ES2837076T3 - Oligonucleótidos para la edición de ARN de cadena sencilla modificados químicamente - Google Patents

Abstract

Un oligonucleótido antisentido (AON) capaz de formar un complejo de cadena doble con una secuencia de ARN objetivo en una célula, preferiblemente una célula humana, para la desaminación de una adenosina objetivo en la secuencia de ARN objetivo por una enzima ADAR presente en la célula, comprendiendo dicho AON un Triplete Central de 3 nucleótidos secuenciales, donde el nucleótido directamente opuesto a la adenosina objetivo es el nucleótido medio del Triplete Central, en el que 1, 2 o 3 nucleótidos en dicho Triplete Central comprenden una modificación de azúcar y/o una modificación de base para hacer que el AON sea más estable y/o más eficaz para inducir la desaminación de la adenosina objetivo; con la condición de que el nucleótido medio no tenga una modificación 2'-O metilo.

Description

DESCRIPCIÓN

Oligonucleótidos para la edición de ARN de cadena sencilla modificados químicamente

Campo de la invención

La invención se refiere con el campo de la medicina. En particular, se relaciona con el campo de la edición de ARN, en el que una secuencia de ARN es dirigida por un oligonucleótido antisentido de cadena sencilla para corregir una mutación genética y/o alterar la secuencia de un ARN objetivo específico. Más en particular, la invención se refiere a modificaciones químicas de los oligonucleótidos para la edición de ARN de cadena sencilla que hacen que los oligonucleótidos sean más estables y aumentan su eficacia de edición de ARN.

Antecedentes de la invención

La edición de ARN es un proceso natural mediante el cual las células eucariotas alteran la secuencia de sus moléculas de ARN, a menudo de una manera precisa y específica del sitio, aumentando así el repertorio de ARN codificados por el genoma en varios órdenes de magnitud. Se han descrito enzimas para la edición de ARN para especies eucariotas en todos los reinos animal y vegetal, y estos procesos juegan un papel importante en el manejo de la homeostasis celular en metazoos, desde las formas de vida más simples, tales como Caenorhabditis elegans, hasta los humanos. Ejemplos de edición de ARN son conversiones de adenosina (A) a inosina (I) y citidina (C) a uridina (U) a través de enzimas llamadas adenosina desaminasa y citidina desaminasa, respectivamente. El sistema de edición de ARN más estudiado es la enzima adenosina desaminasa.

La adenosina desaminasa es una proteína multidominio, que comprende un dominio de reconocimiento y un dominio catalítico. El dominio de reconocimiento reconoce una secuencia y/o conformación específica de ARN de cadena doble (ARNcd), mientras que el dominio catalítico convierte una adenosina en una inosina en una posición cercana, más o menos predefinida, en el ARN objetivo, por desaminación de la nucleobase. La inosina se lee como guanosina por la maquinaria de traducción de la célula, lo que significa que, si una adenosina editada está en una región codificante de un ARNm o pre-ARNm, puede recodificar la secuencia de la proteína.

Las conversiones de A a I también pueden ocurrir en secuencias no codificantes 5' de un ARNm objetivo, creando nuevos sitios de inicio de la traducción secuencia arriba del sitio de inicio original, lo que da lugar a proteínas extendidas en el terminal N. Los eventos de edición también pueden ocurrir en 3'UTR y afectar la regulación y poliadenilación basadas en miARN. Además, las conversiones de A a I pueden tener lugar en elementos de empalme en intrones o exones en pre-ARNm, alterando así el patrón de empalme. Como consecuencia, se pueden incluir u omitir exones. Las adenosina desaminasas forman parte de una familia de enzimas denominadas adenosina desaminasas que actúan sobre el ARN (ADAR), incluidas las desaminasas humanas hADAR1, hADAR2 y hADAR3.

El uso de oligonucleótidos para editar un ARN objetivo aplicando adenosina desaminasa es conocido en la técnica. Montiel-Gonzalez et al., (p Na S 2013, 110 (45): 18285-18290) describieron la edición de un ARN objetivo utilizando una proteína de fusión modificada genéticamente, que comprende un dominio de adenosina desaminasa de la proteína hADAR2, fusionado a una proteína del bacteriófago lambda N, que reconoce secuencia de horquilla del ARN de caja B. Los dominios de unión de ARNcd naturales de hADAR2 han sido removidos para eliminar las propiedades de reconocimiento del sustrato del ADAR natural y reemplazarlo por el dominio de reconocimiento de la caja B de la proteína N lambda. Los autores crearon un oligonucleótido antisentido que comprende una porción de 'ARN guía' que es complementaria a la secuencia objetivo para editar, fusionada a una porción de la caja B para el reconocimiento específico de la secuencia por la proteína de fusión del dominio N-desaminasa. Al hacerlo, se demostró con elegancia que el oligonucleótido de ARN guía dirigía fielmente la proteína de fusión de adenosina desaminasa al sitio objetivo, lo que resulta en una edición de A a I específica del sitio dirigida por ARN guía del ARN objetivo. Los ARN guía divulgados en Montiel-Gonzalez et al., (2013) tienen más de 50 nucleótidos de longitud. Una desventaja de este procedimiento en un entorno terapéutico es la necesidad de una proteína de fusión que consista en el dominio de reconocimiento de la caja B de la proteína N del bacteriófago lambda, fusionado genéticamente al dominio de adenosina desaminasa de una proteína ADAR natural truncada. Requiere que las células objetivo se transduzcan con la proteína de fusión, que es un obstáculo importante, o que las células objetivo se transfecten con un constructo de ácido nucleico que codifica la proteína de fusión de adenosina desaminasa modificada para su expresión. Este último requisito no constituye un obstáculo menor a la hora de lograr la edición en un organismo multicelular, como en la terapia contra una enfermedad humana para corregir un trastorno genético.

Vogel et al., (2014. Angewandte Chemie Int Ed 53: 267-271) divulgaron la edición de ARN que codifica eCFP y Factor V de Leiden, utilizando un ARN guía sustituido con bencilguanosina y una proteína de fusión modificada genéticamente, que comprende los dominios de adenosina desaminasa de ADAR1 o 2 (que carecen de los dominios de unión de ARNcd) fusionados genéticamente a un dominio de etiqueta SNAP (una O6-alquilguanosina-ADN-alquil transferasa modificada). Aunque la proteína de fusión de desaminasa artificial modificada genéticamente podría dirigirse a un sitio de edición deseado en los ARN objetivo en células HeLa en cultivo, a través de su dominio de etiqueta SNAP que está unido covalentemente a un ARN guía a través de una modificación de O6-bencilguanosina del 5', este sistema adolece de inconvenientes similares a los de los ADAR modificados genéticamente descritos por Montiel-Gonzalez et al., (2013), ya que no está claro cómo aplicar el sistema sin tener que modificar genéticamente el ADAR primero y luego transfectar o transducir las células que albergan el ARN objetivo, para proporcionar a las células esta proteína modificada genéticamente. Claramente, este sistema no se adapta fácilmente para su uso en humanos, por ejemplo, en un entorno terapéutico.

Woolf et al., (1995. Proc Natl Acad Sci USA 92: 8298-8302) divulgaron un enfoque más simple, utilizando oligonucleótidos de ARN antisentido de cadena sencilla relativamente largos (25-52 nucleótidos de longitud) en el que los oligonucleótidos más largos (34 mer y 52 mer) podrían promover la edición del ARN objetivo por ADAR endógeno debido a la naturaleza bicatenaria del a Rn objetivo y el oligonucleótido de hibridación. Los oligonucleótidos de Woolf et al., (1995) que eran 100% complementarios a las secuencias de ARN objetivo solo parecían funcionar en extractos celulares o en ovocitos de anfibios (Xenopus) por microinyección, y adolecían de una falta grave de especificidad: casi todas las adenosinas en la cadena de ARN objetivo que era complementaria al oligonucleótido antisentido se editaron. Se probó un oligonucleótido de 34 nucleótidos de longitud, en el que cada nucleótido comprendía una modificación 2'-O-metilo, y se demostró que era inactivo en Woolf et al., (1995). Con el fin de proporcionar estabilidad frente a nucleasas, también se probó un ARN de 34 mer, modificado con nucleótidos fosforotioato modificado con 2'-O-metilo en los 5 nucleótidos del terminal 5' y 3'. Se demostró que la región central no modificada de este oligonucleótido podría promover la edición del ARN objetivo mediante ADAR endógeno, proporcionando las modificaciones terminales de protección contra la degradación por exonucleasas. Woolf et al., (1995) no logró la desaminación de una adenosina objetivo específica en la secuencia de ARN objetivo. Se editaron casi todas las adenosinas opuestas a un nucleótido no modificado en el oligonucleótido antisentido (por lo tanto, casi todas las adenosinas opuestas a nucleótidos en la región central no modificada, si se modificaran los 5 nucleótidos del terminal 5' y 3' del oligonucleótido antisentido, o casi todas las adenosinas en la cadena de ARN objetivo si no se modificaron los nucleótidos). ADAR actúa sobre cualquier ARN de cadena doble (ARNcd). A través de un proceso a veces denominado 'edición promiscua', la enzima editará múltiples adenosinas en un ARNcd. Por lo tanto, existe la necesidad de procedimientos y medios que eviten tal edición promiscua y que solo se dirijan a adenosinas específicas en una secuencia de ARN objetivo. Vogel et al., (2014) demostraron que dicha edición fuera del objetivo se puede suprimir utilizando nucleótidos modificados con 2'-O-metilo en el oligonucleótido en posiciones opuestas a las adenosinas que no deben editarse, y utilizando un nucleótido no modificado directamente opuesto a la adenosina dirigida específicamente en el ARN objetivo. Sin embargo, no se ha demostrado que el efecto de edición específico en el nucleótido objetivo tenga lugar en ese artículo sin el uso de enzimas ADAR recombinantes que forman específicamente enlaces covalentes con el oligonucleótido antisentido.

El documento WO 2016/097212 divulga oligonucleótidos antisentido (AON) para la edición dirigida de ARN, en los que las AON se caracterizan por una secuencia que es complementaria a una secuencia de ARN objetivo (a la que se hace referencia en este documento como la 'porción dirigida') y por la presencia de una estructura de tallo-bucle (denominada en este documento la 'porción de reclutamiento'). Dichos oligonucleótidos se denominan 'AON de axiómeros' o 'AON que forman por sí mismos un bucle'. La porción de reclutamiento actúa reclutando una enzima ADAR natural presente en la célula para el ARNcd formado por hibridación de la secuencia objetivo con la porción de direccionamiento. Debido a que la porción de reclutamiento, no es necesaria para entidades conjugadas o presencia de enzimas ADAR recombinantes modificadas. El documento WO 2016/097212 describe la porción de reclutamiento como una estructura de tallo-bucle que imita un sustrato natural (por ejemplo, el receptor GluB) o una estructura ADN-Z que se sabe que es reconocida por las regiones de unión de ARNcd de las enzimas ADAR. Una estructura de tallobucle puede ser una estructura de tallo-bucle intermolecular, formada por dos cadenas de ácido nucleico separadas, o una estructura de tallo-bucle intramolecular, formada dentro de una única cadena de ácido nucleico. La estructura de tallo-bucle de la porción de reclutamiento como se describe en el documento WO 2016/097212 es una estructura de tallo-bucle intramolecular, formada dentro del propio AON, y capaz de atraer ADAR.

Aún otra técnica de edición que usa oligonucleótidos se conoce como sistema CRISPR/Cas9, pero este complejo de edición actúa sobre el ADN. El último procedimiento adolece del mismo inconveniente que los sistemas ADAR modificados descritos anteriormente, ya que requiere el suministro conjunto a la célula objetivo de la enzima CRISPR/Cas9, o un constructo de expresión que codifica la misma, junto con el oligonucleótido guía.

En vista de lo anterior, sigue existiendo la necesidad de nuevas técnicas y compuestos que puedan utilizar rutas celulares endógenas y enzimas ADAR disponibles de forma natural para editar específicamente ácidos nucleicos endógenos en células de mamíferos, incluso en organismos completos, sin los problemas asociados con los procedimientos de la técnica anterior.

Sumario de la invención

La presente invención elimina los inconvenientes de los procedimientos de acuerdo con la técnica anterior al proporcionar un enfoque dirigido a la edición de ARN usando, en una realización, un oligonucleótido antisentido (AON) capaz de formar un complejo de cadena doble con una secuencia de ARN objetivo en una célula, preferiblemente una célula humana, para la desaminación de una adenosina objetivo en la secuencia de ARN objetivo por una enzima ADAR presente en la célula, comprendiendo dicho AON un Triplete Central de 3 nucleótidos secuenciales, en el que el nucleótido directamente opuesto a la adenosina objetivo es el nucleótido medio del Triplete Central, en el que el nucleótido medio del Triplete Central no tiene una modificación 2'-O-metilo; y en el que 1, 2 o 3 nucleótidos en dicho Triplete Central comprenden una modificación de azúcar y/o una modificación de base y/o una modificación de fosfodiéster (tal como fosforo (di)tioato o amidato). El AON de la presente invención es preferiblemente en su estructura básica un oligorribonucleótido de cadena sencilla.

La presente invención también se refiere al AON de acuerdo con la invención para su uso en el tratamiento o prevención de un trastorno genético, preferiblemente seleccionado del grupo que consiste en: fibrosis quística, síndrome de Hurler, deficiencia de alfa-1-antitripsina (A1AT), enfermedad de Parkinson, enfermedad de Alzheimer, albinismo, esclerosis lateral amiotrófica, asma, p-talasemia, síndrome de Cadasil, enfermedad de Charcot-Marie-Tooth, enfermedad pulmonar obstructiva crónica (EPOC), atrofia muscular espinal distal (DSMA), distrofia muscular de Duchenne/Becker, epidermólisis ampollosa distrófica, epidermólisis ampollosa, enfermedad de Fabry, trastornos asociados al Factor V de Leiden, poliposis adenomatosa familiar, galactosemia, enfermedad de Gaucher, glucosasfosfato deshidrogenasa, hemofilia, hemocromatosis hereditaria, síndrome de Hunter, enfermedad de Huntington, enfermedad de intestino inflamatorio (IBD), síndrome de poliaglutinación heredada, amaurosis congénita de Leber, síndrome de Lesch-Nyhan, síndrome de Lynch, síndrome de Marfan, mucopolisacaridosis, distrofia muscular, distrofia miotónica tipos I y II, neurofibromatosis, enfermedad de Niemann-Pick tipo A, B y C, cáncer relacionado con NY-eso1, síndrome de Peutz-Jeghers, fenilcetonuria, enfermedad de Pompe, enfermedad ciliar primaria, trastornos relacionados con la mutación de protrombina, tales como la mutación de protrombina G20210A, hipertensión pulmonar, retinitis pigmentosa, enfermedad de Sandhoff, síndrome de inmunodeficiencia combinada grave (SCID), anemia de células falciformes, atrofia muscular espinal, enfermedad de Stargardt, enfermedad de Tay-Sachs, síndrome de Usher, inmunodeficiencia ligada al cromosoma X, síndrome de Sturge-Weber y cáncer.

La invención también se refiere a un procedimiento para la desaminación de una adenosina objetivo específica presente en una secuencia de ARN objetivo en una célula, comprendiendo dicho procedimiento las etapas de: proporcionar a dicha célula un AON de acuerdo con la invención; permitir la absorción por la célula de dicho AON; permitir la hibridación de dicho AON con la secuencia de ARN objetivo; permitir que una enzima ADAR de mamífero que comprende un dominio de unión de ARNcd natural como se encuentra en la enzima de tipo silvestre desamine dicha adenosina objetivo en dicha secuencia de ARN objetivo a una inosina; y, opcionalmente, identificar la presencia de dicha inosina en la secuencia de ARN.

En realizaciones preferidas de la presente invención, la secuencia de ARN objetivo codifica CFTR (por ejemplo, para editar una mutación 1784G > A), CEP290 (por ejemplo, para editar una mutación c.2991 l655A > G), alfa1-antitripsina (A1AT; por ejemplo, para editar una mutación 9989G > A; o una mutación 1096G > A), proteína de unión al nucleótido guanina (GNAQ; por ejemplo, para editar una mutación 548G > A), o LRRK2 (por ejemplo, para editar una mutación G6055), o en las que el ARN objetivo es codificado por el gen IDUA (por ejemplo, para editar una mutación c.1205G > A (W402X)).

Breve descripción de los dibujos

La Figura 1 muestra la complementariedad de un oligonucleótido antisentido (AON; cadena superior) con la secuencia de ARN objetivo SERPINA1 mutada humana (cadena inferior; SEQ ID NO: 1), con la adenosina A objetivo en negrita. La secuencia de los AON de la serie ADAR60 se muestra en el presente documento de 3' a 5' (en contraste con la dirección que se muestra en la Figura 2), con el Triplete Central del AON subrayado. Las posiciones en el Triplete Central que se modifican como se describe en los ejemplos proporcionados se indican con las letras YXZ.

La Figura 2 muestra los oligonucleótidos antisentido (AON) y el oligonucleótido sentido (SON) para probar la edición de ARN y la evaluación de la estabilidad como se divulga en el presente documento. Las secuencias independientes tienen una SEQ ID NO como se indica. Las modificaciones específicas de la base YXZ se mencionan en la tercera columna. Los nucleótidos en minúsculas son ARN y 2'-O-metilo modificado. Los nucleótidos en mayúsculas son ARN, excepto los nucleótidos entre corchetes [NNN], que es ADN. Los nucleótidos en minúscula representados como (nnn) son nucleótidos modificados con ARN 2'-fluoro. Los nucleótidos en minúscula representados como <nnn> son nucleótidos modificados con ARN 2 -NH2. Los nucleótidos representados como {N} son ácido nucleico desbloqueado (UNA). idT indica una modificación de T invertida en 3' que mejora la resistencia a la degradación y también bloquea la extensión del terminal 3' de AON durante la amplificación por PCR. * = enlaces fosforotioato; ' = enlaces 3'-metilenfosfonato; " = enlaces 5'-metilenfosfonato; A = enlaces 3'-fosforoamidato; # = enlaces 2'-5'fosfodiéster.

La Figura 3 muestra la resistencia de los AON a la nucleasa, ensayada mediante electroforesis en gel desnaturalizante después de la incubación en medio que contiene FBS (indicado por RX). Los controles se incubaron en PBS (c Tl ). Las identidades de los AON (a Da R60-1 hasta A dA r 60-21) se indican encima del panel (abreviado de 60-1 a 60-21, véase también la Figura 2). Las bandas inferiores (indicadas por una flecha) son productos de degradación resultantes de la escisión de los AON, mientras que las bandas superiores son los AON de longitud completa. Los carriles del marcador contienen un marcador de bajo peso molecular, 10-100 nt (Affymetrix), con 14 fragmentos de oligonucleótidos en incrementos de 5 nt (10 nt - 50 nt) y 10 nt (50 nt -100 nt).

La susceptibilidad a la degradación está indicada por la relación de las bandas, con una mayor prevalencia del producto menor que sugiere una menor estabilidad.

La Figura 4 muestra la complementariedad de un AON (cadena superior) con la secuencia de ARN objetivo IDUA mutada humana (cadena inferior; SEQ ID NO: 2), con la adenosina A objetivo en negrita. La secuencia de los AON de la serie ADAR68 se muestra en el presente documento de 3' a 5' (en contraste con la dirección como se muestra en la Figura 2), con el Triplete Central del AON subrayado. Las posiciones en el Triplete Central que se modifican como se describe en los ejemplos proporcionados se indican con las letras XXY.

La Figura 5 muestra la estabilidad de los oligonucleótidos ADAR65-1, ADAR65-18, ADAR65-20, ADAR65-21 y ADAR65-22 dirigidos contra el gen Idua de ratón mutado (modelo de Hurler), ensayado mediante electroforesis en gel desnaturalizante después de la incubación en medio que contiene FBS. Los controles se incubaron en PBS. Las flechas apuntan a los productos de degradación. Las bandas superiores son AON de longitud completa. Los carriles del marcador (M) contienen marcador de bajo peso molecular, 10-100 nt (Affymetrix), con 14 fragmentos de oligonucleótidos en incrementos de 5 nt (10 nt - 50 nt) y 10 nt (50 nt - 100 nt). La susceptibilidad de AON a la degradación durante dos incubaciones de tiempo diferentes (2 h y 18 h) se indica mediante la relación de las bandas, con una mayor prevalencia del producto inferior que sugiere una estabilidad reducida.

La Figura 6 muestra la estabilidad de los oligonucleótidos ADAR65 adicionales, ensayados mediante electroforesis en gel desnaturalizante después de la incubación durante 2 horas o 18 horas en PBS o FBS, similar a la Figura 5.

La Figura 7 muestra la estabilidad de cuatro oligonucleótidos ADAR93, de los cuales ADAR93-2 contiene ARN no modificado en el Triplete Central, mientras que los otros tres (ADAR93-6, ADAR93-8 y ADAR93-9) tienen dos o tres nucleótidos de ADN en el Triplete Central. La diferencia de las modificaciones adicionales se muestra en la Figura 2. La estabilidad se evaluó mediante electroforesis en gel desnaturalizante después de la incubación durante 2 h, 24 h o 3 días en PBS, DMEM FBS al 15%, líquido cefalorraquídeo humano de donante único (LCR) y lisosomas hepáticos humanos de género mixto (Lyso).

La Figura 8 muestra el análisis de secuenciación de Sanger de fragmentos de PCR generados por RT-PCR después de un ensayo de edición in vitro usando lisado de células HEK293 con ADAR2 sobreexpresado y un objetivo de ARNcs mutante SERPINA1. Se utilizaron ADAR60-1 (A) y ADAR60-15 (B), véase la Figura 2. Los controles negativos fueron un ensayo idéntico con ADAR60-15 pero sin lisado celular (C), y un ensayo idéntico usando el lisado celular HEK293 (con sobreexpresión de ADAR2) en ausencia de AON (D). La secuencia sobre todos los paneles es la SEQ ID NO: 35.

La Figura 9 muestra los resultados de secuenciación del ARN de GFP amplificado por RT-PCR de células que expresan de manera estable el constructo GFP W57X y que fueron transfectados con ADAR2 y por separado con dos oligonucleótidos (ADAR59-2 y ADAR59-10), en los que la adenina en el triplete de ADAR59-10 era una 2-aminopurina. ADAR59-2 no tiene esa modificación, vease la Figura 2. Muestra el efecto potenciador de esta modificación particular sobre la eficiencia de la edición de ARN. La secuencia por encima de ambos paneles es la SEQ ID NO: 36.

La Figura 10 muestra los resultados de secuenciación de un producto de PCR generado a través de ADNc a partir de ARN aislado de células HEPA1-6 de ratón (A) y células CMT64 (B) que no fueron transfectadas (NT, paneles izquierdos) o transfectadas con un oligonucleótido de control que no es de direccionamiento (NTO, paneles del medio) o con ADAR94-1 (paneles de la derecha) para editar el codón de parada del ARNm de Snrpa de ratón. La edición de ARN que está claramente por encima de los niveles de fondo se observa en la posición indicada por la flecha. La secuencia por encima de los tres paneles en A y B es la SEQ ID NO: 37.

La Figura 11 muestra los resultados de secuenciación de un producto de PCR generado mediante ADNc a partir de ARN aislado de células HEPA1-6 de ratón que fueron transfectadas con ADAR94-1 solo o ADAR94-1 en combinación con SON2 como se describe en la Figura 10. La secuencia por encima de ambos paneles es la SEQ ID NO: 38.

La Figura 12 muestra los resultados de secuenciación de un producto de PCR generado mediante ADNc a partir de ARN aislado de células pulmonares primarias de ratón que no fueron transfectadas (NT, panel izquierdo), transfectadas con un oligonucleótido de control (ADAR87-1) hibridado con un oligonucleótido sentido de protección SON2 (panel central), o con un oligonucleótido de direccionamiento al ARN de Snrpa de ratón (ADAR94-1) hibridado con SON2 (panel derecho). Se observa un claro aumento en la señal G después de la transfección con ADAR94-1 SON2 (posición indicada por una flecha), lo que muestra que se puede lograr una edición de ARN altamente específica y significativa con ADAR endógeno en un objetivo endógeno en células primarias ex vivo. La secuencia por encima de los tres paneles es la SEQ ID NO: 37, idéntica a la Figura 10.

La Figura 13 muestra la capacidad de edición de los AON como un porcentaje de ARNm editado en el ARN objetivo total medido por ddPCR. NT: No tratado.

La Figura 14 muestra la actividad enzimática (como unidades de fluorescencia relativas normalizadas a la concentración de proteína total) medida en un ensayo de a-L-iduronidasa que es una indicación de la presencia de un ARNm de Idua tipo silvestre que es el resultado de la edición de a Rn tras la transfección con AON que editan ARN. Se transfectaron fibroblastos embrionarios de ratón que portaban el gen Idua mutado con un plásmido de expresión que también expresaba el gen Idua mutado de ratón, y posteriormente se transfectaron con las AON como se muestra. La actividad promedio y la desviación estándar de dos mediciones duplicadas se muestran para cada AON. NT: no transfectado con AON.

Descripción detallada de la invención

Como se discutió anteriormente, el documento WO 2016/097212 divulga AON para la edición dirigida de ARN, en el que los AON se caracterizan por una 'porción dirigida' y una 'porción de reclutamiento'. El documento WO 2016/097212 describe la porción de reclutamiento como una estructura de tallo-bucle que imita un sustrato natural (por ejemplo, el receptor GluB) o una estructura de ADN-Z que se sabe que es reconocida por las regiones de unión de ARNdc de las enzimas ADAR. La estructura de tallo-bucle de la porción de reclutamiento como se describe en el documento WO 2016/097212 es una estructura de tallo-bucle intramolecular, formada dentro del propio AON, y capaz de atraer ADAR. Existen desventajas potenciales en tener AON que son muy largos debido a tales estructuras, tales como problemas de fabricación, estabilidad, efectos secundarios y son más costosos de producir que las versiones más cortas.

Los AON de la presente invención no comprenden una porción de reclutamiento como se describe en el documento WO 2016/097212. Los AON de la presente invención no comprenden una porción que sea capaz de formar una estructura de vástago-bucle intramolecular. Los AON de la presente invención son más cortos, lo que los hace más baratos de producir, más fáciles de usar y más fáciles de fabricar. Además, no tienen la desventaja de secuestrar potencialmente las enzimas ADAR de su función normal en la célula. Inesperadamente, se encontró que los AON que son complementarios a un ARN objetivo para desaminar una adenosina objetivo presente en una secuencia de a Rn objetivo a la que el AON es complementario, pero, lo que es más importante, carecen de una porción de reclutamiento como se describió anteriormente, parecían todavía capaces de aprovechar enzimas ADAR presentes en la célula para editar la adenosina objetivo. En un aspecto preferido, el AON de la presente invención comprende una falta de coincidencia en la posición de la adenosina objetivo, en el que el nucleótido opuesto es una citidina. Además, cuando una uridina es opuesta a la adenosina objetivo (que de hecho no sería una falta de coincidencia), el AON es capaz de provocar la desaminación de la adenosina objetivo. El documento PCT/EP2017/065467 describe que las faltas de coincidencia adicionales (que resultan en los llamados 'abultamientos' en el ARNcd formado, causados por nucleótidos en el AON que no forman pares de bases perfectos con el ARN objetivo de acuerdo con las reglas de emparejamiento de bases de Watson-Crick) son tolerables, en algunos casos preferibles, pero no esenciales para la edición dirigida específica de la secuencia de ARN objetivo. El número de protuberancias en el AON (cuando se hibrida con su secuencia objetivo de ARN) puede ser uno (generalmente el abultamiento formado en la posición de la adenosina objetivo) o más, dependiendo de la longitud del AON. Las faltas de coincidencia adicionales que inducen abultamientos pueden ser tanto secuencia arriba como secuencia abajo de la adenosina objetivo. Las protuberancias pueden ser protuberancias de una sola falta de coincidencia (causadas por una falta de coincidencia de un par de bases) o abultamientos de múltiples faltas de coincidencia (causadas por las faltas de coincidencia de más de un par de bases consecutivas, preferiblemente dos o tres faltas de coincidencia consecutivas de pares de bases).

Los AON de acuerdo con la presente invención tienen ciertas ventajas sobre los oligonucleótidos descritos en los documentos WO 2016/097212 y PCT/EP2017/065467, en el sentido de que no hay necesidad de estructuras de horquilla o tallo-bucle, que permiten que los AON de la presente invención sean (considerablemente) más cortos. Los oligonucleótidos descritos en el documento WO 2016/097212 tienen el riesgo potencial de secuestrar la enzima ADAR presente en la célula. En este contexto, secuestrar significa que una proteína ADAR natural puede unirse a los oligonucleótidos incluso en ausencia de la formación de un complejo de ARNcd entre la porción de direccionamiento del oligonucleótido y el ARN objetivo. Esta unión directa de ADAR a los oligonucleótidos debido a la presencia de una estructura de tallo-bucle intramolecular, en ausencia de secuencias de ARN objetivo, no tiene lugar cuando se utilizan los AON de la presente invención, que no comprenden una porción que sea capaz de formar una estructura de tallobucle intramolecular. Hay muchos casos en los que se evita preferiblemente la presencia de estructuras de horquilla y/o (tallo)-bucle.

Es un aspecto importante de la invención que el AON comprenda uno o más nucleótidos con una o más modificaciones de azúcar. Por lo tanto, un solo nucleótido del AON puede tener una o más de una modificación de azúcar. Dentro del AON, uno o más nucleótidos pueden tener tales modificaciones de azúcar.

Es un aspecto importante de la invención que el nucleótido dentro del AON de la presente invención que es opuesto al nucleótido que necesita ser editado no contiene una modificación 2'-O-metilo (en este documento y en otros lugares se hace referencia a menudo como un grupo 2'-OMe, como 2'-O-metilación o como un grupo 2'-O-metilo). Se prefiere que los nucleótidos que son directamente 3' y 5' de este nucleótido (los 'nucleótidos vecinos' en el Triplete Central) también carezcan de dicha modificación química, aunque se cree que se tolera que uno o ambos de los nucleótidos vecinos puedan contener un grupo 2'-O-alquilo (tal como un grupo 2'-O-metilo). Uno o ambos nucleótidos vecinos o los tres nucleótidos del Triplete Central pueden ser 2'-OH o una sustitución compatible (como se define en el presente documento).

Otro aspecto importante del AON de la presente invención es que no tiene una porción (que no es complementaria a la secuencia objetivo o la región que comprende la adenosina objetivo) que permita al a On en sí mismo plegarse en una horquilla intramolecular u otro tipo de estructura de (tallo)-bucle (en la presente memoria también denominada "auto-formación de bucle" o "formación propia de bucle") en condiciones fisiológicas, y que puede actuar potencialmente como una estructura que secuestra ADAR. En un aspecto preferido, el AON de cadena sencilla de la presente invención es completamente complementario con el ARN objetivo, aunque opcionalmente puede tener faltas de coincidencia en varias posiciones, especialmente la posición en la adenosina objetivo.

Los AON preferidos de la presente invención no incluyen una modificación de O6-bencilguanosina en terminal 5' o una modificación amino en el terminal 5', y no están unidas covalentemente a un dominio de etiqueta SNAP (una O6-alquilguanosina-ADN-alquil transferasa modificada) en contraste con Vogel et al., (2014). El dominio de la etiqueta SNAP se deriva de la proteína de reparación del ADN humano O6-alquilguanosina-ADN-alquil transferasa (a Gt ) y puede marcarse covalentemente en células vivas usando derivados de O6-bencilguanosina. Vogel et al., (2014) divulga ARN guía con una longitud total de 20 o 17 nucleótidos, en los que los primeros tres nucleótidos en el extremo 5' no se unen a la secuencia de ARN objetivo, sino que unen al ARN guía al dominio de etiqueta SNAP. La porción del ARN guía que se une a la secuencia de ARN objetivo tiene, por lo tanto, 14 o 17 nucleótidos de longitud. Los ARN guía, de las mismas longitudes, con una modificación amino del terminal 5' en lugar de la modificación O6-bencilguanosina del terminal 5' también se describen en Vogel et al., (2014), sin embargo, solo se detectó muy poca o ninguna desaminación o la secuencia de ARN objetivo. En una realización, el AON de la presente invención comprende 0, 1,2 o 3 faltas de coincidencia con la secuencia de ARN objetivo, en el que una sola falta de coincidencia puede comprender múltiples nucleótidos secuenciales.

De manera similar, un AON preferido de la presente invención no incluye una secuencia en horquilla de ARN de caja B, en contraste con Montiel-Gonzalez et al., (2013). La secuencia de horquilla de ARN de caja B utilizada en Montiel-Gonzalez et al., (2013) es un tramo corto de ARN de 17 nucleótidos que es reconocido por la proteína N del bacteriófago lambda. La transcripción de genes posteriores en los primeros operones del bacteriófago requiere un elemento próximo al promotor conocido como nut. Este sitio actúa en cis en forma de ARN para ensamblar un complejo anti-terminación de la transcripción que está compuesto por una proteína N del bacteriófago lambda y factores del huésped. El ARN del sitio nut contiene una estructura pequeña de tallo-bucle llamada caja B. La secuencia en horquilla de ARN de caja B se conoce en la técnica como un palíndromo interrumpido con el potencial para formar una estructura en horquilla (tallo-bucle). Su secuencia varía entre los parientes del bacteriófago lambda que codifican distintos homólogos de N específicos del genoma. Ni Vogel et al., (2014) ni Montiel-Gonzalez et al., (2013) utilizan una enzima ADAR de mamífero presente en la célula, en la que la enzima ADAR comprende su dominio de unión natural a ARNcd como se encuentra en la enzima de tipo silvestre. Vogel et al., (2014) utiliza una proteína de fusión modificada genéticamente que comprende el dominio de adenosina desaminasa de ADAR1 o 2 fusionado a un dominio de etiqueta SNAP y Montiel-Gonzalez et al., utiliza una proteína de fusión modificada genéticamente que comprende el dominio de adenosina desaminasa de la proteína hADAR2, fusionada a la dominio de reconocimiento de caja B de la proteína N del bacteriófago lambda. A diferencia de la técnica anterior, los AON de la presente invención usan una enzima ADAR de mamífero presente en la célula, en la que la enzima ADAR comprende su dominio de unión natural a ARNcd como se encuentra en la enzima de tipo silvestre. Por lo tanto, no hay necesidad de incorporar una secuencia en horquilla de ARN de caja B, una O6-bencilguanosina del terminal 5', una modificación de terminal amino 5' o un dominio de etiqueta SNAP en el AON de la presente invención, para permitir el reclutamiento de ADAR. Los AON de acuerdo con la presente invención tienen por lo tanto ciertas ventajas sobre los oligonucleótidos descritos en Vogel et al., (2014) y Montiel-Gonzalez et al (2013). Los AON de acuerdo con la presente invención pueden utilizar rutas celulares endógenas y enzimas ADAR disponibles de forma natural para editar específicamente una adenosina objetivo en una secuencia de ARN objetivo. En una realización, un AON de la invención no está unido covalentemente a una O6-alquilguanosina-ADN-alquil transferasa humana. Preferiblemente, un AON de la invención no está unido covalentemente a un polipéptido. En otro aspecto del AON de la presente invención, el AON no tiene una caperuza 5'. En eucariotas, la caperuza 5' consiste en un nucleótido de guanosina conectado al ARN a través de un enlace trifosfato de 5' con 5'. Esta guanosina está metilada en la posición 7 y se denomina 7-metilguanosina.

Los AON de la invención son capaces de desaminar un nucleótido de adenosina objetivo específico en una secuencia de ARN objetivo. Por lo tanto, idealmente sólo se desamina una adenosina. Alternativamente, se desaminan 1, 2 o 3 nucleótidos de adenosina, por ejemplo, cuando las adenosinas objetivo están muy próximas entre sí. Entonces se requeriría la presencia de dos o más 'Tripletes Centrales' en un solo AON y, dependiendo de las distancias, se pueden usar. Sin embargo, si la distancia es demasiado grande para cubrir múltiples adenosinas objetivo con un solo AON, el AON comprende preferiblemente solo un Triplete Central opuesto a la adenosina objetivo especificada y única.

Tomando las características de los AON de la presente invención juntas: no hay necesidad de expresión de ADAR recombinante modificada; no hay necesidad de entidades conjugadas adjuntas al AON; o la presencia de porciones de reclutamiento largas que no son complementarias a la secuencia del ARN objetivo. Además de eso, el AON de la presente invención permite la desaminación específica de una adenosina objetivo presente en la secuencia de ARN objetivo por una inosina mediante una enzima ADAR natural que comprende un dominio de unión natural de ARNdc como se encuentra en la enzima de tipo silvestre, sin la riesgo de edición promiscua en otra parte del complejo ARNcd.

El reclutamiento de citidina desaminasa en un sitio objetivo funciona de la misma manera que para las adenosina desaminasas hADARI y hADAR2. Sin embargo, las citidina desaminasas tienen diferentes requisitos de unión y reconocen diferentes estructuras en sus secuencias de ARN objetivo que determinan la edición de la citidina. Una citidina desaminasa particularmente bien estudiada es la Apobec1 humana. El principio general de la edición de ARN usando un constructo de oligonucleótidos para apuntar a un sitio de edición y para reclutar una entidad de edición residente, naturalmente presente, sigue siendo el mismo para las citidina desaminasas, y es parte de la invención divulgada y reivindicada en el presente documento.

El análisis de los objetivos naturales de las enzimas ADAR ha indicado que estos generalmente incluyen faltas de coincidencia entre las dos cadenas que forman la hélice de ARN editada por ADAR1 o 2. Se ha sugerido que estas faltas de coincidencia mejoran la especificidad de la reacción de edición (Stefl et al., 2006. Structure 14 (2): 345-355; Tian et al., 2011. Nucleic Acids Res 39 (13): 5669-5681). La caracterización de patrones óptimos de nucleótidos emparejados/mal emparejados entre los AON y el ARN objetivo también parece crucial para el desarrollo de una terapia eficiente con AON basada en ADAR.

Otra característica mejorada de los AON de la presente invención es el uso de modificaciones específicas de nucleótidos en puntos predefinidos para garantizar la estabilidad, así como la unión y actividad adecuadas de ADAR. Estos cambios pueden variar y pueden incluir modificaciones en la cadena principal del AON, en la fracción de azúcar de los nucleótidos, así como en las nucleobases o los enlaces fosfodiéster. También pueden estar distribuidos de forma variable a lo largo de la secuencia del AON. Pueden ser necesarias modificaciones específicas para respaldar las interacciones de diferentes residuos de aminoácidos dentro de los dominios de unión al ARN de las enzimas ADAR, así como las del dominio desaminasa. Por ejemplo, enlaces de fosforotioato entre nucleótidos o modificaciones 2'-O-metilo pueden tolerarse en algunas partes del AON, mientras que en otras partes deben ser evitados para no interrumpir interacciones cruciales de la enzima con los grupos fosfato y 2'-OH. Parte de estas reglas de diseño se guían por las estructuras publicadas de ADAR2, mientras que otras deben definirse empíricamente. Pueden existir diferentes preferencias para ADAR1 y ADAR2. Las modificaciones también deben seleccionarse de modo que eviten la degradación de los AON.

También pueden ser necesarias modificaciones específicas de nucleótidos para mejorar la actividad de edición en los ARN del sustrato en los que la secuencia objetivo no es óptima para la edición de ADAR. Trabajos anteriores han establecido que ciertos contextos de secuencia son más fáciles de editar. Por ejemplo, la secuencia objetivo 5'-UAG-3' (con la A objetivo en el medio) contiene los nucleótidos vecinos más cercanos más preferidos para ADAR2, mientras que una secuencia objetivo 5'-CAA-3' está desfavorecida (Schneider et al., 2014. Nucleic Acids Res 42 (10): e87). El reciente análisis estructural del dominio de ADAR2 desaminasa sugiere la posibilidad de mejorar la edición mediante una selección cuidadosa de los nucleótidos que son opuestos al trinucleótido objetivo. Por ejemplo, la secuencia objetivo 5'-CAA-3', emparejada con una secuencia 3'-GCU-5' en la cadena opuesta (con la falta de coincidencia de a C formada en el medio), está desfavorecida porque la base de guanosina choca estéricamente con un cadena lateral de aminoácidos de ADAR2. Sin embargo, en el presente documento se postula que una nucleobase más pequeña, como la inosina, podría encajar mejor en esta posición sin causar choques estéricos, al tiempo que conserva el potencial de emparejamiento de bases con la citosina opuesta. Las modificaciones que podrían mejorar la actividad de secuencias subóptimas incluyen el uso de modificaciones de la cadena principal que aumentan la flexibilidad del AON o, por el contrario, lo fuerzan a una conformación que favorece la edición.

El 'Triplete Central' como se usa y define en este documento son los tres nucleótidos opuestos a la adenosina objetivo en el ARN objetivo, en el que el nucleótido medio en el Triplete Central está directamente opuesto a la adenosina objetivo. El Triplete Central no tiene que estar en el medio (en el centro) del AON, puede estar ubicado más al extremo 3' tanto como al extremo 5' del AON, lo que se prefiera para un determinado objetivo. Por lo tanto, central en este aspecto tiene más el significado del triplete que está en el centro de la actividad catalítica cuando se trata de modificaciones químicas y dirigidas a la adenosina objetivo. También debe tenerse en cuenta que los AON a veces se representan de 3' a 5', especialmente cuando la secuencia objetivo se muestra de 5' a 3'. Sin embargo, siempre que en este documento se discute el orden de los nucleótidos dentro del AON, es siempre de 5' a 3' del AON. Por ejemplo, el primer nucleótido del Triplete Central en ADAR60-1 es la U del triplete 5'-UCG-3'. La posición también se puede expresar en términos de un nucleótido particular dentro del AON mientras aún se adhiere a la direccionalidad 5' a 3', en cuyo caso otros nucleótidos 5' de dicho nucleótido se marcan como posiciones negativas y esos 3' como posiciones positivas. Por ejemplo, la C en el Triplete Central es el nucleótido (en la posición 0) opuesto a la adenosina objetivo y la U sería en este caso el nucleótido -1 y la G sería el nucleótido 1, etc.

Como se describe en este documento, y en la mayoría de los ejemplos de AON divulgados en este documento, los nucleótidos fuera del Triplete Central están modificados con 2'-O-metilo. Sin embargo, esto no es un requisito de los AON de la presente invención. El uso de 2'-O-metilación en esos nucleótidos asegura una estabilidad adecuada de esas partes del AON, pero también se pueden aplicar otras modificaciones, tales como modificaciones de 2'-O-metoxietilo (2'-O-MOE).

Los términos 'adenina', 'guanina', 'citosina', 'timina', 'uracilo' e 'hipoxantina' (la nucleobase en la inosina), tal como se utilizan en el presente documento, se refieren a las nucleobases como tales.

Los términos 'adenosina', 'guanosina', 'citidina', 'timidina', 'uridina' e 'inosina' se refieren a las nucleobases unidas al azúcar (desoxi)ribosilo.

El término 'nucleósido' se refiere a la nucleobase unida al azúcar (desoxi)ribosilo.

El término 'nucleótido' se refiere a la nucleobase-(desoxi)ribosil-fosfoenlazadora respectiva, así como a cualquier modificación química de la fracción de ribosa o del grupo fosfo. Por lo tanto, el término incluiría un nucleótido que incluye una fracción ribosilo bloqueada (que comprende un puente 2'-4', que comprende un grupo metileno o cualquier otro grupo, bien conocido en la técnica), un nucleótido que incluye un enlazador que comprende un fosfodiéster, fosfotriéster, fosforo(di)tioato, metilfosfonatos, enlazadores de fosforamidato y similares.

A veces, los términos adenosina y adenina, guanosina y guanina, citosina y citidina, uracilo y uridina, timina y timidina, inosina e hipoxantina, se usan indistintamente para referirse a la nucleobase, nucleósido o nucleótido correspondiente.

A veces, los términos nucleobase, nucleósido y nucleótido se usan indistintamente, a menos que el contexto claramente requiera lo contrario.

Siempre que se hace referencia a un 'oligonucleótido', se entienden tanto oligorribonucleótidos como desoxioligorribonucleótidos a menos que el contexto indique lo contrario. Siempre que se haga referencia a un 'oligorribonucleótido', este puede comprender las bases A, G, C, U o I. Siempre que se haga referencia a un 'desoxioligorribonucleótido', puede comprender las bases A, G, C, T o I. En un aspecto preferido, el AON de la presente invención es un oligorribonucleótido que puede comprender modificaciones químicas.

Siempre que se haga referencia a nucleótidos en el constructo del oligonucleótido, tales como citosina, se incluyen 5-metilcitosina, 5-hidroximetilcitosina, pirrolocitidina y p-D-glucosil-5-hidroximetilcitosina; cuando se hace referencia a adenina, se incluyen 2-aminopurina, 2,6-diaminopurina, 3-deazaadenosina, 7-deazaadenosina, 8-azidoadenosina, 8-metiladenosina, 7-aminometil-7-deazaguanosina, 7-deazaguanosina, N6-metiladenina y 7-metiladenina; cuando se hace referencia a uracilo, se incluyen 5-metoxiuracilo, 5-metiluracilo, dihidrouracilo, pseudouracilo y tienouracilo, dihidrouracilo, 4-tiouracilo y 5-hidroximetiluracilo; cuando se hace referencia a guanosina, se incluyen 7-metilguanosina, 8-aza-7-deazaguanosina, tienoguanosina y 1-metilguanosina.

Siempre que se haga referencia a nucleósidos o nucleótidos, se incluyen derivados de ribofuranosa, tales como 2'-desoxi, 2'-hidroxi, 2-fluororibosa y variantes de 2'-O-sustituidas, tales como 2'-O-metilo, así como otras modificaciones, incluidas las variantes con puente 2'-4'.

Siempre que se haga referencia a oligonucleótidos, los enlaces entre dos mononucleótidos pueden ser enlaces fosfodiéster así como modificaciones de los mismos, incluyendo fosfodiéster, fosfotriéster, fosforo(di)tioato, metilfosfonato, enlazadores fósforo-amidato, y similares.

El término 'que comprende' abarca 'que incluye' así como 'que consiste', por ejemplo, una composición "que comprende X" puede consistir exclusivamente en X o puede incluir algo adicional, por ejemplo, X Y.

El término 'aproximadamente' en relación con un valor numérico x es opcional y significa, por ejemplo, x ± 10%.

La palabra 'sustancialmente' no excluye 'completamente', por ejemplo, una composición que está 'sustancialmente libre de Y' puede estar completamente libre de Y. Cuando sea relevante, la palabra 'sustancialmente' puede omitirse de la definición de la invención.

El término 'secuencia abajo' en relación con una secuencia de ácido nucleico significa además a lo largo de la secuencia en la dirección 3'; el término 'secuencia arriba' significa lo contrario. Por lo tanto, en cualquier secuencia que codifique un polipéptido, el codón de inicio está secuencia arriba del codón de parada en la cadena sentido, pero está secuencia abajo del codón de parada en la cadena antisentido.

Las referencias a 'hibridación' normalmente se refieren a una hibridación específica y excluyen la hibridación no específica. La hibridación específica puede ocurrir bajo las condiciones experimentales elegidas, usando técnicas bien conocidas en el arte, para asegurar que la mayoría de interacciones estables entre la sonda y el objetivo sean en las que la sonda y el objetivo tienen al menos el 70%, preferiblemente al menos el 80%, más preferiblemente al menos 90% de identidad de secuencia.

El término 'falta de coincidencia' se usa en este documento para hacer referencia a nucleótidos opuestos en un complejo de ARN de cadena doble que no forma pares de bases perfectos de acuerdo con las reglas de emparejamiento de bases de Watson-Crick. Los pares de bases que no coinciden son los pares de bases G-A, C-A, U-C, A-A, G-G, C-C, U-U. En algunas realizaciones, los AON de la presente invención comprenden 0, 1, 2 o 3 faltas de coincidencia, en las que una sola falta de coincidencia puede comprender varios nucleótidos secuenciales. Los pares de bases oscilantes son: pares de bases G-U, I-U, I-A e I-C.

Un AON de acuerdo con la presente invención puede modificarse químicamente casi en su totalidad, por ejemplo proporcionando a todos los nucleótidos una fracción de azúcar 2'-O-metilado (2'-OMe). Sin embargo, el nucleótido opuesto a la adenosina objetivo no comprende la modificación 2'-O-metilo, y en otro aspecto preferido adicional, al menos uno de los dos nucleótidos vecinos que flanquean el nucleótido opuesto a la adenosina objetivo no comprende una modificación 2'-O-metilo. La modificación completa, en la que todos los nucleótidos en el AON contienen una modificación 2'-O-metilo (incluido el Triplete Central) da como resultado un oligonucleótido no funcional en lo que respecta a la edición de ARN, presumiblemente porque dificulta la actividad de ADAR en la posición objetivo. En general, una adenosina en un ARN objetivo puede protegerse de la edición proporcionando un nucleótido opuesto con un grupo 2'-O-metilo, o proporcionando una guanosina o adenosina como base opuesta, ya que estas dos nucleobases también pueden reducir la edición de la adenosina opuesta.

Se conocen diversas químicas y modificaciones en el campo de los oligonucleótidos que pueden usarse fácilmente de acuerdo con la invención. Los enlaces internucleosídicos regulares entre los nucleótidos se pueden alterar por mono o di-tioación de los enlaces fosfodiéster para producir ésteres de fosforotioato o ésteres de fosforoditioato, respectivamente. Son posibles otras modificaciones de los enlaces internucleosídicos, que incluyen enlaces de amidación y péptidos. En un aspecto preferido, los AON de la presente invención tienen uno, dos, tres, cuatro o más enlaces fosforotioato entre los nucleótidos más terminales del AON (por lo tanto, preferiblemente en el extremo 5' y 3'), lo que significa que en el caso de cuatro enlaces fosforotioato, los 5 nucleótidos finales se enlazan en consecuencia. El experto en la materia entenderá que el número de tales enlaces puede variar en cada extremo, dependiendo de la secuencia objetivo, o basándose en otros aspectos, tales como la toxicidad.

El azúcar ribosa se puede modificar mediante la sustitución de la fracción 2'-O con un alquilo inferior (C1-4, tal como 2'-O-metilo), alquenilo (C2-4), alquinilo (C2-4), metoxietilo (2'-O-MOE), -H (como en el a Dn ) u otro sustituyente. Los sustituyentes preferidos del grupo 2'-OH son un grupo metilo, metoxietilo o 3,3'-dimetilalilo. Este último es conocido por su propiedad de inhibir la sensibilidad a las nucleasas debido a su volumen, mientras mejora la eficiencia de la hibridación (Angus & Sproat. 1993. FEBS Vol. 325, No. 1, 2, 123-7). Alternativamente, se pueden aplicar secuencias de ácido nucleico bloqueadas (LNA), que comprenden un enlace de puente intramolecular 2'-4' (normalmente un puente de metileno entre el oxígeno 2' y el carbono 4') dentro del anillo de ribosa. Las nucleobases de purina y/o las nucleobases de pirimidina pueden modificarse para alterar sus propiedades, por ejemplo mediante aminación o desaminación de los anillos heterocíclicos. Las químicas y los formatos exactos pueden depender de un constructo del oligonucleótido a otro y de una aplicación a otra, y pueden elaborarse de acuerdo con los deseos y preferencias de los expertos en la técnica. Se cree en la técnica que 4 o más nucleótidos de ADN consecutivos (4 desoxirribosas consecutivas) en un oligonucleótido crean los denominados gapmers que, cuando se hibridan con sus secuencias afines de ARN, inducen la escisión del ARN objetivo por la RNasaH. De acuerdo con la presente invención, la escisión por RNasaH del ARN objetivo generalmente debe evitarse tanto como sea posible.

El AON de acuerdo con la invención debería tener normalmente más de 10 nucleótidos, preferiblemente más de 11, 12, 13, 14, 15, 16, aún más preferiblemente más de 17 nucleótidos. En una realización, el AON de acuerdo con la invención tiene más de 20 nucleótidos. El oligonucleótido de acuerdo con la invención es preferiblemente más corto de 100 nucleótidos, aún más preferiblemente más corto de 60 nucleótidos. En una realización, el AON de acuerdo con la invención tiene menos de 50 nucleótidos. En un aspecto preferido, el oligonucleótido de acuerdo con la invención comprende de 18 a 70 nucleótidos, más preferiblemente comprende de 18 a 60 nucleótidos e incluso más preferiblemente comprende de 18 a 50 nucleótidos. Por lo tanto, en un aspecto más preferido, el oligonucleótido de la presente invención comprende 18, 19, 20, 21,22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35,36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49 o 50 nucleótidos.

Se sabe en la técnica que las entidades de edición de ARN (tales como enzimas ADAR humanas) editan estructuras de ARNdc con especificidad variable, dependiendo de varios factores. Un factor importante es el grado de complementariedad de las dos cadenas que componen la secuencia de ARNcd. La complementariedad perfecta de las dos cadenas suele hacer que el dominio catalítico de hADAR desamine las adenosinas de una manera no discriminativa, reaccionando más o menos con cualquier adenosina que encuentre. La especificidad de hADAR1 y 2 puede aumentarse asegurando una serie de faltas de coincidencia en el ARNcd, que presumiblemente ayudan a posicionar los dominios de unión de ARNcd de una manera que aún no se ha definido claramente. Además, la reacción de desaminación en sí puede mejorarse proporcionando un AON que comprende una falta de coincidencia opuesta a la adenosina que se va a editar. La falta de coincidencia se crea preferiblemente proporcionando una porción de direccionamiento que tiene una citidina opuesta a la adenosina que se va a editar. Como alternativa, también se pueden usar uridinas opuestas a las adenosinas, lo que, comprensiblemente, no dará como resultado una 'falta de coincidencia' porque U y A se emparejan. Tras la desaminación de la adenosina en la cadena objetivo, la cadena objetivo obtendrá una inosina que, para la mayoría de los procesos bioquímicos, es "leída" por la maquinaria bioquímica de la célula como una G. Por lo tanto, después de la conversión de A en I, la falta de coincidencia se ha resuelto , porque I es perfectamente capaz de emparejar bases con la C opuesta en la porción de direccionamiento del constructo del oligonucleótido de acuerdo con la invención. Una vez que la falta de coincidencia se ha resuelto debido a la edición, se libera el sustrato y el complejo de la entidad de edición del constructo del oligonucleótido se libera de la secuencia de ARN objetivo, que luego está disponible para procesos bioquímicos posteriores, tales como empalme y traducción.

El nivel deseado de especificidad para editar la secuencia de ARN objetivo puede depender de una aplicación a otra. Siguiendo las instrucciones de la presente solicitud de patente, los expertos en la técnica serán capaces de diseñar la porción complementaria del oligonucleótido de acuerdo con sus necesidades y, con algo de prueba y error, obtener el resultado deseado.

El oligonucleótido de la invención comprenderá normalmente los nucleótidos A, G, U y C normales, pero también puede incluir inosina (I), por ejemplo, en lugar de uno o más nucleótidos G.

Para evitar la edición no deseada de adenosinas en la secuencia de ARN objetivo en la región de solapamiento con el constructo del oligonucleótido, el oligonucleótido puede modificarse químicamente. Se ha demostrado en la técnica que la 2'-O-metilación de la fracción ribosilo de un nucleósido opuesto a una adenosina en la secuencia de ARN objetivo reduce drásticamente la desaminación de esa adenosina por ADAR (Vogel et al., 2014). Este es un grave inconveniente para usar tales AON en entornos terapéuticos y es un propósito de la presente invención resolver, al menos en parte, el problema de tener nucleótidos de ARN sin modificar en un AON, lo que lo hace propenso a degradarse.

Las moléculas de edición de ARN en la célula serán normalmente de naturaleza proteica, como las enzimas ADAR que se encuentran en los metazoos, incluidos los mamíferos. Preferiblemente, la entidad de edición es una enzima, más preferiblemente una adenosina desaminasa o una citidina desaminasa, aún más preferiblemente una adenosina desaminasa. Las de mayor interés son las ADAR humanas, hADAR1 y hADAR2, incluidas sus isoformas, tales como hADAR1 p110 y p150. Las enzimas de edición de ARN conocidas en la técnica, para las cuales se pueden diseñar convenientemente constructos de oligonucleótidos de acuerdo con la invención, incluyen las adenosina desaminasas que actúan sobre el ARN (ADAR), tales como hADAR1 y hADAR2 en humanos o células humanas y citidina desaminasas. Se ha descrito ADAR3 humana (hADAR3) en la técnica anterior, pero según se informa no tiene actividad desaminasa. Se sabe que hADAR1 existe en dos isoformas; una versión larga inducible por interferón de 150 kDa y una versión más corta, de 100 kDa, que se produce mediante un corte y empalme alternativo a partir de un pre-ARNm común. En consecuencia, el nivel de la isoforma de 150 kDa presente en la célula puede verse influida por el interferón, en particular el interferón-gamma (IFN-gamma). hADAR1 también es inducible por TNF-alfa. Esto proporciona una oportunidad para desarrollar una terapia de combinación, mediante la cual el interferón-gamma o TNF-alfa y los oligonucleótidos de acuerdo con la invención se administran a un paciente como un producto de combinación o como productos separados, simultáneamente o posteriormente, en cualquier orden. Ciertas condiciones de la enfermedad pueden coincidir ya con niveles elevados de IFN-gamma o TNF-alfa en ciertos tejidos de un paciente, creando más oportunidades para hacer que la edición sea más específica para los tejidos enfermos.

Los ejemplos de modificaciones químicas en los AON de la presente invención son modificaciones de la fracción de azúcar, incluso mediante sustituyentes de entrecruzamiento dentro de la fracción de azúcar (ribosa) (por ejemplo, como en los ácidos nucleicos bloqueados: LNA), por sustitución del átomo 2'-O con grupos alquilo (por ejemplo, 2'-O-metilo), alquinilo (2'-O-alquinilo), alquenilo (2'-O-alquenilo), alcoxialquilo (por ejemplo, metoxietilo: 2'-O-MOE), que tiene una longitud como la especificada anteriormente, y similares. Además, el grupo fosfodiéster de la cadena principal puede modificarse mediante tioación, ditioación, amidación y similares para producir fosforotioato, fosforoditioato, fosforamidato, etc., enlaces internucleosídicos. Los enlaces internucleotídicos se pueden reemplazar total o parcialmente por enlaces peptídicos para producir secuencias de ácido peptidonucleico y similares. Alternativamente, o además, las nucleobases pueden modificarse mediante (des)aminación, para producir inosina o 2'6'-diaminopurinas y similares. Una modificación adicional puede ser la metilación del C5 en la fracción de citidina del nucleótido, para reducir las propiedades inmunogénicas potenciales que se sabe que están asociadas con las secuencias de CpG.

En caso de que el complejo ARNcd reclute enzimas ADAR para desaminar una A a una I en la secuencia de ARN objetivo, el par de bases, la falta de coincidencia, la protuberancia o la oscilación entre la adenosina que se va a editar y el nucleótido opuesto puede comprender una adenosina, una guanosina, una uridina o un residuo de citidina, pero preferiblemente un residuo de citidina. Excepto por la posible falta de coincidencia opuesta al sitio de edición (cuando no se aplica uridina), la porción restante del AON puede ser perfectamente complementaria al ARN objetivo. Sin embargo, como se muestra en el presente documento, en ciertos aspectos la invención se refiere a AON que comprenden un número limitado de coincidencias imperfectas. Una persona con experiencia normal en la técnica entenderá que el grado en el que las entidades de edición dentro de la célula se redirigen a otros sitios objetivo puede regularse variando la afinidad de los oligonucleótidos de acuerdo con la invención por el dominio de reconocimiento de la molécula de edición. La modificación exacta puede determinarse mediante ensayo y error y/o mediante procedimientos informáticos basados en interacciones estructurales entre el oligonucleótido y el dominio de reconocimiento de la molécula de edición.

Además, o alternativamente, el grado de reclutamiento y redireccionamiento de la entidad de edición residente en la célula puede regularse mediante la dosificación y el régimen de dosificación del oligonucleótido. Esto es algo que debe determinar el experimentador (in vitro) o el médico, generalmente en ensayos clínicos de fase I y/o II. La invención se refiere a la modificación de secuencias de ARN objetivo en células eucariotas, preferiblemente de metazoo, más preferiblemente de mamíferos. En principio, la invención puede usarse con células de cualquier especie de mamífero, pero preferiblemente se usa con una célula humana.

La invención puede usarse con células de cualquier órgano, por ejemplo, piel, pulmón, corazón, riñón, hígado, páncreas, intestino, músculo, glándula, ojos, cerebro, sangre y similares. La invención es particularmente adecuada para modificar secuencias en células, tejidos u órganos implicados en un estado de enfermedad de un sujeto (humano). Tales células incluyen, pero no se limitan a, células epiteliales de pulmón o del tracto gastrointestinal, células de los órganos reproductores, células musculares, células del ojo, células de la piel, células de tejidos y órganos tales como hígado, riñón, páncreas, células inmunes, células cancerosas, células de glándulas, células del cerebro y similares. La invención también se puede usar con células de mamífero que no están presentes de forma natural en un organismo, por ejemplo, con una línea celular o con una célula madre embrionaria (ES). La invención puede usarse con varios tipos de células madre, incluyendo células madre pluripotentes, células madre totipotentes, células madre embrionarias, células madre pluripotentes inducidas, etc. La célula puede localizarse in vitro o in vivo. Una ventaja de la invención es que puede usarse con células in situ en un organismo vivo, pero también puede usarse con células en cultivo. En algunas realizaciones, las células se tratan ex vivo y luego se introducen en un organismo vivo (por ejemplo, se reintroducen en un organismo del que se derivaron originalmente). La invención también puede usarse para editar secuencias de ARN objetivo en células dentro de un llamado organoide. Se puede pensar en los organoides como tejidos tridimensionales derivados in vitro, pero se manejan usando condiciones específicas para generar tejidos aislados individuales (por ejemplo, véase Lancaster & Knoblich, Science 2014, vol. 345 No. 6194 1247125). En un entorno terapéutico, son útiles porque pueden derivarse in vitro de las células de un paciente, y los organoides pueden reintroducirse al paciente como material autólogo que es menos probable que sea rechazado que un trasplante normal. Por lo tanto, de acuerdo con otra realización preferida, la invención se puede practicar en organoides cultivados a partir de muestras de tejido tomadas de un paciente (por ejemplo, de su tracto gastrointestinal; vease Sala et al., J Surg Res. 2009; 156 (2): 205-12, y también Sato et al., Gastroenterology 2011; 141: 1762-72); tras la edición de ARN de acuerdo con la invención, los organoides, o las células madre que residen dentro de los organoides, pueden usarse para trasplantarse de nuevo al paciente para mejorar la función del órgano.

La célula a tratar generalmente tendrá una mutación genética. La mutación puede ser heterocigótica u homocigótica. La invención se utilizará típicamente para modificar mutaciones puntuales, tales como mutaciones de N por A, en las que N puede ser G, C, U (a nivel T del ADN), preferiblemente mutaciones de G por A, o mutaciones de N por C, en las que N puede ser A, G, U (a nivel T del ADN), preferiblemente mutaciones U por C. A continuación se analizan los genes que contienen mutaciones de interés particular. En algunas realizaciones, sin embargo, la invención se usa de manera opuesta al introducir una mutación asociada a la enfermedad en una línea celular o un animal, con el fin de proporcionar una herramienta de investigación útil para la enfermedad en cuestión. Como ejemplo de creación de un modelo de enfermedad, se puede proporcionar una secuencia de oligonucleótidos que permita el reclutamiento de la actividad de edición en una célula humana para crear una mutación en el gen CEP290, creando un sitio de empalme críptico que forma la base para una forma Amaurosis congénita, de Leber, la forma más común de ceguera infantil congénita. También se puede imaginar que las secuencias no mutadas se dirijan a la edición de ARN, por ejemplo, para alterar el empalme de un ARN objetivo particular, de modo que una versión mutante de ese gen objetivo se traduzca de otra manera, aliviando así la enfermedad. El experto en la materia conoce todo tipo de posibilidades para modificar el ARN objetivo para una amplia variedad de propósitos.

Puede haber surgido una mutación a revertir mediante la edición de ARN a nivel del cromosoma o alguna otra forma de ADN, tal como ADN mitocondrial o ARN, incluyendo pre-ARNm, ARN ribosómico o ARN mitocondrial. Puede realizarse un cambio en un ARN objetivo de un patógeno, incluidos hongos, levaduras, parásitos, cinetoplastos, bacterias, fagos, virus, etc., con los que se ha infectado la célula o el sujeto. Posteriormente, la edición puede tener lugar a nivel de ARN en una secuencia objetivo dentro de dicha célula, sujeto o patógeno. Ciertos patógenos, como los virus, liberan su ácido nucleico, ADN o ARN en la célula del huésped infectado (célula). Otros patógenos residen o circulan en el huésped infectado. Los constructos de oligonucleótidos de la invención pueden usarse para editar secuencias de ARN objetivo que residen en una célula del huésped eucariota infectado, o para editar una secuencia de ARN dentro de la célula de un patógeno que reside o circula en el huésped eucariota, siempre que las células en las tiene lugar la edición contengan una entidad de edición compatible con el constructo del oligonucleótido administrada a la misma.

Sin desear estar ligado a la teoría, se cree que la edición de ARN a través de hADAR1 y hADAR2 tiene lugar en transcripciones primarias en el núcleo, durante la transcripción o empalme, o en el citoplasma, en el que por ejemplo, se pueden editar ARNm, miARN o ARN no codificante maduros. Se sabe que diferentes isoformas de las enzimas de edición se localizan diferencialmente, por ejemplo, con hADAR1 p110 que se encuentra principalmente en el núcleo y hADAR1 p150 en el citoplasma. Se cree que la edición de ARN por citidina desaminasas tiene lugar a nivel del ARNm. No se excluye la edición de codones de ARN mitocondrial o secuencias no codificantes en ARNm maduros.

La invención se usa para realizar un cambio en una secuencia de ARN objetivo en una célula eucariota mediante el uso de un oligonucleótido que es capaz de dirigirse a un sitio para ser editado y reclutar entidades de edición de ARN residentes en la célula para producir la reacción o reacciones de edición. Las reacciones de edición preferidas son desaminaciones de adenosina y desaminaciones de citidina, que convierten las adenosinas en inosinas y las citidinas en uridinas, respectivamente. Los cambios pueden ser en regiones 5' o 3' no traducidas de un ARN objetivo, en sitios de empalme (crípticos), en exones (cambio de aminoácidos en proteína traducida del ARN objetivo, uso de codones o comportamiento de empalme al cambiar silenciadores o potenciadores de empalme exónico, mediante la introducción o eliminación de codones de inicio o parada), en intrones (cambio de empalme alterando silenciadores de empalme intrónico o potenciadores de empalme intrónico, puntos de ramificación) y en general en cualquier región que afecte a la estabilidad, estructura o funcionamiento del ARN. La secuencia de ARN objetivo puede comprender una mutación que se puede desear corregir o alterar, tal como una mutación puntual (una transición o una transversión). Alternativamente, la secuencia de ARN objetivo se muta deliberadamente para crear un fenotipo alterado (o genotipo, en el caso de organismos basados en ARN, tales como los virus de ARN), en los que antes no había mutación. Por ejemplo, se pueden crear líneas celulares o animales que porten cambios (mutaciones) en una secuencia de ARN objetivo, que se pueden usar en ensayos o como sistemas modelo (animal, organoide, etc.) para estudiar enfermedades, probar compuestos experimentales contra enfermedades y similares. Los constructos de oligonucleótidos y los procedimientos de acuerdo con la invención se pueden usar en sistemas de cribado de alto rendimiento (en formato de matriz) para fabricar bancos de células con una gran variedad de ARN objetivo, por ejemplo, codificando una gran variedad de isoformas de proteínas, para experimentación adicional, que incluye cribado de compuestos, modificación de proteínas y similares. El ARN objetivo puede ser cualquier secuencia de a Rn celular o viral, pero más habitualmente es un pre-ARNm o un ARNm con una función de codificación de proteínas.

Simplemente para facilitar la referencia, y sin la intención de limitar la invención, la Tabla 1 a continuación se proporciona para ilustrar los posibles cambios de codones que pueden producirse mediante la edición de adenosina desaminasa dirigida por oligonucleótidos de la invención. En particular, la Tabla 1 no debe interpretarse como una limitación de la aplicabilidad de la invención a secuencias codificantes en cualquier ARN; como ya se señaló, la invención se puede practicar en cualquier ARN objetivo que comprenda una adenosina, ya sea en una región codificante, un intrón, un exón no codificante (tal como una región no traducida 5' o 3'), en miARN, ARNt, ARNr , y así sucesivamente. Para evitar malentendidos sobre la amplitud de la aplicabilidad, los cambios que son intrascendentes ('silenciosos') desde una perspectiva de codificación aún pueden alterar la expresión génica de una determinada proteína, ya que algunos codones para el mismo aminoácido pueden ser más preferidos que otros y pueden conducir, por ejemplo, a diferente estabilidad de transcripción o eficiencia de traducción, lo que hace que la proteína codificada se vuelva más o menos abundante que sin el cambio.

Tabla 1.

continuación

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Las adenosinas objetivo particularmente interesantes para editar usando oligonucleótidos de acuerdo con la invención son aquellas que forman parte de codones para residuos de aminoácidos que definen funciones o características clave, tales como sitios catalíticos, sitios de unión para otras proteínas, unión por sustratos, dominios de localización, para la modificación cotraduccional o postraduccional, tales como glicosilación, hidroxilación, miristoilación, escisión de proteínas por proteasas (para madurar la proteína y/o como parte del enrutamiento intracelular), y así sucesivamente.

Una gran cantidad de enfermedades genéticas son causadas por mutaciones G por A, y estas son enfermedades objetivo preferidas porque la desaminación de adenosina en la adenosina objetivo mutada revertirá la mutación a tipo silvestre. Sin embargo, la reversión a tipo silvestre puede no ser siempre necesaria para obtener un efecto beneficioso. La modificación de una A por una G en un objetivo también puede ser beneficiosa si el nucleótido de tipo silvestre es distinto de G. En ciertas circunstancias, se puede predecir que este será el caso, en otras, esto puede requerir algunas pruebas. En ciertas circunstancias, la modificación de una A en un ARN objetivo por una G en la que el tipo silvestre no es una G puede ser silenciosa (no traducida a un aminoácido diferente), o no tener consecuencias (por ejemplo, un aminoácido es sustituido pero constituye una sustitución conservadora que no altera la estructura y función de la proteína), o el aminoácido es parte de un dominio funcional que tiene cierta robustez al cambio. Si la transición de A por G provocada por la edición de acuerdo con la invención es en un ARN no codificante, o una porción no codificante de un ARN, la consecuencia también puede ser intrascendente o menos severa que la mutación original. Los expertos en la técnica comprenderán que la aplicabilidad de la presente invención es muy amplia y ni siquiera se limita a prevenir o tratar enfermedades. La invención también puede usarse para modificar transcripciones para estudiar el efecto de las mismas, incluso si, o particularmente cuando, tal modificación induce un estado de enfermedad, por ejemplo en una célula o en un modelo animal no humano.

Los ejemplos preferidos de enfermedades genéticas que se pueden prevenir y/o tratar con oligonucleótidos de acuerdo con la invención son cualquier enfermedad en la que la modificación de una o más adenosinas en un ARN objetivo producirá un cambio (potencialmente) beneficioso.

Las secuencias de ARN transcritas que son posibles secuencias de ARN objetivo de acuerdo con la invención, que contienen mutaciones de particular interés incluyen, pero no se limitan a, las transcritas del gen CFTR (el regulador de la conductancia transmembrana de la fibrosis quística), distrofina, huntingtina, neurofibromina 1 , neurofibromina 2, la cadena de p-globina de la hemoglobina, CEP290 (proteína centrosomal de 290 kDa), el gen HEXA de la phexosaminidasa A y cualquiera de los genes Usher (por ejemplo, USH2B que codifica Usherina) responsable de una forma de ceguera genética llamada síndrome de Usher. A continuación se presenta una lista más extensa. La secuencia objetivo se seleccionará en consecuencia, y el constructo de oligonucleótidos incluirá la modificación deseada para corregir la mutación.

Los expertos en la técnica de las mutaciones de FQ reconocen que se conocen entre 1000 y 2000 mutaciones en el gen CFTR, incluyendo R117H, G542X, G551D, R553X, W1282X y N1303K.

En general, las mutaciones en cualquier ARN objetivo que se pueden revertir usando constructos de oligonucleótidos de acuerdo con la invención son mutaciones G por A, en el caso del reclutamiento de adenosina desaminasa, y mutaciones U por C en el caso del reclutamiento de citidina desaminasas y los constructos de oligonucleótidos pueden diseñarse en consecuencia. Las mutaciones que pueden ser dirigidas utilizando constructos de oligonucleótidos de acuerdo con la invención también incluyen C por A, U por A (T por A en el nivel de ADN) en el caso de reclutar adenosina desaminasas, y mutaciones A por C y G por C en el caso de reclutamiento de citidina desaminasas. Aunque la edición de ARN en las últimas circunstancias puede no necesariamente revertir la mutación al tipo silvestre, el nucleótido editado puede dar lugar a una mejora con respecto a la mutación original. Por ejemplo, una mutación que causa un codón de parada en marco, que da lugar a una proteína truncada, tras la traducción, puede cambiarse a un codón que codifica un aminoácido que puede no ser el aminoácido original en esa posición, pero que da lugar a una proteína (de longitud completa) con al menos alguna funcionalidad, al menos más funcionalidad que la proteína truncada.

La secuencia objetivo es endógena a la célula eucariota, preferiblemente de mamífero, más preferiblemente humana. Por lo tanto, la secuencia objetivo no es, por ejemplo, un transgén o un gen marcador que se haya introducido artificialmente en algún momento de la historia de la célula, sino que es un gen que está presente de forma natural en la célula (ya sea en forma mutante o no mutante).

La invención no se limita a corregir mutaciones, ya que en cambio puede ser útil cambiar una secuencia de tipo silvestre en una secuencia mutada aplicando oligonucleótidos de acuerdo con la invención. Un ejemplo en el que puede ser ventajoso modificar una adenosina de tipo silvestre es provocar la omisión de un exón, por ejemplo, modificando una adenosina que resulta ser un sitio de ramificación requerido para el empalme de dicho exón. Otro ejemplo es cuando la adenosina define o es parte de una secuencia de reconocimiento para la unión a proteínas, o está involucrada en una estructura secundaria que define la estabilidad del ARN. Por lo tanto, como se señaló anteriormente, la invención puede usarse para proporcionar herramientas de investigación para enfermedades, para introducir nuevas mutaciones que sean menos perjudiciales que una mutación existente, etc.

La cantidad de oligonucleótido a administrar, la dosis y el régimen de dosificación pueden variar de un tipo de célula a otro, la enfermedad a tratar, la población objetivo, el modo de administración (por ejemplo, sistémica versus local), la gravedad de la enfermedad y el nivel aceptable de actividad secundaria, pero estos pueden y deben evaluarse mediante ensayo y error durante la investigación in vitro, en ensayos preclínicos y clínicos. Los ensayos son particularmente sencillos cuando la secuencia modificada conduce a un cambio fenotípico fácilmente detectable. Es posible que dosis más altas de oligonucleótidos puedan competir por unirse a una entidad de edición de ácido nucleico (por ejemplo, ADAR) dentro de una célula, agotando así la cantidad de la entidad que está libre para participar en la edición de ARN, pero los ensayos de dosificación de rutina revelarán cualquier de tales efectos para un oligonucleótido dado y un objetivo dado.

Una técnica de prueba adecuada implica administrar el constructo de oligonucleótidos a líneas celulares, o un organismo de prueba y luego tomar muestras de biopsia en varios puntos de tiempo a partir de entonces. La secuencia del ARN objetivo se puede evaluar en la muestra de biopsia y se puede seguir fácilmente la proporción de células que tienen la modificación. Una vez que se haya realizado este ensayo entonces, se puede conservar el conocimiento y se puede realizar un administración futura sin necesidad de tomar muestras de biopsia.

Por lo tanto, un procedimiento de la invención puede incluir una etapa de identificación de la presencia del cambio deseado en la secuencia del ARN objetivo de la célula, verificando así que la secuencia de ARN objetivo se ha modificado. Esta etapa implicará típicamente la secuenciación de la parte relevante del ARN objetivo, o una copia de ADNc del mismo (o una copia de ADNc de un producto de empalme del mismo, en caso de que el ARN objetivo sea un pre-ARNm), como se discutió anteriormente, y se puede por lo tanto verificar fácilmente, el cambio de secuencia. Alternativamente, el cambio puede evaluarse a nivel de la proteína (longitud, glicosilación, función o similar), o mediante alguna lectura funcional, tal como una corriente (inducible), cuando, por ejemplo, la proteína codificada por la secuencia del ARN objetivo es un canal de iones. En el caso de la función CFTR, un experto en la técnica conoce bien un ensayo en cámara de Ussing o una prueba NPD en un mamífero, incluidos los seres humanos, para evaluar la restauración o la ganancia de función.

Después de que se ha producido la edición de ARN en una célula, el ARN modificado puede diluirse con el tiempo, por ejemplo debido a la división celular, la semivida limitada de los ARN editados, etc. Por lo tanto, en términos terapéuticos prácticos, un procedimiento de la invención puede implicar la administración repetida de un constructo del oligonucleótido hasta que se hayan modificado suficientes ARN objetivo para proporcionar un beneficio tangible al paciente y/o mantener los beneficios a lo largo del tiempo.

Los oligonucleótidos de la invención son particularmente adecuados para uso terapéutico, por lo que la invención proporciona una composición farmacéutica que comprende un oligonucleótido de la invención y un vehículo farmacéuticamente aceptable. En algunas realizaciones de la invención, el vehículo farmacéuticamente aceptable puede ser simplemente una solución salina. Esta puede ser útilmente isotónica o hipotónica, particularmente para administración pulmonar. La invención también proporciona un dispositivo de administración (por ejemplo, jeringa, inhalador, nebulizador) que incluye una composición farmacéutica de la invención.

La invención también proporciona un oligonucleótido de la invención para usar en un procedimiento para realizar un cambio en una secuencia de ARN objetivo en una célula de mamífero, preferiblemente humana, como se describe en el presente documento. De manera similar, la invención proporciona el uso de un constructo del oligonucleótido de la invención en la fabricación de un medicamento para realizar un cambio en una secuencia de ARN objetivo en una célula de mamífero, preferiblemente humana, como se describe en el presente documento.

La invención también se refiere a un procedimiento para la desaminación de al menos una adenosina objetivo específica presente en una secuencia de ARN objetivo en una célula, comprendiendo dicho procedimiento las etapas de: proporcionar a dicha célula un AON de acuerdo con la invención; permitir la absorción por la célula de dicho AON; permitir la hibridación de dicho AON con la secuencia de ARN objetivo; permitir que una enzima ADAR de mamífero que comprende un dominio de unión de ARNcd natural como se encuentra en la enzima de tipo silvestre desamine dicha adenosina objetivo en dicha secuencia de ARN objetivo hasta una inosina; e identificar opcionalmente la presencia de dicha inosina en la secuencia de ARN. La introducción del AON de acuerdo con la presente invención en la célula se realiza mediante procedimientos generales conocidos por el experto en la técnica. Después de la desaminación, la lectura del efecto (alteración de la secuencia de ARN objetivo) se puede controlar de diferentes maneras. Por lo tanto, la etapa de identificación de si la desaminación deseada de la adenosina objetivo realmente ha tenido lugar depende generalmente de la posición de la adenosina objetivo en la secuencia de ARN objetivo y del efecto en el que se incurre por la presencia de la adenosina (mutación puntual, codón de parada temprano, sitio de empalme aberrante, sitio de empalme alternativo, plegamiento incorrecto de la proteína resultante, etc.). Por lo tanto, en un aspecto preferido, dependiendo del efecto de desaminación final de la conversión de A en i, la etapa de identificación comprende: secuenciar el ARN objetivo; evaluar la presencia de una proteína funcional, alargada, de longitud completa y/o de tipo silvestre cuando dicha adenosina objetivo se localiza en un codón de parada UGA o UAG, que se edita en un codón UGG mediante dicha desaminación; evaluar la presencia de una proteína funcional, alargada, de longitud completa y/o de tipo silvestre cuando dos adenosinas objetivo están ubicadas en un codón de parada UAA, que se edita en un codón UGG mediante la desaminación de ambas adenosinas objetivo; evaluar si el empalme del pre-ARNm fue alterado por dicha desaminación; o usando una lectura funcional, en la que el ARN objetivo después de dicha desaminación codifica una proteína funcional, de longitud completa, alargada y/o de tipo silvestre. En el caso de que haya un codón de parada UAA, significa que ambas adenosinas deben desaminarse. Por lo tanto, la invención también se refiere a oligonucleótidos y procedimientos en los que dos adenosinas que están una al lado de la otra se desaminan conjuntamente mediante una enzima de edición de ARN tal como ADAR. En este caso particular, el codón de parada UAA se convierte en un codón UGG que codifica Trp (vease la Tabla 1). Debido a que la desaminación de la adenosina por una inosina puede resultar en una proteína que ya no sufre de la A mutada en la posición objetivo, la identificación de la desaminación en inosina también puede ser una lectura funcional, por ejemplo, una evaluación de si está presente una proteína funcional, o incluso la evaluación de que una enfermedad causada por la presencia de adenosina se revierte (parcialmente). La evaluación funcional para cada una de las enfermedades mencionadas en este documento se realizará generalmente de acuerdo con procedimientos conocidos por el experto. Cuando la presencia de una adenosina objetivo causa un empalme aberrante, la lectura puede ser la evaluación de si el empalme aberrante todavía se está produciendo, o no, o menos. Por otro lado, cuando se desea la desaminación de una adenosina objetivo para introducir un sitio de empalme, se pueden utilizar enfoques similares para comprobar si realmente se está produciendo el tipo de empalme requerido. Una manera muy adecuada de identificar la presencia de una inosina después de la desaminación de la adenosina objetivo es, por supuesto, la RT-PCR y la secuenciación, usando procedimientos que son bien conocidos por los expertos en la técnica.

La presente invención se refiere a un oligonucleótido antisentido (AON) capaz de formar un complejo de cadena doble con una secuencia de ARN objetivo en una célula, preferiblemente una célula humana, para la desaminación de una adenosina objetivo en la secuencia de ARN objetivo mediante una enzima ADAR presente en la célula, comprendiendo dicho AON un Triplete Central de 3 nucleótidos secuenciales, en el que el nucleótido directamente opuesto a la adenosina objetivo es el nucleótido medio del Triplete Central, en el que 1,2 o 3 nucleótidos en dicho Triplete Central comprenden una modificación de azúcar y/o una modificación de base; con la condición de que el nucleótido medio no tenga una modificación 2'-O-metilo. La modificación de azúcar y/o base de los nucleótidos de la presente invención hace que el AON sea más estable y/o provoca una inducción mejorada de la desaminación de la adenosina objetivo en comparación con los AON que no portan la modificación de azúcar y/o base. En una realización preferida, el nucleótido no complementario que está directamente opuesto a la adenosina objetivo cuando se forma el complejo de cadena doble es una citidina. Esta citidina, junto con los nucleótidos que están directamente 5' y 3' de ella en el AON forman juntos el Triplete Central como se define en el presente documento. Aunque puede haber faltas de coincidencia adicionales entre el AON y la secuencia de ARN objetivo fuera del Triplete Central, la citidina en el centro del Triplete Central forma al menos una falta de coincidencia con la adenosina objetivo en la secuencia objetivo de modo que pueda ser editada por ADAR presente en la célula. La célula es preferiblemente una célula humana y la ADAR es preferiblemente una ADAR humana, más preferiblemente una ADAR endógena en dicha célula sin la necesidad de sobreexpresarla por medios recombinantes. En cualquier caso, el nucleótido medio del Triplete Central no tiene una modificación 2'-O-metilo, lo que permite que actúen las enzimas de edición de ARN celular. En una realización, 1 o 2 nucleótidos en el Triplete Central distintos del nucleótido medio se reemplazan por una inosina. Esto puede ser preferido para permitir un mejor ajuste con la enzima ADAR. En otra realización preferida más, el AON no comprende una porción que sea capaz de formar una estructura de tallo-bucle intramolecular que sea capaz de unirse a una enzima ADAR de mamífero.

Como se ejemplifica en las Figuras 1,2 y 4, el Triplete Central se representa como YXZ o como XXY. Se proporcionan diferentes modificaciones de base. El experto en la materia entenderá que estas modificaciones de base dependen hasta cierto nivel de los nucleótidos opuestos a los nucleótidos del Triplete Central. Por lo tanto, en el ejemplo de YXZ, en el que X es el nucleótido medio opuesto a la adenosina objetivo, X puede ser citidina, 5-metilcitidina, 5-hidroximetilcitidina, uridina o pirrolocitidina, mientras que Y y/o Z pueden ser inosina, 5-metilcitidina, pirrolocitidina, pseudouridina, 4-tiouridina, tienouridina, 2-aminopurina, 2,6-diaminopurina, tienoguanosina, 5-metoxiuridina, dihidrouridina, 5-hidroximetilcitidina, 5-metiluridina, 8-aza-7-deazaguanosina,7-aminometil-7-deazaguanosina, 7-metiladenosina, 8-metiladenosina, 3-deazaadenosina, 7-deazaadenosina, 8-azidoadenosina, etc., dependiendo de los nucleótidos opuestos al Triplete Central; por lo tanto, dependiendo de la secuencia de ARN objetivo y la enfermedad relacionada con ella. Es decir, en una realización preferida, dicha modificación de base se selecciona del grupo que consiste en 2-aminopurina, 2,6-diaminopurina, 3-deazaadenosina, 7-deazaadenosina, 7-metiladenosina, 8-azidoadenosina, 8-metiladenosina, 5-hidroximetilcitidina, 5-metilcitidina, Pirrolocitidina, 7-aminometil-7-deazaguanosina, 7-deazaguanosina, 7-metilguanosina, 8-aza-7-deazaguanosina, tienoguanosina, inosina, 4-tiouridina, 5-metoxiuridina, 5-metiluridina, dihidrouridina, pseudouridina y tienouridina.

En otra realización preferida, la modificación de azúcar se selecciona del grupo que consiste en desoxirribosa (es decir, ADN), ácido nucleico desbloqueado (UNA) y 2'-fluororribosa. En un aspecto particularmente preferido, la presente invención se refiere a un AON que comprende un Triplete Central de 3 nucleótidos secuenciales, en el que el nucleótido directamente opuesto a la adenosina objetivo es el nucleótido medio del Triplete Central, y en el que 1, y preferiblemente 2, e incluso más preferiblemente, los 3 nucleótidos de dicho Triplete Central son nucleótidos de ADN para hacer que el AON sea más estable y/o más eficaz para inducir la desaminación de la adenosina objetivo. En otro aspecto preferido, el resto del AON consiste en nucleótidos de ARN que preferiblemente (pero no necesariamente) están modificados en 2'-O-metilo. Se pueden utilizar otras modificaciones estabilizadoras fuera del Triplete Central. Otras modificaciones de ribosa que son bastante compatibles con la edición dirigida de acuerdo con la invención son 2'-O-metoxietilo (2'-O-MOE), LNA, 2'-F y 2'-NH2. Pueden aplicarse diferentes combinaciones de modificaciones de azúcar (como se enumeran en este documento) de los nucleótidos fuera del Triplete Central. En otro aspecto preferido, el AON de acuerdo con la invención comprende al menos una modificación del enlace internucleósido seleccionada del grupo que consiste en fosforotioato, 3'-metilenfosfonato (es decir, enlace internucleotídico 3'-O-metilfosfonato), 5'-metilenfosfonato (es decir, enlace internucleotídico 5'-O-metilfosfonato), 3'-fosforamidato (es decir, enlace internucleotídico N-3'-fosforamidato) y 2'-5'-fosfodiéster (es decir, enlace internucleotídico 2'-5'-fosfodiéster). Son especialmente preferidos los enlaces fosforotioato. Otros AON preferidos de acuerdo con la invención son AON en los que los 2, 3, 4, 5 o 6 nucleótidos terminales del terminal 5' y 3' del AON están unidos con enlaces fosforotioato, preferiblemente en los que los 5 nucleótidos terminales en el terminal 5' y 3' están unidos con enlaces fosforotioato. Como se divulga en el presente documento, también los nucleótidos dentro del Triplete Central pueden estar conectados a través de enlaces fosforotioato, aunque parece que preferiblemente hay más de uno de estos enlaces presente en el Triplete Central para hacer que el AON sea estable y activo en la edición de ARN. En un aspecto preferido adicional, el AON se hibrida con un oligonucleótido sentido protector (SON) para aumentar la estabilidad y, se plantea la hipótesis, de una actividad prolongada debido al carácter más estable del complejo oligonucleótido antisentido de cadena doble SON. El SON no tiene que tener necesariamente la misma longitud que el oligonucleótido antisentido. Puede ser más largo, igual o más corto.

En un aspecto preferido, todos los nucleótidos en el AON fuera del Triplete Central comprenden un grupo 2'-O-alquilo tal como un grupo 2'-O-metilo, o un grupo 2'-O-metoxietilo. Los nucleótidos fuera del Triplete Central también pueden ser ADN siempre que un tramo de ADN no produzca un gapmer. Además, el AON es preferiblemente más largo de 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16 o 17 nucleótidos, y preferiblemente más corto de 100 nucleótidos, más preferiblemente más corto de 60 nucleótidos. En aún otra realización preferida, el AON comprende de 18 a 70 nucleótidos, más preferiblemente comprende de 18 a 60 nucleótidos e incluso más preferiblemente comprende de 18 a 50 nucleótidos. La invención también se refiere a una composición farmacéutica que comprende el AON de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 12 y un vehículo farmacéuticamente aceptable.

El oligonucleótido de acuerdo con la invención se administra adecuadamente en solución acuosa, por ejemplo, solución salina, o en suspensión, que comprende opcionalmente aditivos, excipientes y otros ingredientes, compatibles con el uso farmacéutico, en concentraciones que varían de 1 ng/ml a 1 g/ml, preferiblemente de 10 ng/ml a 500 mg/ml, más preferiblemente de 100 ng/ml a 100 mg/ml. La dosificación puede oscilar adecuadamente entre aproximadamente 1 |jg/kg y aproximadamente 100 mg/kg, preferiblemente entre aproximadamente 10 jg/kg y aproximadamente 10 mg/kg, más preferiblemente entre aproximadamente 100 jg/kg y aproximadamente 1 mg/kg. La administración puede ser por inhalación (por ejemplo, por nebulización), intranasal, oral, por inyección o infusión, por vía intravenosa, subcutánea, intradérmica, intracraneal, intramuscular, intratraqueal, intraperitoneal, intrarrectal, por inyección directa en un tumor y similares. La administración puede ser en forma sólida, en forma de polvo, pastilla o en cualquier otra forma compatible con el uso farmacéutico en humanos.

La invención es particularmente adecuada para el tratamiento de enfermedades genéticas, tales como fibrosis quística, albinismo, deficiencia de alfa-1-antitripsina (A1AT), enfermedad de Alzheimer, esclerosis lateral amiotrófica, asma, ptalasemia, síndrome de Cadasil, enfermedad de Charcot-Marie-Tooth, enfermedad pulmonar obstructiva crónica (EPOC), atrofia muscular espinal distal (DSMA), distrofia muscular de Duchenne/Becker, epidermólisis ampollosa distrófica, epidermólisis ampollosa, enfermedad de Fabry, trastornos asociados al factor V de Leiden, poliposis adenomatosa familiar, galactosemia, enfermedad de Gaucher, glucosa-6-fosfato deshidrogenasa, hemofilia, hematocromatosis hereditaria, síndrome de Hunter, enfermedad de Huntington, síndrome de Hurler, enfermedad inflamatoria intestinal (IBD), síndrome de poliaglutinación heredada, amaurosis congénita de Leber, síndrome de Lesch-Nyhan, síndrome de Lynch, síndrome de Marfan, mucopolisacaridosis, distrofia muscular, distrofia miotónica tipos I y II, neurofibromatosis, enfermedad de Niemann-Pick tipo A, B y C, cáncer relacionado con NY-eso1, enfermedad de Parkinson, síndrome de Peutz-Jeghers, fenilcetonuria, enfermedad de Pompe, enfermedad ciliar primaria, trastornos relacionados con mutación de protrombina, tales como la mutación G20210A de protrombina, hipertensión pulmonar, retinitis pigmentosa, enfermedad de Sandhoff, síndrome de inmunodeficiencia combinada grave (SCID), anemia de células falciformes, atrofia muscular espinal, enfermedad de Stargardt, enfermedad de Tay-Sachs, síndrome de Usher, inmunodeficiencia ligada al cromosoma X, síndrome de Sturge-Weber, diversas formas de cáncer (por ejemplo, cáncer de mama vinculado a BRCA1 y 2 y cáncer de ovario) y similares.

En algunas realizaciones, el constructo del oligonucleótido puede administrarse sistémicamente, pero es más típico administrar un oligonucleótido a las células en las que se observa el fenotipo de la secuencia objetivo. Por ejemplo, las mutaciones en CFTR provocan fibrosis quística que se observa principalmente en el tejido epitelial pulmonar, por lo que con una secuencia objetivo de CFTR se prefiere administrar el constructo del oligonucleótido específica y directamente a los pulmones. Esto se puede lograr convenientemente mediante inhalación, por ejemplo, de un polvo o aerosol, típicamente mediante el uso de un nebulizador. Especialmente preferidos son los nebulizadores que utilizan la denominada malla vibratoria, incluido el PARI eFlow (Rapid) o el i-neb de Respironics. Los inventores han descubierto que el uso inhalado de constructos de oligonucleótidos puede conducir a la distribución sistémica del constructo del oligonucleótido y la absorción por las células en los tejidos del intestino, hígado, páncreas, riñón y glándulas salivales, entre otros. Por lo tanto, es de esperar que la administración inhalada de constructos de oligonucleótidos de acuerdo con la invención también pueda dirigirse a estas células de manera eficiente, lo que en el caso del direccionamiento al gen CFTR podría conducir a una mejora de los síntomas gastrointestinales también asociados con la fibrosis quística. Para otras secuencias objetivo, dependiendo de la enfermedad y/o del órgano objetivo, la administración puede ser tópica (por ejemplo, en la piel), intradérmica, subcutánea, intramuscular, intravenosa, oral, inyección ocular, etc.

En algunas enfermedades, la capa de moco muestra un grosor aumentado, lo que conduce a una menor absorción de medicamentos a través del pulmón. Una de esas enfermedades es la bronquitis crónica, otro ejemplo es la fibrosis quística. Se encuentran disponibles varias formas de normalizadores del moco, tales como DNasas, solución salina hipertónica o manitol, que está disponible comercialmente con el nombre de Bronchitol. Cuando se utilizan normalizadores de moco en combinación con constructos de oligonucleótidos para la edición de ARN, tales como las constructos de oligonucleótidos de acuerdo con la invención, podrían aumentar la eficacia de esos medicamentos. Por consiguiente, la administración de un constructo del oligonucleótido de acuerdo con la invención a un sujeto, preferiblemente un sujeto humano, se combina preferiblemente con normalizadores de moco, preferiblemente con los normalizadores de moco descritos en el presente documento. Además, la administración de los constructos de oligonucleótidos de acuerdo con la invención se puede combinar con la administración de moléculas pequeñas para el tratamiento de la FQ, tales como compuestos potenciadores, por ejemplo Kalydeco (ivacaftor; VX-770), o compuestos correctores, por ejemplo VX-809 (lumacaftor) y/o VX-661. Otras terapias de combinación en la FQ pueden comprender el uso de un constructo de oligonucleótidos de acuerdo con la invención en combinación con un inductor de adenosina desaminasa, usando IFN-gamma o TNF-alfa.

Alternativamente, o en combinación con los normalizadores del moco, se puede aplicar la administración en partículas o nanopartículas que penetran el moco para la administración eficaz de moléculas de edición de ARN a células epiteliales de, por ejemplo, pulmón e intestino. Por consiguiente, la administración de un constructo del oligonucleótido de acuerdo con la invención a un sujeto, preferiblemente un sujeto humano, usa preferiblemente la administración en partículas o nanopartículas que penetran el moco.

Las infecciones pulmonares crónicas y agudas suelen estar presentes en pacientes con enfermedades tales como fibrosis quística. Los tratamientos con antibióticos reducen las infecciones bacterianas y los síntomas de las mismas, como el espesamiento del moco y/o la formación de biopelículas. El uso de antibióticos en combinación con constructos de oligonucleótidos de acuerdo con la invención podría aumentar la eficacia de la edición de ARN debido a un acceso más fácil de las células objetivo para el constructo del oligonucleótido. Por consiguiente, la administración de un constructo del oligonucleótido de acuerdo con la invención a un sujeto, preferiblemente un sujeto humano, se combina preferiblemente con un tratamiento con antibióticos para reducir las infecciones bacterianas y los síntomas tales como el espesamiento del moco y/o la formación de biopelículas. Los antibióticos se pueden administrar por vía sistémica o local o ambos.

Para su aplicación en, por ejemplo, pacientes con fibrosis quística, los constructos de oligonucleótidos de acuerdo con la invención, o los constructos de oligonucleótidos empaquetados o complejados de acuerdo con la invención, pueden combinarse con cualquier normalizador de moco tal como una DNasa, manitol, solución salina hipertónica y/o antibióticos y/o una molécula pequeña para el tratamiento de la FQ, tal como compuestos potenciadores, por ejemplo, ivacaftor, o compuestos correctores, por ejemplo, lumacaftor y/o VX-661.

Para aumentar el acceso a las células objetivo, podría aplicarse lavado bronqueo-alveolar (BAL) para limpiar los pulmones antes de la administración del oligonucleótido de acuerdo con la invención.

Los inventores de la presente invención han demostrado en el presente documento que ciertas modificaciones de los AON que se dirigen al ARN y que reclutan enzimas ADAR producen una mayor estabilidad y, a través de esto, una mejor aplicabilidad en entornos in vivo. Sin embargo, la estabilidad es una cosa. Además de estabilizar los AON evitando la degradación mediada por nucleasas, los nucleótidos modificados se seleccionan idealmente de modo que apoyen y preferiblemente mejoren la actividad de unión y/o catalítica de las enzimas ADAR. Las características estructurales conocidas de la interacción entre el dominio de desaminasa ADAR2 y un sustrato de ARNcd (proporcionado con gran detalle en Matthews et al., 2016. Nat Struct Mol Biol 23: 426-433) se pueden utilizar para seleccionar racionalmente los AON modificados que mejor se adapten al centro catalítico de la enzima ADAR2. A partir de la estructura (coloreada) descrita en Matthews et al., (2016) se puede ver que ADAR2 contacta con el sitio de edición desde el surco menor de la hélice de ARNcd; Figura 2, Panel A: Vista de la estructura del complejo perpendicular al eje helicoidal del ARNcd. La cadena de ARN rosa es la cadena editada y la cadena azul es la cadena complementaria. La base del objetivo volteada (N) se muestra en rojo. La proteína hace contacto con la hélice a través de su surco menor. Panel B: vista de la estructura a lo largo del eje helicoidal del ARNcd. Panel C: Resumen de los contactos entre el dominio de ADAR2 desaminasa E488Q y el dúplex de ARN. El color rojo indica la cadena objetivo editada y el color azul la cadena complementaria (equivalente a los AON presentados en el presente documento). Las líneas discontinuas indican interacciones de las cadenas laterales de aminoácidos (se indica la identidad y posición de los aminoácidos) del dominio desaminasa con las cadenas de ARN. La Figura 5A de Matthews et al., (2016) muestra en detalle un modelo de relleno de espacio de la interacción del nucleótido 5' con el sitio editado (en la cadena objetivo) y el nucleótido complementario en la otra cadena. En el panel superior, el nucleótido 5' es una uridina, y la interacción con la adenosina opuesta es estabilizada por la glicina 489 del dominio de ADAR2 desaminasa. El panel inferior muestra la interacción modelada de una C (5' al nucleótido editado) con una G complementaria. En este caso, la interacción con la glicina da como resultado un choque con el grupo 2-amino, lo que reduce la eficiencia de edición. El reemplazo de la base de guanosina en la cadena opuesta (o AON) con una inosina resolvería este choque estérico.

Para las modificaciones de base, los inventores de la presente invención dedujeron que las modificaciones químicas que se proyectan en el surco principal de la hélice (Sharma y Watts 2015, Future Med. Chem. 7 (16), 2221-2242) interferirían con la función de al menos ADAR2. Véase la Figura 2 y los ejemplos a continuación para obtener detalles de los diferentes AON. Para los nucleótidos de pirimidina, tales modificaciones incluyen sustituyentes en la posición 4 o 5 de la base, incluyendo 4-tiouridina (véase, por ejemplo, ADAR60-13), 5-metiluridina (véase, por ejemplo, ADAR60-14), 5-metoxiuridina (véase, por ejemplo, ADAR60-26), 5-metilcitidina (véase, por ejemplo, a Da r 60-9, ADAR60-11 hasta ADAR60-16, ADAR60-20, ADAR60-26, ADAR60-27 y ADAR60-29 hasta ADAR60-32 y ADAR68-1 hasta ADAR68-6) y 5-hidroximetilcitidina (véase, por ejemplo, ADAR60-28). Para los nucleótidos de purina, los sustituyentes en las posiciones 7 y 8 de la base se dirigirían de manera similar al surco principal, incluyendo 7-metilguanosina, 7-deazaguanosina, 8-aza-7-deazaguanosina, 7-aminometil-7-deazaguanosina, 7- metiladenosina, 8-metiladenosina, 3-deazaadenosina, 7-deazaadenosina u 8-azidoadenosina (véase ADAR60-29, ADAR60-30, ADAR60-31 y ADAR60-32, y ADAR68-1, ADAR68-2, ADAR68-3, ADAR68-4 y ADAR68-5, respectivamente).

Para modificaciones de la cadena principal (es decir, modificaciones de la fracción ribosilo de los nucleótidos o los enlaces internucleotídicos) del AON, los inventores de la presente invención dedujeron que las modificaciones que no cambian la estructura de la forma A de la hélice de ARN solo interferirían modestamente con la función de ADAR2. La información estructural del dominio de ADAR2 desaminasa también sugiere que en ciertas posiciones es importante retener los grupos químicos que están en contacto con las cadenas laterales de aminoácidos de la enzima, tales como los grupos fosfato y los grupos 2'-hidroxilo. Las modificaciones que permiten la retención de estas características incluyen UNA (véase, por ejemplo, ADAR60-8 y ADAR60-9), 3'-metilenfosfonato, 5'-metilenfosfonato, 3'-fosforamidato o modificaciones de 2'-5'-fosfodiéster (véase ADAR60-22, ADAR60-23, ADAR60-24 y ADAR60-25, respectivamente). En algunos casos, una interacción directa de ADAR2 no está presente para un sustituyente dado en un nucleótido específico. En tales casos, se pueden usar otros grupos químicos que protegen el AON de las nucleasas, pero son lo suficientemente pequeños como para no causar interferencia estérica con ADAR2, por ejemplo, una modificación 2'-fluoro o 2'-H (desoxi) ya que no es más grande que el grupo hidroxilo de origen natural (véase, por ejemplo, ADAR60-7).

Los nucleótidos modificados pueden seleccionarse no solo para proporcionar una protección mejorada contra las nucleasas y una interferencia mínima en la unión de ADAR2, sino también para aumentar específicamente la funcionalidad de ADAR2. En particular, pueden ser necesarias modificaciones de nucleótidos específicas para mejorar la actividad de edición en los ARN del sustrato en los que la secuencia objetivo no es óptima para la edición por ADAR. Trabajos anteriores han establecido que ciertos contextos de secuencia son más fáciles de editar. Por ejemplo, la secuencia objetivo 5'-UAG-3' (con el objetivo A en el medio) contiene los nucleótidos vecinos más cercanos más preferidos para ADAR2, mientras que una secuencia objetivo 5-CAA-3' está desfavorecida (Schneider et al., 2014). El análisis estructural del dominio de ADAR2 desaminasa sugiere la posibilidad de mejorar la edición mediante una selección cuidadosa de los nucleótidos que son opuestos al trinucleótido objetivo (Matthews et al., 2016). Por ejemplo, la secuencia objetivo 5-CAA-3', emparejada con una secuencia 3-GCU-5' en la cadena opuesta (con la falta de coincidencia AC formada en el medio), está desfavorecida porque el grupo amino de la base de guanosina choca estéricamente con una cadena lateral de aminoácidos de ADAR2. Sin embargo, se postula que una nucleobase más pequeña que carece del grupo amino, como la inosina, podría encajar mejor en esta posición sin causar choques estéricos, al tiempo que conserva el potencial de emparejamiento de bases con la citosina opuesta (véase, por ejemplo, ADAR60-10 hasta ADAR60-19, y ADAR60-26, ADAR60-27, ADAR60-28 y ADAR60-32). También podría usarse una inosina dentro de un contexto de secuencia diferente. Por ejemplo, una secuencia objetivo 5-UAG-3' podría emparejarse con la secuencia del Triplete Central de AON 5-CCI-3', formando así un par de bases oscilantes de UI que puede proporcionar una mayor flexibilidad que se necesita para que la adenosina objetivo salga de la hélice al sitio activo de la enzima (véase, por ejemplo, ADAR68-6). Las modificaciones de la cadena principal también pueden tener beneficios adicionales más allá de la protección de nucleasas, tal como proporcionar una mayor flexibilidad para los nucleótidos que rodean el sitio editado, lo que se ha sugerido como un factor importante para posicionar correctamente el sustrato en el sitio activo de la enzima. UNA es una de esas modificaciones de la cadena principal, ya que la estructura abierta de la fracción de azúcar permite un mayor movimiento (véase ADAR60-8 y ADAR60-9). Por el contrario, las modificaciones que podrían mejorar la actividad de secuencias subóptimas también incluyen el uso de modificaciones de la cadena principal que la fuerzan a una conformación que favorece la edición.

Ejemplos

Ejemplo 1. Modificaciones químicas en AON que se dirigen al ARN de SERPINA1 humana para aumentar la estabilidad

La solicitud de patente no publicada PCT/EP2017/065467 describe un procedimiento para la edición dirigida de A a I mediante el uso de oligonucleótidos antisentido (AON). Mientras que la mayoría de los nucleótidos en estos AON son ARN 2'-O-metilado y tienen enlaces fosforotioato, contienen unos pocos, generalmente 3, nucleótidos de ARN sin modificar (el 'Triplete Central') en la porción del AON con el nucleótido central directamente opuesto a la adenosina objetivo y sus 2 nucleótidos vecinos. Esto se debe a que se había demostrado previamente que la edición A a I se inhibe fuertemente cuando los nucleótidos del Triplete Central están 2'-O-metilados (Vogel et al., 2014). Sin embargo, los AON que contienen nucleótidos de ARN no modificados son inherentemente biológicamente inestables debido a nucleasas que pueden hidrolizar los residuos en estas posiciones. Esto puede ser una desventaja para el uso eficiente de los AON como por ejemplo, agentes terapéuticos, ya que pueden degradarse antes de alcanzar sus objetivos.

Los inventores de la presente invención investigaron la estabilidad de los AON con nucleótidos de ARN no modificados en el Triplete Central y si la estabilidad de tales AON podría aumentarse usando modificaciones químicas distintas de la 2'-O-metilación.

En primer lugar, como ejemplo no limitante, el objetivo que se seleccionó para la edición de ARN fue la mutación c.1096G> A en el ARN de SERPINA1, que es la causa de la deficiencia de A1AT (A1ATD). A1ATD es un ejemplo de una enfermedad objetivo para la edición de ARN usando el enfoque como se describe en este documento. En la Figura 1A y B, se ilustra esquemáticamente la complementariedad de los AON ejemplares para el objetivo SERPINA1. La complementariedad de ADAR60-1 con la secuencia objetivo se muestra en la Figura 1A, mientras que el Triplete Central de la serie ADAR60 (5-YXZ-3') se indica como tal en la Figura 1B. Se probó la estabilidad de varios AON que se dirigen al ARN mutante con modificaciones variables en la cadena principal, así como en las bases de los nucleótidos del Triplete Central, incubándolos en medio de cultivo celular (MEM) que contiene suero bovino fetal (FBS) al 15% a 37 °C durante 30 min (RX). Como controles negativos, los AON se incubaron en solución salina tamponada con fosfato (PBS; CTL). A continuación, las muestras se resolvieron en geles desnaturalizantes de poliacrilamida (gel PAGE al 15% con urea 8 M), que posteriormente se tiñeron con azul de toluidina para visualizar los AON y sus fragmentos. Los AON con sus respectivas secuencias y sus modificaciones se indican en la Figura 2. Los tres paneles de la Figura 3 muestran los resultados de los ensayos de estabilidad utilizando los AON de la serie ADAR60. ADAR60-1, que contiene un Triplete Central de ARN 5-UCG-3' sin modificar, se escinde de forma eficaz (~ se degrada) en 30 min en presencia de FBS (hasta aproximadamente el 50%). Incluso es evidente cierta degradación cuando el AON se incuba en tampón de control. La tasa de degradación no se reduce cuando se cambia la ubicación de los tres nucleótidos de ARN (ADAR60-3). Es importante destacar que reducir el número de nucleótidos de ARN sin modificar a 2 (en lugar de 3) da como resultado una reducción en la degradación (ADAR60-2). Un AON totalmente 2'-O-metilado, que en este documento sirve como control negativo, permanece estable en estas condiciones (ADAR60-4), al igual que un AON en el que el Triplete Central se ha cambiado a nucleótidos de ADN (ADAR60-6). Esto muestra al menos que cuando el Triplete Central no está 2'-O-metilado, el AON es propenso a degradarse y que esto puede resolverse agregando al menos un nucleótido 2'-O-metilado al Triplete Central, o modificando el Triplete Central completo con nucleótidos de ADN. Otra modificación del azúcar, el reemplazo del ARN por ácido nucleico desbloqueado (UNA) en 2 de las 3 posiciones del Triplete Central también da como resultado una mayor estabilidad (ADAR60-8), y más aún cuando se combina con la modificación de base 5-metilcitosina en medio del triplete (ADAR60-9). La inclusión de un enlace fosforotioato después de la primera posición del Triplete Central (5'-U*CG-3' en la que el asterisco representa el enlace fosforotioato) no aumenta la estabilidad de forma apreciable (ADAR60-5). Véase el ejemplo 2 a continuación para más experimentos hacia un número creciente de enlaces fosforotioato.

La sustitución de guanosina por inosina también da como resultado una reducción notable de la degradación (ADAR60-10). Cuando esta modificación se combina con el reemplazo de citidina por 5-metilcitidina (ADAR60-11), la estabilidad permanece y aumenta aún más cuando ambas modificaciones se combinan con el reemplazo de uridina por pseudouridina (ADAR60-12).

El reemplazo de los 3 nucleótidos del Triplete Central con nucleótidos modificados pareció producir el mayor efecto sobre la estabilidad. Las modificaciones exactas en cada posición se pueden variar, y esto afecta en gran medida la estabilidad del AON. En AON similares a ADAR60-12, el reemplazo de la pseudouridina con 4-tiouridina (ADAR60-13) o 2,6-diaminopurina (ADAR60-16) da como resultado AON de estabilidad comparable, mientras que 5-metiluridina (ADAR60-14) por el contrario reduce la estabilidad, y la tienouridina (ADAR60-15) provoca una degradación casi completa del AON, incluso más que con el triplete de ARN no modificado.

El reemplazo del C medio en el Triplete Central con pirrolocitidina da como resultado una estabilización aún más significativa que con 5-metilcitidina: los AON con pirrolocitidina e inosina son casi completamente estables en estas condiciones independientemente de si contienen una pseudouridina o uridina no modificada en la primera posición del triplete (ADAR60-18 y ADAR60-17, respectivamente). El reemplazo de la uridina por tienouridina (ADAR60-19) también da como resultado una estabilidad reducida también en este contexto, pero no en la misma medida que con ADAR60-15.

De manera similar a las otras dos posiciones del Triplete Central, la última posición también se puede modificar con diferentes modificaciones de base para lograr la estabilización. En el presente documento, en lugar de inosina, se usó tienoguanosina en combinación con pseudouridina y 5-metilcitidina o pirrolocitidina (ADAR60-20 y ADAR60-21, respectivamente). Ambos AON son completamente estables en estas condiciones; la estabilidad aumentada con tienoguanosina es notable cuando se compara con ADAR60-12 y ADAR60-20, por lo demás similares.

Se prevé que las combinaciones adicionales para lograr un efecto similar para una mayor estabilización sean el reemplazo de por ejemplo, guanosina por 7-metilguanosina, 7-deazaguanosina, 8-aza-7-deazaguanosina o 7-aminometil-7-deazaguanosina (véase A dA r60-29, ADAR60-30, ADAR60-31 y ADAR60-32, respectivamente), o la de citidina por 5-hidroximetilcitosina (véase ADAR60-28), o la de uridina con 5-metoxiuridina o dihidrouridina (véase ADAR60-26 y ADAR60-27, respectivamente). La estabilización también se logró mediante modificaciones de azúcar y de la cadena principal del Triplete Central, incluidas las modificaciones de 2'-fluoro, 3'-metilenfosfonato, 5'-metilenfosfonato, 3'-fosforamidato o 2'-5'fosfodiéster (enlaces de la cadena principal 2' a 5'; véase ADAR60-7, ADAR60-22, ADAR60-23, ADAR60-24 y ADAR60-25, respectivamente).

Los resultados mostrados en este ejemplo indican que no todas las modificaciones son útiles para reducir la degradación de los oligonucleótidos antisentido de edición de ARN, pero muchas modificaciones aumentan la estabilidad y que las modificaciones en y posiblemente alrededor del Triplete Central deben seleccionarse cuidadosamente. La modificación de los nucleótidos en el Triplete Central con químicas específicas aumenta seguramente la estabilidad del oligonucleótido. Con todo, los resultados presentados en este ejemplo muestran que (combinaciones de) modificaciones de los nucleótidos en el Triplete Central pueden mejorar la estabilidad, y que la modificación de varias bases a la vez da como resultado un aumento de la estabilización.

Ejemplo 2. Enlaces de fosforotioato en AON que se dirigen al ARN de Idua de ratón para aumentar la estabilidad

En el ejemplo anterior se demostró que la inclusión de un enlace fosforotioato después de la primera posición dentro del Triplete Central no aumentaba la estabilidad de forma apreciable (Figura 3A; ADAR60-5). Para investigar esto con más profundidad, se probó si la inclusión de más enlaces de fosforotioato dentro de la región del Triplete Central podría, no obstante, tener una influencia y aumentar la estabilidad.

Para ello, los inventores de la presente invención seleccionaron el síndrome de Hurler como sistema modelo, también conocido como mucopolisacaridosis tipo I-Hurler (MPS IH), que en humanos es causado por la mutación c.1205G> A (W402X) del gen IDUA. La secuencia objetivo en el gen humano mutado sería 5'-UAG-3' (con la A objetivo en el medio, véase Figura 4A), y el Triplete Central del AON sería entonces 5'-CCA-3' (incluyendo la C central, no coincidente; véase la Figura 4B para la notación 5'-XXY-3') o 5-CUA-3'. También existe un modelo de ratón para esta mutación (W392X), en el que el gen Idua está mutado. El modelo de ratón Hurler también se utilizó para experimentos adicionales in vivo (véase más abajo). Los oligonucleótidos que tienen el número de serie ADAR65 (vease la Figura 2) se diseñaron para dirigirse al gen Idua mutado de ratón. Se probaron ADAR65-1, ADAR65-18, ADAR65-20, ADAR65-21 y ADAR65-22 para ver si los enlaces fosforotioato adicionales se sumarían a la estabilidad del oligonucleótido. Sorprendentemente, la inclusión de 3 o más fosforotioatos en la región del Triplete Central produjo un aumento de la estabilidad del AON (Figura 5). ADAR65-1 no tiene enlaces de fosforotioato adicionales en la región del Triplete Central y está claramente degradado, mientras que ADAR65-22 tiene 6 enlaces de fosforotioato en y alrededor de la región del Triplete Central y es claramente más estable, incluso después de una incubación de 18 h en FBS. De manera similar, la estabilidad de ADAR65-20 y ADAR65-21 que tienen respectivamente 5 y 3 enlaces fosforotioato en la región del Triplete Central, se incrementó en comparación con ADAR65-18 que (como ADAR65-1) no tiene fosforotioatos adicionales en la región del Triplete Central, excepto por los enlaces terminales del oligonucleótido.

Se combinaron modificaciones de bases tales como 5-metilcitidina y desoxi 2-aminopurina junto con modificaciones de ribosa tales como desoxirribosa (ADN), 2'-O-metilo, 2'-fluoro y una cadena principal de fosfato (enlaces fosforotioato). ADAR65-13, ADAR65-14, ADAR65-15, ADAR65-16, ADAR65-19, ADAR65-20, ADAR65-21, ADAR65-22, ADAR65-23, ADAR65-24, ADAR65-25, ADAR65-26, ADAR65-27, ADAR65-28, ADAR65-29 y ADAR65-30 (Figura 2) se probaron para determinar la estabilidad usando el mismo ensayo que se describió anteriormente. Los resultados que se muestran en la Figura 6 muestran que se puede usar una variedad de combinaciones para obtener estabilidad, incluso después de 18 h de incubación en FBS.

Además de esto, los AON con ARN (ADAR93-2) o ADN (ADAR93-6, ADAR93-8, ADAR93-9) en el Triplete Central y números variables de nucleótidos de fosforotioato (28 en ADAR93-2, 8 en ADAR93-6, 21 en A dA r 93-8, 22 en ADAR93-9) se analizaron para determinar la estabilidad en varias soluciones biológicas. Se utilizó PBS como control negativo. Para imitar las condiciones fisiológicas a las que pueden estar sometidos los AON en la sangre y el sistema nervioso central, los AON se incubaron, respectivamente, en medio de cultivo celular (DMEM) que contenía FBS al 15% o líquido cefalorraquídeo humano de donante único (CSF). Para evaluar si el microambiente ácido de un lisosoma y las nucleasas en el mismo afectarían a la estabilidad de AON, también se incubaron oligonucleótidos en lisosomas de hígado humano de género mixto (Lyso). Se incubaron 200 pmol de AON en cada condición durante 2 h, 24 h o 3 días, después de lo cual las muestras se resolvieron en geles desnaturalizantes de poliacrilamida (gel PAGE al 12% con urea 8 M). Los geles se tiñeron con una solución de azul de toluidina y se destiñeron en agua para visualizar los AON y sus fragmentos. Los resultados se muestran en la Figura 7 e indican (nuevamente) que los oligonucleótidos que contienen ARN sin modificaciones en el Triplete Central (ADAR93-2) son muy propensos a degradarse en FBS, CSF y Lyso porque casi todos los oligonucleótidos se digieren rápidamente bajo estas diferentes circunstancias, mientras que permanecen relativamente estables solo en PBS. Sin embargo, cambiar el Triplete Central para incluir dos o tres nucleótidos de ADN aumenta significativamente la estabilidad del oligonucleótido en los tres entornos diferentes, incluso hasta tres días.

También se diseñaron los oligonucleótidos antisentido ADAR68, ADAR68-1, ADAR68-2, ADAR68-3, ADAR68-4 y ADAR68-5 (véase la Figura 2) que se dirigen potencialmente a la mutación c.1205G> A (W402X) del gen IDUA humano. El Triplete Central modificado puede estar compuesto, por ejemplo, de dos 5-metilcitidinas en combinación con un nucleótido que reemplaza la adenosina, tal como 7-metiladenosina, 8-metiladenosina, 3-deazaadenosina, 7-deazaadenosina u 8-azidoadenosina (ADAR68-1, ADAR68-2, ADAR68-3, ADAR68-4 y ADAR68-5 en la Figura 2). Sin embargo, la adenosina también se puede reemplazar por una base modificada que puede formar un par de bases oscilantes con la uridina opuesta, tal como inosina (ADAR68-6). Estos AON se prueban para determinar su estabilidad y su capacidad para editar el ARN de una secuencia objetivo.

Ejemplo 3. Actividad de edición de ARN de AON con modificaciones de bases químicas combinadas en el Triplete Central

Se usan modificaciones de fosfodiéster de nucleótidos, azúcar y bases para aumentar la estabilidad de los oligonucleótidos contra las nucleasas. Es importante destacar que los inventores de la presente invención previeron que tales modificaciones químicas de nucleótidos también se pueden usar para otros fines, tales como una mayor unión de los AON a su ARN objetivo, para obtener un mejor reconocimiento y/o aumentar la actividad enzimática de las proteínas que actúan en complejos de cadena dobles de AON con sus secuencias de ARN objetivo específicas.

Los inventores primero querían saber si una combinación de modificaciones químicas de bases de nucleótidos en el Triplete Central de un AON podría mejorar la actividad de edición de ADAR2. Para ello, se utilizaron ADAR60-1 y ADAR60-15 (véanse las Figuras 2 y 3) para investigar tal influencia en la mejora de la actividad de edición de la enzima ADAR2 en una molécula de ARN objetivo SERPINA1 mutada humana. Estos dos AON comparten la misma secuencia y longitud, y ambos tienen las modificaciones químicas de fosforotioato de los grupos fosfato, así como las modificaciones 2'-O-metilo de los azúcares ribosa fuera del Triplete Central. Los nucleótidos en el Triplete Central de ADAR60-1 no están modificados, mientras que las bases de nucleótidos en el Triplete Central de ADAR60-15 están químicamente modificadas como se muestra en la Figura 2. La 5-metilcitidina está opuesta a la adenosina objetivo para la edición. Tanto ADAR60-1 como ADAR60-15 se probaron en un ensayo de edición in vitro utilizando lisados de células HEK293 con la isoforma 2 sobreexpresada de ADAR2 (ADAR2a) y ARN objetivo de SERPINA1 que porta la mutación c.1096G> A. Como controles negativos se utilizaron ADAR60-15 sin lisado celular y lisado celular HEK293 con ADAR2a sobreexpresado pero sin oligonucleótidos. El ARNcs plantilla de SERPINA1 se obtuvo mediante transcripción in vitro de una secuencia de ADN de SERPINAImut de 500 ng (amplificada por PCR a partir de fragmentos del gen SERPINAImut gBlocks®) utilizando un kit MEGAscript (Life Technology) aplicando tecnologías generales conocidas por el experto en la materia y siguiendo el protocolo del fabricante, y usando el cebador directo T1promoterF1 (5'-GCGAAGCTTAATACGACTC-3’; SEQ ID NO: 3) y el cebador inverso Serpina1-R2 (5'-CCATGAAGAGGGGAGACTTC-3'; SEQ ID NO: 4). La plantilla de ADN de SERPINAImut tiene la siguiente secuencia (con la adenosina objetivo en negrita y subrayada):

5’ - GCGAAGCTTAATACGACTCACTATAGGGTCAACTGGGCATCACTAAGG

TCTTCAGCAATGGGGCTGACCTCTCCGGGGTCACAGAGGAGGCACCCCT

GAAGCTCTCCAAGGCCGTGCATAAGGCTGTGCTGACCATCGACAAGAAAG

GGACTGAAGCTGCTGGGGCCATGTTTTTAGAGGCCATACCCATGTCTATCC

CCCCCG AGGT C AAGTT CAACAAACCCTTT GTCTT CTT AAT GATT G AACAAAAT

ACCAAGTCTCCCCTCTTCATGG - 3’ (SEQ ID NO:5)

El ARNcs objetivo tiene la siguiente secuencia (con la adenosina objetivo en negrita y subrayada):

5’- UCAACUGGGCAUCACUAAGGUCUUCAGCAAUGGGGCUGACCUCUCCGGGG

UCACAGAGGAGGCACCCCUGAAGCUCUCCAAGGCCGUGCAUAAGGCUGUGCUG

ACCAUCGACAAGAAAGGGACUGAAGCUGCUGGGGCCAUGUUUUUAGAGGCCAU

ACCCAUGUCUAUCCCCCCCGAGGUCAAGUUCAACAAACCCUUUGUCUUCUUAAU

GAUUGAACAAAAUACCAAGUCUCCCCUCUUCAUGG - 3 ’ (SEQ ID NO:6)

El ARNcs objetivo se purificó en gel usando electroforesis en gel de poliacrilamida desnaturalizante. Para obtener los lisados, las células HEK293 se transfectaron primero durante la noche con 500 ng de plásmido de expresión ADARB1 (OriGene) usando Lipofectamina 3000. Después, las células se lisaron usando el reactivo Lysis-M. Se preincubaron juntos AON 200 nM y ARNcs plantilla de SERPINA190 nM en un tampón de ensayo de edición in vitro durante 30 min a 30°C. Después de la preincubación, se añadieron los lisados celulares (10 ^l) y la mezcla de reacción se incubó durante 30 min a 30°C y posteriormente durante 30 min a 37°C. A continuación, los ARN dirigidos se extrajeron mediante extracción con fenol cloroformo y se sometieron a transcripción inversa utilizando los reactivos Maxima RT, utilizando el protocolo del fabricante, y utilizando el cebador directo Serpina1-F2 (5'- TCAACTGGGCATCACTAAGG-3'; SEQ ID NO: 7) y el cebador inverso Serpina1-R2 (véase más arriba). Luego, los ADNc se amplificaron mediante PCR y se analizaron mediante secuenciación de Sanger usando el cebador Serpina1-R1 (5'-CATGAAGAGGGGAGACTTGG-3'; SEQ ID NO: 8).

La Figura 8 muestra que cuando ADAR60-1 se incuba con el ARNcs objetivo de SERPINAImut, no se puede detectar ningún cambio de A por G (panel A, posición indicada por una flecha). Sin embargo, por el contrario, el uso de ADAR60-15 (panel B) muestra un cambio de A por G claramente detectable y significativo, lo que confirma la edición del ARN de SERPINA1 objetivo. Las reacciones de control negativo (paneles C y D) no muestran edición de A por G. Se concluye que las modificaciones químicas de la base de nucleótidos en ADAR60-15 pueden mejorar la actividad de edición de ARN de ADAR2 en comparación con un oligonucleótido que no tiene tales modificaciones (ADAR60-1).

Ejemplo 4. Edición de ARN de una mutación sin sentido en ARN objetivo de GFP utilizando un AON que comprende una modificación de 2-aminopurina en el Triplete Central

La edición de ARN también se investigó en células que contenían un constructo de expresión que codifica una proteína fluorescente verde (GFP), integrada de forma estable en el genoma celular (véase el documento WO 2016/097212 para detalles y constructos). En este constructo, se introdujo un codón de parada (TAG) en la posición del codón 57, dando como resultado un triplete UAG en el ARN objetivo. La edición del ARN en la adenosina en el medio de este triplete eventualmente resultaría en un codón que codifica Trp y luego en la expresión de una proteína de longitud completa. El constructo y la línea celular (células que contienen un plásmido GFP W57X integrado de manera estable) se generaron usando técnicas conocidas por el experto en la materia. Para asegurar que no se editen otras adenosinas en el ARN objetivo, solo los tres nucleótidos en el AON opuestos al codón de parada (el 5-CCA-3' en el oligonucleótido, con el C no emparejado en el medio, véase ADAR59-2 y ADAR59-10, Figura 2) no contienen una modificación 2'-O-metilo, mientras que todos los demás nucleótidos del oligonucleótido antisentido sí la contienen. Además, los cinco nucleótidos terminales en cada lado de todos los oligonucleótidos probados están conectados por enlaces fosforotioato, mientras que los enlaces restantes eran enlaces normales. En ADAR59-10, la A en el Triplete Central del oligonucleótido está químicamente modificada para ser una 2-aminopurina, mientras que ADAR59-2 no tiene esa modificación particular. La Figura 5B en Matthews et al., (2016) muestra que una modificación de 2-aminopurina en esta posición da como resultado una activación reducida (pero no abolida). Sin embargo, la modificación aún puede mejorar la edición de ARN indirectamente, por ejemplo, proporcionando potencialmente una resistencia mejorada a las nucleasas o mejorando los procesos celulares.

Las células que contenían GFP W57X estable se transfectaron primero con 1 |jg de plásmido de sobreexpresión de ADAR2 (véase el ejemplo anterior), seguido de la transfección de 150 nM de cada uno de los oligo en lotes separados 24 h más tarde (ambos con Lipofectamina 2000). Luego, 24 h después de la transfección de AON, se aisló a Rn para la síntesis de ADNc y se realizó la posterior RT-PCR y secuenciación para revelar si se había producido la edición de ARN.

Como se muestra en la Figura 9, el nivel de edición observado con ADAR59-10 mejoró con respecto al control sin la modificación de 2-aminopurina (ADAR59-2). Esto muestra que, a pesar de un efecto negativo sobre la actividad catalítica en sí, una modificación de AON puede tener un efecto positivo en los niveles generales de edición por medios indirectos. Combinando tal modificación con otros nucleótidos modificados que soportan una mayor estabilidad y/o actividad de edición (como se describe en el presente documento), ahora es posible producir AON estables que activan eficazmente la edición de ARN.

Ejemplo 5. Edición de una mutación no sentido en el ARN objetivo de GFP utilizando un AON que comprende modificaciones de ADN en el Triplete Central

De forma similar a lo que se describe en el ejemplo anterior, se investigaron varias otras modificaciones en los AON para la edición eficaz de ARN utilizando el plásmido GFPstop57. Para ello se compararon los oligonucleótidos ADAR59-2, ADAR59-10 y ADAR59-22 (ver Figura 2) con el oligonucleótido de control ADAR65-1 y una situación de control sin transfección de ningún oligonucleótido. En detalle, se sembraron 0,3 x 106 células MCF-7 por pocillo de placas de 6 pocillos en DMEM con FBS al 10%. Después de 24 h, las células se transfectaron con 50 ng del plásmido GFPstop57 usando Lipofectamina 2000. Nuevamente después de 24 h, se transfectaron muestras de células seleccionadas con 100 nM de cada AON usando Lipofectamina 2000. Nuevamente después de 24 h, se aisló el ARN de las células lisadas y se usó como plantilla para la síntesis de cDNA, que se realizó utilizando el kit de síntesis de cDNA Maxima utilizando 500 ng de entrada de RNA. Estas muestras se utilizaron para el análisis de edición cuantitativa mediante PCR digital de gotitas (ddPCR). El ensayo ddPCR para la cuantificación absoluta de las secuencias objetivo de ácido nucleico se realizó utilizando el sistema de PCR digital de gotitas QX-200 de Bio-Rad. Se usó 1 j l de ADNc obtenido de la RT-PCR en una mezcla total de 20 j l de mezcla de reacción, incluido el ddPCR Supermix para sondas sin dUTP (Bio-Rad), un ensayo de genotipo Taqman SNP (Thermo Fisher Scientific) con los cebadores directo e inverso relevantes combinados con las siguientes sondas específicas de genes:

Cebador directo: 5'-ACCCTTAAATTTATTTGCACTA-3' (SEQ ID NO: 9)

Cebador inverso: 5'-CACCATAAGAGAAAGTA-3' (SEQ ID NO: 10)

Sonda de tipo silvestre - FAM NFQ marcada: 5'-CTGTTCCATGGCCAAC-3' (SEQ ID NO: 11)

Sonda mutante - VIC NFQ marcada: 5'-CTGTTCCATAGCCAAC-3' (SEQ ID NO: 12)

Se llenó un volumen total de 20 |jl de mezcla de PCR que incluía ADNc en la fila central de un cartucho de ddPCR (Bio-Rad) usando una pipeta multicanal. Las réplicas se dividieron en dos cartuchos. Las filas inferiores se llenaron con 70 j l de aceite de generación de gotitas para sondas (Bio-Rad). Después del reemplazo de la junta de goma, se generaron gotitas en el generador de gotitas QX200. Se transfirieron 40 j l de emulsión de aceite de la fila superior del cartucho a una placa de PCR de 96 pocillos. La placa de PCR se selló con una lámina de estaño durante 4 segundos a 170 °C utilizando el sellador de placas PX1, seguido del siguiente programa de PCR: 1 ciclo de activación enzimática durante 10 min a 95 °C, 40 ciclos de desnaturalización durante 30 segundos a 95 °C e hibridación/extensión durante 1 min a 59,7 °C, 1 ciclo de desactivación de la enzima durante 10 min a 98 °C, seguido de un almacenamiento a 8 °C. Después de la PCR, la placa se leyó y analizó con el lector de gotitas QX200. Los resultados del ddPCR en el cDNA obtenidos después de la edición del RNA utilizando los diferentes oligonucleótidos antisentido como se discutió anteriormente en el RNA derivado de GFPstop57 se proporcionan en la Tabla 2. Esto muestra que en la población de productos de PCR, después de la transfección del plásmido solo o con el oligonucleótido de control, no pudieron detectarse copias de tipo silvestre. Pero las transfecciones con ADAR59-2, ADAR59-10 y ADAR59-22 dieron como resultado cantidades significativas de copias de tipo silvestre en la población total. El uso de ADAR59-22 (que porta dos nucleótidos de ADN que rodean el C opuesto a la adenosina objetivo) dio como resultado una edición de ARN de hasta un 8,3% de copias de tipo silvestre. Esto indica que el uso de nucleótidos de ADN dentro del Triplete Central es beneficioso para la edición eficiente de ARN usando enzimas ADAR endógenas, porque no se usaron enzimas de edición de ARN adicionales en este experimento.

Tabla 2. Se proporciona el número de copias mutantes (Mut) por j l así como el número de copias de tipo silvestre (WT) por l El r n i T n l l i n r n n l l mn l r h

Por lo tanto, en una realización preferida, la invención también se refiere a los AON de acuerdo con la invención en los que los nucleótidos en el Triplete Central son nucleótidos de ADN, más preferiblemente en los que los dos nucleótidos en cada lado de la C opuestos a la adenosina objetivo en el Tripletes Central son nucleótidos de ADN.

Ejemplo 6. Edición de ARN con ADAR endógeno en un objetivo endógeno in vitro

Luego se investigó si era posible lograr la edición de ARN en un objetivo endógeno con proteínas ADAR endógenas, por lo tanto sin sobreexpresión de ninguna de ellas. El ARN que codifica el polipéptido A de ribonucleoproteína nuclear pequeña de ratón (SNRPA) se eligió como objetivo endógeno debido a su abundante medio y expresión ubicua. SNRPA se asocia con el tallo bucle II de la ribonucleoproteína nuclear pequeña U1, que se une al sitio de empalme 5' de los ARNm precursores y es necesaria para el empalme. La proteína se autorregula a sí misma mediante la inhibición de la poliadenilación de su propio pre-ARNm a través de la dimerización y se ha implicado en el acoplamiento de empalme y poliadenilación. Los AON se diseñaron para editar el codón de parada de tipo silvestre (uAg ) del (pre-)ARNm de Snrpa de ratón, lo que probablemente conduciría a la extensión del mensajero y produciría una proteína más grande con un aumento de 25 aminoácidos codificados por las secuencias posteriores. El tamaño original de la proteína SNRPA es de aproximadamente 31,68 kDa y se calcula que la proteína agrandada es de alrededor de 34,43 kDa. La Figura 2 muestra la secuencia de ADAR94-1 que contiene tres nucleótidos de ADN en el Triplete Central, mientras que todos los demás nucleótidos son ARN modificado con 2'-O-metilo. Los cinco nucleótidos terminales en cada extremo están conectados con enlaces fosforotioato. ADAR94-1 que contiene protuberancias en comparación con la secuencia objetivo fuera del Triplete Central (véase el documento PCT/EP2017/065467) se probó en líneas celulares HEPA1-6 y CMT-64. HEPA1-6 se deriva de un hepatoma de ratón BW7756 que surgió en un ratón C57/L. CMT-64 se aisló de una masa tumoral de carcinoma de pulmón alveogénico primario en un ratón C57BL/lcrf. Las células se sembraron en placas de 6 pocillos 24 h antes de la transfección a una densidad de 1,75 x 105 células/pocillo para HEPA1-6 y 1,5 x 105 células/pocillo para CMT-64. Ambas líneas celulares se cultivaron en medio de cultivo regular (DMEM FBS al 10%). Las células, o bien no se transfectaron (control de NT), se transfectaron con un oligo no dirigido no relacionado (control de NTO; 200 nM de un oligonucleótido de 50 mer) o se transfectaron con una concentración final de ADAR94-1 de 100 nM más un oligonucleótido sentido relacionado con Snrpa específico de ratón que se cree que estabiliza aún más el AON (SON2, véase la Figura 2) usando Lipofectamina 2000 (Invitrogen) siguiendo el protocolo del fabricante. La solicitud de patente no publicada GB 1700939.0 describe el uso de oligonucleótidos sentido protectores (SON) para estabilizar oligonucleótidos antisentido (AON) en la edición adicional de ARN. ADAR94-1 y SON2 se diluyeron en patrones 100 pM y se mezclaron en una proporción de 1:1 y se incubaron con el siguiente programa de hibridación: 60 °C 5 min, 55 °C 5 min, 50 °C 5 min, 45 °C 5 min, 40 °C 5 min, 35 °C 5 min, 30 °C 5 min, 20 °C 5 min, 10 °C hasta su uso. Antes de la transfección, el medio se reemplazó por 1,7 ml/pocillo de medio fresco y se añadió la mezcla de transfección (300 pl), para un total de 2 ml/pocillo. 24 h después de la transfección, se añadieron 2 ml de medio fresco a cada pocillo. Las células se incubaron durante otras 24 h. Luego, se eliminó el medio y las células se lavaron una vez con 1xPBS y luego se agregaron 350 pl de Trizol a cada pocillo para la lisis celular. A continuación, se recogieron las células lisadas y se extrajo el ARN con la minipreparación de ARN Direct-Zol (Zymo) siguiendo las instrucciones proporcionadas por el fabricante. Se eligió no utilizar la DNAsa en columna de este kit, sino que se utilizó el kit TURBO DNA-freeMR para el tratamiento con DNAsa de las muestras de ARN. Para esto, se agregaron 0,5 pl de inhibidor de ARNasa a cada muestra, y el resto de las etapas se realizaron de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Las concentraciones de ARN se midieron utilizando el Nanodrop y se utilizó 400 ng de ARN para la síntesis de ADNc con el kit Maxima Reverse Transcriptase (ThermoFisher Scientific) usando los protocolos del fabricante. La PCR se realizó utilizando el cebador directo Fw1_mSNRPA (5'-GCCTTCGTGGAGTTTGACA-3' SEQ ID NO: 13) y el cebador inverso Rev1_mSNRPA (5'-ACACACGGCTCTGAGAAGGT-3' SEQ ID NO: 14) utilizando procedimientos generalmente conocidos por el experto en la técnica. Los productos de PCR se comprobaron en un bioanalizador Agilent 2100 y se purificaron con el gel Nucleo-Spin y el kit de limpieza de PCR (Macherey-Nagel). Los productos purificados se secuenciaron con el cebador de secuenciación Snrp-1-Fw1 (5'-CGTGGAGTTTGACAATGAAGT-3', SEQ ID NO: 15).

Los resultados de la secuenciación para las células HEPA1-6 se muestran en la Figura 10A y los resultados de la secuenciación para las células CMT64 se muestran en la Figura 10B. Claramente, los controles de oligonucleótidos no transfectados (NT, paneles de la izquierda) y no de direccionamiento (NTO, paneles intermedios) muestran edición de ARN no detectable en el codón de parada (posición media del codón de parada indicada por una flecha). Sin embargo, como se puede ver claramente en los paneles de la derecha, existe una importante edición de ARN detectable cuando se utilizó el oligonucleótido ADAR94-1 (aquí en combinación con el oligonucleótido protector SON2), tanto en células HEPA1-6 como en células CMT64. La Figura 11 muestra que esta edición de ARN de SNRPA también se puede lograr sin el SON protector, pero que la adición del SON reforzó el nivel de edición de ARN. Los procedimientos para este experimento /- SON fueron similares a los descritos anteriormente y se realizaron en células HEPA1-6.

Estos resultados muestran que la edición de ARN se puede lograr con enzimas ADAR endógenas en una secuencia de ARN objetivo endógena, en este ejemplo no limitante usando ARN objetivo de Snrpa como modelo. De manera muy importante, muestra que cuando el Triplete Central del AON consta de tres nucleótidos de ADN secuenciales (mientras que el resto del AON consta de nucleótidos de ARN, que son preferiblemente modificados con 2'-O-metilo), se pueden lograr niveles muy claros y significativos de edición de ARN.

Por lo tanto, en un aspecto preferido, la presente invención se refiere a un AON de edición de ARN que comprende un Triplete Central de 3 nucleótidos secuenciales, en el que el nucleótido directamente opuesto a la adenosina objetivo es el nucleótido medio del Triplete Central, en el que 1, y preferiblemente 2, e incluso más preferiblemente los 3 nucleótidos en dicho Triplete Central son nucleótidos de ADN para hacer que el AON sea más estable y/o más efectivo para inducir la desaminación de la adenosina objetivo. En otro aspecto preferido, el resto del AON consiste en nucleótidos de ARN que preferiblemente están modificados con 2'-O-metilo.

Ejemplo 7. Edición de ARN con ADAR endógeno en un objetivo endógeno ex vivo

Después de haber encontrado evidencia de edición de ARN mediada por ADAR in vitro de la secuencia objetivo de Snrpa como se describe en el ejemplo anterior, se investigó si era posible lograr la edición de ARN ex vivo con proteínas ADAR endógenas en células pulmón primarias de tipo silvestre murinas que utilizan el mismo oligonucleótido ADAR94-1 (véase la Figura 2 y el ejemplo 6). Se aislaron células de un ratón con un fondo C57BL/6J usando un kit de disociación de pulmón de ratón de Miltenyi Biotec (artículo n° 130-095-927). En resumen, todos los reactivos se prepararon en condiciones estériles de acuerdo con el fabricante. Los ratones se sacrificaron mediante asfixia con CO2 y se perfundieron con PBS. A continuación, se diseccionaron los pulmones del cuerpo y se transfirieron a un tubo de 50 ml que contenía PBS en hielo. Posteriormente, los pulmones de los ratones se diseccionaron en lóbulos individuales y se transfirieron a un tubo gentleMACS C que contenía una mezcla de enzimas específica del kit. El tejido se procesó utilizando el programa gentleMACS 37C_m_LDK_1. Una vez finalizado el programa, las muestras se aplicaron a un MACS SmartStrainer (70 pm) y se centrifugaron a 300 xg durante 10 min a 4 °C. Se desechó el sobrenadante y las células se resuspendieron en 10 ml de DMEM FBS al 10%, se contaron y se cultivaron en un matraz de cultivo apropiado hasta su posterior procesamiento. Para la transfección, las células se sembraron en placa a una densidad de 3,0 x 105 células/pocillo. Los oligonucleótidos se hibridaron con SON2, como se describe en el ejemplo 6. Las células no se transfectaron (NT), se transfectaron con una concentración final de oligo 100 nM dirigido a la secuencia de SNRPA humana (ADAR87-1 SON2) o se transfectaron con una concentración final de oligo 100 nM dirigido a la secuencia de Snrpa de ratón (ADAR94-1 SON2) usando Turbofect (ThermoFisher Scientific) siguiendo el protocolo del fabricante. Véase la Figura 2 para la secuencia de ADAR87-1 (véase también el documento PCT/EP2017/065467). Seis horas después de la transfección, el medio se reemplazó con DMEM fresco FBS al 10% y las células se cultivaron en total durante 48 h después de la transfección. Después de estas 48 h, las células se lavaron una vez con IxPBS y se añadieron 350 pl de Trizol a cada pocillo para la lisis celular. El ARN se extrajo con la minipreparación de ARN Direct-Zol (Zymo) de acuerdo con el protocolo del fabricante. Las concentraciones de ARN se midieron usando Nanodrop y se usaron 500 ng de ARN para la síntesis de ADNc con el kit Maxima Reverse Transcriptase (ThermoFisher Scientific) de acuerdo con el protocolo del fabricante. La PCR se realizó utilizando el cebador directo Fw2_mSNRPA (5'-GCTCTCCATGCTCt Tc AACC-3', SEQ ID NO: 16) y el cebador inverso Rev2_mSNRPA (5-TCAGGGACTGAGCCAAGG-3', SEQ ID NO: 17) utilizando procedimientos generalmente conocidos por los expertos en la técnica. Los productos de PCR se comprobaron en un bioanalizador Agilent 2100 y se purificaron con el gel Nucleo-Spin y el kit de limpieza de PCR (Macherey-Nagel). Los productos purificados se secuenciaron con el cebador de secuenciación Snrp-1-Fw1 (ver más arriba). Los resultados de la secuenciación se muestran en la Figura 12. El A objetivo en el codón de parada TAG se representa con una flecha. La edición mediada por ADAR será visible en las secuencias de ADN como un pico de G debajo del pico de A en el codón TAG. El oligonucleótido de control no transfectado (NT, izquierda) y no dirigido (ADAR87-1 SON2, centro) no muestra edición de ARN detectable en el codón de parada TAG. Sin embargo, cuando las células se transfectan con ADAR94-1 SON2 (panel derecho) se observa una clara edición detectable en el codón de parada TAG.

Se concluye que la edición de ARN se puede lograr con ADAR endógeno usando ARN objetivo Snrpa endógeno como modelo. Además, dado que las células usadas en este ejemplo se aislaron directamente de ratones, indica que la edición de ARN específico de sitio con ADAR endógeno en un objetivo endógeno usando un oligonucleótido (terapéutico) es factible in vivo. Además de esto, y como ya se mostró en el ejemplo 6, indica que cuando el Triplete Central del AON objetivo está formado por tres nucleótidos de ADN secuenciales (mientras que el resto del AON está formado por nucleótidos de ARN que están preferiblemente modificados con 2'-O-metilo) se pueden lograr niveles muy claros y significativos de edición de ARN con niveles endógenos de ADAR.

Ejemplo 8. Edición de ARN en células pulmonares primarias WT murinas en (pre-)ARNm de Snrpa medido por ddPCR

Además, se investigaron modificaciones químicas de nucleósidos en posiciones fuera del llamado Triplete Central para una mejora adicional de la capacidad de edición de ARN. Esto también se probó en el modelo Snrpa como se describe en los ejemplos anteriores usando ADAR89-10, ADAR89-15 y ADAR89-20. La ribosa del nucleósido en la posición -1 se modificó con 2'-O-metilo, y los nucleósidos en las posiciones 2 y 3 se modificaron de la siguiente manera: 2'-O-metilo en ADAR89-10, desoxirribosa (ADN) en ADAR89-15 y 2 '-N H en ADAR89-20 (Figura 2). La capacidad de edición de estos AON se probó en un ensayo de células pulmonares primarias como se describe en el ejemplo anterior, y se analizó mediante una técnica de ddPCR de la siguiente manera. La cuantificación absoluta de las secuencias objetivo de ácido nucleico se realizó utilizando el sistema de PCR digital de gotitas QX-200 de Bio-Rad. Se usó 1 pl del ADNc obtenido de la RT-PCR (diluido 1/10) en una mezcla total de 20 pl de mezcla de reacción, incluido el ddPCR Supermix para sondas sin dUTP (Bio-Rad), un ensayo de genotipo Taqman SNP con los cebadores directo e inverso relevantes combinados con las siguientes sondas específicas de genes:

Cebador directo 5'-GCAAGGCTTTAAGATCACACAAA-3' (SEQ ID NO: 18)

Cebador inverso 5-GGAAGGGACTGGGGTACTC-3' (SEQ ID NO: 19)

sonda de tipo silvestre (etiqueta HEX IBFQ) 5-TTTGCCAAGAAGTAGCGCCTTTCCCT-3' (SEQ ID NO: 20) sonda mutante (etiqueta FAM IBFQ) 5-TTTGCCAAGAAGTGGCGCCTTTCCCT-3' (SEQ ID NO: 21)

Se llenó un volumen total de 20 pl de mezcla de PCR que incluía ADNc en la fila central de un cartucho ddPCR (Bio-Rad) utilizando una pipeta multicanal. Las réplicas se dividieron en dos cartuchos. Las filas inferiores se llenaron con 70 pl de aceite de generación de gotitas para sondas (Bio-Rad). Después del reemplazo de la junta de goma, se generaron gotitas en el generador de gotitas QX200. Se transfirieron 40 pl de emulsión de aceite de la fila superior del cartucho a una placa de PCR de 96 pocillos. La placa de PCR se selló con una hoja de estaño durante 4 segundos a 170 °C utilizando el sellador de placas PX1 y se siguió directamente mediante el siguiente programa de PCR: 1 ciclo de activación enzimática durante 10 minutos a 95 °C, 40 ciclos de desnaturalización durante 30 segundos a 95 °C e hibridación/extensión durante 1 min a 63,8 °C, 1 ciclo de desactivación de la enzima durante 10 min a 98 °C, seguido de un almacenamiento a 8 °C. Después del programa de PCR, la placa se leyó y analizó con el lector de gotitas QX200 con los siguientes ajustes: cuantificación absoluta, súper mezcla para sondas sin dUTP, Ch1 FAM de tipo silvestre y CH2 HEX mutante. Los resultados que se proporcionan en la Figura 13 muestran que todos los AON lograron una edición significativa del ARN objetivo, con ADAR89-20 con el mejor rendimiento.

Ejemplo 9. Modificaciones químicas en AON dirigidas a ARN IDUA de ratón para edición de ARN

Luego, los inventores se preguntaron si las modificaciones que producían estabilización podrían combinarse más y si los AON con tales combinaciones serían funcionales en la edición de ARN en el modelo de Hurler (véase también el ejemplo 2). El efecto de estos AON sobre la restauración de la secuencia de tipo silvestre se probó en un ensayo que mide la actividad de la enzima a-L-iduronidasa codificada por el gen Idua de ratón. Para ello, se cultivaron células inmortalizadas de fibroblastos embrionarios de ratón (70.000 por muestra) derivadas de un ratón mutante W392X en medio de crecimiento (DMEM/FCS al 10%) y se transfectaron con 1 pg de un plásmido de expresión que porta el ADNc de W392X de Idua de longitud completa utilizando Lipofectamina 3000. Después de 24 h, las células se transfectaron de manera similar con 100 nM (concentración final) de cada uno de los AON respectivos de la serie ADAR65 (véanse las Figuras 5 y 6 para los resultados de estabilidad) y se cultivaron durante 48 h adicionales. A continuación, se recogieron las células y se lisaron en tampón mPER (Thermo Scientific # 78501). Los fragmentos de células se retiraron de los lisados mediante centrifugación y se utilizaron 25 pl del sobrenadante para el ensayo enzimático 5: se añadieron 25 pl de 4-metilumbeliferil a-L-iduronidasa 360 pM en tampón de formiato de sodio 0,4 M (pH 3,5) en las muestras de lisado, que luego se incubaron durante 2 h a 37 °C. La reacción se terminó mediante la adición de 200 pl de tampón de glicina 0,17 M (pH 9,9), y luego se midió la intensidad de fluorescencia resultante (longitud de onda de excitación 365 nm y emisión 450 nm). Los resultados se normalizaron a la concentración de proteína total de las muestras, como 10 medida por el ensayo BCA (kit de ensayo de proteínas PierceMR BCA, Thermo Scientific).

Los resultados proporcionados en la Figura 14 muestran que todos los oligonucleótidos ADAR65 transfectados fueron capaces de aumentar la actividad de la enzima a-L-iduronidasa por encima de los niveles no transfectados (NT), lo que indica que se editó el (pre-)ARNm objetivo. Parece que la mayoría de los AON aplicados de hecho editan el ARN objetivo de manera bastante eficiente. Como puede verse en una comparación con el ensayo de estabilidad (Figuras 5 y 6), muchos de los AON (especialmente ADAR65-23 a ADAR65-30) muestran una alta estabilidad y también una buena capacidad para restaurar la actividad enzimática de la enzima a-L-iduronidasa, que muestra que el uso de nucleótidos de a Dn y modificaciones 2'-fluoro así como enlaces fosforotioato dentro del Triplete Central son realizaciones útiles y por lo tanto preferidas de la presente invención.

Claims (15)

REIVINDICACIONES

1. Un oligonucleótido antisentido (AON) capaz de formar un complejo de cadena doble con una secuencia de ARN objetivo en una célula, preferiblemente una célula humana, para la desaminación de una adenosina objetivo en la secuencia de ARN objetivo por una enzima ADAR presente en la célula, comprendiendo dicho AON un Triplete Central de 3 nucleótidos secuenciales, donde el nucleótido directamente opuesto a la adenosina objetivo es el nucleótido medio del Triplete Central, en el que 1, 2 o 3 nucleótidos en dicho Triplete Central comprenden una modificación de azúcar y/o una modificación de base para hacer que el AON sea más estable y/o más eficaz para inducir la desaminación de la adenosina objetivo; con la condición de que el nucleótido medio no tenga una modificación 2'-O-metilo.

2. El AON de acuerdo con la reivindicación 1, en el que 2 o 3 nucleótidos en el Triplete Central no tienen una modificación 2'-O-metilo.

3. El AON de acuerdo con la reivindicación 1 o 2, en el que 1 o 2 nucleótidos del Triplete Central, preferiblemente distintos del nucleótido medio, son reemplazados por una inosina.

4. El AON de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en el que el AON no comprende una porción que sea capaz de formar una estructura intramolecular de tallo-bucle que sea capaz de unirse a una enzima ADAR de mamífero.

5. El AON de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en el que la modificación de azúcar se selecciona del grupo que consiste en desoxirribosa (ADN), ácido nucleico desbloqueado (UNA) y 2'-fluororribosa.

6. El AON de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en el que el AON comprende al menos una modificación de enlace internucleosídico seleccionada del grupo que consiste en fosforotioato, 3'-metilenfosfonato, 5'-metilenfosfonato, 3'-fosforamidato y 2'- 5'-fosfodiéster.

7. El AON de acuerdo con la reivindicación 6, en el que los 2, 3, 4, 5 o 6 nucleótidos terminales del extremo 5' y 3' del AON están unidos con enlaces fosforotioato, preferiblemente en los que los 5 nucleótidos terminales en el extremo 5' y el extremo 3' están unidos con enlaces fosforotioato.

8. El AON de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, en el que dicha modificación de base se selecciona del grupo que consiste en 2-aminopurina, 2,6-diaminopurina, 3-deazaadenosina, 7-deazaadenosina, 7-metiladenosina, 8-azidoadenosina, 8-metiladenosina, 5-hidroximetilcitosina, 5-metilcitidina, pirrolocitidina, 7-aminometil-7-deazaguanosina, 7-deazaguanosina, 7-metilguanosina, 8-aza-7-deazaguanosina, tienoguanosina, inosina, 4-tio-uridina, 5-metoxiuridina, dihidrouridina y pseudouridina.

9. El AON de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, en el que el nucleótido medio del Triplete Central es una citidina o una uridina.

10. El AON de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, en el que uno o más nucleótidos en el AON fuera del Triplete Central comprenden una modificación seleccionada del grupo que consiste en: ADN, un grupo 2'-O-alquilo tal como un grupo 2'-O-metilo, un grupo 2'-O-MOE, un grupo 2'-F, un grupo 2 '-N H y un LNA; o combinaciones de los mismos.

11. El AON de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10, en el que el AON comprende de 18 a 70 nucleótidos, preferiblemente comprende de 18 a 60 nucleótidos, más preferiblemente comprende de 18 a 50 nucleótidos.

12. Una composición farmacéutica que comprende el AON de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11, y un vehículo farmacéuticamente aceptable.

13. El AON de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11 para su uso en el tratamiento o prevención de un trastorno genético, preferiblemente seleccionado del grupo que consiste en: fibrosis quística, síndrome de Hurler, deficiencia de alfa-1-antitripsina (A1AT), enfermedad de Parkinson, enfermedad de Alzheimer, albinismo, esclerosis lateral amiotrófica, asma, p-talasemia, síndrome de Cadasil, enfermedad de Charcot-Marie-Tooth, enfermedad pulmonar obstructiva crónica (EPOC), atrofia muscular espinal distal (DSMA), distrofia muscular de Duchenne/Becker, epidermólisis distrófica ampollosa, epidermólisis ampollosa, enfermedad de Fabry, trastornos asociados al Factor V de Leiden, poliposis adenomatosa familiar, galactosemia, enfermedad de Gaucher, glucosa-6-fosfato deshidrogenasa, hemofilia, hemocromatosis hereditaria, síndrome de Hunter, enfermedad de Huntington, enfermedad de intestino inflamatorio (IBD), síndrome de poliaglutinación heredada, amaurosis congénita de Leber, síndrome de Lesch-Nyhan, síndrome de Lynch, síndrome de Marfan, mucopolisacaridosis, distrofia muscular, distrofia miotónica tipos I y II, neurofibromatosis, enfermedad de Niemann-Pick tipo A, B y C, cáncer relacionado con NY-eso1, síndrome de Peutz-Jeghers, fenilcetonuria, enfermedad de Pompe, enfermedad ciliar primaria, trastornos relacionados con la mutación de protrombina, tales como la mutación de protrombina G20210A, hipertensión pulmonar, retinitis pigmentosa, enfermedad de Sandhoff, síndrome de inmunodeficiencia combinada grave (SCID), anemia de células falciformes, atrofia muscular espinal, enfermedad de Stargardt, enfermedad de Tay-Sachs, síndrome de Usher, inmunodeficiencia ligada al cromosoma X, síndrome de Sturge-Weber y cáncer.

14. Un procedimiento in vitro para la desaminación de al menos una adenosina objetivo específica presente en una secuencia de ARN objetivo en una célula, comprendiendo el procedimiento las etapas de:

(i) proporcionar a la celda un AON de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11;

(ii) permitir la absorción por la célula del AON;

(iii) permitir la hibridación del AON con la secuencia de ARN objetivo;

(iv) permitir que una enzima ADAR de mamífero que comprende un dominio de unión de ARNcd natural como se encuentra en la enzima de tipo silvestre desaminar la adenosina objetivo en la secuencia de ARN objetivo a una inosina; y

(v) opcionalmente identificar la presencia de la inosina en la secuencia de ARN.

15. El procedimiento de la reivindicación 14, en el que la etapa (v) comprende:

a) secuenciar la secuencia de ARN objetivo;

b) evaluar la presencia de una proteína funcional, alargada, de longitud completa y/o de tipo silvestre cuando la adenosina objetivo está ubicada en un codón de parada UGA o UAG, que se edita en un codón UGG mediante la desaminación;

c) evaluar la presencia de una proteína funcional, alargada, de longitud completa y/o de tipo silvestre cuando dos adenosinas objetivo están ubicadas en un codón de parada UAA, que se edita en un codón UGG mediante la desaminación de ambas adenosinas objetivo;

d) evaluar si el empalme del pre-ARNm fue alterado por la desaminación; o

e) usar una lectura funcional, en la que el ARN objetivo después de la desaminación codifica una proteína funcional, de longitud completa, alargada y/o de tipo silvestre.