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ES2940708T3 - Métodos para la amplificación de ácidos nucleicos con equilibrio cambiante mediada por endonucleasa (EM-SEq) - Google Patents

Métodos para la amplificación de ácidos nucleicos con equilibrio cambiante mediada por endonucleasa (EM-SEq) Download PDF

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ES2940708T3
ES2940708T3 ES19714758T ES19714758T ES2940708T3 ES 2940708 T3 ES2940708 T3 ES 2940708T3 ES 19714758 T ES19714758 T ES 19714758T ES 19714758 T ES19714758 T ES 19714758T ES 2940708 T3 ES2940708 T3 ES 2940708T3
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Dnae Diagnostics Ltd
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Abstract

La presente invención se relaciona con el diseño de ensayos de biología molecular basados en la amplificación isotérmica de ácidos nucleicos con amplificación por desplazamiento de cadena (SDA) y sus diversas realizaciones y mejoras de métodos. La invención describe un método novedoso para SDA denominado amplificación de equilibrio cambiante mediada por endonucleasas (EM-SEq), que mejora la cinética exponencial y la especificidad de la reacción y permite la amplificación en superficies sólidas. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

DESCRIPCIÓN
Métodos para la amplificación de ácidos nucleicos con equilibrio cambiante mediada por endonucleasa (EM-SEq)
Campo de la invención
La presente invención se relaciona con el diseño de ensayos de biología molecular basados en la amplificación isotérmica de ácidos nucleicos con amplificación por desplazamiento de hebra (SDA) y sus diversas modalidades y mejoras de métodos. La invención describe un método nuevo para la SDA denominado amplificación con equilibrio cambiante mediada por endonucleasas (EM-SEq), que mejora la cinética exponencial y la especificidad de la reacción y permite la amplificación en superficies sólidas.
Antecedentes de la invención
Amplificación por desplazamiento de hebra (SDA)
La SDA es un método isotérmico de amplificación de ácidos nucleicos rápido y eficiente que usa una endonucleasa de ADN específica de secuencia, tal como una enzima de restricción o nickasa, en combinación con una ADN polimerasa que carece de actividad exonucleasa 5'-3' y capaz de desplazar (en lugar de degradar) una hebra de ADN complementaria que se encuentra aguas abajo, mientras se extiende un extremo 3' libre sobre una hebra molde. La SDA se describió originalmente para operar a una temperatura de 37-40 grados Celsius debido al perfil de temperatura de las enzimas disponibles en ese momento, lo que provocaba altos niveles de amplificación fuera de la diana. Sin embargo, se ha descrito una SDAtermófila (tSDA) que usa enzimas termoestables y permite que la reacción se lleve a cabo a 50 grados Celsius y por encima de estos.
Mecanismo de la SDA
Cuando se amplifican secuencias diana que carecen de sitios de reconocimiento de endonucleasas, tales como muchas secuencias que se encuentran en la naturaleza, la reacción comienza, típicamente, con una etapa inicial de desnaturalización por temperatura que permite que dos oligonucleótidos cebadores de simple hebra (más adelante denominados cebadores) se unan específicamente a dos extremos de una secuencia de ADN diana. En sus extremos 5', los dos cebadores portan una secuencia de reconocimiento corta (típicamente entre 6 y 8 nucleótidos de largo) que sirve como sitio de unión para una endonucleasa de ADN dada, que se usa en la reacción. Tras la extensión del cebador por la ADN polimerasa, se crea una especie de ADN de doble hebra que contiene la secuencia de ADN diana flanqueada, en ambos extremos, por la secuencia de reconocimiento de la endonucleasa de ADN elegida. Esta molécula luego sirve como un sustrato para la reacción posterior de SDA (Figura 1A).
El ciclo de amplificación de la SDA continúa con la unión de la endonucleasa de ADN a sus sitios de reconocimiento y la escisión de un enlace fosfodiéster preferentemente en solo una hebra de la estructura del dúplex de ADN (hebra con el extremo 5' proximal). La generación de tales cortes en una hebra simple (más adelante denominados "muescas"), en lugar de escindir el ADN en ambas hebras, puede lograrse al menos de dos formas. Primero, puede usarse una enzima de restricción no palindrómica que muestre sensibilidad a determinadas nucleótidos modificados. Por ejemplo, en su primera aplicación documentada, la SDA se demostró con una enzima de restricción Hindi, que tiene una secuencia de reconocimiento no palindrómica GTT*GAC, donde el asterisco denota el sitio de escisión. Para evitar la escisión de la hebra complementaria que porta la secuencia GTCAAG, se usa desoxiadenosina 5'-[a -tio]trifosfato (dATPaS) en lugar de adenosina 5'-trifosfato estándar (dATP), tanto en la síntesis de cebadores como en la reacción de amplificación. Como resultado, la enzima de restricción HinclI es incapaz de cortar el enlace tioéster formado entre la C y la primera A en la secuencia GTCAAG complementaria, mientras que conserva la capacidad de introducir una muesca entre la segunda T y la G en la secuencia diana GTTGAC en la primera hebra.
Como alternativa al uso de nucleótidos modificados, pueden usarse enzimas de restricción naturales o diseñadas artificialmente para escindir solo una hebra de ADN (también conocidas como enzimas nickasas) en lugar de las enzimas de restricción estándar. Tal modalidad de SDA se conoce como reacción de amplificación con enzima nickasa (NEAR) o amplificación dependiente de la endonucleasa nickasa (NDA). Se han descrito una serie de enzimas nickasas adecuadas, que incluyen la Nt.BspQl, Nt.BbvCl, Nb.BbvCl, Nt.BstNBI y muchas más. Hacer una muesca en una hebra del dúplex de ADN deja un grupo hidroxilo en un extremo 3' libre recién formado, que luego se extiende durante la SDA por la ADN polimerasa antes mencionada con una actividad de desplazamiento de hebra, tal como la polimerasa Bst. Como resultado, la hebra aguas abajo de la muesca se libera en la solución. A medida que se sintetiza la nueva hebra complementaria, se regenera el sitio de reconocimiento de la endonucleasa, lo que permite ciclos de formación de muescas y extensión que producen linealmente hebras simples complementarias aguas abajo de la muesca introducida. Dado que la secuencia diana está flanqueada por sitios de reconocimiento de endonucleasas en ambos extremos, la reacción produce ambas hebras simultáneamente a partir de dos tipos de "unidades amplificadoras" (Figura 1B).
Sin embargo, las hebras de ADN producidas en ese proceso están flanqueadas por un sitio de reconocimiento de endonucleasa truncado (escindido) y, por lo tanto, no pueden amplificarse adicionalmente (Figura 1C). Para lograr la amplificación exponencial, el sitio de reconocimiento debe regenerarse. Lo más común es que esto se logre debido a la presencia de los dos cebadores, que se unen a las hebras producto con sus extremos 3' complementarios (Figura 1E, F). La extensión de la hebra producto a partir de su extremo 3', cuando el cebador se une, regenera uno de los sitios de reconocimiento de endonucleasas escindidos, lo que convierte un producto escindido en una "unidad amplificadora".
Es importante destacar que, dado que ambas hebras de ADN producidas linealmente con sitios de reconocimiento escindidos son perfectamente complementarias, en lugar de unirse a los cebadores libres, también pueden aparearse fácilmente entre sí (renaturalizarse), lo que conduce a una molécula producto de doble hebra "con extremos inertes" que no se puede amplificar (Figura 1D). Se requieren altas concentraciones del cebador para superar la renaturalización del producto. Además, a diferencia de la reacción en cadena de la polimerasa (PCR), la reacción ocurre de forma isotérmica y el sistema no se puede restablecer mediante desnaturalización por calor en cada ciclo para volver a intentar la unión del cebador. Como resultado, la SDA produce al menos tres tipos diferentes de moléculas producto, y el producto con extremos inertes a menudo domina en las últimas etapas de la reacción cuando la relación producto-cebador se vuelve alta. Tal producto con extremos inertes también carece de secuencias o restos químicos presentes en los extremos 5' del cebador. Esto pone limitaciones significativas en el resultado de la SDA, por ejemplo, cuando se intenta la amplificación en superficies con el uso de cebadores inmovilizados.
Una reacción de formación de muescas y extensión típica puede verse, por ejemplo, en el documento US2009/0017453. En tales condiciones, los amplicones generados son cortos (todos los ejemplos tienen una longitud de alrededor de 25 pares de bases) y la mayoría de los amplicones no contienen los adaptadores de amplificación iniciales, que se requieren para el análisis posterior, por tanto el método puede realizar la amplificación de manera que la presencia del material amplificado pueda detectarse, el método no puede usarse para preparar amplicones para una secuenciación adicional.
Una versión de la SDA denominada verdadera SDA isotérmica (iSDA), que permite omitir la etapa inicial de desnaturalización por calor con dos pares de cebadores, uno de los cuales actúa como "solapas", se describe en Analyst (2015) volumen 140 núm. 22, páginas 7540-7549. El método requiere la respiración de la muestra inicialmente para que un cebador preexponencial se inserte en la secuencia genómica y se extienda. Esto evita la necesidad de desnaturalizar con calor para hibridar los cebadores de extensión iniciales. Una vez que se forma el producto preexponencial inicial y se desplaza mediante la extensión de un cebador parachoques para desplazar la hebra extendida sin usar el sitio de restricción, este producto de doble hebra se amplifica mediante la SDA estándar. Por tanto, los problemas de la SDA descritos no se superan ya que la mayoría del material amplificado no puede secuenciarse debido a la falta de extremos adaptados para una amplificación adicional.
A diferencia de la SDA, que usa una endonucleasa de ADN específica de secuencia, tal como una enzima de restricción o nickasa, en combinación con una ADN polimerasa que desplaza la hebra y que carece de actividad de exonucleasa 5'-3', se han informado otras técnicas de amplificación isotérmica. Los ejemplos incluyen el documento US2007/0054301, que describe un método donde los moldes tienen extremos que respiran, de manera que los nuevos cebadores pueden invadir la hebra y, por lo tanto, extenderse. Esto difiere de la SDA, que usa una endonucleasa de ADN específica de secuencia para hacer una muesca en los cebadores y formar un extremo 3' libre para la extensión. El requisito de que un cebador completo invada la hebra y se extienda, en lugar de hacer una muesca y extender un cebador ya hibridado, hace que el método sea diferente y menos eficiente que la SDA.
En la presente descripción se describe un método para la SDA termófila denominado amplificación con equilibrio cambiante mediada por endonucleasas (EM-SEq) que, mediante el diseño de cebadores, limita la generación del producto con extremos inertes, lo que mejora así la cinética exponencial de la reacción y reduce el número de tipos de productos que se generan y cambia el balance entre los productos a aquellos que contienen secuencias de cebador 5'-terminal.
Resumen
Se describe un método mejorado para la amplificación isotérmica de ácidos nucleicos. El método cambia el balance de los productos de doble hebra que tienen extremos inertes que son completamente complementarios a los productos que tienen los extremos correctamente adaptados, adecuados para un uso adicional. El método se basa en la incorporación de regiones terminales que respiran, que están suficientemente, de manera transitoria, como simple hebra, a la temperatura de amplificación isotérmica para hibridar con un cebador y someterse a una extensión rápida. Dichas regiones terminales que respiran, de bajo punto de fusión, pueden verse como extremos deshilachados y se introducen en las hebras antes de que comience la amplificación. La extensión puede luego proceder de la misma manera que otros medios de amplificación por desplazamiento de hebra, a través de etapas repetidas de formación de muescas y extensión, donde la extensión usa una polimerasa con desplazamiento de hebra. Sin embargo, los extremos de bajo punto de fusión introducidos en los moldes previenen la acumulación de amplicones con extremos inertes.
Se describe un método para la amplificación por desplazamiento de hebra de una población de secuencias de ácido nucleico de doble hebra que comprende:
a. modificar los extremos de las hebras en la población de manera que al menos uno de los extremos contenga una región de secuencia de bajo punto de fusión que, a una temperatura por encima de 37 °C y por debajo de 80 °C, esté al menos, de manera transitoria, como simple hebra;
b. copiar la población de moléculas de ácido nucleico que tienen extremos de bajo punto de fusión mediante el uso de uno o más cebadores de amplificación que se hibridan con los extremos de bajo punto de fusión, en donde los cebadores tienen una sección 5' de simple hebra más allá del extremo 3' de la población de moldes de moléculas de ácido nucleico, de manera que el extremo 3' del molde se extiende para formar un sitio de reconocimiento completo para una endonucleasa, y el extremo 3' del cebador se extiende por desplazamiento de hebra para copiar el molde;
c. usar el sitio de reconocimiento completo de la endonucleasa para hacer una muesca en la hebra extendida, lo que libera así un grupo 3'-OH libre dentro del cebador; y
d. extender el grupo 3'-OH liberado mediante el desplazamiento de hebra para volver a copiar el molde,
en donde las etapas b, c y d se realizan isotérmicamente, lo que resulta así en la amplificación por desplazamiento de hebra de la población de secuencias de ácido nucleico de doble hebra.
El método puede realizarse mediante el uso de un único cebador de amplificación, se copia así una hebra de la población de secuencias de ácido nucleico de doble hebra. Alternativamente, el método puede realizarse mediante el uso de dos cebadores de amplificación, se copian así ambas hebras de la población de secuencias de ácido nucleico de doble hebra. Los cebadores de amplificación pueden inmovilizarse sobre un soporte sólido.
Las moléculas denominadas cebadores de amplificación pueden bloquearse en su extremo 3' mediante un resto de bloqueo adecuado, se previene así la extensión del extremo 3' del cebador antes de que la endonucleasa haga una muesca al cebador para acortar el cebador bloqueado y permitir así la amplificación.
Puede usarse cualquier método de desplazamiento de hebras. Por ejemplo, las etapas de extensión b y d pueden realizarse mediante el uso de una polimerasa con desplazamiento de hebra. La polimerasa puede ser la polimerasa Bst o el fragmento de Klenow. Para que se ocurra la amplificación de una muestra de doble hebra, la muestra debe ser de doble hebra con excepción de los extremos de bajo punto de fusión, que están lo suficientemente en simple hebra para que ocurra la hibridación del cebador a la temperatura de amplificación isotérmica.
Los extremos de las hebras pueden modificarse mediante el uso de cualquier método adecuado. Por ejemplo, los extremos de las hebras en la población pueden modificarse mediante la ligazón del adaptador. Alternativamente, los extremos modificados de las hebras en la población pueden obtenerse mediante el uso de la extensión de un cebador que tenga dicha modificación.
Las regiones de bajo punto de fusión pueden prepararse mediante el uso de secuencias de ácido nucleico adecuadas. La diferencia deseada en la temperatura de fusión de los dos tipos de región puede lograrse de varias formas. Por ejemplo, (i) a través de un contenido de GC% significativamente diferente, (ii) el uso de bases modificadas que alteran la estabilidad térmica del dúplex de ADN, tales como, pero sin limitarse a, ácidos nucleicos bloqueados (LNA), ácidos nucleicos desbloqueados (UNA) u 8-aza-7-deazaguanosina, y (iii) complementariedad parcial entre las regiones LL y LR presentes en las moléculas de cebador y las del ADN molde. Por ejemplo, la región de bajo punto de fusión puede contener un par de bases no emparejadas, de manera que las secuencias no sean completamente complementarias. Por ejemplo, los extremos de bajo punto de fusión pueden tener menos del 30 % de contenido de GC. Por ejemplo, los extremos pueden ser secuencias de ADN de 20 nucleótidos de longitud que tienen menos del 30 % de contenido de GC.
El método se basa en que una cantidad suficiente de la región terminal de bajo punto de fusión sea de simple hebra para que pueda ocurrir la hibridación de un cebador a la temperatura de amplificación. La temperatura de amplificación está generalmente por encima de 37 °C y por debajo de 80 °C. La temperatura a la que los extremos están, al menos de manera transitoria, como simple hebra, puede ser la misma que la temperatura de amplificación. La región de bajo punto de fusión puede ser de simple hebra a la temperatura de amplificación isotérmica. La temperatura puede ser de 37-65 °C. La temperatura de amplificación isotérmica puede ser de 50-65 °C. La región de bajo punto de fusión puede ser una secuencia que no exista en la naturaleza.
Para facilitar la hibridación eficiente de la molécula de cebador con la región de simple hebra transitoria de bajo punto de fusión del molde, la secuencia complementaria del cebador puede estar compuesta por nucleótidos con bases modificadas que estabilizan la formación del dúplex. El cebador tiene un extremo 5' saliente. Una vez que el cebador se ha hibridado, de manera transitoria, ocurre una extensión rápida que extiende el extremo 3' del molde, lo que aumenta así la estabilidad del cebador hibridado al aumentar la longitud de la región hibridada.
El cebador extendido produce la secuencia completa de un sitio de restricción de endonucleasa de doble hebra. Parte de la secuencia del sitio de restricción de endonucleasa de doble hebra puede estar en los extremos de bajo punto de fusión modificados. Alternativamente, la secuencia completa puede estar en el cebador. Como ejemplo, si se elige un sitio de reconocimiento de doble hebra de seis bases, tres bases pueden ser de los extremos modificados de bajo punto de fusión de la población, y tres bases pueden estar en el cebador de simple hebra. La extensión de la hebra desde el extremo 3' de la región de bajo punto de fusión extiende el molde, las primeras tres bases forman el sitio de reconocimiento completo. Alternativamente, las seis bases pueden estar en el cebador de simple hebra. La extensión de la hebra desde el extremo 3' de la región de bajo punto de fusión extiende el molde, las primeras seis bases forman el sitio de reconocimiento completo.
Es beneficioso si el sitio de reconocimiento de doble hebra completo no está unido a los extremos de las moléculas molde, de cualquier otra manera, la extensión de la hebra puede ocurrir sin la etapa de extender el extremo 3' del molde para hacer que el cebador saliente sea de doble hebra. El método se basa en que el sitio de reconocimiento de doble hebra completo se hace mediante la extensión del extremo 3' del molde. La extensión del molde opuesto al cebador produce una región de secuencia que permanece de doble hebra a lo largo de toda la amplificación isotérmica.
La muesca en la hebra extendida puede generarse mediante el uso de una enzima. La muesca en la hebra extendida puede generarse mediante el uso de una endonucleasa nickasa. La endonucleasa nickasa puede seleccionarse de la Nt.BspQI, Nt.CviPII, Nt.BstNBI, Nb.BsrDl, Nb.Btsl, Nt.Alwl, Nb.BbvCl, Nt.BbvCI o Nb.Bsml.
La muesca puede generarse donde una hebra es capaz de cortarse y una hebra es resistente al corte. Las hebras resistentes al corte pueden hacerse cuando la extensión se realiza mediante el uso de un dNTP no natural que genera una estructura de ácido nucleico no escindible. Tal dNTP no natural incluye un 5'-[a-tio]trifosfato, que proporciona un enlace tioéster resistente al corte.
La secuencia de reconocimiento de la endonucleasa puede ser
3'- CAGTTG-5'
5'-GTCAAC-3'
La secuencia de reconocimiento de la endonucleasa puede ser
3'- CAG*TTG-5'
5'-GTCsAAC-3'
donde * es el sitio de corte y s es fosfotioato.
Cuando la secuencia de reconocimiento de la endonucleasa es como se muestra más arriba, la secuencia en el extremo de la hebra 5' modificada puede ser 5'-GAC. La secuencia en el extremo 3' de la hebra modificada puede ser 3'-CTG.
Cada cebador en tal esquema requiere una secuencia interna 3'-CAGTTG-5'. La secuencia en el extremo de la hebra 5' modificada puede estar antes de la secuencia 3'-CAGTTG-5', de manera que esta secuencia sea completamente de simple hebra, hasta que se copie mediante la extensión del molde. Alternativamente, el cebador puede hibridarse en un punto dentro de la secuencia siempre que la secuencia 3'-CAGTTG-5' no sea completamente de doble hebra.
El material amplificado puede analizarse adicionalmente, por ejemplo mediante secuenciación. Por tanto, en los métodos descritos, los productos de extensión inmovilizados pueden secuenciarse posteriormente. Cuando la amplificación se realiza mediante el uso de dos cebadores inmovilizados, se copian ambas hebras. Por tanto, ambas hebras pueden secuenciarse. Puede generarse un par de lecturas, una primera lectura de secuenciación a partir de una primera hebra y una segunda lectura a partir de la otra hebra, se generan así un par de lecturas, una lectura a partir de cada hebra de la población de secuencias de ácido nucleico de doble hebra.
También se describen los kits para realizar el método. Se describe un kit para la modificación de secuencias de ácidos nucleicos que comprende:
a. un primer par de moléculas adaptadoras de ácido nucleico para modificar los extremos de una población de secuencias de ácido nucleico de doble hebra, en donde el extremo 5' de una primera hebra del par de adaptadores contiene parte de un sitio de reconocimiento para una endonucleasa, la parte central del par de adaptadores contiene una región de secuencia de bajo punto de fusión que, a una temperatura por encima de 37 °C y por debajo de 80 °C, está, al menos de manera transitoria, como simple hebra, y el extremo 3' de la primera hebra del par de adaptadores y el extremo 5' de la segunda hebra del par de adaptadores puede someterse a ligazón con ambas hebras de la población de secuencias de ácido nucleico de doble hebra; y
b. una enzima ligasa.
El kit puede incluir componentes adicionales, por ejemplo, uno o más cebadores de amplificación o una o más enzimas. Los kits pueden incluir una polimerasa con desplazamiento de hebra. Pueden inmovilizarse uno o más de los reactivos, por ejemplo, pueden inmovilizarse los cebadores de amplificación.
Figuras
Figura 1: Modus operandi de amplificación por desplazamiento de hebra exponencial estándar (SDA). Las líneas verticales denotan enlaces de hidrógeno entre bases apareadas. (A) En su forma más básica, la reacción de SDA comienza con una etapa de desnaturalización inicial, que permite la unión del ADN molde a dos moléculas de cebador que contienen un sitio de reconocimiento de endonucleasa en sus extremos 5, tal como un sitio de unión para una enzima de restricción o nickasa no palindrómica (se muestra como ejemplo el sitio GTT*GAC de la enzima de restricción Hindi, donde el asterisco denota el sitio de escisión). La extensión de la hebra por la ADN polimerasa incorpora el sitio de reconocimiento en la hebra complementaria del dúplex de ADN diana. (B) La reacción está diseñada de manera que la endonucleasa pueda cortar solo una de las hebras de ADN. Esto puede lograrse a través de, por ejemplo, el uso de una enzima de restricción no palindrómica y nucleótidos modificados, o una enzima nickasa. La endonucleasa escinde una hebra del dúplex de ADN. Cuando el mismo sitio de restricción está presente en ambos extremos, en ambas hebras se hace una muesca en los extremos opuestos. Las muescas tienen extremos 3' libres que pueden extenderse mediante una polimerasa con desplazamiento de hebra, tal como la Bst. (C). Los ciclos continuos de escisión y extensión producen, de forma lineal, dos hebras complementarias que contienen la secuencia diana, tanto de las secuencias del cebador como de los sitios de reconocimiento de la endonucleasa truncados (escindidos) en ambos extremos. (D) Estos productos de simple hebra pueden renaturalizarse fácilmente para formar un producto de doble hebra que ya no puede amplificarse. (E,F) Alternativamente, si el producto se une a un cebador complementario en su lugar, puede regenerarse uno de los sitios de reconocimiento de la endonucleasa escindidos. La regeneración del sitio de reconocimiento en las moléculas producto es necesaria para lograr la amplificación exponencial. Debido a que la renaturalización del producto (que se muestra en D) tiene extremos inertes, la cinética de la reacción es subexponencial y la reacción produce al menos tres tipos diferentes de moléculas producto de doble hebra y productos de simple hebra.
Figura 2: Diseño del ADN molde y los cebadores para la amplificación con equilibrio cambiante mediada por endonucleasas (EM-SEq). Las líneas verticales denotan enlaces de hidrógeno entre bases apareadas. (A) ADN molde que sirve como sustrato en la amplificación de EM-SEq. Recuadros blancos: secuencia diana; Recuadros diagonales: Regiones izquierdas de baja Tm (LL); Recuadros con casillas; Regiones derechas de baja Tm (LR). El sitio GTT*GAC de la enzima de restricción HincII, donde el asterisco denota el sitio de escisión, se muestra como un ejemplo. (B) En algunas modalidades, puede que no haya parte del sitio de reconocimiento inicialmente presente en el ADN (arriba) y su incorporación puede ocurrir a medida que avanza la EM-SEq. En otras modalidades, puede que ya esté presente un sitio de reconocimiento parcial o completo en el ADN molde (abajo). La figura muestra el ADN molde como si fuera de doble hebra. Sin embargo, en algunas modalidades puede usarse un ADN molde de simple hebra. (C) Cebadores usados en la reacción de EM-SEq. Recuadros sólidos de color gris oscuro: Regiones izquierdas de alta Tm (HL); recuadros sólidos de color gris claro: Regiones derechas (HR) de alta Tm.
Figura 3: El principio de la cinética de equilibrio cambiante en la EM-SEq. (A) Las regiones de baja temperatura de fusión LL y LR que flanquean la secuencia diana permiten la apertura transitoria de los extremos del dúplex de ADN en ambos extremos del ADN molde (respiración del a Dn ). (B) Equilibrio de unión dinámico entre las moléculas de ADN molde y los cebadores de amplificación. (C) Cinética de la EM-SEq de acuerdo con el principio de Le Chatelier. A: estado unido a sí mismo, B: estado unido al cebador, C: producto extendido rápidamente.
Figura 4: Ciclo de amplificación de la EM-SEq. (A) De forma similar a la SDA estándar, la escisión continua y el desplazamiento de la hebra generan dos moléculas de ADN de simple hebra complementarias, que en la EM-SEq contienen la secuencia diana flanqueada por regiones de bajo punto de fusión LL y LR, así como también sitios de reconocimiento de la endonucleasa truncados (escindidos) en ambos extremos. (B) A diferencia de la SDA estándar, los productos renaturalizados se convierten mediante extensión rápida en productos con sitios de reconocimiento de endonucleasas regenerados. Esto cambia el balance entre los productos que se generan hacia moléculas que pueden amplificarse exponencialmente.
La Figura 4b muestra la extensión mediante el uso de cebadores generados por escisión mediante el uso de una endonucleasa.
Figura 5: Terminación de los amplicones generados por EM-SEq con una ADN polimerasa termoestable. La inactivación por calor tanto de la polimerasa con desplazamiento de hebra, como de la enzima de restricción, activa simultáneamente la polimerasa termoestable de arranque en caliente, que posteriormente rellena las muescas de ADN (asteriscos) a través del traslado de la muesca. Las enzimas activas se muestran en negrita.
Figura 6: La EM-SEq con cebadores unidos a una superficie puede generar amplicones para la secuenciación de nueva generación de extremos apareados. (A) El apareamiento transitorio entre las regiones complementarias de baja temperatura de fusión LULR presentes en el ADN molde y los cebadores unidos a la superficie permite la extensión rápida y el desplazamiento de la hebra (como se representa en la Figura 3), lo que crea dos tipos de unidades de amplificación (como se representa en la Figura 4 ). La figura muestra un ADN molde de doble hebra, sin embargo, otras modalidades pueden usar un ADN molde de simple hebra como entrada. (B) Después de completar la amplificación y rellenar las muescas de ADN, las hebras de ADN complementarias se deshibridan de las hebras de ADN unidas a la superficie y se hibrida un primer cebador de secuenciación, lo que permite la secuenciación de la hebra directa. (C) Después de completar la lectura directa, ocurre la segunda secuenciación, un segundo cebador de secuenciación se híbrida, lo que permite la secuenciación de la hebra inversa. La Figura muestra las regiones de bajo punto de fusión LL y LR que se usan como cebadores de secuenciación; sin embargo, en otras modalidades, los sitios de unión de los cebadores de secuenciación pueden ubicarse en cualquier lugar dentro de los límites de los amplicones generados.
La Figura 7 muestra una versión de la EM-SEq en fase sólida mediante el uso de dos temperaturas.
La Figura 8 muestra dieciséis secuencias de ADN diferentes de 20 nucleótidos de longitud que tienen un contenido de GC del 20 %, 30 %, 40 % o 50 %.
La Figura 9A muestra cómo las dieciséis secuencias diferentes de la Figura 8 se añadieron en pares a una diana de 85 nucleótidos de largo para servir como motivos de los flancos (LL y LR) que modifican el contenido de GC de los extremos de la diana.
La Figura 9B muestra los perfiles de fusión de las construcciones creadas que se probaron en presencia de un tampón que comprende una sal monocatiónica a 70 mM y una sal bicatiónica a 2 mM y un colorante fluorescente de unión a ADN de doble hebra EvaGreen.
La Figura 10 muestra dos secuencias molde de amplificación de longitud completa que se diseñaron mediante la unión de las secuencias de cebador respectivas a ambos extremos de un fragmento del gen ydfU de E. coli de 80 nucleótidos de longitud. TA denota un resto bloqueador de dT invertido.
La Figura 11A muestra datos de fluorescencia en tiempo real y electroforesis en gel de productos de un ensayo preliminar ejecutado con cebadores y un diseño de molde que contiene regiones con temperaturas de bajo punto de fusión con 20 % de GC.
La Figura 11B muestra datos de fluorescencia en tiempo real y electroforesis en gel de productos de un ensayo preliminar ejecutado con cebadores y un diseño de molde que contiene regiones en los flancos con 50 % de GC.
La Figura 12A muestra datos de fluorescencia en tiempo real y electroforesis en gel de productos de un ensayo optimizado ejecutado con cebadores y un diseño de molde que contiene regiones con temperaturas de bajo punto de fusión con 20 % de GC.
La Figura 12B muestra datos de fluorescencia en tiempo real y electroforesis en gel de productos de un ensayo optimizado ejecutado con cebadores y un diseño de molde que contiene regiones en los flancos con 50 % de GC.
La Figura 13 muestra un molde de longitud completa, que contiene regiones de alto punto de fusión con un contenido de GC del 66 % de 30 nucleótidos de longitud en los extremos 5' (HL y HR, en negrita), sitios de reconocimiento para la nickasa Nt.BstNBI, regiones de bajo punto de fusión con un contenido de GC del 20 % de 20 nucleótidos de longitud, que flanquean una secuencia diana y la secuencia de una molécula producto con extremos inertes, que contiene solo regiones de bajo punto de fusión con un contenido de GC del 20 % de 20 nucleótidos de longitud, que flanquean una secuencia diana.
La Figura 14 muestra datos de fluorescencia en tiempo real que muestran que el producto con extremos inertes puede servir como molde en la reacción de EM-SEq, lo que demuestra la invasión de cebadores de la EM-SEq en los extremos de simple hebra transitorios de la molécula.
La Figura 15 muestra secuencias para cebadores directos e inversos no modificados y cebadores directos e inversos de invasión híbrida.
La Figura 16A muestra la electroforesis en gel de productos que muestra que las reacciones que contenían cebadores de invasión híbrida resultaron en un patrón de bandas de productos donde los productos de mayor peso molecular estaban sobrerrepresentados, mientras que los productos de menor peso molecular estaban subrepresentados, en comparación con las reacciones ejecutadas con cebadores no modificados.
La Figura 16B muestra posibles formas previstas de productos.
La Figura 17A muestra la visualización de los productos de reacción de la EM-SEq en un portaobjetos de vidrio.
La Figura 17B muestra la visualización de los productos de reacción de la EM-SEq en la superficie de un chip semiconductor.
Descripción
Un ejemplo de amplificación con equilibrio cambiante mediada por endonucleasas (EM-SEq) se logra con un par de cebadores y ADN de entrada diseñado de acuerdo con un método particular (Figura 2).
Antes de la amplificación, la secuencia de ADN diana se modifica de manera que esté flanqueada en ambos extremos por secuencias adaptadoras compuestas por dos regiones: (i) regiones de baja temperatura de fusión LL y LR (región izquierda de baja Tm y región derecha de baja Tm) colocadas proximalmente y (ii) sitios de reconocimiento de la endonucleasa truncados, tal como un sitio de unión para una enzima de restricción o nickasa no palindrómica (Figura 2A). En algunas modalidades, puede que no haya parte del sitio de reconocimiento inicialmente presente en el ADN molde y su incorporación puede ocurrir a medida que avanza la reacción de EM-SEq. En otras modalidades, puede que ya esté presente un sitio de reconocimiento completo en el ADN molde (Figura 2B). El ADN molde puede ser de doble hebra o de simple hebra.
La EM-SEq usa cebadores, cada uno compuesto por tres regiones: (i) región 5' terminal de alta temperatura de fusión HL o HR (región izquierda de alta Tm y región derecha de alta Tm), (ii) sitio de reconocimiento de la endonucleasa colocado en el centro, que coincide con el sitio de reconocimiento truncado presente en el ADN molde, y (iii) región 3'-terminal de baja temperatura de fusión LL o LR, parcial o completamente complementaria a las presentes en el ADN molde (Figura 2C).
Como los extremos de las hebras a amplificar se han modificado con extremos de simple hebra transitorios (que respiran), los cebadores pueden hibridarse sin tener que desnaturalizar la muestra con calor. Una vez hibridados, el cebador y el extremo 3' adaptado del molde, se someten a la extensión. Una vez extendidos, los extremos ya no respiran, ya que la región que respira ahora es interna a la secuencia.
Las regiones de baja y alta temperatura de fusión LL, LR, HL y HR pueden elegirse entre secuencias que se encuentran en la naturaleza o pueden ser parcial o totalmente artificiales. En lugar de modificar la secuencia diana para que contenga regiones de baja temperatura de fusión LL y LR, las secuencias diana también pueden elegirse de manera que la LL y la LR sean parte de la secuencia diana que se encuentra en la naturaleza.
La diferencia deseada en la temperatura de fusión de los dos tipos de región puede lograrse de varias formas. Por ejemplo, (i) a través de un contenido de GC% significativamente diferente, (ii) el uso de bases modificadas que alteran la estabilidad térmica del dúplex de ADN, tales como, pero sin limitarse a, ácidos nucleicos bloqueados (LNA), ácidos nucleicos desbloqueados (UNA) u 8-aza-7-deazaguanosina, y (iii) complementariedad parcial entre las regiones LL y LR presentes en las moléculas de cebador y las del ADN molde.
A la temperatura de reacción de la SDA termófila, que está, típicamente, entre 50 y 65 grados Celsius, las regiones de baja temperatura de fusión LL y LR que flanquean la secuencia diana permiten la apertura transitoria del dúplex de ADN ("respiración del ADN") en ambos extremos del ADN molde (Figura 3A). En presencia de cebadores de la EM-SEq, que contienen secuencias complementarias a la LL y LR, cada uno de los extremos del ADN molde puede existir en dos estados alternativos: apareado consigo mismo o con su cebador de emparejamiento (Figura 3B). Debido a la naturaleza transitoria e inestable de estas interacciones, el sistema se rige por un equilibrio cinético muy dinámico, donde las regiones LL y LR se unen y disocian continuamente. La cinética de tal equilibrio de unión favorece en gran medida el estado de autoapareamiento debido a la proximidad física inmediata de las regiones LL y LR en las dos hebras complementarias del ADN molde.
Sin embargo, en presencia de una ADN polimerasa, el apareamiento transitorio e infrecuente de algunas moléculas molde con las regiones LL y LR en los cebadores de emparejamiento, puede facilitar eventos de "extensión rápida", donde los extremos 3' de estas moléculas molde se extienden sobre las regiones de altas temperaturas de fusión HL y HR. A diferencia de los eventos de asociación y disociación que crean el equilibrio de unión dinámico, tales eventos de extensión son irreversibles. Tras la extensión del extremo 3', las moléculas permanecen principalmente apareadas debido a que están rodeadas por la región de alta temperatura de fusión HL o HR en un lado y por la secuencia diana en el otro.
La extensión rápida crea un efecto de equilibrio cambiante de acuerdo con el principio de Le Chatelier, por el cual cualquier sistema en equilibrio sujeto a un cambio, por ejemplo, en la concentración de sus reactantes, se reajusta a sí mismo para contrarrestar el efecto del cambio aplicado y se establece un nuevo equilibrio. El efecto de equilibrio cambiante facilita la conversión de la mayoría de las moléculas molde en estados con el sitio de restricción regenerado (Figura 3C). Cuando se aplica al ciclo de amplificación de la SDA, el efecto de equilibrio cambiante, habilitado por la afinidad diferencial de las regiones de temperatura de fusión baja y alta, actúa sobre los productos con extremos inertes autoapareados, lo que regenera los sitios de reconocimiento de la endonucleasa escindidos (Figura 4). Esto cambia el balance entre los productos que se generan hacia moléculas que pueden amplificarse exponencialmente, lo que aumenta la velocidad de reacción y reduce el número de tipos de moléculas de amplicón producidas a dos productos principales, los cuales contienen secuencias o restos presentes en los extremos 5' de los cebadores usados.
La naturaleza transitoria e infrecuente de la interacción entre los cebadores y la baja temperatura del punto de fusión limitan la velocidad a la que el cebador se convierte en un producto que contiene un sitio de reconocimiento de la endonucleasa regenerado y una secuencia de cebador de longitud completa en el extremo 5'. La ineficiencia de este proceso resulta del hecho de que la temperatura del punto de fusión nominal de las secuencias que comprenden el dúplex cebador-molde es la misma que la de las secuencias que comprenden el dúplex formado por las hebras autoapareadas de las regiones terminales complementarias de bajo punto de fusión en el producto de doble hebra (LL y LR). Para facilitar una hibridación más eficiente de la molécula de cebador con la región de simple hebra transitoria de bajo punto de fusión del molde, la secuencia del cebador complementaria a las regiones LL o LR puede estar compuesta por nucleótidos con bases modificadas que estabilizan la formación del dúplex cebador-molde y aumenta su temperatura de punto de fusión sobre los pares de bases G/C o A/T equivalentes.
En ciertas modalidades, los grupos 3'-hidroxilo extensibles en el cebador pueden generarse mediante la escisión de la hebra de una secuencia más larga. La secuencia más larga puede tener un extremo 3' bloqueado que no es extensible. La secuencia más larga contiene la secuencia de reconocimiento completa de una endonucleasa y puede ser escindida por la endonucleasa que escinde el cebador después de que se haya extendido el extremo 3 liberado (Figura 4b).
Dado que la EM-SEq cambia el balance entre los productos generados hacia moléculas con sitios de reconocimiento de la endonucleasa regenerados, a medida que los reactivos de amplificación se agotan, la reacción se estabiliza y las moléculas con muescas están presentes, de manera predominante, en la reacción. Para evitar la generación de moléculas de amplicón con muescas, la endonucleasa debe inactivarse (tal como, mediante inactivación por calor) antes de que se pierda la actividad de la polimerasa y los reactivos se agoten por completo.
Para lograr esto, puede usarse una ADN polimerasa termoestable con desplazamiento de hebra. Alternativamente, si se usa una polimerasa termosensible en la reacción, la EM-SEq puede prepararse con la adición de una ADN polimerasa termoestable de arranque en caliente, sin necesidad de una actividad de desplazamiento de hebra (por ejemplo, polimerasa Taq). En tal modalidad, la inactivación por calor tanto de la polimerasa con desplazamiento de hebra, como de la enzima de restricción, activa simultáneamente la polimerasa termoestable de arranque en caliente, que posteriormente rellena las muescas de ADN a través de un proceso conocido como "traslado de la muesca" (Figura 5).
La EM-SEq en la amplificación en fase sólida para dispositivos de secuenciación de ADN de nueva generación.
Cuando se rellenan las muescas de ADN en las moléculas de amplicón generadas, la mayoría de los productos de la EM-SEq son de doble hebra y contienen las secuencias 5'-terminales de uno de los dos cebadores de la EM-SEq usados. Esto permite el uso de la EM-SEq en la generación de amplicones unidos a una superficie cuando hay cebadores inmovilizados en la reacción (Figura 6).
Es importante destacar que, a diferencia de otros métodos de amplificación isotérmicos, la producción lineal de amplicones a través de ciclos continuos de escisión y desplazamiento de hebras no requiere el apareamiento de los cebadores en el extremo distal de las moléculas de amplicón unidas. Debido a esto, ambos cebadores de la EM-SEq pueden inmovilizarse en la superficie y no es necesario que estén presentes cebadores en solución en la reacción. Esto es particularmente beneficioso si la cantidad de cebador soluble es limitada debido a restricciones de volumen. Además, se espera que la eliminación de los cebadores de la solución reduzca enormemente la amplificación fuera de la diana, que se produce debido a los dímeros de cebadores.
En el contexto de los dispositivos de secuenciación de ADN de nueva generación, la inmovilización de ambos cebadores de la EM-SEq permite la amplificación en fase sólida de ambas hebras de la secuencia diana a la vez en la misma reacción. La amplificación produce un aumento en el número de hebras en solución, cada una de las cuales puede ser capturada por un cebador inmovilizado. Tras el relleno de las muescas de ADN y la desnaturalización de las hebras complementarias, cada cebador inmovilizado puede convertirse en una hebra molde para la secuenciación. Mediante el uso de cebadores inmovilizados que tienen dos secuencias diferentes, es posible realizar una lectura secuencial de extremos apareados en ambas hebras (Figura 6).
En la reacción de EM-SEq descrita anteriormente, la unión de los cebadores a las regiones de bajo punto de fusión de los productos con extremos inertes autoapareados y la conversión resultante de estos productos en productos de extensión con sitios de reconocimiento de la endonucleasa regenerados y secuencias de cebadores completas, ocurre simultáneamente con procesos de escisión y extensión de la hebra que generan copias adicionales de estos productos con extremos inertes. Para superar las interacciones inespecíficas entre las regiones de temperatura de bajo punto de fusión que se abren transitoriamente a la temperatura de reacción, en una modalidad de la EM-SEq, la reacción puede dividirse en dos fases, con procesos de escisión y extensión de la hebra que ocurren en una primera fase, seguidos por la conversión del producto que ocurre en una segunda fase de la reacción, de manera que la segunda fase ocurre a una temperatura más alta que la primera fase. En tal modalidad, las regiones de temperatura de bajo punto de fusión se diseñan de manera que permanezcan en gran medida autoapareadas durante la primera fase, mientras que la elevación de la temperatura de reacción en la segunda fase de la reacción permite la unión de los cebadores y la conversión del producto. En otra modalidad de la EM-SEq, las dos fases pueden separarse mediante una etapa de inactivación de la nickasa y una etapa de activación de la polimerasa que rellena las brechas, de manera que el relleno de brechas y la conversión del producto de extremos inertes ocurran en la segunda fase, impulsados por la actividad de la polimerasa que rellena las brechas (Figura 7).
Los métodos descritos en la presente descripción permiten la generación de fragmentos de ADN "listos para secuenciación" por NGS (secuenciación de nueva generación). Los fragmentos pueden representar una población completa de una muestra, o pueden ser un subconjunto diana del ADN total presente en la muestra de ADN molde original. Solo esos loci de interés se amplifican, por ejemplo, mediante la reacción en cadena de la polimerasa, de manera que los amplicones producidos tienen el ADN molde de interés flanqueado por extremos terminales de secuencia conocida. Estas secuencias conocidas de los extremos son idénticas o sustancialmente idénticas en todos los amplicones generados a partir de un locus dado, y pueden ser asimétricas de manera deliberada y controlable, con secuencias distintas aplicadas a cada uno de los dos extremos de los fragmentos amplificados. Un primer extremo conocido se origina a partir de la región 5' del primer cebador o cebador 'directo' y el segundo extremo conocido se origina a partir dela región 5' del segundo cebador o cebador 'inverso'. Los amplicones así producidos pueden ser funcionalmente equivalentes a fragmentos ligados con adaptadores producidos en métodos de NGS convencionales, pero ofrecen claras ventajas en términos de facilidad, tiempo y costo de producción, así como también la calidad de los datos de secuenciación producidos posteriormente. Los extremos terminales de los amplicones pueden ser aptos para la bioquímica genérica 'estándar' durante las manipulaciones posteriores, tales como la amplificación clonal y la secuenciación del ADN, independientemente del locus del que se originen.
El ácido nucleico de origen puede ser un polinucleótido genómico. El material de origen puede ser eucariota, procariota o de arqueas. Pueden proporcionarse uno o más materiales de origen. El ácido nucleico de origen puede representar un fragmento de un genoma; por ejemplo, un único cromosoma o un único locus genómico (por ejemplo, para la secuenciación rápida de polimorfismos alélicos). En ejemplos particulares, la amplificación puede ser específica para material patógeno dentro de una muestra. Por ejemplo, la amplificación puede seleccionar ácidos nucleicos bacterianos o virales presentes dentro de una muestra humana. Los moldes pueden ser ADN, ARN o sus copias de ADNc.
Los métodos y los cebadores son independientes de las manipulaciones posteriores que generan grupos de productos amplificados clonalmente (aptos para la generación de poblaciones clonales tanto en una superficie, en una perla o en una solución). La tecnología también es independiente de la tecnología que se usa posteriormente para generar los datos de NGS, y podría usarse (por ejemplo) con las tecnologías de 'una base a la vez' Illumina SBS, Ion Torrent o Roche 454, u otras tecnologías de NGS tal como la secuenciación por nanoporos. En general, los métodos descritos en la presente descripción pueden ser ventajosos cuando se desee introducir secuencias definidas en el extremo o extremos de productos amplificados específicos.
También se describen los kits para realizar el método. Se describe un kit para la modificación de secuencias de ácidos nucleicos que comprende:
a. un primer par de moléculas adaptadoras de ácido nucleico para modificar los extremos de una población de secuencias de ácido nucleico de doble hebra, en donde el extremo 5' de una primera hebra del par de adaptadores contiene parte de un sitio de reconocimiento para una endonucleasa, la parte central del par de adaptadores contiene una región de secuencia de bajo punto de fusión que, a una temperatura por encima de 37 °C y por debajo de 80 °C, está, al menos de manera transitoria, como simple hebra, y el extremo 3' de la primera hebra del par de adaptadores y el extremo 5' de la segunda hebra del par de adaptadores puede someterse a ligazón con ambas hebras de la población de secuencias de ácido nucleico de doble hebra; y
b. una enzima ligasa.
El kit puede incluir componentes adicionales, por ejemplo, uno o más cebadores de amplificación o una o más enzimas. Los kits pueden incluir una polimerasa con desplazamiento de hebra. Pueden inmovilizarse uno o más de los reactivos, por ejemplo, pueden inmovilizarse los cebadores de amplificación.
La amplificación se puede llevar a cabo sobre un soporte sólido o en los pocillos de un soporte sólido. Se describen matrices que tienen dos secuencias de cebadores, cada secuencia de cebadores compuesta por tres regiones: (i) región 5' terminal de alta temperatura de fusión HL o HR (región izquierda de alta Tm y región derecha de alta Tm), (ii) sitio de reconocimiento de la endonucleasa colocado en el centro, que coincide con el sitio de reconocimiento truncado presente en el ADN molde, y (iii) región 3'-terminal de baja temperatura de fusión LL o LR, parcial o completamente complementaria a las presentes en el ADN molde (Figura 2C).
Opcionalmente, los cebadores inmovilizados pueden tener bases modificadas en las regiones de bajo punto de fusión que aumentan la estabilidad en comparación con las bases nativas. Opcionalmente, los cebadores pueden tener un bloqueo en 3'. Opcionalmente, los cebadores pueden escindirse en el sitio de reconocimiento central de la endonucleasa antes de la extensión.
También se describen matrices de polinucleótidos amplificados hechos de acuerdo con la invención. La amplificación de los productos en pocillos discretos permite la amplificación clonal a partir de un único molde por pocillo. Los pocillos pueden ser parte de un sistema sensor, tal como un sensor ISFET para detectar la liberación de protones. El sistema sensor puede detectar cambios de pH tales como, por ejemplo, los observados durante las reacciones de incorporación de nucleótidos trifosfato.
Un ejemplo del uso del método en acción puede implicar las etapas de:
Toma de la muestra de ácido nucleico. Modificar la muestra para incluir extremos que respiran de bajo punto de fusión, como se describe en la presente descripción. Tomar un matriz que tiene dos secuencias de cebadores, como se describe en la presente descripción, la matriz es una colección de pocillos que tienen sensores ISFET. Colocar la muestra en la matriz, de manera que la concentración de las moléculas en la muestra dé lugar a una ocupación promedio de menos de una molécula por pocillo. Amplificar las moléculas para producir múltiples copias de las hebras en los pocillos que tienen moléculas, donde ambas hebras pueden amplificarse. Tratar la matriz para eliminar cualquier muesca mediante la extensión de la hebra. Eliminar las hebras hibridadas para hacer que las hebras inmovilizadas sean de simple hebra. Hibridar un primer cebador de secuenciación con una primera de las hebras inmovilizadas y obtener una primera lectura de secuenciación. Eliminar la primera lectura. Hibridar un segundo cebador de secuenciación con la segunda de las hebras inmovilizadas y obtener una segunda lectura de secuenciación, las dos lecturas son de extremos opuestos del molde de doble hebra original.
Ejemplos
Para probar el principio de apertura transitoria de los extremos de la molécula diana, se prepararon dieciséis secuencias de ADN diferentes de 20 nucleótidos de largo que tenían un contenido de GC del 20 %, 30 %, 40 % o 50 % (Figura 8). Las secuencias se añadieron en pares a una diana de 85 nucleótidos de largo para servir como motivos de los flancos (LL y LR) que modifican el contenido de GC de los extremos de la diana (Figura 9). Los perfiles de fusión de las construcciones creadas se probaron en presencia de un tampón que comprende una sal monocatiónica a 70 mM y una sal bicatiónica a 2 mM y un colorante fluorescente de unión a ADN de doble hebra EvaGreen. El diferencial negativo de la intensidad de fluorescencia registrada (-dF) se representó frente a la temperatura de incubación en el intervalo de 30 °C y 90 °C para cada construcción. Las curvas resultantes revelan un aumento en -dF entre 50 °C y 70 °C para construcciones modificadas con secuencias de bajo contenido de GC%, indicativo de apertura transitoria de los extremos de la construcción (Figura 9B).
Un diseño de un par de cebadores de EM-SEq que contienen una región de alto punto de fusión con un contenido de GC del 66 % de 30 nucleótidos de longitud en el extremo 5' (HL y HR, en negrita), un sitio de reconocimiento para la nickasa Nt.BstNBI y una región de bajo punto de fusión con un contenido de GC del 20 % de 20 nucleótidos de longitud en el extremo 3' (LL y LR, subrayados). También se diseñó un par de cebadores de control que contenían una región con un contenido de GC del 50 % de 20 nucleótidos de longitud en el extremo 3'. Además, dos secuencias molde de amplificación de longitud completa se diseñaron mediante la unión de las secuencias de cebador respectivas a ambos extremos de un fragmento del gen ydfU de E. coli de 80 nucleótidos de longitud. TA denota un resto bloqueador de dT invertido (Figura 10).
Se realizó un ensayo de amplificación preliminar en solución con un cebador directo con 20 % de GC en LL, un cebador inverso con 20 % de GC en LR y el molde de longitud completa con 20 % de GC en LL y LR o un cebador directo con 50 % de GC en LL, un cebador inverso con 50 % de GC en LR y el molde de longitud completa con 50 % de GC en LL y LR, en presencia de tampón de amplificación isotérmica 1X (NEB), 0,32 SYBR Green, 6 mM de MgSO4 , 1,4 mM de dNTP, 0,32 U/pl de Bst 2.0 WarmStart (NEB) y 0,4 U/pl de Nt.BstNBI (NEB). Se incubaron reacciones de 25 pl que contenían la cantidad indicada de copias del molde o reacciones de control sin molde (NTC) a 60 °C durante 15 minutos en un termociclador de qPCR. Los datos de fluorescencia en tiempo real y la electroforesis en gel de los productos demuestran que un ensayo ejecutado con un diseño de cebadores y molde que contenía regiones de temperatura de bajo punto de fusión con un 20 % de GC (Figura 11A), mostró una sensibilidad al menos 10 veces mayor y una especificidad mejorada con respecto al ensayo de control, ejecutado con un diseño de cebadores y molde que contenía regiones en los flancos con un 50 % de GC (Figura 11B). Se realizó un ensayo de EM-SEq optimizado en solución con un cebador directo con 20 % de GC en LL, un cebador inverso con 20 % de GC en LR y el molde de longitud completa con 20 % de GC en LL y LR o un cebador directo con 50 % de GC en LL, un cebador inverso con 50 % de GC en LR y el molde de longitud completa con 50 % de GC en LL y LR, en presencia de tampón de amplificación isotérmica 1X (NEB), 0,32 SYBR Green, 3 mM de MgSO4 , 0,7 mM de dNTP, 35 mM de KCl, 5 % de PEG 8000k, 0,37 U/pl de Bst 2.0 WarmStart (NEB) y 0,4 U/pl de Nt.BstNBI (NEB). Se incubaron reacciones de 25 pl que contenían la cantidad indicada de copias del molde o reacciones de control sin molde (NTC) a 60 °C durante 15 minutos en un termociclador de qPCR. Los datos de fluorescencia en tiempo real y la electroforesis en gel de los productos muestran que el ensayo ejecutado con un diseño de cebadores y un molde que contenían regiones de bajo punto de fusión con un 20 % de GC (Figura 12A), demuestra un rendimiento enormemente diferente al ensayo de control ejecutado con un diseño de cebadores y un molde que contenía regiones en los flancos con un 50 % de GC (Figura 12B).
Las reacciones de la EM-SEq se realizaron en solución como se describió anteriormente en presencia de un molde de longitud completa, que contenía regiones de alto punto de fusión con un contenido de GC del 66 % de 30 nucleótidos de longitud en los extremos 5' (HL y HR, en negrita, Figura 13), sitios de reconocimiento para la nickasa Nt.BstNBI, regiones de bajo punto de fusión con un contenido de GC del 20 % de 20 nucleótidos de longitud que flanquean una secuencia diana o en presencia de una molécula producto de extremos inertes como molde, que contiene solo regiones de bajo punto de fusión con un contenido de GC del 20 % de 20 nucleótidos de longitud, que flanquean una secuencia diana. Los datos de fluorescencia en tiempo real muestran que el producto con extremos inertes puede servir como molde en la reacción de EM-SEq, lo que demuestra la invasión de cebadores de la EM-SEq en los extremos de simple hebra transitorios de la molécula (Figura 14).
Las reacciones de la EM-SEq se realizaron en solución como se describió anteriormente en presencia de cebadores de EM-SEq no modificados que comprendían una región de alto punto de fusión con un contenido de GC del 66 % de 30 nucleótidos de longitud en el extremo 5' (HLy HR, en negrita, Figura 15), un sitio de reconocimiento para la nickasa Nt.BstNBI y una región de bajo punto de fusión con un contenido de GC del 20 % de 20 nucleótidos de longitud en el extremo 3' (LL y LR, subrayados) o cebadores de invasión híbridos donde seis de las bases de timidina en las regiones de bajo punto de fusión con un contenido de GC del 20 % se reemplazaron con bases SuperT (5-hidroxibutinil-2'-desoxiuridina, que se denota como T*). La electroforesis en gel de los productos muestra que las reacciones que contenían cebadores de invasión híbrida resultaron en un patrón de bandas de productos donde los productos de mayor peso molecular estaban sobrerrepresentados, mientras que los productos de menor peso molecular estaban subrepresentados, en comparación con las reacciones ejecutadas con cebadores no modificados (Figura 16A). Esto indica que las reacciones de EM-SEq de invasión híbrida promovieron la producción de moléculas con extremos regenerados. La Figura 16B enumera las formas de producto previstas.
Las reacciones de la EM-SEq se realizaron como se describió anteriormente en un portaobjetos de vidrio en presencia de dos cebadores de EM-SEq colocados en la superficie en una relación de 1:1 (Figura 17A). Los puntos que contienen una mezcla de los dos cebadores de EM-SEq varían en diferentes diseños de los restos conectores necesarios para la inmovilización de oligonucleótidos en la superficie. Después de la reacción, los portaobjetos se lavaron, las hebras de ADN complementarias se deshibridaron con NaOH y el ADN amplificado se visualizó mediante la hibridación de una sonda fluorescente específica para la diana amplificada.
Las reacciones de la EM-SEq también se realizaron como se describió anteriormente en una superficie de un chip semiconductor capaz de soportar la secuenciación de ADN a través de la detección de la liberación de protones (Figura 17B). Las flechas indican matrices de puntos de 4x5 en los que se inmovilizaron los cebadores de EM-SEq. Todas las áreas que no sean cebadores de EM-SEq, oligonucleótidos de control positivo o estándares de referencia, contienen cebadores no relacionados. Después de la reacción, los portaobjetos se lavaron, las hebras de ADN complementarias se deshibridaron con NaOH y el ADN amplificado se visualizó mediante la hibridación de una sonda fluorescente específica para la diana amplificada.

Claims (15)

REIVINDICACIONES
1. Un método para la amplificación por desplazamiento de hebra de una población de secuencias de ácido nucleico de doble hebra que comprende:
a. modificar los extremos de las hebras en la población de manera que al menos uno de los extremos contenga una región de secuencia de bajo punto de fusión que, a una temperatura entre 37-80 °C, esté, al menos de manera transitoria, como simple hebra;
b. copiar la población de moléculas de ácido nucleico que tienen extremos de bajo punto de fusión mediante el uso de uno o más cebadores de amplificación que se hibridan con los extremos de bajo punto de fusión, en donde los cebadores tienen una sección 5' de simple hebra más allá del extremo 3' de la población de moldes de moléculas de ácido nucleico, de manera que el extremo 3' del molde se extiende para formar un sitio de reconocimiento completo para una endonucleasa, y el extremo 3' del cebador se extiende por desplazamiento de hebra para copiar el molde;
c. usar el sitio de reconocimiento completo de la endonucleasa para hacer una muesca en la hebra extendida, lo que libera así un grupo 3'-OH libre dentro del cebador; y
d. extender el grupo 3'-OH liberado mediante el desplazamiento de hebra para volver a copiar el molde,
en donde las etapas b, c y d se realizan isotérmicamente, lo que resulta así en la amplificación por desplazamiento de hebra de la población de secuencias de ácido nucleico de doble hebra.
2. El método de acuerdo con la reivindicación 1, etapa a. en donde los extremos de las hebras en la población se modifican de manera que al menos uno de los extremos contiene una región de secuencia de bajo punto de fusión que, a una temperatura entre 37-65 °C, está, al menos de manera transitoria, como simple hebra.
3. El método de acuerdo con la reivindicación 1 o la reivindicación 2 en donde la amplificación se lleva a cabo con un único cebador de amplificación, se copia así una hebra de la población de secuencias de ácido nucleico de doble hebra o la amplificación se lleva a cabo con dos cebadores de amplificación, se copian así ambas hebras de la población de secuencias de ácido nucleico de doble hebra.
4. El método de la reivindicación 3, en donde uno o más de los cebadores de amplificación se inmovilizan sobre un soporte sólido.
5. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4 en donde las etapas de extensión b y d se realizan mediante el uso de una polimerasa con desplazamiento de hebra.
6. El método de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5 en donde los extremos de las hebras en la población se modifican mediante la ligazón de adaptadores.
7. El método de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6 en donde los extremos modificados de las hebras en la población se obtienen mediante el uso de la extensión de un cebador que tiene dicha modificación.
8. El método de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7 en donde los extremos modificados contienen parte de un sitio de reconocimiento para una endonucleasa.
9. El método de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8 en donde la secuencia del cebador de amplificación que tiene una sección de simple hebra 5' más allá del extremo 3' de la población de moldes, tiene una hebra completa de un sitio de reconocimiento para una endonucleasa en dicha sección de simple hebra, y el sitio de reconocimiento de doble hebra completo se hace mediante la extensión de la hebra.
10. El método de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9 en donde la región de bajo punto de fusión contiene un par de bases no emparejadas o una región de 20 nucleótidos que tiene menos del 30 % de contenido de GC.
11. El método de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10 en donde la temperatura de amplificación isotérmica es de 50-65 °C.
12. El método de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11 en donde la muesca en la hebra extendida se genera mediante el uso de una endonucleasa nickasa seleccionada entre Nt.BspQl, Nt.CviPII, Nt.BstNBI, Nb.BsrDI, Nb.BtsI, Nt. Alwl, Nb.BbvCl, Nt.BbvCl o Nb.Bsml.
13. El método de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 12 en donde la extensión se realiza mediante el uso de un dNTP no natural que genera una estructura de ácido nucleico no escindible.
14. El método de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 13, en donde los cebadores se bloquean en su extremo 3' mediante un resto de bloqueo, lo que previene la extensión del extremo 3' antes de que ocurra la muesca.
15. Un kit para la modificación de secuencias de ácidos nucleicos que comprende:
a. un primer par de moléculas adaptadoras para modificar los extremos de una población de secuencias de ácido nucleico de doble hebra, en donde el extremo 5' de una primera hebra del par de adaptadores contiene parte de un sitio de reconocimiento para una endonucleasa, la parte central del par de adaptadores contiene una región de secuencia de bajo punto de fusión que, a una temperatura entre 37-80 °C, está, al menos de manera transitoria, como simple hebra, y el extremo 3' de la primera hebra del par de adaptadores y el extremo 5' de la segunda hebra del par de adaptadores puede someterse a ligazón con ambas hebras de la población de secuencias de ácido nucleico de doble hebra; y
b. una enzima ligasa.
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