ES2951648T3

ES2951648T3 - Inmunoglobulinas de unión a Tgfbeta1 y uso de las mismas

Info

Publication number: ES2951648T3
Application number: ES17716332T
Authority: ES
Inventors: Thomas Schurpf; Gregory J Carven; Abhishek Datta; Kimberly Long
Original assignee: Scholar Rock Inc
Current assignee: Scholar Rock Inc
Priority date: 2016-03-11
Filing date: 2017-03-10
Publication date: 2023-10-24
Anticipated expiration: 2037-03-10
Also published as: CA3055555A1; FI3365368T3; MX2018010948A; KR20230088508A; US20230348583A1; US20190071493A1; EP3365368B1; EP3365368A1; JP2022028680A; KR20250011248A; US11643459B2; IL261442A; PL3365368T3; WO2017156500A1; JP2023108057A; AU2024202692A1; JP2022031403A; IL307835A; DK3365368T3; KR20180122397A

Abstract

En el presente documento se describen inmunoglobulinas, tales como anticuerpos, y porciones de unión a antígeno de las mismas, que se unen específicamente a complejos de GARP-TGFβ1, LTBP1-TGFβ1, LTBP3-TGFβ1 y/o LRRC33-TGFβ1. La solicitud también proporciona métodos de uso de estas inmunoglobulinas para, por ejemplo, inhibir la actividad del TGFβ1 y tratar sujetos que padecen trastornos relacionados con el TGFβ1, tales como cáncer y fibrosis. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

DESCRIPCIÓN

Inmunoglobulinas de unión a Tgfbeta1 y uso de las mismas

CAMPO

[0001] La superfamilia del factor de crecimiento transformante β (TGFβ) de factores de crecimiento están implicados en una serie de cascadas de señalización que regulan diversos procesos biológicos que incluyen, entre otros: la inhibición del crecimiento celular, la homeostasis tisular, la remodelación de la matriz extracelular (ECM), la transición endotelial a mesenquimal (EMT), la migración e invasión celular y la modulación/supresión inmunitaria, así como la transición mesenquimal a epitelial. En relación con la remodelación de la ECM, la señalización de TGFβ puede aumentar las poblaciones de fibroblastos y la deposición de ECM (por ej., colágeno). En el sistema inmunitario, el ligando TGFβ modula la función de las células reguladoras T y el mantenimiento del crecimiento y la homeostasis de las células precursoras inmunitarias. En las células epiteliales normales, el TGFβ es un potente inhibidor del crecimiento y promotor de la diferenciación celular. Sin embargo, a medida que los tumores se desarrollan y progresan, con frecuencia pierden su respuesta negativa de crecimiento al TGFβ. En este escenario, el TGFβ puede convertirse en un promotor del desarrollo tumoral debido a su capacidad para estimular la angiogénesis, alterar el entorno estromal e inducir inmunosupresión local y sistémica. Por estas y otras razones, el TGFβ ha sido una diana terapéutica para diversas indicaciones clínicas. A pesar de los grandes esfuerzos realizados hasta la fecha por varios grupos, el desarrollo clínico de un tratamiento con TGFβ ha sido todo un reto.

[0002] Las observaciones de estudios preclínicos, incluso en ratas y perros, han revelado ciertas toxicidades asociadas con la inhibición de la TGFP in vivo. Además, aunque hasta la fecha se han desarrollado varios inhibidores del TGFP, la mayoría de los programas clínicos direccionados al TGFβ se han interrumpido debido a sus efectos secundarios.

[0003] Por ejemplo, Anderton et al. (Toxicology Pathology, 39: 916-24, 2011) informaron de que los inhibidores de moléculas pequeñas del receptor TGFβ tipo I (ALK5) inducían lesiones valvulares cardíacas caracterizadas por hemorragia, inflamación, degeneración y proliferación de las células intersticiales valvulares en un modelo animal preclínico. La toxicidad se observó en todas las válvulas cardíacas a todas las dosis probadas. Frazier et al. (Toxicology Pathology, 35: 284-295, 2007) informaron de que la administración de la pequeña molécula inhibidora del receptor de TGFβ tipo I (ALK5) GW788388 inducía displasia fiseal en ratas.

[0004] Stauber et al. (J. Clin. Practice 4:3, 2014) informó de que una administración crónica (≥ 3 meses) del inhibidor de la quinasa del receptor I del TGFβ, LY2157299, que se está investigando para ciertos tratamientos contra el cáncer, causó múltiples toxicidades orgánicas que implicaban a los sistemas cardiovascular, gastrointestinal, inmunitario, óseo/cartilaginoso, reproductor y renal, en ratas y perros.

[0005] Se ha notificado que el fresolimumab (GC1008), un anticuerpo TGFβ "pan" capaz de neutralizar todas las isoformas humanas de TGFβ, induce una hiperplasia epitelial de la encía, la vejiga y el epitelio del cornete nasal tras múltiples administraciones en estudios con macacos cynomolgus (Lonning et al., Current Pharmaceutical Biotechnology 12., 2003): 2176-89, 2011). Del mismo modo, en los ensayos clínicos se han notificado diversas erupciones/lesiones cutáneas, hemorragias gingivales y fatiga tras la administración de dosis múltiples del fármaco. La reacción adversa más notable al fresolimumab incluye la inducción de queratoacantomas cutáneos y/o carcinomas de células escamosas en pacientes con cáncer humano (véase, por ejemplo: Lacouture et al., 2015, Cancer Immunol Immunother, 64: 437-46; Stevenson et al., 2013, OncoImmunology, 2:8, e26218; y Lonning et al., 2011). Pruebas adicionales de un ensayo clínico sugieren que en algunos casos este anticuerpo puede acelerar la progresión tumoral (Stevenson et al., 2013, OncoImmunology, 2:8, e26218).

[0006] Por lo tanto, se necesitan nuevos métodos y composiciones para modular la señalización de TGFβ que se puedan utilizar para tratar de forma eficaz y segura enfermedades y trastornos que implican TGFβ, incluyendo, por ejemplo, cáncer, fibrosis e inflamación.

[0007] El documento WO 2011/102483 proporciona anticuerpos monoclonales contra un péptido correspondiente a LAP TGF-β1 y TGF-β2. El documento WO 2013/134365 proporciona miembros de unión específicos, en particular anticuerpos neutralizantes y fragmentos de los mismos, que se unen al factor de crecimiento TGF-β1, en particular reconociendo TGF-β1 humano y de ratón y no reconociendo ni uniéndose a TGF-β2 o TGF-β3.

RESUMEN

[0008] La presente invención proporciona un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo que se une específicamente a todos los siguientes complejos de proTGFβ1/TGFβ1 latente: un complejo TGFβ1-GARP, un complejo TGFβ1-LTBP1, un complejo TGFβ1-LTBP3 y un complejo TGFβ1-LRRC33, e inhibe la liberación de TGFβ1 maduro de los complejos, para su uso en el tratamiento de cáncer o mielofibrosis en un sujeto; en el que el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo: (a) comprende una región variable de cadena pesada que comprende una CDRH1, CDRH2, y CDRH3 y una región variable de cadena ligera que comprende una CDRL1, CDRL2, y CDRL3, en donde: CDRH1 comprende una secuencia como la establecida en SEQ ID Nº: 2; CDRH2 comprende una secuencia como la establecida en SEQ ID Nº: 4; CDRH3 comprende una secuencia según se establece en SEQ ID Nº: 6; CDRL1 comprende una secuencia según se establece en SEQ ID Nº: 8; CDRL2, comprende una secuencia como la establecida en SEQ ID Nº: 10; y CDRL3 comprende una secuencia como la establecida en SEQ ID Nº: 12; b) comprende una región variable de cadena pesada que comprende una CDRH1, CDRH2 y CDRH3 y una región variable de cadena ligera que comprende una CDRL1, CDRL2 y CDRL3, en la que: CDRH1 comprende una secuencia como la establecida en SEQ ID Nº: 1; CDRH2 comprende una secuencia como la establecida en SEQ ID Nº: 3; CDRH3 comprende una secuencia como la establecida en SEQ ID Nº: 5; CDRL1 comprende una secuencia según se establece en SEQ ID Nº: 7; CDRL2, comprende una secuencia como la establecida en SEQ ID Nº: 9; y CDRL3 comprende una secuencia como la establecida en SEQ ID Nº: 11; o (c) compite o compite de forma cruzada con el anticuerpo definido en la parte (a) o (b) para unirse a TGFβ1 que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID Nº: 21; en el que el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo no se une a TOPPβ que tenga la secuencia de aminoácidos de SEQ ID Nº: 22 o TOPPβ con la secuencia de aminoácidos de SEQ ID Nº: 23.

[0009] La presente divulgación se refiere a la modulación selectiva de un subconjunto de efectos de TGFβ. La invención se basa, al menos en parte, en la noción de que la falta de especificidad de isoforma de los antagonistas de TGFβ conocidos hasta la fecha puede subyacer a la fuente de toxicidades asociadas con la inhibición de TGFβ. De hecho, los inventores de la presente divulgación han descubierto que la mayoría de los inhibidores de TGFP descritos hasta la fecha antagonizan múltiples o todas las isoformas de TGFP. Además, la tendencia general descrita en la técnica ha sido que se favorecen los inhibidores (como los anticuerpos anti-TGFβ) que antagonizan múltiples isoformas de TGFβ, por considerar que la neutralización de múltiples isoformas de TGFβ sería necesaria o ventajosa para lograr la "máxima eficacia terapéutica" (véase, por ejemplo, Bedinger et al. (2016) MABS 8(2): 389-404).

[0010] Contrariamente a esta enseñanza general, los inventores de la presente invención buscaron en cambio desarrollar agentes que permitan la inhibición específica de la isoforma de TGFβ1, en contraposición a la inhibición que también afecta a TOPPβ y/o TGFP3, con el objetivo de eliminar o reducir marcadamente las toxicidades (por ej., acontecimientos adversos, efectos secundarios) observadas con antagonistas de TGFβ conocidos in vivo. Este novedoso enfoque se basa, al menos en parte, en la noción de que la utilidad clínica de un inhibidor de la TGFP puede descansar no sólo en su eficacia, sino también en su seguridad. Se pensó que la capacidad de afinar la diana con un grado de especificidad sin precedentes podría lograr tanto la eficacia como la seguridad/tolerabilidad en un entorno clínico.

[0011] En consecuencia, la invención abarca el reconocimiento de que los agentes farmacéuticos que inhiben la señalización de TGFP de una manera isoforma-específica pueden proporcionar perfiles de seguridad mejorados sobre los agentes que afectan a múltiples isoformas de TGFP. Por el contrario, varios antagonistas de la TGFP conocidos en la técnica producen niveles inaceptables de toxicidad a una dosis que ha demostrado ser eficaz in vivo. En tales casos, puede emplearse una dosis más baja para evitar la toxicidad, pero puede que ya no produzca suficiente eficacia in vivo a la dosis reducida. Sin querer ceñirnos a una teoría concreta, se contempla que dicha toxicidad se deriva, al menos en parte, de la falta de especificidad/selectividad isoforma del agente.

[0012] Así, en un aspecto, la divulgación proporciona métodos para reducir toxicidades (por ej., eventos adversos, efectos secundarios no deseados) asociados con la inhibición de TGFP en un sujeto. Los inhibidores específicos de TGFβ1, como los aquí descritos, tienen un perfil de seguridad-eficacia superior, en comparación con los agentes que provocan actividades hacia dianas más amplias (por ej., más de una isoforma de TGFP). Dichos inhibidores específicos de TGFβ1 pueden, por tanto, administrarse a los sujetos que los necesiten a una dosis terapéuticamente eficaz sin causar efectos adversos. Por lo tanto, este enfoque ampliaría el rango de dosis en el que se puede lograr tanto la eficacia como la seguridad/tolerabilidad en los pacientes. Así, la divulgación proporciona métodos para tratar una enfermedad asociada con la señalización de TGFβ1, administrando a un sujeto una cantidad eficaz de un inhibidor de TGFP que es específico o altamente selectivo para la isoforma de TGFβ1. Dichos inhibidores selectivos de la isoforma TGFβ1 o específicos de la isoforma TGFβ1 pueden ser agentes de moléculas pequeñas o biológicos (por ej., anticuerpos). La presente divulgación abarca el uso de cualquiera de estos inhibidores para reducir las toxicidades (por ej., acontecimientos adversos o efectos secundarios) asociadas con la inhibición de TGFP en un sujeto. Según la divulgación, la cantidad eficaz se encuentra dentro de un intervalo de dosificación que permite tanto: i) la eficacia (por ej., efectos terapéuticamente beneficiosos); y, ii) la seguridad (por ej., dentro de niveles aceptables de efectos adversos o secundarios). Los efectos adversos pueden incluir toxicidades cardiovasculares, gastrointestinales, inmunológicas, óseas/cartilaginosas, reproductivas y renales. Las toxicidades cardiovasculares incluyen, entre otras: lesiones de las válvulas cardíacas, por ej., hemorragia, inflamación, degeneración y proliferación de las células intersticiales valvulares. Los efectos adversos pueden incluir hemorragias. Los efectos adversos pueden incluir lesiones cutáneas o tumores. Los efectos adversos pueden incluir la progresión tumoral.

[0013] En consecuencia, la divulgación proporciona anticuerpos inhibidores de TGFβ1 específicos de isoforma o fragmentos de unión a antígeno de los mismos, caracterizados en que inhiben selectivamente el paso de activación de TGFβ1 in vivo pero no inhiben el paso de activación de TGFP2 y/o TOPPβ. Dichos anticuerpos o fragmentos de los mismos pueden administrarse a sujetos que se benefician de la inhibición de TGFβ1, en una cantidad eficaz para lograr la eficacia clínica sin causar niveles inaceptables o intolerables de efectos adversos. Así, la presente divulgación enseña que los inhibidores específicos de la isoforma TGFβ1 se seleccionen específicamente para cumplir tanto los criterios de eficacia como de seguridad para el tratamiento de una enfermedad o afección asociada con la señalización de TGFP en pacientes humanos.

[0014] En un aspecto relacionado, la divulgación proporciona métodos de producción para moduladores de TGFP específicos de isoforma con un perfil de seguridad mejorado (por ej., toxicidad in vivo reducida). Dichos métodos requieren que los agentes candidatos sean probados y seleccionados por su especificidad isoforma. En ocasiones, los agentes candidatos se seleccionan por actividades específicas contra la señalización de TGFβ1, y no contra la señalización de TOPPβ y/o TOPPβ. En ocasiones, dichos agentes son inhibidores específicos de la isoforma TGFβ1. En ocasiones, dichos agentes son anticuerpos o fragmentos de unión a antígeno de los mismos que se unen específicamente y bloquean la activación de TGFβ1, pero no de TOPPβ y/o TGFP3. En ocasiones, dichos anticuerpos o fragmentos de unión a antígeno de los mismos no se unen al factor de crecimiento TGFβ1 maduro libre que no está asociado a un complejo pro/latente.

[0015] El TGFβ está implicado en conferir una serie de efectos celulares/tisulares, y cada uno de esos efectos está mediado en parte por su interacción con las denominadas "moléculas presentadoras". Dado que la expresión de varias moléculas presentadoras es específica del tipo de célula o tejido, se contempla que el TGFβ confiera un efecto celular, dependiendo de su interacción con una molécula presentadora particular (es decir, "contexto"). Así, entre otras cosas, la presente divulgación proporciona anticuerpos monoclonales que se unen selectivamente a TGFβ presente en un contexto particular (es decir, un complejo que comprende TGFβ y una molécula presentadora). Los anticuerpos monoclonales para uso según la invención se unen específicamente a todos los complejos siguientes: i) TGFβ1-GARP; ii) TGFβ1-LRRC33; iii) TGFβ1-LTBP1; y, iv) TGFβ1-LTBP3. Dichos anticuerpos monoclonales no se unen a TGFβ1 maduro que es TGFβ1 libre (por. ej., no complejado con una molécula presentadora).

[0016] La presente divulgación incluye anticuerpos monoclonales que se unen al pequeño complejo latente (por ej., "C4S") de TGFβ1. La divulgación proporciona además anticuerpos monoclonales que se dirigen selectivamente a TGFβ y lo modulan en un contexto particular. Estos anticuerpos monoclonales pueden inhibir o activar la TGFP en un contexto particular.

[0017] En consecuencia, se proporcionan en el presente documento composiciones y métodos para modular (activar o inhibir) un subconjunto de actividades de TGFP. Se proporcionan anticuerpos monoclonales que pueden modular selectivamente un subconjunto de vías de señalización mediadas por TGFβ sin afectar a las otras vías de señalización mediadas por TGFβ. Los anticuerpos monoclonales para uso según la invención pueden modular específicamente todas las siguientes vías de señalización mediadas por TGFβ: i) efectos de TGFβ mediados por GARP, ii) efectos de TGFβ mediados por LRRC33, iii) efectos de TGFβ mediados por LTBP1, y iv) efectos de TGFβ mediados por LTBP3. Dichos anticuerpos monoclonales pueden modular específicamente los efectos de TGFβ mediados por GARP. Dichos anticuerpos monoclonales pueden modular específicamente los efectos del TGFβ mediados por LRRC33. Dichos anticuerpos monoclonales pueden modular específicamente los efectos de TGFβ mediados por LTBP1. Dichos anticuerpos monoclonales pueden modular específicamente los efectos de TGFβ mediados por LTBP3.

[0018] Aspectos de la presente divulgación incluyen composiciones farmacéuticas y métodos para tratar una enfermedad o trastorno en un sujeto humano. En ocasiones, dicha enfermedad o trastorno incluye afecciones asociadas con la regulación/desregulación inmunitaria, afecciones asociadas con la regulación/desregulación de células T; afecciones asociadas con una característica fibrótica (fibrosis); y/o afecciones asociadas con un tumor.

[0019] Debido a que los anticuerpos o fragmentos de los mismos que se dirigen específicamente al complejo pro/latente de TGFβ descrito en el presente documento modulan la etapa de activación (es decir, la liberación de un factor de crecimiento TGFβ maduro y libre a partir del complejo preforma inactivo y latente), en contraposición a dirigirse al factor de crecimiento maduro, libre y ya liberado, el modo de acción de estos agentes moduladores depende de la fuente del factor de crecimiento TGFβ en el tejido. Por lo tanto, se contempla que la identificación de la fuente de TGFβ implicada en un contexto de enfermedad puede ayudar a seleccionar un agente que pueda modular eficazmente el TGFβ en el contexto correcto. Por ejemplo, para tratar un fenotipo de enfermedad que implica efectos de TGFβ1 mediados por GARP, es deseable seleccionar anticuerpos o fragmentos de los mismos que se dirijan específicamente a un complejo GARP-proTGFβ1. Para tratar un fenotipo de enfermedad que implique efectos de TGFβ1 mediados por LRRC33, es deseable seleccionar anticuerpos o fragmentos de los mismos que se dirijan específicamente a un complejo LRRC33-proTGFβ1. Para tratar un fenotipo de enfermedad que implica efectos de TGFβ1 mediados por LTBP1, es deseable seleccionar anticuerpos o fragmentos de los mismos que se dirijan específicamente a un complejo LTBP1-proTGFβ1. Para tratar un fenotipo de enfermedad que implica efectos de TGFβ1 mediados por LTBP2, es deseable seleccionar anticuerpos o fragmentos de los mismos que se dirijan específicamente a un complejo LTBP2-proTGFβ1. Para tratar un fenotipo de enfermedad que implica efectos de TGFβ1 mediados por LTBP3, es deseable seleccionar anticuerpos o fragmentos de los mismos que se dirijan específicamente a un complejo LTBP3-proTGFβ1. Para tratar un fenotipo de enfermedad que implica efectos de TGFβ1 mediados por LTBP4, es deseable seleccionar anticuerpos o fragmentos de los mismos que se dirijan específicamente a un complejo LTBP4-proTGFβ1. Para tratar un fenotipo de enfermedad que implica efectos de TGFβ1 mediados por múltiples (por ej.,dos o más) contextos, es deseable seleccionar anticuerpos o fragmentos de los mismos que puedan dirigirse a los correspondientes contextos múltiples de presentación de TGFβ1.

[0020] Ciertas enfermedades se asocian a múltiples funciones biológicas de la señalización de TGFβ que no se limitan a un único contexto de la función de TGFβ. En tales situaciones, puede ser beneficioso modular los efectos del TGFβ en múltiples contextos. Así, la invención proporciona agentes para su uso en lo direccionamiento y modulación de TGFβ1 de una manera específica de isoforma, en lugar de una manera específica de contexto. Dichos agentes pueden denominarse moduladores de TGFβ1 "específicos de la isoforma y permisivos con el contexto". Los moduladores de TGFβ1 permisivos con el contexto de la invención se dirigen a múltiples contextos (por ej., múltiples tipos de complejos pro/latente-TGFβ1). En algunas formas de realización, los moduladores de TGFβ1 permisivos con el contexto se dirigen a todos los tipos de complejos proTGFβ1/TGFβ1 latente (por ej., asociados a GARP, asociados a LRRC33, asociados a LTBP, etc.) para abarcar todos los contextos.

[0021] Mientras que los moduladores de TGFβ1 permisivos con el contexto son capaces de dirigirse a más de un tipo de complejos pro/latente-TGFβ1 (es decir, con diferentes moléculas presentadoras), en algunas formas de realización, dichos moduladores pueden favorecer uno o más contextos sobre los otros. Así, en algunas formas de realización, un anticuerpo permisivo de contexto que inhibe la activación de TGFβ1 puede inhibir preferentemente la activación de TGFβ1 mediada por una molécula presentadora sobre otra molécula presentadora, incluso si dicho anticuerpo es capaz de unirse a ambos tipos de complejos pro/latente. En algunas formas de realización, dicho anticuerpo es un anticuerpo monoclonal que se une e inhibe la activación de TGFβ1 asociado a LTBP, TGFβ1 asociado a GARP, y TGFβ1 asociado a LRRC33, pero con actividades inhibitorias preferentes hacia TGFβ1 asociado a LTBP. En algunas formas de realización, dicho anticuerpo es un anticuerpo monoclonal que se une e inhibe la activación de TGFβ1 asociada a LTBP1, TGFβ1 asociada a LTBP3, TGFβ1 asociada a GARP, y TGFβ1 asociada a LRRC33, pero con actividades inhibitorias preferentes hacia TGFβ1- y TGFβ1 asociada a LTBP3. En algunas formas de realización, dicho anticuerpo es un anticuerpo monoclonal que se une e inhibe la activación de TGFβ1 asociado a LTBP1, TGFβ1 asociado a LTBP3, TGFβ1 asociado a GARP, y TGFβ1 asociado a LRRC33, pero con actividades inhibitorias preferentes hacia TGFβ1 asociado a GARP y TGFβ1 asociado a LRRC33. En algunas formas de realización, dicho anticuerpo es un anticuerpo monoclonal que se une e inhibe la activación de TGFβ1 asociado a GARP y TGFβ1 asociado a LRRC33, pero con actividades inhibitorias preferentes hacia TGFβ1 asociado a GARP. En algunas formas de realización, dicho anticuerpo es un anticuerpo monoclonal que se une e inhibe la activación de TGFβ1 asociado a GARP y TGFβ1 asociado a LRRC33, pero con actividades inhibitorias preferentes hacia TGFβ1 asociado a LRRC33.

[0022] Así, pueden generarse diversos grados de selectividad para dirigirse a subconjuntos de efectos de TGFβ. Los moduladores específicos de isoforma de TGFP (que se dirigen a una única isoforma de TGFP) proporcionan una mayor selectividad que los moduladores pαn-TGFβ (que se dirigen a múltiples o a todas las isoformas de TGFP). Los moduladores de TGFβ específicos de isoforma y permisivos de contexto (que se dirigen a múltiples contextos de una única isoforma de TOPPβ proporcionan mayor selectividad que los moduladores específicos de isoforma.

[0023] Aspectos de la presente divulgación se refieren a inmunoglobulinas, tales como anticuerpos, o porciones de unión a antígeno de los mismos, que se unen específicamente a un complejo GARP-TGFβ1, un complejo LTBP1-TGFβ1, un complejo LTBP3-TGFβ1 y/o un complejo LRRC33-TGFβ1. Los anticuerpos, o porciones de unión a antígeno de los mismos, descritos en el presente documento, se unen específicamente a un epítopo de TGFβ1 que está disponible para la unión por los anticuerpos, o porciones de unión a antígeno de los mismos, cuando el TGFβ1 está presente en un complejo GARP-TGFβ1, un complejo LTBβ1-TGFβ1, un complejo LTBP3-TGFβ1 y/o un LRRC33-TGFβ1.

[0024] Según la invención, el anticuerpo o porción de unión a antígeno del mismo puede ser un anticuerpo aislado, o porción de unión a antígeno del mismo, que se une específicamente a un epítopo de TGFβ1, en el que el epítopo está disponible para la unión por el anticuerpo cuando el TGFβ1 está presente en los siguientes complejos proteicos: un complejo GARP-TGFβ1, un complejo LTBP1-TGFβ1, un complejo LTBP3-TGFβ1 y un complejo LRRC33-TGFβ1; y en el que el anticuerpo no se une a TGFβ1 maduro libre.

[0025] En ocasiones, el TGFβ1 es TGFβ1 latente. En ocasiones, el TGFβ1 es proTGFβ1.

[0026] El anticuerpo, o porción de unión a antígeno del mismo, para su uso según la invención no se une a TGFβ2. El anticuerpo, o porción de unión a antígeno del mismo, para su uso según la invención no se une a TGFβ3. En algunas formas de realización, el anticuerpo, o la porción de unión a antígeno del mismo, no impide la capacidad de TGFβ1 para unirse a la integrina.

[0027] En algunas formas de realización, el anticuerpo, o la porción de unión a antígeno del mismo, comprende una región variable de cadena pesada que comprende una región 3 determinante de la complementariedad (CDR3) que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID Nº: 5 y una región variable de cadena ligera que comprende una CDR3 con la secuencia de aminoácidos de SEQ ID Nº: 11. En algunas formas de realización, el anticuerpo, o la porción de unión a antígeno del mismo, comprende una región variable de cadena pesada que comprende una región 2 determinante de la complementariedad (CDR2) que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID Nº: 3 y una región variable de cadena ligera que comprende una CDR2 con la secuencia de aminoácidos de SEQ ID Nº: 9. En algunas formas de realización, el anticuerpo, o la porción de unión a antígeno del mismo, comprende una región variable de cadena pesada que comprende una región 1 determinante de la complementariedad (CDR1) que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID Nº: 1 y una región variable de cadena ligera que comprende una CDR1 con la secuencia de aminoácidos de SEQ ID Nº: 7.

[0028] En algunas formas de realización, el anticuerpo, o la porción de unión a antígeno del mismo, comprende un dominio variable de cadena pesada que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% o 99% de identidad con la secuencia de aminoácidos establecida en SEQ ID Nº: 13 y un dominio variable de cadena ligera que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos un 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% o 99% de identidad con la secuencia de aminoácidos establecida en SEQ ID Nº: 14.

[0029] En algunas formas de realización, el anticuerpo, o la porción de unión a antígeno del mismo, comprende un dominio variable de cadena pesada que comprende una secuencia de aminoácidos establecida en SEQ ID Nº: 13 y un dominio variable de cadena ligera que comprende una secuencia de aminoácidos establecida en SEQ ID Nº: 14.

[0030] En algunas formas de realización, el anticuerpo, o la porción de unión a antígeno del mismo, comprende una región variable de cadena pesada que comprende una CDR3 que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID Nº: 6 y una región variable de cadena ligera que comprende una CDR3 con la secuencia de aminoácidos de SEQ ID Nº: 12. En algunas formas de realización, el anticuerpo, o la porción de unión a antígeno del mismo, comprende una región variable de cadena pesada que comprende una CDR2 que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID Nº: 4 y una región variable de cadena ligera que comprende una CDR2 con la secuencia de aminoácidos de SEQ ID Nº: 10. En algunas formas de realización, el anticuerpo, o la porción de unión a antígeno del mismo, comprende una región variable de cadena pesada que comprende una CDR1 que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID Nº: 2 y una región variable de cadena ligera que comprende una CDR1 con la secuencia de aminoácidos de SEQ ID Nº: 8.

[0031] En algunas formas de realización, el anticuerpo, o la porción de unión a antígeno del mismo, comprende un dominio variable de cadena pesada que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos un 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% o 99% de identidad con la secuencia de aminoácidos establecida en SEQ ID Nº: 15 y un dominio variable de cadena ligera que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos un 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% o 99% de identidad con la secuencia de aminoácidos establecida en SEQ ID Nº: 16.

[0032] En algunas formas de realización, el anticuerpo, o la porción de unión a antígeno del mismo, comprende una cadena pesada que comprende una secuencia de aminoácidos establecida en SEQ ID Nº: 15 y una cadena ligera que comprende una secuencia de aminoácidos establecida en SEQ ID Nº: 16.

[0033] El anticuerpo, o la porción de unión a antígeno del mismo, inhibe la activación de TGFβ1.

[0034] El anticuerpo, o la porción de unión a antígeno del mismo, inhibe la liberación de TGFβ1 maduro del complejo GARP-TGFβ1, el complejo LTBP1-TGFβ1, el complejo LTBP3-TGFβ1 y el complejo LRRC33-TGFβ1.

[0035] En algunas formas de realización, el anticuerpo, o la porción de unión a antígeno del mismo, tiene una constante de disociación (K_D) al epítopo de TGFβ1 seleccionada del grupo que consiste en: al menos aproximadamente 10-⁸M; al menos aproximadamente 10^-9M; al menos aproximadamente 10^-10M; al menos aproximadamente 10^-11M; al menos aproximadamente 10^-12M; y al menos aproximadamente 10^-13M.

[0036] En algunas formas de realización, el anticuerpo, o la porción de unión a antígeno del mismo, comprende un dominio constante de inmunoglobulina de cadena pesada de un dominio constante IgM humano, un dominio constante IgG humano, un dominio constante IgG₁humano, un dominio constante IgG₂humano, un dominio constante IgG₂A humano, un dominio constante IgG₂B humano, un dominio constante IgG₂humano, un dominio constante IgG₃humano, un dominio constante IgG₃humano, un dominio constante IgG₄humano, un dominio constante IgA humano, un dominio constante IgA₁humano, un dominio constante IgA₂humano, un dominio constante IgD humano o un dominio constante IgE humano. En algunas formas de realización, el anticuerpo, o la porción de unión a antígeno del mismo, comprende un dominio constante de inmunoglobulina de cadena pesada de un dominio constante _IgG1humano o un dominio constante IgG₄humano. En algunas formas de realización, el anticuerpo, o la porción de unión a antígeno del mismo, comprende un dominio constante de inmunoglobulina de cadena pesada de un dominio constante IgG₄humano. En algunas formas de realización, el anticuerpo, o la porción de unión a antígeno del mismo, comprende un dominio constante de inmunoglobulina de cadena pesada de un dominio constante IgG₄humano que tiene una sustitución de Ser a Pro en la cadena principal que produce una bisagra similar a IgG1 y permite la formación de enlaces disulfuro entre cadenas.

[0037] En algunas formas de realización, el anticuerpo o la porción de unión a antígeno del mismo comprende además un dominio constante de inmunoglobulina de cadena ligera que comprende un dominio constante Ig lambda humano o un dominio constante Ig kappa humano.

[0038] En algunas formas de realización, el anticuerpo es una IgG que tiene cuatro cadenas polipeptídicas que son dos cadenas pesadas y dos cadenas ligeras.

[0039] En algunas formas de realización, el anticuerpo es un anticuerpo humanizado, un diacuerpo o un anticuerpo quimérico. En algunas formas de realización, el anticuerpo es un anticuerpo humanizado. En algunas formas de realización, el anticuerpo es un anticuerpo humano. En algunas formas de realización, el anticuerpo comprende una estructura que tiene una secuencia de aminoácidos de la línea germinal humana.

[0040] En algunas formas de realización, la porción de unión a antígeno es un fragmento Fab, un fragmento F(ab')2, un fragmento scFab o un fragmento scFv.

[0041] En un aspecto, un anticuerpo anti-TGFβ1, o una porción de unión a antígeno del mismo, de la invención compite por la unión con un anticuerpo, o una porción de unión a antígeno del mismo, como se describe en el presente documento.

[0042] El anticuerpo anti-TGFβ1, o porción de unión a antígeno del mismo, puede unirse al mismo epítopo que un anticuerpo, o porción de unión a antígeno del mismo, como se describe en el presente documento.

[0043] En ocasiones, el anticuerpo, o la porción de unión a antígeno del mismo, se conjuga con un fármaco o una fracción detectable. En ocasiones, el anticuerpo, o la porción de unión a antígeno del mismo, se conjuga con el fármaco o con la fracción detectable mediante un enlazador. En ocasiones, el enlazador es un enlazador escindible. En ocasiones, la fracción detectable se selecciona del grupo formado por un agente fluorescente, un agente luminiscente, un agente enzimático y un agente radiactivo.

[0044] Se proporciona aquí una composición farmacéutica que comprende un anticuerpo, o una porción de unión a antígeno del mismo, como se describe aquí, y un portador farmacéuticamente aceptable.

[0045] Se proporciona en el presente documento un método para inhibir la activación de TGFβ1, comprendiendo el método exponer un complejo GARP-TGFβ1, un complejo LTBP1-TGFβ1, un complejo LTBP3-TGFβ1, o un complejo LRRC33-TGFβ1 a un anticuerpo, una porción de unión a antígeno del mismo, o una composición farmacéutica descrita en el presente documento.

[0046] El anticuerpo, o la porción de unión a antígeno del mismo, inhibe la liberación de TGFβ1 maduro del complejo GARP-TGFβ1, el complejo LTBP1-TGFβ1, un complejo LTBP3-TGFβ1 y el complejo LRRC33-TGFβ1.

[0047] En ocasiones, el método se realiza in vitro. En ocasiones, el método se realiza in vivo.

[0048] En ocasiones, el complejo GARP-TGFβ1 o el complejo LRRC33-TGFβ1 está presente en la superficie externa de una célula.

[0049] En ocasiones, la célula es una célula T, un fibroblasto, un macrófago, un monocito, una célula dendrítica, una célula presentadora de antígeno o una microglía.

[0050] En ocasiones, el complejo LTBβ1-TGFβ1 o el complejo LTBP3-TGFβ1 está unido a una matriz extracelular. En ocasiones, la matriz extracelular comprende fibrilina. En ocasiones, la matriz extracelular comprende una proteína con un motivo RGD.

[0051] Se proporciona en el presente documento un método para reducir la activación de TGFβ1 en un sujeto, comprendiendo el método administrar al sujeto una cantidad eficaz de un anticuerpo, una porción de unión a antígeno del mismo, o una composición farmacéutica, como se describe en el presente documento, reduciendo así la activación de TGFβ1 en el sujeto.

[0052] En ocasiones, el sujeto tiene o corre el riesgo de tener fibrosis. En ocasiones, el sujeto padece una distrofia muscular. En ocasiones, el sujeto padece distrofia muscular de Duchenne (DMD). En ocasiones, el sujeto tiene o corre el riesgo de tener fibrosis hepática, renal o pulmonar (por ej., fibrosis pulmonar idiopática). En ocasiones, el sujeto tiene o corre el riesgo de tener cáncer. En ocasiones, el sujeto tiene o corre el riesgo de tener demencia. En ocasiones, el sujeto padece o corre el riesgo de padecer mielofibrosis.

[0053] En ocasiones, el sujeto recibe además una terapia adicional. En ocasiones, la terapia adicional se selecciona del grupo que consiste en un inhibidor de miostatina, un agonista de VEGF, un agonista de IGF1, un agonista de FXR, un inhibidor de CCR2, un inhibidor de CCR5, un inhibidor dual de CCR2/CCR5, un inhibidor de la lisil oxidasa-2, un inhibidor de ASK1, un inhibidor de la acetil-CoA carboxilasa (ACC), un inhibidor de la p38 cinasa, pirfenidona, nintedanib, un inhibidor de GDF11, o cualquier combinación de los mismos.

[0054] En ocasiones, el anticuerpo, o la porción de unión a antígeno del mismo, reduce la actividad supresora de las células T reguladoras.

[0055] En ocasiones, el anticuerpo, o la porción de unión a antígeno del mismo, no induce toxicidad orgánica en el sujeto. En ocasiones, la toxicidad orgánica comprende toxicidad cardiovascular, toxicidad gastrointestinal, inmunotoxicidad, toxicidad ósea, toxicidad cartilaginosa, toxicidad del sistema reproductor o toxicidad renal.

[0056] En un aspecto, el anticuerpo, o el fragmento de unión a antígeno del mismo, es para uso en un método para tratar el cáncer en un sujeto que lo necesita, comprendiendo el método administrar al sujeto una cantidad eficaz del anticuerpo, o la porción de unión a antígeno del mismo, como se describe en el presente documento, tratando así el cáncer en el sujeto.

[0057] En otro aspecto, el anticuerpo, o fragmento de unión a antígeno del mismo, es para uso en un método de reducción del crecimiento tumoral en un sujeto que lo necesita, comprendiendo el método administrar al sujeto una cantidad eficaz de un anticuerpo, una porción de unión a antígeno del mismo, o una composición farmacéutica, como se describe en el presente documento, reduciendo así el crecimiento tumoral en el sujeto.

[0058] En algunas formas de realización, el anticuerpo, o la porción de unión a antígeno del mismo, se administra en combinación con un agente adicional o una terapia adicional. En algunas formas de realización, el agente adicional es un inhibidor del punto de control. En algunas formas de realización, el agente adicional se selecciona del grupo que consiste en un antagonista de PD-1, un antagonista de PDL1, una proteína de fusión de PD-L1 o PDL2, un antagonista de CTLA4, un agonista de GITR, un anticuerpo anti-ICOS, un anticuerpo anti-ICOSL, un anticuerpo anti-B7H3, un anticuerpo anti-B7H4, un anticuerpo anti-TIM3, un anticuerpo anti-LAG3, un anticuerpo anti-OX40, un anticuerpo anti-CD27, un anticuerpo anti-CD70, un anticuerpo anti-CD47, un anticuerpo anti-41BB, un anticuerpo anti-PD-1, un virus oncolítico y un inhibidor de PARP. En algunas formas de realización, la terapia adicional es radiación, un quimioterapéutico o una combinación de los mismos. En algunas formas de realización, la terapia adicional es radiación. En algunas formas de realización, el agente adicional es un agente quimioterapéutico. En algunas formas de realización, el agente quimioterapéutico es Taxol. En algunas formas de realización, el agente adicional es un agente antiinflamatorio. En algunas formas de realización, el agente adicional inhibe el proceso de reclutamiento de monocitos/macrófagos y/o la infiltración tisular. En algunas formas de realización, el agente adicional es un inhibidor de la activación de las células estrelladas hepáticas. En algunas formas de realización, el agente adicional es un antagonista del receptor de quimioquinas, por ej., antagonistas CCR2 y antagonistas CCR5. En algunas formas de realización, dicho antagonista del receptor de quimioquinas es un antagonista específico dual, como un antagonista CCR2/CCR5. En algunas formas de realización, el agente adicional que se administrará como terapia combinada es o comprende un miembro de la superfamilia TGFP de factores de crecimiento o reguladores de los mismos. En algunas formas de realización, dicho agente se selecciona entre moduladores (por ej., inhibidores y activadores) de GDF8/mioostatina y GDF11. En algunas formas de realización, dicho agente es un inhibidor de la señalización GDF8/mioostatina. En algunas formas de realización, dicho agente es un anticuerpo monoclonal que se une específicamente a un complejo de miostatina pro/latente y bloquea la activación de la miostatina. En algunas formas de realización, el anticuerpo monoclonal que se une específicamente a un complejo de miostatina pro/latente y bloquea la activación de la miostatina no se une a la miostatina madura libre.

[0059] Se proporciona en el presente documento un método para tratar un trastorno renal en un sujeto que lo necesita, el método comprende administrar al sujeto una cantidad eficaz de un anticuerpo, una porción de unión a antígeno del mismo, o una composición farmacéutica, como se describe en el presente documento, tratando así el trastorno renal en el sujeto.

[0060] Se proporciona aquí un ácido nucleico que codifica un anticuerpo, o una porción de unión a antígeno del mismo, como se describe aquí. También se proporcionan vectores que comprenden el ácido nucleico.

[0061] Se proporciona aquí una célula que comprende un ácido nucleico que codifica un anticuerpo, o una porción de unión a antígeno del mismo, como se describe aquí. También se proporciona una célula que comprende un vector que comprende un ácido nucleico que codifica un anticuerpo, o una porción de unión a antígeno del mismo, como se describe en el presente documento.

[0062] Se proporciona aquí un kit que comprende un anticuerpo, una porción de unión a antígeno del mismo, o una composición farmacéutica, como se describe aquí, e instrucciones para su uso.

[0063] Se proporciona en el presente documento un método para tratar un daño de miofibra, el método comprende un paso de: administrar a un sujeto que tiene un daño de miofibra un agente que inhibe selectivamente TGFβ1 sobre TGFβ2/3 en una cantidad eficaz para i) promover la reparación de miofibra; ii) proteger de la lesión inducida por contracción; iii) reducir la inflamación en el músculo; y/o, iv) reducir la fibrosis en el músculo. En ocasiones, la cantidad no causa un nivel inaceptable de efectos adversos en el sujeto.

[0064] En ocasiones, el daño de la miofibra está i) asociado con una distrofia muscular; o, ii) asociado con una lesión muscular aguda. En ocasiones, el agente bloquea la activación de TGFβ1 pero no la de TGFβ2 o TGFβ3. En ocasiones, el agente es un anticuerpo monoclonal. En ocasiones, el anticuerpo monoclonal se une a un complejo latente GARP-proTGFβ1, a un complejo latente LRRC33-proTGFβ1, a un complejo latente LTBP1-proTGFβ1, a un complejo latente LTBP2-proTGFβ1, a un complejo latente LTBP3-proTGFβ1, y/o a un complejo latente LTBP4-proTGFβ1. En ocasiones, el sujeto recibe además un inhibidor de la miostatina.

[0065] En ocasiones, el método comprende además un paso de: identificar una fuente o contexto de TGFβ1 asociado a la enfermedad.

[0066] Se proporciona en el presente documento un método para producir una composición farmacéutica que modula la señalización de TGFβ, comprendiendo el método los pasos de: proporcionar uno o más agentes que modulan la señalización de al menos una isoforma de TGFβ; medir las actividades de uno o más agentes hacia todas las isoformas de TGFβ; seleccionar un agente que sea específico de una única isoforma de TGFP; formular en una composición farmacéutica que comprende un modulador de TGFβ específico de isoforma y un excipiente farmacéuticamente aceptable. También se proporciona una composición farmacéutica producida por este método.

[0067] En ocasiones, el modulador de TGFβ específico de isoforma es un modulador específico de TGFβ1. En ocasiones, el modulador específico de TGFβ1 es un inhibidor de TGFβ1. En ocasiones, el modulador de TGFβ específico de isoforma es un anticuerpo o un fragmento del mismo. En ocasiones, el anticuerpo o fragmento del mismo se une específicamente a un complejo pro/latente de TGFβ1. En ocasiones, el anticuerpo o fragmento del mismo no se une al TGFβ1 maduro libre que no está en el complejo pro/latente. En ocasiones, el complejo pro/latente comprende GARP, LRRC33, LTBP1, LTBP2, LTBP3 o LTBP4.

[0068] Se proporciona en el presente documento un método para tratar una enfermedad asociada con la señalización de TGFβ, el método comprende un paso de: administrar a un sujeto que lo necesita una composición farmacéutica proporcionada en el presente documento, en una cantidad eficaz para tratar la enfermedad, en el que la cantidad alcanza una eficacia y seguridad clínicas estadísticamente significativas cuando se administra a una población de pacientes que tienen la enfermedad.

[0069] Se proporciona en el presente documento un inhibidor de TGFβ para su uso en la reducción de efectos adversos en un sujeto, en el que el inhibidor de TGFβ es selectivo de isoforma. El inhibidor del TGFβ puede ser un anticuerpo que inhiba específicamente el TGFβ1.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS

[0070]

FIG.1 es un esquema que representa el TGFβ unido en un complejo latente en el microambiente tisular.

FIGs. 2A y 2B son esquemas que representan la modulación del nicho en el microambiente. FIG. 2A muestra proteínas de unión al factor de crecimiento transformante beta latente (LTBP) que presentan TGFβ en un nicho de enfermedad fibrótica y en un nicho de cicatrización de heridas. FIG.2B ilustra que la proteína predominante de las repeticiones de la glicoproteína A (GARP) modula la activación de TGFβ en el nicho inflamatorio.

FIG. 3 ilustra una plataforma de expresión de proteínas para fabricar un complejo GARP-TGFβ1 y un complejo LTBP-TGFβ1. El sistema de expresión basado en HEK293 utiliza la purificación por afinidad NiNTA y la filtración en gel para obtener cantidades multimiligramo de proteína purificada. Se muestran esquemas de proTGF β1 de tipo salvaje, LTPB1, sGARP y proTGF β1 C4S.

FIGs.4A y 4B muestran la purificación del complejo sGARP-proTGFβ1. FIG.4A es un cromatograma de la muestra y la FIG.4B muestra un blot de los productos y un esquema que ilustra el complejo.

FIGs. 5A y 5B muestran la purificación del complejo sGARP-TGFβ1 LAP. FIG. 5A es un cromatograma de la muestra y la FIG.5B muestra un blot de los productos y un esquema que ilustra el complejo.

FIGs.6A y 6B muestran la purificación de la LTBP1 complejada con proTGFβ1. FIG.6A es un cromatograma de la muestra y la FIG.6B muestra un blot de los productos y un esquema que ilustra el complejo. NR significa no reductor y R significa reductor.

FIG.7 es un gráfico que muestra que Ab1 y Ab2 bloquean la activación de la actividad de TGFβ1.

FIG.8 muestra un análisis inicial dosis-respuesta de Ab1 en células humanas.

FIG. 9 muestra ensayos de células reporteras CAGA12 que ilustran la inhibición de TGFβ1 por Ab1 en células humanas.

FIG. 10 es un gráfico que muestra que la inhibición del complejo GARP bloquea la actividad supresora de las células T reguladoras (Treg) en células T aisladas de sangre de donantes sanos.

FIGs. 11A-11C muestran la inhibición de la liberación de TGFβ1 mediada por integrina a partir de fibroblastos. FIGs. 11A y 11B son gráficos que representan la inhibición del TGFβ1 endógeno en fibroblastos dérmicos humanos normales (círculos), fibroblastos pulmonares humanos normales (cuadrados), fibroblastos pulmonares murinos C57BL/6J (triángulos invertidos) o fibroblastos musculares murinos DBA2/J (círculos) utilizando concentraciones crecientes de Ab1 (FIG.11A) o Ab2 (FIG.11B). FIG.11C proporciona un esquema del sistema de ensayo de co-cultivo.

FIGs.12A y 12B representan la unión de Ab1 (FIG.12A) o Ab2 (FIG.12B) al complejo LRRC33-proTGFβ1. FIG.13A y 13B son gráficos que representan la inhibición del complejo GARP-TGFβ1 (FIG 13A) o del complejo LRRC33-TGFβ1 (FIG.13B) en transfectantes de células SW480/β6 utilizando concentraciones crecientes de Ab1 ("Ab1"), Ab2 ("Ab2"), anticuerpo IgG1 de control del isotipo ("Control del isotipo") o control con vehículo ("Vehículo").

FIG.14 es un gráfico de barras que representa los niveles de hidroxiprolina en el tejido renal de ratones sometidos a cirugía unilateral derecha permanente UUO y a los que se administró PBS (control), 30 mg/kg de anticuerpo de control IgG1 murino, 3 mg/kg de Ab2, o 30 mg/kg de Ab2 por vía intraperitoneal (i.p.) antes de la intervención quirúrgica (barras segunda a quinta); o ratones a los que se administró PBS y se sometieron a una laparotomía (control simulado; primera barra).

FIGs.15A-15H son gráficos de barras que representan los niveles relativos de ARNm del inhibidor-1 del activador del plasminógeno (PAI-1; FIG.15A), factor de crecimiento del tejido conjuntivo (CTGF; FIG. 15B), TGFβ1 (FIG.

15C), fibronectina-1 (FIG.15D), α-actina de músculo liso (α-SMA; FIG.15E), proteína quimiotáctica de monocitos 1 (MCP-1; FIG.15F), colágeno tipo I alfa 1 (Col1a1; FIG.15G), o la cadena alfa 1 del colágeno tipo III (Col3a1; FIG. 15H) en tejido renal de ratones sometidos a cirugía UUO unilateral derecha permanente y a los que se administró PBS (control), 30 mg/kg de anticuerpo control IgG1 murino, 3 mg/kg de Ab2, o 30 mg/kg de Ab2 por vía intraperitoneal (i.p.) el día anterior a la intervención quirúrgica, y luego 1 y 3 días después de la cirugía (barras segunda a quinta de cada gráfico); o ratones a los que se administró PBS y se les practicó una laparotomía (control simulado; primera barra de cada gráfico). Estos datos son representativos de múltiples experimentos.

FIG.16 representa la fracción de volumen de colágeno cortical compuesta (CVF) de tres secciones seriadas del riñón derecho cosechado de ratones que se tiñeron con rojo picrosirio y se sometieron a análisis histológicos cuantitativos utilizando la segmentación del espectro de color. CVF de ratones a los que se practicó una UUO unilateral derecha permanente y a los que se administró PBS ("Veh"), 30 mg/kg de anticuerpo de control IgG1 murino ("IgG Ctrl"), 3 mg/kg de Ab2 ("3 Ab2") o 30 mg/kg de Ab2 ("30 Ab2") por vía intraperitoneal (i. p.) antes de la intervención quirúrgica (barras segunda a quinta de cada gráfico); o ratones a los que se administró PBS y a los que se practicó una laparotomía ("Simulado"; primera barra de cada gráfico).

FIG.17 representa la mediana del volumen tumoral de ratones C57/BL/6 con carcinoma de colon murino MC38 de modelo singénico a los que se administró anticuerpo de control de isotipo IgG1 murino en combinación con anticuerpo de control IgG2a de rata (grupo 1; control); Ab1 en combinación con anticuerpo de control IgG2a de rata (grupo 2); Ab2 en combinación con anticuerpo de control IgG2a de rata (grupo 3); anticuerpo de control IgG1 murino en combinación con anticuerpo anti-PD-1 (grupo 4); Ab1 en combinación con anticuerpo anti-PD-1 (grupo 5); Ab2 en combinación con anticuerpo anti-PD-1 (grupo 6).

FIG.18A-18C muestran la especificidad de unión de anticuerpos monoclonales ejemplares. FIG.18A muestra que Ab1 y Ab2 se unen específicamente a proTGFβ1 medido por ELISA, pero no a proTGFβ2, proTGFβ3 o TGFβ1 maduro. FIG.18B representa un ejemplo de LTBP-proTGFβ1 purificada expresada y purificada para su uso como antígenos para determinar la especificidad de unión de anticuerpos. FIG. 18C representa un ejemplo de un anticuerpo que se une (medido por ELISA) específicamente al complejo LTBP1- proTGFβ1.

FIG. 19 representa una curva de supervivencia de ratas tratadas con control con vehículo (PBS; "Control"); 200 mg/kg de LY2109761; 300 mg/kg de LY2109761; 100 mg/kg de un anticuerpo pan-TGFβ ("Pan-TGFβ Ab"); o 100 mg/kg de Ab2.

FIG.20 representa el peso corporal (media/desviación estándar) de ratas tratadas con control con vehículo (PBS; "Control"); 200 mg/kg de LY2109761; 300 mg/kg de LY2109761; 100 mg/kg de un anticuerpo pan-TGFβ ("Pan-TGFβ Ab"); o 100 mg/kg de Ab2.

FIGs.21A-21C representa el peso corporal de ratas individuales tratadas con control con vehículo (PBS; "Control"), 200 mg/kg de LY2109761, o 300 mg/kg de LY2109761 (FIG.21A); control con vehículo (PBS; "Control"), o 100 mg/kg de un anticuerpo pan-TGFβ ("Pan-TGFβ Ab"); o control con vehículo (PBS; "Control"), o 100 mg/kg de Ab2. FIGs.22A y 22B son gráficos que representan la inhibición del complejo GARP-proTGFβ1 o del complejo LRRC33-proTGFβ1 en células SW480/β6 transfectadas transitoriamente con plásmidos para expresar proTGFβ1 y una molécula presentadora (es decir, GARP o LRRC33) utilizando concentraciones crecientes de cualquiera de los Ab1 (FIG.22A) o Ab2 (FIG.22B). La IC50 (µg/mL) de Ab1 para el complejo GARP-TGFβ1 fue de 0,445, y la IC50 (µg/mL) de Ab1 para el complejo LRRC33-TGFβ1 fue de 1,325.

FIG. 23 representa imágenes de microscopía de secciones teñidas con hematoxilina y eosina de las válvulas cardíacas de ratas tratadas con 200 mg/kg de LY2109761 (panel superior derecho); 100 mg/kg de un anticuerpo pan-TGFβ ("Pan-TGFβ Ab", panel inferior izquierdo); 100 mg/kg de Ab2 (panel inferior derecho), o control no tratado (panel superior izquierdo). Nota: El panel inferior derecho (Ab2) es una sección oblicua que se tiñó más oscura debido al grosor desigual.

DESCRIPCIÓN DETALLADA

[0071] En los mamíferos, la superfamilia del factor de crecimiento transformante beta (TGFP) se compone de al menos 33 productos génicos. Entre ellos figuran las proteínas morfogénicas óseas (BMP), las activinas, los factores de crecimiento y diferenciación (GDF) y las tres isoformas de la familia TGFP: TGFβ1, TGFP2 y TGFP3. Se cree que los TGFβ desempeñan funciones clave en diversos procesos, como la inhibición de la proliferación celular, la remodelación de la matriz extracelular (ECM) y la homeostasis inmunitaria. La importancia de TGFβ1 para la homeostasis de las células T queda demostrada por la observación de que los ratones TGFβ1-/- sobreviven sólo 3-4 semanas, sucumbiendo a un fallo multiorgánico debido a una activación inmunitaria masiva (Kulkarni, A.B., et al., Proc Natl Acad Sci USA, 1993.90(2): p.770-4; Shull, M.M., et al., Nature, 1992.359(6397): p.693-9). Las funciones de TGFβ2 y TGFβ3 están menos claras. Aunque las tres isoformas de TGFP tienen patrones de expresión temporales y espaciales distintos, señalan a través de los mismos receptores, TGFβRI y TGFβRII, aunque en algunos casos, por ejemplo, para la señalización de TGFP2, también se requieren receptores de tipo III como el betaglicano (Feng, X.H. y R. Derynck, Annu Rev Cell Dev Biol, 2005.

21: p. 659-93; Massague, J., Annu Rev Biochem, 1998. 67: p. 753-91). La oligomerización de TGFβRI/II inducida por ligando desencadena la fosforilación de los factores de transcripción SMAD, lo que da lugar a la transcripción de genes diana, como Col1a1, Col3a1, ACTA2 y SERPINE1 (Massague, J., J. Seoane y D. Wotton, Genes Dev, 2005.19(23): p.

2783-810). También se han descrito vías de señalización de TGFP independientes de SMAD, por ejemplo, en el cáncer o en las lesiones aórticas de ratones Marfan (Derynck, R. y Y.E. Zhang, Nature, 2003.425(6958): p.577-84; Holm, T.M., et al., Science, 2011.332(6027): p.358-61).

[0072] La importancia biológica de la vía TGFP en humanos ha sido validada por enfermedades genéticas. La enfermedad de Camurati-Engelman provoca displasia ósea debido a una mutación autosómica dominante en el gen TGFB1, que conduce a la activación constitutiva de la señalización de TGFβ1 (Janssens, K., et al., J Med Genet, 2006.43(1): p.1-11). Los pacientes con síndrome de Loeys/Dietz presentan mutaciones autosómicas dominantes en componentes de la vía de señalización TGFP, que causan aneurisma aórtico, hipertelorismo y úvula bífida (Van Laer, L., H. Dietz y B. Loeys, Adv Exp Med Biol, 2014. 802: p. 95-105). Dado que la desregulación de la vía del TGFP se ha implicado en múltiples enfermedades, se han desarrollado y probado en pacientes varios fármacos dirigidos a la vía del TGFβ, pero con un éxito limitado.

[0073] Los inventores de la presente divulgación razonaron que, aunque las tres isoformas de TGFβ son capaces de señalizar a través de los mismos receptores y transducir los efectores en dirección 3' en células que expresan los receptores, cada isoforma de TGFβ puede generar efectos biológicos distintos in vivo. Además, los inventores contemplan que, al menos en algunas circunstancias, el modo por el que se desencadena la interacción factor de crecimiento-receptor puede proporcionar además especificidad de señalización in vivo. A la luz de este reconocimiento, cabe señalar que los inhibidores de la TGFP descritos en la literatura hasta la fecha carecen de especificidad, como se resume brevemente a continuación.

[0074] Fresolimumab, un anticuerpo monoclonal humanizado que se une a las tres isoformas de TGFP e las inhibe, se ha probado clínicamente en pacientes con glomeruloesclerosis segmentaria focal, melanoma maligno, carcinoma de células renales y esclerosis sistémica (Rice, L.M., et al., J Clin Invest, 2015.125(7): p.2795-807; Trachtman, H., et al., Kidney Int, 2011. 79(11): p. 1236-43; Morris, J.C., et al., PLoS One, 2014. 9(3): p. e90353). Otras empresas han desarrollado anticuerpos monoclonales contra los factores de crecimiento TGFβ con diversos grados de selectividad para las isoformas TGFP. Es probable que estos agentes provoquen toxicidades in vivo a través de la actividad residual contra otros miembros de la familia TGFβ además de TGFβ1. Según el leal saber y entender de los inventores de la presente divulgación, no se ha logrado una especificidad completa para una sola isoforma dirigiéndose al factor de crecimiento maduro, debido al alto grado de identidad de secuencia entre las isoformas.

[0075] Otros enfoques para dirigirse a la vía del TGFβ incluyen ACE-1332, una trampa soluble de ligando TGFβRII-Fc de Acceleron (Yung, L.M., et al., A Am J Respir Crit Care Med, 2016. 194(9): p. 1140-1151), o inhibidores de moléculas pequeñas de la quinasa ALK5, como el galunisertib de Lilly. Mientras que ACE-1332 se une a TGFβ1 y TGFβ3 con una afinidad igualmente alta (Yung, L.M., et al., Am J Respir Crit Care Med, 2016.194(9): p.1140-1151). Los inhibidores de ALK5 bloquean la actividad de todos los factores de crecimiento que señalan a través de TGFR1. Se han detectado toxicidades sustanciales en estudios preclínicos con inhibidores de ALK5 (Anderton, M.J., et al., Toxicol Pathol, 2011.

39(6): p.916-24; Stauber, A., et al., Clinical Toxicology, 2014.4(3): p.1-10), y se requieren sofisticados esquemas clínicos de dosificación para mantener la eficacia y reducir al mismo tiempo los acontecimientos adversos (Herbertz, S., et al., Drug Des Devel Ther, 2015.9: p.4479-99). De hecho, la cuestión de la especificidad de la señalización del TGFβ y su posible efecto sobre la toxicidad observada con los inhibidores del TGFP conocidos no se ha planteado en la mayoría, si no en todos, los fármacos candidatos que intentaban bloquear el TGFβ. Por ejemplo, no se ha abordado en qué medida las toxicidades se deben a la inhibición de TGFβ1 frente a TGFβ2 y/o TGFβ3. Del mismo modo, los modos de activación de TGFβ no se han tenido en cuenta a la hora de diseñar o desarrollar formas de antagonizar la señalización de TGFP.

[0076] Los recientes conocimientos estructurales sobre el mecanismo de activación de TGFβ1 han permitido a los presentes inventores adoptar enfoques novedosos y más específicos para la inhibición de TGFβ (Shi, M., et al., Nature, 2011.474(7351): p.343-9). A diferencia de otras citoquinas, los miembros de la superfamilia TGFβ no se secretan como factores de crecimiento activos, sino como proproteínas diméricas que constan de un prodominio N-terminal y un dominio de factor de crecimiento C-terminal. La escisión del proTGFβ1 por las proteasas furina separa el dominio del factor de crecimiento homodimérico de su predominio, también denominado péptido asociado a la latencia (LAP). Sin embargo, el factor de crecimiento y el LAP permanecen asociados de forma no covalente, formando un complejo latente que es incapaz de unirse a sus receptores e inducir la señalización (FIG. 1). Durante la traducción, el TGFβ1 latente, también denominado complejo latente pequeño (SLC), se une a "moléculas presentadoras" mediante puentes disulfuro, formando el complejo latente grande (LLC). Estas moléculas permiten que proTGFβ1 se presente en contextos celulares o tisulares específicos. Dos cisteínas cerca del extremo N-terminal del TGFβ1 latente se unen a cisteínas situadas adecuadamente en la molécula presentadora. La identidad de la molécula presentadora depende del entorno y del tipo de célula que produce el TGF β1 latente. Por ejemplo, los fibroblastos secretan TGF β1 latente unido a proteínas de unión a TGFP latente (LTBP), que luego se asocia con proteínas de la matriz extracelular (ECM) (es decir, fibronectina, fibrilina-1) para unir TGFP latente a la ECM (Robertson et al. Matrix Biol 47: 44-53 (2015) (FIG. 2A). En la superficie de las células T reguladoras activadas, el TGFβ1 latente está unido covalentemente a la proteína transmembrana GARP (FIG. 2B), y recientemente se ha identificado una proteína estrechamente relacionada con GARP, LRRC33, como molécula presentadora de TGFβ1 en la superficie de monocitos, macrófagos y microglía (Wang, R., et al., Mol Biol Cell, 2012.23(6): p.1129-39 y T.A. Springer, Int. BMP Conference 2016).

[0077] En mamíferos hay cuatro LTBPs conocidas, LTBP1-4, cada una con múltiples variantes de empalme (Robertson, I.B., et al., Matrix Biol, 2015.47: p.44-53). LTBP2 es la única LTBP que no se asocia con TGFβ latente (Saharinen, J. y J. Keski-Oja, Mol Biol Cell, 2000.11(8): p.2691-704). Mientras que la asociación entre LTBP1 o LTBP3 y TGFβ1 latente ha sido bien validada, el papel de LTBP4 en la presentación de TGFβ está menos claro. El complejo con LTBP4 y TGFβ1 latente parece formarse de forma mucho menos eficiente, debido potencialmente a la ausencia de varios residuos cargados negativamente en el dominio de unión a TGFβ de LTBP4 (Saharinen, J. y J. Keski-Oja, Mol Biol Cell, 2000.

11(8): p.2691-704; Chen, Y., et al., J Mol Biol, 2005.345(1): p.175-86). Tanto los ratones LTBP4S-/- como los pacientes con el síndrome de Urban-Rifkin-Davis, que tienen mutaciones nulas en LTBP4, sufren una alteración en el ensamblaje de las fibras elásticas (Urban, Z., et al., Am J Hum Genet, 2009.85(5): p.593-605; Dabovic, B., et al., J Cell Physiol, 2015.

230(1): p. 226-36). Además, mientras que los ratones LTBP4S/- presentan un defecto de septación pulmonar y de elastogénesis, los ratones transgénicos con un LTBP4 que no puede formar un complejo con el TGFβ1 latente no presentan un fenotipo evidente (Dabovic, B., et al., J Cell Physiol, 2015.230(1): p.226-36). No está claro si LTBP4 está directamente implicada en la regulación de TGFβ1 latente al funcionar como molécula presentadora; LTBP4 puede, en cambio, ser necesaria para la correcta formación de fibrillas elásticas en la ECM y su pérdida afectar indirectamente a la activación de TGFβ1 latente a través de defectos en la ECM.

[0078] Varios estudios han arrojado luz sobre los mecanismos de activación de TGFβ1. Se ha demostrado que tres integrinas, αVβ6, αVβ8 y αVβ1, son activadores clave del TGFβ1 latente (Reed, N.I., et al., Sci Transl Med, 2015.7(288): p.288ra79; Travis, M.A. y D. Sheppard, Annu Rev Immunol, 2014.32; p.51-82; Munger, J.S., et al., Cell, 1999.96(3): p.

319-28). Las integrinas αV se unen a la secuencia RGD presente en TGFβ1 y TGFβ1 LAPs con alta afinidad (Dong, X., et al., Nat Struct Mol Biol, 2014.21(12): p.1091-6). Los ratones transgénicos con una mutación en el sitio RGD del TGFβ1 que impide la unión de la integrina, pero no la secreción, fenocopian al ratón TGFβ1-/- (Yang, Z., et al., J Cell Biol, 2007.

176(6): p.787-93). Los ratones que carecen de las integrinas β6 y β8 recapitulan todos los fenotipos esenciales de los ratones sin TGFβ1 y TOPPβ, incluida la inflamación multiorgánica y el paladar hendido, lo que confirma el papel esencial de estas dos integrinas para la activación de TGFβ1 en el desarrollo y la homeostasis (Aluwihare, P., et al., J Cell Sci, 2009.122(Pt 2): p.227-32). La clave para la activación de TGFβ1 latente dependiente de integrina es la unión covalente a las moléculas presentadoras; la interrupción de los enlaces disulfuro entre GARP y TGFβ1 LAP mediante mutagénesis no afecta a la formación del complejo, pero suprime por completo la activación de TGFβ1 por αVβ6 (Wang, R., et al., Mol Biol Cell, 2012. 23(6): p. 1129-39). La reciente estructura del TGFβ1 latente aclara cómo las integrinas permiten la liberación del TGFβ1 activo del complejo latente: el enlace covalente del TGFβ1 latente a su molécula presentadora ancla el TGFβ1 latente, ya sea a la ECM a través de LTBP, o al citoesqueleto a través de GARP o LRRC33. La unión de la integrina a la secuencia RGD provoca un cambio dependiente de la fuerza en la estructura de la LAP, lo que permite que el TGFβ1 activo se libere y se una a los receptores cercanos (Shi, M., et al., Nature, 2011. 474(7351): p. 343-9). La importancia de la activación de TGFβ1 dependiente de integrina en la enfermedad también ha sido bien validada. Un pequeño inhibidor molecular de αVβ1 protege contra la fibrosis pulmonar inducida por bleomicina y la fibrosis hepática inducida por tetracloruro de carbono (Reed, N.I., et al., Sci Transl Med, 2015.7(288): p.288ra79), y el bloqueo de αVβ6 con un anticuerpo o la pérdida de expresión de la integrina β6 suprime la fibrosis pulmonar inducida por bleomicina y la fibrosis inducida por radiación (Munger, J.S., et al., Cell, 1999.96(3): p.319-28); Horan, G.S., et al., Am J Respir Crit Care Med, 2008. 177(1): p. 56-65). Además de las integrinas, se han implicado otros mecanismos de activación de TGFβ1, como la trombospondina-1 y la activación por proteasas como las metaloproteinasas de matriz (MMP), la catepsina D o la calicreína. Sin embargo, la mayoría de estos estudios se realizaron in vitro utilizando proteínas purificadas; existen menos pruebas del papel de estas moléculas a partir de estudios in vivo. La supresión de la trombospondina-1 recapitula algunos aspectos del fenotipo TGFβ1-/- en algunos tejidos, pero no es protectora en la fibrosis pulmonar inducida por bleomicina, que se sabe que depende del TGFβ (Ezzie, M.E., et al., Am J Respir Cell Mol Biol, 2011.44(4): p.556-61). Además, la supresión de las proteasas candidatas no dio lugar a un fenotipo TGFβ1 (Worthington, J.J., J.E. Klementowicz, and M.A. Travis, Trends Biochem Sci, 2011.36(1): p. 47-54). Esto podría explicarse por redundancias o porque estos mecanismos son críticos en enfermedades específicas más que en el desarrollo y la homeostasis.

[0079] El TGFβ se ha implicado en una serie de procesos biológicos, como la fibrosis, la inmunomodulación y la progresión del cáncer. TGFβ1 fue el primer miembro identificado de la superfamilia de proteínas TGFP. Al igual que otros miembros de la superfamilia TGFP, TGFβ1 y las isoformas TOPPβ y TGFP3, se expresan inicialmente como formas proproteicas precursoras inactivas (denominadas proTGFP). Las proteínas TGFP (por ej., TGFβ1, TGFP2 y TGFP3) son escindidas proteolíticamente por proproteína convertasas (por ej., furina) para producir la forma latente (denominada TGFP latente). En algunas formas de realización, una forma proproteica o forma latente de una proteína TGFP (por ej., TGFβ1, TOPPβ y TGFP3) puede denominarse "proteína TGFP pro/latente". TGFβ1 puede presentarse a otras moléculas en complejo con múltiples moléculas incluyendo, por ejemplo, GARP (para formar un complejo GARP-TGFβ1), LRRC33 (para formar un complejo LRRC33-TGFβ1), LTBP1 (para formar un complejo LTBP1-TGFβ1), y/o LTBP3 (para formar un complejo LTBP3-TGFβ1). El TGFβ1 presente en estos complejos puede estar en forma latente (TGFβ1 latente) o en forma precursora (proTGFβ1).

[0080] La presente divulgación está dirigida a inmunoglobulinas, por ej., anticuerpos, o porciones de unión a antígeno de los mismos, que se unen específicamente a (1) una proteína TGFP (por ej., proTGFβ1/TGFβ1 latente, en complejo con una proteína GARP, (2) una proteína TGFP en complejo con una proteína LTBP (por ej., LTBP1 o LTBP3), y/o (3) una proteína TGFP en complejo con una proteína LRRC33. Los anticuerpos, o porciones de unión a antígeno de los mismos divulgados en el presente documento se unen a un epítopo de TGFβ1 que está disponible para la unión por el anticuerpo, o porciones de unión a antígeno de los mismos, cuando el TGFβ1 está presente en un complejo GARP-TGFβ1, un complejo LTBP1-TGFβ1, un complejo LTBP3-TGFβ1, y/o un complejo LRRC33-TGFβ1. Sin querer estar limitado por ninguna teoría particular, la capacidad de los anticuerpos, y porciones de unión a antígeno de los mismos, divulgados en el presente documento para unirse a la proteína TGFP (por ej., TGFβ1, que está en complejo con una proteína GARP, una proteína LTBP, o una proteína LRRC33 permite la orientación de la proteína TGFP de una manera independiente del contexto, y puede ser particularmente adecuada para aplicaciones terapéuticas.

Definiciones

[0081] Para facilitar la comprensión de la divulgación, se definen en primer lugar algunos términos. Estas definiciones deben leerse a la luz del resto de la divulgación y tal como las entiende una persona con conocimientos ordinarios en la técnica. Salvo que se definan de otro modo, todos los términos técnicos y científicos utilizados en el presente documento tienen el mismo significado que comúnmente entiende una persona con conocimientos ordinarios en la técnica. A lo largo de la descripción detallada figuran otras definiciones.

[0082] Tal como se utiliza en el presente documento, el término "unión específica" o "se une específicamente" significa que la interacción del anticuerpo, o la porción de unión a antígeno del mismo, con un antígeno depende de la presencia de una estructura particular (por ej., un determinante antigénico o epítopo). Por ejemplo, el anticuerpo, o la porción de unión a antígeno del mismo, se une a una proteína específica en lugar de a proteínas en general. En algunas formas de realización, un anticuerpo, o porción de unión a antígeno del mismo, se une específicamente a una diana, por ejemplo, TGFβ1, si el anticuerpo tiene una _KDpara la diana de al menos aproximadamente 10^-4M, 10^-5M, 10^-6M, 10^-7M, 10^-8M, 10^-9M, 10^-10M, 10^-11M, 10^-12M, 10^-13M, o menos. En algunas formas de realización, el término "unión específica a un epítopo de TGFβ1", "se une específicamente a un epítopo de TGFβ1", "unión específica a TGFβ1", o "se une específicamente a TGFβ1", tal como se usa en el presente documento, se refiere a un anticuerpo, o porción de unión a antígeno del mismo, que se une a TGFβ1 y tiene una constante de disociación (K_D) de 1,0 x 10-7 M o menos.0 x 10^-7M o menos, según se determina por resonancia de plasmón superficial. En una forma de realización, un anticuerpo, o porción de unión a antígeno del mismo, puede unirse específicamente tanto a ortólogos humanos como no humanos (por ej., ratón) de TGFβ1.

[0083] En algunas formas de realización, la afinidad de unión de un anticuerpo, o porción de unión a antígeno del mismo, a un complejo GARP-TGFβ1, un complejo LTBP1-TGFβ1, un complejo LTBP3-TGFβ1, y/o un complejo LRRC33-TGFβ1 se determina usando un ensayo Octet. En algunas formas de realización, un ensayo Octet es un ensayo que determina uno o más parámetros cinéticos indicativos de la unión entre un anticuerpo y un antígeno. En algunas formas de realización, se utiliza un sistema Octet^®(ForteBio, Menlo Park, CA) para determinar la afinidad de unión de un anticuerpo, o porción de unión a antígeno del mismo, a un complejo GARP-TGFβ1, un complejo LTBβ1-TGFβ1, un complejo LTBP3-TGFβ1, y/o un complejo LRRC33-TGFβ1. Por ejemplo, las afinidades de unión de los anticuerpos pueden determinarse utilizando el sistema de ensayo sin marcador de inmersión y lectura fortéBio Octet QK^eque utiliza interferometría de biocapa. En algunas formas de realización, los antígenos se inmovilizan en biosensores (por ej., biosensores recubiertos de estreptavidina) y los anticuerpos y complejos (por ej., complejos GARP-TGFβ1 biotinilados y complejos LTBP-TGFβ1 biotinilados) se presentan en solución a alta concentración (50 µg/mL) para medir las interacciones de unión. En algunas formas de realización, la afinidad de unión de un anticuerpo, o porción de unión a antígeno del mismo, a un complejo GARP-TGFβ1, un complejo LTBP1-TGFβ1, un complejo LTBP3-TGFβ1, y/o un complejo LRRC33-TGFβ1 se determina usando el protocolo descrito en la Tabla 6.

[0084] Tal como se utiliza en el presente documento, el término "complejo GARP-TGFβ1" se refiere a un complejo proteico que comprende una forma proproteica o forma latente de una proteína del factor de crecimiento transformante-β1 (TGFβ1) y una proteína predominante de repeticiones de glicoproteína-A (GARP). En algunas formas de realización, una forma proproteica o forma latente de la proteína TGFβ1 puede denominarse "proteína proTGFβ1/TGFβ1 latente". En algunas formas de realización, un complejo GARP-TGFβ1 comprende GARP unido covalentemente con proTGFβ1/TGFβ1 latente a través de uno o más enlaces disulfuro. En otras formas de realización, un complejo GARP-TGFβ1 comprende GARP unida de forma no covalente con proTGFβ1/TGFβ1 latente. En algunas formas de realización, un complejo GARP-TGFβ1 es un complejo que se produce de forma natural, por ejemplo, un complejo GARP-TGFβ1 en una célula. Un complejo GARP-TGFβ1 ejemplar se muestra en la FIG.3.

[0085] Tal como se utiliza en el presente documento, el término "complejo LTBP1-TGFβ1" se refiere a un complejo proteico que comprende una forma proproteica o forma latente de la proteína factor de crecimiento transformante-β1 (TGFβ1) y una proteína 1 de unión a TGF-beta latente (LTBP1). En algunas formas de realización, un complejo LTBP1-TGFβ1 comprende LTBP1 unido covalentemente con proTGFβ1/TGFβ1 latente a través de uno o más enlaces disulfuro. En otras formas de realización, un complejo LTBP1-TGFβ1 comprende LTBP1 unido de forma no covalente con proTGFβ1/TGFβ1 latente. En algunas formas de realización, un complejo LTBP1-TGFβ1 es un complejo que se produce de forma natural, por ejemplo, un complejo LTBP1-TGFβ1 en una célula. Un complejo LTBP1-TGFβ1 ejemplar se muestra en la FIG.3.

[0086] Tal como se útiliza en el presente documento, el término "complejo LTBP3-TGFβ1" se refiere a un complejo proteico que comprende una forma proproteica o forma latente de la proteína del factor de crecimiento transformante-β1 (TGFβ1) y una proteína de unión a TGF-beta 1 (LTBP3) latente. En algunas formas de realización, un complejo LTBP3-TGFβ1 comprende LTBP3 unido covalentemente con proTGFβ1/TGFβ1 latente a través de uno o más enlaces disulfuro. En otras formas de realización, un complejo LTBP3-TGFβ1 comprende LTBP1 unido de forma no covalente con proTGFβ1/TGFβ1 latente. En algunas formas de realización, un complejo LTBP3-TGFβ1 es un complejo natural, por ejemplo, un complejo LTBP3-TGFβ1 en una célula. Un complejo LTBP3-TGFβ1 ejemplar se muestra en la FIG.3.

[0087] Tal como se utiliza en el presente documento, el término "complejo LRRC33-TGFβ1" se refiere a un complejo entre una forma proproteica o forma latente de la proteína factor de crecimiento transformante-β1 (TGFβ1) y una proteína 33 que contiene repeticiones ricas en leucina (LRRC33; también conocida como regulador negativo de especies reactivas de oxígeno o NRROS). En algunas formas de realización, un complejo LRRC33-TGFβ1 comprende LRRC33 unido covalentemente con proTGFβ1/TGFβ1 latente a través de uno o más enlaces disulfuro. En otras formas de realización, un complejo LRRC33-TGFβ1 comprende LRRC33 unido de forma no covalente con proTGFβ1/TGFβ1 latente. En algunas formas de realización, un complejo LRRC33-TGFβ1 es un complejo que se produce de forma natural, por ejemplo, un complejo LRRC33-TGFβ1 en una célula.

[0088] El término "anticuerpo" se refiere a una molécula de inmunoglobulina que se une específicamente a un antígeno diana, e incluye, por ejemplo, anticuerpos quiméricos, humanizados, totalmente humanos y biespecíficos. Un anticuerpo intacto comprenderá generalmente al menos dos cadenas pesadas de longitud completa y dos cadenas ligeras de longitud completa, pero en algunos casos puede incluir menos cadenas, como los anticuerpos que se producen naturalmente en los camélidos, que pueden comprender sólo cadenas pesadas. Los anticuerpos pueden derivarse únicamente de una única fuente, o pueden ser "quiméricos", es decir, diferentes porciones del anticuerpo pueden derivarse de dos anticuerpos diferentes. Los anticuerpos, o porciones de los mismos que se unen a antígenos, pueden producirse en hibridomas, mediante técnicas de ADN recombinante o por escisión enzimática o química de anticuerpos intactos. El término anticuerpos, tal como se utiliza aquí, incluye anticuerpos monoclonales, anticuerpos biespecíficos, minicuerpos, anticuerpos de dominio, anticuerpos sintéticos (en ocasiones denominados aquí "miméticos de anticuerpos"), anticuerpos quiméricos, anticuerpos humanizados, anticuerpos humanos, fusiones de anticuerpos (en ocasiones denominados aquí "conjugados de anticuerpos"), respectivamente. En algunas formas de realización, el término también engloba pepticuerpos.

[0089] Las unidades estructurales de anticuerpos de origen natural comprenden típicamente un tetrámero. Cada uno de estos tetrámeros se compone típicamente de dos pares idénticos de cadenas polipeptídicas, cada par con una cadena "ligera" de longitud completa (en ciertas formas de realización, aproximadamente 25 kDa) y una cadena "pesada" de longitud completa (en ciertas formas de realización, aproximadamente 50-70 kDa). La porción aminoterminal de cada cadena suele incluir una región variable de entre 100 y 110 aminoácidos o más que suele ser responsable del reconocimiento del antígeno. La porción carboxi-terminal de cada cadena suele definir una región constante que puede ser responsable de la función efectora. Las cadenas ligeras de los anticuerpos humanos suelen clasificarse en cadenas ligeras kappa y lambda. Las cadenas pesadas suelen clasificarse en mu, delta, gamma, alfa o épsilon, y definen el isotipo del anticuerpo. Un anticuerpo puede ser de cualquier tipo (por ej., IgM, IgD, IgG, IgA, IgY e IgE) y clase (por ej., IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgM1, IgM2, IgA1 e IgA2). En las cadenas ligeras y pesadas de longitud completa, las regiones variable y constante suelen estar unidas por una región "J" de unos 12 o más aminoácidos, y la cadena pesada también incluye una región "D" de unos 10 aminoácidos más (véase, por ej. Fundamental Immunology, Ch.7 (Paul, W., ed., 2ª ed., Ed. Raven Press, N.Y. (1989))). Las regiones variables de cada par de cadenas ligeras/pesadas suelen formar el sitio de unión al antígeno.

[0090] Las regiones variables exhiben típicamente la misma estructura general de regiones marco (FR) relativamente conservadas unidas por tres regiones hipervariables, también llamadas regiones determinantes de la complementariedad o CDR. Las CDR de las dos cadenas de cada par suelen estar alineadas por las regiones marco, lo que puede permitir la unión a un epítopo específico. De N-terminal a C-terminal, las regiones variables de las cadenas ligera y pesada comprenden típicamente los dominios FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3 y FR4. La asignación de aminoácidos a cada dominio suele ajustarse a las definiciones de Kabat Sequences of Proteins of Immunological Interest (National Institutes of Health, Bethesda, Md. (1987 y 1991)), o Chothia & Lesk (1987) J. Mol. Biol.196: 901-917; Chothia et al. (1989) Nature 342: 878-883. Las CDR de una cadena ligera también pueden denominarse CDR-L1, CDR-L2 y CDR-L3, y las CDR de una cadena pesada también pueden denominarse CDR-H1, CDR-H2 y CDR-H3. En algunas formas de realización, un anticuerpo puede comprender un pequeño número de deleciones de aminoácidos del extremo carboxilo de la(s) cadena(s) pesada(s). En algunas formas de realización, un anticuerpo comprende una cadena pesada que tiene deleciones de 1-5 aminoácidos en el extremo carboxilo de la cadena pesada. En ciertas formas de realización, la delineación definitiva de una CDR y la identificación de los residuos que comprenden el sitio de unión de un anticuerpo se logra resolviendo la estructura del anticuerpo y/o resolviendo la estructura del complejo anticuerpo-ligando. En ciertas formas de realización, esto puede lograrse mediante una variedad de técnicas conocidas por los expertos en la materia, como la cristalografía de rayos X. En algunas formas de realización, se pueden emplear varios métodos de análisis para identificar o aproximar las regiones CDR. Algunos ejemplos de estos métodos son, entre otros, la definición de Kabat, la definición de Chothia, la definición de AbM y la definición de contacto.

[0091] Un "sitio funcional de unión a antígeno" de una proteína de unión es aquel que puede unirse a una diana, antígeno o ligando. La afinidad de unión al antígeno del sitio de unión al antígeno no es necesariamente tan fuerte como la proteína de unión parental de la que se deriva el sitio de unión al antígeno, pero la capacidad de unión al antígeno debe ser medible utilizando cualquiera de una variedad de métodos conocidos para evaluar la unión de la proteína de unión a un antígeno. Además, la afinidad de unión a antígeno de cada uno de los sitios de unión a antígeno de una proteína de unión multiespecífica no tiene por qué ser cuantitativamente la misma.

[0092] El término "región variable" o "dominio variable" se refiere a una porción de las cadenas ligera y/o pesada de un anticuerpo, que típicamente incluye aproximadamente los 120 a 130 aminoácidos aminoterminales en la cadena pesada y aproximadamente 100 a 110 aminoácidos aminoterminales en la cadena ligera. En ciertas formas de realización, las regiones variables de diferentes anticuerpos difieren ampliamente en la secuencia de aminoácidos, incluso entre anticuerpos de la misma especie. La región variable de un anticuerpo suele determinar la especificidad de un anticuerpo concreto para su diana.

[0093] Un dominio constante de inmunoglobulina se refiere a un dominio constante de cadena pesada o ligera. Las secuencias de aminoácidos del dominio constante de la cadena pesada y la cadena ligera de la IgG humana son conocidas en la técnica.

[0094] El término "competir" cuando se usa en el contexto de proteínas de unión a antígeno (por ej., un anticuerpo o una porción de unión a antígeno del mismo) que compiten por el mismo epítopo significa competencia entre proteínas de unión a antígeno según se determina mediante un ensayo en el que la proteína de unión a antígeno que se está probando impide o inhibe (por ej., reduce) la unión específica de una proteína de unión a antígeno de referencia a un antígeno común (por ej., TGFβ1 o un fragmento del mismo). Se pueden utilizar numerosos tipos de ensayos de unión competitiva para determinar si una proteína de unión a antígeno compite con otra, por ejemplo: radioinmunoensayo (RIA) directo o indirecto en fase sólida, enzimoinmunoensayo (EIA) directo o indirecto en fase sólida, ensayo de competición en sándwich; EIA directo de biotina-avidina en fase sólida; ensayo marcado directo en fase sólida, y ensayo marcado directo en sándwich en fase sólida. Normalmente, cuando una proteína de unión a antígeno competidora está presente en exceso, inhibirá (por ej., reducirá) la unión específica de una proteína de unión a antígeno de referencia a un antígeno común en al menos un 40-45%, 45-50%, 50-55%, 55-60%, 60-65%, 65-70%, 70-75% o 75% o más. En algunos casos, la unión se inhibe al menos en un 80-85%, 85-90%, 90-95%, 95-97% o 97% o más.

[0095] El término "antígeno" se refiere a una estructura molecular que proporciona un epítopo, por ejemplo, una molécula o una porción de una molécula, o un complejo de moléculas o porciones de moléculas, capaz de ser unido por un agente de unión selectiva, como una proteína de unión a antígeno (incluyendo, por ej. un anticuerpo). Así, un agente de unión selectiva puede unirse específicamente a un antígeno formado por dos o más componentes en un complejo. En algunas formas de realización, el antígeno puede utilizarse en un animal para producir anticuerpos capaces de unirse a dicho antígeno. Un antígeno puede poseer uno o más epítopos capaces de interactuar con diferentes proteínas de unión a antígenos, por ejemplo, anticuerpos.

[0096] Tal como se utiliza en el presente documento, el término "CDR" se refiere a la región determinante de la complementariedad dentro de las secuencias variables de anticuerpos. Hay tres CDR en cada una de las regiones variables de la cadena pesada y la cadena ligera, que se designan CDR1, CDR2 y CDR3, para cada una de las regiones variables. El término "conjunto de CDR", tal como se utiliza en el presente documento, se refiere a un grupo de tres CDR que se encuentran en una única región variable que puede unirse al antígeno. Los límites exactos de estas CDR se han definido de forma diferente según los distintos sistemas. El sistema descrito por Kabat (Kabat et al. (1987; 1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest (National Institutes of Health, Bethesda, Md.) no sólo proporciona un sistema de numeración de residuos inequívoco aplicable a cualquier región variable de un anticuerpo, sino que también proporciona límites de residuos precisos que definen las tres CDR. Estas CDR pueden denominarse CDR de Kabat. Chothia y colaboradores (Chothia & Lesk (1987) J. Mol. Biol.196: 901-917; y Chothia et al. (1989) Nature 342: 877-883) descubrieron que ciertas subporciones dentro de las CDR de Kabat adoptan conformaciones del esqueleto peptídico casi idénticas, a pesar de tener una gran diversidad a nivel de la secuencia de aminoácidos. Estas subporciones se designaron como L1, L2 y L3 o H1, H2 y H3, donde la "L" y la "H" designan las regiones de la cadena ligera y de la cadena pesada, respectivamente. Estas regiones pueden denominarse CDR de Chothia, cuyos límites se solapan con las CDR de Kabat. Otros límites que definen CDR que se solapan con las CDR de Kabat han sido descritos por Padlan (1995) FASEB J.9: 133-139 and MacCallum (1996) J. Mol. Biol.262(5): 732-45. Otras definiciones de los límites de las CDR pueden no seguir estrictamente uno de estos sistemas, pero coincidirán con las CDR de Kabat, aunque pueden acortarse o alargarse a la luz de predicciones o resultados experimentales que demuestren que determinados residuos o grupos de residuos, o incluso CDR enteras, no influyen significativamente en la unión al antígeno. Los métodos utilizados en el presente documento pueden utilizar CDR definidos de acuerdo con cualquiera de estos sistemas, aunque ciertas formas de realización utilizan CDR definidos por Kabat o Chothia.

[0097] Los términos "cristal" y "cristalizado", tal como se utilizan en el presente documento, se refieren a una proteína de unión (por ej., un anticuerpo), o a una porción de unión a antígeno de la misma, que existe en forma de cristal. Los cristales son una forma del estado sólido de la materia, que se distingue de otras formas como el estado sólido amorfo o el estado cristalino líquido. Los cristales se componen de matrices tridimensionales regulares y repetitivas de átomos, iones, moléculas (por ej., proteínas como los anticuerpos) o conjuntos moleculares (por ej., complejos antígeno/anticuerpo). Estas matrices tridimensionales se organizan según relaciones matemáticas específicas bien conocidas en este campo. La unidad fundamental, o bloque de construcción, que se repite en un cristal se denomina unidad asimétrica. La repetición de la unidad asimétrica en una disposición que se ajusta a una simetría cristalográfica determinada y bien definida proporciona la "celda unitaria" del cristal. La repetición de la celda unitaria mediante traslaciones regulares en las tres dimensiones proporciona el cristal. Véase Giege, R. y Ducruix, A. Barrett, Crystallization of Nucleic Acids and Proteins, a Practical Approach, 2nd ea., pp.201-16, Oxford University Press, Nueva York, Nueva York, (1999).

[0098] El término "epítopo" incluye cualquier determinante molecular (por ej., determinante polipeptídico) que pueda unirse específicamente a un agente de unión, inmunoglobulina o receptor de células T. En ciertas formas de realización, los determinantes epitópicos incluyen agrupaciones superficiales químicamente activas de moléculas, como aminoácidos, cadenas laterales de azúcar, fosforilo o sulfonilo, y, en ciertas formas de realización, pueden tener características estructurales tridimensionales específicas, y/o características de carga específicas. Un epítopo es una región de un antígeno unida a una proteína de unión. Así pues, un epítopo consiste en los residuos de aminoácidos de una región de un antígeno (o fragmento del mismo) que se sabe que se une al sitio complementario del compañero de unión específico. Un fragmento antigénico puede contener más de un epítopo. En ciertas formas de realización, un anticuerpo es capaz de unirse específicamente a un antígeno cuando reconoce su antígeno diana en una mezcla compleja de proteínas y/o macromoléculas. Por ejemplo, se dice que los anticuerpos "se enlazan al mismo epítopo" si los anticuerpos compiten entre sí (uno impide la unión o el efecto modulador del otro). Además, las definiciones estructurales de los epítopos (solapamiento, similares, idénticos) son informativas, pero las definiciones funcionales suelen ser más relevantes, ya que engloban parámetros estructurales (unión) y funcionales (modulación, competencia).

[0099] Los términos "tratar" y "tratamiento" incluyen tratamientos terapéuticos, tratamientos profilácticos y aplicaciones en las que se reduce el riesgo de que un sujeto desarrolle un trastorno u otro factor de riesgo. El tratamiento no requiere la curación completa de un trastorno y abarca las formas en que se reducen los síntomas o los factores de riesgo subyacentes.

[0100] Pueden utilizarse técnicas estándar para el ADN recombinante, la síntesis de oligonucleótidos y el cultivo y transformación de tejidos (por ej., electroporación, lipofección). Las reacciones enzimáticas y las técnicas de purificación pueden realizarse de acuerdo con las especificaciones del fabricante o como se hace habitualmente en la técnica o como se describe en el presente documento. Las técnicas y procedimientos anteriores pueden llevarse a cabo generalmente de acuerdo con métodos convencionales bien conocidos en la técnica y como se describe en diversas referencias generales y más específicas que se citan y discuten a lo largo de la presente especificación. Véase, por ej., Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual (2a ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (1989)). A menos que se proporcionen definiciones específicas, las nomenclaturas utilizadas en relación con los procedimientos y técnicas de laboratorio de química analítica, química orgánica sintética y química medicinal y farmacéutica descritos en el presente documento son las conocidas y de uso común en la técnica. Las técnicas estándar pueden utilizarse para síntesis químicas, análisis químicos, preparación, formulación y administración de fármacos y tratamiento de pacientes.

[0101] Los términos "porción de unión a antígeno" o "fragmento de unión a antígeno" de un anticuerpo, tal como se utilizan en el presente documento, se refieren a uno o más fragmentos de un anticuerpo que retienen la capacidad de unirse específicamente a un antígeno (por ej., TGFβ1). Las porciones de unión a antígeno incluyen, pero no se limitan a, cualquier polipéptido o glicoproteína natural, obtenible enzimáticamente, sintético o modificado genéticamente que se una específicamente a un antígeno para formar un complejo. En algunas formas de realización, una porción de unión a antígeno de un anticuerpo puede derivarse, por ej., de moléculas de anticuerpo completas utilizando cualquier técnica estándar adecuada, como la digestión proteolítica o técnicas de ingeniería genética recombinante que impliquen la manipulación y expresión de ADN que codifique dominios variables y opcionalmente constantes de anticuerpos. Ejemplos no limitantes de porciones de unión a antígeno incluyen: (i) fragmentos Fab, un fragmento monovalente formado por los dominios VL, VH, CL y CH1; (ii) fragmentos F(ab')2, un fragmento bivalente formado por dos fragmentos Fab unidos por un puente disulfuro en la región bisagra; (iii) fragmentos Fd formados por los dominios VH y CH1; (iv) fragmentos Fv formados por los dominios VL y VH de un solo brazo de un anticuerpo; (v) moléculas Fv de cadena única (scFv) (véanse, e.g., Bird et al. (1988) SCIENCE 242:423-426; y Huston et al. (1988) PROC. NAT'L ACAD. SCI. USA 85:5879-5883); (vi) fragmentos dAb (véase, por ej., Ward et al. (1989) NATURE 341: 544-546); y (vii) unidades mínimas de reconocimiento consistentes en los residuos de aminoácidos que imitan la región hipervariable de un anticuerpo (por ej., una región aislada determinante de la complementariedad (CDR)). También se incluyen otras formas de anticuerpos de cadena simple, como los diacuerpos. El término porción de unión a antígeno de un anticuerpo incluye un "fragmento Fab de cadena simple" también conocido como "scFab", que comprende un dominio variable de cadena pesada de anticuerpo (VH), un dominio constante de anticuerpo 1 (CH1), un dominio variable de cadena ligera de anticuerpo (VL), un dominio constante de cadena ligera de anticuerpo (CL) y un enlazador, en el que dichos dominios de anticuerpo y dicho enlazador tienen uno de los siguientes órdenes en dirección N-terminal a C-terminal: a) VH-CH1-enlazador-VL-CL, b) VL-CL-enlazador-VH-CH1, c) VH-CL-enlazador-VL-CH1 o d) VL-CH1-enlazador-VH-CL; y en el que dicho enlazador es un polipéptido de al menos 30 aminoácidos, preferentemente entre 32 y 50 aminoácidos.

[0102] Un "anticuerpo aislado", tal como se utiliza aquí, se refiere a un anticuerpo que está sustancialmente libre de otros anticuerpos que tienen diferentes especificidades antigénicas. En algunas formas de realización, un anticuerpo aislado está sustancialmente libre de otro material celular y/o sustancias químicas.

[0103] Un anticuerpo "madurado por afinidad" es un anticuerpo con una o más alteraciones en una o más CDRs del mismo, que resultan en una mejora de la afinidad del anticuerpo por el antígeno en comparación con un anticuerpo parental, que no posee dicha(s) alteración(es). Los anticuerpos madurados por afinidad ejemplares tendrán afinidades nanomolares o incluso picomolares por el antígeno diana. Los anticuerpos madurados por afinidad se producen mediante procedimientos conocidos en la técnica. Marks et al. (1992) Bio/Technology 10: 779-783 describe la maduración de la afinidad mediante la reorganización de los dominios VH y VL. La mutagénesis aleatoria de CDR y/o residuos marco se describe en Barbas, et al. (1994) Proc Nat. Acad. Sci. USA 91.3809-3813; Schier et al. (1995) Gene 169: 147- 155; Yelton et al., (1995) J. Immunol. 155: 1994-2004; Jackson et al. (1995) J. Immunol. 154(7): 3310-9; y Hawkins et al. (1992) J. Mol. Biol.226: 889-896; y la mutación selectiva en posiciones de mutagénesis selectiva, contacto o hipermutación con un residuo de aminoácido potenciador de la actividad se describe en Patente de EEUU N.º 6.914.128.

[0104] El término "anticuerpo injertado con CDR" se refiere a anticuerpos, que comprenden secuencias de región variable de cadena pesada y ligera de una especie, pero en los que las secuencias de una o más de las regiones CDR de VH y/o VL se sustituyen por secuencias CDR de otra especie, como los anticuerpos que tienen regiones variables de cadena pesada y ligera murinas en las que una o más de las CDR murinas (por ej., CDR3) se ha sustituido por secuencias CDR humanas.

[0105] El término "anticuerpo quimérico" se refiere a anticuerpos que comprenden secuencias de región variable de cadena pesada y ligera de una especie y secuencias de región constante de otra especie, como los anticuerpos que tienen regiones variables de cadena pesada y ligera murinas unidas a regiones constantes humanas.

[0106] El término "anticuerpo humano", tal como se utiliza aquí, pretende incluir anticuerpos que tienen regiones variables y constantes derivadas de secuencias de inmunoglobulina de la línea germinal humana. Los anticuerpos humanos de la presente divulgación pueden incluir residuos de aminoácidos no codificados por secuencias de inmunoglobulina de línea germinal humana (por ej., mutaciones introducidas por mutagénesis aleatoria o específica de sitio in vitro o por mutación somática in vivo), por ejemplo en las CDR y en particular en la CDR3. Sin embargo, el término "anticuerpo humano", tal como se utiliza en el presente documento, no pretende incluir anticuerpos en los que secuencias CDR derivadas de la línea germinal de otra especie de mamífero, como el ratón, se han injertado en secuencias marco humanas.

[0107] El término "anticuerpo humanizado" se refiere a anticuerpos que comprenden secuencias de región variable de cadena pesada y ligera de una especie no humana (por ej., un ratón) pero en los que al menos una parte de la secuencia VH y/o VL se ha alterado para ser más "parecida a la humana", es decir, más similar a las secuencias variables de línea germinal humana. Un tipo de anticuerpo humanizado es un anticuerpo CDR-injertado, en el que se introducen secuencias CDR humanas en secuencias VH y VL no humanas para sustituir las correspondientes secuencias CDR no humanas. También "anticuerpo humanizado" es un anticuerpo, o una variante, derivado, análogo o fragmento del mismo, que se une inmunoespecíficamente a un antígeno de interés y que comprende una región FR que tiene sustancialmente la secuencia de aminoácidos de un anticuerpo humano y una región CDR que tiene sustancialmente la secuencia de aminoácidos de un anticuerpo no humano. Como se utiliza en el presente documento, el término "sustancialmente" en el contexto de una CDR se refiere a una CDR que tiene una secuencia de aminoácidos al menos 80%, al menos 85%, al menos 90%, al menos 95%, al menos 98% o al menos 99% idéntica a la secuencia de aminoácidos de una CDR de un anticuerpo no humano. Un anticuerpo humanizado comprende sustancialmente la totalidad de al menos uno, y típicamente dos, dominios variables (Fab, Fab', F(ab')2, FabC, Fv) en los que todas o sustancialmente todas las regiones CDR corresponden a las de una inmunoglobulina no humana (es decir, anticuerpo donante) y todas o sustancialmente todas las regiones FR son las de una secuencia consenso de inmunoglobulina humana. En una forma de realización, un anticuerpo humanizado también comprende al menos una porción de una región Fc de inmunoglobulina, típicamente la de una inmunoglobulina humana. En algunas formas de realización, un anticuerpo humanizado contiene la cadena ligera así como al menos el dominio variable de una cadena pesada. El anticuerpo también puede incluir las regiones CH1, bisagra, CH2, CH3 y CH4 de la cadena pesada. En algunas formas de realización, un anticuerpo humanizado sólo contiene una cadena ligera humanizada. En algunas formas de realización, un anticuerpo humanizado sólo contiene una cadena pesada humanizada. En determinadas formas de realización, un anticuerpo humanizado sólo contiene un dominio variable humanizado de una cadena ligera y/o una cadena pesada humanizada.

[0108] Tal como se utiliza en el presente documento, el término "marco" o "secuencia marco" se refiere a las secuencias restantes de una región variable menos las CDR. Dado que la definición exacta de una secuencia CDR puede ser determinada por diferentes sistemas, el significado de una secuencia marco está sujeto a interpretaciones correspondientemente diferentes. Las seis CDR (CDR-L1, -L2, y -L3 de la cadena ligera y CDR-H1, -H2, y -H3 de la cadena pesada) también dividen las regiones marco de la cadena ligera y de la cadena pesada en cuatro subregiones (FR1, FR2, FR3 y FR4) en cada cadena, en las que CDR1 se sitúa entre FR1 y FR2, CDR2 entre FR2 y FR3, y CDR3 entre FR3 y FR4. Sin especificar las subregiones concretas como FR1, FR2, FR3 o FR4, una región marco, como la denominan otros, representa los FR combinados dentro de la región variable de una única cadena de inmunoglobulina natural. En el presente documento, una FR representa una de las cuatro subregiones, y FRs representa dos o más de las cuatro subregiones que constituyen una región marco.

[0109] Tal como se utiliza en el presente documento, el término "gen de anticuerpo de línea germinal" o "fragmento de gen" se refiere a una secuencia de inmunoglobulina codificada por células no linfoides que no han sufrido el proceso de maduración que conduce al reordenamiento genético y la mutación para la expresión de una inmunoglobulina particular (véase, por ejemplo, Shapiro et al. (2002) Crit. Rev. Immunol.22(3): 183-200; Marchalonis et al. (2001) Adv. Exp. Med. Biol.484: 13-30). Una de las ventajas proporcionadas por diversas formas de realización de la presente divulgación se deriva del reconocimiento de que los genes de anticuerpos de línea germinal tienen más probabilidades que los genes de anticuerpos maduros de conservar estructuras de secuencias de aminoácidos esenciales características de los individuos de la especie, por lo que es menos probable que se reconozcan como de origen extraño cuando se utilizan terapéuticamente en esa especie.

[0110] Tal como se utiliza aquí, el término "neutralizante" se refiere a contrarrestar la actividad biológica de un antígeno cuando una proteína de unión se une específicamente al antígeno. En una forma de realización, la proteína de unión neutralizante se une al antígeno/destino, por ej., citoquina, quinasa, factor de crecimiento, proteína de superficie celular, proteína soluble, fosfatasa o ligando receptor, y reduce su actividad biológica en al menos un 20%, 40%, 60%, 80%, 85%, 90% o 95%.96%, 97%.98%, 99% o más.

[0111] El término "proteína de unión" como se usa aquí incluye cualquier polipéptido que se une específicamente a un antígeno (por ejemplo, TGFβ1), incluyendo, pero no limitado a, un anticuerpo, o porciones de unión a antígeno del mismo, un DVD-IgTM, un TVD-Ig, un RAb-Ig, un anticuerpo biespecífico y un anticuerpo específico dual.

[0112] El término "anticuerpo monoclonal" o "mAb" cuando se utiliza en un contexto de una composición que comprende el mismo puede referirse a una preparación de anticuerpo obtenida a partir de una población de anticuerpos sustancialmente homogéneos, es decir, los anticuerpos individuales que comprenden la población son idénticos excepto por posibles mutaciones naturales que pueden estar presentes en cantidades menores. Los anticuerpos monoclonales son altamente específicos, ya que se dirigen contra un único antígeno. Además, a diferencia de las preparaciones de anticuerpos policlonales que suelen incluir diferentes anticuerpos dirigidos contra diferentes determinantes (epítopos), cada mAb está dirigido contra un único determinante del antígeno. El modificador "monoclonal" no debe interpretarse como un requisito para la producción del anticuerpo mediante un método concreto.

[0113] El término "anticuerpo humano recombinante", tal como se utiliza en el presente documento, pretende incluir todos los anticuerpos humanos que se preparan, expresan, crean o aíslan por medios recombinantes, como los anticuerpos expresados utilizando un vector de expresión recombinante transfectado en una célula huésped (descrito con más detalle en la Sección II C, más adelante), anticuerpos aislados de una biblioteca de anticuerpos humanos recombinantes combinatoria (Hoogenboom, H.R. (1997) TIB Tech. 15: 62-70; Azzazy, H. y Highsmith, W.E. (2002) Clin. Biochem. 35: 425-445; Gavilondo, J.V. and Larrick, J.W. (2002) BioTechniques 29: 128-145; Hoogenboom, H. y Chames, P. (2000) Immunol. Today 21: 371-378), anticuerpos aislados de un animal (por ej., un ratón) transgénico para genes de inmunoglobulina humana (véase, Taylor, L. D. et al. (1992) Nucl. Acids Res.20: 6287-6295; Kellermann, S-A. and Green, L.L. (2002) Cur. Opin. en Biotechnol. 13: 593-597; Little, M. et al. (2000) Immunol. Today 21: 364-370) o anticuerpos preparados, expresados, creados o aislados por cualquier otro medio que implique el empalme de secuencias genéticas de inmunoglobulina humana con otras secuencias de ADN. Dichos anticuerpos humanos recombinantes tienen regiones variables y constantes derivadas de secuencias de inmunoglobulinas de la línea germinal humana. En ciertas formas de realización, sin embargo, dichos anticuerpos humanos recombinantes se someten a mutagénesis in vitro (o, cuando se utiliza un animal transgénico para secuencias Ig humanas, a mutagénesis somática in vivo ) y, por tanto, las secuencias de aminoácidos de las regiones VH y VL de los anticuerpos recombinantes son secuencias que, aunque derivadas de y relacionadas con secuencias VH y VL de la línea germinal humana, pueden no existir de forma natural dentro del repertorio de la línea germinal de anticuerpos humanos in vivo.

[0114] Como se usa aquí, "Inmunoglobulina de Dominio Variable Dual" o "DVD-IgTM" y similares incluyen proteínas de unión que comprenden un polipéptido DVD de cadena pesada emparejado y un polipéptido DVD de cadena ligera con cada cadena pesada y ligera emparejada proporcionando dos sitios de unión a antígeno. Cada sitio de unión incluye un total de 6 CDR implicadas en la unión al antígeno por sitio de unión al antígeno. Un DVD-IgTM suele tener dos brazos unidos entre sí al menos en parte por dimerización de los dominios CH3, siendo cada brazo del DVD biespecífico, lo que proporciona una inmunoglobulina con cuatro sitios de unión. DVD-IgTM figuran en la Publicación de Patente de EE.UU. Nº 2010/0260668 y 2009/0304693;

[0115] Tal como se utiliza en el presente documento, la "inmunoglobulina de triple dominio variable" o "TVD-Ig" y similares son proteínas de unión que comprenden un polipéptido de proteína de unión a TVD de cadena pesada emparejado y un polipéptido de proteína de unión a TVD de cadena ligera con cada cadena pesada y ligera emparejada que proporciona tres sitios de unión a antígeno. Cada sitio de unión incluye un total de 6 CDR implicadas en la unión al antígeno por sitio de unión al antígeno. Una proteína de unión a TVD puede tener dos brazos unidos entre sí al menos en parte por dimerización de los dominios CH3, siendo cada brazo de la proteína de unión a TVD triespecífico, proporcionando una proteína de unión con seis sitios de unión.

[0116] Tal como se utiliza en el presente documento, la "Inmunoglobulina Receptor-Anticuerpo" o "RAb-Ig" y similares son proteínas de unión que comprenden un polipéptido RAb de cadena pesada y un polipéptido RAb de cadena ligera, que juntos forman tres sitios de unión a antígenos en total. Un sitio de unión a antígeno se forma por el emparejamiento de los dominios variables de anticuerpo pesado y ligero presentes en cada uno de los polipéptidos RAb de cadena pesada y RAb de cadena ligera para formar un único sitio de unión con un total de 6 CDR que proporcionan un primer sitio de unión a antígeno. Tanto el polipéptido RAb de cadena pesada como el polipéptido RAb de cadena ligera incluyen una secuencia receptora que se une independientemente a un ligando que proporciona los sitios de unión al segundo y tercer "antígeno". Una RAb-Ig suele tener dos brazos unidos entre sí al menos en parte por dimerización de los dominios CH3, siendo cada brazo de la RAb-Ig triespecífico, lo que proporciona una inmunoglobulina con seis sitios de unión. Los RAb-Igs se describen en la publicación de solicitud de patente estadounidense nº 2002/0127231.

[0117] El término "anticuerpo biespecífico", tal como se utiliza en el presente documento, y diferenciado de una "proteína de unión a medio Ig biespecífica" o "proteína de unión a (medio Ig) biespecífica", se refiere a anticuerpos de longitud completa que se generan mediante la tecnología de cuadroma (véase Milstein, C. y Cuello, A.C. (1983) Nature 305(5934): p.537-540), mediante conjugación química de dos anticuerpos monoclonales diferentes (véase Staerz, U.D. et al. (1985) Nature 314(6012): 628-631), o mediante enfoques knob-into-hole o similares, que introducen mutaciones en la región Fc que no inhiben la dimerización CH3-CH3 (véase Holliger, P. et al. (1993) Proc. Natl. Acad. Sci USA.6444-6448), dando lugar a múltiples especies diferentes de inmunoglobulinas, de las cuales sólo una es el anticuerpo biespecífico funcional. Por función molecular, un anticuerpo biespecífico se une a un antígeno (o epítopo) en uno de sus dos brazos de unión (un par de HC/LC), y se une a un antígeno (o epítopo) diferente en su segundo brazo (un par diferente de HC/LC). Según esta definición, un anticuerpo biespecífico tiene dos brazos de unión al antígeno distintos (tanto en especificidad como en secuencias CDR), y es monovalente para cada antígeno al que se une.

[0118] El término "anticuerpo dual específico", tal como se utiliza en el presente documento, y a diferencia de una proteína de unión a medio Ig biespecífica o una proteína de unión biespecífica, se refiere a anticuerpos de longitud completa que pueden unirse a dos antígenos (o epítopos) diferentes en cada uno de sus dos brazos de unión (un par de HC/LC) (véase la Publicación PCT nº WO 02/02773). En consecuencia, una proteína de unión dual específica tiene dos brazos de unión a antígeno idénticos, con idéntica especificidad e idénticas secuencias CDR, y es bivalente para cada antígeno al que se une.

[0119] El término "anticuerpo pan-TGFβ" se refiere a cualquier anticuerpo que es capaz de unirse a más de una isoforma de TGFβ, por ejemplo, al menos dos de TGFβ1, TGFβ2 y TGFβ3. En algunas formas de realización, un anticuerpo pan-TGFβ se une a las tres isoformas, es decir, TGFβ1, TGFβ2 y TGFβ3. En algunas formas de realización, un anticuerpo pan-TGFβ se une y neutraliza las tres isoformas, es decir, TGFβ1, TGFβ2 y TGFβ3.

[0120] El término "K_on", tal como se utiliza en el presente documento, se refiere a la constante de velocidad de asociación de una proteína de unión (por ej., un anticuerpo) al antígeno para formar el complejo anticuerpo/antígeno, tal como se conoce en la técnica. El "K_on" también se conoce por los términos "constante de velocidad de asociación" o "k_a", utilizados indistintamente en el presente documento. Este valor indica la velocidad de unión de un anticuerpo a su antígeno diana o la velocidad de formación de un complejo entre un anticuerpo y un antígeno: Anticuerpo ("Ab") Antígeno ("Ag")-Ab-Ag.

[0121] El término "K_off", tal como se utiliza en el presente documento, se refiere a la constante de velocidad de disociación de una proteína de unión (por ej., un anticuerpo) del complejo anticuerpo/antígeno, tal como se conoce en la técnica. El "K_off" también se conoce por los términos "constante de velocidad de disociación" o "k_d", utilizados indistintamente en el presente documento. Este valor indica la velocidad de disociación de un anticuerpo de su antígeno diana o la separación del complejo Ab-Ag con el tiempo en anticuerpo libre y antígeno, como muestra la ecuación: Ab Ag←Ab-Ag.

[0122] Los términos "constante de disociación en equilibrio" o "K_D", utilizados indistintamente en el presente documento, se refieren al valor obtenido en una medición de valoración en equilibrio, o dividiendo la constante de velocidad de disociación (k_off) por la constante de velocidad de asociación (k_on). La constante de velocidad de asociación, la constante de velocidad de disociación y la constante de disociación de equilibrio se utilizan para representar la afinidad de unión de una proteína de unión, por ej., un anticuerpo, a un antígeno. Los métodos para determinar las constantes de velocidad de asociación y disociación son bien conocidos en la técnica. El uso de técnicas basadas en la fluorescencia ofrece una alta sensibilidad y la posibilidad de examinar muestras en tampones fisiológicos en equilibrio. Pueden utilizarse otros enfoques e instrumentos experimentales, como un ensayo BIAcore^®(análisis de interacción biomolecular) (por ej., instrumento disponible en BIAcore International AB, una empresa de GE Healthcare, Uppsala, Suecia). Además, también puede utilizarse un ensayo KinExA^®(Kinetic Exclusion Assay), disponible en Sapidyne Instruments (Boise, Idaho).

[0123] El término "enlazador" se utiliza para denotar polipéptidos que comprenden dos o más residuos de aminoácidos unidos por enlaces peptídicos y se utilizan para enlazar una o más porciones de unión a antígenos. Dichos polipéptidos enlazadores son bien conocidos en la técnica (véase, por ej., Holliger, P. et al. (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 6444-6448; Poljak, R.J. et al. (1994) Structure 2:1121-1123). Los enlazadores ejemplares incluyen, entre otros, ASTKGPSVFPLAP (SEQ ID Nº: 55), ASTKGP (SEQ ID Nº: 56); TVAAPSVFIFPP (SEQ ID Nº: 57); TVAAP (SEQ ID Nº: 58); AKTTPKLEEGEFSEAR (SEQ ID Nº: 59); AKTTPKLEEGEFSEARV (SEQ ID Nº: 60); AKTTPKLGG (SEQ ID Nº: 61); SAKTTPKLGG (SEQ ID Nº: 62); SAKTTP (SEQ ID Nº: 63); RADAAP (SEQ ID Nº: 64); RADAAPTVS (SEQ ID Nº: 65); RADAAAAGGPGS (SEQ ID Nº: 66); RADAAAA(G4S₎₄(SEQ ID Nº: 67); SAKTTPKLEEGEFSEARV (SEQ ID Nº: 68); ADAAP (SEQ ID Nº: 69); ADAAPTVSIFPP (SEQ ID Nº: 70); QPKAAP (SEQ ID Nº: 71); QPKAAPSVTLFPP (SEQ ID Nº: 72); AKTTPP (SEQ ID Nº: 73); AKTTPPSVTPLAP (SEQ ID Nº: 74); AKTTAP (SEQ ID Nº: 75); AKTTAPSVYPLAP (SEQ ID Nº: 76); GGGGSGGGGSGGGGS (SEQ ID Nº: 77); GENKVEYAPALMALS (SEQ ID Nº: 78); GPAKELTPLKEAKVS (SEQ ID Nº: 79); GHEAAAVMQVQYPAS (SEQ ID Nº: 80); TVAAPSVFIFPPTVAAPSVFIFPP (SEQ ID Nº: 81); y ASTKGPSVFPLAPASTKGPSVFPLAP (SEQ ID Nº: 82).

[0124] El término "cáncer", tal como se utiliza aquí, se refiere a la condición fisiológica en eucariotas multicelulares que se caracteriza típicamente por la proliferación celular no regulada.

[0125] Por "marcador" y "marcador detectable" o "fracción detectable" se entiende una fracción unida a una pareja de unión específica, como un anticuerpo o un analito, por ej., para hacer detectable la reacción entre los miembros de una pareja de unión específica, como un anticuerpo y un analito, y la pareja de unión específica, por ej., anticuerpo o analito, así marcada se denomina "detectablemente marcada". Así, el término "proteína de unión marcada", tal como se utiliza en el presente documento, se refiere a una proteína con un marcador incorporado que permite la identificación de la proteína de unión. En una forma de realización, el marcador es un marcador detectable que puede producir una señal detectable por medios visuales o instrumentales, por ej., la incorporación de un aminoácido radiomarcado o la unión a un polipéptido de restos de biotinilo que pueden detectarse mediante avidina marcada (por ej., estreptavidina que contiene un marcador fluorescente o actividad enzimática que puede detectarse por métodos ópticos o colorimétricos). Ejemplos de marcadores para polipéptidos incluyen, pero no se limitan a, los siguientes: radioisótopos o radionucleidos (por ej., ³H, ¹⁴C, ³⁵S, ⁹⁰Y, ⁹⁹Tc, ¹¹¹In, ¹²⁵I, ¹³¹I, ¹⁷⁷Lu, ¹⁶⁶Ho, y ¹⁵³Sm); cromógenos; etiquetas fluorescentes (por ej., FITC, rodamina, y fósforos de lantánidos); etiquetas enzimáticas (por ej., peroxidasa de rábano picante, luciferasa y fosfatasa alcalina); marcadores quimioluminiscentes; grupos biotinilo; epítopos polipeptídicos predeterminados reconocidos por un informador secundario (por ej., secuencias de pares de cremalleras de leucina, sitios de unión para anticuerpos secundarios, dominios de unión a metales y etiquetas epitópicas); y agentes magnéticos, como quelatos de gadolinio. Ejemplos representativos de marcadores comúnmente empleados para inmunoensayos incluyen moléculas que producen luz, por ej., compuestos de acridinio, y moléculas que producen fluorescencia, por ej. fluoresceína. En el presente documento se describen otros marcadores. A este respecto, la propia fracción puede no estar marcada de forma detectable, pero puede volverse detectable al reaccionar con otra fracción. El uso de "marcador detectable" pretende abarcar este último tipo de marcador detectable.

[0126] El término "resonancia de plasmón superficial", tal como se utiliza en el presente documento, se refiere a un fenómeno óptico que permite el análisis de interacciones biespecíficas en tiempo real mediante la detección de alteraciones en las concentraciones de proteínas dentro de una matriz biosensora, por ejemplo, utilizando el sistema ^BIAcore®(BIAcore International AB, una empresa de GE Healthcare, Uppsala, Suecia y Piscataway, NJ). Para más descripciones, véase Jönsson, U. et al. (1993) Ann. Biol. Clin.51: 19-26; Jönsson, U. et al. (1991) Biotechniques 11: 620-627; Johnsson, B. et al. (1995) J. Mol. Recognit.8: 125-131; and Johnnson, B. et al. (1991) Anal. Biochem.198: 268-277.

[0127] Un "plásmido" o "vector" incluye una construcción de ácido nucleico diseñada para ser entregada a una célula huésped o transferida entre diferentes células huésped. Un "plásmido de expresión" o "vector de expresión" puede ser un plásmido que tiene la capacidad de incorporar y expresar fragmentos de ácido nucleico heterólogo en una célula. Un plásmido de expresión puede comprender elementos adicionales, por ejemplo, el vector de expresión puede tener dos sistemas de replicación, permitiendo así su mantenimiento en dos organismos. El ácido nucleico incorporado al plásmido puede estar unido operativamente a una secuencia de control de expresión cuando la secuencia de control de expresión controla y regula la transcripción y traducción de esa secuencia polinucleotídica.

[0128] Un "ácido nucleico" o una "secuencia de ácido nucleico" puede ser cualquier molécula, preferentemente una molécula polimérica, que incorpore unidades de ácido ribonucleico, ácido desoxirribonucleico o un análogo de los mismos. El ácido nucleico puede ser monocatenario o bicatenario. Un ácido nucleico monocatenario puede ser una hebra de ácido nucleico de un ADN bicatenario desnaturalizado. Alternativamente, puede ser un ácido nucleico monocatenario no derivado de ningún ADN bicatenario. En un aspecto, el ácido nucleico puede ser ADN. En otro aspecto, el ácido nucleico puede ser ARN. Las moléculas de ácido nucleico adecuadas son el ADN, incluido el ADN genómico o el ADNc. Otras moléculas de ácido nucleico adecuadas son el ARN, incluido el ARNm.

[0129] Salvo en los ejemplos operativos, o cuando se indique lo contrario, todos los números que expresan cantidades de ingredientes o condiciones de reacción utilizados en el presente documento deben entenderse modificados en todos los casos por el término "aproximadamente". El término "aproximadamente", cuando se utiliza en relación con porcentajes, puede significar ±1%.

[0130] Aunque se han descrito e ilustrado aquí varias formas de realización de la presente divulgación, aquellos con conocimientos ordinarios en la materia imaginarán fácilmente una variedad de otros medios y/o estructuras para realizar las funciones y/u obtener los resultados y/o una o más de las ventajas descritas aquí, y cada una de tales variaciones y/o modificaciones se considera dentro del alcance de la presente divulgación. En términos más generales, los expertos en la materia apreciarán fácilmente que todos los parámetros, dimensiones, materiales y configuraciones descritos en el presente documento pretenden ser ejemplares y que los parámetros, dimensiones, materiales y/o configuraciones reales dependerán de la aplicación o aplicaciones específicas para las que se utilicen las enseñanzas de la presente divulgación. Los expertos en la materia reconocerán, o podrán determinar mediante experimentación rutinaria, muchos equivalentes a las formas de realización específicas de la divulgación aquí descritas. Por lo tanto, debe entenderse que las formas de realización anteriores se presentan únicamente a modo de ejemplo y que la invención queda definida por las reivindicaciones. La presente divulgación está dirigida a cada característica individual, sistema, artículo, material y/o método descrito en el presente documento. Además, cualquier combinación de dos o más de dichas características, sistemas, artículos, materiales y/o métodos, si dichas características, sistemas, artículos, materiales y/o métodos no son mutuamente inconsistentes, se incluye dentro del alcance de la presente divulgación.

[0131] Los artículos indefinidos "el/la", tal como se utilizan aquí en la especificación y en las reivindicaciones, a menos que se indique claramente lo contrario, deben entenderse en el sentido de "al menos uno".

[0132] La expresión "y/o", tal como se utiliza en la presente especificación y en las reivindicaciones, debe entenderse en el sentido de "uno o ambos" de los elementos así combinados, es decir, elementos que están presentes conjuntamente en algunos casos y disyuntivamente en otros. Opcionalmente, pueden estar presentes otros elementos distintos de los elementos específicamente identificados por la cláusula "y/o", relacionados o no con los elementos específicamente identificados, a menos que se indique claramente lo contrario. Así, como ejemplo no limitativo, una referencia a "A y/o B", cuando se utiliza junto con un lenguaje abierto como "que comprende" puede referirse, en una forma de realización, a A sin B (incluyendo opcionalmente elementos distintos de B); en otra forma de realización, a B sin A (incluyendo opcionalmente elementos distintos de A); en otra forma de realización, tanto a A como a B (incluyendo opcionalmente otros elementos); etc.

[0133] Tal como se utiliza aquí en la especificación y en las reivindicaciones, la frase "al menos uno", en referencia a una lista de uno o más elementos, debe entenderse en el sentido de al menos un elemento seleccionado de entre uno o más de los elementos de la lista de elementos, pero sin incluir necesariamente al menos uno de todos y cada uno de los elementos específicamente enumerados dentro de la lista de elementos y sin excluir ninguna combinación de elementos de la lista de elementos. Esta definición también permite que opcionalmente puedan estar presentes elementos distintos de los elementos específicamente identificados dentro de la lista de elementos a los que se refiere la frase "al menos uno", ya estén relacionados o no con los elementos específicamente identificados. Así, como ejemplo no limitativo, "al menos uno de A y B" (o, equivalentemente, "al menos uno de A o B", o, equivalentemente "al menos uno de A y/o B") puede referirse, en una forma de realización, a al menos uno, incluyendo opcionalmente más de uno, A, sin B presente (y opcionalmente incluyendo elementos distintos de B); en otra forma de realización, al menos uno, que opcionalmente incluya más de uno, B, sin que esté presente A (y que opcionalmente incluya elementos distintos de A); en otra forma de realización, al menos uno, que opcionalmente incluya más de uno, A, y al menos uno, que opcionalmente incluya más de uno, B (y que opcionalmente incluya otros elementos); etc.

[0134] El uso de términos ordinales tales como "primero", "segundo", "tercero", etc., en las reivindicaciones para modificar un elemento de la reivindicación no connota por sí mismo ninguna prioridad, precedencia u orden de un elemento de la reivindicación sobre otro ni el orden temporal en que se realizan los actos de un método, sino que se utilizan meramente como marcadores para distinguir un elemento de la reivindicación que tiene un cierto nombre de otro elemento que tiene el mismo nombre (pero para el uso del término ordinal) para distinguir los elementos de la reivindicación.

[0135] Los rangos que se proporcionan en este documento se entienden como una abreviatura de todos los valores dentro del rango. Por ejemplo, se entiende que un intervalo de 1 a 50 incluye cualquier número, combinación de números o subintervalo del grupo formado por 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, o 50, (por ej., 10-20, 1-10, 30-40, etc.

Anticuerpos, y Porciones de Unión a Antígeno de los Mismos, que se Unen Específicamente a un Complejo GARP-TGFβ1, a un Complejo LTBP1-TGFβ1, a un Complejo LTBP3-TGFβ1, y/o a un Complejo LRRC33-TGFβ1.

[0136] La presente invención se basa, al menos en parte, en el descubrimiento de anticuerpos, y porciones de unión a antígeno de los mismos, que unen TGFβ1 que está presente en un complejo GARP-TGFβ1, un complejo LTBP1-TGFβ1, un complejo LTBP3-TGFβ1, y un complejo LRRC33-TGFβ1. En consecuencia, los anticuerpos, o porciones de unión a antígeno de los mismos, para su uso según la invención pueden unirse específicamente a un epítopo de TGFβ1, en el que el epítopo está disponible para la unión por el anticuerpo, o porciones de unión a antígeno de los mismos, cuando el TGFβ1 está presente en un complejo GARP-TGFβ1, un complejo LTBP1-TGFβ1, un complejo LTBP3-TGFβ1, y un complejo LRRC33-TGFβ1. En algunas formas de realización, el epítopo está disponible debido a un cambio conformacional en TGFβ1 cuando está en complejo con GARP, LTBP1, LTBP3, y/o LRRC33. En algunas formas de realización, el epítopo en TGFβ1 al que se unen los anticuerpos, o porciones de unión a antígeno de los mismos, no está disponible cuando TGFβ1 no está en complejo con GARP, LTBP1, LTBP3, y/o LRRC33. Los anticuerpos, o porciones de unión a antígeno de los mismos, no se unen específicamente a TGFβ2. Los anticuerpos, o porciones de unión a antígeno de los mismos, no se unen específicamente a TGFβ3. En algunas formas de realización, los anticuerpos, o porciones de unión a antígeno de los mismos, no impiden que TGFβ1 se una a la integrina. Por ejemplo, En algunas formas de realización, los anticuerpos, o porciones de unión a antígeno de los mismos, no enmascaran el sitio de unión a integrina de TGFβ1. Los anticuerpos, o porciones de unión a antígeno de los mismos, inhiben la activación de TGFβ1. Los anticuerpos, o porciones de unión a antígeno de los mismos, inhiben la liberación de TGFβ1 maduro a partir de un complejo GARP-TGFβ1, un complejo LTBP1-TGFβ1, un complejo LTBP3-TGFβ1 y un complejo LRRC33-TGFβ1.

[0137] Los anticuerpos, o porciones de unión a antígeno de los mismos, proporcionados en el presente documento se unen específicamente a un epítopo de TGFβ1, en el que el epítopo está disponible para la unión por el anticuerpo, o porciones de unión a antígeno de los mismos, cuando el TGFβ1 está presente en un complejo GARP-TGFβ1, un complejo LTBβ1-TGFβ1, un complejo LTBP2-TGFβ1, y/o un complejo LRRC33-TGFβ1. En algunas formas de realización, el TGFβ1 comprende una secuencia de aminoácidos natural de mamífero. En alguna forma de realización, el TGFβ1 comprende una secuencia de aminoácidos humana natural. En algunas formas de realización, el TGFβ1 comprende una secuencia de aminoácidos humana, de mono, de rata o de ratón. Un anticuerpo, o porción de unión a antígeno del mismo, para su uso según la invención no se une específicamente a TGFβ2. El anticuerpo, o la porción de unión a antígeno del mismo, no se une específicamente a TGFβ3. El anticuerpo, o la porción de unión a antígeno del mismo, no se une específicamente a TGFβ2 o TGFβ3. El anticuerpo, o la porción de unión a antígeno del mismo, se une específicamente a un TGFβ1 que comprende la secuencia de aminoácidos establecida en SEQ ID Nº: 21. Las secuencias de aminoácidos de TGFβ2, y la secuencia de aminoácidos de TGFβ3 se exponen en SEQ ID Nºs: 22 y 23, respectivamente. En algunas formas de realización, un anticuerpo, o porción de unión a antígeno del mismo, descrito en el presente documento se une específicamente a un TGFβ1 que comprende una secuencia de aminoácidos de origen no natural (denominada de otro modo en el presente documento TGFβ1 de origen no natural). Por ejemplo, un TGFβ1 de origen no natural puede comprender una o más mutaciones generadas recombinantemente en relación con una secuencia de aminoácidos de TGFβ1 de origen natural. En algunas formas de realización, una secuencia de aminoácidos de TGFβ1, TGFβ2 o TGFβ3 comprende la secuencia de aminoácidos como se establece en SEQ ID Nºs: 24-35, como se muestra en la Tabla 1. En algunas formas de realización, una secuencia de aminoácidos de TGFβ1, TGFP2 o TOPPβ comprende la secuencia de aminoácidos como se establece en SEQ ID

Nºs: 24-35, como se muestra en la Tabla 1. En algunas formas de realización, una secuencia de aminoácidos de TGFβ1, TGFP2 o TOPPβ comprende la secuencia de aminoácidos como se establece en SEQ ID Nºs: 36-43, como se muestra en la Tabla 2.

TGFβ1

TGFβ2

TGFβ3

Tabla 1. Ejemplos de secuencias de aminoácidos de TGFβ1, TGFβ2 y TGFβ3.

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Tabla 2. Ejemplos de secuencias de aminoácidos no humanas

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[0138] Un anticuerpo, o porción de unión a antígeno del mismo, como se describe en el presente documento, es capaz de unirse a un complejo LTBP1-TGFβ1. En algunas formas de realización, los complejos proteicos antigénicos (por ej., un complejo LTBP-TGFβ1) pueden comprender una o más proteínas LTBP (por ej., LTBP1, LTBP2, LTBP3 y LTBP4). En algunas formas de realización, la proteína LTBP1 es una proteína de origen natural. En algunas formas de realización, la proteína LTBP1 es una proteína de origen no natural. En algunas formas de realización, la proteína LTBP1 es una proteína recombinante. Dicha proteína LTBP1 recombinante puede comprender LTBP1, variantes empalmadas alternativamente de la misma y/o fragmentos de la misma. Las proteínas LTBP1 recombinantes también pueden modificarse para incluir un o más marcadores detectables. En algunas formas de realización, la proteína LTBP1 comprende una secuencia líder (por ej., una secuencia líder nativa o no nativa). En algunas formas de realización, la proteína LTBP1 no comprende una secuencia líder (es decir, la secuencia líder ha sido procesada o escindida). Dichos marcadores detectables pueden incluir, entre otros, marcadores de biotina, marcadores de polihistidina, marcadores myc, marcadores HA y/o marcadores fluorescentes. En algunas formas de realización, la proteína LTBP1 es una proteína LTBP1 de mamífero. En algunas formas de realización, la proteína LTBP1 es una proteína LTBP1 humana, de mono, de ratón o de rata. En algunas formas de realización, la proteína LTBP1 comprende una secuencia de aminoácidos como se establece en SEQ ID Nºs: 46 y 47 en la Tabla 2. En algunas formas de realización, la proteína LTBP1 comprende una secuencia de aminoácidos como se establece en SEQ ID Nº: 50 en la Tabla 3.

[0139] Un anticuerpo, o porción de unión a antígeno del mismo, como se describe en el presente documento, es capaz de unirse a un complejo LTBP3-TGFβ1. En algunas formas de realización, la proteína LTBP3 es una proteína de origen natural. En algunas formas de realización, la proteína LTBP3 es una proteína de origen no natural. En algunas formas de realización, la proteína LTBP3 es una proteína recombinante. Dicha proteína LTBP3 recombinante puede comprender LTBP3, variantes empalmadas alternativamente de la misma y/o fragmentos de la misma. En algunas formas de realización, la proteína LTBP3 comprende una secuencia líder (por ej., una secuencia líder nativa o no nativa). En algunas formas de realización, la proteína LTBP3 no comprende una secuencia líder (es decir, la secuencia líder ha sido procesada o escindida). Las proteínas LTBP3 recombinantes también pueden modificarse para incluir un o más marcadores detectables. Dichos marcadores detectables pueden incluir, entre otros, marcadores de biotina, marcadores de polihistidina, marcadores myc, marcadores HA y/o marcadores fluorescentes. En algunas formas de realización, la proteína LTBP3 es una proteína LTBP3 de mamífero. En algunas formas de realización, la proteína LTBP3 es una proteína LTBP3 humana, de mono, de ratón o de rata. En algunas formas de realización, la proteína LTBP3 comprende una secuencia de aminoácidos como se establece en SEQ ID Nºs: 44 y 45 de la Tabla 2. En algunas formas de realización, la proteína LTBP1 comprende una secuencia de aminoácidos como se establece en SEQ ID Nº: 51 en la Tabla 3.

[0140] Un anticuerpo, o porción de unión a antígeno del mismo, como se describe en el presente documento, es capaz de unirse a un complejo GARP-TGFβ1. En algunas formas de realización, la proteína GARP es una proteína de origen natural. En algunas formas de realización, la proteína GARP es una proteína no natural. En algunas formas de realización, la proteína GARP es una proteína recombinante. Dicha GARP puede ser recombinante, denominada en el presente documento GARP recombinante. Algunas GARP recombinantes pueden incluir una o más modificaciones, truncamientos y/o mutaciones en comparación con las GARP de tipo silvestre. Las GARP recombinantes pueden modificarse para que sean solubles. En algunas formas de realización, la proteína GARP comprende una secuencia líder (por ej., una secuencia líder nativa o no nativa). En algunas formas de realización, la proteína GARP no comprende una secuencia líder (es decir, la secuencia líder ha sido procesada o escindida). En otras formas de realización, las GARP recombinantes se modifican para incluir uno o más marcadores detectables. En otras formas de realización, dichos marcadores detectables pueden incluir, entre otros, marcadores de biotina, marcadores de polihistidina, marcadores de bandera, marcadores de myc, marcadores de HA y/o marcadores fluorescentes. En algunas formas de realización, la proteína GARP es una proteína GARP de mamífero. En algunas formas de realización, la proteína GARP es una proteína GARP humana, de mono, de ratón o de rata. En algunas formas de realización, la proteína GARP comprende una secuencia de aminoácidos como se establece en SEQ ID Nºs: 48-49 en la Tabla 2. En algunas formas de realización, la proteína GARP comprende una secuencia de aminoácidos como se establece en SEQ ID Nºs: 52 y 53 en la Tabla 4. Los anticuerpos, o porciones de unión a antígeno de los mismos, descritos en el presente documento no se unen a TGFβ1 de una manera dependiente del contexto, por ejemplo la unión a TGFβ1 sólo se produciría cuando la molécula de TGFβ1 estuviera complejada con una molécula de presentación específica, tal como GARP. En cambio, los anticuerpos, y las porciones de unión a antígeno de los mismos, se unen a TGFβ1 de forma independiente del contexto. En otras palabras, los anticuerpos, o porciones de unión a antígeno de los mismos, se unen a TGFβ1 cuando se unen a cualquier molécula presentadora: GARP, LTBP1, LTBP3, or LRCC33.

[0141] Un anticuerpo, o porción de unión a antígeno del mismo, como se describe en el presente documento, es capaz de unirse a un complejo LRRC33-TGFβ1. En algunas formas de realización, la proteína LRRC33 es una proteína de origen natural. En algunas formas de realización, la proteína LRRC33 es una proteína de origen no natural. En algunas formas de realización, la proteína LRRC33 es una proteína recombinante. Dicho LRRC33 puede ser recombinante, denominado en el presente documento LRRC33 recombinante. Algunas proteínas LRRC33 recombinantes pueden comprender una o más modificaciones, truncamientos y/o mutaciones en comparación con la LRRC33 de tipo silvestre. Las proteínas recombinantes LRRC33 pueden modificarse para que sean solubles. Por ejemplo, En algunas formas de realización, el ectodominio de LRRC33 puede expresarse con una etiqueta His C-terminal para expresar la proteína LRRC33 soluble (sLRRC33; véase, por ejemplo, SEQ ID Nº: 84). En algunas formas de realización, la proteína LRRC33 comprende una secuencia líder (por ej., una secuencia líder nativa o no nativa). En algunas formas de realización, la proteína LRRC33 no comprende una secuencia líder (es decir, la secuencia líder ha sido procesada o escindida). En otras formas de realización, las proteínas recombinantes LRRC33 se modifican para comprender un o más marcadores detectables. En otras formas de realización, dichos marcadores detectables pueden incluir, entre otros, marcadores de biotina, marcadores de polihistidina, marcadores de bandera, marcadores de myc, marcadores de HA y/o marcadores fluorescentes. En algunas formas de realización, la proteína LRRC33 es una proteína LRRC33 de mamífero. En algunas formas de realización, la proteína LRRC33 es una proteína LRRC33 humana, de mono, de ratón o de rata. En algunas formas de realización, la proteína LRRC33 comprende una secuencia de aminoácidos como se establece en SEQ ID Nºs: 83, 84 y 85 en la Tabla 4.

Tabla 3. Ejemplos de secuencias de aminoácidos de LTBP.

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Tabla 4 - Ejemplos de secuencias de aminoácidos de GARP y LRRC33.

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[0142] Anticuerpos, o porciones de unión a antígeno de los mismos, divulgados en el presente documento que se unen específicamente a un epítopo de TGFβ1 que está disponible para la unión por el anticuerpo cuando el TGFβ1 está presente en un complejo GARP-TGFβ1, un complejo LTBP1-TGFβ1, un complejo LTBP3-TGFβ1, y un complejo LRRC33-TGFβ1 y las moléculas de ácido nucleico de la presente divulgación que codifican los anticuerpos pueden incluir una o más de las secuencias de aminoácidos CDR mostradas en la Tabla 5.

Tabla 5. Se muestran las regiones determinantes complementarias de la cadena pesada (CDRHs) y de la cadena ligera (CDRLs) determinadas utilizando el esquema de numeración de Kabat para los anticuerpos Ab1 y Ab2.

[0143] Los anticuerpos que se unen específicamente al complejo GARP-TGFβ1, un complejo LTBP1-TGFβ1, un complejo LTBP3-TGFβ1, y un complejo LRRC33-TGFβ1 incluyen cualquier anticuerpo, o porción de unión a antígeno del mismo, que comprende un CDRH1, CDRH2, CDRH3, CDRL1, CDRL2, o CDRL3, o combinaciones de los mismos, como se proporciona para cualquiera de los anticuerpos mostrados en la Tabla 5. Los anticuerpos que se unen específicamente al complejo GARP-TGFβ1, a un complejo LTBP1-TGFβ1, a un complejo LTBP3-TGFβ1 y a un complejo LRRC33-TGFβ1 incluyen las CDRH1, CDRH2, CDRH3, CDRL1, CDRL2 y CDRL3 de cualquiera de los anticuerpos mostrados en la Tabla 5. También se proporciona cualquier secuencia de ácido nucleico que codifica una molécula que comprende un CDRH1, CDRH2, CDRH3, CDRL1, CDRL2, o CDRL3 como se proporciona para cualquiera de los anticuerpos mostrados en la Tabla 5. Los dominios CDR3 de las cadenas pesada y ligera de los anticuerpos pueden desempeñar un papel especialmente importante en la especificidad/afinidad de unión de un anticuerpo a un antígeno. En consecuencia, los anticuerpos que se unen específicamente al complejo GARP-TGFβ1, a un complejo LTBP1-TGFβ1, a un complejo LTBP3-TGFβ1, y a un complejo LRRC33-TGFβ1 de la divulgación, o las moléculas de ácido nucleico que codifican estos anticuerpos, o porciones de unión a antígeno de los mismos, pueden incluir al menos las CDR3 de cadena pesada y/o ligera de los anticuerpos como se muestra en la Tabla 5.

[0144] Aspectos de la invención se refieren a un anticuerpo monoclonal, o porción de unión a antígeno del mismo para uso como se define en las reivindicaciones, que se une específicamente a un complejo GARP-TGFβ1, un complejo LTBP1-TGFβ1, un complejo LTBP3-TGFβ1, y un complejo LRRC33-TGFβ1, y que comprende seis regiones determinantes de complementariedad (CDR): CDRH1, CDRH2, CDRH3, CDRL1, CDRL2 y CDRL3.

[0145] En algunas formas de realización, CDRH1 comprende una secuencia como se establece en cualquiera de las SEQ ID Nº: 1 y 2; En algunas formas de realización, CDRH2 comprende una secuencia como se establece en cualquiera de los SEQ ID Nºs: 3 y 4; En algunas formas de realización, CDRH3 comprende una secuencia como se establece en cualquiera de los SEQ ID Nºs: 5 y 6; CDRL1 comprende una secuencia como la establecida en cualquiera de los SEQ ID Nºs: 7 y 8; En algunas formas de realización, CDRL2 comprende una secuencia como se establece en cualquiera de los SEQ ID Nºs: 9 y 10; En algunas formas de realización, CDRL3 comprende una secuencia como se establece en cualquiera de los SEQ ID Nºs: 11 y 12;

[0146] En algunas formas de realización, (por ej., como para el anticuerpo Ab1, mostrado en la Tabla 5), el anticuerpo o porción de unión a antígeno del mismo, que se une específicamente a un complejo GARP-TGFβ1, un complejo LTBP1-TGFβ1, un complejo LTBP3-TGFβ1, y un complejo LRRC33-TGFβ1 comprende: un CDRH1 que comprende una secuencia de aminoácidos como se establece en SEQ ID Nº: 1, un CDRH2 que comprende una secuencia de aminoácidos según se establece en SEQ ID Nº: 3, un CDRH3 que comprende una secuencia de aminoácidos según se establece en SEQ ID Nº: 5 , un CDRL1 que comprende una secuencia de aminoácidos según se establece en SEQ ID Nº: 7, un CDRL2 que comprende una secuencia de aminoácidos según se establece en SEQ ID Nº: 9, y un CDRL3 que comprende una secuencia de aminoácidos tal como se establece en SEQ ID Nº: 11.

[0147] En algunas formas de realización, el anticuerpo, o la porción de unión a antígeno del mismo, comprende una región variable de cadena pesada que comprende una región 3 determinante de la complementariedad (CDR3) que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID Nº: 5 y una región variable de cadena ligera que comprende una CDR3 con la secuencia de aminoácidos de SEQ ID Nº: 11. En algunas formas de realización, el anticuerpo, o la porción de unión a antígeno del mismo, comprende una región variable de cadena pesada que comprende una región 2 determinante de la complementariedad (CDR2) que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID Nº: 3 y una región variable de cadena ligera que comprende una CDR2 con la secuencia de aminoácidos de SEQ ID Nº: 9. En algunas formas de realización, el anticuerpo, o la porción de unión a antígeno del mismo, comprende una región variable de cadena pesada que comprende una región 1 determinante de la complementariedad (CDR1) que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID Nº: 1 y una región variable de cadena ligera que comprende una CDR1 con la secuencia de aminoácidos de SEQ ID Nº: 7.

[0148] En algunas formas de realización, el anticuerpo, o la porción de unión a antígeno del mismo, comprende un dominio variable de cadena pesada que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% o 99% de identidad con la secuencia de aminoácidos establecida en SEQ ID Nº: 13 y un dominio variable de cadena ligera que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos un 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% o 99% de identidad con la secuencia de aminoácidos establecida en SEQ ID Nº: 14. En algunas formas de realización, el anticuerpo, o la porción de unión a antígeno del mismo, comprende un dominio variable de cadena pesada que comprende una secuencia de aminoácidos establecida en SEQ ID Nº: 13 y un dominio variable de cadena ligera que comprende una secuencia de aminoácidos establecida en SEQ ID Nº: 14.

[0149] En algunas formas de realización, el anticuerpo o porción de unión a antígeno del mismo, que se une específicamente a un complejo GARP-TGFβ1, un complejo LTBP1-TGFβ1, un complejo LTBP3-TGFβ1, y un complejo LRRC33-TGFβ1 comprende una secuencia de aminoácidos de dominio variable de cadena pesada codificada por una secuencia de ácido nucleico que tiene al menos 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, o 99% de identidad con la secuencia de ácido nucleico establecida en SEQ ID Nº: 91, y una secuencia de aminoácidos de dominio variable de cadena ligera codificada por una secuencia de ácido nucleico que tiene al menos un 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% o 99% de identidad con la secuencia de ácido nucleico establecida en SEQ ID Nº: 92. En algunas formas de realización, el anticuerpo o la porción de unión a antígeno del mismo, comprende una secuencia de aminoácidos de dominio variable de cadena pesada codificada por la secuencia de ácido nucleico establecida en SEQ ID Nº: 91, y una secuencia de aminoácidos de dominio variable de cadena ligera codificada por la secuencia de ácido nucleico establecida en SEQ ID Nº: 92.

[0150] En algunas formas de realización, (por ej., como para el anticuerpo Ab2, mostrado en la Tabla 5), el anticuerpo o porción de unión a antígeno del mismo, que se une específicamente a un complejo GARP-TGFβ1, un complejo LTBP1-TGFβ1, un complejo LTBP3-TGFβ1, y un complejo LRRC33-TGFβ1 comprende un CDRH1 que comprende una secuencia de aminoácidos como se establece en SEQ ID Nº: 2, un CDRH2 que comprende una secuencia de aminoácidos según se establece en SEQ ID Nº: 3, un CDRH3 que comprende una secuencia de aminoácidos según se establece en SEQ ID Nº: 6, un CDRL1 que comprende una secuencia de aminoácidos según se establece en SEQ ID Nº: 8, un CDRL2 que comprende una secuencia de aminoácidos según se establece en SEQ ID Nº: 10, y un CDRL3 que comprende una secuencia de aminoácidos tal como se establece en SEQ ID Nº: 12.

[0151] En algunas formas de realización, el anticuerpo, o la porción de unión a antígeno del mismo, comprende una región variable de cadena pesada que comprende una CDR3 que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID Nº: 6 y una región variable de cadena ligera que comprende una CDR3 con la secuencia de aminoácidos de SEQ ID Nº: 12. En algunas formas de realización, el anticuerpo, o la porción de unión a antígeno del mismo, comprende una región variable de cadena pesada que comprende una CDR2 que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID Nº: 4 y una región variable de cadena ligera que comprende una CDR2 con la secuencia de aminoácidos de SEQ ID Nº: 10. En algunas formas de realización, el anticuerpo, o la porción de unión a antígeno del mismo, comprende una región variable de cadena pesada que comprende una CDR1 que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID Nº: 2 y una región variable de cadena ligera que comprende una CDR1 con la secuencia de aminoácidos de SEQ ID Nº: 8.

[0152] En algunas formas de realización, el anticuerpo, o la porción de unión a antígeno del mismo, comprende un dominio variable de cadena pesada que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% o 99% de identidad con la secuencia de aminoácidos establecida en SEQ ID Nº: 15 y un dominio variable de cadena ligera que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos un 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% o 99% de identidad con la secuencia de aminoácidos establecida en SEQ ID Nº: 16. En algunas formas de realización, el anticuerpo, o la porción de unión a antígeno del mismo, comprende un dominio variable de cadena pesada que comprende una secuencia de aminoácidos establecida en SEQ ID Nº: 15 y un dominio variable de cadena ligera que comprende una secuencia de aminoácidos establecida en SEQ ID Nº: 16.

[0153] En algunas formas de realización, el anticuerpo o porción de unión a antígeno del mismo, que se une específicamente a un complejo GARP-TGFβ1, un complejo LTBP1-TGFβ1, un complejo LTBP3-TGFβ1, y un complejo LRRC33-TGFβ1 comprende una secuencia de aminoácidos de dominio variable de cadena pesada codificada por una secuencia de ácido nucleico que tiene al menos 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, o 99% de identidad con la secuencia de ácido nucleico establecida en SEQ ID Nº: 93, y una secuencia de aminoácidos de dominio variable de cadena ligera codificada por una secuencia de ácido nucleico que tiene al menos un 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% o 99% de identidad con la secuencia de ácido nucleico establecida en SEQ ID Nº: 94. En algunas formas de realización, el anticuerpo o la porción de unión a antígeno del mismo, comprende una secuencia de aminoácidos de dominio variable de cadena pesada codificada por la secuencia de ácido nucleico establecida en SEQ ID Nº: 93, y una secuencia de aminoácidos de dominio variable de cadena ligera codificada por la secuencia de ácido nucleico establecida en SEQ ID Nº: 94.

[0154] En algunos ejemplos, cualquiera de los anticuerpos de la divulgación que se unen específicamente a un complejo GARP-TGFβ1, un complejo LTBP1-TGFβ1, un complejo LTBP3-TGFβ1, y un complejo LRRC33-TGFβ1 incluyen cualquier anticuerpo (incluyendo porciones de unión a antígeno de los mismos) que tiene una o más CDR (por ej., CDRH o CDRL) sustancialmente similares a CDRH1, CDRH2, CDRH3, CDRL1, CDRL2, y/o CDRL3. Por ejemplo, los anticuerpos pueden incluir una o más secuencias CDR como se muestra en la Tabla 5 (SEQ ID Nºs: 1-12) que contiene hasta 5, 4, 3, 2 o 1 variaciones de residuos de aminoácidos en comparación con la región CDR correspondiente en cualquiera de las SEQ ID Nºs: 1-12. A continuación se proporcionan las secuencias completas de aminoácidos de la región variable de la cadena pesada y de la región variable de la cadena ligera de los anticuerpos enumerados en la Tabla 5 (por ej., Ab1 y Ab2), así como las secuencias de ácido nucleico que codifican la región variable de la cadena pesada y la región variable de la cadena ligera de los anticuerpos.

Ab1 - Secuencia de aminoácidos de la región variable de la cadena pesada

Ab1 - Secuencia de ácido nucleico de la región variable de la cadena pesada

Ab1 - Secuencia de aminoácidos de la región variable de la cadena ligera

Ab1 - Secuencia de ácido nucleico de la región variable de la cadena ligera

Ab1 - Secuencia de aminoácidos de la cadena pesada

Ab1 - Secuencia de aminoácidos de la cadena ligera

Ab2 - Secuencia de aminoácidos de la región variable de la cadena pesada

Ab2 - Secuencia de ácido nucleico de la región variable de la cadena pesada

Ab2 - Secuencia de aminoácidos de la región variable de la cadena ligera

Ab2 - Secuencia de ácido nucleico de la región variable de la cadena ligera

Ab2 - Secuencia de aminoácidos de la cadena pesada

Ab2 - Secuencia de aminoácidos de la cadena ligera

[0155] En algunas formas de realización, los anticuerpos de la divulgación que se unen específicamente a un complejo GARP-TGFβ1, un complejo LTBP1-TGFβ1, un complejo LTBP3-TGFβ1 y un complejo LRRC33-TGFβ1 incluyen cualquier anticuerpo que incluya un dominio variable de cadena pesada de SEQ ID Nº: 13 ó 17, o un dominio variable de cadena ligera de SEQ ID Nº: 14, o 18. En algunas formas de realización, los anticuerpos de la divulgación que se unen específicamente a un complejo GARP-TGFβ1, un complejo LTBP1-TGFβ1, un complejo LTBP3-TGFβ1 y un complejo LRRC33-TGFβ1 incluyen cualquier anticuerpo que incluya los pares variable de cadena pesada y variable de cadena ligera de los SEQ ID Nºs: 13 y 14; y 17 y 18.

[0156] Aspectos de la divulgación proporcionan anticuerpos que se unen específicamente a un complejo GARP-TGFβ1, un complejo LTBP1-TGFβ1, un complejo LTBP3-TGFβ1, y un complejo LRRC33-TGFβ1 que tiene una secuencia de aminoácidos variable de cadena pesada y/o variable de cadena ligera homóloga a cualquiera de las descritas en el presente documento. En algunas formas de realización, el anticuerpo que se une específicamente a un complejo GARP-TGFβ1, un complejo LTBP1-TGFβ1, un complejo LTBP3-TGFβ1, y un complejo LRRC33-TGFβ1 comprende una secuencia variable de cadena pesada o una secuencia variable de cadena ligera que es al menos 75% (por ej., 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, o 99%) idéntica a la secuencia de aminoácidos variable de cadena pesada de SEQ ID Nº: 13 ó 17, o una secuencia variable de cadena ligera de SEQ ID Nº: 14, o 18. En algunas formas de realización, las secuencias de aminoácidos variables homólogas de cadena pesada y/o variable de cadena ligera no varían dentro de ninguna de las secuencias CDR proporcionadas en el presente documento. Por ejemplo, en algunas formas de realización, el grado de variación de secuencia (por ej., 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, o 99%) puede ocurrir dentro de una secuencia de aminoácidos variable de cadena pesada y/o variable de cadena ligera excluyendo cualquiera de las secuencias CDR proporcionadas en el presente documento.

[0157] En algunas formas de realización, los anticuerpos de la divulgación que se unen específicamente a un complejo GARP-TGFβ1, un complejo LTBP1-TGFβ1, un complejo LTBP3-TGFβ1 y un complejo LRRC33-TGFβ1 incluyen cualquier anticuerpo, o porción de unión a antígeno del mismo, que incluye una cadena pesada de SEQ ID Nº: 15 ó 19, o una cadena ligera de SEQ ID Nº: 16, o 20. En algunas formas de realización, los anticuerpos de la divulgación que se unen específicamente a un complejo GARP-TGFβ1, un complejo LTBP1-TGFβ1, un complejo LTBP3-TGFβ1 y un complejo LRRC33-TGFβ1 incluyen cualquier anticuerpo que incluya los pares de cadena pesada y cadena ligera de los SEQ ID Nºs: 15 y 16; o 19 y 20.

[0158] Aspectos de la divulgación proporcionan anticuerpos que se unen específicamente a un complejo GARP-TGFβ1, un complejo LTBP1-TGFβ1, un complejo LTBP3-TGFβ1, y un complejo LRRC33-TGFβ1 que tiene una cadena pesada y/o una secuencia de aminoácidos de cadena ligera homóloga a cualquiera de las descritas en el presente documento. En algunas formas de realización, el anticuerpo que se une específicamente a un complejo GARP-TGFβ1, un complejo LTBP1-TGFβ1, un complejo LTBP3-TGFβ1, y un complejo LRRC33-TGFβ1 comprende una secuencia de cadena pesada o una secuencia de cadena ligera que es al menos 75% (por ej., 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, o 99%) idéntica a la secuencia de cadena pesada de SEQ ID Nº: 15 ó 19, o una secuencia de aminoácidos de cadena ligera de SEQ ID Nº: 16, o 20. En algunas formas de realización, las secuencias de aminoácidos homólogas de cadena pesada y/o de cadena ligera no varían dentro de ninguna de las secuencias CDR proporcionadas en el presente documento. Por ejemplo, En algunas formas de realización, el grado de variación de secuencia (por ej., 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, o 99%) puede ocurrir dentro de una cadena pesada y/o una secuencia de aminoácidos de cadena ligera excluyendo cualquiera de las secuencias CDR proporcionadas en el presente documento.

[0159] En algunas formas de realización, los anticuerpos de la divulgación que se unen específicamente a un complejo GARP-TGFβ1, un complejo LTBP1-TGFβ1, un complejo LTBP3-TGFβ1 y un complejo LRRC33-TGFβ1 incluyen cualquier anticuerpo, o porción de unión a antígeno del mismo, que incluye una cadena pesada de SEQ ID Nº: 15 ó 19, o una cadena ligera de SEQ ID Nº: 16, o 20. En algunas formas de realización, los anticuerpos de la divulgación que se unen específicamente a un complejo GARP-TGFβ1, un complejo LTBP1-TGFβ1, un complejo LTBP3-TGFβ1 y un complejo LRRC33-TGFβ1 incluyen cualquier anticuerpo que incluya los pares de cadena pesada y cadena ligera de los SEQ ID Nºs: 15 y 16; o 19 y 20.

[0160] Aspectos de la divulgación proporcionan anticuerpos que se unen específicamente a un complejo GARP-TGFβ1, un complejo LTBP1-TGFβ1, un complejo LTBP3-TGFβ1, y un complejo LRRC33-TGFβ1 que tiene una cadena pesada y/o una secuencia de aminoácidos de cadena ligera homóloga a cualquiera de las descritas en el presente documento. En algunas formas de realización, el anticuerpo que se une específicamente a un complejo GARP-TGFβ1, un complejo LTBP1-TGFβ1, un complejo LTBP3-TGFβ1, y un complejo LRRC33-TGFβ1 comprende una secuencia de cadena pesada o una secuencia de cadena ligera que es al menos 75% (por ej., 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, o 99%) idéntica a la secuencia de cadena pesada de SEQ ID Nº: 15 ó 19, o una secuencia de aminoácidos de cadena ligera de SEQ ID Nº: 16, o 20. En algunas formas de realización, las secuencias de aminoácidos homólogas de cadena pesada y/o de cadena ligera no varían dentro de ninguna de las secuencias CDR proporcionadas en el presente documento. Por ejemplo, En algunas formas de realización, el grado de variación de secuencia (por ej., 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, o 99%) puede ocurrir dentro de una cadena pesada y/o una secuencia de aminoácidos de cadena ligera excluyendo cualquiera de las secuencias CDR proporcionadas en el presente documento.

[0161] En algunas formas de realización, el "porcentaje de identidad" de dos secuencias de aminoácidos se determina utilizando el algoritmo de Karlin y Altschul Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:2264-68, 1990, modificado como en Karlin and Altschul Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:5873-77, 1993. Dicho algoritmo está incorporado en los programas NBLAST y XBLAST (versión 2.0) de Altschul, et al. J. Mol. Biol.215:403-10, 1990. Se pueden realizar búsquedas de proteínas BLAST con el programa XBLAST, puntuación=50, longitud de palabra=3 para obtener secuencias de aminoácidos homólogas a las moléculas proteicas de interés. Cuando existen huecos entre dos secuencias, se puede utilizar Gapped BLAST como se describe en Altschul et al., Nucleic Acids Res. 25(17):3389-3402, 1997. Al utilizar los programas BLAST y Gapped BLAST, se pueden utilizar los parámetros por defecto de los respectivos programas (por ej., XBLAST y NBLAST).

[0162] En cualquiera de los anticuerpos o fragmentos de unión a antígeno descritos en el presente documento, pueden introducirse una o más mutaciones conservadoras en las CDR o secuencias marco en posiciones en las que no es probable que los residuos estén implicados en una interacción anticuerpo-antígeno. En algunas formas de realización, dicha(s) mutación(es) conservadora(s) puede(n) introducirse en las CDR o secuencias marco en posición(es) en las que no es probable que los residuos estén implicados en la interacción con un complejo GARP-TGFβ1, un complejo LTBP1-TGFβ1, un complejo LTBP3-TGFβ1, y un complejo LRRC33-TGFβ1 según se determine basándose en la estructura cristalina. En algunas formas de realización, la interfaz probable (por ej., residuos implicados en una interacción antígenoanticuerpo) puede deducirse a partir de información estructural conocida sobre otro antígeno que comparta similitudes estructurales.

[0163] Tal como se utiliza en el presente documento, una "sustitución conservadora de aminoácidos" se refiere a una sustitución de aminoácidos que no altera las características relativas de carga o tamaño de la proteína en la que se realiza la sustitución de aminoácidos. Las variantes pueden prepararse de acuerdo con métodos para alterar la secuencia polipeptídica conocidos por un experto en la materia, como los que se encuentran en las referencias que recopilan dichos métodos, por ej., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, J. Sambrook, et al., eds., Second Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, Nueva York, 1989, o Current Protocols in Molecular Biology, F.M. Ausubel, et al., eds., John Wiley & Sons, Inc., New York. Las sustituciones conservadoras de aminoácidos incluyen las sustituciones realizadas entre aminoácidos dentro de los siguientes grupos: (a) M, I, L, V; (b) F, Y, W; (c) K, R, H; (d) A, G; (e) S, T; (f) Q, N; y (g) E, D.

[0164] En algunas formas de realización, los anticuerpos aquí proporcionados comprenden mutaciones que confieren propiedades deseables a los anticuerpos. Por ejemplo, para evitar posibles complicaciones debidas al intercambio del brazo Fab, que se sabe que ocurre con los mAbs IgG4 nativos, los anticuerpos aquí proporcionados pueden incluir una mutación estabilizadora "Adair" (Angal et al., "A single amino acid substitution abolishes heterogeneity of chimeric mouse/human (IgG4 antibody)" Mol Immunol 30, 105-103; 1993), "A single amino acid substitution abolishes the heterogeneity of chimeric mouse/human (IgG4) antibody, "Mol Immunol 30, 105-108; 1993), en la que la serina 228 (numeración EU; residuo 241 numeración Kabat) se convierte en prolina dando lugar a un anticuerpo similar a IgG1 (CPPCP (SEQ ID Nº: 54)) secuencia bisagra. En consecuencia, cualquiera de los anticuerpos puede incluir una mutación estabilizadora "Adair" o la secuencia de aminoácidos CPPCP (SEQ ID Nº: 54).

[0165] Los anticuerpos de la presente divulgación que se unen específicamente a un complejo GARP-TGFβ1, un complejo LTBP1-TGFβ1, un complejo LTBP3-TGFβ1 y un complejo LRRC33-TGFβ1 pueden comprender opcionalmente regiones constantes de anticuerpo o partes de las mismas. Por ejemplo, un dominio V_Lpuede estar unido en su extremo C-terminal a un dominio constante de cadena ligera como Cκ o Cλ. Del mismo modo, un dominio V_Ho una porción del mismo puede unirse a toda o parte de una cadena pesada como IgA, IgD, IgE, IgG e IgM, y cualquier subclase de isotipo. Los anticuerpos pueden incluir regiones constantes adecuadas (véase, por ejemplo, Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, No.91-3242, National Institutes of Health Publications, Bethesda, Md. (1991)). Por lo tanto, los anticuerpos dentro del alcance de esta posible divulgación incluyen dominios V_Hy V_L, o una porción de unión a antígeno de los mismos, combinados con cualquier región constante adecuada.

[0166] En algunas formas de realización, los anticuerpos que se unen específicamente a un complejo GARP-TGFβ1, un complejo LTBP1-TGFβ1, un complejo LTBP3-TGFβ1 y un complejo LRRC33-TGFβ1 pueden o no incluir la región marco de los anticuerpos de SEQ ID Nº: 13-20. En algunas formas de realización, los anticuerpos que se unen específicamente a un complejo GARP-TGFβ1, un complejo LTBP1-TGFβ1, un complejo LTBP3-TGFβ1 y un complejo LRRC33-TGFβ1 son anticuerpos murinos e incluyen secuencias de región marco murinas.

[0167] En algunas formas de realización, los anticuerpos que se unen específicamente a un complejo GARP-TGFβ1, un complejo LTBP1-TGFβ1, un complejo LTBP3-TGFβ1, y un complejo LRRC33-TGFβ1 de la divulgación pueden unirse a un complejo GARP-TGFβ1, un complejo LTBP1-TGFβ1, un complejo LTBP3-TGFβ1, y un complejo LRRC33-TGFβ1 con afinidad relativamente alta, por ej., con una K_Dinferior a 10^-6M, 10^-7M, 10^-8M, 10^-9M, 10^-10M, 10^-11M o inferior. Por ejemplo, los anticuerpos que se unen específicamente a un complejo GARP-TGFβ1, un complejo LTBP1-TGFβ1, un complejo LTBP3-TGFβ1, y un complejo LRRC33-TGFβ1 pueden unirse a un complejo GARP-TGFβ1, un complejo LTBP1-TGFβ1, un complejo LTBP3-TGFβ1, y un complejo LRRC33-TGFβ1 con una afinidad entre 5 pM y 500 nM, por ejemplo, entre 50 pM y 100 nM, por ejemplo, entre 500 pM y 50 nM. La divulgación también incluye anticuerpos o fragmentos de unión a antígeno que compiten con cualquiera de los anticuerpos descritos en la presente para unirse a un complejo GARP-TGFβ1, un complejo LTBP1-TGFβ1, un complejo LTBP3-TGFβ1, y un complejo LRRC33-TGFβ1 y que tienen una afinidad de 50 nM o inferior (por ej., 20 nM o inferior, 10 nM o inferior, 500 pM o inferior, 50 pM o inferior, o 5 pM o inferior). La afinidad y la cinética de unión de los anticuerpos que se unen específicamente a un complejo GARP-TGFβ1, a un complejo LTBP1-TGFβ1, a un complejo LTBP3-TGFβ1 y a un complejo LRRC33-TGFβ1 pueden ensayarse utilizando cualquier método adecuado, incluyendo, pero sin limitarse a la tecnología de biosensores (por ej., OCTET o BIACORE). Anticuerpos que inhiben el TGFβ

[0168] La presente invención proporciona anticuerpos funcionales para su uso según se define en las reivindicaciones. Como se utiliza aquí, "un anticuerpo funcional" confiere una o más actividades biológicas en virtud de su capacidad para unirse a un antígeno. Los anticuerpos funcionales pueden incluir anticuerpos inhibidores (o anticuerpos inhibidores) y anticuerpos activadores. Así, la presente divulgación incluye anticuerpos TGFβ que pueden modular (por ej., inhibir o activar) un proceso biológico mediado por la señalización de TGFβ.

[0169] Como se usa aquí, el término "anticuerpo inhibidor" se refiere a un anticuerpo que inhibe la liberación del factor de crecimiento maduro o reduce la actividad del factor de crecimiento. Los anticuerpos inhibidores incluyen anticuerpos direccionados a cualquier epítopo que reduzca la liberación o la actividad del factor de crecimiento cuando se asocia con dichos anticuerpos. Dichos epítopos pueden encontrarse en los prodominios de las proteínas TGFβ (por ej., TGFβ1), factores de crecimiento u otros epítopos que conducen a una reducción de la actividad del factor de crecimiento cuando se une al anticuerpo. Los anticuerpos inhibidores para su uso según la presente invención son anticuerpos inhibidores de TGFβ1.

[0170] La presente divulgación proporciona métodos de uso de anticuerpos inhibidores en solución, en cultivo celular y/o en sujetos para modificar la señalización del factor de crecimiento.

Polipéptidos

[0171] Algunos aspectos de la divulgación se refieren a un polipéptido que tiene una secuencia seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID Nº: 13, SEQ ID Nº: 17, SEQ ID Nº: 15, y SEQ ID Nº: 19. En ocasiones, el polipéptido es un dominio de cadena pesada variable o un dominio de cadena pesada. En ocasiones, el polipéptido es al menos un 75% (por ej., 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% o 99%) idéntico a cualquiera de las secuencias de aminoácidos establecidas en SEQ ID NºO: 13, SEQ ID Nº: 17, SEQ ID Nº: 15, y SEQ ID Nº: 19.

[0172] Algunos aspectos de la divulgación se refieren a un polipéptido que tiene una secuencia seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID Nº: 14, SEQ ID Nº: 18, SEQ ID Nº: 16, y SEQ ID Nº: 20. En ocasiones, el polipéptido es un dominio de cadena ligera variable o un dominio de cadena ligera. En ocasiones, el polipéptido es al menos un 75% (por ej., 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% o 99%) idéntico a cualquiera de las secuencias de aminoácidos establecidas en SEQ ID NºO: 14, SEQ ID Nº: 18, SEQ ID Nº: 16, y SEQ ID Nº: 20.

Anticuerpos que Compiten con Anticuerpos que se unen Específicamente a un Complejo GARP-TGFβ1, a un Complejo LTBP1-TGFβ1, a un Complejo LTBP3-TGFβ1 y/o a un Complejo LRRC33-TGFβ1.

[0173] Aspectos de la divulgación se refieren a anticuerpos que compiten o compiten de forma cruzada con cualquiera de los anticuerpos proporcionados en el presente documento. El término "competir", tal como se utiliza en el presente documento con respecto a un anticuerpo, significa que un primer anticuerpo se une a un epítopo (por ej., un epítopo de un complejo GARP-TGFβ1, un complejo LTBP1-TGFβ1, un complejo LTBP3-TGFβ1, y/o un complejo LRRC33-TGFβ1) de una manera suficientemente similar a la unión de un segundo anticuerpo, de tal manera que el resultado de la unión del primer anticuerpo con su epítopo disminuye detectablemente en presencia del segundo anticuerpo en comparación con la unión del primer anticuerpo en ausencia del segundo anticuerpo. La alternativa, en la que la unión del segundo anticuerpo a su epítopo también disminuye de forma detectable en presencia del primer anticuerpo, puede ser el caso, aunque no necesariamente. Es decir, un primer anticuerpo puede inhibir la unión de un segundo anticuerpo a su epítopo sin que ese segundo anticuerpo inhiba la unión del primer anticuerpo a su epítopo respectivo. Sin embargo, cuando cada anticuerpo inhibe de forma detectable la unión del otro anticuerpo con su epítopo o ligando, ya sea en la misma, mayor o menor medida, se dice que los anticuerpos "compiten entre sí" por la unión de su(s) epítopo(s) respectivo(s). Tanto los anticuerpos competidores como los de competencia cruzada están dentro del ámbito de esta divulgación. Independientemente del mecanismo por el que se produzca dicha competencia o competencia cruzada (por ej., impedimento estérico, cambio conformacional o unión a un epítopo común, o parte del mismo), el experto apreciará que dichos anticuerpos competidores y/o de competencia cruzada están incluidos y pueden ser útiles para los métodos y/o composiciones proporcionados en el presente documento.

[0174] Aspectos de la divulgación se refieren a anticuerpos que compiten o compiten de forma cruzada con cualquiera de los anticuerpos específicos, o porciones de unión a antígeno de los mismos, según se proporciona en el presente documento. En algunas formas de realización, un anticuerpo, o una porción de unión a antígeno del mismo, se une en o cerca del mismo epítopo que cualquiera de los anticuerpos proporcionados en el presente documento. En algunas formas de realización, un anticuerpo, o una porción de unión a antígeno del mismo, se une cerca de un epítopo si se une a 15 o menos residuos de aminoácidos del epítopo. En algunas formas de realización, cualquiera de los anticuerpos, o porción de unión a antígeno de los mismos, según se proporciona en el presente documento, se une dentro de 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 o 15 residuos de aminoácidos de un epítopo que está unido por cualquiera de los anticuerpos proporcionados en el presente documento.

[0175] En otra forma de realización, se proporciona en el presente documento un anticuerpo, o porción de unión a antígeno del mismo, que compite o compite de forma cruzada por la unión a cualquiera de los antígenos proporcionados en el presente documento (por ej., un complejo GARP-TGFβ1, un complejo LTBP1-TGFβ1, un complejo LTBP3-TGFβ1, y/o un complejo LRRC33-TGFβ1) con una constante de disociación de equilibrio, K_D, entre el anticuerpo y la proteína de menos de 10^-6M. En otras formas de realización, un anticuerpo compite o compite de forma cruzada por la unión a cualquiera de los antígenos proporcionados en el presente documento con una K_Den un intervalo de 10^-11M a 10^-6M. En algunas formas de realización, se proporciona en el presente documento un anticuerpo anti-TGFβ1, o una porción de unión a antígeno del mismo, que compite por la unión con un anticuerpo, o una porción de unión a antígeno del mismo, descrito en el presente documento. Se proporciona en el presente documento un anticuerpo anti-TGFβ1, o porción de unión a antígeno del mismo, que se une al mismo epítopo que un anticuerpo, o porción de unión a antígeno del mismo, descrito en el presente documento.

[0176] Cualquiera de los anticuerpos aquí proporcionados puede caracterizarse utilizando cualquier método adecuado. Por ejemplo, un método consiste en identificar el epítopo al que se une el antígeno, o "mapeo de epítopos". Existen muchos métodos adecuados para cartografiar y caracterizar la localización de epítopos en proteínas, incluida la resolución de la estructura cristalina de un complejo anticuerpo-antígeno, ensayos de competición, ensayos de expresión de fragmentos de genes y ensayos basados en péptidos sintéticos, como se describe, por ejemplo, en el capítulo 11 de Harlow y Lane, Using Antibodies, a Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., 1999. En un ejemplo adicional, el mapeo de epítopos puede utilizarse para determinar la secuencia a la que se une un anticuerpo. El epítopo puede ser un epítopo lineal, es decir, contenido en un único tramo de aminoácidos, o un epítopo conformacional formado por una interacción tridimensional de aminoácidos que no necesariamente pueden estar contenidos en un único tramo (secuencia lineal de estructura primaria). En algunas formas de realización, el epítopo es un epítopo de TGFβ1 que solo está disponible para la unión por el anticuerpo, o porción de unión a antígeno del mismo, descrito en el presente documento, cuando el TGFβ1 está en un complejo GARP-TGFβ1, un complejo LTBP1-TGFβ1, un complejo LTBP3-TGFβ1, y/o un complejo LRRC33-TGFβ1. Pueden aislarse o sintetizarse (por ej., recombinantemente) péptidos de longitudes variables (por ej., de al menos 4-6 aminoácidos de longitud) y utilizarse para ensayos de unión con un anticuerpo. En otro ejemplo, el epítopo al que se une el anticuerpo puede determinarse en un cribado sistemático utilizando péptidos superpuestos derivados de la secuencia del antígeno diana y determinando la unión por el anticuerpo. Según los ensayos de expresión de fragmentos de genes, el marco de lectura abierto que codifica el antígeno diana se fragmenta al azar o mediante construcciones genéticas específicas y se determina la reactividad de los fragmentos expresados del antígeno con el anticuerpo que se va a analizar. Los fragmentos de genes pueden, por ejemplo, producirse por PCR y luego transcribirse y traducirse en proteínas in vitro, en presencia de aminoácidos radiactivos. A continuación, se determina la unión del anticuerpo a los fragmentos de antígeno marcados radiactivamente mediante inmunoprecipitación y electroforesis en gel. También se pueden identificar determinados epítopos utilizando grandes bibliotecas de secuencias peptídicas aleatorias que se muestran en la superficie de partículas de fagos (bibliotecas de fagos). Alternativamente, una biblioteca definida de fragmentos peptídicos solapados puede probarse para la unión al anticuerpo de prueba en ensayos de unión simples. En un ejemplo adicional, se puede realizar mutagénesis de un dominio de unión a antígeno, experimentos de intercambio de dominios y mutagénesis de barrido de alanina para identificar residuos requeridos, suficientes y/o necesarios para la unión al epítopo. Por ejemplo, los experimentos de intercambio de dominios pueden realizarse utilizando un mutante de un antígeno diana en el que varios fragmentos del complejo GARP-TGFβ1, un complejo LTBP1-TGFβ1, un complejo LTBP3-TGFβ1, y/o un complejo LRRC33-TGFβ1 se han sustituido (intercambiado) con secuencias de una proteína estrechamente relacionada, pero antigénicamente distinta, tal como otro miembro de la familia de proteínas TGFβ (por ej., GDF11). Evaluando la unión del anticuerpo al mutante del complejo a GARP-TGFβ1, un complejo LTBP1-TGFβ1, un complejo LTBP3-TGFβ1, y/o un complejo LRRC33-TGFβ1, puede evaluarse la importancia del fragmento de antígeno particular para la unión del anticuerpo.

[0177] Alternativamente, se pueden realizar ensayos de competición utilizando otros anticuerpos que se sabe que se unen al mismo antígeno para determinar si un anticuerpo se une al mismo epítopo que los otros anticuerpos. Los ensayos de competición son bien conocidos por los expertos en la técnica.

[0178] Además, la interacción de cualquiera de los anticuerpos proporcionados en el presente documento con uno o más residuos en un complejo GARP-TGFβ1, un complejo LTBP1-TGFβ1, un complejo LTBP3-TGFβ1, y/o un complejo LRRC33-TGFβ1 puede determinarse mediante tecnología de rutina. Por ejemplo, puede determinarse una estructura cristalina, y las distancias entre los residuos en un complejo GARP-TGFβ1, un complejo LTBP1-TGFβ1, un complejo LTBP3-TGFβ1, y/o un complejo LRRC33-TGFβ1 y uno o más residuos en el anticuerpo pueden determinarse en consecuencia. Basándose en dicha distancia, se puede determinar si un residuo específico en un complejo GARP-TGFβ1, un complejo LTBP1-TGFβ1, un complejo LTBP3-TGFβ1, y/o un complejo LRRC33-TGFβ1 interactúa con uno o más residuos en el anticuerpo. Además, pueden aplicarse métodos adecuados, como ensayos de competición y ensayos de mutagénesis de diana, para determinar la unión preferente de un anticuerpo candidato.

Producción de Anticuerpos que se Unen a un Complejo GARP-TGFβ1, un Complejo LTBP1-TGFβ1, un Complejo TGFβ1y/o un Complejo LRRC33-TGFβ1

[0179] Pueden utilizarse numerosos métodos para obtener anticuerpos, o fragmentos de unión a antígeno de los mismos, de la divulgación. Por ejemplo, los anticuerpos pueden producirse utilizando métodos de ADN recombinante. Los anticuerpos monoclonales también pueden producirse mediante la generación de hibridomas (véase, por ej., Kohler y Milstein (1975) Nature, 256: 495-499) según métodos conocidos. A continuación, los hibridomas formados de esta manera se examinan mediante métodos estándar, como el ensayo inmunoenzimático (ELISA) y el análisis de resonancia de plasmón superficial (por ej., OCTET o BIACORE), para identificar uno o más hibridomas que produzcan un anticuerpo que se una específicamente a un antígeno especificado. Como inmunógeno puede utilizarse cualquier forma del antígeno especificado, por ejemplo, antígeno recombinante, formas naturales, cualquier variante o fragmento del mismo, así como su péptido antigénico (por ej., cualquiera de los epítopos descritos en el presente documento como epítopo lineal o dentro de un andamio como epítopo conformacional). Un método ejemplar de fabricación de anticuerpos incluye el cribado de bibliotecas de expresión de proteínas que expresan anticuerpos o fragmentos de los mismos (por ej., scFv), por ejemplo, bibliotecas de visualización de fagos o ribosomas. La visualización de fagos se describe, por ejemplo, en Ladner et al., Patente de EE. UU. Nº.5.223.409; Smith (1985) Science 228:1315-1317; Clackson et al. Nature.624-628; Marks et al. (1991) J. Mol. Biol., 222: 581-597; WO 92/18619; WO 91/17271; WO 92/20791; WO 92/15679; WO 93/01288; WO 92/01047; WO 92/09690; y WO 90/02809.

[0180] Además del uso de bibliotecas de visualización, el antígeno especificado (por ej., un complejo GARP-TGFβ1, un complejo LTBP1-TGFβ1, un complejo LTBP3-TGFβ1, y/o un complejo LRRC33-TGFβ1) puede usarse para inmunizar un animal no humano, por ejemplo, un roedor, por ej., un ratón, por ej., un hámster o una rata. En una forma de realización, el animal no humano es un ratón.

[0181] En otra forma de realización, se obtiene un anticuerpo monoclonal del animal no humano, y luego se modifica, por ejemplo, quimérico, utilizando técnicas adecuadas de ADN recombinante. Se han descrito diversos métodos para fabricar anticuerpos quiméricos. Véase, por ejemplo, Morrison et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A.81:6851, 1985; Takeda et al., Nature 314:452, 1985, Cabilly et al., Patente de EE. UU. Nº.4,816,567; Boss et al., Patente de EE. UU. Nº.4.816.397; Tanaguchi et al., Publicación de Patente Europea EP171496; Publicación de Patente Europea 0173494, Patente del Reino Unido GB 2177096B.

[0182] Para otras técnicas de producción de anticuerpos, véase Antibodies: A Laboratory Manual, eds. Harlow et al., Cold Spring Harbor Laboratory, 1988. La presente divulgación no se limita necesariamente a ninguna fuente particular, método de producción u otras características especiales de un anticuerpo.

[0183] Algunos aspectos de la presente divulgación se refieren a células huésped transformadas con un polinucleótido o vector. Las células huésped pueden ser procariotas o eucariotas. El polinucleótido o vector presente en la célula huésped puede integrarse en el genoma de la célula huésped o mantenerse extracromosómicamente. La célula huésped puede ser cualquier célula procariota o eucariota, como una célula bacteriana, de insecto, de hongo, vegetal, animal o humana. En ocasiones, las células fúngicas son, por ejemplo, las del género Saccharomyces, en particular las de la especie S. cerevisiae. El término "procariota" incluye todas las bacterias que pueden transformarse o transfectarse con moléculas de ADN o ARN para la expresión de un anticuerpo o de las cadenas de inmunoglobulina correspondientes. Los huéspedes procariotas pueden incluir bacterias gramnegativas y grampositivas como, por ejemplo, E. coli, S. typhimurium, Serratia marcescens y Bacillus subtilis. El término "eucariota" incluye levaduras, plantas superiores, insectos y células de vertebrados, por ejemplo, células de mamíferos, como las células NSO y CHO. Dependiendo del huésped empleado en un procedimiento de producción recombinante, los anticuerpos o cadenas de inmunoglobulina codificados por el polinucleótido pueden estar glicosilados o no. Los anticuerpos o las cadenas de inmunoglobulina correspondientes también pueden incluir un residuo inicial de aminoácido metionina.

[0184] En ocasiones una vez que se ha incorporado un vector en un hospedador apropiado, el hospedador puede mantenerse en condiciones adecuadas para la expresión de alto nivel de las secuencias de nucleótidos y, si se desea, puede seguir la recogida y purificación de las cadenas ligeras de inmunoglobulina, cadenas pesadas, dímeros de cadenas ligeras/pesadas o anticuerpos intactos, fragmentos de unión a antígeno u otras formas de inmunoglobulina; véase, Beychok, Cells of Immunoglobulin Synthesis, Academic Press, N.Y., (1979). Así, se introducen polinucleótidos o vectores en las células que, a su vez, producen el anticuerpo o los fragmentos de unión al antígeno. Además, para la producción a gran escala del anticuerpo o de los fragmentos de anticuerpo pueden utilizarse animales transgénicos, preferentemente mamíferos, que comprendan las células huésped mencionadas.

[0185] Las células huésped transformadas pueden crecer en fermentadores y cultivarse utilizando cualquier técnica adecuada para lograr un crecimiento celular óptimo. Una vez expresados, los anticuerpos enteros, sus dímeros, cadenas ligeras y pesadas individuales, otras formas de inmunoglobulina o fragmentos de unión a antígeno, pueden purificarse según los procedimientos estándar de la técnica, incluida la precipitación con sulfato de amonio, columnas de afinidad, cromatografía en columna, electroforesis en gel y similares; véase, Scopes, "Protein Purification", Springer Verlag, N.Y. (1982). El anticuerpo o los fragmentos de unión al antígeno pueden aislarse entonces del medio de crecimiento, de lisados celulares o de fracciones de membrana celular. El aislamiento y purificación de los anticuerpos o fragmentos de unión a antígeno, por ejemplo expresados microbialmente, puede realizarse por cualquier medio convencional como, por ejemplo, separaciones cromatográficas preparativas y separaciones inmunológicas como las que implican el uso de anticuerpos monoclonales o policlonales dirigidos, por ejemplo, contra la región constante del anticuerpo.

[0186] Aspectos de la divulgación se refieren a un hibridoma, que proporciona una fuente indefinidamente prolongada de anticuerpos monoclonales. Como alternativa a la obtención de inmunoglobulinas directamente a partir del cultivo de hibridomas, pueden utilizarse células de hibridoma inmortalizadas como fuente de loci de cadena pesada y cadena ligera reordenados para su posterior expresión y/o manipulación genética. Los genes de anticuerpos reordenados pueden transcribirse inversamente a partir de los ARNm apropiados para producir ADNc. En ocasiones, la región constante de la cadena pesada puede intercambiarse por la de un isotipo diferente o eliminarse por completo. Las regiones variables pueden unirse para codificar regiones Fv de cadena simple. Se pueden enlazar múltiples regiones Fv para conferir capacidad de unión a más de una diana o se pueden emplear combinaciones quiméricas de cadenas pesadas y ligeras. Para la clonación de regiones variables de anticuerpos y la generación de anticuerpos recombinantes puede utilizarse cualquier método apropiado.

[0187] En ocasiones, se obtiene un ácido nucleico apropiado que codifica regiones variables de una cadena pesada y/o ligera y se inserta en un vector de expresión que puede transfectarse en células huésped recombinantes estándar. Pueden utilizarse diversas células huésped. En ocasiones, las células huésped de mamíferos pueden ser ventajosas para un procesamiento y una producción eficientes. Las líneas celulares típicas de mamíferos útiles para este fin incluyen células CHO, células 293 o células NSO. La producción del anticuerpo o fragmento de unión a antígeno puede llevarse a cabo cultivando un hospedador recombinante modificado en condiciones de cultivo apropiadas para el crecimiento de las células hospedadoras y la expresión de las secuencias codificantes. Los anticuerpos o fragmentos de unión al antígeno pueden recuperarse aislándolos del cultivo. Los sistemas de expresión pueden diseñarse para incluir péptidos señal de modo que los anticuerpos resultantes se secreten en el medio; sin embargo, también es posible la producción intracelular.

[0188] La divulgación también incluye un polinucleótido que codifica al menos una región variable de una cadena de inmunoglobulina de los anticuerpos descritos en el presente documento. En ocasiones, la región variable codificada por el polinucleótido comprende al menos una región determinante de la complementariedad (CDR) de la VH y/o VL de la región variable del anticuerpo producido por cualquiera de los hibridomas descritos anteriormente.

[0189] Los polinucleótidos que codifican anticuerpos o fragmentos de unión a antígeno pueden ser, por ejemplo, ADN, ADNc, ARN o ADN o ARN producidos sintéticamente o una molécula de ácido nucleico quimérico producida recombinantemente que comprenda cualquiera de esos polinucleótidos solos o en combinación. En ocasiones, un polinucleótido forma parte de un vector. Dichos vectores pueden incluir genes adicionales, como genes marcadores, que permitan la selección del vector en una célula huésped adecuada y en condiciones adecuadas.

[0190] En ocasiones, un polinucleótido está unido operativamente a secuencias de control de expresión que permiten la expresión en células procariotas o eucariotas. La expresión del polinucleótido comprende la transcripción del polinucleótido en un ARNm traducible. Los elementos reguladores que aseguran la expresión en células eucariotas, preferentemente células de mamífero, son bien conocidos por los expertos en la técnica. Pueden incluir secuencias reguladoras que faciliten el inicio de la transcripción y, opcionalmente, señales poli-A que faciliten la terminación de la transcripción y la estabilización del transcrito. Los elementos reguladores adicionales pueden incluir potenciadores transcripcionales y traslacionales, y/o regiones promotoras heterólogas o asociadas de forma natural. Los posibles elementos reguladores que permiten la expresión en células huésped procariotas incluyen, por ejemplo, el promotor PL, Lac, Trp o Tac en E. coli, y ejemplos de elementos reguladores que permiten la expresión en células huésped eucariotas son el promotor AOX1 o GAL1 en levaduras o el promotor CMV, el promotor SV40, el promotor RSV (virus del sarcoma de Rous), el potenciador CMV, el potenciador SV40 o un intrón de globina en células de mamíferos y otros animales.

[0191] Además de los elementos responsables de la iniciación de la transcripción, dichos elementos reguladores también pueden incluir señales de terminación de la transcripción, como el sitio SV40-poly-A o el sitio tk-poly-A, en dirección 3' del polinucleótido. Además, dependiendo del sistema de expresión empleado, pueden añadirse a la secuencia codificante del polinucleótido secuencias líder capaces de dirigir el polipéptido a un compartimento celular o de secretarlo al medio, como ya se ha descrito anteriormente. La(s) secuencia(s) líder(es) se ensambla(n) en fase apropiada con las secuencias de traducción, iniciación y terminación, y preferiblemente, una secuencia líder capaz de dirigir la secreción de la proteína traducida, o una porción de la misma, en, por ejemplo, el medio extracelular. Opcionalmente, puede utilizarse una secuencia polinucleotídica heteróloga que codifique una proteína de fusión que incluya un péptido de identificación C- o N-terminal que imparta las características deseadas, por ejemplo, estabilización o purificación simplificada del producto recombinante expresado.

[0192] En ocasiones, los polinucleótidos que codifican al menos el dominio variable de la cadena ligera y/o pesada pueden codificar los dominios variables de ambas cadenas de inmunoglobulina o sólo uno. Asimismo, los polinucleótidos pueden estar bajo el control del mismo promotor o pueden ser controlados por separado para su expresión. Además, algunos aspectos se refieren a vectores, en particular plásmidos, cósmidos, virus y bacteriófagos utilizados convencionalmente en ingeniería genética que comprenden un polinucleótido que codifica un dominio variable de una cadena de inmunoglobulina de un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno; opcionalmente en combinación con un polinucleótido que codifica el dominio variable de la otra cadena de inmunoglobulina del anticuerpo.

[0193] En ocasiones, las secuencias de control de expresión se proporcionan como sistemas promotores eucarióticos en vectores capaces de transformar o transfectar células huésped eucarióticas, pero también pueden utilizarse secuencias de control para huéspedes procarióticos. Los vectores de expresión derivados de virus tales como retrovirus, virus vaccinia, virus adeno-asociados, virus del herpes o virus del papiloma bovino, pueden utilizarse para administrar los polinucleótidos o el vector a la población celular diana (por ej., para diseñar una célula que exprese un anticuerpo o un fragmento de unión a antígeno). Para construir vectores virales recombinantes pueden utilizarse diversos métodos apropiados. En ocasiones, los polinucleótidos y los vectores pueden reconstituirse en liposomas para su administración a las células diana. Los vectores que contienen los polinucleótidos (por ej., el/los dominio(s) variable(s) pesado(s) y/o ligero(s) de las cadenas de inmunoglobulina que codifican secuencias y secuencias de control de expresión) pueden transferirse a la célula huésped mediante métodos adecuados, que varían en función del tipo de huésped celular.

Modificaciones

[0194] Los anticuerpos, o porciones de unión a antígeno de los mismos, de la divulgación pueden modificarse con un marcador detectable o una fracción detectable, incluyendo, pero sin limitarse a, una enzima, grupo prostético, material fluorescente, material luminiscente, material bioluminiscente, material radiactivo, metal emisor de positrones, ion metálico paramagnético no radiactivo, y etiqueta de afinidad para la detección y aislamiento de un complejo GARP-TGFβ1, un complejo LTBP1-TGFβ1, un complejo LTBP3-TGFβ1, y/o un complejo LRRC33-TGFβ1. La sustancia o fracción detectable puede acoplarse o conjugarse directamente a los polipéptidos de la divulgación o indirectamente, a través de un intermediario (como, por ejemplo, un enlazador (por ej., un enlazador escindible)) utilizando técnicas adecuadas. Entre los ejemplos no limitativos de enzimas adecuadas se incluyen la peroxidasa de rábano picante, la fosfatasa alcalina, la βgalactosidasa, la glucosa oxidasa o la acetilcolinesterasa; entre los ejemplos no limitativos de complejos de grupos prostéticos adecuados se incluyen la estreptavidina/biotina y la avidina/biotina; Como ejemplos no limitativos de materiales fluorescentes adecuados cabe citar la biotina, la umbeliferona, la fluoresceína, el isotiocianato de fluoresceína, la rodamina, la fluoresceína diclorotriazinilamina, el cloruro de dansilo o la ficoeritrina; como ejemplo de material luminiscente cabe citar el luminol; como ejemplos no limitativos de materiales bioluminiscentes cabe citar la luciferasa, la luciferina y la aequorina; y como ejemplos de material radiactivo adecuado cabe citar un ion metálico radiactivo, por ej., emisores alfa u otros radioisótopos como, por ejemplo, yodo (¹³¹I, ¹²⁵I, ¹²³I, ¹²¹I) y tecnecio (⁹⁹Tc, ⁹⁹mTc), talio (²⁰¹Ti), galio (⁶⁸Ga, ⁶⁷Ga), paladio (¹⁰³Pd), molibdeno (⁹⁹Mo), xenón (¹³³Xe), flúor (¹⁸F), ¹⁵³Sm, Lu, ¹⁵⁹Gd, ¹⁴⁹Pm, ¹⁴⁰La, ¹⁷⁵Yb, ¹⁶⁶Ho, ⁹⁰Y, ⁴⁷Sc, ⁸⁶R, ¹⁸⁸Re, ¹⁴²Pr, ¹⁰⁵Rh, ⁹⁷Ru, ⁶⁸Ge, ⁵⁷Co, ⁶⁵Zn, ⁸⁵Sr, ³²P, ¹⁵³Gd, ¹⁶⁹Yb, ⁵¹C r, ⁵⁴Mn, ⁷⁵Se y estaño (¹¹³Sn, ¹¹⁷Sn). La sustancia detectable puede acoplarse o conjugarse directamente a los anticuerpos de la divulgación que se unen específicamente a un complejo GARP-TGFβ1, un complejo LTBP1-TGFβ1, un complejo LTBP3-TGFβ1, y un complejo LRRC33-TGFβ1, o indirectamente, a través de un intermediario (tal como, por ejemplo, un enlazador) utilizando técnicas adecuadas. Cualquiera de los anticuerpos proporcionados en el presente documento que estén conjugados con una sustancia detectable puede utilizarse para cualquier ensayo de diagnóstico adecuado, como los descritos en el presente documento.

[0195] Además, los anticuerpos, o porciones de unión a antígeno de los mismos, de la divulgación también pueden modificarse con un fármaco. El fármaco puede acoplarse o conjugarse directamente a los polipéptidos de la divulgación, o indirectamente, a través de un intermediario (como, por ejemplo, un enlazador (por ej., un enlazador escindible)) utilizando técnicas adecuadas.

Agentes Diana

[0196] En algunas formas de realización, los métodos de la presente divulgación comprenden el uso de uno o más agentes diana para dirigir un anticuerpo, o una porción de unión a antígeno del mismo, como se divulga en el presente documento, a un sitio particular en un sujeto con el fin de modular la liberación de TGFβ maduro de un complejo GARP-TGFβ1, un complejo LTBP1-TGFβ1, un complejo LTBP3-TGFβ1, y/o un complejo LRRC33-TGFβ1. Por ejemplo, los complejos LTBP1-TGFβ1 y LTBP3-TGFβ1 suelen localizarse en la matriz extracelular. Así, los anticuerpos aquí divulgados pueden conjugarse con agentes diana de matriz extracelular con el fin de localizar los anticuerpos en sitios donde residen los complejos LTBP1-TGFβ1 y LTBP3-TGFβ1. En ocasiones, lo direccionamiento selectivo de los anticuerpos conduce a una modulación selectiva de los complejos LTBP1-TGFβ1 y/o LTBP3-TGFβ1. En ocasiones, lo direccionamiento selectivo de los anticuerpos conduce a la inhibición selectiva de los complejos LTBP1-TGFβ1 y/o LTBP3-TGFβ1 (por ej., con fines de tratamiento de la fibrosis). En ocasiones, los agentes direccionados a la matriz extracelular incluyen agentes de unión a heparina, agentes de unión a metaloproteinasas de matriz, dominios de unión a lisil oxidasa, agentes de unión a fibrilina, agentes de unión a ácido hialurónico y otros.

[0197] De manera similar, los complejos GARP-TGFβ1 se localizan típicamente en la superficie de las células, por ejemplo, células T reguladoras (Tregs) FOXP3⁺activadas. Así, los anticuerpos aquí divulgados pueden conjugarse con agentes de unión a células inmunitarias (por ej., células Treg) con el fin de localizar anticuerpos en sitios donde residen complejos GARP-TGFβ1. En ocasiones, lo direccionamiento selectivo de los anticuerpos conduce a una modulación selectiva de los complejos GARP-TGFβ1. En ocasiones, lo direccionamiento selectivo de los anticuerpos conduce a la inhibición selectiva de los complejos GARP-TGFβ1 (por ej., la inhibición selectiva de la liberación de TGFβ1 maduro con fines de modulación inmunitaria, por ejemplo, en el tratamiento del cáncer). En ocasiones, los agentes direccionados a las células Treg pueden incluir, por ejemplo, proteínas CCL22 y CXCL12 o fragmentos de las mismas.

[0198] En ocasiones, pueden usarse anticuerpos biespecíficos que tienen una primera porción que une selectivamente el complejo GARP-TGFβ1 y un complejo LTBP-TGFβ1 y una segunda porción que une selectivamente un componente de un sitio diana, por ejemplo, un componente de la ECM (por ej., fibrilina) o un componente de una célula Treg (por ej., CTLA-4).

Composiciones Farmacéuticas

[0199] En el presente documento se proporcionan composiciones farmacéuticas utilizadas como medicamentos adecuados para la administración en sujetos humanos y no humanos. Uno o más anticuerpos que se unen específicamente a un complejo GARP-TGFβ1, un complejo LTBP1-TGFβ1, un complejo LTBP3-TGFβ1, y/o un complejo LRRC33-TGFβ1 pueden formularse o mezclarse con un portador farmacéuticamente aceptable (excipiente), incluyendo, por ejemplo, un tampón, para formar una composición farmacéutica. Dichas formulaciones pueden utilizarse para el tratamiento de una enfermedad o trastorno que implique la señalización de TGFβ. En ocasiones, dicha enfermedad o trastorno asociado a la señalización de TGFβ implica uno o más contextos, es decir, el TGFβ se asocia a un tipo o tipos concretos de moléculas presentadoras. En ocasiones, dicho contexto se produce de forma específica para cada tipo celular y/o tejido. En ocasiones, por ejemplo, dicha acción dependiente del contexto de la señalización de TGFβ está mediada en parte a través de GARP, LRRC33, LTBP1 y/o LTBP3.

[0200] En ocasiones, el anticuerpo se une específicamente a dos o más contextos de TGFβ, de tal manera que el anticuerpo se une a TGFβ en un complejo con moléculas presentadoras seleccionadas entre dos o más de: GARP, LRRC33, LTBP1 y LTBP3. Así, dichas composiciones farmacéuticas pueden administrarse a pacientes para aliviar una indicación relacionada con el TGFβ (por ej., fibrosis, trastornos inmunitarios y/o cáncer). "Aceptable" significa que el portador es compatible con el principio activo de la composición (y preferiblemente, capaz de estabilizar el principio activo) y no deletéreo para el sujeto a tratar. Los ejemplos de excipientes farmacéuticamente aceptables (portadores), incluidos los tampones, serían evidentes para el experto y se han descrito anteriormente. Véase, por ejemplo, Remington: The Science and Practice of Pharmacy 20th Ed. (2000) Lippincott Williams and Wilkins, Ed. K. E. Hoover. Una composición farmacéutica descrita en el presente documento contiene más de un anticuerpo que se une específicamente a un complejo GARP-TGFβ1, un complejo LTBP1-TGFβ1, un complejo LTBP3-TGFβ1, y/o un complejo LRRC33-TGFβ1 donde los anticuerpos reconocen diferentes epítopos/residuos del complejo GARP-TGFβ1, un complejo LTBP1-TGFβ1, un complejo LTBP3-TGFβ1, y/o un complejo LRRC33-TGFβ1.

[0201] Las composiciones farmacéuticas que se utilizarán en los presentes métodos pueden comprender portadores, excipientes o estabilizadores farmacéuticamente aceptables en forma de formulaciones liofilizadas o soluciones acuosas (Remington: The Science and Practice of Pharmacy 20th Ed. (2000) Lippincott Williams and Wilkins, Ed. K. E. Hoover). Los portadores, excipientes o estabilizadores aceptables no son tóxicos para los receptores en las dosis y concentraciones utilizadas, y pueden comprender tampones como fosfato, citrato y otros ácidos orgánicos; antioxidantes como ácido ascórbico y metionina; conservantes (como cloruro de octadecildimetilbencilamonio; cloruro de hexametonio; cloruro de benzalconio, cloruro de bencetonio; fenol, alcohol butílico o bencílico; alquilparabenos como metil o propilparabeno; catecol; resorcinol; ciclohexanol; 3-pentanol; y m-cresol); polipéptidos de bajo peso molecular (menos de unos 10 residuos); proteínas, como albúmina sérica, gelatina o inmunoglobulinas; polímeros hidrófilos, como polivinilpirrolidona; aminoácidos, como glicina, glutamina, asparagina, histidina, arginina o lisina; monosacáridos, disacáridos y otros hidratos de carbono, como glucosa, manosa o dextranos; agentes quelantes, como EDTA; azúcares, como sacarosa, manitol, trehalosa o sorbitol; contraiones formadores de sal, como sodio; complejos metálicos (por ej., complejos Zn-proteína); y/o tensioactivos no iónicos como TWEEN^™, PLURONICS^™o polietilenglicol (PEG). Los excipientes farmacéuticamente aceptables se describen con más detalle en el presente documento.

[0202] En algunos ejemplos, la composición farmacéutica descrita en el presente documento comprende liposomas que contienen un anticuerpo que se une específicamente a un complejo GARP-TGFβ1, un complejo LTBP1-TGFβ1, un complejo LTBP3-TGFβ1, y/o un complejo LRRC33-TGFβ1, que puede prepararse mediante cualquier método adecuado, tal como se describe en Epstein et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82:3688 (1985); Hwang et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77:4030 (1980); y Patente de EE. UU. Nº. 4,485,045 y 4,544,545; Los liposomas con mayor tiempo de circulación se describen en la Patente de EE. UU. Nº 5.013.556. Pueden generarse liposomas particularmente útiles por el método de evaporación en fase inversa con una composición lipídica que comprende fosfatidilcolina, colesterol y fosfatidiletanolamina derivatizada con PEG (PEG-PE). Los liposomas se extruyen a través de filtros de tamaño de poro definido para producir liposomas con el diámetro deseado.

[0203] Los anticuerpos que se unen específicamente a un complejo GARP-TGFβ1, a un complejo LTBP1-TGFβ1, a un complejo LTBP3-TGFβ1 y/o a un complejo LRRC33-TGFβ1 también pueden quedar atrapados en microcápsulas preparadas, por ejemplo, mediante técnicas de coacervación o mediante polimerización interfacial, por ejemplo, microcápsulas de hidroximetilcelulosa o gelatina y microcápsulas de poli(metilmetacilato), respectivamente, en sistemas coloidales de administración de fármacos (por ej., liposomas, microesferas de albúmina, microemulsiones, nanopartículas y nanocápsulas) o en macroemulsiones. Anteriormente se han descrito técnicas ejemplares, véase, por ejemplo, Remington, The Science and Practice of Pharmacy 20th Ed. Mack Publishing (2000).

[0204] En otros ejemplos, la composición farmacéutica aquí descrita puede formularse en formato de liberación controlada. Ejemplos adecuados de preparaciones de liberación controlada incluyen matrices semipermeables de polímeros hidrófobos sólidos que contienen el anticuerpo, cuyas matrices se presentan en forma de artículos moldeados, por ejemplo películas, o microcápsulas. Entre los ejemplos de matrices de liberación controlada se incluyen poliésteres, hidrogeles (por ej., poli(2-hidroxietilmetacrilato) o poli(vinilalcohol)), polilactidas ( Patente de EE. UU. Nº 3.773.919), copolímeros de ácido L-glutámico y 7 etil-L-glutamato, etilvinilacetato no degradable, copolímeros degradables de ácido láctico y ácido glicólico como el LUPRON DEPOT^™(microesferas inyectables compuestas de copolímero de ácido láctico y ácido glicólico y acetato de leuprolida), isobutirato de acetato de sacarosa y ácido poli-D-(-)-3-hidroxibutírico.

[0205] Las composiciones farmacéuticas que se utilicen para la administración in vivo deben ser estériles. Esto se consigue fácilmente, por ejemplo, por filtración a través de membranas de filtración estériles. Las composiciones de anticuerpos terapéuticos se colocan generalmente en un recipiente con un puerto de acceso estéril, por ejemplo, una bolsa de solución intravenosa o un vial con un tapón perforable por una aguja de inyección hipodérmica.

[0206] Las composiciones farmacéuticas aquí descritas pueden presentarse en formas de dosificación unitarias como comprimidos, píldoras, cápsulas, polvos, gránulos, soluciones o suspensiones, o supositorios, para administración oral, parenteral o rectal, o administración por inhalación o insuflación.

[0207] Para preparar composiciones sólidas como comprimidos, el principio activo principal puede mezclarse con un soporte farmacéutico, por ejemplo , ingredientes convencionales para comprimidos como almidón de maíz, lactosa, sacarosa, sorbitol, talco, ácido esteárico, estearato de magnesio, fosfato dicálcico o gomas, y otros diluyentes farmacéuticos, por ejemplo, agua, para formar una composición sólida de preformulación que contenga una mezcla homogénea de un compuesto de la presente divulgación, o una sal farmacéuticamente aceptable no tóxica del mismo. Cuando se hace referencia a estas composiciones de preformulación como homogéneas, se quiere decir que el ingrediente activo se dispersa uniformemente por toda la composición, de modo que ésta puede subdividirse fácilmente en formas de dosificación unitarias igualmente eficaces, como comprimidos, píldoras y cápsulas. Esta composición sólida de preformulación se subdivide entonces en formas de dosificación unitarias del tipo descrito anteriormente que contienen de 0,1 mg a aproximadamente 500 mg del principio activo de la presente divulgación. Los comprimidos o píldoras de la nueva composición pueden recubrirse o componerse de otro modo para proporcionar una forma de dosificación que ofrezca la ventaja de una acción prolongada. Por ejemplo, el comprimido o píldora puede comprender un componente de dosificación interno y otro externo, este último en forma de sobre sobre el primero. Los dos componentes pueden estar separados por una capa entérica que sirve para resistir la desintegración en el estómago y permite que el componente interno pase intacto al duodeno o se retrase su liberación. Para dichas capas o recubrimientos entéricos pueden utilizarse diversos materiales, entre los que se incluyen diversos ácidos poliméricos y mezclas de ácidos poliméricos con materiales como goma laca, alcohol cetílico y acetato de celulosa.

[0208] Los agentes tensioactivos adecuados incluyen, en particular, agentes no iónicos, tales como polioxietilenosorbitanos (por ej., Tween^™20, 40, 60, 80 u 85) y otros sorbitanos (por ej., Span^™20, 40, 60, 80 u 85). Las composiciones con un agente tensioactivo comprenderán convenientemente entre el 0,05 y el 5% de agente tensioactivo, pudiendo estar entre el 0,1 y el 2,5%. Se apreciará que pueden añadirse otros ingredientes, por ejemplo, manitol u otros vehículos farmacéuticamente aceptables, si es necesario.

[0209] Pueden prepararse emulsiones adecuadas utilizando emulsiones grasas disponibles en el mercado, como Intralipid^™, Liposyn^™, Infonutrol^™, Lipofundin^™y Lipiphysan^™. El principio activo puede disolverse en una composición de emulsión premezclada o, alternativamente, puede disolverse en un aceite (por ej., aceite de soja, aceite de cártamo, aceite de semilla de algodón, aceite de sésamo, aceite de maíz o aceite de almendras) y formarse una emulsión al mezclarse con un fosfolípido (por ej., fosfolípidos de huevo, fosfolípidos de soja o lecitina de soja) y agua. Se apreciará que pueden añadirse otros ingredientes, por ejemplo, glicerol o glucosa, para ajustar la tonicidad de la emulsión. Las emulsiones adecuadas contendrán normalmente hasta un 20% de aceite, por ejemplo, entre un 5 y un 20%.

[0210] Las composiciones de emulsión pueden ser las preparadas mezclando un anticuerpo que se une específicamente a un complejo GARP-TGFβ1, un complejo LTBP1-TGFβ1, un complejo LTBP3-TGFβ1, y/o un complejo LRRC33-TGFβ1 con Intralipid^™o los componentes del mismo (aceite de soja, fosfolípidos de huevo, glicerol y agua).

[0211] Las composiciones farmacéuticas para inhalación o insuflación incluyen soluciones y suspensiones en disolventes acuosos u orgánicos farmacéuticamente aceptables, o mezclas de los mismos, y polvos. Las composiciones líquidas o sólidas pueden contener excipientes farmacéuticamente aceptables adecuados, como se ha indicado anteriormente. En algunas formas de realización, las composiciones se administran por vía respiratoria oral o nasal para un efecto local o sistémico.

[0212] Las composiciones en disolventes preferentemente estériles farmacéuticamente aceptables pueden nebulizarse mediante el uso de gases. Las soluciones nebulizadas pueden respirarse directamente desde el dispositivo nebulizador o éste puede conectarse a una mascarilla facial, una tienda de campaña o un respirador de presión positiva intermitente. Las composiciones en solución, suspensión o polvo pueden administrarse, preferentemente por vía oral o nasal, a partir de dispositivos que administren la formulación de forma adecuada.

Uso de Anticuerpos, y Porciones de Unión a Antígeno de los Mismos, que Unen Específicamente un Complejo GARP-TGFβ1, un Complejo LTBP1-TGFβ1, un Complejo LTBP3-TGFβ1, y/o un Complejo LRRC33-TGFβ1.

[0213] En ocasiones, los anticuerpos, las porciones de unión a antígeno de los mismos y las composiciones de la divulgación pueden usarse para tratar una amplia variedad de enfermedades, trastornos y/o afecciones. Dichas enfermedades, trastornos y/o afecciones pueden ser indicaciones relacionadas con el TGFβ. Tal como se utiliza en el presente documento, el término "indicación relacionada con TGFβ" se refiere a cualquier enfermedad, trastorno y/o afección relacionada con la expresión, la actividad y/o el metabolismo de una proteína miembro de la familia TGFβ o cualquier enfermedad, trastorno y/o afección que pueda beneficiarse de la modulación de la actividad y/o los niveles de una o más proteínas miembro de la familia TGFβ. Las indicaciones relacionadas con el TGFβ pueden incluir, entre otras, la fibrosis, el cáncer (incluidos, entre otros, el cáncer de colon, el cáncer renal, el cáncer de mama, el melanoma maligno y el glioblastoma, la facilitación de la hematopoyesis rápida tras la quimioterapia, la cicatrización ósea, la cicatrización de heridas, demencia, mielofibrosis, enfermedad renal, obstrucción ureteral unilateral (UUO), pérdida y/o degeneración dental, síndromes de proliferación endotelial, asma y alergia, trastornos gastrointestinales, anemia del envejecimiento, aneurisma aórtico, indicaciones huérfanas (como el síndrome de Marfan), obesidad, diabetes, artritis, esclerosis múltiple, distrofia muscular, esclerosis lateral amiotrófica (ALS), enfermedad de Parkinson, osteoporosis, artrosis, osteopenia, síndromes metabólicos, trastornos nutricionales, atrofia de órganos, enfermedad pulmonar obstructiva crónica (COPD) y anorexia. Las indicaciones adicionales pueden incluir cualquiera de las divulgadas en Pub. de EE. UU. Nº 2013/0122007; Pat. de EE.UU. Nº.8.415.459 o Pub. International Nº WO2011/151432.

Fibrosis

[0214] En ocasiones, los anticuerpos y/o composiciones de la presente divulgación pueden ser útiles para alterar la fibrosis. En ocasiones, dichos anticuerpos y/o composiciones son antagonistas de TGFβ (por ej., TGFβ1). TGFβ1 es reconocido como el orquestador central de la respuesta fibrótica. Los anticuerpos direccionados al TGFβ1 disminuyen la fibrosis en numerosos modelos preclínicos. Dichos anticuerpos y/o compuestos basados en anticuerpos incluyen LY2382770 (Eli Lilly, Indianapolis, IN). También se incluyen los descritos en las Patentes de EE.UU. Nº US 6.492.497, US 7.151.169, US 7.723.486 y Pub. Solicitud de EEUU. Nº 2011/0008364.

[0215] Las indicaciones fibróticas para las que los anticuerpos y/o composiciones de la presente divulgación pueden usarse terapéuticamente incluyen, pero no se limitan a, indicaciones pulmonares, (por ej., fibrosis pulmonar idiopática (IPF), trastorno pulmonar obstructivo crónico (COPD), asma alérgica, lesión pulmonar aguda, esofagitis eosinofílica, hipertensión arterial pulmonar y lesión química por gas), indicaciones renales (por ej., glomeruloesclerosis diabética, glomeruloclerosis segmentaria focal (FSGS), enfermedad renal crónica, fibrosis asociada a trasplante renal y rechazo crónico, nefropatía IgA y síndrome urémico hemolítico), fibrosis hepática (por ej., esteatohepatitis no alcohólica (NASH), hepatitis vírica crónica, parasitemia, errores innatos del metabolismo, fibrosis mediada por toxinas, como la fibrosis alcohólica, esteatohepatitis no alcohólica-carcinoma hepatocelular (NASH-HCC), cirrosis biliar primaria y colangitis esclerosante), fibrosis cardiovascular (por ej., cardiomiopatía, cardiomiopatía hipertrófica, aterosclerosis y reestenosis), esclerosis sistémica, fibrosis cutánea (por ej., fibrosis cutánea en la esclerosis sistémica, esclerosis sistémica cutánea difusa, esclerodermia, cicatrización cutánea patológica, queloide, cicatrización posquirúrgica, cirugía de revisión de cicatrices, cicatrización inducida por radiación y heridas crónicas) y cánceres o fibrosis secundaria (por ej., mielofibrosis, cáncer de cabeza y cuello, leucemia megacarioblástica aguda M7 y mucositis). Otras enfermedades, trastornos o afecciones relacionadas con la fibrosis que pueden tratarse utilizando compuestos y/o composiciones de la presente divulgación incluyen, entre otras, el síndrome de Marfan, el síndrome de piel rígida, la esclerodermia, la artritis reumatoide, la fibrosis de la médula ósea, la enfermedad de Crohn, la colitis ulcerosa, el lupus eritematoso sistémico, la distrofia muscular (como la DMD), contractura de Dupuytren, enfermedad de Camurati-Engelmann, cicatrices neurales, demencia, vitreorretinopatía proliferativa, lesión corneal, complicaciones tras cirugía de drenaje de glaucoma y esclerosis múltiple. Muchas de estas indicaciones fibróticas también están asociadas a la inflamación del tejido o tejidos afectados, lo que indica la participación de un componente inmunitario.

[0216] Los anticuerpos aquí descritos pueden utilizarse para tratar la fibrosis. En ocasiones, los agentes específicos de la isoforma TGFβ1 se administran a un sujeto en una cantidad eficaz para tratar la fibrosis. La cantidad eficaz de dicho anticuerpo es una cantidad eficaz para lograr tanto la eficacia terapéutica como la seguridad clínica en el sujeto. El anticuerpo puede ser un anticuerpo permisivo al contexto que puede bloquear la activación de un TGFβ1 mediado por LTBP localizado en la ECM y TGFβ1 mediado por GARP localizado en células inmunitarias. El anticuerpo puede ser un anticuerpo permisivo al contexto que puede bloquear la activación de un TGFβ1 mediado por LTBP localizado en la ECM y TGFβ1 mediado por LRRC33 localizado en monocitos/macrófagos. El LTBP es LTBP1 y/o LTBP3. En ocasiones, puede ser beneficioso dirigir e inhibir el TGFβ1 presentado por el LRRC33 en macrófagos profibróticos similares a M2 en el microambiente fibrótico.

[0217] Los ensayos útiles para determinar la eficacia de los anticuerpos y/o composiciones de la presente divulgación para la alteración de la fibrosis incluyen, pero no se limitan a, ensayos histológicos para contar fibroblastos y análisis inmunohistoquímicos básicos conocidos en la técnica.

Cáncer

[0218] Varios tipos de cáncer pueden tratarse con anticuerpos y/o composiciones de la presente divulgación. Tal como se utiliza aquí, el término "cáncer" se refiere a cualquiera de las diversas neoplasias malignas caracterizadas por la proliferación de células anaplásicas que tienden a invadir el tejido circundante y a metastatizar en nuevos sitios del cuerpo, y también se refiere a la condición patológica caracterizada por dichos crecimientos neoplásicos malignos. Los cánceres pueden ser tumores o neoplasias hematológicas, e incluyen, entre otros, todos los tipos de linfomas/leucemias, carcinomas y sarcomas, como los cánceres o tumores que se encuentran en el ano, vejiga, conducto biliar, hueso, cerebro, mama, cérvix, colon/recto, endometrio, esófago, ojo, vesícula biliar, cabeza y cuello, hígado, riñón, laringe, pulmón, mediastino (pecho), boca, ovarios, páncreas, pene, próstata, piel, intestino delgado, estómago, médula espinal, coxis, testículos, tiroides y útero.

[0219] En el cáncer, TGFP (por ej., TGFβ1) puede promover o inhibir el crecimiento. Por ejemplo, en los cánceres de páncreas, los tumores de tipo salvaje SMAD4 pueden experimentar un crecimiento inhibido en respuesta a la TGFP, pero a medida que la enfermedad progresa, el receptor de tipo II activado constitutivamente suele estar presente. Además, existen cánceres de páncreas sin SMAD4. En algunas formas de realización, los anticuerpos, porciones de unión a antígeno de los mismos, y/o composiciones de la presente divulgación están diseñados para dirigirse selectivamente a componentes de las vías de señalización de TGFP que funcionan de forma única en una o más formas de cáncer. Las leucemias, o cánceres de la sangre o de la médula ósea que se caracterizan por una proliferación anormal de glóbulos blancos, es decir, leucocitos, pueden dividirse en cuatro grandes clasificaciones que incluyen la leucemia linfoblástica aguda (ALL), la leucemia linfocítica crónica (CLL), la leucemia mielógena aguda o leucemia mieloide aguda (AML) (AML con translocaciones entre el cromosoma 10 y 11 [t(10, 11)], el cromosoma 8 y 21 [t(8;21)], cromosoma 15 y 17 [t(15;17)], e inversiones en el cromosoma 16 [inv(16)]; AML con displasia multilinaje, que incluye a pacientes que han tenido previamente un síndrome mielodisplásico (MDS) o una enfermedad mieloproliferativa que se transforma en AML; AML y síndrome mielodisplásico (MDS, relacionados con el tratamiento, categoría que incluye a los pacientes que han recibido quimioterapia y/o radioterapia previas y posteriormente desarrollan AML o MDS; d) AML no clasificada en otras categorías, categoría que incluye los subtipos de LMA que no entran en las categorías anteriores; y e) leucemias agudas de linaje ambiguo, que se producen cuando las células leucémicas no pueden clasificarse como células mieloides o linfoides, o cuando están presentes ambos tipos de células); y leucemia mielógena crónica (CML).

[0220] Los tipos de carcinomas incluyen, entre otros, papiloma/carcinoma, coriocarcinoma, tumor del seno endodérmico, teratoma, adenoma/adenocarcinoma, melanoma, fibroma, lipoma, leiomioma, rabdomioma, mesotelioma, angioma, osteoma, condroma, glioma, linfoma/leucemia, carcinoma de células escamosas, carcinoma de células pequeñas, carcinomas indiferenciados de células grandes, carcinoma de células basales y carcinoma indiferenciado sinonasal.

[0221] Los tipos de sarcomas incluyen, entre otros, el sarcoma de partes blandas, como el sarcoma alveolar de partes blandas, el angiosarcoma, el dermatofibrosarcoma, el tumor desmoide, el tumor desmoplásico de células redondas pequeñas, el condrosarcoma extraesquelético, el osteosarcoma extraesquelético, el fibrosarcoma, el hemangiopericitoma, el hemangiosarcoma, el sarcoma de Kaposi, leiomiosarcoma, liposarcoma, linfangiosarcoma, linfosarcoma, histiocitoma fibroso maligno, neurofibrosarcoma, rabdomiosarcoma, sarcoma sinovial y tumor de Askin, sarcoma de Ewing (tumor neuroectodérmico primitivo), hemangioendotelioma maligno, schwannoma maligno, osteosarcoma y condrosarcoma.

[0222] Los anticuerpos y métodos de la divulgación pueden usarse para tratar uno o más tipos de cáncer o afecciones relacionadas con el cáncer que pueden incluir, entre otros, cáncer de colon, cáncer renal, cáncer de mama, melanoma maligno y glioblastomas (Schlingensiepen et al., 2008; Ouhtit et al., 2013).

[0223] Los anticuerpos, o porciones de unión a antígeno de los mismos, que se unen específicamente a un complejo GARP-TGFβ1, un complejo LTBP1-TGFβ1, un complejo LTBP3-TGFβ1, y un complejo LRRC33-TGFβ1, como se describe en el presente documento, pueden usarse en métodos para tratar el cáncer en un sujeto que lo necesite, comprendiendo dicho método administrar el anticuerpo, o porción de unión a antígeno del mismo, al sujeto de manera que se trate el cáncer. En ciertas formas de realización, el cáncer es de colon.

[0224] Los anticuerpos, o porciones de unión a antígeno de los mismos, que se unen específicamente a un complejo GARP-TGFβ1, un complejo LTBP1-TGFβ1, un complejo LTBP3-TGFβ1, y un complejo LRRC33-TGFβ1, como se describe en el presente documento, pueden usarse en métodos para tratar tumores sólidos. En algunas formas de realización, los tumores sólidos pueden ser tumores desmoplásicos, que suelen ser densos y difíciles de penetrar para las moléculas terapéuticas. Al dirigirse al componente ECM de dichos tumores, dichos anticuerpos pueden "aflojar" el denso tejido tumoral para que se desintegre, facilitando el acceso terapéutico para ejercer sus efectos anticancerígenos. Por lo tanto, se pueden utilizar en combinación terapias adicionales, como cualquier fármaco antitumoral conocido.

[0225] Los anticuerpos, o porciones de unión a antígeno de los mismos, que se unen específicamente a un complejo GARP-TGFβ1, a un complejo LTBP1-TGFβ1, a un complejo LTBP3-TGFβ1, y a un complejo LRRC33-TGFβ1, como se describe en el presente documento, pueden usarse en métodos para inhibir o disminuir el crecimiento de un tumor sólido en un sujeto que tiene un tumor sólido, comprendiendo dicho método administrar el anticuerpo, o la porción de unión a antígeno del mismo, al sujeto de tal manera que se inhiba o disminuya el crecimiento del tumor sólido. En ciertas formas de realización, el tumor sólido es un tumor de carcinoma de colon. Los anticuerpos, o porciones de unión a antígeno de los mismos útiles para el tratamiento de un cáncer es un inhibidor de la activación de TGFβ1 específico de la isoforma y permisivo con el contexto. Dichos anticuerpos se dirigen a un complejo GARP-TGFβ1, un complejo LTBP1-TGFβ1, un complejo LTBP3-TGFβ1 y un complejo LRRC33-TGFβ1.

[0226] En ciertas formas de realización, los anticuerpos, o porciones de unión a antígeno de los mismos, que se unen específicamente a un complejo GARP-TGFβ1, un complejo LTBP1-TGFβ1, un complejo LTBP3-TGFβ1, y un complejo LRRC33-TGFβ1, como se describe en el presente documento, se administran a un sujeto que tiene cáncer o un tumor, ya sea solo o en combinación con un agente adicional, por ejemplo, un anticuerpo anti-PD-1, por ej., un antagonista anti-PD-1). Otras terapias combinadas que se incluyen en la invención son la administración de un anticuerpo, o porción de unión a antígeno del mismo, descrita en el presente documento, con radiación, o un agente quimioterapéutico. Los agentes adicionales ejemplares incluyen, entre otros, un antagonista de PD-1, un antagonista de PDL1, una proteína de fusión de PD-L1 o PDL2, un antagonista de CTLA4, un agonista de GITR, un anticuerpo anti-ICOS, un anticuerpo anti-ICOSL, un anticuerpo anti-B7H3, un anticuerpo anti-B7H4, un anticuerpo anti-TIM3, un anticuerpo anti-LAG3, un anticuerpo anti-OX40, un anticuerpo anti-CD27, un anticuerpo anti-CD70, un anticuerpo anti-CD47, un anticuerpo anti-41BB, un anticuerpo anti-PD-1, un virus oncolítico y un inhibidor de PARP.

Tratamientos

[0227] Para poner en práctica un método descrito en el presente documento, puede administrarse una cantidad eficaz de la composición farmacéutica descrita anteriormente a un sujeto (por ej., un ser humano) que necesite el tratamiento a través de una vía adecuada, como la administración intravenosa, por ejemplo, en forma de bolo o mediante infusión continua durante un periodo de tiempo, por vía intramuscular, intraperitoneal, intracerebroespinal, subcutánea, intraarticular, intrasinovial, intratecal, oral, por inhalación o tópica. Los nebulizadores disponibles comercialmente para formulaciones líquidas, incluidos los nebulizadores de chorro y los nebulizadores ultrasónicos, son útiles para la administración. Las formulaciones líquidas pueden nebulizarse directamente y el polvo liofilizado puede nebulizarse tras su reconstitución. Alternativamente, los anticuerpos, o porciones de unión a antígeno de los mismos, que se unen específicamente a un complejo GARP-TGFβ1, a un complejo LTBP1-TGFβ1, a un complejo LTBP3-TGFβ1, y a un complejo LRRC33-TGFβ1 pueden aerosolizarse utilizando una formulación de fluorocarbono y un inhalador dosificador, o inhalarse como un polvo liofilizado y molido.

[0228] El sujeto a tratar por los métodos aquí descritos puede ser un mamífero, más preferiblemente un humano. Los mamíferos incluyen, entre otros, los animales de granja, los animales de deporte, los animales de compañía, los primates, los caballos, los perros, los gatos, los ratones y las ratas. Un sujeto humano que necesita el tratamiento puede ser un paciente humano que tiene, está en riesgo de tener o se sospecha que tiene una indicación relacionada con TGFβ, como las señaladas anteriormente. Un sujeto con una indicación relacionada con TGFβ puede identificarse mediante un examen médico rutinario, por ej., pruebas de laboratorio, pruebas funcionales de órganos, tomografías computarizadas o ecografías. Un sujeto sospechoso de padecer alguna de estas indicaciones puede mostrar uno o más síntomas de la indicación. Un sujeto de riesgo para la indicación puede ser un sujeto que presente uno o más de los factores de riesgo para dicha indicación.

[0229] Como se usan aquí, los términos "cantidad efectiva" y "dosis efectiva" se refieren a cualquier cantidad o dosis de un compuesto o composición que es suficiente para cumplir su(s) propósito(s) previsto(s), es decir, una respuesta biológica o medicinal deseada en un tejido o sujeto a una relación beneficio/riesgo aceptable. Por ejemplo, en ciertas formas de realización de la presente invención, el propósito previsto puede ser inhibir la activación de TGFβ-1 in vivo, para lograr un resultado clínicamente significativo asociado a la inhibición de TGFβ-1. Las cantidades eficaces varían, como reconocen los expertos en la materia, en función de la afección concreta que se esté tratando, la gravedad de la afección, los parámetros individuales del paciente, incluidos la edad, la condición física, la talla, el sexo y el peso, la duración del tratamiento, la naturaleza de la terapia concurrente (si la hubiera), la vía específica de administración y factores similares dentro del conocimiento y la experiencia del profesional sanitario. Estos factores son bien conocidos por los expertos en la técnica y pueden abordarse mediante experimentos rutinarios. Por lo general, se prefiere utilizar una dosis máxima de los componentes individuales o de sus combinaciones, es decir, la dosis segura más alta según el buen criterio médico. Sin embargo, los expertos en la materia entenderán que un paciente puede insistir en una dosis más baja o tolerable por razones médicas, psicológicas o prácticamente por cualquier otro motivo.

[0230] Consideraciones empíricas, como la vida media, generalmente contribuirán a la determinación de la dosis. Por ejemplo, los anticuerpos que son compatibles con el sistema inmunitario humano, como los anticuerpos humanizados o los anticuerpos totalmente humanos, pueden utilizarse para prolongar la semivida del anticuerpo y evitar que éste sea atacado por el sistema inmunitario del huésped. La frecuencia de administración puede determinarse y ajustarse en el curso de la terapia, y generalmente, pero no necesariamente, se basa en el tratamiento y/o supresión y/o mejora y/o retraso de una indicación relacionada con TGFβ. Alternativamente, pueden ser apropiadas formulaciones de liberación continua controlada de un anticuerpo que se une específicamente a un complejo GARP-TGFβ1, a un complejo LTBP1-TGFβ1, a un complejo LTBP3-TGFβ1 y a un complejo LRRC33-TGFβ1. Varias formulaciones y dispositivos para lograr la liberación controlada serían evidentes para el experto y están dentro del alcance de esta divulgación.

[0231] Las dosis para un anticuerpo que se une específicamente a un complejo GARP-TGFβ1, un complejo LTBP1-TGFβ1, un complejo LTBP3-TGFβ1, y un complejo LRRC33-TGFβ1 como se describe en el presente documento pueden determinarse empíricamente en individuos que han recibido una o más administración(es) del anticuerpo. Los individuos reciben dosis incrementales del antagonista. Para evaluar la eficacia, se puede seguir un indicador de la indicación relacionada con el TGFβ. Por ejemplo, los métodos para medir el daño de las miofibras, la reparación de las miofibras, los niveles de inflamación en el músculo y/o los niveles de fibrosis en el músculo son bien conocidos por los expertos en la técnica.

[0232] La presente invención abarca el reconocimiento de que los agentes capaces de modular el paso de activación de TGFβs de una manera específica de isoforma pueden proporcionar perfiles de seguridad mejorados cuando se usan como medicamento. En consecuencia, la invención proporciona anticuerpos y fragmentos de unión a antígeno de los mismos para su uso de acuerdo con las reivindicaciones que se unen específicamente e inhiben la activación de TGFβ1, pero no TGFβ2 o TGFβ3, confiriendo así la inhibición específica de la señalización de TGFβ1 in vivo al tiempo que minimiza los efectos secundarios no deseados de afectar a la señalización de TGFβ2 y/o TGFβ3.

[0233] En algunas formas de realización, los anticuerpos, o porciones de unión a antígeno de los mismos, tal como se describen en el presente documento, no son tóxicos cuando se administran a un sujeto. En algunas formas de realización, los anticuerpos, o porciones de unión a antígeno de los mismos, como se describe en el presente documento, presentan toxicidad reducida cuando se administran a un sujeto en comparación con un anticuerpo que se une específicamente tanto a TGFβ1 como a TGFβ2. En algunas formas de realización, los anticuerpos, o porciones de unión a antígeno de los mismos, como se describe en el presente documento, presentan toxicidad reducida cuando se administran a un sujeto en comparación con un anticuerpo que se une específicamente tanto a TGFβ1 como a TGFβ3. En algunas formas de realización, los anticuerpos, o porciones de unión a antígeno de los mismos, como se describe en el presente documento, presentan toxicidad reducida cuando se administran a un sujeto en comparación con un anticuerpo que se une específicamente a TGFβ1, TGFβ2 y TGFβ3.

[0234] Generalmente, para la administración de cualquiera de los anticuerpos aquí descritos, una dosis candidata inicial puede ser de aproximadamente 2 mg/kg. A efectos de la presente divulgación, una dosis diaria típica puede oscilar entre 0,1 µg/kg y 3 µg/kg, 30 µg/kg y 300 µg/kg y 3 mg/kg, 30 mg/kg y 100 mg/kg o más, dependiendo de los factores mencionados anteriormente. Para administraciones repetidas durante varios días o más, dependiendo de la afección, el tratamiento se mantiene hasta que se produce una supresión deseada de los síntomas o hasta que se alcanzan niveles terapéuticos suficientes para aliviar una indicación relacionada con el TGFβ, o un síntoma de la misma. Un régimen de dosificación ejemplar comprende la administración de una dosis inicial de aproximadamente 2 mg/kg, seguida de una dosis de mantenimiento semanal de aproximadamente 1 mg/kg del anticuerpo, o seguida de una dosis de mantenimiento de aproximadamente 1 mg/kg cada dos semanas. Sin embargo, otros regímenes de dosificación pueden ser útiles, dependiendo del patrón de decaimiento farmacocinético que el profesional desee lograr. Por ejemplo, se contempla la dosificación de una a cuatro veces por semana. En algunas formas de realización, puede utilizarse una dosificación que oscila entre aproximadamente 3 µg/mg y aproximadamente 2 mg/kg (como aproximadamente 3 µg/mg, aproximadamente 10 µg/mg, aproximadamente 30 µg/mg, aproximadamente 100 µg/mg, aproximadamente 300 µg/mg, aproximadamente 1 mg/kg y aproximadamente 2 mg/kg). Los experimentos farmacocinéticos han demostrado que la concentración sérica de un anticuerpo descrito en el presente documento (por ej., Ab2) permanece estable durante al menos 7 días tras su administración a un modelo animal preclínico (por ej., un modelo de ratón). Sin querer ceñirnos a ninguna teoría en particular, esta estabilidad tras la administración puede ser ventajosa, ya que el anticuerpo puede administrarse con menos frecuencia, manteniendo al mismo tiempo una concentración sérica clínicamente eficaz en el sujeto al que se administra el anticuerpo (por ej., un sujeto humano). En algunas formas de realización, la frecuencia de dosificación es una vez a la semana, cada 2 semanas, cada 4 semanas, cada 5 semanas, cada 6 semanas, cada 7 semanas, cada 8 semanas, cada 9 semanas o cada 10 semanas; o una vez al mes, cada 2 meses o cada 3 meses, o más. El progreso de esta terapia se controla fácilmente mediante técnicas y ensayos convencionales. El régimen de dosificación (incluido el anticuerpo utilizado) puede variar con el tiempo.

[0235] En algunas formas de realización, para un paciente adulto de peso normal, pueden administrarse dosis que oscilan entre aproximadamente 0,3 y 5,00 mg/kg. El régimen de dosificación concreto, por. ej., la dosis, el momento y la repetición, dependerá de cada persona y de su historial médico, así como de las propiedades de cada agente (como la semivida del agente y otras consideraciones pertinentes).

[0236] A los efectos de la presente divulgación, la dosificación adecuada de un anticuerpo que se une específicamente a un complejo GARP-TGFβ1, un complejo LTBP1-TGFβ1, un complejo LTBP3-TGFβ1 y un complejo LRRC33-TGFβ1 dependerá del anticuerpo específico (o composiciones del mismo) empleado, el tipo y la gravedad de la indicación, si el anticuerpo se administra con fines preventivos o terapéuticos, la terapia previa, el historial clínico del paciente y su respuesta, y la discreción del médico tratante.del paciente y su respuesta al antagonista, así como del criterio del médico que le atienda. En ocasiones, un clínico administrará un anticuerpo que se une específicamente a un complejo GARP-TGFβ1, a un complejo LTBP1-TGFβ1, a un complejo LTBP3-TGFβ1 y a un complejo LRRC33-TGFβ1, hasta alcanzar una dosis que logre el resultado deseado. La administración de un anticuerpo que se une específicamente a un complejo GARP-TGFβ1, a un complejo LTBP1-TGFβ1, a un complejo LTBP3-TGFβ1 y a un complejo LRRC33-TGFβ1 puede ser continua o intermitente, dependiendo, por ejemplo, del estado fisiológico del receptor, de si la finalidad de la administración es terapéutica o profiláctica y de otros factores conocidos por los profesionales expertos. La administración del anticuerpo que se une específicamente a un complejo GARP-TGFβ1, a un complejo LTBP1-TGFβ1, a un complejo LTBP3-TGFβ1 y a un complejo LRRC33-TGFβ1 puede ser esencialmente continua durante un periodo de tiempo preseleccionado o puede ser en una serie de dosis espaciadas, por ejemplo, ya sea antes, durante o después de desarrollar una indicación relacionada con TGFβ.

[0237] Como se utiliza en el presente documento, el término "tratar" se refiere a la aplicación o administración de una composición que incluye uno o más agentes activos a un sujeto, que tiene una indicación relacionada con TGFβ, un síntoma de la indicación, o una predisposición hacia la indicación, con el propósito de curar, sanar, aliviar, aliviar, alterar, remediar, mejorar, o afectar la indicación, el síntoma de la indicación, o la predisposición hacia la indicación.

[0238] Aliviar una indicación relacionada con TGFβ con un anticuerpo que se une específicamente a un complejo GARP-TGFβ1, un complejo LTBP1-TGFβ1, un complejo LTBP3-TGFβ1 y un complejo LRRC33-TGFβ1 incluye retrasar el desarrollo o la progresión de la indicación, o reducir la gravedad de la indicación. Aliviar la indicación no requiere necesariamente resultados curativos. Tal como se utiliza en el presente documento, "retrasar" el desarrollo de una indicación asociada a una indicación relacionada con el TGFβ significa diferir, obstaculizar, ralentizar, retardar, estabilizar y/o posponer la progresión de la indicación. Este retraso puede ser de duración variable, en función de los antecedentes de la indicación y/o de las personas tratadas. Un método que "retrasa" o alivia el desarrollo de una indicación, o retrasa la aparición de la indicación, es un método que reduce la probabilidad de desarrollar uno o más síntomas de la indicación en un plazo determinado y/o reduce la extensión de los síntomas en un plazo determinado, en comparación con la no utilización del método. Estas comparaciones suelen basarse en estudios clínicos, en los que se utiliza un número de sujetos suficiente para obtener un resultado estadísticamente significativo.

[0239] Los ratones DBA2/J tienen una deleción de 40 pb en el alelo LTBP4. La desregulación de la ECM a la que se asocia el TGFb1 latente puede exponer el epítopo al que se une el Ab1. Puede haber enfermedades en las que el epítopo al que se une Ab1 quede expuesto, y esas enfermedades pueden ser oportunidades terapéuticas para Ab1 si está indicada la inhibición de TGFb1.

Terapias Combinadas

[0240] La divulgación abarca además composiciones farmacéuticas y métodos relacionados utilizados como terapias combinadas para tratar sujetos que pueden beneficiarse de la inhibición de TGFP in vivo. En cualquiera de estas formas de realización, dichos sujetos pueden recibir terapias combinadas que incluyen una primera composición que comprende al menos un inhibidor de TGFP, por ej., anticuerpo o porción de unión a antígeno del mismo, descrito en el presente documento, junto con una segunda composición que comprende al menos una terapéutica adicional destinada a tratar la misma enfermedad o afección clínica o enfermedades que se solapan. La primera y la segunda composición pueden actuar sobre la misma diana celular o sobre dianas celulares distintas. En algunas formas de realización, la primera y segunda composiciones pueden tratar o aliviar el mismo conjunto o superposición de síntomas o aspectos de una enfermedad o condición clínica. En algunas formas de realización, la primera y segunda composiciones pueden tratar o aliviar un conjunto separado de síntomas o aspectos de una enfermedad o condición clínica. Por poner sólo un ejemplo, la primera composición puede tratar una enfermedad o afección asociada a la señalización de la TGFP, mientras que la segunda composición puede tratar la inflamación o fibrosis asociada a la misma enfermedad, etc. Estas terapias combinadas pueden administrarse conjuntamente. La frase "junto con", en el contexto de las terapias combinadas, significa que los efectos terapéuticos de una primera terapia se solapan temporal y/o espacialmente con los efectos terapéuticos de una segunda terapia en el sujeto que recibe la terapia combinada. Así, las terapias combinadas pueden formularse como una única formulación para la administración concurrente, o como formulaciones separadas, para la administración secuencial de las terapias.

[0241] En formas de realización preferidas, las terapias combinadas producen efectos sinérgicos en el tratamiento de una enfermedad. El término "sinérgico" se refiere a los efectos que son mayores que los efectos aditivos (por ej., mayor eficacia) de cada monoterapia en conjunto.

[0242] En algunas formas de realización, las terapias combinadas que comprenden una composición farmacéutica descrita en el presente documento producen una eficacia que es globalmente equivalente a la producida por otra terapia (como la monoterapia de un segundo agente), pero se asocian con menos efectos adversos no deseados o toxicidad menos grave asociada con el segundo agente, en comparación con la monoterapia del segundo agente. En algunas formas de realización, dichas terapias combinadas permiten una dosificación más baja del segundo agente pero mantienen la eficacia global. Dichas terapias combinadas pueden ser especialmente adecuadas para poblaciones de pacientes en las que se justifique un tratamiento a largo plazo y/o que incluyan a pacientes pediátricos.

[0243] Se proporcionan en el presente documento composiciones farmacéuticas y métodos para su uso en terapias combinadas para la reducción de la activación de la proteína TGFβ1 y el tratamiento o prevención de enfermedades o afecciones asociadas con la señalización de TGFβ1, como se describe en el presente documento. Los métodos o las composiciones farmacéuticas comprenden además una segunda terapia La segunda terapia puede ser útil para tratar o prevenir enfermedades o afecciones asociadas con la señalización de TGFβ1. La segunda terapia puede disminuir o tratar al menos uno o varios síntomas asociados a la enfermedad diana. La primera y la segunda terapias pueden ejercer sus efectos biológicos mediante mecanismos de acción similares o no relacionados; o bien una o ambas terapias pueden ejercer sus efectos biológicos mediante una multiplicidad de mecanismos de acción.

[0244] Debe entenderse que las composiciones farmacéuticas aquí descritas pueden tener la primera y segunda terapias en el mismo portador farmacéuticamente aceptable o en un portador farmacéuticamente aceptable diferente. Además, debe entenderse que la primera y la segunda terapias pueden administrarse simultánea o secuencialmente.

[0245] Los uno o más anticuerpos anti-TGFβ, o porciones de unión a antígeno de los mismos, de la invención pueden usarse en combinación con uno o más agentes terapéuticos adicionales. Ejemplos de los agentes terapéuticos adicionales que pueden usarse con un anticuerpo anti-TGFβ de la invención incluyen, pero no se limitan a, un inhibidor de miostatina, un agonista de VEGF, un agonista de IGF1, un agonista de FXR, un inhibidor de CCR2, un inhibidor de CCR5, un inhibidor dual de CCR2/CCRS, un inhibidor de lisil oxidasa-like-2, un inhibidor de ASK1, un inhibidor de Acetil-CoA Carboxilasa (ACC), un inhibidor de p38 quinasa, Pirfenidona, Nintedanib, un inhibidor de GDF11, y similares.

[0246] En algunas formas de realización, el agente adicional es un inhibidor del punto de control. En algunas formas de realización, el agente adicional se selecciona del grupo que consiste en un antagonista de PD-1, un antagonista de PDL1, una proteína de fusión de PD-L1 o PDL2, un antagonista de CTLA4, un agonista de GITR, un anticuerpo anti-ICOS, un anticuerpo anti-ICOSL, un anticuerpo anti-B7H3, un anticuerpo anti-B7H4, un anticuerpo anti-TIM3, un anticuerpo anti-LAG3, un anticuerpo anti-OX40, un anticuerpo anti-CD27, un anticuerpo anti-CD70, un anticuerpo anti-CD47, un anticuerpo anti-41BB, un anticuerpo anti-PD-1, un virus oncolítico y un inhibidor de PARP. En algunas formas de realización, la terapia adicional es radiación. En algunas formas de realización, el agente adicional es un agente quimioterapéutico. En algunas formas de realización, el agente quimioterapéutico es Taxol. En algunas formas de realización, el agente adicional es un agente antiinflamatorio. En algunas formas de realización, el agente adicional inhibe el proceso de reclutamiento de monocitos/macrófagos y/o la infiltración tisular. En algunas formas de realización, el agente adicional es un inhibidor de la activación de las células estrelladas hepáticas. En algunas formas de realización, el agente adicional es un antagonista del receptor de quimioquinas, por ej., antagonistas CCR2 y antagonistas CCR5. En algunas formas de realización, dicho antagonista del receptor de quimioquinas es un antagonista específico dual, como un antagonista CCR2/CCR5. En algunas formas de realización, el agente adicional que se administrará como terapia combinada es o comprende un miembro de la superfamilia TGFP de factores de crecimiento o reguladores de los mismos. En algunas formas de realización, dicho agente se selecciona entre moduladores (por ej., inhibidores y activadores) de GDF8/mioostatina y GDF11. En algunas formas de realización, dicho agente es un inhibidor de la señalización GDF8/mioostatina. En algunas formas de realización, dicho agente es un anticuerpo monoclonal que se une específicamente a un complejo de miostatina pro/latente y bloquea la activación de la miostatina. En algunas formas de realización, el anticuerpo monoclonal que se une específicamente a un complejo de miostatina pro/latente y bloquea la activación de la miostatina no se une a la miostatina madura libre.

[0247] Dichas terapias combinadas pueden utilizar ventajosamente dosis más bajas de los agentes terapéuticos administrados, evitando así posibles toxicidades o complicaciones asociadas con las diversas monoterapias.

Modulación de la Actividad del TGFβ

[0248] Los métodos de la presente divulgación incluyen métodos de modulación de la actividad del factor de crecimiento en uno o más sistemas biológicos. Dichos métodos pueden incluir el contacto de uno o más sistemas biológicos con un anticuerpo y/o composición de la divulgación. En algunos casos, estos métodos incluyen la modificación del nivel de factor de crecimiento libre en un sistema biológico (por ej., en un nicho celular o sujeto). Los anticuerpos y/o composiciones según dichos métodos pueden incluir, pero no se limitan a biomoléculas, incluyendo, pero no se limitan a proteínas recombinantes, complejos de proteínas y/o anticuerpos, o porciones de antígenos de los mismos, descritos en el presente documento.

[0249] Los métodos de la presente divulgación pueden usarse para reducir o eliminar la actividad del factor de crecimiento, denominados aquí "métodos inhibidores". Algunos de dichos métodos pueden comprender la retención del factor de crecimiento maduro en un complejo TGFP (por ej., un TGFβ1 complejado con GARP, LTBP1, LTBP3 y/o LRRC33) y/o la promoción de la reasociación del factor de crecimiento en un complejo TGFP. En algunos casos, los métodos inhibidores pueden comprender el uso de un anticuerpo que se une específicamente a un complejo GARP-TGFβ1, un complejo LTBP1-TGFβ1, un complejo LTBP3-TGFβ1, y/o un complejo LRRC33-TGFβ1. Según algunos métodos inhibidores, se proporciona uno o más anticuerpos inhibidores.

[0250] Los anticuerpos, las porciones de unión a antígeno de los mismos y las composiciones de la divulgación pueden utilizarse para inhibir la activación de TGFβ1. Se proporciona en el presente documento un método para inhibir la activación de TGFβ1 que comprende exponer un complejo GARP-TGFβ1, un complejo LTBP1-TGFβ1, un complejo LTBP3-TGFβ1, y un complejo LRRC33-TGFβ1 a un anticuerpo, una porción de unión a antígeno del mismo, El anticuerpo, la porción de unión a antígeno del mismo, o la composición farmacéutica, inhibe la liberación de TGFβ1 maduro del complejo GARP-TGFβ1, el complejo LTBP1-TGFβ1, un complejo LTBP3-TGFβ1, y el complejo LRRC33-TGFβ1. En ocasiones, el método se realiza in vitro. En ocasiones, el método se realiza in vivo. En ocasiones, el método se realiza ex vivo.

[0251] En algunas formas de realización, el complejo GARP-TGFβ1, el complejo LTBP1-TGFβ1, el complejo LTBP3-TGFβ1, o el complejo LRRC33-TGFβ1 está presente en la superficie externa de una célula. En algunas formas de realización, la célula es una célula T, un fibroblasto, un macrófago, un monocito o una microglía.

[0252] En algunas formas de realización, el complejo LRRC33-TGFβ1 está presente en la superficie externa de macrófagos profibróticos (tipo M2). En algunas formas de realización, los macrófagos profibróticos (M2-like) están presentes en el microambiente fibrótico. En algunas formas de realización, lo direccionamiento del complejo LRRC33-TGFβ1 en la superficie externa de los macrófagos profibróticos (tipo M2) proporciona un efecto superior en comparación con lo direccionamiento exclusiva de los complejos LTBP1-TGFβ1 y/o LTBP1-TGFβ1.

[0253] En algunas formas de realización, el complejo GARP-TGFβ1, el complejo LTBP1-TGFβ1, el complejo LTBP3-TGFβ1, y/o el complejo LRRC33-TGFβ1 está unido a una matriz extracelular. En algunas formas de realización, la matriz extracelular comprende fibrilina. En algunas formas de realización, la matriz extracelular comprende una proteína con un motivo RGD.

[0254] Se proporciona en el presente documento un método para reducir la activación de la proteína TGFβ1 en un sujeto que comprende administrar un anticuerpo, una porción de unión a antígeno del mismo, o una composición farmacéutica descrita en el presente documento al sujeto, reduciendo así la activación de la proteína TGFβ1 en el sujeto. En ocasiones, el sujeto tiene o corre el riesgo de tener fibrosis. En ocasiones, el sujeto tiene o corre el riesgo de tener cáncer. En ocasiones, el sujeto tiene o corre el riesgo de tener demencia.

[0255] En algunas formas de realización, los anticuerpos, o las porciones de unión a antígeno de los mismos, como se describe en el presente documento, reducen la actividad supresora de las células T reguladoras (Tregs).

Kits Para Uso en el Alivio de Enfermedades/Trastornos Asociados con una Indicación Relacionada con el TGFβ [0256] La presente divulgación también proporciona kits para su uso en el alivio de enfermedades/trastornos asociados con una indicación relacionada con TGFβ. Dichos kits pueden incluir uno o más recipientes que comprenden un anticuerpo, o una porción de unión a antígeno del mismo, que se une específicamente a un complejo GARP-TGFβ1, un complejo LTBP1-TGFβ1, un complejo LTBP3-TGFβ1, y/o un complejo LRRC33-TGFβ1, por ej., cualquiera de los descritos en el presente documento.

[0257] En algunas formas de realización, el kit puede comprender instrucciones de uso de acuerdo con cualquiera de los métodos aquí descritos. Las instrucciones incluidas pueden comprender una descripción de la administración del anticuerpo, o porción de unión a antígeno del mismo, que se une específicamente a un complejo GARP-TGFβ1, un complejo LTBP1-TGFβ1, un complejo LTBP3-TGFβ1 y un complejo LRRC33-TGFβ1 para tratar, retrasar la aparición o aliviar una enfermedad diana como las descritas en el presente documento. El kit puede comprender además una descripción de la selección de un individuo apto para el tratamiento basada en la identificación de si dicho individuo padece la enfermedad diana. En otras formas de realización, las instrucciones comprenden una descripción de la administración de un anticuerpo, o de una porción de unión a antígeno del mismo, a un individuo con riesgo de padecer la enfermedad diana.

[0258] Las instrucciones relativas al uso de anticuerpos, o porciones de unión a antígeno de los mismos, que se unen específicamente a un complejo GARP-TGFβ1, un complejo LTBP1-TGFβ1, un complejo LTBP3-TGFβ1, y un complejo LRRC33-TGFβ1 generalmente incluyen información en cuanto a la dosis, el esquema de dosificación, y la ruta de administración para el tratamiento previsto. Los envases pueden ser dosis unitarias, paquetes a granel (por ej., paquetes multidosis) o dosis subunitarias. Las instrucciones suministradas en los kits de la divulgación suelen ser instrucciones escritas en una etiqueta o prospecto (por ej., una hoja de papel incluida en el kit), pero también se aceptan instrucciones legibles por máquina (por ej., instrucciones transportadas en un disco de almacenamiento magnético u óptico).

[0259] La etiqueta o prospecto indica que la composición se utiliza para tratar, retrasar la aparición y/o aliviar una enfermedad o trastorno asociado con una indicación relacionada con TGFβ. Pueden proporcionarse instrucciones para practicar cualquiera de los métodos aquí descritos.

[0260] Los kits de la presente divulgación se presentan en envases adecuados. Los envases adecuados incluyen, entre otros, viales, botellas, tarros, envases flexibles (por ej., bolsas de Mylar o de plástico selladas) y similares. También se contemplan envases para su uso en combinación con un dispositivo específico, como un inhalador, un dispositivo de administración nasal (por ej., un atomizador) o un dispositivo de infusión como una minibomba. Un kit puede tener un puerto de acceso estéril (por ej., el contenedor puede ser una bolsa de solución intravenosa o un vial con un tapón perforable por una aguja de inyección hipodérmica). El contenedor también puede tener un puerto de acceso estéril (por ej., el contenedor puede ser una bolsa de solución intravenosa o un vial con un tapón perforable por una aguja de inyección hipodérmica). Al menos un agente activo de la composición es un anticuerpo, o una porción de unión a antígeno del mismo, que se une específicamente a un complejo GARP-TGFβ1, un complejo LTBP1-TGFβ1, un complejo LTBP3-TGFβ1 y un complejo LRRC33-TGFβ1 como los descritos en el presente documento.

[0261] Los kits pueden proporcionar opcionalmente componentes adicionales tales como tampones e información interpretativa. Normalmente, el kit comprende un envase y una etiqueta o prospecto(s) en el envase o asociados a él. En ocasiones, los artículos de fabricación comprenden contenidos de los kits descritos anteriormente.

Ensayos para Detectar un Complejo GARP-TGFβ1, un Complejo LTBP1-TGFβ1, un Complejo TGFβ1y/o un Complejo LRRC33-TGFβ1.

[0262] Se proporciona en el presente documento un método para detectar un complejo GARP-TGFβ1, un complejo LTBP1-TGFβ1, un complejo LTBP3-TGFβ1, y/o un complejo LRRC33-TGFβ1 en una muestra obtenida de un sujeto. Tal y como se utiliza aquí, un "sujeto" se refiere a un organismo individual, por ejemplo, un mamífero individual. En ocasiones, el sujeto es un ser humano. En ocasiones, el sujeto es un mamífero no humano. En ocasiones, el sujeto es un primate no humano. En ocasiones, el sujeto es un roedor. En ocasiones, el sujeto es una oveja, una cabra, un bovino, aves de corral, un gato o un perro. En ocasiones, el sujeto es un vertebrado, un anfibio, un reptil, un pez, un insecto, una mosca o un nematodo. En ocasiones, el sujeto es un animal de investigación. En ocasiones, el sujeto es modificado genéticamente, por ejemplo, un sujeto no humano modificado genéticamente. El sujeto puede ser de ambos sexos y encontrarse en cualquier fase de desarrollo. En ocasiones, el sujeto es un paciente o un voluntario sano.

[0263] En ocasiones, un método para detectar un complejo GARP-TGFβ1, un complejo LTBP1-TGFβ1, un complejo LTBP3-TGFβ1, y/o un complejo LRRC33-TGFβ1 en una muestra obtenida de un sujeto comprende (a) poner en contacto la muestra con un anticuerpo que se une específicamente a un complejo GARP-TGFβ1, un complejo LTBP1-TGFβ1, un complejo LTBP3-TGFβ1, y un complejo LRRC33-TGFβ1 en condiciones adecuadas para la unión del anticuerpo al antígeno, si el antígeno está presente en la muestra, formando así complejos de unión; y (b) determinar el nivel del anticuerpo unido al antígeno (por ej., determinar el nivel de los complejos de unión).

[0264] En ocasiones, un ensayo de cribado que utiliza complejos TGFβ1 latentes biotinilados inmovilizados en una superficie, que permite la activación de TGFP latente por integrinas proporcionando unión. También podrían probarse en ese sistema otros activadores distintos de las integrinas. La lectura puede realizarse mediante células informadoras u otras respuestas celulares dependientes de TGFβ.

Ensayos celulares para medir la activación de TGFβ

[0265] La activación de TGFP (y la inhibición de la misma por un inhibidor de prueba de TGFP, tal como un anticuerpo) puede medirse por cualquier método adecuado conocido en la técnica. Por ejemplo, la activación de TGFP mediada por integrina puede utilizarse en un ensayo celular, como el ensayo de luciferasa "CAGA12", descrito con más detalle en el presente documento. Una forma de realización ejemplar de dicho ensayo se representa en la FIG. 11C con fines ilustrativos. Como se muestra, dicho sistema de ensayo puede comprender los siguientes componentes: i) una fuente de TGFβ (recombinante, endógena o transfectada); ii) una fuente de integrina (recombinante, endógena o transfectada); y iii) un sistema informador que responda a la activación de TGFP, como células que expresan receptores de TGFβ capaces de responder a TGFP y traducir la señal en una salida legible (por ej., actividad de luciferasa en células CAGA12 u otras líneas celulares informadoras). En algunas formas de realización, la línea celular informadora comprende un gen informador (por ej., un gen de luciferasa) bajo el control de un promotor que responde a TGFβ (por ej., un promotor de PAI-1). En algunas formas de realización, pueden incorporarse al sistema informador ciertos elementos promotores que confieren sensibilidad. En algunas formas de realización, dicho elemento promotor es el elemento CAGA12. Las líneas celulares informadoras que pueden utilizarse en el ensayo se han descrito, por ejemplo, en Abe et al. (1994) Anal Biochem.

216(2): 276-84. En algunas formas de realización, cada uno de los componentes del ensayo antes mencionados procede de la misma fuente (por ej., la misma célula). En algunas formas de realización, dos de los componentes del ensayo antes mencionados proceden de la misma fuente, y un tercer componente del ensayo procede de una fuente diferente. En algunas formas de realización, los tres componentes del ensayo proceden de fuentes diferentes. Por ejemplo, En algunas formas de realización, la integrina y el complejo TGFβ latente (proTGFβ y una molécula presentadora) se proporcionan para el ensayo a partir de la misma fuente (por ej., la misma línea celular transfectada). En algunas formas de realización, la integrina y el TGF se proporcionan para el ensayo a partir de fuentes separadas (por ej., dos líneas celulares diferentes, una combinación de integrina purificada y una célula transfectada). Cuando se utilizan células como fuente de uno o más de los componentes del ensayo, dichos componentes del ensayo pueden ser endógenos a la célula, expresados de forma estable en la célula, transfectados transitoriamente o cualquier combinación de los mismos. Los resultados de una forma de realización ejemplar no limitante de un ensayo basado en células para medir la activación de TGFP que demuestra la inhibición del complejo GARP-proTGFβ1 o del complejo LRRC33-proTGFβ1 utilizando los anticuerpos Ab1 y Ab2, divulgados en el presente documento, se muestran en las FIGs. 22A y FIG. 22B, respectivamente. En este ensayo ejemplar, la IC50 (µg/mL) de Ab1 para el complejo GARP-TGFβ1 fue de 0,445, y la IC50 (µg/mL) de Ab1 para el complejo LRRC33-TGFβ1 fue de 1,325.

[0266] Un experto podría adaptar fácilmente dichos ensayos a diversas configuraciones adecuadas. Por ejemplo, pueden considerarse diversas fuentes de TGFβ. En algunas formas de realización, la fuente de TGFβ es una célula que expresa y deposita TGFβ (por ej., una célula primaria, una célula propagada, una célula inmortalizada o una línea celular, etc.). En algunas formas de realización, la fuente de TGFβ es TGFβ purificado y/o recombinante inmovilizado en el sistema de ensayo utilizando medios adecuados. En algunas formas de realización, el TGFβ inmovilizado en el sistema de ensayo se presenta dentro de una composición de matriz extracelular (ECM) en la placa de ensayo, con o sin descelularización, que imita el TGFβ originado por fibroblastos. En algunas formas de realización, el TGFβ se presenta en la superficie celular de una célula utilizada en el ensayo. Además, puede incluirse una molécula presentadora de elección en el sistema de ensayo para proporcionar un complejo TGFβ latente adecuado. Un experto en la materia puede determinar fácilmente qué molécula(s) presentadora(s) puede(n) estar presente(s) o expresada(s) en determinadas células o tipos celulares. Utilizando dichos sistemas de ensayo, los cambios relativos en la activación de TGFβ en presencia o ausencia de un agente de ensayo (como un anticuerpo) pueden medirse fácilmente para evaluar los efectos del agente de ensayo sobre la activación de TGFβ in vitro. Los datos de ensayos celulares ejemplares se proporcionan en la sección de Ejemplos más adelante.

[0267] Dichos ensayos basados en células pueden modificarse o adaptarse de varias maneras dependiendo de la isoforma de TGFβ que se estudie, el tipo de complejo latente (por ej., molécula presentadora), y similares. En algunas formas de realización, una célula conocida por expresar integrina capaz de activar TGFβ puede utilizarse como fuente de integrina en el ensayo. Dichas células incluyen células SW480/β6 (por ej., clon 1E7). En algunas formas de realización, las células que expresan integrina pueden ser co-transfectadas con un plásmido que codifica una molécula de presentación de interés (tal como GARP, LRRC33, LTBP (por ej., LTBP1 o LTBP3), etc.) y un plásmido que codifica una pro-forma de la isoforma TGFβ de interés (tal como proTGFβ1). Tras la transfección, las células se incuban durante el tiempo suficiente para permitir la expresión de los genes transfectados (por ej., unas 24 horas), se lavan las células y se incuban con diluciones seriadas de un agente de prueba (por ej., un anticuerpo). A continuación, se añade una línea celular informadora (por ej., células CAGA12) al sistema de ensayo, seguido de un tiempo de incubación adecuado para permitir la señalización de TGFβ. Después de un período de incubación (por ej., unas 18-20 horas) tras la adición del agente de ensayo, se detecta la señal/lectura (por ejemplo, actividad de luciferasa) utilizando medios adecuados (por ejemplo, para líneas celulares informadoras que expresan luciferasa, puede utilizarse el reactivo Bright-Glo (Promega)). En algunas formas de realización, la fluorescencia de la luciferasa puede detectarse utilizando un lector de placas BioTek (Synergy H1), con ajustes de autonivelación.

Ácidos Nucleicos

[0268] Los anticuerpos, porciones de unión a antígeno de los mismos, y/o composiciones de la presente divulgación pueden estar codificados por moléculas de ácido nucleico. Dichas moléculas de ácido nucleico incluyen, sin limitación, moléculas de ADN, moléculas de ARN, polinucleótidos, oligonucleótidos, moléculas de ARNm, vectores, plásmidos y similares. Las células pueden programarse o generarse para expresar moléculas de ácido nucleico que codifican compuestos y/o composiciones de la presente divulgación. En algunos casos, los ácidos nucleicos de la divulgación incluyen ácidos nucleicos de codón optimizado. Los métodos para generar ácidos nucleicos con codones optimizados son conocidos en la técnica y pueden incluir, entre otros, los descritos en las patentes US Nos.5,786,464 y 6,114,148; EJEMPLOS

Ejemplo 1: Inhibición de TGFβ1

[0269] La superfamilia TGFβ incluye propéptidos complejados con factores de crecimiento activos (FIG. 1). Se desarrollaron estrategias de selección para obtener anticuerpos que estabilizan el complejo, lo que resulta en una inhibición más selectiva y potente.

[0270] Utilizando un sistema de expresión basado en HEK293, se realizó afinidad por NiNTA y filtración en gel para obtener cantidades multimiligramo de proteína purificada, que se utilizaron para generar TGFβ1 complejado a LTBP (complejo LTBP-TGFβ1) y TGFβ1 complejado a GARP (complejo GARP-TGFβ1) (FIG.3). La diversidad de las proteínas fabricadas permitió probar la reactividad cruzada entre especies y la cartografía de epítopos. La purificación de un complejo sGARP-proTGFβ (FIG. 4A y 4B), un complejo sGARP-TGFβ LAP (FIG. 5), y un complejo LTBP1-proTGFβ1 (FIG.6).

[0271] Los anticuerpos candidatos se probaron utilizando un ensayo de luminiscencia in vitro (FIG.8). En la prueba, los anticuerpos que inhibían la liberación del factor de crecimiento "apagaban" las células reporteras ante un estímulo de activación normal. Ab1 y Ab2 demostraron ser inhibidores de la activación de complejos TGFβ1 latentes (FIG. 7) y presentaban una reactividad cruzada con el ratón.

[0272] Las curvas iniciales de análisis dosis-respuesta de Ab1 en células que expresan TGFβ1 humano mostraron inhibición de la actividad de TGFβ1 (FIG.8). Utilizando una línea celular informadora CAGA12 más sensible, Ab1 mostró una inhibición similar de la actividad proTGFβ1 humana (FIG.9). Además, se demostró que la inhibición de un complejo GARP bloquea la actividad supresora de las células reguladoras T (Tregs) medida por el porcentaje de células efectoras T en división (Teff) en células T aisladas de sangre de donantes sanos (FIG.10).

[0273] La afinidad de los inhibidores de GARP-proTGFβ1 se midió mediante el ensayo Octet en células GARP-proTGFβ1 humanas, mientras que la actividad se midió mediante células reporteras CAGA12 probando la inhibición de GARP-proTGFβ1 humana. El protocolo utilizado para medir la afinidad de los anticuerpos Ab1 y Ab2 a los complejos aquí proporcionados se resume en la Tabla 6. Los resultados figuran en la Tabla 7.

Tabla 6: Protocolo para realizar el ensayo de unión Octet.

(continuación)

Tabla 7: Afinidad y actividad de los inhibidores de GARP-proTGFβ

[0274] Los clones fueron examinados adicionalmente para selectividad de unión (Tabla 8) y reactividad cruzada de especies (Tabla 9). Ab1 y Ab2 no se unieron a TGFβ1, TGFP2 o TGFP3, pero sí a los complejos proTGFβ1 y mostraron reactividad cruzada entre especies.

Tabla 8: Selectividad de los inhibidores de GARP- roTGF 1

Tabla 9: Reactividad cruzada entre es ecies de los inhibidores de GARP- roTGF 1

Ejemplo 2: Ab1 y Ab2 se unen específicamente a complejos proTGFβ1 de múltiples especies

[0275] Para determinar si Ab1 y Ab2 son capaces de unirse específicamente a complejos proTGFβ1 de múltiples especies, se realizaron ensayos de unión Octet como se describe en la Tabla 6. Como se muestra en la Tabla 10 (a continuación), ambos anticuerpos (es decir, Ab1 y Ab2) se unieron específicamente a complejos LTBP1-proTGFβ1 humanos y murinos, complejos LTBP3-proTGFβ1 humanos y complejos GARP-proTGFβ1 humanos. Sin embargo, sólo Ab2 se unió específicamente a complejos LTBP1-proTGFβ1 de rata.

Tabla 10. Afinidad de Ab1 y Ab2 por Complejos proTGFβ1 de Múltiples Especies

Ejemplo 3: Ab1 αnd Ab2 inhiben el TGFβ1 endógeno en fibroblastos humanos y murinos

[0276] Para determinar si Ab1 y Ab2 eran capaces de inhibir el TGF-β1 endógeno secretado por fibroblastos primarios cultivados de diferente origen, se realizó un ensayo cuantitativo in vitro en el que la actividad del TGF-β1 secretado se determinó midiendo los niveles de luciferasa producidos por células epiteliales de pulmón de visón transfectadas de forma estable con un ácido nucleico que comprendía un gen reportero de luciferasa fusionado a un promotor sintético CAGA12, y co-cultivadas con fibroblastos tratados con Ab1 o Ab2. Como se muestra en las FIGs.11A y 11B, tanto Ab1 como Ab2 inhibieron el TGF-β1 endógeno secretado por fibroblastos dérmicos humanos normales, fibroblastos pulmonares murinos C57BL.6J y fibroblastos musculares DBA2/J. Las diferencias en la inhibición máxima observada con cada anticuerpo fueron específicas de la línea celular.

Ejemplo 4: Ab2 se une a LRRC33-proTGFβ1

[0277] Para determinar si Ab1 y Ab2 se unen a proTGFβ1 que está complejado con LRRC33, se realizaron ensayos de unión Octet. Como se muestra en las Figuras 12A y 12B, tanto Ab1 como Ab2 son capaces de unirse al complejo proteico LRRC33-proTGFβ1. Sin embargo, Ab1 muestra una tasa de activación lenta para unirse al complejo proteico LRRC33-proTGFβ1. La unión de Ab1 y Ab2 al complejo proteico LRRC33-proTGFβ1 se confirmó además mediante ELISA. Ejemplo 5: Ab1 αy Ab2 inhiben la actividad tanto de GARP-proTGFβ1 como de LRRC33-proTGFβ1.

[0278] Para determinar si Ab1 y Ab2 inhiben la actividad de GARP-proTGF-β1 y/o LRRC33-proTGF-β1, se realizó un ensayo in vitro basado en células. En este sistema de ensayo, una línea celular de cáncer de colon humano (células SW480/β6) transfectada de forma estable con la integrina β6 se transfectó conjuntamente con un constructo para expresar proTGF-β1 y un constructo para expresar una molécula presentadora (es decir, GARP o LRRC33). Para expresar las moléculas presentadoras, las construcciones que codifican LRRC33-GARP quimérico (SEQ ID Nº: 85) o GARP. Las células transfectadas se incubaron para permitir una expresión y deposición suficientes de los componentes (integrinas y proTGFβ1 complejado con una molécula presentadora respectiva). La activación de TGFβ1 en presencia o ausencia de Ab1 o Ab2 se ensayó utilizando células reporteras (células CAGA12) que expresan receptores de TGFβ acoplados a su vía de transducción de señales en dirección 3, para medir la actividad inhibidora del anticuerpo. Como se muestra en las Figuras 13A y 13B, Ab1 y Ab2 inhibieron tanto GARP-proTGF-β1 como LRRC33-proTGF-β1.

[0279] Se realizó un ensayo adicional basado en células para detectar la inhibición del complejo GARP-proTGFβ1 o del complejo LRRC33-proTGFβ1 utilizando anticuerpos Ab1 y Ab2. Como se muestra en las FIGs. 22A y FIG. 22B, Ab1 y Ab2 inhibieron tanto GARP-proTGF-β1 como LRRC33-proTGF-β1. En este ensayo, la IC50 (µg/mL) de Ab1 para el complejo GARP-TGFβ1 fue de 0,445, y la IC50 (µg/mL) de Ab1 para el complejo LRRC33-TGFβ1 fue de 1,325.

Ejemplo de Referencia 6: Efectos de Ab2 sobre los Biomarcadores Renales y la Fibrosis en un Modelo de Ratón con Oclusión Ureteral Unilateral (UUO)

[0280] El modelo de ratón con oclusión ureteral unilateral se ha utilizado ampliamente para estudiar la fibrosis intersticial, un proceso patológico común que puede conducir a una enfermedad renal terminal (véase Isaka et al. (2008) Contrib. Nephrol.159: 109-21, y Chevalier (1999) Pediatr. Nephrol.13: 612-9). Los ratones UUO se caracterizan por la activación de miofibroblastos renales, atrofia tubular y fibrosis intersticial con lesiones glomerulares mínimas (véase Lian et al. (2011) Acta Pharmacol. Sin.32: 1513-21). Se considera que el aumento de la expresión de TGFβ1 desempeña un papel en el fenotipo observado en los ratones UUO. Para evaluar el efecto de Ab2 en la presentación de fibrosis intersticial en el modelo de ratón UUO, se realizó el siguiente experimento.

[0281] Brevemente, ratones CD-1 macho de 7-8 semanas de edad (Charles River Laboratories) fueron 4 grupos de ratones (n = 10) a los que se les administró Ab2 (3 mg/kg o 30 mg/kg; volumen de dosificación de 10 mL/kg), anticuerpo de control murino IgG1 (30 mg/kg; volumen de dosificación de 10 mL/kg), o PBS, como control con vehículo por vía intraperitoneal (i.p.) antes de la intervención quirúrgica. Los tratamientos se administraron un día antes de la cirugía (d-1), un día después de la cirugía (d1) y 3 días después de la cirugía (d3). El día 0 (d0), se anestesió a los ratones con anestesia de isoflurano en un nosecone, y se les practicó una laparotomía seguida de una cirugía de LTUO unilateral derecha permanente. A otro grupo de ratones de control (n = 8) se les administró PBS como se ha descrito anteriormente, pero únicamente se les sometió a cirugía simulada (es decir, laparotomía sin oclusión del uréter). Inmediatamente después de finalizar el procedimiento quirúrgico, todos los ratones recibieron una inyección subcutánea de 0,001 mg/kg de buprenorfina. Los ratones fueron sacrificados cinco días después de la cirugía y se recogieron tejidos para su análisis. Tras la extracción, ambos riñones se colocaron en NaCl al 0,9% helado, se desencapsularon y se pesaron. Se evaluaron los niveles de hidroxiprolina para valorar el contenido de colágeno del tejido renal. Como se muestra en la FIG.14, los niveles de hidroxiprolina renal, un marcador de fibrosis tisular y deposición de colágeno, aumentaron significativamente en los ratones que recibieron intervención quirúrgica en comparación con los ratones que recibieron cirugía simulada.

[0282] Se fijó por inmersión una sección transversal media de cada riñón derecho en formalina tamponada neutra al 10% durante 48 horas, que luego se transfirió a etanol al 70% para su procesamiento y análisis histológico. Las secciones de riñón fijadas se embebieron en parafina, se seccionaron (tres secciones seriadas de 5 µm adquiridas con una separación de 200-250 µm por riñón de animal para permitir un mayor muestreo y representación de la lesión renal), se tiñeron con rojo Picrosirius y se sometieron a análisis histológicos cuantitativos mediante segmentación por espectro de color para determinar la fracción de volumen de colágeno cortical (CVF). Se calculó una puntuación CVF compuesta para cada animal determinando la puntuación CVF media para cada una de las tres secciones seriadas. Los análisis estadísticos se realizaron mediante la prueba t no apareada. Como se muestra en la FIG.16, la fibrosis cortical renal, determinada por el CVF, aumentó en los riñones obstruidos por UUO en comparación con los ratones control tratados con simulado. Los ratones que recibieron 3 mg/kg o 30 mg/kg de Ab2 mostraron una atenuación significativa de los aumentos inducidos por la UUO en la CVF, en comparación con los ratones que recibieron el control con vehículo (PBS) o el control con IgG.

[0283] Se determinaron los niveles relativos de expresión de ARNm del inhibidor-1 del activador del plasminógeno (PAI-1), factor de crecimiento del tejido conectivo (CTGF), TGFβ1, fibronectina-1, α-actina de músculo liso (α-SMA), proteína quimiotáctica de monocitos 1 (MCP-1), colágeno tipo I alfa 1 (Col1a1), y colágeno tipo III cadena alfa 1 (Col3a1), en el tejido renal cosechado (FIG. 15A-15H). Los niveles de ARNm se normalizaron utilizando los niveles de ARNm de la hipoxantina fosforribosiltransferasa 1 (HPRT1). Además, en los ratones que recibieron 3 mg/kg o 30 mg/kg de Ab2 antes de la intervención quirúrgica, los niveles de ARNm de PAI-1, CTGF, TGFβ1, fibronectina 1, Col1a1 y Col3a1 disminuyeron significativamente, en comparación con los ratones que recibieron 30 mg/kg de IgG1 de control. En los ratones que recibieron 3 mg/kg de Ab2 antes de la intervención quirúrgica, los niveles de ARNm de α-SMA disminuyeron significativamente, en comparación con los ratones que recibieron 30 mg/kg de IgG1 de control. Además, en los ratones que recibieron 30 mg/kg de Ab2 antes de la intervención quirúrgica, los niveles de ARNm de MCP-1 disminuyeron significativamente, en comparación con los ratones que recibieron 30 mg/kg de IgG1 de control.

[0284] En resumen, se observaron efectos significativos en ratones tratados con Ab2 en el modelo de ratón UUO, con la excepción de los niveles de hidroxiprolina. Como se muestra en las FIGs.15A-15H y 16, el tratamiento con Ab2 atenuó significativamente los aumentos de CVF inducidos por UUO y disminuyó significativamente la expresión génica de marcadores de fibrosis conocidos, como PAI-1, CTGF, TGFβ1, fibronectina 1, Col1a1 y Col3a1. Estos datos demuestran que TGFβ1 es la principal forma de TGFβ que desempeña un papel en la enfermedad renal y que, sorprendentemente, es probable que TGFβ2 y TGFβ3 no participen en la patogénesis.

Ejemplo 7: Efectos de Ab1 y Ab2 Solos o en Combinación con Anticuerpos anti-PD-1 sobre la Progresión Tumoral en el Modelo de Ratón Singénico de Carcinoma de Colon Murino MC38.

[0285] Para evaluar los efectos de Ab1 y Ab2, solos o en combinación con un anticuerpo anti-PD-1 para disminuir la progresión tumoral del carcinoma de colon, se utilizó el modelo singénico de carcinoma de colon murino MC38 de ratón C57BL/6.

Cultivo de Células Tumorales

[0286] Las células de carcinoma de colon murino MC38 se cultivaron en medio de Eagle modificado por Dulbecco (DMEM) que contenía 10% de suero bovino fetal, 100 unidades/mL de penicilina G sódica, 100 µg/mL de sulfato de estreptomicina, 25 µg/mL de gentamicina y 2 mM de glutamina. Los cultivos celulares se mantuvieron en frascos de cultivo tisular en una incubadora humidificada a 37 °C, en una atmósfera de 5% de CO₂y 95% de aire.

Implantación in vivo y Crecimiento Tumoral

[0287] Las células MC38 utilizadas para la implantación se cosecharon durante la fase logarítmica de crecimiento y se resuspendieron en solución salina tamponada con fosfato (PBS). El día del implante tumoral, se inyectó subcutáneamente en el flanco derecho de cada ratón de prueba 5 × 10⁵células (0,1 mL de suspensión celular), y se supervisó el crecimiento tumoral a medida que el tamaño medio se aproximaba al rango objetivo de 80 a 120 mm³. Once días más tarde, designado como Día 1 del estudio, los ratones se clasificaron según el tamaño calculado del tumor en grupos de doce animales cada uno, con volúmenes tumorales individuales que oscilaban entre 63 y 196 mm³y volúmenes tumorales medios de grupo de 95 a 98 mm³. Los tumores se midieron en dos dimensiones con calibradores y el volumen se calculó mediante la fórmula:

donde w = anchura y l = longitud, en mm, del tumor. El peso del tumor puede estimarse suponiendo que 1 mg equivale a 1 mm³de volumen tumoral.

Tratamiento

[0288] Brevemente, ratones hembra C57BL/6 de ocho semanas de edad (n=12) portadores de tumores MC38 subcutáneos (63-172 mm³) en el Día 1 fueron administrados por vía intraperitoneal (i.p.) dos veces por semana durante cuatro semanas ya sea Ab1, Ab2, anticuerpo de control IgG1 murino (cada uno a 30 mg/kg en un volumen de dosificación de 10 mL/kg). Cuando los tumores alcanzaron 150 mm³(día 6) en los grupos de control, se administró a los ratones anticuerpo PD-1 de rata anti-ratón (RMP1-14) o anticuerpo de control IgG2A de rata i.p. dos veces por semana durante dos semanas (cada anticuerpo a 5 mg/kg en un volumen de dosificación de 10 mL/kg).

[0289] El Grupo 1 sirvió como control de crecimiento tumoral, y recibió anticuerpo de control de isotipo IgG1 murino en combinación con anticuerpo de control IgG2a de rata. El grupo 2 recibió Ab1 en combinación con anticuerpo de control IgG2a de rata. El grupo 3 recibió Ab2 en combinación con el anticuerpo de control IgG2a de rata. El grupo 3 recibió anticuerpo de control IgG1 murino en combinación con anticuerpo anti-PD-1. El grupo 4 recibió Ab1 en combinación con anticuerpo anti-PD-1. El grupo 5 recibió Ab2 en combinación con anticuerpo anti-PD-1. El grupo 6 (n=16) no recibió tratamiento y sirvió como grupo de control de muestreo.

Análisis de los Criterios de Valoración y del Retraso del Crecimiento Tumoral (TGD)

[0290] Los tumores se midieron utilizando calibradores dos veces por semana, y cada animal fue eutanasiado cuando su tumor alcanzó el volumen de criterio de valoración de 1.000mm³o al final del estudio (Día 60), lo que ocurriera antes. Los ratones que abandonaron el estudio por el criterio de valoración del volumen tumoral se documentaron como eutanasiados por progresión tumoral (PT), con la fecha de eutanasia. El tiempo hasta el criterio de valoración (TTE) para el análisis se calculó para cada ratón utilizando la siguiente ecuación:

donde TTE se expresa en días, el volumen de criterio de valoración se expresa en mm³, b es el intercepto y m es la pendiente de la línea obtenida por regresión lineal de un conjunto de datos de crecimiento tumoral transformados logarítmicamente. El conjunto de datos consistió en la primera observación que superó el volumen de criterio de valoración utilizado en el análisis y las tres observaciones consecutivas que precedieron inmediatamente a la consecución de este volumen de criterio de valoración. El TTE calculado suele ser inferior a la fecha TP, el día en que se practicó la eutanasia al animal por el tamaño del tumor. A los ratones con tumores que no alcanzaron el volumen de criterio de valoración se les asignó un valor de TTE igual al último día del estudio (Día 60). En los casos en los que el TTE calculado transformado logarítmicamente precedía al día anterior a alcanzar el criterio de valoración o superaba el día de alcanzar el criterio de valoración de volumen tumoral, se realizó una interpolación lineal para aproximar el TTE. Los ratones clasificados como muertos por causas no relacionadas con el tratamiento (NTR) fueron excluidos de los cálculos de TTE (y de todos los análisis posteriores). A los animales clasificados como muertes TR (relacionadas con el tratamiento) o NTRm (muerte no relacionada con el tratamiento debida a metástasis) se les asignó un valor TTE igual al día de la muerte.

[0291] El resultado del tratamiento se evaluó a partir del retraso del crecimiento tumoral (TGD), definido como el aumento de la mediana del tiempo hasta el criterio de valoración (TTE) en un grupo de tratamiento en comparación con el grupo de control:

TGD = T−C,

expresado en días, o como porcentaje de la mediana de la ETT del grupo de control:

donde:

T = mediana de TTE para un grupo de tratamiento, y

C = mediana de TTE para el grupo de control designado.

MTV y Criterios para las Respuestas de Regresión

[0292] La eficacia del tratamiento puede determinarse a partir de los volúmenes tumorales de los animales que permanecen en el estudio el último día. El MTV (n) se definió como la mediana del volumen tumoral el último día del estudio en el número de animales restantes (n) cuyos tumores no habían alcanzado el volumen de criterio de valoración.

[0293] La eficacia del tratamiento también puede determinarse a partir de la incidencia y magnitud de las respuestas de regresión observadas durante el estudio. El tratamiento puede causar la regresión parcial (PR) o la regresión completa (CR) del tumor en un animal. En una respuesta PR, el volumen del tumor era igual o inferior al 50% de su volumen del día 1 durante tres mediciones consecutivas en el transcurso del estudio, e igual o superior a 13,5 mm³en una o más de estas tres mediciones. En una respuesta CR, el volumen tumoral fue inferior a 13,5 mm³durante tres mediciones consecutivas en el transcurso del estudio. Un animal con una respuesta de CR al final de un estudio se clasificó además como superviviente libre de tumor (TFS). Se controló la respuesta de los animales a la regresión.

Inhibición del Crecimiento Tumoral

[0294] El análisis de la inhibición del crecimiento tumoral (IGT) evalúa la diferencia en los volúmenes tumorales medios (TVM) de los ratones tratados y de control. Para este estudio, el criterio de valoración para determinar el TGI fue el día 29, que fue el día en que los ratones de control alcanzaron el volumen tumoral medio de 1500 mm³. Para cada grupo se determinó el MTV (n), la mediana del volumen tumoral para el número de animales, n, en el día del análisis TGI. El porcentaje de inhibición del crecimiento tumoral (%TGI) se definió como la diferencia entre el VTM del grupo de control designado y el VTM del grupo tratado con el fármaco, expresada como porcentaje del VTM del grupo de control:

[0295] El conjunto de datos para el análisis TGI incluyó todos los ratones de un grupo, excepto los que murieron por causas relacionadas con el tratamiento (TR) o no relacionadas con el tratamiento (NTR) antes del día del análisis TGI.

[0296] En el presente estudio, Ab1 y Ab2 se evaluaron solos y en combinación con anti-PD-1 en el modelo singénico de carcinoma de colon murino MC38 de ratón C57BL/6. Los ratones a los que se administró Ab2 en combinación con anti-PD-1 produjeron un TGI significativo el Día 29 (P < 0,05, prueba U de Mann-Whitney), produciendo un beneficio en la supervivencia que fue estadísticamente diferente de los controles tratados con vehículo mediante análisis de supervivencia logrank (P < 0,05, logrank) (véase la FIG.17). Los ratones que recibieron Ab1 o Ab2 en combinación con el anticuerpo de control IgG2a de rata tuvieron respuestas de regresión de 1 CR y 1 PR respectivamente. En combinación con anti-PD-1 las respuestas de regresión de Ab1 y Ab2 fueron 1 PR y 1 CR, y 4 CR, respectivamente. Ab2 en combinación con anti-PD-1 produjo una eficacia significativa a corto plazo en el día 29 y produjo un beneficio de supervivencia global en este estudio TGD de 60 días en el modelo singénico de ratones C57BL/6 de carcinoma de colon murino MC38. Ejemplo de Referencia 8: Papel del TGFβ1 en la Distrofia Muscular

[0297] El TGFβ desempeña múltiples funciones en la función del músculo esquelético, incluyendo la inhibición de la miogénesis, la regulación de la inflamación y la reparación muscular, y la promoción de la fibrosis. Aunque existe un interés considerable en la inhibición de TGFβ como terapia para una amplia gama de enfermedades, incluidas las distrofias musculares, estas terapias inhiben TGFβ1, TGFβ2 y TGFβ3 independientemente del contexto molecular. La falta de especificidad/selectividad de estos inhibidores puede dar lugar a efectos secundarios no deseados que conduzcan a dosis clínicas con una eficacia insuficiente. Aunque se ha informado de que las moléculas inhibidoras pan-TGFβ mejoran la función muscular y reducen la fibrosis en el ratón mdx, aún no se ha abordado si esos efectos se deben a la inactivación de TGFβ1, β2 o β3.

[0298] Para ello, se han generado anticuerpos que bloquean específicamente la activación mediada por integrina de TGFβ1 latente, mientras que ahorran TGFβ2 y β3. Los ratones D2.mdx son tratados con anticuerpos específicos proTGFβ1, con el fin de determinar el papel de TGFβ1 específicamente en la reparación muscular en el músculo distrófico. Se evalúan los efectos funcionales de la inhibición de TGFβ1 sobre la protección frente a lesiones inducidas por contracción, así como sobre la recuperación del mismo método de lesión. La evaluación histológica incluye si el tratamiento afecta al daño muscular, la fibrosis y la inflamación. Además, pueden evaluarse las posibles toxicidades para determinar si los efectos negativos observados de los que se ha informado con la inhibición pan-TGFβ en el músculo (por ej., aumento de la inflamación, déficit a largo plazo de la función muscular) se deben a la inhibición de TGFβ1 o TGFβ2/3. Para comprender si la inhibición de TGFβ1 en contextos moleculares específicos es más eficaz y/o tiene menos efectos negativos (efectos adversos), puede evaluarse la eficacia de los inhibidores de LTBP-proTGFβ1 en este modelo con el fin de deconvolucionar el papel del TGFβ1 presentado por las células inmunitarias del presentado en la matriz extracelular (ECM), lo que podría conducir a terapias antifibróticas más seguras y/o eficaces.

[0299] El músculo distrófico es altamente susceptible a lesiones inducidas por contracción. Tras la lesión, el músculo de los ratones mdx muestra una reducción significativa en la generación de fuerza y una mayor captación de colorante azul de Evan, indicativo de lesión/daño físico en la fibra muscular, en comparación con el WT (Lovering, R.M., et al., Arch Phys Med Rehabil, 2007. 88(5): p. 617-25). Los agentes terapéuticos que reducen la extensión de la lesión inducida por la contracción, o mejoran la recuperación tras la lesión, supondrían un beneficio clínico significativo para los pacientes con distrofia muscular (Bushby, K., et al., Lancet Neurol, 2010.9(1): p.77-93). Se evaluará la capacidad de Ab1 y Ab2 para i) prevenir la lesión inducida por contracción, así como para ii) promover la recuperación de la lesión. La cepa D2.mdx puede utilizarse para nuestros experimentos, en contraposición a la cepa mdx tradicional en el fondo B10. Estos ratones, generados mediante el cruce de mdx con un fondo DBA2/J, tienen la variante no protectora de LTBP4 descrita anteriormente y, por lo tanto, presentan una patología de la enfermedad que es más grave, progresiva y similar a la enfermedad humana que la cepa mdx estándar (Coley, W.D., et al., Hum Mol Genet, 2016.25(1): p.130-45). Dado que se están utilizando ratones D2.mdx, los ratones DBA2/J pueden servir como controles de tipo salvaje. Dado que la DMD afecta principalmente a los varones, los estudios podrían centrarse en ratones macho.

[0300] Para examinar la capacidad de Ab1 y Ab2 para prevenir/limitar la lesión inducida por contracción, ratones D2.mdx machos de 6 semanas de edad (n=10) son tratados con 10 mg/kg/semana de IgG control, Ab1, o Ab2 durante 6 semanas. Para permitir la comparación con trabajos publicados que utilizan un inhibidor pan-TGFβ, un cuarto grupo recibe una dosis de 10 mg/kg/semana de 1D11. Todos los anticuerpos son de isotipo mIgG1 y esta dosis ha demostrado previamente su eficacia en el modelo UUO (FIGs.15 y 16). También se incluye un grupo WT dosificado con el control IgG.24 horas antes del sacrificio, se administra a los ratones un 1% de colorante azul de Evan (EBD) en PBS (volumen 1% del peso corporal) para permitir la evaluación del daño de las miofibras mediante microscopía de fluorescencia. Al final del tratamiento, se somete a los ratones a un protocolo de contracción excéntrica in vivo. La lesión excéntrica del músculo gastrocnemio se puede realizar con un sistema de palanca muscular 305B (Aurora Scientific) como se describe (Khairallah, R.J., et al., Sci Signal, 2012.5(236): p. ra56). Brevemente, se realizan 20 contracciones excéntricas con pausas de 1 minuto entre ellas, y la disminución de la fuerza isométrica máxima antes de la fase excéntrica puede tomarse como una indicación de daño muscular. Se puede determinar la magnitud de la pérdida de fuerza y el porcentaje de fibras EBD positivas. Los ratones DBA2/J sometidos a este protocolo pierden un 30-40% de la fuerza inicial tras 20 contracciones excéntricas. En cambio, los ratones D2.mdx pierden el 80 % de la fuerza inicial siguiendo el mismo protocolo, como se ha descrito previamente (Pratt, S.J., et al., Cell Mol Life Sci, 2015.72(1): p.153-64; Khairallah, R.J., et al., Sci Signal, 2012.5(236): p. ra56). Se puede evaluar la capacidad de Ab1 y Ab2 para reducir la pérdida de fuerza tras una lesión. Los ratones se sacrifican al final del experimento y tanto los músculos gastrocnemios lesionados como los no lesionados pueden recogerse para realizar análisis histológicos. La captación de EBD puede evaluarse en ambos músculos. Se puede medir el área transversal de las miofibras y la extensión de la fibrosis. Para determinar el área transversal, se pueden teñir secciones del vientre medio del músculo con aglutinina de germen de trigo conjugada con un fluoróforo para visualizar las membranas celulares. Las secciones pueden digitalizarse mediante microscopía fluorescente, los límites celulares pueden trazarse mediante software predictivo y el área de la sección transversal puede determinarse mediante mediciones automatizadas no sesgadas. Para analizar la fibrosis, las secciones pueden teñirse con rojo picrosirio (PSR) y calcularse el área de PSR+ por portaobjetos.

[0301] Se evalúa la capacidad de Ab1 y Ab2 para acelerar la recuperación de lesiones inducidas por contracción. Los ratones DBA2/J y D2.mdx de 12 semanas de edad pueden someterse al mismo protocolo de contracción excéntrica descrito anteriormente. Tras la lesión, los ratones se dividen en grupos de tratamiento (n=10) y se les administra un control IgG (para ratones WT y D2.mdx), 1D11, Ab1 o Ab2 (sólo D2.mdx). Los anticuerpos pueden dosificarse a 10mg/kg/semana durante la duración del experimento. Siete y 14 días después de la lesión, se puede medir la fuerza isométrica máxima, la relación tic-tetánica y la relación fuerza-frecuencia para evaluar el efecto del tratamiento en la recuperación de la lesión. Mientras que Ab1 y Ab2 inhiben la liberación de TGFβ1 independientemente de la molécula de presentación, la liberación selectiva de TGFβ1 de la matriz extracelular (es decir, presentado por LTBP) podría tener un mayor beneficio en DMD debido a la preservación de la actividad Treg impulsada por TGFβ1. Para abordar esta cuestión, también pueden evaluarse anticuerpos inhibidores específicos de LTBP-proTGFβ1, tanto por su capacidad para prevenir la lesión inducida por contracción como para acelerar la recuperación de la lesión.

Ejemplo de Referencia 9: Papel del TGFβ1 en la regeneración del músculo esquelético tras una lesión aguda.

[0302] Puede investigarse el papel de TGFβ1 específicamente en la regeneración de miofibras tras una lesión muscular. Los anticuerpos específicos de TGFβ1 pueden emplearse en el modelo de lesión por cardiotoxinas para determinar el papel de TGFβ1 específicamente durante la regeneración de las miofibras. La regeneración puede evaluarse histológicamente y pueden realizarse evaluaciones funcionales de la fuerza y la calidad musculares. Dados los beneficios potenciales de la inhibición de TGFβ1 para la regeneración muscular, las terapias que tienen efectos beneficiosos sin las toxicidades observadas con la inhibición pan-TGFβ serían de gran beneficio. Esto permite investigar los efectos de la inhibición específica de TGFβ1 sobre la función de las células satélite y puede aportar ideas a los estudios de trasplante de células satélite.

[0303] Como se ha descrito anteriormente, el TGFβ parece tener múltiples efectos sobre la biología muscular, incluida la inhibición de la proliferación y diferenciación de mioblastos, así como la promoción de la atrofia y la fibrosis (Allen, R.E. y L.K. Boxhorn, J Cell Physiol, 1987.133(3): p.567-72; Brennan, T.J., et al., Proc Natl Acad Sci USA, 1991.88(9): p.3822-6; Massague, J., et al., Proc Natl Acad Sci USA, 1986.83(21): p.8206-10; Olson, E.N., et al., J Cell Biol, 1986.103(5): p.

1799-805; Li, Y., et al., Am J Pathol, 2004.164(3): p.1007-19; Mendias, C.L., et al., Muscle Nerve, 2012.45(1): p.55-9; Nelson, C.A., et al., Am J Pathol, 2011.178(6): p.2611-21). Sin embargo, estos estudios utilizaron TGFβ1 recombinante en cultivo o inyectado en ratones, lo que puede tener resultados no fisiológicos, ya que el factor de crecimiento se saca de su contexto molecular. Alternativamente, los investigadores utilizaron inhibidores de TGFβ que no son selectivos para TGFβ1.

[0304] Para evaluar los efectos específicos de isoforma de TGFβ1, pueden examinarse múltiples anticuerpos proTGFβ1 (por ej., Ab1 y Ab2) para determinar su capacidad de afectar a la regeneración muscular tras una lesión inducida por CTX. Estos anticuerpos son inhibidores "específicos de isoforma" y "permisivos de contexto" de la activación de TGFβ1, de forma que inhiben específicamente la liberación de TGFβ1 (a diferencia de TGFβ2 o TGFβ3) de cualquier molécula presentadora y no se unen a los factores de crecimiento maduros (FIG.18A).

[0305] La regeneración muscular puede inducirse en ratones machos DBA2/J (n=10) mediante la inyección de CTX en el músculo gastrocnemio derecho. Un día antes de la lesión, se puede administrar a los ratones 10mg/kg de IgG control, 1D11, Ab1 o Ab2. Los anticuerpos se siguen dosificando semanalmente hasta el final del estudio. A los 7 y 14 días después de la lesión, se pueden medir las fuerzas musculares in vivo con un sistema de palanca muscular 305C (Aurora Scientific Inc., Aurora, CAN). Brevemente, para el grupo de músculos plantarflexores, se provocan contracciones mediante estimulación eléctrica percutánea del nervio ciático en ratones anestesiados y, a continuación, se realiza una serie de estimulaciones con una frecuencia de estimulación creciente (pulso de 0,2 ms, duración del tren de 500 ms): 1, 10, 20, 40, 60, 80, 100, 150 Hz, seguido de una estimulación final a 1 Hz. Se determinará la fuerza isométrica máxima máxima, la relación tic-tetánica y la relación fuerza-frecuencia. Tras las mediciones de fuerza, se recogen los músculos gastrocnemio y sóleo lesionados y se preparan para histología. El área de la sección transversal de la miofibra y el área %PSR+ pueden determinarse como se describe en el Ejemplo 8 anterior.

[0306] El tratamiento con Ab1 y Ab2 puede reducir la fibrosis y mejorar la función muscular. Sin embargo, dado el papel del TGFβ1 en la regulación de la activación inmunitaria, es posible que observemos un aumento de la inflamación con los anticuerpos, como se ha informado con el tratamiento con 1D11 (Andreetta, F., et al., J Neuroimmunol, 2006.175(1-2): p.

77-86). En el caso de que el aumento de la inflamación pueda limitar los efectos terapéuticos de la inhibición de TGFβ1, pueden evaluarse posteriormente anticuerpos específicos del contexto para proporcionar un mayor grado de especificidad, lo que puede limitar la toxicidad. Por ejemplo, pueden utilizarse anticuerpos que inhiban la liberación de TGFβ1 de las LTBP únicamente, utilizando las lecturas y métodos descritos anteriormente. Estos anticuerpos pueden limitar la liberación de TGFβ1 sólo de la ECM, sin afectar a la liberación de Tregs o macrófagos.

Ejemplo 10: Selección de agentes inhibidores de TGFβ1 adecuados.

[0307] El análisis de la expresión de proTGFβ1 y sus moléculas presentadoras en músculo sano, en regeneración y enfermo puede proporcionar información útil para ayudar a la selección del enfoque terapéutico óptimo. Dados los beneficios potenciales de la inhibición de TGFβ1 en la regeneración y reparación muscular, comprender el contexto de la presentación de proTGFβ1 (por ej., en la ECM o en las células inmunitarias) en el músculo esquelético en diferentes condiciones (sano, con lesiones agudas y con lesiones crónicas) puede ayudar a informar sobre la utilidad terapéutica de los anticuerpos y, en última instancia, proporcionar información sobre el grado de especificidad/selectividad necesario para lograr tanto la eficacia clínica como la seguridad. La naturaleza de la presentación de TGFβ1 puede variar en función del estado de salud del músculo y a lo largo del curso de la enfermedad, lo que podría tener implicaciones para cualquier terapia dirigida a TGFβ1. La comprensión de los perfiles de expresión de estas moléculas también ayudará a seleccionar el momento adecuado para la dosificación de posibles moléculas terapéuticas. Mediante inmunoelectrotransferencia, inmunohistoquímica e inmunoprecipitación, puede evaluarse la expresión de proTGFβ1 y sus moléculas presentadoras en músculo normal, agudamente lesionado (lesión por cardiotoxina) y crónicamente regenerado (ratón D2.mdx). La expresión de estas moléculas puede investigarse específicamente en tipos celulares clave o en subconjuntos de tipos celulares (por ej., células satélite, macrófagos, progenitores fibroadipogénicos, etc.) en las diferentes condiciones descritas anteriormente.

[0308] Aunque se ha examinado la expresión de isoformas de TGFP en músculos de ratones mdx, trabajos anteriores se centraron en la expresión de los factores de crecimiento maduros (Nelson, C.A., et al., Am J Pathol, 2011.178(6): p.2611-21; Zhou, L., et al., Neuromuscul Disord, 2006.16(1): p.32-8). Dada la especificidad de diana de los anticuerpos TGFβ1 aquí descritos, es esencial que los patrones de expresión se examinen no sólo para TGFβ1 maduro y proTGFβ1, sino también para las moléculas presentadoras, lo que debería proporcionar información sobre la fuente y/o el contexto de un conjunto de TGFβ1 de interés. Lo ideal sería comprender los patrones de expresión de los complejos latentes, no sólo de cada componente.

[0309] Los anticuerpos se seleccionan para inmunoelectrotransferencia e IHC para dianas de interés. Los anticuerpos contra TGFβ1-LAP, LTBP1, LTBP3 y LTBP4 de ratón están disponibles comercialmente. El anticuerpo contra TGFβ1-LAP (clon TW7-16B4) se ha caracterizado ampliamente y es eficaz tanto en citometría de flujo como en inmunoelectrotransferencia (Oida, T. y H.L. Weiner, PLoS One, 2010.5(11): p. e15523). Los anticuerpos contra LTBP1 (ProteinTech # 22065-1-AP) y LTBP3 (Millipore #ABT316) han sido validados internamente utilizando células SW480 transfectadas con LTBP1-proTGFβ1 o LTBP3-proTGFβ1 y han demostrado ser específicos para sus dianas. Puede determinarse la utilidad de estos anticuerpos para la IHC. Se seccionan músculos de ratones sanos y D2.mdx y se analizan los anticuerpos en secciones congeladas y FFPE. Los anticuerpos pueden validarse incluyendo condiciones con un exceso 100x de proteína diana o complejo purificado (de fabricación propia, véanse las FIGs. 18B, por ejemplo) para garantizar que la señal observada es específica.

[0310] Trabajos anteriores han identificado anticuerpos que se unen específicamente a un complejo latente dado pero que no tienen actividad inhibidora. La unión al antígeno por parte de estos anticuerpos se ha confirmado mediante ELISA (FIGs. 18B & 18C) y también pueden ser evaluados por su utilidad en IHC (dada la estructura tridimensional de estos epítopos es poco probable que estos anticuerpos sean eficaces como reactivosde inmunoelectrotransferencia). La presencia de complejos TGFβ1 latentes a partir de tejido a granel también puede evaluarse mediante inmunoelectrotransferencia o inmunoprecipitación. Los complejos latentes pueden identificarse mediante inmunoelectrotransferencia analizando la misma muestra en condiciones reductoras y no reductoras. En condiciones reductoras, TGFβ1, LAP y la molécula presentadora se separan, y las tres moléculas pueden identificarse en el mismo blot pero utilizando métodos de inmunoelectrotransferencia de dos colores. En condiciones no reductoras, el complejo de moléculas presentadoras de LAP permanece asociado mientras se libera TGFβ1; el complejo migra más lentamente que la molécula presentadora vacía y migra junto con TGFβ1-LAP (FIG. 18B). También se evalúa la capacidad de varios anticuerpos de inmunoprecipitar complejos latentes del músculo para demostrar la unión directa de TGFβ1 a moléculas presentadoras específicas.

[0311] Una vez identificados los anticuerpos apropiados, se evalúa la expresión en músculo sano, regenerado y distrófico, mediante western y/o IHC, dependiendo de los anticuerpos disponibles. Los músculos tibial anterior (TA) y del diafragma pueden recogerse de ratones DBA2/J y D2.mdx a las 4, 8 y 12 semanas de edad. Para regenerar el músculo, se puede inyectar cardiotoxina en el TA de ratones DBA2/J de 12 semanas de edad, y recoger los músculos 3, 7 y 14 días después de la lesión. Pueden utilizarse tejidos de al menos 4 ratones para cada condición/punto temporal. También pueden realizarse experimentos de co-tinción para identificar las poblaciones celulares que expresan las distintas moléculas (por ejemplo: CD11b para macrófagos, FoxP3 para Tregs, MyoD para células miogénicas).

Ejemplo 11: Ab2 muestra una toxicidad reducida en comparación con el inhibidor de la quinasa ALK5 LY2109761 y un anticuerpo Pan-TGFβ

[0312] Para evaluar la toxicidad de Ab2, en comparación con la pequeña molécula inhibidora de la quinasa del receptor de TGF-β tipo I (ALK5) LY2109761 y con un anticuerpo pan-TGFβ (hIgG4), se realizaron estudios de toxicidad en ratas. Brevemente, se administró a ratas hembra F344/NHsd Ab2 a 3 mg/kg (1 grupo, n=5), a 30 mg/kg (1 grupo, n=5), o a 100 mg/kg (1 grupo, n=5); un anticuerpo pan-TGFβ a 3 mg/kg (1 grupo, n=5), a 30 mg/kg (1 grupo, n=5), o a 100 mg/kg (1 grupo, n=5); LY2109761 a 200 mg/kg (1 grupo, n=5) o 300 mg/kg (1 grupo, n=5); o PBS (pH 7.4) control con vehículo (1 grupo, n=5). Los animales que recibieron Ab2, el anticuerpo pan-TGFβ o el control con vehículo recibieron una dosis intravenosa (en el día 1), y las ratas que recibieron LY2109761 recibieron una dosis por sonda oral una vez al día durante 7 días (7 dosis). El peso corporal de los animales se determinó en los días 1, 3 y 7 de la fase de dosificación. Los animales fueron sacrificados el día 8 y se realizaron necropsias.

[0313] Como se muestra en los datos de supervivencia de la FIG.19, Ab2 mostró una toxicidad reducida en comparación con los otros grupos de tratamiento. Todos los animales a los que se administraron 300mg/kg del inhibidor de la cinasa ALK5 LY2109761 fueron sacrificados en estado moribundo o hallados muertos los días 3, 6 ó 7 del estudio. Dos de los animales a los que se administró 200 mg/kg de LY2109761 se encontraron muertos al séptimo día del estudio. Un animal al que se le administraron 100 mg/kg del anticuerpo pan-TGFβ murió al sexto día del estudio. Todos los animales a los que se administró hasta 100 mg/kg de Ab 2 sobrevivieron hasta el sacrificio terminal.

[0314] Además, la toxicidad de los tratamientos se evaluó controlando el peso corporal de los animales durante la fase de dosificación. Como se muestra en las FIGs.20 y 21A-21C, los animales que recibieron LY2109761 a dosis de 200 mg/kg o 300 mg/kg mostraron una disminución del peso corporal durante el transcurso del estudio.

[0315] El peso de los órganos del animal también se evaluó post-mortem. Como se muestra en la Tabla 11, se observó un aumento del peso del corazón en los animales a los que se administró ≥ 200 mg/kg de LY2109761. También se observó un aumento del peso del corazón en los animales a los que se administró ≥ 30 mg/kg del anticuerpo pan-TGFβ. No se observaron efectos sobre el peso de los órganos en los animales a los que se administró hasta 100 mg/kg de Ab2.

Tabla 11. Cambios en el Peso de los Órganos en los Grupos de Tratamiento

NE = no evaluado debido a mortalidad temprana.

Nota: Valores de peso absoluto y relación de pesos de órganos (en relación con el cuerpo o el cerebro) para cada

grupos de tratamiento expresados como porcentaje del valor medio del control.

^aControl con vehículo = solución salina tamponada con fosfato (PBS), pH 7,4.

[0316] Aunque no se observaron hallazgos macroscópicos en los animales a los que se administró hasta 100 mg/kg de Ab2 o del anticuerpo pan-TGFβ, se observó una forma anormal del esternón en cuatro animales de cada grupo de tratamiento que recibieron 200 mg/kg o 300 mg/kg de LY2109761. Se observaron 2,5 ml de líquido claro en la cavidad torácica y un timo agrandado debido al exceso de líquido (es decir, edema) en un animal al que se administraron 300 mg/kg de LY2109761, que se encontró muerto el día 3 del estudio.

[0317] Como se muestra en la Tabla 12, a nivel microscópico, los animales administrados ≥ 200 mg/kg de LY2109761 exhibieron hallazgos en las válvulas cardíacas (es decir, valvulopatía). La valvulopatía se caracterizaba por un engrosamiento de la válvula cardiaca debido a hemorragia, hiperplasia endotelial, infiltrados celulares inflamatorios mixtos y/o hiperplasia estromal (véase la FIG.23, panel superior derecho). La mayoría de los animales tenían múltiples válvulas afectadas. Además, se observaron hallazgos en la aurícula que incluían infiltrados celulares inflamatorios mixtos de mínimos a leves, hemorragia mínima y/o hiperplasia mínima del endotelio (endocardio), lo que dio lugar a un aumento de la tinción basófila de la aurícula en las secciones teñidas con hematoxilina y eosina. Los hallazgos en el miocardio también se observaron principalmente en la base del corazón y consistían en una degeneración/necrosis mínima o leve, hemorragia leve y/o infiltrados celulares inflamatorios mixtos leves. Un animal al que se administraron 300 mg/kg de LY2109761 presentó necrosis leve con inflamación de una arteria coronaria. Además, dos animales a los que se administró 200 mg/kg de LY2109761 presentaron infiltrados celulares inflamatorios mixtos mínimos o hemorragia en la raíz aórtica.

Tabla 12. Hallazgos Microscópicos del Corazón en Animales que Recibieron LY2109761

(continuación)

[0318] Como se muestra en la Tabla 13, los animales a los que se administró ≥3 mg/kg del anticuerpo pan-TGFβ mostraron hallazgos en las válvulas cardiacas (es decir, valvulopatía) similares a los descritos en los animales a los que se administró LY2109761, como se ha descrito anteriormente (véase también la FIG.23, panel inferior izquierdo). Los animales a los que se administró ≥30 mg/kg del anticuerpo pan-TGFβ presentaron hallazgos auriculares similares a los descritos en los animales a los que se administró LY2109761. Los animales a los que se administró 100 mg/kg del anticuerpo pan-TGFβ presentaron hallazgos en el miocardio similares a los descritos en los animales a los que se administró LY2109761, y los animales a los que se administró 30 mg/kg del anticuerpo pan-TGFβ presentaron hemorragia en el miocardio. Un animal al que se le administró 100 mg/kg del anticuerpo pan-TGFβ presentó necrosis intramural moderada con hemorragia en una arteria coronaria, que se asoció a leves infiltrados de células inflamatorias mixtas perivasculares.

Tabla 13. Hallazgos Microscópicos del Corazón en Animales que Recibieron el Anticuerpo Pan-TGFβ

(continuación)

[0319] Por el contrario, un solo animal del grupo de tratamiento al que se le administró 100 mg/kg de Ab2 presentaba infiltrados celulares inflamatorios mixtos mínimos en una sola valva de la válvula atrioventricular izquierda (véase FIG.23, panel inferior derecho), que era coherente con un hallazgo de fondo debido a la incidencia única y a la ausencia de hallazgos valvulares concurrentes. Así pues, sorprendentemente, el tratamiento con Ab2 dio lugar a una reducción de la mortalidad y de la cardiotoxicidad en comparación con el tratamiento con el inhibidor de la cinasa ALK5 LY2109761 o con el tratamiento con el anticuerpo pan-TGFβ.

Claims

REIVINDICACIONES

1. Un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo que se une específicamente a todos los siguientes complejos de proTGFβ1/TGFβ1 latente: un complejo TGFβ-GARP, un complejo TGFβ1-LTBP1, un complejo TGFβ1-LTBP3 y un complejo TGFβ1-LRRC33, e inhibe la liberación de TGFβ1 maduro de los complejos, para su uso en el tratamiento del cáncer o la mielofibrosis en un sujeto;

en el que el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo:

(a) comprende una región variable de cadena pesada que comprende una CDRH1, CDRH2 y CDRH3 y una región variable de cadena ligera que comprende una CDRL1, CDRL2 y CDRL3, en la que:

CDRH1 comprende la secuencia SDWIG (SEQ ID Nº: 2);

CDRH2 comprende la secuencia VIYPGDSDTRYSASFQG (SEQ ID Nº: 4);

CDRH3 comprende la secuencia AAGIAAAGHVTAFDI (SEQ ID Nº: 6);

CDRL1 comprende la secuencia KSSQSVLYSSNNKNYLA (SEQ ID Nº: 8);

CDRL2 comprende la secuencia WASTRES (SEQ ID Nº: 10); y

CDRL3 comprende la secuencia QQYYSTPVT (SEQ ID Nº: 12);

(b) comprende una región variable de cadena pesada que comprende una CDRH1, CDRH2 y CDRH3 y una región variable de cadena ligera que comprende una CDRL1, CDRL2 y CDRL3, en la que:

CDRH1 comprende la secuencia SYGMH (SEQ ID Nº: 1);

CDRH2 comprende la secuencia VISYDGSNKYYADSVKG (SEQ ID Nº: 3);

CDRH3 comprende la secuencia DIRPYGDYSAAFDI (SEQ ID Nº: 5);

CDRL1 comprende la secuencia TGSSGSIASNYVQ (SEQ ID Nº: 7);

CDRL2 comprende la secuencia EDNQRPS (SEQ ID Nº: 9); y

CDRL3 comprende la secuencia QSYDSSNHGGV (SEQ ID Nº: 11);

o

(c) compite o compite de forma cruzada con el anticuerpo definido en la parte (a) o (b) para unirse a TGFβ1 que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID Nº: 21;

en el que el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo no se une a TGFβ2 que tenga la secuencia de aminoácidos de SEQ ID Nº: 22 o TGFβ3 con la secuencia de aminoácidos de SEQ ID Nº: 23.

2. El anticuerpo o fragmento de unión a antígeno para su uso según la reivindicación 1, en el que el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno de la parte (a) comprende una región variable de cadena pesada que comprende una secuencia según se establece en SEQ ID Nº: 17 y una región variable de cadena ligera que comprende una secuencia según se establece en SEQ ID Nº: 18 o en el que el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno de la parte (b) comprende una región variable de cadena pesada que comprende una secuencia según se establece en SEQ ID Nº: 13 y una región variable de cadena ligera que comprende una secuencia según se establece en SEQ ID Nº: 14.

3. El anticuerpo o fragmento de unión a antígeno para uso según cualquier reivindicación precedente, en el que el cáncer es un cáncer o tumor que se encuentra en el colon, ano, vejiga, conducto biliar, hueso, cerebro, mama, cuello uterino, recto, endometrio, esófago, ojo, vesícula biliar, cabeza y cuello, hígado, riñón, laringe, pulmón, mediastino (tórax), boca, ovarios, páncreas, pene, próstata, piel, intestino delgado, estómago, médula espinal, coxis, testículos, tiroides o útero.

4. El anticuerpo o fragmento de unión a antígeno para uso según cualquier reivindicación precedente, en el que la terapia reduce el crecimiento tumoral en el sujeto.

5. El anticuerpo o fragmento de unión a antígeno para uso según cualquier reivindicación precedente, en el que la terapia reduce la actividad supresora de las células T reguladoras.

6. El anticuerpo o fragmento de unión a antígeno para uso según cualquier reivindicación precedente, en el que el anticuerpo se administra a una dosis terapéuticamente eficaz de aproximadamente 0,1 µg/kg a aproximadamente 30 mg/kg.

7. El anticuerpo o fragmento de unión a antígeno para uso según cualquier reivindicación precedente, en el que la terapia inhibe o disminuye el crecimiento del tumor sólido.

8. El anticuerpo o fragmento de unión a antígeno para su uso según cualquier reivindicación precedente, en el que el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo debe administrarse en combinación con un agente o terapia adicional, en el que opcionalmente el agente adicional es un inhibidor del punto de control.

9. El anticuerpo o fragmento de unión a antígeno para uso según la reivindicación 8, en el que el agente adicional se selecciona del grupo que consiste en un anticuerpo anti-PD1, un antagonista PD-1, un antagonista PDL1, o una proteína de fusión PD-L1 o PDL2, un antagonista CTLA4, un agonista GITR, un anticuerpo anti-ICOS, un anticuerpo anti-ICOSL, un anticuerpo anti-B7H3, un anticuerpo anti-B7H4, un anticuerpo anti-TIM3, un anticuerpo anti-LAG3, un anticuerpo anti-OX40, un anticuerpo anti-CD27, un anticuerpo anti-CD70, un anticuerpo anti-CD47, un anticuerpo anti-41BB, un virus oncolítico y un inhibidor de PARP.