viral también puede comprender secuencias adicionales entre los dos (o más) transcritos que permiten la expresión bicistrónica o multicistrónica. Los ejemplos de tales secuencias usadas en vectores virales incluyen sitios de entrada a ribosomas internos (IRES), sitios de escisión de furina, péptido viral 2A o cualquier combinación de los mismos.

También pueden usarse otros vectores para el suministro de polinucleótidos, incluyendo vectores virales de ADN, incluyendo, por ejemplo, vectores basados en adenovirus y vectores basados en virus adenoasociados (AAV); vectores derivados de virus del herpes simple (VHS), incluyendo vectores amplicones, VHS con replicación defectuosa y VHS atenuado (Kriskyet al.,Gene Ther. 5: 1517, 1998).

También pueden usarse otros vectores desarrollados recientemente para su uso en terapia génica con las composiciones y métodos de esta divulgación. Tales vectores incluyen los derivados de baculovirus y a-virus (Jolly, D J. 1999. Emerging Viral Vectors. págs. 209-40 en Friedmann T. ed. Development of Human Gene Therapy. Nueva York: Cold Spring Harbor Lab) o vectores plasmídicos (tales como Bella Durmiente u otros vectores de transposones). En algunas realizaciones, un vector viral o plasmídico comprende además un marcador genético para la transducción (por ejemplo, proteína verde fluorescente, huEGFRt).

En algunas realizaciones, un vector que codifica para una proteína de fusión tal como se divulga en el presente documento puede codificar para más de una proteína de fusión. Por ejemplo, un vector puede codificar para dos proteínas de fusión diferentes.

En algunas realizaciones, un vector que codifica para una proteína de fusión tal como se divulga en el presente documento puede comprender además un TCR específico de antígeno. En algunas realizaciones, el TCR específico de antígeno es exógeno. En algunas realizaciones, el TCR específico de antígeno es específico de un antígeno restringido a HLA (CMH) de clase I. En algunas realizaciones, el antígeno es un antígeno específico de cáncer. Las realizaciones en las que el antígeno específico de cáncer comprende WT-1, mesotelina o ciclina-A1 también se encuentran dentro del alcance de la divulgación. En todavía otras realizaciones, un vector que codifica para una proteína de fusión tal como se divulga en el presente documento codifica además para un ligando, que puede ser CD200, CD47, PD-L1 o CD58. En realizaciones todavía adicionales, un vector que codifica para una proteína de fusión tal como se divulga en el presente documento codifica además para un ARNip para reducir la expresión de un receptor endógeno. En algunas realizaciones particulares, el receptor endógeno es CD200R, SIRPa, CD279 (PD-1), CD95 (Fas) o CD2.

En algunas realizaciones, las células huésped capaces de expresar una proteína de fusión de esta divulgación en la superficie celular son células inmunitarias. En algunas realizaciones, las células huésped capaces de expresar una proteína de fusión de esta divulgación en la superficie celular son células T, incluyendo células primarias o líneas celulares derivadas de humanos, ratones, ratas u otros mamíferos. Si se obtiene de un mamífero, una célula T puede obtenerse de numerosas fuentes, incluyendo la sangre, la médula ósea, los ganglios linfáticos, el timo u otros tejidos o fluidos. Una célula T puede enriquecerse o purificarse. Las líneas de células T se conocen bien en la técnica, algunas de las cuales se describen en Sandberget al.,Leukemia 21:130, 2000. En determinadas realizaciones, se usan células T que carecen de expresión endógena de las cadenas a y p de TCR. Tales células T pueden carecer naturalmente de expresión endógena de las cadenas a y p de TCR o pueden haberse modificado para bloquear la expresión (por ejemplo, células T de un ratón transgénico que no expresa las cadenas a y p de TCR o células que se han manipulado para inhibir la expresión de las cadenas a y p de TCR) o para inactivar la cadena a de TCR, la cadena p de TCR o ambos genes. En algunas realizaciones, las células T pueden modificarse por ingeniería para expresar un TCR específico de un antígeno particular.

En determinadas realizaciones, una célula huésped transfectada para expresar una proteína de fusión de esta divulgación es una célula T funcional, tal como una célula T específica de virus, una célula T citotóxica específica de antígeno tumoral, una célula T indiferenciada, una célula T madre de memoria, una célula T de memoria central o efectora, células T y8 o una célula T reguladora CD4+ CD25+. En realizaciones adicionales, una molécula de ácido nucleico que codifica para una proteína de fusión de esta divulgación se introduce en células T CD8+, células T CD8+ indiferenciadas, células T<cm>CD8+, células TCD8+ en masa o cualquier combinación de las mismas. En realizaciones todavía adicionales, una molécula de ácido nucleico que codifica para una proteína de fusión de esta divulgación se introduce en células T CD4+, células T CD4+ indiferenciadas, células T<cm>CD4+, células TCD4+ en masa o cualquier combinación de las mismas. En otras realizaciones, una molécula de ácido nucleico que codifica para una proteína de fusión de esta divulgación se introduce en una población de células T enriquecida en células T CD8+ indiferenciadas y células Tcm CD8+. En todavía otras realizaciones, una molécula de ácido nucleico que codifica para una proteína de fusión de esta divulgación se introduce en una población de células T enriquecida en células T CD4+ indiferenciadas y células Tcm CD4+. En cualquiera de las realizaciones mencionadas anteriormente, las células T contienen además una molécula de ácido nucleico que codifica para un receptor de células T (TCR) específico de antígeno modificado por ingeniería, un TCR de alta afinidad específico de antígeno modificado por ingeniería, una molécula coestimuladora exógena, un receptor de antígeno quimérico (CAR), o cualquier combinación de los mismos.

En determinadas realizaciones, una célula huésped transfectada para expresar una proteína de fusión de esta divulgación es una célula linfocítica natural funcional.

Pueden añadirse una o más citocinas de factores de crecimiento que promueven la proliferación de células T que expresan una proteína de fusión de esta divulgación al cultivo usado para expandir las células T. Las citocinas pueden ser humanas o no humanas. Las citocinas de factores de crecimiento a modo de ejemplo que pueden usarse para promover la proliferación de células T incluyen IL2, IL15 o similares.

En determinadas realizaciones, una célula T huésped transfectada para expresar una proteína de fusión de esta divulgación es una célula T CD4+ que también expresa un TCR de alta afinidad específico de antígeno específico de un antígeno restringido a HLA (CMH) de clase I (véase Sotoet al.,Cancer Immunol Immunother. 62: 359-369, 2013). En determinadas realizaciones, una célula T huésped transfectada para expresar una proteína de fusión de esta divulgación también expresa un TCR recombinante específico de un antígeno canceroso. En algunas realizaciones, el antígeno canceroso es un WT1. “WT1” se refiere al tumor 1 de Wilm, un factor de transcripción que contiene cuatro motivos de dedos de zinc en el extremo C-terminal y un dominio de unión a ADN rico en prolina/glutamina en el extremo N-terminal. WT1 tiene un papel esencial en el desarrollo normal del sistema urogenital y está mutado en un pequeño subconjunto de pacientes con tumores de Wilm. Se ha observado una alta expresión de WT1 en diversos cánceres, incluyendo cáncer de mama, cáncer de ovario, leucemias agudas, neoplasias vasculares, melanomas, cáncer de colon, cáncer de pulmón, cáncer de tiroides, sarcoma de huesos y tejidos blandos y cáncer de esófago. Se ha observado corte y empalme alternativo para WT1.

En determinadas realizaciones, una célula T huésped transfectada para expresar una proteína de fusión de esta divulgación también expresa un TCR recombinante específico de mesotelina. “Mesotelina” (MSLN) se refiere a un gen que codifica para una proteína precursora que se escinde en dos productos, factor potenciador de megacariocitos y mesotelina. El factor de potenciación de megacariocitos funciona como una citocina que puede estimular la formación de colonias en los megacariocitos de la médula ósea. La mesotelina es una proteína de la superficie celular anclada a glicosilfosfatidilinositol que puede funcionar como proteína de adhesión celular. Esta proteína se sobreexpresa en mesoteliomas epiteliales, cánceres de ovario y en carcinomas de células escamosas específicos. El corte y empalme alternativo da como resultado múltiples variantes de transcripción.

En determinadas realizaciones, una célula T huésped transfectada para expresar una proteína de fusión de esta divulgación también expresa un TCR recombinante específico de ciclina-A1.

En determinadas realizaciones, una célula T huésped transfectada para expresar una proteína de fusión de esta divulgación también expresa un CAR.

En todavía otras realizaciones, una célula huésped que expresa una proteína de fusión tal como se divulga en el presente documento comprende además un ligando, que puede ser CD200, CD47, PD-L1 o CD58. En realizaciones todavía adicionales, una célula huésped que expresa una proteína de fusión tal como se divulga en el presente documento expresa además un ARNip para reducir la expresión de un receptor endógeno. En algunas realizaciones particulares, el receptor endógeno es CD200R, SIRPa, CD279 (PD-1), CD95 (Fas) o CD2.

En algunas realizaciones, una célula huésped que expresa una proteína de fusión tal como se divulga en el presente documento puede expresar más de una proteína de fusión. Por ejemplo, la célula huésped puede expresar dos proteínas de fusión diferentes (por ejemplo, una primera proteína de fusión que comprende un ectodominio PD-1 y una segunda proteína de fusión que comprende un ectodominio TIM3).

Usos

Las enfermedades que pueden tratarse con células que expresan proteínas de fusión tal como se describe en la presente divulgación incluyen cáncer, enfermedades infecciosas (infecciones virales, bacterianas, protozoarias), enfermedades inmunitarias (por ejemplo, autoinmunitarias) o enfermedades relacionadas con el envejecimiento (por ejemplo, senescencia). La inmunoterapia adoptiva y la terapia génica son tratamientos prometedores para diversos tipos de cáncer (Morganet al.,Science 314:126, 2006; Schmittet al.,Hum. Gene Ther. 20:1240, 2009; June, J. Clin. Invest. 117:1466, 2007) y enfermedades infecciosas (Kitchenet al.,PLoS One 4:38208, 2009; Rossiet al.,Nat.

Biotechnol. 25:1444, 2007; Zhanget al.,PLoS Pathog. 6:e1001018, 2010; Luoet al.,J. Mol. Med. 89:903, 2011).

Una amplia variedad de cánceres, incluyendo leucemias y tumores sólidos, son susceptibles a las composiciones divulgadas en el presente documento. Los tipos a modo de ejemplo de cáncer que puede tratarse incluyen adenocarcinoma de mama, próstata y colon; todas las formas de carcinoma broncogénico de pulmón; leucemia mieloide; melanoma; hepatoma; neuroblastoma; papiloma; apudoma; coristoma; branquioma; síndrome carcinoide maligno; enfermedad cardiaca carcinoide; y carcinoma (por ejemplo, de Walker, de células basales, basoescamoso, de Brown-Pearce, ductal, tumor de Ehrlich, Krebs 2, de células de Merkel, mucinoso, de pulmón de células no pequeñas, de células de avena, papilar, escirroso, bronquiolar, broncogénico, de células escamosas y células de transición). Los tipos adicionales de cánceres que pueden tratarse incluyen trastornos histiocíticos; histiocitosis maligna; leucemia; enfermedad de Hodgkin; inmunoproliferativos pequeños; linfoma no Hodgkin; plasmocitoma; reticuloendoteliosis; melanoma; condroblastoma; condroma; condrosarcoma; fibroma; fibrosarcoma; tumores de células gigantes; histiocitoma; lipoma; liposarcoma; mesotelioma; mixoma; mixosarcoma; osteoma; osteosarcoma; cordoma; craneofaringioma; disgerminoma; hamartoma; mesenquimoma; mesonefroma; miosarcoma; ameloblastoma; cementoma; odontoma; teratoma; timoma; tumor trofoblástico. Además, también se contemplan los siguientes tipos de cánceres como susceptibles a tratamiento: adenoma; colangioma; colesteatoma; ciclindroma; cistadenocarcinoma; cistadenoma; tumor de células de la granulosa; ginandroblastoma; hepatoma; hidradenoma; tumor de células de los islotes; tumor de células de Leydig; papiloma; tumor de células de Sertoli; tumor de células de la teca; leimioma; leiomiosarcoma; mioblastoma; mioma; miosarcoma; rabdomioma; rabdomiosarcoma; ependimoma; ganglioneuroma; glioma; meduloblastoma; meningioma; neurilemoma; neuroblastoma; neuroepitelioma; neurofibroma; neuroma; paraganglioma; quimiodectoma. Los tipos de cánceres que pueden tratarse también incluyen angioqueratoma; hiperplasia angiolinfoide con eosinofilia; angioma esclerosante; angiomatosis; glomangioma; hemangioendotelioma; hemangioma; hemangiopericitoma; hemangiosarcoma; linfangioma; linfangiomioma; linfangiosarcoma; pinealoma; carcinosarcoma; condrosarcoma; cistosarcoma filoides; fibrosarcoma; hemangiosarcoma; leiomiosarcoma; leucosarcoma; liposarcoma; linfangiosarcoma; miosarcoma; mixosarcoma; carcinoma de ovario; rabdomiosarcoma; sarcoma; neoplasias; nerofibromatosis; y displasia de cuello uterino.

Un ejemplo de la variedad de trastornos hiperproliferativos susceptibles a una terapia con células T con proteína de fusión son los cánceres de células B, incluyendo los linfomas de células B (tales como diversas formas de enfermedad de Hodgkin, linfoma no Hodgkin (LNH) o linfomas del sistema nervioso central), leucemias (tales como leucemia linfoblástica aguda (LLA), leucemia linfocítica crónica (LLC), leucemia de células pilosas, transformación blástica de células B de la leucemia mieloide crónica) y mielomas (tales como mieloma múltiple). Los cánceres de células B adicionales incluyen linfoma linfocítico pequeño, leucemia prolinfocítica de células B, linfoma linfoplasmocítico, linfoma de la zona marginal esplénica, mieloma de células plasmáticas, plasmocitoma solitario de hueso, plasmocitoma extraóseo, linfoma de células B de la zona marginal extraganglionar del tejido linfoide asociado a mucosas (MALT), linfoma de células B de la zona marginal ganglionar, linfoma folicular, linfoma de células del manto, linfoma difuso de células B grandes, linfoma mediastínico (tímico) de células B grandes, linfoma intravascular de células B grandes, linfoma primario de cavidades, linfoma/leucemia de Burkitt, proliferaciones de células B de potencial maligno incierto, granulomatosis linfomatoide y trastorno linfoproliferativo postrasplante.

Las enfermedades inflamatorias y autoinmuitarias incluyen artritis, artritis reumatoide, artritis reumatoide juvenil, osteoartritis, policondritis, artritis psoriásica, psoriasis, dermatitis, polimiositis/dermatomiositis, miositis por cuerpos de inclusión, miositis inflamatoria, necrólisis epidérmica tóxica, esclerodermia y esclerosis sistémicas, síndrome de CREST, enfermedad inflamatoria del intestino, enfermedad de Crohn, colitis ulcerosa, síndrome de dificultad respiratoria, síndrome de dificultad respiratoria del adulto (SDRA), meningitis, encefalitis, uveítis, colitis, glomerulonefritis, afecciones alérgicas, eccema, asma, afecciones que implican infiltración de células T y respuestas inflamatorias crónicas, aterosclerosis, miocarditis autoinmunitaria, deficiencia de adhesión leucocitaria, lupus eritematoso sistémico (LES), lupus eritematoso cutáneo subagudo, lupus discoide, mielitis por lupus, cerebritis lúpica, diabetes juvenil, esclerosis múltiple, encefalomielitis alérgica, neuromielitis óptica, fiebre reumática, corea de Sydenham, respuestas inmunitarias asociadas con hipersensibilidad aguda y retardada mediada por citocinas y linfocitos T, tuberculosis, sarcoidosis, granulomatosis incluyendo granulomatosis de Wegener y enfermedad de Churg-Strauss, agranulocitosis, vasculitis (incluyendo vasculitis/angeítis por hipersensibilidad, ANCA y vasculitis reumatoide), anemia aplásica, anemia de Diamond-Blackfan, anemia hemolítica inmunitaria, incluyendo anemia hemolítica autoinmunitaria (AHAI), anemia perniciosa, aplasia pura de glóbulos rojos (PRCA), deficiencia de factor VIII, hemofilia A, neutropenia autoinmunitaria, pancitopenia, leucopenia, enfermedades que implican diapédesis leucocitaria, trastornos inflamatorios del sistema nervioso central (SNC), síndrome de lesión multiorgánica, miastenia grave, enfermedades mediadas por el complejo antígeno-anticuerpo, enfermedad antimembrana basal glomerular, síndrome de anticuerpos antifosfolípidos, neuritis alérgica, enfermedad de Behcet, síndrome de Castleman, síndrome de Goodpasture, síndrome miasténico de Lambert-Eaton, síndrome de Reynaud, síndrome de Sjorgen síndrome de Stevens-Johnson, rechazo de trasplante de órganos sólidos, enfermedad de injerto contra huésped (EICH), penfigoide ampolloso, pénfigo, poliendocrinopatías autoinmunitarias, espondiloartropatías seronegativas, enfermedad de Reiter, síndrome del hombre rígido, arteritis de células gigantes, nefritis por complejos inmunitarios, nefropatía por IgA, polineuropatías por IgM o neuropatía mediada por IgM, púrpura trombocitopénica idiopática (PTI), púrpura trombocitopénica trombótica (PTT), púrpura de Henoch-Schonlein, trombocitopenia autoinmunitaria, enfermedad autoinmunitaria de los testículos y ovarios, incluyendo orquitis y ooforitis autoinmunitarias, hipotiroidismo primario; enfermedades endocrinas autoinmunitarias que incluyen tiroiditis autoinmunitaria, tiroiditis crónica (tiroiditis de Hashimoto), tiroiditis subaguda, hipotiroidismo idiopático, enfermedad de Addison, enfermedad de Graves, síndromes poliglandulares autoinmunitarios (o síndromes de endocrinopatía poliglandular), diabetes de tipo 1, también conocida como diabetes mellitus insulinodependiente (DMID) y síndrome de Sheehan; hepatitis autoinmunitaria, neumonitis intersticial linfoide (por VIH), bronquiolitis obliterante (no asociada a trasplante), neumonía intersticial inespecífica (NII), síndrome de Guillain-Barré, vasculitis de grandes vasos (incluyendo polimialgia reumática y arteritis de células gigantes (de Takayasu)), vasculitis de vasos medianos (incluyendo enfermedad de Kawasaki y poliarteritis nudosa), espondilitis anquilosante, poliarteritis nudosa (PAN), enfermedad de Berger (nefropatía por IgA), glomerulonefritis de progresión rápida, cirrosis biliar primaria, celiaquía (enteropatía por gluten), crioglobulinemia, crioglobulinemia asociada con hepatitis, esclerosis lateral amiotrófica (ELA), arteriopatía coronaria, poliserositis familiar recurrente, poliangeítis microscópica, síndrome de Cogan, síndrome de Whiskott-Aldrich y tromboangeítis obliterante.

En realizaciones particulares, la proteína de fusión tal como se divulga en el presente documento es para su uso en un método de tratamiento de la leucemia mielocítica aguda, la leucemia linfocítica aguda o la leucemia mielocítica crónica en un sujeto.

Las enfermedades infecciosas incluyen aquellas asociadas con agentes infecciosos e incluyen cualquiera de una variedad de bacterias (por ejemplo,E. coli, S. typhimurium, P. aeruginosa, B. anthracis, C. botulinum, C. dificile, C. perfringens, H. pylori, V. cholerae, Listeriaspp.,Rickettsiaspp.,Chlamydiaspp. patógenas, y similares), micobacterias y parásitos (incluyendo cualquier miembro parasitario conocido de los protozoos). Los virus infecciosos incluyen virus de eucariotas, tales como adenovirus, bunyavirus, herpesvirus, papovavirus, papilomavirus (por ejemplo,<v>P<h>), paramixovirus, picornavirus, rabdovirus (por ejemplo, de la rabia), ortomixovirus (por ejemplo, influenza), poxvirus (por ejemplo, Vaccinia), reovirus, retrovirus, lentivirus (por ejemplo, VIH), flavivirus (por ejemplo, VHC, VHB), o similares. En determinadas realizaciones, la infección con patógenos citosólicos cuyos antígenos se procesan y presentan con moléculas de HLA (CMH) de clase I se tratan con proteínas de fusión de esta divulgación. Una proteína de fusión de esta divulgación puede administrarse a un sujeto en forma unida a células (por ejemplo, terapia génica de una población de células diana (células T maduras (por ejemplo, células T CD8+ o CD4+) u otras células del linaje de células T). En una realización particular, las células del linaje de células T que expresan proteínas de fusión administradas a un sujeto son células singénicas, alogénicas o autólogas.

Las composiciones farmacéuticas que incluyen proteínas de fusión de esta divulgación pueden administrarse de una manera apropiada para la enfermedad o afección que va a tratarse (o prevenirse) tal como determinen los expertos en la técnica médica. Una dosis apropiada, una duración adecuada y una frecuencia de administración de las composiciones estarán determinadas por factores tales como la afección del paciente, el tamaño, el tipo y la gravedad de la enfermedad, la forma particular del principio activo y el método de administración. La presente divulgación proporciona composiciones farmacéuticas que comprenden células que expresan una proteína de fusión tal como se divulga en el presente documento y un portador, diluyentes o excipiente farmacéuticamente aceptables. Los excipientes adecuados incluyen agua, solución salina, dextrosa, glicerol, o similares, y combinaciones de los mismos.

En algunas realizaciones, la divulgación se refiere a la célula huésped que expresa la proteína de fusión tal como se describe en el presente documento para su uso en un método para aumentar la actividad de una célula inmunitaria, potenciar o prolongar una respuesta inmunitaria, estimular una respuesta de células T específica de antígeno, inhibir una ruta de señalización inmunosupresora, tratar el cáncer o un tumor, inhibir la resistencia inmunitaria de las células cancerosas o tratar una infección, que comprende administrar a un sujeto que lo necesita una cantidad eficaz de la célula huésped. En realizaciones adicionales, una célula huésped para su uso en cualquiera de los métodos mencionados anteriormente expresa además un TCR específico de antígeno modificado por ingeniería, un TCR de alta afinidad específico de antígeno modificado por ingeniería, un CAR, una molécula coestimuladora, o cualquier combinación de los mismos. En realizaciones particulares, la proteína de fusión tal como se divulga en el presente documento se usa en métodos para tratar la leucemia que comprenden la expresión conjunta de la proteína de fusión y un TCR recombinante específico de antígeno.

En algunas realizaciones, se proporciona una célula T CD4+ que expresa la proteína de fusión tal como se describe en el presente documento para su uso en métodos para inducir o potenciar una respuesta de HLA de clase I por una célula T CD4+, que comprende administrar a un sujeto que lo necesita una cantidad eficaz de la célula T CD4+. En realizaciones adicionales, una célula huésped para su uso en la inducción o potenciación de una respuesta de HLA de clase I mediante una célula T CD4+ expresa además un TCR específico de antígeno modificado por ingeniería, un TCR de alta afinidad específico de antígeno modificado por ingeniería, un CAR, una molécula coestimuladora, o cualquier combinación de los mismos.

En cualquiera de las realizaciones mencionadas anteriormente, los métodos son eficaces en ausencia de administración de IL-2 exógena.

En todavía otras realizaciones, un sujeto de cualquiera de los métodos mencionados anteriormente se trata además con una terapia complementaria, tal como quimioterapia. Los agentes quimioterápicos a modo de ejemplo incluyen, por ejemplo, agentes alquilantes tales como tiotepa y ciclofosfamida; alquilsulfonatos tales como busulfano, improsulfano y piposulfano; aziridinas tales como benzodopa, carbocuona, meturedopa y uredopa; etileniminas y metilamelaminas que incluyen altretamina, trietilenmelamina, trietilenfosforamida, trietilentiofosforamida y trimetilolomelamina; mostazas nitrogenadas tales como clorambucilo, clornafazina, clorofosfamida, estramustina, ifosfamida, mecloretamina, clorhidrato de óxido de mecloretamina, melfalán, novembiquina, fenetesterina, prednimustina, trofosfamida, mostaza de uracilo; nitrosureas tales como carmustina, clorozotocina, fotemustina, lomustina, nimustina, ranimustina; antibióticos tales como aclacinomisinas, actinomicina, autramicina, azaserina, bleomicinas, cactinomicina, caliqueamicina, carabicina, caminomicina, carzinofilina, cromomicinas, dactinomicina, daunorubicina, detorubicina, 6-diazo-5-oxo-L-norleucina, doxorubicina, epirubicina, esorubicina, idarubicina, marcelomicina, mitomicinas, ácido micofenólico, nogalamicina, olivomicinas, peplomicina, potfiromicina, puromicina, quelamicina, rodorubicina, estreptonigrina, estreptozocina, tubercidina, ubenimex, zinostatina, zorubicina; antimetabolitos tales como metotrexato y 5-fluorouracilo (5-FU); análogos del ácido fólico tales como denopterina, metotrexato, pteropterina, trimetrexato; análogos de purina tales como fludarabina, 6-mercaptopurina, tiamiprina, tioguanina; análogos de pirimidina tales como ancitabina, azacitidina, 6-azauridina, carmofur, citarabina, didesoxiuridina, doxifluridina, enocitabina, floxuridina, 5-FU; andrógenos tales como calusterona, propionato de dromostanolona, epitiostanol, mepitiostano, testolactona; agentes antisuprarrenales tales como aminoglutetimida, mitotano, trilostano; reponedor de ácido fólico tal como ácido frolínico; aceglatona; glucósido de aldofosfamida; ácido aminolevulínico; amsacrina; bestrabucilo; bisantreno; edatraxato; defofamina; demecolcina; diazicuona; elformitina; acetato de eliptinio; etoglúcido; nitrato de galio; hidroxiurea; lentinano; lonidamina; mitoguazona; mitoxantrona; mopidamol; nitracrina; pentostatina; fenamet; pirarubicina; ácido podofilínico; 2-etilhidrazida; procarbazina; PSKTM; razoxano; sizofirán; espirogermanio; ácido tenuazónico; triazicuona; 2,2',2”-triclorotrietilamina; uretano; vindesina; dacarbazina; manomustina; mitobronitol; mitolactol; pipobromano; gacitosina; arabinósido (“Ara-C”); ciclofosfamida; tiotepa; taxanos, por ejemplo, paclitaxel (Taxol™, Bristol-Myers Squibb Oncology, Princeton, N.J.) y docetaxel (Taxotere™, Rhone-Poulenc Rorer, Antony, Francia); clorambucilo; 6-tioguanina; mercaptopurina; metotrexato; análogos de platino tales como cisplatino y carboplatino; vinblastina; platino; etopósido (VP-16); ifosfamida; mitomicina C; mitoxantrona; vincristina; vinorelbina; navelbina; novantrona; tenipósido; daunomicina; aminopterina; Xeloda; ibandronato; CPT-11; inhibidor de la topoisomerasa RFS 2000; difluorometilornitina (DMFO); ácido retinoico; esperamicinas, capecitabina; y sales, ácidos o derivados farmacéuticamente aceptables de cualquiera de los anteriores.

En algunas realizaciones, la terapia complementaria es una vacuna, un inhibidor de una señal de inmunosupresión, un inhibidor de B-Raf, un inhibidor de MEK, un inhibidor de tirosina cinasa, un agente citotóxico, un agente quimioterápico, o cualquier combinación de los mismos. En algunas realizaciones, el inhibidor de una señal de inmunosupresión es un anticuerpo o ARNip. En algunas realizaciones, el anticuerpo o ARNip es específico de PD-1, PD-L1, PD-L2, CTLA4, LAG3, KIR, CD244, B7-H3, B7-H4, BTLA, HVEM, GAL9, TIM3, A2aR, o cualquier combinación de los mismos.

Ejemplos

EJEMPLO 1

CONSTRUCTOS DE PROTEÍNA DE FUSIÓN CD200R-CD28

Las proteínas de fusión a modo de ejemplo tal como se describen en el presente documento se ilustran usando representaciones esquemáticas en la figura 1A. Las proteínas de fusión a modo de ejemplo incluyen proteínas de fusión inmunomoduladoras (IFP) compuestas por el dominio extracelular de CD200R o una porción del mismo, y un dominio de señalización intracelular de CD28 o una porción del mismo (figura 1A, constructos I-V). El componente hidrófobo puede estar compuesto por el dominio transmembrana de o bien CD200R (figura 1A, constructo I) o bien CD28 (figura 1A, constructos II-V), o porciones de los mismos. En algunas de proteínas de fusión CD200R-CD28 a modo de ejemplo, el componente hidrófobo comprende el dominio transmembrana de CD28 y el componente extracelular comprende además una porción extracelular de CD28, particularmente un residuo de cisteína extracelular adyacente al componente hidrófobo (por ejemplo, figura 1A, constructo III, CD200R-CD28Cys; constructo IV, CD200R-3aas-CD28Cys; y constructo V, CD200R-9aas-CD28Cys). El componente extracelular puede comprender la totalidad o una porción del dominio extracelular de CD200R. En algunas realizaciones, el componente extracelular comprende todo el dominio extracelular de CD200R (figura 1A, constructos I-III). En otros ejemplos, el componente extracelular comprende los primeros 235 aminoácidos (conservando un sitio de glicosilación ligado a N) (por ejemplo, figura 1A, constructo IV, CD200R-3aas-CD28Cys) o los primeros 229 aminoácidos (por ejemplo, figura 1a , constructo V, CD200R-9aas-CD28Cys) del extremo N-terminal de CD200R. El tamaño del componente extracelular, que puede manipularse ajustando el constructo de la proteína de fusión, puede afectar a la capacidad de la proteína de fusión para entrar en la sinapsis inmunitaria y colocalizarse con el TCR dentro del cSMAC para proporcionar una fuerte señal coestimuladora. Además, el constructo CD200R-CD28 tiene la capacidad de convertir lo que normalmente sería una señal inhibidora de la unión de CD200R a su diana en una señal positiva generada por el dominio de señalización intracelular de CD28.

Una molécula de ácido nucleico a modo de ejemplo que codifica para una proteína de fusión CD200R-CD28 comprende los siguientes elementos (de 5' a 3'): componente extracelular (CD200R) - dominio de multimerización (cisteína de CD28) - componente hidrófobo (CD28 transmembrana) - componente intracelular (CD28 intracelular). En algunas realizaciones, una molécula de ácido nucleico que codifica para una proteína de fusión CD200R-CD28 comprende una molécula de ácido nucleico tal como se expone en una cualquiera de SEQ ID NO:47-51 ó 1, 6, 7, 10, 12, 14 ó 15.

Los ácidos nucleicos que codifican para los constructos se pidieron de Invitrogen o se generaron internamente mediante PCR, luego se clonaron direccionalmente con TOPO en el vector pENTR™/D-TOPO<®>(Invitrogen) y se transfirieron al vector retroviral pMP71-attR usando la tecnología Gateway<®>(Invitrogen). En determinadas realizaciones, las moléculas de ácido nucleico que codifican para las IFP de la presente divulgación se sometieron a optimización de codones antes de la clonación en el vector retroviral pMP71-attR.

EJEMPLO 2

EXPRESIÓN TRANSGÉNICA DE CONSTRUCTOS CD200R-CD28

Se usó un modelo de ratón preclínico para la leucemia diseminada, basado en la eritroleucemia inducida por el virus C57BL/6 Friend murino (FBL) y ratones transgénicos TCR<gag>, para determinar si los receptores quiméricos de CD200R-CD28 pueden mejorar la función de las células T.

Se generaron ratones transgénicos TCR para producir células T CD8<+>específicas del epítopo gag (TCR<gag>). Se adquirieron ratones C57BL/6 (B6) de Jackson Laboratory. Los ratones transgénicos TCR<gag>expresan un transgén TCR específico del epítopo gag del virus Friend en la célula T CD8<+>(Ohlénet al.,J. Immunol. 166: 2863-2870, 2001). Todos los estudios con animales realizados fueron aprobados según el protocolo del Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales de la Universidad de Washington (protocolo n.° 2013-01). La eritroleucemia inducida por el virus B6 Friend murino (FBL) expresa el epítopo gag codificado por F-MuLV (péptido CCLCLTVFL).

Se insertaron constructos quiméricos CD200R-CD28 basados en genes murinos en el vector retroviral pMP71 y se usaron para transducir esplenocitos primarios de ratón estimulados con anticuerpos anti-CD3 y anti-CD28. Se diseñaron los constructos tal como se describe en el ejemplo 1 y se pidieron de Invitrogen o se generaron internamente mediante PCR. Luego, se clonaron los constructos direccionalmente con TOPO en el vector pENTR™/D-TOPO<®>(Invitrogen) y se transfirieron al vector retroviral pMP71-attR usando la tecnología Gateway<®>(Invitrogen). Se transdujo la línea celular de empaquetamiento retroviral Plat-E (Moritaet al.,2000, Gene Therapy 7:1063-1066, 2000; Cell Biolabs, Inc.) con el vector retroviral usando el reactivo de transducción Effectene (Qiagen). Se recogió el sobrenadante viral los días 2 y 3 y luego se usó para transducir células T TCR<gag>.

Un día antes de la transfección, se estimularon células T TCR<gag>con anticuerpo anti-CD3/CD28 y 100 U/ml de rhlL-2. La transducción de células T TCR<gag>se realizó en placas de 12 pocillos en presencia de IL-2 y Polybrene mediante infección por centrifugación durante 90 minutos a 1000 g. Se transdujeron células FBL con CD200 con infección por centrifugación con Polybrene, de manera similar a la transducción de células T, y posteriormente se clasificaron para generar una población homogénea.

Cinco días después de la transducción, se analizaron las células T CD8<+>para determinar la expresión de constructos mediante tinción con anticuerpo anti-CD200R y citometría de flujo (figura 1B). Se usó como control un vector que codificaba para la proteína verde fluorescente (GFP). La eficiencia de la transducción osciló entre el 4 36 % y la intensidad fluorescente media (MFI) de las células transducidas fue similar entre los constructos.

EJEMPLO 3

LOS CONSTRUCTOS CD200R-CD28 PROMUEVEN LA PROLIFERACIÓN, ACUMULACIÓN Y FUNCIÓN EFECTORA DE CÉLULAS T TRANSDUCIDASIN VITRO

Se evaluó la capacidad de los constructos CD200R-CD28 descritos en los ejemplos 1 y 2 para promover la proliferación, acumulación y función efectora de células T TCR<gag>.

Expansión de células efectoras in vitro

Se generaron células efectoras TCR<gag>in vitrotal como se describió previamente (Stromneset al.,J. Clin. Invest.

120: 3722-34, 2010). Se cultivaron esplenocitos presentadores de antígeno irradiados (5 * 10<6>), células irradiadas FBL (3 * 10<6>) ytgTCR<gag>(10<6>) junto con IL-2 (50 U/ml) en 10 ml de medios de cultivo (IMDM complementados con aminoácidos no esenciales, glutamina 2 |iM, 100 U/ml de penicilina/estreptomicina, FBS al 10% y 2-mercapatoetanol 50 |iM). Se reestimularon las células T semanalmente y se evaluaron mediante citometría de flujo 5-7 días después de la última estimulación.

Ensayo de proliferación de células T in vitro

Se transdujeron células T TCRgag como en el ejemplo 2. Para evaluar la proliferación de células Tin vitro, setiñeron células T TCRgag con Cell Trace Violet (CTV, Life Technologies) según el protocolo del fabricante. Se estimularon células T Tg marcadas con CTV (105) y células T de control con GFP con números de titulación de células FBL CD200- o FBL CD200+. Después de 3 días, se evaluó la dilución de CTV de las células T TCRgag mediante citometría de flujo.

Los resultados de la citometría de flujo que indican el número de células T TCRgag después de la estimulación con números de titulación de células FBL CD200- (parte superior) o FBL CD200+ (parte inferior) se muestran en la figura 2A. Cuatro de los cinco constructos CD200R-CD28 sometidos a prueba mejoraron drásticamente la proliferación de células T TCRgag en respuesta a FBL CD200+ (líneas azules) en comparación con las células T transducidas con control con GFP (líneas rojas).

Ensayo de acumulación de células T in vitro

Para determinar si la proliferación potenciada también dio como resultado una acumulación aumentada de células transducidas, se midió la proporción de células transducidas en la población de TCRgag total durante múltiples ciclos de estimulación con FBL CD200+ irradiadas.

Varios de los constructos promovieron la acumulación de células T transducidas, incluyendo CD200R-CD28tm, CD200R-CD28Cys, CD200R-3aas-CD28Cys y CD200R-9aas-CD28Cys (figura 2B). De estos constructos, CD200R-9aas-CD28Cys mostró el mayor aumento de células T transducidas durante múltiples estimulaciones, lo que dio como resultado una expansión de más de 3 veces en 3 estimulaciones.

Ensayo de enriquecimiento de células T in vitro

Se reestimuló una población mixta de células T CD8+ transducidas y no transducidas con células FBL irradiadas CD200+ o CD200- para determinar si la reestimulación enriquecería la población de células T CD200R-9aas-CD28Cys IFP+ transducidas. La reestimulación repetida con células tumorales CD200+ irradiadas enriqueció las células transducidas con IFP en comparación con las células T de tipo natural, lo que demuestra que el reconocimiento de una diana que expresa el ligando para la IRP CD200R-9aas-CD28Cys potencia la respuesta (figura 2C).

Ensayo de colocalización in vitro

Se tomaron imágenes de las células T transducidas mediante microscopía para determinar si la IFP CD200R-9aas-CD28Cys se colocalizó con el ligando relacionado en la sinapsis inmunitaria (IS) durante la activación de células T. Se usó CTxB para teñir lípidos dentro de la membrana celular, que se enriquecen en la sinapsis (figura 2D, panel I). Se usaron anticuerpos marcados que seleccionan como diana CD200 expresado por la célula FBL (figura 2D, panel II) o CD200R expresado por la célula T (figura 2D, panel III) para visualizar la ubicación de las moléculas en relación con la IS. El ligando CD200 y CD200R se colocalizaron dentro de la IS (figura 2D, panel IV), lo que demuestra que el constructo tiene el tamaño adecuado para acomodarse por la sinapsis inmunitaria.

Ensayo de citotoxicidad basado en CFSE

La señalización aumentada de CD28 también promueve la función efectora (Chen y Flies, Nat. Rev. Immunol. 13: 227-242, 2013). Se sometieron a prueba células T transducidas con la proteína de fusión CD200R-CD28 para determinar una destrucción aumentada de células tumorales diana. Se incubaron tumores FBL y EL4 de control durante 10 minutos a temperatura ambiente con CFSE 2,5 |iM (CFSEhi) o 0,25 |iM (CFSElD) en PBS, respectivamente. Se retiró el colorante en exceso lavando las células tumorales en medios que contenían suero. Se incubó una mezcla 1:1 de células tumorales EL4 y FBL con números titulados de células T efectoras expandidasin vitroTCRgag transducidas con vector con GFP o CD200R-CD28 durante 4 horas en placas de fondo redondo de 96 pocillos a 37 °C y el 5 % de CO2. Se determinó la lisis específica de FBL mediante análisis de citometría de flujo del % de CFSEhi (FBL) de las células positivas para CFSE (FBL+ EL4) totales que quedaban en el pocillo.

Las células T TCRgag transducidas con constructos CD200R-CD28 mostraron una capacidad potenciada para lisar el tumor FBLin vitroen comparación con las células T TCRgag transducidas con un vector vacío (figuras 2e , 2G). Se marcaron células tumorales diana con diferentes diluciones de los colorantes fluorescentes CellTrace Violet (CTV) o CFSE para generar una mezcla 1:1:1 de células EL4 (CTV+), FBL CD200+ (CFSEhi) y dianas de control EL4 inespecíficas (CFSElD) (figura 2F). Además, las células T TCRgag transducidas con control con GFP lisaron FBL CD200- y FBL CD200+ con eficiencias iguales (figura 2G). Por el contrario, las células T TCRgag transducidas con CD200R-9aas-CD28Cys mostraron una destrucción aumentada de células FBL CD200+ en comparación con las células T de control, lisando más del 40 % de FBL CD200+ a la razón E:T más baja sometida a prueba (figura 2G). En conjunto, estos datos muestran que los constructos CD200R-CD28 funcionan para aumentar la acumulación y la actividad lítica de las células T transducidas en respuesta a la estimulación de las células tumorales.

EJEMPLO 4

LAS CÉLULAS T TRANSDUCIDAS CON CD200R-9AAS-CD28CYS MUESTRAN UNA ACUMULACIÓN POTENCIADAIN VIVOEN RESPUESTA AL RECONOCIMIENTO DE FBL

A ratones B6 se les inyectaron por vía intraperitoneal (i.p.) 4 x 10<6>células de leucemia FBL vivas tal como se describió previamente (Stromneset al.,J. Clin. Invest. 120: 3722-34, 2010). Después de dejar pasar 5 días para que FBL se diseminara, los ratones recibieron 180 mg/kg de ciclofosfamida (Cy, “Cytoxan”) por vía i.p. al menos 6 horas antes de la transferencia de las células T efectoras. Para los estudios de supervivencia, se transfirieron 10<5>células T TCR<gag>, que previamente se sometieron a 1-3 estimulacionesin vitro,a ratones portadores de tumores. Para evaluar la proliferación y acumulación a corto plazo, se inyectaron conjuntamente 2 * 10<6>de cada una de las células T transducidas con proteína de fusión y transducidas con control con GFP a ratones portadores de tumores y se sacrificaron los ratones para su análisis 8 días después. Se monitorizaron los ratones periódicamente para detectar la carga tumoral y se sacrificaron si la evidencia de progresión tumoral predecía que se produciría mortalidad en el plazo de 24-48 horas.

Para evaluar si las células T transducidas con proteína de fusión CD200R-9aas-CD28Cys mostraron una mayor proliferación y acumulaciónin vivoen respuesta al reconocimiento de FBL, se transfirió una población mixta de células transducidas con proteína de fusión y de control a ratones portadores de tumores y se determinó la razón de células mediante análisisex vivo,se compararon 8 días después de la transferencia (figura 3A). Mediante el uso de marcadores congénicos, se detectaron las células T transducidas a una razón 1,2-1,4 veces mayor que las células de control tanto en el bazo como en los ganglios linfáticos en relación con la razón que se inyectó (figura 3B). Las células T TCR<gag>CD200R-9aas-CD28Cys<+>transducidas mostraron una expresión reducida de CD62L 3 días tras la transferencia a ratones portadores de tumores, lo que sugería un fenotipo de células T efectoras (figura 3C). Para el día 15, las células T transducidas y de control mostraron fenotipos similares, incluyendo la falta de marcadores de agotamiento (figura 3D). De manera similar a los hallazgosin vitro,las células T que expresaban CD200R-9aas-CD28Cys mostraron una acumulación aumentada en respuesta a la estimulación tumoralin vivo.Además, mostraron patrones de expresión de proteínas coherentes con un fenotipo de células T efectoras durante al menos 3 días tras la transferencia a ratones portadores de tumores.

EJEMPLO 5

LA INMUNOTERAPIA ADOPTIVA CON CÉLULAS T CD200R-CD28+ MUESTRA MAYOR ACTIVIDAD EN LA TERAPIA DE LA LEUCEMIA DISEMINADA

La inmunoterapia adoptiva de células T transducidas con CD200R-CD28 medió en una actividad terapéutica aumentada en el modelo preclínico de ratón de leucemia diseminada.

A los ratones se les inyectó una dosis letal de células de leucemia FBL CD200<+>y cinco días después, cohortes de ratones tratados con Cy recibieron terapia adicional con 10<5>células T (figura 4A). Se evaluó la contribución del enlace de cisteína de CD28 a la eficacia mediada por el constructo CD200R-CD28 comparando células T transducidas con constructos CD200R-CD28tm, CD200R-9aas-CD28Cys y de control con GFP tal como se muestra en la figura 1A. Se administró IL-2 durante 10 días como reactivo terapéutico adicional a una cohorte de ratones para promover la actividad de las células T (Stromneset al.,J. Clin. Invest. 120: 3722-34, 2010). Antes de la inyección, se evaluaron las células T para determinar diversas proteínas de superficie mediante citometría de flujo. Las células T TCR<gag>transducidas y de control mostraron fenotipos similares, lo que indica que la transducción no alteró el fenotipo de las células antes de la inyección (figura 4B).

En la pequeña cohorte de ratones que recibieron inyecciones de IL-2, las células T mejoraron la supervivencia, pero no pudo detectarse una diferencia significativa en la supervivencia de los ratones que recibieron los diferentes grupos de células T (figura 4C). Sin embargo, en la cohorte de ratones que no recibieron inyecciones de IL-2, hubo una mejora significativa en la supervivencia de los ratones que recibieron células T transducidas con constructos CD200R-CD28 de tamaño apropiado para caber dentro de la sinapsis inmunitaria (figura 4D). La mayoría de los ratones que no recibieron células T, que recibieron células T transducidas con el vector de control con GFP o células T transducidas con el ectodominio más grande (IFP CD200R-CD28Cys) no sobrevivieron más allá del día 30 (figuras 4C y 4D, líneas negras continuas, discontinuas y naranjas, respectivamente). Por el contrario, el 71 % de los ratones que recibieron células T CD200R-CD28tm<+>T y el 83 % de los ratones que recibieron células T CD200R-9aas-CD28Cys<+>sobrevivieron más de 100 días tras la terapia (figuras 4C y 4D, líneas verde y roja, respectivamente). Estos datos sugieren que la transducción de células T con constructos CD200R-CD28 que abarcan una distancia similar a una distancia entre membranas en una sinapsis inmunitaria proporciona una coestimulación suficiente para superar la dependencia de la inmunoterapia con células T de la inyección de IL-2 exógena. Además, aunque hubo diferencias en la proliferación y acumulación entre los constructos CD200Rtm-CD28 y CD200R-9aas-CD28Cys sometidos a prueba en ratones que no recibieron inyecciones de IL-2 exógena, ambas IFP potenciaron eficazmente la inmunoterapia con células T para mejorar significativamente el desenlace clínico de, por lo demás, una leucemia progresiva.

EJEMPLO 6

LAS CÉLULAS T CD200R-9AAS-CD28CYS<+>NO PROVOCAN AUTORREACTIVIDAD CON TEJIDOS ENDÓGENOS Y NO MUESTRAN INFILTRACIÓN DE TEJIDOS NORMALESIN VIVO

Para determinar si la transducción de células T TCR<gag>redujo el umbral de activación lo suficiente como para dar como resultado la autorreactividad con tejidos endógenos, se evaluó la toxicidad autoinmunitaria en ratones transgénicos modificados por ingeniería para expresar el Ag tumoral codificado por gag de FBL como autoantígeno en hepatocitos, bajo el control del promotor de albúmina (figura 5A). Se generaron efectores TCR<gag>in vitroy se transfirieron 10<6>a ratones Alb:Gag tratados con Cytoxan con leucemia diseminada. A los 3 y 7 días tras la transferencia, se evaluó el daño hepático mediante la cuantificación de los niveles séricos de las enzimas hepáticas aspartato aminotransferasa (AST) y alanina aminotransferasa (ALT). La terapia adoptiva con células de control o TCR<gag>CD200R-9aas-CD28Cys<+>en ratones no afectó a los niveles séricos de AST o ALT en los días 3 ó 7 tras la transferencia, lo que indica que CD200R-9aas-CD28Cys no induce daño hepático autoinmunitario detectable en ratones Alb:Gag (figura 5B).

Las células T transducidas con IFP no presentan una infiltración aumentada de tejidos normales en comparación con las células T de control. Se sacrificaron los ratones 7 días tras la transferencia y se tiñeron secciones del hígado con un anticuerpo contra el marcador de células T CD3 para cuantificar la infiltración de células T. Se observó una presencia limitada de células T en el tejido hepático, sin diferencias significativas entre los receptores de TCR<gag>CD200R-9aas-CD28Cys<+>o de control, lo que indica que no hay una infiltración celular linfocítica aumentada como resultado de la expresión de IFP (figura 5C).

EJEMPLO 7

EL DOMINIO DE SEÑALIZACIÓN COESTIMULADOR DE 4-1BB PROMUEVE LA ACUMULACIÓN DE CÉLULAS T TRANSDUCIDASIN VITRO

El receptor coestimulador 4-1BB está regulado por incremento en células T activadas, lo que promueve la supervivencia de células T y la producción de citocinas (Chen y Flies, Nat. Rev. Immunol. 13: 227-242, 2013). Para evaluar si el dominio de señalización intracelular de 4-1BB, con o sin el dominio de señalización intracelular de CD28, podría inducir una proliferación y acumulación aumentadas de células T, se generaron IFP usando 4-1BB (CD200R-9aas-4-1BB) o combinando 4-1BB con CD28 (CD200R-9aas-CD28-4-1BB) (figura 6A) usando los métodos descritos en el ejemplo 2. Se transdujeron células T TCR<gag>como en el ejemplo 2, y se generaron células efectoras TCR<gag>in vitrocomo en el ejemplo 3.

Tal como se observó con CD200R-9aas-CD28Cys, las células T transducidas con los constructos de 4-1BB se acumularon durante múltiples tandas de estimulaciónin vitro(figura 6B). Estos datos indican que las IFP de 4-1BB también promueven la proliferación y supervivencia de las células T.

Las células T TCR<gag>transducidas con un CD200R-4-1BB mostraron una capacidad potenciada para lisar el tumor de FBLin vitrousando el ensayo de citotoxicidad basado en CFSE descrito en el ejemplo 3 (figura 6C). Las células T transducidas con CD200R-41BB también promueven la supervivencia (figura 6D).

EJEMPLO 8

LA EXPRESIÓN CONJUNTA DE CD200RTM-CD28 POTENCIA LA FUNCIÓN EN CÉLULAS T PRIMARIAS TCR ESPECÍFICAS DE WT1

Se generó un constructo CD200Rtm-CD28 humano (SEQ ID NO: 1) para determinar si la expresión de IFP potenciaba la función de las células T primarias humanas. Se combinó el constructo con las cadenas beta y alfa del TCR “C4” específico de WT1-<I26>restringido a HLA-A2 ligando los genes con elementos P2A (figura 7A). La primera secuencia de P2A se sometió a optimización de codones para evitar la recombinación genética con la segunda secuencia de P2A. Para generar lentivirus, se transdujeron células 293 T/17 (3 x 10<6>células/placa) con constructos humanos en pRRLSIN y los vectores de empaquetamiento pMDLg/pRRE, pMD2-G y pRSV-REV usando Effectene (Qiagen). Se cambiaron los medios de cultivo el día 1 tras la transfección y se recogió el sobrenadante que contenía virus los días 2 y 3, y se congelaron alícuotas para su uso futuro.

Se usó la sublínea de células T humanas Jurkat, que carece de un TCR endógeno, para someter a prueba la expresión de IFP y TCR. Se transdujeron estas células T Jurkat mediante infección por centrifugación de 2x10<6>células con 2 ml de sobrenadante retroviral a 1000 g durante 90 min a 32 °C. La transducción de la línea de células T humanas Jurkat con el constructo de tres genes dio como resultado una alta expresión de la IFP y expresión del TCR a una MFI similar a la de las células T transducidas sólo con el TCR (figura 7A).

Para transducir células T humanas primarias, se recogieron células mononucleares de sangre periférica (PBMC) de donantes HLA-A2<+>. Se purificaron las células T CD8<+>usando perlas magnéticas de Miltenyi y se estimularon con expansor de células T humanas CD3/CD28 Dynabeads (Life Technologies) y 50 Ul/ml de IL-2. Cuatro horas tras la estimulación, se transdujeron las células T tal como se describió anteriormente para las células T Jurkat. Se reestimularon las células T cada 10-14 días con un protocolo de expansión rápida (REP), tal como se había descrito previamente (Hoet al.,J Immunol Methods 310:40-52, 2006).

Se usó la línea celular humana T2 como APC porque es deficiente en TAP y, por tanto, no puede presentar péptidos endógenos, mientras que la expresión de c MH1 de bajo nivel permite la presentación de péptidos cargados de manera exógena. Se evaluó la expresión de CD200 por las células T2 mediante citometría de flujo (figura 7B). Las células T2 mostraron un bajo nivel de expresión endógena de CD200 (figura 7B).

Las células T transducidas se estimularon con células T2 pulsadas con WT1-I26. A pesar de un bajo nivel de expresión de CD200 en las células diana, las células T transducidas con CD200Rtm-CD28 mostraron una proliferación potenciada en comparación con las células T transducidas con el TCR-C4 solo (figura 7C). Además, las células T transducidas con CD200Rtm-CD28 estimuladas (es decir, células T IFP+) produjeron niveles aumentados de IFNy e IL-2 en comparación con las células T de control cuando se expusieron a células tumorales CD200dim (figura 7D).

En general, estos resultados mostraron que las células T primarias transducidas para expresar un constructo CD200Rtm-CD28 humano y las cadenas beta y alfa de un TCR específico de WT1-I26 mostraron una proliferación potenciada y una producción de citocinas aumentada en relación con las células T transducidas con el constructo de TCR solo.

EJEMPLO 9

LOS CONSTRUCTOS DE PROTEÍNA DE FUSIÓN SIRPa-CD28 PROMUEVEN LA ACUMULACIÓN DE CÉLULAS T TRANSDUCIDASIN VITRO

Las proteínas de fusión a modo de ejemplo tal como se describen en el presente documento también incluyen IFP compuestas por el dominio extracelular de SIRPa, o porciones del mismo, y un dominio de señalización intracelular de CD28 (figura 8A). El componente hidrófobo puede estar compuesto por el dominio transmembrana de o bien SIRPa o bien CD28, o porciones de los mismos. En algunas proteínas de fusión SIRPa-CD28 a modo de ejemplo, el componente hidrófobo comprende el dominio transmembrana de CD28 y el componente extracelular comprende además una porción extracelular de CD28, particularmente un residuo de cisteína extracelular adyacente al componente hidrófobo (por ejemplo, SIRPa-CD28Cys, SIRPa-6aas-CD28Cys, SIRPa-9aas-CD28Cys y SIRPa-9aas-CD28Cys). El componente extracelular puede comprender la totalidad o una porción del dominio extracelular de SIRPa. En algunas realizaciones, el componente extracelular comprende todo el dominio extracelular de SIRPa. En otros ejemplos, el componente extracelular comprende los primeros 367 aminoácidos (por ejemplo, SIRPa-6aas-CD28Cys), los primeros 364 aminoácidos (por ejemplo, SIRPa-9aas-CD28Cys) o los primeros 350 aminoácidos (SIRPa-23aas-CD28Cys) del extremo N-terminal de SIRPa. El tamaño del componente extracelular puede afectar a la capacidad de la proteína de fusión para entrar en la sinapsis inmunitaria y colocalizarse con el TCR dentro del cSMAC para proporcionar una fuerte señal coestimuladora. En algunos ejemplos, el componente extracelular comprende una SIRPa truncada, que puede alterar el tamaño del componente extracelular. Por ejemplo, para tener en cuenta los aminoácidos extracelulares adicionales del dominio extracelular de la proteína de fusión (por ejemplo, 9 ó 12 aminoácidos adicionales), SIRPa-6aas-CD28 tiene una porción truncada de SIRPa que conserva un sitio de glicosilación ligado a N natural. En otro ejemplo, SIRPa-23aas-CD28 tiene una porción truncada de SIRPa que carece de toda la región de tallo del dominio extracelular de SIRPa. Además, un constructo SIRPa-CD28 tiene la capacidad de convertir una señal iniciada por la unión de SIRPa a su diana en una señal positiva (por ejemplo, coestimuladora) generada por el dominio de señalización intracelular de CD28.

Se generaron IFP usando componentes extracelulares de SIRPa (figura 8A) usando los métodos descritos en el ejemplo 2. Se transdujeron células T TCRgag como en el ejemplo 2, y se generaron células efectoras TCRgagin vitrocomo en el ejemplo 3. Se transdujeron células FBL con c D47 o mCherry con infección por centrifugación con Polybrene, de manera similar a la transducción de células T, y posteriormente se clasificaron para generar una población homogénea.

Tal como se observó con CD200R-9aas-CD28Cys, se acumularon las células T transducidas con los constructos de SIRPa durante múltiples tandas de estimulaciónin vitro(figura 8B). Estos datos sugieren que las IFP SIRPa-CD28 también promueven la proliferación y supervivencia de las células T.

Para evaluar la proliferación de células Tin vitro,se realizó un ensayo de proliferación por dilución de CTV tal como se describe en el ejemplo 2. Tal como se observó con CD200R-9aas-CD28Cys, las células T transducidas con los constructos de SIRPa modificados por ingeniería para mantener la distancia sináptica entre células T y células tumorales mostraron una proliferación potenciada en comparación con las células T de control (figura 8C). Además, se destruyeron eficientemente células tumorales CD47+ después de 3 días de cocultivo con células T SIRPa-CD28+ pero no con células T de control o células T transducidas con un constructo de SIRPa que carecía de un dominio de señalización intracelular (figura 8D). Para evaluar además la capacidad lítica de células T SIRPa-CD28+, se usó un ensayo IncuCyte para cuantificar la destrucción de FBL CD47+. Se cocultivaron un total de 105 FBL mCherry+ CD47+ en placas de 24 pocillos con una titulación de células T humanas transducidas con constructos SIRPa-CD28. Se incubó la placa en un IncuCyte (Essen BioScience) dentro de una incubadora de cultivo celular durante 70 horas. Se capturaron imágenes cada hora para controlar la destrucción de las células tumorales, tal como se determinó mediante la pérdida de la señal roja. Las células T SIRPa-CD28+ destruyeron células tumorales CD47+, incluso a la razón efector-diana más baja sometida a prueba (0,4:1; figura 8E).

EJEMPLO 10

LOS CONSTRUCTOS DE PROTEÍNA DE FUSIÓN PD-1-CD28 PROMUEVEN LA PRODUCCIÓN DE CITOCINAS EN CÉLULAS T TRANSDUCIDASIN VITRO

Las proteínas de fusión a modo de ejemplo tal como se describen en el presente documento también incluyen IFP compuestas por el dominio extracelular de PD-1, o porciones del mismo, y un dominio de señalización intracelular de CD28 (figura 9A). El componente transmembrana puede estar compuesto por el dominio transmembrana de o bien PD-1 o bien CD28, o porciones de los mismos. En algunas proteínas de fusión PD1-CD28 a modo de ejemplo, el componente transmembrana comprende el dominio transmembrana de CD28 y el componente extracelular comprende además una porción extracelular de CD28, particularmente un residuo de cisteína extracelular adyacente al componente transmembrana (por ejemplo, PD1-CD28Cys, PD1-9aas-CD28Cys y PD1-21aas-CD28Cys) para promover la dimerización entre cadenas. El componente extracelular puede comprender la totalidad o una porción del dominio extracelular de PD-1, o puede estar truncado (por ejemplo, -9aas en constructos murinos, -12aas o -15aas en constructos humanos; sin la región de tallo de PD-1, -21aas) para mantener la corta distancia espacial entre las células para facilitar el acceso del receptor con ligando a la sinapsis inmunitaria. Además, un constructo PD1-CD28 tiene la capacidad de convertir lo que normalmente sería una señal inhibidora de la unión de PD1 a su diana en una señal positiva (por ejemplo, coestimuladora) generada por el dominio de señalización intracelular de CD28.

Se generaron IFP que comprendían componentes extracelulares de PD-1 (figura 9A) usando los métodos descritos en el ejemplo 2. Se transdujeron células T TCRgag como en el ejemplo 2, y se generaron células efectoras TCRgagin vitrocomo en el ejemplo 3.

Se generaron IFP PD1-CD28 murinas usando los constructos I-IV y VII (figura 9A). Se reestimularon células T PD1-CD28+ en presencia de brefeldina A (para retener las citocinas producidas) con células FBL que expresaban de manera endógena los ligandos de PD-1, PD-L1 y PD-L2. Después de 5 horas, se fijaron las células y se trataron con el kit BD Cytofix/Cytoperm para permitir la tinción intracelular de las citocinas efectoras, IFNy y TNFa. La transducción con cada uno de los cinco constructos PD1-CD28 potenció la producción de citocinas intracelulares en comparación con las células T de control (figura 9B).

Se generaron IFP PD1-CD28 humanas usando los constructos I-III y V-VII (figura 9A). Se generaron vectores que contenían IFP PD1-CD28 y TCR-C4 tal como se describió anteriormente. Se transdujeron células T Jurkat tal como se describió anteriormente. Las células T transducidas con el TCR y PD1-12aas-CD28Cys o PD1-15aas-CD28Cys mostraron altas eficiencias de transducción y expresión de ambas proteínas (figura 10).

EJEMPLO 11

LOS CONSTRUCTOS DE PROTEÍNA DE FUSIÓN FAS-CD28 PROMUEVEN LA ACUMULACIÓN Y LA FUNCIÓN POTENCIADA EN CÉLULAS T TRANSDUCIDASIN VITRO

Las proteínas de fusión a modo de ejemplo tal como se describen en el presente documento también incluyen IFP compuestas por el dominio extracelular de Fas, o porciones del mismo, y un dominio de señalización intracelular de CD28 (figura 11A). El componente transmembrana puede estar compuesto por el dominio de o bien Fas o bien CD28, o porciones de los mismos. En algunas proteínas de fusión Fas-CD28 a modo de ejemplo, el componente transmembrana comprende el dominio transmembrana de CD28 y el componente extracelular comprende además una porción extracelular de CD28, particularmente un residuo de cisteína extracelular adyacente al componente transmembrana (por ejemplo, Fas-CD28Cys y Fas-9aas-CD28Cys). El componente extracelular puede comprender la totalidad o una porción del dominio extracelular de Fas o puede truncarse para conservar una corta distancia espacial entre las células (-9aas) tras la interacción receptor-ligando. Además, un constructo Fas-CD28 tiene la capacidad de convertir una señal iniciada por la unión de Fas a su diana en una señal positiva (por ejemplo, coestimuladora) generada por el dominio de señalización intracelular de CD28.

Se generaron IFP que comprendían componentes extracelulares de Fas (figura 11A) usando los métodos descritos en el ejemplo 2. Se transdujeron células T TCRgag como en el ejemplo 2, y se generaron células efectoras TCRgagin vitrocomo en el ejemplo 3.

Para determinar si la expresión de la IFP Fas-CD28 da como resultado una acumulación aumentada de células transducidas, se midió la proporción de células transducidas de la población mixta en la población de TCRgag total durante múltiples ciclos de estimulación con FBL irradiada, tal como se describe en el ejemplo 3. Todos los constructos promovieron la acumulación de células T transducidas en comparación con las células T de control (figura 11B). Además, la expresión de constructos Fas-CD28, pero no de Fas de longitud completa (FL) promovió la supervivencia o expansión de las células T tras múltiples estimulacionesin vitro(figura 11C).

EJEMPLO 12

CONSTRUCTOS DE PROTEÍNA DE FUSIÓN LAG3-CD28

Las proteínas de fusión a modo de ejemplo tal como se describen en el presente documento también incluyen IFP compuestas por el dominio extracelular de LAG3, o porciones del mismo, y un dominio de señalización intracelular de CD28 (figura 12A). El componente transmembrana puede estar compuesto por el dominio de o bien LAG3 o bien CD28, o porciones de los mismos. En algunas proteínas de fusión LAG3-CD28 a modo de ejemplo, el componente transmembrana comprende el dominio transmembrana de CD28 y el componente extracelular comprende además una porción extracelular de CD28, particularmente un residuo de cisteína extracelular adyacente al componente transmembrana (por ejemplo, LAG3-CD28Cys y LAG3-9aas-CD28Cys). El componente extracelular puede comprender la totalidad o una porción del dominio extracelular de LAG3 o puede truncarse para mantener una corta distancia espacial entre las células (por ejemplo, -9aas) tras la interacción receptor-ligando. Además, un constructo LAG3-CD28 tiene la capacidad de convertir lo que normalmente sería una señal inhibidora de la unión de LAG3 a su diana en una señal positiva (por ejemplo, coestimuladora) generada por el dominio de señalización intracelular de CD28.

Se generaron IFP usando componentes extracelulares de LAG3 (figura 12A) usando los métodos descritos en el ejemplo 2. Se transdujeron células T con constructos LAG3-eGFP tal como se describe. Cinco días después de la transducción, se analizaron las células T CD8+ para determinar la expresión de constructos mediante tinción con anticuerpo anti-LAG3 y citometría de flujo (figura 12B). Se usó como control un vector que codificaba sólo para la proteína verde fluorescente (GFP). Todos los constructos mostraron expresión de LAG3 (figura 12B).

EJEMPLO 13

CONSTRUCTOS DE PROTEÍNA DE FUSIÓN TIM3-CD28

Las proteínas de fusión a modo de ejemplo tal como se describen en el presente documento también incluyen IFP compuestas por el dominio extracelular de TIM3, o porciones del mismo, y un dominio de señalización intracelular de CD28 (figura 13A). El componente transmembrana puede estar compuesto por el dominio de o bien TIM3 o bien CD28, o porciones de los mismos. En algunas proteínas de fusión TIM3-CD28 a modo de ejemplo, el componente transmembrana comprende el dominio transmembrana de CD28 y el componente extracelular comprende además una porción extracelular de CD28, particularmente un residuo de cisteína extracelular adyacente al componente transmembrana (por ejemplo, TIM3-CD28Cys y TIM3-9aas-CD28Cys). El componente extracelular puede comprender la totalidad o una porción del dominio extracelular de TIM3 o puede truncarse para mantener la corta distancia espacial entre las células (por ejemplo, -9aas). Además, un constructo TIM3-CD28 tiene la capacidad de convertir lo que normalmente sería una señal inhibidora de la unión de TIM3 a su diana en una señal positiva generada por el dominio de señalización intracelular de CD28.

Se generaron nuevas IFP usando componentes extracelulares de TIM3 (figura 13A) usando los métodos descritos en el ejemplo 2. Se transdujeron células T con constructos GFP-TIM3 tal como se describe. Cinco días después de la transducción, se analizaron las células T CD8+ para determinar la expresión de constructos mediante tinción con anticuerpo anti-TIM3 y citometría de flujo (figura 13B). Se usó como control un vector que codificaba sólo para la proteína verde fluorescente (GFP). La mayoría de los constructos mostraron una expresión similar de TIM3 (figura 13B).

Claims

REIVINDICACIONES

i.Proteína de fusión, que comprende (a) un componente extracelular compuesto por un dominio de unión que se une específicamente a una diana, (b) un componente intracelular compuesto por un dominio de señalización intracelular y (c) un componente hidrófobo que conecta los componentes extracelular e intracelular, en la que el componente extracelular comprende una porción extracelular de un CD200R y el dominio de señalización intracelular comprende un dominio de señalización intracelular de CD28.
2. Proteína de fusión según la reivindicación 1, en la que la expresión de la proteína de fusión en una célula T que comprende un TCR o un receptor de antígeno quimérico específico de un antígeno da como resultado al menos aproximadamente un aumento de 1,5 veces, 2 veces o 3 veces en la supervivencia, expansión, citotoxicidad, secreción de citocinas y/o respuesta a múltiples rondas de estimulación, por la célula T, en respuesta a la unión del antígeno y/o tras la administración a un sujeto, y/o da como resultado al menos aproximadamente un aumento de 1,5 veces, 2 veces o 3 veces en el tiempo de supervivencia, supervivencia libre de enfermedad o mejora de uno o más síntomas de la enfermedad, de un sujeto al que se le administra la célula, en comparación con una célula sustancialmente igual que la célula T pero que no contiene la proteína de fusión.
3. Proteína de fusión según cualquiera de las reivindicaciones 1-2, en la que el componente extracelular comprende además una porción extracelular adicional.
4. Proteína de fusión según la reivindicación 3, en la que el componente extracelular o la porción extracelular adicional comprende un dominio de multimerización y/o un espaciador.
5. Proteína de fusión según la reivindicación 4, en la que el dominio de multimerización comprende un componente extracelular modificado para contener un residuo de cisteína dentro de aproximadamente 2 a aproximadamente 15 aminoácidos del componente hidrófobo.
6. Proteína de fusión según una cualquiera de las reivindicaciones 1-5, en la que el componente hidrófobo comprende un dominio transmembrana de un CD2, CD3e, CD38, CD3^, CD25, CD27, CD28, CD40, CD79A, CD79B, CD80, CD86, CD95 (Fas), CD134 (OX40), CD137 (4-1BB), CD150 (SLAMF1), CD152 (CTLA4), CD200R, CD223 (LAG3), CD270 (HVEM), CD272 (BTLA), CD273 (PD-L2), CD274 (PD-L1), CD278 (ICOS), CD279 (PD-1), CD300, CD357 (GITR), A2aR, DAP10, FcRa, FcRp, FcRy, Fyn, GAL9, KIR, Lck, LAT, LRP, NKG2D, NOTCH1, NOTCH2, NOTCH3, NOTCH4, PTCH2, ROR2, Ryk, Slp76, SIRPa, pTa, TCRa, TCRP, TIM3, TRIM, LPA5 o Zap70.
7. Proteína de fusión según cualquiera de las reivindicaciones 1-6, en la que el dominio de señalización intracelular comprende además un dominio de señalización intracelular de un CD3e, CD38, CD3^, CD25, CD27, CD40, CD47, CD79A, CD79B, CD134 (OX40), CD137 (4-1BB), CD150 (SLAMF1), CD278 (ICOS), CD357 (GITR), CARD11, DAP10, DAP12, FcRa, FcRp, FcRy, Fyn, Lck, LAT, LRP, NKG2D, NOTCH1, NOTCH2, NOTCH3, NOTCH4, ROR2, Ryk, Slp76, pTa, TCRa, TCRp, TRIM, Zap70, PTCH2 o cualquier combinación de los mismos.
8. Proteína de fusión según cualquiera de las reivindicaciones 1-7, en la que el componente hidrófobo comprende un dominio transmembrana de un CD28 o un CD137 (4-1BB).
9. Proteína de fusión según la reivindicación 8, en la que el componente intracelular comprende un segundo dominio de señalización intracelular.
10. Proteína de fusión según la reivindicación 8 ó 9, en la que el componente extracelular comprende una porción extracelular de un CD28 que se extiende desde el dominio transmembrana de CD28.
11. Proteína de fusión según la reivindicación 1, en la que el componente extracelular comprende una secuencia de aminoácidos codificada por una molécula de ácido nucleico tal como se expone en SEQ ID NO: 2, 8 u 11, el componente hidrófobo comprende una secuencia de aminoácidos codificada por una molécula de ácido nucleico tal como se expone en SEQ ID NO: 3 ó 4, y el componente intracelular comprende una secuencia de aminoácidos codificada por una molécula de ácido nucleico tal como se expone en SEQ ID NO: 5.
12. Proteína de fusión según la reivindicación 11, en la que el componente extracelular comprende además un dominio de multimerización que tiene una secuencia de aminoácidos codificada por una molécula de ácido nucleico tal como se expone en SEQ ID NO: 9.
13.Proteína de fusión según la reivindicación 12, en la que el componente intracelular comprende además un segundo dominio de señalización intracelular que tiene una secuencia de aminoácidos codificada por una molécula de ácido nucleico tal como se expone en SEQ ID NO: 13.
14. Proteína de fusión según la reivindicación 1, en la que el componente extracelular está asociado con una señal negativa y el componente intracelular está asociado con una señal positiva y en la que el componente extracelular comprende un dominio de unión con una secuencia de aminoácidos tal como se expone en SEQ ID NO: 31 ó 34, y un dominio de multimerización con una secuencia de aminoácidos tal como se expone en SEQ ID NO: 32, el componente hidrófobo comprende una secuencia de aminoácidos tal como se expone en SEQ ID NO: 27, y el componente intracelular comprende una aminoácido tal como se expone en SEQ ID NO: 28.
15. Proteína de fusión según la reivindicación 14, en la que el componente intracelular comprende además un segundo dominio de señalización intracelular que tiene una secuencia de aminoácidos tal como se expone en SEQ ID NO: 36.
16. Molécula de ácido nucleico que codifica para una proteína de fusión según una cualquiera de las reivindicaciones 1-15.
17. Vector que comprende una molécula de ácido nucleico según la reivindicación 16.
Vector según la reivindicación 17, en el que el vector es un vector viral, opcionalmente en el que el vector viral es un vector lentiviral o retroviral.
19. Vector según la reivindicación 17 o la reivindicación 18, que codifica además para un TCR específico de antígeno.
20. Célula huésped, que comprende una proteína de fusión según una cualquiera de las reivindicaciones 1-15.
21. Proteína de fusión según una cualquiera de las reivindicaciones 1-15, vector según una cualquiera de las reivindicaciones 17-19 o célula huésped según la reivindicación 20, para su uso en un método para tratar una enfermedad en un sujeto.
22. Proteína de fusión, vector o célula huésped para su uso según la reivindicación 21, en los que la enfermedad es cáncer.