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CN120098057A - 用于免疫方法的被电化学发光标记的探针、使用这类探针的方法和包含这类探针的试剂盒 - Google Patents

用于免疫方法的被电化学发光标记的探针、使用这类探针的方法和包含这类探针的试剂盒 Download PDF

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CN120098057A
CN120098057A CN202510162120.XA CN202510162120A CN120098057A CN 120098057 A CN120098057 A CN 120098057A CN 202510162120 A CN202510162120 A CN 202510162120A CN 120098057 A CN120098057 A CN 120098057A
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CN
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analyte
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CN202510162120.XA
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J·肯坦
M·赫格斯
G·西加尔
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Meso Scale Technologies LLC
Original Assignee
Meso Scale Technologies LLC
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Publication date
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Abstract

本发明涉及被标记的探针。本发明还涉及分析方法和用于这类分析的化合物和试剂盒。

Description

用于免疫方法的被电化学发光标记的探针、使用这类探针的 方法和包含这类探针的试剂盒
本申请是CN202080032283.1的分案申请。
技术领域
序列表
本申请案含有序列表，其已以ASCII格式、以电子方式提交且以全文引用的方式并入本文中。2020年2月26日创建的ASCII拷贝名为0076-0010WO1_SL.txt且大小为12,578个位元组。
本发明涉及进行免疫分析的方法。方法被设计成放大免疫分析信号和锚定其中采用的免疫分析复合物。
背景技术
关于采用结合反应，例如抗原-抗体反应、核酸杂交和受体-配体反应进行样品中所关注分析物的灵敏测量的技术，已开发了大量的文献。许多生物化学结合系统中高程度的特异性已在包含基础研究、人类和兽医诊断学、环境监测和工业测试的多种市场中产生了许多有价值的分析方法和系统。所关注分析物的存在可以通过直接测量分析物在结合反应中的参与来测量。在一些方法中，这种参与可以通过测量连接至结合材料中的一种或多种的可观察标记来指示。
尽管夹心免疫分析形式在许多应用中提供极佳灵敏度和特异性，但一些分析物以对于通过常规免疫分析技术检测来说过低的浓度存在。夹心免疫分析的性能还可以受检测抗体的非特异性结合和包括高解离速率抗体的夹心复合物的不稳定性限制。然而，改良常规免疫分析技术以提高灵敏度和特异性的努力通常产生更复杂、劳力密集的方案，其可能受可以极大影响分析的灵敏度和特异性的各步骤的低效率阻碍。举例来说，在需要多个结合事件和/或反应的复杂分析中，如果任一事件或反应不太理想，那么总体分析的灵敏度和特异性可受损。
发明内容
本发明涵盖以下具体实施例。所属领域的技术人员可以在不脱离本发明的精神和范围的情况下对本文所述的实施例作出各种修改、添加和改变。这类修改、添加和改变意图属于权利要求书的范围内。
实施例(1)：一种检测样品中的所关注分析物的方法，其包括：将分析物结合于：(i)包括用于分析物的捕捉试剂和锚定试剂的表面上的捕捉试剂；和(ii)连接至核酸探针的用于分析物的检测试剂；由此在表面上形成包括捕捉试剂、分析物和检测试剂的复合物；延伸探针以形成包括结合锚定试剂的锚定区的延伸序列；将延伸序列结合于锚定试剂；和测量结合于表面的延伸序列的量。
在实施例(1)中，捕捉试剂可以是抗体、抗原、配体、受体、寡核苷酸、半抗原、抗原决定基、模拟抗原决定基或适体。在具体实施例中，捕捉试剂是抗体。检测试剂可以是抗体、抗原、配体、受体、寡核苷酸、半抗原、抗原决定基、模拟抗原决定基或适体，且在具体实施例中，检测试剂是抗体。在实施例(1)的一个具体实例中，捕捉和检测试剂是针对分析物的抗体。锚定试剂可以包含寡核苷酸序列、适体、适体配体、抗体、抗原、配体、受体、半抗原、抗原决定基或模拟抗原决定基；且任选地，锚定区可以包含适体且锚定试剂可以包含适体配体。锚定区可以包括核酸序列且锚定试剂可以包含DNA结合蛋白。锚定区可以包含寡核苷酸序列且锚定试剂可以包含互补寡核苷酸序列。锚定区可以包含单股寡核苷酸序列或双股寡核苷酸序列。
实施例(1)的结合步骤可以进一步包含在锚定区与锚定试剂之间形成三螺旋。方法还可以进一步包括在结合步骤之前使锚定区变性以暴露单股序列；在结合步骤之前使锚定区暴露于解螺旋酶活性；和/或在结合步骤之前使锚定区暴露于核酸酶处理。在此实施例中，锚定区可以包括一个或多个被半抗原修饰的碱基且锚定试剂可以包含一个或多个对半抗原具有特异性的抗体；和/或锚定区可以包含一个或多个被配体修饰的碱基且锚定试剂可以包含一个或多个对配体具有特异性的受体。延伸序列可以进一步包括一个或多个检测序列且测量步骤可以包含使延伸序列与多个与一个或多个检测序列互补的被标记的探针接触；延伸序列可以包含一个或多个被修饰的碱基且测量步骤可以包含使延伸序列与多个能够结合于一个或多个被修饰的碱基的可检测部分接触；和/或延伸序列可以包括一个或多个被标记的碱基且测量步骤可以进一步包含检测一个或多个被标记的碱基的存在。在此实施例中，一个或多个被修饰的碱基包括适体、适体配体、抗体、抗原、配体、受体、半抗原、抗原决定基或模拟抗原决定基，且多个可检测部分各自包括一个或多个被修饰的碱基和可检测标记的结合搭配物。一个或多个被修饰的碱基可以包括抗生蛋白链菌素且多个可检测部分各自包括生物素和可检测标记；和/或一个或多个被修饰的碱基可以包括生物素且多个可检测部分各自包括抗生蛋白链菌素和可检测标记；和/或一个或多个被修饰的碱基可以包括抗生物素蛋白且多个可检测部分各自包括生物素和可检测标记；和/或一个或多个被修饰的碱基可以包括生物素且多个可检测部分各自包括抗生物素蛋白和可检测标记。
实施例(1)的第一步可以包括使分析物按以下次序与以下物质结合：(i)表面上的捕捉试剂；和(ii)用于分析物的检测试剂；或实施例(1)的第一步可以包括使分析物按以下次序与以下物质结合：(i)用于分析物的检测试剂；和(ii)表面上的捕捉试剂；和/或第一步可以包括使分析物同时或基本上同时与以下物质结合：(i)表面上的捕捉试剂；和(ii)用于分析物的检测试剂。
实施例(1)的延伸步骤可以包括使探针与环状核酸结合和通过滚环扩增来延伸环状模板。实施例(1)的延伸步骤可以包括使探针与模板核酸序列结合和通过聚合酶链反应延伸探针；和/或使探针与模板核酸序列结合，形成环状核酸模板(例如通过连接线性模板以形成环)，和通过滚环扩增延伸环状模板。在这些实施例中，延伸探针可以在探针延伸之后保持局限于表面上。在这类实施例中，探针可以是具有长度为14至24个核苷酸的探针序列的最佳化探针和/或模板可以是具有长度为53至76个核苷酸的模板序列的最佳化模板。因此，复合物可以在延伸步骤之后保持结合于表面，例如延伸探针在表面上的复合物的位置的10-100μm内的位置处结合于锚定试剂。在一个具体实施例中，延伸探针在表面上的复合物的位置的小于100μm、小于50μm或更具体地说，小于10μm的位置处结合于锚定试剂。
实施例(1)的延伸步骤可以包括PCR(聚合酶链反应)、LCR(连接酶链反应)、SDA(股置换扩增)、3SR(自持合成反应)或等温扩增方法。在一个实施例中，延伸步骤可以包含等温扩增方法，例如解螺旋酶依赖性扩增或滚环扩增(RCA)。
实施例(1)中提及的表面可以包括粒子和/或多孔盘的孔。表面可以包括多个不同的结合域且捕捉试剂和锚定试剂位于表面上的两个不同的结合域上。如果表面是盘的孔，那么孔可以包括多个不同的结合域且捕捉试剂和锚定试剂位于孔内的两个不同的结合域上；和/或表面可以包含多个不同的结合域且捕捉试剂和锚定试剂位于表面上的相同结合域上。在一个实施例中，孔可以包含多个不同的结合域且捕捉试剂和锚定试剂位于孔内的相同结合域上。捕捉试剂和锚定试剂可以在表面上的10-100nm内。表面可以包含电极且测量步骤进一步可以包含向电极施加电压波形以产生电化学发光信号，且任选地，方法包含收集电极上的粒子和向电极施加电压波形以产生电化学发光信号。
实施例(1)的测量步骤可以进一步包括使延伸序列与具有可检测标记的检测探针结合、测量可检测标记和将测量值与样品中分析物的量相关联，其中检测探针包括与延伸序列的区域互补的核酸序列。可检测标记可以通过测量光散射、吸光度、荧光、化学发光、电化学发光、生物发光、磷光、放射性、磁场或其组合来测量。在实施例(1)的具体实例中，可检测标记是ECL标记且测量步骤可以包含测量ECL信号。检测探针可以具有多个ECL标记。检测探针可以通过探针核苷酸组分的3'端处的键与多重ECL标记部分连接。
实施例(2)：一种用于检测样品中的所关注分析物的试剂盒，其在一个或多个小瓶、容器或隔室中包括：(a)包括(i)用于分析物的捕捉试剂和(ii)锚定试剂的表面；和(b)连接至核酸探针的用于分析物的检测试剂。
实施例(2)的锚定试剂可以包括寡核苷酸序列、适体、适体配体、抗体、抗原、配体、受体、半抗原、抗原决定基或模拟抗原决定基，且捕捉试剂可以包括抗体、抗原、配体、受体、寡核苷酸、半抗原、抗原决定基、模拟抗原决定基或适体。在具体实施例中，捕捉试剂可以包含抗体和/或检测试剂可以包含抗体、抗原、配体、受体、寡核苷酸、半抗原、抗原决定基、模拟抗原决定基或适体。在试剂盒的具体实施例中，检测试剂是抗体。
实施例(2)的试剂盒的表面可以包含粒子和/或多孔盘的孔。表面可以包括多个不同的结合域且捕捉试剂和锚定试剂位于表面上的两个不同的结合域上。如果试剂盒的表面是盘的孔，那么表面可以包括多个不同的结合域且捕捉试剂和锚定试剂位于孔内的两个不同的结合域上；和/或表面可以包含多个不同的结合域且捕捉试剂和锚定试剂位于表面上的相同结合域上。在试剂盒的具体实例中，表面是孔且孔可以包含多个不同的结合域且捕捉试剂和锚定试剂位于孔内的相同结合域上。捕捉试剂和锚定试剂可以在表面上的10-100nm内。此外，试剂盒的表面可以包括电极。
实施例(3)：一种检测样品中的所关注分析物的方法，其包括：(a)将分析物结合于：(i)包括用于分析物的捕捉试剂和包括锚定寡核苷酸序列的锚定试剂的表面上的捕捉试剂；和(ii)连接至核酸探针的用于分析物的检测试剂；由此在表面上形成包括捕捉试剂、分析物和检测试剂的复合物；(b)延伸探针以形成包括与锚测序列互补的锚测序列补体的延伸序列；(c)使锚测序列与锚测序列补体杂交；和(d)测量结合于表面的延伸序列的量。
在实施例(3)中，捕捉试剂可以是抗体、抗原、配体、受体、寡核苷酸、半抗原、抗原决定基、模拟抗原决定基或适体，且在具体实例中，捕捉试剂是抗体。同样，检测试剂是抗体、抗原、配体、受体、寡核苷酸、半抗原、抗原决定基、模拟抗原决定基或适体，且在实施例(3)的具体实例中，检测试剂是抗体。在实施例(3)的一个实例中，捕捉和检测试剂是针对分析物的抗体。锚定寡核苷酸序列可以包括单股寡核苷酸序列或双股寡核苷酸序列。延伸序列可以进一步包括一个或多个检测序列且测量步骤进一步可以包含使延伸序列与多个与一个或多个检测序列互补的被标记的探针接触；或者或另外，延伸序列进一步可以包含一个或多个被修饰的碱基且测量步骤进一步可以包含使延伸序列与多个能够与一个或多个被修饰的碱基结合的可检测部分接触。在具体实例中，延伸序列进一步可以包含一个或多个被标记的碱基且测量步骤进一步可以包含检测一个或多个被标记的碱基的存在。一个或多个被修饰的碱基包括适体、适体配体、抗体、抗原、配体、受体、半抗原、抗原决定基或模拟抗原决定基，且多个可检测部分各自包括一个或多个被修饰的碱基和可检测标记的结合搭配物。一个或多个被修饰的碱基可以包括抗生蛋白链菌素且多个可检测部分各自包括生物素和可检测标记；一个或多个被修饰的碱基包括生物素且多个可检测部分各自包括抗生蛋白链菌素和可检测标记；一个或多个被修饰的碱基包括抗生物素蛋白且多个可检测部分各自包括生物素和可检测标记；和/或一个或多个被修饰的碱基包括生物素且多个可检测部分各自包括抗生物素蛋白和可检测标记。
实施例(3)的步骤(a)可以包含使分析物按以下次序与以下物质结合：(i)表面上的捕捉试剂；和(ii)用于分析物的检测试剂。或者，步骤(a)可以包含使分析物按以下次序与以下物质结合：(i)用于分析物的检测试剂；和(ii)表面上的捕捉试剂。在另一实例中，步骤(a)可以包含使分析物同时或基本上同时与以下物质结合：(i)表面上的捕捉试剂；和(ii)用于分析物的检测试剂。
实施例(3)的延伸步骤可以包含使探针与模板核酸序列结合和通过聚合酶链反应延伸探针。或者，延伸步骤可以包含使探针与模板环状核酸结合和通过滚环扩增来延伸环状模板。或者，延伸步骤可以包含使探针与模板核酸序列结合、形成环状核酸模板(例如通过连接)和通过滚环扩增延伸环状模板。在这类实施例中，探针可以是具有长度为14至24个核苷酸的探针序列的最佳化探针和/或模板可以是具有长度为53至76个核苷酸的模板序列的最佳化模板。延伸探针可以在探针延伸之后保持局限于表面上，例如复合物在延伸步骤之后保持与表面结合。在一个实例中，延伸探针在表面上的复合物的位置的10-100μm内的位置处结合于锚定试剂。在一个具体实施例中，延伸探针在表面上的复合物的位置的小于100μm、小于50μm或更具体地说，小于10μm的位置处结合于锚定试剂。在此具体实施例中，延伸步骤可以包含PCR(聚合酶链反应)、LCR(连接酶链反应)、SDA(股置换扩增)、3SR(自持合成反应)或等温扩增方法。举例来说，延伸步骤可以包含等温扩增方法，例如解螺旋酶依赖性扩增或滚环扩增(RCA)。
实施例(3)的表面可以包括粒子和/或多孔盘的孔。表面可以包括多个不同的结合域且捕捉试剂和锚定试剂位于表面上的两个不同的结合域上。如果表面是盘的孔，那么其可以包括多个不同的结合域且捕捉试剂和锚定试剂位于孔内的两个不同结合域上。表面可以包括多个不同的结合域且捕捉试剂和锚定试剂位于表面上的相同结合域上。如果表面是孔，那么其可以包括多个不同的结合域且捕捉试剂和锚定试剂位于孔内的相同结合域上。捕捉试剂和锚定试剂可以在表面上的10-100nm内。在具体实例中，表面可以包含电极且测量步骤进一步可以包含向电极施加电压波形以产生电化学发光信号。方法可以进一步包含收集电极上的粒子和向电极施加电压波形以产生电化学发光信号。测量步骤可以进一步包括使延伸序列与具有可检测标记的检测探针结合、测量可检测标记和将测量值与样品中分析物的量相关联，其中检测探针包括与延伸序列的区域互补的核酸序列。在此实施例中，可检测标记是通过测量光散射、吸光度、荧光、化学发光、电化学发光、生物发光、磷光、放射性、磁场或其组合来测量。举例来说，可检测标记是ECL标记且测量步骤可以包含测量ECL信号。检测探针可以具有多个ECL标记。检测探针可以通过探针核苷酸组分的3'端处的键与多重ECL标记部分连接。
实施例(4)：一种检测样品中的所关注分析物的试剂盒，其在一个或多个小瓶、容器或隔室中包括：(a)包括(i)用于分析物的捕捉试剂和(ii)包括锚定寡核苷酸序列的锚定试剂的表面；和(b)连接至核酸探针的用于分析物的检测试剂。
实施例(4)的试剂盒包含捕捉试剂，所述捕捉试剂包括抗体、抗原、配体、受体、寡核苷酸、半抗原、抗原决定基、模拟抗原决定基或适体。在具体实例中，捕捉试剂可以包含抗体。同样，检测试剂可以包含抗体、抗原、配体、受体、寡核苷酸、半抗原、抗原决定基、模拟抗原决定基或适体，且具体来说，检测试剂可以包含抗体。
实施例(4)的试剂盒包含可以包括粒子和/或多孔盘的孔的表面。表面可以包含多个不同的结合域且捕捉试剂和锚定试剂位于表面上的两个不同的结合域上。如果表面是孔，那么孔可以包含多个不同的结合域且捕捉试剂和锚定试剂位于孔内的两个不同结合域上。表面可以包括多个不同的结合域且捕捉试剂和锚定试剂位于表面上的相同结合域上，例如如果表面是孔，那么孔可以包含多个不同的结合域且捕捉试剂和锚定试剂位于孔内的相同结合域上。举例来说，捕捉试剂和锚定试剂在表面上的10-100nm内。实施例(4)的表面可以包含电极。
实施例(5)：一种检测样品中的所关注分析物的方法，其包括：(a)将分析物结合于：(i)包括用于分析物的捕捉试剂和包括锚定寡核苷酸序列的锚定试剂的表面上的捕捉试剂；(ii)连接至第一核酸探针的用于分析物的第一检测试剂；和(iii)连接至第二核酸探针的用于分析物的第二检测试剂；由此在表面上形成包括结合试剂、分析物以及第一和第二检测试剂的复合物；(b)使用需要第一和第二探针邻近的延伸方法来延伸第二探针以形成包括与锚测序列互补的锚测序列补体的延伸序列；(c)使锚测序列与锚测序列补体杂交；和(d)测量与表面结合的延伸序列的量。
实施例(5)的捕捉试剂可以是抗体、抗原、配体、受体、寡核苷酸、半抗原、抗原决定基、模拟抗原决定基或适体。在具体实例中，捕捉试剂是抗体。同样，第一检测试剂是抗体、抗原、配体、受体、寡核苷酸、半抗原、抗原决定基、模拟抗原决定基或适体，且在具体实例中，第一检测试剂是抗体。第二检测试剂可以是抗体、抗原、配体、受体、寡核苷酸、半抗原、抗原决定基、模拟抗原决定基或适体，且在具体实例中，第二检测试剂是抗体。更具体地说，捕捉试剂和第一和第二检测试剂是针对分析物的抗体。
在实施例(5)中，锚定寡核苷酸序列可以包含单股寡核苷酸序列或双股寡核苷酸序列。在此实施例中，延伸序列进一步可以包含一个或多个检测序列且测量步骤进一步可以包含使延伸序列与多个与一个或多个检测序列互补的被标记的探针接触。延伸序列还可以包含一个或多个被修饰的碱基且测量步骤进一步可以包含使延伸序列与多个能够结合于一个或多个被修饰的碱基的可检测部分接触。延伸序列可以进一步包括一个或多个被标记的碱基且测量步骤进一步可以包含检测一个或多个被标记的碱基的存在。一个或多个被修饰的碱基可以包括适体、适体配体、抗体、抗原、配体、受体、半抗原、抗原决定基或模拟抗原决定基，且多个可检测部分各自包括一个或多个被修饰的碱基和可检测标记的结合搭配物。举例来说，一个或多个被修饰的碱基包括抗生蛋白链菌素且多个可检测部分各自包括生物素和可检测标记；一个或多个被修饰的碱基包括生物素且多个可检测部分各自包括抗生蛋白链菌素和可检测标记；一个或多个被修饰的碱基包括抗生物素蛋白且多个可检测部分各自包括生物素和可检测标记；和/或一个或多个被修饰的碱基包括生物素且多个可检测部分各自包括抗生物素蛋白和可检测标记。
实施例(5)的步骤(a)可以包含使分析物按以下次序与以下物质结合：(i)表面上的捕捉试剂；和(ii)用于分析物的检测试剂。或者，步骤(a)可以包含使分析物按以下次序与以下物质结合：(i)用于分析物的检测试剂；和(ii)表面上的捕捉试剂；或步骤(a)可以包含使分析物同时或基本上同时与以下物质结合：(i)表面上的捕捉试剂；和(ii)用于分析物的检测试剂。
实施例(5)的延伸步骤可以包含使探针与模板核酸序列结合和通过聚合酶链反应延伸探针。延伸步骤可以进一步包含使探针与模板核酸序列结合、形成环状核酸模板和通过滚环扩增延伸环状模板。延伸探针可以在探针延伸之后保持局限于表面上，例如复合物在延伸步骤之后保持与表面结合。延伸探针可以在表面上的复合物的位置的10-100μm内的位置处结合于锚定试剂。在一个具体实施例中，延伸探针在距表面上的复合物的位置小于100μm、小于50μm或更具体地说，小于10μm的位置处结合于锚定试剂。延伸步骤可以包含PCR(聚合酶链反应)、LCR(连接酶链反应)、SDA(股置换扩增)、3SR(自持合成反应)或等温扩增方法。在具体实例中，延伸步骤可以包含等温扩增方法，例如解螺旋酶依赖性扩增或滚环扩增(RCA)。
实施例(5)的延伸方法可以包含使步骤(a)中形成的复合物与包括以下的连接序列接触：(i)与第二探针互补的内部序列和(ii)与第一探针的不重叠区域互补的两个末端序列。方法可以进一步包含将连接寡核苷酸的两个末端序列连接以形成与第一和第二探针两者杂交的环状目标序列。或者，延伸方法可以包含使实施例(5)的步骤(a)中形成的复合物与以下各者接触：包含与第一探针的第一区域和第二探针上的第一区域互补的第一连接探针序列的第一连接寡核苷酸序列，和包括与第一探针的第二不重叠区域和第二探针的第二不重叠区域互补的第二探针序列的第二连接寡核苷酸；和任选地，连接第一和第二连接寡核苷酸以形成与第一和第二探针两者杂交的环状目标序列。
实施例(5)的表面可以包含粒子和/或多孔盘的孔。表面可以包含多个不同的结合域且捕捉试剂和锚定试剂位于表面上的两个不同的结合域上。如果表面是盘的孔，那么孔可以包含多个不同的结合域且捕捉试剂和锚定试剂位于孔内的两个不同结合域上。表面还可以包含多个不同的结合域且捕捉试剂和锚定试剂位于表面上的相同结合域上。如果表面是盘的孔，那么孔可以包含多个不同的结合域且捕捉试剂和锚定试剂位于孔内的相同结合域上。捕捉试剂和锚定试剂可以在表面上的10-100nm内。在具体实例中，表面可以包含电极且测量步骤进一步可以包含向电极施加电压波形以产生电化学发光信号，且任选地，实施例(5)的方法进一步包含收集电极上的粒子和向电极施加电压波形以产生电化学发光信号。
实施例(5)的测量步骤进一步可以包含使延伸序列与具有可检测标记的检测探针结合、测量可检测标记和将测量值与样品中分析物的量相关联，其中检测探针包括与延伸序列的区域互补的核酸序列。可检测标记可以通过测量光散射、吸光度、荧光、化学发光、电化学发光、生物发光、磷光、放射性、磁场或其组合来测量。在具体实例中，可检测标记是ECL标记且测量步骤可以包含测量ECL信号。检测探针可以具有多个ECL标记。检测探针可以通过探针核苷酸组分的3'端处的键与多重ECL标记部分连接。
实施例(6)：一种检测样品中的所关注分析物的试剂盒，其在一个或多个小瓶、容器或隔室中包括：(a)包括(i)用于分析物的捕捉试剂和(ii)包括锚定寡核苷酸序列的锚定试剂的表面；(b)连接至第一核酸探针的用于分析物的第一检测试剂；和(c)连接至第二核酸探针的用于分析物的第二检测试剂。
实施例(6)的捕捉试剂可以包含抗体、抗原、配体、受体、寡核苷酸、半抗原、抗原决定基、模拟抗原决定基或适体，且在具体实例中，捕捉试剂可以包含抗体。同样，第一检测试剂可以包含抗体、抗原、配体、受体、寡核苷酸、半抗原、抗原决定基、模拟抗原决定基或适体，且在具体实例中，第一检测试剂可以包含抗体。类似地，第二检测试剂可以包含抗体、抗原、配体、受体、寡核苷酸、半抗原、抗原决定基、模拟抗原决定基或适体，且在具体实例中，第二检测试剂可以包含抗体。
实施例(6)的表面可以包括粒子和/或多孔盘的孔。表面可以包含多个不同的结合域且捕捉试剂和锚定试剂位于表面上的两个不同的结合域上。如果表面是孔，那么孔可以包括多个不同的结合域且捕捉试剂和锚定试剂位于孔内的两个不同结合域上。表面可以包含多个不同的结合域且捕捉试剂和锚定试剂位于表面上的相同结合域上；和/或如果表面是孔，那么孔可以包含多个不同的结合域且捕捉试剂和锚定试剂位于孔内的相同结合域上。捕捉试剂和锚定试剂可以在表面上的10-100nm内。在具体实例中，表面可以包含电极。
实施例(7)：一种检测样品中的所关注分析物的方法，其包括：(a)将分析物结合于：(i)包括捕捉试剂和锚定试剂的表面上的用于分析物的捕捉试剂；(ii)包括第一邻近探针的用于分析物的第一检测试剂，和(iii)包括第二邻近探针的用于分析物的第二检测试剂；由此在表面上形成包括捕捉试剂、分析物以及第一和第二检测试剂的检测复合物；(b)使(c)中形成的检测复合物与包括以下的连接序列接触：(i)与第二邻近探针互补的内部序列和(ii)与第一邻近探针的不重叠区域互补的两个末端序列；(c)使连接序列与第一和第二邻近探针杂交；(d)将连接寡核苷酸的两个末端序列连接以形成与第一和第二邻近探针两者杂交的环状目标序列；(e)通过目标序列的滚环扩增延伸第二邻近探针以产生包括结合锚定试剂的结合域的扩增子；(f)使扩增子与锚定试剂结合；和(g)测量表面上的扩增子的量。
实施例(8)：一种检测样品中的所关注分析物的方法，其包括：(a)将分析物结合于：(i)包括捕捉试剂和锚定试剂的表面上的用于分析物的捕捉试剂；(ii)包括第一邻近探针的用于分析物的第一检测试剂，和(iii)包括第二邻近探针的用于分析物的第二检测试剂；由此在表面上形成包括捕捉试剂、分析物以及第一和第二检测试剂的检测复合物；(b)使(c)中形成的检测复合物与第一连接寡核苷酸和第二连接寡核苷酸接触，其中(i)第一连接子的第一端和第二连接子的第一端与第一邻近探针的两个不重叠区域互补，和(ii)第一连接子的第二端和第二连接子的第二端与第一邻近探针的两个不重叠区域互补；(c)使第一和第二连接寡核苷酸与第一和第二邻近探针杂交；(d)连接第一和第二连接寡核苷酸以形成与第一和第二邻近探针两者杂交的环状目标序列；(e)通过目标序列的滚环扩增延伸第二邻近探针，以产生包括结合锚定试剂的结合域的扩增子；(f)将扩增子与锚定试剂结合；和(g)测量表面上的扩增子的量。
实施例(7)和(8)的捕捉试剂可以是抗体、抗原、配体、受体、寡核苷酸、半抗原、抗原决定基、模拟抗原决定基或适体，且在具体实例中，捕捉试剂是抗体。类似地，第一检测试剂可以是抗体、抗原、配体、受体、寡核苷酸、半抗原、抗原决定基、模拟抗原决定基或适体，例如第一检测试剂是抗体。另外，第二检测试剂是抗体、抗原、配体、受体、寡核苷酸、半抗原、抗原决定基、模拟抗原决定基或适体，例如第二检测试剂是抗体。在实施例(7)和(8)的具体实例中，捕捉试剂和第一和第二检测试剂是针对分析物的抗体。
实施例(7)和(8)的锚定试剂可以包含寡核苷酸序列、适体、适体配体、抗体、抗原、配体、受体、半抗原、抗原决定基或模拟抗原决定基。在一个实例中，结合域可以包含适体且锚定试剂可以包含适体配体。结合域可以包含核酸序列且锚定试剂可以包含DNA结合蛋白；和/或锚定试剂可以包含寡核苷酸序列且扩增子可以包含互补寡核苷酸序列。
实施例(7)和(8)的扩增子可以进一步包括一个或多个检测序列且测量步骤可以进一步包括使延伸序列与多个与一个或多个检测序列互补的被标记的探针接触。此外，扩增子可以进一步包括一个或多个被修饰的碱基且测量步骤进一步可以包含使延伸序列与多个能够结合于一个或多个被修饰的碱基的可检测部分接触。另外，扩增子可以进一步包含一个或多个被标记的碱基且测量步骤进一步可以包含检测一个或多个被标记的碱基的存在。一个或多个被修饰的碱基可以包括适体、适体配体、抗体、抗原、配体、受体、半抗原、抗原决定基或模拟抗原决定基，且多个可检测部分各自包括一个或多个被修饰的碱基和可检测标记的结合搭配物。一个或多个被修饰的碱基可以包括抗生蛋白链菌素且多个可检测部分各自包括生物素和可检测标记；一个或多个被修饰的碱基可以包括生物素且多个可检测部分各自包括抗生蛋白链菌素和可检测标记；一个或多个被修饰的碱基可以包括抗生物素蛋白且多个可检测部分各自包括生物素和可检测标记；和/或一个或多个被修饰的碱基可以包括生物素且多个可检测部分各自包括抗生物素蛋白和可检测标记。
实施例(7)和(8)的步骤(a)可以包括使分析物按以下次序与以下物质结合：(i)表面上的捕捉试剂；和(ii)用于分析物的第一和第二检测试剂。或者，步骤(a)可以包含使分析物按以下次序与以下物质结合：(i)用于分析物的第一和第二检测试剂；和(ii)表面上的捕捉试剂。另外，步骤(a)可以包含使分析物同时或基本上同时与以下物质结合：(i)表面上的捕捉试剂；和(ii)用于分析物的第一和第二检测试剂。
实施例(7)和(8)的扩增子可以在探针延伸之后保持局限于表面上。复合物可以在延伸步骤之后保持与表面结合。举例来说，扩增子在表面上的复合物的位置的10-100μm内的位置处结合于锚定试剂。在一个具体实施例中，延伸探针在表面上的复合物的位置的小于100μm、小于50μm或更具体地说，小于10μm的位置处结合于锚定试剂。
实施例(7)和(8)的表面可以包含粒子和/或多孔盘的孔。表面可以包含多个不同的结合域且捕捉试剂和锚定试剂位于表面上的两个不同的结合域上。如果表面是盘的孔，那么孔可以包括多个不同的结合域且捕捉试剂和锚定试剂位于孔内的两个不同结合域上。表面可以包含多个不同的结合域且捕捉试剂和锚定试剂位于表面上的相同结合域上。如果表面是盘的孔，那么孔可以包含多个不同的结合域且捕捉试剂和锚定试剂位于孔内的相同结合域上。在具体实例中，捕捉试剂和锚定试剂在表面上的10-100nm内。
另外，表面可以包含电极且测量步骤可以包含向电极施加电压波形以产生电化学发光信号。在这些实施例((7)和(8))中，方法可以进一步包含收集电极上的粒子和向电极施加电压波形以产生电化学发光信号。测量步骤可以包含使扩增子与具有可检测标记的检测探针结合、测量可检测标记和将测量值与样品中分析物的量相关联，其中检测探针包括与扩增子的区域互补的核酸序列。可检测标记是通过测量光散射、吸光度、荧光、化学发光、电化学发光、生物发光、磷光、放射性、磁场或其组合来测量。举例来说，可检测标记是ECL标记且测量步骤可以包含测量ECL信号。检测探针可以具有多个ECL标记。检测探针可以通过探针核苷酸组分的3'端处的键与多重ECL标记部分连接。
实施例(9)：一种检测样品中的所关注分析物的试剂盒，其在一个或多个小瓶、容器或隔室中包括：(a)包括(i)用于分析物的捕捉试剂和(ii)锚定试剂的表面；(b)包括第一邻近探针的用于分析物的第一检测试剂；(c)包括第二邻近探针的用于分析物的第二检测试剂；和(d)包括以下的连接序列：(i)与第二邻近探针互补的内部序列和(ii)与第一邻近探针的不重叠区域互补的两个末端序列。在实施例中，第一和第二邻近探针是核酸探针。
实施例(10)：一种检测样品中的所关注分析物的试剂盒，其在一个或多个小瓶、容器或隔室中包括：(a)包括(i)用于分析物的捕捉试剂和(ii)锚定试剂的表面；和(b)包括第一邻近探针的用于分析物的第一检测试剂；(c)包括第二邻近探针的用于分析物的第二检测试剂；和(d)(i)第一连接寡核苷酸和(ii)第二连接寡核苷酸，其中(x)第一连接子的第一端和第二连接子的第一端与第一邻近探针的两个不重叠区域互补，和(y)第一连接子的第二端和第二连接子的第二端与第一邻近探针的两个不重叠区域互补。在实施例中，第一和第二邻近探针是核酸探针。
实施例(9)和(10)的捕捉试剂可以包含抗体、抗原、配体、受体、寡核苷酸、半抗原、抗原决定基、模拟抗原决定基或适体。在具体实例中，捕捉试剂可以包含抗体。第一检测试剂可以包含抗体、抗原、配体、受体、寡核苷酸、半抗原、抗原决定基、模拟抗原决定基或适体，且在具体实例中，第一检测试剂可以包含抗体。第二检测试剂可以包含抗体、抗原、配体、受体、寡核苷酸、半抗原、抗原决定基、模拟抗原决定基或适体，且在具体实例中，第二检测试剂可以包含抗体。
实施例(9)和(10)的表面可以包含粒子和/或多孔盘的孔。表面可以包含多个不同的结合域且捕捉试剂和锚定试剂位于表面上的两个不同的结合域上。如果表面是盘的孔，那么孔可以包含多个不同的结合域且捕捉试剂和锚定试剂位于孔内的两个不同结合域上。表面可以包含多个不同的结合域且捕捉试剂和锚定试剂位于表面上的相同结合域上。如果表面是孔，那么孔可以包含多个不同的结合域且捕捉试剂和锚定试剂位于孔内的相同结合域上。在具体实例中，捕捉试剂和锚定试剂在表面上的10-100nm内。
实施例(9)和(10)的表面可以包含电极。
实施例(11)：一种检测样品中的所关注分析物的方法，其包括：(a)将分析物结合于：(i)包括捕捉试剂和包括锚定寡核苷酸序列的锚定试剂的表面上的用于分析物的捕捉试剂；(ii)包括第一邻近探针的用于分析物的第一检测试剂，和(iii)包括第二邻近探针的用于分析物的第二检测试剂；由此在表面上形成包括捕捉试剂、分析物以及第一和第二检测试剂的检测复合物；(b)使(c)中形成的检测复合物与包括以下的连接序列接触：(i)与第二邻近探针互补的内部序列，(ii)与第一邻近探针的不重叠区域互补的两个末端序列和(iii)匹配锚测序列的序列；(c)使连接序列与第一和第二邻近探针杂交；(d)将连接寡核苷酸的两个末端序列连接以形成与第一和第二邻近探针两者杂交的环状目标序列；(e)通过目标序列的滚环扩增延伸第二邻近探针，以产生包括多个与锚测序列互补的锚测序列补体的扩增子；(f)使锚测序列与锚测序列补体中的一个杂交；和(g)测量表面上的扩增子的量。在实施例中，第一和第二邻近探针是核酸探针。
实施例(12)：一种检测样品中的所关注分析物的方法，其包括：(a)将分析物结合于：(i)包括捕捉试剂和包括锚定寡核苷酸序列的锚定试剂的表面上的用于分析物的捕捉试剂；(ii)包括第一邻近探针的用于分析物的第一检测试剂，和(iii)包括第二邻近探针的用于分析物的第二检测试剂；由此在表面上形成包括捕捉试剂、分析物以及第一和第二检测试剂的检测复合物；(b)使(a)中形成的检测复合物与第一连接寡核苷酸和第二连接寡核苷酸接触，其中(i)第一连接子的第一端和第二连接子的第一端与第一邻近探针的两个不重叠区域互补，(ii)第一连接子的第二端和第二连接子的第二端与第一邻近探针的两个不重叠区域互补，和(iii)第一和/或第二连接子还包括匹配锚测序列的序列；(c)使第一和第二连接寡核苷酸与第一和第二邻近探针杂交；(d)连接第一和第二连接寡核苷酸以形成与第一和第二邻近探针两者杂交的环状目标序列；(e)通过目标序列的滚环扩增延伸第二邻近探针，以产生包括多个与锚测序列互补的锚测序列补体的扩增子；(f)使锚测序列与锚测序列补体中的一个杂交；和(g)测量表面上的扩增子的量。在实施例中，第一和第二邻近探针是核酸探针。
实施例(11)和(12)的捕捉试剂是抗体、抗原、配体、受体、寡核苷酸、半抗原、抗原决定基、模拟抗原决定基或适体。在具体实例中，捕捉试剂是抗体。第一检测试剂是抗体、抗原、配体、受体、寡核苷酸、半抗原、抗原决定基、模拟抗原决定基或适体，且在具体实例中，第一检测试剂是抗体。同样，第二检测试剂是抗体、抗原、配体、受体、寡核苷酸、半抗原、抗原决定基、模拟抗原决定基或适体，且在具体实例中，第二检测试剂是抗体。在一个实例中，第一和第二检测试剂是针对分析物的抗体。
实施例(11)和(12)的扩增子可以进一步包括一个或多个检测序列且测量步骤可以包含使延伸序列与多个与一个或多个检测序列互补的被标记的探针接触。此外，扩增子还可以包括一个或多个被修饰的碱基且测量步骤可以包含使延伸序列与多个能够结合于一个或多个被修饰的碱基的可检测部分接触。扩增子另外包含一个或多个被标记的碱基且测量步骤可以包含检测一个或多个被标记的碱基的存在。一个或多个被修饰的碱基包括适体、适体配体、抗体、抗原、配体、受体、半抗原、抗原决定基或模拟抗原决定基，且多个可检测部分各自包括一个或多个被修饰的碱基和可检测标记的结合搭配物。一个或多个被修饰的碱基可以包括抗生蛋白链菌素且多个可检测部分各自包括生物素和可检测标记；一个或多个被修饰的碱基可以包括生物素且多个可检测部分各自包括抗生蛋白链菌素和可检测标记；一个或多个被修饰的碱基可以包括抗生物素蛋白且多个可检测部分各自包括生物素和可检测标记；和/或一个或多个被修饰的碱基可以包含生物素且多个可检测部分各自包括抗生物素蛋白和可检测标记。
实施例(11)和(12)的步骤(a)可以包括使分析物按以下次序与以下物质结合：(i)表面上的捕捉试剂；和(ii)用于分析物的第一和第二检测试剂。或者，步骤(a)可以包含使分析物按以下次序与以下物质结合：(i)用于分析物的第一和第二检测试剂；和(ii)表面上的捕捉试剂。另外，步骤(a)可以包含使分析物同时或基本上同时与以下物质结合：(i)表面上的捕捉试剂；和(ii)用于分析物的第一和第二检测试剂。
实施例(11)和(12)中的扩增子可以在探针延伸之后保持局限于表面上，且任选地，复合物在延伸步骤之后保持与表面结合。举例来说，扩增子在表面上的复合物的位置的10-100μm内的位置处结合于锚定试剂。在一个具体实施例中，延伸探针在距表面上的复合物的位置小于100μm、小于50μm或更具体地说，小于10μm的位置处结合于锚定试剂。
实施例(11)和(12)的表面可以包含粒子和/或多孔盘的孔。任选地，表面可以包含多个不同的结合域且捕捉试剂和锚定试剂位于表面上的两个不同的结合域上。如果表面是孔，那么孔可以包含多个不同的结合域且捕捉试剂和锚定试剂位于孔内的两个不同结合域上。表面可以包含多个不同的结合域且捕捉试剂和锚定试剂位于表面上的相同结合域上。如果表面是孔，那么孔可以包括多个不同的结合域且捕捉试剂和锚定试剂位于孔内的相同结合域上。捕捉试剂和锚定试剂可以在表面上的10-100nm内。
实施例(11)和(12)的表面可以包括电极且测量步骤可以包含向电极施加电压波形以产生电化学发光信号。任选地，实施例(11)和(12)进一步包括收集电极上的粒子和向电极施加电压波形以产生电化学发光信号。测量步骤还可以包含使扩增子与具有可检测标记的检测探针结合、测量可检测标记和将测量值与样品中分析物的量相关联，其中检测探针包括与扩增子的区域互补的核酸序列。可检测标记可以通过测量光散射、吸光度、荧光、化学发光、电化学发光、生物发光、磷光、放射性、磁场或其组合来测量。在一个实例中，可检测标记是ECL标记且测量步骤可以包含测量ECL信号。检测探针可以具有多个ECL标记。检测探针可以通过探针核苷酸组分的3'端处的键与多重ECL标记部分连接。
实施例(11)和(12)的样品可以包括一个或多个分析物分子，且表面可以包含用于一个或多个分析物分子的多种捕捉试剂，其跨越位于表面上的多个可分辨结合区分布，且方法可以包含：(x)使一个或多个分析物分子与表面上的一种或多种捕捉试剂结合；(y)确定各结合区中存在或不存在分析物分子；和(z)鉴别含有分析物分子的结合区的数目和/或不含分析物分子的分析物域的数目。测量步骤可以包含对来自表面的光学信号成像以产生包括多个像素的影像，且各可分辨结合区映射至影像中的一个或多个像素。可分辨结合区可以是阵列的单元和/或可分辨结合区被配置成分离各个粒子。各可分辨结合区可以是体积<100nL的各个纳米孔，例如其中至少99％的结合区含有零个或一个分析物分子，其中至少约95％的结合区含有零个或一个分析物分子，其中至少约80％的结合区含有零个或一个分析物分子，和/或其中至少约50％的结合区含有零个或一个分析物分子。实施例(11)和(12)的样品中的分析物分子浓度可以使用含有至少一个或一个分析物分子的结合区的数目的校准曲线、泊松分布(Poisson distribution)分析和/或高斯分步(Gaussiandistribution)分析至少部分地确定。
在实施例(11)和(12)中，样品可以包括一个或多个分析物分子，表面可以包含多个粒子，其各自包括多种用于分析物分子的结合试剂，其中多个粒子跨越多个可分辨结合区分布，且方法可以包含：(i)使一个或多个分析物分子与表面上的一种或多种结合试剂结合，和(ii)跨越可分辨结合区的阵列分配多个粒子；和(iii)确定各可分辨结合区中存在或不存在分析物分子，以鉴别含有分析物分子的结合区的数目和/或不含分析物分子的结合区的数目。
实施例(13)：一种检测样品中的所关注分析物的试剂盒，其在一个或多个小瓶、容器或隔室中包括：(a)包括(i)用于分析物的捕捉试剂和(ii)包括锚定寡核苷酸序列的锚定试剂的表面；(b)包括第一邻近探针的用于分析物的第一检测试剂；(c)包括第二邻近探针的用于分析物的第二检测试剂；和(d)包括以下的连接序列：(i)与第二邻近探针互补的内部序列和(ii)与第一邻近探针的不重叠区域互补的两个末端序列。在实施例中，第一和第二邻近探针是核酸探针。
实施例(14)：一种检测样品中的所关注分析物的试剂盒，其在一个或多个小瓶、容器或隔室中包括：(a)包括(i)用于分析物的捕捉试剂和(ii)包括锚定寡核苷酸序列的锚定试剂的表面；和(b)包括第一邻近探针的用于分析物的第一检测试剂；(c)包括第二邻近探针的用于分析物的第二检测试剂；和(d)(i)第一连接寡核苷酸和(ii)第二连接寡核苷酸，其中(x)第一连接子的第一端和第二连接子的第一端与第一邻近探针的两个不重叠区域互补，和(y)第一连接子的第二端和第二连接子的第二端与第一邻近探针的两个不重叠区域互补。在实施例中，第一和第二邻近探针是核酸探针。
实施例(13)和(14)的捕捉试剂可以包括抗体、抗原、配体、受体、寡核苷酸、半抗原、抗原决定基、模拟抗原决定基或适体，例如捕捉试剂可以包含抗体。同样，第一检测试剂可以包含抗体、抗原、配体、受体、寡核苷酸、半抗原、抗原决定基、模拟抗原决定基或适体，例如第一检测试剂可以包含抗体。类似地，第二检测试剂可以包含抗体、抗原、配体、受体、寡核苷酸、半抗原、抗原决定基、模拟抗原决定基或适体，例如第二检测试剂可以包含抗体。
实施例(13)和(14)的表面可以包含粒子和/或多孔盘的孔。可以包含多个不同的结合域且捕捉试剂和锚定试剂位于表面上的两个不同的结合域上。如果表面是孔，那么孔可以包括多个不同的结合域且捕捉试剂和锚定试剂位于孔内的两个不同结合域上。表面可以包含多个不同的结合域且捕捉试剂和锚定试剂位于表面上的相同结合域上。如果表面是孔，那么孔可以包含多个不同的结合域且捕捉试剂和锚定试剂位于孔内的相同结合域上。捕捉试剂和锚定试剂可以在表面上的10-100nm内，且任选地，表面可以包含电极。
实施例(15)：一种检测样品中的分析物的方法，其中所述方法可以包含：(a)使分析物与第一和第二检测试剂结合以形成检测复合物，各检测复合物包括分析物、第一检测试剂和第二检测试剂，其中第一检测试剂具有第一可检测标记且第二检测试剂具有第二可检测标记，(b)跨越多个反应容器分配分析物以使得大多数反应容器含有一个或更少的分析物；和(c)通过计数含有第一和第二可检测标记的反应容器的数目来检测分析物分子的数目。在此实施例(15)中，第一检测试剂可以是抗体、抗原、配体、受体、寡核苷酸、半抗原、抗原决定基、模拟抗原决定基或适体，例如第一检测试剂是抗体。同样，第二检测试剂可以是抗体、抗原、配体、受体、寡核苷酸、半抗原、抗原决定基、模拟抗原决定基或适体，例如第二检测试剂是抗体。在具体实例中，第一和第二检测试剂是针对分析物的抗体。
实施例(15)的步骤(a)可以进一步包括形成包括所述分析物和所述检测试剂的溶液，且步骤(b)可以包含跨越多个反应容器分配溶液以使得在相同容器中发现未结合第一检测试剂和未结合第二检测试剂的可能性小于1/10。或者，实施例(15)的步骤(a)可以进一步包括形成包括所述分析物和所述检测试剂的溶液，且步骤(b)可以包含跨越多个反应容器分配溶液以使得在相同容器中发现未结合第一检测试剂和未结合第二检测试剂的可能性小于1/100。另外，实施例(15)的步骤(a)可以进一步包括形成包括所述分析物和所述检测试剂的溶液，且步骤(b)可以包含跨越多个反应容器分配溶液以使得在相同容器中发现未结合第一检测试剂和未结合第二检测试剂的可能性小于1/1000。此外，实施例(15)的步骤(a)可以进一步包括形成包括所述分析物和所述检测试剂的溶液，且步骤(b)可以包含跨越多个反应容器分配溶液以使得在相同容器中发现未结合第一检测试剂和未结合第二检测试剂的可能性小于1/10000。
实施例(16)：一种检测样品中的分析物的方法，所述方法包括：(a)使分析物与捕捉试剂和第一和第二检测试剂结合以形成检测复合物，各检测复合物包括捕捉试剂、分析物、第一检测试剂和第二检测试剂，其中(i)第一检测试剂具有第一可检测标记且第二检测试剂具有第二可检测标记，(ii)捕捉试剂在表面上；(b)跨越多个反应容器分配分析物以使得大多数反应容器含有一个或更少的分析物；和(c)通过计数含有第一和第二可检测标记的反应容器的数目来检测分析物分子的数目。在此实施例中，捕捉试剂可以是抗体、抗原、配体、受体、寡核苷酸、半抗原、抗原决定基、模拟抗原决定基或适体，例如捕捉试剂是抗体。同样，第一检测试剂可以是抗体、抗原、配体、受体、寡核苷酸、半抗原、抗原决定基、模拟抗原决定基或适体，例如第一检测试剂是抗体。此外，第二检测试剂可以是抗体、抗原、配体、受体、寡核苷酸、半抗原、抗原决定基、模拟抗原决定基或适体，例如第二检测试剂是抗体。举例来说，捕捉试剂、第一和第二检测试剂是针对分析物的抗体。
实施例(16)的步骤(b)可以进一步包括跨越多个反应容器分配溶液，以使得在相同容器中发现未结合第一检测试剂和未结合第二检测试剂的可能性小于1/10。此外，实施例(16)的步骤(b)可以进一步包括跨越多个反应容器分配溶液，以使得在相同容器中发现未结合第一检测试剂和未结合第二检测试剂的可能性小于1/100。实施例(16)的步骤(b)可以进一步包括跨越多个反应容器分配溶液，以使得在相同容器中发现未结合第一检测试剂和未结合第二检测试剂的可能性小于1/1000。另外，实施例(16)的步骤(b)可以进一步包括跨越多个反应容器分配溶液，以使得在相同容器中发现未结合第一检测试剂和未结合第二检测试剂的可能性小于1/10000。
在捕捉试剂与分析物结合之前，实施例(16)的检测复合物中的捕捉试剂可以在表面上；或在将捕捉试剂固定于表面上之前，检测复合物中的捕捉试剂与分析物结合。在一个实例中，捕捉试剂可以包含靶向部分且表面可以包含靶向部分补体。靶向部分和靶向剂结合搭配物是选自以下结合对：抗生物素蛋白-生物素、抗生蛋白链菌素-生物素、受体-配体、抗体-抗原、核酸-核酸补体。
实施例(16)的表面是粒子，且任选地，捕捉试剂固定于多个粒子上，且分析物的分配是通过使分析物与捕捉试剂结合和将粒子分配至多个反应容器中来实现。捕捉试剂可以固定于多个粒子上，且分析物的分配是通过将粒子分配至多个反应容器中且接着使分析物与捕捉试剂结合来实现。
实施例(16)可以进一步包括将多个粒子分配至多个反应容器中，其中多个粒子包括靶向部分，捕捉试剂包括靶向部分补体，且分析物的分配是通过使靶向部分补体与靶向部分结合来实现。实施例(16)还可以包含在分配步骤之前和/或在分配步骤之后洗涤所述粒子。
实施例(16)的表面可以是反应容器中的一个内的位置。在此实施例中，捕捉试剂可以固定于多个反应容器的表面上且分析物的分配是通过使分析物与捕捉试剂结合来实现。任选地，反应容器具有其上固定有靶向部分的表面，捕捉试剂包括靶向部分补体，且分析物的分配是通过使靶向部分补体与靶向部分结合来实现。在此具体实例中，方法可以进一步包括在检测步骤之前洗涤反应容器。
实施例(16)的多个反应容器可以包括纳米孔阵列。多个反应容器可以包括至少10,000个反应容器。在一个实施例中，反应容器的容积小于100nL。任选地，小于50％的反应容器在检测时含有分析物，小于10％的反应容器在检测时含有分析物，小于1％的反应容器在检测时含有分析物，和/或小于0.1％的反应容器在检测时含有分析物。
在实施例(16)的一个方面中，第一可检测标记是偶联酶反应系统的第一酶且第二可检测标记是偶联酶反应系统的第二酶，且步骤(d)可以包含添加反应系统的一种或多种底物、产生酶反应系统的产物和计数含有产物的反应容器。在此实施例中，仅当第一酶和第二酶极为贴近时方可产生产物，例如第一和第二酶在彼此的200nM内，或第一和第二酶在彼此的50nM内。举例来说，第一酶是氧化酶，第二酶是过氧化酶，且底物包括氧化酶底物和被标记的Amplex Red或鲁米诺(luminol)衍生物。在此实施例中，氧化酶可以是葡萄糖氧化酶且氧化酶底物是葡萄糖。在一个实施例中，通过检测复合物中的第一和第二酶催化的反应使得被标记的Amplex Red或鲁米诺固定于表面上，且任选地，所述方法可以包含测量表面上的被标记的Amplex Red或鲁米诺。被标记的Amplex Red或鲁米诺任选地是生物素-Amplex Red或鲁米诺，且方法可以包含添加被标记的抗生蛋白链菌素和测量抗生蛋白链菌素上的标记。
实施例(16)的步骤(d)可以包含测量当第一和第二可检测标记结合于相同分析物分子时产生的邻近依赖性信号，和计数产生邻近依赖性信号的反应容器的数目，例如邻近依赖性信号是通过PLA-RCA来产生。举例来说，第一可检测标记可以是FRET供体且可检测标记是FRET受体，且邻近依赖性信号是通过激发FRET供体和测量来自FRET受体的发射来测量。在一个实例中，可以独立地测量第一和第二可检测标记。任选地，第一和第二可检测标记是就光谱特性来说彼此不同的发光标记。在一个实例中，第一可检测标记是与第一底物反应以产生第一信号的第一酶，且第二可检测标记是与第二底物反应以产生不同第二信号的第二酶，且实施例(16)的步骤(d)可以包含添加第一酶底物和第二酶底物和计数产生第一和第二信号的反应容器的数目。第一和第二信号可以是具有不同光谱特性的吸光度的变化。任选地，第一和第二信号是具有不同光谱特性的发光信号。第一和第二酶可以是水解酶，例如选自磷酸酶、硫酸酯酶、半乳糖苷酶、葡糖醛酸酶或其组合，且第一和第二底物是选自磷酸盐、硫酸盐、半乳糖苷和葡萄糖苷酸修饰的稳定二氧杂环丁烷、4-甲基香豆素基、荧光素或其组合。在具体实例中，第一和第二酶是选自辣根过氧化酶、β-半乳糖苷酶和碱性磷酸酶。实施例(16)的检测步骤可以包含通过光散射、吸光度、荧光、化学发光、电化学发光、发光、放射性、磁场或其组合来检测。
实施例(17)：一种检测样品中的分析物的试剂盒，所述试剂盒在一个或多个小瓶、容器或隔室中包括：(a)包括第一可检测标记的第一检测试剂；(b)包括第二可检测标记的第二检测试剂；(c)被配置成含有一个或更少的分析物分子的多个反应容器。
实施例(18)：一种检测样品中的分析物的试剂盒，所述试剂盒在一个或多个小瓶、容器或隔室中包括：(a)包括第一可检测标记的第一检测试剂；(b)包括第二可检测标记的第二检测试剂；(c)包括捕捉试剂的表面；和(d)被配置成含有一个或更少的分析物分子的多个反应容器。
实施例(17)和(18)的第一和第二检测试剂可以包括抗体、抗原、配体、受体、寡核苷酸、半抗原、抗原决定基、模拟抗原决定基、适体或其组合。在一个实例中，第一和第二检测试剂包括抗体。捕捉抗体可以包括抗体、抗原、配体、受体、寡核苷酸、半抗原、抗原决定基、模拟抗原决定基或适体，例如捕捉抗体可以包含抗体。在一个实例中，捕捉试剂可以包含靶向部分且表面可以包含靶向部分补体，例如靶向部分和靶向剂结合搭配物是选自以下结合对：抗生物素蛋白-生物素、抗生蛋白链菌素-生物素、受体-配体、抗体-抗原、核酸-核酸补体。
实施例(17)和(18)的表面可以是粒子，且举例来说，捕捉试剂固定于多个粒子上。或者，表面是反应容器中的一个内的位置且例如，捕捉试剂固定于多个反应容器的表面上。任选地，反应容器具有在其上固定有靶向部分的表面且捕捉试剂包括靶向部分补体。多个反应容器可以包括纳米孔阵列或分散于油包水乳液中的水滴。多个反应容器可以包含至少10,000个反应容器，且任选地，多个反应容器之一具有小于100nL的容积。
在实施例(17)和(18)的试剂盒中，第一可检测标记可以是偶联酶反应系统的第一酶且第二可检测标记是偶联酶反应系统的第二酶，且试剂盒可以在一个或多个额外小瓶、容器或隔室中包含反应系统的一种或多种底物。举例来说，第一酶是氧化酶，第二酶是过氧化酶，且底物包括氧化酶底物和被标记的Amplex Red或鲁米诺衍生物。在具体实施例中，氧化酶是葡萄糖氧化酶且氧化酶底物是葡萄糖。第一和第二可检测标记可以是邻近依赖性系统的组分，例如第一可检测标记是FRET供体且可检测标记是FRET受体。可以独立地测量第一和第二可检测标记。任选地，第一和第二可检测标记是就光谱特性来说彼此不同的发光标记。
在实施例(17)和(18)的试剂盒中，第一可检测标记是与第一底物反应以产生第一信号的第一酶，且第二可检测标记是与第二底物反应以产生不同的第二信号的第二酶，且试剂盒可以在一个或多个小瓶、容器或隔室中包含第一酶底物和第二酶底物。任选地，第一和第二信号是具有不同光谱特性的吸光度的变化。在一个实例中，第一和第二信号是具有不同光谱特性的发光信号。第一和第二酶可以是水解酶。在一个实例中，第一和第二酶是选自磷酸酶、硫酸酯酶、半乳糖苷酶、葡糖醛酸酶或其组合。第一和第二底物可以选自磷酸盐、硫酸盐、半乳糖苷和葡萄糖苷酸修饰的稳定二氧杂环丁烷、4-甲基香豆素基、荧光素或其组合。任选地，第一和第二酶是选自辣根过氧化酶、β-半乳糖苷酶和碱性磷酸酶。
实施例(19)：一种检测样品中的所关注分析物的方法，其包括：(a)使分析物与捕捉试剂、具有第一可检测标记的第一检测试剂和具有第二可检测标记的第二检测试剂结合和形成复合物，其中复合物中的捕捉试剂固定于表面上；(b)使第一和第二检测试剂交联以形成交联产物；(c)使交联产物从表面释放至洗脱剂中；(d)计数包括第一和第二可检测标记两者的洗提剂中的各个交联产物。在此实例(19)中，捕捉试剂是抗体、抗原、配体、受体、寡核苷酸、半抗原、抗原决定基、模拟抗原决定基或适体，且在具体实例中，捕捉试剂是抗体。同样，第一检测试剂可以是抗体、抗原、配体、受体、寡核苷酸、半抗原、抗原决定基、模拟抗原决定基或适体，且在具体实例中，第一检测试剂是抗体。此外，第二检测试剂是抗体、抗原、配体、受体、寡核苷酸、半抗原、抗原决定基、模拟抗原决定基或适体，且具体来说，第二检测试剂可以是抗体。在一个具体实例中，捕捉试剂和第一和第二检测试剂是针对分析物的抗体。
实施例(19)可以进一步包括添加交联剂以使第一和第二检测试剂交联，例如第一和第二检测试剂包括反应性部分且交联剂是与反应性部分连接的多官能性交联剂。举例来说，反应性部分包括胺、硫醇、酰肼、醛、酯、碘乙酰胺、顺丁烯二酰亚胺、点击化学试剂以及其组合。交联剂可以包括胺、硫醇、酰肼、醛、酯、碘乙酰胺、顺丁烯二酰亚胺、点击化学试剂以及其组合。第一和第二检测试剂可以包含结合部分且交联剂是结合部分的多价结合搭配物。在一个实例中，第一和第二检测试剂是动物物种的抗体且交联剂是靶向动物物种的抗体的多价抗物种抗体。第一和第二检测试剂可以包括生物素且交联剂是抗生蛋白链菌素；第一和第二检测试剂包含抗生蛋白链菌素且交联剂是生物素；第一和第二检测试剂连接至抗生蛋白链菌素且交联剂是包括多个生物素分子的聚合物；和/或第一和第二检测试剂分别包括第一和第二核酸探针，且交联剂是可以包含与第一核酸探针互补的序列和与第二核酸探针互补的独立序列的寡核苷酸。
实施例(19)的表面可以包括粒子、反应容器，例如管或安瓿，和/或表面可以包含多孔盘的孔。实施例(19)的方法可以进一步包含收集所述粒子和洗涤所述粒子以去除杂质，且任选地，第一和第二可检测标记是通过测量光散射、吸光度、荧光、化学发光、电化学发光、生物发光、磷光、放射性、磁场或其组合来测量。在具体实例中，第一和第二可检测标记包括ECL标记且计数步骤可以包含测量ECL信号。
实施例(20)：一种检测样品中的所关注分析物的试剂盒，其在一个或多个小瓶、容器或隔室中包括：(a)包括固定捕捉试剂的表面；(b)具有第一可检测标记的第一检测试剂；(c)具有第二可检测标记的第二检测试剂；和(d)对第一和第二检测试剂具有反应性的交联剂。
实施例(20)的第一和第二检测试剂可以包括反应性部分且交联剂是与反应性部分连接的多官能性交联剂。反应性部分可以包含胺、硫醇、酰肼、醛、酯、碘乙酰胺、顺丁烯二酰亚胺、点击化学试剂以及其组合；且交联剂可以包含胺、硫醇、酰肼、醛、酯、碘乙酰胺、顺丁烯二酰亚胺、点击化学试剂以及其组合。实施例(20)的第一和第二检测试剂可以包括结合部分且交联剂是结合部分的多价结合搭配物，例如第一和第二检测试剂是动物物种的抗体且交联剂是靶向动物物种的抗体的多价抗物种抗体；第一和第二检测试剂包括生物素且交联剂是抗生蛋白链菌素；第一和第二检测试剂包括抗生蛋白链菌素且交联剂是生物素；第一和第二检测试剂连接至抗生蛋白链菌素且交联剂是包括多个生物素分子的聚合物；和/或第一和第二检测试剂分别包括第一和第二核酸探针，且交联剂是可以包含与第一核酸探针互补的序列和与第二核酸探针互补的独立序列的寡核苷酸。
实施例(20)的表面可以包含粒子、多孔盘的孔或反应容器，例如管或安瓿。另外，表面可以包含多个不同结合域且捕捉试剂位于表面上的不同结合域上。如果表面是孔，那么孔可以包含多个不同结合域且捕捉试剂位于孔内的不同结合域上。表面还可以包含电极。
实施例(21)：一种检测样品中的所关注分析物的方法，其包括：(a)使分析物与捕捉试剂、第一检测试剂和第二检测试剂结合以形成复合物，其中第一检测试剂可以包含第一可检测标记和第一核酸探针，第二检测试剂可以包含第二可检测标记和第二核酸探针，且复合物中的捕捉试剂固定于表面上；(b)如下地交联第一和第二检测试剂：(i)使第一探针与第二探针杂交，(ii)使第一和第二探针与具有与第一和第二探针互补的区域的第三核酸杂交，或(iii)连接第一和第二探针；(c)将交联产物从表面释放至洗脱剂中；(d)计数包括第一和第二可检测标记两者的洗脱剂中的各个交联产物。
实施例(21)的捕捉试剂可以是抗体、抗原、配体、受体、寡核苷酸、半抗原、抗原决定基、模拟抗原决定基或适体，例如捕捉试剂是抗体。同样，第一检测试剂是抗体、抗原、配体、受体、寡核苷酸、半抗原、抗原决定基、模拟抗原决定基或适体，例如第一检测试剂是抗体；第二检测试剂可以是抗体、抗原、配体、受体、寡核苷酸、半抗原、抗原决定基、模拟抗原决定基或适体，例如第二检测试剂是抗体。在具体实例中，捕捉试剂和第一和第二检测试剂是针对分析物的抗体。
实施例(21)的表面可以包含粒子、反应容器(例如管或安瓿)或多孔盘的孔。实施例(21)的方法可以进一步包括收集所述粒子和洗涤所述粒子以去除杂质。第一和第二可检测标记可以通过测量光散射、吸光度、荧光、化学发光、电化学发光、生物发光、磷光、放射性、磁场或其组合来测量。在具体实例中，第一和第二可检测标记包括ECL标记且计数步骤可以包含测量ECL信号。
实施例(22)：一种检测样品中的所关注分析物的试剂盒，其在一个或多个小瓶、容器或隔室中包括：(a)包括固定捕捉试剂的表面；(b)具有第一可检测标记和第一核酸探针的第一检测试剂；(c)具有第二可检测标记和第二核酸探针的第二检测试剂；和(d)具有与第一和第二核酸探针互补的区域的第三核酸。
实施例(22)的表面可以包含粒子、多孔盘的孔或反应容器，例如管或安瓿。表面可以包含多个不同结合域且捕捉试剂位于表面上的不同结合域上，且如果表面是孔，那么孔可以包括多个不同结合域且捕捉试剂位于孔内的不同结合域上。表面任选地可以包含电极。
实施例(23)：一种检测样品中的所关注分析物的方法，其包括：(a)使分析物与捕捉试剂、第一检测试剂和第二检测试剂结合以形成复合物，其中第一检测试剂可以包含第一核酸探针，第二检测试剂可以包含第二核酸探针，且复合物中的捕捉试剂固定于表面上；(b)延伸第二核酸探针以形成包括可检测标记的延伸序列，所述延伸取决于第一和第二核酸探针于复合物中的共定位；(c)将延伸序列从表面释放至洗脱剂中；和(d)计数洗脱剂中的各个延伸序列。在此实施例中，捕捉试剂是抗体、抗原、配体、受体、寡核苷酸、半抗原、抗原决定基、模拟抗原决定基或适体。在具体实例中，捕捉试剂是抗体。同样，第一检测试剂是抗体、抗原、配体、受体、寡核苷酸、半抗原、抗原决定基、模拟抗原决定基或适体，且在具体实例中，第一检测试剂是抗体。第二检测试剂是抗体、抗原、配体、受体、寡核苷酸、半抗原、抗原决定基、模拟抗原决定基或适体，且具体来说，第二检测试剂是抗体。在具体实例中，捕捉试剂和第一和第二检测试剂是针对分析物的抗体。
实施例(23)的表面可以包含粒子、反应容器(例如管或安瓿)；或多孔盘的孔。实施例(23)的方法可以进一步包括收集所述粒子和洗涤所述粒子以去除杂质。
实施例(23)的标记可以通过测量光散射、吸光度、荧光、化学发光、电化学发光、生物发光、磷光、放射性、磁场或其组合来测量。在具体实例中，标记可以包含ECL标记且计数步骤可以包含测量ECL信号。
实施例(23)的延伸步骤可以包含使探针与模板核酸序列结合和通过聚合酶链反应延伸探针。延伸步骤还可以包括使第一探针与模板核酸序列结合、形成环状核酸模板和通过滚环扩增延伸环状模板。延伸步骤可以包括使第一探针与模板核酸序列结合、使第二探针与模板序列结合和连接第一和第二探针。任选地，标记是荧光标记且计数各个延伸序列可以包含单分子荧光检测，例如可以包含荧光相关光谱法和/或荧光交叉相关光谱法。单分子荧光检测可以包括使洗脱剂流经毛细管、使光源聚焦于毛细管内的体积上以产生询问区和用光检测器观察询问区以检测荧光分子通过所述询问区。单分子荧光检测还可以包括使洗脱剂流经毛细管、使光源聚焦于毛细管内的体积上以产生询问区和用光检测器观察询问区以检测荧光分子通过所述询问区。
实施例(24)：一种检测样品中的所关注分析物的方法，其包括：(a)使分析物与捕捉试剂、具有第一可检测标记的第一检测试剂和具有第二可检测标记的第二检测试剂结合和形成复合物，其中复合物中的捕捉试剂固定于表面上；(b)通过将固定的捕捉试剂从表面解离至洗脱剂中而从表面释放形成的复合物；和(c)计数包括第一和第二可检测标记两者的洗脱剂中的各个产物。在此实施例中，捕捉试剂是抗体、抗原、配体、受体、寡核苷酸、半抗原、抗原决定基、模拟抗原决定基或适体，例如捕捉试剂是抗体；第一检测试剂是抗体、抗原、配体、受体、寡核苷酸、半抗原、抗原决定基、模拟抗原决定基或适体，例如第一检测试剂是抗体；第二检测试剂是抗体、抗原、配体、受体、寡核苷酸、半抗原、抗原决定基、模拟抗原决定基或适体，例如第二检测试剂是抗体；且在具体实例中，捕捉试剂和第一和第二检测试剂是针对分析物的抗体。
实施例(24)的表面可以包括粒子、反应容器(例如管或安瓿)和/或多孔盘的孔。实施例(24)的方法可以包含收集所述粒子和洗涤所述粒子以去除杂质。第一和第二可检测标记可以通过测量光散射、吸光度、荧光、化学发光、电化学发光、生物发光、磷光、放射性、磁场或其组合来测量，且在具体实施例中，第一和第二可检测标记包括ECL标记且计数步骤可以包含测量ECL信号。
实施例(25)：一种检测样品中的所关注分析物的方法，其包括：(a)将分析物结合于：(i)包括用于分析物的捕捉试剂的表面上的捕捉试剂；(ii)连接至第一核酸探针的用于分析物的第一检测试剂；和(iii)连接至第二核酸探针的用于分析物的第二检测试剂；由此在表面上形成包括结合试剂、分析物和第一和第二检测试剂的复合物；(b)使用需要第一和第二探针邻近的延伸方法来延伸第二探针以形成延伸序列；和(c)测量与表面结合的延伸序列的量。在此实施例中，捕捉试剂是抗体、抗原、配体、受体、寡核苷酸、半抗原、抗原决定基、模拟抗原决定基或适体，例如捕捉试剂是抗体；第一检测试剂是抗体、抗原、配体、受体、寡核苷酸、半抗原、抗原决定基、模拟抗原决定基或适体，例如第一检测试剂是抗体；第二检测试剂是抗体、抗原、配体、受体、寡核苷酸、半抗原、抗原决定基、模拟抗原决定基或适体；例如第二检测试剂是抗体；且在具体实例中，捕捉试剂和第一和第二检测试剂是针对分析物的抗体。
实施例(25)的延伸序列可以包含一个或多个检测序列且测量步骤可以包含使延伸序列与多个与一个或多个检测序列互补的被标记的探针接触；延伸序列可以包含一个或多个被修饰的碱基且测量步骤可以包含使延伸序列与多个能够结合于一个或多个被修饰的碱基的可检测部分接触；和/或延伸序列可以包含一个或多个被标记的碱基且测量步骤可以包含检测一个或多个被标记的碱基的存在。一个或多个被修饰的碱基包括适体、适体配体、抗体、抗原、配体、受体、半抗原、抗原决定基或模拟抗原决定基，且多个可检测部分各自包括一个或多个被修饰的碱基和可检测标记的结合搭配物。一个或多个被修饰的碱基可以包含抗生蛋白链菌素且多个可检测部分各自包括生物素和可检测标记；一个或多个被修饰的碱基包括生物素且多个可检测部分各自包括抗生蛋白链菌素和可检测标记；一个或多个被修饰的碱基包括抗生物素蛋白且多个可检测部分各自包括生物素和可检测标记；和/或一个或多个被修饰的碱基包括生物素且多个可检测部分各自包括抗生物素蛋白和可检测标记。
实施例(25)的步骤(a)可以包含使分析物按以下次序与以下物质结合：(i)表面上的捕捉试剂；和(ii)用于分析物的检测试剂；使分析物按以下次序与以下物质结合：(i)用于分析物的检测试剂；和(ii)表面上的捕捉试剂；或使分析物同时或基本上同时与以下物质结合：(i)表面上的捕捉试剂；和(ii)用于分析物的检测试剂。延伸步骤可以包含使探针与模板核酸序列结合和通过聚合酶链反应延伸探针；或使探针与模板核酸序列结合、形成环状核酸模板和通过滚环扩增延伸环状模板。在此实施例中，延伸探针可以在探针延伸之后保持局限于表面上，例如复合物在延伸步骤之后保持与表面结合。延伸步骤可以包含PCR(聚合酶链反应)、LCR(连接酶链反应)、SDA(股置换扩增)、3SR(自持合成反应)或等温扩增方法。在具体实例中，延伸步骤可以包含等温扩增方法，例如解螺旋酶依赖性扩增或滚环扩增(RCA)。
实施例(25)的延伸方法可以包括使步骤(a)中形成的复合物与包括以下的连接序列接触：(i)与第二探针互补的内部序列，和(ii)与第一探针的不重叠区域互补的两个末端序列。方法可以进一步包括将连接寡核苷酸的两个末端序列连接以形成与第一和第二探针两者杂交的环状目标序列。实施例(25)的延伸方法还可以包含使步骤(a)中形成的复合物与以下各者接触：包含与第一探针的第一区域和第二探针上的第一区域互补的第一连接探针序列的第一连接寡核苷酸序列，和包括与第一探针的第二不重叠区域和第二探针的第二不重叠区域互补的第二探针序列的第二连接寡核苷酸。方法还可以包含连接第一和第二连接寡核苷酸以形成与第一和第二探针两者杂交的环状目标序列。
实施例(25)的表面可以包括粒子或多孔盘的孔。表面可以包含多个不同结合域且捕捉试剂位于表面上的两个不同结合域上。如果表面是孔，那么孔可以包含多个不同结合域且捕捉试剂位于孔内的两个不同结合域上。表面可以包含多个不同结合域且捕捉试剂位于表面上的相同结合域上，且如果表面是孔，那么孔可以包括多个不同结合域且捕捉试剂位于孔内的相同结合域上。表面可以包含电极且测量步骤可以包含向电极施加电压波形以产生电化学发光信号。方法任选地包含收集电极上的粒子和向电极施加电压波形以产生电化学发光信号。测量步骤可以进一步包括使延伸序列与具有可检测标记的检测探针结合、测量可检测标记和使测量值与样品中分析物的量相关联，其中检测探针包括与延伸序列的区域互补的核酸序列。可检测标记可以通过测量光散射、吸光度、荧光、化学发光、电化学发光、生物发光、磷光、放射性、磁场或其组合来测量。在具体实例中，可检测标记是ECL标记且测量步骤可以包含测量ECL信号。检测探针可以具有多个ECL标记。检测探针可以通过探针核苷酸组分的3'端处的键与多重ECL标记部分连接。
实施例(26)：一种检测样品中的所关注分析物的试剂盒，其在一个或多个小瓶、容器或隔室中包括：(a)包括用于分析物的捕捉试剂的表面；(b)连接至第一核酸探针的用于分析物的第一检测试剂；和(c)连接至第二核酸探针的用于分析物的第二检测试剂。
实施例(26)的捕捉试剂可以包含抗体、抗原、配体、受体、寡核苷酸、半抗原、抗原决定基、模拟抗原决定基或适体，例如捕捉试剂可以包含抗体；第一检测试剂可以包含抗体、抗原、配体、受体、寡核苷酸、半抗原、抗原决定基、模拟抗原决定基或适体，例如第一检测试剂可以包含抗体；第二检测试剂可以包含抗体、抗原、配体、受体、寡核苷酸、半抗原、抗原决定基、模拟抗原决定基或适体，例如第二检测试剂可以包含抗体；且表面可以包含粒子和/或多孔盘的孔。表面可以包含多个不同结合域且捕捉试剂位于表面上的两个相同结合域上；且如果表面是孔，那么孔可以包括多个不同结合域且捕捉试剂位于孔内的两个不同结合域上。任选地，表面可以包含多个不同结合域且捕捉试剂位于表面上的相同结合域上，且如果表面是孔，那么孔可以包含多个不同结合域且捕捉试剂位于孔内的相同结合域上。表面可以包括电极。
实施例1-26的表面可以包含分析容器(例如试管、比色管、流量槽、FACS细胞分选仪、滤筒或多孔盘的孔)的内表面。表面还可以包括载玻片、分析芯片或分析阵列；接脚、探针、珠粒或过滤介质；侧流介质，例如过滤膜。
实施例(27)：一种检测包括一个或多个分析物分子的样品中的所关注分析物的方法，所述方法包括：(a)使样品与包括位于表面上的多个可分辨结合区的表面接触，各可分辨结合区包括用于样品中的一个或多个分析物分子的多种捕捉试剂；(b)将一个或多个分析物分子结合于(i)表面上的一种或多种捕捉试剂；(ii)包括第一可检测标记的用于分析物的第一检测试剂，和(iii)包括第二可检测标记的用于分析物的第二检测试剂；由此在表面上的可分辨结合域上形成包括捕捉试剂、分析物和第一和第二检测试剂的检测复合物，其中第一和第二可检测标记是不同标记化合物；(c)确定各结合区中存在或不存在分析物分子；和(d)鉴别含有分析物分子的结合区的数目和/或不含分析物分子的结合区的数目。鉴别步骤可以包含对来自表面的光学信号成像以产生包括多个像素的影像，且各可分辨结合区映射至影像中的一个或多个像素。可分辨结合区可以是阵列的单元和/或被配置成分离各个粒子。各可分辨结合区可以是体积<100nL的各个纳米孔和/或至少99％的结合区含有零个或一个分析物分子；至少约95％的结合区含有零个或一个分析物分子；至少约80％的结合区含有零个或一个分析物分子；或至少约50％的结合区含有零个或一个分析物分子。可以使用含有至少一个或一个分析物分子的结合区的数目的校准曲线、泊松分布分析和/或高斯分步分析至少部分地确定样品中的分析物分子浓度。
实施例(27)的表面可以包含多个粒子，其各自包括多种用于分析物分子的捕捉试剂，其中多个粒子跨越多个可分辨结合区分布，且方法可以包含：(i)使一个或多个分析物分子与表面上的一种或多种捕捉试剂和用于一个或多个分析物分子中的每一个的第一和第二检测试剂结合，其中第一和第二检测试剂分别包含第一和第二可检测标记；(ii)跨越可分辨结合区的阵列分配多个粒子；和(iii)确定各可分辨结合区中存在或不存在分析物分子，以鉴别含有分析物分子的结合区的数目和/或不含分析物分子的结合区的数目，其中任选地，各可分辨结合区是体积<100nL的各个纳米孔，和/或至少99％的结合区含有零个或一个分析物分子；至少约95％的结合区含有零个或一个分析物分子；至少约80％的结合区含有零个或一个分析物分子；和/或至少约50％的结合区含有零个或一个分析物分子。
实施例(27)中的捕捉试剂是抗体、抗原、配体、受体、寡核苷酸、半抗原、抗原决定基、模拟抗原决定基或适体，例如捕捉试剂是抗体；第一检测试剂是抗体、抗原、配体、受体、寡核苷酸、半抗原、抗原决定基、模拟抗原决定基或适体，例如第一检测试剂是抗体；第二检测试剂是抗体、抗原、配体、受体、寡核苷酸、半抗原、抗原决定基、模拟抗原决定基或适体，例如第二检测试剂是抗体。在具体实例中，捕捉试剂和第一和第二检测试剂是针对分析物的抗体。
实施例(27)的步骤(a)可以包含使分析物按以下次序与以下物质结合：(i)表面上的捕捉试剂；和(ii)用于分析物的第一和第二检测试剂；使分析物按以下次序与以下物质结合：(i)用于分析物的第一和第二检测试剂；和(ii)表面上的捕捉试剂；或使分析物同时或基本上同时与以下物质结合：(i)表面上的捕捉试剂；和(ii)用于分析物的第一和第二检测试剂。
实施例(27)的表面可以包含粒子或多孔盘的孔。在具体实例中，表面可以包含电极且鉴别步骤可以包含向电极施加电压波形以产生电化学发光信号。实施例(27)的方法可以进一步包含收集电极上的粒子和向电极施加电压波形以产生电化学发光信号。第一可检测标记是通过测量光散射、吸光度、荧光、化学发光、电化学发光、生物发光、磷光、放射性、磁场或其组合来测量；和/或第二可检测标记是通过测量光散射、吸光度、荧光、化学发光、电化学发光、生物发光、磷光、放射性、磁场或其组合来测量。可以独立地测量第一和第二可检测标记，且在一个实例中，第一和第二可检测标记是就光谱特性来说彼此不同的发光标记。
实施例(27)的表面可以包含分析容器(例如试管、比色管、流量槽、FACS细胞分选仪、滤筒或多孔盘的孔)的内表面。表面还可以包括载玻片、分析芯片或分析阵列；接脚、探针、珠粒或过滤介质；侧流介质，例如过滤膜。
实施例(28)：一种检测包括一个或多个分析物分子的样品中的所关注分析物的试剂盒，所述试剂盒包括：(a)包括位于表面上的多个可分辨结合区的表面，各可分辨结合区包括用于样品中的一个或多个分析物分子的多种捕捉试剂；(b)包括第一可检测标记的用于分析物的第一检测试剂，和(c)包括第二可检测标记的用于分析物的第二检测试剂；其中第一和第二可检测标记是不同标记化合物。
实施例(28)的可分辨结合区可以是阵列的单元和/或被配置成分离各个粒子。各可分辨结合区任选地是体积<100nL的各个纳米孔。表面可以包含多个粒子，其各自包括用于分析物分子的多种捕捉试剂，其中多个粒子跨越多个可分辨结合区分布，且试剂盒可以包含：用于一个或多个分析物分子中的每一个的第一和第二检测试剂，其中第一和第二检测试剂分别包含第一和第二可检测标记。
实施例(28)中的捕捉试剂是抗体、抗原、配体、受体、寡核苷酸、半抗原、抗原决定基、模拟抗原决定基或适体，例如捕捉试剂是抗体；第一检测试剂是抗体、抗原、配体、受体、寡核苷酸、半抗原、抗原决定基、模拟抗原决定基或适体，例如第一检测试剂是抗体；第二检测试剂是抗体、抗原、配体、受体、寡核苷酸、半抗原、抗原决定基、模拟抗原决定基或适体，例如第二检测试剂是抗体。在具体实例中，捕捉试剂和第一和第二检测试剂是针对分析物的抗体。
实施例(28)的表面可以包含粒子或多孔盘的孔。在具体实例中，表面可以包含电极且鉴别步骤可以包含向电极施加电压波形以产生电化学发光信号。第一可检测标记是通过测量光散射、吸光度、荧光、化学发光、电化学发光、生物发光、磷光、放射性、磁场或其组合来测量；和/或第二可检测标记是通过测量光散射、吸光度、荧光、化学发光、电化学发光、生物发光、磷光、放射性、磁场或其组合来测量。可以独立地测量第一和第二可检测标记，且在一个实例中，第一和第二可检测标记是就光谱特性来说彼此不同的发光标记。
实施例(28)的表面可以包含分析容器(例如试管、比色管、流量槽、FACS细胞分选仪、滤筒或多孔盘的孔)的内表面。表面还可以包括载玻片、分析芯片或分析阵列；接脚、探针、珠粒或过滤介质；侧流介质，例如过滤膜。
实施例(29)：一种检测样品中的HIV p24的方法，其包括：(a)将HIV p24结合于：(i)包括用于HIV p24的捕捉试剂和包括锚定寡核苷酸序列的锚定试剂的表面上的捕捉试剂；(ii)连接至第一核酸探针的用于HIV p24的第一检测试剂；和(iii)连接至第二核酸探针的用于HIV p24的第二检测试剂；由此在表面上形成包括结合试剂、HIV p24以及第一和第二检测试剂的复合物；(b)使用需要第一和第二探针邻近的延伸方法来延伸第二探针以形成包括与锚测序列互补的锚测序列补体的延伸序列；(c)使锚测序列与锚测序列补体杂交；和(d)测量与表面结合的延伸序列的量。
实施例(29)的捕捉试剂可以是抗体、抗原、配体、受体、寡核苷酸、半抗原、抗原决定基、模拟抗原决定基或适体。在具体实例中，捕捉试剂是抗体。同样，第一检测试剂是抗体、抗原、配体、受体、寡核苷酸、半抗原、抗原决定基、模拟抗原决定基或适体，且在具体实例中，第一检测试剂是抗体。第二检测试剂可以是抗体、抗原、配体、受体、寡核苷酸、半抗原、抗原决定基、模拟抗原决定基或适体，且在具体实例中，第二检测试剂是抗体。更具体地说，捕捉试剂和第一和第二检测试剂是针对HIV p24的抗体。
在实施例(29)中，锚定寡核苷酸序列可以包含单股寡核苷酸序列或双股寡核苷酸序列。在此实施例中，延伸序列可以包含一个或多个检测序列且测量步骤可以包含使延伸序列与多个与一个或多个检测序列互补的被标记的探针接触。延伸序列还可以包含一个或多个被修饰的碱基且测量步骤可以包含使延伸序列与多个能够结合于一个或多个被修饰的碱基的可检测部分接触。延伸序列可以进一步包括一个或多个被标记的碱基且测量步骤可以包含检测一个或多个被标记的碱基的存在。一个或多个被修饰的碱基可以包括适体、适体配体、抗体、抗原、配体、受体、半抗原、抗原决定基或模拟抗原决定基，且多个可检测部分各自包括一个或多个被修饰的碱基和可检测标记的结合搭配物。举例来说，一个或多个被修饰的碱基包括抗生蛋白链菌素且多个可检测部分各自包括生物素和可检测标记；一个或多个被修饰的碱基包括生物素且多个可检测部分各自包括抗生蛋白链菌素和可检测标记；一个或多个被修饰的碱基包括抗生物素蛋白且多个可检测部分各自包括生物素和可检测标记；和/或一个或多个被修饰的碱基包括生物素且多个可检测部分各自包括抗生物素蛋白和可检测标记。
实施例(29)的步骤(a)可以包含使HIV p24按以下次序与以下物质结合：(i)表面上的捕捉试剂；和(ii)用于HIV p24的检测试剂。或者，步骤(a)可以包含使HIV p24按以下次序与以下物质结合：(i)用于HIV p24的检测试剂；和(ii)表面上的捕捉试剂；或步骤(a)可以包含使HIV p24同时或基本上同时与以下物质结合：(i)表面上的捕捉试剂；和(ii)用于HIV p24的检测试剂。
实施例(29)的延伸步骤可以包含使探针与模板核酸序列结合和通过聚合酶链反应延伸探针。延伸步骤可以进一步包含使探针与模板核酸序列结合、形成环状核酸模板和通过滚环扩增延伸环状模板。延伸探针可以在探针延伸之后保持局限于表面上，例如复合物在延伸步骤之后保持与表面结合。延伸探针可以在表面上的复合物的位置的10-100μm内的位置处结合于锚定试剂。在一个具体实施例中，延伸探针在表面上的复合物的位置的小于100μm、小于50μm或更具体地说，小于10μm的位置处结合于锚定试剂。延伸步骤可以包含PCR(聚合酶链反应)、LCR(连接酶链反应)、SDA(股置换扩增)、3SR(自持合成反应)或等温扩增方法。在具体实例中，延伸步骤可以包含等温扩增方法，例如解螺旋酶依赖性扩增或滚环扩增(RCA)。
实施例(29)的延伸方法可以包含使步骤(a)中形成的复合物与包括以下的连接序列接触：(i)与第二探针互补的内部序列和(ii)与第一探针的不重叠区域互补的两个末端序列。方法可以进一步包含将连接寡核苷酸的两个末端序列连接以形成与第一和第二探针两者杂交的环状目标序列。或者，延伸方法可以包含使实施例(29)的步骤(a)中形成的复合物与以下各者接触：包含与第一探针的第一区域和第二探针上的第一区域互补的第一连接探针序列的第一连接寡核苷酸序列，和包括与第一探针的第二不重叠区域和第二探针的第二不重叠区域互补的第二探针序列的第二连接寡核苷酸；和任选地，连接第一和第二连接寡核苷酸以形成与第一和第二探针两者杂交的环状目标序列。
实施例(29)的表面可以包含粒子和/或多孔盘的孔。表面可以包含多个不同的结合域且捕捉试剂和锚定试剂位于表面上的两个不同的结合域上。如果表面是盘的孔，那么孔可以包含多个不同的结合域且捕捉试剂和锚定试剂位于孔内的两个不同结合域上。表面还可以包含多个不同的结合域且捕捉试剂和锚定试剂位于表面上的相同结合域上。如果表面是盘的孔，那么孔可以包含多个不同的结合域且捕捉试剂和锚定试剂位于孔内的相同结合域上。捕捉试剂和锚定试剂可以在表面上的10-100nm内。在具体实例中，表面可以包含电极且测量步骤可以包含向电极施加电压波形以产生电化学发光信号，且任选地，实施例(29)的方法进一步包含收集电极上的粒子和向电极施加电压波形以产生电化学发光信号。
实施例(29)的测量步骤可以包含使延伸序列与具有可检测标记的检测探针结合、测量可检测标记和将测量值与样品中p24的量相关联，其中检测探针包括与延伸序列的区域互补的核酸序列。可检测标记可以通过测量光散射、吸光度、荧光、化学发光、电化学发光、生物发光、磷光、放射性、磁场或其组合来测量。在具体实例中，可检测标记是ECL标记且测量步骤可以包含测量ECL信号。检测探针可以具有多个ECL标记。检测探针可以通过探针核苷酸组分的3'端处的键与多重ECL标记部分连接。
实施例(30)：一种检测样品中的HIV p24的试剂盒，其在一个或多个小瓶、容器或隔室中包括：(a)包括(i)用于HIV p24的捕捉试剂和(ii)包括锚定寡核苷酸序列的锚定试剂的表面；(b)连接至第一核酸探针的用于HIV p24的第一检测试剂；和(c)连接至第二核酸探针的用于HIV p24的第二检测试剂。
实施例(30)的捕捉试剂可以包含抗体、抗原、配体、受体、寡核苷酸、半抗原、抗原决定基、模拟抗原决定基或适体，且在具体实例中，捕捉试剂可以包含抗体。同样，第一检测试剂可以包含抗体、抗原、配体、受体、寡核苷酸、半抗原、抗原决定基、模拟抗原决定基或适体，且在具体实例中，第一检测试剂可以包含抗体。类似地，第二检测试剂可以包含抗体、抗原、配体、受体、寡核苷酸、半抗原、抗原决定基、模拟抗原决定基或适体，且在具体实例中，第二检测试剂可以包含抗体。
实施例(30)的表面可以包含粒子和/或多孔盘的孔。表面可以包含多个不同的结合域且捕捉试剂和锚定试剂位于表面上的两个不同的结合域上。如果表面是孔，那么孔可以包括多个不同的结合域且捕捉试剂和锚定试剂位于孔内的两个不同结合域上。表面可以包含多个不同的结合域且捕捉试剂和锚定试剂位于表面上的相同结合域上；和/或如果表面是孔，那么孔可以包含多个不同的结合域且捕捉试剂和锚定试剂位于孔内的相同结合域上。捕捉试剂和锚定试剂可以在表面上的10-100nm内。在具体实例中，表面可以包含电极。
实施例(31)：一种检测样品中的HIV p24的方法，其包括：(a)将HIV p24结合于：(i)包括捕捉试剂和锚定试剂的表面上的用于HIV p24的捕捉试剂；(ii)包括第一邻近探针的用于HIV p24的第一检测试剂，和(iii)包括第二邻近探针的用于HIV p24的第二检测试剂；由此在表面上形成包括捕捉试剂、HIV p24以及第一和第二检测试剂的检测复合物；(b)使(c)中形成的检测复合物与包括以下的连接序列接触：(i)与第二邻近探针互补的内部序列和(ii)与第一邻近探针的不重叠区域互补的两个末端序列；(c)使连接序列与第一和第二邻近探针杂交；(d)将连接寡核苷酸的两个末端序列连接以形成与第一和第二邻近探针两者杂交的环状目标序列；(e)通过目标序列的滚环扩增延伸第二邻近探针以产生包括结合锚定试剂的结合域的扩增子；(f)使扩增子与锚定试剂结合；和(g)测量表面上的扩增子的量。
实施例(32)：一种检测样品中的HIV p24的方法，其包括：(a)将HIV p24结合于：(i)包括捕捉试剂和锚定试剂的表面上的用于HIV p24的捕捉试剂；(ii)包括第一邻近探针的用于HIV p24的第一检测试剂，和(iii)包括第二邻近探针的用于HIV p24的第二检测试剂；由此在表面上形成包括捕捉试剂、HIV p24以及第一和第二检测试剂的检测复合物；(b)使(c)中形成的检测复合物与第一连接寡核苷酸和第二连接寡核苷酸接触，其中(i)第一连接子的第一端和第二连接子的第一端与第一邻近探针的两个不重叠区域互补，和(ii)第一连接子的第二端和第二连接子的第二端与第一邻近探针的两个不重叠区域互补；(c)使第一和第二连接寡核苷酸与第一和第二邻近探针杂交；(d)连接第一和第二连接寡核苷酸以形成与第一和第二邻近探针两者杂交的环状目标序列；(e)通过目标序列的滚环扩增延伸第二邻近探针，以产生包括结合锚定试剂的结合域的扩增子；(f)将扩增子与锚定试剂结合；和(g)测量表面上的扩增子的量。
实施例(31)和(32)的捕捉试剂是抗体、抗原、配体、受体、寡核苷酸、半抗原、抗原决定基、模拟抗原决定基或适体，且在具体实例中，捕捉试剂是抗体。类似地，第一检测试剂是抗体、抗原、配体、受体、寡核苷酸、半抗原、抗原决定基、模拟抗原决定基或适体，例如第一检测试剂是抗体。另外，第二检测试剂是抗体、抗原、配体、受体、寡核苷酸、半抗原、抗原决定基、模拟抗原决定基或适体，例如第二检测试剂是抗体。在实施例(31)和(32)的具体实例中，捕捉试剂和第一和第二检测试剂是针对HIV p24的抗体。
实施例(31)和(32)的锚定试剂可以包含寡核苷酸序列、适体、适体配体、抗体、抗原、配体、受体、半抗原、抗原决定基或模拟抗原决定基。在一个实例中，结合域可以包含适体且锚定试剂可以包含适体配体。结合域可以包含核酸序列且锚定试剂可以包含DNA结合蛋白；和/或锚定试剂可以包含寡核苷酸序列且扩增子可以包含互补寡核苷酸序列。
实施例(31)和(32)的扩增子可以包含一个或多个检测序列且测量步骤可以包含使延伸序列与多个与一个或多个检测序列互补的被标记的探针接触。此外，扩增子可以进一步包括一个或多个被修饰的碱基且测量步骤可以包含使延伸序列与多个能够结合于一个或多个被修饰的碱基的可检测部分接触。另外，扩增子可以进一步包含一个或多个被标记的碱基且测量步骤可以包含检测一个或多个被标记的碱基的存在。一个或多个被修饰的碱基可以包括适体、适体配体、抗体、抗原、配体、受体、半抗原、抗原决定基或模拟抗原决定基，且多个可检测部分各自包括一个或多个被修饰的碱基和可检测标记的结合搭配物。一个或多个被修饰的碱基可以包括抗生蛋白链菌素且多个可检测部分各自包括生物素和可检测标记；一个或多个被修饰的碱基可以包括生物素且多个可检测部分各自包括抗生蛋白链菌素和可检测标记；一个或多个被修饰的碱基可以包括抗生物素蛋白且多个可检测部分各自包括生物素和可检测标记；和/或一个或多个被修饰的碱基可以包括生物素且多个可检测部分各自包括抗生物素蛋白和可检测标记。
实施例(31)和(32)的步骤(a)可以包含使HIV p24按以下次序与以下物质结合：(i)表面上的捕捉试剂；和(ii)用于HIV p24的第一和第二检测试剂。或者，步骤(a)可以包含使HIV p24按以下次序与以下物质结合：(i)用于HIV p24的第一和第二检测试剂；和(ii)表面上的捕捉试剂。另外，步骤(a)可以包含使HIV p24同时或基本上同时与以下物质结合：(i)表面上的捕捉试剂；和(ii)用于HIV p24的第一和第二检测试剂。
实施例(31)和(32)的扩增子在探针延伸之后保持局限于表面上。复合物可以在延伸步骤之后保持与表面结合。举例来说，扩增子在表面上的复合物的位置的10-100μm内的位置处结合于锚定试剂。在一个具体实施例中，延伸探针在表面上的复合物的位置的小于100μm、小于50μm或更具体地说，小于10μm的位置处结合于锚定试剂。
实施例(31)和(32)的表面可以包含粒子和/或多孔盘的孔。表面可以包含多个不同的结合域且捕捉试剂和锚定试剂位于表面上的两个不同的结合域上。如果表面是盘的孔，那么孔可以包括多个不同的结合域且捕捉试剂和锚定试剂位于孔内的两个不同结合域上。表面可以包含多个不同的结合域且捕捉试剂和锚定试剂位于表面上的相同结合域上。如果表面是盘的孔，那么孔可以包含多个不同的结合域且捕捉试剂和锚定试剂位于孔内的相同结合域上。在具体实例中，捕捉试剂和锚定试剂在表面上的10-100nm内。
另外，表面可以包含电极且测量步骤可以包含向电极施加电压波形以产生电化学发光信号。在这些实施例((31)和(32))中，方法可以进一步包含收集电极上的粒子和向电极施加电压波形以产生电化学发光信号。测量步骤可以包含使扩增子与具有可检测标记的检测探针结合、测量可检测标记和将测量值与样品中分析物的量相关联，其中检测探针包括与扩增子的区域互补的核酸序列。可检测标记是通过测量光散射、吸光度、荧光、化学发光、电化学发光、生物发光、磷光、放射性、磁场或其组合来测量。举例来说，可检测标记是ECL标记且测量步骤可以包含测量ECL信号。检测探针可以具有多个ECL标记。检测探针可以通过探针核苷酸组分的3'端处的键与多重ECL标记部分连接。
实施例(33)：一种检测样品中的所关注分析物的方法，其包括：(a)在足以形成包括与第一检测试剂结合的分析物的分析物复合物的条件下浓缩样品，其中第一检测试剂连接至第一核酸探针；(b)将步骤(a)中形成的分析物复合物结合于：(i)包括用于分析物的捕捉试剂和包括锚定寡核苷酸序列的锚定试剂的表面上的捕捉试剂；和(ii)连接至第二核酸探针的用于分析物的第二检测试剂；由此在表面上形成包括捕捉试剂、分析物和第一和第二检测试剂的复合物；(c)使用需要第一和第二探针邻近的延伸方法来延伸第二探针，以形成包括与锚测序列互补的锚测序列补体的延伸序列；(d)使锚测序列与锚测序列补体杂交；和(e)测量与表面结合的延伸序列的量。浓缩步骤(a)可以进一步包括(i)使包含分析物的样品与固相接触，所述固相连接至与第一核酸探针的至少一部分互补的靶向剂，由此形成包括通过第一核酸探针与靶向剂之间的结合反应与固相结合的分析物的浓缩复合物；(ii)收集浓缩复合物；(iii)使样品的未结合组分与浓缩复合物分离；和(iv)释放浓缩复合物以使固相与分析物分离以形成分析物复合物。
实施例(34)：一种检测样品中的所关注分析物的试剂盒，其在一个或多个小瓶、容器或隔室中包括：(a)包括(i)用于分析物的捕捉试剂和(ii)包括锚定寡核苷酸序列的锚定试剂的表面；(b)连接至第一核酸探针的用于分析物的第一检测试剂；(c)连接至第二核酸探针的用于分析物的第二检测试剂；和(d)包含与第一核酸探针的至少一部分互补的靶向剂的固相。
实施例(35)：一种检测样品中的外泌体的方法，其包括：(a)将外泌体结合于：(i)包括用于外泌体的捕捉试剂和包括锚定寡核苷酸序列的锚定试剂的表面上的捕捉试剂；(ii)连接至第一核酸探针的用于外泌体的第一检测试剂；和(iii)连接至第二核酸探针的用于外泌体的第二检测试剂；由此在表面上形成包括结合试剂、外泌体以及第一和第二检测试剂的复合物；(b)使用需要第一和第二探针邻近的延伸方法来延伸第二探针以形成包括与锚测序列互补的锚测序列补体的延伸序列；(c)使锚测序列与锚测序列补体杂交；和(d)测量与表面结合的延伸序列的量。
实施例(36)：一种检测样品中的所关注外泌体的试剂盒，其在一个或多个小瓶、容器或隔室中包括：(a)包括(i)用于外泌体的捕捉试剂和(ii)包括锚定寡核苷酸序列的锚定试剂的表面；(b)连接至第一核酸探针的用于外泌体的第一检测试剂；和(c)连接至第二核酸探针的用于外泌体的第二检测试剂。
实施例(37)：一种检测样品中的所关注分析物的方法，其包括：将分析物结合于：(i)包括用于分析物的捕捉试剂和包括锚测序列的锚定试剂的表面上的捕捉试剂；(ii)连接至第一核酸探针的用于分析物的第一检测试剂；和(iii)连接至第二核酸探针的用于分析物的第二检测试剂，由此在表面上形成包括结合试剂、分析物以及第一和第二检测试剂的复合物；(b)延伸第一和第二核酸探针以形成包括与锚测序列互补的锚测序列补体的延伸序列；(c)使锚测序列与锚测序列补体杂交；和(d)使用式I的被标记的探针测量与表面结合的延伸序列的量：
其中B是核苷酸碱基，R是电化学发光标记，L1是键联基团，L2是键联基团，j是0与11之间的整数，k是0与1之间的整数，m是0与11之间的整数，且n是0与5之间的整数。
实施例(38)：一种检测样品中的所关注分析物的方法，其包括：将分析物结合于：(i)包括用于分析物的捕捉试剂和包括锚测序列的锚定试剂的表面上的捕捉试剂；和(ii)连接至核酸探针的用于分析物的检测试剂，由此在表面上形成包括结合试剂、分析物和检测试剂的复合物；(b)延伸核酸探针以形成包括与锚测序列互补的锚测序列补体的延伸序列；(c)使锚测序列与锚测序列补体杂交；和(d)使用式I的被标记的探针测量结合于表面的延伸序列的量。
在以上实施例(1)至(38)中的任一个中，锚定试剂在分析物与捕捉试剂结合之前、期间或之后连接至表面。在包括试剂盒的实施例中，锚定试剂与表面分开提供且接着固定于表面上，其中捕捉试剂固定于表面上。在包括试剂盒的实施例中，锚定试剂和捕捉试剂提供为固定于表面上。
以上实施例(1)至(38)中的任一个可以包含式I的被标记的探针：
其中B是核苷酸碱基，R是电化学发光标记，L1是键联基团，L2是键联基团，j是0与11之间的整数，k是0与1之间的整数，m是0与11之间的整数且n是0与5之间的整数。
以上实施例(1)至(38)中的任一个可以包含式II的被标记的探针：
其中j是0与11之间的整数，k是0与1之间的整数，m是0与11之间的整数，n是0与5之间的整数，且R是电化学发光标记：
本文实施例中所述的方法中的任一种可以包含测量电化学发光的方法，其包括：(a)在其中接近电极的复合物将发射电化学发光的条件下向电极施加电位，其中复合物包括本文提供的目标寡核苷酸和被标记的探针，其中被标记的探针包括与目标寡核苷酸互补的寡核苷酸；和(b)测量发射的电化学发光。
实施例(1)至(38)中的任一个中所述的核酸探针(例如连接至检测试剂)可以包括寡核苷酸，其中寡核苷酸的长度为14-24个核苷酸且包括14或15个5'-GACAGAACTAGACAC-3'(SEQ ID NO:33)的连续核苷酸。在实施例中，本发明提供使核酸探针与非核酸检测试剂结合以形成结合物的方法，其包括使检测试剂和核酸探针与异双官能交联剂在其中检测试剂与交联剂的第一反应性基团反应且核酸与交联剂的第二反应性基团反应以形成结合物的条件下接触，其中异双官能交联剂包括(i)能够与检测试剂反应以将交联剂连接至检测试剂的第一反应性基团，和(ii)能够与核酸探针反应以将交联剂连接至核酸探针，同时基本上不对检测试剂具有反应性的第二反应性基团，其中方法不包括在交联剂与核酸探针反应之前纯化检测试剂和交联剂的反应产物。
在实施例中，本发明提供一种使核酸探针与非核酸检测试剂结合以形成结合物的方法，其包括(a)使检测试剂与异双官能交联剂在其中检测试剂与交联剂的第一反应性基团反应以形成第一组合物的条件下接触，其中异双官能交联剂包括(i)能够与检测试剂反应以将交联剂连接至检测试剂的第一反应性基团，和(ii)能够与核酸探针反应以将交联剂连接至核酸探针，同时基本上不对检测试剂具有反应性的第二反应性基团；(b)使第一组合物与核酸探针在其中交联剂中的第二反应性基团与核酸探针反应以形成结合物的条件下接触，其中方法不包括在交联剂与核酸探针反应之前纯化检测试剂和交联剂的反应产物。
在实施例中，本发明提供一种使核酸探针与非核酸检测试剂结合以形成结合物的试剂盒，其包括：(a)包括以下的异双官能交联剂：(i)能够与检测试剂反应以将交联剂连接至检测试剂的第一反应性基团；和(ii)能够与核酸探针反应以将交联剂连接至核酸探针，同时基本上不对检测试剂具有反应性的第二反应性基团；(b)能够将结合物与未反应的核酸探针分离的第一尺寸分离装置；和(c)核酸结合荧光团，其中荧光团的荧光强度在荧光团与核酸结合时增加。在实施例中，本发明提供一种使核酸探针与非核酸检测试剂结合以形成结合物的方法，其包括：(a)使检测试剂与核酸探针反应以形成结合物；(b)使用尺寸分离装置将结合物与未反应的核酸探针分离以形成纯化结合物；(c)形成包括纯化结合物和核酸结合荧光团的样品的测试组合物，所述核酸结合荧光团针对具有当荧光团与核酸结合时增加的荧光强度进行选择；和(d)测量测试组合物的荧光以确定纯化结合物中核酸探针的量。
附图说明
图1(a)-(c)说明锚定试剂于免疫分析中的用途。图1(a)展示锚定试剂结合于包括捕捉试剂、所关注分析物和包含核酸探针的检测试剂的检测复合物且使其稳定的用途。核酸探针经延伸以结合于锚定试剂。在图1(b)中，锚定试剂包含寡核苷酸序列，所述寡核苷酸序列包含与在检测试剂上形成的延伸序列的一部分互补的区域。图1(c)展示具体实施例，其中两种检测试剂用于结合分析物，各检测试剂包含核酸探针。对检测试剂上的探针进行扩增方法，其使得能够将一个延伸探针与锚定寡核苷酸序列杂交。
图2(a)展示具体实施例，其中对携有锚定试剂的表面上形成的免疫复合物进行PLA-RCA方法，以在与免疫复合物连接的延伸序列中并入多种可检测物质。图2(b)和2(c)是可以用于本发明方法中的连接寡核苷酸的两种替代配置。
图3展示将寡核苷酸连接至蛋白质的一种方法。
图4(a)说明本发明的一个优选实施例，其中表面结合复合物形成于捕捉试剂、分析物与两种检测试剂之间，检测试剂各自分别连接至第一和第二邻近探针，所述探针连接至连接探针以形成通过滚环扩增进行扩增的环状DNA模板。图4(a)还包含扩增试剂，所述扩增试剂包含与随着分析方法进展形成的扩增子的序列互补的锚定寡核苷酸序列。图4(b)展示第一环状DNA模板Circ-1的例示性序列、检测寡核苷酸序列、扩增子的惰性区和部分PP2，其被设计成与第二邻近探针杂交。替代实施例描绘于图4(c)中。
图5和6(a)-(b)说明产生可以通过滚环扩增进行扩增的扩增子的替代方法。
图7说明替代实施例，其中夹心复合物中的各邻近探针的一部分由与各片段杂交的RNA的短股暂时保护。这些股以酶方式去除，以允许邻近探针彼此杂交且延伸链。
图8展示另一实施例，其中邻近探针连接至捕捉试剂和检测试剂，且各邻近探针的一部分由与其杂交的RNA的短股暂时保护，如参看图8在上文所述。
图9展示使用实例1中所述的方法进行的IL-10分析的校准曲线。
图10(a)-(b)展示在使用(a)和不使用(b)锚定试剂的情况下的荧光显微镜影像。
图11(a)展示包含连接位点1或2的单一线性连接寡核苷酸序列的配置，和这些连接子在本发明的分析中的用途。图11(b)展示使用Circ-1和Circ-2的组合相对于包含连接位点1的单一线性连接寡核苷酸序列或包含连接位点2的单一线性连接寡核苷酸序列的分析的比较性能数据。
图12展示使用实例1和6中所述的方法进行的HIV p24分析的校准曲线。
图13展示使用实例1和6中所述的方法进行血清转化组分析的结果。
图14(a)-(c)展示包含分析物浓缩步骤的HIVp24分析的结果。
图15展示包含分析物浓缩步骤的HIVp24分析的校准曲线。
图16是包含分析物浓缩步骤的如本文所述的分析方法的示意图。
图17是如本文所述的分析方法的示意图，其中在通过捕捉试剂和/或锚定试剂结合于表面之前，在溶液中形成扩增子。
图18是分析方法的示意图，所述方法并入使用多个U形钉序列(staple sequence)以粘附至扩增子，由此在表面上形成更紧凑结构。
图19是并入3AB PLA-RCA技术的桥接免疫分析形式和靶向部分和其补体将捕捉试剂结合于表面的用途的示意图。
图20(a)-(b)是用于模板形成的生物合成方法的示意图。
图21是样品多重化的示意图。
图22是使用本文所述的方法检测脂蛋白复合物的示意图。
图23a和图23b展示(a)通过荧光染料方法和凝胶电泳测量的抗体-寡核苷酸结合物的平均标记/蛋白质(L/P)比的比较，和(b)对于游离寡核苷酸和抗体-寡核苷酸结合物中的寡核苷酸，随寡核苷酸浓度而变的通过荧光染料方法测量的信号。
图24展示在抗生蛋白链菌素涂布表面上进行的双抗体扩增ECL免疫分析的示意性描述。
图25(a)-(c)展示(a)针对抗体-寡核苷酸结合反应的粗产物，来自G-100Superfine柱的洗脱概况相对于针对未结合抗体、未结合寡核苷酸和纯化结合物的概况；(b)针对IL-6检测抗体-寡核苷酸结合物的洗脱概况和收集的洗脱份；和(c)使用G-100纯化的IL-6检测抗体-寡核苷酸结合物的扩增ECL免疫分析的校准曲线相对于通过离心超滤纯化结合物时的结果。
图26(a)-(b)展示(a)对于六种不同核酸敏感性荧光染料(左侧)，在结合于游离寡核苷酸相对于与抗体结合的寡核苷酸之后的相对荧光信号；(中间)来自与染料与蛋白质的相互作用相关的抗体-寡核苷酸结合物的信号的％和(右侧)在测量100ng结合物期间获得的信号:背景比；和(b)随寡核苷酸浓度而变的针对三抗体-寡核苷酸结合物使用SYBRGreen I染料测量的荧光信号(和这些信号与通过未结合寡核苷酸获得的这些信号的比较)。
图27(a)-(b)比较以(a)依序和(b)同时分析形式，对于三种不同分析物，在扩增ECL分析中，4种不同被标记检测寡核苷酸构筑体的性能。
图28比较以依序和同时分析形式，对于三种不同分析物，在扩增ECL分析中，2种不同被标记检测寡核苷酸构筑体的性能。
图29(a)-(b)展示交联剂激发比和结合方案对抗体-寡核苷酸结合物的产生和性能的影响，提供了(a)扩增ECL分析中的标记/蛋白质(L/P)和性能，以及(b)通过凝胶电泳的结合物形成的表征。
图30(a)-(b)比较不同生物素-锚定寡核苷酸构筑体在扩增ECL分析中对于两种分析物的性能。
图31(a)-(b)展示(a)检测抗体-寡核苷酸探针结合物的探针长度对使用结合物的分析所获得的信号、背景和检测极限的影响，和(b)探针中的GC含量对分析中的连接步骤针对改变温度的灵敏度的影响。
图32比较扩增ECL分析中的不同Circ寡核苷酸构筑体对于分析物的性能。
图33是在试剂最佳化以进行扩增ECL分析期间进行的改良的示意性描述。
图34(a)-(b)展示(a)比较以常规和放大形式获得的信号的三种分析物的分析的校准曲线；和(b)比较针对41种以不同分析物是目标的不同分析以两种形式获得的检测极限。
具体实施方式
除非本文中另外定义，否则结合本发明使用的科学与技术术语应具有由所属领域的一般技术人员通常理解的含义。另外，除非上下文另外需要，否则单数术语应包含复数且复数术语应包含单数。冠词“一(a/an)”在本文中用于指一个(种)或多于一个(种)(即，至少一个(种))所述冠词的语法对象。举例来说，“一个要素”意指一个要素或超过一个要素。
如本文所使用，术语“约”用于指示值包含用于确定所述值的装置或方法的误差的固有变化。
如本文所用，“在……之间”是包含范围末端的范围。举例来说，x与y之间的数字明确包含数字x和y，以及x和y内的任何数字。
如本文所用，“试剂盒”是指被提供或聚集以共同地用于例如产生组合物、制造装置或进行方法的一组组分。试剂盒可以包含一种或多种组分。试剂盒的组分可以按一个封装或多个封装提供，其中每一个可以含有组分中的一种或多种。试剂盒的所列组分可以转而也提供为单个物理部分或被组合以供试剂盒使用的多个部分。举例来说，试剂盒的仪器组件可以完全组装地提供或以在使用前组装的多个仪器部件形式提供。类似地，试剂盒的液体试剂组分可以提供为容器中的完整液体配制物、待组合以提供完整液体配制物的一种或多种干式试剂和一种或多种液体稀释剂或待组合以提供完整液体配制物的两种或更多种液体溶液。如所属领域中已知，用于分析的试剂盒组分由于具有不同储存需求，例如4℃相对于-70℃的储存温度而通常分开运送和储存。
在分析中测量的分析物或分析中所用的一类试剂的情况下，术语“多种”意指超过一种结构上和/或功能上不同的分析物或试剂(例如捕捉抗体A和捕捉抗体B)，而非仅仅分析物或试剂的超过一个拷贝(例如捕捉抗体A和捕捉抗体A的另一拷贝)。举例来说，术语“多种固定抗原”意指超过一种结构上或功能上不同的抗原经固定，且不描述存在仅一个单一抗原的多个拷贝的情况。然而，在此上下文中使用术语“多种”不排除存在多种分析物或试剂中的任一种的多个拷贝的可能性。举例来说，多种固定抗原可指包括抗原A的一个或多个拷贝和抗原B的一个或多个拷贝的固定抗原。
如本文所用，术语“多肽”意图涵盖单数“多肽(polypeptide)”以及复数“多肽(polypeptides)”，且是指由通过酰胺键(即，肽键)线性连接的单体(氨基酸)构成的分子。术语“多肽”是指氨基酸的任何一条或多条链，且不指产物的具体长度。因此，肽、二肽、三肽、寡肽、“蛋白质”、“氨基酸链”或用于指氨基酸的一条或多条链的任何其它术语均包含于“多肽”的定义内，且可以使用术语“多肽”替代这些术语中的任一个或可以与其互换使用。术语“多肽”还意指多肽的表达后修饰产物，包含但不限于糖基化、乙酰化、磷酸化、酰胺化、通过已知保护基/阻隔基衍生化、蛋白水解分裂或通过非天然存在的氨基酸修饰。多肽可以衍生自天然生物来源或通过重组技术制得，但不一定从指定的核酸序列翻译而成。其可以按任何方式产生，包含化学合成。在多肽的情形下，“线性序列”或“序列”是多肽中在氨基至羧基末端方向上的氨基酸的顺序，其中序列中彼此相邻的残基在多肽的一级结构中邻接。
“结合试剂”或“结合物质”是指特征为与另一物质(其可称为“结合搭配物”)结合的能力的试剂或物质。本发明的结合试剂、结合物质和结合搭配物包含“抗原结合物质”，其是指代抗体、抗体片段、抗体衍生物、抗体类似物、抗体变体、工程改造抗体和其它以与抗体类似的方式结合于抗原的物质的术语。抗原结合物质包含包括抗体的至少一个重链或轻链互补决定区(CDR)的物质。抗原结合物质包含包括来自一种或多种抗体的至少两个CDR的物质。抗原结合物质包含包括来自一种或多种抗体的至少三个CDR的物质。抗原结合物质包含包括来自一种或多种抗体的至少四个CDR的物质。抗原结合物质包含包括来自一种或多种抗体的至少五个CDR的物质。抗原结合物质包含包括来自一种或多种抗体的至少六个CDR的物质。
衍生自抗体的抗原结合物质或其它抗原结合物质可以包含诸如在抗体序列中添加、去除或置换一个或多个抗体以改良所述抗体针对其所期望目标的亲和力和/或特异性(例如通过使用用于抗体的“亲和力成熟”的确立方法)，和/或改良试剂的其它特性(例如改良稳定性或减少样品中的潜在干扰组分，诸如补体、类风湿因子或抗物种抗体的相互作用)。在一个实施例中，抗原结合物质是减少样品的Fc结合组分的潜在干扰的抗体的Fab部分。在测量来自具体物种的样品中的分析物的一个实施例中，抗原结合物质是被设计成匹配所述物种的抗体类别的抗体修饰形式(例如小鼠抗体可被人类化以用于对人类样品进行的分析，以避免来自通常存在于人类样品中的人类抗小鼠抗体(即，靶向小鼠抗体的人类抗体)的干扰。
如本文所用，“人类”或“全人类”抗体包含具有人类免疫球蛋白的氨基酸序列的抗体，且包含从人类免疫球蛋白文库或从针对一种或多种人类免疫球蛋白转殖基因的动物分离且不表达内源免疫球蛋白的抗体，如下文和例如美国专利第5,939,598号中所描述。“人类”或“全人类”抗体还包含包括至少重链可变域或至少重链和轻链可变域的抗体，其中可变域具有人类免疫球蛋白可变域的氨基酸序列。“人类化”抗体是来自其它物种的抗体，其恒定和构架序列已被修饰以尝试匹配一类人类抗体，同时维持结合原始抗体的目标抗原的能力。
术语“抗体”和“免疫球蛋白”在本文中可以互换使用。抗体或免疫球蛋白包括至少重链的可变域，且通常包括至少重链和轻链的可变域。脊椎动物系统中的基本免疫球蛋白结构是相对充分理解的。参见例如，Harlow等人(1988)《抗体：实验室手册(Antibodies:ALaboratory Manual)》(第2版；Cold Spring Harbor Laboratory Press)。
术语“免疫球蛋白”包括各种广泛类别的多肽，其可以生物化学方式区分。所属领域的技术人员应了解，由动物物种产生的重链可分类为不同类别，诸如γ、μ、α、δ或ε，且这些类别可以进一步分为亚类(例如γ1-γ4)。此链的性质将抗体的“类别”分别确定为IgG、IgM、IgA IgG或IgE。免疫球蛋白亚类(同型)，例如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1等被充分表征且已知赋予功能专门化。鉴于本发明，这些类别和同型中的每一种的被修饰形式可由所属领域的技术人员容易地辨别，且因此在本发明的范围内。所有免疫球蛋白类别显然在本发明的范围内。以下讨论通常将针对免疫球蛋白的IgG类别。哺乳动物中产生的IgG的大部分形式包括分子量约为23,000道尔顿的两条相同轻链多肽，和分子量为53,000-70,000的两条相同重链多肽。四条链通常以“Y”配置通过二硫键接合，其中轻链在“Y”的开口处开始支托重链且继续贯穿可变区。精确分子量可以在物种间和亚类间不同。一些物种，诸如骆驼科物种还可以产生无轻链的IgG形式。
轻链还可以按不同可分类形式，诸如κ(Vκ)或λ(Vλ)形式产生。各重链类别可以与κ或λ轻链结合。一般来说，轻链和重链彼此共价键结，且两条重链的“尾”部分通过共价二硫键或非共价键彼此键结。在重链中，氨基酸序列从Y配置的分叉末端处的N端延行至各链的底部的C端。
轻链和重链均分为具有结构和功能同源性的区域。术语“恒定”和“可变”是在功能上使用。就此来说，应了解，轻链(Vκ或Vλ-统称为“VL”)和重链(VH)部分的可变域均决定抗原识别和特异性。相反，轻链(CL)和重链(CH1、CH2或CH3)的恒定域赋予重要生物特性，诸如分泌、经胎盘移动性、Fc受体结合、补体结合等。按照惯例，恒定区域的编号随着其距离抗体的抗原结合位点或氨基末端越远而增大。N端部分是可变区且C端部分是恒定区；CH3和CL域通常分别包括重链和轻链的羧基末端。
如上文所指出，可变区允许抗体选择性识别和特异性结合抗原上的抗原决定基。即，抗体的VL域和VH域或这些可变域内的互补决定区(CDR)的子集组合形成界定三维抗原结合位点的可变区。此四级抗体结构形成存在于Y的各臂末端处的抗原结合位点。更具体地说，抗原结合位点通常由VH和VL链中的每一个上的三个CDR定义。如本文所用，术语HCDR1、HCDR2、HCDR3分别是指VH CDR1、VH CDR2、VH CDR3。同样，如本文所用，术语LCDR1、LCDR2、LCDR3分别是指VL CDR1、VL CDR2和VL CDR3。在一些情况下，例如某些衍生自骆驼科物种或基于骆驼科免疫球蛋白工程改造的免疫球蛋白，完整免疫球蛋白可仅由重链组成，不具有轻链。参见例如Hamers-Casterman等人,《自然(Nature)》363:446-448(1993)。
在天然存在的抗体中，通常存在于各抗原结合域中的六个“互补决定区”或“CDR”是被特异性定位以形成抗原结合域的氨基酸的短、非连续序列，因为抗体在水性环境中假定其三维配置。抗原结合域中的氨基酸的其余部分称为“构架”区，显示较少分子间变化性。构架区主要采用折叠构形且CDR形成环，所述环连接β-折叠结构且在一些情况下形成β-折叠结构的一部分。因此，构架区用于形成骨架，所述骨架通过链间非共价相互作用提供CDR在正确方向上的定位。通过定位的CDR形成的抗原结合域界定与免疫反应性抗原上的抗原决定基互补的表面。此互补表面促进抗体与其同源抗原决定基非共价结合。所属领域的一般技术人员可以容易地鉴别分别包括CDR和构架区的氨基酸的任何给定重链或轻链可变域，因为其已被精确定义(参见下文)。
在存在两种或更多种在所属领域中所用和/或所接受的术语的定义的情况下，除非相反地明确陈述，否则如本文所用的术语的定义意图包含所有这类含义。具体实例是使用术语“互补决定区”(“CDR”)来描述重链和轻链多肽的可变区内所见的非连续抗原组合位点。此区域已由Kabat等人(1983)U.S.Dept.of Health and Human Services,《免疫学感兴趣的蛋白质的序列(Sequences of Proteins of Immunological Interest)》,Chothia和Lesk,《分子生物学杂志(J.Mol.Biol.)》196:901-917(1987)描述，且由Kunik等人,《核酸研究(Nucl.Acids Res.)》40:W521-W524(2012)最近更新，所述文献以引用的方式并入本文中，其中当彼此对照比较时，定义包含氨基酸残基的重叠或亚群。然而，涉及抗体或其变体的CDR的任何定义的应用意图处于如本文中所定义和所用的术语的范围内。涵盖具体CDR的确切残基数目将视CDR的序列和尺寸而变。在抗体的可变区氨基酸序列指定的情况下，所属领域的技术人员可以常规方式判定哪些残基包括具体CDR。
Kabat等人还定义适用于任何抗体的可变域序列编号系统。所属领域的一般技术人员可将此“Kabat编号”系统明确地分配给任何可变域序列，而不依赖于除序列本身以外的任何实验数据。如本文所用，“Kabat编号”是指由Kabat等人(1983)U.S.Dept.of Healthand Human Services,《免疫学感兴趣的蛋白质的序列》所阐述的编号系统。
Kunik等人,《核酸研究》40:W521-W524(2012)公开一种在线工具Paratome，用于基于序列或结构来系统鉴别抗体中的抗原结合区。通常，基于Paratome的分析与Kabat编号匹配，但还可以包含与常规CDR相邻的残基。
本发明的抗体或抗原结合片段、其变体或衍生物包含但不限于多克隆、单克隆、多特异性、人类、人类化、灵长类化、嵌合抗体、单链抗体、抗原决定基结合片段(例如Fab、Fab'和F(ab')2、Fd、Fv、单链Fv(scFv)、二硫键连接的Fv(sdFv))、包括VL或VH域的片段、由Fab表达文库产生的片段和抗个体基因型(抗Id)抗体。scFv构筑体是所属领域中已知的且描述于例如美国专利第5,892,019号中。本发明的免疫球蛋白或抗体可以是免疫球蛋白分子的任何类型IgG、IgE、IgD、IgA和IgY)、类别(例如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1和IgA2等)或亚类。产生抗体和其它抗原结合物质的许多方法是所属领域中众所周知的，且包含从B细胞培养物、从融合瘤细胞培养物、从培养物或被短暂或永久转染的宿主细胞株、从细菌、从酵母、从植物细胞和从昆虫细胞来产生。
如本文所用，术语“重链部分”包含衍生自免疫球蛋白重链的氨基酸序列。包括重链部分的多肽包括以下中的至少一个：CH1域、铰链(例如上、中和/或下铰链区)域、CH2域、CH3域、或其变体或片段。举例来说，用于本发明的结合多肽可以包括含有CH1域的多肽链；包括CH1域、铰链域的至少一部分和CH2域的多肽链；包括CH1域和CH3域的多肽链；包括CH1域、铰链域的至少一部分和CH3域的多肽链或包括CH1域、铰链域的至少一部分、CH2域和CH3域的多肽链。在另一实施例中，本发明的多肽包括含有CH3域的多肽链。另外，用于本发明的结合多肽可缺少CH2域的至少一部分(例如CH2域的全部或部分)。如上文所阐述，所属领域的一般技术人员应了解，这些域(例如重链部分)可被修饰以使其氨基酸序列与天然存在的免疫球蛋白分子不同。
在本文公开的某些抗体或其抗原结合片段、变体或衍生物中，多聚体的一条多肽链的重链部分与多聚体的第二多肽链上的重链部分相同。或者，本发明的含重链部分的单体不相同。举例来说，各单体可以包括不同目标结合位点，形成例如双特异性抗体。
如本文所用，术语“轻链部分”包含衍生自免疫球蛋白轻链，例如κ或λ轻链的氨基酸序列。优选地，轻链部分包括VL或CL域中的至少一个。
如上文所定义的“抗原结合物质”可关于其识别或特异性结合的物质的抗原决定基或部分来描述或指定。与抗体的抗原结合域特异性相互作用的目标多肽部分是“抗原决定基”或“抗原决定子”。目标多肽可以包括单个抗原决定基，但通常包括至少两个抗原决定基，且可以包含任何数目的抗原决定基，其取决于抗原中尺寸、构形和类型。此外，应注意，目标多肽上的“抗原决定基”可以是或可以包含非多肽元件，例如抗原决定基可以包含碳水化合物侧链。
抗原结合物质的肽或多肽抗原决定基的最小尺寸被认为是约四至五个氨基酸。肽或多肽抗原决定基优选含有至少七个，更优选至少九个且最优选至少约15至约30个氨基酸。由于CDR可识别呈三级形式的抗原肽或多肽，包括抗原决定基的氨基酸不必是连续的，且在一些情况下，甚至可不在相同肽链上。由本发明的抗原结合分子识别的肽或多肽抗原决定基可以含有至少4个、至少5个、至少6个、至少7个、更优选至少8个、至少9个、至少10个、至少15个、至少20个、至少25个或约15至约30个连续或非连续氨基酸的序列。
“抗原”意指能够特异性或优先结合抗体结合物质，诸如抗体或其抗原结合片段的物质。
在抗体(和类似地，其它抗原结合物质)的情况下，“优先结合”意指相比于抗体将与参考抗原决定基(其可以是相关、类似、同源或相似抗原决定基)结合，其更容易与抗原决定基特异性结合。因此，“优先结合”于给定抗原决定基的抗体将更容易结合于所述抗原决定基而非参考抗原决定基，尽管这类抗体可以与参考抗原决定基交叉反应。
在抗体(和类似地，其它抗原结合物质)的情况下，“特异性结合”意指抗体通过其抗原结合域结合于抗原决定基，且结合需要抗原结合域与抗原决定基之间的互补性。根据此定义，当相对于随机的无关抗原决定基，抗体通过其抗原结合域优先结合于一个抗原决定基时，将抗体称为“特异性结合”于所述抗原决定基。
作为非限制性实例，如果在实验条件(例如用于进行分析的条件)下，相对于结合于第二抗原决定基的量的结合于第一抗原决定基的量(表示为比率)为大于1、10、100、1,000或10,000，那么可将抗体视为相对于第二抗原决定基优先结合第一抗原决定基。在另一非限制性实例中，如果相对于抗体针对第二抗原决定基的平衡解离常数(KD)，结合于第一抗原决定基的KD(表示为比率)为小于1、0.1、0.01、0.001或0.0001，那么可将抗体视为相对于第二抗原决定基优先结合第一抗原决定基。在另一非限制性实例中，如果相对于抗体针对第二抗原决定基的结合速率常数(也称为结合速率或kon)，结合于第一抗原决定基的kon(表示为比率)为大于1、10、100、1,000或10,000，那么可将抗体视为相对于第二抗原决定基优先结合第一抗原决定基。在另一非限制性实例中，如果相对于抗体针对第二抗原决定基的解离速率常数(也称为解离速率或koff)，从第一抗原决定基解离的koff(表示为比率)为小于1、0.1、0.01、0.001或0.0001，那么可将抗体视为相对于第二抗原决定基优先结合第一抗原决定基。
当比较两种抗体对第一抗原决定基相对于第二抗原决定基的偏好时，对第一抗原决定基具有更强偏好的抗体可称为更特异性针对第一抗原决定基。偏好强度可例如通过在所选实验条件下与两个抗原决定基的结合量的比率、通过KD值的比率、通过kon值的比率和/或通过koff值的比率(这些比率如上一段中所述地确定)来确定。
一般来说，通过使用高亲和力和缓慢解离速率抗体，分析灵敏度和稳固性得以改良。在实施例中，本文公开的抗体或其它抗原结合物质以小于或等于10nM、1nM、500pM、200pM、100pM、30pM或10pM的KD结合目标抗原。在实施例中，本文公开的抗体或其它抗原结合物质以小于或等于10nM、1nM、500pM、200pM、100pM、30pM或10pM的KD结合目标多肽。在实施例中，本文公开的抗体或其它抗原结合物质以小于或等于5×10-2sec-1、10-2sec-1、5×10-3sec-1或10-3sec-1的koff与目标抗原解离。在实施例中，本文公开的本发明的抗体或其它抗原结合物质以小于或等于5×10-4sec-1、10-4sec-1、5×10-5sec-1或10-5sec-1、5×10-6sec-1、10-6sec-1、5×10-7sec-1或10-7sec-1的koff与目标多肽解离。
本发明的抗原结合物质可以具有“多特异性”、双特异性、三特异性或更大多特异性，意指其同时识别和结合于一种或多种不同抗原(例如蛋白质)上存在的两种或更多种不同抗原决定基。因此，抗原结合物质是“单特异性”或“多特异性”，例如“双特异性”是指与结合多肽进行反应的不同抗原决定基的数目。多特异性抗体可以对目标的不同抗原决定基具有特异性，或可以对目标多肽以及异源抗原决定基，诸如异源多肽具有特异性。
如先前所指示，各种免疫球蛋白类别的恒定区的次单位结构和三维配置是众所周知的。如本文所用，术语“VH域”包含免疫球蛋白重链的氨基末端可变域，且术语“CH1域”包含免疫球蛋白重链的第一(大部分氨基末端)恒定区域。CH1域与VH域相邻，且在免疫球蛋白重链的铰链区的氨基末端。
如本文所用，术语“铰链区”包含将CH1域与CH2域接合的重链部分。此铰链区包括大约25个残基且是柔性的，因此允许两个N端抗原结合区独立地移动。铰链区可细分成三个不同域：上、中和下铰链域(Roux等人,《免疫学杂志(J.Immunol.)》161:4083(1998))。
如本文所用，术语“二硫键”包含在两个硫原子之间形成的共价键。氨基酸半胱氨酸包括可以与第二硫醇基形成二硫键或桥的硫醇基。在大部分天然存在的IgG中，CH1和CL区是通过二硫键连接且两条重链是通过两个二硫键在对应于使用Kabat编号系统的239和242的位置(位置226或229，EU编号系统)处连接。
如本文所用，术语“连接(linked)”、“融合(fused/fusion)”可互换使用。这些术语是指通过包含化学结合或重组手段的任何手段使两种或更多种元件或组分接合在一起。“框内融合”是指两个或多于两个聚核苷酸开放阅读框架(ORF)以维持原始ORF的正确翻译阅读框架的方式接合以形成连续较长ORF。因此，重组融合蛋白是单一蛋白质，其含有两个或更多个对应于由原始ORF编码的多肽的区段(所述区段在自然界中通常不如此接合)。虽然阅读框架因此在整个融合区段中连续，但所述区段可以通过例如框内连接序列在物理或空间上分离。举例来说，编码免疫球蛋白可变区的CDR的聚核苷酸可以在框内融合，但通过编码至少一个免疫球蛋白构架区或额外CDR区的聚核苷酸分离，只要“融合”CDR共翻译为连续多肽的一部分即可。
如本文所用的术语“寡核苷酸”是指诸如DNA或RNA的核酸的短聚合物。在实施例中，寡核苷酸的长度为约5至约150个核苷酸。寡核苷酸可被设计成与DNA或RNA序列特异性杂交，例如作为检测与寡核苷酸互补的具体序列的探针。寡核苷酸可以是单股或双股。本文所述的寡核苷酸可以通过任何方式产生，包含化学合成。
术语“寡核苷酸”可以包含包括非天然存在的化学结构的结构类似物。在实施例中，寡核苷酸包括在其5'末端或3'末端处的修饰、内部修饰或其组合。修饰核苷酸和/或核酸的方法是所属领域中已知的。寡核苷酸修饰的实例包含但不限于可以用于将寡核苷酸连接至另一物质或表面的连接修饰；荧光团和荧光淬灭剂；被修饰的碱基；磷酸化修饰，例如当寡核苷酸用作连接酶底物时；间隔子，例如以在寡核苷酸中在核酸序列与反应性官能团之间产生距离；和硫代磷酸酯键，例如以增加寡核苷酸对核酸酶降解的抗性。例示性修饰提供于下表A中。
表A.寡核苷酸修饰
在实施例中，修饰包括生物素、抗生蛋白链菌素、抗生物素蛋白、氨基、硫醇基、醛基、酰肼基、叠氮基、炔基、顺丁烯二酰亚胺基和/或碘乙酰胺基。
在一个实例中，核苷酸和/或核酸可以包含以下化学修饰：将其与另一物质(诸如标记)连接，或提供可以与另一物质(诸如标记)连接的反应性官能团，例如通过使用胺或硫醇修饰的核苷酸碱基、磷酸盐或糖。术语“反应性官能团”是指可经历另一化学反应，例如以与另一官能团形成共价键的原子或一组相关原子。反应性官能团的实例包含但不限于氨基、硫醇基、羟基和羰基。在一个方面中，反应性官能团包含反应性硫醇基。可以通过这些化学修饰连接至核苷酸或核酸的标记包含但不限于可检测部分，诸如生物素、半抗原、荧光团和电化学发光(ECL)标记。
在另一方面中，寡核苷酸中的核苷酸可被修饰以防止其所并入的核酸链的酶促或化学延伸，例如通过用二去氧核糖置换核糖或去氧核糖基团。在另一实例中，将核苷酸碱基(例如糖和/或磷酸基)连接在一起的主链组分可被修饰或置换，例如通过使用肽核酸(PNA)或通过并入核糖类似物，诸如在2'-O-甲基取代的RNA、锁核酸、桥接核酸和吗啉基核酸中发现的这些。这些“主链”类似物可存在于核酸和/或寡核苷酸中的一个、一些或所有主链连接中，且可以提供某些优势，诸如具有改良的结合稳定性和/或与核酸酶的连接稳定性的杂交产物。在核苷酸和核酸结构类似物的另一实例中，可以包含非天然核苷酸碱基。非天然(也称为“非典型”碱基)可以与天然(典型)碱基杂交或其可以与另一非天然碱基杂交。
在核酸的情况下，“探针”通常是指包含可以与另一核酸序列互补的序列的寡核苷酸(通常是5至50个碱基)。在一些应用中，与目标序列中的互补区域杂交的探针可使得探针能够通过聚合酶进行引物延伸，充当目标序列上的相邻单股区域的复制起点(在这类状况下，探针还可以称为“引物”)。
如本文所用的“核酸探针”包含如下的寡核苷酸：(i)经一个或多个反应性部分修饰，所述一个或多个反应性部分可以用于使寡核苷酸与另一物质反应且因此将其连接，或(ii)连接至另一物质(例如通过如第(i)项中所述的反应)。在实施例中，核酸探针连接至检测试剂。在实施例中，核酸探针连接至多肽。在实施例中，核酸探针连接至抗体或其它抗原结合物质。在实施例中，反应性部分是反应性官能团。在实施例中，反应性官能团是烯烃、张力烯烃、炔烃、卤化物、醇、硫醇、胺、磷酸盐、醛、酮、羧酸、羧酸盐、酰胺、酯、硫酯、酰基磷酸盐、酸卤化物、腈、酸酐、肼、四嗪或叠氮化物。在实施例中，反应性部分是结合试剂-结合搭配物对的成员，例如生物素或抗生蛋白链菌素。在实施例中，核酸探针包括与模板寡核苷酸互补的序列以用于扩增。在实施例中，核酸探针与环状模板寡核苷酸结合以用于环状模板寡核苷酸的滚环扩增(RCA)。在实施例中，RCA产生延伸序列。在实施例中，核酸探针是用于RCA的引物。
“被标记的探针”是指包括寡核苷酸和可检测部分(也称为“标记”)的化合物。可检测部分(或标记)是指具有可检测物理特性或能够使化学基团或部分展现可检测物理特性的化学基团或部分，包含例如催化底物转化为可检测产物的酶。标记可以通过光谱学、光化学、生物化学、免疫化学、电学、光学、化学或其它方法来检测。标记的实例包含但不限于放射性同位素、酶、底物、荧光分子、化学发光部分、电化学发光部分、磁性粒子和生物发光部分。在另一方面中，标记是作为结合对的成员的化合物，其中结合对的第一成员(其可称为“主要结合试剂”)附着于底物，例如寡核苷酸，且结合对的另一成员(其可称为“次要结合试剂”)具有可检测物理特性。结合对的非限制性实例包含生物素和抗生蛋白链菌素或抗生物素蛋白；互补寡核苷酸；和抗体/抗原结合对。在实施例中，“被标记的探针”包括寡核苷酸和电化学发光部分。在实施例中，被标记的探针的寡核苷酸包括本文所述的方法的延伸序列的补体。在实施例中，被标记的探针结合于延伸序列，且可检测标记用以使得能够测量延伸序列的量。在本文所述的方法的实施例中，测量被标记的探针(即延伸序列的量)确定样品中分析物的量。
“互补”是指例如根据沃森-克里克(Watson-Crick)碱基配对模型，通过形成氢键而彼此结合(或“杂交”)的核酸分子或核酸分子序列。举例来说，杂交可以出现于两个互补DNA分子之间(DNA-DNA杂交)、两个RNA分子之间(RNA-RNA杂交)或互补DNA与RNA分子之间(DNA-RNA杂交)。杂交可以出现于与较长核苷酸序列的一部分互补的短核苷酸序列之间。杂交可以出现于不具有100％“序列互补性”的序列(即，其中基于诸如沃森-克里克碱基配对模型的碱基配对模型，小于100％的核苷酸比对的序列)之间，尽管相比于具有较大序列互补性的序列，具有较小序列互补性的序列较不稳定且较不可能杂交。在一个方面中，基于沃森-克里克模型，补体的核苷酸具有100％序列互补性。在另一方面中，基于沃森-克里克模型，补体的核苷酸具有至少约90％、95％、97％或99％序列互补性。
如果两个核酸能够杂交或已杂交，那么其分别是“可杂交的”或“杂交的”。两个补体是否杂交可以取决于杂交条件的严格性，其可以取决于诸如温度、溶剂、离子强度和其它参数的条件而变化(产生严格杂交条件的方法已是众所周知且例示于Sambrook等人,《分子克隆：实验室手册(Molecular Cloning:A Laboratory Manual)》第二版,Cold SpringHarbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor(1989)，尤其是其中的第11章和表11.1中)。可选择杂交条件的严格性以在其它潜在交叉反应或干扰序列存在下选择性形成或维持两个互补核酸序列的所期望杂交产物。严格条件是序列依赖性的，通常较长补体在比较短补体更高的温度下特异性杂交。一般来说，对于在界定离子强度、化学变性剂浓度、pH和杂交搭配物浓度下的具体核苷酸序列，严格杂交条件比热熔点(Tm)(即，50％的序列与基本上补体杂交的温度)低约5℃至约10℃。一般来说，与具有较低百分比的G和C碱基的核苷酸序列相比，具有较高百分比的G和C碱基的核苷酸序列在更严格条件下杂交。一般来说，可以通过增加温度、增加pH、降低离子强度和/或增加化学核酸变性剂(诸如甲酰胺、二甲基甲酰胺、二甲亚砜、乙二醇、丙二醇和碳酸伸乙酯)浓度来增加严格性。严格杂交条件通常包含小于约1M、500mM、200mM、100mM或50mM的盐浓度或离子强度；高于约20℃、30℃、40℃、60℃或80℃的杂交温度；和高于约10％、20％、30％、40％或50％的化学变性剂浓度。由于许多因素可影响杂交严格性，因此参数的组合可能比任何单独参数的绝对值更重要。
例示性杂交条件包含缓冲溶液(例如磷酸盐、tris或HEPES缓冲溶液，具有约20至200mM缓冲组分)，其在约6.5至8.5的pH下，且离子强度为约20至200mM，在约15至40℃的温度下。举例来说，缓冲液可以包含浓度是约10mM至约1M、约20mM至约500mM、约30mM至约100mM、约40mM至约80mM或约50mM的盐。例示性盐包含NaCl、KCl、(NH4)2SO4、Na2SO4和CH3COONH4。一个具体实例是在室温(约18至25℃)下的50M Tris-HCl，pH 7.4。另一具体实例是在22℃至37℃(或约27℃)下的66mM乙酸钾、50mM氯化钾、10mM乙酸镁、33mM Tris缓冲液，pH 8.2。
在核酸序列或氨基酸序列的情况下，术语“序列一致性”或“一致性％”是指当在指定比较窗口内比对序列时，所比较序列中相同的残基的百分比。在一些实施例中，仅比对两个或更多个序列的具体部分以确测序列一致性。在一些实施例中，仅比对两个或更多个序列的具体域以确测序列类似性。比较窗口可以是至少10至超过1000个残基、至少20至约1000个残基或至少50至500个残基的片段，其中序列可经比对和比较。用于确测序列一致性的比对方法是众所周知的且可以使用公开可用的数据库(诸如BLAST)进行。当参考氨基酸序列时，“一致性百分比”或“一致性％”可以通过所属领域中已知的方法来确定。举例来说，在一些实施例中，两个氨基酸序列的“一致性百分比”是使用如在Karlin和Altschul,《美国国家科学院院刊(Proceedings of the National Academy of Sciences USA)》90:5873-5877(1993)中修改的Karlin和Altschul,《美国国家科学院院刊》87:2264-2268(1990)的演算法确定。这类演算法被并入至BLAST程式中，例如BLAST+或NBLAST和XBLAST程式，其描述于Altschul等人,《分子生物学杂志(Journal of Molecular Biology)》,215:403-410(1990)中。BLAST蛋白质检索可用诸如XBLAST程式的程式、评分＝50、字长＝3进行，以获得与本发明的蛋白质分子同源的氨基酸序列。当两个序列之间存在空隙时，可如Altschul等人,《核酸研究》25(17):3389-3402(1997)中所述地利用Gapped BLAST。当利用BLAST和Gapped BLAST程式时，可以使用各别程式(例如XBLAST和NBLAST)的预设参数。
在一些实施例中，多肽或核酸分子分别与参考多肽或核酸分子(或参考多肽或核酸分子的片段)具有70％、至少70％、75％、至少75％、80％、至少80％、85％、至少85％、90％、至少90％、95％、至少95％、97％、至少97％、98％、至少98％、99％或至少99％或100％序列一致性。在一些实施例中，多肽或核酸分子分别与参考多肽或核酸分子(或参考多肽或核酸分子的片段)具有约70％、至少约70％、约75％、至少约75％、约80％、至少约80％、约85％、至少约85％、约90％、至少约90％、约95％、至少约95％、约97％、至少约97％、约98％、至少约98％、约99％、至少约99％或约100％序列一致性。
当两个核酸含有补体时发生杂交，尽管取决于杂交的严格性，碱基之间的错配是可能的。在实施例中，能够与第二序列的补体杂交的序列与第二序列基本上类似。在实施例中，能够与第二序列的补体杂交的序列与第二序列具有70％、至少70％、75％、至少75％、80％、至少80％、85％、至少85％、90％、至少90％、95％、至少95％、97％、至少97％、98％、至少98％、99％或至少99％或100％序列一致性。
本发明包含免疫分析方法，其包括(i)锚定在分析中所用的目标分析物与一种或多种分析物结合试剂之间形成的检测复合物；和/或(ii)放大来自被标记检测复合物的信号。锚定可以用于使涉及低结合亲和力相互作用和/或高分子量标记或标记位点的复合物稳定。可以通过将延伸探针连接至含有多个标记或检测标记位点的结合复合物，从而对于每一单独检测复合物放大可检测信号来实现信号放大。在一个优选实施例中，方法包含将包含多个标记或检测标记位点的延伸探针连接至检测复合物，和将复合物锚定至表面以确保复合物保留于表面上。此改良的分析方法可以用于检测极低数目的结合事件，甚至是各个分析物-结合试剂复合物。基本方法不限于免疫分析且可以用于使用其它类别的结合试剂来进行结合分析。
在实施例中，本发明提供使用表面结合锚定试剂的结合分析，以将包含所关注分析物的检测复合物粘附至表面且使检测复合物稳定。此方法可以用于克服形成检测复合物的试剂之间的低结合亲和力和/或防止复合物在后续处理之前从表面解离。在图1(a)中说明了在结合分析中使用锚定试剂。表面(101)包含结合分析物A的捕捉试剂(102)，和锚定试剂(103)。在一个或多个步骤中，分析物结合于捕捉试剂且还结合分析物的检测试剂(104)，其中检测试剂连接至核酸探针(105)。分析物可以同时或基本上同时结合于捕捉试剂和检测试剂，或分析物可以依序(以任一次序)结合于捕捉试剂和检测试剂中的每一个。因此，在表面上形成包含捕捉试剂、分析物和检测试剂的复合物(106)。探针被延伸以形成延伸序列(107)，其包含结合锚定试剂的锚定区。延伸序列结合于锚定试剂且测量与表面结合的延伸序列的量。
结合分析领域的熟练技术人员将易于了解可以用于本发明方法中的捕捉试剂和伴随结合搭配物的范围。这类对的非限制性清单包含(以任一次序)受体/配体对、抗体/抗原、天然或合成受体/配体对、半抗原/抗体对、抗原/抗体对、抗原决定基/抗体对、模拟抗原决定基/抗体对、适体/目标分子对、杂交搭配物和嵌入剂/目标分子对。在一个实施例中，结合分析采用抗体或其它受体蛋白作为用于所关注分析物的捕捉试剂和/或检测试剂。术语“抗体”包含完整抗体分子(包含通过抗体次单位的体外再结合组装的杂交抗体)、抗体片段和包括抗体的抗原结合域的重组蛋白构筑体(如例如Porter,R.R.和Weir,R.C.《细胞生理学杂志(J.Cell Physiol.)》,67(Suppl)；51-64(1966)和Hochman,1.Inbar,D.和Givol,D.《生物化学(Biochemistry)》12:1130(1973)中所述)，以及已被化学修饰(例如通过引入可检测标记)的抗体构筑体。
同样，锚定试剂和对应锚定成员或区域可以包含任何适合的结合对，例如受体/配体对、抗体/抗原、天然或合成受体/配体对、半抗原/抗体对、抗原/抗体对、抗原决定基/抗体对、模拟抗原决定基/抗体对、适体/目标分子对、杂交搭配物、嵌入剂/目标分子对，和使用由静电电荷结合的表面和锚定试剂。举例来说，锚定试剂可以是寡核苷酸序列、适体、适体配体、抗体、抗原、配体、受体、半抗原、抗原决定基或模拟抗原决定基，且对应锚定区相应地包含互补寡核苷酸序列、适体配体、适体、抗原、抗体、受体、配体或抗体。在一个具体实施例中，锚定区是寡核苷酸序列且锚定试剂包括DNA结合蛋白。或者，如果锚定区是双股寡核苷酸序列，那么锚定试剂可以包含嵌入剂。在另一实施例中，锚定区可以包含一个或多个被修饰的寡核苷酸碱基且对应锚定试剂包含与锚定区上的被修饰的碱基结合的一个或多个部分。举例来说，被修饰的碱基可以包含半抗原或配体且对应锚定试剂包含分别对半抗原或配体具有特异性的一个或多个抗体或配体。此外，锚定区可以包含多个可以用于检测检测复合物的被标记核苷酸碱基。
在图1(b)中描绘的具体实施例中，表面结合锚定试剂包含用于将检测复合物锚定至表面的寡核苷酸。锚定寡核苷酸序列与连接至检测复合物的互补寡核苷酸序列结合。在此实施例中，表面(108)包含结合分析物A的捕捉试剂(109)，和包括锚定寡核苷酸序列(111)的锚定试剂(110)。在一个或多个步骤中，分析物结合于捕捉试剂且还结合分析物的检测试剂(112)，其中检测试剂连接至核酸探针(113)。如参看图1(a)在上文所述，分析物可以同时或基本上同时结合于捕捉试剂和检测试剂，或分析物可以依序(以任一次序)结合于捕捉试剂和检测试剂中的每一个。因此，在表面上形成包含结合试剂、分析物和检测试剂的复合物(114)。探针经延伸以形成延伸序列(115)，其包含与锚测序列互补的锚测序列补体。锚测序列与锚测序列补体杂交且测量与表面结合的延伸序列的量。延伸序列还可以包含检测序列，在此情况下，可添加与检测序列互补的检测探针且与延伸序列结合，且测量标记以确定表面上的延伸序列的量。
图1(b)(其中锚定试剂用于将检测复合物粘附至表面，且附着于检测复合物的探针经延伸以产生与锚定试剂结合的延伸区)中描绘的方法的具体实施例进一步包括使检测试剂上的核酸探针与以下各者结合：(i)环状寡核苷酸，其接着进行滚环扩增以产生与锚定试剂结合的扩增子，或(ii)线性寡核苷酸，其末端结合于核酸探针且被连接以形成接着进行滚环扩增以产生与锚定试剂结合的扩增子的环状寡核苷酸。表面包含捕捉试剂和锚定试剂。在一个或多个步骤中，分析物结合于捕捉试剂、包括核酸探针的检测试剂，由此在表面上形成检测复合物。检测复合物与以下各者接触：(i)包括与核酸探针互补的序列的环状寡核苷酸，或(ii)具有与核酸探针的不重叠区域的第一末端序列和第二末端序列的线性寡核苷酸。环状或线性寡核苷酸与核酸探针杂交，且如果使用线性寡核苷酸，那么将线性寡核苷酸的末端序列连接以形成与核酸探针杂交的环状目标序列。通过滚环杂交使核酸探针延伸以产生包括与锚定试剂结合的结合试剂的延伸序列，且测量与表面结合的延伸序列的量。延伸序列还可以包含一个或多个与被标记检测探针互补的检测序列，所述被标记检测探针与扩增子杂交且用于测量与表面结合的扩增子的量。在一个替代实施例中，延伸方法将被标记核苷酸碱基并入至延伸序列中以用于直接检测表面上的扩增子，而不添加一个或多个与扩增子互补的被标记的探针。可以通过并入至来自锚定物和/或检测探针的环状或线性寡核苷酸序列中来实现产生与锚定寡核苷酸和/或检测探针的序列互补的延伸序列。
检测复合物可以包含一种或多种检测试剂，例如以增强分析针对分析物的特异性。如果举例来说，分析被设计成在检测试剂中的每一个邻近分析物时发射可检测信号，或如果可区分来自结合于分析物的单种检测试剂的信号与自结合于分析物的多种检测试剂发射的信号，那么使用多钟检测试剂可增强分析的特异性。这类分析的一个实施例在图1(c)中示出。表面(116)包含结合分析物A的捕捉试剂(117)和包含锚定寡核苷酸序列(119)的锚定试剂(118)。在一个或多个步骤中，分析物结合于捕捉试剂和结合分析物的两种(或更多种)检测试剂(分别是120和121)中的每一种，其中第一和第二检测试剂中的每一个连接至核酸探针(122和123，分别是第一和第二核酸探针)。分析物可以同时或基本上同时，或以依序、逐步方式结合于捕捉试剂和检测试剂。因此，在表面上形成包含捕捉试剂、分析物和第一和第二检测试剂的复合物(124)。使用需要第一和第二探针彼此接近的延伸方法，第一探针经延伸以形成包括与锚测序列互补的锚测序列补体的延伸序列(125)。在倒数第二步中，锚测序列与锚测序列补体杂交且测量与表面结合的延伸序列的量。
图1(c)中描绘的方法的具体实施例显示于图2(a)中，其中锚定试剂用于将检测复合物粘附至表面，且连接至检测复合物的探针经延伸以产生与锚定试剂结合的延伸区。在此实施例中，使用结合于邻近探针的两种检测试剂来检测复合物。所述方法进一步包括将检测试剂与连接序列接合，所述连接序列接着被连接以形成环状目标序列，和进行滚环扩增以产生与锚定试剂结合的扩增子。表面(201)包含捕捉试剂(202)和锚定试剂(203)。在一个或多个步骤中，分析物结合于捕捉试剂、包括第一邻近探针(205)的第一检测试剂(204)和包括第二邻近探针(207)的第二检测试剂(206)，从而在表面上形成检测复合物(208)。检测复合物与两个连接序列(209a和209b)接触，所述两个连接序列各自包含与第一邻近探针的不重叠区域互补的末端序列和与第二邻近探针的不重叠区域互补的末端序列。连接序列与第一和第二邻近探针杂交，且将连接寡核苷酸的末端序列连接以形成与第一和第二邻近探针两者杂交的环状目标序列(210)。通过滚环杂交使第二邻近探针延伸以产生包括与锚定试剂结合的结合试剂的扩增子，且测量与表面结合的扩增子的量。第一邻近探针可被封端或以其它方式被修饰以防止第一探针延伸。(在一个替代实施例中，第一邻近探针经延伸且第二邻近探针可被封端或以其它方式被修饰以防止延伸)。在图2(a)中所描绘的实施例中，扩增子还包含两个或更多个与被标记检测探针互补的检测序列，所述被标记检测探针与扩增子杂交且用于测量与表面结合的扩增子的量。在一个替代实施例(未描绘于图2(a)中)中，延伸方法将被标记核苷酸碱基并入至扩增子中，用于在不添加一个或多个与扩增子互补的被标记的探针的情况下直接检测表面上的扩增子。图2(b)是显示第一和第二连接寡核苷酸(分别是209a和209b)的连接序列组分的示意图，其中第一连接子的第一端(C1(E1))和第二连接子的第一端(C2(E1))与第一邻近探针的两个不重叠区域互补，且第一连接子的第二端(C1(E2))和第二连接子的第二端(C2(E2))与第二邻近探针的两个不重叠区域互补。第一和第二连接子与第一和第二邻近探针杂交，且第一和第二连接子被连接以形成与第一和第二邻近探针两者杂交的环状目标序列。
图2(c)显示连接子的替代实施例。连接序列211包含与第二邻近探针互补的内部序列(CIS)和与第一邻近探针的不重叠区域互补的两个末端序列(分别是CE1和CE2)。在此实施例中，仅需要一个连接事件以形成用于滚环扩增的环状目标序列(即，与第一邻近探针杂交的末端CE1和CE2的连接)，然而，由于引发/延伸来自第二邻近探针，因而维持对于两个邻近探针的邻近度的需求。优选地，第一邻近探针被封端或以其它方式被修饰以防止第一探针延伸。
此后，通过环状目标序列的滚环扩增延伸第二邻近探针，以产生包括与锚定试剂结合的结合区的扩增子，且测量与表面结合的扩增子的量。
可以通过所属领域的技术人员已知的方法设计第一和第二邻近探针的序列。举例来说，探针中的每一个的长度为为20-50个碱基，优选长度为25-40个碱基，且最优选长度为约30-35个碱基。第一和第二邻近探针还包含与在如本文所述的方法中所用的一个或多个连接序列或其部分互补的序列。在一个实施例中，检测复合物与两个连接序列(209a和209b)接触，所述两个连接序列各自包含与第一邻近探针的不重叠区域互补的末端序列和与第二邻近探针的不重叠区域互补的末端序列。因此，在此实施例中，第一和第二邻近探针各自包含与连接子的末端序列互补的不重叠区域。或者，仅可以使用一个连接子且连接序列(211)包含与第二邻近探针互补的内部序列(CIS)和与第一邻近探针的不重叠区域互补的两个末端序列(分别是CE1和CE2)。因此，在此实施例中，第一邻近探针包含与连接子的两个末端序列(分别是CE1和CE2)互补的不重叠区域，且第二邻近探针包含与连接子的内部序列(CIS)互补的序列。第一邻近探针可被封端或以其它方式被修饰以防止第一探针延伸。(在一个替代实施例中，第一邻近探针经延伸且第二邻近探针可被封端或以其它方式被修饰以防止延伸)。
因此，图1至图2中所说明的实施例展示结合分析可被修饰以并入锚定试剂和/或来自检测复合物的信号可被放大。在一个优选实施例中，在结合分析中采用锚定试剂和信号放大方法。在包含使用锚定试剂的实施例中，表面上存在的锚定试剂的浓度是0.2-200μg/mL，具体来说1.0-50μg/mL，且更具体地说3.0-10μg/mL。或者，仅一种或另一种方法可以用于实现增强的结合分析。因此，本发明包含使用如图1-2中所述的信号放大方法的分析，其中省去锚定试剂。
在其中锚定试剂包含直接或间接结合(例如通过结合反应)至表面的锚测序列的这些实施例中，可采用所属领域中确立的用于固定寡核苷酸的方法来产生锚定试剂，包含共价和非共价连接方法。锚定试剂可直接固定于固相上，或其可以通过次要结合试剂，诸如如下所述的靶向试剂间接固定。举例来说，锚定试剂可以与靶向试剂连接或包括靶向试剂，所述靶向试剂与固相上的固定靶向试剂补体结合。靶向试剂与其补体的结合可以是直接的(例如靶向试剂可以是抗生蛋白链菌素且补体可以是生物素)或通过桥接剂间接的(例如靶向试剂和补体可以是生物素，且桥接试剂可以是多价生物素结合受体，诸如抗生蛋白链菌素)。在一个实施例中，靶向剂和其补体包括第一寡核苷酸和互补寡核苷酸、受体-配体对、抗原-抗体对、半抗原-抗体对、抗原决定基-抗体对、模拟抗原决定基-抗体对、适体-目标分子对、杂交搭配物或嵌入剂-目标分子对。选择用于超过一种分析物的多重分析中所用的靶向剂和补体，使得与用于通过所述分析测量的分析物的捕捉试剂或检测试剂相关的靶向剂和补体基本上不对与用于通过所述分析测量的其它分析物的捕捉试剂或检测试剂相关的靶向剂和补体具有交叉反应性。举例来说，结合试剂与其相关结合域的结合(通过其相关靶向剂和靶向剂补体)应大幅超过其与与其它分析物相关的结合域的结合(且呈现不同靶向剂补体)。优选地，相对于与恰当结合域的结合，用于将用于分析物的捕捉试剂或检测试剂与与其它分析物相关的结合域结合的交叉反应为<1％，更优选是<0.1％且更优选是<0.01％。在一个优选实施例中，靶向剂/靶向剂补体包括一对包含补体的寡核苷酸，且靶向剂和其补体在足以使靶向剂与其补体杂交的条件下接触。
当使用靶向剂时，关于分析方法中所用的锚定试剂何时固定于固相上存在一些灵活性。在一个实施例中，通过靶向剂-靶向剂补体相互作用将锚定试剂预固定于固相上提供给用户。在另一实施例中，与靶向剂连接的锚定试剂和支撑固定的靶向剂补体的固相作为独立组分提供。分析方法因此进一步包括通过将靶向剂与其补体结合(直接或通过使用桥接剂)而将锚定试剂固定于固相上的步骤。此步骤可以在与形成检测复合物相关的步骤之前、与其同时或在其之后进行。
在一个实施例中，锚定试剂包括连接或以其它方式结合于锚测序列的蛋白质。在此实施例中，可以使用可以固定于表面上(共价或非共价)且被锚定寡核苷酸修饰的任何蛋白质。非限制性实例包含抗生蛋白链菌素、抗生物素蛋白或牛血清白蛋白(BSA)。在一个优选实施例中，锚定试剂包括BSA。蛋白质可被锚定寡核苷酸修饰且使用已知方法(例如如图3中所说明)，使用磺基丁二酰亚胺基-4-(N-顺丁烯二酰亚胺基甲基)环己烷-1-甲酸酯(磺基-SMCC)，一种公认的异双官能交联剂与表面连接。SMCC的N-羟基丁二酰亚胺(NHS)基团与牛血清白蛋白(BSA)的反应用硫醇反应性顺丁烯二酰亚胺基团标记BSA。顺丁烯二酰亚胺基团转而与被硫醇修饰的寡核苷酸反应，以形成通过稳定硫醚键连接的BSA-寡核苷酸结合物。在一个具体实例中，通过在石墨碳表面，优选网版印刷碳油墨电极上印刷一系列BSA-寡核苷酸结合物而形成阵列。或者，如果蛋白质是抗生物素蛋白或抗生蛋白链菌素，那么锚测序列可以与生物素连接且通过生物素-抗生物素蛋白或生物素-抗生蛋白链菌素相互作用接合至固定抗生物素蛋白或抗生蛋白链菌素。
与锚定试剂连接的锚定寡核苷酸可以是将与在延伸方法期间产生的延伸序列(或扩增子)杂交的任何序列。锚定寡核苷酸还可以包括非互补区域(例如poly(A)序列)，其用作表面与互补(杂交)区域之间的连接序列，以使互补区延伸远离表面。在一个实施例中，杂交序列选择是不与结合于邻近或检测探针相关的扩增子区域(“惰性”区域)。在更具体实施例中，单独或与例如长度为至多30个核苷酸的poly(A)臂组合包含与扩增子惰性区域的全长互补的杂交序列(优选地，长度为约25个核苷酸)。优选地，锚定寡核苷酸是选自：(i)(扩增子惰性区域的全长补体，长度为25个核苷酸)-(20个核苷酸的poly(A)臂)；或(ii)(扩增子惰性区域的一部分的补体，长度为15个核苷酸)-(30个核苷酸的poly(A)臂)。
在一个实施例中，进行邻近连接扩增(PLA)以延伸第二邻近探针。如参看图2(a)-(c)在上文所述，包括两个邻近探针的复合物与一个或多个连接寡核苷酸(209a-209b或211)接触，且杂交连接序列的连接形成接着用于通过环的滚环扩增(RCA)延伸第二邻近探针的环状寡核苷酸。用于邻近连接扩增的适合的探针设计和扩增条件是所属领域中充分确立的。本发明的独特方面是在连接子中的一个中包含与锚定试剂中所用相同的序列。在第二邻近探针的延伸期间，延伸区域因此包含锚测序列的补体，其与锚定试剂杂交，从而使夹心复合物稳定且防止第二邻近探针解离。延伸的第二邻近探针可以含有可检测标记(例如通过在RCA延伸反应期间包含被标记核苷酸)，其可被测量以确定表面上的分析物的量。或者，添加多个包括可检测标记的被标记的探针且与延伸的第二邻近探针杂交，且测量与表面结合的分析物的量。
任何适合的扩增技术可以用于产生延伸序列(或扩增子)，包含但不限于PCR(聚合酶链反应)、LCR(连接酶链反应)、SDA(股置换扩增)、3SR(自持合成反应)和等温扩增方法，例如解螺旋酶依赖性扩增和滚环扩增(RCA)。在一个优选实施例中，使用RCA，因为其具有就灵敏度、多重化、动态范围和可扩充性来说的显著优势。用于RCA的技术是所属领域中已知的(参见例如Baner等人,《核酸研究(Nucleic Acids Research)》,26:5073 5078,1998；Lizardi等人,《自然遗传学(Nature Genetics)》19:226,1998；Schweitzer等人《美国国家科学院院刊(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)》97:10113 119,2000；Faruqi等人,《BMC基因组学(BMC Genomics)》2:4,2000；Nallur等人,《核酸研究(Nucl.Acids Res.)》29:e118,2001；Dean等人《基因组研究(Genome Res.)》11:1095 1099,2001；Schweitzer等人,《自然生物技术(Nature Biotech.)》20:359 365,2002；美国专利第6,054,274号、第6,291,187号、第6,323,009号、第6,344,329号和第6,368,801号)。已知RCA的若干不同变体，包含线性RCA(LRCA)和指数RCA(ERCA)。RCA产生环状模板的成千上万个拷贝，其中拷贝的链与原始目标DNA连接，从而允许目标的空间分辨率和信号的快速放大。RCA促进(i)检测单一目标分子；(ii)自蛋白质以及DNA和RNA放大信号；(iii)鉴别已在固体表面上扩增的分子的位置；(iv)同时测量许多不同目标；和(v)分析溶液或固相中的一个或多个目标。当以阵列或基于粒子的形式进行多重结合分析时，具有检测复合物的RCA产物的空间定位是尤其有利的。
本发明的具体实施例描绘于图4(a)中，其中使用锚定试剂和信号放大方法。在表面(401)上在捕捉试剂(402)、分析物(403)和两种检测试剂(304和305)之间形成复合物，其各自分别包含第一和第二邻近探针(406和407)。添加第一和第二连接寡核苷酸(在图4(a)中分别是Circ-1(408)和Circ-2(409))，其在两个邻近探针均存在于复合物中时各自与两个邻近探针杂交且将其桥接。结合的连接探针分别在连接位点1和2(410和411)处连接以形成环状DNA模板(412)。通过滚环扩增来扩增环状DNA模板以延伸第二邻近探针，且由此产生包括一个或多个检测序列(413)和锚定寡核苷酸序列补体(414)(包含部分锚测序列补体(415))的扩增子。锚定寡核苷酸序列(416)(与捕捉部分(417)连接)和其补体杂交，多个检测探针与多个检测探针序列杂交，且测量与表面结合的分析物的量(未示出但在图1(a)中说明)。图4(b)显示第一环状DNA模板Circ-1(408)(其被设计成与第一邻近探针(PP1)杂交)、检测寡核苷酸序列、扩增子惰性区域(其可全部或部分用于与锚定寡核苷酸序列结合)和部分PP2(其被设计成与第二邻近探针杂交)的例示性序列。另一实施例描绘于图4(c)中，其中通过滚环扩增来扩增环状DNA模板以产生包括多个检测序列(分别是418和419)的扩增子。在另一实施例中，与捕捉部分417连接的锚定寡核苷酸序列(416)可充当具有游离3'端的引物。在此实施例中，第二邻近探针包含与检测序列(413)互补的序列。
在一个实施例中，本文所述的分析形式利用在5'端处与检测序列偶联的检测试剂，其中3'端被暴露以促进与连接探针连接以形成环状DNA模板，所述模板接着通过滚环扩增来扩增以延伸第二邻近探针(PP2)。在此实施例中，PP1潜在地独立地可以用于通过聚合酶延伸，但可以通过添加被修饰的碱基以防止通过聚合酶引发来解决此问题。或者，连接模板PP1可以通过其3'端直接与检测试剂联接，从而防止此寡核苷酸作为DNA聚合酶的引物参与，即使其被降解也是如此。
产生通过RCA或任何适合的扩增方法扩增的目标序列的另一方法说明于图5中。在此实施例中，邻近探针中的每一个可折叠为环状发夹结构。这些发夹结构的形成产生含有重组信号的单股环和双股部分。添加重组酶驱动两个发夹结构的重组以形成环状DNA模板，其随后如上所述地进行RCA。扩增子被标记且任选地锚定至锚定试剂且检测分析物。此实施例的关键要素为重组酶催化含有序列特异性重组位点的DNA的位点特异性重组的能力。举例来说，来自噬菌体P1的Cre重组酶在含有loxP位点的位点处催化重组，且其它非限制性实例包含但不限于Flippase(flp，来自酵母)、Hin(沙门氏菌(Salmonella))和Tre(Cre的工程改造(进化)型式)。此替代方法不需要添加额外组分，诸如寡核苷酸模板、ATP和dNTP。在此实施例中，loxP(重组)位点优选被修饰以为非对称的，使得正常平衡朝向形成所期望重组产物转移。此在图5中以重组位点的淡/浓阴影说明。
此外，图6(a)说明产生通过RCA或任何适合的扩增方法扩增的目标序列的另一方法。与检测试剂连接的邻近探针中的每一个包含loxP位点，其使得能够通过Cre重组酶在两个寡核苷酸之间进行位点特异性重组，使得形成由一个邻近探针的5'部分和侧接lox P位点的另一邻近探针的3'部分构成的新寡核苷酸序列。新产生的目标序列可随后通过任何适合的方法扩增、如上文所述地标记、任选地锚定和检测。图6(a)说明使用T7RNA聚合酶启动子作为扩增的可操作元件的此实施例。还应理解，其它RNA聚合酶位点，诸如在邻近探针的3或5'部分处连接的T3和SP6同样适用于此方法。在此实施例中，loxP(重组)位点优选被修饰以为非对称的，使得正常平衡朝向形成所期望重组产物转移。如图6(b)中所示，方法还可以用于产生可以用于RCA中的环状DNA模板。
本发明包含一种用于检测分析物的方法，其包括将分析物与表面上的捕捉试剂和两种检测试剂结合以形成检测复合物。方法包括测量检测复合物，其中相对于仅包括两种检测试剂中的一种的复合物，测量方法优先测量包括两种检测试剂的复合物。在一个实施例中，方法包括形成复合物，接着使检测试剂交联且检测交联试剂。可以使用任何适合的交联化学方法来接合检测复合物的组分。举例来说，第一和第二检测试剂可以包含反应性部分，其与连接至反应性部分的多官能性交联剂反应且通过添加所述多官能性交联剂而接合。在此实施例中，反应性部分和交联剂可以包含胺、硫醇、酰肼、醛、酯、碘乙酰胺、顺丁烯二酰亚胺、点击化学试剂以及其组合。在另一实施例中，第一和第二检测试剂可以包含结合部分且交联剂是结合部分的多价结合搭配物。此实施例的若干非限制性实例包含：(a)第一和第二检测试剂是动物物种的抗体且交联剂是靶向动物物种的抗体的多价抗物种抗体；(b)第一和第二检测试剂包括生物素且交联剂是抗生蛋白链菌素(或反之亦然)；(c)第一和第二检测试剂连接至抗生蛋白链菌素且交联剂是包括多个生物素分子的聚合物(或反之亦然)；或(d)第一和第二检测试剂分别包括第一和第二核酸探针，且交联剂是包括与第一核酸探针互补的序列和与第二核酸探针互补的独立序列的寡核苷酸。
在具体实施例中，样品中的所关注分析物可如下检测：通过将分析物与固定的捕捉试剂、第一检测试剂和第二检测试剂结合以形成复合物，其中第一检测试剂包括第一可检测标记和第一核酸探针，且第二检测试剂包括第二可检测标记和第二核酸探针。在此实施例中，如下地交联第一和第二检测试剂：(i)使第一探针与第二探针杂交，(ii)使第一和第二探针与具有与第一和第二探针互补的区域的第三核酸杂交，或(iii)连接第一和第二探针。
一旦交联产物结合于表面便可对其进行检测，或任选地，交联产物可从表面释放至洗脱剂中且进行检测。就此来说，仅计数洗脱剂中包含第一和第二可检测标记两者的这些单独交联产物。可采用任何适合的检测方法来检测洗脱剂中标记的存在。在一个优选实施例中，标记是荧光分子且通过单分子荧光检测，例如荧光相关光谱法和/或荧光交叉相关光谱法来计数洗脱剂中存在的被标记交联产物。在此实施例中，单分子荧光检测包括使洗脱剂流经毛细管、使光源聚焦于毛细管内的体积上以产生询问区和用光检测器观察询问区以检测荧光分子通过所述询问区。检测方法可以进一步包括检测与第一标记相关的第一荧光信号和与第二标记相关的第二荧光信号，和在两个信号均从询问区检测时计数检测事件。或者，一个标记是荧光共振能量转移(FRET)供体且另一个标记是FRET受体，且检测方法可以进一步包括在询问区激发FRET供体和检测来自FRET受体的荧光信号。
在具体实施例中，可如下检测样品中的分析物：通过将分析物与固定的捕捉试剂、第一检测试剂和第二检测试剂结合以形成复合物，其中第一检测试剂包括第一核酸探针，第二检测试剂包括第二核酸探针；延伸第二核酸探针以形成包括可检测标记的延伸序列，延伸取决于复合物中第一和第二核酸探针的共定位；将延伸序列从表面释放至洗脱剂中；和计数洗脱剂中的各个延伸序列。延伸步骤可以包含将探针结合于模板核酸序列和通过聚合酶链反应延伸探针。或者，延伸步骤包括使第一探针与模板核酸序列结合、形成环状核酸模板和通过滚环扩增延伸环状模板。延伸步骤还可以包括使第一探针与模板核酸序列结合、使第二探针与模板序列结合和连接第一和第二探针。
在采用捕捉试剂的本发明的方法中，捕捉试剂可直接固定于固相上，或其可以通过次要结合试剂，诸如如下所述的靶向试剂间接固定。举例来说，捕捉试剂可以与靶向试剂连接或包括靶向试剂，所述靶向试剂与固相上的固定靶向试剂补体结合。靶向试剂与其补体的结合可以是直接的(例如靶向试剂可以是抗生蛋白链菌素且补体可以是生物素)或通过桥接剂间接的(例如靶向试剂和补体可以是生物素，且桥接试剂可以是多价生物素结合受体，诸如抗生蛋白链菌素)。在一个实施例中，靶向剂和其补体包括第一寡核苷酸和互补寡核苷酸、受体-配体对、抗原-抗体对、半抗原-抗体对、抗原决定基-抗体对、模拟抗原决定基-抗体对、适体-目标分子对、杂交搭配物或嵌入剂-目标分子对。选择分析中所用的靶向剂和补体，使得与用于通过所述分析测量的分析物的捕捉试剂或检测试剂相关的靶向剂和补体基本上不对与用于通过所述分析测量的其它分析物的捕捉试剂或检测试剂相关的靶向剂和补体具有交叉反应性。举例来说，结合试剂与其相关结合域的结合(通过其相关靶向剂和靶向剂补体)应大幅超过其与与其它分析物相关的结合域的结合(且呈现不同靶向剂补体)。优选地，相对于与恰当结合域的结合，用于将用于分析物的捕捉试剂或检测试剂与与其它分析物相关的结合域结合的交叉反应为<1％，更优选是<0.1％且更优选是<0.01％。在一个优选实施例中，靶向剂/靶向剂补体包括一对包含补体的寡核苷酸，且靶向剂和其补体在足以使靶向剂与其补体杂交的条件下接触。
当使用靶向剂时，关于分析方法中所用的捕捉试剂何时固定于固相上存在一些灵活性。在一个实施例中，通过靶向剂-靶向剂补体相互作用将捕捉试剂预固定于固相上提供给用户。在另一实施例中，与靶向剂连接的捕捉试剂和支撑固定的靶向剂补体的固相作为独立组分提供。分析方法因此进一步包括通过将靶向剂与其补体结合(直接或通过使用桥接剂)而将捕捉试剂固定于固相上的步骤。此步骤可以在与形成检测复合物相关的步骤之前、与其同时或在其之后进行。
在具体实施例中，多功能靶向剂可以用于本文所述的分析方法和组分中。多功能靶向剂可以包含(a)被设计成通过第一区段补体结合于捕捉试剂的第一区段(即，捕捉试剂包含与多官能性靶向剂的第一区段互补的靶向剂补体)，和(b)被设计成结合于扩增子的第二区段(即，多功能靶向剂的第二区段充当表面上的锚定试剂)。因此，在此实施例中，表面包含多功能靶向剂，其与通过第一区段与第一区段补体之间的连接与靶向剂结合的捕捉试剂接触。如本文所述地进行3-AB RCA/PLA分析，且扩增子在测量步骤之前与多功能靶向剂的锚定区段结合。此方法可以用于确保在分析方法中采用1:1比率的捕获剂与锚定试剂。
多种表面适用于本发明的方法，包含来自结合分析领域的常规表面。表面可由多种不同材料制成，包含聚合物(例如聚苯乙烯和聚丙烯)、陶瓷、玻璃、复合材料(例如碳-聚合物复合物，诸如碳基油墨)。适合的表面包含宏观物体表面，诸如分析容器(例如试管、比色管、流量槽、微流体通道、毛细管(例如来自BioTechne的ELLA玻璃纳米反应器)、FACS细胞分选仪、滤筒、多孔盘中的孔等)的内表面、载玻片、分析芯片(诸如用于基因或蛋白质芯片测量中的这些)、接脚或探针、珠粒、过滤介质、侧流介质(例如用于侧流测试条的过滤膜)等。
适合的表面还包含通常用于其它类型的基于粒子的分析中的粒子(包含但不限于胶体或珠粒)，例如磁性、聚丙烯和乳胶粒子；通常用于固相合成的材料，例如聚苯乙烯和聚丙烯酰胺粒子；和通常用于色谱应用的材料，例如二氧化硅、氧化铝、聚丙烯酰胺、聚苯乙烯。材料还可以是纤维，诸如碳原纤维。微米粒子可以是无生命的，或者可以包含有生命的生物实体，诸如细胞、病毒、细菌等。用于本发明方法的粒子可由适合于与一种或多种捕捉试剂或检测试剂连接的任何材料构成，且可以通过例如离心、重力、过滤或磁性收集来收集。可以与捕捉试剂或检测试剂连接的多种不同类型的粒子是市售的，用于结合分析。这些包含非磁性粒子以及包括可磁化材料的粒子，所述可磁化材料允许通过磁场收集粒子。在一个实施例中，粒子由导电和/或半导电材料，例如胶体金粒子构成。微米粒子可以具有多种尺寸和形状。作为实例而非限制，微米粒子可以在5纳米与100微米之间。优选地，微米粒子的尺寸在20nm与10微米之间。粒子可以是球形、长方形、棒状等，或其可以是不规则形状。
本发明方法中所用的粒子可被编码以允许鉴别具体粒子或粒子混合物中的粒子亚群。这类编码粒子的使用已用于使得采用粒子作为结合分析的固相支撑物的分析能够多重化。在一种方法中，制造粒子以包含一种或多种荧光染料且基于荧光发射在一个或多个波长下的强度和/或相对强度来鉴别具体粒子群。此方法已用于Luminex XMAP系统(参见例如美国专利第6,939,720号)和BECTON DICKINSON Cytometric Bead Array系统中。或者，粒子可以通过其它物理特性，诸如尺寸、形状、嵌入光学图案等中的差异来编码。在粒子混合物或集合中提供的一个或多个粒子可被编码以借助于粒子光学特性、尺寸、形状、嵌入光学图案等与混合物中的其它粒子区分开。
在具体实施例中，本发明的方法可以通过使多种不同分析物与用于这些分析物的多种捕捉试剂结合而以多重形式使用，捕捉分析物固定于编码珠粒上，使得所述编码鉴别用于具体珠粒的捕捉试剂(和分析物目标)。方法可以进一步包括计数具有结合分析物的珠粒的数目(使用本文所述的检测方法)。
或者或另外，检测复合物和/或捕捉试剂可直接或间接结合于一个或多个固相上的不同离散结合域，例如如在结合阵列中，其中结合域是各个阵列元件，或在珠粒集合中，其中结合域是各个珠粒，使得在各结合域上产生离散分析信号且从各结合域测量离散分析信号。如果用于不同分析物的捕捉试剂固定于不同结合域中，那么可以独立地测量与这些域结合的不同分析物。在这类实施例的一个实例中，通过在一个或多个表面上固定结合所关注分析物的捕捉试剂的离散域来制备结合域。任选地，表面可部分地界定保持样品或使样品穿过的容器(例如流量槽、孔、比色管等)的一个或多个边界。在一个优选实施例中，在电极上形成各个结合域，用于电化学或电化学发光分析。使用电化学发光对包括多个结合域的表面上的分析物进行多重测量已用于Meso Scale Diagnostics,LLC的和Imager产品线中(参见例如美国专利第7,842,246号和第6,977,722号，其公开内容以全文引用的方式并入本文中)。
另外，检测复合物和/或捕捉试剂可直接或间接结合于电极表面，其任选地包含不同离散结合域，如上文所述。电极表面可以是多孔盘和/或流量槽的组成部分。电极可以包括导电材料，例如金属，诸如金、银、铂、镍、钢、铱、铜、铝、导电允许材料等。其还可以包含氧化物涂覆的金属，例如氧化铝涂覆的铝。电极可以包含工作电极和相对电极，其可由相同或不同材料制成，例如金属相对电极和碳工作电极。在具体实施例中，电极包括碳基材料，诸如碳、碳黑、石墨碳、碳纳米管、碳原纤维、石墨、石墨烯、碳纤维和其混合物。在一个实施例中，电极包括元素碳，例如石墨、碳黑、碳纳米管等。有利地，其可以包含导电碳-聚合物复合物、分散于基质(例如碳墨、碳糊、金属油墨、石墨烯油墨)中的导电颗粒和/或导电聚合物。本发明的一个具体实施例是分析模块，优选多孔盘，其具有包括碳，例如碳层和/或碳墨的网版印刷层的电极(例如工作电极和/或相对电极)。
本发明包含检测和计数各个检测复合物的方法。在具体实施例中，表面可以包括用于样品中存在的一个或多个分析物分子的多种捕捉试剂和跨越位于表面上的多个可分辨结合区分布的多种捕捉试剂。在用于进行和分析测量的条件下，“可分辨结合区”是与各个结合事件相关的最小表面积，所述表面积可被分辨和与发生另一各个结合事件的另一区域区分。因此，方法由以下各者组成：使一个或多个分析物分子与表面上的一种或多种捕捉试剂结合、确定表面上的多个可分辨结合区中存在或不存在分析物分子和鉴别含有分析物分子的可分辨结合区的数目和/或不含分析物分子的分析物域的数目。
可分辨结合区可整体或部分地进行光学询问，即每一单独的可分辨结合区可单独进行光学询问，和/或包括多个可分辨结合区的整个表面可被成像且所述影像内的一个或多个像素或像素分组可映射至各个可分辨结合区。可分辨结合区还可以是多个微米粒子内的微粒。展现光学签名变化的可分辨结合区可以通过常规光学检测系统来鉴别。取决于检测种类(例如荧光实体的类型等)和工作波长，设计用于具体波长的滤光器可以用于可分辨结合区的光学询问。在使用光学询问的实施例中，系统可以包括超过一个光源和/或多个滤光器以调节光源的波长和/或强度。在一些实施例中，使用CCD相机捕捉来自多个可分辨结合区的光学信号。可以用于捕捉影像的相机成像系统的其它非限制性实例包含电荷注入装置(CID)、互补金属氧化物半导体(CMOS)装置、科学CMOS(sCMOS)装置和时间延迟积分(TDI)装置，如将为所属领域的一般技术人员所已知。在一些实施例中，与光电二极体或光电倍增管(PMT)耦合的扫描镜系统可以用于成像。
方法的测量步骤可以包括对来自表面(或其部分)的光学信号成像以产生由多个像素组成的影像，其中各可分辨结合区映射至影像中的一个或多个像素或像素组。可以使用技术公认的方法来完成用以鉴别具有指示结合事件(检测复合物)的信号的像素或像素组的影像分析，例如丰富的影像分析算法和软件可以用于鉴别和计数荧光显微法影像中的被标记生物结构。在一个实施例中，在对影像进行滤波以去除大规模信号梯度之后，使用分割临限值将影像转化为二进制影像。通过鉴别高于临限值强度的连续区域来发现可分辨结合区。如果结合域满足尺寸和强度要求，那么将其分类为结合事件。
在一个实施例中，可分辨结合区是阵列的元件。在一个优选实施例中，阵列为微孔或纳米孔，例如单一底物的各个凹陷或孔的阵列。优选地，孔的体积为小于100nL，优选小于50nL。在一个实施例中，孔的体积介于约10aL-100pL范围内。任选地，孔可被配置成容纳微粒。
在一个实施例中，位于底物上且在分析期间定址的可分辨结合区中的至少50％含有零个或一个分析物分子。优选地，可分辨结合区中的至少80％、更优选至少95％且最优选至少99％含有零个或更多个分析物分子。可以使用含有至少一个或一个分析物分子的结合区的数目的校准曲线、泊松分布分析和/或高斯分步分析至少部分地确定样品中的分析物分子浓度。在具体实施例中，表面包括各自包含多种用于分析物分子的捕捉试剂的多个粒子，和跨越多个可分辨结合区(例如微孔或纳米孔阵列)分布的多个粒子。因此，方法包含：(i)使一个或多个分析物分子与表面上的一种或多种捕捉试剂结合，(ii)跨越可分辨结合区的阵列分配多个粒子；和(iii)确定各可分辨结合区中存在或不存在分析物分子，以鉴别含有分析物分子的结合域的数目和/或不含分析物分子的结合域的数目。
使用本发明的方法中的一种或多种检测受限体积中的分析物也可以是有利的。在这些实施例中，样品中的分析物分子结合于各携有可区分标记的一对检测试剂，且跨越多个位置，例如衬底(例如盘、培养皿、芯片、光纤、网格等)上的孔或反应容器(在本文中称为“反应容器”)分配分析物，以使得大多数反应容器含有一种或更少的分析物。此方法使得用户能够通过计数含有与分析物连接的可区分标记中的每一个的反应容器的数目来检测分析物分子。在一些情况下，定址的多个反应容器是可以含有至少一个分析物分子(例如与至少一个分析物分子相关或不与任何分析物分子相关)的反应容器的总数量的部分或基本上全部。参考以下公布的美国专利申请：美国专利申请案第20070259448号；美国专利申请案第20070259385号；美国专利申请案第20070259381号；和国际专利申请案第PCT/US07/019184号；和国际专利申请案第PCT/US09/005428号。这些公开案中的每一个的公开内容以引用的方式并入本文中。可定址反应容器的至少一部分且可作出指示含有至少一个分析物分子或粒子的反应容器的数目/百分比的量度。在一些情况下，基于所述数目/百分比，可测定流体样品中的分析物分子浓度的量度。
在使得能够检测受限体积中的分析物分子的一个具体实施例中，样品中的分析物可以通过使分析物与第一和第二检测试剂结合以形成检测复合物来检测。各检测复合物包含分析物、第一检测试剂和第二检测试剂，且第一检测试剂和第二检测试剂分别具有第一和第二可检测标记。检测复合物可以同时、基本上同时或依序形成。跨越多个反应容器分配检测复合物，以使得大多数反应容器含有一种或更少的检测复合物，且通过计数含有第一和第二可检测标记中的每一个的反应容器的数目来检测分析物分子的数目。优选地，跨越多个反应容器分配检测复合物，以使得在相同容器中检测到未结合的第一检测试剂和未结合的第二检测试剂的可能性小于约1/10，优选小于约1/100，更优选小于约1/1000，且最优选小于约1/10,000。跨越多个反应容器分配检测复合物，即划分或分离成份或部分，例如通过跨越多个反应容器等分检测复合物的一部分手动进行，和/或通过使包括检测复合物的溶液跨越多个反应容器流动，以使得检测复合物分离至支撑物上的各个反应容器中。
在另一实施例中，样品中的分析物可如下检测：(a)使分析物与表面结合捕捉试剂和第一和第二检测试剂结合以形成检测复合物，其中(i)各检测复合物包含捕捉试剂、分析物、第一检测试剂和第二检测试剂，和(ii)第一检测试剂具有第一可检测标记且第二检测试剂具有第二可检测标记。检测复合物可以通过以任何次序添加组分而形成，例如通过同时或基本上同时将组分放在一起，或依序添加各组分而以逐步方式构建检测复合物。跨越多个反应容器分配检测复合物，以使得大多数反应容器含有一种或更少的分析物，且通过计数含有第一和第二可检测标记的反应容器的数目来检测分析物分子的数目。方法可以在各步骤之后和检测步骤之前进行或不进行洗涤的情况下进行。
表面可以是粒子，且任选地，多种捕捉试剂固定于粒子或多个粒子上。在此实施例中，分配步骤可以数种方式进行：(i)将捕捉试剂固定于多个粒子上且通过使分析物与捕捉试剂结合且将所述粒子分配至多个反应容器中来实现分析物的分配；或(ii)将捕捉试剂固定于多个粒子上且通过将所述粒子分配至多个反应容器中，接着使分析物与捕捉试剂结合来实现分析物的分配。
多个反应容器还可以包括分散于油包水乳液中的水滴。乳液可用直径为至多100μm且体积接近1nL的液滴制成。高容量(即1mL乳液中大于1010个液滴)、制备乳液的简易性和其在大范围条件下的高稳定性使其成为划分生物化学分析的理想手段。各水滴充当独立反应容器，且可跨越多个水滴分配任选地与粒子连接的检测复合物。
或者，表面是反应容器中的一个内的位置，例如如果反应容器是盘的孔，那么表面可以是盘的孔中的一个内的域或区。在此实施例中，捕捉试剂可以固定于多个反应容器的域或区上，且分割步骤是通过使分析物分子与捕捉试剂结合来实现。在另一实施例中，多个反应容器包含固定有靶向部分的区域，捕捉试剂包括靶向部分补体，且分配步骤是通过使靶向部分补体与安置于多个反应容器中的目标部分结合来实现。
在额外或替代实施例中，本文所述的结合分析还可以包含预浓缩步骤以改良分析性能，例如通过增加样品中分析物的浓度和/或通过降低可存在于样品中的可阻碍分析性能的外来物质的浓度。此可如下进行：(a)使包含所关注分析物的样品与连接至结合分析物的第一结合试剂的固相(例如粒子)接触，由此形成包括与所述第一结合试剂结合的分析物的复合物；(b)收集复合物；(c)将样品的未结合组分与复合物分离；(d)释放复合物。浓缩分析物的此方法可以在进行本文所述的结合分析之前进行，以去除可阻碍分析性能的杂质。就此来说，参考美国申请公开案第US2010/0261292号，其公开内容以引用的方式并入本文中。
具体来说，浓缩步骤涉及在足以形成分析物复合物的条件下对包括分析物的样品进行处理，所述分析物复合物包含与第一检测试剂结合的分析物，其中第一检测试剂与第一核酸探针连接。此后，在浓缩步骤结束时形成的分析物复合物结合于(i)包括用于分析物的捕捉试剂和包括锚定寡核苷酸序列的锚定试剂的表面上的捕捉试剂；和(ii)连接至第二核酸探针的用于分析物的第二检测试剂；由此在表面上形成包括捕捉试剂、分析物和第一和第二检测试剂的复合物。对表面结合复合物进行需要第一和第二探针邻近的延伸方法，延伸第二探针以形成包括与锚测序列互补的锚测序列补体的延伸序列。锚测序列接着与锚测序列补体杂交；且测量与表面结合的延伸序列的量。在具体实施例中，浓缩步骤进一步包括：(i)使包含分析物的样品与固相接触，所述固相连接至与第一核酸探针的至少一部分互补的靶向剂，由此形成包括通过第一核酸探针与靶向剂之间的结合反应结合于固相的分析物的浓缩复合物；(ii)收集浓缩复合物；(iii)将样品的未结合组分与浓缩复合物分离；和(iv)释放浓缩复合物以将固相与分析物分离，以形成分析物复合物。
如本文所用，收集是指材料在混合物中的物理定位。收集包含通过结合反应或吸附来定位材料。举例来说，混合物中的材料可以通过在固相上吸附所述材料或通过使所述材料与固相上的结合试剂结合而收集于固相上。然而，收集不限于定位于固相且还可以包括所属领域中用于将材料定位于较大流体体积内的某一位置/体积的技术，例如通过使用光镊(其使用光操纵小至单个原子的微观物体，其中来自聚焦激光光束的辐射压力能够捕获小颗粒)、电场或磁场、聚焦流、密度梯度离心等来定位材料。
本发明的某些实施例包含收集微米粒子或与微米粒子结合的材料。适合的收集方法包含基于微粒的分析技术中已知的许多方法，所述方法实现从悬浮液定位微米粒子。这些包含在重力下或通过离心沉降、过滤至滤膜或多孔膜上、通过施加磁场定位(可磁化粒子)、将粒子结合或吸附至宏观固相、使用光镊等。
如本文所用，释放是指先前收集材料的离域。通过化学键或通过特异性或非特异性结合相互作用保持于局部位置的材料可允许通过破坏键或相互作用而离域，以使得材料可扩散或混合至周围介质中。存在许多可以使用的公认可裂解化学连接基团，其提供可以在不需要苛刻条件的情况下裂解的共价键。举例来说，可以使用硫醇或其它还原剂裂解含二硫键的连接基团，可以使用高碘酸盐裂解含顺式二醇的连接基团，可以通过改变pH或引入竞争性配体来裂解金属配体相互作用(诸如镍-组氨酸)。类似地，存在许多可采用的公认可逆结合对(包含已在亲和色谱技术中鉴别的这些)。举例来说，可以通过改变pH、添加蛋白质变性剂或离液剂、添加竞争配体等来逆转许多抗体-配体对的结合。其它适合的可逆结合对包含互补核酸序列，其杂交可以在多种条件下逆转，包含改变pH、降低盐浓度、将温度增加至高于所述对的熔融温度和/或添加核酸变性剂(诸如甲酰胺)。这类可逆结合对可用作靶向剂(如上文所述)，例如第一靶向剂可连接至结合分析物的第一结合试剂，第二靶向剂可连接至固相，且第一和第二靶向剂的结合相互作用可以用于将第一结合试剂可逆地固定于固相上。
释放还包含通过例如混合、震荡、涡旋、对流流体流动、通过施加磁力、电力或光学力进行混合等来使材料物理离域。当已收集微米粒子或与微米粒子结合的材料时，这类物理方法可以用于将所述粒子再悬浮于周围基质中。释放可简单地与先前的收集步骤相反(例如通过上文所述的机制中的任一种)，或可以通过两种不同机制进行收集和释放。在一个这类实例中，可以通过粒子的物理收集来实现与粒子结合的材料(诸如分析物或包括分析物的复合物)的收集。接着通过裂解键或逆转将材料固定于粒子上的结合反应来释放材料。在第二个这类实例中，通过与连接至表面的结合试剂的结合相互作用在表面上收集材料(诸如包括分析物的复合物的分析物。接着通过破坏键或将结合试剂连接至表面的第二结合相互作用来释放材料。
收集后接着释放可以用于浓缩和/或纯化样品中的分析物。通过在第一体积中收集和释放至第二较小体积中，可浓缩样品中的分析物。通过浓缩，通常有可能显著提高后续测量步骤的灵敏度。通过从样品收集和去除一些或全部未收集的样品，可以减少或消除样品中的潜在分析干扰物。任选地，去除未结合样品可以包含用定义的液体试剂(例如分析或洗涤缓冲液)洗涤收集的材料和将收集的材料释放至所述试剂中，以提供用于后续分析步骤的均一基质。
如以引用的方式并入本文中的US2010/0261292的图3(a)中所说明，方法包含使包括目标分析物的样品与连接至结合目标分析物的第一结合试剂的粒子接触，其中第一结合试剂连接至第一靶向剂且粒子连接至第二靶向剂，且第一结合试剂和粒子通过第一与第二靶向剂之间的结合反应连接，以形成包括与所述第一结合试剂结合的所述目标分析物的复合物。接着收集复合物且将样品中的未结合组分与复合物分离。释放复合物且使释放的复合物与结合于固相的第二结合试剂接触，其中第二结合试剂结合于复合物。此具体实施例说明于图16中。粒子(1601)被修饰以包含捕捉寡核苷酸序列1602，其至少部分与结合于检测抗体1604的邻近探针1603的序列互补。将粒子与邻近探针混合以使捕捉序列与探针序列杂交以形成复合物1605。接着将复合物与包括分析物1606且任选地包括一种或多种污染物1607-1608的样品混合。分析物与检测抗体结合(1609)且去除污染物(1610)。在适合的条件下从包含结合分析物的复合物去除粒子，以形成与邻近探针结合的分析物的浓溶液(1611)，其可如本文所述地用于免疫分析中，其中额外邻近探针与分析物结合且对3-抗体复合物进行RCA-PLA以检测样品中分析物的存在(1612)，例如如图2(a)和随附说明中所述。
在另一实施例中，在溶液中形成检测抗体与分析物之间的免疫分析复合物，接着扩增，且接着通过捕捉试剂和/或锚定物将扩增产物粘附至粒子。任选地，扩增产物可被过滤且接着通过捕捉试剂和/或锚定物捕捉于粒子上。此方法说明于图17中。分析物A(1701)结合于各自结合于邻近探针(分别是1704和1705)的检测抗体(分别是1702和1703)，且形成包括与检测抗体中的每一个结合的分析物的检测复合物(1706)。检测复合物与两个连接序列(1707a和1707b)接触，所述两个连接序列各自包含与第一邻近探针的不重叠区域互补的末端序列和与第二邻近探针的不重叠区域互补的末端序列。连接序列与第一和第二邻近探针杂交，且将连接寡核苷酸的末端序列连接以形成与第一和第二邻近探针两者杂交的环状目标序列(1708)。通过滚环杂交延伸第二邻近探针，以产生包括与锚定试剂互补的结合试剂的扩增子。扩增子与包含捕捉试剂(1710)和锚定试剂(1711)的表面(1709)接触，且通过使用多个被标记的探针(1712)进行标记来测量与表面结合的扩增子的量。
被标记的探针
在实施例中，本发明提供包括寡核苷酸和至少一个电化学发光部分的被标记的探针。在实施例中，本发明提供包括寡核苷酸和至少两个电化学发光部分的被标记的探针。在实施例中，电致发光部分是电化学发光标记。在实施例中，被标记的探针用于本文所述的方法和分析中以测量延伸序列的量。在实施例中，延伸序列是RCA方法的扩增产物(或扩增子)。在实施例中，被标记的探针包括与延伸序列中的检测序列互补的寡核苷酸。在实施例中，在本文所述的方法中，多个被标记的探针用于测量与表面结合的延伸序列的量。在实施例中，测量被标记的探针确定样品中分析物的量。
已知可检测发光标记，诸如荧光团具有自淬灭效应。自淬灭是一种标记的发光强度被另一种降低，通常随着高标记浓度或高标记密度而增加。因此，一般避免紧密靠近的多个发光标记以减少自淬灭效应。因此，本发明人出人意料地发现本发明的被标记的探针尽管含有使多个电化学发光标记保持紧密靠近的结构，但仍相对于仅具有一个标记的探针提供自标记有效产生ECL和改善信号。因此，在实施例中，本发明的被标记的探针包括超过一个电化学发光标记。在实施例中，被标记的探针包括2至10个电化学发光标记。在实施例中，被标记的探针包括2至5个电化学发光标记。在实施例中，被标记的探针包括三个电化学发光标记。在实施例中，被标记的探针包括1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个电化学发光标记。
在实施例中，本发明提供包括寡核苷酸和多个电化学发光标记的被标记的探针。探针可以包含(i)与寡核苷酸的被修饰的核苷酸碱基连接的一个或多个(或两个或更多个)标记，(ii)具有一个或多个(或两个或更多个)标记的被标记部分，所述部分与寡核苷酸的5'端连接，(iii)具有一个或多个(或两个或更多个)标记的被标记部分，所述部分与寡核苷酸的3'端连接，或(iv)(i)、(ii)和(iii)中的两个或更多个的组合。
在实施例中，本发明提供式I的被标记的探针：
其中B是核苷酸碱基，R是电化学发光标记，L1是键联基团，L2是键联基团，j是0与11之间的整数，k是0与1之间的整数，m是0与11之间的整数，且n是0与5之间的整数。
式I的核苷酸碱基B是任何核苷酸碱基，只要所述核苷酸碱基不干扰被标记的探针的电化学发光能力。在实施例中，核苷酸碱基是天然存在的核苷酸碱基。在实施例中，核苷酸碱基是合成核苷酸碱基。在实施例中，核苷酸碱基是嘌呤或嘧啶。在实施例中，核苷酸碱基是腺嘌呤、胞嘧啶、鸟嘌呤、胸腺嘧啶或尿嘧啶。在实施例中，核苷酸碱基是黄嘌呤、次黄嘌呤、2,6-二氨基嘌呤、6,8-二氨基嘌呤、5,6-二氢尿嘧啶、5-甲基胞嘧啶、5-羟甲基胞嘧啶、异鸟嘌呤或异胞嘧啶。
式I的R可以是任何适合的电化学发光标记。适合的电化学发光标记包含钌、锇、铱、铼和镧系金属的电化学发光有机金属复合物。适合的电化学发光标记包含含有联吡啶或啡啉配体(被取代或未被取代)的这些金属的电化学发光有机金属复合物。适合的电化学发光标记的实例可见于美国专利第5,714,089号、第6,316,607号、第6,808,939号、第9,499,573号、第6,468,741号、第6,479,233号和第6,136,268号中。在实施例中，电化学发光标记是
在实施例中，L1和L2独立地是烷基、卤烷基、芳基、芳烷基、杂芳基、杂芳烷基、环烷基、环烷基烷基、杂芳基取代的环烷基、杂取代的环烷基、杂烷基、氰基烷基、杂环基、杂环基烷基、烯基、炔基、苯基或其组合，具有零个或一个或多个任选地被杂原子取代的碳链。在实施例中，L1和L2独立地是具有零个或一个或多个任选地被杂原子取代的碳链的烷基连接基团。在实施例中，一个或多个杂原子独立地是氮、硫、磷酸根或氧。在实施例中，L1的长度为约1至约20个碳和/或杂原子。在实施例中，L1的长度为约4至约15个碳和/或杂原子。在实施例中，L1的长度为约4、约5、约6、约7、约8、约9、约10、约11、约12、约13、约14或约15个碳和/或杂原子。在实施例中，L2的长度为约1至约30个碳和/或杂原子。在实施例中，L2的长度为约7至约26个碳和/或杂原子。在实施例中，L2的长度为约7、约8、约9、约10、约11、约12、约13、约14、约15、约16、约17、约18、约19、约20、约21、约22、约23、约24、约25或约26个碳和/或杂原子。
如本文所用，“在……之间”为包含范围末端的范围。举例来说，0与11之间的整数明确包含整数0和11，和在0与11内的任何整数，即1、2、3、4、5、6、7、8、9和10。0与5之间的整数明确包含整数0和5，和在0与5内的任何整数，即1、2、3和4。
在实施例中，R包括钌络合物RP1P2P3，其中P1、P2和P3中的每一个独立地是联吡啶、被取代的联吡啶、啡啉或被取代的啡啉。在实施例中，化学发光标记R是
在实施例中，B是在尿嘧啶的5位处连接至L1的尿嘧啶。
在实施例中，L1包括
或其组合，其中p为1与12之间的整数。
在实施例中，L2包括
或其组合，其中q是0与11之间的整数。
在实施例中，本发明提供式II的被标记的探针：
其中j是0与11之间的整数，k是0与1之间的整数，m是0与11之间的整数，n是0与5之间的整数，且R是电化学发光标记：
在实施例中，j是0与5之间的整数，k是0，m是0与5之间的整数，且n是2与7之间的整数。在实施例中，k是0，j是0，m是1，且n是5。
在实施例中，被标记的探针的寡核苷酸包括与5'-CAGTGAATGCGAGTCCGTCT-3'(SEQID NO:31)具有至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或约100％序列一致性的序列。在实施例中，被标记的探针的寡核苷酸包括与5'-CAGTGAATGCGAGTCCGTCT-3'(SEQ ID NO:31)具有至少85％序列一致性的序列。在实施例中，被标记的探针的寡核苷酸包括与5'-CAGTGAATGCGAGTCCGTCT-3'(SEQ ID NO:31)具有至少88％序列一致性的序列。在实施例中，被标记的探针的寡核苷酸包括与5'-CAGTGAATGCGAGTCCGTCT-3'(SEQ ID NO:31)具有至少90％序列一致性的序列。在实施例中，被标记的探针的寡核苷酸包括与5'-CAGTGAATGCGAGTCCGTCT-3'(SEQ ID NO:31)具有至少95％序列一致性的序列。在实施例中，被标记的探针的寡核苷酸包括与5'-CAGTGAATGCGAGTCCGTCT-3'(SEQ ID NO:31)具有至少98％序列一致性的序列。在实施例中，被标记的探针的寡核苷酸包括与5'-CAGTGAATGCGAGTCCGTCT-3'(SEQ ID NO:31)具有至少99％序列一致性的序列。
在实施例中，被标记的探针的寡核苷酸包括5'-CAGTGAATGCGAGTCCGTCT-3'(SEQID NO:31)。在实施例中，被标记的探针的寡核苷酸包括5'-CAGTGAATGCGAGTCCGTCTAAG-3'(SEQ ID NO:32)。在实施例中，被标记的探针的寡核苷酸包括一种或多种本文所述的修饰。在实施例中，被标记的探针包括氨基修饰剂。在实施例中，被标记的探针包括内部氨基修饰的dT碱基(iAmMC6T)。在实施例中，被标记的探针包括内部间隔子18(iSp18)。在实施例中，被标记的探针包括3'氨基修饰剂(3AmMO)。在实施例中，被标记的探针的寡核苷酸包括5'-CAGTGAATGCGAGTCCGTCTAAG/iAmMC6T/iSp18/iAmMC6T/iSp18/3AmMO/-3'(具有修饰的SEQID NO:44)。
在实施例中，本发明提供测量电化学发光的方法，其包括：(a)在其中接近电极的复合物将发射电化学发光的条件下向电极施加电位，其中复合物包括本文提供的目标寡核苷酸和被标记的探针，其中被标记的探针包括与目标寡核苷酸互补的寡核苷酸；和(b)测量发射的电化学发光。本文描述了测量电化学发光的例示性电极和方法。
在实施例中，被标记的探针用于本文所述的分析的测量步骤中，即测量与表面结合的延伸序列的量。被标记的探针可以用于本文所述的所有方法，例如使用一种检测试剂、两种检测试剂或两种或更多种检测试剂的方法。在实施例中，测量电化学发光的方法包括：形成包括以下的组合物：(i)包括目标序列的目标核酸，和(ii)被标记的探针，其中被标记的探针包括与目标序列互补的寡核苷酸；在其中被标记的探针与目标核酸杂交以形成复合物的条件下培育组合物；使复合物接近电极，在其中复合物将发射电化学发光的条件下向电极施加电位，和测量发射的电化学发光。
在实施例中，被标记的探针用于本文所述的分析的检测步骤中，即测量与表面结合的延伸序列的量。被标记的探针可以用于本文所述的所有方法，例如使用一种检测试剂、两种检测试剂或两种或更多种检测试剂的方法。
在实施例中，目标核酸是由如本文所述的RCA反应产生的延伸序列。在实施例中，目标核酸固定于电极上。在实施例中，目标核酸固定于电极上，使得复合物的形成使复合物接近电极。在实施例中，目标核酸直接固定于电极上，或其通过如本文所提供的结合试剂间接固定。在实施例中，复合物进一步包括能够结合于目标核酸的结合试剂，其中结合试剂固定于电极上。在实施例中，复合物进一步包括能够结合于目标核酸的结合试剂，其中结合试剂固定于电极上，和使复合物接近电极包括在其中目标核酸结合于结合试剂的条件下将组合物与电极一起培育。在实施例中，结合试剂是锚定试剂。在实施例中，结合试剂包括与目标核酸的补体。
在实施例中，目标核酸固定于固相支撑物上。在实施例中，目标核酸直接固定于固相支撑物上，或其通过如本文所提供的结合试剂间接固定。在实施例中，能够结合于目标核酸的结合试剂固定于固相支撑物上，其中固相支撑物固定于电极上。在实施例中，目标核酸固定于固相支撑物上，且使复合物接近电极包括在其中目标核酸结合于结合试剂的条件下将组合物与电极一起培育。在实施例中，结合试剂固定于固相支撑物上，且使复合物接近电极包括在其中目标核酸结合于结合试剂的条件下将组合物与固相支撑物一起培育，其中目标核酸结合于结合试剂，和收集固相支撑物。
在实施例中，培育持续约9分钟、10分钟、约20分钟、约30分钟、约40分钟、约50分钟、约1小时、约2小时、约3小时、约4小时、约5小时、约6小时、约7小时或约8小时。在实施例中，培育是在约15℃、约18℃、约20℃、约21℃、约22℃、约23℃、约24℃、约25℃、约26℃、约27℃、约28℃、约29℃或约30℃下。在实施例中，培育是在约15℃至约30℃下持续约10分钟至约8小时。在实施例中，培育是在约15℃至约30℃下持续约10分钟至约8小时。在实施例中，培育是在约18℃至约29℃下持续约20分钟至约6小时。在实施例中，培育是在约20℃至约28℃下持续约20分钟至约6小时。在实施例中，培育是在约21℃至约26℃下持续约30分钟至约4小时。在实施例中，培育是在约22℃至约24℃下持续约40分钟至约2小时。在实施例中，培育是在约23℃下持续约1小时。
本文描述了例示性固相支撑物。在实施例中，结合试剂包括与目标寡核苷酸的补体。在实施例中，固相支撑物是粒子，且粒子使用重力、离心、过滤或施加磁场而收集于电极上。
在实施例中，本发明提供测量电化学发光的试剂盒，其包括本文提供的被标记的探针，和电极；ECL读取缓冲液；核酸聚合酶；核酸连接酶；分析稀释剂；额外核酸试剂；分析消耗品；或其组合。额外核酸试剂的实例包含缓冲液和用于溶解、稀释和/或稳定核酸的试剂。可以包括于试剂盒中的分析消耗品的实例是分析模块，设计成在分析的一个或多个步骤期间含有样品和/或试剂；吸管尖端和其它消耗品，用于转移液体样品和试剂；盖和密封件，用于分析中所使用的分析模块和其它消耗品；托架，用于容纳其它分析消耗品；标记(包括人类可读或机器可读格式，诸如条码、RFID等)，用于识别样品或其它分析消耗品；和介质(包括纸质和电子介质)，用于提供关于分析的信息和/或进行分析的说明书。
在实施例中，试剂盒包括电极，且电极为碳基电极。在实施例中，试剂盒包括分析消耗品，且分析消耗品为多孔盘分析消耗品，且盘的各孔包括碳墨电极。在实施例中，试剂盒包括具有多个孔的多孔分析盘，且分析盘用作至少一种结合试剂的容器。在实施例中，结合试剂固定于盘中。盘内的多个孔可以具有固定于其内的结合试剂。这些孔中的每一个中的结合试剂对于这些孔中的所有、这些孔中的一些或这些孔中无一者来说可以是相同的。在实施例中，多种结合试剂作为结合试剂阵列固定于这些孔中的每一个中。固定的结合试剂和/或固定的结合试剂的阵列可以固定于孔内的电极(其可以是碳基电极或更具体地说，碳墨电极)上。
在实施例中，试剂盒包括ECL读取缓冲液，且ECL读取缓冲液包括三丙胺。在实施例中，试剂盒包括ECL读取缓冲液，且ECL读取缓冲液包括丁基二乙醇胺。例示性ECL读取缓冲液描述于例如2019年1月3日申请的U.S.62/787,892中。
被标记的探针的制造方法
本发明包含制造本文所述的被标记的探针的方法。在实施例中，具有两个或更多个烷基胺部分的被修饰寡核苷酸与过量的包括电化学发光标记的胺反应性标记试剂反应。反应混合物接着被纯化以分离产物，其中胺部分中的每一个与电化学发光标记偶联。
在实施例中，具有反应性氨基的被修饰寡核苷酸具有式VIII中所示的结构，且产物具有式I中所示的结构，其中R是电化学发光标记。在实施例中，被修饰寡核苷酸具有式IX中所示的结构，且产物具有式II中所示的结构，其中R是电化学发光标记。所述式的其它成分(L1、L2、k、m等)如针对以上式I和II所描述。
在实施例中，胺反应性标记试剂包括电化学发光标记的活性酯形式，且与胺部分反应以在被修饰寡核苷酸与标记之间形成酰胺键。在实施例中，活性酯是NHS酯。在实施例中，标记是
且胺反应性标记试剂是
在实施例中，被修饰寡核苷酸是通过固相合成制备。在实施例中，最终产物是通过离子交换色谱法纯化。在实施例中，最终产物是通过阴离子交换色谱法纯化。在实施例中，最终产物是通过凝胶电泳纯化。
核酸探针
在实施例中，与检测试剂连接的核酸探针是与检测试剂交联或结合的寡核苷酸。“结合”、“生物结合”或其变体在本文中用于指在两个分子之间形成稳定共价键，分子中的至少一个是生物分子，例如蛋白质、多肽、聚核苷酸等。连接分子可称为“结合物”或“生物结合物”。在实施例中，结合物包括核酸探针和检测试剂。
在实施例中，核酸探针包括与模板核酸的一个或多个互补区。在实施例中，模板核酸是用于例如通过PCR扩增的模板。在实施例中，模板核酸是环状核酸模板，被连接以形成环状核酸模板(例如用于RCA)的一个或多个线性核酸模板。在实施例中，模板核酸序列是如本文中所述的电化学发光测量方法中所用的连接寡核苷酸。在实施例中，连接寡核苷酸是线性寡核苷酸，其5'和3'端能够连接以产生环状核酸模板。在实施例中，连接寡核苷酸包括与其3'端处的序列互补的其5'端处的序列，使得连接酶可将5'端和3'端连接在一起以形成环状核酸模板。在实施例中，环状核酸模板是用于滚环扩增(RCA)的模板。在实施例中，核酸探针是用于RCA反应的引物，即延伸环状核酸模板以形成延伸序列。
本发明人出乎意料地发现较短核酸探针改良本发明的电化学发光测量和分析方法的性能。常规思维是适当性能将需要相对较长寡核苷酸。较短核酸探针提供简化结合方案的额外优势(且具体来说，使得能够使用更简单、劳力密集度更小且更快的方法从未结合的探针分离蛋白质-探针结合物)，且也更容易且更便宜合成和纯化。因此，在实施例中，本发明的核酸探针包括长度为约10至约30个核苷酸的寡核苷酸。在实施例中，核酸探针包括长度为约12至约28个核苷酸的寡核苷酸。在实施例中，核酸探针包括长度为约13至约26个核苷酸的寡核苷酸。在实施例中，核酸探针包括长度为约14至约24个核苷酸的寡核苷酸。在实施例中，核酸探针包括长度为约11至约22个核苷酸的寡核苷酸。在实施例中，核酸探针包括长度为约12至约21个核苷酸的寡核苷酸。在实施例中，核酸探针包括长度为约13至约20个核苷酸的寡核苷酸。在实施例中，核酸探针包括长度为约13至约18个核苷酸的寡核苷酸。在实施例中，核酸探针包括长度为约14至约19个核苷酸的寡核苷酸。在实施例中，核酸探针包括长度为约10、约11、约12、约13、约14、约15、约16、约17、约18、约19、约20、约21、约22、约23、约24、约25、约26、约27、约28、约29或约30个核苷酸的寡核苷酸。在实施例中，核酸探针包括约14个核苷酸的寡核苷酸。在实施例中，核酸探针包括约15个核苷酸的寡核苷酸。在实施例中，核酸探针包括含有5'-GACAGAACTAGACAC-3'(SEQ ID NO:33)的寡核苷酸。在实施例中，核酸探针包括含有5'-ACAGAACTAGACAC-3'(SEQ ID NO:40)的寡核苷酸。在实施例中，核酸探针包括含有5'-GACAGAACTAGACA-3'(SEQ ID NO:41)的寡核苷酸。在实施例中，核酸探针包括含有5'-TGCACAGCTCGACGC-3'(SEQ ID NO:42)的寡核苷酸。在实施例中，核酸探针包括寡核苷酸，其中寡核苷酸的长度为14至24个核苷酸且包括5'-GACAGAACTAGACAC-3'(SEQID NO:33)的14或15个连续核苷酸。
在实施例中，核酸探针包括一个或多个核酸修饰以允许与检测试剂结合。在实施例中，使用异双官能交联剂完成核酸探针与检测试剂的结合。在实施例中，核酸探针包括含有反应性官能团的非天然存在的5'修饰。官能团的非限制性实例包含例如烯烃和张力烯烃、炔烃、卤化物、醇、硫醇、胺、磷酸盐、醛、酮、羧酸、羧酸盐、酰胺、酯、硫酯、酰基磷酸盐、酸卤化物、腈、酸酐、肼、四嗪、叠氮化物等。在实施例中，反应性官能团是硫醇、胺、羧酸、活性酯、肼、醛、酮、炔烃、张力烯烃、叠氮化物或四嗪。在实施例中，反应性官能团是硫醇。在实施例中，反应性官能团是四嗪。在实施例中，反应性官能团是乙烯基或张力烯烃。在实施例中，反应性官能团是叠氮化物。在实施例中，反应性官能团是炔烃或张力炔烃。在实施例中，反应性官能团是4-甲酰基苯甲酰胺。在实施例中，反应性官能团是肼基烟碱酰胺。
在实施例中，非天然存在的5'修饰能够与本发明的异双官能交联剂反应。在实施例中，非天然存在的5'修饰能够与顺丁烯二酰亚胺、碘乙酰胺或活化二硫化物反应。在实施例中，非天然存在的5'修饰能够与四嗪反应。在实施例中，非天然存在的5'修饰能够与乙烯基或张力烯烃反应。在实施例中，非天然存在的5'修饰能够与叠氮化物反应。在实施例中，非天然存在的5'修饰能够与炔烃或张力炔烃反应。在实施例中，非天然存在的5'修饰能够与肼基烟碱酰胺反应。在实施例中，非天然存在的5'修饰能够与4-甲酰基苯甲酰胺反应。
在实施例中，非天然存在的核酸探针具有式III：
且包括反应性官能团(R)，且反应性官能团是硫醇、胺、羧酸、活性酯、肼、醛、酮、炔烃、张力烯烃、叠氮化物或四嗪。在一个实施例中，反应性官能团是硫醇(-R是-SH)。
在实施例中，非天然存在的核酸探针进一步包括含有半抗原或生物素的非天然存在的5'修饰。在实施例中，半抗原包括荧光素、二硝基苯基或地高辛。在实施例中，修饰包括生物素。在实施例中，修饰包括硫醇。在实施例中，修饰为5'硫醇修饰剂C6 S-S(5ThioMC6-D)。
在实施例中，非天然存在的核酸探针具有式IV：
在实施例中，本发明提供包括结合于本文所述的非天然存在的核酸探针的检测试剂的结合化合物。在实施例中，结合化合物的寡核苷酸的长度为14至24个核苷酸且包括SEQID NO:33的14或15个连续核苷酸。在实施例中，结合化合物的寡核苷酸的长度为14至24个核苷酸且包括SEQ ID NO:33的14或15个连续核苷酸，且进一步包括含有反应性官能团的非天然存在的5'修饰。在实施例中，结合化合物的寡核苷酸的长度为14至24个核苷酸且包括SEQ ID NO:33的14或15个连续核苷酸，且进一步包括硫醇、胺、羧酸、活性酯、肼、醛、酮、炔烃、张力烯烃、叠氮化物或四嗪。在实施例中，结合化合物的寡核苷酸的长度为14至24个核苷酸，具有式III且包括SEQ ID NO:33的14或15个连续核苷酸：
其中R是反应性基团。在实施例中，反应性基团R是硫醇、胺、羧酸、活性酯、肼、醛、酮、炔烃、张力烯烃、叠氮化物或四嗪。在实施例中，反应性基团R是硫醇(-R是-SH)。在实施例中，核酸探针包括含有5'-GACAGAACTAGACAC-3'(SEQ ID NO:33)的寡核苷酸。在实施例中，核酸探针包括含有5'-ACAGAACTAGACAC-3'(SEQ ID NO:40)的寡核苷酸。在实施例中，核酸探针包括含有5'-GACAGAACTAGACA-3'(SEQ ID NO:41)的寡核苷酸。在实施例中，核酸探针包括含有5'-TGCACAGCTCGACGC-3'(SEQ ID NO:42)的寡核苷酸。
在实施例中，结合化合物的检测试剂是结合试剂。在实施例中，结合化合物的检测试剂是抗原结合物质。在实施例中，检测试剂是抗体。在实施例中，非天然存在的核酸探针的寡核苷酸的长度为10至30个核苷酸。在实施例中，非天然存在的核酸探针的寡核苷酸的长度为14至19个核苷酸。在实施例中，非天然存在的核酸探针的寡核苷酸的长度为约14、约15、约16、约17、约18或约19个核苷酸。在实施例中，非天然存在的核酸探针的寡核苷酸的长度为14个核苷酸。在实施例中，非天然存在的核酸探针的寡核苷酸的长度为15个核苷酸。
在实施例中，核酸探针包括与模板核酸序列的互补区。在实施例中，模板核酸序列是环状核酸模板，或可连接以形成环状核酸模板的线性核酸模板。在实施例中，环状核酸模板是用于滚环扩增(RCA)的模板。在实施例中，核酸探针是用于RCA反应的引物，即延伸环状核酸模板以形成延伸序列。
在实施例中，本发明的非天然存在的寡核苷酸比常规RCA模板寡核苷酸短。如同核酸探针，较短模板寡核苷酸提供更容易且更便宜合成和纯化的优势。较短模板寡核苷酸还可以增加分析灵敏度，因为相比于较长寡核苷酸，每单位时间在RCA反应中可扩增较短寡核苷酸的更多拷贝。在实施例中，本发明提供长度为约40至约100个核苷酸的非天然存在的寡核苷酸，且在其5'端包括序列5'-GTTCTGTC-3'且在其3'端包括序列5'-GTGTCTA-3'。寡核苷酸的5'端序列和3'端序列还可以分别称为5'末端序列和3'末端序列。在实施例中，非天然存在的寡核苷酸包括5'-CAGTGAATGCGAGTCCGTCTAAG-3'(SEQ ID NO:34)和5'-AAGAGAGTAGTACAGCA-3'(SEQ ID NO:35)。在实施例中，非天然存在的寡核苷酸的长度为约50至约78个核苷酸。在实施例中，非天然存在的寡核苷酸的长度为约53至约76个核苷酸。在实施例中，非天然存在的寡核苷酸的长度为约50至约70个核苷酸。在实施例中，非天然存在的寡核苷酸的长度为约53至约61个核苷酸。在实施例中，非天然存在的寡核苷酸的长度为约54至约61个核苷酸。在实施例中，非天然存在的寡核苷酸的长度为61个核苷酸。在实施例中，非天然存在的寡核苷酸包括约53、约54、约55、约56、约57、约58、约59、约60、约61、约62、约63、约64、约65、约66、约67、约68、约69、约70、约71、约72、约73、约74、约75或约76个核苷酸，且在其5'端包括序列5'-GTTCTGTC-3'且在其3'端包括序列5'-GTGTCTA-3'。在实施例中，寡核苷酸进一步包括5'末端磷酸基团。在实施例中，寡核苷酸在其5'端包括序列5'-GTTCTGTC-3'且在其3'端包括序列5'-GTGTCTA-3'。
在实施例中，寡核苷酸由5'-GTTCTGTCATATTTCAGTGAATGCGAGTCCGTCTAAGAGAGTAGTACAGCAAGAGTGTCTA-3'(SEQ ID NO:36)组成。在实施例中，寡核苷酸由5'-GCTGTGCAATATTTCAGTGAATGCGAGTCCGTCTAAGAGAGTAGTACAGCAAGAGCGTC GA-3'(SEQ ID NO:43)组成。在实施例中，寡核苷酸进一步包括5'末端磷酸基团。在实施例中，寡核苷酸是可连接以形成环状寡核苷酸，例如环状RCA模板的线性寡核苷酸。
寡核苷酸序列
表B是本文提供的寡核苷酸序列的概述。
表B.寡核苷酸序列
表B中提供的寡核苷酸中的任一个可以包括一个或多个修饰。本文描述了寡核苷酸的修饰。在实施例中，表B中的寡核苷酸包括一个或多个修饰以连接至另一物质，诸如标记、蛋白质或表面。在实施例中，表B中的寡核苷酸包括生物素、抗生蛋白链菌素、抗生物素蛋白、氨基、硫醇基、醛基、酰肼基、叠氮基、炔基、顺丁烯二酰亚胺基和/或碘乙酰胺基。在实施例中，表B中的寡核苷酸包括表A中的修饰中的一种或多种。
在实施例中，表B中的寡核苷酸包括5'氨基修饰剂C6(5AmMC6)、5'氨基修饰剂C12(5AmMC12)、氨基修饰剂C6 dT(5AmMC6T、iAmMC6T、3AmMC6T)、3'氨基修饰剂(3AmMO)、UNILINKTM氨基修饰剂(5UniAmM、iUniAmM)、生物素(5Biosg、3Bio)、生物素-叠氮化物(5BioK、iBiodUK)、生物素dT(5BiodT、iBiodT、3BiodT)、生物素-TEG(5BioTEG、3BioTEG)、5'双生物素(52-Bio)、5'可光裂解生物素(5PCBio)、去硫生物素-TEG(5deSBioTEG、ideSBioTEG、3deSBioTEG)、3'硫醇修饰剂C3 S-S(3ThioMC3-D)、二硫醇(5DTPA、iDTPA、3DTPA)、5'硫醇修饰剂C6 S-S(5ThioMC6-D)、5'己炔基(5Hexynyl)、5-辛二炔基(55OctdU、i5OctdU、35OctdU)、C3间隔子(5SpC3、iSpC3、3SpC3)、己二醇(3C6)、1'2'-二去氧核糖dSpacer(5dSp、idSp、3dSp)、可光裂解间隔子(5SpPC、iSpPC)、间隔子9(5Sp9、iSp9、3Sp9)、间隔子18(5Sp18、iSp18、3Sp18)、5'ACRYDITETM(5Acryd)、5'腺苷酰化作用(5rApp)、叠氮化物NHS酯(5AzideN、iAzideN、3AzideN)、3'胆固醇-TEG(3CholTEG)、地高辛NHS酯(5DigN、3DigN)、5'I-连接子(5ILink12)、磷酸化(5Phos、3Phos)、6-FAM叠氮化物(56-FAMK、i6-FAMK)、6-FAM NHS酯(56-FAMN、i6-FAMN)、5-TAMRA叠氮化物(55-TAMK、i5-TAMK)或其组合。
将多肽与寡核苷酸结合的方法
在实施例中，本发明提供将核酸探针与检测试剂结合以形成结合物的方法，和分析结合效率的方法。本发明因此提供标记和定量核酸探针与检测试剂(例如抗体)的偶联效率的简单和定量方法。涉及检测并入至核酸探针中的荧光标记的先前方法具有显著缺点，诸如非特异性结合和增加的背景信号。这类缺点是由于例如荧光标记通常为大型疏水性残基。在诸如本文所述的方法的超灵敏分析中，这类问题提出特别的挑战。本发明方法消除与使用大分子(诸如荧光标记)定量偶联效率相关的这类问题。
在实施例中，使用在与核酸结合时发荧光的化合物来测定核酸探针与检测试剂之间的结合效率，以使得可定量结合物的核酸探针组分。在实施例中，在从结合物反应去除未反应的核酸探针之后，结合物首先使用特异性测量检测试剂的量的分析定量，且接着使用特异性测量核酸探针组分的量的分析定量(通过组合结合物和荧光化合物)。比较荧光信号与对照样品，例如校准寡核苷酸可以进一步确定是否存在最小充分结合(即，高于低对照的荧光信号)，或是否存在未反应核酸探针的不充分去除(即，高于高对照的荧光信号)。
在实施例中，本发明提供将核酸探针与非核酸检测试剂结合以形成结合物的方法，其包括：(a)使检测试剂与核酸探针反应以形成结合物；(b)使用尺寸分离装置将结合物与未反应的核酸探针分离以形成纯化结合物；(c)形成包括纯化结合物和核酸结合荧光团的样品的测试组合物，所述核酸结合荧光团针对具有当荧光团与核酸(例如单股或双股)结合时增加的荧光强度进行选择；和(d)测量测试组合物的荧光以确定结合物中寡核苷酸的量。
在实施例中，荧光团的荧光强度在荧光团结合于单股核酸时增加。在实施例中，荧光团的荧光强度在荧光团结合于双股核酸时增加。在实施例中，荧光团是QUANT-IT、OLIGREEN染料、QUANTI-IT RIBOGREEN染料、QUANTIFLUOR ssDNA染料、SYBR GREEN I染料或SYBR GREEN II染料。在实施例中，荧光团是SYBR Green I染料。
在实施例中，尺寸分离装置被配置成将包括寡核苷酸和检测试剂的结合物与未反应的核酸探针分离。在实施例中，用于将结合物与未反应的核酸探针分离的尺寸分离装置是透析装置、超滤装置或尺寸排阻柱，且分离装置具有适合于将分子量为约5,000道尔顿或更小的寡核苷酸自分子量大于50,000道尔顿的结合物分离的分子量截断。在实施例中，尺寸分离装置是包括尺寸排阻色谱基质的柱。尺寸排阻色谱基质的非限制性实例包含SEPHADEX、SEPHAROSE、SEPHACRYL、ECONO-COLUMN、ECONO-PAC、BIO-SPIN、MICRO BIO-SPIN等，其中所列类型的基质中的每一个包含被配置成分离样品中不同尺寸的化合物的不同珠粒尺寸。在实施例中，尺寸排阻色谱基质包括SEPHADEX G100珠粒。在实施例中，尺寸排阻柱为重力柱、旋转柱、泵柱或基于真空的柱。
在实施例中，将核酸探针与检测试剂结合的方法进一步包括形成至少一种包括已知量的校准寡核苷酸和荧光团的校准组合物，和测量荧光。在实施例中，确定纯化结合物中寡核苷酸的量包括将从测试组合物测量的荧光与用一种或多种校准组合物测量的荧光进行比较。在实施例中，将核酸探针与检测试剂结合的方法进一步包括测量纯化结合物中检测试剂的浓度。在实施例中，检测试剂浓度是使用蛋白质分析来测量。多种适合的蛋白质分析是所属领域中已知的。实例包含基于蛋白质-金属螯合的方法(例如缩二脲法、BCA法、Lowry法)、基于蛋白质-染料相互作用的方法(例如Bradford(Coumassie)法、Quanti-iT法和Qubit法)和基于蛋白质氨基与胺反应性染料的反应的方法(例如CBQCAt法)-参见例如ThermoFisher Scientific的《蛋白质分析技术手册(Protein Assay TechnicalHandbook)》,2017)。在实施例中，使用BCA蛋白质分析来测量检测试剂的浓度。在实施例中，方法进一步包括计算纯化结合物中每一检测试剂的结合寡核苷酸的平均数量。在实施例中，检测试剂是结合试剂。在实施例中，检测试剂是抗原结合物质。
典型结合方法涉及使结合物的第一组分与交联剂反应、纯化第一组分与交联剂的反应产物，接着使反应产物与第二反应组分反应。然而，在某些情况下可能不期望中间纯化步骤，诸如当仅存在有限量的结合物组分时，和/或当以小体积进行反应时。中间纯化步骤对于整体工作流程还可以是繁重的。在本文所述的方法的实施例中，使用交联剂将核酸探针与检测试剂有效地结合，而无需在使交联剂与核酸探针反应之前纯化检测试剂和交联剂的反应产物，从而呈现相比于先前方法的改良。可由于反应物的摩尔比而消除中间纯化步骤。
在实施例中，本发明提供使核酸探针与非核酸检测试剂结合以形成结合物的方法，其包括使检测试剂和核酸探针与异双官能交联剂在其中检测试剂与交联剂的第一反应性基团反应且核酸与交联剂的第二反应性基团反应以形成结合物的条件下接触，其中异双官能交联剂包括(i)能够与检测试剂反应以将交联剂连接至检测试剂的第一反应性基团，和(ii)能够与核酸探针反应以将交联剂连接至核酸探针，同时基本上不对检测试剂具有反应性的第二反应性基团，其中方法不包含在交联剂与核酸探针反应之前纯化检测试剂和交联剂的反应产物。
在实施例中，方法包括在检测试剂与交联剂的第一反应性基团反应，且核酸探针与交联剂的第二反应性基团反应的条件下培育检测试剂、交联剂和核酸探针，以将检测试剂和核酸探针连接至交联剂且形成结合物。在实施例中，培育持续约10分钟至约8小时。在实施例中，培育持续约20分钟至约6小时。在实施例中，培育持续约30分钟至约4小时。在实施例中，培育持续约40分钟至约2小时。在实施例中，培育持续约1小时。在实施例中，培育持续约10分钟、约20分钟、约30分钟、约40分钟、约50分钟、约1小时、约2小时、约3小时、约4小时、约5小时、约6小时、约7小时或约8小时。
在实施例中，培育是在约15℃至约30℃下。在实施例中，培育是在约18℃至约29℃下。在实施例中，培育是在约20℃至约28℃下。在实施例中，培育是在约21℃至约26℃下。在实施例中，培育是在约22℃至约24℃下。在实施例中，培育是在约23℃下。在实施例中，培育是在约15℃、约18℃、约20℃、约21℃、约22℃、约23℃、约24℃、约25℃、约26℃、约27℃、约28℃、约29℃或约30℃下。在实施例中，培育是在约15℃至约30℃下持续约10分钟至约8小时。在实施例中，培育是在约18℃至约29℃下持续约20分钟至约6小时。在实施例中，培育是在约20℃至约28℃下持续约20分钟至约6小时。在实施例中，培育是在约21℃至约26℃下持续约30分钟至约4小时。在实施例中，培育是在约22℃至约24℃下持续约40分钟至约2小时。在实施例中，培育是在约23℃下持续约1小时。
在实施例中，本发明提供一种使核酸探针与非核酸检测试剂结合以形成结合物的方法，其包括：(a)使检测试剂与异双官能交联剂在其中检测试剂与交联剂的第一反应性基团反应以形成第一组合物的条件下接触，其中异双官能交联剂包括(i)能够与检测试剂反应以将交联剂连接至检测试剂的第一反应性基团，和(ii)能够与核酸探针反应以将交联剂连接至核酸探针，同时基本上不对检测试剂具有反应性的第二反应性基团；(b)使第一组合物与核酸探针在其中交联剂中的第二反应性基团与核酸探针反应以形成结合物的条件下接触，其中方法不包含在交联剂与核酸探针反应之前纯化检测试剂和交联剂的反应产物。
在实施例中，方法包括在使检测试剂与交联剂的第一反应性基团反应以将检测试剂连接至交联剂以形成活化检测试剂的条件下培育第一组合物、形成包括活化检测试剂和核酸探针的第二组合物和在使核酸探针与交联剂的第二反应性基团反应以形成结合物的条件下培育第二组合物。
在实施例中，培育持续约10分钟至约8小时。在实施例中，培育持续约20分钟至约6小时。在实施例中，培育持续约30分钟至约4小时。在实施例中，培育持续约40分钟至约2小时。在实施例中，培育持续约1小时。在实施例中，培育持续约10分钟、约20分钟、约30分钟、约40分钟、约50分钟、约1小时、约2小时、约3小时、约4小时、约5小时、约6小时、约7小时或约8小时。
在实施例中，培育是在约15℃至约30℃下。在实施例中，培育是在约18℃至约29℃下。在实施例中，培育是在约20℃至约28℃下。在实施例中，培育是在约21℃至约26℃下。在实施例中，培育是在约22℃至约24℃下。在实施例中，培育是在约23℃下。在实施例中，培育是在约15℃、约18℃、约20℃、约21℃、约22℃、约23℃、约24℃、约25℃、约26℃、约27℃、约28℃、约29℃或约30℃下。在实施例中，培育是在约15℃至约30℃下持续约10分钟至约8小时。在实施例中，培育是在约18℃至约29℃下持续约20分钟至约6小时。在实施例中，培育是在约20℃至约28℃下持续约20分钟至约6小时。在实施例中，培育是在约21℃至约26℃下持续约30分钟至约4小时。在实施例中，培育是在约22℃至约24℃下持续约40分钟至约2小时。在实施例中，培育是在约23℃下持续约1小时。
在实施例中，方法进一步包括使用尺寸分离装置将结合物与未结合的核酸探针分离。在实施例中，方法进一步包括：使用尺寸分离装置将结合物与未反应的核酸探针分离以产生纯化结合物；形成包括纯化结合物和核酸结合荧光团的测试组合物，所述核酸结合荧光团针对具有当荧光团与核酸结合时增加的荧光强度进行选择；和测量测试组合物的荧光以确定纯化结合物中核酸探针的量。在实施例中，荧光团的荧光强度在荧光团结合于单股核酸时增加。在实施例中，荧光团的荧光强度在荧光团结合于双股核酸时增加。在实施例中，荧光团是QUANT-IT、OLIGREEN染料、QUANTI-IT RIBOGREEN染料、QUANTIFLUOR ssDNA染料、SYBR GREEN I染料或SYBR GREEN II染料。在实施例中，荧光团是SYBR Green I染料。在实施例中，测量每一结合物的核酸探针的数目，包括测量纯化结合物中结合寡核苷酸的浓度和纯化结合物中检测试剂的量。在实施例中，检测试剂是蛋白质，例如抗原结合物质。
在实施例中，将核酸探针与检测试剂结合的方法进一步包括形成至少一种包括已知量的校准寡核苷酸和荧光团的校准组合物，和测量荧光。在实施例中，确定纯化结合物中寡核苷酸的量包括将自测试组合物测量的荧光与用一种或多种校准组合物测量的荧光进行比较。在实施例中，将核酸探针与检测试剂结合的方法进一步包括使用蛋白质分析来测量纯化结合物中检测试剂的浓度。在实施例中，使用BCA蛋白质分析来测量检测试剂的浓度。在实施例中，方法进一步包括计算纯化结合物中每一检测试剂的结合寡核苷酸的平均数量。在实施例中，结合化合物的检测试剂是结合试剂。在实施例中，检测试剂是抗原结合物质。在实施例中，检测试剂是非核酸检测试剂。
在实施例中，使用寡核苷酸分析来测试不同浓度下的多种寡核苷酸校准标准物以产生荧光相对于寡核苷酸浓度的校准曲线。接着将结合物的测试样品的荧光相比于校准曲线以确定例如样品中寡核苷酸的浓度。在实施例中以图形方式或以数学方式进行此比较，例如通过将校准点拟合至数学模型和使用所述模型对来自测试样品的荧光值进行反拟合以确定样品中的寡核苷酸浓度。或者，使用对结合水平的更定性评估。举例来说，以等于结合物中寡核苷酸的最小可接受浓度的水平测试单一浓度的寡核苷酸校准标准品(低对照样品)：在此情况下，结合物样品的荧光信号与低对照的荧光的简单比较可以用于确定结合物具有可接受的标记水平(结合物的荧光≥低对照的荧光)或不具有可接受的标记水平(结合物的荧光<低对照的荧光)。类似地，还可以测试具有高于结合物中寡核苷酸的最大预期浓度的水平的另一寡核苷酸校准标准品(高对照样品)；在此情况下，结合物的荧光信号与荧光信号的比较可以用于确定结合物是否被过度标记或纯化步骤是否未充分去除未结合的寡核苷酸(结合物的荧光＞高对照的荧光)。在实施例中，可接受的寡核苷酸浓度的范围(表示为寡核苷酸的分子/结合物的分子的最小值至最大值)为1至8、1至6、2至5、2至4、3至4、1至2、或约1、约2或约3。
在实施例中，交联剂的第一反应性基团包括胺反应性部分。氨基反应性部分可对多肽的游离氨基具有反应性，例如在多肽的N端处，或在多肽中的赖氨酸残基处。在实施例中，第一反应性基团包括活性酯(即，酯-C(O)OR，其中离去基HOR被选择成使得酯与亲核物质HNuc快速反应以形成结合物-C(O)Nuc，其对与亲核试剂反应具有相对较高速率常数)。在实施例中，选择活性酯以在温和条件(例如6至9范围内的pH和0至40℃的温度)下容易地(例如以小于一天的时间标度)与蛋白质上的亲核试剂(例如蛋白质上的赖氨酸胺)反应，以形成结合物(例如通过形成酰胺键)。在实施例中，第一反应性基团是酯，其中离去基是N-羟基丁二酰亚胺、N-羟基磺基丁二酰亚胺、羟基苯并三唑(HOBt)、1-羟基-7-氮杂苯并三唑(HOAt)或五氟苯酚。在实施例中，第一反应性基团包括N-羟基丁二酰亚胺酯或N-羟基磺基丁二酰亚胺酯。在实施例中，N-羟基丁二酰亚胺或N-羟基磺基丁二酰亚胺首先与羧酸反应以形成N-羟基磺基丁二酰亚胺酯或N-羟基磺基丁二酰亚胺酯，随后与检测试剂反应。
在实施例中，交联剂的第二反应性基团包括顺丁烯二酰亚胺、碘乙酰胺、活化二硫化物、硫醇、胺、羧酸、活性酯、肼、醛、酮、炔烃、张力烯烃、叠氮化物或四嗪。在实施例中，核酸探针包括硫醇部分且第二反应性基团包括顺丁烯二酰亚胺、碘乙酰胺或活化二硫化物部分；核酸探针包括烯烃或张力烯烃部分且第二反应性基团包括四嗪部分；核酸探针包括四嗪部分且第二反应性基团包括乙烯基或张力烯烃部分；核酸探针包括炔烃或张力炔烃部分且第二反应性基团包括叠氮化物部分；核酸探针包括叠氮化物部分且第二反应性基团包括炔烃或张力炔烃部分；核酸探针包括4-甲酰基苯甲酰胺部分且第二反应性基团包括肼基烟碱酰胺部分；或核酸探针包括肼基烟碱酰胺部分且第二反应性基团包括4-甲酰基苯甲酰胺部分。在实施例中，核酸探针包括硫醇，且第二反应性基团是硫醇反应性基团。
在实施例中，第二反应性基团包括顺丁烯二酰亚胺、碘乙酰胺或活化二硫化物部分。在实施例中，第二反应性基团包括顺丁烯二酰亚胺或碘乙酰胺部分。在实施例中，第二反应性基团包括四嗪部分。在实施例中，第二反应性基团包括乙烯基或张力烯烃部分。在实施例中，第二反应性基团包括叠氮化物部分。在实施例中，第二反应性基团包括炔烃或张力炔烃部分。在实施例中，第二反应性基团包括肼基烟碱酰胺部分。在实施例中，第二反应性基团包括4-甲酰基苯甲酰胺部分。在实施例中，第二反应性基团是硫醇反应性基团。
在实施例中，核酸探针包括硫醇，第一反应性基团是胺反应性基团，第二反应性基团是硫醇反应性基团，且异双官能交联剂是式V化合物：
其中R是0与24之间的整数。在实施例中，R是1与20之间的整数。在实施例中，R是2与15之间的整数。在实施例中，R是3与10之间的整数。在实施例中，R是4。
在实施例中，交联剂是同双官能交联剂。在实施例中，同双官能交联试剂包括第一和第二反应性基团，其中第一和第二反应性基团是相同官能团。在实施例中，第一和第二反应性基团各包括顺丁烯二酰亚胺、碘乙酰胺或活化二硫化物部分。在实施例中，第一和第二反应性基团各包括顺丁烯二酰亚胺或碘乙酰胺部分。在实施例中，第一和第二反应性基团各包括四嗪部分。在实施例中，第一和第二反应性基团各包括乙烯基或张力烯烃部分。在实施例中，第一和第二反应性基团各包括叠氮化物部分。在实施例中，第一和第二反应性基团各包括炔烃或张力炔烃部分。在实施例中，第一和第二反应性基团各包括肼基烟碱酰胺部分。在实施例中，第一和第二反应性基团各包括4-甲酰基苯甲酰胺部分。在实施例中，第一和第二反应性基团各自是硫醇反应性基团。
在实施例中，本发明提供将核酸探针与非核酸检测试剂结合以形成结合物的方法，其包括使检测试剂与同双官能交联剂接触，其中同双官能交联剂包括(i)能够与检测试剂反应以将交联剂连接至检测试剂的第一反应性基团，和(ii)能够与核酸探针反应以将交联剂连接至核酸探针的第二反应性基团，其中第一和第二反应性基团是相同官能团；去除未反应的交联剂；接着使连接至交联剂的检测试剂与核酸探针接触。
在实施例中，本发明提供将核酸探针与非核酸检测试剂结合以形成结合物的方法，其包括使核酸探针与同双官能交联剂接触，其中同双官能交联剂包括(i)能够与检测试剂反应以将交联剂连接至检测试剂的第一反应性基团，和(ii)能够与核酸探针反应以将交联剂连接至核酸探针的第二反应性基团，其中第一和第二反应性基团是相同官能团；去除未反应的交联剂；接着使连接至交联剂的核酸探针与检测试剂接触。
在实施例中，核酸探针包括5'-GACAGAACTAGACAC-3'(SEQ ID NO:33)的14或15个连续核苷酸。在实施例中，核酸探针包括含有5'-GACAGAACTAGACAC-3'(SEQ ID NO:33)的寡核苷酸。在实施例中，核酸探针包括含有5'-ACAGAACTAGACAC-3'(SEQ ID NO:40)的寡核苷酸。在实施例中，核酸探针包括含有5'-GACAGAACTAGACA-3'(SEQ ID NO:41)的寡核苷酸。在实施例中，核酸探针包括含有5'-TGCACAGCTCGACGC-3'(SEQ ID NO:42)的寡核苷酸。在实施例中，核酸探针包括5'修饰。在实施例中，核酸探针在5'末端处经硫醇部分修饰。在实施例中，核酸探针是式IIIA化合物：
在实施例中，核酸探针的寡核苷酸包括5'-GACAGAACTAGACAC-3'(SEQ ID NO:33)。在实施例中，核酸探针的寡核苷酸包括5'-ACAGAACTAGACAC-3'(SEQ ID NO:40)。在实施例中，核酸探针的寡核苷酸包括5'-GACAGAACTAGACA-3'(SEQ ID NO:41)。在实施例中，核酸探针包括含有5'-TGCACAGCTCGACGC-3'(SEQ ID NO:42)的寡核苷酸。
在实施例中，尺寸分离装置被配置成将包括寡核苷酸和检测试剂的结合物与未反应的核酸探针分离。在实施例中，用于将结合物与未反应的核酸探针分离的尺寸分离装置是透析装置、超滤装置或尺寸排阻柱，且分离装置具有适合于将分子量为约5,000道尔顿或更小的寡核苷酸自分子量大于50,000道尔顿的结合物分离的分子量截断。在实施例中，尺寸分离装置是包括尺寸排阻色谱基质的柱。尺寸排阻色谱基质的非限制性实例包含SEPHADEX、SEPHAROSE、SEPHACRYL、ECONO-COLUMN、ECONO-PAC、BIO-SPIN、MICRO BIO-SPIN等，其中所列类型的基质中的每一个包含被配置成分离样品中不同尺寸的化合物的不同珠粒尺寸。在实施例中，尺寸排阻色谱基质包括SEPHADEX G100珠粒。在实施例中，尺寸排阻柱为重力柱、旋转柱、泵柱或基于真空的柱。在实施例中，检测试剂是抗原结合物质。在实施例中，检测试剂是非核酸检测试剂。
在实施例中，控制结合反应中一种或多种组分的摩尔比以使得可再现结合能够实现每个结合物所期望数目个连接寡核苷酸，而无需中间纯化步骤。在实施例中，交联试剂相对于检测试剂的量呈摩尔过量，且核酸探针的量相对于交联剂的量呈摩尔过量。在实施例中，以相对于检测试剂的量约1.5、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或15倍摩尔过量添加交联剂的量。在实施例中，以约1.5至15、2至12、3至10或4至8的摩尔过量(相对于检测试剂)添加交联剂的量。在实施例中，交联剂的量为相对于检测试剂的量至少10倍摩尔过量。在实施例中，交联剂的量为相对于检测试剂的量至少六倍摩尔过量。在实施例中，交联剂的量为相对于检测试剂的量至少五倍摩尔过量。在实施例中，交联剂的量为相对于检测试剂的量至少四倍摩尔过量。在实施例中，核酸探针的摩尔量为交联剂的摩尔量的至少1.1倍。在实施例中，核酸探针的摩尔量为交联剂的摩尔量的至少1.1倍、至少1.2倍、至少1.3倍、至少1.4倍、至少1.5倍、至少1.6倍、至少1.7倍、至少1.8倍、至少1.9倍或至少2.0倍。在实施例中，方法使得至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或约100％的检测试剂与核酸探针结合。在实施例中，方法使得至少95％的检测试剂与核酸探针结合。
在实施例中，使用本文所提供的方法将超过一个核酸探针与检测试剂结合。在实施例中，与结合物中的各检测试剂偶联的核酸探针的平均数目为约2或更大。在实施例中，与结合物中的各检测试剂偶联的核酸探针的平均数目为约1至约20。在实施例中，与结合物中的各检测试剂偶联的核酸探针的平均数目为约2至约15。在实施例中，与结合物中的各检测试剂偶联的核酸探针的平均数目为约2至约7。在实施例中，与结合物中的各检测试剂偶联的核酸探针的平均数目为约3至约6。在实施例中，与结合物中的各检测试剂偶联的核酸探针的平均数目为约2至约4。在实施例中，与结合物中的各检测试剂偶联的核酸探针的平均数目为约3至约4。在实施例中，与结合物中的各检测试剂偶联的核酸探针的平均数目为约1、约2、约3、约4、约5、约6、约7、约8、约9、约10、约11、约12、约13、约14、约15、约16、约17、约18、约19、约20或大于20。
因此，在实施例中，结合物包括检测试剂和约1、约2、约3、约4、约5、约6、约7、约8、约9、约10、约11、约12、约13、约14、约15、约16、约17、约18、约19、约20或大于20个核酸探针。
在实施例中，检测试剂是蛋白质且结合物为式VI化合物：
其中R是0与24之间的整数，x是1与20之间的整数，且-NH-是源自蛋白质的氨基。在实施例中，核酸探针的寡核苷酸包括5'-GACAGAACTAGACAC-3'(SEQ ID NO:33)的14至15个连续寡核苷酸。在实施例中，核酸探针包括含有5'-GACAGAACTAGACAC-3'(SEQ ID NO:33)的寡核苷酸。在实施例中，核酸探针包括含有5'-ACAGAACTAGACAC-3'(SEQ ID NO:40)的寡核苷酸。在实施例中，核酸探针包括含有5'-GACAGAACTAGACA-3'(SEQ ID NO:41)的寡核苷酸。在实施例中，核酸探针包括含有5'-TGCACAGCTCGACGC-3'(SEQ ID NO:42)的寡核苷酸。在实施例中，R是1至20。在实施例中，R是2至15。在实施例中，R是3至10。在实施例中，R是4。在实施例中，R是1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23或24。在实施例中，x是1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20。在实施例中，x是1。在实施例中，x是2。
在实施例中，式VI的结合物是通过包括以下的方法产生：(a)形成包括检测试剂和核酸探针的结合物，包括(i)使检测试剂与异双官能交联剂中的NHS酯部分反应以形成活化检测试剂；(ii)使异双官能交联剂中的顺丁烯二酰亚胺部分与核酸探针的含硫醇寡核苷酸反应以形成结合物；(iii)去除未反应的核酸探针，其中交联剂是式VII化合物：
其中R是0与24之间的整数。
与本文所述的方法一起使用时，结合物的检测试剂可以是本文提供的任何检测试剂。举例来说，检测试剂可以是抗体、抗原、配体、受体、半抗原、抗原决定基、模拟抗原决定基或适体。适用于结合方法的检测试剂不限于本申请案中所述的分析的检测试剂。因此，在结合的情况下，结合物的检测试剂不限于在本文的分析方法中使用。在结合方法和结合物自身的情况下，检测试剂可因此用于任何其它适合和适当的应用，例如本文未明确描述的额外分析方法中。
用于将多肽与寡核苷酸结合的试剂盒
在实施例中，本发明提供用于将核酸探针与非核酸检测试剂结合以形成结合物的试剂盒，其包括：(a)包括以下的异双官能交联剂：(i)能够与检测试剂反应以将交联剂连接至检测试剂的第一反应性基团，和(ii)能够与核酸探针反应以将交联剂连接至核酸探针，同时基本上不对检测试剂具有反应性的第二反应性基团；(b)能够将结合物与未反应的核酸探针分离的第一尺寸分离装置；和(c)核酸结合荧光团，其中荧光团的荧光强度在荧光团结合于核酸时增加。在实施例中，荧光团的荧光强度在荧光团结合于单股核酸时增加。
在实施例中，交联剂的第一反应性基团包括胺反应性部分。氨基反应性部分可对多肽的游离氨基具体反应性，例如在多肽的N端处，或在多肽中的赖氨酸残基处。在实施例中，第一反应性基团包括活性酯(即，酯-C(O)OR，其中离去基HOR被选择成使得酯与亲核物质HNuc快速反应以形成结合物-C(O)Nuc，其对与亲核试剂反应具有相对较高速率常数)。在实施例中，选择活性酯以在温和条件(例如6至9范围内的pH和0至40℃的温度)下容易地(例如以小于一天的时间标度)与蛋白质上的亲核试剂(例如蛋白质上的赖氨酸胺)反应，以形成结合物(例如通过形成酰胺键)。在实施例中，第一反应性基团是酯，其中离去基是N-羟基丁二酰亚胺、N-羟基磺基丁二酰亚胺、N-羟基磺基丁二酰亚胺、羟基苯并三唑(HOBt)、1-羟基-7-氮杂苯并三唑(HOAt)或五氟苯酚。在实施例中，第一反应性基团包括N-羟基丁二酰亚胺酯或N-羟基磺基丁二酰亚胺酯。在实施例中，N-羟基丁二酰亚胺或N-羟基磺基丁二酰亚胺首先与羧酸反应以形成N-羟基磺基丁二酰亚胺酯或N-羟基磺基丁二酰亚胺酯，随后与检测试剂反应。
在实施例中，交联剂的第二反应性基团包括顺丁烯二酰亚胺、碘乙酰胺、活化二硫化物、硫醇、胺、羧酸、活性酯、肼、醛、酮、炔烃、张力烯烃、叠氮化物或四嗪。在实施例中，核酸探针包括硫醇部分且第二反应性基团包括顺丁烯二酰亚胺、碘乙酰胺或活化二硫化物部分；核酸探针包括烯烃或张力烯烃部分且第二反应性基团包括四嗪部分；核酸探针包括四嗪部分且第二反应性基团包括乙烯基或张力烯烃部分；核酸探针包括炔烃或张力炔烃部分且第二反应性基团包括叠氮化物部分；核酸探针包括叠氮化物部分且第二反应性基团包括炔烃或张力炔烃部分；核酸探针包括4-甲酰基苯甲酰胺部分且第二反应性基团包括肼基烟碱酰胺部分；或核酸探针包括肼基烟碱酰胺部分且第二反应性基团包括4-甲酰基苯甲酰胺部分。在实施例中，核酸探针包括硫醇，且第二反应性基团是硫醇反应性基团。
在实施例中，第二反应性基团包括顺丁烯二酰亚胺、碘乙酰胺或活化二硫化物部分。在实施例中，第二反应性基团包括顺丁烯二酰亚胺或碘乙酰胺部分。在实施例中，第二反应性基团包括四嗪部分。在实施例中，第二反应性基团包括乙烯基或张力烯烃部分。在实施例中，第二反应性基团包括叠氮化物部分。在实施例中，第二反应性基团包括炔烃或张力炔烃部分。在实施例中，第二反应性基团包括肼基烟碱酰胺部分。在实施例中，第二反应性基团包括4-甲酰基苯甲酰胺部分。在实施例中，第二反应性基团是硫醇反应性基团。
在实施例中，核酸探针包括硫醇，第一反应性基团是胺反应性基团，第二反应性基团是硫醇反应性基团，且异双官能交联剂是式V化合物：
其中R是0与24之间的整数。在实施例中，R是1与20之间的整数。在实施例中，R是2与15之间的整数。在实施例中，R是3与10之间的整数。在实施例中，R是4。
在实施例中，试剂盒进一步包括核酸探针。在实施例中，核酸探针包括5'-GACAGAACTAGACAC-3'(SEQ ID NO:33)的14或15个连续核苷酸。在实施例中，核酸探针包括含有5'-GACAGAACTAGACAC-3'(SEQ ID NO:33)的寡核苷酸。在实施例中，核酸探针包括含有5'-ACAGAACTAGACAC-3'(SEQ ID NO:40)的寡核苷酸。在实施例中，核酸探针包括含有5'-GACAGAACTAGACA-3'(SEQ ID NO:41)的寡核苷酸。在实施例中，核酸探针包括含有5'-TGCACAGCTCGACGC-3'(SEQ ID NO:42)的寡核苷酸。在实施例中，核酸探针包括5'修饰。在实施例中，核酸探针在5'末端处经硫醇部分修饰。在实施例中，核酸探针是式IIIA化合物：
在实施例中，核酸探针的寡核苷酸包括5'-GACAGAACTAGACAC-3'(SEQ ID NO:33)的14或15个连续核苷酸。在实施例中，核酸探针包括含有5'-GACAGAACTAGACAC-3'(SEQ ID NO:33)的寡核苷酸。在实施例中，核酸探针包括含有5'-ACAGAACTAGACAC-3'(SEQ ID NO:40)的寡核苷酸。在实施例中，核酸探针包括含有5'-GACAGAACTAGACA-3'(SEQ ID NO:41)的寡核苷酸。在实施例中，核酸探针包括含有5'-TGCACAGCTCGACGC-3'(SEQ ID NO:42)的寡核苷酸。
在实施例中，第一尺寸分离装置被配置成将包括寡核苷酸和检测试剂的结合物与未反应的核酸探针分离。在实施例中，用于将结合物与未反应的核酸探针分离的第一尺寸分离装置是透析装置、超滤装置或尺寸排阻柱，且分离装置具有适合于将分子量为约5,000道尔顿或更小的寡核苷酸自分子量大于50,000道尔顿的结合物分离的分子量截断。在实施例中，第一尺寸分离装置是包括尺寸排阻色谱基质的柱。尺寸排阻色谱基质的非限制性实例包含SEPHADEX、SEPHAROSE、SEPHACRYL、ECONO-COLUMN、ECONO-PAC、BIO-SPIN、MICRO BIO-SPIN等，其中所列类型的基质中的每一个包含被配置成分离样品中不同尺寸的化合物的不同珠粒尺寸。在实施例中，尺寸排阻色谱基质包括SEPHADEX G100珠粒。在实施例中，尺寸排阻柱为重力柱、旋转柱、泵柱或基于真空的柱。
在实施例中，荧光团是QUANT-IT、OLIGREEN染料、QUANTI-IT RIBOGREEN染料、QUANTIFLUOR ssDNA染料、SYBR GREEN I染料或SYBR GREEN II染料。在实施例中，荧光团是SYBR Green I染料。
在实施例中，试剂盒进一步包括校准寡核苷酸。在实施例中，校准寡核苷酸的浓度随试剂盒提供。在实施例中，校准寡核苷酸结合于荧光团。在实施例中，不同浓度的校准寡核苷酸与荧光团一起使用，以产生使荧光强度与寡核苷酸浓度相关的校准曲线。
在实施例中，试剂盒进一步包括第二尺寸分离装置，用于在结合之前使检测试剂脱盐。如本文所用，“脱盐(desalt/desalting)”或其变体是指交换其中储存有具体高分子量化合物的溶液(或缓冲液)的低分子量组分的过程，且也称为“缓冲液交换”。在实施例中，第二尺寸分离装置被配置成将检测试剂自适合于储存(例如在4℃、-20℃或-80℃下储存检测试剂)的缓冲液脱盐至适合于与核酸探针进行结合反应的缓冲液中。在实施例中，第二尺寸分离装置是透析装置、超滤装置或尺寸排阻柱，且分离装置具有适合于将分子量为约5,000道尔顿或更小的分子自分子量大于50,000道尔顿的检测试剂分离的分子量截断。在实施例中，第二尺寸分离装置是包括尺寸排阻色谱基质的脱盐柱。尺寸排阻色谱基质的非限制性实例包含SEPHADEX、SEPHAROSE、SEPHACRYL、ECONO-COLUMN、ECONO-PAC、BIO-SPIN、MICRO BIO-SPIN等，其中所列类型的基质中的每一个包含被配置成分离样品中不同尺寸的化合物的不同珠粒尺寸。在实施例中，脱盐为重力柱、旋转柱、泵柱或基于真空的柱。
在实施例中，检测试剂是抗原结合物质。在实施例中，检测试剂是非核酸检测试剂。在实施例中，试剂盒组分在单个包装中。在实施例中，试剂盒组分在一个或多个小瓶、包装或容器中。
与本文所述的试剂盒一起使用时，结合物的检测试剂可以是本文提供的任何检测试剂。举例来说，检测试剂可以是抗体、抗原、配体、受体、半抗原、抗原决定基、模拟抗原决定基或适体。适合与结合试剂盒一起使用的检测试剂不限于本申请案中所述的分析的检测试剂。因此，在结合的情况下，结合物的检测试剂不限于在本文的分析方法中使用。在结合方法和结合物自身的情况下，检测试剂可因此用于任何其它适合和适当的应用，例如本文未明确描述的额外分析方法中。
使用两种抗体的检测方法
在实施例中，本发明提供使用两种抗体，具体来说一种捕捉抗体和一种检测抗体来检测样品中的所关注分析物的方法。尽管三抗体(3-Ab)形式可就特异性来说提供一些优势，但二抗体(2-Ab)分析形式更易于开发、需要更少试剂(如果用于目标的可用试剂有限，那么其可以是优势)且可更适合于由于小尺寸、存在非免疫原性序列或存在高度可变序列而不具有可以用于结合的三个正交抗原决定基的目标。
2-Ab分析的挑战包含确定盘格式和涂布浓度、可行性、用于分析的各种寡核苷酸的序列、捕捉抗体和锚定寡核苷酸涂布浓度、用于结合检测抗体和核酸探针的方法、评估结合效率的方法、纯化技术、缓冲液组分等。本发明的组合物和方法克服这类挑战。
在实施例中，本发明提供一种检测样品中的所关注分析物的方法，其包括：将分析物结合于(i)包括用于分析物的捕捉试剂的表面上的捕捉试剂，其中表面涂布有抗生蛋白链菌素且捕捉试剂包括生物素；和(ii)包括核酸探针的用于分析物的单一检测试剂；由此在表面上形成包括捕捉试剂、分析物和检测试剂的复合物；延伸核酸探针以形成延伸序列；和使用被标记的探针测量与表面结合的延伸序列的量。
在实施例中，本发明提供检测样品中的所关注分析物的方法，其包括：将分析物结合于(i)包括用于分析物的捕捉试剂和锚定试剂的表面上的捕捉试剂，其中表面涂布有抗生蛋白链菌素且捕捉试剂和锚定试剂包括生物素；和(ii)包括核酸探针的用于分析物的单一检测试剂；由此在表面上形成包括捕捉试剂、分析物和检测试剂的复合物；延伸核酸探针以形成包括结合锚定试剂的锚定区的延伸序列；将延伸序列与锚定试剂结合；和使用被标记的探针测量与表面结合的延伸序列的量。
在实施例中，本发明提供测量分析物的方法，其包括：(a)将分析物结合于(i)表面上的结合域中的捕捉试剂和(ii)包括检测试剂和核酸探针的结合物；由此在结合域中形成包括捕捉试剂、分析物和结合物的复合物；(b)延伸结合物的核酸探针以形成包括与被标记的探针的寡核苷酸互补的检测序列补体的延伸序列；(c)将包括寡核苷酸的被标记的探针与延伸序列结合；和(d)测量与结合域结合的被标记的探针的量，其中被标记的探针是根据本发明的被标记的探针。
在实施例中，本发明提供测量分析物的方法，其包括：(a)将分析物结合于(i)表面上的结合域中的捕捉试剂，其中结合域进一步包括含有锚定寡核苷酸的锚定试剂，和(ii)包括检测试剂和核酸探针的结合物；由此在结合域中形成包括捕捉试剂、分析物和结合物的复合物；(b)延伸结合物的核酸探针以形成包括与锚定寡核苷酸互补的锚定寡核苷酸补体和与被标记的探针的寡核苷酸互补的检测序列补体的延伸序列；(c)将包括寡核苷酸的被标记的探针与延伸序列结合；和(d)测量与结合域结合的被标记的探针的量，其中被标记的探针是根据本发明的被标记的探针。
在实施例中，本发明提供测量分析物的方法，其包括：(a)将分析物结合于(i)表面上的结合域中的捕捉试剂和(ii)包括检测试剂和核酸探针的结合物，所述核酸探针包括具有第一探针序列和相邻第二探针序列的寡核苷酸；由此在结合域中形成包括捕捉试剂、分析物和结合物的复合物；(b)将复合物中的核酸探针结合于连接寡核苷酸，其中连接寡核苷酸包括与第一探针序列互补的5'末端序列、与第二探针序列互补的3'末端序列和能够与被标记的探针的检测寡核苷酸的补体杂交的序列；(c)将连接寡核苷酸连接以形成环状模板寡核苷酸；(d)通过滚环扩增延伸核酸探针以形成延伸序列；(e)将包括检测寡核苷酸的被标记的探针结合于延伸序列；和(f)测量与结合域结合的被标记的探针的量；其中被标记的探针是根据本发明的被标记的探针。
在实施例中，本发明提供测量分析物的方法，其包括：(a)将分析物结合于(i)表面上的结合域中的捕捉试剂，其中结合域进一步包括具有锚定寡核苷酸的锚定试剂，和(ii)包括检测试剂和核酸探针的结合物，所述核酸探针包括具有第一探针序列和相邻第二探针序列的寡核苷酸；由此在结合域中形成包括捕捉试剂、分析物和结合物的复合物；(b)将复合物中的核酸探针结合于连接寡核苷酸，其中连接寡核苷酸包括与第一探针序列互补的5'末端序列、与第二探针序列互补的3'末端序列、能够与锚定寡核苷酸的补体杂交的第一内部序列和能够与被标记的探针的检测寡核苷酸的补体杂交的第二内部序列；(c)将连接寡核苷酸连接以形成环状模板寡核苷酸；(d)通过滚环扩增延伸核酸探针以形成延伸序列；(e)将包括检测寡核苷酸的被标记的探针结合于延伸序列；和(f)测量与结合域结合的被标记的探针的量；其中被标记的探针是根据本发明的被标记的探针。
在实施例中，本发明提供测量分析物的方法，其包括在溶液中形成检测试剂与分析物之间的复合物，接着扩增，例如通过RCA，其中扩增产物通过捕捉试剂和/或锚定试剂结合于表面。在实施例中，表面是粒子。在实施例中，表面是电极。任选地，在通过捕捉试剂和/或锚定试剂与表面结合之前过滤扩增产物。
在实施例中，测量分析物的方法包括：(a)在溶液中将分析物结合于(i)包括靶向试剂的捕捉试剂，和(ii)包括检测试剂和核酸探针的结合物，由此在溶液中形成包括捕捉试剂、分析物和结合物的复合物；(b)延伸结合物的核酸探针以形成包括与被标记的探针的寡核苷酸互补的检测序列补体的延伸序列；(c)将捕捉试剂结合于包括与靶向试剂互补的靶向试剂补体的表面上的结合域；(d)将包括寡核苷酸的被标记的探针结合于延伸序列；和(e)测量与结合域结合的被标记的探针的量，其中被标记的探针是根据本发明的被标记的探针。
在实施例中，测量分析物的方法包括：(a)在溶液中将分析物结合于(i)捕捉试剂，和(ii)包括检测试剂和核酸探针的结合物，由此在溶液中形成包括捕捉试剂、分析物和结合物的复合物；(b)延伸结合物的核酸探针以形成包括与锚定寡核苷酸互补的锚定寡核苷酸补体和与被标记的探针的寡核苷酸互补的检测序列补体的延伸序列；(c)将延伸序列结合于表面上的结合域中的锚定寡核苷酸；(d)将包括寡核苷酸的被标记的探针结合于延伸序列；和(e)测量与结合域结合的被标记的探针的量，其中被标记的探针是根据本发明的被标记的探针。
在实施例中，测量分析物的方法包括：(a)在溶液中将分析物结合于包括检测试剂和核酸探针的结合物，所述核酸探针包括具有第一探针序列和相邻第二探针序列的寡核苷酸，由此在溶液中形成包括分析物和结合物的复合物；(b)将复合物中的核酸探针结合于连接寡核苷酸，其中连接寡核苷酸包括与第一探针序列互补的5'末端序列、与第二探针序列互补的3'末端序列和能够与被标记的探针的检测寡核苷酸的补体杂交的序列；(c)将连接寡核苷酸连接以形成环状模板寡核苷酸；(d)通过滚环扩增延伸核酸探针以形成包括与锚定寡核苷酸互补的锚定寡核苷酸补体和与被标记的探针的寡核苷酸互补的检测序列补体的延伸序列；(e)将延伸序列结合于表面上的结合域中的锚定试剂；(f)将包括检测寡核苷酸的被标记的探针结合于延伸序列；和(g)测量与结合域结合的被标记的探针的量；其中被标记的探针是根据本发明的被标记的探针。
在实施例中，本发明提供测量分析物的方法，其包括：(a)将分析物结合于(i)表面上的结合域中的捕捉试剂，和(ii)式VI的结合物：
其中R是0与24之间的整数，x是1与20之间的整数，且-NH-是源自蛋白质的氨基；由此在结合域中形成包括捕捉试剂、分析物和结合物的复合物；(b)延伸结合物的核酸探针以形成延伸序列；和(c)测量与结合域结合的延伸序列的量。
在实施例中，本发明提供测量分析物的方法，其包括：(a)将分析物结合于(i)表面上的结合域中的捕捉试剂，其中结合域进一步包括锚定寡核苷酸，和(ii)式VI的结合物：
其中R是0与24之间的整数，x是1与20之间的整数，且蛋白质-NH-是源自蛋白质的氨基的结合形式；由此在结合域中形成包括捕捉试剂、分析物和结合物的复合物；(b)延伸结合物的核酸探针以形成包括与锚定寡核苷酸互补的锚定寡核苷酸补体的延伸序列；和(c)测量与结合域结合的延伸序列的量。
在实施例中，蛋白质是检测试剂。在实施例中，R是1至20。在实施例中，R是2至15。在实施例中，R是3至10。在实施例中，R是4。在实施例中，R是1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23或24。在实施例中，x是1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20。在实施例中，x平均为约2至4，或约3。
在实施例中，本发明提供测量分析物的方法，其包括：(a)将分析物结合于(i)表面上的结合域中的捕捉试剂，和(ii)式VI的结合物：
其中“蛋白质”是检测试剂，R是0与24之间的整数，x是1与20之间的整数，且蛋白质-NH-是源自蛋白质的氨基的结合形式；其中结合物包括检测试剂和核酸探针，所述核酸探针包括具有第一探针序列和相邻第二探针序列的寡核苷酸；由此在结合域中形成包括捕捉试剂、分析物和结合物的复合物；(b)将复合物中的核酸探针结合于连接寡核苷酸，其中连接寡核苷酸包括与第一探针序列互补的5'末端序列、与第二探针序列互补的3'末端序列和能够与被标记的探针的检测寡核苷酸的补体杂交的序列；(c)将连接寡核苷酸连接以形成环状模板寡核苷酸；(d)通过滚环扩增延伸核酸探针以形成延伸序列；(e)将包括检测寡核苷酸的被标记的探针结合于延伸序列；和(f)测量与结合域结合的被标记的探针的量。
在实施例中，本发明提供测量分析物的方法，其包括：(a)将分析物结合于(i)表面上的结合域中的捕捉试剂，其中结合域进一步包括含有锚定寡核苷酸的锚定寡核苷酸，和(ii)式VI的结合物：
其中“蛋白质”为检测试剂，R是0与24之间的整数，x是1与20之间的整数，且蛋白质-NH-是源自蛋白质的氨基的结合形式；其中结合物包括检测试剂和核酸探针，所述核酸探针包括具有第一探针序列和相邻第二探针序列的寡核苷酸；由此在结合域中形成包括捕捉试剂、分析物和结合物的复合物；(b)将复合物中的核酸探针结合于连接寡核苷酸，其中连接寡核苷酸包括与第一探针序列互补的5'末端序列、与第二探针序列互补的3'末端序列、能够与锚定寡核苷酸的补体杂交的第一内部序列和能够与被标记的探针的检测寡核苷酸的补体杂交的第二内部序列；(c)将连接寡核苷酸连接以形成环状模板寡核苷酸；(d)通过滚环扩增延伸核酸探针以形成延伸序列；(e)将包括检测寡核苷酸的被标记的探针结合于延伸序列；和(f)测量与结合域结合的被标记的探针的量。
在实施例中，蛋白质是检测试剂。在实施例中，R是1至20。在实施例中，R是2至15。在实施例中，R是3至10。在实施例中，R是4。在实施例中，R是1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23或24。在实施例中，x是1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20。在实施例中，x平均为约2至4，或约3。在实施例中，结合物包括含有第一和第二探针序列的寡核苷酸。在实施例中，结合物通过本文提供的方法产生。
在实施例中，本发明提供测量分析物的方法，其包括：(a)将分析物结合于(i)表面上的结合域中的捕捉试剂，和(ii)包括检测试剂和核酸探针的结合物，所述核酸探针包括具有第一探针序列和相邻第二探针序列的寡核苷酸；由此在结合域中形成包括捕捉试剂、分析物和结合物的复合物；(b)将复合物中的核酸探针结合于连接寡核苷酸，其中连接寡核苷酸包括与第一探针序列互补的5'末端序列和与第二探针序列互补的3'末端序列；(c)将连接寡核苷酸连接以形成环状模板寡核苷酸；(d)通过滚环扩增延伸核酸探针以形成延伸序列；(e)测量与结合域结合的延伸序列的量；其中第一和第二探针序列的长度总和为14至24个核苷酸。
在实施例中，本发明提供测量分析物的方法，其包括：(a)将分析物结合于(i)表面上的结合域中的捕捉试剂，其中结合域进一步包括具有锚定寡核苷酸的锚定试剂，和(ii)包括检测试剂和核酸探针的结合物，所述核酸探针包括具有第一探针序列和相邻第二探针序列的寡核苷酸；由此在结合域中形成包括捕捉试剂、分析物和结合物的复合物；(b)将复合物中的核酸探针结合于连接寡核苷酸，其中连接寡核苷酸包括与第一探针序列互补的5'末端序列、与第二探针序列互补的3'末端序列和能够与锚定寡核苷酸的补体杂交的内部序列；(c)将连接寡核苷酸连接以形成环状模板寡核苷酸；(d)通过滚环扩增延伸核酸探针以形成延伸序列；(e)测量与结合域结合的延伸序列的量；其中第一和第二探针序列的长度总和为14至24个核苷酸。
在实施例中，本发明提供测量分析物的方法，其包括：(a)将分析物结合于(i)表面上的结合域中的捕捉试剂和(ii)包括检测试剂和核酸探针的结合物，所述核酸探针包括具有第一探针序列和相邻第二探针序列的寡核苷酸；由此在结合域中形成包括捕捉试剂、分析物和结合物的复合物；(b)将复合物中的核酸探针结合于连接寡核苷酸，其中连接寡核苷酸包括与第一探针序列互补的5'末端序列、与第二探针序列互补的3'末端序列和能够与被标记的探针的检测寡核苷酸的补体杂交的内部序列；(c)将连接寡核苷酸连接以形成环状模板寡核苷酸；(d)通过滚环扩增延伸核酸探针以形成延伸序列；(e)将包括检测寡核苷酸的被标记的探针结合于延伸序列；和(f)测量与结合域结合的被标记的探针的量；其中第一和第二探针序列的长度总和为14至24个核苷酸。
在实施例中，本发明提供测量分析物的方法，其包括：(a)将分析物结合于(i)表面上的结合域中的捕捉试剂，其中结合域进一步包括具有锚定寡核苷酸的锚定试剂，和(ii)包括检测试剂和核酸探针的结合物，所述核酸探针包括具有第一探针序列和第二探针序列的寡核苷酸；由此在结合域中形成包括捕捉试剂、分析物和结合物的复合物；(b)将复合物中的核酸探针结合于连接寡核苷酸，其中连接寡核苷酸包括与第一探针序列互补的5'末端序列、与第二探针序列互补的3'末端序列、能够与锚定寡核苷酸的补体杂交的第一内部序列和能够与被标记的探针的检测寡核苷酸的补体杂交的第二内部序列；(c)将连接寡核苷酸连接以形成环状模板寡核苷酸；(d)通过滚环扩增延伸核酸探针以形成延伸序列；(e)将包括检测寡核苷酸的被标记的探针结合于延伸序列；和(f)测量与结合域结合的被标记的探针的量；其中第一和第二探针序列的长度总和为14至24个核苷酸。
在实施例中，核酸探针包括长度为约10至约30个核苷酸的寡核苷酸。在实施例中，核酸探针包括长度为约12至约28个核苷酸的寡核苷酸。在实施例中，核酸探针包括长度为约13至约26个核苷酸的寡核苷酸。在实施例中，核酸探针包括长度为约14至约24个核苷酸的寡核苷酸。在实施例中，核酸探针包括长度为约11至约22个核苷酸的寡核苷酸。在实施例中，核酸探针包括长度为约12至约21个核苷酸的寡核苷酸。在实施例中，核酸探针包括长度为约13至约20个核苷酸的寡核苷酸。在实施例中，核酸探针包括长度为约14至约18个核苷酸的寡核苷酸。
在实施例中，第一和第二探针序列的长度总和为约10至约30个核苷酸。在实施例中，第一和第二探针序列的长度总和为约12至约28个核苷酸。在实施例中，第一和第二探针序列的长度总和为约13至约26个核苷酸。在实施例中，第一和第二探针序列的长度总和为约14至约24个核苷酸。在实施例中，第一和第二探针序列的长度总和为约11至约22个核苷酸。在实施例中，第一和第二探针序列的长度总和为约12至约21个核苷酸。在实施例中，第一和第二探针序列的长度总和为约13至约20个核苷酸。在实施例中，第一和第二探针序列的长度总和为约14至约18个核苷酸。
在实施例中，核酸探针包括长度为约10、约11、约12、约13、约14、约15、约16、约17、约18、约19、约20、约21、约22、约23、约24、约25、约26、约27、约28、约29或约30个核苷酸的寡核苷酸。在实施例中，核酸探针包括长度为约14个核苷酸的寡核苷酸。在实施例中，核酸探针包括长度为约15个核苷酸的寡核苷酸。在实施例中，核酸探针包括含有5'-GACAGAACTAGACAC-3'(SEQ ID NO:33)的14或15个连续核苷酸的寡核苷酸。在实施例中，核酸探针包括寡核苷酸，其中寡核苷酸的长度为14至24个核苷酸且包括5'-GACAGAACTAGACAC-3'(SEQ ID NO:33)的14或15个连续核苷酸。在实施例中，核酸探针包括含有5'-GACAGAACTAGACAC-3'(SEQ ID NO:33)的寡核苷酸。在实施例中，核酸探针包括含有5'-ACAGAACTAGACAC-3'(SEQ ID NO:40)的寡核苷酸。在实施例中，核酸探针包括含有5'-GACAGAACTAGACA-3'(SEQ ID NO:41)的寡核苷酸。在实施例中，核酸探针包括含有5'-TGCACAGCTCGACGC-3'(SEQ ID NO:42)的寡核苷酸。
在实施例中，第一和第二探针序列的组合长度为约10、约11、约12、约13、约14、约15、约16、约17、约18、约19、约20、约21、约22、约23、约24、约25、约26、约27、约28、约29或约30个核苷酸。在实施例中，第一和第二探针序列的组合长度为约14个核苷酸。在实施例中，第一和第二探针序列的组合长度为约15个核苷酸。在实施例中，第一和第二探针序列组合地包括序列5'-GACAGAACTAGACAC-3'(SEQ ID NO:33)的14或15个连续核苷酸。在实施例中，第一和第二探针序列组合地长度为14至24个核苷酸且包括序列5'-GACAGAACTAGACAC-3'(SEQ ID NO:33)的14或15个连续核苷酸。在实施例中，第一和第二探针序列组合地包括序列5'-GACAGAACTAGACAC-3'(SEQ ID NO:33)。在实施例中，第一和第二探针序列组合地包括序列5'-ACAGAACTAGACAC-3'(SEQ ID NO:40)。在实施例中，第一和第二探针序列组合地包括序列5'-GACAGAACTAGACA-3'(SEQ ID NO:41)。在实施例中，第一和第二探针序列组合地包括序列5'-TGCACAGCTCGACGC-3'(SEQ ID NO:42)。
在实施例中，核酸探针包括含有反应性官能团的非天然存在的5'修饰。官能团的非限制性实例包含例如烯烃和张力烯烃、炔烃、卤化物、醇、硫醇、胺、磷酸盐、醛、酮、羧酸、羧酸盐、酰胺、酯、硫酯、酰基磷酸盐、酸卤化物、腈、酸酐、肼、四嗪、叠氮化物等。在实施例中，反应性官能团是硫醇、胺、羧酸、活性酯、肼、醛、酮、炔烃、张力烯烃、叠氮化物或四嗪。在实施例中，反应性官能团是硫醇。在实施例中，反应性官能团是四嗪。在实施例中，反应性官能团是乙烯基或张力烯烃。在实施例中，反应性官能团是叠氮化物。在实施例中，反应性官能团是炔烃或张力炔烃。在实施例中，反应性官能团是4-甲酰基苯甲酰胺。在实施例中，反应性官能团是肼基烟碱酰胺。
在实施例中，非天然存在的5'修饰能够与本发明的异双官能交联剂反应。在实施例中，非天然存在的5'修饰能够与顺丁烯二酰亚胺、碘乙酰胺或活化二硫化物反应。在实施例中，非天然存在的5'修饰能够与四嗪反应。在实施例中，非天然存在的5'修饰能够与乙烯基或张力烯烃反应。在实施例中，非天然存在的5'修饰能够与叠氮化物反应。在实施例中，非天然存在的5'修饰能够与炔烃或张力炔烃反应。在实施例中，非天然存在的5'修饰能够与肼基烟碱酰胺反应。在实施例中，非天然存在的5'修饰能够与4-甲酰基苯甲酰胺反应。
在实施例中，核酸探针具有式IIIA：
且包括反应性官能团，且反应性官能团是硫醇、胺、羧酸、活性酯、肼、醛、酮、炔烃、张力烯烃、叠氮化物或四嗪。
在实施例中，核酸探针进一步包括含有半抗原或生物素的非天然存在的5'修饰。在实施例中，半抗原包括荧光素、二硝基苯基或地高辛。在实施例中，修饰包括生物素。
在实施例中，核酸探针具有式IV：
在实施例中，核酸探针包括与模板核酸序列上的一个或多个序列互补的一个或多个序列。在实施例中，模板核酸序列是环状核酸模板，或可连接(一旦与核酸探针杂交)以形成环状核酸模板的线性核酸模板。在实施例中，环状核酸模板是用于滚环扩增(RCA)的模板。在实施例中，核酸探针是用于RCA反应的引物，即延伸环状核酸模板以形成延伸序列。
在实施例中，被标记的探针包括寡核苷酸和电化学发光部分。在实施例中，被标记的探针包括一个或多个电化学发光标记。在实施例中，被标记的探针包括寡核苷酸和多个电化学发光标记。在实施例中，被标记的探针包括(i)与寡核苷酸的被修饰的核苷酸碱基连接的一个或多个(或两个或更多个)标记，(ii)具有一个或多个(或两个或更多个)标记的被标记部分，所述部分与寡核苷酸的5'端连接，(iii)具有一个或多个(或两个或更多个)标记的被标记部分，所述部分与寡核苷酸的3'端连接，或(iv)(i)、(ii)和(iii)中的两个或更多个的组合。在实施例中，被标记的探针具有式I：
其中B是核苷酸碱基，R是电化学发光标记，L1是键联基团，L2是键联基团，j是0与11之间的整数，k是0与1之间的整数，m是0与11之间的整数，且n是0与5之间的整数。
在实施例中，R包括钌络合物RP1P2P3，其中P1、P2和P3中的每一个独立地是联吡啶、被取代的联吡啶、啡啉或被取代的啡啉。在实施例中，化学发光标记R是
在实施例中，B是在尿嘧啶的5位处连接至L1的尿嘧啶。
在实施例中，L1包括
或其组合，其中p为1与12之间的整数。
在实施例中，L2包括
或其组合，其中q是0与11之间的整数。
在实施例中，本发明提供式II的被标记的探针：
其中j是0与11之间的整数，k是0与1之间的整数，m是0与11之间的整数，n是0与5之间的整数，且R是电化学发光标记：
在实施例中，j是0与5之间的整数，k是0，m是0与5之间的整数，且n是2与7之间的整数。在实施例中，k是0，j是0，m是1，且n是5。
在实施例中，被标记的探针的寡核苷酸包括与5'-CAGTGAATGCGAGTCCGTCT-3'(SEQID NO:31)具有至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或约100％序列一致性的序列。在实施例中，被标记的探针的寡核苷酸包括与5'-CAGTGAATGCGAGTCCGTCT-3'(SEQ ID NO:31)具有至少85％序列一致性的序列。在实施例中，被标记的探针的寡核苷酸包括与5'-CAGTGAATGCGAGTCCGTCT-3'(SEQ ID NO:31)具有至少88％序列一致性的序列。在实施例中，被标记的探针的寡核苷酸包括与5'-CAGTGAATGCGAGTCCGTCT-3'(SEQ ID NO:31)具有至少90％序列一致性的序列。在实施例中，被标记的探针的寡核苷酸包括与5'-CAGTGAATGCGAGTCCGTCT-3'(SEQ ID NO:31)具有至少95％序列一致性的序列。在实施例中，被标记的探针的寡核苷酸包括与5'-CAGTGAATGCGAGTCCGTCT-3'(SEQ ID NO:31)具有至少98％序列一致性的序列。在实施例中，被标记的探针的寡核苷酸包括与5'-CAGTGAATGCGAGTCCGTCT-3'(SEQ ID NO:31)具有至少99％序列一致性的序列。
在实施例中，被标记的探针的寡核苷酸包括5'-CAGTGAATGCGAGTCCGTCT-3'(SEQID NO:31)。在实施例中，被标记的探针的寡核苷酸包括5'-CAGTGAATGCGAGTCCGTCTAAG-3'(SEQ ID NO:32)。在实施例中，被标记的探针的寡核苷酸包括一种或多种本文所述的修饰。在实施例中，被标记的探针包括氨基修饰剂。在实施例中，被标记的探针包括内部氨基修饰的dT碱基(iAmMC6T)。在实施例中，被标记的探针包括内部间隔子18(iSp18)。在实施例中，被标记的探针包括3'氨基修饰剂(3AmMO)。在实施例中，被标记的探针的寡核苷酸包括5'-CAGTGAATGCGAGTCCGTCTAAG/iAmMC6T/iSp18/iAmMC6T/iSp18/3AmMO/-3'(具有修饰的SEQID NO:44)。
在实施例中，核酸探针与连接寡核苷酸的一部分互补。在实施例中，第一和第二探针序列各自与连接寡核苷酸的不同部分互补。在实施例中，连接寡核苷酸是线性寡核苷酸。在实施例中，连接寡核苷酸是用于扩增的模板寡核苷酸。在实施例中，连接寡核苷酸被连接以形成用于RCA的环状模板寡核苷酸。在实施例中，连接寡核苷酸的5'末端序列与第一或第二探针序列中的一个互补，且连接寡核苷酸的3'末端序列与第一或第二探针序列中的另一个互补。
在实施例中，连接寡核苷酸的第一内部序列能够与锚定试剂的锚定寡核苷酸的补体杂交。在实施例中，连接寡核苷酸的第一内部序列与锚定寡核苷酸具有70％、至少70％、75％、至少75％、80％、至少80％、85％、至少85％、90％、至少90％、95％、至少95％、97％、至少97％、98％、至少98％、99％或至少99％或100％序列一致性。在实施例中，从连接寡核苷酸扩增的延伸序列包括与锚定寡核苷酸互补的序列。
在实施例中，连接寡核苷酸的第二内部序列能够与被标记的探针的寡核苷酸(检测寡核苷酸)的补体杂交。在实施例中，连接寡核苷酸的第二内部序列与被标记的探针的检测寡核苷酸具有70％、至少70％、75％、至少75％、80％、至少80％、85％、至少85％、90％、至少90％、95％、至少95％、97％、至少97％、98％、至少98％、99％或至少99％或100％序列一致性。在实施例中，从连接寡核苷酸扩增的延伸序列包括与被标记的探针的检测寡核苷酸互补的序列。
在实施例中，连接寡核苷酸的长度为约53至约76个核苷酸，且在其5'端包括序列5'-GTTCTGTC-3'且在其3'端包括序列5'-GTGTCTA-3'。寡核苷酸的5'端序列和3'端序列还可以分别称为5'末端序列和3'末端序列。在实施例中，连接寡核苷酸包括5'-CAGTGAATGCGAGTCCGTCTAAG-3'(SEQ ID NO:34)和5'-AAGAGAGTAGTACAGCA-3'(SEQ ID NO:35)。在实施例中，连接寡核苷酸的长度为约40至约100个核苷酸。在实施例中，连接寡核苷酸的长度为约50至约78个核苷酸。在实施例中，连接寡核苷酸的长度为约53至约76个核苷酸。在实施例中，连接寡核苷酸的长度为约50至约70个核苷酸。在实施例中，连接寡核苷酸的长度为约53至约61个核苷酸。在实施例中，连接寡核苷酸的长度为约54至约61个核苷酸。在实施例中，连接寡核苷酸的长度为约61个核苷酸。在实施例中，连接寡核苷酸的长度为约53、约54、约55、约56、约57、约58、约59、约60、约61、约62、约63、约64、约65、约66、约67、约68、约69、约70、约71、约72、约73、约74、约75或约76个核苷酸，且在其5'端包括序列5'-GTTCTGTC-3'且在其3'端包括序列5'-GTGTCTA-3'。在实施例中，连接寡核苷酸进一步包括5'末端磷酸基团。在实施例中，连接寡核苷酸在其5'端包括序列5'-GTTCTGTC-3'且在其3'端包括序列5'-GTGTCTA-3'。在实施例中，连接寡核苷酸包括5'末端磷酸。
在实施例中，连接寡核苷酸由5'-GTTCTGTCATATTTCAGTGAATGCGAGTCCGTCTAAGAGAGTAGTACAGCAAGAGTGTCTA-3'(SEQ ID NO:36)组成。在实施例中，寡核苷酸由5'-GCTGTGCAATATTTCAGTGAATGCGAGTCCGTCTAAGAGAGTAGTACAGCAAGAGCGTCGA-3'(SEQ ID NO:43)组成。在实施例中，连接寡核苷酸进一步包括5'末端磷酸基团。在实施例中，连接寡核苷酸是可连接以形成环状寡核苷酸，例如环状RCA模板的线性寡核苷酸。
在实施例中，本发明的锚定寡核苷酸比常规锚定寡核苷酸短。如同核酸探针和模板寡核苷酸，较短锚定寡核苷酸提供更容易且更便宜合成和纯化的优势。较短锚定寡核苷酸还可以按通过减少来自可存在于样品中的结合试剂，例如可存在于血液样品中的抗DNA抗体的非特异性结合来提高分析灵敏度。在实施例中，锚定试剂包括锚定寡核苷酸，且锚定寡核苷酸的长度为约10至约30个核苷酸。在实施例中，锚定寡核苷酸的长度为约15至约28个核苷酸。在实施例中，锚定寡核苷酸的长度为约17至约25个核苷酸。在实施例中，锚定寡核苷酸的长度为约17、约18、约19、约20、约21、约22、约23、约24或约25个核苷酸。在实施例中，锚定寡核苷酸包括5'-AAGAGAGTAGTACAGCA-3'(SEQ ID NO:35)。在实施例中，锚定寡核苷酸由5'-AAGAGAGTAGTACAGCAGCCGTCAA-3'(SEQ ID NO:37)组成。在实施例中，锚定试剂包括氨基修饰剂。在实施例中，氨基修饰剂为5'氨基修饰剂C6(5AmMC6)。在一些实施例中，氨基修饰剂为3'氨基修饰的dT碱基(3AmMC6T)。在实施例中，锚定试剂包括5'-/5AmMC6/AAGAGAGTAGTACAGCAGCCGTCAA/3AmMC6T/3'(具有修饰的SEQ ID NO:45)。
在实施例中，锚定试剂在将分析物结合于捕捉试剂之前、期间或之后连接至表面。因此，在包括试剂盒的实施例中，锚定试剂可以与表面分开提供且接着固定于表面上，其中表面包括固定于其上的捕捉试剂。在实施例中，锚定试剂在捕捉试剂已固定于表面上之后和添加包括分析物的样品之前固定于表面上。在实施例中，锚定试剂在将包括分析物的样品添加至包括固定捕捉试剂的表面期间固定至表面上。在实施例中，锚定试剂在形成包括分析物、捕捉试剂和检测试剂的复合物之后固定至表面上。在实施例中，锚定试剂与检测试剂同时添加至表面。在实施例中，锚定试剂在延伸步骤之前添加至表面。在实施例中，洗涤步骤先于将锚定试剂添加至表面。在实施例中，其中在将包括分析物的样品添加至表面之后添加锚定试剂，且在添加锚定试剂之前进行洗涤步骤，洗涤步骤消除样品中的潜在干扰，例如归因于样品-DNA相互作用，诸如分析物-DNA相互作用或抗DNA反应性(例如在抗DNA抗体的情况下)、DNA结合蛋白或DNA或RNA。在实施例中，锚定试剂和捕捉试剂包括不同靶向试剂，且表面包括能够结合于不同靶向试剂的靶向试剂补体。在一些实施例中，靶向试剂补体是抗体，且锚定试剂包括能够结合于抗体靶向试剂补体的抗原。举例来说，锚定试剂可以包括二硝基苯酚(DNP)，且表面可以包括抗DNP抗体。
在实施例中，捕捉试剂和/或检测试剂是蛋白质。在实施例中，捕捉试剂和/或检测试剂是抗原结合物质。在实施例中，捕捉试剂和/或检测试剂是抗体。在实施例中，捕捉试剂和检测试剂是抗原结合物质。在实施例中，捕捉试剂和检测试剂是抗体。
捕捉和检测试剂，例如捕捉和检测抗体的选择和其性能将取决于抗体特征，包含亲和力、纯度、降解、聚集、解离速率和与其它分析物和抗体的非特异性结合。特征为具有低水平的降解和聚集的高亲和力结合抗体可以是优选的。
分析的灵敏度、特异性和形式可受捕捉抗体和检测抗体的选择影响，捕捉抗体和检测抗体各自必须识别分析物上的不同的不重叠抗原决定基。通常，鉴别抗体对的最全面方式为测试捕捉抗体形式和检测抗体形式的抗体的各组合。
对于许多分析，优选地，捕捉抗体和检测抗体均为单克隆抗体，其各自识别独特抗原决定基。单克隆抗体通常更易于在批次之间复制且可大量产生，从而使得分析寿命延长。由于试剂可用性或所期望灵敏度，可能无法选择两种单克隆抗体。在实施例中，当使用单克隆抗体和多克隆抗体两者时，优选使用单克隆抗体作为捕捉抗体且使用多克隆抗体作为检测抗体。
使用多克隆抗体的潜在优势为其可以含有多种识别不同抗原决定基的抗体，从而产生更高亲合力。当多克隆抗体未经亲和纯化时，其含有可能导致非特异性问题或降低分析性能的非特异性抗体。亲和纯化的多克隆抗体比通过蛋白A或G纯化的多克隆抗体具有更大特异性，但其仍可展现批次间变化性，因为各批次可以是抗体的不同混合物。当使用多克隆抗体作为捕捉抗体时，其可以含有共用或阻断检测抗体抗原决定基的一群抗体，从而导致信号或灵敏度降低。
在方法的实施例中，锚定试剂和捕捉试剂各包括能够与靶向试剂补体结合的靶向试剂，结合域包括固定于其上的靶向试剂补体，且方法进一步包括将锚定试剂和捕捉试剂结合于结合域。通过使用靶向试剂和靶向试剂补体将试剂固定至结合域中的方法、这些方法形成阵列的用途、这些阵列于分析中的用途以及例示性靶向试剂和靶向试剂补体描述于美国专利第10,189,023号中。本文描述了将捕捉试剂和锚定试剂直接或间接固定至表面的方法，例如通过使用靶向试剂。在实施例中，靶向试剂和靶向试剂补体是选自以下的结合搭配物对的两个成员：抗生物素蛋白-生物素、抗生蛋白链菌素-生物素、抗体-半抗原、抗体-抗原、抗体-抗原决定基标签、核酸-互补核酸、适体-适体目标和受体-配体。在实施例中，靶向试剂是生物素且靶向试剂补体是抗生蛋白链菌素。
本文提供了用于本发明的适合表面，且包含在结合分析技术中用作固相支撑物的表面。在实施例中，表面是粒子。在实施例中，表面是珠粒。本文提供粒子和珠粒的非限制性实例，且包含以珠粒-阵列分析形式使用的珠粒(诸如以LUMINEX商标出售的这些)和磁珠(诸如用于Roche ELECSYS电化学发光分析中的这些)。在实施例中，表面包括多孔盘的孔。在实施例中，表面包括多个不同结合域。在实施例中，表面包括电极。在实施例中，电极为碳墨电极。在实施例中，表面包括电极且方法的检测步骤包括向电极施加电位和测量电化学发光。在实施例中，向电极施加电位产生电化学发光信号。
多重方法
在实施例中，本发明提供测量多种分析物的方法。在实施例中，方法包括重复本文提供的测量分析物的方法的一个或多个步骤，以测量一种或多种额外分析物，其中各分析物结合于相同表面或不同表面上的不同结合域中的不同捕捉试剂。
在实施例中，用于一种或多种额外分析物中的各分析物的被标记的探针是式I化合物：
其中B是核苷酸碱基，R是电化学发光标记，L1是键联基团，L2是键联基团，j是0与11之间的整数，k是0与1之间的整数，m是0与11之间的整数，且n是0与5之间的整数。
在实施例中，R包括钌络合物RP1P2P3，其中P1、P2和P3中的每一个独立地是联吡啶、被取代的联吡啶、啡啉或被取代的啡啉。在实施例中，化学发光标记R是
在实施例中，B是在尿嘧啶的5位处连接至L1的尿嘧啶。
在实施例中，L1包括
或其组合，其中p为1与12之间的整数。
在实施例中，L2包括
或其组合，其中q是0与11之间的整数。
在实施例中，本发明提供式II的被标记的探针：
其中j是0与11之间的整数，k是0与1之间的整数，m是0与11之间的整数，n是0与5之间的整数，且R是电化学发光标记：
在实施例中，j是0与5之间的整数，k是0，m是0与5之间的整数，且n是2与7之间的整数。在实施例中，k是0，j是0，m是1，且n是5。
在实施例中，用于各分析物的被标记的探针包括相同寡核苷酸。在实施例中，寡核苷酸由5'-CAGTGAATGCGAGTCCGTCT-3'(SEQ ID NO:31)组成。
在实施例中，被标记的探针的寡核苷酸包括与5'-CAGTGAATGCGAGTCCGTCT-3'(SEQID NO:31)具有至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或约100％序列一致性的序列。在实施例中，被标记的探针的寡核苷酸包括与5'-CAGTGAATGCGAGTCCGTCT-3'(SEQ ID NO:31)具有至少85％序列一致性的序列。在实施例中，被标记的探针的寡核苷酸包括与5'-CAGTGAATGCGAGTCCGTCT-3'(SEQ ID NO:31)具有至少88％序列一致性的序列。在实施例中，被标记的探针的寡核苷酸包括与5'-CAGTGAATGCGAGTCCGTCT-3'(SEQ ID NO:31)具有至少90％序列一致性的序列。在实施例中，被标记的探针的寡核苷酸包括与5'-CAGTGAATGCGAGTCCGTCT-3'(SEQ ID NO:31)具有至少95％序列一致性的序列。在实施例中，被标记的探针的寡核苷酸包括与5'-CAGTGAATGCGAGTCCGTCT-3'(SEQ ID NO:31)具有至少98％序列一致性的序列。在实施例中，被标记的探针的寡核苷酸包括与5'-CAGTGAATGCGAGTCCGTCT-3'(SEQ ID NO:31)具有至少99％序列一致性的序列。
在实施例中，被标记的探针的寡核苷酸包括5'-CAGTGAATGCGAGTCCGTCT-3'(SEQID NO:31)。在实施例中，被标记的探针的寡核苷酸包括5'-CAGTGAATGCGAGTCCGTCTAAG-3'(SEQ ID NO:32)。在实施例中，被标记的探针的寡核苷酸包括一种或多种本文所述的修饰。在实施例中，被标记的探针包括氨基修饰剂。在实施例中，被标记的探针包括内部氨基修饰的dT碱基(iAmMC6T)。在实施例中，被标记的探针包括内部间隔子18(iSp18)。在实施例中，被标记的探针包括3'氨基修饰剂(3AmMO)。在实施例中，被标记的探针的寡核苷酸包括5'-CAGTGAATGCGAGTCCGTCTAAG/iAmMC6T/iSp18/iAmMC6T/iSp18/3AmMO/-3'(具有修饰的SEQID NO:44)。
在实施例中，用于一种或多种额外分析物中的各分析物的连接寡核苷酸进一步包括5'末端磷酸基团。在实施例中，用于各分析物的连接寡核苷酸的长度为53至61个核苷酸。在实施例中，用于各分析物的连接寡核苷酸具有相同序列。在实施例中，连接寡核苷酸的长度为约53至约76个核苷酸，且在其5'端包括序列5'-GTTCTGTC-3'且在其3'端包括序列5'-GTGTCTA-3'。寡核苷酸的5'端序列和3'端序列还可以分别称为5'末端序列和3'末端序列。在实施例中，连接寡核苷酸包括5'-CAGTGAATGCGAGTCCGTCTAAG-3'(SEQ ID NO:34)和5'-AAGAGAGTAGTACAGCA-3'(SEQ ID NO:35)。在实施例中，连接寡核苷酸的长度为约40至约100个核苷酸。在实施例中，连接寡核苷酸的长度为约50至约78个核苷酸。在实施例中，连接寡核苷酸的长度为约53至约76个核苷酸。在实施例中，连接寡核苷酸的长度为约50至约70个核苷酸。在实施例中，连接寡核苷酸的长度为约53至约61个核苷酸。在实施例中，连接寡核苷酸的长度为约54至约61个核苷酸。在实施例中，连接寡核苷酸的长度为约61个核苷酸。在实施例中，连接寡核苷酸的长度为约53、约54、约55、约56、约57、约58、约59、约60、约61、约62、约63、约64、约65、约66、约67、约68、约69、约70、约71、约72、约73、约74、约75或约76个核苷酸，且在其5'端包括序列5'-GTTCTGTC-3'且在其3'端包括序列5'-GTGTCTA-3'。在实施例中，连接寡核苷酸进一步包括5'末端磷酸基团。在实施例中，连接寡核苷酸在其5'端包括序列5'-GTTCTGTC-3'且在其3'端包括序列5'-GTGTCTA-3'。在实施例中，连接寡核苷酸包括5'末端磷酸。
在实施例中，连接寡核苷酸由5'-GTTCTGTCATATTTCAGTGAATGCGAGTCCGTCTAAGAGAGTAGTACAGCAAGAGTGTCTA-3'(SEQ ID NO:36)组成。在实施例中，寡核苷酸由5'-GCTGTGCAATATTTCAGTGAATGCGAGTCCGTCTAAGAGAGTAGTACAGCAAGAGCGTCGA-3'(SEQ ID NO:43)组成。在实施例中，连接寡核苷酸进一步包括5'末端磷酸基团。在实施例中，连接寡核苷酸是可连接以形成环状寡核苷酸，例如环状RCA模板的线性寡核苷酸。
在实施例中，用于一种或多种额外分析物中的各分析物的核酸探针的长度为14至19个核苷酸。在实施例中，用于一个或多个额外分析物中的各分析物的核酸探针的长度为14个核苷酸。在实施例中，用于一种或多种额外分析物中的各分析物的核酸探针的长度为15个核苷酸。在实施例中，核酸探针的长度为小于24个核苷酸。在实施例中，核酸探针的长度为小于19个核苷酸。在实施例中，核酸探针的长度为小于15个核苷酸。在实施例中，核酸探针包括长度为约10至约30个核苷酸的寡核苷酸。在实施例中，核酸探针包括长度为约12至约28个核苷酸的寡核苷酸。在实施例中，核酸探针包括长度为约13至约26个核苷酸的寡核苷酸。在实施例中，核酸探针包括长度为约14至约24个核苷酸的寡核苷酸。在实施例中，核酸探针包括长度为约11至约22个核苷酸的寡核苷酸。在实施例中，核酸探针包括长度为约12至约21个核苷酸的寡核苷酸。在实施例中，核酸探针包括长度为约13至约20个核苷酸的寡核苷酸。在实施例中，核酸探针包括长度为约14至约18个核苷酸的寡核苷酸。在实施例中，核酸探针包括长度为约10、约11、约12、约13、约14、约15、约16、约17、约18、约19、约20、约21、约22、约23、约24、约25、约26、约27、约28、约29或约30个核苷酸的寡核苷酸。在实施例中，核酸探针包括含有5'-GACAGAACTAGACAC-3'(SEQ ID NO:33)的14或15个连续核苷酸的寡核苷酸。在实施例中，核酸探针包括寡核苷酸，其中寡核苷酸的长度为14至19个核苷酸且包括5'-GACAGAACTAGACAC-3'(SEQ ID NO:33)的14或15个连续核苷酸。在实施例中，核酸探针包括含有5'-GACAGAACTAGACAC-3'(SEQ ID NO:33)的寡核苷酸。在实施例中，核酸探针包括含有5'-ACAGAACTAGACAC-3'(SEQ ID NO:40)的寡核苷酸。在实施例中，核酸探针包括含有5'-GACAGAACTAGACA-3'(SEQ ID NO:41)的寡核苷酸。在实施例中，核酸探针包括含有5'-TGCACAGCTCGACGC-3'(SEQ ID NO:42)的寡核苷酸。
在实施例中，用于一种或多种额外分析物中的各分析物的结合物具有相同核酸探针序列。在实施例中，核酸探针包括5'-GACAGAACTAGACAC-3'(SEQ ID NO:33)的14或15个连续核苷酸。在实施例中，核酸探针包括含有5'-GACAGAACTAGACAC-3'(SEQ ID NO:33)的寡核苷酸。在实施例中，核酸探针包括含有5'-ACAGAACTAGACAC-3'(SEQ ID NO:40)的寡核苷酸。在实施例中，核酸探针包括含有5'-GACAGAACTAGACA-3'(SEQ ID NO:41)的寡核苷酸。在实施例中，核酸探针包括含有5'-TGCACAGCTCGACGC-3'(SEQ ID NO:42)的寡核苷酸。
在实施例中，提供包括锚定寡核苷酸的锚定试剂，且用于一种或多种额外分析物中的各分析物的锚定寡核苷酸的长度为17至25个核苷酸。在实施例中，锚定试剂包括锚定寡核苷酸，且锚定寡核苷酸的长度为约10至约30个核苷酸。在实施例中，锚定寡核苷酸的长度为约15至约28个核苷酸。在实施例中，锚定寡核苷酸的长度为约17至约25个核苷酸。在实施例中，锚定寡核苷酸的长度为约17、约18、约19、约20、约21、约22、约23、约24或约25个核苷酸。在实施例中，相同锚定寡核苷酸用于一种或多种额外分析物中的各分析物。在实施例中，锚定寡核苷酸包括5'-AAGAGAGTAGTACAGCA-3'(SEQ ID NO:35)。在实施例中，锚定寡核苷酸由5'-AAGAGAGTAGTACAGCAGCCGTCAA-3'(SEQ ID NO:37)组成。
在实施例中，不同检测试剂用于各分析物。在实施例中，相同检测试剂用于各分析物。在实施例中，不同捕捉试剂用于各分析物。在实施例中，捕捉试剂和/或检测试剂包括蛋白质。在实施例中，捕捉试剂和/或检测试剂包括抗体。在实施例中，捕捉试剂和/或检测试剂包括抗原结合物质。在实施例中，捕捉试剂和检测试剂是抗原结合物质。在实施例中，捕捉试剂和检测试剂是抗体。
在实施例中，表面包括多个结合域，且各分析物在多个结合域中的不同结合域中形成复合物。在实施例中，表面是粒子。在实施例中，表面是珠粒。在实施例中，表面是盘。在实施例中，表面是多孔阵列中的孔。在实施例中，表面包括电极。在实施例中，电极为碳墨电极。在实施例中，用于一种或多种额外分析物中的各分析物的各结合域在独立表面上，且表面是珠粒阵列中的珠粒。在实施例中，用于一种或多种额外分析物中的各分析物的各结合域在单一表面上，且结合域在表面上形成捕捉试剂阵列的元件。在实施例中，表面包括电极且方法的检测步骤包括向电极施加电位和测量电化学发光。在实施例中，向电极施加电位产生电化学发光信号。
在实施例中，通过使一个或多个表面与包括多种分析物的单一液体体积接触来并行地进行各分析物与其对应捕捉试剂的结合。在实施例中，多种分析物包含分析物和一种或多种额外分析物。在实施例中，对于各分析物并行地进行方法的各步骤。在实施例中，方法为同时多重分析。表面上分析物的多重测量描述于本文中；另外参见例如美国专利第7,842,246号和第6,977,722号。
在实施例中，各结合域包括能够结合于靶向试剂补体的靶向试剂补体，且各锚定试剂和捕捉试剂包括能够结合于连接试剂的补充连接试剂，且方法进一步包括如下地将捕捉试剂和锚定试剂固定于各结合域中：(1)通过补充连接试剂将捕捉和锚定试剂结合于与连接试剂连接的靶向试剂补体；和(2)将步骤(1)的产物结合于包括靶向试剂补体的结合域，其中(i)各结合域包括不同靶向试剂补体，和(ii)各靶向试剂补体选择性地结合于靶向试剂中的一个。
因此，在实施例中，表面包括靶向试剂补体；靶向试剂连接至连接试剂；且捕捉试剂和锚定试剂中的每一个包括补充连接试剂。因此，在实施例中，表面上的靶向试剂补体结合于靶向试剂，靶向试剂连接至连接试剂，连接试剂结合于捕捉试剂和锚定试剂上的补充连接试剂。
在实施例中，连接试剂具有多于一个用于补充连接试剂的结合位点，且捕捉试剂和锚定试剂的固定进一步包括：通过补充连接试剂将捕捉和锚定试剂结合于与连接试剂连接的靶向试剂；和将产物结合于包括靶向试剂补体的结合域，其中(i)各结合域包括不同靶向试剂补体，和(ii)各靶向试剂补体选择性地结合于靶向试剂中的一个。例如，在靶向剂为寡核苷酸、连接试剂是抗生蛋白链菌素且补充连接试剂是生物素的情况下，生物素标记的寡核苷酸可结合于抗生蛋白链菌素的四个生物素结合位点中的第一个，以形成与连接试剂连接的靶向试剂。生物素标记的捕捉试剂(即，与补充连接试剂连接的捕捉试剂)可随后结合于抗生蛋白链菌素上其余的生物素结合位点，以将靶向剂连接至捕捉试剂。
例示性靶向试剂和靶向试剂补体是本文所述的。在实施例中，靶向试剂和靶向试剂补体是选自以下的结合搭配物对的两个成员：抗生物素蛋白-生物素、抗生蛋白链菌素-生物素、抗体-半抗原、抗体-抗原、抗体-抗原决定基标签、核酸-互补核酸、适体-适体目标和受体-配体。在实施例中，靶向试剂是生物素且靶向试剂补体是抗生蛋白链菌素。在实施例中，连接试剂和补充连接试剂对是与靶向试剂和靶向试剂补体对不同的结合搭配物对。在实施例中，连接试剂是抗生物素蛋白或抗生蛋白链菌素，且补充连接试剂是生物素。在实施例中，靶向试剂和靶向试剂补体是互补寡核苷酸。
可以在分析最佳化期间选择用于本文所述的分析的各种试剂的浓度。在实施例中，用于结合于表面的捕捉试剂的浓度是约0.01μg/mL至约0.5μg/mL；约0.1μg/mL至约0.4μg/mL；约0.2μg/mL至约0.3μg/mL；或约0.25μg/mL。在实施例中，用于结合于表面的捕捉试剂的浓度是小于0.25μg/mL。在实施例中，用于结合于分析物的检测试剂的浓度是约0.01μg/mL至约0.5μg/mL；约0.05μg/mL至约0.3μg/mL；约0.1μg/mL至约0.2μg/mL；或约0.125μg/mL。在实施例中，用于结合于分析物的检测试剂的浓度是约0.125μg/mL。
本文所述的分析方法可以具有在其期间发生结合或其它类型的反应的分析步骤。例如，方法可以包括以下中的一个或多个：(i)将分析物结合于捕捉试剂和包括检测试剂和核酸探针的检测结合物，(ii)延伸核酸探针以形成延伸序列，(iii)将延伸序列结合于锚定寡核苷酸，(iv)将延伸序列结合于被标记检测探针，和(v)测量被标记的探针。在另一实例中，方法可以包括以下中的一个或多个：(i)将分析物结合于捕捉试剂和包括检测试剂和核酸探针的检测结合物，(ii)将连接寡核苷酸结合于核酸探针，(iii)将连接序列连接以形成环状模板，(iv)进行环状模板的滚环扩增以延伸核酸探针和形成延伸序列，(v)将延伸序列结合于锚定寡核苷酸，(vi)将延伸序列结合于被标记检测探针，和(vii)测量被标记的探针。应了解，某些陈述步骤内的不同反应可以依序或同时进行(例如，分析物与捕捉试剂和检测结合物的结合可以同时进行，或可首先进行分析物与捕捉试剂的结合，接着进行与检测结合物的结合，或可首先进行分析物与检测试剂的结合，接着进行与检测结合物的结合)。还应理解，某些步骤还可以同时进行(例如核酸探针的延伸和检测探针的结合可以依序或同时进行)。
还应理解，在一些情况下，可以通过在具有这些类型的反应的一个或多个步骤之后进行“洗涤”步骤以将溶液中的未反应或残余材料去除远离表面且防止其干扰表面处之后续反应或表面测量，来改良包括结合或其它涉及固定于表面上的材料的所进行反应的方法的性能。例如，在涉及分析物或试剂结合于表面的步骤之后，洗涤步骤可以用于从接触表面的溶液去除未结合的分析物或试剂。在另一实例中，在涉及表面结合物质的连接、延伸或扩增的步骤之后，洗涤步骤可以用于从接触表面的溶液去除过量未结合的反应物或酶。可例如使用手动洗涤方法，或使用自动洗盘机(例如BIOTEK 405LS Microplate Washers)进行洗涤步骤。当使用自动洗盘机进行本文所述的分析时，在实施例中，可以通过使用低分配流动速率和通过将分配尖端定位于孔的外边缘(例如朝向孔的一侧偏移的水平分配)来获得最优选结果。可以在本文提供的分析的检测步骤之后使用低流动速率分配洗涤，且所有其它洗涤步骤可以使用预设洗涤程式。或者，可以良好再现性进行手动洗涤，其限制条件为洗涤缓冲液经完全去除。还应理解，包括结合或其它反应的步骤可能需要一定量的时间以进展至所期望程度(培育时间)，且其可以在所选温度下进行以提供最有效或最佳性能。在实施例中，使分析物与表面上的捕捉试剂结合的培育时间是约1分钟至24小时、约5分钟至4小时、约9分钟至2小时、约9分钟、约15分钟、约30分钟、约1小时或约2小时。在实施例中，此步骤的培育温度是约10℃至50℃、15℃至40℃、约室温、约25℃、约27℃、约30℃或约37℃。
在实施例中，使检测结合物与分析物结合(其可以与使分析物与捕捉试剂结合同时或依序进行)的时间是约1分钟至24小时、约5分钟至4小时、约9分钟至2小时、约9分钟、约1小时或约2小时。在实施例中，此步骤的培育温度是约10℃至50℃、15℃至40℃、约室温、约25℃、约27℃、约30℃或约37℃。
在实施例中，使连接寡核苷酸与检测结合物中的核酸探针结合和将连接寡核苷酸连接以形成环状模板寡核苷酸(其可以同时或依序进行)的时间是约1分钟至24小时、约5分钟至4小时、约9分钟至2小时、约9分钟、约15分钟、约30分钟、约1小时或约2小时。在实施例中，此步骤的培育温度是约10℃至50℃、15℃至40℃、约室温、约25℃、约27℃、约30℃或约37℃。
在实施例中，延伸核酸探针(例如通过滚环扩增)的时间是约1分钟至24小时、约5分钟至4小时、约9分钟至2小时、约9分钟、约15分钟、约30分钟、约1小时或约2小时。在实施例中，此步骤的培育温度是约10℃至50℃、15℃至40℃、约室温、约25℃、约27℃、约30℃或约37℃。
在实施例中，(i)依序进行将分析物结合于表面和将检测结合物结合于分析物，各自在室温(约18至27℃)下持续1至2小时，各自接着进行洗涤步骤，(ii)在室温下持续约30分钟同时进行连接寡核苷酸的结合和连接，接着进行洗涤步骤，和/或(iii)在约27℃的设定温度下经约1小时同时进行滚环扩增、检测探针结合和(如果存在锚定寡核苷酸)与锚定寡核苷酸结合，接着进行洗涤步骤。
在一个实施例中，表面是磁珠(例如抗生蛋白链菌素涂布的磁珠)且分析步骤包含：(i)将生物素标记的捕捉试剂和检测结合物(包括核酸探针)结合于分析物以形成包括捕捉试剂、分析物和检测结合物的复合物；(ii)在抗生蛋白链菌素涂布的磁珠上捕捉复合物，(iii)将核酸探针结合于连接寡核苷酸和将连接寡核苷酸连接以形成环状寡核苷酸模板，(iv)通过滚环扩增延伸核酸探针和将检测探针结合于扩增产物，和(v)将珠粒引入至流量槽中且通过施加磁场捕捉电极上的珠粒、向电极施加电位和进行电化学发光测量以测量珠粒上的检测探针的量。珠粒可以提供有预结合的锚定寡核苷酸、生物素标记的锚定寡核苷酸可以在步骤(ii)期间添加或锚定寡核苷酸可以在独立步骤中结合于珠粒；在这些情况下，方法还将包含将延伸探针结合于锚定寡核苷酸。在实施例中，各持续设定培育时间进行各个步骤(如果在同时操作中进行两个或更多个步骤，那么此同时操作在时间是预设的培育时间)。在实施例中，持续相同培育时间进行各步骤或操作。在实施例中，此培育时间是每个步骤或操作约9分钟。在实施例中，持续约9分钟的数倍的培育时间进行各步骤或操作。在实施例中，在步骤(ii)、步骤(iii)和/或步骤(iv)之后洗涤磁珠(例如通过使用磁体在管中收集磁珠且从管中去除液体)。还可以在于流量槽中收集珠粒的操作期间洗涤珠粒。
在实施例中，检测步骤包括使延伸序列与本文提供的被标记的探针接触。在实施例中，将延伸序列和被标记的探针培育约1分钟至24小时、约5分钟至4小时、约9分钟至2小时、约30分钟至90分钟、约9分钟、约30分钟、约1小时、约90分钟或约2小时。在实施例中，此步骤的培育温度是约10℃至50℃、15℃至40℃、约室温、约23℃、约25℃、约27℃、约30℃或约37℃。在实施例中，检测步骤包括使延伸序列与被标记的探针在约27℃下接触约60分钟。检测步骤可被修改以使分析灵敏度和信号:背景比最佳化。两个参数可能对这些因素的影响最大：(1)温度和(2)检测步骤的培育时间。一般来说，信号和背景均随着温度和培育时间的增加而增加。如果期望更短的培育时间，那么可能最优选的是提高温度或改变其它分析参数中的一个以增加信号。或者，如果分析背景极低和/或需要更多信号，那么可增加检测步骤培育时间和/或温度以增加信号且潜在地增加灵敏度。在背景信号过高的情况下，较低温度可以与较短培育时间组合。此可使得具体信号与背景一起减少，但可产生增加的信号:背景比。在实施例中，一旦确定了优选培育时间和温度，就不应在分析执行之间改变时间和温度，以提高分析一致性。例如，可以使用恒温振荡器或其它可控温度振荡器来获得培育温度和时间的一致性。
用于双抗体分析的试剂盒
在实施例中，本发明提供一种用于进行分析的试剂盒，其包括：(a)根据本发明的被标记的探针；(b)连接寡核苷酸，其包括5'末端核苷酸序列和3'末端核苷酸序列，其中5'和3'末端核苷酸序列能够与核酸探针杂交，和内部核苷酸序列，所述内部核苷酸序列能够与被标记的探针的检测寡核苷酸的补体杂交；(c)核酸连接酶；和(d)核酸聚合酶。
在实施例中，本发明提供一种用于进行分析的试剂盒，其包括：(a)包括锚定寡核苷酸的锚定试剂；(b)根据本发明的被标记的探针；(c)连接寡核苷酸，其包括5'末端核苷酸序列和3'末端核苷酸序列，其中5'和3'末端核苷酸序列能够与核酸探针杂交；能够与锚定寡核苷酸的补体杂交的第一内部核苷酸序列；和能够与被标记的探针的检测寡核苷酸的补体杂交的第二内部核苷酸序列；(d)核酸连接酶；和(e)核酸聚合酶。
在实施例中，本发明提供一种用于进行分析的试剂盒，其包括：(a)被标记的探针；(b)连接寡核苷酸，其包括5'末端核苷酸序列、3'末端核苷酸序列，其中5'和3'末端核苷酸序列能够与核酸探针杂交，和内部核苷酸序列，所述内部核苷酸序列能够与被标记的探针的检测寡核苷酸的补体杂交；(d)核酸连接酶；和(e)核酸聚合酶；其中5'和3'末端核苷酸序列不与内部序列重叠，5'和3'末端序列的长度总和为14至24个核苷酸的长度，且连接寡核苷酸的长度为53至76个核苷酸。
在实施例中，本发明提供一种用于进行分析的试剂盒，其包括：(a)包括锚定寡核苷酸的锚定试剂；(b)被标记的探针；(c)连接寡核苷酸，其包括5'末端核苷酸序列、3'末端核苷酸序列，其中5'和3'末端核苷酸序列能够与核酸探针杂交；能够与锚定寡核苷酸的补体杂交的第一内部核苷酸序列；和能够与被标记的探针的检测寡核苷酸的补体杂交的第二内部核苷酸序列；(d)核酸连接酶；和(e)核酸聚合酶；其中5'和3'末端核苷酸序列不与第一和第二内部序列重叠，5'和3'末端序列的长度总和为14至24个核苷酸的长度，且连接寡核苷酸的长度为53至76个核苷酸。
在实施例中，核酸探针包括长度为约10至约30个核苷酸的寡核苷酸。在实施例中，核酸探针包括长度为约12至约28个核苷酸的寡核苷酸。在实施例中，核酸探针包括长度为约14至约26个核苷酸的寡核苷酸。在实施例中，核酸探针包括长度为约14至约24个核苷酸的寡核苷酸。在实施例中，核酸探针包括长度为约11至约22个核苷酸的寡核苷酸。在实施例中，核酸探针包括长度为约12至约21个核苷酸的寡核苷酸。在实施例中，核酸探针包括长度为约13至约20个核苷酸的寡核苷酸。在实施例中，核酸探针包括长度为约14至约18个核苷酸的寡核苷酸。
在实施例中，核酸探针包括长度为约10、约11、约12、约13、约14、约15、约16、约17、约18、约19、约20、约21、约22、约23、约24、约25、约26、约27、约28、约29或约30个核苷酸的寡核苷酸。在实施例中，核酸探针包括长度为约14个核苷酸的寡核苷酸。在实施例中，核酸探针包括长度为约15个核苷酸的寡核苷酸。在实施例中，核酸探针包括含有5'-GACAGAACTAGACAC-3'(SEQ ID NO:33)的寡核苷酸。在实施例中，核酸探针包括寡核苷酸，其中寡核苷酸的长度为14至24个核苷酸且包括5'-GACAGAACTAGACAC-3'(SEQ ID NO:33)的14或15个连续核苷酸。在实施例中，核酸探针包括含有5'-GACAGAACTAGACAC-3'(SEQ ID NO:33)的寡核苷酸。在实施例中，核酸探针包括含有5'-ACAGAACTAGACAC-3'(SEQ ID NO:40)的寡核苷酸。在实施例中，核酸探针包括含有5'-GACAGAACTAGACA-3'(SEQ ID NO:41)的寡核苷酸。在实施例中，核酸探针包括含有5'-TGCACAGCTCGACGC-3'(SEQ ID NO:42)的寡核苷酸。
在实施例中，被标记的探针包括寡核苷酸(其可称为检测寡核苷酸)和电化学发光部分。在实施例中，被标记的探针包括一个或多个电化学发光标记。在实施例中，被标记的探针包括寡核苷酸和多个电化学发光标记。被标记的探针可以包含(i)与寡核苷酸的被修饰的核苷酸碱基连接的一个或多个(或两个或更多个)标记，(ii)具有一个或多个(或两个或更多个)标记的被标记部分，所述部分与寡核苷酸的5'端连接，(iii)具有一个或多个(或两个或更多个)标记的被标记部分，所述部分与寡核苷酸的3'端连接，或(iv)(i)、(ii)和(iii)中的两个或更多个的组合。
在实施例中，被标记的探针具有式I：
其中B是核苷酸碱基，R是电化学发光标记，L1是键联基团，L2是键联基团，j是0与11之间的整数，k是0与1之间的整数，m是0与11之间的整数，且n是0与5之间的整数。
在实施例中，R包括钌络合物RP1P2P3，其中P1、P2和P3中的每一个独立地是联吡啶、被取代的联吡啶、啡啉或被取代的啡啉。在实施例中，化学发光标记R是
在实施例中，B是在尿嘧啶的5位处连接至L1的尿嘧啶。
在实施例中，L1包括
或其组合，其中p为1与12之间的整数。
在实施例中，L2包括
或其组合，其中q是0与11之间的整数。
在实施例中，本发明提供式II的被标记的探针：
其中j是0与11之间的整数，k是0与1之间的整数，m是0与11之间的整数，n是0与5之间的整数，且R是电化学发光标记：
在实施例中，j是0与5之间的整数，k是0，m是0与5之间的整数，且n是2与7之间的整数。在实施例中，k是0，j是0，m是1，且n是5。
在实施例中，被标记的探针的寡核苷酸包括与5'-CAGTGAATGCGAGTCCGTCT-3'(SEQID NO:31)具有至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或约100％序列一致性的序列。在实施例中，被标记的探针的寡核苷酸包括与5'-CAGTGAATGCGAGTCCGTCT-3'(SEQ ID NO:31)具有至少85％序列一致性的序列。在实施例中，被标记的探针的寡核苷酸包括与5'-CAGTGAATGCGAGTCCGTCT-3'(SEQ ID NO:31)具有至少88％序列一致性的序列。在实施例中，被标记的探针的寡核苷酸包括与5'-CAGTGAATGCGAGTCCGTCT-3'(SEQ ID NO:31)具有至少90％序列一致性的序列。在实施例中，被标记的探针的寡核苷酸包括与5'-CAGTGAATGCGAGTCCGTCT-3'(SEQ ID NO:31)具有至少95％序列一致性的序列。在实施例中，被标记的探针的寡核苷酸包括与5'-CAGTGAATGCGAGTCCGTCT-3'(SEQ ID NO:31)具有至少98％序列一致性的序列。在实施例中，被标记的探针的寡核苷酸包括与5'-CAGTGAATGCGAGTCCGTCT-3'(SEQ ID NO:31)具有至少99％序列一致性的序列。
在实施例中，被标记的探针的寡核苷酸包括5'-CAGTGAATGCGAGTCCGTCT-3'(SEQID NO:31)。在实施例中，被标记的探针的寡核苷酸包括5'-CAGTGAATGCGAGTCCGTCTAAG-3'(SEQ ID NO:32)。在实施例中，被标记的探针的寡核苷酸包括一种或多种本文所述的修饰。在实施例中，被标记的探针包括氨基修饰剂。在实施例中，被标记的探针包括内部氨基修饰的dT碱基(iAmMC6T)。在实施例中，被标记的探针包括内部间隔子18(iSp18)。在实施例中，被标记的探针包括3'氨基修饰剂(3AmMO)。在实施例中，被标记的探针的寡核苷酸包括5'-CAGTGAATGCGAGTCCGTCTAAG/iAmMC6T/iSp18/iAmMC6T/iSp18/3AmMO/-3'(具有修饰的SEQID NO:44)。
在实施例中，核酸探针包括第一和第二核酸探针序列，其彼此相邻且各自与连接寡核苷酸的一部分互补。在实施例中，连接寡核苷酸是线性寡核苷酸。在实施例中，连接寡核苷酸是用于扩增的模板寡核苷酸。在实施例中，连接寡核苷酸被连接以形成用于RCA的环状模板寡核苷酸。在实施例中，连接寡核苷酸的5'末端序列与第一或第二核酸序列中的一个互补，且连接寡核苷酸的3'末端序列与第一或第二核酸探针序列中的另一个互补。通过选择连接寡核苷酸的适当5'和3'末端序列以及适当互补第一和第二探针序列，连接子与核酸探针的结合将连接子的钝端置于附近(即，连接子上的两个末端核苷酸是与核酸探针上的相邻核苷酸结合的氢)，以使得能够在连接酶存在下连接以形成环状寡核苷酸模板。
在实施例中，连接寡核苷酸具有第一内部序列，且连接寡核苷酸的第一内部序列能够与锚定试剂的锚定寡核苷酸的补体杂交。在实施例中，连接寡核苷酸的第一内部序列与锚定寡核苷酸具有70％、至少70％、75％、至少75％、80％、至少80％、85％、至少85％、90％、至少90％、95％、至少95％、97％、至少97％、98％、至少98％、99％或至少99％或100％序列一致性。在实施例中，从连接寡核苷酸扩增的延伸序列包括与锚定寡核苷酸互补的序列。
在实施例中，连接寡核苷酸的内部序列(或如果存在第一内部序列，那么为连接寡核苷酸的第二内部序列)能够与被标记的探针的寡核苷酸的补体杂交。在实施例中，连接寡核苷酸的内部序列(或第二内部序列)与被标记的探针的寡核苷酸具有70％、至少70％、75％、至少75％、80％、至少80％、85％、至少85％、90％、至少90％、95％、至少95％、97％、至少97％、98％、至少98％、99％或至少99％或100％序列一致性。在实施例中，从连接寡核苷酸扩增的延伸序列包括与被标记的探针的检测寡核苷酸互补的序列。
在实施例中，连接寡核苷酸的长度为约53至约76个核苷酸，且在其5'端包括序列5'-GTTCTGTC-3'且在其3'端包括序列5'-GTGTCTA-3'。寡核苷酸的5'端序列和3'端序列还可以分别称为5'末端序列和3'末端序列。在实施例中，连接寡核苷酸包括5'-CAGTGAATGCGAGTCCGTCTAAG-3'(SEQ ID NO:34)和5'-AAGAGAGTAGTACAGCA-3'(SEQ ID NO:35)。在实施例中，连接寡核苷酸的长度为约40至约100个核苷酸。在实施例中，连接寡核苷酸的长度为约50至约78个核苷酸。在实施例中，连接寡核苷酸的长度为约53至约76个核苷酸。在实施例中，连接寡核苷酸的长度为约50至约70个核苷酸。在实施例中，连接寡核苷酸的长度为约53至约61个核苷酸。在实施例中，连接寡核苷酸的长度为约54至约61个核苷酸。在实施例中，连接寡核苷酸的长度为约61个核苷酸。在实施例中，连接寡核苷酸的长度为约53、约54、约55、约56、约57、约58、约59、约60、约61、约62、约63、约64、约65、约66、约67、约68、约69、约70、约71、约72、约73、约74、约75或约76个核苷酸，且在其5'端包括序列5'-GTTCTGTC-3'且在其3'端包括序列5'-GTGTCTA-3'。在实施例中，连接寡核苷酸进一步包括5'末端磷酸基团。在实施例中，连接寡核苷酸在其5'端包括序列5'-GTTCTGTC-3'且在其3'端包括序列5'-GTGTCTA-3'。在实施例中，连接寡核苷酸包括5'末端磷酸。
在实施例中，连接寡核苷酸由5'-GTTCTGTCATATTTCAGTGAATGCGAGTCCGTCTAAGAGAGTAGTACAGCAAGAGTGTCTA-3'(SEQ ID NO:36)组成。在实施例中，寡核苷酸由5'-GCTGTGCAATATTTCAGTGAATGCGAGTCCGTCTAAGAGAGTAGTACAGCAAGAGCGTCGA-3'(SEQ ID NO:43)组成。在实施例中，连接寡核苷酸进一步包括5'末端磷酸基团。在实施例中，连接寡核苷酸是可连接以形成环状寡核苷酸，例如环状RCA模板的线性寡核苷酸。
在实施例中，5'和3'末端序列的长度总和为10至30个核苷酸的长度。在实施例中，5'和3'末端序列的长度总和为12至25个核苷酸的长度。在实施例中，5'和3'末端序列的长度总和为14至19个核苷酸的长度。在实施例中，5'和3'末端序列的长度总和为约10、约11、约12、约13、约14、约15、约16、约17、约18、约19、约20、约21、约22、约23、约24、约25、约26、约27、约28、约29或约30个核苷酸。在实施例中，5'和3'末端序列的长度总和为约14个核苷酸。在实施例中，5'和3'末端序列的长度总和为约15个核苷酸。在实施例中，5'和3'末端序列的长度总和为小于19个核苷酸。在实施例中，5'和3'末端序列的长度总和为小于15个核苷酸。
在实施例中，包含锚定试剂且锚定试剂包括锚定寡核苷酸，且锚定寡核苷酸的长度为约10至约30个核苷酸。在实施例中，锚定寡核苷酸的长度为约15至约28个核苷酸。在实施例中，锚定寡核苷酸的长度为约17至约25个核苷酸。在实施例中，锚定寡核苷酸的长度为约17、约18、约19、约20、约21、约22、约23、约24或约25个核苷酸。在实施例中，锚定寡核苷酸包括5'-AAGAGAGTAGTACAGCA-3'(SEQ ID NO:35)。在实施例中，锚定寡核苷酸由5'-AAGAGAGTAGTACAGCAGCCGTCAA-3'(SEQ ID NO:37)组成。在实施例中，锚定试剂是
在实施例中，试剂盒进一步包括核酸探针，其包括与连接寡核苷酸的5'末端序列互补的第一序列和与连接寡核苷酸的3'末端序列互补的相邻第二序列。
在实施例中，试剂盒进一步包括用于分析物的捕捉试剂，和用于分析物的检测试剂，其中捕捉试剂和检测试剂能够结合于分析物以形成复合物，且检测试剂连接至核酸探针，所述核酸探针包括与连接寡核苷酸的5'末端序列互补的第一序列和与连接寡核苷酸的3'末端序列互补的相邻第二序列。
在实施例中，试剂盒进一步包括用于多种分析物的多种捕捉试剂，和用于多种分析物的一种或多种检测试剂，其中对于各分析物，试剂盒包括能够与分析物结合以形成复合物的捕捉试剂和检测试剂，且一种或多种检测试剂各自连接至核酸探针，所述核酸探针包括与连接寡核苷酸的5'末端序列互补的第一序列和与连接寡核苷酸的3'末端序列互补的相邻第二序列。
在实施例中，核酸探针包括序列5'-GACAGAACTAGACAC-3'(SEQ ID NO:33)的14或15个连续核苷酸。在实施例中，核酸探针包括序列5'-GACAGAACTAGACAC-3'(SEQ ID NO:33)。在实施例中，核酸探针包括序列5'-ACAGAACTAGACAC-3'(SEQ ID NO:40)。在实施例中，核酸探针包括序列5'-GACAGAACTAGACA-3'(SEQ ID NO:41)。在实施例中，核酸探针包括含有5'-TGCACAGCTCGACGC-3'(SEQ ID NO:42)的寡核苷酸。在实施例中，核酸探针包括含有反应性官能团的非天然存在的5'修饰。官能团的非限制性实例包含例如烯烃和张力烯烃、炔烃、卤化物、醇、硫醇、胺、磷酸盐、醛、酮、羧酸、羧酸盐、酰胺、酯、硫酯、酰基磷酸盐、酸卤化物、腈、酸酐、肼、四嗪、叠氮化物等。在实施例中，反应性官能团是硫醇、胺、羧酸、活性酯、肼、醛、酮、炔烃、张力烯烃、叠氮化物或四嗪。在实施例中，反应性官能团是硫醇。在实施例中，反应性官能团是四嗪。在实施例中，反应性官能团是乙烯基或张力烯烃。在实施例中，反应性官能团是叠氮化物。在实施例中，反应性官能团是炔烃或张力炔烃。在实施例中，反应性官能团是4-甲酰基苯甲酰胺。在实施例中，反应性官能团是肼基烟碱酰胺。
在实施例中，非天然存在的5'修饰能够与本发明的异双官能交联剂反应。在实施例中，非天然存在的5'修饰能够与顺丁烯二酰亚胺、碘乙酰胺或活化二硫化物反应。在实施例中，非天然存在的5'修饰能够与四嗪反应。在实施例中，非天然存在的5'修饰能够与乙烯基或张力烯烃反应。在实施例中，非天然存在的5'修饰能够与叠氮化物反应。在实施例中，非天然存在的5'修饰能够与炔烃或张力炔烃反应。在实施例中，非天然存在的5'修饰能够与肼基烟碱酰胺反应。在实施例中，非天然存在的5'修饰能够与4-甲酰基苯甲酰胺反应。
在实施例中，非天然存在的核酸探针具有式IIIA：
且包括反应性官能团，且反应性官能团是硫醇、胺、羧酸、活性酯、肼、醛、酮、炔烃、张力烯烃、叠氮化物或四嗪。
在实施例中，核酸探针进一步包括含有半抗原或生物素的非天然存在的5'修饰。在实施例中，半抗原包括荧光素、二硝基苯基或地高辛。在实施例中，修饰包括生物素。
在实施例中，核酸探针具有式IV：
在实施例中，核酸探针包括与模板核酸序列的互补区。在实施例中，模板核酸序列是环状核酸模板，或可连接以形成环状核酸模板的线性核酸模板。在实施例中，环状核酸模板是用于滚环扩增(RCA)的模板。在实施例中，核酸探针是用于RCA反应的引物，即延伸环状核酸模板以形成延伸序列。
在实施例中，核酸探针结合于检测试剂。在实施例中，检测试剂是蛋白质且结合物为式VI化合物：
其中R是0与24之间的整数，x是1与20之间的整数，且-NH-是源自蛋白质的氨基。在实施例中，R是1至20。在实施例中，R是2至15。在实施例中，R是3至10。在实施例中，R是4。在实施例中，R是1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23或24。在实施例中，x是1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20。在实施例中，x是1。在实施例中，x是2。
在实施例中，捕捉试剂和/或检测试剂是蛋白质。在实施例中，捕捉试剂和/或检测试剂是抗原结合物质。在实施例中，捕捉试剂和检测试剂是蛋白质。在实施例中，捕捉试剂和检测试剂是抗体。
在实施例中，锚定试剂进一步包括能够结合于靶向试剂补体的靶向试剂。在实施例中，锚定试剂和捕捉试剂各自包括能够结合于靶向试剂补体的靶向试剂。在实施例中，试剂盒进一步包括在其上固定有靶向试剂补体的固相支撑物。靶向试剂和靶向试剂补体是本文所述的。在实施例中，靶向试剂和靶向试剂补体是选自以下的结合搭配物对的两个成员：抗生物素蛋白-生物素、抗生蛋白链菌素-生物素、抗体-半抗原、抗体-抗原、抗体-抗原决定基标签、核酸-互补核酸、适体-适体目标和受体-配体。在实施例中，靶向试剂是抗生物素蛋白或抗生蛋白链菌素，且靶向试剂补体是生物素。在实施例中，靶向试剂补体是抗生物素蛋白或抗生蛋白链菌素，且靶向试剂是生物素。
在实施例中，固相支撑物包括表面。本文提供了用于本发明的适合的表面和固相支撑物，且包含在结合分析技术中用作固相支撑物的表面。在实施例中，固相支撑物是电极。在实施例中，固相支撑物是碳基电极。在实施例中，试剂盒包括多孔盘分析消耗品，且盘的各孔包括碳墨电极。在实施例中，固相支撑物是粒子。在实施例中，固相支撑物是珠粒。
在实施例中，锚定试剂包括锚定寡核苷酸，且锚定寡核苷酸的长度为约10至约30个核苷酸。在实施例中，锚定寡核苷酸的长度为约15至约28个核苷酸。在实施例中，锚定寡核苷酸的长度为约17至约25个核苷酸。在实施例中，锚定寡核苷酸的长度为约17、约18、约19、约20、约21、约22、约23、约24或约25个核苷酸。在实施例中，锚定寡核苷酸包括5'-AAGAGAGTAGTACAGCA-3'(SEQ ID NO:35)。在实施例中，锚定寡核苷酸由5'-AAGAGAGTAGTACAGCAGCCGTCAA-3'(SEQ ID NO:37)组成。在实施例中，锚定试剂是
在实施例中，试剂盒进一步包括固相支撑物，且锚定试剂固定于固相支撑物上。在实施例中，试剂盒进一步包括固相支撑物，且锚定试剂和捕捉试剂固定于固相支撑物上。本文描述了将锚定试剂和捕捉试剂固定于诸如固相支撑物的表面上的方法。
在实施例中，固相支撑物包括表面。在实施例中，固相支撑物是电极。在实施例中，固相支撑物是碳基电极。在实施例中，试剂盒包括多孔盘分析消耗品，且盘的各孔包括碳墨电极。在实施例中，固相支撑物是粒子。在实施例中，固相支撑物是珠粒。
在包括多种捕捉试剂的试剂盒的实施例中，试剂盒进一步包括固相支撑物，且锚定试剂和捕捉试剂固定于固相支撑物上以形成阵列，其中各阵列元件包括多种捕捉试剂和锚定试剂中的一个。在实施例中，固相支撑物包括表面。在实施例中，固相支撑物是电极。在实施例中，固相支撑物是碳基电极。在实施例中，试剂盒包括多孔盘分析消耗品，且盘的各孔包括碳墨电极。在实施例中，固相支撑物是粒子。在实施例中，固相支撑物是珠粒。
在包括多种捕捉试剂的试剂盒的实施例中，试剂盒进一步包括一个或多个固相支撑物，且锚定试剂和捕捉试剂固定于一个或多个固相支撑物上以形成阵列，其中各阵列元件包括多种捕捉试剂和锚定试剂中的一个。在实施例中，试剂盒包括多个固相支撑物，且各固相支撑物具有至少一个阵列元件。在实施例中，试剂盒包括多个固相支撑物，且各固相支撑物仅具有一个阵列元件。在实施例中，固相支撑物包括表面。在实施例中，固相支撑物是电极。在实施例中，固相支撑物是碳基电极。在实施例中，试剂盒包括多孔盘分析消耗品，且盘的各孔包括电极中的一个。在实施例中，固相支撑物是粒子。在实施例中，固相支撑物是珠粒阵列中的珠粒。
在包括多种捕捉试剂的试剂盒的实施例中，试剂盒进一步包括具有固定于一个或多个固相支撑物上的多种不同靶向试剂补体的阵列，各阵列元件包括不同靶向试剂补体，且不同靶向试剂补体中的每一个是不同靶向试剂的结合搭配物。在实施例中，捕捉试剂连接至不同靶向试剂中的一个，且捕捉试剂中的每一个连接至不同靶向试剂。此外，将锚定试剂分为多个各自具有至少一个锚定试剂拷贝的部分，且各部分中的锚定试剂连接至不同靶向试剂。因此，在实施例中，固相支撑物包括靶向试剂补体，且捕捉试剂和锚定试剂中的每一个包括靶向试剂。在实施例中，各捕捉试剂和锚定试剂部分可分开提供，连接至相同靶向试剂的所有试剂/部分以混合物形式且与其它试剂分开提供，所有捕捉试剂以混合物形式提供且所有锚定试剂部分以混合物形式提供，或所有捕捉试剂和锚定试剂部分以一种混合物形式提供。
在实施例中，捕捉试剂包括补充连接试剂；锚定试剂包括补充连接试剂；靶向试剂连接至连接试剂；且连接试剂是补充连接试剂的结合搭配物。因此，在实施例中，固相支撑物包括靶向试剂补体，靶向试剂补体结合于与连接试剂连接的靶向试剂，连接试剂结合于捕捉试剂和锚定试剂上的补充连接试剂。
例示性靶向试剂和靶向试剂补体是本文所述的。在实施例中，靶向试剂和靶向试剂补体是选自以下的结合搭配物对的两个成员：抗生物素蛋白-生物素、抗生蛋白链菌素-生物素、抗体-半抗原、抗体-抗原、抗体-抗原决定基标签、核酸-互补核酸、适体-适体目标和受体-配体。在实施例中，靶向试剂是生物素且靶向试剂补体是抗生蛋白链菌素。在实施例中，连接试剂和补充连接试剂对是与靶向试剂和靶向试剂补体对不同的结合搭配物对。在实施例中，连接试剂是抗生物素蛋白或抗生蛋白链菌素，且补充连接试剂是生物素。在实施例中，靶向试剂和靶向试剂补体是互补寡核苷酸。
在实施例中，阵列在一个固相支撑物上，且固相支撑物是电极。在实施例中，固相支撑物是碳基电极。在实施例中，试剂盒包括多孔盘分析消耗品，且盘的各孔包括碳墨电极。在一些实施例中，固相支撑物是粒子。在实施例中，阵列的各元件在不同固相支撑物上，且固相支撑物是珠粒。在实施例中，连接试剂和补充连接试剂是选自以下的结合搭配物对的两个成员：抗生物素蛋白-生物素、抗生蛋白链菌素-生物素、抗体-半抗原、抗体-抗原、抗体-抗原决定基标签、核酸-互补核酸、适体-适体目标和受体-配体。在实施例中，连接试剂是生物素且补充连接试剂是抗生蛋白链菌素。在实施例中，连接试剂是抗生物素蛋白或抗生蛋白链菌素，且补充连接试剂是生物素。
在实施例中，本发明的试剂盒进一步包括以下中的一种或多种：阻断试剂、结合分析反应缓冲液、连接酶反应缓冲液、聚合酶反应缓冲液、ECL读取缓冲液和/或独特产品标识符。阻断试剂可以用于降低分析背景信号、防止非特异性结合和/或稳定检测复合物以改良检测。在实施例中，结合分析反应缓冲液、连接酶反应和/或聚合酶反应缓冲液中的每一个是Tris缓冲液、磷酸盐缓冲液、MOPS缓冲液、PIPES缓冲液或HEPES缓冲液。在实施例中，结合分析反应缓冲液、连接酶反应缓冲液和聚合酶反应缓冲液为相同缓冲液。在实施例中，结合分析反应缓冲液、连接酶反应和/或聚合酶反应缓冲液的盐浓度是约10mM至约1M、约20mM至约500mM、约30mM至约100mM、约40mM至约80mM或约50mM。在实施例中，结合分析反应缓冲液、连接酶反应和/或聚合酶反应缓冲液包括NaCl、KCl、(NH4)2SO4、Na2SO4或CH3COONH4。在实施例中，聚合酶反应缓冲液的盐浓度是约50mM。在实施例中，聚合酶反应缓冲液包括KCl。在实施例中，聚合酶反应缓冲液包括浓度是约50mM的KCl。在实施例中，ECL读取缓冲液包括三丙胺。在实施例中，ECL读取缓冲液包括丁基二乙醇胺。在实施例中，独特产品标识符为“条形码”寡核苷酸序列，例如允许鉴别对应核苷酸或分子的短核苷酸(通常长度为约5至约40个核苷酸)。
额外实施例
在实施例中，本文提供的检测和测量分析物的方法可呈竞争性分析形式。一般来说，竞争性分析，例如竞争性免疫分析或竞争性抑制分析，分析物和竞争物竞争结合于结合试剂。在这类分析中，通常通过直接测量竞争物来间接测量分析物。如本文所用，“竞争物”是指如下化合物：能够与分析物结合于相同结合试剂，使得结合试剂，例如抗原结合物质或抗体可仅结合分析物或竞争物，但不结合二者。在实施例中，竞争性分析用于检测和测量不能结合超过一种结合试剂的分析物，例如小分子分析物或不具有超过一个不同结合位点的分析物。举例来说，如果结合试剂是抗体，那么一种抗体与小分析物的结合产生阻止第二抗体结合的位阻。本文描述了适合于竞争性分析的分析物的实例。竞争性免疫分析的其它实例包含美国专利第4,235,601号；第4,442,204号；和第5,028,535号中所述的这些。
在竞争性分析的上下文中，“捕捉试剂”和“检测试剂”可指结合试剂，例如抗原结合物质或抗体；或者，“捕捉试剂”和“检测试剂”可以是分析物的竞争物。在竞争性分析的实施例中，捕捉试剂或检测试剂中的一个如本文所定义，且捕捉试剂或检测试剂中的另一个为分析物的竞争物，例如被修饰小分子，诸如激素。在实施例中，竞争物包括本发明的核酸探针。在实施例中，竞争物具有与分析物相同的结构且包括标记或探针，例如可检测标记或核酸探针。在实施例中，竞争物具有与分析物类似的结构且包括标记或探针，例如可检测标记或核酸探针。在实施例中，竞争物的组成可以与分析物极不同，只要其能够与分析物竞争分析中所用的结合试剂(例如被选择成结合于结合试剂中的分析物识别位点或袋的核酸或肽适体)。这类适体可以使用所属领域中确立的用于筛选肽或核酸的方法选择，例如通过关于具有所期望结合活性的适体筛选肽或核酸的随机文库。
在实施例中，分析物是(或分析物和竞争物各自是)激素。在实施例中，分析物是(或分析物和竞争物各自是)半抗原。在实施例中，分析物是(或分析物和竞争物各自是)代谢物。在实施例中，分析物是(或分析物和竞争物各自是)内分泌激素(诸如雌激素或睾固酮)、抗苗勒管激素(anti-Müllerian hormone)、生长激素(例如人类生长激素或重组人类生长激素)或破坏环境内分泌的化学物质，诸如Tian等人,《农业化学和生物技术(Chemicaland Biological Technologies in Agriculture)》5:5(2018)中公开的这些。在实施例中，分析物是(或分析物和竞争物各自是)碳水化合物或碳水化合物衍生物，诸如糖苷，诸如洋地黄毒苷或水杨苷。在实施例中，分析物是(或分析物和竞争物各自是)脂质，例如胆固醇。在实施例中，分析物是(或分析物和竞争物各自是)半抗原，例如地高辛。在实施例中，分析物是(或分析物和竞争物各自是)维生素，例如维生素A、维生素B、叶酸、维生素C、维生素D、维生素E、维生素K等。在实施例中，分析物是(或分析物和竞争物各自是)半抗原，例如苯胺和其衍生物、漆酚、联胺肼、氟烷、荧光素、生物素、地高辛和二硝基苯酚。在实施例中，竞争物是捕捉试剂。在实施例中，竞争物是检测试剂且包括核酸探针。
在实施例中，竞争物结合于表面，且分析物和检测试剂(例如包括检测抗体和核酸探针的结合物)在溶液中，且竞争物与分析物竞争结合于检测试剂。在这类实施例中，包括竞争物和检测试剂的表面上的复合物被检测和测量，且竞争物的测量量用于确定分析物的量。在实施例中，捕捉试剂结合于表面，分析物和可检测标记的竞争物在溶液中，且可检测标记的竞争物与分析物竞争结合于捕捉试剂。在这类实施例中，包括捕捉试剂和可检测标记的竞争物的表面上的复合物经检测和测量，且竞争物的测量量用于确定分析物的量。在实施例中，捕捉试剂、检测试剂与分析物(如上文所述)之间的竞争性反应系在溶液中进行，且捕捉试剂随后固定于表面上(例如通过使用包括靶向部分的捕捉试剂和包括靶向部分补体的表面)。
在实施例中，本发明提供测量分析物的方法，其包括：(a)将分析物结合于表面上的结合域中的第一捕捉试剂，其中结合域进一步包括含有锚定寡核苷酸的锚定试剂；(b)将包括检测试剂和核酸探针的结合物结合于结合域中的第二捕捉试剂，以形成包括第二捕捉试剂和结合物的复合物，其中检测试剂是与分析物竞争结合于第一和第二捕捉试剂的竞争物；(c)延伸复合物中的结合物的核酸探针以形成延伸序列，其包括与锚定寡核苷酸互补的锚定寡核苷酸补体和与被标记的探针的检测寡核苷酸互补的检测序列补体；(d)将包括检测寡核苷酸的被标记的探针结合于延伸序列；和(e)测量结合于结合域的被标记的探针的量；其中被标记的探针是根据本发明的被标记的探针。
在实施例中，本发明提供测量分析物的方法，其包括：(a)将分析物结合于包括第一检测试剂和核酸探针的第一结合物；(b)将表面上的结合域中的捕捉试剂结合于包括第二检测试剂和核酸探针的第二结合物，以形成包括捕捉试剂和第二结合物的复合物，其中(i)结合域进一步包括含有锚定寡核苷酸的锚定试剂，和(ii)捕捉试剂是用于结合于第一和第二检测试剂的分析物的竞争物；(c)延伸复合物中的第二结合物的核酸探针以形成延伸序列，其包括与锚定寡核苷酸互补的锚定寡核苷酸补体和与被标记的探针的检测寡核苷酸互补的检测序列补体；(d)将包括检测寡核苷酸的被标记的探针结合于延伸序列；和(e)测量结合于结合域的被标记的探针的量；其中被标记的探针是根据本发明的被标记的探针。
另外，本文所述的方法可以用于检测和定量寡聚分析物。如果目标抗原是同源寡聚物，即具有两个或更多个相同次单位的抗原，那么检测抗体需要用连接模板寡核苷酸和引物寡核苷酸独立地标记。此可导致低效率，因为仅具有模板寡核苷酸的两种抗体或仅具有引发寡核苷酸的两种抗体可结合且这类非生产性复合物可降低此方法的灵敏度。此问题可以在此方法应用于检测具体寡聚结构时加剧，其中使用额外具体模板寡核苷酸以允许特异性检测寡聚物。因此，本文所述的方法可以包含预先形成一组检测抗体，其被配置成有效结合所期望寡聚物分析物，以及用于形成滚环模板的模板。此可以使用额外寡核苷酸序列，例如骨架寡核苷酸实现，所述额外寡核苷酸序列可以与抗体偶联的寡核苷酸特异性杂交，以使得在检测抗体混合物中以寡聚形式配置的抗体匹配目标抗原寡聚物。此预组织步骤允许检测抗体与目标寡聚物的最佳结合。在检测抗体与寡聚物抗原结合后，可以通过核酸外切酶降解或另一适合的化学方法或核酸内切酶处理来去除骨架寡核苷酸。一旦去除骨架寡核苷酸，便可如本文所述地进行邻近连接滚环扩增。
在另一实施例中，本文所述的分析形式进一步包含一个或多个对照分析。可以在结合域上包含阴性对照，所述结合域包含不具有对应检测抗体的捕捉抗体，从而为所有样品提供一致背景信号。高于预设临限值的信号的测量可指示不当分析处理或存在引起被标记检测探针的非特异性结合的样品依赖性基质效应。此外，在针对执行多种控制功能的人类目标抗原(诸如分泌或细胞内蛋白)的分析中，还可以包含样本对照。正信号将指示存在人类材料，且因此测试样品添加和质量。人类抗原还可以充当细菌抗原提取的方法对照。例如，可选择细胞内人类分析物作为也需要检测溶解和萃取的样本对照，例如Akt。低于预定义临限值的信号的测量将指示未添加样品、试剂或方法发生故障或存在干扰扩增或检测的物质。除了内部对照以外，外部阳性和阴性对照还可以用于所述方法和/或试剂盒。阳性对照可以包括代表通过多重组检测的所有特异性目标抗原的非感染性细菌提取物的混合物，在测试时对于所有分析提供正信号。阴性对照包括无任何目标蛋白的代表性基质。
可以通过本发明的方法分析的样品的实例包含但不限于食品样品(包含食品提取物、食品匀浆、饮料等)、环境样品(例如土壤样品、环境污泥、收集的环境气溶胶、环境湿巾、水滤液等)、工业样品(例如来自工业生产过程的起始物质、产物或中间物)、人类临床样品、兽医样品和其它生物来源的样品。可分析的生物样品包含但不限于粪便、粘膜拭子、生理样品和/或含有细胞悬浮液的样品。生物样品的具体实例包含血液、血清、血浆、粪便、粘膜拭子、组织抽出物、组织匀浆、细胞培养物和细胞培养上清液(包含真核和原核细胞的培养物)、尿液、唾液、痰液和脑脊髓液样品。
可以使用本发明的方法测量的分析物包含但不限于蛋白质、毒素、核酸、微生物、病毒、细胞、真菌、孢子、碳水化合物、脂质、糖蛋白、脂蛋白、多糖、药物、激素、类固醇，以上分子的营养物、代谢物和任何被修饰衍生物，或包括以上分子中的一种或多种的任何复合物，或其组合。样品中所关注分析物的水平可指示疾病或疾病病况，或其可简单地指示患者是否暴露于所述分析物。
在具体实施例中，所关注分析物是外泌体，即由大部分细胞类型释放的小膜囊泡。外泌体的释放和后续吸收为细胞间通信的方法且在许多生理和病理过程的调节中起作用。已显示外泌体含有多种信号传导分子，包含但不限于表面结合和胞质蛋白、脂质、mRNA和miRNA，且已表明这些物质的身分和其于各外泌体中的浓度可以用于推断其细胞起源和功能。因此，患者的总外泌体群体的基因组或蛋白质组剖析可以是各种病理病况，尤其包含癌症、传染病、肾病和肝病和创伤性脑损伤提供有价值的预后信息。
通常通过从生物体液分离大量外泌体、破坏其膜且通过常规方法(诸如蛋白质印迹、PCR或测序)分析含量而在聚集体中测量外泌体。然而，本发明的方法和试剂盒可以用于通过捕捉表面上的外泌体和后续检测由外泌体表达的目标分子来表征外泌体。若干蛋白质已在大部分外泌体中鉴别为常见，例如CD9、CD63、CD81、Hsp70、PDCD6IP、Tsg101，且在一个实施例中，这些目标可单独地或组合地用于通过一种或多种捕捉试剂与一种或多种常见外泌体目标蛋白之间的结合相互作用来捕捉表面上的外泌体。在替代或额外实施例中，存在于外泌体上或外泌体中的疾病相关标记用于通过一种或多种捕捉试剂与疾病相关外泌体标记之间的结合相互作用来捕捉表面上的外泌体。接着可以使用一种或多种检测试剂对捕捉的外泌体进行探测，所述一种或多种检测试剂针对常见外泌体蛋白中的一种或多种，或针对存在于外泌体的一部分内或其表面上的一个或多个额外分子目标。当为捕捉试剂和检测试剂选择不同目标时，仅将检测包括两个目标的这些外泌体，从而在鉴别或定量外泌体亚群中允许额外特异性。在具体实施例中，所用样品为纯化的外泌体制剂。
在具体实施例中，可以使用一对检测试剂实现具体表型不同的外泌体亚群的检测，所述检测试剂仅在通过与本文所述的近端目标的结合相互作用接近时才产生信号。在本发明实施例中，近端目标可以是相同分子上的不同抗原决定基，其可以是在单一外泌体内部保持接近或结合于相同外泌体的膜中的相同分子物质的不同拷贝，或其可以是单一外泌体之中或之上的不同相互作用物质，诸如两种相互作用的蛋白质(例如四跨膜蛋白-整合素复合物)、蛋白质受体和配体(例如EFG和EGFR)或mRNA分子和RNA结合蛋白(例如Argonaute 1-4，或GW182)。另外，使用本文所述的方法准许分析至多三个不同目标分子，其可能不在功能上相关，但通过存在于单一外泌体内而相关。本文所述的PLA/RCA方法中所用的邻近探针可经延长以准许在外泌体之上或之中相隔更远定位的目标分子的连接和后续扩增。在一个实施例中，使用针对扩增子的特异性荧光探针进行PLA/RCA分析。此后，用通用荧光试剂(例如针对外泌体中的RNA的吖啶橙)标记捕捉外泌体，且对捕捉外泌体成像以确定两个荧光标记之间的相关性。使用通用荧光试剂允许基于尺寸和染色强度从所期望外泌体或其子集选择信号。
为了探测内部目标分子(货物蛋白、脂质或RNA分子)，外泌体可以在捕捉之前或之后但在添加检测试剂之前固定和透性化。如果使用本文所述的方法询问透性化外泌体，那么检测试剂中的一或两者可以包括能够结合于具体RNA序列的寡核苷酸探针，以使得能够检测mRNA、miRNA和/或蛋白质与RNA之间的相互作用。
可以使用本文所述的方法在使用或不使用锚定试剂的情况下测量外泌体。如上文所述，在图1(a)中说明了在结合分析中使用锚定试剂，且如果分析物是外泌体，那么表面(101)包含捕捉试剂，例如针对常见外泌体目标蛋白。在具体实施例中，表面还包含锚定试剂(103)。在一个或多个步骤中，将外泌体结合于捕捉试剂和检测试剂(104)，所述检测试剂还通过相同或不同外泌体目标蛋白结合外泌体，其中检测试剂连接至核酸探针(105)。因此，在表面上形成包含捕捉试剂、外泌体和检测试剂的复合物。探针经延伸以形成延伸序列(107)，其包含结合锚定试剂的锚定区。延伸序列结合于锚定试剂且测量与表面结合的延伸序列的量。
同样，图1(b)中所说明的方法还可以应用于外泌体检测。在具体实施例中，检测复合物可以包含一种或多种检测试剂以增强分析针对外泌体的特异性，例如如图1(c)中所说明。在一个或多个步骤中，外泌体结合于捕捉试剂和两种(或更多种)结合由外泌体表达的目标蛋白的检测试剂(分别是120和121)中的每一个，其中第一和第二检测试剂中的每一个连接至核酸探针(分别是122和123，第一和第二核酸探针)。外泌体可以同时或基本上同时，或以依序、逐步方式结合于捕捉试剂和检测试剂。因此，在表面上形成包含捕捉试剂、外泌体以及第一和第二检测试剂的复合物(124)。使用需要第一和第二探针彼此接近的延伸方法，第一探针经延伸以形成包括与锚测序列互补的锚测序列补体的延伸序列(125)。在倒数第二步中，锚测序列与锚测序列补体杂交且测量与表面结合的延伸序列的量。类似地，在图2(a)-(c)中的每一个中描绘的方法可以用于检测外泌体。
本发明的分析可以用于确定样品中的一种或多种，例如两种或更多种分析物的浓度。因此，可以在相同样品中测量两种或更多种分析物。可以在相同样品中测量的分析物组包含例如与疾病状态或生理状况相关的分析物或活性的分析组。某些这类组包含以下组：细胞介素和/或其受体(例如TNF-α、TNF-β、ILl-α、ILl-β、IL2、IL4、IL6、IL-10、IL-l2、IFN-γ等中的一种或多种)、生长因子和/或其受体(例如EGF、VGF、TGF、VEGF等中的一种或多种)、滥用药物、治疗药物、维生素、病原体特异性抗体、自体抗体(例如针对Sm、RNP、SS-A、SS-α、J0-1和Scl-70抗原的一种或多种抗体)、过敏原特异性抗体、肿瘤标记(例如CEA、PSA、CA-125II、CA 15-3、CA19-9、CA72-4、CYFRA 21-1、NSE、AFP等中的一种或多种)、包含充血性心脏病和/或急性心肌梗塞的心脏疾病的标记(例如肌钙蛋白T、肌钙蛋白I、肌钙蛋白C、肌血球素、CKMB、髓过氧化酶、麸胱甘肽过氧化酶、β-利钠蛋白(BNP)、α-利钠蛋白质(ANP)、内皮素、醛固酮、C反应蛋白(CRP)等中的一种或多种)、与止血相关的标记(例如纤维蛋白单体、D-二聚体、凝血酶-抗凝血酶复合物、凝血酶原片段1和2、抗因子Xa等中的一种或多种)、急性病毒性肝炎感染的标记(例如针对A型肝炎病毒的IgM抗体、针对B型肝炎核心抗原的IgM抗体、B型肝炎表面抗原、针对C型肝炎病毒的抗体等中的一种或多种)、阿尔茨海默症(Alzheimer's Disease)的标记(α-淀粉状蛋白、β-淀粉状蛋白、Aβ42、Aβ40、Aβ38、Aβ39、Aβ37、Aβ34、tau蛋白等)、骨质疏松的标记(例如交联Nor C端肽、总去氧吡啶啉、游离去氧吡啶啉、骨钙化素、碱性磷酸酶、I型胶原蛋白的C端前肽、骨特异性碱性磷酸酶等中的一种或多种)、生育状态或生育相关病症的标记(例如雌二醇、孕酮、促卵泡激素(FSH)、黄体激素(LH)、促乳素、hCG、睾固酮等中的一种或多种)、甲状腺病症的标记(例如促甲状腺激素(TSH)、总T3、游离T3、总T4、游离T4和反向T3中的一种或多种)和前列腺癌的标记(例如总PSA、游离PSA、复合PSA、前列腺酸磷酸酶、肌酸激酶等中的一种或多种)。本发明的某些实施例包含测量例如一种或多种、两种或更多种、四种或更多种或10种或更多种与具体疾病状态或生理状况相关的分析物(例如在组中分组在一起的分析物，诸如以上列出的这些；例如适用于诊断甲状腺病症的组可以包含例如促甲状腺激素(TSH)、总T3、游离T3、总T4、游离T4和反向T3中的一种或多种)。
在一个优选实施例中，组包含传统样品基质中的一种或多种低丰度分析物，例如浓度是小于约100fg/mL的且更优选是小于约10fg/mL的分析物。可以包含于组中的分析物的非限制性清单包含例如IL-17、IL-21、IL-31、Ab-38、Ab-40、Ab-42、Ab-39、Ab-43、Ab-15、Ab-16、Ab-17、Aβ寡聚物、C-肽、IL-13、IL-17A、IL-2、IL-4、IL-5、IL-6、IL-8、IL-12/23p40、IL-12p70、INF-g、PSA、PSAc、Tau、磷酸化Tau、TNFa、肌钙蛋白I、心肌肌钙蛋白T、肌钙蛋白C、VEGF、VEGF-A、VEGF-B、VEGF-C、VEGF-D、EPO、LC3B、白蛋白、CHO-P、大肠杆菌HCP、IgA、IgE、IgG、IgG1、IgG4、IgM、NSO-P、Per-C6、残留蛋白A、IgG2、IgG3、IgG4、AFP、CA125、凋亡蛋白酶-3活性、CXCL11/I-TAC、ErbB2/HER2、HGFR/o-MET、IFN-β、MMP1、MMP2、MMP3、MMP9、β-NGF、TFF3、TIMP1、Kim-1、α-2巨球蛋白、D-二聚体、ICAM-1、髓过氧化酶、肌血球素、PAI-1、PCSK9、纤维蛋白溶酶原、肾素/前肾素、tPA、CXCL1/GRO-α、CCL2/MCP1、CCL3/MIP-1α、CCL4/MIP-1β、CCL5/Rantes、CRP、CXCL9/MIG、CXCL10/IL-10、G-CSF、GM-CSF、IFN-α、IFN-γ、IL1α、IL-1β、IL2、IL3、IL4、IL5、IL6、IL7、IL8、IL12(p70)、IL13、IL15、IL18、IL-22、IL-23、IL-33、c-MET、脂联素、FGF21、TSLP、GLP-1、生长激素、IGF1、IGF2、胰岛素、瘦素、促乳素、HIV p24、HB-EGF、AKT、磷酸化AKT以及其组合。
在具体实施例中，组包含传统样品基质中的一种或多种低丰度分析物，例如浓度是小于约100fg/mL且更优选是小于约10fg/mL的分析物，且组包含以下人类目标中的一种或多种：G-CDF、GM-CSF、IFNγ、IL-1β、IL-2、IL-4、IL-5、IL-6、IL-10、IL-12/23p40、IL12p70、IL-17A、IL21、IL-22、IL-23、IL-31、IL-33、TNFα、TSLP、VEGF、复合PSA、游离PSA、Aβ42、Aβ40、Aβ38、tau、心肌肌钙蛋白I、心肌肌钙蛋白T、HIV p24、C-肽和/或FGF21。
另外，本文所述的方法和试剂盒可以用于免疫分析以检测单一生物体对抗微生物耐药性标记(PBP2a/mecA(金黄色葡萄球菌(S.aureus)，革兰氏阳性)TEM1(大肠杆菌(E.coli)，革兰氏阴性))的敏感性。这些分析可以用于革兰氏阳性和革兰氏阴性细菌两者中的这类分析物。涉及针对万古霉素、β-内酰胺、碳青霉烯类、氨基糖苷和巨环内酯抗生素的抗微生物耐药性的以下目标蛋白中的一种或多种可以包含于分析中：erm家族、vanA、vanB、aac(6')-aph(2”)、KPC、NDM、OXA-48、VIM、OXA-23样、OXA-40样、OXA-58样、CTX-M-1和CTX-M-9家族的ESBL基因以及其组合。此外，以下蛋白质中的一种或多种可以包含于分析中：50S核糖体蛋白L20、30S核糖体蛋白S7、30S核糖体蛋白S2、50S核糖体蛋白L21、50S核糖体蛋白L17、30S核糖体蛋白S4、50S核糖体蛋白L15、30S核糖体蛋白S5、50S核糖体蛋白L16、30S核糖体蛋白S3、50S核糖体蛋白L22、50S核糖体蛋白L4、核糖体蛋白L25、50S核糖体蛋白L5、30S核糖体蛋白S2、核糖体蛋白L30、L31和L32以及其组合。另外，以下目标中的一种或多种可单独或与本文鉴别的标记中的一种或多种组合评估，例如延长因子EF-TU、ACP、酰基载体蛋白、RplL、核糖体蛋白GroS(MopB，65,000)、伴随蛋白系统Gro-EL-Gro-ES和GapA的组分、糖酵解中的酶以及其组合。
另外，本文所述的方法和试剂盒还可以用于免疫分析以检测保健相关感染(HAI生物体)，包含但不限于肺炎克雷伯氏菌(Klebsiella pneumonia)、鲍氏不动杆菌(Acinetobacter baumannii)、绿脓杆菌(Pseudomonas aeruginosa)、肠杆菌属(Enterobacter)物种和肠外致病性大肠杆菌。下标提供了用于HAI生物体中的每一个的耐药性标记：
病原体 耐药性标记(GenBank标识)
肺炎克雷伯氏杆菌 KPC(KPC-2:AAK70220.1)
鲍氏不动杆菌 VIM(VIM-1:CCG05854.1)
绿脓杆菌 IMP-1(AAL17637.1)
肠杆菌属物种 OXA-48(AGD80396.1)
肠外致病性大肠杆菌 NDM(NDM-1:AHF22464.1)
可以在本文所述的免疫分析中评估具体外膜蛋白：
另外，本文所述的方法和试剂盒可以用于免疫分析中以检测以下类别的生物标记中的一种或多种：细胞介素、循环肿瘤特异性蛋白、与一种或多种传染病相关的蛋白质、细胞内标记等，以及其组合。
另外，可以使用本文所述的方法和试剂盒，通过评估以下列出的相关抗原中的一种或多种的存在或不存在来鉴别以下自体免疫疾病：
在具体实施例中，组包含传统样品基质中的一种或多种低丰度分析物，例如浓度是小于约100fg/mL的且更优选是小于约10fg/mL的分析物。组优选包含以下分析物中的一种或多种：IL-17、IL-21、IL-31、IL-22、IL-23、IL-33、心肌肌钙蛋白T以及其组合。在具体实施例中，样品中检测的分析物的浓度在0.01fM-100fM、0.03fM-50fM或0.03fM-10fM范围内。在一些实施例中，可基本上精确确定的样品中的分析物分子的浓度是小于约100fM、小于约10fM、小于约3fM、小于约1fM、小于约0.3fM、小于约0.1fM、小于约0.03fM或更小。如果样品中分析物分子的测量浓度在样品中分析物分子的实际浓度的约20％以内，那么可将样品中分析物分子的浓度视为被基本上精确确定。在某些实施例中，样品中分析物分子的测量浓度可以在样品中分析物分子的实际浓度的约10％以内、约3％以内、或约1％以内。分析的检测极限为给出高于背景信号至少2.5标准差的信号的彼浓度，且优选地，分析可检测样品中的大致10-10,000个分子，或样品中的100-5,000个分子，或样品中的100-1000个分子。
在另一实施例中，本文所述的方法可以用于检测由于最近的暴露和/或感染而呈低丰度的分析物。各种疾病或病况(例如癌症)、细菌感染(例如炭疽芽孢杆菌(Bacillusanthracis)(炭疽))、病毒感染(例如HIV、肝炎、HPV等)、毒素暴露(例如蓖麻毒素、肉毒杆菌毒素A、B或E等)的早期诊断受限于以下事实：可用技术，诸如ELISA的检测极限(LOD)高于可指示疾病发作的低丰度蛋白质的循环浓度。组可以包含传统样品基质中的一种或多种低丰度分析物，例如浓度是小于约100fg/mL或小于约10fg/mL的分析物。可以包含于组中的分析物的非限制性清单包含例如HIVgp41；HIVgp120；HIVgp160；HIVp24；HIVp66；HIVp51；HIVp17；HIVp31；Tat；Nef；Viv；A、B、C、d或E抗原肝炎；16、18、31、33、35、39、45、51、52、56、58、59、68、73和/或82型HPV；HPV-E6和E7蛋白；IL-17；IL-21；IL-31；IL-22；IL-23；IL-33；心肌肌钙蛋白T；以及其组合。另外，组还可以包含可由于最近的疾病发作、暴露和/或感染而呈低丰度的以下分析物中的一种或多种：Ab-38、Ab-40、Ab-42、Ab-39、Ab-43、Ab-15、Ab-16、Ab-17、Aβ寡聚物、C-肽、IL-13、IL-17A、IL-2、IL-4、IL-5、IL-6、IL-8、INF-g、PSA、Tau、磷酸化Tau、TNFa、肌钙蛋白I、心肌肌钙蛋白T、肌钙蛋白C、VEGF、VEGF-A、VEGF-B、VEGF-C、VEGF-D、EPO、LC3B、白蛋白、CHO-P、大肠杆菌HCP、IgA、IgE、IgG、IgG1、IgG4、IgM、NSO-P、Per-C6、残留蛋白A、IgG2、IgG3、IgG4、AFP、CA125、凋亡蛋白酶-3活性、CXCL11/I-TAC、ErbB2/HER2、HGFR/o-MET、IFN-β、MMP1、MMP2、MMP3、MMP9、β-NGF、TFF3、TIMP1、Kim-1、α-2巨球蛋白、D-二聚体、ICAM-1、髓过氧化酶、肌血球素、PAI-1、PCSK9、纤维蛋白溶酶原、肾素/前肾素、tPA、CXCL1/GRO-α、CCL2/MCP1、CCL3/MIP-1α、CCL4/MIP-1β、CCL5/Rantes、CRP、CXCL9/MIG、CXCL10/IL-10、G-CSF、GM-CSF、IFN-α、IFN-γ、IL1α、IL-1β、IL-3、IL-7、IL-12(p70)、IL-13、IL-15、IL-18、c-MET、脂联素、FGF21、GLP-1、生长激素、IGF1、IGF2、胰岛素、瘦素、促乳素、HB-EGF、AKT、磷酸化AKT以及其组合。
本发明的方法被设计成允许检测多种生物和生物化学试剂，如上文所述。在一个实施例中，方法可以用于检测致病性和/或潜在致病性病毒、细菌和毒素，包含多种相关临床和环境基质(包含且不限于血液、痰液、粪便、过滤器、拭子等)中的生物战剂(“BWA”)。可以使用本发明的方法分析(单独或呈组合形式)的病原体和毒素的非限制性清单：炭疽芽孢杆菌(炭疽)、鼠疫耶尔森菌(Yersinia pestis)(瘟疫)、霍乱弧菌(Vibrio cholerae)(霍乱)、土拉热弗朗西丝菌(Francisella tularensis)(土拉菌病)、布鲁氏菌属(Brucellaspp.)(布氏杆菌病)、贝氏考克斯菌(Coxiella burnetii)、(Q热)、李氏菌属(listeria)、沙门氏菌属、志贺杆菌属、霍乱弧菌(V.cholera)、沙眼披衣菌(Chlamydia trachomatis)、类鼻疽伯克霍尔德氏菌(Burkholderia pseudomallei)、正痘病毒，包含天花病毒(天花)、病毒性脑炎、委内瑞拉马脑炎病毒(Venezuelan equine encephalitis virus，VEE)、西部马脑炎病毒(western equine encephalitis virus，WEE)、东部马脑炎病毒(eastern equineencephalitis virus，EEE)、α病毒、病毒性出血热、沙粒病毒科(Arenaviridae)、布尼亚病毒科(Bunyaviridae)、丝状病毒科(Filoviridae)、黄病毒科(Flaviviridae)、埃博拉病毒(Ebola virus)、葡萄球菌肠毒素、蓖麻毒素、肉毒杆菌毒素(A、B、E)、肉毒梭菌(Clostridium botulinum)、霉菌毒素、镰刀菌属(Fusarium)、Myrotecium、头孢菌属(Cephalosporium)、木霉菌属(Trichoderma)、轮状单孢菌(Verticimonosporium)、葡萄穗霉菌(Stachybotrys)、鼻疽、小麦真菌、球芽孢杆菌(Bacillus globigii)、粘质沙雷氏菌(Serratia marcescens)、黄雨、单端孢霉烯族真菌毒素(trichothecene mycotoxins)、鼠伤寒沙门杆菌(Salmonella typhimurium)、黄霉毒素(aflatoxin)、印鼠客蚤(Xenopsyllacheopis)、山穿手瘙(Diamanus montanus)、类天花、猴痘、沙状病毒(Arenavirus)、汉坦病毒(Hantavirus)、拉沙热(Lassa fever)、阿根廷出血热(Argentine hemorrhagicfevers)、玻利维亚出血热(Bolivian hemorrhagic fevers)、东非瑞夫特河谷羊热病病毒(Rift Valley fever virus)、克里米亚-冈果病毒(Crimean-Congo virus)、汉坦病毒、马堡出血热(Marburg hemorrhagic fevers)、黄热病病毒(yellow fever virus)、登革热病毒(dengue fever viruses)、流感(包含人类和动物株，包含H5N1禽流感、A型流感、H1特异性A型流感、H3特异性A型流感、H5特异性A型流感、2009-H1N1特异性A型流感、B型流感)、RSV、人类免疫缺陷病毒I和II(HIV I和II)、A型肝炎、B型肝炎、C型肝炎、肝炎(非A、B或C)、肠病毒、埃-巴二氏病毒(Epstein-Barr virus)、细胞巨大病毒、单纯疱疹病毒、沙眼披衣菌、淋病奈瑟菌(Neisseria gonorrheae)、阴道毛滴虫(Trichomonas vaginalis)、人类乳头状瘤病毒(human papilloma virus)、梅毒螺旋体(Treponema pallidum)、肺炎链球菌(Streptococcus pneumonia)、伯氏疏螺旋体(Borellia burgdorferi)、流感嗜血杆菌(Haemophilus influenzae)、肺炎霉浆菌(Mycoplasma pneumoniae)、肺炎嗜衣原体(Chlamydophila pneumoniae)、嗜肺性退伍军人杆菌(Legionella pneumophila)、金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、葡萄球菌肠毒素B(SEB)、相思子毒素(Abrin)、志贺毒素(Shiga Toxin)1、志贺毒素2、粘膜炎莫拉氏菌(Moraxella catarrhalis)、酿脓链球菌(Streptococcus pyogenes)、艰难梭菌(Clostridium difficile)、奈瑟氏脑膜炎菌(Neisseria meningitidis)、肺炎克雷伯氏杆菌(Klebsiella pneumoniae)、结核分支杆菌(Mycobacterium tuberculosis)、A群链球菌(Group A streptococcus)、大肠杆菌O157、冠状病毒、柯沙奇(Coxsackie)A病毒、鼻病毒、副流感病毒、呼吸道融合病毒(RSV)、间质肺炎病毒、痘疮和腺病毒。
对本文所述的结合分析的改良可以用于扩大结合分析的动态范围，即可以在不稀释或浓缩样品或改变产生类似结果的分析条件(例如所采用试剂的浓度等)的情况下通过系统或方法定量的流体样品中的分析物分子的浓度范围，且其中分析物分子的测量浓度可基本上精确确定。如果流体样品中分析物分子的测量浓度在流体样品中分析物分子的实际(例如真实)浓度的约10％内，那么流体样品中分析物分子的浓度可被视为基本上精确确定。在某些实施例中，流体样品中分析物分子的测量浓度在实施例中基本上精确确定，其中测量浓度在流体样品中分析物分子的实际浓度的约5％内、约4％内、约3％内、约2％内、约1％内、约0.5％内、约0.4％内、约0.3％内、约0.2％内或约0.1％内。在一些情况下，确定的浓度测量值与真实(例如实际)浓度相差不超过约20％、不超过约15％、不超过约10％、不超过约5％、不超过约4％、不超过约3％、不超过约2％、不超过约1％或不超过约0.5％。在一些实施例中，可以通过使用所选的分析方法确定已知浓度的流体样品中分析物分子的浓度且比较测量浓度与实际浓度来确定分析方法的精确性。
在一些实施例中，系统或方法可能能够在以下动态范围内测量流体样品中分析物分子的浓度：大于约1000(3log)、约10,000(4log)、约100,000(5log)、约350,000(5.5log)、1,000,000(6log)、约3,500,000(6.5log)、约10,000,000(7log)、约35,000,000(7.5log)、约100,000,000(8log)或更大。
在一些实施例中，可基本上精确确定的流体样品中分析物分子的浓度(例如未知浓度)为小于约5000fM(飞摩尔)、小于约3000fM、小于约2000fM、小于约1000fM、小于约500fM、小于约300fM、小于约200fM、小于约100fM、小于约50fM、小于约25fM、小于约10fM、小于约5fM、小于约2fM、小于约1fM、小于约500aM(渺摩尔(attomolar))、小于约100aM、小于约10aM、小于约5aM、小于约1aM、小于约0.1aM、小于约500zM(仄摩尔(zeptomolar))、小于约100zM、小于约10zM、小于约5zM、小于约1zM、小于约0.1zM或更小。在一些情况下，检测极限(例如可以在溶液中确定的分析物分子的最低浓度)为约100fM、约50fM、约25fM、约10fM、约5fM、约2fM、约1fM、约500aM(渺摩尔)、约100aM、约50aM、约10aM、约5aM、约1aM、约0.1aM、约500zM(仄摩尔)、约100zM、约50zM、约10zM、约5zM、约1zM、约0.1zM或更小。在一些实施例中，可基本上精确确定的流体样品中分析物分子或粒子的浓度是约5000fM至约0.1fM、约3000fM至约0.1fM、约1000fM至约0.1fM、约1000fM至约0.1zM、约100fM至约1zM、约100aM至约0.1zM或更小。检测上限(例如可以在溶液中确定的分析物分子的上限浓度)为至少约100fM、至少约1000fM、至少约10pM(皮摩尔)、至少约100pM、至少约100pM、至少约10nM(奈摩尔)、至少约100nM、至少约1000nM、至少约10μM、至少约100μM、至少约1000μM、至少约10mM、至少约100mM、至少约1000mM或更大。在一些实施例中，确定的流体样品中分析物分子或粒子的浓度是小于约50×10-15M，或小于约40×10-15M，或小于约30×10-15M，或小于约20×10-15M，或小于约10×10-15M，或小于约，或小于约1×10-15M。
在一些实施例中，可基本上精确确定的样品中的分析物分子的浓度是小于约100fM、小于约10fM、小于约3fM、小于约1fM、小于约0.3fM、小于约0.1fM、小于约0.03fM或更小。在一些实施例中，可基本上精确确定的样品中分析物分子的浓度是约5000fM至约0.1fM、约3000fM至约0.1fM、约1000fM至约0.1fM、约1000fM至约1fM、约100fM至约1fM、约100fM至约0.1fM。如果样品中分析物分子的测量浓度在样品中分析物分子的实际浓度的约20％以内，那么可将样品中分析物分子的浓度视为被基本上精确确定。在某些实施例中，样品中分析物分子的测量浓度可以在样品中分析物分子的实际浓度的约10％以内、约3％以内、或约1％以内。在一些实施例中，可以通过使用所选分析方法确定已知浓度的样品中分析物分子的浓度来确定分析方法的精确性。优选地，分析可检测样品中的大约10-10,000个分子，优选样品中的100-5,000个分子，且更优选样品中的100-1000个分子。
相对于例如使用相同捕捉抗体和两种检测抗体中的任一个和相同标记和检测技术测量的常规夹心免疫分析技术，使用本文所述的分析形式可改良检测信号和分析灵敏度多达10倍，优选多达50倍、100倍或多达1000倍。优选地，相对于标准夹心免疫分析，使用本文所述的分析形式改良检测信号和分析灵敏度多达100倍。
尤其在与灵敏的光学检测技术结合时，本发明的方法的一个有利方面是信号放大允许将各个结合事件检测为光亮点。可随后通过计数各个事件(其可以通过提供改良的结合事件与背景噪音的区分而提供更好的针对低分析物浓度的灵敏度)或通过在针对所有结合事件的信号内整合(其可针对测量高分析物浓度提供更好的动态范围)来进行信号定量。
本发明的方法可以用于多种分析装置和/或形式。分析装置可以包含例如分析模块，诸如分析盘、滤筒、多孔分析盘、反应容器、试管、比色管、流量槽、分析芯片、侧流装置等，具有在分析进展时添加或预装载于分析模块的孔、腔室或分析区域中的分析试剂(其可以包含靶向剂或其它结合试剂)。这些装置可对于特异性结合分析，例如免疫分析或免疫色谱分析采用多种分析形式。说明性分析装置和形式描述于下文中。在某些实施例中，本发明的方法可采用以干燥状态储存的分析试剂，且分析装置/试剂盒可以进一步包括或提供有用于将分析试剂维持于干燥状态的干燥材料。预装有分析试剂的分析装置可极大地提高分析测量速度且降低其复杂度，同时维持储存期间的极佳稳定性。干燥的分析试剂可以是任何可被干燥且接着在用于分析之前复原的分析试剂。这些包含但不限于适用于结合分析的结合试剂、酶、酶底物、指示剂染料和其它可以用于检测所关注分析物的反应性化合物。分析试剂还可以包含不直接涉及检测机制但在分析中起辅助作用的物质，包含但不限于封闭剂、稳定剂、洗涤剂、盐、pH缓冲液、防腐剂等。试剂可以游离形式存在或负载于固相上，包含分析模块中的隔室(例如腔室、通道、流量槽、孔等)的表面或胶体、珠粒或其它微粒支撑物的表面。
本发明的方法可以与用于测量分析物的量，且特别是测量与固相结合的分析物的量的多种方法一起使用。可以使用的技术包含但不限于所属领域中已知的技术，诸如基于细胞培养的分析、结合分析(包含凝集测试、免疫分析、核酸杂交分析等)、酶分析、比色分析等。其它适合的技术将为所属领域的一般技术人员显而易见。一些测量技术允许通过目视检查进行测量，其它技术可能需要或受益于使用仪器进行测量。
用于测量分析物的量的方法包含无标记技术，其包含但不限于i)测量在将分析物结合于表面之后表面处的质量或折射率变化的技术(例如表面声波技术、表面电浆子共振感测器、椭偏测量技术等)，ii)质谱技术(包含如MALDI、SELDI等的技术，其可测量表面上的分析物)，iii)色谱或电泳技术，iv)荧光技术(其可基于分析物的固有荧光)等。
用于测量分析物的量的方法还包含通过检测可直接或间接(例如通过使用分析物的被标记结合搭配物)连接至分析物的标记测量分析物的技术。适合的标记包含可直接观察的标记(例如可以在视觉上看到的粒子，和产生可测量信号，诸如光散射、吸光度、荧光、化学发光、电化学发光、放射性、磁场等标记)。可以使用的标记还包含酶或其它化学反应性物质，其具有产生诸如光散射、吸光度、荧光等的可测量信号的化学活性。使用酶作为标记在酶联免疫吸附分析(也称为ELISA、酶免疫分析或EIA)中沿用已久。在ELISA形式中，将未知量的抗原贴附至表面且接着在表面上洗涤特异性抗体以使其可结合于抗原。此抗体连接至酶，且在最终步骤中添加一种物质，酶将所述物质转化为提供可检测信号变化的产物。产物形成可以是可检测的，例如由相对于底物的诸如吸光度、荧光、化学发光、光散射等可测量特性的差异所致。可以与根据本发明的固相结合方法一起使用的某些(但并非所有)测量方法可受益于或需要洗涤步骤以自固相去除未结合组分(例如标记)。因此，本发明的方法可以包括这类洗涤步骤。
在采用一对可检测标记的这些实施例中，这些被标记物质是基于其独立可检测的能力和/或这些物质共同起作用以在所述对标记彼此邻近，即各自直接或间接结合于检测复合物中的所关注分析物时产生可检测信号的能力而选择。在一个实施例中，第一可检测标记是偶联酶反应系统的第一酶且第二可检测标记是偶联酶反应系统的第二酶，且方法进一步包含添加反应系统的一种或多种底物，由此产生酶反应系统的可检测产物的步骤。可将包含可检测产物的这些反应容器与不包含可检测产物的这些反应容器区分开。在一个优选实施例中，仅在第一酶和第二酶极为贴近，例如小于200nm，理想地小于50nm时产生可检测产物。在一个实施例中，第一酶是氧化酶，例如葡萄糖氧化酶，第二酶是过氧化酶，且底物包括氧化酶底物，例如葡萄糖，和被标记酪酰胺、Amplex Red(10-乙酰基-3,7-二羟基啡噁嗪)，或鲁米诺(luminol)衍生物(在本文中统称为被标记反应性衍生物且在一个优选实施例中，被标记反应性衍生物包括Amplex Red或鲁米诺)。在此实施例中，第一酶与底物反应产生产物，所述产物与第二酶反应产生第二产物，所述第二产物与被标记反应性衍生物反应产生可检测物质。优选地，检测复合物中经第一和第二酶催化的反应使得被标记反应性衍生物固定于表面上，其可被测量以确定表面上存在的分析物分子的数目。在一个实施例中，被标记反应性衍生物为生物素-酪酰胺，且方法进一步包括添加被标记抗生蛋白链菌素和测量抗生蛋白链菌素上的标记。
方法中可用的邻近依赖性另一标记系统是FRET对，例如第一可检测标记是FRET供体且可检测标记是FRET受体。荧光共振能量转移(FRET)为两个染料分子的电子激发态之间的距离依赖性相互作用，其中激发在无光子发射的情况下从供体分子转移至受体分子。FRET的效率取决于分子间分离的倒数六次方，使其在与生物大分子的尺寸类似的距离上有用。在此标记系统中，通过激发FRET供体和测量从FRET受体的发射来测量邻近依赖性信号。供体和受体分子优选紧邻，例如约10-100埃，受体的吸收光谱优选与供体的荧光发射光谱重叠，且供体和受体跃迁偶极取向应大致平行。FRET对的非限制性清单提供于下表1中。
表1.FRET对实例
供体 受体
荧光素 四甲基如果丹明
IAEDANS 荧光素
EDANS Dabcyl
荧光素 荧光素
BODIPY FL BODIPY FL
荧光素 QSY 7和QSY 9染料
存在多种用于光学显微镜的FRET检测方法，例如受体光漂白、供体光漂白、比率成像、敏化发射和荧光寿命测量。
可以用于采用一对检测标记的实施例中的另一适合的标记系统为其中可独立测量第一和第二可检测标记的系统。例如，第一和第二可检测标记可以是就光谱特性来说彼此不同的发光标记。或者，第一可检测标记是与第一底物反应以产生第一信号的第一酶，且第二可检测标记是与第二底物反应以产生不同第二信号的第二酶，且方法进一步包括添加第一酶底物和第二酶底物和计数产生第一和第二信号的反应容器的数目。第一和第二信号可以是具有不同光谱特性的吸光度和/或发光信号的变化。
如果第一和第二可检测标记包含第一和第二酶，那么其可各自为水解酶，例如磷酸酶、硫酸酯酶、半乳糖苷酶、葡糖醛酸酶或其组合，且因此第一和第二底物是选自磷酸盐、硫酸盐、半乳糖苷和葡萄糖苷酸修饰的稳定化二氧杂环丁烷、4-甲基香豆素基、荧光素或其组合。或者，第一和第二酶是选自辣根过氧化酶、β-半乳糖苷酶和碱性磷酸酶。
或者，用于检测分析物分子的标记可以是可以用于单分子荧光检测，例如荧光相关光谱法和/或荧光交叉相关光谱法的荧光物质。单分子荧光检测包括使包含可检测物质的洗脱剂流经毛细管、使光源聚焦于毛细管内的体积上以产生询问区和用光检测器观察询问区以检测荧光分子通过所述询问区。
在一个实施例中，可以使用基于电化学发光的分析形式，例如基于电化学发光(ECL)的免疫分析来测量样品中的所关注分析物。ECL的高灵敏度、宽动态范围和选择性为医学诊断的重要因素。市售ECL仪器已展示优越性能且其已出于包含其极佳灵敏度、动态范围、精确度和复杂样品基质的耐受性的原因而得到广泛使用。可诱导发射ECL的物质(ECL活性物质)已用作ECL标记，例如i)有机金属化合物，其中金属来自例如第VIII族贵金属，包含含Ru和含Os的有机金属化合物，诸如三联吡啶基钌(RuBpy)部分，和ii)鲁米诺和相关化合物。在ECL方法中以ECL标记参与的物质在本文中称为ECL共反应物。常用共反应物包含叔胺(例如参见美国专利第5,846,485号)、草酸盐和来自RuBpy的用于ECL的过硫酸盐和来自鲁米诺的用于ECL的过氧化氢(参见例如美国专利第5,240,863号)。由ECL标记产生的光可用作诊断程序中的报告信号(Bard等人，美国专利第5,238,808号，以引用的方式并入本文中)。例如，ECL标记可共价偶联至结合剂，诸如抗体、核酸探针、受体或配体；可以通过测量从ECL标记发射的ECL来监测结合相互作用中结合试剂的参与。或者，来自ECL活性化合物的ECL信号可指示化学环境(参见例如美国专利第5,641,623号，其描述监测ECL共反应物形成或分解的ECL分析)。关于ECL、ECL标记、ECL分析和用于进行ECL分析的仪器的更多背景，参见美国专利第5,093,268号；第5,147,806号；第5,324,457号；第5,591,581号；第5,597,910号；第5,641,623号；第5,643,713号；第5,679,519号；第5,705,402号；第5,846,485号；第5,866,434号；第5,786,141号；第5,731,147号；第6,066,448号；第6,136,268号；第5,776,672号；第5,308,754号；第5,240,863号；第6,207,369号；第6,214,552号和第5,589,136号，和公布的PCT第W099/63347号；第WOOO/03233号；第W099/58962号；第W099/32662号；第W099/14599号；第W098/12539号；第W097/36931号和第W098/57154号，其均以引用的方式并入本文中。
本发明的方法可应用于单重或多重形式，在多重形式中，对单一样品进行多次分析测量。可以用于本发明的多重测量包含但不限于如下的多重测量：i)涉及使用多个感测器；ii)使用基于表面上的位置可区分的表面(例如阵列)上的离散分析域；iii)涉及使用基于诸如尺寸、形状、颜色等粒子特性可区分的粒子上涂布的试剂；iv)产生基于光学特性(例如吸光度或发射光谱)可区分的分析信号，或v)基于分析信号的时间特性(例如信号的时间、频率或相位)。
在一些实施例中，可以通过比较测量参数与校准标准而至少部分地确定样品中分析物分子的浓度的量度。例如，包括分析物分子的结合表面的分数可以与校准曲线进行比较以确定样品中分析物分子的浓度的量度。可以通过在用于分析测试样品的条件下用多个已知浓度的标准化样品完成分析来产生校准曲线。可对于各标准化样品获取与分析物分子的检测/定量有关的信号的读数，因此允许形成校准曲线，所述校准曲线将分析物分子的检测与已知浓度的分析物分子相关联。可接着在包括未知浓度的分析物分子的样品上完成分析，且可以在校准曲线上绘制来自此分析的分析物分子的检测值，因此确定样品中分析物分子的浓度的测量值。
在使用成像技术测量光学信号(诸如荧光、化学发光或电化学发光)的具体情况下，结合事件可检测为亮点光源。当点源的表面密度较低时(例如当发现RxR区域(其中R是检测系统的空间分辨率)中的点源的概率小于10％时)，可能的是任何观察的点源是由单一结合事件所致。在这些条件下，计数事件可以提供最灵敏测量。随着表面密度增加，分辨和计数各个结合事件变得越来越困难。在这些条件下，在结合表面上积分光学信号提供更精确测量。
熟练技术人员将显而易见的是本文所述的方法可应用于所属领域的技术人员已知的许多免疫分析平台。可调整免疫分析平台的各种特征以适合于具体平台，但这些调节完全在一般技术人员的技术范围内。例如，本文所述的方法可应用于使用编码粒子的基于珠粒的形式。在这类系统中，使用的珠粒可以是磁性或非磁性的，且珠粒的表面被修饰以包含捕捉试剂的一个或多个拷贝。此系统中采用的检测试剂是一对检测试剂。在一个实施例中，两种检测试剂包含可区分的荧光标记。或者，如本文所述，两种检测试剂被核酸探针修饰，在此情况下，免疫分析方法包含延伸方法，例如RCA-PLA，以产生指示可检测的各检测试剂的存在的扩增产物。如果检测包含两种可区分的荧光标记，那么测量步骤包含将珠粒引入至流量槽中，且如果珠粒是磁性的，那么在流量槽中捕捉珠粒。如果检测试剂被核酸探针修饰，那么测量步骤包含在珠粒上形成夹心复合物、进行RCA-PLA和用荧光标记的检测探针来标记扩增子。接着将被标记珠粒引入至流量槽中，且如果珠粒是磁性的，那么在流量槽中捕捉珠粒。在各实施例中，可基于荧光标记的被编码珠粒的鉴别使分析以光谱方式多重化。在各实施例中，用于多色检测的激发光源和发射光检测器可以用于检测结合事件，定量是通过计数具有两种可检测标记的珠粒或包含经可检测标记的延伸产物的这些珠粒来实现，且定量还通过积分强度，例如通过对于所有结合事件在信号上积分进行检测来实现。因此，可以提供一种用于上文所述的方法的试剂盒，其在一个或多个小瓶、容器或隔室中包含以下中的一种或多种：(a)具有捕捉试剂的磁性或非磁性珠粒；(b)具有可区分的荧光标记的两种检测试剂；和(c)任选的用于分析方案的缓冲剂和/或稀释剂。可以用于上文所述的方法的另一试剂盒可以在一个或多个小瓶、容器或隔室中包含以下中的一种或多种：(a)具有捕捉试剂的磁性或非磁性珠粒；(b)被核酸探针修饰的两种检测试剂(任选地，分开提供检测试剂且另外与说明书一起提供邻近探针(1和2)，以用探针修饰检测试剂)；和(c)荧光标记的探针；用邻近探针修饰检测试剂所需的任选的试剂；分析稀释剂、校准剂、环化寡核苷酸、连接混合物或其组分，例如连接缓冲液、ATP、BSA、Tween 20、T4 DNA连接酶；RCA混合物或其组分，例如BSA、缓冲液、dNTP、Tween 20、Phi29 DNA聚合酶。
在另一实施例中，本文所述的方法可应用于流量槽分析的、基于珠粒的形式。在这类系统中，使用的珠粒可以是磁性的且珠粒的表面被修饰以包含捕捉试剂的一个或多个拷贝。如本文所述，此系统中采用的检测试剂是被核酸探针修饰的一对检测试剂，在此情况下，免疫分析方法包含延伸方法，例如RCA-PLA，以产生指示可检测的各检测试剂的存在的扩增产物。测量步骤包含在珠粒上形成夹心复合物、进行RCA-PLA和用ECL标记的检测探针来标记扩增子。接着将被标记珠粒引入至流量槽中且在流量槽中捕捉珠粒。具体来说，施加磁场以将磁性粒子，例如珠粒吸引至电极表面，其可以包括各种金属，例如铂。电压源用于向电极施加电压且发射光检测器可以用于检测结合事件；定量是通过计数具有经可检测标记的延伸产物的珠粒来实现，且定量还通过积分强度，例如通过对于所有结合事件在信号上积分进行检测来实现。可以用于上文所述的方法的试剂盒可以在一个或多个小瓶、容器或隔室中包含以下中的一种或多种：(a)具有捕捉试剂的磁珠；(b)被核酸探针修饰的两种检测试剂(任选地，分开提供检测试剂且另外与说明书一起提供邻近探针(1和2)，以用探针修饰检测试剂)；和(c)ECL标记的探针；用邻近探针修饰检测试剂所需的任选的试剂；分析稀释剂、校准剂、环化寡核苷酸、连接混合物或其组分，例如连接缓冲液、ATP、BSA、Tween20、T4DNA连接酶；RCA混合物或其组分，例如BSA、缓冲液、dNTP、Tween 20、Phi29 DNA聚合酶。
在流量槽分析的、基于珠粒的形式的一个具体实施例中，样品与生物素标记的单克隆分析物特异性捕捉抗体和单克隆分析物特异性抗体的混合物一起培育，各抗体结合于寡核苷酸，其反应形成夹心复合物。在添加抗生蛋白链菌素涂布的微米粒子之后，复合物通过生物素与抗生蛋白链菌素之间的相互作用而结合于固相。将连接混合物添加至混合物中，且将混合物与连接混合物一起培育，洗涤以去除过量环化寡核苷酸，且与RCA混合物一起培育。混合物经洗涤且添加生物素标记的检测探针的混合物。为了并入适合的标记，例如发光、化学发光或电化学发光标记，例如SULFO-TAG，合成具有末端生物素标记的检测探针且预先结合于SULFO-TAG标记的抗生蛋白链菌素。将反应混合物抽吸至测量元件中，其中将微米粒子磁性捕捉至电极(例如金属电极，诸如铂电极)的表面上。接着用适合的洗涤缓冲液，例如PROCELL(含TPA的缓冲液)去除未结合物质。接着向电极施加电压，诱导化学发光发射，其是通过光电倍增器来测量。可以在任何适合的流量槽，例如COBAS和/或ELECSYS仪器(购自Hoffmann-La Roche LTD.)中进行施加电压和测量所得发射。
在另一实施例中，本文所述的方法可应用于基于珠粒的形式，以毛细流动数位地计数各个分子。在这类系统中，使用的珠粒可以是磁性的且珠粒的表面被修饰以包含捕捉试剂的一个或多个拷贝。此系统中采用的检测试剂是包含可区分的荧光标记的一对检测试剂。测量步骤包含形成包含捕捉试剂、分析物和检测试剂的夹心复合物；交联检测试剂；洗脱检测试剂；和将珠粒引入至流量槽中。用于多色检测的激发光源和发射光检测器可以用于检测结合事件，定量是通过关联流量槽中两个荧光团的检测来实现，且定量还通过积分强度，例如通过对于所有结合事件在信号上积分进行检测来实现。可以用于上文所述的方法的试剂盒可以在一个或多个小瓶、容器或隔室中包含以下中的一种或多种：(a)具有捕捉试剂的磁珠；(b)具有可区分的荧光标记的两种可交联检测试剂；和(c)任选的用于分析方案的缓冲剂和/或稀释剂。
此外，本文所述的方法可应用于基于珠粒的形式，其包含将珠粒分离至各个纳米孔中。在这类系统中，使用的珠粒可以是磁性的且珠粒的表面被修饰以包含捕捉试剂的一个或多个拷贝。此系统中采用的检测试剂是包含可区分的酶标记的一对检测试剂。测量步骤包含形成包含捕捉试剂、分析物和检测试剂的夹心复合物，和添加用于两种酶标记的底物。接着在各个纳米孔中捕捉珠粒。分析可基于具有不同光谱特性的酶产物的鉴别而以光谱方式多重化。用于多色检测的激发光源和发射光检测器可以用于检测结合事件，定量是通过计数含有两种酶产物的纳米孔来实现，且定量还通过积分强度，例如通过对于所有纳米孔在信号上积分进行检测来实现。可以用于上文所述的方法的试剂盒可以在一个或多个小瓶、容器或隔室中包含以下中的一种或多种：(a)具有捕捉试剂的磁珠；(b)各自经可区分的酶标记修饰的两种检测试剂，例如生物素标记的检测试剂和半抗原结合检测试剂；(c)抗生蛋白链菌素-β半乳糖苷酶、抗半抗原结合酶、试卤灵-β-d-哌喃半乳糖苷；(d)阵列，例如QUANTERIX DVD格式阵列；(e)碳氟油；和(f)任选的用于分析方案的缓冲剂和/或稀释剂。在此具体实施例中，通过组合使用纳米孔高灵敏度系统与基于邻近度的检测系统来增强可检测信号。尽管使用具体基于邻近度的检测系统来说明此具体实施例，但熟练技术人员应理解如下事实：本文所述的其它基于邻近度的检测系统还可以用于增强分析中的可检测信号，例如FRET供体/受体系统；就光谱特性来说彼此不同的发光标记；或使用如上文所述的第一和第二酶(其为水解酶)，和适当的伴随底物。
另外，本文所述的方法可应用于基于珠粒-阵列的平台。在这类系统中，使用的珠粒可以是非磁性的且珠粒的表面被修饰以包含捕捉试剂的一个或多个拷贝。此系统中采用的检测试剂是包含第一和第二核酸探针的一对检测试剂。测量步骤包含形成包含捕捉试剂、分析物和检测试剂的夹心复合物；延伸探针中的一个以形成延伸序列，其中延伸取决于夹心复合物中第一和第二探针的共定位；用荧光探针标记延伸序列；和将延伸序列从表面释放至洗脱剂中。用于多色检测的激发光源和发射光检测器可以用于检测结合事件，定量是通过计数各个经可检测标记的延伸产物来实现，且定量还通过积分强度，例如通过对于所有结合事件在信号上积分进行检测来实现。可以用于上文所述的方法的试剂盒可以在一个或多个小瓶、容器或隔室中包含以下中的一种或多种：(a)具有捕捉试剂的非磁性珠粒；(b)被核酸探针修饰的两种检测试剂(任选地，分开提供检测试剂且另外与说明书一起提供邻近探针(1和2)，以用探针修饰检测试剂)；和(c)荧光标记的探针；用邻近探针修饰检测试剂所需的任选的试剂；分析稀释剂、校准剂、环化寡核苷酸、连接混合物或其组分，例如连接缓冲液、ATP、BSA、Tween 20、T4 DNA连接酶；RCA混合物或其组分，例如BSA、缓冲液、dNTP、Tween 20、Phi29 DNA聚合酶。
可以使用包含分析中采用的一组组分的一个或多个试剂盒来进行本文所述的结合分析。例如，用于检测样品中的分析物的试剂盒在一个或多个小瓶、容器或隔室中包含：包含用于分析物的捕捉试剂和锚定试剂的表面；和连接至核酸探针的用于分析物的检测试剂。这类试剂盒可以包含包括锚定寡核苷酸序列的锚定试剂。
可以用于进行本文所述的方法的另一试剂盒在一个或多个小瓶、容器或隔室中包含：包括用于分析物的捕捉试剂和包括锚定寡核苷酸序列的锚定试剂的表面；连接至第一核酸探针的第一检测试剂；和连接至第二核酸探针的第二检测试剂。
可以用于进行本文所述的结合分析的另一试剂盒在一个或多个小瓶、容器或隔室中包含：包括用于分析物的捕捉试剂和锚定试剂的表面；包括第一邻近探针的用于分析物的第一检测试剂；包括第二邻近探针的用于分析物的第二检测试剂；和连接序列，其包括(i)与第二邻近探针互补的内部序列，和(ii)与第一邻近探针的不重叠区域互补的两个末端序列。或者，试剂盒可替代地包含包括用于分析物的捕捉试剂和锚定试剂的表面；包括第一邻近探针的用于分析物的第一检测试剂；包括第二邻近探针的用于分析物的第二检测试剂；和(i)第一连接寡核苷酸和(ii)第二连接寡核苷酸，其中(x)第一连接子的第一端和第二连接子的第一端与第一邻近探针的两个不重叠区域互补，且(y)第一连接子的第二端和第二连接子的第二端与第一邻近探针的两个不重叠区域互补。另外，这些试剂盒中的任一个或两个中的锚定试剂可以包含锚定寡核苷酸序列。
此外，可以使用试剂盒进行本文所述的方法，所述试剂盒在一个或多个小瓶、容器或隔室中包含包括第一可检测标记的第一检测试剂；包括第二可检测标记的第二检测试剂；被配置成含有一个或更少的分析物分子的多个反应容器；和任选的包括捕捉试剂的表面。
最后，使用本文所述的方法检测分析物的试剂盒可以在一个或多个小瓶、容器或隔室中包含包括固定捕捉试剂的表面；具有第一可检测标记的第一检测试剂；具有第二可检测标记的第二检测试剂；和对第一和第二检测试剂具有反应性的交联剂。交联剂可以包含多官能性交联剂，其连接与检测试剂连接的反应性部分或与检测试剂连接的结合部分的多价结合搭配物。适合的多官能性交联剂包含但不限于胺、硫醇、酰肼、醛、酯、碘乙酰胺、顺丁烯二酰亚胺、点击化学试剂以及其组合。同样，多价结合搭配物的实例是靶向检测试剂的多价抗物种抗体，所述检测试剂是所述动物物种的抗体。当与连接至检测试剂的伴侣结合搭配物配对时，交联剂还可以包含抗生蛋白链菌素、抗生物素蛋白或生物素。交联剂还可以是包含与直接或间接结合于试剂盒组分的核酸探针互补的序列的寡核苷酸。在一个具体实施例中，本文所述的方法中所用的试剂盒在一个或多个小瓶、容器或隔室中包含：包括固定捕捉试剂的表面；具有第一可检测标记和第一核酸探针的第一检测试剂；具有第二可检测标记和第二核酸探针的第二检测试剂；和具有与第一和第二核酸探针互补的区域的第三核酸。
本文所述的试剂盒的表面可以包含用于一个或多个分析物分子的多种捕捉试剂，其中捕捉试剂跨越位于表面上的多个可分辨结合区或反应容器分布，例如在阵列、多孔盘或微孔或纳米孔盘中。另外，表面还可以包含多个粒子，其各自包括多种用于分析物分子的捕捉试剂。
上文所描述的试剂盒可以进一步包含以下中的一种或多种：一种或多种额外试剂、缓冲剂、聚合酶、连接酶和/或dNTP(被标记或未标记)。另外，如果一种或多种检测试剂包括可检测标记，那么试剂盒还可以包含用于试剂盒中采用的可检测标记的共反应物。或者，如果一种或多种检测试剂是偶联酶反应系统的组分，那么检测试剂中的每一个包括第一和第二酶，且试剂盒在一个或多个容器、小瓶或隔室中进一步包含用于偶联酶反应系统的一种或多种底物，且任选地包含被配置成结合于偶联酶反应系统的产物的被标记组分。例如，第一酶可以是氧化酶，第二酶是过氧化酶，且试剂盒进一步包含氧化酶底物和被标记的酪酰胺衍生物。在另一实施例中，第一和第二可检测试剂包括邻近依赖性检测系统的组分，例如FRET供体和FRET受体，或就光谱特性来说彼此不同的发光标记。
其它替代实施例
另一实施例说明于图7中。图(a)中的夹心免疫分析复合物中的各邻近探针的一部分经与各片段杂交的RNA的短股暂时保护。以酶方式去除RNA股，以使得邻近探针中的每一个可彼此杂交且使用生物素标记的dNTP通过聚合酶延伸来延伸链(图(b))。并入至链中的各生物素标记的碱基结合于经可检测标记标记的抗生蛋白链菌素(图(c))。
另一方法说明于图8中。邻近探针可连接至锚定试剂和检测试剂(如图(a)中所示)，或邻近探针中的每一个可连接至如上文所描述的两种检测试剂(未示出)。与图7中所说明的方法非常相似，各邻近探针的一部分经与各片段杂交的RNA的短股暂时保护。以酶方式去除RNA股，以使得邻近探针中的每一个可彼此杂交且使用生物素标记的dNTP通过聚合酶延伸来延伸链(图(b))。并入至链中的各生物素标记的碱基结合于经可检测标记标记的抗生蛋白链菌素(图(c))。
图18中示出了另一实施例。在此实施例中，多个短寡核苷酸用作U形钉序列(1801)以与扩增子的一部分杂交，且因此将产物折叠为易于成像的紧凑结构。各U形钉序列包括至少两个序列(分别是1802和1803)，其各自与扩增子的序列互补，且当各U形钉序列与其补体杂交时，扩增子折叠回自身，如图18中所示。另外，如上文所描述，扩增子还可以按通过与锚定试剂(1804)的锚定相互作用粘附至表面。可以通过在扩增步骤期间将U形钉序列添加至反应混合物而原位进行装订过程。因此，在完成各扩增循环时，U形钉序列自由地与新形成的扩增子杂交且使其折叠。还可以在完成扩增过程之后添加U形钉，使得线性扩增子折叠为线圈或平板，其取决于U形钉序列和其对应补体的设计。标记分子，例如ECL或荧光可并入至U形钉序列中(或其可如上所述地并入至扩增子中)。此实施例将在表面上产生三维结构，从而产生较高信号密度的较小特征，其使得更容易在表面上对扩增子成像。
手动和自动实施例
可手动、使用自动化技术或两者来进行本文公开的方法。自动化技术可以是部分自动化的，例如一个或多个模块化仪器，或完全整合的自动化仪器。
例示性自动化系统讨论和描述于共有的国际专利申请公开案第WO 2018/017156号和第WO 2017/015636号和国际专利申请公开案第WO 2016/164477号中，其各自以全文引用的方式并入本文中。
可以在其上进行本文方法的自动化系统(模块和完全整合)可以包括以下自动化子系统：计算机子系统，其可以包括硬件(例如个人计算机、膝上型计算机、硬件处理器、光盘、键盘、显示器、打印机)、软件(例如程序，诸如驱动器、驱动器控制器和数据分析器)和数据库；液体处理子系统，例如样品处理和试剂处理，例如自动移液头、注射器、搅拌设备、超声波混合设备、磁性混合设备；样品、试剂和消耗品储存和处理子系统，例如机器人操作臂、管或盖或箔穿刺设备、盖去除设备，传送设备，诸如线性和环形传送机和机器人操作臂、管架、盘托架、槽托架、吸管端托架、盘振荡器；离心机、分析反应子系统，例如基于流体和基于消耗品(诸如管和多孔盘)；容器和消耗品洗涤子系统，例如盘洗涤设备；磁力分离器或磁性粒子浓缩器子系统，例如流量槽、管和盘型；细胞和粒子检测、分类和分离子系统，例如流式细胞仪和库尔特计数器；检测子系统，诸如比色、浊度、荧光和ECL检测器；温度控制子系统，例如空气处理、空气冷却、空气升温、风扇、鼓风机、水浴；废物子系统，例如液体和固体废物容器；全局唯一标识符(GUI)检测子系统，例如1D和2D条形码扫描仪，诸如平板和棒型；样品标识符检测子系统，例如1D和2D条形码扫描仪，诸如平板和棒型。分析子系统，例如色谱系统，诸如高效液相色谱(HPLC)、快速蛋白质液相色谱(FPLC)和质谱仪还可以是模块或完全整合的。
进行样品鉴别和制备的系统或模块可以与进行分析和进行检测或进行两者的系统或模块组合(或与其邻接或邻近或机械连接或耦接)。相同种类的多个模块化系统可被组合以提高通量。模块化系统可以与进行其它类型的分析，诸如化学、生物化学和核酸分析的模块组合。
自动化系统可允许分批、连续、随机存取和实时工作流程以及单一、中等和高样品通量。
系统可以包括例如以下装置中的一种或多种：盘封口机(例如Zymark)、盘清洗机(例如BioTek、TECAN)、试剂分配器和/或自动移液站和/或液体处理站(例如TECAN、Zymark、Labsystems、Beckman、Hamilton)、培育箱(例如Zymark)、盘振荡器(例如Q.Instruments、Inheco、Thermo Fisher Scientific)、化合物库或样品储存和/或化合物和/或样品检索模块。这些装置中的一种或多种通过机器人总成耦接至本发明的设备，以使得可自动进行整个分析过程。根据替代实施例，在设备和各种装置(例如盘堆叠)之间手动移动容器(例如盘)。
自动化系统可被配置成执行以下功能中的一种或多种：(a)将诸如盘的消耗品移至检测子系统中、在检测子系统内部移动和移出检测子系统，(b)在其它子系统之间移动消耗品，(c)储存消耗品，(d)样品和试剂处理(例如适于混合试剂和/或将试剂引入至消耗品中)，(e)消耗品振荡(例如用于混合试剂和/或提高反应速率)，(f)消耗品洗涤(例如洗涤盘和/或进行分析洗涤步骤(例如孔抽吸))，(g)测量流量槽或消耗品(诸如管或盘)中的ECL。自动化系统可被配置成处理置于架子、多孔盘(诸如96或384孔盘)中的各个管。
在如本文所述的自动化系统中整合组件和模块的方法是所属领域中众所周知的，参见例如Sargeant等人,平台完善，医疗产品外包(Platform Perfection,MedicalProduct Outsourcing),2010年5月17日。
在实施例中，自动化系统是全自动的、模块化的、计算机化的、对大范围的分析物进行体外定量和定性测试且进行光度分析、离子选择性电极测量和/或电化学发光(ECL)分析。在实施例中，系统包括以下硬件单元：控制单元、核心单元和至少一个分析模块。
在实施例中，控制单元使用图形用户介面来控制所有仪器功能，且由诸如监视器的读出装置、诸如键盘和滑鼠的输入装置和例如Windows操作系统的个人计算机使用构成。在实施例中，核心单元由管理向各分配的分析模块输送样品的若干组件构成。核心单元的实际组成取决于分析模块的配置，分析模块可由所属领域的技术人员使用所属领域中已知的方法来配置。在实施例中，核心单元包括至少取样单元和一个齿条转子作为主要组件。输送线和第二齿条转子为可能的扩展。若干其它核心单元组件可以包含样品架装载器/卸载器、端口、条形码读取器(用于架子和样品)、供水系统和系统接口端口。在实施例中，分析模块进行ECL分析且包括试剂区域、测量区域、消耗品区域和预清洁区域。
实例
实例1.邻近连接和滚环扩增的一般方案
通过添加邻近探针1和2如下地修饰针对目标分析物的一对检测抗体：向含200μg第一检测抗体的100μL缓冲液中添加1.74μL 23mM磺基-SMCC，在150mM磷酸盐缓冲液中稀释，且在室温下培育30分钟。通过尺寸排阻色谱去除游离磺基-SMCC。检测抗体的最终浓度是2mg/mL或稍低。在室温下持续1小时用5μL含1mM DTT的100mM磷酸盐缓冲液、0.5mM EDTA，pH 8.4还原九十五(95)μL的300μM硫醇修饰的寡核苷酸(邻近探针1和2)。邻近探针1和2的序列是：
硫醇修饰的邻近探针1：SH-AAA AAA AAA AGA CGC TAA TAG TTA AGA CGC TTU UU(SEQ ID No.1；其中三个U残基为2'O-甲基RNA)
硫醇修饰的邻近探针2：SH-AAA AAA AAA ATA TGA CAG AAC TAG ACA CTC TT(SEQID No.2)。
例如通过使用三个旋转柱分离物去除过量磺基-SMCC和DTT，且将抗体和DNA合并以用于共价结合。将溶液在室温下在混合下培育1小时。例如通过尺寸排阻色谱纯化抗体-邻近探针结合物，以去除未结合的抗体和寡核苷酸。
用适当封闭溶液将MSD盘封闭1小时且洗涤。盘上的各结合域包含捕捉抗体和锚定部分(以BSA-寡核苷酸结合物形式固定，寡核苷酸选择为对滚环扩增子具有特异性)。此实例中所用的锚定寡核苷酸的序列是5'-AAGAGAGTAGTACAGCAGCCGTCAAAAAAAAAAAA-/3ThioMC3-D/-3'(SEQ ID NO:3)。将二十五(25)μl的各分析稀释剂和校准剂，或样品(按需要稀释)(产生50μL总体积)添加至各孔中。将盘在振荡下培育1-3小时且洗涤各孔。将如上文所述制备的用邻近探针1和2标记的检测抗体的溶液添加至各孔中(每孔25μL)，且在振荡下培育1-2小时(或者，可以依序添加各个检测抗体，其中各添加之后为1小时培育)。将包含以下组分的连接混合物添加至各孔中：(i)环化寡核苷酸1(4nM)、环化寡核苷酸2(4nM)、连接缓冲液、ATP(1mM)、T4 DNA连接酶(0.15U/μL)，其中环化寡核苷酸中的每一个是：
环化寡核苷酸1：磷酸-CTA TTA GCG TCC AGT GAA TGC GAG TCC GTC TAA GAGAGT AGT AGA GCA GCC GTC AAG AGT GTC TA(SEQ ID No.4)。
环化寡核苷酸2：磷酸-GTT CTG TCA TAT TTA AGC GTC TTAA(SEQ ID No.5)。
将盘与连接混合物一起在室温下培育30分钟，洗涤以去除过量环化寡核苷酸，且与RCA混合物一起在37℃下培育1.5小时，其中RCA混合物含有RCA缓冲液、dNTP(各250μM)、Phi29 DNA聚合酶(0.125U/ml)。盘经洗涤且添加检测探针的混合物且在37℃下培育30分钟，其中检测探针混合物包含：20mM Tris、1mM SDTA、250mM NaCl、0.01％ Triton、BSA(200μg/ml)、Tween 20(0.05％)、检测探针(6.25nM)。检测探针是序列CAG TGAATG CGA GTC CGTCT(SEQ ID No.6)。为了并入电化学发光标记SULFO-TAG(Meso Scale Diagnostics)，合成了具有末端生物素标记的检测探针且与SULFO-TAG标记的抗生蛋白链菌素预先结合。将盘洗涤且用150μl MSD读取缓冲液填充且立即在MSD 6000读取器上读取(盘和读取器由Meso Scale Discovery,Rockville,MD供应)。
此通用程序用于检测以下分析物：肌钙蛋白I、Akt(总)、磷酸化Akt(473)、磷酸化Akt(308)、A型流感核蛋白(NP)、IL-12p40、IL-12p70、Aβ1-42、使用TNFα模型系统的桥接和同型分析Ig分析、使用B型肝炎表面抗原的桥接和同型分析Ig分析以及使用Lyme C6的桥接和同型分析Ig分析。相对于标准夹心免疫分析的ECL信号和分析灵敏度的增加在分析之间改变，但观察到高达100倍的改良。对于某些测试的分析，例如肌钙蛋白-I、Akt(总)、IL-12p40、IL-12p70和Aβ1-42，锚定部分的存在通过防止检测复合物在扩增步骤期间解离而改良信号和/或稀释线性。图9中示出了根据上文所述的程序进行的IL-10分析的校准曲线。另外，表2(下文)展示相对于来自Meso Scale Diagnostics(MSD),Rockville,MD的标准双抗体免疫分析方案(第3栏，“MSD V-Plex 2-AB免疫分析方案”)的LOD，根据上文所述的程序进行的一组代表性分析(第2栏，“3-AB RCA/PLA分析”)的LOD。
表2.
实例2.具有或不具有锚定试剂的分析方案
各用肌钙蛋白I捕捉抗体(220μg/mL)如上文实例1中所述地涂布MSD 7点MULTI-SPOT盘。捕捉抗体在具有或不具有锚定部分BSA的情况下共点样，对扩增子具有特异性的寡核苷酸共价连接至所述锚定部分(5μg/mL锚定物，如果存在)。将二十五(25)μl的各分析稀释剂、校准剂或样品(按需要稀释)添加至各孔中(总共50μl)。将盘在振荡下培育2小时且洗涤各孔。将如上文所述制备的用邻近探针1和2标记的检测抗体的溶液添加至各孔中(每孔25μL)，且在振荡下培育1小时。如上文实例1中所述，将连接混合物添加至各孔中。如上文实例1中所述，将盘与连接混合物一起在室温下培育30分钟，洗涤以去除过量环化寡核苷酸，且与RCA混合物一起在37℃下培育1.5小时。如上文实例1中所述，盘经洗涤且添加检测探针的混合物且在37℃下培育30分钟。盘经洗涤且用150μl MSD读取缓冲液填充且立即在MSDSECTOR 6000读取器上读取。从盘顶部去除MSD电极以进行荧光成像，且用PBS和盖玻片保持润湿。用Zyla相机、20×物镜、2×2像素组合(binning)、客户滤光器组、在2秒曝光下在显微镜上查看表面。
如表3(下文)中所示，在锚定试剂存在下，ECL值高4-5倍，且检测极限低三倍(更灵敏)。
表3
图10(a)和(b)展示具有(组(a))和不具有5μg/mL锚定试剂(组(b))的盘表面的荧光显微镜影像。影像展示与各个结合事件相关的亮荧光点，且证实在锚定试剂存在下，RCA扩增更高效地产生可观察结合事件。
实例3.一个与两个连接寡核苷酸的比较
使用具有一个连接位点的单一线性连接寡核苷酸替代具有两个独立连接位点的两个连接寡核苷酸来重复实例2中所述的分析，以形成环状模板。如图11(a)中所示，制备在连接位点1或连接位点2处开放的单一线性连接寡核苷酸。将两个单一线性连接寡核苷酸与实例1和2中所用的寡核苷酸，Circ-1和Circ-2的组合并排测试。采用实例2中所述的方案且另外，在三种浓度下测试单一线性连接寡核苷酸：125nM、62.5nM和31nM，而使用Circ-1和Circ-2寡核苷酸的组合的标准分析是在125nM下测试。如图11(b)中所示，两个单一线性连接子寡核苷酸以与双组分连接寡核苷酸混合物(Circ-1和Circ-2)大致相同的效率成功地并入至RCA扩增产物中。基于信号强度、非特异性背景和总体灵敏度，在连接位点1处开放的单一线性连接寡核苷酸具有与双组分连接子混合物类似的性能。如所预期，在连接位点2处开放的单一线性连接寡核苷酸具有更高的非特异性背景和更低的灵敏度。在此后一种情况下，连接和引发均仅取决于邻近探针#1的存在；因此，丧失了邻近扩增方法的一些特异性益处。
实例4.使用替代邻近探针、锚定寡核苷酸和连接序列进行的三抗体分析
使用实例1中概述的方案，使用以下替代试剂组进行分析：
表4
下表5中的结果是针对肌钙蛋白分析，其中肌钙蛋白的浓度是500pg/mL且MULTI-SPOT盘的各孔包含具有来自表4中所列的组中的一个的锚定寡核苷酸的一个捕捉点。所述分析使用一个邻近探针(1)和一个邻近探针(2)，浓度与实例1中所述相同。组(a)-(c)的非特异性结合更高，因为与实例1中所述相比，其具有高9倍的检测寡核苷酸-SA-STAG的浓度。检测寡核苷酸-SA-STAG的较高浓度由一起滴定预结合复合物，而非如同实例1单独滴定SA-STAG而产生。
表5.
PLA组 (a) (b) (c) 实例1
肌钙蛋白 178,560 138,540 189,166 273,261
零肌钙蛋白 412 314 545 88
实例5.在其它免疫分析平台上进行的三抗体分析
(a)使用编码粒子的基于珠粒的免疫分析形式
在96孔过滤盘中进行所有分析步骤。用真空歧管(不超过10英寸Hg)从盘去除液体。切勿将盘翻转过来。如果发生堵塞，那么使用15ml锥形管的尖端轻轻按压堵塞孔下方的区域，且接着使用1ml巴斯德吸管橡胶球或将拇指置于堵塞孔上以通过产生压力来去除堵塞物。在最终抽吸步骤后，在一叠纸巾上轻轻敲打盘的底部且接着用Kimwipe轻擦过滤盘底部，以去除残余液体/液滴。
洗涤溶液制备：通过用285ml去离子水稀释20×洗涤溶液瓶的全部内容物来制备1×工作洗涤溶液。
分析标准品制备：在100％分析稀释剂(血清和血浆样品)或50％分析稀释剂/50％组织培养基(组织培养上清液)中复原冻干标准品；复原体积：(i)1小瓶：1ml；(ii)2小瓶：每小瓶0.5ml。在室温下再水化8-10分钟。轻轻翻转小瓶几次且使小瓶再静置3-5分钟以确保完全水合。如果使用超过1种标准品，那么组合相等体积的各标准品且轻轻混合。进行复原标准品的3倍连续稀释以制备七点标准曲线。
分析物捕捉：
(1)涡旋(30秒)且声波处理(30秒)10×捕捉珠粒储备液。在箔片包装管中，将10×捕捉珠粒储备液(每孔2.5μL)在工作洗涤溶液(每孔25μL，每个分析约2,000至5,000个珠粒)中稀释。为了更高程度的多重化，调节工作洗涤溶液的体积以顾及保留的10×捕捉珠粒储备液的额外体积。
(2)用200μl工作洗涤溶液预润湿标准品和样品孔。
(3)涡旋(30秒)且声波处理(30秒)稀释的捕捉珠粒溶液。立即向各分析孔添加25μl，接着添加200μL的1×洗涤溶液。抽吸且用200μL工作洗涤溶液重复洗涤。按需要轻敲和轻擦过滤盘底部。
(4)向所有分析孔中添加50μl培育缓冲液。
(5)向指定孔中添加100μl标准品。对于指定用于样品的孔，添加50μl分析稀释剂，接着添加50μl样品。将盘覆盖且在室温下在轨道盘振荡器(500-600rpm)上培育2小时。在所有培育期间用不透明盖覆盖分析盘以避光。可能需要根据定轨振荡器的半径来调整速度。
分析物检测
(6)制备荧光标记的检测抗体的1×混合物：在稀释剂(每孔100μL)中稀释10×检测抗体混合物(每孔10μL)。混合物包含对所关注分析物具有特异性的一对检测抗体，一个用Alexa Fluor 350(蓝色荧光标记)标记且另一个用Alexa Fluor 594(红色荧光标记)标记(这些荧光标记中的每一个购自Life Technologies,Grand Island,NY,www.lifetechnologies.com)。为了更高程度的多重化，调节稀释剂的体积以顾及所需的10×抗体混合物储备液的额外体积。抽吸且用200μl工作洗涤溶液洗涤分析孔两次。将100μl稀释的检测抗体混合物添加至各分析孔。将盘覆盖且在盘式振荡器(500-600rpm)上培育1小时。
分析读取
(8)抽吸且用200μl工作洗涤溶液洗涤分析孔3次。用干净的纸巾擦干过滤盘底部以完全去除所有残余液滴。将100μl工作洗涤溶液添加至各分析孔且将盘置于盘式振荡器(500-600rpm)上2-3分钟。
(9)在包含用于各荧光标记的色彩通道的多色荧光粒子分析仪(诸如FACS系统或改良的XMAP仪器)中分析珠粒悬浮液。为了使灵敏度最大，在任何粒子可能仅具有零个或一个结合分析物的条件下执行分析，且通过计数对包括两个荧光标记的给定分析物具有特异性的粒子的数目(基于粒子编码)来定量分析物的量。任选地，分析可以使用编码珠粒以多重形式执行，其中编码指示珠粒上的捕捉抗体的分析物特异性，和额外检测抗体对针对各分析物的特异性。当确定编码时(如在使用并入珠粒中的额外荧光颜色的XMAP中)，分析仪应具有额外检测通道，用于测量额外颜色和鉴别珠粒编码。
(b)使用包含锚定部分的编码粒子，使用被核酸探针修饰的两种检测试剂的基于珠粒的免疫分析形式
如实例5(a)中所概述，所有分析步骤均在96孔过滤盘中进行。如实例5(a)中所描述来制备洗涤溶液和分析标准品，且如实例1中所述，通过添加邻近探针1和2来修饰针对目标分析物的一对检测抗体。如实例5(a)中所述，在捕捉珠粒上捕捉分析物。捕捉珠粒包含以BSA-寡核苷酸结合物形式固定至珠粒表面的锚定部分，其中选择对滚环扩增子具有特异性的寡核苷酸。所用锚定寡核苷酸的序列是SEQ ID NO:3。
将二十五(25)μl分析稀释剂、校准剂或样品(按需要稀释)与捕捉珠粒的混合物混合。将混合物在振荡下培育1-3小时且洗涤。将如上文所述制备的用邻近探针1和2标记的检测抗体的溶液添加至混合物中，且在振荡下培育1-2小时(或者，可以依序添加各各个检测抗体，其中各添加之后为1小时培育)。添加实例1中所述的连接混合物。将混合物与连接混合物一起在37℃下培育30分钟，洗涤以去除过量环化寡核苷酸，且与RCA混合物一起在37℃下培育1.5小时，其中RCA混合物如上文实例1中所述。混合物经洗涤且添加荧光素标记的检测探针的混合物且在37℃下培育30分钟，其中检测探针混合物如上所述。混合物经洗涤且将粒子抽吸至多通道荧光粒子分析仪中。
(c)基于珠粒的形式和将捕捉分析物分子分离至各个纳米孔中
在100μl的25％牛血清(2-4倍稀释)中制备样品且将涂布有捕捉抗体的500K珠粒(顺磁2.7μm，任选地被荧光编码)添加至样品。将样品在23℃下培育约2小时。样品用PBS(5×，0.1％ Tween-20)洗涤三次，且添加被标记检测抗体的混合物(包含第一生物素标记的检测抗体和半抗原结合抗体的混合物)。将混合物在23℃下培育约1小时。将混合物用PBS(5×，0.1％ Tween-20)洗涤三次，添加酶标记抗生蛋白链菌素-β-半乳糖苷酶(40pM)，还添加抗半抗原结合酶，且将混合物在23℃下培育约30分钟(或在SIMOA分析仪中培育3分钟)。将混合物用PBS(5×，0.1％ Tween-20)洗涤七次且添加酶底物，15μl试卤灵-β-d-哌喃半乳糖苷(100μM，于加样缓冲液中)。
将混合物抽吸至纳米孔阵列(由QUANTERIX以DVD格式提供，由环烯烃聚合物制成，每个圆盘具有24个样品)上且使其沉降约2分钟。阵列用缓冲液冲洗，阵列用氟碳油密封，在23℃下培育2-5分钟，且在多色荧光成像仪上读取结果。影像分析用于计数含有两种荧光酶产物的纳米孔的数目且因此提供与样品中分析物的浓度相关的值。
(d)分析的流量槽，基于珠粒的免疫分析形式
第一培育：使10μl样品，生物素标记的单克隆分析物特异性捕捉抗体(2.6mg/l的工作溶液)和各结合于寡核苷酸的单克隆分析物特异性抗体的混合物(0.3mg/l的工作溶液)反应以形成夹心复合物。如同实例1制备单克隆分析物特异性抗体的混合物，且混合物包含如上文实例1中所述的结合于邻近探针1和2的一对抗体。
第二培育：在添加抗生蛋白链菌素涂布的微米粒子(DYNAL M280，2.8μm，0.72mg/ml，生物素的结合能力是470ng/mg)之后，复合物通过生物素与抗生蛋白链菌素之间的相互作用变得与固相结合。将连接混合物添加至混合物，其中根据实例1中所述的方案制备连接混合物。如实例1中所述，将混合物与连接混合物一起在37℃下培育30分钟，洗涤以去除过量环化寡核苷酸，且与RCA混合物一起培育。混合物经洗涤且添加生物素标记的检测探针的混合物且在37℃下培育30分钟，其中如实例1中所描述来制备检测探针混合物。为了并入电化学发光标记SULFO-TAG(Meso Scale Diagnostics)，合成了具有末端生物素标记的检测探针且与SULFO-TAG标记的抗生蛋白链菌素预先结合。
将反应混合物抽吸至测量元件中，其中将微米粒子磁性捕捉至电极表面上。接着用PROCELL(含TPA的缓冲液)去除未结合物质。接着向电极施加电压，诱导化学发光发射，其是通过光电倍增器来测量。通过校准曲线(其为通过2点校准专门产生的仪器)和通过试剂条形码提供的主曲线来确定结果。
实例6.检测HIV-1P24
材料、方法和结果：
实例1中所述的程序用于检测HIV-1p24。自HIV-1混合效价性能组(购自SeracareLife Sciences,www.seracarecatalog.com)、HIV-1血清转化组(亦购自Seracare LifeSciences)、HIV抗体阳性样品(购自ProMedDx,LLC，www.promeddx.com)和正常匹配样品(购自Bioreclamation，www.bioreclamation.com)测试大约64个血清或血浆样品。图12中示出了根据上文所述的程序进行的HIV-1p24分析的校准曲线。发现分析的LOD为1.3fg/mL，LLOQ是3.0fg/mL，且ULOQ是37,500fg/mL。25μL样品的1.3fg/mL的检测极限对应于大致650个p24分子且各病毒粒子(分子)产生大约2000个p24蛋白的拷贝。
混合效价性能组PRA204(B)由根据市售分析(bioMerieux、Perkin Elmer和Zeptometrix)对于HIV p24抗原具有介于弱至强阳性范围内的反应性的一组十个样本组成。组中包含两个阴性样本。分析结果展示于下表6中：
表6.
对于大部分样品，HIV p24水平较高且高于ULOQ。所有十个阳性样品均为可检测的且与市售p24试剂盒类似，而阴性样品(基于商业分析，分别是PRA204(B)-10和-20)相当低，分别是大约3和2fg/mL。
血清转化组的分析结果展示于图13中。发现3抗体分析形式与PCR一样灵敏，且在来自PRB948和PRB962组的两个样品中检测第一阳性样品和p24水平的时间的估计延迟与PCR试剂盒类似且比其它商业p24分析表达更好。数据展示于表7中。
表7.
Abbott BBI是指Abbott BBI HIV-1抗原测试。
Coulter BBI是指Coulter BBI HIV-1抗原测试。
DuPont BBI是指DuPont BBI HIV-1抗原测试。
Inno.是指Innogenetics R129 HIV-1抗原测试。
Roche PCR是指Roche PCR HIV RNABBI测试。Coulter是指Coulter ELISAHIV-1抗原测试。
PE是指Perkin Elmer ELISAHIV-1抗原测试。
Zepto.是指Zeptometrix ELISA HIV-1抗原测试。Roche Ultra是指RocheUltrasensitive HIV-1RNA测试。
Roche标准是指Roche标准HIV-1RNA测试。
BLD＝低于检测极限且NT＝未测试。
结论：
最近感染HIV的患者对疾病传播的贡献不成比例。感染后最初几周的病毒负荷较高，且新感染的患者不太可能意识到其被感染且可将疾病传播给其它人。因此，急性HIV感染的早期检测对公共卫生非常重要。PCR方法为就灵敏度来说的黄金标准；其可检测少至60个HIV RNA拷贝/mL血清或血浆(30个病毒粒子/mL)。然而，PCR技术复杂且昂贵，且因此不适合于所有情形。免疫分析更简单且更便宜，但当前第4代p24免疫分析的检测极限仅为约10pg/mL，或大约2亿5千万个衣壳蛋白/mL。在每一病毒基础上，这些免疫分析的灵敏度比PCR测试低数千倍，尽管每一病毒存在约2,000个p24衣壳蛋白。
如本文所述，开发了基于MSD的技术的下一代电化学发光分析形式且表征了其性能。此新颖p24免疫分析的检测极限为大约1fg/mL，比当前p24免疫分析灵敏10,000倍。1fg/mL的灵敏度对应于25μL的我们的样品体积中小于1个病毒粒子。定量的下限和上限分别是3fg/mL和38,000fg/mL。盘内CV为7％，且总CV为15％。加标回收率和稀释线性为80％至120％。在32个明显健康供体的血清或血浆中不可检测到p24。p24混合效价组显示3-AB HIVp24分析与商业p24免疫分析之间的良好相关性。测试两个血清转化组：SeraCare PRB948(第0和18天，PCR阴性；第22和23天，PCR阳性)和PRB962(第0和2天，PCR阴性；第7、9、14和17天，PCR阳性)。在两种情况下，3AB HIVp24分析结果均对于所有PCR阴性样品呈阴性且对于PCR阳性样品呈阳性，且远在常规p24免疫分析之前检测到感染。
总之，本文所述的3-AB HIVp24免疫分析的灵敏度比p24 ELISA的当前极限高10,000倍且与PCR分析的灵敏度类似。所述分析不需要专门设备且可以在MESO QUICKPLEX SQ120和成像仪上执行。
____________________________实例7.浓缩分析物，接着进行3-AB RCA/PLA分析
(a)实验条件展示于下表8(a)中：
表8(a).
为了捕捉相对短的寡核苷酸邻近探针序列(例如长度为9-13个核苷酸)，制备与一部分邻近探针序列互补的捕捉寡核苷酸且在3'端进行生物素标记。表8(b)展示了邻近探针和捕捉寡核苷酸序列的细节：
表8(b).
计算的熔融温度展示于表8(c)中：
如下制备经捕捉寡核苷酸修饰的珠粒：五十(50)μL DYNAL MYONE抗生蛋白链菌素T1珠粒浆液在涡旋之后添加至五个1.5mL埃彭道夫管(Eppendorf tube)，各管具有跨越两个结合条件实验进行分割所需的量的两倍。珠粒用1ml稀释剂100(购自Meso ScaleDiscovery,Rockville,MD)洗涤三次且将1.2mL的各捕捉寡核苷酸以包含EDTA的稀释剂100中每ml各捕捉寡核苷酸200pmol添加至各小瓶中。通过旋转将溶液在室温下培育1小时，且向各管中的溶液掺加游离生物素直至在包含EDTA的稀释剂100中为5nmol/mL。通过旋转将溶液在室温下培育15分钟，且珠粒用1mL 0.5M NaCl/BSA溶液洗涤三次。管用1mL0.5MNaCl/BSA填充，混合且各捕捉寡核苷酸-珠粒混合物等分至2小瓶中，总共10小瓶。
从所有小瓶抽吸溶液且将在0.5M和1M NaCl/BSA中呈1μg/mL(6.7pmol/mL)的1mLPP1(结合于对HIVp24具有特异性的检测抗体的PP1序列)添加至各捕捉管中。将溶液在室温下在旋转下培育40分钟。将各管用盐溶液洗涤三次(不洗涤不包含捕捉寡核苷酸的对照)。向四个管中以7pg/mL添加1mL HIVp24，同时将抗原自储备溶液掺入无捕捉对照管中。将溶液在旋转下在4℃下培育隔夜且将具有捕捉寡核苷酸的各管用盐溶液(各1mL)洗涤三次。各管用洗涤缓冲液(0.1×PBS，500mM NaCl，1mM EDTA，0.1％ Triton X-100，2mg/mL BSA)填充1/3，混合且将400μL珠粒的等分试样添加至针对2种释放盐条件的两个小瓶中，总共18个管。从除了无捕捉对照管以外的所有小瓶去除洗涤缓冲液，且将400μL 0.0M和10mM盐缓冲液添加至管中。将管的内容物混合且将来自各管(包含无捕捉对照管)的100μL等分试样添加至用于分析三种温度释放条件的三个基质盘中。将盘在混合下在恒温振荡器中分别在25℃、30℃和37℃下培育5分钟。将珠粒磁性分离且将25μL上清液添加至掺有5μL 6×PBS，包含mIgG的分析盘的孔中(每种条件重复三次)。将盘在室温下在振荡下培育1小时且在PBS缓冲液中洗涤三次。如实例1中所述，盘上的各结合域包含捕捉抗体和锚定部分，且在培育步骤后，在各结合域处形成包含结合于抗原的捕捉抗体的复合物，所述抗原结合于具有PP1序列的检测抗体(对照结合域除外)。
将标记有PP2(或用于对照的PP1+PP2)的检测抗体溶液添加至各孔中(每孔25μL)，且在振荡下培育1小时，接着洗涤。如实例1中所述，将连接混合物添加至各孔中且将盘与连接混合物一起在室温下培育30分钟，洗涤以去除过量环化寡核苷酸，且与RCA混合物一起在37℃下培育1.5小时。盘被洗涤且添加检测探针的混合物且在37℃下培育30分钟。盘经洗涤且用150μl MSD读取缓冲液填充且立即在MSD SECTOR Reader上读取。
此实验的结果展示于图14中。
(b)进行额外实验以进一步评估分析物浓度条件。一般实验条件描述于表9(a)中：
五十(50)μL DYNAL MYONE抗生蛋白链菌素T1珠粒浆液在涡旋之后添加至微量离心管。珠粒用1ml稀释剂100洗涤三次且将1mL捕捉寡核苷酸Cap 1:9添加至包含EDTA的稀释剂100。通过旋转将溶液在室温下培育1小时且向溶液掺加游离生物素直至在包含EDTA的稀释剂100中为10×过量。通过旋转将溶液在室温下培育30分钟且将珠粒用1mL洗涤缓冲液洗涤三次。添加一(1.0)mL含PP1的结合缓冲液且将溶液在室温下在旋转下培育40分钟。将管用洗涤缓冲液洗涤三次且将1mL稀释剂2添加至珠粒中，混合，且针对1×、0.5×、0.25×和0.125×珠粒-PP1浓度在抗原水平2-4下跨越12个管分配珠粒溶液。将所需体积的珠粒-PP转移至对照管。将HIVp24和稀释剂2添加至珠粒溶液以获得5mL总体积的抗原和珠粒-PP的所需最终浓度。未掺加珠粒对照管以仅包含1×浓度的游离PP1和所有4种水平的抗原。管在旋转下在4℃下培育隔夜，且通过每次转移1mL将5mL珠粒溶液转移至1.5mL埃彭道夫管。各管用洗涤缓冲液洗涤(三次)。不洗涤无珠粒的对照管。在第三次洗涤之后，将100μL的0盐溶液添加至试管中，且将500μL的0盐溶液添加至对照管中，且将管在25℃下培育6分钟。将上清液转移至分析盘且如同实例7(a)进行分析。结果展示于表9(b)-(c)中：
表9(b)：
表9(c)：
在用磁珠浓缩分析物之后，观察到大致五十倍的信号增加。未浓缩样品#1显示与对照#1信号类似的结果，其表明PP-抗原复合物以最高效率释放。使用分析物预浓缩，实现小于0.1fg/mL的检测，其与1个病毒粒子/mL病毒负荷类似。相比的下，商业病毒分析可合理地检测大约50个拷贝/mL，其等同于25个病毒粒子/mL。此实验在具有或不具有预浓缩的情况下的校准曲线展示于图15中。
实例8.使用珠粒沉降方案的3-AB RCA/PLA基于珠粒的分析
如实例7中所述地进行针对IL-4的3-AB RCA/PLA分析，不同之处在于使用二氧化硅珠粒替代DYNABEADS。在固定于37℃下的MSD大点多孔分析盘(购自Meso ScaleDiscovery,Rockville,MD)中进行RCA和检测培育。珠粒不包含锚定试剂。在RCA培育步骤期间使珠粒通过重力缓慢沉降至孔的表面上，其中取决于溶液体积，沉降时间大约为5-8分钟。通过在摆斗离心机中旋转盘来洗涤盘。初步测试表明，在以跨越孔表面的仅略微梯度旋转之后，珠粒均匀分散。
用15相对于90分钟RCA培育来测试方案。发现与磁捕捉相比，通过使用珠粒沉降的15分钟RCA培育，分析的灵敏度和动态范围提高了大约10倍。通过90分钟RCA培育步骤，灵敏度进一步提高(最多大约50-100倍)。
或者，如本文所述地进行3-AB RCA/PLA分析，其中珠粒包含锚定试剂且在连接步骤期间添加封闭剂(大约2.5mg/ml)以减少非特异性结合。可以使用多种封闭剂，包含但不限于mBSA、剪切的poly(A)、polyBSA-I、mIgG、Tween、polyBSA-II、酵母RNA、mBSA+poly(A)和/或polyBSA+poly(A)。
实例9.修改的桥接免疫分析格式
如上所陈述，实例1中所述的程序用于使用TNFα模型系统的桥接和亚型分析Ig分析、使用Hep B表面抗原的桥接和亚型分析Ig分析以及使用Lyme C6的桥接和亚型分析Ig分析。对此程序的修改展示于图19中，其中使用(i)PP2修饰的抗人类Ig抗体(1902)和(ii)PP1标记的自体抗原(1903)来检测自体抗体(1901)，接着如实例1中所述地进行PLA-RCA。图19中所示的形式还展示使用靶向部分(1904)和其与自体抗原(1905)结合的补体作为将捕捉部分(在此情况下为自体抗原)粘附至表面(1906)的手段。
同样，可如实例1中所述地进行针对抗体(例如自体抗体)的免疫分析，其中针对所述抗体的抗原用作捕捉部分(直接连接至表面或通过靶向部分和其补体)，且两种检测物质为连接至PP1的同型抗体和连接至PP2的抗原(或反之亦然)。形成夹心复合物，接着如实例1中所述地进行PLA-RCA。这些修改的分析形式还可以包含锚定部分以将扩增子粘附至表面。
实例10.用于产生邻近连接滚环模板的生物合成方法
可以生物合成方式产生邻近连接滚环模板。此方法利用初始高度纯化和充分表征的模板在有效的基于溶液的连接和RCA反应系列中产生RCA产物。此方法还可以在珠粒上进行以增强反应的选择性。
在扩增种子RCA模板之后，使用与短合成序列组合的独特限制酶对单股产物进行位点特异性裂解。因此，RCA模板产生自其自身产物。对以生物合成方式产生的RCA模板进行HPLC或凝胶纯化以产生含有100％适当的5'和3'末端的产物。此方法说明于图20(a)中。此方法需要将限制位点添加至RCA模板中以导引所期望连接位点处的裂解。优选是限制酶，诸如从限制位点切割大致14-20个碱基的这些。或者，还可以使用此方法与来自M13噬菌体或类似物的单股DNA组合，以毫克量产生单股模板。此方法可消除进行RCA模板的基于RCA的扩增的需要，仅需要将模板克隆至M13载体中以产生DNA。此说明于图20(b)中。
实例11.样品多重化
本文所述的方法用于基于使用光谱特征对样品进行多重化。样品多重化使得用户能够进行内部校准和控制，减少成本且提高通量。通过使用基于对分析物编码的空间和光谱特征的独特特征对所述分析物多重化的能力还可以用于样品多重化。
使用成像扩增产物的荧光染料比编码对样品进行多重化。对于样品中的各分析物，采用能够产生独特滚环产物的一组独特分析试剂，各试剂可用独特检测寡核苷酸检测。可根据例如实例1中描述的程序进行一组独特分析试剂的合成和使用。如图21中所说明，含有所关注分析物的各样品A和B与对所述分析物具有特异性的两种检测抗体一起培育，各检测抗体带有独特邻近探针。此培育步骤将一组独特邻近探针与所述样品中的分析物连接，从而与分析物形成双抗体复合物且“编码”样品。在此培育之后，将编码样品合并且作为混合物添加至单一捕捉抗体表面，培育且洗涤。
在洗涤步骤后，添加捕捉的三抗体复合物，用于各组邻近探针的线性滚环模板，且如实例1中所述地使混合物经受杂交条件。此混合物被连接以产生滚环模板，洗涤，进行滚环扩增且洗涤。各滚环扩增子与互补且独特的检测寡核苷酸杂交，所述寡核苷酸基于2个或更多个荧光标记的比率经独特光谱特征编码。在检测探针杂交之后，对分析表面进行成像且各滚环产物基于其光谱特征，例如2个或更多个荧光标记的比率解码，且计数。此允许确定多个样品中的分析物水平。使用此方法，用户可组合样品和分析物多重化，允许在测试和对照样品中同时测试多种分析物。
实例12.检测脂蛋白复合物
本文所述的方法用于检测和定量脂蛋白复合物，例如HDL和LDL中存在的蛋白质复合物组。例如，使用实例1中所述的方法，在脂蛋白复合物内检测三种不同蛋白质和/或抗原决定基，且因此可分析患者的脂蛋白内的蛋白质概况。
在人类中，血脂蛋白分为5大类：HDL、LDL、IDL、VLDL和乳糜微粒。其中，HDL和LDL部分作为心血管健康的风险标记已受到大部分临床关注。这些关键脂蛋白由多种蛋白质和脂质的复合物构成。与这些脂蛋白相关的蛋白质由对其功能必不可少的蛋白质和乘客蛋白组成。这些脂蛋白还可以进行修饰个体的风险概况的修饰，诸如氧化。例如，较高水平的被氧化HDL和LDL与不良心血管事件的风险提高相关。LDL通常由两种核心蛋白质Apo(a)和ApoB，以及脂质构成。Apo(a)升高与心脏病风险提高相关；另外，Apo(a)蛋白长度的变化还与改变的风险概况相关。Apo(a)蛋白的尺寸由于尺寸多态性而变化，尺寸多态性由LPA基因中可变数目的所谓的三环重复(kringle repeats)引起。LDL粒子中的ApoB携有用于各种组织中的LDL受体的配体。高水平的ApoB还与斑块形成相关，从而导致心血管疾病。HDL通常由一组核心蛋白构成，包含：ApoA1、ApoE、ApoC和ApoA-II。除了这些核心蛋白以外，还已知HDL与也具有临床价值的其它蛋白质相关。例如，已证实HDL相关SAA和SP-B与心脏事件和死亡率相关。通过升高ApoA-II，HDL组成的变化还与致动脉粥样硬化风险有关。
在实例1中所述的程序之后，如图22中所概述地进行脂蛋白复合物的多重邻近分析。图22说明了HDL脂蛋白复合物的检测，其中对核心蛋白中的每一个具有特异性的捕捉抗体固定至表面以将脂蛋白复合物结合于表面。添加对其它核心蛋白具有特异性的检测抗体，各检测抗体携有邻近探针。如实例1中所述地完成分析。
实例13.形成抗体-寡核苷酸结合物的简化方案
制备含有2mg/mL含抗体的磷酸盐缓冲盐水，pH 7.4+1mM EDTA(PBS/EDTA)的抗体溶液。如果提供的抗体在不相容溶液中，诸如含有干扰NHS酯或顺丁烯二酰亚胺反应的组分，那么首先使用Zeba 40凝胶过滤旋转柱或10kD截止AMICON离心超滤装置将抗体缓冲交换至PBS/EDTA中，且接着稀释至2mg/mL。
抗体接着与(i)具有NHS酯和顺丁烯二酰亚胺部分的异双官能交联剂(式V化合物，其中r＝4(化合物1))和(ii)经5'末端硫醇修饰的单股DNA寡核苷酸(寡核苷酸序列＝5'-GACAGAACTAGACAC-3'(SEQ ID NO:33))(式IIIA化合物(化合物2))反应，以形成抗体和寡核苷酸的结合物。
寡核苷酸＝5'-GACAGAACTAGACAC-3'(SEQ ID NO:33)
通过将适当体积的交联剂(呈DMSO中的1.5mM溶液形式)添加至抗体溶液进行反应，以使得交联剂的激发比(CRxl)等于6，其中CRxl定义为添加的交联剂分子的数目与抗体分子的数目的比。所得溶液被混合且接着在23℃下持续等于1小时的交联剂培育时间(Txl)进行培育。接着添加适当体积的硫醇修饰的寡核苷酸(呈PBS/EDTA中的2mg/mL溶液形式)以使寡核苷酸的激发比(CRon)等于9，其中CRon定义为添加的寡核苷酸分子的数目与抗体分子的数目的比。所得溶液经混合且接着在23℃下持续等于一小时的寡核苷酸培育时间(Txl)进行培育。根据此方案，相对于交联剂，寡核苷酸是1.5倍摩尔过量。这些条件应产生每一抗体的寡核苷酸的平均数目约为3至4的结合物。注意：交联剂分子的量可调高(例如CRxl＝8或10)或调低(例如CRxl＝3或4)，以产生每一抗体的结合寡核苷酸的平均数目更高或更低的产物；在这些情况下，CRon将调整为相对于交联剂维持1.5倍过量。
对于具有100μg至500μg抗体的反应，通过将最终反应混合物添加至柱顶部且使其穿过柱而将最终反应混合物装载至Sephadex G100 Superfine凝胶过滤树脂的2mL(±0.1mL)柱(在由PBS/EDTA加上0.05％叠氮化钠组成的收集缓冲液中预平衡)上。接着将额外堆叠体积的收集缓冲液装载至柱上，以使得柱上装载的总体积(反应溶液加上堆叠体积)为0.65mL。接着将收集管置于柱出口下方，装载额外洗脱体积的收集缓冲液且收集含有抗体-寡核苷酸结合物的所得洗脱剂。洗脱体积设定为每100μg抗体100μL加上200μL，至多为最大500μL(或者，整个反应规模可以使用的最大洗脱体积为500μL，代价为在较低规模下另外稀释结合物)。下表列出了三种不同反应规模下的反应物和收集缓冲液等分试样的体积。可以通过使用较大柱且适当缩放体积来实现含有大于500μg抗体的反应规模。
实例14.测量寡核苷酸并入至抗体-寡核苷酸结合物中的程度的简化方案
使用标准蛋白质测量分析，尤其是二喹啉甲酸(BCA)分析(在获自ThermoFisherScientific的试剂盒形式中可用)来测量抗体-寡核苷酸结合物的溶液中蛋白质的浓度。接着在收集缓冲液中稀释结合物(参见实例13)，以得到100μg/mL的蛋白质浓度。
通过将寡核苷酸结合于SYBR-Green I(一种DNA敏感性荧光染料)来测量稀释结合物中寡核苷酸的浓度。
在DMSO中制备SYBR Green I的1000×储备溶液，浓度是在370nm光下提供约0.8至1.0的吸光度。通过将1000×溶液在PBS中稀释1000倍来制备1×SYBR Green I试剂。将10μL体积的结合物添加至200μL的SYBR-Green I的1×溶液中。将混合物在室温下培育5分钟且接着使用荧光盘读取器，使用485nm的激发波长和528nm的发射波长来测量混合物的荧光。通过与校准曲线比较来确定定量浓度值，所述校准曲线是通过测试用于产生结合物的游离寡核苷酸的连续稀释液产生(使用来自实例13的式IIIA化合物作为校准标准)。寡核苷酸的摩尔浓度除以抗体的摩尔浓度得到每一抗体的寡核苷酸的数目。
或者，可以使用对结合水平的更定性评估。例如，可以等于结合物中寡核苷酸的最小可接受浓度的水平测试单一浓度的式IIIA化合物(低对照样品)(例如对于一些应用，临限值浓度可设定为指示每一蛋白质的寡核苷酸的平均数目大于或等于2)：在此情况下，结合物样品的荧光信号与低对照的荧光的简单比较可以用于确定结合物具有可接受的标记水平(结合物的荧光≥低对照的荧光)或不具有可接受的标记水平(结合物的荧光<低对照的荧光)。类似地，还可以测试由具有高于结合物中寡核苷酸的最大预期浓度的水平的式IIIA化合物制备的另一标准品(高对照样品)(例如，对于一些应用，临限值浓度可设定为指示每一蛋白质的寡核苷酸的平均数目小于或等于6)；在此情况下，结合物的荧光信号与荧光信号的比较可以用于确定结合物是否被过度标记或纯化步骤是否未充分去除未结合寡核苷酸(结合物的荧光＞高对照的荧光)。
对于如同实例14，但使用不同水平的交联剂以改变结合寡核苷酸/抗体分子的比制备的一组抗体-寡核苷酸结合物，图23a展示通过荧光方法确定的标记比与基于平均分子量(如使用EXPERION仪器通过凝胶电泳所测量)确定的标记比密切相关。图23b比较随制剂中寡核苷酸的浓度而变的游离寡核苷酸和由三种不同抗体形成的抗体-寡核苷酸复合物的荧光分析信号(在结合物的情况下，通过凝胶电泳使用EXPERION仪器确定)。所述图展示荧光不受结合或抗体间差异影响。
实例15.合成被标记检测探针
通过固相合成合成了具有一个或多个一级烷基氨基的一系列寡核苷酸(下文编号为4至7的化合物)，且在烷基氨基处用MSD SULFO-TAG NHS酯(Meso Scale Diagnostics)标记以产生被一个或多个SULFO-TAG(STAG)标记标记的寡核苷酸(下文编号为9至12的化合物)。这些测试寡核苷酸包含其中通过使用被修饰胸苷在寡核苷酸序列中引入标记位点的寡核苷酸(下文编号为5和10的化合物)和其中所有修饰位点均在寡核苷酸序列外部的寡核苷酸(下文编号为4、6、7、9、11和12的化合物)(下文公开的SEQ ID NO:31、31和31)。
使用相对于烷基氨基的数目大约13倍过量的NHS酯在pH 8的磷酸盐缓冲液中执行标记反应，以驱动所有这些基团的标记。通过使用pH 8处的盐梯度在阳离子树脂上进行离子交换色谱来纯化被标记产物。完全标记的产物以梯度终点附近的单峰形式出现。
实例16.双抗体扩增夹心免疫分析的方案
在各孔底部上包含整合式碳墨电极的MSD MULTI-ARRAY多孔盘中执行分析。电极在固相结合分析中充当捕捉试剂的固相支撑物，以及从电极上的结合复合物中存在的ECL标记产生ECL的电化学能量来源。程序中所用的具体MULTI-ARRAY盘是MSD GOLD 96SmallSpot SA盘，其在各孔中的工作电极上配备有抗生蛋白链菌素的固定层。根据常规程序使用生物素NHS酯试剂(EZ-Link Sulfo-NHS-Biotin，ThermoFisher Scientific)对捕捉抗体进行生物素标记。根据实例14中的程序制备检测抗体和探针寡核苷酸的结合物(检测抗体-探针结合物)。环化寡核苷酸具有5'末端磷酸基团。检测寡核苷酸是如实例15中所述的化合物11。针对各分析最佳化所使用的分析和检测抗体稀释剂以提供最优选抗原-抗体结合和最小化样品基质效应，尽管为用于扩增形式，通过添加鲑鱼精子DNA达到15μg/mL的浓度来修饰分析稀释剂。此实例中所述的程序使用以下寡核苷酸序列：
锚定寡核苷酸(锚定物)：5'-AAGAGAGTAGTACAGCAGCCGTCAA-3'(SEQ ID NO:37)
探针寡核苷酸(探针)：5'-GACAGAACTAGACAC-3'(SEQ ID NO:33)
环化寡核苷酸(Circ)：5'-GTTCTGTCATATTTCAGTGAATGCGAG TCCGTCTAAGAGAGTAGTACAGCAAGAGTGTCTA-3'(SEQ ID NO:36)
检测寡核苷酸(检测剂)：5'-CAGTGAATGCGAGTCCGTCTAAG-3'(SEQ ID NO:32)
通过将生物素标记的试剂结合于抗生蛋白链菌素涂布的电极而将捕捉抗体和锚定寡核苷酸固定于MSD盘中的电极上。首先，将盘的孔用含有0.05％ Tween-20的PBS(PBS-T)洗涤三次。接着向各孔中添加50μL在含牛血清白蛋白(BSA)的缓冲液中含有生物素标记的捕捉抗体(0.25μg/mL)和3'-生物素标记的锚定寡核苷酸(化合物13，0.2ng/mL)的溶液(通过组合捕捉抗体和锚定物的储备溶液制备)。接着将盘在室温下在振荡下培育至少1小时或不振荡培育隔夜，且接着用PBS-T洗涤3次以去除未结合的生物素标记试剂。
接着向各孔中添加25μL含有鲑鱼精子DNA的分析稀释剂和25μL样品且将盘在室温下培育1至2小时。将盘再次用PBS-T洗涤三次以去除过量样品。接着将含检测抗体-寡核苷酸探针结合物(50μL，通常浓度是约0.01μg/mL至0.5μg/mL)的抗体稀释剂添加至孔中且在室温下培育一小时以完成夹心复合物形成。接着通过用PBS-T洗涤孔三次来去除过量检测抗体。
将夹心复合物结合于DNA环以准备进行滚环扩增，其通过向各孔中添加50μL在Tris-HCl缓冲液，pH 7.4中含有DNA连接酶、Circ寡核苷酸、乙酰化和聚合BSA、MgCl2、DTT和ATP的溶液，且将盘在室温下在振荡下培育30分钟以使Circ寡核苷酸结合于任何结合检测抗体-寡核苷酸探针结合物的探针组分，且使连接酶环化Circ寡核苷酸以形成结合环。接着将盘用PBS-T洗涤三次以去除未结合的Circ寡核苷酸和连接酶。如下地进行滚环扩增和用ECL标记来标记扩增产物：通过向各孔中添加50μL在Tris缓冲液，pH 8.2中含有DNA聚合酶、四种标准dNTP中的每一个、检测探针、乙酸钾、50mM氯化钾、乙酸镁、DTT和Tween-20的溶液，且将盘在27℃下振荡一小时以通过滚环扩增延伸探针寡核苷酸，将扩增产物锚定至锚定寡核苷酸且将检测寡核苷酸与扩增产物杂交。接着通过用PBS-T洗涤盘三次来去除过量检测寡核苷酸。
为了进行ECL测量，将150μL含ECL共反应物的ECL读取缓冲液(MSD Read BufferGold，Meso Diagnostics)添加至各孔中且在ECL盘读取器(MSD Sector Imager 6000或MSDQuikPlex 120，Meso Scale Diagnostics)上分析所述盘。盘读取器向盘的各孔中的工作电极(和相关相对电极)施加电位，对所得电化学发光发射成像且对于各分析测量报告与发射光的量成比例的定量值。图24中提供了双抗体扩增分析形式的示意图，其说明Circ寡核苷酸的结合和其后续连接和滚环扩增，以形成与固定的锚测序列和标记的检测序列两者结合的延伸产物。
实例17.选择尺寸排阻树脂用于抗体-寡核苷酸结合物纯化
如实例13中所述地以200μg规模制备具有15聚体寡核苷酸的抗体-寡核苷酸结合物，不同之处在于结合物纯化步骤。在此实例中，将使用多种不同尺寸排阻树脂的纯化相互比较且与通过使用离心超滤装置(具有50kD截断的AMICON超滤装置，根据制造商建议使用)的纯化比较。为了比较尺寸排阻树脂，将结合反应产物装载于以下树脂的2mL柱上：
树脂 供应商 产品型号 粒度(μm)
Sephadex G-50Fine Sigma G5080 20-80
Sephadex G-50Fine Roche 03117928001 20-80
Sephadex G-100Fine Sigma 27119-5 40-120
Sephadex G-100Superfine GE Healthcare 17-0061-01 10-40
Superdex G-200 GE Healthcare 17-1043-01 24-44
Sephacryl S-200 GE Healthcare 17-0584-10 50
Sephacryl S-300 GE Healthcare 17-0599-10 50
另外，还使用纯结合物、未结合抗体和未结合寡核苷酸进行执行，以鉴别反应混合物中各种可能组分的峰位置。在装载树脂之后，产物用收集缓冲液洗脱且以0.2mL洗脱份收集。
在测试的树脂中，G-100Superfine具有结合物和未结合寡核苷酸的最优选分离。图25(a)中示出了使用G-100Superfine树脂的未纯化结合物的洗脱概况，同样示出了未结合抗体、未结合寡核苷酸和纯结合物的对照概况。对于蛋白质使用BCA分析且对于寡核苷酸使用SYBR Green I分析来定量洗脱液分数(如实例14中所述)。如图中所示，G-100Superfine柱上的纯化可以高产率(通常为80至85％)提供纯化结合物，且未结合寡核苷酸的污染极小(通常小于10％)。
为了测试纯化结合物的活性，制备结合物以用于针对IL-6的夹心免疫分析的检测抗体。使用G-100Superfine柱或使用Amicon超滤装置纯化结合物。分析中所用的来自G-100纯化的洗脱份展示于图25(b)的G-100洗脱概况中。检测抗体结合物与生物素标记的IL-6捕捉抗体配对且用于在滚环扩增双抗体分析中测量一系列IL-6校准标准物(使用与实例16中所述的方案类似的方案)。图25(c)提供随校准剂浓度而变的测量ECL信号，且展示使用G-100方法和Amicon方法纯化的检测抗体得到几乎相同的分析信号。结果表明，使用G-100重力纯化不会不利地影响抗体-寡核苷酸功能，尽管其进行起来比Amicon方法(其需要多次离心机执行以制备装置和进行纯化)简单得多且更快。
实例18.用于定量抗体-寡核苷酸结合物的替代荧光染料
鉴别了多种已知在结合于核酸时增加荧光的荧光染料。使用与实例14中所述类似的形式(除了改变染料)，测试染料灵敏且特异性地测量抗体-寡核苷酸结合物中的15聚体寡核苷酸的能力。下表中列出了测试的染料，以及制造商报告的检测电泳凝胶中的未结合核酸的灵敏度(以绝对浓度或相对于使用溴化乙锭染色剂)。所述表还提供不同形式的核酸的报告灵敏度，以及染料荧光的峰值激发和发射波长。
图26(a)展示比较染料性能的三个图。左图展示相对于抗体结合物中等效浓度的寡核苷酸的未结合寡核苷酸的荧光信号(其中结合物中寡核苷酸的浓度是基于在Experion电泳仪中使用凝胶电泳分离测量的平均分子量而确定)；所有染料对于未结合和结合寡核苷酸具有大致等效的荧光信号(比率在约0.9与1.1之间)，表明寡核苷酸与蛋白质的结合不干扰荧光信号的产生。中图比较不存在寡核苷酸的未结合抗体的信号相对于等效浓度的结合物的信号；相对于结合物，所有染料对于抗体提供低信号(比率小于约2％)，表明抗体的存在不干扰测量。右图展示获自100ng结合物的信号的信号:背景比(基于蛋白质测量)；所有染料的比率均大于5(且一些比率大于10或15)，表明分析方法具有足以分析少至100ng结合物中的寡核苷酸水平的灵敏度。尽管所有测试的染料具有足够性能，但选择SYBR GreenI进行进一步开发，因为其通常用于定量凝胶中的DNA和qPCR，且其在开发用于测量荧光素的滤光器组(497nm处的激发，520nm处的发射)下工作良好。图26(b)展示了随游离形式或抗体结合物形式的寡核苷酸的浓度而变的来自SYBR Green I的荧光信号，且表明两种形式的信号在宽分析动态范围内紧密匹配。
实例19.替代被标记检测探针
为了比较用于滚环扩增分析的被标记检测探针的不同可能结构，使用针对IL-4、IL-6和IL-10的捕捉-检测抗体对，且改变使用的检测探针的结构来进行实例16中所述的双抗体程序。在此实验中，比较的检测探针是实例15中所述的以下SULFO-TAG标记的化合物：来自实例15的化合物9(具有单一3'标记，在实例中称为“1X 3”)、化合物10(具有2个内部标记核苷酸和3'标记，在实例中称为“2X Internal&3'”、化合物11(具有3标记连接至3'端的结构，在实例中称为“3X 3'+18EG B”)和化合物12(具有3'标记通过PEG连接子连接至3'端的结构，在实例中称为“3X 3'+18EG”)。评估的另一检测探针方法为使用预先结合于SULFO-TAG标记的抗生蛋白链菌素的3'生物素标记的探针(称为“SA检测”)。除了实例16中所述的方案(称为“同时”方案，因为检测探针与聚合酶一起添加，使得在形成滚环产物时发生检测探针结合)以外，还执行称为“依序”方案的修改方案。在依序方案中，从聚合酶反应省去检测探针，在聚合酶反应步骤之后添加洗涤步骤以去除聚合酶溶液，且在额外培育步骤中添加检测探针。在使检测探针结合之后，孔被洗涤，用ECL读取缓冲液填充且如同同时方案测量ECL。
在第一实验中，使用依序(图27(a))和同时(图27(b))方案来比较“SA检测”、“1x3'”、“2xInternal&3'”和“3x3'+18EG”检测探针。在依序方案中，图展示相对于单独标记的“1x3'”结构，使用多标记的寡核苷酸结构(“2xInternal&3'”和“3x3'+18EG”)提供信号的1.5至2倍增加，表明多个ECL标记即使在小寡核苷酸密集时也可以在不破坏杂交效率的情况下提供增加的ECL信号。在同时方案中，内部标记的结构(“2xInternal&3'”)也相对于单独标记的结构提供增加的信号，然而，末端标记的“3x3'+18EG”给出低得多的信号，可能是由于探针与聚合酶的相互作用。出人意料地，去除“3x3+18EG”结构与寡核苷酸之间的聚乙二醇连接子(即，提供“3x3+18EG B”结构)消除此干扰。在第二实验中，显示“2xInternal&3'”和“3x3'+18EG B”检测探针在依序和同时方案两者中的性能大致相等。图28展示根据两种方案用两个检测探针测量的校准曲线，且也具有一表，所述表呈现中水平校准标准的信号(“Cal3”)、空白信号(“NSB”和估计的检测极限(LOD))。应注意，尽管依序方案的信号倾向于高于同时方案，但背景信号倾向于类似地更高，使得两种方案的总体灵敏度大致类似。
实例20.形成抗体-寡核苷酸结合物的替代条件
根据实例13的程序制备IL-4检测抗体的抗体-寡核苷酸探针结合物，除了改变两个参数：(i)x-连接剂的激发比(CRxl)在3至14之间变化(测试CRxl值包含3、5、8、9、10、11、12和14)和(ii)交联剂的培育时间(Txl)为0分钟或预设的60分钟。寡核苷酸的激发比(CRon)和寡核苷酸的培育时间(Ton)分别保持恒定于15和1小时。对于Txl＝0条件(称为“同时”条件，与交联剂同时添加寡核苷酸(一种方法为在交联剂之前添加寡核苷酸，使得交联剂在添加时与蛋白质和寡核苷酸两者同时反应)。在添加寡核苷酸之前使交联剂与蛋白质反应的预设条件称为“依序”条件。如下分析所得抗体-寡核苷酸探针结合物的性能：(i)通过使用实例14中所述的蛋白质和寡核苷酸分析程序来确定每个抗体分子的连接寡核苷酸的数目，和(ii)当在如实例16中所述执行的IL-4分析中使用抗体-寡核苷酸探针结合物作为检测抗体时，通过测量由中水平IL-4校准标准产生的信号。
图29(a)中的表展示依序和同时方案均有效地产生在IL-4分析中提供ECL信号的结合物。依序方案中3或同时方案中8的CRxl值足以获得标记:蛋白质比(“L/P”，每个抗体的连接寡核苷酸的平均数目)高于3个寡核苷酸/抗体的目标值的结合物。在此标记:蛋白质比下，泊松分布(Poisson distribution)预测小于5％残留的未标记抗体(通过呈模型化凝胶影像形式的图29(b)中所示的EXPERION凝胶电泳结果确认未标记抗体的低水平)。图29(a)和29(b)还展示CRxl的进一步增加可以用于在免疫分析中提供更高标记比和更高信号。
实例21.用于滚环扩增免疫分析的寡核苷酸序列的最佳化
在实例16中所述的程序的开发中，测试多种寡核苷酸序列和结构且进行比较以使性能最佳化，同时使试剂的成本、尺寸和复杂度最小化。使用与实例16中的程序类似的程序执行数据，除了取代寡核苷酸序列或试剂。
锚定寡核苷酸序列
测试生物素标记的锚定寡核苷酸的变化形式且相比于具有长PolyA连接子的锚测序列的对照锚定物(与实例1中所用的锚定寡核苷酸类似)。测试的结构如下所示：
锚定寡核苷酸 修饰 m，n
对照 Poly A生物素连接子 m＝18，n＝0
寡核苷酸1 无Poly A连接子 m＝0，n＝0
寡核苷酸2 无Poly A连接子+1个PEG间隔子 m＝0，n＝1
寡核苷酸3 无Poly A连接子+2个PEG间隔子 m＝0，n＝2
寡核苷酸4 无Poly A连接子+3个PEG间隔子 m＝0，n＝3
在扩增ECL分析中针对IL-4和IL-10测试这些锚定寡核苷酸中的每一个。图30(a)和30(b)中所示的结果提供针对关于含有高水平校准标准(High-Cal)、中水平校准标准(Mid-Cal)和空白样品(NSB)的样品的各分析测量的ECL信号。所述图表明可以在不存在Poly A或PEG间隔子的情况下维持最优选性能。
抗体-寡核苷酸结合物中的寡核苷酸探针序列
进行实验以通过修饰实例1中所述的硫醇修饰的邻近探针2构筑体(以下结构)来确定用于抗体-寡核苷酸结合物的最优选探针配置。
在新探针中，去除Poly A连接子且通过在探针结合序列的两端添加或去除碱基来产生一系列改变长度(8至30个碱基)的探针结合序列，同时维持与Circ寡核苷酸的末端的互补性。这些新探针构筑体结合于检测抗体以进行IL-10免疫分析(与实例13类似)，且以双抗体滚环扩增形式进行测试(与实例16类似)。图31(a)展示针对中水平IL-2校准标准测量的特异性信号(Mid Cal)、在不存在IL-2的情况下的非特异性信号(NSB)和估计的检测极限(LOD)。出人意料地，通过省略连接单元和缩短探针结合序列(杂交长度)至约14至15个碱基，信号得以增加且检测极限得以提高。使用较短探针不仅提供更好的性能，且还降低产生探针的成本和复杂度，且通过使得能够使用简单的尺寸分离装置来分离结合物与未结合探针而简化用于纯化抗体-探针结合物的程序。基于实验，选择使用15聚体探针序列：5'-GACAGAACTAGACAC-3'(SEQ ID NO:33)。
还研究对15聚体探针的序列的修饰。所选序列具有约47％的GC含量(15个碱基中的7个)。测试了另一15聚体探针，其中GC含量升至大于60％或约67％(15个碱基中的10个)；对Circ寡核苷酸的互补区进行类似改变。
高GC探针：TGCACAGC-TCGACGC(SEQ ID NO:42)
高GC Circ：GCTGTGCAATATTTCAGTGAATGCGAGTCCGTCTAAG AGAGTAGTACA GCAAGA-GCGTCGA(SEQ ID NO:43)
图31(b)提供随连接步骤期间的温度而变的高水平(High Cal)、中水平(Mid-Cal)和空白(NSB)校准标准物的信号，且展示增加的GC序列可以在更高温度下提供探针-Circ复合物的更好稳定性，其可以是提高扩增分析形式的连接步骤的温度和动力学提供机会。
模板(Circ)寡核苷酸序列
进行实验以如实例3和图11(a)中所述地通过修饰对于邻近探针2具有单一连接位点的整体连接寡核苷酸(Circ)来确定最优选Circ寡核苷酸构筑体。此Circ寡核苷酸设计用于实例1中所述的三抗体邻近硫醇修饰的邻近探针2构筑体(以下结构)。此Circ包含用于未被长度最佳化的双抗体寡核苷酸探针结合物(包含未以双抗体扩增形式使用的结合物)的结合位点。测试的Circ序列包含：
Circ寡核苷酸 长度 修饰
常规Circ2 90bp 原始全长Circ
LCS2 Min 2 78bp 去除未使用的探针结合位点
LCS2 Min 1 68bp 去除所有未使用的序列
LCS2 Min 3 61bp 将锚测序列从25bp减小至16bp
LCS2 Min 4 53bp 将探针结合序列从25bp减小至16bp
使所有Circ序列包含5'末端磷酸。使用具有15聚体探针的检测抗体-寡核苷酸探针序列，针对IL-10在分析中测试Circ序列。图32展示当使用不同Circ序列时，随IL-10浓度而变的分析信号。结果表明分析信号在Circ长度减小至低于90个碱基对(bps)或大约或低于78bp时增加，其中在约61至约68bps的范围内获得最大信号。减小的Circ长度不仅提高性能且还降低产生寡核苷酸的成本和复杂度，可使得滚环扩增产物中环重复的拷贝数增加且可降低非所期望核酸相互作用的风险。选择61bp序列用于分析：GTTCTGTCATATTTCAGTGAATGCGAGTCCGTCTAAGAGAGTAGT
ACAGCAAGAGTGTCTA(SEQ ID NO:36)。
图33中示出了相对于实例3中所用的锚定物、模板、结合物和检测寡核苷酸，对此实例中所述的这些的修饰的概述。
实例22.双抗体滚环扩增分析与常规非扩增免疫分析的比较
如实例16中所述地进行针对一系列不同分析物的分析。各分析使用如实例13和14中所述制备和表征的生物素标记的捕捉抗体和检测抗体-寡核苷酸探针结合物。将分析性能与常规ECL分析形式进行比较。在常规形式中，替代使用检测抗体探针结合物，检测抗体经MSD SULFO-TAG NHS标记以20的激发比标记(通常提供每个抗体约8个标记的最终标记比)。与扩增分析相同地执行常规分析，直至检测抗体结合步骤(除了所用的被标记检测抗体中存在差异)。在常规分析中，在完成与检测抗体的培育步骤后，用PBS-T将盘洗涤3次，将150μL MSD GOLD Read Buffer添加至各孔中，且在ECL盘读取器上分析所述盘。
图34(a)展示通过扩增显著改善的三个分析(IL-2、IL-4和IL-10)的校准曲线。所述图比较以标准和扩增分析形式获得的信号且表明通过扩增，信号的改善介于约30倍至约100倍范围内。图34(b)比较针对人类蛋白质目标的41种分析的标准和扩增型式的检测极限(估计为给出比分析背景高2.5个标准差的信号的浓度)：IL-2、IL-4、IL-6、IL-10、IL-17A、TSLP、TNF-α、IL-21、IFN-γ、GM-CSF、IL-1β、IL-33、IL-31、IL-12p70、IL-22、IL-5、G-CSF、IL-15、IL-16、VEGF-A、IL-23、IFN-α2a、伊红趋素-3、IFN-β、IL-9、IL-7、IL-29/IFN-λ1、TPO、IL-27、MCP-3、MIP-3α、IL-3、I-TAC、IL-1α、IL-17B、IL-17C、IL-17E/IL-25、IL-17F、IL-17D、IL17A/F和TNF-β。在测试的分析中，约90％(37/41)通过扩增使检测极限提高了至少2倍，约68％(28/41)提高了至少5倍，约56％(23/41)提高了至少10倍，约44％(18/41)提高了至少25倍，且约21％提高了至少100倍。最大提高为约718倍。
实例23.在其它免疫分析平台上进行的双抗体分析
(a)使用编码粒子的基于珠粒的免疫分析形式
在96孔过滤盘中进行所有分析步骤。用真空歧管(不超过10英寸Hg)自盘去除液体。切勿将盘翻转过来。如果发生堵塞，那么使用15ml锥形管的尖端轻轻按压堵塞孔下方的区域，且接着使用1ml巴斯德吸管橡胶球或将拇指置于堵塞孔上以通过产生压力来去除堵塞物。在最终抽吸步骤后，在一叠纸巾上轻轻敲打盘的底部且接着用Kimwipe轻擦过滤盘底部，以去除残余液体/液滴。
洗涤溶液制备：通过用285ml去离子水稀释20×洗涤溶液瓶的全部内容物来制备1×工作洗涤溶液。
分析标准品制备：在100％分析稀释剂(血清和血浆样品)或50％分析稀释剂/50％组织培养基(组织培养上清液)中复原冻干标准品；复原体积：(i)1小瓶：1ml；(ii)2小瓶：每小瓶0.5ml。在室温下再水化8-10分钟。轻轻翻转小瓶几次且使小瓶再静置3-5分钟以确保完全水合。如果使用超过1种标准品，那么组合相等体积的各标准品且轻轻混合。进行复原标准品的3倍连续稀释以制备七点标准曲线。
分析物捕捉：
(1)涡旋(30秒)且声波处理(30秒)10×捕捉珠粒储备液。在箔片包装管中，将10×捕捉珠粒储备液(每孔2.5μL)在工作洗涤溶液(每孔25μL，每个分析约2,000至5,000个珠粒)中稀释。为了更高程度的多重化，调节工作洗涤溶液的体积以顾及保留的10×捕捉珠粒储备液的额外体积。
(2)用200μl工作洗涤溶液预润湿标准品和样品孔。
(3)涡旋(30秒)且声波处理(30秒)稀释的捕捉珠粒溶液。立即向各分析孔添加25μl，接着添加200μL的1×洗涤溶液。抽吸且用200μL工作洗涤溶液重复洗涤。按需要轻敲和轻擦过滤盘底部。
(4)向所有分析孔中添加50μl培育缓冲液。
(5)向指定孔中添加100μl标准品。对于指定用于样品的孔，添加50μl分析稀释剂，接着添加50μl样品。将盘覆盖且在室温下在轨道盘振荡器(500-600rpm)上培育2小时。在所有培育期间用不透明盖覆盖分析盘以避光。可能需要根据定轨振荡器的半径来调整速度。
分析物检测
(6)制备1×荧光标记的检测抗体：在稀释剂(100μl/孔)中稀释10×检测抗体(10μl/孔)。用荧光标记，诸如Alexa Fluor 350(蓝色荧光标记)或Alexa Fluor 594(红色荧光标记)(购自Life Technologies,Grand Island,NY)标记检测抗体。为了更高程度的多重化，调节稀释剂的体积以顾及所需的10×抗体储备液的额外体积。抽吸且用200μl工作洗涤溶液洗涤分析孔两次。将100μl稀释的检测抗体添加至各分析孔。将盘覆盖且在盘式振荡器(500-600rpm)上培育1小时。
分析读取
(8)抽吸且用200μl工作洗涤溶液洗涤分析孔3次。用干净的纸巾擦干过滤盘底部以完全去除所有残余液滴。将100μl工作洗涤溶液添加至各分析孔且将盘置于盘式振荡器(500-600rpm)上2-3分钟。
(9)在包含用于各荧光标记的色彩通道的多色荧光粒子分析仪(诸如FACS系统或改良的XMAP仪器)中分析珠粒悬浮液。为了使灵敏度最大，在任何粒子可能仅具有零个或一个结合分析物的条件下执行分析，且通过计数对包括荧光标记的给定分析物具有特异性的粒子的数目(基于粒子编码)来定量分析物的量。任选地，分析可以使用编码珠粒以多重形式执行，其中编码指示珠粒上的捕捉抗体的分析物特异性，和检测抗体针对各分析物的特异性。当确定编码时(如在使用并入珠粒中的额外荧光颜色的XMAP中)，分析仪应具有额外检测通道，用于测量额外颜色和鉴别珠粒编码。
(b)使用包含锚定部分的编码粒子，使用被核酸探针修饰的检测试剂的基于珠粒的免疫分析形式
如实例23(a)中所概述，所有分析步骤均在96孔过滤盘中进行。如实例23(a)中所描述来制备洗涤溶液和分析标准品，且如实例13中所述通过添加SEQ ID NO:33的核酸探针来修饰针对目标分析物的检测抗体。如实例23(a)中所述，在捕捉珠粒上捕捉分析物。捕捉珠粒包含以BSA-寡核苷酸结合物形式固定至珠粒表面的锚定部分，其中选择对滚环扩增子具有特异性的寡核苷酸。所用锚定寡核苷酸的序列是SEQ ID NO:37或45。
将二十五(25)μl分析稀释剂、校准剂或样品(按需要稀释)与捕捉珠粒的混合物混合。将混合物在振荡下培育1-3小时且洗涤。将如上文所述制备的用SEQ ID NO:33的核酸探针标记的检测抗体的溶液添加至混合物中，且在振荡下培育1-2小时(或者，可以依序添加各个检测抗体，其中各添加之后为1小时培育)。添加实例1中所述的连接混合物。将混合物与连接混合物一起在37℃下培育30分钟，洗涤以去除过量环化寡核苷酸，且与RCA混合物一起在37℃下培育1.5小时，其中RCA混合物如上文实例1中所述。混合物经洗涤且添加荧光素标记的检测探针的混合物且在37℃下培育30分钟，其中检测探针混合物如上所述。混合物经洗涤且将粒子抽吸至多通道荧光粒子分析仪中。
(c)基于珠粒的形式和将捕捉分析物分子分离至各个纳米孔中
在100μl的25％牛血清(2-4倍稀释)中制备样品且将涂布有捕捉抗体的500K珠粒(顺磁2.7μm，任选地被荧光编码)添加至样品。将样品在23℃下培育约2小时。将样品用PBS(5×，0.1％ Tween-20)洗涤三次，且添加标记的检测抗体(生物素标记的检测抗体或半抗原结合抗体)。将混合物在23℃下培育约1小时。将混合物用PBS(5×，0.1％ Tween-20)洗涤三次，添加酶标记抗生蛋白链菌素-β-半乳糖苷酶(40pM)，还添加抗半抗原结合酶，且将混合物在23℃下培育约30分钟(或在Simoa分析仪中培育3分钟)。将混合物用PBS(5×，0.1％Tween-20)洗涤七次且添加酶底物，15μl试卤灵-β-d-哌喃半乳糖苷(100μM，于加样缓冲液中)。
将混合物抽吸至纳米孔阵列(由QUANTERIX以DVD格式提供，由环烯烃聚合物制成，每个圆盘具有24个样品)上且使其沉降约2分钟。阵列用缓冲液冲洗，阵列用氟碳油密封，在23℃下培育2-5分钟，且在多色荧光成像仪上读取结果。影像分析用于计数含有两种荧光酶产物的纳米孔的数目且因此提供与样品中分析物的浓度相关的值。
(d)分析的流量槽，基于珠粒的免疫分析形式
第一培育：使10μl样品，生物素标记的单克隆分析物特异性捕捉抗体(2.6mg/l的工作溶液)和结合于核酸探针的单克隆分析物特异性检测抗体的混合物(0.3mg/l的工作溶液)反应以形成夹心复合物。如实例13中所述，单克隆分析物特异性检测抗体结合于SEQ IDNO:33的核酸探针。
第二培育：在添加抗生蛋白链菌素涂布的微米粒子(DYNAL M280，2.8μm，0.72mg/ml，生物素的结合能力为470ng/mg)之后，复合物通过生物素与抗生蛋白链菌素之间的相互作用变得与固相结合。将连接混合物添加至混合物，其中根据实例1中所述的方案制备连接混合物。如实例1中所述，将混合物与连接混合物一起在37℃下培育30分钟，洗涤以去除过量环化寡核苷酸，且与RCA混合物一起培育。混合物经洗涤且添加生物素标记的检测探针的混合物且在37℃下培育30分钟，其中如实例1中所描述来制备检测探针混合物。为了并入电化学发光标记SULFO-TAG(Meso Scale Diagnostics)，合成了具有末端生物素标记的检测探针且与SULFO-TAG标记的抗生蛋白链菌素预先结合。
将反应混合物抽吸至测量元件中，其中将微米粒子磁性捕捉至电极表面上。接着用PROCELL(含TPA的缓冲液)去除未结合物质。接着向电极施加电压，诱导电化学发光发射，其是通过光电倍增器来测量。通过校准曲线(其为通过2点校准专门产生的仪器)和通过试剂条形码提供的主曲线来确定结果。
任选地，为了稳定扩增复合物与珠粒的连接，在开始程序之前，或在添加RCA混合物之前或期间将包括SEQ ID NO:37或45的生物素锚定寡核苷酸结合于珠粒。
实例24.使用磁珠的三抗体RCA/PLA基于珠粒的分析
使用DYNABEAD 280(具有环氧连接化学物质的2.8μm磁珠)，基本上如实例1中所述地进行针对IL-4的三抗体RCA/PLA分析。这些DYNAL珠粒以20:1的抗体:锚定物比涂布有IL-4捕捉抗体和BSA锚定寡核苷酸。在涂布步骤后，珠粒用含0.5％ BSA的PBS封闭、洗涤且储存于0.1％ BSA中。如同实例1在PCR管条中进行RCA和检测培育步骤，其中在旋转混合器上培育，且将磁力分离用于洗涤步骤。在RCA和检测步骤后，珠粒经洗涤且再悬浮于1×读取缓冲液中且转移至MSD大点多孔分析盘(购自Meso Scale Discovery,Rockville,MD)。在读取ECL之前，使用96个磁体的阵列将MSD大点盘中的磁珠下拉至大点多孔分析盘的电极表面上。来自IL-4分析的结果展示于下表中。
下表展示了对珠粒使用磁性捕捉，来自DYNAL磁珠上的三抗体RCA/PLA IL-4分析的数据。ECL信号来自校准曲线的两个拷贝。
实例25.用于扩增夹心免疫分析的方案；在样品培育之后添加锚定寡核苷酸
改变实例16中的分析形式以允许在将分析物捕捉至固相上之后引入锚定DNA序列。这些形式允许在不存在锚定DNA的情况下将含有分析物的样品与捕捉抗体一起培育，消除了由样品DNA相互作用(诸如抗DNA反应性、DNA结合蛋白相互作用和分析物DNA相互作用)所致的干扰的可能。
基本上如实例16中所述地在各孔底部上包含整合式碳墨电极的MSD MULTI-ARRAY多孔盘中执行分析，修改如下。锚定寡核苷酸含有与实例16中相同的序列，且添加5'氨基修饰剂(/5AmMC6/)和3'氨基修饰的dT碱基(/3AmMC6T/)。使用DNP的NHS酯(DNP-X-SE D2248；THERMOFISHER)以20:1的摩尔激发比用二硝基苯酚(DNP)标记此氨基修饰的锚定物，接着使用7K ZEBA树脂脱盐。DNP的并入量测量为每个寡核苷酸1.9个DNP。使用生物素NHS酯试剂(EZ-LINK磺基-NHS-生物素，THERMOFISHER SCIENTIFIC)根据制造商程序标记抗DNP单克隆抗体纯系3571-E73-2(MSD)。如同实例15，用探针寡核苷酸(探针高GC)标记实例16中的检测抗体(IL-4抗体)。
此实例中所用的寡核苷酸如下(由商业核酸探针制造商制造)；
锚定寡核苷酸(锚定物)：5'-/5AmMC6/AAGAGAGTAGTACAGCAGCCGTCAA/3AmMC6T/3'(具有修饰的SEQ ID NO:45)
探针寡核苷酸(高GC探针)：5'-/5ThioMC6-D/TGCACAGCTCGACGC(具有修饰的SEQID NO:42)
环化寡核苷酸(高GC Circ)：/5Phos/GCTGTGCAATATTTCAGTGAATGCGAGT CCGTCTAAGAGAGTAGTACAGCAAGAGCGTCGA(具有修饰的SEQ ID NO:43)
检测寡核苷酸(检测剂)：5'-CAGTGAATGCGAGTCCGTCTAAG/iAmMC6T/iSp18/iAmMC6T/iSp18/3AmMO/-3'(具有修饰的SEQ ID NO:44)
通过将生物素标记的试剂结合于抗生蛋白链菌素涂布的电极而将捕捉抗体和抗DNP抗体固定于MSD盘中的电极上。首先，将盘的孔用含有0.05％ Tween-20的PBS(PBS-T)洗涤三次。接着向各孔中添加50μL在含牛血清白蛋白(BSA)的缓冲液中含有生物素标记的捕捉抗体(0.25μg/mL)和抗DNP抗体(20ng/mL)的溶液(通过组合IL-4捕捉抗体和抗DNP抗体的储备溶液制备)。接着将盘在室温下在振荡下培育至少1小时或不振荡培育隔夜，且接着用PBS-T洗涤3次以去除未结合的生物素标记抗体。将这些盘与含有添加的IL-4校准剂的样品一起培育。
在一种形式中，在IL-4-探针培育步骤中将检测抗体与2nM DNP标记的锚定寡核苷酸一起添加。如同实例15处理检测抗体，但使用如上的高GC Circ。在一种替代形式中，将0.5nM DNP标记的锚定物添加至实例16的连接步骤中，接着使用如上的高GC Circ进行如实例15的方法。此两种形式均能够产生与实例16中概述的标准形式类似的结果(如下表中所示)。
表：来自具有不同锚定形式的分析的ECL信号。
如上表中所示，以三种不同锚定形式测试来自IL-4校准剂的ECL信号以用于扩增的夹心免疫分析：如实例16中的标准和两种替代方法，其允许使用基于抗体的捕捉方法在样品培育后引入锚定寡核苷酸。在第一种替代方法中，将锚定寡核苷酸与探针标记的抗IL-4抗体一起引入(DNP-锚定物探测步骤)。在第二种替代方法中，在连接步骤(DNP-锚定物连接步骤)中引入锚定寡核苷酸。
本发明的范围不受本文所述的具体实施例限制。实际上，根据前述描述和随附图式，除了本文中所述的修改的外，方法的各种修改对所属领域的技术人员来说还将变得显而易见。这类修改意图属于权利要求书的范围内。本文中引用各种公开案，其公开内容以全文引用的方式并入。
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Claims (10)

1.一种式I的被标记的探针，
其中B是核苷酸碱基，R是电化学发光标记，L1是键联基团，L2是键联基团，j是0与11之间的整数，k是0与1之间的整数，m是0与11之间的整数且n是0与5之间的整数。
2.根据权利要求1所述的被标记的探针，其中R包括钌络合物RP1P2P3，其中P1、P2和P3中的每一个独立地是联吡啶、被取代的联吡啶、啡啉或被取代的啡啉。
3.根据权利要求2所述的被标记的探针，其中所述电化学发光标记R是：
4.根据权利要求1至3中任一项所述的被标记的探针，其中B是尿嘧啶，所述尿嘧啶在位置5处与L1连接。
5.根据权利要求1至4中任一项所述的被标记的探针，其中L1包括：
或
其组合，
其中p为1与12之间的整数。
6.根据权利要求1至5中任一项所述的被标记的探针，其中L2包括：
或
其组合，
其中q是0与11之间的整数。
7.一种式II的被标记的探针：
其中j是0与11之间的整数，k是0与1之间的整数，m是0与11之间的整数，n是0与5之间的整数，且R是电化学发光标记：
8.根据权利要求1所述的被标记的探针，其中k是0，j是0，m是1且n是5。
9.根据权利要求1至8中任一项所述的被标记的探针，其中所述寡核苷酸包括与
5'-CAGTGAATGCGAGTCCGTCT-3'(SEQ ID NO:31)具有至少90％序列一致性的序列。
10.根据权利要求1至8中任一项所述的被标记的探针，其中所述寡核苷酸包括
5'-CAGTGAATGCGAGTCCGTCT-3'(SEQ ID NO:31)。
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