ES2961374T3 - Amplificación con cebadores de composición de nucleótidos limitada - Google Patents

Abstract

La invención proporciona métodos de amplificación a partir de un único cebador o un par de cebadores directos e inversos de composición de nucleótidos limitada. La composición limitada de nucleótidos significa que los cebadores están subrepresentados en al menos un tipo de nucleótido. Dichos cebadores tienen una capacidad muy reducida para cebarse entre sí o para extenderse iniciado mediante un cebador incorrecto desde lugares distintos a los sitios de unión del cebador previstos en un ácido nucleico diana. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

DESCRIPCIÓN

Amplificación con cebadores de composición de nucleótidos limitada

La presente invención se refiere a métodos para amplificar ácidos nucleicos objetivo con niveles reducidos de productos de amplificación no previstos.

ANTECEDENTES

La amplificación por PCR fue inventada por Kary Mullis en 1983 (Mullis, 1987 Patente de Estados Unidos N° 4.683.202; Saiki et al., 1985, Science (Nueva York, N.Y.), 230(4732), 1350-1354), por la que más tarde ganó el Premio Nobel. Desde entonces, se han descrito varios métodos de amplificación de ácidos nucleicos basados en cebadores y dependientes de la plantilla, incluyendo el ensayo de desplazamiento de cadena (George T. Walker, Little y Nadeau, 1993, Patente de Estados Unidos N° 5,270,184; George T. Walker, 1995, Patente de Estados Unidos N° 5,455,166; G. T. Walker et al., 1992,Nucleic Acids Research,20(7), 1691-1696, 1992,Proceedings ofthe National Academy of Sciences ofthe United States of America,89(1), 392-396) y los sistemas de amplificación basados en la transcripción, incluyendo los métodos descritos en las Patentes de Estados Unidos N° 5,437,990; 5,409,818; y 5,399,491; el sistema de amplificación de transcripción (TSA) (Kwoh et al., 1989,Proceedings o fthe National Academy of Sciences ofthe United States of America,86(4), 1173-1177; Kacian & Fultz, 1995, Patente de Estados Unidos N° 5.480.784; Kacian & Fultz, 1996, Patente de Estados Unidos N° 5,399,491); y la replicación de secuencia autosostenida (3SR) (Fahy, Gingeras, Guatelli, Kwoh, & Whitfield, 1992, WO 92/08800; Guatelli et al., 1990,Proceedings ofthe National Academy of Sciences ofthe United States of America,87(5), 1874-1878); reacción en cadena de ligación (a veces denominada amplificación de oligonucleótidos ligasa OLA) (Laffler, Carrino, & Marshall, 1993,Annales De Biologie Clinique,51(9), 821-826); tecnología de sondas cicladas (CPT) (Duck, Alvarado-Urbina, Burdick, & Collier, 1990a,BioTechniques,9(2), 142-148), amplificación por círculo rodante (RCA) (Fire & Xu, 1995,Proceedings o fthe National Academy of Sciences,92(10), 4641-4645; Lizardi, 1998, Patente de Estados Unidos N° 5.854.033), amplificación basada en la secuencia del ácido nucleico (NASBA) (Compton, 1991,Nature,350(6313), 91-92, Malek, Davey, Henderson y Sooknanan, 1992), tecnología de escisión invasiva, amplificación dependiente de la helicasa (HDA) (Kong, Vincent y Xu, 2004, US 2004-0058378 A1; Kong, Vincent y Xu, 2007 Patente de Estados Unidos. US2007/0254304 A1), amplificación exponencial (EXPAR) (Van Ness, Van Ness, & Galas, 2003,Proceedings of the National Academy of Sciences ofthe United States of America,100(8), 4504-4509), reacción de hibridación en cadena (HCR)(R. M. Dirks & Pierce, 2004,Proceedings ofthe National Academy of Sciences ofthe United States of America,101(43), 15275 15278, R. Dirks & Pierce, 2012, Patente de Estados Unidos N° 8,105,778), y ensamblaje catalizado de horquillas (CHA) (Li, Ellington, & Chen, 2011,Nucleic Acids Research,39(16), e110). Aunque la técnica de amplificación de ácidos nucleicos ha sido ampliamente adoptada, no está exenta de inconvenientes que limitan su precisión y sensibilidad. Habitualmente, el producto de amplificación previsto resulta de la extensión de un par de cebadores directo e inverso que se unen a sus sitios de unión de cebadores perfectamente complementarios. Pero los productos de amplificación no deseados pueden surgir de la duplexión de los cebadores y de que cada uno sirva de plantilla para la extensión del otro (dímero de cebador) o de cebadores que se ceban desde sitios de unión de cebadores secundarios (no deseados) que tienen varios grados de malapareamiento según las reglas convencionales de emparejamiento de Watson-Crick. En consecuencia, el producto de amplificación previsto se sintetiza junto con varios productos no previstos o de fondo. La presencia de estos productos no deseados o de fondo se hace más significativa a medida que disminuye la concentración inicial del objetivo deseado en la muestra o a medida que aumenta el número de ciclos de PCR (consultar las FIGS. 2 y 3 que comparan cebadores convencionales con la composición limitada de cebadores de la invención) o cuando se usa más de un par de cebadores como en la amplificación multiplex. En consecuencia, la sensibilidad de detección es limitada, al igual que el intervalo de ciclos a lo largo del cual puede detectarse un aumento lineal de la señal de un producto de amplificación deseado.

La amplificación inespecífica puede reducirse reduciendo la formación de productos de extensión del cebador antes del inicio de la reacción. En un método, denominado protocolo de "arranque en caliente", se retienen uno o más reactivos críticos de la mezcla de reacción hasta que la temperatura se eleva lo suficiente como para proporcionar la especificidad de hibridación necesaria. Los métodos manuales de arranque en caliente, en los que los tubos de reacción se abren tras el paso inicial de incubación a alta temperatura y se añaden los reactivos que faltan, requieren mucho trabajo y aumentan el riesgo de contaminación de la mezcla de reacción. Alternativamente, puede usarse un material sensible al calor, como la cera, para separar o secuestrar los componentes de la reacción, como se describe en (Bloch, Raymond, & Read, 1995 Patente de Estados Unidos N° 5,411,876), y (Chou, Russell, Birch, Raymond, & Bloch, 1992,Nucleic Acids Research,20(7), 1717-1723). En estos métodos, una incubación previa a la reacción a alta temperatura funde el material termosensible, permitiendo de este modo que se mezclen los reactivos.

Otro método para reducir la formación de productos de extensión del cebador antes del inicio de la reacción se basa en la inactivación termorreversible de la ADN polimerasa. Birch, Laird, & Zoccoli, 1997 Patente de Estados Unidos N° 5,677,152; Birch, Laird, & Zoccoli, 1998 Patente de Estados Unidos N° 5,773,258, describen ADN polimerasas modificadas reversiblemente por la unión covalente de un grupo modificador. La incubación de la ADN polimerasa inactivada a alta temperatura da como resultado la escisión del enlace modificador-enzima, reactivando de este modo la enzima.

La inhibición reversible no covalente de una ADN polimerasa por anticuerpos específicos de ADN polimerasa se describe en Scalice, Sharkey, Christy Jr, Esders, & Daiss, 1994, Patente de Estados Unidos N° 5338671.

La amplificación no específica también puede reducirse degradando enzimáticamente los productos de extensión formados antes del inicio de la reacción usando los métodos descritos en Gelfand, Kwok, & Sninsky, 1995, Patente de Estados Unidos N° 5,418,149. La degradación de los productos de extensión recién sintetizados se consigue incorporando a la mezcla de reacción dUTP y UNG, e incubando la mezcla de reacción a 45-60° C antes de llevar a cabo la reacción de amplificación. La extensión del cebador da lugar a la formación de ADN que contiene uracilo, que es degradado por el UNG en las condiciones previas a la amplificación. Una desventaja de este método es que la degradación del producto de extensión compite con la formación del producto de extensión y la eliminación del producto de extensión del cebador no específico puede ser menos completa. Una ventaja de este método es que el ADN que contiene uracilo introducido en la mezcla de reacción como contaminación de una reacción anterior también se degrada y, por lo tanto, el método también reduce el problema de la contaminación de una PCR por el ácido nucleico amplificado de reacciones anteriores.

Otro método para reducir la formación de productos de extensión del cebador antes del inicio de la reacción se basa en el uso de cebadores modificados en o cerca del extremo 3' mediante la adición de una fracción a una amina exocíclica, como se describe en Will, 1999, Patente de Estados Unidos N° 6,001,611.

A pesar de los esfuerzos para reducir la amplificación inespecífica, la mayoría de los métodos se enfocan en reducir los productos falsos positivos de la extensión del cebador a baja temperatura. Pocos métodos abordan el problema de los productos falsos positivos de la interacción de los cebadores a alta temperatura una vez iniciado el ciclo de amplificación, lo que en la presente se describe como interacción transitoria de los cebadores durante el proceso de amplificación. Este problema aumenta a medida que se multiplexan más y más cebadores en las reacciones de amplificación para obtener resultados de alto rendimiento. La interacción transitoria se forma cuando los segmentos internos de los cebadores hibridan entre sí dentro de un cebador o entre cebadores. Las hibridaciones pueden ser de pares de bases consecutivos siguiendo las reglas de emparejamiento de Watson-Crick, o de pares de bases mezclados con emparejamiento Watson-Crick (emparejamiento perfecto) y no Watson-Crick (emparejamiento erróneo o malapareamiento). La formación de malapareamientos de ADN en solución ha sido revisada por Seela & Budow, 2008,Molecular bioSystems,4(3), 232-245. Entre los ocho posibles malapareamientos, los pares GG, GT y GA son los más estables. Aunque los pares de bases con malapareamientos son menos estables que los pares de Watson-Crick y la estabilidad está influida por el contexto de bases de las secuencias, el problema es particularmente grave porque cada vez se multiplexan más cebadores en las reacciones de amplificación para lograr resultados de alto rendimiento, lo que da lugar a una diversidad extrema de secuencias. En teoría, los malapareamientos cerca del extremo terminal 3' de los cebadores influyen drásticamente en la eficacia de extensión de los cebadores. Aunque esto es cierto, Kwok et al., 1990,Nucleic Acids Research,18(4), 999-1005 y Stadhouders et al., 2010,The Journal of Molecular Diagnostics: JMD,12(1), 109-117 mostraron que los malapareamientos del extremo 3 'tenían un efecto de menor a mayor; sin embargo, ninguno eliminaba la extensión del cebador. Cuando los malapareamientos se localizan en la posición N° 2 del extremo 3' de los cebadores, sólo los pares AA GA tuvieron un fuerte efecto perjudicial sobre las extensiones de los cebadores. En conjunto, los dúplex de ADN con malapareamientos se forman a través de interacciones transitorias tanto durante la preamplificación como durante la amplificación. El emparejamiento dinámico (coincidencias perfectas o no coincidencias) de los nucleótidos 3' de los cebadores con una extensión del cebador inicial de plantilla da como resultado productos de amplificación no deseados. La US 20110294129 A1 analiza un método de amplificación y/o de detección para eliminar contaminantes en una muestra biológica líquida que contiene ácidos nucleicos de interés a amplificar, que incluye tratar la muestra biológica química o enzimáticamente para convertir un tipo de base de los ácidos nucleicos de interés en otro tipo de base; añadir cebadores de amplificación, destinados a amplificar específicamente los ácidos nucleicos de interés convertidos, cada cebador estando constituido por tres tipos diferentes de bases; añadir a la muestra biológica, tras estos tratamientos, los reactivos de amplificación y los cebadores previamente sintetizados; y colocar la solución y los reactivos en condiciones que permitan la amplificación y/o detección de los ácidos nucleicos convertidos. La WO 2010/021702 A1 analiza sistemas de reconocimiento molecular auto-evitantes (SAMRS), moléculas similares al ADN que se unen al ADN natural que tiene una secuencia complementaria de Watson-Crick, pero no se unen a otros análogos de oligonucleótidos que contienen SAMRS cuando los componentes de SAMRS se emparejan con otros componentes de SAMRS y, cuando una vez unidos, sirven como cebadores para la extensión de la polimerasa, así como plantillas en el cebado inverso característico de la reacción en cadena de la polimerasa.

SUMARIO

La invención proporciona un método para amplificar un segmento de un ácido nucleico objetivo como se define en la reivindicación 1. Las características adicionales de la invención se definen en las reivindicaciones dependientes. La interacción cebador-cebador y la amplificación inespecífica han sido problemas fundamentales en todos los métodos de amplificación. Para abordar este problema fundamental, se ha descubierto un novedoso método de diseño de cebador o sonda que puede suprimir sustancialmente el dímero del cebador y los productos de amplificación de reacción lateral no deseados. La invención proporciona un método de amplificación de un segmento de un ácido nucleico objetivo que comprende: poner en contacto una muestra que comprende un ácido nucleico objetivo con cebadores directos e inversos; opcionalmente que tienen una cadena que comprende un complemento de un sitio de unión al cebador directo y un sitio de unión al cebador inverso; realizar reacción de amplificación en la que un segmento amplificado del ácido nucleico objetivo se forma por extensión de los cebadores directos e inversos con el ácido nucleico objetivo sirviendo como plantilla; en donde los cebadores están infrarrepresentados en uno o más de los cuatro tipos de nucleótidos estándar, el tipo o tipos de nucleótidos infrarrepresentados siendo los mismos en los cebadores, cada cebador tiene dos menos unidades del tipo o tipos de nucleótidos infrarrepresentados en las posiciones internas, y el segmento amplificado es el producto de amplificación predominante formado a partir de por extensión de los cebadores directos y/o inversos; en donde el método se realiza un multiplex con una pluralidad de pares de cebadores, cada cebador en el multiplex teniendo el mismo tipo o tipos de nucleótidos infrarrepresentados

En la invención divulgada, el objetivo a detectar puede contener una región particular en la que la región de hibridación o unión del cebador o la sonda contenga solamente tres tipos de nucleótidos. En tal situación, la composición del cebador o sonda también tendría tres tipos de nucleótidos solamente: ATC, ATG, ACG y TCG. El nucleótido faltante se denomina nucleótido infrarrepresentado. El nucleótido infrarrepresentado puede ser un tipo de nucleótido, o dos tipos de nucleótidos o tres tipos de nucleótidos en un cebador o sonda. Como ejemplo de composición del cebador o sonda sólo tiene ATC, el nucleótido infrarrepresentado es G. El cebador contiene tres tipos de nucleótidos con opción de que el nucleótido 3' sea complementario con el nucleótido infrarrepresentado. Por ejemplo, para el cebador ATC, el nucleótido del extremo 3' es C que es complementario con el nucleótido infrarrepresentado G. Este cebador o sonda de tipo de tres nucleótidos no forma dímero de cebador para producir productos falsos positivos porque el extremo 3' del cebador o sonda siempre está malapareado y no puede extenderse. Estos tipos de cebadores o sondas se denominan cebadores o sondas infrarrepresentados. El sitio de unión del cebador se denomina sitio de unión infrarrepresentado. En un sistema de amplificación de plantilla, se incluyen reactivos adecuados para extender el cebador infrarrepresentado con un ácido nucleico objetivo como plantilla. En un sistema de amplificación de señal, se incluyen reactivos adecuados para permitir que una sonda infrarrepresentada se hibride con el objetivo para generar una señal de detección.

En una situación de amplificación exponencial como la PCR, se necesitan dos cebadores. Uno o ambos cebadores pueden ser cebadores infrarrepresentados. En el caso de que tanto el cebador directo como el inverso sean cebadores infrarrepresentados, el ácido nucleico objetivo que se va a detectar puede tener una región que contenga tres segmentos: el segmento de unión del cebador directo, el segmento de unión del cebador inverso y el segmento entre los dos sitios de unión de los cebadores. Ambos segmentos de unión del cebador contienen los mismos tres tipos de nucleótidos. El segmento entre dos sitios de unión de cebadores contiene cero nucleótidos o nucleótidos que no tienen nucleótido infrarrepresentado y nucleótidos complementarios del nucleótido infrarrepresentado. En tal situación, la amplificación PCR sólo necesita tres tipos de desoxirribonucleótidos trifosfatos. Estos tipos de cebador directo e inverso infrarrepresentados no se usan mutuamente como plantilla para formar productos de dímeros de cebador. Además, los productos de amplificación no deseados procedentes de la hibridación errónea de los cebadores infrarrepresentados directo e inverso se terminan porque el sistema no dispone de cuartos nucleótidos. El software está diseñado para buscar la región en el objetivo adecuado para dicha amplificación.

En otra realización, el sistema de amplificación mencionado puede incluir dideoxinucleótidos trifosfatos complementarios al nucleótido o nucleótidos infrarrepresentados en los cebadores. Cualquier producto de extensión no deseado de los cebadores directo e inverso se termina mediante la incorporación del dideoxinucleótido.

En otra realización, en la que no puede encontrarse un segmento de unión de cebador infrarrepresentado en el objetivo, el cebador infrarrepresentado puede contener un número limitado de nucleótidos infrarrepresentados, como uno o dos. Los cebadores que contienen uno o dos nucleótidos infrarrepresentados pueden reducir drásticamente la interacción cebador-cebador, a la vez que aumentan la eficiencia de hibridación cebador-plantilla. Cuando se incluye un número limitado de nucleótidos infrarrepresentados en el cebador, el sistema de reacción necesita incluir un conjunto de los cuatro tipos de desoxinucleótidos trifosfato para la amplificación.

En otra realización, cuando se incluye un número limitado de nucleótidos infrarrepresentados en el cebador infrarrepresentado, puede usarse en el sistema de amplificación una cantidad reducida de desoxinucleótidos trifosfatos complementarios al nucleótido o nucleótidos infrarrepresentados. La cantidad reducida puede ser del 99% al 0,001% con respecto a la cantidad regular de desoxinucleótidos trifosfatos en el sistema de amplificación.

En otra realización, en la que no puede encontrarse un segmento de unión del cebador infrarrepresentado en el objetivo, los cebadores pueden tener un número limitado de pares de bases de malapareadas para excluir por lo menos uno o todos los nucleótidos infrarrepresentados en los cebadores infrarrepresentados.

En otra realización, cuando un cebador infrarrepresentado hibrida con un segmento de unión de cebador con un número limitado de pares de bases malapareadas, pueden usarse muchos enfoques para mejorar la eficiencia de hibridación del cebador infrarrepresentado. Por ejemplo, puede incluirse un reactivo de unión de malapareamiento en el sistema de amplificación para mejorar la eficiencia de hibridación del cebador infrarrepresentado. Por ejemplo, la eficiencia de hibridación del cebador con malapareamiento C-C puede mejorarse incluyendo un ion de plata, un complejo de rodio, un derivado de 2-amino-7-metil-1,8-naftiridina, etcétera.

En otra realización, puede usarse un cebador infrarrepresentado para amplificar cualquier segmento del objetivo mientras se incluye en el sistema de amplificación un conjunto regular de los cuatro tipos de desoxinucleótidos trifosfatos.

En otra realización, el extremo 5' de los cebadores infrarrepresentados son los nucleótidos infrarrepresentados para inhibir cualquier producto de dímero de cebador producido para ser usado además como cebador para producir dímero de cebador concatémero.

En otra realización, el cebador consiste en un segmento 3' con composición limitada de nucleótidos, un segmento 5' con composición regular de cuatro tipos de nucleótidos, y un conector entre dos segmentos con secuencias artificiales de la misma composición limitada de nucleótidos que el segmento 3'.

En otra realización, el conector descrito anteriormente puede formar una estructura de horquilla.

En otra realización, el cebador infrarrepresentado necesita una sonda de unión para cohibridar con el objetivo y formar una estructura de unión de tres vías para facilitar la unión del cebador infrarrepresentado a su sitio de unión.

En otra realización, los cebadores infrarrepresentados tienen secuencias artificiales con cola en su extremo 5'.

En otra realización, cuando los cebadores infrarrepresentados tienen secuencias artificiales en el segmento 5', las secuencias artificiales pueden incluir secuencias que interaccionarán con enzimas específicas o formarán estructuras de reconocimiento químico particulares antes o después de la síntesis de la cadena complementaria del cebador. Por ejemplo, para la amplificación de mellado, las secuencias artificiales incluirán secuencias de reconocimiento de enzimas de restricción. Para la amplificación por transcripción, como la TMA (amplificación mediada por transcripción), las secuencias artificiales incluirán secuencias promotoras. La secuencia del extremo 5' puede formar una estructura G-cuadruplex para reconocer un ligando específico, y demás. Las secuencias artificiales también pueden incluir códigos de barras.

En otra realización, el cebador infrarrepresentado es una mezcla de cebadores degenerados. En otra realización, el cebador infrarrepresentado es una mezcla de cebadores aleatorios. Todos los oligonucleótidos en la mezcla están infrarrepresentados en el mismo tipo o tipos de nucleótidos. En algunas realizaciones, el cebador tiene más del 1%, pero no más del 20% de nucleótidos infrarrepresentados. En algunas realizaciones, el cebador degenerado o el cebador aleatorio tiene una cola 5' con una secuencia artificial.

En otra realización, cuando las secuencias objetivo proceden de organismos de una variedad de especies o genotipos, o de una mezcla de más de un alelo, un cebador con nucleótido o nucleótidos infrarrepresentados puede contener bases degeneradas en determinadas posiciones para coincidir con diferentes variaciones de secuencia y la amplificación puede incluir una combinación de un cebador infrarrepresentado y un cebador degenerado. La proporción de concentración del cebador infrarrepresentado y del cebador degenerado puede variar.

En otra realización, el cebador infrarrepresentado está provisto de un cebador auxiliar para facilitar la hibridación y amplificación del objetivo. El cebador auxiliar se une al mismo sitio de unión del cebador que el cebador infrarrepresentado con un menor número de malapareamientos. El cebador auxiliar se proporciona en baja concentración (por ejemplo, <0,01%, 0,1%, 0,5%, 1%, 2%, 5%, 10% o 50% de la concentración del cebador infrarrepresentado).

En otra realización, cuando se necesitan más de un cebador o sonda infrarrepresentados. Los cebadores o sondas pueden unirse a cadenas opuestas o a las mismas cadenas de la plantilla. Para la amplificación de señal de unión de tres vías, dos sondas se hibridarán a la misma cadena. Para la amplificación PCR, los cebadores infrarrepresentados directo e inverso se hibridarán a cadenas opuestas.

En otra realización, después de que el cebador o la sonda infrarrepresentado hibride con un ácido nucleico objetivo, una reacción de extensión para amplificar el objetivo puede ser amplificación lineal o amplificación exponencial y la condición de amplificación puede ser isotérmica o de ciclos de temperatura.

En otra realización, cuando se usan uno o más cebadores o sondas en un sistema de reacción, no es necesario que todos los cebadores o sondas sean cebadores infrarrepresentados. Por ejemplo, en la amplificación LAMP, se necesitan cuatro cebadores. BIP o FIP o tanto BIP como FIP pueden ser cebadores infrarrepresentados. Pero no es necesario que los demás cebadores sean cebadores infrarrepresentados.

En otra realización, cuando se necesita una sonda infrarrepresentada, como la sonda candado, el segmento del extremo 3' o el segmento del extremo 5' o tanto el segmento del extremo 3' como el segmento del extremo 5' de la sonda pueden tener el mismo tipo de nucleótidos infrarrepresentados. El conector entre el extremo 3' y el extremo 5' puede ser cualquier secuencia artificial.

En otra realización, en sistemas de amplificación multiplexados, se necesitan múltiples pares de cebadores infrarrepresentados. En algunas realizaciones, los pares múltiples de cebadores infrarrepresentados tienen uno o más de un tipo de secuencia universal en el extremo 5'. Las secuencias universales del extremo 5' pueden ser cualquier secuencia artificial. En la amplificación multiplex, los objetivos de amplificación pueden ser del mismo gen, o de genes diferentes, o de la misma muestra o de muestras diferentes.

En otra realización, el cebador o la sonda infrarrepresentados puede tener nucleótidos no naturales como inosina, 5' nitroindol, 7-deaza-2'-desoxiadenosina, 7-deaza-2'-desoxiguanosina, IsoC o isoG. El cebador o la sonda infrarrepresentado también pueden ser PNA, LNA, y demás. En algunas realizaciones, la inclusión de los nucleótidos no naturales anteriores en el cebador aumenta su Tm y la eficiencia de hibridación con la plantilla.

En otra realización, el cebador infrarrepresentado está unido en su extremo 5' por un segmento de oligonucleótido que puede formar una estructura de lazo de vástago. La base terminal 5' del segmento es el complemento del nucleótido infrarrepresentado. Cuando se usan dos de estos cebadores en la amplificación por PCR con tres tipos de desoxinucleótidos trifosfatos incluidos en el sistema de amplificación, el producto amplificado puede ligarse para formar un producto circular con ligasa. En otra realización, cuando sólo un cebador tiene la estructura de lazo 5', el producto de amplificación se liga para formar una estructura de horquilla.

En otra realización, el cebador infrarrepresentado contiene un nucleótido infrarrepresentado internamente. Cuando el desoxinucleótido trifosfato complementario al nucleótido infrarrepresentado no se incluye en la reacción, la extensión se detendrá en el nucleótido infrarrepresentado interno del cebador y el producto de amplificación contendrá un extremo pegajoso diseñado. El extremo pegajoso diseñado puede ligarse con cualquier tipo de adaptador para su aplicación en sentido descendente.

En otra realización, se proporcionan uno, dos o tres tipos de dNTPs en la reacción de cebado infrarrepresentada.

En otra realización, se proporciona deoxiinosina trifosfato, y/o 7-deaza-2'-deoxiguanosina 5'-trifosfato, y/o 7-deaza-2'-deoxiadenosina 5'-trifosfato en la reacción de amplificación.

En otra realización, se proporcionan cuatro tipos de dNTPs, pero uno, dos o tres tipos de dNTPs están a diferentes concentraciones para la reacción de extensión del cebador infrarrepresentado.

En otra realización, se proporcionan uno, dos o tres tipos de monómeros de trifosfato de nucleótido en la reacción de extensión del cebador infrarrepresentado.

En otra realización, se proporcionan monómeros de trifosfato de nucleótidos no naturales en la reacción de extensión del cebador infrarrepresentado.

En otra realización, cuando se usa más de un cebador infrarrepresentado, los cebadores pueden proporcionarse en diferentes concentraciones en las reacciones. Por ejemplo, un cebador en concentración más alta llevará a cabo una amplificación asimétrica.

En otra realización, los cebadores o sondas infrarrepresentados pueden estar recubiertos o fijados a una superficie como perlas o superficies de vidrio. Para la reacción de amplificación, el cebador directo o el cebador inverso, o tanto el cebador directo como el cebador inverso, pueden fijarse a una superficie.

En otra realización, para la amplificación multiplex con múltiples pares de cebadores infrarrepresentados, los productos de amplificación pueden detectarse con micromatrices, secuenciación, perlas o como nanopartículas. Uno de los pares de cebadores infrarrepresentados se injerta en una superficie junto con cebadores libres en solución. Estos métodos permiten la amplificación y la fijación simultáneas de un producto de PCR sobre la superficie. Opcionalmente, ambos cebadores pueden injertarse en una superficie para la amplificación. El patrón de como los cebadores o sondas infrarrepresentados se fijan a una superficie puede ser codificado o no codificado, o distribuido aleatoriamente.

En otra realización, la amplificación se detecta con colorantes intercalantes fluorescentes, sondas fluorescentes, etiquetas de marcadores de detección, etiquetas de masa, electroforesis, etiquetas magnéticas o análisis de curvas de fusión.

En otra realización, un cebador infrarrepresentado está enlazado en su extremo 5' a un oligonucleótido artificial cuya temperatura de fusión es diferente a la de un producto de amplificación cebado a partir de ese cebador. La reacción de amplificación se monitoriza basándose en una transición desde el pico de fusión del oligonucleótido artificial al del producto de amplificación. Este formato puede ser multiplexado enlazando diferentes cebadores a diferentes oligonucleótidos artificiales que tengan diferentes temperaturas de fusión. En otra realización, los cebadores infrarrepresentados están unidos en su extremo 5' por secuencias artificiales que pueden formar una estructura de lazo de vástago con una temperatura de fusión diferente de las temperaturas de fusión de los amplicones. En algunas realizaciones, el análisis de la curva de fusión se mide a partir de la presencia de un colorante intercalante de cadena doble. En otra realización, se unen un fluoróforo y un inactivador a las secuencias artificiales del extremo 5'. En otra realización, el fluoróforo y el inactivador están unidos a la secuencia complementaria de las secuencias artificiales del extremo 5'. En otra realización, el fluoróforo y el inactivador se unen a la secuencia artificial del extremo 5' y a las secuencias complementarias de las secuencias artificiales del extremo 5' por separado. En otra realización, las secuencias artificiales del extremo 5' del cebador infrarrepresentado pueden formar una estructura de lazo y vástago.

En algunas realizaciones, en una reacción multiplex, los cebadores infrarrepresentados se unen en sus extremos 5' a más de un tipo de secuencia artificial. En la reacción se incluyen uno o más de un tipo de secuencias complementarias de las secuencias artificiales del extremo 5'. En algunas realizaciones, se unen diferentes secuencias complementarias de las secuencias artificiales del extremo 5' con diferentes fluoróforos y inactivadores. En otra realización, múltiples secuencias artificiales del extremo 5' en los cebadores infrarrepresentados pueden formar cadenas dobles con secuencias complementarias comunes de las secuencias artificiales del extremo 5'. Pero las secuencias artificiales del extremo 5' son diferentes por sólo una o más de una mutación. La desaparición de un pico de fusión indica que está presente su objetivo correspondiente.

En otra realización, se proporciona un oligonucleótido marcado con un fluoróforo y un inactivador en la reacción de amplificación de la plantilla. El oligonucleótido es complementario a un segmento en el amplicón. Durante el análisis de la curva de fusión después de la reacción de amplificación, el oligonucleótido se disocia del amplicón unido y un pico de fusión a su Tm indica la presencia de plantilla. En algunas realizaciones, se proporcionan múltiples oligonucleótidos con diferentes Tm en la reacción. En algunas realizaciones, el segmento en el amplicón que hibrida con el oligonucleótido contiene mutaciones para alterar la Tm. En algunas realizaciones, se incluyen en la reacción múltiples oligonucleótidos marcados con diferentes fluoróforos, el análisis de la curva de fusión se realiza en múltiples canales para aumentar la multiplicidad.

En otra realización, un cebador infrarrepresentado está unido en su extremo 5' por una secuencia artificial marcada con fluoróforo. En la reacción también se proporciona un oligonucleótido marcado con un inactivador. El oligonucleótido inactivador hibrida con el cebador infrarrepresentado y se inactiva la fluorescencia. En la amplificación de la plantilla, el cebador infrarrepresentado participa en la extensión del cebador y se convierte en un amplicón de cadena doble. El oligonucleótido inactivador se disocia del cebador y se libera la fluorescencia.

En otra realización, un cebador infrarrepresentado está enlazado en su extremo 5' a una secuencia artificial que tiene un nucleótido infrarrepresentado en su extremo 3'. En la reacción también se proporciona un oligonucleótido marcado con un fluoróforo y un inactivador. El oligonucleótido hibrida con la secuencia artificial en el cebador y la región de hibridación cubre el nucleótido infrarrepresentado. Durante la amplificación, la actividad 5' nucleasa de la ADN polimerasa digiere el oligonucleótido separando el fluoróforo y el inactivador y libera fluorescencia. Las extensiones terminan en el nucleótido infrarrepresentado y el oligonucleótido digerido se disocia de su región de unión permitiendo la hibridación de otro oligonucleótido intacto. El proceso se repite y se amplifica la señal.

En otra realización, para la amplificación multiplex con múltiples pares de cebadores infrarrepresentados, se une una cola universal con secuencia artificial al extremo 5' de los cebadores infrarrepresentados. También se proporciona una sonda de detección universal en la reacción, que consiste en ADN de cadena doble con un segmento saliente 3'. La sonda universal se marca con un fluoróforo en una cadena y un inactivador en la otra cadena, de tal manera que en forma de cadena doble la sonda no es fluorescente. El segmento saliente 3' contiene la misma secuencia que la cola universal en los cebadores infrarrepresentados. La secuencia sintetizada complementaria a la cola universal se hibrida con el segmento saliente 3' de la sonda universal y la extensión da como resultado la separación de las cadenas dobles de la sonda universal y la liberación de fluorescencia. En algunas realizaciones, se proporcionan más de un tipo de cola universal y sonda universal en la reacción para la detección multiplex. En algunas realizaciones, la sonda universal es una baliza molecular con un saliente 3'. En otra realización, se une un fluoróforo a los cebadores infrarrepresentados y se proporciona en la reacción un producto químico inactivador intercalante de cadena doble. Durante la amplificación exponencial, el inactivador líquido se intercala a los productos de cadena doble amplificados para inactivar la etiqueta fluorescente para la detección en tiempo real. El inactivador líquido es un producto químico no fluorescente que interactúa con el ADN de cadena doble e inactiva la etiqueta fluorescente de proximidad.

En otra realización, se une un fluoróforo a los cebadores infrarrepresentados que genera fluorescencia aumentada cuando el cebador unido se extiende para formar una cadena doble (sonda light-up).

En otra realización, se une un fluoróforo a los cebadores infrarrepresentados y se marca un tipo de dNTP con un fluoróforo diferente. La fluorescencia en tiempo real se detecta por FRET. En algunas realizaciones, se proporciona ddNTP marcado con fluoróforo.

En otra realización, puede unirse una plantilla de oligonucleótidos a un analito. Por ejemplo, el analito puede ser una proteína o un anticuerpo. La amplificación de la plantilla de oligonucleótidos con cebadores infrarrepresentados indica la presencia del analito. En algunas realizaciones, los cebadores o sondas infrarrepresentados están unidos a un analito. La amplificación con los cebadores o sondas infrarrepresentados indica la presencia o ausencia del analito.

En otra realización, la presente invención se usa para la detección de mutaciones. Tales mutaciones incluyen inserciones, deleciones, reordenamientos, transiciones, transversiones, polimorfismos y sustituciones de nucleótidos.

Se describe un kit para su uso en la secuenciación, resecuenciación, monitorización de la expresión génica, elaboración de perfiles de diversidad genética, diagnóstico, selección, secuenciación del genoma completo, descubrimiento y puntuación de polimorfismos del genoma completo, análisis del transcriptoma o cualquier otra aplicación que implique la amplificación o detección de ácidos nucleicos o la secuenciación. Dicho kit no es parte de la materia reivindicada. Este kit puede comprender cualquiera de los cebadores o pares de cebadores o sondas infrarrepresentados descritos en la presente y los reactivos necesarios para aplicaciones específicas.

Se describe un aparato para llevar a cabo los métodos de la invención. Dicho aparato no es parte de la materia reivindicada. Dicho aparato puede realizar, por ejemplo, un proceso de muestreo, mezclado de cebadores o sondas infrarrepresentados, mezclado de reactivos, amplificación y detección de señales.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS

La Fig. 1 muestra un ácido nucleico objetivo y cebadores de tres nucleótidos y sitios de unión de cebadores ejemplares. La parte superior de la figura muestra una cadena del ácido nucleico objetivo que contiene el complemento del sitio de unión del cebador directo (nucleótidos ATC) contiguo al sitio de unión del cebador inverso (sitio ATG). La parte inferior muestra los cebadores unidos a sus respectivos sitios de unión en cadenas opuestas. La amplificación puede realizarse en presencia de dTTP, dATP y dGTP (y otros componentes típicos de la PCR), pero el dCTP no es necesario porque no hay nucleótidos G en las cadenas del ácido nucleico objetivo que se amplifica.

Las Figs. 2A, B comparan la interacción de cebadores transitoria de cebadores de cuatro nucleótidos convencionales (A) y cebadores de tres nucleótidos (B).

Las Figs. 3A, B comparan el producto de amplificación de la amplificación de dímeros de cebadores de cebadores de tres nucleótidos (A) con cebadores de cuatro nucleótidos convencionales (B).

Las Figs. 4A-B muestran la PCR en tiempo real de ADN genómico humano (A) con tres cebadores de tipo nucleótido y tres dNTPs en comparación con un control sin plantilla (B).

La Fig. 5 muestra una plantilla en la que los sitios de unión del cebador muestran tres malapareamientos (cebador directo) o dos malapareamientos (cebador inverso) con cebadores de composición del tipo de tres nucleótidos. La Fig. 6 muestra ejemplos de reactivos de unión de malapareamiento.

La Fig. 7 muestra la amplificación de una plantilla en la que sitios de unión de cebadores del tipo de tres nucleótidos están separados por un segmento que incluye todos los tipos de cuatro nucleótidos. La amplificación se realiza en presencia de todos los mononucleótidos trifosfatos de tipos de cuatro nucleótidos.

Las Figs. 8A-C muestran la fluorescencia a lo largo del tiempo (A, B) y la electroforesis en gel (C) de la amplificación con cebadores de tipo de tres nucleótidos y los cuatro dNTPs.

La Fig. 9 compara el dímero de cebadores entre cebadores de tres nucleótidos y cebadores de cuatro nucleótidos. Las Figs. 10A-D muestran la PCR con cebadores que contienen 1 o 2 unidades del nucleótido infrarrepresentado (G).

Las Figs. 11A-C muestran la amplificación con mononucleótido trifosfato que es el complemento de nucleótido infrarrepresentado presente en cantidad reducida en comparación con otros tipos de nucleótidos trifosfatos (A), ausente (B) y en ausencia de plantilla (C).

La Fig. 12 muestra la amplificación con el mononucleótido trifosfato que es el complemento del nucleótido infrarrepresentado en los cebadores suministrados como ddNTP.

Las Figs. 13A, B muestran la detección multiplex de múltiples plantillas con el análisis de la curva de fusión. La Fig. 14 muestra el enlace de un cebador de tres nucleótidos demasiado corto para cebar la amplificación por sí mismo a un segmento de sujeción de punto de apoyo.

La Fig. 15 muestra un formato alternativo de sujeción de punto de apoyo.

La Fig. 16 muestra el uso de una unión de tres vías cuando un cebador de tres nucleótidos es demasiado corto para soportar la amplificación por sí mismo.

Las Figs. 17A-B y 18A-B muestran formatos alternativos de uniones de tres vías.

La Fig. 19 muestra la amplificación y detección multiplex en la que un cebador de tipo de tres nucleótidos está enlazado en su extremo 5' a un segmento artificial enlazado a un fluoróforo.

Las Figs. 20A, B muestran la fluorescencia a lo largo del tiempo para la amplificación de la plantilla (A) y el control sin plantilla (B).

Las Figs. 21A, B muestran la fluorescencia a lo largo del tiempo para la amplificación de la plantilla (A) y el control sin plantilla (B).

La Fig. 22 muestra la PCR asimétrica con un exceso de cebador inverso.

La Fig. 23 muestra un formato de sonda Taqman.

La Fig. 24 muestra un formato de baliza molecular.

Fig. 25 amplificación multiplex y detección usando un cebador de tipo de tres nucleótidos con una cola fluorescente universal y un inactivador.

Fig. 26 amplificación y detección de productos finales pegajosos.

Fig. 27 amplificación y detección de productos circulares.

Fig. 28 amplificación del genoma completo con cebadores de tres nucleótidos.

Fig. 29 uso de cebadores de tres nucleótidos en combinación con la amplificación de mellado o amplificación mediada por transcripción.

Fig. 30 uso de cebadores de tipo de tres nucleótidos para la amplificación LAMP o amplificación por recombinasa polimerasa.

Figs. 31A, B, C: amplificación isotérmica por mecanismo de mellado, amplificación mediada por transcripción o amplificación por círculo rodante.

Las Figs. 32A y B muestran la inmunoPCR en la que un ácido nucleico objetivo se une a un analito mediante uno o más anticuerpos.

La Fig. 33 muestra una reacción de amplificación en la que un cebador está marcado con un primer fluoróforo y un nucleótido trifosfato usado en la amplificación está marcado con un segundo fluoróforo. La transferencia de energía entre los fluoróforos en el producto de amplificación genera una señal.

La Fig. 34 muestra una reacción de amplificación en la que un cebador está marcado con un fluoróforo y un nucleótido trifosfato usado en la amplificación está marcado con un inactivador. La señal del fluoróforo se inactiva a medida que se forma el producto de amplificación generando una señal.

La Fig. 35 muestra una reacción de amplificación en la que se marca un cebador con un fluoróforo y se introduce un agente intercalante de ADN en la mezcla de amplificación. La intercalación del agente en el producto de amplificación inactiva la señal del fluoróforo a medida que se forma el producto de amplificación.

La Fig. 36 muestra una reacción de amplificación en la que un cebador está marcado con un fluoróforo luminoso. Dicho fluoróforo no tiene señal en el cebador, pero cuando el cebador se incorpora en un producto de amplificación, el fluoróforo se intercala en el producto de amplificación y genera una señal.

La Fig. 37 muestra una reacción de amplificación múltiplex con cebadores infrarrepresentados de cola de cadena doble y un método de detección con análisis de curva de fusión.

Las Figs. 38A-E muestran una reacción de amplificación múltiplex con cebadores infrarrepresentados de cola especial y su cadena parcialmente complementaria, y un método de detección con la actividad Flap 5' de la ADN polimerasa. La Fig. 38A muestra el cebador y un oligonucleótido complementario marcado con un fluoróforo y un inactivador. La Fig. 38B muestra la extensión. La Fig. 38C muestra la escisión del fluoróforo de su oligonucleótido por la actividad endonucleasa Flap 5' generando una señal fluorescente. Las Figs. 38D y E muestran la extensión y escisión de otra plantilla.

Las Figs. 39A, B muestran un método de monitorización de una reacción de amplificación en la que uno de los cebadores está enlazado a una cola de oligonucleótido artificial en una reacción de amplificación que incluye un oligonucleótido complementario a la cola marcado con un fluoróforo y un inactivador. Antes de la amplificación (A), el inactivador y el fluoróforo y el inactivador están próximos y la señal es baja. Después de la amplificación (B), el oligonucleótido marcado hibrida con la cola complementaria del cebador separando el inactivador y el fluoróforo y aumentando la señal.

Las Figs. 40A, B muestran un método de monitorización de una reacción de amplificación en la que uno de los cebadores está enlazado a una cola de oligonucleótido artificial que incluye un inactivador y un fluoróforo. Antes de la amplificación (A), el inactivador y el fluoróforo están próximos en el espacio por lo que la señal es baja. Después de la amplificación (B), el fluoróforo y el inactivador se separan aún más por la duplexión del oligonucleótido artificial a una cadena complementaria y la señal fluorescente aumenta.

DEFINICIONES

A menos que se definan de otro modo, todos los términos técnicos y científicos usados en la presente tienen el mismo significado que se entiende comúnmente en la técnica a la que pertenece la invención. Las siguientes definiciones complementan las del técnica y están dirigidas a la presente solicitud y no deben imputarse a ningún caso relacionado o no relacionado, por ejemplo, a ninguna patente o solicitud de propiedad compartida. Aunque en la puesta en práctica puede usarse cualquier método y material similar o equivalente a los descritos en la presente para las pruebas de la presente invención, en la presente se describen los materiales y métodos preferidos. Por consiguiente, la terminología empleada en la presente tiene por objeto describir únicamente realizaciones particulares y no se pretende que sea limitativa. El término "un" o "una" entidad se refiere a una o más de esa entidad; por ejemplo, "un ácido nucleico" representa uno o más ácidos nucleicos. Por lo tanto, los términos "un" (o "uno"), "uno o más" y "por lo menos uno" pueden usarse indistintamente en la presente.

Los ácidos nucleicos incluyen el ADN y el ARN, y las quimeras de ADN-ARN pueden ser de cadena doble o de cadena sencilla. El ADN puede ser genómico, ADNc o sintético. El ARN puede ser ARNm, ARNt, ARNr, ARNhn, entre otros. El término "ácido nucleico" abarca cualquier cadena física de unidades monoméricas que pueda corresponderse con una cadena de nucleótidos, incluyendo un polímero de nucleótidos (por ejemplo, un polímero típico de ADN o ARN), ácido nucleico peptídico (PNA), oligonucleótidos modificados (por ejemplo, oligonucleótidos que comprenden bases que no son típicas del ARN o ADN biológico en solución, como los oligonucleótidos 2'-O-metilados), y similares. Un ácido nucleico puede ser, por ejemplo, de cadena sencilla o de cadena doble.

Las cuatro bases nucleotídicas convencionales son A, T/U, C y G, T estando presente en el ADN y U en el ARN. Los nucleótidos que se encuentran en las objetivos suelen ser nucleótidos naturales (desoxirribonucleótidos o ribonucleótidos). Tal es el caso de los nucleótidos que forman los cebadores.

La complementariedad de las cadenas de ácidos nucleicos significa que las cadenas forman un dúplex estable debido al enlace de hidrógeno entre sus grupos de nucleobases. Las bases complementarias son, en el ADN, A con T y C con G, y, en el ARN, C con G y U con A. Los nucleótidos en las cadenas respectivas son complementarios cuando forman uno de estos (emparejamientos Watson-Crick) cuando las cadenas están alineadas al máximo. Los nucleótidos están malapareados cuando no forman un par de complementariedad cuando sus respectivas cadenas están alineadas al máximo. La complementariedad de las cadenas puede ser perfecta o sustancial. La complementariedad perfecta entre dos cadenas significa que las dos cadenas pueden formar un dúplex en el que cada base del dúplex está unida a una base complementaria por emparejamiento Watson-Crick. Complementariedad sustancial significa que la mayoría pero no necesariamente todas las bases en las cadenas forman pares Watson-Crick para formar un complejo híbrido estable en un conjunto de condiciones de hibridación (por ejemplo, concentración de sal y temperatura). Por ejemplo, algunos cebadores pueden formar dúplex con un sitio de unión de cebador a pesar de hasta 1, 2 o 3 posiciones de malapareamiento, siempre que tales malapareamientos no se encuentren en el extremo 3' y preferiblemente no estén próximos al mismo (por ejemplo, dentro de 4 nucleótidos). Tales condiciones pueden predecirse usando las secuencias y cálculos matemáticos estándar para predecir la Tm de las cadenas hibridadas, o mediante la determinación empírica de la Tm mediante el uso de métodos rutinarios. La Tm se refiere a la temperatura a la que una población de complejos de hibridación formados entre dos cadenas de ácido nucleico se desnaturaliza en un 50%. A una temperatura inferior a la Tm, se favorece la formación de un complejo de hibridación, mientras que a una temperatura superior a la Tm, se favorece la fusión o separación de las cadenas en el complejo de hibridación. La Tm puede estimarse para un ácido nucleico con un contenido conocido de G+C en una solución acuosa de NaCl 1 M usando, por ejemplo, Tm=81,5+0,41(% de G+C)-675/N-% de malapareamiento, donde N=número total de bases.

Un malapareamiento significa que un nucleótido de una cadena de ácido nucleico no se empareja o no puede emparejarse mediante el emparejamiento de bases Watson-Crick con un nucleótido de una cadena de ácido nucleico complementaria opuesta. Ejemplos de malapareamientos son, entre otros, los pares de bases AA, AG, AC, GG, CC, TT, Tg , TC, UU, Ug , UC y UT. Los malapareamientos pueden producirse entre moléculas de ADN y ADN, moléculas de ADN y ARN, moléculas de ARN y ARN, y entre otros análogos de ácidos nucleicos naturales o artificiales.

Los reactivos o agentes de unión a los malapareamientos son cualquier molécula o cualquier modificación de los cebadores infrarrepresentados que pueda estabilizar la hibridación de los cebadores infrarrepresentados con los sitios de unión de los cebadores infrarrepresentados mediante interacción química o interacción física. La modificación de los cebadores infrarrepresentados puede modificarse de cualquier manera, siempre que una modificación dada sea compatible con la función deseada de un cebador infrarrepresentado dado que pueda determinarse fácilmente. Las modificaciones incluyen modificaciones de bases, modificaciones de azúcares o modificaciones de la estructura principal. Algunas moléculas pequeñas pueden unirse a bases malapareadas mediante enlaces de hidrógeno presumiblemente complementarios a los de la base no apareada y estabilizar el dúplex con una alta selectividad de bases. Se ha demostrado que los iones metálicos interactúan con los ácidos nucleicos para la formación y el plegamiento de su estructura. Ono A., Togashi H. (Ono & Togashi, 2004,Angewandte Chemie(Ed internacional en inglés), 43(33), 4300-4302) demostraron que la adición de ion de mercurio en solución aumenta la Tm del dúplex de ADN con malapareamiento T-T en 5° C. Torigoe H., Okamoto I. et al. (Torigoe et al., 2012,Biochimie,94(11), 2431-2440) demostraron que el ion de plata se une selectivamente y estabiliza el malapareamiento C-C. Cordier C., Pierre V. C. et al. diseñaron y sintetizaron una serie de complejos de rodio capaces de reconocer sitios de malapareamiento con alta selectividad (Cordier, Pierre y Barton, 2007,Journal of the American Chemical Society,129(40), 12287-12295). Nakatani K., Sando S., et al. (Nakatani, Sando, Kumasawa, Kikuchi, & Saito, 2001,Journal ofthe American Chemical Society,123(50), 12650-12657) han desarrollado una serie de moléculas pequeñas basadas en naftiridinas para reconocer selectivamente el ADN malapareado.

Las condiciones de hibridación o apareamiento incluyen los componentes químicos y sus concentraciones (por ejemplo, sales, agentes quelantes, formamida) de una solución acuosa u orgánica que contiene los ácidos nucleicos, y la temperatura de la mezcla en la que una cadena de ácido nucleico se une a una segunda cadena de ácido nucleico mediante interacciones de cadenas complementarias para producir un complejo de hibridación.

Una muestra es una composición en la que pueden estar presentes uno o más ácidos nucleicos objetivo de interés, incluyendo muestras de pacientes, materiales vegetales o animales, materiales de desecho, materiales para análisis forenses, muestras medioambientales, células tumorales circulantes (CTC), ADN libre de células, biopsia líquida y similares. Las muestras incluyen cualquier tejido, célula o extracto derivado de un organismo vivo o muerto que pueda contener un ácido nucleico objetivo, por ejemplo, sangre periférica, médula ósea, plasma, suero, tejido de biopsia, incluyendo los ganglios linfáticos, tejido respiratorio o exudados, tejido gastrointestinal, orina, heces, semen u otros fluidos corporales. Las muestras de especial interés son las muestras de tejidos (incluidos los fluidos corporales) de un ser humano o un animal que tiene o se sospecha que tiene una enfermedad o afección, en particular una infección por un virus. Otras muestras de interés incluyen las industriales, como las de análisis de agua, análisis de alimentos, control de la contaminación y similares. Los componentes de la muestra pueden incluir ácidos nucleicos objetivo y no objetivo, y otros materiales como sales, ácidos, bases, detergentes, proteínas, carbohidratos, lípidos y otros materiales orgánicos o inorgánicos. Una muestra puede someterse o no a procesamiento para purificar un ácido nucleico objetivo antes de la amplificación. El procesamiento posterior puede consistir en el tratamiento con un detergente o desnaturalizante para liberar los ácidos nucleicos de las células o los virus, la eliminación o inactivación de los componentes de los ácidos no nucleicos y la concentración de los ácidos nucleicos.

Un ácido nucleico objetivo se refiere a una molécula de ácido nucleico o población de moléculas de ácido nucleico relacionadas que está o puede estar presente en una muestra. Un ácido nucleico objetivo incluye un segmento a amplificar definido por los sitios de unión del cebador. El segmento puede ser el ácido nucleico completo o cualquier segmento del mismo de longitud susceptible de amplificación. Por ejemplo, un ácido nucleico objetivo puede ser un cromosoma completo, gen o ADNc, y un segmento objetivo puede tener, por ejemplo, sólo 40-500 de estos nucleótidos. Un segmento objetivo puede presentarse en cualquier cadena (sentido o antisentido) de la estructura. Un ácido nucleico objetivo puede ser ARN (por ejemplo, ARN viral, micro<a>R<n>, ARNm, ARNc, ARNr, ARNhn o ADN (genómico o ADNc), entre otros.

El ácido nucleico objetivo puede proceder de un microorganismo patógeno, como un virus, una bacteria o un hongo, o puede ser endógeno de un paciente. Los ácidos nucleicos virales (por ejemplo, genómicos, ARNm) forman un objetivo útil para el análisis de secuencias virales. Algunos ejemplos de virus que pueden detectarse son el VIH, la hepatitis (A, B o C), el virus del herpes (por ejemplo, VZV, HSV-1, HAV-6, HSV-II, CMV y virus de Epstein Barr), adenovirus, XMRV, virus de la gripe, flavivirus, echovirus, rinovirus, virus coxsackie, cornovirus, virus respiratorio sincitial, virus de las paperas, rotavirus, virus del sarampión, virus de la rubéola, parvovirus, virus vaccinia, virus HTLV, virus del dengue, virus relacionado con MLV, virus del papiloma, virus del molusco, poliovirus, virus de la rabia, virus JC y virus de la encefalitis arboviral. Ejemplos de tales bacterias incluyen clamidia, bacterias rickettsiales, micobacterias, estafilococos, treptococos, neumonococos, meningococos y conococos, klebsiella, proteus, serratia, pseudomonas, legionella, difteria, salmonella, bacilos, cólera, tétanos, botulismo, ántrax, peste, leptospirosis, bacterias de la enfermedad de Lymes, estreptococos o neisseria. El ARNr es un ácido nucleico objetivo particularmente útil para tipificar bacterias. La detección de genes humanos o animales es útil para detectar la presencia o susceptibilidad a enfermedades. Ejemplos de genes que pueden someterse a detección incluyen fusiones de genes del cáncer, BRACA-1 o BRAC-2, p53, CFTR, citocromos P450), para genotipado (por ejemplo, identificación forense, pruebas de paternidad, portador heterocigoto de un gen que actúa cuando es homocigoto, tipado HLA), determinación de la eficacia de fármacos en un individuo (por ejemplo, diagnósticos acompañantes) y otros usos.

Un tipo de nucleótido infrarrepresentado es aquel presente en no más del 20% de las posiciones de un cebador o de un sitio de unión de cebadores, o de ambos. Típicamente, un cebadortiene una composición nucleotídica de A, G, C, T o A, G, C, U. Un cebador puede incluir nucleótidos no naturales, como Iso C e IsoG, deaza G o deaza A. Estos se puntúan de la misma manera que los nucleótidos estándar correspondientes para determinar el número o el porcentaje de nucleótidos infrarrepresentados. Un análogo se corresponde con un nucleótido natural si tiene la misma afinidad relativa de emparejamiento con otros nucleótidos naturales. Por tanto, deaza G o inosina son análogos de G porque se emparejan más fuertemente con C que cualquiera de los otros nucleótidos naturales. Por ejemplo, si G es un tipo de nucleótido infrarrepresentado, para determinar el porcentaje del tipo de nucleótido infrarrepresentado en un cebador, deaza G se incluye en el numerador (así como en el denominador) y deaza A sólo en el denominador. Por tanto, el porcentaje de nucleótidos infrarrepresentados en un cebador que contiene una G, una G deaza y 20 nucleótidos en total es del 10%. Un tipo de nucleótido infrarrepresentado está presente en 0, 1 o 2 unidades en posiciones internas y opcionalmente una en la posición 5' terminal en cada cebador y 0, 1, 2, 3 o 4 unidades en cada sitio de unión del cebador, y en 0 unidades en una secuencia artificial. Lo ideal es que una y sólo una unidad del tipo de nucleótido infrarrepresentado se encuentre en la posición 5' terminal. Si uno y sólo uno de los cuatro tipos de nucleótidos está infrarrepresentado, será el menos representado (incluyendo la representación nula) de los cuatro tipos de nucleótidos estándar. Si el cebador contiene una posición degenerada, la posición se cuenta como una posición de tipo de nucleótido infrarrepresentado (es decir, tanto en el numerador como en el denominador) si la degeneración incluye el tipo de nucleótido infrarrepresentado y sólo en el denominador en caso contrario. Un análogo de nucleótido que no tenga preferencia entre los tipos de nucleótidos naturales se trata igual que una posición degenerada. Un cebador que contenga uno o varios tipos de nucleótidos infrarrepresentados se denomina cebador infrarrepresentado. Una sonda que contenga uno o varios tipos de nucleótidos infrarrepresentados se denomina sonda infrarrepresentada.

El término "dNTP" se refiere de manera general a un desoxinucleótido individual o combinación de desoxinucleótidos que contienen un fosfato, azúcar y base orgánica en forma de trifosfato, que proporcionan precursores requeridos por una ADN polimerasa para la síntesis de ADN. Una mezcla de dNTP puede incluir cada uno de los desoxinucleótidos de origen natural (es decir, adenina (A), guanina (G), citosina (C), uracilo (U) y timina (T)). En algunas realizaciones, cada uno de los desoxinucleótidos de origen natural puede sustituirse o suplementarse con un análogo sintético, como inosina, isoG, IsoC, deaza G, deaza A, etcétera. Cuando los nucleótidos están infrarrepresentados en un cebador o una sonda, los nucleótidos se denominan nucleótidos infrarrepresentados. Los nucleótidos infrarrepresentados pueden incluirse en un sistema de reacción en forma de desoxinucleótidos o dideoxinucleótidos o ribonucleótidos. Sus complementos se denominan nucleótidos complementarios de nucleótidos infrarrepresentados. El término "ddNTP" se refiere de manera general a un dideoxinucleótido individual o combinación de dideoxinucleótidos que contienen un fosfato, azúcar y base orgánica en forma de trifosfato, que proporcionan precursores requeridos por una ADN polimerasa para la síntesis de ADN. Una mezcla de ddNTP puede incluir cada uno de los dideoxinucleótidos de origen natural (es decir, adenina (A), guanina (G), citosina (C), uracilo (U) y timina (T)). En algunas realizaciones, cada uno de los dideoxinucleótidos de origen natural puede sustituirse o suplementarse con un análogo sintético, como inosina, isoG, IsoC, deazaG, deaza A, etcétera. El término "NTP" se refiere de manera general a un ribonucleótido individual o combinación de ribonucleótidos que contienen un fosfato, azúcar y base orgánica en forma de trifosfato, que proporcionan precursores requeridos por una ARN polimerasa para la síntesis del ARN. Una mezcla de NTP puede incluir cada uno de los ribonucleótidos de origen natural (es decir, adenina (A), guanina (G), citosina (C), uracilo (U)). En algunas realizaciones, cada uno de los ribonucleótidos naturales puede sustituirse o suplementarse con un análogo sintético, como inosina, isoG, IsoC, deazaG, deaza A, etcétera.

En esta invención un sitio de unión del cebador o sitio de unión de la sonda es intercambiable con sitio de unión del cebador infrarrepresentado o sitio de unión de la sonda infrarrepresentado. Un sitio de unión de cebador es un sitio completo o parcial en un ácido nucleico objetivo con el que hibrida un cebador. Un sitio parcial puede suplementarse mediante la provisión de secuencias de punto de apoyo y de unión, que también contienen sitios parciales de unión de cebadores. Un sitio de unión parcial de una secuencia de unión o punto de apoyo puede combinarse con un sitio de unión parcial del cebador en un ácido nucleico objetivo para formar un sitio de unión completo del cebador.

En esta invención el término cebador o sonda es intercambiable con cebador infrarrepresentado o sonda infrarrepresentada. Un cebador o una sonda es un oligonucleótido complementario al sitio de unión del cebador o la sonda aportado total o parcialmente por un ácido nucleico objetivo. Un cebador o una sonda pueden estar enlazados en su extremo 5' a otro ácido nucleico (a veces denominado cola), que no se encuentra en o no es complementario al ácido nucleico objetivo. Una cola 5' puede tener una secuencia artificial. En el caso de un cebador o una sonda exactamente complementarios a un cebador o a un sitio de unión de la sonda, la demarcación entre el cebador o la sonda y la cola es fácilmente evidente, ya que la cola comienza con el primer nucleótido no complementario encontrado a partir del extremo 3' del cebador o la sonda. Para un cebador sustancialmente complementario a un sitio de unión del cebador, el último nucleótido del cebador es el último nucleótido complementario al sitio de unión del cebador encontrado alejándose del extremo 3' del cebador que contribuye a la unión del cebador al ácido nucleico objetivo (es decir, el cebador con este nucleótido 5 'tiene mayor TM para el ácido nucleico objetivo que un cebador sin el nucleótido 5'). La complementariedad o no entre los nucleótidos en el cebador y el sitio de unión del cebador se determina mediante el emparejamiento Watson-Crick o no en el alineamiento máximo de las secuencias respectivas.

Un cebador o una sonda es un oligonucleótido. El término "oligonucleótido" abarca tanto un "oligonucleótido" singular como un "oligonucleótido" plural, y se refiere a cualquier polímero de dos o más de nucleótidos, nucleósidos, nucleobases o compuestos relacionados usados como reactivo en los métodos de amplificación de la presente invención, así como en los métodos de detección posteriores. El oligonucleótido puede ser ADN y/o ARN y/o análogos de los mismos y/o ADN ARN quimérico. El término oligonucleótido no denota ninguna función particular del reactivo, sino que se usa genéricamente para cubrir todos los reactivos descritos en la presente. Un oligonucleótido puede desempeñar varias funciones diferentes, por ejemplo, puede funcionar como cebador si es capaz de hibridar con una cadena complementaria y puede extenderse además en presencia de una polimerasa de ácido nucleico, puede proporcionar un promotor si contiene una secuencia reconocida por una ARN polimerasa y permite la transcripción, puede contener reactivos de detección para la generación/amplificación de señales, y puede servir para impedir la hibridación o impedir la extensión del cebador si se sitúa y/o modifica adecuadamente. Los oligonucleótidos específicos de la presente invención se describen con más detalle a continuación. Como se usa en la presente, un oligonucleótido puede tener prácticamente cualquier longitud, limitado únicamente por su función específica en la reacción de amplificación o en la detección de un producto de amplificación de la reacción de amplificación. Los oligonucleótidos de una secuencia y estructura química definidas pueden producirse por técnicas convencionales, como por síntesis química o bioquímica, y por expresión in vitro o in vivo a partir de moléculas de ácido nucleico recombinantes, por ejemplo, vectores bacterianos o virales. Tal como se pretende en esta divulgación, un oligonucleótido no consiste únicamente en ADN cromosómico de tipo salvaje o en los productos de transcripción in vivo del mismo. Los oligonucleótidos pueden modificarse de cualquier manera, siempre que una modificación dada sea compatible con la función deseada de un oligonucleótido dado, como puede determinarse fácilmente. Las modificaciones incluyen modificaciones de bases, modificaciones delazúcar o modificaciones de la estructura principal. Las modificaciones de bases incluyen, pero no se limitan al uso de las siguientes bases además de adenina, citidina, guanosina, timina y uracilo: C-5 propina, 2-amino adenina, 5-metil citidina, inosina y bases dP y dK. Los grupos de azúcar de las subunidades nucleosídicas pueden ser ribosa, desoxirribosa y análogos de los mismos, incluyendo, por ejemplo, ribonucleósidos que tienen una sustitución 2'-O-metilo (2'-O-ME) en la fracción ribofuranosilo. Ver "Method for Amplifying Target Nucleic Adds Using Modified Primers," (Becker, Majlessi, & Brentano, 2000, Patente de Estados Unidos N° 6,130,038). Otras modificaciones del azúcar incluyen, pero no se limitan a, modificaciones 2'-amino, 2'-fluoro, alfa-treofuranosilo y pentopuranosilo. Las subunidades nucleosídicas pueden estar unidas por enlaces como enlaces fosfodiéster, enlaces modificados o por elementos no nucleotídicos que no impidan la hibridación del oligonucleótido con su secuencia de ácido nucleico objetivo complementaria. Los enlaces modificados incluyen aquellos enlaces en los que un enlace fosfodiéster estándar se sustituye por un enlace diferente, como un enlace fosforotioato o un enlace metilfosfonato. Las subunidades de nucleobases pueden unirse, por ejemplo, sustituyendo la estructura principal natural de fosfato de desoxirribosa del ADN por una estructura principal de pseudopéptido, como una estructura principal de 2-aminoetilglicina que acopla las subunidades de nucleobases mediante un conector carboximetilo a la amina secundaria central. (Los análogos de ADN que tienen una estructura principal pseudopeptídica se denominan comúnmente "ácidos nucleicos peptídicos" o "PNA" y se describen en Nielsen et al., "Peptide Nucleic Acids," (Nielsen, Buchardt, Egholm, & Berg, 1996, Patente de Estados Unidos N° 5,539,082). Otras modificaciones de enlace incluyen, pero no se limitan a, enlaces de morfolino, Ejemplos no limitativos de oligonucleótidos u oligómeros contemplados por la presente invención incluyen análogos de ácidos nucleicos que contienen análogos de nucleósidos y nucleótidos (LNA) bicíclicos y tricíclicos. Ver Imanishi et al., "Bicyclonucleoside and Oligonucleotide Analogues," (Imanishi & Obika, 2o0l, Patente de Estados Unidos N° 6,268,490); y Wengel et al., "Oligonucleotide Analogues," (Wengel & Nielsen, 2003, Patente de Estados Unidos N° 6,670,461). La presente invención contempla cualquier análogo de ácido nucleico siempre que el oligonucleótido modificado pueda realizar su función pretendida, por ejemplo, hibridar con un ácido nucleico objetivo en condiciones de hibridación o amplificación estrictas, o interactuar con una ADN o ARN polimerasa, iniciando de este modo la extensión o transcripción. En el caso de las sondas de detección, los oligonucleótidos modificados también deben ser capaces de hibridar preferiblemente con el ácido nucleico objetivo en condiciones de hibridación estrictas. El extremo 3-terminal de un oligonucleótido (u otro ácido nucleico) puede bloquearse de varias maneras usando una fracción de bloqueo, como se describe a continuación. Un oligonucleótido "bloqueado" no se extiende eficazmente mediante la adición de nucleótidos a su extremo terminal 3', por una ADN polimerasa dependiente de ADN o ARN, para producir una cadena complementaria de ADN. Como tal, un oligonucleótido "bloqueado" no puede ser un "cebador".

El término "cebador degenerado" se refiere a una mezcla de cebadores similares con bases diferentes en las posiciones variables (Mitsuhashi, J. Clin. Lab. Anal., 10(5): 28593 (1996); von Eggeling et al., Cell. Mol. Biol., 41(5):653 70 (1995); (Zhang et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89:5847 5851 (1992); Telenius et al., Genomics, 13(3):718 25 (1992)). Tales cebadores pueden incluir inosina, ya que la inosina es capaz de formar pares de bases con adenosina, citosina, guanina o timidina. Los cebadores degenerados permiten el apareamiento y la amplificación de una variedad de secuencias objetivo que pueden estar relacionadas. Los cebadores degenerados que se aparean al ADN objetivo pueden funcionar como sitio de cebado para una amplificación adicional. Una región degenerada es una región de un cebador que varía, mientras que el resto del cebador puede permanecer igual. Los cebadores (o regiones) degenerados denotan más de un cebador y pueden ser aleatorios. Un cebador (o regiones) aleatorio denota que la secuencia no está seleccionada, y puede ser degenerado pero no tiene por qué serlo. En algunas realizaciones, las regiones 3' específicas del objetivo tienen una Tm de entre aproximadamente 5° C y 50° C. En algunas realizaciones, un 15-mer tiene una Tm de menos de aproximadamente 60° C.

Un "segmento 3' o región de unión 3' o sitio de unión 3' o región de hibridación 3 '" de cebador es capaz de unirse a una secuencia genómica que se produce en un genoma con una frecuencia particular. En algunas realizaciones, esta frecuencia está comprendida entre aproximadamente el 0,01% y el 2,0%, por ejemplo, entre aproximadamente el 0,05% y el 0,1% o entre aproximadamente el 0,1% y el 0,5%. En algunas realizaciones, la longitud del "sitio de unión" de un cebador depende principalmente de las longitudes promediadas de los productos de PCR predichos basados en cálculos bioinformáticos. La definición incluye, sin limitación, una "región de unión" de entre aproximadamente 4 y 12 bases de longitud. En realizaciones más particulares, la longitud de la región de unión 3' puede ser, por ejemplo, entre aproximadamente 4 y 20 bases, o entre aproximadamente 8 y 15 bases. Se incluyen dentro de la definición las regiones de unión que tienen una Tm de entre aproximadamente 10° C y 60° C. El término "segmento de unión del cebador", cuando se usa en la presente, se refiere a un cebador de secuencia especificada.

El término "aleatorio o región aleatoria" se refiere a una región de un cebador de oligonucleótidos que es capaz de aparearse en sitios no especificados de un grupo de secuencias objetivo, como en un genoma. El término "cebador aleatorio" como se usa en la presente se refiere a un cebador que puede incluir una región de unión específica del objetivo en el segmento 3' y una secuencia artificial en el segmento 5'. La "región aleatoria" facilita la unión del cebador al ADN objetivo y la unión de la enzima polimerasa usada en la amplificación por PCR al dúplex formado entre el cebador y el ADN objetivo. Los nucleótidos de la región aleatoria pueden ser nucleobases o análogos de nucleobases degenerados o inespecíficos, promiscuos. La longitud de la "región aleatoria" del cebador de oligonucleótidos depende, entre otras cosas, de la longitud de la región específica. En ciertas realizaciones, sin limitación, la "región aleatoria" tiene entre aproximadamente 2 y 15 bases de longitud, entre aproximadamente 4 y 12 bases de longitud o entre aproximadamente 4 y 6 bases de longitud. En otra realización, las regiones específica y aleatoria combinadas tendrán aproximadamente 9 bases de longitud, por ejemplo, si la región específica tiene 4 bases, la región aleatoria tendrá 5 bases.

En algunas realizaciones, el segmento 3' del cebador comprende tanto una región específica como una región aleatoria o degenerada. En otras realizaciones, el segmento 3' incluye una región específica y una región aleatoria o una región degenerada. En otras realizaciones, el segmento 3' del cebador objetivo sólo incluye una región específica, una región aleatoria o una región degenerada. Por supuesto, también pueden usarse regiones conocidas (secuencias que se conocen) o formar parte de las opciones divulgadas en la presente.

Una polimerasa es una enzima que puede realizar la extensión dirigida por la plantilla de un cebador hibridado con la plantilla. Puede ser una ADN polimerasa, una ARN polimerasa o una transcriptasa inversa. Los ejemplos de ADN polimerasas son:E. coliADN polimerasa I, Taq ADN polimerasa, S.pneumoniaeADN polimerasa I, Tfl ADN polimerasa,D. radioduransADN polimerasa I, Tth ADN polimerasa, Tth<x>L ADN polimerasa,M. tuberculosisADN polimerasa I,M. thermoautotrophicumADN polimerasa I, Herpes simplex-1 ADN polimerasa, T4 ADN polimerasa, thermosequenase o una T7 a Dn polimerasa de tipo salvaje o modificada, 029 polimerasa, Bst polimerasa, Vent polimerasa, 9° Nm polimerasa, fragmento de Klenow de ADN polimerasa I. Ejemplos de transcriptasa inversa: AMV transcriptasa inversa, MMLV transcriptasa inversa, VIH transcriptasa inversa. Ejemplos de ARN polimerasas: ARN polimerasa T7 o ARN polimerasa SP6, ARN polimerasas bacterianas y ARN polimerasas eucariotas.

La amplificación se refiere o a la producción de una copia o copias adicionales de todo o un segmento de un ácido nucleico objetivo mediante la extensión de cebadores dirigida por plantilla (amplificación objetivo) o la amplificación de la señal de detección para la medición cualitativa/cuantitativa (amplificación de señal) o ambas. La amplificación puede realizarse en condiciones isotérmicas o de ciclos de temperatura, o combinadas. La amplificación puede ser lineal o exponencial.

Muchos métodos bien conocidos de amplificación de objetivos de ácidos nucleicos requieren termociclado para desnaturalizar alternativamente los ácidos nucleicos de cadena doble e hibridar los cebadores; sin embargo, otros métodos bien conocidos de amplificación de ácidos nucleicos son isotérmicos. La reacción en cadena de la polimerasa, comúnmente denominada PCR (Mullis, 1987 Patente de Estados Unidos N° 4.683.202; Saiki et al., 1985, Science (New York, N.Y.), 230(4732), 1350-1354), usa múltiples ciclos de desnaturalización, apareamiento de pares de cebadores en cadenas opuestas y extensión de cebadores para aumentar exponencialmente el número de copias de la secuencia objetivo. En una variante denominada RT-PCR, se usa la transcriptasa inversa (RT) para elaborar ADN complementario (ADNc) a partir de ARNm, y el ADNc se amplifica mediante PCR para producir múltiples copias de ADN (Gelfand et al., "Reverse Transcription with Thermostable DNA Polymerases-High Temperature Reverse Transcription," (Gelfand, 1994, Patente de Estados Unidos N° 5,322,770; Gelfand & Myers, 1994, Patente de Estados Unidos N° 5,310,652). Otro método de amplificación del ácido nucleico se denomina método LCR (reacción en cadena de la ligasa, Laffler, Carrino y Marshall, 1993,Annales De Biologie Clinique,51(9), 821-826). La LCR (Laffler et al., 1993,Annales De Biologie Clinique, 51(9),821-826) se basa en la reacción en la que dos sondas adyacentes hibridan con una secuencia objetivo y se ligan entre sí mediante una ligasa. Las dos sondas no podrían ligarse en ausencia de la secuencia de nucleótidos objetivo, por lo que la presencia del producto ligado es indicativa de la secuencia de nucleótidos objetivo. El método LCR también requiere el control de la temperatura para la separación de una cadena complementaria de una plantilla. Otro método es la amplificación por desplazamiento de cadena (George T. Walker, Little y Nadeau, 1993, Patente de Estados Unidos N° 5,270,184; George T. Walker, 1995, Patente de Estados Unidos N° 5,455,166; G. T. Walker et al, 1992,Nucleic Acids Research,20(7), 1691-1696, 1992,Proceedings ofthe National Academy of Sciences ofthe United States of America,89(1), 392-396), denominada comúnmente SDA, que usa ciclos de apareamiento de pares de secuencias de cebadores a cadenas opuestas de una secuencia objetivo, extensión de cebadores en presencia de un dNTP para producir un producto de extensión de cebador dúplex hemifosforotioado, mellado mediado por endonucleasas de un sitio de reconocimiento de una endonucleasa de restricción hemimodificada, y extensión del cebador mediada por polimerasas desde el extremo 3' del mellado para desplazar una cadena existente y producir una cadena para la siguiente ronda de apareamiento del cebador, mellado y desplazamiento de la cadena, lo que resulta en la amplificación geométrica del producto. La SDA termofílica (tSDA) usa endonucleasas y polimerasas termofílicas a temperaturas más elevadas en esencialmente el mismo método (Frailer, Spargo, Van, Walker, & Wright, 2002, Patente Europea N°0684315). Otros métodos de amplificación incluyen la amplificación basada en la secuencia de ácidos nucleicos (Compton, 1991,Nature,350(6313), 91-92, Malek, Davey, Henderson, & Sooknanan, 1992), comúnmente denominada NASBA; uno que usa una ARN replicasa para amplificar la propia molécula de la sonda (Lizardi, Guerra, Lomeli, Tussie-Luna, & Russell Kramer, 1988,Nature Biotechnology,6(10), 1197-1202), denominado comúnmente Op replicasa; un método de amplificación basado en la transcripción (Kwoh et al., 1989,Proceedings ofthe National Academy of Sciences ofthe United States of America,86(4), 1173 1177); replicación de secuencia autosostenida (3SR), (Guatelli et al., 1990,Proceedings ofthe National Academy of Sciences ofthe United States of America,87(5), 1874-1878; Landgren (1993)Trends in Genetics9, 199-202; y Lee, H. et al., NUCLEIC ACID AMPLIFICATION TECHNOLOGIES (1997)); y, amplificación mediada por transcripción (Kwoh et al., 1989,Proceedings ofthe National Academy of Sciences ofthe United States of America,86(4), 1173 1177; Kacian & Fultz, 1995, Patente de Estados Unidos N° 5.480.784; Kacian & Fultz, 1996, Patente de Estados Unidos N° 5,399,491), denominado comúnmente TMA. Para un análisis adicional sobre los métodos de amplificación conocidos, consultar Persing, David H., 1993, "In Vitro Nucleic Acid Amplification Techniques" en Diagnostic Medical Microbiology: Principles and Applications (Persing et al., Eds.), págs. 51-87 (American Society for Microbiology, Washington, D.C.). Otros métodos de amplificación ilustrativos adecuados para su uso de acuerdo con la presente invención también incluyen la amplificación en círculo rodante (RCA) (Fire & Xu, 1995,Proceedings o fthe National Academy of Sciences,92(10), 4641-4645; Lizardi, 1998, Patente de Estados Unidos N° 5,854,033); amplificación de ácidos nucleicos usando agentes de mellado (Van Ness, Galas, & Van Ness, 2006, Patente de Estados Unidos N° 7,112,423); reacción de amplificación de extensión y mellado (NEAR) (Maples et al., 2009, US 2009-0017453 A1); amplificación dependiente de helicasa (HDA) (Kong, Vincent y Xu, 2004, u S 2004-0058378 A1; Kong, Vincent y Xu, 2007 Patente US US2007/0254304 A1); y amplificación isotérmica mediada por bucle (LAMP) (Notomi & Hase, 2002, Patente de Estados Unidos N° 6,410,278), y amplificación por cebado de cuádruplex(Analyst,2014, 139, 1644-1652). amplificación Expar (PNAS 15 de abril de 2003 100, 4504-4509). Amplificación por cebado cruzado (Sci Rep. 2012; 2: 246). Amplificación Sm AP (Nature Methods 04/2007; 4(3):257-62). Amplificación por desplazamiento múltiple (MDA,Proceedings ofthe National Academy of Sciences2005, 102 (48): 17332-6.), Amplificación de recombinasa polimerasa(Journal of Clinical Virology54 (4): 308-12). Amplificación isotérmica con cebador único (SPIA) (clinical chemistry, 2005 vol. 51 N° 101973-1981).

Otro aspecto de la amplificación es la amplificación de señal. Cuando se dispone de una cantidad suficiente de ácidos nucleicos que detectar, resulta ventajoso detectar directamente esa secuencia, en lugar de hacer más copias de ese objetivo (por ejemplo, como en la PCR y la LCR). Los métodos tradicionales de detección directa, como la transferencia Northern y Southern y los ensayos de protección de RNasa, habitualmente requieren el uso de radiactividad y no son susceptibles de automatización. Otras técnicas han intentado eliminar el uso de radiactividad y/o mejorar la sensibilidad en formatos automatizables. La reacción de sonda cíclica (CPR) (Duck, Alvarado-Urbina, Burdick, & Collier, 1990b,BioTechniques,9(2), 142-148), usa un oligonucleótido quimérico largo en el que una porción central está hecha de ARN mientras que los dos extremos están hechos de ADN. La hibridación de la sonda con un ADN objetivo y la exposición a una RNasa H termoestable provoca la digestión de la porción de ARN. Esto desestabiliza las porciones de ADN restantes del dúplex, liberando el resto de la sonda del ADN objetivo y permitiendo que otra molécula de sonda repita el proceso. El ADN ramificado (ADNb), descrito por Urdea etal., 1987,Gene,61(3), 253-264, implica oligonucleótidos con estructuras ramificadas que permiten que cada oligonucleótido individual lleve de 35 a 40 marcadores (por ejemplo, enzimas de fosfatasa alcalina). Aunque esto aumenta la señal de un evento de hibridación, la señal de la unión no específica aumenta de manera similar. Otras amplificaciones de señal incluyen: escisión invasiva de ácidos nucleicos (Prudent, Hall, Lyamichev, Brow, & Dahlberg, 2006, Patente de Estados Unidos N° 7,011,944); reacción en cadena de hibridación (HCR) (R. M. Dirks & Pierce, 2004,Proceedings o fthe National Academy of Sciences o fthe United States of America,101(43), 15275-15278, R. Dirks & Pierce, 2012, Patente de Estados Unidos N° 8,105,778) y detección colorimétrica basada en G-quadruplex DNAzima. Amplificación CHA(J. Am. Chem. Soc.,2013, 135 (20), pp 7430-7433). Amplificación de señal SMART (Biotechniques marzo de 2002; 32(3):604-6, 608-11.)

Los productos de amplificación pueden detectarse cualitativa (es decir, señal positiva con respecto al control) o cuantitativamente (intensidad de la señal relacionada con la cantidad absoluta o relativa de analito que da lugar al producto de amplificación). La detección puede incluir, pero no requiere, análisis adicionales, como la secuenciación de un producto de amplificación. Los métodos proporcionados por la invención también pueden incluir detectar directamente un ácido nucleico particular en un producto de reacción de captura o de amplificación, como un amplicón objetivo particular o un conjunto de amplicones. Por consiguiente, las mezclas de la invención pueden comprender conjuntos de sondas especializadas incluyendo TAQMAN®, que usa una sonda hidrolizable que contiene moléculas informadoras e inactivador detectables, que pueden ser liberadas por una ADN polimerasa con actividad de exonucleasa 5 T ^3 ' (Livak, Flood, & Marmaro, 1996, Patente de Estados Unidos N° 5.538.848); baliza molecular, que utiliza una sonda de horquilla con moléculas informadoras e inactivadoras en extremos opuestos (Tyagi, Kramer y Lizardi, 1999,Patente de Estados Unidos N° 5.538.848).Patente de Estados Unidos N° 5.925.517); cebadores de transferencia de energía por resonancia de fluorescencia (FRET), que usan un par de cebadores adyacentes con elementos donantes y aceptores fluorescentes, respectivamente (Wittwer, Ririe y Rasmussen, 2001, Patente de Estados Unidos N° 6.000.000). Patente de Estados Unidos N° 6.174.670); y LIGHTUP™, una única sonda corta que sólo emite fluorescencia cuando se une al objetivo (Kubista & Svanvik, 2001, Patente de Estados Unidos N° 6.329.144). De manera similar, SCORPION™ (whitcombe, Theaker, Gibson y Little, 2001, Patente de Estados Unidos N° 6.326.145) y SIMPLEPROBES™ (Wittwer et al., 2003, Patente de Estados Unidos N° 6.635.427) usan sondas de informador/colorante únicas. Las sondas detectoras de amplicones pueden diseñarse de acuerdo con la modalidad de detección concreta usada, y como se analiza en las patentes mencionadas anteriormente. Otros métodos de detección incluyen: electroforesis en gel, espectrometría de masas o electroforesis capilar, curva de fusión, colorante quelante fluorescente basado en ácido nucleico, como verde SYBR™, o detección de productos de amplificación usando un marcador fluorescente y un inactivador soluble (Will, Gupta y Geyer, 2014, Patente de Estados Unidos N° 8.658.366).

El término "amplificación multiplex" se refiere a la amplificación de más de un ácido nucleico de interés. Por ejemplo, puede referirse a la amplificación de múltiples secuencias a partir de la misma muestra o a la amplificación de una de varias secuencias en una muestra como se analiza, por ejemplo, en George T. Walker, Nadeau, & Little, 1995 Patente de Estados Unidos N° 5,422,252; y George T. Walker, Nadeau, Spears, et al., 1995, Patente de Estados Unidos N° 5,470,723, que proporcionan ejemplos de amplificación multiplex por desplazamiento de cadena. El término también se refiere a la amplificación de una o más secuencias presentes en múltiples muestras, ya sea simultáneamente o de manera escalonada.

La amplificación en tiempo real se refiere a una reacción de amplificación en la que la cantidad de producto de reacción, es decir, el amplicón, se monitoriza a medida que avanza la reacción. Las formas de amplificación en tiempo real difieren principalmente en los mecanismos de detección usados para monitorizar los productos de la reacción. Los métodos de detección se revisan en Mackay, Arden, & Nitsche, 2002,Nucleic Acids Research,30(6), 1292-1305.

El término "marcador de detección" se refiere a cualquier átomo o molécula que pueda usarse para proporcionar, o ayudar a proporcionar, una señal detectable (preferiblemente cuantificable), y que pueda unirse a un ácido nucleico o a una proteína. Los marcadores pueden proporcionar señales detectables por fluorescencia, radiactividad, colorimetría, gravimetría, magnetismo, actividad enzimática y similares. Los marcadores de detección pueden incorporarse de varias maneras: (1) los cebadores comprenden el marcador o marcadores, por ejemplo, unido a la base, a una ribosa, a un fosfato o a estructuras análogas en un análogo de ácido nucleico; (2) los nucleótidos trifosfatos se modifican en la base o en la ribosa (o en estructuras análogas en un análogo de ácido nucleico) con el marcador o marcadores; los nucleótidos modificados con el marcador se incorporan luego en una cadena recién sintetizada mediante una enzima de extensión como una polimerasa; (3) se usan nucleótidos modificados que comprenden un grupo funcional que puede usarse (reacción postenzimática) para añadir un marcador detectable; (4) se usan cebadores modificados que comprenden un grupo funcional que puede usarse para añadir una marcador detectable de manera similar; (5) puede usarse una sonda de marcador que se marca directamente e hibrida con una porción del amplicón; (6) un marcador que puede incorporarse a productos amplificados; (7) un marcador que puede reaccionar con subproductos de la reacción de amplificación.

Los términos "ciclar térmicamente", "ciclado térmico", "ciclos térmicos" o "ciclo térmico" se refieren a ciclos repetidos de cambios de temperatura desde una temperatura de desnaturalización total, a una temperatura de apareamiento (o hibridación), a una temperatura de extensión y de vuelta a la temperatura de desnaturalización total. Los términos también se refieren a ciclos repetidos de una temperatura de desnaturalización y una temperatura de extensión, donde las temperaturas de apareamiento y extensión se combinan en una temperatura. Una temperatura totalmente desnaturalizante desenrolla todos los fragmentos de cadena doble en cadenas sencillas. Una temperatura de apareamiento permite que un cebador se hibride o aparee con la secuencia complementaria de una cadena separada de un plantilla de ácido nucleico. La temperatura de extensión permite la síntesis de una cadena naciente de ADN del amplicón.

El término "mezcla de reacción", "mezcla de amplificación" o "mezcla de PCR" se refiere a una mezcla de componentes necesarios para amplificar por lo menos un amplicón a partir de plantillas de ácido nucleico. La mezcla puede comprender nucleótidos (dNTP), una polimerasa termoestable, cebadores y una pluralidad de plantillas de ácido nucleico. La mezcla puede comprender además un tampón Tris, una sal monovalente y Mg2+. La concentración de cada componente es bien conocida en la técnica y puede optimizarse adicionalmente.

Los términos "producto amplificado" o "amplicón" se refieren a un fragmento de ADN amplificado por una polimerasa usando un par de cebadores en un método de amplificación como la PCR.

"Fluoróforo" se refiere a una molécula que absorbe energía luminosa a una longitud de onda de excitación definida y emite energía luminosa a una longitud de onda definida diferente.

Un "inactivador" incluye cualquier fracción capaz de absorber la energía de un marcador fluorescente excitado cuando se encuentra cerca del marcador fluorescente y capaz de disipar esa energía. Un inactivador puede ser un inactivador fluorescente o un inactivador no fluorescente, también denominado inactivador oscuro. Los fluoróforos enumerados anteriormente pueden desempeñar una función inactivadora si se acercan a otro fluoróforo, en cuyo caso puede producirse inactivación FRET o inactivación por contacto. Se prefiere usar un inactivador oscuro que no emita luz visible. Ejemplos de inactivadores oscuros incluyen, pero no se limitan a, DABCYL éster succinimidílico de (ácido 4-(4-dimetilaminofenilazo)benzoico), éster succinimidílico de ácido carboxílico de diarilrhodamina (QSY-7) y éster succinirnidílico de ácido 4',5-carboxílico de dinitrofluoresceína, (QSY33), inactivador, o " inactivadores Black hole" (BHQ-1, BHQ-2 y BHQ--3), análogos de nucleótidos, residuos G de nucleótidos, nanopartículas y partículas de oro.

El término "mutación" se refiere a uno o más nucleótidos en una secuencia de ácidos nucleicos objetivo que difieren de una forma prototípica del ácido nucleico objetivo designado tipo salvaje. La secuencia designada tipo salvaje es la forma alélica más común de una secuencia, la primera forma descubierta de la secuencia y/o una forma de la secuencia asociada con un fenotipo normal (no enfermo). Los polimorfismos de un solo nucleótido (SNP) son una forma de mutación.

El término "superficie" se refiere a cualquier superficie sólida a la que puedan unirse covalentemente ácidos nucleicos, como por ejemplo perlas de látex, perlas de dextrano, poliestireno, superficie de polipropileno, gel de poliacrilamida, superficies de oro, superficies de vidrio y obleas de silicio. Preferiblemente, el soporte sólido es una superficie de vidrio.

El término "unido a una superficie", como se usa en la presente, se refiere a cualquier método de unión químico o no químico que incluya grupos funcionales modificables químicamente. "Unión" se refiere a la inmovilización de ácido nucleico en soportes sólidos mediante una unión covalente o mediante adsorción pasiva irreversible o mediante afinidad entre moléculas (por ejemplo, inmovilización en una superficie recubierta de avidina por moléculas biotiniladas). La unión debe ser lo suficientemente fuerte como para que no pueda eliminarse mediante lavado con agua o tampón acuoso en condiciones de desnaturalización del ADN.

Un extremo pegajoso es un extremo de cadena sencilla de un ácido nucleico adyacente a un segmento de cadena doble del ácido nucleico. Los ácidos nucleicos con extremos pegajosos con secuencias complementarias pueden aparearse a través de los extremos pegajosos y someterse a ligación entre sí.

Una secuencia artificial es una secuencia que carece de complementariedad con un ácido nucleico objetivo natural que se sabe o se sospecha que puede estar presente en una muestra, o que por lo menos no se pretende que la tenga. Las secuencias artificiales pueden servir, entre otras cosas, como conectores que unen segmentos que hibridan con un ácido nucleico objetivo o como colas para marcar cebadores, entre otros propósitos.

DESCRIPCIÓN DETALLADA

I. General

La invención proporciona métodos de amplificación a partir de un único cebador o un par de cebadores directo e inverso de composición de nucleótidos limitada. La composición de nucleótidos limitada significa que los cebadores están infrarrepresentados en por lo menos un tipo de nucleótido. Tales cebadores tienen una capacidad muy reducida para cebarse entre sí o para extenderse iniciados por cebado erróneo desde sitios distintos a los de unión del cebador previstos en un ácido nucleico objetivo. El uso de tales cebadores para la amplificación específica del objetivo requiere la identificación de los sitios de unión del cebador en un ácido nucleico objetivo que soportan la unión del cebador y la amplificación. En algunos ácidos nucleicos objetivo, pueden identificarse sitios de unión del cebador que tengan complementariedad completa con cebadores de composición nucleotídica limitada. Más a menudo, los segmentos de composición nucleotídica limitada en los ácidos nucleicos objetivo son demasiado cortos por sí mismos para servir como sitios de unión de cebadores. Sin embargo, tales sitios pueden adaptarse para someterse a amplificación con cebadores de composición nucleotídica limitada mediante una variedad de técnicas descritas a continuación, que incluyen el uso de oligonucleótidos auxiliares de punto de apoyo o de unión, cebadores con hibridación de malapareamiento al sitio de unión del cebador, agentes estabilizadores de malapareamiento y presencia de números limitados del nucleótido infrarrepresentado en los cebadores. La invención divulgada incluye métodos que pueden mejorar la eficiencia de hibridación del cebador infrarrepresentado al sitio de unión del cebador infrarrepresentado. Los presentes métodos pueden usarse en una variedad de formatos de amplificación, como PCR, TMA, reacción en cadena de la ligasa, NEAR, LAMP, RPA, EXPAR, y demás, y con una variedad de formatos de detección. Los métodos se multiplexan para la detección de múltiples ácidos nucleicos objetivo simultáneamente.

II. Diseño de cebadores

a. Principios básicos

El presente método parte de un concepto básico de una composición nucleotídica limitada de cebadores en la que uno o más tipos de nucleótidos están infrarrepresentados (por ejemplo, A, T, C y no G) y luego selecciona los mejores sitios de unión de cebadores dentro de un ácido nucleico objetivo para el emparejamiento con cebadores de esa composición (por ejemplo, A, T y G). Dependiendo de los sitios de unión del cebador seleccionados, la composición nucleotídica de los cebadores puede ajustarse adicionalmente (por ejemplo, permitiendo un número limitado de unidades de un nucleótido infrarrepresentado) para mejorar la complementariedad con los sitios de unión del cebador.

Un diseño de cebador preferido es que uno y sólo uno de los cuatro tipos de nucleótidos estándar esté infrarrepresentado tanto en el cebador directo como en el inverso. En otras palabras, tales cebadores pueden consistir en A, T/U y C con G infrarrepresentada, A, T/U, G con C infrarrepresentada, A, G y C con T infrarrepresentada o T, G y C con A infrarrepresentada. El tipo de nucleótido infrarrepresentado es preferiblemente G o C. Si el tipo de nucleótido infrarrepresentado está presente en un cebador, es preferible que se encuentre en una posición distinta del nucleótido 3', lo más preferible como el nucleótido 5' o un nucleótido de cola 5' enlazado al nucleótido 5' del cebador. La inclusión de un nucleótido 5' infrarrepresentado aumenta la temperatura de fusión (TM) de unión del cebador sin aumentar significativamente los productos de amplificación no deseados.

El nucleótido 3' de un cebador está ocupado preferiblemente por el complemento del tipo de nucleótido infrarrepresentado. Por ejemplo, si el tipo de nucleótido infrarrepresentado es G, entonces el nucleótido 3' es preferiblemente C y viceversa. La C o G terminal inhibe la extensión del dímero del cebador porque no hay base complementaria en los cebadores con la que emparejarse. La eliminación o infrarrepresentación de un tipo de nucleótido limita sustancialmente el número de nucleótidos que pueden formar pares Watson-Crick entre los cebadores o entre los cebadores y los sitios de unión de cebadores malapareados El emparejamiento correcto de las bases del nucleótido 3' de un cebador es de suma importancia para su capacidad de soportar la extensión dependiente de la plantilla. El uso del complemento del tipo de nucleótido infrarrepresentado en esta posición reduce sustancialmente la extensión de dímeros y malapareamientos de cebadores.

Otras características del diseño de los cebadores son similares a las de los cebadores convencionales. Un cebador tiene una secuencia complementaria a su sitio de unión. Algunos cebadores tienen por lo menos 15, 20, 25, 30, 35 o 40 nucleótidos de longitud. Algunos cebadores no tienen más de 25, 30, 40, 50 o 75 nucleótidos de longitud. Los cebadores pueden tener cualquier permutación de estas longitudes inferior y superior, por ejemplo, de 15-50 de 20-30 o 30-40 nucleótidos. La temperatura de fusión de un cebador con su sitio de unión puede ser, por ejemplo, de 45-80 C o, preferiblemente, de 55-65 C. Por convención, para cebadores que se unen a cadenas opuestas, una de las cuales es la cadena codificante, el cebador directo es complementario a la cadena no codificante, de tal manera que el producto extendido es la cadena codificante, y el cebador inverso a la cadena codificante, de manera que el producto extendido es la cadena no codificante. Para los ácidos nucleicos objetivo que no tienen cadenas codificantes y no codificantes, la designación del cebador directo e inverso es arbitraria. Lo mismo ocurre cuando los cebadores directo e inverso se unen a sitios de unión de cebadores en la misma cadena. Los cebadores pueden tener colas 5' no complementarias con un ácido nucleico objetivo. Tales colas pueden usarse para unir fluoróforos o inactivadores, o pueden contener códigos de identificación, o pueden enlazar segmentos discontinuos de cebador complementarios a su ácido nucleico objetivo.

Las condiciones de amplificación habitualmente son similares a las de los cebadores convencionales en términos detampones, Mg2+, enzimas, temperaturas, etc. La amplificación convencional se realiza con los cuatro tipos de nucleótidos estándar presentes como monómeros dNTP. La amplificación con cebadores de composición nucleotídica limitada puede realizarse de este modo, pero también puede realizarse con los complementos del tipo o tipos de nucleótidos infrarrepresentados ausentes o presentes a concentración reducida o proporcionados como ddNTP(s), como se describe más adelante.

Habitualmente, pero no invariablemente, los cebadores directo e inverso se unen a cadenas opuestas de un ácido nucleico objetivo. Por tanto, una cadena de un ácido nucleico objetivo contiene, por ejemplo, el complemento del sitio de unión del cebador directo y el sitio de unión del cebador inverso, y la otra cadena contiene el sitio de unión del cebador directo y el complemento del sitio de unión del cebador inverso. En algunos formatos, los sitios de unión del cebador directo e inverso se encuentran en la misma cadena. Por ejemplo, los cebadores directo e inverso enlazados pueden unirse a sitios de unión en la misma cadena y amplificar mediante un mecanismo de círculo rodante. Algunos pares de cebadores de unión de tres vías también pueden unirse a sitios de la misma cadena de ácido nucleico, de tal manera que un cebador sirve de plantilla para el otro.

La búsqueda de sitios de unión de cebadores adecuados en un ácido nucleico objetivo se basa en los principios del diseño de cebadores, en el sentido de que los sitios de unión de cebadores deben ser complementarios a los cebadores. Por ejemplo, para el uso con cebadores que están infrarrepresentados en un único tipo de nucleótido, puede buscarse en un ácido nucleico objetivo un sitio de unión de cebador directo y un sitio de unión de cebador inverso que estén infrarrepresentados en el complemento del tipo de nucleótido infrarrepresentado en los cebadores. Preferiblemente, se identifican un sitio de unión de cebador directo y un sitio de unión de cebador inverso en los que el complemento del tipo de nucleótido infrarrepresentado está ausente. Sin embargo, si no pueden encontrarse tales sitios, pueden usarse otros sitios de unión del cebador, preferiblemente aquellos en los que se minimice el número de unidades del complemento del tipo de nucleótido infrarrepresentado. A menudo, el complemento del tipo de nucleótido infrarrepresentado en los cebadores está a su vez infrarrepresentado en los sitios de unión del cebador, pero esto no es esencial. Algunos sitios de unión del cebador directo e inverso no tienen más de 4, 3, 2 o 1 unidades del complemento del nucleótido infrarrepresentado en los cebadores.

Para cebadores ATC, puede usarse software para buscar regiones ATC y ATG contiguas o próximas que representen el complemento del sitio de unión del cebador directo y del sitio de unión del cebador inverso, respectivamente. Para usar cebadores ATG, el software puede buscar regiones ATG y ATC para el complemento del sitio de unión del cebador directo y el sitio de unión del cebador inverso respectivamente. Para usar cebadores CGA, el software puede buscar regiones CGA y CGT que representen el complemento del sitio de unión del cebador directo y el sitio de unión del cebador inverso, respectivamente. Para usar cebadores CGT, el software puede buscar regiones CGT y CGA para el complemento del sitio de unión del cebador directo y el sitio de unión del cebador inverso, respectivamente.

El complemento del sitio de unión del cebador directo (o el propio sitio de unión del cebador directo si se encuentra en la misma cadena que el cebador inverso) y el sitio de unión del cebador inverso pueden ser contiguos entre sí o estar separados por nucleótidos intermedios en una cadena del ácido nucleico objetivo. Los nucleótidos intermedios, si los hay, pueden excluir el nucleótido infrarrepresentado en los cebadores y su complemento, o pueden incluir uno o ambos de estos nucleótidos y cualquiera de los otros dos de los cuatro tipos de nucleótidos estándar. Si no son contiguos, el complemento del sitio de unión del cebador directo (o el propio sitio de unión del cebador directo) y el sitio de unión del cebador inverso deben estar lo suficientemente juntos como para que la extensión del cebador sea compatible con la técnica de amplificación (por ejemplo, no más de 100, 500, 1000 o 10000 nucleótidos).

La Fig. 1 muestra una representación sencilla del método en la que los cebadores directo e inverso consisten cada uno en nucleótidos A, T y C, con un nucleótido C en las posiciones 3'. En otras palabras, G es el tipo de nucleótido infrarrepresentado. El sitio de unión del cebador inverso consiste en A, T y G (el complemento del C, e infrarrepresentado en los cebadores). El complemento del sitio de unión del cebador directo mostrado consiste en A, T y C, lo que implica que el sitio de unión del cebador directo (al igual que el sitio de unión del cebador inverso) consiste en A, T y G. Los cebadores directo e inverso son perfectamente complementarios a los sitios de unión del cebador directo e inverso, respectivamente. El complemento del sitio de unión del cebador directo y los sitios de unión del cebador inverso son contiguos. Puede formarse un producto de amplificación cuando se suministra una reacción con los tres monómeros de trifosfato de nucleótidos complementarios a los tipos de tres nucleótidos en los cebadores directo e inverso, A, T y G. La formación de dímeros de cebador y el cebado erróneo se inhiben como se ha descrito porque pocas bases pueden emparejarse entre cebadores y o entre un cebador y un sitio de unión de cebador malapareado. Pero incluso si los cebadores pudieran unirse a sitios de unión de cebadores no pretendidos lo suficiente como para iniciar la extensión, no se formaría ningún producto de amplificación porque el monómero de trifosfato de nucleótido omitido en la mezcla de amplificación detiene la amplificación siempre que la cadena extendida necesite incorporar una C.

Alternativamente, los sitios de unión de cebadores pueden no ser contiguos y estar separados por una región que incluya los cuatro nucleótidos estándar, como se muestra en la Fig. 7. En tal caso, la amplificación se realiza con los cuatro monómeros de nucleótido trifosfato estándar.

b. Malapareamientos entre los sitios de unión de cebadores y los cebadores

La Fig. 5 muestra una situación más típica en la que una búsqueda de un ácido nucleico objetivo para sitios de unión de cebadores directo e inverso no mostró ningún par adecuado de sitios de unión de cebadores directo e inverso que tengan una complementariedad completa con cebadores formados por nucleótidos A, T, C (es decir, ningún sitio de unión de cebadores en el que el tipo de nucleótido infrarrepresentado estuviera totalmente ausente). La región ATC más larga contiene 7 nucleótidos (CATCCTC) y la región ATG más larga (CGATTGGTATG) contiene 12 nucleótidos. Estas regiones no son lo suficientemente largas como para usarlas como cebadores porque sus Tm son demasiado bajas. En tales casos, pueden usarse cebadores malapareados con los sitios de unión del cebador. En la Fig. 5, el sitio de unión del cebador directo tiene tres unidades de C y el sitio de unión del cebador inverso tiene dos unidades de C alineadas con los nucleótidos C en los cebadores. Por consiguiente, cuando tales cebadores y sitios de unión de cebadores hibridan entre sí, hay tres posiciones de malapareamiento entre el cebador directo y su sitio de unión y dos malapareamientos entre el cebador inverso y su sitio de unión. No obstante, la hibridación y la extensión pueden seguir produciéndose, aunque con una eficacia reducida. La hibridación y la extensión pueden incrementarse si la mezcla de la reacción se suministra con un agente estabilizador malapareado. Los agentes estabilizadores o de unión malapareados son moléculas o modificaciones de los cebadores infrarrepresentados que pueden estabilizar la hibridación de los cebadores infrarrepresentados con los sitios de unión de cebadores infrarrepresentados mediante interacción química o física (ver la Fig. 6). La modificación de los cebadores infrarrepresentados puede modificarse de cualquier manera, siempre que una modificación dada sea compatible con la función deseada de un cebador infrarrepresentado dado, como puede determinarse fácilmente. Las modificaciones incluyen modificaciones de bases, modificaciones de azúcar o modificaciones de la estructura principal, como PNA, LNA, o 2' fluoro 2' metiloxi. Los metaloinsertores de rodio como ejemplos de agentes estabilizadores de malapareamientos se describen en Ernst et al. J. Am. Chem. Soc. 131, 2359-2366 (2009). Sustancias químicas como los metaloinsertores de rodio pueden unirse específicamente a lo malapareamiento del ADN y tienen una constante de unión de 2,0x10 M7-1 en un malapareamiento de CC. La unión de metaloinsertores de rodio puede aumentar la temperatura de fusión del ADN de cadena doble que incluye un malapareamiento de 18,7° C. Por lo tanto, estos reactivos de unión de malapareamientos pueden añadirse a las reacciones de PCR con cebadores del tipo de tres nucleótidos para estabilizar específicamente los malapareamientos y aumentar la eficacia de la PCR. Además de los malapareamientos C-C, estos reactivos pueden estabilizar los malapareamientos T-C o A-C, entre otras posibilidades. Incluso con estos agentes estabilizadores, los cebadores malapareados pueden hibridar con una plantilla con una eficiencia ligeramente reducida, pero la amplificación puede continuar.

c. Inclusión de unas pocas unidades de nucleótidos infrarrepresentadas

Alternativa o adicionalmente al uso de un agente estabilizador de malapareamientos, el número de malapareamientos puede reducirse introduciendo un número limitado de unidades del tipo de nucleótido infrarrepresentado (típicamente hasta 2 posiciones internas) en posiciones de un cebador que reduzcan el número de malapareamientos con su sitio de unión al cebador. También puede usarse un nucleótido infrarrepresentado en la posición 5' del cebador o en una cola inmediatamente 5' al extremo 5' del cebador. Por ejemplo, con los cebadores y los sitios de unión del cebador mostrados en la Fig. 5, la introducción de dos G en cada uno de los cebadores directo e inverso reduce los malapareamientos a uno en el caso del cebador directo y a ninguno en el caso del cebador inverso.

La elección entre usar un agente estabilizador de malapareamientos o incluir una o más unidades del tipo de nucleótido infrarrepresentado en los cebadores depende del número de posiciones de malapareamiento entre los cebadores directo e inverso hipotéticos que carecen por completo de los tipos de nucleótidos infrarrepresentados y sus respectivos sitios de unión. Si hay más de dos malapareamientos entre dicho cebador y su sitio de unión o se produce un malapareamiento cerca (por ejemplo, dentro de 4 nucleótidos) del extremo 3' de un cebador, se prefiere eliminar uno o más malapareamientos mediante la inclusión de uno o más nucleótidos infrarrepresentados en el cebador.

En el caso de los cebadores ATC, en lugar de introducir G en el cebador infrarrepresentado, pueden introducirse una o más bases no naturales como alternativa siempre que las bases no naturales puedan ayudar a reducir la interacción dímero cebador en comparación con los cebadores ATGC convencionales. Un ejemplo de bases no naturales es la inosina. La introducción de G aumenta la eficiencia de hibridación del cebador con su sitio de unión, pero también aumenta las interacciones inter- e intracebador porque ahora hay pares CG. Por otro lado, la inosina mantiene la eficiencia de hibridación del cebador con su sitio de unión con la ayuda de pares de bases flanqueantes. Pero uno o unos pocos pares de C e I entre o dentro de los cebadores contribuyen poco a la unión y no dan como resultado una formación sustancial de dímeros de cebadores. Preferiblemente, tales cebadores consisten en un segmento 3' que contiene sólo A, T y C para minimizar el efecto de malapareamiento en la eficiencia de extensión del cebador, y un segmento 5' que incluye sólo cualquier número de residuos de inosina (por ejemplo, 1-10).

En situaciones en las que los sitios de unión de los cebadores no coinciden perfectamente con cebadores en los que un tipo de nucleótido infrarrepresentado está totalmente ausente, la amplificación todavía puede producirse sin que el complemento del tipo de nucleótido infrarrepresentado en los cebadores se suministre como un monómero de trifosfato de nucleótido, pero es más eficaz si se suministra este tipo de nucleótido. Sin embargo, este tipo de nucleótido puede suministrarse a una concentración reducida en comparación con los otros cuatro nucleótidos estándar (por ejemplo, <10x, <100x o <1000x cada uno de los otros monómeros de trifosfato de nucleótido), o puede suministrarse como un NTP dideoxi. La extensión resultante de un cebado erróneo se termina con el NTP dideoxi. El uso de cualquier estrategia (reducción de la concentración de nucleótidos o uso de ddNTP) disminuye los productos de amplificación no pretendidos de un cebado erróneo o de dímeros de cebadores. Los cebadores con sustituciones de inosina requieren dCTP en la reacción para una extensión eficiente sobre las bases de inosina. Sin embargo, el dCTP puede suministrarse a una concentración reducida en comparación con los otros tipos de monómeros de trifosfato de nucleótidos.

Cuando las secuencias objetivo proceden de organismos de varias especies o genotipos, la plantilla es una mezcla de más de un alelo. El cebadore con nucleótido infrarrepresentado puede contener bases degeneradas en ciertas posiciones para coincidir con diferentes variaciones de secuencia.

Los cebadores infrarrepresentados con malapareamientos o sustituciones de inosina pueden usarse en combinación con los cebadores convencionales de sus secuencias originales (es decir, sin malapareamientos ni sustituciones de inosina) en reacciones de amplificación. Sin embargo, un cebador convencional debe tener concentraciones reducidas, entre el 0,1% y el 50% de la concentración de un cebador infrarrepresentado. Los cebadores convencionales hibridan con sus sitios de unión de manera más eficiente que los cebadores infrarrepresentados y sus productos de extensión proporcionan los cebadores infrarrepresentados con más plantillas. Los tipos de dNTP que son complemento del nucleótido infrarrepresentado se proporcionan a concentraciones reducidas como se ha mencionado anteriormente o se omiten por completo dependiendo de la composición de los cebadores infrarrepresentados. Dicha combinación de cebadores convencionales e infrarrepresentados facilita la amplificación a partir de cebadores infrarrepresentados y mantiene las bajas interacciones cebador-cebador.

d. Cebadores de punto de apoyo

La Fig. 14 muestra una situación en la que una búsqueda de un ácido nucleico objetivo para sitios de unión de cebadores adecuados muestra un sitio de unión de cebador inverso adecuado y un sitio de unión de cebador directo potencial, que tiene una composición de nucleótidos limitada (por ejemplo, un tipo de nucleótido está ausente), pero es demasiado corto por sí mismo para soportar la unión del cebador. En esta situación, se diseña un cebador directo en el que un segmento de cebador con un tipo de nucleótido infrarrepresentado se enlaza en su extremo 5' a un segmento de ácido nucleico de secuencia artificial (es decir, no complementario al ácido nucleico objetivo) que tiene el mismo nucleótido infrarrepresentado, que a su vez se enlaza en su extremo 5' a un segundo segmento de cebador en el que están representados los cuatro nucleótidos, que es complementario al ácido nucleico objetivo. Dicho cebador puede hibridar con el ácido nucleico objetivo con el segmento de secuencia artificial formando un giro flanqueado por los dos segmentos de cebador que han hibridado con el ácido nucleico objetivo. Como el segundo segmento de cebador ayuda al primer segmento de cebador a formar un dúplex con el ácido nucleico objetivo, a pesar de que el primer segmento de cebador es demasiado corto para formar un dúplex estable, el segundo segmento de cebador puede denominarse cebador de punto de apoyo. Tales cebadores pueden amplificarse en una mezcla de amplificación en la que el complemento del tipo de nucleótido infrarrepresentado no se suministra como monómero de trifosfato de nucleótido o en el que se suministran los cuatro monómeros de trifosfato de nucleótido estándar. Cualquiera o ambos cebadores pueden suministrarse con secuencias de punto de apoyo y secuencias artificiales, como se ha descrito. En una variación adicional, en lugar de que la secuencia artificial forme sólo un lazo cuando el primer y el segundo segmentos del cebador hibridan con el ácido nucleico objetivo, como se muestra en la Fig. 14, la secuencia artificial puede formar una estructura de lazo y vástago, tal como se muestra en la Fig. 15. El extremo 3' de la región conectora es el complemento del extremo 3' de la región de cebado 5'. El cebador forma una estructura de horquilla que estabiliza su hibridación con la plantilla y aumenta su eficacia de amplificación.

En otro formato, un único sitio de unión del cebador puede usar dos tipos de cebadores para la amplificación simultánea. Uno de los cebadores se denomina auxiliar, en el que el segmento 3' del cebador con nucleótidos infrarrepresentados se enlaza directamente con el segmento 5' del cebador, que es similar al cebador convencional. El auxiliar puede hibridar con el objetivo con suficiente eficiencia para iniciar la amplificación debido a la ayuda del segmento del cebador convencional. Para la detección de alelos múltiples, el segmento 5' del cebador puede contener bases degeneradas. El otro cebador es un cebador infrarrepresentado y muy similar al cebador auxiliar cambiando simplemente el cuarto nucleótido en su segmento 5' con el complemento del tipo de nucleótido infrarrepresentado. El auxiliar se proporciona en cantidad limitada para minimizar la amplificación no pretendida, aunque suficiente para iniciar la amplificación. El segundo cebador se proporciona en concentración regular para llevar a cabo la amplificación.

e. Cebadores de unión de tres vías

El tipo de situación que se muestra en la Fig. 14, en la que uno o ambos sitios de unión del cebador con un tipo de nucleótido infrarrepresentado es demasiado corto para soportar la unión del cebador, puede abordarse alternativamente mediante el uso de secuencias de unión de tres vías, como se muestra en la Fig. 16. Aquí, un segmento de cebador con un tipo de nucleótido infrarrepresentado (1) se enlaza en su extremo 5' a un segmento artificial del mismo tipo de nucleótido infrarrepresentado (2). Luego, este cebador se mantiene en su sitio en el ácido nucleico objetivo con un cebador de unión que comprende un sitio de unión objetivo (4) y el complemento del segmento artificial (3). El sitio de unión al objetivo del cebador de unión incluye los cuatro nucleótidos estándar. El cebador de unión puede usarse a una concentración reducida (número de copias) con respecto al cebador de composición limitada de nucleótidos. Cualquiera o ambos de los cebadores directo e inverso, pueden sustituirse por secuencias de unión de tres vías.

La Fig. 17 muestra un formato alternativo para sondas de unión de tres vías. En este formato, un segmento de cebador con un tipo de nucleótido infrarrepresentado (2) está enlazado en su extremo 3' a un segmento artificial infrarrepresentado en el mismo tipo de nucleótido (1). Se suministra una sonda de unión que tiene un segmento de unión al objetivo (3) enlazado en su extremo 5' a un segmento artificial (4) que tiene un nucleótido infrarrepresentado que es el complemento del nucleótido infrarrepresentado en el segmento del cebador (2). Los dos segmentos artificiales (1) y (4) son complementarios entre sí pero de longitudes desiguales, de tal manera que el segmento artificial más corto (1) puede extenderse usando el segmento artificial más largo como plantilla. El cebador inverso se diseña usando un enfoque análogo. Los productos de extensión de los cebadores directo e inverso son de secuencia complementaria y pueden servir como plantilla para la extensión del otro, dando como resultado un producto de amplificación.

La Fig. 31B muestra una disposición similar en la que un segmento de cebador con un tipo de nucleótido infrarrepresentado está enlazado en su extremo 3' a un ácido nucleico que tiene el complemento de una secuencia promotora. Se suministra una sonda de unión que tiene un segmento de unión al objetivo con un nucleótido infrarrepresentado enlazado en su extremo 5' a un ácido nucleico que tiene la secuencia promotora, que a su vez está enlazado en su extremo 5' a un ácido nucleico con una secuencia artificial. El promotor puede iniciar la transcripción para generar una transcripción de la secuencia artificial enlazada al promotor que indique la presencia del ácido nucleico objetivo.

La Fig. 31A muestra una disposición similar a la de la Fig. 31B, pero en la que, como alternativa a un promotor, la sonda de unión puede enlazarse a través de un ácido nucleico con un sitio de restricción al ácido nucleico con una secuencia artificial. Esta disposición soporta la amplificación por mellado. El oligonucleótido1 (izquierda) consiste en un segmento artificial 3' con sitio de restricción enlazado a un segmento 5', que es un cebador del tipo de tres nucleótidos. El oligonucleótido2 (derecha) consiste en una secuencia artificial 5' con sitio de restricción enlazada a un segmento 3', que es un cebador del tipo de tres nucleótidos, y un segmento conector complementario a la secuencia 3' del oligonucleótido 1. Los oligonucleótidos1 y 2 forman una estructura de unión de tres vías con la plantilla. El oligonucleótido 1 se extiende y forma un sitio de restricción completo. Una enzima de mellado mella y libera el producto extendido. El mellado y la extensión se repiten en ciclos posteriores.

Las Figs. 18A, B muestran una variación del formato de la Fig. 17 en la que el cebador directo es como se describe en la Fig. 17 pero el cebador inverso es un cebador universal artificial que tiene el mismo tipo de nucleótido infrarrepresentado que el cebador directo. El cebador directo es específico de la secuencia objetivo y el cebador universal es el mismo para diferentes objetivos. En la Fig. 18A, la región del tipo de tres nucleótidos (secuencia 2) del cebador 1 hibrida con una plantilla. El extremo 3' del cebador 1 (secuencia 1) hibrida con la región del tipo de tres nucleótidos (secuencia 4) y extiende la secuencia 5. El producto de extensión del cebador directo puede servir como plantilla para la extensión del cebador universal generando un producto de amplificación (Fig. 18B).

f. Formatos de círculo rodante

La Fig. 31C muestra los cebadores directo e inverso enlazados por un ácido nucleico de secuencia artificial. Tanto los cebadores directo e inverso como la secuencia artificial tienen un tipo de nucleótido infrarrepresentado. Los cebadores directo e inverso se unen a sitios de unión en la misma cadena de un ácido nucleico objetivo y el mellado se rellena con ligasa. Tras la ligación, los cebadores libres se digieren para dejar sólo los productos circulares ligados. El producto ligado puede amplificarse mediante replicación en círculo rodante.

g. Formatos de detección

Los métodos anteriores son compatibles con una variedad de formatos de detección. En un formato, uno o más de los monómeros de trifosfato de nucleótido usados para la amplificación están marcados, de tal manera que el marcador de detección se incorpora a un producto de amplificación con el monómero marcado. La diferenciación del producto de amplificación de cualquier monómero marcado no incorporado permite la detección de la señal de amplificación. En otro formato, uno o ambos de los cebadores infrarrepresentados directo e inverso se enlaza a un marcador de detección. La diferenciación del producto de amplificación de cualquier cebador marcado no incorporado permite la detección de la señal de amplificación. El marcador de detección puede unirse en cualquier posición del cebador. En otro formato, cualquiera o ambos cebadores infrarrepresentados directo e inverso están enlazados a un segmento de reconocimiento enzimático (por ejemplo, un promotor reconocido por una polimerasa). En otro formato, tanto los monómeros de nucleótidos trifosfato como cualquiera o ambos de los cebadores de nucleótidos infrarrepresentados directo e inverso usados para la amplificación están marcados. La diferenciación del producto de amplificación a partir de cualquier cebador marcado no incorporado y/o monómeros de trifosfato de nucleótidos permite la detección de la señal de amplificación. En otro formato, se incluyen reactivos o productos químicos especiales en la mezcla de amplificación como SYBR que permite monitorizar la amplificación. En otro formato, un producto secundario como el pirofosfato permite la detección de la reacción de amplificación. En otro formato, el producto de amplificación se detecta basándose en la masa, el tamaño, la temperatura, la electricidad, la radiación, el color, la absorción, la reflexión, la velocidad, y demás. En otro formato, cualquiera o ambos de los cebadores infrarrepresentados directo e inverso o parte de los cebadores infrarrepresentados se marcan con fluoróforos. En la reacción de amplificación pueden proporcionarse productos químicos de inactivación, como azul de metileno nuevo, 7-deaza-2'-deoxiguanosina-5'-trifosfato o 7-deaza-2'-deoxiadenosina-5'-trifosfato. Los productos químicos de inactivación se incorporan específicamente a los productos de amplificación e inactivan la señal de fluorescencia, mientras que no tienen ningún efecto sobre los cebadores marcados con fluoróforos libres.

En una variación, el segmento artificial hibrida inicialmente con un oligonucleótido complementario enlazado a un inactivador, que inactiva la fluorescencia del marcador fluorescente. El oligonucleótido complementario con el inactivador se desprende al realizar la amplificación, de tal manera que surge una señal fluorescente a medida que avanza la amplificación. La Fig. 19 muestra que el cebador 1 de la izquierda está marcado con F1. El cebador 2 de la derecha está marcado con F2. Este producto de amplificación puede detectarse en tiempo real sin eliminar el cebador marcado con fluorescencia no incorporado. Opcionalmente, dicho formato de detección puede realizarse con un exceso del cebador no marcado (cebador inverso como se muestra en la Fig. 20) para mejorar la eficiencia de detección de la sonda. Dicho formato de detección puede multiplexarse para la detección simultánea de múltiples objetivos.

La Fig. 25A muestra la composición de los cebadores usados en un método ejemplar. Uno de los cebadores del tipo de tres nucleótidos tiene una cola en su extremo 5' con secuencias artificiales universales de tres nucleótidos. Una sonda marcada con fluoróforo en el extremo 5' consiste en una secuencia 3' que es la misma que la secuencia artificial de un cebador y una sonda de detección 5'. También se proporciona una sonda marcada inactivadora del extremo 3' complementaria la sonda de detección 5'. La fluorescencia se inactiva cuando no se produce amplificación.

La Fig. 25B muestra múltiples pares de cebadores con la misma cola artificial 5' usados para detectar múltiples objetivos. Un cebador inverso se extiende hasta la secuencia de cola artificial y genera la secuencia complementaria a la cola artificial. El cebador inverso recién generado extendido en su extremo 3' hibrida con la sonda marcada con fluorescencia y se extiende para reemplazar la sonda marcada con inactivador. Esto termina con fluorescencia libre para ser detectada. Pueden usarse diferentes sondas marcadas con fluoróforos y secuencias de cola de cebador para la detección multicolor.

En otro formato de detección (formato Taqman®) mostrado en la Fig. 23, uno de los cebadores puede estar enlazado en su extremo 5' a un segmento artificial que tiene el mismo nucleótido o nucleótidos infrarrepresentados que el cebador al que está enlazado. Dicho cebador se suministra con un oligonucleótido complementario que tiene un marcador fluorescente en un extremo y un inactivador en el otro. Cuando la extensión del cebador inverso se encuentra con el oligonucleótido inactivador, la actividad de exonucleasa 5' de la polimerasa digiere la sonda Taqman® y separa el fluoróforo y el inactivador dando lugar a una señal fluorescente. Dicha señal puede detectarse sin necesidad de retirar el cebador no usado, permitiendo la detección en tiempo real.

Las Figs. 38A-E muestran otro formato de detección que usa una actividad de endonucleasa Flap 5' de la Taq ADN polimerasa. La Fig. 38A muestra la estructura del cebador. Uno de los cebadores está enlazado en su extremo 5' a un segmento artificial que tiene el mismo nucleótido o nucleótidos infrarrepresentados que el cebador al que está enlazado. Un único nucleótido "G" sirve de conector entre el cebador y el segmento artificial. Un oligonucleótido complementario que tiene un fluoróforo marcado en un extremo y un inactivador marcado internamente se suministra en cantidad igual o superior. El segmento 3' del oligonucleótido complementario hibrida con el segmento artificial del cebador y el segmento 5' no es complementario con la secuencia del cebador. La Fig. 38B muestra que el cebador ha generado el producto de extensión del cebador y un cebador inverso se une al producto y se extiende. La Fig. 38C muestra que cuando la extensión del cebador inverso se encuentra con la unión de hibridación entre el segmento artificial y el oligonucleótido del complemento, la actividad de endonucleasa Flap 5' de la ADN polimerasa escinde los oligonucleótidos del complemento y separa el fluoróforo y el inactivador dando lugar a la señal de fluorescencia. La extensión del cebador inverso se detiene en la "G" porque no se proporciona dCTP en la reacción. Otro oligonucleótido del complemento puede unirse ahora al segmento artificial del cebador (Fig. 38D) y se escinde para liberar la señal de fluorescencia (Fig. 38E). El proceso se repite y la señal de fluorescencia se amplifica.

Las Figs. 39A, B muestran un formato de detección en tiempo real susceptible de multiplexación usando un oligo marcado con un inactivador de fluoróforo. La Fig. 39A muestra la estructura del cebador. Uno de los cebadores está enlazado en su extremo 5' a un segmento artificial que tiene el mismo nucleótido o nucleótidos infrarrepresentados que el cebador al que está enlazado. En la reacción de amplificación también se proporciona un fluoróforo y un oligonucleótido marcado con un inactivador que tiene la misma secuencia que el segmento artificial. En su forma de cadena sencilla, el fluoróforo y el inactivador están en proximidad y se inactiva la fluorescencia. La Fig. 39B muestra que durante la amplificación del objetivo, las extensiones del cebador inverso generan la secuencia complementaria de la cola artificial. El oligonucleótido marcado con FQ, que tiene la misma secuencia que la cola artificial, puede hibridar con la secuencia complementaria sintetizada. El fluoróforo y el inactivador dejan de estar próximos y se libera la fluorescencia. Esta reacción puede facilitarse mediante una reacción asimétrica en la que el cebador inverso esté en cantidad excesiva, de tal manera que haya cadenas sencillas de la secuencia complementaria disponibles para que el oligonucleótido FQ hibride.

Las Fig. 40A y B muestran otro formato de detección en tiempo real susceptible de multiplexación. La Fig. 40A muestra la estructura del cebador. Uno de los cebadores está enlazado en su extremo 5' a un segmento artificial que tiene el mismo nucleótido o nucleótidos infrarrepresentados que el cebador al que está enlazado. Un fluoróforo y un inactivador están unidos al segmento artificial y por lo menos uno de los marcadores es interno al segmento artificial. En la forma de cadena sencilla, el fluoróforo y el inactivador están en proximidad y la fluorescencia se inactiva. La Fig. 40B muestra que durante la amplificación del objetivo, el segmento artificial se vuelve de cadena doble. El fluoróforo y el inactivador ya no están en proximidad y se libera la fluorescencia.

La Fig. 24 muestra otro formato de detección (baliza molecular). Uno de los cebadores se enlaza de nuevo en su extremo 5' a un segmento artificial que tiene el mismo nucleótido o nucleótidos infrarrepresentados que el cebador al que está enlazado. La amplificación se realiza en presencia de una sonda de baliza molecular que tiene una estructura de horquilla con un fluoróforo y un inactivador en los extremos de la horquilla y la secuencia de lazo complementaria al complemento del segmento artificial enlazado al cebador. Cuando se forma un producto de amplificación, el segmento de lazo de la baliza molecular hibrida con el segmento artificial, separando el fluoróforo y el inactivador y generando una señal fluorescente. Esta señal puede detectarse en tiempo real sin necesidad de eliminar la baliza molecular no incorporada.

Todos los formatos que incluyen cebadores marcados o cebadores que tienen secuencias artificiales enlazadas que hibridan con oligonucleótidos marcados pueden multiplexarse fácilmente usando diferentes marcadores fluorescentes y diferentes secuencias artificiales para cada objetivo a detectar. Cuando son de acuerdo con la invención, las amplificaciones multiplexadas se realizan con múltiples cebadores o pares de cebadores, el tipo o tipos de nucleótidos infrarrepresentados son los mismos en todos los cebadores presentes en el multiplex. Por ejemplo, todos los cebadores pueden tener una G infrarrepresentada o una C infrarrepresentada.

Los productos de amplificación también pueden detectarse mediante el análisis de la curva de fusión (cambios en la absorción con la temperatura), espectrometría de masas, electroforesis en gel o electroforesis capilar, entre otras técnicas.

Los métodos divulgados reducen en gran medida la formación de dímeros de cebadores y las amplificaciones inespecíficas, permitiendo de este modo el uso de colorantes intercalantes de cadena doble para detectar amplicones, lo que resulta muy rentable en comparación con el uso de oligonucleótidos marcados con fluoróforos. Estos métodos pueden adaptarse para usar el análisis de la curva de fusión para diferenciar entre diferentes amplicones basándose en su Tm. La presencia o ausencia de un pico de fusión a una temperatura determinada determina la presencia o ausencia de su amplicón correspondiente. Preferiblemente, pueden diferenciarse 3 o 4 o 5 o 6 amplicones por su Tm, que varía entre 65° C y 95° C. Sin embargo, debido a la naturaleza de un amplicón regular, su Tm no puede estar en el intervalo inferior de Tm (es decir, 40° C-65° C.). Una secuencia de cola artificial con una Tm en el intervalo de Tm inferior (40° C-65° C) se une al extremo 5' de uno o más cebadores infrarrepresentados (Fig. 37). Una cadena de la secuencia de cola artificial puede tener el mismo tipo o tipos de nucleótidos infrarrepresentados que el cebador al que está enlazada. Diferentes cebadores infrarrepresentados pueden tener la misma cola artificial o diferentes colas artificiales con diferentes Tm. Las secuencias complementarias de las colas artificiales también se proporcionan en la reacción de tal manera que puedan formar cadenas dobles. Si el cebador no participa en la reacción de PCR, permanece inalterado en la solución. Después de la PCR, la cola de cadena doble permanece y muestra un pico de fusión a su Tm durante el análisis de la curva de fusión. Sin embargo, si el cebador participa en las reacciones de PCR, sus productos extendidos sirven como plantillas para que otros cebadores hibriden y se extiendan, y se convierte en parte del amplicón de cadena doble. La cola de cadena doble se desprende y desaparece su correspondiente pico de fusión en el intervalo de baja Tm (40° C-65° C). Por tanto, a medida que avanza la amplificación se produce una transición desde el pico de fusión de la cola o colas del cebador al de los productos de amplificación que incorporan tales cebadores. Preferiblemente, pueden introducirse 3 o 4 o 5 o 6 tipos de colas artificiales con diferentes Tm en diferentes cebadores infrarrepresentados. La desaparición de un pico de fusión indica la presencia del objetivo correspondiente. Este método aumenta enormemente la multiplicidad de la reacción con un solo tipo de colorante intercalante de cadena doble. En lugar de una cola artificial y una cadena complementaria, también pueden usarse estructuras de lazo y vástago para unir los cebadores infrarrepresentados.

La combinación de la detección de fluorescencia multicanal y la diferenciación de Tm permite incluso una multiplicidad más alta. Una serie de secuencias artificiales con diferentes Tm puede marcarse con un fluoróforo y sus secuencias complementarias con un inactivador. Una segunda serie de las secuencias artificiales puede marcarse con otro fluoróforo y sus secuencias complementarias con otro inactivador. Cuando las dos series de secuencias se unen al extremo 5' de diferentes cebadores infrarrepresentados, la desaparición de un pico de fusión tras la reacción de amplificación en un canal de fluorescencia indica la presencia del objetivo correspondiente. El fluoróforo y el inactivador también pueden estar ambos marcados en las secuencias complementarias de tal manera que su fluorescencia esté al nivel mínimo en forma de cadena sencilla y aumente cuando hibride con las colas artificiales de los cebadores infrarrepresentados. Cuando se usan estructuras de lazo y vástago para unir cebadores infrarrepresentados, el fluoróforo y el inactivador se marcan en los dos extremos de las estructuras de lazo y vástago, en otras palabras, uno del fluoróforo y el inactivador se marcan internamente en el cebador. Las diferencias de Tm entre las cadenas dobles/los lazos y vástagos pueden introducirse usando secuencias diferentes o usando bases malapareadas en una cadena.

En otro formato de análisis de curvas de fusión multicanal, se pone una cola en un cebador infrarrepresentado en su extremo 5' con una secuencia artificial. También se proporciona un oligonucleótido marcado con fluoróforo e inactivador con la misma secuencia que la cola artificial. La secuencia complementaria de la cola artificial (o del oligonucleótido marcado con fluoróforo y inactivador) se sintetiza si el cebador infrarrepresentado participa en la reacción. Durante el análisis de la curva de fusión tras la reacción de amplificación, el oligonucleótido marcado con fluoróforo e inactivador hibrida con la secuencia complementaria y se disocia cuando la temperatura alcanza su Tm. El oligonucleótido tiene una señal de fluorescencia más alta cuando se duplexa con su cadena complementaria que la señal cuando está en forma de cadena sencilla. Por lo tanto, se observa un pico de fusión. Preferiblemente, pueden resolverse 2, 3, 4, 5 o 6 picos de fusión en un intervalo de temperatura en un canal de fluoróforo. El método puede detectar más objetivos en formato multicanal. La diferencia en Tm puede ser introducida por secuencias con diferente composición de bases, secuencias con diferente longitud, secuencias con malapareamientos con su cadena complementaria, y similares.

Los métodos divulgados pueden usarse para detectar analitos distintos de los ácidos nucleicos, por ejemplo, proteínas o anticuerpos. Puede unirse una plantilla de oligonucleótidos a un analito. Después de separar la plantilla de oligonucleótidos no unida, la amplificación de la plantilla de oligonucleótidos con cebadores infrarrepresentados indica la presencia del analito. Alternativamente, los cebadores o sondas infrarrepresentados pueden unirse a un analito. La detección de los cebadores o sondas infrarrepresentados indica la presencia o ausencia del analito. Por ejemplo, tras la ligadura por proximidad de cebadores o sondas infrarrepresentados unidos al analito, la detección de los productos ligados indica la presencia o ausencia del analito.

Las Figs. 32A y B muestran formatos ejemplares para inmunoPCR en los que los cebadores tienen uno o más tipos de nucleótidos infrarrepresentados. En la Fig. 32A, los antígenos recubiertos a una superficie sólida se detectan con anticuerpos unidos por oligonucleótidos que sirven como plantilla de PCR en tiempo real. La señal de PCR en tiempo real indica la presencia del antígeno. El oligonucleótido también puede unirse a anticuerpos secundarios que se unen a anticuerpos primarios. El ensayo también puede usarse en inmunoensayos tipo sándwich. En la Fig. 32B, los anticuerpos específicos de diferentes epítopos de un antígeno o múltiples anticuerpos se unen a diferentes oligonucleótidos. Cuando los anticuerpos se unen al antígeno, los oligonucleótidos 1 y 2 se ligan con ayuda de oligonucleótidos auxiliares. El producto de la ligación sirve como plantilla de PCR en tiempo real para la detección de antígenos. Este ensayo también puede usarse para la detección de interacciones proteína-proteína, donde cada proteína se une con un anticuerpo específico que está unido con un oligonucleótido. Las interacciones proteínaproteína dan como resultado la ligadura por proximidad de dos oligonucleótidos que luego sirven como plantilla de PCR en tiempo real para la detección.

La Fig. 33 muestra la detección de PCR en tiempo real con transferencia de energía entre fluoróforos.

El cebador 1 (o ambos cebadores) con tipo o tipos de nucleótidos infrarrepresentados se marca con el fluoróforo 1 en su extremo 5'. Por ejemplo, como se muestra en la figura, el cebador 1 está marcado en su extremo 5' A. En la reacción de PCR, el dTTP marcado con fluoróforo 2 se incorpora al producto. La excitación del fluoróforo 2 da como resultado la transferencia de energía del fluoróforo 2 al fluoróforo 1. Luego se excita el fluoróforo 1. A continuación se excita el fluoróforo 1 y se detecta la señal.

La Fig. 34 muestra la detección por PCR en tiempo real con un dNTP modificado químicamente. Uno o más cebadores con nucleótidos infrarrepresentados se marcan con fluoróforos. Uno o más tipos de dNTPs se marcan con un producto químico intercalante de ADN de cadena doble, o se modifican como deaza dGTP o deaza dATP. Los dNTP marcados o modificados se intercalan en el producto de la PCR y se inactiva la fluorescencia del cebador. La caída de la señal indica la presencia de plantilla. En otra realización, el dNTP modificado puede usarse para detectar selectivamente la señal de los colorantes intercalantes de ADN de cadena doble. Por ejemplo, deaza-G o deaza-A inactivarán la señal de verde SYBR en su proximidad, por lo que un producto de PCR regular que contenga deaza-Gs distribuidos uniformemente no es detectado por verde SYBR. Los cebadores infrarrepresentados pueden tener secuencias artificiales en sus extremos 5' que no contienen bases complementarias a los desoxinucleótidos trifosfatos modificados. Las secuencias complementarias sintetizadas de las secuencias artificiales en el extremo 5' no contendrán el dNTP modificado que inactivará el colorante intercalante. Por ejemplo, cuando el cebador ATC se pone en la cola en su extremo 5' con una secuencia artificial que no contiene C, los productos de amplificación PCR incluyen dos segmentos: un segmento que contiene deaza-G y un segmento que no contiene deaza-G. La fluorescencia del colorante intercalante verde SYBR se inactivará por la deaza-G en el primer segmento y la fluorescencia verde SYBR en el segundo segmento no se inactivará.

La Fig. 35 muestra la detección por PCR en tiempo real con transferencia de energía entre el fluoróforo y los productos químicos intercalantes del ADN. Uno o más cebadores con nucleótidos infrarrepresentados se marcan con fluoróforo. Se añade un producto químico intercalante de ADNdc a la reacción de PCR. El producto químico puede ser un inactivador de la fluorescencia que provoca la caída de la señal de fluorescencia cuando hay una plantilla. El producto químico también puede servir como donante de transferencia de energía que excita el fluoróforo en los cebadores cuando hay una plantilla.

La Fig. 36 muestra la detección por PCR en tiempo real con un fluoróforo Lightup®. Uno o más cebadores con nucleótidos infrarrepresentados se marcan con un fluoróforo Lightup®. El fluoróforo no tiene fluorescencia cuando los cebadores están en forma de cadena sencilla. En la reacción de PCR, los cebadores hibridan con las plantillas y se extienden para formar una cadena doble. Entonces, el fluoróforo se intercala en la cadena doble de ADN y se detecta la fluorescencia.

Para la amplificación multiplex con múltiples pares de cebadores o sondas infrarrepresentados, los productos de amplificación pueden detectarse con micromareices, o secuencias, o perlas o nanobarras. Uno de los pares de cebadores infrarrepresentados se injerta en una superficie junto con cebadores libres en solución. Estos métodos permiten la amplificación y la unión simultáneas de un producto de PCR en la superficie (Oroskar et al., 1996,Clinical Chemistry,42(9), 1547-1555). Opcionalmente, ambos cebadores pueden injertarse en una superficie para la amplificación. Los cebadores o sondas infrarrepresentados unidos a una superficie pueden estar codificados o no codificados, o distribuidos aleatoriamente.

La WO96/04404 (Mosaic Technologies, Inc. et al) divulga un método de detección de un ácido nucleico objetivo en una muestra que contiene potencialmente el ácido nucleico objetivo. El método implica la inducción de una amplificación basada en PCR del ácido nucleico objetivo sólo cuando el ácido nucleico objetivo está presente en la muestra que se está probando. Para la amplificación de la secuencia objetivo, ambos cebadores se fijan a un soporte sólido, lo que da como resultado que las secuencias de ácidos nucleicos objetivo amplificadas también se unan al soporte sólido. La técnica de amplificación divulgada en este documento se denomina a veces técnica de "amplificación puente", en la que ambos cebadores infrarrepresentados, directo e inverso, se unen a un soporte. En esta técnica, los dos cebadores infrarrepresentados están, como en la PCR convencional, específicamente diseñados para que flanqueen la secuencia de ADN objetivo particular que se va a amplificar. Por tanto, si el ácido nucleico objetivo particular está presente en la muestra, el ácido nucleico objetivo puede hibridar con los cebadores infrarrepresentados y amplificarse por PCR. El primer paso en este proceso de amplificación por PCR es la hibridación del ácido nucleico objetivo con el primer cebador infrarrepresentado específico unido al soporte ("cebador 1"). Un primer producto de amplificación, que es complementario al ácido nucleico objetivo, se forma entonces por extensión de la secuencia del cebador 1. Al someter el soporte a condiciones de desnaturalización, el ácido nucleico objetivo se libera y puede participar entonces en reacciones de hibridación adicionales con otras secuencias del cebador 1 que puedan estar unidas al soporte. El primer producto de amplificación que está unido al soporte, puede entonces hibridar con el segundo cebador infrarrepresentado específico ("cebador 2") unido al soporte y un segundo producto de amplificación que comprende una secuencia de ácido nucleico complementaria al primer producto de amplificación puede formarse por extensión de la secuencia del cebador 2 y también se une al soporte. Por tanto, el ácido nucleico objetivo y el primero y el segundo productos de amplificación son capaces de participar en una pluralidad de procesos de hibridación y extensión, limitados únicamente por la presencia inicial del ácido nucleico objetivo y el número de secuencias de cebador 1 y cebador 2 inicialmente presentes, y el resultado es un número de copias de la secuencia objetivo unidas a la superficie.

Los productos de amplificación sólo se forman si el ácido nucleico objetivo está presente. Por lo tanto, la monitorización del soporte para detectar la presencia o ausencia de uno o más productos de amplificación es indicativo de la presencia o ausencia de una secuencia objetivo específica.

La técnica de mosaico puede usarse para lograr un grado de multiplexación en el que varias secuencias de ácidos nucleicos objetivo diferentes pueden amplificarse simultáneamente mediante la disposición de diferentes conjuntos del primer y el segundo cebadores infrarrepresentados, como se divulga en la presente, específicos para cada secuencia de ácido nucleico objetivo diferente, en diferentes regiones del soporte sólido.

h. Amplificación de productos con un extremo pegajoso

Convencionalmente, un producto de PCR con un extremo pegajoso se produce con cebadores de cola de sitios de restricción seguidos de digestión con enzimas de restricción, o la adición de una adenina extra en el extremo 3' por la actividad de adenina transferasa de la Taq polimerasa. Aunque el primer enfoque da resultados deseables, requiere pasos adicionales, requiere mucho tiempo y no siempre es adecuado para aplicaciones en sentido descendente. El segundo enfoque sólo produce salientes cortos que tienen baja eficiencia para las ligaciones. En la presente invención se divulga, como se muestra en la Fig. 26, que los cebadores infrarrepresentados se enlazan en su extremo 5' con una secuencia artificial y un nucleótido infrarrepresentado situado entre la secuencia artificial del extremo 5' y los cebadores infrarrepresentados. Dependiendo de la aplicación, uno o ambos cebadores infrarrepresentados pueden ir seguidos de secuencias artificiales. Cuando se proporcionan sólo monómeros trifosfato de 3 nucleótidos omitiendo el complemento del nucleótido infrarrepresentado, las extensiones de los cebadores se detienen en la posición del nucleótido infrarrepresentado en el cebador. La amplificación da como resultado productos con saliente 5' en uno o ambos lados. La libre elección de la secuencia y la longitud de la cola artificial permite varias aplicaciones, como la clonación, la hibridación con ADN de cadena sencilla en superficie sólida, la ligación con adaptadores, etc.

i. Cebadores Smrt™-Bell para un producto de amplificación circular

Los métodos también pueden realizarse con cebadores enlazados a lazos de horquilla que forman cebadores con forma de campana, útiles para generar productos circulares para la secuenciación de próxima generación, como se muestra en las Figs. 26 y 27. Los cebadores directos e inversos con un tipo de nucleótido infrarrepresentado se enlazan cada uno en el extremo 5' a un brazo de un cebador de horquilla (que puede tener cualquier composición de nucleótidos). El nucleótido más 5' del cebador es el complemento del nucleótido infrarrepresentado. Los dos cebadores hibridan a sitios de unión contiguos en el ácido nucleico objetivo o a sitios de unión no contiguos pero libres del tipo de nucleótido infrarrepresentado. Ambos cebadores se extienden en una mezcla de amplificación que carece del complemento del nucleótido infrarrepresentado. La extensión se detiene cuando es necesario que se incorpore el nucleótido trifosfato del complemento del nucleótido infrarrepresentado. Las cadenas extendidas de dos cebadores hibridan entre sí dejando una estructura circular con mellas entre el extremo 3' de un cebador y el 5' del otro cebador. Las mellas se sellan con ligasa generando un producto circular, que puede servir como plantilla para la secuenciación SMRT™Bell. El proceso se muestra con más detalle en las Figs. 27A-C. La Fig. 27A muestra un primer cebador incluye una región de unión a objetivo A con un nucleótido infrarrepresentado enlazado a una horquilla con regiones de vástago complementarias C que también es una región de unión a objetivo y C' y un lazo E 3' del cual es una región de unión objetivo. El cebador inverso tiene una región de unión a objetivo B con un tipo de nucleótido infrarrepresentado enlazado a un lazo de horquilla con segmentos D que también es una región de unión objetivo y D' que forma el vástago y un lazo F 3' del cual es una región de unión objetivo. En esta configuración, los segmentos A, C y parte de E del cebador directo se unen a la plantilla al igual que los segmentos B, D y parte de F del cebador inverso. La Fig. 27B muestra que ambos cebadores se aparean con las plantillas. Las secuencias ACE del cebador 1 hibridan con las secuencias A'C'E' de las plantillas y extienden la secuencia B'. Las secuencias BDF del cebador 2 hibridan con las secuencias B'D'F' de las plantillas y extienden la secuencia A'. La extensión se detiene cuando se necesita el nucleótido no proporcionado. La Fig. 27C muestra que los dos productos de extensión del paso B forman estructuras de horquilla e hibridan entre sí en las regiones A'B o AB'. Las mellas de las flechas se ligan. Se genera un producto circular. Los oligonucleótidos no circulares del sistema pueden digerirse con exonucleasa. Alternativamente, el cebador infrarrepresentado puede tener una estructura de lazo y vástago en el segmento del extremo 5'. Cuando se usan ambos tipos de cebadores infrarrepresentados en la amplificación usando polimerasa sin desplazamiento de cadena en el sistema de amplificación, el producto amplificado puede ligarse para formar un producto circular con ligasa. Los oligonucleótidos no circulares en el sistema pueden digerirse con una exonucleasa. La secuencia de lazo y vástago en el segmento del extremo 5' puede ser la misma o diferente para ambos cebadores infrarrepresentados. Los productos circulares ligados pueden cortarse con diferentes productos químicos o enzimas para linealizar los productos circulares para su aplicación en sentido descendiente. Los métodos de la invención divulgada pueden usarse para la preparación de bibliotecas de secuencias de segunda generación.

i. Cebadores infrarrepresentados en más de un tipo de nucleótido

La estrategia y los principios para cebadores con un solo tipo de nucleótido infrarrepresentado pueden aplicarse a cebadores o con dos o incluso tres nucleótidos infrarrepresentados (o, en otras palabras, que consisten total o principalmente en un único nucleótido). El uso de cebadores infrarrepresentados en un solo nucleótido tiene una aplicabilidad más amplia en ácidos nucleicos objetivo naturales porque los sitios de unión para tales cebadores se producen con una frecuencia estadísticamente mayor. Sin embargo, algunas formas de amplificación, como la inmuno-PCR, amplifican ácidos nucleicos de secuencias artificiales. Tales secuencias artificiales pueden diseñarse para ser amplificadas con cebadores con dos o incluso tres nucleótidos del tipo infrarrepresentado como con un nucleótido de tipo infrarrepresentado.

En los cebadores infrarrepresentados en dos tipos de nucleótidos, los dos tipos de nucleótidos infrarrepresentados no deben ser complementarios entre sí. En otras palabras, los tipos de nucleótidos infrarrepresentados pueden ser A con C, A con G, T/U con C o T/U con G. Esto deja cebadores que consisten total o principalmente en los mismos dos tipos de nucleótidos no complementarios. Tales cebadores tienen una capacidad reducida para soportar la extensión de dímeros de cebadores o de malapareamientos de cebadores. Los cebadores que tienen tres nucleótidos infrarrepresentados o, en otras palabras, que consisten total o sustancialmente en un solo tipo de nucleótido también tienen una capacidad reducida para soportar la extensión de dímero de cebador o de cebador no malapareado. Los sitios de unión de los cebadores se seleccionan mediante principios análogos a los descritos anteriormente, y las secuencias de los cebadores pueden ajustarse para acomodar un pequeño número de nucleótidos infrarrepresentados si es necesario. También pueden usarse estrategias de cebadores de unión y de puntos de apoyo. La amplificación con tales cebadores se realiza por lo menos con los complementos de los nucleótidos no infrarrepresentados en los cebadores y, opcionalmente, también con los complementos del nucleótido o nucleótidos infrarrepresentados, que, como se ha señalado, pueden suministrarse en concentración reducida o como nucleótidos dideoxi.

j. Métodos de amplificación

La estrategia y los principios descritos anteriormente pueden incorporarse a cualquier método de amplificación que implique la extensión dirigida por una plantilla a partir de cebadores simples o emparejados. La reacción en cadena de la polimerasa es una implementación que incluye opcionalmente la RT-PCR. La PCR se caracteriza por ciclos de temperatura para permitir el apareamiento del cebador, la extensión del cebador y la desnaturalización de una cadena extendida de su plantilla.

La amplificación mediada por transcripción (TMA) es una forma isotérmica alternativa en la que uno o ambos cebadores están enlazados a un promotor en su extremo 5', habitualmente un promotor T7, como se muestra en la Fig. 29B. La Fig. 29B muestra dos cebadores del tipo de tres nucleótidos con secuencias promotoras para una ARN polimerasa. Una vez formado el promotor de cadena doble, la ARN polimerasa inicia la amplificación de la transcripción. El producto de la amplificación son moléculas de ARN de cadena sencilla. La TMA también puede acoplarse a la transcripción inversa.

Otro formato de amplificación isotérmica que puede usarse con los cebadores de la invención es la reacción de amplificación de mellado (NEAR). La NEAR amplifica exponencialmente el ADN a una temperatura constante usando una polimerasa y una enzima de mellado. Los cebadores para la amplificación de mellado se enlazan a segmentos artificiales en sus extremos 5', los segmentos 5' contienen un sitio de corte y empalmen para la enzima de mellado (como se muestra en la Fig. 29A). En el primer ciclo, ambos cebadores hibridan con una plantilla y se extienden. En el siguiente ciclo, ambos cebadores pueden hibridar con los productos del primer ciclo y extenderse para generar el sitio de mellado completo en la cola artificial. Una vez que se forma el sitio de mellado, la enzima de mellado mella y libera una cadena. La extensión y el mellado se repiten en el siguiente ciclo.

Otro procedimiento de amplificación isotérmica que puede usarse con cebadores de la invención es la amplificación isotérmica mediada por lazo o (LAMP). La LAMP usa uno o más cebadores que tienen nucleótidos infrarrepresentados de acuerdo con la invención. (Fig. 30, panel izquierdo). En la LAMP, la secuencia objetivo se amplifica a una temperatura constante de 60-65° C usando o dos o tres conjuntos de cebadores y una polimerasa con alta actividad de desplazamiento de cadena además de una actividad de replicación. Típicamente, se usan 4 cebadores diferentes para identificar 6 regiones distintas en el gen objetivo, lo que aumenta en gran medida la especificidad. Un par adicional de "cebadores de lazo" puede acelerar adicionalmente la reacción.

Otro formato de amplificación isotérmica es la amplificación por recombinasa polimerasa (RPA), una alternativa isotérmica de un solo tubo a la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) (Fig. 30 derecha). El proceso RPA emplea tres enzimas principales: una recombinasa, una proteína de unión al ADN de cadena sencilla (SSB) y una polimerasa de sustitución de cadenas. Las recombinasas son capaces de emparejar cebadores de oligonucleótidos con secuencias homólogas en el ADN dúplex. Las SSB se unen a las cadenas de ADN desplazadas y evitan que los cebadores se desplacen. Finalmente, la polimerasa que desplaza la cadena comienza la síntesis de ADN donde el cebador se ha unido al ADN objetivo. Al usar dos cebadores opuestos, de manera muy similar a la PCR, si la secuencia objetivo está realmente presente, se inicia una reacción de amplificación exponencial del ADN. Los dos cebadores pueden ser cebadores con tipos de nucleótidos infrarrepresentados, como se ha descrito anteriormente.

Otros formatos de amplificación más en los que pueden usarse los cebadores de la invención incluyen el ensayo de desplazamiento de cadena, los sistemas de amplificación basados en la transcripción, la replicación de secuencia autosostenida (3SR), la reacción en cadena de ligación (a veces denominada amplificación oligonucleotídica ligasa OLA), tecnología de sonda cíclica (CPT), amplificación en círculo rodante (RCA), amplificación de bases de secuencias de ácidos nucleicos (NASBA), tecnología de escisión invasiva, amplificación dependiente de helicasa (HDA), amplificación exponencial (EXPAR), reacción de hibridación en cadena (HCR) y ensamblaje catalizado de horquillas (Ch a ).

Otro formato de amplificación es la inmuno-PCR en la que un analito se enlaza a un ácido nucleico (que puede tener una secuencia artificial) y el analito se detecta por amplificación del ácido nucleico. Dicha amplificación puede realizarse con un par de cebadores con tipos de nucleótidos infrarrepresentados (por ejemplo, completamente ausentes) complementarios a los sitios de unión del cebador infrarrepresentados en los complementos del nucleótido o nucleótidos infrarrepresentados.

Los métodos anteriores amplifican un ácido nucleico objetivo específico predeterminado o un segmento del mismo determinado por los cebadores seleccionados y sus sitios de unión de cebadores complementarios (en otras palabras, amplificación específica del objetivo). El producto de amplificación de un par de cebadores que se unen a sus sitios de unión de cebadores previstos predomina sobre cualquiera o todos los demás productos de amplificación cebados a partir del mismo par de cebadores, ya sea por unión de dímeros de cebadores o por cebado erróneo en la secuencia objetivo. Preferiblemente, el producto de amplificación de los cebadores que se unen a sus sitios de unión de cebadores previstos están presentes en un exceso de por lo menos 10, 50, 100 o 1000 veces (en moles, masa o número de copias) de cualquiera o todos los demás productos de amplificación cebados por ese par de cebadores. En una amplificación multiplex se usan múltiples pares de cebadores. El número de pares de cebadores puede ser por ejemplo de 2-50 o más, preferiblemente 5-25 o 10-20, o por lo menos 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 o 20. Cuando se usan múltiples pares de cebadores, el producto de amplificación previsto de cada par de cebadores a partir de la unión del par de cebadores a sus sitios de unión previstos está presente en un exceso de por lo menos 10, 50, 100 o 1000 veces (en moles, masa o número de copias) con respecto a cualquiera o todos los demás productos de amplificación cebados por ese par de cebadores. Excepto en el formato de cebado aleatorio descrito a continuación, los cebadores usados en los métodos no son cebadores aleatorios en los que la mayoría o todas las posiciones de cebador están ocupadas por selecciones aleatorias o degeneradas de nucleótidos que varían entre los cebadores. Más bien, cada par de cebadores está diseñado para hibridar con sitios de unión de cebadores específicos en un ácido nucleico objetivo, y típicamente los diferentes pares de cebadores no están relacionados entre sí según lo requieran los diferentes sitios de unión de cebadores en los ácidos nucleicos objetivo que se detectan. Por ejemplo, un par de cebadores puede estar diseñado para unirse a sitios de unión de cebadores en un ácido nucleico objetivo en un patógeno y un segundo par de cebadores a sitios de unión de cebadores en un ácido nucleico objetivo diferente en un patógeno diferente. Salvo por coincidencia, los diferentes ácidos nucleicos objetivo y, en consecuencia, los sitios de unión del cebador y los cebadores no están relacionados entre sí.

III. Cebado aleatorio con cebadores degenerados

La invención proporciona además métodos de amplificación de cebado aleatorio con cebadores infrarrepresentados degenerados, denominados cebadores degenerados infrarrepresentados. Tales métodos emplean cebadores con un segmento de hibridación 3' que varía aleatoriamente entre cebadores (como se muestra en la Fig. 28) enlazado a un segmento artificial 5', que es el mismo en diferentes cebadores. El segmento artificial 5' consiste en sólo tres tipos de nucleótidos con la posible excepción de un nucleótido infrarrepresentado en el extremo 5' y el segmento de hibridación 3' consiste en los mismos tres tipos de nucleótidos. En otra realización, el segmento 3' también consiste en los mismos tres tipos de nucleótidos excepto que también puede incluir un número limitado de unidades del cuarto tipo de nucleótido en posiciones excepto en el extremo 3'. El número limitado de unidades del cuarto tipo de nucleótido (G) presentes en el segmento aleatorio 3' es superior al 1%, pero inferior al 20%. Habitualmente, no más de 1, 2 o 3 de estos nucleótidos están presentes en el segmento aleatorio 3'. La inclusión de un número limitado de unidades del tipo de nucleótido infrarrepresentado en el segmento 3' aumenta significativamente la diversidad de cebadores aleatorios sin aumentar significativamente las interacciones de cebadores aleatorios no intencionadas. En otra realización, los cebadores degenerados infrarrepresentados pueden incluir nucleótidos no naturales, como inosina, nitroindol, siempre y cuando los nucleótidos no naturales incluidos en los cebadores infrarrepresentados puedan ayudar a reducir la interacción de cebadores en comparación con los cebadores tradicionales A, T, G, C. Los nucleótidos no naturales pueden incluirse en el segmento artificial 5' o en el segmento de hibridación aleatoria 3', o incluirse tanto en el segmento artificial 5' como en el segmento de hibridación aleatoria 3'. Un ejemplo del segmento de hibridación 3' consiste en A, T, C y puede incluirse un cuarto nucleótido no natural inosina en posición aleatoria. En tal caso, el segmento de hibridación aleatoria 3' consiste en cuatro nucleótidos A, T, C y I. En otra realización, los nucleótidos no naturales pueden incluirse también como infrarrepresentados en los cebadores infrarrepresentados degenerados. Un ejemplo de cebadores degenerados infrarrepresentados A, T, C puede incluir inosina con la cantidad entre el 0,1% y el 25%. La invención divulgada puede incluir uno o dos amplificaciones de pasos: una amplificación inicial realizada con cada uno de los cuatro monómeros de nucleótidos trifosfato genera productos de amplificación primarios flanqueados por el segmento artificial 5' y su complemento. Luego se realiza una amplificación secundaria con cebadores con segmento 3' que es complementario al complemento del segmento artificial 5' de los cebadores aleatorios. Tales métodos son particularmente útiles para amplificar grandes regiones de ADN, como BACS, YACS, cromosomas completos o genomas completos o amplificación de una sola célula. El producto amplificado puede detectarse mediante la adición de verde SYBR o mediante sondas marcadas con fluorescencia, entre otros métodos. Los cebadores usados en la amplificación secundaria pueden tener colas 5' para otras aplicaciones como la preparación de bibliotecas de secuenciación, amplificación de células individuales entre otras. La amplificación puede realizarse mediante PCR o métodos isotérmicos divulgados en la presente.

IV. Reacciones de extensión

Los principios de diseño de cebadores analizados anteriormente también pueden usarse para cebadores usados en reacciones de extensión, como la extensión de una sola base en la que un cebador hibrida adyacente a una mutación, como un SNP, pero sin abarcarla, o la extensión específica de un alelo en la que un cebador hibrida a través de un sitio de mutación. En las reacciones que implican la extensión a partir de un único cebador, la dimerización cebador-cebador no es un problema, pero la unión malapareada de un cebador a un ácido nucleico objetivo (o a un ácido nucleico no objetivo) sí lo es, y también pueden surgir problemas de cebador-dímero en la extensión multiplex.

V. Detección de mutaciones

La presente invención puede usarse para detectar una mutación en ácidos nucleicos objetivo indicativa de inestabilidad genómica. Por ejemplo, los métodos de detección de mutaciones son útiles para detectar y/o identificar mutaciones u otras alteraciones asociadas con enfermedades, como el cáncer y otras afecciones, trastornos o síndromes genéticos patológicos. Tales mutaciones incluyen inserciones, deleciones, reordenamientos, transiciones, traducciones, tranversiones, polimorfismos y sustituciones de nucleótidos. Más específicamente, las mutaciones pueden incluir polimorfismos de nucleótido único (SNP). La presente invención puede usarse para identificar la presencia o ausencia de mutaciones. En general, las mutaciones pueden incluir cualquier cambio en el ácido nucleico objetivo, como una pérdida de heterocigosidad u otros indicios de inestabilidad genómica.

Generalmente, los métodos para detectar una mutación en un ácido nucleico objetivo incluyen un ensayo basado en la hibridación o la exposición de una plantilla de ácido nucleico objetivo que se sospecha contiene una mutación a un cebador infrarrepresentado que es capaz de hibridar con una región conocida próxima a la mutación sospechada. El cebador infrarrepresentado se extiende y uno o más nucleótidos complementarios se hibridan a través del sitio sospechoso de contener la mutación. La presencia o ausencia de una mutación se determina analizando los nucleótidos que se incorporan o no se incorporan al cebador infrarrepresentado. En un formato, uno o más cebadores infrarrepresentados contienen 7-deaza-2'-deoxiguanosina y/o 7-deaza-2'-deoxiadenosina en el extremo 3'. Los nucleótidos no naturales en el extremo 3' inhiben o facilitan aún más la amplificación en las plantillas para detectar mutaciones.

Muchos métodos de detección de mutaciones descritos en la literatura pueden usar la presente invención para mejorar la precisión de la detección. Por ejemplo, la detección de SNPs se realiza usando dos métodos principales, el tradicional y métodos de alto rendimiento. El enfoque tradicional basado en gel usa técnicas moleculares estándar, como el sistema de mutación refractaria a la amplificación (ARMS), digestiones de restricción y diversas formas de electroforesis en gel (por ejemplo, RFLP), electroforesis en gel de gradiente desnaturalizante (DGGE) y polimorfismo de conformación de cadena sencilla (SSCP). Los métodos de alto rendimiento incluyen métodos de discriminación alélica (hibridación específica de alelos, extensión de cebador de base única específica de alelo), sonda de candado, sonda de inversión molecular (MIP), química de ensayo de alto rendimiento (discriminación por endonucleasas Flap, ligadura de oligonucleótidos), matrices de ADN, pirosecuenciación, secuenciación de segunda generación y ciclador de luz.

VI. Aplicación informática

La selección de los sitios de unión de cebadores y de los cebadores puede realizarse mediante el análisis implementado por ordenador de un ácido nucleico objetivo en un ordenador programado por medios de almacenamiento legibles por ordenador no transitorios. La secuencia de un ácido nucleico objetivo (una o ambas cadenas) se recibe en un ordenador. El ordenador también almacena o recibe por entrada del usuario las composiciones de nucleótidos deseadas de los cebadores (por ejemplo, A, T, C). Luego, el ordenador se programa para buscar la secuencia objetivo para identificar los sitios de unión del cebador directo e inverso que se encuentren a una distancia entre sí compatible con la amplificación y que se correspondan más estrechamente con la composición del cebador. Si la composición del cebador es A, T, C, entonces los sitios de unión del cebador directo e inverso deben corresponder lo más estrechamente posible a A, T y G. El ordenador puede identificar los sitios de unión del cebador directo e inverso en cadenas opuestas o puede identificar un complemento de los sitios de unión del cebador directo y el sitio de unión del cebador inverso en la misma cadena y calcular el sitio de unión del cebador directo a partir de su complemento. Luego, el ordenador puede proporcionar pares de candidatos de sitios de unión de cebadores, que pueden diferir en varios grados de la composición ideal buscada. El ordenador también puede mostrar diseños de cebadores que hibridan con cada uno de los pares de sitios de unión de cebadores. Pueden mostrarse múltiples diseños de cebadores para el mismo par de sitios de unión de cebadores con diferentes números de unidades del nucleótido infrarrepresentado y diferentes números de malapareamientos.

Un sistema informático puede incluir un bus que interconecte subsistemas principales como un procesador central, una memoria de sistema, un controlador de entrada/salida, un dispositivo externo como una impresora a través de un puerto paralelo, una pantalla de visualización a través de un adaptador de pantalla, un puerto serie, un teclado, una unidad de disco fija y una conexión a Internet. Pueden conectarse muchos otros dispositivos, como un escáner a través de un controlador I/O, un ratón conectado a un puerto serie o una interfaz de red. Muchos otros dispositivos o subsistemas pueden conectarse de manera similar. Además, no es necesario que todos los dispositivos estén presentes para poner en práctica la presente invención, como se analiza a continuación. Los dispositivos y subsistemas pueden interconectarse de diferentes maneras. El código fuente para implementar la presente invención puede estar dispuesto de manera operativa en la memoria del sistema o almacenado en medios de almacenamiento como un disco fijo, disco compacto o similar. El sistema informático puede ser un ordenador central, un PC, una tableta o un teléfono móvil, entre otras posibilidades.

VII. Método y kits de aplicación

Cualquiera de los cebadores y sondas divulgados puede incorporarse en kits. Un kit de este tipo incluye preferiblemente por lo menos un par de cebadores y preferiblemente por lo menos 5, 20 o 20 pares de cebadores. Preferiblemente, los pares de cebadores de un kit pueden usarse en la misma reacción multiplex, lo que significa que tienen temperaturas de fusión compatibles, así como el mismo tipo o tipos de nucleótidos infrarrepresentados. En tales kits puede incluirse cualquier otro reactivo cuyo uso se haya divulgado con dichos cebadores y sondas, incluyendo NTP para su inclusión en reacciones de amplificación, agentes estabilizadores de malapareamientos, fluoróforos u otros marcadores. Los kits también pueden incluir instrucciones que detallen cómo usar el kit en cualquiera de los métodos divulgados.

Se describen kits para la detección e identificación de microorganismos, por ejemplo, patógenos que infectan a mamíferos. Tales kits pueden usarse, por ejemplo, para identificar la cepa particular de un virus que está infectando a un sujeto humano, por ejemplo, la cepa particular del virus de la inmunodeficiencia humana, o el virus del papiloma (HPV), entre otros. Las cepas de microorganismos a menudo difieren entre sí en unos pocos nucleótidos, mientras que el resto de sus genomas es idéntico. Por tanto, pueden elaborarse sondas para reconocer las regiones conservadas y para identificar el nucleótido o nucleótidos variables particulares.

Por ejemplo, el procedimiento de la presente invención permite detectar una amplia variedad de enfermedades infecciosas. Típicamente, éstas están provocadas por agentes infecciosos bacterianos, virales, parasitarios y fúngicos. Usando la presente invención también puede determinarse la resistencia de varios agentes infecciosos a los fármacos.

La presente invención también es útil para la detección de la resistencia a fármacos por parte de agentes infecciosos. Por ejemplo, con la presente invención pueden identificarse elEnterococcus faeciumresistente a la vancomicina, elStaphylococcus aureusresistente a la meticilina, elStreptococcus pneumoniaeresistente a la penicilina,el Mycobacterium tuberculosisresistente a múltiples fármacos y el virus de la inmunodeficiencia humana resistente al AZT.

Las enfermedades genéticas también pueden detectarse mediante el procedimiento de la presente invención. Esto puede llevarse a cabo mediante la selección prenatal o postnatal de aberraciones cromosómicas y genéticas o de enfermedades genéticas. Ejemplos de enfermedades genéticas detectables incluyen: deficiencia de 21 hidroxilasa, fibrosis quística, síndrome X Frágil, síndrome de Turner, distrofia muscular de Duchenne, síndrome de Down u otras trisomías, cardiopatías, enfermedades de un solo gen, tipificación HLA, fenilcetonuria, anemia falciforme. enfermedad de Tay-Sachs, talasemia, síndrome de Klinefelter, enfermedad de Huntington, enfermedades autoinmunes, lipidosis, defectos de la obesidad, hemofilia, errores innatos del metabolismo y diabetes.

Los cánceres que pueden detectarse mediante el proceso de la presente invención generalmente implican oncogenes, genes supresores de tumores o genes implicados en la amplificación, replicación, recombinación o reparación del ADN. Algunos ejemplos son: gen BRCA1, gen p53, gen APC, amplificación Her2/Neu, Bcr/AB1, gen K-ras, y virus del papiloma humano tipos 16 y 18. Varios aspectos de la presente invención pueden usarse para identificar amplificaciones, deleciones grandes, así como mutaciones puntuales y pequeñas deleciones/inserciones de los genes anteriores en los siguientes cánceres humanos comunes: leucemia, cáncer de colon, cáncer de mama, cáncer de pulmón, cáncer de próstata, tumores cerebrales, tumores del sistema nervioso central, tumores de vejiga, melanomas, cáncer de hígado, osteosarcoma y otros cánceres óseos, carcinomas testiculares y ováricos, tumores de cabeza y cuello, y neoplasias cervicales.

En el área de la monitorización medioambiental, la presente invención puede usarse para la detección, identificación y monitorización de microorganismos patógenos y autóctonos en ecosistemas y microcosmos naturales y artificiales, como los sistemas municipales de depuración de aguas residuales y los depósitos de agua, o en zonas contaminadas sometidas a biorremediación. También es posible detectar plásmidos que contengan genes que pueden metabolizar xenobióticos, monitorizar microorganismos objetivo específicos en estudios de dinámica de poblaciones, o bien detectar, identificar o monitorizar microorganismos modificados genéticamente en el medio ambiente y en plantas industriales.

La presente invención puede usarse para la preparación de bibliotecas de secuenciación para NGS, amplificación y detección de células individuales como ARN-sec, detección prenatal como síndrome de Down, etc.

La presente invención también puede usarse en una variedad de ámbitos forenses, incluyendo la identificación humana para personal militar e investigación criminal, pruebas de paternidad y análisis de relaciones familiares, tipificación de compatibilidad HLA, repeticiones tandom cortas (STR) y detección de contaminación en sangre, esperma u órganos de trasplante.

En la industria alimentaria y de piensos, la presente invención tiene una amplia variedad de aplicaciones. Por ejemplo, puede usarse para la identificación y caracterización de organismos de producción como la levadura para la producción de cerveza, vino, queso, yogur, pan, etcétera. Otra área de uso es con respecto al control de calidad y certificación de productos y procesos (por ejemplo, ganado, pasteurización y procesamiento de carne) para contaminantes. Otros usos incluyen la caracterización de plantas, bulbos y semillas con propósitos de reproducción, la identificación de la presencia de patógenos específicos de plantas y la detección e identificación de infecciones veterinarias y en programas de cría de animales.

En la medida en que una versión diferente de una secuencia, sitio web u otra referencia pueda estar presente en diferentes momentos, se entenderá la versión asociada con la referencia en la fecha de presentación efectiva. Por fecha de presentación efectiva se entiende la fecha de prioridad más temprana en la que se divulga el número de registro en cuestión. Salvo que se deduzca lo contrario del contexto, cualquier elemento, realización, paso, característica o aspecto de la invención puede realizarse en combinación con cualquier otro.

Ejemplos

Ejemplos 1 y 2: Interacciones transitorias en cebadores convencionales y cebadores de tres nucleótidos

Aunque la formación de dímeros de cebadores no se comprende del todo, está claro que la interacción entre cebadores es responsable de productos de amplificación no deseados. En teoría, con la ayuda del cálculo, pueden diseñarse cuidadosamente los cebadores de cuatro nucleótidos convencionales para evitar estructuras secundarias e interacciones cebador-cebador. Estos cálculos funcionan bien para un solo par de cebadores, pero no tanto para los multiplex.

Diseñamos un conjunto de cebadores de cuatro nucleótidos (cebador regular 1-32) mediante cálculo teórico. En el multiplexado con 32 cebadores, encontramos un nivel extremadamente alto de interacciones cebador-cebador. También se multiplexó un conjunto de cebadores de tres nucleótidos con secuencias aleatorias. Las interacciones entre cebadores fueron mucho menores en el multiplex con cebadores de tres nucleótidos.

Usamos verde SYBR para detectar cualquier interacción cebador-cebador formada en la reacción. Una reacción de 25 ul contenía Tris-HCl 10 mM (pH8,3), KCl 50 mM (dilución 1:10 de tampón II de PCR AmpliTaq Gold, Life Technologies), MgCl22 mM (dilución 1:12,5 de una solución madre de MgCl225 mM, Life Technologies), 0,2 mM de cada dNTP (dilución 1:12.5 diluida a partir de una solución de 2,5 mM de cada dNTP, que se preparó a partir de soluciones madre de dNTP 100 mM, Life Technologies), y 1x verde SYBR II (dilución 1:100 a partir de una solución madre de 100x, que se preparó a partir de una solución madre de 10000x, Sigma-Aldrich). Se añadieron 32 cebadores del tipo de cuatro nucleótidos o cebadores del tipo de tres nucleótidos (IDTDNA) a concentraciones finales de 2,6 uM, 5,2 uM, 13 uM, 26 uM, 39 uM y 52 uM. Las reacciones se calentaron a 95 C durante 2 min y se enfriaron a 65 C para la detección de la señal.

La Fig. 2A muestra interacciones de cebadores del tipo de cuatro nucleótidos. Cuando no había cebadores (0 uM), la señal de fluorescencia era cero. 2,6 uM muestra una señal de fluorescencia a aprox. 100 k. 5,2 uM muestra una señal de fluorescencia a aprox. 150 k-180 k. 13,1 uM muestra una señal de fluorescencia a aprox. 250 k-300 k.

26 uM y 39 uM muestran una señal de fluorescencia a aprox. 300 k-350 k.

La Fig. 2B muestra las interacciones de cebadores del tipo de tres nucleótidos. Las concentraciones de cebadores de 2,6 uM, 5,2 uM y 13 uM sólo mostraron un nivel mínimo de fluorescencia inferior a 10 k. Las concentraciones de 26 uM, 39 uM y 52 uM mostraron un aumento gradual de la fluorescencia desde aprox. 12,5 k hasta aproximadamente 25 k.

Ejemplo 3: Formación de dímeros de cebadores de cuatro y tres nucleótidos en reacciones PCR

Como se muestra en el ejemplo 2, las interacciones cebador-cebador están a un nivel extremadamente alto para los cebadores del tipo de cuatro nucleótidos y muy bajas para los cebadores del tipo de tres nucleótidos. Por lo tanto, en las reacciones de PCR, los cebadores del tipo de tres nucleótidos deberían tener una formación de cebadordímero mucho menor. Hemos multiplexado los mismos conjuntos de cebadores usados en el ejemplo anterior en reacciones de PCR.

Para los cebadores de tres nucleótidos, una reacción de PCR de 25 ul contenía Tris-HCl 10 mM (pH8,3), KCl 50 mM, MgCl22 mM, dATP 0,2 mM, dTTP 0,2 mM, dGTP 0,2 mM, 1x verde SYBR II y 1,875 u de ADN polimerasa AmpliTaqGold (Life Technologies). Para los cebadores de cuatro nucleótidos, se añade también dCTP 0,2 mM. Tanto los cebadores de tres nucleótidos como los cebadores normales de cuatro nucleótidos se añaden a una concentración total de 2,6 uM. El ciclado de PCR se llevó a cabo en el sistema de PCR en tiempo real StepOne™. Las condiciones de ciclado fueron las siguientes: 95° C 10 minutos, 10 ciclos de (95° C 15 segundos, 60° C 30 segundos), y 50 ciclos de (95° C 15 segundos, 65° C 30 segundos). Ambas reacciones se repitieron 48 veces.

La Fig. 3A muestra la formación de dímeros de cebadores del tipo de tres nucleótidos. Sólo 2 de las 48 repeticiones presentaron dímeros de cebadores a 50 y 55 ciclos. La Fig. 3B muestra la formación de dímeros de cebadores de cuatro nucleótidos. Las 48 reacciones presentaban sistemáticamente dímeros de cebadores antes de los 30 ciclos.

Ejemplo 4: Reacción de PCR en tiempo real con cebadores del tipo de tres nucleótidos y dNTPs del tipo de tres nucleótidos

Se diseñaron cebadores del tipo de tres nucleótidos con malapareamientos para detectar ADN genómico humano.

Una reacción de PCR de 25 ul contenía ADN genómico humano 100 ng (NEB), Tris-HCl 10 mM (pH8,3), KCl 50 mM, MgCl2 2 mM, dATP 0,2 mM, dTTP 0,2 mM, dGTP 0,2 mM, 1x verde SY<b>R II, 0,8 mM de cada cebador (Hemo2F, Hemo2R), 1,25 u de ADN polimerasa AmpliTaqGold. Una reacción de control sin plantilla no contenía ADN genómico humano. El ciclado de PCR se llevó a cabo en el sistema de PCR en tiempo real StepOne™ (Life Technologies). Las condiciones de ciclado fueron las siguientes: 95° C 10 minutos, 60 ciclos de (95° C 15 segundos, 60° C 15 segundos). La señal de fluorescencia se registró en el paso de apareamiento.

La Fig. 4A muestra la fluorescencia a lo largo del tiempo de una reacción de PCR con ADN genómico humano como plantilla. La Fig. 4B muestra la fluorescencia a lo largo del tiempo para la reacción de PCR de un control sin plantilla.

Con la PCR en tiempo real con cebadores de tres nucleótidos se detectaron fácilmente 100 ng de ADN genómico humano. Cuando no había plantilla, no se formaban dímeros de cebadores.

Ejemplo 5: PCR en tiempo real y detección del punto final con cebadores de tipo de tres nucleótidos y dNTPs de 4 nucleótidos

En este ejemplo, se usaron cebadores de tipo de tres nucleótidos de la misma manera que se usarían cebadores convencionales de cuatro nucleótidos. Se probaron dos conjuntos de cebadores para la detección del HPV11. HPV11-1F y HPV11-1R no tenían malapareamientos, HPV11MM1F tenía malapareamientos en la posición 12 y 18, y HPV11MM1R tenía malapareamientos en la posición 11 y 22.

La plantilla del HPV se diluyó a 105 (1 pg), 104 (100 fg), 103 (10 fg), 102 (0,1 fg), 101 (0,01 fg) copias/ul. Una reacción de PCR de 25 ul contenía 1 ul de plantilla, Tris-HCl 10 mM (pH8,3), KCl 50 mM, MgCl 22 mM, 0,2 mM de cada dATP, dTTP y dGTP, 1x verde SYBR II, 0,8 mM de cada cebador, 1,25 u de ADN polimerasa AmpliTaq Gold. El ciclado de PCR se llevó a cabo en el sistema de PCR en tiempo real StepOne™. Las condiciones de ciclado fueron las siguientes: 95° C 10 minutos, 60 ciclos de (95° C 15 segundos, 60° C 15 segundos). La señal de fluorescencia se registró en el paso de apareamiento. Después de 60 ciclos, se añadió el colorante de carga 6xADN y se cargaron 10 ul de muestras en un gel de agarosa al 0,8%.

Las Figs. 8A, B muestran la fluorescencia a lo largo del tiempo para todas las plantillas que incluyen H<2>O para un control sin plantilla. Se pudieron detectar fácilmente tan sólo 10 copias de la plantilla del h Pv , mientras que el control sin plantilla no tuvo amplificación a lo largo de 60 ciclos. La Fig. 8C muestra una imagen de electroforesis en gel de los productos de amplificación. Todas las plantillas se amplificaron con productos de tamaño correcto, independientemente de la presencia de malapareamientos en las secuencias de los cebadores.

Ejemplo 6: cebador de tipo de tres nucleótidos con 5' G

La región de hibridación de los cebadores del tipo de tres nucleótidos en la plantilla habitualmente está flanqueada por una C en su extremo 3'. De lo contrario, cuando se trata de una A T o G, podrían incluirse más bases en el cebador de acuerdo con la composición limitada. En este ejemplo, diseñamos un cebador del tipo de tres nucleótidos con una G en su extremo 5' para que coincidiera con la C 3' de la plantilla. Tales cebadores tienen una Tm más alta y una mayor eficacia de hibridación.

La adición de una G en el extremo 5' permite potencialmente el emparejamiento de C del mismo cebador o de un cebador diferente. Sin embargo, este emparejamiento no afecta a la formación de dímeros de cebadores, ya que no puede producirse ninguna extensión en el extremo 5'. En algunos casos extremos, cuando se forman dímeros de cebadores, el producto de extensión no intencionada termina con una C en su extremo 3' como otros cebadores. La 3' C evita una extensión adicional cuando este producto interactúa con otros cebadores porque la 3' C no puede emparejarse con ninguna otra base en los cebadores.

Ejemplo 7: Los reactivos de unión de malapareamientos estabilizan la hibridación de la plantilla del cebador

Las amplificaciones pueden realizarse con cebadores con malapareamientos. Cuando se introducen más malapareamientos en los cebadores, la hibridación cebador-plantilla es menos eficiente. En este ejemplo, se añaden reactivos de unión de malapareamientos a la reacción para estabilizar la hibridación cebador-plantilla y aumentar la eficacia de la amplificación.

Para comprobar el efecto del reactivo de unión de malapareamientos en la hibridación cebador-plantilla, se mezclan pares de oligonucleótidos sintéticos con distintos grados de malapareamientos con el reactivo de unión de malapareamientos. Típicamente, los oligonucleótidos se suministran a 0,1-1 uM en presencia de 10 mM Tris-HCl (pH8,3), 50 mM KCl, 2 mM MgCl2, 0,2 mM dATP, 0,2 mM dTTP, 0,2 mM dGTP, 1x verde SYBR II. El reactivo de unión de malapareamientos se proporciona en concentraciones de 0x, 0,001x, 0,01x, 0,1x o 1x de los oligos. El análisis de la curva de fusión se lleva a cabo en las siguientes condiciones: la mezcla se calienta a 95° C durante 1 minuto para desnaturalizar completamente dos oligos; luego, la mezcla se enfría lentamente hasta la temperatura deseada, modificada de acuerdo con la temperatura de fusión teórica de los dos oligos, por ejemplo, 10-20 grados por debajo de la temperatura de fusión de un oligonucleótido suponiendo que no haya malapareamiento; luego la mezcla se calienta 0,1-0,3° C por paso, y se recoge la señal de fluorescencia en cada paso. Se trazan las curvas de fusión de los oligonucleótidos con distintos grados de malapareamiento y distintas cantidades de reactivo de unión a malapareamiento y se calculan las temperaturas de fusión. Se selecciona el reactivo de unión de malapareamiento que aumenta la temperatura de fusión de los oligonucleótidos con malapareamiento para usarlo en la amplificación.

Una reacción de amplificación de 25 ul contiene plantillas, 10 mM Tris-HCl (pH8,3), 50 mM KCl, 2 mM MgCl2, 0,2 mM dATP, 0,2 mM dTTp, 0,2 mM dGTP, 1x verde SYBR II y 1,25 u de ADN polimerasa AmpliTaq Gold. Los cebadores de tres nucleótidos se añaden típicamente a una concentración de 100 nm, 200 nM, 400 nM u 800 nM. Los reactivos de unión de malapareamiento se añaden en la reacción a una concentración típicamente en una proporción con la concentración de cebadores de 1:1000, 1:100, 1:10, 1:1 10:1, 100:1, 1000:1. Las condiciones de ciclado de la PCR son las siguientes 95° C 10 minutos, 10 ciclos de (95° C 15 segundos, 60° C 30 segundos), y 50 ciclos de (95° C 15 segundos, 65° C 30 segundos).

Ejemplo 8: Comparación de la formación de dímeros de cebadores entre cebadores de tres nucleótidos y cebadores de cuatro nucleótidos

Hemos comparado la formación de dímeros de cebadores entre cebadores de tres nucleótidos con dNTPs de tres nucleótidos y cebadores de cuatro nucleótidos con dNTPs de cuatro nucleótidos. En este ejemplo, comparamos la formación de dímeros de cebadores para una situación más, cebadores de tres nucleótidos con dNTPs de cuatro nucleótidos. Los cebadores de tres nucleótidos se diseñaron para amplificar secuencias genómicas humanas dirigidas a la hemoglobina (Hemo1F, Hemo1R, Hemo2F, Hemo2R), PPIA (PPIAF y PPIAR), GAPDH (GAPDHF, GAPDHR) y YWHZ (YWHZ1F, YWHZ1R, YWHZ2F, YWHZ2R). Los cebadores del tipo de cuatro nucleótidos (regulares 1-12) se diseñaron para la detección del HPV, pero se aquí usaron para compararlos con los cebadores de tres nucleótidos. Todas las reacciones contenían 12 oligos.

Una reacción de PCR de 25 ul contiene 10 mM Tris-HCl (pH8,3), 50 mM KCl, 2 mM MgCl2, 0,2 mM dATP, 0,2 mM dTTP, 0,2 mM dGTP, 1x verde SYBR II y 1,875 u de ADN polimerasa AmpliTaq Gold. En las reacciones con 4 dNTPs, se añade 0,2 mM dCTP. Tanto los cebadores de tres nucleótidos como los cebadores regulares de cuatro nucleótidos se añadieron a una concentración total de 2,62 uM. El ciclado de PCR se llevó a cabo en el sistema de PCR en tiempo real StepOne™. Las condiciones de ciclado fueron las siguientes 95° C 10 minutos, 10 ciclos de (95° C 15 segundos, 60° C 30 segundos), y 50 ciclos de (95° C 15 segundos, 65° C 30 segundos). No había plantilla. Después de realizar la PCR, la mezcla se analizó en un gel de agarosa al 1,5%. Cualquier producto detectable sería el resultado de la amplificación a partir de la formación de dímeros de cebadores.

La Fig. 9 muestra la imagen del gel de agarosa. El carril 1 es una escalera de ADN. El carril 2 son cebadores del tipo de tres nucleótidos con dNTPs de tres nucleótidos. El carril 3 son cebadores del tipo de tres nucleótidos con dNTPs de cuatro nucleótidos. El carril 4 es de cebadores del tipo de cuatro nucleótidos con dNTPs de cuatro nucleótidos. Ambas reacciones con cebadores del tipo de tres nucleótidos no tuvieron ningún producto visible, mientras que los cebadores de cuatro nucleótidos formaron dímeros de cebadores en ausencia de plantilla.

Ejemplo 9: PCR con cebadores restringidos con 1 o 2 nucleótidos infrarrepresentados

Ciertas plantillas no son adecuadas para diseñar cebadores del tipo de tres nucleótidos. Por ejemplo, un cebador puede ser inadecuado cuando una malapareamiento está muy cerca del extremo 3' de uno o ambos cebadores, o cuando tiene que haber muchos malapareamientos. En tal caso, pueden usarse cebadores restringidos con 1 o 2 nucleótidos infrarrepresentados. Estos cebadores todavía pueden tener malapareamientos con la plantilla si es necesario, pero no tienen más de 2 nucleótidos infrarrepresentados para minimizar las interacciones cebadorcebador.

Se diseñaron dos conjuntos de cebadores para la secuencia genómica humana dirigida a atm y csfl r. ATM_F y ATM_R contienen cada uno malapareamientos 1 G y 2. CSF1R_F y CSF1R_R contienen 2 G cada uno. Los tamaños esperados del producto son 301 pb y 232 pb. Una reacción de PCR de 25 ul contenía 10 ng de ADN genómico humano, 10 mM Tris-HCl (pH8,3), 50 mM KCl, 2 mM MgCl2, 0,2 mM dATP, 0,2 mM dTTP, 0,2 mM dGTP, 0,2 mM dCTP, 1x verde SYBR II, 400 nM de cada cebador y 1,25 u de ADN polimerasa AmpliTaq Gold. El ciclado de PCR se llevó a cabo en el sistema de PCR en tiempo real StepOne™. Las condiciones de ciclado fueron las siguientes: 95° C 10 minutos, 10 ciclos de (95° C 15 segundos, 60° C 30 segundos, 72° C 30 segundos), y 35 ciclos de (95° C 15 segundos, 65° C 30 segundos, 72° C 30 segundos). Los productos de la PCR se analizaron en un gel de agarosa al 1,5%.

La Fig. 10A muestra una imagen de gel de agarosa. El carril 1 es una escalera de ADN. El carril 2 es el producto atm PCR. El carril 3 es el producto de la PCR de csflr.

No se realizaron reacciones de control de plantilla para comparar la formación de dímeros de cebadores restringidos y de cebadores regulares de cuatro nucleótidos. Una reacción de PCR de 25 ul contenía 10 mM Tris-HCl (pH8,3), 50 mM KCl, 2 mM MgCl2, 0,2 mM dATP, 0,2 mM dTTP, 0,2 mM dGTP, 0,2 mM dCTP, 1x verde SYBR II y 1,875 u de ADN polimerasa AmpliTaq Gold. Tanto los cebadores restringidos (ATC-1G-1 a ATC-1G-10, ATC-2G-1 a ATC-2G-10) como los cebadores regulares de cuatro nucleótidos (regular 1-10) se multiplexaron con 10 oligonucleótidos y se añadieron a una concentración total de 50 uM. El ciclado de PCR se llevó a cabo en el sistema de PCR en tiempo real StepOne™. Las condiciones de ciclado fueron las siguientes: 95° C 10 minutos, 10 ciclos de (95° C 15 segundos, 60° C 30 segundos), y 50 ciclos de (95° C 15 segundos, 65° C 30 segundos). La señal de fluorescencia se recogió en el paso de apareamiento.

La Fig. 10B muestra la fluorescencia a lo largo del tiempo para cebadores restringidos con 1G (nucleótido infrarrepresentado). La Fig. 10C muestra la fluorescencia a lo largo del tiempo para cebadores restringidos con 2G. La Fig. 7D muestra la fluorescencia a lo largo del tiempo para cebadores regulares de cuatro nucleótidos. Ambos cebadores restringidos redujeron la formación de dímeros de cebadores y la amplificación de falsos positivos fue indetectable hasta los 40 ciclos. Los cebadores regulares de cuatro nucleótidos tenían fuertes interacciones cebadorcebador y la amplificación falsa positiva aparecía sistemáticamente a aproximadamente 25 ciclos.

Ejemplo 10: Cebador de punto de apoyo

Cuando es necesario amplificar ciertas secuencias objetivo y no se dispone de una secuencia del tipo de tres nucleótidos de longitud suficiente para el objetivo, puede usarse un cebador de punto de apoyo. Tanto el segmento 5' como el segmento 3' de los cebadores de punto de apoyo pueden unirse a la secuencia objetivo, por lo que la hibridación cebador-plantilla es más eficaz que la del cebador corto del tipo de tres nucleótidos. El conector artificial del tipo de tres nucleótidos sirve entonces como plantilla para la extensión y proporciona suficiente longitud de unión cebador-plantilla para ciclos posteriores. Con la omisión de un tipo de monómeros de nucleótidos de trifosfato, la naturaleza del tipo de cuatro nucleótidos del segmento 5' del cebador de punto de apoyo no aumenta significativamente la amplificación no intencionada. Los cebadores de punto de apoyo también pueden proporcionarse en concentraciones bajas para reducir aún más la posibilidad de amplificación no intencionada.

Una reacción de PCR de 25 ul contiene plantillas, 10 mM Tris-HCl (pH8,3), 50 mM KCl, 2 mM MgCl2, 0,2 mM dATP, 0,2 mM dTTP, 0,2 mM dGTP, 1x verde SYBR II y 1,25 u de ADN polimerasa AmpliTaq Gold. Los cebadores de tres nucleótidos se añaden típicamente a una concentración de 100 nM, 200 nM, 400 nM u 800 nM. Los cebadores de punto de apoyo se añaden típicamente a una concentración de 1 nM, 10 nM, 100 nM, 200 nM, 400 nM, 800 nM. Las condiciones de ciclado de la PCR son las siguientes 95° C 10 minutos, 10 ciclos de (95° C 15 segundos, 60° C 30 segundos), y 50 ciclos de (95° C 15 segundos, 65° C 30 segundos).

Ejemplo 11: Formato de unión de tres vías para cebador de tres nucleótidos

La Fig. 16A muestra una plantilla a amplificar. En la Fig. 16B, la región 5' del tipo de cuatro nucleótidos (secuencia 4) del ayudante de unión de 3 vías hibrida con la plantilla. El cebador directo (secuencia 1) hibrida con la plantilla junto a la región de hibridación de la secuencia 4. Los segmentos artificiales enlazados al extremo 5' del cebador directo (secuencia 2) y al extremo 3' del auxiliar de unión de 3 vías (secuencia 3) son complementarios entre sí e hibridan juntos para estabilizar la estructura completa e iniciar la extensión de la polimerasa. En la otra cadena, un cebador inverso hibrida y se extiende en la región de tres nucleótidos donde hibrida la secuencia 1. En la Fig. 16C, el producto de extensión del cebador directo hibrida con el cebador inverso y genera productos de longitud completa. Puede aplicarse un formato de unión de tres vías a ambos cebadores.

Una reacción de PCR de 25 ul contiene plantillas, 10 mM Tris-HCl (pH8,3), 50 mM KCl, 2 mM MgCl2, 0,2 mM dATP, 0,2 mM dTTP, 0,2 mM dGTP, 1x verde SYBR II y 1,25 u de ADN polimerasa AmpliTaq Gold. Los cebadores de tres nucleótidos se añaden típicamente a una concentración de 100 nM, 200 nM, 400 nM u 800 nM. Los auxiliares de unión de tres vías se añaden típicamente a una concentración de 1 nM, 10 nM, 100 nM, 200 nM, 400 nM, 800 nM. Las condiciones de PCR son las siguientes: 95° C 10 minutos, 10 ciclos de (95° C 15 segundos, 60° C 30 segundos), y 50 ciclos de (95° C 15 segundos, 65° C 30 segundos).

Ejemplo 12: PCR con cebador malapareado de tres nucleótidos o cebador restringido con cantidad limitada de uno de los cuatro nucleótidos de monofosfato

Cuando se usan cebadores de tres nucleótidos con G ausente y con por lo menos un malapareamiento para la amplificación con monofosfatos de tres nucleótidos, la extensión de los cebadores se detiene cuando se requiere dCTP. Los productos intermedios hibridarán entre sí o hibridarán con los cebadores para extenderse a productos completos. Cuando se proporciona dCTP en cantidad limitada, la incorporación de dCTP en la extensión del cebador genera más plantilla, por lo que generará más productos intermedios para la PCR con cebadores de tres nucleótidos, lo que aumenta la eficacia de la PCR. Preferiblemente los cebadores restringidos no contienen más de 2 Gs. Cuando la plantilla lo permite, el dCTP se proporciona en una cantidad limitada para que sea suficiente para la extensión de la PCR; sin embargo, sigue limitando la formación de dímeros de cebadores o la amplificación inespecífica con la plantilla.

Se ha diseñado un conjunto de cebadores para el HPV que contiene 1G en el cebador directo y 2Gs (11-1G-F, 11-2G-R) en el cebador inverso. Una reacción de PCR de 25 ul contenía 1 pg de ADN HPV11, 10 mM Tris-HCl (pH8,3), 50 mM KCl, 2 mM MgCl2, 0,2 mM dATP, 0,2 mM dTTP, 0,2 mM dGTP, 4x verde SYBR II, 400 nM de cada cebador y 1,875 u de ADN polimerasa AmpliTaq Gold. En las reacciones con dCTP, se añadió dCTP a 1 uM (1/200 de la cantidad habitual). El ciclado de la PCR se llevó a cabo en el sistema de PCR en tiempo real StepOne™. Las condiciones de ciclado fueron las siguientes: 95° C 10 minutos, 10 ciclos de (95° C 15 segundos, 60° C 30 segundos), y 50 ciclos de (95° C 15 segundos, 65° C 30 segundos). La señal de fluorescencia se recogió en el paso de apareamiento.

La Fig. 11A muestra la fluorescencia a lo largo del tiempo para la PCR con cebador restringido con 1 uM de dCTP. La Fig. 11B muestra la fluorescencia a lo largo del tiempo para la PCR con cebador restringido sin dCTP. La Fig. 11C muestra la fluorescencia a lo largo del tiempo para el cebador restringido y el control sin plantilla con 1 uM de dCTP. Un valor tan bajo como 1 uM de dCTP es suficiente para la amplificación con cebadores restringidos. Cuando no se proporciona dCTP, la extensión del cebador se detiene cuando se requiere dCTP. Por lo tanto, sólo se forman productos cortos de cadena doble, lo que da lugar a una curva de amplificación retardada y a una señal de amplificación baja. En el control sin plantilla, con 1 uM de dCTP, no se formó ningún dímero de cebador en 60 ciclos.

Ejemplo 13: Reducción de la amplificación inespecífica en PCR multiplex con cebadores de tipo de tres nucleótidos añadiendo monofosfato de cuatro nucleótidos como ddNTP

Los cebadores de tres nucleótidos también pueden reducir la amplificación inespecífica de la plantilla porque los cebadores no pueden extender secuencias largas sin dCTP en el sitio de cebado inespecífico. Cuando se proporciona ddCTP en una reacción de PCR, cada vez que la extensión del cebador no específico se encuentra con una G en la plantilla, se incorpora ddCTP y evita que este producto siga extendiéndose. Sin embargo, la PCR con cebadores específicos de tres nucleótidos no incorpora ddCTP y, por lo tanto, no se ve afectada por la adición de ddCTP. Hemos diseñado cebadores de tres nucleótidos para la detección del HPV56 en muestras cervicales de pacientes. El ADN genómico humano siempre está presente en grandes cantidades en las muestras de pacientes. Ocasionalmente, los cebadores HPV56 pueden reaccionar con el ADN genómico humano y tener una amplificación inespecífica cuando no hay ADN HPV56. Cuando se añade ddCTP en la reacción a 0,2 mM, la tasa de amplificación inespecífica se reduce a un nivel indetectable.

Una reacción de PCR de 25 ul contenía 100 ng de plantilla de ADN genómico humano, 10 mM Tris-HCl (pH8,3), 50 mM KCl, 2 mM MgCl2, 0,2 mM dATP, 0,2 mM dTTP, 0,2 mM dGTP, 1x verde SYBR II, 400 nM de cada cebador HPV56 y YWHZ humano, y 1,875 u de ADN polimerasa AmpliTaq Gold. Para las reacciones con ddCTP, se añade 0,2 mM de ddCTP. El ciclado de la PCR se llevó a cabo en el sistema de PCR en tiempo real StepOne™. Las condiciones de ciclado fueron las siguientes: 95° C 10 minutos, 10 ciclos de (95° C 15 segundos, 60° C 30 segundos), y 50 ciclos de (95° C 15 segundos, 65° C 30 segundos).

En la reacción PCR usamos tanto cebadores HPV56 (56MM1F, 56MM1R) como cebadores humanos YWHZ (YWHZF1Tmtail, YWHZR1Tmtail). Se repitió la reacción con ddCTP para tener un producto amplificado inespecífico. Se repitió la reacción sin ddCTP y no se observó amplificación inespecífica. La Fig. 12 muestra una imagen de gel. El carril 1 es la escalera de ADN. El carril 2 muestra el producto YWHZ a 116 pb y un producto inespecífico del cebador HPV56 a 81 pb cuando no se proporciona ddCTP. El carril 3 muestra sólo el producto YWHZ cuando se proporciona ddCTP.

Ejemplo 14: Detección multiplex de múltiples muestras con análisis de la curva de fusión

Como se muestra en el ejemplo 13, diseñamos cebadores HPV de tres nucleótidos para detectar el HPV en muestras de pacientes y cebadores YWHZ humanos como control interno. Cuando usamos el colorante intercalante de ADN verde SYBR como reactivos de detección de señales, tanto el HPV como el control interno se detectaron con el mismo colorante. Para diferenciar los dos tipos de reacción, los cebadores se modificaron de tal manera que los productos de PCR del HPV y del control interno tuvieran Tm diferentes, y los separamos con análisis de curva de fusión. Se realizó un control negativo con sólo ADN genómico humano como plantilla.

Una reacción de PCR de 25 ul contenía 10 pg de plantilla de ADN HPV56, 10 ng de plantilla de ADN genómico humano, 10 mM Tris-HCl (pH8,3), 50 mM KCl, 2 mM MgCl2, 0,2 mM dATP, 0,2 mM dTTP, 0,2 mM dGTP, 1x verde SYBR II y 1,875 u de ADN polimerasa AmpliTaq Gold. Las concentraciones de cebadores son de 100 nM cada cebador. En la muestra negativa, no se añade ADN HPV56. El ciclado de PCR se llevó a cabo en el sistema de PCR en tiempo real StepOne™. Las condiciones de ciclado fueron las siguientes: 95° C 10 minutos, 10 ciclos de (95° C 15 segundos, 60° C 30 segundos), y 50 ciclos de (95° C 15 segundos, 65° C 30 segundos). La señal de fluorescencia se registró en el paso de apareamiento y el análisis de la curva de fusión se realizó al final del programa de ciclado.

La Fig. 13A muestra dos picos de curvas de fusión bien resueltos generados a 72,47° C y 79,86° C correspondientes a los productos HPV56 y YWHZ humano. Por el contrario, en la Fig. 13B, los controles negativos no mostraron un pico de curva de fusión a 72,47° C, lo que indica que no había HPV56 presente.

Ejemplo 16: Detección PCR en tiempo real con cebador de tres nucleótidos marcado con fluorescencia

Además de la detección basada en verde SYBR, también probamos la detección basada en fluorescencia con cebadores de tres nucleótidos. Los cebadores marcados con fluorescencia permiten un alto multiplexado y posibilitan la detección de múltiples canales en una reacción de tubo único. Añadimos una cola artificial de tres nucleótidos a los cebadores YWHZ humanos y marcamos la cola con fluoróforo FAM en el extremo 5', y una sonda marcada con inactivador que es complementaria a la cola artificial. Hemos diseñado cuidadosamente la secuencia de cola/sonda con una Tm más baja que la de los cebadores para que la extensión pueda producirse a una temperatura de apareamiento más alta para garantizar la extensión completa a la región de cola, antes de que los inactivadores hibriden con los cebadores de fluorescencia libre a una temperatura más baja para la detección de la señal. El ensayo puede facilitarse con una concentración asimétrica de cebadores en la reacción de PCR, en donde el cebador inverso se proporciona en cantidad en exceso para generar preferiblemente cadenas que se detectan mediante el cebador marcado con fluorescencia (Fig. 22). Como la generación de la señal depende de la extensión del cebador inverso, el exceso de cebador inverso aumenta la señal y, por tanto, la eficacia de la reacción.

Una reacción de PCR de 25 ul contenía 10 ng de plantilla de ADN genómico humano, 10 mM de Tris-HCl (pH8,3), 50 mM de KCl, 2 mM de MgCl2, 0,2 mM de dATP, 0,2 mM de dTTP, 0,2 mM de dGTP, 1,25 u de ADN polimerasa AmpliTaq Gold, 100 nM de cebador marcado con fluorescencia, 100 nM de sonda BHQ y 100 nM de cebador inverso. El ciclado de PCR se llevó a cabo en el sistema de PCR en tiempo real StepOne™. Las condiciones de ciclado fueron las siguientes: 95° C 10 minutos, 60 ciclos de (95° C 15 segundos, 60° C 30 segundos, 50° C 30 segundos y 50° C 15 segundos). La señal de fluorescencia se registró en el segundo paso de 50° C.

La Fig. 20A muestra la fluorescencia a lo largo del tiempo para la amplificación con plantilla. La Fig. 20B muestra la fluorescencia en el tiempo para una reacción de control sin plantilla. 10 ng de ADN genómico humano se detectan bien con el cebador marcado con FAM. No se observó ningún producto de amplificación de dímeros de cebadores en el control.

Ejemplo 17: PCR multiplex con cebador universal marcado con fluorescencia

Los cebadores marcados directamente con fluorescencia del último ejemplo permiten un alto nivel de multiplexación y detección de señales multicanal. Sin embargo, el marcado individual de los cebadores no es rentable. En este ejemplo, hemos diseñado un cebador universal marcado con fluorescencia que puede detectar múltiples productos de una reacción multiplex. Además de los cebadores PCR regulares de tres nucleótidos, introdujimos una cola universal de tres nucleótidos en el extremo 5' de cada cebador. En la reacción, se incluye un cebador universal que tiene la misma secuencia que la cola del cebador. Al cebador universal también se le introdujo una cola con una secuencia de doble cadena en la que una cadena tiene una secuencia de tres nucleótidos y está marcada con un fluoróforo y la cadena complementaria está marcada con un inactivador. Usamos cebadores YWHZ para diseñar el ensayo. Empleamos la PCR asimétrica para generar preferencialmente cadenas que se detectan por el cebador universal. Demostramos que el cebador universal marcado con fluorescencia puede combinarse con una reacción de PCR multiplex de tres nucleótidos para amplificar eficientemente múltiples secuencias objetivo.

Una reacción de PCR de 25 ul contenía 100 ng de ADN genómico humano, 10 mM Tris-HCl (pH8,3), 50 mM KCl, 2 mM MgCl2, 0,2 mM dATP, 0,2 mM dTTP, 0,2 mM dGTP, 1.25 u de ADN polimerasa AmpliTaq Gold, 100 nM de cebador universal marcado con fluorescencia, 100 nM de sonda BHQ, 100 nM de cebador directo YWHZ con cola y 400 nM de cebador inverso YWHZ. El ciclado de PCR se llevó a cabo en la máquina de PCR en tiempo real BioRad CFX96. Las condiciones de ciclado fueron las siguientes 95° C 10 minutos, 60 ciclos de (95° C 15 segundos, 60° C 30 segundos, 50° C 30 segundos y 50° C 15 segundos). La señal de fluorescencia se registró en el segundo paso a 50° C.

La Fig. 21A muestra la fluorescencia a lo largo del tiempo para la amplificación con plantilla. La Fig. 21B muestra la fluorescencia a lo largo del tiempo para una reacción de control sin plantilla. Se detectaron fácilmente 100 ng de ADN genómico humano con el cebador universal marcado con FAM. No se detectó ningún producto de amplificación por formación de dímeros de cebador en el control sin plantilla.

Ejemplo 18: Formato de sonda Taqman

En lugar de marcar la fluorescencia en el cebador, en este formato la fluorescencia se marca en la sonda, como en el formato de sonda Taqman. Cuando el cebador inverso se extiende a la sonda Taqman, la actividad 5' exo de la ADN polimerasa digiere la sonda, liberando fluorescencia libre para su detección.

En este ejemplo, se introducen colas de cebadores de tres nucleótidos con secuencias artificiales universales. En la reacción p Cr , se proporciona una sonda en formato Taqman. La sonda es complementaria a la secuencia artificial universal y está marcada con un fluoróforo y un inactivador. La PCR se lleva a cabo con un cebador de dicho formato o con ambos cebadores de dicho formato. Cuando la extensión del cebador se encuentra con la sonda Taqman, la actividad 5' exo nucleasa de la ADN polimerasa digiere la sonda y separa el fluoróforo del inactivador generando la señal de fluorescencia.

Una reacción de PCR de 25 ul contiene plantillas, 10 mM Tris-HCl (pH8,3), 50 mM KCl, 2 mM MgCl2, 0,2 mM dATP, 0,2 mM dTTP, 0,2 mM dGTP y 1,25 u de ADN polimerasa AmpliTaq Gold. Los cebadores de tres nucleótidos se añaden típicamente a una concentración de 100 nM, 200 nM, 400 nM u 800 nM. La sonda Taqman se añade típicamente a concentraciones de 100 nM, 200 nM, 400 nM. Las condiciones de ciclado de PCR son las siguientes 95° C 10 minutos, 60 ciclos de (95° C 15 segundos, 60° C 30 segundos, 72° C 60 segundos).

Ejemplo 19: Formato de baliza molecular

En la reacción se proporciona una baliza molecular marcada con un fluoróforo. El cebador directo se inserta en cola con una secuencia artificial de tres nucleótidos que contiene la misma secuencia que la baliza molecular. Cuando el cebador inverso se extiende a la secuencia artificial y genera su secuencia complementaria. La baliza molecular hibrida con la secuencia, la fluorescencia ya no está inactiva y se detecta.

En este ejemplo, se introducen colas de cebadores de tres nucleótidos con secuencias artificiales universales. En la reacción PCR, se proporciona una sonda en formato de baliza molecular. La sonda tiene estructura de horquilla y está marcada con un fluoróforo y un inactivador. Como sonda libre, conserva la estructura de horquilla y se inactiva el fluoróforo. Su secuencia de lazo es la misma que la secuencia artificial universal. Cuando se realiza la PCR, las extensiones del cebador generan la secuencia complementaria de la secuencia artificial universal. La sonda hibrida ahora con la secuencia complementaria y deja de tener la estructura de horquilla. Esto provoca la separación del fluoróforo y el inactivador, generando la señal de fluorescencia.

Una reacción de PCR de 25 ul contiene plantillas, 10 mM Tris-HCl (pH8,3), 50 mM KCl, 2 mM MgCl2, 0,2 mM dATP, 0,2 mM dTTP, 0,2 mM dGTP y 1,25 u de ADN polimerasa AmpliTaq Gold. Los cebadores de tres nucleótidos se añaden típicamente a una concentración de 100 nM, 200 nM, 400 nM u 800 nM. La sonda de baliza molecular se añaden típicamente a concentraciones de 100 nM, 200 nM, 400 nM. Las condiciones del ciclado de PCR son las siguientes 95° C 10 minutos, 60 ciclos de (95° C 15 segundos, 60° C 30 segundos, 72° C 60 segundos).

Ejemplo 20: Amplificación del genoma completo

Los cebadores aleatorios restringidos de tres nucleótidos que contienen un nucleótido infrarrepresentado se completan en las colas con secuencias artificiales. Estos cebadores aleatorios se usan para amplificar el ADN genómico completo. Los productos de la PCR se amplifican con cebadores universales, que tienen las mismas secuencias que las secuencias artificiales de los cebadores aleatorios. Los productos amplificados pueden usarse para la secuenciación.

Al contrario que la tecnología PCR, que se lleva a cabo con ciclos de temperatura, en la amplificación isotérmica, que se lleva a cabo a una temperatura constante y no requiere un termociclador, también se usan cebadores de tres nucleótidos. El producto amplificado puede detectarse añadiendo verde SYBR o sondas marcadas con fluorescencia. Típicamente, la amplificación isotérmica se lleva a cabo con ADN polimerasa por desplazamiento de cadena.

Una reacción de PCR de 25 ul contiene plantillas, 10 mM Tris-HCl (pH8,3), 50 mM KCl, 2 mM MgCl2, 0,2 mM dATP, 0,2 mM dTTP, 0,2 mM dGTP, 1x verde SYBR II y 2,5 u de ADN polimerasa AmpliTaq Gold. Los cebadores aleatorios se añaden típicamente a una concentración de 100 nM, 200 nM, 400 nM, 800 nM, 1 uM, 2 uM, 5 uM o 10 uM. Las condiciones de ciclado de PCR son las siguientes 95° C 10 minutos, 60 ciclos de (95° C 15 segundos, 60° C 30 segundos, 72° C 60 segundos). En la reacción de PCR secundaria, los productos de la reacción anterior se diluyen 1:10, 1:100, 1:1000 o 1:10000, y se añade 1 ul de dilución como plantilla. Los cebadores universales se usan típicamente a una concentración de 100 nM, 200 nM, 400 nM u 800 nM. Otros reactivos se proporcionan de manera similar. Para la reacción isotérmica, la amplificación se incuba a 60° C durante el tiempo deseado.

Ejemplo 21: Amplificación isotérmica

En este ejemplo se muestran cuatro tipos de amplificación isotérmica: Amplificación isotérmica mediada por lazo (LAMP), reacción de amplificación enzimática de mellado (NEAR), amplificación mediada por transcripción (TMA), amplificación por círculo rodante (RCA), amplificación dependiente de helicasa (HDA), amplificación exponencial (EXPAR), reacción en cadena de hibridación (HCR), ensamblaje catalizado de horquillas (CHA).

La LAMP se realiza típicamente en una mezcla de reacción total de 25-100 ul que contiene 0,1-0,8 mM de cada uno de FIP y BIP, 0-0,2 mM de cada uno de los cebadores de mellado, 0,1-0,4 mM de cada uno de los cebadores de lazo, 0,8-1,6 mM dNTPs, 0.25-1M betaína, 20 mM Tris-HCl (pH<8>,<8>), 10 mM KCl, 10 mM (NH<4>)<2>SO<4>, 2-4 mM MgSO<4>, 0,1% de Triton X-100, 4-8 unidades del fragmento grande de la ADN polimerasa Bst (New England Biolabs) y las cantidades especificadas de ADN objetivo de cadena doble. La mezcla se incuba a 60° C y se analiza en tiempo real. La amplificación se detecta con verde SYBR o sondas marcadas con fluorescencia.

La NEAR se realiza típicamente en una mezcla de reacción total de 10-100 ul que contiene plantilla, 45,7 mM Tris, 13,9 mM KCl, 10 mM (NH4)2SO4, 50 mM NaCl, 0,5 mM DTT, 15 mM MgCl2, 0,1% de Triton X-100, 0,008 mM de EDTA,<6>ug/ml de BSA, 3,9% de glicerol, 0,1-0,3 U/ul de enzima de mellado, 0,1-0,4 U/ul de enzima de desplazamiento de cadena, 0,1-0,8 uM de cada cebador. La mezcla se incuba a 54-60° C y la amplificación se detecta con sondas marcadas con fluorescencia.

El TMA se realiza típicamente en un volumen total de 25-100 ul de mezcla de reacción que contiene 2 mM de cada dNTP,<8>mM de cada rNTP, 80 mM de Tris-HCl pH 7,5 a 25° C, 50 mM de MgCl2, 35 mM de KCl, 10% (p/v) de polivinilpirrolidona y 0,1-1 uM de cebador con secuencia promotora y cebador inverso. La mezcla de la reacción se incuba a 60° C durante 10 min en aceite para permitir la desnaturalización del ARN. Luego, la mezcla se enfría a 42° C durante 5 min. antes de añadir la mezcla enzimática que contiene transcriptasa inversa MMLV (2000 unidades/ensayo) y ARN polimerasa T7 (2000 unidades/ensayo) en<8>mM Hepes pH 7,5, 50 mM N-acetil-L-cisteína, 0,04 mM acetato de zinc,<80>mM trehalosa, 140 mM Tris-HCl pH 8,0 a 25° C, 70 mM KCl, 1 mM EDTA, 0,01% (p/v) de rojo de fenol, 10% (v/v) de Triton X-100 y 20% (v/v) de glicerol) y la incubación continuó durante 60 min adicionales a 42° C.

La reacción de amplificación RCA se realiza típicamente en una mezcla de 50 pl que contiene plantilla,<8>U de Bst ADN polimerasa (New England Biolabs), 100-800 nM de cada cebador RCA y 400 pM de mezcla de dNTP. La mezcla se incuba a 65° C durante 60 minutos y se enfría a 10° C.

Los productos de amplificación se detectan con verde SYBR o sondas marcadas con fluorescencia y pueden usarse en otras aplicaciones.

La reacción de amplificación HDA se realiza típicamente en una reacción de 50 pl que contiene los siguientes reactivos: tampón 1xHDA (360 mM Tris-Acetato (pH7,5), 250 mM KOAC, 100 mM D<t>T, 1 mg/ml de BSA, y 50 mM acetato de magnesio), plantilla, 0,1-0,8 pM cada cebador, 0,4 mMpl dNTPs, 4 mM ATP, ADN polimerasa, helicasa, y T4 gp32. La reacción de amplificación se realiza sin desnaturalización inicial (por ejemplo, los reactivos se añaden como se ha descrito anteriormente), o con desnaturalización inicial y apareamiento (por ejemplo, la ADN polimerasa y la helicasa se añaden después de realizar el paso inicial). La reacción se incuba durante una hora a 37° C. Los productos de amplificación se detectan con verde SYBR o sondas marcadas con fluorescencia. La reacción de amplificación EXPAR se realiza típicamente a 60° C. La reacción contiene 85 mM KCl, 25 mM Tris-HCl (pH<8>,<8>, 25° C.), 2,0 mM MgSO4, 5 mM MgCl2, 10 mM (NH4)2SO4, 0,1% (vol:vol) Triton X-100, 0,5 mMDTT, enzima de mellado, Vent exo-polimerasa, 400 uM dNTPs, 10 ug/ml BSA, plantilla y cebadores. Los productos de amplificación se detectan con verde SYBR o sondas marcadas con fluorescencia.

La reacción HCR se realiza típicamente en 4-50 ul que contienen tampón 1xHBN (150 mM Na2HPO4 y 1,5 M NaCl, pH<6>,<8>), 1,0 uM de cada una de las horquillas H1 y H2, y 0,1-1 uM de iniciador. La reacción se lleva a cabo con las siguientes condiciones: ebullición en un baño de agua durante 5 min seguido de un enfriamiento gradual hasta temperatura ambiente durante<1>h.

La reacción CHA se realiza típicamente en una mezcla de 5-50 ul que contiene 10-1000 nM de cada horquilla H1 y H2, 50-1000 nM de dúplex informador (oligo marcado con fluoróforo: oligo marcado con inactivador=1:2,1x de tampón TNaK (20 mM Tris, pH 7,5; 140 mM NaCl; 5 mM KCl). H1 y H2 se volvieron a plegar por separado (90° C

Claims (18)

REIVINDICACIONES

1. Un método de amplificación de un segmento de un ácido nucleico objetivo que comprende:

poner en contacto una muestra que comprende un ácido nucleico objetivo con cebadores directo e inverso; y realizar una reacción de amplificación en donde un segmento amplificado del ácido nucleico objetivo se forma por extensión de los cebadores directo e inverso con el ácido nucleico objetivo que sirve de plantilla;

en donde los cebadores están infrarrepresentados en uno o más de los cuatro tipos de nucleótidos estándar, el tipo o tipos de nucleótidos infrarrepresentados siendo los mismos en los cebadores, cada cebador tiene dos o menos unidades del tipo o tipos de nucleótidos infrarrepresentados en posiciones internas, y el segmento amplificado es el producto de amplificación predominante formado a partir de la extensión de los cebadores directo y/o inverso;

en donde el método se realiza en multiplex con una pluralidad de pares de cebadores, cada cebador en el multiplex teniendo el mismo tipo o tipos de nucleótidos infrarrepresentados.

2. El método de la reivindicación 1, en donde el ácido nucleico objetivo tiene una cadena que comprende un complemento de un sitio de unión del cebador directo y un sitio de unión del cebador inverso.

3. El método de la reivindicación 2, en donde cada uno de los cebadores directo e inverso no tiene más de una unidad del tipo de nucleótido infrarrepresentado en una posición interna y el sitio de unión del cebador directo y el sitio de unión del cebador inverso no tienen más de dos unidades del complemento del tipo de nucleótido infrarrepresentado.

4. El método de cualquier reivindicación anterior, en donde los cebadores directo e inverso tienen uno y sólo uno de los cuatro tipos de nucleótidos estándar infrarrepresentados.

5. El método de cualquier reivindicación anterior, en donde los cebadores directo e inverso consisten en los tres tipos de nucleótidos estándar distintos de un tipo de nucleótido infrarrepresentado y el sitio de unión del cebador directo y el sitio de unión del cebador inverso consisten en los tres tipos de nucleótidos estándar distintos del complemento del tipo de nucleótido infrarrepresentado en los cebadores directo e inverso.

6. El método de cualquier reivindicación anterior, en donde el tipo o tipos de nucleótidos infrarrepresentados en los cebadores directo e inverso no ocupan las posiciones 3' de los cebadores directo e inverso y/o en donde el cebador directo e inverso tiene una unidad de un tipo de nucleótido infrarrepresentado en el extremo 5'.

7. El método de cualquiera de las reivindicaciones 2-6, en donde el complemento del sitio de unión del cebador directo y el sitio de unión del cebador inverso son contiguos o en donde el complemento del sitio de unión del cebador directo y el sitio de unión del cebador inverso están separados por una región que excluye el tipo de nucleótido infrarrepresentado en los cebadores directo e inverso y su complemento, o

en donde el complemento del sitio de unión del cebador directo y el sitio de unión del cebador inverso están separados por una región que incluye el nucleótido infrarrepresentado en los cebadores directo e inverso o su complemento o ambos.

8. El método de cualquier reivindicación anterior, en donde el nucleótido 3' de los cebadores directo y/o inverso es el complemento del nucleótido infrarrepresentado en los cebadores directo e inverso, opcionalmente en donde el nucleótido 3' de los cebadores directo y/o inverso es C o G.

9. El método de cualquier reivindicación anterior, en donde el cebador directo y/o inverso contiene un nucleótido no natural, que es inosina, isoC, isoG, 7-deaza-2'-desoxiguanosina, 7-desaza-2'-desoxiadenosina, hipoxantina, derivados de azole carboxamida, 3-nitropirrol, 5- nitroindol, nitroimidazol, 3-nitroimidazol, 4-nitropirazol, 4-nitrobenzimidazol, 4-aminobenzimidazol, 5-imidazol 4,5-dicarboxamida, o 5-nitroindazol.

10. El método de cualquier reivindicación anterior, en donde el cebador directo y/o inverso está enlazado en su extremo 5' con un oligonucleótido artificial que tiene el mismo tipo o tipos de nucleótidos infrarrepresentados que los cebadores directo y/o inverso.

11. El método de cualquier reivindicación anterior, en donde la reacción de amplificación se realiza con monómeros de trifosfatos de nucleótidos, omitiéndose los monómeros de trifosfatos de nucleótidos complementarios al tipo o tipos de nucleótidos infrarrepresentados en los cebadores directo e inverso; o

en donde el o los monómeros complementarios de trifosfato de nucleótido del tipo o tipos de nucleótidos infrarrepresentados en los cebadores directo e inverso están presentes a una concentración reducida con respecto a los demás monómeros estándar de trifosfato de nucleótido.

12. El método de cualquiera de las reivindicaciones 2-11, que comprende además buscar en una secuencia de una cadena del ácido nucleico objetivo para el complemento del sitio de unión del cebador directo y el sitio de unión del cebador inverso o, si no puede encontrarse el complemento del sitio de unión del cebador directo e inverso, otros sitios de unión del cebador en los que se minimice el número de unidades del complemento de un tipo de nucleótido infrarrepresentado.

13. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 2-12, en donde el sitio de unión del cebador directo y/o el sitio de unión del cebador inverso incluyen por lo menos una unidad de un tipo de nucleótido complementario del tipo o tipos de nucleótidos infrarrepresentados en los cebadores directo e inverso y la hibridación de los cebadores y los sitios de unión de los cebadores da como resultado por lo menos un malapareamiento, opcionalmente, en donde la hibridación de los cebadores directo e inverso con los sitios de unión del cebador da como resultado el apareamiento entre un tipo de nucleótido no natural en los cebadores y un complemento del tipo o tipos de nucleótidos infrarrepresentados de los sitios de unión del cebador y/o en donde la reacción de amplificación se realiza en presencia de un agente estabilizador de malapareamientos.

14. El método de cualquier reivindicación anterior, en donde el cebador directo y/o inverso está enlazado en su extremo 5' a un segmento conector de secuencia artificial que tiene el mismo tipo o tipos de nucleótidos infrarrepresentados que el cebador directo o inverso, que está enlazado en su extremo 5' a un segmento 5' que incluye los cuatro tipos de nucleótidos estándar y complementario al ácido nucleico objetivo o,

en donde el cebador directo y/o inverso es un segmento de cebador enlazado en su extremo 5' a un segmento artificial que tiene el mismo tipo o tipos de nucleótidos infrarrepresentados que el segmento de cebador, y la amplificación se realiza con un cebador de unión que comprende un sitio de unión al objetivo y un complemento del segmento artificial; y un sitio de unión al objetivo del cebador de unión incluye los cuatro tipos de nucleótidos estándar o

en donde el cebador directo y/o inverso está enlazado en su extremo 5' a un oligonucleótido de cadena doble, una de cuyas cadenas tiene el mismo tipo o tipos de nucleótidos infrarrepresentados que el cebador al que está enlazado, en donde el oligonucleótido de cadena doble tiene una temperatura de fusión diferente a la del producto de amplificación predominante formado por la extensión de los cebadores directo e inverso; en donde la formación del producto de amplificación predominante se detecta mediante un análisis de la curva de fusión, en donde la temperatura de fusión predominante pasa de la del oligonucleótido de cadena doble a la del producto de amplificación predominante, opcionalmente realizado con diferentes cebadores de la pluralidad de pares de cebadores enlazados a diferentes segmentos artificiales con diferentes temperaturas de fusión.

15. El método de cualquier reivindicación anterior, en donde el cebador directo y/o inverso está enlazado en su extremo 5' a un oligonucleótido artificial que tiene el mismo tipo o tipos de nucleótidos infrarrepresentados que el cebador al que está enlazado, y el segmento amplificado se detecta con un oligonucleótido marcado con fluoróforo e inactivador que tiene las mismas secuencias que el oligonucleótido artificial, que hibrida con una cadena complementaria del oligonucleótido artificial formado durante la reacción de amplificación, separando de este modo el fluoróforo y el inactivador para generar una señal fluorescente que indica la presencia del segmento amplificado; o

en donde el cebador directo y/o inverso está enlazado en su extremo 5' a un oligonucleótido artificial de cadena sencilla que tiene el mismo tipo o tipos de nucleótidos infrarrepresentados que el cebador al que está enlazado, el oligonucleótido artificial estando marcado con un fluoróforo y un inactivador, por lo que el segmento amplificado formado por extensión de los cebadores directo e inverso separa el fluoróforo y el inactivador generando una señal fluorescente que indica la presencia del segmento amplificado, o

en donde el cebador directo y/o inverso está enlazado en su extremo 5' a una cola marcada fluorescentemente que tiene el mismo tipo o tipos de nucleótidos infrarrepresentados que el cebador al que está enlazado, y/o en donde el cebador directo y/o inverso se suministra con la cola hibridada con un oligonucleótido marcado con un inactivador, en donde el oligonucleótido se disocia del cebador durante la reacción de amplificación separando el inactivador del oligonucleótido marcado fluorescentemente generando una señal fluorescente.

16. El método de cualquier reivindicación anterior, realizado con diferentes regiones de unión a objetivo de la pluralidad de pares de cebadores enlazados a colas con diferentes marcadores fluorescentes, y/o

se realiza con diferentes regiones de unión a objetivo de la pluralidad de pares de cebadores enlazados a un segmento artificial 5' común, y la amplificación se realiza con una sonda de detección que tiene un segmento 3' complementario al complemento del segmento artificial 5' común, y/o

en donde el cebador directo y/o inverso está enlazado en su extremo 5' a una cola artificial con el mismo nucleótido infrarrepresentado que el cebador al que está enlazado, y el cebador se suministra hibridado a un oligonucleótido que comprende un fluoróforo y un inactivador en donde el inactivador o fluoróforo se escinde del oligonucleótido en la amplificación generando una señal fluorescente.

17. El método de cualquier reivindicación anterior, en donde el cebador directo y/o inverso está enlazado en su extremo 5' a una cola que está infrarrepresentada en el mismo tipo o tipos de nucleótidos que el cebador al que está enlazado, y se proporciona un oligonucleótido de baliza molecular que comprende una horquilla con un lazo que hibrida con el complemento de la cola 5' y un fluoróforo y un inactivador en sus extremos, en donde el oligonucleótido de baliza molecular hibrida con el segmento amplificado que separa el fluoróforo y el inactivador generando una señal fluorescente, y/o

en donde el cebador directo y/o inverso tiene un extremo pegajoso 3' de cadena sencilla y una estructura de lazo de horquilla en su segmento de extremo 5' y el último nucleótido en el extremo 5' de la estructura de lazo de horquilla es el complemento de un tipo de nucleótido infrarrepresentado, opcionalmente en donde los productos de amplificación se ligan para formar un producto ligado, por ejemplo un producto circular.

18. El método de cualquier reivindicación anterior, en donde la muestra se pone en contacto con los cebadores directo e inverso a concentraciones diferentes entre sí, y/o

la amplificación se realiza con ciclado de temperatura, o la amplificación se realiza isotérmicamente, y/o

en donde el segmento amplificado se detecta mediante análisis de la curva de fusión, electroforesis capilar, espectroscopia de masas, detección de fluorescencia en tiempo real, secuenciación o hibridación a una micromatriz.