ES2970730T3 - Microorganismo productor de ácido 5'-xantílico y método para producir ácido 5'-xantílico utilizando el mismo - Google Patents
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Abstract
La presente solicitud se refiere a un microorganismo que produce ácido 5'-xantílico y a un método para producir ácido 5'-xantílico utilizando el mismo. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)
Description
DESCRIPCIÓN
Microorganismo productor de ácido 5'-xantílico y método para producir ácido 5'-xantílico utilizando el mismoCampo técnico
La presente descripción se refiere a un microorganismo que produce monofosfato de 5'-xantosina y un método para producir monofosfato de 5'-xantosina mediante el uso del mismo.
Técnica anterior
El monofosfato de 5'-xantosina (XMP) no solo tiene importancia fisiológica en animales y plantas como un intermedio en la biosíntesis de ácidos nucleicos y sistemas metabólicos, sino que también se utiliza para diversos fines: alimentos, medicina y diversos usos médicos. En particular, cuando se usa junto con el glutamato monosódico (MSG), existe un efecto sinérgico para mejorar los sabores. Por consiguiente, XMP es uno de los potenciadores del sabor basados en ácido nucleico que han recibido atención como condimento.
Además, el monofosfato de 5'-xantosina es un intermedio en el metabolismo de la biosíntesis de nucleótidos de purina, y es una materia prima importante para la producción de monofosfato de 5'-guanosina (GMP). Un método bien conocido para preparar el monofosfato de guanosina que tiene alto valor comercial y afecta al aumento de la intensidad del sabor es la fermentación de un microorganismo, que implica la producción de monofosfato de 5'-xantosina y la conversión enzimática del mismo a monofosfato de 5'-guanosina. Como este método es el más económico, se necesita el monofosfato de 5'-xantosina tanto como el monofosfato de 5'-guanosina.
Entre los métodos para preparar el monofosfato de 5'-xantosina, se conocen (1) la síntesis química, (2) la desaminación del monofosfato de 5'-xantosina producido, (3) la producción mediante fermentación añadiendo xantina como precursor al medio de cultivo, (4) fermentación directa con una cepa mutante de un microorganismo que produce monofosfato de 5'-xantosina, etc. Entre los diversos métodos, la fermentación directa de monofosfato de 5'-xantosina con una cepa de microorganismo mutante es la más ventajosa económicamente. Sin embargo, sigue demandándose investigación sobre métodos para producir monofosfato de 5'-xantosina con alto rendimiento.
Descripción Detallada
Problema técnico
Los presentes inventores hicieron grandes esfuerzos para desarrollar microorganismos capaces de producir monofosfato de 5'-xantosina con alto rendimiento y, como resultado, descubrieron que el rendimiento de producción de monofosfato de 5'-xantosina aumenta cuando se mejora la actividad de una proteína en particular, completando de esta manera la presente descripción.
Solución técnica
Un objeto de la presente descripción es proporcionar un microorganismo del géneroCorynebacteriumque produce monofosfato de 5'-xantosina en el que se ha mejorado la actividad de una proteína que comprende una secuencia de aminoácidos de la Id. de sec. n.°: 2.
Otro objeto de la presente descripción es proporcionar un método para producir monofosfato de 5'-xantosina usando el microorganismo.
Efectos ventajosos
El microorganismo del géneroCorynebacteriumde la presente descripción tiene una actividad mejorada de una proteína que exporta el monofosfato de 5'-xantosina, aumentando de esta manera la producción de monofosfato de 5'-xantosina, y esto puede contribuir significativamente a la reducción del coste de producción del monofosfato de 5'-xantosina.
Mejor modo
La invención se define en las reivindicaciones adjuntas.
En lo sucesivo, la presente descripción se describe con más detalle. Mientras tanto, cada descripción y realización ilustrativa descritas en la presente descripción se puede aplicar a otras descripciones y realizaciones ilustrativas. Es decir, todas las combinaciones de los diversos elementos descritos en la presente descripción están comprendidas dentro del alcance de la presente descripción. Además, el alcance de la presente descripción no puede considerarse limitado por la descripción específica siguiente.
Como aspecto para conseguir los objetos anteriores, la presente descripción proporciona un microorganismo del géneroCorynebacteriumque produce monofosfato de 5'-xantosina en el que se ha mejorado la actividad de una proteína que comprende una secuencia de aminoácidos de la Id. de sec. n.°: 2.
La invención se refiere a un microorganismo del género Corynebacterium que produce monofosfato de 5'-xantosina, en donde se modifica la actividad de una proteína que comprende una secuencia de aminoácidos de la Id. de sec. n.°: 2 para mejorarse en comparación con la cepa precursora, en donde la modificación comprende un aumento en el número de copias de los polinucleótidos que codifican la proteína, la sustitución de un promotor del polinucleótido por otro promotor que tiene actividad mejorada, la sustitución de un codón de iniciación o una combinación de los mismos.
Como se utiliza en la presente memoria, el término “ monofosfato de 5'-xantosina” se refiere a un compuesto denominado ácido 5'-xantílico, xantosina, etc. En la presente descripción, el monofosfato de 5'-xantosina puede usarse indistintamente con “XMP” .
Como se utiliza en la presente memoria, la expresión “ proteína que comprende una secuencia de aminoácidos de la Id. de sec. n.°: 2” se refiere a una proteína presente endógenamente en un microorganismo del géneroCorynebacteriumcodificada por un gen transportador de la superfamilia de facilitadores principales (transportador MFS) que exporta monofosfato de 5'-xantosina desde el microorganismo. Específicamente, puede ser una proteína transportadora de MFS que incluye la secuencia de aminoácidos de la Id. de sec. n.°: 2 que está presente endógenamente en el microorganismo del géneroCorynebacterium.Además, la proteína puede ser una proteína que consiste o está compuesta por la secuencia de aminoácidos de la Id. de sec. n.°: 2, pero no se limita a lo indicado. La proteína transportadora de MFS de la presente descripción puede denominarse “xmpE” o “proteína xmpE” .
Como se utiliza en la presente memoria, “ proteína que comprende una secuencia de aminoácidos de una Id. de sec. n.° particular” , siempre que tenga una actividad idéntica o correspondiente a una proteína que incluye la misma Id. de sec. n.°, puede incluir la adición de una secuencia que no altere la función de la proteína en la parte frontal del extremo de la secuencia de aminoácidos; una mutación natural; o una mutación silenciosa de la misma. En el caso de proteínas que tienen dicha adición o mutación de secuencia, es evidente que también están incluidas dentro del alcance de la presente descripción.
Además, la proteína de la presente descripción puede comprender la secuencia de aminoácidos de la Id. de sec. n.°: 2, pero también tener al menos 60 % de homología o identidad con la Id. de sec. n.°: 2. La proteína que comprende la secuencia de aminoácidos que tiene al menos 60 % de homología o identidad con la Id. de sec. n.°: 2 puede ser una proteína que incluye una secuencia de aminoácidos que tiene al menos 60 %, específicamente 70 %, más específicamente 80 %, incluso más específicamente 83 %, 84 %, 85 %, 88 %, 90 %, 93 %, 95 % o 97 % de homología o identidad con la Id. de sec. n.°: 2. La secuencia de aminoácidos que tiene la homología o identidad puede excluir la que tenga un 100 % de identidad respecto de dicho intervalo o que tenga una identidad de menos del 100 %. Es evidente que siempre que la secuencia de aminoácidos, como una secuencia que tenga la homología o identidad de secuencia, tenga sustancialmente una actividad biológica idéntica o correspondiente a la de la Id. de sec. n.°: 2, queda incluida en el alcance de la presente descripción incluso aunque parte de la secuencia tenga deleciones, modificaciones, sustituciones o adiciones de una secuencia de aminoácidos.
Además, una secuencia de nucleótidos de un gen que codifica la proteína que comprende la secuencia de aminoácidos de la Id. de sec. n.°: 2 se puede obtener de una base de datos conocida tal como NCBI GenBank, pero sin limitarse a lo anterior. Específicamente, la proteína que comprende la secuencia de aminoácidos de la Id. de sec. n.°: 2 puede estar codificada por un gen que incluye una secuencia de nucleótidos de la Id. de sec. n.°: 1, así como un gen que consiste o está compuesto por la secuencia de nucleótidos de la Id. de sec. n.°: 1, pero sin limitarse a lo anterior.
Además, la secuencia de nucleótidos de la Id. de sec. n.°: 1 puede no solo incluir la secuencia de nucleótidos de la Id. de sec. n.°: 1 en sí misma, sino también una secuencia de nucleótidos que tenga al menos un 80 % de homología o identidad con la Id. de sec. n.°: 1.
Específicamente, cualquier secuencia de nucleótidos capaz de codificar una secuencia de aminoácidos que tenga al menos 80 % de homología o identidad con la Id. de sec. n.°: 2 queda incluida dentro del alcance de la presente descripción, pero la proteína puede estar codificada por un gen que incluye una secuencia de nucleótidos que tiene al menos 80 %, específicamente 83 %, 84 %, 85 %, 88 %, 90 %, 93 %, 95 % o 97 % de homología o identidad con la Id. de sec. n.°: 1. Sin embargo, es evidente que una secuencia de nucleótidos queda incluida dentro del alcance de la presente descripción sin limitación siempre que codifique una proteína que tenga actividad
correspondiente a la de la proteína que incluye la secuencia de aminoácidos de la Id. de sec. n.°: 2.
Además, es evidente que, debido a la degeneración del código genético, puede incluirse dentro del alcance de la presente descripción un polinucleótido que puede traducirse a una proteína que incluya la misma secuencia de aminoácidos o una proteína que tenga homología o identidad con la misma. Además, una sonda que pueda prepararse a partir de una secuencia génica conocida, p. ej., cualquier secuencia que codifique una proteína que tenga actividad de una proteína que incluya la secuencia de aminoácidos de la Id. de sec. n.°: 2 por hibridación en todo o en parte de la secuencia de nucleótidos con su secuencia complementaria en condiciones rigurosas puede incluirse sin limitación. Por “condiciones rigurosas” se entienden las condiciones que permiten la hibridación específica entre polinucleótidos. Las condiciones se han descrito detalladamente en la referencia (J. Sambrook y col., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2a Edición, Cold Spring Harbor Laboratory press, Cold Spring Harbor, Nueva York, 1989); por ejemplo, una condición en la que genes que tienen una alta homología o identidad de al menos el 40 %, específicamente el 85 %, específicamente el 90 %, más específicamente el 95 %, más específicamente el 97 %, y particularmente específicamente el 99 % se hibridan mientras que los que tienen una homología o identidad más baja no se hibridan; o una condición de hibridación Southern convencional, es decir, lavado una vez, específicamente de dos a tres veces a una temperatura y concentración de sal equivalente a 60 °C, 1 x SSC, SDS al 0,1 %, específicamente 60 °C, 0,1 x SSC, SDS al 0,1 %, más específicamente 68 °C, 0,1 x SSC, SDS al 0,1 %. Aunque la hibridación puede permitir el emparejamiento incorrecto entre bases dependiendo del grado de rigor, se exige que dos ácidos nucleicos tengan una secuencia complementaria entre sí. Como se utiliza en la presente memoria, el término “complementario” se usa para describir la relación entre bases de nucleótidos que pueden hibridarse entre sí. Con respecto al ADN, por ejemplo, la adenosina es complementaria de la timina y la citosina es complementaria de la guanina. Por consiguiente, la presente descripción también puede incluir un fragmento de ácido nucleico aislado complementario no solo de una secuencia de ácido nucleico sustancialmente similar sino también la secuencia completa.
Específicamente, el polinucleótido que tiene homología o identidad se puede detectar usando una condición de hibridación que incluye una etapa de hibridación a un valor de T<m>de 55 °C y las condiciones descritas anteriormente. Además, el valor de T<m>puede ser de 60 °C, 63 °C o 65 °C, pero sin limitarse a lo anterior, y los expertos en la técnica pueden ajustarlo apropiadamente.
Un grado apropiado de rigor de la hibridación de polinucleótidos depende de la longitud y el grado de complementariedad del polinucleótido y las variables son bien conocidas en el campo técnico correspondiente (véase Sambrook y col., citado anteriormente, 9.50-9.51, 11.7-11.8).
Como se utiliza en la presente memoria, el término “ homología” se refiere al grado de identidad entre dos secuencias de aminoácidos o secuencias de nucleótidos dadas, y se puede expresar como porcentaje. En la presente memoria descriptiva, la secuencia homóloga que tiene la misma actividad o una similar con la secuencia de aminoácidos o secuencia de polinucleótidos dada se puede indicar en términos de “% de homología” .
Como se utiliza en la presente memoria, el término “ identidad” se refiere al grado de relación de secuencias entre las secuencias de aminoácidos o nucleótidos y, en algunos casos, se puede determinar por una coincidencia entre las cadenas de tales secuencias.
Los términos “ homología” e “ identidad” se utilizan a menudo indistintamente entre sí.
La homología o identidad de secuencias de polinucleótidos o polipéptidos conservados se puede determinar mediante algoritmos de alineación estándar y utilizarse con penalizaciones de separación predeterminadas establecidas por el programa que se vaya a utilizar. Generalmente, se espera que básicamente los polinucleótidos o polipéptidos homólogos o idénticos se hibriden con rigor moderado o alto, a lo largo de al menos aproximadamente 50 %, 60 %, 70 %, 80 % o 90 % de la longitud completa de todos los polinucleótidos o polipéptidos diana. También se consideran polinucleótidos que contienen codones degenerados en lugar de codones en los polipéptidos de hibridación.
Que cualesquiera dos secuencias de polinucleótidos o polipéptidos tenga una homología o identidad de, por ejemplo, al menos 50 %, 55 %, 60 %, 65 % 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o 99 % se puede determinar usando un algoritmo informático conocido tal como el programa “ PASTA” (p. ej., Pearson y col., (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85: 2444) usando parámetros predeterminados. Alternativamente, se puede determinar mediante el algoritmo Needleman-Wunsch (Needleman y Wunsch, 1970, J. Mol. Biol. 48: 443-453) tal como se realiza en el programa Needleman del paquete EMBOSS (EMBOSS: The European Molecular Biology Open Software Suite, Rice y col., 2000, Trends Genet. 16: 276-277) (preferiblemente, versión 5.0.0 o posterior). (Incluye el paquete informático GCG [Devereux, J., y col., Nucleic Acids Research 12: 387 (1984]), BLAs Tp , BLASt N, FASTA (Atschul, [S.] [F.,] [Y COL, J MOLEC BIOL 215]: 403 (1990); Guide to Huge Computers, Martin J. Bishop, [ED.,] Academic Press, San Diego, 1994, y [CARILLO ETA/.](1988) SIAM J Applied Math 48: 1073). Por ejemplo, la homología o identidad se pueden determinar utilizando BLAST o ClustalW del National Center for Biotechnology Information (NCBI).
La homología o identidad del polinucleótido o polipéptido se puede determinar comparando la información de la secuencia publicada (p. ej., Smith y Waterman, Adv. Appl. Math (1981) 2:482), por ejemplo, usando el programa informático GAP como se describe en Needleman y col. (1970), J Mol Biol.48: 443. En resumen, el programa GAP define la homología o identidad como un valor obtenido dividiendo el número de símbolos alineados de manera similar (es decir, nucleótidos o aminoácidos) por el número total de símbolos en la más corta de las dos secuencias. Los parámetros predeterminados del programa GAP pueden incluir (1) una matriz de comparación unaria (que contiene un valor de 1 para identidades y 0 para no identidades) y la matriz de comparación ponderada de Gribskov y col. (1986), Nucl. Acids Res. 14:6745, como se describe en Schwartz y Dayhoff, eds., Atlas of Protein Sequence and Structure, National Biomedical Research Foundation, págs. 353-358, 1979; (2) una penalización de 3,0 para cada espacio y una penalización de 0,10 adicional para cada símbolo en cada hueco (o penalización por apertura de hueco de 10 y una penalización por extensión de hueco de 0,5); y (3) ninguna penalización para los espacios finales. Por consiguiente, como se utiliza en la presente memoria, el término “ homología” o “ identidad” se refiere a una relevancia entre polipéptidos o polinucleótidos.
El microorganismo del géneroCorynebacteriumque produce monofosfato de 5'-xantosina en la presente descripción puede tener una actividad mejorada de la proteína que incluye la secuencia de aminoácidos de la Id. de sec. n.°: 2.
La mejora en la actividad de la proteína que incluye la secuencia de aminoácidos de la Id. de sec. n.°: 2 puede usarse indistintamente con la mejora de la actividad de xmpE o la de una proteína codificada por un gen que incluye la secuencia de nucleótidos de la Id. de sec. n.°: 1.
Como se utiliza en la presente memoria, la expresión “actividad mejorada de una proteína que comprende la secuencia de aminoácidos de la Id. de sec. n.°: 2” se refiere a la expresión mejorada de la proteína en comparación con su cepa precursora o la de la proteína que incluye la secuencia de aminoácidos de la Id. de sec. n.°: 2 en comparación con una cepa no modificada; la actividad mejorada de la misma con expresión equivalente; o una actividad mejorada y expresión de la misma. La expresión también se refiere a una actividad mejorada de la proteína en comparación con su actividad endógena así como una expresión o actividad mejorada de xmpE en comparación con la cepa precursora o la cepa no modificada de la misma.
Según la presente descripción, la mejora de la actividad de la proteína se puede lograr aplicando diversos métodos conocidos en la técnica. Por ejemplo, la mejora de la actividad se puede lograr aumentando el número de copias de polinucleótidos que codifican la proteína, potenciando la actividad promotora, la sustitución de un codón de iniciación o una combinación de los mismos; específicamente, 1) aumentar el número de copias del polinucleótido que codifica la proteína; 2) modificar la secuencia de un regulador de expresión (promotor, operador, etc.) para aumentar la expresión del polinucleótido; 3) modificar una secuencia del gen (codón de iniciación, etc.) en un cromosoma para potenciar la actividad de la proteína, o una combinación de los mismos, pero sin limitarse a lo anterior.
Específicamente, con respecto a la mejora de la actividad de la proteína, el método para modificar la secuencia de un regulador de expresión puede lograrse aplicando diversos métodos conocidos en la técnica. Por ejemplo, la modificación puede llevarse a cabo para mejorar la actividad de la secuencia reguladora de expresión induciendo una modificación por deleción, inserción o sustitución no conservadora o conservadora, o una combinación de las mismas en la secuencia reguladora; o mediante la sustitución de la secuencia de nucleótidos por una secuencia de nucleótidos que tenga una actividad más potenciada. El regulador de expresión incluye un promotor, un potenciador, un operador, un sitio de unión al ribosoma y una secuencia que regula la terminación de la transcripción y la traducción, pero sin limitarse a lo anterior.
Además, el método para modificar la secuencia del gen puede llevarse a cabo para mejorar la actividad de la proteína mediante la inducción de una modificación por deleción, inserción o sustitución no conservadora o conservadora, o una combinación de las mismas en la secuencia; o sustituir la secuencia génica por una secuencia génica modificada que tenga una actividad más potenciada, pero sin limitarse a lo anterior.
En una realización ilustrativa específica, la mejora de la actividad de la proteína se puede lograr aumentando el número de copias de xmpE; sustituyendo un promotor de xmpE por otro promotor que tenga actividad potenciada; sustituyendo el codón de iniciación de xmpE; o una combinación de los mismos.
Como se utiliza en la presente memoria, el término “vector” se refiere a una construcción de ADN que comprende la secuencia de nucleótidos del polinucleótido que codifica la proteína diana unida operativamente a la secuencia reguladora adecuada para expresar la proteína diana en el hospedador apropiado. La secuencia reguladora puede incluir el promotor que puede iniciar la transcripción, cualquier secuencia del operador para regular la transcripción, la secuencia que codifica el sitio de unión al ribosoma de ARNm adecuado y la secuencia que controla la terminación de la transcripción y la traducción. El vector se puede transfectar a un hospedador adecuado y, a continuación, se puede replicar o funcionar independientemente del genoma del hospedador y se puede integrar en el propio genoma.
Como se utiliza en la presente memoria, el término “transformación” se refiere a la introducción de un vector que incluye un polinucleótido que codifica una proteína diana en una célula hospedadora para que la proteína codificada por el polinucleótido se pueda expresar en la célula hospedadora. Siempre que se pueda expresar en la célula hospedadora, el polinucleótido transformado bien puede integrarse o colocarse en el cromosoma de la célula hospedadora o bien puede localizarse extracromosómicamente. Además, el polinucleótido incluye ADN y ARN que codifica para la proteína diana. El polinucleótido puede introducirse en cualquier forma, siempre que pueda introducirse en la célula hospedadora y expresarse en la misma. Por ejemplo, el polinucleótido puede introducirse en la célula hospedadora en forma de un casete de expresión, que es una construcción de polinucleótido que incluye todos los elementos necesarios para la expresión autónoma. El casete de expresión puede incluir un promotor operativamente unido al gen, una señal de terminación de la transcripción, un sitio de unión al ribosoma y una señal de terminación de la traducción. El casete de expresión puede estar en forma de un vector de expresión autorreplicable. Además, el polinucleótido puede introducirse en la célula hospedadora tal cual y unirse operativamente a la secuencia requerida para su expresión en la célula hospedadora.
Como se utiliza en la presente memoria, la expresión “ microorganismo que produce monofosfato de 5'-xantosina” o “ microorganismo que tiene capacidades para producir monofosfato de 5'-xantosina” se refiere a un microorganismo que tiene capacidades naturales para producir monofosfato de 5'-xantosina o un microorganismo en el que se proporciona capacidad de producir monofosfato de 5'-xantosina a una cepa precursora que no tiene capacidad para producir monofosfato de 5'-xantosina. Específicamente, puede ser un microorganismo que tenga capacidades para producir monofosfato de 5'-xantosina, en el que se ha mejorado la actividad de una proteína que incluye la secuencia de aminoácidos de la Id. de sec. n.°: 2 o proteína xmpE.
Además, considerando el objeto de la presente descripción, la capacidad de producir monofosfato de 5'-xantosina del microorganismo puede mejorarse/potenciarse debido a la mejora en la capacidad exportadora de monofosfato de 5'-xantosina.
Específicamente, los términos “capacidad para producir” y “capacidad exportadora” se pueden usar indistintamente. Además, el microorganismo puede usarse indistintamente con “ microorganismo que exporta monofosfato de 5'-xantosina” o “ microorganismo que tiene capacidad exportadora de monofosfato de 5'-xantosina” . Puede referirse a un microorganismo que tiene naturalmente la capacidad exportadora de monofosfato de 5'-xantosina o un microorganismo en el que se ha transferido la capacidad exportadora de monofosfato de 5'-xantosina a una cepa precursora que no tenía capacidad exportadora de monofosfato de 5'-xantosina.
Específicamente, el microorganismo del géneroCorynebacteriumque produce monofosfato de 5'-xantosina puede serCorynebacterium stationisoCorynebacterium glutamicumoCorynebacterium ammoniagenes; y más específicamente puede serCorynebacterium stationis,pero sin limitarse a lo anterior.
En otro aspecto, la presente descripción proporciona un método para producir monofosfato de 5'-xantosina que comprende cultivar el microorganismo del géneroCorynebacteriumen un medio de cultivo; y recuperar el monofosfato de 5'-xantosina del microorganismo o el medio de cultivo.
El microorganismo y el monofosfato de 5'-xantosina según la presente descripción son los mismos que se han descrito anteriormente.
El microorganismo del géneroCorynebacteriumde la presente descripción puede serCorynebacterium stationis,pero sin limitarse a lo anterior.
Con respecto al método de la presente descripción, el microorganismo del géneroCorynebacteriumse puede cultivar usando cualesquiera condiciones de cultivo y métodos conocidos en la técnica.
Como se utiliza en la presente memoria, el término “cultivo” se refiere al cultivo del microorganismo en condiciones ambientales moderadamente controladas artificialmente. El proceso de cultivo de la presente descripción se puede llevar a cabo según un medio de cultivo adecuado y condiciones de cultivo conocidas en la técnica. Además, el método de cultivo incluye un cultivo por lotes, un cultivo continuo y un cultivo semicontinuo; específicamente, se puede cultivar continuamente en un proceso por lotes o de alimentación por lotes, o un proceso de alimentación por lotes repetido, pero el método de cultivo no se limita a lo anterior.
El medio utilizado para el cultivo cumplirá los requisitos de las cepas específicas de una manera adecuada. El medio de cultivo para el microorganismo del géneroCorynebacteriumes conocido en la técnica (p. ej., Manual of Methods for General Bacteriology by the American Society for Bacteriology, Washington DC, EE.UU., 1981).
Específicamente, las fuentes de azúcar que se pueden usar para el medio incluyen sacáridos y carbohidratos tales como glucosa, sacarosa, lactosa, fructosa, maltosa, almidón, celulosa, etc.; aceites y grasas tales como el aceite de soja, aceite de girasol, aceite de ricino, aceite de coco, etc.; ácidos grasos tales como ácido palmítico, ácido esteárico, ácido linoleico, etc.; glicerol; alcoholes tales como etanol; y ácidos orgánicos tales como ácido acético. Estas sustancias se pueden usar individualmente o en una mezcla, pero sin limitarse a lo anterior.
Las fuentes de carbono que se pueden usar pueden ser sacarosa o glucosa en bruto o melazas que contengan una gran cantidad de sacarosa; y pueden ser específicamente glucosa purificada, pero sin limitarse a lo anterior. Se pueden usar otras fuentes de carbono diversas.
Las fuentes de nitrógeno que se pueden usar incluyen peptona, extracto de levadura, extracto de carne de ternera, extracto de malta, solución de maíz macerado, grano molido grueso de soja y urea o compuestos inorgánicos, por ejemplo, sulfato de amonio, cloruro de amonio, fosfato de amonio, carbonato de amonio y nitrato de amonio. Las fuentes de nitrógeno también se pueden usar individualmente o en una mezcla, pero sin limitarse a lo anterior.
Las fuentes de fosfato que se pueden usar incluyen dihidrogenofosfato de potasio, hidrogenofosfato de dipotasio o las correspondientes sales que contienen sodio.
Además, el medio de cultivo puede contener sales metálicas tales como sulfato de magnesio o sulfato de hierro. Además de los materiales anteriores, se pueden usar sustancias esenciales para el crecimiento tales como aminoácidos y vitaminas. También se pueden usar precursores apropiados para el medio de cultivo. Las materias primas descritas anteriormente se pueden añadir por lotes o de forma continua a una incubadora de una manera apropiada.
El pH del medio de cultivo se puede ajustar usando un compuesto básico tal como hidróxido de sodio, hidróxido de potasio y amoniaco; o un compuesto ácido tal como ácido fosfórico y ácido sulfúrico de una manera apropiada. Además, la formación de espuma puede suprimirse mediante el uso de un agente antiespumante tal como éster de poliglicol de ácido graso. El oxígeno o un gas que contiene oxígeno (por ejemplo, aire) se puede inyectar en el medio de cultivo para mantener condiciones aerobias.
Específicamente, la temperatura de cultivo es normalmente de 30 0C a 37 0C, más específicamente de 32 0C a 33 0C. El cultivo puede continuar hasta que se obtiene una cantidad deseada de monofosfato de 5'-xantosina, pero específicamente puede realizarse de 40 horas a 120 horas.
La separación de monofosfato de 5'-xantosina del cultivo puede llevarse a cabo mediante un método convencional conocido en la técnica; p. ej., centrifugación, filtración, cromatografía de intercambio iónico, cristalización, etc. Por ejemplo, el cultivo puede centrifugarse a una velocidad baja para eliminar la biomasa y, a continuación, el sobrenadante obtenido puede separarse mediante cromatografía de intercambio iónico. Sin embargo, la separación no se limita a lo anterior.
La etapa de recuperación puede incluir además un proceso de purificación.
Modo para la invención
De aquí en adelante, la presente descripción se describirá con más detalle con referencia a los siguientes ejemplos ilustrativos. Sin embargo, estos ejemplos son solo para fines ilustrativos, y no se pretende que la presente descripción esté limitada por estos ejemplos.
Ejemplo 1: Descubrimiento de la proteína exportadora de monofosfato de 5'-xantosina (XMP)
Para identificar la proteína de membrana deCorynebacteriuminvolucrada en la exportación de XMP, se preparó una genoteca de ADN deCorynebacterium stationis(ATCC6872). El ADN genómico de la cepa ATCC6872 (es decir,Corynebacterium stationisde tipo natural) se extrajo usando el G-spin Total DNA Extraction Minin Kit de Intron (n.° cat.
17045) según el protocolo proporcionado en el mismo. Se preparó la biblioteca de proteínas de membrana usando el ADN genómico extraído como molde.
Para investigar qué proteína tiene la función de exportación, se introdujo la genoteca de ADN preparada en la cepa KCCM-10530 deCorynebacteriumusada como cepa precursora en la patente coreana número 10-2011 -0105662.
A continuación se añadió XMP de forma adicional al medio de cultivo mínimo que contenía agar al 1,7 % para establecer una condición de cribado en la que la cepa KCCM-10530 muestra inhibición del crecimiento. La cepa KCCM-10530 se transformó por electroporación con una genoteca plasmídica de una proteína de membrana de la cepa ATCC6872 y se seleccionaron las colonias que crecieron normalmente en la condición donde se agrega una cantidad excesiva de XMP al medio de cultivo. Se obtuvo un plásmido de la colonia seleccionada y su secuencia de nucleótidos se analizó con un método de análisis de secuencias de nucleótidos. Se identificó un tipo de proteína de membrana implicada en la eliminación de la inhibición del crecimiento en la condición de cantidad excesiva de XMP agregada determinada en el experimento anterior.
Se confirmó que la proteína de membrana deCorynebacteriumtenía la secuencia de nucleótidos de la Id. de sec. n.°: 1 y la secuencia de aminoácidos de la Id. de sec. n.°: 2 (NCBI GenBank: NZ_CP014279.1, WP_066795121, transportador de MFS). La proteína de membrana se conoce como transportador MFS, pero su función aún no está completamente identificada. Además, no se sabe que tenga la función de exportar XMP. En la presente descripción, la proteína de membrana se denomina “xmpE” .
Ejemplo 2: Identificación de xmpE
Ejemplo 2-1: Preparación del vector deficiente en xmpE
Se preparó un vector deficiente para confirmar si la capacidad exportadora de XMP disminuye cuando xmpE, la proteína involucrada en la eliminación de la inhibición del crecimiento debido a XMP identificada en el Ejemplo 1, se elimina de la cepa productora de XMP.
Se obtuvo un fragmento de gen para la preparación del vector mediante PCR usando el ADN genómico de la cepa ATCC6872 como cepa precursora. Específicamente, se llevó a cabo la PCR para la xmpE usando cebadores con las Id. de sec. nros: 3 y 4. Los cebadores que se usaron se prepararon basándose en la información sobre genes deCorynebacterium stationis(ATCC6872) registrados en el Genbank de los National Institutes of Health (NIH) (NCBI Genbank: NZ_CP014279.1) y la secuencia de nucleótidos circundantes.
La PCR se realizó en las siguientes condiciones: desnaturalización a 94 °C durante 5 minutos; 25 ciclos de desnaturalización a 94 °C durante 30 segundos, hibridación a 52 °C durante 30 segundos y polimerización a 72 °C durante 1 minuto. La polimerización final se realizó después a 72 °C durante 5 minutos. Como fragmento génico de xmpE amplificado usando los cebadores de las Id. de sec. nros.: 3 y 4, se obtuvo un molde de polinucleótido de aproximadamente 1,0 kpb. El fragmento de gen obtenido se clonó usando un vector T (Solgent) para obtener un vector TOPO-AxmpE.
Ejemplo 2-2: Preparación de cepa deficiente en xmpE
La cepa KCCM-10530 se transformó por electroporación con el vector preparado en el ejemplo 2-1 (con el método de transformación descrito en Appl. Microbiol. Biotechnol. (1999) 52:541-545), y la cepa que tiene el vector insertado en un cromosoma debido a la recombinación de secuencia homóloga se seleccionó de un medio de cultivo que contenía 25 mg/l de kanamicina. La cepa deficiente en xmpE seleccionada se denominó “ KCCM-10530_AxmpE” , y se evaluó su capacidad para producir XMP.
La cepa original deCorynebacterium stationis,KCCM-10530, y la cepa KCCM-10530_AxmpE se inocularon en un tubo de 14 ml que tenía 3 ml del medio de cultivo de siembra siguiente y se cultivaron a 30 °C durante 24 horas con agitación a 170 rpm. A continuación, los cultivos de siembra se añadieron en una cantidad de 0,7 ml a 32 ml del siguiente medio de cultivo de producción (24 ml de medio de cultivo principal 8 ml de medio de cultivo estéril adicional) en los respectivos frascos de tipo vigreux de 250 ml, seguido de cultivo a 30 0C durante 72 horas con agitación a 170 rpm. Se realizó un análisis por HPLC para medir la cantidad de XMP producida después de completar el cultivo. La constitución del medio de cultivo y el resultado de las concentraciones de XMP en el medio de cultivo son como se muestra en la Tabla 1, más adelante.
Medio de cultivo mínimo para XMP
glucosa 2 %, sulfato de sodio 0,3 %, fosfato monopotásico 0,1 %, fosfato dipotásico 0,3 %, sulfato de magnesio 0,3 %, cloruro de calcio 10 mg/l, sulfato de hierro 10 mg/l, sulfato de cinc 1 mg/l, cloruro de manganeso 3,6 mg/l, L-cisteína 20 mg/l, pantotenato de calcio 10 mg/l, clorhidrato de tiamina 5 mg/l, biotina 30 pg/l, adenina 20 mg/l, guanina 20 mg/l, pH 7,3 Medio de cultivo nutricional para XMP
peptona 1 %, extracto de carne de ternera 0,5 %, cloruro de sodio 0,25 %, extracto de levadura 1 %, urea 0,3 %, adenina 50 mg/l, guanina 50 mg/l, agar 2 %, pH 7,2
Medio de cultivo para siembra en matraz de XMP
glucosa 20 g/l, peptona 10 g/l, extracto de levadura 10 g/l, cloruro de sodio 2,5 g/l, urea 3 g/l, adenina 150 mg/l, guanina 150 mg/l, pH 7,0
Medio de cultivo para producción de XMP en matraz (medio de cultivo principal)
glucosa 50 g/l, sulfato de magnesio 10 g/l, cloruro de calcio 100 mg/l, sulfato de hierro 20 mg/l, sulfato de manganeso 10 mg/l, sulfato de cinc 10 mg/l, sulfato de cobre 0,8 mg/l, histidina 20 mg/l, cisteína 15 mg/l, beta-alanina 15 mg/l, biotina 100 pg/l, tiamina 5 mg/l, adenina 50 mg/l, guanina 25 mg/l, niacina 5 mg/l, pH 7,0
Medio de cultivo para producción de XMP en matraz (medio de cultivo estéril adicional)
fosfato monopotásico 18 g/l, fosfato dipotásico 42 g/l, urea 7 g/l, sulfato de amonio 5 g/l
[Tabla 1]
Se compararon las concentraciones de XMP en los medios de cultivo de la cepa precursora KCCM-10530 y la cepa deficiente en xmpE, KCCM-10530AxmpE; como resultado, como se muestra en la Tabla 1 anterior, la concentración de XMP de la cepa KCCM-10530AxmpE disminuyó al menos aproximadamente 10 g/l en comparación con la cepa precursora en las mismas condiciones.
Por consiguiente, se confirmó que xmpE era una proteína involucrada en la exportación de XMP.
Ejemplo 3: Mejora de la actividad de la proteína xmpE
La actividad de la proteína xmpE en la cepa se mejoró según los siguientes ejemplos, y se examinó la cepa con actividad xmpE mejorada con respecto a si aumentó su capacidad para producir/exportar XMP.
Ejemplo 3-1: Aumento del número de copias de xmpE
Ejemplo 3-1 -1: Preparación del vector para aumentar el número de copias de xmpE
Para confirmar si la capacidad exportadora de XMP aumenta cuando se mejora la actividad de xmpE, que se predice que está implicada en la capacidad exportadora de XMP, se preparó un vector para mejorar un gen xmpE. Usando un método para aumentar el número de copias como el método de mejora, se realizó el siguiente experimento.
El fragmento génico para la preparación del vector se obtuvo mediante PCR usando ADN genómico de la cepa ATCC6872 como molde. Específicamente, el gen xmpE se amplificó para contener 484 pb aguas arriba del gen xmpE mediante el uso de un par de cebadores de la Id. de sec. nros.: 5 y 6. El fragmento del gen xmpE amplificado se trató con las enzimas de restricción XbaI y SpeI. La clonación se realizó en el sitio XbaI del vector pDZ (patente coreana n.° 10-0924065 y la publicación internacional núm. 2008-033001) para preparar un vector pDZ-xmpE. A continuación se llevó a cabo la PCR sobre el gen xmpE usando un par de cebadores con Id. de sec. nros.: 6 y 7 para preparar el vector que contiene dos copias. Cada fragmento de ADN así obtenido se escindió con la enzima de restricción de ADN SpeI, y se clonó en el vector pDZ-xmpE escindido por la enzima de restricción de ADN XbaI para preparar un vector. El vector que contiene dos copias del gen xmpE se denominó “pDZ-xmpEX2” .
Ejemplo 3-1-2: Evaluación de la capacidad para producir XMP de la cepa que tiene un mayor número de copias de xmpE
La cepa KCCM-10530 se transformó por electroporación con el vector pDZ-xmpEX2 preparado en el Ejemplo 3-1-1 (con el método de transformación descrito en Appl. Microbiol. Biotechnol. (1999) 52:541-545), y la cepa que tiene el vector insertado en el cromosoma debido a la recombinación de secuencia homóloga se seleccionó de un medio de cultivo que contenía 25 mg/l de kanamicina. La cepa en la que se inserta un gen diana se seleccionó mediante un cruce secundario de la cepa primaria seleccionada. La inserción exitosa del gen de la cepa transformada final se confirmó mediante PCR mediante el uso de un par de cebadores de la Id. de sec. nros.: 8 y 9. La cepa seleccionada con un mayor número de copias de xmpE se denominó “ KCCM-10530xmpEX2” , y se evaluó su capacidad para producir XMP.
Para medir la capacidad de producir XMP de la cepa, se usó el mismo método que en el Ejemplo 2-2. El análisis por HPLC se realizó para medir la cantidad de XMP producida después de completar el cultivo, y el resultado es como se muestra en la Tabla 2 siguiente.
[Tabla 2]
Se compararon las concentraciones de XMP en los medios de cultivo de la cepa precursora deCorynebacteríum stationis,KCCM-10530, y la cepa KCCM-10530xmpEX2 que tiene un mayor número de copias de xmpE; como resultado, como se muestra en la Tabla 2 anterior, la concentración de XMP de la cepa KCCM-10530-xmpEX2 fue de 1,3 g/l, lo que indica un aumento de la concentración de aproximadamente el 11 % en comparación con la cepa precursora en las mismas condiciones.
Esto puede entenderse como un resultado muy significativo a través del cual se confirma que dicho aumento en la cantidad de XMP producido se debe a la actividad de la proteína xmpE mejorada.
Ejemplo 3-2: Mejora de la expresión de xmpE a través de la sustitución del promotor
Ejemplo 3-2-1: Preparación del vector para reemplazar el promotor xmpE
Para confirmar si la capacidad exportadora de XMP aumenta cuando se mejora la actividad de xmpE, que se predice que está implicada en la capacidad exportadora de XMP, se preparó un vector en el que el promotor del gen xmpE se sustituye por un promotor de expresión más intensa. Un fragmento génico para la preparación del vector se obtuvo con la PCR usando ADN genómico de la cepa ATCC6872 como molde.
Se usó como promotor Pcj7, del que se ha informado que se expresa fuertemente enCorynebacterium stationissegún la patente coreana n.° 10-0620092.
Para amplificar un fragmento del gen Pcj7, se usaron un par de cebadores de la Id. de sec. nros.: 10 y 11 con el ADN genómico de la cepa ATCC6872 como molde. Cada gen xmpE se amplificó mediante PCR usando un par de cebadores de la Id. de sec. nros.: 12 y 13; y 14 y 15, respectivamente. La reacción de la PCR se realizó en las siguientes condiciones: desnaturalización a 94 °C durante 5 minutos; 25 ciclos de desnaturalización a 94 °C durante 30 segundos, hibridación a 52 0C durante 30 segundos y polimerización a 72 0C durante 1 minuto. La polimerización final se realizó después a 72°Cdurante 5 minutos. Se obtuvo una plantilla polinucleotídica de 2,3 kpb mediante una reacción en cadena de la polimerasa solapante usando los tres fragmentos de genes amplificados Pcj7, xmpE-1 y xmpE-2 como moldes. El fragmento de gen obtenido se escindió mediante la enzima de restricción XbaI y se clonó en el vector lineal pDZ escindido con XbaI usando ligasa T4 para preparar un vector “pDZ-Pcj7/xmpE” .
Ejemplo 3-2-2: Preparación de la cepa que tiene un promotor xmpE sustituido y evaluación de su capacidad para producir XMP
La cepa KCCM10530 se transformó por electroporación con el vector pDZ-Pcj7/xmpE preparado en el Ejemplo 3-2-1 (con el método de transformación descrito en Appl. Microbiol. Biotechnol. (1999) 52:541-545), y la cepa que tiene el vector insertado en el cromosoma debido a la recombinación de secuencia homóloga se seleccionó de un medio de cultivo que contenía 25 mg/l de kanamicina. La cepa en la que se mejora un gen diana se seleccionó mediante un cruce secundario de la cepa primaria seleccionada. La inserción exitosa del gen promotor de la cepa transformada final se confirmó mediante PCR mediante el uso de un par de cebadores de la Id. de sec. nros.: 16 y 17. La cepa en la que el promotor se ha sustituido por un promotor más fuerte se denominó “ KCCM-10530-Pcj7/xmpE” , y se evaluó su capacidad para producir XMP.
Para medir la capacidad de producir XMP de la cepa, se usó el mismo método que en el Ejemplo 2-2. El análisis por HPLC se realizó para medir la cantidad de XMP producida después de completar el cultivo, y el resultado es como se muestra en la Tabla 3 siguiente.
[Tabla 3]
Se compararon las concentraciones de XMP en los medios de cultivo de la cepa precursora deCorynebacterium stationis,KCCM-10530, y la cepa KCCM-10530-Pcj7/xmpE que, debido al promotor de intensidad de expresión mayor, tiene una expresión mejorada de xmpE; como resultado, como se muestra en la Tabla 3 anterior, la concentración de XMP de la cepa KCCM-10530-Pcj7/xmpE fue de 0,7 g/l, lo que indica un aumento de la concentración de aproximadamente el 6 % en comparación con la cepa precursora en las mismas condiciones.
Esto puede entenderse como un resultado muy significativo a través del cual se confirma que dicho aumento en la cantidad de XMP producido se debe a la actividad de la proteína xmpE mejorada.
Ejemplo 3-3: Sustitución del codón de iniciación de xmpE
Ejemplo 3-3-1: Preparación del vector para sustituir el codón de iniciación de xmpE
Para confirmar si la capacidad de excreción de XMP aumenta cuando se mejora la expresión de la proteína xmpE, que se predice que está implicada en la capacidad de excreción de XMP, se preparó un vector en el que el codón de iniciación gtg se sustituye por atg. Un fragmento génico para la preparación del vector se obtuvo con la PCR usando un ADN genómico de la cepa ATCC6872 como molde. Para preparar un vector que tiene el codón de iniciación gtg sustituido por atg, se obtuvieron dos fragmentos génicos A y B usando pares de cebadores de la Id. de sec. nros.: 18 y 19, y 20 y 21, respectivamente. La reacción de la PCR se realizó en las siguientes condiciones: 25 ciclos de desnaturalización a 94 °C durante 5 minutos; desnaturalización a 94 °C durante 30 segundos; hibridación a 52 °C durante 30 segundos; y polimerización a 72 0C durante 1 minuto. La polimerización final se realizó después a 72°Cdurante 5 minutos. Como resultado, se obtuvieron polinucleótidos de aproximadamente 0,7 kpb y 1 kpb para los fragmentos A y B, respectivamente. Usando los dos fragmentos como moldes, la PCR se llevó a cabo usando un par de cebadores de la Id. de sec. nros.: 18 y 21 para obtener un resultante de PCR de aproximadamente 1,7 kpb (en adelante, “fragmento de gla” ). La polimerización se realizó en las siguientes condiciones: 25 ciclos de desnaturalización a 94 0C durante 5 minutos; desnaturalización a 94 0C durante 30 segundos; hibridación a 55 0C durante 30 segundos; y polimerización a 72 0C durante 120 segundos. La polimerización final se realizó después a 72 °C durante 7 minutos.
El fragmento de gen obtenido se escindió mediante la enzima de restricción Xbal y se clonó en el vector lineal pDZ escindido con XbaI usando ligasa T4 para preparar un vector “ pDZ-xmpE (gla)” .
Ejemplo 3-3-2: Preparación de la cepa que tiene un codón de iniciación xmpE sustituido y evaluación de su capacidad para producir XMP
La cepa KCCM-10530 se transformó por electroporación con el vector pDZ-xmpE(gla) preparado en el Ejemplo 3-3-1 (con el método de transformación descrito en Appl. Microbiol. Biotechnol. (1999) 52:541-545), y la cepa que tiene el vector insertado en el cromosoma debido a la recombinación de secuencia homóloga se seleccionó de un medio de cultivo que contenía 25 mg/l de kanamicina. La cepa en la que se mejora un gen diana se seleccionó mediante un cruce secundario de la cepa primaria seleccionada. La inserción exitosa del gen promotor de la cepa transformada final se confirmó mediante PCR mediante el uso de un par de cebadores de la Id. de sec. nros.: 18 y 21, seguido de análisis de la secuencia de nucleótidos sustituida por un método de análisis de secuencias de nucleótidos. La cepa seleccionada en la que el codón de iniciación xmpE se ha sustituido por atg se denominó CJX1662, y se evaluó su capacidad para producir XMP.
Para medir la capacidad de producir XMP de la cepa, se usó el mismo método que en el Ejemplo 2-2.
El análisis por HPLC se realizó para medir la cantidad de XMP producida después de completar el cultivo, y el resultado es como se muestra en la Tabla 4 siguiente.
[Tabla 4]
Se compararon las concentraciones de XMP en los medios de cultivo de la cepa precursora deCorynebacteríum stationis,KCCM-10530, y la cepa CJX1662 que tiene el codón de iniciación de xmpE sustituido; como resultado, como se muestra en la Tabla 4 anterior, la concentración de XMP de la cepa CJX1662 fue de 2,3 g/l, lo que indica un aumento de la concentración de aproximadamente el 20 % en comparación con la cepa precursora en las mismas condiciones.
Esto puede entenderse como un resultado muy significativo a través del cual se confirma que dicho aumento en la cantidad de XMP producido se debe a la actividad de la proteína xmpE mejorada.
Además, la cepa CJX1662 preparada anteriormente se depositó en el Korean Culture Center of Microorganisms (KCCM), una autoridad depositaria internacional en virtud del Tratado de Budapest, el 11 de abril de 2018, y se le asignó el número de acceso KCCM12248P.
Ejemplo 3-4 Preparación de una capa que tiene xmpE mejorada basándose en la línea celular productora de XMP natural
Ejemplo 3-4-1: Preparación de una capa que tiene xmpE mejorada basándose en la línea celular productora de XMP natural
Se preparó una cepa que tiene capacidad para producir de XMP de forma productiva por debilitamiento de las actividades de la adenilosuccinato sintetasa y la XMP deshidrogenasa, que pertenecen a las rutas de descomposición de XMP, en una cepa ATCC6872 natural. Para atenuar las actividades de las dos enzimas, se preparó una cepa en la que la “a” , el primer nucleótido de la secuencia de nucleótidos de purA y guaA, los genes que codifican respectivamente las dos enzimas, se sustituyen por una “t” . Más específicamente, la cepa preparada por debilitamiento de la expresión de los dos genes en la cepa ATCC6872 se denominó CJX1663.
La cepa CJX1663 preparada se transformó por electroporación con el vector pDZ-xmpE(gla) preparado en el Ejemplo 3-3-2, y la cepa que tiene el vector insertado en el cromosoma debido a la recombinación de secuencia homóloga se seleccionó de un medio de cultivo que contenía 25 mg/l de kanamicina. La cepa en la que se mejora un gen diana se seleccionó mediante un cruce secundario de la cepa primaria seleccionada. La inserción exitosa del gen promotor de la cepa transformada final se confirmó mediante PCR mediante el uso de un par de cebadores de la Id. de sec. nros.: 18 y 21.
La cepa en la que el codón de iniciación xmpE seleccionado se ha sustituido por atg se denominó CJX1663_xmpE(gla), y se evaluó su capacidad para producir XMP.
El análisis por HPLC se realizó para medir la cantidad de XMP producida después de completar el cultivo, y el resultado es como se muestra en la Tabla 5 siguiente.
[Tabla 5]
Se compararon las concentraciones de XMP en los medios de cultivo de la cepa precursora deCorynebacteríum stationis,CJX1663, y la cepa CJX1663_xmpE(gla) que tiene el codón de iniciación de xmpE sustituido; como resultado, como se muestra en la Tabla 5 anterior, la concentración de XMP de la cepa CJX1663_xmpE(gla) fue de 2,8 g/l, lo que indica un aumento de la concentración de aproximadamente el 33 % en comparación con la cepa precursora en las mismas condiciones.
Se confirmó a partir del resultado que al mejorar la actividad de la proteína (xmpE) de la presente descripción, que exporta monofosfato de 5'-xantosina, se puede aumentar la productividad de XMP.
Mientras tanto, las secuencias de los cebadores utilizados en la presente descripción son como se muestran en la Tabla 6.
[Tabla 6]
Claims (6)
1. Un microorganismo del géneroCorynebacteriumque produce monofosfato de 5'-xantosina, en donde se modifica la actividad de una proteína que comprende una secuencia de aminoácidos de la Id. de sec. n.°: 2 para mejorarse en comparación con la cepa precursora, en donde la modificación comprende un aumento en el número de copias de los polinucleótidos que codifican la proteína, la sustitución de un promotor del polinucleótido por otro promotor que tiene actividad mejorada, la sustitución de un codón de iniciación o una combinación de los mismos.
2. El microorganismo del géneroCorynebacteriumde la reivindicación 1, en donde la proteína está codificada por un gen que comprende una secuencia de nucleótidos de la Id. de sec. n.°: 1.
3. El microorganismo del géneroCorynebacteriumde la reivindicación 1, en donde el otro promotor que tiene actividad mejorada es Pcj7 del genPcj7deCorynebacterium stationis.
4. El microorganismo del géneroCorynebacteriumde la reivindicación 1, en donde el microorganismo del géneroCorynebacteriumque produce monofosfato de 5'-xantosina esCorynebacterium stationis.
5. Un método para producir monofosfato de 5'-xantosina, que comprende:
cultivar el microorganismo del géneroCorynebacteriumde cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4 en un medio de cultivo; y recuperar el monofosfato de 5'-xantosina del microorganismo o el medio de cultivo.
6. El método para producir monofosfato de 5'-xantosina de la reivindicación 5, en donde el microorganismo del géneroCorynebacteriumque produce monofosfato de 5'-xantosina esCorynebacterium stationis.
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