ES2952606T3 - Derivados de licofelona y métodos de uso - Google Patents

Abstract

Se divulgan derivados de licofelone para el tratamiento de enfermedades inflamatorias crónicas y cánceres epiteliales asociados con inflamación crónica. Los agentes apuntan a mPGES-1 y 5-LOX. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

DESCRIPCIÓN

Derivados de licofelona y métodos de uso

Antecedentes

Los datos epidemiológicos, preclínicos y clínicos sugieren que la inflamación juega un papel clave en el cáncer colorrectal (CCR). Los estudios sugieren que el riesgo de CCR es alto en sujetos con colitis ulcerosa (CU) y enfermedad de Crohn (EC). A nivel mundial, el CCR es el tercer cáncer más comúnmente diagnosticado y la segunda causa principal de muerte en los Estados Unidos. Se estima que habrá 1,35 millones de casos nuevos y aproximadamente 700.000 muertes en todo el mundo anualmente; y 142.820 nuevos casos diagnosticados en Estados Unidos en 2013 y 50.830 muertes por esta enfermedad. Está ampliamente notificado y aceptado que los genes inflamatorios, tales como la expresión de ciclooxigenasa-2 (COX-2) y su metabolito prostaglandina-E2 (PGE2) juegan un papel clave en la progresión y metástasis del CCR. Existen múltiples niveles de salidas de control para la regulación de la producción de PGE2. El uso de agentes antiinflamatorios mostró efectos protectores en CCR, lo que estimuló el interés en la prevención primaria con el uso de agentes pertenecientes a los antiinflamatorios no esteroideos (AINE) e inhibidores selectivos de la COX-2. Los AINE como la aspirina y los inhibidores selectivos de la COX-2 demostraron efectos protectores convincentes en modelos animales e investigación clínica. Aunque los AINE fueron eficaces para mostrar los efectos preventivos del CCR, se asocian con hemorragia gastrointestinal debido a la inhibición de la ciclooxigenasa-1 (COX-1) junto con la ciclooxigenasa-2 (COX-2). Una gran cantidad de estudios clínicos con diferentes diseños siguieron con resultados similares con AINE e inhibidores selectivos de la COX-2. Los inhibidores selectivos de la COX-2 proporcionaron una mejor eficacia y hasta cierto punto carecieron de toxicidad gastrointestinal. Ha habido varios ensayos controlados con placebo sobre el uso de inhibidores de la COX-2 en la prevención de la recurrencia del adenoma en la poliposis adenomatosa familiar (PAF), un trastorno hereditario caracterizado por cáncer de colon y recto, y pacientes esporádicos con antecedentes previos de adenoma. Uno de los ensayos con el inhibidor selectivo de la COX-2 proporcionó un 30-55 % menos de riesgo de recurrencia del adenoma y se asoció con un mayor riesgo de acontecimientos cardiovasculares (CV). Por lo tanto, los beneficios protectores contra el cáncer de los inhibidores selectivos de la COX-2 parecen ser superados por un aumento en el riesgo de acontecimientos cardiovasculares, debido a trombosis dependiente de plaquetas. La razón de esta toxicidad parece deberse al desequilibrio de las enzimas COX y lipooxigenasa (LOX) debido a la inhibición de la COX-2 que bloquea PGE2 pero también prostaglandina-E2 (PGI2); por otra parte, cambiando el metabolismo de metabolitos de LOX como los leucotrienos (LTs). Tanto los niveles bajos de PGI2 como los niveles altos de LTs son factores de riesgo establecidos de trombosis y riesgo CV.

Se ha identificado que 5 -LOX y su molécula aguas abajo leucotrieno B4 (LTB4) están identificadas en el desarrollo de CCR. Al igual que COX-2 y su PGE2 aguas abajo, 5-LOX y LTB4 están muy elevados en CCR, relacionados con el tamaño y la invasión tumorales. Por tanto, el bloqueo de PGE2 y LTs respetando la PGI2 es un problema importante en el desarrollo de agentes anticancerosos sin efectos secundarios no deseados y riesgo CV. Mecanísticamente, uno de esos controles es a través de la expresión de prostaglandina E sintasas específicas, que utilizan el producto de COX prostaglandina-H₂ PGH₂ para producir PGE2. La prostaglandina E sintasa-1 microsómica (mPGES-1) es, al igual que COX-2, inducida por estímulos proinflamatorios y regulada al alza en tumores colorrectales y principal contribuyente de PGE2. Confirmando esta hipótesis, se notifica que la pérdida de expresión de mPGES-1 suprime la neoplasia intestinal en ratones mutantes para Apc. Por tanto, dirigirse selectivamente a mPGES-1 bloquearía la producción de PGE2 pero respetaría la PGI2 que se requiere para los efectos antitrombóticos para evitar el riesgo cardiovascular (CV). COX-1 y COX-2 son responsables de la producción de las PG, por tanto, la inhibición puede reducir el dolor y la inflamación, sin embargo, esta inhibición también puede provocar un procesamiento alternativo del ácido araquidónico a través de la vía de 5-LOX, lo que da como resultado un aumento de los LT proinflamatorios y gastrotóxicos.

Los estudios mecanicistas moleculares sugieren que dirigirse a mPGES-1 y 5-LOX evitaría la PGI2 y los efectos secundarios cardiovasculares y renales. La licofelona (ácido 2,2-dimetil-6-(4-clorofenil-7-fenil-2,3-dihidro-1H-pirrazolina-5-il]acético), descubierta por Merckle GmbH y desarrollada por EuroAlliance, es un inhibidor de 5-LOX COX-1 y COX-3 competitivo. Disminuye la producción tanto de LT como de PG, reduciendo así la inflamación y el dolor con baja gastrotoxicidad. Por tanto, posee efectos analgésicos, antiinflamatorios y antiasmáticos significativos a dosis que no causan efectos secundarios gastrointestinales (GI). Por tanto, el diseño y desarrollo de fármacos antiinflamatorios que carecen de toxicidad GI, y toxicidad protrombótica y nefrotoxicidad son una necesidad clínica significativa para muchas enfermedades, incluida la prevención y el tratamiento del CCR.

Liu et al., Eur J Med Chem., 2011, 46(3), 907-13 describe una serie de derivados de licofelona sustituidos en C5 que se desarrollaron mediante un enfoque de síntesis paralela y se investigó su citotoxicidad frente a las células MCF-7 y MDA-MB-231, así como su potencia antiinflamatoria. in vitro e in vivo. Liedtke et al., J. Med. Chem., 2009, 52(15), 4968-4972 describe la síntesis y evaluación de inhibidores para la prostaglandina E2 sintasa-1 microsómica (mPGES-1), basándose en el armazón de arilpirrolizina. Zheng Zhi Chao et al., 2011, Chinese Journal of New Drugs, 20(2), 173­ 176 describe la síntesis del fármaco antiinflamatorio no esteroideo ML4000 y la evaluación de su actividad biológica. El documento WO2009056077 describe un método de fabricación de ácido 2-(6-(4-clorofenil)-2,2-dimetil-7-fenil-2,3-dihidro-1H-pirrolizina-5-il)acético (licofelona) a partir de 6-(4-clorofenil)-2,2-dimetil-7-fenil-2,3-dihidro-1H-pirrolizina.

Breve descripción de los dibujos

Varias realizaciones de la presente divulgación se ilustran por la presente en los dibujos adjuntos. Debe tenerse en cuenta, sin embargo, que los dibujos adjuntos solo ilustran varias realizaciones típicas y, por lo tanto, no se pretende que se consideren limitantes del alcance de los conceptos inventivos divulgados en el presente documento.

La figura 1 es un esquema de la síntesis de licofelona-glicina (LFA-9) a partir de licofelona.

La figura 2 es una representación gráfica de (a) el diseño experimental usado en los análisis experimentales descritos en el presente documento, (b) pesos corporales de ratones macho a lo largo del tiempo después del tratamiento con LFA-9, y (c) pesos corporales de ratones hembra a lo largo del tiempo después del tratamiento con LFA-9.

La figura 3 muestra el número total y el tamaño de los tumores de intestino delgado (pólipos) en ratones macho ApcMin/+ (A y B, respectivamente) después del tratamiento con LFA-9.

La figura 4 muestra el número total y el tamaño de los tumores de intestino delgado (pólipos) en ratones hembra ApcMin/+ (A y B, respectivamente) después del tratamiento con LFA-9.

La figura 5 muestra el número total de tumores de colon en ratones macho ApcMin/+ (A) y en ratones hembra ApcMin/+ (B), después del tratamiento con LFA-9.

La figura 6 muestra el efecto inhibidor del tratamiento con LFA-9 sobre la multiplicidad de tumores de colon en ratas F344.

La figura 7 muestra el efecto del tratamiento con LFA-9 sobre la multiplicidad de adenomas en ratas F344.

La figura 8 muestra el efecto del tratamiento con LFA-9 sobre la multiplicidad de adenocarcinomas en ratas F344. La figura 9 muestra el efecto inhibidor del tratamiento con LFA-9 sobre la incidencia de tumores de colon en ratas F344.

La figura 10 muestra el efecto inhibidor del tratamiento con LFA-9 sobre la incidencia de adenomas en ratas F344. La figura 11 muestra el efecto inhibidor de LFA-9 sobre la incidencia de adenocarcinomas en ratas F344.

La figura 12 muestra el efecto inhibidor de LFA-9 sobre citocinas y receptores inflamatorios en tumores de colon. Descripción detallada

Se necesitan nuevos fármacos antiinflamatorios sin efectos secundarios no deseados para el tratamiento de enfermedades inflamatorias crónicas y cánceres epiteliales, tales como los cánceres epiteliales que están asociados con la inflamación crónica. En el presente trabajo, una serie de agentes que se dirigen a mPGES-1 y 5-LOX, con captación renal limitada, fueron diseñados. Entre los diversos agentes sintetizados, la licofelona-glicina (LFA-9) es un análogo de licofelona (un inhibidor dual de COX-LOX), que mostró una alta selectividad para la inhibición de mPGES-1 y 5-LOX. Basándose en experimentos iniciales, se investigó más a fondo los efectos de LFA-9 en modelos en roedores para la inflamación y la tumorigénesis. Se investigó la capacidad de LFA-9 para prevenir la inflamación GI, inhibición de úlceras y tumores del intestino delgado (SI) y colon en ratones ApcMin/+ y cáncer de colon inducido por azoximetano (AOM), como se explica con más detalle a continuación. LFA-9 proporciona prevención y tratamiento de cánceres epiteliales y enfermedades inflamatorias crónicas. Sin desear limitarse a ninguna teoría, se cree que el derivado de licofelona divulgado en el presente documento actúa contra dichos cánceres y enfermedades inflamatorias (1) dirigiéndose e inhibiendo selectivamente tanto mPGES-1 como 5-LOX, (2) inhibiendo ambos macrófagos RAW inducidos por LPS/IL1b, y (3) suprimiendo significativamente la actividad de mPGES-1 y 5-LOX del tumor colónico de una manera dependiente de la dosis.

El alcance de la protección está determinado por las reivindicaciones de acuerdo con el Artículo 69 EPC y el Protocolo sobre la Interpretación del Artículo 69 EPC. La materia objeto que no está dentro del alcance de la protección de la presente patente se divulga con fines de referencia.

Todas las patentes, las solicitudes de patentes publicadas y las publicaciones que no son de patentes mencionadas en la memoria descriptiva son indicativas del nivel de habilidad de los expertos en la materia a la que se refiere la presente divulgación.

A menos que se definan de otro modo en el presente documento, los términos científicos y técnicos usados en relación con la presente divulgación, tendrán los significados habitualmente entendidos por los expertos en la materia. Además, a menos que el contexto requiera lo contrario, los términos en singular incluirán pluralidades y los términos en plural incluirán el singular.

Como se utiliza de acuerdo con las composiciones y su uso de acuerdo con la presente divulgación, los siguientes términos, a menos que se indique lo contrario, se entenderán como que tienen los siguientes significados:

El uso del término "un" o "una" cuando se usa junto con la expresión "que comprende" en las reivindicaciones y/o la memoria descriptiva puede significar "uno/a", pero también es consistente con el significado de "uno o más", "al menos uno", y "uno o más de uno". El uso del término "o" en las reivindicaciones se usa para dar a entender "y/o" a menos que se indique explícitamente para referirse únicamente a alternativas o cuando las alternativas sean mutuamente excluyentes, aunque la divulgación respalda una definición que se refiere únicamente a alternativas y a "y/o". Se entenderá que el uso de la expresión "al menos uno" incluye uno así como cualquier cantidad más de uno, incluyendo aunque sin limitación, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 30, 40, 50, 100 o cualquier número entero inclusive. La expresión "al menos uno" podrá extenderse hasta 100 o 1000 o más, dependiendo del término al que se adjunte; además, las cantidades de 100/1000 no deben considerarse limitantes, ya que límites más altos también pueden producir resultados satisfactorios. Además, el uso de la expresión "al menos uno de X, Y y Z" se entenderá que incluye X solo, Y solo y Z solo, así como cualquier combinación de X, Y y Z.

Como se usan en esta memoria descriptiva y en la(s) reivindicación(es), las palabras "comprendiendo" (y cualquier forma de comprender, tal como "comprenden" y "comprende"), "teniendo" (y cualquier forma de tener, tal como "tienen" y "tiene"), "incluyendo" (y cualquier forma de incluir, tal como "incluye" e "incluyen") o "conteniendo" (y cualquier forma de contener, tal como "contiene" y "contienen") son inclusivas o abiertas y no excluyen elementos o etapas de métodos adicionales que no se hayan mencionado.

La expresión "o combinaciones de los mismos" como se usa en el presente documento se refiere a todas las permutaciones y combinaciones de los artículos enumerados antes de la expresión. Por ejemplo, "A, B, C, o combinaciones de los mismos" se pretende que incluya al menos uno de: A, B, C, AB, AC, BC o ^a B^c , y, si el orden es importante en un contexto concreto, también BA, CA, CB, CBA, BCA, ACB, BAC o CAB. Continuando con este ejemplo, se incluyen expresamente combinaciones que contienen repeticiones de uno o más elementos o términos, tales como BB, AAA, A^a B, BBC, AAABCCCC, C^b B^a AA, CABABB y así sucesivamente. El experto en la materia entenderá que normalmente no hay ningún límite para el número de elementos o términos en ninguna combinación, a menos que resulte evidente de otra forma a partir del contexto.

A lo largo de la presente solicitud, el término "aproximadamente" se usa para indicar que un valor incluye la variación de error inherente para la composición, el método usado para administrar la composición, o la variación que existe entre los sujetos de estudio. Como se usan en el presente documento, los calificativos "alrededor de" o "aproximadamente" tienen la intención de incluir no solo el valor, cantidad, grado, orientación, u otra característica calificada o valor exacto, sino que están destinados a incluir algunas ligeras variaciones debido a errores de medición, tolerancias de fabricación, tensión ejercida sobre diversas partes o componentes, error del observador, uso y desgaste, y sus combinaciones, por ejemplo. El término "alrededor de" o "aproximadamente", como se usa en el presente documento cuando se refiere a un valor medible tal como una cantidad, una duración temporal y similares, pretende abarcar, por ejemplo, variaciones de ± 20 % o ± 10 %, o ± 5 %, o ± 1 %, o ± 0,1 % del valor especificado, ya que tales variaciones son apropiadas para realizar los métodos divulgados y tal como lo entienden los expertos en la materia. Como se usa en el presente documento, el término "sustancialmente" significa que el acontecimiento o circunstancia descrito posteriormente ocurre completamente o que el acontecimiento o circunstancia descrito posteriormente ocurre en gran medida o grado. Por ejemplo, el término "sustancialmente" significa que el acontecimiento o circunstancia descrito posteriormente ocurre al menos el 90 % del tiempo, o al menos el 95 % del tiempo, o al menos el 98 % del tiempo.

Como se usa en el presente documento, cualquier referencia a "una realización" significa que un elemento, rasgo, estructura o característica particular descrito en relación con la realización se incluye en al menos una realización. Las apariciones de la expresión "en una realización" o "en cualquier realización" en diversos lugares en la presente memoria descriptiva no se refieren todas necesariamente a la misma realización.

La expresión "farmacéuticamente aceptable" se refiere a compuestos y composiciones que son adecuados para su administración a seres humanos y/o animales sin efectos secundarios adversos indebidos, tales como toxicidad, irritación y/o respuesta alérgica proporcionales a una relación beneficio/riesgo razonable.

Por "biológicamente activo" se entiende la capacidad de modificar el sistema fisiológico de un organismo sin hacer referencia a cómo el agente activo tiene sus efectos fisiológicos.

Como se usa en el presente documento, "pura", o "sustancialmente pura" significa que una especie objeto es la especie predominante presente (es decir, en una base molar es más abundante que cualquier otra especie objeto en su composición), y particularmente una fracción sustancialmente purificada es una composición en la que la especie objeto comprende al menos aproximadamente el 50 por ciento (sobre una base molar) de todas las especies macromoleculares presentes. En general, una composición sustancialmente pura comprenderá más del 80 % de todas las especies macromoleculares presentes en la composición, más particularmente más de aproximadamente el 85 %, más de aproximadamente el 90 %, más de aproximadamente el 95 % o más de aproximadamente el 99 %. El término "pura" o "sustancialmente pura" también se refiere a preparaciones en las que la especie objetivo (por ejemplo, el compuesto peptídico) es al menos un 60 % (p/p) pura, o al menos un 70 % (p/p) pura, o al menos 75 % (p/p) pura, o al menos un 80 % (p/p) pura, o al menos un 85 % (p/p) pura, o al menos un 90 % (p/p) pura, o al menos un 92 % (p/p) pura, o al menos un 95 % (p/p) pura, o al menos un 96 % (p/p) pura, o al menos un 97 % (p/p) pura, o al menos un 98 % (p/p) pura, o al menos un 99 % (p/p) pura o un 100 % (p/p) pura.

Los términos "sujeto" y "paciente" se usan indistintamente en el presente documento y se entenderá que se refieren a un animal de sangre caliente, particularmente un mamífero, y más particularmente, seres humanos. Los animales que están dentro del alcance del término "sujeto" como se usa en el presente documento incluyen, pero sin limitación, perros, gatos, ratas, ratones, cobayas, chinchillas, caballos, cabras, rumiantes tales como ganado vacuno, ovejas, cerdos, aves de corral tales como pollos, gansos, patos y pavos, animales de zoo, monos del Viejo y Nuevo Mundo y primates no humanos.

"Tratamiento" se refiere a tratamientos terapéuticos. "Prevención" se refiere a medidas de tratamiento profiláctico o preventivo. El término "tratar" se refiere a administrar la composición a un paciente con fines terapéuticos.

Las expresiones "composición terapéutica" y "composición farmacéutica" se refieren a una composición que contiene un agente activo que puede administrarse a un sujeto mediante cualquier método conocido en la técnica o contemplado de otro modo en el presente documento, en donde la administración de la composición provoca un efecto terapéutico como se describe en otra parte en el presente documento. Además, las composiciones de la presente divulgación pueden diseñarse para proporcionar liberación retardada, controlada, prolongada y/o sostenida usando técnicas de formulación que son bien conocidas en la técnica.

La expresión "cantidad eficaz" se refiere a una cantidad de un agente activo (derivado de licofelona) que es suficiente para exhibir un efecto terapéutico detectable sin efectos secundarios adversos excesivos (tales como toxicidad, irritación y respuesta alérgica) acorde con una relación riesgo/beneficio razonable cuando se usa a la manera de los conceptos inventivos. La cantidad eficaz para un paciente dependerá del tipo de paciente, el tamaño y el estado de salud del paciente, la naturaleza y gravedad de la afección a tratar, el método de administración, la duración del tratamiento, la naturaleza de la terapia concurrente (si la hay), las formulaciones específicas empleadas, y similares. Por tanto, no es posible especificar una cantidad eficaz exacta por adelantado. Sin embargo, la cantidad eficaz para una situación dada puede ser determinada por un experto en la materia usando experimentación de rutina basada en la información proporcionada en el presente documento.

En ciertas realizaciones no limitantes, la posología del derivado de licofelona administrado a un sujeto podría estar en un intervalo de 1 |jg por kg de masa corporal del sujeto a 500 mg/kg, o en un intervalo de 100 |jg por kg a 250 mg/kg, o en un intervalo de 1 mg por kg a 100 mg/kg, o en un intervalo de 10 mg de compuesto por kg a 100 mg/kg, o en un intervalo de 25 mg por kg a 75 mg/kg.

La(s) posología(s) puede(n) administrarse, por ejemplo, pero no a modo de limitación, en una sola vez, o administrarse en múltiples ocasiones (por ejemplo, pero no de manera limitativa, de una a cinco veces al día, o una o dos veces por semana), o de forma continua mediante un goteo venoso, dependiendo del efecto terapéutico deseado. Por ejemplo, la composición se puede proporcionar en una infusión IV. La administración de los compuestos usados en la composición farmacéutica se puede llevar a cabo de diversas formas convencionales, tales como, pero sin limitación, por vía oral, por inhalación, por vía rectal, o por inyección cutánea, subcutánea, intraperitoneal, vaginal o intravenosa. Las formulaciones orales pueden formularse de modo que los compuestos pasen a través de una porción del sistema digestivo antes de ser liberados, por ejemplo, puede que no se liberen hasta llegar al intestino delgado o al colon.

Cuando se administra por vía oral una cantidad terapéuticamente eficaz de la composición, puede estar en forma de preparaciones sólidas o líquidas tales como cápsulas, píldoras, comprimidos, pastillas para chupar, comprimidos bucodispersables, polvos, suspensiones, soluciones, elixires o emulsiones. Las formas farmacéuticas unitarias sólidas pueden ser cápsulas del tipo de gelatina ordinaria que contienen, por ejemplo, tensioactivos, lubricantes y cargas inertes tales como lactosa, sacarosa y almidón de maíz, o las formas farmacéuticas pueden ser preparaciones de liberación sostenida. La composición farmacéutica puede contener un portador sólido, tal como una gelatina o un adyuvante. El comprimido, la cápsula y el polvo pueden contener de aproximadamente el 0,05 a aproximadamente el 95 % del compuesto de sustancia activa en peso seco. Cuando se administra en forma líquida, se puede añadir un portador líquido, tal como agua, petróleo, aceites de origen animal o vegetal, tales como aceite de cacahuete, aceite mineral, aceite de soja, aceite de sésamo o aceites sintéticos. La forma líquida de la composición farmacéutica puede contener además solución salina fisiológica, dextrosa u otra solución de sacáridos o glicoles tales como etilenglicol, propilenglicol o polietilenglicol. Cuando se administra en forma líquida, la composición farmacéutica contiene particularmente de aproximadamente el 0,005 a aproximadamente el 95 % en peso de la sustancia activa. Por ejemplo, podría administrarse por vía oral una dosis de aproximadamente 10 mg a aproximadamente 1000 mg una o dos veces al día.

Las composiciones de la presente divulgación se pueden preparar en comprimidos con bases de comprimido convencionales tales como lactosa, sacarosa y almidón de maíz en combinación con aglutinantes, tales como goma arábiga, almidón de maíz o gelatina, agentes disgregantes tales como almidón de patata o ácido algínico, y un lubricante tal como ácido esteárico o estearato de magnesio. Las preparaciones líquidas se preparan disolviendo las composiciones en un disolvente farmacéuticamente aceptable acuoso o no acuoso que también puede contener agentes de suspensión, agentes edulcorantes, agentes aromatizantes y agentes conservantes como se conocen en la técnica.

Para la administración parenteral, por ejemplo, las composiciones se pueden disolver en un portador farmacéutico fisiológicamente aceptable y se pueden administrar como una solución o una suspensión. Los portadores farmacéuticos adecuados ilustrativos son agua, solución salina, soluciones de dextrosa, soluciones de fructosa, etanol, o aceites de origen animal, vegetal o sintético. El portador farmacéutico también puede contener conservantes y tampones como se conocen en la técnica.

Cuando una cantidad eficaz del compuesto o composición se administra por inyección intravenosa, cutánea o subcutánea, el compuesto está particularmente en forma de una solución o suspensión acuosa parenteralmente aceptable, libre de pirógenos. La preparación de dichas soluciones parenteralmente aceptables, que tienen debidamente en cuenta el pH, la isotonicidad, la estabilidad y similares, está dentro de la habilidad de la técnica. Una composición farmacéutica particular para inyección intravenosa, cutánea o subcutánea puede contener, además del agente o agentes activos, un vehículo isotónico, tal como inyección de cloruro de sodio, inyección de Ringer, inyección de dextrosa, inyección de dextrosa y clorito sódico, inyección de Ringer lactato u otro vehículo conocido en la técnica. La(s) composición(es) farmacéutica(s) de la presente divulgación también pueden contener estabilizantes, conservantes, tampones, antioxidantes u otros aditivos conocidos por los expertos en la materia.

Como se ha indicado, cantidades y modos de administración particulares pueden ser determinados por un experto en la materia. Un experto en la materia de preparar formulaciones puede seleccionar fácilmente la forma y el modo de administración apropiados, dependiendo de las características particulares de las composiciones seleccionadas, la infección a tratar, la fase de la infección y otras circunstancias relevantes usando tecnología de formulación conocida en la técnica, descrita, por ejemplo, en Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 21a edición.

Pueden emplearse métodos farmacéuticos adicionales para controlar la duración de la acción de las composiciones. Se pueden lograr preparaciones de semivida aumentada y/o de liberación controlada mediante el uso de polímeros para conjugar, complejar con y/o absorber las sustancias activas descritas en el presente documento. La administración controlada y/o el aumento de la semivida pueden lograrse seleccionando macromoléculas apropiadas (por ejemplo, pero no a modo de limitación, polisacáridos, poliésteres, poliaminoácidos, homopolímeros polivinilpirrolidona, etilenvinilacetato, metilcelulosa o carboximetilcelulosa y acrilamidas tales como N-(2-hidroxipropil)metacrilamida), y la concentración adecuada de macromoléculas, así como los métodos de incorporación, para controlar la liberación. Los compuestos también pueden conjugarse iónica o covalentemente con las macromoléculas descritas anteriormente.

Otro posible método útil para controlar la duración de la acción de los compuestos o composiciones mediante preparaciones de liberación controlada y la semivida es la incorporación de los compuestos en partículas de un material polimérico tal como poliésteres, poliamidas, poliaminoácidos, hidrogeles, poli(ácido láctico), copolímeros de etileno acetato de vinilo, micelas de copolímero de, por ejemplo, polietilenglicol (PEG) y poli(l-aspartamida).

El derivado de acetoamido de licofelona de la presente divulgación está representado por la siguiente estructura (Estructura 1):

en donde el compuesto es licofelona-glicina (LFA-9), en el que X = Cl, Ri=H y R2=CH₂COOH, o R2=H y RFCH₂COOH.

Los ejemplos de enfermedades y afecciones que pueden tratarse con el compuesto de la presente divulgación incluyen, pero sin limitación, enfermedades inflamatorias crónicas, o enfermedades que tienen un componente inflamatorio crónico, tales como, pero sin limitación, ateroesclerosis, diabetes, enfermedades inflamatorias intestinales, artritis, psoriasis, enfermedades autoinmunitarias y enfermedad de Alzheimer. Los ejemplos de enfermedades y afecciones que pueden tratarse con el compuesto de la presente divulgación también incluyen cánceres que están asociados con un componente inflamatorio crónico, tales como, pero sin limitación, cánceres de carcinoma epitelial tales como cánceres colorrectal, pancreático, de pulmón, peritoneal, de vejiga, de mama, de próstata, renal, de hígado, de conducto biliar, testicular, de piel, de estómago, de ovario, de trompas de Falopio y de útero.

Ejemplos

La presente divulgación se analizará ahora en términos de varios aspectos ejemplos específicos, no limitantes. Los ejemplos descritos a continuación, que incluyen realizaciones particulares, servirán para ilustrar la práctica de la presente divulgación, entendiéndose que las particularidades mostradas son únicamente a modo de ejemplo y con fines de análisis ilustrativo de realizaciones particulares, y se presentan con el fin de proporcionar lo que se cree que es un descripción de procedimientos útil y fácilmente comprensible así como de los principios y aspectos conceptuales de la presente divulgación.

Síntesis de licofelona-glicina (LFA-9)

La síntesis de LFA-9 se logró en una estrategia sintética de dos etapas (figura 1). En primer lugar, a una solución de licofelona (28,45 g, 75 mmol) en diclorometano (CH₂Cb) (300 ml) se le añadió N-hidroxisuccinimida (NHS) (9,50 g, 82,5 mmol) en diclorometano (300 ml) y WN-diciclohexilcarbodiimida (DCC) (17,03 g, 82,5 mmol) en diclorometano (100 ml). La mezcla de reacción se agitó a temperatura ambiente (TA) durante una noche. El progreso de la reacción se monitorizó por TLC. Después de que se completara la reacción, W,N-diciclohexilurea (un subproducto) se filtró en un embudo sinterizado y el filtrado se evaporó en un evaporador rotatorio a presión reducida para obtener licofelona-NHS con un rendimiento cuantitativo. Este compuesto se usó inmediatamente para la siguiente etapa sin purificación adicional. En segundo lugar, a una solución de licofelona-NHS (35,79 g, 75 mmol) en W,N-dimetilformamida (DMF) (650 ml) se le añadió glicina (5,63 g, 75 mmol) en Na₂HPO₄0,2 M (100 ml, pH 8,0). La mezcla de reacción se agitó a temperatura ambiente durante una noche. El progreso de la reacción se monitorizó por TLC. Después de que se completara la reacción, los disolventes se evaporaron en un evaporador rotatorio a presión reducida y el producto se extrajo en acetato de etilo (2 x 300 ml). Después, la capa orgánica combinada se lavó con agua (2 x 100 ml) y con salmuera (2 x 100 ml). La capa orgánica se secó sobre sulfato de sodio y los disolventes se evaporaron en un evaporador rotatorio a presión reducida para obtener el LFA-9 en bruto. El compuesto en bruto se purificó en una columna de gel de sílice eluyendo con acetato de etilo para obtener el LFA-9 puro como un sólido blanco (16,50 g, 50,3 %). Como alternativa, el compuesto en bruto se purificó por recristalización usando una mezcla de disolventes de acetato de etilo/hexano (26,40 g, 80,51 %). (Punto de fusión: 106 - 108 °C, 1 *H RMN (300 MHz, CDCl3) 8 (ppm): 1,29 (s, 6H, 2 x CH3), 2,85 (s, 2H, CH₂), 3,55 (s, 2H, CH₂), 3,72 (s, 2H, CH₂), 4,04 (d, Jgem = 5,3 Hz, 2H, NH-CH₂), 7,03-7,29 (m, 9H, Ar-H). 13C RMN (75 MHz, CDCl3) 8 (ppm): 28,0, 33,0, 40,6, 41,2, 43,3, 58,0, 115,0, 117,2, 124,3, 124,8, 2 X 128,0, 128,5, 131,2, 131,9, 134,1, 134,9, 135,5, 171,4, 172,9. ESI-MS: m/z 435 [M-H]-).

ESTUDIOS ANIMALES

Animales: Se obtuvieron ratas Fischer (F344) macho endogámicas libres de patógenos de Harlan Laboratories en las cantidades requeridas. Se realizaron una serie de pruebas para verificar la salud de los animales, y los animales fueron trasladados a la sala experimental solo cuando todas las pruebas certificaron su excelente estado de salud.

Dietas experimentales/Preparación/Control de calidad: La nutrición adecuada y controlada de los animales de laboratorio es esencial para lograr la reproducibilidad de los datos. Se usaron dietas purificadas basadas en la dieta modificada del Instituto Americano de Nutrición (AIN)-76A (modificaciones con Dextrosa y almidón de maíz superior en lugar de sacarosa (caseína, 20 %; almidón de maíz, 52 %; Dextrosa 13 %, aceite de maíz, 5,0 %; Alphacel/celulosa, 5,0 %; DL-metionina, 0,3 %; Mezcla de minerales AIN, 3,5 %; mezcla de vitaminas, AlN, 1,0 %; y bitartrato de colina, 0. 2 %). Todas las dietas experimentales modificadas con AIN-76A se formularon y prepararon en el laboratorio central de formulación de dietas de investigación de barrera para roedores. Todos los ingredientes de la dieta purificada se adquirieron a granel de Bioserv, NJ. Todos los ingredientes de las dietas se mezclaron completamente para que todos los micronutrientes se distribuyeran uniformemente. Para asegurar que LFA-9 se distribuya uniformemente en la dieta, estos agentes se mezclaron previamente con una pequeña cantidad de dieta de control en una batidora, se añadieron a cantidades previamente pesadas de dieta de control en un mezclador Hobart y se mezclaron completamente durante unos 45 minutos. A continuación, se analizaron alícuotas de muestras tomadas de las porciones superior, media e inferior de las dietas para determinar la homogeneidad de los agentes de las dietas experimentales. Se estableció la frecuencia de preparación de dietas experimentales que contienen LFA-9, midiendo la estabilidad de este agente en la dieta cada día durante 7 días. El LFA-9 almacenado en recipientes para alimentos durante siete días mostró una estabilidad >96 %. Basándose en esta información, la frecuencia de preparación de las dietas experimentales fue una vez a la semana, y los vasos de comida se cambiaron 3 veces a la semana. Todas las dietas se almacenaron en recipientes herméticos a 4 °C en una cámara frigorífica.

1. Dosis máxima tolerada (DMT) y ulceración GI: La DMT y los niveles de posología de LFA-9 para inhibir mPGES-1 y 5-LOX se investigaron en el modelo en ratones macho C57B6/J. LFA-9 se administró en la dieta, de 100 ppm a 1.600 ppm, respectivamente, intervalo de dosis para un período de 6 semanas en ratones. Los pesos corporales y los síntomas de toxicidad se registraron dos veces por semana durante 6 semanas. Se comparó LFA-9, con otro inhibidor selectivo de mPGES-1 y 5-LOX (YS-121), como control positivo para las actividades potenciales. Todos los órganos se examinaron macroscópicamente en busca de anomalías en la necropsia. Los hígados, el riñón, el estómago, el tracto intestinal y la sangre se obtuvieron de los animales y se analizaron para el perfil de enzimas hepáticas, ulceración GI y niveles de agentes de prueba.

Ulceración GI y toxicidad de las criptas: La gradación de la ulceración del colon se llevó a cabo usando los siguientes criterios.

Grado 0: Sin ulceraciones ni daños en las mucosas;

Grado 1: Hasta 15 pequeñas ulceraciones mucosas (<1 mm de diámetro), observable solo como ligeras depresiones en la luz reflejada;

Grado 2: Pequeñas ulceraciones de la mucosa y ≤ 10 ulceraciones medianas (1-2 mm de diámetro) sin ulceraciones > 2 mm de diámetro;

Grado 3: Ulceraciones pequeñas y medianas ≤ 3 mm y < 4 mm de diámetro sin adherencias intestinales;

Grado 4: Predominantemente ulceraciones medianas y grandes (>4 en total) con ulceraciones grandes que muestran signos de perforaciones y adherencias que dificultan la extirpación del intestino intacto; Grado 5: La necropsia de animales muertos o sacrificados revela evidencia de peritonitis masiva resultante de perforaciones intestinales. Todos los animales encontrados muertos serán sometidos a necropsia para confirmar que la causa más probable de muerte se debió a ulceraciones intestinales.

Resultados: Las ratas a las que se les administró LFA-9 en la dieta hasta 800 ppm no exhibieron toxicidad y ganaron pesos corporales similares a los ratones alimentados con la dieta de control. Sin embargo, la administración de LFA-9 en la dieta a 1.600 ppm condujo a un retraso significativo del peso corporal en comparación con los ratones alimentados con dieta de control. En ratones alimentados con 1600 ppm de LFA-9 durante seis semanas, se observó una pérdida de peso corporal de ~30 % (P<0,001) en comparación con el aumento de peso corporal de los ratones alimentados con dieta de control. Además, los ratones a los que se les administró 1.600 ppm de LFA-9 mostraron un retraso en el crecimiento del peso corporal y 3 animales murieron al final de la exposición de seis semanas. Además, se observó ulceración estomacal notable (Grados 2 a 3) y ulceración colónica (Grado 1 a 2) a nivel microscópico en ratones alimentados con 1.600 ppm de LFA-9; y se percibió un aumento de los niveles de enzimas hepáticas en suero. La patología macroscópica sugiere que los ratones expuestos a 1.600 ppm de LFA-9 muestran una toxicidad hepática modesta (tabla 1). Como se muestra en la tabla 1, YS-121 tuvo una toxicidad significativa a niveles de dosis de 75 ppm y superiores. En conjunto, el peso corporal y las observaciones histológicas macroscópicas sugieren que 800 ppm de LFA-9 administradas en la dieta no inducen ninguna pérdida de peso corporal ni síntomas histológicos macroscópicos de toxicidad en ratones C57BL/6.

Tabla 1. Efecto de LFA-9 e YS-121 sobre la ulceración gastrointestinal (GI) y los niveles de enzimas hepáticas unidad/l Media+ETM de ratones macho C57.

*Significativamente diferente del suero de ratones alimentados con dieta de control en los niveles de enzimas hepáticas II. Efecto inhibidor ex vivo de LFA-9 sobre mPGES-1 y 5-LOX usando y 14C-AA, respectivamente como sustratos: Se utilizaron tumores colónicos de rata inducidas por AOM alimentadas con dieta de control para evaluar el efecto inhibidor de LFA-9 sobre mPGES-1 y 5-LOX. Se utilizaron cinco concentraciones diferentes de LFA-9 para evaluar las actividades inhibidoras de enzimas. Resumiendo, los adenocarcinomas (AC) tubulares colónicos se homogeneizaron en tampón Tris-HCl 100 mM. Las muestras homogeneizadas (100 mg de proteína) se incubaron con una mezcla de reacción que contenía LFA-9 de 0 a 20 uM con 14C-PGH₂ (12 |jmol=~500.000 CPM) para ensayo de mPGES-1 o 0-20 uM junto con 14C-AA (12 uM, ~600.000 CPM) para ensayos de 5-LOX y COX-2. La mezcla de reacción se incubó durante 20 minutos y 14C-PGE2, 5-14C-HETE y otros metabolitos de 14-C se extrajeron y analizaron mediante Radio-HPLC de acuerdo con el trabajo publicado anteriormente.

Resultados: Se observó una inhibición dependiente de la dosis de mPGES-1 y 5-LOX en comparación con el control. Una concentración promedio de 7,5 μM de LFA-9 inhibe las actividades de mPGES-1 y 5-LOx en ~57 % y ~68 %, respectivamente, con una inhibición mínima de COX-1/COX-2 (tabla 2).

Tabla 2. Efecto de LFA-9 e YS-121 sobre los niveles de enzimas mPGES-1, 5-LOX y COX-2 en tumores colónicos inducidos por AOM mediante el método Ex-Vivo; y efecto sobre las enzimas metabolizadoras de AA de la mucosa l ni in i r A M D l infl m i n n r F 44 m h .

* Porcentaje de inhibición de 14C-PGE2 de 14C-PGH₂ en comparación con homogeneizados de tumores de colon no tratados.

** Porcentaje de inhibición de 5-14C-HETE de 14C-AA en comparación con homogeneizados de tumores de colon no tratados.

*** Porcentaje de inhibición de 14C-PG y TX distintos de 14C-AA en comparación con homogeneizados de tumores de colon no tratados; ND, no determinado.

III. Inhibición de la inflamación inducida por AOM más DSS por LFA-9: Ratas F344 macho de 8 semanas de edad tratadas con AOM (15 mg/kg de peso corporal) y expuestas a DSS al 2 % durante tres días. Seguido de este tratamiento, las ratas fueron alimentadas con diferentes dosis dietéticas de LFA-9 (100 - 800 ppm) durante dos semanas, antes de que las muestras de la mucosa del colon fueran analizadas para las actividades de mPGES-1, 5-LOX y COX-2. Los resultados se resumen en la tabla 2 anterior. Además, la inflamación se puntuó siguiendo los siguientes criterios:

Puntuación de inflamación basada en observaciones histológicas usando la clasificación de Sydney modificada para la inflamación del colon:

Se han aplicado los siguientes criterios de puntuación:

i. Puntuación 0: Sin inflamación ni cambios en la morfología de las criptas colónicas

ii. Puntuación 1: Presencia de infiltración de neutrófilos e inflamación linfocítica crónica.

iii. Puntuación 2: Daño epitelial superficial, atrofia leve, folículos linfoides

iv. Puntuación 3: Atrofia severa y metaplasia intestinal.

Resultados: Las ratas alimentadas con dieta de control tratadas con AOM/DSS mostraron predominantemente una inflamación de puntuación 2, y menos ratas tenían una puntuación inflamatoria de 3. Todas las ratas alimentadas con LFA-9 tenían una puntuación de inflamación de 1 (dosis más bajas a más altas) o ninguna inflamación. Por tanto, LFA-9 a >100 ppm bloqueó completamente la inflamación.

IV. Efecto de LFA-9 sobre la formación de focos de criptas aberrantes (ACF) colónicos inducida por AOM/DSS:

La tabla 3 resume el efecto de LFA-9 sobre la inhibición de la formación de ACF en el colon. Los ACF se forman antes que los pólipos colorrectales y son un indicador del potencial de cáncer. Ambos agentes suprimieron los ACF colónicos inducidos por AOM de forma dependiente de la dosis. El LFA-9 dietético a 600 ppm inhibió los ACF totales colónicos inducidos por AOM y las AC de múltiples criptas en >60 %.

Considerados en conjunto, los resultados anteriores indican que LFA-9 hasta un nivel de 800 ppm no indujo toxicidad significativa en ratas F344 macho. Por consiguiente, los ensayos de eficacia en tumores de colon inducidos por AOM en rata se realizaron a 800 ppm como la dosis más alta.

Tabla 3. Determinación de los efectos de respuesta a la dosis de LFA-9 sobre ACF colónicos inducidos por DSS en ratas F344 macho.

V. Determinación de los efectos de la eficacia farmacodinámica en tumores inducida por LFA-9 en modelos de cáncer colorrectal.

(A) Eficacia de LFA-9 en el modelo de poliposis adenomatosa familiar (PAF) de ratones.

Cría y genotipado de ratones APC Min/+: Todos los experimentos con animales se realizaron de acuerdo con las pautas institucionales del Consejo Estadounidense de Cuidado Animal y fueron aprobados por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales (IACUC) en el Centro de Ciencias de la Salud de la Universidad de Oklahoma (OUHSC). Ratones APCMin/+ macho (C57BL/6J) y de tipo silvestre hembra compañeros de camada se adquirieron inicialmente en The Jackson Laboratory (Bar Harbor, ME) como fundadores, y nuestra propia colonia de cría se estableció en las instalaciones de barrera para roedores de OUHSC y se genotipó de acuerdo con las instrucciones del proveedor. Todos los ratones se alojaron 3 por jaula en jaulas ventiladas en condiciones estandarizadas (21 °C, humedad relativa 60 %, ciclo de 12 h luz/12 h oscuridad, 20 cambios de aire/h). A todos los ratones se les permitió acceso ad libitum a las respectivas dietas y agua de grifo automatizada purificada por ósmosis inversa.

Dietas: Todos los ingredientes de dieta para las dietas semipurificadas se adquirieron de Bioserve (Frenchtown, NJ) y se almacenaron a 4 °C antes de la preparación de la dieta. Las dietas se basaron en la dieta Instituto Americano de Nutrición (AIN)-76A modificada. LFA-9 se mezcló previamente con una pequeña cantidad de dieta y a continuación se mezcló con la dieta a granel usando un mezclador Hobart. Tanto las dietas de control como las experimentales se prepararon semanalmente y se almacenaron en una cámara frigorífica. El contenido de agente en las dietas experimentales se determinó periódicamente en múltiples muestras tomadas de las porciones superior, media e inferior de las preparaciones dietéticas individuales para verificar la distribución uniforme. En este estudio, se usaron 0 ppm, 350 ppm, 700 ppm de LFA9 en las dietas de control.

Estudios de tumorigénesis intestinal en ratones APC Min/+: Se usaron ratones APCMin/+ macho y hembra genotipados en el estudio de eficacia. El protocolo experimental se resume en la figura 2A. Se distribuyeron ratones de cinco semanas de edad de modo que los pesos corporales promedio en cada grupo fueran iguales (10/9 ratones APCMin/+ en cada grupo) y fueron alimentados con dieta AIN-76A durante una semana. A las 6 semanas de edad, los ratones fueron alimentados con dietas de control o experimentales que contenían 0 ppm, 350 ppm o 700 ppm de LFA9 en la dieta hasta la finalización del estudio. El peso corporal, el consumo de alimentos y líquidos se monitorizaron semanalmente en busca de signos de pérdida de peso o letargo que pudieran indicar obstrucción intestinal o anemia. Los ratones se revisaron de forma rutinaria para detectar cualquier anomalía. Después de 12 semanas, todos los ratones fueron sacrificados por asfixia con CO2, la sangre se recogió inmediatamente mediante punción cardíaca, y el suero se separó por centrifugación y se almacenó a -80 °C hasta su posterior análisis. Este punto en el tiempo fue elegido para minimizar el riesgo de mortalidad intercurrente causada por anemia progresiva severa, prolapso rectal u obstrucción intestinal, lo que generalmente ocurre entre los ratones Min a >20 semanas de edad. Después de la necropsia, se recogió todo el tracto intestinal, se lavó con NaCl al 0,9 % y se abrió longitudinalmente desde el esófago hasta el recto distal. El tejido se aplanó sobre papel de filtro para exponer los tumores y se congeló brevemente en hielo seco para ayudar a la puntuación visual de los tumores. El número, la ubicación y el tamaño de los tumores visibles en todo el intestino se determinaron bajo un microscopio de disección (X5). Todos los tumores fueron puntuados y subdivididos por ubicación (duodenal, yeyunal e íleon y colon) y tamaño (>2 mm, 1-2 o <1 mm de diámetro). Este procedimiento fue completado por dos personas que desconocían el grupo experimental y el estado genético de los ratones. Tumores colónicos y otros tumores del intestino delgado que requirieron una evaluación histopatológica adicional para identificar adenoma, adenocarcinoma y ganglios linfáticos agrandados se fijaron en formalina tamponada neutra al 10 %, se embebieron en bloques de parafina y se procesaron mediante tinción H&E de rutina. Además, se recogieron múltiples muestras de tumores del intestino delgado y se almacenaron en nitrógeno líquido para el análisis de las actividades y los niveles de expresión de los marcadores moleculares.

Análisis estadísticos: Todos los resultados se expresan como media ± ET y se analizaron mediante la prueba de la t de Student. Las diferencias se consideraron significativas al nivel de P < 0,05. Todos los análisis estadísticos se realizaron con GraphPad Prism Software 5.1 (GraphPad Software, Inc, San Diego, CA).

Monitorización de la salud de los ratones: Los pesos corporales de los ratones APCMin/+ que consumieron LFA-9 en sus dietas fueron, en general, mayores aumentos de peso y los ratones estaban menos anémicos que los alimentados con una dieta de control. Se observaron diferencias estadísticamente significativas (P > 0,05) en los pesos corporales entre los grupos dietéticos (figuras 2B y C). Los ratones APCMin/+ desarrollan espontáneamente tumores intestinales, principalmente en el intestino delgado con menos tumores en el colon. Como era de esperar, ratones APCMin/+ de control comenzaron a perder peso corporal a ~14 semanas de edad, debido a obstrucción intestinal y anemia progresiva. En ratones de tipo silvestre, la administración de LFA9 no produjo ningún cambio importante atribuible a la toxicidad en el hígado, los riñones o los pulmones y tampoco tuvo ningún efecto sobre el aumento de peso corporal.

(B) Resultados de eficacia de ratones APC Min/+ alimentados con 350 y 700 ppm de LFA-9: LFA-9 previene el desarrollo de pólipos en ratones Apc transgénicos mutantes. Para estos experimentos, se examinaron los tumores de colon y pólipos de diferente tamaño y número en diferentes regiones del intestino delgado en estos ratones. Ratones APCMin/+ macho y hembra alimentados con la dieta de control desarrollaron un promedio de 55,7±3,83 y 59,2±5,98 pólipos intestinales, respectivamente (figura 3A, figura 4A). La administración de LFA9 a 350 y 700 ppm durante 14 semanas redujo significativamente la multiplicidad total de tumores intestinales y el tamaño de forma dependiente de la dosis en ratones machos y hembras (medias ± ETM de tumores para 350 y 700 ppm; 31,6 ± 5,99 y 24,3 ± 3,7, respectivamente, en ratones macho; y 26,2 5,68 y 15,5±1,79, respectivamente, en ratones hembra; figura 3A, figura 4A). La dosis alta de LFA9 mostró aproximadamente un 56 % (P < 0,0001) y un 73,8 % de inhibición de tumores intestinales en ratones macho y hembra, respectivamente. De manera interesante, el número de pólipos de gran tamaño (>2 mm) se redujo drásticamente con los tratamientos con LFA9 (figura 3B, figura 4B). Los ratones alimentados con 350 ppm de LFA9 tenían un 76,8 % (macho) y un 81,6 % (hembra) menos pólipos con tamaños superiores a 2 mm. Los ratones alimentados con 700 ppm de LFA9 mostraron más del 81 % de supresión de pólipos de más de 2 mm de tamaño en ambos sexos en comparación con los ratones de control (figura 3B, figura 4B). El número medio de tumores de colon en ratones macho y hembra fue de 1,11 y 1,0, respectivamente, en ratones de control alimentados con dieta; mientras que los ratones alimentados con 350 ppm de LFA9 mostraron una inhibición de tumores de colon del 60 % (macho) y del 90 % (hembra), respectivamente. Cabe destacar que tanto los ratones macho como hembra alimentados con 700 ppm de LFA9 mostraron una inhibición del 91 % de los tumores de colon (figura 5A, B). Ratones hembra tratados con LFA9 (350 y 700 ppm; 9/10 por grupo de tratamiento) tuvo una reducción del 90 % en los tumores colónicos (1,22-0,1 tumores por ratón, P<0,003) en comparación con los ratones de control no tratados (figura 5B).

(C) I. Eficacia de LFA-9 en la formación de adenocarcinoma (AC) de colon de rata inducido por AOM

Estudios de eficacia en tumores por AOM en ratas: Se ha evaluado LFA-9 a dosis de 200, 400 y 800 ppm mediante la administración en fase tardía de ACHtemprana de adenomas de la carcinogénesis de colon inducida por AOM, es decir, 7 semanas después del tratamiento carcinógeno. En el transcurso del bioensayo, se evaluó el efecto de las dosis de LFA-9 sobre el aumento de peso corporal. La administración crónica de LFA-9 hasta 800 ppm en la dieta no mostró ningún retraso significativo en el peso corporal ni ninguna toxicidad observable.

Después de 42 semanas de alimentación con dieta experimental y un total de 52 semanas de duración experimental, se realizó la necropsia de las ratas. Después de la necropsia de las ratas, los tumores colónicos se analizaron histológicamente. La evaluación histopatológica del tumor colónico ha sido realizada por dos patólogos de forma independiente. Los tumores colónicos se clasificaron histopatológicamente en adenomas o adenocarcinomas ya sea exofíticos (no invasivos) o endofíticos (invasivos). Sobre la base de las observaciones histológicas macroscópicas, LFA-9 suprimió significativamente los tumores colónicos inducidos por AOM. Las incidencias de tumores de colon (% de ratas con tumores colónicos) se resumen en la tabla 2 y la multiplicidad de tumores (media de tumores colónicos/rata) en la tabla 5. Sobre la base de la histopatología, se observó que aproximadamente el 34 % de los tumores colónicos eran adenomas y el 66 % restante eran adenocarcinomas, la mayoría (69 %) no invasivos y menos (31 %) invasivos. Como se muestra en las tablas 4 y 5, la administración de LFA-9 en la dieta suprimió tanto la incidencia (53 a 48 %) como la multiplicidad (38 a 47 %) de adenomas colónicos. Por otra parte, el LFA-9 dietético mostró la supresión de la incidencia y la multiplicidad de la inhibición del adenocarcinoma invasivo y no invasivo (>63 % a 92 %). En conjunto, el inhibidor de mPGES-1 LFA-9 suprimió significativamente la progresión de adenomas tempranos a la formación de adenocarcinoma de manera extensa.

(C) II. Efecto inhibidor de LFA-9 sobre la incidencia de adenoma de colon y adenocarcinoma inducido por azoximetano en ratas F344 macho

Ensayo biológico: Los tumores colónicos (TC) fueron inducidos por un carcinógeno específico de colon, azoximetano (AOM) (15 mg/kg en peso, una vez por semana durante 2 semanas) en ratas F344 a las 8 semanas de edad. Las ratas se mantuvieron con una dieta AIN-76A o una dieta AIN-76A que contenía 200 ppm, 400 ppm u 800 ppm de LFA-9 durante 32 semanas. Las ratas se sacrificaron por asfixia con CO₂36 semanas después del segundo AOM y se extirparon los dos cólones, se enjuagaron en PBS, se abrieron longitudinalmente y se aplanaron sobre un papel de filtro. Se anotaron la ubicación y el tamaño de cada tumor. Se eliminaron los tumores, se congelaron instantáneamente o se fijaron en formalina tamponada al 10 % durante 24 horas y se transfirieron a etanol al 80 % para el análisis histopatológico. El número y el tipo de tumores de colon (adenoma y adenocarcinoma) se analizaron histológicamente con enmascaramiento de los grupos de tratamiento y se compararon con tumores colónicos de ratas alimentadas con dieta de control.

Resultados: Se evaluaron los efectos de la administración dietética de LFA-9 sobre la tumorigénesis de colon inducida por azoximetano. El tratamiento con LFA-9, a todas las dosis, disminuyó significativamente la multiplicidad total de tumores de colon: a 200 ppm al 64 %, a 400 ppm al 69,1 % y a 800 ppm al 71,1 %, p < 0,0001 (figura 6). Los tumores colónicos se dividieron histopatológicamente en adenomas (no malignos) y adenocarcinomas (malignos). Se observó una reducción significativa en la multiplicidad de adenomas con todas las dosis de LFA-9 probadas: 200 ppm, 38,3 %, (0,50 ± 0,07, P < 0,015); 400 ppm, 46,9 %, (0,43 ± 0,06, P < 0,0033) y dosis alta 800 ppm, 42 %, (0,47 ± 0,06, P < 0,0072), como se muestra en la figura 7, en comparación con el grupo de dieta de control. Es importante destacar que, LFA-9 causó una reducción significativa en la multiplicidad de adenocarcinoma a 200 ppm a una inhibición del 77 % (0,37 ± 0,07, P< 0,0001), a 400 ppm a una inhibición del 81,3 % (0,30 ± 0,07, p < 0,0001) y a 800 ppm a una inhibición del 85,7 % (0,23 ± 0,05, p < 0,0001) en comparación con adenocarcinomas colónicos de ratas alimentadas con dieta de control (figura 8). LFA-9 mostró un efecto significativo sobre la incidencia (porcentaje de ratas con tumores colónicos) de tumores de colon en comparación con ratas alimentadas con dieta de control en un 47,5 % a 200 ppm, 55,5 % a 400 ppm y 47,5 % a 800 ppm (figura 9). De forma similar, LFA-9 a 200 ppm, 400 ppm y 800 ppm causó una reducción significativa en la incidencia de adenoma de colon (53 %, 53 % y 58,2 %; figura 10). Es importante destacar que, LFA-9 demostró ser mucho más protector al inhibir la incidencia de adenocarcinoma de colon inducido por AOM (60 %, 67,9 % y 76 %; figura 11) en comparación con la incidencia de adenocarcinoma de colon de ratas del grupo de dieta de control. Cabe destacar que incluso dosis bajas de LFA-9 mostraron un efecto significativo sobre la incidencia de adenoma y adenocarcinomas. En conjunto, LFA-9 causó una reducción significativa en la incidencia y multiplicidad de tumores de colon en comparación con el grupo de dieta de control.

(D) Efecto de los inhibidores de mPGES-1 sobre la incidencia de tumores de colon inducidos por AOM: Como se muestra en la tabla 4, la incidencia tumoral se presentó en forma de adenoma, adenocarcinoma de adenocarcinomas no invasivos o invasivos o totales e incidencia de tumores colorrectales totales. Las ratas expuestas al tratamiento con AOM mostraron un 64 % de ratas con adenomas (principalmente tubulares y muy pocos vellosos) y un 83 % de ratas con adenocarcinomas con la mayoría de tipo no invasivo en el momento de la terminación. Además, la histopatología de los tumores sugiere que aproximadamente el 44 % de las ratas presentaban adenocarcinomas colónicos altamente invasivos en ratas tratadas con carcinógeno y alimentadas con dieta de control. La administración de LFA-9 en la dieta suprimió significativamente la incidencia de adenomas colónicos (53 a 58 %). Por otra parte, el LFA-9 dietético mostró la supresión de la incidencia de la inhibición del adenocarcinoma invasivo y no invasivo (63 % a 92 %). En conjunto, ambos inhibidores de mPGES-1 suprimieron significativamente la incidencia de tumores de colon al inhibir y retrasar la progresión de adenomas tempranos a la formación de adenocarcinoma de manera extensa.

(E) Efecto de los inhibidores de mPGES-1 sobre la multiplicidad de tumores de colon inducidos por AOM: La tabla 5 muestra las multiplicidades de tumores de colon (tumores colónicos medios por rata) inducidas con un carcinógeno de colon en ratas alimentadas con dieta de control o inhibidores de mPGES-1. Las multiplicidades tumorales se presentaron en forma de adenoma, adenocarcinoma de adenocarcinomas no invasivos o invasivos o totales y con multiplicidades de tumores colorrectales en conjunto. Las ratas alimentadas con la dieta de control tenían 1,11 ± 0,15 adenocarcinomas no invasivos y 0,50 ± 0,08 invasivos. La administración de LFA-9 en la dieta suprimió significativamente la multiplicidad de adenomas colónicos (38 a 47 %). Además, el LFA-9 dietético mostró supresión de la multiplicidad de adenocarcinoma invasivo y no invasivo (77 % a 94 %). En conjunto, el inhibidor de mPGES-1 LFA-9 suprimió significativamente las multiplicidades de tumores de colon al inhibir y retrasar la progresión de adenomas tempranos a la formación de adenocarcinoma de manera extensa.

(F) Efectos antiinflamatorios de LFA-9 en tumores colónicos de rata inducidos por AOM

Ensayo biológico: Los tumores colónicos (TC) fueron inducidos por el carcinógeno específico de colon Azoximetano (15 mg/kg en peso, una vez por semana durante 2 semanas) en ratas F344 a las 8 semanas de edad. Las ratas fueron alimentadas con diferentes dosis de LFA-9 durante 32 semanas. Las ratas se sacrificaron 36 semanas después del segundo AOM y se analizaron en busca de citocinas y receptores inflamatorios y se compararon con tumores colónicos de ratas alimentadas con dieta de control.

Análisis por PCR en tiempo real de citocinas y receptores inflamatorios: Los tumores de colon de ratas alimentadas con dieta de control y animales tratados con LFA-9 (800 ppm) se analizaron usando una matriz de PCR con citocinas inflamatorias, receptores y genes implicados en las respuestas inflamatorias, de Qiagen. LFA-9 alteró significativamente los genes tras el tratamiento en comparación con los tumores de colon de control (figura 12). Los resultados indican que una cantidad de citocinas inflamatorias y sus receptores disminuyeron significativamente y también varios genes implicados en la migración de Treg, Se redujeron la EMT y las metástasis. Por lo tanto, LFA-9 posee propiedades antiinflamatorias y disminuyó Ccl11, IL11, Tnfrsf11b, IL15, Tnfsf13, Bmp2, Vegfa, Ccl6, Csf1, Fas1g, Cx3cl1, Ccr10, IL6, ILlr1, Tnfsf10, IL10ra, Ccl20, IL16, IL7, Cxcr1, Tnfsf13b, Pf4, Ccl19, Cxcl1, Aimp1, Csf3, IL4, IL33 en tumores de colon tratados.

Análisis

Dosis tóxica mínima: La LFA-9 dietética administrada a ratones hasta 800 ppm en la dieta no induce ninguna toxicidad y aumentos de peso corporal similares a los ratones alimentados con dieta de control. Sin embargo, la administración dietética de LFA-9 a 1.600 ppm causó un retraso significativo en el peso corporal con ulceración notable en el estómago y el colon, con un aumento en las enzimas hepáticas y también murieron 3 animales en comparación con los ratones alimentados con dieta de control. En conjunto, el peso corporal y las observaciones histológicas macroscópicas sugieren que 800 ppm de LFA-9 administradas en la dieta no inducen ninguna pérdida de peso corporal ni síntomas histológicos macroscópicos de toxicidad en ratones C57BL/6. Las dosis de ^l FA-9 de hasta 800 ppm probadas no mostraron ulceración y demostraron tener una función antiinflamatoria según los resultados de la puntuación de ulceración e inflamación.

Estudios de ACF en el modelo de AOM-DSS en rata: El tratamiento con AOM-DSS indujo significativamente la inflamación del colon y la formación de ACF. El tratamiento con LFA-9 a >100 ppm suprimió significativamente la infiltración de células inflamatorias en la mucosa y submucosa del colon. LFA-9 (dosis de 200, 400 y 600 ppm) suprimió tanto ACF colónicos totales como los AC de múltiples criptas de una manera dependiente de la dosis.

Estudio en ratón Apc Min: Los resultados indican que LFA-9 posee propiedades quimiopreventivas eficaces en ratones APCMin/+ sin evidencia de toxicidad. LFA-9 mostró una inhibición dependiente de la dosis de la incidencia y el tamaño de los pólipos del intestino delgado en ratones APCMin/+ de ambos sexos. Los tumores de colon se redujeron significativamente en ratones APCMin/+ tanto hembra como macho por ambas dosis de LFA9. Se observó que las dosis usadas en este estudio no eran tóxicas según la observación general de los órganos y el aumento de peso corporal de los ratones experimentales.

Tumores de colon inducidos por AOM en ratas: Los resultados del estudio de eficacia a largo plazo indican que LFA-9 inhibe eficazmente los tumores de colon inducidos por AOM en ratas. Se observó que las dosis probadas en este estudio no eran tóxicas sin ninguna pérdida de peso corporal y carecían de toxicidad orgánica en ratas experimentales. LFA-9 mostró inhibición dependiente de la dosis de adenocarcinomas de colon. Mostró una inhibición significativa de las multiplicidades de adenocarcinoma de colon invasivo y no invasivo.

En conjunto, estos estudios indican que LFA-9 suprimió significativamente la inflamación, las actividades enzimáticas de mPGES-1, 5-LOX, los tumores intestinales en ratones Apc min, los ACF en el modelo de AOM-DSS en rata y la incidencia y multiplicidad de tumores de colon inducidos por AOM en el modelo en rata al inhibir y retrasar la progresión de los adenomas tempranos a la formación de adenocarcinoma significativamente en comparación con los animales de control no tratados.

Derivados de licofelona

La presente descripción incluye un compuesto que tiene la fórmula estructural (estructura 1):

en donde el derivado de licofelona es LFA-9 (es decir, licofelona-glicina), en donde X=Cl, uno de Ri y R2=H, y uno de Ri y R2=CH₂COOH.

El compuesto se puede disponer en un portador, diluyente o vehículo farmacéuticamente aceptable para formar una composición. El compuesto o la(s) composición(es) que contiene(n) el compuesto se puede usar en un método para tratar una enfermedad o afección relacionada con la inflamación en un sujeto que necesita dicha terapia, por ejemplo, en donde la enfermedad o afección relacionada con la inflamación es aterosclerosis, diabetes, enfermedades inflamatorias intestinales, artritis, psoriasis, enfermedades autoinmunitarias, enfermedad de Alzheimer, o un cáncer asociado con un componente inflamatorio crónico, en donde el método comprende administrar al sujeto una cantidad terapéuticamente eficaz del compuesto o la composición. Los ejemplos de cánceres asociados con un componente inflamatorio crónico incluyen cánceres de carcinoma epitelial tales como cánceres colorrectal, pancreático, de pulmón, peritoneal, de vejiga, de mama, de próstata, renal, de hígado, de conducto biliar, testicular, de piel, de estómago, de ovario, de trompas de Falopio y de útero.

Claims (8)

REIVINDICACIONES

1. Un compuesto que comprende la fórmula estructural:

en donde

X=Cl;

uno de R1 y R2=H, y uno de R1 y R2=CH₂COOH.

2. Una composición farmacéutica, que comprende el compuesto de la reivindicación 1 y un portador, diluyente o vehículo farmacéuticamente aceptable.

3. Un compuesto como se define en la reivindicación 1, para su uso en un método de tratamiento de un sujeto humano o animal mediante terapia.

4. Un compuesto como se define en la reivindicación 1, para su uso en el tratamiento de una enfermedad o afección relacionada con la inflamación en un sujeto humano o animal.

5. Un compuesto para su uso de acuerdo con la reivindicación 4, en donde la enfermedad o afección relacionada con la inflamación se selecciona de aterosclerosis, diabetes, enfermedades inflamatorias intestinales, artritis, psoriasis, enfermedades autoinmunitarias, enfermedad de Alzheimer y un cáncer asociado con un componente inflamatorio crónico.

6. Un compuesto para su uso de acuerdo con la reivindicación 5, en donde el cáncer asociado con un componente inflamatorio crónico es un cáncer de carcinoma epitelial.

7. Un compuesto para su uso de acuerdo con la reivindicación 6, en donde el cáncer de carcinoma epitelial se selecciona de cánceres colorrectal, pancreático, de pulmón, peritoneal, de vejiga, de mama, de próstata, renal, de hígado, de conducto biliar, testicular, de piel, de estómago, de ovario, de trompas de Falopio y de útero.

8. Un compuesto para su uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 3-7, en donde el compuesto es un componente de una composición que comprende un portador, diluyente o vehículo farmacéuticamente aceptable.