ES2831031T3 - Proteínas de fusión para el tratamiento del CNS - Google Patents

Abstract

Una composición que comprende: un polipéptido que comprende un dominio de degradación de proteoglicanos y un dominio que promueve la regeneración neural, en el que el dominio que promueve la regeneración neural es NgR27-311.

Description

DESCRIPCIÓN

Proteínas de fusión para el tratamiento del CNS

Antecedentes y sumario

La lesión de la médula espinal (SCI) inflige trauma a las células y tejidos del sistema nervioso central (CNS) y provoca una afección grave y debilitante en el individuo. Después de una SCI, la regeneración limitada de las neuronas lesionadas da como resultado una discapacidad permanente caracterizada por cierta pérdida de sensibilidad, parálisis y disfunción autónoma. Una razón por la que las neuronas no se regeneran es su incapacidad para atravesar la cicatriz glial que se desarrolla después de la SCI. Esta cicatriz glial contiene moléculas de matriz extracelular que incluyen proteoglicanos de sulfato de condroitina (CSPG). Los estudios in vitro muestran que las neuronas no logran extender los procesos sobre las superficies recubiertas de CSPG, mientras que los datos in vivo correlacionan el fracaso de la regeneración con áreas de expresión de CSPG. Dentro de la mielina del sistema nervioso central (CNS) del adulto también hay varios compuestos inhibidores del crecimiento de axones identificados como la glucoproteína asociada a mielina (MAG), OMgp y Reticulon 4 o Nogo que han demostrado ser inhibidores del crecimiento de neuronas.

La enzima condroitinasa ABC de tipo I que degrada proteglicanos (SEQ ID NO: 1) se ha usado para potenciar el crecimiento neuronal en un modelo de lesión de la columna dorsal de la lesión de la médula espinal. También se ha informado de que el tratamiento de una lesión de la médula espinal con un antagonista del receptor NOGO promueve un cierto grado limitado de regeneración neuronal. Se ha informado además de que la creación de un ratón con deficiencia genética de NOOO dio como resultado ciertos grados limitados e inconsistentes de regeneración neuronal después de la hemisección dorsal de la médula espinal.

Los tratamientos experimentales para la lesión del CNS han usado la aplicación de condroitinasa al espacio extracelular, sin embargo, la enzima digiere CSPG en la matriz extracelular y no en las reservas intracelulares. Adicionalmente, la difusión de condroitinasa dentro del parénquima (el tejido esencial y distintivo de un órgano o un crecimiento anormal que se distingue de su marco de soporte) o entre compartimentos anatómicos es limitada. El acceso limitado de fármacos, agentes de formación de imágenes y anestésicos, etc. a las células y/o tejidos diana del sistema nervioso central (CNS) puede reducir la utilidad o eficacia de cualquiera de estas sustancias.

El suministro de moléculas terapéuticas y de diagnóstico en células y tejidos depende, en parte, de matrices extracelulares, así como de carbohidratos y proteínas unidos a las membranas celulares. La matriz extracelular está compuesta en parte por proteoglicanos, entre ellos se encuentran los proteoglicanos sulfatados con condroitina (CSPG). Los CSPG son una familia de proteoglicanos compuestos de una proteína central y glucosaminoglicanos sulfatados unidos covalentemente. Cada proteoglicano está determinado por las cadenas laterales de glucosaminoglicano. Para los CSPG, estas cadenas laterales están formadas por aproximadamente 40 a 100 disacáridos sulfatados compuestos de condroitina 4, 6 y dermatán sulfato. El componente proteico del CSPG se sintetiza ribosómicamente y la glucosilación se produce en el retículo endoplásmico y el aparato de Golgi. A continuación, las cadenas de azúcar se sulfatan en las posiciones 4 o 6 mediante varias sulfotransferasas de glucosaminoglicano.

Se pueden usar proteínas de transducción para transportar polipéptidos y cargas de polinucleótidos a través de barreras anatómicas y al interior de las células. Por ejemplo, la proteína TAT del virus de la inmunodeficiencia humana (VIH) contiene un dominio de transducción de proteínas (PTD) que participa en la transducción del VIH a las células. El PTD contiene un dominio de 11 aminoácidos (péptido TAT) que es responsable de la actividad del PTD. El péptido TAT se puede unir a proteínas y facilitar la transducción de las proteínas a las células. El mecanismo de transducción es independiente del peso molecular o de las propiedades químicas de las proteínas que están unidas al péptido TAT. Los estudios in vivo muestran que si se inyecta en ratones una proteína de fusión que consiste en el péptido TAT unido a la enzima de 120 kd, beta-galactosidasa (P-Gal), entonces se observa una liberación sólida de p-Gal en una amplia variedad de células. Cuando se unió al péptido de transducción TAT, se observó actividad de p-Gal en el cerebro; sin el péptido TAT, no se observó p-Gal en el cerebro. El transporte a través de la barrera hematoencefálica normalmente está restringido a ciertas moléculas pequeñas hidrófobas y péptidos lipófilos particulares de bajo peso molecular. El transporte de proteínas tan grandes como p-Gal al cerebro generalmente no es posible sin una alteración sustancial de la barrera hematoencefálica, pero el péptido TAT facilita el transporte mientras deja intacta la barrera hematoencefálica.

Las proteínas quiméricas, también denominadas proteínas de fusión, son proteínas híbridas que combinan al menos partes de dos o más proteínas o polipéptidos precursores. Las proteínas quiméricas se pueden producir mediante tecnología recombinante, esto es fusionando al menos una parte de la secuencia codificante de un gen con al menos una parte de la secuencia codificante de otro gen. El gen fusionado se puede usar luego para transformar un organismo apropiado que luego expresa la proteína de fusión.

Complejos de péptidos Tat Frankel et al. (Patentes de Estados Unidos Nos. 5,804,604; 5,747,641; 5,674,980; 5,670,617; 5,652,122) describe el uso de péptidos Tat para transportar moléculas de carga biológicamente activas unidas covalentemente al citoplasma y núcleos de las células. Frankel solo describe unidades estructurales de carga unidas covalentemente que son (terapéuticas, de diagnóstico o profilácticos), y no enseña ni sugiere la unión de moléculas que facilitan la difusión, plasticidad, crecimiento de neuritas y regeneración de axones. Estas moléculas pueden incluir, pero no se limitan a, moléculas que superan la inhibición del crecimiento neurítico o promueven el crecimiento nervioso, tal como los antagonistas NOGO solubles como NgR²⁷-³ii, moléculas de adhesión de células neurales como L1, factores neurotróficos, factores de crecimiento, inhibidores de la fosfodiesterasa e inhibidores. de MAG o MOG. Además, los mutantes de deleción se pueden combinar con otros compuestos que promueven la remielinización, tales como las neuregulinas (GGF2) y los anticuerpos que promueven la remielinización o moléculas que degradan proteoglicanos a péptidos Tat.

La regeneración después de SCI está limitada debido a una variedad de obstáculos que incluyen el depósito de CSPG en la cicatriz glial, desmielinización de axones, falta de soporte trófico y falta de guía axonal. Una sola terapia dirigida contra un aspecto de la SCI puede no ser tan eficaz como un enfoque combinatorio. Las proteínas de fusión con condroitinasa permitirán la terapia combinatoria con una sola proteína. Los socios de fusión para condroitinasa que se construirán en esta propuesta fueron elegidos entre las proteínas que tienen evidencia de eficacia en SCI.

El uso de una molécula que tiene la capacidad tanto de degradar las glicoproteínas de la matriz extracelular como de bloquear o superar la naturaleza inhibidora de los componentes de mielina se puede usar para mejorar la capacidad de las neuronas dañadas para crecer o regenerarse en comparación con cualquier tratamiento solo. Las moléculas que degradan proteoglicanos también se pueden usar ventajosamente para proporcionar un método para facilitar el acceso y la difusión de sustancias en células o tejidos mediante el uso de al menos una enzima capaz de escindir proteoglicanos y preferiblemente degradar proteoglicanos de sulfato de condroitina (CSPG).

Las realizaciones de la presente divulgación incluyen composiciones que comprenden polipéptidos que escinden proteoglicanos, polipéptidos que bloquean y/o superan la actividad de moléculas inhibidoras del crecimiento neuronal, o una combinación de estos. Las composiciones que contienen la molécula de degradación de proteoglicanos o moléculas inhibidoras del crecimiento neuronal también pueden incluir moléculas para la transducción de los polipéptidos a través de las membranas celulares y la barrera hematoencefálica. Las composiciones se pueden usar en el tratamiento de lesiones de la médula espinal y trastornos relacionados del sistema nervioso central (CNS). Las composiciones se pueden usar en la regeneración de tejido neurológico dañado y facilitan la difusión y transporte de moléculas terapéuticas capaces de bloquear y/o vencer la actividad de moléculas inhibidoras del crecimiento neuronal en tejido dañado o enfermo.

Las realizaciones de la presente divulgación incluyen composiciones y métodos para su uso para facilitar la administración y difusión de agentes terapéuticos o de diagnóstico, y preferiblemente agentes que promueven la regeneración de nervios y axones, en células o tejidos. Preferiblemente, la composición incluye el uso de una enzima capaz de escindir proteoglicanos de sulfato de condroitina (CSPG) para aumentar la difusión de estos agentes en las células o tejidos del sistema nervioso central.

Las composiciones de la presente divulgación pueden incluir proteínas quiméricas o de fusión capaces de uso sistémico en el tratamiento de lesiones de la médula espinal y trastornos relacionados del sistema nervioso central (CNS) y, en particular, proteínas de fusión capaces de cruzar la barrera hematoencefálica. La proteína de fusión puede incluir un dominio de transducción de polipéptido, un dominio de polipéptido capaz de degradar un proteoglicano, preferiblemente un dominio que escinde el proteoglicano de sulfato de condroitina (CSPG), un dominio de polipéptido que bloquea o supera la actividad de moléculas inhibidoras del crecimiento neuronal, o cualquier combinación de estos dominios de polipéptidos que se pueden usar en el tratamiento de lesiones de la médula espinal y trastornos relacionados del sistema nervioso central (CNS). Los diversos dominios de polipéptidos se pueden unir o unirse químicamente mediante enlazantes polipeptídicos.

Las composiciones de la presente divulgación incluyen polinucleótidos que codifican las proteínas quiméricas o de fusión capaces de uso sistémico en el tratamiento de lesiones de la médula espinal y trastornos relacionados del sistema nervioso central (CNS) y, en particular, codifican proteínas de fusión capaces de cruzar la barrera hematoencefálica. Los polinucleótidos que codifican estas proteínas quiméricas o de fusión pueden incluir un dominio de polinucleótido que codifica un dominio de transducción de polipéptidos, un dominio de polinucleótido que codifica un dominio de polipéptido capaz de degradar un proteoglucano, preferiblemente escindiendo el proteoglicano de sulfato de condroitina (CSPG), un dominio de polinucleótido que codifica para un dominio de polipéptido que bloquea o supera la actividad de moléculas inhibidoras del crecimiento neuronal, o cualquier combinación de estos dominios que se pueda usar en el tratamiento de lesiones de la médula espinal y trastornos relacionados del sistema nervioso central (CNS). El polinucleótido también incluye uno o más dominios de polinucleótido que codifican polipéptidos que unen los dominios de polipéptido para formar la proteína de fusión.

Una realización es una composición y un método para su uso que facilita el acceso y distribución del agente terapéutico y de diagnóstico en la composición en células, a través de membranas o en tejidos mediante el uso de composición que incluye al menos una enzima capaz de escindir proteoglicanos, preferiblemente la composición incluye una proteína de fusión que tiene una enzima capaz de escindir los CSPG. Las moléculas o agentes en la composición pueden incluir uno o más factores de crecimiento que incluyen, factor neurotrófico derivado del cerebro, factor de crecimiento similar a la insulina, factor de crecimiento de fibroblastos, factor neurotrófico ciliar, factor neurotrófico derivado de la glía, factor de crecimiento transformante, factor de crecimiento glial 2, L1, GM1, factor de crecimiento endotelial vascular, factor de crecimiento nervioso, inmunofilinas. Las moléculas en la composición pueden incluir agentes fluorescentes o de contraste para la formación de imágenes. Los agentes pueden incluir células para trasplante: células madre, neuronas, otras, células como agentes de administración, agentes quimioterapéuticos, antibióticos, terapias con anticuerpos, antagonistas del receptor Nogo, otras enzimas condroitinasas. La composición puede incluir un dominio de transducción, una enzima capaz de escindir proteoglicanos o ambos. Preferiblemente, la composición incluye una proteína de fusión que tiene un dominio de transducción, un dominio de enzima capaz de escindir proteoglicanos o ambos. La proteína de fusión puede facilitar el transporte o modificar el transporte de tales agentes a células, tejidos y/o ubicaciones inaccesibles de otro modo; y/o para mejorar las tasas de penetración, la distancia de penetración; o proporcionar una distribución de concentración más uniforme. Preferiblemente, el transporte modificado se produce mediante el uso de al menos una enzima capaz de escindir CSPG. Las composiciones se pueden usar para tratar una lesión del CNS, preferiblemente la composición se usa en el tratamiento del daño neuronal de una lesión por contusión.

Las realizaciones de la presente divulgación incluyen proteínas quiméricas de un dominio de degradación de proteoglicanos unidas a un polipéptido que bloquea la acción de inhibidores del crecimiento neuronal tales como, pero sin limitarse a, un dominio antagonista del receptor de Nogo (NgR^27-311) o una variante unida a una condroitinasa como condroitinasa ABC I o una variante de condroitinasa que tiene uno o más aminoácidos N terminales suprimidos. El compuesto puede incluir proteínas quiméricas de un dominio de degradación de proteoglicanos unido a un polipéptido que es un promotor de adhesión de células neurales, tales como un dominio promotor de adhesión de células neurales L1 o variante unida a condroitinasa ABC I o una variante de condroitinasa que tiene uno o más aminoácidos N terminales suprimidos. Las proteínas quiméricas pueden incluir proteínas quiméricas de un dominio de degradación de proteoglicanos unido a un polipéptido que es un estimulador de células gliales, tal como, pero no limitado a, un estimulador de células gliales GGF2 o variante unida a condroitinasa ABCI o una variante de condroitinasa que tiene uno o más aminoácidos N terminales suprimidos.

Se puede usar un sistema de expresión recombinante de E. Coli y un procedimiento de purificación para producir condroitinasa ABCI esencialmente pura y catalíticamente activa. Estos métodos se pueden modificar para producir quimeras de moléculas degradantes de proteoglicanos y otros agentes.

La quimera se puede ensayar para determinar la actividad enzimática de la condroitinasa y la actividad biológica específica de cada socio de fusión. Los métodos para medir las actividades de la quimera se pueden modificar para los usados para medir la actividad de la condroitinasa, incluido un ensayo espectrofotométrico, zimografía, un ensayo de HPLC para detectar productos de digestión de disacáridos CSPG y un ensayo de crecimiento de neuritas in vitro. Se puede usar un ensayo de colapso del cono de crecimiento de neuronas para evaluar los antagonistas del receptor NOGO y se puede usar un ensayo de crecimiento de neuritas para medir la actividad de LI. La actividad de GGF2 se puede medir usando un ensayo de proliferación de células de Schwann.

Las composiciones y el método de la presente divulgación se pueden usar para el tratamiento de lesiones de la médula espinal y en la promoción de la regeneración de axones. Las composiciones también se pueden usar para promover la plasticidad, el recrecimiento, la reparación y/o la regeneración de neuronas disfuncionales en el CNS que se han dañado como resultado de una enfermedad, tales como enfermedades degenerativas que incluyen la enfermedad de Alzheimer y Parkinson. Ventajosamente, el uso de polipéptidos que degradan proteoglicanos o polipéptidos transductores de membrana en las composiciones de la presente divulgación también promueve la difusión y el acceso del tejido dañado o enfermo a otros agentes terapéuticos que promueven la regeneración de neuronas.

Descripción de los dibujos

El archivo de esta patente contiene al menos un dibujo/fotografía ejecutado en color. La Oficina proporcionará copias de esta patente con dibujo (s)/fotografía (s) en color, previa solicitud y pago de la tarifa necesaria.

En parte, otros aspectos, características, beneficios y ventajas de las realizaciones de la presente divulgación serán evidentes con respecto a la siguiente descripción, las reivindicaciones adjuntas y los dibujos adjuntos donde:

La figura 1 es un ejemplo ilustrativo de una construcción ABCI de TAT-condroitinasa; la secuencia de ADN para el fragmento de gen completo fusionada con la secuencia de Tat seguida por el enlazante de 5-glicina, los oligonucleótidos sentido y antisentido que tienen las secuencias como 5'-tatgtatggtc gtaaaaagcgtc gtcaacgtcgtcgtgg tggtggtggtca-3' y 5'-tatgaccaccaccaccaccacgac gacgttgacgac gcttttt acgaccataca-3' se hibridaron y ligaron en el sitio NdeI que se encuentra en el extremo 5' del gen ABCI clonado en pET15b (Novagen) en los sitios NdeI y BamHI. La secuencia del péptido Tat⁴⁸-⁵⁷ (GRKKRRQRR) se une con la secuencia ABCI mediante un enlazante de pentaglicina.

La figura 2 son imágenes de la sección del cerebro; (I) ilustrando lóbulos de rata adulta que se incubaron en betagalactodidasa sola (B&D), o con la adición de condroitinasa ABCI (A, 0.5 U/ml o C, 0.005 U/ml); (II) Penetración de la eosina Y a través de la corteza de un hemisferio cerebral tratado con condroitinasa y el control muestra aproximadamente la misma penetración, la eosina Y es un ion híbrido, tiene una carga negativa general al pH bajo al que se usó, y es de 692 kDa ; (III) Una solución saturada de rojo Congo demuestra una mayor penetración a través de la corteza de un hemisferio cerebral tratado con condroitinasa en comparación con el cerebro no tratado, el rojo Congo es un colorante cargado negativamente de 697 kDa;

La figura 3 (A) es un diagrama que representa la proteína GGF de longitud completa (GGF² -M¹-E⁴²²) y los tres fragmentos GGF2 que contienen los dominios Ig y EFG solos y en combinación; (B) una presentación esquemática de proteínas quiméricas de una molécula de degradación de proteoglicanos como condroitinasa ABCI y una isoforma del gen de neuregulina 1, GGF2;

La figura 4 ilustra la estructura de (A) una proteína quimérica NgR²⁷-³ii-N terminal condroitinasa ABCI con y sin un péptido espaciador o grupo de enlace; (B) una proteína quimérica condroitinasa ABCI NgR²⁷-³¹¹-C terminal con y sin un péptido espaciador o grupo de enlace; (C) una proteína quimérica condroitinasa ABCI N-terminal de dominio extracelular L1 con y sin un espaciador o péptido de enlace; (D) una proteína quimérica condroitinasa ABCI C-terminal de dominio extracelular L1 con y sin un espaciador o péptido de enlace.

La figura 5 (A) puntuaciones BBB de animales con lesión de la médula espinal tratados con condroitinasa (condroitinasa ABC I), penicilinasa o líquido cefalorraquídeo artificial (aCSF); (B) Secciones parasagitales de médula espinal de animales lesionados tratados con condroitinasa (columna izquierda) o penicilinasa (columna derecha). Las secciones se cortaron a 30 micrómetros. Cada conjunto de imágenes contiene cuatro secciones parasagitales realineadas con el cordón rostral a la izquierda y el cordón caudal a la derecha. La sección más central de cada conjunto se ha eliminado y reemplazado a continuación para facilitar la visualización. Los pares de imágenes tienen tinción de Weil, anti-GFAP y una tinción de amino cúprico de degeneración neuronal (de arriba a abajo). (C) y (D) Distribución de las puntuaciones BBB individuales según el grupo de tratamiento. Las puntuaciones son puntuaciones BBB a las diez semanas posteriores a la cirugía. Los promedios de grupo se muestran debajo de los puntos de datos.

Descripción detallada

Antes de que se describan las presentes composiciones y métodos, se debe entender que esta divulgación no se limita a las moléculas, composiciones, metodologías o protocolos particulares descritos, ya que estos pueden variar. También se debe entender que la terminología utilizada en la descripción tiene el propósito de describir únicamente las versiones o realizaciones particulares, y no pretende limitar el alcance de la presente invención, que estará limitada únicamente por las reivindicaciones adjuntas.

También se debe tener en cuenta que, como se usa en este documento y en las reivindicaciones adjuntas, las formas singulares "un", "una" y "el" incluyen la referencia en plural a menos que el contexto indique claramente lo contrario. De este modo, por ejemplo, la referencia a una "célula" es una referencia a una o más células y sus equivalentes conocidos por los expertos en la técnica, y así sucesivamente. A menos que se defina de otro modo, todos los términos técnicos y científicos usados en este documento tienen los mismos significados que los entendidos comúnmente por un experto en la técnica. Aunque cualquier método y material similar o equivalente a los descritos en este documento se puede usar en la práctica o ensayo de realizaciones de la presente invención, ahora se describen los métodos, dispositivos y materiales preferidos. Nada en este documento se debe interpretar como una admisión de que la invención no tiene derecho a ser anterior a dicha divulgación en virtud de la invención anterior.

"Opcional" u "opcionalmente" significa que el evento o circunstancia descrito posteriormente puede ocurrir o no, y que la descripción incluye casos en los que ocurre el evento y casos en los que no.

Las enzimas apropiadas que escinden los CSPG incluyen condroitinasa ABC tipo I, condroitinasa ABC tipo II, condroitinasa AC y condroitinasa B o enzimas de mamíferos con actividad similar a la condroitinasa tales como hialuronidasa 1, hialuronidasa 2, hialuronidasa 3, hialuronidasa 4, hialuronidasa, catepsinas, ADAMT y PH-20 o mezclas de los mismos.

Los CSPG son una familia de proteoglicanos compuesta por una proteína central y glucosaminoglicanos sulfatados unidos covalentemente. Las cadenas de polisacáridos son escindidas por varias enzimas, incluida una familia de condroitinasas. Hasta la fecha, esta familia de enzimas contiene al menos cuatro miembros, condroitinasa ABC I, ABC II, AC y B. La condroitinasa ABC I es una exo-liasa que escinde tanto condroitinas como dermatán sulfato. Se ha usado ampliamente en el estudio de la regeneración neuronal in vitro sobre sustratos cargados de CSPG y más recientemente en estudios in vivo después de una lesión del CNS.

Las proteínas y polipéptidos que se pueden usar en las composiciones y proteínas de fusión de la presente divulgación son las que promueven la plasticidad así como la regeneración de neuronas y axones lesionados o enfermos. Estas proteínas y polipéptidos regeneradores pueden incluir proteínas de adhesión celular, aquellas que estimulan las células gliales, y polipéptidos que bloquean el efecto inhibidor de proteínas que actúan como inhibidores del crecimiento de axones.

La plasticidad del sistema nervioso se refiere a cualquier tipo de reorganización funcional. Esta reorganización ocurre con el desarrollo, el aprendizaje y la reparación de la memoria y el cerebro. Los cambios estructurales que ocurren con la plasticidad pueden incluir formación de sinapsis, eliminación de sinapsis, brote de neuritas e incluso pueden incluir el fortalecimiento o debilitamiento de las sinapsis existentes. La regeneración generalmente se diferencia de la plasticidad por el crecimiento a largo plazo de los axones en los tractos interrumpidos que es característico de la regeneración.

Las proteínas y polipéptidos que son capaces de bloquear la actividad de moléculas inhibidoras del crecimiento neuronal pueden incluir péptidos y polipéptidos que bloquean las propiedades inhibidoras de péptidos tales como, pero sin limitación, Nogo, MAG, OMgp. Las composiciones apropiadas que superan la actividad de moléculas inhibidoras del crecimiento neuronal incluyen, pero no se limitan a, inhibidores de la familia de la proteína quinasa C, inhibidores de la familia de la quinasa Rho y agentes, tales como inhibidores de la fosfodiesterasa, que aumentan el AMP cíclico intracelular y L1. Se ha demostrado que el péptido (NgR²⁷-³i i ) inhibe la unión de Nogo66, OMgp, MAG y MOG a NogoR unido a la membrana y supera los efectos inhibidores de Nogo sobre la regeneración de los procesos nerviosos.

Las proteínas y polipéptidos que afectan la adhesión celular o estimulan las células pueden incluir, pero no se limitan a, polipéptidos tales como L1 y GGF2. L1 es una proteína de adhesión de células neurales que es un potente estimulador del crecimiento de neuritas in vitro, por lo que se ha encontrado que el tratamiento de la SCI aguda en roedores usando una forma soluble de L1 conduce a un aumento en la recuperación de la función neurológica. GGF2 estimula las células gliales y se ha demostrado que mejora las medidas de resultado clínico en un modelo murino de encefalomielitis alérgica experimental (EAE), probablemente como resultado de la estimulación de oligodendrocitos para promover la remielinización.

Las secuencias de péptidos que penetran la membrana celular incluyen, pero no se limitan a, RQARRNRRRRWRERQR-51 (motivo básico de la proteína Rev del VIH-1; (SEQ ID NO:51)); MPKTRRRPRRSQRKRPPTP-119 (motivo básico de la proteína Rex de HILV-1; SEQ ID NO:52)) (Kubota et al. 1989); la tercera hélice del homeodominio de Antennapedia (Derossi, et al., J. Biol. Chem. 271:18188-93, 1996) (43-RQILIWFQNRRMKWLL-58 (SEQ ID NO:53)); un péptido derivable de la región variable de la cadena pesada de un anticuerpo monoclonal anti-ADN (Avrameas, et al., Proc. Natl. Acad. Sci.

95:5601-06, 1998) (VAYISRGGVSTYYSDTVKGRFTRQKYNKRA (SEQ ID NO:54)); y la proteína VP22 del virus del herpes simple (Elliot and O'Hare, Cell, 88:223-33,1997) (1-MTSRRSVKSGPREVPRDEYEDLYYTPSSGMASPDSPPDTSRRGALQTRSRQR GEVRFVQYDESDYALYGGSSSEDDEHPEVPRTRRPVSGAVLSGPGPARAPPPP AGSGGAGRTPTTAPRAPRTQRVATKAPAAPAAETTRGRKSAQPESAALPDAP ASRAPTVQLWQMSRPRTDEDLNELLGITHRVTVCEGKNLLQRANELVNPDV VQDVDAATATRGRSAASRPTERPRAPARSASRPRRPVE-246 (SEQ ID NO:55)). En una realización preferida, el péptido básico se puede derivar de la proteína Tat del virus de inmunodeficiencia humana tipo 1 (VIH-1) (Fawell et al., Proc. Natl. Acad. Sci., 91:664-68, 1994). En particular, el péptido Tat puede comprender cualquier residuo secuencial del motivo peptídico básico de la proteína Tat 37-72 (Vives et al. 1997) (37-CFITKALGISYGRKKRRQRRRPPQGSQTHQVSLSKQ-72 (SEQ ID NO:56)). El número mínimo de residuos de aminoácidos puede estar en el intervalo de aproximadamente tres a aproximadamente seis, preferiblemente desde aproximadamente tres a aproximadamente cinco, y más preferiblemente de aproximadamente cuatro, esto es, el requisito mínimo de una vuelta helicoidal Alfa. Una realización preferida comprende los residuos 48-57 de la proteína Tat (GRKKRRQRRR) (SEQ ID NO:57).

Los dominios de PTD apropiados incluyen los derivados de la proteína TAT. Las proteínas Tat y péptidos Tat es una proteína de 86 aminoácidos que participa en la replicación del virus de inmunodeficiencia humana tipo 1 (VIH-1). La proteína de transactivación Tat del VIH-1 es absorbida eficazmente por las células (Mann and Frankel 1991; Vives et al.

1994), y las concentraciones bajas (nM) son suficientes para transactivar un gen indicador expresado a partir del promotor del VIH-1 (Mann and Frankel 1991). La proteína Tat exógena es capaz de translocarse a través de la membrana plasmática y llegar al núcleo para transactivar el genoma viral.

Se cree que una región de la proteína Tat centrada en un grupo de aminoácidos básicos es responsable de esta actividad de translocación (Vives et al. 1997). La captación celular y la translocación nuclear mediada por péptidos Tat se han demostrado en varios sistemas (Vives, et al., J Biol Chem 272:16010-16017, 1997; Jones, Genes Dev 11:2593-2599, 1997) . El acoplamiento químico de un péptido derivado de Tat (residuos 37-72) a varias proteínas da como resultado su internalización en varias líneas celulares o tejidos (Fawell, et al., Proc Natl Acad Sci USA 91:664-668,1994; Anderson, et al., Biochem Biophys Res Commun 194:876-8884, 1993; Fahraeus, et al., Curr Biol 6:84-91, 1996; Nagahara, et al., Nat Med 4:1449-1452, 1998). Un péptido sintético que consta de los aminoácidos básicos Tat 48-60 con un residuo de cisteína en el extremo C acoplado a fluoresceína maleimida se transloca al núcleo celular según se determina mediante microscopía de fluorescencia (Vives et al. 1997). Además, una proteína de fusión (Tat-NLS-.beta.-Gal) que consta de los aminoácidos Tat 48-59 fusionados por sus aminoácidos terminal amino con los aminoácidos beta-galactosidasa 9-1023 se transloca al núcleo celular en un factor citosólico dependiente del ATP, de manera independiente (Efthymiadis et al.

1998) .

Las proteínas quiméricas, también denominadas en la técnica proteínas de fusión, son proteínas híbridas que combinan al menos partes de dos o más proteínas o péptidos precursores. Las proteínas quiméricas se pueden producir mediante tecnología recombinante, esto es fusionando al menos una parte de la secuencia codificante de un gen con al menos una parte de la secuencia codificante de otro gen. Cuando sea deseable, se pueden fusionar uno o más genes para péptidos enlazantes a la secuencia codificante de genes para los otros dominios de polipéptidos en la proteína de fusión. El gen fusionado se puede usar luego para transformar un organismo apropiado tal como, pero sin limitarse a, células de E. coli o CHO que luego expresan la proteína de fusión.

Los genes que codifican mutantes de deleción de terminales ya sea N o C de los dominios de polipéptidos de las proteínas de fusión se pueden usar en construcciones para la expresión de las proteínas de fusión. Preferiblemente, los mutantes de deleción generados mantienen su actividad catalítica de degradación de proteoglicanos, actividad de bloqueo, actividad de crecimiento o actividad de transducción. Los mutantes de deleción generados de las moléculas que degradan proteoglicanos como la enzima condroitinasa ABCI, donde al mutante le falta un cierto número de aminoácidos del N- y/o C-terminal, son aquellos que retienen alguna actividad de degradación de proteoglicanos. Las deleciones N-terminales de condroitinasa como condroitinasa ABC I mantienen una etiqueta de histidina que está unida al extremo N. Se espera que una construcción de ADN de fusión de condroitinasa ABC I mutante por deleción de TAT se pueda expresar sin la eliminación del polipéptido TAT durante la expresión. Por ejemplo, fusionar el péptido TAT en el extremo N del mutante de deleción ya sea ABCI-NA20 o ABCINA60. Fragmentos de polipéptidos, tales como los que se muestran en la figura 3 para GGF2, se puede usar en la construcción de proteínas de fusión quiméricas.

Se pueden preparar mutantes de deleción catalíticamente activos de condroitinasa ABCI, por ejemplo, pero sin limitarse a la deleción de 20, 40 y 60 aminoácidos respectivamente del extremo N de la proteína ABCI madura. La deleción de 60 aminoácidos del N-terminal y 80 aminoácidos del extremo C-terminal también se puede usar para hacer un mutante de deleción de una condroitinasa ABCI que degrada proteoglicanos. Estos mutantes de deleción y los de otras moléculas que degradan proteoglicanos se pueden usar para la construcción de proteína quimérica de fusión N-terminal. Se pueden realizar estudios bioquímicos comparativos detallados para determinar la eficacia de la condroitinasa ABCI madura frente a diversos mutantes de deleción en composiciones y proteínas de fusión con respecto a la especificidad del sustrato, la unión del sustrato y la penetración tisular.

Se puede preparar un mutante de condroitinasa ABCI que tiene una estructura proteica nativa, pero que carece de actividad catalítica, como control nulo o negativo para bioensayos y estudios de SCI. En base a la estructura cristalina de la condroitinasa ABCI, se puede preparar un mutante específico de sitio designado H501a e Y508a para anular la actividad catalítica en el supuesto sitio activo. Tales mutantes se pueden probar para la inactivación de la actividad catalítica y SEC para compararlos con la enzima de tipo salvaje. Si el mutante de actividad nula se crea con éxito, proporcionará un control negativo para las diversas proteínas de fusión para su uso en bioensayos y, en última instancia, en estudios de SCI con animales.

Un sistema de expresión de E. Coli puede consistir en producir condroitinasa usando vectores de expresión de PET (Novagen). La proteína de fusión GGF2-condroitinasa ABCI se puede expresar en E. coli. Las construcciones para proteínas de fusión mutantes de deleción de Tat-condroitinasa, proteínas de fusión Tat-GGF2 o proteínas de fusión Tatcondroitinasa-GGF2 se pueden expresar a partir de E. coli. Otras proteínas de fusión se pueden expresar en las líneas celulares CHO.

La tabla 1 ilustra diversos componentes no limitantes que se pueden usar en las composiciones de la presente divulgación como una mezcla, y preferiblemente como una molécula de fusión o quimérica. La composición o molécula quimérica descrita puede incluir una o más de las moléculas en la tabla 1. En el caso de moléculas quiméricas, se usan uno o más segmentos enlazantes, preferiblemente polipéptidos.

Tabla 1 Com onentes de las com osiciones

En la figura 4A y la figura 4B se ilustra una ilustración esquemática de versiones no limitantes de proteínas de fusión quiméricas.

Un componente peptídico de cualquier columna en la tabla 1 se podría unir mediante un enlazante oligopéptido bien conocido en la técnica, tal como un péptido rico en glicina, se pueden usar por ejemplo Gly-Gly-Gly-Gly-Gly, o enlazantes preparados que incluyen uno de los aminoácidos de origen natural así como aminoácidos sustituidos o beta o gamma como ácido 4-aminobutírico o ácido 6-aminocaproico. También se pueden usar otros enlazantes que incluyen pero no se limitan a alquil diaminas, amino o alquil dioles. Preferiblemente, el componente de transducción de la proteína de fusión está en una posición terminal en la proteína quimérica. Otros ejemplos de enlazantes comunes pueden incluir, pero sin limitarse a enlazantes ricos en Gly-Gly-Ala-Gly-Gly, Gly/Ser (por ejemplo, Gly⁴Ser³), o enlazantes ricos en Gly/Ala. Además, los enlazantes pueden tener cualquier longitud y diseño para promover o restringir la movilidad de los componentes en la proteína de fusión.

La incorporación de aminoácidos no naturales, incluidos aminoácidos no nativos sintéticos, aminoácidos sustituidos o uno o más D-aminoácidos en los péptidos (u otros componentes de los complejos) de la presente divulgación (denominada posteriormente en este documento como "péptidos D") es ventajoso en un número de formas diferentes. Los péptidos que contienen D-aminoácidos exhiben una mayor estabilidad in vitro o in vivo en comparación con sus homólogos que contienen L-aminoácidos. De este modo, la construcción de péptidos que incorporan D-aminoácidos puede ser particularmente útil cuando se desea o se requiere una mayor estabilidad intracelular. Más específicamente, los péptidos D son resistentes a las peptidasas y proteasas endógenas, proporcionando así una mejor liberación oral transepitelial y transdérmica de fármacos unidos y conjugados, una biodisponibilidad mejorada de los complejos que penetran la membrana y una vida útil intravascular e intersticial prolongada cuando tales propiedades son deseables. El uso de péptidos D también puede mejorar la administración transepitelial transdérmica y oral de fármacos enlazados y otras moléculas de carga.

En una lesión de la médula espinal, los axones de las neuronas motoras sensoriales ascendentes y descendentes se interrumpen, lo que puede dar como resultado la pérdida de sensibilidad y parálisis. Estos axones no se regeneran con éxito, lo que conduce a una discapacidad permanente. Una cicatriz envuelve el sitio de la lesión que se cree que forma una pared del área de tejido frágil, estabiliza la barrera hematoencefálica y previene una cascada abrumadora de daño tisular incontrolado. Esta cicatriz está compuesta por células gliales hipertróficas y una matriz extracelular (ECM). Los proteoglicanos de sulfato de condroitina (CSPG) son un componente importante de la cicatriz. Son expresados por las células gliales y depositados en el ECM en regiones de ruptura de la barrera hematoencefálica. La evidencia in vitro demuestra que estos CSPG son potentemente inhibidores del crecimiento de los axones y, sin desear ceñirse a ninguna teoría, se cree que contribuyen al fracaso de los axones de la médula espinal para regenerar y reformar las sinapsis funcionales. Los estudios in vivo han demostrado que los axones en regeneración pueden crecer hasta la cicatriz e incluso más allá.

Los CSPG y los componentes de la sustancia blanca se aceptan generalmente como barreras moleculares que las neuronas deben superar para regenerar y restablecer las conexiones funcionales después de una lesión. Las neuronas sensoriales adultas trasplantadas colocadas distalmente a una cicatriz en formación pueden regenerarse de manera robusta incluso a lo largo de las vías de degeneración de la materia blanca; sin embargo, la regeneración cesa abruptamente cuando los axones entran en el proteoglicano que contiene la cicatriz glial. El tratamiento de las vías de la sustancia blanca del CNS con condroitinasa mejora la capacidad de las neuronas para crecer en estos sustratos.

Los tejidos del sistema nervioso central están estrechamente compactados con células y tienen un espacio extracelular limitado. Las proteínas y los carbohidratos de la matriz extracelular proporcionan cargas y fuerzas osmóticas, así como sitios de unión específicos e inespecíficos, que pueden impedir la penetración de agentes terapéuticos. La escisión enzimática de estos componentes celulares y de la matriz puede posteriormente o facilitar el acceso de compuestos o células a través de los tejidos. Una molécula de degradación de proteoglicanos como la condroitinasa ABC I que es una enzima que digiere proteoglicanos de sulfato de condroitina se puede usar para promover la difusión de moléculas terapéuticas en el CNS. Los péptidos Tat para transportar moléculas de carga biológicamente activas unidas covalentemente al citoplasma y núcleos de las células. En el caso de una proteína de fusión que tiene un dominio de polipéptido de transducción de proteínas como la proteína tat del VIH, se pueden administrar moléculas terapéuticas para la regeneración de axones a través de la barrera hematoencefálica.

El tratamiento de las lesiones del modelo de SCI, preferiblemente la lesión del modelo de contusión, se puede usar para determinar el grado de regeneración y recuperación funcional lograda por las composiciones y el método de la presente divulgación. El grado de recuperación funcional se puede demostrar mediante la mejora de la conducción del tracto corticoespinal, la mejor eliminación de la cinta, la marcha en viga, la marcha en cuadrícula y la colocación de la pata después del tratamiento con condroitinasa de una lesión de la columna dorsal. Mejora de la habilidad motora así como de la función autónoma: la función intestinal, vesical, sensora y sexual también se pueden usar como medidas de mejora de la función y relacionadas con la estructura molecular y los componentes en las composiciones de la presente divulgación.

Además de la capacidad de la condroitinasa para potenciar la regeneración, la condroitinasa digiere componentes de la red perineuronal (PNN). La densidad del PNN es variable dentro del CNS y es particularmente densa en las cortezas somatosensorial, auditiva, visual y el hipocampo. También se ha demostrado que la PNN es densa alrededor de las neuronas motoras espinales. Los inventores han descubierto el PNN denso dentro del cuerno dorsal del cordón. La digestión del PNN puede mejorar la plasticidad dentro del hipocampo y la corteza visual. La plasticidad dentro de los sistemas intactos en la SCI incompleta, especialmente en la región de los generadores de patrones centrales o en el núcleo reticular, puede apoyar la función de sistemas dañados o destruidos. La promoción de la plasticidad en estos sistemas puede ser un mecanismo distinto o adicional a la regeneración por el cual la condroitinasa puede mejorar la función después de una lesión del CNS. Adicionalmente, la regeneración y la plasticidad pueden trabajar en conjunto para afectar la recuperación después de una lesión; de hecho, se ha demostrado que el tracto corticoespinal es fundamental para la modulación de la plasticidad de la médula espinal.

La recuperación de la función neurológica después de una lesión por contusión en el CNS o un estado de enfermedad se puede promover administrando las proteínas de fusión o mezclas que incluyen uno o más de los componentes en la tabla 1, a células, un tejido o un sujeto que tiene neuronas dañadas o enfermas, ya sea que la lesión o la enfermedad sea inmediata o de larga duración.

Las proteínas de fusión en este documento se administran en una cantidad eficaz para degradar los CSPG y promover de ese modo la recuperación de la función neurológica. Una vez que las proteínas o polipéptidos de las composiciones se han purificado en la medida deseada, se pueden suspender o diluir en un portador o excipiente fisiológico apropiado para el tratamiento de SCI. En modelos de SCI, las dosis intratecales eficaces en ratas han sido de aproximadamente 0. 06 unidades en días alternos durante 14 días. Una dosis para un ser humano de 70 kilogramos puede ser de aproximadamente 17 unidades. Aproximadamente a 100 unidades/miligramo, esto equivaldría a unos 170 microgramos. Las dosis de hasta 20 unidades parecen seguras en la rata. Se pueden inyectar composiciones que incluyen una molécula que degrada proteoglicanos en una mezcla o como parte de una proteína de fusión diluida en un portador o excipiente farmacéuticamente aceptable, generalmente en concentraciones en el intervalo de 1 |ig a 500 mg/kg del huésped. La administración del agente puede ser mediante inyección en bolo, administración intravenosa, infusión continua, liberación sostenida de implantes o productos farmacéuticos de liberación sostenida. La administración puede ser por inyección, tales como por vía intramuscular, peritoneal, subcutánea o intravenosa. La administración oral puede incluir comprimidos o cápsulas, preferiblemente la dosificación oral es una formulación de liberación sostenida para una administración una o dos veces al día. La administración percutánea puede ser una vez al día, y preferiblemente es menos de una administración al día. La administración al paciente humano u otro sujeto mamífero se puede continuar hasta que se logre una mejora medible en la función motora o autónoma en el paciente.

Las proteínas de fusión condroitinasa PTD se pueden administrar con un portador farmacéutico apropiado. La administración de las composiciones de la presente divulgación como mezclas o proteínas quiméricas puede ser tópica, local o sistémica. Las proteínas de fusión quiméricas también pueden ser secretadas por células genéticas, preferiblemente una proteína de fusión quimérica que tiene una porción de degradación de proteoglicanos como condroitinasa y una porción de polipéptido de transducción como TAT puede ser secretada por células modificadas genéticamente que se implantan, ya sea libres o en una cápsula, en o cerca del sitio de la lesión del CNS.

Una vez que se administran las composiciones ya sea como mezclas o proteínas de fusión, la degradación de los CSPG elimina las moléculas inhibidoras que bloquean el crecimiento de neuritas y permiten la regeneración de neuritas en el área afectada. Por ejemplo, la condroitinasa AC y la condroitinasa B degradan CS y DS, respectivamente, dando como resultado disacáridos insaturados sulfatados. La condroitinasa AC escinde el CS en 1, 4 enlaces glicosídicos entre N-acetilgalactosamina y ácido glucurónico en el esqueleto de polisacáridos del CS. La escisión se produce mediante eliminación beta en un patrón de acción endolítica aleatoria. La condroitinasa B escinde el enlace de ácido idurónico de 1, 4 galactosamina en el esqueleto polisacárido de DS. La escisión de tanto CS como DS se produce a través de un procedimiento de eliminación beta que diferencia estos mecanismos enzimáticos de las enzimas degradantes de GAG de mamíferos. La condroitinasa ABCI, condroitinasa ABCII, son exo y endoliasas que escinden tanto CS como DS. La eliminación de CS y DS de la cicatriz glial permite la regeneración de excrecencias de neuritas en el área lesionada.

Se pueden usar mezclas de cualquiera de estos polipéptidos de fusión para proporcionar un tratamiento terapéutico para lesiones y trastornos del CNS que pueden incluir, pero no se limitan a, lesión por contusión, lesión cerebral traumática, accidente cerebrovascular, esclerosis múltiple, lesión del plexo braquial, amblioplia, lesiones de la médula espinal. Las lesiones de la médula espinal incluyen enfermedades y lesiones traumáticas, tales como el aplastamiento de neuronas provocado por un accidente automovilístico, caída, contusión o herida de bala, así como otras lesiones. La práctica de los presentes métodos puede conferir beneficios clínicos al mamífero tratado, proporcionando mejoras clínicamente relevantes en al menos una de las funciones de coordinación motora y percepción sensorial del sujeto. Las mejoras clínicamente relevantes pueden variar desde una mejora detectable hasta una restauración completa de una función deteriorada o pérdida del CNS.

La regeneración de las células nerviosas en el área del CNS afectada permite el retorno de la función motora y sensorial. La mejora clínicamente relevante variará desde una mejora detectable hasta una restauración completa de una función nerviosa deteriorada o perdida, variando con los pacientes individuales y las lesiones.

Una variante de una proteína o fragmentos de la misma se refiere a una molécula sustancialmente similar ya sea a la proteína completa o un fragmento, que posee una actividad biológica que es sustancialmente similar a una actividad biológica de la proteína o fragmentos del complemento. Una molécula es sustancialmente similar a otra molécula si ambas moléculas tienen estructuras sustancialmente similares o si ambas moléculas poseen una actividad biológica similar.

Las variantes de la proteína del complemento o sus fragmentos se producen por medios químicos o recombinantes. También se pueden preparar variantes de los polinucleótidos construidos para expresar proteínas de fusión. Las variantes pueden incluir, por ejemplo, deleciones de, o inserciones o sustituciones de residuos de aminoácidos dentro de la secuencia de aminoácidos, o deleción, sustitución o inserción de ácidos nucleicos de una secuencia que codifica una proteína de fusión particular o dominio de polipéptido en la proteína de fusión. Por ejemplo, en algunos casos, la eliminación de uno o más residuos de aminoácidos de un polipéptido de condroitinasa se puede realizar sin un cambio significativo en su actividad de degradación de CSPG. Los cambios sustanciales en las propiedades funcionales, como la degradación de proteoglicanos o la actividad de bloqueo contra los inhibidores del crecimiento de axones, se realizan seleccionando sustituciones que son menos conservadoras, esto es. que difieren más significativamente en su efecto sobre el mantenimiento de la estructura, carga o hidrofobicidad del esqueleto peptídico en el área de sustitución.

No se espera que la mayoría de las deleciones, inserciones y sustituciones produzcan cambios radicales en las características de la molécula de proteína; sin embargo, cuando sea difícil predecir el efecto exacto de la sustitución, deleción o inserción antes de hacerlo, un experto en la técnica apreciará que el efecto se evaluará mediante ensayos de cribado de rutina. Por ejemplo, un cambio en el carácter de regeneración de axones de la molécula de polipéptido, a través de más o menos degradación de proteoglicanos, se puede medir con pruebas de recuperación funcional, así como ensayos de HPLC para detectar productos de digestión de disacáridos de CSPG.

La presente divulgación se refiere al uso de una molécula de degradación de proteoglicanos, una proteína tat del VIH o un polipéptido derivado de tat, o una combinación de estos como una mezcla o proteína de fusión para administrar una molécula de interés en el CNS o un sitio en el CNS donde se ha producido daño al tejido neuronal por enfermedad o trauma. En particular, el sitio del daño en el CNS es donde se produjo la cicatrización como resultado de una contusión. La molécula de interés, denominada opcionalmente agente o molécula de carga, puede ser una molécula terapéutica que promueva la plasticidad, el crecimiento de axones, una molécula de diagnóstico o una molécula que degrada los proteoglicanos. En el caso de una proteína de fusión que tiene un dominio de polipéptido de transducción de proteínas como la proteína tat de HTV, se pueden administrar moléculas terapéuticas para la regeneración de axones a través de la barrera hematoencefálica o se pueden administrar moléculas que degradan proteoglicanos a las células para degradar las reservas celulares de proteoclicanos y promover la regeneración del axón.

Los polipéptidos de transporte de esta divulgación se pueden unir ventajosamente a moléculas de carga mediante reticulación química o mediante fusión genética. Un residuo de cisteína terminal único es un medio preferido de reticulación química. Según algunas realizaciones preferidas, el terminal carboxi de la unidad estructural de transporte se fusiona genéticamente con el terminal amino de la unidad estructural de carga. La realización de la presente divulgación consiste en una metionina amino terminal seguida de los residuos tat 47-58, seguido de un polipéptido condroitinasa.

Se apreciará que los 86 aminoácidos completos que componen la proteína tat pueden no ser necesarios para la actividad de absorción de tat. Por ejemplo, se puede usar un fragmento de proteína o un péptido que tiene menos de 86 aminoácidos, pero que exhibe captación en las células y o puede cruzar la barrera hematoencefálica, se puede usar (un fragmento o porción de tat funcionalmente eficaz). Por ejemplo, la proteína tat que contiene los residuos 1-72 puede ser suficiente para la actividad de absorción y los residuos tat 1-67 pueden mediar en la entrada de una proteína heteróloga en las células. El péptido sintético que contiene los residuos de tat 1-58 puede tener actividad de absorción.

El péptido tat puede ser una secuencia de aminoácidos única (esto es, continua) presente en la proteína tat o puede ser dos o más secuencias de aminoácidos que están presentes en la proteína tat, pero en la proteína de origen natural están separadas por otras secuencias de aminoácidos. Como se usa en este documento, la proteína tat incluye una secuencia de aminoácidos de origen natural que es la misma que la de la proteína tat de origen natural, su equivalente funcional o fragmentos funcionalmente equivalentes de la misma (péptidos). Tales equivalentes funcionales o fragmentos funcionalmente equivalentes pueden poseer una actividad de captación en la célula o a través de la barrera hematoencefálica que es sustancialmente similar a la de la proteína tat de origen natural. La proteína Tat se puede obtener de fuentes naturales o se puede producir usando técnicas de ingeniería genética o síntesis química.

La secuencia de aminoácidos de la proteína tat del VIH de origen natural se puede modificar, mediante la adición, deleción y/o sustitución de al menos un aminoácido presente en la proteína tat de origen natural, para producir proteína tat modificada (también denominada en este documento como proteína o polipéptido tat). De este modo, se pueden producir análogos de proteína tat modificada o péptidos tat con mayor estabilidad usando técnicas conocidas. Por lo tanto, las proteínas o péptidos tat pueden tener secuencias de aminoácidos que son sustancialmente similares, aunque no idénticas, a las de la proteína tat de origen natural o porciones de la misma. Además, se puede agregar colesterol u otros derivados lipídicos a la proteína tat para producir una tat modificada que tiene una mayor solubilidad en la membrana.

La proteína tat de HTV-1 de origen natural tiene una región (aminoácidos 22-37) en la que 7 de los 16 aminoácidos son cisteína. Esos residuos de cisteína son capaces de formar enlaces disulfuro entre sí, con residuos de cisteína en la región rica en cisteína de otras moléculas de proteína tat y con residuos de cisteína en una proteína de carga o la unidad estructural de carga de un conjugado. Esta formación de enlaces disulfuro puede provocar la pérdida de la actividad biológica de la carga. Adicionalmente, incluso si no hay posibilidad de enlaces disulfuro a la unidad estructural de carga (por ejemplo, cuando la proteína de carga no tiene residuos de cisteína), la formación de enlaces disulfuro entre polipéptidos de transporte puede conducir a la agregación e insolubilidad del polipéptido de transporte, el conjugado del polipéptido de transporte-carga, o ambos. La región rica en cisteína tat se puede suprimir para evitar la formación de enlaces disulfuro y prevenir la agregación y la insolubilidad del polipéptido de transporte, el conjugado del polipéptido de transporte-carga o ambos.

La condroitinasa también es capaz de promover la plasticidad en regiones del CNS con PNN significativamente denso, incluyendo corteza, tectum, hipocampo y médula espinal. Es razonable que alguna combinación de efectos, incluida la regeneración, la germinación y la plasticidad, sean responsables de la mejora de la función después de la SCI con el tratamiento con condroitinasa o el tratamiento con moléculas de fusión, incluida la condroitinasa u otra molécula degradadora de proteoglicanos.

NbR27 -³¹¹:Nogo es un componente de mielina de alto peso molecular que inhibe el crecimiento de neuritas. La región amino terminal (Nogo66) es la parte de la molécula que está específicamente asociada con la inhibición del crecimiento de neuritas. Los métodos de clonación de expresión revelaron que el receptor de Nogo66 (NgR) es una glicoproteína anclada a GPI expresada principalmente en neuronas. NgR interactúa no solo con Nogo, sino también con otros inhibidores asociados a la mielina tales como MAG y MOG. Debido a su papel central en las propiedades inhibidoras de la mielina en las neuronas, NgR ha sido el objetivo de enfoques para antagonizar sus interacciones con sus ligandos. El segmento soluble de NgR interactúa con Nogo66, MAG y m Og . La región abarca los residuos 27-311 y, por lo tanto, este fragmento de NgR puede actuar como un receptor señuelo que interferirá con la inhibición de neuronas asociada a la mielina. Si NgR^27-311 se une a una molécula que degrada proteoglicanos como la condroitinasa ABCI para formar una proteína de fusión quimérica, se esperaría que el dominio de polipéptido NgR^27-311 de la proteína de fusión limite la inhibición asociada a la mielina del crecimiento de neuritas y promueva la regeneración axonal en las regiones de condroitinasa digeridas con condroitinasa de una lesión de la médula espinal.

Para el (NgR²⁷-³¹¹) clonado, la región precisa de interés o los fragmentos se pueden derivar del clon inicial. La actividad biológica de NgR²⁷-³¹¹, sus fragmentos y polipéptidos de fusión que incluyen NgR^27-311 se pueden confirmar usando un ensayo in vitro para el colapso de conos de crecimiento en neuronas. Se ha establecido el ensayo de colapso del cono de crecimiento y la adición de MAG o Nogo66 provoca el colapso de los conos de crecimiento de una manera dependiente de la dosis. Si NgR²⁷-³¹¹, sus fragmentos y polipéptidos de fusión, incluido NgR²⁷-³¹¹, son activos, si son biológicamente activos, entonces deberían inhibir el colapso del cono de crecimiento mediado por MAG y Nogo66. Los datos del colapso del cono de crecimiento se pueden recopilar mediante la inspección de fotomicrografías de neuronas DRG en respuesta a Nogo66 y MAG.

El polipéptido L1 es un miembro de la superfamilia de inmunoglobulinas de moléculas de adhesión celular y se expresa en axones en crecimiento, células progenitoras gliales y células de Schwann durante toda la vida, pero sólo tiene una expresión limitada en el CNS. L1 interactúa consigo mismo y con otras moléculas extracelulares, tales como el receptor FGF, para promover la fasciculación y el crecimiento de neuritas. La expresión de L1 generalmente se asocia con un entorno permisivo para la regeneración axonal, la región precisa de interés, o los fragmentos de L1 se pueden derivar del clon inicial. Por ejemplo, las células de Schwann que expresan L1 apoyan la regeneración de nervios periféricos y se observa crecimiento axonal en los nervios ópticos de ratones transgénicos que expresan L1 en astrocitos pero no en nervios ópticos de tipo salvaje. Los fibroblastos diseñados para expresar L1 apoyan el crecimiento axonal cuando se trasplantan a la médula espinal. Finalmente, una forma soluble de L1 ligada a Fc promovió la recuperación funcional después de SCL aguda. Si L1 está ligada a una molécula de degradación de proteoglicanos como la condroitinasa ABCI en una proteína de fusión, es razonable esperar que la proteína de fusión promueva la regeneración axonal en las regiones de digestión de condroitinasa de una lesión de la médula espinal

Las neuregulinas y sus receptores comprenden un factor de crecimiento diverso y un sistema receptor de tirosina quinasa que se ha demostrado que es esencial para la organogénesis en el CNS, el epitelio muscular y otros tejidos. g GF2 es una isoforma soluble del gen de la neuregulina 1. Inicialmente se caracterizó como un mitógeno de células de Schwann 32, pero estudios posteriores han demostrado acciones directas sobre oligodendrocitos, neuronas y otros tipos de células. GGF2 disminuye la desmielinización y la inflamación y mejora la remielinización en un modelo de ratón para la esclerosis múltiple. En base a estos resultados, es razonable esperar que un GGF2 humano recombinante sea un tratamiento potencial para la desmielinización asociada con la SCI. Con GGF2 está ligado a una molécula degradante de proteoglicanos como condroitinasa ABCI, es razonable esperar que promueva la remielinización de axones en regiones digeridas con condroitinasa de una SCL

Tabla 2. Ejemplos de fragmentos de GGF2 no limitantes para expresión en E. coli para su uso en composiciones y m i i n li i f i n.

La eficacia de una composición de la presente divulgación, tal como una molécula de degradación de proteoglicanos y una molécula que bloquea la actividad de un inhibidor del crecimiento de axones, ya sea como una mezcla o como una proteína de fusión, se puede evaluar usando un modelo de SCI de rata validado en tres niveles diferentes de gravedad de la SCI.

Una molécula de degradación de proteoglicanos como la condroitinasa ABCI está disponible comercialmente en pequeñas cantidades como una enzima derivada de forma natural (Seikagaku Corporation) y se puede preparar mediante un sistema de producción recombinante para que tenga esencialmente la misma actividad que la enzima purificada de Proteus vulgaris. El ADN genómico se puede aislar de Proteus vulgaris usando el kit DNeasy Tissue (Qiagen). Los cebadores de PCR se pueden sintetizar con un sitio de restricción Ndel en el extremo 5' y un sitio BamHI en el extremo 3' con secuencias 5'- CAT ATG GCC ACC AGC MT CCT GCA TTT G-3'(F2) y 5'- GGA TCC TCA AGG GAG TGG CGA GAG-3'(R) respectivamente, para sintetizar la proteína madura. Los productos de PCR de 3.0 kb se pueden ligarse en el vector pCR 2.1 (kit de clonación TOPO, Invitrogen) y transformarse en células competentes DH5a (Invitrogen). El ADN plasmídico se puede aislar a partir de un número de clones seleccionados mediante digestión con la enzima de restricción EcoRI. La integridad de un gen preparado de esta manera se puede confirmar mediante secuenciación repetida de ADN.

La secuencia de condroitinasa ABCI se puede clonar en un vector PET (Novogen) para su expresión en E. Coli. Después de la inducción de la expresión génica con IPTG, las bacterias se pueden lisar mediante sonicación con la extracción concomitante de condroitinasa ABCI con Triton X-1 14/PBS. Los inventores descubrieron que la mayor parte de la condroitinasa ABCI recombinante se encontró en la fracción citosólica del lisado de células bacterianas que permitió el desarrollo de un protocolo de purificación de condroitinasa ABCI que produce una enzima con alta actividad con altos rendimientos. El protocolo incluye cromatografía de intercambio catiónico como una etapa de captura y filtración en gel como etapa de pulido. Después de estas etapas, la condroitinasa ABCI alcanza una pureza de ~95 %. La filtración por membrana de intercambio aniónico (Intercept Q, Millipore) se puede usar para la eliminación de endotoxinas y ADN del huésped. Se espera que esta etapa elimine aproximadamente el 75 % de la endotoxina. Después de la filtración, la condroitinasa ABCI se puede dializar en solución reguladora volátil, pH 8.0 y liofilizar hasta sequedad. El producto final es estable a -70 °C para almacenamiento a largo plazo. El cABCI purificado es una proteína muy básica con pI-9.5 según se determina mediante análisis IEF-PAGE de las muestras del lisado celular crudo.

Se puede usar una variedad de métodos analíticos para comparar la actividad enzimática de la versión recombinante de condroitinasa ABCI con la de una forma comercialmente disponible de la enzima (Seikagaku Corporation) purificada de Proteus vulgaris. Los métodos se pueden adaptar para evaluar la actividad de proteínas de fusión que incluyen polipéptidos que degradan proteoglicanos como condroitinasa. Las mediciones de actividad específica se obtuvieron usando un ensayo espectrofotométrico aceptado que mide el cambio en la absorbancia debido a la producción de productos de reacción a partir de la degradación de proteoglicanos. La forma recombinante de condroitinasa ABCI tenía aproximadamente un 25 % más de actividad específica que la condroitinasa ABCI de Seikagaku. La cromatografía de exclusión por tamaño se puede usar para comparar las propiedades hidrodinámicas de las enzimas. Los perfiles de elución de la enzima recombinante fueron idénticos a los de la enzima de origen natural.

Se puede usar una forma de zimografía para caracterizar adicionalmente la enzima y se puede adaptar para la caracterización de las proteínas de fusión. Los geles de poliacrilamida se pueden polimerizar en presencia de agrecano, un sustrato para la condroitinasa ABCI. Las muestras de enzimas se pueden resolver en los geles impregnados con agrecano mediante electroforesis en presencia de SDS. A continuación, los geles se pueden someter a una etapa de renaturalización en la que se extrajo el SDS y se dejó que las enzimas se replegaran. La enzima se replega y recupera la actividad, luego digiere agrecano dentro del gel y la pérdida resultante de carbohidratos en esa región del gel puede visualizarse mediante una tinción específica de carbohidratos. Se esperaría una pérdida similar de carbohidratos en el gel para las formas activas de una proteína de fusión que incluye una porción de polipéptido que degrada los proteoglicanos. En el caso de la condroitinasa ABCI recombinante, su actividad se puede visualizar como una mancha clara en el zimograma. Los resultados de la zimografía fueron consistentes con el análisis espectrofotométrico que demuestra que la forma recombinante de condroitinasa ABCI tiene la misma o mayor actividad específica que la forma natural.

Se pueden usar métodos de HPLC para detectar los cuatro y seis disacáridos sulfatados (A4DS y A6DS, respectivamente) liberados como resultado de la digestión con condroitinasa ABCI de CSPG. Los dos disacáridos se pueden resolver eficazmente mediante cromatografía de intercambio aniónico. El ensayo de HPLC se ha validado al demostrar que la cuantificación de A4DS y A6DS de los cromatogramas produce una relación lineal con las cantidades inyectadas en la HPLC. La producción de A4DS y A6DS a partir de la digestión con CSPG está directamente relacionada con la cantidad de actividad específica de condroitinasa determinada por el ensayo espectrofotométrico descrito anteriormente. Este ensayo se puede usar como un medio sensible y preciso para cuantificar independientemente A4DS y A6DS liberados por digestión con condroitinasa de una variedad de sustratos y también se puede usar para determinar la actividad de polipéptidos de condroitinasa en una proteína de fusión.

Otro ensayo funcional que se puede realizar para caracterizar la actividad del polipéptido de proteoglicano es cuando las neuronas del ganglio de la raíz dorsal (DRG) se siembran en placa sobre agrecano o agrecano tratado con un proteoglicano como condroitinasa ABCI. Se espera que las neuronas sembradas en placa sobre agrecano no se adhieran a la placa y no extiendan los axones. Por el contrario, se esperaría que las neuronas sembradas en placas sobre agrecano tratadas con un polipéptido que degrada los proteoglicanos como condroitinasa ABCI en una composición o como parte de un polipéptido de fusión se adhieran a la superficie y extiendan los axones. Se cree que el extenso crecimiento de axones, que se observa para la condroitinasa ABCI, se debe a la digestión de los carbohidratos en la proteína del núcleo de agrecano que crea un sustrato más permisivo para el crecimiento de axones.

El modelo de contusión de rata de SCI es un modelo clínicamente relevante y se puede usar para evaluar la eficacia de las proteínas de fusión y otras composiciones de la presente invención para promover la regeneración de axones. Con una SCI de contusión, las células se destruyen, se produce una hemorragia y comienza la inflamación. Las células destruidas son eliminadas por los macrófagos y comienza una gliosis reactiva. Se forma una cavidad quística y la gliosis madura y se convierte en una cicatriz glial. La mielina en el área se destruye y muchas neuronas locales que no se destruyen quedan en un estado desmielinizado.

El modelo de compresión con fórceps de SCI es un modelo de contusión desarrollado y caracterizado. Este modelo ha sido validado y da como resultado lesiones muy similares a los modelos impactadores usados más ampliamente. El modelo puede implicar una compresión con fórceps a nivel vertebral T9/T10. Los fórceps comprimen el cordón a un ancho de 0.9, 1.3 o 1.7 mm durante 15 segundos. Estos tres niveles de compresión permiten una lesión grave, leve o moderada. Este modelo ha sido validado usando la prueba locomotora de campo abierto y el sistema de puntuación de Basso, Bresnahan y Beattie (BBB). También se caracterizó histológicamente. Las pruebas de comportamiento y la puntuación BBB demostraron que los fórceps producen una lesión altamente reproducible, con una recuperación similar a la observada con los modelos impactadores. Estos datos de prueba y puntuación demuestran que el modelo de compresión de fórceps es comparable a otros modelos de contusión y suficientemente reproducible para usarse como un modelo experimental de SCI y se puede usar para la evaluación de composiciones de la presente divulgación.

El tejido de animales lesionados por compresión con fórceps se puede procesar histológicamente para examinar la formación de quistes, cicatrices gliales y conservación de materia blanca. Al igual que con otros modelos de SCI por contusión, se forma un quiste central después de la lesión, con un tamaño que aumenta con el aumento de la gravedad de la lesión (disminución de la brecha del fórceps). Alrededor del quiste se forma una cicatriz glial que se caracteriza por astrogliosis (GFAP), activación de macrófagos y pérdida de mielina.

Se ilustrarán diversos aspectos de la presente divulgación con referencia a los siguientes ejemplos no limitantes.

Ejemplo 1

Este ejemplo ilustra cómo se puede administrar, estudiar y demostrar que una molécula degradadora de proteoglicanos muestra una mejora funcional en animales que tienen una lesión por contusión modelo.

El modelo de compresión con fórceps de SCI es un modelo de contusión desarrollado y caracterizado. Este modelo ha sido validado y da como resultado lesiones muy similares a los modelos impactadores usados más ampliamente. El modelo puede implicar una compresión con fórceps a nivel vertebral T9/T10. Los fórceps comprimen el cordón a un ancho de 0.9, 1.3 o 1.7 mm durante 15 segundos. Estos tres niveles de compresión permiten una lesión grave, leve o moderada.

Las ratas se lesionaron con el modelo de compresión de fórceps en las vértebras T9/T10/En el momento de la cirugía se colocó un catéter intratecal para la administración de condroitinasa. Los animales se trataron todos los días durante una semana y luego en días alternos durante una semana con 0.06 U/dosis de condroitinasa ABC I (Seikagaku), penicilinasa o líquido cefalorraquídeo artificial (aCSF). Las dosis y los controles se obtuvieron de Bradbury et al., 2002. El comportamiento se evaluó usando pruebas locomotoras en campo abierto y el sistema de puntuación BBB en el día 2 y luego semanalmente después de la lesión durante diez semanas.

La figura 5A que se muestran son puntuaciones BBB medias para animales tratados con condroitinasa ABC I, penicilinasa y aCSF. Las ratas tratadas con aCSF o penicilinasa se recuperaron hasta una puntuación BBB media de aproximadamente 4. Las ratas tratadas con condroitinasa se recuperaron hasta una puntuación BBB media de aproximadamente 8. Múltiples animales se recuperaron hasta puntuaciones superiores a 10, lo que indica una entrada supraespinal. Las puntuaciones de condroitinasa fueron significativamente diferentes de ambos grupos de control por ANOVA y Tukey post hoc.

El tejido de estos animales se procesó inmunohistoquímicamente para la proteína ácida fibrilar glial (GFAP) para evaluar la arquitectura general de la cicatriz. El tejido también se tiñó con una tinción de Weil y una tinción de degeneración de plata para evaluar la mielina y la degeneración de neuronas, respectivamente. Curiosamente, no se observaron diferencias obvias en estos parámetros entre los tejidos tratados experimentales y de control.

En la figura 5B la gran lesión que comprende varios segmentos y la preservación en el cordón ventral. La tinción de Weil reveló una desmielinización extensa tanto en los animales tratados como en los no tratados. Las imágenes GFAP (conjunto medio) demuestran la extensión de la cicatriz que se forma después de una lesión con fórceps. La mancha de degeneración de plata amino cúprica inferior demuestra la vasta degeneración neural que se extiende tanto rostral como caudalmente después de la lesión. De nuevo, no se observaron diferencias obvias entre los tejidos tratados con condroitinasa y los de control.

Se han realizado experimentos preliminares adicionales a niveles de lesión moderados y se observó una mejora significativa en la actividad locomotora en campo abierto con el tratamiento con condroitinasa. Los animales que recibieron condroitinasa ABCI se recuperaron hasta una puntuación BBB media de 9.1 a diez semanas después de la lesión, en comparación con 7.1 para los controles con penicilinasa. La consistencia de los datos (SEM de 0.6 y 0.3, respectivamente) y la región de puntajes en la escala BBB hacen que este cambio de 2 puntos no solo sea estadísticamente significativo, sino también clínicamente significativo. Una puntuación de 9 indica colocación plantar con soporte de peso o soporte de peso frecuente o constante con etapa dorsal, mientras que una puntuación de 7 indica movimiento de cada articulación en la extremidad trasera pero sin soporte de peso y sin barrido constante de las extremidades. Un examen de las puntuaciones de los animales individuales a las diez semanas muestra que 6 de 12 animales en el grupo de condroitinasa se recuperaron a puntuaciones de 9 o más, mientras que solo uno de 12 animales en el grupo de penicilinasa se recuperó a una puntuación de 9. Un animal de cada grupo se eliminó del análisis porque su puntuación nunca llegó a superar los 2.5, lo que indica una gravedad de la lesión fuera de las normas del modelo. La figura 5C y la figura 5D incluye un gráfico de dispersión de puntuaciones a las 10 semanas para cada animal en los grupos de tratamiento con penicilinasa y condroitinasa para la lesión moderada. Las medias de grupo se muestran a continuación.

Los resultados muestran en este estudio bien controlado, que la condroitinasa mejora la función locomotora de campo abierto en ratas que se lesionaron con el modelo de compresión de fórceps en T9/T10 vertebral. Los animales se recuperaron con puntuaciones BBB medias de 9.7 y 9.9 para los grupos de penicilinasa y condroitinasa, respectivamente. Este estudio demuestra un efecto significativo en niveles de lesiones graves y moderadas, pero no en niveles de lesiones leves. No se observaron diferencias significativas entre los grupos en el estudio de lesiones leves (fórceps de 1.3 mm). No está claro si la condroitinasa no es eficaz con una lesión leve, si la condroitinasa efectuó cambios que no fueron evaluados adecuadamente por las pruebas locomotoras de campo abierto, tales como la longitud de la zancada, la ubicación de las patas, las funciones sensoriales o autonómicas. El análisis preliminar de la histología de los animales en este estudio confirmó la colocación de los catéteres y las lesiones en cada animal. Los experimentos en curso que sacrifican animales en puntos de tiempo después de la lesión con y sin tratamiento con condroitinasa caracterizarán el contenido de CSPG de la cicatriz y los efectos de la digestión con condroitinasa sobre la expresión del antígeno stub. Los experimentos futuros ampliarán la batería de pruebas de comportamiento y examinarán el cordón en busca de evidencia de regeneración con el rastreo del tracto.

Se realizaron dos estudios de toxicidad aguda en ratas. El primero fue un estudio intravenoso (IV) en el que se inyectaron a las ratas 0, 0.2, 0.775 o 7.775 mg/kg de condroitinasa a Bc I. En el segundo estudio, se colocaron catéteres intratecales (IT) sobre la médula espinal usando los mismos métodos empleados en los estudios de SCI en animales y se administraron 0.06, 0.6 y 6.0 unidades de condroitinasa ABCI a través de los catéteres IT. Estas dosis fueron 1, 10 y 100 veces mayores que las concentraciones locales estimadas de condroitinasa ABCI logradas con catéteres IT en los experimentos SCI. Se controlaron el dolor y la angustia de los animales y se adquirieron diariamente los pesos corporales. No se observaron reacciones manifiestas durante o inmediatamente después de la dosificación de condroitinasa ABCI. No se observó hinchazón, inflamación, hematomas o necrosis en el lugar de la inyección para el experimento intravenoso. No se observaron cambios en la temperatura corporal en los animales tratados por vía IT. No se observaron alteraciones en la alimentación, el aseo o las vocalizaciones. Se evaluó el comportamiento motor de los animales en una piscina abierta. El personal de cuidado animal o los especialistas en comportamiento no notaron anomalías. Los animales no mostraron signos de dolor o hinchazón de las articulaciones. No hubo diferencias significativas en el cambio de peso entre los grupos de tratamiento. Los resultados demuestran que el tratamiento con condroitinasa ABCI no está asociado con toxicidad aguda usando dosis IV e IT sustancialmente mayores que las dosis IT eficaces.

Ejemplo 2

Este ejemplo describe la preparación del agonista del receptor de Nogo, la proteína de adhesión de células neurales L1 y los dominios de polipéptidos GGF2 que se pueden usar para las composiciones y proteínas de fusión de la presente divulgación.

Se seleccionó una porción soluble del receptor Nogo humano que abarca los aminoácidos 27 a 311 (NgR²⁷-³¹¹) ya que se ha demostrado que inhibe la unión de Nogo66, MAG y MOG a NgR unido a la membrana. Se diseñaron cebadores flanqueando esta región y se realizó RT-PCR usando ARN del hipocampo humano (BD Biosciences). La región de 1.05 kb se amplificó y purificó con éxito.

Se preparó L1 a través de una línea celular CHO del laboratorio de la Dra. Melitta Schachner que secreta L1 humana como una proteína de fusión con Fc humana (L1-Fc). Las células se cultivaron en botellas rotativas y luego se purificó L1-Fc del medio acondicionado usando cromatografía en columna de afinidad de proteína A. La pureza de L1-Fc se evaluó mediante SDS-PAGE y se observó una única banda al peso molecular apropiado. La actividad biológica de L1-Fc se confirmó usando un ensayo de crecimiento de neuritas. Las placas de cultivo de tejidos se recubrieron con ya sea poli L-lisina o L1-Fc y luego se aislaron células granulares cerebelares de ratas del día 10 postnatal y se colocaron en cultivo sobre los sustratos. Se observó que las neuronas colocadas sobre el sustrato L1-Fc exhibieron un número sustancial de neuritis prolongada en comparación con los controles del sustrato de polilisina. Estos resultados demuestran que la L1-Fc producida es biológicamente activa en la promoción del crecimiento de neuritas. Este ensayo de crecimiento de neuritas se usará para evaluar la actividad biológica relacionada con la porción L1 de la proteína de fusión condroitinasa ABCI.

Se obtuvo de CeNes una línea celular CHO que secreta una forma soluble de glicoproteína GGF2 de longitud completa. Se completó una amplia optimización de los medios y métodos de purificación para obtener GGF2 esencialmente pura y biológicamente activa. Se desarrollaron un número de métodos analíticos para caracterizar la GGF2, incluidos SDS-PAGE, enfoque isoeléctrico, mapeo de péptidos y análisis de carbohidratos. Por ejemplo, un gel SDS-PAGE de GGF2 reducido y no reducido; el aislado está esencialmente libre de proteínas contaminantes y muestra el peso molecular y la estructura monomérica esperados. La actividad biológica de GGF2 se ensayó usando un método de proliferación de células de Schwann de rata primaria y el efecto esperado se obtuvo de forma reproducible con cuatro lotes independientes de GGF2. Se desarrolló otro ensayo funcional que mide la fosforilación de la quinasa Akt, un componente de señalización celular aguas abajo de la vía del receptor erbB. Se observó que existe una fosforilación dependiente de la dosis de la quinasa Akt.

Ejemplo 3

Este ejemplo ilustra la manipulación de condroitinasa ABCI para la construcción de quimeras.

La condroitinasa ABCI se clonó a partir de P. vulgans y se expresó en E. coli. Sorprendentemente, los intentos repetidos para crear proteínas de fusión N-terminal no tuvieron éxito porque la porción de fusión N-Terminal se escindió de la condroitinasa ABCI durante la síntesis. Sin embargo, se prepararon mutantes de deleción catalíticamente activos con etiquetas de fusión de His N-terminal denominadas ABC INA2O, ABC INA4O y ABCI-NA6O por deleción de 20, 40 y 60 aminoácidos respectivamente del extremo N de la proteína ABCI madura. A diferencia de la condroitinasa ABCI de longitud completa, los mutantes de deleción N-terminal son capaces de sintetizar una etiqueta 6xHis como una proteína de fusión N-terminal. También se observó que la deleción de 80 aminoácidos del extremo C-terminal formaba un mutante con actividad de degradación de proteoglicanos de condroitinasa ABCI como se probó en un ensayo de zimografía.

Las proteínas de fusión con NgR^27-311 o L1 con una molécula de degradación de proteoglicanos tales como la condroitinasa ABCI usarán la expresión de mamíferos y se pueden realizar en células CHO. El ADNc de la condroitinasa ABCI se ha clonado en el vector pSECTag (Invitrogen) en el marco de lectura apropiado. Se puede desarrollar una línea celular CHO que tiene condroitinasa ABCI secretora y se puede ensayar la actividad catalítica del medio acondicionado mediante un ensayo de zimografía para confirmar que la condroitinasa ABCI expresada en células de mamífero es funcional. Se puede sintetizar una versión optimizada por codones de células de mamífero de condroitinasa ABCI mediante métodos conocidos en la técnica para su uso en la expresión de células CHO.

GGF2 es una variante empalmada del gen NRG1 expresado en el cerebro y la médula espinal de humanos adultos. Es una proteína glicosilada de masa molecular entre 66-90 kDa. Los inventores han descubierto que la GGF2 recombinante expresado en células CHO está altamente glicosilado y promueve la proliferación de células de Schwann in vitro y además que un dominio similar a EGF de NRG1 expresado en E. coli es completamente funcional para promover la proliferación y supervivencia de miocitos.

Los inventores han expresado fragmentos de GGF2 en E. coli como se describe en la sección de datos preliminares. Se puede determinar el dominio GGF2 específico responsable de la proliferación de células de Schwann y, de este modo, de la remielinización. Si los dominios de Ig y EGF juntos o por separado muestran actividad biológica in vitro, entonces se pueden usar para formar proteínas de fusión quiméricas.

Clonación y expresión de NgR^27-311 en células CHO. Se aisló un fragmento NgR correspondiente a los residuos 1-359 mediante RT-PCR de ARN poli K de hipocampo humano (BD Biosciences) y su estructura puede confirmarse mediante secuenciación de ADN. El fragmento de gen correspondiente a los residuos 27-311 se puede clonar a partir del fragmento más grande y luego subclonarse en el vector pSECTag (Invitrogen) en el marco de lectura apropiado para expresar el fragmento como proteína secretora en células CHO. El ADN plasmídico que contiene el gen NgR^27-311 se puede transfectar en células CHO y la línea celular que produce NgR^27-311 se puede seleccionar bajo la presión de selección de higromicina B. Se puede construir un plásmido de expresión de quimera NgR²⁷-³¹¹-ABCI para la expresión en un sistema de expresión de células CHO usando métodos conocidos en la técnica

Ejemplo 4

Este ejemplo ilustra métodos que se pueden usar para purificar y aislar la condroitinasa ABCI expresada y los dominios GGF2 expresados en E. coli. Este método se puede aplicar a la purificación de proteínas de fusión quiméricas de la presente divulgación.

Los inventores han desarrollado un sistema de expresión recombinante de E. coli eficaz y un procedimiento de purificación para condroitinasa ABCI que podrían aplicarse para la purificación de derivados quiméricos de condroitinasa ABCI.

Por ejemplo, la expresión de varios dominios GGF2 en el huésped de expresión de condroitinasa ABCI, E. Coli. se ha preformado y se han probado los siguientes péptidos: aa250-402, aa250-422 y aa350-402. Estos péptidos expresados se encontraron en la fracción soluble de los lisados de E. coli. Es razonable esperar que los productos quiméricos finales de estos péptidos con condroitinasa ABCI en E. coli también sean solubles. Además, se espera que las características de carga de los productos quiméricos en comparación con la condroitinasa ABCI recombinante sean similares. De este modo, los valores teóricos del punto isoeléctrico (p1) para los péptidos GGF2 son 9.3 para aa250-402, 9.18 para aa250-422 y 7.55 para aa350-402. Se espera que la fusión de los dos primeros péptidos con condroitinasa ABCI dé como resultado proteínas quiméricas con valores de p1 todavía por encima de 9. En este caso, se espera que la cromatografía SP funcione bien como etapa de captura. El péptido GGF2 más pequeño, aa 350-402, reducirá el p1 de la quimera condroitinasa ABCI final a aproximadamente 8.4. Este cambio puede requerir la optimización de las condiciones de la etapa de captura.

Los productos quiméricos de condroitinasa ABCI con péptidos NgR^27-311 y L1 se pueden expresar en un sistema de células CHO. Antes de la purificación de las proteínas quiméricas expresadas, las condiciones de crecimiento para la línea celular que produce las proteínas quiméricas NgR^27-311 o L1 se optimizarán en medio libre de suero. Se puede realizar un estudio detallado de optimización de medios para determinar las condiciones de producción más altas. El volumen de escalado se puede decidir en base a la tasa de producción de las proteínas quiméricas (pg/célula/día). Los medios acondicionados de las diversas líneas celulares productoras de quimeras se pueden recolectar y someter a filtración de flujo tangencial.

La cromatografía de intercambio iónico se puede usar para capturar las proteínas secretadas de los medios acondicionados, la cromatografía de filtración en gel se puede usar como una etapa de purificación de pulido y luego se puede usar la filtración con membrana de intercambio aniónico para la eliminación de endotoxinas y ADN. En cada etapa, la eficacia de la purificación se analizará mediante SDS-PAGE y cuantificación espectrofotométrica de la concentración de proteína.

Ejemplo 5

Este ejemplo profético describe la evaluación in vitro de la actividad biológica de la quimera: cada quimera se puede ensayar para determinar la actividad enzimática de la condroitinasa y la actividad biológica específica de cada socio de fusión.

La primera etapa en el análisis puede emplear metodologías bioquímicas de proteínas convencionales para confirmar la fidelidad de la expresión génica. Estos incluyen SDSPAGE, lEE, espectrometría de masas y cromatografía de exclusión por tamaño.

La actividad específica de la quimera condroitinasa se puede determinar usando un ensayo espectrofotométrico estándar y aceptado uniformemente. La producción de productos de reacción a partir de la actividad catalítica de un polipéptido quimérico de condroitinasa se puede determinar midiendo la absorbancia del producto a una longitud de onda de 232 nm. Una mezcla de reacción típica consta de 120 microlitros de mezcla de reacción (Tris 40 mM, pH 8.0, acetato de Na 40 mM, caseína al 0.002 %) combinada con sustrato (5 microlitros de condroitina C 50 mM) y 1.5 microlitros de polipéptido de fusión quimérico de condroitinasa ABCI o muestra de prueba. El cambio en las unidades de absorbancia es la tasa inicial que se puede convertir en una unidad de medida de actividad.

Ensayo de HPLC de disacárido: se espera que la actividad catalítica del polipéptido quimérico de condroitinasa en un sustrato de CSPG libere dos especies de disacáridos sulfatados que incluyen a-AAUA- [1 ^ 3]-GaINAc-4S (A4DS) y a-AAUA-L1 ^ 3]-GaINAc-6S (a-A6DS). Estas especies se pueden resolver mediante HPLC y la cuantificación de los cromatogramas resultantes es una medida sensible y precisa de la actividad de la condroitinasa. Para realizar el ensayo, las muestras de reacciones de digestión de condroitinasa llevadas a cabo con condroitinasa de tipo salvaje y proteínas de fusión de condroitinasa se pueden clarificar por centrifugación y luego se pueden someter a un método de HPLC de intercambio aniónico validado como sigue. Se puede usar una columna analítica Dionex CarboPac PA-10 (4 x 250 mm) equipada con una columna de protección Dionex CarboPac PA-10 (4x 50 mm) con una fase móvil que consta de un gradiente de agua a pH 3.5 (solución reguladora A) y NaCl 2M, a pH 3.5 (solución reguladora B). La detección se puede establecer en una longitud de onda de 232 nm. Una tasa de flujo de 1 mL/minuto y un gradiente continuo de 45 minutos de 100 % A 100 % B proporciona una resolución aceptable de A4DS y A6DS. Se pueden generar curvas estándar usando cantidades conocidas de A4DS y A6DS.

La zimografía permite la resolución de proteínas por peso molecular con una evaluación concomitante de la actividad condroitinasa. Se puede polimerizar un gel de poliacrilamida al 10 % en presencia de 85 pg/ml de agrecano. Las muestras se pueden hervir en una solución reguladora de carga de SDS y luego los analitos se pueden resolver mediante electroforesis. Después de la separación, el gel se puede incubar durante 1 hora a temperatura ambiente en Triton X100 al 2.5 % y luego durante 16 horas a 37 °C en Triton X-100 nuevo al 2.5 %. Durante estas incubaciones, el SOS se puede extraer del gel y la condroitinasa se pliega y digiere el agrecano en sus inmediaciones. Después del procedimiento de replegamiento, el gel se puede teñir en busca de carbohidratos: El gel se puede incubar primero en cetilpiridinio al 0.2 % durante 90 minutos a temperatura ambiente y luego se puede transferir a azul de toludina al 0.2 % en 49:50:1 H2O, etanol y ácido acético 30 minutos. A continuación, el gel se puede desteñir completamente. Después de la decoloración, el gel se puede incubar durante la noche en una solución de 50 microgramos/ml de Stains-All (Sigma) en etanol al 50 %. La actividad de la condroitinasa se puede detectar como una mancha clara en el gel que coincide con el peso molecular de la enzima. Se ha demostrado que el tamaño del claro guarda una relación casi lineal con la actividad de la unidad.

La quimera NgR^27-311-condroitinasa se puede evaluar para determinar la actividad del receptor señuelo Nogo. El ensayo se puede usar para medir el colapso de los conos de crecimiento: los ganglios de la raíz dorsal (DRG) se disecan de las crías de rata Sprague Dawley del día 1 postnatal (PI) y se disocian en 200 U/ml de colagenasa I (Worthington) y 2.5 U/ml de dispasa. (Boehringer/Roche) 2 veces durante 30 min. a 37 °C. Se eliminan las enzimas y se puede agregar ADNasa (0.5 mg/ml) a los ganglios. La trituración se puede hacer con una punta de pipeta unida a un Pipetman de 1000 |il. La suspensión celular resultante se puede filtrar a través de un filtro celular de 40 micrómetros y centrifugar a 70xg durante 5 min. Las células se pueden volver a suspender en DMEM/FBS al 10 % y se pueden sembrar previamente durante 2 horas en una placa de cultivo de tejidos sin recubrimiento (100 mm de diámetro). Las neuronas no adherentes se extraen y se siembran en placas a 10,000 células/pocillo en una placa de 24 pocilios recubierta con Polilisina/laminina en Neurobasal/B27 libre de suero con 50 ng/ml de NGF. Después de 20 a 24 horas, se puede agregar MAG o Nogo66 en concentraciones variables durante 1 hora a 37 °C para inducir el colapso del cono de crecimiento. La quimera NgR^27-311-condroitinasa se puede agregar en diversas concentraciones para competir con MAG y Nogo66 y de este modo proteger a las neuronas del colapso del cono de crecimiento. Los cultivos se pueden fijar agregando un volumen igual de paraformaldehído al 8 %/sacarosa 0,6 M precalentado al medio durante 20 min., mientras que las células se mantienen en una placa caliente a 37 °C. Los conos de crecimiento se pueden marcar con faloidina AlexaS68 (Molecular Probes). En resumen, las células se pueden permeabilizar con Triton-X 100 al 0,1 % durante 5 min. a RT, bloqueado durante 20 min. en BSA al 1 % en PBS y se incubó en faloidina, diluida 1:40 en BSA al 1 %, en PBS durante 20 min. a RT. Las células se pueden lavar en PBS y montar en medio de montaje fluorescente (DAKO). El porcentaje de conos de crecimiento colapsados se determina analizando un mínimo de 100 conos de crecimiento por pocillo con un objetivo de 40x.

La actividad biológica de las proteínas de fusión de L1 se puede determinar usando un ensayo estandarizado de crecimiento de neuritas. Después de grabar un círculo de 25 mm en el centro de una placa de 35 mm tratada con cultivo de tejidos, se puede agregar 1 ml de 10 |ig/ml de poli-lisina a cada círculo grabado e incubar a 37 °C, durante 60 minutos. La polilisina proporciona un control negativo para el crecimiento de neuritas. Los círculos grabados se pueden lavar 2 veces con la solución salina balanceada de Hank más calcio y magnesio (HBSS++) después del último enjuague; se colocan 1.2 |il de L1-Fc (0.6 uM, 0.3 |iM, 0.15 |iM, 0.075 |iM) en las placas de Petri para que sirvan como control positivo y se pueden aplicar diversas concentraciones de la proteína de fusión L1-condroitinasa a las placas como muestras de prueba. Las placas se pueden incubar durante 1 hora a temperatura ambiente. Las manchas se aspiran ligeramente, para no secarlas, e inmediatamente se lavan 2 veces con 1 ml de HBSS + y luego se agrega 1 ml de BSA al 1 % en PBS a cada círculo grabado. Después de aproximadamente 15 minutos a temperatura ambiente, los círculos grabados se pueden lavar 2 veces con HBSS++ y una vez con medio de bioensayo (NeuralBasal (Gibco) suplementos de B27 (Gibco) L-glutamina ácido L-glutámico, penicilina y estreptomicina (100 U/ml) 1 % de suero fetal bovino que permanecerá en las placas de Petri hasta el momento del ensayo. Para proporcionar neuronas a la placa sobre los sustratos se recolectan células granulares cerebelosas del día postnatal (PND) 9 o 10. Se extrae el cerebro del cráneo de 1 cría, y el cerebelo se separa del resto del tejido. Se extraen las meninges y el cerebelo se coloca en HBSS + helado. El tejido se pica y se tripsiniza con tripsina al 0.25 % durante 15 minutos a 37 °C. La acción de la tripsina se inhibe añadiendo 0.5 mg/ml de inhibidor de tripsina de soja (Gibco). El tejido se enjuaga con HBSS++ y se tritura usando una pipeta Pasteur estrechada con llama recubierta con EBS. Las células disociadas se sedimentan a 500xg durante 3 minutos, el sobrenadante se decanta y las células se resuspenden en 2 ml de medio de cultivo. Después de triturar ligeramente, la suspensión celular se coloca cuidadosamente en capas sobre un cojín de BSA al 3.5 % (en PBS) y se centrifuga a 500xg durante 3 minutos. Se aspira el sobrenadante y se resuspende las pellas en 2 ml de medio de cultivo. Se realiza un recuento de células y las células se diluyen hasta una concentración de trabajo final de 1.5x105 células/ml. Se agrega una alícuota de 300 |il de células diluidas al centro de cada placa, lo que da como resultado una distribución uniforme de 6 x 104 células en toda la superficie del círculo grabado. Las células se dejan crecer durante 16 horas a 37 °C en un ambiente humidificado suplementado con CO² al 5 %. Al día siguiente, las placas se retiran de la incubadora a 37 °C, las células se fijan con paraformaldehído al 4 % y se registra el crecimiento de neuritas mediante fotomicroscopía.

Se pueden realizar ensayos de actividad biológica para GGF2 usando proliferación de células de Schwann. Se disecan los nervios ciáticos de crías de rata Sprague Dawley de tres días y se disocian en medio L-15 (Invitrogen) que contiene tripsina al 0.25 % y colagenasa de tipo I al 0.03 % (SIGMA) durante 15 minutos a 37 °C. Los nervios se centrifugan a 400 xg durante 5 minutos y el medio de disociación se reemplaza por DMEM/FBS al 10 %. Los nervios se trituran usando una jeringa de 10 ml con una aguja de 21 g y posteriormente una aguja de 23 g. La suspensión celular se filtra a través de una malla de 40 |im colocada sobre la abertura de un tubo cónico de 50 ml. Las células se pueden centrifugar a 400xg durante 5 min, se pueden sembrar en un matraz T-75 recubierto de poli-D-Iisina (PDL) a una densidad de aproximadamente 5 millones de células en 15 ml de DMEM/FBS al 10 %/PenStrep y se incuba a una incubadora a 37 °C regulada con 10 % de CO². Después de una incubación de 24 horas, las células se pueden lavar dos veces con DMEM/FBS al 10 % y volver a alimentar con medio de inhibición de fibroblastos que consiste en DMEM/FBS al 10 % y 10 |il/ml de arabinósido de citosina 1 mM (Ara-C). Después de un tiempo de incubación de 2 a 3 días, el medio de inhibición de fibroblastos se reemplaza por medio de crecimiento de células de Schwann (DMEM/FBS al 10 %/150 ng/ml de GGF2/forskolina 5 |iM). Las células se pueden expandir y se congelan alícuotas de 2 x 106 células/ml en DMEM/DMSO al 10 %, FBS al 54 % en nitrógeno líquido. En el momento de su uso, las células de Schwann se descongelan y se siembran en placas a una densidad de aproximadamente 16,000 células/pocillo en una placa de cultivo tisular de 96 pocillos recubierta con PDL en DMEM/FBS al 5 %. Después de aproximadamente 24 horas, se agrega GGF2 en diluciones seriadas que varían desde 100 ng/ml a 0.78 ng/ml que contienen forskolina 5 |iM para establecer una curva estándar. También se pueden agregar muestras de proteínas de fusión GGF2 en diluciones en serie junto con forskolina 5 |iM. Se agrega BrdU a 10 |iM. Las células se incuban durante 48 horas en una incubadora de CO2 al 10 %. Se puede usar un kit de ELISA BrdU de Roche Applied Science (No. de cat. 1647229) para detectar la proliferación de células de Schwann. Se vierte el medio de la placa y la placa se golpea ligeramente sobre papel de seda. Se agrega una alícuota de 200 ^l/pocillo de Fix/Denat y se incuba durante 30 min a 15-25 °C. Se puede agregar una alícuota de 100 ^l/pocillo de solución de trabajo anti-BrdU-POD (el anticuerpo liofilizado se disuelve en 1.1 ml de agua bidestilada y se diluye 1:100 con una solución de dilución de anticuerpo) e incubar durante 90 min a temperatura ambiente. Los pocillos se pueden lavar 3 veces con 200-300 ^l/pocillo de solución de lavado. Se agrega una alícuota de 100 |il de solución de sustrato y se incuba durante 15 minutos o hasta que el desarrollo de color sea suficiente para la detección fotométrica. Las placas se leen en un lector de placas SpectraMax a 450 nm ya sea antes de la adición de la solución de parada a 370 nm o después de la adición de 50 ml de ácido sulfúrico 1N a cada pocillo.

ELISA de Akt [pS473]: Se cultivan células de glioma C6, obtenidas de ATCC, en DMEM/FBS al 10 % en un matraz T-75 hasta la confluencia. Después de la tripsinización, las células se siembran en una placa de 24 pocillos a una densidad de 500,000 células/pocillo en 0.5 ml de medio. Un día después de la siembra en placa, las células se tratan con GGF2 (lote: Glu de Lonza Biologics) en diluciones en serie que varían desde 0.78 a 100 ng/ml durante 30 minutos a 37 °C para establecer una curva estándar. Como control negativo, se agrega wortmanina, un inhibidor de la PI3-quinasa, a las células a 10 nnM durante 30 minutos antes de la adición de GGF2. También se agregarán muestras de proteínas de fusión GGF2 en diluciones seriadas. Las células se lavan con PBS y luego se extraen con 100 |il de solución reguladora de extracción celular (Tris 10 mM, pH 7.4, NaCl 100 mM, EDTA 1 mM, EGTA 1 mM, NaF 1 mM, Na⁴P²Oy 20 mM, NaaVO⁴2 mM, Triton X-100 al 1 %, glicerol al 10 %, SDS al 0.1 %, desoxicolato al 0.5 %, PMSF 1 mM, cóctel inhibidor de proteasa (Pierce)). Los extractos celulares se mantienen a -80 °C hasta su uso posterior. Se puede usar un kit ELISA de Biosource (Cat. # KHOO1 II) para medir los niveles de quinasa Akt fosforilada. Brevemente, se cargan 100 |il de una dilución 1:50 de muestras y una dilución en serie de estándares de Akt [pS473] en pocillos recubiertos previamente con anticuerpo anti-Akt durante 2 h a temperatura ambiente (RT) o durante la noche a 4 °C. Se lavan los pocillos y se agrega el anticuerpo anti-Akt [pS473] y se incuban durante 1 hora. Después del lavado, se agrega a los pocillos antisuero anticonejo conjugado con HRp y se incuba durante 30 min. Después del lavado, se agrega cromógeno TMB a los pocillos y se incuba durante 30 min a Rt antes de detener la reacción con la solución de parada. La placa se lee en un lector de placas SpectraMax a 450 nm. Las densidades ópticas se representan frente a los estándares de Akt [pS473] y la concentración de pAkt en las muestras C6 se deduce de la curva estándar.

Ejemplo 6

Este ejemplo ilustra la construcción de una proteína de fusión del polipéptido condroitinasa y un péptido de transducción celular TAT.

La secuencia génica que codifica una enzima condroitinasa se puede unir funcionalmente al dominio de transducción de proteínas del VIH denominado péptido TAT. La construcción de ADN de fusión de genes quiméricos TAT-condroitinasa ABCI resultante se muestra en la figura 1. Se observó que durante la expresión bacteriana de esta construcción, el péptido TAT se eliminó de la enzima condroitinasa en algún punto de procesamiento durante el crecimiento bacteriano. También se observó la eliminación de péptidos unidos en el N-terminal n durante la expresión de una enzima ABCI de condroitinasa etiquetada con histidina en el N-terminal.

Se generaron mutantes de deleción de la enzima condroitinasa ABCI donde al mutante le faltaba un cierto número de aminoácidos de la porción N-terminal del polipéptido pero mantenía su actividad de degradación de proteoglicanos. Se observó que estas deleciones N-terminal mantenían una etiqueta de histidina que estaba unida al extremo N. Se espera que diversas construcciones de ADN de fusión de condroitinasa ABCI mutante con deleción de TAT se puedan expresar sin eliminar el polipéptido TAT durante la expresión. Por ejemplo, el péptido TAT se puede fusionar en el extremo N de mutantes de deleción como mutante de deleción ABCI-NA20 o ABCI-NA60. Sin desear limitarse a ninguna teoría, los inventores creen que la enzima degradante de proteoglicanos nativa contiene una secuencia señal que está unida al extremo N. Esta secuencia señal se elimina durante la producción natural en bacterias y en la producción de la enzima clonada en E. coli. Se cree que alguna señal dentro de los aminoácidos N-terminales indica a las bacterias que eliminen cualquier cosa adherida a este extremo.

Se puede preparar una construcción de ADN con el péptido TAT unido al extremo N de uno de los mutantes de deleción de condroitinasa y transferencia de Western y gel de proteína que muestre esta proteína y actividad expresadas.

Ejemplo 7

Este ejemplo ilustra la difusión de moléculas en células y tejidos usando una composición que degrada proteoglicanos.

Se extrajo del cráneo un cerebro de una rata Sprague Dawley adulta y se dividió en cuartos en las secciones frontal derecha, frontal izquierda, posterior derecha y posterior izquierda, correspondientes aproximadamente a los lóbulos frontal (frontal) y occipito-parietal (posterior). (A) El cuarto frontal derecho se colocó en líquido cefalorraquídeo artificial (catálogo No. 59-7316; aparato de Harvard, Holliston, MA) que contenía la enzima beta-galactosidasa (catálogo No., G 5160; Sigma, St. Louis, MO) y condroitinasa ABC I a 0.5 U/ml (catálogo No. C 3667; Sigma, St. Louis, m O) durante 2 horas a 37 °C. El cuarto de cerebro se enjuagó varias veces en solución salina regulada con fosfato (PBS) y luego se procesó con un kit de tinción Beta-Gal (Catálogo No. Gal-S; Sigma, St. Louis, MO). Se dejó que se desarrollara la reacción sustrato-enzima (producto azul) durante 1 hora, y se enjuagó el cerebro varias veces en p Bs y se cortaron losas del centro de cada bloque de cerebro usando navajas de afeitar rectas paralelas. (B) El cuarto frontal izquierdo se colocó en líquido cefalorraquídeo artificial (catálogo No. 59-7316; aparato de Harvard, Holliston, MA) que contenía la enzima beta-galactosidasa (catálogo No., G 5160; Sigma, St. Louis, MO) durante 2 horas a 37 °C. El cuarto de cerebro se enjuagó varias veces en solución salina regulada con fosfato (PBS) y luego se procesó con un kit de tinción Beta-Gal (Catálogo No. Gal-S; Sigma, St. Louis, MO). Se dejó que se desarrollara la reacción sustrato-enzima (producto azul) durante 1 hora, y se enjuagó el cerebro varias veces en PBS y se cortaron losas del centro de cada bloque de cerebro usando navajas de afeitar rectas paralelas. (C) El cuarto frontal derecho se colocó en líquido cefalorraquídeo artificial (Catálogo No. 59-7316; Aparato de Harvard, Holliston, MA) que contenía la enzima betagalactosidasa (Catálogo No., G 5160; Sigma, St. Louis, MO) y condroitinasa ABC I en 0.5 U/mi (Catálogo No. C 3667; Sigma, St. Louis, MO) durante 2 horas a 37 °C. El cuarto de cerebro se enjuagó varias veces en solución salina regulada con fosfato (PBS) y luego se procesó con un kit de tinción Beta-Gal (Catálogo No. Gal-S; Sigma, St. Louis, MO). Se dejó que se desarrollara la reacción sustrato-enzima (producto azul) durante 1 hora, y se enjuagó el cerebro varias veces en p Bs y se cortaron losas del centro de cada bloque de cerebro usando navajas de afeitar rectas paralelas. (D) El cuarto trasero izquierdo se colocó en líquido cefalorraquídeo artificial (catálogo No. 59­ 7316; aparato de Harvard, Holliston, MA) que contenía la enzima beta-galactosidasa (catálogo No., G 5160; Sigma, St. Louis, MO) durante 2 horas. a 37 °C. El cuarto de cerebro se enjuagó varias veces en solución salina regulada con fosfato (PBS) y luego se procesó con un kit de tinción Beta-Gal (Catálogo No. Gal-S; Sigma, St. Louis, MO). Se dejó que se desarrollara la reacción sustrato-enzima (producto azul) durante 1 hora, y se enjuagó el cerebro varias veces en PBS y se cortaron losas del centro de cada bloque de cerebro usando navajas de afeitar rectas paralelas. Las imágenes de cerebros se adquirieron en un escáner y se muestran en la figura 2 (I) (A-D).

Se remojaron hemisferios de cerebro de rata adulta en solución reguladora sola o que contenía 33 U/ml de condroitinasa ABCI (Acorda) durante 2 horas a 37 grados C. Se enjuagaron los hemisferios y se colocaron inmediatamente en eosina Y (Sigma) o una solución saturada de rojo Congo (Sigma) en etanol al 70 %. Se cortaron losas de tejido y se adquirieron imágenes en un escáner. Véase la figura 2 (II) Eosina y la figura 2 (III) Rojo Congo.

La solución saturada de rojo Congo en la figura 2 (III) demuestra una mayor penetración a través de la corteza de un hemisferio cerebral tratado con condroitinasa en comparación con el cerebro no tratado. El rojo Congo es un tinte con carga negativa de 697 kDA. En la figura 2 (II), la penetración de la eosina Y a través de la corteza de un hemisferio cerebral tratado con condroitinasa parece un poco más difusa, pero la penetración no parece ser más profunda en comparación con el cerebro no tratado. La eosina Y es ion híbrido, que tiene una carga negativa global al pH bajo al que se usó, y es de 692 kDa. Figura 2 (I) Se incubaron los lóbulos de rata adulta en beta-galactosidasa sola (B&D), o con la adición de condroitinasa ABCI (A, 0.5 U/ml o C, 0.005 U/ml).

Los resultados mostraron que el tejido tratado con condroitinasa afectaba la penetración de la beta-galactosidasa en el tejido del CNS. La condroitinasa tuvo efectos dramáticos sobre la tasa de penetración del tinte rojo Congo, pero aparentemente no la eosina.

Ejemplos

Este ejemplo ilustra un protocolo de ensayo de condroitinasa ABCI que se puede modificar para medir la actividad de proteínas de fusión mutante de deleción de condroitinasa ABCI o la actividad de otras proteínas de fusión de polipéptidos que degradan proteoglicanos de la presente invención.

La producción de productos de reacción a partir de la actividad catalítica de una molécula de degradación de proteoglicanos o proteína de fusión se determina midiendo la absorbancia del producto a una longitud de onda de 232 nm. Una mezcla de reacción típica consiste en 120 |il de mezcla de reacción (Tris 40 mM, pH 8.0, acetato de Na 40 mM, caseína al 0.002 %) combinada con un sustrato (5 |il de condroitina C 50 mM) y 1.5 |il de condroitinasa ABCI o una proteína de fusión de un mutante de deleción de condroitinasa ABCI-TAT. Referencia cABCI de Seikagaku: congelada a -20 °C en alícuotas de 5 ml, usar 1 ml por reacción, condroitina C 50 mM (MW 521) en agua: congelada a -20 °C en alícuotas de 100 ml. Se pueden preparar alícuotas de la mezcla de reacción de aproximadamente 120 |il a 37 °C, durante 3 min o más. Se usa una longitud de onda de 232 nm con el espectrómetro.

Conocer el coeficiente de extinción para el producto de reacción, medir el cambio en la absorbancia del producto de reacción a 232 nm leyendo a lo largo del tiempo tras la adición de una cantidad conocida de condroitinasa ABCI u otro polipéptido que degrada los proteoglicanos • proteínas de fusión al 120 |iI de mezcla de reacción con 0.002 % de caseína y sustrato de condroitina agregado, se puede determinar la actividad específica en (|imol/min/mg de la proteína de fusión que degrada el proteoglicano, Seikagaku condroitinasa ABCI tiene una actividad específica bajo estas condiciones de ensayo de aproximadamente 450 (|imol/min/mg.

En una realización, la presente divulgación proporciona una composición que comprende:

un ácido nucleico aislado que comprende una secuencia que codifica un polipéptido, comprendiendo dicho polipéptido al menos dos de un dominio de transducción de proteínas, un dominio de degradación de proteoglicanos o un dominio que promueve la regeneración neural.

Opcionalmente, el ácido nucleico codifica el dominio TAT del dominio de transducción de proteínas.

Opcionalmente, los dos dominios cualesquiera de dicho polipéptido están unidos entre sí por un dominio de polipéptido enlazante.

Opcionalmente, el ácido nucleico codifica un dominio de degradación de proteoglicanos que es un mutante de deleción de condroitinasa ABCI.

Opcionalmente, el dominio que promueve la regeneración neural es L1, una variante que es al menos 80 % de L1, o un mutante de deleción de LL. En una realización de la composición anterior, el dominio que promueve la regeneración neural es GGF2, una variante funcional que es al menos un 80 % de GGF2, o un mutante de deleción funcional de GGF2. En una realización de la composición anterior, el dominio que promueve la regeneración neural es NgR²⁷-³¹¹, una variante funcional que es al menos 80 % homóloga con NgR²r³¹¹, o un mutante de deleción funcional de NgR2r311.

Opcionalmente, la composición se expresa a partir de células modificadas genéticamente.

La composición se puede combinar con células del CNS.

En una realización adicional, la presente divulgación proporciona un polipéptido que comprende al menos dos de un dominio de transducción de proteínas, un dominio de degradación de proteoglicanos o un dominio que promueve la regeneración neural.

Opcionalmente, el dominio de transducción de proteínas es un dominio TAT.

Opcionalmente, dos dominios de dicho polipéptido se unen entre sí mediante un dominio de polipéptido enlazante. Opcionalmente, el dominio de degradación de proteoglicanos es un mutante de deleción de condroitinasa ABCI.

Opcionalmente, el dominio que promueve la regeneración neural es L1, una variante que es al menos 80 % de L1, o un mutante de deleción de L1. Alternativamente, el dominio que promueve la regeneración neural es GGF2, una variante funcional que es al menos el 80 % de GGF2, o un mutante de deleción funcional de GGF2. Opcionalmente, el dominio que promueve la regeneración neural es NgR²⁷-³¹¹, una variante funcional que es al menos 80 % homóloga con NgR²⁷-³¹¹, o un mutante de deleción funcional de NgR²⁷-³¹¹.

Opcionalmente, la composición tiene una condroitinasa.

La composición se puede combinar con un excipiente farmacéuticamente aceptable.

La composición se puede combinar con células del CNS.

En una realización adicional, la presente divulgación proporciona un método para promover la recuperación de la función neurológica que comprende:

identificar un paciente que tiene una función neurológica comprendida caracterizada por una lesión SCI; y administrar una composición que comprende al menos dos de: un polipéptido de transducción de proteínas, un polipéptido que degrada los proteoglicanos o un polipéptido que promueve la regeneración neural, a un paciente que necesita tal tratamiento. Opcionalmente, la composición es secretada por células modificadas genéticamente que se implantan cerca del sitio de la lesión del CNS.

Opcionalmente, la proteína de degradación de protoglicanos es condroitinasa ABC I, condroitinasa ABC II, condroitinasa a C, condroitinasa B, hialuronidasa ¹ , hialuronidasa ² , hialuronidasa 3, hialuronidasa 4, PH^{2 0} , o una combinación de estas. Opcionalmente, los polipéptidos se unen entre sí.

En otra realización, la presente divulgación proporciona un método para facilitar la difusión de un agente en un sistema nervioso central que comprende:

administrar el agente al sistema nervioso central; y modificar una matriz extracelular en el sistema nervioso central para permitir la penetración del agente en la matriz extracelular.

Opcionalmente, este método comprende además la etapa de usar al menos una enzima capaz de escindir proteoglicanos en la matriz extracelular.

Opcionalmente, en el que los proteoglicanos son proteoglicanos de sulfato de condroitina.

Opcionalmente, al menos una enzima se selecciona del grupo que consiste en condroitinasa ABC Tipo I, condroitinasa ABC Tipo II, condroitinasa AC, condroitinasa B, hialuronidasa 1, hialuronidasa 2, hialuronidasa 3, hialuronidasa 4, catespinas, PH20, ADAMT y cualquier combinación de los mismos.

Opcionalmente, se administra al menos una enzima con uno o más portadores farmacéuticos.

Opcionalmente, el agente se selecciona del grupo que consiste en biológicos complejos, moléculas pequeñas y células trasplantadas.

El agente se puede administrar por vía tópica, local o sistémica. Opcionalmente, la administración del agente es mediante inyección en bolo, administración intravenosa, infusión continua, liberación sostenida de implantes o productos farmacéuticos de liberación sostenida.

En otra realización, la presente divulgación proporciona un método de penetración de un agente a través de una matriz extracelular, que comprende:

administrar al menos una enzima capaz de escindir proteoglicanos de sulfato de condroitina.

Opcionalmente, al menos una enzima se selecciona del grupo que consiste en condroitinasa ABC Tipo I, condroitinasa ABC Tipo II, condroitinasa AC, condroitinasa B, hialuronidasa 1, hialuronidasa 2, hialuronidasa 3, hialuronidasa 4, catespinas, PH20, ADAMT y combinaciones de los mismos. Opcionalmente, se administra al menos una enzima en una cantidad eficaz. Opcionalmente, el agente se selecciona del grupo que consiste en biológicos complejos, moléculas pequeñas y células trasplantadas.

El método puede comprender además la etapa de administrar el agente por vía tópica, local o sistémica. Opcionalmente, la etapa de administrar el agente es mediante inyección en bolo, administración intravenosa, infusión continua, liberación sostenida de implantes o productos farmacéuticos de liberación sostenida.

En una realización adicional, la presente divulgación proporciona un método para mejorar la captación de un agente en un sistema nervioso central, que comprende:

administrar el agente y al menos una enzima capaz de escindir proteoglicanos de sulfato de condroitina.

Opcionalmente, al menos una enzima se selecciona del grupo que consiste en condroitinasa ABC Tipo I, condroitinasa ABC Tipo II, condroitinasa AC, condroitinasa B, hialuronidasa 1, hialuronidasa 2, hialuronidasa 3, hialuronidasa 4, catespinas, ADAMT, PH20 y cualquier combinación de los mismos. Opcionalmente, se administra al menos una enzima en una cantidad eficaz.

Opcionalmente, se administra al menos una enzima con uno o más portadores farmacéuticos. El portador farmacéutico se puede seleccionar del grupo que consiste en diluyentes, aglutinantes, lubricantes, agentes colorantes, agentes desintegrantes, agentes reguladores, agentes isotonizantes, polioles, conservantes y anestésicos.

Opcionalmente, el agente se selecciona del grupo que consiste en biológicos complejos, moléculas pequeñas y células trasplantadas. El agente se puede administrar por vía tópica, local o sistémica. Opcionalmente, la administración del agente es mediante inyección en bolo, administración intravenosa, infusión continua, liberación sostenida de implantes o productos farmacéuticos de liberación sostenida.

SEQ ID NO: 1 Proteína condroitinasa ABC I

ORIGEN

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í m p ' " “

SEQ ID NO: 2 Proteína 2NA20ABCI (Ajs-Nio»)

aqnnpl adfssdknsi 6Í Itlsdkrsiin gnqsllwkwk ggssftlhkk livptdkeas kflwgrestpv fsfwlynckp 121 idgyltidfg eklistseaq agfkvkldft gwrtvgvsln ndlenncmtl natncssdgt 1S1 qdsigrslgakvdsirfkap snvsqgciyi drimfavdda ryqwadyqvk trisepeiqf 241 hnvkpqlpvt pefilaaidii rqrlinefvg ge-ketnlíde enisklksdf dalnthtlan 301 ggtqgrhlit dkqiiiyqpe ninsqdkqlf dnyvilgnyt tlmfnisray vlckdptqka 361 qlkqmyllmt khlldqgfvk gsajvtthhw gyasrwwyts tllmsdiilke anlqtqvydg 421 Uwysrefka sfdmkvsads sdQdyñiÜa rqhlaHlle pddqkrinlv ntfshyitga 481 Itqvppggkd glrpdgtawr hcgnypgysf pnfknnsqli yllrdtpfsv gesgwimlkk 541 aíflvsawiysi] pevglplagr hpfnspslks vaqgyywlam saksspdkti asiylaisdk 601 íqnesteifg etitpasípq gfyafnggaf gihrwqdkmv tlkayntnvw sseiynkdnr 661 ygryqshgva qivsngsqls qgyqqegwdw nrmegattih lplkdldspk phtlmqrger 721 gfsgtssleg qygrnmafnli ypanlerfdp nftakksvla adnhlifigs mnssdknkn 781 vettlfqhaí tptlnrlwin gqkienmpyq ttlqqgdwli dangngylit qeekvimrq 841 hqvsaenknrqpecgnfsía widhsirpkd asyeymvfM atpekmgema qkfrenngly 901 qvlrkdkdvh iildklsnvt gyafyqpasi edkwíkkvnk paiymthrqk dtlivsavtp 961 dlnmtiqkaa tpvíinvtin gkwqsadkns evkyqv&gdn teltftsyfg ipqeiklspl 1021 p ' " ' ‘ ‘ SEQ ID NO: 3 Proteína Ni60 ABCI (Fas-Nnm)

ftlhkk livptdkeas kawgratpv fsfwlynekp 121 idgyltídfg ekliütseaq agfkvkldft gwrtvgvsln ndlennemtl tiatnlssdgt 181 qdsigrslga kvdsirtkap snvsqgeiyi drimfsvdda ryqwsdyqvk trise pe iqf 241 hnvkpqlpvt penlaaidli rqrlinefvg geketnlaíe enisklksdf dalnthtlan 301 ggtqgrhlit dkqiiiyqpe ninsqdkqlf dnyvilgnyt tímfnisray vlekdptqka 361 qlkjqmylínit khlldqgfvk gsalvtthhw gyssrwwyis tllmsdalke anjqcqvyds 411 Ilwysrefks sfdmkvsads sdídyfntls rqh Jal lile pddqkrjnlv ntfshyilga 481 Itqvppggkd glrpdgtawr hcgnypgysf pafknasqli yUrdtpfsv gesgwnnlkk 541 aravaawiysn pevglplagr hpfnspslks vftqgyywlam naksspdktl asiylaisdfc 601 tqneattufg etitpaalpq gfyafnggaf gihrvvqdkmv tlkaynlnvw sseiynfcdnr 661 ygryqshgva qivsngsqla qgyqqegwdw nrmegattih íplkdldspk phtlmqrger 721 gfsgtssleg qygmmainli ypanierfdp nñakksvla adnhUfiga ninssdknkn 781 vcttlfqhai tptlntlwin gqkñenmpyq ttlqqgdwU dsngngylit qaekvnvsrq 841 hqvsaenknr qptegnfssa wldhstrpkd asyeymvfld atpekmgema qkfrenngly 901 qvlrkdkdvh iildklanvt gyafyqpasl edkwikkvnk paivrnthrqk dtlivaavtp 961 dlmntrqkaa tpvtinvtin gkwqsadkns evkyqvsgdn teltftsyfg ipqeiklspl 1021 p " ~

SEQ ID NO: 4 Proteína Na6Ü CA8Ü ABCI {Fbs-Nejz)

ftlhkk livptdkeas kawgrsatpv fsfwlynekp 121 idgyltídfg eklistseaq agfkvkldft gwrtvgvsln ndlenreuttl nattitssdgt 181 qdsigjBlga kvdsírfkap snvsqgeiyi drimfsvdda ryqwsdyqvk trlsepeiqf 241 hnvkpqlpvt penlaaidli rqrlinefvg geketnlale enisklksdf dálnthtlaji 301 ggtqgrhlit dkqiiiyqpe nlnsqdkqlf dnyvilgnyt tímfnisray vlskdptqka 361 qlkqmyllmt khlldqgfvk gsalvtlhhw gyssrwwyis tllmsdalke anlqfcqvyds 421 llwysnefks sfdmkvsads sdídyfntls rqhlalllle pddqknnlv ntfshyitga 4S1 Itqvppggkd glrpdgtawr hegnypgysf pafknasqli yUrdtpfsv gesgwnnlkk 541 smvsawiysn pevjzlplagi hpfnspslks vaqgyywlatn sales sjvjktl aaiylaisdk 60) tqnestflifg etitpaslpq gfyafnggaf giíirwqdkmv tlkayntnvw sseiynkdnr 661 ygryqahgva qivsngsqls qgyqqegwdw nimegattih Iplkdldspk phtlmqrger 721 gfggtssleg qygmmafhli ypanierfdp nftakksvla adnhlifígs ninssdknkn 781 vettlfqhai tptlntlwin gqkienmpyq ttlqqgdwli dsngngylit qaekvnvsrq 841 hqvsafinknr qptegnfssa widhstipkd asyeymvfld atpekmgpma qkfrenngly 901 qvlrkdkdvh iildkletivt gyafyqpasi edkwikkvnk pa

SEQ ID NO: 5 Proteína condroitinasa AC Locus 1HMW A

ORIGEN

1 mkkJfvtciv ffsilspali iaqqtgtae] imkrvmldlk kplmmdkva eknlntlqpd 61 gswkdvpykd damtnwlpnn hllqletiiq ayiekdshyy gddkvfdqís kafkywydsd 121 pksmwwhne iatpqalgem liltnrygkkp Idealvhklt ermkrgepek ktganktdia 1S1 Ihyfyrallt sdealJsfav kelfypvqfv hyeeglqydy sylqhgpqjq issygavfit 241 gvlkíanyvr dtpyalscek Jaifskyyrd syikairgsy mdfrtvegrgv srpdilnkka 301 ekkrlIvaJcm idlkhleewa daiartdstv asgykiepyh hqfwngdyvq blrp&ysfnv 361 mivsknrrs eagnkenlig rylsdgatni qlrgpeyyni mpvwewdkip gitsrdyltd 421 rpltkJwgeq gsndfaggvs dgvygasaya ldydslqakk awfffdkeiv dgaginsna 481 penitttlnq swlngpvist agktgrgkit tfkaqgqfwi Ihdaigyyfp eganlsistq 541 sqkgnwfhin nshskdcvsg dvfkJwinhg aipenaqyay ivlpginkpe eikkyngtap 601 kvJantnqlq avyhqqldniv qaifytagkl svagieietd kpcavlikhi ngkqviwaad 661 plqkektavl sitdlktgkt nrvkidi^qq efagatvdk

SEQ ID NO: 6 Proteína CA20Q AC (Qa-Tjoo)

qqtgtael imkrvmldlk kplmmdkva eknlntlqpd 61 gswkdvpykd damtnwlprai hllqlctiiq ayiekdshyy gddkvfdqis kafkywydsd 121 pksmwwhne iatpqalgcm lilmrygkkp Ideal vhklt ermkrg¡cpek ktganktdia 131 Ihyfyrallt sdtallsfav kelfypvqfv hyeeglqydy syiqhgpqtq issygavfit 241 gvlklanyvrdtpyalsteklaifskyyod sylkairgsy midfnvegrgv srpdilrrkka 301 ekkrllvakin idlkhteewa daiartdstv aagykkpyh hqfwngdyvq hlrpaysfnv 361 rmvskrtm esgnkenllg rylsdgatni qlrgpeyyni mpvwewdkip gitsndyltd 421 rpltklwgoq gstidfaggvs dgvygasaya Idydslqakk awfffdkeivclgaginsna 481 pemttünq swlngpviat

SEQ O NO: 7 Proteína CA22A AC (Qu-AW

qqtgtael imkrvmldlk kplmindkva eknlntlqpd 61 gswkdvpykd damtirwlpnn hllqletiiq ajiekdshyy gddkvfdqis kafkywydsd 121 pksmwwhne iatpqalgem ¡ihnryglcfcp Ideal vhklt ermkrgepek krgjinktdia 181 Ihyfyrallt sdeallsfav kelfypvqfv hyeeglqydy sylqhgpqlq issygavfit 241 gvUdanyvrdtpyalstck laifskyyrd sylkairgsy mdftivegrgv srpdilnkka 301 ekkrilvakm idlkhteewa daiafftdstv aagykiepyh hqfwngdyvq hlrpaysfnv 361 rmvskrtris esgnkcnllg rylsdgatni qlrgpeyyni mpvwewdkip gitsrúyltd 421 rpltklwgeq gsndfaggvs dgvygasaya Jdydsiqakk awfffdkdv clgaginsna

SEQ ID NO: 8 Proteína NA20CA200AC (Lo-Tsoa)

lmmdkva eknlntlqpd 61 gswkdvpykd damtnwlpnn hllqlctiiq ayiekdshyy gddkvfdqis kafkywydsd 121 pksmwwhne iatpqalgem lilmrygkkp 1 deaJvhklt ermkrgepek ktganktdia 131 ihyfyrallt sdeallsfav kelfypvqfv hyeeglqydy sylqhgpqlq issygavfit 241 gvlklanyvrdtpyalstek laifskyyrd sylkairgsy mdfnvegrgv srpdilnkka 301 ekkrilvakm idlkhteewa daiandstv aagykiepyh hqfwngdyvq hlrpaysfnv 361 rmvskrtm esgnkenJlg rylsdgatni qlrgpeyyni mpvwewdkip gitsrdyltd 42] rpltklwgeq gsndfaggvs dgvygasaya Idydslqakk awfffdkeiv clgaginana 481 pertitttínq swlngpvjst

SEQ ID NO: 9 Proteína NASO CA2O0 AC CTm-Tsdq)

tnwlpnn hlJqJetiiq ayickcbhyy gddkvfdqis kafkywydsd 121 pksmwwhne iatpqalgem lilmrygkkp Ideal vhklt ermkrgepek ktganktdia 181 Ihyfyrallt sdeallsfav kelfypvqfv hyeeglqydy sylqhgpqíq issygavfit 241 gvlklanyvr dtpyalstek laifskyyrd sylkairgsy mdfiivegrgv stpdilnkka 301 ekkr!lvakm idlkhteewa daiartdstv aagykiepyh hqfwngdyvq hlrpaysfnv 361 rmvskrtm csgnkenflg rylsdgatni qlrgpeyyni mpvwewdkip gitsrdyltd 421 rpltklwgeq gsndfaggvs dgvygasaya Jdydslqakk awfffdkeiv clgaginsna 431 penitttlnq swlngpvist

SEQ ÍD NO! 10 Proteína NA1G0 CA200 AC (S,W-T5Q0)

smwwhne ifltpqaígern lilmiygkkp Idealvhldt ennkigcpek ktganktdia ]&1 lhyfyrallt sdeaílsfav kdfypvqfv hyeeglqydy syiqhgpqlq issygavfit 241 gvlklanyVTdtpyalstek laifskyyrd aylkairgsy mdfnvegrgv srpdilnkka 301 ckkrllvakm idlkhteewa daiartdstv aagykicpyh hqfavngdyvq hlrpaysfnv 361 rmvskrtrrs esgnkenllg rylsdgatni qlrgpeyyní mpvwewdkip gUsidyitd 421 ipítklwgeq gsiidfuggva dgvygasaya Idydslqakk awfffdkciv clgaginsna 481 pemtulnq swlngpvist

SEQ ID NO: 11 Proteína NA5Ü CA275 AC (Twí-tííJ

tnwlpnn hllqletiiq ayiekdahyy gddkvfdqis kafkywydad 121 pksmwwhne iatpqaigem lílmtygkkp Idealvhklt ermkrgepek ktganktdia 131 lhyfyrallt sdeallsi'av kelfypvqfv hyeeglqydy sylqhgpqlq issygavfit 241 gvlklanyvrdtpyalstek laifskyyrd aylkairgsy mdfnvegrgv srpdikLkka 301 ckki'llvakin idlkhteewa daiartdstv aagykíepyh hqfwngdyvq hlrpaysfnv 361 rmvskrtrrs esgnkenllg ryl&dgatni qligpeyyni mpvwewdkip gitsrdyltd 421 rpltkl

SEQ ID NO: 12 Proteína condnoitinasa B Locus Q46079

ORIGEN

t mkmlnklagy llpimvllnv apclgqvvas tietlyqvvke vkpgglvqia dgtykdvqli 61 vsnsgksgjp itikalnpgk vfftgdakve Irgehlileg ¡wfkdgnrai qawkshgpgl 121 vaiygsynrí tacvfdcfde ansayittsl tedgkvpqhc ridhcsftdk itídqvinln 181 ntaraikdgs vggpgmyhrv dhcffsnpqk pgnagggiri gyymdignc lvdsulfmrq 241 dscacittsk sqenvyygnt ylncqgtmnf ifigdhqvain nfyigndqrf gyggmfvwgs 301 rtiviacnyfe ísetiksrgn aalylnpgam asehalafdm liannafmv ngyaihfnpl 361 derrkeycaa nrlkfctphq lmUcgnlftk dkpyvypffk ddyfiagknu wtgnvalgve 421 kgipvmsan reaykpvkik diqpiegial dJnaliakgi tgkplswdev rpywJkempg 481 tyaltarlsa draakfkavi kmich

SEQ ID NO: 13 Proteína NASO Chase E (O ios-Hjm)

gnrai qswkshgpgl 121 vaiygsyori tacvfdjcfde ansayittsl tedgkvpqhc ridhcaftdk itídqvinln 181 ntaraikdgs vggpgmyhrv dhcffsnpqk pgnagggiri gyymdígm IvdsnJfmrq 241 cUeaciitsk sqenvyygnt ylncqgtmnf rtigdhqvain nfyigndqrf gyggmfvwgs 301 rhviacnyfe Jsetiksrgn aalylnpgam asehalafdm Jiannaflnv ngyaihfnpl 361 deirkcycaa nrlkfetphq Imíkgnlffk dkpyvypffk ddyfidgkns wtgnvalgve 421 kgipvnisan rsaykpvkik diqpiegjal dlnaJjskgi ígkplswdev ipywlfeempg 481 tyaltarlsa draakfkavi krnkeh

SEQ H> -NO: JM P roten a NA 120 Chase

ittsl tedgkvpqhc ridhcsfrdt iffdqvinín LSI ntaraikdgs vggpgmyhrv dhcffsnpqk pgnagggiri gyymdigrc Ivdsnlfmrq 241 dseaeí i tsk sqenvyygnt ylncqgtínnf rhgdhqvain nfyigiidqrf gyggmfvwgs 301 riwiacnyfe Jsetiksrgn aalylnpgam asehalafdm üannafinv ngyaihfnpl

361 derrkeyeaa nrlkfetphq ünlkgnJffk dkpyvypffk ddyfiagkns vvtgnvalgve 421 kgipvnisan isaykpvkik diqpiegial dlnaliskgi ígkpíswdev rpywlkempg 481 tyalterlsa draakfkavi Jtmkeh

SEQ ID NO: 1S Proteína CA19 Chase B (Qa-Uas)

qw as netlyqvvke vkpggivqia dgtykdvqli 61 vsnsgksglp itikalnpgk vfflgdakve Irgetilileg iwíkdgnrai qawkshgpgl 121 vaiygsynri tacvfdcfde ansay ittsl tedgkvpqhc ridhcsíídk itídqvinJti 181 ntaraikdgs vggpgmyhrv dhcffsnpqk pgnagggjri gyymdigit Ivdsnlfmrq 241 dseaeiitak sqenvyygnt ylncqgtronf rhgdhqvam nfyigndqrf gyggmfvwgp 301 rhviacnyfe Isetiksrgn aaJylnpgam asehalafdm liannafinv rgyaihftipí 361 tiende vean nrlkfetphq lmlkgnlffk dkpyvypffk rfdyfiagkns wtgnvalgvc 421 kgipvnisan rsaykpvkik diqpiegial dlnaliskgi tgkplswdev rpywlkempg 481 tyaltarl

SEQ ID NO; 16 Proteína CA12Ü Chase B (Qjs-Kjw)

qvvas netlyqvvke vkpggjvqia dgtykdvqli 61 vsnsgksglp itikalnpgk vfflgdakve IrgehÜleg iwfkdgnrai qawksjigpgl 121 vaiygsynri lacvfdcfde ansayittsJ tedgkvpqhc ndhcsftdk itfdqvinln 181 DtarnikdgB vggpgmyhrv dhcffsnpqk pgnagggiri gyymdigrc Ivdsnlfmrq 241 dseaeiitsk sqenvyygnt ylncqgtmnf rhgdhqvain nfyigndqrf gyggmfvwgs 301 rtwiacnyfe lsetiksrgn ítalyltipgam asehalafdm liannafmv ngyaíhfnpl 361 denkeycaa nrlkfetphq Imlkgnlffk

SEQ ID NO: 17 Proteína NA120 CA120 Chase B {Iiíd-Kaw)

ittsl tedgkvpqhc ridhcsftdk itfdqvinln

181 ntaraikdgs vggpgmyhrv dhcffsnpqk pgnagggiri gyymdígrc Ivdsnlfmrq 241 dseaeiitsk sqenvyygnt ylncqgtmnf fhgdhqvain nfyigndqrf gyEgmfv’Wgs 301 rhviacnyfe lsetiksrgn aalylnpgam asehalafdm Harmafinv ngyaihfnpl 361 denkeycaa nrlkfetphq Imlkgnlffk

SEQ ID NO: 18 Nudeótido condroítinasa ^{AC Locus} CHU27583

ORIGEN

1 atgaagaaat tatttgtaac etgtatagtc tttttctcta. ttttaagtcc tgcíctgctt

61 attgcacage agaceggtac tgeagaactg attatgaagc gggrgatgcc ggaccttaaa 121 ñagcctttgc gcaaCíügga (aaggtggcg gaaaagaacc tgaatacgct gcagcctgac 161 ggtagctgga aggatgtgcc ttíitaaagat gatgccatga ccaaltggtt gccaaacaac 241 cacctgctac aattggaaac tattatacag gettataltg anaaagatag tcactatt&t 301 ggcgscgata aagtgtttga ccagatttcc aaagctttta agtaitggta tgacagcgae 361 ccgaaitagoc gcaactggtg gcacMtgaa attgccactc cgcaggccct tggtgaaatg 421 ctgatcctga tgcgttacgg taaaaagccg cttgatgaag cattggtgca taaattgacc 461 gnaagaatgii agcggggcga accggagaag aaaacggggg ccaacaaaac agata tegee 541 ctgcaílact tttatcgtgc tttgttaacg tctgatgagg ctttgctttc cttcgccgta

601 aaagaattgt UtBlcccgt acagtttgta cactatgagg aaggcctgca ataegattat 661 ícclacclgc ¿ígcacggtCc gcaattücag utatígaget aOggtgccgt attlattacc 721 ggggiactga aacttgccaa ttacgttagg gatatcctrt atgctttiag taccgagaaa 781 ctggctatal ttteaaagta ttaccgcgac agítate tga aagctatecg íggaagttat

841 atggatttta acgtagaagg ccgcggagta agccygccag acattctaaa taaaaaggea 001 gaaaaaaaga ggttgctggt ggcgaagatg atcgatctta agCatuCtga agaalgggct 961 gatge gatas ccaggacaga lago ata gil gcggccggct ataagaUga gccctatcac 1021 catcagttct ggsatggtga ttatgtgcaa caíttaagac ctgcctattc ttttaatgtt 1031 cgtatggtga gtaagcggac ccgacgcagt gaatccggca ataaagaaaa cctgctgggc 1141 aggtstttat ctgatggggc tacta acata caattgegeg gaccagaata ctacaacatt 1201 atgceggtat gggaatggg* caagaitcct ggi-aLtücca gctgt gaita tttaaccgiic 1261 agacctttga cgaagctttg gggagagcag gggagcaatg actttgcagg aggggtgtct 1321 gatggtgtat scggggccag tgcctacgoa ttggattacg atagc'taca ggciaagaaa 1381 gcctggttct tttttgacas agagattgta tgtcttggíg ccggtatcftfl cageaatgcc 1441 cctgaaaaca Uateactac ccttaaccag agctggttaa atggcccggt tataagtact 1501 gcaggtaaaa. ccggccgggg taaaataaca aegUiaaag cacagggaca gttctggttg 1561 Ugeaegatg cgattggtta ttactttcct gaaggggpca accttagtct gagtacccag 1621 tcgcaaaaag gcaattggtt ccac atoase aattcacatt caaaagatg» agtttetggt 1681 gatgtattta agctttggat caaccatggt gceaggccag aaastgcgcfl glatgcttat 1741 atcgmtgc cgggaataaa caagccggaa gaaattaass aataíaatgg aacggcaccg 1801 aaagtccttg ceaataceaa ocagetgeag gcagmato ateageagtt agatatggta 1861 caggctatot tctaiacagc tggaiaatta agcgtagcgg gcatagasat tgaaacagat 1921 asgccatgtg cagtgetgat caagc acate aatggoaagc aggtaaUlg ggctgcCgat 1931 ccattgcaaa aag&aaagüc tgcagtgttg agcatcaggg atttaaaaat aggaaaaaca 2041 aatcgggtaa aasitgatrt tctgcaacag gaatttgcag gtgcaacggt tgaactgaas 2101 tag

SEQ ID NO; 19 Deleción ácido nucleico condroitinasa AC NA50 C A215 (ajjo — tur»)

atgccatga ccaattggtt gccaa&caac

241 cacctgctac aattggaaac tattatacag gcttatattg aaaaagatag tcactaítat

301 ggcgacgsta aagtgtttga ccagatttcc aaagctltta agtartggta tgiicagcgac

3(51 ccgaasagcc gcaactggtg gcacaatgaa attgccactc cgcaggccct tggtgaaatg

421 ctgatcctga tgcgftacgg taaaaagccg cttgatgaag caitggtgca taaattgacc

481 gaaagaalga agcggggcga accggagaag aaaacggggg ccaacaaaac agatalcgcc 541 ctgcanact tttatcgtgc tttgttaacg tdgatgagg dttgctttc cttcgccgta

601 aaagaattgt Utateecgt acagiUgta cadatgagg aaggcctgca atacgattat

661 tedacctgc agcacggtcc gcaattacag atatcgagct acggtgccgt atttattacc

721 ggggtactga aacltgccaa ttacgttagg gatacccctt atgctttaag taccgagaaa

7&1 ctggctatat tttcanagta ttsccgcgac agttalctga aagctatccg tgg&agttat

841 atggalltta acgtagaagg ccgcggagta agccggccag acattctaaa laaaaaggca

901 gaaaaaaaga ggttgdggt ggcgaagatg atcgatctta agcatactga agaatgggd

961 gatgcgatag ecaggacaga tagc&cagtt gcggccgga ataagattga gccctaícac

1021 catCagttd ggünlggtga tta(gtgcua Cátttaagae ctgcc tarto títtaatgtf

1081 caUEggtca gtaagcggac ccgacgcagt gaatccggca ataaagaaaa cctgctggge 1141 aggtatttat ctgaíggggc tactaacata caattgcgcg gaccagaata ctataacaft

1201 atgccggtat gggaatggga caagattcct ggcat&acca gccgtgatta tttaaccgac

1261 agücdttgacgaagctt

SEQ ID NO: 20 Ácido nucleico condroitinasa B Locus CHU27584

ORIGEN

1 atgaagatgc tgaataaáct agccggatac ttattgccga Icaiggtgct gctgaatgtg 61 gcaccalgct caggtcaggt tgttgcttca aatgaaactt rataccaggt ígtaaaggag 121 gtaaaacccg gtggtctggt acagattgcc gatgggactt ataaagatgt teagctgatt 1S1 gtcagcaatt caggaaaaic tggtttgccc atcactatta aagccctgaa cccgggtaag 241 gtttttttta ccggagatgc taaagtagag ctgaggggcg agcacctgat actggaaggc 301 atctggttta aagacgggaa cagagctatt caggcatgga aatcacatgg acccggattg 361 gtggctaiat atggtagcta taaccgcatt accgcatgtg tatttgattg itttgatgaa

421 gccaaüctg cttacaltac tacttcgctt accgaagacg gaa&ggtacc tcaacattgc 4S1 cgcatagacc attgcagttt taccgataag atcacttttg accaggtaat taacctgaac

541 aatacagcca gagctattaa agacggttcg gtgggaggac cggggatgta ccatcgtgrt 601 gatcactgti tmttccaá tcegcaaaaa ccgggtaatg ccggaggggg aatcaggait 661 ggctattacc gtaatgatai aggecgttgt ctggtagact ctaacctgft tatgcgtcag

721 gattcggaag cagagatcat eatcagcaaa tcgcaggaaa atgtttnlta tggtaatact 731 tasctgaatt gccagggcac catgaaettt cgtcacggtg atcaicaggt ggecattaac 841 aatttttata taggcaatga ccagcgam ggatacgggg gnalgtttgt ttggggaagc 901 aggcatgtca tagcctgtaa ttattttgag ctgtccgaaa ccataaügtc gagggggaac 961 gccgcattgt atttaaaccc cggtgctaig gcttcggagc atgctettgc tttcgatalg 1021 ttgatagcca acaacgcttt catcaatgta aatgggtatg ccatccaüt taatccattg 1081 gaigagcgca gaaaagaata ttgtgcagcc aataggcna ngttcgaaac ecogcaccag 1141 ctaatgUaa aaggcaatct tttctttaag gataa&cctt atgtttaccc attTtttaaa

1201 gaigattatt ttatagcagg gaaaaatagc tggactggta atgtagcctt aggtgtggaa 1261 nagggaatcc ctgttaacat ttcggCCaat aggtctgcct ataagccggt aaaaatLaaa 1321 gatalccagc ccaiagaagg aatcgctctt gatctcaatg cgctgatcag caaaggcatt 1381 acaggaaagc cocttagctg ggatgaagta aggccctact ggttaaaaga aatgcccggg 1441 acgtatgctt taacggceag gctttctgca gatagggctg caaagtttaa agccgtaatt 1501 aaaagaaata aagagcactg a

SEQ □> NO: 21 Deleción ácido nucleico condroitinasa B NM20CA120

Euto)

attac tacttcgctt accgaagaeg gaaaggtacc tcaacattgc

431 cgcatagacc attgcagtlt taccgataag atcacttttg accaggtaat taacctgaac

541 aatacagcca gagctattaa agacggttcg gtgggaggac eggggmtgta ccatcgtgtt

601 gatcactgtt ttttttccaa tccgcaaaua ccgggttmtg ccggaggggg aütcaggatt

661 ggctanacc glaatgatat aggecgttgt ctggtagact ctaacctgtt tatgcgtcag

72 L gattcggaag engagatcat caccagcaaa tcgc aggaaa atgtttatta t ggtaalact

731 tacctguatt gccagggcac catgaacttt cgtcacggtg atcatcaggt ggccattaac

841 aattrtrata taggcaatga ccagcgattt ggatacgggg gaaigmgt ttggggaagc

901 aggcatgtca tagcctgtaa ttattttgag ctgtccgaaa ccataaagtc gagg&ggaac

961 gccgcattgt atrtaaaccc cggtgctatg gctlc ggagc atgctettgc tttcgatatg

1021 tlgatagcca acaacgcttt catcaatgta aatgggtatg ccutccattt taatccattg

1081 gatgagcgca gaaaagaata ttgtgcagcc aataggctta agttcgaaac cccgcaccag 1141 ctaatgttaa aaggcaatct tttctttaag

SEQ ID NO; 22 Ácido nucleico condroitinasa ABCI Locus 129953

ORIGEN

1 ggaattCCUt cactcsatca ttaaatttag gcacaacgat gggctatcag ogltatgaca 61 aatttaMga agg&cgcatt ggtttcactg ttagccagcg tttcLaagga gaaaaataat 121 gccgatatu cgtttlactg caciigcaat gacaugggg ciattateag cgccuataa 181 cgcgatggca gccaccagca atcctgcatt tgatcctaaa aatctgatgc agtcagaaat 241 ttaccatm gcacaaaata acccattagc’agacttctca tcagaiaaaa acteaatact 301 aacgttarct gataaacgta gcattatggg aaaccaaLct cttttatgga aatgguaagg 361 tggtagtagc tttactttac alnas asad gattgtcccc accgatasag aagcatctaa 421 agcatgggga cgctcatcta cccccgtm ctcattttgg ctltacaatg aaaaaccgat 481 tgatggttMcttaciatcg atttcggaga aaaactc&lt tcaaccagtg aggctcaggc 541 aggctttaaa gtcmaattag atttcactgg ctggcgtgct gtgggagtct ctüaaataa 601 cgatcttgaa aatcgagaga tgaccttaaa tgcaaccaat acctcctctg atggtactca 661 agacagcau g&gcgttett Uggtgciaa agtcgatagt attcgtttta aagcgjcettc 721 taatgtgagt cagggtgaaa tctatatcga ccgtattatg ttttctgtcg atgatgctcg 781 ctaccaaigg tctgattatc aagiaftauac tcgcuatca gaacctgaaa ttcaatttca 841 eaacgtaaag ccacaactoc ctgtaacacc tgaaaattta gcggccattg aicttaítcg 901 ccaacgtcta attaatgúat ttgtcggagg tgaaaaagag acaaacctcg cattagaaga 961 gástate age aaattaaaaa gtgatttcga tgctcrtaat attcacactt lagcaaatgg 1021 tggaacgcaa ggcagacatc tgatcactga taaacaaatc attatttatc aaccagagaa 1081 tcttaautcc caagataaac aactaittga taattatgtt attttaggta artacacgac 1141 attaatgttt satattagcc gtgcttaigt gctggaaaaa gatcccacac aaaággcgca 1201 ¿ctaaagjcag atgtacttat taatgacaaa gcatilatla gatcaaggct ttgttaaagg 1261 gagtgcttta gtgacaaccc atcactgggg atacagttct cgttggtggt atatttccac 1321 gttattaatg tctgatgcac tamagaagc gaacctacaa actcaagttt atgartcatt 1381 actgtggtat tcacgtgagt ttaaaagtag ttttgatatg uaagtfiagtg ctgatagccc 1441 tgatetagpt tatttcaata ccttatctcg ccaacat.tta gccttattat tactagagcc 1501 tgitgatcaa aagcgtátca acttagttaa tactttcagc carta talca ctggcgcatt 1561 aacgcaagtg ccaccgggtg gtaaagalgg Ulacgccct gatggtacag carggcgaca 1621 tgaaggcaac tatccgggcl actcttlccc agcclttaaa aatgcctctc agcttama 1681 tttanacgc gatacaecat ttteagtggg tgaaagtggt tggaataaec tgaaaaaagc 1741 gatggtttca gcgtggplct acagtaatcc- agaagttgga ttaccgctlg caggaagaca 1801 cccttltasc tcaccttcgt taaaatcagc cgctcaaggc mttactggc ttgccatgtc 1861 tgcaa&atca tcgcctgam aaacacttgc atctatttat e-ttgcgaua. gtgátaaaac 1921 aca&aítlg&a tcaactgcta ttmggaga aactattaca ccagcgtctt lacctcaagg 1981 tttclatgcc tttaatggcg gtgctragg tattcategt tggcaagata aaatggtgac 2041 actgsaagct tataacacca atgtttggtc atctgaaatt tataacaaag ataacegíta 2101 tggccgltac caaagtcatg glgtcgctca aatagtgagt aaiggctcgc agctttcaca 2161 gggctatcag cuagaaggtt gggattggaa tagaatgcaa ggggcaacca ctattcacct 2221 tcctcitaaa gacttagaca gtectaaaec tcatacctta aigcaacgtg gagagcgtgg 2281 atttagcgga acate atece ttgaaggtca atatggcatg atggcaítcg atettattta 2341 tcccgccaat cttgagcgtt ttgatccíaa tttcactgcg aaaaagagtg tattageege 2401 tgataatcac ttaattttta ttggtagcaa tataaatagj: agtgataaaa ataaaaatgt 2461 tgaaacgacc ttatteeaac atgccattac tccaacatta aatacccttt ggattaatgg 2521 acaaaagaia gaaaacatgo cttatcaaac aacacttcaa caaggtgatt ggttaattea 2581 tagcaatggc aatggtiact taattaetca agcaguaaaa gtaaatgtaa gtcgccaaca 2641 tcaggtttea gcggaaaata aaaatcgcca accgacagaa ggaaacltta gcteggcatg 2701 gatcgateac agcactcgcc ccaaagatgc cagttatgag tatatggtct ttttagatgc 2761 gac acelgas aaaatgggag agatggcaca aaaattccgt gaaaataatg ggttutatca 2321 ggucttcgt aaggataaag acgttcatat tattetega: aaaetcagea atgtaacggg 2881 ¿itatgcctlt tateagccag catcaattga agacaaatgg atcaaaaagg ttaataaacc 2941 tgcaattgtg atgaetcate gacaaaaaga cactcttatt gtcagtgcag ttacacctga 3001 trtaaatatg actegecaaa aagcagcaac tcctgfeacc ateaatgtca cgattaatgg 3061 caaatggcaa tctgctgata aaaatagtga agtgaaatat caggtttctg gtgataacae 3121 EgaaclgaCg tttacgagtt aetttggtat tecacaagaa atcaancccc cgccactcce 3181 Ltgatttaat caaaagaacg ctcttgcgtt cctttutat ttgcaggaaa tctgattatg 3241 ctaaraaaaa accctttagc ccacgcggtt acattaagee tctgtttatc attocccgea 3301 caageattac ccactctgtc teatgaaget ttcggcgata tttatctttt tgaaggtgaa 3361 itacccaatacocttaccac ttcaaataat aatcaattat cgctaagcaa acagcatgct 3421 aaagalggtg uacaatcact caíiíttggc&a talcaaccac aagcaacatt aacaciaaat 3481 aatattgtta attaccaaga tgataaasat acagCí&cac cnctcacttt lutgatgtgg 3541 atttataalg aaaaucctca atcttcccca ttaacgttag catttaaaca aaataataáa 3601 attgcactaa gtttmtgc tgaacttaal macggggt ggcgaggtai tgctgttoct 3661 tttcgtgaja tgeaaggctc tgcgacaggl caacttgatc aartagtgat caccgctcca 3721 aaecaagccg gaacactett Uttgatcaa atcatcatga gtgtaccgtt agacaategt 3781 tgggcagíac ctgactatca aacaccttac gtanataacg cagtaaacac gatggtlagt 3841 aaaaactgga gtgcaitatí gatgtacgál cagatgtttc aagcccftfta ccctacttta 3901 aacctcgatactgaattícg cgatgaccaa aeagaaatgg cttcgattta tcagcgcttt 3961 gaatattatc aaggaattcc

SEQ ID NOs 23 Ácido nucleico condroitinasa ABCI fusión TAT

ggtcgtaaaaagcgtcgtcaacgtc gtcg tggtggtggtggtggtgceaccagca atcctgcatt tgatecta&a aatctgalgc agtcagaaat 241 ttaccatttt gcacaaaata aeceaUagc agacktctca tcagátaaaa actcaarjic: 301 aacgttaoct gata&acgta gcattatggg aaaccaatct cttttatgga aatggaaagg 361 tggtaglagc tttactttac ataa&aaact gattgtcccc accgataaag iiagc atetas 421 agcalgggga cgctcatcta cccccglttt ctcattttgg ctttscaatg aaaaaccgat 481 tgalggttat cttactatcg atttcggaga aaaactcatt tcaaccagtg aggctcaggc 541 aggcttiaas gtaaaattag atltcactgg ctggcgtgct gtgggagtct ctíuaataa 601 cgatcttgas aatcgagaga tgaccuaaa tgcaaccaat acctcctctg atggtactca 661 agacagcatt gggcgttctt taggtgctau agtcgatagt attcgtttta aagcgccttc 721 taatgtgagt csgggtgaaa teta talega ccgtattatg tmctgtcg atgatgctcg 781 ctaccaaigg tctgattatc aagtasaaac tcgettatca gaseeLgaaa ItcaaUlca 841 caajcgtaaag ccacaactac ctgtaacacc tgaawaltta gcggccattg atcltaltcg 901 cca&cgteta attaatgaat ttgtcggagg tgaaaaagag acaaacctcg caítagaaga 961 gaatatcagc aaauaaaaa gtgatttcga tgctettaat attcacactt tagcaaateg 1021 tggaacgcaa ggcagacatc tgatcactga taaacaaafc attatnatc aaccagagaa 1081 tcttuactce cuagataaae aactatttga taattatgtt attttaggta attacacgac 1141 attaatgttt flatattagcc gtgcttatgt gctggaaaaa gatcccacac aaaaggcgea 1201 actaaagcag atgtacttat laatgacaaa ecatitaUa gatcaaggct ttgttaaagg 1261 gagtgcttta gtgacaaccc atcactgggg ataeagttct egttggíggt ataíttecac 1321 gttattaatg tctgatgcac tasas saagc gaseelacas actca&gm atgattcatt 1381 actgtggtaL tcacgtgagt ttaaaagtag ttttgatatg aaagtaagtg ctgatagctc 1441 tgatctagat tsttteaata ccitaiclcg ccaacattta gecttattai tactagagce 1501 tgatgatcaa aagcgtatca acttagttaa tactttcagc cattatatca ctggcgcatt 1561 aacgcaagtg ccaccgggtg gtaaagatgg tttacgccct gatggtacag catggcgaca 1621 tgaaggcaac tatccgggct aclctttccc agcctnaaa aatgcctctc agcttatna 1681 tltattacgc galacaccat íttcagtggg tgaaagtggt tggualaacc Igaaíiaaagc 1741 gatggtltca gcglggatct acagtaatec agaagUgga Ifaccgcttg caggaagaca 1801 ccctttLaac tcaccttcgt taaaatcag! cgctcaaggc tattoctggc ttgccaitgfc 1861 tgcaaaatca tcgcctgata aaacacttgc atctatttat cttgcgatta gtgataaaac 1921 acsaaatgaá ícaflcígcta tttttggaga fiactaítEica ccagcgtctt tficctcaagg 19S1 tttctatgcc tttaatggcg gtgcttttgg cattcatcgt tggcaagata aaatggtgac 2041 ¡id gas age I tataacacca atgtttgglc atctgaaatt tataacaaag ataaecgtta 210] tggccgttac caaagtcatg gtglcgctca aatagtgagt aaüggcEcgc agctttcaca 2161 gggctatcag caagaaggtt gggattggaa tagaatgeaa ggggcnacca ctattcacct 2221 fcctcuaaa gacttagaca gtcxtaaacc tcaracctta atgcaacgtg gagagcglgg 2231 atttagcgga acate atece ttgaaggtca atatggtatg atggcatfcg atettattta 2341 teccgccaat cttgagcgtt ttgatcctaa tttcactgcg aaaaagagtg tattageege

2401 tgHtaatcac ctaattma ttggtagcaa tataaatagt agtgataafts ataaaaatgt

246) tgaaacgacc ttattccaac atgccattac tccaacatta aaiacccm ggattaatgg

2521 acaaaagaia gaaaaeatgc cttatcaaac aacacttcaa eaaggtgatt ggrtaattga

2581 tagcaatggc aatggttact taattactca agcagaaaaa gtaaatgtaa gtcgccaaca

2641 Lcaggtttca gcggaaaata aaaatcgcca accgacagaa ggaaacttta gctcggcaíg 2701 gatcgatcac agcactcgcc ccaaagatgc Cagttatgag tütatggtct rtttagatgc

2761 gseacetgaa aaaaigggag agatggcaca aaaattccgt gaauataatg ggttatatca 2821 ggitcücg! aaggataaag acgttcatat tattetegat aaactcagca atgtaacggg

2881 atatgeettt tatcagccag catcaattga agacaaatgg atcaáaaagg ttaataaauc

2941 tgcaattgtg atgactcatc gaeaaaaaga cactcttatt gtcagtgcag ttacacctga

3001 tttaaatatg actcgccaaa aagcagcaac tcctgtcacc atcaalgica cgattaatgg

3061 caaatggcaa tctgctgata aaaatagtga agtgaaatat caggtttctg gtgataacac

3121 igaactgacg tttacgagtt actttggtat tccacaagaa atc&aactct cgccactccc

3181 ttgattt&atcaaaagaacg ctcttgcgtt cctttütat ttgcaggaaa tctganatg

3241 ctaalaaaaa accctttagc ccacgcggtt acattaagcc tctgtttatc attacccgca

3301 caagcattac ccactctgtc teatgaaget ttcggcgata tttatttttt tgaaggtgaa

3361 ttacccaata cccttaccac ttcaaalual aatcaattát cgctaagcaa aeageatget

3421 aaagatggtg aacaatcact caaatggeaa tatca&ccac aagcaacatt aacactaaat 3481 aatattgtta attaccaaga tgataaaaat acagccacac cacrcacttt tatgatgtgg

3541 atttatáatg aaaaacctca atcttcccca ttaacgttag catttaaaca aaataataaa

3601 attgeactaa gttttaatgc tgaacttaat tttacggggt ggcgaggtat tgetgttcct

3661 tttcgtgata tgcaaggcte tgcgacaggt caacttgatc aattagtgat caccgctcca

3721 aaccaagccg gaacactctt ttttgatcaa atcatcatga gtgtaccgtt agacaatcgt

3781 tgggcagláe ctgac talca aacaecttac gtmataacg cagtaaacac gatggttagt

3841 aaaaactgga gtgeattatt gatgtacgut eagatgtttc aagcccatta ccctacttta

3901 aaettegata ctgaatttcg cgatgaccaa acagaaatgg cttcgattta tcagcgcttt

3961 gaatattate aaggaattcc

SEQ ID NO: 24 Una secuencia TAT VIH y protesta Gly penta enlazante

G R K K R R Q R R R G G G G G

SEQ ID NO: 25 Secuencia TAT y acide nucleico Gly penta enlazante

ggt cgt aaa aag cgt cgt caa cgt cgt cgt ggt ggt ggt ggt ggt

SEQ Q) NO: 26 Ácido nucleico condroitinasa ABC II de la presente invención [tacccactctgtctcatgaagcUicggcgatatttatctüttgaaggcgaattacccaatatccttaccacttcaúataataatcaattatEg etaage aaaeage atgctaaagatggtgaacaatc actcaaat ggcaatatcaaccac aagcaacaUaacajctaaataatattgttaatt jcc a ngat garaaaaat acagccac acc actcacuttatgatgtggatttataatgaaaaacc EcaaEcttccc cattaacgttagcat tta aacaaaataataaaiUtgcactaagUtEaatgCtgaacttaatttiacggggíggCgílggfflttgcigttccttitcgigalaigt'aiiggctc tgcgacaggtjcaacttgatcaattagtgatcajccgctccaaaccaagccggaajcactctnntgntcaaatcaícatgaglgtaccgtta gacaatcgttgggcagtacctgactateaaacaccttacgtaaataacgcagtaaflcacgatggttagtaaaaactggagtgcattattg atgtacgatcagatgtttcüagüccattaccctacttlaaacttcgataictgaatttcgicgatgaccaaacagaaatggcttcgatttatcag cgctttgaatattatcaaggaattcgtagtgaiaaaaaaattactccagatatgctagatañacaittflgcgttatgggaaaaattggggna acacaacac gCEgatggctcaatcacag.gaaaag)CccttgatcajCcc taacc ggcaacattitatgaaagtcgaaggigtattEagtga ggggaetcaaaaagcattacttgatgccaatatgctaagagaígtgggcaaaaí:gcetcttcajiactgctaHtacttgcgtíigcgattca ttatcagcaactggtagaa^aaattagaagagcgictatttattaggtaicrcgttatgticcttgaacaaggttttacacgaggaagtggtta ccflflaitflEtactcalgttggttaccyaaoc ag agaactttitgatgc atggmattggccgtc atgttcUEcaflaaaHtnactttltagccc ccactcaajcaHgctfltgatgtggtHCAacgccacaggacgtatttUg&aaaagataatgaaattgngatgcaaatgtcgatflttctcaaE ac tcaatlgcaaiggatgataaaaag«taUgatgctac cggattaicaacaac gtcaacaa gccttagc ge aactgcaaagtlggcta aataaaaccattc taagctcaa&Aggtgttgctggcggtnc&aatctgatggUctatttttcaccauc acaac attacccc gcttatgcm aflgatgcatitggíggtttagcacccagigtoatgcattiiagtgattcíu:cttttcgcttaictacttcagcacalgagcatttiaaíiga(gU ttgttaaaaa(gcggatcEacaccaaagflgacacaafLticctgtggtattaagtggtcgtcatccaactgggttgcataajiatagggaícg cgccaítta!iatggatggcflttagtaggaa:cctagatggcaaacaaaagttagataccacattalccgccgcttatgcaaacttagac aacaaaacgcattttgaaggc attaacgctga&agtgagccagtc ggcgc atgggcaatgaattatgcatcaatggc aatac aac gaa gagcatcgacccaatcacEacaacaaagctggctcgcc&tagcgcgcggttttagccgttatcttgttgEtaatgBaagctatgaaaala acttaccgrtatggtcgttatttacaíitüiggacaaitggaaaltíatccagciEaluaaíJtcaalcaggglltiigccBtgctggatgggau ggaatagatalíxaggtacaacaactattcatcttccctataacgaacttgajigcajaaacltaatcaattacctgctgcaggtattgaaga aatgugc[itcaacagaaagttflctctggtgi;aaatacccttaataatflíicagíaEgtttgccatgaaflttacacggtcacagtaaatati;a ucaacaaagcttaagggc aaataaalcctatttcUñtttgataatagagttaítgclttaggctcaggtattgaaaatgatgataaBC aacat acgaccgaaacaiicactattccagUtgccgtc(:ctaaallaciigtc:agt.gat(;altaülggcaaaaaggtaaiitcaatlagaCactcaatt jiactttaáataatgcagatacattaattgatcctgccggcaatttatataagctí;actaaaggacaaactgta£Laatttagnaicaaáaaca acaac acUgalgatagaaattcaaaajcc aac agaacaflttatitgcaacagcLgttatttctcatggtaaggcaiCc gagtaatgaaaaU atgaatatgc aatagctatcgaagcac aaaataataaagctcccaamc 3cagtattacaacaUátgMcagctceatgcggtaaa ag ataaaaüiaccijaagaagagggatatggtTtttttgaagccactaflgtTaaflHtcagcggaigcaacattattatccagigatgcgccggt taíggtcatggctaaaatacaaaatcagcaaitaamtaagtaugttaatcctEatrtaaatttatatcaaggtagagaaaaagalcaatít gaEgataaaggtaa£caaatcgaagttagtglttattctcglcattggcaacagcagaatcgcaatca¿caajtagtactaLtaccgtaaa aggaatatg^aaattaacgacicc tcaacc^ggtgttilt&ttaagcacc acaataac racactctt&ttacgacaacaacc atacaggc aacacc tactgttattaatttagtt aagtaa

SEQ ID NO: 27 Protelna condroitinasa ABC II de la presente Invención

abc (presente invención) 990 aa va, >_ abc (madura) 990 aa Matriz de puntuación: . penallzaclón brecha: - 12 / - 2

99-3% de identidad; Puntuación de alineación global: 6393

10 20 30 40 50 60

457676 LPTLSHfiAí'GDinjFEGELPmLrrSMNlíQLfíLSiíQHAXDGEQSLfíWQYÜPQATLTLNHI

“ * ■ ► » ! « ■ • * « * * ■ * -t >k * ■ ■ a f ■ ■ ■ .a ■ ■ o. ■ r ■ » _ LP'rLSHEAFGUl VljFEGELPiraiJrrStnorQLSLSKQHJUtDGSQSLKWQ’f QPQATLTLNNI

10 20 30 40 50 60

70 BU 90 100 110 ISO

i 5161 6 W0DDlO3,rATPLTE,MHWIVlWEK¿»QS5PLTLAFICQWNKIALSFNAELHBTGWHGIAVPFR

i ; : ; ; ; : ; ; ; ; : ; ; ; : ; j j t: : l ¡::: í ; I :: i ::!! í : t : i : : _ VTfYQDD]TNTATFLTFHMWIYT'JEKPQSSPLTLAFK3NNKlAIiSFNAELNP'IGWRGlAVPFR

70 ao 90 100' u o iso

n o 140 150 ISO 170 180 457676 DMQGSATGQLDQLVTTAPi#QAG,rLFFl>QIIMSVPLDNRWAVPOTQTPYVNNAWTHVSKN

■ ■ ■ ■ ■ ■ i » ■ ■ ■ ■ ■ • * ■ - * ■ ■ ■ ■ ■ * ■ * I J ü J X . i J a « J « J f l 4. S ! i , T , T J . ^ 3 . ¡r ■ m r a- r. _ DMQGSTTCGQLDQLVITAPNQAGTLFFDQimSVPLDNRWAVPDrQTÍ’YVíllJAVUTMVSKM'

130 140 150 160 170 190

190 200 210 220 230 240

457679 WSALHÍTOQMFQAHTPTLNFDTEFRODOTEMASIYQRF2YYQG1RSDKKITPDMIJ1KHLA

790 000 310 020 330 040

050 860 870 800 890 900 457676 RAP:<rrVLOHNDOLrtAVíCDKITQE3GYOPFEATKLKSADATLLSSDAPVMVMAKIQBQ®)

_ KAPEyrVIíQliríDtarHAVIíDKITQEEQYAFFEATKLKSAIJATtiSSnAPVMVMAKIQNDQL a&0 860 370 eso 090 900

910 920 930 94D 950 960 457676 TLSrVWDIJILyqgmkdqfdd kgn qiEVSVY"SRüWLTaesqstnstitvkgiwklttpq

_ TLSXVNPDLHXjVQGREKDQFDÜKGNQIEVSWSRHWLTAESQSTNSTITVKGIWKLT'TPQ 910 920 930 940 950 960

970 930 990

457676 PGVirKHHNJíHlTLirTTTrrQATPWTlTLVK

_ POTltKHHfO iKTLlTTTTIQATPÍVlNIjVK

970 980 990

SEQ ID NO: 28 Ácido nucleico condroltlnasa ABC I de la presente Invención gccaccagcaatcctgcatttgatcctaaaaatctgatgcagícagaaatttaiCcattttgcacaaaatafloccartagcagactGetca£c agataaaaactcaatactflajcgttatctgataaacgtagcattatgggaaaocaatctcttttatgga&atggaaaggtggtiigtagcttta ctttacataaaaaac'igaUEtccccaccgataaagaagcatctaaagcatggggacgctCAtccacccccgtlttctcaltttggctttac aatgaaflaaccgattgatggttatcttactaíjcgalttcggagaflflaHctcatttcaajccagtgagg!ctcaggcaggctttflflagtaaaart agattlcactggclggcgtactgtgggagtctctttaaataacgíitcttgañaatcgagagatgaccttaaargcaaccaatacctctEctg atggtactcaagacagcattgggcgactttaggtgctamgtcgaiagtattEgttttaaagpgiccttjctaatgtgagtcagggtgaaatc tatatcgaccgttótatguttctgticgatgatgcicgctaccaatggtctgattatcaagtaaflflactcgcttatcagaajcctgflaancaatt t¡cacaacgtaaagccacaactacctgtaacacctgaaaatxtagcggccattgatcttattcgccaacgtctaa[taatgaantgtcggag gtgaaaaagugacaaacctcgcattagaagagaatatcagcaaattaaaaagtga(ttcgatgG[ic[Matactcacactnagii;aaatg gtggaacg¡caagg¡cagBCatctEatcaiCtgataaacaaatcauaittatcaacoagagaatcttaactctcaagataaa)Caactatttgat anttatgttatttlaggtsaJifi.cacgacattaatgtttflatattagccgtgctt2tgtgctggaaaaagatcccacacaaaaggcgcaacLi aagcagatgtacttattaatgacaaagcatttattagatcaaggCtttgtta¡iagggagtgctttagtgaí:nacccatca£:tggggataca gtti:tegltggtíígtataitLccacgttattaatgtctg¡(tgcactflJiaí6gaagcgaacctacaaacccaagtttatgatil;atilií:[gtggtat tcacgtgagtttaaaagtagtutgatatgaaagtaagtgctgaitagcljctgatctagattatttcafltajccttatctcgccaaí:atttagcctt attactactagagcctgatgaiu:aaaagcgtatjcaajcttagttaatactctcag!ccattatatcactggcg!cattaacgcaagtgccaccgg gtggtaaagatggtuaceccctgatggtflcagcatggcgacatgaaggcüactaticcgggctacictttcccagcctilíJaaaatgcct etcagcttamautáttacgcgatacaccanucagtgggtgaaagtggttggaatagcctgaaaaaagcgatggtttcagcgtggatct a£agt&atccagaagttggattaccgcítgcagg¡iagaca£cctcttaBctca£Ctícgttaaaatcagtcgctcaaggctattactgg!Ct tgccatgtctgcaaaatcatcgcctgataaaacacttgcatctatttatcttgpgattagtgBtaaaacacaaaatgaatcaactgctattttt ggagaaactattacacc age gtcttt acoco aaggttlctatgcctttaaíggc ggtgcttttggtattcatcgttggcaagataaaarggtg acacLgaaagcttataaciiccaargtttggtcatctgaíLatttataacaíiíigataflccEltatggccgctaccaaagtcatggtgLcgGtca aatagigagtaatggctcgcagctttcacagggctatjcagcaagaaggttgggattggaatagaatgccaggggcaaccactatccac cttcctcttaaaga£ttagacagtcctaaacctcataccttaatgcaacgtggagflgcgtggatttagcggaacatcatcccttgaaggtc aatatggcatgatggeattcgatcttaUtatcccgccaarcttgagcgUttgaicctaatttcaetgcgaaaaagagígtattagccgctg ataacc acttaaEttttallggl a ge aal ataaata gta gt ga [¡wuiaal aa aaatgttgaiiacgacct (¡i ttcc aacat gcu atrae iccaac a Étaaataccc itt ggatt :ialg g ac Líaaagut agaaaaé at gcetl ntcaaac ¡rae ac etc aactLagg rgattggttaaf t gal agcüütg gcaRtggttacttaatEactcaagcagaaaaagtaaatgtaagtcgccaacatcaggtttcagcggaaaataaaaalcgceaaccgaca gaagganactttagctcggcatggatcgatjcacagcacTiCgccccaaagatgccagttatgagtaEatggtcttrrt.agfltgcgacacct gaaaaaatgggagagatggcacaaaaattccglgaaaataatgggtíatatcaggttcttjcgtaaggataasgacgttcatattiittcicg ataaactüagcaatgtaacgggatatgcottttatcagccagcatcaattgaagacaaatggatcaaaaoggtlaataaacctgcaattgt gatgaetcatcgaGaaaaagacactcttactgtoagtgcagttacacctgatttaaatatgHct(;gccaaaaagc:agcaactcctgtcacc 4itcaatgteacgartaatggcaaatgg¡caatctgctgai:aaaíLatagtgaagtgaaatatcaggtttctggtgataacactg&ajctg0cgt ttacgagtmctttggtuttccacaagaaatcaasctctcgccactecettga

SEQ ID NO; 29 Proteína condroitinasa ABC I do la presente invención

365019 ATS N PAFOPKN LMQSEi YHF AiQNN FLADFSSDKNSILTLS D KRSIMG NQSLLWKWKGGS5

M+ J i» .■ !* - ! * f +■ ■■■■■■*■* in a n ia

365019 FTLH KKJ.J VPTDKEASKAWGRS STP VF5F WLYN EKPlDGYLTl DFGEKLISTSEAQ AGFK 365019 VKLDFTG WRTVGVSLN N DLENREMTLNAT NTSS DGTQDSIGRSLG AKVDSF RFKAPS N VS 365019 ÜGEIY10RIMFSVDDARYQ WSDYQVKTRLSEP EIGFH NVKPQLPVTF EN LAAIDU RQRL 366019 ÍN EFVGGEKETN LALE E NISKLKSDFDALNTHTLANGGTGGRHLITDKQIIIYQ PENL N S 365019 QDKQCFD NYVILGNYTTLMFNISRAYVLÉKDPTGKAQLKQM YILMTKH LLDQGFVKGS AL 365019 VTT H M WG YSSRWWYIS7LLMSD ALKEANLQTQVYDSLL WYSREFKSSFDMKVS ADSSDLD 365019 YFNTLSRQHLALLLLEPDDQKRINLVNTFSHYITGALTQVPPGGKDGLRPDGTAWRHEGN 365019 YPGYSFPAFKNASOU YLLFt DTPFSVGESGWNSLKKAM VS AWt YSN P EVGLPLAG RHPLN 365019 S PSLKSVAQGYYWLftMSAKSS PDKTLASIYLAÍSDKTQNESTAIFGETITPASLPQGFYA 365019 FNGGAFGIHRWQ DKMVTLKAYNTMVWSS El YNKDN RYG RYQSHGVAQ fVSNGSQL5QGYQ 365019 GEGWDWNRMPG ATP HLPLKDL OS PKP HTLMGRG ERG FSGTSS LEGO YG MMAFDLJ YPAN 365019 LERFDPN FTAKKSVLAAD N hUFIGSN INS SD KNKNIVETTLFQHAIT PTLNTLW1NGQKI 365019 ENMPYQmaCK3DWUDSNGNGYUTQA£KVlWSRQHQVSAENKNRGPTEGNFSSAWLDH 365019 STRPKDASYEYMVFLDATPEKUGEMAQKFRENNGLYQVLRKOKDVHÜLDKLSNVTGYAF 365019 YQPAS IEDKWIKKVN KPAIVMTHRQ KDTUVSAVTP DLNMTRQKAATPVT1NVTING KWQ 365019 SADKNS EVKYGVSGDNTELTFTSYFGl PQ El KLSPLP

Proteína hialuronidasa 1, SEQ ID NO: 30, Locus HSU9Ó07S

Proteína liialuronidasa 2, SEQ ID NO: 31,

Proteína hialuronidasa 3, SEQ ZD NO: 32, Lúcu3 BC012S92

Proteína liialuronidasa 4, SEQ ID NO: 33, AFOQ90Í0

Proteína PH-20, SEQ ID NO: 34.

PéptidoTat SEQ ID NO: 35

ABCI un mulante específico de sitio designado H501a y Y508a SEQ ID NO: 36

SEQ ID NO: 37 Proteína condroitinasa ABCI Locus P59807

ORIGEN

1 mpififmla mtlgJIsapy namaatsnpa fdpknlmqse iyh/atjnnpl adfssdknsi

61 lthdkrsirn gnqsllwkwk ggssfílhkk iivptdkcas kawgrsstpv fsfwlynekp

121 idgyJtidfg eklistseaq agfkvkldft gwravgvsln ndlenremtl nátntósdgt 181 qdsigrsiga kvdsirfkap snvsqgeiyí drimfsvdda ryqwsdyqvk trisepciqf 24 i hnvkpqlpvt pert[aa:díi rqrtinefvg geketnlaie eni&klkidf óaJnilulan 301 ggtqgrhlil dkqüiyqpe nlnsqdkqlf dmyvilgnyt tlmfnisray vlckdptqka 361 qikqmyllml khlldqgfvk gsolvtthhw gyssiwwyis ülmsíMke anlqtqvydi 421 llwysiefks sfdmkvsads sdldyfntil pqhlaJllie pddqkiínlv ntfshyitga 481 ltqvppggkd glrpdgtawr hegnypgysf pafknasqli yllndtpfsv gtsgwnnlkk 541 amvsawiysfi pevglplagr hpfnspslks vaqgyywlam sakaspdktl asiylaisdk 601 tqnestaifg etitpaslpq gfyafnggaf gjhrwqdbnv dkayntnvw sseiynkdnr 661 ygryqshgvaqivsngsqls qgyqqegwdw nrtnegaitih Iplkdldspk phtlmqrger 721 gfsgtssleg qygmmafnli ypanleifdp nftakksvla adnhlifigü ninssdknkn 781 vetüfqhai tptlmlwin gqkienmpyq tllqqgdwli dsngngylit qaekvnvsrq 841 hqvsacttknr qptegjifssa wídhstrpkd asyeymvfld atpekmgema qkfrenngly 901 qvlrkdkdvh iildklsrm gyafyqpasi edkwikkvnk paivmthnqk dtlivsavtp 961 dlnmtxqkaa tpvtmvtin gkwqsadkns evkyqvsgdn tcltftsyfg ipqeikJspl 1021 pXX

SEQ ID NO: 38 NA2Ú A B O (A^Njoia), proteina

aqnnpt adfsadknai 61 ltlsdkrsirn gnqsilwkwk ggsaftlhkk livptdkeas kawcrsstpv fsfwlynekp 121 idgylüdfg eklistseaq agfkvkldñ gwravgv&ln ndlennemtl natntssdgt 181 qdaigrslga kvdsirfkap snvsqgeiyi drimfsvdda ryqwadyqvk trlsepeiqf 241 hnvkpqlpvt penlaaidli rqrlinefvg gekemlale enisklksdf dalnihllan 301 ggtqgrhlit dkqiiiyqpe nlnsqdkqlf dnyvilgnyt Ümfnisray vlekdptqka 361 qikqmyllmt khlldqgfvk gsalvtthhw gyssrwwyis tllmSdaJke anlqtqvyds 421 liw ynefb sfdmkvsads sdldyfntls rqhlalllle pddqkrinlv ntfshyitga 481 Itqvppggkd glipdgtawr hegoypgysf pafknasqlí yUrdtpfsv gesgwnnlkk 541 amvsawiysn pevglplagr hpfhspslks vaqgyywlam saksspdktl asiylaisdk 601 tqneataifg etitpaslpq gfyafnggaf gjhrwqdkmv Ükayntnvw s&dynkdtir 661 ygryqshgvaqivsngsqlsqgyqqegwdw nmegattih ipjkdidspk phtimqrger 721 gfsgtsaleg qygmmafnli ypanlerfdp nftakk&vla adnhlifigs nínssdknkn 781 vetllfqhai tptlnüwin gqkienmpyq ttlqqgdwli dangngyliL qaekvnvsrq S41 hqvsaenknr qptegnfsaa widhstrpkd asyeymvfld atpekmgema qkfrenngly 901 qvlrkdkdvh iildkJsnvt gyafyqpasi edkwikkvnk paivmthtqk dtlivsavtp 961 dlnmtrqkaa tpvtinvtin gkwqsadkns evkyqvsgdn teilftsyfg ipqeiklspl 1021 pXX ’

SEQ ID NO: 39 Proteína NAÓO ABCI (F^sj-N ^iou)

ftJhkk iivptdkeas kflwgrsstpv fifwlytiekp 121 idgyltidfg eklistseaq agfkvkldft gwravgvsln ndJenremÜ natntssdgt 1&1 qdsigrsiga kvdsirfkap srmqgeiyt drimfsvddaryqwsdyqvktrJisepeiqf 241 Knvlcpqlpvt penlaaidli rqrlinefvg gekelnJale eniskiksdf dalnihtlan 301 ggtqgriilit dkqíiivqpe itínsqdkqif dnyvilgnyt tlmfnismy vlekdpíqkíi 361 qlkqmylJmt khlldqgfvk gsalvtthhw gyssrwwyis tllniadalke anlqtqvyds 421 ¡Iwysrefks sfdmkvaads sdldyfntls rqhlalllíe pddqkrinlv ntfshyitga &1 Itqvppggkd glrpdgtawr hegnypgysf pafknasqli yllidtpfsv gesgwmiikk 541 amvsawiysn pevglplagr hpfn&pslks vaqgyywlam salcsspdktl asiyiaisdk 601 tqreetaifg etilpaslpq gfyafnggaf gihrwqdkmv tlkayntnvw SSeiyñkdnr

661 ygryqshgva qivsngaqls qgyqqegwdw nrmegattih Lplkdldspk phtlmqrger 721 gfsgtssleg qygmmafnli ypanlerfdp nftakksvla adnhlifigs ninssdknkn 7B1 vettlfqhai tptlntJwin gqkienmpyq ttlqqgdwli dsngngylit qaekvnvsrq 841 hqvsaenknr qptegnfssa widhstrpkd asyeymvfld atpekmgema qkfreimgly 901 qvlrkdkdvh i ildklanvt gyafyqpaai edkwikkvnk paivmthtqk dtlivaavtp 961 dinrntrqkaa tpvtmvtin gkwqsiidkns tvkyqvsgdn (eltftsyfg ipqciklspl 1021 pXX ~ ’ ’

SEQ ID NO, 40: Protena

■ NA60 CABO ABCI (Fu -A*a)

ftlhkk livptdkfias kawgrsstpv fsfwJvnekp 121 idgyltidfg eklistseaq agfkvkldft gwravgvsln ndlenrernti natr.tssdgt LSI qd&igrslga kvdsirfkap snvsqgeiyi dnmí'svdda. ryqwsdyqvk trlsepciqf 241 Knvkpqlpvt penlaaidli rqrlinefvg gcketnlale entsklksdf dalnihtlan 301 ggtqgrfilít dkqiiiyqpe nlnsqdkqlf dnyvilgnyt tlmfnisray vlekdptqka 361 qLkqmyUmt khlldqgfvk gsalvtthhw gyssfwwyia tllmsdalke atilqtqvyds 421 Uwy&refks sfdmkvsads sdldyfntls rqhlalllíe pddqkrinlv ntfshyitga 481 Itqvppggjcd glrpdgtawr hegnypgysf pafknasqli ylltdtpfsv gesgwnnlkk 541 amvsawtysn pevglplagr hpfhspslks vaqgyywlam saksspdktl asiylaisdk 601 tqnesiaifg eütpttslpq gfyafttggaf gihiwqdiánv tlkayntnvw sseíynkdnr 661 ygiyqshgva qivsngsqls qgyqqegwdw nrmegattih iplkdldapk phtlmqrger 721 gf&gtssleg qygmmafnli ypanlerfdp nftakksvla adnhlifigs ninssdknkn 781 vettlfqhai tptlntlwin gqkicnmpyq ttlqqgdwli d&ngngyiit qaekvnvarq S41 hqvsaenknr qptegnfssa widhatrpkd asyeymvlld atpekragema qkfnenngly 901 qvlrkdkdvh iildklanvt gyafyqpasi edkwikkvnk pa

SEQIDNO.41: I- Ácido nucleico para TAT-ABCI-nAÍO

1 ggtc gtaaaaagcg tcgtcaacgt cgtcgtcctc ctcaatgcgc acáaaataae 61 ccattagcag acttctcatc agataaaaac tcaatactaa cgrtatctga taaaegiagc 121 attatgggaa accaatctct tttatggaaa tggaaaggtg gta-gtagctt tactttacat 181 aaauaactga ttgtccccac cgat&aagaa gcatctaaag catggggacg cicatee ace 241 cccgttttct cattttggct tracaatgaa aaacceattg atggttatcí tactatcgat 301 ttcggagaaa aactcatttc aaccagrgag gctcaggcag gcmaaagt aaaattagat 361 Itcactggct ggegtactgt gggagtctct ttaaataacg atcttgaaaa tcgagagaig 421 accttaantg caaccaatac ctcclctgat ggtactcaag acagcattgg gcgttcCLta 481 ggtgctaaag tegatagtat tegttttaaa gcgccttcta algtgagtca gggtgáaatc 541 catatcgacc gtattatgtt ttctgtcgat gatgclcgct accaatggtc tgattaicaa 601 gtaaaaactc gcttatcaga acctgaaalt caatttcáca acgíaaagcc acaactacct 661 gtañcacctg aaaatttagc ggecattgal cttattcgcc aacgtctaat matgaattt 721 gtcggaggtg aaaaagágac aaacctcgca ttagaagaga atatcagcaa attaaaaagt 781 gatttcgatg ctcttaatac tcacacuta gcaaatggtg gaucgcaagg cagacatctg 841 aicactgata aacaaatcat tatttaícaa ccagagaatc ttaacfclca agat&aacaa 901 ctatugata attatgltal tttaggtaat tacacgacat taatglllaa laltagctgt 961 gcltatgtgc tggaüaaaga tcccacacaa aaggcgcaac taaagcagat gucUatta 1021 atgacaaagc atttattaga icaaggcitt gttaaaggga gtgcittagi gactiacecat 1081 cactggggat acagttcrcg ttggcggtat atttccacgl taüaatgtc rgatgcacta 1141 aaagaagega ¡icctacaaac tcaagtttat galle attac tgtggtattc acgtgagttt 1201 aaaagtagtt íígatatgaa agtaagtgct gatagetetg alctagatta tttcaatacc 1261 ttútcícgcc aacantagc detracta ctagugcctg atgatciaaa gcgtatcaac

1321 ttagnaata ctttcagcca Uatatcact ggcgcattaacgcaagtgcc accgggtggt

1381 aaagatggtt tacgocctga tggtacagca tggcgaqatg aaggceacta tccgggctac

1441 tcttlcccag ccttiaaaaa igcctctcag cttatttatt tatt&cgcga tacaocattt

1501 tcagtgggtg aaagtggttg gaatagcctg flüaaaflgcga tggutcagc gtggatctac

1561 agtaaíccag aagttggatt aucgcttgca ggaag&cacc ctcttaactc accttcgtta

1621 aaatcagtcg ctcaaggcta ttactggctt gccalgtctg caaaáteatc gcctgataaa

1681 acacttgcat ctaittatct tgegattagt gataaaaeac aaaatgaatc aactgctatt

1741 ttt&gagaaa cLaítacacc agcgtcttta cctcaaggtt tctatgcclt taaiggcggt

1 SO L gcttttggta ttcatcgttg gcaagataaa aiggtg&cac tgaaagctta taacaccaat

1861 gtttggtcat clgaaattta taacanagat aaccgttatg gccgttacca aagtcatggt

1921 gtcgctcaaa tagtgagtaa tggctcgcag cttteacagg gctatcagca agaaggttgg

1981 gattggaata gaatgccagg ggcasccact atccaccttc ctcttaaaga cttagacagt

2041 ccUiaflcttc ataccttaat gcaacgtgga gagcgtggat ttagcggaac atcatccctt

2101 gaaggtcaat atggcatgai ggcattcgat cttamatc ccgccaatct tgagcgtttt

2161 gatcctaatt tcaclgcgaa ¡¿aagagtgta ttagccgctg ataalcactt aatttu&tt

2221 ggtagcaaia taaatagtag tgataaaaat üaauatgltg aaacgacctt attccaacat

2281 gccBttflctc caacaltaaa laccclttgg attaatggac aaaagalaga uaacatgect

2341 tatcaaacaacacttcaaca aggtgaítgg ttaattgata gcaatggcaa tggttacíta

2401 attadcaag cagaaaaagt aaaigtaagt cgccaacatc agglttcagc ggaaaaíaaa

2461 aategscaac cgacagaagg aaactttagc tcggcatgga tcgatcacag cactcgcccc

2521 aaagatgcca gttatgagta tatggtcnt itagfltgcga cacctgaaaa aatgggagag

2581 atggcacaaa aattccgtga aaataatggg ttatatcagg ttcttcgtaa ggataaagac

2641 gttcatütta ttctcgama actcagcaat gtaacgggat atgcctttta tcagceagca

2701 tcaaugaag ac&aatggat caaaaaggtt aataaacctg caattgtgat gactcaícga

2761 caaaaagacacicttattgt cagtgcagtt acacctgatttaaataigac tcgccaaaaa

2821 gcagtLtáctc ctgtcaccal caatgtcacg attaatggca aatggcaatc tgctgataaa

28SI aatagígaag tgaaatatca ggtuctggt gatnacactg auctgacgtt tncgagttac

2941 ttrggtaLtc cacaagaaat caaacictcg ctactccctt ga .

SEQ ID NO, 42: II- Secuencia de aminoácido para TAT-ÁBCI-nA20;

grkkrrqjTrppqcaqnnpladfssdkiisi I tlsdkrsi mgnq si lwkwkggss ftlhkklivptdkjeas kawgrsstpvfsfw 1 ynekpidgy Itidfgekiis tseaqagfkvlddftgwrtvgv s| nndlcm,emtlnatntssdgtqdsi grs i gak vds i ríka psn v sqgei yidrimfs vddar yq wsdyq vktrlsepeiqfhn vkpqlp vtpen J aaidlinqrlinefvggeketn Ifllecnisk Iksdfd aln t htl an ggtqgrhlitjdkqiiiyqpeii Insqdkqlfdjiyvi I gnyttl mfnísray vlekdptqkaqlkqrnyllrntkhJJ dqgfv kgsal vtthh wgy as™ wyí s d línsdalkeanlqtq vydsll w y srefkssfdmkvsadssdl dyíntl srqhlal 11J epddqkr inl v ntfshy itgaltq vppggkdglrpdgtawrhegn y p gy afp afknasqli y llrdt pfs v gesgwnslkkam vsa wiy snp cvglp I agrh p¡ n spslks vaqgyywlams áksspdktlasiylaisdktqnestaj fgetitpaslpqgf yafnggal'gihrwqdk mvtlkaymnvw&seí ynkdnrygry qshg vaq i vsn gsqlsq gy q qe g wd wnmipgatti hipl kdldspkphtlmqrger gfs gt ssiegqygminafd! iypan] crfdpnftakks vlaadnhli figaninssdbiki] vettlfqhaitptlntiwingqkjenm pyqtilqqgdwlídsrtgngylitqaekvü vsrqhqv saenknrqplegnfssa wi dhstrpkdas y eym vfldatpí kmgema q kfncnngjyq vlrkdkdvhi ildlds n vtgyafyqpasiedk wi kkvn kpaivmthriqkdtlivsavtpdinmtriqkaatpvtin vti ngkwqsfldkusevkyqvsgdnteltftsyfgipqdk! splp

SEQ (D NO. 43; II. Secuencia de ácido nucleico para T A T “ABCI-n¿60: ggtc gUuiaaagc gtcgtt aac gtcgtcgtcctc ci caatgctttac tttac aiaaa aaacc gaUgtccccaccgat&â giiíigcateta aagcatgg ggacgctcafcc&c cocc gttttctottttggctttacaatgaaaaacc galtgatg ettatcttactatc gatttc g gagaaa aaccc atttcaaecagtga ggctc aggc aggerttaaa gínasai) ag ante actggc tggpgtact gtgggagtctc tttaaataacgat cttgimaai¡cgagagatgaiCCttaaatg]caajceaatacctcctEtgatggtactcaagacagcaJttgggcgtiEtttaggtgctaaagtcg ata gtattcgttttaaagc gccttctaatgtgagtcagggtgaaatctatatcgaccgtatiatgtttlc tglc gálgatgctcgctaccaatg gtotgattatcaagtaaaaactcgcttaicagaacctgaaattcaatilcacaacgtflaagcí;acaactacctgtaacHcctgaaaatttag c ggccattgatcttattc gccaac gtet aatmatgaattt gtcgg aggt gaaaaaga g ae aaacetc gcattag aagagaatatcagca aa(taa3aagtgat£tcgatgctcttaatactcacactttagcaaatggtggaacgca&ggcagacatctgatjcactgataaacaaiil:catt atttatcaaccagagaatcttaactcicaagat&aacaHiCtatttgfltaattHtgttaUttaggtaattacaegataitaatgtttaatattagc cgtgcttatgtgctggaaaaagatcccacacaaaaggcgcaactaaagcagatgtacttaitiiíifgflCJiaBgcatttattagatcaaggc mgttaaagggagtgctttagtgajcnacccatcajctggggatacagttc:tcg«ggtggtalLttil:cacgtiattaaígtctgatgcactaa üagaage ga acctac aaaetca agti tatgatteattac Igtggt attcac gtgagrttaaaagtagttttgataigaaa gt aagtgct gata gctcIgatEtagaítatttcaataccttatctcgccaacatttBgcctlattwotaciagagcctgatgalcilaaagcijIatcaflcitagttaat actitiagccaXtataticactggcgcattaflcgcaagtgccaccgggtggtaaagatggUlacgccctgatggtacagcatggcgacat gaaggcaactacccgggctactcttticccagcctttaaaafltgccticticagcttatttatttattacgcgatacaocatmicagtgggtgaa agíggttggaatagcd gaa aaaagcgatggtttc age gtggatctacagtaatccagaagttggattacegcttgcaggaagacac<;c látasete accttcgnaaaatcagtcgctcaaggetattactggcttgccatgtctgcaaaatc ate geccgataaaaeuacgcajtjctart tatcttgcgattagtgamaaacacaaaatgaatcaactgctattt:[tggagaaactattacajcc3gcgtctttacctjcaaggtttcta.tgcct ttaatggcggtgcttttggtatlcatcgCtggcaagataaaatggtgacactga&Bgcttataacaccaatgtttggtcatc£gaaatttaiaa eaíiagata accgtcatg ge c gttaccaaagt e atggtgtcgetc aaatagtgagtaatggctcgcagetttcacagggctatcagc aag aaggi:ggg&ttggafl.tagaatgccaggggcaaccactatccaccttcctettaaagaí:ttagacagtcctaflfl£ctcatflccltaalgc aac gtggagagcgtggaí ttagcggaacatcataccttgaaggtcaatatggcatgatggc attcgaxcttatttatccc gccaatcttgs gcgtmgatcctíiaLttcactgegaaaaagJigtgtattagccgctgataatcacttaatttttattggtageaata[aaatagtíigtgataaa ¡laLaaaafltgttgaaacgaccttetticcaBcatgccattaciJCcaacaitaaatacccittggauaatggacaaaagatagaaaacatgc c Uatcaaacaacacttcaae aaggtga LiggtLaaLtgatagcaa Lggcaatg gttaettaattac tcaage agaaaaagtaaat gtaagt c gee aacatcaggtttc-agcggaaaataaaaatt gccaacegac aga&ggaaactttagctc ggcatggatcgatcacagcactc ge cccaaagatgccagtLatgaglatatggU;tilttagatgcgacacctgaa¡iaaatgggagagaiggcacaflaflanccg]tgaaflataat gggttatatcag gtte tic gtaaggataaflgac gttcat altat'c te gataaae te agcaaí gtaaí: ggg atatgcaittaic agcca ec a teai)ttaaagfleaaatggatfaaaaagg(l¡«ilaaaectgcaattgtgatgactcatcgacaanaagacacccttaugtcag[gcagtEn eajcctgatttaaataigactcgccaaaaagcagcaactcctgtEaccfltcaatgtcacgattaatggcaaatggcaatetgctgataflfla atagtgaagtgaaüiatcaggtitctggtgataacaciigaactgacgtttacgagttactttggtattccacailgaaatcaaactctcgcca ctcccttga

SEQ ID NO.44: iv. Secuencia de aminoácido paraTAT*ABCI*nAi60

grkkrrqntppqc ftlhkkli vptdkeaska w gysatp vfsfwl yn ekpidgy Itidfgekii stseaqagfkvkldftgwrtvg va] n ndleruerntJnamtssdgtqdsi grsí gak vds i rfkapsti vsqgei yidrimfs vddary q w sdyq vk trísepeiq fhn v kp q Ipvtpenl aaidlirqrlinif vggjtkctnJ aJccn i skJksdfdal n thtl anggtq grhl ítdkq i i iyq pen] nsqdkq I fdn y vil gn y ttlmfhi sray vi ekdp [qk aq Ikqmy 11 mtkhlldqgfvkgsaí vtthh wgy ssrw wy ¡ stJ] msdalkeanlqtqvy da 11 w y srefkssfdink vsadssdldyfntlsnqh I al 1 IlepddqkrtTtl vntfshyitgaJtq vppggkdglrpdgtawriiegnypgy s fpafkrtasqli y llrdtpfavgesgwns 1 kkamv sawíysnpev gJplagiftp Jnsps Jksv aqgyyw larmaksspdktJasiy 1 aisdktqnjestaifgetitpaslpqgfyafn ggafgihrwqdkmvtíkayntnvw ssei ynkdnrygryqshgvaqi vsn gsq ]t qgyqqegwd^nrmpgatti h Ipl kdldspkpht] mqrgcTgfsgtsalegqyg mmafdiiypanlerfdpnftakksvJaadn h I i fi gsrin ssdknkn vettlfqhai tptintl wingqkien mpy qtt Jqqgdw I i dsn gngylíiqsekvnvsiqhqvsaenkrir qpttgnfssa widhstrpkdas y eym vfldatpekmgemaqkfrenngl yq v 1 rkdkd vh ¡ j IdkJ sn vtgy afyqpasi edk wi kkvnkpaivmthrqkdüi vsav tpd] nmtrqk aatpvtin vti ngkwqs adknsevkyq vsgdnteUftsyfgípqeiklsp lp

SEQ ID NO.45: V. Secuencia de nucleótido para ABCI*TAT-C:

gccaccagC aatcct ge atttgalcctaaflaaEctgatgc agí c ¡igaaalttaeealtttgc acaaaataac ccattagc agac ticte ate agatAaaaactcaacactaac gttatctgataaácgtagc attatpggaauccaatctcttttatggaaatggaaaggtggtagtflgcttta etttac aiUaaaaacígattgtcccc&cc gftiaaflgaagCÉíctaaagcatggggacgctc utccuccoccgttttctc sttttggctttac □atgoaaaacc gaUgalggttatcttactatc gattte ggagaaaaactcatttcaaccagtgaggctjcaggcaggctt1 aaagtaaaatt agatttcac tggct ggcgtact gtgggagtctc tttaaataac gatc 11 gaaaatc gagagat gaccttaaatgcaacc&atacctcc tetg atggtac1¡caagaca£eattgggcg|ttcUtagglgctaaagtcgatagtattcgttttaaagcgccttctHatgtgagtcagggtgaaatc tatatcgaccgtattatgttttctgtcgatgatgctcg!CtaocaatggtctgartatcaagLaüflaEijctcgcttatcagaacCtgaaattcaaU tjcacaacgTaaagccacaacliicctgtaacBCCtgaaaaatagcggccattgatcttattcgccaacgtctaattaatgaBtítgtcggag g[ga&fl4ag&gacaaacctcgcattHg3iagagHatatcag¡caaaitaaaaagJ:garttcgatgctcttaatajCtcaca£:tttagcaaatg gtggaacgcaaggcagacatctgatcactgataaacaaatcatMttaEcaaccagflgaatcttaactjctjcaagataaajcaactatttgat üattatgttatttta ggtaattacacgflcattaatgtttaatattagccgtgc ttatgtgctggaaaaagatcccac acaaaaggcgeaacta aagcagatgtflCttattaaigacaaagcatttattagat)caaggctttgttaaagggagtgctttaglgaciiBí:ccatcactggggataca gttctcgttggtggtatatttccacgttatlaatgtctgatgcactaaaagaflgcgBfloctBCflafflctEaagtttatgaticailBctgtggtHt tcacgtgagtttaaaagtíigttttgai;atgaaagtaagtgctgatagctctgatctagattatttcaataccttatctcgccaacatttagccn attactactagagcctgatgatcaaaagcgtatCMCttagttaatacmcagccattatEtcactggcgcattaacgcaagtgccací:gg gtggtaaagatggtttaEgccctgatggtacagcatggi;gHicatgaa-ggeaactatccgggciactctttcccagccutaaaaalgect etcage ttaitiatttattac gcgatac acc attttcagtgggtgaaagi ggttggaa tage e Egaaaaaagcgatggtttcagcgtggatcc acagiaai c c agaagtt ggatt sccgcttgca gg aagacacct te íiaae tcaccttc gttaaaatcagtc gctcaaggctaUactggct tgccatgtctgcaaaatcajfccgcctgataanacacttgcatEtatttatcttgcgattagtgataaaacac0aaatgaatcfiactgctattttt ggagaaacta[tacaccagcgtctttacctcaaggtitctfltgcctttaatggcggtgcUttggtattciit¡cgUggcaagataaaatggtg acactgaa¿igcttataaoaccafltgutggtcaEcteaaatttataflcaangataaccgrtatggccgttaccaaagtcatggtgtcgí:tca aaiagtgagtaatggctcgc agctttcacagggctatcagcaagaaggttgggflUggaaragaatgcc aggggcaaccactatccac cucetciiflaagacttagac agre era íuiecteauccttaatgcaacgtggagagvgtggatttiigcggaacateatcccttgflaggtc aaiatggcmgaiggcatEcgatcttatttatoccgccMtciEgagcgtmgatcctaatttcactgcgaaaaflgagtgtattagccgctg ataatcaettaattnLatigg[agcflatataaatagragtgataaaaataaaíiatgttgaaacgaccttariccaacatgccattactccaajC iLttaaatacCvtttggaLlaacggac.aaaagatagaaaacatgccttatcaaucaacacttcaacaaggtgattggttaattgatagcaatg gcautggttac ilaaiiac Ce aage agaaaaagtaaat gtaagtc gee aac atcag gtttcagc ggaaaata aaaatcgccaacc g aca gaaggaaactuagctc ggcalggaic gatcacagcactcgcccc oflEgatgccagtttttgagtatalggtcttrttagatgc gacacct gaaaasatgggagagatggcacaaaaattccgtgaaaataaitgggttataícaggttcttcgtaaggfltaaagacgttcatattattctcg ataaactcagc aai gi aacgggatatgccttttatca.gcc ageate aart gaagac aaatggaíc aaaaaggtEaatímcct ge aattgt gatgactcatjcgac¿]3aaagacucicttat[gccagtgcagttaca£(;LgatttaaaiatgactC£Ccaaaaagcag]C<jLactcctgtcfljcc atcaatgtcacgattaatgg!caaatggcaatjctgctgataaaaíiLagtgaAglgaaatatcaggttrctggtgutaacactgaajctgacgt ttac gagtiacttl ggtattce ae aagaaatc aaac bctcgccactcect

ggtc gtaaaaagcgtc gtcaac gt c gle a teclee re aatgc tag

SEQ ID NO. 46: V. Secuencia de aminoácido para ABCI-TAT-Ci

atsnpafdpJcnimqsei yhfaqn api adfisuknsi lt Isdkni m gnqsl I w kwkggs sítJhkJdi vptdke askaw grsstpv fsfwlyaekpidgyl lidfgcklisrMaqaglTívkldflgwnvgvg IniidlenremUnamtssdgtqdsi grs Jgakvdsi rfka ps ¡i v sqgeiyidrinifs vddaryqwsdyq vktrl sepeiqfhn vkpqlp v tpeni aaid lirqrli nefvggeketn! aleen i sklk sdfdalnthtlan ggtqgrhlitdkqiií yqpen Insqdkqlfdny viígn yttlmfnisráy vlekdptqkaqlkqmyJ Imtkh lid qgfv kgsalvtthhwgys snvwy i stilmsdalkeanlqtqv ydslJ w yarefkssfd mkvsadssd i d yfntlsrqhl al 11 lepd dqkrinl vntfsil yi tgal tqvppggkdglipdgta witiegn ypgysfpafknasc í i yllrdtpfs vgesg wns I kkamvsawi y snpe vgl plagrhplnsps I ks vaqgyy wlamsaksspdkt] asi yl nisdkrqncstaifgcti tpasl pqgfy afnggafgi hr wq dkm vdkayntn vwssei y nkdnry gryq shgvaqi vsngjq lsqgyqqeg wdwitrmpgatti hlpikdidspkphtlm qrgergfsgísslegq y gmmafdlj y pan lerfdpn ftakkavlaadnhJiíi gsni nssdknknvettlfqhai tptí ntlwin gqki enmpy qtt Jqqgd wl idsn gngy li tqaekvn vstqhqvs aenknrqptegnfssa w idhstrpkdasye ym vfldatpekm gpniaqíiíriennglyqv IfkdkdvhiildJdsnvtgyafyiqpssied kwikk wlcpaivmthfqkdtli vsavtpdJtimtrqkaa tpvtinvtingkwqsadlüVíevkyqvsgdnteltftByfgipqeiklspIpgrkJtnqnTppqc

SBQ ID NO. 47 Sectienda de nadeótido para condroitinasa ABCI-ná20

ge acaaaataac

61 ccattagcag iicttctcatc agataaaaac tcaatactíta cgttatctga taaaegtagc 121 attatgggaa acc aatctct tttatggaaa tggaaaggtg gtagtagctt tactttacat 181 Maaaactga ttgtcccc&c cgataaagaa geatcmaag catggggacg ctcatccaec 241 cccgttfíjct catlttggct ttac&atg&a aaaccgHUg atggttatct e&Clalcgac 301 rtcggugaaít aoctcatttc aaecagtgag getcaggeag gctttaaagt aaaattagat 361 ttcactgget ggcgtactgt gggagtctct ttaaataaeg atcttgaaaa tegagagatg 421 accrtaaatg caaccaatac ctcctctgat ggtactclag acagcuttgg gcgttcttta 431 ggtgetaaag tcgaíagtat tcgttttaaa gcgcí'ttcta atgtgagtca gggtgaaatc 541 tatatcgaec gtRitatgtí ttctgtcgat gatgeteget accaatggtc tgattatcaa 601 gtaaaaactc getuteaga acctgaaatt caatttcaca acgtaaagce acaactacct 661 gta&c&cctg aaaatttagc ggccattgat cnattcgcc oacgtctimt taatgaattt 721 gtcggaggtg aiiíiaagtigfic aaacctcgca ttagaagaga atatcagcaa attaaaaagt 731 gitttcgatg ctcttaatac tcacacttta gcaaatggtg caacgcaagg cag&calctg 841 atcacígata aacaaatcat tatúate aa ccagagaatc ttaactctca agataaaca& 901 ctstttgata attatgttat tttaggtaat (acacgacat taatgtttaa Lartagccgt

961 gpttatgtgc tggaaaaaga tcccacacaa aaggcgcaac taaagcagat gtac Italia 1021 atgajcaaagc atnattaga tcaaggcttt gttaaaggga gtgctttagt gacnacccat 1081 caetggggat acagttctcg ttggtggtat atttccacgt tattaatgtc tgatgeacta 1141 aaagaigcga acctacaaac tcaagtttat gattcattac tgtggtattc acgtgagttt 1201 aaaagtagtt itgatatgaü agtaágtgct gatagetetg atetagatta tttcaatacc 1261 ttatctcgcc aacattíagc cttattaeta ctagagcctg atgatcaaaa gegtatcaac 1321 tLagttaatfl ctttcagcca ttatatcact ggcgcauaa cgcaagtgcc accgggtggt 1381 aaagaiggtt tacgccctga iggtaeagca tggcgacatg aaggcaacta tccgggctac 1441 tetttoocag cctrtaaaaa tgectetcag cttattt&tt tattacgcgu taettccatu

1501 tcagtgggtg aaagtggttg gamagCCtg aasaaagCga tggtttcagc gtggatctae 1561 agtaatecag aagttgg&nt accgettgca ggaagacace ctcttaactc aceite gtta 1621 aaatcagtcg ctcaaggcta tiaetggctt gccatgtctg caaaatcatc gcctgataaa 1681 acacttgcat ctatttabct tgcgBttagt gutaaaacac aaaatgaaic aactgctatt 1741 tilggagaaa ctattacacc age gtc tita ccteaaggtt tetatgeett laatggcggt 1801 gcrtttggta ttcatcgttg gcaagataaa atggtgacac tgaaagctta taacaccaat 1861 gtttggtcat ctgauattta taacaaagat aaccgttatg gccgttacca aagtcatggt 1921 gtcgctcaaa tagtgagtaa tggctcgtag etttcacagg gcCatcagca agaaggítgg 1981 gertggaata gaatgccagg ggcaaccact Eitcc aceite etettaaaga cttagacagt 2041 eciaaacctc ataccttaat gcaacgtgga gagcgtggat ttagcggaac atcacccctt 2101 gaaggtcáat atggcatgüt ggeattega: cttatúate ccgccaatct tgagcgttct 2161 gaicctaatt tcactgcgaa aaagagtgta ttagccgctg ataalcactt aarttttau

2221 ggtagcaata taaatagtag tgataaaaat aaaaatgttg anaegaectt attccaacat 2281 gocattaetc eaacattaaa jaecenigg attaatggae aaaagataga aaacatgcct 2341 talcaaacaa cacttcaaca aggtgattgg raattgtita geaatggcaa tggttactta 2401 attactcaag cagaaaaagt aaatgtaagl cgeeaacaic aggtttcage ggaaaalaaa 2461 aatcgccaae cgacagaagg aaaetttagc teggcatgga tcgateacag cáete gtx:cc 2521 aaagatgcca gttatgagta tatggtcttt itagatgcga caccigaaaa aatgggagag 2581 atggcacaaa aattccgtga aaataatggg ttaiatcagg ttcttcgtaa ggataaagac

2641 gtrcatatta ttctcgaiaa actcagcaat gtaacgggat atgcctttta tcagccagca 2701 tcaattgaag acaaatggat caaaaaggtl aaüiüücctg caattgtgat gacteatcga 2761 Cáaáaagaca ctcttattgt cagtgcagtt ScacClgatt taaatatgsc tcgccaaaaa 2821 gcagcaactc ctgtcaccat caatgtcacg attaat&gca aatggcaatc tgctgataaa 2881 aatflgtgaag tgaaatatca ggtttctggt gataacacLg aactg&egtt tacgagttac 2941 tttggtattc cacaagaaat caaactctcg ccactccctt ga

SEQ lO NO, 48: III. Secuencia de ácido nucleico para ABCI-nAóO:

tttactttac ataaaaaactgattgtcüccac cgaiaaagaagcatctiaaec atggggac gcteaiccacccccgtttfctcaanggctt tacaatgaaaaaccgattgatggttajtcttactatcgat]tjtjcggngaaaflactcatttciiaccagtgaggctcaggcaggctttaaagtaa afl(iflgatttcflctggctggcgíactgtgggagtctcntaaataacgatjctrgaaaatcgagagaigaccttaaatgcaaccaatacctcc tctgatggtactcaa£acagcattggg¡i:gUCEttaggtgctaaagtcgatagtfltrjcgtmaaag)cgccitctaatgtgagtcagggtga aatctataccgBiccgtattatgCtttctgtcgaigatgctcgctaccaatggtctgattaticaagtaaaaactcgcUJitcagaacctgaaaitt eaatucac aaegtaaagccacaactacc (gtaacacc rgaaaattt ageggcc augatgttattcgcc aacgic Laartaat gaatugtc ggaggtgaaaaagagaCDaacctcgcauagaagagaatatcagcaaattaaaaagtgautcgatgctcttaíiíactcaicaiCtnagca aatggtggAacgcaaggcagacslclgStcactgBtaAAcaaatcattatttaicaaccag&gBaidlflflCtctcaAgaCuucaactaj ttgataattatgnattnaggtaattacacgacattaatgtttaatattagccgtgc;ttatgtgctggMaaagatc:ccacacaaaaggcgca ¿rctaaagcagatgta<Cttatta&tgiLcaaagcatttattagatjcaaggctttgttaaaggg&gtgctttagtgacnacccatcac.tggggat acagitctegUggtggtatflmccacgttattaatgtctga£gcactaaaagaagcgaacciacHflactcaagttiatEattcat[act£tg glatlcacgcgaglttaüaagíagtittgatatgaaagiaagigctgatagcrctgatctagattaittcaütaccttatclcgccímcatEtag Ccttattacxactagagcctgatgatcaaaagcgtatcaacuagnaatacutcagccattatatcactggcgcat^iacgcaagtg!ccac cgggLggtaaagatggtitacgccctgatggtücagLatggcgacatgaaggcaactatccgggctjictcttícccagcctttaaüaat gtttictcagcttatttantattacgcgatacaccamtcagtgggtgaaagLggttggaamgcctgaaaaaagcgatggttticagcgtg gafe lacagtaalCCagaagtfggattaccgî tgicaggaagacajccctC ttaacteac ette gttaaaalcagtcgetcaaggytuüact ggfftgccatgtctgcaaaatcatcgcctgataüaacacttgc ateta tita te ttgcgattagtgataaa&c&caaaatgaatcaactgcta tttttggagaaaclattacaccag)Cgfc ttt&cctcaaggtttc tatgcctttaatggc ggtgcttttggtattc atcgttggeaagataaaatg gtgacajctgaaagcttataacaccaatgtttggtcatotgaaatttatfiacaaagataaccgtt^tggccgttaccaaagtcatggtgtcgc [caaatagtgagtaatggictjcgc agettte acagggctatcagc aagaaggttgggattggaatagaatg¡ccaggggc aaccactatc caccttcctcttaaagacttagacagtcctaaacctcamccttaatgcaacgtggagagogtggatttagcggaacatcaiicccitgaag gtcaatatggcalgátgg!C#tticgatjtUatttatcccgccaatcltgagCgLttlguU;i;taattt£actgcgaaaaagagcglattagccg ctgataaücíicttaatttttaitggtagoaacacaajicagtagtgataiiaaataaaaatgttgaaacgaccttmccaasatgccarractcc aacHttaaatacccttrggattaatggacaaíiagatagaaaacatgccttatcaaacaacajCtGcaacaaggtgHttggttaatrgatagc aaLggcaatggttaclLiiaLtactcaflgcagaaaaaglaafltgtflagtcgccaacarcaggiíícagcggaíLflataaaaalcgccaacc gacagaaggaaac tttagctc ggcatggatjcgatcacagcactcgccccaaagatgcc agltatgagtatatggtetnttagatgcgac acctgaaaaaatgggagaga[ggcacaaaaattccgig&ttataaEgggttntatcaggttctfjcgtaaggataaagacgttcatattatt ctcgaiaaaccc age aatgt aacgggatatgcctttt alcagcc agc-atcaattgaagacaaatg@aicaaaaaggttaataaaccrgca altgtgatgactcatcgacaaflflflgflcacícttartgícflgtgcagttacajcctgatttaaatatgactcgccaaaaagcagcflactcctgt caiccatcaatgtcacgattaatggcaaatggcaatctgctgataaaaatagtgaagtgnaataticaggtttictggigataacactgaaccg acgrttacgagtractttggfattceaeaagíiaatcaaacrctcgccaetcectfga

SEQ ID NO, 49: Secuencia de ácido nucleico para TAT

ggtcgtaaaaagcgtcgtcaacgtcgtcgtjccccctcaatgí:

(SEQ ID NO, 50) Secuencia de aminoácido para un péptidoTAT

grkkiiqiu'ppqc

Claims (6)

REIVINDICACIONES

1. Una composición que comprende:

un polipéptido que comprende un dominio de degradación de proteoglicanos y un dominio que promueve la regeneración neural, en el que el dominio que promueve la regeneración neural es NgR²⁷-³¹¹.

2. La composición de la reivindicación 1, en la que el dominio de degradación de proteoglicanos se selecciona de condroitinasa ABC I, condroitinasa ABC II, condroitinasa AC, condroitinasa B, hialuronidasa 1, hialuronidasa 2, hialuronidasa 3, hialuronidasa 4 y PH20.

3. La composición de la reivindicación 1, en la que el dominio de degradación de proteoglicanos y el dominio que promueve la regeneración neural están unidos por un péptido enlazante.

4. La composición de la reivindicación 3, en la que el polipéptido enlazante comprende una secuencia seleccionada del grupo que consiste en enlazantes ricos en Gly-Gly-Gly- Gly-Gly, Gly-Gly-Ala-Gly-Gly, Gly/Ser, y enlazantes ricos en Gly/Ala.

5. La composición de la reivindicación 1, en la que el dominio de degradación de proteoglicanos es condroitinasa ABC I, y el dominio que promueve la regeneración neural es NgR²⁷-³¹¹.

6. La composición de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, que comprende además un excipiente farmacéuticamente aceptable.