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ES2942031T3 - Métodos mejorados para realizar ensayos multiplexados - Google Patents

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ES2942031T3
ES2942031T3 ES14778374T ES14778374T ES2942031T3 ES 2942031 T3 ES2942031 T3 ES 2942031T3 ES 14778374 T ES14778374 T ES 14778374T ES 14778374 T ES14778374 T ES 14778374T ES 2942031 T3 ES2942031 T3 ES 2942031T3
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ES
Spain
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agent
targeting
reagent
analyte
Prior art date
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Active
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ES14778374T
Other languages
English (en)
Inventor
Eli N Glezer
Sudeep Kumar
Pankaj Oberoi
George Sigal
Michael Tsionsky
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Meso Scale Technologies LLC
Original Assignee
Meso Scale Technologies LLC
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Publication date
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Abstract

La invención se refiere a métodos para realizar ensayos de unión en fase sólida. Un ejemplo es un método de ensayo que tiene una especificidad de analito mejorada donde la especificidad está limitada por la presencia de interacciones de unión no específicas. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

DESCRIPCIÓN
Métodos mejorados para realizar ensayos multiplexados
Declaración sobre investigación patrocinada federalmente
Esta invención se hizo con soporte federal, bajo la concesión 5RCA130391-04, otorgada por el National Cancer Institute. El gobierno de Estados Unidos tiene determinados derechos en la invención.
Campo de la invención
Se proporcionan métodos mejorados para realizar ensayos de unión. Estos métodos incluyen el uso de un complejo de agente de unión que permite al usuario configurar un ensayo para cumplir sus necesidades de un conjunto convencional de materiales de ensayo. Los métodos de la invención potencian en gran medida la productividad y la flexibilidad en el desarrollo del ensayo.
Antecedentes de la invención
Se ha desarrollado un cuerpo sustancial de la bibliografía con respecto a las técnicas que emplean reacciones de unión, por ejemplo, reacciones de antígeno-anticuerpo, hibridación de ácidos nucleicos y reacciones de receptorligando, para la medición sensible de analitos de interés en muestras. El alto grado de especificidad en muchos sistemas de unión bioquímica ha llevado a muchos métodos de ensayo y sistemas de valor, en una variedad de mercados, incluyendo diagnósticos básicos, diagnósticos humanos y veterinarios, monitorización ambiental y pruebas industriales. La presencia de un analito de interés puede medirse midiendo directamente la participación del analito en una reacción de unión. En algunos enfoques, esta participación puede indicarse mediante la medición de un marcador observable, unido a uno o más de los materiales de unión.
Los ensayos comercialmente disponibles se suministran generalmente en una configuración preestablecida, ofreciendo al usuario poca o ninguna flexibilidad para evaluar la(s) diana(s) que puede(n) ser de interés único para él o ella. Tales paneles comerciales pueden incluir analitos diana que son de poco o ningún interés, y/o pueden no incluir el o los analitos diana deseados. Por tanto, existe la necesidad de proporcionar al usuario un método flexible para configurar un ensayo multiplexado definido por el usuario, usando un conjunto convencional de materiales y métodos de ensayo.
Se han descrito ensayos múltiplex basados en el uso de oligonucleótidos, para unir ligandos de afinidad, tales como anticuerpos, a la superficie de un sustrato plástico (Keum-Soo Song y col: “ 9G DNAChip: a platform for the efficient detection of proteins” , Chemical Communications 2011,47[27]:7716-7718; QuantiScientifics: “The A2 Multiplex ELISA Human Cytokine Panel” , julio de 2012; QuantiScientifics: “Optimization of oligo-antibody conjugate loading for use in the A2Multiplex ELISA” , septiembre de 2012).
Resumen de la invención
La presente invención se expone a continuación y en el conjunto de reivindicaciones adjuntas, y contempla las siguientes realizaciones específicas.
Realización (1): un método para realizar un ensayo de unión multiplexado para una pluralidad de analitos de interés, que comprende:
(a) combinar, en una o más etapas, los siguientes componentes:
(i) una muestra que comprende un primer analito de interés y un segundo analito de interés,
(ii) un primer agente de direccionamiento, inmovilizado en un primer dominio de unión, siendo el primer agente de direccionamiento un oligonucleótido,
(iii) un primer complemento de agente de direccionamiento, conectado a un primer agente de unión, en donde el primer complemento de agente de direccionamiento es un compañero de unión del primer agente de direccionamiento, siendo el primer complemento del agente de direccionamiento un oligonucleótido complementario al primer oligonucleótido de agente de direccionamiento,
(iv) un primer reactivo de unión conectado a un primer agente de unión suplementario, en donde el primer reactivo de unión es un compañero de unión del primer analito,
(v) un primer reactivo de detección que se une al primer analito, comprendiendo el primer reactivo de detección un marcador detectable, en donde el marcador detectable es un marcador electroquimioluminiscente, siendo el primer reactivo de detección un anticuerpo,
(vi) un segundo agente de direccionamiento, inmovilizado en un segundo dominio de unión, siendo el segundo agente de direccionamiento un oligonucleótido,
(vii) un segundo complemento de agente de direccionamiento, conectado a un segundo agente de unión, en donde el segundo complemento de agente de direccionamiento es un compañero de unión del segundo agente de direccionamiento, siendo el segundo complemento del agente de direccionamiento un oligonucleótido complementario al segundo oligonucleótido de agente de direccionamiento,
(viii) un segundo reactivo de unión conectado a un segundo agente de unión suplementario, en donde el segundo reactivo de unión es un compañero de unión del segundo analito, y
(ix) un segundo reactivo de detección, que se une al segundo analito, el segundo reactivo de detección comprende un marcador detectable, en donde el marcador detectable es un marcador electroquimioluminiscente, siendo el segundo reactivo de detección un anticuerpo, y
(x) opcionalmente, al menos dos copias de un agente de puente,
en donde,
si se omite el agente de puente, (a) el primer y segundo agentes de unión son biotina, y el primer y segundo agentes de unión suplementarios son estreptavidina o avidina; o (b) el primer y segundo agentes de unión son estreptavidina o avidina, y el primer y segundo agentes de unión suplementarios son biotina; o
si se incluye el agente de puente, el agente de puente es estreptavidina o avidina, y el primer y segundo agentes de unión, y el primer y segundo agentes de unión suplementarios, son cada uno biotina;
(b) formando
(i) un primer complejo de unión en el primer dominio de unión, que comprende el primer agente de direccionamiento, el primer complemento de agente de direccionamiento, el primer reactivo de unión, el primer reactivo de detección y el primer analito, y (ii) un segundo complejo de unión en el segundo dominio de unión, que comprende el segundo agente de direccionamiento, el segundo complemento de agente de direccionamiento, el segundo reactivo de unión, el segundo reactivo de detección y el segundo analito, en donde el par de oligonucleótidos complementario colocado en cada uno de los dominios de unión primero y segundo, es diferente, y
(c) medir la cantidad del primer y segundo analitos en el primer y segundo dominios de unión, respectivamente, midiendo la presencia de los marcadores detectables, mediante electroquimioluminiscencia.
En un ejemplo de la realización (1), denominada realización (1 )(a), la muestra contiene uno o más analitos adicionales de interés, y para cada analito adicional de interés, la etapa de combinación comprende, además, combinar, en una o más etapas, un agente de direccionamiento adicional, inmovilizado en un dominio de unión adicional, un complemento de agente de direccionamiento adicional, conectado a un agente de unión, y un reactivo de unión adicional conectado a un agente de unión complementario, y un complejo de unión adicional en el dominio de unión adicional, que comprende el agente de direccionamiento adicional, el complemento de agente de direccionamiento adicional, el reactivo de unión adicional y el analito adicional; la etapa de formación comprende, además, formar un complejo de unión adicional en el dominio de unión adicional, que comprende el agente de direccionamiento adicional, el complemento de agente de direccionamiento adicional, el reactivo de unión adicional y el análisis adicional; y la medición comprende, además, medir la cantidad de analito adicional en el dominio de unión adicional.
En un ejemplo adicional de la realización (1), denominada realización (1)(b), el primer complemento de agente de direccionamiento y el primer reactivo de unión se proporcionan como un primer complejo de direccionamiento previamente unido, que comprende el primer complemento de agente de direccionamiento y el primer reactivo de unión, unido a través de una interacción de unión entre el agente de unión y el agente de unión suplementario; y el segundo complemento de agente de direccionamiento y el segundo reactivo de unión se proporcionan como un segundo complejo de direccionamiento, unido previamente, que comprende el segundo complemento de agente de direccionamiento y el segundo reactivo de unión, unido a través de una interacción de unión entre el agente de unión y el agente de unión suplementario.
Además, en otro ejemplo de la realización (1), denominada realización (1)(c), el primer complejo de direccionamiento se proporciona previamente unido al primer agente de direccionamiento, inmovilizado en el primer dominio de unión; y el segundo complejo de direccionamiento se proporciona previamente unido al segundo agente de direccionamiento, inmovilizado en el segundo dominio de unión. En este ejemplo, la etapa de combinación incluye, además: combinar el primer y segundo complejo de direccionamiento con la muestra, para formar una mezcla de los mismos, unir el primer analito al primer reactivo de unión en el primer complejo de direccionamiento, y unir el segundo analito al segundo reactivo de unión en el segundo complejo de direccionamiento, que pone en contacto una mezcla del primer y segundo complejo de direccionamiento unidos a los primeros y segundos analitos, respectivamente, con los primeros y segundos dominios de unión; y unir el primer complejo de direccionamiento al primer agente de direccionamiento en el primer dominio de unión, y unir el segundo complejo de direccionamiento al segundo agente de direccionamiento en el segundo dominio de unión.
En un ejemplo particular de la realización (1), denominada realización (1 )(d), la etapa de combinación incluye, además, combinar, en un primer volumen de líquido, dicho primer complemento de agente de direccionamiento, dicho primer reactivo de unión y, si se usa, dicho reactivo de puente, y unir dicho primer complemento de agente de direccionamiento y dicho primer reactivo de unión, a través de sus agentes de unión, unidos para formar un primer complejo de direccionamiento; y combinar, en un segundo volumen de líquido, dicho segundo complemento de agente de direccionamiento, dicho segundo reactivo de unión y, si se usa, dicho reactivo de puente, y unir dicho segundo complemento complejo de agente de direccionamiento y dicho segundo reactivo de unión, a través de sus agentes de unión, unidos para formar un segundo complejo de direccionamiento.
En un ejemplo específico de la realización (1), denominada realización (1)(e), la etapa de combinación incluye, además, combinar dichos primer y segundo complejos de direccionamiento, poner en contacto la combinación de dichos primer y segundo complejos de direccionamiento, con dichos primer y segundo dominios de unión, y unir dicho primer complejo de direccionamiento a dicho primer agente de direccionamiento, en dicho primer dominio de unión, y unir dicho segundo complejo de direccionamiento a dicho segundo agente de direccionamiento, en dicho segundo dominio de unión. En este ejemplo, la etapa de combinación incluye: combinar el primer y el segundo complejos de direccionamiento, con la muestra, para formar una mezcla de los mismos, unir el primer analito al primer reactivo de unión en el primer complejo de direccionamiento, y unir el segundo analito al segundo reactivo de unión en el segundo complejo de direccionamiento, poner en contacto una mezcla del primer y segundo complejos de direccionamiento, unidos al primer y segundo analitos, respectivamente, con el primer y segundo dominios de unión; y unir el primer complejo de direccionamiento al primer agente de direccionamiento, en el primer dominio de unión, y unir el segundo complejo de direccionamiento al segundo agente de direccionamiento, en el segundo dominio de unión.
En las realizaciones (1)(c) y (1)(e), los complejos de direccionamiento primero y segundo pueden combinarse con la muestra, antes de poner en contacto el primer y segundo complejos de direccionamiento, con el primer y segundo dominios de unión. Además, en estas realizaciones específicas, los complejos de direccionamiento primero y segundo pueden combinarse con la muestra, después de poner en contacto el primer y segundo complejos de direccionamiento, con el primer y segundo dominio de unión; o los complejos de direccionamiento primero y segundo pueden combinarse con la muestra, y ponerse en contacto con el primer y segundo dominios de unión al mismo tiempo.
En la realización (1 )(d), la etapa de combinación puede incluir, además, las etapas de: poner en contacto dichos primer y segundo complejos de direccionamiento, en dichos primer y segundo dominios de unión, con dicha muestra, unir dicho primer analito al primer reactivo de unión en dicho primer complejo de direccionamiento, y unir dicho segundo analito a dicho segundo reactivo de unión en dicho segundo complejo de direccionamiento.
En las realizaciones (1) y (1 )(a)-(e), el agente de puente puede omitirse, y (a) el agente de unión es biotina, y el agente de unión suplementario es estreptavidina o avidina; o (b) el agente de unión es estreptavidina o avidina, y el agente de unión suplementario es biotina.
Alternativa o adicionalmente, en las realizaciones (1) y (1)(a)-(e), el agente de puente puede incluirse, el agente de puente puede ser estreptavidina o avidina, y los agentes de unión y los agentes de unión complementarios, pueden comprender cada uno biotina.
El primer y segundo reactivos de unión referenciados en las realizaciones (1) y (1 )(a)-(e), cada uno puede comprender un receptor, ligando, anticuerpo, hapteno, antígeno, epítopo, mimítopo, aptámero, o un intercalador capaz de unirse a dichos primer y segundo analitos, respectivamente. Por ejemplo, el primer y segundo reactivos de unión son antígenos. Alternativa o adicionalmente, el primer y segundo reactivos de unión son anticuerpos.
En las realizaciones (1) y (1 )(a)-(e), el método puede incluir realizar un ensayo de unión de tipo sándwich.
En un ejemplo específico de las realizaciones (1) y (1 )(a)-(e), los componentes combinados en la etapa de combinación comprenden, además, un primer reactivo de detección que se une al primer analito, y un segundo reactivo de detección que se une al segundo analito, y el primer y segundo complejos formados en la segunda etapa comprenden, además, los reactivos de detección primero y segundo, respectivamente. Por ejemplo, el primer y segundo reactivos de detección comprenden, cada uno, un marcador detectable. En otro ejemplo de esta realización, el primer y segundo reactivos de unión y el primer y segundo reactivos de detección son anticuerpos. Además, el primer y segundo reactivos de detección pueden unirse al primer o segundo analito y, opcionalmente, el primer y segundo reactivos de detección comprenden, cada uno, un marcador detectable. En un ejemplo específico, el primer y segundo reactivos de unión son antígenos, los analitos son anticuerpos contra los antígenos, y los reactivos de detección comprenden anticuerpos anti-inmunoglobulina, proteína A, proteína G o proteína L.
El método de las realizaciones (1) y (1 )(a)-(e), puede incluir realizar un ensayo de unión competitiva.
Aún más, los componentes combinados en las realizaciones (1) y (1)(a)-(e), pueden comprender, además, un primer reactivo de detección que compite con el primer analito, para unirse al primer reactivo de unión, y un segundo reactivo de detección que compite con el segundo analito, para unirse al segundo reactivo de unión.
En las realizaciones (1) y (1)(a)-(e), se incluyen uno o más de los siguientes elementos adicionales del método: el primer y segundo reactivos de detección pueden comprender marcadores detectables; el primer y segundo reactivos de unión son anticuerpos, y el primer y segundo reactivos de detección son análogos estructurales de los analitos; la etapa de medición comprende medir la presencia del primer y segundo marcadores detectables, mediante electroquimioluminiscencia; el primer y segundo marcador detectable es un marcador electroquimioluminiscente, y la etapa de medición comprende, además, medir una señal electroquimioluminiscente y correlacionar la señal con una cantidad de primer y segundo analito en la muestra; los dominios de unión primero y segundo están posicionados en un electrodo, y la etapa de medición comprende, además, aplicar una forma de onda de tensión al electrodo, para generar electroquimioluminiscencia; cada uno de los dominios de unión primero y segundo, es un elemento de una matriz de dominios de unión y, opcionalmente, la matriz se ubica dentro de un pocillo de una placa de múltiples pocillos; cada uno de los dominios de unión primero y segundo, se coloca cada uno en una superficie de una o más micropartículas y, opcionalmente, las partículas se codifican para permitir la identificación de partículas específicas y la discriminación entre el primer y segundo dominios de unión.
Realización (1)(f): incluye los elementos de la realización (1) y una o más características adicionales de las realizaciones (1)(a)-(e), en donde el primer agente de direccionamiento y el primer complemento de agente de direccionamiento, y el segundo agente de direccionamiento y el segundo complemento de agente de direccionamiento, comprenden cada uno un par de oligonucleótidos complementarios. En este ejemplo específico, el primer y segundo reactivos de unión pueden ser anticuerpos. Además, en este ejemplo específico, el par de oligonucleótidos complementarios, colocado en cada uno de los dominios de unión primero y segundo, es diferente, y se selecciona de:
Figure imgf000005_0001
Realización (1)(g): incluye los elementos de la realización (1) y una o más características adicionales de las realizaciones (1)(a)-(e), en donde el primer agente de direccionamiento y el primer complemento de agente de direccionamiento, y el segundo agente de direccionamiento y el segundo complemento de agente de direccionamiento, comprenden cada uno un par de oligonucleótidos complementario. En este ejemplo específico, el primer y segundo reactivos de unión pueden ser anticuerpos. Además, en este ejemplo específico, el par de oligonucleótidos complementarios, colocado en cada uno de los dominios de unión primero y segundo, es diferente, y se selecciona de:
Figure imgf000006_0001
En las realizaciones (1)(f) y/o (1)(g), hay al menos 7 dominios de unión, o al menos 10 dominios de unión; o al menos 16 dominios de unión; o al menos 25 dominios de unión.
En las realizaciones (1) y (1 )(a), cada uno del primer y segundo agentes de direccionamiento complementarios, puede unirse selectivamente a uno de los dominios de unión primero y segundo, respectivamente. Por ejemplo, la reactividad cruzada para la unión del agente de direccionamiento complementario, a otros dominios de unión, es inferior al 5 % de la unión al uno de los dominios de unión; o la reactividad cruzada para la unión de cada primer y segundo agente de direccionamiento complementario, a un tercer dominio de unión, es inferior al 1 % de la unión al uno de los dominios de unión; o la reactividad cruzada para la unión de cada primer y segundo agente de direccionamiento complementario, a un tercer dominio de unión, es inferior al 0,5 % de la unión al uno de los dominios de unión; o la reactividad cruzada para la unión de cada primer y segundo agente de direccionamiento complementario, a un tercer dominio de unión, es inferior al 0,1 % de la unión al uno de los dominios de unión.
En las modalidades (1) y (1)(a), el primer y segundo reactivos de unión pueden unirse cada uno a diferentes analitos de interés; o el primer y segundo reactivos de unión son, cada uno, preferentemente selectivos para un analito diferente de interés.
El primer y segundo reactivos de unión de una cualquiera de las realizaciones anteriores, pueden diferir en la afinidad y/o selectividad para diferentes analitos de interés, por ejemplo, la reactividad cruzada del primer analito al segundo reactivo de unión, es menor del 5 % de la unión al primer reactivo de unión, o la reactividad cruzada del primer analito al segundo reactivo de unión, es menor del 1 % de la unión al primer reactivo de unión, o la reactividad cruzada del primer analito al segundo reactivo de unión, es menor del 0,5 % de la unión al primer reactivo de unión, o la reactividad cruzada del primer analito al segundo reactivo de unión, es menor del 0,1 % de la unión al primer reactivo de unión, o la reactividad cruzada observada de un analito de interés para reactivos de unión no específicos, es menor del 5 % de la unión al reactivo de unión seleccionado para la unión a ese analito, o la reactividad cruzada observada de un analito de interés para los reactivos de unión no específicos, es menor del 1 % de la unión al reactivo de unión seleccionado para la unión a ese analito, o la reactividad cruzada observada de un analito de interés para los reactivos de unión no específicos, es inferior al 0,5 % de la unión al reactivo de unión seleccionado para la unión a ese analito, o la reactividad cruzada observada de un analito de interés para reactivos de unión no específicos, es inferior al 0,1 % de la unión al reactivo de unión seleccionado para unirse a dicho analito. Además, en este ejemplo específico de las realizaciones anteriores, la reactividad cruzada del primer analito con un reactivo de unión ubicado en el segundo dominio de unión, es inferior al 5 % de la unión con un reactivo de unión ubicado en el primer dominio de unión, o la reactividad cruzada del primer analito con un reactivo de unión ubicado en el segundo dominio de unión, es inferior al 1 % de la unión con un reactivo de unión ubicado en el primer dominio de unión, o la reactividad cruzada del primer analito con un reactivo de unión ubicado en el segundo dominio de unión, es inferior al 0,5 % de la unión a un reactivo de unión situado en el primer dominio de unión, o la reactividad cruzada del primer analito con un reactivo de unión situado en el segundo dominio de unión, es inferior al 0,1 % de la unión a un reactivo de unión ubicado en el primer dominio de unión, o la reactividad cruzada observada de un analito de interés para los reactivos de unión ubicados en un dominio de unión no específico, es inferior al 5 % de la unión a los reactivos de unión en el dominio de unión asignado a ese analito, o la reactividad cruzada observada de un analito de interés para los reactivos de unión ubicados en un dominio de unión no específico, es inferior al 1 % de la unión a los reactivos de unión en el dominio de unión asignado a ese analito, o la reactividad cruzada observada de un analito de interés para los reactivos de unión ubicados en un dominio de unión no específico, es inferior al 0,5 % de la unión a los reactivos de unión en el dominio de unión asignado a ese analito, o la observada la reactividad cruzada de un analito de interés para los reactivos de unión ubicados en un dominio de unión no específico, es inferior al 0,1 % de la unión a los reactivos de unión en el dominio de unión asignado a ese analito.
En las realizaciones (1) y (1)(a), los agentes de direccionamiento primero y segundo, y los complementos de agentes de direccionamiento primero y segundo, respectivamente, se pueden usar para mapear un conjunto de reactivos de unión, a un conjunto de dominios de unión y cada uno de los dominios de unión. los reactivos del conjunto se unen a un analito de interés diferente. Por ejemplo, cada uno de los reactivos de unión en el conjunto es preferentemente selectivo para un analito diferente de interés, o cada uno de los reactivos de unión en el conjunto difiere en la afinidad y/o selectividad para diferentes analitos de interés.
Realización (16): un método para realizar un ensayo de unión para una pluralidad de analitos, que comprende: (a) poner en contacto una muestra con dos o más dominios de unión, unidos a al menos un primer y segundo reactivo de unión que se unen a un primer y segundo analito, respectivamente, de la pluralidad de analitos, para formar complejos que comprenden el primer analito unido al primer reactivo de unión y el segundo analito unido al segundo reactivo de unión, en donde (x) el primer dominio de unión comprende un primer complejo de reactivo de unión, que comprende (i) un primer agente de direccionamiento, unido al primer dominio de unión y a un primer complemento de agente de direccionamiento; y (ii) el primer reactivo de unión unido al primer complemento de agente de direccionamiento, a través de un complejo de unión; e (y) el segundo dominio de unión comprende un segundo complejo de reactivo de unión, que comprende (i) un segundo agente de direccionamiento, unido al segundo dominio de unión y a un segundo complemento de agente de direccionamiento; y (ii) el segundo reactivo de unión, unido al segundo complemento de agente de direccionamiento, a través de un complejo de unión;
(b) poner en contacto el primer y segundo complejos de reactivos de unión, con una pluralidad de reactivos de detección, que comprenden un primer reactivo de detección que se une al primer analito o un complejo que comprende el primer analito, y un segundo reactivo de detección que se une al segundo analito o un complejo que comprende el segundo analito; y (c) medir la cantidad del primer y segundo analitos unidos a los dos o más dominios de unión.
En la realización (16), se puede adoptar una o más de las siguientes características: el primer y segundo reactivos de unión comprenden cada uno un receptor, ligando, anticuerpo, hapteno, antígeno, epítopo, mimítopo, aptámero, o un intercalador capaz de unirse al primer y segundo analito, respectivamente, por ejemplo, el primer y segundo reactivos de unión comprenden cada uno un anticuerpo capaz de unirse al primer y segundo analito, respectivamente; el primer agente de direccionamiento y el primer complemento de agente de direccionamiento comprenden un oligonucleótido y un oligonucleótido complementario, respectivamente; el segundo agente de direccionamiento y el segundo complemento de agente de direccionamiento comprenden un oligonucleótido y un oligonucleótido complementario, respectivamente; el complejo de unión comprende un agente de unión y un agente de unión suplementario, conectado al mismo, por ejemplo, el complejo de unión que se forma por una interacción de unión entre (a) el agente de unión, es biotina, y el agente de unión suplementario es estreptavidina o avidina; o (b) el agente de unión es estreptavidina o avidina, y el agente de unión suplementario es biotina.
Además, la realización (16) incluye una o más de las siguientes características: cada uno de la pluralidad de reactivos de detección comprende un marcador detectable; un subconjunto de la pluralidad de reactivos de detección comprende un marcador detectable; la etapa de medición comprende medir la presencia del marcador detectable en la muestra, mediante electroquimioluminiscencia; el marcador detectable es un marcador electroquimioluminiscente, y la etapa de medición comprende medir una señal electroquimioluminiscente y correlacionar la señal con una cantidad de analito en la muestra, por ejemplo, los dos o más dominios de unión están posicionados en un electrodo, y la etapa de medición comprende, además, aplicar una forma de onda de tensión al electrodo, para generar electroquimioluminiscencia y, opcionalmente, los dos o más dominios de unión están ubicados dentro de uno o más pocillos de una placa de múltiples pocillos.
La realización (16) puede incluir realizar un inmunoensayo de tipo sándwich, o un inmunoensayo competitivo.
En la realización (16), el primer agente de direccionamiento y el primer complemento de agente de direccionamiento pueden comprender un par de oligonucleótidos, en donde el par se selecciona de:
Figure imgf000007_0001
Figure imgf000008_0003
Además, en la realización (16), el primer agente de direccionamiento y el primer complemento de agente de direccionamiento pueden comprender un par de oligonucleótidos, en donde el par se selecciona de:
Figure imgf000008_0001
En un ejemplo de la realización (16), el segundo agente de direccionamiento y el segundo complemento de agente de direccionamiento pueden incluir un par de oligonucleótidos, en donde el par se selecciona de:
Figure imgf000008_0002
Figure imgf000009_0002
En un ejemplo adicional de la realización (16), el segundo agente de direccionamiento y el segundo complemento de agente de direccionamiento pueden incluir un par de oligonucleótidos, en donde el par se selecciona de:
Figure imgf000009_0001
La realización (16) puede incluir uno o más de los siguientes elementos: el primer agente de direccionamiento y el primer complemento de agente de direccionamiento comprenden un primer oligonucleótido y un primer oligonucleótido complementario, respectivamente, y el primer oligonucleótido y el primer oligonucleótido complementario comprenden, cada uno, de aproximadamente 10 a 50 bases; el primer agente de direccionamiento y el primer complemento de agente de direccionamiento comprenden un primer oligonucleótido y un primer oligonucleótido complementario, respectivamente, y el primer oligonucleótido y el primer oligonucleótido complementario comprenden, cada uno, de aproximadamente 10 a 25 bases; el primer reactivo de unión es un anticuerpo que comprende una molécula de biotina, y el primer agente de direccionamiento es un primer oligonucleótido que comprende una molécula de estreptavidina, y el complejo de unión está formado por una reacción entre la biotina y las moléculas de estreptavidina; y/o el segundo reactivo de unión es un anticuerpo que comprende una molécula de biotina adicional, y el segundo agente de direccionamiento es un segundo oligonucleótido que comprende una molécula de estreptavidina adicional, y el complejo de unión está formado por una reacción entre la biotina adicional y las moléculas de estreptavidina adicionales.
Realización (17): un método para realizar un ensayo de unión para una pluralidad de analitos, que comprende: (a) formar un primer complejo de reactivo de unión, que comprende un primer reactivo de unión específico para un primer analito en la pluralidad de analitos y un primer agente de direccionamiento, en donde el primer reactivo de unión está unido a un agente de unión, y el primer agente de direccionamiento está unido a un agente de unión suplementario, en donde el primer complejo de reactivo de unión está formado por una reacción entre el agente de unión y el agente de unión suplementario; (b) formar un segundo complejo de reactivo de unión, que comprende un segundo reactivo de unión específico para un segundo analito en la pluralidad de analitos y un segundo agente de direccionamiento, en donde el segundo reactivo de unión está unido a un segundo agente de unión, y el segundo agente de direccionamiento está unido a un segundo complemento de agente de unión, en donde el segundo complejo de reactivo de unión está formado por una reacción entre el segundo agente de unión y el segundo complemento de agente de unión; (c) mezclar el primer y segundo complejos de reactivos de unión, con dos o más dominios de unión, cada uno unido a un primer complemento de agente de direccionamiento y un segundo complemento de agente de direccionamiento, respectivamente, en condiciones suficientes para unir el primer agente de direccionamiento, al primer complemento de agente de direccionamiento, y el segundo agente de direccionamiento, al segundo complemento de agente de direccionamiento; (d) mezclar una muestra que comprende la pluralidad de analitos a la mezcla formada en la etapa (c); (e) añadir una pluralidad de reactivos de unión adicionales a la mezcla formada en la etapa (d), en donde la pluralidad de reactivos de unión adicionales incluye (i) un primer reactivo de detección específico para el primer analito y/o un primer complejo de reactivo de unión; y (ii) un segundo reactivo de detección específico para el segundo analito y/o un segundo complejo de reactivo de unión; y (f) medir la cantidad del primer y segundo analitos unidos a los dominios de unión.
La realización (17) puede incluir una o más de las siguientes características: el primer y segundo reactivos de unión comprenden cada uno un receptor, ligando, anticuerpo, hapteno, antígeno, epítopo, mimítopo, aptámero, o un intercalador capaz de unirse al primer y segundo analitos, respectivamente, por ejemplo, el primer y segundo reactivos de unión comprenden cada uno un anticuerpo capaz de unirse al primer y segundo analito, respectivamente; el primer agente de direccionamiento y el primer complemento de agente de direccionamiento comprenden un oligonucleótido y un oligonucleótido complementario; el segundo agente de direccionamiento y el segundo complemento de agente de direccionamiento comprenden un oligonucleótido y un oligonucleótido complementario; el complejo de unión comprende un agente de unión y un agente de unión suplementario conectado al mismo; (a) el agente de unión es biotina, y el agente de unión suplementario es estreptavidina o avidina; o (b) el agente de unión es estreptavidina o avidina, y el agente de unión suplementario es biotina.
Además, la realización (17) incluye una o más de las siguientes características: cada uno de la pluralidad de reactivos de detección comprende un marcador detectable, por ejemplo, un subconjunto de la pluralidad de reactivos de detección comprende un marcador detectable; la etapa de medición comprende medir la presencia del marcador detectable en la muestra, mediante electroquimioluminiscencia; el marcador detectable es un marcador electroquimioluminiscente, y la etapa de medición comprende medir una señal electroquimioluminiscente y correlacionar la señal con una cantidad de analito en la muestra; los dos o más dominios de unión están posicionados en un electrodo, y la etapa de medición comprende, además, aplicar una forma de onda de tensión al electrodo, para generar electroquimioluminiscencia, por ejemplo, los dos o más dominios de unión están ubicados dentro de uno o más pocillos de una placa de múltiples pocillos.
La realización (17) puede comprender realizar un inmunoensayo de tipo sándwich, o un inmunoensayo competitivo.
En la realización (17), el primer agente de direccionamiento y el primer complemento de agente de direccionamiento comprenden un par de oligonucleótidos, en el que el par se selecciona de:
Figure imgf000010_0001
Figure imgf000011_0002
En un ejemplo específico de la realización (17), el primer agente de direccionamiento y el primer complemento de agente de direccionamiento comprenden un par de oligonucleótidos, en donde el par se selecciona de:
Figure imgf000011_0001
En un ejemplo adicional de la realización (17), el segundo agente de direccionamiento y el segundo complemento de agente de direccionamiento comprenden un par de oligonucleótidos, en donde el par se selecciona de:
Figure imgf000011_0003
Figure imgf000012_0002
En otro ejemplo adicional de la realización (17), el segundo agente de direccionamiento y el segundo complemento de agente de direccionamiento comprenden un par de oligonucleótidos, en donde el par se selecciona de:
Figure imgf000012_0001
La realización (17) puede incluir uno o más de los siguientes elementos: el primer agente de direccionamiento y el primer complemento de agente de direccionamiento comprenden un primer oligonucleótido y un primer oligonucleótido complementario, respectivamente, y el primer oligonucleótido y el primer oligonucleótido complementario comprenden, cada uno, de aproximadamente 10 a 50 bases; el primer agente de direccionamiento y el primer complemento de agente de direccionamiento comprenden un primer oligonucleótido y un primer oligonucleótido complementario, respectivamente, y el primer oligonucleótido y el primer oligonucleótido complementario comprenden, cada uno, de aproximadamente 10 a 25 bases; el primer reactivo de unión es un anticuerpo que comprende una molécula de biotina, y el primer agente de direccionamiento comprende un primer oligonucleótido que incluye una molécula de estreptavidina, y el complejo de unión está formado por una reacción entre la biotina y las moléculas de estreptavidina; el segundo reactivo de unión es un anticuerpo que comprende una molécula de biotina adicional, y el segundo agente de direccionamiento comprende un segundo oligonucleótido que incluye una molécula de estreptavidina adicional, y el complejo de unión está formado por una reacción entre la biotina adicional y las moléculas de estreptavidina adicional; el segundo agente de direccionamiento y el segundo complemento de agente de direccionamiento comprenden un segundo oligonucleótido y un segundo oligonucleótido complementario, respectivamente, y el segundo oligonucleótido y el segundo oligonucleótido complementario comprenden, cada uno, de aproximadamente de 10 a 50 bases; el segundo agente de direccionamiento y el segundo complemento de agente de direccionamiento comprenden un segundo oligonucleótido y un segundo oligonucleótido complementario, respectivamente, y el segundo oligonucleótido y el segundo oligonucleótido complementario comprenden, cada uno, de aproximadamente 10 a 25 bases; el segundo reactivo de unión es un anticuerpo que comprende una molécula de biotina, y el segundo agente de direccionamiento comprende un segundo oligonucleótido que incluye una molécula de estreptavidina, y el complejo de unión está formado por una reacción entre la biotina y las moléculas de estreptavidina; y/o el método comprende, además, la etapa de lavar la mezcla formada en la etapa (c), antes de la etapa (d) de mezclado.
Realización (18): un método para realizar un ensayo de unión para una pluralidad de analitos en una muestra, que comprende: (a) formar un primer complejo de reactivo de unión, que comprende un primer reactivo de unión específico para un primer analito en la pluralidad de analitos y un primer agente de direccionamiento, en donde el primer reactivo de unión está unido a un agente de unión, y el primer agente de direccionamiento está unido a un agente de unión suplementario, en donde el primer complejo de reactivo de unión está formado por una reacción entre el agente de unión y el agente de unión suplementario; (b) formar un segundo complejo de reactivo de unión, que comprende un segundo reactivo de unión específico para un segundo analito en la pluralidad de analitos y un segundo agente de direccionamiento, en donde el segundo reactivo de unión está unido a un segundo agente de unión y el segundo agente de direccionamiento está unido a un segundo complemento de agente de unión, en donde el segundo complejo de reactivo de unión está formado por una reacción entre el segundo agente de unión y el segundo complemento de agente de unión; (c) mezclar el primer y segundo complejos de reactivos de unión y la muestra, con dos o más dominios de unión, cada uno unido a un primer complemento de agente de direccionamiento y un segundo complemento de agente de direccionamiento, respectivamente, en condiciones suficientes para unir el primer agente de direccionamiento, al primer complemento de agente de direccionamiento, y el segundo agente de direccionamiento, al segundo complemento de agente de direccionamiento; (d) añadir una pluralidad de reactivos de unión adicionales a la mezcla formada en la etapa (c), en donde la pluralidad de reactivos de unión adicionales incluye (i) un primer reactivo de detección específico para el primer analito y/o un primer complejo de reactivo de unión; y (ii) un segundo reactivo de detección específico para el segundo analito y/o un segundo complejo de reactivo de unión; y (e) medir la cantidad del primer y segundo analitos unidos a los dominios de unión.
Además, la realización (18) puede incluir uno o más de los siguientes: el primer y segundo reactivos de unión comprenden cada uno un receptor, ligando, anticuerpo, hapteno, antígeno, epítopo, mimítopo, aptámero, o un intercalador capaz de unirse a los analitos primero y segundo, respectivamente; un primer y segundo reactivos de unión comprenden cada uno un anticuerpo capaz de unirse al primer y segundo analito, respectivamente; el primer agente de direccionamiento y el primer complemento de agente de direccionamiento comprenden un oligonucleótido y un oligonucleótido complementario; el segundo agente de direccionamiento y el segundo complemento de agente de direccionamiento comprenden un oligonucleótido y un oligonucleótido complementario; el complejo de unión comprende un agente de unión y un agente de unión suplementario conectado al mismo, por ejemplo, (a) el agente de unión es biotina, y el agente de unión suplementario es estreptavidina o avidina; o (b) el agente de unión es estreptavidina o avidina, y el agente de unión suplementario es biotina.
Aún más, la realización (18) incluye uno o más de los siguientes elementos: cada uno de la pluralidad de reactivos de detección comprende un marcador detectable; la pluralidad de reactivos de detección comprende un marcador detectable; la etapa de medición comprende medir la presencia del marcador detectable en la muestra, mediante electroquimioluminiscencia; el marcador detectable es un marcador electroquimioluminiscente, y la etapa de medición comprende medir una señal electroquimioluminiscente y correlacionar la señal con una cantidad de analito en la muestra; los dos o más dominios de unión están posicionados en un electrodo, y la etapa de medición comprende, además, aplicar una forma de onda de tensión al electrodo, para generar electroquimioluminiscencia; y/o los dos o más dominios de unión están ubicados dentro de uno o más pocillos de una placa de múltiples pocillos.
La realización (18) puede incluir realizar un inmunoensayo de tipo sándwich, o un inmunoensayo competitivo.
En un ejemplo específico de la realización (18), el primer agente de direccionamiento y el primer complemento de agente de direccionamiento comprenden un par de oligonucleótidos, en donde el par se selecciona de:
Figure imgf000013_0001
En otro ejemplo de la realización (18), el primer agente de direccionamiento y el primer complemento de agente de direccionamiento comprenden un par de oligonucleótidos, en donde el par se selecciona de:
Figure imgf000014_0001
En otro ejemplo más de la realización (18), el segundo agente de direccionamiento y el segundo complemento de agente de direccionamiento comprenden un par de oligonucleótidos, en donde el par se selecciona de:
Figure imgf000014_0002
En un ejemplo adicional de la realización (18), el segundo agente de direccionamiento y el segundo complemento de agente de direccionamiento comprenden un par de oligonucleótidos, en donde el par se selecciona de:
[Par ¡Secuencia “[PaT ¡Secuencia
Figure imgf000015_0001
La realización (18) puede incluir una o más de las siguientes características: el primer agente de direccionamiento y el primer complemento de agente de direccionamiento comprenden un primer oligonucleótido y un primer oligonucleótido complementario, respectivamente, y el primer oligonucleótido y el primer oligonucleótido complementario comprenden, cada uno, de aproximadamente 10 a 50 bases; el primer agente de direccionamiento y el primer complemento de agente de direccionamiento comprenden un primer oligonucleótido y un primer oligonucleótido complementario, respectivamente, y el primer oligonucleótido y el primer oligonucleótido complementario comprenden, cada uno, de aproximadamente 10 a 25 bases; el primer reactivo de unión es un anticuerpo que comprende una molécula de biotina, y el primer agente de direccionamiento comprende un primer oligonucleótido que incluye una molécula de estreptavidina, y el complejo de unión está formado por una reacción entre la biotina y las moléculas de estreptavidina; el segundo reactivo de unión es un anticuerpo que comprende una molécula de biotina adicional, y el segundo agente de direccionamiento comprende un segundo oligonucleótido que incluye una molécula de estreptavidina adicional, y el complejo de unión está formado por una reacción entre la biotina adicional y las moléculas de estreptavidina adicional; el segundo agente de direccionamiento y el segundo complemento de agente de direccionamiento comprenden un segundo oligonucleótido y un segundo oligonucleótido complementario, respectivamente, y el segundo oligonucleótido y el segundo oligonucleótido complementario comprenden, cada uno, de aproximadamente de 10 a 50 bases; el segundo agente de direccionamiento y el segundo complemento de agente de direccionamiento comprenden un segundo oligonucleótido y un segundo oligonucleótido complementario, respectivamente, y el segundo oligonucleótido y el segundo oligonucleótido complementario comprenden, cada uno, de aproximadamente 10 a 25 bases; el segundo reactivo de unión es un anticuerpo que comprende una molécula de biotina, y el segundo agente de direccionamiento comprende un segundo oligonucleótido que incluye una molécula de estreptavidina, y el complejo de unión está formado por una reacción entre la biotina y las moléculas de estreptavidina; y/o el método comprende, además, la etapa de lavar la mezcla formada en la etapa (c), antes de la etapa (d) de mezclado.
En un ejemplo específico de una cualquiera de las realizaciones anteriores, el número de pares de reactivos de unión en el conjunto es equivalente al número de dominios de unión en la matriz, o el número de pares de reactivos de unión en el conjunto es menor que el número de dominios de unión en la matriz.
Breve descripción de los dibujos
Los dibujos adjuntos se proporcionan para ilustrar, en lugar de limitar, el alcance de la invención.
Las Figuras 1 (a)-(d) ilustran un formato de ensayo que comprende la conjugación directa de reactivos de unión, A', B’ y C', con una pluralidad de dominios de unión, X, Y y Z, respectivamente, a través de reacciones entre agentes de direccionamiento, A” , B” y C” , y complementos de agentes de direccionamiento, A™, B” ’ y C™ respectivamente. Los agentes de direccionamiento están unidos a los reactivos de unión, A', B' y C', en una serie de dominios de unión, X, Y y Z, para formar complejos de reactivos de unión, Arc, Brc y Crc, respectivamente [panel (b)], que reaccionan con los analitos A, B y C, respectivamente. La presencia de analitos A, B y C en el soporte sólido, se detecta mediante la adición de reactivos de detección marcados, A*, B* y C*, que reaccionan con analitos, A, B y C, respectivamente [panel (c)]. La Figura 1 (d) es una vista ampliada de los complejos de reactivo de unión formados en los dominios de unión X, Y y Z, los complejos de reactivos de unión Arc, Brc y Crc, respectivamente.
Las Figuras 2(a)-(d) ilustran un formato de ensayo que comprende la conjugación directa de reactivos de unión, por ejemplo, anticuerpos, A', B' y C', a una pluralidad de dominios de unión, X, Y y Z, respectivamente, a través de reacciones entre agentes de direccionamiento de oligonucleótidos, A” , B” y C” , y complementos de agentes de direccionamiento de oligonucleótidos, A", B" y C", respectivamente. Los agentes de direccionamiento de oligonucleótidos están unidos a reactivos de unión, A', B' y C', en una serie de dominios de unión, X, Y y Z, para formar complejos de reactivos de unión, Arc, Brc y Crc, respectivamente [panel (b)], que reaccionan con los analitos A, B y C, respectivamente. La presencia de analitos A, B y C en el soporte sólido, se detecta mediante la adición de reactivos de detección marcados, A*, B* y C*, que reaccionan con analitos, A, B y C, respectivamente [panel (c)]. La Figura 2(d) es una vista ampliada de los complejos de reactivo de unión formados en los dominios de unión X, Y y Z, los complejos de reactivos de unión Arc, Brc y Crc, respectivamente.
Las Figuras 3(a)-(e) ilustran un formato de ensayo que implica la conjugación de una pluralidad de reactivos de unión, A', B' y C', con una pluralidad de dominios de unión, X, Y y Z, respectivamente, a través de una serie de complejos de unión. Tal como se muestra en el panel (a), los reactivos de unión A', B', y C’ están unidos a agentes de unión, La, Lb, y Lc, mientras que los agentes de direccionamiento A” , B” y C” están unidos a agentes de unión complementarios, La', Lb', y Lc', respectivamente. Los reactivos de unión A', B’ y C’ se mezclan con agentes de direccionamiento para formar complejos de reactivos de unión, Arc, Brc y Crc, respectivamente. Los complejos de reactivos de unión formados en el panel (a) se mezclan con una pluralidad de dominios de unión, X, Y y Z, a los que se unen los complementos de agentes de direccionamiento, A", B" y C" [panel (b)], para adherir los complejos de reactivo de unión a los dominios de unión [véase el panel (c)]. Se añade una muestra que comprende analitos A, B y C, a la mezcla, y simultánea o secuencialmente, un conjunto de reactivos de detección, A*, B* y C*, también se añaden, para detectar analitos unidos a los dominios de unión. La Figura 3(e) es una vista ampliada de los complejos de reactivo de unión formados en los dominios de unión X, Y y Z, los complejos de reactivos de unión Arc, Brc y Crc, respectivamente.
Las Figuras 4(a)-(e) ilustran un formato de ensayo que implica la conjugación de una pluralidad de reactivos de unión, A', B' y C', con una pluralidad de dominios de unión, X, Y y Z, respectivamente, a través de una serie de complejos de unión. Tal como se muestra en el panel (a), los reactivos de unión A', B', y C’ están unidos a agentes de unión, La, Lb, y Lc, mientras que los agentes de direccionamiento A” , B” y C” están unidos a agentes de unión complementarios, La', Lb', y Lc’, respectivamente. Los reactivos de unión A', B’ y C’, se mezclan con agentes de direccionamiento de oligonucleótidos, para formar complejos de reactivos de unión, Arc, Brc y Crc, respectivamente. Los complejos de reactivo de unión formados en el panel (a) se mezclan con una pluralidad de dominios de unión, X, Y y Z, a los que se unen los complementos de agente de direccionamiento de oligonucleótidos, A", B" y C" [panel (b)], para adherir los complejos de reactivo de unión a los dominios de unión [véase el panel (c)]. Se añade una muestra que comprende analitos A, B y C, a la mezcla, y simultánea o secuencialmente, un conjunto de reactivos de detección, A*, B* y C*, también se añaden para detectar analitos unidos a los dominios de unión. La Figura 4(e) es una vista ampliada de los complejos de reactivo de unión formados en los dominios de unión X, Y y Z, los complejos de reactivos de unión Arc, Brc y Crc, respectivamente.
Las Figuras 5(a)-(d) ilustran diversas combinaciones de reactivos que pueden usarse en el formato de ensayo de la invención. En la Figura 5(a), todos los reactivos se mezclan con la muestra en una sola etapa, mientras que en la Figura 5(b), todos los reactivos se mezclan, y luego se añaden a la superficie, y en 5(c), los reactivos de unión modificados y los complementos de agentes de direccionamiento modificados, se mezclan, se añaden a una superficie que porta una pluralidad de dominios de unión, incluyendo cada uno un agente de direccionamiento, y la mezcla de superficie se mezcla con la muestra y los reactivos de detección, en una etapa o dos [una adición de etapa de reactivos de muestra y detección se muestra en la Figura 5(c), y la adición secuencial de reactivos de muestra y detección se muestra en la Figura 5(d)].
Las Figuras 6(a)-(f) muestran diversas superficies modificadas, por ejemplo, partículas y sustratos que portan una pluralidad de dominios de unión que pueden usarse en el formato de ensayo de la invención.
La Figura 7 muestra un procedimiento para modificar químicamente un anticuerpo con sulfo-SMCC, para producir un anticuerpo activado por maleimida, que puede conjugarse con un oligonucleótido a través de un grupo tiol en el oligonucleótido.
Las Figuras 8(a)-(g) muestran los resultados de un formato de ensayo directo en un panel de quimiocinas de 7 plex y un panel TH1/TH2 de 10 plex.
Las Figuras 9(a)-(c) muestran un procedimiento para la producción y el uso de una placa de ensayo de múltiples pocillos, en un formato de ensayo indirecto, usando anticuerpos de captura biotinilados con oligonucleótido modificado con moléculas de estreptavidina.
Las Figuras 10(a)-(c) muestran un procedimiento para la producción y el uso de una placa de ensayo de múltiples pocillos, en un formato de ensayo indirecto, usando anticuerpos de captura biotinilados, estreptavidina pura y oligonucleótidos biotinilados.
Las Figuras 11(a)-(g) muestran una comparación de valores de LOD para tres formatos diferentes de ensayo, mediados por oligonucleótidos, para un panel de citocina B.
Descripción detallada de la invención
A menos que se defina lo contrario en el presente documento, los términos científicos y técnicos usados en relación con la presente invención tendrán los significados que comúnmente entienden los expertos en la técnica. Además, a menos que requiera lo contrario por el contexto, los términos en singular incluirán pluralidades y los términos en singular incluirán el singular. Los artículos “un” y “una” se usan en el presente documento para referirse a uno o más de uno (es decir, a al menos uno) del objeto gramatical del artículo. A modo de ejemplo, “un elemento” significa un elemento o más de un elemento.
La presente descripción describe formatos flexibles de ensayo de unión en fase sólida, que permiten a un usuario o fabricante configurar un ensayo basado en requisitos de usuario específicos. Los métodos descritos en el presente documento proporcionan una plataforma flexible para crear un ensayo de unión multiplexado para una pluralidad de analitos diana. Con un soporte que incluye una pluralidad de dominios de unión que portan una serie de complementos de agente de direccionamiento genéricos, es posible configurar un ensayo multiplexado para cualquier conjunto de analitos. Sólo se necesita seleccionar qué analitos se evaluarán en qué dominio de unión y par, los reactivos de unión apropiados y los agentes de direccionamiento con cada dominio de unión seleccionado. Usando esta plataforma, un usuario puede construir un panel de ensayo personalizado.
Tales formatos de ensayo multiplexados flexibles se pueden lograr usando los métodos y productos descritos en la presente memoria. Por ejemplo, un método de la invención, para realizar un ensayo de unión multiplexado para una pluralidad de analitos de interés, puede implementarse usando las siguientes etapas:
(a) combinar, en una o más etapas, los siguientes componentes:
(i) una muestra que comprende un primer analito de interés y un segundo analito de interés,
(ii) un primer agente de direccionamiento, inmovilizado en un primer dominio de unión, siendo el primer agente de direccionamiento un oligonucleótido,
(iii) un primer complemento de agente de direccionamiento, conectado a un primer agente de unión, en donde el primer complemento de agente de direccionamiento es un compañero de unión del primer agente de direccionamiento, siendo el primer complemento del agente de direccionamiento un oligonucleótido complementario al primer oligonucleótido de agente de direccionamiento,
(iv) un primer reactivo de unión conectado a un primer agente de unión suplementario, en donde el primer reactivo de unión es un compañero de unión del primer analito,
(v) un primer reactivo de detección que se une al primer analito, comprendiendo el primer reactivo de detección un marcador detectable, en donde el marcador detectable es un marcador electroquimioluminiscente, siendo el primer reactivo de detección un anticuerpo,
(vi) un segundo agente de direccionamiento, inmovilizado en un segundo dominio de unión, siendo el segundo agente de direccionamiento un oligonucleótido,
(vii) un segundo complemento de agente de direccionamiento, conectado a un segundo agente de unión, en donde el segundo complemento de agente de direccionamiento es un compañero de unión del segundo agente de direccionamiento, siendo el segundo complemento del agente de direccionamiento un oligonucleótido complementario al segundo oligonucleótido de agente de direccionamiento,
(viii) un segundo reactivo de unión conectado a un segundo agente de unión suplementario, en donde el segundo reactivo de unión es un compañero de unión del segundo analito, y
(ix) un segundo reactivo de detección que se une al segundo analito, el segundo reactivo de detección comprende un marcador detectable, en donde el marcador detectable es un marcador electroquimioluminiscente, siendo el segundo reactivo de detección un anticuerpo, y
(x) opcionalmente, al menos dos copias de un agente de puente,
en donde,
si se omite el agente de puente, (a) el primer y segundo agentes de unión son biotina, y el primer y segundo agentes de unión suplementarios son estreptavidina o avidina; o (b) el primer y segundo agentes de unión son estreptavidina o avidina, y el primer y segundo agentes de unión suplementarios son biotina; o
si se incluye el agente de puente, el agente de puente es estreptavidina o avidina, y el primer y segundo agentes de unión y el primer y segundo agentes de unión suplementarios, son cada uno biotina;
(b) formar
(i) un primer complejo de unión en el primer dominio de unión, que comprenda el primer agente diana, el primer complemento del agente diana, el primer reactivo de unión, el primer reactivo de detección y el primer analito, y (ii) un segundo complejo de unión en el segundo dominio de unión, que comprenda el segundo agente diana, el segundo complemento del agente diana, el segundo reactivo de unión, el segundo reactivo de detección y el segundo analito, en el que el par de oligonucleótidos complementarios situado en cada uno de los dominios de unión primero y segundo, es diferente, y
(c) medir la cantidad de los analitos primero y segundo en los dominios de unión primero y segundo, respectivamente, midiendo la presencia de las etiquetas detectables, mediante electroquimioluminiscencia. En una realización, si no se usa un agente de puente, el método incluye (a) combinar los componentes (i)-(ix) en una o más etapas, (b) formar los complejos de unión primero y segundo en los dominios de unión primero y segundo, respectivamente, y (c) medir la cantidad de los analitos primero y segundo en los dominios de unión primero y segundo, respectivamente. Por ejemplo, el primer complemento de agente de direccionamiento y el primer reactivo de unión pueden proporcionarse como un primer complejo de direccionamiento previamente unido, que incluye el primer complemento de agente de direccionamiento y el primer reactivo de unión, unido a través de una interacción de unión entre el agente de unión y el agente de unión suplementario; e igualmente, el segundo complemento de agente de direccionamiento y el segundo reactivo de unión pueden proporcionarse como un segundo complejo de direccionamiento unido previamente, que comprende el segundo complemento de agente de direccionamiento y el segundo reactivo de unión, unido a través de una interacción de unión entre el agente de unión y el agente de unión suplementario. En esta realización, el primer complejo de direccionamiento puede proporcionarse previamente unido al primer agente de direccionamiento, inmovilizado en el primer dominio de unión; y, asimismo, el segundo complejo de direccionamiento puede proporcionarse previamente unido, al segundo agente de direccionamiento, inmovilizado en el segundo dominio de unión. Cuando el primer y segundo reactivos de unión se proporcionan en complejos de direccionamiento unidos previamente, la etapa de combinación puede incluir, además, combinar el primer y segundo complejos de direccionamiento con la muestra, para formar una mezcla de los mismos, unir el primer analito al primer reactivo de unión en el primer complejo de direccionamiento, y unir el segundo analito al segundo reactivo de unión en el segundo complejo de direccionamiento, poner en contacto una mezcla de los primer y segundo complejos de direccionamiento unidos, al primer y segundo analitos, respectivamente, con el primer y segundo dominios de unión. Los complejos de unión en el primer y segundo dominios se forman, de este modo, uniendo el primer complejo de direccionamiento, al primer agente de direccionamiento, en el primer dominio de unión, y uniendo el segundo complejo de direccionamiento, al segundo agente de direccionamiento, en el segundo dominio de unión. Además, la etapa de combinación puede incluir, además, combinar los complejos de direccionamiento primero y segundo, con la muestra; y unir el primer analito al primer reactivo de unión en el primer complejo de direccionamiento, y unir el segundo analito al segundo reactivo de unión en el segundo complejo de direccionamiento.
En otra realización alternativa, la etapa de combinación (a) incluye las etapas de combinar, en un primer volumen de líquido, dicho primer complemento de agente de direccionamiento, dicho primer reactivo de unión y, si se usa, dicho reactivo de puente, y unir dicho primer complemento de agente de direccionamiento y dicho primer reactivo de unión, a través de sus agentes de unión, unidos para formar un primer complejo de direccionamiento; y combinar, en un segundo volumen de líquido, dicho segundo complemento de agente de direccionamiento, dicho segundo reactivo de unión y, si se usa, dicho reactivo de puente, y unir dicho segundo complemento complejo de agente de direccionamiento y dicho segundo reactivo de unión, a través de sus agentes de unión, unidos para formar un segundo complejo de direccionamiento. En esta realización, la etapa de combinación (a) también puede incluir las etapas de combinar dichos primer y segundo complejos de direccionamiento, poner en contacto la combinación de dichos primer y segundo complejos de direccionamiento, con dichos primer y segundo dominios de unión, y unir dicho primer complejo de direccionamiento a dicho primer agente de direccionamiento, en dicho primer dominio de unión, y unir dicho segundo complejo de direccionamiento a dicho segundo agente de direccionamiento, en dicho segundo dominio de unión. En esta realización, la etapa de combinación incluye, además, combinar la combinación de los complejos de direccionamiento primero y segundo con la muestra, y unir el primer analito al primer reactivo de unión en el primer complejo de direccionamiento, y unir el segundo analito al segundo reactivo de unión en el segundo complejo de direccionamiento. Los complejos de direccionamiento primero y segundo pueden combinarse con la muestra, antes de poner en contacto los complejos de direccionamiento primero y segundo con el primer y segundo dominio de unión; el primer y segundo complejos de direccionamiento pueden combinarse con la muestra, después de poner en contacto el primer y segundo complejos de direccionamiento con el primer y segundo dominio de unión; o los complejos de direccionamiento primero y segundo pueden combinarse con la muestra, y ponerse en contacto con el primer y segundo dominios de unión, al mismo tiempo.
Si se incluye un agente de puente en el método, entonces, el agente de unión y los agentes de unión suplementarios, se unen cada uno al agente de puente, y, por tanto, la etapa de combinación lleva esos elementos unidos a los agentes de unión y los agentes de unión suplementarios juntos. Por ejemplo, la etapa de combinación (a) incluye combinar, en un primer volumen de líquido, (xi) el primer complemento de agente de direccionamiento, el primer reactivo de unión y el reactivo de puente, e incluir, además, formar el primer complejo de direccionamiento, al unir el primer complemento de agente de direccionamiento y el primer reactivo de unión, a través de un complejo de puente que incluye el agente de unión, unido al agente de puente, al que se une el agente de unión suplementario. La etapa de combinación (a) también incluye combinar, en un segundo volumen de líquido, (xii) el complemento del segundo agente de direccionamiento, el segundo reactivo de unión y el reactivo de puente, e incluye, además, formar el segundo complejo de direccionamiento, uniendo el complemento del segundo agente de direccionamiento y el segundo reactivo de unión, a través de un complejo puente, que incluye el agente de unión, unido al agente de unión, al que se une el agente de unión suplementario. En esta realización, la etapa de combinación (a) también puede incluir combinar (xiii) los complejos de direccionamiento primero y segundo, y combinar la combinación de los complejos de direccionamiento primero y segundo con el primer y segundo dominios de unión, y unir el primer complejo de direccionamiento en el primer dominio de unión, y unir el segundo complejo de direccionamiento en el segundo dominio de unión. En esta realización, la etapa de combinación incluye, además, combinar (xiv) el primer y segundo complejos de direccionamiento con la muestra, y unir el primer analito al primer reactivo de unión en el primer complejo de direccionamiento, y unir el segundo analito al segundo reactivo de unión en el segundo complejo de direccionamiento. Los complejos de direccionamiento primero y segundo pueden combinarse con la muestra, antes de poner en contacto los complejos de direccionamiento primero y segundo con el primer y segundo dominio de unión; el primer y segundo complejos de direccionamiento pueden combinarse con la muestra, después de poner en contacto el primer y segundo complejos de direccionamiento con el primer y segundo dominio de unión; o los complejos de direccionamiento primero y segundo pueden combinarse con la muestra, y ponerse en contacto con el primer y segundo dominios de unión, al mismo tiempo.
Los métodos descritos en el presente documento pueden usarse para multiplexar una pluralidad de analitos de interés en una muestra. A este respecto, la muestra contiene uno o más analitos adicionales de interés, y para cada analito adicional de interés, la etapa de combinación (a) comprende, además, combinar, en una o más etapas, (ix) un agente de direccionamiento adicional, inmovilizado en un dominio de unión adicional, un complemento de agente de direccionamiento adicional, conectado a un agente de unión, y un reactivo de unión adicional, conectado a un agente de unión suplementario, y (x) un complejo de unión adicional en el dominio de unión adicional, que comprende el agente de direccionamiento adicional, el complemento de agente de direccionamiento adicional, el reactivo de unión adicional y el analito adicional; la etapa de formación (b) comprende, además, formar (iii) un complejo de unión adicional en el dominio de unión adicional, que comprende el agente de direccionamiento adicional, el complemento de agente de direccionamiento adicional, el reactivo de unión adicional y el analito adicional; y la medición en la etapa (c) comprende, además, medir la cantidad del analito adicional en el dominio de unión adicional.
En una realización específica, la invención incluye un método para realizar un ensayo de unión, para una pluralidad de analitos, que comprende (a) poner en contacto una muestra con dos o más dominios de unión, unidos a al menos un primer y segundo reactivo de unión, que se unen a un primer y segundo analito, respectivamente, de la pluralidad de analitos, para formar complejos que comprenden el primer analito unido al primer reactivo de unión, y el segundo analito unido al segundo reactivo de unión, en donde (x) el primer dominio de unión comprende un primer complejo de reactivo de unión, que comprende (i) un primer agente de direccionamiento unido al primer dominio de unión y a un primer complemento de agente de direccionamiento; y (ii) el primer reactivo de unión, unido al primer complemento de agente de direccionamiento, a través de un complejo de unión; e (y) el segundo dominio de unión comprende un segundo complejo de reactivo de unión, que comprende (i) un segundo agente de direccionamiento unido al segundo dominio de unión y a un segundo complemento de agente de direccionamiento; y (ii) el segundo reactivo de unión, unido al segundo complemento de agente de direccionamiento, a través de un complejo de unión; (b) poner en contacto el primer y segundo complejos de reactivos de unión con una pluralidad de reactivos de detección, que comprenden un primer reactivo de detección, que se une al primer analito o un complejo que comprende el primer analito, y un segundo reactivo de detección que se une al segundo analito o un complejo que comprende el segundo analito; y (c) medir la cantidad del primer y segundo analitos, unidos a los dos o más dominios de unión.
En otra realización específica, el método incluye: (a) formar un primer complejo de reactivo de unión, que comprende un primer reactivo de unión específico para un primer analito en la pluralidad de analitos y un primer agente de direccionamiento, en donde el primer reactivo de unión está unido a un agente de unión, y el primer agente de direccionamiento está unido a un agente de unión suplementario, en donde el primer complejo de reactivo de unión está formado por una reacción entre el agente de unión y el agente de unión suplementario; (b) formar un segundo complejo de reactivo de unión, que comprende un segundo reactivo de unión específico para un segundo analito en la pluralidad de analitos y un segundo agente de direccionamiento, en donde el segundo reactivo de unión está unido a un segundo agente de unión, y el segundo agente de direccionamiento está unido a un segundo complemento de agente de unión, en donde el segundo complejo de reactivo de unión está formado por una reacción entre el segundo agente de unión y el segundo complemento de agente de unión; (c) mezclar el primer y segundo complejos de reactivos de unión con dos o más dominios de unión, cada uno unido a un primer complemento de agente de direccionamiento y un segundo complemento de agente de direccionamiento, respectivamente, en condiciones suficientes para unir el primer agente de direccionamiento, al primer complemento de agente de direccionamiento, y el segundo agente de direccionamiento, al segundo complemento de agente de direccionamiento; (d) mezclar una muestra que comprende la pluralidad de analitos a la mezcla formada en la etapa (c); (e) añadir una pluralidad de reactivos de unión adicionales a la mezcla formada en la etapa (d), en donde la pluralidad de reactivos de unión adicionales incluye (i) un primer reactivo de detección específico para el primer analito y/o un primer complejo de reactivo de unión; y (ii) un segundo reactivo de detección específico para el segundo analito y/o un segundo complejo de reactivo de unión; y (f) medir la cantidad del primer y segundo analitos, unidos a los dominios de unión.
Una realización específica adicional incluye (a) formar un primer complejo de reactivo de unión, que comprende un primer reactivo de unión específico para un primer analito en la pluralidad de analitos y un primer agente de direccionamiento, en donde el primer reactivo de unión está unido a un agente de unión, y el primer agente de direccionamiento está unido a un agente de unión suplementario, en donde el primer complejo de reactivo de unión está formado por una reacción entre el agente de unión y el agente de unión suplementario; (b) formar un segundo complejo de reactivo de unión, que comprende un segundo reactivo de unión específico para un segundo analito en la pluralidad de analitos y un segundo agente de direccionamiento, en donde el segundo reactivo de unión está unido a un segundo agente de unión, y el segundo agente de direccionamiento está unido a un segundo complemento de agente de unión, en donde el segundo complejo de reactivo de unión está formado por una reacción entre el segundo agente de unión y el segundo complemento de agente de unión; (c) mezclar el primer y segundo complejos de reactivos de unión y la muestra, con dos o más dominios de unión, cada uno unido a un primer complemento de agente de direccionamiento y un segundo complemento de agente de direccionamiento, respectivamente, en condiciones suficientes para unir el primer agente de direccionamiento, al primer complemento de agente de direccionamiento, y el segundo agente de direccionamiento, al segundo complemento de agente de direccionamiento; (d) añadir una pluralidad de reactivos de unión adicionales a la mezcla formada en la etapa (c), en donde la pluralidad de reactivos de unión adicionales incluye (i) un primer reactivo de detección específico para el primer analito y/o un primer complejo de reactivo de unión; y (ii) un segundo reactivo de detección específico para el segundo analito y/o un segundo complejo de reactivo de unión; y (e) medir la cantidad del primer y segundo analitos, unidos a los dominios de unión.
Las realizaciones específicas del método de la presente invención, se ilustran en las Figuras 3-6. Las Figuras 1 y 2 ilustran un método de ensayo directo que no implica un complejo de unión. Estas cifras se proporcionan con fines comparativos. La Figura 1 ilustra un ensayo multiplexado directo para los analitos A, B y C. Los reactivos de unión específicos para estos analitos, A', B’ y C', respectivamente, están unidos a agentes de direccionamiento, A” , B” y C” . Una disolución que incluye estos reactivos de unión, unidos a sus correspondientes agentes de direccionamiento, se mezcla con una fase sólida a la que complementos de agentes de direccionamiento A", B" y C", respectivamente, se unen a una serie de dominios de unión discretos. Los reactivos de unión se adsorben a la superficie, para formar complejos de reactivos de unión, Arc, Brc y Crc, cada reactivo de unión fijado a través del agente de direccionamiento complementa a un dominio de unión discreto en la superficie. La superficie se pone en contacto con una muestra que comprende analitos A, B y C, así como reactivos de unión a detección, A*, B* y C*, que son capaces de unirse a los analitos A, B y C, respectivamente, y/o un complejo que comprende esos analitos. Los reactivos de unión de detección incluyen un marcador detectable. Alternativamente, la superficie se pone en contacto con una muestra que comprende la pluralidad de analitos, y posteriormente se pone en contacto con una mezcla de reactivos de unión de detección. Una vez que los reactivos de unión de detección están unidos a la superficie y, opcionalmente, la superficie se lava para eliminar los reactivos no unidos, la presencia de cada analito se detecta a través de los reactivos de detección unidos a cada dominio de unión discreto. La Figura 2 ilustra una realización específica de la Figura 1, que implica el uso de anticuerpos como reactivos de unión, y pares de oligonucleótido-oligonucleótido complementario como pares de agente de direccionamiento/complemento de agente de direccionamiento. Será evidente para el experto en la técnica que los métodos directos ilustrados en las Figuras 1 y 2, no son configurables por el usuario. Cada dominio de unión individual incluye un complemento de agente de direccionamiento predeterminado, de modo que sólo un único agente dirigido a reactivo de unión puede unirse a un único dominio de unión en la matriz.
Las Figuras 3-4 ilustran realizaciones particulares de la presente invención, que ofrecen la flexibilidad óptima del usuario, en una configuración de ensayo definida por el usuario. La Figura 3 ilustra un formato de unión indirecta para los analitos A, B y C, que incorpora una serie de complejos de unión que permiten al usuario adaptar el ensayo para sus necesidades. Las Figuras 3(a)-(b) ilustran un enfoque general para hacer los complejos de direccionamiento de la invención: una serie de disoluciones que se forman incluyen uno de los reactivos de unión (A', B' y C'), unidos a un agente de unión (La , Lb y Lc, respectivamente). Las disoluciones también incluyen los correspondientes agentes de direccionamiento, (A” para A', B” para B', y C” para C'), unidos a un agente de unión suplementario (La', Lb' y Lc', respectivamente). Las disoluciones se mezclan para formar la mezcla de complejos de reactivo de unión-agente de direccionamiento-agente de direccionamiento, que se muestran en el panel (b). Una ventaja de este enfoque es que no requiere que los reactivos de unión para cada complejo de direccionamiento sean reactivos no cruzados y, de hecho, permita que los agentes de unión se usen en cada complejo de direccionamiento (es decir, La = Lb = Lc, y La' = Lb' = Lc'). En una realización ilustrada en las Figuras 3(c)-(e), la mezcla de complejos de reactivo de unión-complejo de unión-agente diana, se mezcla con una superficie que comprende una pluralidad de dominios de unión discretos, a los que se unen los complementos del agente diana, Á", B" y C". Los complejos reactivo de unión-complejo de uniónagente diana, se adsorben para formar complejos reactivo de unión, Arc, Brc y Crc, tal como se muestra en el panel (c). En la Figura 3(e) se muestra una vista ampliada de los complejos reactivos de unión. La superficie se pone en contacto con una muestra que comprende analitos A, B y C, así como reactivos de unión a detección, A*, B* y C*, que son capaces de unirse a los analitos A, B y C, respectivamente, y/o un complejo que comprende esos analitos. Los reactivos de unión de detección incluyen un marcador detectable. Alternativamente, la superficie se pone en contacto con una muestra que comprende la pluralidad de analitos, y posteriormente se pone en contacto con una mezcla de reactivos de unión de detección. Una vez que los reactivos de unión de detección están unidos a la superficie y, opcionalmente, la superficie se lava para eliminar los reactivos no unidos, la presencia de cada analito se detecta a través de los reactivos de detección unidos a cada dominio de unión discreto [panel 3(d)]. La Figura 4 ilustra una realización específica de la Figura 3, que implica el uso de anticuerpos como reactivos de unión, y pares de oligonucleótido-oligonucleótido complementario como pares de agente de direccionamiento/complemento de agente de direccionamiento. Tal como se indica para la Figura 3, los agentes de unión para cada reactivo de unión pueden ser los mismos, y los complementos de los agentes de unión para cada agente diana pueden ser los mismos.
El experto en la técnica apreciará fácilmente que son posibles diversas permutaciones del formato de ensayo representado en las Figuras 3-4. Determinadas realizaciones preferidas se representan en las Figuras 5(a)-(c). Por ejemplo, todos los reactivos, es decir, los reactivos de unión modificados por agentes de unión suplementarios, los complementos de los agentes diana modificados por agentes de unión, los reactivos de detección, y la muestra, pueden mezclarse con los dominios de unión modificados por agentes diana de la superficie, en una sola etapa, para formar los complejos mostrados en las Figuras 3(d) y 4(d), opcionalmente, se lavan, y se analizan para detectar la presencia de los analitos A, B y C, unidos a la superficie [Figura 5(a)]. Alternativamente, los reactivos de unión modificados por agentes de unión suplementarios, y los agentes diana modificados por agentes de unión, pueden mezclarse en una sola etapa, añadirse a la superficie que tiene dominios de unión modificados por agentes diana, en una etapa posterior, añadirse los reactivos de muestra y detección, y analizarse en una etapa final [Figura 5(b)]. En aún otra realización, los reactivos de unión modificados por agentes de unión suplementarios, y los complementos de los agentes diana modificados por agentes de unión, pueden mezclarse, añadirse a la superficie que porta los agentes diana en dominios de unión discretos, mezclarse con la muestra y, a continuación, añadirse los reactivos de detección [Figura 5(c)]. Las disoluciones de analito individuales pueden añadirse a cada dominio de unión secuencial o simultáneamente, en una sola mezcla, y, asimismo, pueden añadirse reactivos de detección individuales a cada dominio de unión secuencialmente o simultáneamente, en una sola mezcla. Cualquier etapa de unión a la superficie puede ser seguida, opcionalmente, por una etapa de lavado para eliminar cualquier componente no unido del ensayo, antes de proceder a la siguiente etapa.
Los siguientes materiales/métodos se usan en la presente invención.
(i) Muestras/analitos
Los ejemplos de muestras que pueden analizarse mediante los métodos de la presente invención, incluyen, pero no se limitan a, muestras de alimentos (incluyendo extractos de alimentos, homogeneizados de alimentos, bebidas, etc.), muestras ambientales (por ejemplo, muestras de suelo, lodos ambientales, aerosoles ambientales recolectados, toallitas ambientales, filtrados de agua, etc.), muestras industriales (por ejemplo, materiales de partida, productos o productos intermedios de un proceso de producción industrial), muestras clínicas humanas, muestras veterinarias y otras muestras de origen biológico. Las muestras biológicas que pueden analizarse incluyen, pero no se limitan a, heces, hisopos de la mucosa, fluidos fisiológicos y/o muestras que contienen suspensiones de células. Los ejemplos específicos de muestras biológicas incluyen sangre, suero, plasma, heces, hisopos de mucosa, aspirados de tejido, homogeneizados de tejido, cultivos celulares y sobrenadantes de cultivo celular (incluyendo cultivos de células eucariotas y procariotas), orina, saliva, esputo y líquido cefalorraquídeo.
Los analitos que pueden medirse usando los métodos de la invención, incluyen, pero no se limitan a, proteínas, toxinas, ácidos nucleicos, microorganismos, virus, células, hongos, esporas, hidratos de carbono, lípidos, glucoproteínas, lipoproteínas, polisacáridos, fármacos, hormonas, esteroides, nutrientes, metabolitos y cualquier derivado modificado de las moléculas anteriores, o cualquier complejo que comprenda una o más de las moléculas anteriores o combinaciones de las mismas. El nivel de un analito de interés en una muestra puede ser indicativo de una enfermedad o afección patológica, o puede simplemente indicar si el paciente estuvo expuesto a ese analito.
Los ensayos de la presente invención pueden usarse para determinar la concentración de uno o más, por ejemplo, dos o más analitos, en una muestra. Por tanto, dos o más analitos pueden medirse en la misma muestra. Los paneles de analitos que pueden medirse en la misma muestra incluyen, por ejemplo, paneles de ensayos para analitos o actividades asociados con un estado patológico o afecciones fisiológicas. Determinados paneles de este tipo incluyen paneles de citocinas y/o sus receptores (por ejemplo, uno o más de TNF-alfa, TNF-beta, ILl-alfa, ILl-beta, IL2, IL4, IL6, IL-10, IL-l2, IFN-y, etc.), factores de crecimiento y/o sus receptores (por ejemplo, uno o más de EGF, VGF, TGF, VEGF, etc.), drogas de abuso, drogas terapéuticas, vitaminas, anticuerpos específicos de patógenos, autoanticuerpos (por ejemplo, uno o más anticuerpos dirigidos contra los antígenos Sm, RNP, SS-A, SS-alfa, J0-1, y Scl-70), anticuerpos específicos de alérgenos, marcadores tumorales (por ejemplo, uno o más de CEA, PSA, CA-125 II, CA 15-3, c A 19-9, CA 72-4, CYFRA 21 -1, NSE, AFP, etc.), marcadores de enfermedad cardiaca, incluyendo enfermedad cardiaca congestiva y/o infarto agudo de miocardio (por ejemplo, uno o más de troponina T, troponina I, mioglobina, CKMB, mieloperoxidasa, glutatión peroxidasa, proteína p-natriurética [BNP], proteína alfa-natriurética [ANP], endotelina, aldosterona, proteína C-reactiva [CRP], etc.), marcadores asociados con la hemostasia (por ejemplo, uno o más de los siguientes: monómero de fibrina, dímero D, complejo trombina-antrombina, fragmentos 1 y 2 de protrombina, anti-factor Xa, etc.), marcadores de infección aguda por hepatitis vírica (por ejemplo, uno o más de anticuerpos IgM contra el virus de la hepatitis A, anticuerpos IgM contra el antígeno central de la hepatitis B, antígeno de superficie de la hepatitis B, anticuerpos contra el virus de la hepatitis C, etc.), marcadores de la enfermedad de Alzheimer (alfa-amiloide, beta-amiloide, Ap 42, Ap 40, Ap 38, Ap 39, Ap 37, Ap 34, proteína tau, etc.), marcadores de osteoporosis (por ejemplo, uno o más de los telopéptidos Nor C reticulados, la desoxipiridinolina total, la desoxipiridinolina libre, la osteocalcina, la fosfatasa alcalina, el propéptido C-terminal del colágeno tipo I, la fosfatasa alcalina específica del hueso, etc.), marcadores del estado de fertilidad o de trastornos asociados a la fertilidad (por ejemplo, uno o más de estradiol, progesterona, hormona foliculoestimulante [FSH], hormona lutenizante [LH], prolactina, hCG, testosterona, etc.), marcadores de trastornos tiroideos (por ejemplo, uno o más de la hormona estimulante del tiroides [TSH], T3 total, T3 libre, T4 total, T4 libre y T3 inversa), y marcadores de cáncer de próstata (por ejemplo, uno o más de PSA total, PSA libre, PSA complejado, fosfatasa ácida prostática, creatina cinasa, etc.). Determinadas realizaciones de la invención incluyen medir, por ejemplo, uno o más, dos o más, cuatro o más, o 10 o más, analitos asociados con un estado patológico específico o afección fisiológica (por ejemplo, analitos agrupados juntos en un panel, tales como los enumerados anteriormente; por ejemplo, un panel útil para el diagnóstico de trastornos de la tiroides puede incluir, por ejemplo, una o más de una hormona estimulante de la tiroides [TSH], total T3, libre T3, total T4, libre T4, y T3 inverso).
Los métodos de la presente invención están diseñados para permitir la detección de una amplia variedad de agentes biológicos y bioquímicos, tal como se describió anteriormente. En una realización, los métodos pueden usarse para detectar virus, bacterias y toxinas patógenos y/o potencialmente patógenos, incluidos los agentes de guerra biológica (“ BWA” ) en una variedad de matrices clínicas y ambientales relevantes, que incluyen, entre otros, sangre, esputo, heces, filtros, hisopos, etc. Una lista no limitativa de patógenos y toxinas que pueden analizarse (solos o en combinación) usando los métodos de la presente invención es Bacillus anthracis (ántrax), Yersinia pestis (plaga), Vibrio cholerae (cólera), Francisella tularensis (tularemia), Brucella spp. (brucelosis), Coxiella burnetii (fiebre Q), Listeria, Salmonella, Shigella, V. cholera, Chlamydia trachomatis, Burkholderia pseudomallei, virus ortopox, incluido el virus de la viruela (viruela), encefalitis viral, virus de la encefalitis equina venezolana (VEE), virus de la encefalitis equina occidental (WEE), virus de la encefalitis equina del este (EEE), Alphavirus, fiebres hemorrágicas virales, Arenaviridae, Bunyaviridae, Filoviridae, Flaviviridae, virus del ébola, enterotoxinas estafilocócicas, ricina, toxinas botulínicas (A, B, E), Clostridium botulinum, micotoxina, Fusarium, Myrotecium, Cephalosporium, Trichoderma, Verticimonosporium, Stachybotrys, muermo, hongo del trigo, Bacillus globigii, Serratia marcescens, lluvia amarilla, micotoxinas de tricoteceno, Salmonella typhimurium, aflatoxina, Xenopsylla cheopis, Diamanus montanus, alastrim, viruela del simio, Arenavirus, Hantavirus, fiebre de Lassa, fiebres hemorrágicas argentinas, fiebres hemorrágicas bolivianas, virus de la fiebre del Valle del Rift, virus Crimea-Congo, virus Hanta, fiebres hemorrágicas de Marburgo, virus de la fiebre amarilla, virus del dengue, gripe (incluidas las cepas humanas y animales, incluyendo gripe aviar H5N1, gripe A, gripe A, específica H1, gripe A, H3 específica, gripe A, H5 específica, gripe A, 2009-H1N1 específica, gripe B), VRS, virus de la inmunodeficiencia humana I y II (VIH I y II), hepatitis A, hepatitis B, hepatitis C, hepatitis (no A, B o C), enterovirus, virus de Epstein-Barr, citomegalovirus, virus del herpes simple, Chlamydia trachomatis, Neisseria gonorrheae, Trichomonas vaginalis, virus del papiloma humano, Treponema pallidum, Streptococcus pneumonía, Borellia burgdorferi, Haemophilus influenzae, Mycoplasma pneumoniae, Chlamydophila pneumoniae, Legionella pneumophila, Staphylococcus aureus, enterotoxina B de Staphylococcus (SEB), Abrin, toxina 1 de Shiga, toxina 2 de Shiga, Moraxella catarrhalis, Streptococcus pyogenes, Clostridium difficile, Neisseria meningitidis, Klebsiella pneumoniae, Mycobacterium tuberculosis, estreptococos de grupo A, E. coli 0157, coronavirus, virus Coxsackie A, rinovirus, virus paragripal, virus respiratorio sincicial (VRS), metapneumovirus, vaccinia y adenovirus.
(ii) Reactivos de unión
El experto en la técnica en el campo de los ensayos de unión apreciará fácilmente el alcance de los agentes de unión y los compañeros de unión complementarios que pueden usarse en los presentes métodos. Una lista no limitativa de tales pares incluye (en cualquier orden) oligonucleótidos y complementos, pares receptor/ligando, anticuerpos/antígenos, pares receptor/ligando naturales o sintéticos, aminas y compuestos carbonílicos (es decir, unión mediante la formación de una base de Schiff), pares hapteno/anticuerpo, pares antígeno/anticuerpo, pares epítopo/anticuerpo, pares mimítopo/anticuerpo, pares aptámero/molécula diana, socios de hibridación y pares intercalador/molécula diana.
En una realización preferida, los ensayos de unión de los métodos de la presente invención emplean anticuerpos u otras proteínas receptoras como reactivos de unión. El término “anticuerpo” incluye moléculas de anticuerpo intactas (incluyendo anticuerpos híbridos ensamblados por reasociación in vitro de subunidades de anticuerpos), fragmentos de anticuerpo y constructos de proteínas recombinantes que comprenden un dominio de unión a antígeno de un anticuerpo (tal como se describe, por ejemplo, en Porter, R. R. y Weir, R. C. J. Cell Physiol., 67 [supl.]; 51-64 [1966] y Hochman, 1. Inbar, D. y Givol, D. Biochemistry 12: 1130 [1973]), así como constructos de anticuerpos que se han modificado químicamente, por ejemplo, mediante la introducción de un marcador detectable.
(iii) Agentes de direccionamiento, agentes de unión y agentes de puente
Los reactivos de unión están unidos a componentes que permiten su unión entre sí y/o a fases sólidas, directa o indirectamente. Estos componentes se denominan en el presente documento, agentes de direccionamiento y agentes de unión. Tal como se usa en el presente documento, los agentes de direccionamiento y sus complementos se usan para adherir un reactivo de unión a una superficie o soporte, mientras que los agentes de unión y los agentes de unión suplementarios se usan para unir un reactivo de unión a un agente de direccionamiento, directa o indirectamente, a través de un agente de puente, si se usa.
El agente de direccionamiento y su complemento comprenden un primer oligonucleótido y un oligonucleótido complementario. Los agentes de direccionamiento y complementos usados en un ensayo, se seleccionan de manera que los agentes de direccionamiento y complementos asociados con un reactivo de unión para un analito (por ejemplo, un primer analito) medido por el ensayo, sean sustancialmente no reactivos con los agentes de direccionamiento y complementos asociados con los reactivos de unión para los otros analitos medidos por el ensayo (por ejemplo, un segundo analito). Por consiguiente, en un ensayo de la invención, la unión de un reactivo de unión a su dominio de unión asociado (a través de su agente de direccionamiento asociado y el complemento del agente de direccionamiento) debe ser sustancialmente mayor que su unión a dominios de unión asociados con otros analitos (y que presentan diferentes complementos de agentes de direccionamiento). Preferiblemente, la reactividad cruzada para la unión de reactivos de unión para un analito a dominios de unión asociados con otros analitos, en relación con la unión al dominio de unión correcto, es<1 %, más preferiblemente <0,1 %, y más preferiblemente <0,01 %. En una realización preferida, el agente diana/complemento del agente diana, comprenden un par de oligonucleótidos que incluyen secuencias complementarias, y el agente diana y su complemento se ponen en contacto en condiciones suficientes para hibridar el agente diana con su complemento.
La longitud preferida es de aproximadamente 5 a 100 bases, preferiblemente de aproximadamente 10 a 50 bases, y más preferiblemente de aproximadamente 10 a 25 bases. Además, las secuencias de oligonucleótidos de direccionamiento no necesitan ser idénticas en longitud, y en determinadas realizaciones puede ser beneficioso proporcionar una secuencia de oligonucleótidos dirigida que sea más larga que su compañero de unión, por ejemplo, en hasta 25 bases, o hasta 15 bases, o hasta 10 bases. Las secuencias de oligonucleótidos y sus complementos, se pueden generar mediante técnicas conocidas en la técnica para generar pares de oligonucleótidos complementarios, con energías de unión similares (o temperaturas de fusión) y reactividad cruzada entre pares baja (por ejemplo, software comercial o público, para seleccionar sondas o cebadores para ensayos de ácidos nucleicos multiplexados). Las secuencias de oligonucleótidos pueden incluir bases de ácidos nucleicos naturales, así como bases no naturales y/o modificadas. Por ejemplo, las secuencias de oligonucleótidos pueden incluir Iso-dC y/o Iso-dG, que son variantes químicas de citosina y guanina, respectivamente, disponibles de EraGen Biosciences, Inc. (www.eragen.com). La incorporación de dichas bases modificadas en secuencias de oligonucleótidos, expande eficazmente el alfabeto genético y permite la síntesis de oligonucleótidos que tienen una especificidad aumentada y un potencial de hibridación no coincidente. Por ejemplo, un oligonucleótido que contiene Iso-dC puede diseñarse de modo que se hibridará con un oligo complementario que contenga Iso-dG, pero no se hibridará con ninguna secuencia de ácidos nucleicos que se produzca de manera natural.
En un enfoque, un algoritmo informático puede usarse para generar pares de secuencias de oligonucleótidos, basándose en una o más, y preferiblemente todas, de las siguientes reglas: (i) contenido de GC entre aproximadamente el 40-60 %, por ejemplo, el 40-50 %; (ii) una cadena máxima de repeticiones de bases en una secuencia de no más de tres; (iii) un número máximo de coincidencias de pares de bases de seis entre secuencias en diferentes pares, con no más de cuatro coincidencias seguidas; (iv) un rechazo de secuencias con tamaños de bucle de horquilla previstos entre 2-5, oligonucleótidos si tienen cuatro o más coincidencias de pares de bases en la región del tallo (se retienen los tamaños de bucle de seis o más); y (v) una mayor energía libre (AG°) de las interacciones específicas resultantes de un 40-60 % o 40-50 % de contenido de GC (AG° depende de la temperatura y la concentración de sal, y a 23 0C y 200 mM de un catión monovalente, pH 7,0, AG° preferiblemente supera -15 kcal/mol). En una realización particular, se considera al menos un contenido relativo de GC y AG°, junto con una o más reglas identificadas anteriormente, en la selección de oligonucleótidos. En una realización, puede ser ventajoso diseñar secuencias de oligonucleótidos que minimicen la unión no específica, y esto se pueda lograr mediante una variedad de métodos. Por ejemplo, pueden diseñarse pares de oligonucleótidos/oligonucleótidos que no formen más de tres pares G/C consecutivos con otros oligonucleótidos usados en el ensayo. Alternativa o adicionalmente, se puede promediar una o más de las siguientes configuraciones: formación de bucles de un solo nucleótido, o emparejamientos erróneos de un solo nucleótido posicionados entre secuencias ricas en G/C, cuando se aparean con otros oligonucleótidos usados en el ensayo.
En una realización, el agente de direccionamiento y el complemento del agente de direccionamiento comprenden un par de oligonucleótidos, en donde el par se selecciona de uno de los siguientes pares de secuencias en la Tabla 1 (a):
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En una realización particular, el agente de direccionamiento y el complemento del agente de direccionamiento comprenden un par de oligonucleótidos, en donde el par se selecciona de uno de los siguientes pares de secuencias en la Tabla 1 (b):
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El agente de direccionamiento y el complemento del agente de direccionamiento pueden estar presentes en una razón 1:1. Alternativamente, el agente de direccionamiento puede estar presente en un exceso, por ejemplo, en una razón 2:1 de agente de direccionamiento con respecto a complemento del agente de direccionamiento, para aumentar la probabilidad del agente de direccionamiento de unirse a su complemento.
En una realización, el agente de unión es biotina, y el agente de unión suplementario es estreptavidina o avidina (o viceversa).
Determinadas realizaciones descritas en la presente descripción emplean agentes de unión que se unen directamente a agentes de unión complementarios. En estas y otras de tales realizaciones, los agentes de unión y de unión suplementarios que se unen entre sí, pueden sustituirse por agentes de unión y de unión suplementarios que pueden unirse simultáneamente a un agente de puente. En estas realizaciones alternativas, se incluye un agente de puente en la mezcla del agente de unión y el agente de unión suplementario, cuando se forma el complejo de direccionamiento. Un agente de puente, si se usa, se une al agente de unión y al agente de unión suplementario. Por ejemplo, el agente de puente incluye un sitio de unión para el agente de unión y un sitio de unión adicional para el agente de unión suplementario, y la combinación de los tres componentes, es decir, el agente de puente, el agente de unión, y el agente de unión suplementario, comprende un complejo de puente. En una realización, el agente de puente es estreptavidina o avidina (cada uno de los cuales son tetrámeros, con cuatro sitios de unión independientes para biotina), y el agente de unión y el agente de unión complementario son cada uno biotina, de manera que el complejo de puente comprende (biotina-(estreptavidina (o avidina))-biotina).
En una realización preferida, se forma un complejo de unión mediante una reacción de unión entre un agente de unión, La, y un agente de unión suplementario, La'. Un formato de ensayo multiplexado puede configurarse para detectar analitos A, B y C, y, por tanto, los complejos de reactivos diseñados para interactuar con esos analitos individuales pueden incluir agentes de unión y agentes de unión suplementarios, seleccionados de La y La ', Lb y Lb', y Lc y Lc'. Cada uno de los pares de agente de unión/agente de unión suplementario usados para construir los complejos de unión, pueden ser iguales o diferentes. En una realización preferida, cada uno de los pares de agentes de unión/agente de unión suplementario comprende el mismo conjunto de reactivos. En una realización particularmente preferida, cada uno de los pares de agente de unión/agente de unión suplementario comprende, por ejemplo, una molécula de biotina como agente de unión en un reactivo de unión, y una molécula de estreptavidina o avidina en un agente diana, como agente de unión suplementario (o viceversa). Además, también puede formarse un complejo de unión mediante una reacción de unión entre una molécula de biotina en un reactivo de unión y una molécula de estreptavidina o avidina en un agente de direccionamiento, en donde la molécula de estreptavidina o avidina se une al agente de direccionamiento, a través de una reacción con una molécula de biotina (que actúa como agente de puente) en el agente de direccionamiento. En una realización preferida, una vez que se forma un complejo de unión entre una biotina y una molécula de estreptavidina en un reactivo de unión y un agente de direccionamiento, respectivamente (o viceversa), se puede añadir una molécula de biotina libre en exceso, para evitar la reactividad cruzada entre reactivos de unión adicionales y agentes de direccionamiento que pueden combinarse en disolución.
(iv) Fases sólidas
Una amplia variedad de fases sólidas son adecuadas para su uso en los métodos de la presente invención, incluyendo fases sólidas convencionales de la técnica de ensayos de unión. Las fases sólidas pueden estar hechas de una variedad de materiales diferentes que incluyen polímeros (por ejemplo, poliestireno y polipropileno), cerámica, vidrio, materiales compuestos (por ejemplo, compuestos de carbono-polímero, tales como tintas basadas en carbono). Las fases sólidas adecuadas incluyen las superficies de objetos macroscópicas, tales como una superficie interior de un recipiente de ensayo (por ejemplo, tubos de ensayo, cubetas, celdas de flujo, cartuchos, pocillos en una placa de múltiples pocillos, etc.), portaobjetos, chips de ensayo (tales como los usados en mediciones de chip o chip de proteína), pasadores o sondas, perlas, medios de filtración, medios de flujo lateral (por ejemplo, membranas de filtración usadas en tiras de prueba de flujo lateral), etc.
Las fases sólidas adecuadas incluyen, además, partículas (que incluyen, pero no se limitan a, coloides o perlas) comúnmente usadas en otros tipos de ensayos basados en partículas, por ejemplo, partículas magnéticas, polipropileno y látex, materiales usados típicamente en síntesis en fase sólida, por ejemplo, poliestireno y partículas de poliacrilamida, y materiales típicamente usados en aplicaciones cromatográficas, por ejemplo, sílice, alúmina, poliacrilamida, poliestireno. Los materiales también pueden ser una fibra, tal como una fibrilla de carbono. Las micropartículas pueden ser inanimadas o, alternativamente, pueden incluir entidades biológicas animadas, tales como células, virus, bacterias y similares. Una partícula usada en el presente método puede estar compuesta de cualquier material adecuado para unirse a uno o más reactivos de unión, y que puede recogerse mediante, por ejemplo, centrifugación, gravedad, filtración o recogida magnética. Una amplia variedad de diferentes tipos de partículas que se pueden unir a los reactivos de unión, se venden comercialmente para su uso en ensayos de unión. Estas incluyen partículas no magnéticas, así como partículas que comprenden materiales magnetizables que permiten que las partículas se recolecten con un campo magnético. En una realización, las partículas están compuestas por un material conductor y/o semiconductor, por ejemplo, partículas de oro coloidal. Las micropartículas pueden tener una amplia variedad de tamaños y formas. A modo de ejemplo, y no de limitación, las micropartículas pueden tener entre 5 nanómetros y 100 micrómetros. Preferiblemente, las micropartículas tienen tamaños entre 20 nm y 10 micrómetros. Las partículas pueden ser esféricas, oblongas, tipo varilla, etc., o pueden tener forma irregular.
Las Figuras 6(a)-(c) ilustran diversos conjuntos de partículas que pueden usarse en la presente invención. La Figura 6(a) muestra un conjunto de partículas, proporcionadas en uno o más viales, recipientes o compartimentos, que se modifican cada uno con un agente de direccionamiento distinto. Alternativamente, tal como se muestra en la Figura 6(b), se puede proporcionar un conjunto de partículas en uno o más viales, recipientes o compartimentos, que se modifican cada uno con un reactivo de unión distinto, estando el reactivo de unión unido a la partícula en un complejo de direccionamiento que comprende el reactivo de unión (a través de la unión de un agente de unión complementario) a un complemento de agente de direccionamiento que está unido a un agente de direccionamiento en la superficie de la partícula. Aún más, la Figura 6(c) muestra aún otra realización en la que se proporciona un conjunto mixto de partículas, en donde un subconjunto incluye partículas que se modifican cada una con un reactivo de unión distinto [tal como en la Figura 6(b)], y un subconjunto incluye partículas que se modifican cada una con un agente de direccionamiento distinto [tal como en la Figura 6(a)]. Las partículas mostradas en la Figura 6(c) incluyen un subconjunto de partículas preconfiguradas con reactivos de unión para un conjunto predeterminado de analitos, y un subconjunto de partículas no configuradas, que pueden ser modificadas por un usuario, para unir un conjunto adicional de reactivos de unión, para un conjunto adicional de analitos, es decir, al unir las partículas a un conjunto adicional de complejos de direccionamiento que comprenden reactivos de unión adicionales. Estos reactivos adicionales pueden proporcionarse por el usuario, permitiendo, de este modo, que el usuario añada un conjunto de ensayos definidos por el usuario, a un conjunto predefinido de ensayos.
Las partículas usadas en el presente método pueden codificarse para permitir la identificación de partículas o subpoblaciones específicas de partículas en una mezcla de partículas. El uso de tales partículas codificadas se ha usado para permitir la multiplexación de ensayos que emplean partículas como soportes en fase sólida para ensayos de unión. En un enfoque, las partículas se fabrican para incluir uno o más colorantes fluorescentes, y las poblaciones específicas de partículas se identifican basándose en la intensidad y/o la intensidad relativa de las emisiones de fluorescencia en una o más longitudes de onda. Este enfoque se ha usado en los sistemas Luminex xMAP (véase, por ejemplo, la patente estadounidense n. ° US-6.939.720) y los sistemas de matrices de perlas citométricas de Becton Dickinson. Alternativamente, las partículas pueden codificarse a través de diferencias en otras propiedades físicas, tales como tamaño, forma, patrones ópticos incrustados y similares. Tal como se indica mediante la eclosión cruzada de las partículas en las Figuras 6(a)-(c), una o más partículas proporcionadas en una mezcla o conjunto de partículas, pueden codificarse para ser distinguibles de otras partículas en la mezcla, en virtud de propiedades ópticas de partículas, tamaño, forma, patrones ópticos incrustados y similares.
Alternativa o adicionalmente, los reactivos de unión pueden unirse a través de complejos de reactivos de unión, a diferentes dominios de unión discretos, en una o más fases sólidas, por ejemplo, como en una matriz de unión, de manera que las señales de ensayo discretas se generan en cada dominio de unión y, por tanto, los diferentes analitos unidos a esos dominios se pueden medir independientemente. En un ejemplo de tal realización, los dominios de unión se preparan inmovilizando, en una o más superficies, dominios discretos de agentes de direccionamiento que, a través de un complejo de reactivo de unión, construido sobre los dominios individuales, están configurados para unirse a analitos de interés. Opcionalmente, la(s) superficie(s) puede(n) definir, en parte, uno o más límites de un recipiente (por ejemplo, una celda de flujo, pocillo, cubeta, etc.) que mantiene la muestra, o a través de la cual se pasa la muestra. En una realización preferida, los dominios de unión individuales se forman en electrodos, para su uso en ensayos electroquímicos o electroquimioluminiscencia. Se ha usado medición multiplexada de analitos en una superficie que comprende una pluralidad de dominios de unión, usando electroquimioluminiscencia, en la línea de productos MULTI-ARRAY® y SECTOR® Imager, de Meso Scale Diagnostics, LLC (véanse, por ejemplo, las patentes estadounidenses n. ° US-7.842.246 y n. ° US-6.977.722).
Las Figuras 6(d)-(f) ilustran diversos formatos de placa alternativos, que incluyen dominios de unión distintos que pueden usarse en la presente invención. La Figura 6(d) muestra una superficie que porta una pluralidad de dominios de unión que se modifican cada uno con un agente de direccionamiento distinto. Alternativamente, tal como se muestra en la Figura 6(e), se puede proporcionar una superficie que tenga una pluralidad de dominios de unión, cada uno modificado con un reactivo de unión distinto, estando unido el reactivo de unión al dominio de unión, en un complejo de direccionamiento que comprende el reactivo de unión (a través de la unión de un agente de unión suplementario) a un complemento de agente de dirección que está unido a un agente de dirección en el dominio de unión. Aún más, la Figura 6(f) muestra aún otra realización, en la que se proporciona un conjunto mixto de dominios de unión en una superficie, en donde un subconjunto incluye dominios de unión que se modifican cada uno con un reactivo de unión distinto [tal como en la Figura 6(e)], y un subconjunto incluye dominios de unión que están modificados cada uno por un agente de direccionamiento distinto [tal como en la Figura 6(d)]. Los dominios de unión mostrados en la Figura 6(f), incluyen un subconjunto de dominios de unión preconfigurados con reactivos de unión para un conjunto predeterminado de analitos, y un subconjunto de dominios de unión no configurados, que pueden ser modificados por un usuario, para unir un conjunto adicional de reactivos de unión para un conjunto adicional de analitos, es decir, mediante la unión de estos dominios de unión no configurados a un conjunto adicional de complejos de direccionamiento que comprenden reactivos de unión adicionales. Estos reactivos adicionales pueden ser proporcionados por el usuario, permitiendo, así, que el usuario añada un conjunto de ensayos definidos por el usuario a un conjunto predefinido de ensayos.
Los reactivos, es decir, los agentes de direccionamiento, pueden unirse a una superficie mediante métodos conocidos, por ejemplo, métodos establecidos para modificar partículas o para formar matrices. Un ejemplo no limitativo de un método para unir una proteína u oligonucleótido a una superficie, se ilustra en la Figura 7. Este método usa sulfosuccinimidil-4-(N-maleimidometil)ciclohexano-1-carboxilato (sulfo-SMCC), un agente de reticulación heterobifuncional bien establecido. La reacción del grupo N-hidroxisuccinimida (NHS), de SMCC, con albúmina de suero bovino (BSA), marca la BSA con grupos maleimida reactivos con tiol. Los grupos maleimida, a su vez, se hacen reaccionar con oligonucleótidos modificados con tiol, para formar conjugados de BSA-oligonucleótido que están unidos a través de enlaces tioéter estables. Las matrices de estos reactivos pueden formarse mediante la impresión de patrones de los reactivos, en superficies que adsorben o reaccionan con proteínas (tales como BSA), generando, así, matrices estampadas de los oligonucleótidos asociados. En un ejemplo específico, se forman matrices mediante impresión de matrices de los conjugados BSA-oligonucleótido, en superficies de carbono grafíticas, preferiblemente, electrodos de tinta de carbono impresos en pantalla. Sorprendentemente, se ha encontrado que los reactivos modificados con tiol, que incluyen oligonucleótidos modificados con tiol, reaccionan irreversiblemente con superficies de carbono grafíticas que incluyen electrodos de tinta de carbono serigrafiados (incluso cuando no se conjugan con una proteína, tal como BSA). Por consiguiente, los reactivos modificados con tiol (incluyendo los oligonucleótidos y péptidos modificados con tiol) pueden inmovilizarse en superficies de carbono, incubando las superficies de carbono con una disolución que contiene los reactivos, y permitiendo que el reactivo reaccione irreversiblemente con la superficie. Además, las matrices de dichos reactivos modificados con tiol (incluyendo las matrices que comprenden oligonucleótidos y/o péptidos modificados con tiol) pueden formarse mediante la impresión de disoluciones que contienen estos reactivos, en las superficies de carbono, incubar las disoluciones estampadas en la superficie, y permitir que los reactivos reaccionen irreversiblemente con la superficie.
(v) Dispositivos de ensayo y reactivos complementarios
Los métodos de la presente invención pueden usarse en una variedad de dispositivos y/o formatos de ensayo. Los dispositivos de ensayo pueden incluir, por ejemplo, módulos de ensayo, tales como placas de ensayo, cartuchos, placas de ensayo de múltiples pocillos, recipientes de reacción, tubos de ensayo, cubetas, celdas de flujo, chips de ensayo, dispositivos de flujo lateral, etc., que tienen reactivos de ensayo (que pueden incluir agentes de direccionamiento u otros reactivos de unión) añadidos a medida que el ensayo progresa o se carga previamente en los pocillos, cámaras o regiones de ensayo del módulo de ensayo. Estos dispositivos pueden emplear una variedad de formatos de ensayo, para ensayos de unión específicos, por ejemplo, ensayos de inmunoensayo o inmunocromatográficos. Los dispositivos y formatos de ensayo ilustrativos se describen a continuación en el presente documento. En determinadas realizaciones, los métodos de la presente invención pueden emplear reactivos de ensayo que se almacenan en un estado seco, y los dispositivos/kits de ensayo pueden comprender o suministrarse, además, con materiales desecantes, para mantener los reactivos de ensayo en un estado seco. Los dispositivos de ensayo precargados con los reactivos de ensayo, pueden mejorar, en gran medida, la velocidad, y reducir la complejidad de las mediciones del ensayo, mientras se mantiene una excelente estabilidad durante el almacenamiento. Los reactivos de ensayo secos pueden ser cualquier reactivo de ensayo que pueda secarse y luego reconstituirse antes de su uso en un ensayo. Estos incluyen, pero no se limitan a, reactivos de unión útiles en ensayos de unión, enzimas, sustratos de enzimas, colorantes indicadores y otros compuestos reactivos que pueden usarse para detectar un analito de interés. Los reactivos de ensayo también pueden incluir sustancias que no están directamente implicadas en el mecanismo de detección, pero desempeñan un papel auxiliar en un ensayo que incluye, pero no se limita a, agentes de bloqueo, agentes estabilizantes, detergentes, sales, tampones de pH, conservantes, etc. Los reactivos pueden estar presentes en forma libre, o soportados en fases sólidas que incluyen las superficies de compartimentos (por ejemplo, cámaras, canales, células de flujo, pocillos, etc.) en los módulos de ensayo o las superficies de coloides, perlas u otros soportes en forma de partículas.
(vi) Métodos de medición
Los métodos de la invención pueden usarse con una variedad de métodos para medir la cantidad de un analito y, en particular, medir la cantidad de un analito unido a una fase sólida. Las técnicas que pueden usarse incluyen, pero no se limitan a, técnicas conocidas en la técnica, tales como ensayos basados en cultivos celulares, ensayos de unión (incluyendo pruebas de aglutinación, inmunoensayos, ensayos de hibridación de ácidos nucleicos, etc.), ensayos enzimáticos, ensayos colorimétricos, etc. Otras técnicas adecuadas serán fácilmente evidentes para un experto en la técnica. Algunas técnicas de medición permiten realizar mediciones mediante inspección visual, otras pueden requerir o beneficiarse del uso de un instrumento para realizar la medición.
Los métodos para medir la cantidad de un analito incluyen técnicas sin etiqueta, que incluyen, pero no se limitan a i) técnicas que miden cambios en la masa, o índice de refracción en una superficie, después de la unión de un analito a una superficie (por ejemplo, técnicas de ondas acústicas superficiales, sensores de resonancia de plasmón superficial, técnicas elipsométricas, etc.), ii) técnicas espectrométricas de masa (incluyendo técnicas como MALDI, SELDI, etc., que pueden medir analitos en una superficie), iii) técnicas cromatográficas o electroforéticas, iv) técnicas de fluorescencia (que pueden basarse en la fluorescencia inherente de un analito), etc.
Los métodos para medir la cantidad de un analito, también incluyen técnicas que miden analitos a través de la detección de marcadores que pueden unirse directa o indirectamente (por ejemplo, a través del uso de compañeros de unión marcados de un analito) a un analito. Las etiquetas adecuadas incluyen etiquetas que pueden visualizarse directamente (por ejemplo, partículas que pueden verse visualmente), y etiquetas que generan una señal medible, tal como electroquimioluminiscencia. Las etiquetas que pueden usarse, también incluyen enzimas u otras especies químicamente reactivas que tienen una actividad química que conduce a una señal medible, tal como dispersión de luz, absorbancia, fluorescencia, etc. El uso de enzimas como marcadores, está muy establecido en ensayos inmunosorbentes unidos a enzimas, también denominados ELISAs, inmunoensayos enzimáticos o EIAs. En el formato ELISA, se fija una cantidad desconocida de antígeno a una superficie, y luego se lava un anticuerpo específico sobre la superficie, para que pueda unirse al antígeno. Este anticuerpo está unido a una enzima, y en la etapa final se añade una sustancia que la enzima convierte en un producto que proporciona un cambio en una señal detectable. La formación de producto puede ser detectable, por ejemplo, debido a una diferencia, en relación con el sustrato, en una propiedad medible, tal como absorbancia, fluorescencia, quimioluminiscencia, dispersión de luz, etc. Determinados (pero no todos) métodos de medición que pueden usarse con métodos de unión en fase sólida de acuerdo con la invención, pueden beneficiarse o requerir una etapa de lavado para eliminar los componentes no unidos (por ejemplo, marcadores) de la fase sólida.
En una realización, un(os) analito(s) de interés en la muestra se mide(n) usando formatos de ensayo basados en electroquimioluminiscencia, por ejemplo, inmunoensayos basados en electroquimioluminiscencia (ECL). La alta sensibilidad, amplio intervalo dinámico y selectividad de ECL, son factores importantes para el diagnóstico médico. Los instrumentos ECL comerciales han demostrado un rendimiento excepcional y se han usado ampliamente, por razones que incluyen su excelente sensibilidad, intervalo dinámico, precisión y tolerancia de las matrices de muestras complejas. Las especies que pueden inducirse a emitir ECL (especies activas con ECL) se han usado como marcadores ECL, por ejemplo, i) compuestos organometálicos donde el metal es de, por ejemplo, los metales nobles del grupo VIII, incluyendo compuestos organometálicos que contienen Ru y que contienen O, tales como el resto de tris-bipiridil-rutenio (RuBpy), y ii) luminol y compuestos relacionados. Las especies que participan con el marcador ECL en el proceso ECL, se denominan en el presente documento como correactantes de ECL. Los correactantes usados comúnmente incluyen aminas terciarias (por ejemplo, véase la patente estadounidense US-5.846.485), oxalato y persulfato para ECL, a partir de RuBpy, y peróxido de hidrógeno para ECL, a partir de luminol (véase, por ejemplo, la patente estadounidense n.° US-5.240.863). La luz generada por marcadores de ECL se puede usar como señal informadora en los procedimientos de diagnóstico (Bard y col., patente estadounidense n.° US-5.238.808). Por ejemplo, un marcador ECL puede acoplarse covalentemente a un agente aglutinante, tal como un anticuerpo, sonda de ácido nucleico, receptor o ligando; la participación del reactivo de unión en una interacción de unión puede controlarse midiendo la ECL emitida desde el marcador de ECL. Alternativamente, la señal de ECL de un compuesto activo con ECL puede ser indicativa del entorno químico (véase, por ejemplo, la patente estadounidense n.° US-5.641.623, que describe ensayos con ECL que monitorizan la formación o destrucción de correactantes de ECL). Para más antecedentes de ECL, marcadores de ECL, ensayos de ECL e instrumentación para realizar ensayos de ECL, véanse las patentes estadounidenses n.os US-5.093.268; US-5.147.806; US-5.324.457; US-5.591.581; u S-5.597.910; US-5.641.623; US-5.643.713; US-5.679.519; US-5.705.402; US-5.846.485; US-5.866.434; US-5.786.141; US-5.731.147; US-6.066.448; US-6.136.268; US-5.776.672; US-5.308.754; US-5.240.863; US-6.207.369; US-6.214.552 y US-5.589.136, y los documentos PCT publicados n.os WO99/63347; WO00/03233; WO99/58962; WO99/32662; WO99/14599; WO98/12539; WO97/36931 y WO98/57154.
Los métodos de la invención pueden aplicarse a formatos de un solo plex, o multiplex donde se realicen múltiples mediciones de ensayo en una única muestra. Las mediciones multiplex que pueden usarse con la invención incluyen, pero no se limitan a, mediciones multiplex i) que implican el uso de múltiples sensores; ii) que usan dominios de ensayo discretos en una superficie (por ejemplo, una matriz) que son distinguibles en función de la ubicación en la superficie; iii) que involucren el uso de reactivos que recubren partículas que se distinguen en función de una propiedad de la partícula, tal como el tamaño, la forma, el color, etc.; iv) que producen señales de ensayo que son distinguibles, basándose en las propiedades ópticas (por ejemplo, espectro de absorbancia o emisión); o v) que se basan en propiedades temporales de la señal de ensayo (por ejemplo, tiempo, frecuencia o fase de una señal).
Estas y otras realizaciones de la invención, se ilustran en los siguientes ejemplos no limitados.
Ejemplos
Ejemplo 1 - Formato de ensayo directo
El procedimiento para la preparación y el uso de una placa de múltiples pocillos para un ensayo directo, se ilustra en la Figura 2. Se indicó el diseño experimental, es decir, qué secuencia de oligonucleótidos se ubicó en el dominio de unión de una placa de ensayo de múltiples pocillos. La placa de ensayo de múltiples pocillos se obtuvo de Meso Scale Discovery, una división de Meso Scale Diagnostics, lLC (Rockville, MD). Se preparó una disolución de trabajo de cada complemento de secuencia de oligonucleótidos individual (550 ul), diluyendo una disolución madre de complemento de secuencia, aproximadamente 50 veces, en diluyente 100 (disoluciones madre de la secuencia de oligonucleótidos complemento y diluyente 100, están disponibles de Meso Scale Discovery).
Cada anticuerpo de captura se marcó con un oligonucleótido que tenía un grupo tiol terminal, usando un reactivo de acoplamiento bifuncional [carboxilato de 4-(N-maleimidometil)-1-ciclohexano sulfosuccinimidilo (“ SMCC” )] y protocolos de acoplamiento convencionales, tal como se muestra en la Figura 5(d), por ejemplo, la proteína se hace reaccionar con el éster NHS en SMCC, para marcar la proteína, y el complejo resultante se hace reaccionar con oligonucleótidos tiolados que reaccionan con el grupo maleimida en SMCC. A continuación, se añadió una solución agrupada (50 ul) de un conjunto de anticuerpos-oligo-conjugados a cada pocillo de la placa de pocillos múltiples, en tampón de hibridación durante 1 hora a temperatura ambiente, para hibridar las secuencias complementarias de oligonucleótidos, e inmovilizar, así, los anticuerpos de captura en la placa de pocillos múltiples, para formar una pluralidad de complejos de reactivos de unión.
Se añadió una disolución que incluía una pluralidad de analitos (25 ul de diluyente MSD 2, con 25 ul de disolución calibradora de diluyente MSD 2) a cada pocillo de la placa preparada, se incubó durante 1 hora a temperatura ambiente, se lavó 3 veces con PBS, y se añadió un conjunto de anticuerpos de detección marcados (50 ul de diluyente MSD 3) a cada pocillo de la placa de pocillos múltiples. La placa se incubó con agitación, y los pocillos se lavaron con 3x PBS, se llenaron con 150 ul de tampón de lectura T (Meso Scale Discovery), y se analizaron en un instrumento SECTOR® Imager.
Este protocolo se usó para realizar un ensayo para un panel de quimiocinas 7-plex, y el resultado se muestra en las Figuras 8(a)-(g). Los analitos ensayados en este experimento fueron eotaxina, MIP-1b, TARC, IL-8, MCP-4, IP-10, y MCP-1 (todos los analitos humanos). Además, este protocolo se usó para realizar un ensayo para un panel TH1/TH2 10-plex, que incluye IFNg, IL-1b, IL-2, IL-4, IL-5, IL-8, IL-10, IL-12p70, IL-13 y TNFa (todos analitos humanos). Los resultados para ambos ensayos se compararon con un inmunoensayo directo convencional, sin ligadores de oligonucleótidos.
Ejemplo 2 - Formato de ensayo indirecto usando un conjugado oligonucleótido-SA
El procedimiento para la preparación y el uso de una placa de múltiples pocillos, para un ensayo indirecto, usando conjugados de oligonucleótido-SA, se ilustra en las Figuras 9(a)-(c). El diseño experimental para la placa de ensayo de múltiples pocillos se realizó como en el Ejemplo 1. Se preparó una disolución de trabajo de cada complemento de secuencia de oligonucleótidos individual, unida a estreptavidina (SA) (550 ul), diluyendo una disolución madre de complemento de secuencia, aproximadamente 50 veces, en diluyente 100 (disoluciones madre de la secuencia de oligonucleótidos complemento y diluyente 100, están disponibles a través de Meso Scale Discovery). Se añadió una disolución de anticuerpo biotinilado a la disolución de trabajo deseada del complemento de secuencia de oligonucleótidos, para preparar un conjunto de mezclas individuales de anticuerpo de captura biotinilado/oligonucleótido-SA. La concentración de anticuerpo biotinilado en la mezcla estaba en el intervalo de aproximadamente 5-30 ug/ml. La mezcla se mezcló suavemente durante 30-45 minutos a temperatura ambiente. Se añadieron cincuenta (50) ul de disolución de biotina (Meso Scale Discovery) (aproximadamente un exceso de tres veces de biotina) a cada mezcla de complemento de anticuerpo/oligonucleótido biotinilado individual, y esta mezcla se mezcló suavemente durante 10-15 minutos a temperatura ambiente. Se combinaron volúmenes iguales (550 ul) de complementos de anticuerpos/oligonucleótidos biotinilados individuales, y el volumen total de la disolución se ajustó a 5500 ul, con la adición de un tampón de conjugación (PBS con EDTA 0,1 M a pH 7,4).
La placa de múltiples pocillos se dejó calentar hasta temperatura ambiente (aproximadamente 10 minutos). Se añadieron cincuenta (50) ul de anticuerpos/complementos de oligonucleótidos biotinilados a cada pocillo de la placa. La placa se cubrió con un sello adhesivo, y se incubó durante 1 hora en un agitador de placas a temperatura ambiente. Cada pocillo se lavó con solución salina tamponada con fosfato (PBS, 3X).
Se añadió una disolución que incluía una pluralidad de analitos (25 ul de diluyente MSD 2, con 25 ul de disolución calibradora de diluyente MSD 2) a cada pocillo de la placa preparada, se incubó durante 1 hora a temperatura ambiente, se lavó 3 veces con PBS, y se añadió un conjunto de anticuerpos de detección marcados (50 ul de diluyente MSD 3) a cada pocillo de la placa de pocillos múltiples. La placa se incubó con agitación, y los pocillos se lavaron con 3x PBS, se llenaron con 150 ul de tampón de lectura T (Meso Scale Discovery), y se analizaron en un instrumento SECTOR® Imager.
Ejemplo 3 - Formato de ensayo indirecto usando oligonucleótidos de SA/biotinilado
El procedimiento para la preparación y el uso de una placa de múltiples pocillos, para un ensayo indirecto, usando anticuerpos de captura biotinilados, estreptavidina pura y oligonucleótidos biotinilados, se ilustra en las Figuras 10(a)-(c). El diseño experimental para la placa de ensayo múltiples pocillos se realizó como en el Ejemplo 1. Se preparó una disolución de trabajo de un exceso de cada complemento de secuencia de oligonucleótidos individual, unida a estreptavidina (SA) (550 ul), diluyendo una disolución madre de complemento de secuencia, de aproximadamente 50 veces, en diluyente 100 (disoluciones madre de la secuencia de oligonucleótidos complemento y diluyente 100, están disponibles a través de Meso Scale Discovery). Se añadió una disolución de anticuerpo biotinilado a la disolución de trabajo deseada del complemento de secuencia de oligonucleótidos, para preparar un conjunto de mezclas individuales de anticuerpo de captura biotinilado/oligonucleótido-SA. La concentración de anticuerpo biotinilado en la mezcla, estaba en el intervalo de aproximadamente 5-30 ug/ml. La mezcla se mezcló suavemente durante 30­ 45 minutos a temperatura ambiente. Se añadieron cincuenta (50) ul de disolución de biotina (Meso Scale Discovery) (aproximadamente un exceso de tres veces de biotina) a cada mezcla de complemento de anticuerpo/oligonucleótido biotinilado individual, y esta mezcla se mezcló suavemente durante 10-15 minutos a temperatura ambiente. Se combinaron volúmenes iguales (550 ul) de complementos de anticuerpos/oligonucleótidos biotinilados individuales, y el volumen total de la disolución se ajustó a 5500 ul, con la adición de un tampón de conjugación (disponible a través de Meso Scale Discovery).
La placa de múltiples pocillos se dejó calentar hasta temperatura ambiente (aproximadamente 10 minutos). Se añadieron cincuenta (50) ul de anticuerpos/complementos de oligonucleótidos biotinilados a cada pocillo de la placa. La placa se cubrió con un sello adhesivo, y se incubó durante 1 hora en un agitador de placas, a temperatura ambiente. Cada pocillo se lavó con solución salina tamponada con fosfato (PBS, 3X).
Se añadió una disolución que incluía una pluralidad de analitos (25 ul de diluyente MSD 2, con 25 ul de disolución calibradora de diluyente MSD 2) a cada pocillo de la placa preparada, se incubó durante 1 hora a temperatura ambiente, se lavó 3 veces con PBS, y se añadió un conjunto de anticuerpos de detección marcados (50 ul de diluyente MSD 3) a cada pocillo de la placa de pocillos múltiples. La placa se incubó con agitación, y los pocillos se lavaron con 3x PBS, se llenaron con 150 ul de tampón de lectura T (Meso Scale Discovery), y se analizaron en un instrumento SECTOR® Imager.
Ejemplo 4 - Resultados comparativos de tres formatos de ensayo usando el panel de citocinas B de 7 plex
Se sometió a prueba un panel de citocina B de 7 plex (IL-8, hTNF-a, hEotaxina-3, h-Eotaxina, hMCP-1, HIP-10 y hMIP-1a) en los formatos de ensayo descritos en los Ejemplos 1, 2 y 3, es decir, directo, indirecto con conjugado de oligonucleótido-SA, e indirecto con SA puro/oligonucleótidos biotinilados. Los valores de LOD para los ensayos se estimaron a partir de una curva de calibración de 8 puntos, adoptando 2,5 desviaciones estándar. Los resultados se muestran en las Figuras 11 (a)-(g). Los valores de LOD para los formatos de ensayo directo e indirecto, se comparan con los valores de LOD observados para los formatos convencionales de adsorción pasiva e inmunoensayo, para todos los ensayos sometidos a ensayo. El enfoque indirecto con SA puro mostró una propagación significativa en los valores de LOD: algunos ensayos, IL-8 y hIP-10, mostraron valores de LOD más altos en comparación con los formatos de ensayo restantes, mientras que eotaxina y MIP-10 mostraron valores de LOD más bajos.

Claims (1)

  1. REIVINDICACIONES
    Un método para realizar un ensayo de unión multiplexado para una pluralidad de analitos de interés, que comprende
    (a) combinar, en una o más etapas, los siguientes componentes:
    (i) una muestra que comprende un primer analito de interés y un segundo analito de interés, (ii) un primer agente de direccionamiento, inmovilizado en un primer dominio de unión, siendo el primer agente de direccionamiento un oligonucleótido,
    (iii) un primer complemento de agente de direccionamiento, conectado a un primer agente de unión, en donde el primer complemento de agente de direccionamiento es un compañero de unión del primer agente de direccionamiento, siendo el primer complemento del agente de direccionamiento un oligonucleótido complementario al primer oligonucleótido de agente de direccionamiento, (iv) un primer reactivo de unión conectado a un primer agente de unión suplementario, en donde el primer reactivo de unión es un compañero de unión del primer analito,
    (v) un primer reactivo de detección que se une al primer analito, comprendiendo el primer reactivo de detección un marcador detectable, en donde el marcador detectable es un marcador electroquimioluminiscente, siendo el primer reactivo de detección un anticuerpo,
    (vi) un segundo agente de direccionamiento, inmovilizado en un segundo dominio de unión, siendo el segundo agente de direccionamiento un oligonucleótido,
    (vii) un segundo complemento de agente de direccionamiento, conectado a un segundo agente de unión, en donde el segundo complemento de agente de direccionamiento es un compañero de unión del segundo agente de direccionamiento, siendo el segundo complemento del agente de direccionamiento un oligonucleótido complementario al segundo oligonucleótido de agente de direccionamiento,
    (viii) un segundo reactivo de unión conectado a un segundo agente de unión complementario, en donde el segundo reactivo de unión es un compañero de unión del segundo analito, y
    (ix) un segundo reactivo de detección que se une al segundo analito, el segundo reactivo de detección comprende un marcador detectable, en donde el marcador detectable es un marcador electroquimioluminiscente, siendo el segundo reactivo de detección un anticuerpo, y
    (x) opcionalmente, al menos dos copias de un agente de puente,
    en donde,
    si se omite el agente de puente, (a) el primer y segundo agentes de unión son biotina, y el primer y segundo agentes de unión suplementarios son estreptavidina o avidina; o (b) el primer y segundo agentes de unión son estreptavidina o avidina, y el primer y segundo agentes de unión suplementarios son biotina; o
    si se incluye el agente de puente, el agente de puente es estreptavidina o avidina, y el primer y segundo agentes de unión y el primer y segundo agentes de unión suplementarios, son cada uno biotina;
    (b) formando
    (i) un primer complejo de unión en el primer dominio de unión, que comprende el primer agente de direccionamiento, el primer complemento de agente de direccionamiento, el primer reactivo de unión, el primer reactivo de detección y el primer analito, y (ii) un segundo complejo de unión en el segundo dominio de unión, que comprende el segundo agente de direccionamiento, el segundo complemento de agente de direccionamiento, el segundo reactivo de unión, el segundo reactivo de detección y el segundo analito, en donde el par de oligonucleótidos complementario colocado en cada uno de los dominios de unión primero y segundo, es diferente, y
    (c) medir la cantidad del primer y segundo analitos en el primer y segundo dominios de unión, respectivamente, midiendo la presencia de los marcadores detectables, mediante electroquimioluminiscencia.
    El método según la reivindicación 1, en donde la muestra contiene uno o más analitos adicionales de interés, y para cada analito adicional de interés, la etapa de combinación (a) comprende, además,
    combinar, en una o más etapas, (xi) un agente de direccionamiento adicional, inmovilizado en un dominio de unión adicional, un complemento de agente de direccionamiento adicional, conectado a un agente de unión adicional, y un reactivo de unión adicional conectado a un agente de unión adicional, y (xii) un complejo de unión adicional en el dominio de unión adicional, que comprende el agente de direccionamiento adicional, el complemento de agente de direccionamiento adicional, el reactivo de unión adicional y el analito adicional;
    la etapa de formación (b) comprende, además, formar (iii) un complejo de unión adicional en el dominio de unión adicional, que comprende el agente de direccionamiento adicional, el complemento de agente de direccionamiento adicional, el reactivo de unión adicional y el analito adicional; y la medición en la etapa (c) comprende, además, medir la cantidad del analito adicional en el dominio de unión adicional.
    3. El método según la reivindicación 1, en donde
    el primer complemento de agente de direccionamiento y el primer reactivo de unión se proporcionan como un primer complejo de direccionamiento previamente unido, que comprende el primer complemento de agente de direccionamiento y el primer reactivo de unión, unido a través de una interacción de unión entre el primer agente de unión y el primer agente de enlace suplementario; y el segundo complemento de agente de direccionamiento y el segundo reactivo de unión se proporcionan como un segundo complejo de direccionamiento previamente unido, que comprende el segundo complemento de agente de direccionamiento y el segundo reactivo de unión, unido a través de una interacción de unión entre el segundo agente de unión y el segundo agente de unión suplementario.
    4. El método según la reivindicación 1, en donde la etapa (a) comprende las siguientes etapas, en cualquier orden:
    combinar, en un primer volumen de líquido, dicho primer complemento de agente de direccionamiento, dicho primer reactivo de unión y, si se usa, dicho reactivo de puente, y unir dicho primer complemento de agente de direccionamiento y dicho primer reactivo de unión, a través de su primer agente de unión unido y el primer agente de unión suplementario, para formar un primer complejo de direccionamiento; y
    combinar, en un segundo volumen de líquido, dicho segundo complemento de agente de direccionamiento, dicho segundo reactivo de unión y, si se usa, dicho reactivo de puente, y unir dicho segundo complemento complejo de agente de direccionamiento y dicho segundo reactivo de unión, a través de su segundo agente de unión unido y segundo agente de unión suplementario, para formar un segundo complejo de direccionamiento.
    5. El método según la reivindicación 1, en donde el método comprende realizar un ensayo de unión de tipo sándwich.
    6. El método según la reivindicación 1, en donde el método comprende realizar un ensayo de unión competitiva.
    7. El procedimiento según la reivindicación 1, en donde los componentes combinados en la etapa (a) comprenden, además, (xi) un primer reactivo de detección, que compite con el primer analito para unirse al primer reactivo de unión, y (xii) un segundo reactivo de detección, que compite con el segundo analito para unirse al segundo reactivo de unión.
    8. El método según las reivindicaciones 1 o 2, en donde hay al menos 10 dominios de unión.
    9. El método según las reivindicaciones 1 o 2, en donde la reactividad cruzada observada de un analito de interés, para los reactivos de unión ubicados en un dominio de unión no específico, es inferior al 0,5 % de la unión a los reactivos de unión en el dominio de unión asignado a ese analito.
    10. El método según las reivindicaciones 1 o 2, en donde la reactividad cruzada observada de un analito de interés, para los reactivos de unión ubicados en un dominio de unión no específico, es inferior al 0,1 % de la unión a los reactivos de unión en el dominio de unión asignado a ese analito.
    11. El método según la reivindicación 4, en donde la etapa (a) comprende, además, las siguientes etapas, en cualquier orden:
    combinar dichos primer y segundo complejos de direccionamiento,
    poner en contacto la combinación de dichos primer y segundo complejos de direccionamiento, con dichos primer y segundo dominios de unión, y
    unir dicho primer complejo de direccionamiento a dicho primer agente de direccionamiento, en dicho primer dominio de unión, y unir dicho segundo complejo de direccionamiento a dicho segundo agente de direccionamiento, en dicho segundo dominio de unión.
    12. El método según una cualquiera de las reivindicaciones 3 o 4, en donde la etapa de combinación (a) comprende, además, las siguientes etapas, en cualquier orden:
    combinar el primer y segundo complejos de direccionamiento, con la muestra, para formar una mezcla de los mismos,
    unir el primer analito al primer reactivo de unión, en el primer complejo de direccionamiento, y unir el segundo analito al segundo reactivo de unión, en el segundo complejo de direccionamiento, poner en contacto una mezcla de los complejos de direccionamiento primero y segundo, unidos a analitos primero y segundo, respectivamente, con el primer y segundo dominios de unión; y unir el primer complejo de direccionamiento al primer agente de direccionamiento, en el primer dominio de unión, y unir el segundo complejo de direccionamiento al segundo agente de direccionamiento, en el segundo dominio de unión.
    13. El método según la reivindicación 12, en donde el primer y segundo complejos de direccionamiento se combinan con la muestra, antes de poner en contacto el primer y segundo complejos de direccionamiento, con el primer y segundo dominios de unión.
    14. El método según la reivindicación 12, en donde el primer y segundo complejos de direccionamiento se combinan con la muestra, después de poner en contacto el primer y segundo complejos de direccionamiento, con el primer y segundo dominios de unión.
    15. El método según la reivindicación 12, en donde el primer y segundo complejos de direccionamiento se combinan con la muestra, y se ponen en contacto con el primer y segundo dominios de unión, al mismo tiempo.
    16. El método según la reivindicación 3, en donde la etapa (a) comprende, además, las siguientes etapas, en cualquier orden:
    poner en contacto dichos primer y segundo complejos de direccionamiento, en dichos primer y segundo dominios de unión, con dicha muestra,
    unir dicho primer analito al primer reactivo de unión, en dicho primer complejo de direccionamiento, y
    unir dicho segundo analito a dicho segundo reactivo de unión, en dicho segundo complejo de direccionamiento.
    17. El método según la reivindicación 1, en donde el primer y segundo reactivos de unión comprenden cada uno un receptor, ligando, anticuerpo, hapteno, antígeno, epítopo, mimítopo, aptámero, o un intercalador capaz de unirse a dichos primer y segundo analitos, respectivamente.
    18. El método según la reivindicación 1, en donde el primer y segundo reactivos de unión son antígenos, los analitos son anticuerpos contra los antígenos, y los reactivos de detección comprenden anticuerpos antiinmunoglobulina, proteína A, proteína G o proteína L.
    19. El método según la reivindicación 1, en donde los dominios de unión primero y segundo se colocan en un electrodo, y la etapa de medición comprende, además, aplicar una forma de onda de voltaje al electrodo, para generar electroquimioluminiscencia.
    20. El procedimiento según la reivindicación 1, en donde cada uno de los dominios de unión primero y segundo, es un elemento de una serie de dominios de unión.
    21. El método según la reivindicación 20, en donde la matriz se ubica dentro de un pocillo de una placa de múltiples pocillos.
    22. El método según la reivindicación 1, en donde cada uno de los dominios de unión primero y segundo se coloca cada uno sobre una superficie de una o más micropartículas.
    23. El método según la reivindicación 22, en donde las partículas se codifican para permitir la identificación de partículas específicas, y la discriminación entre el primer y segundo dominios de unión.
    24. El método según la reivindicación 1, en donde el par de oligonucleótidos complementarios colocado en cada uno de los dominios de unión primero y segundo, se selecciona de:
    Figure imgf000033_0001
    Figure imgf000034_0001
    25. El método según la reivindicación 24, en donde hay al menos 7 dominios de unión.
    26. El método según la reivindicación 24, en donde hay al menos 16 dominios de unión.
    27. El método según la reivindicación 24, en donde hay al menos 25 dominios de unión.
    28. El método según las reivindicaciones 1 o 2, en donde cada uno de los primeros y segundos agentes de direccionamiento complementarios, se une selectivamente a uno de los dominios de unión primero y segundo, respectivamente.
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