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ES2966980T3 - Detección de antígenos de Trichinella - Google Patents

Detección de antígenos de Trichinella Download PDF

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ES2966980T3
ES2966980T3 ES18209802T ES18209802T ES2966980T3 ES 2966980 T3 ES2966980 T3 ES 2966980T3 ES 18209802 T ES18209802 T ES 18209802T ES 18209802 T ES18209802 T ES 18209802T ES 2966980 T3 ES2966980 T3 ES 2966980T3
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trichinella
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antigen
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ES18209802T
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Jana Braasch
Stefanie Ostermann
Monika Mackiewicz
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Euroimmun Medizinische Labordiagnostika AG
Original Assignee
Euroimmun Medizinische Labordiagnostika AG
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Abstract

La presente invención está dirigida a un método para la detección en una muestra de extracto de tejido, al uso de un sistema de detección según la invención para la detección de y a un kit que comprende (a) un vehículo de detección que comprende un primer anticuerpo contra uno o más antígenos de, y (b)(i) un segundo anticuerpo contra uno o más antígenos de, en donde el segundo anticuerpo está unido a una molécula de señalización, o (b)(ii) uno o más antígenos de los cuales están unidos a una molécula de señalización, los antígenos de (b)(ii) están diseñados de tal manera que liberan la unión de los antígenos de (a) al primer anticuerpo mediante desplazamiento competitivo. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

DESCRIPCIÓN
Detección de antígenos deTrichinella
El siguiente hallazgo se basa en un procedimiento de detección deTrichinellaen una sonda de muestreo de tejidos.
Trichinella spiralis (T. spiralis)es una cepa del géneroTrichinellaque puede provocar enfermedades graves en los seres humanos. La denominada triquinosis se produce por la ingesta de carne roja o, a veces, roja, infectada con triquinosis. Los síntomas de esta enfermedad son, en primer lugar, el hipotiroidismo, la diarrea y los dolores musculares.
A medida que avanza la enfermedad, se presentan síntomas de parálisis, hinchazón facial -especialmente periorbitaria-, conjuntivitis, dolor de cabeza, erupción cutánea y miocarditis [1]. El parásito se transmite por vía respiratoria a través de diversos organismos, como las aves, los pájaros, las aves silvestres o los nematodos. Se conocen 11 especies distintas del géneroTrichinella,que se dividen en dos grupos: Las especies, comoT. spiralis,que forman una cápsula de colágeno en el músculo del organismo económico y se desprenden rápidamente, y las especies, que no forman cápsula, comoT. pseudospiralis[2].
T. spiralises una especie con escasa incidencia en todo el mundo. En la Unión Europea (UE) existen pocas cantidades de tricomoniasis en las aves de corral, procedentes de la caza y la cría en cautividad, pero su prevalencia es mucho mayor en las aves silvestres, como los cetáceos salvajes, los perros de caza y los perros de presa, así como en las aves de caza privadas. En China, el índice de precios de los cigarrillos es generalmente inferior al 4%. Entre 1964 y 2002 hubo más de 500 empresas con un total de más de 25.000 empleados [3].
El ciclo biológico deT. spiralisse conoce desde hace tiempo. Tras la ingesta oral de los huevos infectados conT. spiralis,se liberan las larvas después de unas 24 horas en el estómago, hasta que se elimina el colágeno mediante la fluidez de la ingesta. Durante más de cuatro episodios, las larvas adquieren una forma adulta y se convierte en el comienzo de la historia. Al cabo de 5-10 días nacen nuevas larvas (NBL -New Born Larvae)que penetran en el intestino y en el sistema linfático. 6-12 Días más tarde, las larvas penetran en los músculos estriados (ML - larvas musculares) y después de 4-6 semanas comienza la formación de la cápsula, que con el tiempo se calcifica cada vez más. Un intercambio metabólico con el tejido tiene lugar durante años o décadas [4].
Para mejorar la musculatura de la piel, T. spiralis manipula el sistema inmunitario de la piel con la ayuda de varias proteínas que se congelan en el tejido circundante. Las denominadas proteínas excretoras y secretoras (E/S-Proteína) proceden en su mayor parte del estreptococo, que se encuentra en unos 50 grandes vasos sanguíneos, los Estecocitos.
El estudio de la triquinosis, también conocido como triquinoscopia, es un estudio de los tejidos leñosos deT. spiralisdespués de la exposición. Forma parte de la investigación histórica sobre la caza y la captura de aves en las zonas de caza, y fue creada a mediados del siglo XIX. Jahrhunderts zu mehreren Epidemien kam. Así se estableció en 1866 en el Reino de Prusia la obligatoriedad de la triquinoscopia. Si el pescado se destina a la alimentación humana, deberán estudiarse todas las especies dentro de la UE que puedan ser víctimas de laT. spiralis,por ejemplo, Cerdos domésticos, caballos, osos o jabalíes (EG Nr. 2015/1375).
El coste de la prueba de latrichinellapor cerdo oscila entre 0,12 y 3,70 euros, dependiendo del tamaño del matadero y del número de animales sacrificados [5].
La serología no es fiable en la investigación de la tricomoniasis, ya que se produce una seroconversión con una infecciosidad de 20.000 larvas después de 3-4 semanas y de 100 larvas después de 5-7 semanas [6].
Existen varios sistemas de detección para la detección deT. spiralisen animales, que de acuerdo con el Reglamento de la UE (EG Nr. 2015/1375) son seguros y se encuentran en los tejidos o en el uso laboral. Además del procedimiento mecánico de dosificación artesanal con el Stomacher Lab-blender 3500, la dosificación automática de muestras de hasta 35 g con el Trichomatic-35®-Mixer y la digestión artesanal con los kits PrioCHECK® Trichinella AAD, existen otros dos procedimientos: el procedimiento magnético para la toma de muestras y la técnica de "aislamiento en filtro" mediante la prueba de aglutinación de látex (Trichin-L-Antigen-Test-Kit de Bio-Rad). En este contexto, cabe señalar que el procedimiento más utilizado y al mismo tiempo considerado de referencia es el procedimiento de agitación magnética para la digestión artificial. El nuevo procedimiento consiste en una prueba magnética para el análisis químico de muestras con la técnica de "aislamiento en el filtro" y la determinación de la longitud mediante pruebas de aglutinación de látex.
El proceso de agitación magnética para la digestión artificial de muestras a granel es bien conocido por los expertos en la técnica [7]. Este procedimiento tiene numerosas desventajas, como la calidad variable de la pepsina utilizada, la sensibilidad a la temperatura y al tiempo (la digestión debe realizarse durante 30 minutos entre 46 °C y 48 °C), la alta intensidad del tiempo (debido al proceso de digestión, a los pasos de sedimentación, limpieza de equipos y microscopía), evaluación manual por parte de personal especialmente capacitado, manejo difícil y a veces peligroso de cada uno de los pasos debido, por ejemplo, a la manipulación de ácido clorhídrico, evaluación difícil (por ejemplo, el líquido digestivo puede no haberse lavado lo suficiente y, por lo tanto, las larvas pueden pasar desapercibidas debido a la turbidez excesiva) y riesgo de contaminación debido a equipos mal limpiados.
También la técnica de "aislamiento en el filtro" y la posterior determinación de la concentración mediante el test de aglutinación de látex Trichin-L presentan varios inconvenientes. Por ejemplo, el procedimiento mencionado en la presente memoria también tiene las desventajas mencionadas anteriormente con respecto a la digestión, ya que el paso de digestión es idéntico. Sin embargo, la sensibilidad de las pruebas a los productos químicos, como los detergentes en las soluciones de reintegración, puede ser muy alta. Por otra parte, existen muchos equipos que deben ser reintegrados de forma regular, ya que el riesgo de contaminación es muy elevado.
El documento DE4004537 C1 desvela un dispositivo para el uso artificial de carne, en el que la carne se procesa química y mecánicamente.
El documento WO2006/034716 A1 desvela un sistema y procedimiento para detectar larvas deTrichinelladigiriendo enzimáticamente carne, filtrando la solución resultante y luego analizándola.
El documento US4613568 A desvela un procedimiento para extraer parásitos y sus huevos de la carne usando pepsina y realizando varios ajustes de pH.
El documento WO2010/146184 A1 divulga procedimientos para digerir carne con enzimas digestivas activas en un ambiente alcalino
Por lo tanto, es necesario un procedimiento que, gracias a su fácil manejo, permita una eliminación rápida, económica y, sobre todo, segura de lasTrichinellaen los tejidos blandos, especialmente en los musculares.
A continuación se describen procedimientos, aplicaciones y kits que permiten una eliminación deTrichinellarápida, económica y eficaz.
Los autores de la presente investigación han comprobado, sin lugar a dudas, que la extracción (mecánica) de una muestra infectada conTrichinellapuede dar lugar a una prueba de detección deTrichinellamediante inmunoensayo. Un ensayo diferente requiere la detección de < 7 ng de antígenode Trichinellapor ml de extracto de tejido o menos. Por otra parte, si el 90 % de los componentes de la muestra de la muestra de sangre tienen un espesor de 200 pm o menos (D90 < 200 pm), puede lograrse una eliminación eficaz deTrichinella.
En primer lugar, la presente investigación se centra en un procedimiento de detección deTrichinellaen una sonda de muestreo, cuando el 90% de las partículas de la sonda de muestreo tienen un espesor de 200 pm o menos (D90 < 200 pm) y cuando en la fabricación de la sonda de muestreo no se produce ninguna transformación enzimática y/o química de las partículas. La detección deTrichinellase realiza mediante la detección de antígenos de Trichinella, o mediante la detección de antígenos específicos deTrichinellaen la sonda de extirpación gaseosa mediante inmunoensayo.
En realizaciones preferentes de la invención, la muestra de extracto de tejido es una muestra de mamífero, preferentemente una muestra de cerdo.
En otros modelos anteriores, el extractor de cableado está fabricado con material sintético.
En realizaciones preferentes del procedimiento de acuerdo con la invención, al producir la muestra de extracto de tejido (a) no se supera una temperatura de 45 °C, preferentemente 40 °C.
Por otra parte, el procedimiento en las formas de aplicación autorizadas (a) no requiere un microscopio; (b) se utiliza en el marco de un lavado en seco y/o (c) requiere una concentración de < 7 ng de antígeno por ml de extracto de sangre.
En otras formas de aplicación más avanzadas, el procedimiento de detección puede realizarse mediante inmunoensayo, ELISA, ensayo lineal, Western Blot, ensayo con microesferas, ensayo de flujo lateral, ensayo de filtración vertical o ensayo de inmunofiltración tridimensional.
Trichinella spiralisse encuentra en formas de presentación anteriores.
No se ha descrito aquí y no forma parte de la investigación un uso de un sistema de detección para la detección de Trichinella, preferentemente en el contexto de la inspección de carne, comprendiendo el sistema de detección (a) un portador de detección que comprende un primer anticuerpo contra uno o más antígenos de Trichinella, y (b)(i) un segundo anticuerpo contra uno o más comprende varios antígenos de Trichinella, (b)(ii) comprende una variedad de antígenos de Trichinella que están unidos a una molécula señal, donde los antígenos de (b)(ii) están diseñados de tal manera que unen los antígenos de (a) al primer anticuerpo mediante desplazamiento competitivo.
Lo que en la presente memoria se describe y no forma parte del hallazgo es lo siguiente un kit que comprende (a) un portador de detección que comprende un primer anticuerpo contra uno o más antígenos de Trichinella, y (b)(i) un segundo anticuerpo contra uno o más antígenos de Trichinella, estando unido el segundo anticuerpo a una molécula de señalización, o bien (b)(ii) uno o varios antígenos deTrichinella, que se encuentren en una cápsula de señalización, a condición de que los antígenos de (b)(ii) sean tan fuertes que se produzca una unión del antígeno de (a) con el primer antígeno mediante una modificación competitiva.
Este kit contiene una descripción de un procedimiento de detección deTrichinella.
Tal como se ha descrito anteriormente, el primer aspecto de la presente investigación se basa en un procedimiento de detección deTrichinellaen una sonda de muestreo, cuando el 90% de las partículas de la sonda de muestreo tienen un espesor de 200 jm o menos (D90 < 200 |jm).
El término "Detección" o "Detectando", que en la presente memoria se utiliza de manera uniforme, se refiere a la detección cualitativa o cuantitativa deTrichinella.La evaluación cualitativa significa que la presencia o ausencia deTrichinellaes inaceptable. La estimación cuantitativa se basa en la estimación de la cantidad relativa o absoluta deTrichinellaen una sonda.
El término"Trichinella",que en la presente memoria se utiliza de forma genérica, se refiere a un grupo de gusanos de la carpa (StammNematoda)con una vida parasitaria. Los mamíferos, incluidos los humanos, y las aves sirven como huéspedes intermedios y finales. Los principales transmisores a los humanos son los cerdos infectados o su carne cruda, por ejemplo, carne consumida como Mett o carne poco cocida. Taxonómicamente, las Trichinellas se pueden clasificar de la siguiente manera: Filo: nematodos (Nematoda); Clase: Adenophorea (Adenophorea); Subclase: Enoplea (Enoplea); Orden: Trichocephalida; Familia: Trichinellidae; Género: Trichinella. En realizaciones preferentes de la invención, Trichinella se selecciona del grupo que consiste enTrichinella espiralis,Trichinella nativa, Trichinella britovi, Trichinella murrelli, Trichinella T6, Trichinella T7, Trichinella nelsoni, Trichinella T8, Trichinella T9, Trichinella pseudospiralis, Trichinella papuae y Trichinella zimbabwensis. . En realizaciones preferentes adicionales, la especie Trichinella es un organismo que forma una cápsula de colágeno en una célula muscular del organismo huésped y está permanentemente encerrado por ella. En una realización aún más preferente, Trichinella esTrichinella espiralis. Trichinella espiralises un nematodo y el representante más importante de las Trichinellas en Europa Central. Ocurre en todo el mundo, pero no es de gran importancia en las zonas tropicales.T. espiralisprovoca el cuadro clínico de triquinelosis.
El término "muestra de extracto de tejido", tal como se utiliza en la presente memoria, significa una mezcla de diversas sustancias de origen biológico. El material de origen biológico puede ser tejido epitelial (capas de células que recubren todas las superficies internas y externas), tejido conectivo y de sostén (tejido que proporciona cohesión estructural y rellena espacios), tejido especializado (como sangre, células libres, etc.) , tejido muscular (células especializadas en el movimiento activo mediante filamentos contráctiles), tejido nervioso (células que forman el cerebro, la médula espinal y los nervios periféricos) y líquido tisular como la linfa. Más preferentemente, el tejido es tejido muscular. El tejido muscular puede ser músculo liso, músculo cardíaco y/o músculo esquelético. En otras realizaciones preferentes, la muestra se toma del diafragma, la lengua o los músculos intercostales del individuo a examinar. El tejido es preferentemente un tejido sólido.
Una muestra de extracto de tejido puede ser heterogénea u homogénea. Una muestra de extracto de tejido heterogéneo contiene tejido de diferentes tipos de tejido. Una muestra de extracto de tejido homogéneo incluye sólo un tejido determinado. Se prefiere una muestra de extracto de tejido homogénea. En realizaciones alternativas, la muestra es una muestra agrupada, es decir, el material de muestra proviene de diferentes individuos. O la muestra proviene exclusivamente de un solo individuo.
El extracto se puede obtener a partir de trozos de tejido o células viables. Estos se trituran y se mezclan con una solución acuosa, tal como soluciones tampón, H2O, medios celulares y mezclas de los mismos. El proceso de fabricación preferiblemente no incluye el cultivo de células.
En las versiones anteriores de la detección, la sonda de trazado transversal es una sonda Saugetier. En otras formas de aplicación, la sonda se aplica a perros, gatos, cabras, gatos monteses o personas. También se han detectado ejemplares de la especie doméstica(Sus scrofa domesticus),de la especie salvaje(Sus scrofa),de laespeciesalvanius (Sus salvanius),de la especie barbuda(Sus barbatus),de laespecieahoenobarbus (Palawan-Bartschwein),de la especiebuculenta(Annamitisches Pustelschwein), Visayas-Pustelschwein(Suscebifrons),Sulawesi-Pustelschwein(Sus celebensis),Mindoro-Pustelschwein(Sus oliveri),Philippinisches Pustelschwein(Sus philippensis),Javanisches Pustelschwein(Sus verrucosus)o Bawean-Pustelschwein(Sus blouchi).
El término "diámetro de partícula", tal y como se utiliza en la presente memoria, se refiere a una medición volumétrica o de longitud de las partículas examinadas en el extracto de tejido. Las partículas examinadas pueden tener una forma aproximadamente redondeada o una estructura fibrosa alargada. En realizaciones preferentes, en la muestra de extracto de tejido, el 90 % de las partículas tienen un diámetro de 200 jm o menos (D90 < 200 jm ), 190 jm o menos (D90 < 190 jm ), 180 jm o menos (D90 < 180 jm ), 170 jm o menos (D90 < 170 jm ), 160 jm o menos (D90 < 160 jm ), 150 jm o menos (D90 < 150 jm ), 140 jm o menos (D90 < 140 jm ), 130 jm o menos (D90 < 130 jm ), 120 jm o menos (D90 < 120 jm ), 110 jm o menos (D90 < 110 jm ), 100 jm o menos (D90 < 100 jm ), 95 jm o menos (D90 < 95 jm ) , 90 jm o menos (D90 < 90 jm ), 85 jm o menos (D90 < 85 jm ), 80 jm o menos (D90 < 80 jm ), 75 jm o menos (D90 < 75 jm), 70 jm o menos ( D90 < 70 jm ), 65 jm o menos (D90 < 65 jm ), 60 jm o menos (D90 < 60 jm), 55 jm o menos (D90 < 55 jm ), 50 jm o menos (D90 < 50 jm ), 45 jm o menos (D90 < 45 jm ), 40 jm o menos (D90 < 40 jm ), 35 jm o menos (<d>90 < 35 jm ), 30 jm o menos (D90 < 30 jm ), 25 jm o menos (D90 < 25 jm ), 20 jm o menos (D90 < 20 jm ), 17 jm o menos (D90 < 17 jm ), 15 jm o menos (D90 < 15 jm ), 13 jm o menos (D90 < 13 jm), 10 jm o menos (D90 < 10 jm ), 8 jm o menos (D90 < 8 jm ) o 6 jm o menos (D90 < 6 jm).
La medición de los valores de partículas puede llevarse a cabo mediante dispositivos que utilicen un análisis dinámico de los mismos (p. ej. Camsizer®XT de la empresa Retsch), o bien equipos basados en la capacidad de funcionamiento del tratamiento estadístico por láser (p. ej. lA-960 de la empresa HORIBA). El tamaño de partícula se puede medir en xcmin y se define de la siguiente manera de acuerdo con DIN 66141: Diámetro de partícula más corto de las mediciones del diámetro máximo dentro de una proyección de partícula (inglés:particle diameter which is the shortest chord of the measured set of máximum chords of a particle projection)[10]. Alternativamente, se puede ajustar el tamaño de la partícula con el medidor de velocidad (xFe). La herramienta de medición de la fuerza es una medida para el tamaño del objeto dentro de una zona distinta. En general, puede definirse como la distancia entre dos niveles paralelos que se aproximan al objeto. Por lo tanto, también hay que tener en cuenta el peso del calibre, que depende de la medición de la altura del objeto con una escala. En el análisis de las dimensiones parciales, por ejemplo en la microscopía, en la que se utiliza la herramienta de medición de la velocidad en proyectos de objetos tridimensionales (3D) sobre una superficie 2D, ésta se define como la distancia entre dos líneas tangenciales paralelas en lugar de dos ejes. En el caso de una parte convexa, el valor medio de la huella (valor medio en todas las posiciones) es igual al valor de la huella de una corona con el mismo perímetro. El máximo valor de salida es el mayor valor de salida dentro de los satélites de valores de salida combinados. El valor mínimo es el valor más alto dentro de los satélites gemelos de valores de referencia.
Alternativamente, el comprador se centrará en una cantidad menor, de modo que la suma de las cantidades compradas de todas las partes iguales se dividirá entre la cantidad total de las partes iguales. En otra forma de funcionamiento alternativa, si se utiliza en función del tamaño de la pieza, el controlador puede seleccionar "D50", de modo que aproximadamente el 50% de las piezas seleccionadas tengan un tamaño de pieza menor que el mínimo definido, y que aproximadamente el 50% de las piezas seleccionadas tengan un tamaño de pieza mayor que el mínimo definido.
En realizaciones preferentes del procedimiento de acuerdo con la invención, no es superadauna temperatura de 100 °C, 90 °C, 80 °C, 70 °C, 60 °C, 55 °C, 50 °C, 45 °C, 44 °C, 43 °C, 42 °C, 41 °C, 40 °C, 39 °C o 38 °C .
El término "preparación de la muestra de extracto de tejido", tal como se utiliza en la presente memoria, se refiere a un proceso mecánico que consiste en extraer una muestra de sangre de un organismo no estudiado, comprimirla (mecánicamente) y tratarla por filtración y/o centrifugación. La detección de antígenos puede realizarse entonces utilizando el procedimiento de acuerdo con la invención.
La extracción de las membranas mucosas se realiza sólo mecánicamente, por ejemplo, sin alteración enzimática y/o química de las membranas. La trituración mecánica se puede realizar cortando, desgarrando o triturando, pero preferentemente se consigue cortando (por ejemplo, usando un molino de aspas). Con la extracción de la sonda también se extraen latrichinellalarvaria presente en la sonda. Después de ser trituradas, las larvas de Trichinella trituradas tienen un tamaño que corresponde al tejido triturado.
El término "no enzimático", tal y como se utiliza en la presente memoria, significa que no se ha utilizado ninguna enzima para el tratamiento de la muestra. En particular, no se han añadido a la base de datos ninguna proteína (p. ej. pepsina), lipasas, amilasas, cutinasas, celulasas o hemicelulasas.
La mención "sin alteraciones químicas", tal como se utiliza en la presente memoria, significa que no se utilizan sustancias químicas, como aceites, bases, productos de oxidación, etc., para la limpieza de los filtros.
Por otra parte, el procedimiento en las formas de utilización autorizadas (a) no debe utilizarse con un microscopio; (b) debe emplearse en el marco de la inspección de carne y/o (c) debe tener una distancia de seguridad de < 20 ng, < 15 ng, < 10 ng, < 9 ng, < 8 ng, < 7 ng, < 6 ng, < 5 ng, < 4 ng, < 3 ng, < 2 ng, < 1 ng, < 0,5 ng, < 0,25 ng, < 0,1 ng, < 0,05 ng, < 0,01 ng, < 0,005 ng o < 0,001 ng de antígeno por ml de extracto de tejido.
El término "sin certificado microscópico", tal como se utiliza en la presente memoria, se refiere a la evaluación de una prueba de detección deTrichinella,ya que para la evaluación de las pruebas de detección no se requiere un certificado microscópico ni una prueba microscópica, en particular una prueba microscópica manual.
El término "inspección de carne", o también "Inspección de animales y carnes", tal como se utiliza en la presente memoria, se refiere a un proceso que debe llevarse a cabo de manera que la carne, como medio de vida, sólo pueda utilizarse en el tráfico, a condición de que se trate de una actividad peligrosa para las personas. Este estudio es un componente esencial de los procedimientos de control de la higiene de los peces. La investigación se lleva a cabo, por regla general, en dos fases: la investigación de los tejidos y la investigación de los flancos.
En una forma de ejecución anterior, el término "diferenciación por proximidad", tal como se utiliza en la presente memoria, se refiere a la menor cantidad de una sustancia (antígeno) que, debido a su proximidad a una sustancia determinada, puede ser diferenciada de otra. Alternativamente, el término "reducción de la dosis" puede referirse a la concentración de un antígeno en una solución, cuyo valor es mayor que la inseguridad asociada. El límite de detección se puede definir arbitrariamente como 3 desviaciones estándar (SD) de la concentración cero.
En otras formas de aplicación posteriores, el procedimiento de detección se realizará mediante un inmunoensayo, un ensayo lineal, un ensayo de Western Blot, un ensayo con microesferas, un ensayo de flujo lateral, un ensayo de filtración vertical o un ensayo de inmunofiltración tridimensional.
En su forma actual, el término "inmunoensayo", como se utiliza en la presente memoria, se refiere a la detección o cuantificación de un análisis, como por ejemplo los antígenos deTrichinellaobtenidos, es decir, una reacción inmunitaria entre un anticuerpo y el antígeno. En el momento de la detección, el analista puede determinar si se trata de un péptido, un péptido modificado postraduccionalmente, una glucoproteína, un zucker, un lípido, una nucleína y/o cualquier otra molécula deTrichinella.
En una versión anterior, el término "ELISA", tal como se utiliza en la presente memoria, significaEnzyme-linked Immunosorbent Assay (ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas)y se refiere a una prueba de detección de anticuerpos (ensayo). La prueba ELISA pertenece al grupo de pruebas de inmunoensayo, se basa en la rotura enzimática de la célula y se diferencia de las pruebas de inmunoadsorción enzimática (EIA). Las formas de aplicación disponibles incluyen ELISA directo, ELISA indirecto, ELISA directo en sándwich, ELISA puente, ELISA indirecto en sándwich y ELISA competitivo. El experto en la técnica conoce las formas y capacidades de ELISA.
En su forma actual, el "ensayo de flujo lateral" (en inglés, "Lateral-Flow-Assay") es un procedimiento bioquímico para la detección cualitativa de sustancias/antibióticos con anticuerpos. El ensayo de flujo lateral es una combinación de una cromatografía de densidades y una inmunofracción. El ensayo de flujo lateral puede utilizarse en forma de prueba.
En una versión anterior, el término "ensayo de filtración vertical", tal como se utiliza en la presente memoria, se refiere a la inmovilización de ligandos o antígenos con una membrana durante la investigación. La diferencia entre el ensayo de flujo lateral y el ensayo de filtración vertical es la diferencia entre el flujo lateral y el flujo vertical. La diferencia entre el ensayo de flujo lateral y el ensayo de filtración vertical estriba en la fluidez de la prueba entre el flujo lateral y el flujo vertical. La tecnología de flujo vertical presenta algunas ventajas frente al ensayo de flujo lateral, por ejemplo, la posibilidad de realizar ensayos más precisos.
El término "ensayo de inmunofiltración en 3D", tal como se utiliza en la presente memoria, se refiere a una prueba inmunológica en formato de ensayo de flujo lateral, que se basa en el mismo proceso bioquímico de análisis mediante estructuras de sensores que el ensayo de flujo lateral. La diferencia radica en que las sondas y los antígenos, así como los conjugados y los lavados de superficie, se introducen secuencialmente en un molde poroso de tres dimensiones, inmovilizado al anticuerpo de captura. Todas las soluciones y sus componentes, como los analizadores/instrumentos y los dispositivos de detección, se aplican en el ámbito de los formularios. Aprovechando los efectos de enriquecimiento, es posible aumentar los límites de detección.
En una forma de presentación actualizada, el símbolo "Lineblot" se refiere a un ensayo en el que un antígeno casi idéntico se encuentra en una posición casi incorrecta en la línea de prueba. La fabricación de probetas de ensayo individuales se describe en el apartado técnico. Si en la sonda se encuentra un anticuerpo, entonces su complejo con el antígeno puede cambiar de color. La visualización se realiza de forma visual o mediante la lectura intensiva de las bandas. La muestra de prueba puede contener un control positivo en forma de banda, que aparece cuando se inyecta suero en la muestra de prueba, independientemente de si éste contiene los análisis mencionados.
En su forma actual, el término "ensayo con microesferas" se refiere a una prueba en la que se utiliza como cebo una microesfera, o una microesfera magnética, y en la que se inmoviliza un reactivo de búsqueda, o un anticuerpo contra un antígeno de Trichinella. La eliminación de los complejos anticuerpo-antígeno puede realizarse mediante quimioluminiscencia con la ayuda de un segundo anticuerpo que, mediante quimioluminiscencia, emita una señal más potente. La perla es preferiblemente químicamente inerte y comprende carbohidratos inertes.
En las versiones anteriores de los reglamentos de aplicación, estos reglamentos contienen los siguientes elementos:
(a) Proporcionar un vehículo de detección que comprende un primer anticuerpo contra uno o más antígenos de Trichinella;
(b) ponerse en contacto con el portador de la evidencia con la muestra;
(c) (i) el contacto con el notificador y la entrega de un material de prueba con un segundo anticuerpo contra uno o varios antígenos deTrichinella,a condición de que el segundo anticuerpo esté incluido en una célula de señalización y que se mida la presencia deTrichinellaen la sonda a partir de una de las señales de la célula de señalización; o bien
(c)(ii) ponerse en contacto con el Portador de evidencia y, en su caso, adjuntar material de prueba con uno o varios antígenos deTrichinella,a condición de que los antígenos mencionados en (c)(ii) se adjunten a una célula señalizadora y sean de tal naturaleza que se produzca una unión del antígeno mencionado en (a) con el primer anticuerpo a través de una reacción competitiva, a condición de que se confirme la presencia deTrichinellaen la célula señalizadora.
En otras realizaciones preferentes, tiene lugar una etapa de lavado después de las etapas de contacto (b), (c)(i) y (c)(ii).
Por otra parte, en las formas de aplicación de las normas, el uso y los kits, la herramienta de señalización puede utilizarse con técnicas analíticas, como la fluorescencia, la quimioluminiscencia, la radioactividad, la espinoresonancia electrónica, la espectroscopia de absorción ultravioleta/de luz intensa, la espectrometría de masas, la espinoresonancia Kerns, la magnetorresonancia y los procedimientos de medición electroquímicos.
Existen varios antígenos de laTrichinellaconocidos desde el punto de vista técnico. El antígeno es preferiblemente Tyvelosa.
El primer y el segundo anticuerpo están relacionados con diferentes epitopos de los antígenos.
En otras formas de administración posteriores, el primer y/o segundo anticuerpo del grupo se compone de un anticuerpo que se opone a una modificación postraduccional (por ejemplo, en una proteína de sustrato), que se opone a una molécula de Tyvelosa, un anticuerpo que se opone a un antígeno excretor-secretor (E/S) deTrichinella,y un anticuerpo que se opone a un lisado deTrichinella spiralis.
El término "anticuerpo", tal y como se utiliza en la presente memoria, se refiere a las proteínas de la clase de la globulina, que se encuentran en los tejidos como reacción a diferentes sustancias, denominadas antígenos. Los anticuerpos son componentes de los sistemas inmunitarios. Los anticuerpos se producen a partir de un tipo de células blandas, los linfocitos B. Pueden diferenciarse en varios tipos, como la inmunoglobulina A, la inmunoglobulina D, la inmunoglobulina E, la inmunoglobulina G, la inmunoglobulina M, la inmunoglobulina W y la inmunoglobulina Y. En versiones anteriores, el primer y/o segundo anticuerpo era la inmunoglobulina G.
Los anticuerpos utilizados en las formas de presentación anteriores proceden de un grupo compuesto por un anticuerpo con una secuencia VH similar a la SEQ ID NÚM.:1 y una secuencia VL similar a la SEQ ID NÚM.:2, un anticuerpo con una secuencia VH similar a la SEQ ID NÚM.:3 y una secuencia VL similar a la SEQ ID NÚM.:4, el anticuerpo 18H1(IgG2a), que se une a la Tyvelosa y se describe en [11], y sus variantes.
El término "Variante", tal y como se utiliza en la presente memoria, se refiere al anticuerpos y a las secuencias VH- y VL, que tienen una homología de al menos el 70%, al menos el 75%, al menos el 80%, al menos el 85%, al menos el 90%, al menos el 95%, al menos el 97% o al menos el 99% con respecto a los anticuerpos de referencia o a las secuencias de referencia. Sólo se utilizarán variantes que tengan actividad biológica. La "actividad biológica", tal y como se utiliza en este contexto, significa, en particular, que el péptido en cuestión tiene una actividad de al menos el 30 %, al menos el 40 %, al menos el 50 %, al menos el 60 %, al menos el 70 %, al menos el 80 %, al menos el 90 %, al menos el 95 % de su índice de actividad específico, así como el porcentaje de referencia. Pueden utilizarse fragmentos funcionales o derivados de anticuerpos o variantes de los mismos, por ejemplo Fab, F(ab'), Fr, ScTv y dAb o aptámeros con una actividad biológica similar.
La muestra de extracto de tejido se tritura exclusivamente de forma mecánica. Esto significa que no existe ningún paso de trituración que se lleve a cabo química y/o enzimáticamente utilizando moléculas o compuestos añadidos externamente al proceso. En otras formas de tratamiento anteriores, el procedimiento no contiene ninguna molécula química y/o enzimática externa, de modo que la actividad proteolítica es mayor que la cuarta, la décima o la doble de la actividad intermedia proteolítica.
En otra realización preferida del procedimiento de acuerdo con la invención, la muestra de extracto de tejido contiene al menos 30 %, al menos 35 %, al menos 40 %, al menos 45 %, al menos 50 %, al menos 55 %, al menos 60 %, al menos 65 %, al menos 70 %, al menos 75 %, al menos 80 %, al menos 85 %, al menos 90 %, al menos 95 %, al menos 97 % o al menos 99 % de todas las proteasas interfaces no escindidas. Estas Proteasas tienen una actividad hidrolítica frente a las uniones peptídicas y pertenecen a la clase EC 3.4. En otras formas de aplicación de las normas de detección, las concentraciones mínimas son del 30%, del 35%, del 40%, del 45%, del 50%, del 55%, del 60%, del 65%, del 70%, del 75%, al menos el 80%, al menos el 85%, al menos el 90%, al menos el 95%, al menos el 97% o al menos el 99% de interfaces de pepsina, quimosina, catepsina E, papaína, catepsina K, caspasa, calpaína, peptidasa escitalidoglutámica, termolisina, colagenasas, carboxipeptidasa A. Por ejemplo, quimotripsina, plasmina, trombina, tripsina, granzimas y/o calicreína no se escinden.
En una forma de aplicación más reciente de los procedimientos de búsqueda, los porcentajes mínimos del 30%, el 35%, el 40%, el 45%, el 50%, el 55%, el 60%, el 65%, el 70%, el 75%, el 80%, el 85%, el 90%, el 95%, el 97% o el 99% de los porcentajes de pepsina, quimosina, quimotripsina y/o tripsina no están presentes. Sin embargo, en la prueba de alcoholemia no se han detectado más de un 30%, más de un 35%, más de un 40%, más de un 45%, más de un 50%, más de un 55%, más de un 60%, más de un 65%, más de un 70%, más de un 75%, más de un 80%, más de un 85%, más de un 90%, más de un 95%, más de un 97% o más de un 99% de células de pepsina.
Las células de las denominadas peptidasas son de naturaleza técnica, como por ejemplo https://web.expasy.Org/peptide_cutter/peptidecutter_enzymes.html#Pepsy, por lo tanto, están incluidos en la descripción.
La determinación de la identidad/homología de las secuencias de nucleótidos o aminoácidos se realiza mediante una comparación de secuencias. Esta comparación de secuencias se basa en el algoritmo BLAST (vgl. [12] y [13]) y, en principio, se basa en el hecho de que los distintos tipos de compuestos de nucleótidos o aminoácidos en las secuencias de nucleótidos o aminoácidos están relacionados entre sí. Se denomina alineación a un orden tabular de las posiciones indicadas. El algoritmo FASTA es otro de los algoritmos más fiables de la técnica. Las Comparaciones Secuenciales (Alineaciones), especialmente las Comparaciones Secuenciales Múltiples, se obtienen mediante programas informáticos. A menudo se utilizan, por ejemplo, Clustal-Serie (véase el ejemplo [14]), T-Coffee (véase el ejemplo [15]) o programas basados en estos algoritmos. También es posible realizar comparaciones de secuencias (alineaciones) con el programa informático Vector NTI® Suite 10.3 (Invitrogen Corporation, 1600 Faraday Avenue, Carlsbad, California, EE.UU.) con los parámetros estándar recomendados, cuyo módulo AlignX para comparaciones de secuencias se basa en ClustalW.
Esta comparación también incluye una evaluación de la similitud de las secuencias anteriores. Se trata de un porcentaje de identidad, es decir, la cantidad de nucleótidos o aminoácidos idénticos que se encuentran en una misma posición o en una alineación distinta. El término más conocido de homología se refiere a los compuestos de aminoácidos que se obtienen a partir de la mezcla de aminoácidos con una actividad química diferente, ya que estos compuestos dentro de las proteínas tienen actividades químicas similares. Por lo tanto, la similitud de las secuencias también puede ser de un porcentaje de similitud o de un porcentaje de similitud. Los marcadores de identidad y/o de homología pueden obtenerse para todos los polipéptidos o genes, o sólo para algunas áreas. Las secuencias de nucleótidos o aminoácidos homólogas o idénticas se definen mediante escisiones en las secuencias. Estas áreas suelen tener funciones idénticas. Pueden ser pequeñas y contener sólo unos pocos nucleótidos o aminoácidos. A menudo, estos pequeños componentes son esenciales para el funcionamiento general de las proteínas. Por lo tanto, no es necesario que las secuencias se basen únicamente en pequeñas áreas individuales. Si bien no se han descrito de otro modo, los indicadores de identidad u homogeneidad de la siguiente lista se basan en los resultados de las pruebas de nucleótidos o aminoácidos descritas anteriormente.
La expresión "de tal manera que se vincula el antígeno con el anticuerpo mediante la restricción de la competencia", tal y como se utiliza en la presente memoria, se refiere a los antígenos que se vinculan con antígenos ya existentes a un anticuerpo determinado. Los antígenos competitivos presentan una similitud estructural y, por lo tanto, pueden ser considerados como análogos estructurales. El antígeno verde puede tener una mayor afinidad con el anticuerpo que el antígeno verde y/o el antígeno verde se encuentra en mayor concentración que el antígeno verde.
El término "antígeno", tal y como se utiliza en la presente memoria, se refiere principalmente a los antígenos que pueden unirse de forma específica a los anticuerpos y a los receptores linfocitarios específicos. Los antígenos pueden ser proteínas, pero también glicoproteínas, carbohidratos, lípidos u otras sustancias. Por lo general, los antígenos son proteínas o proteínas modificadas postraduccionalmente.
Más allá de lo descrito en la presente memoria y sin formar parte del hallazgo, está el uso de uno de los sistemas de detección para detectar la presencia deTrichinella,a condición de que el sistema de detección (a) cuente con un anticuerpo contra una o variasTrichinella, y (b)(i) cuente con un segundo anticuerpo contra una o variasTrichinella,(b)(ii) uno o varios Antígenos de Trichinella que están unidos a una molécula señal, donde los antígenos de (b)(ii) están diseñados de tal manera que liberan una unión de los antígenos de (a) al primer anticuerpo mediante desplazamiento competitivo.
El término "sistema de evidencia", tal y como se utiliza en la presente memoria, se refiere a (a) un portador de evidencia, tal y como se define en la presente memoria, y (b) uno o más antígenos o anticuerpos incluidos en un molécula de señalización. Los componentes de (a) y (b) se combinan de forma sinérgica, de modo que la penetración de uno de los antígenos objeto de estudio da lugar a un complejo de unión de todas las moléculas que lo componen, el cual, debido a la intensidad de las señales, permite la detección de los antígenos objeto de estudio en una sonda.
El término "portador de evidencia", tal y como se utiliza en la presente memoria, se refiere a una cepa que contiene un antibiótico contra uno o varios antibióticos deTrichinella.El transportador puede ser un buen soporte, como un portaobjetos, una Placa de 6 pocillos, 12 pocillos, 96 pocillos o 384 pocillos, una Membrana, o una Membrana de Nitrocelulosa, un Material de Filtro, una Cuenta, o una Cuenta Magnética o un Material de Cromatografía en Capa Fina. Alternativamente, el controlador puede ser también una perla, si el diámetro de la misma es inferior a 1000 pm, 800 pm, 600 pm, 400 pm, 200 pm, 100 pm, 90 pm, 80 pm, 70 pm, 60 pm, 50 pm, 40 pm, 30 pm, 20 pm, 10 pm o 5 pm. El fabricante puede seleccionar entre materiales sintéticos, vidrio, metal o una combinación de ellos.
De acuerdo con lo descrito en este punto y sin formar parte de la determinación, un kit debe contener (a) un anticuerpo contra uno o más antígenos deTrichinella, y (b)(i) uno o más antígenos deTrichinella, (b)(ii) uno o varios Antígenos de Trichinella que están unidos a una molécula señal, donde los antígenos de (b)(ii) están diseñados de tal manera que liberan una unión de los antígenos de (a) al primer anticuerpo mediante desplazamiento competitivo.
El término "kit", tal como se utiliza en la presente memoria, se refiere a un envase que contiene componentes (p. ej., una caja de cartón, botellas, platos, tubos, cuencos, etc.), que contienen cada uno un material específico, en el presente caso en particular un soporte de detección como se define en la presente memoria y un antígeno o anticuerpo unido a una molécula señal. Por lo general, el kit incluye un manual de instrucciones para el uso de los materiales mencionados anteriormente. El manual de instrucciones puede estar escrito o impreso en papel o en cualquier otro soporte, o puede presentarse en forma de medios electrónicos, como una banda magnética, un disco duro o una banda de CD-ROM. El Kit incluye un Control Positivo, provisto de un antígeno diferente y/o sondas para la calibración o el establecimiento de una curva de calibración.
Este kit contiene una descripción de un procedimiento de detección deTrichinella.
LaFig. 1muestra la proteína E/S de una larva deTrichinella spiralisaislada. La proteína E/S de las larvas se encuentra en el envase y en el resto del producto. Las proteínas se incorporan al material de prueba mediante la filtración de las membranas mucosas.
LaFig. 2muestra un esquema de tinción delELISA de captura de antígeno de Trichinella.1)Anti-Trichinella-AKC9inmovilizado en una placa de microtitulación, 2) Sonda(antígeno de Trichinella),3) Prueba-AK B7 biotinilado, unido a estreptavidina con PolyHRP80.
LaFig.3muestra la inmunidad parcial de la masa de la aguja con la boquilla GM200 de Retsch. 100 x 1 g Los músculos del pilar del diafragma se trituraron con 200 ml de PBS en el GM200 a 10.000 rpm durante 6 o 9 minutos. El tamaño de partícula se representa frente a Q3[%] (porcentaje en volumen). Cada vez se midieron aproximadamente 60 millones de partículas. A) Determinación del tamaño de partícula con el Camsizer®XT. norte=3. B) Determinación del tamaño de partícula con HORIBA LA-960. n=1.
LaFig. 4muestra una imagen de cada pieza de plástico durante el funcionamiento con el Camsizer®XT. La forma no suele ser redonda, sino muy fibrosa y alargada, por lo que la relación ancho/largo disminuye.
LaFig. 5Muestra la prueba de los anticuerpos anti-[TRISP][B7] y anti-[TRISP][C9] para la detección de Trichinella. A)-D)T. espiralis-IIFT(prueba de inmunofluorescencia indirecta): Se incubaron Ak B7 y AK C9 con una concentración de 2 |jg/ml. A) B) Incubación con AK B7: La AK muestra una clara reacción tanto en la larva de Trichinella encapsulada en corte transversal como en la larva muscular; C) D) Incubación con AK C9: Al igual que B7, la AK muestra una reacción clara tanto en la larva de Trichinella encapsulada en corte transversal como en la larva muscular; E) Western blot: se aplicaron 5 jg de lisado deT. espiralisy la incubación se realizó con AK B7 y AK C9 (concentración 0,4 jg/ml).
LaFig.6muestra la prueba de la especificidad de los anticuerpos anti-TRISP[B7] y anti-TRISP[C9] mediante Western blot. Carril 1) Trypanosoma cruzi, 2) Ascaris suum, 3) Strongyloides ratti, 4) Toxocara cati, 5) Toxoplasma gondii, 6) Salmonella typhimurium, 7) Salmonella cholerasuis cepa A, 8) Salmonella cholerasuis cepa B, 9) Salmonella typhisuis, 10) Trichuris suis, 11)Trichinella espiralis.Aplicado: 5 jg de lisado cada uno. Incubación con AK B7 (concentración 0,4 jg/ml, 2 h).
LaFig. 7muestra los resultados del ELISA de captura de antígeno deT. espiralis.A) Límite de detección del ELISA de captura de antígeno deT. espiralis.Se representan gráficamente diferentes concentraciones de antígeno E/S frente a la D.O. B) ELISA de captura de antígeno deT. espiraliscon antígeno E/S, extracto de tejido positivo y negativo como material de muestra. Había aproximadamente 100 larvas de Trichinella encapsuladas en la muestra de extracto de tejido positivo. Línea discontinua: corte.
LaFig. 8muestra los resultados del ELISA de captura de antígeno deT. espiraliscon extracto de tejido positivo y negativo como material de muestra. Había aproximadamente 100 larvas de Trichinella encapsuladas en el extracto de tejido positivo. El material de muestra se trituró durante 3, 6 y 9 minutos. Línea discontinua: corte. n=3
LaFig. 9muestra un esquema de incubación del inmunoensayo de quimioluminiscencia de Trichinella incubado manualmente. 1) Ab 18H1 de captura anti-Trichinella inmovilizado en una perla magnética, 2) muestra (antígeno de Trichinella), 3) Ab B7 de detección anti-Trichinella biotinilado, 4) reactivo de extravidina/acridinio.
LaFig. 10muestra el esquema de procesamiento del analizador de quimioluminiscencia para el inmunoensayo de quimioluminiscencia automatizado de Trichinella. La varilla magnética transporta sucesivamente las perlas inmovilizadas con Anti-Trichinella AK 18H1 a recipientes de reacción llenos de diversos reactivos. La muestra y el disparador B se añaden automáticamente.
LaFig. 11muestra los resultados del inmunoensayo de quimioluminiscencia automatizado de Trichinella. Los tamaños de partículas de la carne de cerdo picada se midieron después de 2, 3, 5 y 7 minutos usando el analizador de tamaño de partículas LA-960 de HORIBA. Además, se picaron muestras de carne, negativas y enriquecidas con 6, 13 y 30 larvas de Trichinella, durante entre 2 y 7 min. El extracto de tejido resultante se incubó con el CLIA automatizado. Los resultados se dan en unidades relativas de luminosidad (RLU).
Secuencias:
En el presente estudio se han detectado diversos componentes peptídicos, en particular
SEQ ID NÚM.:1(Anti-[TRISP][B7] VH):
AVTLDESGGGLQTPRGGLSLVCKASGYTFSSHNMAWVRQAPGKGLEFVAGISNTGSFTLYGAAVKGRATISRDNGQ STVRLQLNNLRAEDTGTYCAKHAGVGLYSIDAWGHGTEVIVSS
SEQ ID NÚM.:2(Anti-[TRISP][B7] VL):
ALTQPSSVSANLGGTVKITCSGGTSDYGWYQKAPGSAPVTLIYDNTNRPSDIPSRFSGSLSGSTNTLTITGVQAEDEA VYFCGSADRTYAGVFGAGTTLTVL
SEQ ID NÚM.:3(ANTI-[TRISP][C9] VH):
AVTLDESGGGLQTPGGALSLVCKASGFSISSMQWVRQAPGKGLEWVAGIYYDGNTWYAPAVKGRATISRDNGQSTV RLRLNNLRAEDTATYFCAKYAGGYSIDAWGHGTEVIVSS
SEQ ID NÚM.:4(ANTI-[TRISP][C9] VL):
ALTQPSSVSANPGETVKITCSGSSGSYGWYQKSPGSGPVTVIYYNDKRPSDIPSRFSGSASGSTATLTITGVQAEDEA VYFCGGYDSSTYVGIFGAGTTLTVL
SEQ ID NÚM.:5(ANTI-[TRISP][18H1] VH):
QVQLKESGPGLVQPSQTLSLTCTVSGLSLTSNSVGWIRQPPGKGLEWMGIIWSNGGTDYNSAIKSRLSISRDTSKSQ VFLKMHSLQTEDTAMYFCARGPYYGSYRLGYFDYWGQGVMVTVSS
SEQ ID NÚM.:6(ANTI-[TRISP][18H1] VL):
DVVMTQSPSSLAVSAGETVTLNCQSSQSLLYSGTQNNYLAWYQQKPGQSPKLLISWASTRQSGVPLRFIGSGSGTD FTLTITSVQAEDLAIYYCQQFYDTPLTFGSGTKLEIK
Los resultados anteriores se ilustrarán con ejemplos no coincidentes, que permitirán determinar otros aspectos, formas de aplicación, aspectos y ventajas de los resultados anteriores.
Ejemplo 1: Material y procedimientos
Material
Procedimientos
Procedimientos para la obtención de permisos de trabajo en Internet
En el siguiente procedimiento de desinfección, el tejido no se desinfectará enzimáticamente, sino que se desinfectará mecánicamente. De este modo, el tamaño parcial de los flecos será < 200 pm. Las larvas, con la cápsula de colágeno, miden entre 200 y 600 pm de longitud y entre 200 y 300 pm de anchura, por lo que, con un tamaño de partícula superior a 200 pm, laslarvas de Trichinellaetiquetadas deben ser detectadas al menos una vez por la aguja de la criba. En el envase se encuentran varias proteínas E/S que, una vez extraídas, quedan libres en el material de prueba (figura 1). La proteína somática puede ser detectada mediante la extracción de la larva.
En combinación con el corte se realiza un análisis de antígeno en forma de unELISA de captura de antígenoo de un inmunoensayo de quimioluminiscencia manual o automático.
Preparación de muestras
En el matadero es habitual retirar unos 5 g de carne por animal. La muestra suele tomarse de la parte muscular del diafragma de un animal que ya ha sido sacrificado. Para la prueba de trichinella, se utiliza 1 g de material de muestra por cerdo. En otros casos, como el cáncer o la hiperplasia prostática Benigna, la probabilidad varía. Como regla general, se combinan 100 muestras de cerdos, lo que da como resultado un tamaño de muestra de 100 x 1 g. La muestra se enfría a 4 °C.
Molienda de las muestras de carne.
El material de muestra (100 x 1 g de carne) se colocó en el recipiente de trituración de una trituradora que había sido preenfriado a 4°C. Puedes utilizar el molinillo grindomix GM 200 de Retsch. El principio de trituración se basa en cortar la muestra. El molino de cuchillas puede equiparse con una cuchilla dentada para poder picar finamente también materiales fibrosos como, por ejemplo, tejido muscular. Para la sonda, utilice 200 ml de PBS a 4°C. A 10.000 rpm. y, por tanto, con la máxima potencia, el material de prueba fue como se indica a continuación, por ejemplo. 9 minutos de duración, picado.
Con el fin de comprobar si la molienda de la carne era satisfactoria, se llevó a cabo una medición parcial con el Camsizer®XT de la empresa Retsch y el LA-960 de la empresa HORIBA. El LA-960 se basa en el principio de funcionamiento del tratamiento láser estadístico, mientras que Camsizer®XT se basa en un análisis de imagen dinámico. Se tomaron tres muestras de carne después de 6 minutos y 9 minutos respectivamente y se midieron inmediatamente después. Se midieron una media de 60 millones de partículas. El tamaño de partícula se midió en xc min y se definió de la siguiente manera según DIN 66141 de la siguiente manera: Diámetro de partícula más corto de las mediciones del diámetro máximo dentro de una proyección de partícula (en español:diámetro de partícula que es la cuerda más corta del conjunto medido de cuerdas máximas de una proyección de partícula)[8].
Centrifugación
Después de la extracción, la sonda de 1 ml a 15 ml del muestreador se conectó a una pipeta. La sedimentación de la parte grande en la sonda se realizó mediante centrifugación durante 10 minutos a 5.000 x g y 4 °C. El resto de la muestra después de la sedimentación es el material de prueba para la siguiente prueba de detección de antígenos y se denomina extracto de membrana. El soporte después de la sedimentación es el material de prueba para la siguiente determinación del antígeno y se denomina extracto de membrana.
Procedimiento para detectarTrichinella espiralisa partir de muestras de extractos de tejido.
Preparación del material de muestra.
Lisado deT. espiralis
Las larvas de músculo (ML) deT. espiralisfueron proporcionadas por Justyna Bien del Instituto PAS Witold Stefanski de Varsovia. Se centrifugaron 120.000 ml durante 10 minutos a 16.000 x g a temperatura ambiente (TA) para que se sedimentaran todas las larvas. Se descartó el sobrenadante y se añadió 1 ml de PBS. Utilizar las torres de perforación y homogeneidad manualmente. A continuación, se analizaron las muestras con ultrasonidos: 20 ciclos de 5 segundos cada uno a intensidad media y un descanso de 5 segundos en hielo entre tratamientos. Se realiza una centrifugación continua de 20 minutos a 16.000 xg y 4°C. El sobrenadante representa el antígeno lisado deT. espiralis.
Antígeno E/S
El antígeno E/S deT. spiralisML fue desarrollado por Justyna Bien del Instituto Witold Stefanski PAS de Varsovia.
Producción de anticuerpos.
Los anticuerpos utilizados para el ELISA de captura de antigeno se han desarrollado mediante el procedimiento Phage Display [9]. Las secuencias de las regiones variables de las cadenas pesada y ligera (VH y VL) de los dos anticuerpos anti-[TRISP][B7] y anti-[TRISP][C9] (abreviados: AK B7 y AK C9) son las siguientes:
Anti-[TRISP][B7] VH (SEQ ID NUM.:1):
AVTLDESGGGLQTPRGGLSLVCKASGYTFSSHNMAWVRQAPGKGLEFVAGISNTGSFTLYGAAVKGRATISRDNGQ STVRLQLNNLRAEDTGTYCAKHAGVGLYSIDAWGHGTEVIVSS
Anti-[TRISP][B7] VL (SEQ ID NUM.:2):
ALTQPSSVSANLGGTVKITCSGGTSDYGWYQKAPGSAPVTLIYDNTNRPSDIPSRFSGSLSGSTNTLTITGVQAEDEA VYFCGSADRTYAGVFGAGTTLTVL
ANTI-[TRISP][C9] VH (SEQ ID NUM.:3):
AVTLDESGGGLQTPGGALSLVCKASGFSISSMQWVRQAPGKGLEWVAGIYYDGNTWYAPAVKGRATISRDNGQSTV RLRLNNLRAEDTATYFCAKYAGGYSIDAWGHGTEVIVSS
ANTI-[TRISP][C9] VL (SEQ ID NUM.:4):
ALTQPSSVSANPGETVKITCSGSSGSYGWYQKSPGSGPVTVIYYNDKRPSDIPSRFSGSASGSTATLTITGVQAEDEA VYFCGGYDSSTYVGIFGAGTTLTVL
Biotinilación de anticuerpos Anti-[TRISP][B7]
El AK B7 se utilizó para elELISA de captura de antígenocon EZ-Link™ NHS-PEG12-Biotin en una cubeta de 20 moléculas durante un periodo de tiempo a temperatura ambiente en el rotador de ensayo. Para eliminar la biotina de forma segura, el anticuerpo (AK) se colocó, siguiendo las instrucciones del fabricante, sobre una columna de cromatografía de alta resolución (Zeba™ Spin Desalting Columns).
SDS PAGE y análisis Western blot
Para la SDS PAGE, se utilizaron 5 |jg de cada uno de lisado deT. espiraliso lisado de Trypanosoma cruzi, Ascaris suum, Strongyloides ratti, Toxocara cati, Toxoplasma gondii, Salmonella typhimurium, Salmonella cholerasuis cepa A, Salmonella cholerasuis cepa B, Salmonella typhisuis y Trichuris suis. Se cargó un gel de poliacrilamida utilizado y se realizó electroforesis durante 50 min a 175 V en tampón MOPS. La transferencia se realizó sobre una membrana de nitrocelulosa durante 60 min a 400 mA en tampón de transferencia. Para el bloqueo, la membrana se incubó en Wash Buffer Plus durante 30 minutos en un agitador basculante. Después se aplicaron AK B7 y C9 en tampón de lavado Plus a una concentración de 0,4 jg/m l y se incubaron durante la noche en el agitador basculante. Después de lavar con tampón de lavado, la membrana se incubó con el conjugado enzimático “IgG antihumana marcada con fosfatasa alcalina” de EUROIMMUN diluido en tampón de lavado Plus. Finalmente, después de otro paso de lavado, se añadió la solución de sustrato (NBT/BCIP) y se incubó hasta que se observó un cambio de color claro.
Prueba de inmunofluorescencia indirecta
Para comprobar qué estructuras se unen a los anticuerpos desarrollados, se desarrolló una prueba de inmunofluorescencia indirecta paraT. espiralis.Los BIOCHIPS se cargaron con secciones congeladas de larvas de músculo deT. espiralisy larvas encapsuladas. La incubación y la microscopía se llevaron a cabo según las instrucciones del IIFT Anti-Schistosoma mansoni de EUROIMMUN (n.° de pedido FI 2300-1005 G). Se añadieron AK B7 y C9 al BIOCHIPS como muestra a una concentración de 2 pg/ml.
Detección de antígenos mediante ELISA de captura de antígenos
Para la determinación del antígeno se utilizó como procedimiento de referencia unensayo inmunoenzimático(ELISA). Se utilizó una placa de 96 pocillos con 0,25 pg/ml de AK C9 en PBS durante la noche a 4°C. El último día, la placa de microtitulación se mezcló una vez con PBST (PBS 0,05% de Tween-20), se bloqueó con una esponja de bloqueo durante 2 horas y, a continuación, se cerró durante 2 horas.
Como prueba de los antígenos unidos a AK C9, se prepararon juntos AK B7 con una concentración de 0,05 pg/ml y estreptavidina-poliHRP80 con una concentración de 0,1 pg/ml en tampón de dilución de AK y se incubaron durante la noche.
Incubación de muestras
La incubación se realizó de acuerdo con el esquema descrito en la figura 2. Como pruebas se utilizaron los antígenos E/S deT. spiralisen distintas concentraciones (0-50 ng/ml) y se extrajeron muestras de sangre en un volumen de 100 pl en la placa de microtitulación. La incubación se realizó durante una hora a temperatura ambiente en una cámara de rotación. La sonda de muestreo "positiva" se construyó cuando, después de la extracción, se observó que el polvo de Trichinella era negativo, ya que en la sonda había unos 100 restos deTrichinella.
Después de un breve lavado con una ampolla de lavado, se inyectó el conjugado con un volumen de 100 pl durante un período de tiempo a temperatura ambiente en un escurridor rotatorio. Luego se lavó nuevamente seis veces y se aplicó el sustrato. Después de 15 minutos se terminó la reacción con un tope y se determinó la densidad óptica (D.O.) de las probetas con un fotómetro a una longitud de onda de 450 nm.
Ejemplo 2: Resultados
Molienda de las muestras de carne
Inmediatamente después de moler la carne de cerdo con el molino de cuchillas GM200, se realizó la determinación del tamaño de partícula con el Camsizer®XT y el HORIBA LA-960. El muestreo tuvo lugar después de 6 o 9 minutos. Los resultados de la distribución de masa se pueden ver en la Figura 3, donde el tamaño de partícula [pm] se representa en un diagrama frente a Q3 [%]. Q3 es el porcentaje de partículas menores que x en relación al volumen total. Dado que los dos dispositivos de medición del tamaño de partículas se basan en procedimientos de medición diferentes, los resultados difieren.
Los resultados de la medición con el HORIBA LA-960 muestran que el 95% de las partículas son < 26 pm y todas las partículas son < 100 pm. Con la medición Camsizer®XT, el 95% de las partículas son < 300 pm. Sólo el 70% de las partículas de carne son <100 pm. La Figura 4 muestra un ejemplo de la forma de las partículas de carne. Las fibras musculares y las miofibrillas hacen que la estructura sea muy fibrosa, lo que reduce significativamente la relación ancho-largo.
En cualquier caso, estadísticamente, la cápsula de colágenode la larva de Trichinella,si está disponible, sólo puede ser afectada una vez por el microorganismo, ya que las proteínas E/S pueden estar presentes. Estas proteínas libres se detectan en el siguiente paso mediante unELISA de captura de antígeno.
Preparación del material de muestra y de los anticuerpos
Para determinar si los anticuerpos Anti-[TRISP][B7] y Anti-[TRISP][C9] son adecuados para una prueba de detección de antígenosde T. spiralis,se utilizó como prueba de funcionamiento una prueba de inmunofluorescencia indirecta (IIFT) y una prueba Western blot. Los resultados se muestran en la Figura 5.
Con el uso de AK B7, la capa anestésica se vuelve más fluorescente (Figura 5 A). Las larvas del interior y las distintas proteínas de la capa externa presentan la misma fluorescencia. El corte transversal de la membrana mucosa muestra una reacción muy intensa en la membrana superior (figura 5 B).
En la sección transversal de la larva encapsulada, toda la larva emite una fluorescencia más intensa cuando se incuba con AK C9 (Figura 5 C). Las proteínas individuales de la superficie de la cápsula y de la cápsula cortada emiten una débil fluorescencia. En la larva muscular, no sólo la membrana externa muestra una reacción clara, sino también el interior de la larva (Figura 5 D).
En el Western blot se observan también reacciones idénticas para los AK B7 y C9 (Fig. 5 E). Los dos AK muestran un patrón de bandas idéntico. Se producen bandas fuertes a aproximadamente 48, 50, 52, 60, 65 y 110 kDa. El epitopo unido al Abs parece encontrarse en varias proteínas o glicoproteínas, lo que puede tener un efecto positivo en la detección de concentraciones muy bajas de antígenos de Trichinella en el material de muestra.
Con el fin de averiguar si las proteínas AK deT. spiralisse asocian a estructuras específicas y no a estructuras antigénicas de otros parásitos y/o bacterias, se realizó una prueba de Western blot. De este modo, se obtuvieron lisados de agentes patógenos que se encuentran en los tejidos. El resultado se muestra en la figura 6. Los lisados obtenidos no contienen ninguna estructura derivada de AK B7 o AK C9. Una reacción positiva falsa puede producirse en unELISA de captura de antígenomás tardío para este agente patógeno con mayor probabilidad.
Captura de antígeno ELISA
Para el ensayo ELISA deT. spiralisse utilizaron diferentes concentraciones de antígenos E/S (Fig. 7 A). La escala de detección se sitúa en un punto de corte de 0,3 O.D. para aproximadamente 6 ng/ml.
En la Figura 7 B se muestran los resultados de las pruebas de trazado de la red que se han realizado con los procedimientos descritos anteriormente. Se utilizó tanto una sonda positiva, que contenía unas 100 larvas etiquetadas, como una sonda negativa. ElELISA de captura de antígenomuestra una diferencia de aproximadamente 2 O.D entre la muestra positiva y la negativa.
La concentración de antígeno deT. espiralisen la muestra de extracto de tejido corresponde a aproximadamente 30 ng/ml de antígeno E/S. 100 larvas encapsuladas trituradas liberan aproximadamente la misma cantidad de proteínas en el jugo de la carne que pueden detectarse mediante el ELISA de captura de antígeno.
ELISA de captura de antígenoscon material de prueba con diferentes grados de concentración
La Figura 8 muestra los resultados de la trituración después de 3, 6 y 9 minutos de extracto de tejido positivo y negativo. Se puede observar que el extracto de tejido negativo sin larvas en el material de muestra no muestra ninguna reacción significativa ya que la D.O. en el ELISA está por debajo del límite de 0,3. Sin embargo, el extracto de tejido, que se preparó a partir de carne y contenía aproximadamente 100 larvas deT. espiralisencapsuladas, muestra una reacción clara con > 1,5 D.O. Los efectos del grado de conminución son sorprendentes, ya que la reacción aumenta al aumentar el tiempo de conminución. La D.O. para la trituración de 9 minutos es 0,5 mayor que para la trituración de 3 minutos.
La reacción en ELISA es más lenta con el material de prueba inyectado a los 3 minutos que con la inyección a los 9 minutos. Una coloración más prolongada de la muestra conduce a una mayor concentración del antígenoT. spiralislibre. Con una inmovilización por inmovilización prolongada, todos loscarcinomas de Trichinellaetiquetados serán detectados, como mínimo, una vez y, en la mayoría de los casos, casi siempre por el injertador de la inmovilización por inmovilización, por lo que, en comparación con una inmovilización por inmovilización prolongada, se dispone de más antígenos detectables para ELISA en el material de prueba.
Ejemplo 3: Detección de antígenos mediante un inmunoensayo de quimioluminiscencia automatizado e incubado manualmente
Para el inmunoensayo de quimioluminiscencia (CLIA) incubado manualmente y basado en perlas, los anticuerpos de captura no se acoplaron a una placa de microtitulación, sino a perlas magnéticas. Para ello se utilizaron Dynabeads™ activados con tosilo. La superficie de poliuretano hidrófobo se activó con grupos tosilo, lo que permitió que los anticuerpos se conectaran covalentemente a las perlas. Se equilibraron 4 mg de perlas con 1 ml de tampón Tris 1 M. Se añadieron Tris 30 mM, sulfato de amonio 0,4 M y 28 |jg de anticuerpo anti-[TRISP][18H1] (abreviado: AK 18H1) a las perlas equilibradas. La incubación tuvo lugar durante la noche a 37°C en un mezclador de rodillos. Al día siguiente, las perlas se lavaron tres veces con 1 ml de StabilCoat® Plus y luego se incubaron durante la noche a 37°C en un mezclador de rodillo para bloquear cualquier grupo funcional que todavía fuera reactivo. Después del bloqueo, las perlas se recogieron en StabilCoat® Plus fresco y se almacenaron a una concentración de 1 mg/ml a 4°C hasta su uso.
Las perlas recubiertas con 18H1-AK se pipetearon en un pocillo de placa de microtitulación (placa de poliestireno NuncTM) a 10 jg cada una para CLIA. Se añadieron 100 j l de la muestra de extracto de tejido sin diluir y se incubaron durante 30 minutos en un agitador giratorio. Después del lavado automático tres veces con el limpiador de microplacas HydroFlex™, se incubaron 100 j l de B7-AK biotinilado con una concentración de 0,1 jg/m l durante 30 minutos en el agitador giratorio. A esto le siguieron tres lavados automáticos. Para la reacción de quimioluminiscencia, se añadió a las perlas el reactivo extravidina/acridinio a una concentración de 80 ng/ml y un volumen de 100 j l y se incubó durante 15 minutos. Después de tres lavados, la medición se realizó utilizando el luminómetro de microplacas Centro XS3. El luminómetro añadió automáticamente 100 j l de los activadores A y B a cada lote para iniciar la reacción de quimioluminiscencia. La emisión de luz se midió a una longitud de onda de 425 nm durante 1 segundo y se informó en unidades relativas de luz (RLU). El esquema de incubación del CLIA incubado manualmente se puede ver en la Figura 9.
El inmunoensayo de quimioluminiscencia automatizado y basado en microesferas se basa en el procedimiento CLIA de inyección manual. La diferencia radica en que la prueba se realiza con ayuda de un analizador de quimioluminiscencia automatizado (Automated Chemiluminescent Analyzer SuperFlex, PerkinElmer). Las perlas se colocan de forma inmediata en las distintas posiciones por medio de una barra magnética. La lengüeta magnética está situada en un campo eléctrico que se puede controlar y permite que las cuentas se enciendan, se apaguen y se enciendan en un intervalo predeterminado.
Para el CLIA automatizado, las muestras de extracto de tejido se cargaron en el compartimento de muestras del analizador. Los cartuchos de reactivo se llenaron como se muestra en la Figura 10. Se usaron 10 |jg de las perlas recubiertas con 18H1-AK por reacción. Estos se incubaron con 100 j l de muestra de extracto de tejido y 100 j l de Abs anti-TRISP[B7] biotinilados con una concentración de 0,25 jg/m l durante 30 minutos. Después de la incubación, las perlas se recogieron con la varilla magnética y se lavaron 3 veces en tampón de lavado (V = 400 jl). A esto le siguió una incubación de 10 minutos con 100 j l de reactivo de extravidina/acridinio a 0,1 jg/ml. Después de lavar tres veces, las perlas se colocaron en 100 j l de Trigger A y se pipeteó Trigger B (V = 100 j l ) desde el analizador para iniciar la reacción de quimioluminiscencia. La emisión de luz se midió a una longitud de onda de 425 nm durante 1 s mediante el luminómetro integrado en el analizador y se informó en unidades relativas de luminosidad (RLU).
Resultados del inmunoensayo de quimioluminiscencia (CLIA) incubados manualmente
Se incubaron diferentes concentraciones de muestras de lisado deT. espiraliscon el CLIA incubado manualmente. El límite de detección fue 1 ng/ml de lisado deT. espiralis.
Resultados del inmunoensayo de quimioluminiscencia automatizado (CLIA)
También se incubaron diversas concentraciones de muestras de lisado deT. espiraliscon el inmunoensayo de quimioluminiscencia automatizado. El límite de detección fue 10 pg/ml de lisado deT. espiralis.Además de las muestras de carne infectadas con Trichinella, también se trituraron muestras de carne mezcladas con una cantidad definida de larvas de músculo de Trichinella. Estaban equipados con de 3 a 30 larvas. El límite de detección del CLIA automatizado para la cantidad definida de larvas de músculo fue de 3 larvas por 100 gramos de carne.
La Figura 11 muestra la correlación entre el tamaño de partícula y los resultados CLIA del extracto de tejido picado y positivo para Trichinella. Se puede observar que el tamaño de partícula de la carne disminuye a medida que avanza el tiempo de picado, pero la respuesta del CLIA aumenta. A medida que avanza el picado de la carne y, por tanto, también de las larvas, se liberan cada vez más antígenos de Trichinella. Luego, CLIA puede detectarlos. Las unidades relativas de luz (RLU) también aumentan a medida que aumenta el número de larvas en la muestra de carne. El extracto de tejido positivo para Trichinella, que se creó a partir de muestras de carne mezcladas con 30 larvas, muestra después de 6 minutos de molienda una reacción que es más de tres veces más alta (150.000 RLU) que el extracto de tejido de 6 larvas (50.000 RLU).
La invención se describe en la presente memoria de forma genérica y general. Cada uno de los tipos y subgrupos más restringidos cubiertos por la divulgación genérica también forma parte de la invención. Esto incluye la descripción general de la invención con una salvedad o calificación negativa que elimina cualquier materia de un (sub)grupo, independientemente de si la materia eliminada se cita específicamente en la presente memoria o no. Otras realizaciones están incluidas en las siguientes reivindicaciones.
Un experto en la técnica debe tener claro que la experiencia adquirida es esencial para comprender los objetivos y las ventajas obtenidas, así como las dificultades que ello conlleva. Además, será fácilmente evidente para los expertos en la técnica que se pueden realizar diversas sustituciones y modificaciones a la invención aquí descrita sin apartarse de la invención. Los procedimientos descritos en la presente memoria son representativos de formas de aplicación anteriores, que son ejemplares y no se consideran reflejo del entorno en el que se producen. El usuario no tendrá en cuenta las modificaciones y otros usos que se hayan establecido en el momento de la búsqueda y definido en el momento de las respuestas. La enumeración o discusión de los documentos publicados con anterioridad en esta descripción no se considerará como una indicación de que el documento se refiere a la técnica o a una cuestión general.
La invención descrita ilustrativamente en la presente memoria puede realizarse adecuadamente en ausencia de cualquier elemento o limitación no divulgada específicamente en el presente documento. Así, por ejemplo, los campos "sin asignar", "asignado", "con asignación", etc. están asignados sin asignar y sin asignación. En consecuencia, se entiende que la palabra "comprende" o variaciones tales como "comprende" o "que comprende" están implícitas, es decir, por ejemplo, que los números especificados están incluidos pero no excluidos. Por lo tanto, las indicaciones y referencias aquí utilizadas son indicaciones y referencias de la descripción y no de la descripción, y no es posible utilizar dichas indicaciones y referencias para describir cualquier equivalente de las mercancías o elementos descritos y descritos. Es decir, son posibles diversas modificaciones dentro del alcance de la invención reivindicada. Por lo tanto, debe entenderse que, en caso de que las conclusiones anteriores se basen en ejemplos de formas de ejecución y en opciones específicas, las modificaciones y variaciones de las conclusiones, que en la presente memoria se exponen, pueden ser aplicadas por expertos del sector, y que dichas modificaciones y variaciones pueden ser aplicadas dentro de los límites de la protección de las conclusiones.
Abreviaturas
Bibliografía
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Claims (7)

  1. REIVINDICACIONES
    1 . Procedimiento para la detección deTrichinellaen una muestra de extracto de tejido, en el que al menos 90 % de las partículas en la muestra de extracto de tejido tienen un diámetro de 200 |jm o menos (D90 < 200 |jm) y en el que no se lleva a cabo escisión enzimática y/o química del tejido durante la producción de la muestra de extracto de tejido.
  2. 2. El procedimiento de acuerdo con la reivindicación 1, en el que la muestra de extracto de tejido es una muestra de mamífero, preferentemente una muestra de un cerdo.
  3. 3. El procedimiento de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 o 2, en el que la muestra de extracto de tejido es de músculo.
  4. 4. El procedimiento de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en el que durante la producción de la muestra de extracto de tejido no se supera una temperatura de 45 °C, preferentemente 40 °C.
  5. 5. El procedimiento de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en el que el procedimiento (a) no contiene ningún microprocesador;
    (b) se utiliza en el contexto de la inspección de la carne; y o
    (c) tiene un límite de detección de <7 ng de antígeno por ml de extracto de tejido.
  6. 6. El procedimiento de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en el que el procedimiento se lleva a cabo mediante un inmunoensayo, preferentemente mediante un ELISA, ensayo de flujo lateral, ensayo de transferencia lineal, ensayo de Western blot, ensayo basado en perlas, ensayo de filtración vertical o ensayo de inmunofiltración 3D.
  7. 7. El procedimiento de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, en el queTrichinellaesTrichinella espiralis.
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