ES2831834T3

ES2831834T3 - Método basado en células para determinar la potencia de la defibrotida

Info

Publication number: ES2831834T3
Application number: ES15798418T
Authority: ES
Inventors: Terenzio Ignoni; Vijay Kumar; Claudio Verga
Original assignee: Gentium SRL
Current assignee: Gentium SRL
Priority date: 2014-11-27
Filing date: 2015-11-23
Publication date: 2021-06-09
Anticipated expiration: 2035-11-23
Also published as: CA2968608A1; JP2022160596A; US20230194502A1; EP4368990A3; MX2022003399A; AU2020250225A1; PL3120153T3; DK3120153T3; EP4368990A2; IL277068A; IL252484B; US20200057051A1; IL252484A0; CN107109458A; JP2017535277A; AU2015352743B2; DK3748358T3; KR20220104070A; EP3026122A1; KR102421677B1

Abstract

Un metodo para medir la actividad biologica de un lote de muestra de defibrotida que comprende: crecimiento de celulas de mamifero en cultivo; incubar las celulas con una solucion que contiene al menos un agente citotoxico y al menos una concentracion de defibrotida del lote de muestra; determinar la viabilidad de las celulas expuestas al lote de muestra de defibrotida despues de un periodo de incubacion, comparar la viabilidad celular con la viabilidad celular para un lote de referencia de defibrotida y calcular la actividad biologica del lote de muestra de defibrotida basandose en la comparacion; en el que dicho al menos un agente citotoxico es fludarabina, 9-beta-D-arabinofuranosil-2-fluoroadenina (F-Ara-A) o doxorrubicina.

Description

DESCRIPCIÓN

Método basado en células para determinar la potencia de la defibrotida

Antecedentes de la invención

Las sustancias medicinales deben producirse a un nivel de actividad específica constante para que puedan administrarse de forma segura. Por ejemplo, los ensayos para moléculas biológicas tales como la heparina tienen variabilidad de un lote a otro en términos de longitud de cadena, peso molecular, composición, grado de sulfatación, etc. También es necesario estandarizar otras sustancias que se extraen de sustancias naturales. Véase, por ejemplo, la patente de los Estados Unidos No. 7.575.886. Una de esas sustancias es la defibrotida. La defibrotida es una mezcla heterogénea de polinucleótidos monocatenarios de diferentes longitudes que se extrae de órganos de mamíferos.

Hay ensayos disponibles para evaluar la actividad biológica de la defibrotida, incluyendo la prueba de placa de fibrina y el registro tromboelastográfico del tiempo de lisis de la euglobulina (Prino G. et al., Indagini preliminari sull'attivitfibrinolitica, nell'animale e nell'uomo , di una nuova sostanza presente in diversi organi animali, Simposio Internazionale: La ricerca scientifica nell'industria farmaceutica en Italia, Roma, 2-4 de octubre de 1975-II Farmaco, Ed. Prat.) (1969), 24,552-561), el método de la plasmina (patente de Estados Unidos No. 7.338.777) y el método de la euglobulina (documento WO2013/190582). Aunque estos métodos son herramientas útiles de fabricación farmacéutica, todos estos métodos, que se basan en las propiedades profibrinolíticas de la defibrotida, implican una evaluación de la actividad de la defibrotida en proteínas o enzimas aisladas.

Por lo tanto, existe una necesidad en la técnica de métodos novedosos para determinar la actividad biológica de la defibrotida en un contexto celular que proporcione un proceso preciso y fiable para evaluar la potencia, por ejemplo, en comparación con una preparación estándar de defibrotida de referencia, de nuevos lotes de defibrotida independientemente del proceso de fabricación utilizado.

Sumario de la invención

La presente invención se basa, en parte, en el descubrimiento de que la defibrotida protege a las células de mamífero de la citotoxicidad inducida por agentes citotóxicos particulares de una manera dependiente de la dosis. Los inventores han aprovechado este efecto de protección celular y han desarrollado un método basado en células para evaluar la potencia de los lotes de defibrotida y han definido una unidad de medida para facilitar una administración eficaz y segura. Dichos métodos permiten, entre otras cosas, el control de calidad durante el proceso de fabricación de defibrotida, la estandarización de lotes de defibrotida producidos por diferentes métodos o fuentes, y la dosificación consistente de pacientes con defibrotida.

Breve descripción de los dibujos

Figura 1. Viabilidad de las células HMEC incubadas con fludarabina en presencia o ausencia de concentraciones variables de defibrotida medida por el ensayo de MTT. Se incubaron HMEC-1 con fludarabina (F-Ara) a razón de 10 |jg/mL en presencia o ausencia de concentraciones variables de defibrotida (DF) (1 |jg/mL-100 |jg/mL) durante 72 horas y se midió la viabilidad de las células con el ensayo de MTT. Prueba t de Student: §p <0,01, F-ara 10 jig/mL frente al control (ctr); * p <0,05, células tratadas con DF a razón de 1 jig/mL frente a F-ara 10 jig/mL; ** p <0,001, DF a razón de 10 y 100 jg/m L frente a F-ara 10 jg/mL.

Figura 2. Viabilidad de las células SK-HEP-1 incubadas con doxorrubicina en presencia o ausencia de concentraciones variables de defibrotida medida por el ensayo de CCK-8. Las células SK-HEP-1 se incubaron con doxorrubicina (Dox) a 0,1 jg/m L en presencia o ausencia de concentraciones variables de defibrotida (DF) (1 jg/mL-100 jg/mL) durante 72 horas y la viabilidad de las células se midieron con el ensayo de CCK-8. Prueba t de Student: §p <0,01, Dox 0,1 jg/m L frente al control (ctr); * p <0,01, células tratadas con DF a 50 o 100 jg/m L frente a Dox 0,1 jg/mL.

Figura 3. Viabilidad de las células HMEC-1 incubadas con fludarabina en presencia o ausencia de concentraciones variables de defibrotida, AC o ACTG medidas mediante el ensayo de MTT. Las células HMEC-1 se incubaron con fludarabina (F-Ara) a razón de 50 jg/m L en presencia o ausencia de concentraciones variables de oligonucleótidos sintéticos aleatorios de adenina-citosina (AC) de aproximadamente 16 kDa (1-500 jg/mL) (Figura 3A), oligonucleótidos sintéticos aleatorios de adenina-citosina-guanina-timina (ACGT) de aproximadamente 17 kDa (12,5-50 jg/mL) (Figura 3B), o defibrotida (5-100 jg/mL) (Figura 3C) durante 72 horas y se midió la viabilidad de las células con el ensayo de MTT. Prueba t de Student: * p <0,01, F-ara 50 jg/mL frente al control (Ctr), ** p <0,01 F-ara 50 jg/m L frente a defibrotida. No hubo una protección significativa por ninguno de los oligonucleótidos sintéticos.

Figura 4. Viabilidad de las células SK-HEP-1 incubadas con fludarabina en presencia o ausencia de concentraciones variables de ACTG, tpA o glutatión medidas mediante el ensayo de CCK-8. Las células SK-HEP-1 se incubaron con fludarabina (F-Ara) a razón de 10 jg/m L en ausencia o presencia, (AG), de concentraciones variables de oligonucleótidos sintéticos aleatorios de adenina-citosina-guanina-timina (ACGT) de aproximadamente 17 kDa (1,25 80 jg/mL), tPA (10-320 UI/mL) o glutatión (1,25-80 jg/mL) durante 72 horas y se midió la viabilidad de las células con el ensayo de CCK-8. Prueba t de Student: * p <0,01, F-Ara 10 jg/m L frente al control (Ctr). No hubo una protección significativa de la citotoxicidad inducida por F-Ara por ACGT, tPA o glutatión.

Figura 5. Comparación de las curvas de respuesta a la dosis de defibrotida estándar frente a muestras de defibrotida estresada por ácido (Figura 5A) y estresada por base (Figura 5B) en el ensayo de protección celular. Los datos brutos de absorbancia se procesaron utilizando el programa de análisis estadístico PLA2 (análisis de función logística de 4 parámetros). La absorbancia del colorante indicador de viabilidad celular (CCK-8) se representa en el eje Y como "respuesta". La dosis se representa en el eje X y es una serie de dilución doble de defibrotida en el ensayo (1,25 - 80 |jg/mL); STD representa la defibrotida estándar de referencia. Los trazos inferiores en cada panel, que corresponden a las muestras estresadas, indican una potencia reducida. Usando este programa de análisis estadístico, ambas muestras estresadas no cumplieron con los criterios estadísticos de aceptación.

Figura 6. Viabilidad de las células SK-HEP-1 incubadas con fludarabina en presencia o ausencia de concentraciones variables de defibrotida medida por el ensayo de CCK-8. Las células SK-HEP-1 se incubaron con fludarabina (F-Ara) a 10 jg/m L en ausencia o presencia de concentraciones variables de defibrotida (DF) (1 jg/mL-100 jg/mL) durante 72 horas y se midió la viabilidad de las células con el ensayo de CCK-8. Prueba t de Student: p <0,01, F-Ara 10 jg/mL frente al control (Ctr) y para células tratadas con DF a una concentración > 1 jg/m L frente a F-Ara 10 jg/mL.

Figura 7. Evaluación de la relación de potencia entre una muestra de defibrotida de referencia estandarizada (estándar) y una muestra de defibrotida de actividad biológica desconocida. Las células SK-HEP-1 se expusieron a 6 diluciones en serie (1:2) de defibrotida estándar y de muestra para obtener una concentración de 80, 40, 20, 10, 5, 2,5 y 1,25 jg/m L en presencia de fludarabina (F- Ara) (10 jg/mL). Cada concentración del estándar y la muestra constaba de 4 repeticiones. Después de 72 horas de incubación a 37 °C, se midió la viabilidad de las células con el ensayo de CCK-8. Las medidas de absorbancia se sometieron a análisis estadístico para la determinación de la potencia de la muestra (análisis logístico de 4 parámetros).

Descripción detallada de la invención

La presente invención proporciona un método fiable para determinar la actividad biológica de la defibrotida basándose en la capacidad de la defibrotida para proteger las células vivas de los efectos de ciertos agentes citotóxicos. Este efecto de protección celular es importante para el uso de la defibrotida como medicamento. Este método permite estandarizar la actividad de la defibrotida que se obtiene por diferentes métodos o fuentes. El método también permite el establecimiento y asignación de una unidad de medida para facilitar la administración segura y eficaz de defibrotida.

En una realización de la invención, el método para evaluar la potencia de un lote de muestra de defibrotida comprende (i) hacer crecer células de mamífero en cultivo, (ii) incubar las células con una solución que contiene al menos un agente citotóxico y al menos una concentración de defibrotida del lote de muestra, (iii) determinar la viabilidad de las células después de un período de incubación, y (iv) calcular la potencia del lote de muestra de defibrotida basándose en la medición de la viabilidad celular. En algunas realizaciones, el método comprende además comparar la viabilidad celular para el lote de muestra de defibrotida con la viabilidad celular para un lote de referencia de defibrotida y calcular la potencia del lote de muestra de defibrotida basándose en la comparación.

Para el propósito de la presente invención, el término "potencia" se refiere a la medida de la actividad biológica de la defibrotida, en particular basada en la medida de la capacidad de la defibrotida para proteger las células vivas de los efectos de los agentes citotóxicos. La defibrotida (Merck Index, 1996, No. 2915; cA s número 83712-60-1) es una sustancia de origen natural. Es la sal de sodio de polidesoxirribonucleótidos de bajo peso molecular que se obtienen por extracción de órganos animales. Se sabe que la defibrotida tiene un peso molecular (PM) entre 14 y 19 kDa, pero las técnicas de medición específicas muestran que la defibrotida tiene un peso molecular promedio (PM de alrededor de 16,1 kDa ± 2,0 kDa si se determina mediante la técnica de SEC-HPLC; un PM de alrededor de 17,6 kDa ± 1,0 kDa si se determina mediante la técnica PAGE; y un PM de alrededor de 16,7 kDa ± 1,6 kDa si se determina mediante la técnica de dispersión de luz láser de múltiples ángulos. "Analysis of Aggregates and Particles in Protein Pharmaceuticals" H. Mahler y W. Jiskoot (eds.), 2012 John Wiley & Sons, Inc. La defibrotida tiene numerosas aplicaciones terapéuticas, incluido el uso como agente antitrombótico (patente de los Estados Unidos No. 3.829.567), tratamiento de arteriopatías periféricas, tratamiento de insuficiencia renal aguda (patente de los Estados Unidos No.

4.694.134) y tratamiento de isquemia miocárdica aguda (patente de los Estados Unidos No. 4.693.995). Más recientemente, la defibrotida se ha utilizado para el tratamiento y la prevención del síndrome de obstrucción sinusoidal/enfermedad venosa oclusiva (ensayo clínico de la UE EudraCT: 2004-000592-33, ensayo clínico de los Estados Unidos 2005-01 (identificador de ClinicalTrials.gov: NCT00358501). Otros usos de la defibrotida se describen en las siguientes patentes y solicitudes de patente: patentes de los Estados Unidos Nos. 3.770.720; 3.829.567; 3.899.481; 4.693.134; 4.693.995; 4.938.873; 4.985.552; 5.081.109; 5.116.617; 5.223.609; 5.646.127; 5.646.268; 5.977.083; 6.067.377 ; 8.771.663, publicaciones de patentes de los Estados Unidos Nos. 20080194506; 20090131362; 20110092576; 20130231470; 20140005256, solicitud de patente de los Estados Unidos No. 14/323,918; y el documento WO 2013/190582.

Los métodos descritos en el presente documento pueden usarse para evaluar la potencia de lotes de defibrotida fabricados mediante diferentes métodos o extraídos de diferentes órganos de animales. Por ejemplo, en algunas realizaciones, el lote de muestra de defibrotida se extrae de tejido bovino, tal como pulmón, intestino o membranas mucosas de bovino. En otras realizaciones, el lote de muestra de defibrotida se extrae de tejido porcino, tal como pulmón, intestino o membranas mucosas porcinos. Los lotes de muestras de defibrotida también se pueden extraer de otros órganos de otras especies animales, incluidos ovejas y caballos.

En determinadas realizaciones, los lotes de muestras de defibrotida que se van a evaluar para determinar la potencia mediante los métodos descritos en el presente documento se fabrican mediante un proceso como el descrito en las patentes de los Estados Unidos Nos. 4.985.552 y 5.223609. En particular, la defibrotida obtenida con este proceso es un polidesoxirribonucleótido que corresponde a la siguiente fórmula de secuencia aleatoria:

P1-5,(dAp)12-24,(dGp)10-20,(dTp)13-26,(dCp)10-20

en la que:

P = radical fosfórico

dAp = monómero desoxiadenílico

dGp = monómero desoxiguanílico

dTp = monómero desoxitimidílico

dCp = monómero desoxicitidílico.

Los lotes de muestras de defibrotida pueden tener una o más o todas las siguientes propiedades físico-químicas: electroforesis = movilidad anódica homogénea; coeficiente de extinción, Elcm1% a 260 ± 1 nm = 220 ± 10; relación de extinción, E²³⁰/E²⁶⁰= 0,45 ± 0,04; coeficiente de extinción molar (referido al fósforo), £(P) = 7750 ± 500; potencia de giro [a]D20° = 53° ± 6; hipercromicidad reversible, indicada como % en ADN nativo, h = 15 ± 5; y una relación purina: pirimidina de 0,95 ± 0,5. En determinadas realizaciones, los lotes de muestras de defibrotida que se evaluarán para determinar la potencia mediante los métodos de la invención pueden haber sido sometidos a un estrés fisicoquímico o sospechado de estar expuestos a un estrés fisicoquímico, tal como alta temperatura, pH extremo, peróxido de hidrógeno, etc. Por lo tanto, los métodos de la invención también se pueden usar para evaluar la potencia de lotes de defibrotida o composiciones que comprenden defibrotida que se han almacenado en condiciones subóptimas o durante periodos de tiempo prolongados. En determinadas realizaciones, los métodos se pueden usar para controlar la estabilidad de lotes de defibrotida o composiciones que comprenden defibrotida, por ejemplo, para predecir la vida útil.

Los métodos de la invención comprenden hacer crecer células de mamífero en cultivo. En determinadas formas de realización, las células de mamífero son células humanas. En algunas realizaciones, las células humanas son células epiteliales humanas. En otras realizaciones, las células humanas son células endoteliales humanas. En una realización particular, las células endoteliales humanas son células endoteliales sinusoidales de hígado humano, tales como células SK-HEP-1. En otra realización particular, las células endoteliales humanas son células endoteliales microvasculares humanas, tales como células HMEC-1. En otra realización particular, las células epiteliales son queratinocitos (por ejemplo, células HaCaT) o células epiteliales alveolares (por ejemplo, células A549). Las células de mamíferos se pueden obtener de depósitos reconocidos, tal como la American Type Culture Collection (ATCC) así como otras fuentes.

Los medios de crecimiento adecuados para el crecimiento de células de mamíferos en cultivo son bien conocidos en la técnica y se describen, por ejemplo, en "Culture of Animal Cells: A Manual of Basic Technique and Specialized Applications" R. I. Freshney, 2010, Wiley-Blackwell. El medio óptimo para cada tipo de células se puede obtener de proveedores especializados de las células (por ejemplo: ATCC-LGC, MI, Italia; CDC, Atlanta, Ga , EE. UU.). En determinadas realizaciones, las células de mamífero se cultivan en medio esencial mínimo de Eagle (EMEM) suplementado con suero bovino fetal (FBS) al 10% (v/v), 100 unidades/mL de penicilina, 100 |jg/mL de estreptomicina y 2,5 jg/m L anfotericina B. En otras realizaciones, las células de mamífero se cultivan en medio RpMI 1640 suplementado con suero bovino fetal (FBS) al 10% (v/v), 100 unidades/mL de penicilina, 100 jg/m L de estreptomicina y 2,5 jg/m L de anfotericina B. En determinadas realizaciones, el medio de crecimiento puede contener L-glutamina (por ejemplo, 2 mM), hidrocortisona (por ejemplo, 10 jg/mL) y factor de crecimiento epidérmico (por ejemplo, 10 jg/mL).

La densidad de las células de mamífero puede ser de aproximadamente 5 x 104 células/mL a aproximadamente 5 x 105 células/mL, de aproximadamente 2,5 x 105 células/mL a aproximadamente 2,5 x 105 células/mL, o desde aproximadamente 5 x 104 células/mL hasta aproximadamente 2 x 105 células/mL. Para obtener una respuesta de ensayo óptima, la densidad celular puede, en ciertas realizaciones, optimizarse teniendo en cuenta la naturaleza del agente citotóxico y el tipo de célula utilizada para el ensayo. Por ejemplo, en las formas de realización en las que se utilizan células endoteliales humanas para el ensayo, las densidades celulares particularmente adecuadas oscilan entre aproximadamente 2,5 x 104 células/mL y aproximadamente 2 x 105 células/mL, preferiblemente aproximadamente 5 x 104 células/mL. Estas densidades celulares son particularmente adecuadas para ensayos en los que la doxorrubicina o fludarabina es el agente citotóxico.

En otro aspecto de la invención, los métodos comprenden incubar las células de mamífero en cultivo con una solución que comprende un agente citotóxico y al menos una concentración de defibrotida del lote de muestra bajo evaluación. Como se usa en este documento, el término "agente citotóxico" se refiere a un compuesto que tiene un efecto tóxico en una célula, tal como la inducción de necrosis celular, la inhibición del crecimiento o división celular o la inducción de la apoptosis celular. La citotoxicidad de los compuestos puede resultar de varias propiedades, que incluyen, pero no se limitan a, propiedades antimetabolito, propiedades alquilantes, propiedades de intercalación de ácidos nucleicos o propiedades apoptóticas. Una propiedad antimetabolito es la capacidad del compuesto, o sus metabolitos, para interferir con la síntesis adecuada de biomoléculas, tales como el ADN y el ARN. Los ejemplos de compuestos que tienen una propiedad antimetabolito incluyen análogos de nucleobases (por ejemplo, análogos de purina y pirimidina), análogos de nucleósidos y nucleótidos y compuestos antifolato. Ejemplos de análogos de nucleobases y nucleósidos que tienen efectos citotóxicos incluyen, pero no se limitan a, azatioprina, tiopurinas (por ejemplo, tioguanina, mercaptopurina), fludarabina, pentostatina, 5-fluorouracilo, 6-azauracilo, clofarabina, nelarabina, cladribina, citarabina floxuridina capecitabina, gemcitabina, azacitidina y decitabina. Los ejemplos de antifolatos incluyen metotrexato, aminopterina, pemetrexed, pralatrexato y raltitrexed.

Una propiedad alquilante es la capacidad del compuesto, o sus metabolitos, para transferir grupos alquilo a biomoléculas o formar enlaces covalentes con grupos reactivos dentro de biomoléculas (por ejemplo, grupos amino, carboxilo, sulfhidrilo y fosfato), que pueden inactivar o interferir con su función biológica. Muchos agentes alquilantes pueden entrecruzar las cadenas de ADN, lo que dificulta la replicación del ADN, lo que puede conducir a la inducción de apoptosis. Ejemplos de agentes alquilantes incluyen mostazas de nitrógeno (por ejemplo, mecloretamina, ciclofosfamida, melfalán, clorambucilo, ifosfamida y busulfano), nitrosoureas (por ejemplo, N-nitroso-N-metilurea, carmustina, lomustina y semustina, fotemustina y estreptozotocina), tetrazinas (por ejemplo, dacarbacina, mitozolomida y temozolomida), aziridinas (por ejemplo, tiotepa, mitomicina y diaziquona) y cisplatinos (por ejemplo, cisplatino, carboplatino y oxaliplatino).

Una propiedad de intercalación de ácidos nucleicos es la capacidad del compuesto, o sus metabolitos, de insertarse en la doble hélice de ADN, lo que puede provocar mutaciones o intercalarse dentro de regiones de estructuras helicoidales de ARN. Los ejemplos de agentes intercalantes incluyen bromuro de etidio, mitomicina, actinomicina, plicamicina, antraciclinas (por ejemplo, doxorrubicina, daunorrubicina, epirrubicina, idarrubicina, valrubicina y mitoxantrona), talidomida y bleomicinas.

Una propiedad apoptótica es la capacidad del compuesto, o sus metabolitos, para inducir la muerte celular programada. Una clase particular de compuestos que pueden inducir la apoptosis son los agentes antimicrotúbulos, que interfieren con la mitosis y dan como resultado la detención del ciclo celular, induciendo así la apoptosis. Los agentes antimicrotúbulos incluyen alcaloides de la vinca, tales como vincristina, vinblastina, vinorelbina, vindesina y vinflunina, y taxanos, tales como paclitaxel y docetaxel.

Los inhibidores de la topoisomerasa también son citotóxicos en virtud de su capacidad para prevenir la replicación y transcripción del ADN y/o al provocar roturas de la cadena de ADN, induciendo así la apoptosis. Los inhibidores de la topoisomerasa incluyen, pero no se limitan a, irinotecano, topotecano, etopósido, doxorrubicina, mitoxantrona y tenipósido.

El agente citotóxico usado en los métodos de la divulgación es generalmente un compuesto químico sintético, semisintético o natural. El compuesto puede tener una o más de las propiedades descritas anteriormente. El agente citotóxico puede ser cualquiera de los compuestos descritos en este documento o un metabolito del mismo. En algunas realizaciones de esta divulgación, el agente citotóxico puede seleccionarse de fludarabina, citarabina, 5-fluorouracilo, metotrexato, busulfano, melfalán, cisplatino, bromuro de etidio, doxorrubicina, antraciclinas, talidomida o combinaciones de los mismos. En determinadas realizaciones, el agente citotóxico utilizado en los métodos de la invención es fludarabina o su metabolito activo, 9-beta-D-arabinofuranosil-2-fluoroadenina (F-Ara-A). En otras realizaciones, el agente citotóxico usado en los métodos de la invención es doxorrubicina.

Los agentes citotóxicos alternativos comúnmente conocidos por el experto en la técnica son igualmente adecuados para su uso en los métodos de la presente divulgación. Por ejemplo, en algunas realizaciones, los agentes citotóxicos ralentizan o detienen la progresión del ciclo celular y/o inducen la apoptosis de las células. Dichos tipos de agentes citotóxicos incluyen estaurosporina, bendamustina, carmustina, imatinib y sus sales (comercializadas como Gleevec), Ara-C, gemtuzumab (tal como Gemtuzumab ozogamicina, comercializada como Mylotarg), azacitidina (comercializadas como Vidaza), decitabina (comercializadas como Dacogen), Vorinostat (comercializado como Zolinza) y Thapsigargina, H²O²y acetato de miristato de forbol. Consulte también la lista de NIOSH de Antineoplásicos y Otros Medicamentos Peligrosos en Entornos de Atención Médica 2012, HHS, publicación No. 2012-150 (http://www.cdc.gov/niosh/docs/2012-150/pdfs/2012-150.pdf).

La concentración del agente citotóxico usado en los métodos de la invención variará dependiendo del agente citotóxico particular y del tipo de célula de mamífero que se use. En realizaciones en las que fludarabina o F-Ara-A es el agente citotóxico, el agente está presente en el medio de crecimiento a una concentración final de aproximadamente 10 |jg/mL a aproximadamente 50 jg/mL. En otras realizaciones en las que la doxorrubicina es el agente citotóxico, el agente está presente en el medio de crecimiento a una concentración final de aproximadamente 0,1 jg/m L a aproximadamente 10 jg/mL.

Los agentes citotóxicos se pueden usar solos o en combinación de 2, 3, 4, 5, 6 o más agentes. En ciertas realizaciones, la potencia de un único lote de muestra de defibrotida puede evaluarse evaluando independientemente su efecto de protección celular para dos agentes citotóxicos diferentes. A modo de ejemplo, se puede obtener un primer valor de potencia del lote de muestra de defibrotida realizando el método con un primer agente citotóxico (por ejemplo, fludarabina) y se puede obtener un segundo valor de potencia realizando el método con un segundo agente citotóxico (por ejemplo, doxorrubicina). La potencia total del lote de muestra de defibrotida se puede determinar mediante una comparación matemática del primer y segundo valores de potencia, por ejemplo, promediando los dos valores o calculando una relación de los dos valores.

En determinadas realizaciones, se puede usar un conjunto particular de condiciones de cultivo para inducir la citotoxicidad de las células de mamífero en lugar de emplear un agente o agentes citotóxicos específicos. Por ejemplo, los métodos pueden comprender exponer células de mamíferos a un medio de cultivo inductor de apoptosis en presencia de al menos una concentración de defibrotida, determinar la viabilidad de las células después de un período de incubación y calcular la potencia de la defibrotida basándose en la medición de la viabilidad celular. Un medio de cultivo que induce la apoptosis puede incluir un medio que tiene un pH ácido (por ejemplo, pH de aproximadamente 2 a aproximadamente 6 o de aproximadamente 4,5 a aproximadamente 6,5) o un pH básico (por ejemplo, pH de aproximadamente 7,5 a aproximadamente 10 o aproximadamente 8 a aproximadamente 9,5). El medio de cultivo inductor de apoptosis también incluye medio que no contiene factores de crecimiento esenciales (por ejemplo, factor de crecimiento de fibroblastos, factor de crecimiento epidérmico, factor de crecimiento derivado de plaquetas) ya que la retirada de factores de crecimiento se reconoce como un inductor de apoptosis. Como se usa en este documento, "medio inductor de apoptosis" también puede referirse a un medio en un intervalo de temperatura particular (por ejemplo, mayor de 37 °C) o intervalo de concentración de oxígeno (menos del 5% de oxígeno) que induce la apoptosis. El medio o las condiciones de cultivo que inducen la apoptosis pueden ser ajustados fácilmente por un experto en la técnica para el tipo de célula de mamífero particular que se emplee en los métodos. U.V. u otros tipos de radiación también pueden usarse para inducir la apoptosis. En algunas realizaciones, la solución de incubación comprende al menos una concentración de defibrotida del lote de muestra bajo evaluación además del agente citotóxico. La concentración de defibrotida del lote de muestra (por ejemplo, concentración final en medio que contiene células) puede estar en el intervalo de aproximadamente 1 |jg/mL a aproximadamente 1 mg/mL, de aproximadamente 1 |jg/mL a aproximadamente 100 jg/mL, de aproximadamente 1,25 jg/m L a aproximadamente 80 jg/mL, o de aproximadamente 5 jg/m L a aproximadamente 50 jg/mL.

En determinadas realizaciones, se prueban múltiples concentraciones de la defibrotida del lote de muestra. Por ejemplo, en una realización, se analizan por separado al menos dos concentraciones diferentes de defibrotida del lote de muestra. En otra realización, se analizan por separado al menos tres concentraciones diferentes de defibrotida del lote de muestra. En una realización particular, se analizan por separado al menos cuatro concentraciones diferentes de defibrotida del lote de muestra. Las múltiples concentraciones de defibrotida del lote de muestra están preferiblemente dentro de los intervalos descritos anteriormente. En algunas realizaciones, las concentraciones múltiples de la defibrotida del lote de muestra se preparan mediante diluciones sucesivas 1:2 de una solución patrón.

En algunas realizaciones, el método comprende además probar un lote de defibrotida de referencia simultáneamente con el lote de muestra de defibrotida. El lote de defibrotida de referencia se prueba típicamente a varias concentraciones conocidas de defibrotida. En algunas realizaciones, pueden ensayarse múltiples concentraciones del lote de defibrotida de referencia. Al igual que con las concentraciones múltiples del lote de muestra de defibrotida, las concentraciones múltiples del lote de referencia de defibrotida se pueden preparar mediante dilución en serie de una solución patrón de acuerdo con un factor de dilución predeterminado. Las concentraciones de la defibrotida del lote de referencia están preferiblemente en el mismo intervalo de concentración que las concentraciones de la defibrotida del lote de muestra. Por ejemplo, las concentraciones de defibrotida del lote de referencia (por ejemplo, concentración final en medio que contiene células) pueden ser de aproximadamente 1 jg/m L a aproximadamente 1 mg/mL, de aproximadamente 1 jg/m L a aproximadamente 100 jg/mL, de aproximadamente 1,25 jg/m L a aproximadamente 80 jg/mL, o de aproximadamente 5 jg/m L a aproximadamente 50 jg/mL.

En algunas realizaciones del método, se preparan al menos 4 concentraciones del lote de muestra de defibrotida y del lote de referencia de defibrotida con al menos 3 réplicas para cada concentración del lote de muestra y lote de referencia.

En determinadas realizaciones, los métodos comprenden un control positivo de la citotoxicidad. Por ejemplo, las células de mamífero se incuban con el agente citotóxico solo (es decir, sin ninguna defibrotida) en las mismas condiciones.

En algunas realizaciones, los métodos comprenden un control negativo de citotoxicidad. Por ejemplo, en una realización, las células de mamífero se incuban en una solución sin ningún agente de defibrotida o citotóxico en las mismas condiciones. Tales soluciones pueden contener el medio de crecimiento celular y opcionalmente cualquier vehículo o disolvente.

En una realización particular, la incubación de las células de mamífero con el agente citotóxico con y sin defibrotida (lotes de muestra y de referencia, controles positivos y negativos) se lleva a cabo en una placa de microtitulación de múltiples pozos (por ejemplo, 96 pozos). La posterior determinación de la viabilidad celular también se puede realizar en la placa de microtitulación. En algunas realizaciones relacionadas, los pozos de la placa de microtitulación se recubren con una matriz de unión celular, tal como poli-D-lisina.

El período de incubación para obtener una respuesta de ensayo aceptable se puede optimizar, en relación con el agente citotóxico y el tipo de célula utilizado en el método. Un experto en la técnica puede ajustar estos parámetros basándose en el conocimiento general común.

En ciertas realizaciones de los métodos, las células se pueden incubar con el agente citotóxico y la defibrotida de la muestra y/o lotes de referencia durante un período que varía de aproximadamente 12 a aproximadamente 120 horas, de aproximadamente 24 a aproximadamente 96 horas, de aproximadamente 48 a aproximadamente 72 horas, o de aproximadamente 48 a aproximadamente 96 horas. En una realización, el período de incubación es de al menos aproximadamente 24 horas. En otra realización, el período de incubación es de al menos aproximadamente 48 horas. En otra realización más, el período de incubación es de al menos aproximadamente 72 horas.

Las condiciones de incubación adecuadas para tipos de células de mamíferos específicos se pueden encontrar en manuales generales de laboratorio, tales como "Culture of Animal Cells: A Manual Of Basic Technique and Specialized Applications" R. I. Freshney, 2010, Wiley-Blackwell. Los puntos de ajuste para la temperatura y el % de CO²durante el período de incubación son otras variables que se pueden ajustar para optimizar la respuesta del ensayo. De acuerdo con una realización de la presente invención, las células de mamífero se incuban a una temperatura que varía entre aproximadamente 35 °C y aproximadamente 39 °C. En otra realización, las células de mamífero se incuban a una temperatura que varía entre aproximadamente 36 °C y aproximadamente 38 °C. De acuerdo con un aspecto adicional de la presente invención, las células de mamífero se incuban a una concentración de CO²que varía de aproximadamente 0 a aproximadamente 10% (v/v) para mantener un pH óptimo del medio para el crecimiento celular. En otra realización, la concentración de CO²puede ser de aproximadamente 1 a aproximadamente 5%.

En otro aspecto de los métodos de la invención, la viabilidad de las células de mamífero se determina después de la incubación con el agente citotóxico y la defibrotida de un lote de muestra. Hay varias técnicas disponibles para evaluar la viabilidad celular (véase, por ejemplo, Assay Guidance Manual, NCBI, 2013, G. Sitta Sittampalam et al. Eds., Disponible en Internet en http://www.ncbi.nlm.nih.gov/books/NBK53196/; Stoddart MJ., Cells viability assays: introduction; Methods Mol Biol. 2011; 740: 1-6 y Riss et al., ASSAY and Drug Development Technologies, Vol. 2 (1): 51-62, 2004 ), y cualquier técnica específica descrita en este documento es solo ilustrativa. En algunas realizaciones, la viabilidad celular se evalúa mediante el uso de kits disponibles comercialmente, tales como el Cell Counting Kit 8 (Dojindo Molecular Technology Inc.; Sigma-Aldrich) y los disponibles en Life Technologies (véase http: //www.lifetcchnologies.com/us/en/home/reference/molecular-probes-the-handbook/tests-for-cell-viability-proliferationand-function.html) y Thermo Scientific (véase http://www.piercenet.com/product/alamarblue-cell-viability-assayreagent).

Algunos métodos adecuados para determinar la viabilidad celular que se pueden utilizar con los métodos de la invención incluyen métodos para evaluar la integridad de la membrana, ensayos que miden la reducción u oxidación, métodos que miden el contenido de ATP celular, ensayos de actividad mitocondrial y ensayos de caspasa. Los métodos para evaluar la integridad de la membrana (por ejemplo, citólisis o ensayos de fuga de membrana) incluyen métodos de exclusión de colorante vitales, tales como los que utilizan azul de tripano, yoduro de propidio, eritrosina B o 7-aminoactinomicina D, ensayos de lactosa deshidrogenasa y ensayos de biomarcadores de proteasa. Dichos métodos generalmente implican medir la presencia de enzimas intracelulares en el medio extracelular (por ejemplo, lactosa deshidrogenasa) o la presencia de colorantes impermeables a la membrana intracelularmente como indicaciones de membranas celulares comprometidas.

Los ensayos basados en redox son típicamente métodos colorimétricos o fluorimétricos en los que ciertas clases de compuestos (tintes/colorantes) cambian de color o fluorescencia como resultado de reacciones bioquímicas llevadas a cabo por células vivas. Un ejemplo de estos tipos de ensayos incluye el ensayo de MTT en el que las enzimas oxidorreductasa celulares reducen el colorante de tetrazolio MTT bromuro de 3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)-2,5-difeniltetrazolio a su formazán insoluble, que tiene un color púrpura. Se pueden usar otros colorantes de tetrazolio estrechamente relacionados en ensayos similares para medir la viabilidad celular. Por lo tanto, en determinadas realizaciones de los métodos de la invención, la viabilidad celular se determina realizando un ensayo colorimétrico basado en la reducción de colorantes de tetrazolio. Los colorantes de tetrazolio adecuados incluyen bromuro de 3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)-2,5-difeniltetrazolio (MTT), 2,3-bis-(2-metoxi-4-nitro-5-sulfofenil)-2H-tetrazolio-5-carboxanilida (XTT), 3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)-5-(3-carboximetoxifenil)-2-(4-sulfofenil)-2H-tetrazolio (MTS) y sales de tetrazolio soluble en agua, tales como WST-1 y WST-8 (2-(2-metoxi-4-nitrofenil)-3-(4-nitrofenil)-5-(2,4-disulfofenil)-2H-tetrazolio). Tales técnicas son bien conocidas en la técnica y se describen, por ejemplo, en Mosmann, "Rapid colorimetric assay for cellular growth and survival: application to proliferation and cytotoxicity assays", J Immunol Methods. 16 de diciembre de 1983; 65: 55-63. Un ensayo similar basado en redox para determinar la viabilidad celular utiliza el colorante fluorescente, resazurina (10-óxido de 7-hidroxi-3H-fenoxazin-3-ona). La resazurina se reduce a resorufina fluorescente altamente roja en células vivas y, por lo tanto, la viabilidad celular se puede determinar midiendo el aumento de fluorescencia en presencia del colorante.

La viabilidad celular también se puede evaluar midiendo cambios en los procesos intracelulares, tales como cambios en los radicales libres intracelulares (por ejemplo, especies reactivas de oxígeno, óxido nítrico), concentración de iones libres (por ejemplo, Ca2+, Mg2+, Zn2+) y potencial de membrana. Los indicadores de fluorescencia para controlar y cuantificar tales cambios están disponibles comercialmente a través de varias fuentes, tales como los reactivos a base de fluorescencia disponibles a través de Life Technologies y Promega. Uno de estos ensayos implica el uso de calceína AM, que es un colorante permeable a las células que es un sustrato para las esterasas celulares. La actividad enzimática en las células vivas convierte la calceína AM en un producto fluorescente, lo que permite la determinación del número de células vivas mediante el aumento de la fluorescencia. La cuantificación del contenido de trifosfato de adenosina (ATP) también se ha utilizado como marcador de la viabilidad celular. El contenido de ATP celular se puede medir por la cantidad de luz producida a través de la reacción con la enzima luciferasa usando, por ejemplo, un luminómetro.

En algunas realizaciones, la viabilidad celular se puede medir manualmente, por ejemplo contando células vivas con la ayuda de microscopios adecuados o por medio de un equipo adecuado para evaluar el cambio de absorbancia/fluorescencia, seleccionado entre un espectrofotómetro, un espectrofluorímetro, un citómetro de flujo o una combinación de los mismos. Los expertos en la técnica conocen otras técnicas para evaluar la viabilidad celular y pueden ser adoptadas para usar con los métodos de la presente invención. Dependiendo del ensayo utilizado para evaluar la viabilidad celular, la medición de la viabilidad celular puede ser un cambio en la absorbancia o fluorescencia de la solución o medio que contiene células, un porcentaje o número de células vivas, o un porcentaje o número de células muertas. En algunas realizaciones, un cambio en la absorbancia o la fluorescencia se puede convertir en un porcentaje o número de células vivas o células muertas. Por ejemplo, en las realizaciones en las que se produce un cambio de color o fluorescencia como resultado de un tinte o colorante que impregna una membrana celular comprometida (por ejemplo, azul de tripano, eritrosina B o yoduro de propidio), un aumento en la absorbancia o fluorescencia en una longitud de onda particular indica un aumento en el número de células muertas. En otras realizaciones en las que se produce un cambio de color o fluorescencia como resultado de una reacción celular (por ejemplo, ensayo de MTT, ensayo de calceína AM), el número de células vivas se correlaciona con un aumento de absorbancia o fluorescencia a una longitud de onda particular. Por lo tanto, en determinadas realizaciones de los métodos de la invención, la viabilidad celular se determina midiendo la absorbancia o la fluorescencia de la solución que contiene las células de mamífero tras la incubación con el agente citotóxico y la defibrotida. En una realización, la viabilidad celular (por ejemplo, absorbancia o fluorescencia) para cada concentración de defibrotida del lote de muestra (por ejemplo, absorbancia/fluorescencia de cada pozo de la placa de microtitulación que contiene diferentes concentraciones de defibrotida del lote de muestra) se mide y se representa frente a la correspondiente concentración de defibrotida para crear una curva de dosis-respuesta. En algunas realizaciones, la curva de dosis-respuesta es una curva sigmoidea (es decir, en forma de S). El intervalo de concentraciones de defibrotida que se prueban puede expandirse o agregarse un número adicional de concentraciones para obtener una curva de dosis-respuesta sigmoidea.

Las lecturas de absorbancia o fluorescencia u otras mediciones de viabilidad celular (por ejemplo, número o porcentaje de células vivas; por ejemplo, número o porcentaje de células muertas) para cada una de las muestras (por ejemplo, los controles positivo y negativo, el lote de referencia de defibrotida y el lote de muestra de defibrotida ), conocidas como datos sin procesar, se pueden procesar y someter a análisis estadísticos adicionales. Se puede emplear un software dedicado para el análisis estadístico, tal como el especialmente diseñado para la evaluación de bioensayos como, por ejemplo, PLA 2 (Stegmann Systems GmbH, Alemania) o, alternativamente, una hoja de cálculo comercial lista para usar personalizada para la evaluación estadística de datos de ensayos biológicos.

En determinadas realizaciones, los métodos de la invención comprenden comparar la viabilidad celular medida para muestras que contienen el lote de muestra de defibrotida con la viabilidad celular medida para un lote de referencia de defibrotida. En algunas realizaciones, las medidas de viabilidad celular para el lote de referencia de defibrotida se obtuvieron antes del análisis del lote de muestra de defibrotida. Tales mediciones anteriores para lotes de referencia de defibrotida se pueden almacenar en una base de datos de referencia o en un medio de almacenamiento legible por ordenador. En determinadas realizaciones, las mediciones de viabilidad celular para el lote de referencia representan un promedio de las mediciones de viabilidad celular obtenidas a partir de una población de lotes de referencia de defibrotida. Por lo tanto, la potencia del lote de muestra de defibrotida se puede calcular con base en las mediciones de viabilidad celular para el lote de muestra en comparación con una curva de calibración estándar obtenida del análisis previo de un lote de referencia de defibrotida o población de lotes de defibrotida. En otras realizaciones, las mediciones de viabilidad celular para el lote de referencia de defibrotida se adquieren al mismo tiempo que las mediciones de viabilidad celular para el lote de muestra de defibrotida. Por ejemplo, una serie de concentraciones para el lote de muestra de defibrotida se procesan en paralelo con una serie de concentraciones para el lote de referencia de defibrotida.

El lote de referencia de defibrotida es preferiblemente un lote de defibrotida estandarizado que tiene una actividad biológica conocida (por ejemplo, actividad profibrinolítica, actividad de protección celular). Por ejemplo, en una realización particular, el lote de referencia de defibrotida tiene una actividad de protección celular de entre 630 y 905 Unidades/mg. El lote de defibrotida estandarizado puede tener una o más de las siguientes características: un peso molecular promedio de entre aproximadamente 14 y aproximadamente 19 kDa medido por SEC-HPLC, un coeficiente de extinción (£1%) de aproximadamente 207-233, una relación de extinción ( Emín./Emáx.) de aproximadamente 0,41 -0,49, una relación de purina a pirimidina superior a aproximadamente 0,80 (por ejemplo, aproximadamente 0,80 a aproximadamente 1,50), coeficiente de extinción molar (£(P), referido al fósforo) de aproximadamente 7200 a aproximadamente 8400, poder rotatorio ([a]D20°) de aproximadamente 45 ° a aproximadamente 60 °, e hipercromicidad reversible, indicada como % en ADN nativo (h) de aproximadamente 8 a aproximadamente 22. En algunas realizaciones, el lote de referencia de defibrotida es un lote de defibrotida fabricado en condiciones GMP para uso clínico. En otras realizaciones, el lote de referencia de defibrotida es un lote comercial de defibrotida disponible a través de Gentium (Villa Guardia, Italia).

En algunas realizaciones, las mediciones de viabilidad celular para múltiples concentraciones de defibrotida del lote de referencia se adquieren para crear una curva de calibración. En una realización, la creación de la curva de calibración comprende la adquisición de los datos de absorbancia relacionados con las muestras a concentraciones crecientes conocidas de defibrotida del lote de referencia y el procesamiento estadístico de esos datos para obtener la curva de calibración, que representa la correlación entre el aumento en la viabilidad celular en presencia de un agente citotóxico y la dosis de defibrotida. En determinadas realizaciones, la viabilidad celular medida para el lote de muestra de defibrotida se compara con una curva de calibración obtenida de las mediciones de viabilidad celular con un lote de referencia de defibrotida para determinar la potencia del lote de muestra de defibrotida.

En algunas realizaciones, una curva de dosis-respuesta obtenida de las mediciones de viabilidad celular del lote de muestra de defibrotida se compara con la curva de calibración obtenida de las mediciones de viabilidad celular con un lote de referencia de defibrotida. En tales realizaciones, la curva de dosis-respuesta y la curva de calibración pueden ser curvas sigmoideas (véase la Figura 7, por ejemplo). La diferencia entre las dos curvas es una función de la diferencia en la actividad biológica entre el lote de muestra de defibrotida y el lote de referencia de defibrotida. Esta diferencia es la potencia del lote de muestra de defibrotida en comparación con el lote de referencia. En una realización, se usa un modelo de función logística de cuatro parámetros (4-PL, Farmacopea Europea, sección 5.3.2) para determinar la diferencia entre la curva de dosis-respuesta para el lote de muestra de defibrotida y la curva de calibración para el lote de referencia de defibrotida para calcular la potencia del lote de muestra de defibrotida. En otra realización, se usa un modelo de función logística de cinco parámetros (5-PL, RA Dudley et al., "Guidelines for immunoassay data processing", Clin. Chem., 1985, 31: 1264-1271) para determinar la diferencia entre la curva de dosis-respuesta para el lote de muestra de defibrotida y la curva de calibración para el lote de referencia de defibrotida para calcular la potencia del lote de muestra de defibrotida.

En algunas realizaciones, los datos obtenidos de las mediciones de viabilidad celular de las muestras con el lote de muestras de defibrotida pueden evaluarse para parámetros estadísticos adicionales para asegurar que los datos sean válidos. Por ejemplo, los datos pueden ser necesarios para satisfacer ciertos criterios estadísticos, como los exigidos por las agencias reguladoras. Tales pruebas pueden incluir pruebas de linealidad, paralelismo y regresión lineal en el nivel de significancia de, por ejemplo, 0,05, tal que Fsin linealidad < Fcrítico, Fsin paralelismo < Fcrítico y Fregresión > Fcrítico, respectivamente, como se detalla, por ejemplo en, la Farmacopea europea, sección 5.3.2, 2014 y Farmacopea de los Estados Unidos, capítulo (1034), Análisis de ensayos biológicos, 2014.

La potencia del lote de muestra de defibrotida calculada a partir de los métodos estadísticos anteriores se puede expresar como un porcentaje del lote de referencia de defibrotida, unidades de actividad de protección por peso de defibrotida u otras unidades que pueden ser o no arbitrarias. En algunas realizaciones, una unidad de protección de defibrotida es la concentración de defibrotida que media la protección celular semimáxima de células SK-HEP-1 en presencia de 10 |jg/mL de fludarabina en las condiciones de ensayo dadas. En una realización, la potencia del lote de muestra de defibrotida se expresa como una relación de potencia con respecto a la potencia del lote de referencia de defibrotida. En determinadas realizaciones, la relación de potencia para el lote de muestra de defibrotida se calcula usando la siguiente fórmula:

Relación de potencia = Cref/Cmuest

En la que, C son las concentraciones de materiales de defibrotida de referencia (ref) y muestra (muest) requeridas para lograr el mismo efecto.

Los métodos para evaluar la potencia de un lote de muestra de defibrotida como se describe en este documento pueden usarse en la preparación de composiciones farmacéuticas que comprenden defibrotida para ajustar la cantidad de defibrotida incluida en las composiciones para asegurar que las composiciones comprendan dosis precisas y consistentes. Por lo tanto, los métodos de la invención se pueden usar durante el proceso de fabricación para evaluar la potencia de diferentes lotes de defibrotida preparados en diferentes ubicaciones, mediante diferentes métodos o de diferentes fuentes.

Los métodos de la invención también pueden usarse para controlar la estabilidad de lotes de defibrotida o composiciones farmacéuticas que comprenden defibrotida a lo largo del tiempo. Por ejemplo, la potencia de un lote o composición se puede determinar mediante los métodos descritos en este documento periódicamente a lo largo del tiempo (por ejemplo, mensualmente, semestralmente, anualmente) o después de la exposición a condiciones extremas para monitorear la actividad de la defibrotida e identificar lotes o composiciones que tienen deteriorado o degradado.

Estos y otros aspectos de la invención se ilustrarán mejor en los siguientes ejemplos, que, sin embargo, no deben considerarse como limitantes de la invención que se define en las reivindicaciones adjuntas.

Ejemplos

Materiales y Métodos

Los siguientes materiales se usaron en los Ejemplos que se dan a continuación.

Aparatos

Un lector de microplacas Víctor 3 equipado con diferentes filtros de emisión y absorción (Perkin Elmer, Milán, Italia), operado por el software Wallac (Perkin Elmer, Milán, Italia).

Pipetas monocanal y multicanal con ajuste continuo de volumen equipadas con puntas estériles para biología molecular (Gilson, Milán, Italia. Incubadora celular con control de temperatura y CO²(Thermo Fischer Scientific, Milán, Italia).

Cabinas de flujo laminar para cultivo de tejidos modelo HERAcell-150 (Thermo Fischer Scientific, Milán, Italia).

Balanza analítica AX 26 DR (Mettler, Milán, Italia).

pHmetro modelo 780 (Metrohm Italia, Milán, Italia).

Matraces de cultivo celular, 25 y 75 cm2, tapón de ventilación (Corning Incorporated, NY, EE.UU.). Placas transparentes, estériles de 96 pozos con o sin recubrimiento de poli-D-lisina (Sigma Aldrich, Milán, Italia).

Cámara de recuento Neubauer y microscopio óptico (Carl Zeiss, Milán, Italia).

Unidad de esterilización de filtro medio de vacío (Sigma Aldrich, Milán, Italia).

Programas informáticos

Microsoft Excel 2003 (Microsoft Corporation, Redmond, Wash., EE. UU.)

PLA 2 (Stegmann Systems GmbH, Alemania).

Células

Línea celular endotelial microvascular humana (HMEC-1, CDC, Atlanta, GA, EE. UU.)

Línea celular endotelial sinusoidal hepática (SK-HEP-1, ATCC, Manassas, VA, EE. UU.).

Reactivos y compuestos químicos

Defibrotida (Gentium, Italia)

9-beta-D-arabinofuranosil-2-fluoroadenina, grado analítico (Sigma Aldrich, Milán, Italia), denominada como fludarabina o F-ara en las figuras y ejemplos a continuación.

Doxorrubicina, grado analítico (Sigma Aldrich, Milán, Italia)

Anfotericina B (Sigma-Aldrich, Milán, Italia)

Dimetilsulfóxido (DMSO) (Sigma-Aldrich, Milán, Italia)

Gelatina, al 2% en agua, grado para cultivo de tejidos (Sigma-Aldrich, Milán, Italia)

Solución salina tamponada con fosfato de Dulbecco (D-PBS) (Sigma-Aldrich, Milán, Italia)

Etanol absoluto (Sigma-Aldrich, Milán, Italia)

Suero fetal bovino (FBS) (Sigma-Aldrich, Milán, Italia)

Penicilina-Estreptomicina 100X (Sigma-Aldrich, Milán, Italia)

MTT (Sigma-Aldrich, Milán, Italia)

CCK-8 (Sigma Aldrich, Milán, Italia)

Azul de tripano (Sigma-Aldrich, Milán, Italia)

Medio esencial mínimo de Eagle (EMEM) Número ATCC: 30-2003 (ATCC Manassas, VA, EE. UU.) Oligonucleótido (ACGT)n de aproximadamente 17 KDa (Sigma Genosys, Milán, Italia)

Oligonucleótido (AC)n de aproximadamente 17 KDa (Sigma Genosys, Milán, Italia)

Glutatión (Sigma-Aldrich, Milán, Italia)

Activador del plasminógeno tisular humano (tPA) (Sigma-Aldrich, Milán, Italia)

Agua grado para biología molecular (Sigma-Aldrich, Milán, Italia).

Preparación de medio de crecimiento celular para SK-HEP-1

El medio de crecimiento celular para SK-HEP-1 fue medio esencial mínimo de Eagle (EMEM) suplementado con 10% (v/v) de suero fetal bovino (FBS), 1x Penicilina-Estreptomicina y 1x Anfotericina B. A partir de 500 mL de medio EMEM se extrajeron 65 mL y se añadieron 50 mL de FBS, 5 mL de un concentrado 100x de solución patrón de penicilinaestreptomicina y 10 mL de concentrado 50x de solución patrón de anfotericina B. El medio se esterilizó por filtración usando una unidad de esterilización para filtración de medio.

Preparación de medio de crecimiento celular para HMEC-1

El medio de crecimiento celular para HMEC-1 fue medio RPMI 1640 suplementado con FBS al 10% (v/v), 1x penicilinaestreptomicina y 1x anfotericina B. A partir de 500 mL de medio RPMI 1640 se extrajeron 65 mL y se añadieron 50 mL de FBS, 5 mL de un concentrado 100x de solución patrón de penicilina-estreptomicina y 10 mL de concentrado 50x de solución patrón de anfotericina B, L-glutamina 2 mM, 10 |jg/mL de hidrocortisona. El medio se esterilizó por filtración usando una unidad de esterilización para filtración de medio y se añadió factor de crecimiento epidérmico estéril a una concentración de 10 jg/mL.

Cultivo y preparación de SK-HEP-1

La línea celular endotelial sinusoidal de hígado humano SK-HEP-1 se obtuvo de la American Type Culture Collection (ATCC) y se cultivó en medio EMEM completo en una incubadora de células humidificada que contenía CO²al 5% a 37 °C utilizando matraces de cultivo de tejido recubiertos de gelatina. Las células se subcultivaron mediante desprendimiento mediado por tripsina cada 2-3 días siguiendo las instrucciones proporcionadas por la ATCC. Las células se transfirieron en serie a matraces de cultivo cuando el cultivo tenía una confluencia del 80-90% y se usaron para el ensayo de protección entre los pases 3 a 10. Es decir, de 3 a 10 pases más allá del número de pases caracterizado de las células recibidas de la ATCC.

Se preparó y contó una suspensión de SK-HEP-1 para su uso en el ensayo de protección celular. Brevemente, las células se lavaron con D-PBs y se separaron usando 1 mL de solución de tripsina y se resuspendieron en medio completo hasta una concentración celular de 105, 2 x 105 o 4 x 105 células/mL. Las células se contaron usando una cámara de recuento Neubauer en presencia de azul de tripano para evaluar el porcentaje de viabilidad de los cultivos. El cultivo celular utilizado en el ensayo de protección celular tenía una viabilidad > 90%.

Cultivo y preparación de HMEC-1

La línea celular endotelial microvascular humana (HMEC-1) se obtuvo de los Centros para el Control y la Prevención de Enfermedades (CDC) y se cultivó en medio RPMI 1640 completo en una incubadora de células humidificadas que contenía CO²al 5% a 37 °C. Las células se subcultivaron mediante desprendimiento mediado por tripsina cada 2-3 días y se transfirieron en serie a matraces de cultivo cuando el cultivo tenía una confluencia del 80-90% y se usaron para el ensayo de protección entre los pases 3 a 10.

Se preparó y se contó una suspensión de HMEC-1 para su uso en el ensayo de protección celular. Brevemente, las células se lavaron con D-PBS y se separaron usando 1 mL de solución de tripsina y se resuspendieron en medio completo hasta una concentración celular de 105, 2 x 105 o 4 x 105 células/mL. Las células se contaron usando una cámara de recuento Neubauer en presencia de azul de tripano para evaluar el porcentaje de viabilidad de los cultivos. El cultivo celular utilizado en el ensayo de protección celular tenía una viabilidad > 90%.

Preparación de soluciones patrón

1. Fludarabina

Se disolvió un vial de 10 mg de fludarabina en 1 mL de DMSO para obtener una solución de 10 mg/mL y se almacenó a 4 °C. La solución patrón se diluyó 1:1 con medio de cultivo completo para obtener la solución patrón de trabajo de 5 mg/mL.

2. Defibrotida

La solución patrón de defibrotida se preparó el día de su uso. Se pesaron con precisión aproximadamente 100 mg de sustancia farmacológica defibrotida en un tubo estéril de 50 mL y se disolvieron en 20 mL de D-PBS para obtener una solución de 5 mg/mL. Esta solución se diluyó 1:10 con medio de cultivo completo para obtener la solución patrón de trabajo de 0,5 mg/mL utilizada para producir la serie de diluciones de concentración.

3. Activador tisular del plasminógeno (tPA)

Se disolvió el contenido de dos viales de 10 jg de t-PA (aproximadamente 400.000 Ul/mg por vial) en 2 mL de D-PBS para obtener una solución de 4000 UI/mL y se almacenó a -80 °C.

4. oligonucleótido ACGT

Se disolvió un vial de 1 mg de oligonucleótido ACGT en 2 mL de D-PBS para obtener una solución de 0,5 mg/mL y se almacenó a 4 °C.

5. Glutatión

Se disolvieron 100 mg de glutatión en 20 mL de PBS y se diluyó 1:10 con medio de crecimiento completo hasta una concentración final de 0,5 mg/mL.

6. Doxorrubicina

Se disolvió un vial de 10 mg de doxorrubicina en 10 mL de DMSO y se almacenó a -80 °C. Se preparó una solución patrón de trabajo mediante dilución en medio completo hasta 200 |jg/mL.

Deposiciones en placa

Se colocaron 50 jL de las suspensiones de células, o medio solo para blancos, preparado a las concentraciones descritas anteriormente en pozos de una placa de microtitulación de 96 pozos recubiertos con poli-D-lisina. Las placas se colocaron en la incubadora de células durante 3 horas, después de lo cual se añadieron 50 jL de la solución de desafío a los pozos que contenían células. Se utilizaron tres o cuatro pozos replicados para cada condición experimental. Por ejemplo, la preparación de soluciones que contienen fludarabina en ausencia o presencia de defibrotida se presenta en la Tabla 1. Después de la adición de la solución a los pozos, las placas se devolvieron a la incubadora y se evaluó la viabilidad celular después de 24, 48 o 72 h. Para una medición de fondo, se incluyeron 100 jL de medio completo solo en 3 a 4 pozos replicados.

Tabla 1. Pre aración de soluciones de^ fludarabina defibrotida

Viabilidad celular usando el ensayo de MTT

Después del período especificado de incubación, se midió la viabilidad celular en cada pozo usando el ensayo de MTT. El ensayo de MTT se basa en la escisión de las sales de tetrazolio por la deshidrogenasa mitocondrial en células viables que conduce a la producción de un colorante de formazán insoluble. Se añadió colorante de MTT, 10 jL de una solución de 2 mg/mL en D-PBS, a cada pozo y luego se incubaron las placas durante 3 horas. A continuación, las placas se centrifugaron y se aspiraron bien. El colorante se solubilizó con 200 jL de una mezcla DMSO/Etanol (1:1) y se leyó la absorbancia en los pozos a 570-590 nm en un lector de microplacas. También se proceso un pozo de blanco que contenía sólo medio y fármaco citotóxico (fludarabina o doxorrubicina) como control en todos los experimentos.

Viabilidad celular usando el ensayo de CCK-8

Después del período especificado de incubación, se midió la viabilidad celular en cada pozo usando el kit de recuento de células CCK-8 (Sigma Aldrich, Milán, Italia) siguiendo las instrucciones del fabricante. El ensayo se basa en la reducción por la actividad deshidrogenasa de las células viables de la sal de tetrazolio soluble en agua WST-8 (2-(2-metoxi-4-nitrofenil)-3-(4-nitrofenil)-5-(2,4-disulfofenil)-2H-tetrazolio). El colorante de formazán reducido es soluble en medios de cultivo de tejidos. La cantidad de formazán es directamente proporcional al número de células viables. La sensibilidad de detección de CCK-8 es más alta que las otras sales de tetrazolio tales como MTT. A diferencia del MTT, no se requiere ninguna etapa de solubilización y, por lo tanto, el ensayo se puede medir de forma continua.

Brevemente, después del tiempo de incubación especificado, se añadieron 10 jL del reactivo suministrado a cada pozo de la placa de microtitulación y la placa se devolvió a la incubadora. Después de 3 horas, se midió la absorbancia a 450 nm con una corrección de fondo a 590 nm. La absorbancia del blanco de medio se restó de las muestras de prueba.

Ejemplo 1

El presente ejemplo muestra la magnitud del efecto de protección de la defibrotida contra la citotoxicidad inducida por fludarabina de las células HMEC-1 a concentraciones fisiológicamente relevantes de fludarabina y defibrotida.

Se cultivaron células HMEC-1 de acuerdo con el procedimiento mencionado anteriormente. Se utilizó para el ensayo una densidad celular de 500.000 células/mL. El agente citotóxico fue fludarabina a una concentración de 10 |jg/mL. Se añadió defibrotida al pozo de la microplaca a una concentración de 100, 10 o 1 jg/mL. Se realizaron cuatro repeticiones de cada condición. La viabilidad de las células HMEC se evaluó después de 72 horas con el ensayo de MTT descrito anteriormente. La defibrotida protegió a las células de la citotoxicidad inducida por fludarabina de una manera dependiente de la dosis con un efecto de protección de más del 50 % observado con 100 jg/m L de defibrotida (Figura 1).

Ejemplo 2

El presente ejemplo muestra la magnitud del efecto de protección de la defibrotida contra la citotoxicidad inducida por doxorrubicina de las células SK-HEP-1 a concentraciones fisiológicamente relevantes de doxorrubicina y defibrotida.

Se cultivaron células SK-HEP-1 de acuerdo con el procedimiento mencionado anteriormente. Para el experimento se utilizó una densidad celular de aproximadamente 50.000 células/mL. El agente citotóxico fue doxorrubicina a una concentración de 0,1 jg/mL. Se añadió defibrotida al pozo de la microplaca a una concentración de 100, 50, 20, 10, 5 0 1 jg/mL. Se realizaron tres réplicas de cada condición. La viabilidad se evaluó después de 72 horas con el kit de ensayo de CCK-8 como se describió anteriormente. A concentraciones de 50 jg/m L o más, la defibrotida protegió significativamente a las células SK-HEP-1 de la citotoxicidad inducida por doxorrubicina (Figura 2).

Ejemplo 3

El presente ejemplo compara la eficacia protectora contra la citotoxicidad inducida por fludarabina de la defibrotida y los oligonucleótidos sintéticos que tienen una longitud promedio y una composición base similar a la de defibrotida.

Se cultivaron células HMEC-1 de acuerdo con el procedimiento mencionado anteriormente. Para el experimento se utilizó una densidad celular de aproximadamente 500.000 células/mL. El agente citotóxico fue fludarabina a una concentración de 50 jg/mL. Se añadieron oligonucleótidos sintéticos (adenina-citosina (AC) de aproximadamente 16 kDa o adenina-citosina-guanina-timina (ACGT) de aproximadamente 17 kDa) o defibrotida a cada pozo a concentraciones variables. Específicamente, los oligonucleótidos AC se agregaron a cada pozo a una concentración de 1, 10, 100 o 500, mientras que los oligonucleótidos ACGT se añadieron a cada pozo a una concentración de 12,5, 25 o 50 jg/mL. Se añadió defibrotida a cada pozo a una concentración de 5, 25, 50 o 100 jg/mL. Cada condición de tratamiento se realizó por triplicado. La viabilidad se evaluó con el ensayo de MTT después de 24, 48 y 72 horas.

Como se muestra en las Figuras 3A y 3B, ni los oligonucleótidos AC ni los oligonucleótidos ACGT tuvieron ningún efecto protector contra la citotoxicidad inducida por fludarabina de las células HMEC-1 después de 72 horas de incubación. Por el contrario, la defibrotida exhibió una protección dependiente de la dosis de las células de la citotoxicidad inducida por fludarabina (Figura 3C).

Ejemplo 4

Los experimentos descritos en este ejemplo probaron la capacidad de un oligonucleótido sintético ACGT, tPA y glutatión para proteger las células SK-HEP-1 de la toxicidad inducida por fludarabina.

Las células SK-HEP-1 se cultivaron y expandieron de acuerdo con el procedimiento mencionado anteriormente. Para el experimento se utilizó una densidad celular de aproximadamente 50.000 células/mL. El agente citotóxico fue fludarabina a una concentración de 10 jg/mL. Se añadió un oligonucleótido sintético aleatorio (ACGT), tPA o glutatión a cada pozo en concentraciones variables. Específicamente, el oligonucleótido ACGT o glutatión se agregó a cada pozo a una concentración de 1,25, 2,5, 5, 10, 20, 40 u 80 jg/mL, mientras que el tPA se añadió a una concentración de 10, 20, 40, 80, 160 o 320 UI/mL. Cada condición de tratamiento se realizó por triplicado. La viabilidad se evaluó con el kit de ensayo de CCK-8 después de 72 horas de incubación. No se observó protección de las células SK-HEP-1 de la citotoxicidad inducida por fludarabina con ninguno de los tres compuestos (Figura 4).

Ejemplo 5

El presente ejemplo evalúa la eficacia protectora contra la citotoxicidad inducida por fludarabina de la defibrotida que ha sido modificada como resultado del estrés fisicoquímico.

Las muestras de defibrotida se sometieron a estrés sometiendo una muestra estándar de defibrotida a 1) un estrés ácido o 2) un estrés básico. El estrés ácido implicó incubar la muestra estándar de defibrotida en un tampón de fosfato que tiene un pH de aproximadamente 3 a aproximadamente 80 °C durante 18 horas. El estrés básico implicó incubar la muestra estándar de defibrotida en un tampón de fosfato con un pH de aproximadamente 12 a aproximadamente 80 °C durante 18 horas. Después del período de incubación, las soluciones se llevaron a neutralidad con ácido fosfórico o hidróxido de sodio.

Se cultivaron células SK-HEP-1 de acuerdo con el procedimiento mencionado anteriormente. Para el experimento se utilizó una densidad celular de aproximadamente 50.000 células/mL. El agente citotóxico fue fludarabina a una concentración de 10 |jg/mL. Se añadieron a cada pozo defibrotida estándar (sin modificar), defibrotida sometida a estrés ácido o defibrotida sometida a estrés básico a una concentración de 80, 40, 20, 10, 5, 2,5 o 1,25 jg/mL. Cada condición de tratamiento se realizó por triplicado.

La viabilidad de las células se evaluó con el kit de ensayo de CCK-8 después de 72 horas de incubación. Se construyeron curvas de dosis-respuesta para la defibrotida no modificada, la defibrotida con estrés ácido y la defibrotida con estrés básico. En la Figura 5 se muestra una comparación de las curvas dosis-respuesta. Tanto las muestras de defibrotida con estrés ácido como con estrés básico fueron menos potentes que la defibrotida sin modificar para proteger las células SK-HEP-1 de la citotoxicidad inducida por fludarabina (Figura 5).

Ejemplo 6

El presente ejemplo muestra la magnitud del efecto de protección de la defibrotida contra la citotoxicidad inducida por fludarabina de las células SK-HEP-1 a concentraciones fisiológicamente relevantes de defibrotida y fludarabina.

Las células SK-HEP-1 se cultivaron y expandieron de acuerdo con el procedimiento mencionado anteriormente. Las células a una densidad celular de aproximadamente 50.000 células/mL se sembraron en una microplaca de 96 pozos recubiertos con poli-D-lisina. El agente citotóxico fue fludarabina a una concentración de 10 jg/mL. Se añadió defibrotida a cada pozo a una concentración de 100, 50, 40, 20, 10, 5 o 1 jg/mL. Cada condición de tratamiento se procesó en 4 pozos replicados. La viabilidad se evaluó después de 72 horas de incubación con el kit de ensayo de CCK-8. La defibrotida produjo un efecto de protección celular dependiente de la dosis de citotoxicidad inducida por fludarabina con más del 80% de las células sobreviviendo con concentraciones de defibrotida de 40 jg/m L o más (Figura 6).

Ejemplo 7

El presente ejemplo muestra la aplicación del ensayo de protección basado en células para la evaluación de la potencia de una muestra de defibrotida de actividad biológica desconocida.

Las células SK-HEP-1 se cultivaron y expandieron de acuerdo con el procedimiento mencionado anteriormente. Las células se sembraron en placas a una densidad celular de aproximadamente 50.000 células/mL en microplacas recubiertas con poli-D-lisina. El agente citotóxico fue fludarabina a una concentración de 10 jg/mL. El estándar de referencia de defibrotida y la muestra de prueba de defibrotida se añadieron a pozos separados a una concentración de 80, 40, 20, 10, 5, 2,5 o 1,25 jg/mL. Se procesaron cuatro pozos replicados para cada condición de tratamiento. La viabilidad de las células se evaluó con el kit de ensayo de CCK-8 después de 72 horas de incubación.

Las absorbancias medidas para las muestras estándar de referencia de defibrotida y las muestras de prueba de defibrotida se sometieron a un análisis de función logística de 4 parámetros. Es decir, la dosis-respuesta de las curvas de defibrotida de referencia y muestra se puede describir mediante una función logística de 4 parámetros:

i) = 8 a-p

l+e-p(x-Y)

En la que, u es la respuesta, a es la asíntota superior, 5 es la asíntota inferior, p es el factor de pendiente y y es la ubicación horizontal de la curva de muestra en el eje x. La potencia de la muestra de prueba de defibrotida se determinó calculando una relación de potencia frente al estándar de referencia de defibrotida. La relación de potencia para la muestra de prueba de defibrotida fue 1,157 (Figura 7).

Ejemplo 8

El presente ejemplo evalúa la precisión de las determinaciones de la potencia de defibrotida del ensayo de protección basado en células. Se midió la potencia de la misma muestra de prueba de defibrotida, frente a un estándar de referencia de defibrotida, en ensayos repetidos por diferentes analistas, utilizando diferentes lotes de medio calificado, lotes de células y dispositivos de pipeteo.

Las células SK-HEP-1 se cultivaron y expandieron de acuerdo con el procedimiento mencionado anteriormente. Las células se sembraron en placas a una densidad celular de aproximadamente 50.000 células/mL en microplacas recubiertas con poli-D-lisina. El agente citotóxico fue fludarabina a una concentración de 10 jg/mL. El estándar de referencia de defibrotida y la muestra de prueba de defibrotida se añadieron a pozos separados a la misma serie de concentraciones que se describe en el Ejemplo 7. Se procesaron cuatro pozos replicados para cada condición experimental. La viabilidad de las células se evaluó con el kit de ensayo de CCK-8 después de 72 horas de incubación.

Las absorbancias medidas para cada pozo en cada ensayo se sometieron a un análisis de función logística de 4 parámetros y la relación de potencia frente al estándar de referencia de defibrotida se calculó como se describe en el Ejemplo 7. La relación de potencia de la misma muestra de prueba de defibrotida en cada proceso de ensayo se muestra en la Tabla 2. A partir de las mediciones de potencia realizadas por diferentes analistas en las condiciones variables que se muestran en la Tabla 2, el ensayo tiene una precisión alta (% de desviación estándar relativa de 7,8) y un sesgo bajo de <3%.

Tabla 2. La precisión del ensayo se demuestra analizando la misma muestra de ensayo, frente al estándar de defibrotida, en diferentes procesos de ensayo, en diferentes días y células con un número de pases diferente.

Ejemplo 9

El presente ejemplo muestra una comparación de la potencia determinada por el ensayo de protección basado en células para tres lotes diferentes de defibrotida y un patrón de referencia de defibrotida.

Las células SK-HEP-1 se cultivaron y expandieron de acuerdo con el procedimiento mencionado anteriormente. Las células se sembraron en placas a una densidad celular de aproximadamente 50.000 células/mL en microplacas recubiertas con poli-D-lisina. El agente citotóxico fue fludarabina a una concentración de 10 |jg/mL. El estándar de referencia de defibrotida y las diferentes muestras de prueba de defibrotida de tres lotes separados se añadieron a pozos separados a una concentración de 80, 40, 20, l0, 5, 2,5 o 1,25 jg/mL. Se procesaron cuatro pozos replicados para cada condición experimental. La viabilidad de las células se evaluó con el kit de ensayo de c CK-8 después de 72 horas de incubación.

Las absorbancias medidas para cada pozo se sometieron a un análisis de función logística de 4 parámetros y la relación de potencia para cada lote de defibrotida se calculó como se describe en el Ejemplo 7. La relación de potencia relativa con respecto al estándar de defibrotida, de cada uno de las muestras de prueba de defibrotida de los tres lotes se muestra en la Tabla 3.

Tabla 3. Relaciones de potencia para tres lotes diferentes de defibrotida analizados frente a un estándar de referencia de defibrotida.

Se entiende que la invención descrita no se limita a la metodología, protocolos y materiales particulares descritos ya que estos pueden variar. También se entiende que la terminología usada en este documento tiene el propósito de describir realizaciones particulares únicamente y no pretende limitar el alcance de la presente invención que estará limitada únicamente por las reivindicaciones adjuntas.

Los expertos en la técnica reconocerán, o serán capaces de determinar usando únicamente experimentación rutinaria, muchos equivalentes a las realizaciones específicas de la invención descritas en el presente documento. El alcance técnico de la presente invención está definido por las reivindicaciones adjuntas.

Claims

REIVINDICACIONES

1. Un método para medir la actividad biológica de un lote de muestra de defibrotida que comprende: crecimiento de células de mamífero en cultivo;

incubar las células con una solución que contiene al menos un agente citotóxico y al menos una concentración de defibrotida del lote de muestra;

determinar la viabilidad de las células expuestas al lote de muestra de defibrotida después de un período de incubación, comparar la viabilidad celular con la viabilidad celular para un lote de referencia de defibrotida y calcular la actividad biológica del lote de muestra de defibrotida basándose en la comparación;

en el que dicho al menos un agente citotóxico es fludarabina, 9-beta-D-arabinofuranosil-2-fluoroadenina (F-Ara-A) o doxorrubicina.

2. El método de la reivindicación 1, en el que las células se incuban con el agente citotóxico y al menos cuatro concentraciones diferentes de defibrotida del lote de muestra, y en el que la viabilidad celular se determina para cada una de las concentraciones para crear una curva de dosis-respuesta.

3. El método de las reivindicaciones 1 o 2, en el que la viabilidad celular medida para el lote de muestra de defibrotida se compara con una curva de calibración obtenida de las mediciones de viabilidad celular con el lote de referencia de defibrotida.

4. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en el que calcular la actividad biológica del lote de muestra de defibrotida comprende determinar una relación de actividad biológica relativa a la actividad biológica de un lote de referencia de defibrotida.

5. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en el que las células de mamífero son células endoteliales humanas, células epiteliales humanas, células endoteliales sinusoidales de hígado humano o células endoteliales microvasculares humanas.

6. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en el que las células de mamífero están presentes a una densidad de aproximadamente 5 x 104 células/mL a aproximadamente 5 x 105 células/mL.

7. El método de la reivindicación 1, en el que fludarabina o F-Ara-A está presente en la solución a una concentración de aproximadamente 10 |jg/mL a aproximadamente 50 |jg/mL o en el que la doxorrubicina está presente en la solución a una concentración de aproximadamente 0,1 jg/m L a aproximadamente 10 jg/mL.

8. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, en el que al menos una concentración de defibrotida del lote de muestra está en el intervalo de aproximadamente 1 jg/m L a aproximadamente 100 jg/mL.

9. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, en el que el período de incubación es de al menos 24 horas, al menos 48 horas o al menos 72 horas.

10. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, en el que la determinación de la viabilidad celular comprende realizar un ensayo colorimétrico basado en la reducción de colorantes de tetrazolio.

11. El método de la reivindicación 10, en el que el colorante de tetrazolio es bromuro de 3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)-2,5-difeniltetrazolio o 2-(2-metoxi-4-nitrofenil)-3-(4-nitrofenil)-5-(2,4-disulfofenil)-2H-tetrazolio.

12. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11, en el que la determinación de la viabilidad celular comprende medir la absorbancia de la solución después de la incubación con las células.

13. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 12, en el que el lote de muestra de defibrotida se extrae de tejido bovino o tejido porcino.

14. Un método para preparar una composición farmacéutica que comprende defibrotida, en el que el método de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 13 se usa para medir la actividad biológica de la defibrotida para:

a) ajustar la cantidad de defibrotida incluida en las composiciones para asegurar que las composiciones comprendan dosis precisas y consistentes; y/o

b) medir la actividad biológica de diferentes lotes de defibrotida preparados en diferentes lugares, por diferentes métodos o de diferentes fuentes.

15. Un método para controlar la estabilidad de lotes de defibrotida o composiciones farmacéuticas que comprenden defibrotida, en el que el método de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 13 se usa para medir la actividad biológica de la defibrotida en el lote o composición a lo largo del tiempo; opcionalmente en el que, la actividad biológica de la defibrotida se mide: mensualmente, 2 veces al año, anualmente, después de la exposición a condiciones extremas para monitorear la actividad de la defibrotida, o para identificar lotes o composiciones que se han deteriorado o degradado.