[go: up one dir, main page]

ES2552356T3 - Procedimiento para la caracterización de la actividad biológica de huevos de Trichuris - Google Patents

Procedimiento para la caracterización de la actividad biológica de huevos de Trichuris Download PDF

Info

Publication number
ES2552356T3
ES2552356T3 ES09769081.2T ES09769081T ES2552356T3 ES 2552356 T3 ES2552356 T3 ES 2552356T3 ES 09769081 T ES09769081 T ES 09769081T ES 2552356 T3 ES2552356 T3 ES 2552356T3
Authority
ES
Spain
Prior art keywords
eggs
determination
embryonated
trichuris
procedure
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Active
Application number
ES09769081.2T
Other languages
English (en)
Inventor
Bernhard Tewes
Rudolf Wilhelm
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Dr Falk Pharma GmbH
Original Assignee
Dr Falk Pharma GmbH
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Dr Falk Pharma GmbH filed Critical Dr Falk Pharma GmbH
Application granted granted Critical
Publication of ES2552356T3 publication Critical patent/ES2552356T3/es
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
    • C12Q1/6888—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for detection or identification of organisms
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/02—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving viable microorganisms
    • C12Q1/04—Determining presence or kind of microorganism; Use of selective media for testing antibiotics or bacteriocides; Compositions containing a chemical indicator therefor
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/66—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving luciferase
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/5005—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells
    • G01N33/5008—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells for testing or evaluating the effect of chemical or biological compounds, e.g. drugs, cosmetics
    • G01N33/502—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells for testing or evaluating the effect of chemical or biological compounds, e.g. drugs, cosmetics for testing non-proliferative effects
    • G01N33/5029—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells for testing or evaluating the effect of chemical or biological compounds, e.g. drugs, cosmetics for testing non-proliferative effects on cell motility
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/158—Expression markers
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
    • G01N2333/435—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from animals; from humans
    • G01N2333/43504—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from animals; from humans from invertebrates
    • G01N2333/43526—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from animals; from humans from invertebrates from worms

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

Procedimiento para la determinación fiable, con la exactitud necesaria para un producto farmacéutico, de la actividad biológica de huevos embrionados de Trichuris, en el que se realizan al menos 3 de las siguientes determinaciones: a) determinación y/o comprobación del estadio del desarrollo embrionario de huevos de helmintos con ayuda del análisis por PCR cuantitativa usando secuencias de marcadores adecuadas para la determinación del número de copias del ADN genómico, b) determinación de la actividad metabólica de huevos embrionados de helmintos con procedimientos bioquímicos y/o de biología molecular, midiéndose para la determinación de la actividad metabólica de huevos embrionados de Trichuris el contenido de ATP y/o tratándose los huevos de Trichuris en primer lugar con un agente de pretratamiento seleccionado de ácido hipocloroso, quitinasa y/o proteasa y tiñéndose después con sales de tetrazolio, c) determinación de la capacidad de inducción de la expresión génica en huevos embrionados de helmintos, d) determinación microscópica de la motilidad de larvas de helmintos que se encuentran en el huevo durante largos espacios de tiempo de observación tras incubación previa a temperaturas elevadas y/o e) determinación de la tasa de eclosión de larvas de Trichuris en el animal de experimentación, cuantificándose los huevos embrionados intactos recuperados del contenido intestinal en comparación con un patrón interno.

Description

imagen1
imagen2
imagen3
imagen4
imagen5
imagen6
5
10
15
20
25
30
35
40
45
imagen7
En la determinación de la motilidad de larvas es decisivo un calentamiento exacto para el éxito del procedimiento. En primer lugar se incuban previamente los huevos durante un espacio de tiempo de 2 a 30 horas, preferentemente de 4 a 20 horas a una temperatura ajustada de manera exacta que se encuentra entre 36 ºC y 42 ºC, preferentemente de 37 ºC a 41 ºC y de manera especialmente preferente a 39,5 ºC. Tras esta incubación previa se pasan las larvas a un microscopio adecuado, pudiéndose mantener la temperatura ajustada al menos de manera aproximada. La observación se realiza entonces con un registro a cámara rápida durante un espacio de tiempo de 2 minutos a 4 horas, preferentemente de 30 minutos a 2 horas a una temperatura entre 36 ºC y 42 ºC, preferentemente de 38 ºC a 40 ºC.
La figura 7 muestra los resultados de un índice de motilidad determinado de acuerdo con la invención, no pudiéndose observar motilidad de ningún tipo en caso de huevos de lombriz inactivados, por el contrario en caso de los huevos de lombriz activados aumenta el índice de motilidad con el tiempo.
La figura 8 muestra el índice de motilidad en relación con distintos espacios de tiempo de observación.
e) Determinación de la tasa de eclosión en el intestino
El principio de esta etapa de procedimiento consiste en la determinación de la tasa de eclosión de larvas de helmintos en el intestino de animales de experimentación o como alternativa en el contenido intestinal que se tomó previamente de los animales de experimentación.
La tasa de eclosión puede determinarse en una forma de realización en el contenido intestinal que se toma de los animales de experimentación, y concretamente de manera preferente al inicio del colon o al final del duodeno. Entonces, la tasa de eclosión puede determinarse en el contenido intestinal, sin que la tasa de eclosión deba determinarse directamente en un animal de experimentación. Además puede realizarse el procedimiento también mediante estudio de los huevos que han pasado el intestino y se recuperan de las heces. Esto tiene la ventaja de que no ha de sacrificarse el animal de experimentación y puede usarse múltiples veces para la determinación de la tasa de eclosión.
En la etapa de procedimiento recién desarrollada se analiza en un intervalo relativamente corto tras inoculación del contenido intestinal y se recuentan los huevos intactos así como las envolturas de huevos dejadas atrás tras la eclosión. Es esencialmente ventajoso en comparación con la determinación de la infectividad descrita en el estado de la técnica que con la eclosión se someta a estudio sólo la primera fase del ciclo de vida, que se ve influido sólo poco por los factores individuales del huésped.
Sorprendentemente pudo mostrarse por primera vez para Trichuris suis que las larvas eclosionan de manera cuantitativa no sólo en el huésped apropiado, el cerdo, sino también en el conejo. Con ello está a disposición por ejemplo para Trichuris suis un animal de experimentación con dimensiones intestinales más pequeñas, lo que facilita claramente la búsqueda de los huevos microscópicamente pequeños y la envolturas de los huevos.
Sorprendentemente se encontró que puede teñirse la cáscara del huevo con colorantes fluorescentes comerciales desarrollados para la marcación de proteínas. El acoplamiento de colorantes fluorescentes a la envoltura del huevo facilita esencialmente la búsqueda de los huevos, dado que el contenido intestinal puede someterse a estudio mediante microscopia de fluorescencia.
Otra novedad esencial es el uso de huevos de helmintos no embrionados o inactivados como patrón interno, invariable. Éstos tienen el mismo tiempo de tránsito o de permanencia en el intestino, sin embargo a diferencia de los huevos embrionados y biológicamente activos permanecen intactos en el tracto intestinal. Mediante la marcación de los huevos previstos como patrón interno con un segundo colorante fluorescente (distinto) puede diferenciarse fácilmente entre el patrón interno y los huevos que van a someterse a estudio.
Para el análisis se someten a estudio en el contenido intestinal, en un momento adecuado tras la inoculación, el número de los huevos intactos marcados con el colorante fluorescente 1 y las envolturas de los huevos vacías de la muestra que va a someterse a estudio así como los huevos marcados con colorante fluorescente 2 del patrón interno. La tasa de eclosión en el intestino puede calcularse tal como sigue basándose en los huevos intactos (no eclosionados).
Fórmula para el cálculo de la tasa de eclosión:
8
imagen8
En la siguiente tabla 2 están resumidas la reacción de PCR así como las determinaciones preferentes y los valores que pueden obtenerse preferentemente con ello, los valores límites preferentes describen si la preparación sometida a estudio presenta la actividad biológica necesaria.
Tabla 2
Determinación preferente
Parámetro Objetivo
a) PCR, ADN genómico
número de copias de ADN genómico/huevo intervalo: 50-1200 copias/huevo en d28 (al inicio del desarrollo embrionario se encuentra el número de copias en 1 copia/huevo; tras el desarrollo embrionario de 28 días debía conseguirse al menos un número de copias de 50/huevo.)
b1) actividad metabólica variante 1: contenido de ATP
contenido promedio de ATP/huevo intervalo: > 1 pmol de ATP/huevo embrionado
b2) actividad metabólica variante 2: coloración de la actividad
proporción de huevos con coloración de actividad positiva intervalo: ≥ 50 % (como mínimo el 50 % de los huevos debían presentar una coloración de la actividad metabólica positiva)
c) expresión génica
proporción de huevos que intervalo: ≥ 50 % (en como mínimo el 50 % de los huevos
que puede inducirse
muestran una expresión génica que puede inducirse debe poder inducirse la expresión génica)
d) índice de motilidad
proporción de huevos que contienen una larva motil intervalo: ≥ 50 % (como mínimo el 50 % de los huevos debían contener una larva motil)
e) tasa de eclosión
proporción de huevos que eclosionan en el intestino intervalo ≥ 40 % (de cómo mínimo el 40 % de los huevos embrionados administrados debía eclosionar una larva)
En una forma de realización preferente, el nuevo procedimiento de ensayo comprende la determinación de la capacidad de activación inducida por la temperatura de huevos embrionados de helmintos in vitro. Se miden dos parámetros complementarios (índice de motilidad y contenido promedio de ATP), que juntos forman la puntuación de 10 la actividad in vitro. La puntuación de la actividad in vitro muestra una buena correlación con la actividad biológica in vivo. Sin embargo, ésta es sólo predictiva para la actividad biológica cuando las larvas usadas están completamente embrionadas. Para ello se usa un procedimiento de PCR cuantitativa que mide el número de copias del genoma de
T. suis en el huevo. Mediante un ensayo de eclosión in vivo novedoso realizado en paralelo se asegura que los
huevos sometidos a prueba en condiciones fisiológicas están realmente activos. Esquemáticamente se representa el 15 procedimiento preferente tal como sigue:
9
imagen9
imagen10
(continuación)
Instrumento:
AB7900HT (Applied Biosystems)
concentración final de sonda TaqMan:
200 nM
volumen de muestras:
5 l
volumen total de la reacción de PCR:
25 l
programa de temperatura:
50 ºC / 2 min 95 ºC / 10 min 40 ciclos [95 ºC / 9 s; 60 ºC / min]
La eficacia de la amplificación del procedimiento se encuentra entre el 92 % y el 98 % y la sensibilidad es suficientemente grande para poder determinar el número de copias de los genes ITS2 en un huevo individual.
Con el procedimiento de PCR se sometió a estudio el número de copias de ITS2 de huevos no embrionados y completamente embrionados de Trichuris suis. Los resultados están representados en la siguiente tabla.
Tabla 4: PCR cuantitativa para la región ITS2 en huevos no embrionados y embrionados de Trichuris suis
Muestra (respectivamente 1000 huevos) Valor Ct Número copias relativo de ITS2
TSO no embrionado (L0) 25,5 1 TSO embrionado (L1) 15,5 1024
(valor Ct (cicle treshold, umbral de ciclo): número de ciclos de PCR que son necesarios para obtener una señal de fluorescencia que se diferencia significativamente de la fluorescencia de fondo)
El análisis por PCR muestra que el número de copias de ITS2 en TSO embrionados se encuentra más alto aproximadamente en un factor 1000 que el número de copias de ITS2 en TSO no embrionados. Dado que el huevo
10 no embrionado (L0) puede considerarse como célula individual, esto significa que la larva L1 de T. suis tiene aproximadamente 1000 células somáticas. Para T. suis no se ha conocido hasta ahora el número de células somáticas en la larva L1; para el organismo relacionado C. elegans se encontró un tamaño de 959 células somáticas, lo que coincide bien con las aproximadamente 1000 células encontradas en este caso.
Para comprobar si con el procedimiento de ensayo pueden someterse a estudio distintos estadios del desarrollo 15 larval, se embrionaron TSO durante 4 semanas y se sometieron a estudio regularmente con la ITS2-PCR (tabla 5).
Tabla 5: número copias relativo de ITS-2 dependiendo de la duración del desarrollo embrionario
Duración del desarrollo embrionario Ct (T) -Ct (0) Número de copias relativo de ITS2
0 días (estado L0)
0 1
7 días
2,52 6
14 días
6,04 66
21 días
7,37 165
28 días
7,76 216
90 días (estado L1)
10,0 1024
El ejemplo muestra de manera unívoca que el procedimiento puede usarse para caracterizar distintos estadios del desarrollo larval entre L0 y L1 por medio del número de las células somáticas. Por consiguiente es adecuado este procedimiento especialmente para analizar, de manera concomitante con el procedimiento, el transcurso del
20 desarrollo embrionario. Como especificación especialmente preferente en la producción de una preparación de huevos de helmintos aparece la obtención de un número de copias relativo de 50 -1200 en el intervalo de los primeros 28 días del desarrollo embrionario.
Ejemplo 2:
12
imagen11
5
10
15
20
25
30
Esta observación era inesperada, dado que las larvas L1 recién embrionadas que se encuentran en el huevo estaban consideradas hasta ahora como inmóviles (Parasitology 1973, 67: 253-262). Probablemente no se observó la motilidad de las larvas en el huevo hasta ahora ya que es necesaria una incubación previa larga y los movimientos lentos pueden observarse sólo a cámara rápida.
La comparación de huevos activos e inactivados muestra de manera unívoca que mediante el estudio de la motilidad puede diferenciarse de manera sencilla entre huevos de Trichuris suis biológicamente activos e inactivos.
Además de la fase de activación, la longitud del intervalo de observación influye sobre el índice de motilidad medido, dado que las larvas no se mueven de manera sincrónica y por consiguiente un intervalo de observación más largo eleva la probabilidad de detectar en un huevo vital los movimientos esporádicos. Esto muestra el estudio (figura 7), en el que se observó una preparación de Trichuris suis tras la fase de activación (8 horas a 37 ºC) durante espacios de tiempo de distinta duración a de 39,5 ºC a 40 ºC. El estudio muestra también que la motilidad permanece estable durante todo el periodo de observación de 8 horas.
Una característica representativa y novedosa de este procedimiento son por tanto la fase de activación con control de temperatura exacto así como el largo intervalo de observación. El ejemplo 4 muestra que pueden inducirse y medirse movimientos en larvas L1 en reposo, que se encuentran aún en el huevo, mediante condiciones adecuadas de temperatura y observación. Con el procedimiento puede determinarse de manera sencilla la motilidad como condición previa para la eclosión y con ello como parámetro para la actividad biológica de los huevos y puede diferenciarse de manera unívoca entre larvas L1 activas e inactivas.
4.2 Condiciones de ensayo ventajosas
Han resultado ventajosas las siguientes condiciones de ensayo: una muestra con 15.000 huevos de helmintos en 300 l de tampón fosfato, pH 7,4 se transfiere a la cámara de una placa de 96 pocillos (superficie de la base: 0,31 cm2). Con esta densidad de sembrado se encuentran con ampliación de 200 veces aproximadamente 80-150 huevos en el campo de visión del microscopio. Tras una incubación de 8 horas a 37 ºC (fase de activación) se eleva la temperatura hasta 39,5 ºC y se seleccionan 4 campos de observación sucesivos y se observan durante respectivamente 2 horas. A este respecto se registra una película con 3 imágenes por minuto. A continuación se determina el número de huevos así como el número de larvas que se mueven y se calcula el índice de motilidad. El índice de motilidad de la muestra resulta del valor medio de las 4 mediciones individuales.
4.3 Reproducibilidad y precisión -comparación con el ensayo de infectividad
Para la comprobación de la reproducibilidad del ensayo de motilidad en las condiciones descritas anteriormente se sometieron a ensayo 4 muestras análogas de una carga de Trichuris suis en 4 días distintos. Los resultados de medición están expuestos en las siguientes tablas. Como comparación están expuestos los resultados de 4 series de medición con el ensayo de infectividad, que se obtuvieron con la misma carga de Trichuris suis.
14
imagen12
Tabla 7: determinación del índice de motilidad de una carga de Trichuris suis (resultados de 4 ensayos independientes que están constituidos por respectivamente 4 mediciones)
Ensayo de motilidad
Ensayo de infectividad
Serie de medición
Medición Índice de motilidad (%) Medición individual Valor medio Precisión Serie de medición Animal de experimentación Tasa de infectividad (%) Medición individual Valor medio Precisión
1
n.º 1 n.º 2 n.º 3 n.º 4 78,4 77,5 78,2 82,2 79,1  2,1 2,7 % 1 n.º 1 n.º 2 n.º 3 n.º 4 n.º 5 27,4 23,5 29,5 24,5 25,9  2,5 9,6 %
2
n.º 1 n.º 2 n.º 3 n.º 4 73,0 82,4 84,3 78,5 79,6  5,0 6,3 % 2 n.º 1 n.º 2 n.º 3 n.º 4 n.º 5 7,4 29,9 26,7 10,7 38,6 22,6  13,2 58,4 %
3
n.º 1 n.º 2 n.º 3 n.º 4 87,5 85,4 80,8 76,0 82,4  5,1 6,2 % 3 n.º 1 n.º 2 n.º 3 n.º 4 n.º 5 17,1 33,1 49,9 31,8 29,1 32,2  11,8 36,6 %
4
n.º 1 n.º 2 n.º 3 n.º 4 81,1 80,2 77,6 80,3 79,8  1,5 1,9 % 4 n.º 1 n.º 2 n.º 3 n.º 4 n.º 5 23,4 23,7 27,9 24,1 19,8 23,8  2,9 12,1 %
imagen13
imagen14
La marcación con fluorescencia puede usarse ventajosamente para la evaluación microscópica de la tasa de eclosión. Ésta ofrece además también la posibilidad para el análisis objetivo y rápido por medio citometría de flujo activada por fluorescencia.
En total muestra el ejemplo de manera unívoca que con el procedimiento descrito en el presente documento puede
5 someterse a estudio la fase de la eclosión de manera cuantitativa y puede usarse para la determinación de la actividad biológica. Un intervalo adecuado para la tasa de eclosión como medida de la actividad biológica de preparaciones de huevos de helmintos se encuentra en el 25 %-100 %.
Ejemplo 6:
Correlación de la capacidad de activación inducida por la temperatura in vitro con la actividad biológica in vivo
10 Para correlacionar la capacidad de activación inducida por la temperatura con la actividad biológica in vivo se sometieron a estudio 12 muestras de TSO de distinta calidad. Las muestras se sometieron a estudio en primer lugar con el procedimiento de PCR para determinar la completitud del desarrollo embrionario. A continuación se determinó el índice de motilidad y el contenido de ATP tras activación inducida por la temperatura. De manera paralela se realizó para cada una de las 12 muestras un ensayo de infectividad en el cerdo. El ensayo de infectividad se realizó
15 según el procedimiento descrito por Kringel et al. en respectivamente 5 cerdos. Los dos parámetros in vitro, la motilidad y el contenido de ATP, se agruparon en una puntuación de la actividad in vitro:
imagen15
Muestra
Número de células/ larva (ITS2 PCR) Contenido de ATP [nmol] Índice de motilidad [%] Puntuación de actividad in vitro [%] Infectividad [%]
A
> 1000 6,13  0,8 15,30 %  5,9 % 13,8 %  3,7 % 7,9 %  11,5 %
B
> 1000 13,40  4,9 23,40 %  4,0 % 25,1 %  6,9 % 24,3 %  1,6 %
C
> 1000 20,70  2,5 51,80 %  3,2 % 46,6 %  4,1 % 39,8 %  3,7 %
D
> 1000 36,35  1,8 45,10 %  1,2 % 58,9 %  2,4 % 43,8 %  6,7 %
E
> 1000 32,75  6,9 85,00 %  2,8 % 75,3 %  8,3 % 46,8 %  10,3 %
F
> 1000 35,73  3,0 88,80 %  1,1 % 80,1 %  3,5 % 50,8 %  11,5 %
G
> 1000 41,27  1,6 86,90 %  3,5 % 84,7 %  3,3 % 67,0 %  5,0 %
H
> 1000 40,20  4,0 93,20 %  1,5 % 86,8 %  4,8 % 73,4 %  9,2 %
I
> 1000 51,88  4,0 76,80 %  1,2 % 90,3 %  4,7 % 81,1 %  4,5 %
J
> 1000 46,60  3,5 88,60 %  2,4 % 90,9 %  4,7 % 80,1 %  4,4 %
K
> 1000 46,44  7,0 91,10 %  1,1 % 92,0 %  7,6 % 78,8 %  6,2 %
L
> 1000 48,67  3,9 91,80 %  2,3 % 94,6 %  5,0 % 65,6 %  17,8 %
La correlación entre la puntuación de la actividad in vitro y la infectividad está mostrada en la figura 10. 20 El ejemplo muestra una buena correlación de la puntuación de la actividad in vitro con la actividad biológica in vivo.
18

Claims (1)

  1. imagen1
ES09769081.2T 2008-05-21 2009-05-20 Procedimiento para la caracterización de la actividad biológica de huevos de Trichuris Active ES2552356T3 (es)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
EP08009344A EP2123774A1 (de) 2008-05-21 2008-05-21 Verfahren zur Charakterisierung der biologischen Aktivität von Helminth-Eiern
EP08009344 2008-05-21
PCT/EP2009/056106 WO2009156232A1 (de) 2008-05-21 2009-05-20 Verfahren zur charakterisierung der biologischen aktivität von helminth-eiern, nämlich von trichuris eiern

Publications (1)

Publication Number Publication Date
ES2552356T3 true ES2552356T3 (es) 2015-11-27

Family

ID=39768691

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
ES09769081.2T Active ES2552356T3 (es) 2008-05-21 2009-05-20 Procedimiento para la caracterización de la actividad biológica de huevos de Trichuris

Country Status (17)

Country Link
US (1) US8993332B2 (es)
EP (2) EP2123774A1 (es)
JP (1) JP5753778B2 (es)
CN (1) CN102037141B (es)
AU (1) AU2009262381B2 (es)
CA (1) CA2723402C (es)
CY (1) CY1116916T1 (es)
DK (1) DK2279264T3 (es)
ES (1) ES2552356T3 (es)
HR (1) HRP20151173T1 (es)
HU (1) HUE026151T2 (es)
PL (1) PL2279264T3 (es)
PT (1) PT2279264E (es)
RU (1) RU2540145C2 (es)
SI (1) SI2279264T1 (es)
UA (1) UA103769C2 (es)
WO (1) WO2009156232A1 (es)

Families Citing this family (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
RU2492637C2 (ru) * 2011-07-26 2013-09-20 Закрытое акционерное общество "АЛЬФА-ТЭК" Способ предынкубационной обработки яиц препаратом галосепт
US9224200B2 (en) 2012-04-27 2015-12-29 Parasite Technologies A/S Computer vision based method for extracting features relating to the developmental stages of Trichuris spp. eggs
RU2609145C2 (ru) * 2015-06-08 2017-01-30 ФАНО России Федеральное государственное бюджетное научное учреждение Всероссийский научно-исследовательский институт фундаментальной и прикладной паразитологии животных и растений им. К.И. Скрябина (ФГБНУ "ВНИИП им. К.И. Скрябина") Способ сбора максимального количества зрелых (=оплодотворённых) яиц (in vitro) от самок возбудителя паразитарного зооноза trichuris (=trichocephalus) suis
US9603875B1 (en) 2016-01-07 2017-03-28 NeuOva, LLC Method of making a consumable product with purified embryonated Trichuris suis ova
JP6231709B1 (ja) * 2016-05-31 2017-11-15 シスメックス株式会社 蛍光画像分析装置および分析方法
CN106689063B (zh) * 2016-12-07 2020-03-17 中国科学院动物研究所 一种稻螟赤眼蜂的人工繁育生产方法

Family Cites Families (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO1999033479A1 (en) 1997-12-31 1999-07-08 University Of Iowa Research Foundation Use of parasitic biological agents for prevention and control of autoimmune diseases
US7083911B2 (en) 2001-02-16 2006-08-01 Promega Corporation Method for detection of ATP
US20090074818A1 (en) * 2005-12-30 2009-03-19 Christian Mollin Outzen Kapel Composition Comprising Parasite Eggs And Methods For Isolation And Storage Of Parasite Eggs
DE102006023906A1 (de) 2006-05-19 2007-11-22 Ovamed Gmbh Verfahren zum Nachweis der Viabilität

Also Published As

Publication number Publication date
EP2123774A1 (de) 2009-11-25
CA2723402A1 (en) 2009-12-30
AU2009262381A1 (en) 2009-12-30
HK1147113A1 (en) 2011-07-29
UA103769C2 (ru) 2013-11-25
EP2279264A1 (de) 2011-02-02
RU2010152016A (ru) 2012-06-27
CA2723402C (en) 2018-06-19
US20110191869A1 (en) 2011-08-04
WO2009156232A9 (de) 2010-02-18
CY1116916T1 (el) 2017-04-05
HRP20151173T1 (hr) 2015-12-04
PT2279264E (pt) 2015-11-20
US20120060229A9 (en) 2012-03-08
HUE026151T2 (en) 2016-05-30
AU2009262381B2 (en) 2015-03-26
WO2009156232A1 (de) 2009-12-30
JP5753778B2 (ja) 2015-07-22
EP2279264B1 (de) 2015-08-19
DK2279264T3 (en) 2015-11-23
PL2279264T3 (pl) 2016-01-29
CN102037141A (zh) 2011-04-27
RU2540145C2 (ru) 2015-02-10
US8993332B2 (en) 2015-03-31
JP2011523847A (ja) 2011-08-25
CN102037141B (zh) 2014-02-26
SI2279264T1 (sl) 2015-11-30

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Peak et al. Development and validation of a quantitative, high-throughput, fluorescent-based bioassay to detect schistosoma viability
ES2552356T3 (es) Procedimiento para la caracterización de la actividad biológica de huevos de Trichuris
Shen et al. Rapid profiling cell cycle by flow cytometry using concurrent staining of DNA and mitotic markers
JP2013240352A (ja) 発光タンパクによる長期モニタリング方法および解析方法
Volpe et al. Relationship between motility and mitochondrial functional status in canine spermatozoa
Zhao et al. A screening platform for glioma growth and invasion using bioluminescence imaging
CN102023207B (zh) 在整体斑马鱼上进行酶联免疫吸附检测的方法及其应用
JP2011523847A5 (es)
Sena-Lopes et al. Cell viability analysis of Toxocara cati larvae with LIVE/DEAD® Viability/Cytotoxicity kit
WO2011033290A2 (en) Dual-fluorescence assay
Arai et al. qMaLioffG: A single green fluorescent protein FLIM indicator enabling quantitative imaging of endogenous ATP
ES2392604B1 (es) Método para la identificación del sexo en peces
He et al. Non-invasive diagnosis of bacterial and non-bacterial inflammations using a dual-enzyme-responsive fluorescent indicator
ES2398811B1 (es) Método para la identificación del sexo en peces
CN113801191B (zh) 一种检测衣原体的多肽探针及其应用
US20150132788A1 (en) Establishing the viability of biological samples
Gholamalamdari et al. Labeling of Nascent RNA in C. elegans Intestine
Koseki et al. Improvement of the embryonic stem cell test endpoint analysis by use of field potential detection
Paluch et al. THE EFFECT OF IN VITRO SEMEN STORAGE TEMPERATURE AND AGE OF MALES ON SPERMATOZOA MOTILITY PARAMETERS OF TURKEYS SEMEN
Minero et al. Bacterial efflux pumps excrete SYTO™ dyes from bacteria and lead to false-negative staining results
Brookes et al. Identifying Types of Neurons
Whitefield Chromatin Mechanics: Starting Local, Going Global
Damayanti Linear and Nonlinear Fluorescence Lifetime Imaging for Biosensing Applications
JP2007155557A (ja) 微弱光解析方法
HK1147113B (en) Method for characterising the biological activity of trichuris eggs