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ES2973573T3 - Métodos para atrapar e identificar con código de barras unidades biológicas discretas en hidrogel - Google Patents

Métodos para atrapar e identificar con código de barras unidades biológicas discretas en hidrogel Download PDF

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ES2973573T3
ES2973573T3 ES18733327T ES18733327T ES2973573T3 ES 2973573 T3 ES2973573 T3 ES 2973573T3 ES 18733327 T ES18733327 T ES 18733327T ES 18733327 T ES18733327 T ES 18733327T ES 2973573 T3 ES2973573 T3 ES 2973573T3
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hydrogel
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ES18733327T
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Stuart J Edelstein
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Scipio Bioscience SAS
Original Assignee
Scipio Bioscience SAS
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Abstract

La presente invención se refiere a métodos para atrapar y codificar con barras unidades biológicas discretas en un hidrogel. Se relaciona además con métodos para analizar la expresión genética, genotipo, haplotipo o epigenoma en unidades biológicas discretas. La presente invención también se refiere a kits para implementar los métodos de la presente divulgación. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

DESCRIPCIÓN
Métodos para atrapar e identificar con código de barras unidades biológicas discretas en hidrogel
Campo de la invención
La presente invención se refiere a métodos para atrapar e identificar con código de barras unidades biológicas discretas en un hidrogel. En particular, la presente invención se refiere a métodos para el análisis de la expresión de unidades biológicas discretas. Los métodos de la presente invención se pueden utilizar además para la elaboración de perfiles del transcriptoma, genotipado, faseo y/o haplotipado unicelulares.
Antecedentes de la invención
Para obtener un análisis de secuenciación de nueva generación (NGS), deben producirse tres tareas: 1) preparación de muestras (prep. de muestras), 2) secuenciación y 3) bioinformática. La microfluídica se ha aprovechado para mejorar el primero de los tres requisitos, prep. de muestras, específicamente, permitiendo la paralelización de alto rendimiento (HT) de reacciones y eficacias de escala. Una aplicación que tiene una necesidad crítica de preparación de muestras microfluídicas HT es el análisis de la expresión génica de células individuales mediante secuenciación de ARN (RNAseq de células individuales). El motivo de esto es que el número de células que se van a analizar puede variar de cientos a miles, y cada flujo de trabajo comienza por aislar primero células individuales en cámaras de reacción individuales. Por tanto, la capacidad de paralelización HT de las reacciones de cualquier plataforma microfluídica debe ser compatible con estos requisitos de número de células.
La primera plataforma microfluídica que se comercializó para el análisis RNAseq de células individuales estaba basada en la tecnología de chips de PDMS (polidimetilsiloxano). Las versiones disponibles de la plataforma pueden procesar de decenas a cientos de células. Las células de una suspensión se aíslan en cámaras de PDMS con un volumen de nanolitros (nL) y a continuación se lisan mediante la aplicación de un reactivo de lisis a través de la abertura de la válvula y el acceso a la entrada de reactivos de lisis apropiada. La abertura de la válvula y la selección de entradas de reactivos específicas se hacen en cada etapa posterior para lograr consecutivamente la transcripción inversa del ARNm, la adición de secuencias de adaptador al ADNc y la PCR. Los amplicones de productos de células individuales se recogen a continuación del chip y se procesan en masa para finalizar la prep. de muestras de secuenciación. Las plataformas que utilizan arquitectura de PDMS son limitadas, ya que requieren costosos chips de PDMS multicapa y sofisticado instrumental de control térmico y de la presión para manejar esos chips. Además, el número de reacciones está determinado por los elementos de PDMS más pequeños que se pueden fabricar. Para un chip de dimensiones razonables, esto significa que no se pueden procesar más de 1000 células en un momento dado, lo que no es suficiente para una proporción grande de muestras biológicas. E incluso si el rendimiento es adecuado, la infraestructura de PDMS, tanto desde el punto de vista del chip como del instrumento, es prohibitivamente costosa.
Las emulsiones de gotículas de agua en aceite son otra forma de microfluídica. En comparación con la tecnología basada en PDMS, las gotículas tienen la ventaja de proporcionar un aumento significativo en los números de reacciones. El rendimiento solo está limitado por el volumen de la emulsión y los números aumentan proporcionalmente al disminuir el tamaño de las gotículas. Los documentos WO2016130704 y WO2017075265 también han dado a conocer métodos basados en la encapsulación de células individuales en hidrogeles. Sin embargo, no se daba a conocer ninguna partícula identificada con código de barras que sea capaz de formar un complejo con la célula. En su lugar, las partículas identificadas con código de barras se ponían en contacto con la célula después de la lisis celular.
El descubrimiento de la encapsulación de perlas recubiertas con oligos clonales, que son exclusivos para cada perla, ha permitido la codificación molecular paralela de reacciones de gotículas. Por ejemplo, en el área de aplicación de la expresión génica, después de la lisis celular en gotículas, los oligos de las perlas se unen al ARNm y, en el proceso, codifican el transcriptoma de una sola célula con una etiqueta molecular de la perla común, también conocida como código de barras de la perla. Tras la secuenciación, las secuencias con el mismo código de barras se pueden agrupar, lo que reconstruye eficazmente el acoplamiento previo de una perla y una célula en cámaras de reacción o gotículas individuales, y permite el análisis de células individuales. Las etapas de biología molecular varían según las diversas formas de las plataformas tecnológicas que codifican gotículas. En Drop-SEQ, después de la unión del ARNm a los oligos de las perlas en gotículas, las etapas posteriores de transcripción inversa y preparación de muestras tienen lugar en masa sobre emulsiones rotas. En otras plataformas comercializadas, la transcripción inversa se produce en gotículas, teniendo lugar en masa las etapas finales de preparación de muestras.
Por ejemplo, el documento WO2015200541 da a conocer métodos para analizar el ácido nucleico de una pluralidad de células formando particiones en un dispositivo microfluídico, comprendiendo cada partición una sola partícula identificada con código de barras y una sola célula. Tras la lisis celular, la secuencia de captura de la partícula identificada con código de barras se puede hibridar al ácido nucleico de la célula individual en cada partición.
Aunque eliminan el cuello de botella del rendimiento de la tecnología de chips de PDMS, las gotículas tienen otros inconvenientes importantes. En primer lugar, las gotículas y su formación monodispersa son incompatibles con los niveles de detergente que se utilizan para lisar células difíciles de lisar (tales como células vegetales, determinadas bacterias, en particular, bacterias gram+, mohos, esporas, levaduras, micobacterias, etc.), acceder a los núcleos y realizar varias etapas de biología molecular críticas. En segundo lugar, la realización de reacciones de biología molecular de múltiples etapas es extremadamente difícil en gotículas. Aunque es posible mediante la fusión o picoinyección de gotículas, por ejemplo, los flujos de trabajo de gotículas de múltiples etapas aumentan significativamente la complejidad y el coste de la configuración microfluídica. En tercer lugar, las plataformas de gotículas requieren aceites de alto grado, chips sofisticados, cuyos elementos son difíciles de fabricar a escala industrial, e instrumentos para acomodar y administrar un control de flujo preciso a través de esos chips. Los tres elementos requeridos para las plataformas de gotículas, a saber, aceites, chips e instrumentos, suponen una carga para la fabricación y la asistencia técnica, y lo que es más importante, aumentan significativamente los costes para el usuario final, limitando de ese modo la adopción generalizada de la tecnología de gotículas.
La presente invención está diseñada para eliminar los inconvenientes de las tecnologías existentes. De hecho, sorprendentemente, los inventores han desarrollado un nuevo método para el análisis de la expresión génica de células individuales que no requiere chips de PDMS ni gotículas y, al mismo tiempo, conserva el beneficio clave de las plataformas de gotículas al poder procesar más de miles de células. Basada en la utilización de una plataforma de hidrogeles, esta nueva tecnología también resuelve los tres problemas clave asociados a las tecnologías de gotículas. En primer lugar, la plataforma de hidrogeles admite cualquier nivel de detergente, lo que crea la posibilidad de lisar cualquier célula o núcleos, además de admitir reacciones de bioquímica y biología molecular clave. En segundo lugar, las reacciones de múltiples etapas se pueden realizar con facilidad, ya que los reactivos solubles pueden acceder fácilmente al área del reactor a través del hidrogel. Las reacciones posteriores se realizan simplemente intercambiando la solución mayoritaria en contacto con el hidrogel. En tercer lugar, no hay necesidad de aceites, chips e instrumentos de generación de gotículas costosos. Para la automatización, se puede utilizar un instrumento para manejar la plataforma de reactores de hidrogel, pero no es necesario.
Las limitaciones de las tecnologías de PDMS y gotículas, y las mejoras de la plataforma de reactores de hidrogel, no se limitan al área de la expresión génica de células individuales. Afectan a cualquier aplicación donde el sustrato tenga múltiples sitios de unión de cebador, tales como genomas de células individuales y moléculas de ADN desnudo largas que se utilizan como sustratos en aplicaciones de faseo y estructura del genoma. Las reacciones de biología molecular varían según la identidad del sustrato y los requisitos de rendimiento del método de prep. de muestras. Sin embargo, los métodos fundamentales para atrapar e identificar con código de barras unidades biológicas en hidrogel siendo los mismos.
Compendio
La presente invención se refiere a un método para atrapar unidades biológicas discretas en un hidrogel, comprendiendo dicho método las etapas de:
a) poner en contacto una pluralidad de unidades biológicas con una pluralidad de unidades de código de barras para formar complejos unidad biológica/unidad de código de barras, en donde cada unidad de código de barras comprende un código de barras exclusivo, y en donde dichas unidades de código de barras comprenden al menos un medio implicado en la unión de dichas unidades biológicas,
b) poner en contacto dichos complejos unidad biológica/unidad de código de barras con una solución de hidrogel, y
c) polimerizar la solución de hidrogel para incluir complejos unidad biológica/unidad de código de barras discretos en una matriz de hidrogel,
d) identificar con código de barras el ácido nucleico de la unidad biológica dentro de cada uno de dichos complejos unidad biológica/unidad de código de barras en la matriz de hidrogel.
La presente invención se refiere además a un método para analizar la expresión génica en unidades biológicas discretas, comprendiendo dicho método las etapas de:
a) poner en contacto una pluralidad de unidades biológicas con una pluralidad de unidades de código de barras para formar complejos unidad biológica/unidad de código de barras, en donde cada unidad de código de barras comprende un código de barras exclusivo, y en donde dichas unidades de código de barras comprenden al menos un medio implicado en la unión de dichas unidades biológicas,
b) poner en contacto dichos complejos unidad biológica/unidad de código de barras con una solución de hidrogel,
c) polimerizar la solución de hidrogel para incluir complejos unidad biológica/unidad de código de barras discretos en una matriz de hidrogel,
d) liberar ácidos nucleicos desde cada unidad biológica en la matriz de hidrogel,
e) identificar con código de barras dichos ácidos nucleicos procedentes de cada unidad biológica en la matriz de hidrogel,
f) sintetizar una genoteca de ADNc a partir de los ácidos nucleicos procedentes de cada unidad biológica, g) amplificar dicha genoteca de ADNc procedente de cada unidad biológica, en donde la amplificación de dicha genoteca de ADNc procedente de cada unidad biológica incorpora copias clonales de dicho código de barras exclusivo en los productos de amplificación procedentes de cada unidad biológica, y
h) opcionalmente, secuenciar los productos de amplificación.
La presente invención se refiere además a un método para analizar el genotipo en unidades biológicas discretas, comprendiendo dicho método las etapas de:
a) poner en contacto una pluralidad de unidades biológicas con una pluralidad de unidades de código de barras para formar complejos unidad biológica/unidad de código de barras, en donde cada unidad de código de barras comprende un código de barras exclusivo, y en donde dichas unidades de código de barras comprenden al menos un medio implicado en la unión de dichas unidades biológicas,
b) poner en contacto dichos complejos unidad biológica/unidad de código de barras con una solución de hidrogel, c) polimerizar la solución de hidrogel para incluir complejos unidad biológica/unidad de código de barras discretos en una matriz de hidrogel,
d) liberar ADN genómico desde cada unidad biológica en la matriz de hidrogel,
e) identificar con código de barras dicho ADN genómico procedente de cada unidad biológica en la matriz de hidrogel, f) opcionalmente, sintetizar una genoteca de ADN a partir de los ácidos nucleicos procedentes de cada unidad biológica,
g) amplificar dicho ADN genómico o genoteca de ADN procedente de cada unidad biológica, en donde la amplificación de dicho ADN genómico o genoteca de ADN procedente de cada unidad biológica incorpora copias clonales de dicho código de barras exclusivo en los productos de amplificación de cada unidad biológica, y h) opcionalmente, secuenciar los productos de amplificación.
La presente invención se refiere además a un método para analizar el haplotipo de unidades biológicas discretas, comprendiendo dicho método las etapas de:
a) poner en contacto una pluralidad de unidades biológicas con una pluralidad de unidades de código de barras para formar complejos unidad biológica/unidad de código de barras, en donde cada unidad de código de barras comprende un código de barras exclusivo, y en donde dichas unidades de código de barras comprenden al menos un medio implicado en la unión de dichas unidades biológicas,
b) poner en contacto dichos complejos unidad biológica/unidad de código de barras con una solución de hidrogel, c) polimerizar la solución de hidrogel para incluir complejos unidad biológica/unidad de código de barras discretos en una matriz de hidrogel,
d) opcionalmente, liberar ácidos nucleicos desde cada unidad biológica en la matriz de hidrogel,
e) identificar con código de barras dichos ácidos nucleicos procedentes de cada unidad biológica en la matriz de hidrogel,
f) opcionalmente, sintetizar una genoteca de ADN a partir de los ácidos nucleicos procedentes de cada unidad biológica,
g) amplificar dichos ácidos nucleicos o genoteca de ADN procedentes de cada unidad biológica, en donde la amplificación de dichos ácidos nucleicos o genoteca de ADN procedentes de cada unidad biológica incorpora copias clonales de dicho código de barras exclusivo en los productos de amplificación procedentes de cada unidad biológica, y
h) opcionalmente, secuenciar los productos de amplificación.
La presente invención se refiere además a un método para analizar el epigenoma en unidades biológicas discretas, comprendiendo dicho método las etapas de:
a) poner en contacto una pluralidad de unidades biológicas celulares con una pluralidad de unidades de código de barras para formar complejos unidad biológica/unidad de código de barras, en donde cada unidad de código de barras comprende un código de barras exclusivo, y en donde dichas unidades de código de barras comprenden al menos un medio implicado en la unión de dichas unidades biológicas,
b) poner en contacto dichos complejos unidad biológica/unidad de código de barras con una solución de hidrogel, c) polimerizar la solución de hidrogel para incluir complejos unidad biológica/unidad de código de barras discretos en una matriz de hidrogel,
d) liberar ADN no unido al nucleosoma desde cada unidad biológica en la matriz de hidrogel,
e) identificar con código de barras dicho ADN no unido al nucleosoma procedente de cada unidad biológica en la matriz de hidrogel,
f) opcionalmente, sintetizar una genoteca de ADN a partir del ADN no unido al nucleosoma procedente de cada unidad biológica,
g) amplificar dicho ADN no unido al nucleosoma o genoteca de ADN procedente de cada unidad biológica, en donde la amplificación de dicho ADN no unido al nucleosoma o genoteca de ADN procedente de cada unidad biológica incorpora copias clonales de dicho código de barras exclusivo en los productos de amplificación de cada unidad biológica, y
h) opcionalmente, secuenciar los productos de amplificación.
En una realización, las unidades biológicas están inmovilizadas sobre un soporte. En una realización, las unidades de código de barras están inmovilizadas sobre un soporte.
En una realización, las unidades biológicas están inmovilizadas sobre un soporte en una capa de hidrogel. En una realización, las unidades de código de barras están inmovilizadas sobre un soporte en una capa de hidrogel.
En una realización, el código de barras exclusivo está presente en múltiples copias clonales sobre cada unidad de código de barras.
En una realización, el código de barras exclusivo comprende un código de barras de secuencias de ácido nucleico.
En una realización, el código de barras exclusivo comprende un cebador de secuencias de ácido nucleico. En una realización, el cebador de secuencias de ácido nucleico comprende cebadores de secuencias de ácido nucleico aleatorios. En una realización, el cebador de secuencias de ácido nucleico comprende cebadores de secuencias de ácido nucleico específicos.
En una realización, el al menos un medio implicado en la unión de unidades biológicas comprende proteínas, péptidos y/o fragmentos de los mismos; anticuerpos y/o fragmentos de los mismos; ácidos nucleicos; carbohidratos; vitaminas y/o derivados de las mismas; coenzimas y/o derivados de las mismas; ligandos de receptores y/o derivados de los mismos; y/o grupos hidrófobos.
En una realización, cada unidad de código de barras consiste en una perla.
En una realización, la etapa de identificación con código de barras se lleva a cabo en la matriz de hidrogel mediante hibridación de moldes de cebador.
En un ejemplo, la etapa de identificación con código de barras se lleva a cabo en la matriz de hidrogel mediante extensión dirigida por cebadores.
En una realización, la etapa de identificación con código de barras se lleva a cabo en la matriz de hidrogel mediante ligadura.
En una realización, las unidades biológicas discretas comprenden células, grupos de células, virus, núcleos, mitocondrias, cloroplastos, macromoléculas biológicas, exosomas, cromosomas, fragmentos de ADN de transposición conservadora de contigüidad y/o fragmentos de ácidos nucleicos.
En una realización, las células o grupos de células comprenden células en cultivoin vitro,células madre, células tumorales, células de biopsias tisulares, células sanguíneas y células de secciones tisulares.
Definiciones
En la presente invención, los términos siguientes tienen los significados siguientes.
- El término“aproximadamente”,o“de forma aproximada”,puede significar dentro de un intervalo de error aceptable para el valor particular, como lo determina un experto en la materia, el cual dependerá, en parte, de cómo se mida o determine el valor, es decir, de las limitaciones del sistema de medición. Por ejemplo,“aproximadamente”puede significar dentro de 1 o más de 1 desviación estándar, según la práctica en la técnica. Alternativamente,“aproximadamente”, antes de una cifra, significa más o menos 10% del valor de dicha cifra. Alternativamente, en particular en lo que respecta a sistemas o procedimientos biológicos, el término puede significar dentro de un orden de magnitud, dentro de 5 veces, y más preferiblemente dentro de 2 veces, de un valor. Donde se describen valores particulares en la presente solicitud y las reivindicaciones, a menos que se indique de otro modo, debe asumirse que el término“aproximadamente”significa dentro de un intervalo de error aceptable para el valor particular.
- El término“amplificación”se refiere al procedimiento para producir múltiples copias, es decir, al menos 2 copias, de una secuencia molde deseada. Las técnicas para amplificar ácidos nucleicos son bien conocidas por el experto en la materia, e incluyen métodos de amplificación específica, así como métodos de amplificación aleatoria.
- El término“adición de cola A”se refiere a un método enzimático para añadir un nucleótido de A en ausencia de molde al extremo 3' de una molécula de ADN bicatenario romo.
- El término“código de barras”se refiere a un patrón molecular que se puede utilizar como identificador exclusivo para identificar exclusivamente una unidad biológica discreta. El término“código de barras”se refiere además al patrón molecular que se utiliza para identificar la fuente u origen de un analito dentro de una muestra, tal como, por ejemplo, una secuencia de ácido nucleico extraída o derivada de una unidad biológica discreta.
- El término“unidad de código de barras”se refiere a un sustrato o matriz identificable sobre el que se puede unir o inmovilizar una unidad biológica. La unidad de código de barras puede ser rígida, sólida o semisólida.
- El término“identificación con código de barras”se refiere a la fijación de un código de barras de la unidad de código de barras discreta, preferiblemente un código de barras de ácido nucleico, a las secuencias de ácido nucleico molde de la unidad biológica mediante hibridación de moldes de cebador, síntesis de ADN dependiente de cebador y/o ligadura.
- El término“perla”se refiere a una partícula discreta, que puede ser esférica (por ejemplo, microesferas) o tener una forma irregular. Las perlas pueden ser tan pequeñas como de aproximadamente 0,1 pm de diámetro o tan grandes como de aproximadamente varios milímetros de diámetro.
- El término“unidad biológica”se refiere a estructuras biológicas discretas y porciones, componentes o combinaciones de estructuras biológicas. Los ejemplos de unidades biológicas incluyen, pero no se limitan a, una célula o un grupo de células, un virus, un orgánulo, tal como un núcleo, una mitocondria o un cloroplasto, un complejo macromolecular, tal como un exosoma, una macromolécula biológica, tal como un cromosoma, un fragmento de ácido nucleico, un fragmento de ADN de transposición conservadora de contigüidad (ADN-CPT), una proteína o un péptido.
- El término“carbohidrato”se refiere a cualquiera de una clase de compuestos orgánicos con la fórmula general Cx(H2O)y. Los carbohidratos incluyen azúcares, almidones, celulosas y gomas. Un carbohidrato puede ser un monosacárido, un disacárido o un polisacárido. Los carbohidratos pueden ser naturales o sintéticos.
Un monosacárido es un monómero, o azúcar simple, que tiene una estructura de una sola cadena o un solo anillo. Los monosacáridos se pueden clasificar además mediante su estructura y el número de átomos de carbono en el anillo o la cadena, tales como aldosas, cetosas, piranosas, furanosas, triosas, tetrosas, pentosas, hexosas y heptosas, entre otros. Los ejemplos de monosacáridos incluyen, pero no se limitan a, N-acetilglucosamina, alosa, altrosa, arabinosa, desoxirribosa, dihidroxiacetona, eritrosa, fructosa, fucosa, a-L-fucopiranosa, galactosa, b-D-galactopiranosa, ácido galacturónico, glucosa (dextrosa), ácido glucurónico, gliceraldehído, gulosa, idosa, lixosa, manosa, a-D-manopiranosa, ácido manurónico, ácido neuramínico, psicosa, ramnosa, ribosa, ribulosa, sorbosa, tagatosa, treosa, xilosa y xilulosa.
Los disacáridos se forman a partir de dos monosacáridos unidos mediante enlaces glicosídicos. Los ejemplos de disacáridos incluyen, pero no se limitan a, celobiosa, gentiobiosa, isomaltosa, lactosa, lactulosa, laminaribiosa, maltosa, manobiosa, melibiosa, nigerosa, rutinosa, sacarosa, trehalosa y xilobiosa. Los polisacáridos son polímeros formados a partir de dos o más monosacáridos unidos mediante enlaces glicosídicos. Los polisacáridos formados a partir de 3-10 monosacáridos a menudo se denominan oligosacáridos. Los ejemplos de polisacáridos incluyen, pero no se limitan a, agarosa, alginato, amilopectina, amilosa, carragenano, celulosa, quitina, quitohexanosa, quitosano, sulfato de condroitina, curdlano, sulfato de dermatano, dextrano, dextrina, emulsano, furcelarano, galactomanano, glucomanano, goma de gelano, glucosamina, glucógeno, glicosaminoglicano, goma guar, goma arábiga, sulfato de heparano, heparina, ácido hialurónico, ácido hialurónico desacilado, inulina, isomaltulosa, goma de karaya, sulfato de queratano, laminarano, goma de garrofín, ácido murámico, ácido péctico, pectina, pululano, pustulano, goma de ramsano, esquizofilano, escleroglucano, estaquiosa, almidón, goma de tragacanto, goma de welano, xantano y goma de xantano.
Como se emplea en la presente memoria, el término“carbohidrato”también se refiere a“glicoconjugados”, que son carbohidratos unidos covalentemente a otras especies químicas, tales como, por ejemplo, proteínas y lípidos. Los ejemplos de glicoconjugados incluyen, pero no se limitan a, glicolípidos, glicopéptidos, glicoproteínas, lipopolisacáridos y peptidoglicanos.
- El término“genoteca de ADNc”se refiere a una genoteca compuesta por ADN complementarios que se transcriben mediante transcripción inversa a partir de ARNm.
- Los términos“célula”y“grupo de células”incluyen, pero no se limitan a, células en cultivoin vitro; células madre, tales como células madre embrionarias, células madre adultas, células madre cancerígenas, células madre pluripotentes inducidas o células madre inducidas; células tumorales, tales como células neoplásicas; células de biopsias tisulares; células sanguíneas, tales como eritrocitos, leucocitos, mastocitos, macrófagos, trombocitos o células progenitoras de los mismos; y células de secciones tisulares.
- El término“copias clónales”se refiere a una población de copias idénticas de un solo código de barras.
- Los términos“recubrir”y“recubrimiento”se refieren a la cubrición, modificación o funcionalización de un sustrato, por ejemplo, de un soporte y/o una unidad de código de barras.
- El término“coenzima”se refiere a un elemento no proteínico que se une a una apoenzima, que es un factor que ayuda a una reacción enzimática cambiando una estructura química durante una reacción enzimática y aportando elementos funcionales, tales como átomos o electrones, a un sustrato de reacción. La“coenzima”también puede denominarse“cofactor”o“enzima auxiliar”.
Los ejemplos de coenzimas incluyen, pero no se limitan a, dinucleótido de nicotinamida y adenina (NAD), NADH, fosfato de dinucleótido de nicotinamida y adenina (NADP), NADPH, trifosfato de adenosina (ATP), sulfato de fosfoadenililo (PAPS), difosfato de uridina (UDP), difosfato de citidina (CDP), trifosfato de guanosina (GTP), trifosfato de inosina (ITP), pirofosfato de tiamina (TPP), mononucleótido de flavina (EMM), dinucleótido de flavina y adenina (FAD), coenzima-A (CoA), biocitina, ácido tetrahidrofólico, coenzima B12, lipoil-lisina, 1, 1 -cis-retinal y 1,2,5-dihidroxicolecalciferol.
- Los términos“complemento” o “complementaria”se refieren a una secuencia de polinucleótidos capaz de formar apareamientos de bases mediante enlaces de hidrógeno con otra secuencia de polinucleótidos. Por ejemplo, la guanina (G) es la base complementaria de la citosina (C), y la adenina (A) es la base complementaria de la timina (T) y del uracilo (U).
- El término“contigüidad”se refiere a una relación espacial entre dos o más fragmentos de ADN basada en información compartida. El aspecto compartido de la información puede ser con respecto a relaciones espaciales adyacentes, compartimentales y distantes. La información relativa a estas relaciones facilita, a su vez, el ensamblaje jerárquico o mapeo de lecturas de secuencias derivadas de los fragmentos de ADN. Esta información de contigüidad mejora la eficacia y exactitud de dicho ensamblaje o mapeo, dado que los métodos de ensamblaje o mapeo tradicionales, utilizados en asociación con la secuenciación de escopeta convencional, no tienen en cuenta los orígenes o coordenadas genómicos relativos de las lecturas de secuencias individuales, ya que estos se refieren a la relación espacial entre los dos o más fragmentos de ADN de los que se obtuvieron las lecturas de secuencias individuales.
- El término“copia de una secuencia molde deseada”no significa necesariamente complementariedad o identidad de secuencia perfecta a la secuencia molde. Las copias pueden incluir, por ejemplo, análogos de nucleótidos, tales como desoxiinosina, alteraciones de secuencia intencionadas y/o errores de secuencia que se producen durante la amplificación. En una realización, una copia de una secuencia deseada es al menos aproximadamente 50%, al menos aproximadamente 60%, al menos aproximadamente 70%, al menos aproximadamente 80%, al menos aproximadamente 90%, al menos aproximadamente 95%, al menos aproximadamente 96%, al menos aproximadamente 97%, al menos aproximadamente 98%, al menos aproximadamente 99%, al menos aproximadamente 100% idéntica a la secuencia molde.
- El término“detergente”se refiere a moléculas que tienen características lipofílicas, así como hidrofílicas (es decir, anfifílicas). Los detergentes se clasifican en cuatro amplios grupos, en función de la carga eléctrica de los tensioactivos.
(1) Detergentes aniónicos se refiere a detergentes con una carga iónica negativa. Los ejemplos de detergentes aniónicos incluyen, pero no se limitan a, dodecilsulfato de sodio (SDS), N-laurilsarcosina (sarcosilo), colato de sodio, desoxicolato de sodio, glicocolato de sodio, taurocolato de sodio, taurodesoxicolato de sodio y dodecilsulfato de litio (LDS).
(2) Detergentes catiónicos se refiere a detergentes con una carga iónica positiva. Los ejemplos de detergentes catiónicos incluyen, pero no se limitan a, sales de amonio cuaternario, aminas con enlace amida, polioxietilen alquilaminas y aminas alicíclicas, etilendiaminas sustituidas con N, N, N', N'-tetraquis, 2-alquil-1 -hidroxietil-2-imidazolin aminas etoxiladas y sales de alquilamonio.
(3) Detergentes no iónicos se refiere a detergentes que no tienen ningún grupo iónico. Los ejemplos de detergentes no iónicos incluyen, pero no se limitan a, polisorbatos, etoxilatos de octilfenol, glucaminas, Lubrol, Brij, Nonidet, poloxámeros, Genapol e Igepal.
Los ejemplos de polisorbatos incluyen, pero no se limitan a, polisorbato 20 (Tween 20), polisorbato 40 (Tween 40), polisorbato 60 (Tween 60), polisorbato 65 (Tween 65), polisorbato 80 (Tween 80) y polisorbato 85 (Tween 85).
Los ejemplos de etoxilatos de octilfenol incluyen, pero no se limitan a, Triton X-15, Triton X-35, Triton X-45, Triton X-100, Triton X-102, Triton X-114, Triton X-165 (70%), Triton X-305 (70%), Triton X-405 (70%) y Triton X-705 (70%).
Los ejemplos de glucaminas incluyen, pero no se limitan a, N-octanoil-N-metilglucamina (MEGA-8), N-nonanoil-N-metilglucamina (MEGA-9) y N-decanoil-N-metilglucamina (m EgA-10).
Los ejemplos de Lubrol incluyen, pero no se limitan a, Lubrol WX, Lubrol PX, Lubrol 12A9, Lubrol 17A10, Lubrol 17A 17, Lubrol N13 y Lubrol G.
Los ejemplos de Brij incluyen, pero no se limitan a, Brij 35, Brij 58, Brij 93, Brij 97, Brij C2, Brij S2, Brij L4, Brij C10, Brij O10, Brij S10, Brij 020, Brij S20, Brij L23 y Brij S100.
Los ejemplos de Nonidet incluyen, pero no se limitan a, Nonidet P40.
Los ejemplos de poloxámero incluyen, pero no se limitan a, poloxámero 124, poloxámero 181, poloxámero 182, poloxámero 184, poloxámero 188 (Pluronic F68), poloxámero 331, poloxámero 407 (Pluronic F127)
Los ejemplos de Genapol incluyen, pero no se limitan a, Genapol X-080, Genapol X-100 y Genapol C-100.
Los ejemplos de Igepal incluyen, pero no se limitan a, Igepal CA-210, Igepal CA-520, Igepal CA-630, Igepal CA-720, Igepal c O-520, Igepal CO-630, Igepal CO-720, Igepal CO-890 e Igepal dM-970.
(4) Detergentes iónicos dipolares se refiere a detergentes que tienen grupos iónicos, pero no carga neta. Los ejemplos de detergentes iónicos dipolares incluyen, pero no se limitan a, amidosulfobetaínas, alquilbetaínas y propanosulfonatos de amonio, tales como amidosulfobetaína-14, amidosulfobetaína-16, 3-[(3-colamidopropil) dimetilamonio]-1 -propanosulfonato (CHAPS), 3-[(3-colamidopropil)dimetilamonio]-2-hidroxi-1 -propanosulfonato (CHAPSO), 3-(4-heptil)fenil-3-hidroxipropil)dimetilamoniopropanosulfonato (C7BzO), EMPIGEN® Bb , ion dipolar de 3-(N,N-dimetiloctilamonio)propanosulfonato, ion dipolar de 3-(decildimetilamonio)propanosulfonato, ion dipolar de 3-(dodecildimetilamonio)propanosulfonato, ion dipolar de 3-(N,N-dimetilmiristilamonio)propanosulfonato, ion dipolar de 3-(N,N-dimetilpalmitilamonio)propanosulfonato, ion dipolar de 3-(N,N-dimetiloctadecilamonio)propanosulfonato.
- El término“epigenoma”se refiere a todos los cambios químicos en el ADN y/o las proteínas histonas de una célula, y responsables de la regulación de la expresión génica, el desarrollo, la diferenciación y la supresión de los elementos transponibles.
- El término“estructura del genoma”se refiere al orden, los números y la presencia de unidades genéticas (tales como locus, genes y similares) situadas a lo largo de un cromosoma.
- El término“haplotipo”se refiere a un grupo de genes de diferentes locus sobre un solo cromosoma que se heredan juntos de un solo progenitor. La información de los haplotipos contribuye a la comprensión de los posibles efectos funcionales de las variantes génicas sobre la misma cadena (en cis) o una cadena alélica (en trans) de ADN.
- El término“hidrogel”se refiere a una red de polímeros, hidrófila y con alto contenido de agua, con reticulaciones físicas o químicas. Los hidrogeles se encuentran habitualmente en dos estados, en función, entre otros, del grado de reticulación: un estado sol y un estado gel. En el estado sol, el hidrogel se comporta como un líquido, mientras que en el estado gel, el hidrogel no presenta flujo. Como resultará evidente al experto en la materia, aunque el hidrogel ya puede ser un polímero en estado sol, el término “polimerización del hidrogel” se utiliza en la presente memoria para designar la polimerización y/o reticulación necesarias para lograr la transición de sol a gel.
- El término“matriz de hidrogel”se refiere a la estructura física del hidrogel en estado gel, es decir, la red reticulada de polímeros que logra la porosidad deseada para la finalidad de la presente invención, como se da a conocer además en la presente memoria.
- El término“identidad”, cuando se utiliza en una relación entre dos o más secuencias de ácido nucleico, se refiere al grado de similitud de secuencia entre ácidos nucleicos, como se determina mediante el número de coincidencias entre cadenas de dos o más residuos de nucleótidos. La“identidad”mide el porcentaje de coincidencias idénticas entre la menor de dos o más secuencias con alineaciones de huecos (si las hay) abordadas mediante un modelo matemático o un programa informático particular (es decir,“algoritmos”). La identidad de secuencias de ácido nucleico relacionadas se puede calcular fácilmente mediante métodos conocidos. Dichos métodos incluyen, pero no se limitan a, los descritos en Lesk, Arthur M. (1988), “Computational molecular biology”, Nueva York, NY: Oxford University Press; Smith, Douglas W. (1993), “Biocomputing: informatics and genome projects”, Nueva York, NY: Academic Press; Griffin, Annette M., y Hugh G. Griffin (1994), “Computer analysis of sequence data, parte 1”, Totowa, NJ: Humana; vonHeinje, Gunnar (1987), “Sequence analysis in molecular biology: treasure trove or trivial pursuit”, Academic Press; Gribskov, Michael y John Devereux (1991), “Sequence analysis primer”, Nueva York, NY: M. Stockton Press; Carilloet al.,1988. SIAM J. Applied Math. 48:1073. Los métodos preferidos para determinar la identidad están diseñados para dar la mayor coincidencia entre las secuencias ensayadas. Los métodos para determinar la identidad se describen en programas informáticos disponibles al público. Los métodos de programas informáticos preferidos para determinar la identidad entre dos secuencias incluyen el paquete de programas GCG, que incluye GAP (Devereuxet al.,1984). Nucl Acid Res. 2:387; Genetics Computer Group, Universidad de Wisconsin, Madison, Wis.), BLASTN y FASTA (Altschulet al.,1990. J Mol Biol. 215:403-410). El programa BLASTX está disponible al público en el Centro Nacional de Información Biotecnológica (NCBI) y otras fuentes (manual de BLAST; Altschuletal.,NCB/NLM/NIH Bethesda, Maryland 20894; Altschuletal.,1990. J Mol Biol. 215:403-410). El bien conocido algoritmo de Smith Waterman también se puede utilizar para determinar la identidad.
- El término“ligadura”se refiere al procedimiento para unir moléculas de ADN con enlaces covalentes. Por ejemplo, la ligadura de ADN implica crear un enlace fosfodiéster entre el hidroxilo 3' de un nucleótido y el fosfato 5' de otro. La ligadura se lleva a cabo preferiblemente a una temperatura que varía de aproximadamente 4 a aproximadamente 37 °C en presencia de una enzima ligasa. Los ejemplos de ligasas adecuadas incluyen ligasa deThermus thermophilus,ligasa deThermus acquaticus,ligasa deE. coli,ligasa de T4 y ligasa dePyrococcus.
- El término“lisado”se refiere a una genoteca líquida o sólida de materiales después de un procedimiento de lisis de una unidad biológica.
- El término“lisis”, o“lisar”, se refiere a la ruptura de una unidad biológica con el fin de obtener acceso a materiales que de otro modo son inaccesibles. Cuando la unidad biológica es una célula, lisis se refiere a romper la membrana celular de la célula, lo que permite la transferencia de reactivos a la célula a través de los orificios de la membrana celular y/o provoca que el contenido celular se derrame. Los métodos de lisis son bien conocidos por el experto en la materia e incluyen, pero no se limitan a, lisis proteolítica, lisis química, lisis térmica, lisis mecánica y lisis osmótica.
- Los términos“cebador de secuencias de ácido nucleico”o“cebador”se refieren a un oligonucleótido que es capaz de hibridarse con un ácido nucleico y sirve como sitio de inicio para la polimerización de nucleótidos en condiciones apropiadas, tales como la presencia de trifosfatos de nucleósidos y una enzima para la polimerización, tal como ADN o ARN polimerasa, o transcriptasa inversa, en un tampón apropiado y a una temperatura adecuada.
- El término“oligonucleótido”se refiere a un polímero de nucleótidos, generalmente a un polímero monocatenario de nucleótidos. En algunas realizaciones, el oligonucleótido comprende de 2 a 500 nucleótidos, preferiblemente de 10 a 150 nucleótidos, preferiblemente de 20 a 100 nucleótidos. Los oligonucleótidos pueden ser sintéticos o se pueden preparar enzimáticamente. En algunas realizaciones, los oligonucleótidos pueden comprender monómeros de ribonucleótidos, monómeros de desoxirribonucleótidos o una mezcla de ambos.
- Los términos“secuencia ancla para PCR”y“secuencia de etiqueta universal”son intercambiables y se refieren a una secuencia de ácido nucleico útil para permitir la amplificación, preferiblemente la amplificación por PCR, y la secuenciación adicional de secuencias de ácido nucleico extraídas o derivadas de las unidades biológicas. En una realización, el ancla para PCR carece de homología con la secuencia molde. En una realización, el ancla para PCR es común para todo el flujo de trabajo de preparación de muestras.
- El término“faseo”se refiere a la identificación del complemento individual de cromosomas homólogos.
- Los términos“pulido”o“arromado”se refieren a la eliminación de extremos salientes de ADN 3' o 5' incompatibles para el fomento de la ligadura de extremos romos. Se pueden utilizar varias técnicas bien conocidas por el experto en la materia para el pulido de extremos de ADN. Por ejemplo, se pueden eliminar nucleótidos desapareados terminales de extremos de ADN utilizando una enzima con actividad de exonucleasa, que hidroliza un enlace fosfodiéster terminal, eliminando de ese modo una base del extremo saliente cada vez. En los fragmentos de ADN con extremos salientes 5', estos se pueden arromar rellenando con ADN polimerasa un extremo 3' entrante en presencia de dNTP. La eliminación o relleno de extremos se puede lograr utilizando varias enzimas, que incluyen el fragmento grande de ADN polimerasa I (Klenow), la ADN polimerasa de T4 o la nucleasa de judía mungo.
- Los términos“reacción en cadena de la polimerasa”o“PCR”abarcan métodos que incluyen, pero no se limitan a, PCR específica de alelo, PCR asimétrica, PCR de inicio en caliente, PCR específica de intersecuencia, PCR específica de metilación, PCR con minicebadores, amplificación múltiple de sondas dependiente de ligadura, PCR múltiple, PCR cuantitativa de PCR1 anidada, PCR con transcripción inversa y/o PCR de toma de contacto. Las enzimas ADN polimerasa adecuadas para amplificar ácidos nucleicos comprenden, pero no se limitan a, fragmento de Stoffel de polimerasa deTaq,polimerasa deTaq,ADN polimerasa Advantage, AmpliTaq, AmpliTaq Gold, polimerasa deTaqTitanium, ADN polimerasa KlenTaq, polimerasa deTaqPlatinum, polimerasa deTaqAccuprime, polimerasa dePfu,polimerasa dePfuturbo, polimerasa Vent, exopolimerasa Vent, polimerasa dePwo,ADN polimerasa 9 Nm, Therminator, ADN polimerasa dePfx,ADN polimerasa Expand, ADN polimerasa dertTH,polimerasa DyNAzyme-EXT, fragmento de Klenow, ADN polimerasa I, polimerasa de T7, SequenaseTM, polimerasa deTfi,ADN polimerasa de T4, polimerasa deBst,polimerasa deBca,polimerasa deBsu,ADN polimerasa de phi-29 y ADN polimerasa Beta, o versiones modificadas de las mismas. En una realización, la ADN polimerasa tiene una actividad de corrección de errores 3'-5', es decir, exonucleasa. En una realización, la ADN polimerasa tiene una actividad de corrección de errores 5'-3', es decir, exonucleasa. En una realización, la ADN polimerasa tiene actividad de desplazamiento de cadena, es decir, la ADN polimerasa provoca la disociación de un ácido nucleico apareado de su cadena complementaria en una dirección de 5' a 3', junto con, y cerca de, la síntesis de ácidos nucleicos dependiente de molde. Las ADN polimerasas, tales como la<a>D<n>polimerasa I de E.coli,el fragmento de Klenow de ADN polimerasa I, la ADN polimerasa de bacteriófago T7 o T5 y la transcriptasa inversa del VIH, son enzimas que poseen tanto actividad de polimerasa como actividad de desplazamiento de cadena. Se pueden utilizar agentes tales como helicasas, junto con agentes inductores que no poseen actividad de desplazamiento de cadena, con el fin de producir el efecto de desplazamiento de cadena, es decir, el desplazamiento de un ácido nucleico acoplado a la síntesis de un ácido nucleico de la misma secuencia. Asimismo, se podrían utilizar proteínas, tales como Rec A o proteína de unión de ADN monocatenario deE. colio de otro organismo, para producir o fomentar el desplazamiento de cadena, junto con otros agentes inductores (Kornberg A. y Baker T. A. (1992). Capítulos 4-6. In DNA replication (2.a edición, páginas 113 225). Nueva York: W. H. Freeman).
- El término“extensión dirigida por cebadores”se refiere a cualquier método conocido en la técnica en donde se utilizan cebadores para iniciar la replicación de secuencias de ácido nucleico en la amplificación lineal o logarítmica de moléculas de ácidos nucleicos. La extensión dirigida por cebadores se puede lograr mediante cualquiera de diversos esquemas conocidos en esta técnica, que incluyen, pero no se limitan a, reacción en cadena de la polimerasa (PCR), reacción en cadena de la ligasa (LCR) y amplificación por desplazamiento de cadena (SDA). La“extensión dirigida por cebadores”se puede llevar a cabo mediante enzimas ADN polimerasa, como se han descrito anteriormente en la presente memoria.
- El término“técnicas de amplificación aleatoria”incluye, sin limitación, amplificación de desplazamiento múltiple (MDA), PCR aleatoria, amplificación aleatoria de ADN polimórfico (RAPD) o múltiples ciclos de amplificación basados en hibridación y bucle (MALBAC).
- El término“ligando de un receptor”se refiere a cualquier sustancia que se une a otra entidad, tal como un receptor, desde un complejo más grande.
- El término“transcripción inversa”se refiere a la replicación de ARN utilizando una ADN polimerasa dirigida por ARN (transcriptasa inversa, RT) para producir cadenas complementarias de ADN (ADNc). La transcripción inversa de ARN se puede llevar a cabo mediante técnicas bien conocidas por el experto en la materia utilizando una enzima transcriptasa inversa y una mezcla de trifosfato de 4 desoxirribonucleótidos (dNTP), a saber, trifosfato de desoxiadenosina (dATP), trifosfato de desoxicitidina (dCTP), trifosfato de desoxiguanosina (dGTP) y trifosfato de (desoxi)timidina (dTTP). En algunas realizaciones, la transcripción inversa de ARN comprende una primera etapa de síntesis de ADNc de primera cadena. Los métodos para la síntesis de ADNc de primera cadena son bien conocidos por el experto en la materia. Las reacciones de síntesis de ADNc de primera cadena pueden utilizar una combinación de cebadores específicos de secuencia, cebadores de oligo(dT) o cebadores aleatorios. Los ejemplos de enzimas transcriptasa inversa incluyen, pero no se limitan a, transcriptasa inversa de M-MLV, SuperScript II (Invitrogen), SuperScript III (Invitrogen), SuperScript IV (Invitrogen), Maxima (ThermoFisher Scientific), ProtoScript II (New England Biolabs) y PrimeScript (ClonTech).
- Los términos“elaboración de perfiles del epigenoma unicelular”o“epigenómica unicelular”se refieren al análisis del epigenoma de una sola célula.
- Los términos“genotipado unicelular”o“genómica unicelular”se refieren al análisis del genoma de una sola célula.
- El término“haplotipado unicelular”se refiere a la resolución de haplotipos sobre la base del genoma completo.
- Los términos“elaboración de perfiles del transcriptoma unicelular”o“transcriptómica unicelular”se refieren al análisis del transcriptoma de una sola célula.
- El término“región de espaciador”se refiere a un grupo químico o un resto de anclaje que se utiliza para alargar la longitud de un oligonucleótido. Los ejemplos de espaciadores incluyen, pero no se limitan a, polímeros de etilenglicol, alquilo, oligonucleótidos, péptidos y peptidomiméticos.
- El término“técnicas de amplificación específica”incluye, sin limitación, métodos que requieren la variación cíclica de la temperatura (tales como reacción en cadena de la polimerasa (PCR), reacción en cadena de la ligasa, amplificación basada en transcripción) y/o sistemas de amplificación isotérmicos (tales como replicación de secuencias autosostenida, sistema de replicasa, sistema de helicasa, amplificación de desplazamiento de cadena, amplificación basada en círculos rodantes y NASBA).
- El término“soporte”se refiere a una matriz sobre la que se pueden inmovilizar unidades biológicas y/o unidades de código de barras. El soporte puede ser rígido, sólido o semisólido.
- Los términos“molde”o“secuencia molde”se refieren a una secuencia de ácido nucleico para la que se desea la amplificación. Un molde puede comprender ADN o ARN. En una realización, la secuencia molde es conocida. En una realización, la secuencia molde no es conocida.
- El término“cambio de molde”se refiere a la capacidad de una transcriptasa inversa para cambiar de un molde de secuencias de ácido nucleico inicial al extremo 3' de un nuevo molde de secuencias de ácido nucleico (denominado“oligonucleótido de cambio de molde”) que tiene poca o ninguna complementariedad al extremo 3' del ADNc sintetizado a partir del molde inicial.
- Los términos“secuencia de adaptador de cambio de molde”y“oligonucleótido de cambio de molde”se refieren a un molde de oligonucleótido al que una polimerasa cambia desde un molde inicial (por ejemplo, un molde de ADN o ARN) durante una reacción de polimerización de ácidos nucleicos. A este respecto, el molde de ADN o ARN se puede denominar“molde donador”y el oligonucleótido de cambio de molde se puede denominar“molde aceptor”.
Cuando se produce la transcripción inversa utilizando una transcriptasa inversa del virus de la leucemia murina de Moloney (transcriptasa inversa de M-MLV), la actividad de nucleotidiltransferasa (TdT) terminal de la enzima da como resultado la adición de nucleótidos no dirigida por molde al extremo 3' de la cadena de ADNc incipiente. Un“oligonucleótido de cambio de molde”añadido de forma exógena se hibrida al tracto de C mediante un sitio de cebador de poli(G). La transcriptasa inversa cambia a continuación los moldes del ARNm al oligonucleótido de cambio de molde, añadiendo una“secuencia de adaptador”, o“adaptador”, al ADNc de primera cadena de (es decir, “añadiendo un adaptador”).Preferiblemente, la secuencia de adaptador comparte homología con el ancla para PCR.
- El término“transcriptoma”se refiere a todo el componente de ARN de una célula individual. En algunos casos, el término“transcriptoma”puede referirse específicamente a los productos poliadenilados de ARN polimerasa II.
- La expresión“secuencia de identificador molecular exclusiva”se refiere a una secuencia de ácido nucleico útil para discriminar entre duplicados de los productos de amplificación después de la amplificación por PCR y la secuenciación adicional de secuencias de ácido nucleico de las unidades biológicas.
- El término“vitamina”se refiere a cualquiera de un grupo de sustancias orgánicas esenciales, en pequeñas cantidades, para el metabolismo normal en un sujeto. Los ejemplos de vitaminas incluyen, pero no se limitan a, a caroteno, p-caroteno, g-caroteno, retinol y tretinoína (vitamina A); tiamina (vitamina B1) y análogos tales como acefurtiamina, alitiamina, benfotiamina, fursultiamina, octotiamina, prosultiamina y sulbutiamina; riboflavina (vitamina B2); niacina y ácido nicotínico (vitamina B3); adenina, carnitina y colina (vitamina B4); ácido pantoténico, dexpantenol y pantetina (vitamina B5); piridoxina, fosfato de piridoxal, piridoxamina y piritinol (vitamina B6); biotina (vitamina B7); monofosfato de adenosina (AMP) e inositol (vitamina B8); ácido fólico, ácido dihidrofólico, ácido folínico y ácido levomefólico (vitamina B9); ácido 4-aminobenzoico (pABA) (vitamina B10); ácido pteril-hepta-glutámico (PHGA) (vitamina B11); adenosilcobalamina, cianocobalamina, hidroxocobalamina y metilcobalamina (vitamina B12); ácido orótico (vitamina B13); ácido pangámico (vitamina B15); dimetilglicina (DMG) (vitamina B16); amigdalina (vitamina B17); L-carnitina (vitamina B20); ácido ascórbico y ácido deshidroascórbico (vitamina C); ergosterol y ergocalciferol (vitamina D2); 7-deshidrocolesterol, previtamina D3, colecalciferol, 25-hidroxicolecalciferol, calcitriol y ácido calcitroico (vitamina D3); dihidroergocalciferol (vitamina D4); alfacalcidol, dihidrotaquisterol, calcipotriol, tacalcitol y paricalcitol (vitamina D5); a-tocoferol, p-tocoferol, g-tocoferol, 8-tocoferol, a-tocotrienol, p-tocotrienol, g-tocotrienol, 8-tocotrienol y tocofersolano (vitamina E); filoquinona (vitamina K1); menaquinonas (vitamina K2); menadiona (vitamina K3); menadiol (vitamina K4); y derivados de las mismas.
- La terminología utilizada en la presente memoria tiene la finalidad de describir únicamente casos particulares y no está destinada a ser limitante. Como se utiliza en la presente memoria, las formas singulares“un”, “uno/a”y“el/la”están destinadas a incluir también las formas plurales, a menos que el contexto lo indique claramente de otro modo. Además, en la medida en que se utilizan los términos“que incluye”, “incluye”, “que tiene”, “tiene”, “con”o variantes de los mismos en la descripción detallada y/o las reivindicaciones, dichos términos están destinados a ser inclusivos, de una manera similar al término“que comprende”.
Descripción detallada
La presente invención se refiere a métodos para atrapar e identificar con código de barras unidades biológicas discretas en un hidrogel. En una realización, una pluralidad de unidades biológicas están unidas sobre un soporte. En una realización, una pluralidad de unidades de código de barras están unidas sobre un soporte.
En una realización, el método comprende poner en contacto una pluralidad de unidades biológicas con una pluralidad de unidades de código de barras para formar complejos unidad biológica/unidad de código de barras. En una realización, el método comprende además poner en contacto los complejos unidad biológica/unidad de código de barras con una solución de hidrogel. En una realización, el método comprende además polimerizar la solución de hidrogel para incluir el complejo unidad biológica/unidad de código de barras en una matriz de hidrogel. En una realización, el método comprende además identificar con código de barras el ácido nucleico de la unidad biológica dentro de cada complejo unidad biológica/unidad de código de barras en la matriz de hidrogel.
En una realización, las unidades biológicas y las unidades de código de barras se desunen después de la polimerización del hidrogel, es decir, las propiedades químicas de la unión de los complejos unidad biológica/unidad de código de barras se degradan. Las técnicas para romper complejos son bien conocidas por el experto en la materia.
En una realización, se pueden realizar ensayos de bioquímica y biología molecular sobre unidades biológicas atrapadas en un hidrogel según la presente invención. En una realización, se pueden realizar ensayos de bioquímica y biología molecular sobre unidades biológicas discretas atrapadas en un hidrogel según la presente invención. En una realización, se pueden realizar ensayos de bioquímica y biología molecular sobre unidades de código de barras atrapadas en un hidrogel según la presente invención. En una realización, se pueden realizar ensayos de bioquímica y biología molecular sobre unidades de código de barras discretas atrapadas en un hidrogel según la presente invención. En una realización, el hidrogel se puede despolimerizar para permitir determinados ensayos de bioquímica y biología molecular en solución y/o en masa.
Los ejemplos de ensayos de bioquímica y biología molecular incluyen, pero no se limitan a, lisis celular, PCR, transcripción inversa, hidrolización de ácidos nucleicos, desprotección de extremos (es decir, hidrólisis de una estructura de caperuza 5'), elaboración de perfiles del transcriptoma (o transcriptómica), genotipado (o genómica), elaboración de perfiles del epigenoma (o epigenómica), faseo y haplotipado.
En la presente memoria se describen varios aspectos de los métodos según la presente invención con referencia a aplicaciones de ejemplos con fines ilustrativos. Debe entenderse que se exponen numerosos detalles, relaciones y métodos específicos para proporcionar una comprensión completa de las características descritas en la presente memoria. Sin embargo, un experto en la materia relevante reconocerá fácilmente que las características descritas en la presente memoria se pueden poner en práctica sin uno o más de los detalles específicos o con otros métodos. Las características descritas en la presente memoria no están limitadas por el orden de actos o eventos ilustrado, ya que algunos actos pueden producirse en diferentes órdenes y/o simultáneamente a otros actos o eventos. Además, no todos los actos o eventos ilustrados son necesarios para implementar una metodología de conformidad con las características descritas en la presente memoria.
Los hidrogeles se pueden clasificar en hidrogeles físicos y químicos con base en su mecanismo de reticulación. En una realización, los hidrogeles se preparan a partir de al menos un polímero natural. En una realización, los hidrogeles se preparan a partir de al menos un polímero sintético. En una realización, los hidrogeles se preparan a partir de al menos un polímero híbrido natural/sintético. En una realización, los hidrogeles se preparan a partir de al menos un polímero natural y al menos un polímero sintético.
En una realización, los hidrogeles utilizados en la presente invención son hidrogeles físicos.
Las reticulaciones de hidrogeles físicos incluyen, pero no se limitan a, cadenas entrelazadas, enlaces de hidrógeno, interacción hidrófoba y formación de cristalitos. El hidrogel físico se puede sintetizar mediante interacción iónica, cristalización, formación de estereocomplejos, polisacáridos hidrofobizados, interacción de proteínas y enlace de hidrógeno.
En una realización, los hidrogeles físicos son permanentes. En una realización, los hidrogeles físicos son reversibles. En una realización, los hidrogeles utilizados en la presente invención son hidrogeles químicos.
Las reticulaciones de hidrogeles químicos incluyen, pero no se limitan a, enlaces covalentes. Los hidrogeles químicos se pueden sintetizar mediante polimerización por crecimiento de cadena, polimerización por adición y condensación, y polimerización por haz de rayos gamma y de electrones.
En una realización, los hidrogeles químicos se forman mediante polimerización de macrómeros funcionalizados en los extremos.
En una realización, los hidrogeles químicos son permanentes. En una realización, los hidrogeles químicos son reversibles. En una realización, los hidrogeles son hidrogeles de polisacáridos.
Los polisacáridos incluyen, pero no se limitan a, alginato, agarosa, k-carragenano, i-carragenano, quitosano, dextrano, heparina, gelano, goma de gelano natural, ramsano, ramsano desacetilado, S-657, welano.
En una realización, los hidrogeles de polisacáridos polimerizados se forman mediante reticulación covalente, reticulación iónica, conjugación química, esterificación y/o polimerización.
En una realización, el hidrogel de polisacáridos es alginato y el alginato polimerizado se forma mediante reticulación iónica en presencia de un catión divalente, tal como calcio.
En una realización, los hidrogeles son hidrogeles basados en proteínas.
Las proteínas incluyen, pero no se limitan a, colágeno, fibrina, gelatina y laminina.
En una realización, los hidrogeles basados en proteínas polimerizados se forman mediante gelificación térmica. En una realización, los hidrogeles a base de proteínas se reticulan utilizando un reticulante.
Los reticulantes de hidrogeles basados en proteínas incluyen, pero no se limitan a, carbodiimida, cianamida, almidón dialdehído, diimida, diisocianato, adipimidato de dimetilo, compuestos epoxídicos, etilaldehído, formaldehído, glutaraldehído, gliceraldehído, hexametilendiamina, tereftalaldehído y mezclas de los mismos.
En una realización, los hidrogeles son hidrogeles de polisacáridos combinados con proteínas, como se han descrito anteriormente en el presente memoria.
En una realización, los hidrogeles son hidrogeles sintéticos no biodegradables.
Los polímeros no biodegradables incluyen, pero no se limitan a, monómeros vinilados y macrómeros vinilados, en particular, metacrilato de 2-hidroxietilo, metacrilato de 2-hidroxipropilo, acrilamida, ácido acrílico, N-isopropilacrilamida, poli(N-isopropilacrilamida), monoacrilato de metoxipolietilenglicol.
En una realización, la polimerización de moléculas no biodegradables requiere al menos un reticulante. En una realización, los hidrogeles sintéticos no biodegradables se forman mediante copolimerización de moléculas no biodegradables y un reticulante.
Los reticulantes de hidrogeles sintéticos no biodegradables incluyen, pero no se limitan a, N,N'-metilenbisacrilamida, diacrilato de etilenglicol y diacrilato de polietilenglicol.
En una realización, la polimerización de moléculas no biodegradables requiere además al menos un iniciador, tal como, por ejemplo, iones persulfato (persulfato de amonio, persulfato de potasio y similares), nitrato de amonio y cerio (IV), tetrametiletilendiamina (TEMED).
En una realización, el hidrogel se puede despolimerizar. Por “despolimerización” se entiende una reacción durante la cual el hidrogel vuelve a solución. Como le resultará evidente al experto en la materia, esto no requiere necesariamente despolimerización exhaustiva y/o rotura exhaustiva de las reticulaciones. El grado de despolimerización y/o rotura de las reticulaciones requerido para lograr la transición de gel a sol dependerá de la naturaleza del hidrogel y se puede determinar fácilmente mediante métodos habituales. En una realización, la despolimerización del hidrogel es química. En una realización, la despolimerización del hidrogel es térmica. En una realización, la despolimerización del hidrogel es enzimática.
En una realización, la despolimerización del hidrogel se puede lograr mediante eliminación de cationes divalentes. Los ejemplos de hidrogeles que se pueden despolimerizar mediante eliminación de cationes divalentes incluyen, pero no se limitan a, alginato. En una realización, la despolimerización del hidrogel se puede lograr mediante la adición de agente reductor. Los ejemplos de agentes reductores incluyen, pero no se limitan a, fosfinas (por ejemplo, tris(2-carboxietil)fosfina (TCEP)) y ditiotreitol (DTT). Los ejemplos de hidrogeles que se pueden despolimerizar mediante adición de agente reductor incluyen, pero no se limitan a, hidrogeles copolimerizados con un reticulante, tal como hidrogeles sintéticos no biodegradables.
En una realización, la despolimerización del hidrogel se puede lograr mediante fusión térmica, es decir, fusión con aumento de la temperatura.
En una realización, el hidrogel utilizado en la presente invención es termosensible.
Por“termorreversible”se entiende un hidrogel que, después de ser formado, se despolimeriza si se eleva la temperatura por encima del punto de fusión del, al menos un, polímero y se vuelve a formar si se enfría hasta temperatura ambiente o por debajo de su punto de fusión. En una realización, el hidrogel utilizado en la presente invención es termorreversible.
Por“termosensible”se entiende un hidrogel que, después de ser formado, se despolimeriza si se eleva la temperatura por encima del punto de fusión del, al menos un polímero, y no se vuelve a formar, incluso cuando se enfría hasta temperatura ambiente o por debajo de su punto de fusión.
En una realización, el punto de fusión del, al menos un, polímero del hidrogel está entre aproximadamente 20 °C y aproximadamente 200 °C, preferiblemente entre aproximadamente 25 °C y aproximadamente 100 °C.
En una realización, el hidrogel tiene un tamaño de poro lo suficientemente pequeño como para atrapar una unidad biológica, una unidad de código de barras y/o un analito extraído o derivado de una unidad biológica. En una realización, el hidrogel tiene un tamaño de poro lo suficientemente grande como para permitir la difusión de reactivos de bioquímica y biología molecular.
En una realización, el hidrogel tiene un tamaño de poro que varía entre aproximadamente 1 nm y 1 pm, preferiblemente entre aproximadamente 10 nm y 500 nm, más preferiblemente entre 25 nm y 250 nm.
En una realización, la matriz de hidrogel es accesible a reactivos de bioquímica y biología molecular. En una realización, la matriz de hidrogel tiene al menos una superficie accesible a reactivos de bioquímica y biología molecular. En un ejemplo, la al menos una superficie accesible a reactivos de bioquímica y biología molecular es natural. En una realización, la al menos una superficie accesible a reactivos de bioquímica y biología molecular se conforma antes, durante y/o después de la polimerización del hidrogel.
En una realización, la composición, figura, forma y modificaciones de la unidad de código de barras se pueden seleccionar de entre un abanico de opciones en función de la aplicación.
Los materiales ejemplares que se pueden utilizar como unidad de código de barras en la presente invención incluyen, pero no se limitan a, acrílicos, carbono (por ejemplo, grafito, fibra de carbono), celulosa (por ejemplo, acetato de celulosa), cerámica, vidrio de poro controlado, polisacáridos reticulados (por ejemplo, agarosa, SEPHAROSE™ o alginato), geles, vidrio (por ejemplo, vidrio modificado o funcionalizado), oro (por ejemplo, Au (111) atómicamente uniforme), grafito, vidrios inorgánicos, polímeros inorgánicos, látex, óxidos de metales (por ejemplo, SiO2, TiO2, acero inoxidable), metaloides, metales (por, ejemplo, Au (111) atómicamente uniforme), mica, sulfuros de molibdeno, nanomateriales (por ejemplo, nanoláminas de grafito pirolítico altamente orientado [HOPG]), nitrocelulosa, NYLON™, haces de fibra óptica, polímeros orgánicos, papel, plásticos, polacriloilmorfolida, poli(4-metilbuteno), tereftalato de polietileno, poli(butirato de vinilo), polibutileno, polidimetilsiloxano (PDMS), polietileno, poliformaldehído, polimetacrilato, polipropileno , polisacáridos, poliestireno, poliuretanos, difluoruro de polivinilideno (PVDF), cuarzo, rayón, resinas, cauchos, material semiconductor, sílice, silicio (por ejemplo, silicio de superficie oxidada), sulfuro y TEFLON™.
En una realización, la unidad de código de barras está compuesta por un solo material. En otra realización, la unidad de código de barras está compuesta por una mezcla de varios materiales diferentes.
En una realización, las unidades de código de barras utilizadas en la presente invención pueden ser cuadrículas de cuadrados simples, cuadrículas de damero, conjuntos ordenados hexagonales y similares. Las unidades de código de barras adecuadas también incluyen, pero no se limitan a, perlas, portaobjetos, chips, partículas, hebras, geles, láminas, tubos, esferas, recipientes, capilares, almohadillas, cortes, películas, placas de cultivo, placas de microtitulación, tales como de 768 pocillos, 384 pocillos, 96 pocillos, 48 pocillos, 24 pocillos, 12 pocillos, 8 pocillos, 6 pocillos, 4 pocillos, 1 pocillo y similares. En diversas realizaciones, la unidad de código de barras puede ser biológica, no biológica, orgánica, inorgánica o cualquier combinación de las mismas.
Por consiguiente, una sola unidad de código de barras en una pluralidad de unidades de código de barras puede ser una parte mínima e indivisible de dicha pluralidad de unidades de código de barras. Una sola unidad de código de barras en una pluralidad de unidades de código de barras puede ser, por ejemplo, un solo cuadrado sobre una cuadrícula, una sola perla en una población de perlas, un solo pocillo en una placa de microtitulación, etc. Alternativamente, una sola unidad de código de barras en una pluralidad de unidades de código de barras puede ser una parte mínima de dicha pluralidad de unidades de código de barras, en donde se produce un solo evento de unión entre una unidad biológica y una unidad de código de barras a nivel molecular. Alternativamente, una sola unidad de código de barras en una pluralidad de unidades de código de barras puede ser una parte de dicha pluralidad de unidades de código de barras que varían de aproximadamente 1 pm2 a aproximadamente 1 mm2, preferiblemente de aproximadamente 1 pm2 a aproximadamente 100 pm2, más preferiblemente de aproximadamente 1 pm2 a aproximadamente 50 pm2. En una realización, este intervalo de tamaños se elige por la capacidad de fabricación. En una realización, este intervalo de tamaños se elige para garantizar la formación de complejos unidad biológica/unidad de código de barras con una relación de 1:1. La superficie de la unidad de código de barras se puede modificar, según métodos conocidos por el experto en la materia, para fomentar el atrapamiento o inmovilización de unidades biológicas sobre la misma.
En una realización, la unidad de código de barras comprende grupos reactivos sobre su superficie, tales como carboxilo, amino, hidroxilo, epoxi y similares.
En una realización, la unidad de código de barras puede tener modificaciones funcionales, tales como grupos funcionales fijados a su superficie.
En una realización, la unidad de código de barras utilizada en la presente invención está identificada con código de barras.
En una realización, cada unidad de código de barras individual en una pluralidad de unidades de código de barras comprende un código de barras exclusivo. En una realización, cada unidad de código de barras individual en una pluralidad de unidades de código de barras comprende copias clonales de un código de barras exclusivo.
En una realización, la unidad de código de barras comprende al menos un medio implicado en la unión de al menos una unidad biológica.
En una realización preferida, la unidad de código de barras es una perla.
La implementación de métodos según la presente invención puede basarse en la identificación posterior de cada unidad biológica discreta y/o de los analitos de reacción unidos a cada unidad de código de barras. Por lo tanto, puede ser deseable añadir al menos un identificador o código de barras a la unidad de código de barras con el fin de transmitir información sobre la fuente u origen de la unidad biológica y/o de un analito dentro de una muestra, tal como, por ejemplo, una secuencia de ácido nucleico extraída o derivada de una unidad biológica discreta.
En una realización, la unidad de código de barras está identificada con código de barras. En una realización, cada unidad de código de barras individual en una pluralidad de unidades de código de barras comprende un código de barras exclusivo. En una realización, cada unidad de código de barras individual en una pluralidad de unidades de código de barras comprende copias clonales de un código de barras exclusivo.
Los códigos de barras pueden ser de un abanico de formatos diferentes, que incluyen marcadores, etiquetas, sondas, y similares.
En una realización, la unidad de código de barras está identificada con código de barras ópticamente. En una realización, la unidad de código de barras está identificada con código de barras no ópticamente. En una realización, la unidad de código de barras está identificada con código de barras óptica y no ópticamente.
Los códigos de barras ópticos incluyen, pero no se limitan a, cromóforos, puntos cuánticos, monómeros de estireno, y combinaciones de los mismos, que se pueden identificar, por ejemplo, mediante su espectro, tal como espectro Raman o espectro electromagnético; y/o mediante su intensidad de color.
Los códigos de barras no ópticos incluyen, pero no se limitan a, secuencias biomoleculares, tales como secuencias de ADN, ARN y/o proteínas, que se pueden identificar, por ejemplo, mediante secuenciación.
En una realización, el número de códigos de barras exclusivos utilizados en la presente invención varía de aproximadamente 2 a aproximadamente 1012.
En una realización, el número de copias clonales de cada código de barras exclusivo comprendido en cada unidad de código de barras individual en una pluralidad de unidades de código de barras varía de aproximadamente 2 a aproximadamente 1012.
En una realización, la unidad de código de barras según la presente invención comprende códigos de barras no ópticos. En una realización, la unidad de código de barras según la presente invención comprende códigos de barras de ácidos nucleicos. En una realización, el código de barras es monocatenario. En una realización, el código de barras es bicatenario. En una realización, el código de barras es monocatenario y/o bicatenario. En una realización, la unidad de código de barras según la presente invención comprende códigos de barras de ADN. En una realización, la unidad de código de barras según la presente invención comprende códigos de barras de ARN. En una realización, la unidad de código de barras según la presente invención comprende una mezcla de códigos de barras de ADN y ARN.
En una realización, el código de barras según la presente invención comprende de 5 a 20 nucleótidos, preferiblemente de 8 a 16 nucleótidos.
En una realización, la unidad de código de barras comprende una pluralidad de secuencias de ácido nucleico exclusivas, es decir, copias clonales de un código de barras exclusivo.
En una realización, dichas secuencias de ácido nucleico exclusivas son secuencias degeneradas. En una realización, dichas secuencias de ácido nucleico exclusivas están basadas en química combinatoria.
Las técnicas para fijar covalentemente códigos de barras sobre un soporte, preferiblemente sobre una unidad de código de barras, son bien conocidas por el experto en la materia e incluyen, sin limitación, replicación de cebadores unidos de manera combinatoria, ligadura de adaptadores de manera combinatoria y adición química de nucleótidos de manera combinatoria.
En una realización, dichas secuencias de ácido nucleico exclusivas se amplifican sobre la unidad de código de barras de modo tal que cada unidad de código de barras individual en una pluralidad de unidades de código de barras está recubierta con copias clonales de una secuencia de ácido nucleico de partida.
En una realización, la fijación covalente de códigos de barras de ácido nucleico a la unidad de código de barras se lleva a cabo directamente durante la síntesis de los códigos de barras. En una realización, la fijación covalente de códigos de barras de ácido nucleico a la unidad de código de barras se lleva a cabo después de la síntesis del código de barras.
Las técnicas para fijar covalentemente códigos de barras de ácido nucleico sobre una unidad de código de barras son bien conocidas por el experto en la materia. En una realización, la identificación con código de barras del ácido nucleico de la unidad biológica se logra mediante hibridación de moldes de cebador del código de barras al ácido nucleico de la unidad biológica. En una realización, la identificación con código de barras del ácido nucleico de la unidad biológica se logra mediante extensión dirigida por cebadores del código de barras al ácido nucleico de la unidad biológica. En una realización, la identificación con código de barras del ácido nucleico de la unidad biológica se logra mediante ligadura del código de barras al ácido nucleico de la unidad biológica.
La implementación de los métodos según la presente invención puede basarse en la inmovilización, replicación, extensión y/o amplificación de secuencias de ácido nucleico de, o procedentes de, las unidades biológicas. Por lo tanto, puede ser deseable añadir al menos un cebador de secuencias de ácido nucleico a la unidad de código de barras, preferiblemente al menos un cebador de secuencias de ácido nucleico a cada unidad de código de barras individual en una pluralidad de unidades de código de barras, con el fin de inmovilizar, replicar, extender y/o amplificar la información genética de, o procedente de, las unidades biológicas.
En una realización, el cebador de secuencias de ácido nucleico es monocatenario. En una realización, el cebador de secuencias de ácido nucleico es bicatenario. En una realización, el cebador de secuencias de ácido nucleico es monocatenario y/o bicatenario.
En una realización, el cebador de secuencias de ácido nucleico es un cebador de secuencias de ácido nucleico degenerado (es decir, aleatorio). En una realización, el cebador de secuencias de ácido nucleico es específico para una secuencia de ácido nucleico de interés. En una realización, el cebador de secuencias de ácido nucleico puede cebarse en múltiples ubicaciones de las secuencias de ácido nucleico de, o procedentes de, las unidades biológicas. En una realización, las secuencias de ácido nucleico de, o procedentes de, las unidades biológicas comprenden múltiples sitios de cebado.
En una realización, el cebador de secuencias de ácido nucleico comprende una secuencia de poli-dT. En una realización, el cebador de secuencias de ácido nucleico comprende una secuencia de poli-dU. Por consiguiente, el cebador de secuencias de ácido nucleico es específico para una secuencia de poli-A. Las secuencias de poli-A se pueden encontrar, por ejemplo, sobre el extremo 3' de los ARNm, dentro de la cola de poli-A.
En una realización, el cebador de secuencias de ácido nucleico comprende la secuencia (dT)<n>VN, en donde n varía de 5 a 50, V representa cualquier nucleótido, excepto T/U (es decir, A, C o G), y N representa cualquier nucleótido (es decir, A, T/U, C o G). En una realización, el cebador de secuencias de ácido nucleico comprende la secuencia (dU)<n>VN, en donde n varía de 5 a 50, V representa cualquier nucleótido, excepto T/U (es decir, A, C o G), y N representa cualquier nucleótido (es decir, A, T/U, C o G). Por consiguiente, el cebador de secuencias de ácido nucleico es específico para una secuencia de (A)<n>BN, en donde n varía de 5 a 50, B representa cualquier nucleótido, excepto A (es decir, T/U, C o G), y N representa cualquier nucleótido (es decir, A, T/U, C o G). Las secuencias de (A)<n>BN se pueden encontrar, por ejemplo, sobre el extremo 3' de los ARNm, superpuestas entre la cola de poli-A y la región no traducida (UTR) o la secuencia codificante (CDS) 3'.
En una realización, el cebador de secuencias de ácido nucleico comprende una secuencia de poli-I. Por consiguiente, el cebador de secuencias de ácido nucleico no es específico y puede cebarse a cualquier secuencia de ácido nucleico de, o procedente de, las unidades biológicas. En una realización, el cebador de secuencias de ácido nucleico comprende de 5 a 50 nucleótidos, preferiblemente de 5 a 30 nucleótidos.
En una realización, la fijación covalente de cebadores de secuencias de ácido nucleico a la unidad de código de barras se lleva a cabo directamente durante la síntesis de los cebadores de secuencias de ácido nucleico. En una realización, la fijación covalente de cebadores de secuencias de ácido nucleico a la unidad de código de barras se lleva a cabo después de la síntesis de los cebadores de secuencias de ácido nucleico.
En una realización, la unidad de código de barras comprende al menos un oligonucleótido.
En una realización, el al menos un oligonucleótido es un oligonucleótido de ADN. En una realización, el al menos un oligonucleótido es un oligonucleótido de ARN. En una realización, el al menos un oligonucleótido es un oligonucleótido híbrido de ADN/ARN.
En una realización, el al menos un oligonucleótido es monocatenario. En una realización, el al menos un oligonucleótido es bicatenario. En una realización, el al menos un oligonucleótido es monocatenario y/o bicatenario.
En una realización, el al menos un oligonucleótido comprende al menos un código de barras de ácido nucleico y al menos un cebador de secuencias de ácido nucleico. En una realización, el al menos un oligonucleótido comprende, de 5' a 3', al menos un código de barras de ácido nucleico y al menos un cebador de secuencias de ácido nucleico. En una realización, el al menos un oligonucleótido comprende, de 5' a 3', al menos un cebador de secuencias de ácido nucleico y al menos un código de barras de ácido nucleico. En una realización, los códigos de barras de ácido nucleico son idénticos en todos los oligonucleótidos sobre la superficie de una unidad de código de barras dada. En una realización, los códigos de barras de ácido nucleico son diferentes en todos los oligonucleótidos sobre la superficie de una unidad de código de barras con respecto a otra unidad de código de barras. En una realización, el cebador de secuencias de ácido nucleico es idéntico en todos los oligonucleótidos sobre la superficie de una unidad de código de barras dada. En una realización, el cebador de secuencias de ácido nucleico es diferente en todos los oligonucleótidos sobre la superficie de una unidad de código de barras dada. En una realización, el cebador de secuencias de ácido nucleico es idéntico en todos los oligonucleótidos y unidades de código de barras. En una realización, el código de barras de ácido nucleico comprende de 5 a 20 nucleótidos, preferiblemente de 8 a 16 nucleótidos. En una realización, el cebador de secuencias de ácido nucleico comprende de 5 a 50 nucleótidos, preferiblemente de 5 a 30 nucleótidos.
En una realización, el al menos un oligonucleótido comprende además un ancla para PCR. En una realización, el ancla para PCR es idéntica en todos los oligonucleótidos y unidades de código de barras. En una realización, el ancla para PCR comprende de 10 a 30 nucleótidos, preferiblemente de 15 a 25 nucleótidos.
En una realización, el al menos un oligonucleótido comprende además una secuencia de identificador molecular exclusiva. En una realización, la secuencia de identificador molecular exclusiva es diferente en todos los oligonucleótidos sobre la superficie de una unidad de código de barras dada. En una realización, la secuencia de identificador molecular exclusiva comprende de 10 a 30 nucleótidos, preferiblemente de 15 a 25 nucleótidos.
En una realización, el al menos un oligonucleótido comprende además una región de espaciador.
En una realización, el al menos un oligonucleótido comprende, de 5' a 3' (es decir, de proximal a distal con respecto a la superficie de la unidad de código de barras):
- opcionalmente, una región de espaciador;
- opcionalmente, un ancla para PCR;
- un código de barras de ácido nucleico;
- opcionalmente, una secuencia de identificador molecular exclusiva; y
- un cebador de secuencias de ácido nucleico.
En una realización, el al menos un oligonucleótido comprende, de 3' a 5' (es decir, de distal a proximal con respecto a la superficie de la unidad de código de barras):
- opcionalmente, una región de espaciador;
- opcionalmente, un ancla para PCR;
- un código de barras de ácido nucleico;
- opcionalmente, una secuencia de identificador molecular exclusiva; y
- un cebador de secuencias de ácido nucleico.
En una realización, la fijación covalente de oligonucleótidos de ácido nucleico a la unidad de código de barras se lleva a cabo directamente durante la síntesis de los oligonucleótidos de ácido nucleico. En una realización, la fijación covalente de oligonucleótidos de ácido nucleico a la unidad de código de barras se lleva a cabo después de la síntesis de los oligonucleótidos de ácido nucleico.
Las técnicas para fijar covalentemente y/o sintetizar oligonucleótidos de ácido nucleico sobre una unidad de código de barras, tal como tubos o perlas de vidrio o plástico, filtros de nitrocelulosa o nailon, pocillos de microtitulación, geles de perlas de agarosa y partículas magnéticas son bien conocidas por el experto en la materia. Estas incluyen, pero no se limitan a, irradiación UV, biotina-avidina/estreptavidina y fijación química covalente (Macoskoetal.,2015). Cell.
161:1202-1214; Fanet al.,2015. Science. 347(6222):1258367; Beaucage, S.L. (1993), In Protocols for oligonucleotides and analogs-Synthesis and properties. Totowa, NJ: Humana Press, 20:33-61; Conneret al.,1983. Proc Natl Acad Sci. EE. UU. 80:278-282; Lockleyet al.,1997. Nucleic Acids Res. 25:1313-1314; Jooset al.,1997. Anal Biochem. 247:96-101; Cohenet al.,1997. Nucl Acid Res. 25:911-912; Yanget al.,1998. Chem Lett. 3:257-258; Maskoset al.,1992. Nucl Acid Res. 20:1679-1684; Chriseyet al.,1996. Nucl Acid Res. 24:3131-3039; Chriseyet al.,1996. Nucl Acid Res. 24:3040-3047; Marbleet al.,1995. Biotechnol Prog. 11:393-396; Liuet al.,1997. Promega Notes Mag. 64:21-25; Weileret al.,1996. Anal Biochem. 243:218-227; Beattieet al.,1995. Mol Biotechnol. 4:213-225; Rasmussenet al.,1991. Anal Biochem. 198:138-142; Timofeevet al.,1996. Nucl Acid Res. 24:3142-3148; Yershovet al.,1997. Anal Biochem. 250:203-211; DeAngeliset al.,1995. Nucl Acid Res. 23:4742-4743; Haukaneset al.,1993. Biotechnology. 11:60-63).
La implementación de los métodos según la presente invención puede basarse en la unión y/o la inmovilización de una unidad biológica sobre la unidad de código de barras. Por lo tanto, puede ser deseable añadir al menos un medio para unir una unidad biológica a la unidad de código de barras con el fin de atrapar unidades biológicas discretas.
En una realización, la unión y/o la inmovilización de una unidad biológica a la unidad de código de barras es inespecífica. En una realización, la unión y/o la inmovilización de una unidad biológica a la unidad de código de barras es específica. En una realización, la unión y/o la inmovilización de una unidad biológica sobre la unidad de código de barras requiere la presencia de al menos un medio para unir una unidad de código de barras sobre la unidad biológica.
Los medios para unir una unidad biológica y/o medios para unir una unidad de código de barras comprenden, pero no se limitan a, una proteína o un fragmento de la misma, un péptido, un anticuerpo o un fragmento del mismo, un ácido nucleico (tal como ADN o ARN, monocatenarios o bicatenarios), un carbohidrato, una vitamina o un derivado de la misma, una coenzima o un derivado de la misma, un ligando de receptor o derivado del mismo, un grupo hidrófobo.
En una realización, los medios para unir una unidad biológica y/o los medios para unir una unidad de código de barras comprenden al menos una proteína y/o al menos un péptido. Los ejemplos de proteínas o péptidos incluyen, pero no se limitan a, anticuerpos (por ejemplo, IgA, IgD, IgE, IgG e IgM) y fragmentos de los mismos, que incluyen, pero no se limitan a, fragmentos Fab, fragmentos F(ab')2, fragmentos scFv, diacuerpos, triacuerpos, fragmentos scFv-Fc, minicuerpos; proteína A, proteína G, avidina, estreptavidina, receptores y fragmentos de los mismos, y ligandos y fragmentos de los mismos.
En una realización, los medios para unir una unidad biológica y/o los medios para unir una unidad de código de barras comprenden al menos un ácido nucleico. Los ejemplos de ácidos nucleicos incluyen, pero no se limitan a, ADN, ARN y ácidos nucleicos artificiales, tales como ácidos nucleicos que comprenden inosina, xantosina, wybutosina y/o análogos de los mismos.
En una realización, los medios para unir una unidad biológica y/o los medios para unir una unidad de código de barras comprenden al menos un carbohidrato. Los ejemplos de carbohidratos incluyen, pero no se limitan a, monosacáridos, disacáridos y polisacáridos.
En una realización, los medios para unir una unidad biológica y/o los medios para unir una unidad de código de barras comprenden al menos una vitamina.
En una realización, los medios para unir una unidad biológica y/o los medios para unir una unidad de código de barras comprenden al menos una coenzima.
En una realización, los medios para unir una unidad biológica y/o los medios para unir una unidad de código de barras comprenden al menos un ligando de receptor.
En una realización, los medios para unir una unidad biológica y/o los medios para unir una unidad de código de barras comprenden al menos un grupo hidrófobo. Los ejemplos de grupos hidrófobos incluyen, pero no se limitan a, grupos alquilo que tienen de aproximadamente 2 a aproximadamente 8 átomos de carbono, tales como un etilo, propilo, butilo, pentilo, heptilo u octilo, y formas isoméricas de los mismos; o grupos arilo, tales como fenilo, bencilo o naftilo.
Las técnicas para recubrir una unidad de código de barras con un medio para unir una unidad biológica son bien conocidas por el experto en la materia.
En una realización, el recubrimiento puede ser un recubrimiento integral, es decir, que cubre completamente la unidad de código de barras, o puede ser un recubrimiento parcial, es decir, que cubre solo partes de la unidad de código de barras.
En una realización, el recubrimiento de una unidad de código de barras con un medio para unir una unidad biológica requiere la funcionalización de la unidad de código de barras. Los ejemplos de unidades de códigos de barras funcionalizadas incluyen, pero no se limitan a, unidades de código de barras funcionalizadas con amino, unidades de código de barras funcionalizadas con carboxilo, unidades de código de barras funcionalizadas con hidroxilo y unidades de código de barras funcionalizadas con epoxi. Las técnicas para funcionalizar una unidad de código de barras son bien conocidas en la técnica e incluyen, pero no se limitan a, reticulación de organosilanos, tales como derivados de metoxisilanoisilano, etoxisilano y acetoxisilano.
Los ejemplos de técnicas para recubrir una unidad de código de barras con un medio para unir una unidad biológica incluyen, pero no se limitan a, adsorción y fijación covalente. La fijación covalente se puede realizar sobre unidades de código de barras funcionalizadas utilizando agentes de acoplamiento, tales como carbodiimida (EDC), N-hidroxisuccinimida (NHS), sulfo-NHS, dimetilaminopropilo (DEAP), glutaraldehído, aldehído, cianoborohidruro de sodio (NaCNBH<3>), 3-(2-piridilditio)propionato de succinimidilo (SPDP), ditiotreitol (DTT) y/o bromuro de cianógeno (BrNC). En una realización, el al menos un medio para unir una unidad de código de barras está presente de forma natural sobre, y/o en, la unidad biológica. En una realización, el al menos un medio para unir una unidad de código de barras no está presente de forma natural sobre, ni/o en, la unidad biológica.
En una realización, la unidad biológica se incuba con al menos un anticuerpo antes de la unión y/o la inmovilización sobre la unidad de código de barras. En una realización, el al menos un anticuerpo es específico contra la unidad biológica. En una realización, el al menos un anticuerpo está funcionalizado. Los ejemplos de funcionalización incluyen, pero no se limitan a, una proteína o un fragmento de la misma, un péptido, un anticuerpo o un fragmento del mismo, un ácido nucleico (tal como ADN o ARN, monocatenarios o bicatenarios), un carbohidrato, una vitamina o un derivado de la misma, una coenzima o un derivado de la misma, un ligando de receptor o derivado del mismo, y un grupo hidrófobo. En una realización, el anticuerpo está biotinilado, es decir, está funcionalizado con un resto de biotina. La implementación de los métodos según la presente invención puede basarse en la unión y/o la inmovilización de una sola unidad biológica sobre una sola unidad de código de barras. Por lo tanto, puede ser deseable impedir que más de una unidad biológica se una a cada unidad de código de barras o, alternativamente, impedir que más de una unidad de código de barras se una a cada unidad biológica.
En función de parámetros tales como la concentración y/o el tamaño tanto de las unidades biológicas como de las unidades de código de barras, se puede unir más de una unidad biológica a una sola unidad de código de barras y viceversa. Por consiguiente, los métodos según la presente invención proporcionan medios para garantizar, seleccionar y/o purificar complejos unidad biológica/unidad de código de barras con una relación de 1:1. Los métodos según la presente invención también proporcionan medios para formar complejos unidad biológica/unidad de código de barras con una relación de 1:1.
En una realización, los métodos de la presente invención comprenden una etapa de selección y/o purificación de complejos unidad biológica/unidad de código de barras con una relación de 1:1. Según una realización, se puede poner en contacto una pluralidad de unidades biológicas con una pluralidad de unidades de código de barras para formar complejos unidad biológica/unidad de código de barras, que se pueden seleccionar y/o purificar adicionalmente.
Las técnicas para seleccionar y/o purificar complejos son bien conocidas por el experto en la materia e incluyen, pero no se limitan a, técnicas de cromatografía de exclusión por tamaños, técnicas de gradiente de densidad y/o técnicas de filtración. En una realización, los métodos de la presente invención comprenden un medio para formar complejos unidad biológica/unidad de código de barras con una relación de 1:1.
En una realización, las unidades biológicas están unidas a un soporte. En una realización, las unidades de código de barras están unidas a un soporte.
La unión de una pluralidad de unidades biológicas a un soporte antes de ponerlas en contacto con una pluralidad de unidades de código de barras crea un obstáculo y permite que el soporte actúe como un impedimento, impidiendo la unión múltiple de unidades de código de barras a una sola unidad biológica. Por tanto, puede ser deseable utilizar unidades de código de barras más grandes, con respecto a las unidades biológicas. Adicionalmente, se puede utilizar una concentración limitante de unidades de código de barras, con respecto a las unidades biológicas, para garantizar la unión de, como máximo, una unidad de código de barras por unidad biológica.
Alternativamente, la unión de una pluralidad de unidades de código de barras a un soporte antes de ponerlas en contacto con una pluralidad de unidades biológicas crea un obstáculo y permite que el soporte actúe como un impedimento, impidiendo la unión múltiple de unidades biológicas a una sola unidad de código de barras. Por tanto, puede ser deseable utilizar unidades de código de barras más pequeñas, con respecto a las unidades biológicas. Adicionalmente, se puede utilizar una concentración limitante de unidades biológicas, con respecto a las unidades de código de barras, para garantizar la unión de, como máximo, una unidad biológica por unidad de código de barras.
En una realización, la composición, aspecto, forma y modificaciones del soporte se pueden seleccionar de entre un abanico de opciones en función de la aplicación.
Los materiales ejemplares que se pueden utilizar como soporte en la presente invención incluyen, pero no se limitan a, acrílicos, carbono (por ejemplo, grafito, fibra de carbono), celulosa (por ejemplo, acetato de celulosa), cerámica, vidrio de poro controlado, polisacáridos reticulados (por ejemplo, agarosa, SEPHAROSE™ o alginato), geles, vidrio (por ejemplo, vidrio modificado o funcionalizado), oro (por ejemplo, Au (111) atómicamente uniforme), grafito, vidrios inorgánicos, polímeros inorgánicos, látex, óxidos de metales (por ejemplo, SiO2, TiO2, acero inoxidable), metaloides, metales (por, ejemplo, Au (111) atómicamente uniforme), mica, sulfuros de molibdeno, nanomateriales (por ejemplo, nanoláminas de grafito pirolítico altamente orientado [HOPG]), nitrocelulosa, NYLON™, haces de fibra óptica, polímeros orgánicos, papel, plásticos, polacriloilmorfolida, poli (4-metilbuteno), tereftalato de polietileno), poli(butirato de vinilo), polibutileno, polidimetilsiloxano (PDMS), polietileno, poliformaldehído, polimetacrilato, polipropileno , polisacáridos, poliestireno, poliuretanos, difluoruro de polivinilideno (PVDF), cuarzo, rayón, resinas, cauchos, material semiconductor, sílice, silicio (por ejemplo, silicio de superficie oxidada), sulfuro y TEFLON™.
En una realización, el soporte está compuesto por un solo material. En otra realización, el soporte está compuesto por una mezcla de varios materiales diferentes.
En una realización, el soporte utilizado en la presente invención puede ser tubos, perlas, portaobjetos, chips, partículas, hebras, geles, láminas, tubos, esferas, recipientes, capilares, almohadillas, cortes, películas, placas de cultivo, placas de microtitulación, tales como de 768 pocillos, 384 pocillos, 96 pocillos, 48 pocillos, 24 pocillos, 12 pocillos, 8 pocillos, 6 pocillos, 4 pocillos, 1 pocillo, cuadrículas de cuadrados, cuadrículas de damero, conjuntos ordenados hexagonales y similares. En diversas realizaciones, el soporte puede ser biológico, no biológico, orgánico, inorgánico o cualquier combinación de los mismos.
La superficie del soporte se puede modificar, según métodos conocidos por el experto en la materia, para fomentar el atrapamiento o inmovilización de unidades biológicas sobre el mismo.
En una realización, el atrapamiento o inmovilización de una unidad biológica y/o de una unidad de código de barras al soporte es inespecífico.
En una realización, las unidades biológicas y/o unidades de código de barras están atrapadas o inmovilizadas en una capa de hidrogel que recubre el soporte.
En una realización, el atrapamiento o inmovilización de una unidad biológica y/o de una unidad de código de barras al soporte es específica.
En una realización, el soporte comprende grupos reactivos sobre su superficie, tales como carboxilo, amino, hidroxilo, epoxi, y similares. En una realización, el soporte puede tener modificaciones funcionales, tales como grupos funcionales fijados a su superficie. En una realización, el soporte comprende al menos un medio implicado en la unión de al menos una unidad biológica y/o al menos una unidad de código de barras.
Los medios para unir una unidad biológica y/o una unidad de código de barras comprenden, pero no se limitan a, una proteína o un fragmento de la misma, un péptido, un anticuerpo o un fragmento del mismo, un ácido nucleico (tal como ADN o ARN, monocatenarios o bicatenarios), un carbohidrato, una vitamina o un derivado de la misma, una coenzima o un derivado de la misma, un ligando de receptor o derivado del mismo, y un grupo hidrófobo, como se ha descrito anteriormente en la presente memoria.
Las técnicas para recubrir un soporte con un medio para unir una unidad biológica y/o una unidad de código de barras son bien conocidas por el experto en la materia.
En una realización, el recubrimiento puede ser un recubrimiento integral, es decir, que cubre completamente el soporte, o puede ser un recubrimiento parcial, es decir, que cubre solo partes del soporte.
En una realización, el recubrimiento de un soporte con un medio para unir una unidad biológica y/o una unidad de código de barras requiere la funcionalización del soporte. Los ejemplos de soportes funcionalizados incluyen, pero no se limitan a, soportes funcionalizados con amino, soportes funcionalizados con carboxilo, soportes funcionalizados con hidroxilo y soportes funcionalizados con epoxi. Las técnicas para funcionalizar un soporte son bien conocidas en la técnica e incluyen, pero no se limitan a, reticulación de organosilanos, tales como derivados de metoxisilanoisilano, etoxisilano y acetoxisilano.
Los ejemplos de técnicas para recubrir un soporte con un medio para unir una unidad biológica y/o una unidad de código de barras incluyen, pero no se limitan a, adsorción y fijación covalente. La fijación covalente se puede realizar sobre soportes funcionalizados utilizando agentes de acoplamiento, tales como carbodiimida (EDC), N-hidroxisuccinimida (NHS), sulfo-NHS, dimetilaminopropilo (DEAP), glutaraldehído, aldehído, cianoborohidruro de sodio (NaCNBH3), 3-(2-piridilditio)propionato de succinimidilo (SPDP), ditiotreitol (DTT) y/o bromuro de cianógeno (BrNC). En una realización, el método para atrapar unidades biológicas discretas en un hidrogel, según la presente invención, comprende las etapas de:
a) poner en contacto una pluralidad de unidades biológicas con una pluralidad de unidades de código de barras para formar complejos unidad biológica/unidad de código de barras,
b) poner en contacto dichos complejos unidad biológica/unidad de código de barras con una solución de hidrogel,
c) polimerizar la solución de hidrogel para incluir dichos complejos unidad biológica/unidad de código de barras en una matriz de hidrogel, e
d) identificar con código de barras el ácido nucleico de la unidad biológica dentro de cada uno de dichos complejos unidad biológica/unidad de código de barras en la matriz de hidrogel.
En una realización, cada unidad de código de barras comprende al menos un medio implicado en la unión de una unidad biológica, como se ha definido anteriormente en la presente memoria. En una realización, cada unidad biológica comprende al menos un medio implicado en la unión de la unidad de código de barras, como se ha definido anteriormente en la presente memoria.
En una realización, cada unidad de código de barras comprende un código de barras exclusivo, como se ha definido anteriormente en la presente memoria. En una realización, cada unidad de código de barras comprende copias clonales de un código de barras exclusivo.
En una realización, cada unidad de código de barras comprende al menos un cebador de secuencias de ácido nucleico, como se ha definido anteriormente en la presente memoria.
En una realización, cada unidad de código de barras comprende un oligonucleótido de ácido nucleico, como se ha definido anteriormente en la presente memoria.
En una realización, la pluralidad de unidades biológicas está unida a un soporte, como se ha definido anteriormente en la presente memoria. En una realización, la pluralidad de unidades de código de barras está unida a un soporte, como se ha definido anteriormente en la presente memoria.
En una realización, los métodos según la presente invención pueden comprender una etapa de selección y/o separación de las unidades biológicas. La selección y/o separación de unidades biológicas puede basarse en la expresión de una molécula de superficie dada, tal como una proteína o un carbohidrato, o en características de dispersión de la luz y fluorescencia específicas de cada unidad biológica. La selección y/o separación de unidades biológicas también pueden basarse en su tamaño. Los métodos para seleccionar y/o clasificar unidades biológicas son bien conocidos por el experto en la materia y comprenden, pero no se limitan a, separación de células activada por fluorescencia (FACS), hibridaciónin situfluorescente-citometría de flujo (FISH-FC), plataforma IsoRaft, tecnología de laboratorio en un chip DEPArray, separación magnética de células, inmunoprecipitación, filtración y similares.
En una realización, los métodos según la presente invención pueden comprender una etapa de lisis de las unidades biológicas.
En una realización, los métodos según la presente invención pueden comprender una etapa de transcripción inversa del contenido de ARN de las unidades biológicas, preferiblemente del contenido de ARNm de las unidades biológicas.
En una realización, los ensayos de bioquímica y biología molecular se pueden llevar a cabo antes, durante o después de la etapa de identificación con código de barras del ácido nucleico de la unidad biológica dentro de cada uno de dichos complejos unidad biológica/unidad de código de barras en la matriz de hidrogel.
En una realización, los métodos según la presente invención pueden comprender una etapa de preamplificación de los ácidos nucleicos de las unidades biológicas, tales como ADN, ARN o ADNc. En una realización, los métodos según la presente invención pueden comprender una etapa de preamplificación de los ácidos nucleicos de las unidades biológicas, tales como ADN, ARN o ADNc, antes de la etapa de identificación con código de barras del ácido nucleico de la unidad biológica dentro de cada uno de dichos complejos unidad biológica/unidad de código de barras en la matriz de hidrogel.
En una realización, los métodos según la presente invención pueden comprender una etapa de purificación de moldes para ensayos de bioquímica y biología molecular. Las proteínas y complejos endógenos o exógenos unidos a moldes de ácido nucleico o membranas que encapsulan moldes de ácido nucleico se pueden eliminar del hidrogel después de atrapar el complejo unidad biológica/unidad de código de barras. Las técnicas para la purificación de ácidos nucleicos son bien conocidas por el experto en la materia e incluyen, sin limitación, la utilización de proteinasa K y/o detergentes, tales como SDS, sarcosilo, NP-40, y similares.
En una realización, los métodos según la presente invención pueden comprender una etapa de lavado de los ácidos nucleicos amplificados. Antes de preparar una genoteca de ácidos nucleicos para secuenciación, puede ser deseable eliminar los cebadores monocatenarios y los productos de reacción, tales como enzimas. Las técnicas para el lavado de ácidos nucleicos son bien conocidas por el experto en la materia e incluyen, sin limitación, la utilización de nucleasas específicas de ácidos nucleicos monocatenarios y/o la utilización de fosfatasas para desfosforilar los extremos fosforilados de los ácidos nucleicos. Los ejemplos de nucleasas específicas de ácidos nucleicos monocatenarios incluyen, pero no se limitan a, exonucleasa I, nucleasa de judía mungo, nucleasa Bh1, nucleasa P1, nucleasa S1, nucleasa BAL 31. Los ejemplos de fosfatasas incluyen, pero no se limitan a, fosfatasa alcalina, tal como fosfatasa alcalina de gamba.
En una realización, los métodos según la presente invención pueden comprender una etapa de dimensionamiento de los ácidos nucleicos amplificados. Los secuenciadores de lectura corta, tales como Illumina o Ion Torrent, funcionan de forma óptima cuando se alimentan genotecas de ADN que contienen fragmentos de tamaños similares, según las recomendaciones del fabricante. Cuando el tamaño de las genotecas no se selecciona correctamente, estos secuenciadores pueden volverse menos eficaces. Las técnicas para la selección de tamaños de ADN son bien conocidas por el experto en la materia, e incluyen, pero no se limitan a, electroforesis en gel de ácidos nucleicos, protocolos basados en perlas, electroforesis en gel de campo pulsado (PFGE) y selección de tamaños automatizada.
En una realización, los métodos según la presente invención pueden comprender una etapa de fragmentación de genotecas de ácidos nucleicos y/o ADNc.
En una realización, los métodos según la presente invención pueden comprender una etapa de fragmentación enzimática de genotecas de ácidos nucleicos y/o ADNc.
En una realización, los métodos según la presente invención pueden comprender una etapa de fragmentación mecánica de genotecas de ácidos nucleicos y/o ADNc.
En una realización, los métodos según la presente invención pueden comprender una etapa de pulido de genotecas de ácidos nucleicos y/o ADNc.
En una realización, los métodos según la presente invención pueden comprender una etapa de adición de colas A en genotecas de ácidos nucleicos y/o ADNc.
En una realización, los métodos según la presente invención pueden comprender una etapa de ligadura de genotecas de ácidos nucleicos y/o ADNc.
En una realización, los métodos según la presente invención pueden comprender una etapa de tagmentación. Las técnicas para tagmentar genotecas de ácidos nucleicos y/o ADNc son bien conocidas por el experto en la materia.
En una realización, los métodos según la presente invención pueden comprender una etapa de secuenciación de ácidos nucleicos. En una realización, la secuenciación de ácidos nucleicos se puede llevar a cabo mediante secuenciación de nueva generación (NGS). Los métodos de NGS de genotecas de ácidos nucleicos son conocidos por el experto en la materia y comprenden, pero no se limitan a, secuenciación de extremos apareados, secuenciación por síntesis y secuenciación de lectura única.
En una realización, los métodos según la presente invención comprenden poner en contacto la matriz de hidrogel con reactivos de bioquímica y biología molecular útiles para llevar a cabo el método. En una realización, la matriz de hidrogel es lo suficientemente porosa como para permitir la difusión de reactivos de bioquímica y biología molecular, sin permitir la difusión de la unidad de código de barras, la unidad biológica y/o los analitos, tales como, por ejemplo, ácidos nucleicos extraídos o derivados de una unidad biológica discreta. En una realización, las etapas posteriores se pueden realizar intercambiando y/o lavando los reactivos de bioquímica y biología molecular en contacto con la matriz de hidrogel. Los reactivos de bioquímica y biología molecular son bien conocidos por el experto en la materia y abarcan todos los reactivos conocidos para realizar ensayos de bioquímica y biología molecular, tales como soluciones (soluciones de tampón, soluciones de lavado, y similares), detergentes, enzimas, cebadores de ácidos nucleicos, y similares.
En una realización, la difusión de reactivos de bioquímica y biología molecular es una difusión pasiva. La difusión pasiva incluye, pero no se limita a, ósmosis y difusioforesis.
En una realización, la difusión de reactivos de bioquímica y biología molecular es una difusión activa. Las técnicas para la difusión activa en un hidrogel son bien conocidas por el experto en la materia e incluyen, pero no se limitan a, la utilización de bombas, electroósmosis y electroforesis.
En una realización, las etapas posteriores se realizan intercambiando el reactivo mayoritario en contacto con el hidrogel.
En una realización, los métodos según la presente invención no requieren la utilización de aceites, chips y/o instrumentos de generación de gotículas costosos.
En una realización, los métodos según la presente invención se pueden automatizar.
En una realización, los métodos según la presente invención pueden comprender una etapa de disolución de la matriz de hidrogel. En una realización, la disolución de la matriz de hidrogel puede producirse en cualquier momento durante todo el método. Las técnicas para disolver una matriz de hidrogel son bien conocidas por el experto en la materia y comprenden, pero no se limitan a, despolimerización enzimática utilizando enzimas, tales como agarasa, y despolimerización térmica utilizando calor.
En una realización, la disolución de la matriz de hidrogel puede producirse una vez que se ha incorporado al menos una copia, preferiblemente copias clonales, de un código de barras exclusivo de al menos una unidad de código de barras en la unidad biológica y/o analitos, tales como, por ejemplo, ácidos nucleicos extraídos o derivados de una unidad biológica discreta.
En una realización, la despolimerización de la matriz de hidrogel puede producirse una vez que se ha cebado al menos un ácido nucleico extraído o derivado de una unidad biológica discreta al, al menos un, oligonucleótido, preferiblemente al, al menos un, oligonucleótido que comprende un cebador de secuencias de ácido nucleico de una unidad de código de barras discreta.
Los métodos descritos en la presente memoria se pueden implementar en un abanico de aplicaciones, que incluyen, pero no se limitan a, elaboración de perfiles del transcriptoma unicelular, genotipado unicelular, faseo y elaboración de perfiles del epigenoma unicelular.
Resultará evidente que las realizaciones citadas en las solicitudes dadas a conocer no son todas ellas características obligatorias de la presente invención, sino que son solo meras ilustraciones de la implementación de la presente invención. El experto en la materia de elaboración de perfiles del transcriptoma unicelular, genotipado unicelular, faseo y/o elaboración de perfiles del epigenoma unicelular sabrá cómo adaptar el método utilizando el conocimiento general del campo. Además, las etapas se pueden combinar con, y/o modificar mediante, cualesquiera otras etapas, aspectos y/o características adecuados de la presente divulgación, que incluyen los descritos en la bibliografía científica y los documentos de patente enumerados en la presente divulgación o conocidos por el experto en la materia.
La presente invención se refiere a un método para analizar la expresión génica en unidades biológicas discretas.
La elaboración de perfiles del transcriptoma unicelular se basa en la amplificación del contenido de ARNm de una sola célula y su secuenciación. La generación del transcriptoma de una sola célula requiere generalmente una primera etapa de transcripción inversa para convertir los ARNm con colas de poli(A) en ADNc de primera cadena, que se pueden amplificar y secuenciar adicionalmente.
En una realización, el método para analizar la expresión génica en unidades biológicas discretas puede comprender las etapas de:
a) poner en contacto una pluralidad de unidades biológicas con una pluralidad de unidades de código de barras para formar complejos unidad biológica/unidad de código de barras, en donde cada unidad de código de barras comprende un código de barras exclusivo, y en donde dichas unidades de código de barras comprenden al menos un medio implicado en la unión de dichas unidades biológicas,
b) poner en contacto dichos complejos unidad biológica/unidad de código de barras con una solución de hidrogel,
c) polimerizar la solución de hidrogel para incluir dichos complejos unidad biológica/unidad de código de barras en una matriz de hidrogel, y
d) liberar ácidos nucleicos desde cada unidad biológica en la matriz de hidrogel,
e) identificar con código de barras dichos ácidos nucleicos procedentes de cada unidad biológica en la matriz de hidrogel,
f) sintetizar una genoteca de ADNc a partir de los ácidos nucleicos procedentes de cada unidad biológica, g) amplificar dicha genoteca de ADNc procedente de cada unidad biológica, en donde la amplificación de dicha genoteca de ADNc procedente de cada unidad biológica incorpora copias clonales de dicho código de barras exclusivo en los productos de amplificación procedentes de cada unidad biológica, y
h) secuenciar los productos de amplificación.
En una realización, el método para analizar la expresión génica en unidades biológicas discretas según la presente invención comprende etapas adicionales que son bien conocidas por el experto en la materia. Dichas etapas se describen en Macoskoetal.,2015. Cell. 161:1202-1214; Fanetal.,2015. Science. 347(6222):1258367; Kleinetal.,2015. Cell. 161 (5):1187-201; Gierahnet al.,2017. Nat Methods. 14(4):395-398; y las solicitudes de patente de EE. UU. US2016-0289669, US2016-0265069, US2016-0060621 y US2015-0376609.
En una realización, cada unidad de código de barras comprende al menos un oligonucleótido que comprende un cebador de secuencias de ácido nucleico de poli-DT, un código de barras exclusivo y/o un ancla para PCR.
En una realización, cada unidad de código de barras comprende al menos un oligonucleótido que comprende un cebador de secuencias de ácido nucleico de poli-DU, un código de barras exclusivo y/o un ancla para PCR.
En una realización, cada unidad de código de barras comprende al menos un oligonucleótido que comprende un cebador de secuencias de ácido nucleico de (dT)nVN, un código de barras exclusivo y/o un ancla para PCR, en donde n varía de 5 a 50, V representa cualquier nucleótido, excepto T/U (es decir, A, C o G), y N representa cualquier nucleótido (es decir, A, T/U, C o G).
En una realización, cada unidad de código de barras comprende al menos un oligonucleótido que comprende un cebador de secuencias de ácido nucleico de (dU)nVN, un código de barras exclusivo y/o un ancla para PCR, en donde n varía de 5 a 50, V representa cualquier nucleótido, excepto T/U (es decir, A, C o G), y N representa cualquier nucleótido (es decir, A, T/U, C o G).
En una realización, la liberación de ácidos nucleicos desde cada unidad biológica se realiza mediante lisis celular, preferiblemente mediante lisis celular utilizando un detergente no iónico y/o proteinasa K.
En una realización, el método comprende además una etapa de eliminación por lavado del detergente no iónico y/o la proteinasa K.
En una realización, el método comprende además una etapa de inactivación de la proteinasa K. En una realización, la inactivación de la proteinasa K se realiza mediante inhibición térmica y/o química.
En una realización, la síntesis de una genoteca de ADNc a partir de los ácidos nucleicos procedentes de cada unidad biológica se realiza con al menos un cebador de secuencias de ácido nucleico del, al menos un, oligonucleótido de la unidad de código de barras.
En una realización, la síntesis de una genoteca de ADNc a partir de los ácidos nucleicos procedentes de cada unidad biológica se realiza mediante transcripción inversa, es decir, utilizando una transcriptasa inversa.
En una realización, la transcriptasa inversa es una transcriptasa inversa de M-MLV.
En una realización, se sintetiza una cadena complementaria de los ADNc de la genoteca de ADNc, preferiblemente utilizando componentes de reacción de la segunda cadena. En una realización, la cadena complementaria de los ADNc de la genoteca de ADNc se sintetiza utilizando ARNasa H, ADN polimerasa I y/o ADN ligasa.
En una realización, la genoteca de ADNc se fragmenta para obtener fragmentos de ADNc. Los métodos para fragmentar ADN son bien conocidos en la técnica, e incluyen, pero no se limitan a, sonicación Covaris y corte enzimático del ADN.
En una realización, los fragmentos de ADNc se pulen. En una realización, se añaden colas A en los fragmentos de ADNc.
En una realización, se añaden adaptadores a la genoteca de ADNc. Los adaptadores se pueden añadir a la genoteca de ADNc utilizando diversos métodos, que incluyen, pero no se limitan a, transposición y ligadura de Tn5.
En una realización, la amplificación de la genoteca de ADNc se realiza con al menos un cebador de secuencias de ácido nucleico del, al menos un, oligonucleótido de la unidad de código de barras.
En una realización, las etapas de amplificación se pueden mejorar utilizando cebadores de secuencias de ácido nucleico libres, es decir, cebadores de secuencias de ácido nucleico que no están unidos a una unidad de código de barras.
La presente invención también se refiere a un método para analizar el genotipo en unidades biológicas discretas.
El genotipado unicelular se basa en la amplificación del genoma completo (WGA) del ADN de una sola célula para generar ADN suficiente para la secuenciación. Hay varios métodos de WGA disponibles y bien conocidos por el experto en la materia. Sin embargo, algunos métodos conducen a sesgo de amplificación y a cobertura genómica inadecuada posterior. La WGA exponencial basada en PCR con cebadores degenerados introduce sesgo dependiente de la secuencia. La amplificación de desplazamiento múltiple (MDA), que utiliza la ADN polimerasa de f29 de desplazamiento de cadena, representa una mejora, pero también puede introducir sesgo debido a la amplificación no lineal. Los ciclos múltiples de hibridación y amplificación basada en bucle (MALBAC) son otro método que introduce preamplificación cuasilineal para reducir el sesgo asociado a la amplificación no lineal. Se basa en la ADN polimerasa deBstIpara la fase de preamplificación cuasilineal, junto con enzimas de PCR de alta fidelidad para la amplificación exponencial posterior (Zongetal.,2012). Science. 338(6114):1622-6; Luet al.,2012. Science. 338(6114):1627-30).
En una realización, el método para analizar el genotipo en unidades biológicas discretas puede comprender las etapas de:
a) poner en contacto una pluralidad de unidades biológicas con una pluralidad de unidades de código de barras para formar complejos unidad biológica/unidad de código de barras, en donde cada unidad de código de barras comprende un código de barras exclusivo, y en donde dichas unidades de código de barras comprenden al menos un medio implicado en la unión de dichas unidades biológicas,
b) poner en contacto dichos complejos unidad biológica/unidad de código de barras con una solución de hidrogel,
c) polimerizar la solución de hidrogel para incluir dichos complejos unidad biológica/unidad de código de barras en una matriz de hidrogel, y
d) liberar ADN genómico desde cada unidad biológica en la matriz de hidrogel,
e) identificar con código de barras dicho ADN genómico procedente de cada unidad biológica en la matriz de hidrogel,
f) opcionalmente, sintetizar una genoteca de ADN a partir de los ácidos nucleicos procedentes de cada unidad biológica,
g) amplificar dicho ADN genómico o genoteca de ADN procedente de cada unidad biológica, en donde la amplificación de dicho ADN genómico o genoteca de ADN procedente de cada unidad biológica incorpora copias clonales de dicho código de barras exclusivo en los productos de amplificación de cada unidad biológica, y
h) secuenciar los productos de amplificación.
En una realización, el método para analizar el genotipo en unidades biológicas discretas según la presente invención comprende etapas adicionales que son bien conocidas por el experto en la materia. Dichas etapas se describen en Hutchisonet al.,2005. Proc Natl Acad Sci USA. 102(48):17332-6; Leunget al.,2016. Proc Natl Acad Sci USA.
113(30):8484-9; Wanget al.,2012. Cell. 150(2):402-12; Marcyet al.,2007. PLoS Genet. 3(9):1702-8; Goleet al.,2013. Nat Biotechnol. 31 (12):1126-32; Zhanget al.,2006. Nat Biotechnol. 24(6):680-6; y las solicitudes internacionales WO2016/061517 y WO2005/003304.
En una realización, cada unidad de código de barras comprende al menos un oligonucleótido que comprende un cebador de secuencias de ácido nucleico, un código de barras exclusivo y/o un ancla para PCR. En una realización, cada unidad de código de barras comprende al menos un oligonucleótido que comprende un cebador de oligo-dN (tal como un cebador de hexanucleótidos d(N6) o un cebador de octanucleótidos d(Ns), en donde N representa cualquier nucleótido (es decir, A, T/U, C o G)), un código de barras exclusivo y/o un ancla para PCR.
En una realización, la liberación de ADN genómico desde cada unidad biológica se realiza mediante lisis celular y/o nuclear, preferiblemente mediante lisis celular y/o núcleo utilizando un detergente iónico y/o proteinasa K.
En una realización, el método comprende además una etapa de eliminación por lavado del detergente iónico y/o la proteinasa K.
En una realización, el método comprende además una etapa de inactivación de la proteinasa K. En una realización, la inactivación de la proteinasa K se realiza mediante inhibición térmica y/o química.
En una realización, el método comprende además una etapa de desnaturalización del ADN genómico. Los métodos para desnaturalizar ADN genómico son bien conocidos por el experto en la materia e incluyen, pero no se limitan a, tratamiento alcalino y/o calor.
En una realización, la síntesis de una genoteca de ADNc a partir de los ácidos nucleicos procedentes de cada unidad biológica se realiza con al menos un cebador de secuencias de ácido nucleico del, al menos un, oligonucleótido de la unidad de código de barras.
En una realización, la síntesis de una genoteca de ADNc a partir de los ácidos nucleicos procedentes de cada unidad biológica se realiza mediante extensión dirigida por cebadores.
En una realización, la amplificación de ADN genómico se realiza mediante amplificación del genoma completo (WGA). En una realización, la amplificación de ADN genómico se realiza con al menos un cebador de secuencias de ácido nucleico del, al menos un, oligonucleótido de la unidad de código de barras.
En una realización, el ADN genómico amplificado se fragmenta para obtener fragmentos de ADN. Los métodos para fragmentar ADN son bien conocidos en la técnica, e incluyen, pero no se limitan a, sonicación Covaris y corte enzimático del ADN.
En una realización, los fragmentos de ADNc se pulen. En una realización, se añaden colas A en los fragmentos de ADNc.
En una realización, se añaden adaptadores a los fragmentos de ADN. Los adaptadores se pueden añadir a los fragmentos de ADN utilizando diversos métodos, que incluyen, pero no se limitan a, transposición y/o ligadura de Tn5.
En una realización, el método para analizar el genotipo en unidades biológicas discretas puede implementar preparación directa de genotecas (DLP). En una realización, el ADN genómico amplificado se tagmenta. En una realización, el ADN genómico no amplificado se tagmenta. La preparación directa de genotecas y la tagmentación son bien conocidas por el experto en la materia. Se puede hacer referencia, por ejemplo, a Vitaket al.,2017. Nat Methods.
14(3):302-308; Adey et al., 2010. Genoma Biol. 11(12):R119; Gertzet al.,2012. Genome Res. 22(1 ):134-41; and Zahnet al.,2017. Nat Methods. 14(2):167-173. Por tanto, en una realización, cada unidad de código de barras comprende al menos un oligonucleótido que comprende un cebador de secuencias de ácido nucleico, un código de barras exclusivo y/o un ancla para PCR. En una realización, el cebador de secuencias de ácido nucleico tiene una secuencia que es complementaria a, al menos un, adaptador de Tn5. En una realización, el cebador de secuencias de ácido nucleico comprende, o consiste en, la secuencia 5'-TCGTCGGCAGCGTC-3' (SEQ ID NO: 1) o 5'-GTCTCGTGGGCTCG-3' (SEQ ID NO: 2).
En una realización, el método comprende una etapa de ligadura del ADN genómico tagmentado procedente de cada unidad biológica al, al menos un, oligonucleótido de cada unidad de código de barras.
En una realización, el método comprende una etapa de amplificación de los fragmentos de ADN. Las técnicas para amplificar fragmentos de ADN son bien conocidas por el experto en la materia.
En una realización, la amplificación de los fragmentos de ADN se realiza con al menos un cebador de secuencias de ácido nucleico del, al menos un oligonucleótido, de la unidad de código de barras. En una realización, la amplificación de los fragmentos de ADN se realiza con al menos un cebador de secuencias de ácido nucleico que no es el, al menos un, cebador de secuencias de ácido nucleico del, al menos un, oligonucleótido de la unidad de código de barras.
En una realización, las etapas de amplificación se pueden mejorar utilizando cebadores de secuencias de ácido nucleico libres, es decir, cebadores de secuencias de ácido nucleico que no están unidos a una unidad de código de barras.
La presente invención también se refiere a un método para analizar el haplotipo de unidades biológicas discretas, es decir, para el faseo.
El faseo se basa en la amplificación del genoma completo (WGA) de un ADN de alto peso molecular, es decir, mayor de 25 o 50 kilobases, para generar ADN suficiente para la secuenciación. Hay varios métodos de WGA disponibles y bien conocidos por el experto en la materia. Sin embargo, algunos métodos conducen a sesgo de amplificación y a cobertura genómica inadecuada posterior. La WGA exponencial basada en PCR con cebadores degenerados introduce sesgo dependiente de la secuencia. La amplificación de desplazamiento múltiple (MDA), que utiliza la ADN polimerasa de f29 de desplazamiento de cadena, representa una mejora, pero también puede introducir sesgo debido a la amplificación no lineal. Los ciclos múltiples de hibridación y amplificación basada en bucle (MALBAC) son otro método que introduce preamplificación cuasilineal para reducir el sesgo asociado a la amplificación no lineal. Se basa en la a Dn polimerasa deBstIpara la fase de preamplificación cuasilineal, junto con enzimas de PCR de alta fidelidad para la amplificación exponencial posterior (Zonget al.,2012). Science. 338(6114):1622-6; Luet al.,2012. Science. 338(6114):1627-30). Alternativamente, se puede utilizar la transposasa Tn5 y la amplificación posterior para la preparación de genotecas en un método denominado “transposición conservadora de contigüidad” (CPT-seq) (Aminiet al.,2014). Nat Genet. 46(12):1343-9). En este método, la primera etapa, después de que se ha purificado opcionalmente el ADN genómico, es tagmentar el ADN mediante la transposición de Tn5. Esto fragmenta el ADN y añade adaptadores universales directamente al molde. Después de rellenar los huecos, se produce a continuación la PCR utilizando cebadores complementarios a los adaptadores de Tn5 insertados, seguida de secuenciación.
En una realización, el método para analizar el haplotipo en unidades biológicas discretas puede comprender las etapas de:
a) poner en contacto una pluralidad de unidades biológicas con una pluralidad de unidades de código de barras para formar complejos unidad biológica/unidad de código de barras, en donde cada unidad de código de barras comprende un código de barras exclusivo, y en donde dichas unidades de código de barras comprenden al menos un medio implicado en la unión de dichas unidades biológicas,
b) poner en contacto dichos complejos unidad biológica/unidad de código de barras con una solución de hidrogel,
c) polimerizar la solución de hidrogel para incluir dichos complejos unidad biológica/unidad de código de barras en una matriz de hidrogel, y
d) opcionalmente, liberar ácidos nucleicos desde cada unidad biológica en la matriz de hidrogel,
e) identificar con código de barras dichos ácidos nucleicos procedentes de cada unidad biológica en la matriz de hidrogel,
f) opcionalmente, sintetizar una genoteca de ADN a partir de los ácidos nucleicos procedentes de cada unidad biológica,
g) amplificar dichos ácidos nucleicos o genoteca de ADN procedentes de cada unidad biológica, en donde la amplificación de dichos ácidos nucleicos o genoteca de ADN procedentes de cada unidad biológica incorpora copias clonales de dicho código de barras exclusivo en los productos de amplificación procedentes de cada unidad biológica, y
h) secuenciar los productos de amplificación.
En una realización, el método para analizar el haplotipo en unidades biológicas discretas según la presente invención comprende etapas adicionales que son bien conocidas por el experto en la materia. Dichas etapas se describen en las solicitudes internacionales WO2015/126766, WO2016/130704, WO2016/61517, WO2015/95226, WO2016/003814, WO2005/003304, WO2015/200869, WO2014/124338, WO2014/093676; la solicitud de patente de EE. UU. US2015-066385; Kuleshovetal.,2014. Nat Biotechnol. 32(3):261-6; Aminietal.,2014. Nat Genet.
46(12):1343-9; Kaperet al.,2013. Proc Natl Acad Sci USA. 110(14):5552-7; Peterset al.,2012. Nature.
487(7406):190-5 y Zhenget al.,2016. Nat Biotechnol. 34(3):303-11.
En una realización, el, al menos un, medio para unir una unidad biológica es un anticuerpo anti-T n5. En una realización, el, al menos un, medio para unir una unidad biológica es estreptavidina y la unidad biológica se pone en contacto con un anticuerpo anti-Tn5 biotinilado.
En una realización, cada unidad de código de barras comprende al menos un oligonucleótido que comprende un cebador de secuencias de ácido nucleico, un código de barras exclusivo y/o un ancla para PCR. En una realización, el cebador de secuencias de ácido nucleico tiene una secuencia que es complementaria a, al menos, un adaptador de Tn5. En una realización, el cebador de secuencias de ácido nucleico comprende, o consiste en, la secuencia 5'-TCGTCGGCAGCGTC-3' (SEQ ID NO: 1) o 5'-GTCTCGTGGGCTCG-3' (SEQ ID NO: 2). En otra realización, cada unidad de código de barras comprende al menos un oligonucleótido que comprende un cebador de oligo-dN (tal como un cebador de hexanucleótidos d(N6) o un cebador de octanucleótidos d(N8), en donde N representa cualquier nucleótido (es decir, A, T/U, C o G)), un código de barras exclusivo y/o un ancla para PCR. En una realización, la liberación de ácidos nucleicos desde cada unidad biológica se realiza mediante lisis celular y/o nuclear, preferiblemente mediante lisis celular y/o nuclear utilizando un detergente iónico y/o proteinasa K.
En una realización, la síntesis de una genoteca de ADN a partir de los ácidos nucleicos procedentes de cada unidad biológica se realiza con al menos un cebador de secuencias de ácido nucleico del, al menos un, oligonucleótido de la unidad de código de barras.
En una realización, el método comprende además una etapa de eliminación por lavado del detergente iónico y/o la proteinasa K.
En una realización, el método comprende además una etapa de inactivación de la proteinasa K. En una realización, la inactivación de la proteinasa K se realiza mediante inhibición térmica y/o química.
En una realización, el método comprende además una etapa de desnaturalización de los ácidos nucleicos procedentes de cada unidad biológica. Los métodos para desnaturalizar ácidos nucleicos son bien conocidos por el experto en la materia e incluyen, pero no se limitan a, tratamiento alcalino y/o calor.
En una realización, la amplificación de los ácidos nucleicos procedentes de cada unidad biológica se realiza mediante amplificación del genoma completo (WGA). En una realización, la amplificación de los ácidos nucleicos procedentes de cada unidad biológica se realiza con al menos un cebador de secuencias de ácido nucleico del, al menos un, oligonucleótido de la unidad de código de barras. En una realización, los ácidos nucleicos amplificados procedentes de cada unidad biológica se fragmentan para obtener fragmentos de ácido nucleico. Los métodos para fragmentar ADN son bien conocidos en la técnica e incluyen, pero no se limitan a, sonicación Covaris y corte enzimático del ADN.
En una realización, los fragmentos de ácido nucleico se pulen. En una realización, se añaden colas A en los fragmentos de ácido nucleico.
En una realización, se añaden adaptadores a los fragmentos de ácido nucleico, preferiblemente adaptadores de Tn5. Los adaptadores se pueden añadir a los fragmentos de ácido nucleico utilizando diversos métodos, que incluyen, pero no se limitan a, transposición y ligadura de Tn5.
En una realización, el método para analizar el haplotipo en unidades biológicas discretas puede implementar transposición conservadora de contigüidad (CTP-seq). Dicho método se describe en la solicitud internacional WO2016/061517.
En una realización, el método comprende una etapa de tagmentación de los ácidos nucleicos procedentes de cada unidad biológica, preferiblemente con transposasa Tn5. En una realización, los ácidos nucleicos procedentes de cada unidad biológica son ADN de alto peso molecular (ADN-APM). En una realización, la tagmentación de ADN-APM procedente de cada unidad biológica conserva la contigüidad del ADN-APM de cada unidad biológica.
En una realización, el método comprende una etapa de interrupción de la contigüidad de los ácidos nucleicos procedentes de cada unidad biológica, preferiblemente del ADN-APM procedente de cada unidad biológica. Las técnicas para interrumpir la contigüidad son bien conocidas por el experto en la materia e incluyen, pero no se limitan a, liberación de complejos de Tn5 desde los ácidos nucleicos procedentes de cada unidad biológica, preferiblemente utilizando un detergente iónico y/o proteinasa K.
En una realización, el método comprende una etapa de relleno de huecos del adaptador, preferiblemente del adaptador de Tn5. En una realización, el método comprende una etapa de amplificación de los ácidos nucleicos tagmentados procedentes de cada unidad biológica. En una realización, la amplificación de los ácidos nucleicos tagmentados procedentes de cada unidad biológica se realiza con al menos un cebador de secuencias de ácido nucleico del, al menos un, oligonucleótido de la unidad de código de barras. En una realización, el método comprende una etapa de ligadura de los ácidos nucleicos tagmentados procedentes de cada unidad biológica al, al menos un, oligonucleótido de cada unidad de código de barras.
En una realización, el método comprende una etapa de amplificación de los ácidos nucleicos tagmentados. Las técnicas para amplificar ácidos nucleicos son bien conocidas por el experto en la materia. En una realización, la amplificación de los ácidos nucleicos tagmentados se realiza con al menos un cebador de secuencias de ácido nucleico del, al menos un, oligonucleótido de la unidad de código de barras.
En una realización, las etapas de amplificación se pueden mejorar utilizando cebadores de secuencias de ácido nucleico libres, es decir, cebadores de secuencias de ácido nucleico que no están unidos a una unidad de código de barras.
La presente invención también se refiere a un método para analizar el epigenoma en unidades biológicas discretas.
Se ha desarrollado el posicionamiento de nucleosomas de células individuales basado en transposición de Tn5, denominado “ensayo para cromatina accesible a transposasa con secuenciación de alto rendimiento” (ATAC-seq) (Buenrostroetal.,2015). Nature. 523(7561):486-90). En este método, la primera etapa permite el acceso molecular a ADN libre de nucleosoma utilizando detergentes no iónicos en bajo porcentaje sobre células intactas o núcleos aislados. El ADN accesible se tagmenta a continuación mediante transposición de Tn5. Esto fragmenta el ADN y añade adaptadores universales directamente al molde. A continuación, se produce la PCR utilizando cebadores complementarios a esos adaptadores, seguida de secuenciación.
Por tanto, en una realización, el método para analizar el epigenoma en unidades biológicas discretas puede comprender las etapas de:
a) poner en contacto una pluralidad de unidades biológicas celulares con una pluralidad de unidades de código de barras para formar complejos unidad biológica/unidad de código de barras, en donde cada unidad de código de barras comprende un código de barras exclusivo, y en donde dichas unidades de código de barras comprenden al menos un medio implicado en la unión de dichas unidades biológicas,
b) poner en contacto dichos complejos unidad biológica/unidad de código de barras con una solución de hidrogel,
c) polimerizar la solución de hidrogel para incluir dichos complejos unidad biológica/unidad de código de barras en una matriz de hidrogel, y
d) liberar ADN no unido al nucleosoma desde cada unidad biológica en la matriz de hidrogel,
e) identificar con código de barras dicho ADN no unido al nucleosoma procedente de cada unidad biológica en la matriz de hidrogel,
f) opcionalmente, sintetizar una genoteca de ADN a partir del ADN no unido al nucleosoma procedente de cada unidad biológica,
g) amplificar dicho ADN no unido al nucleosoma o genoteca de ADN procedente de cada unidad biológica, en donde la amplificación de dicho ADN no unido al nucleosoma o genoteca de ADN procedente de cada unidad biológica incorpora copias clonales de dicho código de barras exclusivo en los productos de amplificación de cada unidad biológica,
h) secuenciar los productos de amplificación.
En una realización, la amplificación del ADN no unido al nucleosoma o genoteca de ADN procedentes de cada unidad biológica comienza a partir de sitios de inicio no nucleosómicos. Los sitios de inicio no nucleosómicos son sitios donde se produce la transposición, es decir, donde el ADN es accesible. Opcionalmente, los sitios de inicio no nucleosómicos son sitios donde se fragmenta enzimáticamente el ADN y donde se liga el ADN.
En una realización, el método para analizar el epigenoma en unidades biológicas discretas según la presente invención comprende etapas adicionales que son bien conocidas por el experto en la materia. Dichas etapas se describen en la solicitud internacional WO2014/189957; Buenrostroetal.,2015. Nature. 523(7561):486-90; Buenrostroetal.,2013. Nat Methods. 10(12):1213-8; y Christiansenet al.,2017. Methods Mol Biol. 1551:207-221.
En una realización, cada unidad de código de barras comprende al menos un oligonucleótido que comprende un cebador de secuencias de ácido nucleico, un código de barras exclusivo y/o un ancla para PCR. En una realización, el cebador de secuencias de ácido nucleico tiene una secuencia que es complementaria a la, al menos una, secuencia de adaptador, preferiblemente al menos una secuencia de adaptador de Illumina. En una realización, el cebador de secuencias de ácido nucleico tiene una secuencia que es complementaria a, al menos, un adaptador de Tn5. En una realización, el cebador de secuencias de ácido nucleico comprende, o consiste en, la secuencia 5'-TCGTCGGCAGCGTC-3' (SEQ ID NO: 1) o 5'-GTCTCGTGGGCTCG-3' (SEQ ID NO: 2).
En una realización, la liberación de ADN no unido al nucleosoma procedente de cada unidad biológica se realiza mediante lisis celular, preferiblemente mediante lisis celular utilizando un detergente no iónico y/o proteinasa K.
En una realización, la síntesis de una genoteca de ADN a partir del ADN no unido al nucleosoma procedente de cada unidad biológica se realiza con al menos un cebador de secuencias de ácido nucleico del, al menos un, oligonucleótido de la unidad de código de barras.
En una realización, el método comprende además una etapa de eliminación por lavado del detergente no iónico y/o la proteinasa K.
En una realización, el método comprende además una etapa de inactivación de la proteinasa K. En una realización, la inactivación de la proteinasa K se realiza mediante inhibición térmica y/o química.
En una realización, el ADN no unido al nucleosoma se tagmenta. Las técnicas de tagmentación son bien conocidas por el experto en la materia. En una realización, la tagmentación de ADN no unido al nucleosoma se realiza mediante la transposición de Tn5, preferiblemente utilizando secuencias de adaptador de Illumina.
En una realización, el método comprende una etapa de ligadura del ADN no unido al nucleosoma tagmentado procedente de cada unidad biológica al, al menos un, oligonucleótido de cada unidad de código de barras.
En una realización, el método comprende una etapa de amplificación del ADN no unido al nucleosoma tagmentado procedente de cada unidad biológica. Las técnicas para amplificar ADN son bien conocidas por el experto en la materia.
En una realización, la amplificación del ADN no unido al nucleosoma tagmentado se realiza con al menos un cebador de secuencias de ácido nucleico del, al menos un, oligonucleótido de la unidad de código de barras. En una realización, la amplificación del ADN no unido al nucleosoma tagmentado se realiza con al menos un cebador de secuencias de ácido nucleico que no es el, al menos un, cebador de secuencias de ácido nucleico del, al menos un, oligonucleótido de la unidad de código de barras.
En una realización, la amplificación del ADN no unido al nucleosoma tagmentado incorpora la secuencia de adaptador de las transposasas Tn5 en los productos de amplificación procedentes de cada unidad biológica.
En una realización, las etapas de amplificación se pueden mejorar utilizando cebadores de secuencias de ácido nucleico libres, es decir, cebadores de secuencias de ácido nucleico que no están unidos a una unidad de código de barras.
Breve Descripción de los Dibujos
LaFigura 1es un diagrama que ilustra el atrapamiento y la identificación con código de barras de unidades biológicas en hidrogel. Se utilizan los símbolos siguientes:(A)unidad de código de barras;(B)unidad biológica;(B*)unidad de código de barras identificada con código de barras;(C)medio para unir unidades biológicas;(Hs)hidrogel (estado sol);(He)matriz de hidrogel (hidrogel en estado gel); (H<g>/H<s>) hidrogel en estado sólido o gel;(1)unión de unidades biológicas y unidades de código de barras;(2)puesta en contacto con solución de hidrogel;(3)polimerización de hidrogel;(4)identificación con código de barras de unidades biológicas;(5)extensión dirigida por cebadores, ligadura, amplificación, fragmentación, adición de adaptador;(6)secuenciación de nueva generación.
LaFigura 2es un diagrama que ilustra la unión de múltiples unidades biológicas a una sola unidad de código de barras. Se utilizan los símbolos siguientes: (A1,A2)unidades de código de barras; (B1,B2)unidades biológicas;(C)medio para unir unidades biológicas; (Y)datos sesgados;(1)unión de unidades biológicas y unidades de código debarras;(2-6)etapas 2 a 6 de laFigura 1.
LaFigura 3es un diagrama que ilustra la unión de múltiples unidades de código de barras a una sola unidad biológica. Se utilizan los símbolos siguientes: (A1,A2)unidades de código de barras; (B1,B2)unidades biológicas;(C)medio para unir unidades biológicas;(1)unión de unidades biológicas y unidades de código de barras;(2-6)etapas 2 a 6 de laFigura 1.
LaFigura 4es un diagrama que ilustra la unión de unidades biológicas a un soporte sólido antes de la unión a unidades de código de barras, el atrapamiento y la identificación con código de barras. Las unidades de códigos de barras son significativamente más grandes que las unidades biológicas, lo que impide, por lo tanto, la unión de múltiples unidades de códigos de barras a una sola unidad biológica. Se utilizan los símbolos siguientes:(A1, A2)unidades de código de barras; (B1,B2)unidades biológicas;(C)medio para unir unidades biológicas;(S)soporte sólido;(11)unión de unidades biológicas al soporte sólido;(12)adición de unidades de código de barras en solución;(1)unión de unidades biológicas y unidades de código de barras;(2-6)etapas 2 a 6 de laFigura 1.
LaFigura 5es un diagrama que ilustra la unión de unidades biológicas a un soporte sólido antes de la unión a unidades de código de barras, el atrapamiento y la identificación con código de barras. Las unidades biológicas son significativamente más grandes que las unidades de código de barras, lo que impide, por lo tanto, la unión de múltiples unidades biológicas a una sola unidad de código de barras. Se utilizan los símbolos siguientes:(A1, A2)unidades de código de barras; (B1,B2)unidades biológicas;(C)medio para unir unidades biológicas;(D)medio para unir unidades de código de barras;(S)soporte sólido;(21)unión de unidades de código de barras al soporte sólido;(22)adición de unidades biológicas en solución; (1) unión de unidades biológicas y unidades de código de barras;(2-6)etapas 2 a 6 de laFigura 1.
LaFigura 6es un diagrama que ilustra la unión de unidades biológicas a un soporte sólido antes de la unión a unidades de código de barras, el atrapamiento y la identificación con código de barras. Las unidades de código de barras y las unidades biológicas tienen prácticamente el mismo tamaño. Las unidades de código de barras están en dilución limitante para impedir la unión de múltiples unidades de código de barras a una sola unidad biológica. Se utilizan los símbolos siguientes:(A)unidad de código de barras; (B1,B2)unidades biológicas;(C)medio para unir unidades biológicas;(S)soporte sólido;(11)unión de unidades biológicas al soporte sólido;(12*)adición de unidades de código de barras en solución en una concentración limitante;(1)unión de unidades biológicas y unidades de código de barras;
(2-6)etapas 2 a 6 de laFigura 1.
LaFigura 7es un diagrama que ilustra la unión de unidades de código de barras a un soporte sólido antes de la unión a unidades biológicas, el atrapamiento y la identificación con código de barras. Las unidades biológicas y las unidades de código de barras tienen prácticamente el mismo tamaño. Las unidades biológicas están en dilución limitante para impedir la unión de múltiples unidades biológicas a una sola unidad de código de barras. Se utilizan los símbolos siguientes: (A1,A2)unidades de código de barras;(B)unidad biológica;(C)medio para unir unidades biológicas;(D)medio para unir unidades de código de barras;(S)soporte sólido;(21)unión de unidades de código de barras al soporte sólido;(22*)adición de unidades biológicas en una concentración limitante; (1) unión de unidades biológicas y unidades de código de barras;(2-6)etapas 2 a 6 de laFigura 1.
LaFigura 8es un diagrama que ilustra un posible flujo de trabajo de RNAseq del transcriptoma de células individuales, utilizando unidades de código de barras que comprenden un oligonucleótido, el cual comprende un cebador de secuencias de ácido nucleico de poli-DT, un código de barras exclusivo y un ancla para PCR. Están presentes múltiples oligonucleótidos de código de barras desde la primera etapa, pero aquí solo se muestra uno, como (a), después de la etapa 84 por motivos de simplicidad. Las etapas 1-3(1-3)se pueden realizar como en laFigura 1o pueden implicar un soporte sólido e incluir, por lo tanto, las etapas adicionales de lasFiguras 4a7.Se utilizan los símbolos siguientes:
(A)unidad de código de barras;(B)unidad biológica; (H<g>) matriz de hidrogel (hidrogel en estado gel); (H<g>/H<s>) hidrogel en estado sólido o gel;(R)ARNm de poli(A);(a)código de barras;(PCR)ancla para PCR; (Tn) cebador de poli(T);
(ADN1)ADNc de primera cadena;(ADN2)ADNc de la 2.a cadena;(83*)lisis celular mediante aplicación de un detergente no iónico;(84)identificación con código de barras,es decir,cebado de ARNm de poli(A) con cebador de oligo d(T) de oligonucleótidos de código de barras;(85)síntesis de ADNc de la 2.a cadena (opcionalmente, mediante cambio y amplificación del molde);(86)fragmentación, adición de adaptador, amplificación, secuenciación de nueva generación.
La Figura 9es un diagrama que ilustra un posible flujo de trabajo del faseo, utilizando unidades de código de barras que comprenden un oligonucleótido, el cual comprende un cebador de secuencias de ácido nucleico de adaptador de Tn5 complementario, un código de barras exclusivo y un ancla para PCR. Están presentes múltiples oligonucleótidos de código de barras desde la primera etapa, pero aquí solo se muestra uno, después de la etapa 94, por motivos de simplicidad. Es posible la unión a un soporte sólido de la unidad de código de barras como en las Figuras 5 y 7, o de las transposasas como en lasFiguras 4a6. Se utilizan los símbolos siguientes:(A)unidad de código de barras;(CPT)ADN de transposición conservadora de contigüidad;(Tn5)transposasa Tn5;(Tn5s)secuencia de adaptador de Tn5;
(a)código de barras;(PCR)ancla para PCR; (Tn5p) cebador del adaptador de Tn5;(Hs)hidrogel (estado sol);(He)matriz de hidrogel (hidrogel en estado gel); (H<g>/H<s>) hidrogel en estado sólido o gel;(91)unión de transposasa a unidad de código de barras;(2)puesta en contacto con solución de hidrogel; (3) polimerización de hidrogel;(94)liberación de transposasa;(95)ligadura, relleno de huecos; (96) amplificación, secuenciación de nueva generación.
Ejemplos
La presente invención se ilustra mediante los ejemplos siguientes. Sin embargo, debe entenderse que la presente invención no se limita a los detalles específicos de estos ejemplos.
Ejemplo 1: Atrapamiento e identificación con código de barras de unidades biológicas discretas en un hidrogel
La presente invención se refiere al atrapamiento de unidades biológicas discretas (es decir, células o grupos de células, virus, orgánulos, complejos macromoleculares o macromoléculas biológicas).
La presente invención y sus aplicaciones se basan en la implementación de etapas sucesivas descritas en laFigura 1.
En una primera etapa, se forman complejos unidad biológica/unidad de código de barras, comprendiendo cada complejo una sola unidad de código de barras y una sola unidad biológica (etapa 1 de laFigura 1). Los complejos unidad biológica/unidad de código de barras se pueden formar tras la unión y/o inmovilización de la unidad biológica sobre la unidad de código de barras. Por tanto, las unidades de código de barras deben portar sobre su superficie un medio para unir, específica o inespecíficamente, unidades biológicas. Estos medios incluyen proteínas o fragmentos de las mismas, péptidos, anticuerpos o fragmentos de los mismos, ácidos nucleicos, carbohidratos, vitaminas o derivados de las mismas, coenzimas o derivados de las mismas, ligandos de receptores o derivados de los mismos y/o grupos hidrófobos. Simultáneamente, las unidades biológicas deben portar, de forma natural o no, un medio complementario, que se une al medio de la unidad de código de barras. Por ejemplo, un medio para unir una unidad biológica puede ser un anticuerpo dirigido a moléculas expresadas o presentes (ya sea de forma natural o artificial) en la superficie de la unidad biológica. Otra opción puede ser la utilización de un anticuerpo biotinilado dirigido a las moléculas expresadas o presentes en la superficie de la unidad biológica, y la unión posterior de la unidad biológica que porta el anticuerpo biotinilado a las unidades de código de barras recubiertas con estreptavidina.
Una vez que se forman los complejos unidad biológica/unidad de código de barras, se pueden poner en contacto con una solución de hidrogel que, tras la polimerización, atrapa los complejos unidad biológica/unidad de código de barras (etapas 2-3 de laFigura 1). A continuación, se pueden realizar ensayos de bioquímica y biología molecular directamente en la matriz de hidrogel poniendo en contacto el hidrogel con cualquier reactivo y/o solución requeridos.
Por ejemplo, una solución de hidrogel adecuada puede ser alginato. Su tamaño de grano fino permite la formación de poros muy pequeños tras la polimerización con calcio, que atrapan los complejos unidad biológica/unidad de código de barras sin ningún riesgo de difusión y, al mismo tiempo, siguen permitiendo la difusión de componentes más pequeños, como reactivo y/o solución. Habitualmente, cuando la unidad biológica es una célula, un grupo de células, un núcleo o un orgánulo, una primera etapa comprenderá la lisis de la unidad biológica para liberar su contenido de ácido nucleico. La plataforma de hidrogeles admite cualquier nivel de detergente, lo que permite lisar incluso unidades biológicas difíciles de lisar.
A continuación, los ácidos nucleicos liberados se pueden identificar con código de barras (etapa 4 de laFigura 1) mediante cebado al oligonucleótido recubierto sobre la superficie de la unidad de código de barras. Habitualmente, cada unidad de código de barras comprende copias clonales de un oligonucleótido, que está compuesto por al menos un sitio de cebado (cebador de secuencias de ácido nucleico) y una secuencia de código de barras. La secuencia de código de barras debe ser siempre idéntica en cada oligonucleótido de una unidad de código de barras dada para permitir la identificación de la fuente u origen de los ácidos nucleicos extraídos o derivados de una unidad biológica discreta.
Una vez que se logra la identificación con código de barras (es decir, el cebado de los ácidos nucleicos de la unidad biológica al cebador de secuencias de ácido nucleico de la unidad de código de barras), se pueden llevar a cabo ensayos de bioquímica y biología molecular clásicos sobre los ácidos nucleicos identificados con código de barras, ya sea mientras siguen atrapados en la matriz de hidrogel, o en solución, después de que la matriz de hidrogel se haya disuelto. Estos incluyen, sin limitación y no necesariamente en este orden, extensión dirigida por cebadores, ligadura, amplificación, fragmentación, adición de adaptador, secuenciación de nueva generación y similares (etapas 5-6 de laFigura 1). Por ejemplo, cuando se utiliza alginato como hidrogel, el calcio se puede eliminar por lavado del hidrogel para permitir la despolimerización. La estabilización de los ácidos nucleicos cebados, es decir, identificados con código de barras, antes de cualquier ensayo de bioquímica y biología molecular y, en particular, antes de la extensión dirigida por cebadores, se puede lograr utilizando otros cationes, tales como sodio.
Una etapa crucial cuando se implementa el método de la presente invención es la unión de una sola unidad biológica a una sola unidad de código de barras, para formar un complejo 1:1. Como se muestra en laFigura 2,la unión de múltiples unidades biológicas a una sola unidad de código de barras distorsiona los datos posteriores recuperados y, en particular, los datos de secuenciación de nueva generación de células individuales. Tras el análisis de las secuencias, las secuencias con “código de barras 1” estarían sesgadas o corruptas, ya que se recopilan a partir de dos unidades biológicas distintas.
Asimismo, la unión de múltiples unidades de código de barras a una sola unidad biológica distorsiona los datos de secuenciación de nueva generación de células individuales (Figura 3). Los datos de las secuencias recopilados desde la “unidad biológica 1” (B1) estarían representados dos veces, mediante el “código de barras 1” y el “código de barras 2” (A1 y A2).
Hay varias formas que pueden ayudar a evitar la formación de complejos unidad biológica/unidad de código de barras no estequiométricos.
LaFigura 4muestra la inmovilización de las unidades biológicas de interés sobre un soporte recubierto con medio para unir dichas unidades biológicas (etapa 11). Una vez inmovilizadas sobre el soporte, las unidades biológicas se pueden poner en contacto con unidades de códigos de barras (etapa 12), preferentemente con unidades de códigos de barras que sean de mayor tamaño, con respecto a las unidades biológicas, para crear un obstáculo e impedir la unión de múltiples unidades de códigos de barras sobre una sola unidad biológica (etapa 1). Por lo tanto, dado que solo se une una unidad de código de barras por unidad biológica, es posible analizar los datos de secuenciación de nueva generación posteriores en unidades biológicas individuales.
Dicha configuración se puede implementar fácilmente utilizando un soporte, tal como un tubo de microcentrífuga, recubierto con un medio para unir unidades biológicas, tal como biotina. Las unidades biológicas, tales como las células, se ponen en contacto con anticuerpos acoplados a estreptavidina y a continuación se depositan en el tubo para permitir la unión. Las células excedentes se eliminan. Las unidades de código de barras recubiertas con biotina, tales como perlas, se depositan a continuación en el tubo para permitir la unión a las células. Las perlas excedentes se eliminan. A continuación se vierte una solución de hidrogel en el tubo, tal como alginato de sodio, junto con iones calcio para permitir que el alginato polimerice. Las células atrapadas se pueden procesar a continuación, tal como, por ejemplo, mediante adición de detergente sobre la parte superior del tubo. El detergente llega a las células atrapadas por capilaridad y lisa su membrana, liberando su contenido de ácido nucleico. El tamaño de poro del alginato es lo suficientemente pequeño como para evitar la difusión de ácidos nucleicos y, al mismo tiempo, permitir la difusión de reactantes y sustratos más pequeños. La identificación con código de barras se produce a medida que los ácidos nucleicos procedentes de una célula discreta se liberan y se fijan al código de barras de las secuencias de ácido nucleico de su perla de código de barras adyacente. Una vez que los ácidos nucleicos están correctamente identificados con código de barras, la muestra se puede lavar para eliminar los iones calcio. El hidrogel de alginato se disuelve, y las etapas adicionales se pueden procesar directamente en el tubo, en solución.
Alternativamente, se pueden unir las unidades de código de barras sobre un soporte recubierto con medio para unir dichas unidades de código de barras. Una vez unidas al soporte, las unidades de código de barras se pueden poner en contacto con unidades biológicas, preferentemente con unidades biológicas que sean de mayor tamaño, con respecto a las unidades de código de barras, para crear un obstáculo e impedir la unión de múltiples unidades biológicas sobre una sola unidad de código de barras (Figura 5).
Dicha configuración también se puede implementar utilizando un soporte, tal como un tubo de microcentrífuga recubierto con una capa fina de hidrogel que, tras la polimerización, inmoviliza las unidades de código de barras en todo el soporte. Las unidades biológicas, tales como células, se depositan a continuación en el tubo para permitir la unión a las unidades de código de barras (siempre que la capa de hidrogel que inmoviliza las unidades de código de barras sea más fina que la dimensión más pequeña de la unidad de código de barras, es decir, que al menos una parte de la unidad de código de barras siga estando accesible para la puesta en contacto de unidades biológicas). Las células excedentes se eliminan. A continuación se vierte una solución de hidrogel en el tubo y se deja polimerizar. Las células atrapadas se pueden procesar a continuación como se ha descrito anteriormente en la presente memoria. Una vez que los ácidos nucleicos están correctamente identificados con código de barras, se pueden disolver ambos hidrogeles (es decir, la capa fina que recubre el tubo y la matriz de hidrogel que atrapa las unidades biológicas), y se pueden procesar etapas adicionales directamente en el tubo, en solución.
Otra estrategia para evitar la formación de complejos unidad biológica/unidad de código de barras no estequiométricos es la utilización de un soporte donde se unen y/o inmovilizan unidades biológicas de interés (Figura 6) o unidades de código de barras (Figura 7), como se ha descrito anteriormente, junto con concentraciones limitantes de unidades de código de barras o unidades biológicas, respectivamente. Preferiblemente, la concentración de unidades libres (unidades de código de barras o unidades biológicas, respectivamente) es inferior a la concentración de unidades unidas al soporte (unidades biológicas o unidades de código de barras, respectivamente). Esto garantiza la unión de, como máximo, una unidad de código de barras por unidad biológica y a la inversa, lo que hace posible analizar los datos de secuenciación de nueva generación posteriores en unidades biológicas individuales. Algunas unidades biológicas (etapa 1 de laFigura 6)o unidades de código de barras (etapa 1 de laFigura 7) no están acopladas con una unidad de código de barras o una unidad biológica, respectivamente, y por lo tanto no generan ningún dato.
Ejemplo 2: Elaboración de perfiles del transcriptoma unicelular
La elaboración de perfiles del transcriptoma unicelular es uno de los numerosos ensayos de bioquímica y biología molecular que se pueden llevar a cabo utilizando el método de la presente invención(Figura 8).
Después de formar complejos unidad biológica/unidad de código de barras en una solución de hidrogel como se ha descrito en el ejemplo 1 (etapas 1-3 de laFigura 1); opcionalmente después de las etapas adicionales (11 y 12, o 12*, o 21 y 22, o 22*) de cualquiera de lasFiguras 4-7, se permite que el hidrogel polimerice, atrapando de ese modo los complejos unidad biológica/unidad de código de barras (“1-3” en laFigura 8).
Más habitualmente, las unidades biológicas serán una célula, tal como una célula de mamífero, por ejemplo, o cualquier otra célula adecuada para la elaboración de perfiles del transcriptoma unicelular. La elaboración de perfiles del transcriptoma unicelular se basa en la amplificación del contenido de ARNm de una sola célula y su secuenciación. Por lo tanto, una primera etapa es liberar el contenido de ARNm de las células, lisando las células directamente en el hidrogel. Para ello, se pueden aplicar detergentes no iónicos, o cualquier otro reactivo adecuado para la lisis celular, directamente sobre la matriz de hidrogel. El reactivo puede alcanzar las unidades biológicas por difusión y lisarlas (etapa 83* de laFigura 8).
Los ARNm liberados se unen en su entorno local a los oligonucleótidos portados por las unidades de código de barras. Estos oligonucleótidos están presentes en múltiples copias clonales sobre cada unidad de código de barras y son exclusivos en cuanto a su secuencia, de unidad de código de barras a unidad de código de barras. Comprenden un ancla para PCR, una secuencia de código de barras exclusiva y un cebador de secuencias de ácido nucleico.
Los ARNm de mamífero poseen una secuencia de poli(A) 3' natural que, por lo tanto, puede cebarse a un cebador de secuencias de ácido nucleico que comprende una secuencia de poli(T) (etapa 84 de laFigura 8). Tras el cebado (es decir, la identificación con código de barras), pueden tener lugar las siguientes etapas de biología molecular, ya sea en la matriz de hidrogel o en solución. Habitualmente, la síntesis de ADNc de primera cadena se producirá en 3' del oligonucleótido de la unidad de código de barras utilizando una enzima transcriptasa inversa.
A continuación se puede producir la síntesis de ADNc de la segunda cadena, opcionalmente mediante cambio y amplificación del molde (etapa 85 de laFigura 8). Las siguientes etapas comprenden, por ejemplo, fragmentación de la genoteca de ADNc, adición de adaptador y amplificación.
Por último, los productos identificados con código de barras, amplificados y con adaptador añadido se pueden secuenciar mediante secuenciación de nueva generación (etapa 86 de laFigura 8).
Ejemplo 3: Faseo
El faseo es otro ensayo de biología molecular que se puede llevar a cabo utilizando el método de la presente invención(Figura 9).
En una primera etapa, se ensamblan los transposomas mezclando una transposasa Tn5 con ADN de alto peso molecular (es decir, la unidad biológica). Esta etapa, a veces denominada tagmentación, crea fragmentos de ADN de transposición conservadora de contigüidad (ADN-CPT), y va seguida de una segunda etapa, en donde los transposomas se ponen en contacto con unidades de código de barras que comprenden un medio para unir la unidad biológica (etapa 91 de laFigura 9). Ventajosamente, este medio une transposasas Tn5.
A continuación, los complejos ADN-CPT/unidad de código de barras se ponen en contacto con una solución de hidrogel, que se deja polimerizar (etapas 2-3 de laFigura 9).Una vez atrapados en la matriz del hidrogel, se liberan las transposasas Tn5 utilizando detergentes iónicos y/o proteinasa K, interrumpiendo de ese modo la contigüidad y produciendo fragmentos de ADN que comprenden una secuencia de adaptador de Tn5 (etapa 94 de laFigura 9).
Los fragmentos de ADN liberados, que comprenden una secuencia de adaptador de Tn5, se pueden cebar en su entorno local a un cebador de secuencias de ácido nucleico portado por las unidades de código de barras, y que comprende una secuencia de adaptador de Tn5 complementaria (tal como, por ejemplo, SEQ ID NO: 1 o SEQ ID NO: 2). Estos oligonucleótidos están presentes en múltiples copias clonales sobre cada unidad de código de barras y son exclusivos en cuanto a su secuencia, de unidad de código de barras a unidad de código de barras. Comprenden un ancla para PCR, una secuencia de código de barras exclusiva y un cebador de secuencias de ácido nucleico, complementario a la secuencia de adaptador de Tn5 (cebador del adaptador de Tn5, Tn5<P>). Tras el cebado (es decir, la identificación con código de barras), pueden tener lugar las siguientes etapas de biología molecular, ya sea en la matriz de hidrogel o en solución, tras la disolución del hidrogel. La ligadura, el relleno de huecos y la amplificación (etapa 95 de laFigura 9) se pueden producir en la matriz de hidrogel o en solución.
Por último, los productos identificados con código de barras, amplificados y con adaptador añadido se pueden secuenciar mediante secuenciación de nueva generación (etapa 96 de laFigura 9).
Se pueden encontrar otras variaciones de biología molecular en la solicitud de patente internacional WO2016/061517 (por ejemplo, en las Figuras 15-21).

Claims (13)

REIVINDICACIONES
1. Un método para atrapar unidades biológicas discretas en un hidrogel, comprendiendo dicho método las etapas de: a) poner en contacto una pluralidad de unidades biológicas con una pluralidad de unidades de código de barras para formar complejos unidad biológica/unidad de código de barras, en donde cada unidad de código de barras comprende un código de barras exclusivo, y en donde dichas unidades de código de barras comprenden al menos un medio implicado en la unión de dichas unidades biológicas,
b) poner en contacto dichos complejos unidad biológica/unidad de código de barras con una solución de hidrogel, y c) polimerizar la solución de hidrogel para incluir complejos unidad biológica/unidad de código de barras discretos en una matriz de hidrogel,
d) identificar con código de barras el ácido nucleico de la unidad biológica dentro de cada uno de dichos complejos unidad biológica/unidad de código de barras en la matriz de hidrogel.
2. Un método para analizar la expresión génica en unidades biológicas discretas, comprendiendo dicho método las etapas de:
a) poner en contacto una pluralidad de unidades biológicas con una pluralidad de unidades de código de barras para formar complejos unidad biológica/unidad de código de barras, en donde cada unidad de código de barras comprende un código de barras exclusivo, y en donde dichas unidades de código de barras comprenden al menos un medio implicado en la unión de dichas unidades biológicas,
b) poner en contacto dichos complejos unidad biológica/unidad de código de barras con una solución de hidrogel, c) polimerizar la solución de hidrogel para incluir complejos unidad biológica/unidad de código de barras discretos en una matriz de hidrogel,
d) liberar ácidos nucleicos desde cada unidad biológica en la matriz de hidrogel,
e) identificar con código de barras dichos ácidos nucleicos procedentes de cada unidad biológica en la matriz de hidrogel,
f) sintetizar una genoteca de ADNc a partir de los ácidos nucleicos procedentes de cada unidad biológica, g) amplificar dicha genoteca de ADNc procedente de cada unidad biológica, en donde la amplificación de dicha genoteca de ADNc procedente de cada unidad biológica incorpora copias clonales de dicho código de barras exclusivo en los productos de amplificación procedentes de cada unidad biológica, y
h) opcionalmente, secuenciar los productos de amplificación.
3. Un método para analizar el genotipo en unidades biológicas discretas, comprendiendo dicho método las etapas de: a) poner en contacto una pluralidad de unidades biológicas con una pluralidad de unidades de código de barras para formar complejos unidad biológica/unidad de código de barras, en donde cada unidad de código de barras comprende un código de barras exclusivo, y en donde dichas unidades de código de barras comprenden al menos un medio implicado en la unión de dichas unidades biológicas,
b) poner en contacto dichos complejos unidad biológica/unidad de código de barras con una solución de hidrogel, c) polimerizar la solución de hidrogel para incluir complejos unidad biológica/unidad de código de barras discretos en una matriz de hidrogel,
d) liberar ADN genómico desde cada unidad biológica en la matriz de hidrogel,
e) identificar con código de barras dicho ADN genómico procedente de cada unidad biológica en la matriz de hidrogel, f) opcionalmente, sintetizar una genoteca de ADN a partir de los ácidos nucleicos procedentes de cada unidad biológica,
g) amplificar dicho ADN genómico o genoteca de ADN procedente de cada unidad biológica, en donde la amplificación de dicho ADN genómico o genoteca de ADN procedente de cada unidad biológica incorpora copias clonales de dicho código de barras exclusivo en los productos de amplificación de cada unidad biológica, y h) opcionalmente, secuenciar los productos de amplificación.
4. Un método para analizar el haplotipo en unidades biológicas discretas, comprendiendo dicho método las etapas de: a) poner en contacto una pluralidad de unidades biológicas con una pluralidad de unidades de código de barras para formar complejos unidad biológica/unidad de código de barras, en donde cada unidad de código de barras comprende un código de barras exclusivo, y en donde dichas unidades de código de barras comprenden al menos un medio implicado en la unión de dichas unidades biológicas,
b) poner en contacto dichos complejos unidad biológica/unidad de código de barras con una solución de hidrogel, c) polimerizar la solución de hidrogel para incluir complejos unidad biológica/unidad de código de barras discretos en una matriz de hidrogel,
d) opcionalmente, liberar ácidos nucleicos desde cada unidad biológica en la matriz de hidrogel,
e) identificar con código de barras dichos ácidos nucleicos procedentes de cada unidad biológica en la matriz de hidrogel,
f) opcionalmente, sintetizar una genoteca de ADN a partir de los ácidos nucleicos procedentes de cada unidad biológica,
g) amplificar dichos ácidos nucleicos o genoteca de ADN procedentes de cada unidad biológica, en donde la amplificación de dichos ácidos nucleicos o genoteca de ADN procedentes de cada unidad biológica incorpora copias clonales de dicho código de barras exclusivo en los productos de amplificación procedentes de cada unidad biológica, y
h) opcionalmente, secuenciar los productos de amplificación.
5. Un método para analizar el epigenoma en unidades biológicas discretas, comprendiendo dicho método las etapas de:
a) poner en contacto una pluralidad de unidades biológicas celulares con una pluralidad de unidades de código de barras para formar complejos unidad biológica/unidad de código de barras, en donde cada unidad de código de barras comprende un código de barras exclusivo, y en donde dichas unidades de código de barras comprenden al menos un medio implicado en la unión de dichas unidades biológicas,
b) poner en contacto dichos complejos unidad biológica/unidad de código de barras con una solución de hidrogel, c) polimerizar la solución de hidrogel para incluir complejos unidad biológica/unidad de código de barras discretos en una matriz de hidrogel,
d) liberar ADN no unido al nucleosoma desde cada unidad biológica en la matriz de hidrogel,
e) identificar con código de barras dicho ADN no unido al nucleosoma procedente de cada unidad biológica en la matriz de hidrogel,
f) opcionalmente, sintetizar una genoteca de ADN a partir del ADN no unido al nucleosoma procedente de cada unidad biológica,
g) amplificar dicho ADN no unido al nucleosoma o genoteca de ADN procedente de cada unidad biológica, en donde la amplificación de dicho ADN no unido al nucleosoma o genoteca de ADN procedente de cada unidad biológica incorpora copias clonales de dicho código de barras exclusivo en los productos de amplificación de cada unidad biológica, y
h) opcionalmente, secuenciar los productos de amplificación.
6. El método según la reivindicación 1,2, 3, 4 o 5, en donde:
- dichas unidades biológicas están inmovilizadas sobre un soporte; o
- dichas unidades de código de barras están inmovilizadas sobre un soporte.
7. El método según la reivindicación 6, en donde dichas unidades biológicas o dichas unidades de código de barras están inmovilizadas sobre un soporte en una capa de hidrogel.
8. El método según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, en donde dicho código de barras exclusivo está presente en múltiples copias clonales sobre cada unidad de código de barras.
9. El método según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, en donde dicho código de barras exclusivo comprende un código de barras de secuencias de ácido nucleico.
10. El método según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, en donde dicho código de barras exclusivo comprende además un cebador de secuencias de ácido nucleico.
11. El método según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10, en donde dicha unidad de código de barras consiste en una perla.
12. El método según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11, en donde dichas unidades biológicas discretas comprenden células, grupos de células, virus, núcleos, mitocondrias, cloroplastos, macromoléculas biológicas, exosomas, cromosomas, fragmentos de ADN de transposición conservadora de contigüidad y/o fragmentos de ácidos nucleicos.
13. El método según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 12, en donde dicho al menos un medio implicado en la unión de dichas unidades biológicas comprende una proteína o un fragmento de la misma, un péptido, un anticuerpo o un fragmento del mismo, un ácido nucleico, un carbohidrato, una vitamina o un derivado de la misma, una coenzima o un derivado de la misma, un ligando de receptor o derivado del mismo, o un grupo hidrófobo.
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Families Citing this family (11)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
GB201622222D0 (en) 2016-12-23 2017-02-08 Cs Genetics Ltd Reagents and methods for molecular barcoding of nucleic acids of single cells
SG11201911961RA (en) 2018-04-20 2020-01-30 Illumina Inc Methods of encapsulating single cells, the encapsulated cells and uses thereof
MY202795A (en) 2018-10-26 2024-05-22 Illumina Inc Modulating polymer beads for dna processing
CN109569023B (zh) * 2018-11-29 2021-03-02 杭州立昂科技有限公司 参杂去污剂的干燥水凝胶颗粒及大分子浓缩和比活性提升
WO2021011895A1 (en) * 2019-07-18 2021-01-21 Celldom, Inc. Methods and devices for single cell barcoding
JP2023505712A (ja) * 2019-12-12 2023-02-10 キージーン ナムローゼ フェンノートシャップ 半固体状態での核酸操作
WO2023139272A1 (en) 2022-01-24 2023-07-27 Scipio Bioscience Gelation device with piston
EP4272764A1 (en) 2022-05-03 2023-11-08 Scipio Bioscience Method of complexing biological units with particles
CN119497758A (zh) 2022-07-12 2025-02-21 巴黎科学与文学联大 用于对细胞或细胞器进行空间示踪和测序的方法
CN115463622A (zh) * 2022-08-03 2022-12-13 广东纤友朵美生物科技有限公司 一种基于氧化果胶的凝胶及其制备方法
CN120005966A (zh) * 2023-11-15 2025-05-16 粤港澳大湾区精准医学研究院(广州) 一种水凝胶及其应用

Family Cites Families (22)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20050053980A1 (en) 2003-06-20 2005-03-10 Illumina, Inc. Methods and compositions for whole genome amplification and genotyping
EP2324045A4 (en) * 2008-08-05 2013-04-03 Univ Cornell PHOTOVERNETIC NUCLEIC ACID HYDROGEL
EP2625320B1 (en) * 2010-10-08 2019-03-27 President and Fellows of Harvard College High-throughput single cell barcoding
CA2861387A1 (en) * 2012-02-02 2013-08-08 Invenra, Inc. High throughput screen for biologically active polypeptides
CA2881685C (en) * 2012-08-14 2023-12-05 10X Genomics, Inc. Microcapsule compositions and methods
EP2931919B1 (en) 2012-12-14 2019-02-20 10X Genomics, Inc. Methods and systems for processing polynucleotides
JP2016511243A (ja) 2013-02-08 2016-04-14 テンエックス・ジェノミクス・インコーポレイテッド ポリヌクレオチドバーコード生成
EP4617376A2 (en) 2013-05-23 2025-09-17 The Board of Trustees of the Leland Stanford Junior University Transposition into native chromatin for personal epigenomics
EP3039158B1 (en) 2013-08-28 2018-11-14 Cellular Research, Inc. Massively parallel single cell analysis
US10395758B2 (en) 2013-08-30 2019-08-27 10X Genomics, Inc. Sequencing methods
WO2015061719A1 (en) * 2013-10-25 2015-04-30 Massachusetts Institute Of Technology Method and apparatus for tracking cell identity
DK3083994T3 (da) 2013-12-20 2021-09-13 Illumina Inc Bevarelse af genomisk konnektivitetsinformation i fragmenterede genomiske DNA-prøver
KR20220119751A (ko) * 2013-12-30 2022-08-30 아트레카, 인크. 핵산 바코드를 이용하는 단일 세포와 관련된 핵산의 분석
MY200537A (en) 2014-02-18 2024-01-02 Illumina Inc Methods and compositions for dna profiling
CN105392902B (zh) 2014-06-24 2021-10-29 生物辐射实验室股份有限公司 数字式pcr条码化
WO2015200893A2 (en) * 2014-06-26 2015-12-30 10X Genomics, Inc. Methods of analyzing nucleic acids from individual cells or cell populations
EP3161162A4 (en) 2014-06-26 2018-01-10 10X Genomics, Inc. Analysis of nucleic acid sequences
SG11201610910QA (en) 2014-06-30 2017-01-27 Illumina Inc Methods and compositions using one-sided transposition
KR102643955B1 (ko) 2014-10-17 2024-03-07 일루미나 케임브리지 리미티드 근접 보존 전위
EP3248018B1 (en) * 2015-01-22 2020-01-08 Becton, Dickinson and Company Devices and systems for molecular barcoding of nucleic acid targets in single cells
KR20240091073A (ko) * 2015-02-10 2024-06-21 일루미나, 인코포레이티드 세포 성분을 분석하기 위한 방법 및 조성물
WO2017075265A1 (en) * 2015-10-28 2017-05-04 The Broad Institute, Inc. Multiplex analysis of single cell constituents

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