ES2965777T3

ES2965777T3 - Síntesis enzimática de ácidos L-nucleicos

Info

Publication number: ES2965777T3
Application number: ES13724519T
Authority: ES
Inventors: Andreas Pech; Ralf David; Florian Jarosch; Michael Jahnz; Sven Klussmann
Original assignee: Aptarion Biotech AG
Current assignee: Aptarion Biotech AG
Priority date: 2012-05-16
Filing date: 2013-05-16
Publication date: 2024-04-16
Anticipated expiration: 2033-05-16
Also published as: JP6522496B2; EP2850192B1; KR102168915B1; AU2013262069C1; EP2850192A2; IL235556B; RU2704833C2; EP2850192C0; CN104379748A; US11015178B2; CN109554418A; CN104379748B; IL235556A0; JP2015516165A; US20180208910A1; US9850471B2; AU2013262069B2; CA2873452A1; WO2013170963A3; RU2014140243A

Abstract

La presente invención se relaciona con un método para agregar uno o más L-nucleótidos al extremo 3' de un primer ácido L-nucleico, en donde el método comprende la etapa de hacer reaccionar uno o más L-nucleótidos con el primer L-nucleótido. ácido en presencia de una proteína que comprende un resto que exhibe actividad enzimática, en donde la actividad enzimática es capaz de agregar uno o más L-nucleótidos al extremo 3' del primer ácido L-nucleico. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

DESCRIPCIÓN

Síntesis enzimática de ácidos L-nucleicos

La presente invención se refiere a un método para añadir uno o más L-nucleótidos al extremo 3' de un primer ácido L-nucleico, y una proteína que comprende un resto que muestra actividad enzimática.

La disponibilidad de la tecnología genética en el sentido más amplio contribuyó en gran medida al progreso logrado en las últimas décadas en los campos de la medicina y el diagnóstico, así como en la investigación básica. El poder de la síntesis proporcionado por la tecnología genética va más allá del de la síntesis química. En particular, la tecnología genética y la ingeniería genética permiten la producción de cantidades realmente ilimitadas de L-péptidos y L-proteínas haciendo uso de la maquinaria enzimática de las células procarióticas y eucariotas. En particular, las enzimas y polimerasas, ya sean formas nativas o variantes de dichas formas nativas, permiten la síntesis de ácidos D-nucleicos uniendo los componentes básicos de dichos ácidos D-nucleicos, es decir, D-nucleótidos a una longitud que es, al menos no con un rendimiento razonable, alcanzable mediante síntesis química.

Debido a la especificidad quiral, las enzimas utilizadas en la tecnología genética sólo pueden hacer uso de los componentes básicos y sustratos, respectivamente, cuya quiralidad se ajuste a su propia quiralidad. Los componentes básicos y los sustratos, respectivamente, de quiralidad opuesta, no pueden estar sujetos a la actividad de las enzimas. Debido al principio de reciprocidad quiral, el procesamiento de los componentes básicos y sustratos, respectivamente, de quiralidad opuesta requiere que las enzimas también tengan quiralidad opuesta.

Este principio de reciprocidad quiral se utiliza intensamente, por ejemplo, en la generación de ácidos L-nucleicos que se unen a objetivos, también conocidos y denominados como spiegelmers. Hasta la fecha, los spiegelmers se identifican mediante un proceso que utiliza, en una primera etapa, una biblioteca de ácidos D-nucleicos para la selección in vitro frente a la forma enantiomérica de la molécula objetivo o estructura objetivo, tal como D-péptidos o D-proteínas. En una segunda etapa, los ácidos D-nucleicos así identificados que se unen a la forma enantiomérica de la molécula objetivo o la estructura objetivo se preparan como los ácidos L-nucleicos correspondientes. Como resultado del principio de reciprocidad quiral, estos ácidos L-nucleicos, es decir, los spiegelmers, son capaces de unirse a la molécula objetivo verdadera o real, tal como los L-péptidos o las L-proteínas, y no a la forma enantiomérica de las mismas, tal como los D-péptidos o las D-proteínas utilizadas para el proceso de selección. Preferiblemente, dicha molécula objetivo o estructura objetivo verdadera o real es la molécula objetivo o estructura objetivo presente en un sistema biológico tal como un cuerpo humano o animal. Los métodos para la preparación de dichos spiegelmers se describen, por ejemplo, en "The Aptamer Handbook" (eds. Klussmann, 2006).

Una forma de facilitar el proceso de identificación de spiegelmers podría ser rediseñar el proceso de modo que los ácidos L-nucleicos se seleccionen directamente de una biblioteca de ácidos L-nucleicos utilizando la molécula objetivo o la estructura objetivo en esa forma enantiomérica mostrada por la molécula objetivo o la estructura objetivo verdadera o real. Como parte del proceso es la amplificación de aquellos ácidos L-nucleicos que inicialmente se unen a la molécula objetivo y a la estructura objetivo, respectivamente, se requeriría una polimerasa que añada al menos un nucleótido a un L-cebador. Hasta la fecha no se conoce ninguna polimerasa que consista en L-aminoácidos capaz de hacerlo. Debido a esto, existe la necesidad de una polimerasa y enzimas similares que consistan en D-aminoácidos. Como la tecnología genética no puede proporcionar una polimerasa funcionalmente activa que consista en D-aminoácidos, se requiere una síntesis química. Sin embargo, la síntesis de D-proteínas o D-polipéptidos se limita a moléculas comparativamente pequeñas. La D-proteína más grande sintetizada hasta ahora es la forma de D-proteína de la proteína angiogénica del factor de crecimiento endotelial vascular (abreviado VEGF-A) que consiste en 102 D-aminoácidos (Mandal et al., 2012), sin embargo, las polimerasas, normalmente consisten en más de 300 aminoácidos.

El documento de Patente WO 98/08856 se refiere a un proceso para identificar y producir ácidos L-nucleicos que interactúan con una molécula objetivo.

El documento de Patente WO 03/035665 A1 se refiere a un ácido L-nucleico modificado que comprende un resto de ácido L-nucleico y un resto distinto del ácido L-nucleico conjugado con el resto de ácido L-nucleico.

El documento de Patente WO 03/029069 A2 se refiere a un método para marcar ácidos L-nucleicos.

El documento de Patente DE 101 56274 A1 se refiere a un método para la síntesis de los total-D-polipéptidos.

El documento de Patente WO 2006/028496 se refiere a una composición de polimerasa reparadora de lesiones.

Brewster J.H. (Science, vol. 258, no. 5086, 20 de noviembre de 1992, p. 1289) comenta sobre la aplicabilidad de las reglas de simetría en enzimas.

Church G ("Life: ¡What a concept!", Edge, 27 de agosto de 2007, páginas 1-14) presenta reflexiones sobre, entre otras cosas, la imagen especular de un mundo biológico.

Church G ("Fabricating with DNA": presentación realizada en el 4° Fab Lab Forum & Digital Fabrication Symposium el 22 de agosto de 2007) reporta sobre los avances realizados en el campo de la biología sintética.

Por lo tanto, el problema subyacente a la presente invención es la provisión de un método que permita la adición de al menos un nucleótido a un ácido L-nucleico tal como un cebador. Un problema adicional subyacente a la presente invención es la provisión de un método para amplificar un ácido L-nucleico objetivo utilizando L-nucleótidos. Otro problema más subyacente a la presente invención es la provisión de medios que permitan la práctica de dichos métodos.

Estos y otros problemas subyacentes a la presente invención se resuelven mediante el objetivo de las reivindicaciones independientes adjuntas. Se pueden tomar realizaciones preferidas a partir de las reivindicaciones dependientes adjuntas.

Más específicamente, el problema subyacente a la presente invención se resuelve en un primer aspecto mediante un método para añadir uno o más L-nucleótidos al extremo 3' de un primer ácido L-nucleico, en donde el método comprende la etapa de hacer reaccionar uno o más L-nucleótidos con el primer ácido L-nucleico en presencia de una polimerasa, en donde la polimerasa es capaz de añadir uno o más L-nucleótidos al extremo 3' del primer ácido L-nucleico y en donde la polimerasa consiste en un secuencia de aminoácidos, en donde los aminoácidos de la secuencia de aminoácidos son D-aminoácidos.

En una realización del primer aspecto, la polimerasa es una polimerasa termoestable.

En una realización del primer aspecto, la secuencia de aminoácidos de la polimerasa comprende al menos 300 aminoácidos.

En una realización del primer aspecto, la secuencia de D-aminoácidos de la polimerasa es al menos un 85 % idéntica a la secuencia de L-aminoácidos de una polimerasa de tipo nativo.

El problema subyacente a la presente invención se resuelve en un segundo aspecto mediante una proteína que comprende un resto que muestra actividad enzimática, en donde el resto que muestra actividad enzimática consiste en una secuencia de aminoácidos, en donde los aminoácidos de la secuencia de aminoácidos son D-aminoácidos. en donde la actividad enzimática es capaz de añadir uno o más L-nucleótidos al extremo 3' del primer ácido L-nucleico.

En una realización del segundo aspecto, la secuencia de D-aminoácidos del resto que muestra actividad enzimática es al menos 85 % idéntica a la secuencia de L-aminoácidos de una polimerasa de tipo nativo.

En una realización del segundo aspecto, el resto que muestra actividad enzimática es un resto que muestra actividad de polimerasa, preferiblemente la actividad de polimerasa es una actividad de polimerasa termoestable.

En una realización del segundo aspecto, la secuencia de aminoácidos del resto que muestra actividad de polimerasa comprende al menos 300 aminoácidos.

En una realización del segundo aspecto, la proteína es una polimerasa que comprende una secuencia de aminoácidos según SEQ ID NO: 15.

En una realización del segundo aspecto, la proteína es una polimerasa que comprende una secuencia de aminoácidos según la SEQ ID NO: 1.

En una realización del segundo aspecto, la proteína es una variante de polimerasa de una polimerasa de tipo nativo, en donde la polimerasa de tipo nativo consiste en una secuencia de aminoácidos según SEQ ID NO: 15, y en donde la variante de polimerasa comprende una secuencia de aminoácidos, en donde la secuencia de aminoácidos de la variante de la polimerasa difiere de la secuencia de aminoácidos de la polimerasa de tipo nativo en al menos una posición de aminoácidos y en donde la secuencia de aminoácidos de la variante de la polimerasa es idéntica al menos en un 85 % a la secuencia de aminoácidos según SEQ ID NO: 15.

En una realización del segundo aspecto, la variante de polimerasa tiene actividad de polimerasa termoestable.

En una realización del segundo aspecto, la proteína es una variante de polimerasa de una polimerasa de tipo nativo, en donde la polimerasa de tipo nativo consiste en una secuencia de aminoácidos según la SEQ ID NO: 1, y en donde la variante de polimerasa comprende una secuencia de aminoácidos, en donde la secuencia de aminoácidos de la variante de la polimerasa difiere de la secuencia de aminoácidos de la polimerasa de tipo nativo en al menos una posición de aminoácidos y en donde la secuencia de aminoácidos de la variante de la polimerasa es idéntica al menos en un 85 % a la secuencia de aminoácidos según SEQ ID NO: 1.

En una realización del primer aspecto, la secuencia de aminoácidos del resto que muestra actividad de polimerasa comprende entre 300 y 900 aminoácidos, preferiblemente 300 y 600 aminoácidos, más preferiblemente entre 300 y 360 aminoácidos, lo más preferiblemente de 340 a 360 aminoácidos.

En una realización del primer aspecto, la actividad de polimerasa es una actividad de DNA-polimerasa.

En una realización del primer aspecto, la actividad de DNA-polimerasa es una actividad de DNA-polimerasa dependiente del DNA.

En una realización del primer aspecto, el resto que muestra actividad de polimerasa se selecciona del grupo de polimerasa X del virus de la peste porcina africana, dominio central de polimerasa X de Thermus thermophilus, polimerasa beta de rata, polimerasa beta eucariótica, fragmento de Klenow, exopolimerasa de Klenow, DNA-polimerasa T4, DNA-polimerasa Phi29, Sequenasa, DNA-polimerasa T7, polimerasa SP6, DNA-polimerasa I, polimerasa lambda, y variantes de todas y cada una de las mismas, en donde preferiblemente el resto que muestra actividad de polimerasa es la Polimerasa X del Virus de la Peste Porcina Africana o una variante de la misma, que consiste en una secuencia de aminoácidos seleccionada de una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en una secuencia de aminoácidos según SEQ ID NO: 1, una secuencia de aminoácidos según SEQ ID NO: 2, una secuencia de aminoácidos según SEQ ID NO: 3 y una secuencia de aminoácidos según SEQ ID NO: 4.

En una realización del primer aspecto, el resto que muestra actividad de polimerasa se selecciona del grupo de polimerasa DPO4, DNA polimerasa de Thermococcus litoralis, Pyrococcus sp. DNA polimerasa, DNA polimerasa de Pyrococcus furiosus, polimerasa de Pfuturbo, DNA-polimerasa de Sulfolobus solfataricus, DNA polimerasa de Thermococcus gorgonarius, polimerasa KOD, polimerasa Taq, polimerasa Tth, polimerasa Pyrobest, polimerasa Pwo, polimerasa Sac, polimerasa Bst, polimerasa Poc, polimerasa Pab, polimerasa Mth, polimerasa Pho, polimerasa ES4, polimerasa EX-Taq, polimerasa LA-Taq, Expandir polimerasas, polimerasa Platinum Taq, Polimerasa Hi-Fi, polimerasa Tbr, polimerasa Tfl, polimerasa Tru, polimerasa Tac, polimerasa Tne, polimerasa Tma, polimerasa Tih, polimerasa Tfi, AmpliTaq, fragmento de Stoffel, DNA polimerasa de 9°Nm, Therminator, Therminator II, polimerasa de alta fidelidad Phusion, Paq5000, Pfx-50, Proofstart, FideliTaq, Elongase y variantes de las mismas, en donde preferiblemente el resto que muestra actividad de polimerasa es la polimerasa Dpo4 o una variante de la misma, que consiste en una secuencia de aminoácidos seleccionada de una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en la secuencia de aminoácidos según SEQ ID NO: 15, secuencia de aminoácidos según SEQ ID NO: 16, secuencia de aminoácidos según SEQ ID NO: 17, secuencia de aminoácidos según SEQ ID NO: 18, secuencia de aminoácidos según SEQ ID NO: 19, secuencia de aminoácidos según SEQ ID NO: 20, secuencia de aminoácidos según SEQ ID NO: 21 y secuencia de aminoácidos según SEQ ID NO: 22.

En una realización del primer aspecto, la etapa de hacer reaccionar se lleva a cabo en condiciones que permiten la adición de al menos uno o más L-nucleótidos al primer ácido L-nucleico, preferiblemente permiten la adición de 5 a 20000 L-nucleótidos, preferiblemente de 10 a 2000 L-nucleótidos, más preferiblemente de 50 a 500 L-nucleótidos, lo más preferiblemente de 50 a 100 L-nucleótidos.

En una realización del primer aspecto, la adición de al menos uno o más L-nucleótidos al primer ácido L-nucleico es una unión covalente de al menos uno o más L-nucleótidos al primer ácido L-nucleico, preferiblemente mediante la formación de un enlace fosfodiéster 3'-5' entre el OH en 3’ del primer ácido L-nucleico y el fosfato en 5' de uno de al menos uno o más L-nucleótidos.

En una realización del primer aspecto, el primer ácido L-nucleico es un cebador que consiste en DNA, RNA, DNA modificado, RNA modificado o combinaciones de los mismos.

En una realización del primer aspecto, el primer ácido L-nucleico consiste en L-nucleótidos y opcionalmente una modificación.

En una realización del primer aspecto, el primer ácido L-nucleico consiste en L-nucleótidos.

En una realización del primer aspecto, la reacción comprende además un segundo ácido L-nucleico, en el que una molécula del primer ácido L-nucleico se hibrida con una molécula del segundo ácido L-nucleico, preferiblemente a través del emparejamiento de bases de Watson-Crick.

En una realización del primer aspecto, la polimerasa sintetiza un tercer ácido L-nucleico que es complementario al segundo ácido L-nucleico, en donde el tercer ácido L-nucleico comprende el primer ácido L-nucleico y los L-nucleótidos añadidos al extremo 3' del primer ácido L-nucleico.

Se describe un método para amplificar un ácido L-nucleico objetivo en presencia de L-nucleótidos y una proteína que comprende un resto que muestra actividad enzimática, en donde la actividad enzimática es capaz de amplificar el ácido L-nucleico objetivo.

En un ejemplo de dicho método, el resto que muestra actividad enzimática consiste en una secuencia de aminoácidos, en donde los aminoácidos de la secuencia de aminoácidos son D-aminoácidos.

En un ejemplo de dicho método, el resto que muestra actividad enzimática es un resto que muestra actividad de polimerasa.

En un ejemplo de dicho método, la actividad enzimática es una actividad de polimerasa.

En un ejemplo de dicho método, la actividad de polimerasa es una actividad de polimerasa termoestable.

En un ejemplo de dicho método, la secuencia de aminoácidos del resto que muestra actividad de polimerasa comprende al menos 300 aminoácidos.

En un ejemplo de dicho método, la secuencia de aminoácidos del resto que muestra actividad de polimerasa comprende entre 300 y 900 aminoácidos, preferiblemente 300 y 600 aminoácidos, más preferiblemente entre 300 y 360 aminoácidos, lo más preferiblemente entre 340 y 360 aminoácidos.

En un ejemplo de dicho método, la actividad de polimerasa es una actividad de DNA-polimerasa.

En un ejemplo de dicho método, la actividad de la DNA-polimerasa es una actividad de la DNA-polimerasa dependiente de DNA.

En un ejemplo de dicho método, el resto que muestra actividad enzimática es una enzima.

En un ejemplo de dicho método, el resto que muestra actividad de polimerasa es una polimerasa.

En un ejemplo de dicho método, el resto que muestra actividad de polimerasa se selecciona del grupo de polimerasa X del virus de la peste porcina africana, dominio central de la polimerasa X de Thermus thermophilus, polimerasa beta de rata, polimerasa beta eucariótica, fragmento de Klenow, exopolimerasa de Klenow, DNA-polimerasa T4, DNA-polimerasa Phi29, Sequenasa, DNA-polimerasa T7, polimerasa SP6, DNA-polimerasa I, polimerasa lambda y variantes de todas y cada una de las mismas, en donde preferiblemente el resto que muestra actividad de polimerasa es la polimerasa X del virus de la peste porcina africana o una variante de la misma que consiste en una secuencia de aminoácidos seleccionada de una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en una secuencia de aminoácidos según SEQ ID NO: 1, una secuencia de aminoácidos según SEQ ID NO: 2, una secuencia de aminoácidos según SEQ ID NO: 3 y una secuencia de aminoácidos según SEQ ID NO: 4.

En un ejemplo de dicho método, el resto que muestra actividad de polimerasa se selecciona del grupo de polimerasa DPO4, DNA-polimerasa de Thermococcus litoralis, Pyrococcus sp. DNA-polimerasa, DNA-polimerasa de Pyrococcus furiosus, polimerasa de Pfuturbo, polimerasa de Sulfolobus solfataricus, DNA-polimerasa de Thermococcus gorgonarius, polimerasa KOD, polimerasa Taq, polimerasa Tth, polimerasa Pyrobest, polimerasa Pwo, polimerasa Sac, polimerasa Bst, polimerasa Poc, polimerasa Pab, polimerasa Mth , polimerasa Pho, polimerasa ES4, polimerasa EX-Taq, polimerasa LA-Taq, polimerasas Expand, polimerasa Platinum Taq, polimerasa Hi-Fi, polimerasa Tbr, polimerasa Tfl, polimerasa Tru, polimerasa Tac, polimerasa Tne, polimerasa Tma, polimerasa Tih, polimerasa Tfi, AmpliTaq, fragmento de Stoffel, DNA-polimerasa de 9°Nm, Therminator, Therminator II, polimerasa de alta fidelidad Phusion, Paq5000, Pfx-50, Proofstart, FideliTaq, Elongase y variantes de los mismos, en donde preferiblemente el resto que muestra actividad de polimerasa es la polimerasa Dpo4 o una variante de la misma que consiste en una secuencia de aminoácidos seleccionada de una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en una secuencia de aminoácidos según SEQ ID NO: 15, una secuencia de aminoácidos según SEQ ID NO: 16, una secuencia de aminoácidos según SEQ ID NO: 17, una secuencia de aminoácidos según SEQ ID NO: 18, una secuencia de aminoácidos según SEQ ID NO: 19, una secuencia de aminoácidos según SEQ ID NO: 20, una secuencia de aminoácidos según SEQ ID NO: 21 y una secuencia de aminoácidos según SEQ ID NO: 22.

En un ejemplo de dicho método, la etapa de hacer reaccionar se lleva a cabo en condiciones que permiten la amplificación del ácido L-nucleico objetivo.

En un ejemplo de dicho método, el método hace uso de al menos un cebador, preferiblemente dos cebadores, en donde al menos un cebador consiste en L-nucleótidos y opcionalmente una modificación.

En un ejemplo de dicho método, los cebadores consisten en L-nucleótidos.

En un ejemplo de dicho método, el ácido L-nucleico objetivo consiste en L-nucleótidos.

En un ejemplo de dicho método, el método es una reacción en cadena de la polimerasa.

En un ejemplo de dicho método, el ácido L-nucleico objetivo consiste en L-DNA.

En un ejemplo de dicho método, el ácido L-nucleico objetivo consiste en 20 a 20000 L-nucleótidos, preferiblemente de 30 a 2000 L-nucleótidos, más preferiblemente de 40 a 500 L-nucleótidos, lo más preferiblemente de 50 a 100 L-nucleótidos.

El problema subyacente a la presente solicitud también se resuelve en un segundo aspecto que también es la primera realización del segundo aspecto, mediante una proteína que comprende un resto que muestra actividad enzimática, en donde el resto que muestra actividad enzimática consiste en una secuencia de aminoácidos, en donde los aminoácidos de la secuencia de aminoácidos son D-aminoácidos, en donde la actividad enzimática es capaz de añadir uno o más L-nucleótidos al extremo 3' de un primer ácido L-nucleico.

En una segunda realización del segundo aspecto que también es una realización de la primera realización del segundo aspecto, el resto que muestra actividad enzimática es un resto que muestra actividad de polimerasa.

En una tercera realización del segundo aspecto que también es una realización de la primera realización del segundo aspecto, la actividad enzimática es una actividad de polimerasa.

En una cuarta realización del segundo aspecto que también es una realización de la tercera realización del segundo aspecto, la actividad de polimerasa es una actividad de polimerasa termoestable.

En una quinta realización del segundo aspecto que también es una realización de la segunda, tercera y cuarta realización del segundo aspecto, la secuencia de aminoácidos del resto que muestra actividad de polimerasa comprende al menos 300 aminoácidos.

En una sexta realización del segundo aspecto que también es una realización de la quinta realización del segundo aspecto, la secuencia de aminoácidos del resto que muestra actividad de polimerasa comprende entre 300 y 900 aminoácidos, preferiblemente 300 y 600 aminoácidos, más preferiblemente entre 300 y 360 aminoácidos, lo más preferiblemente entre 340 y 360 aminoácidos.

En una séptima realización del segundo aspecto que también es una realización de la tercera, cuarta, quinta y sexta realización del segundo aspecto, la actividad de polimerasa es una actividad de DNA-polimerasa.

En una octava realización del segundo aspecto que también es una realización de la séptima realización del segundo aspecto, la actividad de DNA-polimerasa es una actividad de DNA-polimerasa dependiente de DNA.

En una novena realización del segundo aspecto que también es una realización de la primera, segunda, tercera, cuarta, quinta, sexta, séptima y octava realización del segundo aspecto, el resto que muestra actividad enzimática es una enzima.

En una décima realización del segundo aspecto que también es una realización de la segunda, tercera, cuarta, quinta, sexta, séptima y octava realización del segundo aspecto, el resto que muestra actividad de polimerasa es una polimerasa.

En una undécima realización del segundo aspecto que también es una realización de la primera, segunda, tercera, séptima, octava, novena y décima realización del segundo aspecto, el resto que muestra una actividad de polimerasa se selecciona del grupo de polimerasa X del virus de la peste porcina africana, dominio central de la polimerasa X de Thermus thermophilus, polimerasa beta de rata, polimerasa beta eucariota, fragmento de Klenow, exopolimerasa de Klenow, DNA-polimerasa T4, DNA-polimerasa Phi29, secuenciasa, DNA polimerasa T7, polimerasa SP6, DNA polimerasa I, polimerasa lambda y variantes de todos y cada una de las mismas, en donde preferiblemente el resto que muestra actividad de polimerasa es la Polimerasa X del Virus de la Peste Porcina Africana o una variante de la misma, que consiste en una secuencia de aminoácidos seleccionada de una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en una secuencia de aminoácidos según SEQ ID NO: 1, una secuencia de aminoácidos según SEQ ID NO: 2, una secuencia de aminoácidos según SEQ ID NO: 3 y una secuencia de aminoácidos según SEQ ID NO: 4.

En una duodécima realización del segundo aspecto que también es una realización de la primera, segunda, tercera, cuarta, quinta, sexta, séptima, octava, novena y décima realización del segundo aspecto, el resto que muestra actividad de polimerasa se selecciona del grupo de polimerasa DPO4, DNA-polimerasa de Thermococcus litoralis, Pyrococcus sp. DNA-polimerasa, DNA-polimerasa de Pyrococcus furiosus, polimerasa de Pfuturbo, polimerasa de Sulfolobus solfataricus, DNA-polimerasa de Thermococcus gorgonarius, polimerasa KOD, polimerasa Taq, polimerasa Tth, polimerasa Pyrobest, polimerasa Pwo, polimerasa Sac, polimerasa Bst, polimerasa Poc, polimerasa Pab, polimerasa Mth , polimerasa Pho, polimerasa ES4, polimerasa EX-Taq, polimerasa LA-Taq, polimerasas Expand, polimerasa Platinum Taq, Polimerasa Hi-Fi, polimerasa Tbr, polimerasa Tfl, polimerasa Tru, polimerasa Tac, polimerasa Tne, polimerasa Tma, polimerasa Tih, polimerasa Tfi, AmpliTaq, fragmento de Stoffel, DNA-polimerasa de 9°Nm, Therminator, Therminator II, polimerasa de alta fidelidad Phusion, Paq5000, Pfx-50, Proofstart, FideliTaq, Elongase y variantes de los mismos, en donde preferiblemente el resto que muestra actividad de polimerasa es la polimerasa Dpo4 o una variante de la misma, que consiste en una secuencia de aminoácidos seleccionada de una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en una secuencia de aminoácidos según SEQ ID NO: 15, una secuencia de aminoácidos según SEQ ID NO: 16, una secuencia de aminoácidos según SEQ ID NO: 17, una secuencia de aminoácidos según SEQ ID NO: 18, una secuencia de aminoácidos según SEQ ID NO: 19, una secuencia de aminoácidos según SEQ ID NO: 20, una secuencia de aminoácidos según SEQ ID NO: 21 y una secuencia de aminoácidos según SEQ ID NO: 22.

En una realización de la invención como se define en las reivindicaciones, la proteína es una variante de polimerasa de una polimerasa de tipo nativo, en donde la polimerasa de tipo nativo consiste en una secuencia de aminoácidos según SEQ ID NO: 15, y en donde la variante de polimerasa tiene actividad de polimerasa, preferiblemente una actividad de polimerasa termoestable.

En una realización, la variante de polimerasa comprende una secuencia de aminoácidos, en la que la secuencia de aminoácidos de la variante de polimerasa difiere de la secuencia de aminoácidos de la polimerasa de tipo nativo en al menos una posición de aminoácido.

En una realización, la secuencia de aminoácidos de la variante de la polimerasa difiere de la secuencia de aminoácidos de la polimerasa de tipo nativo en una o dos posiciones de aminoácidos.

En una realización, la secuencia de aminoácidos de la variante de polimerasa difiere de la secuencia de aminoácidos de la polimerasa de tipo nativo en la posición de aminoácido 155 y/o 203 de la secuencia de aminoácidos según SEQ ID NO: 15 o en una posición de aminoácido correspondiente al mismo, en donde preferiblemente el aminoácido(s) en la posición 155 y/o 203 está(n) sustituido(s) por una cisteína.

En una realización, la variante de polimerasa consiste en una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en una secuencia de aminoácidos según SEQ ID NO: 16, una secuencia de aminoácidos según SEQ ID NO: 17 y una secuencia de aminoácidos según SEQ ID NO: 18.

En una realización, la variante de polimerasa consiste en una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en una secuencia de aminoácidos según SEQ ID NO: 19, una secuencia de aminoácidos según SEQ ID NO: 20, una secuencia de aminoácidos según SEQ ID NO: 21 y una secuencia de aminoácidos según SEQ ID NO: 22. En una realización, los aminoácidos de la secuencia de aminoácidos de la variante de polimerasa son D-aminoácidos. En una realización, los aminoácidos de la secuencia de aminoácidos de la variante de polimerasa son L-aminoácidos. En una realización de la invención como se define en las reivindicaciones, la proteína es una variante de polimerasa de una polimerasa de tipo nativo, en donde la polimerasa de tipo nativo consiste en una secuencia de aminoácidos según SEQ ID NO: 1, y en donde la variante de polimerasa tiene una actividad de polimerasa.

En una realización, la secuencia de aminoácidos de la variante de la polimerasa difiere de la secuencia de aminoácidos de la polimerasa de tipo nativo en una posición de aminoácido.

En una realización, la secuencia de aminoácidos de la variante de polimerasa difiere de la secuencia de aminoácidos de la polimerasa de tipo nativo en al menos una posición de aminoácido, en donde la al menos una posición de aminoácido se selecciona de la posición de aminoácido 80, la posición de aminoácido 86 y la posición de aminoácido 124, cada una de la secuencia de aminoácidos según SEQ ID NO: 1 o en una posición de aminoácido correspondiente de la misma.

En una realización, la variante de polimerasa consiste en una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en una secuencia de aminoácidos según SEQ ID NO: 2, una secuencia de aminoácidos según SEQ ID NO: 3 y una secuencia de aminoácidos según SEQ ID NO: 4.

En una realización, los aminoácidos de la secuencia de aminoácidos de la variante de polimerasa son D-aminoácidos. En una realización, los aminoácidos de la secuencia de aminoácidos de la variante de polimerasa son L-aminoácidos. También se describe el uso de una proteína que comprende un resto que muestra actividad enzimática en un método para añadir uno o más L-nucleótidos al extremo 3' de un ácido L-nucleico.

También se describe el uso de una proteína que comprende un resto que muestra actividad enzimática en un método para amplificar un ácido L-nucleico objetivo en la presencia de L-nucleótidos.

En un ejemplo de dicho uso, el método para amplificar un ácido L-nucleico objetivo es una reacción en cadena de la polimerasa.

En un ejemplo de dicho uso, la proteína consiste en una secuencia de aminoácidos, en donde los aminoácidos de la secuencia de aminoácidos son D-aminoácidos.

También se describe un método para la identificación de una molécula objetivo que se une a una molécula de ácido L-nucleico que comprende las siguientes etapas de

(a) generar una población heterogénea de moléculas de ácido L-nucleico;

(b) poner en contacto la población heterogénea de moléculas de ácido L-nucleico de la etapa (a) con la molécula objetivo;

(c) separar las moléculas de ácido L-nucleico que no están unidas por la molécula objetivo; y

(d) amplificar las moléculas de ácido L-nucleico que están unidas por la molécula objetivo, en donde la etapa de amplificación utiliza una proteína según cualquier realización del tercer, cuarto, quinto, sexto y séptimo aspecto, en donde la proteína consiste en una secuencia de aminoácidos, en donde los aminoácidos de la secuencia de aminoácidos son D-aminoácidos.

En un ejemplo de dicho método, el método comprende además la etapa de

(e) secuenciar las moléculas de ácido L-nucleico que están unidas por la molécula objetivo; y

(f) sintetizar moléculas de ácido nucleico cuya secuencia de nucleótidos es idéntica a la secuencia de nucleótidos de las moléculas de ácido L-nucleico secuenciadas en la etapa (e).

En un ejemplo de dicho método, las moléculas de ácido nucleico de la población heterogénea de moléculas de ácido L-nucleico de la etapa (a) comprenden en su extremo 5' y en su extremo 3' un sitio de unión del cebador y, respectivamente, una secuencia que es complementaria a un sitio de unión del cebador que permite la amplificación de las moléculas de ácido L-nucleico obtenidas en la etapa (d) mediante una reacción en cadena de la polimerasa, en donde la polimerasa usada en la reacción en cadena de la polimerasa es una proteína según cualquier realización del tercer, cuarto, quinto, sexto y séptimo aspecto, los cebadores usados en la reacción en cadena de la polimerasa consisten en L-nucleótidos, y los nucleótidos usados en la reacción en cadena de la polimerasa son L-nucleótidos. En un ejemplo de dicho método, después de la etapa (d) se introduce la siguiente etapa:

(da) poner en contacto las moléculas de ácido nucleico amplificadas con la molécula objetivo, en donde

la etapa (b) y opcionalmente las etapas (c) y/o (d) se llevan a cabo antes de la etapa (e), en donde las etapas (da), (b), (c) y opcionalmente (d) se llevan a cabo en este orden una o varias veces.

En un ejemplo de dicho método, la molécula objetivo que se une al ácido L-nucleico es un DNA.

En un ejemplo de dicho método, la molécula objetivo que se une a la molécula de ácido L-nucleico consiste en L-nucleótidos.

También se describe un método para producir una proteína según el segundo aspecto, incluyendo cualquier realización del mismo, en el que

a) dos o más fragmentos de la proteína según cualquier realización del tercer, cuarto, quinto, sexto y séptimo aspecto se sintetizan químicamente, por lo que los fragmentos en su totalidad forman la secuencia de aminoácidos de la proteína, preferiblemente los fragmentos se sintetizan mediante síntesis de péptidos en fase sólida, y

b) los fragmentos de la etapa a) se unen entre sí mediante condensación de segmentos, unión química nativa, unión enzimática o combinaciones de los mismos,

en donde la proteína consiste en una secuencia de aminoácidos, en donde los aminoácidos de la secuencia de aminoácidos son D-aminoácidos.

En un ejemplo de dicho método, la enzima que se usa en la unión enzimática es Clostripaína.

También se describe un método para unir un primer D-péptido o una primera D-proteína y un segundo D-péptido o una segunda D-proteína entre sí mediante unión enzimática, en donde

el primer D-péptido o la primera D-proteína está protegido en su extremo N-terminal mediante un grupo protector y está protegido en su extremo C-terminal mediante un grupo 4-guanidinofeniléster, y

el segundo D-péptido o la segunda D-proteína comprende un extremo N-terminal libre y un grupo tioalquiléster o tioariléster en su extremo C-terminal.

En una realización de dicho método, la enzima que se usa en la unión enzimática es Clostripaína.

Sorprendentemente, los presentes inventores han descubierto que es posible sintetizar químicamente proteínas que consisten en D-aminoácidos que son funcionalmente activas, por lo que dichas proteínas tienen un tamaño normalmente mostrado por una polimerasa. Más específicamente, los presentes inventores han ideado un método que permite la síntesis de dichas D-proteínas y de D-polimerasas, es decir, polimerasas que consisten en D-aminoácidos, que son activas como polimerasas. Basándose en este sorprendente hallazgo, ahora están disponibles las proteínas y las actividades enzimáticas necesarias para la síntesis enzimática de ácidos L-nucleicos y moléculas de ácido L-nucleico. Dicha síntesis enzimática de ácidos L-nucleicos y moléculas de ácido L-nucleico comprende, pero no se limita a, un método para añadir uno o más L-nucleótidos al extremo 3' de un primer ácido L-nucleico y un método para amplificar un ácido L-nucleico objetivo en presencia de L-nucleótidos como un ácido L-nucleico, es decir, el producto de amplificación es un ácido L-nucleico.

Como estos métodos y actividades enzimáticas son parte de un proceso alternativo de identificación de spiegelmers que se utilizan, ahora se puede poner en práctica dicho proceso alternativo de identificación de spiegelmers.

Los presentes inventores han desarrollado un método para añadir uno o más L-nucleótidos al extremo 3' de un primer ácido L-nucleico, en donde el método comprende la etapa de hacer reaccionar el uno o más L-nucleótidos con el primer ácido L-nucleico en presencia de una proteína que comprende un resto que muestra actividad enzimática, en donde la actividad enzimática es capaz de añadir uno o más L-nucleótidos al extremo 3' del primer ácido L-nucleico.

En una realización preferida, la actividad enzimática es capaz de añadir de 5 a 20000 L-nucleótidos al extremo 3' del primer ácido L-nucleico, preferiblemente de 10 a 2000 L-nucleótidos, más preferiblemente de 50 a 500 L-nucleótidos, lo más preferiblemente de 50 a 100 L-nucleótidos.

El término adición tal y como se usa preferiblemente en la presente memoria es la unión covalente entre dos moléculas, según la presente invención la unión covalente de un ácido L-nucleico y de al menos uno o más L-nucleótidos al ácido L-nucleico, preferiblemente formando un enlace fosfodiéster 3'-5' entre el OH en 3’ del primer ácido L-nucleico y el fosfato en 5' de uno de al menos uno o más L-nucleótidos. Según la presente invención, el L-nucleótido añadido al ácido L-nucleico forma el extremo 3' del ácido L-nucleico prolongado por dicho L-nucleótido.

En una realización preferida, el método para añadir uno o más L-nucleótidos al extremo 3' de un primer ácido L-nucleico comprende un segundo ácido L-nucleico, en el que una molécula del primer ácido L-nucleico se hibrida con una molécula del segundo ácido L-nucleico, preferiblemente a través del emparejamiento de bases de Watson-Crick. En una realización más preferida, el método permite la síntesis de un tercer ácido L-nucleico que es complementario al segundo ácido L-nucleico, en donde el tercer ácido L-nucleico comprende el primer ácido L-nucleico y los L-nucleótidos añadidos al extremo 3' del primer ácido L-nucleico, es decir, al primer ácido L-nucleico se le añaden uno o más L-nucleótidos al extremo 3' de un primer ácido L-nucleico dando como resultado el tercer ácido L-nucleico.

La proteína que comprende un resto que muestra actividad enzimática según la presente invención comprende proteínas que solo tienen un resto que muestra actividad enzimática y proteínas que tienen un resto que muestra actividad enzimática y otros residuos o partes, en donde otros residuos o partes de la proteína no tienen actividad enzimática. Según la presente invención, la secuencia de aminoácidos del resto que muestra actividad enzimática comprende entre 300 y 900 aminoácidos, preferiblemente 300 y 600 aminoácidos, más preferiblemente entre 300 y 360 aminoácidos, lo más preferiblemente de 340 a 360 aminoácidos.

La proteína que comprende un resto que muestra actividad enzimática según la presente invención es preferiblemente un resto que muestra actividad de polimerasa. La proteína que comprende un resto que muestra actividad de polimerasa según la presente invención comprende polimerasas que solo tienen un resto que muestra actividad de polimerasa y polimerasas que tienen un resto que muestra actividad de polimerasa y otros residuos o partes, en donde otros residuos o partes de la polimerasa no tienen actividad de polimerasa. Según la presente invención, la secuencia de aminoácidos del resto que muestra actividad polimerasa comprende entre 300 y 900 aminoácidos, preferiblemente 300 y 600 aminoácidos, más preferiblemente entre 300 y 360 aminoácidos, lo más preferiblemente de 340 a 360 aminoácidos.

El resto que muestra actividad de polimerasa según la presente invención es preferiblemente un resto que muestra actividad de polimerasa termoestable, más preferiblemente un resto que muestra actividad de DNA-polimerasa termoestable y lo más preferiblemente un resto que muestra actividad de DNA-polimerasa termoestable dependiente del DNA.

El resto que muestra actividad de polimerasa según la presente invención es preferiblemente un resto que muestra actividad de DNA-polimerasa, más preferiblemente un resto que muestra actividad de DNA-polimerasa dependiente del DNA o un resto que muestra actividad de DNA-polimerasa termoestable, lo más preferiblemente un resto que muestra actividad de DNA-polimerasa termoestable dependiente del DNA.

El término actividad enzimática tal y como se usa en la presente memoria es la catalización de una reacción específica, preferiblemente añadiendo uno o más nucleótidos al extremo 3' de un ácido nucleico, la amplificación de un ácido nucleico y/o una actividad de polimerasa, más preferiblemente añadiendo uno o más L-nucleótidos al extremo 3' de un ácido L-nucleico y la amplificación de un ácido L-nucleico.

El término actividad de polimerasa según la presente invención es la capacidad de una enzima de polimerizar L-nucleótidos y/o polimerizar L-nucleótidos a un ácido L-nucleico, en donde preferiblemente los L-nucleótidos son L-nucleósidos trifosfato.

La actividad de polimerasa según la presente invención es preferiblemente una actividad de polimerasa termoestable, más preferiblemente una actividad de DNA-polimerasa termoestable y lo más preferiblemente una actividad de DNA-polimerasa termoestable dependiente del DNA.

La actividad de polimerasa según la presente invención es preferiblemente una actividad de DNA-polimerasa, más preferiblemente una actividad de DNA-polimerasa dependiente del DNA o una actividad de DNA-polimerasa termoestable, lo más preferiblemente una actividad de DNA-polimerasa termoestable dependiente del DNA.

Las polimerasas conocidas provienen de fuentes naturales o son variantes optimizadas o mutadas de polimerasas de fuentes naturales. Las polimerasas consisten en componentes básicos quirales, es decir, L-aminoácidos. En consecuencia, la estructura de las polimerasas también es inherentemente quiral, lo que da como resultado un reconocimiento de sustrato estereoespecífico. Por lo tanto, estas enzimas sólo aceptan moléculas de sustrato en la configuración quiral adecuada, es decir, correspondiente. Por lo tanto, las polimerasas conocidas polimerizan Dnucleótidos o trifosfatos de D-nucleósidos, en donde utilizan como cadena plantilla un ácido D-nucleico que consiste en D-nucleótidos para sintetizar una cadena de ácido D-nucleico complementaria que consiste en D-nucleótidos. Además de la cadena plantilla, la polimerasa utiliza opcionalmente un cebador que se hibrida con la cadena plantilla y consiste en D-nucleótidos. Dado que los ácidos nucleicos naturales están compuestos de D-nucleótidos y pueden procesarse, por ejemplo, amplificado por proteínas y enzimas, en particular que consisten en L-aminoácidos, un ácido L-nucleico no es reconocido por dichas proteínas y enzimas, respectivamente, que consisten en L-aminoácidos. En consecuencia, los ácidos L-nucleicos que se unen a una molécula objetivo o una estructura objetivo, también denominados como spiegelmers, no pueden obtenerse directamente mediante un proceso de selección in vitro utilizando la forma natural de dicha molécula objetivo o estructura objetivo.

Sorprendentemente, los presentes inventores han descubierto que es posible producir una polimerasa que puede añadir un nucleótido de ácido L-nucleico a un cebador que consiste en L-nucleótidos que se hibridan con una cadena plantilla de ácido L-nucleico. Además, los presentes inventores han descubierto sorprendentemente que es posible producir una polimerasa que puede usarse para la amplificación de un ácido L-nucleico, preferiblemente en un proceso que se conoce como reacción en cadena de la polimerasa (abreviado PCR).

Una polimerasa es una enzima que polimeriza los trifosfatos de nucleósidos. Una polimerasa utiliza una cadena de ácido nucleico plantilla para sintetizar una cadena de ácido nucleico que es complementaria a la cadena de ácido nucleico plantilla. Además de la cadena de ácido nucleico plantilla, la polimerasa usa opcionalmente un cebador que se hibrida basándose en la complementariedad de bases con la cadena de ácido nucleico plantilla. La cadena de ácido nucleico plantilla, el cebador y la cadena de ácido nucleico sintetizado por la polimerasa pueden ser independientemente DNA o RNA. Una polimerasa como se usa preferiblemente en la presente memoria incluye una DNA polimerasa y una RNA polimerasa, preferiblemente una DNA polimerasa dependiente del DNA, una DNA polimerasa dependiente del RNA tal como una transcriptasa inversa, una RNA polimerasa dependiente del RNA y una DNA polimerasa dependiente de RNA. Más preferiblemente, la polimerasa es una polimerasa termoestable. No es necesario que una polimerasa contenga todos los aminoácidos que se encuentran en una enzima nativa o de tipo nativo correspondiente, sino sólo aquellos que son suficientes para permitir que la polimerasa lleve a cabo una actividad catalítica deseada. En una realización, una actividad de polimerasa es una actividad catalítica que se selecciona del grupo que comprende actividades catalíticas que incluyen, por ejemplo, actividades de polimerización 5'-3', exonucleasa 5'-3' y exonucleasa 3'-5'.

Las polimerasas según la presente invención, tal y como se definen en las reivindicaciones, consisten en D-aminoácidos y L-nucleótidos polimerizados o trifosfatos de L-nucleósidos, en donde las polimerasas según la presente invención utilizan como cadena plantilla un ácido L-nucleico que consiste en L-nucleótidos para sintetizar una cadena complementaria de ácido L-nucleico que consiste en L-nucleótidos. Además de la cadena plantilla, las polimerasas según la presente invención utilizan opcionalmente un cebador que se hibrida con la cadena plantilla y consiste en L-nucleótidos. La cadena plantilla, el cebador y la cadena de ácido nucleico sintetizada pueden ser independientemente L-DNA o L-RNA. Las polimerasas según la presente invención incluyen DNA-polimerasas que consisten en D-aminoácidos y RNA-polimerasas que consisten en D-aminoácidos, preferiblemente DNA-polimerasas dependientes del DNA que consisten en D-aminoácidos, DNA-polimerasas dependientes del RNA tales como transcriptasas inversas que consisten en D-aminoácidos, RNA-polimerasas dependientes del RNA que consisten en D-aminoácidos y DNA-polimerasas dependientes del RNA que consisten en D-aminoácidos. Más preferiblemente, la polimerasa según la presente invención es una polimerasa termoestable que consiste en D-aminoácidos. No es necesario que una polimerasa según la presente invención contenga todos los aminoácidos encontrados en una enzima nativa, sino sólo aquellos que son suficientes para permitir que las polimerasas según la presente invención lleven a cabo una actividad catalítica deseada. Las actividades catalíticas incluyen, por ejemplo, actividades de polimerización 5'-3', exonucleasa 5'-3' y exonucleasa 3'-5'.

Una polimerasa que consiste únicamente en L-aminoácidos se denomina preferiblemente en la presente memoria “total-L-polimerasa”. '

Una polimerasa que consiste únicamente en D-aminoácidos se denomina preferiblemente en la presente memoria “total-D-polimerasa” . '

En una realización preferida, la polimerasa según la presente invención, tal y como se define en las reivindicaciones, se selecciona del grupo de polimerasa X del virus de la peste porcina africana, dominio central de la polimerasa X de Thermus thermophilus, polimerasa beta de rata, polimerasa beta eucariota, fragmento de Klenow, exo-polimerasa de Klenow, DNA-polimerasa T4, DNA-polimerasa Phi29, Sequenasa, DNA-polimerasa T7, Polimerasa SP6, DNA-polimerasa I, polimerasa lambda, polimerasa DPO4, DNA-polimerasa Thermococcus litoralis, Pyrococcus sp. Dnapolimerasa, DNA-polimerasa de Pyrococcus furiosus, polimerasa Pfuturbo™, DNA-polimerasa de Sulfolobus solfataricus, DNA-polimerasa de Thermococcus gorgonarius, polimerasa KOD, polimerasa Taq, polimerasa Tth, polimerasa Pyrobest, polimerasa Pwo, polimerasa Sac, polimerasa Bst, polimerasa Poc, polimerasa Pab, polimerasa Mth, polimerasa Pho, polimerasa ES4, polimerasa EX- Taq™, polimerasa LA-Taq™, polimerasa Expand™, platino™ Taqpolimerasas, polimerasa Hi-Fi™, polimerasa Tbr, polimerasa Tfl, polimerasa Tru, polimerasa Tac, polimerasa Tne, polimerasa Tma, polimerasa Tih, polimerasa Tfi, AmpliTaq™, Fragmento de Stoffel, DNA-polimerasa 9°Nm™, Therminator™, Therminator II™, polimerasa Phusion High Fidelity™, Paq5000™, Pfx-50™, Proofstart™, Fideli Taq™, Elongase™, y variantes de todos y cada uno de los mismos.

En una realización más preferida, la polimerasa según la presente invención, tal y como se define en las reivindicaciones, es la Polimerasa X del virus de la peste porcina africana que consiste en la secuencia de aminoácidos según SEQ ID NO: 1. En otra realización más preferida, la polimerasa según la presente invención es una variante de la polimerasa X del virus de la peste porcina africana, lo más preferiblemente una variante de la polimerasa X del virus de la peste porcina africana de una secuencia de aminoácidos seleccionada de una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en una secuencia de aminoácidos según SEQ ID NO: 2, una secuencia de aminoácidos según SEQ ID NO: 3 y una secuencia de aminoácidos según SEQ ID NO: 4.

En una realización más preferida, la polimerasa según la presente invención, tal y como se define en las reivindicaciones, es la polimerasa Dpo4 que consiste en la secuencia de aminoácidos según SEQ ID NO: 15. En otra realización más preferida, la polimerasa según la presente invención es una variante de la polimerasa Dpo4, lo más preferiblemente una variante de la polimerasa Dpo4 que consiste en una secuencia de aminoácidos seleccionada de una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en una secuencia de aminoácidos según SEQ ID NO: 16, una secuencia de aminoácidos según SEQ Id NO: 17, una secuencia de aminoácidos según SEQ ID NO: 18, una secuencia de aminoácidos según SEQ ID NO: 19, una secuencia de aminoácidos según SEQ ID NO: 20, una secuencia de aminoácidos según SEQ ID NO: 21 y una secuencia de aminoácidos según SEQ ID NO: 22.

Una variante de una polimerasa es una polimerasa que difiere de la secuencia de aminoácidos de la polimerasa en una o más posiciones de aminoácidos. La posición de un aminoácido en la secuencia de aminoácidos está determinada preferiblemente por su posición en el extremo N-terminal y en el extremo C-terminal de la polimerasa y/o su posición con respecto a los aminoácidos que rodean el aminoácido, de modo que

a) si la polimerasa está truncada en el extremo N-terminal, la posición del aminoácido está determinada por su posición en el extremo C-terminal de la polimerasa y con respecto a los aminoácidos que rodean al aminoácido,

b) si la polimerasa está truncada en el extremo C-terminal, la posición del aminoácido está determinada por su posición en el extremo N-terminal de la polimerasa y con respecto a los aminoácidos que rodean al aminoácido, y

b) si la polimerasa está truncada en el extremo N-terminal y en el extremo C-terminal, la posición del aminoácido está determinada por su posición con respecto a los aminoácidos que rodean al aminoácido.

Una polimerasa según la presente invención, tal y como se define en las reivindicaciones, que es termoestable, no se ve relativamente afectada por temperaturas elevadas. En un ejemplo específico, no limitante, una polimerasa con termoestabilidad no se ve afectada por una temperatura de al menos 50°C, por ejemplo, 50°C, 60°C, 75°C, 80°C, 82°C, 85 °C, 88°C, 90°C, 92°C, 95°C o incluso temperaturas más altas.

Dentro del proceso de polimerización de trifosfatos de L-nucleósidos, la polimerasa añade un trifosfato de nucleósido a otro trifosfato de nucleósido, dando como resultado preferiblemente un oligonucleótido, también denominado ácido nucleico. En una realización preferida, la polimerasa añade sólo un trifosfato de nucleósido a un trifosfato de nucleósido o al nucleótido terminal de un ácido nucleico, por ejemplo, si el nucleótido es un nucleótido terminador de cadena tal como un didesoxinucleótido. Dichos nucleótidos terminadores de cadena se utilizan para secuenciar ácidos nucleicos y son conocidos por los expertos en la técnica.

El proceso de polimerización de trifosfatos de L-nucleósidos se puede utilizar para amplificar un ácido L-nucleico, preferiblemente un ácido L-nucleico objetivo.

La amplificación es cualquier proceso que aumenta el número de copias de un ácido nucleico, preferiblemente un ácido L-nucleico objetivo.

En una realización preferida, el ácido L-nucleico objetivo consiste en 20 a 20000 L-nucleótidos, preferiblemente de 30 a 2000 L-nucleótidos, más preferiblemente de 40 a 500 L-nucleótidos, lo más preferiblemente de 50 a 100 L-nucleótidos.

Un ejemplo de amplificación es uno en el que un ácido nucleico se pone en contacto con un par de cebadores, en condiciones que permiten la hibridación de los cebadores con una plantilla de ácido nucleico. Los cebadores se extienden mediante la polimerasa añadiendo uno o más trifosfatos de nucleósidos al cebador en condiciones adecuadas, se disocian de la plantilla del ácido nucleico y después se vuelven a hibridar, extender y disociar para amplificar el número de copias de la molécula de ácido nucleico. El producto de la amplificación in vitro puede caracterizarse mediante electroforesis, patrones de escisión con endonucleasas de restricción, hibridación o unión de oligonucleótidos y/o secuenciación de ácidos nucleicos, utilizando técnicas estándar.

Un experto en la técnica conoce técnicas de amplificación in vitro alternativas que incluyen la amplificación isotérmica sin transcripción, amplificación por desplazamiento de cadena y amplificación sin transcripción del RNA NASBA™.

Algunos de los métodos de amplificación se basan en ciclos térmicos, que consisten en ciclos de calentamiento y enfriamiento repetidos de la reacción para la fusión de un ácido nucleico, preferiblemente un ácido nucleico bicatenario, y la replicación enzimática del ácido nucleico. Estas etapas de ciclo térmico son necesarias primero para separar físicamente las dos cadenas de un ácido nucleico bicatenario a alta temperatura en un proceso llamado fusión de ácidos nucleicos. A una temperatura más baja, la polimerasa utiliza cada cadena como plantilla en la síntesis de ácido nucleico para amplificar selectivamente el ácido nucleico objetivo. Los cebadores que contienen secuencias complementarias a la región objetivo junto con una polimerasa (que da nombre al método) son componentes clave para permitir una amplificación selectiva y repetida. A medida que progresa el método de amplificación basado en ciclos térmicos, el ácido nucleico generado se utiliza a su vez como una plantilla para la replicación, poniendo en marcha una reacción en cadena en la que la plantilla de ácido nucleico se amplifica exponencialmente.

El método de amplificación más destacado mediante amplificación térmica es la reacción en cadena de la polimerasa (abreviada PCR).

Los cebadores son moléculas cortas de ácido nucleico que consisten en DNA o RNA o combinaciones de los mismos, preferiblemente oligonucleótidos de DNA de 10 nucleótidos o más de longitud. Más preferiblemente, los cebadores más largos pueden tener aproximadamente 15, 20 o 25 nucleótidos o más de longitud. Los cebadores pueden hibridarse con una cadena de ácido nucleico objetivo complementaria mediante la hibridación de ácido nucleico para formar un híbrido entre el cebador y la cadena de ácido nucleico objetivo, y después el cebador se puede extender a lo largo de la cadena de ácido nucleico objetivo mediante una polimerasa. Se pueden usar pares de cebadores para la amplificación de un ácido nucleico, por ejemplo, mediante PCR u otros métodos de amplificación de ácidos nucleicos conocidos en la técnica.

El uso de la polimerasa de la presente invención que consiste en D-aminoácidos hace necesario que el cebador y la cadena de ácido nucleico objetivo complementaria consistan en L-nucleótidos. Preferiblemente al menos un cebador consiste en L-nucleótidos y opcionalmente una modificación.

Los métodos para preparar y utilizar cebadores y sondas de ácidos nucleicos se describen, por ejemplo, en Sambrook et al. (Sambrock et al., 1989). Los pares de cebadores de PCR pueden derivarse de una secuencia conocida, por ejemplo, utilizando programas informáticos destinados a ese fin, tal como Primer. Un experto en la técnica apreciará que la especificidad de una sonda o cebador particular aumenta con su longitud.

Las polimerasas según la presente invención, tal y como se definen en las reivindicaciones, consisten en D-aminoácidos. Debido a esto, las polimerasas según la presente invención que consisten en D-aminoácidos no pueden aislarse de fuentes naturales y no pueden producirse mediante expresión recombinante usando bacterias, levaduras, hongos, virus o células animales y tienen que producirse mediante un proceso químico, preferiblemente tal como síntesis de péptidos en fase sólida (abreviado SPPS) en combinación con métodos de unión.

La síntesis de péptidos en fase sólida es la última tecnología para la síntesis de péptidos o fragmentos de proteínas: pequeñas perlas sólidas, insolubles pero porosas, se tratan con unidades funcionales ("enlazadores") sobre las cuales se pueden construir cadenas peptídicas. El péptido permanecerá unido covalentemente a la perla hasta que un reactivo tal como el fluoruro de hidrógeno anhidro o el ácido trifluoroacético lo escinda. De este modo, el péptido queda "inmovilizado" en la fase sólida y puede retenerse durante un proceso de filtración, mientras que los reactivos de la fase líquida y los subproductos de la síntesis se eliminan. El principio general de la SPPS es uno de ciclos repetidos de acoplamiento-lavado-desprotección-lavado. La amina N-terminal libre de un péptido unido a la fase sólida se acopla (ver más abajo) a una única unidad de aminoácido N-protegido. Después, esta unidad se desprotege, mostrando una nueva amina N-terminal a la que se puede unir otro aminoácido. La superioridad de esta técnica radica parcialmente en la capacidad de realizar ciclos de lavado después de cada reacción, eliminando el exceso de reactivo con todo el péptido de interés en crecimiento permaneciendo unido covalentemente a la resina insoluble. Hay dos formas de SPPS más utilizadas: Fmoc y Boc. El extremo N-terminal de los monómeros de aminoácidos está protegido por cualquiera de estos dos grupos y se añade a una cadena de aminoácidos desprotegida. SPPS está limitado por los rendimientos y, normalmente, los péptidos y proteínas en el intervalo de 70 aminoácidos están superando los límites de la accesibilidad sintética. La dificultad sintética también depende de la secuencia. Se puede acceder a oligopéptidos y proteínas sintéticos más grandes mediante el uso de métodos de unión tal como la condensación de fragmentos, la unión química nativa o la unión enzimática para acoplar dos péptidos entre sí. Sin embargo, la D-proteína más grande sintetizada hasta ahora es la forma de D-proteína de la proteína angiogénica del factor de crecimiento endotelial vascular (abreviado VEGF-A) que consiste en 102 D-aminoácidos (Mandal et al., 2012),

La condensación de fragmentos utiliza péptidos en los que las cadenas laterales de los aminoácidos del péptido están completamente protegidas por grupos químicos y el péptido se acopla en solución.

La unión química nativa se lleva a cabo en solución acuosa. El reto es la preparación del componente básico de péptido-tioéster desprotegido necesario. En la unión química nativa, el grupo tiolato de un resto de cisteína N-terminal de un péptido2desprotegido ataca al tioéster C-terminal de un segundo péptido1desprotegido en un tampón acuoso a pH 7,0, 20°C < T < 37°C. Esta etapa de transtioesterificación reversible es quimioselectiva y regioselectiva y conduce a la formación de un tioéster intermediario3. Este intermediario se reordena mediante un desplazamiento intramolecular de S,N-acilo que da como resultado la formación de un enlace amida nativo ("péptido")4en el sitio de unión.

Como se muestra en los ejemplos, los inventores pudieron demostrar sorprendentemente que un tioéster C-terminal que es necesario para la unión química nativa es estable en las condiciones de la unión enzimática, de modo que la unión química nativa y la unión enzimática se pueden usar en combinación.

La unión enzimática de D-péptidos funciona mediante el uso de proteasas que comprenden las siguientes etapas: (a) preparar un componente amino, donde dicho componente amino es exclusivamente un D-péptido, (b) preparar un componente carboxi, donde dicho componente carboxi comprende un grupo saliente y es exclusivamente un D-péptido y (c) hacer reaccionar el componente amino y el componente carboxi en presencia de una proteasa para formar un enlace peptídico entre el componente amino y el componente carboxi con la eliminación del grupo saliente para dar exclusivamente un D-polipéptido (véase el documento de Patente WO2003047743). Preferiblemente la proteasa es Clostripaína.

Una polimerasa de la presente invención como se define en las reivindicaciones también comprenderá una polimerasa que es esencialmente homóloga a la polimerasa de la presente invención y en particular a la(s) secuencia(s) particular(es) descrita(s) en la presente memoria, en donde el término sustancialmente homólogo se entenderá tal como que la homología es al menos el 85 %, preferiblemente el 90 % y más preferiblemente más del 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o 99 %.

Un resto que muestra actividad de polimerasa de la presente invención como se define en las reivindicaciones también comprenderá un resto que muestra actividad de polimerasa que es esencialmente homólogo al resto que muestra actividad de polimerasa de la presente invención y en particular a la(s) secuencia(s) particular(es) descrita(s) en la presente memoria, en donde el término sustancialmente homólogo se entenderá tal como que la homología es al menos el 85 %, preferiblemente el 90 % y más preferiblemente más del 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o 99 %.

El porcentaje real de aminoácidos homólogos presentes en la polimerasa de la presente invención o en el resto que muestra actividad de polimerasa de la presente invención dependerá del número total de aminoácidos presentes en la polimerasa o en el resto que muestra actividad de polimerasa. La modificación porcentual puede basarse en el número total de aminoácidos presentes en la polimerasa o en el resto que muestra actividad de polimerasa.

La homología entre dos polimerasas o dos restos que muestran actividad de polimerasa se puede determinar cómo sabe el experto en la técnica. Más específicamente, se puede usar un algoritmo de comparación de secuencias para calcular el porcentaje de homología de secuencia para la(s) secuencia(s) de prueba con respecto a la secuencia de referencia, basándose en los parámetros del programa designados. La secuencia de prueba es preferiblemente la polimerasa o el resto que muestra actividad de polimerasa que se dice que es homóloga o que se va a probar si es homóloga y, de ser así, en qué medida, a una polimerasa o resto que muestra actividad de polimerasa diferente, por lo que dicha polimerasa o resto que muestra actividad de polimerasa diferente también se denomina secuencia de referencia de homología. El alineamiento óptimo de secuencias de aminoácidos de la polimerasa para la comparación se puede realizar, por ejemplo, mediante el algoritmo de homología local de Smith & Waterman (Smith & Waterman, 1981) mediante el algoritmo de alineamiento de homología de Needleman & Wunsch (Needleman & Wunsch, 1970) mediante el método de búsqueda de similitud de Pearson & Lipman (Pearson & Lipman, 1988), mediante implementaciones computarizadas de estos algoritmos (GAP, BESTFIT, FASTA y TFASTA en el Wisconsin Genetics Software Package, Genetics Computer Group, 575 Science Dr., Madison, Wisconsin), o mediante inspección visual.

Un ejemplo de un algoritmo que es adecuado para determinar el porcentaje de identidad de secuencia es el algoritmo usado en la herramienta de búsqueda de alineamiento local básico (en lo sucesivo "BLAST"), véase, por ejemplo, Altschul et al (Altschul et al. 1990 y Altschul et al, 1997). El software para realizar el análisis BLAST está disponible públicamente a través del National Center for Biotechnology Information (en adelante "NCBI"). Los parámetros predeterminados utilizados para determinar la identidad de la secuencia utilizando el software disponible en NCBI, por ejemplo, BLASTN (para secuencias de nucleótidos) y BLASTP (para secuencias de aminoácidos) se describen en McGinnis et al (McGinnis et al., 2004).

Una polimerasa de la presente invención como se define en las reivindicaciones también comprenderá una polimerasa que tiene un cierto grado de identidad con respecto a la polimerasa de la presente invención y en particular con la polimerasa particular de la presente invención descrita en la presente memoria y definida por su secuencia de aminoácidos. La polimerasa, respectivamente, de la presente invención tal y como se define en las reivindicaciones también comprende aquellas polimerasas que tienen una identidad de al menos el 85 %, preferiblemente el 90 % y más preferiblemente más del 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o 99 % con respecto a la polimerasa de la presente invención y en particular a la polimerasa particular de la presente invención descrita en la presente memoria y definida por su secuencia de aminoácidos o una parte de la misma.

Un resto que muestra actividad de polimerasa de la presente invención tal y como se define en las reivindicaciones también comprenderá un resto que muestra actividad de polimerasa que tiene un cierto grado de identidad con respecto al resto que muestra actividad de polimerasa de la presente invención y en particular al resto particular que muestra actividad de polimerasa de la presente invención descrita en la presente memoria y definida por su secuencia de aminoácidos. La presente invención, tal y como se define en las reivindicaciones, también comprende aquellos restos que muestran actividad de polimerasa que tienen una identidad de al menos el 85 %, preferiblemente el 90 % y más preferiblemente más del 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o 99 % con respecto al resto que muestra actividad de polimerasa de la presente invención y en particular al resto particular que muestra actividad de polimerasa de la presente invención descrita en la presente memoria y definida por su secuencia de aminoácidos o una parte de la misma.

En relación con la presente solicitud, los términos molécula de ácido nucleico y ácido nucleico se utilizan de manera indistinta a menos que se indique explícitamente lo contrario.

Tal y como se usa preferiblemente en la presente memoria, "ácido nucleico" y "ácido nucleico" se refieren a polinucleótidos u oligonucleótidos tales como ácido desoxirribonucleico (abreviado DNA) y ácido ribonucleico (abreviado RNA). Además, el término "un ácido nucleico" incluye una pluralidad de ácidos nucleicos. También debe entenderse que los términos "ácido nucleico" y "ácidos nucleicos" incluyen, como equivalentes, variantes y análogos de RNA o DNA preparados a partir de análogos de nucleótidos, polinucleótidos u oligonucleótidos monocatenarios (sentido o antisentido) y bicatenarios. Los desoxirribonucleótidos incluyen desoxiadenosina, desoxicitidina, desoxiguanosina y desoxitimidina. Los ribonucleótidos incluyen adenosina, citidina, guanosina y uridina. La referencia a una molécula de ácido nucleico como "polinucleótido" se utiliza en su sentido más amplio para referirse a dos o más nucleótidos o análogos de nucleótidos unidos por un enlace covalente, incluyendo moléculas monocatenarias o bicatenarias. El término "oligonucleótido" también se usa en la presente memoria para referirse a dos o más nucleótidos o análogos de nucleótidos unidos por un enlace covalente, aunque, como se define en la presente memoria, los oligonucleótidos comprenden menos de cien nucleótidos.

El ácido nucleico se caracteriza porque todos los nucleótidos consecutivos que forman el ácido nucleico están unidos o conectados entre sí mediante uno o más de un enlace covalente. Más específicamente, cada uno de dichos nucleótidos está unido o conectado a otros dos nucleótidos, preferiblemente a través de enlaces fosfodiéster u otros enlaces, formando un alargamiento de nucleótidos consecutivos. Sin embargo, en dicha disposición, los dos nucleótidos terminales, es decir, preferiblemente el nucleótido en el extremo 5' y en el extremo 3', están unidos cada uno a un único nucleótido sólo bajo la condición de que dicha disposición sea lineal y no circular y por lo tanto, una molécula lineal en lugar de circular.

En otra realización de la presente solicitud, el ácido nucleico comprende al menos dos grupos de nucleótidos consecutivos, por lo que dentro de cada grupo de nucleótidos consecutivos cada nucleótido se une o conecta a otros dos nucleótidos, preferiblemente a través de enlaces fosfodiéster u otros enlaces, formando un alargamiento de nucleótidos consecutivos. Sin embargo, en dicha disposición, los dos nucleótidos terminales, es decir, preferiblemente el nucleótido en el extremo 5' y en el extremo 3', están unidos cada uno solamente a un único nucleótido. En dicha realización, los dos grupos de nucleótidos consecutivos, sin embargo, no están unidos ni conectados entre sí a través de un enlace covalente que une un nucleótido de un grupo y un nucleótido de otro o el otro grupo a través de un enlace covalente, preferiblemente un enlace covalente formado entre un resto de azúcar de uno de dichos dos nucleótidos y un resto de fósforo del otro de dichos dos nucleótidos o nucleósidos. En una realización alternativa, los dos grupos de nucleótidos consecutivos, sin embargo, se unen o se conectan entre sí a través de un enlace covalente que une un nucleótido de un grupo y un nucleótido de otro o el otro grupo a través de un enlace covalente, preferiblemente un enlace covalente formado entre un resto de azúcar de uno de dichos dos nucleótidos y un resto de fósforo del otro de dichos dos nucleótidos o nucleósidos. Preferiblemente, los al menos dos grupos de nucleótidos consecutivos no están unidos mediante ningún enlace covalente. En otra realización preferida, los al menos dos grupos están unidos a través de un enlace covalente que es diferente de un enlace fosfodiéster.

El término ácido nucleico abarca también preferiblemente un ácido D-nucleico o un ácido L-nucleico. Preferiblemente, el ácido nucleico es el ácido L-nucleico 1. Además, es posible que una o varias partes del ácido nucleico esté presente como un ácido D-nucleico y al menos una o varias partes del ácido nucleico sea un L-ácido nucleico. El término "parte" del ácido nucleico significará tan solo un nucleótido. Dicho ácido nucleico se denomina generalmente en la presente memoria ácido D- y L-nucleico, respectivamente. Por lo tanto, en una realización preferida, el ácido nucleico según la presente invención consiste en L-nucleótidos y comprende al menos un D-nucleótido. Preferiblemente, dicho D-nucleótido está unido a un extremo de uno cualquiera de los alargamientos y de cualquier ácido nucleico.

El ácido L-nucleico tal y como se usa en la presente memoria es un ácido nucleico que consiste en L-nucleótidos, preferiblemente que consiste completamente en L-nucleótidos.

El ácido D-nucleico tal y como se usa en la presente memoria es un ácido nucleico que consiste en D-nucleótidos, preferiblemente que consiste completamente en D-nucleótidos.

Además, si no se indica lo contrario, cualquier secuencia de nucleótidos se establece en la presente memoria en la dirección 5' ^ 3'.

Independientemente de si el ácido nucleico consiste en D-nucleótidos, L-nucleótidos o una combinación de ambos, siendo la combinación, por ejemplo, una combinación aleatoria o una secuencia definida de alargamientos que consisten en al menos un L-nucleótido y al menos ácido D-nucleico, la molécula de ácido nucleico puede consistir en desoxirribonucleótido(s), ribonucleótido(s) o combinaciones de los mismos.

Independientemente de si el ácido nucleico es un ácido D-nucleico, un ácido L-nucleico, una mezcla de los mismos, un DNA o un RNA, o cada una y cualquier combinación de los mismos, el término ácido nucleico como se usa preferiblemente en la presente memoria también abarcará un ácido nucleico monocatenario y un ácido nucleico bicatenario, donde preferiblemente la molécula de ácido nucleico sometida al método según la presente invención es un ácido nucleico monocatenario.

El término ácido nucleico, tal y como se utiliza preferiblemente en la presente memoria, también abarcará un ácido nucleico modificado. El ácido nucleico modificado puede ser una molécula de RNA modificada con nucleótidos o una molécula de DNA modificada con nucleótidos, por lo cual las moléculas de RNA o DNA se modifican ampliamente en los nucleótidos individuales para mejorar la estabilidad mediante la modificación con grupos resistentes a nucleasas, por ejemplo, 2'-amino, 2'-C-alil, 2'-fluor, 2'-O-metil, 2'-H (para una revisión, véase Usman & Cedergren, 1992).

El término ácido nucleico, tal y como se utiliza preferiblemente en la presente memoria, también abarcará un ácido nucleico completamente cerrado. Se consigue una estructura completamente cerrada, es decir, circular, para el ácido nucleico si el ácido nucleico cuya secuencia de nucleótidos debe determinarse según la presente invención está cerrado, preferiblemente mediante un enlace covalente, realizándose más preferiblemente dicho enlace covalente entre el extremo 5' y el extremo 3' de las secuencias de moléculas de ácido nucleico tal y como se describe en la presente memoria.

El término ácido nucleico, tal y como se utiliza preferiblemente, también abarcará cualquier molécula de ácido nucleico que comprenda un resto de molécula distinta de ácido nucleico. Dicho resto de molécula distinta de ácido nucleico puede seleccionarse de un grupo que comprende péptidos, oligopéptidos, polipéptidos, proteínas, carbohidratos y diversos grupos, como se describirá con más detalle a continuación. Por lo tanto, el término ácido nucleico también abarcará conjugados y/o complejos que comprenden al menos un resto de ácido nucleico y al menos un resto adicional que puede usarse para facilitar la administración de las moléculas de ácido nucleico en un sistema biológico, tal como una célula. Los conjugados y complejos proporcionados pueden impartir actividad terapéutica transfiriendo compuestos terapéuticos a través de membranas celulares, alterando la farmacocinética y/o modulando la localización del ácido nucleico de la invención. Estos tipos de conjugados y complejos son preferiblemente adecuados para la administración de moléculas, incluyendo, pero no limitado a, moléculas pequeñas, lípidos, fosfolípidos, nucleósidos, nucleótidos, ácidos nucleicos, anticuerpos, toxinas, polímeros cargados negativamente y otros polímeros, por ejemplo proteínas, péptidos, hormonas, carbohidratos, polietilenglicoles o poliaminas, a través de las membranas celulares. En general, los transportadores descritos están diseñados para ser utilizados individualmente o como parte de un sistema multicomponente, con o sin enlazadores degradables. Se espera que estos compuestos mejoren la administración y/o localización de moléculas de ácido nucleico en varios tipos de células que se originan en diferentes tejidos, en presencia o ausencia de suero (véase la patente de EE. UU. US 5,854,038). Los conjugados de las moléculas descritas en la presente memoria se pueden unir a moléculas biológicamente activas mediante enlazadores que son biodegradables, tales como moléculas enlazadoras de ácidos nucleicos biodegradables.

Como se detallará a continuación en relación con el ácido nucleico cuya secuencia se va a determinar, el resto distinto de ácido nucleico puede ser un resto de PEG, es decir, un resto de poli(etilenglicol), o un resto de HES, es decir, un resto de hidroxietilalmidón.

El resto distinto de ácido nucleico y preferiblemente el resto de PEG y/o HES pueden unirse a la molécula de ácido nucleico directamente o a través de un enlazador. También está dentro de la presente invención que la molécula de ácido nucleico comprenda una o más modificaciones, preferiblemente uno o más restos de PEG y/o HES. En una realización, la molécula enlazadora individual une más de un resto PEG o resto HES a una molécula de ácido nucleico. El enlazador utilizado en relación con la presente invención puede ser en sí mismo lineal o ramificado. Este tipo de enlazadores son conocidos por los expertos en la técnica y se describen con más detalle en las Solicitudes de Patente WO 2005/074993 y WO 2003/035665.

En una realización preferida, el enlazador es un enlazador biodegradable. El enlazador biodegradable permite modificar las características de las moléculas de ácido nucleico en términos de, entre otros, tiempo de residencia en el cuerpo del animal, preferiblemente en el cuerpo humano, debido a la liberación de la modificación de las moléculas de ácido nucleico. El uso de un enlazador biodegradable puede permitir un mejor control del tiempo de residencia de las moléculas de ácido nucleico. Una realización preferida de dichos enlazadores biodegradables son enlazadores biodegradables tales como los descritos en, pero no limitado a, las Solicitudes de Patente Internacionales WO 2006/052790, WO 2008/034122, WO 2004/092191 y WO 2005/099768, por lo que en las Solicitudes de Patentes Internacionales WO 2004/092191 y WO 2005/099768, el enlazador es parte de un profármaco de oligonucleótido polimérico, que consiste en una o dos modificaciones como se describe en la presente memoria, una molécula de ácido nucleico y el enlazador biodegradable entre ellos.

Como se usa preferiblemente en la presente memoria, "nucleótidos" incluyen, pero no se limitan a, los nucleósidos mono, di y trifosfatos de DNA naturales: mono, di y trifosfato de desoxiadenosina; mono, di y trifosfato de desoxiguanosina; mono, di y trifosfato de desoxitimidina; y mono, di y trifosfato de desoxicitidina (denominados en la presente memoria dA, dG, dT y dC o A, G, T y C, respectivamente). El término nucleótidos también incluye los nucleósidos mono, di y trifosfatos del RNA naturales: mono, di y trifosfato de adenosina; mono, di y trifosfato de guanina; mono, di y trifosfato de uridina; y mono, di y trifosfato de citidina (denominados en la presente memoria A, G, U y C, respectivamente) se refieren a una combinación de base, azúcar y fosfato que es la unidad monomérica de una molécula de ácido nucleico, es decir, una molécula de DNA y una molécula de RNA. Sin embargo, en otras palabras, el término "nucleótidos" se refiere a cualquier compuesto que contenga un azúcar de tipo furanósido cíclico (p-D/L-ribosa en el RNA y P-D/L-2'-desoxirribosa en el DNA), que está fosforilado en la posición 5' y tiene una base de tipo purina o pirimidina unida a la posición del azúcar C-1 ’ mediante un enlace -glicosol C1 '-N. Los nucleótidos pueden ser naturales o sintéticos, incluyendo un nucleótido que ha sido modificado en masa incluyendo, entre otros, nucleótidos que tienen nucleósidos modificados con bases modificadas (por ejemplo, 5-metilcitosina) y grupos de azúcar modificados (por ejemplo, 2'-O-metilo ribosilo, 2'-O-metoxietil ribosilo, 2'-fluoro ribosilo, 2'-amino ribosilo y similares).

El término "nucleobase" cubre las nucleobases naturales adenina (A), guanina (G), citosina (C), timina (T) y uracilo (U), así como las nucleobases no naturales tales como xantina, diaminopurina, 8-oxo-N6-metiladenina, 7-desazaxantina, 7-desazaguanina, N4,N4-etanocitosina, N6,N6-etano-2,6-diaminopurina, 5-metilcitosina, 5~alquinil de (C3-C6)-citosina, 5-fluorouracilo, 5-bromouracilo, pseudoisocitosina, 2-hidroxi-5-metil-4-triazolopiridina, isocitosina, isoguanina, inosina y las nucleobases "no naturales" descritas en el documento de Patente US 5,432,272, en la publicación de Freier & Altmann (Freier & Altmann, 1997). Por lo tanto, el término "nucleobase" incluye no sólo los heterociclos de purina y pirimidina conocidos, sino también los análogos heterocíclicos y tautómeros de los mismos.

Está dentro de la presente invención que el ácido nucleico monocatenario puede formar estructuras tridimensionales distintas y estables y unirse específicamente a una molécula objetivo como los anticuerpos. Dichas moléculas de ácido nucleico compuestas de D-nucleótidos se denominan aptámeros. Los aptámeros se pueden identificar frente a varias moléculas objetivos, por ejemplo, pequeñas moléculas, proteínas, ácidos nucleicos e incluso células, tejidos y organismos y pueden inhibir la funciónin vitroy/oin vivode la molécula objetivo específica. Los aptámeros generalmente se identifican mediante un proceso de selección dirigido a un objetivo, llamado selección o Systematic Evolution of Ligands by Exponential Enrichmentin vitro(abreviado SELEX) (Bock et al, 1992; Ellington & Szostak, 1990; Tuerk & Gold, 1990). Los aptámeros no modificados se eliminan rápidamente del torrente sanguíneo, con una vida media de minutos a horas, principalmente debido a la degradación de la nucleasa y la eliminación del cuerpo por los riñones, como resultado del peso molecular inherentemente bajo del aptámero. Por lo tanto, para utilizar los aptámeros terapéuticamente, deben modificarse en la posición 2' del esqueleto del azúcar (por ejemplo, ribosa) (Burmester et al, 2006).

Las nucleasas omnipresentes que explican la inestabilidad de los aptámeros consisten en componentes básico quirales, es decir, L-aminoácidos. En consecuencia, la estructura de las nucleasas también es inherentemente quiral, lo que da como resultado un reconocimiento del sustrato estereoespecífico. Por tanto, estas enzimas sólo aceptan moléculas de sustrato en la configuración quiral adecuada. Dado que los aptámeros y las moléculas de ácido nucleico naturales están compuestos de D-nucleótidos, un L-oligonucleótido debería escapar del reconocimiento enzimático y la degradación posterior. Debido al mismo principio, desafortunadamente, en este caso la naturaleza no desarrolló ninguna actividad enzimática para amplificar dichas imágenes especulares de los ácidos nucleicos. Por consiguiente, los aptámeros de ácido L-nucleico no se pueden obtener directamente empleando el proceso SELEX. Sin embargo, los principios de la estereoquímica revelan un desvío que eventualmente conduce a los aptámeros funcionales deseados del ácido L-nucleico.

Si un(D)-aptámero seleccionado in vitro se une a su objetivo natural, la imagen especular estructural de este aptámero se une con las mismas características a la imagen especular del objetivo natural. Aquí, ambos compañeros tienen la misma quiralidad (no natural). Debido a la homoquiralidad de la vida y de la mayoría de los compuestos bioquímicos, dichos ligandos enantio-RNA, por supuesto, tendrían un uso práctico limitado. Si, por el contrario, el proceso SELEX se lleva a cabo frente a la imagen especular del objetivo (no natural), se obtendrá un aptámero que reconoce este objetivo (no natural). La configuración de la imagen especular correspondiente de dicho aptámero (el L-aptámero deseado) reconoce a su vez el objetivo natural. Este proceso de selección de la imagen especular para la generación de moléculas de ácido nucleico bioestables se publicó por primera vez en 1996 (Klussmann et al, 1996; Nolte et al, 1996) y da como resultado la generación de ligandos funcionales de imágenes especulares de moléculas de ácido nucleico que muestran no sólo alta afinidad y especificidad por una determinada molécula objetivo, sino al mismo tiempo también estabilidad biológica. Está dentro de la presente invención que la molécula de ácido nucleico monocatenario es un ácido L-nucleico que se une al ligando y que se denomina "spiegelmer" (de la palabra alemana "Spiegel", espejo) (véase "The Aptamer Handbook"; eds. Klussmann, 2006)

Entre otras cosas, los ácidos nucleicos según la presente invención pueden comprender una modificación que permita preferiblemente la detección de los ácidos nucleicos según la presente invención. Dicha modificación se selecciona preferiblemente del grupo que comprende marcadores radiactivos, enzimáticos y fluorescentes. Dicha modificación también se selecciona entre D-nucleótidos que a su vez pueden modificarse mediante una modificación seleccionada del grupo que comprende marcadores radiactivos, enzimáticos y fluorescentes.

Las diversas SEQ.ID.Nos., la naturaleza química de los ácidos nucleicos, péptidos, oligopéptidos y proteínas utilizados en la presente memoria, la secuencia real de los mismos y el número de referencia interno se resumen en la siguiente tabla.

��

�� Se entenderá que lo anterior es una representación de las moléculas tal y como se usaron en relación con la presente invención. La lista de secuencias adjunta solo refleja la mera secuencia de aminoácidos o nucleótidos de los mismos y no ninguna característica adicional de dichas moléculas como se indica en la tabla anterior.

La presente invención se ilustra mejor mediante las figuras, los ejemplos y el listado de secuencias de los que se pueden extraer características, realizaciones y ventajas adicionales, en las que

Figura 1A muestra la composición de plantillas de D-DNA de 1 espacio para la prueba de actividad de la L-polimerasa X;

Figura 1B muestra la composición de plantillas de D-DNA de 6 espacios para la prueba de actividad de la L-polimerasa X;

Figura 2 A-B muestra analíticas del producto del D-polipéptido sintetizado Ac-MLTLIQGKKIVNHLRSRLAFEYNGQLIKILSKNIVAVGSL-OGp (1) mediante UPLC (A) y espectrometría de masas (B);

Figura 3 A-B muestra analíticas del producto del D-polipéptido sintetizado H-RREEKLNDVDLLIIVPEKKLLKHVLPNIRIKGLSFSVKA-SMe (2) mediante UPLC (A) y espectrometría de masas (B);

Figura 4 AB muestra analíticas del producto del D-polipéptido sintetizado H-CGERKCVLFIEWEKKTYQLDLFTALAEEKPYAIFHFTGPVSYLIRIRAALKKKNYKLNQYGLFKNQTL VPLKITTEKELI KELGFTYRIPKKRL-OH(3)mediante UPLC (A) y espectrometría de masas (B);

Figura 5 A-B muestra analíticas del producto del D-polipéptido sintetizado Ac-MLTLIQGKKIVNHLRSRLAFEYNGQLIKILSKNIVAVGSLRREEKMLNDVDLLIIVPEKKLLKHVLPNIRI KGLSFSVKA-SMe (4) mediante UPLC (A) y espectrometría de masas (B);

Figura 6 A-B muestra analíticas de la unión química nativa del producto del D-polipéptido Ac-MLTLIQGKKIVNHLRSRLAFEYNGQLIKILSKNIVAVGSLRREEKMLNDVDLLIIVPEKKLLKHVLPNIRI KGLSFSVKACGERKCVLFIEWEKKTYQLDLFTALAEEKPYAIFHFTGPVSYLIRIRAALKKKNYKLNQ YGLFKNQTLVPLKITTEKELIKELGFTYRIPKKRL-OH (5) mediante SDS-PAGE (A) y espectrometría de masas (B);

Figura 7 muestra la composición de plantillas de L-DNA de 1 espacio para la prueba de la actividad de la D-polimerasa X;

Figura 8 muestra la electroforesis en gel de la prueba de la actividad de elongación del L-DNA de la D-polimerasa X en sustratos de 1 espacio;

Figura 9A muestra la composición de plantillas de L-DNA de 6 espacios para la prueba de la actividad de la D-polimerasa X;

Figura 9B muestra la electroforesis en gel para la prueba de la actividad de elongación del L-DNA de la D-polimerasa X en un sustrato de 6 espacios;

Figura 10A muestra el sustrato de D-DNA del complejo cebador-plantilla para la prueba de la actividad de la L-polimerasa X;

Figura 10B muestra la electroforesis en gel para la prueba de la actividad de elongación de D-DNA de la L-polimerasa X realizado a temperatura constante;

Figura 10C muestra la electroforesis en gel para la prueba de la actividad de elongación del D-DNA de la L-polimerasa X realizado mediante ciclos térmicos;

Figura 11 A-B muestra analíticas de la variante A155C de la total-L-polimerasa sintética dpo4 mediante SDS-PAGE (A) y espectrometría de masas LC-ESI (B);

Figura 12 A muestra la electroforesis en gel para la prueba de la actividad por PCR de D-DNA de las variantes A155C, V203C, C31S y A155C/V203C de la L-polimerasa dpo4

Figura 12 B muestra la electroforesis en gel para la prueba de la actividad por PCR de D-D-DNA de la L-polimerasa dpo4 recombinante y sintética;

Fig. 13 muestra analíticas del producto de D-polipéptido sintetizado H-RTFPHGISKETAYSESVKLLQKILEEDERKIRRIGVRFSKFIEAIGLDKFFDT-NH2 (1) mediante espectrometría de masas;

Fig. 14 muestra analíticas del producto del D-polipéptido sintetizado BocVDTLSIEFDKLKGMIGEAKAKYLISLARDEYNEPIRTRVRKSIGRIVTMKRNSRNLEEIKPYLFRAIEES YYKLDKRIPKAIHVVAVTEDLDIVSRG-OH (2) mediante espectrometría de masas;

Fig. 15 muestra analíticas del producto del D-polipéptido de condensación de fragmentos H-VDTLSIEFDKLKGMIGEAKAKYLISLARDEYNEPIRTRVRKSIGRIVTMKRNSRNLEEIKPYLFRAIEES YYKLDKRIPKAIHVVAVTEDLDIVSRGRTFPHGISKETAYSESVKLLQKILEEDERKIRRIGVRFSKFIE AIGLDKFFDT-NH<2>(3) mediante espectrometría de masas;

Figura 16 A-B muestra analíticas del producto del D-polipéptido sintetizado Z-CDMAKPNGIKVIDDEEVKRLIRELDIADVPGIGNITAEKLKKLGINKL-bencil-tioéster(4)mediante RP-HPLC (A) y espectrometría de masas (B);

Figura 17 A-B muestra analíticas del producto del D-polipéptido sintetizado H-RKEVYQQVSSRIMNLLREYSEKIEIASIDEAYLDISDKVRDYREAYNLGLEIKNKILEKEKITVTVGISK NKVFAKIA-SMe (7) mediante UPLC (A) y espectrometría de masas (B);

Figura 18 A-B muestra analíticas del producto del D-polipéptido sintetizado Ac-MIVLFVDFDYFYAQVEEVLNPSLKGKPVVVCVFSGRFEDSGAVATANYEARKFGVKAGIPIVEAKKI LPNAVYLPM-OGp (6) mediante UPLC (A) y espectrometría de masas (B);

Figura 19 A-B muestra analíticas del producto de unión del D-polipéptido mediado por clostripaína Ac-MIVLF VDFDYFYAQVEEVLNPSLKGKPVVVCVFSGRFEDSGAVATANYEARKFGVKAGIPIVEAKKILPNAV YLPMRKEVYQQVSSRIMNLLREYSEKIEIASIDEAYLDISDKVRDYREAYNLGLEIKNKILEKEKITVTV GISKNKVFAKIA-SMe (8) mediante SDS-PAGE (A) y espectrometría de masas ESI (B):

Figura 20 A-B muestra analíticas del producto de unión química nativa del fragmento 155-352 (V203C) de la total L-polimerasa dpo4 mediante SDS-PAGE (A) y espectrometría de masas LC-ESI (B).Ejemplos

Abreviatura tal y como se utiliza en los ejemplos.

Acetonitrilo ACN (Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Schnelldorf, Alemania)

DCM diclorometano (Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Schnelldorf, Alemania)

DIPEA N,N-diisipropilamina (Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Schnelldorf, Alemania)

EDT (Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Schnelldorf, Alemania)

Fmoc 9-fluorenil-metoxicarbonil-HATU (hexafluorofosfato de 2-(7-Aza-1H-benzotriazol-1-il)-1,1,3,3-tetrametiluronio) (CreoSalus, Louisville KY, USA) HFIP 1,1,1,3,3,3-hexafluorofosfato (Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Schnelldorf, Alemania)

HPLC Cromatografía líquida de alta eficacia (a veces denominada cromatografía líquida de alta presión)

MeIm metil imidazol (Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Schnelldorf, Alemania)

MeOH metanol (Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Schnelldorf, Alemania)

MSNT 1 -(Mesitilen-2-sulfonil)-3-nitro-1,2,4-triazol (Merck KGaA, Darmstadt, Alemania)

NMP N-metilpirrolidona (Iris Biotech GmbH, Marktredwitz, Alemania)

PyBOP hexafluorofosfato de (benzotriazol-1 -iloxi)tripirrolidinfosfonio (MERCK KGAA, DARMSTADT, ALEMANIA) SDS Dodecilsulfato de sodio (Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Schnelldorf, Alemania)

TBTU tetrafluoroborato de O-(benzotriazol-1-il)-N,N,N',N'-tetrametiluronio (Merck KGaA, Darmstadt, Alemania) tBu (terc-butilo-)

TFA Ácido trifluoroacético (Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Schnelldorf, Alemania)

TFE 1,1,1 -trifluoroetanol (Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Schnelldorf, Alemania)

THF (Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Schnelldorf, Alemania)

TIS (Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Schnelldorf, Alemania)

TLC Cromatografía en capa fina

Tris Tris(hidroximetil)aminometano (Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Schnelldorf, Alemania)

UPLC Cromatografía líquida de ultra eficacia

Ejemplo 1 - Expresión recombinante y purificación de tipo nativo y variantes de la polimerasa X.

La polimerasa X del virus de la peste porcina africana (abreviado ASFV) fue descrita y caracterizada por Oliveros et al en 1997. El gen de tipo nativo de la polimerasa X tiene un marco de lectura abierto (abreviado ORF) de sólo 525 pares de bases, incluyendo el codón de inicio y el codón de parada (Oliveros et al, 1997). La proteína codificada tiene una longitud de sólo 174 aminoácidos. Este ejemplo describe cómo la polimerasa X, así como las variantes de la misma, se han expresado en E. coli y se han purificado usando una etiqueta de His6.

1.1 Constructos de expresión

Dado que el uso de codones de la ASFV difiere del de E. coli, un gen sintético optimizado para codones de E. coli para la polimerasa X se adquirió de GeneArt AG (Regensburg, Alemania). La secuencia del gen sintético se proporcionó en el vector pCR4-Blunt-TOPO (compañía creadora: Invitrogen, Karlsruhe, Alemania). El marco de lectura abierto optimizado con codones que incluye el codón de inicio y dos codones de parada tenía la siguiente secuencia:

ATGCTGACCCTGATTCAGGGCAAAAAAATCGTGAACCATCTGCGTAGCCGTCTGGCCTTTGA

ATATAACGGCCAGCTGATTAAAATTCTGAGCAAAAACATTGTGGCGGTGGGCAGCCTGCGTC

GTGAAGAAAAAATGCTGAACGATGTGGATCTGCTGATTATTGTGCCGGAAAAAAAACTGCTG

AAACATGTGCTGCCGAACATTCGTATTAAAGGCCTGAGCTTTAGCGTGAAAGTGTGCGGCGA

ACGTAAATGCGTGCTGTTTATCGAATGGGAAAAAAAAACCTACCAGCTGGACCTGTTTACCG

CGCTGGCCGAAGAAAAACCGTATGCGATCTTTCATTTTACCGGTCCGGTGAGCTATCTGATT

CGTATTCGTGCGGCGCTGAAAAAAAAAAACTACAAACTGAACCAGTATGGCCTGTTTAAAAA

CCAGACCCTGGTGCCGCTGAAAATTACCACCGAAAAAGAACTGATTAAAGAACTGGGCTTTA

CCTATCGCATTCCGAAAAAACGCCTGTAATAA.

Para obtener un constructo de expresión para la polimerasa X, también denominada total-L-polimerasa X, se cortó el gen de la polimerasa X de pCR4-Blunt-TOPO con BamHI y PstI y se subclonó en el vector pRSET-A (Invitrogen, Karlsruhe, Alemania).

La subclonación añadió una etiqueta His6 al extremo N-terminal y puso el gen bajo el control del promotor T7. El constructo se denominó pMJ14 y se usó para la expresión de la total-L-polimerasa X en E. coli. La proteína polimerasa X expresada a partir de pMJ14 tenía la siguiente secuencia de 210 aminoácidos:

MRGSHHHHHHGMASMTGGQQMGRDLYDDDDKDRWGSMLTLIQGKKIVNHLRSRLAFEYNGQL

IKILSKNIVAVGSLRREEKMLNDVDLLIIVPEKKLLKHVLPNIRIKGLSFSVKVCGERKCVL

FIEWEKKTYQLDLFTALAEEKPYAIFHFTGPVSYLIRIRAALKKKNYKLNQYGLFKNQTLVP

LKITTEKELIKELGFTYRIPKKRL.

Los 36 aminoácidos iniciales representaban la etiqueta His6 que incluye algunos aminoácidos espaciadores y algunas otras etiquetas de secuencia (líder del gen 10 de T7, epítopo Anti-Express). La parte final de 174 aminoácidos era idéntica a la secuencia de la proteína de polimerasa X que se encuentra en la ASFV.

Los constructos de expresión para variantes de la total-L-polimerasa X se realizaron utilizando el kit QuikChange disponible comercialmente (Stratagene GmbH, Waldbronn, Alemania) según el protocolo del fabricante. El plásmido pMJ14 sirvió como plantilla. Los oligonucleótidos necesarios para QuikChange se sintetizaron en las instalaciones de NOXXON (QC10_alto, QC10_bajo) o se adquirieron en Purimex (Grebenstein, Alemania) (QC26_alto, QC26_bajo, QC27_alto, QC27_bajo, QC31_alto, QC31_bajo). Se elaboraron y utilizaron las siguientes variantes de constructos de expresión para la expresión de las variantes de la total-L-polimerasa en E. coli:

1.2 Expresión de proteínas en E. coli.

La total-L-polimerasa X se expresó en E. coli utilizando el constructo de expresión pMJ14. Se expresaron variantes de la total-L-polimerasa X a partir de pMJ130, pMJ356, pMJ357 o pMJ412. Para la expresión, se transformó el constructo de expresión apropiado en la cepa competente de E. coli 'BL-21 (DE3) pLysS' (Novagen/VWR, Dresden, Alemania) y se mantuvo con el antibiótico ampicilina. El cultivo se hizo crecer a 37°C en medio 2YT hasta que la densidad óptica a 600 nm alcanzó aproximadamente 0,6. Después se indujo la expresión de proteínas añadiendo isopropil beta-D-1-tiogalactopiranósido (abreviado IPTG) a una concentración final de 0,4 mM. La expresión se realizó durante 4 horas a 30°C. Las células se recogieron mediante centrifugación y se almacenaron a -80°C o se procesaron inmediatamente.

1.3 Purificación de proteínas

Se resuspendieron células de E. coli frescas o congeladas en hielo en un 'tampón de lisis y unión' (fosfato de sodio 50 mM, pH 7,5, NaCl 500 mM, imidazol 40 mM) y se lisaron usando una disruptora celular ’French Press' (G. Heinemann, Schwabisch Gmünd, Alemania). La purificación se realizó a 4°C utilizando material 'Ni-NTA Superflow' (Qiagen, Hilden, Alemania). La elución por etapas se realizó con tampón de elución (fosfato de sodio 50 mM, pH 7,5, NaCl 500 mM, imidazol 200 mM). Las fracciones se analizaron utilizando SDS-PAGE (Invitrogen, Karlsruhe, Alemania), se combinaron y, si era necesario, se purificaron adicionalmente con cromatografía de intercambio aniónico en un sistema 'ÁKTA purifier' utilizando material 'Q Sepharose fast flow' (GE Healthcare, Friburgo , Alemania). La identidad de la proteína se confirmó mediante espectrometría de masas MALDI y las fracciones correctas se combinaron, concentraron y volvieron a tamponar. La proteína purificada se almacenó a -20°C en un tampón que consistía en fosfato de sodio 25 mM, pH 7,5, NaCl 250 mM y glicerol al 50 %. Las concentraciones de proteína se estimaron mediante un ensayo de proteína BCA (Pierce/Perbio Science, Bonn, Alemania) utilizando un estándar de albúmina sérica bovina (abreviado BSA).

Ejemplo 2 - Confirmación de actividad de la polimerasa X y variantes de la polimerasa X.

Los ensayos de actividad para la total-L-polimerasa X y variantes de la total-L-polimerasa X (véase Ejemplo 1) se realizaron con diferentes tipos de complejos de sustrato formados por oligonucleótidos, en los que los sustratos y oligonucleótidos consisten en D-DNA-nucleótidos.

2.1 Ensayos de actividad en sustratos con nucleótido de 1 espacio.

Lista de oligonucleótidos para los sustratos de 1 espacio:

Los complejos de sustrato se prepararon hibridando una cadena plantilla de un oligonucleótido de DNA que consiste en 33 nucleótidos (también denominada cadena inferior) con dos oligonucleótidos de DNA diferentes que consisten en 15 y 17 nucleótidos, respectivamente, que se hibridaron con la cadena plantilla en su extremo 5' y extremo 3', respectivamente, dando como resultado un espacio de un nucleótido en la cadena superior. Los complejos contenían A, C, G o T en la posición de la plantilla dentro del espacio. Antes de la hibridación, el oligonucleótido SP-1, que consiste en 15 nucleótidos, se marcó radiactivamente en su extremo 5' con 32P mediante una reacción de quinasa estándar que emplea gamma-32P-adenosina-trifosfato (ATP) y polinucleótido quinasa T4. La hibridación se realizó en Tris-HCl 10 mM, MgCl<2>5 mM, pH 8,0 calentando 10 min a 65°C y enfriando lentamente. El gamma-32P-ATP no incorporado se eliminó mediante purificación sobre columnas NAP (GE Healthcare).

En el ensayo de actividad, la total-L-polimerasa X y variantes de la misma se combinaron con complejos de sustrato de 1 espacio configurados en D (véase Figura 1 A). Como control negativo, cada sustrato también se incubó sin la total L-polimerasa X y variantes de la misma y D-desoxi-nucleótido-trifosfatos (dNTP). Dependiendo de la base de la plantilla dentro del complejo de 1 espacio, durante el ensayo solo se añadió el D-dNTP correspondiente. Un ensayo típico de 6 gl contenía complejo de sustrato 50 nM, 1,7 ng/gl de la total-L-polimerasa X o variantes de la misma, 8 gM de un D-dNTP y tampón (Tris-HCl 50 mM, MgCl<2>10 mM, 4 % de glicerol, 0,1 mg/ml de albúmina sérica bovina (<b>S<a>), pH 7,5). Los D-dNTPs se adquirieron en Rovalab (Teltow, Alemania). El tiempo de incubación fue de 30 minutos a 37°C. Todo el volumen del ensayo se mezcló con tampón/tinte de muestra, se cargó en un gel de secuenciación desnaturalizante y se separó durante 4 horas. El gel se expuso a una pantalla Kodak K durante la noche a -80°C y se leyó usando el sistema BioRad Fx phosphoimager.

La total-L-polimerasa X y las variantes I124G, V80A y V80G estaban activas en estas condiciones y llenaron el nucleótido de 1 espacio entre los dos oligonucleótidos de DNA de cadena superior.

2.2 Ensayo de actividad sobre un sustrato con 1 espacio de 6 nucleótidos.

Lista de oligonucleótidos para el sustrato de 6 espacios:

Los complejos de sustrato se prepararon hibridando una cadena plantilla de un oligonucleótido de DNA que consiste en 33 nucleótidos (denominada cadena inferior) con dos oligonucleótidos de DNA diferentes que consisten en 15 y 12 nucleótidos, respectivamente, que se hibridaron con la cadena plantilla en su extremo 5' y su extremo 3', respectivamente, dando como resultado un espacio de seis nucleótidos en la cadena superior. Antes de la hibridación, el oligonucleótido SP-1 que consiste en 15 nucleótidos se marcó radiactivamente en su extremo 5' con 32P mediante una reacción de quinasa estándar que emplea gamma-32P-adenosina-trifosfato (ATP) y polinucleótido quinasa T4. La hibridación se realizó en Tris-HCl 10 mM, MgCl<2>5 mM, pH 8,0 calentando 10 min a 65°C y enfriando lentamente. El gamma-32P-ATP no incorporado se eliminó mediante purificación sobre columnas NAP (GE Healthcare, Friburgo, Alemania).

En el ensayo de la actividad, la total-L-polimerasa X y variantes de la misma se combinaron con un complejo de sustrato de 6 espacios configurado en D (Figura 1B). Como un control negativo, el sustrato también se incubó sin la total-L-polimerasa X o variantes de la misma y desoxinucleótidos-trifosfatos (D-dNTPs). Un ensayo típico de 6 gl contenía un complejo de sustrato 50 nM, hasta 1,3 ng/gl de la total-L-polimerasa X o variantes de la misma, 8 gM de cada uno de los D-dNTPs y tampón (Tris-HCl 50 mM, MgCl<2>10 mM, 4 % de glicerol, 0,1 mg/ml de albúmina sérica bovina (BSA), pH 7,5). Los D-dNTPs se adquirieron en Rovalab (Teltow, Alemania). Un tiempo de incubación típico fue de 30 minutos a 37°C. Todo el volumen del ensayo se mezcló con tampón/tinte de muestra, se cargó en un gel de secuenciación desnaturalizante y se separó durante 4 horas. El gel se expuso a una pantalla Kodak K durante la noche a -80°C y se leyó usando el sistema BioRad Fx phosphoimager.

La total-L-polimerasa X y las variantes (excepto C86S) estaban activas en estas condiciones y llenaron el espacio de 6 nucleótidos entre los dos oligonucleótidos de DNA de cadena superior.

Ejemplo 3 - Síntesis de una variante de la polimerasa Pol X que consiste en D-aminoácidos.

En el ejemplo se describe la síntesis de la variante V80A de la total-D-polimerasa X. La secuencia de aminoácidos de la variante V80A de la total-D-polimerasa es Ac-MLTLIQGKKIVNHLRSRLAFEYNGQLIKILSKNIVAVGSLRREEKMLNDVDLLIIVPEKKLLKHVLPNIRIKGLSFSVKACG ERKCVLFIEWEKKTYQLDLFTALAEEKPYAIFHFTGPVSYLIRIRAALKKKNYKLNQYGLFKNQTLVPLKITTEKELIKELG FTYRIPKKRL-OH.

Todos los aminoácidos utilizados están protegidos según Solid-phase peptide synthesis Fmoc/tBu strategy requirements (Eric Atherton et al., 1981). Todos los aminoácidos utilizados son D-aminoácidos (Bachem, Bubendorf, Suiza).

3.1 Síntesis de HO-Gp(Boc)<2>

El 4-guanidinofenol protegido con terc-butiloxicarbonilo se sintetizó de manera análoga a Sekizaki et al. (Sekizaki et al., 1996). Según esto se disolvieron 40 mmol de W,W'-Bis-(íerc-butiloxicarbonil)-S-metilisotiourea (Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Schnelldorf, Deutschland) y 60 mmoles de 4-aminofenol (Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Schnelldorf, Deutschland) en 250 ml de THF en un matraz de fondo redondo de 500 ml. Después de esto, la solución se lavó con argón durante 10 minutos y se mantuvo en agitación durante 120 horas mientras se sellaba con un tubo de CaCl<2>.

Después de evaporar el disolvente, el residuo se precipitó con metanol enfriado con hielo. El precipitado se secó al vacío sobre P<4>O<10>. Finalmente, el producto se purificó mediante cromatografía flash con DCM. Se combinaron las fracciones que contenían el producto y se evaporó el disolvente a presión reducida. Para las analíticas se utilizaron TLC, HPLC de fase reversa, espectrometría de masas y NMR. La masa determinada experimentalmente corresponde a la masa calculada de 351 Da.

3.2 Síntesis de H-D-Leu-OGp(Boc)<2>

1 mmol de Z-D-Leu-OH (Bachem, Bubendorf, Suiza), 0,9 eq. de TBTU y 0,9 eq. de HO-Gp(Boc<)2>se disolvieron en 10 ml de DMF. Después de la adición de 2 eq. de DIPEA la solución se agitó durante 2 horas. Después de evaporar el disolvente, el producto bruto se purificó con cromatografía flash usando DCM. Las fracciones puras de Z-D-Leu-OGp(Boc<)2>se combinaron y el disolvente se evaporó.

Z-D-Leu-OGp(Boc<)2>se disolvió en 10 ml de MeOH y se lavó con argón. La escisión hidrolítica del grupo Z N-terminal se logró mediante la adición de catalizador Pd/C y H<2>en 2 horas. Después de filtrar H-D-Leu-OGp(Boc<)2>se evaporó el MeOH a presión reducida. Las analíticas se realizaron mediante HPLC de fase reversa y espectrometría de masas. Se encontró la masa correcta de 465 Da para el producto y corresponde a la masa calculada.

3.3 Síntesis del total-D-péptido AcMLTLIQGKKIVNHLRSRLAFEYNGQLIKILSKNIVAVGSL-OGp (1)

0,10 mmol de resina TentaGel-R-Trityl (Rapp Polymere, Tübingen, Alemania) se cargaron con Fmoc-D-Ser(tBu)-OH (Bachem, Bubendorf, Suiza) como lo describen Barlos et al. (Barlos et al., 1989). Por lo tanto, se incubaron 0,10 mmol de resina dos veces durante 30 minutos con 0,6 mmol de cloruro de tionilo y posteriormente se lavaron con DCM. Después de esto, la resina se incubó durante 90 minutos con 0,6 mmol de Fmoc-D-Ser(tBu)-OH, 2,4 mmol de DIPEA en 6 ml de DCM. Posteriormente, la resina se bloqueó tres veces durante 10 minutos usando una solución de MeOH al 10 % (v/v), DIPEA al 10 % (v/v) en DCM y se lavó con DCM. La síntesis automatizada se realizó utilizando un ABI 433 (Applied Biosystems, Foster City, USA) con el protocolo FASTmoc. Se activaron 10 eq. de los aminoácidos usando 9 eq. de HATU y 20 eq. de DIPEA en NMP. El tiempo de acoplamiento fue de 45 min y la desprotección de Fmoc se realizó tres veces durante 7 min con piperidina al 20% (v/v) (Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Schnelldorf, Deutschland) en NMP.

La escisión del ácido peptídico completamente protegido se logró incubando la resina de peptidilo dos veces en 10 ml de HFIP al 30 % (v/v) en DCM durante 2 horas. Después de filtrar el péptido, se evaporó el disolvente y el residuo precipitó usando éter dietílico enfriado con hielo. El péptido precipitado se aisló y se secó.

0,01 mmol de péptido totalmente protegido, 4 eq. de PyBOP y 5 eq. de HD-Leu-OGp(Boc<)2>se disolvieron en 6 ml de NMP. Después de la adición de 10 eq. de DIPEA la mezcla se agitó durante 4 horas. Después de esto, el disolvente se redujo, se evaporó y el residuo se precipitó con éter dietílico enfriado con hielo. El éster peptídico precipitado se secó y posteriormente se escindieron los grupos protectores usando EDT al 2,5%, agua al 2,5% y TIS al 2,5% en TFA durante 2 horas. Después de la evaporación del TFA, el péptido se precipitó con éter dietílico enfriado con hielo. La purificación por HPLC en fase reversa del éster peptídico se realizó en una columna C18 (Phenomenex, Aschaffenburg, Alemania) usando un gradiente de ACN/agua. Las fracciones que contienen producto se combinaron y se liofilizaron.

El producto final se caracterizó por HPLC/UPLC (Figura 2A) y espectrometría de masas (Figura 2B). La masa medida para el producto de 4654,7 Da está en correspondencia con la masa teórica de 4652,7 Da.

3.4 Síntesis del total-D-péptido H-RREEKLNDVDLLIIVPEKKLLKHVLPNIRIKGLSFSVKA-SMe (2)

0,10 mmoles de resina TentaGel-R-NH<2>(Rapp Polymere, Tübingen, Alemania) se cargaron con Fmoc-D-Ala-OH usando 5 eq. de aminoácido, 4,9 eq. de HATU y 10 eq. de DIPEA durante 45 min en 6 ml de NMP. Posteriormente la resina se lavó con THF. La conversión a Fmoc-d-Ala-^[CS-NH]-R-TentaGel se logró mediante incubación con 4 eq. de reactivo de Lawesson en THF a 80°C durante 2 horas. Después de esto, la resina se lavó con NMP. Posteriormente, la resina así preparada se usó en la síntesis automatizada de péptidos como se describió anteriormente (véase el Ejemplo 1.3).

Después de esto, se generó el tioéster correspondiente mediante incubación con yoduro de metilo en DMF durante la noche según Sharma et al. (Sharma et al., 2011). Después de filtrar la resina, se evaporó el disolvente que contenía el tioéster peptídico y el residuo precipitó usando éter dietílico enfriado con hielo. La escisión de los grupos protectores de las cadenas laterales se realizó con 2,5 % de EDT, 2,5 % de agua y 2,5 % de TIS en TFA durante 2 horas. Después de la evaporación del TFA, el péptido se precipitó con éter dietílico enfriado con hielo. La purificación por HPLC en fase reversa del tioéster peptídico se realizó en una columna C18 (Phenomenex, Aschaffenburg, Alemania) usando un gradiente de ACN/agua. Las fracciones que contienen producto se combinaron y se liofilizaron.

El producto final se caracterizó por HPLC/UPLC (Figura 3A) y espectrometría de masas (Figura 3B). La masa del producto determinada experimentalmente (4683,8 Da) está de conformidad con el valor teórico de 4681,7 Da.

3.5 Síntesis del total-D-péptido H-CGERKCVLFIEWEKKTYQLDLFTALAEEKPYAIFHFTGPVSYLIRIRAALKKKNYKLNQYGLFKNQTLVPLKITTEKEL IKELGFTYRIPKKRL-OH (3)

0,10 mmol de resina TentaGel-R-PHB (Rapp Polymere, Tübingen, Alemania) se cargaron con Fmoc-D-Leu-OH usando 6 eq. de aminoácido, 6 eq. de MSNT y 4,5 eq de MeIm en DCM. La síntesis automatizada se realizó utilizando un ABI 433 con el protocolo FASTmoc. 10 eq. de los aminoácidos se activaron usando 9 eq. de HATU y 20 eq. de DIPEA en NMP. El tiempo de acoplamiento fue de 45 min y la desprotección de Fmoc se realizó tres veces durante 7 min con piperidina al 20% (v/v) en NMP. Se realizaron etapas de doble acoplamiento después de 42 aminoácidos. La escisión del péptido protegido por Fmoc N-terminal se logró utilizando EDT al 2,5%, agua al 2,5% y TIS al 2,5% en TFA durante 2 horas. Después de la evaporación del TFA, el péptido se precipitó con éter dietílico enfriado con hielo. La purificación por HPLC en fase reversa del péptido protegido N-terminal bruto se realizó en una columna C18 usando un gradiente de ACN/agua. Las fracciones que contenían el producto se combinaron y se liofilizaron. Posteriormente, el péptido protegido con Fmoc se disolvió y se agitó en piperina al 20 % en DMF para escindir el grupo Fmoc del N-terminal. Después de 20 minutos, se evaporó el disolvente y el residuo precipitó usando éter dietílico enfriado con hielo. Posteriormente, el péptido bruto precipitado se purificó usando HPLC de fase reversa con una columna C18 con un gradiente de ACN/agua. Las fracciones que contenían el producto se combinaron y se liofilizaron.

El producto final se caracterizó por HPLC/UPLC (Figura 4A) y espectrometría de masas (Figura 4B). La masa determinada del producto (11184,3 Da) corresponde a la masa teórica de 11178,2 Da.

3.6 Síntesis del total-D-péptido Ac-MLTLIQGKKIVNHLRSRLAFEYNGQLIKILSKNIVAVGSLRREEKMLNDVDLLIIVPEKKLLKHVLPNIRIKGLSFSVKA-SMe (4) mediante unión del péptido 1 con el péptido 2 catalizada por proteasa

El péptido1se disolvió 0,2 mM y péptido2se disolvió 0,6 mM en tampón fosfato de sodio (100 mM, pH 8,5, con NaCl 100 mM) que contenía Triton X100 al 2 % (Sigma Aldrich Chemie GmbH, Schnelldorf, Alemania). Después de la adición de Clostripaína 20 pM (Endoprotease Arg-C, Worthington Biochemical Corporation, Lakewood, Nueva Jersey, USA), la mezcla de reacción se agitó durante la noche a 37°C. Los péptidos precipitados se centrifugaron, se disolvieron en H<2>O/ACN/ácido fórmico 60/40/0,5 y se purificaron mediante HPLC de fase reversa utilizando una columna RP-18 (Phenomenex, Aschaffenburg, Alemania) con un gradiente de ACN en agua del 30 % al 60 % en 30 min. Las fracciones que contenían el producto se combinaron y se liofilizaron.

El péptido final se analizó mediante UPLC de fase reversa (Figura 5A) y espectrometría de masas ESI (Figura 5B). El peso molecular teórico (Mteórico = 9199,3 Da) corresponde al peso molecular observado (Mobs = 9199,4Da).

3.7 Síntesis de la variante V80A de la total-D-polimerasa X mediante la unión química nativa del péptido 4 con el péptido 3

Ambos péptidos3y4se disolvieron 0,2 M en tampón TRIS (pH 8,6) que contenía guanidina HCl 6 M (Sigma Aldrich Chemie GmbH, Schnelldorf, Alemania), ácido mercaptofenilacético 200 mM (Sigma Aldrich Chemie GmbH, Schnelldorf, Alemania) y clorhidrato de Tris(2-carboxietil)fosfina 5 mM (Sigma Aldrich Chemie GmbH, Schnelldorf, Alemania). La mezcla de reacción se agitó durante 72 h a temperatura ambiente. Posteriormente, la mezcla se purificó mediante HPLC de fase reversa utilizando una columna RP-8 (Phenomenex, Aschaffenburg, Alemania) con un gradiente de ACN en agua del 30 % al 60 % en 30 min. Las fracciones que contenían el producto de unión se agruparon y se secaron. El polvo seco se disolvió en agua y se purificó mediante cromatografía de exclusión por tamaño utilizando una columna SEC3000 (Phenomenex, Aschaffenburg, Alemania) con tampón fosfato de sodio (Sigma Aldrich Chemie GmbH, Schnelldorf, Alemania) (50 mM, pH 6,8, SDS al 0,5%) como eluyente. Las fracciones que contenían el producto se combinaron y se liofilizaron.

El producto final se analizó mediante SDS-PAGE (Figura 6A) y espectrometría de masas ESI (Figura 6B). Se encontró una banda clara en el carril 7 entre 14,4 kDa y 21,5 kDa que indica la polimerasa pura de longitud completa. El peso molecular teórico (Mteórico = 20342 Da) corresponde al peso molecular observado (Mobs = 20361 Da) como se muestra por ESI-MS.

Ejemplo 4 - Confirmación de la actividad de la variante sintética de la polimerasa X que consiste en D-aminoácidos

La variante V80A de la total-D-polimerasa X seca según el ejemplo 3 se disolvió en clorhidrato de guanidinio 6 M y se volvió a plegar a 4°C mediante diálisis por etapas en dispositivos de diálisis disponibles comercialmente (Pierce/PerBio, Bonn, Alemania) con un corte de peso molecular de 3500. El tampón final fue fosfato de sodio 50 mM, cloruro de sodio 500 mM, pH 7,5. La concentración de proteínas se estimó mediante electroforesis en gel de poliacrilamida (PAGE) con dodecilsulfato de sodio (SDS) en geles prefabricados (Invitrogen, Karlsruhe, Alemania) utilizando una serie estándar de concentraciones de proteínas conocidas seguidas por tinción con SYPRO-RED (Invitrogen, Karlsruhe, Alemania) y análisis de bandas densiométricas en un instrumento de escáner BioRad Fx.

El ensayo de actividad para la variante V80A de la total-D-polimerasa X se realizó con dos tipos de sustrato diferentes:

4.1 Ensayos de actividad en sustratos con un espacio de 1 nucleótido.

Los sustratos se prepararon hibridando un oligonucleótido de DNA de cadena inferior de 33 unidades con dos oligonucleótidos de DNA de cadena superior de 17 unidades, dando como resultado un espacio de 1 nucleótido en la cadena superior. Los oligonucleótidos se sintetizaron en configuración L. Antes de la hibridación, el oligonucleótido de cadena superior de 17 unidades MJ_1_58_MD se marcó radiactivamente en su extremo 5' con 32P mediante una reacción de quinasa estándar que emplea gamma-32P-adenosina-trifosfato (gamma-32P-ATP) y polinucleótido quinasa T4. Para facilitar la reacción de quinasa del L-oligonucleótido MJ_1_58_MD, se añadieron dos bases de guanosina configuradas en D en el extremo 5' durante la síntesis de oligonucleótidos. La hibridación se realizó en Tris-HCl 10 mM, MgCl<2>5 mM, pH 8,0 calentando 10 min a 65°C y enfriando lentamente. El gamma-32P-ATP no incorporado se eliminó mediante purificación sobre columnas NAP (GE Healthcare, Friburgo, Alemania). Los complejos contenían A, C, G o T en la posición de la plantilla dentro del espacio. Para la configuración de los complejos de sustrato, véase la Figura 7.

En el ensayo de actividad, la variante V80A de la total-D-polimerasa X sintética se combinó con complejos de sustrato de 1 espacio configurados en L. Como control negativo, cada sustrato también se incubó sin la variante V80A de la total-D-polimerasa X y L-desoxi-nucleótido-trifosfatos (dNTPs). Dependiendo de la base de la plantilla dentro del complejo de 1 espacio, solo se añadió el L-dNTP correspondiente durante el ensayo. Un ensayo típico de 6 pl contenía complejo de sustrato 50 nM, 1,7 ng/pl de la variante V80A de la total-D-polimerasa X, 8 pM de un L-dNTP y tampón (Tris-HCl 50 mM, MgCl<2>10 mM, 4 % de glicerol, 0,1 mg/ml de albúmina sérica bovina (BSA), pH 7,5). Los L-dNTPs se adquirieron como síntesis personalizada de Rasayan, Inc. (Encinitas, CA, USA). El tiempo de incubación fue de 30 minutos a 37°C. Todo el volumen del ensayo se mezcló con tampón/tinte de muestra, se cargó en un gel de secuenciación desnaturalizante y se separó durante 4 horas. El gel se expuso a una pantalla Kodak K durante la noche a -80°C y se leyó usando el sistema BioRad Fx phosphoimager.

Como puede verse en la Figura 8, la variante V80A de la total-D-polimerasa X proporciona productos de elongación en sustratos de 1 espacio de L-DNA, confirmando así la actividad de la proteína sintética. Es de destacar que sólo la variante V80A de la total-D-polimerasa X combinada con sustrato L y L-dNTPs dio algún producto de elongación. Además, sólo las muestras que contenían el L-dNTP correspondiente a su base de plantilla produjeron un producto de elongación. Eso significa que en el complejo A el nucleótido dTTP, en el complejo C el nucleótido dGTP, en el complejo G el nucleótido dCTP y en el complejo T el nucleótido dATP tenían que estar presentes para producir cualquier producto de elongación.

4.2 Ensayo de actividad en sustratos con un espacio de 6 nucleótidos.

Los sustratos se prepararon hibridando un oligonucleótido de DNA de cadena inferior de 33 unidades con dos oligonucleótidos de DNA de cadena superior de 17 unidades y 12 unidades, dando como resultado un espacio de 6 nucleótidos en la cadena superior. Los oligonucleótidos se sintetizaron en configuración L. Antes de la hibridación, se marcó radiactivamente el oligonucleótido de cadena superior de 17 unidades MJ_1_58_MD (configuración L) en su extremo 5' con 32P mediante una reacción de quinasa estándar que emplea gamma-32P-adenosina-trifosfato (ATP) y el polinucleótido quinasa T4. Para facilitar la reacción de quinasa del L-oligonucleótido MJ_1_58_MD, se añadieron dos bases de guanosina configuradas en D en el extremo 5' durante la síntesis de oligonucleótidos. La hibridación se realizó en Tris-HCl 10 mM, MgCl<2>5 mM, pH 8,0 calentando 10 min a 65°C y enfriando lentamente. El gamma-32P-ATP no incorporado se eliminó mediante purificación sobre columnas NAP (GE Healthcare, Friburgo, Alemania). Para la configuración de los complejos de sustrato, véase la Figura 9A.

En el ensayo de actividad, la variante V80A de la total-D-polimerasa X sintética se combinó con un complejo de sustrato de 6 espacios configurado en L. Como control negativo, el sustrato también se incubó sin variante V80A de la total-D-polimerasa X y desoxi-nucleótidos-trifosfato (L-dNTPs). Un ensayo típico de 6 pl contenía un complejo de sustrato 50 nM, hasta 1,3 ng/ pl de variante V80A de la total-D-polimerasa X, 8 pM de cada uno de los L-dNTP y tampón (Tris-HCl 50 mM, MgCl<2>10 mM, 4 °% de glicerol, 0,1 mg/ml de albúmina sérica bovina (BSA), pH 7,5). Los L-dNTPs se adquirieron como síntesis personalizada de Rasayan, Inc. (Encinitas, CA, USA). Un tiempo de incubación típico fue de 30 minutos a 37°C, pero dependiendo de la actividad del lote, se usaron incubaciones más largas. Todo el volumen del ensayo se mezcló con tampón/tinte de muestra, se cargó en un gel de secuenciación desnaturalizante y se separó durante 4 horas. El gel se expuso a una pantalla Kodak K durante la noche a -80°C y se leyó usando el sistema BioRad Fx phosphoimager.

Como se puede ver en la Figura 9B, la variante V80A de la total-D-polimerasa X sintética proporciona productos de elongación N+6 en sustratos de 6 espacios del L-DNA, confirmando así la actividad de la proteína sintética. Sin embargo, la síntesis del producto de elongación N+6 fue menos evidente que la del producto de elongación N+1 en el mismo complejo de 6 espacios. También fue necesario aumentar el tiempo de incubación para llenar el espacio de 6. Es de destacar que sólo la variante V80A de la total-D-polimerasa X combinada con sustrato L más L-dNTPs dio algún producto de elongación.

Ejemplo 5 - Síntesis de DNA mediante polimerasa X y variantes de polimerasa X.

La polimerasa X del virus de la peste porcina africana (abreviado ASFV) se describe en la bibliografía (Oliveros, 1997) como una enzima altamente distributiva con función de reparación de espacios. Como se muestra en el Ejemplo 2, se ha demostrado que la total-L-polimerasa X y variantes de la misma catalizan la incorporación de sólo muy pocos nucleótidos después de cada iniciación en sustratos con espacios. En la presente memoria describimos un método que permite usar la total-L-polimerasa X y variantes para sintetizar DNA más largo y mostrar la polimerización completa de una cadena de 83 unidades.

5.1 Sustrato de cebador-plantilla

Se ha utilizado un complejo cebador-plantilla para la prueba de la actividad de la total-L-polimerasa X y variantes de la misma. El mismo complejo también se ha utilizado para probar las variantes V80G y V80A de la total-L-polimerasa X.

Listado de D-oligonucleótidos para el complejo cebador-plantilla sin espacio:

El sustrato se preparó hibridando un oligonucleótido de DNA de cadena inferior que consiste en 83 nucleótidos (MJ_1_1_DD) con un oligonucleótido de DNA que consiste en 19 nucleótidos. Los oligonucleótidos se sintetizaron en NOXXON. El oligonucleótido MJ_1_33_DD lleva el tinte fluorescente Atto-532 (AttoTec, Siegen, Alemania). La hibridación se realizó en Tris-HCl 10 mM, MgCl<2>5 mM, pH 8,0 calentando durante 10 min a 65°C y enfriando lentamente. El complejo cebador-plantilla se representa en la Figura 10A.

5.2 Reacción a temperatura constante.

En el ensayo de actividad, se combinaron la total-L-polimerasa X o variantes V80G o V80A de la total-L-polimerasa X con un complejo cebador-plantilla configurado en D. Un ensayo típico de 6 pl contenía un complejo de sustrato 50 nM, hasta 1,3 ng/pl de la total-L-polimerasa X o variantes V80G o V80A de la total-L-polimerasa X, 8 pM de cada uno de los D-dNTPs y tampón (Tris-HCl 50 mM, MgCl<2>10 mM, 4 % de glicerol, 0,1 mg/ml de albúmina sérica bovina (BSA), pH 7,5). Los D-dNTPs se adquirieron en Rovalab (Teltow, Alemania). El tiempo de incubación fue de 30 minutos a 37°C para las muestras Pol-X. Como control negativo, el sustrato también se incubó sin ninguna total-L-polimerasa X o variantes V80G o V80A de la total-L-polimerasa X y sin desoxi-nucleótidos-trifosfatos (D-dNTPs). Se realizó un control positivo con polimerasa Taq (Invitrogen, Karlsruhe, Alemania) utilizada a una concentración final de 0,083 U/pl en tampón Taq suministrado por el fabricante. Las muestras de Taq se incubaron durante 30 minutos a 60°C. Todo el volumen del ensayo se mezcló con tampón/tinte de muestra y se separó en un gel desnaturalizante. El gel se leyó utilizando el sistema BioRad Fx phosphoimager.

La total-L-polimerasa X o las variantes V80G o V80A de la total-L-polimerasa X estaban activas, pero no pudieron completar la polimerización de la plantilla completa de 83 unidades. El control positivo de la polimerasa Taq muestra una polimerización completa de la plantilla de 83 unidades, véase la Figura 10B.

5.3 Reacción en condiciones de ciclo térmico.

Bajo el supuesto de que la total-L-polimerasa X después del inicio cataliza la incorporación de un solo nucleótido y después se detiene mientras permanece en el sustrato de DNA, realizamos repetidos pulsos de calor (50 °C, 2 minutos) para permitir la total-L-polimerasa X para la disociación y reasociación con la plantilla. Utilizando este procedimiento de ciclo térmico repetido, pudimos realizar la polimerización completa de las 83 unidades con la total-L-polimerasa X. Las reacciones y los controles se configuraron como se describió anteriormente para temperatura constante, excepto que el perfil de temperatura para las muestras de la total-L-polimerasa X se procesaron de la siguiente manera:

5 a 25 ciclos de (30 minutos a 20°C // 2 minutos a 50°C)

después una etapa final de 30 minutos a 20°C

Se observó que a partir de 15 ciclos en adelante la total-L-polimerasa X fue capaz de polimerizar la cadena plantilla completa de 83 unidades, similar al control positivo, véase la Figura 10C.

Ejemplo 6 - Elongación del cebador con una variante de la polimerasa X sintética que consiste en D-aminoácidos

El método descrito en este ejemplo utiliza sustratos configurados en L para probar la polimerasa configurada totalmente en D.

6.1 Sustrato de cebador-plantilla

Listado de L-oligonucleótidos para el complejo cebador-plantilla sin espacio:

El sustrato se prepara hibridando un oligonucleótido de DNA de cadena inferior de 83 unidades con el oligonucleótido de DNA de cadena superior de 19 unidades. Los oligonucleótidos se sintetizan en las instalaciones internas de NOXXON en configuración L. Antes de la hibridación, el oligonucleótido de cadena superior de 21 unidades MJ_1_109_MD se marca radioactivamente en su extremo 5' con 32P mediante una reacción de quinasa estándar que emplea gamma-32P-adenosina-trifosfato (ATP) y el polinucleótido quinasa T4. Para facilitar la reacción de quinasa del L-oligonucleótido MJ_1_109_MD, se añaden dos bases de guanosina configuradas en D en el extremo 5' durante la síntesis de oligonucleótidos. La hibridación se realiza en Tris-HCl 10 mM, MgCl<2>5 mM, pH 8,0 calentando 10 min a 65°C y enfriando lentamente. El gamma-32P-ATP no incorporado se elimina mediante purificación sobre columnas NAP (GE Healthcare, Friburgo, Alemania).

6.2 Reacción a temperatura constante.

En el ensayo de actividad, la variante V80A de la total-D-polimerasa X sintética se combina con un complejo cebadorplantilla configurado en L. Un ensayo típico de 6 pl contiene un complejo de sustrato 50 nM, hasta 1,3 ng/pl de variante de la total-D-polimerasa X, 8 pM de cada uno de los L-dNTPs y tampón (Tris-HCl 50 mM, MgCl<2>10 mM, 4 % de glicerol, 0,1 mg/ml de albúmina sérica bovina (BSA), pH 7,5). Los L-dNTPs se adquirieron en Rasayan, Inc. (Encinitas, CA, USA). El tiempo de incubación es de al menos 30 minutos a 37°C. Como control negativo, el sustrato también se incuba sin ninguna polimerasa y sin desoxi-nucleótidos-trifosfatos (L-dNTPs). Todo el volumen del ensayo se mezcla con tampón/tinte de muestra y se separa en un gel desnaturalizante. El gel se lee utilizando el sistema BioRad Fx phosphoimager.

La variante V80A de la total-D-polimerasa X sintética está activa en esta condición, pero, al igual que el equivalente de la total-L-polimerasa X, no es capaz de polimerizar la cadena plantilla completa de 83 nucleótidos.

6.3 Reacción en condiciones de ciclo térmico.

De manera análoga al Ejemplo 5, se utiliza un procedimiento de ciclo térmico repetido para permitir la polimerización completa del sustrato L de 83 unidades con la variante V80A de la total-D-polimerasa X. Las reacciones y los controles se configuran como se describió anteriormente para temperatura constante, excepto que el perfil de temperatura se ejecutó de la siguiente manera:

5 a 25 ciclos de (30 minutos a 20°C // 2 minutos a 50°C)

después una etapa final de 30 minutos a 20°C

Se observa que la variante V80A de la total-D-polimerasa X, de manera similar al equivalente de la total-L-polimerasa X, es capaz de polimerizar la cadena plantilla completa de 83 unidades cuando se utiliza la elongación por ciclo térmico.

Ejemplo 7 - Expresión recombinante y purificación de la polimerasa Dpo4 y variantes de la polimerasa Dpo4, consistiendo todas ellas en L-aminoácidos.

La polimerasa Dpo4 se descubrió originalmente en Sulfolobus Solfataricus (abreviado Sso) (Boudsocq, 2001). El gen de tipo nativo tiene un marco de lectura abierto (abreviado ORF) de 1059 pares de bases que incluyen el codón de inicio y el codón de parada. La proteína codificada tiene una longitud de 352 aminoácidos. Este ejemplo describe cómo la polimerasa Dpo4 y las variantes de la polimerasa Dpo4 se expresaron en E. coli y se purificaron usando Strep-Tag.

7.1 Constructos de expresión

Dado que el uso de codones de Sso difiere del de E. coli, se adquirió de GeneArt AG (Regensburg, Alemania) un gen sintético optimizado con codones de E. coli para la polimerasa Dpo4 de Sso de tipo nativo. La secuencia del gen sintético se proporcionó en el vector pENTRY-IBA10 (compañía creadora: IBA GmbH, Gottingen, Alemania). El marco de lectura abierto optimizado para codones que incluye el codón de inicio, pero no incluye el codón de parada, tenía la siguiente secuencia:

ATGATTGTGCTGTTTGTGGATTTTGATTATTTTTATGCCCAGGTGGAAGAAGTTCTGAATCC

GAGCCTGAAAGGTAAACCGGTTGTTGTTTGTGTTTTTAGCGGTCGCTTTGAAGATAGCGGTG

CAGTTGCAACCGCCAATTATGAAGCCCGTAAATTTGGTGTTAAAGCCGGTATTCCGATTGTT

GAAGCCAAAAAAATTCTGCCGAATGCAGTTTATCTGCCGATGCGCAAAGAAGTTTATCAGCA

GGTTAGCAGCCGTATTATGAATCTGCTGCGCGAATATAGCGAAAAAATTGAAATTGCCAGCA

T T GAT GAAG CCTATCTG GATAT TAG C GATAAAG T G C G C GAT TAT C G C GAAG CATATAAT C T G

GGCCTGGAAATTAAAAATAAAATCCTGGAAAAAGAAAAAATTACCGTGACCGTGGGCATTAG

C AAAAAT AAAG T G T T T G C C AAAAT T G C AG C AGAT AT G G C AAAAC C GAAT G G C AT T AAAG T GA

TTGATGATGAAGAAGTGAAACGTCTGATTCGCGAACTGGATATTGCAGATGTTCCGGGTATT

G G CAATAT TAC C G CAGAAAAAC T GAAAAAAC T G G G CAT TAATAAAC T G G T T GATAC C C T GAG

CATTGAATTTGATAAACTGAAAGGCATGATTGGTGAAGCGAAAGCCAAATATCTGATTAGCC

TGGCACGTGATGAATATAATGAACCGATTCGTACCCGTGTTCGTAAAAGCATTGGTCGTATT

GTGACCATGAAACGCAATAGCCGTAATCTGGAAGAAATTAAACCGTACCTGTTTCGTGCAAT

T GAAGAAAGC TAT TATAAAC T GGATAAAC GCAT T C C GAAAGCCATTCATGTTGTTGCAGT TA

CCGAAGATCTGGATATTGTTAGCCGTGGTCGTACCTTTCCGCATGGTATTAGCAAAGAAACC

GCCTATAGCGAAAGCGTTAAACTGCTGCAGAAAATCCTGGAAGAAGATGAACGTAAAATTCG

TCGTATTGGTGTGCGCTTTAGCAAATTTATTGAAGCCATTGGCCTGGATAAATTTTTTGATA

CC.

Para obtener el constructo de expresión de la polimerasa Dpo4, también denominado total-L-polimerasa Dpo4, se subclonó el gen de pENTRY-IBAlo en el vector pASG-IBA5 (IBA GmbH, Gottingen, Alemania), utilizando un kit de clonación StarGate disponible comercialmente (IBA GmbH). La subclonación añadió un Strep-Tag II al extremo N-terminal y un codón de parada al extremo C-terminal, y puso el gen bajo el control del promotor tet. El constructo se denominó pMJ343 y se usó para la expresión de la total-L-polimerasa Dpo4 en E. coli. La total-L-polimerasa Dpo4 expresada a partir de pMJ343 tenía la siguiente secuencia de 368 aminoácidos:

MASAWSHPQFEKSGMIVLFVDFDYFYAQVEEVLNPSLKGKPVWCVFSGRFEDSGAVATANY

EARKFGVKAGIPIVEAKKILPNAVYLPMRKEVYQQVSSRIMNLLREYSEKIEIASIDEAYLD

ISDKVRDYREAYNLGLEIKNKILEKEKITVTVGISKNKVFAKIAADMAKPNGIKVIDDEEVK

RLIRELDIADVPGIGNITAEKLKKLGINKLVDTLSIEFDKLKGMIGEAKAKYLISLARDEYN

EPIRTRVRKSIGRIVTMKRNSRNLEEIKPYLFRAIEESYYKLDKRIPKAIHWAVTEDLDIV

SRGRTFPHGISKETAYSESVKLLQKILEEDERKIRRIGVRFSKFIEAIGLDKFFDTGS.

Los 14 aminoácidos iniciales representaban Strep-Tag II, incluyendo algunos aminoácidos espaciadores, los 2 aminoácidos finales representaban aminoácidos espaciadores y la parte intermedia de 352 aminoácidos era idéntica a la secuencia de la polimerasa Dpo4 que se encuentra en Sso.

Los constructos de expresión para variantes de la total-L-polimerasa Dpo4 se realizaron utilizando el kit QuikChange disponible comercialmente (Stratagene GmbH, Waldbronn, Alemania) según el protocolo del fabricante. El plásmido pMJ343 sirvió como plantilla. Los oligonucleótidos necesarios para QuikChange se sintetizaron en NOXXON (QC_38_alto, QC_38_bajo, QC_39_alto, QC_39_bajo, QC_40_alto, QC_40_bajo) o se adquirieron en Purimex (Grebenstein, Alemania) (QC_28_alto, QC_28_bajo, QC_29_alto, QC_29_bajo, q C_30_ alto, QC_30_bajo).

Se elaboraron y utilizaron las siguientes variantes de constructos de expresión para la expresión de las variantes de la total-L-polimerasa Dpo4 en E. coli.

��

��7.2 Expresión de proteínas en E. coli.

La total-L-polimerasa Dpo4 se expresó en E. coli utilizando el constructo de expresión pMJ343. Se expresaron variantes mutantes de la total-L-polimerasa Dpo4 a partir de pMJ361, pMJ362, pMJ363, pMJ365, pMJ502, pMJ503 o pMJ504. Para la expresión, se transformó el constructo de expresión apropiado en la cepa de E. coli 'NEB express' (New England Biolabs, Frankfurt am Main, Alemania) usando 'Transformation and Storage Solution' (Epicentre/Biozym, Hessisch Oldendorf, Alemania) y se mantuvo con el antibiótico ampicilina. La expresión se realizó en medio 'EnBase Flo' o 'EnPresso' (BioSilta, Oulu, Finlandia) durante 48 h a 30°C utilizando 200 ng/ml de anhidrotetraciclina (IBA GmbH, Gottingen, Alemania) como inductor. Las células se recogieron mediante centrifugación y se almacenaron a -80°C o se procesaron inmediatamente.

7.3 Purificación de proteínas

Se resuspendieron células de E. coli frescas o congeladas en hielo en 'Tampón W' (Tris-HCl 100 mM, pH 8,0, NaCl 150 mM, EDTA 1 mM) y se lisaron usando un disruptor celular ’French Press' (G. Heinemann, Schwabisch Gmünd, Alemania). La purificación se realizó a 4°C en un sistema 'ÁKTA Express' equipado con columnas StrepTrap HP de 5 ml (GE Healthcare, Friburgo, Alemania). La elución por etapas se realizó con tampón W que incluía destiobiotina 2,5 mM (IBA GmbH, Gottingen, Alemania). Las fracciones se analizaron utilizando SDS-PAGE (Invitrogen, Karlsruhe, Alemania), se combinaron y, si era necesario, se purificaron adicionalmente con cromatografía de intercambio aniónico en un sistema 'ÁKTA purifier' equipado con columnas 'Q HP' (GE Healthcare, Friburgo, Alemania). La identidad de la proteína se confirmó mediante espectrometría de masas LC-MS y las fracciones correctas se combinaron, se concentraron y se volvieron a tamponar utilizando dispositivos de concentración VivaSpin 15R con un límite de peso molecular (MWCO) de 10000 (VivaSciences/Sartorius Stedim Biotech, Gottingen, Alemania). La proteína purificada se almacenó a -20°C en un tampón que consistía en KCl 100 mM, Tris-HCl 10 mM, pH 7,4, EDTA 0,1 mM, DTT 1 mM y glicerol al 50 %. Las concentraciones de proteínas se estimaron mediante densiometría en gel utilizando un estándar de albúmina sérica bovina (abreviado BSA) en SDS-PAGE y tinción con SYPRO Red (Invitrogen, Karlsruhe, Alemania).

Ejemplo 8 - Producción de una polimerasa sintética Dpo4 que consiste en dos fragmentos.

La total-L-polimerasa Dpo4 tiene una longitud de 352 aminoácidos. Para producir químicamente la total-L-polimerasa Dpo4, dicha total-L-polimerasa Dpo4 sintética tuvo que ensamblarse a partir de fragmentos más cortos que pueden sintetizarse mediante síntesis de péptidos en fase sólida, en donde dichos fragmentos más cortos tuvieron que unirse mediante un método de unión peptídica tal como la unión química nativa. Este ejemplo describe cómo los fragmentos de unión 1-154, 155-352, 155-202 y 203-352 de Dpo4 se expresaron en E. coli, se purificaron y se unieron entre sí mediante unión química nativa para producir la total-L-polimerasa sintética Dpo4.

8.1 Constructos de expresión

Como se describe en el Ejemplo 7, el gen para la total-L-polimerasa Dpo4 se obtuvo como un constructo genético sintético de una fuente comercial (GeneArt, Regensburg, Alemania). Todos los fragmentos de este ejemplo se clonaron basándose en esa secuencia optimizada de codones. Se prepararon los siguientes constructos de expresión para los fragmentos 1 -154, 155-352, 155-202 y 203-352 de la variante A155C de la total-L-polimerasa Dpo4:

8.1.1 Fragmento 1-154-tioéster de la variante A155C de la total-L-polimerasa Dpo4 - Constructo de expresión pMJ370

Este constructo contiene el fragmento 1 -154 de la variante A155C de la total-L-polimerasa Dpo4 seguido de una inteína Mxe GyrA, que se usó para producir el tioéster, y un dominio de unión a quitina (CBD). El constructo se ensambló a partir de dos productos de PCR. El producto 1 de la PCR se preparó utilizando pMJ343 como una plantilla y los cebadores MJ_1_90_DD (5'-Fosfato-AGCGGCTCTTCGATGATTGTGCTGTTTGTGGATTTT-3') y MJ_1_91_DD (5'-Fosfato-AGCGGCTCTTcGGCATGCAATTTTGGCAAACACTTT-3') para amplificar el fragmento 1-154 de la variante A155C de la total-L-polimerasa Dpo4. El producto 2 de la PCR se preparó utilizando pTWIN1 (New England Biolabs, Frankfurt am Main, Alemania) como plantilla y los cebadores MJ_1_72_DD (5'-Fosfato-AGCGGCTCTTCGTGCATCACGGGAGAT-3') y MJ_1_73_DD (5'-FosfatoAGCGGCTCTTCGCCCTTGAAGCTGCCACAAGGCAGGAACGTT-3') para amplificar la inteína Mxe Gyr A y el CBD. Los cebadores MJ_1_90_DD y MJ_1_91_DD eran de Purimex (Grebenstein, Alemania), mientras que los cebadores MJ_1_72_DD y MJ_1_73_DD eran de IBA GmbH (Gottingen, Alemania). Los dos productos de PCR se purificaron en gel en un sistema flash-gel (LONZA, Basilea, Suiza) y se clonaron juntos en pENTRY-IBA20 usando el kit de clonación StarGate Mutagenesis ENTRY (IBA GmbH, Gottingen, Alemania) para dar como resultado pMJ366. La subclonación de pMJ366 en pASG-IBAwt1 (iBa GmbH, Gottingen, Alemania) utilizando el kit de clonación StarGate Transfer (IBA GmbH, Gottingen, Alemania) produjo pMJ370. El constructo pMJ370 codifica el fragmento 1-154-tioéster de la variante A155C de la total-L-polimerasa Dpo4 con la siguiente secuencia de proteínas de 154 aminoácidos de longitud (después de la escisión de la inteína/producción de tioéster):

MI VLFVDFDYFYAQVEEVLNPSLKGKPVWCVFSGRFEDSGAVATANYEARKFGVKAGIPIV

EAKKILPNAVYLPMRKEVYQQVSSRIMNLLREYSEKIEIASIDEAYLDISDKVRDYREAYNL

GLEIK NKI LEKEKITVTVGISKNKVFAKI A -tioéster .

8.1.2 Fragmento 155-352 de la variante A155C de la total-L-polimerasa Dpo4 - Constructo de expresión pMJ384

Este constructo contiene una etiqueta 'Profinity eXact' seguida del fragmento 155-352 de la variante A155C de la total-L-polimerasa Dpo4. La etiqueta 'Profinity eXact' se utilizó para la purificación y la escisión proteolítica. El constructo se ensambló a partir de dos productos de PCR. El producto 1 de la PCR se preparó utilizando pPAL7 (Bio-Rad, München, Alemania) como una plantilla y los cebadores MJ_1_99_DD (5'-Fosfato-AGCGGCTCTTCGATGGGAGGGAAATCAAACGGGGAA-3') y MJ_1_100_DD (5'-Fosfato-AGCGGCTCTTCGGCACAAAGCTTTGAAGAGCTTGTC-3') para amplificar la etiqueta ‘Profinity eXact’. El producto 2 de la PCR se preparó utilizando pMJ361 como una plantilla y los cebadores MJ_1_96_DD (5'-Fosfato-AGCGGCT CTTCGT GCGAT AT GGCAAAACCGAATGGCATT AAA-3') y MJ_1_97_DD (5'-Fosfato-AGCGGCTCTTCGCCCTTAGGTATCAAAAAATTTATCCAGG-3') para amplificar el fragmento 155-352 de Dpo4 que contiene la mutación A155C. Los cebadores MJ_1_96_DD, MJ_1_97_DD, MJ_1_99_DD y MJ_1_100_DD eran todos de Purimex (Grebenstein, Alemania). Los 2 productos de PCR se purificaron en gel en un sistema flash-gel (LONZA, Basilea, Suiza) y se clonaron juntos en pENTRY-IBA20 utilizando el kit de clonación StarGate Mutagenesis ENTRY (IBA GmbH, Gottingen, Alemania) para dar como resultado pMJ382. La subclonación de pMJ382 en pASG-IBA5 (IBA GmbH, Gottingen, Alemania) utilizando el kit de clonación StarGate T ransfer (IBA GmbH, Gottingen, Alemania) produjo pMJ384. El constructo pMJ384 codifica el fragmento 155-352 de la total-L-polimerasa Dpo4 que contiene la mutación A155C con la siguiente secuencia de proteínas de 198 aminoácidos de longitud (después de la escisión proteolítica):

CDMAKPNGIKVIDDEEVKRLIRELDIADVPGIGNITAEKLKKLGINKLVDTLSIEFDKLKGM

IGEAKAKYLISLARDEYNEPIRTRVRKSIGRIVTMKRNSRNLEEIKPYLFRAIEESYYKLDK

RIPKAIHWAVTEDLDIVSRGRTFPHGISKETAYSESVKLLQKILEEDERKIRRIGVRFSKF

IEAIGLDKFFDT.

8.1.3 Fragmento 203-352 de la variante A155C de la total-L-polimerasa Dpo4 - Constructo de expresión pMJ385

Este constructo contiene una etiqueta 'Profinity eXact' seguida del fragmento 203-352 de dpo4 que contiene la mutación V203C. La etiqueta 'Profinity eXact' se utilizó para la purificación y la escisión proteolítica. El constructo se ensambló a partir de dos productos de PCR. El producto de PCR 1 se preparó utilizando pPAL7 (Bio-Rad, München, Alemania) como una plantilla y los cebadores MJ_1_99_DD (5'-Fosfato-AGCGGCTCTTCGATGGGAGGGAAATCAAACGGGGAA-3') y MJ_1_100_DD (5'-Fosfato-AGCGGCTCTTCGGCACAAAGCTTTGAAGAGCTTGTC-3') para amplificar la etiqueta ‘Profinity eXact’. El producto 2 de la PCR se preparó usando pMJ362 como una plantilla y los cebadores MJ_1_98_DD (5'-Fosfato-AGCGGCT CTTCGT GT GAT ACCCT GAGCATT GAATTT-3') y MJ_1_97_DD (5'-Fosfato-AGCGGCTCTTCGCCCTTAGGTATCAAAAAATTTATCCAGG-3') para amplificar el fragmento 203-352 de dpo4 que contiene la mutación V203C. Los cebadores MJ_1_97_DD, MJ_1_98_DD, MJ_1_99_DD y MJ_1_100_ d D fueron todos de Purimex (Grebenstein, Alemania). Los 2 productos de PCR se purificaron en gel en un sistema flash-gel (LONZA, Basilea, Suiza) y se clonaron juntos en pENTRY-IBA20 utilizando el kit de clonación StarGate Mutagenesis ENTRY (IBA GmbH, Gottingen, Alemania) para dar como resultado pMJ383. La subclonación de pMJ383 en pASG-IBA5 (IBA GmbH, Gottingen, Alemania) utilizando el kit de clonación StarGate Transfer (IBA GmbH, Gottingen, Alemania) produjo pMJ385. El constructo pMJ385 codifica el fragmento 203-352 de dpo4 con V203C con la siguiente secuencia de proteínas de 150 aminoácidos de longitud (después de la escisión proteolítica):

CDTLSIEFDKLKGMIGEAKAKYLISLARDEYNEPIRTRVRKSIGRIVTMKRNSRNLEEIKPY

LFRAIEESYYKLDKRIPKAIHWAVTEDLDIVSRGRTFPHGISKETAYSESVKLLQKILEED

ERKIRRIGVRFSKFIEAIGLDKFFDT

8.1.4 Fragmento 155-202 de la total-L-polimerasa Dpo4 - Constructo de expresión pMJ388

Este constructo contiene el fragmento 155-202 de dpo4 seguido de una inteína Mxe GyrA, que se usó para producir el tioéster, y un dominio de unión a quitina (CBD). El constructo se ensambló a partir de dos productos de PCR. El producto de PCR 1 se preparó utilizando pMJ343 como una plantilla y los cebadores MJ_1_101_DD (5'-Fosfato-AGCGGCTCTTCGATGGCAGATATGGCAAAACCGAAT-3') y MJ_1_102_DD (5'-Fosfato-AGCGGCTCTTCGGCACAGTTTATTAATGCCCAGTTT-3') para amplificar el fragmento 155-202 de dpo4. El producto 2 de la PCR se preparó utilizando pTWIN1 (New England Biolabs, Frankfurt am Main, Alemania) como una plantilla y los cebadores MJ_1_72_DD (5'-Fosfato-AGCGGCTCTTCGTGCATCACGGGAGAT-3') y MJ_1_73_DD (5'-Fosfato-AGCGGCTCTTCGCCCTTGAAGCTGCCACAAGGCAGGAACGTT-3') para amplificar la inteína Mxe Gyr A y el CBD. Los cebadores MJ_1_101_DD y MJ_1_102_DD fueron de Purimex (Grebenstein, Alemania), mientras que los cebadores MJ_1_72_DD y MJ_1_73_DD fueron de IBA GmbH (Gottingen, Alemania). Los 2 productos de PCR se purificaron en gel en un sistema flash-gel (LONZA, Basilea, Suiza) y se clonaron juntos en pENTRY-IBA20 utilizando el kit de clonación StarGate Mutagenesis ENTRY (IBA GmbH, Gottingen, Alemania) para dar como resultado pMJ386. La subclonación de pMJ386 en pASG-IBAwt1 (IBA GmbH, Gottingen, Alemania) utilizando el kit de clonación StarGate Transfer (IBA GmbH, Gottingen, Alemania) produjo pMJ388. El constructo pMJ388 codifica el fragmento 155-202 de dpo4 con la siguiente secuencia de proteínas de 48 aminoácidos de longitud (después de la escisión mediada por E. coli de la metionina inicial y después de la escisión de inteína/producción de tioéster):

8.2 Expresión de proteínas en E. coli.

Para la expresión, se transformó el constructo de expresión apropiado en la cepa de E. coli 'NEB express' (New England Biolabs, Frankfurt am Main, Alemania) usando 'Transformation and Storage Solution' (Epicentre/Biozym, Hessisch Oldendorf, Alemania) y se mantuvo con el antibiótico ampicilina. La expresión se realizó en medio 'EnBase Flo' o 'EnPresso' (BioSilta, Oulu, Finlandia) a temperatura ambiente, utilizando 200 ng/ml de anhidrotetraciclina (IBA GmbH, Gottingen, Alemania) como inductor durante un período de una noche. Las células se recogieron mediante centrifugación y se almacenaron a -80°C o se procesaron inmediatamente.

8.3 Purificación y generación de un tioéster a partir de los constructos pMJ370 y pMJ388 con inteína Mxe Gyr A

Se resuspendieron células de E. coli frescas o congeladas en hielo en un 'tampón de columna' (HEPES 20 mM, pH 8,5, NaCl 500 mM) y se lisaron utilizando un disruptor celular 'French Press' (G. Heinemann, Schwabisch Gmünd, Alemania). La purificación se realizó a 4°C en un sistema 'ÁKTA Express' (GE Healthcare, Friburgo, Alemania) equipado con columnas que contenían perlas de unión a quitina (New Englands Biolabs, Frankfurt am Main, Alemania). Después de aplicar el lisado celular y lavar con tampón de columna hasta el valor inicial, las columnas se incubaron durante 20 horas a 4°C con 2-mercaptoetanosulfonato 50 mM (abreviado MESNA) en tampón de columna para inducir la escisión de proteínas mediada por inteína y la formación del tioéster. La proteína escindida que lleva el tioéster se eliminó de la columna con tampón de columna, se concentró y se sometió a filtración en gel usando material medio BioGel P60 (BioRad, München, Alemania) en un tampón que consistía en Bis-Tris 5 mM, pH 6,5, NaCl 250 mM. Las concentraciones de proteínas se estimaron mediante densiometría en gel utilizando un estándar de albúmina sérica bovina (BSA) en SDS-PAGE y tinción con SYPRO Red (Invitrogen, Karlsruhe, Alemania). La identidad de la proteína y la presencia del tioéster se confirmaron mediante espectrometría de masas LC-MS.

8.4 Purificación y escisión proteolítica del constructo pMJ384 con la etiqueta 'Profinity eXact'

La purificación del fragmento 155-352 de la variante A155C de la total-L-polimerasa Dpo4 a partir de pMJ384 se realizó de la siguiente manera: se resuspendieron células de E. coli frescas o congeladas en hielo en 'Tampón W' (Tris-HCl 100 mM, pH 8,0, NaCl 150 mM, EdTA 1 mM) y se lisaron usando un disruptor celular 'French Press' (G. Heinemann, Schwabisch Gmünd, Alemania). La purificación se realizó a 4°C en un sistema 'ÁKTA Express' equipado con columnas StrepTrap HP de 5 ml (GE Healthcare, Friburgo, Alemania). La elución por etapas se realizó con tampón W que incluía destiobiotina 2,5 mM (IBA GmbH, Gottingen, Alemania). La proteína eluida se sometió a intercambio de tampón en 'tampón de elución Profinity eXact' (fosfato de sodio 0,1 M, pH 7,2, NaF 0,1 M) utilizando una columna de desalinización HiPrep 26/10 (GE Healthcare, Friburgo, Alemania) y después se bombeó lentamente a través de un Columna Profinity eXact. La muestra se concentró, se suplementó con Tris(2-carboxietil)fosfina) (TCEP) hasta una concentración final de 1 mM y se aplicó a filtración en gel usando una columna de grado preparativo HiLoad 16/60 Superdex 75 (GE Healthcare, Friburgo, Alemania) desarrollada en un tampón que consistía en Bis-Tris 5 mM, pH 6,5, NaCl 250 mM. La proteína se concentró y se almacenó a -80°C. Las concentraciones de proteínas se estimaron mediante densiometría en gel utilizando un estándar de albúmina sérica bovina (BSA) en SDS-PAGE y tinción con SYPRO Red (Invitrogen, Karlsruhe, Alemania). La identidad de las proteínas se confirmó mediante espectrometría de masas LC-MS.

8.5 Purificación y escisión proteolítica del constructo pMJ385 con la etiqueta 'Profinity eXact'

La purificación del fragmento 203-352 de dpo4 con V203C a partir de pMJ385 se realizó de la siguiente manera: los cuerpos de inclusión se prepararon y desnaturalizaron como se describe en el manual 'i-FOLD Protein refolding system' (Novagen/Merck-Millipore, Darmstadt, Alemania). La proteína solubilizada se sometió a intercambio de tampón en 'Tampón W' (Tris-HCl 100 mM, pH 8,0, NaCl 150 mM, EDTA 1 mM) utilizando material fino Sephadex G-25 (GE Healthcare, Friburgo, Alemania) y se purificó a 4°C en un sistema 'ÁKTA Express' equipado con columnas StrepTrap HP (GE Healthcare, Friburgo, Alemania). La elución por etapas se realizó con tampón W que incluía destiobiotina 2,5 mM (IBA GmbH, Gottingen, Alemania). La solución de proteína eluida se suplementó con NaF hasta una concentración final de 0,1 M y Tris(2-carboxietil)fosfina) (TCEP) hasta una concentración final de 1 mM y después se bombeó lentamente a través de una columna Profinity eXact. El flujo se diluyó 1:3 con agua desionizada y el pH se ajustó a 7,2 usando HCl. La muestra se purificó adicionalmente mediante cromatografía de intercambio catiónico utilizando columnas HiTrap SP HP (GE Healthcare, Friburgo, Alemania) equilibradas en 'Tampón A' (fosfato de sodio 50 mM, pH 7,2, 2-mercaptoetanol 1 mM). La elución por etapas se realizó utilizando 17 %, 25 % y 100 % de 'Tampón B' (fosfato de sodio 50 mM, pH 7,2, NaCl 1 M, 2-mercaptoetanol 1 mM). Las fracciones se combinaron, se concentraron y se aplicaron a filtración en gel usando una columna de grado preparativo HiLoad 16/60 Superdex 75 (GE Healthcare, Friburgo, Alemania) desarrollada en agua desionizada. La proteína se congeló por choque en nitrógeno líquido y se liofilizó. Las concentraciones de proteínas se estimaron mediante densiometría en gel utilizando un estándar de albúmina sérica bovina (BSA) en SDS-PAGE y tinción con SYPRO Red (Invitrogen, Karlsruhe, Alemania). La identidad de las proteínas se confirmó mediante espectrometría de masas LC-MS.

8.6 Síntesis de la variante A155C de la total-L-polimerasa Dpo4 sintética mediante unión química nativa de los fragmentos 1-154-tioéster y 155-352

Los fragmentos 1 -154-tioéster y 155-352 de la variante A155C de la total-L-polimerasa Dpo4 se disolvieron 50 pM en tampón TRIS (pH 8,6) que contenía Triton X100 al 2 %, tiofenol al 1 % y clorhidrato de tris(2-carboxietil)fosfina 5 mM. La mezcla de reacción se agitó durante 72 h a temperatura ambiente. Posteriormente, el éxito de la unión se analizó mediante SDS-PAGE (Figura 11A) y espectrometría de masas LC-ESI (columna RP18, gradiente de ACN con TFA al 0,1 % en agua con 0,1 % de TFA al 5-95 % en 20 min, Figura 11B). Se encontró una banda clara en el carril alrededor de 41 kDa que indica la polimerasa de longitud completa. El peso molecular teórico (Mteórico = 40223 Da) corresponde al peso molecular observado (Mobs = 40265 Da) como se muestra por ESI-MS.

8.7 Síntesis del fragmento 155-352 mediante unión química nativa de los fragmentos 155-202-tioéster y 203 352

Los fragmentos 155-202-tioéster y 203-352 de V203C de la total-L-polimerasa Dpo4 se disolvieron 0,2 M en tampón TRIS (pH 8,6) que contenía SDS al 2 %, tiofenol al 1 % y clorhidrato de tris(2-carboxietil)fosfina 5 mM. La mezcla de reacción se agitó durante 72 h a temperatura ambiente. El análisis del éxito de la unión se realizó mediante SDS-PAGE (Figura 20A) y espectrometría de masas LC-ESI (columna RP18, gradiente de ACN con TFA al 0,1 % en agua con 0,1 % de TFA al 5-95 % en 20 min, Figura 20B). Se encontró una banda clara en el carril 7 de alrededor de 21,5 kDa que indica el producto de unión. El peso molecular teórico (Mteórico = 22749 Da) corresponde al peso molecular observado (Mobs = 22769 Da) como se muestra por ESI-MS.

Ejemplo 9 - Confirmación de la actividad de la polimerasa Dpo4 y variantes de la polimerasa Dpo4 que consisten en L-aminoácidos.

Este ejemplo describe una prueba de actividad de PCR para la total-L-polimerasa Dpo4 y variantes de la total-L-polimerasa Dpo4 según el ejemplo 7 y para la total-L-polimerasa Dpo4 sintética según el ejemplo 8.

9.1 Plantillas para ensayo de actividad de PCR.

La plantilla para la reacción de PCR es un oligonucleótido de D-DNA monocatenario de 83 unidades (MJ 1_1 DD) a partir del cual, en el primer ciclo térmico, se forma la cadena opuesta. A partir de entonces, ambas cadenas sirven como plantilla para la amplificación exponencial. El oligonucleótido de D<n>A plantilla y los cebadores de DNA se sintetizan en NOXXON en configuración D.

Lista de oligonucleótidos para el ensayo de actividad de PCR:

9.2 reacciones de PCR

15 pl de reacciones de PCR contenían 0,2 mM de cada uno de los cuatro D-dNTPs, plantilla de DNAss de 83 unidades 10 nM (MJ_1_1_DD), 1 pM de cebador directo e inverso, 1x tampón ThermoPol (Invitrogen, Tris-HCl 20 mM, KCl 10 mM, (NH4)2SO410 mm, MgSO4 2 mM, 0,1 % de Triton X-100, pH 8,8 a 25°C) y al menos 0,67 ng/pl de la total-Lpolimerasa Dpo4 o una variante de la total-L-polimerasa Dpo4 o la total-L-polimerasa sintética Dpo4. El cebador directo es DE4.40T7, el cebador inverso es DE4.40R, lo que produce un producto de PCR de 102 pares de bases de longitud. Los D-dNTPs se adquirieron en Rovalab (Teltow, Alemania). Los controles negativos se realizaron omitiendo la total-L-polimerasa Dpo4 o una variante de la total-L-polimerasa Dpo4 o la total-L-polimerasa Dpo4 sintética. Los controles positivos se realizaron utilizando la total-L-dpo4 disponible comercialmente (New England Biolabs, Frankfurt am Main, Alemania).

El programa de ciclo térmico consistió en 1 ciclo (85°C, 3 min), después al menos 7 ciclos (85°C, 30 s/56°C, 1 min/60°C, 4 min) y después se mantuvo a 4°C. Se mezclaron alícuotas de 4 pl de las reacciones de PCR con tampón de carga de muestra y se analizaron en TBE-PAGE o en geles de agarosa (LONZA, Colonia, Alemania). Una escalera estándar de DNA que contenía, entre otros, una banda de 100 pb se aplicó sobre el gel.

9.3 Confirmación de actividad

Se probaron la total-L-polimerasa Dpo4, las variantes A155C, V203C, C31S, A155C/V203C, S85C, S86C, S96C de la total-L-polimerasa Dpo4 y la total-L-polimerasa Dpo4 sintética. Todas las polimerasas probadas fueron capaces de amplificar la cadena plantilla en la reacción de PCR. La Figura 12A muestra el análisis de las reacciones de PCR realizadas con las variantes A155C, V203C, C31S, A155C/V203C de la total-L-polimerasa Dpo4, todas las cuales mostraron una banda en el intervalo de aproximadamente 100 pb en comparación con la escalera estándar de DNA. El tamaño esperado del producto de PCR era de 102 pares de bases. Dicha banda no aparece en los controles negativos, donde se omite la polimerasa. También dicha banda de 102 pb migra más alto que la plantilla de 83 unidades. La Figura 12B muestra el análisis de las reacciones de PCR realizadas con la total-L-polimerasa dpo4 recombinante y con la total-L-polimerasa dpo4 sintética que se preparó mediante la unión de fragmentos. El gel mostró bandas en el intervalo de aproximadamente 100 pb en comparación con la escalera estándar de DNA. El tamaño esperado del producto de PCR era de 102 pares de bases. Dicha banda es muy débil en los controles negativos, donde se omite la polimerasa. La total-L-polimerasa dpo4 recombinante y la total-L-polimerasa dpo4 sintética muestran una actividad idéntica, como se puede observar al comparar los carriles 2 y 3 de la Figura 12B.

Ejemplo 10 - Síntesis de una variante de la polimerasa Dpo4 que consiste en D-aminoácidos.

En el ejemplo se describe la síntesis de la variante A155C/V203C de la total-D-polimerasa Dpo. La secuencia de aminoácidos de la variante A155C/V203C de la total-D-polimerasa Dpo es

Ac-MIVLFVDFDYFYAQVEEVLNPSLKGKPVVVCVFSGRFEDSGAVATANYEARKFG

VKAGIPIVEAKK1LPNAVYLPMRKEVYQQVSSRIMNLLREYSEKIEIASIDEAYLDISD

KVRDYREAYNLGLEIKNKILEKEKITVTVGISKNKVFAKIACDMAKPNGIKVIDDEEV

KRLIRELDIADVPGIGNITAEKLKKLGINKLCDTLSIEFDKLKGMIGEAKAKYLISLAR

DE YNEPIRTR VRK SIGRIVTMKRN SRNLEEIKPYLFR AFEES YYKLDKRIPKAIHVV A V

TEDLDIVSRGRTFPHG1SKETAYSESVKLLQKILEEDERKIRRIGVRFSKFIEA1GLDKFF

DT-OH.

Todos los aminoácidos utilizados están protegidos segúnSolid-phase peptide synthesis Fmoc/tBu strategy requirements(Eric Atherton et al, 1981). Todos los aminoácidos utilizados son D-aminoácidos (Bachem, Bubendorf, Suiza).

10.1 Síntesis de H-D-Met-OGp(Boc)<2>

1 mmol de ZD-Met-OH, 0,9 eq. de TBTU y 0,9 mmol de HO-Gp(Boc<)2>se disolvieron en 10 ml de DMF. Después de la adición de 2 eq. de DIPEA la solución se agitó durante 2 horas. Después de evaporar el disolvente, el producto bruto se purificó con cromatografía flash usando DCM. Las fracciones puras de Z-D-Met-OGp(Boc<)2>se combinaron y el disolvente se evaporó.

ZD-Met-OGp(Boc<)2>se disolvió en 10 ml de MeOH y se lavó con argón. La escisión hidrolítica del grupo Z N-terminal se logró mediante la adición de catalizador Pd/C e H<2>en 2 horas. Después de la filtración de H-D-Met-OGp(Boc<)2>se evaporó el MeOH a presión reducida. Las analíticas se realizaron mediante HPLC de fase reversa y espectrometría de masas. La masa calculada de 482 Da está en conformidad con la masa determinada de 483 Da.

10.2 Síntesis del total-D-péptido

H-RTFPHGISKETAYSESVKLLQKILEEDERKIRRIGVRFSKFIEAIGLDKFFDT-NH<2>(1)

0,1 mmol de resina NovaSynTG de amida de rink Fmoc-Sieber se cargó después de la desprotección de Fmoc con Fmoc-D-Thr(tBu)-OH usando 5 eq. de aminoácido, 4,9 eq. de HATU y 10 eq. de DIPEA durante 45 min en 6 ml de NMP.

La síntesis automatizada se realizó utilizando un ABI 433 con el protocolo FASTmoc. 10 eq. de los aminoácidos se activaron usando 9 eq. de HATU y 20 eq. de DIPEA en NMP. El tiempo de acoplamiento fue de 45 min y la desprotección del Fmoc se realizó tres veces durante 7 min con piperidina al 20% (v/v) en NMP. Se realizó un doble acoplamiento después del acoplamiento de 42 aminoácidos.

La escisión del ácido peptídico completamente protegido se logró incubando la resina de peptidilo dos veces en 10 ml de TFA al 1 % (v/v) en DCM durante 2 horas. Después de filtrar el péptido, se evaporó el disolvente y el residuo precipitó usando éter dietílico enfriado con hielo. El péptido precipitado se aisló y se secó.

El producto final se caracterizó por HPLC y espectrometría de masas (Figura 13). La masa calculada para el producto (6244 Da) corresponde a la masa medida (6249 Da).

10.3 Síntesis del total-D-péptido completamente Boc-protegido

VDTLSIEFDKLKGMIGEAKAKYLISLARDEYNEPIRTRVRKS1GRIVTMKRNSRNLEEI KPYLFRAIEESYYKLDKRIPKAIHVVAVTEDLDIVSRG-OH(2)

0,10 mmol de resina TentaGel-R-Trityl se cargó con Fmoc-D-Gly-OH como se describe en Barlos et al. (Barlos et al., 1989). Por lo tanto, se incubaron 0,10 mmoles de resina dos veces durante 30 minutos con 0,6 mmoles de cloruro de tionilo y posteriormente se lavaron con DCM. Después de esto, la resina se incubó durante 90 minutos con 0,6 mmol de Fmoc-Gly-OH, 2,4 mmol de DIPEA en 6 ml de DCM. Posteriormente, la resina se bloqueó tres veces durante 10 minutos usando una solución de MeOH al 10% (v/v), 10% de DIPEA (v/v) en DCM y se lavó con DCM. La síntesis automatizada se realizó utilizando un ABI 433 con el protocolo FASTmoc. 10 eq. de los aminoácidos se activaron usando 9 eq. de HATU y 20 eq. de DIPEA en NMP. El tiempo de acoplamiento fue de 45 min y la desprotección de Fmoc se realizó tres veces durante 7 min con piperidina al 20% (v/v) en NMP. Se realizó un doble acoplamiento después del acoplamiento de 39 aminoácidos.

La escisión del ácido peptídico completamente protegido se logró incubando la resina de peptidilo dos veces en 10 ml de HFIP al 30 % (v/v) en DCM durante 2 horas. Después de filtrar el péptido, se evaporó el disolvente y el residuo se precipitó usando éter dietílico enfriado con hielo. El péptido precipitado se aisló y se secó. El producto final se caracterizó por HPLC y espectrometría de masas (Figura 14). La masa del producto determinada experimentalmente (11289 Da) estaba en conformidad con el valor teórico (11286 Da).

10.4 Síntesis del total-D-péptido

H-VDTLSIEFDKLKGMIGEAKAKYLISLARDEYNEPIRTRVRKSIGRIVTMKRNSRNLE

EIKP YLFR AIEE S YYKLDKRIPK AIHVV A VTEDLDIV SRGRTFPFTGISKET AY SES VKLL OKILEEDERKIRRTGVRFSKFIEAIGLDKFFDT-NH2Í3)

por condensación de fragmentos del péptido 1 con el péptido 2.

5 pmol de(2)y 1 eq. de(1)se disolvieron en TFE al 25% (v/v) en DCM. Después de la adición de 5 eq. de PyBOP y 10 eq. de DIPEA la mezcla se agitó durante la noche. Después de evaporar el disolvente, el péptido se precipitó usando éter dietílico enfriado con hielo y se separó por filtración.

La escisión de los grupos protectores de la cadena lateral del péptido se realizó con EDT al 2,5%, agua al 2,5% y TIS al 2,5% en TFA durante 2 horas. Después de la evaporación del TFA, el péptido se precipitó con éter dietílico enfriado con hielo. La purificación por HPLC en fase reversa del péptido protegido con Fmoc en el N-terminal se realizó en una columna C18 usando un gradiente de ACN/agua. Las fracciones que contenían producto se combinaron y se liofilizaron.

El producto final se caracterizó por HPLC y espectrometría de masas (Figura 15). La masa determinada experimentalmente (17531 Da) corresponde a la masa molecular teórica (17512 Da).

10.5 Síntesis del total-D-péptido

Z-CDMAKPNGlKVlDDEEVKRLIRELDIADVPGlGNlTAEKJ.KKI.GINKF-bencil-

tioéster (41.

0,10 mmol de resina TentaGel-R-Trityl se cargaron con Fmoc-D-Leu-OH como se describe en Barlos et al. (Barlos et al., 1989). Por lo tanto, se incubaron 0,10 mmol de resina dos veces durante 30 minutos con 0,6 mmol de cloruro de tionilo y posteriormente se lavó con DCM. Después de esto, la resina se incubó durante 90 minutos con 0,6 mmol de Fmoc-D-Leu-OH, 2,4 mmol de DIPEA en 6 ml de DCM. Después, la resina se bloqueó tres veces durante 10 minutos usando una solución de 10% de MeOH (v/v), 10% de DIPEA (v/v) en DCM y se lavó con DCM. La síntesis automatizada se realizó usando un ABI 433 con el protocolo FASTmoc. 10 eq. de los aminoácidos se activaron usando 9 eq. de HATU y 20 eq. de DIPEA en NMP. El tiempo de acoplamiento fue de 45 min y la desprotección del Fmoc se realizó tres veces durante 7 min con piperidina al 20% (v/v) en NMP.

La escisión del ácido peptídico completamente protegido se logró incubando la resina de peptidilo dos veces en 10 ml de HFIP al 30 % (v/v) en DCM durante 2 horas. Después de filtrar el péptido, se evaporó el disolvente y el residuo se precipitó usando éter dietílico enfriado con hielo. El péptido precipitado se aisló y se secó.

El péptido 4 N-terminal Z- y completamente protegido en la cadena lateral se disolvió 1 mM en DMF. Después de la adición de 5 eq. de PyBOP, 10 eq. de DIPEA y 30 eq. de bencilmercaptano, la mezcla se agitó durante 4 h. Después se evaporó la DMF, se precipitó el péptido y se lavó con éter dietílico enfriado con hielo. Los grupos protectores de la cadena lateral se eliminaron mediante tratamiento con EDT al 2,5%, agua al 2,5% y TIS al 2,5% en TFA durante 2 horas. Después de la evaporación del TFA, el péptido se precipitó y se lavó con éter dietílico enfriado con hielo. A continuación, el péptido-bencil-tioéster se purificó mediante HPLC de fase reversa y se analizó mediante HPLC de fase reversa (Figura 16A) y ESI-MS (Figura 16B). El peso molecular teórico (Mteórico = 5527 Da) corresponde al peso molecular observado (Mobs = 5533 Da) como se muestra por ESI-MS.

10.6 Síntesis del total-D-péptido

H-RKEVYOOVSSRIMNLLREYSEKIEIAS1DEAYLDISDKVRDYREAYNLGLE1KNKILE KEKITVTVGISKNKVFAKIA-SMe (7)

0,10 mmoles de la resina TentaGel-R-NH<2>se cargaron con Fmoc-D-Ala-OH usando 5 eq. de aminoácido, 4,9 eq. de HATU y 10 eq. de DIPEA durante 45 min en 6 ml de NMP. Posteriormente la resina se lavó con THF. La conversión a Fmoc-D-Ala-^[CS-NH]-R-TentaGel se logró mediante la incubación con 4 eq. de reactivo de Lawesson en THF a 80°C durante 2 horas. Después de esto, la resina se lavó con NMP. Posteriormente, la resina así preparada se usó en la síntesis automatizada de péptidos como se describió anteriormente (ABI 433, protocolo FASTmoc, se activaron 10 eq. de aminoácidos usando 9 eq. de HATU y 20 eq. de DIPEA en NMP; el tiempo de acoplamiento fue de 45 min y la desprotección con Fmoc se realizó tres veces durante 7 min con piperidina al 20% (v/v) en NMP). Se realizaron etapas de doble acoplamiento después de 44 aminoácidos acoplados.

Después de esto, se generó el tioéster correspondiente mediante incubación con yoduro de metilo en DMF durante la noche según Sharma et al. (Sharma et al, 2011). Después de filtrar la resina, se evaporó el disolvente que contenía el tioéster peptídico y el residuo se precipitó usando éter dietílico enfriado con hielo. La escisión de los grupos protectores de las cadenas laterales se realizó con 2,5 % de EDT, 2,5 % de agua y 2,5 % de TIS en TFA durante 2 horas. Después de la evaporación del TFA, el péptido se precipitó con éter dietílico enfriado con hielo. La purificación por HPLC en fase reversa del tioéster peptídico se realizó en una columna C18 usando un gradiente de ACN/agua. Las fracciones que contenían el producto se combinaron y se liofilizaron.

El producto final se caracterizó por HPLC (Figura 17A) y espectrometría de masas (Figura 17B). La masa molecular del producto determinada mediante espectrometría de masas (9155 Da) estaba en conformidad con la masa calculada (9150 Da).

10.7 Síntesis de

Ac-MIVLFVDFDYFYAOVEEVLNPSLKGKPVVVCVFSGRFEDSGAVATANYEARKFG

VKAGIPIVEAKKILPNAVYLPM-OGp (6)

0,10 mmol de resina TentaGel-R-Trityl se cargaron con Fmoc-D-Pro-OH como se describe en Barlos et al. (Barlos et al., 1989). Por lo tanto, se incubaron 0,10 mmol de resina dos veces durante 30 minutos con 0,6 mmol de cloruro de tionilo y posteriormente se lavaron con DCM. Después de esto, la resina se incubó durante 90 minutos con 0,6 mmol de Fmoc-D-Pro-OH, 2,4 mmol de DIPEA en 6 ml de DCM. Posteriormente, la resina se bloqueó tres veces durante 10 minutos usando una solución de MeOH al 10% (v/v), 10% de DIPEA (v/v) en DCM y se lavó con DCM. La síntesis automatizada se realizó utilizando un ABI 433 con el protocolo FASTmoc. 10 eq. de los aminoácidos se activaron usando 9 eq. de HATU y 20 eq. de DIPEA en NMP. El tiempo de acoplamiento fue de 45 min y la desprotección de Fmoc se realizó tres veces durante 7 min con piperidina al 20% (v/v) en NMP. Se realizó un doble acoplamiento después del acoplamiento de 46 aminoácidos. La acetilación de los N-terminales se realizó con anhídrido acético al 10% (v/v) y DIPEA al 10% (v/v) en DMF tres veces durante 10 minutos.

0,01 mmol de péptido totalmente protegido, 4 eq. de PyBOP y 5 eq. de HD-Met-OGp(Boc)<2>se disolvieron en 6 ml de NMP. Después de la adición de 10 eq. de DIPEA la mezcla se agitó durante 4 horas. Después de esto, el disolvente se redujo, se evaporó y el residuo se precipitó con éter dietílico enfriado con hielo. El éster peptídico precipitado se secó y posteriormente se escindieron los grupos protectores usando EDT al 2,5%, agua al 2,5% y TIS al 2,5% en TFA durante 2 horas. Después de la evaporación del TFA, el péptido se precipitó con éter dietílico enfriado con hielo. La purificación por HPLC en fase reversa del éster peptídico se realizó en una columna C18 usando un gradiente de ACN/agua. Las fracciones que contenían producto se combinaron y se liofilizaron.

El producto final se caracterizó por HPLC (Figura 18A) y espectrometría de masas (Figura 18B). La masa determinada experimentalmente (8547 Da) correspondía a la masa molecular teórica (8541 Da).

10.8 Síntesis del total-D-péptido

H-CDMAK.PNGIKVIDDEEVKRLIRELÜIADVPGIGNITAEKLKK.LGINK.LCDTLSIEFDK LKGMIGEAKAKYLISLARDEYNEPIRTRVRKSIGRIVTMKRNSRNLEEIKPYLFRAIEES YYKLDKRIPKAIHVVAVTEDLDIVSRGRTFPHGISKETAYSESVKLLOKILEEDERKIR RIG VRFSKFIEAIGLDKFFDT-OH (5)

por unión química nativa del péptido 4 con el péptido 3

Ambos péptidos3y4se disuelven 0,2 M en tampón TRIS (pH 8,6) que contiene 2% de SDS, 1% de tiofenol y clorhidrato de tris(2-carboxietil)fosfina 5 mM. La mezcla de reacción se agitó durante 72 h a temperatura ambiente. Después la mezcla se purifica mediante HPLC de fase reversa. Para la eliminación del grupo protector Z del N-terminal, el péptido se disolvió en 270 eq. de TFA y 50 eq. de tioanisol y se agita durante 6 h a temperatura ambiente (Yoshiaki Kisoet al, 1980). Después de la evaporación del TFA, el péptido se precipitó y se lavó con éter dietílico enfriado con hielo y se purificó nuevamente mediante HPLC de fase reversa (Phenomenex, Aschaffenburg, Alemania). El análisis del péptido5libre se realiza mediante SDS-PAGE, UPLC de fase reversa y espectrometría de masas ESI. Se encuentra la masa correcta del producto.

10.9 Síntesis del total-D-péptido

Ac-MIVLFVDFDYFYAOVEEVLNPSLKGKPVVVCVFSGRFEDSGAVATANYEARKFG

VK AGIPIVE AKKILPN A VYLPMRKE VYOO V S SRIMNLLRE Y SEKIEIA SIDE A YLDISD KVRDYREAYNLGLEIKNKILEKEKITVTVGISKNKVFAKIA-SMe (81

mediante la unión catalizada por proteasa del péptido 6 con el péptido 7

El péptido6se disolvió 0,2 mM y el péptido7se disolvió 0,6 mM en tampón fosfato de sodio (100 mM, pH 8,5, con NaCl 100 mM) que contenía urea 4 M. Después de la adición de clostripaína 20 pM (Endoprotease Arg-C, Worthington Biochemical Corporation, Lakewood, Nueva Jersey, USA), la mezcla de reacción se agitó durante la noche a 37°C. Los péptidos precipitados se centrifugaron, se disolvieron en H<2>Ü/ácido fórmico 80/20 y se purificaron mediante HPLC de fase reversa utilizando una columna RP-18 (Phenomenex, Aschaffenburg, Alemania) con un gradiente de ACN en agua del 5 % al 95 % en 30 min. El péptido final se analizó mediante SDS-PAGE (Figura 19A) y espectrometría de masas ESI (Figura 19B). Se encontró una banda en el carril 1 entre 14,4 kDa y 21,5 kDa que indica el producto de unión. El peso molecular teórico del producto de unión (Mteórico = 17476 Da) corresponde al peso molecular observado (Mobs = 17486 Da) como se muestra por ESI-MS.

10.10 Síntesis de la variante A115C/V203C de la total-D-polimerasa Dpo mediante unión química nativa del péptido 8 con el péptido 5

Ambos péptidos5y8se disuelven 0,2 M en tampón TRIS (pH 8,6) que contiene 2% de Triton X100, 1% de tiofenol y clorhidrato de tris(2-carboxietil)fosfina 5 mM. La mezcla de reacción se agita durante 72 h a temperatura ambiente. Posteriormente, la mezcla se purifica mediante HPLC de fase reversa y se analiza mediante SDS-PAGE, UPLC de fase reversa y espectrometría de masas ESI. Se encuentra la masa correcta del producto de unión.

Ejemplo 11 - Confirmación de la actividad de la polimerasa dpo4 sintética que consiste en D-aminoácidos

Este ejemplo describe una prueba de actividad de PCR para la variante A155C/V203C de la total-D-polimerasa Dpo según el ejemplo 10.

Sorprendentemente, la variante A155C/V203C de la total-D-polimerasa Dpo4 sintética es activa sin esfuerzos de replegamiento adicionales y, por lo tanto, se utiliza sin procedimiento de replegamiento adicional. La concentración de proteínas se estima mediante electroforesis en gel de poliacrilamida (abreviado PAGE) con dodecilsulfato de sodio (abreviado SDS) en geles prefabricados (Invitrogen, Karlsruhe, Alemania) utilizando una serie estándar de concentraciones de proteínas conocidas seguidas de tinción con SYPRO-RED (Invitrogen, Karlsruhe, Alemania) y análisis de bandas densiométricas en un instrumento de escáner BioRad Fx.

11.1 Plantillas para ensayo de actividad de PCR.

La plantilla para la reacción de PCR es un oligonucleótido de L-DNA monocatenario de 83 unidades (MJ_1_105_LD) a partir del cual, en el primer ciclo térmico, se prepara la cadena opuesta. A partir de entonces, ambas cadenas sirven como plantilla para la amplificación exponencial. El oligonucleótido de DNA plantilla y los cebadores de DNA se sintetizan en NOXXON en configuración L.

Lista de oligonucleótidos para ensayo de actividad de PCR:

11.2 reacciones de PCR

15 pl de reacciones de PCR contienen 0,2 mM de cada uno de los cuatro L-dNTPs, plantilla de ssDNA de 83 unidades 10 nM (MJ_1_105_LD), 1 pM de cebador directo e inverso, 1x tampón ThermoPol (Invitrogen, Tris-HCl 20 mM, KCl 10 mM, (NH4)2SÜ410 mM, MgSÜ4 2 mM, 0,1 % de Triton X-100, pH 8,8 a 25 °C) y al menos 0,67 ng/gl de la variante A155C/V203C de la total-D-polimerasa Dpo4. El cebador directo es MJ_oligo_187_LD que produce un producto de PCR de 102 pb, que se distingue de la plantilla de 83 unidades. El cebador inverso es MJ_oligo_189_LD. Los L-dNTPs se adquieren como síntesis personalizada de Rasayan, Inc. (Encinitas, CA, USA).

Los controles negativos se realizan omitiendo la variante A155C/V203C de la total-D-polimerasa Dpo4.

El programa de ciclo térmico consiste en 1 ciclo (85°C, 3 min), después al menos 7 ciclos (85°C, 30 s/56°C, 1 min/60°C, 4 min) y después se mantiene a 4°C. Se mezclan alícuotas de 4 pl de las reacciones de PCR con tampón de carga de muestra y se analizan en geles TBE. Sobre el gel se aplica una escalera estándar de DNA que contiene, entre otros, una banda de 100 pb.

11.3 Confirmación de actividad

La reacción de PCR con la variante A155C/V203C de la total-D-polimerasa Dpo4 y el sustrato de L-DNA y los L-nucleótidos produce una banda en el intervalo de aproximadamente 100 pb en comparación con la escalera estándar de DNA. Dicha banda no aparece en los controles negativos, donde se omite la polimerasa. También dicha banda de 102 pb migra más alto que la plantilla de 83 unidades. La apariencia dependiente de la variante A155C/V203C de la total-D-polimerasa Dpo4 de un producto de amplificación de L-DNA confirma así la actividad de la variante A155C/V203C de la total-D-polimerasa Dpo4 sintética en un proceso de amplificación térmica.

Ejemplo 12 - Síntesis de ácidos D- o L-nucleicos.

Los ácidos nucleicos de L-DNA o los ácidos nucleicos de D-DNA se produjeron mediante síntesis en fase sólida con un sintetizador ABI 394 (Applied Biosystems, Foster City, CA, EE. UU.) utilizando química de fosforamidita de 2'TBDMS DNA con grupos protectores de amina exocíclica estándar (Damha y Ogilvie, 1993). Para la síntesis del DNA se aplicaron dA(N-Bz)-, dC(N-Ac)-, dG(N-ibu)- y dT en la configuración D y L. Todas las fosforamiditas se adquirieron en ChemGenes, Wilmington, MA. Después de la síntesis y desprotección, los ácidos nucleicos de L-DNA o los ácidos nucleicos de D-DNA se purificaron mediante electroforesis en gel.

Referencias

Los datos bibliográficos completos de los documentos indicados en la presente memoria son, si no se indica lo contrario, los siguientes.

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Las características de la presente invención descritas en la memoria descriptiva, las reivindicaciones y/o los dibujos pueden, tanto por separado como en cualquier combinación de las mismas, ser material para realizar la invención en diversas formas de la misma.

Claims

REIVINDICACIONES

1. Un método para añadir uno o más L-nucleótidos al extremo 3' de un primer ácido L-nucleico, en donde el método comprende la etapa de hacer reaccionar uno o más L-nucleótidos con el primer ácido L-nucleico en presencia de un polimerasa, en donde la polimerasa es capaz de añadir uno o más L-nucleótidos al extremo 3' del primer ácido L-nucleico y en donde la polimerasa consiste en una secuencia de aminoácidos, en donde los aminoácidos de la secuencia de aminoácidos son D-aminoácidos.

2. El método según la reivindicación 1, en el que la polimerasa es una polimerasa termoestable.

3. El método según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 2, en el que la secuencia de D-aminoácidos de la polimerasa es al menos un 85% idéntica a la secuencia de L-aminoácidos de una polimerasa de tipo nativo.

4. El método según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en el que la secuencia de aminoácidos de la polimerasa comprende al menos 300 aminoácidos.

5. Una proteína que comprende un resto que muestra actividad enzimática, en donde el resto que muestra actividad enzimática consiste en una secuencia de aminoácidos, en donde los aminoácidos de la secuencia de aminoácidos son D-aminoácidos, en donde la actividad enzimática es capaz de añadir uno o más L-nucleótidos al extremo 3' de un primer ácido L-nucleico.

6. La proteína según la reivindicación 5, en la que la secuencia de D-aminoácidos del resto que muestra actividad enzimática es al menos un 85% idéntica a la secuencia de L-aminoácidos de una polimerasa de tipo nativo.

7. La proteína según una cualquiera de las reivindicaciones 5 a 6, en la que el resto que muestra actividad enzimática es un resto que muestra actividad de polimerasa, preferiblemente la actividad de polimerasa es una actividad de polimerasa termoestable.

8. La proteína según la reivindicación 7, en la que la secuencia de aminoácidos del resto que muestra actividad de polimerasa comprende al menos 300 aminoácidos.

9. La proteína según la reivindicación 5, en la que la proteína es una polimerasa que comprende una secuencia de aminoácidos según SEQ ID NO: 15.

10. La proteína según la reivindicación 5, en la que la proteína es una polimerasa que comprende una secuencia de aminoácidos según SEQ ID NO: 1.

11. La proteína según la reivindicación 5, en la que la proteína es una variante de polimerasa de una polimerasa de tipo nativo, en donde la polimerasa de tipo nativo consiste en una secuencia de aminoácidos según SEQ ID NO: 15, y en donde la variante de polimerasa comprende una secuencia de aminoácidos, en donde la secuencia de aminoácidos de la variante de la polimerasa difiere de la secuencia de aminoácidos de la polimerasa de tipo nativo en al menos una posición de aminoácido y en donde la secuencia de aminoácidos de la variante de la polimerasa es idéntica al menos en un 85 % a la secuencia de aminoácidos según SEQ ID NO: 15.

12. La proteína según la reivindicación 11, en la que la variante de polimerasa tiene actividad de polimerasa termoestable.

13. La proteína según la reivindicación 5, en la que la proteína es una variante de polimerasa de una polimerasa de tipo nativo, en donde la polimerasa de tipo nativo consiste en una secuencia de aminoácidos según SEQ ID NO: 1, y en donde la variante de polimerasa comprende una secuencia de aminoácidos, en donde la secuencia de aminoácidos de la variante de la polimerasa difiere de la secuencia de aminoácidos de la polimerasa de tipo nativo en al menos una posición de aminoácido y en donde la secuencia de aminoácidos de la variante de la polimerasa es idéntica al menos en un 85 % a la secuencia de aminoácidos según SEQ ID NO: 1.