ES2926648T3 - Promotor novedoso y método de producción de nucleótidos de purina mediante el uso del mismo - Google Patents
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Abstract
La presente descripción se refiere a un polinucleótido que tiene una nueva actividad promotora, una composición para expresar un gen que comprende el polinucleótido, un microorganismo que comprende el gen y un método para preparar nucleótidos de purina utilizando el microorganismo. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)
Description
DESCRIPCIÓN
Promotor novedoso y método de producción de nucleótidos de purina mediante el uso del mismo
Campo Técnico
La presente divulgación se refiere a un polinucleótido que tiene actividad de promotor, una composición para la expresión génica que contiene el polinucleótido, un microorganismo que contiene el gen, un método para preparar nucleótidos de purina mediante el uso del microorganismo y un uso del polinucleótido.
Antecedentes de la Técnica
El monofosfato de 5'-inosina (de aquí en adelante, IMP), un material basado en ácido nucleico, es un intermediario del sistema metabólico biosintético de ácido nucleico usado en varios campos (por ejemplo, medicinas, diversas aplicaciones médicas, etcétera). Además, IMP es un material ampliamente usado como aditivo para condimentar alimentos o alimentos junto con el monofosfato de 5'-guanina (de aquí en adelante, GMP). Se conoce que el IMP en sí mismo produce un sabor a carne de res y potencia el sabor del ácido glutámico monosódico (MSG) como GMP y, por lo tanto, se ha destacado como un condimento a base de ácido nucleico basado en el sabor.
Los métodos para preparar IMP pueden incluir un método para degradar enzimáticamente el ácido ribonucleico extraído de células de levadura, un método para fosforilar químicamente la inosina producida por fermentación (Agri. Biol. Chem., 36, 1511 (1972), etcétera), un método de cultivo de un microorganismo que produce directamente IMP y recuperación de IMP a partir del medio de cultivo, etcétera. Entre estos métodos, el método más usado es el que usar un microorganismo capaz de producir directamente IMP.
Además, el método de preparación de GMP puede incluir un método para convertir el 5'-monofosfato de xantosina (de aquí en adelante, XMP) producido por fermentación microbiana en GMP mediante el uso de un microorganismo corineforme y un método para convertir XMP producido por fermentación microbiana en GMP mediante el uso de Escherichia coli. Entre los métodos anteriores, cuando se produce GMP mediante un método en el que primero se produce XMP y después se convierte en GMP, debe potenciarse la productividad de XMP (es decir, un precursor de la reacción de conversión durante la fermentación microbiana) y, además, el GMP ya producido durante todo el proceso de la reacción de conversión, así como también el XMP producido debe protegerse para que no se pierda.
Mientras tanto, dado que las enzimas en la naturaleza no siempre exhiben propiedades óptimas en términos de actividad, estabilidad, especificidad de sustrato para los isómeros ópticos, etcétera, requeridas en aplicaciones industriales, se han realizado varios intentos para mejorar las enzimas para mejorar el uso deseado mediante la modificación de sus secuencias de aminoácidos. Entre estos, el diseño racional y la mutagénesis dirigida al sitio de enzimas se han aplicado para mejorar las funciones enzimáticas en algunos casos; sin embargo, estos métodos tienen la desventaja de que la información sobre la estructura de la enzima diana no es suficiente o la correlación entre estructura y función no está clara y, por lo tanto, no pueden aplicarse de manera efectiva. En este caso, se informó que la actividad de una enzima puede potenciarse tras mejorar la enzima a través de un método de evolución dirigida, en el que las enzimas de los rasgos deseados se seleccionan a partir de una genoteca de variantes de enzimas construidas mediante la modificación aleatoria de genes de enzimas.
Divulgación
Problema Técnico
Los inventores de la presente divulgación han realizado una extensa investigación para la producción de alto rendimiento de nucleótidos de purina a través de la fermentación microbiana. Como resultado, han descubierto promotores que son más efectivos para una mayor productividad de nucleótidos de purina, por consiguiente se completa la presente divulgación.
Solución Técnica
Un objeto de la presente divulgación es proporcionar un polinucleótido que tenga actividad de promotor.
Otro objeto de la presente divulgación es proporcionar una composición para la expresión génica que contenga el polinucleótido.
Aún otro objeto de la presente divulgación es proporcionar un vector que contenga el polinucleótido y un gen que codifique una proteína diana.
Aún otro objeto de la presente divulgación es proporcionar un microorganismo del género Corynebacterium que contenga el vector.
Aún otro objeto de la presente divulgación es proporcionar un microorganismo del género Corynebacterium que contenga el polinucleótido y un gen que codifique una proteína diana.
Aún otro objeto de la presente divulgación es proporcionar un método para preparar nucleótidos de purina, que incluye cultivar el microorganismo del género Corynebacterium en un medio.
Aún otro objeto de la presente divulgación es proporcionar un uso del polinucleótido para aumentar la expresión de una proteína diana.
Efectos ventajosos
Cuando se cultiva un microorganismo del género Corynebacterium mediante el uso de un polinucleótido que tiene una actividad promotora novedosa de la presente divulgación, es posible producir nucleótidos de purina con un alto rendimiento. Además, los nucleótidos de purina preparados pueden aplicarse no solo a piensos para animales o aditivos para piensos para animales sino también a diversos productos tales como alimentos para seres humanos, aditivos para alimentos, medicinas, etcétera.
Mejor Modo
La presente divulgación se describe en detalle cómo sigue. Mientras tanto, las respectivas descripciones y modalidades descritas en la presente divulgación también pueden aplicarse a otras descripciones y modalidades. Es decir, todas las combinaciones de varios elementos descritos en la presente divulgación pertenecen al alcance de la presente divulgación. Además, el alcance de la presente divulgación no está limitado por la divulgación específica a continuación.
Para lograr los objetivos anteriores, un aspecto de la presente divulgación proporciona un polinucleótido de la SEQ ID NO: 1 que tiene una actividad promotora, en el que la secuencia de polinucleótidos incluye al menos una sustitución de nucleótidos en la misma. Específicamente, la presente divulgación proporciona un polinucleótido de la SEQ ID NO: 1 que tiene una actividad promotora en la que la secuencia de polinucleótidos incluye al menos una sustitución de nucleótidos en ella, y la sustitución de polinucleótidos es al menos uno seleccionado del grupo que consiste en una sustitución del nucleótido 143 y una sustitución del nucleótido 189.
Otro aspecto de la presente divulgación proporciona un polinucleótido que tiene actividad de promotor, en el que, en la secuencia de polinucleótidos de la SEQ ID NO: 1, i) el nucleótido 143 se sustituye por timina (T); ii) el nucleótido 189 se sustituye por timina (T); o iii) el nucleótido 143 se sustituye por timina (T) y el nucleótido 189 se sustituye por timina (T).
Como se usa en la presente divulgación, el término "polinucleótido" se refiere a una hebra de ADN que tiene más de una cierta longitud como un polímero de nucleótidos, que es una cadena larga de monómeros de nucleótidos conectados por enlaces covalentes.
Como se usa en la presente divulgación, el término "polinucleótido que tiene una actividad promotora" se refiere a una región del ADN presente en la vecindad de una región, que está implicada en la transcripción de un gen diana que incluye una ARN polimerasa, un potenciador, etcétera, para la expresión del gen diana que se conectará aguas abajo de este. Para los fines de la presente divulgación, el polinucleótido puede usarse como un promotor atenuado para uso general, por ejemplo, como un promotor que puede atenuar la expresión de la adenilosuccinato sintetasa. Además, el polinucleótido se refiere a un polinucleótido implicado en la producción o aumento de nucleótidos de purina, pero el polinucleótido no se limita a ello.
Como se usa en la presente divulgación, la SEQ ID NO: 1 se refiere a una secuencia de polinucleótidos que tiene una actividad promotora. La secuencia de polinucleótidos de la SEQ ID NO: 1 puede obtenerse de NCBI GenBank, que es una base de datos conocida. En una modalidad, la secuencia de polinucleótidos de la SEQ ID NO: 1 puede derivarse de un microorganismo del género Corynebacterium, pero el microorganismo no se limita a ello.
Además, el polinucleótido puede ser uno en el que, en la secuencia de la SEQ ID NO: 1, el nucleótido 143 y/o el nucleótido 189 se sustituyen por un nucleótido diferente. Tal polinucleótido puede referirse a la secuencia de nucleótidos de la SEQ ID NO: 1 y/o una secuencia de nucleótidos que tiene al menos 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o 99 % o más homología o identidad con la secuencia de nucleótidos de la SEQ ID NO: 1, en la que el nucleótido 143 y/o el nucleótido 189 se sustituyen por un nucleótido diferente. La secuencia de nucleótidos que tiene homología o identidad puede ser la del intervalo anterior, se excluye una secuencia que tenga una identidad del 100 %, o puede ser una secuencia que tenga una identidad inferior al 100 %.
En una modalidad, la secuencia de polinucleótidos de la presente divulgación puede ser una en la que, en la secuencia de polinucleótidos de la SEQ ID NO: 1, i) el nucleótido 143 se sustituye por timina (T); ii) el nucleótido 189 se sustituye por timina (T); o iii) el nucleótido 143 se sustituye por timina (T) y el nucleótido 189 se sustituye por timina (T), pero la secuencia de polinucleótidos no se limita a ello. Específicamente, la secuencia de polinucleótidos de la presente
divulgación puede incluir la secuencia de nucleótidos de la SEQ ID NO: 2, la SEQ ID NO: 3 o la SEQ ID NO: 4, pero la secuencia de polinucleótidos no se limita a ello. Más específicamente, en la secuencia de polinucleótidos de la presente divulgación, el polinucleótido en el que el nucleótido 143 se sustituye por timina (T) puede consistir en la secuencia de nucleótidos de la SEQ ID NO: 2; el polinucleótido en el que el nucleótido 189 se sustituye por timina (T) puede consistir en la secuencia de nucleótidos de la SEQ ID NO: 3; o el polinucleótido en el que el nucleótido 143 se sustituye por timina (T) y el nucleótido 189 se sustituye por timina (T) puede consistir en la secuencia de nucleótidos de la SEQ ID NO: 4, pero la secuencia de polinucleótidos de la presente divulgación no se limita a ello. El polinucleótido puede ser uno que tenga al menos 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o 99 % o más de homología o identidad con la secuencia de nucleótidos de la SEQ ID NO: 2, la SEQ ID NO: 3 o la SEQ ID NO: 4. La secuencia de polinucleótidos que tiene homología o identidad puede ser la del intervalo anterior, se excluye una secuencia que tenga una identidad del 100 %, o puede ser una secuencia que tenga una identidad inferior al 100 %.
Además, es evidente que cualquier polinucleótido que tenga una secuencia de polinucleótidos con deleción, modificación, sustitución o adición en parte de la secuencia también puede usarse en la presente divulgación, siempre que el polinucleótido tenga una actividad equivalente o correspondiente a un polinucleótido que consiste en una secuencia de nucleótidos de la SEQ ID NO correspondiente, incluso si se describe como "polinucleótido que tiene una secuencia de nucleótidos de una SEQ ID NO particular" en la presente divulgación. Por ejemplo, siempre que la variante de polinucleótido tenga una actividad idéntica o correspondiente a la del polipéptido, no excluye la adición de una secuencia sin sentido aguas arriba o aguas abajo de la SEQ ID NO correspondiente, mutación natural o mutación silenciosa, además a la modificación particular en la posición 143 o 189 que proporciona una actividad particular a partir de esta, y dicha adición o mutación de secuencia también cae dentro del alcance de la presente divulgación.
La homología y la identidad se refieren a un grado de relación entre dos secuencias de nucleótidos dadas y pueden expresarse como porcentaje.
Los términos "homología" e "identidad" se usan a menudo indistintamente entre sí.
La homología o la identidad de secuencia de un polinucleótido conservado pueden determinarse mediante un algoritmo de alineamiento estándar y pueden usarse en combinación las penalizaciones por espacios predeterminadas, establecidas por un programa que se va a usar. Sustancialmente, las secuencias homólogas o idénticas pueden hibridarse en condiciones moderadamente o muy rigurosas a lo largo de toda su secuencia o al menos aproximadamente 50 %, aproximadamente 60 %, aproximadamente 70 %, aproximadamente 80 % o aproximadamente 90 % de la longitud total. Con respecto a los polinucleótidos a hibridar, pueden considerarse además polinucleótidos que incluyen un codón degenerado en lugar de un codón.
Puede determinarse si dos secuencias de polinucleótidos tienen homología, similitud o identidad mediante, por ejemplo, un algoritmo informático conocido tal como el programa "FASTA" mediante el uso de parámetros predeterminados como en Pearson y otros (1988) (Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85]: 2444). Alternativamente, puede determinarse mediante el uso del algoritmo Needleman-Wunsch (Needleman y Wunsch, 1970, J. Mol. Biol. 48: 443 453), como se realiza en el programa Needleman del paquete EMBOSS (EMBOSS: The European Molecular Biology Open Software Suite, Rice y otros, 2000, Trends Genet. 16: 276 a 277) (versión 5.0.0 o posteriores) (que incluye el paquete de programa GCG (Devereux, J., y otros, Nucleic Acids Research 12: 387 (1984)), BLASTP, BLASTN, FASTA (Atschul, [S.] [F.] y otros, JMolec Biol 215]: 403 (1990); Guide to Huge Computers, Martin J. Bishop, [ED.,] Academic Press, San Diego, 1994, y [Carillo y otros](1988) SIAM J Applied Math 48: 1073). Por ejemplo, la homología, similitud, o identidad puede determinarse mediante el uso de BLAST o ClustalW del Centro Nacional para la Información Biotecnológica (NCBI).
La homología, la similitud o la identidad de polinucleótidos pueden determinarse mediante comparación de la información de la secuencia mediante el uso del programa informático GAP (por ejemplo, Needleman y otros (1970), J Mol Biol 48: 443) como se describe en Smith y Waterman, Adv. Appl. Math (1981) 2:482. Brevemente, el programa GAP define la similitud como el número de símbolos alineados (es decir, nucleótidos o aminoácidos) que son similares, dividido por el número total de símbolos en la secuencia más corta de las dos. Los parámetros predeterminados para el programa GAP pueden incluir: (1) una matriz de comparación unitaria (que contiene un valor de 1 para identidades y 0 para no identidades) y la matriz de comparación ponderada (o EDNAFULL (versión EMBOSS de NCBI NUC4.4) Gribskov y otros (1986), Nucl. Acids Res. 14: 6745, como se describió en Schwartz y Dayhoff, eds., Atlas of Protein Sequence and Structure, Fundación Nacional de Investigación Biomédica, págs. 353 a 358, 1979; (2) una penalización de 3,0 por cada espacio y una penalización adicional de 0,10 por cada símbolo en cada espacio (o una penalización de apertura de espacio de 10, penalización de extensión de espacio de 0,5); y (3) sin penalización por espacios en los extremos. Por lo tanto, el término "homología" o "identidad", como se usa en la presente divulgación, representa relevancia entre secuencias.
Además, debido a la degeneración de los codones o tras considerar los codones preferidos en un bioorganismo en el que va a expresarse el polinucleótido, pueden realizarse varias modificaciones en la región codificante del polinucleótido dentro del alcance que no altera la secuencia del polinucleótido. Cualquier secuencia de polinucleótidos en la que el nucleótido 143 y/o el nucleótido 189 de la secuencia de nucleótidos de la SEQ ID NO: 1 se sustituye por un nucleótido diferente puede incluirse sin limitación. Además, pueden incluirse sin limitación cualquier secuencia de
polinucleótidos, en la que el nucleótido 143 y/o el nucleótido 189 de la secuencia de nucleótidos de la SEQ ID NO: 1 se sustituye por un nucleótido diferente, que puede hibridarse en condiciones rigurosas con cualquier sonda que pueda prepararse a partir de secuencias de genes conocidas (por ejemplo, secuencias complementarias a la totalidad o parte de la secuencia de nucleótidos anterior).
El término "condiciones rigurosas" se refiere a condiciones que permiten la hibridación específica entre polinucleótidos. Tales condiciones se describen específicamente en referencias (por ejemplo, J Sambrook y otros). Por ejemplo, las condiciones pueden incluir realizar la hibridación entre genes que tienen una alta homología, una homología del 40 % o más, específicamente del 80 % o más, del 85 % o más, y del 90 % o más, más específicamente del 95 % o más, incluso más específicamente del 97 % o más, y más específicamente del 99 % o más, a la vez que no se realiza la hibridación entre genes que tienen una homología menor a las homologías descritas antes; o se realiza la hibridación una vez, específicamente dos o tres veces, en condiciones de lavado convencionales para la hibridación Southern de 60 °C, SSC 1* y SDS 0,1 %, específicamente a una concentración de sales y temperatura correspondientes a 60 °C, SSC 0,1* y SDS 0,1 %, y más específicamente 68 °C, SSC 0,1* y SDS 0,1 %.
La hibridación requiere que dos ácidos nucleicos tengan secuencias complementarias, aunque pueden ocurrir apareamientos erróneos entre bases, en dependencia de la rigurosidad de la hibridación. El término "complementario" se usa para describir la relación entre las bases de nucleótidos que pueden hibridar entre sí. Por ejemplo, con respecto al ADN, la adenosina es complementaria a la timina y la citosina es complementaria a la guanina. Por consiguiente, la presente divulgación también puede incluir fragmentos de ácido nucleico aislados complementarios a la secuencia completa, así como también secuencias de ácido nucleico sustancialmente similares.
Específicamente, los polinucleótidos que tienen una homología pueden ser detectados a un valor Tm de 55 °C mediante el uso de condiciones de hibridación que incluyen una etapa de hibridación y mediante el uso de las condiciones descritas anteriormente. Además, el valor Tm puede ser de 60 °C, 63 °C, o 65 °C, pero la temperatura no se limita a ello y puede ajustarse apropiadamente por los expertos en la técnica de acuerdo con el propósito que se pretende.
El rigor adecuado para la hibridación de polinucleótidos depende de la longitud y el grado de complementariedad de los polinucleótidos, y las variables relacionadas se conocen bien en la técnica (ver Sambrook y otros, supra, 9.50 a 9.51 y 11.7 a 11.8).
Aún otro aspecto de la presente divulgación proporciona una composición para la expresión génica que contiene el polinucleótido.
La composición para la expresión génica se refiere a una composición capaz de expresar un gen que puede expresarse por el promotor de la presente divulgación. Por ejemplo, la composición para la expresión génica puede incluir un polinucleótido que tenga una actividad promotora novedosa y puede incluir además cualquier constitución capaz de operar el polinucleótido como promotor sin limitación. En la composición para la expresión génica de la presente divulgación, el polinucleótido puede estar en una forma incluida en un vector para expresar un gen ligado operativamente en una célula hospedera en la que se introduce el polinucleótido.
Aún otro aspecto de la presente divulgación proporciona un polinucleótido que tiene la actividad promotora, o un vector que incluye el polinucleótido y un gen que codifica una proteína diana. Específicamente, la proteína diana puede ser la adenilosuccinato sintetasa, pero no se limita a ella.
Como se usa en la presente divulgación, el término "vector" se refiere a una construcción de ADN que contiene la secuencia de nucleótidos que codifica un polinucleótido diana, que está unido operativamente a una secuencia de control apropiada de modo que el polipéptido diana se exprese en un hospedero apropiado. La secuencia de control puede incluir un promotor para iniciar la transcripción, cualquier secuencia operadora para controlar dicha transcripción, una secuencia que codifica un sitio de unión al ribosoma apropiado en el ARNm y una secuencia para controlar la terminación de la transcripción y la traducción. Tras la transformación en una célula hospedera adecuada, el vector puede replicarse o funcionar independientemente del genoma del hospedero o puede integrarse en el propio genoma.
El vector usado en la presente divulgación puede no estar particularmente limitado siempre que el vector sea replicable en una célula hospedera y puede usarse cualquier vector conocido en la técnica. Los ejemplos de los vectores usados comúnmente pueden incluir plásmidos, cósmidos, virus y bacteriófagos naturales o recombinantes. Por ejemplo, como vector de fago o vector de cósmido, pueden usarse pWE15, M13, MBL3, MBL4, IXII, ASHII, APII, t10, t11, Charon4A, Charon21A, etcétera y como vector de plásmido, pueden usarse los basados en pBR, pUC, pBluescriptlI, pGEM, pTZ, pCL, pET, etcétera. Específicamente, pueden usarse los vectores pDZ, pACYC177, pAcYc184, pCL, pECCG117, pUC19, pBR322, pMW118, pCC1BAC, etcétera.
En una modalidad, el polinucleótido diana puede insertarse en el cromosoma a través de un vector para la inserción cromosómica. La inserción del polinucleótido en el cromosoma puede realizarse mediante el uso de cualquier método conocido en la técnica, (por ejemplo, mediante recombinación homóloga), pero el método no se limita a ello. Puede incluirse además un marcador de selección para confirmar la inserción del vector en el cromosoma. El marcador de
selección se usó para la selección de células transformadas con el vector (es decir, para confirmar la presencia de la inserción de la molécula de ácido nucleico diana), y pueden usarse marcadores capaces de proporcionar fenotipos seleccionables (por ejemplo, resistencia a fármacos, auxotrofia, resistencia a agentes citotóxicos y expresión de polipéptidos de superficie). En las circunstancias donde se tratan agentes selectivos, solo aquellas células capaces de expresar los marcadores de selección pueden sobrevivir o expresar otros rasgos fenotípicos y por tanto, pueden seleccionarse las células transformadas.
Aún otro aspecto de la presente divulgación proporciona un microorganismo del género Corynebacterium que incluye un vector, en el que el vector incluye un polinucleótido que tiene una actividad promotora de la presente divulgación y un gen que codifica una proteína diana.
Además, aún otro aspecto de la presente divulgación proporciona un microorganismo del género Corynebacterium, que incluye un polinucleótido que tiene una actividad promotora de la presente divulgación y un gen que codifica una proteína diana.
Específicamente, el microorganismo puede ser un microorganismo que se prepara mediante la transformación a través del vector que incluye el polinucleótido que tiene una actividad promotora y el gen que codifica una proteína diana; o un microorganismo que incluye el polinucleótido que tiene una actividad promotora y el gen que codifica una proteína diana, pero el microorganismo no se limita a ellos.
Como se usa en la presente divulgación, el término "transformación" se refiere a un proceso de introducir un vector que incluye un polinucleótido que codifica una proteína diana en una célula hospedera de manera que la proteína codificada por el polinucleótido puede expresarse en la célula hospedera. No importa si el polinucleótido transformado se inserta en el cromosoma de la célula hospedera y se ubica en el mismo o se ubica fuera del cromosoma, siempre que el polinucleótido transformado pueda expresarse en la célula hospedera. Además, el polinucleótido incluye ADN o ARN que codifican la proteína diana. El polinucleótido puede introducirse en cualquier forma, siempre que el polinucleótido pueda introducirse en la célula hospedera y expresarse en esta. Por ejemplo, el polinucleótido puede introducirse en una célula hospedera en forma de un casete de expresión, que es una construcción génica que incluye todos los elementos que se requieren para su expresión autónoma. El casete de expresión puede incluir un promotor, una señal de terminación de la transcripción, un sitio de unión al ribosoma y una señal de terminación de la traducción que puede unirse operativamente al polinucleótido. El casete de expresión puede estar en forma de un vector de expresión autorreplicable. Además, el polinucleótido puede introducirse en la célula hospedera tal como debe unirse operativamente a la secuencia requerida para la expresión en la célula hospedera, pero el polinucleótido no se limita a ello.
Además, el término "unido operativamente" se refiere a un enlace funcional entre la secuencia génica y una secuencia promotora que inicia y media la transcripción del polinucleótido que tiene una actividad promotora de la presente divulgación.
Como se usa en la presente divulgación, el término "microorganismo que incluye un polinucleótido y una proteína diana" se refiere a un microorganismo en el que la expresión de una proteína diana se controla por el polinucleótido. El microorganismo puede ser un microorganismo capaz de producir nucleótidos de purina, un microorganismo que naturalmente tiene una capacidad débil para producir nucleótidos de purina o un microorganismo dotado de la capacidad de producir nucleótidos de purina en el que su cepa original no tiene capacidad para producir nucleótidos de purina. Específicamente, el microorganismo puede ser un microorganismo en el que la actividad de la adenilosuccinato sintetasa, por ejemplo, un microorganismo que incluye un polinucleótido en el que, en la secuencia de nucleótidos de la SEQ ID NO: 1, el nucleótido 143 y/o el nucleótido 189 se sustituye por un nucleótido diferente, pero el microorganismo no se limita a ello. Más específicamente, el microorganismo puede ser un microorganismo que incluye un polinucleótido que tiene una actividad promotora, en el que se sustituye al menos un nucleótido en la secuencia de polinucleótidos de la SEQ ID NO: 1. La sustitución del polinucleótido puede incluir una sustitución del nucleótido 143 con timina (T) y/o una sustitución del nucleótido 143 con timina (T).
Para la célula hospedera o el microorganismo, para los fines de la presente divulgación, cualquier célula hospedera o microorganismo que sea capaz de producir nucleótidos de purina tras incluir el polinucleótido y una proteína diana puede pertenecer al alcance de la presente divulgación.
En la presente divulgación, el microorganismo capaz de producir nucleótidos de purina puede usarse indistintamente con un microorganismo que produce nucleótidos de purina y un microorganismo que tiene la capacidad de producir nucleótidos de purina.
Para los fines de la presente divulgación, el término "nucleótido de purina" se refiere a un nucleótido que tiene una estructura basada en purina, por ejemplo, IMP, XMP o GMP, pero el nucleótido de purina no se limita a ello.
Específicamente, el término "monofosfato de 5'-inosina (IMP)" es un material de ácido nucleico que consiste en la fórmula 1 a continuación.
Fórmula 1
IMP también se conoce por sus nombres IUPAC, monofosfato de 5'-inosina o ácido de 5'-inosina, e IMP se usa ampliamente en alimentos como potenciador del sabor junto con XMP o GMP.
El término "monofosfato de 5'-guanina (GMP)" se refiere a un material de ácido nucleico que consiste en la fórmula 2 a continuación.
Fórmula 2
GMP también se conoce por sus nombres IUPAC, [(2R,3S,4R,5R)-5-(2-amino-6-oxo-1,6-dihidro-9H-purin-9-il)-3,4 -dihidroxitetrahidro-2-furanil]metil dihidrógeno fosfato, ácido 5'-guanidílico, 5'-guanílico o ácido guanílico.
GMP está en forma de sal y se usa ampliamente como aditivo para alimentos, tales como guanilato de sodio, guanilato de dipotasio y guanilato de calcio. GMP tiene un efecto sinérgico para potenciar los sabores cuando se usa como aditivo junto con IMP. GMP puede prepararse por conversión a partir de XMP, pero el método de preparación de GMP no se limita a ello. Como se confirma en una modalidad de la presente divulgación, el promotor de la presente divulgación puede aumentar la producción de XMP, y GMP también puede convertirse a partir de XMP, por consiguiente aumenta la cantidad de producción de GMP. Por lo tanto, es evidente que GMP también pertenece al alcance de la presente divulgación.
Como se usa en la presente divulgación, el término "monofosfato de 5'-xantosina (XMP)" es un material intermedio del metabolismo de las purinas, que consiste en la fórmula 3 a continuación.
XMP también se conoce por sus nombres IUPAC, monofosfato de 5'-inosina o ácido 5'-xantílico. XMP puede formarse a partir de IMP mediante la acción de la deshidrogenasa, o puede convertirse en GMP mediante la acción de la GMP sintasa. Además, XMP puede formarse a partir de XTP mediante la desoxirribonucleósido trifosfato pirofosfohidrolasa, que es una enzima que incluye la actividad XTPasa.
Formula 3
Como se usa en la presente divulgación, el término "microorganismo que produce nucleótidos de purina" incluye tanto un microorganismo de tipo salvaje como microorganismos en los que se produjo una modificación genética natural o
artificial, y el microorganismo puede ser un microorganismo en el que se potencia o debilita un mecanismo particular debido a motivos tales como la inserción de un gen exógeno, potenciación o inactivación de la actividad de un gen endógeno, etcétera. El microorganismo puede ser un microorganismo en el que se produjo una modificación genética o se potencia una actividad de este para la producción prevista de nucleótidos de purina. Para los fines de la presente divulgación, el microorganismo que produce nucleótidos de purina se caracteriza porque tiene una mayor productividad de los nucleótidos de purina deseados al contener el polinucleótido y, específicamente, el microorganismo puede ser un microorganismo del género Corynebacterium. Específicamente, el microorganismo que produce nucleótidos de purina o el microorganismo capaz de producir nucleótidos de purina puede ser un microorganismo en el que algunos de los genes implicados en la vía de biosíntesis de nucleótidos de purina están potenciados o debilitados, o algunos de los genes implicados en la vía de degradación de nucleótidos de purina están potenciados o debilitados, o parte del(los) gen(es) implicados en la vía de degradación de nucleótidos de purina están potenciados o debilitados. Por ejemplo, el microorganismo puede ser un microorganismo en el que se potencia la expresión de purF que codifica la fosforribosilpirofosfato amidotransferasa o la expresión de purA. Además, de acuerdo con el nucleótido de purina, puede controlarse la expresión de guaB, que es un gen que codifica la inosina-5'-monofosfato deshidrogenasa. Específicamente, cuando el nucleótido de purina es IMP, puede debilitarse la expresión de guaB, mientras que cuando el nucleótido de purina es XMP o GMP, puede potenciarse la expresión de guaB.
Como se usa en la presente divulgación, el término "microorganismo del género Corynebacterium que produce nucleótidos de purina 5'" se refiere a un microorganismo del género Corynebacterium que tiene la capacidad de producir nucleótidos de purina de forma natural o mediante modificación. Específicamente, como se usa en la presente divulgación, el microorganismo del género Corynebacterium que tiene la capacidad de producir nucleótidos de purina puede ser un microorganismo del género Corynebacterium que tiene una capacidad mejorada para producir nucleótidos de purina debido a la inclusión del polinucleótido que tiene una actividad promotora de la presente divulgación, o debido a la transformación por un vector que incluye el polinucleótido y un gen que codifica una proteína diana.
El "microorganismo del género Corynebacterium que tiene una capacidad mejorada para producir nucleótidos de purina" se refiere a un microorganismo que tiene una capacidad mejorada para producir nucleótidos de purina, en comparación con su cepa original antes de la transformación o un microorganismo no modificado. El "microorganismo no modificado" se refiere a una cepa de tipo salvaje propiamente dicha, un microorganismo que no incluye la proteína modificada que produce nucleótidos de purina, o un microorganismo que no se transforma con el vector que incluye el polinucleótido y un gen que codifica una proteína diana.
Como se usa en la presente divulgación, el "microorganismo del género Corynebacterium" puede ser específicamente Corynebacterium glutamicum, Corynebacterium ammoniagenes, Brevibacterium lactofermentum, Brevibacterium flavum, Corynebacterium thermoaminogenes, Corynebacterium efficiens, Corynebacterium stationis, etcétera, pero el microorganismo del género Corynebacterium no se limita necesariamente a ellos.
Aún otro aspecto de la presente divulgación proporciona un método para preparar un material diana que incluye cultivar el microorganismo del género Corynebacterium en un medio. En una modalidad, el método de la presente divulgación puede incluir además una etapa de recuperación del material diana a partir del microorganismo o medio de cultivo después de la etapa de cultivo. Específicamente, el material diana puede ser nucleótidos de purina, pero no se limita a ellos.
En el método anterior, el cultivo del microorganismo puede realizarse mediante un cultivo discontinuo conocido, un cultivo continuo, un cultivo discontinuo alimentado, etcétera, pero el método de cultivo no se limita particularmente a ellos. En particular, las condiciones de cultivo pueden no estar particularmente limitadas, pero puede ajustarse un pH apropiado (por ejemplo, pH 5 a pH 9, específicamente pH 6 a pH 8, y más específicamente pH 6,8) mediante el uso de un compuesto básico (por ejemplo, hidróxido de sodio, hidróxido de potasio o amoníaco) o un compuesto ácido (por ejemplo, ácido fosfórico o ácido sulfúrico), y puede mantenerse una condición aeróbica tras añadir oxígeno o una mezcla de gases que contenga oxígeno al cultivo. La temperatura de cultivo puede mantenerse de 20 °C a 45 °C, y específicamente de 25 °C a 40 °C, y el cultivo puede realizarse por de aproximadamente 10 horas a aproximadamente 160 horas, pero las condiciones no se limitan a ello. Los nucleótidos de purina producidos por el cultivo pueden secretarse en el medio o pueden permanecer dentro de las células.
Además, en el medio de cultivo a usar, como fuente de carbono, pueden usarse solos o en combinación, los azúcares y carbohidratos (por ejemplo, glucosa, sacarosa, lactosa, fructosa, maltosa, melaza, almidón y celulosa); aceites y grasas (por ejemplo, aceite de soja, aceite de girasol, aceite de cacahuete y aceite de coco); ácidos grasos (por ejemplo, ácido palmítico, ácido esteárico y ácido linoleico); alcoholes (por ejemplo, glicerol y etanol); ácidos orgánicos (por ejemplo, ácido acético), etcétera, pero la fuente de carbono no se limita a ellos. Como fuente de nitrógeno, pueden usarse solos o en combinación, los compuestos orgánicos que contienen nitrógeno (por ejemplo, peptona, extracto de levadura, jugo de carne, extracto de malta, licor de maceración de maíz, harina de soja y urea) o un compuesto inorgánico (por ejemplo, sulfato de amonio, cloruro de amonio, fosfato de amonio, carbonato de amonio y nitrato de amonio), etcétera, pero la fuente de nitrógeno no se limita a ellos. Como fuente de fósforo, pueden usarse solos o en combinación, fosfato dihidrógeno de potasio, fosfato ácido de dipotasio, una sal que contiene sodio correspondiente a ellos, etcétera, pero la fuente de fósforo no se limita a ellos. Además, el medio puede incluir además materiales
esenciales que promueven el crecimiento tales como otras sales metálicas (por ejemplo, sulfato de magnesio o sulfato de hierro), aminoácidos y vitaminas.
Un método para recuperar los nucleótidos de purina producidos en la etapa de cultivo de la presente divulgación es recoger los nucleótidos de purina diana a partir del cultivo mediante el uso de un método apropiado conocido en la técnica de acuerdo con el método de cultivo. Por ejemplo, pueden usarse centrifugación, filtración, cromatografía de intercambio aniónico, cristalización, HPLC, etcétera, y los nucleótidos de purina diana pueden recuperarse del medio o microorganismo mediante el uso de un método apropiado conocido en la técnica.
Además, la etapa de recuperación puede incluir un proceso de purificación. El proceso de purificación puede realizarse mediante el uso de un método apropiado conocido en la técnica. Por lo tanto, los nucleótidos de purina recuperados pueden estar en forma purificada o en un líquido de fermentación microbiana que incluye nucleótidos de purina (Introduction to Biotechnology and Genetic Engineering, A. J. Nair, 2008).
Además, para los fines de la presente divulgación, en el caso de que un microorganismo incluya un polinucleótido que tenga la actividad promotora descrita anteriormente, el microorganismo se caracteriza porque aumenta la cantidad de un material diana. En particular, mientras que una cepa de tipo salvaje del género Corynebacterium no puede producir nucleótidos de purina en absoluto, o produce solo una pequeña cantidad incluso si es posible, el microorganismo de la presente divulgación, tras incluir un polinucleótido que tiene la actividad promotora, puede aumentar la cantidad de producción de nucleótidos de purina.
Aún otro aspecto de la presente divulgación proporciona un uso del polinucleótido para aumentar la expresión de una proteína diana.
Descripción detallada de la invención
De aquí en adelante, la presente divulgación se describirá en detalle a través de modalidades ilustrativas. Sin embargo, será aparente para los expertos en la técnica a los que pertenece la presente divulgación que estas modalidades ilustrativas se proporcionan solo con fines ilustrativos y no pretenden limitar el alcance de la presente divulgación.
Ejemplo 1: Preparación de una cepa productora de IMP de tipo salvaje
Una cepa de tipo salvaje del género Corynebacterium no puede producir IMP en absoluto o producir solo una pequeña cantidad, incluso si es posible. Por lo tanto, se preparó una cepa productora de IMP basada en la cepa de tipo salvaje de Corynebacterium stationis ATCC6872. Más específicamente, se preparó una cepa en la que se potencia la actividad del gen purF, que codifica la fosforribosilpirofosfato amidotransferasa, y se debilita la actividad de guaB, que codifica IMP.
Ejemplo 1-1: Preparación de cepa potenciada con purF
Para preparar una cepa en la que se modifica el codón de inicio del gen purF, primero se preparó un vector de inserción que contenía el gen purF. Para clonar el gen purF en un vector de inserción, específicamente, se realizó PCR mediante el uso del ADN genómico de Corynebacterium stationis ATCC6872 como molde y los conjuntos de cebadores de las SEQ ID NOS: 6 y 7 y las SEQ ID NOS: 8 y 9 durante 30 ciclos de desnaturalización a 94 °C por 30 segundos, hibridación a 55 °C por 30 segundos, y extensión a 72 °C por 2 min. La PCR se realizó nuevamente mediante el uso de dos fragmentos de ADN obtenidos mediante la PCR anterior como molde y el conjunto de cebadores de las SEQ ID NOS: 6 y 9 por 30 ciclos de desnaturalización a 94 °C durante 30 segundos, hibridación a 55 °C durante 30 segundos y extensión a 72 °C por 2 min para obtener fragmentos de ADN. Los fragmentos de ADN obtenidos se digirieron con la enzima de restricción XbaI y se clonaron en el vector pDZ (Patente coreana núm. 10-0924065 y Publicación de Patente Internacional núm. WO 2008-033001) digerido con la misma enzima. El vector preparado de esta manera se denominó pDZ-purF-gla.
Tabla 1
El vector recombinante pDZ-purF-g1a se transformó en Corynebacterium stationis ATCC6872 mediante electroporación y las cepas en las que el vector se insertó en el cromosoma mediante recombinación homóloga se seleccionaron en un medio que contenía 25 mg/l de kanamicina. Las cepas primarias seleccionadas se sometieron a reticulación secundaria y estas cepas seleccionadas se sometieron a secuenciación, y por consiguiente se seleccionó la cepa final en la que se introdujo la modificación. La cepa se denominó cepa 6872-purF(gla).
Ejemplo 1-2: Preparación de cepa debilitada con guaB
Para preparar una cepa en la que se modifica el codón de inicio del gen guaB, se preparó un vector de inserción que contenía el gen guaB. Para clonar el gen guaB en el vector de inserción, específicamente, se realizó una PCR mediante el uso del ADN genómico de Corynebacterium stationis ATCC6872 como molde y los conjuntos de cebadores de las SEQ ID NOS: 11 y 12 y las SEQ ID NOS: 13 y 14. La PCR se realizó de nuevo mediante el uso de los productos de la PCR obtenidos por la PCR anterior como molde y el conjunto de cebadores de las SEQ ID NOS: 11 y 14 y los fragmentos de ADN obtenidos se clonaron como en el Ejemplo 1-1. El vector preparado de esta manera se denominó pDZ-guaB-alt. El vector se introdujo en el 6872-purF(gla) de la misma manera y finalmente se seleccionó la cepa en la que se introdujo la modificación anterior. La cepa productora de IMP seleccionada finalmente se denominó CJI2330.
Tabla 2
Ejemplo 1-3: Prueba de título de fermentación de CJI2330
Después de distribuir un medio de cultivo de siembra (2 ml) en tubos de ensayo (diámetro: 18 mm), los tubos se esterilizaron en autoclave. Cada uno de ATCC6872 y CJI2330 se inoculó e incubó a 30 °C durante 24 horas con agitación y se usó como cultivo de siembra. Se distribuyó un medio de fermentación (29 ml cada uno) en matraces Erlenmeyer de 250 ml y se esterilizaron en autoclave a 121 °C durante 15 min. El cultivo de siembra (2 ml) se inoculó en el medio y se cultivó durante 3 días. Las condiciones de cultivo se ajustaron a 170 rpm, 30 °C y pH 7,5.
Después de completar el cultivo, se midió la cantidad de producción de IMP mediante HPLC (SHIMAZDU LC20A) y los resultados del cultivo son los que se muestran en la Tabla 3 a continuación. Los siguientes resultados sugieren que CJI2330 tiene la capacidad de producir IMP.
Tabla 3
- Medio de cultivo de siembra: glucosa 1 %, peptona 1 %, extracto de carne 1 %, extracto de levadura 1 %, cloruro de sodio 0,25 %, adenina 100 mg/l, guanina 100 mg/l, a pH 7,5
- Medio de fermentación: glutamato de sodio 0,1 %, cloruro de amonio 1 %, sulfato de magnesio 1,2 %, cloruro de calcio 0,01 %, sulfato de hierro 20 mg/l, sulfato de manganeso 20 mg/l, sulfato de zinc 20 mg/l, sulfato de cobre 5 mg/l, cisteína-L 23 mg/l, alanina 24 mg/l, ácido nicotínico 8 mg/l, biotina 45 pg/l, clorhidrato de tiamina 5 mg/l, adenina 30 mg/l, ácido fosfórico 1,9 % (85 %), glucosa 2,55 %, fructosa 1,45 %
Ejemplo 2: Descubrimiento de modificación en la que se debilita la actividad del promotor purA
Para debilitar la expresión de la adenilosuccinato sintetasa para mejorar la capacidad de producción de nucleótidos de purina, se preparó una genoteca de variantes del gen purA que codifica la adenilosuccinato sintetasa y se intentó descubrir la modificación debilitada del promotor, en la que se debilitó la actividad del promotor, lo que aumenta la producción de nucleótidos de purina.
Ejemplo 2-1: Preparación de un vector que contiene el promotor purA
Para preparar una genoteca de variantes del promotor purA, primero se preparó un vector de expresión de proteína fluorescente verde (GFP) que contenía el promotor purA de la SEQ ID NO: 1. La PCR se realizó mediante el uso del ADN genómico de Corynebacterium stationis ATCC6872 como molde y un conjunto de cebadores de la SEQ ID NO: 15 y la SEQ ID NO: 16 por 30 ciclos de desnaturalización a 94 °C durante 30 segundos, hibridación a 55 °C durante 30 segundos y extensión a 72 °C por 2 min. Los fragmentos de ADN obtenidos se digirieron con KpnI y EcoRV se clonaron en el vector p117-gfp (Publicación de solicitud de patente coreana núm. 10-0620092), que ya estaba digerido con las mismas enzimas de restricción, y el vector así preparado se denominó p117-PpurA-gfp.
Tabla 4
Ejemplo 2-2: Preparación de una genoteca de variantes del promotor purA
Se preparó una genoteca de variantes del gen purA sobre la base del vector preparado en el Ejemplo 2-1. La genoteca se preparó mediante el uso de un kit de PCR propenso a errores (Clontech Diversify® PCR Random Mutagenesis Kit). En condiciones en las que pueden producirse modificaciones, la PCR se realizó mediante el uso de un conjunto de cebadores de las SEQ ID NOS: 15 y 17. Específicamente, en condiciones donde pueden ocurrir de 2 a 4 modificaciones por 1000 pb, se realizó un precalentamiento a 94 °C durante 30 segundos, seguido de 25 ciclos de un proceso de 94 °C durante 30 segundos y 68 °C durante 1 minuto 30 segundos. Un producto de PCR así obtenido se sometió a PCR mediante el uso de un megacebador (500 ng a 125 ng) durante 25 ciclos de un proceso de 95 °C durante 50 segundos, 60 °C durante 50 segundos y 68 °C durante 12 min, tratado con DpnI, y se transformó en E. coli DH5a y se extendió sobre un medio sólido LB que contenía kanamicina (25 mg/l). Después de seleccionar 20 tipos diferentes de colonias transformadas, se obtuvieron plásmidos a partir de estas y se sometieron a análisis de secuenciación. Como resultado, se confirmó que se introdujeron modificaciones en diferentes sitios a una frecuencia de 3,5 modificaciones/kb. Se recogieron aproximadamente 10000 colonias de E. coli transformadas y se extrajeron sus plásmidos, y se denominaron "genoteca p117-PpurA-gfp".
Ejemplo 3: Evaluación de la genoteca preparada y selección de variantes
Ejemplo 3-1: Evaluación de la genoteca
La genoteca p117-PpurA-gfp preparada en el Ejemplo 2-2 se transformó en la cepa CJI2330 preparada en el Ejemplo 1 por electroporación, y la cepa se extendió en un medio nutritivo que contenía 25 mg/l de kanamicina para obtener 5000 colonias en las que se insertó el vector modificado. Las colonias se denominaron "CJI2330_p117-PpurA(mt1)" a "CJI2330_p117-PpurA(mt5000)".
- Medio nutritivo: peptona 1 %, extracto de carne 1 %, cloruro de sodio 0,25 %, extracto de levadura 1 %, agar 2 %, a pH 7,2
Cada una de las 5000 colonias obtenidas se inoculó en 200 pl de un medio de cultivo de siembra esterilizado en autoclave y se cultivó en una placa de 96 pocillos profundos con agitación a 30 °C y 1200 rpm durante 24 horas mediante el uso de un agitador de microplacas (TAITEC) y se usó como cultivo de siembra. El medio de fermentación esterilizado en autoclave (290 pl) se distribuyó en una placa de 96 pocillos profundos y se inocularon 20 pl de cada uno de los cultivos de siembra a ellos y se cultivaron con agitación en las mismas condiciones anteriores durante 72 horas para obtener las células. Después, las células recogidas se lavaron con solución salina tamponada con fosfato 1x (cloruro de sodio (80 g), cloruro de potasio (2 g), fosfato de sodio (14,4 g), fosfato de potasio (2,4 g) y agua estéril (0,8 L)), se resuspendió en el mismo tampón y se midió la intensidad de fluorescencia. La intensidad de la fluorescencia se midió mediante la irradiación de la luz de excitación a 488 nm, y la luz emitida por la misma se midió a 511 nm mediante el uso del lector de microplacas y, por consiguiente, se midió el nivel de expresión del gen GFP. Tras la medición, se seleccionaron dos colonias mutantes (es decir, PpurA(mt3) y PpurA(mt378)) en las que la intensidad de la fluorescencia se debilitó en comparación con la PpurA-gfp de tipo salvaje.
Ejemplo 3-2: Confirmación de modificación en el promotor purA
Para confirmar la modificación génica de la cepa mutante, se realizó una PCR en cada una de las cepas PpurA(mt3) y PpurA(mt378) mediante el uso del conjunto de cebadores de las SEQ ID NOS: 15 y 17, y el producto de la PCR se sometió a secuenciación, por consiguiente se confirma la presencia de modificación en el promotor purA.
Específicamente, se confirmó que PpurA(mt3) incluía una secuencia de polinucleótidos en la que el nucleótido 189 de la secuencia de polinucleótidos de la SEQ ID NO: 1 se sustituye por timina (T). Además, se confirmó que PpurA (mt378) incluía una secuencia de polinucleótidos en la que el nucleótido 143 de la secuencia de polinucleótidos de la SEQ ID NO: 1 se sustituye por timina (T). Por consiguiente, en los Ejemplos a continuación, se realizaron intentos para confirmar si la modificación anterior puede afectar a la cantidad de producción de nucleótidos de purina en cada microorganismo del género Corynebacterium.
Ejemplo 4: Confirmación de la capacidad de producción de IMP en una cepa productora de IMP derivada de ATCC6872
Se preparó una cepa productora de IMP derivada de ATCC6872 y se introdujo en la cepa la modificación confirmada en el Ejemplo 3 y se confirmó la capacidad de producir IMP de la cepa.
Ejemplo 4-1: Selección de cepa productora de IMP derivada de ATCC6872
Para preparar una cepa productora de IMP derivada de la cepa ATCC6872, el cultivo de ATCC6872 se suspendió en tampón fosfato (pH 7,0) o tampón citrato (pH 5,5) a una densidad de 107 células/ml a 108 células/ml y tratado con UV a temperatura ambiente o 32 °C durante 20 min a 40 min para inducir una mutación. La cepa se lavó dos veces con solución salina 0,85 % y se extendió, previa dilución, sobre un medio mínimo que contenía agar 1,7 % y se complementó con un material resistente a una concentración adecuada, por consiguiente se obtuvieron colonias. Cada colonia se cultivó en un medio nutritivo y después se cultivó en un medio de cultivo de siembra durante 24 horas. Después de cultivar cada colonia en un medio de fermentación durante 3 a 4 días, se seleccionaron las colonias que mostraron la producción más excelente de IMP acumulada en el medio de cultivo. Para preparar una cepa productora de IMP a alta concentración, se proporcionó adenina-auxótrofa, guanina-tipo permeable, sensibilidad a la lisozima, resistencia a la 3,4-deshidroprolina, resistencia a la estreptomicina, resistencia a la sulfaguanidina, resistencia a la norvalina y resistencia a la trimetoprima tras realizar los procedimientos correspondientes en una forma secuencial. Como resultado, finalmente se seleccionó la cepa CJI2332 provista de resistencia a los materiales anteriores y con excelente productividad de IMP. Se compararon las resistencias de la cepa CJI2332 con respecto a las de ATCC6872 y los resultados se muestran en la siguiente Tabla 7.
Tabla 7
- Medio mínimo: glucosa 2 %, sulfato de sodio 0,3 %, fosfato monopotásico 0,1 %, fosfato dipotásico 0,3 %, sulfato de magnesio 0,3 %, cloruro de calcio 10 mg/l, sulfato de hierro 10 mg/l, sulfato de zinc 1 mg/l, cloruro de manganeso 3,6 mg/l, L-cisteína 20 mg/l, pantotenato de calcio 10 mg/l, clorhidrato de tiamina 5 mg/l, biotina 30 pg/l, adenina 20 mg/l, guanina 20 mg/l, ajustado a pH 7,3.
La cepa CJI2332 se depositó en el Centro Coreano de Cultivo de Microorganismos (KCCM) el 22 de junio de 2018, de conformidad con las disposiciones del Tratado de Budapest y se le asignó el número de acceso KCCM12277P.
Ejemplo 4-2: Prueba de título de fermentación de CJI2332
Después de distribuir un medio de cultivo de siembra (2 ml) en cada tubo de ensayo (diámetro: 18 mm), los tubos se esterilizaron en autoclave. Cada uno de ATCC6872 y CJI2332 se inoculó e incubó a 30 °C durante 24 horas con agitación y se usó como cultivo de siembra. Se distribuyó un medio de fermentación (29 ml cada uno) en matraces Erlenmeyer de 250 ml y se esterilizaron en autoclave a 121 °C durante 15 min. El cultivo de siembra (2 ml) se inoculó en el medio y se cultivó durante 3 días. Las condiciones de cultivo se ajustaron a 170 rpm, 30 °C y pH 7,5.
Después de completar el cultivo, se midió la cantidad de producción de IMP mediante HPLC (SHIMAZDU LC20A), y los resultados del cultivo son los que se muestran en la Tabla 8 a continuación.
Tabla 8
Ejemplo 4-3: Preparación del vector de inserción que contiene la modificación del promotor purA
Para introducir las modificaciones seleccionadas en el Ejemplo 3 en las cepas, se preparó un vector de inserción. Los procesos para preparar el vector para la introducción de las modificaciones PpurA(c143t), PpurA(a189t) y PpurA(c143t, a189t) son los siguientes.
La PCR se realizó mediante el uso del ADN genómico de la cepa ATCC6872 como molde y los conjuntos de cebadores de las SEQ ID NOS: 18 y 19 y las SEQ ID NOS: 20 y 21. La PCR se realizó como sigue: desnaturalización a 94 °C durante 5 min; 20 ciclos de desnaturalización a 94 °C durante 30 segundos, hibridación a 55 °C durante 30 segundos y polimerización a 72 °C durante 1 min; y polimerización a 72 °C durante 5 min. La PCR se realizó de nuevo de la misma manera mediante el uso de fragmentos de ADN obtenidos como molde y el conjunto de cebador de las SEQ ID NOS: 18 y 21 y los fragmentos de genes obtenidos de esta manera se digirieron por separado con XbaI. Cada uno de los fragmentos de ADN se clonó en un vector pDZ lineal digerido con XbaI mediante el uso de ligasa T4 y, por consiguiente, se preparó el vector pDZ-purA(c143t)-purA.
Después, se realizó la PCR mediante el uso del ADN genómico de la cepa ATCC6872 como molde y los conjuntos de cebadores de las SEQ ID NOS: 18 y 22 y las SEQ ID NOS: 23 y 21. La PCR se realizó como sigue: desnaturalización a 94 °C durante 5 min; 20 ciclos de desnaturalización a 94 °C durante 30 segundos, hibridación a 55 °C durante 30 segundos y polimerización a 72 °C durante 1 min; y polimerización a 72 °C durante 5 min. La PCR se realizó de nuevo de la misma manera mediante el uso de fragmentos de ADN obtenidos como molde y el conjunto de cebador de las SEQ ID NOS: 18 y 21 y los fragmentos de genes obtenidos de esta manera se digirieron por separado con XbaI. Cada uno de los fragmentos de ADN se clonó en un vector pDZ lineal digerido con XbaI mediante el uso de ligasa T4, por consiguiente se preparó el vector pDZ-purA(a189t)-purA.
Además, para examinar el efecto de la introducción de dos modificaciones simultáneas, se preparó un vector en el que se introdujeron las dos modificaciones. Después, se realizó la mutagénesis dirigida al sitio mediante el uso del pDZ-purA(c143t) preparado como cadena principal. Específicamente, la PCR se realizó mediante el uso de los conjuntos de cebadores de las SEQ ID NOS: 24 y 25 en las siguientes condiciones: 18 ciclos de desnaturalización a 94 °C durante 30 segundos, hibridación a 55 °C durante 30 segundos y polimerización a 68 °C durante 1 minuto; y polimerización a 72°C durante 12 min. Cada uno de los productos de PCR obtenidos se digirió con DpnI, se transformó en DH5a y, por consiguiente, se obtuvo el vector pDZ-PpurA(c143t, a189t)-purA.
Tabla 9
Ejemplo 4-4: Introducción de variantes del promotor purA en cepas CJI2330 y CJI2332 derivadas de ATCC6872 y evaluación de estas
La modificación del promotor purA se introdujo en cada una de las cepas CJI2330 productoras de IMP derivadas del tipo salvaje preparadas en el Ejemplo 1 y la cepa CJI2332 seleccionada en el Ejemplo 4-1, y se evaluó la cantidad de iMp producida por cada cepa. Para confirmar la presencia de una modificación en el promotor purA de la cepa CJI2332, se amplificó por PCR el ADN genómico de la cepa CJI2332. Específicamente, en primer lugar, los fragmentos del promotor purA se amplificaron por PCR mediante el uso del ADN genómico de la cepa CJI2332 como molde y el conjunto de cebadores de las SEQ ID NOS: 15 y 21, en los que la PCR se realizó mediante 28 ciclos de
desnaturalización a 94 °C durante 1 minuto; hibridación a 58 °C durante 30 segundos y polimerización a 72 °C durante 1 min mediante el uso de ADN polimerasa Taq. Se analizaron las secuencias de nucleótidos obtenidas de los fragmentos del promotor purA amplificado y, como resultado, se confirmó que la secuencia de nucleótidos del promotor purA de la cepa CJI2332 era la misma que la de Corynebacterium stationis ATCC6872 de tipo salvaje.
Después, los vectores pDZ-PpurA(c143t)-purA, pDZ-PpurA(a189t)-purA y pDZ-PpurA(c143t, a189t)-purA se transformaron en la cepa CJI2330 y la cepa CJI2332, y las cepas en las que cada uno de los vectores se insertó en el cromosoma por recombinación de secuencias homólogas que se seleccionaron en un medio que contenía kanamicina (25 mg/l). Las cepas primarias seleccionadas se sometieron a reticulación secundaria y, por consiguiente, se seleccionaron las cepas en las que se introdujo una modificación en el promotor de un gen diana. Para confirmar la introducción de la modificación génica en las cepas transformadas finales, se realizó PCR mediante el uso del conjunto de cebadores de las SEQ ID NOS: 15 y 21 y los productos de PCR se confirmaron mediante el análisis de estas secuencias de nucleótidos. Como resultado, se confirmó que la modificación genética se introdujo en las cepas. Las cepas así preparadas se denominaron CJI2330_PpurA(c143t)-purA, CJI2330_PpurA(a189t)-purA, CJI2330_PpurA(c143t, a189t)-purA, CJI2332_PpurA(c143t)-purA, y CJI2332_PpurA(a189t)-purA, CJI2332_PpurA(c143t, a189t)-purA.
El CJI2332_PpurA(c143t)-purA se denomina CJI2352 y se depositó en el Centro Coreano de Cultivo de Microorganismos (KCCM) el 10 de septiembre de 2018, de conformidad con las disposiciones del Tratado de Budapest y se le asignó el número de acceso KCCM12315P. Además, el CJI2332_PpurA(a189t)-purA preparado se denomina CJI2365 y se depositó en el Centro Coreano de Cultivo de Microorganismos (KCCM) el 10 de septiembre de 2018, según las disposiciones del Tratado de Budapest y se le asignó el número de acceso KCCM12314P.
Se evaluó la capacidad de producción de IMP de cada cepa. Después de completar el cultivo, se midió la cantidad de producción de IMP mediante un método que usa HPLC, y los resultados del cultivo son los que se muestran en la Tabla 10 a continuación.
Tabla 10
Ejemplo 5: Confirmación de la capacidad de producción de ácido 5'-xantílico (XMP) tras la introducción de la variante del promotor purA
Ejemplo 5-1: Selección de cepas productoras de XMP derivadas de ATCC6872
Para preparar una cepa productora de monofosfato de 5'-xantosina (XMP) derivada de ATCC6872, la cepa Corynebacterium stationis ATCC6872 se suspendió en tampón fosfato (pH 7,0) o tampón citrato (pH 5,5) a una densidad de 107 células/ml a 108 células/ml y se trató con UV a temperatura ambiente o 32 °C durante de 20 min a 40 min para inducir una mutación. La cepa se lavó dos veces con solución salina 0,85 % y se extendió, previa dilución, sobre un medio mínimo que contenía agar 1,7 % y se complementó con un material resistente a una concentración adecuada, por consiguiente se obtuvieron colonias. Cada colonia se cultivó en un medio nutritivo y después se cultivó en un medio de cultivo de siembra durante 24 horas. Después de cultivar cada colonia en un medio de fermentación durante de 3 a 4 días, se seleccionaron las colonias que mostraron la producción más excelente de XMP acumulada en el medio de cultivo. Específicamente, se seleccionaron cepas de aquellas que pueden crecer en un medio donde se añada fluorotriptófano de acuerdo con concentraciones (medio de adición), y más específicamente, de aquellas que pueden crecer en un medio con una concentración de fluorotriptófano de 100 mg/l y tiene una concentración mejorada de ácido 5'-xantílico. La cepa seleccionada se denominó CJX1664.
- Medio mínimo: glucosa 20 g/l, fosfato monopotásico 1 g/l, fosfato dipotásico 1 g/l, urea 2 g/l, sulfato de amonio 3 g/l, sulfato de magnesio 1 g/l, cloruro de calcio 100 mg/l, sulfato de hierro 20 mg/l, sulfato de manganeso 10 mg/l, sulfato de zinc 10 mg/l, biotina 30 pg/l, clorhidrato de tiamina 0,1 mg/l, sulfato de cobre 0,8 mg/l, adenina 20 mg/l, guanina 20 mg /l, a pH 7,2
Medio de adición: un medio donde se añade fluorotriptófano en una concentración de 10 mg/l, 20 mg/l, 50 mg/l, 70 mg/l, 100 mg/l y 200 mg/l a un medio mínimo
Las características bioquímicas de la cepa CJX1664 se muestran en la Tabla 11 a continuación. Con referencia a la Tabla 11, la cepa CJX1664 puede cultivarse en un medio de adición donde se añade fluorotriptófano a una concentración de 100 mg/l.
Tabla 11
La cepa CJX1664 se depositó en el Centro Coreano de Cultivo de Microorganismos (KCCM) el 6 de julio de 2018, según las disposiciones del Tratado de Budapest y se le asignó el número de acceso KCCM12285P.
Ejemplo 5-2: Prueba de título de fermentación CJX1664
Después de distribuir un medio de cultivo de siembra (2 ml) en cada uno de los tubos de ensayo (diámetro: 18 mm), los tubos se esterilizaron en autoclave. Cada uno de ATCC6872 y CJX1664 se inoculó e incubó a 30 °C durante 24 horas con agitación y se usó como cultivo de siembra. Se distribuyó un medio de fermentación (29 ml cada uno) en matraces Erlenmeyer de 250 ml y se esterilizaron en autoclave a 121 °C durante 15 min. El cultivo de siembra (2 ml) se inoculó en el medio y se cultivó durante 3 días. Las condiciones de cultivo se ajustaron a 170 rpm, 30 °C y pH 7,5.
Después de completar el cultivo, se midió la cantidad de producción de XMP mediante un método que usa HPLC (SHIMAZDU LC20A), y los resultados del cultivo son los que se muestran en la Tabla 12 a continuación.
Tabla 12
Ejemplo 5-3: Introducción de variantes en la cepa CJX1664 y evaluación de estas
Para confirmar la presencia de una modificación en el promotor purA de la cepa CJX1664 seleccionada en el Ejemplo 5-1, se amplificó por PCR el ADN genómico de la cepa CJX1664. Específicamente, en primer lugar, los fragmentos del promotor purA se amplificaron por PCR mediante el uso del ADN genómico de la cepa CJX1664 como molde y los cebadores de las SEQ ID NOS: 17 y 18, en los que la PCR se realizó mediante 28 ciclos de desnaturalización a 94 °C durante 1 min; hibridación a 58 °C durante 30 segundos y polimerización a 72 °C durante 1 min mediante el uso de ADN polimerasa Taq. Se analizaron las secuencias de nucleótidos obtenidas de los fragmentos del promotor purA amplificado y, como resultado, se confirmó que la secuencia de nucleótidos del promotor purA de la cepa CJI2332 era la misma que la de Corynebacterium stationis ATCC6872 de tipo salvaje.
Cada uno de los vectores preparados en el Ejemplo 4-3 se transformó en la cepa CJX1664, y las cepas en las que cada uno de los vectores se insertó en el cromosoma por recombinación de secuencias homólogas se seleccionaron en un medio que contenía kanamicina (25 mg/l). Las cepas primarias seleccionadas se sometieron a reticulación secundaria y, por consiguiente, se seleccionaron las cepas en las que se introdujo una modificación en el promotor de un gen diana. La presencia de la introducción de una modificación génica en la cepa transformada final se confirmó mediante el análisis de las secuencias de nucleótidos.
Se evaluaron las capacidades de producción de XMP de las cepas CJX1664, CJX1664_PpurA(c143t)-purA, CJX1664_PpurA(a189t)-purA, y CJX1664_PpurA(c143t, a189t)-purA. Después de completar el cultivo, se midió la cantidad de producción de XMP mediante un método que usa HPLC, y los resultados del cultivo son los que se muestran en la Tabla 13 a continuación.
El CJX1664_PpurA(c143t)-purA se denomina CJX1680 y se depositó en el Centro Coreano de Cultivo de Microorganismos (KCCM) el 10 de septiembre de 2018, de conformidad con las disposiciones del Tratado de Budapest y se le asignó el número de acceso KCCM12311P. Además, el CJX1664_PpurA(a189t)-purA preparado se denomina
Claims (11)
1. Un polinucleótido que tiene una actividad de un promotor, en donde, en la secuencia de polinucleótidos de la SEQ ID NO: 1, i) el nucleótido 143 se sustituye por timina (T); ii) el nucleótido 189 se sustituye por timina (T); o iii) el nucleótido 143 se sustituye por timina (T) y el nucleótido 189 se sustituye por timina (T).
2. El polinucleótido de acuerdo con la reivindicación 1, en donde el polinucleótido comprende la secuencia de nucleótidos de la SEQ ID NO: 2, la SEQ ID NO: 3 o la SEQ ID NO: 4.
3. Una composición para la expresión génica que comprende el polinucleótido de la reivindicación 1.
4. Un vector que comprende el polinucleótido de la reivindicación 1 y una secuencia de nucleótidos que codifica una proteína diana, que está unida operativamente a dicho polinucleótido.
5. El vector de acuerdo con la reivindicación 4, en donde la proteína diana es la adenilosuccinato sintetasa.
6. Un microorganismo del género Corynebacterium que comprende el vector de la reivindicación 4 o 5.
7. Un microorganismo del género Corynebacterium que comprende el polinucleótido de la reivindicación 1 y una secuencia de nucleótidos que codifica una proteína diana que está unida operativamente a dicho polinucleótido.
8. El microorganismo de acuerdo con la reivindicación 7, en donde la proteína diana es la adenilosuccinato sintetasa.
9. El microorganismo de acuerdo con la reivindicación 7, en donde el microorganismo del género Corynebacterium es Corynebacterium stationis.
10. Un método para preparar nucleótidos de purina, que comprende cultivar el microorganismo del género Corynebacterium de acuerdo con la reivindicación 8 en un medio.
11. El método de acuerdo con la reivindicación 10, que comprende además recuperar nucleótidos de purina del microorganismo o medio de cultivo después del cultivo.
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