ES2941631T3 - Compuestos de Pirido[4,3-d][1,3]oxazin-2-ona como inhibidores de IDH1 e IDH2 mutantes - Google Patents

Abstract

Un compuesto, como se define en el presente documento, o una composición farmacéutica que contiene el compuesto, para usar en el tratamiento del cáncer mutante IDH1 o IDH2 y que tiene la estructura: (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

DESCRIPCIÓN

Compuestos de Pirido[4,3-d][1,3]oxazin-2-ona como inhibidores de IDH1 e IDH2 mutantes

La proteína isocitrato deshidrogenasa (IDH) es una enzima importante en el ciclo del ácido cítrico (de los ácidos tricarboxílicos o de Krebs). El ciclo del ácido cítrico es de vital importancia para muchas rutas bioquímicas y es uno de los primeros componentes establecidos del metabolismo celular.

Las isocitrato deshidrogenasas catalizan la descarboxilación oxidativa de isocitrato a a-cetoglutarato (2-oxoglutarato). Estas enzimas pertenecen a dos subclases distintas, de las que una utiliza nicotinamida adenina dinucleótido (NAD(+)) como aceptor de electrones y la otra nicotinamida adenina dinucleótido fosfato (NADP(+)). Se han descrito tres isocitrato deshidrogenasas de mamífero: una isocitrato deshidrogenasa dependiente de NAD(+), una enzima de múltiples subunidades que se circunscribe a la matriz mitocondrial y dos isocitrato deshidrogenasas dependientes de NADP(+), una de las cuales es mitocondrial y la otra predominantemente citosólica. Cada isoenzima dependiente de NADP(+) es un dímero. La proteína codificada por el gen de IDH1 es la isocitrato deshidrogenasa dependiente de NADP(+) que se encuentra en el citoplasma y los peroxisomas. La enzima citoplásmica desempeña un papel importante en la producción citoplasmática de NADPH. La IDH1 se expresa en una amplia gama de especies y en organismos que carecen de un ciclo completo de ácido cítrico.

Recientemente, en varios tipos de cánceres se han descubierto mutaciones en la IDH1 y la isoforma IDH2 relacionada. Se descubrió que las mutaciones se producen en aminoácidos específicos a lo largo de la secuencia proteica y se expresan de forma heterocigótica, lo que es congruente con una ganancia de función. Estas mutaciones se producen en restos funcionalmente conservados y los estudios bioquímicos de las formas mutantes de IDH1 e IDH2 demostraron una pérdida de la función normal, la conversión reversible de isocitrato a a-cetoglutarato. El resultado de estas mutaciones es permitir una conversión nueva (o neomórfica) del a-cetoglutarato (aKG) a 2-hidroxiglutarato (2HG). Como resultado, las células cancerosas que albergan formas mutantes de IDH1 o IDH2 forman concentraciones sustancialmente más altas de 2HG. Los niveles altos de 2HG dan como resultado un bloqueo en la diferenciación celular que puede revertirse mediante la inhibición de la IDHIor o la IDH2 mutante.

La solicitud PCT/US2016/043264 desvela inhibidores covalentes de IDH1 mutante. Existe una necesidad adicional de compuestos que inhiban selectivamente la enzima IDH1 y la IDH2 mutantes para el tratamiento de diversos cánceres. Existe una necesidad adicional de compuestos que inhiban selectivamente la enzima IDH1 y la IDH2 mutantes que demuestren actividad neomórfica con respecto a IDH1 e IDH2 de tipo silvestre para el tratamiento de diversos cánceres. La presente invención proporciona compuestos de Fórmula I o la que son inhibidores de IDH1 e IDH2 mutantes. Los compuestos de Fórmula I o la son inhibidores covalentes que inhiben selectivamente IDH1 e IDH2 mutantes.

Un aspecto de la invención es proporcionar compuestos inhibidores de enzimas IDH1 e IDH2 mutantes de la Fórmula:

en la que:

R1 es -CH2CH(CHa)2, -CH2CH3, -CH2CH2OCH3 o -CH2-ciclopropilo;

R2 es -CH3 o -CH2CH3;

X es CH; o

una sal aceptable para uso farmacéutico del mismo.

Los siguientes compuestos inhibidores de la enzima IDH1 e IDH2 mutantes de la Fórmula la no forman parís de la invención reivindicada:

en la que

R1 es -CH2CH(CHa)2, -CH2CH3, -CH2CH2OCH3 o -CH2-ciclopropilo;

R2 es -CH3 o -CH2CH3; o

una sal aceptable para uso farmacéutico del mismo.

Otro aspecto de la presente invención proporciona una composición farmacéutica que comprende un compuesto inhibidor de IDH1 mutante de Fórmula Ia, o una sal aceptable para uso farmacéutico del mismo, y un vehículo aceptable para uso farmacéutico.

Un aspecto adicional de la presente invención proporciona un compuesto de Fórmula Ia o una sal aceptable para uso farmacéutico del mismo, para uso en terapia.

Otro aspecto de la presente invención proporciona un compuesto de Fórmula Ia o una sal aceptable para uso farmacéutico del mismo, para uso en el tratamiento de un cáncer que expresa IDH1 mutante o IDH2 mutante, que es glioma, glioblastoma, glioblastoma multiforme, astrocitomas, oligodendrogliomas, paraganglioma, fibrosarcoma, linfoma de linfocitos T angioinmunoblástico (LTAI), síndrome mielodisplásico (SMD), leucemia linfoblástica aguda de linfocitos B (LLAB), cáncer de tiroides, cáncer colorrectal, leucemia mieloide aguda (LMA), melanoma, cáncer de próstata, condrosarcoma o colangiocarcinoma.

Un aspecto adicional de la presente invención proporciona un compuesto de Fórmula Ia, o una sal aceptable para uso farmacéutico del mismo, para uso en el tratamiento de un cáncer que expresa IDH1 mutante o IDH2 mutante que es fibrosarcoma, leucemia mieloide aguda, glioma o glioblastoma.

Otro aspecto de la presente invención proporciona el uso de un compuesto de Fórmula I o Ia, o una sal aceptable para uso farmacéutico del mismo, para la fabricación de un medicamento para el tratamiento de un cáncer que expresa IDH1 mutante o IDH2 mutante que es glioma, glioblastoma, glioblastoma multiforme, astrocitomas, oligodendrogliomas, paraganglioma, fibrosarcoma, linfoma de linfocitos T angioinmunoblástico (LTAI), síndrome mielodisplásico (SMD), leucemia linfoblástica aguda de linfocitos B (LLAB), cáncer de tiroides, cáncer colorrectal, leucemia mieloide aguda (LMA), melanoma, cáncer de próstata, condrosarcoma o colangiocarcinoma.

Un aspecto adicional de la presente invención proporciona el uso de un compuesto de Fórmula I o Ia, o una sal aceptable para uso farmacéutico del mismo, para la fabricación de un medicamento para el tratamiento de un cáncer que expresa IDH1mutante o IDH2 mutante que es fibrosarcoma, leucemia mieloide aguda, glioma o glioblastoma.

El término "paciente" se refiere a un mamífero y "mamífero" incluye, pero sin limitación, un ser humano.

"Cantidad eficaz para uso terapéutico" significa la dosificación del compuesto de Fórmula I o Ia, o una sal aceptable para uso farmacéutico del mismo, o una composición farmacéutica que contiene el compuesto, o una sal aceptable para uso farmacéutico del mismo, necesaria para inhibir a IDH1 mutante o IDH2 mutante en un paciente con cáncer, lo que lleva a la liberación del bloqueo de la diferenciación, con la inhibición resultante del crecimiento de las células tumorales, y elimina, ralentiza o detiene la progresión del cáncer en un paciente. Las dosificaciones previstas de un compuesto de Fórmula I o Ia, o una sal aceptable para uso farmacéutico del mismo, están en el intervalo de 1 mg/paciente/día a 2000 mg/paciente/día. Se prevé que las dosis preferentes estén en el intervalo de 5 mg/paciente/día a 1800 mg/paciente/día. Se prevé que las dosis más preferentes estén en el intervalo de 40 mg/paciente/día a 1600 mg/paciente/día. Un médico determinará la dosificación exacta necesaria para tratar a un paciente y la duración del tratamiento en vista del estadio y la gravedad de la enfermedad, así como de las necesidades específicas y la respuesta del paciente individual. Aunque expresada como dosificación diaria, la administración de la dosis se puede ajustar para proporcionar un beneficio terapéutico más óptimo a un paciente y para tratar o mejorar cualquier toxicidad relacionada con el fármaco. Además de la dosificación diaria, puede ser apropiada la dosificación dos veces al día (B.I.D., forma siglada de bis in die (dos veces al día)); la dosificación tres veces al día (TI.D., forma siglada de ter in die); la dosificación en días alternos (Q2D, forma siglada de quaque 2 die); cada dos días durante un período de cinco días seguido de dos días sin dosificación (T.I.W., forma siglada de ter in week) o cada tres días (Q3D, forma siglada de quaque 3 die).

Los términos "tratamiento", "tratar", y " tratando", están destinados a incluir la gama completa de tratamientos para el cáncer que padece el paciente, tal como la administración del compuesto activo para aliviar, ralentizar o revertir uno o más de los síntomas y retrasar la progresión del cáncer incluso si el cáncer no se elimina realmente.

El término -CH2CH(CH3)2 significa 2-metilpropilo, el término -CH2CH2OCH3 significa 2-metoxietilo, y el término -CH2-ciclopropilo significa ciclopropilmetilo.

Un compuesto de Fórmula I o Ia, o una sal aceptable para uso farmacéutico del mismo, se formulan preferentemente como una composición farmacéutica, utilizando un vehículo aceptable para uso farmacéutico, y se administra mediante una diversidad de vías. Preferentemente, tales composiciones son para administración oral. Dichas composiciones farmacéuticas y procedimientos para prepararlas son bien conocidos en la técnica. Véase, por ejemplo, REMINGTON: THE SCIENCE AND PRACTICE OF PHARMACY, L.V Allen, editor, 22a edición, Pharmaceutical Press, 2012.

Un compuesto de Fórmula I o Ia, o una sal aceptable para uso farmacéutico, puede administrarse simultáneamente con, antes o después, de uno o más de otros agentes terapéuticos. El compuesto de Fórmula I o Ia, o una sal farmacéuticamente aceptable, cuando se administra con uno o más de otros agentes terapéuticos, se puede administrar por separado, por la misma vía de administración o una distinta, o juntos en la misma composición farmacéutica que el otro agente (o agentes) terapéutico. Cuando se administran uno o más agentes terapéuticos adicionales, la administración de cada agente terapéutico puede ser simultánea, por separado o secuencial.

Un compuesto de Fórmula I o Ia es capaz de reaccionar con varios ácidos orgánicos e inorgánicos para formar una sal de adición de ácido aceptable para uso farmacéutico. Dichas sales farmacéuticamente aceptables y la metodología común para prepararlas son bien conocidas en la técnica. Véase, por ejemplo, P Stahl, y col., HANDBOOK OF PHARMACEUTICAL SALTS: PROPERTIES, SELECTION AND USE, (VCHA/Wiley-VCH, 2002); S.M. Berge, et al., "Pharmaceutical Salts", Journal of Pharmaceutical Sciences, Vol. 66 , No. 1, January 1977).

Un compuesto de Fórmula I o Ia, o una sal aceptable para uso farmacéutico del mismo, puede prepararse mediante una diversidad de procedimientos conocidos en la técnica, así como los descritos a continuación. Para preparar un compuesto de Fórmula I o Ia, o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, las etapas sintéticas específicas pueden combinarse en un orden distinto.

De manera adicional, determinados intermedios descritos en las siguientes preparaciones pueden contener uno o más grupos protectores de nitrógeno. Se comprende que los grupos protectores pueden variar, como apreciará un experto en la técnica, dependiendo de las condiciones de reacción particulares y las transformaciones particulares a realizar. Las condiciones de protección y desprotección son bien conocidas por el experto en la técnica y se describen en la bibliografía (véase, por ejemplo, "Greene's Protective Groups in Organic Synthesis", Quinta edición, by Peter G.M. Wuts and Theodora W. Greene, John Wiley and Sons, Inc. 2014).

Los compuestos de Fórmula I o Ia se nombran de acuerdo con la IUPAC (forma siglada de International Union of Pure and Applied Chemistry, Unión Internacional de Química Pura y Aplicada) y también se pueden nombrar de acuerdo con el CAS (forma siglada de Chemical Abstracts Service, Servicio del Chemical Abstracts) y se pueden utilizar otros nombres para identificar inequívocamente un compuesto de Fórmula I o Ia, o una sal aceptable para uso farmacéutico del mismo.

Se comprenderá que un compuesto de Fórmula I o Ia se puede representar como un único estereoisómero. Hay dos centros quirales que dan lugar a cuatro diastereómeros. Como se usa en el presente documento, las referencias a un único estereoisómero pretenden incluir también mezclas estereoisoméricas que incluyen el compuesto mencionado o representado de Fórmula I o Ia. En el presente documento, las designaciones de Cahn-IngoldPrelog de (R)- y (S)-pueden utilizarse para referirse a estereoisómeros específicos. Se pueden preparar estereoisómeros específicos mediante síntesis estereoespecífica utilizando materiales de partida enriquecidos o enantioméricamente puros. Los estereoisómeros específicos de los materiales de partida, intermedios o mezclas racémicas que incluyen compuestos de Fórmula I o Ia pueden resolverse mediante técnicas bien conocidas en la técnica, tal como los que se encuentran en la Stereochemistry of Organic Compounds, E. I. Eliel y S. H. Wilen (Wiley 1994), y Enantiomers, Racemates, and Resolutions, J., Jacques, A. Collet y S. H. Wilen (Wiley 1991), incluida la cromatografía en fases estacionarias quirales, resoluciones enzimáticas, o cristalización fraccionada o cromatografía de diastereómeros formados para tal fin, tal como las sales diastereoméricas. Para compuestos de Fórmula I o Ia que tienen una configuración con todos los estereocentros mostrados, "sustancialmente enantioméricamente puro" significa que la pureza isomérica es superior al 90 % de exceso enantiomérico. En otra realización, un compuesto de Fórmula I o Ia la pureza isomérica es superior al 95 % de exceso enantiomérico. En otra realización más, un compuesto de Fórmula I o Ia la pureza isomérica es superior al 98 % de exceso enantiomérico. En aún otra realización, un compuesto de Fórmula I o Ia la pureza isomérica es superior al 99 % de exceso enantiomérico. Todos los estereoisómeros, individualmente e incluyendo mezclas diastereoméricas de los compuestos de Fórmula I o Ia, se contemplan dentro del ámbito de la presente invención. Las designaciones "isómero 1" e "isómero 2" y "diastereómero 1" y "diastereómero 2" se refieren a los compuestos que eluyen de la cromatografía quiral en primer y segundo lugar, respectivamente, y si la cromatografía quiral se inició en un momento anterior de la síntesis, se aplica la misma designación a los intermedios y ejemplos posteriores.

Los compuestos empleados como materiales de partida iniciales en la síntesis de los compuestos de Fórmula I o Ia son bien conocidos y, en la medida en que no esté disponible en el mercado, se sintetizan fácilmente utilizando las referencias concretas proporcionadas, mediante procedimientos convencionales comúnmente empleados por los expertos en la materia, o se encuentran en textos de referencia generales.

Los ejemplos de procedimientos y métodos conocidos incluyen los descritos en textos de referencia generales tales como Comprehensive Organic Transformations, VCH Publishers Inc, 1989; Compendium of Organic Synthetic Methods, Volumes 1- 10, 1974-2002, Wiley Interscience; Advanced Organic Chemistry, Reactions Mechanisms, and Structure, 5a edición, Michael B. Smith and Jerry March, Wiley Interscience, 2001; Advanced Organic Chemistry, 4a edición, Part B, Reactions and Synthesis, Francis A. Carey and Richard J. Sundberg, Kluwer Academic / Plenum Publishers, 2000, etc., y referencias citadas en dichos documentos.

Algunas abreviaturas se definen del siguiente modo: "ACN" significa acetonitrilo; "aKG" significa alfa-cetoglutarato o 2-cetoglutarato; "aloc" significa aliloxicarbonilo; "ATCC" significa Colección americana de cultivos tipo; "BCA" significa ácido bicin-conínico; "BSA" significa seroalbúmina bovina; "CDI" significa 1,1'-carbonildiimidazol; "DCC" significa 1,3-diciclohexilcarbodiimida; "DCM" significa diclorometano; "DEAD" significa dietil azodicarboxilato; "DIAD" significa diisopropilo azodicarboxilato; "DIC" significa diisopropilcarbodiimida; "DIPEA" significa diisopropiletilamina o N-etil-N-isopropil-propan-2-amina; "DMAP" significa dimetilaminopiridina; "DMF" significa dimetilformamida; "DMSO" significa dimetil sulfóxido; "DTT" significa ditiotreitol; "EDC" significa EDAC, EDCI, o clorhidrato de 1-(3-dimetilaminopropil)-3-etilcarbodiimida; "EDTA" significa ácido etilendiaminotetraacético; "EGTA" significa ácido etilenglicoltetraacético; "EtOAc" significa acetato de etilo; "EtOH" significa etanol o alcohol etílico; "Ej." significa ejemplo; "HATU" significa (dimetilamino)-N,N-dimetil(3H-[1,2,3]triazolo[4,5-6]piridin-3-iloxi)metaniminio hexafluorofosfato; "HBTU" significa 2-(1H-benzotriazol-1-yl)-1,1,3,3-tetrametiluronio hexafluorofosfato; "2HG" significa 2-hidroxiglutarato; "d5-3HG" significa ácido 3-hidroxi-1,5-pentanodioico-2,2,3,4,4-d5; "HILIC" (del inglés hydrophilic interaction liquid chromatography) significa cromatografía líquida de interacción hidrófila; "HOAt" significa 1-hidroxi-7-azobenzotriazol; "HOBt" significa hidrato de 1-hidroxilbenzotriazol; "HPLC" significa cromatografía líquida de alto rendimiento; "CI50" significa la concentración de un agente que produce un 50% de la respuesta inhibidora máxima posible para el agente; "mCPBA "significa ácido mefa-cloroperbenzoico; "MeOH" significa metanol o alcohol metílico; "NADP+ y NADPH" significan respectivamente las formas oxidadas y reducidas de nicotinamida adenina dinucleótido fosfato; "NMP" significa N-metil-2-pirrolidona; "GP" significa grupo protector; "Prep" significa preparación; "PyBOP" significa hexafluorofosfato de benzotriazol-1-iloxitripirrolidino-fosfonio; "PyBrop" significa hexafluorofosfato de bromo-tris-pirrolidino fosfonio; "rpm" significa revoluciones por minuto; "(R) -RUCY®-XylBINAP "significa RuCl[(R)-daipena][(R)-xilbinap; "SNAr "significa sustitución aromática nucleófila; "TEA" significa trietilamina; "TFA" significa ácido trifluoroacético; "THF" significa tetrahidrofurano y "Tris" significa tris(hidroximetil)aminometano.

Los compuestos de Fórmula I o Ia, o una sal aceptable para uso farmacéutico de los mismos, pueden prepararse mediante una diversidad de procedimientos conocidos en la técnica, algunos de los cuales se ilustran a continuación en los esquemas, preparaciones y ejemplos. Las etapas sintéticas específicos para cada una de las rutas descritas pueden combinarse de distintas formas, o junto con etapas de esquemas distintos, para preparar los compuestos de Fórmula I o Ia, o una sal farmacéuticamente aceptable de los mismos. Los productos de cada etapa del siguiente esquema se pueden recuperar por procedimientos convencionales bien conocidos en la técnica, incluyendo extracción, evaporación, precipitación, cromatografía, filtración, trituración y cristalización. En los esquemas que se presentan a continuación, todos los sustituyentes, a menos que se indique lo contrario, son los definidos anteriormente. Los reactivos y los materiales de partida están fácilmente disponibles para un experto en la materia.

En el Esquema 1, una serie de reacciones conducen a una 1 -sustituido-7-(metilsulfonil)-1,4-dihidro-2H-pirimido[4,5-d][1,3]oxazin-2-ona, (4), el producto de la Etapa C, en el cual R2 es como se ha definido anteriormente. "PG" es un grupo protector desarrollado para el grupo amino o el grupo oxígeno, tal como carbamatos, amidas o ésteres. Por ejemplo, la 5-hidroxi metil 4-amino-2-metilsulfanil-pirimidina se puede ciclar en condiciones convencionales de carbamoilación a la oxazin-2-ona usando trifosgeno y una base orgánica, tal como DIPEA o TEA a una temperatura de aproximadamente -30 a -35 °C para dar el Compuesto (2), el producto de la Etapa A. Como alternativa, se puede usar un carbonil dihaluro o un carbonil di-pseudohaluro, tal como CDI, fosgeno o difosgeno en lugar de trifosgeno para completar la carbamoilación. La amina de la oxazina puede alquilarse con el haluro de alquilo sustituido apropiado, tal como un reactivo de yodo en un solvente tal como NMP y una base inorgánica tal como K2CO3 a una temperatura de aproximadamente 50-65 °C para dar el Compuesto (3), el producto de la Etapa B. Alternativamente, una reacción de Mitsunobu para alquilar la oxazina usando un alcohol apropiado, tal como MeOH. Las reacciones de Mitsunobu son bien conocidas en la técnica y pueden convertir un grupo hidroxilo en un grupo saliente que es desplazado por una amplia variedad de nucleófilos como un carbamato usando trifenilfosfina y un azodicarboxilato, tal como DIAD o DEAD en un disolvente, tal como THF para dar el Compuesto (3). El sulfuro puede oxidarse a la sulfona en condiciones bien conocidas en la técnica, tal como mCPBA o peroximonosulfato potásico a una temperatura de aproximadamente 10 a 25 °C en un disolvente, tal como ACN o DCM para dar el Compuesto (4), el producto de la Etapa C.

Esquema 2

Proteoe-r

arbón acron

tapa D

Etapa

. ra eqar

Eiapa J 2. Afquilaeion

er

En el Esquema 2, se puede generar un (4-(1-aminoetil)fenil)metanol (7) en varias etapas a partir de un haluro de arilo, tal como un bromuro (5) usando procedimientos bien conocidos por el experto en la técnica. La amina puede protegerse en la subetapa 1, Etapa D, en la que "PG" es un grupo protector desarrollado para el grupo amino, tal como una amida. El bromuro de arilo protegido (5) se puede convertir en una cetona en condiciones de carbonilación de litio para dar la aril cetona (6 ) en la subetapa 2, Etapa D. Después, la cetona se puede reducir usando un agente reductor, tal como borohidruro sódico en un disolvente, tal como MeOH en la subetapa 1, Etapa E. La amina se puede desproteger en esta etapa (subetapa 2, Etapa E) o en un punto posterior de la síntesis para dar el Compuesto (7).

Como alternativa, el Compuesto (6) se puede convertir directamente en el Compuesto (12) en una aminación reductora usando isopropóxido de titanio (IV) en un disolvente, tal como THF y con calentamiento a aproximadamente 60 °C seguido de enfriamiento y la adición de MeOH y un agente, tal como cianoborohidruro sódico dar el Compuesto (12). El Compuesto (7) se puede convertir en un haluro de bencilo, tal como un cloruro en condiciones de halogenación estándar usando un agente de halogenación, tal como cloruro de tionilo o POCh en un disolvente, tal como DCM para dar el Compuesto (10), Etapa I. El Compuesto (10) puede protegerse si es necesario y alquilarse en la Etapa J. Por ejemplo, la amina, (10) se puede proteger en la subetapa 1 de la Etapa J usando un grupo protector, tal como un trifluoroacetilo o CBZ. Tales grupos protectores son bien conocidos y apreciados en la técnica. Como alternativa, el Compuesto 10 se puede preparar a partir de un aldehído, Compuesto (8). El Compuesto (8) se puede preparar por oxidación del correspondiente alcohol bencílico en condiciones tales como peryodinano de Dess-Martin en un disolvente, tal como DCM para dar un aldehído (8). Se puede lograr una reacción de Grignard en la Etapa G sobre el aldehído para dar el Compuesto (7). El Compuesto (7) de la Etapa G se puede clorar en la Etapa H para dar el Compuesto (10) como se discutió anteriormente para la Etapa I. El cloruro del Compuesto (10) se puede desplazar con una piperazina monoprotegida en un procedimiento de dos pasos en un recipiente. No siempre es necesario proteger la 1 -feniletilamina, pero si se elige la protección, es ventajoso usar un grupo protector diferente en la 1-feniletilamina que el producto amina piperazina (11), Etapa J, subetapa 1, para desproteger selectivamente una u otra PG en la etapa deseada. Por ejemplo, la 1-feniletilamina se puede hacer reaccionar con anhídrido trifluoroacético usando una base orgánica, tal como TEA en un disolvente como DCM a una temperatura de aproximadamente 0-5 °C para dar el producto de amina protegida de la subetapa 1, Etapa J. Un experto en la materia entendería que se pueden usar otros grupos protectores en la amina, tal como CBZ. El desplazamiento del cloruro se puede lograr entonces en condiciones bien conocidas por un experto en la materia. Por ejemplo, el haluro puede ser desplazado por la piperazina protegida o desprotegida usando una base inorgánica, tal como K2CO3y usando KI, o Nal como catalizador nucleófilo para acelerar la reacción. La mezcla se puede calentar a aproximadamente 60-80 °C en un disolvente, tal como ACN para dar el Compuesto protegido (11) de la subetapa 2, Etapa J. El grupo protector de la 1 -feniletilamina se puede retirar con una base, tal como hidróxido potásico acuoso para dar el Compuesto (11) de la subetapa 3, Etapa J.

En el Esquema 3, el Compuesto (11) se puede hacer reaccionar con el Compuesto (4), Esquema 1, en una reacción SNAr usando una base orgánica, tal como DIPEA, CsF para acelerar la reacción, un disolvente, tal como DMSO, y una temperatura de aproximadamente 70-80 °C para dar el producto de la Etapa L. En la Etapa M, subetapa 1, una piperazina protegida con terc-butoxi se puede desproteger usando un ácido, tal como HCl en dioxano y MeOH o TFA en DCM, mientras que una piperazina protegida con aloc puede desprotegerse en presencia de una fuente de paladio, tal como tetraquis(trifenilfosfina)paladio (0) catalítico en un disolvente, tal como THF usando un nucleófilo blando, tal como dimedona para dar la piperazina desprotegida de la subetapa 1, Etapa M. En la subetapa 2, Etapa M, la piperazina se puede amidar con cloruro de acriloilo a una temperatura de aproximadamente -50 a -78 °C con o sin una base orgánica, tal como TEA si la amina es una sal ácida en un disolvente, tal como DCM para dar compuestos de Fórmula Ia. Como alternativa, se puede realizar un acoplamiento de amida con ácido acrílico y la amina apropiada en un disolvente, tal como DMF con un reactivo de acoplamiento, tal como EDC y un aditivo, tal como HOBt. Un experto en la materia reconocerá que hay varios procedimientos y reactivos para la formación de amidas que resultan de la reacción de ácidos carboxílicos y aminas. Por ejemplo, la reacción de la amina y el ácido acrílico apropiados en presencia de un reactivo de acoplamiento con o sin una base orgánica, tal como DIPEA o TEA puede proporcionar un compuesto de Fórmula Ia. Otros reactivos de acoplamiento incluyen carbodiimidas, tales como Dc C, DIC o un carbonildiimidazol, tal como CDI. También se pueden usar otros aditivos de acoplamiento de amidas, tal como HOAt para mejorar la reacción. De manera adicional, pueden usarse sales de uronio o fosfonio de aniones no nucleofílicos, tal como HBTU, HATU, PyBOP y PyBrOP, en lugar de los reactivos de acoplamiento más tradicionales. Puede usarse un aditivo como DMAP para acelerar la reacción de amidación deseada.

Como alternativa en el Esquema 4, la amina del producto desprotegido del Compuesto (7), Esquema 2 se puede hacer reaccionar con el Compuesto (4) como se describe en el Esquema 3, Etapa L en una alquilación de SNAr para dar el Compuesto 13. El hidroxilo se puede clorar como se describe en la Etapa I, Esquema 2 para dar el Compuesto 14, Etapa O. El cloro del Compuesto (14) se puede desplazar en una alquilación con la piperazina, tal como se describe en el Esquema 2, Etapa 11, subetapa 2 para dar el Compuesto (5). La piperazina protegida puede desprotegerse y luego amidarse la piperazina como se describe en el Esquema 3, Etapa M para dar compuestos de Fórmula Ia.

Esquema 5

1. Proteger

2. Carbomlacion

Etapa D

PG = grupo de protección

1, Reducir _{Etapa E}

2. Desproteqer

. Alquiladóri

(PG-piperazina

. ^Desprotege

En el esquema 5, se puede generar un (4-(1-aminoetil)fenil)metanol (7a) quiral en varias etapas a partir de un haluro de arilo quiral, tal como un bromuro (5a) usando procedimientos bien conocidos por el experto en la técnica. La amina puede protegerse en la subetapa 1, Etapa D, en la que "PG" es un grupo protector desarrollado para el grupo amino, tal como una amida. El bromuro de arilo (5a) se puede convertir en una cetona en condiciones de carbonilación de litio para dar la arilcetona (6a) en la subetapa 2, Etapa D. La cetona se puede reducir asimétricamente usando un agente reductor quiral, tal como (R)-RUCY-XylBINAP en un disolvente, tal como EtOH para proporcionar el compuesto 7a en la subetapa 1, Etapa E. El compuesto (7a) se puede convertir en un haluro de bencilo quiral, tal como un cloruro en condiciones de halogenación estándar usando un agente de halogenación, tal como cloruro de benzoílo en un disolvente, tal como éter t-butílico para dar el compuesto (10a), Etapa I. El Compuesto (10a) se hace reaccionar primero con una piperazina protegida (PG-piperazina) en presencia de una base, tal como bicarbonato sódico en un disolvente, tal como acetonitrilo para dar una forma protegida en la subetapa 1, Etapa J. Después, la forma protegida se desprotege con una base, tal como hidróxido potásico acuoso en un disolvente, tal como EtOH para proporcionar el compuesto (11a), subetapa 2, Etapa J.

En el Esquema 6 , una serie de reacciones conduce a un 1-sustituido-7-doro-4H-pirido[4,3-d][1,3]oxazin-2-ona (18), el producto de la Etapa C en el que R2 es como se ha definido anteriormente. Por ejemplo, el 4,6-dicloropiridin-3-carboxilato de etilo (15) se puede hacer reaccionar con una amina en condiciones estándar para dar el 6-cloro-4-(amino)piridin-3-carboxilato (16) en un disolvente, tal como acetonitrilo. La reducción del grupo éster en el Compuesto (16) usando un reactivo hidruro, tal como hidruro de litio y aluminio en un disolvente, tal como THF proporciona el (4-amino-6-cloro-3-piridil)metanol (17). El Compuesto tal como el 17 se puede ciclar en condiciones estándar de carbamoilación a la oxazin-2-ona usando trifosgeno y una base orgánica como DIPEA o TEA a una temperatura de aproximadamente -20 °C para dar el Compuesto (18), el producto de la Etapa C Alternativamente, se puede usar un dihaluro carbonilo o un di-pseudohaluro carbonilo, tales como CDI, fosgeno o difosgeno en lugar de trifosgeno para completar la carbamoilación. El compuesto 11, preparado como se muestra anteriormente en los esquemas 2 o 5, o como se describe en alternativas a cualquiera de los esquemas, puede hacerse reaccionar con el Compuesto 18 en condiciones de alquilación estándar. Después, el compuesto intermedio resultante se desprotege y se amida como se describe anteriormente en los Esquemas 3 o 4 para producir los compuestos de Fórmula I en la que X es CH.

En una etapa opcional, se puede formar una sal aceptable para uso farmacéutico de un compuesto de Fórmula I o la mediante la reacción de una base libre apropiada de Fórmula I o la con un ácido apropiado aceptable para uso farmacéutico en un disolvente adecuado en condiciones estándar. De manera adicional, la formación de tales sales puede ocurrir simultáneamente tras la desprotección de un grupo protector de nitrógeno. La formación de tales sales es bien conocida y apreciada en la técnica. Véase, por ejemplo, Gould, P.L., "Salt selection for basic drugs", International Journal of Pharmaceutics, 33: 201-217 (1986); Bastin, R.J., et al., "Salt Selection and Optimization Procedures for Pharmaceutical New Chemical Entities", Organic Process Research and Development, 4: 427-435 (2000); y Berge, S.M., et al., "Pharmaceutical Salts", Journal of Pharmaceutical Sciences, 66 : 1-19 (1977). Un experto en la materia apreciará que un compuesto de Fórmula I o Ia se convierte fácilmente y puede aislarse como una sal farmacéuticamente aceptable.

Preparación 1

7-Metilsulfanil-1,4-dihidropirimido[4,5-d][1,3]oxazin-2-ona

Se añadió trifosgeno (859 g, 2,9 mol) a una solución de (4-amino-2-metilsulfanil-pirimidin-5-il)metanol (900 g, 5,26 mol) en THF (22,5 L ) durante 15 minutos a -30 °C. Se añadió DIPEA (2,449 g, 18,92 mol) durante 1 hora, mientras que se mantenía la temperatura de reacción entre -35 y -30 °C. Después, la mezcla de reacción se vertió sobre agua enfriada con hielo (30 L) y se añadió 2-metiltetrahidrofurano (10 L). La fase orgánica se lavó con agua y salmuera. La fase orgánica se secó sobre Na2SO4 y se concentró a sequedad. El producto en bruto se suspendió con éter de petróleo/EtOAc (1:1), se filtró y se concentró para dar un sólido de color amarillo el cual se llevó a cabo sin purificación adicional (890,5 g, 1,62 mol, pureza del 83 %, rendimiento del 86 %). MS (m/z): 198 (M+H).

Preparación 2

1 -Etil-7-(metiltio)-1,4-dihidro-2H-pirimido[4,5-d][1,3]oxazin-2-ona

A una solución de 7-metilsulfanil-1,4-dihidropirimido[4,5-d][1,3]oxazin-2-ona (280 g, 1,42 mol) en NMP (2,24 L) se añadieron K2CO3 (294,2 g, 2,13 mol) y yoduro de etilo (336,3 g, 1,99 mol) a temperatura ambiente. La mezcla se agitó durante 16 horas a 50 °C y después se diluyó con DCM (3 l) y agua (6 l). La fase orgánica se separó y se lavó con agua y salmuera y se concentró a sequedad para dar el compuesto del título en bruto (286 g, 1,27 mol, pureza del 83 %, rendimiento del 91 %). MS (m/z): 226 (M+H).

Preparación 3

1 -Metil-7-metilsulfanil-4H-pirimido[4,5-d][1,3]oxazin-2-ona

A una solución de trifenilfosfina (1,61 g, 6,08 mmol) y 7-metilsulfanil-1,4-dihidropirimido[4,5-d][1,3]oxazin-2-ona (1,00 g, 5,07 mmol) en THF (25 ml) se añadió MeOH (0,248 ml, 6,08 mmol) seguido de la adición gota a gota de DIAD (1,21 ml, 6,08 mmol) a temperatura ambiente. Después de agitar durante una noche el disolvente se retiró al vacío y el aceite resultante de color amarillo se purificó por cromatografía sobre gel de sílice (EtOAc al 40-50 %/hexanos) para dar el compuesto del título en forma de un sólido de color blanco (1,08 g, 5,11 mmol, cuantitativo). MS (m/z): 212 (M+H).

Preparación 4

1 -Etil-7-(metilsulfonil)-1,4-dihidro-2H-pirimido[4,5-d][1,3]oxazin-2-ona

A una solución en agitación de 1-etil-7-(metiltio)-1,4-dihidro-2H-pirimido[4,5-d][1,3]oxazin-2-ona (286 g, 1,24 mol) en ACN (2,8 L) y agua (1,4 L) se añadió peroximonosulfato potásico (1526 g, 2,48 mol) en forma de un sólido durante 20 minutos, y la mezcla resultante se agita durante 16 horas a 10-20 °C. La mezcla de reacción se filtró y la torta de filtro obtenida se lavó con DCM. El filtrado combinado y el DCM se lavaron con Na2SO3 al 5 %, agua y salmuera. La fase orgánica se secó sobre Na2SO4 y se concentró para proporcionar el compuesto del título (133,8 g, pureza del 93 %, rendimiento del 41 %). MS (m/z): 258 (M+H).

El siguiente compuesto se prepara esencialmente por el procedimiento de Preparación 4.

Tabla 1

Preparación 6

N-[(1S)-1 -(4-Bromofenil)etil]-2,2,2-trifluoro-acetamida

Se añadió gota a gota anhídrido trifluoroacético (165 ml, 1,17 mol) a una solución de (1S)-1-(4-bromofenil)etanamina (213 g, 1,06 mol) en ACN (1,3 L) a 5 °C seguido de la adición gota a gota de TEA (326 ml, 2,34 mol) durante 1 hora. Después de 30 minutos, se añadieron agua (3 l) y salmuera (1 l) dando como resultado la formación de un precipitado incoloro. La suspensión se agitó durante 15 minutos y después, el sólido se filtró, se lavó con agua y hexanos, y se secó con corriente de aire seguido de secado a 40 °C al vacío para dar el compuesto del título (290 g, 92 %). RMN 1H (d6-DMSO) 51,44 (d, 3H, J = 7,1 Hz), 4,98 (dddd, 1H, J= 7,6, 7,1,7,1,7,1 Hz), 7,30 (d, 2H, J = 8,4 Hz), 7,55 (d, 2H, J = 8,4 Hz), 9,91 (d, 1H, J = 7,6 Hz).

Preparación 7

N-[(1S)-1 -[4-(2-Cidopropilacetil)fenil]etil]-2,2,2-trifluoro-acetamida

Se añadió gota a gota litio n-butílico (2,5 M en hexanos, 53 ml, 130mmol) a una solución de N-[(1S)-1-(4-bromofenil)etil]-2,2,2-trifluoro-acetamida (18,00 g, 60,79 mmol) en THF (600 ml) a -78 °C para mantener una temperatura interna por debajo de -70 °C. Después de que se completase la adición, la mezcla se agitó durante 45 minutos a -78 °C y después se añadió 2-ciclopropil-N-metoxi-N-metil-acetamida (11,4 g, 79,6 mmol) como una solución en THF (10 ml). La mezcla se agitó a -78 °C durante 45 minutos, se añadió cloruro de amonio acuoso saturado y la mezcla se calentó a temperatura ambiente. Las capas se separaron y la capa orgánica se secó sobre sulfato sódico anhidro, se filtró y se concentró a presión reducida. Al sólido se le añadió una pequeña cantidad de DCM y la mezcla se calentó brevemente para disolver los sólidos. La mezcla se concentra hasta justo antes de la precipitación y después se añadieron gota a gota hexanos (150 ml) con agitación vigorosa para dar un sólido incoloro. El sólido se recogió por filtración, se lavó con una pequeña cantidad de hexanos y se secó a presión reducida para dar el compuesto del título (13,82 g, 76 %) en forma de un sólido incoloro. MS (m/z): 298,3 (M-H).

El siguiente compuesto se prepara esencialmente por el procedimiento de Preparación 7.

Tabla 2

Preparación 9

1-[4-[(1S)-1-Aminoetil]fenil]-2-ciclopropil-etanol

Se añadió borohidruro sódico (0,1411 g, 2 equiv., 3,729 mmol) a una solución de N-[(1S)-1-[4-(2-ciclopropilacetil)fenil]etil]-2,2,2-trifluoro-acetamida (558 mg, 1,86 mmol) en MeOH (15 ml) enfriado en un baño de agua enfriada con hielo. La mezcla se agitó durante aproximadamente 2,5 horas, y después se añadió hidróxido potásico (800 mg, 14,2 mmol) en agua (3 ml). La mezcla se agita a temperatura ambiente durante aproximadamente 20 horas. La mezcla se concentra y se repartió entre DCM y agua. La capa orgánica se lava con cloruro sódico acuoso saturado, se secó sobre sulfato sódico, se filtró y se concentró para dar el compuesto del título (354 mg, 1,38 mmol, 74 %) en forma de un sólido de color blanco. El material se usa sin purificación adicional. ES/MS (m/z): 189,0 (M-OH).

Preparación 10

2,2,2-Trifluoro-N-[(1S)-1-(4-formilfenil)etil]acetamida

Se añadió periodinano de Dess-Martin (20,9 g, 49,3 mmol) a una solución a 0 °C de 2,2,2-trifluoro-N-[(1S)-1-[4-(hidroximetil)fenil]etil]acetamida (11,1 g, 44,9 mmol) en DCM (450 ml). La mezcla de reacción se agitó durante una noche y se dejó calentar a temperatura ambiente. La mezcla de reacción se diluyó con DCM adicional y se lavó con NaHCÜ3 acuoso saturado, Na2S2Ü3 acuoso saturado y salmuera. Los extractos orgánicos combinados se secaron (Na2SÜ4), se filtraron y se concentraron para dar un residuo, el cual se purificó por cromatografía sobre gel de sílice eluyendo con un gradiente de EtOAc al 0-50 %/hexanos para dar el compuesto del título en forma de un sólido de color blanco (9,5 g, 39 mmol, 86 %). ES/MS (m/z): 244 (M-H).

Preparación 10a

2,2,2-Trifluoro-N-[(1S)-1-[4-(hidroximetil)fenil]etil]acetamida

Se añadió anhídrido trifluoroacético (12 ml, 85,4 mmol) a una solución a 0 °C de [4-[(1S)-1-aminoetil]fenil]metanol (10,8 g, 71,4 mmol) en CH2Ch (150 ml). Después de 10 minutos, se añadió gota a gota trietilamina (24 ml, 172 mmol) en CH2Cl2 (8 ml) durante 30 minutos, el baño de refrigeración se retiró y la reacción se agitó durante una noche. La mezcla de reacción se concentró al vacío, se diluyó con CH2Ch adicional, y se lavó con HCl acuoso 1 N y agua. La fase orgánica se secó (Na2SÜ4), se filtró y se concentró. El material en bruto se purifica por cromatografía sobre gel de sílice eluyendo con un gradiente de EtOAc al 0-50 %/hexanos para dar el compuesto del título en forma de un sólido de color blanco (11,1 g, 44,9 mmol, 63 %). ES/MS (m/z): 246 (M-H).

Preparación 11

2,2,2-Trifluoro-N-[(1S)-1-[4-(1-hidroxi-3-metil-butil)fenil]etil]acetamida

A una solución de 2,2,2-trifluoro-N-[(1S)-1-(4-formilfenil)etil]acetamida (1,72 g, 7,01 mmol) en THF (35 ml) enfriada en un baño de agua enfriada con hielo se añadió bromuro de isobutilmagnesio (2 M en éter dietílico, 7,0 ml, 14,0 mmol) y se agitó durante aproximadamente 30 minutos. La mezcla se inactivó con cloruro de amonio acuoso saturado y se repartió entre EtOAc y agua. La capa orgánica se lavó con cloruro sódico acuoso saturado, se secó sobre sulfato sódico, se filtró y se concentró para dar el compuesto del título en forma de un aceite (1,40 g, 4,15 mmol, 59 %) el cual se usó sin purificación adicional. ES/MS (m/z): 302,0 (M-H).

El siguiente compuesto se prepara esencialmente por el procedimiento de Preparación 11.

Tabla 3

Preparación 13

4-[2-ciclopropil-1 -[4-[(1S)-1 -[(2,2,2-trifluoroacetil)amino]etil]fenil]etil]piperazin-1 -carboxilato de terc-butilo

Se añadió isopropóxido de titanio (IV) (60 ml, 200 mmol) a una solución de N-[(1S)-1-[4-(2-ciclopropilacetil)fenil]etil]-2,2,2-trifluoro-acetamida (12,0 g, 40,1 mmol) y piperazin-1-carboxilato de terc-butilo (17,9 g, 96,1 mmol) en THF (80 ml) y la mezcla se agitó a 60 °C hasta el día siguiente. La mezcla se enfrió a temperatura ambiente y se añadió MeOH (80 ml) seguido de la adición en porciones de cianoborohidruro sódico (5,3 g, 80 mmol). La mezcla se agitó a temperatura ambiente durante 8 horas y después se añadieron agua y MeOH y la mezcla se agitó a temperatura ambiente durante una noche. La mezcla se filtró para retirar 'los sólidos y los sólidos se aclararon con MeOH y agua. El filtrado se concentró parcialmente para retirar la mayoría del MeOH y el residuo se extrajo con EtOAc (2x). Los extractos orgánicos combinados se secaron sobre sulfato sódico anhidro, se filtraron y se concentraron a presión reducida. El material en bruto se purificó por cromatografía en columna eluyendo con un gradiente de EtOAc del 0 % al 30 % en disolvente B en el que el disolvente B es 1: 1 de hexanos:DCM para dar el compuesto del título (10,5 g, 56 %) en forma de un sólido incoloro. MS (m/z): 470,3 (M+H).

Preparación 14

4-[1-[4-[(1S)-1-aminoetil]fenil]-2-ciclopropil-etil]piperazin-1-carboxilato de terc-butilo

Se añadió hidróxido potásico acuoso (5 M, 69 ml, 350 mmol) a una solución de 4-[2-ciclopropil-1-[4-[(1S)-1-[(2,2,2-trifluoroacetil)amino]etil]fenil]etil]piperazin-1-carboxilato de terc-butilo (32,24 g, 68,67 mmol) en EtOH (350 ml) y la mezcla resultante se agitó a temperatura ambiente durante 4 horas. El EtOH se retiró a presión reducida y al residuo se le añadió bicarbonato sódico acuoso saturado y la mezcla se extrajo con DCM. Los extractos orgánicos combinados se secaron sobre sulfato sódico anhidro, se filtraron y se concentraron a presión reducida para dar el compuesto del título (24,33 g, pureza del 96,5 % que contenía DCM residual al 3,5 %, rendimiento del 92 %) en forma de un aceite viscoso incoloro. MS (m/z): 374,3 (M+H).

El siguiente compuesto se prepara esencialmente por el procedimiento de Preparación 14.

Tabla 4

Preparación alternativa 14

Una solución de hidróxido potásico (1,28 g, 22,9 mmol) en agua (4 ml) se añadió a una solución de 4-[2-ciclopropil-1-[4-[(1s)-1-[(2,2,2-trifluoroacetil)amino]etil]fenil]etil]piperazin-1-carboxilato de terc-butilo (2,15 g, 4,58 mmol) en EtOH (23 ml) y la mezcla se agitó a temperatura ambiente. Después de aproximadamente 6 horas, la mezcla se concentró. El residuo se repartió entre DCM y una solución saturada de bicarbonato sódico. La capa orgánica se lavó con agua y cloruro sódico acuoso saturado, se secó sobre sulfato sódico, se filtró y se concentró para dar el compuesto del título en forma de un aceite el cual se usó sin purificación (1,73 g, 4,49 mmol, 98 %). ES/MS (m/z): 374,2 (M+H).

Preparación 18

4-[(1R)-1-[4-[(1S)-1-aminoetil]fenil]-2-ciclopropil-etil]piperazin-1-carboxilato de terc-butilo, diastereómero 1

Preparación 19

4-[(1S)-1-[4-[(1S)-1-aminoetil]fenil]-2-ciclopropil-etil]piperazin-1-carboxilato de terc-butilo, diastereómero 2

Una mezcla 1:1 de 4-[(1R)-1-[4-[(1S)-1-aminoetil]fenil]-2-ciclopropil-etil]piperazin-1-carboxilato de terc-butilo, diastereómero 1 y 4-[(1S)-1-[4-[(1S)-1-aminoetil]fenil]-2-ciclopropil-etil]piperazin-1-carboxilato de terc-butilo, diastereómero 2 (3,23 g) se disolvió en MeOH (40 ml) y se separó en diastereómeros individuales por cromatografía HPLC preparativa quiral usando las siguientes condiciones: columna Chiralpak AD, 20 ^m, (8 x 33 cm); volumen de inyección 10 ml; eluyente MeOH al 100% con DMEA al 0,2%; longitud de onda de detección 220 nm; caudal 400 ml/min. La Preparación 12, 4-[(1R)-1-[4-[(1S)-1-aminoetil]fenil]-2-ciclopropil-etil]piperazin-1-carboxilato de tercbutilo, diastereómero 1, se obtuvo a partir del primer pico que eluyó en forma de un aceite viscoso transparente (1,50 g, 46%, >99% de). MS (m/z): 374,3 (M+H). Preparación 13, 4-[(1S)-1-[4-[(1S)-1-aminoetil]fenil]-2-ciclopropiletil]piperazin-1-carboxilato de terc-butilo, diastereómero 2 , se obtuvo a partir del pico que eluyó en segundo lugar en forma de un aceite viscoso transparente (1,46 g, 45 %, >98,2 % de). ^m S (m/z): 374,3 (M+H).

Preparación 20

N,3-Dimetoxi-N-metil-propanamida

Una solución de ácido 3-metoxipropanoico (62 g, 577,7 mmol) en DCM (1200 ml) se trató en porciones lentamente con 1,1'-carbonildiimidazol (103 g, 635,2 mmol) y se agitó a temperatura ambiente durante 2 horas. Se añadió clorhidrato de N,O-dimetilhidroxilamina (62 g, 635,6 mmol) y la mezcla se agitó a temperatura ambiente durante una noche. La mezcla se lavó con agua (2x), HCl ac. 0,1 M (2x) y con bicarbonato sódico acuoso saturado (2x), se secó sobre sulfato de magnesio, se filtró y se concentró a sequedad para dar el material en bruto. El material en bruto se cromatografía sobre gel de sílice eluyendo con un gradiente de acetona al 20-40 % en hexanos. El aceite resultante se seca durante una noche al vacío para dar el compuesto del título (69,5 g, 81,7 %). RMN 1H (CDCh) 52,72 (t, 2H), 3,2 (s, 3H), 3,38 (s, 3H), 3,7 (m, 5H).

Preparación 21

2,2,2-Trifluoro-N-[(1S)-1-[4-(1-hidroxi-3-metoxi-propil)fenil]etil]acetamida

Se disolvió 2,2,2-trifluoro-N-[(1S)-1-[4-(3-metoxipropanoil)fenil]etil]acetamida (23,62 g, 73,98 mmol, 95 % en masa) en MeOH (700 ml) y se trató con borohidruro sódico (5,6 g, 150 mmol). Después de agitar a temperatura ambiente durante 2 horas la mezcla se trató con cloruro de amonio acuoso saturado y el MeOH se evaporó. El material resultante se repartió entre agua y EtOAc, se separó y los extractos orgánicos combinados se secaron sobre Na2SO4, se filtraron y se concentraron a sequedad. El material en bruto se cromatografía sobre gel de sílice eluyendo con EtOAc al 40 % en hexanos para dar el compuesto del título en forma de un sólido de color blanco (17,82 g, 79 %). MS (m/z): 306 (M+H).

Preparación 22

4-[3-metoxi-1-[4-[(1S)-1-[(2,2,2-trifluoroacetil)amino]etil]fenil]propil]piperazin-1-carboxilato de terc-butilo

Se disolvió 2,2,2-trifluoro-N-[(1S)-1-[4-(1-hidroxi-3-metoxi-propil)fenil]etil]acetamida (21,76 g, 71,27 mmol) en DCM (350 ml) y se enfrió a -10 °C. Se añadió gota a gota cloruro de tionilo (26,12 g, 16 ml, 219,6 mmol) y la reacción se agitó durante 2 horas. La mezcla se concentró a sequedad, se volvió a disolver en DCM y se volvió a concentrar. El material en bruto se disolvió en ACN (300 ml) y se añadieron piperazin-1-carboxilato de t-butilo (26,55 g, 142,6 mmol), carbonato potásico (39,5 g, 286 mmol) y yoduro potásico (12,0 g, 72,3 mmol). La mezcla se calentó a 80 °C durante 72 horas. El sólido de color blanco resultante se filtró y se lavó con EtOAc. Los filtrados combinados se lavaron con cloruro de amonio acuoso, se secó sobre sulfato de magnesio, se filtró y se concentró. El material en bruto se cromatografía sobre gel de sílice eluyendo con un gradiente de EtOAc al 40-80 % en hexanos para dar el compuesto del título en forma de una espuma de color blanco (29,63 g, 88 %). MS (m/z): 474 (M+H).

Preparación 23

4-[1-[4-(1S)-1-aminoetil]fenil]-3-metoxi-propil]piperazin-1-carboxilato de tere-butilo, diastereómero 1

Preparación 24

4-[1-[4-(1S)-1-aminoetil]fenil]-3-metoxi-propil]piperazin-1-carboxilato de terc-butilo, diastereómero 2

A una solución de 4-[3-metoxi-1-[4-[(1S)-1-[(2,2,2-trifluoroacetil)amino]-etil]propil]piperazin-1-carboxilato de terc-butilo (29,60 g, 62,5 mmol) en EtOH (310 ml) se añadió hidróxido potásico ac. (63 ml, 5 M). La solución se agitó durante 4 horas a temperatura ambiente y después la mezcla se concentró a sequedad. El residuo en bruto se trató con agua y bicarbonato sódico acuoso saturado y se extrajo con DCM (3x). Los extractos orgánicos combinados se secaron sobre sulfato sódico, se filtraron y se concentraron para dar el compuesto del título (23,6 g) el cual se disolvió en MeOH (236 ml) y se separó en diastereómeros individuales mediante cromatografía SFC quiral usando las siguientes condiciones: columna: Lux Cellulose-1, (5 x 25 cm); volumen de inyección: 1 ml cada 2,5 minutos, eluyente MeOH al 15 %/CO2, detección de longitud de onda 230 nm; caudal 300 g/min; temperatura de columna: 40 °C; Punto de partida BPR: 10 MPa; temperatura BPR: 40 °C. El compuesto del título de la Preparación 28 se obtuvo a partir del pico que eluyó en primer lugar en forma de un aceite viscoso transparente de color amarillo (10,1 g, 42,8 %, 96,6 % de). Ms (m/z): 378 (M+H). El compuesto de la Preparación 29 se aisló como el pico que eluyó en segundo lugar en forma de un aceite viscoso transparente de color amarillo (10,3 g, 43,6 %, 95,2 % de). MS (m/z): 378 (M+H).

Preparación 25

7-[[(1S)-1 -[4-(1 -Cloro-2-ciclopropil-etil)fenil]etil]amino]-1 -etil-4H-pirimido[4,5-d][1,3]oxazin-2-ona

Se añadió cloruro de tionilo (0,23 ml, 3,219 mmol) a una mezcla de 7-[[(1S)-1-[4-(2-ciclopropil-1-hidroxietil)fenil]etil]amino]-1-etil-4H-pirimido[4,5-d][1,3]oxazin-2-ona (432 mg, 1,03 mmol) y carbonato potásico (741 mg, 5,37 mmol) en DCM (20 ml) y la mezcla se agitó a temperatura ambiente durante 20 minutos. La mezcla se filtró a través de tierra de diatomeas y se concentró para dar el compuesto del título (518 mg, 1,07 mmol, 100 %) en forma de una espuma de color blanco, el cual se usó sin purificación adicional. ES/MS (m/z): 401,2/403,2 (M+H).

Los siguientes compuestos se prepararon esencialmente mediante el procedimiento de la Preparación 25.

Tabla 5

Preparación 29

-[(1R)-2-cidopropil-1-[4-[(1S)-1-[(1-etil-2-oxo-4H-pirimido[4,5-d][1,3]oxazin-7-il)amino]etil]fenil]etil]piperazin-1-carboxilato de tere-butilo

A una solución de 4-[(1R)-1-[4-[(1S)-1-aminoetil]fenil]-2-cidopropil-etil]piperazin-1-carboxilato de terc-butilo (864 mg, 3,35 mmol) y 1-etil-7-(metilsulfonil)-1,4-dihidro-2H-pirimido[4,5-d][1,3]oxazin-2-ona (1,14 g, 3,05 mmol), en DMSO (15 ml) se añadieron CsF (1,39 g, 9,15 mmol) y DIPEA (0,80 ml, 4,6 mmol). La mezcla se agitó a 60 °C durante 1,5 horas. La mezcla se enfrió a temperatura ambiente, se diluyó con EtOAc y se lavó con agua (2x). Los lavados acuosos combinados se extrajeron con EtOAc y los extractos orgánicos combinados se secaron (Na2SO4), se filtraron y se concentraron a sequedad. El producto en bruto resultante se purificó por cromatografía sobre gel de sílice eluyendo con un gradiente de EtOAc del 55 % al 95 % en hexanos para dar el compuesto del título en forma de un sólido incoloro (1,47 g, 88 %). MS (m/z): 551,3 (M+H).

Los siguientes compuestos se prepararon esencialmente mediante el procedimiento de Preparación 29.

Tabla 6

Preparación 39

7-[[(1S)-1 -[4-[(1R)-2-CiclopropiM -piperazin-1-il-etil]fenil]etil]amino]-1-etil-4H-pirimido[4,5-d][1,3]oxazin-2-ona

Se añadió gota a gota ácido clorhídrico (95 ml, 5,5 M en isopropanol, 520 mmol) a una solución de 4-[(1R)-2-cidopropil-1-[4-[(1S)-1-[(1-etil-2-oxo-4H-pirimido[4,5-d][1,3]oxazin-7-il)amino]etil]fenil]etil]piperazin-1-carboxilato de terc-butilo (29,45 g, 53,48 mmol) en EtOAc (570 ml) a 40 °C. La mezcla se dejó en agitación 3 horas, a temperatura ambiente y después, se añadió agua (300 ml). Las capas se separaron y la capa orgánica se extrajo con agua (2 x 150 ml). El pH de los extractos acuosos combinados se ajustó a pH 10 mediante la adición de NaOH 5 N dando como resultado la formación de un sólido incoloro. El sólido se recogió por filtración, se lavó con agua y se secó al aire para dar el compuesto del título (25,18 g, 99 %) en forma de un sólido incoloro. MS (m/z): 451,2 (M+H).

El siguiente compuesto se prepara esencialmente por el procedimiento de Preparación 39.

Tabla 7

Preparación 41

7-[[(1S)-1 -[4-(2-Ciclopropil-1 -piperazin-1 -il-etil)fenil]etil]amino]-1 -metil-4H-pirimido[4,5-d][1,3]oxazin-2-ona, diastereómero 1

4-[2-ciclopropil-1-[4-[(1S)-1-[(1-metil-2-oxo-4H-pirimido[4,5-d][1,3]oxazin-7-il)amino]etil]fenil]etil]piperazin-1-carboxilato de terc-butilo, diastereómero 1 (245 mg, 0,46 mmol) se disolvió en DCM (2,5 ml). Se añadió TFA (0,7 ml, 9 mmol) y la reacción se agitó a temperatura ambiente durante 90 minutos. La mezcla se inactiva con K2CO3 ac. al 20 % y se extrajo con DCM (3x). Los extractos orgánicos combinados se secaron sobre Na2SO4, se filtraron y se concentraron a sequedad a alto vacío durante una noche para dar el compuesto del título en forma de una espuma de color blanco, (196 mg, 88,5 %). MS (m/z): 437 (M+H).

Los siguientes compuestos se prepararon esencialmente mediante el procedimiento de Preparación 41.

Tabla 8

Preparación 49

7-[[(1S)-1 -[4-(2-CidopropiM-piperazin-1 -il-etil)fenil]etil]amino]-1-etil-4H-pirimido[4,5-d][1,3]oxazin-2-ona

Una mezcla de 7-[[(1S)-1-[4-(1-doro-2-cidopropil-etil)fenil]etil]amino]-1-etil-4H-pirimido[4,5-d][1,3]oxazin-2-ona (518 mg, 1,07 mmol), carbonato potásico (445 mg, 3,217 mmol), yoduro sódico (161 mg, 1,07 mmol) y piperazina (277 mg, 3,22 mmol) en ACN (3 ml) se calentó en un vial cerrado herméticamente a 70 °C. Después de ~8 horas, la mezcla se enfrió a temperatura ambiente, se diluyó con EtOAc, se filtró a través de tierra de diatomeas y se concentró. El material en bruto se purifica sobre gel de sílice eluyendo con un gradiente de NH33 M del 1 % al 7 %/MeOH en DCM para dar el compuesto del título (306 mg, 0,66 mmol, 62 %) en forma de un sólido de color blanco. ES/MS (m/z): 451,2 (M+H).

Los siguientes compuestos se prepararon esencialmente mediante el procedimiento de Preparación 49 usando la piperazina protegida apropiada.

Tabla 9

Preparación 53

4-[1-[4-[(1S)-1-[(2,2,2-trifluoroacetil)amino]etil]fenil]propil]piperazin-1-carboxilato de tere-butilo, isómero 1

Preparación 54

4-[1-[4-[(1S)-1-[(2,2,2-trifluoroacetil)amino]etil]fenil]propil]piperazin-1-carboxilato de tere-butilo, isómero 1

Se disolvió 4-[1-[4-[(1S)-1-[(2,2,2-trifluoroacetil)amino]etil]-fenil]propil]piperazin-1-carboxilato de tere-butilo (29,2 g, 65,8 mmol) en MeOH (584 ml) y se resolvió mediante cromatografía SFC quiral usando las siguientes condiciones: columna: Chiralpak AD-H, 5x25 cm; eluyente CO2/MeOH 85/15 con dimetiletilamina al 0,5%; caudal 300 g/min; detección de longitud de onda 230 nm; temperatura de columna 40 °C; Punto de partida BPR 10MPa; 40 °C de temperatura del disolvente. El isómero 1 se aisló como el pico que eluyó en primer lugar (14,15 g, 31,9 mmol). ES/MS (m/z): 444 (M+H). El isómero 2 se aisló como el pico que eluyó en segundo lugar (13,87 g, 31,3 mmol). ES/M^s (m/z): 444 (M+H).

Preparación 55

4-[1-[4-[(1S)-1 -[(1-etil-2-oxo-4H-pirimido[4,5-d][1,3]oxazin-7-il)amino]etil]fenil]-3-metil-butil]piperazin-1-carboxilato de tere-butilo, isómero 1

Preparación 56

4-[1-[4-[(1S)-1 -[(1-etil-2-oxo-4H-pirimido[4,5-d][1,3]oxazin-7-il)amino]etil]fenil]-3-metil-butil]piperazin-1-carboxilato de tere-butilo, isómero 2

Se disolvió 4-[1-[4-[(1S)-1-[(1-etil-2-oxo-4H-pirimido[4,5-d][1,3]oxazin-7-il)amino]etil]fenil]-3-metil- butil]piperazin-1-carboxilato de ferc-butilo (2,6 g, 4,70 mmol) en isopropanol:cloroformo 4:1 (50 ml) y se resolvió mediante cromatografía SFC quiral usando las siguientes condiciones: columna: Chiralpak AD-H, 5x25 cm; volumen de inyección 1 ml; eluyente CO2/IPA 75/25 con dimetiletilamina al 0,5 %; caudal 280 g/min; detección de longitud de onda 240 nm; temperatura de columna 40 °C; Punto de partida BPR 10 MPa; 40 °C de temperatura del disolvente. La Preparación 45 se aisló como el pico que eluyó en primer lugar (1,02 g, 1,89 mmol). ES/MS (m/z): 553,4 (M+H). La Preparación 46 se aisló como el pico que eluyó en segundo lugar (1,05 g, 1,90 mmol). ES/MS (m/z): 553,4 (M+H).

Los ejemplos 1 a 8 y 11 a 16 no forman parte de la invención reivindicada.

Ejemplo 1

7-[[(1S)-1-[4-[(1R)-2-Ciclopropil-1-(4-prop-2-enoilpiperazin-1-il)etil]fenil]etil]amino]-1-etil-4H-pirimido[4,5-d][1,3]oxazin-2-ona

Se añadió gota a gota cloruro de acriloílo (305 pl, 3,75 mmol, en 2 ml de DCM) a una solución de 7-[[(1S)-1-[4-[(1R)-2-ciclopropil-1-piperazin-1-il-etil]fenil]etil]amino]-1-etil-4H-pirimido[4,5-d][1,3]oxazin-2-ona (1,73 g, 3,26 mmol) en DCM a -78 °C. Después de 2 minutos a -78 °C, se añadieron unas gotas de MeOH seguido de bicarbonato sódico acuoso saturado y la mezcla se dejó calentar a temperatura ambiente. Se añadió DCM, las capas se separaron y la capa acuosa se extrajo con DCM. Los extractos orgánicos combinados se secaron (Na2SO4), se filtraron y se concentraron a sequedad. El producto en bruto resultante se purificó por cromatografía sobre gel de sílice (Disolvente A del 25 % al 40 % en Disolvente B en el que el Disolvente A es MeOH al 10 %/acetona y el Disolvente B es hexanos) para dar el compuesto del título en forma de un sólido incoloro (1,16 g, 70 %). MS (m/z): 505,3 (M+H).

Los siguientes compuestos se prepararon esencialmente mediante el procedimiento de Ejemplo 1.

Tabla 11

Determinación de la estructura cristalina de rayos X IDH1 en complejo con 7-[[(1S)-1-[4-[(1S)-2-ciclopropil-1-(4-prop-2-enoilpiperazin-1-il)etil]fenil]etil]amino]-1-etil-4H-pirimido[4,5-d][1,3]oxazin-2-ona.

La estructura cristalina de IDH1 en complejo con 7-[[(1S)-1-[4-[(1S)-2-ciclopropil-1-(4-prop-2-enoilpiperazin-1-il)etil]fenil]etil]amino]-1-etil-4H-pirimido[4,5-d][1,3]oxazin-2-ona se determina a partir de los datos de difracción de rayos X recopilados en la línea de haz de sincrotrón APS 31-ID operada en la Fuente avanzada de fotones en el Argonne National Laboratory, Argonne, IL 60439. La proteína IDH1 con una mutación R132H está disponible comercialmente de múltiples fuentes. Como alternativa, La proteína IDH1 R132H puede aislarse de una línea celular disponible comercialmente que alberga la mutación mediante técnicas bien conocidas y usadas habitualmente por los expertos en la materia. Los cristales se obtienen de bandejas de gotas equilibradas a 21 °C con proteína IDH1 con la mutación R132H a una concentración de 15 mg/ml en un tampón que contiene HEPES 10 mM pH 7,5, cloruro sódico 150 mM, glicerol al 10 %, ditiotreitol 5 mM y 7-[[(1S)-1-[4-[(1S)-2-ciclopropil-1-(4-prop-2-enoilpiperazin-1-il)etil]fenil]etil]amino]-1-etil-4H-pirimido[4,5-d][1,3]oxazin-2-ona 2 mM, y se mezcla con un volumen igual de solución de depósito que contiene Bis Tris100 mM pH 5, DMSO al 5 %, PEG 3350 al 22 % y sulfato de amonio 200 mM. Los cristales se remojan durante la noche en una solución que contiene 3 mM de 7-[[(1S)-1-[4-[(1S)-2-ciclopropil-1-(4-prop-2-enoilpiperazin-1-il)etil]fenil]etil]amino]-1-etil-4H-pirimido[4,5-d][1,3]oxazin-2-ona, antes de ser transferido a una solución suplementada con etilenglicol al 22 % y congelado instantáneamente para la recolección de datos. Los datos de difracción con una resolución de 2,8 Á se recogen con radiación de rayos X de longitud de onda 0,9793 Á. Los cristales pertenecen al Grupo espacial P43212 con parámetros de celda a=82,74 A, b=82,74 A, c=299,4Á, a=p=Y=90°. La estructura se determina por reemplazo molecular y contiene una molécula de dímero de IDH1. Los mapas de densidad de electrones de diferencia calculados después de modelar la proteína IDH1 tienen una densidad clara para dos moléculas unidas de 7-[[(1S)-1-[4-[(1S)-2-ciclopropil-1-(4-prop-2-enoilpiperazin-1-il)etil]fenil]etil]amino]-1-etil-4H-pirimido[4,5-d][1,3]oxazin-2-ona.

La estereoquímica de 7-[[(1S)-1-[4-[(1S)-2-ciclopropil-1-(4-prop-2-enoilpiperazin-1-il)etil]fenil]etil]amino]-1-etil-4H-pirimido[4,5-d][1,3]oxazin-2-ona se determina a partir de la densidad electrónica, y ambas moléculas de 7-[[(1S)-1-[4-[(1S)-2-ciclopropil-1-(4-prop-2-enoilpiperazin-1-il)etil]fenil]etil]amino]-1-etil-4H-pirimido[4,5-d][1,3]oxazin-2-ona se moldean y la estructura del cocomplejo se refina a factores R de Rwork=0,192 y Rfree=0,228.

Tabla 12

Ejemplo 13

1-Etil-7-[[(1S)-1-[4-[3-metoxi-1-(4-prop-2-enoilpiperazin-1-il)propil]fenil]etil]amino]-4H-pirimido[4,5-d][1,3]oxazin-2-ona, diastereómero 1

Se disolvió 4-[(1S)-1-[4-[(1S)-1-[(1-etil-2-oxo-4H-pirimido[4,5-d][1,3]oxazin-7-il)amino]etil]fenil]-3-metoxipropil]piperazin-1-carboxilato de tere-butilo (1,372 g, 2,473 mmol) en DCM (15 ml) y se añadió TFA (10 ml, 15,08 g, 132,3 mmol). La reacción se agitó durante 1 hora y después se concentró a sequedad. El material en bruto se disolvió en DCM (12 ml) y DIPEA (1,25 ml, 7,17 mmol) y la mezcla se enfrió a -78 grados. Se añadió gota a gota cloruro de acriloílo (0,18 ml, 0,20 g, 2,2 mmol). Después de 10 minutos, se añadieron unas gotas de metanol para inactivar el cloruro de acriloílo restante y la reacción se concentró a sequedad (frío). El material en bruto se cromatografía sobre gel de sílice eluyendo con un gradiente de acetona al 50-70 % en hexanos para dar el compuesto del título en forma de una espuma de color blanco (867 mg, 73 %). MS (m/z): 509 (M+H).

El siguiente compuesto se prepara esencialmente por el procedimiento del Ejemplo 13.

Tabla 13

Ejemplo 15

Disulfato de 7-[[(1S)-1 -[4-[(1S)-2-ciclopropil-1 -(4-prop-2-enoilpiperazin-1 -il)etil]fenil]etil]amino]-1 -etil-4H-pirimido[4,5-d][1,3]oxazin-2-ona

Se colocó 7-[[(1S)-1-[4-[(1S)-2-ciclopropil-1-(4-prop-2-enoilpiperazin-1-il)etil]fenil]etil]amino]-1-etil-4H-pirimido[4,5-d][1,3]oxazin-2-ona (188 mg) en 5 ml de acetona mientras se agitaba a 1000 rpm/60 °C. La muestra era una solución transparente. Se añadieron gota a gota 45 ^l de ácido sulfúrico (diluido en 2 ml de acetona). Después de unas pocas gotas, se formó una suspensión espesa de color blanca. Después de la adición de la mitad del ácido sulfúrico, se cambió la consistencia de la suspensión. La adición de la segunda mitad del ácido sulfúrico se realiza lentamente, gota a gota. La goma en suspensión se pegó ligeramente antes de convertirse en una suspensión de sólido de color blanco brillante que fluye libremente. Se apagó el calor de la placa después de 30 minutos y la muestra se enfrió a temperatura ambiente, dando una suspensión espesa de sólido de color blanco. El sólido de color blanco se aisló por filtración al vacío. La torta resultante fue un sólido de color blanco brillante. La muestra se secó en su lugar sobre el filtro en corriente de aire durante 20 minutos, después en el horno de vacío a 70 °C durante la noche. Se recuperaron 266 mg (rendimiento del 96,9 %).

Ejemplo 16

Ácido 7-[[(1S)-1-[4-[2-cidopropil-1-(4-prop-2-enoilpiperazin-1-il)etil]fenil]etil]amino]-1-etil-4H-pirimido[4,5-d][1,3]oxazin-2-ona 4-hidroxibenzoico

Se añadió ácido 4-hidroxibenzoico (0,023 g, 0,165 mmol) a una solución de 7-[[(1S)-1-[4-[2-ciclopropil-1-(4-prop-2-enoilpiperazin-1-il)etil]fenil]etil]amino]-1-etil-4H-pirimido[4,5-d][1,3]oxazin-2-ona (84 mg, 0,165 mmol) en diclorometano (5 ml). Después de agitar 5 minutos, el disolvente se evaporó lentamente en un flujo de nitrógeno. Además, el sólido resultante se secó al vacío para dar 4-hidroxibenzoato de 7-[[(1S)-1-[4-[2-ciclopropil-1-(4-prop-2-enoilpiperazin-1-il)etil]fenil]etil]amino]-1-etil-4H-pirimido[4,5-d][1,3]oxazin-2-ona (105 mg, 0,1617 mmol) en forma de un sólido de color blanco. MS (m/z): 423,2 (M+H).

Preparación 57

2-Ciclopropil-M-metoxi-M-metilacetamida

En un matraz de fondo redondo de 500 ml en agitación se cargaron diclorometano (160 ml, 8 volúmenes) y 1,1'-carbonildiimidazol (35,63 g, 1,1 equiv.). La mezcla heterogénea se enfrió a 15 °C y a la mezcla se le cargó una solución de ácido 2-ciclopropilacético (20,0 g, 1,0 equiv.) en diclorometano (40 ml, 2 volúmenes) a una velocidad que controla la temperatura interna por debajo de 20 °C. La solución resultante se calentó a 25 °C y se agitó durante 2 horas. Después, la solución se enfrió a 15 °C y se cargó en porciones de clorhidrato de N,0-dimetil hidroxilamina (21,43 g, 1,1 equiv.), manteniendo la temperatura interna por debajo de 20 °C. La mezcla heterogénea resultante se calentó a 25 °C y se agitó durante 15 horas. Después, la mezcla de reacción se diluyó con agua (160 ml, 8 volúmenes) y se agitó durante 15 minutos. Se detuvo la agitación y se separó la capa acuosa inferior. La capa acuosa resultante se extrajo con diclorometano otras dos veces (100 ml, 5 volúmenes x 2) y las capas orgánicas se combinaron. La capa orgánica combinada se lavó dos veces con HCl 1,5 N (100 ml, 5 volúmenes x 2). Después, la capa orgánica se lavó dos veces con bicarbonato sódico acuoso al 10 % (100 ml, 5 volúmenes x 2). Después, la capa orgánica se lavó con agua (100 ml, 5 volúmenes) seguido de cloruro sódico acuoso saturado (100 ml, 5 volúmenes). La capa orgánica se secó sobre sulfato sódico anhidro (1,0 % p/p). La masa se filtró y se lavó con diclorometano (20 ml, 1 volumen) y después se concentró al vacío. El sólido resultante se secó a alto vacío durante 5 horas para obtener el compuesto del título (25,9 g, rendimiento del 90,5 %). ES/EM m/z 144,1 (M+H).

Síntesis alternativa de la Preparación 6

(S)-W-(1-(4-bromofenil)etil)-2,2,2-trifluoroacetamida

En un matraz de fondo redondo de 250 ml en agitación se cargó diclorometano (100 ml, 10 volúmenes) seguido de (S)-(-)-1-(4-bromofenil)etilamina (10,0 g, 1,0 equiv.). La solución se enfrió a 0 °C y a la solución enfriada se le cargó lentamente anhídrido trifluoroacético (13,12 g, 1,25 equiv.), manteniendo la temperatura interna por debajo de 5 °C. La mezcla heterogénea resultante se agitó a 0 °C durante 2 horas, momento en el cual se cargó lentamente trimetilamina (12,64 g, 2,5 equiv.), manteniendo la temperatura interna por debajo de 5 °C. La mezcla se agitó durante una hora adicional y después se interrumpió mediante la adición de agua (30 ml, 3 volúmenes). La mezcla bifásica se calentó a 25 °C y se agitó durante 30 minutos. Después, las capas se separaron y la capa acuosa se extrajo adicionalmente dos veces con diclorometano (50 ml, 5 volúmenes x 2). Las capas orgánicas combinadas se lavaron con cloruro sódico acuoso saturado (50 ml, 5 volúmenes) y se secaron sobre sulfato sódico anhidro (1 % en peso). La solución seca se filtró y se lavó con diclorometano (10 ml, 1 volumen) y la solución se concentró al vacío para dar un sólido en bruto de color blanco. El sólido en bruto se suspendió en éter de petróleo (100 ml, 10 volúmenes) durante 2 horas a 25 °C y el sólido se recogió por filtración. El sólido húmedo se secó al vacío a 40 °C durante 8 horas para obtener el compuesto del título (13,3 g, rendimiento del 90 %). ES/EM m/z 295,3 (M+H).

Preparación 58

(S)-M-(1-(4-(2-ciclopropilacetil)feml)etil)-2,2,2-trifluoroacetamida

A un recipiente de reacción 10 L con agitación superior se cargó metil terc-butil éter (1500 ml, 15 volúmenes). A la solución en agitación se le cargó (S)-N-(1-(4-bromofenil)etil)-2,2,2-trifluoroacetamida (100 g, 1,0 equiv.). La mezcla heterogénea se agitó a 25 °C durante 30 minutos y después se cargó tetrahidrofurano (500 ml, 5 volúmenes). La solución homogénea resultante se enfrió a -83 °C. Se añadió lentamente litio n-butílico (297 ml, 2,2 equiv.) a la solución manteniendo la temperatura por debajo de -78 °C y la solución resultante se agitó a -83 °C durante 1,5 horas. A la solución enfriada se añadió una solución de 2-ciclopropil-N-metoxi-N-metilacetamida (53,19 g, 1,1 equiv.) en metil tercbutil éter (200 ml, 2 volúmenes), manteniendo la temperatura interna por debajo -78 °C. La solución resultante se agitó a -83 °C durante 1,5 horas, momento en el cual la solución se calentó a -30 °C y se interrumpió mediante la adición de cloruro de amonio acuoso saturado (5 L , 5 volúmenes). La mezcla de reacción interrumpida de reacción se calentó a 25 °C y las capas se separaron. La capa acuosa se extrajo con metil terc-butil éter (500 ml, 5 volúmenes). Las capas orgánicas combinadas se lavaron con agua (500 ml, 5 volúmenes), seguido de cloruro sódico acuoso saturado (500 ml, 5 volúmenes) y después se secaron sobre sulfato sódico anhidro (50 g, 0,5 % p/p). La masa se filtró y se lavó con metil terc-butil éter (50 ml, 0,5 volúmenes). La solución resultante se concentró al vacío hasta que quedó aproximadamente 1 volumen de solución. Se cargó éter de petróleo (1500 ml, 15 volúmenes) a la mezcla concentrada y la suspensión resultante se agitó por debajo de 30 °C durante 2 horas. El sólido se recogió por filtración y se secó al vacío a 40 °C durante 8 horas para obtener el compuesto del título (65,9 g, rendimiento del 67 %). ES/e M m/z 298,0 (M-H).

Preparación 59

M-((S)-1-(4-((S)-2-ciclopropiM-hidroxietil)feml)etil)-2,2,2-trifluoroacetamida

En un reactor hidrogenador se cargó etanol absoluto (7,89 kg, 10 volúmenes). A la solución en agitación se le cargó (S)-N-(1-(4-(2-ciclopropilacetil)fenil)etil)-2,2,2-trifluoroacetamida (1,0 kg, 1,0 equiv.). A la solución se cargó una solución de terc-butóxido potásico (1,0 M en tBuOH, 0,41 kg, 0,5 volúmenes) manteniendo la temperatura interna por debajo de 30 °C. Después, a la solución se cargó (R)-RuCY®-XylBINAP (0,0675 kg, 0,017 equiv.). El hidrogenador se purgó con gas hidrógeno dos veces, mientras que se agitaba a 25 °C. Después de la purga, la solución se agitó en 4,5 kg de presión de hidrógeno a 25 °C durante 5 horas. Después de 5 horas, la solución se ventiló y luego se concentró a un aceite con vacío por debajo de 42 °C. El aceite se disolvió en metil terc-butil éter (11,115 kg, 15 volúmenes) y después se concentró a un aceite con vacío por debajo de 45 °C. El aceite se disolvió en metil terc-butil éter (11,115 kg, 15 volúmenes) y después se concentró a un aceite con vacío por debajo de 45 °C. Al aceite se cargó metil terc-butil éter (22,23 kg, 30 volúmenes) a 25 °C. La solución resultante se lavó con agua (15,0 kg, 15 volúmenes) seguido de una solución de NaCI en agua (5,4 kg de NaCI en 15,0 L agua). La capa orgánica se secó sobre sulfato sódico anhidro (1,5 kg, 1,5 p/p) y después se filtró y se lavó con metil terc-butil éter (1,112 kg, 1,5 volúmenes). A la solución filtrada se le cargó carbón vegetal activo (0,3 kg, 0,3 p/p) y la mezcla se agitó y se calentó a 40 °C durante 2 horas. Después, la mezcla se filtró y se lavó con metil terc-butil éter (1,112 kg, 1,5 volúmenes). La solución filtrada se concentró hasta un aceite con vacío por debajo de 45 °C. El aceite se disolvió en éter de petróleo (9,84 kg, 15 volúmenes) y se concentró hasta un aceite con vacío por debajo de 45 °C. El aceite se disolvió en éter de petróleo (9,84 kg, 15 volúmenes) y se concentró hasta un aceite con vacío por debajo de 45 °C. Al aceite se le cargó éter de petróleo (19,68 kg, 30 volúmenes) y la mezcla se agitó a 30 °C durante 3 horas y el sólido resultante se recogió por filtración y se lavó con éter de petróleo (9,84 kg, 15 volúmenes). El sólido aislado se secó al vacío a 40 °C durante 5 horas para obtener el compuesto del título (0,79 kg, 79 %). ES/E^m m/z 300,0 (M-H).

Preparación 60

N-((S)-1-(4-((R)-1-doro-2-ddopropMetM)feml)etM)-2,2,2-trifluoroacetamida

A un reactor se cargaron metil terc-butil éter (4,45 kg, 6 volúmenes) y N-((S)-1-(4-((S)-2-ciclopropil-1-hidroxietil)fenil)etil)-2,2,2-trifluoroacetamida (1,0 kg, 1,0 equiv.). La solución se enfrió 10 °C y se cargó lentamente 1-formilpirrolidina (0,066 kg, 0,2 equiv.) manteniendo la temperatura interna por debajo de 13 °C. Después, a la solución se le cargó lentamente cloruro de benzoílo (0,56 kg, 1,2 equiv.) manteniendo la temperatura interna por debajo de 13 °C. La solución resultante se calentó a 25 °C y se agitó durante hasta 36 horas (la reacción se puede controlar durante el curso de la reacción y, si se detiene, se pueden realizar cargas adicionales de 1-formil pirrolidina y cloruro de bencilo). Después, la reacción completa se concentró hasta un aceite al vacío a 40 °C. El aceite se enfrió a 15 °C y después se inactiva con una solución acuosa de bicarbonato sódico al 10% (22,0 kg, 20 volúmenes) y se agitó durante 3 horas a 25 °C. A la mezcla bifásica se le cargó éter de petróleo (6,56 kg, 10 volúmenes). La capa orgánica se separó. La capa acuosa se extrajo con éter de petróleo (6,56 kg, 10 volúmenes). Las capas orgánicas combinadas se lavaron con bicarbonato sódico acuoso al 10 % (5,0 l, 5 volúmenes) tres veces. Después, la capa orgánica se lavó con agua (5,0 l, 5 volúmenes) seguido de salmuera (5,0 l, 5 volúmenes). La capa orgánica se secó sobre sulfato sódico anhidro (0,5 kg, 0,5 p/p). Después, la mezcla se filtró y se lavó con éter de petróleo (0,33 kg, 0,5 volúmenes). El filtrado se concentró hasta un aceite con vacío por debajo de 40 °C. El aceite se disolvió en acetonitrilo (3,93 kg, 5 volúmenes) y se concentró hasta un aceite con vacío por debajo de 40 °C. El aceite se disolvió en acetonitrilo (3,93 kg, 5 volúmenes) y se concentró hasta un aceite con vacío por debajo de 40 °C. El aceite se disolvió en acetonitrilo (7,86 kg, 10 volúmenes) y la solución obtenida del compuesto del título se usó en bruto en la siguiente etapa. ES/EM m/z 318,0 (M-H).

Preparación 61

4-((S)-2-ddopropiM-(4-((S)-1-(2,2,2-trífluoroacetamido)etN)feml)etNpiperazm-1-carboxNato de tere-butilo

A la solución obtenida previamente de N-((S)-1-(4-((R)-1-cloro-2-ciclopropiletil)fenil)etil)-2,2,2-trifluoroacetamida se cargó N-Boc-piperazina (0,924 kg, 1,5 equiv.) seguido de bicarbonato sódico (1,1 kg, 4,0 equiv.). La mezcla resultante se calentó a 85 °C durante 60 horas. Nota: se tomaron muestras de la reacción cada 24 horas y después de tomar cada muestra, la reacción se cargó una cantidad adicional de N-Boc-piperazina (0,31 kg, 0,5 equiv.). Una vez completada, la reacción se concentró al vacío a 45 °C para producir un aceite. El aceite se diluyó con agua (10,0 kg, 10 volúmenes) y metil terc-butil éter (7,41 kg, 10 volúmenes). La mezcla bifásica resultante se separó y la capa acuosa se extrajo con metil terc-butil éter (7,41 kg, 10 volúmenes). Las capas orgánicas combinadas se extrajeron con ácido cítrico al 30 % (5,0 l, 5 volúmenes) cinco veces. Las capas acuosas combinadas se lavaron dos veces con éter de petróleo (6,56 kg, 10 volúmenes). La capa acuosa se llevó a un pH de 9 con la adición de carbonato sódico (aproximadamente 25,0 kg, 25 p/p) a 15 °C. La capa acuosa basificada se extrajo con metil terc-butil éter (7,41 kg, 10 volúmenes). Las capas orgánicas combinadas se lavaron con agua (5,0 l, 5 volúmenes) y salmuera (5,0 l, 5 volúmenes). La capa orgánica se secó sobre sulfato sódico anhidro (0,5 kg, 50 % p/p). La mezcla se filtró y se lavó con metil terc-butil éter (0,37 kg, 0,5 volúmenes). El filtrado se concentra hasta un aceite por vacío a 40 °C. El aceite resultante se disolvió en etanol absoluto (3,95 kg, 5 volúmenes) y la solución en bruto del compuesto del título se usó directamente en la siguiente etapa. ES/EM m/z 374,3 (M+H-CF3Co ).

Preparación 62

4-((S)-1 -(4-((S)-1 -aminoetil)fenil)-2-cidopropiletil)piperazin-1 -carboxilato de tere-butilo

A la solución obtenida previamente de 4-((S)-2-ciclopropil-1-(4-((S)-1-(2,2,2-trifluoroacetamido)etil)fenil)etilpiperazin-1-carboxilato de terc-butilo se cargó etanol absoluto (3,7 kg, 3,7 p/p). La solución se enfrió a 20 °C y se cargó hidróxido potásico 1 M acuoso (0,168 kg KOH en 3,0 kg agua). La mezcla resultante se agitó a 25 °C durante 10 horas y después se templó mediante la adición lenta de ácido cítrico acuoso al 30 % (5,0 kg, 5 p/p) manteniendo la temperatura interna por debajo de 30 °C. A la solución interrumpida se cargó metil terc-butil éter (7,4l kg, 7,41 p/p). Las capas se separaron y la capa orgánica se extrajo con ácido cítrico acuoso al 30 % (5,0 kg, 5 p/p). La capa acuosa se llevó a un pH de 8 con la adición de carbonato sódico (aproximadamente 25,0 kg, 25 p/p) a 15 °C. La capa acuosa basificada se extrajo dos veces con acetato de etilo (7,41 kg, 7,41 p/p). Las capas orgánicas combinadas se lavaron con agua (5,0 kg, 5 p/p) y después salmuera (5,0 kg, 5 p/p). La capa orgánica se secó sobre sulfato sódico anhidro (0,5 kg, 50 % en peso), después se filtró y se lavó con acetato de etilo (0,37 kg, 0,37 p/p). La solución se concentra hasta un aceite por vació a 45 °C. El aceite resultante se disolvió en alcohol isopropílico (2 l, 2 volúmenes), y la solución resultante se concentró hasta un aceite por vacío en 45 °C. El aceite resultante se disolvió en alcohol isopropílico (1,2 l, 1,2 volúmenes) y la solución en bruto del compuesto del título se usó directamente en la siguiente etapa de purificación. ES/EM m/z 374,2 (M+H).

A un matraz de fondo redondo de 1000 ml se cargó una solución de 4-((S)-1-(4-((S)-1-aminoetil)fenil)-2-ciclopropiletil)piperazin-1-carboxilato de terc-butilo (30,0 g, 1,0 equiv.) en alcohol isopropílico (270 ml, 9 volúmenes). A la solución en agitación a 20-30 °C se le cargó ácido L-dibenzoil tartárico (L-DBTA, 34,5 g, 1,2 equiv.). La solución se agitó a 20-30 °C durante 2-4 horas. La suspensión resultante se dejó en agitación durante 8-12 horas a 20-30 °C. A la suspensión ligera se le cargó MTBE (300 ml, 10 volúmenes). La suspensión resultante se dejó en agitación y se espesó a 20-30 °C durante 12-16 horas. Después, el sólido se recogió por filtración y se lavó con MTBE (150 ml, 5 volúmenes). El sólido se secó a presión reducida a 45-55 °C durante 12 horas para proporcionar sal del ácido L-dibenzoil tartárico de 4-((S)-1-(4-((S)-1-aminoetil)fenil)-2-ciclopropiletil)piperazin-1-carboxilato de terc-butilo como un sólido de color blanco (48,8 g, rendimiento del 83 %, >98:2 dr).

En un matraz de fondo redondo de 1000 ml en agitación se cargó sal del ácido L-dibenzoil tartárico de 4-((S)-1-(4-((S)-1-aminoetil)fenil)-2-ciclopropiletil)piperazin-1-carboxilato de terc-butilo (40,0 g, 1,0 equiv.) seguido de diclorometano (400 ml, 10 volúmenes). A la solución en agitación a 15-25 °C se le cargó una solución acuosa de Na2CO3 al 10 % (suficiente para llevar el pH a 8-10, aproximadamente 6-8 volúmenes). La mezcla bifásica se agitó durante 1 hora a 15-25 °C y después las capas se separaron en un embudo de decantación. A la capa orgánica se le carga DMSO (240 ml, 6 volúmenes). La solución se concentra a presión reducida por debajo de 40 °C para retirar el diclorometano. Después, la solución de 4-((S)-1-(4-((S)-1-aminoetil)fenil)-2-ciclopropiletil)piperazin-1-carboxilato de terc-butilo de base libre en DMSO se usó directamente en la siguiente etapa.

Preparación 63

6-Cloro-4-(metilamino)piridin-3-carboxilato de etilo

Se añadió gota a gota metil amina (16 ml, 11,6 mol/ L en agua, 186 mmol) a una solución de 4,6-dicloropiridin-3-carboxilato de etilo (20 g, 92 mmol) en acetonitrilo (300 ml) a 0 °C. La mezcla de reacción se dejó calentar a temperatura ambiente durante 2 h. A la mezcla de reacción se añadieron agua y acetato de etilo y la capa acuosa se extrajo con acetato de etilo. Los extractos orgánicos combinados se secaron sobre Na2SO4 anhidro, se filtraron y se concentraron a sequedad. El material en bruto resultante se purificó por cromatografía sobre gel de sílice (EtOAc al 0­ 100 %/hexanos) para dar, después de la concentración de las fracciones apropiadas, 6-cloro-4-(metilamino)piridin-3-carboxilato de etilo en forma de un sólido de color blanco (10,46 g, 52,14 mmol, rendimiento del 57 %). MS (m/z): 201 (M+H).

Preparación 64

[6-Cloro-4-(metilamino)-3-piridil]metanol

Una solución de 6-cloro-4-(metilamino)piridin-3-carboxilato de etilo (10,46 g, 52,14 mmol) en THF (100 ml) se añadió gota a gota a una mezcla de hidruro de litio y aluminio (78,2 ml, 1,0 mol/ L en THF, 78,2 mmol) a 0 °C. La mezcla de reacción se dejó calentar a temperatura ambiente durante 1,5 h. A la mezcla de reacción se le añadió, secuencialmente, agua (3 ml), NaoH acuoso al 15 % (3 ml), y después agua (9 ml). Después de agitar, la mezcla de reacción se filtró a través de una capa de Celite. El filtrado se diluyó con agua y se extrajo con diclorometano. Los extractos orgánicos combinados se secaron sobre Na2SO4 anhidro, se filtraron y se concentraron a sequedad para proporcionar [6-cloro-4-(metilamino)-3-piridil]metanol en forma de un sólido de color amarillo pálido (2,78 g, rendimiento del 27 %). La torta de filtro de Celite se lavó además con metanol y el filtrado se concentró a sequedad. Los sólidos de la torta de filtro se recogieron y se agitaron con diclorometano y se filtraron a través de Celite. El filtrado se combinó con el residuo del metanol lavado y el material se concentró a sequedad y el material se reservó. A los sólidos recogidos de la filtración se le añadió 4:1 de cloroformo:alcohol isopropílico y la mezcla se agitó durante una noche. La mezcla se filtró sobre una capa de Celite, el filtrado se combinó con el residuo reservado y se concentró a sequedad para proporcionar una cantidad adicional de [6-cloro-4-(metilamino)-3-piridil]metanol en forma de un sólido de color amarillo pálido (5,07 g, rendimiento del 56 %). La recuperación total de [6-cloro-4-(metilamino)-3-piridil]metanol fue 7,85 g, rendimiento del 83 %. MS (m/z): 173 (M+H).

Preparación 65

7-Cloro-1-metil-4H-pirido[4,3-d][1,3]oxazin-2-ona

Se añadió trifosgeno (6,04 g, 20,4 mol) a una solución de [6-cloro-4-(metilamino)-3-piridil]metanol (5,07 g, 29,1 mol) y DIPEA (51,2 ml, 291 mmol) en THF (100 ml) a -20 °C. El baño frío se retiró y la mezcla se dejó calentar a temperatura ambiente. Después de 30 minutos, se añadió agua y la mezcla se extrajo con diclorometano. Los extractos orgánicos combinados se secaron sobre Na2SO4 anhidro, se filtraron y se concentraron a sequedad. El material en bruto resultante se purificó por cromatografía sobre gel de sílice (EtOAc al 0-100 %/hexanos) para dar, después de la concentración de las fracciones apropiadas, 7-cloro-1-metil-4H-pirido[4,3-d][1,3]oxazin-2-ona en forma de un sólido de color naranja (5,13 g, 24,5 mmol, rendimiento del 84 %). MS (m/z): 199 (M+H).

Preparación 66

4-[2-ciclopropil-1 -[4-[(1S)-1 -[(1-metM-2-oxo-4H-pirido[4,3-d][1,3]oxazm-7-M)ammo]etM]fenM]etM]piperazm-1-carboxilato de terc-butilo, diastereómero 1

A una solución de 4-[1-[4-[(1S)-1-aminoetil]fenil]-2-ciclopropiletil]piperazin-1-carboxilato de terc-butilo (1,30 g, 3,48 mmol), 7-cloro-1-metil-4H-pirido[4,3-d][1,3]oxazin-2-ona (864 mgs, 4,35 mmol) y carbonato de cesio (2,27 g, 6,96 mmol) en tolueno (17,4 ml) en nitrógeno, se añadió dicloro[1,3-bis(2,6-di-3-pentilfenil)imidazol-2-ilideno](3-cloropiridil)paladio (II) (291 mgs, 0,348 mmol), y la mezcla se calentó a 75 °C hasta el día siguiente. Después de enfriar a temperatura ambiente, la mezcla se filtró a través de un lecho de gel de sílice y eluyó con acetato de etilo. El filtrado se concentra a presión reducida y el residuo adquirido se purificó por cromatografía sobre gel de sílice (EtOAc al 20­ 100 %/hexanos). Las fracciones mixtas se volvieron a purificar por cromatografía sobre gel de sílice (metil ferc-butil éter/hexanos 50-100 %) y las fracciones puras combinadas de ambas columnas se concentraron para dar 4-[2-cidopropil-1-[4-[(1S)-1-[(l-metil-2-oxo-4H-pirido[4,3-d][1,3]oxazin-7-il)amino]etil]fenil]etil]piperazin-1-carboxilato de terc-butilo, diastereómero 1 como una espuma de color blanquecino (1,312 g, 2,400 mmol, rendimiento del 69 %). MS (m/z): 536 (M+).

El cáncer se reconoce cada vez más como un grupo heterogéneo de enfermedades cuyo inicio y progresión se inducen por la función anómala de uno o más genes que regulan la reparación del ADN, la estabilidad del genoma, la proliferación celular, la muerte celular, la adhesión, la angiogénesis, la invasión y la metástasis en microentornos celulares y tisulares. La función variante o anómala de los genes de "cáncer" puede ser el resultado de un polimorfismo del ADN de origen natural, de cambios en el número de copias del genoma (a través de amplificación, supresión, de la pérdida o duplicación de cromosomas), de cambios en la estructura de genes y cromosomas (a través de translocación cromosómica, de inversión u otro reordenamiento que conduzca a la expresión génica desregulada) y de mutaciones puntuales. Las neoplasias cancerosas pueden inducirse por una función genética anómala y mantenerse por la misma función genética anómala, o el mantenimiento y la progresión pueden estar exacerbados por funciones genéticas anómalas adicionales.

Independientemente de las anomalías cromosómicas genéticas mencionadas con anterioridad, cada uno de los cánceres también puede incluir modificaciones epigenéticas del genoma, que incluyen metilación del ADN, sellado genómico y modificación de histonas por acetilación, metilación o fosforilación. Una modificación epigenética puede desempeñar un papel en la inducción y/o mantenimiento de la malignidad.

Se han recopilado extensos catálogos de las anomalías citogenéticas en el cáncer humano, que se mantienen y actualizan periódicamente en línea (véase el sitio de internet de The Mitelman Database of Chromosome Aberrations in Cancer at the US National Cancer Institute (NCI) Cancer Genome Anatomy Project (CGAP)). El Wellcome Trust Sanger Institute Cancer Genome Project mantiene en línea un "Censo de genes del cáncer" detallado de todos los genes humanos que se han relacionado causalmente con oncogénesis, así como la base de datos COSMIC (Catalogue of Somatic Mutations in Cancer) de mutaciones somáticas en el cáncer humano. Otra fuente que contiene abundante información sobre los cambios citogenéticos relacionados causalmente con diversos cánceres es el Atlas de genética y citogenética en oncología y hematología.

El diagnóstico de neoplasias cancerosas por biopsia, inmunofenotipado y otras pruebas son conocidos y se utilizan de forma rutinaria. Además del bandeo cromosómico de alta resolución y de las tecnologías avanzadas de obtención de imágenes cromosómicas, se pueden determinar las anomalías cromosómicas en casos sospechosos de cáncer mediante análisis citogenéticos tal como la hibridación fluorescente in situ (FISH, forma siglada de fluorescence in situ hybridization), cariotipado, cariotipo espectral (SKY, forma siglada de spectral karyotyping), FISH múltiple (M-FISH), hibridación genómica comparativa (CGH, forma siglada de comparative genomic hybridization), matrices de polimorfismo de un único nucleótido (chips de SNP) y otras pruebas de diagnóstico y análisis conocidas y utilizadas por los expertos en la técnica.

Se han identificado mutaciones en IDH1 e IDH2 en múltiples tipos de tumores cancerosos que incluyen, pero sin limitación, glioma, glioblastoma multiforme, astrocitomas, oligodendrogliomas, paraganglioma, síndrome mielodisplásico (SMD), leucemia linfoblástica aguda de linfocitos B (LLAB), de tiroides, colorrectal, leucemia mieloide aguda (LMA), Dang et al., TrendsMol. Med., 2010, 16: 387-397; Ward y col., Oncogene, 2012, 31(19): 2491-2498; melanoma, Shibata y et al., Am. J. Pathol., 2010, 178(3): 1395-1402; de próstata, Flaherty y col., J. Clin. Oncol., 2014, 32 (supl. 4; Resumen 213); Cairns y col., Cancer Discovery, 2013, 3: 730-741; condrosarcoma y colangiocarcinoma, Balss y col., Acta Neuropathol., 2012, 124: 883-891; Cairns y col., Cancer Discovery, 2013, 3: 730-741; linfoma de linfocitos T angioinmunoblástico (LTAI), Cairns y col. Blood, 2012. 119(8):1901-1903. Se han encontrado mutaciones en o cerca de restos particulares en el sitio activo: G97D, R100, R132H, R132C, R132S, R132V, R132G, V71I, R132L y G123R para IDH1, Dang y col., Trends Mol. Med., 2010, 16: 387-397; Ward y col., 2012 y Tabla complementaria 2.

Se ha demostrado que las formas mutantes de IDH1 e IDH2 tienen una actividad neomórfica (ganancia de función) que reduce el a-cetoglutarato a 2-hidroxiglutarato. La producción endógena de 2-hidroxiglutarato es enantioespecífica, lo que da como resultado la generación del enantiómero D (también denominado enantiómero (R). Normalmente, las células tienen niveles bajos de 2-hidroxiglutarato mientras que las células que albergan mutaciones IDH1 o IDH2 muestran niveles significativamente elevados de 2-hidroxiglutarato. Se detectan niveles significativamente elevados de 2-hidroxiglutarato en tumores que albergan las mutaciones y en el plasma de pacientes con IDH1 o IDH2 mutante. Los niveles altos de 2-hidroxiglutarato se asocian con un fenotipo de hipermetilación que da como resultado un bloqueo en la diferenciación, lo que conduce a un aumento de la oncogénesis.

La actividad de un inhibidor covalente irreversible específico se define por su unión a la diana (IDH1 o IDH2), definida por Ki, y la tasa potencial máxima de formación de enlaces covalentes, definido por kinact. Estos dos factores no son entidades separadas, sino que trabajan juntos para producir el efecto deseado de formación de enlaces covalentes. Esto se ilustra con los siguientes 3 puntos.

En primer lugar, el hecho de que un electrófilo, por ejemplo, acrilamida, debe estar correctamente posicionado con respecto a un nucleófilo, por ejemplo, cisteína, es un componente fundamental de la formación de enlaces covalentes en química orgánica. Existe un ángulo y una distancia precisos en los que el nucleófilo debe acercarse al electrófilo para formar el enlace covalente. La simple colocación de un electrófilo cerca de un nucleófilo no es suficiente para la formación de enlaces covalentes.

En segundo lugar, cuando se incorpora un grupo reactivo en un núcleo que contiene fracciones de enlaces de hidrógeno para estabilizar la unión del inhibidor a la enzima, por ejemplo, un núcleo orientador, un experto en la técnica debe considerar la forma en que el núcleo orientador se une a la diana y coloca al electrófilo con respecto al nucleófilo a la luz del ángulo y la distancia óptimos mencionados anteriormente. De nuevo, la simple colocación de un electrófilo cerca de un nucleófilo no es suficiente para la formación de enlaces covalentes. Los cambios en el núcleo orientador pueden afectar la capacidad de un compuesto inhibidor para formar un enlace covalente.

En tercer lugar, cuando los dos puntos anteriores se consideran en conjunto, la simple presencia de una fracción electrófila en un núcleo orientador no es suficiente para sugerir que se formará un enlace covalente.

Los siguientes estudios in vitro e in vivo demuestran la actividad inhibidora de las proteínas IDH1 e IDH2 mutantes y la eficacia de los compuestos analizados de Fórmula I o Ia contra diversas líneas celulares de cáncer específicas. Los expertos en la materia generalmente reconocen estos a ensayos como indicativos de actividad terapéutica clínica humana. Se cree que la inhibición de las proteínas neomórficas IDH1 o IDH2 mutantes en los estudios desvelados será eficaz contra proteínas neomórficas IDH1 e IDH2 mutantes adicionales. Los ensayos que la evidencian la actividad inhibidora y la eficacia de IDH1 o IDH2 mutante pueden llevarse a cabo sustancialmente como sigue o mediante ensayos similares que proporcionen datos similares.

Los resultados de los siguientes ensayos demuestran que los compuestos ejemplificados y analizados son útiles como inhibidores de IDH1 e IDH2 mutantes y pueden ser útiles en el tratamiento de cánceres que expresan IDH1 o IDH2 mutante.

Ensayos bioquímicos para enzimas mutantes IDH1 e IDH2

Las enzimas mutantes IDH1-R132H, IDH1-R132C, IDH2-R172K y IDH2-R140Q catalizan la conversión de aKG en 2HG. El 2HG se analiza utilizando extracción en fase sólida en línea y espectrometría de masas. Este análisis se lleva a cabo en un instrumento RapidFire® acoplado a un espectrómetro de masas de triple cuadrupolo 6460 (G6460A Agilent).

Las proteínas mutantes de IDH1 (R132H y R132C) y mutantes de IDH2 (R140Q y R172K) conteniendo una etiqueta His de extremo N terminal se expresan en E. coli, y se purifican utilizando cromatografía de afinidad de níquel. Los ensayos enzimáticos se llevan a cabo en placas de polipropileno de 96 pocillos con fondo en V que contienen tampón Tris-HCl 100 mM, DTT 1 mM, TRITON™ X-100 al 0,005 %, NaCl 120 mM. Para IDH1 R132H, se incluyen acetoglutarato, NADPH y MnCh a concentraciones finales de 300 pM, 2,5 pM y 300 pM, respectivamente. Para IDH1 R132C, se incluyen a-cetoglutarato, NADPH y MnCh a concentraciones finales de 100 pM, 10 pM y 100 pM, respectivamente. Para IDH2 R172K, se incluyen a-cetoglutarato, NADPH y MnCh a concentraciones finales de 150 pM, 10 pM y 150 pM, respectivamente. Para IDH2 R140Q, se incluyen a-cetoglutarato, NADPH y MnCh a concentraciones finales de 3000 pM, 10 pM y 100 pM, respectivamente. pH final = 7,0 El compuesto de prueba disuelto en una solución madre de DMSO se diluye en la mezcla de reacción a una concentración final de DMSO del 4 %. Los compuestos se analizan en un formato de respuesta a la dosis. El ensayo se inicia mediante la adición de enzima. Las enzimas se utilizan a las siguientes concentraciones finales: IDH1 R132H, 2 nM; IDH1 R132C, 0,5 nM; IDH2 R172K, 1,2 nM; IDH2 R140Q, 1,2 nM. Después de 90 minutos, la reacción se templa añadiendo ACN (50:50) que contiene ácido 3-hidroxi-1,5-pentanodioico-2,2,3,4,4-d5 (5ds5-3HG) como estándar interno para el análisis de espectrometría de masas y la cuantificación del producto de reacción. El 2-hidroxiglutarato (2HG) de muestras inactivadas se separa utilizando cromatografía en columna de intercambio aniónico fuerte (Phenomenex Strata-X-A SecurityGuard) y se analiza mediante espectrometría de masas en un espectrómetro de masas de triple cuadrupolo 6460 (G6460A Agilent). La señal de 2HG detectada se transforma en una concentración de analito utilizando una curva de calibración generada utilizando concentraciones conocidas de 2HG. Para cada compuesto analizado, el % de inhibición se calcula utilizando una muestra de control de DMSO como el 0 % de inhibición y un control sin enzima como el 100 % de inhibición. Los valores de CI50 se obtienen a partir de los valores de % de inhibición individuales a distintas concentraciones de compuesto utilizando una ecuación de 4 parámetros. Estos cálculos se llevan a cabo utilizando los programas de análisis de datos Activity Base (IDBS) o Screener (Genedata).

Los resultados de este ensayo demuestran que los compuestos analizados y ejemplificados inhiben la actividad de IDH1 mutante contra IDH1/R132H e IDH1/R132C, e inhiben la actividad de |D^h 2 mutante contra IDH2/R140Q e IDH2/R172K.

Los siguientes Ejemplos se analizan esencialmente como se describe anteriormente y presentan actividad contra IDH1 mutante e IDH2 mutante como se muestra a continuación en la Tabla 14 (los Ejemplos 1 a 8 y 11 a 16 no forman parte de la invención reivindicada).

Tabla 14

Media ± desviación estándar de la media.

Ensayos bioquímicos para las enzimas IDH1 e IDH2 de tipo silvestre

Las enzimas IDH1 e IDH2 catalizan la conversión de isocitrato a aKG. Las proteínas de tipo silvestre IDH1 (Centro Nacional de Información Biotecnológica, Referencia: NP_001269316.1) e IDH2 (Centro Nacional de Información Biotecnológica, Referencia: EAX02082.1) conteniendo una etiqueta His de extremo N terminal se expresan en E. coli y se purifican utilizando cromatografía de afinidad de níquel. Los ensayos enzimáticos se llevan a cabo en placas de polipropileno de 96 pocillos con fondo en V que contienen tampón Tris-HCl 100 mM a pH 7,5, DTT 1 mM, TRITON™ X-100 al 0,005 %, NaCl 120 mM. Para el ensayo del tipo silvestre de IDH1, se incluyen isocitrato, NADP+ y MnCh a concentraciones finales de 85 j M, respectivamente a 50 j M y 20 ^j M. Para el ensayo del tipo silvestre de IDH2, se incluyen isocitrato, NADP+ y MnCh a concentraciones finales de 30 ^j M, 50 ^j M y 10 ^j M, respectivamente. Los inhibidores disueltos en una solución madre de DMSO se diluyen en la mezcla de reacción a una concentración final de DMSO del 4 %. El ensayo enzimático se termina (inactiva) añadiendo ACN (50:50) que contiene ácido d6-2-cetopentanodioico (d6-aKG) como patrón interno para el análisis de espectrometría de masas. Se combinan diez microlitros de mezcla de reacción con 100 j l de agua, 50 j l de O-bencilhidroxilamina 1 M en tampón de piridina (piridina al 8,6 %, pH 5) y 50 j l de clorhidrato de N- (3-dimetilaminopropil)-N-etilcarbodiimida (EDC) 1 M en tampón de piridina. Después de derivatización a temperatura ambiente durante una hora, las muestras se extraen con 600 j l de EtOAc. Se retiran cuatrocientos j l de la capa superior, se secan en nitrógeno caliente y se reconstituyen con 100 j l de MeOH/agua (1:1). Se inyectan 10 ^j L de muestra derivatizada en un sistema de LC-MS que consiste en un sistema de HPLC Shimadzu Prominence 20A y un espectrómetro de masas de triple cuadrupolo Thermo Quantum Ultra™. Los analitos se separan en una columna Waters XBridge™ C18 (2,1 x 50 mm, 3,5 jm ) con un caudal de 0,6 ml/minuto. La fase móvil A es ácido fórmico al 0,1 % en agua y la fase móvil B es MeOH. La señal de aKG detectada se transforma en concentración de analito utilizando una curva de calibración generada utilizando concentraciones conocidas de aKG. Para cada compuesto analizado, el % de inhibición se calcula utilizando una muestra de control de DMSO como el 0 % de inhibición y un control sin enzima como el 100 % de inhibición. Los valores de CI50 se obtienen a partir de los valores de % de inhibición individuales a distintas concentraciones de compuesto utilizando una ecuación de 4 parámetros. Estos cálculos se llevan a cabo utilizando los programas de análisis de datos Activity Base (IDBS) o Screener (Genedata).

Los resultados de este ensayo demuestran que los compuestos ejemplificados y analizados son menos activos para inhibir la enzima de tipo silvestre IDH1 en comparación con las enzimas mutantes IDH1 R132H o R132C y menos activos para inhibir la enzima de tipo silvestre IDH2 en comparación con las enzimas mutantes IDH2 R140Q o R172K.

Los siguientes Ejemplos (que no forman parte de la invención reivindicada) de la Tabla 15 se analizan esencialmente como se describe anteriormente y son menos activos para inhibir las enzimas de tipo silvestre en comparación con las enzimas mutantes.

Tabla 15

Ensayo de dilución de salto bioquímico de IDH1 (R132H)

Los compuestos de Ejemplo liofilizados se reconstituyen a 10 mM o 100 mM con DMSO al 100 % y se mantienen a temperatura ambiente hasta que se prueban. La proteína IDH1(R132H)-His se expresa y purifica mediante procedimientos muy conocidos y comúnmente utilizados por los expertos en la materia. Los reactivos del ensayo incluyen los siguientes: Ácido a-cetoglutárico (Sigma Núm. de cat. K1875), MnCh- Fisher Scientific Núm. de cat. M87-100, NADPH - Sigma-Aldrich Núm. de cat. N7505, Tris-HCl (Invitrogen, Núm. de cat. 15567-027), NaCl (Sigma, S3014), ditiotreitol (Sigma, D5545) y TRITON™ X100 (Peirce, 28314). El kit NAD(P)H-Glo™ de Promega (G9061).

El tampón de ensayo utilizado de principio a fin contiene Tris-HCl 100 mM pH 7,0, NaCl 120 mM, DTT 1 mM, TRITON™ X-100 al 0,005 % y DMSO al 2 % (a partir de la adición del compuesto de prueba). El CI50 de cada compuesto se determina incubando una respuesta a la dosis del compuesto, preparado en un Echo555, con IDH1(R132H) 1,5 nM, a-cetoglutarato 1 mM, MnCh 1 mM y NADPH 15 pM en tampón de ensayo. La reacción se incuba durante 2 horas a temperatura ambiente, a continuación se detiene utilizando 6-ciclopropil-5- (isoquinolin-5-il)-2-[(3R)-4-(3-metoxipropanoil)-3-metilpiperazin-1-il]piridin-3-carbonitrilo (10 pM). Las concentraciones de NADPH se miden utilizando el kit NAD(P)H-Glo™, de acuerdo con lo especificado por el proveedor. La señal luminiscente se lee en el Envision (Perkin Elmer; 0,1 seg/espejo de luminiscencia/filtro lum700 WL400-700). En el experimento de dilución de salto posterior, una concentración de compuesto equivalente a 10x la CI50 se preincuba con IDH1(R132H) 100 nM. La concentración de compuesto es siempre mayor o igual que la concentración de enzima. Después de 2 horas a temperatura ambiente, esta mezcla se diluye 1:100 en una solución que contiene a-cetoglutarato (10 mM), MnCh (10 mM) y NADPH (15 |^jM). Esta reacción enzimática final contiene IDH1(R132H) 1 nM y 0,1 x [CI50]. Después de una incubación de 2 horas a temperatura ambiente, la concentración de NADPH se mide como se especifica anteriormente, utilizando 6-ciclopropil-5-(iso-quinolin-5-il)-2-[(3R)-4-(3-metoxipropanoil)-3-metilpiperazin-1-il]piridina-3-carbonitrilo y el kit NAD(P)H-Glo™. Se incluyen tres controles: 1) "Control de 10x" que contiene compuesto 10xCI50 en la preincubación y el ensayo enzimático excepto a-cetoglutarato 1 mM, MnCl 1 mM2y se usa NADpH 15 ^j M en el ensayo final que mide la actividad enzimática, 2) "Control de actividad máx." que contiene DMSO en lugar del compuesto para la preincubación y el ensayo enzimático y 3) "Control de 0,1 x" que contiene DMSO en lugar del compuesto en la preincubación y compuesto 0,1xCl50 en el ensayo enzimático. Se incluye un "control de actividad mín." que carece de enzima, pero que por lo demás es equivalente al "Control de actividad máx.". Se realiza un segundo conjunto de controles de actividad máx. y mín. utilizando a-cetoglutarato 1 mM, MnCh 1 mM y NADPH 15 ^j M. Cada condición de ensayo se prueba por triplicado y se realizan 32 repeticiones para el control de actividad máx. (10 mM) y el control de actividad mín. (10 mM), mientras que se realizan 16 repeticiones para el control de actividad máx. (1 mM) y el control de actividad mín. (1 mM).

La concentración de NADP (producto) producida en cada experimento/control se determina utilizando el porcentaje de disminución en la señal observada con respecto al control de actividad mín., que contiene NADPH 15 j M. El control de actividad mín. (1 mM y 10 mM) y el control de actividad máxima (1 mM y 10 mM) se promedian y se calcula la desviación típica para cada uno. La señal para cada dilución de salto y para los controles de 0,1 x se multiplica por 15 y después se divide por los recuentos promedio para los pocillos de control de actividad mín. (10 mM). Este número se resta de 15 para calcular el NADP (Producto ^j M). Se utilizan los mismos cálculos para los controles 10x pero se utilizan los controles de actividad mín. (1 mM). Los jmoles del producto para los controles de actividad máx. (1 mM y 10 mM) se calculan multiplicando los recuentos promedio por 15 y luego se dividen por los respectivos controles de actividad mín. (1 mM y 10 mM). El NADP j M para cada pocillo se divide por el control de actividad máx. promedio (1 mM o 10 mM) y luego se multiplica por 100 para determinar el % de actividad de IDH para la dilución de salto del compuesto, el Control de 10x y el Control de 0,1 x. Un compuesto que pasa debe mostrar una actividad <30 % para el control de 10x - lo que demuestra que la concentración de preincubación es suficiente para saturar la enzima con compuesto. Además, el compuesto debe mostrar una actividad >70-80 % para el control de 0,1 x, lo que confirma que no hay inhibición a la concentración de 0,1 x/compuesto diluido.

Los compuestos de ejemplo se analizan esencialmente como se describe anteriormente y presentan datos de % de recuperación para IDH1/R132H en este ensayo. Los compuestos ejemplificados y analizados de la presente invención inhiben la enzima 2 horas después de la dilución, contrariamente al compuesto (o compuestos) de la técnica, que no inhiben la enzima 2 horas después de la dilución con el % de recuperación. Los datos de este ensayo demuestran que los compuestos analizados de la presente invención actúan de una manera compatible con la inhibición covalente de IDH1 mutante ya que la dilución del inhibidor no da como resultado la recuperación de la actividad enzimática.

Ensayos basados en células para los inhibidores de mutantes de IDH1

Para probar la inhibición celular de IDH1 R132C mutante, se utiliza la línea celular de fibrosarcoma HT1080 (adquirida en la ATCC). Para analizar la inhibición basada en células de la mutación R132H, la línea celular de glioma U87MG (ATCC) se transfectó de manera estable con una construcción de ADN que expresa la enzima mutante R132H mediante procedimientos bien conocidos y que utilizan de forma rutinaria los expertos en la materia.

Ensayo en células HT1080:

Se siembran quince mil células en placas de 96 pocillos revestidas con poli-D-lys (15.000 células/pocillo) 18-24 horas antes del tratamiento con los compuestos. Cuatro horas antes del tratamiento con compuesto, las células se privan de glutamina eliminando el medio normal y reemplazándolo por medio sin glutamina. Después de la privación, las células se tratan a continuación con distintas concentraciones de compuestos de prueba (20 ^j M a 1 nM; o 0,2 ^j M a 0,01 nM) disueltas en medio sin glutamina que contiene DMSO a una concentración final del 0,2 %. La incubación inicial del compuesto es de 1 hora a 37 °C/CO2 al 5 %. Después de 1 hora, se añade glutamina a una concentración final de 2 mM y a continuación las células tratadas se incuban durante 18 horas más a 37 °C/CO2 al 5 %. Después de una incubación de 18 horas, se analizan 2HG y aKG intracelulares en lisados celulares. Los lisados se preparan tras la eliminación del medio y la adición de tampón que contiene Tris-HCl 25 mM pH 7,5, NaCl 150 mM, EDTA1 mM, EGTA 1 mM/TRITON™ 1 % - X 100 a las células. Se añade una alícuota de lisado a una mezcla de d6-aKG yd5-3HG como patrones internos y la mezcla se trata con clorhidrato de O-bencilhidroxilamina en presencia de N-(3-dimetilaminopropilo)-N-etilcarbodiimida (EDC) y piridina. A continuación se extraen los derivados del analito con EtOAc, se secan y después se reconstituyen con MeOH al 50 % en H2O. Las muestras preparadas como se describe se inyectan en la HPL^c para separar los derivados de 2HG y aKG (y los estándares internos correspondientes) utilizando una cromatografía de fase inversa en una columna C18. El análisis de las muestras se lleva a cabo utilizando un espectrómetro de masas de triple cuadrupolo 6460 (G6460A Agilent). Las señales de 2HG y aKG detectadas se transforman en concentración de analito utilizando la relación de aKG/d6-aKG y la relación de 2HG/d5-3HG que se extrapola dentro de una curva de calibración. El porcentaje de inhibición para cada muestra individual se obtiene después de normalizar la concentración calculada de 2HG o aKG con respecto a las referencias máximas y mínimas obtenidas en presencia y ausencia de glutamina durante el tratamiento de las células con los compuestos. Los valores de CI50 se obtienen a partir del % de inhibición individual utilizando una ecuación sigmoidea de 4 parámetros de respuesta a la dosis. Estos cálculos se llevan a cabo utilizando automáticamente los programas de análisis de datos Activity Base (IDBS) o Screener (Genedata).

Los resultados de este ensayo demuestran que los Ejemplos analizados en la Tabla 15 inhiben la producción de 2-hidroxiglutarato, lo que indica en este ensayo la inhibición de IDH1 R132C mutante en células. aKG, un metabolito generado por IDH1 de tipo silvestre, no se ve afectado por los inhibidores, lo que indica que en este ensayo los compuestos son selectivos para IDH1 mutante sobre IDH1 de tipo silvestre en células. Los valores CI50 resultantes para los siguientes Ejemplos (los Ejemplos 1 a 8 y 11 a 16 no forman parte de la invención reivindicada) se muestran en la Tabla 16. Para los ensayos en que la curva de inhibición no alcanzó el 50 %, se muestra la concentración más alta analizada (por ejemplo, CI50>20 j M o >0,2 j M).

Tabla 16

Ensayo en células U87MG/IDH1R132H

Se siembran células en placas de 96 pocillos revestidas con poli-D-lys (12.000 células/pocillo) 18-24 horas antes del tratamiento con los compuestos. Cuatro horas antes del tratamiento con compuesto, las células se privan de glutamina eliminando el medio normal y reemplazándolo por medio sin glutamina. Después de la privación, las células se tratan después con distintas concentraciones de compuestos de prueba (20 ^j M a 1 nM) disueltos en medio sin glutamina que contiene DMSO a una concentración final del 0,2 %. La incubación inicial del compuesto es de 1 hora a 37 °C/CO2 al 5 %. Después de 1 hora, se añade glutamina a una concentración final de 2 mM y a continuación las células tratadas se incuban durante 18 horas más a 37 °C/CO2 al 5 %. 2HG intracelular se analiza en los lisados celulares obtenidos después de la eliminación del medio y del tratamiento con tampón de lisis (Tris-HCl 25 mM, pH 7,5, NaCl 150 mM, E^d T^a 1 mM, EGTA 1 mM/TRITON™ 1 % - X 100). Los lisados celulares se conservan a -80 °C hasta su procesamiento. Para la extracción de analitos, se transfiere una alícuota de lisado descongelado a una placa de 96 pocillos profundos y se trata con MeOH frío que contiene d5-3HG como patrón interno seguido de cloroformo y H2O (1:4:3:2). La fase superior se recoge después de la separación y se inyecta en una HPLC para separar 2HG (y el patrón interno) utilizando cromatografía de interacción hidrófila (HILIC) acoplada a detección por MS/MS en un espectrómetro de masas de triple cuadrupolo 6460. El porcentaje de inhibición para cada muestra individual se obtiene después de normalizar la concentración calculada de 2HG con respecto a las referencias máximas y mínimas obtenidas en presencia y ausencia de glutamina durante el tratamiento de las células con los compuestos. Los valores de CI50 se obtienen a partir del % de inhibición individual utilizando una ecuación sigmoidea de 4 parámetros de respuesta a la dosis. Estos cálculos se llevan a cabo utilizando automáticamente los programas de análisis de datos Activity Base (IDBS) o Screener (Genedata).

Los siguientes Ejemplos (los Ejemplos 1 a 8 y 11 a 16 no forman parte de la invención reivindicada) se analizan esencialmente como se describe anteriormente y presentan actividad de inhibición contra IDH1/R132H mutante en células U87MG en este ensayo como se muestra a continuación en la Tabla 17.

Tabla 17

Ensayo de 2-hidroxiglutarato ^{i n v i v o}

Para el análisis in vivo de los inhibidores de IDH1, se cultivan tumores de xenoinjerto subcutáneo en ratones desnudos atímicos (20-22 g, Harlan Laboratories) después de la implantación de células HT1080 (fibrosarcoma que porta IDH1 mutante con R132C) o células TB08 (glioblastoma secundario que porta el IDH1 mutante con R132H). Los disponen de alimento y agua a demanda y se aclimatan durante 1 semana antes de la implantación de las células. Se implantan células tumorales (HT1080) o fragmentos tumorales (TB08) en el flanco trasero derecho. Para HT1080, se implantan 5,0 x 106 células en una mezcla 1:1 con Matrigel en un volumen final de 0,2 ml. Para TB08, los fragmentos de tumor generados a partir de muestras de tumor explantadas se implantan directamente en el flanco trasero. Los volúmenes tumorales se miden con un calibrador dos veces por semana y el volumen tumoral se calcula utilizando 0,536 x L x W2, en que L = largo y W = anchura. Cuando los volúmenes tumorales alcanzan los 150-400 mm3, los animales se distribuyen al azar en grupos (n=3-6 por grupo) y se les administra dosis de inhibidores de IDH1 o control de vehículo. Para los inhibidores de IDH1, los compuestos se formulan en un vehículo que contiene hidroxietilcelulosa al 1 %/Tween™ 80 al 0,25 %/antiespumante al 0,05 % o goma arábiga al 10 % con 1,1 equivalentes en moles de HCl.

Los compuestos se someten a ultrasonidos en baño para obtener una suspensión. Los compuestos se administran en dosis en miligramos por kilogramo (mpk) mediante sonda oral en un volumen final de 0,2 ml. Para determinar la inhibición de 2HG, los compuestos se administran en dosis dos veces al día (BID) durante 3 días (número total de dosis = 6). Después del tratamiento con compuesto, los ratones se sacrifican con anestesia con isofluorano y dislocación cervical. Los tumores se extirpan, se colocan en tubos etiquetados y se congelan inmediatamente en nitrógeno líquido. Los tumores se almacenan a -80 °C para su procesamiento.

Preparación de lisados tumorales

Se prepara tampón XY Lite en agua de calidad molecular, que contiene los siguientes componentes: Tris 25 mM, pH 7,5, NaCl 150 mM, TRITON™ X-100 al 1 %, EDTA 1 mM, EGTA 1 mM. A XY Lite (40 ml) se añaden 800 pl de cóctel de inhibidores de proteasa y fosfatasa Halt (cóctel inhibidor de proteasa y fosfatasa Halt™, sin EDTa , Thermo Scientific, Núm. de cat. 78441). Las muestras se agitan en agitadora vorticial y a continuación se enfrían en hielo. Se etiquetan tubos de lisis A con tapa naranja y se colocan en una gradilla sobre hielo. Se coloca un mortero y una mano de mortero de cerámica en hielo seco para que se enfríen. Se coloca un cuadrado de papel de aluminio de 5,08 x 5,08 cm en el fondo del mortero. Se transfiere una muestra de tumor al mortero preenfriado sobre el cuadrado de papel de aluminio. Se añade nitrógeno líquido (aproximadamente 5 ml) y se deja evaporar, supercongelando el tumor. Se coloca otro trozo de papel de aluminio sobre el tumor y el tumor se rompe en pedazos pequeños con la mano de mortero de cerámica. El tumor triturado se transfiere rápidamente al tubo de lisis. Se añade XY Lite (500 pl) helado a cada tubo y se tapa. A continuación, los tumores se procesan en FastPrep-24 MP Biomedicals haciéndolo girar dos veces durante 35 segundos cada vez a la velocidad 5. A continuación, las muestras se centrifugan en una microcentrífuga Beckman Microfuge R a 4 °C a 14.000 rpm durante 30 minutos. El sobrenadante se transfiere a una placa de 96 pocillos profundos enfriada previamente. El sedimento se descarta.

Ensayo de proteínas

En primer lugar se genera una placa de diluciones para el ensayo de proteínas añadiendo tampón XY (145 pl) a una placa Corning de 96 pocillos de fondo redondo, no estéril. A esto, se le añade el lisado tumoral (5 pl) y se mezcla suavemente. La placa se mantiene en hielo. Se configuran diluciones en serie del patrón de BSA (Thermo Scientific cat. 232092 mg/ml) de la siguiente manera: Se colocan cinco tubos de 0,5 ml en una gradilla y se añade tampón XY (60 pl) a cada uno. Se añade solución madre de BSA (60 pl) al primer tubo y se agita en vorticialmente. Se transfieren 60 pl del primer tubo al siguiente tubo, se agita vorticialmente, y así sucesivamente, hasta que la serie de diluciones se completa de la siguiente manera: Tubo 1 = solución madre de BSA, los Tubos 2-5 son diluciones en serie 1:2, el Tubo 6 = tampón XY solo. Los reactivos del ensayo de proteínas de BCA de Thermo se mezclan de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Se añade el reactivo de ^b C^a mezclado (200 pl) a cada muestra y se incuba durante 15 minutos. Los resultados del ensayo de proteínas se leen en lector de placas SOFTmax Pro. Basándose en los resultados del ensayo de proteínas, se añade la cantidad apropiada de tampón XY a cada lisado tumoral para generar una concentración final de proteína de 5 mg/ml. Todas las muestras se etiquetan y almacenan a -80 °C.

Análisis de metabolitos en lisados tumorales

Los efectos in vivo de la inhibición de IDH1 sobre las concentraciones de 2HG y aKG totales se determinan mediante análisis por cromatografía líquida-espectrometría de masas (LC-MS) de xenoinjertos tumorales. El procedimiento utiliza derivatización con O-bencilhidroxilamina antes del análisis por LC-MS. Se colocan diez microlitros de cada lisado tumoral en una placa de 96 pocillos de pocillos profundos y se combinan con 100 pl de solución de estándar interno que contiene d5-3HG 10 pM y d6-aKG 10 pM. Se añaden a cada muestra 50 pl de O-bencilhidroxilamina 1 M en tampón de piridina (piridina al 8,6 %, pH 5) y 50 pl de clorhidrato de N-(3-dimetilaminopropil)-N-etilcarbodiimida (EDC) 1 M en tampón de piridina. La reacción de derivatización continúa a temperatura ambiente durante una hora. Utilizando un manipulador de líquidos Beckman Biomek FX se añaden 600 pl de EtOAc a cada muestra. Las placas se sellan y agitan con agitador vorticial durante 5 minutos, a continuación se centrifugan durante 5 minutos a 4000 rpm en una centrífuga Eppendorf 5810R. Se transfieren 400 pl de la capa superior a una nueva placa de 96 pocillos. Las muestras se secan en nitrógeno calentado a 50 °C y se reconstituyen con 100 pl de MeOH/agua (1:1). Se inyecta un microlitro de muestra derivatizada en un sistema de LC-MS que consiste en un sistema de HPLC Shimadzu Prominence 20A y un espectrómetro de masas de triple cuadrupolo Thermo Quantum Ultra™. Los analitos se separan en una columna Water XBridge™ C18 (2,1 x 50 mm, 3,5 pm) con un caudal de 0,6 ml/minuto. La fase móvil A es ácido fórmico al 0,1 % en agua y la fase móvil B es MeOH. El perfil de gradiente es: 0 minutos, B al 5 %; 3 minutos, B al 100 %; 4,00 minutos, B al 100 %; 4,1 minutos, B al 5 %; 5,50 minutos, detener. El espectrómetro de masas utiliza una sonda HESI-II que se hace funcionar en modo de control de reacción seleccionado de iones positivos. Las curvas de calibración se construyen trazando las concentraciones de analito frente a las relaciones de áreas de los picos del analito/estándar interno y realizando un ajuste cuadrático de los datos utilizando una ponderación de 1/concentración con el software Xcalibur™. Las concentraciones de analito para las incógnitas se calculan a partir de las curvas de calibración. Los datos de los metabolitos del ensayo de LC-M^s se expresan en nmol/mg de proteína. El nivel promedio de 2HG en el grupo tratado con vehículo se utiliza para determinar el control de 0 % de inhibición. A continuación, se determina el % de inhibición en cada animal tratado con inhibidor con respecto al control de vehículo. Los datos se analizan en el programa informático JMP para determinar el % de inhibición promedio en cada grupo de dosis, la desviación típica y el error típico.

A continuación, se muestran en la Tabla 18 los datos que demuestran la inhibición in vivo de 2-hidroxiglutarato en ratones con xenoinjerto de IDH1 mutante mediante los compuestos ejemplificados y probados.

Tabla 18

Claims (6)

REIVINDICACIONES

1. Un compuesto de la Fórmula:

en el que:

R¹ es -CH²CH(CH³)², -CH²CH³ , -CH²CH²OCH³ o -CH²-ciclopropilo;

R² es -CH³ o -CH²CH³ ;

o una sal aceptable para uso farmacéutico del mismo.

2. El compuesto de la reivindicación 1, que es:

7-[[(1S)-1-[4-[2-Ciclopropil-1-(4-prop-2-enoilpiperazin-1-il)etil]fenil]etil]amino]-1-metil-4H-pirido[4,3-d][1,3]oxazin-2-ona, isómero 1

7-[[(1S)-1 -[4-[2-Ciclopropil-1-(4-prop-2-enoilpiperazin-1-il)etil]fenil]etil]amino]-1-metil-4H-pirido[4,3-d][1,3]oxazin-2-ona, isómero 2

o una sal aceptable para uso farmacéutico del mismo.

3. Una composición farmacéutica que comprende un compuesto de la reivindicación 1 o la reivindicación 2, o una sal aceptable para uso farmacéutico del mismo, y un vehículo aceptable para uso farmacéutico.

4. El compuesto de acuerdo con la reivindicación 1 o la reivindicación 2, o una de sus sales aceptables para uso farmacéutico, para uso en terapia.

5. Un compuesto de la reivindicación 1 o la reivindicación 2, o una sal aceptable para uso farmacéutico del mismo, para uso en el tratamiento de un cáncer que expresa IDH1 mutante o IDH2 mutante, que es glioma, glioblastoma, glioblastoma multiforme, astrocitomas, oligodendrogliomas, paraganglioma, fibrosarcoma, linfoma de linfocitos T angioinmunoblástico (LTAI), síndrome mielodisplásico (SMD), leucemia linfoblástica aguda de linfocitos B (LLAB), cáncer de tiroides, cáncer colorrectal, leucemia mieloide aguda (LMA), melanoma, cáncer de próstata, condrosarcoma o colangiocarcinoma.

6. Un compuesto para uso de acuerdo con la reivindicación 5, en el que el cáncer que expresa IDH1 mutante o IDH2 mutante es fibrosarcoma, leucemia mieloide aguda, glioma o glioblastoma.