MD3555105T2

MD3555105T2 - Compuși de 7-feniletilamino-4H-pirimido[4,5-d][1,3]oxazin-2-onă ca calitate de inhibitori ai mutanţilor IDH1 și IDH2

Info

Publication number: MD3555105T2
Application number: MDE20191188T
Authority: MD
Inventors: Renato Alejandro Bauer; Serge Louis Boulet; Timothy Paul Burkholder; Raymond Gilmour; Patric James Hahn; Zoran Rankovic
Original assignee: Lilly Co Eli
Priority date: 2016-12-16
Filing date: 2017-12-08
Publication date: 2021-01-31
Also published as: DK3555105T3; US11649247B2; CY1123577T1; CN110072867A; CN110072867B; AU2020260493B2; SI3555105T1; JOP20190142B1; MX385562B; JP6793836B2; CA3045303C; WO2018111707A1; US11001596B2; US20210206780A1; EA036112B1; EP3555105B1; MY197313A; JP2020502157A; ES2835281T3; PT3555105T

Abstract

Un compus, cum este definit aici, sau o compoziţie farmaceutică conţinȃnd compusul, pentru utilizare în tratarea cancerului mutant IDH1sau IDH2 avȃnd structura:

Description

Proteina izocitrat dehidrogenază (IDH) este o enzimă importantă în ciclul acidului citric (acid tricarboxilic sau Krebs). Ciclul acidului citric este centralizat important la multe căi biochimice şi este una dintre componentele stabilite cel mai timpuriu ale metabolismului celular.

Izocitratul dehidrogenază catalizează decarboxilarea oxidativă a izocitratului la α-ketoglutarat (2-oxoglutarat). Aceste enzime aparţin la două subclase distincte, din care una utilizează dinucleotide nicotinamidă adenine (NAD(+)) ca acceptor de electron şi cealaltă fosfat de dinucleotide nicotinamidă adenine (NADP(+)). Au fost raportate trei izocitrat dehidrogenaze de mamifer: un izocitrat dehidrogenază dependent de NAD(+), o enzimă multisubunitară care se localizează la matricea mitocondrială, şi doi izocitraţi dehidrogenază dependenţi de NADP(+), din care unul este mitocondrial şi celălalt predominant citosolic. Fiecare izozimă dependentă de NADP(+) este un dimer. Proteina codificată de gena IDH1 este izocitratul dehidrogenază dependent de NADP(+) găsit în citoplasmă şi peroxizomi. Enzima citoplasmatică serveşte un rol semnificativ în producţia de NADPH citoplasmatică. IDH1 este exprimată într-un larg interval de specii şi în organisme cărora le lipseşte un ciclu complet de acid citric.

Recent, mutaţii în IDH1, şi izoformele asociate IDH2, au fost găsite în câteva tipuri de cancere. S-a descoperit că mutaţiile apar la aminoacizi specifici de-a lungul secvenţei de proteină şi sunt exprimate heterozigot, consistent cu un cȃştig de funcţionare. Aceste mutaţii apar la reziduurile conservate funcţional şi studii biochimice ale formelor mutante de IDH1 şi IDH2 au demonstrat o pierdere a funcţionării normale, conversia reversibilă a izocitratului la α-ketoglutarat. Rezultatul acestor mutaţii este de a permite o nouă (sau neomorfică) conversie a α-ketoglutaratului (αKG) la 2-hidroxiglutarat (2HG). Ca rezultat, celulele canceroase care găzduiesc forme mutante de IDH1 sau IDH2 formează concentraţii substanţial mai ridicate de 2HG. Nivelurile ridicate de 2HG conduc la un bloc în diferenţierea celulară care poate fi inversat prin inhibarea mutanţilor IDH1 sau IDH2.

Cererea de brevet PCT/US2016/043264 divulgă inhibitori covalenţi ai IDH1 mutant. Cererea de brevet PCT/IB2012/055133 divulgă de asemenea inhibitori de proteine IDH mutante. Există o necesitate suplimentară pentru compuşi care inhibă selectiv enzimele IDH1 şi IDH2 mutante pentru tratamentul diferitelor cancere. Există o necesitate suplimentară pentru compuşi care inhibă selectiv enzimele IDH1 şi IDH2 mutante demonstrând activitate neomorfică asupra IDH1 şi IDH2 de tip sălbatic pentru tratamentul diferitelor cancere. Prezenta invenţie furnizează compuşi cu Formula I sau Ia care sunt inhibitori de IDH1 şi IDH2 mutanţi. Compuşii cu Formula I sau Ia sunt inhibitori covalenţi care inhibă selectiv IDH1 şi IDH2 mutanţi.

Un aspect din prezenta divulgare este de a furniza compuşi inhibitori ai enzimei IDH1 şi IDH2 mutante cu formula:

în care:

R1 este -CH2CH(CH3)2, -CH2CH3, -CH2CH2OCH3, sau -CH2-ciclopropil;

R2 este -CH3 sau -CH2CH3;

X este N sau CH; sau

o sare acceptabilă farmaceutic a acestuia.

Un aspect al invenţiei este de a furniza compuşi inhibitori ai enzimei IDH1 şi IDH2 mutante cu formula:

în care

R1 este -CH2CH(CH3)2, -CH2CH3, -CH2CH2OCH3, sau -CH2-ciclopropil;

R2 este -CH3 sau -CH2CH3; sau

o sare acceptabilă farmaceutic a acestuia.

Un alt aspect din prezenta invenţie furnizează un compus cu formula Ia care este:

7-[[(1S)-1-[4-[(1R)-2-ciclopropil-1-(4-prop-2-enoilpiperazin-1-il)etil]fenil]etil]amino]-1-etil-4H-pirimido[4,5-d][1,3]oxazin-2-onă;

7-[[(1S)-1-[4-[(1S)-2-ciclopropil-1-(4-prop-2-enoilpiperazin-1-il)etil]fenil]etil]amino]-1-etil-4H-pirimido[4,5-d][1,3]oxazin-2-onă;

1-etil-7-[[(1S)-1-[4-[1-(4-prop-2-enoilpiperazin-1-il)propil]fenil]etil]amino]-4H-pirimido[4,5-d][1,3]oxazin-2-onă, izomer 1;

1-etil-7-[[(1S)-1-[4-[1-(4-prop-2-enoilpiperazin-1-il)propil]fenil]etil]amino]-4H-pirimido[4,5-d][1,3]oxazin-2-onă, izomer 2;

sau o sare acceptabilă farmaceutic oricăror dintre aceştia.

Un alt aspect din prezenta invenţie este un compus cu Formula Ia care este 7-[[(1S)-1-[4-[(1S)-2-ciclopropil-1-(4-prop-2-enoilpiperazin-1-il)etil]fenil]etil]amino]-1-etil-4H-pirimido[4,5-d][1,3]oxazin-2-onă sau o sare acceptabilă farmaceutic a acestuia.

Un alt aspect din prezenta invenţie furnizează o compoziţie farmaceutică cuprinzând un compus inhibitor al IDH1 mutant cu Formula Ia, sau o sare acceptabilă farmaceutic a acestuia, şi un purtător acceptabil farmaceutic.

Un alt aspect din prezenta divulgare furnizează o metodă de tratare a unui cancer care exprimă IDH1 mutant sau IDH2 mutant care este gliom, glioblastom, glioblastom multiform, astrocitom, oligodendrogliom, paragangliom, fibrosarcom, limfom al celulei T angioimunoblastic (AITL), sindrom mielodisplazic (MDS), leucemie limfoblastică acută a celulei B (B-ALL), cancer la tiroidă, cancer colorectal, leucemie mieloidă acută (AML), melanom, cancer la prostată, condrosarcom sau colangiocarcinom la un pacient, cuprinzând administrarea la un pacient care are nevoie de aceasta, a unei cantităţi eficiente terapeutic dintr-un compus cu Formula I sau Ia, sau o sare acceptabilă farmaceutic a acestuia.

Un alt aspect din prezenta divulgare furnizează o metodă de tratare a unui cancer care exprimă IDH1 mutant sau IDH2 mutant care este fibrosarcom, leucemie mieloidă acută, gliom, sau glioblastom la un pacient, cuprinzând administrarea la un pacient care are nevoie de aceasta a unei cantităţi eficiente terapeutic dintr-un compus cu Formula I sau Ia, sau o sare acceptabilă farmaceutic a acestuia.

Un alt aspect din prezenta invenţie furnizează un compus cu Formula Ia, sau o sare acceptabilă farmaceutic a acestuia, pentru utilizare în terapie.

Un alt aspect din prezenta invenţie furnizează un compus cu Formula Ia, sau o sare acceptabilă farmaceutic a acestuia, pentru utilizare în tratamentul unui cancer care exprimă IDH1 mutant sau IDH2 mutant care este gliom, glioblastom, glioblastom multiform, astrocitom, oligodendrogliom, paragangliom, fibrosarcom, limfom al celulei T angioimunoblastic (AITL), sindrom mielodisplazic (MDS), leucemie limfoblastică acută a celulei B (B-ALL), cancer la tiroidă, cancer colorectal, leucemie mieloidă acută (AML), melanom, cancer la prostată, condrosarcom sau colangiocarcinom.

Un alt aspect din prezenta invenţie furnizează un compus cu Formula la, sau o sare acceptabilă farmaceutic a acestuia, pentru utilizare în tratamentul unui cancer care exprimă IDH1 mutant sau IDH2 mutant care este fibrosarcom, leucemie mieloidă acută, gliom, sau glioblastom.

Un alt aspect din prezenta divulgare furnizează utilizarea unui compus cu Formula I sau la, sau a unei săruri acceptabilă farmaceutic a acestuia, pentru fabricarea unui medicament pentru tratamentul unui cancer care exprimă IDH1 mutant sau IDH2 mutant care este gliom, glioblastom, glioblastom multiform, astrocitom, oligodendrogliom, paragangliom, fibrosarcom, limfom al celulei T angioimunoblastic (AITL), sindrom mielodisplazic (MDS), leucemie limfoblastică acută a celulei B (B-ALL), cancer la tiroidă, cancer colorectal, leucemie mieloidă acută (AML), melanom, cancer la prostată, condrosarcom sau colangiocarcinom.

Un alt aspect din prezenta divulgare furnizează utilizarea unui compus cu Formula I sau la, sau a unei săruri acceptabilă farmaceutic a acestuia, pentru fabricarea unui medicament pentru tratamentul unui cancer care exprimă IDH1 mutant sau IDH2 mutant care este fibrosarcom, leucemie mieloidă acută, gliom, sau glioblastom.

Termenul „pacient« înseamnă mamifer şi „mamifer« include, dar nu este limitat la, un om.

„Cantitate eficientă terapeutic« înseamnă dozajul compusului cu Formula I sau Ia, sau o sare acceptabilă farmaceutic a acestuia, sau o compoziţie farmaceutică conţinând compusul, sau o sare acceptabilă farmaceutic a acestuia, necesare pentru a inhiba IDH1 mutant sau IDH2 mutant la un pacient cu cancer, conducând la eliberarea blocării în diferenţiere cu inhibarea rezultantă a creşterii celulei tumorale şi eliminarea sau încetinirea sau oprirea progresului cancerului la un pacient. Dozajele anticipate dintr-un compus cu Formula I sau la, sau o sare acceptabilă farmaceutic a acestuia sunt în intervalul de la 1 mg/pacient/zi până la 2000 mg/pacient/zi. Dozajele preferate sunt anticipate a fi în intervalul de la 5 mg/pacient/zi până la 1800 mg/pacient/zi. Cele mai preferate dozaje sunt anticipate a fi în intervalul de la 40 mg/pacient/zi până la 1600 mg/pacient/zi. Dozajul exact necesar pentru a trata un pacient şi lungimea timpului de tratament vor fi determinate de către un medic avȃnd în vedere stadiul şi severitatea bolii precum şi nevoile specifice şi răspunsul pacientului individual. Deşi exprimate ca dozaj pe o bază zilnică, dozarea administrării poate fi ajustată pentru a furniza un beneficiu terapeutic mai optim la un pacient şi pentru a gestiona sau ameliora orice toxicitate asociată cu medicamentul. În plus faţă de doza zilnică, poate fi adecvată dozarea de două ori pe zi (B.I.D.); dozarea de trei ori pe zi (T.I.D.); dozarea în fiecare altă zi (Q2D); fiecare altă zi pe o perioadă de cinci zile urmată de două zile fără dozare (T.I.W.); sau la fiecare a treia zi (Q3D).

Termenii „tratament«, „tratează«, şi „tratarea«, sunt destinaţi să includă întregul spectru al intervenţiei pentru cancerul de care suferă pacientul, cum ar fi administrarea compusului activ pentru a atenua, încetini, sau inversa unul sau mai multe simptoame şi pentru a întârzia progresul cancerului chiar dacă cancerul nu este de fapt eliminat.

Termenul -CH2CH(CH3)2 înseamnă 2-metilpropil, termenul -CH2CH2OCH3 înseamnă 2-metoxietil, şi termenul -CH2-ciclopropil înseamnă ciclopropilmetil.

Un compus cu Formula I sau la, sau o sare acceptabilă farmaceutic a acestuia, este preferabil formulat ca compoziţie farmaceutică utilizând un purtător acceptabil farmaceutic şi administrat pe o varietate de căi. Preferabil, astfel de compoziţii sunt pentru administrare orală. Astfel de compoziţii farmaceutice şi procedee pentru prepararea lor sunt bine cunoscute în domeniu. Vezi, de exemplu, REMINGTON: THE SCIENCE ŞI PRACTICE OF PHARMACY, L.V. Allen, Editor, ediţia a 22-a, Pharmaceutical Press, 2012.

Într-o realizare particulară, compoziţia farmaceutică cuprinde 7-{[(1S)-1-{4-[(1S)-1-(4-acriloilpiperazin-1-il)-2-ciclopropiletil]fenil}etil]amino}-1-etil-1,4-dihidro-2H-pirimido[4,5-d][1,3]oxazin-2-onă sau o sare acceptabilă farmaceutic a acesteia, împreună cu un purtător acceptabil farmaceutic şi opţional alte ingrediente terapeutice în special pentru tratamentul cancerului în general sau a unui tip specific de cancer.

Un compus cu Formula I sau la, sau o sare acceptabilă farmaceutic, poate fi administrat fie simultan cu, sau înainte, sau după, unul sau mai mulţi alţi agenţi terapeutici. Compusul cu Formula I sau Ia, sau o sare acceptabilă farmaceutic, când se administrează cu unul sau mai mulţi alţi agenţi terapeutici, poate fi administrat separat, pe aceeaşi sau pe căi diferite de administrare, sau împreună în aceeaşi compoziţie farmaceutică ca celălalt agent terapeutic. Unde sunt administraţi unul sau mai mulţi agenţi terapeutici suplimentari, administrarea fiecărui agent terapeutic poate fi simultană, separată, sau secvenţială.

Un compus cu Formula I sau Ia este capabil să reacţioneze cu un număr de acizi anorganici şi organici pentru a forma sarea de adiţie a unui acid acceptabilă farmaceutic. Astfel de săruri acceptabile farmaceutic şi metodologia comună pentru prepararea lor sunt bine cunoscute în domeniu. Vezi, de exemplu, P. Stahl, şi colab., HANDBOOK OF PHARMACEUTICAL SALTS: PROPERTIES, SELECTION AND USE, (VCHA/Wiley-VCH, 2002); S.M. Berge, şi colab., „Pharmaceutical Salts, „Journal of Pharmaceutical Sciences, Vol. 66, nr. 1, ianuarie 1977.

Un compus cu Formula I sau la, sau o sare acceptabilă farmaceutic a acestuia, poate fi preparat printr-o varietate de proceduri cunoscute în domeniu, precum şi prin cele descrise mai jos. Etapele de sinteză specifice pot fi combinate într-o ordine diferită pentru a prepara un compus cu Formula I sau Ia, sau o sare acceptabilă farmaceutic a acestuia.

Suplimentar, anumiţi intermediari descrişi în următoarele preparări pot conţine unul sau mai multe grupări de protecţie la azot. Se înţelege că grupările de protecţie pot fi variate cum este apreciat de către o persoană calificată în domeniu depinzând de condiţiile de reacţie particulare şi transformările particulare, care sunt efectuate. Condiţiile de protecţie şi deprotejare sunt bine cunoscute specialistului calificat şi sunt descrise în literatură (vezi de exemplu „Greene's Protective Groups in Organic Synthesis«, a cincea ediţie, de Peter G.M. Wuts şi Theodora W. Greene, John Wiley & Sons, Inc. 2014).

Compuşii cu Formula I sau Ia sunt denumiţi în conformitate cu IUPAC, şi pot fi de asemenea denumiţi în conformitate cu CAS, şi pot fi utilizate şi alte nume pentru a identifica neambiguu un compus cu Formula I sau Ia, sau o sare acceptabilă farmaceutic a acestuia.

Se va înţelege că un compus cu Formula I sau Ia poate fi reprezentat ca stereoizomer singur. Există doi centri chirali dând naştere la patru diastereomeri. Aşa cum s-a utilizat în acest document, referirile la un singur stereoizomer se înţelege că includ de asemenea amestecuri stereoizomerice incluzând compuşii denumiţi sau reprezentaţi cu Formula I sau Ia. Aici, desemnările Cahn-Ingold-Prelog ale (R) şi (S) pot fi utilizate pentru a se referi la stereoizomerii specifici. Stereoizomerii specifici pot fi preparaţi prin sinteză stereospecifică utilizând materii prime enantiomeric pure sau îmbogăţite. Stereoizomerii specific ai materiilor prime, intermediarilor, sau amestecurilor racemice incluzând compuşii cu Formula I sau Ia pot fi rezolvaţi prin tehnici bine cunoscute în domeniu, cum ar fi cele găsite în Stereochemistry of Organic Compounds, E. I. Eliel şi S. H. Wilen (Wiley 1994) şi Enantiomers, Racemates, and Resolutions, J., Jacques, A. Collet, şi S. H. Wilen (Wiley 1991), incluzând cromatografia cu fază chirală staţionară, separări enzimatice, sau cristalizare fracţională sau cromatografie de diastereomeri formaţi în acel scop, cum ar fi sărurile diastereomerice. Pentru compuşii cu Formula I sau Ia având o configuraţie cu toţi stereocentrii prezentaţi, „substanţial enantiomeric pur« înseamnă că puritatea izomerică este mai mare de 90% exces enantiomeric. Într-o altă realizare, o puritate izomerică a unui compus cu Formula I sau Ia este mai mare de 95% exces enantiomeric. În încă o altă realizare puritatea izomerică a unui compus cu Formula I sau Ia este mai mare de 98% exces enantiomeric. În încă o altă realizare puritatea izomerică a unui compus cu Formula I sau Ia este mai mare de 99% exces enantiomeric. Toţi stereoizomerii, individuali şi incluzând amestecurile diastereomerice ale compuşilor cu Formula I sau Ia sunt avuţi în vedere în domeniul prezentei invenţii. Desemnările „izomer 1« şi „izomer 2« şi „diastereomer 1« şi „diastereomer 2« se referă la compuşii care eluează din cromatografia chirală primul şi respectiv al doilea, şi dacă cromatografia chirală este iniţiată devreme în sinteză, aceeaşi desemnare este aplicată intermediarilor şi exemplelor ulterioare.

Compuşii utilizaţi ca materii prime iniţiale în sinteza compuşilor cu Formula I sau Ia sunt bine cunoscuţi şi, în măsura în care nu sunt disponibili comercial, pot fi cu uşurinţă sintetizaţi utilizând referirile specifice furnizate, prin proceduri standard utilizate în mod obişnuit de cei având calificare obişnuită în domeniu sau care sunt găsite în texte de referinţă generale.

Exemple de proceduri cunoscute şi metode le includ pe cele descrise în texte de referinţă generale cum ar fi Comprehensive Organic Transformări, VCH Publishers Inc, 1989; Compendium of Organic Sintetic Methods, Volumes 1-10, 1974-2002, Wiley Interscience; Advanced Organic Chemistry, Reactions Mechanisms, and Structure, 5th Edition, Michael B. Smith and Jerry March, Wiley Interscience, 2001; Advanced Organic Chemistry, 4th Edition, Part B, Reactions and Synthesis, Francis A. Carey and Richard J. Sundberg, Kluwer Academic/Plenum Publishers, 2000, etc., şi referiri citate în acestea.

Anumite abrevieri sunt definite după cum urmează: „ACN« înseamnă acetonitril; „αKG« înseamnă alfa-ketoglutarat sau 2-ketoglutarat; „aloc« înseamnă aliloxicarbonil; „ATCC« înseamnă Colecţia de Culturi de Tip American; „BCA« înseamnă acid bicinconinic; „BSA« înseamnă albumină din ser bovin; „CDI« înseamnă 1,1'-carbonildiimidazol; „DCC« înseamnă 1,3-diciclohexilcarbodiimidă; „DCM« înseamnă diclorometan; „DEAD« înseamnă dietil azodicarboxilat; „DIAD« înseamnă azodicarboxilat de diizopropil; „DIC« înseamnă diizopropilcarbodiimidă; „DIPEA« înseamnă diizopropiletilamină sau N-etil-N-izopropil-propan-2-amină; „DMAP« înseamnă dimetilaminopiridină; „DMF« înseamnă dimetilformamidă; „DMSO« înseamnă dimetil sulfoxid; „DTT« înseamnă ditiotreitol; „EDC« înseamnă EDAC, EDCI, sau clorhidrat de 1-(3-dimetilaminopropil)-3-etilcarbodiimidă; „EDTA« înseamnă acid etilendiaminotetraacetic; „EGTA« înseamnă acid etilen glicol tetraacetic; „EtOAc« înseamnă acetat de etil; „EtOH« înseamnă etanol sau alcool etilic; „Ex« înseamnă exemplu; „HATU« înseamnă hexafluorofosfat de (dimetilamino)-N,N-dimetil(3H-[1,2,3]triazolo[4,5-b]piridin-3-iloxi)metaniminiu; „HBTU« înseamnă hexafluorofosfat de 2-(1H-benzotriazol-1-il)-1,1,3,3-tetrametiluroniu; „2HG« înseamnă 2-hidroxiglutarat; „d5-3HG« înseamnă acid 3-hidroxi-1,5-pentandioic-2,2,3,4,4-d5; „HILIC« înseamnă cromatografie lichidă cu interacţiune hidrofilă; „HOAt« înseamnă 1-hidroxi-7-azobenzotriazol; „HOBt« înseamnă 1-hidroxilbenzotriazol hidrat; „HPLC« înseamnă cromatografie lichidă de înaltă performanţă; „IC50« înseamnă concentraţia unui agent care produce 50% din răspunsul inhibitor maxim posibil pentru acel agent; „mCPBA« înseamnă acid meta-cloroperbenzoic; „MeOH« înseamnă metanol sau metil alcool; „NADP+ şi NADPH« înseamnă formele oxidată şi redusă de fosfat de dinucleotide nicotinamidă adenine respectiv; „NMP« înseamnă N-metil-2-pirolidonă; „PG« înseamnă grupare de protecţie; „Prep« înseamnă preparare; „PyBOP« înseamnă hexafluorofosfat de benzotriazol-1-iloxitripirolidino-fosfonium; „PyBrop« înseamnă fosfat de bromo-tris-pirolidino fosfoniuhexafluoro; „rpm« înseamnă rotaţii pe minut; „(R)-RUCY®-XylBINAP« înseamnă RuCl[(R)-daipena][(R)-xilbinap; „SNAr« înseamnă substituţie aromatică nucleofilică; „TEA« înseamnă trietilamină; „TFA« înseamnă acid trifluoroacetic; „THF« înseamnă tetrahidrofuran; şi „Tris« înseamnă tris(hidroximetil)aminometan.

Compuşii cu Formula I sau la, sau sărurile acceptabile farmaceutic ale acestora, pot fi preparate printr-o varietate de proceduri cunoscute în domeniu, din care unele sunt ilustrate în schemele, preparările, şi exemplele de mai jos. Etapele de sinteză specifice pentru fiecare din căile descrise pot fi combinate în diferite moduri, sau în conjuncţie cu etape din diferite scheme, pentru a prepara compuşi cu Formula I sau Ia, sau săruri acceptabile farmaceutic ale acestora. Produsele fiecărei etape din schemele de mai jos pot fi recuperate prin metode convenţionale bine cunoscute în domeniu, incluzând extragerea, evaporarea, precipitarea, cromatografierea, filtrarea, triturarea, şi cristalizarea. În schemele de mai jos, toţi substituenţii dacă nu se indică altfel, sunt cum s-au definit anterior. Reactivii şi materiile prime sunt cu uşurinţă disponibile cuiva având calificare obişnuită în domeniu.

În Schema 1, o serie a reacţiilor conduce la un 1-substituit-7-(metilsulfonil)-1,4-dihidro-2H-pirimido[4,5-d][1,3]oxazin-2-onă, (4), produsul din Etapa C unde R2 este cum s-a definit anterior. „PG« este o grupare de protecţie dezvoltată pentru gruparea amino sau gruparea oxigen cum ar fi pentru carbamaţi, amide sau esteri. De exemplu, 5-hidroxi metil 4-amino-2-metilsulfanil-pirimidină poate fi ciclizată sub condiţii standard de carbamoilare la oxazină-2-onă utilizând trifosgen şi o bază organică cum ar fi DIPEA sau TEA la o temperatură de la aproximativ -30 pȃnă la -35°C pentru a da Compusul (2), produsul din Etapa A. Alternativ, o dihalogenură carbonil sau o di-pseudohalogenură carbonil cum ar fi CDI, fosgen, sau difosgen poate fi utilizată în loc de trifosgen pentru a completa carbamoilarea. Amina oxazinei poate fi alchilată cu halogenura alchil substituită adecvat cum ar fi un reactiv iodo într-un solvent cum ar fi NMP şi o bază anorganică cum ar fi K2CO3 la o temperatură de aproximativ 50-65°C pentru a da Compusul (3), produsul din Etapa B. Alternativ, o reacţie Mitsunobu poate fi realizată pentru a alchila amina oxazinei utilizând un alcool adecvat cum ar fi MeOH. Reacţiile Mitsunobu sunt bine cunoscute în domeniu şi pot converti o grupare hidroxil într-o grupare îndepărtabilă care este afişată de o largă varietate de nucleofile cum ar fi un carbamat utilizând trifenilfosfină şi un azodicarboxilat cum ar fi DIAD sau DEAD într-un solvent cum ar fi THF pentru a da Compusul (3). Sulfida poate fi oxidată la sulfonă în condiţii bine cunoscute în domeniu cum ar fi mCPBA sau peroximonosulfat de potasiu la o temperatură de aproximativ 10 până la 25°C într-un solvent cum ar fi ACN sau DCM pentru a da Compusul (4), produsul din Etapa C.

În Schema 2, un (4-(1-aminoetil)fenil)metanol (7) poate fi generat în câteva etape dintr-o aril halogenură cum ar fi o bromură (5) utilizând proceduri bine cunoscute specialistului calificat. Amina poate fi protejată în sub-etapa 1, Etapa D, unde „PG« este o grupare de protecţie dezvoltată pentru gruparea amino cum ar fi o amidă. Aril bromura protejată (5) poate fi convertită la o cetonă sub condiţii de carbonilare cu litiu pentru a da aril cetona (6) în sub-etapa 2, Etapa D. Cetona poate fi apoi redusă utilizând un agent reducător cum ar fi borohidrura de sodiu într-un solvent cum ar fi MeOH în sub-etapa 1, Etapa E. Amina poate fi deprotejată în această etapă (sub-etapa 2, Etapa E) sau la un moment mai târziu în sinteză pentru a da Compusul (7). Alternativ, Compusul (6) poate fi convertit direct la Compusul (12) într-o aminare reductivă utilizând izopropoxid de titan(IV) într-un solvent cum ar fi THF şi cu încălzire la aproximativ 60°C urmată de răcire şi adăugare de MeOH şi un agent reducător cum ar fi cianoborohidrură de sodiu pentru a da Compusul (12). Compusul (7) poate fi convertit la o benzil halogenură cum ar fi o clorură sub condiţii standard de halogenare utilizând un agent de halogenare cum ar fi clorura de tionil sau POCl3 într-un solvent cum ar fi DCM pentru a da compusul (10), Etapa I. Compusul (10) poate fi protejat dacă este necesar şi alchilat în Etapa J. De exemplu, amina (10) poate fi protejată în sub-etapa 1 a Etapei J utilizând o grupare de protecţie cum ar fi un trifluoroacetil sau CBZ. Astfel de grupări de protecţie sunt bine cunoscute şi apreciate în domeniu. Alternativ, Compusul 10 poate fi preparat dintr-o aldehidă, Compusul (8). Compusul (8) poate fi preparat prin oxidarea alcoolului benzilic corespunzător sub astfel de condiţii ca periodinanul Dess-Martin într-un solvent cum ar fi DCM pentru a da o aldehidă (8). O reacţie Grignard poate fi realizată în Etapa G pe aldehidă pentru a da Compusul (7). Compusul (7) din etapa G poate fi clorinat în Etapa H pentru a da Compusul (10) cum s-a discutat mai sus pentru Etapa I. Clorura compusului (10) poate fi afişată cu o piperazină mono-protejată în a doua etapă, procedură cu un singur recipient. Nu este întotdeauna necesară protecţia 1-feniletilaminei dar dacă se alege protecţia, este avantajoasă utilizarea a diferite grupări de protecţie pe 1-feniletilamină decât pe produsul piperazină amină (11), Etapa J, sub-etapa 1, pentru a deproteja selectiv unul sau cealaltă PG în etapa dorită. De exemplu, 1-feniletilamina poate fi reacţionată cu anhidridă trifluoroacetică utilizând o bază organică cum ar fi TEA într-un solvent cum ar fi DCM la o temperatură de aproximativ 0-5°C pentru a da produsul amină protejat din sub-etapa 1, Etapa J. O persoană calificată în domeniu ar înţelege că pot fi utilizate şi alte grupări de protecţie pe amină, cum ar fi CBZ. Deplasarea clorurii poate fi apoi realizată în condiţii bine cunoscute de către o persoană calificată în domeniu. De exemplu, halogenura poate fi deplasată de piperazina protejată sau neprotejată utilizând o bază anorganică cum ar fi K2CO3 şi se utilizează KI, sau NaI ca şi catalizator nucleofilic pentru a accelera reacţia. Amestecul poate fi încălzit la aproximativ 60-80°C într-un solvent cum ar fi ACN pentru a da compusul protejat (11) din sub-etapa 2, Etapa J. Gruparea de protecţie pe 1-feniletilamină poate fi îndepărtată cu o bază cum ar fi hidroxid de potasiu apos pentru a da Compusul (11) din sub-etapa 3, Etapa J.

În Schema 3, Compusul (11) poate fi reacţionat cu Compusul (4), Schema 1, într-o reacţie SNAr utilizând o bază organică cum ar fi DIPEA, CsF pentru a accelera reacţia, un solvent cum ar fi DMSO, şi o temperatură de aproximativ 70-80°C pentru a da produsul din Etapa L. În Etapa M, sub-etapa 1, o terţ-butoxi piperazină protejată poate fi deprotejată utilizând un acid cum ar fi HCl în dioxan şi MeOH sau TFA în DCM în timp ce o aloc piperazină protejată poate fi deprotejată în prezenţa unei surse de paladiu cum ar fi tetrakis(trifenilfosfin)paladiu(0) catalitic într-un solvent cum ar fi THF utilizând o nucleofilă moale cum ar fi dimedona pentru a da piperazina deprotejată din sub-etapa 1, Etapa M. În sub-etapa 2, Etapa M, piperazina poate fi amidată cu clorură de acriloil la o temperatură de la aproximativ -50 pȃnă la -78°C cu sau fără o bază organică cum ar fi TEA dacă amina este o sare acidă într-un solvent cum ar fi DCM pentru a da compuşi cu Formula Ia. Alternativ, o cuplare amidă poate fi realizată cu acid acrilic şi amina adecvată într-un solvent cum ar fi DMF cu un reactiv de cuplare cum ar fi EDC şi un aditiv cum ar fi HOBt. O persoană calificată în domeniu va recunoaşte că există un număr de metode şi reactivi pentru formarea amidei care rezultă din reacţia de acizi carboxilici şi amine. De exemplu, reacţia aminei adecvate şi acidului acrilic în prezenţa unui reactiv de cuplare cu sau fără o bază organică cum ar fi DIPEA sau TEA poate furniza un compus cu Formula Ia. Alţi reactivi de cuplare includ carbodiimide, cum ar fi DCC, DIC, sau un carbonildiimidazol cum ar fi CDI. Alţi aditivi de cuplare amidici, cum ar fi HO At pot fi de asemenea utilizaţi pentru a spori reacţia. Suplimentar, ar putea fi utilizate săruri de uroniu sau fosfoniu de anioni non-nucleofilici, cum ar fi HBTU, HATU, PyBOP, şi PyBrOP în loc de reactivii de cuplare mai tradiţionali. Un aditiv cum ar fi DMAP poate fi utilizat pentru a accelera reacţia de amidare dorită.

Alternativ în Schema 4, amina produsului deprotejat al compusului (7), Schema 2 poate fi reacţionată cu Compusul (4) cum s-a descris în Schema 3, Etapa L într-o alchilare SNAr pentru a da Compusul 13. Hidroxilul poate fi clorinat cum s-a descris în Etapa I, Schema 2 pentru a da Compusul 14, Etapa O. Clorura compusului (14) poate fi afişată într-o alchilare cu piperazină cum s-a descris în Schema 2, Etapa 11, sub-etapa 2 pentru a da Compusul (5). Piperazina protejată poate fi deprotejată şi piperazina apoi amidată cum s-a descris în Schema 3, Etapa M pentru a da compuşi cu Formula Ia.

În schema 5, un (4-(1-aminoetil)fenil)metanol chiral (7a) poate fi generat în câteva etape dintr-o halogenură chiral aril cum ar fi o bromură (5a) utilizând proceduri bine cunoscute specialistului calificat. Amina poate fi protejată în sub-etapa 1, Etapa D, unde „PG« este o grupare de protecţie dezvoltată pentru gruparea amino cum ar fi o amidă. Bromura aril (5a) poate fi convertită la o cetonă sub condiţii de carbonilare cu litiu pentru a da aril cetona (6a) în sub-etapa 2, Etapa D. Cetona poate fi apoi redusă asimetric utilizând un agent reducător chiral cum ar fi (R)-RUCY-XylBINAP într-un solvent cum ar fi EtOH pentru a furniza compusul 7a în sub-etapa 1, Etapa E. Compusul (7a) poate fi convertit la o halogenură chiral benzil cum ar fi o clorură, sub condiţii standard de halogenare utilizând un agent de halogenare cum ar fi clorura de benzoil într-un solvent cum ar fi t-butil eter pentru a da compusul (10a), Etapa I. Compusul (10a) este mai întȃi reacţionat cu o piperazină protejată (PG-piperazină) în prezenţa unei baze cum ar fi bicarbonatul de sodiu într-un solvent cum ar fi acetonitril pentru a da forma protejată în sub-etapa 1, Etapa J. Forma protejată este apoi deprotejată cu o bază cum ar fi hidroxidul de potasiu apos într-un solvent cum ar fi EtOH pentru a furniza compusul (11a), sub-etapa 2, Etapa J.

În Schema 6, o serie a reacţiilor conduce la o 1-substituit-7-cloro-4H-pirido[4,3-d][1,3]oxazin-2-onă (18), produsul din Etapa C unde R2 este cum s-a definit anterior. De exemplu, etil 4,6-dicloropiridin-3-carboxilat (15) poate fi reacţionat cu o amină sub condiţii standard pentru a da 6-cloro-4-(amino)piridin-3-carboxilat (16) într-un solvent cum ar fi acetonitril. Reducerea grupării ester în Compusul (16) utilizând un reactiv hidrură cum ar fi hidrură de litiu aluminiu într-un solvent cum ar fi THF dau (4-amino-6-cloro-3-piridil)metanol (17). Compusul cum ar fi 17 poate fi ciclizat sub condiţii standard de carbamoilare la oxazină-2-onă utilizând trifosgen şi o bază organică cum ar fi DIPEA sau TEA la o temperatură de aproximativ -20°C pentru a da Compusul (18), produsul din Etapa C. Alternativ o dihalogenură carbonil sau o di-pseudohalogenură carbonil cum ar fi CDI, fosgen, sau difosgen poate fi utilizată în loc de trifosgen pentru a completa carbamoilarea. Compusul 11, preparat aşa cum se arată mai sus în Schemele 2 sau 5, sau cum s-a descris în alternativele la fiecare Schemă, poate fi reacţionat cu Compusul 18 sub condiţii standard de alchilare. Compusul intermediar rezultat este apoi deprotejat şi amidat cum s-a descris mai sus în Schemele 3 sau 4 pentru a da compuşii cu Formula I unde X este CH.

Într-o etapă opţională, o sare acceptabilă farmaceutic a unui compus cu Formula I sau Ia poate fi formată prin reacţia unei baze libere adecvate cu Formula I sau Ia cu un acid acceptabil farmaceutic adecvat într-un solvent adecvat sub condiţii standard. Suplimentar, formarea de astfel de săruri poate avea loc simultan după deprotejarea unei grupări de protecţie la azot. Formarea de astfel de săruri este bine cunoscută şi apreciată în domeniu. Vezi, de exemplu, Gould, P.L., „Salt selection for basic drugs," International Journal of Pharmaceutics, 33: 201-217 (1986); Bastin, R.J., şi colab. „Salt Selection and Optimization Procedures for Pharmaceutical New Chemical Entities«, Organic Process Research and Development, 4: 427-435 (2000); şi Berge, S.M., şi colab., „Pharmaceutical Salts«, Journal of Pharmaceutical Sciences, 66: 1-19, (1977). Cineva având calificare obişnuită în domeniu va aprecia că un compus cu Formula I sau Ia este cu uşurinţă convertit la şi poate fi izolat ca sare acceptabilă farmaceutic.

Preparare 1

7-metilsulfanil-1,4-dihidropirimido[4,5-d][1,3]oxazin-2-onă

Se adaugă trifosgen (859 g, 2,9 mol) la o soluţie de (4-amino-2-metilsulfanil-pirimidin-5-il)metanol (900 g, 5,26 mol) în THF (22,5 L) peste 15 minute la -30°C. Se adaugă DIPEA (2,449 g, 18,92 mol) într-o oră, în timp ce se menţine temperatura reacţiei între -35 şi -30°C. Amestecul de reacţie este apoi turnat peste apă cu gheaţă (30 L) şi se adaugă 2-metiltetrahidrofuran (10 L). Faza organică este spălată cu apă şi saramură. Faza organică este uscată pe Na2SO4 şi este concentrată la sec. Produsul brut este suspendat cu eter de petrol/EtOAc (1:1), filtrat, şi concentrat pentru a da un solid galben care este transportat fără purificare suplimentară (890,5 g, 1,62 mol, puritate 83%, randament 86%). MS (m/z): 198 (M+H).

Preparare 2

1-etil-7-(metiltio)-1,4-dihidro-2H-pirimido[4,5-d][1,3]oxazin-2-onă

La o soluţie de 7-metilsulfanil-1,4-dihidropirimido[4,5-d][1,3]oxazin-2-onă (280 g, 1,42 mol) în NMP (2,24 L) se adaugă K2CO3 (294,2 g, 2,13 mol) şi iodură de etil (336,3 g, 1,99 mol) la temperatura camerei. Amestecul este agitat timp de 16 ore la 50°C şi apoi diluat cu DCM (3 L) şi apă (6 L). Faza organică este separată şi spălată cu apă şi saramură şi concentrată la sec pentru a da compusul brut din titlu (286 g, 1,27 mol, puritate 83%, randament 91%). MS (m/z): 226 (M+H).

Preparare 3

1-metil-7-metilsulfanil-4H-pirimido[4,5-d][1,3]oxazin-2-onă

La o soluţie de trifenilfosfină (1,61 g, 6,08 mmol) şi 7-metilsulfanil-1,4-dihidropirimido[4,5-d][1,3]oxazin-2-onă (1,00 g, 5,07 mmol) în THF (25 mL) se adaugă MeOH (0,248 mL, 6,08 mmol) urmat de adăugarea în picătură de DIAD (1,21 mL, 6,08 mmol) la temperatura ambiantă. După agitare peste noapte, solventul este îndepărtat sub vid şi uleiul galben rezultat este purificat prin cromatografie pe gel de siliciu (40-50% EtOAc/hexani) pentru a da compusul din titlu ca solid alb (1,08 g, 5,11 mmol, cantitativ). MS (m/z): 212 (M+H).

Preparare 4

1-etil-7-(metilsulfonil)-1,4-dihidro-2H-pirimido[4,5-d][1,3]oxazin-2-onă

La o soluţie agitată de 1-etil-7-(metiltio)-1,4-dihidro-2H-pirimido[4,5-d][1,3]oxazin-2-onă (286 g, 1,24 mol) în ACN (2,8 L) şi apă (1,4 L) se adaugă peroximonosulfat de potasiu (1526 g, 2,48 mol) ca solid peste 20 minute, şi amestecul rezultat este agitat timp de 16 ore la 10-20°C. Amestecul de reacţie este filtrat şi turta filtrată obţinută este spălată cu DCM. Filtratele combinate şi DCM sunt spălate cu 5% Na2SO3, apă, şi saramură. Faza organică este uscată pe Na2SO4 şi concentrată pentru a furniza compusul din titlu (133,8 g, puritate 93%, randament 41%). MS (m/z): 258 (M+H).

Următorul compus este preparat în mod esenţial prin metoda de Preparare 4.

Tabelul 1

Nr. prep. Denumire chimică Structură ES/MS (m/z) (M+H) 5 1-metil-7-metilsulfonil-4H-pirimido[4,5-d] [1,3]oxazin-2-onă 244

Preparare 6

N-[(1S)-1-(4-bromofenil)etil]-2,2,2-trifluoro-acetamidă

Se adaugă anhidridă trifluoroacetică (165 mL, 1,17 mol) în picătură la o soluţie de (1S)-1-(4-bromofenil)etanamină (213 g, 1,06 mol) în ACN (1,3 L) la 5°C urmată de adăugarea în picătură de TEA (326 mL, 2,34 mol) într-o oră. După 30 minute, se adaugă apă (3 L) şi saramură (1 L) conducând la formarea a unui precipitat incolor. Suspensia este agitată timp de 15 minute şi apoi solidul este filtrat, spălat cu apă şi hexani, şi uscat prin curent de aer urmat de uscare la 40°C sub vid pentru a da compusul din titlu (290 g, 92%). 1H NMR (d6-DMSO) δ 1,44 (d, 3H, J = 7,1 Hz), 4,98 (dddd, 1H, J= 7,6, 7,1, 7,1, 7,1 Hz), 7,30 (d, 2H, J = 8,4 Hz), 7,55 (d, 2H, J = 8,4 Hz), 9,91 (d, 1H, J = 7,6 Hz).

Preparare 7

N-[(1S)-1-[4-(2-ciclopropilacetil)fenil]etil]-2,2,2-trifluoro-acetamidă

Se adaugă n-butil litiu (2,5 M în hexani, 53 mL, 130 mmol) în picătură la o soluţie de N-[(1S)-1-(4-bromofenil)etil]-2,2,2-trifluoro-acetamidă (18,00 g, 60,79 mmol) în THF (600 mL) la -78°C astfel încât să menţină o temperatură internă sub -70°C. După ce adăugarea este completă, amestecul este agitat timp de 45 minute la -78°C şi apoi se adaugă 2-ciclopropil-N-metoxi-N-metil-acetamidă (11,4 g, 79,6 mmol) ca soluţie în THF (10 mL). Amestecul este agitat la -78°C timp de 45 minute, se adaugă clorură de amoniu saturată apoasă, şi amestecul este încălzit la temperatura camerei. Straturile sunt separate şi stratul organic este uscat pe sulfat de sodiu anhidru, filtrat, şi concentrat sub presiune redusă. La solid se adaugă o cantitate mică de DCM şi amestecul este încălzit rapid pentru a dizolva solidele. Amestecul este concentrat până înainte de precipitare şi apoi se adaugă hexani (150 mL) în picătură cu agitare viguroasă pentru a da un solid incolor. Solidul este colectat prin filtrare, spălat cu o cantitate mică de hexani, şi uscat sub presiune redusă pentru a da compusul din titlu (13,82 g, 76%) ca solid incolor. MS (m/z): 298,3 (M-H).

Următorul compus este preparat în mod esenţial prin metoda de Preparare 7.

Tabelul 2

Nr. prep. Denumire chimică Structură ES/MS (m/z) (M+H) 8 2,2,2-trifluoro-N-[(1S)-1-[4-(3-metoxipropanoil)fenil]etil]acetamidă, 304

Preparare 9

1-[4-[(1S)-1-aminoetil]fenil]-2-ciclopropil-etanol

Se adaugă borohidrură de sodiu (0,1411 g, 2 echiv., 3,729 mmol) la o soluţie de N-[(1S)-1-[4-(2-ciclopropilacetil)fenil]etil]-2,2,2-trifluoro-acetamidă (558 mg, 1,86 mmol) în MeOH (15 mL) răcită într-o baie de apă cu gheaţă. Amestecul este agitat timp de aproximativ 2,5 ore, şi apoi se adaugă hidroxid de potasiu (800 mg, 14,2 mmol) în apă (3 mL). Amestecul este agitat la temperatura camerei timp de aproximativ 20 ore. Amestecul este concentrat şi partiţionat între DCM şi apă. Stratul organic este spălat cu clorură de sodiu saturată apoasă, uscat pe sulfat de sodiu, filtrat, şi concentrat pentru a da compusul din titlu (354 mg, 1,38 mmol, 74%) ca solid alb. Materialul este utilizat fără purificare suplimentară. ES/MS (m/z): 189,0 (M-OH).

Preparare 10

2,2,2-trifluoro-N-[(1S)-1-(4-formilfenil)etil]acetamidă

Se adaugă periodinan Dess-Martin (20,9 g, 49,3 mmol) la 0°C la o soluţie de 2,2,2-trifluoro-N-[(1S)-1-[4-(hidroximetil)fenil]etil]acetamidă (11,1 g, 44,9 mmol) în DCM (450 mL). Amestecul de reacţie este agitat peste noapte şi lăsat să se încălzească la temperatura camerei. Amestecul de reacţie este diluat cu DCM suplimentar şi spălat cu NaHCO3 saturată apoasă, Na2S2O3 saturată apoasă, şi saramură. Organicele combinate sunt uscate (Na2SO4), filtrate, şi concentrate pentru a da un reziduu care este purificat prin cromatografie pe gel de siliciu eluând cu un gradient de 0-50% EtOAc/hexani pentru a da compusul din titlu ca solid alb (9,5 g, 39 mmol, 86%). ES/MS (m/z): 244 (M-H).

Preparare 10a

2,2,2-trifluoro-N-[(1S)-1-[4-(hidroximetil)fenil]etil]acetamidă

Se adaugă anhidridă trifluoroacetică (12 mL, 85,4 mmol) la 0°C la o soluţie de [4-[(1S)-1-aminoetil]fenil]metanol (10,8 g, 71,4 mmol) în CH2Cl2 (150 mL). După 10 minute, se adaugă trietilamină (24 mL, 172 mmol) în CH2Cl2 (8 mL) în picătură în 30 minute, baia de răcire este îndepărtată şi reacţia este agitată peste noapte. Amestecul de reacţie este concentrat sub vid, diluat cu CH2Cl2 suplimentar, şi spălat cu 1 N HCl apos şi apă. Faza organică este uscată (Na2SO4), filtrată, şi concentrată. Materialul brut este purificat prin cromatografie pe gel de siliciu eluând cu un gradient de 0-50% EtOAc/hexani pentru a da compusul din titlu ca solid alb (11,1 g, 44,9 mmol, 63%). ES/MS (m/z): 246 (M-H).

Preparare 11

2,2,2-trifluoro-N-[(1S)-1-[4-(1-hidroxi-3-metil-butil)fenil]etil]acetamidă

La o soluţie de 2,2,2-trifluoro-N-[(1S)-1-(4-formilfenil)etil]acetamidă (1,72 g, 7,01 mmol) în THF (35 mL) răcită într-o baie de apă cu gheaţă se adaugă bromură de izobutilmagneziu (2 M în dietil eter, 7,0 mL, 14,0 mmol) şi se agită timp de aproximativ 30 minute. Amestecul este stins cu clorură de amoniu saturată apoasă şi partiţionat între EtOAc şi apă. Stratul organic este spălat cu clorură de sodiu saturată apoasă, uscat pe sulfat de sodiu, filtrat, şi concentrat pentru a da compusul din titlu ca un ulei (1,40 g, 4,15 mmol, 59%) care este utilizat fără purificare suplimentară. ES/MS (m/z): 302,0 (M-H).

Următorul compus este preparat în mod esenţial prin metoda de Preparare 11.

Tabelul 3

Nr. prep. Denumire chimică Structură ES/MS (m/z) (M+H) 12 2,2,2-trifluoro-N-[(1S)-1-[4-(1-hidroxipropil)fenil]etil]acetamidă 293 (M+NH4)

Preparare 13

terţ-butil 4-[2-ciclopropil-1-[4-[(1S)-1-[(2,2,2-trifluoroacetil)amino]etil]fenil]etil] piperazin-1-carboxilat

Se adaugă izopropoxid de titan(IV) (60 mL, 200 mmol) la o soluţie de N-[(1S)-1-[4-(2-ciclopropilacetil)fenil]etil]-2,2,2-trifluoro-acetamidă (12,0 g, 40,1 mmol) şi terţ-butil piperazin-1-carboxilat (17,9 g, 96,1 mmol) în THF (80 mL) şi amestecul este agitat la 60°C peste noapte. Amestecul este răcit la temperatura camerei şi se adaugă MeOH (80 mL) urmat de adăugarea în porţiuni a cianoborohidrurii de sodiu (5,3 g, 80 mmol). Amestecul este agitat la temperatura camerei timp de 8 ore şi apoi se adaugă apă şi MeOH şi amestecul este agitat la temperatura camerei peste noapte. Amestecul este filtrat pentru a îndepărta solidele şi solidele sunt clătite cu MeOH şi apă. Filtratul este concentrat parţial pentru a îndepărta cea mai mare parte de MeOH şi reziduul este extras cu EtOAc (2Ч). Extractele organice combinate sunt uscate pe sulfat de sodiu anhidru, filtrate, şi concentrate sub presiune redusă. Materialul brut este purificat prin cromatografie pe coloană eluând cu un gradient de 0% până la 30% EtOAc în solvent B unde solventul B este 1:1 hexani:DCM pentru a da compusul din titlu (10,5 g, 56%) ca solid incolor. MS (m/z): 470,3 (M+H).

Preparare 14

terţ-butil 4-[1-[4-[(1S)-1-aminoetil]fenil]-2-ciclopropil-etil]piperazin-1-carboxilat

Se adaugă hidroxid de potasiu apos (5 M, 69 mL, 350 mmol) la o soluţie de terţ-butil 4-[2-ciclopropil-1-[4-[(1S)-1-[(2,2,2-trifluoroacetil)amino]etil]fenil]etil]piperazin -1-carboxilat (32,24 g, 68,67 mmol) în EtOH (350 mL) şi amestecul rezultat este agitat la temperatura camerei timp de 4 ore. EtOH este îndepărtat sub presiune redusă şi la reziduu se adaugă bicarbonat de sodiu apos saturat şi amestecul este extras cu DCM. Extractele organice combinate sunt uscate pe sulfat de sodiu anhidru, filtrate, şi concentrate sub presiune redusă pentru a da compusul din titlu (24,33 g, puritate 96,5% conţinând 3,5% DCM rezidual, randament 92%t) ca ulei vȃscos incolor. MS (m/z): 374,3 (M+H).

Următorul compus este preparat în mod esenţial prin metoda de Preparare 14.

Tabelul 4

Nr. prep. Denumire chimică Structură ES/MS (m/z) (M+H) 15 terţ-butil 4-[1-[4-[(1S)-1-aminoetil]fenil]-3-metil-butil]piperazin-1-carboxilat 376 16 terţ-butil 4-[(1R)-1-[4-[(1S)-1-aminoetil] fenil]propil]piperazin-1-carboxilat, izomer 1 348 17 terţ-butil 4-[(1R)-1-[4-[(1S)-1-aminoetil]fenil]propil]piperazin-1-carboxilat, izomer 2 348

Preparare alternativă 14

Se adaugă o soluţie de hidroxid de potasiu (1,28 g, 22,9 mmol) în apă (4 mL) la o soluţie de terţ-butil 4-[2-ciclopropil-1-[4-[(1s)-1-[(2,2,2-trifluoroacetil)amino]etil] fenil]etil]piperazin-1-carboxilat (2,15 g, 4,58 mmol) în EtOH (23 mL) şi amestecul este agitat la temperatura camerei. După aproximativ 6 ore, amestecul este concentrat. Reziduul este partiţionat între DCM şi soluţie saturată de bicarbonat de sodiu. Stratul organic este spălat cu apă şi clorură de sodiu saturată apoasă, uscat pe sulfat de sodiu, filtrat, şi concentrat pentru a da compusul din titlu ca un ulei care este utilizat fără purificare (1,73 g, 4,49 mmol, 98%). ES/MS (m/z): 374,2 (M+H).

Preparare 18

terţ-butil 4-[(1R)-1-[4-[(1S)-1-aminoetil]fenil]-2-ciclopropil-etil]piperazin-1-carboxilat, diastereomer 1

Preparare 19

terţ-butil 4-[(1S)-1-[4-[(1S)-1-aminoetil]fenil]-2-ciclopropil-etil]piperazin-1-carboxilat, diastereomer 2

Un amestec 1:1 de terţ-butil 4-[(1R)-1-[4-[(1S)-1-aminoetil]fenil]-2-ciclopropil-etil]piperazin-1-carboxilat, diastereomer 1 şi terţ-butil 4-[(1S)-1-[4-[(1S)-1-aminoetil] fenil]-2-ciclopropil-etil]piperazin-1-carboxilat, diastereomer 2 (3,23 g) este dizolvat în MeOH (40 mL) şi este separat în diastereomeri individuali prin cromatografie preparativă HPLC chirală utilizând următoarele condiţii: coloană Chiralpak AD, 20 µm, (8 x 33 cm); volum de injecţie 10 mL; eluent 100% MeOH cu 0,2% DMEA; lungime de undă de detecţie 220 nm; debit 400 mL/min. Prepararea 12, terţ-butil 4-[(1R)-1-[4-[(1S)-1-aminoetil]fenil]-2-ciclopropil-etil]piperazin-1-carboxilat, diastereomer 1, este obţinută de la primul maxim de eluare ca ulei vȃscos clar (1,50 g, 46%, >99% de). MS (m/z): 374,3 (M+H). Prepararea 13, terţ-butil 4-[(1S)-1-[4-[(1S)-1-aminoetil]fenil]-2-ciclopropil-etil]piperazin-1-carboxilat, diastereomer 2, este obţinută de la al doilea maxim de eluare ca ulei vȃscos clar (1,46 g, 45%, >98,2% de). MS (m/z): 374,3 (M+H).

Preparare 20

N,3-dimetoxi-N-metil-propanamidă

O soluţie de acid 3-metoxipropanoic (62 g, 577,7 mmol) în DCM (1200 mL) este tratată încet în porţiuni cu 1,1'-carbonildiimidazol (103 g, 635,2 mmol) şi agitată la temperatura camerei timp de 2 ore. Se adaugă clorhidrat de N,O-dimetilhidroxilamină (62 g, 635,6 mmol) şi amestecul este agitat la temperatura camerei peste noapte. Amestecul este spălat cu apă (2×), 0,1M HCl apos (2×), şi cu bicarbonat de sodiu apos saturat (2Ч), uscat pe sulfat de magneziu, filtrat şi concentrat la sec pentru a da materialul brut. Materialul brut este cromatografiat pe gel de siliciu eluând cu un gradient de 20-40% acetonă în hexani. Uleiul rezultat este uscat peste noapte sub vid pentru a da compusul din titlu (69,5g, 81,7%). 1H NMR (CDCl3) δ 2,72 (t, 2H), 3,2 (s, 3H), 3,38 (s, 3H), 3,7 (m, 5H).

Preparare 21

2,2,2-trifluoro-N-[(1S)-1-[4-(1-hidroxi-3-metoxi-propil)fenil]etil]acetamidă

2,2,2-trifluoro-N-[(1S)-1-[4-(3-metoxipropanoil)fenil]etil]acetamida (23,62 g, 73,98 mmol, 95% din masă) este dizolvată în MeOH (700 mL) şi tratată cu borohidrură de sodiu (5,6 g, 150 mmol). După agitare la temperatura camerei timp de 2 ore amestecul este tratat cu clorură de amoniu saturată apoasă şi MeOH este evaporat. Materialul rezultat este partiţionat între apă şi EtOAc, separat şi organicele combinate sunt uscate pe Na2SO4, filtrate, şi concentrate la sec. Materialul brut este cromatografiat pe gel de siliciu eluând cu 40% EtOAc în hexani pentru a da compusul din titlu ca solid alb (17,82g, 79%). MS (m/z): 306 (M+H).

Preparare 22

terţ-butil 4-[3-metoxi-1-[4-[(1S)-1-[(2,2,2-trifluoroacetil)amino]etil]fenil]propil] piperazin-1-carboxilat

2,2,2-trifluoro-N-[(1S)-1-[4-(1-hidroxi-3-metoxi-propil)fenil]etil]acetamida (21,76g, 71,27 mmol) este dizolvată în DCM (350mL) şi răcită la -10°C. Se adaugă clorură de tionil (26,12 g, 16 mL, 219,6 mmol) în picătură şi reacţia este agitată timp de 2 ore. Amestecul este concentrat la sec, redizolvat în DCM, şi reconcentrat. Materialul brut este dizolvat în ACN (300 mL) şi t-butil piperazin-1-carboxilat (26,55 g, 142,6 mmol), carbonat de potasiu (39,5 g, 286 mmol) şi se adaugă iodură de potasiu (12,0 g, 72,3 mmol). Amestecul este încălzit la 80°C timp de 72 ore. Solidul alb rezultat este filtrat şi spălat cu EtOAc. Filtratele combinate sunt spălate cu clorură de amoniu apoasă, uscate pe sulfat de magneziu, filtrate, şi concentrate. Materialul brut este cromatografiat pe gel de siliciu eluând cu un gradient de 40-80% EtOAc în hexani pentru a da compusul din titlu ca spumă albă (29,63g, 88%). MS (m/z): 474 (M+H).

Preparare 23

terţ-butil 4-[1-[4-(1S)-1-aminoetil]fenil]-3-metoxi-propil]piperazin-1-carboxilat, diastereomer 1

Preparare 24

terţ-butil 4-[1-[4-(1S)-1-aminoetil]fenil]-3-metoxi-propil]piperazin-1-carboxilat, diastereomer 2

La o soluţie de terţ-butil 4-[3-metoxi-1-[4-[(1S)-1-[(2,2,2-trifluoroacetil)amino]-etil]propil]piperazin-1-carboxilat (29,60 g, 62,5 mmol) în EtOH (310 mL) se adaugă hidroxid de potasiu apos (63 mL, 5 M). Soluţia este agitată timp de 4 ore la temperatura camerei şi apoi amestecul este concentrat la sec. Reziduul brut este tratat cu apă şi bicarbonat de sodiu apos saturat şi extras cu DCM (3Ч). Extractele organice combinate sunt uscate pe sulfat de sodiu, filtrate, şi concentrate pentru a da compusul din titlu (23,6g) care este dizolvat în MeOH (236 mL) şi separat în diastereomeri individuali prin cromatografie SFC chirală utilizând următoarele condiţii: coloană: Lux Celuloză-1, (5 x 25 cm); volum de injecţie: 1 mL la fiecare 2,5 minute, eluent 15% MeOH/CO2, lungime de undă de detecţie 230 nm; debit 300 g/min; temperatura coloanei: 40°C; punct de setare BPR: 100 bar; temperatură BPR: 40°C. Compusul din titlu al Preparării 28 este obţinut de la primul maxim de eluare ca ulei galben vȃscos clar (10,1 g, 42,8%, 96,6% de). MS (m/z): 378 (M+H). Compusul Preparării 29 este izolat ca al doilea maxim de eluare ca ulei galben vȃscos clar (10,3 g, 43,6%, 95,2% de). MS (m/z): 378 (M+H).

Preparare 25

7-[[(1S)-1-[4-(1-cloro-2-ciclopropil-etil)fenil]etil]amino]-1-etil-4H-pirimido[4,5-d][1,3]oxazin-2-onă

Se adaugă clorură de tionil (0,23 mL, 3,219 mmol) la un amestec de 7-[[(1S)-1-[4-(2-ciclopropil-1-hidroxi-etil)fenil]etil]amino]-1-etil-4H-pirimido[4,5-d][1,3]oxazin-2-onă (432 mg, 1,03 mmol) şi carbonat de potasiu (741 mg, 5,37 mmol) în DCM (20 mL) şi amestecul este agitat la temperatura camerei timp de 20 minute. Amestecul este filtrat prin pământ de diatomee şi concentrat pentru a da compusul din titlu (518 mg, 1,07 mmol, 100%) ca spumă albă, care este utilizat fără purificare suplimentară. ES/MS (m/z): 401,2/403,2 (M+H).

Următorii compuşi sunt preparaţi în mod esenţial prin metoda de Preparare 25.

Tabelul 5

Nr. prep. Denumire chimică Structură ES/MS (m/z) (M+H) 26 N-[(1S)-1-[4-(1-cloro-2-ciclopropil-etil) fenil]etil]-2,2,2-trifluoro-acetamidă 318 27 N-[(1S)-1-[4-(1-cloro-3-metil-butil)fenil]etil] -2,2,2-trifluoro-acetamidă 320 28 N-[(1S)-1-[4-(1-cloropropil)fenil]etil]-2,2,2-trifluoro-acetamidă 311 (M+NH4)

Preparare 29

terţ-butil 4-[(1R)-2-ciclopropil-1-[4-[(1S)-1-[(1-etil-2-oxo-4H-pirimido[4,5-d][1,3] oxazin-7-il)amino]etil]fenil]etil]piperazin-1-carboxilat

La o soluţie de terţ-butil 4-[(1R)-1-[4-[(1S)-1-aminoetil]fenil]-2-ciclopropil-etil]piperazin-1-carboxilat (864 mg, 3,35 mmol), şi 1-etil-7-(metilsulfonil)-1,4-dihidro-2H-pirimido[4,5-d][1,3]oxazin-2-onă (1,14 g, 3,05 mmol), în DMSO (15 mL) se adaugă CsF (1,39 g, 9,15 mmol) şi DIPEA (0,80 mL, 4,6 mmol). Amestecul este agitat la 60°C timp de 1,5 ore. Amestecul este răcit la temperatura camerei, diluat cu EtOAc, şi spălat cu apă (2×). Spălările apoase combinate sunt extrase cu EtOAc şi extractele organice combinate sunt uscate (Na2SO4), filtrate, şi concentrate la sec. Produsul brut rezultat este purificat prin cromatografie pe gel de siliciu eluând cu un gradient de 55% până la 95% EtOAc în hexani pentru a da compusul din titlu ca solid incolor (1,47 g, 88%). MS (m/z): 551,3 (M+H).

Următorii compuşi sunt preparaţi în mod esenţial prin metoda de Preparare 29.

Tabelul 6

Nr. prep. Denumire chimică Structură ES/MS (m/z) (M+H) 30 terţ-butil 4-[(1S)-2-ciclopropil-1-[4-[(1S)-1-[(1-etil-2-oxo-4H-pirimido[4,5-d][1,3]oxazin-7-il)amino]etil]fenil]etil]piperazin-1-carboxilat, 551 31 terţ-butil 4-[1-[4-[(1S)-1-[(1-etil-2-oxo-4H-pirimido[4,5-d][1,3]oxazin-7-il)amino]etil] fenil]-3-metoxi-propil]piperazin-1-carboxilat (diastereomer 1) 555 32 terţ-butil 4-[1-[4-[(1S)-1-[(1-etil-2-oxo-4H-pirimido[4,5-d][1,3]oxazin-7-il)amino]etil] fenil]-3-metoxi-propil]piperazin-1-carboxilat (diastereomer 2) 555 33 terţ-butil 4-[2-ciclopropil-1-[4-[(1S)-1-[(1-metil-2-oxo-4H-pirimido[4,5-d][1,3]oxazin-7-il)amino]etil]fenil]etil]piperazin-1-carboxilat (diastereomer 1) 537 34 terţ-butil 4-[2-ciclopropil-1-[4-[(1S)-1-[(1-metil-2-oxo-4H-pirimido[4,5-d][1,3]oxazin-7-il)amino]etil]fenil]etil]piperazin-1-carboxilat (diastereomer 2) 537 35 terţ-butil 4-[1-[4-[(1S)-1-[(1-etil-2-oxo-4H-pirimido[4,5-d][1,3]oxazin-7-il)amino]etil] fenil]-3-metil-butil]piperazin-1-carboxilat 553 36 terţ-butil 4-[(1R/S)-1-[4-[(1S)-1-[(1-etil-2-oxo -4H-pirimido[4,5-d][1,3]oxazin-7-il)amino] etil]fenil]propil]piperazin-1-carboxilat, izomer 1 525 37 terţ-butil 4-[(1R/S)-1-[4-[(1S)-1-[(1-etil-2-oxo -4H-pirimido[4,5-d][1,3]oxazin-7-il)amino] etil]fenil]propil]piperazin-1-carboxilat, izomer 2 525 38 7-[[(1S)-1-[4-(2-ciclopropil-1-hidroxi-etil) fenil]etil]amino]-1-etil-4H-pirimido[4,5-d] [1,3]oxazin-2-onă 383

Preparare 39

7-[[(1S)-1-[4-[(1R)-2-ciclopropil-1-piperazin-1-il-etil]fenil]etil]amino]-1-etil-4H-pirimido[4,5-d][1,3]oxazin-2-onă

Se adaugă acid clorhidric (95 mL, 5,5 M în izopropanol, 520 mmol) în picătură la o soluţie de terţ-butil 4-[(1R)-2-ciclopropil-1-[4-[(1S)-1-[(1-etil-2-oxo-4H-pirimido[4,5-d][1,3]oxazin-7-il)amino]etil]fenil]etil]piperazin-1-carboxilat (29,45 g, 53,48 mmol) în EtOAc (570 mL) la 40°C. Amestecul este lăsat să se agite 3 ore, la temperatura camerei, şi apoi se daugă apă (300 mL). Straturile sunt separate şi stratul organic este extras cu apă (2 × 150 mL). PH-urile extractelor apoase combinate sunt ajustate la pH 10 prin adăugarea de 5 N NaOH conducând la formarea a unui solid incolor. Solidul este colectat prin filtrare, spălat cu apă, şi aer uscat pentru a da compusul din titlu (25,18 g, 99%) ca solid incolor. MS (m/z): 451,2 (M+H).

Următorul compus este preparat în mod esenţial prin metoda de Preparare 39.

Tabelul 7

Nr. prep. Denumire chimică Structură ES/MS (m/z) (M+H) 40 7-[[(1S)-1-[4-[(1S)-2-Ciclopropil-1-piperazin-1-il-etil]fenil]etil]amino]-1-etil-4H-pirimido[4,5-d] [1,3]oxazin-2-onă 451

Preparare 41

7-[[(1S)-1-[4-(2-ciclopropil-1-piperazin-1-il-etil)fenil]etil]amino]-1-metil-4H-pirimido[4,5-d][1,3]oxazin-2-onă, diastereomer 1

Terţ-butilul 4-[2-ciclopropil-1-[4-[(1S)-1-[(1-metil-2-oxo-4H-pirimido[4,5-d][1,3]oxazin-7-il)amino]etil]fenil]etil]piperazin-1-carboxilat, diastereomer 1 (245 mg, 0,46 mmol) este dizolvat în DCM (2,5 mL). Se adaugă TFA (0,7 mL, 9 mmol) şi reacţia este agitată la temperatura camerei timp de 90 de minute. Amestecul este stins cu 20% aq K2CO3 şi extras cu DCM (3Ч). Extractele organice combinate sunt uscate pe Na2SO4, filtrate, şi concentrate la sec pe vid înaintat peste noapte pentru a da compusul din titlu ca spumă albă, (196 mg, 88,5%). MS (m/z): 437 (M+H).

Următorii compuşi sunt preparaţi în mod esenţial prin metoda de Preparare 41.

Tabelul 8

Nr. prep. Denumire chimică Structură ES/MS (m/z) (M+H) 42 7-[[(1S)-1-[4-(2-ciclopropil-1-piperazin-1-il-etil)fenil]etil]amino]-1-metil-4H-pirimido[4,5-d][1,3]oxazin-2-onă, diastereomer 2 437 43 1-etil-7-[[(1S)-1-[4-(3-metil-1-piperazin-1-il-butil)fenil]etil]amino]-4H-pirimido[4,5-d][1,3]oxazin-2-onă, izomer 1 453 44 1-etil-7-[[(1S)-1-[4-(3-metil-1-piperazin-1-il-butil)fenil]etil]amino]-4H-pirimido[4,5-d][1,3]oxazin-2-onă, izomer 2 453 45 7-[[(1S)-1-[4-(2-ciclopropil-1-piperazin-1-il-etil)fenil]etil]amino]-1-metil-4H-pirido[4,3-d][1,3]oxazin-2-onă, izomer 1 436 46 7-[[(1S)-1-[4-(2-ciclopropil-1-piperazin-1-il-etil)fenil]etil]amino]-1-metil-4H-pirido[4,3-d][1,3]oxazin-2-onă, izomer 2 436 47 1-etil-7-[[(1S)-1-[4-[(1R/S)-1-piperazin-1-ilpropil]fenil]etil]amino]-4H-pirimido[4,5-d][1,3]oxazin-2-onă, izomer 1 425 48 1-etil-7-[[(1S)-1-[4-[(1R/S)-1-piperazin-1-ilpropil]fenil]etil]amino]-4H-pirimido[4,5-d][1,3]oxazin-2-onă, izomer 2 425

Preparare 49

7-[[(1S)-1-[4-(2-ciclopropil-1-piperazin-1-il-etil)fenil]etil]amino]-1-etil-4H-pirimido[4,5-d][1,3]oxazin-2-onă

Un amestec de 7-[[(1S)-1-[4-(1-cloro-2-ciclopropil-etil)fenil]etil]amino]-1-etil-4H-pirimido[4,5-d][1,3]oxazin-2-onă (518 mg, 1,07 mmol), carbonat de potasiu (445 mg, 3,217 mmol), iodură de sodiu (161 mg, 1,07 mmol) şi piperazină (277 mg, 3,22 mmol) în ACN (3 mL) este încălzit într-o fiolă etanşată până la 70°C. După ∼8 ore, amestecul este răcit la temperatura camerei, diluat cu EtOAc, filtrat prin pământ de diatomee, şi concentrat. Materialul brut este purificat pe gel de siliciu eluând cu un gradient de 1% până la 7% 3 M NH3/MeOH în DCM pentru a da compusul din titlu (306 mg, 0,66 mmol, 62%) ca solid alb. ES/MS (m/z): 451,2 (M+H).

Următorii compuşi sunt preparaţi în mod esenţial prin metoda de Preparare 49 utilizând piperazina protejată adecvată.

Tabelul 9

Nr. prep. Denumire chimică Structură ES/MS (m/z) (M+H) 50 terţ-butil 4-[2-ciclopropil-1-[4-[(1S)-1-[(2,2,2-trifluoroacetil)amino]etil]fenil]etil]piperazin-1-carboxilat 470 51 terţ-butil 4-[3-metil-1-[4-[(1S)-1-[(2,2,2-trifluoroacetil)amino]etil]fenil]butil]piperazin-1-carboxilat 472 52 terţ-butil 4-[1-[4-[(1S)-1-[(2,2,2-trifluoroacetil) amino]etil]fenil]propil]piperazin-1-carboxilat 444

Preparare 53

terţ-butil 4-[1-[4-[(1S)-1-[(2,2,2-trifluoroacetil)amino]etil]fenil]propil]piperazin-1-carboxilat, izomer 1

Preparare 54

terţ-butil 4-[1-[4-[(1S)-1-[(2,2,2-trifluoroacetil)amino]etil]fenil]propil]piperazin-1-carboxilat, izomer 2

Terţ-butil 4-[1-[4-[(1S)-1-[(2,2,2-trifluoroacetil)amino]etil]-fenil]propil]piperazin-1-carboxilat (29,2 g, 65,8 mmol) este dizolvat în MeOH (584 mL) şi rezolvat prin cromatografie SFC chirală utilizând următoarele condiţii: coloană: Chiralpak AD-H, 5x25 cm; eluent 85/15 CO2/MeOH cu 0,5% dimetiletilamină; debit 300 g/min; lungime de undă de detecţie 230 nm; temperatura coloanei 40°C; punct de setare BPR 100 bar; temperatură solvent 40°C. Izomerul 1 este izolat ca primul maxim de eluare (14,15 g, 31,9 mmol). ES/MS (m/z): 444 (M+H). Izomerul 2 este izolat ca al doilea maxim de eluare (13,87 g, 31,3 mmol). ES/MS (m/z): 444 (M+H).

Preparare 55

terţ-butil 4-[1-[4-[(1S)-1-[(1-etil-2-oxo-4H-pirimido[4,5-d][1,3]oxazin-7-il)amino] etil]fenil]-3-metil-butil]piperazin-1-carboxilat, izomer 1

Preparare 56

terţ-butil 4-[1-[4-[(1S)-1-[(1-etil-2-oxo-4H-pirimido[4,5-d][1,3]oxazin-7-il)amino] etil]fenil]-3-metil-butil]piperazin-1-carboxilat, izomer 2

Terţ-butilul 4-[1-[4-[(1S)-1-[(1-etil-2-oxo-4H-pirimido[4,5-d][1,3]oxazin-7-il)amino]etil]fenil]-3-metil-butil]piperazin-1-carboxilat (2,6 g, 4,70 mmol) este dizolvat în 4:1 izopropanol:cloroform (50 mL) şi rezolvat prin cromatografie SFC chirală utilizând următoarele condiţii: coloană: Chiralpak AD-H, 5x25 cm; volum de injecţie 1 mL; eluent 75/25 CO2/IPA cu 0,5% dimetiletilamină; debit 280 g/min; lungime de undă de detecţie 240 nm; temperatura coloanei 40°C; punct de setare BPR 100 bar; temperatură solvent 40°C. Prepararea 45 este izolată ca primul maxim de eluare (1,02 g, 1,89 mmol). ES/MS (m/z): 553,4 (M+H). Prepararea 46 este izolată ca al doilea maxim de eluare (1,05 g, 1,90 mmol). ES/MS (m/z): 553,4 (M+H).

Exemplul 1

7-[[(1S)-1-[4-[(1R)-2-ciclopropil-1-(4-prop-2-enoilpiperazin-1-il)etil]fenil]etil] amino]-1-etil-4H-pirimido[4,5-d][1,3]oxazin-2-onă

Se adaugă clorură de acriloil (305 µL, 3,75 mmol, în 2 mL DCM) în picătură la o soluţie de 7-[[(1S)-1-[4-[(1R)-2-ciclopropil-1-piperazin-1-il-etil]fenil]etil]amino]-1-etil-4H-pirimido[4,5-d][1,3]oxazin-2-onă (1,73 g, 3,26 mmol) în DCM la -78°C. După 2 minute la -78°C, se adaugă câteva picături de MeOH urmate de bicarbonat de sodiu apos saturat şi amestecul este lăsat să se încălzească la temperatura camerei. Se adaugă DCM, straturile sunt separate, şi stratul apos este extras cu DCM. Extractele organice combinate sunt uscate (Na2SO4), filtrate, şi concentrate la sec. Produsul brut rezultat este purificat prin cromatografie pe gel de siliciu (25% până la 40% Solvent A în Solvent B unde Solvent A este 10% MeOH/acetonă şi Solvent B este hexani) pentru a da compusul din titlu ca solid incolor (1,16 g, 70%). MS (m/z): 505,3 (M+H).

Următorii compuşi sunt preparaţi în mod esenţial prin metoda din exemplul 1 (în care Exemple 9 şi 10 nu sunt părţi ale invenţiei).

Tabelul 11

Nr. ex. Denumire chimică Structură ES/M S (m/z) (M+H ) 2 7-[[(1S)-1-[4-[(1S)-2-ciclopropil-1-(4-prop-2-enoilpiperazin-1-il)etil]fenil] etil]amino]-1-etil-4H-pirimido[4,5-d][1,3] oxazin-2-onă 505 3 7-[[(1S)-1-[4-[2-ciclopropil-1-(4-prop-2-enoilpiperazin-1-il)etil]fenil]etil]amino]-1-metil-4H-pirimido[4,5-d][1,3]oxazin-2-onă, diastereomer 1 491 4 7-[[(1S)-1-[4-[2-ciclopropil-1-(4-prop-2-enoilpiperazin-1-il)etil]fenil]etil]amino]-1-metil-4H-pirimido[4,5-d][1,3]oxazin-2-onă, diastereomer 2 491 5 7-[[(1S)-1-[4-[2-ciclopropil-1-(4-prop-2-enoilpiperazin-1-il)etil]fenil]etil]amino]-1-etil-4H-pirimido[4,5-d][1,3]oxazin-2-onă 505 6 1-etil-7-[[(1S)-1-[4-[3-metil-1-(4-prop-2-enoilpiperazin-1-il)butil]fenil]etil]amino] -4H-pirimido[4,5-d][1,3]oxazin-2-onă 507 7 1-etil-7-[[(1S)-1-[4-[3-metil-1-(4-prop-2-enoilpiperazin-1-il)butil]fenil]etil]amino] -4H-pirimido[4,5-d][1,3]oxazin-2-onă, izomer 1 507 8 1-etil-7-[[(1S)-1-[4-[3-metil-1-(4-prop-2-enoilpiperazin-1-il)butil]fenil]etil]amino] -4H-pirimido[4,5-d][1,3]oxazin-2-onă, izomer 2 507 9 7-[[(1S)-1-[4-[2-ciclopropil-1-(4-prop-2-enoilpiperazin-1-il)etil]fenil]etil]amino]-1-metil-4H-pirido[4,3-d][1,3]oxazin-2-onă, izomer 1 490 10 7-[[(1S)-1-[4-[2-ciclopropil-1-(4-prop-2-enoilpiperazin-1-il)etil]fenil]etil]amino]-1-metil-4H-pirido[4,3-d][1,3]oxazin-2-onă, izomer 2 490 11 1-etil-7-[[(1S)-1-[4-[(1R/S)-1-(4-prop-2-enoilpiperazin-1-il)propil]fenil]etil]amino ]-4H-pirimido[4,5-d][1,3]oxazin-2-onă, izomer 1 479 12 1-etil-7-[[(1S)-1-[4-[(1R/S)-1-(4-prop-2-enoilpiperazin-1-il)propil]fenil]etil]amino ]-4H-pirimido[4,5-d][1,3]oxazin-2-onă, izomer 2 479

Determinarea structurii cristaline cu raze X a IDH1 în complex cu 7-[[(1S)-1-[4-[(1S)-2-ciclopropil-1-(4-prop-2-enoilpiperazin-1-il)etil]fenil]etil]amino]-1-etil-4H-pirimido[4,5-d][1,3]oxazin-2-onă.

Structura cristalină a IDH1 în complex cu 7-[[(1S)-1-[4-[(1S)-2-ciclopropil-1-(4-prop-2-enoilpiperazin-1-il)etil]fenil]etil]amino]-1-etil-4H-pirimido[4,5-d][1,3]oxazin-2-onă este determinată din datele de difracţie cu raze X colectate la linia fasciculului sincrotron APS 31-ID operată la Advanced Photon Source la laboratorul Argonne National Laboratory, Argonne, IL 60439. Proteina IDH1 cu o mutaţie R132H este disponibilă comercial din multiple surse. Alternativ, proteina IDH1 R132H poate fi izolată dintr-o linie celulară disponibilă comercial care găzduieşte mutaţia prin tehnici bine cunoscute şi utilizate în mod obişnuit de către cei calificaţi în domeniu. Cristalele sunt obţinute din tăvi de aşezare a picăturilor echilibrate la 21°C cu proteină IDH1 cu mutaţia R132H la o concentraţie de 15 mg/ml într-un tampon conţinând 10 mM HEPES pH 7,5, 150 mM clorură de sodiu, 10% glicerol, 5 mM ditiotreitol şi 2 mM 7-[[(1S)-1-[4-[(1S)-2-ciclopropil-1-(4-prop-2-enoilpiperazin-1-il)etil]fenil]etil]amino]-1-etil-4H-pirimido[4,5-d][1,3]oxazin-2-onă, şi amestecate cu un volum egal de soluţie rezervor conţinând 100mM Bis Tris pH 5,5% DMSO, 22% PEG 3350 şi 200mM sulfat de amoniu. Cristalele sunt udate peste noapte într-o soluţie conţinând 3 mM de 7-[[(1S)-1-[4-[(1S)-2-ciclopropil-1-(4-prop-2-enoilpiperazin-1-il)etil]fenil]etil]amino]-1-etil-4H-pirimido[4,5-d][1,3]oxazin-2-onă, înainte de a fi transferate la o soluţie suplimentată cu 22% etilen glicol şi congelate rapid pentru colectarea datelor. Datele de difracţie până la rezoluţia de 2,8 Е sunt colectate cu radiaţii cu raze X de lungime de undă 0,9793 Å. Cristalele aparţin grupului spaţial P43212 cu parametrii celulari a=82,74 Е, b=82,74 Е, c=299,4Е, α=β=γ=90°. Structura este determinată de înlocuirea moleculară şi conţinutul unei molecule dimer de IDH1. Diferenţa densităţii electronilor se potriveşte cu cea calculată după ce modelarea proteinei IDH1 a avut o densitate clară pentru două molecule legate de 7-[[(1S)-1-[4-[(1S)-2-ciclopropil-1-(4-prop-2-enoilpiperazin-1-il)etil]fenil]etil]amino]-1-etil-4H-pirimido[4,5-d][1,3]oxazin-2-onă.

Stereochimia 7-[[(1S)-1-[4-[(1S)-2-ciclopropil-1-(4-prop-2-enoilpiperazin-1-il)etil]fenil]etil]amino]-1-etil-4H-pirimido[4,5-d][1,3]oxazin-2-onei este determinată din densitatea electronilor, şi ambele molecule de 7-[[(1S)-1-[4-[(1S)-2-ciclopropil-1-(4-prop-2-enoilpiperazin-1-il)etil]fenil]etil]amino]-1-etil-4H-pirimido[4,5-d][1,3]oxazin-2-onă sunt modelate şi structura co-complexă rafinată la factori R de Rfuncţionare=0,192 şi Rliber=0,228.

Tabelul 12

Coordonatele 7-[[(1S)-1-[4-[(1S)-2-ciclopropil-1-(4-prop-2-enoilpiperazin-1-il)etil]fenil] etil]amino]-1-etil-4H-pirimido[4,5-d][1,3]oxazin-2-onei. ATOM X Y Z O2 48,364 1,353 -2,648 C21 49,136 0,711 -1,964 C22 48,932 -0,779 -1,799 C23 47,694 -1,239 -2,530 N5 50,174 1,294 -1,330 C18 50,422 2,738 -1,428 C17 51,848 3,008 -1,849 C19 51,126 0,603 -0,449 C20 52,568 0,906 -0,834 N4 52,797 2,388 -0,868 C16 54,242 2,810 -1,061 C24 55,094 2,321 0,113 C25 56,411 3,091 0,050 C27 57,062 3,523 1,306 C26 56,432 4,534 0,413 C13 54,761 2,408 -2,428 C12 55,212 1,125 -2,730 C11 55,701 0,819 -3,988 C14 54,812 3,365 -3,432 C15 55,295 3,057 -4,691 C10 55,742 1,778 -4,997 C8 56,243 1,464 -6,405 C9 55,107 1,279 -7,400 N3 57,128 0,291 -6,469 C1 58,372 0,310 -5,968 N 59,104 -0,809 -6,086 N1 58,775 1,474 -5,441 C2 60,041 1,523 -5,009 N2 60,425 2,651 -4,254 C6 59,506 3,796 -4,105 C7 58,569 3,631 -2,901 C5 61,546 2,595 -3,438 O1 61,736 3,358 -2,523 O 62,437 1,605 -3,629 C4 62,347 0,684 -4,739 C3 60,923 0,429 -5,132 C 60,369 -0,717 -5,655

Exemplul 13

1-etil-7-[[(1S)-1-[4-[3-metoxi-1-(4-prop-2-enoilpiperazin-1-il)propil]fenil]etil]amino]-4H-pirimido[4,5-d][1,3]oxazin-2-onă, diastereomer 1

Terţ-butilul 4-[(1S)-1-[4-[(1S)-1-[(1-etil-2-oxo-4H-pirimido[4,5-d][1,3]oxazin-7-il) amino]etil]fenil]-3-metoxi-propil]piperazin-1-carboxilat (1,372 g, 2,473 mmol) este dizolvat în DCM (15 mL) şi se adaugă TFA (10 mL, 15,08 g, 132,3 mmol). Reacţia este agitată timp de 1 oră şi apoi concentrată la sec. Materialul brut este dizolvat în DCM (12 mL) şi DIPEA (1,25 mL, 7,17 mmol) şi amestecul este răcit la -78 grade. Se adaugă clorură de acriloil (0,18 mL, 0,20 g, 2,2 mmol) în picătură. După 10 minute, se adaugă câteva picături de metanol pentru a stinge clorura de acriloil rămasă şi reacţia este concentrată la sec (rece). Materialul brut este cromatografiat pe gel de siliciu eluând cu un gradient de 50-70% acetonă în hexani pentru a da compusul din titlu ca spumă albă (867mg, 73%). MS (m/z): 509 (M+H).

Următorul compus este preparat în mod esenţial prin metoda din exemplul 13.

Tabelul 13

Nr. ex. Denumire chimică Structură ES/MS (m/z) (M+H) 14 1-etil-7-[[(1S)-1-[4-[3-metoxi-1-(4-prop-2-enoilpiperazin-1-il)propil]fenil]etil]amino]-4H-pirimido[4,5-d][1,3]oxazin-2-onă, diastereomer 2 509

Exemplul 15

disulfat de 7-[[(1S)-1-[4-[(1S)-2-ciclopropil-1-(4-prop-2-enoilpiperazin-1-il)etil] fenil]etil]amino]-1-etil-4H-pirimido[4,5-d][1,3]oxazin-2-onă

7-[[(1S)-1-[4-[(1S)-2-ciclopropil-1-(4-prop-2-enoilpiperazin-1-il)etil]fenil]etil] amino]-1-etil-4H-pirimido[4,5-d][1,3]oxazin-2-ona (188 mg) este plasată în 5 mL de acetonă în timp ce se agită la 1000 rpm/60°C. Mostra este o soluţie clară. Se adaugă 45 µL de acid sulfuric în picătură (diluat în 2 mL de acetonă). O suspensie albă groasă rezultă după câteva picături. După adăugarea a jumătate din acidul sulfuric, consistenţa suspensiei se modifică. Adăugarea celei de a doua jumătăţi de acid sulfuric este făcută încet, în picătură. Suspensia devine puţin gumoasă înainte de a se transforma într-o suspensie albă strălucitoare care curge liber de solid. Căldura este oprită la placă după 30 minute, şi mostra răcită la temperatura camerei, dȃnd o suspensie groasă de solid alb. Solidul alb este izolat prin filtrare în vid. Turta rezultată este un solid alb strălucitor. Mostra este uscată pe loc cu filtru sub curent de aer timp de 20 minute, apoi la 70°C într-un cuptor cu vid peste noapte. S-au recuperat 266 mg (randament 96,9%).

Exemplul 16

acid 4-hidroxibenzoic de 7-[[(1S)-1-[4-[2-ciclopropil-1-(4-prop-2-enoilpiperazin-1-il)etil]fenil]etil]amino]-1-etil-4H-pirimido[4,5-d][1,3]oxazin-2-onă

Se adaugă acid 4-hidroxibenzoic (0,023 g, 0,165 mmol) la o soluţie de 7-[[(1S)-1-[4-[2-ciclopropil-1-(4-prop-2-enoilpiperazin-1-il)etil]fenil]etil]amino]-1-etil-4H-pirimido[4,5-d][1,3]oxazin-2-onă (84 mg, 0,165 mmol) în diclorometan (5 ml). După o agitare de 5 minute, solventul este evaporat încet sub o curgere de azot. Solidul rezultat este uscat mai departe sub vid pentru a da 7-[[(1S)-1-[4-[2-ciclopropil-1-(4-prop-2-enoilpiperazin-1-il)etil]fenil]etil]amino]-1-etil-4H-pirimido[4,5-d][1,3]oxazin-2-onă 4-hidroxibenzoat (105 mg, 0,1617 mmol) ca solid alb. MS (m/z): 423,2 (M+H).

Preparare 57

2-ciclopropil-N-metoxi-N-metilacetamidă

Într-un balon agitat de 500 mL cu fund rotund se încărcă diclorometan (160 mL, 8 volume) şi 1,1'-carbonildiimidazol (35,63g, 1,1 echiv.). Amestecul eterogen este răcit la 15°C şi la amestec se încărcă o soluţie de acid 2-ciclopropilacetic (20,0g, 1,0 echiv.) în diclorometan (40 mL, 2 volume) la o rată care să controleze temperatura internă sub 20°C. Soluţia rezultată este încălzită la 25°C şi agitată timp de 2 ore. Soluţia este apoi răcită la 15°C şi se încărcă clorhidrat de N,O-dimetil hidroxilamină (21,43g, 1,1 echiv.) în porţii, menţinând temperatura internă sub 20°C. Amestecul eterogen rezultat este încălzit la 25°C şi agitat timp de 15 ore. Amestecul de reacţie este apoi diluat cu apă (160 mL, 8 volume) şi agitat timp de 15 minute. Agitarea este oprită şi stratul apos mai scăzut este separat. Stratul apos rezultat este extras cu diclorometan de încă două ori (100 mL, 5 volume x 2) şi straturile organice sunt combinate. Stratul organic combinat este spălat de două ori cu 1,5 N HCl (100 mL, 5 volume x 2). Stratul organic este apoi spălat de două ori cu 10% bicarbonat de sodiu apos (100 mL, 5 volume x 2). Stratul organic este apoi spălat cu apă (100 mL, 5 volume) urmată de clorură de sodiu saturată apoasă (100 mL, 5 volume). Stratul organic este uscat pe sulfat de sodiu anhidru (1,0% g/g). Masa este filtrată şi spălată cu diclorometan (20 mL, 1 volum) şi apoi concentrată sub vid. Solidul rezultat este uscat sub vid înaintat timp de 5 ore pentru a obţine compusul din titlu (25,9g, randament 90,5%). ES/MS m/z 144,1 (M+H).

Sinteză alternativă a Preparării 6

(S)-N-(1-(4-bromofenil)etil)-2,2,2-trifluoroacetamidă

Într-un balon agitat de 250 mL cu fund rotund este încărcat diclorometan (100 mL, 10 volume) urmat de (S)-(-)-1-(4-bromofenil)etilamină (10,0g, 1,0 echiv.). Soluţia este răcită la 0°C şi la soluţia răcită se încărcă încet anhidridă trifluoroacetică (13,12g, 1,25 echiv.), menţinând temperatura internă sub 5°C. Amestecul eterogen rezultat este agitat la 0°C timp de 2 ore, timp în care se încarcă încet trimetilamină (12,64g, 2,5 echiv.), menţinând temperatura internă sub 5°C. Amestecul este agitat timp de încă o oră suplimentară şi apoi stins prin adăugarea de apă (30 mL, 3 volume). Amestecul bifazic este încălzit la 25°C şi agitat timp de 30 minute. Straturile sunt apoi separate şi stratul apos este extras suplimentar de două ori cu diclorometan (50 mL, 5 volume x 2). Straturile organice combinate sunt spălate cu clorură de sodiu saturată apoasă (50 mL, 5 volume) şi uscate pe sulfat de sodiu anhidru (1g%). Soluţia uscată este filtrată şi spălată cu diclorometan (10 mL, 1 volum) şi soluţia este concentrată sub vid pentru a da un solid brut alb. Solidul brut este suspendat în eter de petrol (100 mL, 10 volume) timp de 2 ore la 25°C şi solidul este colectat prin filtrare. Solidul umed este uscat sub vid la 40°C timp de 8 ore pentru a obţine compusul din titlu (13,3 g, randament 90%). ES/MS m/z 295,3 (M+H).

Preparare 58

(S)-N-(1-(4-(2-ciclopropilacetil)fenil)etil)-2,2,2-trifluoroacetamidă

La un vas de reacţie de 10 L cu agitare la partea superioară se încărcă metil terţ-butil eter (1500 mL, 15 volume). La soluţia agitată se încărcă (S)-N-(1-(4-bromofenil)etil)-2,2,2-trifluoroacetamidă (100g, 1,0 echiv.). Amestecul eterogen este agitat la 25°C timp de 30 minute şi apoi se încărcă tetrahidrofuran (500 mL, 5 volume). Soluţia omogenă rezultată este răcită la -83°C. Se adaugă încet la soluţie n-butil litiu (297 mL, 2,2 echiv.) menţinând temperatura sub -78°C şi soluţia rezultată este agitată la -83°C timp de 1,5 ore. La soluţia răcită se adaugă o soluţie de 2-ciclopropil-N-metoxi-N-metilacetamidă (53,19g, 1,1 echiv.) în metil terţ-butil eter (200 mL, 2 volume), menţinând temperatura internă sub -78°C. Soluţia rezultată este agitată la -83°C timp de 1,5 ore, în care timp soluţia este încălzită la -30°C şi stinsă prin adăugarea de clorură de amoniu saturată apoasă (5 L, 5 volume). Amestecul de reacţie stins este încălzit la 25°C şi straturile sunt separate. Stratul apos este extras cu metil terţ-butil eter (500 mL, 5 volume). Straturile organice combinate sunt spălate cu apă (500 mL, 5 volume), urmată de clorură de sodiu saturată apoasă (500 mL, 5 volume) şi apoi uscate pe sulfat de sodiu anhidru (50g, 0,5% g/g). Masa este filtrată şi spălată cu metil terţ-butil eter (50 mL, 0,5 volume). Soluţia rezultată este concentrată sub vid până când a rămas aproximativ 1 volum de soluţie. Se încarcă eter de petrol (1500 mL, 15 volume) la amestecul concentrat şi suspensia rezultată este agitată sub 30°C timp de 2 ore. Solidul este colectat prin filtrare şi uscat sub vid la 40°C timp de 8 ore pentru a obţine compusul din titlu (65,9 g, randament 67%). ES/MS m/z 298,0 (M-H).

Preparare 59

N-((S)-1-(4-((S)-2-ciclopropil-1-hidroxietil)fenil)etil)-2,2,2-trifluoroacetamidă

Într-un reactor hidrogenator se încărcă etanol absolut (7,89 kg, 10 volume). La soluţia agitată se încărcă (S)-N-(1-(4-(2-ciclopropilacetil)fenil)etil)-2,2,2-trifluoroacetamidă (1,0 kg, 1,0 echiv.). La soluţie se încărcă o soluţie terţ-butoxid de potasiu (1,0 M în tBuOH, 0,41 kg, 0,5 volume) menţinând temperatura internă sub 30°C. La soluţie se încărcă apoi (R)-RUCY®-XylBINAP (0,0675 kg, 0,017 echiv.). Hidrogenatorul este purjat cu gaz de hidrogen de două ori, în timp ce se agită la 25°C. După purjare, soluţia este agitată sub presiune de 4,5 kg de hidrogen la 25°C timp de 5 ore. După 5 ore, soluţia este aerisită şi apoi concentrată la un ulei cu vid sub 42°C. Uleiul este dizolvat în metil terţ-butil eter (11,115 kg, 15 volume) şi apoi concentrată la un ulei cu vid sub 45°C. Uleiul este dizolvat în metil terţ-butil eter (11,115 kg, 15 volume) şi apoi concentrat la un ulei cu vid sub 45°C. La ulei se încărcă metil terţ-butil eter (22,23 kg, 30 volume) la 25°C. Soluţia rezultată este spălată cu apă (15,0 kg, 15 volume) urmată de o soluţie de NaCl în apă (5,4kg NaCl în 15,0 L apă). Stratul organic este uscat pe sulfat de sodiu anhidru (1,5kg, 1,5 g/g) şi apoi filtrat şi spălat cu metil terţ-butil eter (1,112 kg, 1,5 volume). La soluţia filtrată se încărcă cărbune activat (0,3 kg, 0,3 g/g) şi amestecul este agitat şi încălzit la 40°C timp de 2 ore. Amestecul este apoi filtrat şi spălat cu metil terţ-butil eter (1,112 kg, 1,5 volume). Soluţia filtrată este concentrată la un ulei cu vid sub 45°C. Uleiul este dizolvat în eter de petrol (9,84 kg, 15 volume) şi concentrat la un ulei cu vid sub 45°C. Uleiul este dizolvat în eter de petrol (9,84 kg, 15 volume) şi concentrat la un ulei cu vid sub 45°C. La ulei se încărcă eter de petrol (19,68 kg, 30 volume) şi amestecul este agitat la 30°C timp de 3 ore şi solidul rezultat este colectat prin filtrare şi spălat cu eter de petrol (9,84 kg, 15 volume). Solidul izolat este uscat sub vid la 40°C timp de 5 ore pentru a obţine compusul din titlu (0,79 kg, 79%). ES/MS m/z 300,0 (M-H).

Preparare 60

N-((S)-1-(4-((R)-1-cloro-2-ciclopropiletil)fenil)etil)-2,2,2-trifluoroacetamidă

Un reactor este încărcat cu metil terţ-butil eter (4,45 kg, 6 volume) şi N-((S)-1-(4-((S)-2-ciclopropil-1-hidroxietil)fenil)etil)-2,2,2-trifluoroacetamidă (1,0 kg, 1,0 echiv.). Soluţia este răcită la 10°C şi se încarcă încet 1-formilpirolidină (0,066 kg, 0,2 echiv.) menţinând temperatura internă sub 13°C. La soluţie se încarcă apoi încet clorură de benzoil (0,56 kg, 1,2 echiv.) menţinând temperatura internă sub 13°C. Soluţia rezultată este încălzită la 25°C şi agitată timp de până la 36 ore (reacţia poate fi monitorizată în timpul cursului reacţiei şi dacă se stinge, poate fi încarcată suplimentar cu 1-formilpirolidină şi clorură de benzoil). Reacţia completă este apoi concentrată la un ulei cu vid sub 40°C. Uleiul este răcit la 15°C şi apoi stins cu o soluţie apoasă 10% de bicarbonat de sodiu (22,0 kg, 20 volume) şi agitat timp de 3 ore la 25°C. La amestecul bifazic se încărcă eter de petrol (6,56 kg, 10 volume). Stratul organic este separat. Stratul apos este extras cu eter de petrol (6,56 kg, 10 volume). Straturile organice combinate sunt spălate cu bicarbonat de sodiu 10% apos (5,0 L, 5 volume) de trei ori. Stratul organic este apoi spălat cu apă (5,0 L, 5 volume) urmată de saramură (5,0 L, 5 volume). Stratul organic este uscat pe sulfat de sodiu anhidru (0,5 kg, 0,5 g/g). Amestecul este apoi filtrat şi spălat cu eter de petrol (0,33 kg, 0,5 volume). Filtratul este concentrat la un ulei cu vid sub 40°C. Uleiul este dizolvat în acetonitril (3,93 kg, 5 volume) şi concentrat la un ulei cu vid sub 40°C. Uleiul este dizolvat în acetonitril (3,93 kg, 5 volume) şi concentrat la un ulei cu vid sub 40°C. Uleiul este dizolvat în acetonitril (7,86 kg, 10 volume) şi soluţia obţinută a compusului din titlu este utilizată brut în etapa următoare. ES/MS m/z 318,0 (M-H).

Preparare 61

terţ-butil 4-((S)-2-ciclopropil-1-(4-((S)-1-(2,2,2-trifluoroacetamido)etil)fenil) etilpiperazin-1-carboxilat

La soluţia obţinută anterior de N-((S)-1-(4-((R)-1-cloro-2-ciclopropiletil)fenil) etil)-2,2,2-trifluoroacetamidă se încărcă N-Boc-piperazină (0,924 kg, 1,5 echiv.) urmată de bicarbonat de sodiu (1,1 kg, 4,0 echiv.). Amestecul rezultat este încălzit la 85°C timp de 60 ore. Notă: reacţia este eşantionată la fiecare 24 ore şi după fiecare eşantionare se ia o mostră, reacţia este încărcată cu o cantitate suplimentară de N-Boc-piperazină (0,31 kg, 0,5 echiv.). Odată completă, reacţia este concentrată cu vid sub 45°C pentru a da un ulei. Uleiul este diluat cu apă (10,0 kg, 10 volume) şi metil terţ-butil eter (7,41 kg, 10 volume). Amestecul bifazic rezultat este separat şi stratul apos este extras cu metil terţ-butil eter (7,41 kg, 10 volume). Straturile organice combinate sunt extrase cu 30% acid citric (5,0 L, 5 volume) de cinci ori. Straturile apoase combinate sunt spălate de două ori cu eter de petrol (6,56 kg, 10 volume). Stratul apos este adus la un pH de 9 cu adăugare de carbonat de sodiu (aproximativ 25,0 kg, 25 g/g) la 15°C. Stratul apos bazificat este extras cu metil terţ-butil eter (7,41 kg, 10 volume). Straturile organice combinate sunt spălate cu apă (5,0 L, 5 volume) şi saramură (5,0 L, 5 volume). Stratul organic este uscat pe sulfat de sodiu anhidru (0,5 kg, 50% g/g). Amestecul este filtrat şi spălat cu metil terţ-butil eter (0,37 kg, 0,5 volume). Filtratul este concentrat la un ulei cu vid sub 40°C. Uleiul rezultat este dizolvat în etanol absolut (3,95 kg, 5 volume) şi soluţia brută a compusului din titlu este utilizată direct în etapa următoare. ES/MS m/z 374,3 (M+H-CF3CO).

Preparare 62

terţ-butil 4-((S)-1-(4-((S)-1-aminoetil)fenil)-2-ciclopropiletil)piperazin-1-carboxilat

La soluţia anterior obţinută de terţ-butil 4-((S)-2-ciclopropil-1-(4-((S)-1-(2,2,2-trifluoroacetamido)etil)fenil)etilpiperazin-1-carboxilat se încărcă etanol absolut (3,7 kg, 3,7 g/g). Soluţia este răcită la 20°C şi la ea se încărcă hidroxid de potasiu 1M apos (0,168 kg KOH în 3,0 kg apă). Amestecul rezultat este agitat la 25°C timp de 10 ore şi apoi stins prin adăugarea lentă de acid citric apos 30% (5,0 kg, 5 g/g) menţinând temperatura internă sub 30°C. La soluţia stinsă se încarcă metil terţ-butil eter (7,41 kg, 7,41 g/g). Straturile sunt separate şi stratul organic este extras cu acid citric apos 30% (5,0 kg, 5 g/g). Stratul apos este adus la un pH de 8 cu adăugare de carbonat de sodiu (aproximativ 25,0 kg, 25 g/g) la 15°C. Stratul apos bazificat este extras de două ori cu acetat de etil (7,41 kg, 7,41 g/g). Straturile organice combinate sunt spălate cu apă (5,0 kg, 5 g/g) şi apoi saramură (5,0 kg, 5 g/g). Stratul organic este uscat pe sulfat de sodiu anhidru (0,5 kg, 50g%), apoi filtrat şi spălat cu acetat de etil (0,37 kg, 0,37 g/g). Soluţia este concentrată la un ulei cu vid sub 45°C. Uleiul rezultat este dizolvat în alcool izopropilic (2 L, 2 volume), şi soluţia rezultată este concentrată la un ulei cu vid sub 45°C. Uleiul rezultat este dizolvat în alcool izopropilic (1,2 L, 1,2 volume) şi soluţia brută a compusului din titlu este utilizată direct în etapa următoare de purificare. ES/MS m/z 374,2 (M+H).

La un balon de 1000 mL cu fund rotund se încărcă o soluţie de terţ-butil 4-((S)-1-(4-((S)-1-aminoetil)fenil)-2-ciclopropiletil)piperazin-1-carboxilat (30,0 g, 1,0 echiv.) în alcool izopropilic (270 mL, 9 volume). La soluţia agitată la 20-30°C se încărcă acid L-dibenzoil tartric (L-DBTA, 34,5 g, 1,2 echiv.). Soluţia este agitată la 20-30°C timp de 2-4 ore. Suspensia rezultată este lăsată să se agite peste 8-12 ore la 20-30°C. La suspensia uşoară se încărcă MTBE (300 mL, 10 volume). Suspensia rezultată este lăsată să se agite şi să se îngroaşe la 20-30°C peste 12-16 ore. Solidul este apoi colectat prin filtrare şi spălat cu MTBE (150 mL, 5 volume). Solidul este uscat sub presiune redusă la 45-55°C timp de 12 ore pentru a da sarea acidului tartaric L-dibenzoil de terţ-butil 4-((S)-1-(4-((S)-1-aminoetil)fenil)-2-ciclopropiletil)piperazin-1-carboxilat ca solid alb (48,8 g, randament 83%, >98:2 dr).

La un balon de 1000 mL cu fund rotund se încărcă sarea acidului tartaric L-dibenzoil de terţ-butil 4-((S)-1-(4-((S)-1-aminoetil)fenil)-2-ciclopropiletil)piperazin-1-carboxilat (40,0 g, 1,0 echiv.) urmată de diclorometan (400 mL, 10 volume). La soluţia agitată la 15-25°C se încărcă o soluţie apoasă de 10% Na2CO3 (suficientă pentru a aduce pH-ul până la 8-10, aproximativ 6-8 volume). Amestecul bifazic este agitat timp de 1 oră la 15-25°C şi apoi straturile sunt separate într-o pâlnie separatoare. La stratul organic se încărcă DMSO (240 mL, 6 volume). Soluţia este concentrată sub presiune redusă sub 40°C pentru a îndepărta diclorometanul. Soluţia de terţ-butil 4-((S)-1-(4-((S)-1-aminoetil)fenil)-2-ciclopropiletil)piperazin-1-carboxilat fără baze în DMSO este apoi utilizată direct în etapa următoare.

Preparare 63

Etil 6-cloro-4-(metilamino)piridin-3-carboxilat

Se adaugă metil amină (16 mL, 11,6 mol/L în apă, 186 mmol) în picătură la o soluţie de etil 4,6-dicloropiridin-3-carboxilat (20 g, 92 mmol) în acetonitril (300 mL) la 0°C. Amestecul de reacţie este lăsat să se încălzească la temperatura camerei peste 2 ore. La amestecul de reacţie se adaugă apă şi acetat de etil şi stratul apos este extras cu acetat de etil. Extractele organice combinate sunt uscate pe Na2SO4 anhidru, filtrate, şi concentrate la sec. Materialul brut rezultat este purificat prin cromatografie pe gel de siliciu (0-100% EtOAc/hexani) pentru a da, după concentraţia fracţiunilor adecvate, etil 6-cloro-4-(metilamino)piridin-3-carboxilat ca solid alb (10,46 g, 52,14 mmol, randament 57%). MS (m/z): 201 (M+H).

Preparare 64

[6-cloro-4-(metilamino)-3-piridil]metanol

Se adaugă o soluţie de etil 6-cloro-4-(metilamino)piridin-3-carboxilat (10,46 g, 52,14 mmol) în THF (100 mL) în picătură la un amestec de hidrură de litiu aluminiu (78,2 mL, 1,0 mol/L în THF, 78,2 mmol) la 0°C. Amestecul de reacţie este lăsat să se încălzească la temperatura camerei peste 1,5 ore. La amestecul de reacţie se adaugă, secvenţial, apă (3 mL), NaOh apos 15% (3 ml), şi apoi apă (9 mL). După agitare, amestecul de reacţie este filtrat printr-un strat de celite. Filtratul este diluat cu apă şi extras cu diclorometan. Extractele organice combinate sunt uscate pe Na2SO4 anhidru, filtrate, şi concentrate la sec pentru a da [6-cloro-4-(metilamino)-3-piridil]metanol ca solid galben pal (2,78 g, randament 27%). Turta filtrată de celite este spălată suplimentar cu metanol şi filtratul este concentrat la sec. Solidele din turta filtrată sunt colectate şi agitate cu diclorometan şi filtrate prin celite. Filtratul este combinat cu reziduul din spălările cu metanol şi materialul este concentrat la sec şi materialul este rezervat. La solidele colectate din filtrare se adaugă cloroform: alcool izopropilic 4:1 şi amestecul este agitat peste noapte. Amestecul este filtrat peste un strat de celite, filtratul este combinat cu reziduul rezervat şi concentrat la sec pentru a da o cantitate suplimentară de [6-cloro-4-(metilamino)-3-piridil]metanol ca solid galben pal (5,07 g, randament 56%). Recuperarea totală a [6-cloro-4-(metilamino)-3-piridil]metanolului este 7,85 g, randament 83%). MS (m/z): 173 (M+H).

Preparare 65

7-cloro-1-metil-4H-pirido[4,3-d][1,3]oxazin-2-onă

Trifosgenul (6,04 g, 20,4 mol) se adaugă la o soluţie de [6-cloro-4-(metilamino)-3-piridil]metanol (5,07 g, 29,1 mol) şi DIPEA (51,2 mL, 291 mmol) în THF (100 mL) la -20°C. Baia rece este îndepărtată şi amestecul este lăsat să se încălzească la temperatura camerei. După 30 minute, se adaugă apă şi amestecul este extras cu diclorometan. Extractele organice combinate sunt uscate pe Na2SO4 anhidru, filtrate, şi concentrate la sec. Materialul brut rezultat este purificat prin cromatografie pe gel de siliciu (0-100% EtOAc/hexani) pentru a da, după concentraţia fracţiunilor adecvate, 7-cloro-1-metil-4H-pirido[4,3-d][1,3]oxazin-2-onă ca un solid oranj (5,13 g, 24,5 mmol, randament 84%). MS (m/z): 199 (M+H).

Preparare 66

terţ-butil 4-[2-ciclopropil-1-[4-[(1S)-1-[(1-metil-2-oxo-4H-pirido[4,3-d][1,3]oxazin-7-il)amino]etil]fenil]etil]piperazin-1-carboxilat, diastereomer 1

La o soluţie de terţ-butil 4-[1-[4-[(1S)-1-aminoetil]fenil]-2-ciclopropiletil]piperazin-1-carboxilat (1,30 g, 3,48 mmol), 7-cloro-1-metil-4H-pirido[4,3-d][1,3]oxazin-2-onă (864 mgs, 4,35 mmol), şi carbonat de cesiu (2,27 g, 6,96 mmol) în toluen (17,4 mL) sub azot se adaugă dicloro[1,3-bis(2,6-di-3-pentilfenil)imidazol-2-iliden](3-cloropiridil)paladiu(II) (291 mgs, 0,348 mmol) şi amestecul este încălzit la 75°C peste noapte. După răcire la temperatura camerei, amestecul este filtrat printr-un dop de gel de sliciu şi eluat cu acetat de etil. Filtratul este concentrat sub presiune redusă şi reziduul obţinut este purificat prin cromatografie pe gel de siliciu (20-100% EtOAc/hexani). Fracţiunile amestecate sunt repurificate prin cromatografie pe gel de siliciu (50-100% metil terţ-butil eter/hexani) şi fracţiunile combinate pure din ambele coloane sunt concentrate pentru a da terţ-butil 4-[2-ciclopropil-1-[4-[(1S)-1-[(1-metil-2-oxo-4H-pirido[4,3-d][1,3]oxazin-7-il)amino]etil]fenil]etil]piperazin-1-carboxilat, diastereomer 1 ca o spumă albă (1,312 g, 2,400 mmol, randament 69%). MS (m/z): 536 (M+).

Cancerul este recunoscut din ce în ce mai mult ca o colecţie eterogenă de boli a căror început şi progres sunt induse de funcţionarea aberantă a uneia sau mai multor gene care reglează repararea AND-ului, stabilitatea genomului, proliferarea celulară, moartea celulei, adeziunea, angiogeneza, invazia, şi metastaza în micromediile celulare şi de ţesut. Varianta sau funcţionarea aberantă a genelor „canceroase« poate rezulta din polimorfismul ADN care apare natural, modificări în numărul copiilor de genom (prin amplificare, deleţie, pierderea cromozomului, sau duplicare), modificări în gene şi stuctura cromozomului (prin translocare cromozomială, inversie, sau alt rearanjament care conduce la dereglarea expresiei genei), şi mutaţii punctuale. Neoplasmele canceroase pot fi induse de o funcţionare aberantă a genei, şi menţinute de aceeaşi funcţionare aberantă a genei, sau întreţinerea şi progresul exacerbat de funcţii suplimentare aberante ale genei.

Dincolo de aberaţiile cromozomiale genetice menţionate mai sus, fiecare cancer poate include de asemenea modificări epigenetice ale genomului incluzând metilarea ADN, imprimarea genomică, şi modificarea histonă prin acetilare, metilare, sau fosforilare. O modificare epigenetică poate juca un rol în inducerea şi/sau întreţinerea malignităţii.

Au fost compilate cataloage extensive de aberaţii citogenetice în cancerul uman şi sunt menţinute şi actualizate regulat online (vezi baza de date Mitelman a aberaţiilor cromozomiale în cancer pe web situsul Institutului Naţional al Cancerului din S.U.A. (NCI) Proiectul pentru anatomia genomului canceros (CGAP)). Proiectul Wellcome Trust Sanger Institute Cancer Genom menţine o „Cancer Gene Census« detaliată online a tuturor genelor umane care au fost legate cauzal la tumorigeneză precum şi baza de date COSMIC (Catalogul de mutaţii somatice în cancer) a mutaţiilor somatice în cancerul uman. O sursă suplimentară conţinând informaţie abundentă despre modificările citogenetice legate cauzal la diferite cancere este Atlasul geneticii şi Citogenetice în oncologie şi hematologie.

Diagnosticul malignităţilor canceroase prin biopsie, imunofenotipare şi alte teste sunt cunoscute şi utilizate în mod obişnuit. În plus faţă de rezoluţia ridicată a legării cromozomilor şi a tehnologiilor imagistice avansate cromozomiale, aberaţiile cromozomiale în cazurile suspecte de cancer pot fi determinate prin analiză citogenetică cum ar fi hibridizarea fluorescentă in situ (FISH), kariotiparea, kariotiparea spectrală (SKY), FISH multiplex (M-FISH), hibridizarea genomică comparativă (CGH), matrice de polimorfisme de nucleotide singure (SNP Chips) şi alte teste de diagnoză şi analiză cunoscute şi utilizate de către cei calificaţi în domeniu.

Mutaţiile în IDH1 şi IDH2 au fost identificate în multiple tipuri de tumori canceroase incluzând, dar fără a se limita la, gliom, glioblastom multiform, astrocitom, oligodendrogliom, paragangliom, sindrom mielodisplazic (MDS), leucemie limfoblastică acută a celulei B (B-ALL), tiroidă, colorectal, leucemie mieloidă acută (AML), Dang şi colab., TrendsMol. Med., 2010, 16: 387-397; Ward şi colab., Oncogene, 2012, 31(19): 2491-2498; melanom, Shibata şi colab., Am. J. Pathol., 2010, 178(3): 1395-1402; prostate, Flaherty şi colab., J. Clin. Oncol., 2014, 32 (suppl. 4; Abstract 213); Cairns şi colab., Cancer Discovery, 2013, 3: 730-741; chondrosarcoma and cholangiocarcinom, Balss şi colab., Acta Neuropathol., 2012, 124: 883-891; Cairns şi colab., Cancer Discovery, 2013, 3: 730-741; angioimunoblastic T cell limphoma (AITL), Cairns şi colab. Blood, 2012. 119(8):1901-1903. Mutaţiile au fost găsite la, sau lângă reziduuri particulare în situsul activ: G97D, R100, R132H, R132C, R132S, R132V, R132G, V71I, R132L, şi G123R pentru IDH1, Dang şi colab., Trends Mol. Med., 2010, 16: 387-397; Ward şi colab., 2012 and Supplementary Table 2.

S-a arătat că formele mutante de IDH1 şi IDH2 au o activitate neomorfică (poartă de funcţionare) reducȃnd α-ketoglutaratul până la 2-hidroxiglutarat. Producţia endogenă de 2-hidroxiglutarat este enantiospecifică conducând la generarea de D-enantiomeri (denumiţi de asemenea (R) enantiomeri). În mod normal, celulele au niveluri scăzute de 2-hidroxiglutarat în timp ce celulele care găzduiesc mutaţii IDH1 sau IDH2 dovedesc niveluri semnificativ ridicate de 2-hidroxiglutarat. Niveluri semnificativ ridicate de 2-hidroxiglutarat sunt detectate în tumorile care găzduiesc mutaţiile şi în plasma pacienţilor cu IDH1 sau IDH2 mutant. Niveluri ridicate de 2-hidroxiglutarat sunt asociate cu un fenotip de hipermetilare conducând la o blocare în diferenţierea care conduce la sporirea tumorigenezei.

Activitatea unui inhibitor covalent ireversibil specific este definită prin legarea sa la ţintă (IDH1 sau IDH2), definită prin KI, şi rata potenţialului maxim al formării legăturii covalente, definit de kinact. Aceşti doi factori nu sunt entităţi separate, ci mai degrabă lucrează împreună pentru a produce efectul dorit al formării legăturii covalente. Acest lucru este ilustrat de următoarele 3 puncte.

Mai întȃi, faptul că o electrofilă de exemplu, acrilamidă, trebuie să fie corespunzător poziţionată faţă de o nucleofilă, de exemplu cisteină, este o componentă fundamentală a formării legăturii covalente în chimia organică. Există un unghi precis şi o distanţă la care nucleofilele trebuie abordate electrofil pentru a forma legătura covalentă. Simpla plasare a unui electrofil lângă o nucleofilă nu este suficient pentru formarea legăturii covalente.

În al doilea rȃnd, când o grupare reactivă este încorporată pe un miez care conţine radicali de legare la hidrogen pentru a stabiliza legarea inhibitorului la enzimă de exemplu, un miez de orientare, un specialist calificat trebuie să ia în considerare cum miezul de orientare se leagă la ţintă şi poziţiile electrofile faţă de nucleofile în lumina unghiului optim şi distanţei menţionate mai sus. Din nou, simpla plasare a unui electrofil lângă o nucleofilă nu este suficientă pentru formarea legăturii covalente. Modificările în miezul de orientare pot impacta abilitatea unui compus inhibitor de a forma o legătură covalentă.

În al treilea rȃnd, când cele două puncte de mai sus sunt considerate împreună, simpla prezenţă a unui radical electrofil pe un miez de orientare nu este suficientă să sugereaze că o legătură covalentă va fi formată.

Următoarele studii in vitro şi in vivo demonstrează activitatea inhibitoare a proteinei IDH1 şi IDH2 mutante şi eficacitatea compuşilor testaţi cu Formula I sau Ia împotriva diferitelor linii celulare canceroase specifice. Aceste teste sunt în general recunoscute de către cei calificaţi în domeniu ca o indicaţie a activităţii terapeutice clinice umane. Se crede că inhibarea proteinelor neomorfice IDH1 sau IDH2 mutante în studiile divulgate va fi eficientă împotriva proteinelor neomorfice IDH1 şi IDH2 mutante suplimentare. Testele care evidenţiază activitatea inhibitoare a IDH1 sau IDH2 mutante şi eficacitatea pot fi efectuate substanţial după cum urmează sau prin teste similare rezultând date similare.

Rezultatele următoarelor teste demonstrează că compuşii exemplificaţi şi testaţi sunt utili ca inhibitori mutanţi ai IDH1 şi IDH2 şi pot fi utili în tratarea cancerelor care exprimă IDH1 sau IDH2 mutante.

Teste biochimice pentru enzimele mutante IDH1 şi IDH2

Enzimele mutante IDH1-R132H, IDH1-R132C, IDH2-R172K şi IDH2-R140Q catalizează conversia aKG până la 2HG. 2HG este analizată utilizând extracţia în linie a fazei solide şi spectrometria de masă. Această analiză este efectuată într-un instrument RapidFire® cuplat la un spectrometru de masă triplu cvadripol 6460 (G6460A Agilent).

Proteinele mutante IDH1 (R132H şi R132C) şi proteinele mutante IDH2 (R140Q şi R172K) conţinând etichete His N-terminale sunt exprimate în E.coli şi purificate utilizând cromatografia de afinitate cu nichel. Testele enzimatice sunt efectuate în plăci de polipropilenă cu fundul în formă de V, cu 96 de godeuri, conţinând 100 mM tampon Tris-HCl, 1 mM DTT, 0,005% TRITON™ X-100, 120 mM NaCl. Pentru IDH1 R132H, α-ketoglutarat, NADPH şi MnCl2 sunt incluse la concentraţii finale de 300 µM, 2,5 µM şi respectiv 300 µM. Pentru IDH1 R132C, α-ketoglutarat, NADPH şi MnCl2 sunt incluse la concentraţii finale de 100 µM, 10 µM şi respectiv 100 µM. Pentru IDH2 R172K, α-ketoglutarat, NADPH şi MnCl2 sunt incluse la concentraţii finale de 150 µM, 10 µM şi respectiv 150 µM. Pentru IDH2 R140Q, α-ketoglutarat, NADPH şi MnCl2 sunt incluse la concentraţii finale de 3000 µM, 10 µM şi respectiv 100 µM. PH final = 7,0. Compusul de testat dizolvat în stoc DMSO este diluat în amestecul de reacţie la o concentraţie DMSO finală de 4%. Compuşii sunt testaţi în format de răspuns la doză. Testul este început prin adăugarea enzimei. Enzimele sunt utilizate la următoarele concentraţii finale: IDH1 R132H, 2 nM; IDH1 R132C, 0,5 nM; IDH2 R172K, 1,2 nM; IDH2 R140Q, 1,2 nM. După 90 minute reacţia este stinsă prin adăugare de ACN (50:50) conţinând acid 3-hidroxi-1,5-pentandioic-2,2,3,4,4-d5 (5d5-3HG) ca un standard intern pentru analiza prin spectrometrie de masă şi cuantificarea produsului de reacţie. 2-hidroxiglutaratul (2HG) în mostrele stinse este separat utilizând cromatografie pe coloană cu schimb puternic de anioni (Fenomenex Strata-X-A SecuritateGuard) şi analizat prin spectrometrie de masă într-un spectrometru de masă triplu cvadripol 6460 (G6460A Agilent). Semnalul 2HG detectat este transformat într-o concentraţie de analit utilizând o curbă de calibrare generată utilizând concentraţiile 2HG cunoscute. Pentru fiecare compus testat, inhibarea procentuală este calculată utilizând o mostră de control DMSO ca inhibare 0% şi nici un control cu enzimă ca inhibare 100%. Valorile IC50 sunt obţinute din valorile de inhibare procentuală individuale la diferite concentraţii de compus utilizând o ecuaţie cu 4 parametri. Aceste calcule sunt efectuate utilizând programe de analiză a datelor activităţii de bază (IDBS) sau Screener (Genedata).

Rezultatele acestui test demonstrează că compuşii exemplificaţi şi testaţi inhibă activitatea IDH1 mutant împotriva IDH1/R132H şi IDH1/R132C şi inhibă activitatea IDH2 mutant împotriva IDH2/R140Q şi IDH2/R172K .

Următoarele exemple sunt testate esenţial cum s-a descris mai sus şi prezintă activitatea împotriva IDH1 mutant şi IDH2 mutant aşa cum se arată în Tabelul 14 de mai jos.

Tabelul 14

Exemplu # IDH1/R132H IC50 (µM) IDH1/R132C IC50 (µM) IDH2/R140Q IC50 (µM) IDH2/R172K IC50 (µM) 1 0,00569 ± 0,000766, n=3 0,00431 ± 0,000895, n=3 0,113 0,0328 2 0,00627 ± 0,00127, n=3 0,00371 ± 0,00126, n=3 0,0369 0,0115 3 0,0111 ± 0,0035, n=2 0,0156 ± 0,0075, n=2 0,0648 0,0156 4 0,0137 ± 0,0030, n=2 0,00869 ± 0,00280, n=2 0,0811 0,028 5 0,00276 0,00249 6 0,00491 0,00505 7 0,00638 <0,00508 0,0743 0,0224 8 <0,00508 <0,00508 0,046 0,017 9 0,00743 ± 0,00188, n=2 0,0151 + 0,0024, n=2 10 0,0139 ± 0,0017, n=2 0,0165 ± 0,0019, n=2 11 0,00978 ± 0,00038, n=2 0,0156 ± 0,0034, n=2 0,0543 0,02 12 0,0294 ± 0,0331, n=2 0,0,0390 ± 0,0629, n=2 0,134 0,0263 13 0,0124 ± 0,0105, n=2 0,0166 ± 0,0055, n=2 0,239 0,039 14 0,0190 ± 0,0224, n=2 0,0186 ± 0,0176, n=2 0,746 0,162 Medie + deviaţia standard a mediei.

Teste biochimice pentru enzimele IDH1 şi IDH2 de tip sălbatic

Enzimele IDH1 şi IDH2 catalizează conversia izocitratului la αKG. Proteinele IDH1 de tip sălbatic (Centrul Naţional pentru Biotehnologia Informaţiei, Acces: NP_001269316,1) şi IDH2 (Centrul Naţional pentru Biotehnologia Informaţiei, Acces: EAX02082,1) conţinând etichete His N-terminale sunt exprimate în E. coli şi purificate utilizând cromatografie de afinitate cu nichel. Testele enzimatice sunt efectuate în plăci de polipropilenă cu fundul în formă de V, cu 96 de godeuri, conţinând 100 mM tampon Tris-HCl la pH 7,5, 1 mM DTT, 0,005% TRITON™ X-100, 120 mM NaCl. Pentru izocitratul de test de tip sălbatic IDH1, NADP+ şi MnCl2 sunt incluse la concentraţiile de 85 µM, 50 µuM şi respectiv 20 µM. Pentru izocitratul de test de tip sălbatic IDH2, NADP+ şi MnCl2 sunt incluse la concentraţiile de 30 µM, 50 µM şi respectiv 10 µM. Inhibitorii dizolvaţi în soluţie stoc DMSO sunt diluaţi în amestecul de reacţie la o concentraţie DMSO finală de 4%. Testul enzimatic este oprit (stins) prin adăugare de ACN (50:50) conţinând acid d6-2-ketopentandioic (d6-αKG) ca un standard intern pentru analiza prin spectrometrie de masă. Zece microlitri de amestec de reacţie sunt combinaţi cu 100 µL de apă, 50 µL de O-benzilhidroxilamină 1 M în tampon de piridină (8,6% piridină, pH 5), şi 50 µL de clorhidrat de N-(3-dimetilaminopropil)-N-etilcarbodiimidă (EDC) 1 M în tampon de piridină. După derivatizare la temperatura camerei timp de o oră, mostrele sunt extrase cu 600 µL de EtOAc. Patru sute µL din stratul superior sunt îndepărtaţi, uscaţi sub azot încălzit şi reconstituiţi cu 100 µL de MeOH/apă (1:1). Zece µL de mostră derivatizată sunt injectaţi pe un sistem LC-MS constând dintr-un sistem Shimadzu Prominence 20A HPLC şi un spectrometru de masă triplu cvadripol Thermo Quantum Ultra™. Analiţii sunt separaţi pe o coloană Waters XBridge™ C18 (2,1 x 50 mm, 3,5 µm) cu un debit de 0,6 mL/minut. Faza mobilă A este 0,1% acid formic în apă şi faza mobilă B este MeOH. Semnalul aKG detectat este transformat în concentraţie de analit utilizând o curbă de calibrare generată utilizând concentraţiile αKG cunoscute. Pentru fiecare compus testat, inhibarea procentuală este calculată utilizând o mostră de control DMSO ca inhibare 0% şi nici un control cu enzimă ca inhibare 100%. Valorile IC50 sunt obţinute din valorile de inhibare procentuală individuală la diferite concentraţii de compus utilizând o ecuaţie cu 4 parametri. Aceste calcule sunt efectuate utilizând programe de analiză de date ale activităţii de bază (IDBS) sau Screener (Genedata).

Rezultatele acestui test demonstrează că compuşii exemplificaţi şi testaţi sunt mai puţin activi la inhibarea enzimei de tip sălbatic IDH1 în comparaţie cu enzimele mutante IDH1 R132H sau R132C şi mai puţin activi la inhibarea enzimei de tip sălbatic IDH2 în comparaţie cu enzimele mutante IDH2 R140Q sau R172K.

Următoarele Exemple din Tabelul 15 sunt testate esenţial cum s-a descris mai sus şi sunt mai puţin active la inhibarea enzimelor de tip sălbatic în comparaţie cu enzimele mutante.

Tabelul 15

Exemplu # IC50 a IDH1 de tip sălbatic (µM) IC50 a IDH2 de tip sălbatic (µM) 1 0,0854 ± 0,107, n=2 0,801 ± 0,745, n=2 2 0,105 ± 0,113, n=2 0,884 ± 0,748, n=2 3 0,425 3,37 4 0,302 3,7 6 0,0549 0,493 7 0,233 1,53 8 0,237 1,62 11 0,345 2,08 12 0,277 3,22 13 0,456 7,03 14 0,392 7,4

IDH1 (R132H) Test de diluţie al saltului biochimic

Compuşii liofilizaţi exemplificaţi sunt reconstituiţi până la 10 mM sau 100 mM cu 100% DMSO şi ţinuţi la temperatura camerei până când sunt testaţi. Proteina IDH1(R132H)-His este exprimată şi purificată prin metode bine cunoscute şi utilizate în mod obişnuit de către cei calificaţi în domeniu. Reactivii testaţi au inclus următoarele: acid α-ketoglutaric (Sigma Cat# K1875), MnCl2 - Fisher Scientific Cat# M87-100, NADPH - Sigma-Aldrich Cat# N7505, Tris-HCl (Invitrogen, Cat#15567-027), NaCl (Sigma, S3014), ditiotreitol (Sigma, D5545), şi TRITON™ X100 (Peirce, 28314). Trusa NAD(P)H-Glo™ de la Promega (G9061).

Tamponul de testare utilizat conţine 100 mM Tris-HCl pH 7,0, 120 mM NaCl, 1 mM DTT, 0,005% TRITON™ X-100, şi 2% DMSO (de la adăugarea compusului de testat). IC50 a fiecărui compus este determinat prin incubarea unui compus de răspuns la doză, preparat pe un Echo555, cu 1,5 nM IDH1(R132H), 1 mM α-ketoglutarat, 1 mM MnCl2, şi 15 µM NADPH în tampon de testare. Reacţia este incubată timp de 2 ore la temperatura camerei, apoi oprită utilizând 6-ciclopropil-5-(izochinolin-5-il)-2-[(3R)-4-(3-metoxipropanoil)-3-metilpiperazin-1-il]piridin-3-carbonitril (10 µM). Concentraţiile NADPH sunt măsurate utilizând trusa NAD(P)H-Glo™, conform specificaţiilor vendorului. Semnalul luminiscent este citit pe Envision (Perkin Elmer; 0,1 sec/oglindă luminiscentă/filtru Lum700 WL400-700). În experimentul diluţiei de salt ulterior, un echivalent al concentraţiei compusului până la 10× IC50 este preincubat cu 100 nM IDH1(R132H). Concentraţia de compus este întotdeauna mai mare ca, sau egală cu concentraţia enzimei. După 2 ore la temperatura camerei, acest amestec este diluat 1:100 într-o soluţie conţinând α-ketoglutarat (10 mM), MnCl2 (10 mM), şi NADPH (15 µM). Această enzimă finală de reacţie conţine 1 nM IDH1(R132H) şi 0,1 Ч [IC50]. După o incubare de 2 ore la temperatura camerei, concentraţia de NADPH este măsurată cum s-a specificat mai sus, utilizând 6-ciclopropil-5-(izochinolin-5-il)-2-[(3R)-4-(3-metoxipropanoil)-3-metilpiperazin-1-il]piridin-3-carbonitril şi trusa NAD(P)H-Glo™. Sunt incluse trei controale: 1) „10Ч Control« conţinând 10ЧIC50 compus în testul de preincubare şi enzimă cu excepţia a 1 mM α-ketoglutarat, 1 mM MnCl2, şi 15 µM NADPH, este utilizat în testul final de măsurare a activităţii enzimei, 2) „Control maxim al activităţii« conţinând DMSO în locul compusului atȃt pentru testul de preincubare cȃt şi pentru testul de enzimă, şi 3) „0,1Ч Control« conţinând DMSO în locul compusului în testul de preincubare şi 0,1ЧIC50 compus în testul de enzimă. O enzimă căreia îi lipseşte „controlul minim al activităţii«, dar altfel echivalentă cu „controlul maxim al activităţii« este inclusă. Un al doilea set de controale maxime şi minime ale activităţii este efectuat utilizând 1 mM α-ketoglutarat, 1 mM MnCl2, şi 15 µM NADPH. Fiecare afecţiune testată este testată în triplicat şi 32 de replicate sunt efectuate pentru controlul maxim al activităţii (10 mM) şi controlul minim al activităţii (10 mM) în timp ce 16 replicate sunt efectuate pentru controlul maxim al activităţii (1 mM) şi controlul minim al activităţii (1 mM).

Concentraţia de NADP (produs) produsă în fiecare experiment/control este determinată utilizând scăderea procentuală în semnalul observat faţă de controlul minim al activităţii, conţinând 15 µM NADPH. Controlul minim al activităţii (1 mM şi 10 mM) şi controlul maxim al activităţii (1 mM şi 10 mM) sunt mediate şi deviaţia standard a fost calculată pentru fiecare. Semnalul pentru fiecare diluţie de salt şi pentru 0,1× Controale sunt multiplicate cu 15 apoi divizate prin numărul mediu pentru godeurile de control minim al activităţii (10 mM). Acest număr este scăzut din 15 pentru a calcula NADP (produs µM). Aceleaşi calcule sunt utilizate pentru 10Ч Controale dar sunt utilizate şi controalele minime ale activităţii (1 mM). µmolii produsului pentru controalele maxime ale activităţii (1 mM şi 10 mM) sunt calculate prin multiplicarea numărului mediu cu 15 apoi împărţind la respectivele controale minime ale activităţii (1 mM şi 10 mM). µM NADP pentru fiecare godeu este împărţit la media controlului maxim al activităţii (1 mM sau 10 mM) apoi multiplicat cu 100 pentru a determina activitatea IDH procentuală pentru compusul diluţiei de salt, 10Ч Control, şi 0,1× Control. Un compus care trece trebuie să prezinte <30% activitate pentru 10× control - arătând că, concentraţia de preincubare este suficientă pentru a satura enzima cu compus. În plus, compusul trebuie să prezinte >70-80% activitate pentru 0,1× control confirmȃnd că nu există inhibare la concentraţia compusului 0,1Ч/diluat.

Compuşii exemplificaţi sunt testaţi esenţial cum s-a descris mai sus şi prezintă date de recuperare procentuală pentru IDH1/R132H în acest test. Compuşii exemplificaţi şi testaţi ai prezentei invenţii inhibă enzima la 2 ore după diluţie contrar compuşilor din domeniu care nu inhibă enzima la 2 ore după diluţie cu recuperare procentuală. Datele din acest test demonstrează că compuşii testaţi ai prezentei invenţii acţionează într-o manieră consistentă cu inhibarea covalentă a IDH1 mutant deoarece diluţia inhibitorului nu conduce la recuperarea activităţii enzimei.

Teste pe bază de celule pentru inhibitori mutanţi ai IDH1

Pentru a testa inhibarea celulară a IDH1 mutant R132C, este utilizată linia celulară fibrosarcom HT1080 (cumpărată de la ATCC). Pentru testarea inhibării pe bază celulară a mutaţiei R132H, linia celulară gliom U87MG (ATCC) a fost transfectată stabil cu o construcţie ADN care exprimă enzima mutantă R132H prin metode bine cunoscute şi utilizate în mod obişnuit de către cei calificaţi în domeniu.

Test celular HT1080:

Cincisprezece mii de celule sunt placate în plăci cu 96 de godeuri acoperite cu poli-D-lys (15.000 celule/godeu) cu 18-24 ore înainte de tratamentul cu compuşi. Patru ore înainte de tratamentul cu compuşi, celulele sunt înfometate de glutamină prin îndepărtarea mediului normal şi înlocuirea cu mediu fără glutamină. După recoltare, celulele sunt apoi tratate cu diferite concentraţii ale compuşilor testaţi (20 µM până la 1 nM; sau 0,2 µM până la 0,01 nM) dizolvate în mediu fără glutamină conţinând DMSO la o concentraţie finală de 0,2%. Incubarea iniţială a compusului este timp de 1 oră la 37°C/5% CO2. După 1 oră, se adaugă glutamină la o concentraţie finală de 2 mM şi celulele tratate sunt apoi incubate pentru încă 18 ore la 37°C/5% CO2. După 18 ore de incubare, 2HG şi aKG intracelulare sunt analizate în lizatele celulare. Lizatele sunt preparate după îndepărtarea mediului şi adăugarea tamponului conţinând 25 mM Tris-HCl pH 7,5, 150 mM NaCl, 1 mM EDTA, 1 mM EGTA/1% TRITON™-X 100 la celule. O alicotă a lizatului se adaugă la un amestec de d6-αKG şi d5-3HG ca standarde interne şi amestecul este tratat cu O-benzilhidroxilamină în prezenţa clorhidratului de N-(3-dimetilaminopropil)-N'-etilcarbodiimidă (EDC) şi piridinei. Derivaţii analiţi sunt apoi extraşi cu EtOAc, uscaţi, şi apoi reconstituiţi cu 50% MeOH în H2O. Mostrele preparate cum s-a descris, au fost injectate în HPLC pentru a separa derivaţii 2HG şi aKG (şi corespunzător standardele interne) utilizând o cromatografie cu fază inversă într-o coloană C18. Analiza mostrelor este efectuată utilizând un spectrometru de masă triplu cvadripol 6460 (G6460A Agilent). Semnalele 2HG şi aKG detectate sunt transformate în concentraţie de analit utilizând raportul de αKG/d6-αKG şi raportul de 2HG/d5-3HG care sunt extrapolate într-o curbă de calibrare. Inhibarea procentuală pentru fiecare mostră individuală este obţinută după normalizarea concentraţiei 2HG sau aKG calculate la referirile maxime şi minime obţinute în prezenţa şi în absenţa glutaminei în timpul tratamentului celulei cu compuşi. Valorile IC50 sunt obţinute din inhibările procentuale individuale utilizând o ecuaţie sigmoidală de răspuns la doză cu 4 parametri. Aceste calcule sunt efectuate în mod automat utilizând programe de analiză a datelor activităţii de bază (IDBS) sau Screener (Genedata).

Rezultatele acestui test demonstrează că exemplele testate în Tabelul 15 inhibă producţia de 2-hidroxiglutarat, care indică inhibarea de IDH1 R132C mutant în celule în acest test. αKG, un metabolit generat de IDH1 de tip sălbatic nu este afectat de inhibitori, care indică că compuşii sunt selectivi pentru IDH1 mutant faţă de IDH1 de tip sălbatic în celule în acest test. Valorile IC50 rezultate pentru următoarele exemple sunt prezentate în Tabelul 16. Pentru acele teste în care curba de inhibare nu a atins 50%, este prezentată cea mai mare concentraţie testată (de exemplu IC50 >20 µM sau >0,2 µM).

Tabelul 16

Exemplu # IC50 a HT1080 (R132C, 2-hidroxiglutarat) (µM) IC50 a HT1080 (R132C, αKG) (µM) 1 0,000698 ± 0,000352, n=7 >20,0 2 0,00128 ± 0,00100, n=8 >20,0 3 0,00127 ± 0,00044, n=2 >0,200 4 0,00334 ± 0,00140, n=2 >0,200 5 0,000623 ± 0,000745, n=2 >20,0 6 0,00112 ± 0,00052, n=4 19,2 7 0,000625 ± 0,000182, n=2 >0,200 8 0,000775 ± 0,0000981, n=2 >0,200 9 0,00275 ± 0,00046, n=3 >20,0 10 0,00391 ± 0,00259, n=3 >20,0 11 0,00104 ± 0,00050, n=4 >20,0 12 0,00272 ± 0,00330, n=4 >20,0 13 0,000987 ± 0,000009, n=2 >20,0 14 0,00138 ± 0,00015 n=3 >20,0 Medie + deviaţie standard of media.

Test celular U87MG/IDH1R132H

Celulele sunt placate în plăci cu 96 de godeuri acoperite cu poli-D-lys (12.000 celule/godeu) cu 18-24 ore anterior tratamentului cu compuşi. Patru ore înainte de tratamentul cu compuşi, celulele sunt înfometate de glutamină prin îndepărtarea mediului normal şi înlocuirea cu mediu fără glutamină. După recoltare, celulele sunt apoi tratate cu diferite concentraţii ale compuşilor testaţi (20 µM până la 1 nM) dizolvaţi în mediu fără glutamină conţinând DMSO la o concentraţie finală de 0,2%. Incubarea iniţială a compusului este timp de 1 oră la 3°C/5% CO2. După 1 oră, glutamina se adaugă la o concentraţie finală de 2 mM şi celulele tratate sunt apoi incubate pentru încă 18 ore la 37°C/5% CO2. 2HG intracelular este analizat în lizatele celulare obţinute după îndepărtarea mediului şi tratamentul cu tampon de lizare (25 mM Tris-HCl pH 7,5, 150 mM NaCl, 1 mM EDTA, 1 mM EGTA/1% TRITON™-X 100). Lizatele celulare sunt conservate la -80°C până când sunt procesate. Pentru extragerea analitului, o alicotă de lizat dezgheţat este transferată la o placă adȃncă cu 96 de godeuri şi tratată cu MeOH rece conţinând d5-3HG ca un standard intern urmat de cloroform şi H2O (1:4:3:2). Faza superioară este colectată după separare şi injectată în HPLC pentru a separa 2HG (şi standardul intern) utilizând cromatografia de interacţiune hidrofilă (HILIC) cuplată la detecţia MS/MS într-un spectrometru de masă triplu cvadripol 6460. Inhibarea procentuală pentru fiecare mostră individuală este obţinută după normalizarea concentraţiei 2HG calculată la referirile maxime şi minime obţinute în prezenţa şi în absenţa glutaminei în timpul tratamentului celulei cu compuşi. Valorile IC50 sunt obţinute din inhibarea procentuală individuală utilizând o ecuaţie sigmoidală de răspuns la doză cu 4 parametri. Aceste calcule sunt efectuate în mod automat utilizând programele de analiză a activităţii de bază (IDBS) sau Screener (Genedata).

Următoarele exemple sunt testate esenţial cum s-a descris mai sus şi prezintă activitate de inhibare împotriva IDH1/R132H mutant în celulele U87MG în acest test aşa cum se arată în Tabelul 17 de mai jos.

Tabelul 17

Exemplu # U87MG (IC50 a IDH1/R132H 2-hidroxiglutarat (µM) 1 0,000209 ± 0,000100, n=6 2 0,000406 ± 0,000375, n=8 3 0,000426 ± 0,000188, n=2 4 0,000805 ± 0,000187, n=2 5 0,000295 ± 0,00200, n=2 6 0,000379 ± 0,000202, n=2 7 0,000356 ± 0,000178, n=2 8 0,000432 ± 0,000016, n=2 9 0,000388 ± 0,000703, n=2 10 0,000529 ± 0,000356, n=2 11 0,000258 ± 0,000209, n=3 12 0,00135 ± 0,00151, n=4 13 0,000267 ± 0,000227, n=2 14 0,000353 ± 0,000483, n=2 Medie ± deviaţia standard a mediei.

Test 2-Hidroxiglutarat in vivo

Pentru testarea in vivo a inhibitorilor IDH1, tumorile xenogrefă subcutanate sunt crescute în şoareci nuzi atimici (20-22g, Harlan Laboratories) după implantarea fie a celulelor HT1080 (fibrosarcom care poartă IDH1 mutant R132C) sau fie a celulelor TB08 (glioblastom secundar care poartă IDH1 mutant R132H). Şoarecii sunt alimentaţi şi spălaţi ad libitum şi sunt aclimatizaţi timp de 1 săptămână înainte de implantarea celulelor. Celulele tumorale (HT1080) sau fragmentele tumorale (TB08) sunt implantate în flancul drept din spate. Pentru HT1080, 5,0 x 106 celulele sunt implantate într-un amestec 1:1 cu Matrigel într-un volum final de 0,2 ml. Pentru TB08, fragmentele tumorale generate din mostrele explantate din tumoare sunt implantate direct în flancul posterior. Volumele tumorale sunt măsurate cu şublerul de două ori săptămânal şi volumul tumoral este calculat utilizând 0,536 Ч L Ч W2, unde L=lungimea şi W=lăţimea. Când volumele tumorale ating 150-400 mm3, animalele sunt randomizate, plasate în grupuri (n=3-6 pe grup) şi dozate cu inhibitori IDH1 sau vehicul cu control. Pentru inhibitorii IDH1, compuşii sunt formulaţi în vehicul conţinând fie 1% hidroxietilceluloză/0,25% Tween™ 80/0,05% Antifoam sau 10% Acacia cu 1,1 mol echivalent de HCl. Compuşii sunt sonicaţi în baie pentru a obţine o suspensie. Compuşii sunt dozaţi pe o bază de miligram pe kilogram (mpk) prin gavaj oral într-un volum final de 0,2 ml. Pentru a determina inhibarea 2HG, compuşii sunt dozaţi de două ori zilnic (BID) timp de 3 zile (număr total de doze = 6). După tratamentul cu compus, şoarecii sunt eutanasiaţi cu anestezie cu izofluoran şi dislocare cervicală. Tumorile sunt excizate, puse în tuburi etichetate, şi imediat congelate în azot lichid. Tumorile sunt depozitate la -80°C pentru procesare.

Prepararea lizatelor tumorale

Tamponul XY Lite este preparat în apă de calitate moleculară şi conţine următoarele componente: 25 mM Tris, pH 7,5, 150 mM NaCl, 1% TRITON™ X-100, 1 mM EDTA, 1 mM EGTA. La XY Lite (40 ml), se adaugă 800 µl de coctail de protează Halt şi inhibitori de fosfatază (coctail de protează Halt™ şi inhibitori de fosfatază, Thermo Scientific fără EDTA, Cat# 78441). Mostrele sunt vortexate şi apoi răcite pe gheaţă. Tuburile portocalii astupate de lizare-A sunt etichetate şi plasate într-un raft pe gheaţă. Un mojar ceramic cu pistil este plasat în gheaţă uscată pentru a se răci. O folie de aluminiu de 2 × 2 inci pătraţi este plasată la partea inferioară a mojarului. O mostră din tumoare este transferată la mojarul prerăcit pe folia pătrată. Se adaugă azotul lichid (aproximativ 5 ml) şi se lasă să se evapore, superîngheţȃnd tumoarea. O altă piesă din folie este plasată peste tumoare şi tumoarea este zdrobită în piese mici cu pistilul ceramic. Tumoarea zdrobită este transferată repede la tubul de lizare. Se adaugă XY Lite cu gheaţă rece (500 µL) la fiecare tub şi se acoperă. Tumorile sunt apoi procesate pe FastPrep-24 MP Biomedicals prin rotirea de două ori timp de 35 secunde fiecare la o viteză setată la 5. Mostrele sunt apoi centrifugate în Beckman Microfuge R la 4°C la 14.000 rpm timp de 30 minute. Supernatantul este transferat la o placă adȃncă cu 96 de godeuri prerăcită. Peletul este eliminat.

Test proteic

O placă de diluţie a testului de proteină este generată mai întȃi prin adăugarea tamponului XY (145 µl) la o placă Corning nesterilă cu fund plat cu 96 de godeuri. La aceasta, se adaugă lizatul tumoral (5 µL) şi se amestecă uşor. Placa este ţinută pe gheaţă. Diluţiile seriale de BSA standard (Thermo Scientific cat. 23209 2 mg/mL) sunt setate după cum urmează: Cinci tuburi de 0,5 mL sunt plasate într-un raft şi tamponul XY (60 µL) se adaugă la fiecare. Stocul BSA (60 µl) se adaugă la primul tub şi se vortexează. 60 µl din primul tub sunt transferaţi la următorul tub, se vortexează, şi tot aşa, până când seria de diluţie este completă după cum urmează: Tub 1= stoc BSA, Tuburile 2-5 sunt diluţii seriale 1:2, Tubul 6= tampon XY singur. Reactivii termo de testare a proteinei BCA sunt amestecaţi în conformitate cu instrucţiunile fabricantului. Se adaugă reactiv BCA amestecat (200 µl) la fiecare mostră şi se incubează timp de 15 minute. Rezultatele testelor de proteină sunt citite pe cititorul de placă SOFTmax Pro. Pe baza rezultatelor testelor de proteină, cantitatea adecvată de tampon XY se adaugă la fiecare lizat tumoral pentru a genera o concentraţie finală de proteină de 5 mg/mL. Toate mostrele sunt etichetate şi depozitate la -80°C.

Analiza metaboliţilor în lizatele tumorale

Efectele in vivo ale inhibării IDH1 asupra concentraţiilor de 2HG şi aKG totale sunt determinate prin analiză de spectrometrie de masă cu cromatografie de lichide (LC-MS) a xenogrefelor tumorale. Metoda utilizează derivatizarea cu O-benzilhidroxilamină înainte de analiza prin LC-MS. Zece microlitri din fiecare lizat tumoral sunt plasaţi într-o placă adȃncă cu 96 de godeuri şi combinaţi cu 100 µL de soluţie standard internă conţinând 10 µM d5-3HG şi 10 µM d6-αKG. 50 µL de 1 M O-benzilhidroxilamină în tampon de piridină (8,6% piridină, pH 5) şi 50 µL de 1 M clorhidrat de N-(3-dimetilaminopropil)-N-etilcarbodiimidă (EDC) în tampon de piridină se adaugă la fiecare mostră. Reacţia de derivatizare continuă la temperatura camerei timp de o oră. Utilizând un mȃnuitor de lichide Beckman Biomek FX, 600 µL de EtOAc se adaugă la fiecare mostră. Plăcile sunt etanşate şi vortexate timp de 5 minute, apoi ele sunt centrifugate timp de 5 minute la 4000 rpm într-o centifugă Eppendorf 5810R. 400 µL din stratul superior sunt transferaţi la o placă nouă cu 96 de godeuri. Mostrele sunt uscate sub azot încălzit la 50°C şi reconstituite cu 100 µL de MeOH/apă (1:1). Un microlitru de mostră derivatizată este injectat pe un sistem LC-MS constând dintr-un sistem Shimadzu Prominence 20A HPLC şi un spectrometru de masă triplu cvadruplu Thermo Quantum Ultra™. Analiţii sunt separaţi pe o coloană Water XBridge™ C18 (2,1 x 50 mm, 3,5 µm) cu un debit de 0,6 mL/minut. Faza mobilă A este 0,1% acid formic în apă şi faza mobilă B este MeOH. Profilul gradientului este: 0 minute, 5% B; 3 minute, 100% B; 4,00 minute, 100% B; 4,1 minute, 5% B; 5,50 minute, stop. Spectrometrul de masă utilizează o sondă HESI-II operată în mod de monitorizare a reacţiei selectate de ioni pozitivi. Curbele de calibrare sunt construite prin plotarea concentraţiilor de analit vs. raportul zonelor de analit/maxim intern standard şi efectuarea unei ajustări pătratice a datelor utilizând o ponderare 1/concentraţie cu software-ul Xcalibur™. Concentraţiile de analit pentru necunoscute sunt calculate înapoi din curbele de calibrare. Datele despre metaboliţi din testul LC-MS sunt exprimate în nmol/mg proteină. Nivelul 2HG mediu în grupul tratat cu vehicul este utilizat pentru a determina controlul de inhibare de 0%. Inhibarea procentuală la fiecare animal tratat cu inhibitor este apoi determinată faţă de controlul cu vehicul. Datele sunt analizate în software-ul JMP pentru a determina inhibarea procentuală medie în fiecare grup de dozare, deviaţia standard, şi eroarea standard.

Datele demonstrând inhibarea in vivo a 2-hidroxiglutaratului la şoarecii cu xenogrefă mutanţi IDH1 prin compuşii exemplificaţi şi testaţi sunt prezentate în Tabelul 18 de mai jos.

Tabelul 18

Model xenogrefă Tratament sau nr. ex. Doză Şoareci (n) 2HG, inhibare % medie Dev std Er std medie TB08 (R132H) Vehicul 0 mpk 5 0 30,3 13,55 TB08 (R132H) 1 1 mpk 5 21,4 21 9,38 TB08 (R132H) 1 2 mpk 5 16,1 30,3 13,6 TB08 (R132H) 1 4 mpk 5 41,5 26 11,6 TB08 (R132H) 1 8 mpk 5 78,8 1,8 0,8 TB08 (R132H) 1 16 mpk 5 92,1 1,8 0,8 TB08 (R132H) 1 32 mpk 5 95,8 0,7 0,3 Model xenogrefă Tratament sau nr. ex. Doză Şoareci (n) 2HG, inhibare % medie Dev std Er std medie TB08 (R132H) Vehicul 0 mpk 5 0 39,2 17,5 TB08 (R132H) 2 1 mpk 5 37,4 13,3 5,9 TB08 (R132H) 2 2 mpk 5 23,9 16,2 7,2 TB08 (R132H) 2 4 mpk 5 63,7 12,1 5,4 TB08 (R132H) 2 8 mpk 5 80,95 6,27 2,8 TB08 (R132H) 2 16 mpk 5 92,97 2,63 1,1 TB08 (R132H) 2 32 mpk 5 96,88 0,68 0,3

Model xenogrefă Tratament sau nr. ex. Doză Şoareci (n) 2HG, inhibare % medie Dev std Er std medie TB08 (R132H) Vehicul 0,00 mpk 5 0 24,4 10,9 TB08 (R132H) 8 10,0 mpk 5 60,36 10,06 4,5 TB08 (R132H) 7 10,0 mpk 5 69,56 9,15 4,1 TB08 (R132H) 4 10,0 mpk 5 61,82 14,4 6,4 TB08 (R132H) 3 10,0 mpk 5 87,26 3,95 1,77 TB08 (R132H) 14 10,0 mpk 5 86,71 5,27 2,36 Model xenogrefă Tratament sau nr. ex. Doză Şoareci (n) 2HG, inhibare % medie Dev std Er std medie TB08 (R132H) Vehicul 0,00 mpk 5 0 26,87 12,02 TB08 (R132H) 11 10,0 mpk 5 90,63 4,5 2,01

Model xenogrefă Tratament sau nr. ex. Doză Şoareci (n) 2HG, inhibare % medie Dev std Er std medie TB08 (R132H) Vehicul 0,00 mpk 5 0 39,6 17,7 TB08 (R132H) 13 10,0 mpk 5 86,3 3,7 1,67 TB08 (R132H) 12 10,0 mpk 5 94,16 0,66 0,3

Claims

1. Un compus cu formula:

în care: R1 este -CH2CH(CH3)2, -CH2CH3, -CH2CH2OCH3, sau -CH2-ciclopropil; R2 este -CH3 sau -CH2CH3; sau o sare acceptabilă farmaceutic a acestuia.

2. Un compus conform revendicării 1 care este: 7-[[(1S)-1-[4-[(1R)-2-ciclopropil-1-(4-prop-2-enoilpiperazin-1-il)etil]fenil]etil]amino]-1-etil-4H-pirimido[4,5-d][1,3]oxazin-2-onă; 7-[[(1S)-1-[4-[(1S)-2-ciclopropil-1-(4-prop-2-enoilpiperazin-1-il)etil]fenil]etil]amino]-1-etil-4H-pirimido[4,5-d][1,3]oxazin-2-onă; 1-etil-7-[[(1S)-1-[4-[1-(4-prop-2-enoilpiperazin-1-il)propil]fenil]etil]amino]-4H-pirimido[4,5-d][1,3]oxazin-2-onă, izomer 1; 1-etil-7-[[(1S)-1-[4-[1-(4-prop-2-enoilpiperazin-1-il)propil]fenil]etil]amino]-4H-pirimido[4,5-d][1,3]oxazin-2-onă, izomer 2; sau o sare acceptabilă farmaceutic a oricărora din aceştia.

3. Un compus conform revendicării 2 care este 7-[[(1S)-1-[4-[(1S)-2-ciclopropil-1-(4-prop-2-enoilpiperazin-1-il)etil]fenil]etil]amino]-1-etil-4H-pirimido[4,5-d][1,3]oxazin-2-onă sau o sare acceptabilă farmaceutic a acestuia.

4. O compoziţie farmaceutică cuprinzând un compus conform revendicării 1, sau o sare acceptabilă farmaceutic a acestuia, şi un purtător acceptabil farmaceutic.

5. Un compus conform revendicării 1, sau o sare acceptabilă farmaceutic a acestuia, pentru utilizare în terapie.

6. Un compus conform oricăreia dintre revendicările 1 până la 3, sau o sare acceptabilă farmaceutic a acestuia, pentru utilizare în tratamentul unui cancer care exprimă IDH1 mutant sau IDH2 mutant care este gliom, glioblastom, glioblastom multiform, astrocitom, oligodendrogliom, paragangliom, fibrosarcom, limfom al celulei T angioimunoblastic (AITL), sindrom mielodisplazic (MDS), leucemie limfoblastică acută a celulei B (B-ALL), cancer la tiroidă, cancer colorectal, leucemie mieloidă acută (AML), melanom, cancer la prostată, condrosarcom sau colangiocarcinom.

7. Un compus pentru utilizare în conformitate cu revendicarea 6 în care cancerul care exprimă IDH1 mutant sau IDH2 mutant este fibrosarcom, leucemie mieloidă acută, gliom, sau glioblastom.