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ES2958933T3 - Conjugados de anticuerpo biparatópico anti-HER2-fármaco y métodos de uso - Google Patents

Conjugados de anticuerpo biparatópico anti-HER2-fármaco y métodos de uso Download PDF

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ES2958933T3
ES2958933T3 ES19766478T ES19766478T ES2958933T3 ES 2958933 T3 ES2958933 T3 ES 2958933T3 ES 19766478 T ES19766478 T ES 19766478T ES 19766478 T ES19766478 T ES 19766478T ES 2958933 T3 ES2958933 T3 ES 2958933T3
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ES
Spain
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antibody
her2
antigen
binding
linker
Prior art date
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Active
Application number
ES19766478T
Other languages
English (en)
Inventor
Kevin Hamblett
Rupert H Davies
James R Rich
Gerald J Rowse
Vincent K C Fung
Stuart D Barnscher
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Zymeworks BC Inc
Original Assignee
Zymeworks BC Inc
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
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Publication date
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Abstract

Conjugados de fármaco-anticuerpo biparatópicos (ADC) anti-HER2 en los que el fármaco es un análogo de auristatina y se conjuga con el anticuerpo en una relación fármaco-anticuerpo (DAR) promedio baja, y métodos para usar los ADC en el tratamiento de una Cáncer que expresa HER2. Los ADC de DAR promedio bajo (<3,9) como se describen en el presente documento tienen una tolerabilidad mejorada y una toxicidad reducida en comparación con un ADC correspondiente que tiene un DAR >=3,9 cuando se administra a la misma dosis de toxina. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

DESCRIPCIÓN
Conjugados de anticuerpo biparatópico anti-HER2-fármaco y métodos de uso
Campo
La presente descripción se refiere al campo de los agentes terapéuticos para el cáncer y, en particular, a conjugados de anticuerpo-fármaco que comprenden un anticuerpo anti-HER2 biparatópico y un análogo de auristatina.
Antecedentes
HER2 (ErbB2) es un receptor tirosina quinasa unido a la superficie transmembrana que es un miembro de la familia ErbB de receptores tirosina quinasas y normalmente participa en las rutas de transducción de señales que conducen al crecimiento y diferenciación celular. HER2 es un objetivo prometedor para el tratamiento del cáncer de mama, ya que se encontró que es sobreexpresado en aproximadamente una cuarta parte de los pacientes con cáncer de mama (Bange et al,Nature Medicine7:548 (2001)).
Herceptin® (trastuzumab, patente de EE. UU. N.° 5,821,337) fue el primer anticuerpo monoclonal desarrollado para el tratamiento del cáncer de mama positivo para HER2 y ha aumentado los tiempos de supervivencia para los pacientes, de modo que ahora son los mismos que para los pacientes con cáncer de mama negativo para HER2. Pertuzumab (Perjeta®, patente de EE. UU. N.° 7,862,817) es un anticuerpo monoclonal humanizado, que está diseñado específicamente para evitar que el receptor HER2 se empareje (se dimerice) con otros receptores HER (EGFR/HER1, HER3 y HER4) en el superficie de las células, un proceso que se cree que desempeña un papel en el crecimiento del tumor y la supervivencia. Se cree que la combinación de Perjeta, Herceptin y quimioterapia proporciona un bloqueo más completo de las rutas de señalización de HER. Pertuzumab se une al dominio II de HER2, esencial para la dimerización, mientras que trastuzumab se une al dominio extracelular IV de HER2.
Li et al. (CáncerRes.,73:6471-6483 (2013)) describen anticuerpos bivalentes, biespecíficos contra HER2 que se basan en las secuencias nativas de trastuzumab y pertuzumab y que superan la resistencia de trastuzumab. Se han descrito otros anticuerpos anti-HER2 biespecíficos (publicaciones de solicitudes de patentes internacionales N.° WO 2015/077891 y WO 2016/179707; publicaciones de solicitudes de patente de EE. UU. N.° 2014/0170148, 2015/0284463, 2017/0029529 y 2017/0291955; patente de EE. UU. N.° 9,745,382). También se ha descrito un conjugado de anticuerpo-fármaco que comprende un anticuerpo biparatópico dirigido a HER2 conjugado de forma específica para el sitio con un derivado de tubulisina (Li et al.,Cáncer Cell,29:117-129 (2016)).
Las auristatinas son análogos sintéticos de dolastatina 10, que es un potente inhibidor de microtúbulos con actividad anticancerosa. Se han descrito conjugados de anticuerpo-fármaco que comprenden cargas activas de auristatina, tal como monometilauristatina E (MMAE) o monometilauristatina F (MMAF), (patentes de EE. UU. N.° 7,498,298 y 7,659,241; publicaciones de solicitudes de patentes internacionales N.° Wo 2002/088172 y WO 2016/041082). La publicación de solicitud de patente Internacional N.° WO 2106/041082 describe auristatinas modificadas con N-acil-sulfonamida y su uso como cargas activas de conjugados de anticuerpofármaco.
Esta información de antecedentes se proporciona con el fin de dar a conocer la información que el solicitante cree que es de posible relevancia para la presente descripción. No se pretende necesariamente admitir, ni debe interpretarse, que cualquiera de la información anterior constituye técnica anterior en contra de la invención reivindicada.
Compendio
En el presente documento se describen conjugados de anticuerpo biparatópico anti-HER2-fármaco y métodos de uso. En un aspecto, la presente descripción se refiere a un conjugado de anticuerpo-fármaco que comprende un anticuerpo biparatópico anti-HER2 conjugado con un análogo de auristatina por medio de un enlazador (L) en una relación promedio de fármaco a anticuerpo (DAR) baja, en donde el anticuerpo biparatópico anti-HER2 comprende una primera construcción de polipéptido de unión a antígeno que se une a un primer epítopo de HER2 y una segunda construcción de polipéptido de unión a antígeno que se une a un segundo epítopo de HER2, siendo el primer y el segundo epítopos de HER2 epítopos diferentes, y en donde la DAR promedio baja es una DAR promedio de menos de 3,9.
En determinadas realizaciones del conjugado de anticuerpo-fármaco, el análogo de auristatina-enlazador tiene la Fórmula general (II):
en donde:
X es -C(O)NHCH(CH<2>R2)-, o X está ausente;
R1 se selecciona de:
L es el enlazador, y
2 representa el punto de unión del enlazador-toxlna al anticuerpo blparatóμlco antl-HER2;
en donde el anticuerpo biparatópico anti-HER2 comprende una primera construcción de polipéptido de unión a antígeno que se une a un primer epítopo de HER2 y una segunda construcción de polipéptido de unión a antígeno que se une a un segundo epítopo de HER2, siendo el primer y el segundo epítopo de HER2 epítopos diferentes, y
en donde la DAR promedio baja es una DAR promedio de menos de 3,9.
En determinadas realizaciones, la DAR promedio baja del conjugado de anticuerpo-fármaco está entre 0,5 y 3,5, o entre 0,5 y 2,5.
En determinadas realizaciones, el conjugado de anticuerpo-fármaco comprende 5% o más de especies de DAR0 o 15% o más de especies de DAR0. En algunas realizaciones, el conjugado de anticuerpo-fármaco comprende entre aproximadamente 5% y aproximadamente 50% de especies de DAR0, o entre aproximadamente 10% y aproximadamente 30% de especies de DAR0, o entre aproximadamente 10% y aproximadamente 25% de especies de DAR0, o entre aproximadamente 15% y aproximadamente 25% de especies de DAR0.
En determinadas realizaciones, el conjugado de anticuerpo-fármaco comprende 25% o menos de especies de DAR6 o superiores, o 15% o menos de especies de DAR6 o superiores. En algunas realizaciones, el conjugado de anticuerpo-fármaco comprende entre 0% y aproximadamente 15% de especies de DAR6 o superiores, o entre aproximadamente 0% y aproximadamente 10% de especies de DAR6 o superiores.
Otro aspecto de la presente descripción se refiere a una composición farmacéutica que comprende un conjugado de anticuerpo biparatópico anti-HER2-fármaco como se describe en el presente documento y un vehículo o diluyente farmacéuticamente aceptable.
Otro aspecto se refiere a un método para inhibir el crecimiento de una célula cancerosa que expresa HER2, comprendiendo el método poner en contacto la célula cancerosa con una cantidad eficaz de un conjugado de anticuerpo biparatópico anti-HER2-fármaco como se describe en el presente documento.
Otro aspecto se refiere a compuestos para usar en un método para tratar un cáncer que expresa HER2 que comprende administrar a un sujeto que tiene un cáncer que expresa HER2 una cantidad efectiva de un conjugado de anticuerpo biparatópico anti-HER2-fármaco como se describe en el presente documento. Otro aspecto se refiere a un conjugado de anticuerpo-fármaco como se describe en el presente documento para uso en terapia.
Otro aspecto se refiere a un conjugado de anticuerpo-fármaco como se describe en el presente documento para su uso para tratar un cáncer que expresa HER2 en un sujeto que lo necesite.
Otro aspecto se refiere a un uso de un conjugado de anticuerpo-fármaco como se describe en el presente documento en la fabricación de un medicamento para el tratamiento de un cáncer que expresa HER2.
Otro aspecto se refiere a una composición de conjugado de anticuerpo-fármaco que comprende un anticuerpo biparatópico anti-HER2 conjugado con un análogo de auristatina por medio de un enlazador (L), teniendo el análogo de auristatina-enlazador la Fórmula general (II):
en donde:
X está ausente;
R1 se selecciona de:
L es el enlazador, y
representa el punto de unión del análogo de auristatina-enlazador al anticuerpo biparatópico anti-HER2;
en donde el anticuerpo biparatópico anti-HER2 comprende una primera construcción de polipéptido de unión a antígeno que se une a un primer epítopo de HER2 en ECD4 de HER2 y una segunda construcción de polipéptido de unión a antígeno que se une a un segundo epítopo de HER2 en ECD2 de HER2, y en donde la composición de conjugado de anticuerpo-fármaco tiene una DAR promedio de entre 0,5 y 2,5 y comprende entre aproximadamente 10% y aproximadamente 30% de especies de DAR0 y entre 0% y aproximadamente 15% de especies de DAR6 o superiores.
Breve descripción de los dibujos
La Figura 1 muestra la SDS-PAGE no reductora y reductora de (A) v17597 (anticuerpo biparatópico anti-HER2 conjugado con el enlazador-toxina 001 con DAR4), y (B) v21252 (anticuerpo biparatópico anti-HER2 conjugado con el enlazador-toxina 001 con DAR2), cada uno comparado con el anticuerpo biparatópico anti-HER2 original (v10000).
La Figura 2 muestra gráficos de cromatografía de interacción hidrófoba (HIC) para (A) anticuerpo biparatópico anti-HER2 original v10000, (B) v17597 (anticuerpo biparatópico anti-HER2 conjugado con el enlazador-toxina 001 que muestra una DAR promedio de 3,92) y (C) v21252 (anticuerpo biparatópico anti-HER2 conjugado con el enlazador-toxina 001 que muestra una d Ar promedio de 2,07). Las contribuciones individuales de las especies de DAR0, DAR2, DAR4 y DAR6 a la DAR promedio de los ADC purificados se muestran en (D) y (E). La Figura 3 muestra gráficos de cromatografía de exclusión por tamaño (SEC) para (A) anticuerpo biparatópico anti-HER2 original v10000, (B) v17597 (anticuerpo biparatópico anti-HER2 conjugado con el enlazador-toxina 001 con DAR4), y (C) v21252 (anticuerpo biparatópico anti-HER2 conjugado con el enlazador-toxina 001 con DAR2).
La Figura 4 muestra los resultados de los ensayos de unión por citometría de flujo en células positivas para el antígeno, comparación de v17597 (anticuerpo biparatópico anti-HER2 conjugado con el enlazador-toxina 001 con DAR4) y v10000 (anticuerpo anti-HER2 biparatópico original) que se une a (A) células de carcinoma de mama JIMT-1, y (B) células de carcinoma de vejiga RT-112, y (C ) comparación de v21252 (anticuerpo biparatópico anti-HER2 conjugado con el enlazador-toxina 001 con DAR2) y v10000 (anticuerpo biparatópico anti-HER2 original) que se une a células de carcinoma de mama JIMT-1.
La Figura 5 muestra los resultados del tratamiento de las líneas celulares de carcinoma de mama que expresan HER2 BT-474 (A), SK-BR-3 (B), HCC1954 (C), JIMT-1 (D) y ZR-75-1 (E), y la línea celular negativa para HER2 MDA-MB-468 (F) con v17597 (anticuerpo biparatópico anti-HER2 conjugado con el enlazador-toxina 001 con DAR4) y v21252 (anticuerpo biparatópico anti-HER2 conjugado con el enlazador-toxina 001 con DAR2).
La Figura 6 muestra los resultados del tratamiento de la línea celular de carcinoma de ovario que expresa HER2 SK-OV-3 (A), y las líneas celulares de carcinoma de mama ZR-75-1 (B) y JIMT-1 (C) con conjugados de anticuerpo-fármaco que comprenden v10000 conjugado con el enlazador-toxina 001 con varias DAR promedio. Las contribuciones individuales de las especies de DAR0, DAR2, DAR4 y DAR6 a la DAR promedio de los ADC que tienen una DAR promedio de 0,7, 2,2 y 3,9 se muestran en (D).
La Figura 7 muestra los resultados del tratamiento de ratones con xenoinjertos derivados de pacientes con cáncer de mama HBCx-13b cada 14d x2 con las dosis indicadas de (A) v17597 (anticuerpo biparatópico anti-HER2 conjugado con el enlazador-toxina 001 con DAR4) y (B) v21252 (anticuerpo biparatópico anti-HER2 conjugado con el enlazador-toxina 001 con DAR2). v15496 = vehículo.
La Figura 8 muestra los resultados del tratamiento de ratones con xenoinjertos derivados de pacientes con cáncer de mama ST-9101 vez al día con las dosis indicadas de (A) v17597 (anticuerpo biparatópico anti-HER2 conjugado con el enlazador-toxina 001 con DAR4) y (B) v21252 (anticuerpo biparatópico anti-HER2 conjugado con el enlazador-toxina 001 con DAR2). v15496 = vehículo.
La Figura 9 muestra (A) los perfiles de concentración sérica media (±SD) de v21252-tiempo, y (B) los perfiles de concentración sérica media (±SD) de anticuerpos totales-tiempo, después de la administración de una dosis única de v21252 a macacos cangrejeros hembra (n=3) de 9 mg/kg o 12 mg/kg.
La Figura 10 muestra los perfiles de concentración sérica media (±SD) de v21252-tiempo el día 1 (A) y el día 29 (B) después de una infusión quincenal de v21252 a macacos cangrejeros (n=6) de 12 mg/kg o 9 mg/kg.
La Figura 11 muestra los perfiles de concentración sérica media (±SD) de anticuerpos totales-tiempo el día 1 (A) y el día 29 (B) después de una infusión quincenal de v21252 a macacos cangrejeros (n=6) de 12 mg/kg o 9 mg/kg.
La Figura 12 muestra los perfiles de concentración sérica media (±SD)-tiempo tanto para v21252 como el anticuerpo total (conjugado y no conjugado) después de una infusión quincenal de v21252 a macacos cangrejeros (n=6) de 12 mg/kg o 9 mg/kg.
La Figura 13 muestra la internalización de v21252 conjugado con pHAb en comparación con trastuzumab conjugado con pHAb-enlazador-toxina 001 y el control negativo en (A) células SκΒR3 y (B) células JIMT-1.
La Figura 14 muestra la internalización de v21252 conjugado con pHAb (A) en comparación con trastuzumab conjugado con pHAb-enlazador-toxina 001 (B) en células SκΒR3 en varios puntos de tiempo como se indica. Los núcleos se muestran en gris y el pHAb se muestra en blanco.
La Figura 15 muestra la exposición comparativa en macacos cangrejeros y ratones tratados con v21252 con las dosis indicadas: (A) exposición en macacos cangrejeros y ratones a los que se les implantó por vía subcutánea un tumor derivado de paciente con HER2 alto (HBCx-13b), (B) exposición en macacos cangrejeros y ratones a los que se implantó por vía subcutánea un tumor derivado de paciente con HER2 bajo (ST-910).
La Figura 16 muestra los resultados del tratamiento de ratones con xenoinjerto derivado de paciente con cáncer de ovario LTL-654 semanal x4 con 3 mg/kg de vehículo o v21252.
La Figura 17 proporciona los resultados de supervivencia para ratones a los que se implantó por vía intracraneal células de tumor de mama BT-474 después de administración i.v. semanal de vehículo, conjugado de control (anticuerpo humanizado contra el virus respiratorio sincitial conjugado con el enlazador-toxina 001), v21252, v7155 (T-DM1, DAR3,5) y v24029 (trastuzumab conjugado con un inhibidor de la topoisomerasa I derivado del exatecán (DXd) con DAR8), cada uno en 6 mg/kg semanales durante 12 inyecciones en total.
La Figura 18 proporciona los resultados de supervivencia para ratones a los que se les implantó por vía intracraneal células de tumor de mama BT-474 después de administración i.v. de vehículo, conjugado de control (anticuerpo humanizado contra el virus respiratorio sincitial conjugado con el enlazador-toxina 001), o v7155 (T-DM1, DAR3,5) en 6 mg/kg semanales durante 12 inyecciones en total o v21252 o v24029 (trastuzumab conjugado con un inhibidor de la topoisomerasa I derivado de exatecán (DXd) con DAR8), cada uno en 6 mg/kg cada dos semanas durante 6 inyecciones en total.
Descripción detallada
La presente descripción se refiere a conjugados de anticuerpo biparatópico anti-HER2-fármaco (ADC) en los que el fármaco es un análogo de auristatina y está conjugado con el anticuerpo en una relación de fármaco a anticuerpo (DAR) promedio baja. Los ADC de DAR promedio baja (<3,9) como se describe en el presente documento tienen una tolerabilidad mejorada y una toxicidad reducida en comparación con un ADC correspondiente que tiene una DAR >3,9 cuando se administra con la misma dosis de toxina (análogo de auristatina). De particular interés son los ADC que tienen una DAR promedio de aproximadamente 2,5 o menos, tal como entre aproximadamente 1,8 y 2,5.
La presente descripción también se refiere a los ADC descritos en el presente documento para usar en el tratamiento de un cáncer que expresa HER2.
Definiciones
A menos que se defina de otro modo, todos los términos técnicos y científicos empleados en el presente documento tienen el mismo significado que entiende comúnmente un experto en la técnica.
El término "sujeto", como se usa en el presente documento, se refiere a un animal, en algunas realizaciones un mamífero, que es el objeto de tratamiento, observación o experimento. El animal puede ser un ser humano, un primate no humano, un animal de compañía (por ejemplo, perro, gato o similares), un animal de granja (por ejemplo, vaca, oveja, cerdo, caballo o similares) o un animal de laboratorio (por ejemplo, rata, ratón, conejillo de Indias, primate no humano o similar). En determinadas realizaciones, el sujeto es un ser humano.
El término "mamífero", tal como se utiliza en el presente documento, incluye, pero no se limita a, seres humanos, primates no humanos, caninos, felinos, murinos, bovinos, equinos y porcinos. En determinadas realizaciones, el mamífero es un ser humano.
Como se usa en el presente documento, el término "aproximadamente" se refiere a una variación de aproximadamente /-10% de un valor dado. Debe entenderse que dicha variación está siempre incluida en cualquier valor dado proporcionado en el presente documento, se mencione o no específicamente.
El uso de la palabra "un" o "una" cuando se usa en el presente documento junto con el término "que comprende" puede significar "uno", pero también está de acuerdo en determinadas realizaciones con el significado de "uno o más", "al menos uno" y "uno o más de uno"
Como se usa en el presente documento, los términos "que comprende", "que tiene", "que incluye" y "que contiene", y variaciones gramaticales de los mismos, son inclusivos o abiertos y no excluyen elementos y/o etapas de método adicionales, no mencionados. La expresión "que consiste esencialmente en" cuando se usa en el presente documento en relación con una composición, uso o método, indica que pueden estar presentes elementos y/o etapas de método adicionales, pero que estas adiciones no afectan materialmente a la manera en la que funciona la composición, método o uso mencionados. La expresión "que consiste en" cuando se usa en el presente documento en relación con una composición, uso o método, excluye la presencia de elementos y/o etapas de método adicionales. Una composición, uso o método descrito en el presente documento que comprende ciertos elementos y/o etapas también puede, en determinadas realizaciones, consistir esencialmente en esos elementos y/o etapas, y en otras realizaciones consistir en esos elementos y/o etapas, se mencionen o no específicamente estas realizaciones.
Está contemplado que cualquier realización comentada en el presente documento se puede implementar con respecto a cualquier método, uso o composición descritos en el presente documento.
Las funciones, estructuras y/o características particulares descritas en conexión con una realización descrita en el presente documento pueden combinarse con funciones, estructuras y/o características descritas en conexión con otra realización descrita en el presente documento de cualquier manera adecuada para proporcionar una o más realizaciones adicionales.
También debe entenderse que la exposición positiva de una característica en una realización sirve como base para excluir la característica en una realización alternativa. Por ejemplo, cuando se presenta una lista de opciones para una realización o reivindicación determinada, debe entenderse que pueden eliminarse una o más opciones de la lista y la lista abreviada puede formar una realización alternativa, se mencione o no específicamente dicha realización alternativa.
Conjugados de anticuerpo biparatópico anti-HER2-fármaco
Los conjugados de anticuerpo-fármaco (ADC) de la presente descripción comprenden un anticuerpo biparatópico anti-HER2 conjugado con una toxina por medio de un enlazador en una relación de fármaco a anticuerpo (DAR) promedio baja, siendo la toxina una toxina basada en auristatina (o "análogo de auristatina"). Se conocen en la técnica ejemplos de toxinas basadas en auristatina.
En determinadas realizaciones, el análogo de auristatina es un compuesto de Fórmula general (I):
X es -C(O)NHCH(CH<2>R2)-, o X está ausente;
R1 se selecciona de:
y
R2 es fenilo.
"DAR baja" como se usa en el presente documento, se define como una DAR promedio menor de 3,9, pero más de 0,5. En algunas realizaciones, la DAR promedio de los ADC es menor de 3,5. En algunas realizaciones, la DAR promedio de los ADC es menor de 3,4, por ejemplo, menor de 3,3, menor de 3,2 o menor de 3,1. En algunas realizaciones, la DAR promedio de los ADC es 3.0 o menos. En algunas realizaciones, la DAR promedio de los ADC es 2,9 o menos, por ejemplo, 2,8 o menos, 2,7 o menos, o 2,6 o menos. En algunas realizaciones, la DAR promedio de los ADC es 2,5 o menos, por ejemplo, 2,4 o menos, 2,3 o menos, o 2,2 o menos. En algunas realizaciones, la DAR promedio de los ADC es de aproximadamente 2,0.
En algunas realizaciones, la DAR promedio de los ADC está entre 0,5 y 3,8, por ejemplo, entre 0,5 y 3,5, o entre 0,5 y 2,5. En algunas realizaciones, la DAR promedio de los ADC está entre 0,7 y 3,8, por ejemplo, entre 0,7 y 3,5, entre 0,7 y 3,0, o entre 0,7 y 2,5. En algunas realizaciones, la DAR promedio de los a Dc está entre 1,0 y 3,8, por ejemplo, entre 1,0 y 3,5, entre 1,0 y 3,0, o entre 1,0 y 2,5. En algunas realizaciones, la DAR promedio de los a Dc está entre 1,5 y 3,8, por ejemplo, entre 15 y 3,5, entre 1,5 y 3,0, o entre 1,5 y 2,5. En algunas realizaciones, la DAR promedio de los a Dc está entre 1,6 y 3,8, por ejemplo, entre 1,6 y 3,5, entre 1,6 y 3,0, o entre 1,6 y 2,5. En algunas realizaciones, la DAR promedio de los ADC está entre 1,8 y 2,8, por ejemplo, entre 1,8 y 2,5.
Como se indicó anteriormente, los ADC de DAR promedio baja (<3,9) como se describen en el presente documento tienen una tolerabilidad mejorada y una toxicidad reducida en comparación con un ADC correspondiente que tiene una DAR >3,9 cuando se administra con la misma dosis de toxina. Como se sabe en la técnica, la mayoría de los métodos de conjugación producen una composición de ADC que incluye varias especies de DAR, siendo la DAR dada el promedio de las especies de DAR individuales. Sin estar limitado por ninguna teoría en particular, la mayor tolerabilidad y la menor toxicidad del ADC de DAR baja pueden deberse a una o ambas de una disminución de las especies de DAR alta (6 o más) en la composición del ADC y/o un aumento en las especies de DAR0 en la composición de ADC.
En determinadas realizaciones, las composiciones de ADC que incluyen una proporción de especies de DAR0 por encima de un cierto umbral pueden ser ventajosas. En consecuencia, en algunas realizaciones, la composición de ADC con DAR baja puede incluir 5% o más de especies de DAR0. En algunas realizaciones, la composición de ADC con dAr baja puede incluir 10% o más de especies de DAR0. En algunas realizaciones, la composición de ADC de DAR baja puede incluir 15% o más especies de DAR0, por ejemplo, 20% o más especies de DAR0. En algunas realizaciones, la composición de<a>D<c>de DAR baja puede incluir entre aproximadamente 5% y aproximadamente 50% de especies de DAR0. En algunas realizaciones, la composición de ADC de DAR baja puede incluir entre aproximadamente 10% y aproximadamente 50% de especies de DAR0, por ejemplo, entre aproximadamente 10% y aproximadamente 40%, entre aproximadamente 10% y aproximadamente 30% de especies de DAR0, o entre aproximadamente 10% y aproximadamente 25% de especies de DAR0. En algunas realizaciones, la composición de ADC de DAR baja puede incluir entre aproximadamente 12% y aproximadamente 28% de especies de DAR0, por ejemplo, entre aproximadamente 12% y aproximadamente 28% de especies de DAR0, o entre aproximadamente 15% y aproximadamente 25% de especies de DAR0.
En determinadas realizaciones, las composiciones de ADC que incluyen una proporción de especies de DAR6 o superiores por debajo de un cierto umbral pueden ser ventajosas. En consecuencia, en algunas realizaciones, la composición de a Dc de DAR baja puede incluir menos de aproximadamente 35% de DAR6 o especies superiores. En algunas realizaciones, la composición de ADC de DAR baja puede incluir 30% o menos de especies de DAR6 o superiores. En algunas realizaciones, la composición de ADC de DAR baja puede incluir 25% o menos de especies de DAR6 o superiores, por ejemplo, 20% o menos, 15% o menos, o 10% o menos de especies de DAR6 o superiores. En algunas realizaciones, la composición de ADC de DAR baja puede incluir 9% o menos de especies de DAR6 o superiores, por ejemplo, 8% o menos, 7% o menos, 6% o menos, o 5% o menos de especies de DAR6 o superiores. En algunas realizaciones, la composición de ADC de DAR baja puede incluir entre 0% y aproximadamente 35% de especies de DAR6 o superiores. En algunas realizaciones, la composición de ADC de DAR baja puede incluir entre 0% y aproximadamente 30% de especies de DAR6 o superiores, por ejemplo, entre 0% y aproximadamente 25%, o entre 0% y aproximadamente 20% de especies de DAR6 o superiores. En algunas realizaciones, la composición de ADC de DAR baja puede incluir entre 0% y aproximadamente 15% de especies de DAR6 o superiores, por ejemplo, entre aproximadamente 0% y aproximadamente 10%, entre aproximadamente 0% y aproximadamente 8%, o entre aproximadamente 0% y aproximadamente 5% de especies de DAR6 o superiores.
Ciertas realizaciones se refieren a ADC que comprenden un anticuerpo biparatópico anti-HER2 conjugado con un análogo de auristatina por medio de un enlazador (L) en una relación de fármaco a anticuerpo (DAR) promedio baja, teniendo el análogo de auristatina-enlazador la Fórmula general (II):
en donde X y R1 son como se definen para la Fórmula general (I);
L es el enlazador, y
representa el punto de unión del análogo de auristatina-enlazador al anticuerpo biparatópico anti-HER2.
Determinadas realizaciones se refieren a un ADC que tiene la Fórmula general (III):
L es un enlazador;
n es la relación de fármaco a anticuerpo (DAR) promedio y es inferior a 3,9, y
Ab es un anticuerpo biparatópico anti-HER2.
Anticuerpos biparatópicos anti-HER2
Los ADC descritos en el presente documento comprenden un anticuerpo biparatópico anti-HER2 que se une a dos epítopos diferentes de HER2.
El término "anticuerpo", como se usa en el presente documento, generalmente se refiere a una molécula de unión proteínica con funciones similares a inmunoglobulina. Los ejemplos típicos de un anticuerpo son inmunoglobulinas, así como derivados o fragmentos funcionales de las mismas que todavía conservan la especificidad de unión. Las técnicas para la producción de anticuerpos son bien conocidas en la técnica. El término "anticuerpo" también puede incluir inmunoglobulinas de diferentes clases (es decir, IgA, IgG, IgM, IgD e IgE) y subclases (tales como IgG<1>, IgG<2>, IgG3, IgG4, IgA<1>e IgA<2>). Ejemplos ilustrativos de un anticuerpo son anticuerpos completos y fragmentos de unión a antígeno de los mismos, tales como fragmentos Fab, F(ab')<2>, fragmentos Fv, fragmentos Fv monocatenarios (scFv), diacuerpos, anticuerpos de dominio y combinaciones de los mismos. Los anticuerpos de dominio pueden ser anticuerpos de dominio único, anticuerpos de dominio variable único o dominio variable único de inmunoglobulina que tiene un solo dominio variable, que puede ser un dominio variable de cadena pesada o un dominio variable de cadena ligera, que se unen específicamente a un antígeno o epítopo independientemente de otras regiones o dominios variables. El término "anticuerpo" también incluye realizaciones tales como anticuerpos quiméricos, de cadena única y humanizados.
Un anticuerpo completo típico comprende al menos dos cadenas pesadas (H) y dos cadenas ligeras (L) interconectadas por enlaces disulfuro. Cada cadena pesada está compuesta de una región variable de cadena pesada (VH) y una región constante de cadena pesada (CH). La región constante de cadena pesada comprende tres dominios: CH1, CH2y CH3. Los dominios constantes de cadena pesada que corresponden a las diferentes clases de inmunoglobulinas se conocen como a (IgA), 5 (IgD), £ (IgE),<y>(IgG) y |J (IgM). Cada cadena ligera está compuesta de una región variable de cadena ligera (VL) y una región constante de cadena ligera. La región constante de cadena ligera comprende solo un dominio: CL. Las cadenas ligeras se clasifican como kappa o lambda. Las regiones VH y VL también se pueden subdividir en regiones de hipervariabilidad, denominadas regiones determinantes de la complementariedad (CDR), intercaladas con regiones que están más conservadas, denominadas regiones armazón (FW). Cada VH y VL está compuesta por tres CDR y cuatro FW, dispuestas del extremo amino al extremo carboxi en el siguiente orden: FW1, CDR1, FW2, CDR2, FW3, CDR3, FW4. Las regiones variables de las cadenas pesadas y ligeras contienen un dominio de unión (un paratopo) que interacciona con un antígeno. Las regiones constantes de los anticuerpos pueden mediar en la unión de la inmunoglobulina a los tejidos o factores del hospedante, incluyendo varias células del sistema inmunitario (tales como las células efectoras) y C1q, que es un componente del sistema del complemento.
En determinadas realizaciones, los anticuerpos biparatópicos anti-HER2 para su inclusión en los ADC descritos en el presente documento comprenden dos construcciones de polipéptidos de unión a antígeno, cada una de las cuales se une a un epítopo diferente de HER2. Una "construcción de polipéptido de unión a antígeno", como se usa en el presente documento, puede ser una construcción basada en inmunoglobulina, por ejemplo, un fragmento de anticuerpo, o puede ser un formato mimético de anticuerpo no basado en inmunoglobulina, tal como una anticalina, un Fynomer, un Affimer, un alfacuerpo, una DARPin o un Avimer. En algunas realizaciones, las construcciones de polipéptidos de unión a antígeno comprendidas por el anticuerpo biparatópico anti-HER2 pueden ser construcciones basadas en inmunoglobulina. En algunas realizaciones, las construcciones de polipéptidos de unión a antígeno comprendidas por el anticuerpo biparatópico anti-HER2 pueden ser fragmentos de anticuerpos.
En determinadas realizaciones, las construcciones de polipéptidos de unión a antígeno comprendidas por el anticuerpo biparatópico anti-HER2 pueden ser cada una independientemente un fragmento Fab, un fragmento Fab', un scFv o un sdAb. En algunas realizaciones, las construcciones de polipéptidos de unión a antígeno comprendidas por el anticuerpo biparatópico anti-HER2 pueden ser cada una independientemente un fragmento Fab o un scFv. En algunas realizaciones, una construcción de polipéptido de unión a antígeno comprendida por el anticuerpo biparatópico anti-HER2 puede ser un fragmento Fab y la otra construcción de polipéptido de unión a antígeno puede ser un scFv.
En determinadas realizaciones, al menos una de las construcciones de polipéptidos de unión a antígeno comprendidas por el anticuerpo biparatópico anti-HER2 puede ser un fragmento Fab o un fragmento Fab'. Un "fragmento Fab" contiene el dominio constante de la cadena ligera (CL) y el primer dominio constante de la cadena pesada (CH1) junto con los dominios variables de las cadenas ligera y pesada (VL y VH, respectivamente). Los fragmentos Fab' se diferencian de los fragmentos Fab por la adición de unos pocos restos de aminoácidos en el extremo C del dominio CH1 de la cadena pesada, incluyendo una o más cisteínas de la región bisagra del anticuerpo. Un fragmento Fab también puede ser una molécula Fab monocatenaria, es decir, una molécula Fab en la que la cadena ligera de Fab y la cadena pesada de Fab están conectadas por medio de un enlazador peptídico para formar una cadena peptídica sencilla. Por ejemplo, el extremo C de la cadena ligera de Fab puede estar conectado al extremo N de la cadena pesada de Fab en la molécula Fab monocatenaria.
En determinadas realizaciones, al menos una de las construcciones de polipéptidos de unión a antígeno comprendidas por el anticuerpo biparatópico anti-HER2 puede ser un Fv monocatenario (scFv). Un "scFv" incluye un dominio variable de cadena pesada (VH) y un dominio variable de cadena ligera (VL) de un anticuerpo en una sola cadena polipeptídica. Opcionalmente, el scFv puede comprender además un enlazar polipeptídico entre los dominios VH y VL que permite que el scFv forme una estructura deseada de unión al antígeno. Por ejemplo, un scFv puede incluir un VL conectado desde su extremo C al extremo N de un VH mediante un enlazador polipeptídico. Alternativamente, un scFv puede comprender un VH conectado por su extremo C al extremo N de un VL por medio de una cadena polipeptídica o enlazador (véase la revisión en Pluckthun en The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, vol. 113, Rosenburg y Moore eds., Springer-Verlag, Nueva York, págs. 269-315 (1994)).
En determinadas realizaciones, al menos una de las construcciones de polipéptidos de unión a antígeno comprendidas por el anticuerpo biparatópico anti-HER2 puede estar en un formato de anticuerpo de dominio único (sdAb). Un formato sdAb se refiere a un solo dominio de inmunoglobulina. El sdAb puede ser, por ejemplo, de origen camélido. Los anticuerpos de camélidos carecen de cadenas ligeras y sus sitios de unión a antígeno consisten en un único dominio, denominado "VHH". Un sdAb comprende tres CDR/bucles hipervariables que forman el sitio de unión a antígeno: CDR1, CDR2 y CDR3. Los sdAbs son bastante estables y fáciles de expresar, por ejemplo, como una fusión con la cadena Fc de un anticuerpo (véase, por ejemplo, Harmsen y De Haard,Appl. Microbio! Biotechnol.77(1): 13-22 (2007)).
Formatos de anticuerpos
Los anticuerpos biparatópicos anti-HER2 para su inclusión en los ADC descritos en el presente documento pueden tener varios formatos. Los componentes mínimos del anticuerpo biparatópico anti-HER2 son una primera construcción de polipéptido de unión a antígeno que se une a un primer epítopo de HER2 y una segunda construcción de polipéptido de unión a antígeno que se une a un segundo epítopo de HER2, siendo el primer y el segundo epítopo de HER2 diferentes. Un anticuerpo que comprende dos construcciones de polipéptidos de unión a antígeno que se unen a diferentes epítopos de HER2 puede considerarse que es un anticuerpo bivalente, biparatópico. Ciertas realizaciones se refieren a anticuerpos biparatópicos anti-HER2 bivalentes. En algunas realizaciones, el anticuerpo biparatópico anti-HER2 puede comprender una o más construcciones de polipéptidos de unión a antígeno adicionales, cada una de las cuales se une al primer o segundo epítopo de HER2. Por ejemplo, en algunas realizaciones, el anticuerpo biparatópico anti-HER2 puede ser trivalente o tetravalente.
En algunas realizaciones, el anticuerpo biparatópico anti-HER2 comprende además un enlazador que une la primera y segunda construcciones de polipéptidos de unión a antígeno. En algunas realizaciones, el anticuerpo biparatópico anti-HER2 comprende además un armazón y la primera y segunda construcciones de polipéptidos de unión a antígeno están unidas operativamente al armazón. La expresión "unido operativamente", como se utiliza en el presente documento, significa que los componentes descritos están en una relación que les permite funcionar de la manera prevista.
Por lo tanto, se puede considerar que los anticuerpos biparatópicos anti-HER2 tienen una arquitectura modular que incluye dos módulos de construcción de polipéptido de unión a antígeno y, opcionalmente, uno de o tanto un módulo enlazador como un módulo de armazón. Un experto en la técnica entenderá que estos módulos se pueden combinar de varias maneras para proporcionar anticuerpos biparatópicos anti-HER2 que tienen diferentes formatos. Estos formatos se basan generalmente en formatos de anticuerpos conocidos en la técnica (véase, por ejemplo, revisión de Brinkmann y Kontermann,MABS,9(2): 182-212 (2017), y Müller y Kontermann, "Bispecific Antibodies" en Handbook of Therapeutic Antibodies, Wiley-VCH Verlag GmbH & Co. (2014)).
En determinadas realizaciones, el anticuerpo biparatópico anti-HER2 comprende dos construcciones de polipéptidos de unión a antígeno unidas operativamente a un armazón. Los armazones adecuados se describen a continuación. En algunas realizaciones, el anticuerpo biparatópico anti-HER2 comprende dos construcciones de polipéptidos de unión a antígeno unidas operativamente a un armazón, y al menos una de las construcciones de polipéptidos de unión a antígeno es un scFv. En algunas realizaciones, el anticuerpo biparatópico anti-HER2 comprende dos construcciones de polipéptidos de unión a antígeno unidas operativamente a un armazón, y al menos una de las construcciones de polipéptidos de unión a antígeno es un Fab.
En algunas realizaciones, el anticuerpo biparatópico anti-HER2 puede comprender tres o cuatro construcciones de polipéptidos de unión a antígeno y un armazón. En este formato, al menos la primera y segunda construcciones de unión a antígeno están operativamente unidas al armazón. Las construcciones tercera y cuarta opcionales de polipéptidos de unión a antígeno pueden estar cada una independientemente unidas operativamente al armazón o a la primera construcción de polipéptido de unión a antígeno o a la segunda construcción de polipéptido de unión a antígeno.
Los anticuerpos biparatópicos anti-HER2 que carecen de un armazón comprenden típicamente dos construcciones de polipéptidos de unión a antígeno unidas operativamente por uno o más enlazadores. Las construcciones de polipéptidos de unión a antígeno pueden estar en forma de scFv, Fab, sdAb o una combinación de los mismos. Por ejemplo, utilizando scFv como construcciones de polipéptidos de unión a antígeno, pueden construirse formatos tales como scFv en tándem ((scFv)<2>o taFv), en los que los scFv están conectados entre sí mediante un enlazador flexible. Los scFv también se pueden usar para construir formatos de diacuerpo, que comprenden dos scFv conectados por un enlazador corto (normalmente aproximadamente 5 aminoácidos de longitud). La longitud restringida del enlazador da como resultado la dimerización de los scFv de una manera de cabeza a cola. En cualquiera de los formatos anteriores, los scFv pueden estabilizarse aún más mediante la inclusión de un enlace disulfuro entre dominios. Por ejemplo, se puede introducir un enlace disulfuro entre VL y VH mediante la introducción de un resto de cisteína adicional en cada cadena (por ejemplo, en la posición 44 en VH y 100 en VL) (véase, por ejemplo, Fitzgerald et al.,Protein Engineering,10: 1221-1225 (1997)), o puede introducirse un enlace disulfuro entre dos VH para proporcionar una construcción que tenga un formato DART (véase, por ejemplo, Johnson et al.,J Mol. Biol., 399:436-449 (2010)).
De manera similar, en algunas realizaciones se pueden emplear formatos que comprenden dos sdAb, tales como VH o VHH, conectados entre sí por medio de un enlazador adecuado.
Otros ejemplos de formatos de anticuerpos biparatópicos anti-HER2 que carecen de un armazón incluyen aquellos basados en fragmentos Fab, por ejemplo, formatos Fab<2>y F(ab')<2>, en los que los fragmentos Fab están conectados por medio de un enlazador o una región bisagra de IgG.
Las combinaciones de construcciones de polipéptidos de unión a antígeno en diferentes formas también se pueden emplear para generar formatos sin armazón alternativos. Por ejemplo, se puede fusionar un scFv o un sdAb al extremo C de una o ambas cadenas ligera y pesada de un fragmento Fab dando como resultado una construcción bivalente (Fab-scFv/sdAb).
En determinadas realizaciones, el anticuerpo biparatópico anti-HER2 puede comprender dos construcciones de polipéptidos de unión a antígeno y uno o más enlazadores, y no incluye un armazón. En algunas realizaciones, el anticuerpo biparatópico anti-HER2 comprende dos construcciones de polipéptidos de unión a antígeno que son scFv, Fab, sdAb, o una combinación de los mismos, y uno o más enlazadores, y no incluye un armazón.
Armazones
Los anticuerpos biparatópicos anti-HER2 que comprenden un armazón pueden construirse uniendo las dos construcciones de polipéptidos de unión a antígeno a un armazón adecuado. Las construcciones de polipéptidos de unión a antígeno pueden estar en una o en combinación de las formas descritas anteriormente (por ejemplo, scFv, Fab y/o sdAb). Ejemplos de armazones adecuados se describen con más detalle a continuación e incluyen, pero no se limitan a, regiones Fc de inmunoglobulina, albúmina, análogos y derivados de albúmina, péptidos de heterodimerización (tales como cremalleras de leucina, péptidos "cremallera" formadores de heterodímeros derivados de Jun y Fos, dominios CH1 y CL de IgG o toxinas barnasa-barstar), citocinas, quimiocinas o factores de crecimiento. Otros ejemplos incluyen anticuerpos basados en la tecnología DOCK-AND-LOCK™ (DNL™) desarrollada por IBC Pharmaceuticals, Inc. e Immunomedics, Inc. (véase, por ejemplo, Chang, et al.,Clin Cáncer Res13:5586s-5591s (2007)).
En algunas realizaciones, los anticuerpos biparatópicos anti-HER2 comprenden dos o más construcciones de polipéptidos de unión a antígeno y un armazón. En algunas realizaciones, los anticuerpos biparatópicos anti-HER2 comprenden dos construcciones de polipéptidos de unión a antígeno unidas operativamente a un armazón.
Un armazón puede ser un péptido, polipéptido, polímero, nanopartícula u otra entidad química. Cuando el armazón es un polipéptido, cada construcción de polipéptido de unión a antígeno del anticuerpo biparatópico anti-HER2 puede unirse al extremo N o C del armazón polipeptídico. También se contemplan en determinadas realizaciones anticuerpos biparatópicos anti-HER2 que comprenden un armazón polipeptídico en el que una o más de las construcciones de polipéptidos de unión a antígeno están unidas a una región distinta del extremo N o C, por ejemplo, a través de la cadena lateral de un aminoácido con o sin un enlazador.
En realizaciones donde el armazón es un péptido o polipéptido, las construcciones de polipéptidos de unión a antígeno pueden unirse al armazón mediante fusión genética o conjugación química. Típicamente, cuando el armazón es un péptido o polipéptido, las construcciones de polipéptidos de unión a antígeno se unen al armazón por fusión genética. En algunas realizaciones, cuando el armazón es un polímero o una nanopartícula, las construcciones de polipéptidos de unión a antígeno pueden unirse al armazón mediante conjugación química.
En la técnica se conocen una serie de dominios de proteína que comprenden pares selectivos de dos polipéptidos diferentes y se pueden usar para formar un armazón. Un ejemplo son los dominios de cremallera de leucina tales como Fos y Jun que se emparejan selectivamente (Kostelny, et al.,J Immunol,148:1547-53 (1992); Wranik, et al.,J. Biol. Chem.,287: 43331-43339 (2012)). Otros pares moleculares de emparejamiento selectivo incluyen, por ejemplo, el par barnasa barstar (Deyev, et al.,Nat Biotechnol,21:1486-1492 (2003)), pares de cadenas de ADN (Chaudri, et al.,FEBS Letters,450(1-2):23-26 (1999)) y pares de proteínas fluorescentes divididas (publicación de solicitud de patente internacional n.° WO 2011/135040).
Otros ejemplos de armazones de proteína incluyen regiones Fc de inmunoglobulina, albúmina, análogos y derivados de albúmina, toxinas, citocinas, quimiocinas y factores de crecimiento. Se ha descrito el uso de armazones de proteína en combinación con restos de unión a antígenos (véase, por ejemplo, Müller et al.,J Biol Chem,282:12650-12660 (2007); McDonaugh et al.,Mol Cancer Ther,11:582-593 (2012); Vallera et al.,Clin Cancer Res,11:3879-3888 (2005); Song et al.,Biotech Appl Biochem,45: 147-154 (2006), y publicación de solicitud de patente de EE. UU. n.° 2009/0285816).
Por ejemplo, se ha demostrado que fusionar restos de unión a antígeno tales como scFv, diacuerpos o diacuerpos monocatenarios a albúmina mejora la semivida en suero de las fracciones de unión a antígeno (Mülleret al., ib.).Los restos de unión a antígeno pueden fusionarse en los extremos N y/o C de la albúmina, opcionalmente por medio de un enlazador.
Se han descrito derivados de albúmina en forma de heteromultímeros que comprenden dos polipéptidos transportadores obtenidos por segmentación de una proteína de albúmina de manera que los polipéptidos transportadores se autoensamblan para formar albúmina cuasinativa (véase las publicaciones de solicitud de patente internacional N.° WO 2012/116453 y WO 2014/012082). Como resultado de la segmentación de la albúmina, el heteromultímero incluye cuatro extremos y, por lo tanto, puede fusionarse con hasta cuatro restos de unión a antígeno diferentes, opcionalmente mediante enlazadores.
En determinadas realizaciones, el anticuerpo biparatópico anti-HER2 puede comprender un armazón proteico. En algunas realizaciones, el anticuerpo biparatópico anti-HER2 puede comprender un armazón proteico que se basa en una región Fc de inmunoglobulina, una albúmina o un análogo o derivado de albúmina. En algunas realizaciones, el anticuerpo biparatópico anti-HER2 puede comprender un armazón proteico que se basa en una región Fc de inmunoglobulina, por ejemplo, una región Fc de IgG.
En algunas realizaciones, el anticuerpo biparatópico anti-HER2 puede comprender un armazón proteico que se basa en una albúmina, por ejemplo, albúmina de suero humano (HSA), o un análogo o derivado de albúmina. En algunas realizaciones, el anticuerpo biparatópico anti-HER2 puede comprender un armazón de proteína que se basa en un derivado de albúmina como se describe en la publicación de solicitud de patente internacional N.° WO 2012/116453 o WO 2014/012082.
Regiones Fc
Las expresiones "región Fc", "Fc" o "dominio Fc" como se usan en el presente documento se refieren a una región C-terminal de una cadena pesada de inmunoglobulina que contiene al menos una porción de la región constante. La expresión incluye regiones Fc de secuencia natural y regiones Fc variantes. A menos que se especifique lo contrario en el presente documento, la numeración de los restos de aminoácidos en la región Fc o región constante es según el sistema de numeración EU, también denominado índice EU, como se describe en Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5a. ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991).
En determinadas realizaciones, los anticuerpos biparatópicos anti-HER2 pueden comprender un armazón que se basa en una región Fc de inmunoglobulina. En algunas realizaciones, la región Fc puede ser dimérica y estar compuesta por dos polipéptidos Fc. En algunas realizaciones, la región Fc puede estar compuesta por un solo polipéptido.
Un "polipéptido Fc" de un Fc dimérico se refiere a uno de los dos polipéptidos que forman el dominio Fc dimérico, es decir, un polipéptido que comprende una o más regiones constantes C-terminales de una cadena pesada de inmunoglobulina que es capaz de una autoasociación estable. Las expresiones "primer polipéptido Fc" y "segundo polipéptido Fc" pueden usarse indistintamente con la condición de que la región Fc comprenda un primer polipéptido Fc y un segundo polipéptido Fc
Una región Fc comprende un dominio CH3o tanto un dominio CH3como uno CH2. Por ejemplo, un polipéptido Fc de una región Fc de IgG dimérico comprende una secuencia de dominio constante CH2de IgG y de CH3de IgG. El dominio CH3comprende dos secuencias de CH3, una de cada uno de los dos polipéptidos Fc de la región Fc dimérica. El dominio CH2comprende dos secuencias CH2, una de cada uno de los dos polipéptidos Fc de la región Fc dimérica.
En algunas realizaciones, el anticuerpo biparatópico anti-HER2 puede comprender un armazón que se basa en una región Fc de IgG. En algunas realizaciones, el anticuerpo biparatópico anti-HER2 puede comprender un armazón que se basa en una región Fc humana. En algunas realizaciones, el anticuerpo biparatópico anti-HER2 puede comprender un armazón basado en una región Fc de IgG humana, por ejemplo, una región Fc de IgG1 humana.
En determinadas realizaciones, el anticuerpo biparatópico anti-HER2 puede comprender un armazón basado en una región Fc de IgG, que es una región Fc heterodímera, que comprende un primer polipéptido Fc y un segundo polipéptido Fc, comprendiendo cada uno una secuencia CH3, y opcionalmente una secuencia CH2.
En algunas realizaciones, el anticuerpo biparatópico anti-HER2 puede comprender un armazón basado en una región Fc que comprende el primer y segundo polipéptidos Fc, y la primera construcción de polipéptido de unión a antígeno está unida operativamente al primer polipéptido Fc y la segunda construcción de polipéptido de unión a antígeno está operativamente unida al segundo polipéptido Fc.
En algunas realizaciones, el anticuerpo biparatópico anti-HER2 puede comprender un armazón basado en una región Fc que comprende el primer y segundo polipéptidos Fc, en el que la primera construcción de polipéptido de unión a antígeno está unida operativamente al primer polipéptido Fc y la segunda construcción de polipéptido de unión a antígeno está unida operativamente al segundo polipéptido Fc, y en el que la primera y segunda construcciones de polipéptidos de unión a antígeno son independientemente un fragmento Fab o un scFv.
En algunas realizaciones, el anticuerpo biparatópico anti-HER2 puede comprender un armazón basado en una región Fc que comprende dos secuencias de CH3, al menos una de las cuales comprende una o más modificaciones de aminoácidos. En algunas realizaciones, el anticuerpo biparatópico anti-HER2 puede comprender un armazón basado en una región Fc que comprende dos secuencias de CH3y dos secuencias de CH2, comprendiendo al menos una de las secuencias de CH2una o más modificaciones de aminoácidos.
En algunas realizaciones, el anticuerpo biparatópico anti-HER2 comprende una región Fc heterodímera que comprende un dominio CH3modificado, en donde el dominio CH3modificado es un dominio CH3modificado asimétricamente. Generalmente, el primer polipéptido Fc del Fc heterodímero comprende una primera secuencia de CH3y el segundo polipéptido Fc comprende una segunda secuencia de CH3.
Como se usa en el presente documento, "modificación asimétrica de aminoácidos" se refiere a una modificación donde un aminoácido en una posición específica en una primera secuencia de CH3es diferente al aminoácido en una segunda secuencia de CH3en la misma posición. Para las secuencias de CH3que comprenden modificaciones asimétricas de aminoácidos, la primera y la segunda secuencia de CH3normalmente se emparejarán preferentemente para formar un heterodímero, en lugar de un homodímero. Estas modificaciones asimétricas de aminoácidos pueden ser un resultado de la modificación de sólo uno de los dos aminoácidos en la misma posición respectiva de aminoácidos en cada secuencia, o de modificaciones diferentes de ambos aminoácidos en cada secuencia en la misma posición respectiva en cada una de la primera y segunda secuencia de CH3. Cada una de la primera y segunda secuencia de CH3de un Fc heterodímero puede comprender una o más de una modificación de aminoácidos asimétrica.
En algunas realizaciones, el anticuerpo biparatópico anti-HER2 puede comprender un armazón basado en una región Fc modificada como se describe en la publicación de solicitud de patente internacional N.° WO 2012/058768 o WO 2013/063702.
La Tabla 1 proporciona la secuencia de aminoácidos de la secuencia Fc de IgG1 humana (1), correspondiente a los aminoácidos 231 a 447 de la cadena pesada de IgG1 humana de longitud completa. La secuencia de CH3comprende los aminoácidos 341-447 de la cadena pesada de IgG1 humana de longitud completa.
En determinadas realizaciones, el anticuerpo biparatópico anti-HER2 puede comprender un armazón de Fc heterodímero que comprende un dominio de CH3modificado que comprende modificaciones de aminoácidos asimétricas que promueven la formación de un Fc heterodímero en lugar de un Fc homodímero. En algunas realizaciones, el anticuerpo biparatópico anti-HER2 puede comprender un armazón Fc heterodímero que incluye modificaciones en una o más de las siguientes posiciones: L351, F405, Y407, T366, K392, T394, T350, S400 y/o N390, usando la numeración EU.
En determinadas realizaciones, el anticuerpo biparatópico anti-HER2 puede comprender un Fc heterodímero que comprende un dominio CH3modificado que tiene una primera secuencia polipeptídica que comprende modificaciones de aminoácidos en las posiciones F405 e Y407, y opcionalmente comprende además una modificación de aminoácido en la posición L351, y una segunda secuencia polipeptídica que comprende modificaciones de aminoácidos en las posiciones T366 y T394, y opcionalmente comprende además una modificación de aminoácido en la posición K392. En algunas realizaciones, una primera secuencia polipeptídica del dominio CH3modificado puede comprender modificaciones de aminoácidos en las posiciones F405 e Y407, y opcionalmente comprende además una modificación de aminoácidos en la posición L351, y una segunda secuencia polipeptídica del dominio CH3modificado comprende modificaciones de aminoácidos en las posiciones T366 y T394, y opcionalmente comprende además una modificación de aminoácido en la posición K392, y la modificación de aminoácido en la posición F405 es F405A, F405I, F405M, F405S, F405T o F405V; la modificación de aminoácido en la posición Y407 es Y407I o Y407V; la modificación de aminoácido en la posición T366 es T366I, T366L o T366M; la modificación de aminoácido en la posición T394 es T394W; la modificación de aminoácido en la posición L351 es L351Y, y la modificación de aminoácido en la posición K392 es K392F, K392L o K392M. En algunas realizaciones, la modificación de aminoácido en la posición F405 es F405A, F405S, F405T o F405V.
En algunas realizaciones, el anticuerpo biparatópico anti-HER2 puede comprender un Fc heterodímero que comprende un dominio CH3modificado que tiene una primera secuencia polipeptídica de Fc que comprende modificaciones de aminoácidos en las posiciones F405 e Y407, y opcionalmente comprende además una modificación de aminoácido en la posición L351, y un segunda secuencia polipeptídica de Fc que comprende modificaciones de aminoácidos en las posiciones T366 y T394, y opcionalmente comprende además una modificación de aminoácido en la posición K392, y la modificación de aminoácido en la posición F405 es F405A, F405I, F405M, F405S, F405T o F405V; la modificación de aminoácido en la posición Y407 es Y407I o Y407V; la modificación de aminoácido en la posición T366 es T366I, T366L o T366M; la modificación de aminoácido en la posición T394 es T394W; la modificación de aminoácido en la posición L351 es L351Y, y la modificación de aminoácidos en la posición K392 es K392F, K392L o K392M, y una o tanto la primera como la segunda secuencia polipeptídica de Fc comprende además la modificación de aminoácido T350V. En algunas realizaciones, la modificación de aminoácido en la posición F405 es F405A, F405S, F405T o F405V.
En determinadas realizaciones, el anticuerpo biparatópico anti-HER2 puede comprender un Fc heterodímero que comprende un dominio CH3modificado como se describió anteriormente, en el que la primera secuencia polipeptídica de Fc comprende modificaciones de aminoácidos en las posiciones F405 e Y407, y opcionalmente comprende además una modificación de aminoácido en la posición l351, y la segunda secuencia polipeptídica de Fc comprende modificaciones de aminoácidos en las posiciones T366 y T394, y opcionalmente comprende además una modificación de aminoácido en la posición K392, y en la que la primera secuencia polipeptídica de Fc comprende además una modificación de aminoácidos en una o en ambas de las posiciones S400 o Q347 y/o la segunda secuencia polipeptídica de Fc comprende además una modificación de aminoácidos en una o ambas de las posiciones K360 o N390, donde la modificación de aminoácido en la posición S400 es S400E, S400D, S400R o S400K; la modificación de aminoácido en la posición Q347 es Q347R, Q347E o Q347K; la modificación de aminoácido en la posición K360 es K360D o K360E, y la modificación de aminoácido en la posición N390 es N390R, N390K o N390D. En algunas realizaciones, la modificación de aminoácidos en la posición F405 es F405A, F405S, F405T o F405V.
En algunas realizaciones, el anticuerpo biparatópico anti-HER2 puede comprender un armazón Fc heterodímero que tiene un dominio CH3modificado que comprende las modificaciones de una cualquiera de la variante 1, variante 2, variante 3, variante 4 o variante 5, como se muestra en la Tabla 1.
Tabla 1: Secuencias de Fc de IgG1
En determinadas realizaciones, el anticuerpo biparatópico anti-HER2 puede comprender un armazón Fc heterodímero que tiene un dominio CH3modificado con una primera secuencia de CH3que comprende una o más modificaciones de aminoácidos seleccionadas de L351Y, F405A e Y407V, y la segunda secuencia de CH3que comprende las modificaciones de aminoácidos T366L o T366I; K392L o K392M y T394W, y una o tanto la primera como la segunda secuencia de CH3pueden comprender además opcionalmente la modificación de aminoácido T350V.
En determinadas realizaciones, el anticuerpo biparatópico anti-HER2 puede comprender un armazón de Fc heterodímero que tiene un dominio CH3modificado que comprende modificaciones de aminoácidos asimétricas como se describió anteriormente que favorecen la formación de un Fc heterodímero en el que el dominio CH3heterodímero tiene una estabilidad que es comparable a un dominio CH3homodímero de tipo natural. La estabilidad del dominio CH3se puede evaluar midiendo la temperatura de fusión (Tm) del dominio CH3, por ejemplo, mediante calorimetría diferencial de barrido (DSC). En algunas realizaciones, la una o más modificaciones asimétricas de aminoácidos favorecen la formación de un dominio Fc heterodímero en el que el dominio CH3tiene una estabilidad como se observa por la temperatura de fusión (Tm) en un estudio de calorimetría diferencial de barrido que está dentro de aproximadamente 8°C , por ejemplo, dentro de aproximadamente 7°C, aproximadamente 6°C, aproximadamente 5°C o aproximadamente 4°C, de lo observado para el correspondiente dominio CH3homodímero simétrico de tipo natural.
Se puede formar un Fc heterodímero que comprende secuencias de CH3modificadas con una pureza de al menos aproximadamente 75% en comparación con el Fc homodímero en el producto expresado. En algunas realizaciones, el anticuerpo biparatópico anti-HER2 puede comprender un armazón de Fc heterodímero que tiene un dominio CH3modificado que comprende modificaciones de aminoácidos asimétricas que favorecen la formación de un Fc heterodímero con una pureza mayor de aproximadamente 80%, mayor de aproximadamente 85%, mayor de aproximadamente 90%, mayor de aproximadamente 95% o mayor de aproximadamente 97%
Métodos adicionales para modificar polipéptidos Fc monoméricos para favorecer la formación de Fc heterodímeros son conocidos en la técnica e incluyen, por ejemplo, los descritos en la publicación de solicitud de patente internacional N.° WO 96/027011 (botones en agujeros); Gunasekaran et al.J Biol Chem,285, 19637-46 (2010) (diseño electrostático para conseguir heterodimerización selectiva); Davis et al.,Prot Eng Des Sel,23(4):195-202 (2010) (tecnología de dominio de ingeniería de intercambio de cadenas (SEED)), y Labrijn et al.,Proc Natl Acad Sci USA,110(13):5145-50 (2013) intercambio Fab-brazo).
En algunas realizaciones, en las que el anticuerpo biparatópico anti-HER2 comprende un armazón Fc heterodímero, el Fc heterodímero también comprende un dominio CH2. En algunas realizaciones, el dominio CH2es un dominio CH2modificado. Un ejemplo de un dominio CH2de un Fc son los aminoácidos 231-340 de la secuencia mostrada en la Tabla 1. Varias funciones efectoras son mediadas por receptores de Fc (FcR), que se unen al Fc de un anticuerpo.
Los receptores Fc (FcR) incluyen receptores de las subclases FcyRI, FcyRII y FcyRIII, incluidas variantes alélicas y formas de empalme alternativo de estos receptores. El término FcR también puede incluir en determinadas realizaciones el receptor neonatal, FcRn.
Las modificaciones en el dominio CH2pueden afectar a la unión de los FcR al Fc. Se conocen en la técnica una serie de modificaciones de aminoácidos en la región Fc para alterar selectivamente la afinidad de Fc por diferentes receptores Fcy. En algunas realizaciones, en las que el anticuerpo biparatópico anti-HER2 comprende un armazón Fc heterodímero que tiene un dominio CH2modificado, el dominio CH2modificado puede comprender una o más modificaciones para favorecer la unión selectiva de los receptores de Fcy.
Los ejemplos no limitantes de modificaciones que alteran la unión de Fc por FcR incluyen S298A/E333A/K334A y S298A/E333A/K334A/K326A (Lu, et al.,J. Immunol. Methods,365(1-2):132-41 (2011)); F243L/R292P/Y300L/V305I/P396L y F243L/R292P/Y300L/L235V/P396L (Stavenhagen, et al., Cancer Res, 67(18):8882-90 (2007) y Nordstrom JL, et al.,Breast Cancer Res,13(6):R123 (2011)); F243L (Stewart, et al.,Protein Eng Des Sel.24(9):671-8 (2011)); S298A/E333A/K334A (Shields, et al.,J Biol Chem,276(9):6591-604 (2001)); S239D/I332E/A330L y S239D/I332E (Lazar, et al.,Proc Natl Acad Sci USA,103(11):4005-10 (2006)); S239D/S267E y S267E/L328F (Chu, et al.,Mol Immunol,45(15):3926-33 (2008)). Las modificaciones adicionales que afectan a la unión de Fc por los FcR se describen enTherapeutic Antibody Engineering(Strohl y Strohl, Woodhead Publishing series enBiomedicineN.° 11, ISBN 1907568379, Oct 2012, página 283). Las regiones Fc que comprenden modificaciones asimétricas que afectan a la unión por los FcR se describen en la publicación de patente internacional N.° WO 2014/190441.
Se pueden realizar modificaciones adicionales en las regiones Fc para mejorar su capacidad para mediar en la función efectora. Dichas modificaciones son conocidas en la técnica e incluyen la afucosilación, o ingeniería de la afinidad del Fc hacia un receptor activador, principalmente FcYRIIIa para ADCC, y hacia C1q para CDC. En determinadas realizaciones, el anticuerpo biparatópico anti-HER2 puede comprender una región Fc modificada para mejorar su capacidad para mediar la función efectora.
Los métodos para producir anticuerpos con poca o ninguna fucosa en el sitio de glicosilación de Fc (Asn 297, numeración EU) sin alterar la secuencia de aminoácidos son bien conocidos en la técnica. Por ejemplo, la tecnología GlymaX® (ProBioGen AG) (véase von Horsten et al.,Glycobiology,20(12):1607-18 (2010) y la patente de EE. UU. N.° 8,409,572). En determinadas realizaciones, el anticuerpo biparatópico anti-HER2 puede comprender una región Fc que está aglicosilada. En este contexto, el anticuerpo biparatópico anti-HER2 puede estar totalmente afucosilado (es decir, sin fucosa detectable) o parcialmente afucosilado, de modo que el anticuerpo biparatópico anti-HER2 contenga menos de 95%, menos de 85%, menos de 75%, menos de 65%, menos de 55%, menos de 45%, menos de 35%, menos de 25%, menos de 15% o menos de 5%, o cualquier cantidad intermedia, de la cantidad de fucosa normalmente detectada para una construcción similar producida por un sistema de expresión de mamíferos.
Las modificaciones de Fc que reducen la unión de FcyR y/o el complemento y/o la función efectora se conocen en la técnica e incluyen las descritas anteriormente. Diversas publicaciones describen estrategias que se han utilizado para diseñar anticuerpos con actividad efectora reducida o silenciada (véase, por ejemplo, Strohl,Curr Opin Biotech20:685-691 (2009), y Strohl y Strohl, "Antibody Fc engineering for optimal antibody performance". En Therapeutic Antibody Engineering, Cambridge: Woodhead Publishing (2012), págs. 225-249). Estas estrategias incluyen la reducción de la función efectora a través de la modificación de la glicosilación, el uso de armazones de IgG2/IgG4 o la introducción de mutaciones en las regiones bisagra o CH2del Fc (véase también, publicación de patente de EE. UU. N.° 2011/0212087, publicación de patente internacional N.° WO 2006/105338, publicación de patente de EE. UU. N.° 2012/0225058, publicación de patente de EE. UU. N.° 2012/0251531 y Strop et al.,J. Mol Biol.420: 204-219 (2012)).
Ejemplos específicos, no limitantes, de modificaciones de aminoácidos conocidas para reducir la unión de FcyR o del complemento a Fc incluyen los identificados en la Tabla 2.
Tabla 2: Modificaciones para reducir la unión de FcyR o del complemento al Fc
En algunas realizaciones, el anticuerpo biparatópico anti-HER2 puede comprender una región Fc que comprende un dominio CH2modificado que tiene una o más mutaciones identificadas en la T abla 2. En algunas realizaciones, el anticuerpo biparatópico anti-HER2 puede comprender una región Fc que comprende un dominio CH2modificado que tiene modificaciones de aminoácidos en las posiciones L234, L235 y/o D265. En algunas realizaciones, el anticuerpo biparatópico anti-HER2 puede comprender una región Fc que comprende un dominio CH2modificado que tiene las modificaciones de aminoácidos L234A, L235A y D265S.
Epítopos de HER2
Las dos construcciones de polipéptidos de unión a antígeno compuestas por el anticuerpo biparatópico anti-HER2 se unen cada una a un epítopo diferente de HER2, es decir, una primera construcción de polipéptido de unión a antígeno se une a un primer epítopo de HER2 y a una segunda construcción de polipéptido de unión a antígeno se une a un segundo epítopo de HER2. En el contexto de la presente descripción, cada una de las construcciones de polipéptidos de unión a antígeno se une específicamente a su epítopo diana.
"Se une específicamente" o "unión específica" significa que la unión es selectiva para el antígeno y puede discriminarse de interacciones no deseadas o no específicas. La capacidad de una construcción de polipéptido de unión a antígeno para unirse a un epítopo específico se puede medir, por ejemplo, mediante un ensayo de inmunoabsorción ligado a enzimas (ELISA), técnicas de resonancia de plasmón superficial (SPR) (analizadas en un instrumento BIAcore) (Liljeblad et al,Glyco J17, 323-329 (2000)) o ensayos de unión tradicionales (Heeley,Endocr Res28, 217-229 (2002)). En algunas realizaciones, se considera que la construcción de polipéptido de unión a antígeno se une específicamente a su epítopo diana cuando el grado de unión de la construcción de polipéptido de unión a antígeno a una proteína no relacionada es menor de aproximadamente 10% de la unión de la construcción de polipéptido de unión a antígeno a su epítopo diana medido, por ejemplo, por SPR.
"HER2" (también conocido como ErbB2) se refiere a la proteína HER2 humana descrita, por ejemplo, en Semba et al.,PNAS(EE. UU.), 82:6497-6501 (1985) y Yamamoto et al.,Nature,319:230-234 (1986) (número de acceso en GenBank X03363). Los términos "erbB2" y "neu" se refieren al gen que codifica la proteína HER2 humana. Los términos p185 o p185neu también pueden usarse para referirse al producto de proteína del gen neu.
HER2 comprende un dominio extracelular, que normalmente se une a un ligando de HER, un dominio transmembrana lipófilo, un dominio de tirosina quinasa intracelular conservado y un dominio de señalización carboxilo terminal que alberga varios restos de tirosina que pueden fosforilarse. El dominio extracelular (ecto) de HER2 comprende cuatro dominios, Dominios I-IV. La secuencia de HER2 se proporciona en la Tabla 3 (SEQ ID NO: 2). Los límites del dominio extracelular (ECD) son: Dominio I - aproximadamente aminoácidos 1 165; Dominio II: aproximadamente aminoácidos 166-322; Dominio III - aproximadamente aminoácidos 323-488 y Dominio IV - aproximadamente aminoácidos 489-607.
Tabla 3: Secuencia de aminoácidos de HER2 humano (2)
"Epítopo 2C4" es la región en el dominio extracelular de HER2 a la que se une el anticuerpo 2C4 y comprende restos del dominio II en el dominio extracelular de HER2 (también denominado ECD2). 2C4 y Pertuzumab se unen al dominio extracelular de HER2 en la unión de los dominios I, II y III (Franklin et al.Cáncer Cell5:317-328 (2004)).
"Epítopo 4D5" es la región en el dominio extracelular de HER2 a la que se unen el anticuerpo 4D5 (ATCC CRL 10463) y trastuzumab. Este epítopo está cerca del dominio transmembrana de HER2, y dentro del dominio IV de HER2 (también denominado ECD4).
En general, el anticuerpo biparatópico anti-HER2 de la presente descripción se unirá a epítopos dentro de los dominios extracelulares de HER2. En algunas realizaciones, los epítopos de HER2 primero y segundo unidos por las construcciones de polipéptidos de unión a antígeno primera y segunda del anticuerpo biparatópico anti-HER2 son epítopos que no se superponen. En algunas realizaciones, los epítopos de HER2 primero y segundo unidos por las construcciones de polipéptidos de unión a antígeno primera y segunda del anticuerpo biparatópico anti-HER2 están en diferentes dominios extracelulares de HER2. En algunas realizaciones, la primera construcción de polipéptido de unión a antígeno del anticuerpo biparatópico anti-HER2 se une a un primer epítopo de HER2 en un primer dominio de HER2, y la segunda construcción de polipéptido de unión a antígeno se une a un segundo epítopo de HER2 en un segundo dominio de HER2. En algunas realizaciones, el primer dominio de HER2 es ECD2 y el segundo dominio de HER2 es ECD4.
En algunas realizaciones, una de las construcciones de polipéptidos de unión a antígeno que comprende el anticuerpo biparatópico anti-HER2 compite con trastuzumab por la unión a HER2. En algunas realizaciones, una de las construcciones de polipéptidos de unión a antígeno comprendida por el anticuerpo biparatópico anti-HER2 compite con pertuzumab por la unión a HER2. En algunas realizaciones, una de las construcciones de polipéptidos de unión a antígeno comprendidas por el anticuerpo biparatópico anti-HER2 compite con trastuzumab por la unión a HER2, y la otra construcción de polipéptido de unión a antígeno compite con pertuzumab por la unión a HER2.
En algunas realizaciones, una de las construcciones de polipéptidos de unión a antígeno comprendidas por el anticuerpo biparatópico anti-HER2 está en un formato Fab o scFv y compite con trastuzumab por la unión a HER2, y la otra construcción de polipéptido de unión a antígeno está en un formato Fab o scFv y compite con pertuzumab por la unión a HER2. En algunas realizaciones, una de las construcciones de polipéptidos de unión a antígeno comprendidas por el anticuerpo biparatópico anti-HER2 está en un formato Fab y compite con trastuzumab por la unión a HER2, y la otra construcción de polipéptido de unión a antígeno está en un formato scFv y compite con pertuzumab por la unión a HER2.
En algunas realizaciones, una de las construcciones de polipéptidos de unión a antígeno comprendidas por el anticuerpo biparatópico anti-HER2 se une al mismo epítopo en HER2 que trastuzumab. En algunas realizaciones, una de las construcciones de polipéptidos de unión a antígeno comprendidas por el anticuerpo biparatópico anti-HER2 se une al mismo epítopo en HER2 que pertuzumab. En algunas realizaciones, una de las construcciones de polipéptidos de unión a antígeno comprendida por el anticuerpo biparatópico anti-HER2 se une al mismo epítopo en HER2 que trastuzumab, y la otra construcción de polipéptido de unión a antígeno se une al mismo epítopo en HER2 que pertuzumab.
En algunas realizaciones, una de las construcciones de polipéptidos de unión a antígeno comprendida por el anticuerpo biparatópico anti-HER2 comprende las secuencias de CDR de trastuzumab o una variante de las mismas que comprenden una o más mutaciones que se sabe que aumentan la unión de HER2, y el otra construcción de polipéptido de unión a antígeno comprende las CDR de pertuzumab o una variante de las mismas que comprenden una o más mutaciones que se sabe que aumentan la unión de HER2. Las mutaciones de la bibliografía que se sabe que mejoran la unión de HER2 con trastuzumab o pertuzumab incluyen las enumeradas en las Tablas 4 y 5 a continuación (HC = cadena pesada; LC = cadena ligera). También se contemplan combinaciones de estas mutaciones.
Tabla 4: Mutaciones de trastuzumab que aumentan la unión a HER2
Tabla 5: Mutaciones de pertuzumab que aumentan la unión a HER2
En la técnica se conocen varios anticuerpos biparatópicos anti-HER2 y pueden ser anticuerpos candidatos adecuados para su inclusión en los ADC descritos en el presente documento. Los ejemplos incluyen anticuerpos descritos en las publicaciones de solicitud de patente de EE. UU. N.° 2014/0170148; 2015/0284463; 2016/0289335; 2017/0029529; 2017/0291955 y 2018/0022820, y publicación de solicitud de patente internacional N.° WO 2016/179707.
En determinadas realizaciones, el anticuerpo biparatópico anti-HER2 es uno de los anticuerpos biparatópicos descritos en la publicación de solicitud de patente de Ee . UU. N.° 2016/0289335. En algunas realizaciones, el anticuerpo biparatópico anti-HER2 es uno de v5019, v5020, v7091, v10000, v6902, v6903 o v6717 (véanse las Tablas 6, 6A y 6B y las Tablas de secuencias). En algunas realizaciones, una de las construcciones de polipéptidos de unión a antígeno del anticuerpo biparatópico anti-HER2 comprende una secuencia de VH y una secuencia de VL del brazo de unión a ECD2 de uno de v5019, v5020, v7091, v10000, v6902, v6903 o v6717. En algunas realizaciones, una de las construcciones de polipéptidos de unión a antígeno del anticuerpo biparatópico anti-HER2 comprende una secuencia de VH y una secuencia de VL del brazo de unión a ECD2 de uno de v5019, v5020, v7091, v10000, v6902, v6903 o v6717, y la otra construcción de polipéptido de unión a antígeno comprende una secuencia de VH y una secuencia de VL del brazo de unión a ECD4 de uno de v5019, v5020, v7091, v10000, v6902, v6903 o v6717.
En algunas realizaciones, una de las construcciones de polipéptidos de unión a antígeno del anticuerpo biparatópico anti-HER2 comprende las secuencias de CDR del brazo de unión a ECD2 de uno de v5019, v5020, v7091, v10000, v6902, v6903 o v6717. En algunas realizaciones, una de las construcciones de polipéptidos de unión a antígeno del anticuerpo biparatópico anti-HER2 comprende las secuencias de CDR del brazo de unión a ECD2 de uno de v5019, v5020, v7091, v10000, v6902, v6903 o v6717, y la otra construcción de polipéptido de unión a antígeno comprende las secuencias de CDR del brazo de unión a ECD4 de uno de v5019, v5020, v7091, v10000, v6902, v6903 o v6717.
Un experto en la técnica apreciará que se puede introducir un número limitado de sustituciones de aminoácidos en las secuencias de CDR o en las secuencias de VH o VL de anticuerpos conocidos sin que el anticuerpo pierda su capacidad para unirse a su diana. Las sustituciones de aminoácidos candidatas pueden identificarse por modelización computacional o mediante técnicas conocidas en la técnica tales como el barrido de alanina, ensayándose en las variantes resultantes la actividad de unión mediante técnicas convencionales. Por consiguiente, en determinadas realizaciones, una de las construcciones de polipéptidos de unión a antígeno del anticuerpo biparatópico anti-HER2 comprende un conjunto de CDR (es decir, CDR1, CDR2 y CDR3 de cadena pesada, y CDR1, CDR2 y CDR3 de cadena ligera) que tienen 90% o más, 95% o más, 98% o más, 99% o más, o 100% de identidad de secuencia con un conjunto de CDR del brazo de unión a ECD2 de uno de v5019, v5020, v7091, v10000, v6902, v6903 o v6717, en donde la construcción de polipéptido de unión a antígeno retiene la capacidad de unirse a ECD2. En determinadas realizaciones, una de las construcciones de polipéptidos de unión a antígeno del anticuerpo biparatópico anti-HER2 comprende una variante de estas secuencias de CDR que comprende entre 1 y 10 sustituciones de aminoácidos en las seis CDR (es decir, las CDR pueden modificarse incluyendo hasta 10 sustituciones de aminoácidos con cualquier combinación de CDR modificadas), por ejemplo, entre 1 y 7 sustituciones de aminoácidos, entre 1 y 5 sustituciones de aminoácidos, entre 1 y 4 sustituciones de aminoácidos, entre 1 y 3 sustituciones de aminoácidos, entre 1 y 2 sustituciones de aminoácidos, o 1 sustitución de aminoácido, en las CDR, en donde la variante conserva la capacidad de unirse a ECD2. Típicamente, dichas sustituciones de aminoácidos serán sustituciones de aminoácidos conservadoras. En determinadas realizaciones, una de las construcciones de polipéptidos de unión a antígeno del anticuerpo biparatópico anti-HER2 comprende un conjunto de CDR (es decir, CDR1, CDR2 y CDR3 de cadena pesada, y CDR1, CDR2 y CDR3 de cadena ligera) que tienen 90% o más, 95% o más, 98% o más, 99% o más, o 100% de identidad de secuencia con un conjunto de CDR del brazo de unión a ECD2 de v10000, en donde la construcción de polipéptido de unión a antígeno conserva la capacidad de unirse a ECD2.
En determinadas realizaciones, una de las construcciones de polipéptidos de unión a antígeno del anticuerpo biparatópico anti-HER2 comprende una secuencia de VH que es al menos 80%, al menos 85%, al menos 90%, al menos 91%, al menos 92%, al menos 93%, al menos 94%, al menos 95%, al menos 96%, al menos 97%, al menos 98%, al menos 99% o 100% idéntica a la secuencia de VH del brazo de unión a ECD2 de uno de v5019, v5020, v7091, v10000, v6902, v6903 o v6717, en donde la construcción de polipéptido de unión a antígeno retiene la capacidad de unirse a ECD2. En algunas realizaciones, una de las construcciones de polipéptidos de unión a antígeno del anticuerpo biparatópico anti-HER2 comprende una secuencia de VL que es al menos 80%, al menos 85%, al menos 90%, al menos 91%, al menos 92%, al menos 93%, al menos 94%, al menos 95%, al menos 96%, al menos 97%, al menos 98%, al menos 99% o 100% idéntica a la secuencia de VL del brazo de unión a ECD2 de uno de v5019, v5020, v7091, v10000, v6902, v6903 o v6717, en donde la construcción de polipéptido de unión a antígeno retiene la capacidad de unirse a ECD2.
En determinadas realizaciones, una de las construcciones de polipéptidos de unión a antígeno del anticuerpo biparatópico anti-HER2 comprende una secuencia de VH que es al menos 80%, al menos 85%, al menos 90%, al menos 91%, al menos 92%, al menos 93%, al menos 94%, al menos 95%, al menos 96%, al menos 97%, al menos 98%, al menos 99% o 100% idéntica a la secuencia de VH del brazo de unión a ECD2 de v10000, en donde la construcción polipeptídica de unión a antígeno conserva la capacidad de unirse a ECD2. En algunas realizaciones, una de las construcciones de polipéptidos de unión a antígeno del anticuerpo biparatópico anti-HER2 comprende una secuencia de VL que es al menos 80%, al menos 85%, al menos 90%, al menos 91%, al menos 92%, al menos 93%, al menos 94%, al menos 95%, al menos 96%, al menos 97%, al menos 98%, al menos 99% o 100% idéntica a la secuencia de VL del brazo de unión a ECD2 de v10000, en donde la construcción de polipéptido de unión a antígeno conserva la capacidad de unirse a ECD2.
En determinadas realizaciones, una de las construcciones de polipéptidos de unión a antígeno del anticuerpo biparatópico anti-HER2 comprende un conjunto de CDR (es decir, CDR1, CDR2 y CDR3 de cadena pesada, y CDR1, Cd R2 y CDR3 de cadena ligera) que tienen 90% o más, 95% o más, 98% o más, 99% o más, o 100% de identidad de secuencia con un conjunto de CDR del brazo de unión a ECD4 de uno de v5019, v5020, v7091, v10000, v6902, v6903 o v6717, en donde la construcción de polipéptido de unión a antígeno conserva la capacidad de unirse a ECD4. En determinadas realizaciones, una de las construcciones de polipéptidos de unión a antígeno del anticuerpo biparatópico anti-HER2 comprende una variante de estas secuencias de CDR que comprende entre 1 y 10 sustituciones de aminoácidos en las seis CDR (es decir, las CDR pueden modificarse incluyendo hasta 10 sustituciones de aminoácidos con cualquier combinación de CDR modificadas), por ejemplo, entre 1 y 7 sustituciones de aminoácidos, entre 1 y 5 sustituciones de aminoácidos, entre 1 y 4 sustituciones de aminoácidos, entre 1 y 3 sustituciones de aminoácidos, entre 1 y 2 sustituciones de aminoácidos, o 1 sustitución de aminoácido, en las CDR, en donde la variante conserva la capacidad de unirse a ECD4. Típicamente, dichas sustituciones de aminoácidos serán sustituciones de aminoácidos conservadoras. En determinadas realizaciones, una de las construcciones de polipéptidos de unión a antígeno del anticuerpo biparatópico anti-HER2 comprende un conjunto de CDR (es decir, CDR1, CDR2 y CDR3 de cadena pesada, y CDR1, CDR2 y CDR3 de cadena ligera) que tienen 90% o más, 95% o más, 98% o más, 99% o más, o 100% de identidad de secuencia con un conjunto de CDR del brazo de unión a ECD4 de v10000, en donde la construcción de polipéptido de unión a antígeno conserva la capacidad de unirse a ECD4.
En determinadas realizaciones, una de las construcciones de polipéptidos de unión a antígeno del anticuerpo biparatópico anti-HER2 comprende una secuencia de VH que es al menos 80%, al menos 85%, al menos 90%, al menos 91%, al menos 92%, al menos 93%, al menos 94%, al menos 95%, al menos 96%, al menos 97%, al menos 98%, al menos 99% o 100% idéntica a la secuencia de VH del brazo de unión a ECD4 de uno de v5019, v5020, v7091, v10000, v6902, v6903 o v6717, en donde la construcción de polipéptido de unión a antígeno retiene la capacidad de unirse a ECD4. En algunas realizaciones, una de las construcciones de polipéptidos de unión a antígeno del anticuerpo biparatópico anti-HER2 comprende una secuencia de VL que es al menos 80%, al menos 85%, al menos 90%, al menos 91%, al menos 92%, al menos 93%, al menos 94%, al menos 95%, al menos 96%, al menos 97%, al menos 98%, al menos 99% o 100% idéntica a la secuencia de VL del brazo de unión a ECD4 de uno de v5019, v5020, v7091, v10000, v6902, v6903 o v6717, en donde la construcción de polipéptido de unión a antígeno retiene la capacidad de unirse a ECD4.
En determinadas realizaciones, una de las construcciones de polipéptidos de unión a antígeno del anticuerpo biparatópico anti-HER2 comprende una secuencia de VH que es al menos 80%, al menos 85%, al menos 90%, al menos 91%, al menos 92%, al menos 93%, al menos 94%, al menos 95%, al menos 96%, al menos 97%, al menos 98%, al menos 99% o 100% idéntica a la secuencia de VH del brazo de unión a ECD4 de v10000, en donde la construcción de polipéptido de unión a antígeno conserva la capacidad de unirse a ECD4. En algunas realizaciones, una de las construcciones de polipéptidos de unión a antígeno del anticuerpo biparatópico anti-HER2 comprende una secuencia de VL que es al menos 80%, al menos 85%, al menos 90%, al menos 91%, al menos 92%, al menos 93%, al menos 94%, al menos 95%, al menos 96%, al menos 97%, al menos 98%, al menos 99% o 100% idéntica a la secuencia de VL del brazo de unión a ECD4 de v10000, en donde la construcción de polipéptido de unión a antígeno conserva la capacidad de unirse a ECD4.
Tabla 6: Ejemplos de anticuerpos biparatópicos anti-HER2
Tabla 6A: Secuencias de CDR del brazo de unión a ECD2 de las variantes v5019, v5020, v7091, v10000, v6902, v6903 y v6717
Tabla 6B: Secuencias de CDR del brazo de unión a ECD4 de las variantes v5019, v5020, v7091, v10000, v6902, v6903 y v6717
En determinadas realizaciones, el anticuerpo biparatópico anti-HER2 es uno de los anticuerpos biparatópicos descritos en la publicación de solicitud de patente de EE. UU. N.° WO 2016/179707. Esta solicitud describe variantes de alta afinidad del anticuerpo anti-HER2 pertuzumab, incluidos anticuerpos biparatópicos que comprenden secuencias de una variante de alta afinidad como un dominio de unión a antígeno. En algunas realizaciones, el anticuerpo biparatópico anti-HER2 es uno de v7133, v15079, v15080, v15081, v15082, v15083, v15084 o v15085 (véanse las Tablas 7 y 7A y las Tablas de secuencias). En algunas realizaciones, una de las construcciones de polipéptidos de unión a antígeno del anticuerpo biparatópico anti-HER2 comprende una secuencia de VH y una secuencia de VL del brazo de unión a ECD2 de uno de v7133, v15079, v15080, v15081, v15082, v15083, v15084 o v15085. En algunas realizaciones, una de las construcciones de polipéptidos de unión a antígeno del anticuerpo biparatópico anti-HER2 comprende las secuencias de CDR del brazo de unión a ECD2 de uno de v7133, v15079, v15080, v15081, v15082, v15083, v15084 o v15085. En algunas realizaciones, una de las construcciones de polipéptidos de unión a antígeno del anticuerpo biparatópico anti-HER2 comprende una secuencia de VH y una secuencia de VL del brazo de unión a ECD2 de uno de v7133, v15079, v15080, v15081, v15082, v15083, v15084 o v15085, y la otra construcción de polipéptido de unión a antígeno comprende la secuencia de VH y la secuencia de VL de trastuzumab. En algunas realizaciones, una de las construcciones de polipéptidos de unión a antígeno del anticuerpo biparatópico anti-HER2 comprende las secuencias CDR del brazo de unión a ECD2 de uno de v7133, v15079, v15080, v15081, v15082, v15083, v15084 o v15085, y la otra construcción de polipéptido de unión a antígeno comprende la secuencias de CDR de trastuzumab.
Tabla 7: Ejemplos adicionales de anticuerpos biparatópicos anti-HER2
Tabla 7A: Secuencias de CDR del brazo de unión a ECD2 de las variantes v7133, v15079, v15080, v15081, v15082, v15083, v15084 y v15085
Propiedades de los anticuerpos biparatópicos anti-HER2
La conjugación de la toxina con una DAR baja es particularmente beneficiosa para los anticuerpos biparatópicos anti-HER2 que muestran una mayor unión a HER2 y/o una mayor internalización en células que expresan HER2 en comparación con un anticuerpo monoespecífico bivalente correspondiente. Un anticuerpo monoespecífico bivalente correspondiente puede comprender dos de las primeras construcciones de polipéptidos de unión a antígeno, o dos de las segundas construcciones de polipéptidos de unión a antígeno que comprende el anticuerpo biparatópico.
En determinadas realizaciones, los anticuerpos biparatópicos anti-HER2 muestran una mayor unión (es decir, se unen con una mayor afinidad) a HER2 en comparación con un anticuerpo monoespecífico bivalente correspondiente. El aumento de la unión puede mostrarse, por ejemplo, mediante una disminución de la constante de disociación y/o un aumento de la unión máxima.
Una constante de disociación o (Kd) se refiere a la constante de equilibrio de disociación de una interacción ligando-proteína particular, tal como interacciones anticuerpo-antígeno. La Kd mide la tendencia de dos proteínas (p. ej. AB) a disociarse de forma reversible en componentes más pequeños (A+B), y se define como la relación entre la velocidad de disociación (también llamada "constante de disociación" o koff) y la velocidad de asociación (también llamada "constante de asociación" o kon). Por tanto, Kd es igual a koff/kon y se expresa como una concentración molar (M). De ello se deduce que cuanto menor sea la Kd, más fuerte será la afinidad de unión. Los valores de Kd para anticuerpos pueden determinarse utilizando métodos bien establecidos en la técnica. Los ejemplos de dichos métodos incluyen la resonancia de plasmón superficial (SPR), que generalmente usa un sistema de biosensor como un sistema Biacore®, y la calorimetría de titulación isotérmica (ITC).
La KD aparente, o constante de equilibrio de disociación aparente, representa la concentración de anticuerpo a la que se observa la mitad de la unión celular máxima. La K<d>aparente depende de las condiciones del experimento de unión celular, tales como los diferentes niveles de receptor expresados en las células y las condiciones de incubación y, por lo tanto, la KD aparente es, por lo general, diferente a los valores de KD determinados a partir de los experimentos moleculares sin células, tales como SPR y ITC. Sin embargo, existe una buena coincidencia en términos generales entre los diferentes métodos.
La unión máxima (o "Bmáx") se refiere al nivel de unión de anticuerpo máximo en las células a concentraciones saturantes de anticuerpo. Este parámetro puede darse en la unidad arbitraria MFI para comparaciones relativas o convertirse en un valor absoluto que corresponde a la cantidad de anticuerpos unidos a la célula con el uso de una curva de calibración.
Bmáx y Kd aparente pueden determinarse mediante diversas técnicas. Un ejemplo es la medición de la unión a células que expresan el antígeno diana mediante citometría de flujo. Normalmente, en tal experimento, las células que expresan el antígeno diana de interés se incuban con anticuerpos en distintas concentraciones, se lavan, se incuban con un agente secundario para detectar el anticuerpo, se lavan y se analizan en el citómetro de flujo para medir la intensidad fluorescente mediana (MFI) que representa la resistencia de la señal de detección en las células, lo cual a su vez se relaciona con la cantidad de anticuerpos unidos a las células. La concentración de anticuerpo frente a los datos de MFI después se ajusta en una ecuación de unión de saturación para dar la Bmáx y Kd aparente.
En determinadas realizaciones, el anticuerpo biparatópico anti-HER2 presenta un aumento en Bmáx en una célula diana que presenta HER2 en comparación con un anticuerpo de referencia correspondiente. Para un anticuerpo biparatópico anti-HER2 que comprende una primera construcción de polipéptido de unión a antígeno y una segunda construcción de polipéptido de unión a antígeno como se describe en el presente documento, un anticuerpo de referencia correspondiente sería un anticuerpo monoespecífico bivalente que comprende dos de las primeras construcciones de polipéptidos de unión a antígeno, o dos de las segundas construcciones de polipéptidos de unión a antígeno. En determinadas realizaciones, la Bmáx determinada para el anticuerpo biparatópico anti-HER2 es al menos aproximadamente 110% de la Bmáx de un anticuerpo de referencia correspondiente. En algunas realizaciones, la Bmáx determinada para el anticuerpo biparatópico anti-HER2 es al menos aproximadamente 125% de la Bmáx para un anticuerpo de referencia correspondiente, por ejemplo, aproximadamente 150% de la Bmáx del anticuerpo de referencia correspondiente, o al menos aproximadamente 200% de la Bmáx del anticuerpo de referencia correspondiente.
En algunas realizaciones, la Bmáx determinada para el anticuerpo biparatópico anti-HER2 es 1,1, 1,2, 1,3, 1,4, 1,5, 1,6, 1,7, 1,8, 1,9 o 2,0 veces la Bmáx de un anticuerpo de referencia.
En determinadas realizaciones, los anticuerpos biparatópicos anti-HER2 muestran una mayor internalización en las células que expresan HER2 que un anticuerpo monoespecífico bivalente de referencia correspondiente. Los anticuerpos biparatópicos anti-HER2 se internalizan en las células HER2+ mediante la unión al receptor HER2. Por lo tanto, se puede considerar que los anticuerpos biparatópicos anti-HER2 pueden inducir la internalización del receptor en las células HER2+.
La internalización de anticuerpos se puede medir utilizando métodos conocidos en la técnica, por ejemplo, mediante un método de internalización directa según el protocolo detallado en Schmidt, M. et al.,Cáncer Immunol Immunother,57: 1879-1890 (2008). Como se sabe en la técnica, las células cancerosas pueden expresar HER2 en varios niveles. Un método para clasificar las células que expresan HER2 es como HER2 1+, 2+ o 3+ (bajo, medio y alto, respectivamente). En determinadas realizaciones, el anticuerpo biparatópico anti-HER2 muestra una mayor internalización que un anticuerpo monoespecífico bivalente de referencia correspondiente en células que expresan HER2 en el nivel 3+. En determinadas realizaciones, el anticuerpo biparatópico anti-HER2 muestra una mayor internalización que un anticuerpo monoespecífico bivalente de referencia correspondiente en células que expresan HER2 en el nivel 2+. En determinadas realizaciones, el anticuerpo biparatópico anti-HER2 muestra una mayor internalización que un anticuerpo monoespecífico bivalente de referencia correspondiente en células que expresan HER2 en el nivel 1+. Los ejemplos de líneas celulares que expresan diferentes niveles de HER2 se describen con más detalle a continuación.
En el contexto de la presente descripción, se considera que un anticuerpo biparatópico anti-HER2 demuestra una mayor internalización en células que expresan HER2 que un anticuerpo monoespecífico bivalente de referencia correspondiente cuando la cantidad de anticuerpo biparatópico anti-HER2 internalizado en las células que expresan HER2 es al menos 1,2 veces mayor que la cantidad de anticuerpo monoespecífico bivalente de referencia internalizado en las mismas células que expresan HER2. En determinadas realizaciones, la cantidad de anticuerpo internalizado se determina mediante el método de internalización directa según el protocolo detallado en Schmidt, M. et al.,CáncerImmunolImmunother,57:1879-1890 (2008). En algunas realizaciones, la cantidad de anticuerpo internalizado se determina en células que expresan HER2 que expresan HER2 en el nivel 2+.
En algunas realizaciones, se considera que un anticuerpo biparatópico anti-HER2 demuestra una mayor internalización en células que expresan HER2 que un anticuerpo monoespecífico bivalente de referencia correspondiente cuando la cantidad de anticuerpo biparatópico anti-HER2 internalizado en las células que expresan HER2 es al menos 1,3 veces mayor que la cantidad de anticuerpo monoespecífico bivalente de referencia internalizado en las mismas células que expresan HER2. En algunas realizaciones, se considera que un anticuerpo biparatópico anti-HER2 demuestra una mayor internalización en las células que expresan HER2 que un anticuerpo monoespecífico bivalente de referencia correspondiente cuando la cantidad de anticuerpo biparatópico anti-HER2 internalizado en las células que expresan HER2 es al menos 1,4 veces. mayor, por ejemplo, al menos 1,5 veces mayor, 1,6 veces mayor, 1,7 veces mayor, 1,8 veces mayor, 1,9 veces mayor o 2,0 veces mayor, que la cantidad de anticuerpo monoespecífico bivalente de referencia internalizado en las mismas células que expresan HER2. En determinadas realizaciones, la cantidad de anticuerpo internalizado se determina mediante el método de internalización directa según el protocolo detallado en Schmidt, M. et al.,Cáncer Immunol Immunother,57:1879-1890 (2008). En algunas realizaciones, la cantidad de anticuerpo internalizado se determina en células que expresan HER2 que expresan HER2 en el nivel 2+.
Análogos de auristatina
Los ADC descritos en el presente documento comprenden una toxina basada en auristatina (o "análogo de auristatina"). En la técnica se conocen varios análogos de auristatina. Los ejemplos incluyen, pero no se limitan a, monometilauristatina F (MMAF), monometilauristatina E (MMAE), auristatina EB (AEB), auristatina EVB (AEVB) y auristatina F fenilendiamina (AFP). La síntesis y la estructura de varios análogos de auristatina se describen en las patentes de EE. UU. N.° 6,884,869; 7,098,308; 7,256,257 y 7,498,298.
En determinadas realizaciones, el análogo de auristatina incluido en los ADC descritos en el presente documento puede ser un análogo de auristatina como se describe en la publicación de solicitud de patente internacional N.° WO 2016/041082. En determinadas realizaciones, el análogo de auristatina incluido en los ADC descritos en el presente documento es un compuesto de Fórmula general (I):
X es -C(O)NHCH(CH<2>R2)-, o X está ausente;
R1 se selecciona de:
y
R2 es fenilo.
En determinadas realizaciones, en los compuestos de Fórmula general (I), R1 se selecciona de:
En determinadas realizaciones, en los compuestos de Fórmula general (I), X está ausente.
En determinadas realizaciones, el compuesto de Fórmula general (I) tiene la Fórmula general (IV):
en donde R1 es como se define para la Fórmula general (I).
En determinadas realizaciones, en los compuestos de Fórmula general (IV), R1 se selecciona de:
En determinadas realizaciones, en los compuestos de Fórmula (IV), R1 es:
En determinadas realizaciones, en los compuestos de Fórmula (IV), R1 es:
En determinadas realizaciones, el compuesto de Fórmula general (I) tiene la Fórmula general (V):
en donde R1 es como se define para la Fórmula general (I).
En determinadas realizaciones, en compuestos de Fórmula general (V), R1 se selecciona de:
En determinadas realizaciones, en los compuestos de Fórmula (V), R1 es:
En determinadas realizaciones, en los compuestos de Fórmula (V), R1 es:
Los compuestos de Fórmula general (I) pueden prepararse mediante protocolos de química orgánica sintética convencionales a partir de materiales de partida disponibles comercialmente. Se proporcionan métodos de ejemplo en la publicación de solicitud de patente internacional N.° WO 2016/041082 y en la sección de Ejemplos a continuación.
Debe entenderse que la referencia a los compuestos de Fórmula general (I) a lo largo del resto de esta descripción incluye, en diversas realizaciones, compuestos de Fórmula general (IV) y (V), en la misma medida que si las realizaciones que mencionan cada una de estas fórmulas individualmente se mencionaran específicamente.
En determinadas realizaciones, el ADC de la presente descripción comprende un anticuerpo biparatópico anti-HER2 conjugado con un análogo de auristatina (toxina) por medio de un enlazador (L), en el que el enlazadortoxina tiene la Fórmula general (II):
en donde:
X es -C(O)NHCH(CH<2>R2)-, o X está ausente;
R1 se selecciona de:
R2 es fenilo.
(L) es un enlazador, y
^ representa el punto de unión del enlazador-toxina al anticuerpo biparatópico anti-HER2.
En algunas realizaciones, en el enlazador-toxina de Fórmula general (II), R1 se selecciona de:
En algunas realizaciones, en el enlazador-toxina de Fórmula general (II), X está ausente.
En algunas realizaciones, en el enlazador-toxina de Fórmula general (II), L es un enlazador escindible. En algunas realizaciones, en el enlazador-toxina de Fórmula general (II), L es un enlazador que contiene péptido.
En determinadas realizaciones, el enlazador-toxina de Fórmula general (II) tiene la Fórmula general (X):
en donde R1, L y ^ son como se definen anteriormente para la Fórmula general (II).
En algunas realizaciones, en el enlazador-toxina de Fórmula general (X), R1 se selecciona de:
En algunas realizaciones, en el enlazador-toxina de Fórmula general (X), R1 es
En algunas realizaciones, en los compuestos de Fórmula (X), R1 es:
En algunas realizaciones, en el enlazador-toxina de Fórmula general (X), L es un enlazador escindible. En algunas realizaciones, en el enlazador-toxina de Fórmula general (X), L es un enlazador que contiene péptido.
En algunas realizaciones, en el enlazador-toxina de Fórmula general (X), L es un enlazador escindible por proteasa.
En determinadas realizaciones, el enlazador-toxina de Fórmula general (II) tiene la Fórmula general (XI):
en donde R1, L y<son como se definen anteriormente para la Fórmula general (II).
En algunas realizaciones, en el enlazador-toxina de Fórmula general (XI), R1 se selecciona de:
En algunas realizaciones, en el enlazador-toxina de Fórmula general (XI), R1 es:
En algunas realizaciones, en el enlazador-toxina de Fórmula general (XI), R1 es:
En algunas realizaciones, en el enlazador-toxina de Fórmula general (XI), L es un enlazador escindible. En algunas realizaciones, en el enlazador-toxina de Fórmula general (XI), L es un enlazador que contiene péptido.
En algunas realizaciones, en el enlazador-toxina de Fórmula general (XI), L es un enlazador escindible por proteasa.
También se contemplan en el presente documento ADC que comprenden un anticuerpo biparatópico anti-HER2 conjugado con un enlazador-toxina de Fórmula general (II), Fórmula (X) o Fórmula (XI), en el que el enlazador tiene la Fórmula general (VIII) o (IX) como se muestra a continuación.
En determinadas realizaciones, el ADC comprende un enlazador-toxina que tiene la estructura:
en donde A-S- es el punto de unión al anticuerpo biparatópico anti-HER2.
En determinadas realizaciones, el ADC de la presente descripción que comprende un anticuerpo biparatópico anti-HER2 conjugado con un análogo de auristatina (toxina) por medio de un enlazador (L) tiene la Fórmula general (III):
L es un enlazador;
n es la relación de fármaco a anticuerpo (DAR) promedio y es inferior a 3,9, y
Ab es un anticuerpo biparatópico anti-HER2.
En algunas realizaciones, en el ADC de Fórmula general (III), R1 se selecciona de:
En algunas realizaciones, en el ADC de Fórmula general (III). X está ausente.
En algunas realizaciones, en el ADC de Fórmula general (III). R1 es:
y
X está ausente.
En algunas realizaciones, en el ADC de Fórmula general (III), R1 es:
X está ausente.
En algunas realizaciones, en el ADC de Fórmula general (111), X es -C(O)NHCH(CH<2>R2)-En algunas realizaciones, en el ADC de Fórmula general (III), R1 es:
X es -C(O)NHCH(CH<2>R2)-.
En algunas realizaciones, en el ADC de Fórmula general (III), R1 es:
X es -C(O)NHCH(CH<2>R2)-.
En algunas realizaciones, en el ADC de Fórmula general (III), L es un enlazador escindible.
En algunas realizaciones, en el ADC de fórmula general (III), L es un enlazador que contiene péptido.
En algunas realizaciones, en el ADC de Fórmula general (III), L es un enlazador escindible por proteasa. En algunas realizaciones, en el ADC de fórmula general (III), n está entre 0,5 y 3,8.
En algunas realizaciones, en el ADC de Fórmula general (III), n está entre 0,7 y 3,8, entre 0,7 y 3,5, entre 0,7 y 3,0, o entre 0,7 y 2,5.
En algunas realizaciones, en el ADC de Fórmula general (III), n está entre 1,0 y 3,8, entre 1,0 y 3,5, entre 1,0 y 3,0, o entre 1,0 y 2,5.
En algunas realizaciones, en el ADC de Fórmula general (III), n está entre 1,5 y 3,8, entre 1,5 y 3,5, entre 1,5 y 3,0 o entre 1,5 y 2,5.
En algunas realizaciones, en el ADC de Fórmula general (III), n está entre 1,6 y 3,8, entre 1,6 y 3,5, entre 1,6 y 3,0 o entre 1,6 y 2,5.
En algunas realizaciones, en el ADC de Fórmula general (III), n está entre 1,8 y 2,8, o entre 1,8 y 2,5.
También se contemplan combinaciones de cualquiera de las realizaciones anteriores para compuestos de Fórmula general (III) y cada combinación forma una realización separada para los fines de la presente descripción.
Enlazadores
En los ADC descritos en el presente documento, el anticuerpo biparatópico anti-HER2 está unido al análogo de auristatina (toxina) mediante un enlazador. Los enlazadores son restos bifuncionales o multifuncionales capaces de unir una o más moléculas de toxina a un anticuerpo. Un enlazador puede ser bifuncional (o monovalente), de modo que une un solo fármaco a un solo sitio en el anticuerpo, o puede ser multifuncional (o polivalente), de modo que une más de una molécula de toxina a un solo sitio en el anticuerpo. Los enlazadores capaces de unir una molécula de toxina a más de un sitio en el anticuerpo también pueden considerarse multifuncionales.
La unión de un enlazador a un anticuerpo se puede lograr de una variedad de formas, tal como a través de lisinas superficiales en el anticuerpo, acoplamiento reductor a carbohidratos oxidados en el anticuerpo o a través de restos de cisteína en el anticuerpo liberados mediante la reducción de enlaces disulfuro entre cadenas. Alternativamente, la unión de un enlazador a un anticuerpo puede lograrse mediante la modificación del anticuerpo para incluir restos de cisteína adicionales (véase, por ejemplo, patentes de EE. UU. 7,521,541; 8,455,622 y 9,000,130) o aminoácidos no naturales que proporcionan asas reactivas, tales como selenometionina, p-acetilfenilalanina, formilglicina o p-azidometil-L-fenilalanina (véase, por ejemplo, Hofer et al.,Biochemistry,48:12047-12057 (2009); Axup et al.,PNAS,109:16101-16106 (2012); Wu et al.,PNAS,106:3000-3005 (2009); Zimmerman et al. ,Bioconj. Chem.,25:351-361 (2014)), para permitir la conjugación específica del sitio.
Los enlazadores incluyen un grupo funcional capaz de reaccionar con el grupo o grupos diana en el anticuerpo, y uno o más grupos funcionales capaces de reaccionar con un grupo diana en la toxina. Los grupos funcionales adecuados se conocen en la técnica e incluyen los descritos, por ejemplo, enBioconjugate Techniques(G.T. Hermanson, 2013, Academic Press).
Ejemplos no limitantes de grupos funcionales para reaccionar con cisteínas o tioles libres incluyen maleimida, haloacetamida, haloacetilo, ésteres activados tales como ésteres de succinimida, ésteres de 4-nitrofenilo, ésteres de pentafluorofenilo, ésteres de tetrafluorofenilo, anhídridos, cloruros de ácido, cloruros de sulfonilo, isocianatos e isotiocianatos. También son útiles en este contexto las maleimidas "autoestabilizantes" como se describe en Lyon et al.,Nat. Biotechnol.,32:1059-1062 (2014).
Los ejemplos no limitantes de grupos funcionales para reaccionar con lisinas superficiales en un anticuerpo y aminas libres en una toxina incluyen ésteres activados tales como ésteres de N-hidroxisuccinimida (NHS), ésteres de sulfo-NHS, ésteres de imido tales como reactivo de Traut, isotiocianatos, aldehídos y anhídridos de ácido tales como el anhídrido dietilentriaminopentaacético (DTPA). Otros ejemplos incluyen tetrafluoroborato de succinimido-1,1,3,3-tetrametiluronio (TSTU) y hexafluorofosfato de benzotriazol-1-il-oxitripirrolidinofosfonio (PyBOP).
Los ejemplos no limitantes de grupos funcionales capaces de reaccionar con un grupo electrofílico en el anticuerpo o la toxina (tal como un grupo carbonilo de aldehído o cetona) incluyen hidrazida, oxima, amino, hidrazida, tiosemicarbazona, carboxilato de hidrazina y arilhidrazida.
Otros enlazadores incluyen aquellos que tienen un grupo funcional que permite la formación de puente de dos cisteínas intercatenarias en el anticuerpo, tal como un enlazador ThioBridge™ (Badescu et al.,Bioconjug. Chem.,25:1124-1136 (2014)), un enlazador de ditiomaleimida (DTM) (Behrens et al.,Mol. Pharm.,12:3986-3998 (2015)), un enlazador basado en ditioaril-(TCEP)piridazindiona (Lee et al.,Chem. Sci.,7:799-802 (2016)), un enlazador basado en dibromopiridazindiona (Maruani et al.,Nat. Commun.,6:6645 ( 2015)) y otros conocidos en la técnica.
Un enlazador puede comprender uno o más componentes enlazadores. Típicamente, un enlazador comprenderá dos o más componentes enlazadores. Los ejemplos de componentes enlazadores incluyen grupos funcionales para la reacción con el anticuerpo, grupos funcionales para la reacción con la toxina, extensores, componentes peptídicos, grupos autoinmoladores, grupos de autoeliminación, fracciones hidrófilas y similares. En la técnica se conocen varios componentes enlazadores, algunos de los cuales se describen a continuación.
Ciertos componentes enlazadores útiles se pueden obtener de diversas fuentes comerciales, tales como Pierce Biotechnology, Inc. (ahora Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA) y Molecular Biosciences Inc. (Boulder, Colo.), o se pueden sintetizar de acuerdo con los procedimientos descritos en la técnica (véase, por ejemplo, Toki et al.,J. Org. Chem.,67:1866-1872 (2002); Dubowchik, et al.,Tetrahedron Letters,38: 5257-60 (1997), Walker, M.A.,J. Org. Chem.,60:5352-5355 (1995), Frisch, et al.,Bioconjugate Chem.,7:180-186 (1996); patentes de EE. UU. N.° 6,214,345 y 7,553,816, y publicación de solicitud de patente internacional N.°<w>O 02/088172).
Los ejemplos de componentes enlazadores incluyen, pero no se limitan a, éster de N-(p-maleimidopropiloxi)-N-hidroxisuccinimida (BMPS), éster de N-(£-maleimidocaproiloxi)succinimida (EMCS), éster de N-[<y>-maleimidobutiriloxi]succinimida (GMBS), 1,6-hexano-bis-vinilsulfona (HBVS), 4-(N-maleimidometil)ciclohexano-1-carboxi-(6-amidocaproato) de succinimidilo (LC-SMCC), éster de mmaleimidobenzoil-N-hidroxisuccinimida (MBS), hidrazida del ácido 4-(4-N-maleimidofenil)butírico (MPBH), 3-(bromoacetamido)propionato de succinimidilo (SBAP), yodoacetato de succinimidilo (SIA), (4-yodoacetil)aminobenzoato de succinimidilo (STAB), N-succinimidil-3-(2-piridilditio)propionato (SPDP), N-succinimidil-4-(2-piridiltio)pentanoato (SPP), 4-(N-maleimidometil)ciclohexano-1-carboxilato de succinimidilo (SMCC), 4-(p-maleimidofenil)butirato de succinimidilo (SMPB), 6-[(p-maleimidopropionamido)hexanoato] de succinimidilo (SMPH), iminotiolano (IT), sulfo-EMCS, sulfo-GMBS, sulfo-KMUS, sulfo-MBS, sulfo-SlAB, sulfo-SMCC, sulfo-SMPB y (4-vinilsulfona)benzoato de succinimidilo (SVSB).
Los ejemplos adicionales incluyen reactivos de bis-maleimida tales como ditiobismaleimidoetano (DTME), bismaleimido-trioxietilenglicol (BMPEO), 1,4-bismaleimidobutano (BMB), 1,4-bismaleimidil-2,3-dihidroxibutano (BMDB), bismaleimidohexano (BMH), bismaleimidoetano (b Mo E), BM(PEG)<2>y BM(PEG)3; derivados bifuncionales de imidoésteres (tales como adipimidato de dimetilo HCl), ésteres activos (tales como suberato de disuccinimidilo), aldehídos (tales como glutaraldehído), compuestos de bis-azido (tales como bis(pazidobenzoil)hexanodiamina), derivados de bis-diazonio (tales como bis-(p-diazoniobenzoil)-etilenodiamina), diisocianatos (tales como 2,6-diisocianato de tolueno) y compuestos de flúor bis-activos (tales como 1,5-difluoro-2,4-dinitrobenceno).
Los enlazadores adecuados normalmente son más químicamente estables a las condiciones fuera de la célula que a las condiciones dentro de la célula, aunque se pueden contemplar enlazadores menos estables en ciertas situaciones, tales como cuando la toxina es selectiva o dirigida y tiene un toxicidad baja para las células normales. Los enlazadores pueden ser "enlazadores escindibles" o "enlazadores no escindibles". Un enlazador escindible típicamente es susceptible a la escisión en condiciones intracelulares, por ejemplo mediante procesos lisosomales. Los ejemplos incluyen enlazadores que son sensibles a la proteasa, sensibles a los ácidos, sensibles a la reducción o fotolábiles. Los enlazadores no escindibles, por el contrario, se basan en la degradación del anticuerpo en la célula, lo que típicamente da como resultado la liberación de un resto de aminoácido-enlazador-toxina.
Los enlazadores escindibles adecuados incluyen, por ejemplo, enlazadores que comprenden un componente peptídico que incluye dos o más aminoácidos y es escindible mediante una proteasa intracelular, tal como una proteasa lisosomal o una proteasa endosomal. Un componente peptídico puede comprender restos de aminoácidos que se encuentran de forma natural y/o aminoácidos menores y/o análogos de aminoácidos que no se encuentran de forma natural, tales como citrulina. Los componentes peptídicos pueden diseñarse y optimizarse para la escisión enzimática mediante una enzima particular, por ejemplo, una proteasa asociada a tumores, catepsina B, C o D, o una plasmina proteasa.
En determinadas realizaciones, el enlazador incluido en los ADC puede ser un enlazador que contiene dipéptido, tal como un enlazador que contiene valina-citrulina (Val-Cit) o fenilalanina-lisina (Phe-Lys). Otros ejemplos de dipéptidos adecuados para su inclusión en enlazadores incluyen Val-Lys, Ala-Lys, Me-Val-Cit, Phe-homoLys, Phe-Cit, Leu-Cit, Ile-Cit, Trp-Cit, Phe-Arg, Ala-Phe, Val-Ala, Met-Lys, Asn-Lys, Ile-Pro, Ile-Val, Asp-Val, His-Val, Met-(D)Lys, Asn-(D)Lys, Val-(D)Asp, NorVal-(D)Asp, Ala-(D)Asp, Me3Lys-Pro, FenilGly-(D)Lys, Met-(D)Lys, Asn-(D)Lys, Pro-(D)Lys y Met-(D)Lys. Los enlazadores escindibles también pueden incluir componentes peptídicos más largos tales como tripéptidos, tetrapéptidos o pentapéptidos. Los ejemplos incluyen, pero no se limitan a los tripéptidos Met-Cit-Val, Gly-Cit-Val, (D)Phe-Phe-Lys y (D)Ala-Phe-Lys, y los tetrapéptidos Gly-Phe-Leu-Gly y Ala-Leu-Ala-Leu.
Ejemplos adicionales de enlazadores escindibles incluyen enlazadores que contienen disulfuro, tales como, por ejemplo, N-succinimidil-4-(2-piridilditio)butanoato (SPBD) y N-succinimidil-4-(2-piridilditio)-2-sulfobutanoato (sulfo-SPBD). Los enlazadores que contienen disulfuro pueden incluir opcionalmente grupos adicionales para proporcionar un impedimento estérico adyacente al enlace disulfuro con el fin de mejorar la estabilidad extracelular del enlazador, por ejemplo, la inclusión de un grupo dimetilo geminal. Otros enlazadores adecuados incluyen enlazadores hidrolizables a un pH específico o dentro de un intervalo de pH, tales como enlazadores de hidrazona. Los enlazadores que comprenden combinaciones de estas funcionalidades también pueden ser útiles, por ejemplo, los enlazadores que comprenden tanto una hidrazona como un disulfuro son conocidos en la técnica.
Un ejemplo adicional de un enlazador escindible es un enlazador que comprende un p-glucurónido, que es escindible por p-glucuronidasa, una enzima presente en lisosomas y el intersticio tumoral (véase, por ejemplo, De Graaf et al.,Curr. Pharm. Des.,8: 1391-1403 (2002)).
Los enlazadores escindibles pueden comprender además opcionalmente uno o más componentes adicionales tales como grupos autoinmoladores y de autoeliminación, extensores o restos hidrófilos.
Los grupos autoinmoladores y de autoeliminación que encuentran uso en enlazadores incluyen, por ejemplo, grupos p-aminobenciloxicarbonilo (PABC) y p-aminobencil éter (PABE), y etilendiamina metilada (MED). Otros ejemplos de grupos autoinmoladores incluyen, pero no se limitan a, compuestos aromáticos que son electrónicamente similares al grupo PABC o PABE, tales como derivados heterocíclicos, por ejemplo derivados de 2-aminoimidazol-5-metanol como se describe en la patente de EE. UU. N.° 7,375,078. Otros ejemplos incluyen grupos que sufren ciclación tras la hidrólisis del enlace amida, tales como amidas de ácido 4-aminobutírico sustituidas y no sustituidas (Rodrigues et al.,Chemistry Biology,2:223-227 (1995)) y amidas de ácido 2-aminofenilpropiónico (Amsberry et al.,J. Org. Chem.,55:5867-5877 (1990)).
Los extensores que encuentran uso en enlazadores para ADC incluyen, por ejemplo, grupos alquileno y extensores basados en ácidos alifáticos, diácidos, aminas o diaminas, tales como diglicolato, malonato, caproato y caproamida. Otros extensores incluyen, por ejemplo, extensores basados en glicina, extensores de polietilenglicol (PEG) y extensores de monometoxipolietilenglicol (mPEG). Los extensores de PEG y mPEG también funcionan como restos hidrófilos.
Ejemplos de componentes encontrados comúnmente en enlazadores escindibles que pueden encontrar uso en los ADC de la presente descripción en algunas realizaciones incluyen, pero no se limitan a, SPBD, sulfo-SPBD, hidrazona, Val-Cit, maleidocaproilo (MC o mc), mc-Val-Cit, mc-Val-Cit-PABC, Phe-Lys, mc-Phe-Lys, mc-Phe-Lys-PABC, trietilenglicolato de maleimido (MT), MT-Val-Cit, MT-Phe-Lys y adipato (AD).
En determinadas realizaciones, el enlazador incluido en los ADC de la presente descripción son enlazadores basados en péptidos que tienen la Fórmula general (VI):
en donde:
Z es un grupo funcional capaz de reaccionar con el grupo diana del anticuerpo;
Str es un extensor;
AAi y AA<2>son cada uno independientemente un aminoácido, en donde AA<1>-[AA<2>]m forma un sitio de escisión de proteasa;
X es un grupo autoinmolador;
D es el punto de unión al análogo de auristatina;
s es 0 o 1;
m es un número entero entre 1 y 4, y
o es 0, 1 o 2.
En algunas realizaciones, en la Fórmula general (VI), Z es:
En algunas realizaciones, en la Fórmula general (VI), Str se selecciona de:
y
en donde:
R es H o alquilo C<1>-C<6>;
p es un número entero entre 2 y 10, y
q es un número entero entre 1 y 10.
En algunas realizaciones, en la Fórmula general (VI), Str es:
en donde p y q son como se definen anteriormente.
En algunas realizaciones, en la Fórmula general (VI), Str es:
en donde p es un número entero entre 2 y 6, y
q es un número entero entre 2 y 8.
En algunas realizaciones, en la Fórmula general (VI), AA<1>-[AA<2>]m se selecciona de Val-Lys, Ala-Lys, Phe-Lys, Val-Cit, Phe-Cit, Leu-Cit, Ile-Cit, Trp-Cit, Phe-Arg, Ala-Phe, Val-Ala, Met-Lys, Asn-Lys, Ile-Pro, Ile-Val, Asp-Val, His-Val, Met-(D)Lys, Asn-(D)Lys, Val-(D)Asp, NorVal-(D)Asp, Ala-(D)Asp, Me3Lys-Pro, PhenylGly-(D)Lys, Met-(D)Lys, Asn-(D)Lys, Pro-(D)Lys, Met-(D)Lys, Met-Cit-Val, Gly-Cit-Val, (D)Phe-Phe-Lys, (D)Ala-Phe-Lys, Gly-Phe-Leu-Gly y Ala-Leu-Ala-Leu.
En algunas realizaciones, en la Fórmula general (VI), m es 1 (es decir AA<1>-[AA<2>]m es un dipéptido).
En algunas realizaciones, en la Fórmula general (VI), AA<1>-[AA<2>]m es un dipéptido seleccionado de Val-Lys, Ala-Lys, Phe-Lys, Val-Cit, Phe-Cit, Leu-Cit, Ile-Cit y Trp-Cit.
En algunas realizaciones, en la Fórmula general (VI), cada X se selecciona independientemente de paminobenciloxicarbonilo (PABC), p-aminobencil éter (PABE) y etilendiamina metilada (MED).
En algunas realizaciones, en la Fórmula general (VI), m es 1,2 o 3.
En algunas realizaciones, en la Fórmula general (VI), s es 1.
En algunas realizaciones, en la Fórmula general (VI), o es 0.
En algunas realizaciones, en la Fórmula general (VI):
Z es
en donde p es un número entero entre 2 y 6, y q es un número entero entre 2 y 8;
m es 1 y AAi-[AA<2>]m es un dipéptido seleccionado de Val-Lys, Ala-Lys, Phe-Lys, Val-Cit, Phe-Cit, Leu-Cit, Ile-Cit y Trp-Cit;
s es 1, y
o es 0.
En algunas realizaciones, el enlazador es un enlazador que contiene disulfuro y el ADC tiene la Fórmula general (VII):
(V II)
en donde:
A es el anticuerpo;
D es el análogo de auristatina;
Y es -(CH<2>)p- o -(CH<2>CH<2>O)q-, en donde p y q son cada uno independientemente un número entero entre 1 y 10;
cada R es independientemente H o alquilo C<1>-C<6>;
r es 1, 2 o 3, y
en donde
representa un enlace amida formado entre el enlazador y el grupo £-amino de una lisina superficial en el anticuerpo.
En algunas realizaciones en la Fórmula general (VII), p y q son cada uno independientemente un número entero entre 1 y 4.
En algunas realizaciones en la Fórmula general (VII), Y es -(CH<2>)p- y p es un número entero entre 1 y 4. En algunas realizaciones en la Fórmula general (VII), cada R es independientemente H o Me.
En algunas realizaciones en la Fórmula general (VII), r es 1 o 2.
En la técnica se conocen varios enlazadores no escindibles para unir fármacos a anticuerpos y pueden ser útiles en los ADC de la presente descripción en determinadas realizaciones. Ejemplos de enlazadores no escindibles incluyen enlazadores que tienen un resto éster de N-succinimidilo o éster de N-sulfosuccinimidilo para la reacción con el anticuerpo, así como un resto basado en maleimido o haloacetilo para la reacción con la toxina, o viceversa. Un ejemplo de tal enlazador no escindible se basa en sulfosuccinimidil-4-[N-maleimidometil]ciclohexano-1-carboxilato (sulfo-SMCC). Otros ejemplos no limitantes de tales enlazadores incluyen aquellos basados en N-succinimidil-4-(maleimidometil)ciclohexanocarboxilato (SMCC), N-succinimidil-4-(N-maleimidometil)-ciclohexano-1-carboxi-(6-amidocaproato) ("cadena larga" SMCC o LC-SMCC), éster de N-succinimidilo del ácido K-maleimidoundecanoico (KMUA), éster de N-succinimidilo del ácido Y-maleimidobutírico (GMBS), éster de N-hidroxisuccinimida del ácido £-maleimidocaproico (EMCS), éster de m-maleimidobenzoil-N-hidroxisuccinimida (MBS), éster de N-(a-maleimidoacetoxi)-succinimida (AMAS), succinimidil-6-(p-maleimidopropionamido)hexanoato (SMPH), N-succinimidil-4-(p-maleimidofenil)-butirato (SMPB) y N-(p-maleimidofenil)isocianato (PMPI). Otros ejemplos incluyen aquellos que comprenden un grupo funcional basado en haloacetilo tal como N-succinimidil-4-(yodoacetil)-aminobenzoato (SIAB), N-succinimidilyodoacetato (SIA), N-succinimidil-bromoacetato (SBA) y N-succinimidil-3-(bromoacetamido)propionato (SBAP).
Otros ejemplos de enlazadores no escindibles incluyen ácidos maleimidocarboxílicos, tales como maleimidocaproilo (MC).
La selección de un enlazador apropiado para un ADC dado la puede hacer fácilmente el experto que tenga conocimiento de la técnica y teniendo en cuenta factores relevantes, tales como el sitio de unión al anticuerpo, cualquier restricción estructural de la toxina y la hidrofobicidad de la toxina (véase, por ejemplo, revisión en Nolting, Capítulo 5, Antibody-Drug Conjugates: Methods in Molecular Biology, 2013, Ducry (Ed.), Springer). En determinadas realizaciones, el enlazador incluido en los ADC de la presente descripción tiene la Fórmula general (VIII):
en donde:
A-S- es el punto de unión al anticuerpo biparatópico anti-HER2;
Y es uno o más componentes enlazadores adicionales, o está ausente, y
D es el punto de unión al análogo de auristatina.
En determinadas realizaciones, el enlazador incluido en los ADC de la presente descripción tiene la Fórmula general (IX):
en donde:
A-S- es el punto de unión al anticuerpo biparatópico anti-HER2;
Y es uno o más componentes enlazadores adicionales, o está ausente, y
D es el punto de unión al análogo de auristatina.
Preparación de conjugados de anticuerpo-fármaco
Los ADC de la presente descripción se pueden preparar mediante una de varias rutas conocidas en la técnica, empleando reacciones de química orgánica, condiciones y reactivos conocidos por los expertos en la técnica (véase, por ejemplo,Bioconjugate Techniques(G.T. Hermanson, 2013, Academic Press y los ejemplos que se proporcionan en el presente documento). Por ejemplo, la conjugación puede lograrse mediante (1) la reacción de un grupo nucleofílico o un grupo electrofílico de un anticuerpo con un enlazador bifuncional para formar un intermedio anticuerpo-enlazador Ab-L, mediante un enlace covalente, seguido de una reacción con un análogo de auristatina activado (D), o (2) reacción de un grupo nucleofílico o un grupo electrofílico de un análogo de auristatina con un enlazador para formar el enlazador-toxina D-L, mediante un enlace covalente, seguida de una reacción con el grupo nucleofílico o un grupo electrofílico de un anticuerpo. Los métodos de conjugación (1) y (2) pueden emplearse con una variedad de anticuerpos, análogos de auristatina y enlazadores para preparar los ADC descritos en el presente documento.
Como se describió anteriormente, el análogo de auristatina se puede conjugar a través de un enlazador apropiado a varios grupos en el anticuerpo para proporcionar el ADC. Por ejemplo, la conjugación puede ser a través de lisinas superficiales, a través de carbohidratos oxidados o a través de restos de cisteína que se han liberado por reducción de uno o más enlaces disulfuro entre cadenas. Alternativamente, el anticuerpo puede modificarse para incluir restos de cisteína adicionales o aminoácidos no naturales que proporcionen asas reactivas, tales como selenometionina, p-acetilfenilalanina, formilglicina o p-azidometil-L-fenilalanina. Tales modificaciones son bien conocidas en la técnica (véase, por ejemplo, las patentes de EE. UU. N.° 7,521,541; 8,455,622 y 9,000,130; Hofer et al.,Biochemistry,48:12047-12057 (2009); Axup et al.,PNAS,109:16101-16106 (2012); Wu et al.,PNAS,106:3000-3005 (2009); Zimmerman et al.,Bioconj. Chem,25:351-361 (2014)).
En determinadas realizaciones, los ADC de la presente descripción comprenden un análogo de auristatina conjugado a través de un enlazador apropiado a restos de cisteína que se han liberado por reducción de uno o más enlaces disulfuro entre cadenas.
En los ADC descritos en el presente documento, el anticuerpo biparatópico anti-HER2 se conjuga con la toxina a través de un enlazador con una relación de fármaco a anticuerpo (DAR) promedio baja, específicamente una DAR promedio de menos de 3,9 pero más de 0,5, por ejemplo, entre aproximadamente 1,5 y aproximadamente 2,5 en determinadas realizaciones.
Se conocen varios métodos en la técnica para preparar ADC con una DAR promedio baja (véase, por ejemplo, revisión de McCombs y Owen,The AAPS Journal,17(2):339-351 (2015) y referencias en el mismo; Boutureira y Bernardes,Chem. Rev.,115:2174-2195 (2015)).
Por ejemplo, para la conjugación con restos de cisteína, se puede realizar una reducción parcial de los enlaces disulfuro entre cadenas del anticuerpo seguido de la conjugación con el enlazador-toxina. La reducción parcial se puede lograr limitando la cantidad de agente reductor utilizado en la reacción de reducción (véase, por ejemplo, Lyon et al.,Methods in Enzymology,502:123-138 (2012), y ejemplos en el mismo, y los ejemplos proporcionados en el presente documento). Los agentes reductores adecuados son conocidos en la técnica e incluyen, por ejemplo, ditiotreitol (DTT), tris(2-carboxietil)fosfina (TCEP), 2-mercaptoetanol, cisteamina y varias fosfinas solubles en agua. Alternativamente, o además, se pueden emplear menos equivalentes de enlazadortoxina para obtener una DAR promedio baja.
Alternativamente, se puede emplear un anticuerpo diseñado en el que uno o más de los restos de cisteína que forman los enlaces disulfuro entre cadenas se reemplazan con un resto de serina que da como resultado menos restos de cisteína disponibles para la conjugación (véase McDonagh et al.,Protein Eng. Des. Sel. PEDS,19(7):299-307). El anticuerpo modificado por ingeniería genética se puede tratar después con agente reductor y conjugar con el enlazador-toxina.
Otro enfoque es emplear un enlazador de bis-tiol que une dos cisteínas que normalmente forman un enlace disulfuro entre cadenas. El uso de un enlazador de bis-tiol que lleva solo una molécula de toxina produciría un ADC con una DAR4 máxima para un anticuerpo de tamaño completo, si los cuatro enlaces disulfuro entre cadenas se reducen y reemplazan con el enlazador de bis-tiol. Se puede usar la reducción parcial de los enlaces disulfuro entre cadenas y/o menos equivalentes de enlazador junto con un enlazador de bis-tiol con el fin de reducir aún más la DAR. En la técnica se conocen varios enlazadores de bis-tiol (véase, por ejemplo, Badescu et al.,Bioconjug. Chem.,25(6):1124-1136 (2014); Behrens et al.,Mol. Pharm.,12:3986-3998 (2015); Lee et al.,Chem. Sci.,7:799-802 (2016); Maruani et al.,Nat. Commun.,6:6645 (2015)).
También se pueden emplear enfoques de modificación de cisteínas con el fin de generar ADC con una DAR promedio baja. Dichos enfoques implican la modificación de cisteínas accesibles al disolvente en el anticuerpo con el fin de proporcionar una manipulación específica del sitio para la conjugación. Se han identificado varios sitios apropiados para la introducción de un resto de cisteína con la estructura de IgG, e incluyen los descritos en Junutula, et al.,J. Immunol Methods,332(1-2):41-52 (2008); Junutula, et al.,Nat. Biotechnol.,26(8), 925 932 (2008), y patentes de EE. UU. N.° 9,315,581; 9,000,130; 8,455,622; 8,507,654 y 7,521,541.
También se pueden preparar ADC de DAR promedio baja mediante conjugación de lisina empleando cantidades limitantes de enlazador-toxina activada. También se puede emplear la reacción selectiva en los aminoácidos N-terminales del anticuerpo. Por ejemplo, la serina N-terminal puede oxidarse a un aldehído con peryodato, luego reaccionar con el enlazador-toxina (véase, por ejemplo, Thompson, et al.,Bioconjug. Chem.,26(10):2085-2096 (2015)). De manera similar, los restos de cisteína N-terminales se pueden hacer reaccionar selectivamente con aldehídos para dar tiazolidinonas (véase, por ejemplo, Bernardes, et al.,Nature Protocols,8:2079-2089).
Enfoques adicionales incluyen la modificación del anticuerpo para incluir uno o más aminoácidos no naturales, tales como p-acetilfenilalanina (pAcPhe) o selenocisteína (Sec). El grupo ceto en pAcPhe se puede hacer reaccionar con un enlazador-toxina que comprende una alcoxiamina o hidrazida terminal para formar un enlace de oxima o hidrazona (véase, por ejemplo, AXup, et al.,PNAS USA,109: 16101-16106 (20l2)). Los anticuerpos que contienen Sec se pueden hacer reaccionar con enlazador-toxinas que contienen maleimida o yodoacetamida para formar un conjugado de selenoéter (véase, por ejemplo, Hofer, et al.,Biochemistry,48:12047-12057 (2009)).
Los anticuerpos también se pueden modificar para incluir marcadores peptídicos reconocidos por ciertas enzimas para permitir la conjugación catalizada por enzimas. Por ejemplo, la sortasa-A (SortA) reconoce la secuencia LPXTG. Este pentapéptido puede modificarse en el extremo N o C del anticuerpo para permitir la conjugación mediada por SortA (véase, por ejemplo, publicación de solicitud de patente de<e>E. UU. N.° 2016/0136298; Komberger y Skerra,mAbs,6(2):354-366 (2014)). Las transglutaminasas también se han empleado para generar ADC de DAR2 usando anticuerpos que se han desglicosilado en la posición N297 (que expone Q295 para conjugación enzimática) o modificando anticuerpos para incluir un "marcador de glutamina" (LLQG) (Jeger, et al.,Angew. Chem.,49:9995-9997 (2010); Strop, et al.,Chem. Biol.,20(2):161-167 (2013)). En otro enfoque, se puede introducir un resto de formilglicina en un anticuerpo modificando una secuencia consenso apropiada en el anticuerpo y coexpresando el anticuerpo modificado con la enzima generadora de formilglicina (FGE). La funcionalidad aldehido de la formilglicina introducida se puede utilizar entonces como un asa para la conjugación de la toxina (véase, por ejemplo, Drake, et al.,Bioconjug. Chem.,25(7): 1331-1341 (2014)).
Otro enfoque utilizado para generar ADC de DAR2 es mediante la conjugación de enlazador-toxina con los azúcares nativos que se encuentran en los anticuerpos glicosilados. La conjugación con anticuerpos glicosilados se puede lograr, por ejemplo, mediante la oxidación con peryodato de los restos de azúcar terminales para producir aldehídos, que luego se pueden conjugar con un enlazador-toxina adecuada, o mediante enfoques de glicoingeniería en los que los azúcares nativos se modifican con restos de ácido siálico terminales, que luego puede oxidarse para producir aldehidos para la conjugación con el enlazador-toxina (Zhou, et al.,Bioconjug. Chem.,25(3):510-520 (2014)).
También se ha descrito el uso de entrecruzamiento UV para la conjugación de restos activos con anticuerpos. Este método utiliza el sitio de unión de nucleótidos (NBS) para la funcionalización covalente específica del sitio de anticuerpos con restos tiol reactivos. Se usó una versión de cisteína conjugada con ácido indol-3-butírico (IBA) para fotorreticular de forma específica del sitio un resto tiol reactivo con anticuerpos en el NBS. El resto tiol se puede usar luego para conjugar el enlazador-toxina que tiene un grupo reactivo tiol (Alves, et al.,Bioconjug. Chem.,25(7):1198-1202 (2014)).
Alternativamente, los ADC con una DAR promedio baja pueden aislarse de una preparación de ADC que contiene una mezcla de especies de DAR utilizando técnicas de separación cromatográfica, tales como la cromatografía de interacción hidrófoba (véase, por ejemplo, Hamblett, et al.,Clin. CancerRes.,10:7063-7070 (2004); Sun, et al.,Bioconj Chem.,28:1371-81 (2017); publicación de solicitud de patente de EE. UU. N.° 2014/0286968).
Las preparaciones de ADC con una DAR promedio baja también se pueden generar añadiendo un anticuerpo no conjugado (es decir, DARO) a preparaciones de<a>D<c>que tienen una DAR promedio > 3,9. Como se sabe en la técnica, la mayoría de los métodos de conjugación producen una preparación de ADC que incluye varias especies de DAR, siendo la DAR dada el promedio de las especies de DAR individuales. En determinadas realizaciones, las preparaciones de ADC que incluyen una proporción de especies de DARO pueden ser ventajosas. En algunas realizaciones, la preparación de ADC que tiene una DAR promedio inferior a 3,9 puede incluir al menos 5% de especies de DARO. En algunas realizaciones, la preparación de ADC puede incluir al menos 10% de especies de DARO, por ejemplo, al menos 15% de especies de DARO o al menos 20% de especies de DARO. En algunas realizaciones, la preparación de ADC puede incluir entre aproximadamente 5% y aproximadamente 50% de especies de DARO. En algunas realizaciones, la preparación de ADC puede incluir entre aproximadamente 10% y aproximadamente 50% de especies de DARO, por ejemplo, entre aproximadamente 10% y aproximadamente 40%, o entre aproximadamente 10% y aproximadamente 30% de especies de DARO.
La DAR promedio para los ADC puede determinarse mediante técnicas convencionales tales como análisis espectroscópico<u>V/VIS, técnicas basadas en ELISA, técnicas cromatográficas tales como cromatografía de interacción hidrófoba (HIC), espectrometría de masas (MS) UV-MALDI y MS MALDI- TOF. Además, la distribución de formas ligadas a fármacos (por ejemplo, la fracción de especies de DAR0, DAR1, DAR2, etc.) también puede analizarse mediante diversas técnicas conocidas en la técnica, incluida la MS (acompañada o no de una etapa de separación cromatográfica), cromatografía de interacción hidrófoba, HPLC de fase inversa o electroforesis en gel de enfoque isoeléctrico (IEF) (véase, por ejemplo, Sun et al.,Bioconj Chem.,28:1371-81 (2017); Wakankar et al.,mAb,3:161-172 (2011)).
En determinadas realizaciones, la DAR promedio de los ADC se determina mediante técnicas de cromatografía de interacción hidrófoba (HIC).
Después de la conjugación, los ADC pueden purificarse y separarse de los reaccionantes no conjugados y/o cualquier agregado conjugado mediante métodos de purificación conocidos en la técnica. Tales métodos incluyen, pero no se limitan a, cromatografía de exclusión por tamaño (SEC), cromatografía de interacción hidrófoba (HIC), cromatografía de intercambio iónico, cromatoenfoque, ultrafiltración, ultrafiltración centrífuga y combinaciones de los mismos.
Ensayo
La actividad anticancerosa de los ADC en células cancerosas que expresan HER2 se puede ensayarin vitroy/oin vivousando técnicas convencionales.
Por ejemplo, la actividad citotóxica de los ADC se puede medir exponiendo células cancerosas que expresan HER2 al ADC en un medio de cultivo celular, cultivando las células durante un periodo de tiempo apropiado (por ejemplo, de aproximadamente 6 h a aproximadamente 7 días), luego midiendo la viabilidad celular. Se pueden incluir como control células que no expresan HER2.
Se conocen en la técnica una variedad de líneas celulares de cáncer que expresan HER2 en niveles variables, que pueden usarse para ensayar los ADC y muchas están disponibles comercialmente (por ejemplo, de la American Type Culture Collection, Manassas, VA; Addexbio Technologies, San Diego, CA; DSMZ, Braunschweig, Alemania). Los ejemplos incluyen las líneas celulares BT-474 (3+), SK-BR-3 (3+), HCC1954 (3+), JIMT-1 (2+) y ZR-75-1 (1+). Estos y otros ejemplos se resumen en la Tabla 8.
Tabla 8: Niveles de expresión relativos de HER2 en líneas celulares de interés
La capacidad de los ADC para inhibir el crecimiento tumoralin vivose puede determinar en un modelo animal apropiado usando técnicas convencionales conocidas en la técnica (véase, por ejemplo, Enna, et al.,Current Protocolsin Pharmacology,J. Wiley & Sons, Inc., Nueva York, NY). En general, los modelos animales actuales para el cribado de compuestos antitumorales son modelos de xenoinjerto, en los que se ha implantado un tumor humano en un animal, típicamente un roedor.
Por ejemplo, los ADC se pueden ensayarin vivoen tumores que expresan HER2 utilizando ratones a los que se les injerta por vía subcutánea un fragmento tumoral, o se les implanta un número apropiado de células cancerosas, el día 0. Se deja que los tumores se desarrollen hasta el tamaño deseado, eliminándose los animales que tienen tumores insuficientemente desarrollados. El tratamiento con ADC generalmente comienza de 3 a 22 días después del injerto, dependiendo del tipo de tumor. El ADC se puede administrar a los animales, por ejemplo, mediante inyección intravenosa (i.v.). Los tumores se miden después de un período de tiempo predeterminado o de forma continua (por ejemplo, 2 o 3 veces por semana) hasta un punto final predeterminado para el estudio, por ejemplo, cuando el tumor alcanza un tamaño o peso predeterminado. Los tumores que expresan HER2 en varios niveles pueden usarse en los modelos de xenoinjerto. Los xenoinjertos derivados de paciente (PDX) son particularmente útiles.
Los efectos tóxicosin vivode los ADC pueden evaluarse inicialmente en roedores, por ejemplo ratones o ratas, midiendo su efecto en el peso corporal de los animales durante el tratamiento. También se pueden realizar perfiles hematológicos y análisis de enzimas hepáticas en muestras de sangre tomadas de los animales.
La toxicidadin vivoy la farmacocinética se pueden analizar adicionalmente en modelos animales apropiados, por ejemplo, ratas o primates no humanos, siguiendo protocolos convencionales. Los macacos cangrejeros son particularmente útiles a este respecto ya que el HER2 humano y de macaco cangrejero comparten una homología de secuencia de 98%.
Los ADC descritos en el presente documento tienen una tolerabilidad mejorada y una menor toxicidad en comparación con un ADC correspondiente que tiene una DAR >3,9 cuando se administra con la misma dosis de toxina. En determinadas realizaciones, los ADC muestran una mejora en la tolerabilidad superior a 2x la de un ADC correspondiente que tiene una DAR >3,9 cuando se administra con la misma dosis de toxina. En algunas realizaciones, los ADC muestran una mejora en la tolerabilidad superior a 2,2x, por ejemplo, 2,3x, 2,4x o 2,5x, la de un ADC correspondiente que tiene una DAR >3,9 cuando se administra con la misma dosis de toxina. La mejora en la tolerabilidad se puede determinar, por ejemplo, mediante la comparación de la dosis máxima tolerada (MTD), el nivel sin acontecimiento adverso observado (NOAEL) o la dosis más alta sin toxicidad grave (HNSTD) para el ADC de la presente descripción y el ADC correspondiente que tiene una DAR >3,9. MTD, NOAEL y/o HNSTD pueden medirse mediante técnicas convencionales en un modelo animal apropiado, por ejemplo, un roedor o un primate no humano.
Composiciones farmacéuticas
Para uso terapéutico, los ADC se pueden proporcionar en forma de composiciones que comprenden el ADC y un vehículo o diluyente farmacéuticamente aceptable. Las composiciones se pueden preparar mediante procedimientos conocidos usando ingredientes bien conocidos y fácilmente disponibles.
Las composiciones farmacéuticas pueden formularse para la administración a un sujeto, por ejemplo, por vía oral (incluyendo, por ejemplo, bucal o sublingual), tópica, parenteral, rectal o vaginal, o por inhalación o pulverización. El término "parenteral" como se usa en el presente documento incluye inyección subcutánea e inyección o infusión intradérmica, intraarticular, intravenosa, intramuscular, intravascular, intraesternal, intratecal. La composición farmacéutica normalmente se formulará en un formato adecuado para la administración al sujeto, por ejemplo, como un jarabe, elixir, comprimido, pastilla para chupar, pastilla, cápsula dura o blanda, píldora, supositorio, suspensión oleosa o acuosa, polvo o gránulo dispersable, emulsión, inyectable o solución. Las composiciones farmacéuticas se pueden proporcionar como formulaciones farmacéuticas unitarias.
En determinadas realizaciones, las composiciones farmacéuticas que comprenden los ADC se formulan para administración parenteral en una forma farmacéutica unitaria inyectable, por ejemplo, como formulaciones liofilizadas o soluciones acuosas.
Los vehículos farmacéuticamente aceptables generalmente no son tóxicos para los receptores en las dosis y concentraciones empleadas. Ejemplos de dichos vehículos incluyen, pero no se limitan a, tampones tales como fosfato, citrato y otros ácidos orgánicos; antioxidantes como ácido ascórbico y metionina; conservantes tales como cloruro de octadecildimetilbencilamonio, cloruro de hexametonio, cloruro de benzalconio, cloruro de bencetonio, fenol, alcohol butílico, alcohol bencílico, alquilparabenos (tales como metil o propilparabeno), catecol, resorcinol, ciclohexanol, 3-pentanol y m-cresol; polipéptidos de bajo peso molecular (menos de aproximadamente 10 restos); proteínas tales como albúmina sérica o gelatina; polímeros hidrófilos tales como polivinilpirrolidona; aminoácidos tales como glicina, glutamina, asparagina, histidina, arginina o lisina; monosacáridos, disacáridos y otros carbohidratos tales como glucosa, manosa o dextrinas; agentes quelantes tales como EDTA; azúcares tales como sacarosa, manitol, trehalosa o sorbitol; contraiones formadores de sales tales como sodio; complejos metálicos tales como complejos de Zn-proteína y tensioactivos no iónicos tales como polietilenglicol (p Eg ).
En determinadas realizaciones, las composiciones que comprenden los ADC pueden estar en forma de una solución o suspensión inyectable estéril acuosa u oleaginosa. Dichas suspensiones se pueden formular utilizando agentes dispersantes o humectantes y/o agente de suspensión adecuados que se conocen en la técnica. La solución o suspensión inyectable estéril puede comprender el ADC en un diluyente o vehículo no tóxico aceptable por vía parenteral. Los diluyentes y vehículos aceptables que pueden emplearse incluyen, por ejemplo, 1,3-butanodiol, agua, solución de Ringer o solución isotónica de cloruro de sodio. Además, se pueden emplear aceites fijos estériles como vehículo. Para este fin, se pueden emplear diversos aceites fijos blandos, incluidos mono o diglicéridos sintéticos. Además, los ácidos grasos, tales como ácido oleico, son útiles en la preparación de inyectables. También se pueden incluir en la solución o suspensión inyectable adyuvantes tales como anestésicos locales, conservantes y/o agentes de taponamiento.
En determinadas realizaciones, la composición que comprende el ADC puede formularse para administración intravenosa a seres humanos. Normalmente, las composiciones para administración intravenosa son soluciones en tampón acuoso isotónico estéril. En los casos que sea necesario, la composición también puede incluir un agente solubilizante y/o un anestésico local, tal como lignocaína, para aliviar el dolor en el sitio de inyección. Generalmente, los ingredientes se suministran por separado o se mezclan entre sí en forma farmacéutica unitaria, por ejemplo, como un polvo liofilizado seco o concentrado sin agua en un recipiente herméticamente cerrado, tal como una ampolla o una bolsita que indica la cantidad de agente activo. Cuando la composición se va a administrar por infusión, se puede dispensar con una botella de infusión que contiene agua o solución salina estéril de calidad farmacéutica. Cuando la composición se administra por inyección, se puede proporcionar una ampolla de agua estéril para inyección o solución salina para que los ingredientes se puedan mezclar antes de la administración.
Otras composiciones farmacéuticas y métodos para preparar composiciones farmacéuticas se conocen en la técnica y se describen, por ejemplo, en "Remington: The Science and Practice of Pharmacy" (anteriormente "Remingtons Pharmaceutical Sciences"); Gennaro, A., Lippincott, Williams & Wilkins, Philadelphia, PA (2000).
Métodos de uso
Los ADC descritos en el presente documento se pueden usar en métodos para inhibir el crecimiento de células tumorales que expresan HER2. Las células pueden serin vitrooinvivo. En determinadas realizaciones, los ADC pueden usarse en métodos para tratar un cáncer o tumor que expresa HER2 en un sujeto.
El tratamiento de un cáncer que expresa HER2 puede dar como resultado uno o más de alivio de los síntomas, reducción del tamaño del tumor, inhibición del crecimiento del tumor, disminución de una o más consecuencias patológicas directas o indirectas de la enfermedad, prevención de metástasis, disminución de la velocidad de progresión de la enfermedad, mejora o paliación del estado de la enfermedad, mejora de la supervivencia, aumento de la supervivencia libre de progresión, remisión y/o mejora del pronóstico.
En determinadas realizaciones, el tratamiento de un cáncer que expresa HER2 con un ADC como se describe en el presente documento ralentiza la progresión de la enfermedad. En algunas realizaciones, el tratamiento de un cáncer que expresa HER2 con un ADC como se describe en el presente documento da como resultado la regresión del tumor. En algunas realizaciones, el tratamiento de un cáncer que expresa HER2 con un ADC como se describe en el presente documento da como resultado la inhibición del crecimiento del tumor.
Los cánceres que expresan HER2 son típicamente tumores sólidos. Los ejemplos de tumores sólidos que expresan HER2 incluyen, pero no se limitan a, cáncer de mama, cáncer de ovario, cáncer de pulmón, cáncer gástrico, cáncer de esófago, cáncer colorrectal, cáncer urotelial, cáncer de páncreas, cáncer de glándulas salivales y cáncer de cerebro. El cáncer de mama que expresa HER2 incluye cánceres de mama negativos para receptores de estrógenos (ER-) y/o negativos para receptores de progesterona (PR-) y cánceres de mama triple negativo (ER-, PR-, HER2 bajo). Los cánceres de pulmón que expresan HER2 incluyen el cáncer de pulmón no microcítico (NSCLC) y el cáncer de pulmón microcítico.
En determinadas realizaciones, los ADC descritos en el presente documento pueden usarse en el tratamiento del cáncer de mama, cáncer de ovario, cáncer de pulmón o cáncer gástrico que expresan HER2. En algunas realizaciones, los ADC descritos en el presente documento pueden usarse en el tratamiento del cáncer de mama que expresa HER2. En algunas realizaciones, los ADC descritos en el presente documento pueden usarse en el tratamiento del cáncer de mama que expresa HER2 que también es negativo para receptores de estrógenos y receptores de progesteronas. En algunas realizaciones, los ADC descritos en el presente documento pueden usarse en el tratamiento del cáncer de mama triple negativo (TNBC) que expresa HER2. En algunas realizaciones, los ADC descritos en el presente documento pueden usarse en el tratamiento del cáncer de mama que expresa HER2 que ha metastatizado en el cerebro. En algunas realizaciones, los ADC descritos en el presente documento pueden usarse en el tratamiento del cáncer de ovario que expresa HER2.
Como se conoce en la técnica, los cánceres que expresan HER2 pueden caracterizarse por el nivel de HER2 que expresan (es decir, por el "estado de HER2"). El estado de HER2 se puede evaluar, por ejemplo, por inmunohistoquímica (IHC), hibridación in situ fluorescente (FISH) e hibridación in situ cromogénica (CISH).
La IHC identifica la expresión de la proteína HER2 en la membrana celular. Las secciones de tejido injertadas en parafina de una biopsia tumoral se pueden someter al ensayo IHC y acordar un criterio de intensidad de tinción de HER2 de la siguiente manera:
Puntuación 0: no se observa tinción o se observa tinción de membrana en menos de 10% de las células tumorales; típicamente <20.000 receptores/célula.
Puntuación 1+: se detecta una tinción de membrana leve/apenas perceptible en más de 10% de las células tumorales. Las células solo se tiñen en parte de su membrana. Típicamente aproximadamente 100.000 receptores/célula.
Puntuación 2+: se observa una tinción de la membrana completa de débil a moderada en más de 10% de las células tumorales; normalmente aproximadamente 500.000 receptores/célula.
Puntuación 3+: se observa una tinción de la membrana completa de moderada a fuerte en más de 10% de las células tumorales; normalmente aproximadamente 2.000.000 de receptores/célula.
Los tumores con puntuaciones de 0 o 1+ para la expresión de HER2 se caracterizan como negativos para HER2, mientras que los tumores con puntuaciones de 2+ o 3+ se caracterizan como positivos para HER2.
Ejemplos de kits comerciales aprobados por la FDA disponibles para la detección de HER2 usando IHC incluyen HercepTest™ (Dako DenmarkA/S); PAt Hw AY (Ventana Medical Systems, Inc.); kit InSite™HER2/NEU (Biogenex Laboratories, Inc.) y Bond Oracle HER2 IHC System (Leica Biosystems.
Los ADC como se describen en el presente documento pueden ser útiles en el tratamiento de cánceres que expresan HER2 en varios niveles. En determinadas realizaciones, los ADC pueden usarse en el tratamiento de cánceres que expresan niveles altos de HER2 (IHC 3+). En algunas realizaciones, los ADC pueden usarse en el tratamiento de cánceres que expresan niveles altos de HER2 (IHC 3+) o niveles moderados de HER2 (IHC 2+ o IHC 2+/3+). En algunas realizaciones, los ADC pueden usarse en el tratamiento de cánceres que expresan niveles altos de HER2 (IHC 3+), niveles moderados de HER2 (IHC 2+ o IHC 2+/3+) o niveles bajos de HER2 (IHC 1+ o IHC 1+/2+). En algunas realizaciones, los ADC descritos en el presente documento pueden usarse en el tratamiento de cánceres que se califican como negativos para HER2 por IHC.
En determinadas realizaciones, los niveles de HER2 del cáncer que se va a tratar con los ADC se determinan por IHC. En algunas realizaciones, los niveles de HER2 del cáncer que se va a tratar con los ADC se determinan por IHC realizada usando el ensayo Herceptest™.
Los cánceres que expresan HER2 pueden ser de naturaleza homogénea (es decir, la mayoría de las células tumorales expresan una cantidad similar de HER2) o pueden ser de naturaleza heterogénea (es decir, comprender diferentes poblaciones de células tumorales que expresan diferentes niveles de HER2). Se contempla que los ADC pueden usarse para tratar cánceres que expresan HER2 que son homogéneos o heterogéneos con respecto a los niveles de HER2.
En determinadas realizaciones, los ADC encuentran uso en métodos para tratar a un sujeto que tiene un cáncer que expresa HER2 que es resistente o se está volviendo resistente a otras terapias de referencia. En algunas realizaciones, los ADC encuentran uso en métodos para tratar a un sujeto que tiene un cáncer que expresa HER2 que no responde a una o más terapias actuales, tales como trastuzumab (Herceptin®), pertuzumab (Perjeta®), T-DM1 (Kadcyla® o trastuzumab emtansina) o taxanos (tales como paclitaxel, docetaxel, cabazitaxel y similares). En algunas realizaciones, los ADC encuentran uso en métodos para tratar a un sujeto que tiene un cáncer que expresa HER2 que es resistente a trastuzumab. En algunas realizaciones, los ADC encuentran uso en métodos para tratar a un sujeto que tiene un cáncer que expresa HER2 que es resistente a pertuzumab. En algunas realizaciones, los ADC encuentran uso en métodos para tratar a un sujeto que tiene un cáncer que expresa HER2 que es resistente a T-DM1. En algunas realizaciones, los ADC encuentran uso en el tratamiento del cáncer metastásico cuando el paciente ha progresado con la terapia anti-HER2 previa.
Cuando los ADC se usan en el tratamiento de sujetos que tienen un cáncer que expresa HER2 que es resistente, refractario y/o recidivante del tratamiento con otro agente terapéutico, los ADC pueden ser parte de una terapia de segunda línea, o una terapia de tercera o cuarta línea, dependiendo del número de tratamientos previos que haya sufrido el sujeto.
En determinadas realizaciones, los ADC descritos en el presente documento pueden usarse junto con un agente antitumoral adicional en el tratamiento de sujetos que tienen un cáncer que expresa HER2. El agente antitumoral adicional puede ser un anticuerpo terapéutico tales como los indicados anteriormente o un agente quimioterapéutico. Los agentes quimioterapéuticos comúnmente utilizados para el tratamiento de cánceres que expresan HER2 incluyen, por ejemplo, cisplatino, carboplatino, paclitaxel, paclitaxel unido a albúmina Abraxane®), docetaxel, gemcitabina, vinorelbina, irinotecán, etopósido, vinblastina, pemetrexed, 5-fluorouracilo (con o sin ácido folínico), capecitabina, carboplatino, epirubicina, oxaliplatino, folfirinox, ciclofosfamida y diversas combinaciones de estos agentes como se conoce en la técnica. El(los) agente(s) adicional(es) puede(n) administrarse(n) al sujeto al mismo tiempo que los ADC o secuencialmente.
En determinadas realizaciones, se contempla que los ADC descritos en el presente documento se pueden usar para tratar a un sujeto que tiene un cáncer que expresa HER2 que no se ha sometido a ningún tratamiento anticanceroso anterior (es decir, los ADC se pueden usar como terapia de primera línea).
En determinadas realizaciones, el sujeto que se trata con el ADC en los métodos anteriores puede ser un ser humano, un primate no humano u otro mamífero. En algunas realizaciones, el sujeto que se trata con el ADC en los métodos anteriores es un sujeto humano.
La cantidad del ADC que se va a administrar a un sujeto variará a la luz de las circunstancias relevantes, incluida la afección que se va a tratar, la vía de administración elegida, el compuesto real administrado, la edad, peso y respuesta del sujeto individual y la gravedad de los síntomas del sujeto, pero es una cantidad terapéuticamente eficaz.
La expresión "cantidad terapéuticamente eficaz" como se usa en el presente documento se refiere a la cantidad de ADC requerida para ser administrada con el fin de lograr el objetivo del método mencionado, por ejemplo, la mejora de uno o más de los síntomas de la enfermedad que se está tratando. La cantidad del ADC descrito en el presente documento que será eficaz en el tratamiento de un cáncer que expresa HER2 puede determinarse mediante técnicas clínicas convencionales. Además, se pueden emplear opcionalmente ensayosin vitropara ayudar a identificar intervalos de dosis óptimos. Las dosis efectivas se extrapolan de curvas de respuesta a la dosis derivadas de sistemas de ensayo en modelos animales oin vitro.
Kits farmacéuticos
Ciertas realizaciones proporcionan kits farmacéuticos que comprenden un ADC como se describe en el presente documento.
El kit normalmente comprenderá un recipiente y una etiqueta y/o prospecto en o asociado con el recipiente. La etiqueta o prospecto contiene instrucciones habitualmente incluidas en los envases comerciales de productos terapéuticos, proporcionando información sobre las indicaciones, uso, dosificación, administración, contraindicaciones y/o advertencias relativas al uso de dichos productos terapéuticos. La etiqueta o prospecto puede incluir además un aviso en la forma prescrita por una agencia gubernamental que regula la fabricación, uso o venta de productos farmacéuticos o biológicos, aviso que refleja la aprobación por la agencia de fabricación, para uso o venta para administración humana o animal. La etiqueta o prospecto también indica que el ADC es para usar para tratar un cáncer que expresa HER2. El recipiente contiene una composición que comprende el ADC y, en algunas realizaciones, puede tener un puerto de acceso estéril (por ejemplo, el recipiente puede ser una bolsa de solución intravenosa o un vial que tiene un tapón que puede perforarse con una aguja de inyección hipodérmica).
Además del contenedor que contiene la composición que comprende el ADC, el kit puede comprender uno o más recipientes adicionales que comprenden otros componentes del kit. Por ejemplo, un tampón farmacéuticamente aceptable, tal como agua bacteriostática para inyección (BWFI), solución salina tamponada con fosfato, solución de Ringer o solución de dextrosa; otros tampones o diluyentes.
Los recipientes adecuados incluyen, por ejemplo, botellas, viales, jeringas, bolsas de solución intravenosa y similares. Los recipientes pueden estar formados de una variedad de materiales, tales como vidrio o plástico. Si es apropiado, uno o más componentes del kit pueden estar liofilizados o proporcionarse en una forma seca, tal como un polvo o gránulos, y el kit puede contener adicionalmente un disolvente adecuado para la reconstitución del(de los) componente(s) liofilizado(s) o seco(s).
El kit puede incluir además otros materiales deseables desde un punto de vista comercial o de usuario, tales como filtros, agujas y jeringas.
Los siguientes ejemplos se proporcionan con fines ilustrativos y no pretenden limitar el alcance de la invención de ninguna manera.
Ejemplos
Ejemplo 1: Síntesis de enlazador-toxina
El siguiente ejemplo describe la preparación de un enlazador-toxina de ejemplo (enlazador-toxina 001) que comprende el siguiente análogo de auristatina (Compuesto 9):
Se pueden emplear protocolos similares para preparar enlazadores-toxinas que comprenden otros análogos de auristatina que incluyen los siguientes compuestos de ejemplo (véase también la publicación de solicitud de patente internacional N.° WO 2016/041082):
1.1 (2R,3R)-3-metoxi-2-metil-3-((S)-pirrolidin-2-il)propanoato de etilo (Compuesto 1)
A una solución agitada de ácido (2R,3R)-3-((S)-1-(terc-butoxicarbonil)pirrolidin-2-il)-3-metoxi-2-metilpropanoico (Boc-Dap-OH, 4,31 g, 15,0 mmol) en etanol absoluto (27,0 ml) a 0°C se añadió gota a gota cloruro de tionilo (3,0 ml). La solución resultante se dejó calentar a temperatura ambiente y el progreso se vigiló por HPLC-MS. Después de 18 h, no se detectó ningún material de partida restante y la solución se concentró a sequedad a presión reducida. El aceite resultante se suspendió en tolueno (10 ml) y se concentró a presión reducida dos veces, luego se suspendió en éter dietílico (5 ml) y se concentró a presión reducida dos veces para proporcionar una espuma sólida blanca (3,78 g, rendimiento cuantitativo %). MSm/zobs. = 216,5 (M+1).
1.2 Ácido (3R,4S,5S)-4-((S)-2-(((benciloxi)carbonil)amino)-N,3-dimetilbutanamido)-3-metoxi-5-metilheptanoico (Compuesto 3)
El compuesto 2 se preparó como se describe en la publicación de solicitud de patente internacional N.° WO 2016/041082.
A una solución agitada del compuesto 2 (6,965 g, 14,14 mmol) en diclorometano (20 ml) se le añadió ácido trifluoroacético (5,0 ml). Se vigiló la finalización de la reacción por HPLC-MS y después de 40 h no quedaba material de partida. La reacción se concentró a presión reducida, se coevaporó con tolueno (2 x 10 ml) y diclorometano (2 x 10 ml) para obtener un sólido blanco espumoso (6,2 g, rendimiento cuantitativo con TfA residual). Este material se disolvió en 200 ml de EtOAc:hexanos 1:3 caliente y se dejó enfriar a temperatura ambiente. Durante el enfriamiento, se formó un precipitado así como algunos cristales pequeños. Se añadieron 5 ml de EtOAc y la suspensión se calentó una vez más para disolver completamente el precipitado. Se formaron más cristales al enfriar a temperatura ambiente y el matraz se puso a -30°C durante la noche. A la mañana siguiente las aguas madre se decantaron y los cristales se enjuagaron con 2 x 50 ml de hexanos y se secaron con alto vacío. Se recuperaron 5,67 g de producto cristalino. MSm/zobs. = 405,7 (M+1).
1.3 (2R,3R)-3-((S)-1-((3R,4S,5S)-4-((S)-2-(((benciloxi)carbonil)amino)-N,3-dimetilbutanamido)-3-metoxi-5-metilheptanoil)pirrolidin-2-il)-3-metoxi-2-metilpropanoato de etilo (Compuesto 4)
A una solución agitada del compuesto 3 (6,711 g, 15,37 mmol, 1,025 eq) en una mezcla de diclorometano (5,0 ml) y W,N-dimetilformamida (5,0 ml) a temperatura ambiente se añadió HATU (5,732 g, 15,07 mmol, 1,005 eq) y W,N-diisopropiletilamina (7,84 ml, 3 eq). Después de agitar durante 30 minutos a temperatura ambiente, se añadió gota a gota una solución del compuesto 1 (3,776 g, 15,00 mmol, 1,0 eq) en una mezcla de diclorometano (1,0 ml) y W,N-dimetilformamida (1,0 ml), el compuesto 1 residual se enjuagó con 3 ml adicionales de diclorometano:N,N-dimetilformamida 1:1. La reacción se vigiló por HPLC-MS y no se observó compuesto 1 restante después de 15 minutos. La reacción se concentró a presión reducida, se diluyó con acetato de etilo (~125 ml) y la fase orgánica se extrajo con HCl 1 M (2 * 50 ml), 1 * dH<2>O (1 * 50 ml), NaHCO3saturado (3 * 50 ml), salmuera (25 ml). Las capas acuosas ácida y básica se lavaron ambas con 25 ml de EtOAc. Todos los compuestos orgánicos se combinaron y se secaron sobre MgSO4, se filtraron y se concentraron para dar un aceite rojo. El residuo se disolvió en una cantidad mínima de diclorometano (~10 ml), se cargó en una columna de gel de sílice Biotage® SNAP Ultra de 360 g (Isolera™ Flash System; Biotage AB, Suecia) para su purificación (EtOAc en hexanos al 20-100% en más de 10 volúmenes de columna). Las fracciones que contenían producto puro se combinaron para recuperar 7,9 g de un sólido blanco espumoso. Las fracciones impuras se sometieron a una segunda purificación en una columna de gel de sílice Biotage® SNAP Ultra de 100 g y se combinaron con el producto puro para recuperar un sólido de espuma blanca (8,390 g, 88,3%). MSm/zobs. = 634,7 (M+1).
1.4 Ácido (2R,3R)-3-((S)-1-((3R,4S,5S)-4-((S)-2-(((benciloxi)carbonil)amino)-N,3-dimetilbutanamido)-3-metoxi-5-metilheptanoil)pirrolidin-2-il)-3-metoxi-2-metilpropanoico (Compuesto 5)
A una solución agitada del compuesto 4 (8,390 g, 13,24 mmol) en 1,4-dioxano (158 ml) se añadió dH<2>O (39, 7 ml) e hidróxido de litio monohidrato (1 M en H<2>O, 39,7 ml, 3 eq). La reacción se agitó a 4°C y se vigiló por HPLC-MS para determinar el consumo de material de partida, que tardó 3 días hasta que solo quedaron trazas del compuesto 4. Durante el curso de la reacción, se formó un nuevo producto, correspondiente a la pérdida de metanol (eliminación p, <2%) en un porcentaje pequeño además del material deseado. La reacción se acidificó con la adición de HCl acuoso 1 M (50 ml) y se concentró a presión reducida para eliminar el dioxano. La mezcla de reacción restante se extrajo con acetato de etilo (4 x 50 ml) y las fases orgánicas se combinaron, se lavaron con salmuera (15 ml 2 ml de HCl 2 M), se secaron sobre MgSO4, se filtraron y se concentraron a presión reducida para producir un aceite de color claro. El aceite se volvió a disolver en éter dietílico (~50 ml) y se concentró a presión reducida (3x) para facilitar la eliminación del dioxano residual, proporcionando el producto del título como un aceite duro (7,81 g, 97% de rendimiento con algo de dioxano residual y compuesto 4). MSm/zobs. = 606,7 (M+1).
1.5 ((S)-1-(((3R,4S,5S)-3-metoxi-1-((S)-2-((1R,2R)-1-metoxi-2-metil-3-oxo)-3-((4-(2,2,2-trifluoroacetamido)fenil)sulfonamido)propil)pirrolidin-1-il)-5-metil-1-oxoheptan-4-il)(metil)amino)-3-metil-1-oxobutan-2-il)carbamato de bencilo (Compuesto 7)
El compuesto 6 se preparó como se describe en la publicación de solicitud de patente internacional N.° WO 2016/041082.
A una solución agitada del compuesto 5 (7,12 g, 11,754 mmol) en diclorometano (20 ml) se añadió 2,2,2-trifluoro-N-(4-sulfamoilfenil)acetamida (compuesto 6, 4,095 g, 1,3 eq , disuelto en 3 ml de DMF), N,N-dimetilpiridina (1,867 g, 1,3 eq) y N,N-dimetilformamida (1,5 ml) para generar una suspensión de color amarillo claro. La adición de 5 ml adicionales de DMF no clarificó la solución. Se añadió hidroclorurodeN-(3-dimetilaminopropil)-N'-etilcarbodiimida (EDCI) (2,817 g, 1,25 eq) en una sola porción y la reacción se vigiló por HPLC-MS. Después de 48 h, la reacción ya no progresaba y se añadieron 400 mg adicionales de EDCI. Después de 18 h, no se observó material de partida restante y la reacción se concentró a presión reducida para dar un aceite amarillo. El aceite se disolvió en acetato de etilo (—150 ml) y HCl 1 M (20 ml), y la fase orgánica se lavó con HCl 2 M frío (2 * 10 ml), NaHCOs saturado (1 * 10 ml), salmuera (20 ml 5 ml de HCl 2 M). Las fracciones acuosas ácidas y básicas se extrajeron con EtOAc (1 x 20 ml), se combinaron todas las fracciones orgánicas, se secaron sobre MgSO4y se concentraron a presión reducida para producir un sólido bruto oleoso (13 g). El residuo se disolvió en diclorometano (—10 ml), se cargó en una columna de gel de sílice Biotage® SnAp Ultra de 360 g y se purificó en un gradiente de EtOAc (AcOH al 2%) en hexanos al 10-100% en 12 volúmenes de columna con una meseta de 3 volúmenes de columna de 50% de EtOAc. Las fracciones que contenían el producto puro se combinaron, se concentraron a presión reducida, se disolvieron y se concentraron a partir del tolueno (2 x 10 ml) y éter dietílico (2 x 10 ml) para proporcionar el producto deseado, 7,1 g de una espuma blanca sólida. Las fracciones impuras se sometieron a una purificación repetida en condiciones de gradiente poco profundo utilizando una columna de gel de sílice Biotage® SNAP Ultra de 100 g en un instrumento Isolera™. Todas las fracciones puras se combinaron para recuperar el producto puro como un sólido de espuma blanca (8,60 g, 86%). MSm/zobs. = 856,7 (M+1).
1.6 (S)-2-amino-N-((3R,4S,5S)-3-metoxi-1-((S)-2-((1R,2R)-1-metoxi-2-metil-3-oxo-3-((4-(2,2,2-trifluoroacetamido)fenil)sulfonamido)propil)pirrolidin-1-il)-5-metil-1-oxoheptan-4-il)-N,3-dimetilbutanamida (Compuesto 7a)
El compuesto 7 (3,71 g, 4,33 mmol) se disolvió en N,N-dimetilformamida al 10% en acetato de etilo (30 ml) en un matraz de fondo redondo que contenía un agitador magnético y equipado con un adaptador de línea de gas de 3 vías. Se extrajo el aire del recipiente dos veces a presión reducida y se cargó con nitrógeno gaseoso. Se añadió paladio sobre carbono al 10% (0,461 g, 0,1 eq) en una sola porción, se ajustó el adaptador de 3 vías al matraz, se ajustó un globo de hidrógeno al adaptador y se extrajo el aire del recipiente dos veces a presión reducida y se cargó con hidrógeno. La reacción se dejó en agitación durante 2 días, tiempo durante el cual se recargó ocasionalmente el globo de hidrógeno. Después de aproximadamente 48 h, el análisis de HPLC-MS indicó que no quedaba material de partida. La reacción se diluyó con metanol (20 ml) y se filtró a través de un tapón de Celite. El Celite se lavó con metanol (2 x 50 ml). Todos los filtrados se combinaron y concentraron a presión reducida y el aceite resultante se disolvió y se concentró a partir del diclorometano. Después de secar a presión reducida, se aisló el compuesto del título como un polvo incoloro (3,10 g, 99%). MSm/zobs. = 722,6 (M+1).
1.7 (S)-2-((S)-2-(dimetilamino)-3-metilbutanamido)-N-((3R,4S,5S)-3-metoxi-1-((S)-2-((1R,2R)-1-metoxi-2-metil-3-oxo-3-((4-(2,2,2-trifluoroacetamido)fenil)sulfonamido)propil)pirrolidin-1-il)-5-metil-1-oxoheptan-4-il)-N,3-dimetilbutanamida (Compuesto 8)
A una solución agitada de N,N-(L)-dimetilvalina (1,696 g, 9,35 mmol) en N,N-dimetilformamida (10 ml) se le añadió HATU (3,216 g, 8,46 mmol) y diisopropiletilamina (3,10 ml, 17,8 mmol). Después de 5 minutos resultó una solución amarilla transparente. Se continuó agitando durante 10 minutos más, luego se añadió el compuesto 7a (3,213 g, 4,45 mmol) en una sola porción. Después de 1 h adicional de agitación, la HPLC-MS indicó que quedaban cantidades en trazas del compuesto 7a y la reacción fue de 16 h. A continuación, la reacción se concentró a presión reducida, se diluyó con acetato de etilo (120 ml) y 40 ml de NaHCO3(sat.):LiCl al 5% 1:1 y se transfirió a un embudo de separación. La capa acuosa se separó y la fase orgánica se lavó con LiCl (1 * 20 m), NaHCO3(sat., 2 * 20 ml). Las capas acuosas se combinaron y se extrajeron con EtOAc (3 * 50 ml). Las capas orgánicas se combinaron y lavaron con salmuera (1 x 20 ml), se secaron sobre sulfato de sodio, se filtraron y concentraron para dar un aceite cargado de DMF que se concentró mediante un evaporador rotatorio para eliminar la DMF residual, lo que produjo 7 g de aceite crudo de color pajizo. El aceite se disolvió en una cantidad mínima de metanol al 10% en diclorometano (~11 ml) y se cargó en una columna de gel de sílice Biotage® SNAP Ultra de 360 g para purificación (MeOH al 2-20% en CH<2>Cl<2>en 15 volúmenes de columna, eluyendo el producto alrededor de 10-13%). Las fracciones que contenían el producto deseado se combinaron y concentraron a presión reducida para dar el compuesto del título como una espuma incolora. Las fracciones impuras se combinaron, se evaporaron y se sometieron a purificación repetida en una columna de gel de sílice Biotage® SNAP Ultra de 100 g en un instrumento Isolera™ y se combinaron con el producto puro de la primera columna para producir una espuma sólida incolora (3,78 g). MSm/zobs. = 850,6 (M+1).
1.8 (S)-N-((3R,4S,5R)-1-((S)-2-((1R,2R)-3-((4-aminofenil)sulfonamido)-1-metoxi-2-metil-3-oxopropil)pirrolidin-1-il)-3-metoxi-5-metil-1-oxoheptan-4-il)-2-((S)-2-(dimetilamino)-3-metilbutanamido)-N,3-dimetilbutanamida (Compuesto 9)
A una solución agitada del compuesto 8 (0,980 g, 1,154 mmol) en 1,4-dioxanos (15 ml) se le añadió agua (3,5 ml) e hidróxido de litio monohidrato 1 M (3 eq, 3,46 ml). La suspensión clara resultante se dejó agitar a 4°C y se vigiló por HPLC-MS para determinar el consumo del material de partida. Cuando se completó la conversión (~5 días), la reacción se neutralizó con 3,46 ml de HCl 1 M y se concentró a presión reducida para eliminar el dioxano. La fase acuosa resultante se diluyó con 60 ml de EtOAc y 5 ml de salmuera, luego se extrajo con acetato de etilo (2 x 30 ml). Las fracciones orgánicas se combinaron, se secaron sobre Na2SO4, se filtraron y evaporaron para dar el compuesto del título como un sólido tostado (0,930 g). Rf = 0,5 (8% MeOH en CH<2>Ch). MSm/zobs. = 753,7 (M+1).
1.9 3-(2-(2-(2-(2,5-dioxo-2,5-dihidro-1H-pirrol-1-il)etoxi)etoxi)etoxi)propanoato de 2,3,5,6-tetrafluorofenilo (Compuesto 15)
En un matraz cónico seco de 50 ml, se disolvieron ácido 3-(2-(2-(2-aminoetoxi)etoxi)etoxi)propanoico (compuesto 14, 1,000 g, 4,52 mmol) y anhídrido maleico (0,443 g, 4,52 mmol) en W,N-dimetilformamida anhidra (5 ml). La reacción se agitó a temperatura ambiente durante 6 h en N<2>, momento en el que se enfrió a 0°C y se añadió gota a gota sin-colidina (1,263 ml, 2,1 eq). En un matraz cónico de 50 ml seco separado, se disolvió tetrafluorofenol (3,002 g, 4 eq) en W,N-dimetilformamida anhidra (10 ml). El matraz se enfrió a 0°C en un baño de hielo y se añadió gota a gota anhídrido trifluoroacético (2,548 ml, 4 eq). Este matraz se agitó durante 15 minutos, momento en el que se añadió gota a gota sin-colidina (2,407 ml, 4 eq). Se dejó agitar el matraz durante otros 15 minutos y luego se añadieron los contenidos al primer matraz gota a gota, mediante jeringa. La reacción se dejó calentar a temperatura ambiente y se continuó agitando en atmósfera de N<2>. La reacción se vigiló por HPLC-MS para determinar el consumo de los materiales de partida. Después de 6 días, la reacción se completó con el consumo total del compuesto 14, dejando solo el compuesto 15 y una pequeña cantidad (~5%) de la amida bis-TFP-maleica intermedia. La reacción se transfirió a un embudo de separación, se diluyó con éter dietílico (75 ml) y se lavó con LiCl al 5% (1 * 20 ml), HCl 1 M (2 * 20 ml), NaHCO3sat. (5 * 20 ml) y salmuera (1 * 20 ml). La capa orgánica se secó sobre Na2SO4, se filtró y se evaporó para dar un aceite bruto marrón con DMF residual. El aceite bruto se disolvió en 8 ml de DMF:H<2>O TFA al 0,1% 1:1, se cargó en una columna Biotage® SNAP Ultra C18 de 60 g (Biotage AB, Uppsala, Suecia) y se purificó con un gradiente lineal de 30-100% de ACN/H<2>O TFA al 0,1% en 8 volúmenes de columna. Las fracciones puras se agruparon y se diluyeron con salmuera (20 ml), luego se extrajeron con 3 * 50 ml de Et<2>O. Los compuestos orgánicos combinados se secaron sobre MgSO4, se filtraron y evaporaron para recuperar un aceite amarillo claro (1,34 g, 66% de rendimiento).
1.10 ((S)-1-(((S)-1-((4-(N-((2R,3R)-3-((S)-1-((3R,4S,5S)-4-((S)-2-((S)-2-(dimetilamino)-3-metilbutanamido)-N,3-dimetilbutanamido)-3-metoxi-5-metilheptanoil)pirrolidin-2-il)-3-metoxi-2-metilpropanoil)sulfamoil)fenil)amino)-1-oxo-5-ureidopentan-2-il)amino)-3-metil-1-oxobutan-2-il)carbamato de terc-butilo (Compuesto 12)
El compuesto 11 se preparó como se describe en la publicación de solicitud de patente internacional N.° WO 2016/041082.
A un matraz vacío en forma de pera de 25 ml, se añadió el compuesto 11 (1,342 g, 3,58 mmol, 3,0 eq), hidrocloruro de 1-etil-3-(3-dimetilaminopropil)carbodiimida (0,664 g, 3,46 mmol, 2,9 eq) y 7-hidroxiazabenzotriazol (HOAT) (0,472 g, 3,46 mmol, 2,9 eq). Estos sólidos se disolvieron en una mezcla de N,N-dimetilformamida (0,5 ml) y diclorometano (4,5 ml) con agitación a temperatura ambiente durante 30 minutos. Por separado, el compuesto 9 (0,900 g, 1,20 mmol) se disolvió en una mezcla de N,N-dimetilformamida (0,2 ml) y diclorometano (1,8 ml) y se añadió al matraz en forma de pera, enjuagando con diclorometano (1,0 ml). La velocidad de agitación se aumentó a 1000 rpm, produciendo un vórtice. A los 2 minutos de añadir el compuesto 9, se añadió cloruro de cobre (II) (0,514 g, 3,83 mmol, 3,2 eq) en una porción directamente en el centro del vórtice a través de un embudo de polvo estrecho. La solución inicialmente de color amarillo claro se convirtió en una suspensión de color marrón oscuro que cambió en 10 minutos a una suspensión de color verde oscuro. Se vigiló la finalización de la reacción por HPLC-MS y no se observaron cambios en el progreso de la reacción entre las muestras tomadas a los 30 minutos y 1 h (~95% completo). La reacción se dejó en agitación durante la noche a temperatura ambiente, luego se añadieron a la suspensión agitada 2-(2-aminoetilamino)etanol (0,483 ml, 4,781 mmol, 4 eq), EtOAc (10 ml) y dH<2>O (5 ml), que sufrió un cambio de color a azul profundo. La suspensión se agitó vigorosamente durante 4 h mientras los sólidos suspendidos se disolvían gradualmente en la mezcla bifásica. Esta mezcla se transfirió a un embudo de separación y se diluyó con EtOAc (100 ml) y salmuera (10 ml), y la fase acuosa se extrajo con IpOH/EtOAc al 10% (4 x 50 ml). Las capas orgánicas se combinaron y se lavaron con salmuera (10 ml), se secaron sobre Na2SO4y se evaporaron para dar un sólido bruto ligeramente azul. Este sólido bruto se disolvió en una mezcla de metanol (0,5 ml) y diclorometano (6 ml) y se purificó en una columna de gel de sílice Biotage® SNAP Ultra de 100 g (MeOH en CH<2>Cl<2>al 2-20% en 10 volúmenes de columna, seguido de una meseta de 8 volúmenes de columna de MeOH al 20%). El producto eluyó como un pico ancho después de 1-2 volúmenes de columna con MeOH en CH<2>Cl<2>al 20%. Las fracciones que contenían el material deseado se combinaron y concentraron a presión reducida para dar el compuesto del título como un sólido blanco (1,105 g, 83%). MSm/zobs. = 555,9 ((M+2)/2), 1109,8 (M+1).
1.11 (S)-2-((S)-2-amino-3-metilbutanamido)-N-(4-(N-((2R,3R)-3-((S)-1-((3R,4S,5R)-4-((S)-2-((S)-2-(dimetilamino)-3-metilbutanamido)-N,3-dimetilbutanamido)-3-metoxi-5-metilheptanoil)pirrolidin-2-il)-3-metoxi-2-metilpropanoil)sulfamoil)fenil)-5-ureidopentanamida (Compuesto 13)
A una solución del compuesto 12 (0,926 g, 0,834 mmol) se añadió una mezcla de diclorometano (10 ml) y ácido trifluoroacético (2,0 ml). La reacción se vigiló por HPLC-MS para determinar el consumo del material de partida (~45 minutos). La reacción se coevaporó con acetonitrilo (2 x 10 ml) y diclorometano (2 x 10 ml) a presión reducida para eliminar el exceso de ácido trifluoroacético. El residuo resultante se disolvió en una cantidad mínima de diclorometano y metanol (3:1, v/v, ~2 ml) y se añadió gota a gota con una pipeta a una solución agitada de éter dietílico (200 ml) y hexanos (100 ml), produciendo una suspensión de sólidos blancos claros. Los sólidos se filtraron y secaron al vacío para dar el compuesto del título en forma de un polvo blanco, como la sal de trifluoroacetato (1,04 g, rendimiento cuantitativo con algunos disolventes residuales). MSm/zobs. = 505,8 ((M+2)/2).
1.12 (S)-N-(4-(N-((2R,3R)-3-((S)-1-((3R,4S,5R)-4-((S)-2-((S)-2-(dimetilamino)-3-metilbutanamido)-N,3-dimetilbutanamido)-3-metoxi-5-metilheptanoil)pirrolidin-2-il)-3-metoxi-2-metilpropanoil)sulfamoil)fenil)-2-((S)-1-(2,5-dioxo-2,5-dihidro-1H-pirrol-1-il)-14-isopropiM2-oxo-3,6,9-trioxa-13-azapentadecanamido)-5-ureidopentanamida (enlazador-toxina 001)
A una solución agitada del Compuesto 13 (0,722 g, 0,584 mmol) en N,N-dimetilformamida (4 ml) se le añadió el compuesto 15 (0,314 g, 1,2 eq) y diisopropiletilamina (0,305 ml, 3,0 eq). El análisis de HPLC-MS a las 2 h indicó que no quedaba material de partida. La reacción se acidificó con TFA (300 μl) y luego se diluyó con diH<2>O TFA al 0,1% (9 ml). La solución resultante se cargó en una columna Biotage® SNa P Ultra C18 de 120 g (Biotage, Uppsala, Suecia) y se purificó en un gradiente de ACN/H<2>O TFA al 0,1%: 20-60% de ACN en 10 volúmenes de columna, 60-100% de ACN en 5 volúmenes de columna. El producto eluyó cerca del 40% de ACN. Las fracciones puras identificadas por LCMS se combinaron y liofilizaron. Se recuperó un sólido de polvo blanco del liofilizador. La liofilización se repitió a mayor concentración (aprox. 50 mg/ml en H<2>O/ACN 2:1) en un vial para producir un sólido liofilizado más denso y menos floculante (754,2 mg, 91%). MSm/zobs. = 647,4 ((M+2)/2), 1292,8 (M+1).
Ejemplo 2: Conjugación del enlazador-toxina al anticuerpo biparatópico
Se generaron conjugados de anticuerpo-fármaco (ADC) del mAb anti-HER2 biparatópico, v10000 y el enlazador-toxina 001 mediante la reducción parcial de los enlaces disulfuro entre cadenas del anticuerpo, seguido de la protección terminal de los restos de cisteína libres por reacción con el componente maleimida del enlazador-toxina. Mediante la variación de la cantidad de TCEP utilizada para reducir el anticuerpo, se pueden obtener ADC con relaciones promedio de fármaco a anticuerpo de entre 0 y 6. Los ADC se purificaron para eliminar las moléculas pequeñas contaminantes y se caracterizaron para demostrar la DAR, pureza, contenido monomérico, niveles de endotoxinas y unión a células tumorales positivas para el antígeno.
La preparación de v10000 se describe en la publicación de solicitud de patente internacional N.° WO 2015/077891. Los detalles de este anticuerpo se proporcionan en la Tabla 9 a continuación. Las secuencias se proporcionan en las tablas de secuencias.
Tabla 9
2.1 Conjugación del anticuerpo anti-HER2 por reducción parcial de enlaces disulfuro entre cadenas (v17597; DAR 3,9)
Una solución (138,9 ml) del anticuerpo v10000 (2,0 g) en acetato de sodio 10 mM, sacarosa al 9% (p/v), pH 4.5 se redujo mediante la adición de una mezcla recién preparada de Na2HPO4200 mM, pH 8,9 (15,4 ml), solución de DTPA 5 mM (39,5 ml en PBS, pH 7,4), y solución de TCEP 10 mM (3,68 ml, 2,3 eq). Después de 90 minutos a 37°C, la reacción se enfrió en hielo antes de la adición de un exceso del enlazador-toxina 001 (6,41 ml; 8 eq) de una solución madre de DMSO 20 mM. La reacción de conjugación se inactivó después de 90 minutos por adición de un exceso de una solución de N-acetilcisteína 20 mM (4,81 ml; 6 eq).
2.2 Conjugación del anticuerpo anti-HER2 por reducción parcial de enlaces disulfuro entre cadenas (v21252; DAR 2,1)
En una solución (138,9 ml) del anticuerpo v10000 (2,0 g) en acetato de sodio 10 mM, sacarosa al 9% (p/v), pH 4.5 se ajustó el pH mediante la adición de Na2HPO4200 mM, pH 8,9 (15,4 ml). Después de la adición de una solución de DTPA (44 ml en PBS, pH 7,4, concentración final 1,0 mM), se inició la reducción de los disulfuros entre cadenas mediante la adición de una solución acuosa de TCEP 10 mM (1,68 ml, 1,05 eq). Después de 90 minutos a 37°C, la reacción se enfrió en hielo antes de la adición de un exceso del enlazador-toxina 001 (4,81 ml; 6 eq) de una solución madre en DMSO 20 mM. La reacción de conjugación se inactivó después de 90 minutos por adición de un exceso de una solución de N-acetilcisteína 20 mM (4,81 ml; 6 eq).
2.3 Purificación de conjugados de anticuerpo y fármaco v17597 y v21252
[Las soluciones de conjugado de anticuerpo y fármaco (ADC) inactivadas se purificaron con 9-15 diavolúmenes de acetato de sodio 10 mM, sacarosa al 9% (p/v), pH 4,5 en un instrumento de filtración de flujo tangencial Millipore Labscale™ usando un módulo de ultrafiltración Pellicon® XL (Ultracel®30 kDa 0,005 m2; Millipore Sigma). El ADC eluido se filtró en condiciones estériles (0,22 um). Los ADC producidos a pequeña escala se purificaron en columnas Zeba™ de MWCO 40 KDa (ThermoFisher Scientific, Waltham, MA) preacondicionadas con PBS o acetato de sodio 10 mM, sacarosa al 9% (p/v), pH 4,5.
Después de la purificación, la concentración de ADC se determinó mediante un ensayo de BCA con referencia a una curva de calibración generada a partir de v10000. Alternativamente, las concentraciones se estimaron midiendo la absorción a 280 nm (£ = 195065 M-1cm-1).
Las muestras de los ADC se evaluaron mediante SDS-PAGE no reductora y reductora (véase la Figura 1). No se observaron bandas extrañas.
2.4 Cromatografía de interacción hidrófoba
El anticuerpo y los ADC se analizaron por cromatografía de interacción hidrófoba (HIC) para estimar la relación de fármaco a anticuerpo (DAR). La cromatografía se realizó en una columna de HIC Proteomix® Etilo (7,8 x 50 mm, 5 |jm) (Sepax Technologies Inc., Newark, DE) empleando un gradiente de 80% de MPA/20% de MPB a 35% de m Pa /65% de MPB durante un período de 13,5 minutos a un caudal de 1 ml/min (MPA = (NH4)2SO41,5 M, NaxPO425 mM y MPB = 75% de NaxPO425 mM, 25% de isopropanol).
La relación promedio de fármaco a anticuerpo (DAR) de un ADC puede variar dependiendo del número de enlaces disulfuro liberados durante la reducción del anticuerpo. Una sola reacción de conjugación que produce un ADC con una DAR promedio particular comprende una mezcla de especies. Para v17597 y v21252, se generó una mezcla de cuatro especies: anticuerpo no conjugado, ADC con DAR de 2, ADC con DAR de 4 y ADC con DAR de 6.
Los resultados de la HIC se muestran en la Figura 2 y muestran que v17597 tiene una DAR promedio de 3,92 (Figura 2A), y v21252 tiene una DAR promedio de 2,07 (Figura<2>B).
Las contribuciones individuales de las especies de DAR0, DAR2, DAR4 y DAR6 a la DAR promedio de los ADC purificados se evaluaron mediante la integración del cromatograma de HPLC-HIC. Cada pico del cromatograma de HIC se aisló mediante cromatografía preparativa y la identidad del pico se verificó mediante LC-MS. El % de contenido de especies DAR individuales para cada variante (determinado por HIC) se muestra en la Tabla 10 y en la Figura 2D. Como se puede ver en la Tabla 10 y la Figura 2D, v17597 contiene significativamente más especies de DAR6 que v21252 y v21252 contiene significativamente más especies de DAR0 que v17597.
La figura 2E ilustra el cambio en las cantidades relativas de especies de DAR 0, 2, 4 y 6 dentro de v10000-enlazador toxina 001 para una serie de preparaciones de ADC que tienen valores promedio de DAR que varían de 0,5 a 6.
Tabla 10: Distribución de DAR para v17597 y v21252
2.5 Cromatografía de exclusión por tamaño
El grado de agregación del anticuerpo y los ADC (~15 ug, 5 ul de volumen de inyección) se evaluó mediante cromatografía de exclusión por tamaño (SEC) en una columna de SEC ACQU iTy UPlC® Protein BEH (200 angstrom, 1,7 jm , 4,6 x 150 mm) (Waters Corporation, Milford, MA) utilizando una fase móvil que consiste en fosfato 150 mM, pH 6,8 y un caudal de 400 ul/min. La detección fue por absorbancia a 280 nm.
Los resultados se muestran en la Figura 3 y se resumen en la Tabla 11. El mAb v10000 es altamente monomérico por análisis de SEC. No se observó aumento significativo en la agregación tras la conjugación con el enlazador-toxina 001. Una comparación de v21252 y v17597 indica que el grado de agregación no se ve afectado al aumentar la DAR de 2 a 4.
Tabla 11: Resumen de los resultados de la SEC
2.6 Cuantificación de toxina libre y enlazador-toxina por LC-MS-MS
Las concentraciones residuales de toxina libre (Compuesto 9), enlazador-toxina 001 y fármaco enlazador N-acetilcisteína-enlazador-toxina 001 inactivado en las formulaciones de ADC se evaluaron mediante separación por cromatografía líquida (LC) y detección de masas, con referencia a las curvas de calibración para cada analito. Las separaciones se realizaron en una columna PolymerX™ RP-1 (3 |jm, 100 angstrom, 50x 4 mm) (Phenomenex Inc., Torrance, CA) empleando un caudal de 0,4 ml/min, una temperatura de columna de 30°C y un gradiente de 75% de MPA/25% de MPB a 60% de MPA/40% de MPB durante 7,8 minutos (MPA = ácido fórmico acuoso al 0,1% y MPB = ácido fórmico al 0,1% en acetonitrilo). La detección de masas ESI-MRM en modo positivo se logró en un espectrómetro de masas de triple cuadrupolo Agilent 6470 (Agilent Technologies, Santa Clara, CA).
Todas las muestras contenían < 0,1% en moles de analito con respecto a la carga activa conjugada total.
2.7 Ensayo de unión por citometría de flujo en células positivas para el antígeno
La unión de ADC a líneas de células tumorales positivas para el antígeno JIMT-1 (carcinoma de mama, Addexbio Technologies, San Diego, CA) y RT-112/84 (carcinoma de vejiga, Sigma-Aldrich, St. Louis, MO) se comparó con la unión del anticuerpo original (v10000) por citometría de flujo. Las células se cultivaron según las instrucciones del proveedor. Brevemente, las células (50.000 células/pocillo) se incubaron con diluciones en serie de anticuerpo o ADC durante 90 minutos en hielo. Después de esta incubación, las células se lavaron dos veces y luego se incubaron con un reactivo secundario anti-hIgG conjugado con AlexaFluor® 647 (Jackson ImmunoResearch Inc., Westgrove, PA) durante 60 minutos en hielo. A continuación, las células se lavaron dos veces y la fluorescencia se analizó mediante citometría de flujo (citómetro de flujo LSRFortessa™ X-20, BD, San José, CA).
Los resultados se muestran en la Figura 4 y demuestran que la unión de v17597 y v21252 a las células positivas para el antígeno no se ve afectada por la conjugación con la toxina, mostrando ambos ADC una unión similar al anticuerpo original v10000.
2.8 Ensayo de endotoxinas
El nivel de endotoxina de los ADC formulados se evaluó utilizando un ensayo de punto final de gelificación de lisado de amebocitos de Limulus (LAL) (Genscript ToxinSensor™ Single Test Kit; GenScript, Piscataway, NJ) con un umbral de 0,125 UE/ml. Todos los ADC empleados en experimentosin vivo(a continuación) se dosificaron por debajo de 5 unidades de endotoxina por kilogramo de masa corporal.
Ejemplo 3: Actividadin vitrode ADC biparatópicos
La potenciain vitrode v17597 y v21252 se midió mediante un ensayo de proliferación celular en células tumorales positivas para el antígeno BT-474 (carcinoma ductal, ATCC, Manassas, VA (HTB-20)), SK-BR-3 (carcinoma de mama, ATCC, Manassas, VA (HTB-30)), HCC-1954 (carcinoma de mama, ATCC (Cr L-2338)), JIMT-1 (carcinoma de mama, Addexbio Technologies, San Diego, CA, (C0006005)), ZR-75-1 (carcinoma de mama, ATCC (CRL-1500)) y células tumorales negativas para el antígeno MDA-MB-468 (carcinoma de mama, Addexbio Technologies (C0006003)). Las células se cultivaron según las instrucciones del proveedor. Brevemente, el día anterior a la adición del ADC, las células (50 ul/pocillo, 1000 células/pocillo) se añadieron a placas de 384 pocillos estériles tratadas con cultivo de tejidos (TC) (ThermoFisher Scientific, Waltham, MA) y se incubaron durante la noche a 37°C/5% de CO<2>para permitir que las células se adhieran a la superficie de la placa. En una placa estéril de 96 pocillos con fondo en U, los ADC se diluyeron en medio de crecimiento completo a 4,3 veces la concentración máxima final deseada y se titularon 1:3 en el mismo medio, creando una titulación de dosis-respuesta de 10 puntos. Se incluyeron pocillos de control sin ADC (medio de crecimiento solo) en cada microplaca de titulación de 96 pocillos. Se añadieron 15 ul de la titulación de dosis-respuesta de 10 puntos a cada pocillo de la placa de 384 pocillos que contenía las células sembradas, por triplicado, y las placas se incubaron a 37°C/5% de CO<2>durante 5 noches. Después de una incubación de 5 noches, se cuantificó la viabilidad celular mediante la adición de 20 ul/pocillo de CellTiter-Glo® (Promega, Madison, WI) y la incubación a temperatura ambiente durante 30 min. La luminiscencia se midió usando un luminómetro de microplacas. Las unidades relativas de luz (URL) recogidas se convirtieron en % de citotoxicidad utilizando el control de medio de crecimiento solo mencionado anteriormente (% de citotoxicidad = 1-[URL de pocillo/URL promedio de control de medio solo]). Los datos se ajustaron a las curvas utilizando métodos de regresión no lineal disponibles con el software Prism® (GraphPad Software, La Jolla, CA).
Los resultados se muestran en la Figura 5 y se resumen en la Tabla 12. Los resultados muestran que tanto v17597 como v21252 demuestran destrucción celular selectiva. Las líneas celulares que expresan HER2 BT-474, SK-BR-3, HCC1954, JIMT-1 y ZR-75-1 (Figura 5A-E) eran sensibles tanto a v17597 como a v21252. Tanto v17597 como v21252 fueron ineficaces contra las células MDA-MB-468 (Figura 5F), que son de una línea celular de carcinoma de mama negativo para HER2.
Tabla 12: Actividadin vitrode v17597 y v21252
Ejemplo 4: Ensayo de proliferaciónin vitrode v10000-enlazador-toxina 001 a diferentes DAR promedio
Se prepararon ADC compuestos por v10000 conjugado con el enlazador-toxina 001 con una DAR promedio que variaba de 0,7 a 3,9 variando la cantidad de TCEP (de 0,5 a 10 equivalentes molares) utilizada en la reacción de reducción. La reacción de conjugación se llevó a cabo de acuerdo con los procedimientos resumidos en el Ejemplo 2 y los ADC resultantes se purificaron utilizando una columna Zeba™ de 40 kDa, preequilibrada con PBS a pH 7,4.
La potenciain vitrode los ADC se midió mediante un ensayo de proliferación celular en células tumorales positivas para el antígeno SK-OV-3 (carcinoma de ovario, ATC<c>, Manassas, VA (HTB-77)), JIMT-1 (carcinoma de mama, DSMZ, Braunschweig, Alemania (ACC 589)) y ZR-75-1 (carcinoma de mama, ATCC (CRL-1500)). Las células se cultivaron según las instrucciones del proveedor. Brevemente, el día anterior a la adición de ADC, se añadieron células (100 ul/pocillo, 2500 células/pocillo) a placas estériles de paredes opacas de 96 pocillos tratadas con TC (Corning 3904) y se incubaron durante la noche a 37°C/5% de CO<2>para permitir que las células se adhieran a la superficie de la placa. Al día siguiente, los ADC se diluyeron en medio de crecimiento completo (placa de fondo en U de 96 pocillos) a 5 veces la concentración máxima final deseada y se titularon 1:3 en el mismo medio, ocho etapas (9 puntos de titulación de compuesto en total). También se incluyó un punto de titulación de control que contenía medio de crecimiento solo, creando una titulación de dosis-respuesta de 10 puntos en total. Se añadieron 25 ul de la titulación de dosis-respuesta de 10 puntos a cada pocillo de la placa de 96 pocillos que contenía las células sembradas, por triplicado, y las placas se incubaron a 37°C/5% de CO<2>durante 5 noches. Después de la incubación, se cuantificó la viabilidad celular mediante la adición de 25 ul/pocillo de CellTiter-Glo® (Promega Corporation, Madison, WI) y la incubación a temperatura ambiente durante 30 min. Luego se midió la luminiscencia usando un luminómetro de microplaca y las unidades relativas de luz (URL) recogidas se convirtieron en % de citotoxicidad como se describe en el Ejemplo 3.
Los resultados se muestran en la Figura 6. Los ADC que tenían DAR promedio entre 3,9 y 1,6 mostraron una potencia comparable en las tres líneas celulares, sin embargo, el ADC con DAR promedio de 0,7 mostró una disminución significativa en la potencia. Las cantidades aproximadas de especies de DAR individuales que componen los ADC de DAR0,7, DAR2,2 y DAR3,9 se muestran en la Tabla 13 y la Figura 6D. Puede verse que el ADC de DAR0,7 contiene aproximadamente tres veces más especies<d>AR0 (aproximadamente 65% frente a aproximadamente 20%) que el ADC de DAR1,9. A su vez, el ADC de DAR2,2 contiene significativamente más especies de DAR0 que las especies de DAR3,9 (aproximadamente 20% frente a <3%). Sin embargo, el ADC de DAR2,2 mostró una potenciain vitrocomparable a la del ADC de DAR3,9. Estos resultados sugieren que puede haber un umbral para la proporción de especies de DAR0 que puede contener una preparación de ADC antes de que se vea afectada la potencia del<a>D<c>.
Tabla 13: Distribución aproximada de DAR para los ADC
Ejemplo 5: Internalización de ADC biparatópicos en células que expresan HER2
Para determinar la intemalización de v21252, se acopló el colorante pHAb (Promega Corporation, Madison, WI) a restos amina de v21252, trastuzumab-enlazador-toxina 001 y un ADC de control negativo según los protocolos recomendados por el fabricante. El ADC de control negativo era un anticuerpo anti-proteína F del RSV conjugado con el enlazador-toxina 001.
Los anticuerpos conjugados con pHAb pueden usarse para vigilar la internalización de anticuerpos mediada por receptores. El anticuerpo conjugado con el colorante pHAb unido al antígeno en la membrana celular presenta una fluorescencia mínima, pero después de la internalización mediada por el receptor y el tránsito a través del endosoma y el sistema lisosomal, el conjugado de anticuerpo-pHAb se expone a un pH más ácido, lo que hace que el conjugado de anticuerpo-pHAb sea fluorescente
Se incubaron v21252 conjugado con pHAb, trastuzumab conjugado con pHAb-enlazador-toxina 001 y control conjugado con pHAb con las líneas celulares que expresan h ER2 SκΒR3 y JIMT-1. Brevemente, se sembraron células tumorales SκΒR3 y JIMT-1 HER2+ en una placa de fondo óptico negro de 384 pocillos (ThermoFisher Scientific, Waltham, MA) con 5000 células/pocillo en medio de ensayo. La placa se incubó durante la noche a 37°C 5% de CO<2>. Al día siguiente, se añadieron a las placas anticuerpos conjugados con pHAb en 10 ug/ml y 1 ug/ml final en medio de ensayo. Se añadieron medios que contenían tinción violeta de Vybrant® DyeCycle™ (ThermoFisher Scientific, Waltham, MA) a una concentración final de 2 uM para visualizar los núcleos. La placa se incubó a 37°C 5% de CO2entre puntos de tiempo. Los pocillos de muestra se escanearon en varios puntos de tiempo en la plataforma de cribado de alto contenido (HCS) CellInsight™ CX5 (HCS) (ThermoFisher Scientific, Waltham, MA). La placa se escaneó usando un objetivo de 20x en la Bioaplicación SpotAnalysis con 2 canales. El canal 1 (385 nm, Violeta Vybrant Dye Cycle) se usó como canal de enfoque y el canal 2 (560 nm, pHAb) se usó para obtener datos de internalización. La fluorescencia de los anticuerpos conjugados con pHAb internalizados se midió usando el parámetro "Intensidad total media de la mancha".
Los resultados se muestran en las Figuras 13 y 14 y muestran que v21252 se internaliza y transita hacia los lisosomas en células que expresan HER2 a un nivel mayor que el trastuzumab monoespecífico-enlazadortoxina 001.
Ejemplo 6: actividadin vitrode ADC biparatópicos
6.1 Los ADC v 17597 y v21252 inhiben el crecimiento de xenoinjertos derivados de pacientes con cáncer de mama HBCx-13b
Se implantó por vía subcutánea en ratones atímicos hembra (Envigo, Huntingdon, Reino Unido) un fragmento tumoral de 20 mm3 (n=7 por grupo). Una vez que los tumores alcanzaron un tamaño de 75 a 200 mm3, los animales se asignaron a los grupos de tratamiento y se administró v17597, v21252 o vehículo mediante inyección intravenosa para un total de 2 dosis el día 1 y el día 15 (cada 14d x2) como se indica en la Figura 7. Las mediciones de los tumores se realizaron con un calibrador quincenalmente. Los ratones se sacrificaron de forma ética cuando los tumores alcanzaron un tamaño de 1764 mm3. Los volúmenes tumorales se dieron como la media ± SEM para cada grupo.
La Figura 7A proporciona los resultados de la respuesta tumoral en ratones a los que se implantó por vía subcutánea fragmentos de tumor HBCx-13b después de la administración i.v. de vehículo o v17597. La Figura 7B proporciona los resultados de la respuesta tumoral en ratones a los que se implantó por vía subcutánea fragmentos de tumor HBCx-13b después de la administración i.v. de vehículo o v21252. Estos resultados muestran que el tratamiento de ratones con injertos de HBCx-13b con v17597 o v21252 da como resultado una reducción del volumen del tumor de una manera dependiente de la dosis.
6.2 Los ADC v 17597 y v21252 inhiben el crecimiento de xenoinjertos derivados de pacientes con cáncer de mama ST-910
Se implantó en ratones desnudos atímicos hembra (Charles Rivers Laboratories, Wilmington, MA) por vía subcutánea un fragmento tumoral de ~70 mg (n = 6 por grupo). Una vez que los tumores alcanzaron un tamaño de 125 a 250 mm3, los animales se asignaron a grupos de tratamiento y se dosificaron v17597, v21252 o vehículo mediante inyección intravenosa única como se indica en la Figura 8. Las mediciones de los tumores se realizaron con un calibrador digital quincenalmente. Los ratones se sacrificaron de forma ética cuando los tumores alcanzaron un tamaño de 2000 mm3. Los volúmenes tumorales se dieron como la media ± SEM para cada grupo.
La Figura 8A proporciona los resultados de la respuesta tumoral en ratones a los que se implantó por vía subcutánea fragmentos de tumor ST-910 después de la administración i.v. de vehículo o v17597. La Figura 8B proporciona los resultados de la respuesta tumoral en ratones a los que se implantó por vía subcutánea fragmentos de tumor ST-910 después de la administración i.v. de vehículo o v21252. Estos resultados muestran que el tratamiento de ratones con injertos de ST-910 con v17597 o v21252 da como resultado una reducción del volumen del tumor de una manera dependiente de la dosis.
ST-910 es un xenoinjerto derivado de paciente (PDX) que representa cáncer de mama HER2 1+ mientras que HBCx-13b (usado en el Ejemplo 6.1) es un PDX que representa cáncer de mama HER23+. Los ejemplos 6.1 y 6.2 demuestran así que tanto v17597 como v21252 son activos tanto en tumores HER23+ como HER2 1+.
6.3 Análisis farmacocinético
Para los xenoinjertos derivados de paciente, HBCx-13b y ST-910, se recogieron muestras farmacocinéticas para determinar los anticuerpos totales (anticuerpos no conjugados y conjugados) en puntos de tiempo preespecificados y se evaluaron usando un ensayo basado en ELISA para la cuantificación de anticuerpos totales. Las concentraciones séricas de anticuerpos totales para v21252 o v17597 se analizaron primero recubriendo placas ELISA de 384 pocillos con anticuerpo de cabra anti-Fc de IgG humana (Jackson ImmunoResearch, West Grove, PA) en PBS a pH 7,4 e incubando a 4°C durante la noche. Al día siguiente, las placas se lavaron y bloquearon usando diluyente de ensayo y se incubaron a TA durante 1 h. Después del bloqueo, las muestras de la curva de calibración, los controles y las muestras de suero diluido se añadieron a las placas y se incubaron a TA durante 1 h. El anticuerpo de detección, conjugado de HRP-anti-F(ab')2de IgG humana de cabra (Jackson ImmunoResearch), se añadió luego a las placas y después de 1 h de incubación a TA, se añadió el sustrato de HRP 3,3',5,5'-tetrametilbencidina (TMB) a las placas. La TMB se inactivó usando HCl y la absorbancia se midió a 450 nm usando un lector de placas. La Figura 15 muestra el perfil de concentración sérica de anticuerpos totales - tiempo para HBCx-13b (A) y ST-910 (B).
Ejemplo 7: Estudio farmacocinético/tolerabilidad de dosis única de v17597 y v21252 en macacos cangrejeros
El objetivo de este estudio era caracterizar la farmacocinética (PK) y la tolerabilidad de v17597 y v21252 en macacos cangrejeros después de una única administración de infusión intravenosa (i.v.). El macaco cangrejero se seleccionó para la evaluación de seguridad no clínica de v17597 y v21252 basado en la homología de secuencia y la afinidad de unión. El HER2 humano y de macaco cangrejero comparten una homología de secuencia de 98%, mientras que la homología de secuencia para el HER2 de perro y ratón/rata es de 93% y 88%, respectivamente. Además, v17597 y v21252 se unen al HER2 de macaco cangrejero con una afinidad similar a la del HER2 humano (Kd de mono = 0,55 x 10'9; Kd humana = 0,83 x 10'9) y no se unen al HER2 de perro, ratón o rata.
El estudio demuestra que una dosis única de v17597 en dosis de 3, 6 o 9 mg/kg era bien tolerada, y que una dosis única de v21252 en dosis de 9 o 12 mg/kg era bien tolerada.
Materiales y métodos
Tolerabilidad
Se administró una dosis única de v17597 (3, 6 o 9 mg/kg) o v21252 (9 mg/kg o 12 mg/kg) mediante infusión i.v. durante 60 minutos a macacos cangrejeros hembra (N= 3). La tolerabilidad general se evaluó con observaciones clínicas, peso corporal, consumo de alimentos y patología clínica (hematología y química clínica). Se recogió sangre durante todo el estudio para el análisis bioanalítico de v17597 o v21252, anticuerpo total y toxina libre (Compuesto 9). En la Tabla 14 se resume el diseño del estudio.
Tabla 14: Diseño del estudio de tolerabilidad general y farmacocinética de dosis única en macacos cangrejeros
Metodología bioanalítica
v17597 y v21252: Las concentraciones séricas de v17597 o v21252 (DAR de 1 o mayor) se analizaron usando un ensayo de electroquimioluminiscencia con la plataforma Meso Scale Discovery (ECL/MSD) (Meso Scale Diagnostics, LLC, Rockville, MD) con IgG de ratón anti-toxina como agente de captura y anti-pertuzumab sulfo-TAG como agente de detección.
Anticuerpo total: El ensayo bioanalítico de anticuerpos totales midió el componente de anticuerpo de v17597 o v21252 independientemente de si el componente de anticuerpo estaba conjugado con toxina (en todas las DAR) o no. Las concentraciones séricas de anticuerpos totales se analizaron usando un ensayo de electroquimioluminiscencia con la plataforma Meso Scale Discovery (ECL/MSD) con anticuerpo antipertuzumab como agente de captura y anti-trastuzumab sulfo-TAG como agente de detección.
Toxina (Compuesto 9): Las concentraciones séricas de toxina se analizaron usando un método de LC-MS/MS. Las muestras de suero se precipitaron con acetonitrilo/metanol (50:50, v/v) y se analizaron los líquidos sobrenadantes. El sistema de cromatografía de líquidos utilizado fue una columna de fase inversa con un flujo en gradiente compuesto por agua/ácido acético (100/0,05, v/v) y acetonitrilo. La toxina y el patrón interno (toxina-d4; compuesto deuterado 9) se detectaron utilizando un sistema de espectrómetro de masas de triple cuadrupolo equipado con una fuente de ionización por electropulverización (ESI) operada en el modo de iones positivos.
Análisis farmacocinético
Se usó análisis no compartimental de los resultados bioanalíticos de las muestras de suero para derivar los parámetros PK (concentración sérica máxima [Cmáx], semivida terminal [T<1/2>], aclaramiento [CL] y volumen de distribución aparente [Vss]).
Resultados
Farmacocinética
v17597: la exposición a v17597 fue generalmente proporcional a la dosis entre 3 y 9 mg/kg. La Cmáx se alcanzó al final de la infusión de 60 minutos (mediana de Tmáx) y aumentó de manera proporcional a la dosis. La exposición sistémica (AUC<0>-— aumentó de forma ligeramente mayor a la proporcional a la dosis. La semivida terminal media preliminar (T<1/2>) en general parecía aumentar con el aumento de la dosis, el aclaramiento (CL) en general parecía disminuir con el aumento de la dosis y el volumen de distribución aparente (Vss) en general no parecía cambiar con la dosis.
v21252: la exposición a v21252 fue en general proporcional a la dosis entre 9 y 12 mg/kg. La Cmáx se alcanzó al final de la infusión de 60 minutos (mediana de Tmáx) y aumentó de manera proporcional a la dosis. El perfil de concentración sérica de v21252 - tiempo se muestra en la Figura 9A. La exposición sistémica (AUC0-— aumentó de forma ligeramente mayor a la proporcional a la dosis. La semivida terminal media preliminar (T<1/2>), el aclaramiento (CL) y el volumen de distribución aparente (Vss) en general no parecieron cambiar con la dosis.
Anticuerpos totales (conjugado y no conjugado): La concentración sérica máxima de anticuerpos totales (Cmáx) se alcanzó al final de la infusión de<60>minutos (mediana de Tmáx). El perfil de concentración sérica de anticuerpos totales - tiempo de v21252 se muestra en la Figura 9B. Se utilizó un modelo no compartimental para derivar los parámetros PK. La Cmáx aumentó de una manera proporcional a la dosis, mientras que el AUC<0>-- aumentó de una manera ligeramente mayor que la proporcional a la dosis para v17597 y v21252. La semivida terminal media de v17597 aumentó al aumentar la dosis, mientras que el aclaramiento sérico (CL) y el volumen de distribución aparente total (Vss) de los anticuerpos totales disminuyeron al aumentar la dosis. La semivida terminal media y el volumen de distribución aparente total (Vss) de v21252 aumentó al aumentar la dosis, mientras que el aclaramiento sérico (CL) de los anticuerpos totales disminuyeron al aumentar la dosis.
Toxina (Compuesto 9): Después de la administración de una dosis única de v17597 (3,<6>o 9 mg/kg) o v21252 (9 mg/kg o 12 mg/kg), todas las concentraciones séricas de toxina estaban por debajo del límite inferior de cuantificación (LLOQ, < 5,00 ng/ml).
Tolerabilidad
Una dosis única de v17597 (3,<6>o 9 mg/kg) o v21252 en dosis de 9 o 12 mg/kg era bien tolerada. No hubo mortalidad durante el transcurso del estudio. No se observaron efectos relacionados con el tratamiento en las observaciones clínicas, el consumo de alimentos o el peso corporal.
En algunos animales se observaron cambios de mínimos a leves en los parámetros de patología clínica que se consideraron relacionados con el tratamiento. No hubo efectos relacionados con el artículo de ensayo entre los puntos finales de hematología en ningún grupo de tratamiento. Todas las fluctuaciones se consideraron dentro de los intervalos esperados para fluctuaciones biológicas y/o relacionadas con el procedimiento a pesar de cualquier diferencia aparente entre los valores individuales.
Ejemplo<8>: Estudio de toxicidad no GLP de v17597 en macacos cangrejeros
Se realizó un estudio de toxicidad no GLP para investigar la toxicocinética y la toxicidad de v17597 en macacos cangrejeros. El estudio se diseñó basándose en los resultados del estudio de farmacocinética/tolerabilidad de dosis única en macacos cangrejeros hembra (Ejemplo<6>).
El estudio demostró que la administración de v17597 semanalmente en dosis de 2,25 y 4,5 mg/kg, y quincenalmente en dosis de 4,5 y 9 mg/kg no era bien tolerada en macacos cangrejeros machos y hembras. El nivel sin efectos adversos (NOAEL) y la dosis más alta sin toxicidad grave (HNSTD) para v17597 después de la administración semanal o quincenal durante hasta 6 semanas se consideró que era menor de 2,25 mg/kg administrado semanalmente o 4,5 mg/kg administrado quincenalmente.
Materiales y métodos
El vehículo o v17597 se administró mediante una infusión i.v. semanal de 1 h los días 1, 8, 15, 22, 29 y 36 en dosis de 0, 2,25 y 4,5 mg/kg, y una vez cada dos semanas los días 1, 15 y 29 en dosis de 4,5 y 9 mg/kg. Se evaluó en todos los animales los cambios en los signos clínicos, consumo de alimentos, peso corporal, presión arterial, ECG, frecuencias respiratorias (visual), patología clínica (hematología, química clínica, coagulación, análisis de orina), pesos de órganos y examen macroscópico/microscópico de tejidos. Se recogió sangre para análisis toxicocinético y análisis de anticuerpos antifármaco (ADA). Los animales que recibieron dosis semanales terminaron el día 42 y los animales que recibieron dosis cada dos semanas terminaron el día 36. El diseño del estudio se presenta en la Tabla 15.
Tabla 15: Diseño del estudio
Resultados
Basándose en el peso corporal, las observaciones clínicas y los resultados de la patología clínica, se consideró que v17597 era adverso en todas las dosis ensayadas en este estudio. Los animales de 9 mg/kg/dosis (quincenal) y una hembra de 4,5 mg/kg/dosis (quincenal) terminaron antes de tiempo y solo recibieron dosis los días 1 y 15.
Basándose en los resultados de este estudio, el nivel sin efectos adversos (NOAEL) y la dosis más alta sin toxicidad grave (HNSTD) para v17597 después de la administración semanal o quincenal durante hasta 6 semanas se consideró que era menor de 2,25 mg/kg administrado semanalmente o 4,5 mg/kg administrado quincenalmente.
Ejemplo 9: Estudio de toxicidad no GLP de v21252 en macacos cangrejeros
El objetivo de este estudio era caracterizar aún más la toxicocinética y la toxicidad de v21252.
El estudio demostró que la administración de v21252 los días 1, 15 y 29 en dosis de hasta 12 mg/kg era clínicamente bien tolerada en macacos cangrejeros machos y hembras. El nivel sin acontecimientos adversos observados (NOAEL) era de 12 mg/kg y la dosis más alta sin toxicidad grave (HNSTD) era superior a 12 mg/kg.
Materiales y métodos
En este estudio, el vehículo o v21252 se administró a macacos cangrejeros machos y hembras mediante una infusión i.v. de 1 h una vez cada dos semanas los días 1, 15 y 29 en dosis de 0, 9 y 12 mg/kg (3 animales por sexo en cada nivel de dosis). Se evaluó en todos los animales los cambios en los signos clínicos, consumo de alimentos, peso corporal, presión arterial, ECG, frecuencias respiratorias (visual), patología clínica (hematología, química clínica, coagulación, análisis de orina), pesos de órganos y examen macroscópico/microscópico de tejidos. Se recogió sangre para el análisis toxicocinético (TK) (v21252, anticuerpo total y toxina libre (Compuesto 9)) y análisis de anticuerpos antifármaco (ADA), y los animales se sacrificaron el día 36. A otro grupo de animales se le administró una dosis única de 12 mg/kg de v21252 el día 1 y terminaron 4, 8 y 15 días después de la dosis (n=2 por punto de tiempo). El diseño del estudio se presenta en la Tabla 16.
Tabla 16: Diseño del estudio de toxicidad no GLP
Resultados
Farmacocinética
v21252: La farmacocinética se calculó después de la administración repetida de v21252. La Cmáx se alcanzó al final de la perfusión de 60 minutos o 60 minutos después del final de la perfusión (mediana de Tmáx). El perfil de concentración sérica de v21252 - tiempo se muestra en la Figura 10. El día 1, la Cmáx y la exposición sistémica (AUC<0-168>h) aumentaron de forma ligeramente mayor que la proporcional a la dosis. El día 29, la Cmáx y el AUC<0 -168>h aumentaron de una manera aproximadamente proporcional a la dosis. La exposición sistémica y el AUC<0-168>h no parecieron cambiar y no mostraron acumulación después de la administración repetida. Las semividas de eliminación medias (T<1/2>) aumentaron del grupo de 9 mg/kg al grupo de 12 mg/kg. Un mecanismo de aclaramiento saturable para v21252 puede explicar la diferencia en T<1/2>y el aclaramiento entre los grupos de dosis baja (9 mg/kg) y alta (12 mg/kg).
Anticuerpos totales (conjugado y no conjugado): Los anticuerpos totales se midieron en macacos cangrejeros después de las administraciones repetidas de v21252. La Cmáx para anticuerpos totales se alcanzó al final de la perfusión de 60 minutos (mediana de Tmáx). El perfil de concentración sérica de anticuerpos totales - tiempo se muestra en la Figura 11. El día 1, la Cmáx y la exposición sistémica (AUC<0-168>h) aumentaron de forma ligeramente mayor que la proporcional a la dosis. El día 29, la Cmáx y el AUC<0-168>h aumentaron de una manera aproximadamente proporcional a la dosis. La exposición sistémica AUC<0-168>h no cambió y no mostró acumulación después de administraciones repetidas. Similar a v21252, las semividas de eliminación medias (T<1/2>) para el anticuerpo total aumentaron del grupo de 9 mg/kg al grupo de 12 mg/kg.
La farmacocinética de v21252 según lo indicado por los perfiles de concentración sérica-tiempo de v21252 y los anticuerpos totales son indicativos de una pérdida mínima de enlazador-toxina de v21252in vivo(véase la Figura 12).
Toxina (Compuesto 9): La toxina libre se midió en macacos cangrejeros después de las administraciones repetidas de v21252. Todas las concentraciones séricas de la carga activa (compuesto 9) estaban por debajo del límite de cuantificación (< 0,500 ng/ml) con la excepción de una hembra con 12 mg/kg el día 1, una hembra con 9 mg/kg el día 29 y un macho con 12 mg/kg el día 29.
Anticuerpos antifármaco (ADA): Los anticuerpos anti-v21252 se cribaron en macacos cangrejeros después de las administraciones repetidas de v21252. Se detectaron ADA en el suero de una sola hembra en la cohorte de dosificación de 9 mg/kg.
Toxicidad
En general, la administración de v21252 era clínicamente bien tolerada en todas las dosis ensayadas. No se observaron cambios relacionados con el tratamiento en el análisis de orina, los parámetros de ECG o las frecuencias respiratorias.
Se observaron efectos mínimos esporádicos en los pesos corporales individuales en animales que recibieron administraciones repetidas de v21252 en 12 mg/kg/dosis. Estos animales se recuperaron todos total o parcialmente el día 35. Todos los demás animales mantuvieron o aumentaron de peso durante todo el estudio.
Se observaron cambios de mínimos a leves en los signos clínicos, la patología clínica, el peso de los órganos o el examen macroscópico/microscópico de los tejidos en algunos animales. Las observaciones macroscópicas que se consideraron relacionadas con v21252 se limitaron a la decoloración roja observada en el sitio de infusión en todos los animales, incluidos los controles. Los cambios de peso de los órganos relacionados con el artículo de ensayo se limitaron al bazo. En animales que terminaron el día 36 después de 3 dosis quincenales, los efectos microscópicos relacionados con el tratamiento incluyeron cambios en el tracto gastrointestinal, hígado, bazo, ganglios linfáticos, páncreas, piel y los sitios de infusión i.v. Todos fueron clasificados como mínimos o leves. En animales que terminaron en diversos tiempos después de una dosis única de 12 mg/kg, se observaron efectos similares relacionados con el artículo de ensayo de mínimos a leves.
El análisis PK confirmó la exposición sistémica en los animales tratados con v21252 y la exposición sistémica media aumentó con el aumento de la dosis de una manera proporcional a la dosis para v21252 y el anticuerpo total, mientras que la exposición a la toxina libre (compuesto 9) solo se vio en niveles bajos en unos pocos animales.
Las Tablas 17-20 muestran una comparación de los resultados de los estudios PK/tolerabilidad y los estudios de dosis repetidas no GLP para v17597 y v21252.
Tabla 17: Comparación de la mortalidad observada en estudios de dosis única y dosis repetidas para v17597 y v21252 en macacos cangrejeros
Tabla 18: Comparación de NOAEL y HNSTD determinado en estudios de dosis repetidas para v17597 y v21252 en macacos cangrejeros
Tabla 19: Análisis bioanalítico de ADC
Tabla 20: Análisis bioanalítico de anticuerpos totales
Conclusiones
Se ha demostrado que los análogos de auristatina de Fórmula general (I) tienen buena tolerabilidadin vivocuando se administran a ratones. La conjugación del compuesto 9 con el anticuerpo monoespecífico anti-HER2 trastuzumab en una DAR4 promedio produjo un ADC que mostró una tolerabilidad excelente en macacos cangrejeros con una dosis de toxicidad no grave (HNSTD) más alta de 18 mg/kg. Por el contrario, el ADC que comprende el compuesto 9 conjugado con un anticuerpo biparatópico anti-HER2, v10000, en una DAR4 promedio (v17597) mostró una tolerabilidad muy disminuida con una HNSTD de menos de 4,5 mg/kg (Ejemplo 8). Sin estar limitado por ninguna teoría en particular, se propone que la tolerabilidad disminuida observada para v17597 puede deberse en parte a la mayor unión en la diana e internalización del anticuerpo biparatópico en comparación con el trastuzumab monoespecífico, conduciendo a una mayor toxicidad en la diana y/o una proporción reducida de DAR0 o especies solas en la DAR4 promedio (v17597) en comparación con la DAR2 promedio (v21252) que aumenta la toxicidad asociada con especies de DAR más altas (DAR2, DAR4 y DAR6), y/o proporción aumentada de especies de DAR6 en la DAR4 promedio en comparación con DAR2 promedio aumentando la toxicidad asociada con las especies de DAR superiores.
Sorprendentemente, sin embargo, el ADC que comprende el compuesto 9 conjugado con v10000 con una DAR2 promedio (v21252) mostró una tolerabilidad muy mejorada con una HNST<d>de 12 mg/kg (Ejemplo 9). Este resultado es inesperado ya que se ha demostrado previamente que la toxicidad de los ADC que comprenden monometilauristatina E (MMAE) o un maitansinoide se correlaciona directamente con la cantidad total de fármaco unido al anticuerpo, es decir, la relación entre DAR y la dosis máxima tolerada es lineal para los ADC (Hamblett, et al.,Clin. Cáncer Res.,10:7063-7070 (2004); Sun, et al.,Bioconj Chem.,28: 1371-81 (2017)). Específicamente, la dosis máxima tolerada de un ADC con 8 moléculas de fármaco por anticuerpo era de 50 mg/kg, y la dosis máxima tolerada de un ADC con 4 moléculas de fármaco por anticuerpo (es decir, la mitad de la cantidad de toxina) era de 100 mg/kg (Hamblett,et al., ib.).Es decir, un ADC con la mitad de la cantidad de toxina del ADC DAR8, cuando se administró en la misma dosis de anticuerpo, mostró una MTD que era el doble que la del ADC DAR8.
v21252 tiene una DAR de 2 y, por lo tanto, la mitad de la cantidad de toxina que v17597 cuando se administra con la misma dosis de anticuerpo. Basándose en estudios previos con v17597, por lo tanto, se esperaba que la cantidad de v21252 que sería tolerada fuera inferior a 9 mg/kg (es decir, 2 veces la dosis máxima tolerada para v17597). Sin embargo, como se muestra en el Ejemplo 9, era tolerado v21252 administrado a macacos cangrejeros en dosis de 9 o 12 mg/kg cada dos semanas durante tres dosis y 12 mg/kg se designó como un nivel sin acontecimientos adversos observados (NOAEL).
Es importante señalar que v21252 tiene menos toxicidad y más tolerabilidad en comparación con v17597 cuando se administra quincenalmente, aunque tiene una mayor exposición. Basándose en el estudio de toxicología no GLP en los macacos cangrejeros (Ejemplo 8), se consideró que v17597 tenía resultados adversos en dosis quincenales tanto de 4,5 como de 9 mg/kg. Sin embargo, en un estudio similar no GLP (Ejemplo 9), no se consideró que v21252 tuviera resultados adversos en dosis quincenales de 9 mg/kg y 12 mg/kg, a pesar de tener aumentos de exposición de aproximadamente 1,8 a 4,6 veces (AUC<0-336>h después de la primera dosis o AUC<0-168>h última dosis) en comparación con 4,5 mg/kg de v17597 (resumido en las Tablas 19 y 20).
Además, v21252 demostró eficaciain vivoen los niveles de exposición que se mostró que son tolerados en macacos cangrejeros. Específicamente, se lograron respuestas completas en modelos de xenoinjertos derivados de pacientes de tumores tanto con HER2 alto como con HER<2>bajo a exposiciones toleradas en macacos cangrejeros, como se resume en la Figura 15 (véase también el Ejemplo 6).
Ejemplo 10: Estudio de toxicidad GLP de v21252 en macacos cangrejeros
En un estudio de toxicidad GLP posterior, se administró v21252 a macacos cangrejeros cada dos semanas en 0, 6, 12 y 18 mg/kg durante 4 dosis, con un período de recuperación de 6 semanas. Se determinó que la dosis más alta sin toxicidad grave (HNSTD) era de 18 mg/kg. v21252 era bien tolerado en todas las dosis. Ninguna observación clínica se consideró adversa y no se observó mortalidad en este estudio de GLP. La única observación clínica consistente fue un aumento de la diarrea. No se observaron cambios en el peso corporal en todas las dosis y no se consideraron adversos los resultados patológicos clínicos (función hepática: aspartato transaminasa y alanina transaminasa y hematología: neutrófilos, plaquetas, hemoglobina y linfocitos). La exposición (Cmáx y AUC<0-168>h) de v21252 fue prácticamente idéntica a la de v10000 (anticuerpo solo). Los detalles del estudio se proporcionan a continuación.
El objetivo de este estudio GLP era caracterizar adicionalmente la toxicocinética y la toxicidad de v21252 administrado 4 veces por vía intravenosa a macacos cangrejeros.
En el estudio de toxicidad GLP, se administró v21252 a macacos cangrejeros machos y hembras los días 1, 15, 29 y 43 en dosis de 0, 6, 12 y 18 mg/kg, con un periodo de recuperación de 6 semanas. El nivel sin acontecimientos adversos observados (NOAEL) era de 12 mg/kg y la dosis más alta sin toxicidad grave (HNSTD) era 18 mg/kg.
Materiales y métodos
En este estudio, se administró vehículo o v21252 a macacos cangrejeros machos y hembras mediante una infusión i.v. de 1 h una vez cada dos semanas los días 1, 15, 29 y 43 en dosis de 0, 6, 12 y 18 mg/kg (4 animales por sexo en cada nivel de dosis y 2 animales adicionales por sexo en 0, 12 y 18 mg/kg para la evaluación de la recuperación). Se evaluó en todos los animales los cambios en los signos clínicos, consumo de alimentos, peso corporal, presión arterial, ECG, frecuencias respiratorias (visual), patología clínica (hematología, química clínica, coagulación, análisis de orina), pesos de órganos y examen macroscópico/microscópico de tejidos. Se recogió sangre para el análisis toxicocinético (TK) (v21252, anticuerpo total y toxina libre (compuesto 9)) y análisis de anticuerpos antifármaco (ADA), y los animales terminaron el día 50 y después de 6 semanas de recuperación el día 92. El diseño del estudio se presenta en la Tabla 21.
Tabla 21: Diseño del estudio de toxicidad GLP
Resultados
Farmacocinética
v21252: Las concentraciones séricas máximas medianas de v21252 se observaron 1 h después del inicio de la infusión (SOI, por sus siglas en inglésstart of infusión)los días 1 y 43. Después de la administración quincenal de v21252, los valores medios de Cmáx y AUC para v21252 aumentaron con el aumento de la dosis. Los aumentos en Cmáx eran aproximadamente proporcionales a la dosis el día 1. El día 1, un aumento de 1:2:3 veces en la dosis de v21252 dio como resultado un aumento aproximado de 1:2,3:3,3 veces en los valores de Cmáx, un aumento aproximado de 1:2,6:3,8 veces en los valores medios de AUC<0-168>h, y un aumento aproximado de 1:2,9:4,5 veces en los valores de AUC<0-336>h. El día 43, la Cmáx y el AUC<0-168>h eran aproximadamente proporcionales a la dosis. El día 43, un aumento de 1:2:3 veces en la dosis de v21252 dio como resultado un aumento aproximado de 1:2,5:3,5 veces en los valores de Cmáx y un aumento aproximado 1:3,2:4,7 veces en los valores de AUC<0-168>h. La exposición sistémica a v21252 no parecía cambiar después de la infusión i.v. quincenal repetida de 6 mg/kg, sin embargo, la exposición en general parecía aumentar después de la infusión i.v. quincenal repetida de 12 y 18 mg/kg. Las relaciones de acumulación medias del AUC<0-168>h fueron 1,20, 1,47 y 1,50 en 6, 12 y 18 mg/kg, respectivamente. Las relaciones de acumulación de AUC<0-168>h individuales variaron de 1,01 a 1,64 con 6 mg/kg, de 1,17 a 1,95 con 12 mg/kg y de 0,983 a 2,08 con 18 mg/kg.
Anticuerpos totales (conjugado y no conjugado): Las concentraciones séricas máximas medianas de anticuerpos totales se observaron 1 h después del SOI de v21252 los días 1 y 43. Después de la administración quincenal de v21252, los valores medios de Cmáx y AUC<0-168>h aumentaron con el aumento de la dosis. El día 1, un aumento de 1:2:3 veces en la dosis de v21252 dio como resultado un aumento de aproximadamente 1:2,1:3,3 veces en los valores de Cmáx, un aumento aproximado de 1:2,4:3,8 veces en los valores de AUC0-168 h y un aumento aproximado de 1:2,8:4,5 veces en los valores medios de AUC<0-336>h. El día 43, un aumento de 1:2:3 veces en la dosis de v21252 dio como resultado un aumento de aproximadamente 1:2,6:3,9 veces en los valores de Cmáx y un aumento aproximado de 1:3,1:4,8 veces en los valores de AUC<0-168>h La exposición sistémica a los anticuerpos totales no parecía cambiar después de la infusión IV quincenal repetida de v21252 en 6 mg/kg, pero sí parecía aumentar después de la infusión IV quincenal repetida de v21252 en 12 y 18 mg/kg. Las relaciones de acumulación medias de AUC<0-168>h fueron 1,20, 1,47 y 1,50 en 6, 12 y 18 mg/kg, respectivamente.
Toxina (compuesto 9): La toxina libre se midió después de las administraciones repetidas de v21252. La mayoría de las concentraciones séricas de toxina (compuesto 9) estaban por debajo del límite de cuantificación (< 0,500 ng/ml). Se observaron las siguientes excepciones: una hembra con 12 mg/kg el día 43 tenía una única concentración de toxina cuantificable (compuesto 9) (0,513 ng/ml a las 72 h después de la dosis); un macho con 18 mg/kg el día 29 tenía una única concentración de toxina cuantificable (compuesto 9) (0,532 ng/ml 1 hora después del SOI); dos machos y dos hembras con 18 mg/kg el día 43 tenían cada uno una única concentración de toxina cuantificable (compuesto 9) (0,555, 0,505, 0,556 y 0,653 ng/ml, respectivamente, a las 24 h después del SOI); y un macho con 18 mg/kg el día 43 tuvo cuatro concentraciones de toxina cuantificables consecutivas (compuesto 9) con un valor de AUC<0-168>h de 125 h*ng/ml.
Anticuerpos antifármaco (ADA): Un total de 144 muestras de todas las cohortes de dosificación se seleccionaron para ADA. Siete muestras se confirmaron como positivas en el ensayo de confirmación/inmunodepleción, incluido un animal de control y una muestra previa al ensayo de un animal tratado. Se consideró que estas dos últimas muestras se debían a anticuerpos reactivos preexistentes y no estaban relacionadas con la exposición a v21252. Para las cinco muestras positivas restantes, una hembra que recibió una dosis de 18 mg/kg tuvo un título detectable el día 43, y los 4 animales restantes (2 hembras que recibieron dosis de 12 mg/kg y un macho y una hembra que recibieron dosis de 18 mg/kg) tenían títulos detectables en el punto de recuperación del día 92. Aunque los resultados reales del anticuerpo anti-v21252 no sugieren una fuerte respuesta inmunogénica en la mayoría de los animales, el v21252 circulante podría unirse a los anticuerpos anti-v21252, lo que limita la detección de los anticuerpos dentro de este formato de ensayo. Sin embargo, es poco probable que los ADA afecten significativamente a la PK de v21252, ya que no se observaron cambios en los datos de tiempo de concentración sérica en la dosificación el día 43 en comparación con la dosificación el día 1.
Toxicidad
La administración de dosis repetidas de v21252 (cada dos semanas x4) en general era bien tolerada. No hubo muertes relacionadas con v21252 y no se observaron efectos en las evaluaciones oftálmicas y electrocardiográficas, frecuencias respiratorias visuales, análisis de orina o evaluaciones de troponina I. No se observaron cambios relacionados con v21252 en los parámetros de peso corporal durante los periodos de tratamiento o recuperación después de la administración de v21252.
Se observó una mayor incidencia de heces blandas/acuosas en animales a los que se administró dosis repetidas de v21252 en > 6 mg/kg. Además, se observó inapetencia esporádica en animales machos y hembras con 18 mg/kg y se observó esporádicamente una postura encorvada en hembras con 18 mg/kg. Después del período de recuperación, la inapetencia y la postura encorvada desaparecieron, mientras que la incidencia de heces blandas/acuosas disminuyó o se resolvió, lo que sugiere la reversión de los efectos relacionados con v21252. Durante el estudio, los animales recibieron suplementación de fluidos/nutricional (dieta de Gatorade congelado y PeptoPro®) debido a las repetidas observaciones de heces blandas/líquidas. Las hembras que recibieron la administración repetida de v21252 recibieron suplementación de fluidos y/o nutricional desde el día 4 (6 y 18 mg/kg) o el día 8 (12 mg/kg) hasta el final del período de tratamiento. De manera similar, los machos que recibieron la administración repetida de v21252 recibieron suplementación de fluidos y/o nutricional desde el día 8 (12 mg/kg) o el día 7 (18 mg/kg) hasta el final del período de tratamiento. No se proporcionaron fluidos ni suplementación durante la recuperación.
Los resultados patológicos clínicos no se consideraron adversos debido a la gravedad limitada y la reversibilidad de los hallazgos. Los cambios hematológicos relacionados con el artículo de ensayo incluyeron: aumentos en los recuentos de monocitos, alteraciones morfológicas en los neutrófilos, disminuciones en los recuentos de reticulocitos y la masa de glóbulos rojos (RBC, hemoglobina y hematocrito) con un aumento concomitante en el ancho de distribución de los glóbulos rojos. Hubo aumentos de mínimos a leves en las concentraciones medias de fibrinógeno en relación con las medias iniciales los días 8 a 50 en machos con 18 mg/kg y en hembras con > 12 mg/kg. Estos cambios estaban relacionados con el artículo de ensayo y eran indicativos de un estímulo inmunitario o inflamatorio. Estos cambios se habían resuelto el día 92. Se observaron cambios relacionados con el tratamiento en AST, fósforo, proteína total, albúmina, globulina y citrulina.
Las Tablas 22-25 muestran una comparación de los resultados de los estudios de dosis repetidas no GLP para v17597 y v21252 y el estudio GLP para v21252.
Tabla 22: Comparación de la mortalidad observada en estudios de dosis repetidas cada dos semanas para v17597 y v21252 en macacos cangrejeros
Tabla 23: Comparación de NOAEL y HNSTD determinado en estudios de dosis repetidas cada dos semanas para v17597 y v21252 en macacos cangrejeros
Tabla 24: Comparación de los parámetros PK de ADC para v17597 DAR4 y v21252 DAR2 (coincidencia de dosis de toxina)
Tabla 25: Comparación de los parámetros PK de anticuerpos totales para v17597 DAR4 y v21252 DAR2 (coincidencia de dosis de toxina)
Conclusiones
Se determinó que la dosis más alta sin toxicidad grave (HNSTD) de v21252 era 18 mg/kg. v21252 era bien tolerado en todas las dosis. Ninguna observación clínica se consideró adversa y no se observó mortalidad en este estudio de GLP. La única observación clínica consistente fue un aumento de la diarrea. No se observaron cambios en el peso corporal en todas las dosis y no se consideraron adversos los resultados patológicos clínicos (función hepática: aspartato transaminasa y alanina transaminasa y hematología: neutrófilos, plaquetas, hemoglobina y linfocitos). Estos resultados de toxicología de GLP respaldan la dosificación clínica por encima de las dosis eficaces previstas en seres humanos.
Sorprendentemente, el ADC que comprende el compuesto 9 conjugado con v10000 con una DAR2 promedio (v21252) mostró tolerabilidad mejorada en comparación con un ADC con una DAR4 promedio (v17597) con una HNSTD de 18 mg/kg. Este resultado es inesperado, ya que se ha demostrado previamente que el compuesto de toxina 9 conjugado con v10000 con una DAR4 promedio (v17597) cuando se administró con una dosis de toxina de 0,36 mg/kg se asoció con mortalidad cuando se administró de forma aguda (con un dosis única de 9 mg/kg) o de forma subcrónica (con dos dosis de 4,5 mg/kg separadas por dos semanas) (Ejemplo 8). Por el contrario, cuando se administró v21252 (DAR2) con una dosis de toxina de 0,36 mg/kg (compuesto 9) para cuatro dosis (una dosis de toxina acumulada de 1,44 mg/kg), no hubo mortalidad y hubo toxicidad sustancialmente reducida en comparación con v17597. Por ejemplo, v21252 administrado con una dosis acumulada de 0,96 mg/kg de toxina (compuesto 9) no se asoció con resultados adversos y se designó como un nivel de acontecimiento adverso no observado (NOAEL). Además, se administró una dosis acumulada de toxina de 1,44 mg/kg (compuesto 9) con 18 mg/kg de v21252 en 4 dosis y fue tolerada. Esta es una dosis cuatro veces mayor que la dosis de v17597 que se asoció con la mortalidad (0,36 mg/kg).
Es importante destacar que v21252 tiene menos toxicidad y más tolerabilidad en comparación con v17597 cuando se dosifica cada dos semanas, incluso aunque tiene una exposición aproximadamente dos veces mayor (AUC<0-336>h después de la primera dosis) y una semivida dos veces más larga después de la primera dosis en comparación con las dosis de toxina correspondiente (4,5 mg/kg de v17597 frente a 9 mg/kg de v21252 y 9 mg/kg de v17597 frente a 18 mg/kg de v21252) (resumido en las Tablas 24 y 25).
Ejemplo 11: v21252 inhibe el crecimiento de xenoinjerto derivado de paciente de HER2 bajoin vivo
LTL-654 se obtuvo de una metástasis de paciente con carcinoma seroso de ovario y se calificó por inmunohistoquímica (IHC) como negativo para HER2. Una biopsia anterior fue calificada por IHC como equívoca para HER2.
Se implantaron en ratones NOD Rag gamma hembra (NRG) por vía subcutánea a través de la cápsula renal dos fragmentos tumorales LTL-654, aproximadamente de 15 mm3 cada uno. Los animales se asignaron aleatoriamente a uno de los dos grupos de tratamiento con ocultación de seis animales cada uno cuando los volúmenes tumorales medios alcanzaron 70,3-77,8 mm3.
Los animales se trataron con vehículo o 3 mg/kg de v21252 administrado por vía intravenosa una vez a la semana para cuatro inyecciones totales (cada semanax4) (Tabla 21). El tamaño del tumor se midió usando un sistema de imágenes Vevo®3100 (FUJIFILM VisualSonics, Inc., Toronto, Canadá) usando el modo tridimensional (3D). Se registraron y analizaron múltiples imágenes (de 70 a 100 por tumor) por todo el tumor usando el software Vevo® LAB v2.1.0 (FUJIFILM VisualSonics, Inc.). El tamaño del tumor se midió una vez por semana después de la aleatorización hasta el día 24. Los ratones se sacrificaron de forma ética cuando los tumores individuales alcanzaron un tamaño de 1500 mm3. Los volúmenes tumorales se dieron como la media ± SEM para cada grupo.
La Figura 16 proporciona los resultados de la respuesta tumoral en ratones a los que se implantaron por vía subcutánea fragmentos de tumor LTL-654 después de la administración i.v. de vehículo o v21252, que demuestran que el tratamiento de ratones con injerto de LTL-654 con v21252 inhibía la tasa de crecimiento de los xenoinjertos de tumor LTL-654.
Este ejemplo demuestra que v21252 es eficaz en un xenoinjerto derivado de un paciente en el que la expresión de HER2 es suficientemente baja como para ser puntuado por IHC como negativo para HER2.
Tabla 21: Diseño del estudio del modelo de PDX de cáncer de ovario LTL-654
Ejemplo 12: v21252 prolonga la supervivencia de ratones que llevan tumores de mama humanos implantados por vía intracranealin vivo
Las construcciones utilizadas en este ejemplo fueron: conjugado de control (anticuerpo humanizado contra el virus sincitial respiratorio conjugado con enlazador-toxina 001), v21252, v7155 (T-DM1, DAR3,5) y v24029 (trastuzumab conjugado con DAR8 con un inhibidor de la topoisomerasa I derivado de exatecán (DXd)). Los tumores de mama humanos BT-474 implantados por vía intracraneal utilizados en este ejemplo sirven como un modelo de metástasis cerebral de cáncer de mama positivo para HER2.
Se irradiaron ratones atímicos Balb/c hembra (CByJ.Cg-Foxn1nu/J) con una fuente y (2 Gy, 60Co, BioMep, Breteniéres, Francia). A los ratones anestesiados se les inyectaron de forma estereotáctica 1x105 células<b>T-474 en 2 microlitros de medio RPMI 1640 sin rojo fenol. Los animales se aleatorizaron en grupos de tratamiento y, empezando el día 8, se les administró por vía intravenosa vehículo, conjugado de control, v21252, v7155 o v24029 en 6 mg/kg cada semana durante doce inyecciones en total (Tabla 26). Los pesos corporales se registraron dos veces por semana hasta el día 18 y luego diariamente. Los ratones se sacrificaron de forma ética cuando la pérdida de peso corporal alcanzó o superó el 20% durante 3 días consecutivos.
La Figura 17 proporciona los resultados de supervivencia para ratones a los que se implantó por vía intracraneal células tumorales BT-474 después de la administración i.v. de vehículo, conjugado de control, v21252, v7155 o v24029.
Dos cohortes adicionales de animales a los que se implantó por vía intracraneal células BT-474 también se aleatorizaron en grupos de tratamiento y, empezando el día 8, se les administró por vía intravenosa v21252 o v24029 en 6 mg/kg cada dos semanas durante seis inyecciones totales. Los pesos corporales se registraron dos veces por semana hasta el día 18 y luego diariamente. Los ratones se sacrificaron de forma ética cuando la pérdida de peso corporal alcanzó o superó el 20% durante 3 días consecutivos.
La Figura 18 proporciona los resultados de supervivencia para ratones a los que se implantó por vía intracraneal células tumorales BT-474 después de la administración i.v. semanal (cada sem) de vehículo, conjugado de control o v7155, o administración i.v. cada dos semanas (cada 2sem) de v21252 o v24029.
Este ejemplo demuestra que v21252 es eficaz para prolongar la supervivencia de ratones a los que se implantó por vía intracraneal células tumorales de mama BT-474.
Tabla 26: Diseño de estudio de modelo de cáncer de mama humano BT-474 implantado por vía intracraneal
Tablas de secuencias
TablaA:Números de clones para las variantes v5019, v5020, v7091, v10000, v6903, v6902 y v6717
Tabla B: Secuencia para las variantes v5019, v5020, v7091, v10000, v6903, v6902 y v6717 por número de clon
Tabla C: Secuencias para las regiones VH y VL de las variantes v7133, v15082, v15085, v15083, v15080, v15079,v15084yv15081

Claims (24)

  1. REIVINDICACIONES 1. Un conjugado de anticuerpo-fármaco que comprende un anticuerpo biparatópico anti-HER2 conjugado con un análogo de auristatina por medio de un enlazador (L) con una relación de fármaco a anticuerpo (DAR) promedio baja, en donde el anticuerpo biparatópico anti-HER2 comprende una primera construcción de polipéptido de unión a antígeno que se une a un primer epítopo de HER2 y una segunda construcción de polipéptido de unión a antígeno que se une a un segundo epítopo de HER2, en donde el primer y segundo epítopos de HER2 están en diferentes dominios de HER2, en donde el análogo de auristatina y el enlazador tienen la Fórmula general (X):
    en donde: R1 se selecciona de:
    L es el enlazador, y representa el punto de unión del enlazador al anticuerpo biparatópico anti-HER2, y en donde la DAR promedio baja es una DAR promedio entre 1,5 y 2,5.
  2. 2. El conjugado de anticuerpo-fármaco según la reivindicación 1, en donde R1 es:
  3. 3. El conjugado de anticuerpo-fármaco según la reivindicación 1 o 2, en donde la DAR promedio está entre 1,8 y 2,5.
  4. 4. El conjugado de anticuerpo-fármaco según la reivindicación 1 o 2, en donde la DAR promedio es aproximadamente 2,0.
  5. 5. El conjugado de anticuerpo-fármaco según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en donde el conjugado comprende entre aproximadamente 10% y aproximadamente 30% de especies de DAR0.
  6. 6. El conjugado de anticuerpo-fármaco según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en donde el conjugado comprende entre aproximadamente 10% y aproximadamente 25% de especies de DAR0.
  7. 7. El conjugado de anticuerpo-fármaco según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en donde el conjugado comprende entre aproximadamente 15% y aproximadamente 25% de especies de DAR0.
  8. 8. El conjugado de anticuerpo-fármaco según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, en donde el conjugado comprende entre 0% y aproximadamente 15% de especies de DAR6 o superiores, o entre aproximadamente 0% y aproximadamente 10% de especies de DAR6 o superiores.
  9. 9. El conjugado de anticuerpo-fármaco según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, en donde L es un conector escindible, opcionalmente un conector escindible por proteasa.
  10. 10. El conjugado de anticuerpo-fármaco según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, en donde L tiene la Fórmula general (VI):
    en donde: Z es un grupo funcional capaz de reaccionar con un grupo diana en el anticuerpo biparatópico anti-HER2; Str es un extensor; AA<1>y AA<2>son cada uno independientemente un aminoácido, en donde AA<1>-[AA<2>]m forma un sitio de escisión de proteasa; X es un grupo autoinmolador; D es el punto de unión al análogo de auristatina; s es 0 o 1; m es un número entero entre 1 y 4, y o es 0, 1 o 2, opcionalmente en donde s es 1 y o es 0.
  11. 11. El conjugado de anticuerpo-fármaco según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, en donde L tiene la Fórmula general (IX):
    en donde: A-S- es el punto de unión al anticuerpo biparatópico anti-HER2; Y es uno o más componentes enlazadores adicionales, o está ausente, y D es el punto de unión al análogo de auristatina.
  12. 12. El conjugado de anticuerpo-fármaco según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, en donde el análogo de auristatina y el enlazador tienen la estructura:
    en donde A-S- es el punto de unión al anticuerpo biparatópico anti-HER2.
  13. 13. El conjugado de anticuerpo-fármaco según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 12, en donde el anticuerpo biparatópico anti-HER2 se une a HER2 con mayor afinidad en comparación con un anticuerpo monoespecífico bivalente correspondiente, y/o en donde el anticuerpo biparatópico anti-HER2 muestra una mayor internalización en células que expresan HER2 en comparación con un anticuerpo monoespecífico bivalente correspondiente.
  14. 14. El conjugado de anticuerpo-fármaco según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 13, en donde la primera construcción de polipéptido de unión a antígeno es un scFv, y la segunda construcción de polipéptido de unión a antígeno es un Fab.
  15. 15. El conjugado de anticuerpo-fármaco según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 14, en donde el primer epítopo de HER2 está en ECD4 de HER2 y el segundo epítopo de HER2 está en ECD2 de HER2, opcionalmente en donde la primera construcción de polipéptido de unión a antígeno compite con trastuzumab por la unión a HER2, y/o en donde la segunda construcción de polipéptido de unión a antígeno compite con pertuzumab por la unión a HER2.
  16. 16. El conjugado de anticuerpo-fármaco según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 15, en donde: (a) la primera construcción de polipéptido de unión a antígeno comprende las secuencias de CDR del brazo de unión a ECD4 de uno cualquiera de v5019, v5020, v7091, v10000, v6902, v6903 o v6717, y la segunda construcción de polipéptido de unión a antígeno comprende las secuencias de CDR del brazo de unión ECD2 de uno cualquiera de v5019, v5020, v7091, v10000, v6902, v6903, v6717, v7133, v15079, v15080, v15081, v15082, v15083, v15084 o v15085, o (b) la primera construcción de polipéptido de unión a antígeno comprende las secuencias de CDR del brazo de unión a ECD4 de v10000, y la segunda construcción de polipéptido de unión a antígeno comprende las secuencias de CDR del brazo de unión a ECD2 de v10000.
  17. 17. El conjugado de anticuerpo-fármaco según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 15, en donde la primera construcción de polipéptido de unión a antígeno comprende las secuencias de CDR expuestas en las SEQ ID NO: 67, 68, 69, 70, 71 y 72, y la segunda construcción de polipéptido de unión a antígeno comprende las secuencias de CDR expuestas en las SEQ ID NO: 27, 28, 29, 39, 40 y 41.
  18. 18. El conjugado de anticuerpo-fármaco según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 15, en donde la primera construcción de polipéptido de unión a antígeno comprende la secuencia de VH como se expone en la SEQ ID NO: 66 y la secuencia de VL como se expone en la SEQ ID NO: 65, y la segunda construcción de polipéptido de unión a antígeno comprende la secuencia de VH como se expone en la SEQ ID NO: 38 y la secuencia de VL como se expone en la SEQ ID NO: 26.
  19. 19. El conjugado de anticuerpo-fármaco de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 18, en donde el anticuerpo biparatópico anti-HER2 comprende además un armazón que es una región Fc de IgG, en donde la primera y segunda construcciones de polipéptidos de unión a antígeno están unidas operativamente al armazón, y en donde la región Fc de IgG es una región Fc heterodímera que comprende un dominio CH3modificado.
  20. 20. El conjugado de anticuerpo-fármaco según la reivindicación 19, en donde el dominio CH3modificado comprende una primera secuencia de polipéptido y una segunda secuencia de polipéptido, y en donde: (a) la primera secuencia de polipéptido del dominio CH3modificado comprende las modificaciones de aminoácidos L351Y, F405A e Y407V, y la segunda secuencia de polipéptido del dominio CH3modificado comprende las modificaciones de aminoácidos T366L, K392M y T394W; o (b) la primera secuencia de polipéptido del dominio CH3modificado comprende las modificaciones de aminoácidos L351Y, F405A e Y407V, y la segunda secuencia de polipéptido del dominio CH3modificado comprende las modificaciones de aminoácidos T366L, K392L y T394W; o (c) la primera secuencia de polipéptido del dominio CH3modificado comprende las modificaciones de aminoácidos T350V, L351Y, F405A e Y407V y la segunda secuencia de polipéptido del dominio CH3modificado comprende las modificaciones de aminoácidos T350V, T366L, K392M y T394W; o (d) la primera secuencia de polipéptido del dominio CH3modificado comprende las modificaciones de aminoácidos T350V, L351Y, F405A e Y407V, y la segunda secuencia de polipéptido del dominio CH3modificado comprende las modificaciones de aminoácidos T350V, T366L, K392L y T394W; o (e) la primera secuencia de polipéptido del dominio CH3modificado comprende las modificaciones de aminoácidos T350V, L351Y, S400E, F405A e Y407V, y la segunda secuencia de polipéptido del dominio CH3modificado comprende las modificaciones de aminoácidos T350V, T366L, N390R, K392M y T394W.
  21. 21. El conjugado de anticuerpo-fármaco según la reivindicación 1, en donde (a) la primera construcción de polipéptido de unión a antígeno del anticuerpo biparatópico anti-HER2 es un scFv que comprende la secuencia de VH como se expone en la SEQ ID NO: 66 y la secuencia de VL como se expone en la SEQ ID NO: 65, y la segunda construcción de polipéptido de unión a antígeno del anticuerpo biparatópico anti-HER2 es un Fab que comprende la secuencia de VH como se expone en la SEQ ID NO: 38 y la secuencia de VL como se expone en la SEQ ID NO: 26; (b) el anticuerpo biparatópico anti-HER2 comprende además un armazón que es una región Fc de IgG heterodímera que comprende un dominio CH3modificado, en donde la primera y la segunda construcciones de polipéptidos de unión a antígeno están unidas operativamente al armazón, en donde el dominio CH3modificado comprende una primera secuencia de polipéptido y una segunda secuencia de polipéptido, comprendiendo la primera secuencia de polipéptido las modificaciones de aminoácidos T350V, L351Y, F405A y Y407V, y comprendiendo la segunda secuencia de polipéptido las modificaciones de aminoácidos T350V, T366L, K392L y T394W; (c) el análogo de auristatina y el enlazador tienen la estructura:
    (d) la DAR promedio está entre 1,8 y 2,5, y (e) el conjugado comprende entre aproximadamente 10% y aproximadamente 25% de especies de DAR0.
  22. 22. Una composición farmacéutica que comprende el conjugado de anticuerpo-fármaco según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 21 y un vehículo o diluyente farmacéuticamente aceptable.
  23. 23. Un conjugado de anticuerpo-fármaco según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 21 para usar para tratar un cáncer que expresa HER2 en un sujeto que lo necesite.
  24. 24. El conjugado de anticuerpo-fármaco para su uso según la reivindicación 23, en donde el cáncer que expresa HER2 es un cáncer de mama, un cáncer de ovario, un cáncer de pulmón o un cáncer gástrico.
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