ES2638819T3 - Proteínas de fusión para el tratamiento del SNC - Google Patents

Abstract

Una composición que comprende: un polipéptido que comprende un dominio de transducción de la proteína TAT y un mutante por deleción de condroitinasa ABC I, en donde el dominio de transducción de la proteína TAT está anclado al extremo N del mutante por deleción de condroitinasa ABC I y el mutante por deleción de condroitinasa ABC I se selecciona entre SEQ ID NO: 2 y SEQ ID NO: 3.

Description

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DESCRIPCION

Protemas de fusion para el tratamiento del SNC Antecedentes y compendio

La lesion de la medula espinal (LME) inflige trauma a las celulas y tejidos del sistema nervioso central (SNC) y provoca una afeccion grave y debilitante en el individuo. Tras la LME, la regeneracion limitada de las neuronas lesionadas da como resultado una incapacidad permanente caracterizada por cierta perdida de sensibilidad, paralisis y disfuncion autonoma. Una de las razones por las que las neuronas no se regeneran es su incapacidad para atravesar la cicatriz glial que se desarrolla despues de la LME. Esta cicatriz glial contiene moleculas de matriz extracelular que incluyen proteoglicanos de sulfato de condroitina (PGSC). Estudios in vitro muestran que las neuronas no logran extender los procesos a lo largo de las superficies recubiertas con PGSC, mientras que los datos in vivo correlacionan el fracaso de la regeneracion con las zonas de expresion de PGSC. En la mielina del sistema nervioso central (SNC) adulto, tambien se han identificado varios compuestos inhibidores del crecimiento del axon como la glicoprotema asociada a la mielina (MAG), OMgp, y Reticulon 4 o Nogo que se ha demostrado que son inhibidores del crecimiento de las neuronas.

La enzima de degradacion de proteoglicano, la condroitinasa ABC tipo I (SEQ ID NO: X) se ha utilizado para potenciar el crecimiento neuronal en un modelo de lesion de la columna dorsal de dano de la medula espinal. Tambien se ha informado que el tratamiento de una lesion de la medula espinal con antagonista del receptor de NOGO promueve cierto grado limitado de regeneracion neuronal. Se ha informado adicionalmente que la creacion de un raton con el gen NOGO desactivado daba como resultado ciertos grados limitados e incoherentes de regeneracion neuronal despues de la hemiseccion dorsal de la medula espinal.

Los tratamientos experimentales para la lesion del SNC han utilizado la aplicacion de condroitinasa al espacio extracelular, sin embargo la enzima digiere la PGSC en la matriz extracelular y no las reservas intracelulares. Ademas, la difusion de la condroitinasa dentro del parenquima, el tejido esencial y distintivo de un organo o un crecimiento anormal que se distingue de su armazon de soporte) o entre los compartimentos anatomicos es limitada. El acceso limitado de farmacos, agentes de formacion de imagenes y anestesicos, etc., a las celulas y/o tejidos del Sistema Nervioso Central (SNC) puede reducir la utilidad o eficacia de cualquiera de estas sustancias.

El suministro de moleculas terapeuticas y de diagnostico a celulas y tejidos depende, en parte, de matrices extracelulares, asf como de los carbohidratos y las protemas ligados a las membranas celulares. La matriz extracelular esta compuesta en parte por proteoglicanos, entre ellos los proteoglicanos de sulfato de condroitina (PGSC). Los PGSC son una familia de proteoglicanos compuestos por una protema nucleo y glicosaminoglicanos sulfatados ligados covalentemente. Cada proteoglicano esta determinado por las cadenas laterales de glicosaminoglicano. Para los PGSC estas cadenas laterales se componen de aproximadamente 40 a 100 disacaridos sulfatados compuestos por sulfatos de condroitina 4, 6 y de dermatan. El componente proteico del PGSC se sintetiza ribosomicamente y la glicosilacion se produce en el retmulo endoplasmico y en el aparato de Golgi. Las cadenas de azucares se sulfatan a continuacion en las posiciones 4 o 6 por medio de diversas glicosaminoglicano sulfotransferasas.

Se pueden utilizar protemas de transduccion para transportar cargas de polipeptidos y polinucleotidos a traves de barreras anatomicas y al interior de las celulas. Por ejemplo, la protema TAT del virus de la inmunodeficiencia humana (VIH) contiene un dominio de transduccion de protemas ("PTD" en sus siglas en ingles) que esta implicado en la transduccion del VIH a las celulas. El PTD contiene un dominio de 11 aminoacidos (Peptido TAT) que es responsable de la actividad del PTD. El Peptido TAT se puede unir a protemas y facilitar la transduccion de las protemas a las celulas. El mecanismo de transduccion es independiente del peso molecular o de las propiedades qmmicas de las protemas que estan ligadas al Peptido TAT. Los estudios in vivo muestran que si una protema de fusion consistente en el Peptido TAT ligado a la enzima de 120 kd, la beta-galactosidasa (p-Gal), se inyecta a ratones, se observa un suministro robusto de p-Gal a una amplia variedad de celulas. Cuando se urna al peptido de transduccion TAT, se observaba actividad p-Gal en el cerebro; sin el peptido TAT, no se observaba p-Gal en el cerebro. El transporte a traves de la barrera hematoencefalica se restringe normalmente a ciertas moleculas pequenas hidrofobas y peptidos lipofilos de bajo peso molecular concretos. El transporte de protemas tan grandes como p-Gal al cerebro no suele ser posible sin una interrupcion sustancial de la barrera hematoencefalica, pero el Peptido TAT facilita el transporte a la vez que deja intacta la barrera hematoencefalica.

Las protemas quimericas, tambien denominadas protemas de fusion, son protemas hnbridas que combinan al menos partes de dos o mas protemas o polipeptidos precursores. Las protemas quimericas pueden ser producidas mediante tecnologfa recombinante, es decir, mediante la fusion de al menos una parte de la secuencia codificante de un gen con al menos una parte de la secuencia codificante de otro gen. El gen fusionado se puede utilizar a continuacion para transformar un organismo adecuado que expresa en ese caso la protema de fusion.

En Tat Peptide Complexes, Frankel et al. (Patentes de los Estados Unidos 5.804.604; 5.747.641; 5.674.980; 5.670.617; 5.652.122) describen el uso de peptidos Tat para transportar moleculas de carga biologicamente activas ligadas covalentemente al citoplasma y los nucleos de las celulas. Frankel solo describe moleculas de carga ligados

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covalentemente que son (terapeuticas, diagnosticas o profilacticas), y no ilustra ni sugiere el anclaje de moleculas que facilitan la difusion, la plasticidad, el crecimiento de las neuritas y la regeneracion del axon. Estas moleculas pueden incluir, pero no se limitan a, moleculas que superan la inhibicion del crecimiento de las neuritas o promueven el crecimiento nervioso tales como antagonistas de NOGO solubles como NgR27-3ii, moleculas de adherencia de celulas neurales como Li, factores neurotroficos, factores de crecimiento, inhibidores de fosfodiesterasa e inhibidores de MAG o MOG. Adicionalmente, se pueden combinar los mutantes por delecion con otros compuestos que promueven la remielinizacion tales como las neurregulinas (GGF2) y los anticuerpos que promueven la remielinizacion, o las moleculas que degradan los proteoglicanos a peptidos Tat.

La regeneracion despues de la LME es limitada debido a una variedad de obstaculos que incluyen el deposito de PGSC en la cicatriz glial, la desmielinizacion de los axones, la falta de apoyo trofico y la falta de orientacion axonal. Una sola terapia dirigida contra un aspecto de la LME puede no ser tan eficaz como un enfoque combinatorio. Las protemas de fusion con condroitinasa permitiran la terapia combinatoria con una sola protema. Los companeros de fusion para la condroitinasa que se construiran en esta propuesta se eligieron entre las protemas que tienen evidencia de eficacia en la LME.

El uso de una molecula que tiene la capacidad tanto de degradar las glicoprotemas de la matriz extracelular como de bloquear o superar la naturaleza inhibidora de los componentes de la mielina se puede emplear para mejorar la capacidad de las neuronas danadas para crecer o regenerarse en comparacion con cualquiera de los tratamientos solo. Las moleculas de degradacion de proteoglicanos se pueden utilizar tambien ventajosamente para proporcionar un metodo para facilitar el acceso y la difusion de sustancias a celulas o tejidos mediante el uso de al menos una enzima capaz de escindir los proteoglicanos y preferiblemente de degradar proteoglicanos de sulfato de condroitina (PGSC).

De acuerdo con el primer aspecto de la presente invencion, se proporcionan composiciones que comprenden un polipeptido que comprende un dominio de transduccion de la protema TAT y un mutante por delecion de la condroitinasa ABC 1, en donde el dominio de transduccion de la protema TAT esta anclado al extremo N del mutante por delecion de condroitinasa ABC 1 y el mutante por delecion de condroitinasa ABC 1 se selecciona entre SEQ ID NO: 2 y SEQ ID NO: 3. Las realizaciones de la presente invencion incluyen por lo tanto composiciones que comprenden polipeptidos que escinden proteoglicanos, opcionalmente las composiciones pueden comprender adicionalmente polipeptidos que bloquean y/o superan la actividad de las moleculas inhibidoras del crecimiento neuronal. Las composiciones tambien incluyen moleculas para la transduccion de los polipeptidos a traves de las membranas celulares y de la barrera hematoencefalica. Las composiciones se pueden utilizar en el tratamiento de las lesiones de la medula espinal y trastornos relacionados del sistema nervioso central (SNC). Las composiciones se pueden utilizar en la regeneracion de tejido neurologico danado y facilitar la difusion y el transporte de las moleculas terapeuticas capaces de bloquear y/o superar la actividad de la molecula inhibidora del crecimiento neuronal en el tejido enfermo o danado.

Las realizaciones de la presente invencion incluyen composiciones que facilitan el suministro y la difusion de agentes terapeuticos o de diagnostico, y preferiblemente agentes que promueven la regeneracion de nervios y axones, en celulas o tejidos. La composicion incluye el uso de una enzima capaz de escindir los proteoglicanos de sulfato de condroitina (PGSC) para aumentar la difusion de estos agentes a celulas o tejidos del sistema nervioso central.

Las composiciones de la presente invencion comprenden protemas quimericas o de fusion que pueden ser susceptibles de uso sistemico en el tratamiento de lesiones de la medula espinal y trastornos relacionados del sistema nervioso central (SNC), y en particular, protemas de fusion capaces de atravesar la barrera hematoencefalica. La protema de fusion incluye un dominio de transduccion de polipeptidos, un dominio de polipeptido capaz de escindir un proteoglicano de sulfato de condroitina (PGSC), y opcionalmente un dominio de polipeptido que bloquea y/o supera la actividad de las moleculas inhibidoras del crecimiento neuronal, todos los cuales se pueden utilizar en el tratamiento de lesiones de la medula espinal y trastornos relacionados del sistema nervioso central (SNC). Los diversos dominios de polipeptidos pueden estar ligados o unidos qmmicamente entre sf por conectores polipeptfdicos.

Tambien se contemplan los polinucleotidos que codifican las protemas quimericas o de fusion susceptibles de uso sistemico en el tratamiento de lesiones de la medula espinal y trastornos relacionados del sistema nervioso central (SNC) y, en particular, codifican protemas de fusion capaces de atravesar la barrera hematoencefalica. Los polinucleotidos que codifican estas protemas quimericas o de fusion pueden incluir un dominio polinucleotfdico que codifica un dominio de transduccion de polipeptidos, un dominio polinucleotfdico que codifica un dominio de polipeptido capaz de degradar un proteoglicano, preferiblemente escindiendo un proteoglicano de sulfato de condroitina (PGSC), un dominio de polinucleotido que codifica un dominio de polipeptido que bloquea y/o supera la actividad de moleculas inhibidoras del crecimiento neuronal, o cualquier combinacion de estos dominios que pueda ser utilizada en el tratamiento de las lesiones de la medula espinal y trastornos relacionados del sistema nervioso central (SNC). El polinucleotido tambien incluye uno o mas dominios de polinucleotidos que codifican polipeptidos que conectan los dominios del polipeptido entre sf para formar la protema de fusion.

Una realizacion de la presente invencion es una composicion de acuerdo con el primer aspecto que facilita el acceso y la distribucion del agente terapeutico y de diagnostico de la composicion a las celulas, a traves de membranas o a

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los tejidos mediante el uso de la enzima capaz de escindir los PGSC. Las moleculas o agentes de la composicion pueden incluir uno o mas factores de crecimiento, incluyendo Factor neurotrofico derivado del cerebro, Factor de crecimiento de tipo insulmico, Factor de crecimiento de fibroblastos, Factor neurotrofico ciliar, Factor neurotrofico derivado de glia, Factor de crecimiento transformante, Factor de crecimiento glial 2, L1, GM1, Factor de crecimiento endotelial vascular, Factor de crecimiento nervioso, Inmunofilinas. Las moleculas de la composicion pueden incluir agentes fluorescentes o de contraste para la formacion de imagenes. Los agentes pueden incluir celulas para celulas madre de trasplante, neuronas, otras, celulas como agentes de suministro, agentes quimioterapeuticos, antibioticos, terapias con anticuerpos, antagonistas del receptor de Nogo, otras enzimas condroitinasas. La protema de fusion puede facilitar el transporte o modificar el transporte de tales agentes a celulas, tejidos, y/u otras localizaciones inaccesibles; y/o potenciar las tasas de penetracion, distancia de penetracion; o proporcionar una distribucion de la concentracion mas uniforme. El transporte modificado se produce mediante el uso de al menos una enzima capaz de escindir PGSC. Las composiciones se pueden utilizar para tratar una lesion del SNC, preferiblemente la composicion se utiliza en el tratamiento del dano neuronal por una lesion por contusion.

Se contemplan protemas quimericas de un dominio de degradacion de proteoglicanos ligado a un polipeptido que bloquea la accion de los inhibidores del crecimiento neuronal tales como, pero no limitados a, un dominio antagonista del receptor de Nogo (NgR27-3ii) o una variante ligada a una condroitinasa como la Condroitinasa ABC 1 o una variante de condroitinasa que tiene uno o mas aminoacidos N terminales suprimidos. El compuesto puede incluir protemas quimericas de un dominio de degradacion de proteoglicano unido a un polipeptido que es un promotor de adherencia de celulas neurales tal como un dominio promotor de la adherencia de celulas neurales Li o una variante ligada a condroitinasa ABC 1 o una variante de condroitinasa que tiene uno o mas aminoacidos N terminales suprimidos. Las protemas quimericas pueden incluir protemas quimericas de un domino de degradacion de proteoglicanos ligado a un polipeptido que es un estimulador de las celulas gliales, tal como, pero no limitado a, un estimulador de celulas gliales GGF2 o una variante ligada a condroitinasa ABC 1 o una variante de condroitinasa que tiene uno o mas aminoacidos N terminales suprimidos.

Se puede utilizar un sistema de expresion recombinante de E. coli y un proceso de purificacion para producir condroitinasa ABCI esencialmente pura y catalfticamente activa. Estos metodos se pueden modificar para producir quimeras de moleculas de degradacion de proteoglicanos y otros agentes.

La quimera se puede analizar para determinar la actividad enzimatica de la condroitinasa y la actividad biologica espedfica de cada companero de fusion. Los metodos para medir las actividades de la quimera pueden ser modificados para aquellos utilizados para medir la actividad condroitinasa, incluyendo un analisis espectrofotometrico, zimograffa, un analisis de HPLC para detectar productos de digestion de disacaridos PGSC y un analisis de crecimiento de neuritas in vitro. Se puede utilizar un analisis de colapso de cono de crecimiento de neuronas para evaluar los antagonistas de receptores de NOGO y se puede utilizar un analisis de crecimiento de neurita para medir la actividad de Li. La actividad de GGF2 se puede medir utilizando un analisis de proliferacion de celulas de Schwann.

Las composiciones de la presente invencion se pueden utilizar para el tratamiento de lesiones de la medula espinal y en la promocion de la regeneracion de axones. Las composiciones de la presente invencion tambien se pueden utilizar para promover la plasticidad, el re-crecimiento, la reparacion y/o la regeneracion de neuronas disfuncionales en el SNC que han sido danadas como resultado de una enfermedad, tales como las enfermedades degenerativas incluyendo la enfermedad de Alzheimer y de Parkinson. Ventajosamente, el uso de polipeptidos de degradacion de proteoglicanos y polipeptidos transductores de membrana en las composiciones de la presente invencion tambien promueve la difusion y el acceso del tejido danado o enfermo a otros agentes terapeuticos que promueven la regeneracion de neuronas.

Descripcion de los dibujos

El expediente de esta patente contiene al menos un dibujo/fotograffa ejecutados en color. Las copias de esta patente con dibujos/fotograffas en color seran proporcionados por la Oficina mediante peticion y pago de la tasa necesaria.

En parte, seran evidentes otros aspectos, caractensticas, beneficios y ventajas de las realizaciones de la presente invencion con respecto a la siguiente descripcion, reivindicaciones adjuntas y dibujos adjuntos en los que:

La FIG. 1 es un ejemplo ilustrativo de un constructo de TAT-condroitinasa ABCI; la secuencia de ADN para todo el fragmento genico fusionada con la secuencia de Tat seguida del conector de 5-glicina; los oligonucleotidos efectores y antisentido que tienen las secuencias como 5'-tatgtatggtc gtaaaaagcgtc gtcaacgtcgtcgtgg tggtggtggtca-3' y 5'-tatgaccaccaccaccaccacgac gacgttgacgac gcttttt acgaccataca-3' se re- asociaron y se ligaron en el sitio Ndel que esta en el extremo 5' del gen ABCI clonado en pET15b (Novagen) en los sitios NdeI y BamHI. La secuencia del peptido Tat48 s7 (GRKKRRQRR) esta unida con la secuencia de ABCI por un conector de pentaglicina.

La FIG. 2 son imagenes de secciones de cerebro; (I) que ilustran lobulos de rata adulta que se incubaron en beta-galactodidasa sola (B & D), o con la adicion de Coindroitinasa ABCI (A, 0,5 U/ml o C, 0,005 U/ml); (II) penetracion de eosina Y a traves de la corteza de un hemisferio cerebral tratado con Coindroitinasa y control

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que muestra aproximadamente la misma penetracion, la eosina Y es un zwiterion, que tiene una carga negativa global al pH bajo al que se utilizo, y es de 692 kDa; (III) Una solucion saturada de Rojo Congo muestra una mayor penetracion a traves de la corteza de un hemisferio cerebral tratado con condroitinasa en comparacion con el cerebro no tratado, el Rojo Congo es un colorante cargado negativamente de 697 kDa;

La FIG. 3 (A) es un diagrama que representa la protema GGF completa (GGF2-M1-E422) y los tres fragmentos de GGF2 que contienen los dominios Ig y EGF solos y combinados; (B) una presentacion esquematica de protemas quimericas de una molecula de degradacion de proteoglicano como condroitinasa ABCI y una isoforma gGF2 del gen de neurregulina 1;

La FIG. 4 ilustra la estructura de (A) una protema quimerica de NgR27-3ii-condroitinasa ABCI N-terminal con y sin un grupo espaciador o conector peptfdico; (B) una protema quimerica de NgR27-3ii-condroitinasa ABCI C- terminal con y sin un grupo espaciador o conector peptfdico; (C) una protema quimerica de dominio extracelular Li y condroitinasa ABCI N-terminal con y si, un peptido espaciador o conector; (D) una protema quimerica de dominio extracelular Li y condroitinasa ABCI C-terminal con y sin un peptido espaciador o conector.

FIG. 5 (A) puntuaciones BBB de animales con lesiones en la medula espinal tratados con condroitinasa (Condroitinasa ABC I), penicilinasa o fluido cerebroespinal artificial (aFCE); (B) Secciones parasagitales de las medulas espinales de animales lesionados tratados con condroitinasa (columna izquierda) o penicilinasa (columna derecha). Las secciones se cortaron a 30 micras. Cada conjunto de imagenes contiene cuatro secciones parasagitales realineadas con la medula rostral a la izquierda y la medula caudal a la derecha. La seccion mas central de cada conjunto se ha eliminado y se ha reemplazado a continuacion para facilitar la visualizacion. Los pares de imagenes de degeneracion neuronal estan tenidos con Weil, anti-GFAP y un colorante aminocuprico (de arriba hacia abajo). (C) y (D) Distribucion de las puntuaciones individuales BBB de acuerdo con el grupo de tratamiento. Las puntuaciones son puntuaciones BBB a las diez semanas de la cirugfa. Los promedios de grupo se muestran debajo de los puntos de datos.

Descripcion detallada

Antes de describir las presentes composiciones y metodos, se debe entender que esta invencion no esta limitada a las composiciones y moleculas asociadas, metodologfas o protocolos particulares descritos, ya que estos pueden variar. Tambien se debe entender que la terminologfa utilizada en la descripcion tiene el proposito de describir unicamente las versiones o realizaciones particulares y no pretende limitar el alcance de la presente invencion que estara limitado solamente por las reivindicaciones adjuntas.

Tambien se debe observar que, segun se utilizan en la presente memoria y en las reivindicaciones adjuntas, las formas singulares "un", "una", "uno" y "el" y "la" incluyen la referencia plural a menos que el contexto indique claramente lo contrario. Asf, por ejemplo, la referencia a una "celula" es una referencia a una o mas celulas y equivalentes de las mismas conocidos por los expertos en la tecnica, y asf sucesivamente. A menos que se defina lo contrario, todos los terminos tecnicos y cientfficos utilizados en la presente memoria tienen los mismos significados que comunmente entienden los expertos en la tecnica. Aunque se puede utilizar cualquier metodo y material similar o equivalente a los descritos en la presente memoria en la practica o ensayo de las realizaciones de la presente invencion, se describen a continuacion los metodos, dispositivos y materiales preferidos.

"Opcional" u "opcionalmente" significa que el evento o circunstancia descritos con posterioridad pueden ocurrir o no, y que la descripcion incluye los casos en los que ocurre el evento y los casos en los que no ocurre.

Las enzimas que escinden los PGSC incluyen la condroitinasa ABC tipo I, la condroitinasa ABC tipo II, la condroitinasa AC y la condroitinasa B, o enzimas de mamffero con actividad similar a la condroitinasa, tales como la hialuronidasa i, la hialuronidasa 2, la hialuronidasa 3, la hialuronidasa 4, las catepsinas, las ADAMT y PH-20, o mezclas de las mismas.

Los PGSC son una familia de proteoglicanos compuestos por una protema nucleo y glicosaminoglicanos sulfatados ligados covalentemente. Las cadenas de polisacaridos son escindidas por varias enzimas, incluyendo una familia de condroitinasas. Hasta la fecha, esta familia de enzimas contiene al menos cuatro miembros, la condroitinasa ABC I, ABC II, AC y B. La condroitinasa ABC I es una exo-liasa que escinde tanto la condroitina como sulfatos de dermatan. Se ha utilizado ampliamente en el estudio de la regeneracion neuronal in vitro sobre sustratos cargados de PGSC y mas recientemente en estudios in vivo despues de la lesion del SNC.

Las protemas y polipeptidos que se pueden utilizar en las composiciones y protemas de fusion de la presente invencion son aquellos que promueven la plasticidad asf como la regeneracion de neuronas o axones lesionados o enfermos. Estas protemas y polipeptidos regeneradores pueden incluir protemas de adherencia celular, aquellas que estimulan las celulas gliales, y los polipeptidos que bloquean el efecto inhibidor de las protemas que actuan como inhibidores del crecimiento axonal.

La plasticidad del sistema nervioso se refiere a cualquier tipo de reorganizacion funcional. Esta reorganizacion se produce con el desarrollo, el aprendizaje y la memoria y la reparacion del cerebro. Los cambios estructurales que ocurren con la plasticidad pueden incluir la formacion de sinapsis, la eliminacion de sinapsis, la germinacion de

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neuritas e incluso pueden incluir el fortalecimiento o el debilitamiento de las sinapsis existentes. La regeneracion se diferencia generalmente de la plasticidad por el crecimiento a largo plazo de los axones en los tractos desorganizados que es caractenstico de la regeneracion.

Las protemas y polipeptidos que son capaces de bloquear la actividad de las moleculas inhibidoras del crecimiento neuronal pueden incluir peptidos y polipeptidos que bloquean las propiedades inhibidoras del peptido tales como, pero no limitados a Nogo, MAG, OMgp. Las composiciones adecuadas que superan la actividad de las moleculas inhibidoras del crecimiento neuronal incluyen, pero no se limitan a, los inhibidores de la familia de la Protema Quinasa C, los inhibidores y agentes de la familia de la Quinasa Rho, tales como los inhibidores de la fosfodiesterasa, que aumentan el AMP ciclico intracelular y L1. Se ha demostrado que el peptido (NgR27-3ii) inhibe la union de Nogo66, OMgp, MAG y MOG a NogoR unido a la membrana y supera los efectos inhibidores de Nogo sobre la regeneracion de procesos nerviosos.

Las protemas y polipeptidos que afectan a la adherencia celular o estimulan las celulas pueden incluir, pero no se limitan, a polipeptidos tales como Li y GGF2. Li es una protema de adherencia de celulas neurales que es un potente estimulador del crecimiento de neuritas in vitro para el cual se ha encontrado que el tratamiento de LME aguda en roedores utilizando una forma soluble de Li conduce a un aumento en la recuperacion de la funcion neurologica. GGF2 estimula las celulas gliales y se ha demostrado que mejora las medidas de resultado clinico en un modelo murino de encefalomielitis alergica experimental (EAE) probablemente como resultado de la estimulacion de oligodendrocitos para promover la remielinizacion.

Las secuencias peptfdicas capaces de atravesar la membrana celular utiles en la presente invencion se pueden obtener de la protema Tat del virus de la inmunodeficiencia humana de tipo i (VIH-i) (Fawell et al., Proc. Nat. Acad. Sci., 9i: 664-68, i994). En particular, el peptido Tat puede comprender cualquier residuo secuencial del motivo del peptido alcalino de la protema Tat 37-72 (Vives et al., i997) (37-

CFITKALGISYGRKKRRQRRRPPQGSQTHQVSLSKQ-72 (SEQ ID NO: 56)). El numero mmimo de residuos de aminoacidos puede estar en el intervalo de aproximadamente tres a aproximadamente seis, preferiblemente de aproximadamente tres a aproximadamente cinco y lo mas preferiblemente aproximadamente cuatro, es decir, el requisito mmimo para un giro helicoidal alfa. Una realizacion preferida comprende los residuos de la protema Tat 4857 (GRKKRRQRRR) (SEQ ID NO: 57).

Protemas y Peptidos Tat. Tat es una protema de 86 aminoacidos implicada en la replicacion del virus de la inmunodeficiencia humana de tipo i (VIH-i). La protema de transactivacion Tat del VIH-i es eficazmente absorbida por las celulas (Mann y Frankel i99i; Vives et al., i994), y son suficientes bajas concentraciones (nM) para transactivar un gen informador expresado a partir del promotor de VIH-i (Mann y Frankel i99i). La protema Tat exogena es capaz de translocarse a traves de la membrana plasmatica y alcanzar el nucleo para transactivar el genoma viral.

Se cree que una region de la protema Tat centrada en una agrupacion de aminoacidos alcalinos es responsable de esta actividad de translocacion (Vives et al., i997). La absorcion celular y la translocacion nuclear mediada por peptidos Tat se han demostrado en varios sistemas (Vives, et al., J. Biol. Chem. 272: i60i0-i60i7, i997; Jones, Genes Dev ii:2593-2599, i997). El acoplamiento qmmico de un peptido derivado de Tat (residuos 37-72) a varias protemas da como resultado su internalizacion en varias lmeas o tejidos celulares (Fawell et al., Proc Natl Acad Sci USA 9i:664-668, i994, Anderson, et al., Biochem Biophys Res Commun i94:876-8884, i993, Fahraeus y col., Curr Biol 6:84-9i, i996, Nagahara et al., Nat Med 4:i449-i452, i998). Un peptido sintetico que consiste en los aminoacidos alcalinos 48-60 de Tat con un residuo de cistema en el extremo C acoplado a maleimida de fluorescema se transloca al nucleo celular segun se determina mediante microscopfa de fluorescencia (Vives et al., i997). Ademas, una protema de fusion (Tat-NLS-p-Gal) que consiste en los aminoacidos 48-59 de tat fusionados por su extremo amino terminal a los aminoacidos 9-i.023 de p-galactosidasa se transloca al nucleo celular de una manera independiente de los factores citosolicos, dependiente de ATP (Efthymiadis et al., i998).

Las protemas quimericas, tambien denominadas en la tecnica protemas de fusion, son protemas tubridas que combinan partes de al menos dos o mas protemas o peptidos precursores. Las protemas quimericas se pueden producir mediante tecnologfa recombinante, es decir, fusionando al menos una parte de la secuencia codificante de un gen a al menos una parte de la secuencia codificante de otro gen. Cuando sea deseable, se pueden fusionar uno o mas genes para los peptidos conectores con la secuencia codificante de genes para los otros dominios de polipeptidos de la protema de fusion. El gen fusionado se puede utilizar a continuacion para transformar un organismo adecuado tal como, pero sin limitarse a, celulas de E. coli o CHO que despues expresan la protema de fusion.

Los genes que codifican mutantes por delecion N-terminal o C-terminal de dominios de polipeptidos de las protemas de fusion se pueden utilizar en constructos para la expresion de las protemas de fusion. Preferiblemente, los mutantes por delecion generados mantienen su actividad de degradacion catalftica de proteoglicano, actividad de bloqueo, actividad de crecimiento o actividad de transduccion. Los mutantes por delecion generados de las moleculas de degradacion de proteoglicanos como la enzima condroitinasa ABCI en la que el mutante no tiene cierto numero de aminoacidos del extremo N- y/o C-terminal son aquellos que conservan alguna actividad de degradacion de proteoglicanos. Las deleciones N-terminales de condroitinasa como la condroitinasa ABC I mantienen una

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etiqueta de histidina que esta anclada al extremo N-terminal. Se espera que un constructo de ADN de fusion de TAT- mutante por delecion de condroitinasa ABC I se pueda expresar sin la eliminacion del polipeptido TAT durante la expresion. Por ejemplo, un peptido TAT Fusionado en el extremo N del mutante por delecion ABCI-NA20 o ABCI- nA60. Se pueden utilizar fragmentos de polipeptidos, tales como los mostrados en la FIG. 3 para GGF2 en la construccion de protemas de fusion quimericas.

Los mutantes por delecion cataltticamente activos de la condroitinasa ABCI se pueden preparar suprimiendo 20 o 60 aminoacidos respectivamente del extremo N de la protema ABCI madura. Estos mutantes por delecion se pueden utilizar para la construccion de la protema quimerica de fusion N-terminal. Se pueden realizar estudios bioqmmicos comparativos detallados para determinar la eficacia de la condroitinasa ABCI madura frente a diversos mutantes por delecion en composiciones y protemas de fusion con respecto a la especificidad del sustrato, la union al sustrato y la penetracion en el tejido.

Se puede preparar un mutante de condroitinasa ABCI que tiene estructura de protema nativa, pero carece de actividad catalttica como un control nulo o negativo para bioanalisis y estudios de LME. Basandose en la estructura cristalina de la condroitinasa ABCI, se puede preparar un mutante espedfico de sitio denominado H501a e Y508a para inactivar la actividad catalftica en el supuesto sitio activo. Tales mutantes se pueden someter a ensayo para determinar la inactivacion de la actividad catalftica y a SEC para comparar con la enzima de tipo salvaje. Si el mutante de actividad nula se crea satisfactoriamente proporcionara un control negativo para las diversas protemas de fusion para su uso en bioanalisis y, en ultima instancia, en estudios con animales con LME.

Se puede utilizar un sistema de expresion de E. Coli para elaborar condroitinasa utilizando vectores de expresion de PET (Novagen). La protema de fusion de GGF2-condroitinasa ABCI se puede expresar en E. coli. Los constructos para las protemas de fusion de Tat-mutantes por delecion de condroitinasa, las protemas de fusion de Tat-GGF2 o las protemas de fusion de Tat-condroitinasa-GGF2 se pueden expresar a partir de E. coli. Se pueden expresar otras protemas de fusion en lmeas de celulas CHO.

La Tabla 1 ilustra varios componentes no limitantes que se pueden utilizar en composiciones descritas en la presente memoria en forma de una molecula de fusion o quimerica. La composicion o molecula quimerica descritas pueden incluir una o mas de las moleculas de la Tabla 1 y todas las caractensticas de la reivindicacion 1. En el caso de moleculas quimericas, se utilizan uno o mas segmentos conectores, preferiblemente polipeptidos.

Tabla 1 Componentes de las composiciones

Moleculas de transduccion

Moleculas de degradacion de proteoglicanos Moleculas terapeuticas, de diagnostico, antagonistas de receptores

Residuos 48-57 de la protema Tat Motivo alcalino de la protema Rev de VIH-1 Motivo alcalino de la protema Rev de VIH-1 Protema VP22 del virus Herpes simplex

Cualquier agente que degrada las glicoprotemas de la matriz extracelular incluyendo: Crondroitinasa ABC I, Condroitinasa ABC II, Condroitinasa AC, Condroitinasa B, Hialuronidasa 1, Hialuronidasa 2, Hialuronidasa 3, Hialuronidasa 4, mutantes por delecion y/o sustitucion de PH20 de las moleculas enumeradas mas arriba que mantienen la actividad enzimatica. Cualquier peptido que bloquea las propiedades inhibidoras de Nogo, MAG, OMgp incluyendo: Peptido 1-40* de Nogo Cualquier componente del peptido 1-40 de Nogo que mantiene la capacidad de bloquear las propiedades inhibidoras de Nogo Otros peptidos que bloquean Nogo Anticuerpos que reconocen Nogo Peptidos que bloquean MAG Anticuerpos que reconocen MAG Peptidos que bloquean OMgp Anticuerpos que reconocen OMgp Anticuerpos que reconocen el receptor de Nogo-66 Peptidos que bloquean el receptor de P75 Anticuerpos que reconocen el receptor de neurotrofina p75 Peptidos o anticuerpos que bloquean otros receptores de Nogo, MAG y/u oMgp Peptido que supera las propiedades inhibidoras de Mielina, Nogo, MaG, OMgp incluyendo: Inhibidores de la familia de protema quinasa C* Inhibidores de la familia de la quinasa Rho Agentes que aumentan la concentracion de AMPc intracelular L1

*Peptido 1-40 de Nogo: NEP-1-40 de 40 aa humano (Acetil-RIY KGV IQA IQK SDE GHP FRA YLE SEV AIS EEL VQK YSN S-amida correspondiente a los aa 1-40 de Nogo-66

En la FIG. 4A y FIG. 4B, se expone una ilustracion esquematica de las protemas de fusion quimericas.

5 Se puede utilizar un componente peptfdico de cualquier columna de la Tabla 1 que podna estar conectado por medio de un conector oligopeptidico bien conocido en la tecnica tal como un peptido rico en glicina, por ejemplo Gly-Gly- Gly-Gly-Gly, o conectores preparados incluyendo cualquiera de los aminoacidos naturales asf como aminoacidos sustituidos o beta o gamma como acido 4-aminobutmco o acido 6-aminocaproico. Tambien se pueden utilizar otros conectores, incluyendo pero no limitados a, alquil diaminas, amino, o alquil dioles. Preferiblemente, el componente 10 de Transduccion de la protema de fusion esta en una posicion terminal en la protema quimerica. Otros ejemplos de conectores comunes pueden incluir, pero no estanan limitados a Gly-Gly-Ala-Gly-Gly, conectores ricos en Gly/Ser (por ejemplo Gly4Ser3), o conectores ricos en Gly/Ala. Adicionalmente, los conectores pueden tener cualquier longitud y diseno para promover o restringir la movilidad de los componentes de la protema de fusion.

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La incorporacion de aminoacidos no naturales, incluyendo aminoacidos no nativos sinteticos, aminoacidos sustituidos o uno o mas D-aminoacidos a los peptidos (u otros componentes de los complejos) descritos en la presente memoria (a los que se hace referencia en lo sucesivo como "D-peptidos") es ventajosa de muchas formas diferentes. Los peptidos que contienen D-aminoacidos muestran una mayor estabilidad incrementada in vitro o in vivo en comparacion con los homologos que contienen L-aminoacidos. De este modo, la construccion de peptidos que incorporan D-aminoacidos puede ser particularmente util cuando se desea o se requiere una mayor estabilidad intracelular. Mas espedficamente, los D-peptidos son resistentes a las peptidasas y proteasas endogenas, proporcionando de este modo un mejor suministro oral, transepitelial y transdermico de farmacos y productos conjugados ligados, una mejor biodisponibilidad de complejos que pueden penetrar la membrana, y vidas intravasculares e intersticiales prolongadas cuando tales propiedades son deseables. El uso de D-peptidos tambien puede potenciar el suministro transdermico, oral y transepitelial de farmacos conectados y otras moleculas de carga.

En una lesion de la medula espinal, los axones de las neuronas sensoriales ascendentes y motoras descendentes se rompen, lo que puede dar lugar a perdida de sensibilidad y paralisis. Estos axones no se regeneran satisfactoriamente conduciendo a una discapacidad permanente. Una cicatriz envuelve el sitio de la lesion que se cree encapsula la zona de tejido fragil, estabiliza la barrera hematoencefalica y evita una abrumadora cascada de dano tisular no controlado. Esta cicatriz se compone de celulas gliales hipertroficas y una matriz extracelular (MEC). Los proteoglicanos de sulfato de condroitina (PGSC) son un componente importante de la cicatriz. Son expresados por las celulas gliales y depositados en la MEC en regiones de ruptura de la barrera hematoencefalica. La evidencia in vitro demuestra que estos PGSC son potentes inhibidores para el crecimiento de axones y sin desear estar limitados por la teona, se cree que contribuyen al fracaso de los axones de la medula espinal para regenerar y reformar las sinapsis funcionales. Los estudios in vivo han demostrado que los axones regeneradores son capaces de crecer hacia dentro, e incluso hacia afuera, de la cicatriz.

Los PGSC y los componentes de la sustancia blanca son generalmente aceptados como barreras moleculares que las neuronas deben superar con el fin de regenerarse y restablecer las conexiones funcionales despues de la lesion. Las neuronas sensoriales adultas trasplantadas colocadas en posicion distal con respecto a una cicatriz en formacion pueden regenerarse de forma robusta incluso a lo largo de las vfas de degeneracion de la sustancia blanca, sin embargo, la regeneracion cesa bruscamente cuando los axones internalizan el proteoglicano que contiene la cicatriz glial. El tratamiento de las vfas de la sustancia blanca del SNC con condroitinasa aumenta la capacidad de las neuronas para crecer en estos sustratos.

Los tejidos del sistema nervioso central estan fuertemente compactados con celulas y tienen un espacio extracelular limitado. Las protemas y carbohidratos de la matriz extracelular proporcionan fuerzas de carga y osmoticas asf como sitios de union espedficos y no espedficos que pueden impedir la penetracion de agentes terapeuticos. La escision enzimatica de estos componentes de la matriz y celulares puede mas tarde facilitar el acceso de compuestos o celulas a traves de tejidos. Se puede utilizar una molecula de degradacion de proteoglicanos como Condroitinasa ABC I que es una enzima que digiere los proteoglicanos de sulfato de condroitina para promover la difusion de moleculas terapeuticas al SNC. Los peptidos Tat transportan moleculas de carga biologicamente activas unidas covalentemente al citoplasma y a los nucleos de las celulas. En el caso de una protema de fusion que tiene un dominio polipeptfdico de transduccion de protemas como la protema tat de VIH, se pueden suministrar moleculas terapeuticas para la regeneracion de axones a traves de la barrera hematoencefalica.

El tratamiento de las lesiones del modelo de LME, preferiblemente la lesion del modelo de contusion, se puede utilizar para determinar el grado de regeneracion y recuperacion funcional obtenido por las composiciones y el metodo descrito en la presente memoria. El grado de recuperacion funcional se puede demostrar mediante una mejor conduccion del tracto corticoespinal, una mejor retirada de la cinta, paseo por barra, paseo por rejilla y colocacion de las patas despues del tratamiento con condroitinasa de una lesion de columna dorsal. Tambien se pueden utilizar la mejora de la habilidad motora asf como de las funciones autonomas: funcion del intestino, de la vejiga, sensora y sexual como medidas de mejora de la funcion y se pueden relacionar con la estructura molecular y los componentes de las composiciones de la presente invencion.

Ademas de la capacidad de la condroitinasa para mejorar la regeneracion, la condroitinasa digiere componentes de la red perineuronal (RPN). La densidad de la RPN es variable dentro del SNC y es particularmente densa en los cortex somatosensorial, auditivo, visual y en el hipocampo. Tambien se ha demostrado que la RPN es densa alrededor de las neuronas motoras espinales. Los autores de la presente invencion han descubierto la RPN densa dentro del cuerno dorsal de la medula. La digestion de la RPN puede aumentar la plasticidad dentro del hipocampo y el cortex visual. La plasticidad dentro de sistemas intactos en la LME incompleta, especialmente en la region de los generadores de patrones centrales o en el nucleo reticular, puede apoyar la funcion de sistemas danados o destruidos. La promocion de la plasticidad en estos sistemas puede ser un mecanismo distinto o adicional a la regeneracion mediante el cual la condroitinasa puede mejorar la funcion despues de la lesion del SNC. Ademas, la regeneracion y la plasticidad pueden trabajar de manera concertada para afectar a la recuperacion despues de la lesion; de hecho, se ha demostrado que el tracto corticoespinal es cntico para la modulacion de la plasticidad de la medula espinal.

La recuperacion de la funcion neurologica despues de una lesion por contusion en el SNC o un estado de enfermedad se puede promover administrando las protemas de fusion a celulas, un tejido, o un sujeto que tienen

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neuronas danadas o enfermas, tanto si la lesion o enfermedad es inmediata como si es de larga duracion.

Las protemas de fusion de la presente memoria se administran en una cantidad eficaz para degradar los PGSC y de ese modo promover la recuperacion de la funcion neurologica. Una vez que las protemas o polipeptidos de las composiciones se han purificado hasta el grado deseado, se pueden suspender o diluir en un portador o excipiente fisiologicos apropiados para el tratamiento de la LME. En modelos de LME, las dosis intratecales eficaces en ratas han sido de aproximadamente 0,06 unidades en dfas alternos durante 14 dfas. Una dosis para un ser humano de 70 kilogramos puede ser de aproximadamente 17 unidades. A aproximadamente 100 unidades/miligramo, esto equivaldna a aproximadamente 170 microgramos. Las dosis de hasta 20 unidades parecen seguras en rata. Se pueden inyectar composiciones que incluyen una molecula de degradacion de proteoglicano como parte de una protema de fusion diluida en un portador o excipiente farmaceuticamente aceptables, generalmente a concentraciones en el intervalo de 1 |jg a 500 mg/kg de anfitrion. La administracion del agente se puede realizar mediante inyeccion en embolada, administracion intravenosa, infusion continua, liberacion sostenida de implantes o farmacos de liberacion sostenida. La administracion puede ser por medio de inyeccion, por ejemplo intramuscular, peritoneal, subcutanea, intravenosa. La administracion oral puede incluir comprimidos o capsulas, preferiblemente la dosificacion oral es una formulacion de liberacion sostenida para su administracion una o dos veces al dfa. La administracion percutanea puede ser una vez al dfa, y preferiblemente es menos de una vez al dfa. La administracion al paciente humano u otro sujeto mairnfero puede continuar hasta que se consiga una mejora medible de la funcion autonoma o motora en el paciente.

Las protemas de fusion de condroitinasa PTD se pueden administrar con un portador farmaceutico adecuado. La administracion de las composiciones de protemas quimericas de la presente invencion puede ser topica, local o sistemica. Las protemas de fusion quimericas tambien pueden ser secretadas por celulas modificadas geneticamente, preferiblemente una protema de fusion quimerica puede ser secretada por celulas modificadas geneticamente que se implantan, libres o en capsulas, en o cerca del sitio de lesion del SNC.

Una vez que se administran las composiciones, la degradacion de los PGSC elimina las moleculas inhibidoras que bloquean el crecimiento de las neuritas, y permite la regeneracion de neuritas en el area afectada. La condroitinasa ABC I es una endo y exo liasa que escinde tanto CS como DS. La eliminacion de CS y DS de la cicatriz glial permite la regeneracion de los crecimientos de neuritas en el area danada.

Se pueden utilizar mezclas de cualquiera de estos polipeptidos de fusion para proporcionar un tratamiento terapeutico para las lesiones y trastornos del SNC que pueden incluir pero no se limitan a lesion por contusion, lesion cerebral traumatica, apoplejfa, esclerosis multiple, lesion por plexo braquial, amblioplfa, lesiones de la medula espinal. Las lesiones de la medula espinal incluyen enfermedades y lesiones traumaticas, tales como el aplastamiento de las neuronas provocado por un accidente de automovil, cafda, contusion o herida de bala, asf como otras lesiones. La practica de los presentes metodos puede conferir beneficios clmicos al mamffero tratado, proporcionando mejoras clmicamente relevantes en al menos una de las funciones de coordinacion motora del sujeto y la percepcion sensorial. Las mejoras clmicamente relevantes pueden oscilar desde una mejora detectable hasta una restauracion completa de una funcion deteriorada o perdida del SNC.

La regeneracion de las celulas nerviosas en la zona afectada del SNC permite el retorno de la funcion motora y sensorial. La mejona clmicamente relevante va desde una mejora detectable hasta una restauracion completa de la funcion nerviosa alterada o perdida, variando con los pacientes individuales y las lesiones.

Una variante de una protema o fragmentos de la misma hacen referencia a una molecula sustancialmente similar a la protema completa o a un fragmento, que posee una actividad biologica que es sustancialmente similar a una actividad biologica de la protema o de los fragmentos del complemento. Una molecula es sustancialmente similar a otra molecula si ambas moleculas tienen estructuras sustancialmente similares o si ambas moleculas poseen una actividad biologica similar.

Las variantes de las protemas del complemento o sus fragmentos se producen por medios qmmicos o recombinantes. Tambien se pueden preparar variantes de los polinucleotidos construidos para expresar protemas de fusion. Las variantes pueden incluir, por ejemplo, deleciones, o inserciones o sustituciones, de residuos de aminoacidos dentro de la secuencia de aminoacidos, o delecion, sustitucion o insercion de acidos nucleicos de una secuencia que codifica una protema de fusion o un dominio polipeptfdico de la protema de fusion concretos. Por ejemplo, en algunos casos la eliminacion de uno o mas residuos de aminoacidos de un polipeptido de condroitinasa se puede realizar sin cambio significativo en su actividad de degradacion de PGSC. Los cambios sustanciales en las propiedades funcionales como la degradacion de proteoglicanos o la actividad de bloqueo contra los inhibidores del crecimiento de axones se realizan seleccionando sustituciones que son menos conservativas, es decir, que difieren mas significativamente en su efecto sobre el mantenimiento de la estructura, la carga o el caracter hidrofobo de la cadena principal del peptido en la zona de la sustitucion.

No se espera que la mayona de deleciones, inserciones y sustituciones produzcan cambios radicales en las caractensticas de la molecula de protema; sin embargo, cuando es diffcil predecir el efecto exacto de la sustitucion, delecion o insercion antes de realizarlas, un experto en la tecnica apreciara que el efecto se evaluara mediante analisis de escrutinio rutinarios. Por ejemplo, un cambio en el caracter de regeneracion del axon de la molecula

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polipeptidica, por medio de una degradacion mayor o menor del proteoglicano, se puede medir con ensayos de recuperacion funcional asf como analisis de HPLC para detectar disacaridos producto de digestion de PGSC.

La utilizacion de una molecula de degradacion de proteoglicano y una protema tat de VIH, o un polipeptido derivado de tat, en forma de una protema de fusion puede suministrar una molecula de interes al SNC o un sitio en el SNC donde se ha producido el dano del tejido neuronal por enfermedad o trauma. En particular, el sitio del dano en el SNC es donde se ha producido la cicatrizacion como resultado de una lesion por contusion. La molecula de interes, opcionalmente referida como agente o molecula de carga, puede ser una molecula terapeutica que promueve la plasticidad, el crecimiento del axon, una molecula de diagnostico o una molecula de degradacion de proteoglicano. La protema de fusion que tiene una protema tat de VIH de transduccion de protemas permite que las moleculas terapeuticas para la regeneracion del axon sean suministradas a traves de la barrera hematoencefalica o que la molecula de degradacion de proteoglicano pueda ser suministrada a las celulas para degradar los almacenes celulares de proteoglicanos y promover la regeneracion del axon.

Los polipeptidos de transporte de esta invencion pueden estar ventajosamente anclados a moleculas de carga por medio de entrecruzamiento qmmico o por medio de fusion genetica. Un residuo de cistema terminal unico es un medio preferido de entrecruzamiento qmmico. De acuerdo con algunas realizaciones preferidas de esta invencion, el extremo carboxi del radical de transporte se fusiona geneticamente con el extremo amino del radical de carga. La realizacion de la presente invencion consiste en una metionina amino-terminal seguida de los residuos tat 47-58, seguidos por un polipeptido de condroitinasa.

Se apreciara que los 86 aminoacidos completos que constituyen la protema tat pueden no ser necesarios para la actividad de absorcion de tat. Por ejemplo, se puede utilizar un fragmento de protema o un peptido que tiene menos de 86 aminoacidos, pero que muestra absorcion en celulas y/o puede atravesar la barrera hematoencefalica, (un fragmento o porcion de tat funcionalmente eficaz). Por ejemplo, la protema tat que contiene los residuos 1-72 puede ser suficiente para la actividad de absorcion y los residuos de tat 1-67 pueden mediar la entrada de una protema heterologa a las celulas. El peptido sintetico que contiene los residuos de tat 1-58 puede tener actividad de absorcion.

El peptido tat puede ser una secuencia de aminoacidos unica (es decir, continua) presente en la protema tat o puede consistitr en dos o mas secuencias de aminoacidos que estan presentes en la protema tat, pero en la protema natural estan separadas por otras secuencias de aminoacidos. Segun se utiliza en la presente memoria, la protema tat incluye una secuencia de aminoacidos de origen natural que es la misma que la de la protema tat natural, sus equivalentes funcionales o fragmentos funcionalmente equivalentes de los mismos (peptidos). Tales equivalentes funcionales o fragmentos funcionalmente equivalentes pueden poseer actividad de absorcion hacia el interior de la celula o a traves de la barrera hematoencefalica que es sustancialmente similar a la de la protema tat natural. La protema tat se puede obtener a partir de fuentes naturales o se puede producir utilizando tecnicas de ingeniena genetica o smtesis qmmica.

La secuencia de aminoacidos de la protema tat del VIH de origen natural se puede modificar, mediante adicion, delecion y/o sustitucion de al menos un aminoacido presente en la protema tat natural, para producir la protema tat modificada (tambien denominada en la presente memoria protema o polipeptido de tat). Por lo tanto, se pueden producir analogos de protema de tat o peptidos de tat modificados con mayor estabilidad utilizando tecnicas conocidas. Por lo tanto, las protemas o peptidos de tat pueden tener secuencias de aminoacidos que son sustancialmente similares, aunque no identicas, a la de la protema tat de origen natural o porciones de la misma. Ademas, se pueden anadir colesterol u otros derivados lipidicos a la protema tat para producir una tat modificada que tiene una mayor solubilidad de membrana.

La protema tat de VIH-1 natural tiene una region (aminoacidos 22-37) en donde 7 de los 16 aminoacidos son cistema. Esos residuos de cistema son capaces de formar enlaces disulfuro entre sf, con residuos de cistema de la region rica en cistema de otras moleculas de protema tat y con residuos de cistema de una protema de carga o el radical de carga de un producto conjugado. Semejante formacion de enlaces disulfuro puede causar la perdida de la actividad biologica de la carga. Ademas, incluso si no hay posibilidad de union de disulfuro al radical de carga (por ejemplo, cuando la protema de carga no tiene residuos de cistema), la formacion de enlaces disulfuro entre polipeptidos de transporte puede conducir a la agregacion e insolubilidad del polipeptido de transporte, el producto conjugado de polipeptido de transporte-carga, o ambos. La region rica en cistema de tat se puede suprimir para evitar la formacion de enlaces disulfuro y prevenir la agregacion e insolubilidad del polipeptido de transporte, el producto conjugado de polipeptido de transporte-carga, o ambos.

La condroitinasa tambien es capaz de promover la plasticidad en las regiones del SNC con una RPN significativamente densa, incluyendo el cortex, el tectum, el hipocampo y la medula espinal. Es razonable que una combinacion de efectos, incluyendo la regeneracion, el brote y la plasticidad, sea responsable de la mejora de la funcion despues de la LME con tratamiento con condroitinasa o tratamiento con moleculas de fusion que incluyen condroitinasa u otra molecula de degradacion de proteoglicanos.

NbR27 -311: Nogo es un componente de mielina de alto peso molecular que inhibe el crecimiento de las neuritas. La region amino terminal (Nogo66) es la parte de la molecula que esta espedficamente asociada con la inhibicion del

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crecimiento de las neuritas. Los metodos de clonacion de la expresion revelaron que el receptor para Nogo66 (NgR) es una glicoprotema anclada a GPI expresada principalmente en neuronas. El NgR interactua no solo con Nogo, sino tambien con otros inhibidores asociados a mielina tales como MAG y MOG. Debido a su papel central en las propiedades inhibidoras de la mielina en las neuronas, NgR ha sido la diana de enfoques para suscitar antagonismo sobre sus interacciones con sus ligandos. El segmento soluble de NgR interactua con Nogo66, MAG y MOG. La region abarca los residuos 27-311 y este fragmento de NgR puede por tanto actuar como un receptor senuelo que interferira en la inhibicion de las neuronas asociada a mielina. Si NgR27-3ii esta ligado a una molecula de degradacion de proteoglicano como la condroitinasa ABCI para formar una protema de fusion quimerica, cabna esperar que el dominio del polipeptido NgR27-3ii de la protema de fusion limitara la inhibicion del crecimiento de neuritas asociada a la mielina y promoviera la regeneracion axonal en las regiones digeridas con condroitinasa de una lesion de la medula espinal.

Para el producto clonado (NgR27-3ii), la region precisa de interes, o los fragmentos pueden derivar del clon inicial. La actividad biologica de NgR27-3ii, sus fragmentos y los polipeptidos de fusion que incluyen NgR27-3ii se puede confirmar utilizando un analisis in vitro para el colapso de conos de crecimiento en las neuronas. Se ha establecido el analisis del colapso del cono de crecimiento, y la adicion de MAG o Nogo66 causa el colapso de los conos de crecimiento de una manera dependiente de la dosis. Si NgR27-3ii, sus fragmentos y polipeptidos de fusion incluyendo NgR27-3ii son activos, es biologicamente activo, en ese caso debenan inhibir el colapso del cono de crecimiento mediado por MAG y Nogo66. Los datos del colapso del cono de crecimiento se pueden recoger para la inspeccion de fotomicrograffas de neuronas GRD en respuesta a Nogo66 y MAG.

El polipeptido Li es un miembro de la superfamilia de las inmunoglobulinas de las moleculas de adherencia celular y se expresa en axones en crecimiento, celulas progenitoras gliales y celulas de Schwann a lo largo de la vida, pero solo tiene una expresion limitada en el SNC. Li interactua consigo mismo y con otras moleculas extracelulares, tales como el receptor de FGF para promover la fasciculacion y el crecimiento de las neuritas. La expresion de Li se asocia generalmente con un entorno permisivo para la regeneracion axonal, la region precisa de interes, o los fragmentos de Li pueden derivar del clon inicial. Por ejemplo, las celulas de Schwann que expresan Li apoyan la regeneracion nerviosa periferica y el crecimiento axonal se observa en los nervios opticos de ratones transgenicos que expresan Li en astrocitos pero no en nervios opticos de tipo salvaje. Los fibroblastos disenados para expresar Li apoyan el crecimiento axonal cuando se trasplantan a la medula espinal. Finalmente, una forma soluble de Li ligada a Fc promovio la recuperacion funcional despues de una LME aguda. Si Li esta unido a una molecula de degradacion de proteoglicanos como la condroitinasa ABCI en una protema de fusion, es razonable esperar que la protema de fusion promueva la regeneracion axonal en las regiones digeridas con condroitinasa de una lesion de la medula espinal.

Las neurregulinas y sus receptores comprenden un sistema diverso de factores de crecimiento y receptores de tirosina quinasa que se ha demostrado esencial para la organogenesis en el SNC, el epitelio muscular y otros tejidos. GGF2 es una isoforma soluble del gen de la neurregulina i. Inicialmente se caracterizo como un mitogeno de celulas de Schwann 32, pero estudios posteriores han demostrado acciones directas sobre oligodendrocitos, neuronas y otros tipos de celulas. GGF2 disminuye la desmielinizacion y la inflamacion y mejora la remielinizacion en un modelo de raton para la esclerosis multiple. Basandose en estos resultados, es razonable esperar que un GGF2 humano recombinante sea un tratamiento potencial para la desmielinizacion asociada con la LME. Cuando GGF2 esta ligado a una molecula de degradacion de proteoglicano como la condroitinasa ABCI, es razonable esperar que se promueva una remielinizacion de los axones en las regiones digeridas con condroitinasa de una LME.

Tabla 2. Ejemplos de fragmentos de GGF2 no limitantes para la expresion en E. coli para su uso en composiciones y composiciones de polipeptidos de fusion

Constructo

Dominio Sec Nucleotidos Sec aminoacidos Peso Molecular

GGF2-FL

GGF2 completo Mi-E422 46 kDa

GGF2/i

Dominio Ig + Dominio EGF 748-i206 L250-C402 i6,8 kDa

GGF2/2

Dominio Ig a extremo C 748-i266 L250-E422 i9 kDa

GGF2/3

Dominio EGF i048-i206 T350-C402 5,7 kDa

La eficacia de una composicion de la presente invencion, puede ser evaluada utilizando un modelo de LME de rata validado a tres niveles diferentes de gravedad de LME.

Se encuentra disponible en el mercado una molecula de degradacion de proteoglicanos como la condroitinasa ABCI en pequenas cantidades como una enzima obtenida de forma natural (Seikagaku Corporation) y se puede fabricar

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mediante un sistema de produccion recombinante para que tenga esencialmente la misma actividad que la enzima purificada a partir de Proteus vulgaris. El ADN genomico se puede aislar de Proteus vulgaris utilizando el kit DNeasy Tissue (Qiagen). Los cebadores de PCR se pueden sintetizar con un sitio de restriccion Ndel en el extremo 5' y un sitio BamHI en el extremo 3' que tienen las secuencias 5'-CAT ATG GCC ACC AGC MT CCT GCA TTT G-3' (F2) y 5'-GGA TCC TCA AGG GAG TGG CGA GAG-3' (R), respectivamente, para sintetizar la protema madura. Los productos de PCR de 3,0 kb se pueden ligar al vector pCR 2.1 (kit de clonacion TOPO, Invitrogen) y transformar en celulas DH5a competentes (Invitrogen). El ADN del plasmido se puede aislar a partir de numerosos clones escrutados mediante digestion con la enzima de restriccion EcoRI. La integridad de un gen preparado de esta manera se puede confirmar mediante secuenciacion de ADN repetida.

La secuencia de la condroitinasa ABCI se puede clonar en un vector PET (Novogen) para la expresion en E. Coli Despues de la induccion de la expresion genica con IPTG, las bacterias se pueden lisar por sonicacion con la extraccion concomitante de condroitinasa ABCI con Triton X-114/PBS. Los autores de la presente invencion descubrieron que la mayona de la condroitinasa ABCI recombinante se encontraba en la fraccion citosolica del producto lisado de celulas bacterianas, lo que permitfa el desarrollo de un protocolo de purificacion de la condroitinasa ABCI que produce una enzima con alta actividad a altos rendimientos. El protocolo incluye cromatograffa de intercambio cationico como etapa de captura y filtracion en gel como etapa de refinado. Despues de estas etapas, la condroitinasa ABCI alcanza una pureza de ~95%. La filtracion en membrana de intercambio anionico (Intercept Q, Millipore) se puede utilizar para la eliminacion de endotoxina y de ADN del anfitrion. Se espera que esta etapa elimine aproximadamente 75% de la endotoxina. Despues de la filtracion, la condroitinasa ABCI puede ser sometida a dialisis en un tampon volatil, pH 8,0 y liofilizada hasta sequedad. El producto final es estable a -70°C para su almacenamiento a largo plazo. La cABCI purificada es una protema altamente alcalina con pI~9,5 como se determina por medio de analisis IEF-PAGE de las muestras del producto lisado celular bruto.

Se puede utilizar una diversidad de metodos analtticos para comparar la actividad enzimatica de la version recombinante de la condroitinasa ABCI con la de una forma disponible comercialmente de la enzima (Seikagaku Corporation) purificada a partir de Proteus vulgaris. Los metodos se pueden adaptar para evaluar la actividad de protemas de fusion incluyendo polipeptidos de degradacion de proteoglicanos como la condroitinasa. Se obtuvieron mediciones espedficas de la actividad utilizando un analisis espectrofotometrico aceptado que mide el cambio en absorbancia debido a la produccion de productos de reaccion procedentes de la degradacion de proteoglicanos. La forma recombinante de condroitinasa ABCI tema aproximadamente 25% mas de actividad espedfica que la condroitinasa ABCI de Seikagaku. La cromatograffa de exclusion por tamano se puede utilizar para comparar las propiedades hidrodinamicas de las enzimas. Los perfiles de elucion para la enzima recombinante fueron identicos al de la enzima natural.

Se puede utilizar una forma de zimograffa para caracterizar adicionalmente la enzima y se puede adaptar para la caracterizacion de las protemas de fusion. Los geles de poliacrilamida se pueden polimerizar en presencia de agrecano, un sustrato para la condroitinasa ABCI. Las muestras enzimaticas se pueden resolver sobre los geles impregnados con agrecano por medio de electroforesis en presencia de SDS. Los geles se pueden someter a continuacion a una etapa de renaturalizacion en donde se extrae el SDS y se deja que se replieguen las enzimas. La enzima se repliega y recupera la actividad, a continuacion digiere el agrecano del gel y la perdida de carbohidrato resultante en esa region del gel se puede visualizar mediante una tincion espedfica de carbohidrato. Se esperana una perdida similar de carbohidrato en el gel para formas activas de una protema de fusion que incluyera una porcion de polipeptido de degradacion de proteoglicano. En el caso de la Condroitinasa ABCI recombinante, su actividad se puede visualizar como un punto claro en el zimograma. Los resultados de la zimograffa fueron compatibles con el analisis espectrofotometrico que demuestra que la forma recombinante de la condroitinasa ABCI tiene la misma o mayor actividad espedfica que la forma natural.

Se pueden utilizar metodos de HPLC para detectar los disacaridos con cuatro y seis sulfatos (A4DS y A6DS, respectivamente) liberados como resultado de la digestion con condroitinasa ABCI de PGSC. Los dos disacaridos se pueden resolver eficazmente mediante cromatograffa de intercambio anionico. El analisis mediante HPLC ha sido validado demostrando que la cuantificacion de A4DS y A6DS de los cromatogramas proporciona una relacion lineal con las cantidades inyectadas en la HPLC. La produccion de A4DS y A6DS de la digestion de PGSC esta directamente relacionada con la cantidad de actividad espedfica de condroitinasa determinada por el analisis espectrofotometrico descrito anteriormente. Este analisis se puede utilizar como un metodo sensible y preciso para cuantificar independientemente los A4DS y A6DS liberados por digestion con condroitinasa de una variedad de sustratos y tambien se puede utilizar para determinar la actividad de los polipeptidos de condroitinasa en una protema de fusion.

Otro analisis funcional que se puede realizar para caracterizar la actividad del polipeptido de proteoglicano es aquel en el que las neuronas ganglionares de la rafz dorsal (GRD) se cultivan sobre agrecano o se tratan con agrecano con un proteoglicano como la condroitinasa ABCI. Se espera que las neuronas cultivadas en agrecano no logren adherirse a la placa ni extender los axones. Por el contrario, se esperana que las neuronas cultivadas sobre agrecano tratado con un polipeptido de degradacion de proteoglicano como la condroitinasa ABCI en una composicion o como parte de un polipeptido de fusion se adhirieran a la superficie y extendieran los axones. Se cree que el intenso crecimiento del axon, que se observa para la condroitinasa ABCi se debe a la digestion de los carbohidratos en la protema del nucleo de agrecano que crea un sustrato mas permisivo para el crecimiento del

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axon.

El modelo de contusion de rata de LME es un modelo clmicamente relevante y se puede utilizar para evaluar la eficacia de las protemas de fusion y otras composiciones de la presente invenciOn para promover la regeneraciOn del axOn. Con una LME por contusion, las celulas se destruyen, se produce una hemorragia y comienza la inflamaciOn. Las celulas destruidas son eliminadas por los macrOfagos y comienza una gliosis reactiva. Se forma una cavidad qmstica y la gliosis madura a una cicatriz glial. La mielina del area se destruye y muchas neuronas locales que no se destruyen quedan en un estado desmielinizado.

El modelo de compresiOn con fOrceps de LME es un modelo de contusiOn desarrollado y caracterizado. Este modelo ha sido validado y da como resultado lesiones que son muy similares a las de los modelos de impactador mas ampliamente utilizados. El modelo puede implicar una compresiOn con fOrceps a nivel vertebral T9/T10. El fOrceps comprime la medula a una anchura de 0,9, 1,3 O 1,7 mm durante 15 segundos. Estos tres niveles de compresiOn permiten una lesiOn grave, leve o moderada. Este modelo ha sido validado utilizando la prueba de locomociOn en campo abierto y el sistema de puntuaciOn de Basso, Bresnahan y Beattie (BBB). Tambien se caracterizO histolOgicamente. Las pruebas conductuales y la puntuaciOn BBB demostraron que el fOrceps produce una lesiOn altamente reproducible, con una recuperaciOn similar a la observada con los modelos con impactador. Estas pruebas y datos de puntuaciOn demuestran que el modelo de compresiOn con fOrceps es comparable a otros modelos de contusiOn y suficientemente reprodudible como para ser utilizado como modelo experimental de LME y se puede utilizar para la evaluaciOn de composiciones de la presente invenciOn.

El tejido de animales lesionados por compresiOn con fOrceps puede ser procesado histolOgicamente para examinar la conservaciOn de materia blanca, la cicatriz glial y la formaciOn de quistes. Al igual que con otros modelos de LME por contusiOn, se forma un quiste central despues de la lesiOn, con un tamano que aumenta con el aumento de la gravedad de la lesiOn (disminuciOn del espacio del fOrceps). Alrededor del quiste se forma una cicatriz glial que se caracteriza por astrogliosis (GFAP), activaciOn de macrOfagos y perdida de mielina.

Se ilustraran varios procedimientos experimentales con referencia a los siguientes ejemplos no limitantes.

Ejemplo 1

Este ejemplo ilustra cOmo se puede administrar una molecula de degradaciOn de proteoglicano y estudiar y demostrar que muestra una mejora funcional en animales que tienen una lesiOn modelo por contusiOn.

El modelo de compresiOn con fOrceps de LME es un modelo de contusiOn desarrollado y caracterizado. Este modelo ha sido validado y da como resultado lesiones que son muy similares a los modelos con impactador mas ampliamente utilizados. El modelo puede implicar una compresiOn con fOrceps a nivel vertebral T9/T10. El fOrceps comprime la medula a una anchura de 0,9, 1,3 O 1,7 mm durante 15 segundos. Estos tres niveles de compresiOn permiten una lesiOn grave, leve o moderada.

Las ratas se lesionaron con el modelo de compresiOn con fOrceps en la vertebra T9/T10. En el momento de la cirugfa se colocO un cateter intratecal para el suministro de condroitinasa. Los animales se trataron todos los dfas durante una semana y a continuaciOn en dfas alternos durante una semana con 0,06 U/dosis de condroitinasa ABC I (Seikagaku), penicilinasa o fluido cerebroespinal artificial (aFCE). Las dosis y los controles se obtuvieron de Bradbury et al., 2002. El comportamiento se evaluO mediante pruebas locomotoras de campo abierto y el sistema de puntuaciOn BBB el dfa 2 y despues semanalmente tras la lesiOn durante diez semanas.

La FIG. 5A mostrada son las puntuaciones BBB medias para los animales tratados con condroitinasa ABC I, penicilinasa y aFCE. Las ratas tratadas con aFCE o penicilinasa se recuperaron hasta una puntuaciOn BBB media de aproximadamente 4. Las ratas tratadas con condroitinasa se recuperaron hasta una puntuaciOn BBB media de aproximadamente 8. Varios animales recuperaron puntuaciones superiores a 10, indicando una entrada supraespinal. Las puntuaciones de condroitinasa fueron significativamente diferentes de las de los dos grupos de control por ANOVA y post hoc de Tukey.

El tejido de estos animales fue procesado inmunohistoqmmicamente para determinar la protema acida fibrilar glial (GFAP) para evaluar la arquitectura general de la cicatriz. El tejido tambien se tinO con un colorante de Weil y un colorante de degeneraciOn de plata para evaluar la degeneraciOn de la mielina y las neuronas, respectivamente. Curiosamente no se observaron diferencias obvias en estos parametros entre los tejidos tratados experimentalmente y de control.

En la FIG. 5B la lesiOn grande comprende varios segmentos y la conservaciOn de la medula ventral. La tinciOn de Weil revelO una desmielinizaciOn intensa en los animales tratados y no tratados. Las imagenes GFAP (conjunto medio) demuestran la extensiOn de la cicatriz que se forma despues de la lesiOn con el fOrceps. La tinciOn de degeneraciOn de plata amino-cuprica de la parte inferior muestra la vasta degeneraciOn neural que se extiende rostralmente y caudalmente despues de la lesiOn. De nuevo, no se observaron diferencias evidentes entre los tejidos tratados con condroitinasa y de control.

Se han realizado experimentos preliminares adicionales a niveles de lesiOn moderados y se ha observado una

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mejora significativa en la actividad locomotora en campo abierto con el tratamiento con condroitinasa. Los animales que recibieron condroitinasa ABCI se recuperaron hasta una puntuacion BBB media de 9,1 a las diez semanas despues de la lesion, en comparacion con 7,1 para los controles con penicilinasa. La consistencia de los datos (ETM de 0,6 y 0,3, respectivamente) y la region de las puntuaciones en la escala BBB hacen que este cambio de 2 puntos no solo sea estadfsticamente significativo, sino tambien clmicamente significativo. Una puntuacion de 9 indica la colocacion plantar con apoyo de peso o apoyo de peso frecuente a consistente con escalonamiento dorsal, mientras que una puntuacion de 7 indica el movimiento de cada articulacion en la extremidad posterior pero sin apoyo de peso y sin barrido consistente de extremidades. Un examen de las puntuaciones del animal individual a las diez semanas muestra que 6 de 12 animales del grupo con condroitinasa se recuperaron hasta puntuaciones de 9 o mas, mientras solamente uno de 12 animales del grupo con penicilinasa se recupero hasta una puntuacion de 9. Un animal de cada grupo se elimino del analisis debido a que su puntuacion no logro superar nunca mas de 2.5, indicando una gravedad de la lesion fuera de las normas del modelo. Las FIG. 5C y FIG. 5D incluyen un diagrama de dispersion de puntuaciones a las 10 semanas para cada animal en los grupos de tratamiento con penicilinasa y condroitinasa para la lesion moderada. Las medias de los grupos se muestran a continuacion.

Los resultados muestran en este estudio bien controlado que la condroitinasa mejora la funcion locomotora en campo abierto en ratas que se lesionaron con el modelo de compresion con forceps en las vertebras T9/T10. Los animales se recuperaron hasta puntuaciones BBB medias de 9,7 y 9,9 para los grupos con penicilinasa y condroitinasa, respectivamente. Este estudio demuestra un efecto significativo en los niveles de lesiones severas y moderadas, pero no en los niveles de lesiones leves. No se observaron diferencias significativas entre los grupos en el estudio de lesion leve (forceps a 1,3 mm). No esta claro si la condroitinasa no es eficaz con las lesiones leves, si la condroitinasa realiza cambios que no son adecuadamente analizados por medio de la prueba locomotora en campo abierto, tal como la longitud de la zancada, la colocacion de la pata, las funciones sensoriales o autonomas. El analisis preliminar de histologia de animales en este estudio confirmo la colocacion de los cateteres y lesiones en cada animal. Los experimentos en curso que sacrifican animales en los puntos de tiempo despues de la lesion con y sin tratamiento con condroitinasa caracterizaran el contenido de PGSC de la cicatriz y los efectos de la digestion con condroitinasa en la expresion del antfgeno del munon. Experimentos futuros ampliaran la batena de pruebas de comportamiento y examinaran la medula para determinar la evidencia de regeneracion con rastreo del tracto.

Se realizaron dos estudios de toxicidad aguda en ratas. El primero fue un estudio intravenoso (IV) en donde se inyectaron a las ratas 0, 0,2, 0,775 o 7,775 mg/kg de condroitinasa ABCI. En el segundo estudio, se colocaron cateteres intratecales (IT) sobre las medulas espinales utilizando los mismos metodos empleados en los estudios de LME en animales y se suministraron 0,06, 0,6 y 6,0 unidades de condroitinasa ABCI a traves de los cateteres IT. Estas dosis fueron 1, 10 y 100 veces mayores que las concentraciones locales estimadas de condroitinasa ABCI logradas con los cateteres IT en los experimentos de LME. Los animales fueron controlados para detectar dolor y el estres y se obtuvieron los pesos corporales diariamente. No se observaron reacciones manifiestas durante o inmediatamente despues de la administracion de condroitinasa ABCI. No se observo hinchazon, inflamacion, moretones o necrosis en el sitio de la inyeccion para el experimento IV. No se observaron cambios en la temperatura corporal en animales tratados por via IT. No se observaron alteraciones en la alimentacion, aseo o vocalizaciones. Los animales fueron evaluados para determinar el comportamiento motor en una piscina abierta. No se observaron anomalfas por el personal de cuidado de animales o especialistas en comportamiento. Los animales no mostraron signos de sensibilidad articular o hinchazon. No hubo diferencias significativas en el cambio de peso entre los grupos de tratamiento. Los resultados demuestran que el tratamiento con condroitinasa ABCI no esta asociado con toxicidad aguda utilizando dosis IV e IT sustancialmente mayores que las dosis IT eficaces.

Ejemplo 2

Este ejemplo describe la preparacion de los dominios de agonista del receptor de Nogo, de la protema de adherencia celular neural L1 y del polipeptido GGF2, que se pueden utilizar para las composiciones y protemas de fusion descritas en la presente memoria.

Se selecciono una porcion soluble del receptor de Nogo humano que abarcaba los aminoacidos 27 a 311 (NgR27- 311), ya que se ha demostrado que inhibe la union de Nogo66, MAG y MOG a NgR unido a la membrana. Se disenaron cebadores que flanqueaban esta region, y se realizo una RT-PCR utilizando ARN de hipocampo humano (BD Biosciences). La region de 1,05 kb se amplifico y se purifico satisfactoriamente.

Se preparo L1 a traves de una lmea celular CHO del laboratorio del Dr. Melitta Schachner que secreta L1 humana como una protema de fusion con Fc humano (L1-Fc). Las celulas se hicieron crecer en botellas rodadoras y despues se purifico la L1-Fc a partir del medio acondicionado utilizando la cromatograffa en columna de afinidad con protema A. La pureza de L1-Fc se evaluo mediante SDS-PAGE y se observo una banda unica con el peso molecular apropiado. La actividad biologica de L1-Fc se confirmo utilizando un analisis de crecimiento neuntico. Las placas de cultivo tisular se recubrieron con poli-L-lisina o L1-Fc y despues se aislaron las celulas granulares cerebelosas de ratas de 10 dfas de edad y se colocaron en cultivo sobre los sustratos. Se observo que las neuronas cultivadas en placa sobre el sustrato L1-Fc exhibfan un numero sustancial de neuritas largas en comparacion con los controles del sustrato de polilisina. Estos resultados demuestran que la L1-Fc producida es biologicamente activa en la promocion del crecimiento de las neuritas. Este analisis de crecimiento neuntico se utilizara para evaluar la actividad biologica relacionada con la porcion L1 de la protema de fusion de condroitinasa ABCI.

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Se obtuvo una lmea celular CHO que secretaba una forma soluble de glicoprotema GGF2 completa a partir de CeNes. Se completo la optimizacion exhaustiva de medios y metodos de purificacion para obtener GGF2 esencialmente puro y biologicamente activo. Se desarrollaron varios metodos analfticos para caracterizar el GGF2 incluyendo SDS-PAGe, isoelectroenfoque, mapeo de peptidos y analisis de carbohidratos. Por ejemplo, un gel SDS- PAGE de GGF2 reducido y no reducido; el producto aislado esta esencialmente libre de protemas contaminantes y muestra el peso molecular y la estructura monomerica esperados. La actividad biologica de GGF2 se analizo utilizando un metodo de proliferacion de celulas de Schwann primarias de rata y el efecto esperado se obtuvo reproduciblemente con cuatro lotes independientes de GGF2. Se desarrollo otro analisis funcional que media la fosforilacion de la quinasa Akt, un componente de senalizacion celular aguas abajo de la via del receptor erbB. Se observo que existfa una fosforilacion dependiente de la dosis de la quinasa Akt.

Ejemplo 3

Este ejemplo ilustra la manipulacion de la condroitinasa ABCI para la construccion de quimeras.

La condroitinasa ABCI se clono a partir de P. vulgaris y se expreso en E. coli. Sorprendentemente los intentos repetidos de crear protemas de fusion N-terminales no tuvieron exito porque la porcion de fusion N-terminal se escindio de la condroitinasa ABCI durante la smtesis. Sin embargo, los mutantes por delecion cataltticamente activos con etiquetas de fusion de His N-terminales denominados ABC I-NA2O, ABC I-NA4O y ABCI-NA6O se prepararon mediante la supresion de 20, 40 y 60 aminoacidos respectivamente del extremo N-terminal de la protema ABCI madura. A diferencia de la condroitinasa ABCI completa, los mutantes por delecion N-terminal son capaces de sintetizar una etiqueta 6xHis como una protema de fusion N-terminal. Tambien se observo que la delecion de 80 aminoacidos del extremo C formaba un mutante con la actividad de degradacion de proteoglicano de la condroitinasa ABCI como se verifico en un analisis de zimograffa.

Las protemas de fusion con NgR27-3ii, o L1 con una molecula de degradacion de proteoglicano tal como condroitinasa ABCI utilizaran la expresion de mairnfero y se pueden elaborar en celulas CHO. El ADNc para la condroitinasa ABCI ha sido clonado en el vector pSECTag (Invitrogen) en el marco de lectura apropiado. Se puede desarrollar una lmea celular CHO que tiene condroitinasa ABCI secretora y se puede someter a ensayo el medio acondicionado para determinar la actividad catalftica mediante un analisis de zimograffa para confirmar que la condroitinasa ABCI expresada en celulas de mamffero es funcional. Se puede sintetizar una version de la condroitinasa ABCI optimizada para codones de celulas de mamffero por medio de metodos conocidos en la tecnica para su uso en la expresion de celulas CHO.

GGF2 es una variante de corte y empalme del gen NRG1 expresado en el cerebro y la medula espinal de seres humanos adultos. Es una protema glicosilada de masa molecular entre 66-90 kDa. Los autores de la presente invencion han descubierto que el GGF2 recombinante expresado en celulas CHO esta altamente glicosilado y promueve la proliferacion de celulas de Schwann in vitro, y adicionalmente que un dominio de tipo EGF de NRGi expresado en E. coli es totalmente funcional para promover la proliferacion y supervivencia de miocitos.

Los autores de la presente invencion han expresado fragmentos de GGF2 en E. coli como se ha descrito en la seccion de datos preliminares. Se puede determinar el dominio espedfico de GGF2 responsable de la proliferacion de celulas de Schwann y, portanto, de la remielinizacion. Si los dominios Ig y EGF juntos o por separado muestran actividad biologica in vitro, se pueden utilizar para formar protemas de fusion quimericas.

Clonacion y expresion de NgR27-3ii en celulas CHO. Se aislo un fragmento NgR correspondiente a los residuos 1359 por RT-PCR a partir de ARN poli K de hipocampo humano (BD Biosciences) y su estructura se puede confirmar mediante secuenciacion de ADN. El fragmento genico correspondiente a los residuos 27-311 se puede clonar a partir del fragmento mayor y despues subclonar en el vector pSECTag (Invitrogen) en el marco de lectura apropiado para expresar el fragmento como una protema secretora en celulas CHO. El ADN del plasmido que contiene el gen NgR27-3ii se puede transfectar en celulas CHO y la lmea celular que produce NgR27-3ii se puede seleccionar bajo presion de seleccion con higromicina B. El plasmido de expresion de la quimera de NgR27-3ii-ABCI se puede construir para su expresion en un sistema de expresion de celulas CHO utilizando metodos conocidos en la tecnica.

Ejemplo 4

Este ejemplo ilustra metodos que se pueden utilizar para purificar y aislar dominios expresados de condroitinasa ABCI y GGF2 expresados en E. coli. Estos metodos se pueden aplicar a la purificacion de protemas de fusion quimericas de la presente invencion.

Los autores de la presente invencion han desarrollado un sistema de expresion recombinante de E. coli eficaz y un proceso de purificacion para condroitinasa ABCI que se podnan aplicar para la purificacion de derivados quimericos de condroitinasa ABCI.

Por ejemplo, se ha llevado a cabo la expresion de diversos dominios de GGF2 en el anfitrion de expresion de la condroitinasa ABCI, E. coli, y se han sometido a ensayo los siguientes peptidos: aa250-402, aa250-422 y aa350- 402. Estos peptidos expresados se encontraron en la fraccion soluble de los productos lisados de E. coli. Es razonable esperar que los productos quimericos finales de estos peptidos con condroitinasa ABCI en E. coli tambien

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sean solubles. Ademas, se espera que las caractensticas de carga de los productos quimericos en comparacion con la condroitinasa ABCI recombinante sean similares. Por lo tanto, los valores del punto isoelectrico teorico (p1) para los peptidos de GGF2 son 9,3 para aa250-402, 9,18 para aa250-422 y 7,55 para aa350-402. Se espera que la fusion de los dos primeros peptidos con condroitinasa ABCI de como resultado protemas quimericas con valores pi todav^a por encima de 9. En este caso se espera que la cromatograffa SP tenga un buen rendimiento como etapa de captura. El peptido de GGF2 mas pequeno, aa 350-402, reducira la pi de la quimera de condroitinasa ABCI final a aproximadamente 8,4. Este cambio puede requerir la optimizacion de las condiciones de la etapa de captura.

Los productos quimericos de la condroitinasa ABCI con peptidos NgR27-3ii y Li se pueden expresar en un sistema de celulas CHO. Antes de la purificacion de las protemas quimericas expresadas, las condiciones de crecimiento para la lmea celular que produce las protemas quimericas NgR27-3ii o Li se optimizaran en medio libre de suero. Se puede realizar un estudio detallado de optimizacion de los medios para determinar las condiciones de produccion mas alta. El volumen de aumento a escala se puede decidir basandose en la velocidad de produccion de las protemas quimericas (pg/celulaMa). Los medios acondicionados de las diversas lmeas celulares productoras de quimeras pueden ser recogidos y sometidos a filtracion de flujo tangencial. Se puede utilizar la cromatograffa de intercambio ionico para capturar las protemas secretadas a partir de los medios acondicionados, se puede utilizar la cromatograffa de filtracion en gel como una etapa de purificacion de refinado y a continuacion se puede utilizar la filtracion en membrana de intercambio anionico para la eliminacion de endotoxinas y ADN. En cada etapa se analizara la eficacia de la purificacion por SDS-PAGE, y la cuantificacion espectrofotometrica de la concentracion de protema.

Ejemplo 5

Este ejemplo profetico describe la evaluacion in vitro de la actividad biologica de la quimera: Cada quimera se puede analizar para determinar la actividad enzimatica de la condroitinasa y la actividad biologica espedfica de cada companero de fusion.

La primera etapa en el analisis puede emplear metodologfas bioqmmicas convencionales de protemas para confirmar la fidelidad de la expresion genica. Estas incluyen SDSPAGE, IEE, espectrometna de masas y cromatograffa de exclusion portamano.

La actividad espedfica de la quimera de condroitinasa se puede determinar utilizando un analisis espectrofotometrico convencional y uniformemente aceptado. La produccion de productos de reaccion a partir de la actividad catalttica de un polipeptido quimerico con condroitinasa se puede determinar midiendo la absorbancia del producto a una longitud de onda de 232 nm. Una mezcla de reaccion tfpica consiste en i20 microlitros de mezcla de reaccion (Tris 40 mM, pH 8,0, Acetato de Na 40 mM, casema al 0,002%) combinada con sustrato (5 microlitros de condroitina C 50 mM) y i,5 microlitros de polipeptido de fusion quimerico con condroitinasa ABCI o muestra de ensayo. El cambio en las unidades de absorbancia es la velocidad inicial que se puede convertir en una medida de actividad unitaria.

Analisis por HPLC de disacaridos: Se espera que la actividad catalftica del polipeptido quimerico con condroitinasa sobre un sustrato de PGSC libere dos especies de disacaridos sulfatados que incluyen a-A AUA-[i^-3]-GaINAc- 4S(A 4DS) y a-A AUA-[i^-3]-GaINAc-6S (A 6DS). Estas especies pueden ser resueltas por HPLC y la cuantificacion de los cromatogramas resultantes es una medida sensible y precisa de la actividad de la condroitinasa. Para realizar el analisis, las muestras de las reacciones de digestion con condroitinasa llevadas a cabo con las protemas de fusion de condroitinasa de tipo salvaje y condroitinasa se pueden aclarar por centrifugacion y despues someter a un metodo de HPLC de intercambio anionico validado de la siguiente manera. Se puede utilizar una columna analftica Dionex CarboPac PA-i0 (4 x 250 mm) equipada con una columna protectora Dionex CarboPac PA-i0 (4 x 50 mm) con una fase movil que consiste en un gradiente de agua a pH 3,5 (tampon A) y NaCl 2M, a pH 3,5 (tampon B). La deteccion se puede establecer a una longitud de onda de 232 nm. Una velocidad de flujo de i ml/minuto y un gradiente continuo de 45 minutos de i00% de A a i00% de B proporciona una resolucion aceptable de A4Ds y A6DS. Las curvas patron se pueden generar utilizando cantidades conocidas de A4DS y A6DS.

La zimograffa permite la resolucion de protemas por su peso molecular con una evaluacion concomitante de la actividad condroitinasa. Un gel de poliacrilamida al i0% se puede polimerizar en presencia de 85 pg/ml de agrecano. Las muestras se pueden hervir en un tampon de carga-SDS y a continuacion los analitos se pueden resolver mediante electroforesis. Despues de la separacion, el gel se puede incubar durante i hora a temperatura ambiente en Triton Xi00 al 2,5% y a continuacion i6 horas a 37°C en Triton X-i00 al 2,5% de nueva aportacion. Durante estas incubaciones, el SDS puede extraerse del gel y la condroitinasa se repliega y digiere el agrecano en su proximidad inmediata. Despues del proceso de replegamiento, el gel se puede colorear para determinar los carbohidratos. El gel se puede incubar primero en Cetilpiridinio al 0,2% durante 90 minutos a temperatura ambiente y despues transferir a Azul de Toluidina al 0,2% en H2O 49:50:i, Etanol, y Acido acetico durante 30 minutos. El gel puede estar en ese momento completamente destenido. Despues de destenir el gel se puede incubar durante la noche en una solucion de 50 microgramos/ml de Stains-All (Sigma) en etanol del 50%. La actividad de la condroitinasa se puede detectar como una mancha clara en el gel que coincide con el peso molecular de la enzima. Se ha demostrado que el tamano del aclaramiento esta casi linealmente relacionado con la actividad de una Unidad.

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La quimera de NgR27-3ii-condroitinasa se puede evaluar para determinar la actividad del receptor de Nogo senuelo. El analisis se puede utilizar para medir el colapso de los conos de crecimiento: Se diseccionan ganglios de la rafz dorsal (GRD) de los cnas de ratas Sprague Dawley 1 dfa despues del nacimiento (Pi) y se disocian en 200 U/ml de colagenasa I (Worthington) y 2,5 U/ml de dispasa (Boehringer/Roche) 2 veces durante 30 min. a 37°C. Las enzimas se eliminan y se puede anadir ADNasa (0,5 mg/ml) a los ganglios. La trituracion se puede realizar con una punta de pipeta unida a un Pipetman de 1000 pl. La suspension de celulas resultante se puede filtrar a traves de un filtro de celulas de 40 micras y se centrifuga a 70 xg durante 5 min. Las celulas se pueden volver a suspender en DMEM/FBS al 10% y se pre-cultivan en placa durante 2 horas sobre una placa de cultivo de tejidos no recubiertas (100 mm de diametro). Las neuronas no adherentes se eliminan y se cultivan en placa a 10.000 celulas/pocillo en una placa de 24 pocillos recubierta con Poli-lisina/laminina en Neurobasal/B27 libre de suero con 50 ng/ml de NGF. Despues de 20 a 24 horas, se puede anadir MAG o Nogo66 a concentraciones variables durante 1 hora a 37°C para inducir el colapso del cono de crecimiento. La quimera de NgR 27-311-condroitinasa se puede anadir a diversas concentraciones para competir con MAG y Nogo66 y asf proteger las neuronas del colapso del cono de crecimiento. Los cultivos se pueden fijar anadiendo un volumen igual de paraformaldehndo al 8% precalentado/sacarosa 0,6 M al medio durante 20 min. mientras que las celulas se mantienen en una placa caliente a 37°C. Los conos de crecimiento se pueden marcar con faloidina AlexaS68 (Molecular Probes). Brevemente, las celulas pueden ser permeabilizadas con Triton-X 100 al 0,1% durante 5 min. a la temperatura ambiente, se bloquean durante 20 min. en BSA al 1% en PBS y se incuban en faloidina, se diluyen 1:40 en BSA al 1%, en PBS durante 20 min a RT. Las celulas se pueden lavar en PBS y se pueden montar en medio de montaje fluorescente (DAKO). El porcentaje de conos de crecimiento colapsado se determina analizando un mmimo de 100 conos de crecimiento por pocillo bajo un objetivo de 40x.

La actividad biologica de las protemas de fusion con L1 se puede determinar utilizando un analisis normalizado de crecimiento de neuritas. Despues de grabar un cfrculo de 25 mm en el centro de una placa de 35 mm tratada con cultivo de tejidos, se puede anadir 1 ml de poli-lisina de 10 pg/ml a cada cfrculo grabado y se incuba a 37°C durante 60 minutos. La poli-lisina proporciona un control negativo para el crecimiento de las neuritas. Los drculos grabados se pueden lavar 2 veces con solucion salina equilibrada de Hank mas calcio y magnesio (HBSS++) despues del ultimo enjuague; se aplican 1,2 pl de L1-Fc (0,6 pM, 0,3 pM, 0,15 pM, 0,075 pM) sobre las placas de petri para que sirvan como un control positivo y se pueden aplicar diversas concentraciones de la protema de fusion de L1- condroitinasa a las placas como muestras de ensayo. Las placas se pueden incubar durante 1 hora a temperatura ambiente. Las aplicaciones se aspiran ligeramente, para no secarlas e inmediatamente se lavan 2 veces con 1 ml de HBSS++ y despues se anade a cada cfrculo grabado 1 ml de BSA al 1% en PBS. Despues de aproximadamente 15 minutos a temperatura ambiente, los drculos grabados se pueden lavar dos veces con HBSS++ y una vez con medio de bioanalisis (NeuralBasal (Gibco) + suplementos B27 (Gibco) + L-glutamina + acido L-glutamico, penicilina y estreptomicina 100 U/ml) + suero bovino fetal al 1% que permanecera en las placas de petri hasta el momento del analisis. Para proporcionar neuronas a la placa sobre los sustratos, se recogen celulas granulosas cerebelosas de los dfas 9 o 10 despues del nacimiento (PND). El cerebro se separa del craneo de 1 cna y el cerebelo se separa del resto del tejido, se elimina la meninges y se coloca el cerebelo en HBSS++ enfriado con hielo. Se tritura el tejido y se trata con tripsina utilizando tripsina al 0,25% durante 15 minutos a 37°C. La accion de tripsina se inhibe anadiendo 0,5 mg/ml de inhibidor de tripsina de soja (Gibco). El tejido se enjuaga con HBSS++ y se tritura con una pipeta Pasteur estrechada a la llama revestida con EBS. Las celulas disociadas se sedimentan a 500 xg durante 3 minutos, el sobrenadante se decanta y las celulas se resuspenden en 2 ml de medio de crecimiento. Despues de triturar ligeramente, la suspension celular se aplica cuidadosamente como recubrimiento sobre la parte superior de una almohadilla de BSA al 3,5% (en PBS), y se centrifuga a 500 xg durante 3 minutos. El sobrenadante se aspira y el sedimento se resuspende en 2 ml de medio de crecimiento. Se realiza un recuento celular y las celulas se diluyen hasta una concentracion final de trabajo de 1,5 x 105 celulas/ml. Se anade una alfcuota de 300 pl de celulas diluidas al centro de cada placa, dando como resultado la distribucion uniforme de 6 x 104 celulas a traves de toda el area superficial del cfrculo grabado. Se deja que las celulas crezcan durante 16 horas a 37°C en un entorno humidificado con un suplemento de CO2 al 5%. Al dfa siguiente se retiran las placas de la incubadora a 37°C, se fijan las celulas con paraformaldetndo al 4% y se registra el crecimiento de neuritas mediante fotomicroscopia.

Los analisis de actividad biologica para GGF2 se pueden realizar utilizando la proliferacion de celulas de Schwann. Se diseccionan los nervios ciaticos de cnas de ratas Sprague Dawley de tres dfas de edad y se disocian en medio L- 15 (Invitrogen) que contiene tripsina al 0,25% y colagenasa de tipo I (SIGMA) al 0,03% durante 15 minutos a 37°C. Los nervios se centrifugan a 400 xg durante 5 minutos y el medio de disociacion se sustituye por DMEM/FBS al 10%. Se trituran los nervios utilizando una jeringa de 10 ml con una aguja de 21 g y posteriormente una aguja de 23 g. La suspension de celulas se filtra a traves de una malla de 40 pm colocada sobre la abertura de un tubo conico de 50 ml. Las celulas se pueden centrifugar a 400 xg durante 5 min, cultivar en placa en un matraz T-75 recubierto con poli-D-lisina (PDL) a una densidad de aproximadamente 5 millones de celulas en 15 ml de DMEM/FBS al 10%/PenStrep y se incuban en una incubadora a 37°C regulada con CO2 al 10%. Despues de una incubacion de 24 horas, las celulas se pueden lavar dos veces con DMEM/FBS al 10% y volver a alimentar con medio de inhibicion de fibroblastos que consiste en DMEM/FBS al 10% y 10 pl/ml de arabinosido de citosina 1 mM (Ara-C). Despues de un tiempo de incubacion de 2 a 3 dfas, se reemplaza el medio de inhibicion de fibroblastos por medio de crecimiento de celulas de Schwann (DMEM/FBS al 10%/150 ng/ml de GGF2/forskolina 5 pM). Las celulas se pueden expandir y se congelan alfcuotas de 2 x 106 celulas/ml en DMEM/DMSO al 10%, FBS al 54% en nitrogeno lfquido. En el momento del uso, las celulas de Schwann se descongelan y se cultivan en placa a una densidad de aproximadamente 16.000

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celulas/pociMo en una placa de cultivo de tejidos de 96 pocillos recubierta con PDL en DMEM/FBS al 5%. Despues de aproximadamente 24 horas, se anade gGF2 en una dilucion seriada que oscila entre 100 ng/ml y 0,78 ng/ml que contiene forskolina 5 pM para establecer una curva patron. Tambien se pueden anadir muestras de protemas de fusion de GGF2 en dilucion seriada junto con forskolina 5 pM. Se anade BrdU 10 pM. Las celulas se incuban durante 48 horas en una incubadora de CO2 al 10%. Se puede utilizar un kit de ELISA de BrdU de Roche Applied Science (Num. de catalogo 1 647 229) para detectar la proliferacion de celulas de Schwann. El medio se vierte de la placa y la placa se tapa con un panuelo de papel. Se anade una almuota de 200 pl/pocillo de Fix/Denat y se incuba durante 30 min a 15-25°C. Se disuelve una almuota de 100 pl/pocillo de solucion de trabajo anti-BrdU-POD (el anticuerpo liofilizado se disuelve en 1,1 ml de agua doblemente destilada y se diluye 1:100 con solucion de dilucion de anticuerpo) y se incuba durante 90 minutos a temperatura ambiente. Los pocillos se pueden lavar 3 veces con 200300 pl/pocillo de solucion de lavado. Se anade una almuota de 100 pl de solucion de sustrato y se incuba durante 15 minutos o hasta que el desarrollo del color sea suficiente para la deteccion fotometrica. Las placas se leen en un lector de placas SpectraMax a 450 nm bien antes de la adicion de la solucion de parada a 370 nm bien despues de la adicion de 50 ml de acido sulfurico 1N a cada pocillo.

ELISA Akt [pS473]: Se cultivan celulas de glioma C6, obtenidas de la ATCC, en DMEM/FBS al 10% en un matraz T- 75 hasta la confluencia. Despues del tratamiento con tripsina, las celulas se cultivan en una placa de 24 pocillos a una densidad de 500.000 celulas/pocillo en 0,5 ml de medio. Un dfa despues del cultivo en placa las celulas se tratan con GGF2 (lote: Glu de Lonza Biologics) a diluciones seriadas que oscilan entre 0,78 y 100 ng/ml durante 30 minutos a 37°C para establecer una curva patron. Como control negativo, se anade wortmanina, un inhibidor de quinasa PI3, a las celulas a 10 nnM durante 30 minutos antes de la adicion de GGF2. Las muestras de protemas de fusion de GGF2 tambien se anadiran en una dilucion seriada. Las celulas se lavan con PBS y despues se extraen con 100 pl de tampon de extraccion celular (Tris 10 mM, pH 7,4, NaCl 100 mM, EDTA 1 mM, EgTa 1 mM, NaF 1 mM, Na4P2O7 20 mM, Na3VO4 2 mM, Triton X-100 al 1%, glicerol al 10%, SDS al 0,1%, desoxicolato al 0,5%, PMSF 1 mM, coctel inhibidor de proteasa (Pierce)). Los extractos de celulas se mantienen a -80°C hasta su uso posterior. Se puede utilizar un kit ELlSA de Biosource (Numero de catalogo KHOO1 II) para medir los niveles de quinasa Akt fosforilada. En resumen, se cargan 100 pl de una dilucion 1:50 de muestras y una dilucion seriada de patrones de Akt [pS473] en pocillos recubiertos de antemano con anticuerpo anti-Akt durante 2 horas a temperatura ambiente (RT) o durante una noche a 4°C. Los pocillos se lavan y se anade el anticuerpo anti-Akt [pS473] y se incuba durante 1 hora. Despues del lavado, se anade el antisuero anti-conejo conjugado con HRP a los pocillos y se incuba durante 30 min. Despues del lavado, se anade cromogeno TMB a los pocillos y se incuba durante 30 minutos a RT antes de detener la reaccion con solucion de parada. La placa se lee en un lector de placas SpectraMax a 450 nm. Las densidades opticas se trazan frente a los patrones de Akt [pS473] y la concentracion de pAkt en las muestras C6 se deduce de la curva patron.

Ejemplo 6

Este ejemplo ilustra la construccion de una protema de fusion de polipeptido de condroitinasa y un peptido de transduccion celular TAT.

La secuencia genica que codifica una enzima condroitinasa puede estar funcionalmente unida al dominio de transduccion de protemas del VIH denominado peptido TAT. El constructo de ADN de la fusion de TAT-condroitinasa ABCI de los genes quimericos resultantes se muestra en la FIG. 1. Se observo que durante la expresion bacteriana de este constructo, el peptido TAT se elimino de la enzima condroitinasa en algun punto del procesamiento durante el crecimiento bacteriano. La eliminacion de los peptidos unidos al extremo N-terminal tambien se observo durante la expresion de una enzima condroitinasa ABCI etiquetada con histidina N-terminal.

Se generaron mutantes por delecion de la enzima condroitinasa ABCI, donde el mutante habfa perdido un cierto numero de aminoacidos de la porcion N-terminal del polipeptido, pero mantema la actividad de degradacion de proteoglicano. Se observo que esta delecion N-terminal mantema una etiqueta de histidina que estaba anclada al extremo N-terminal. Se espera que se puedan expresar diversos constructos de ADN de la fusion TAT-mutante por delecion de condroitinasa ABCI sin la eliminacion del polipeptido TAT durante la expresion. Por ejemplo, el peptido TAT puede estar fusionado en el extremo N de los mutantes por delecion como ABCI-NA20 o el mutante por delecion ABCI-NA60. Sin pretender estar limitado por la teona, los autores de la presente invencion creen que la enzima de degradacion de proteoglicano nativa contiene una secuencia senal que esta anclada al extremo N- terminal. Esta secuencia senal se elimina durante la produccion natural en bacterias y en la produccion de la enzima clonada en E. coli. Se cree que alguna senal dentro de los aminoacidos n-terminales instruye a las bacterias para eliminar cualquier elemento unido a este extremo.

Se puede elaborar un constructo de ADN con el peptido TAT anclado al extremo N de uno de los mutantes por delecion de condroitinasa y realizar una transferencia Western y un gel de protema que muestran esta protema expresada y su actividad.

Ejemplo 7

Este ejemplo ilustra la difusion de moleculas a celulas y tejidos utilizando una composicion de degradacion de proteoglicano.

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Se extrajo del craneo un cerebro de rata Sprague Dawley adulta y se dividio en cuatro en secciones frontal derecha, frontal izquierda, trasera derecha y trasera izquierda, que correspondfan aproximadamente a los lobulos frontal (frontal) y occipito-parietal (trasero). (A) Se coloco el cuarto frontal derecho en fluido cerebroespinal artificial (Num. Catalogo 59-7316, Harvard Apparatus, Holliston, Massachusetts) que contema la enzima beta-galactosidasa (Num. Catalogo G 5160; Sigma, St. Louis, MO) y Condroitinasa ABC I a 0,5 U/ml (Num. Catalogo C 3667; Sigma, St. Louis, MO) durante 2 horas a 37°C. El cuarto cerebral se aclaro varias veces en solucion salina tamponada con fosfato (PBS) y a continuacion se proceso con un kit de tincion Beta-Gal (Num. Catalogo Gal-S, Sigma, St. Louis, MO). Se dejo que la reaccion sustrato-enzima (producto azul) se desarrollara durante 1 hora, y el cerebro se enjuago varias veces en PBS y las porciones de la mitad de cada corte del bloque de cerebro se cortaron utilizando rasuradoras rectas paralelas. (B) Se coloco el cuarto frontal izquierdo en fluido cerebroespinal artificial (Num. Catalogo 59-7316, Harvard Apparatus, Holliston, MA) que contema la enzima beta-galactosidasa (Num. Catalogo, G 5160; Sigma, St. Louis, MO) durante 2 horas a 37°C. El cuarto cerebral se enjuago varias veces en solucion salina tamponada con fosfato (PBS) y despues se proceso con un kit de tincion Beta-Gal (Num. Catalogo Gal-Sigma, St. Louis, MO). Se permitio que la reaccion sustrato-enzima (producto azul) se desarrollara durante 1 hora, y se enjuago el cerebro varias veces en PBS y se cortaron porciones del centro de cada bloque de cerebro utilizando rasuradoras rectas paralelas. (C) El cuarto frontal derecho se coloco en fluido cerebroespinal artificial (Num. Catalogo 59-7316; Harvard Apparatus, Holliston, MA) que contema la enzima beta-galactosidasa (Num. de Catalogo, G 5160, Sigma, St. Louis, mO) y condroitinasa ABC I a 0,5 U/ml (Num. de Catalogo C 3667, Sigma, St. Louis, MO) durante 2 horas a 37°C. El cuarto de cerebro se aclaro varias veces en solucion salina tamponada con fosfato (PBS) y despues se proceso con un kit de tincion Beta-Gal (Num. de Catalogo Gal-S, Sigma, St. Louis, MO). Se permitio que se desarrollara la reaccion sustrato-enzima (producto azul) durante 1 hora, y se enjuago el cerebro varias veces en PBS y se cortaron porciones del centro de cada bloque cerebral utilizando rasuradoras rectas paralelas. (D) Se coloco el cuarto trasero izquierdo en fluido cerebroespinal artificial (Num. Catalogo 59-7316, Harvard Apparatus, Holliston, MA) que contema la enzima beta-galactosidasa (Num. Catalogo, G 5160; Sigma, St. Louis, MO) durante 2 horas a 37°C. El cuarto de cerebro se enjuago varias veces en solucion salina tamponada con fosfato (PBS) y despues se proceso con un kit de tincion Beta-Gal (Num. de Catalogo Gal-S, Sigma, St. Louis, MO). Se permitio que se desarrollara la reaccion sustrato-enzima (producto azul) durante 1 hora, y se enjuago el cerebro varias veces en PBS y se cortaron porciones del centro de cada bloque cerebral utilizando rasuradoras rectas paralelas. Se obtuvieron imagenes de los cerebros en un escaner y se muestran en la FIG. 2 (I) (A-D).

Los hemisferios de cerebro de rata adulta se empaparon en tampon solo o que contema 33 U/ml de condroitinasa ABCI (Acorda) durante 2 horas a 37 grados C. Se lavaron los hemisferios y se colocaron inmediatamente en Eosina Y (Sigma) o en una solucion saturada de Rojo Congo (Sigma) en etanol del 70%. Se cortaron porciones de tejido y se obtuvieron imagenes en un escaner. Vease la FIG. 2 (II) Eosina y la FIG. 2 (III) Rojo Congo.

FIG. 2(III) La solucion saturada de la Rojo Congo muestra una mayor penetracion a traves de la corteza de un hemisferio cerebral tratado con Condroitinasa en comparacion con un cerebro no tratado. Rojo Congo es un colorante cargado negativamente de 697 kDA. FIG. 2(II) La penetracion de Eosina Y a traves de la corteza de un hemisferio cerebral tratado con Condroitinasa se ve ligeramente mas difusa, pero la penetracion no parece ser mas profunda en comparacion con un cerebro no tratado. La eosina Y es zwiterionica, tiene una carga negativa global al pH bajo al que se utiliza, y tiene 692 kDa. FIG. 2 (I) Los lobulos de rata adulta se incubaron en beta-galactosidasa sola (B & D), o con la adicion de Condroitinasa AbCi (A, 0,5 U/ml o C, 0,005 U/m).

Los resultados mostraron que el tejido tratado con condroitinasa afecto a la penetracion de la beta-galactosidasa en el tejido del SNC. La condroitinasa tuvo efectos drasticos sobre la tasa de penetracion del colorante Rojo Congo pero aparentemente no de la Eosina.

Ejemplo 8

Este ejemplo ilustra un Protocolo de Analisis de Condroitinasa ABCI que puede ser modificado para medir la actividad de las protemas de fusion de mutantes por delecion de Condroitinasa ABCI o la actividad de otras protemas de fusion de polipeptidos de degradacion de proteoglicanos descritos en la presente memoria.

La produccion de productos de reaccion a partir de la actividad catalttica de una molecula de degradacion de proteoglicano o protema de fusion se determina mediante una medicion de la absorbancia del producto a una longitud de onda de 232 nm. Una mezcla de reaccion tfpica consiste en 120 p, l de mezcla de reaccion (Tris 40 mM, pH 8,0, Acetato de Na 40 mM, casema al 0,002%) combinada con un sustrato (5 ; il de condroitina C 50 mM) y 1,5 pl de condroitinasa ABCI o una protema de fusion de un mutante por delecion de la condroitinasa ABCl-TAT. Referencia de cABCI de Seikagaku: congelada a -20°C en almuotas de 5 ml, utilizar 1 ml por reaccion, condroitina C 50 mM (PM 521) en agua: congelada a -20°C en almuotas de 100 ml. Se pueden preparar almuotas de la mezcla de reaccion de aproximadamente 120 pl a 37°C durante 3 minutos o mas. Se utiliza una longitud de onda de 232 nm con el espectrometro.

Conociendo el coeficiente de extincion para el producto de reaccion, midiendo el cambio en la absorbancia del producto de reaccion a una lectura de 232 nm en el tiempo tras la adicion de una cantidad conocida de la Condroitinasa ABCI u otras protemas de fusion de polipeptidos de degradacion de proteoglicanos a la mezcla de reaccion de 120 pl con casema al 0,002% y sustrato de condroitina anadido, se puede determinar la actividad

espedfica en moles/min/mg de la protema de fusion de degradacion de proteoglicano. La Condroitinasa ABCI de Seikagaku tiene una actividad espedfica bajo estas condiciones de analisis de aproximadamente 450 pmoles/min/mg.

SEQ ID NO: 1 Protema Condroitinasa ABC I ORIGEN

atsnpa fdpknlmqse iyhfaqnnpl adfssdknsi 61 Itlsdkrsim gnqsllwkwk ggssftlhkk livptdkeas kawgrsstpv fsfwlynekp 121 idgyltidfg ekUstseaq agfkvkldft gwrTvgvsln ndlenremtl natntssdgt 181 qdsigrslga kvdsirfkap snvsqgeiyi drimfsvdda ryqwsdyqvk trlsepeiqf 241 hnvkpqlpvt penlaaidli rqrlinefvg geketnlale enisklksdf dalnThtlan 301 ggtqgrhlit dkqiiiyqpe nlnsqdkqlf dnyvilgnyt tlmfnisray vlekdptqka 361 qlkqmyllmt khlldqgfvk gsalvtthhw gyssrwwyis tllmsdalke anlqtqvyds 421 llwysrefks sfdmkvsads sdldyfhtls iqhlalllle pddqkrinlv ntfshyitga 481 Itqvppggkd glrpdgtawr hegnypgysf pafknasqli yllrdtpfsv gesgwnnlkk 541 amvsawiysn pevglplagr hpfnspslks vaqgyywlam saksspdkd asiylaisdk 601 tqnestaifg etitpaslpq gfyafnggaf gihrwqdkmv tlkayntnvw sseiynkdnr 661 ygryqshgva qivsngsqls qgyqqegwdw nrmegattih lplkdldspk phtlmqrger 721 gfsgtssleg qygmmafnli ypanlerfdp nftakksvla adnhlifigs ninssdknkn 781 vettlfqhai tptlntlwin gqkienmpyq ttlqqgdwli dsngngylit qaekvnvsrq 841 hqvsaenknr qptegnfssa widhstrpkd asyeymvfld atpekmgema qkfrenngly 901 qvlrkdkdvh iildklsnvt gyafyqpasi edkwikkvnk paivmthrqk dtlivsavtp 961 dlnmtrqkaa tpvtinvtin gjkwqsadkns evkyqvsgdn teltftsyfg ipqeiklspl

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SEQ ID NO: 2 Protema NA20 ABCI (A45-N1023)

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61 Itlsdkrsim gnqsllwkwk ggssftlhkk livptdkeas kawgrsstpv fsfwlynekp 121 idgyltidfg ekhstseaq agfkvkldft gwrtvgvsln ndlenremtl natntssdgt 181 qdsigrslga kvdsirfkap snvsqgeiyi drimfsvdda ryqwsdyqvk trlsepeiqf 241 hnvkpqlpvt penlaaidli rqrlinefvg geketnlale enisklksdf dalnthtlan 301 ggtqgrhlit dkqiiiyqpe nlnsqdkqlf dnyvilgnyt tlmfnisray vlekdptqka 361 qlkqmyllmt khlldqgfvk gsalvtthhw gyssrwwyis tllmsdalke anlqtqvyds 421 llwysrefks sfdmkvsads sdldyfhtls rqhlalllle pddqkrinlv ntfshyitga 481 Itqvppggkd glrpdgtawr hegnypgysf pafknasqli yllrdtpfsv gesgwnnlkk 541 amvsawiysn pevglplagr hpfnspslks vaqgyywlam saksspdktl asiylaisdk 601 tqnestaifg etitpaslpq gfyafnggaf gihrwqdkmv tlkayntnvw sseiynkdnr 661 ygryqshgva qivsngsqls qgyqqegwdw nrmegattih lplkdldspk phtlmqrger 721 gfsgtssleg qygmmafnli ypanlerfdp nftakksvla adnhlifigs ninssdknkn 781 vettlfqhai tptlntlwin gqkienmpyq ttlqqgdwli dsngngylit qaekvnvsrq 841 hqvsaenknr qptegnfssa widhstrpkd asyeymvfld atpekmgema qkfrenngly 901 qvlrkdkdvh iildklsnvt gyafyqpasi edkwikkvnk paiymthrqk dtlivsavtp 961 dlnmtrqkaa tpvtinvtin gkwqsadkns evkyqvsgdn teltftsyfg ipqeiklspl

5 1021p

SEQ ID NO: 3 Protema NA60 ABCI (F85-N1023)

ftlhkk livptdkeas kawgrsstpv fsfwlynekp 121 idgyltidfg eklistseaq agfkvkldft gwrtvgvsln ndlenremtl natntssdgt 181 qdsigrslga kvdsirfkap snvsqgeiyi drimfsvdda ryqwsdyqvk trlsepeiqf 241 hnvkpqlpvt penlaaidli rqrlinefvg geketnlale enisklksdf dalnthtlan 301 ggtqgrhlit dkqiiiyqpe nlnsqdkqlf dnyvilgnyt tlmfnisray vlekdptqka 361 qlkqmyllmt khlldqgfvk gsalvtthhw gyssrwwyis tllmsdalke anlqtqvyds 421 llwysrefks sfdmkvsads sdldyfntls rqhlalllle pddqkrinlv ntfshyitga 481 ltqvppggkd glrpdgtawr hegnypgysf pafknasqli yllrdtpfsv gesgwnnlkk 541 amvsawiysn pevglplagr hpfnspslks vaqgyywlam saksspdktl asiylaisdk 601 tqnestaifg etitpaslpq gfyafnggaf gihrwqdkmv tlkayntnvw sseiynkdnr 661 ygryqshgva qivsngsqls qgyqqegwdw nnnegattih Iplkdldspk phtlmqrger 721 gfsgtssleg qygmmafnli ypanlerfdp nftakksvla adnhlifigs ninssdknkn 781 vettlfqhai tptlntlwin gqkiemnpyq ttlqqgdwli dsngngylit qaekvnvsrq 841 hqvsaenknr qptegnfssa widhstrpkd asyeymvfld atpekmgema qkfrenngly 901 qvlrkdkdvh iildklsnvt gyafyqpasi edkwikkvnk paivmthrqk dtlivsavtp 961 dlnmtrqkaa tpvtinvtin gkwqsadkns evkyqvsgdn teltftsyfg ipqeiklspl

1021 p

SEQ ID No. 4: Protema NA60 CA80 ABCI (F85-A942)

ftlhkk livptdkeas kawgrsstpv fsfwlynekp 121 idgyltidfg eklistseaq agfkvkldft gwrtvgvsln ndlenremtl natntssdgt 181 qdsigrslga kvdsirfkap snvsqgeiyi drimfsvdda ryqwsdyqvk trlsepeiqf 241 hnvkpqlpvt penlaaidli rqrlinefvg geketnlale enisklksdf dalnthtlan 301 ggtqgrhlit dkqiiiyqpe nlnsqdkqlf dnyvilgnyt tlmfnisray vlekdptqka 361 qlkqmyllmt khlldqgfvk gsalvtthhw gyssrwwyis tllmsdalke anlqtqvyds 421 llwysrefks sfdmkvsads sdldyfhtls rqhlalllle pddqkrinlv ntfshyitga 481 ltqvppggkd glrpdgtawr hegnypgysf pafknasqli yllrdtpfsv gesgwnnlkk 541 amvsawiysn pevglplagr hpfnspslks vaqgyywlam saksspdktl asiylaisdk 601 tqnestaifg etitpaslpq gfyafnggaf gihrwqdkmv tlkayntnvw sseiynkdnr 661 ygryqshgva qivsngsqls qgyqqegwdw nrmegattih Iplkdldspk phtlmqrger 721 gfsgtssleg qygmmafnli ypanlerfdp nftakksvla adnhlifigs ninssdknkn 781 vettlfqhai tptlntlwin gqkienmpyq ttlqqgdwli dsngngylit qaekvnvsrq 841 hqvsaenknr qptegnfssa widhstrpkd asyeymvfld atpekmgema qkfrenngly 901 qvlrkdkdvh iildklsnvt gyafyqpasi edkwikkvnk pa

SEQ ID NO: 5 Protema Condroitinasa AC Locus 1HMW_A

5 ORIGEN

1 mkklfvtciv ffsilspall iaqqtgtael imkrvmldlk kplmmdkva eknlntlqpd 61 gswkdvpykd damtnwlpnn hllqletiiq ayiekdshyy gddkvfdqis kafkywydsd 121 pksmwwhne iatpqalgem lilmrygkkp Idealvhidt ermkrgepek ktganktdia 181 lhyfyrallt sdeailsfav kelfypvqfv hyeeglqydy sylqhgpqlq issygavfit 241 gvlldanyvr dtpyalstek laifskyyrd sylkairgsy mdfnvegrgv srpdilnkka 301 ekkrllvakm idlkhteewa daiartdstv aagykiepyh hqfwngdyvq hlrpaysfnv 361 rmvskrtrrs esgnkenllg rylsdgatni qlrgpeyyni mpvwewdkip gitsrdyltd 421 rpltklwgeq gsndfaggvs dgvygasaya Idydslqakk awfffdkeiv clgaginsna 481 penitttlnq swlngpvist agktgrgkit tfkaqgqfwl lhdaigyyfp eganlslstq

541 sqkgnwfhin nshskdevsg dvfklwinhg arpenaqyay ivlpginkpe eikkyngtap 601 kvlantnqlq avyhqqldmv qaifytagkl svagieietd kpcavlikhi ngkqviwaad 661 plqkektavl sirdlktgkt nrvkidfipqq efagatvelk

qqtgtael imkrvmldlk kplmmdkva eknlntlqpd 61 gswkdvpykd damtnwlpnn hllqletiiq ayiekdshyy gddkvfdqis kafkywydsd 121 pksmwwhne iatpqalgem lilmrygkkp ldealvhklt ermkrgepek ktganktdia 181 lhyfyrallt sdeallsfav kelfypvqfv hyeeglqydy sylqhgpqlq issygavfit 241 gvlklanyvr dtpyalstek laifskyyrd syikairgsy mdfnvegrgv srpdilnkka 301 ckkrllvakm idlkhteewa daiartdstv aagykiepyh hqfwngdyvq hlrpaysfnv 361 rmvskrtrrs esgnkenllg rylsdgatni qlrgpeyyni mpvwewdkip gitsrdyltd 421 rpltklwgeq gsndfaggvs dgvygasaya Idydslqakk awfffdkeiv clgaginsna 481 penitttlnq swlngpvist

SEQ ID NO: 7 Protema CA220 AC (Q23-A480)

qqtgtael imkrvmldlk kplmmdkva eknlntlqpd 61 gswkdvpykd damtnwlpnn hllqletiiq ayiekdshyy gddkvfdqis kafkywydsd 121 pksmwwhne iatpqalgem lilmrygkkp ldealvhklt ermkrgepek ktganktdia 181 lhyfyrallt sdeallsfav kelfypvqfv hyeeglqydy sylqhgpqlq issygavfit 241 gvlklanyvr dtpyalstek laifskyyrd syikairgsy mdfnvegrgv srpdilnkka 301 ekkrllvakm idlkhteewa daiartdstv aagykiepyh hqfwngdyvq hlrpaysfnv 361 rmvskrtrrs esgnkenllg rylsdgatni qlrgpeyyni mpvwewdkip gitsrdyltd 421 rpltklwgeq gsndfaggvs dgvygasaya Idydslqakk awfffdkeiv clgaginsna

SEQ ID NO: 8 Protema NA20 CA200 AC (L43-T500)

lmmdkva eknlntlqpd

61 gswkdvpykd damtnwlpnn hllqletiiq ayiekdshyy gddkvfdqis kafkywydsd 121 pksmwwhne iatpqalgem Iilmiygkkp ldealvhklt ermkrgepek ktganktdia 181 lhyfyrallt sdeallsfav kelfypvqfv hyeeglqydy sylqhgpqlq issygavfit 241 gvlklanyvr dtpyalstek laifskyyrd syikairgsy mdfnvegrgv srpdilnkka 301 ekkrllvakm idlkhteewa daiartdstv aagykiepyh hqfwngdyvq hlrpaysfnv 361 rmvskrtrrs esgnkenllg rylsdgatni qlrgpeyyni mpvwewdkip gitsrdyltd 421 rpltklwgeq gsndfaggvs dgvygasaya Idydslqakk awfffdkeiv clgaginsna 5 481 penitttlnq swlngpvist

SEQ ID NO: 9 Protema NA50 CA200 AC (T74-T500)

tnwlpnn hllqletiiq ayiekdshyy gddkvfdqis kafkywydsd 121 pksmwwhne iatpqalgem lilmrygkkp ldealvhklt ermkrgepek ktganktdia 181 lhyfyrallt sdeallsfav kelfypvqfv hyeeglqydy sylqhgpqlq issygavfit 241 gvlldanyvr dtpyalstek laifskyyrd syikairgsy mdfnvegrgv srpdilnkka 301 ekkrllvakm idlkhteewa daiartdstv aagykiepyh hqfwngdyvq hlrpaysfnv 361 rmvskrtrrs esgnkenllg rylsdgatni qlrgpeyyni mpvwewdkip gitsrdyltd 421 rpltklwgeq gsndfaggvs dgvygasaya Idydslqakk awfffdkeiv clgaginsna 481 penitttlnq swlngpvist

SEQ ID NO: 10 Protema NA100 CA200 AC (S123-T500)

smwwhne iatpqalgem lilmrygkkp ldealvhklt ermkrgepek ktganktdia 181 lhyfyrallt sdeallsfav kelfypvqfv hyeeglqydy sylqhgpqlq issygavfit 241 gvlklanyvr dtpyalstek laifskyyrd syikairgsy mdfiivegrgv srpdilnkka 301 ekkrllvakm idlkhteewa daiartdstv aagykiepyh hqfwngdyvq hlrpaysfnv 361 rmvskrtrrs esgnkenllg rylsdgatni qlrgpeyyni mpvwewdkip gitsrdyltd 421 rpltklwgeq gsndfaggvs dgvygasaya Idydslqakk awfffdkeiv clgaginsna 481 penitttlnq swlngpvist

5

10

tnwlpnn hllqletiiq ayiekdshyy gddkvfdqis kafkywydsd 121 pksmwwhne iatpqalgem lilmrygkkp ldealvhldt ermkrgepek ktganktdia 181 lhyfyrallt sdeallsfav kelfypvqfv hyeeglqydy sylqhgpqlq issygavfit 241 gvlklanyvr dtpyalstek Iaifskyyrd sylkairgsy mdfnvegrgv srpdilnkka 301 ekkrllvakm idlichteewa daiartdstv aagykiepyh hqfwngdyvq hlrpaysfnv 361 rmvskrtrrs esgnkenllg rylsdgatni qlrgpeyyni mpvwewdkip gitsrdyltd 421 rpltkl

SEQ ID NO: 12 Protema Condroitinasa B Locus Q46079

ORIGEN

1 mkmlnklagy llpimvllnv apclgqwas netlyqwke vkpgglvqia dgtykdvqli 61 vsnsgksglp itikalnpgk vfftgdakve lrgehlileg iwfkdgnrai qawkshgpgl 121 vaiygsynri tacvfdcfde ansayittsl tedgkvpqhc ridhcsftdk itfdqvinln 181 ntaraikdgs vggpgmyhrv dhcffsnpqk pgnagggiri gyymdigrc lvdsnlfmrq 241 dseaeiitsk sqenvyygnt ylncqgtmnf rhgdhqvain nfyigndqrf gyggmfvwgs 301 rhviacnyfe lsetiksrgn aalylnpgam asehalafdm liannafinv ngyaihfnpl 361 derrkeycaa nrlkfetphq lralkgnlffk dkpyvypffk ddyfiagkns wtgnvalgve 421 kgipvnisan rsaykpvkik diqpiegial dlnaliskgi tgkplswdev rpywlkempg 481 tyaltarlsa draakfkavi kmkeh

SEQ ID NO: 13 Protema NA80 Condroitinasa B (Gi06-H5o6)

gnrai qawkshgpgl

121 vaiygsynri tacvfdcfde ansayittsl tedgkvpqhc ridhcsftdk itfdqvinln 181 ntaraikdgs vggpgmyhrv dhcffsnpqk pgnagggiri gyymdigrc lvdsnlfmrq 241 dseaeiitsk sqenvyygnt ylncqgtmnf rhgdhqvain nfyigndqrf gyggmfvwgs 301 rhviacnyfe lsetiksrgn aalylnpgam asehalafdm liannafinv ngyaihfnpl 361 derrkeycaa nrlkfetphq lmlkgnlffk dkpyvypffk ddyfiagkns wtgnvalgve 421 kgipvnisan rsaykpvkik diqpiegial dlnaliskgi tgkplswdev rpywlkempg 481 tyaltarlsa draakfkavi kmkeh

SEQ ID NO: 14 Protema NA120 Condroitinasa B (Ii46-H506)

ittsl tedgkvpqhc ridhcsftdk itfdqvinln 181 ntaraikdgs vggpgmyhrv dhcffsnpqk pgnagggiri gyymdigrc lvdsnlfmrq 241 dseaeiitsk sqenvyygnt ylncqgtmnf rhgdhqvain nfyigndqrf gyggmfvwgs 301 rhviacnyfe lsetiksrgn aalylnpgam asehalafdm liannafinv ngyaihfnpl

361 derrkeycaa nrlkfetphq lmlkgnlffk dkpyvypffk ddyfiagkns wtgnvalgve 421 kgipvnisan rsaykpvkik diqpiegial dlnaliskgi tgkplswdev rpywlkempg 481 tyaltarlsa draakfkavi kmkeh

SEQ ID NO: 15 Protema CA19 Condroitinasa B (Q26-L488)

qwas netlyqwke vkpgglvqia dgtykdvqli 61 vsnsgksglp itikalnpgk vfftgdakve lrgehlileg iwfkdgnrai qawkshgpgl 121 vaiygsynri tacvfdcfde ansayittsl tedgkvpqhc ridhcsftdk itfdqvinln 181 ntaraikdgs vggpgmyhrv dhcffsnpqk pgnagggiri gyymdigrc lvdsnlfmrq 241 dseaeiitsk sqenvyygnt ylncqgtmnf rhgdhqvain nfyigndqrf gyggmfvwgs 301 rhviacnyfe lsetiksrgn aalylnpgam asehalafdm liannafinv ngyaihfnpl 361 derrkeycaa nrlkfetphq lmlkgnlffk dkpyvypffk ddyfiagkns wtgnvalgve 421 kgipvnisan rsaykpvkik diqpiegial dlnaliskgi tgkplswdev rpywlkempg 481 tyaltarl

qwas netlyqwke vkpgglvqia dgtykdvqli 61 vsnsgksglp itikalnpgk vfftgdakve lrgehlileg iwfkdgnrai qawkshgpgl 121 vaiygsynri tacvfdcfde ansayittsl tedgkvpqhc ridhcsftdk itfdqvinln 181 ntaraikdgs vggpgmyhrv dhcffsnpqk pgnagggiri gyymdigrc lvdsnlfmrq 241 dseaeiitsk sqenvyygnt ylncqgtmnf rhgdhqvain nfyigndqrf gyggmfvwgs 301 rhviacnyfe lsetiksrgn aalylnpgam asehalafdm liannafinv ngyaihfnpl 361 derrkeycaa nrlkfetphq lmlkgnlffk

SEQ ID NO: 17 Protema NA120 CA120 Condroitinasa B (I146-K39o)

ittsl tedgkvpqhc ridhcsftdk itfdqvinln

181 ntaraikdgs vggpgmyhrv dhcffsnpqk pgnagggiri gyymdigrc lvdsnlfmrq 241 dseaeiitsk sqenvyygnt ylncqgtmnf rhgdhqvain nfyigndqrf gyggmfvwgs 301 rhviacnyfe lsetiksrgn aalylnpgam asehalafdm liannafinv ngyaihfnpl 361 derrkeycaa nrlkfetphq lmlkgnlffk

SEQ ID NO: 18 Locus CHU27583 del nucleotido de Coindroitinasa AC

5 ORIGEN

1 atgaagaaat tatttgtaac ctgtatagtc tttttctcta ttttaagtcc tgctctgctt 61 attgcacagc agaccggtac tgcagaactg attatgaagc gggtgatgct ggaccttaaa 121 aagcctttgc gcaatatgga taaggtggcg gaaaagaacc tgaatacgct gcagcctgac 181 ggtagctgga aggatgtgcc ttataaagat gatgccatga ccaattggtt gccaaacaac 241 cacctgctac aattggaaac tattatacag gcttatattg aaaaagatag tcactattat 301 ggcgacgata aagtgtttga ccagatttcc aaagctttta agtattggta tgacagcgac 361 ccgaaaagcc gcaactggtg gcacaatgaa attgccactc cgcaggccct tggtgaaatg 421 ctgatcctga tgcgttacgg taaaaagccg cttgatgaag cattggtgca taaattgacc 481 gaaagaatga agcggggcga accggagaag aaaacggggg ccaacaaaac agatatcgcc 541 ctgcattact tttatcgtgc tttgttaacg tctgatgagg ctttgctttc cttcgccgta 601 aaagaattgt tttatcccgt acagtttgta cactatgagg aaggcctgca atacgattat 661 tcctacctgc agcacggtcc gcaattacag atatcgagct acggtgccgt atttattacc 721 ggggtactga aacttgccaa ttacgttagg gatacccctt atgctttaag taccgagaaa 781 ctggctatat tttcaaagta ttaccgcgac agttatctga aagctatccg tggaagttat

841 atggatttta acgtagaagg ccgcggagta agccggccag acattctaaa taaaaaggca 901 gaaaaaaaga ggttgctggt ggcgaagatg atcgatctta agcatactga agaatgggct 961 gatgcgatag ccaggacaga tagcacagtt gcggccggct ataagattga gccctatcac 1021 catcagttct ggaatggtga ttatgtgcaa catttaagac ctgcctattc ttttaatgtt 1081 cgtatggtga gtaagcggac ccgacgcagt gaatccggca ataaagaaaa cctgctgggc 1141 aggtatttat ctgatggggc tactaacata caattgcgcg gaccagaata ctataacatt 1201 atgccggtat gggaatggga caagattcct ggcataacca gccgtgatta tttaaccgac 1261 agacctttga cgaagctttg gggagagcag gggagcaatg actttgcagg aggggtgtct 1321 gatggtgtat acggggccag tgcctacgca ttggattacg atagcttaca ggcaaagaaa 1381 gcctggttct tttttgacaa agagattgta tgtcttggtg ccggtatcaa cagcaatgcc 1441 cctgaaaaca ttaccactac ccttaaccag agctggttaa atggcccggt tataagtact 1501 gcaggtaaaa ccggccgggg taaaataaca acgtttaaag cacagggaca gttctggttg 1561 ttgcacgatg cgattggtta ttactttcct gaaggggcca accttagtct gagtacccag 1621 tcgcaaaaag gcaattggtt ccacatcaac aattcacatt caaaagatga agtttctggt 1681 gatgtattta agctttggat caaccatggt gccaggccag aaaatgcgca gtatgcttat 1741 atcgttttgc cgggaataaa caagccggaa gaaattaaaa aatataatgg aacggcaccg 1801 aaagtccttg ccaataccaa ccagctgcag gcagtttatc atcagcagtt agatatggta 1861 caggctatct tctatacagc tggaaaatta agcgtagcgg gcatagaaat tgaaacagat 1921 aagccatgtg cagtgctgat caagcacatc aatggcaagc aggtaatttg ggctgccgat 1981 ccattgcaaa aagaaaagac tgcagtgttg agcatcaggg atttaaaaac aggaaaaaca 2041 aatcgggtaa aaattgattt tccgcaacag gaatttgcag gtgcaacggt tgaactgaaa 2101 tag

//

SEQ ID NO: 19 Deletion NA50 C A275 (a220 - 11278) del acido nucleico de Condriotinasa AC

atgccatga ccaattggtt gccaaacaac

241 cacctgctac aattggaaac tattatacag gcttatattg aaaaagatag tcactattat 301 ggcgacgata aagtgtttga ccagatttcc aaagctttta agtattggta tgacagcgac 361 ccgaaaagcc gcaactggtg gcacaatgaa attgccactc cgcaggccct tggtgaaatg 421 ctgatcctga tgcgttacgg taaaaagccg cttgatgaag cattggtgca taaattgacc 481 gaaagaatga agcggggcga accggagaag aaaacggggg ccaacaaaac agatatcgcc 541 ctgcattact tttatcgtgc tttgttaacg tctgatgagg ctttgctttc cttcgccgta 601 aaagaattgt tttalcccgt acagtttgta cactatgagg aaggcctgca atacgattat 661 tcctacctgc agcacggtcc gcaattacag atatcgagct acggtgccgt atttattacc 721 ggggtactga aacttgccaa ttacgttagg gatacccctt atgctttaag taccgagaaa 781 ctggctatat tttcaaagta ttaccgcgac agttatctga aagctatccg tggaagttat 841 atggatttta acgtagaagg ccgcggagta agccggccag acattctaaa taaaaaggca 901 gaaaaaaaga ggttgctggt ggcgaagatg atcgatctta agcatactga agaatgggct 961 gatgcgatag ccaggacaga tagcacagtt gcggccggct ataagattga gccctatcac 1021 catcagttct ggaatggtga ttatgtgcaa catttaagac ctgcctattc ttttaatgtt 1081 cgtatggtga gtaagcggac ccgacgcagt gaatccggca ataaagaaaa cctgctgggc 1141 aggtatttat ctgatggggc tactaacata caattgcgcg gaccagaata ctataacatt 1201 atgccggtat gggaatggga caagattcct ggcataacca gccgtgatta tttaaccgac 1261 agaectttga cgaagctt

SEQ ID NO: 20 Locus CHU27584 del acido nucleico de Condroitinasa B ORIGEN

1 atgaagatgc tgaataaact agccggatac ttattgccga tcatggtgct gctgaatgtg 61 gcaccatgct taggtcaggt tgttgcttca aatgaaactt tataccaggt tgtaaaggag

121 gtaaaacccg gtggtctggt acagattgcc gatgggactt ataaagatgt tcagctgatt 181 gtcagcaatt caggaaaatc tggtttgccc atcactatta aagccctgaa cccgggtaag 241 gtttttttta ccggagatgc taaagtagag ctgaggggcg agcacctgat actggaaggc 301 atctggttta aagacgggaa cagagctatt caggcatgga aatcacatgg acccggattg 361 gtggctatat atggtagcta taaccgcatt accgcatgtg tatttgattg ttttgatgaa 421 gccaattctg cttacattac tacttcgctt accgaagacg gaaaggtacc tcaacattgc 481 cgcatagacc attgcagttt taccgaiaag atcacttttg accaggtaat taacctgaac 541 aatacagcca gagctattaa agacggttcg gtgggaggac cggggatgta ccatcgtgtt 601 gatcactgtt ttttttccaa tccgcaaaaa ccgggtaatg ccggaggggg aatcaggatt 661 ggctattacc gtaatgatat aggccgttgt ctggtagact ctaacctgtt tatgcgtcag 721 gattcggaag cagagatcat caccagcaaa tcgcaggaaa atgtttatta tggtaatact 781 tacctgaatt gccagggcac catgaacttt cgtcacggtg atcatcaggt ggccattaac 841 aatttttata taggcaatga ccagcgattt ggatacgggg gaatgtttgt ttggggaagc 901 aggcatgtca tagcctgtaa ttattttgag ctgtccgaaa ccataaagtc gagggggaac 961 gccgcattgt atttaaaccc cggtgctatg gcttcggagc atgctcttgc tttcgatatg 1021 ttgatagcca acaacgcttt catcaatgta aatgggtatg ccatccattt taatccattg 1081 gatgagcgca gaaaagaata ttgtgcagcc aataggctta agttcgaaac cccgcaccag 1141 ctaatgttaa aaggcaatct tttctttaag gataaacctt atgtttaccc attttttaaa 1201 gatgattatt ttatagcagg gaaaaatagc tggactggta atgtagcctt aggtgtggaa 1261 aagggaatcc ctgttaacat ttcggccaat aggtctgcct ataagccggt aaaaattaaa 1321 gatatccagc ccatagaagg aatcgctctt gatctcaatg cgctgatcag caaaggcatt 1381 acaggaaagc cccttagctg ggatgaagta aggccctact ggttaaaaga aatgcccggg 1441 acgtatgctt taacggccag gctttctgca gatagggctg caaagtttaa agccgtaatt 5 1501 aaaagaaata aagagcactg a

SEQ ID NO: 21 Deletion NA120 CA120 (a436 - gn70) del acido nucleico de Condriotinasa B

attac tacttcgctt accgaagacg gaaaggtacc tcaacattgc 481 cgcatagacc attgcagttt taccgataag atcacttttg accaggtaat taacctgaac 541 aatacagcca gagctattaa agacggttcg gtgggaggac cggggatgta ccatcgtgtt 601 gatcactgtt ttttttccaa tccgcaaaaa ccgggtaatg ccggaggggg aatcaggatt 661 ggctattacc gtaatgatat aggccgttgt ctggtagact ctaacctgtt tatgcgtcag 721 gattcggaag cagagatcat caccagcaaa tcgcaggaaa atgtttatta tggtaatact 781 tacctgaatt gccagggcac catgaacttt cgtcacggtg atcatcaggt ggccattaac 841 aatttttata taggcaatga ccagcgattt ggatacgggg gaatgtttgt ttggggaagc 901 aggcatgtca tagcctgtaa ttattttgag ctgtccgaaa ccataaagtc gagggggaac 961 gccgcattgt atttaaaccc cggtgctatg gcttcggagc atgctcttgc tttcgatatg 1021 ttgatagcca acaacgcttt catcaatgta aatgggtatg ccatccattt taatccattg 1081 gatgagcgca gaaaagaata ttgtgcagcc aataggctta agttcgaaac cccgcaccag 1141 ctaatgttaa aaggcaatct tttctttaag

SEQ ID NO: 22 Locus I29953 del acido nucleico de Condroitinasa ABCI ORIGEN

1 ggaattccat cactcaatca ttaaatttag gcacaacgat gggctatcag cgttatgaca 61 aatttaatga aggacgcatt ggtttcactg ttagccagcg tttctaagga gaaaaataat 121 gccgatattt cgttttactg cacttgcaat gacattgggg ctattatcag cgccttataa 181 cgcgatggca gccaccagca atcctgcatt tgatcctaaa aatctgatgc agtcagaaat 241 ttaccatttt gcacaaaata acccattagc agacttctca tcagataaaa actcaatact 301 aacgttatct gataaacgta gcattatggg aaaccaatct cttttatgga aatggaaagg

Claims (7)

1. Una composicion que comprende:

un polipeptido que comprende un dominio de transduccion de la protema TAT y un mutante por delecion de condroitinasa ABC I, en donde el dominio de transduccion de la protema TAT esta anclado al extremo N del 5 mutante por delecion de condroitinasa ABC I y el mutante por delecion de condroitinasa ABC I se selecciona

entre SEQ ID NO: 2 y SEQ ID NO: 3.

2. La composicion de la reivindicacion 1, en donde el dominio de transduccion de la protema es un dominio TAT representado por SEQ ID NO: 57.

3. La composicion de la reivindicacion 1, en donde el dominio TAT y el mutante por delecion de condroitinasa ABC I 10 estan unidos entre sf por un dominio de polipeptido conector.

4. La composicion de la reivindicacion 3, en donde el dominio del polipeptido conector comprende un peptido rico en glicina.

5. La composicion de la reivindicacion 3, en donde el dominio de polipeptido conector comprende una secuencia seleccionada del grupo que consiste en conectores ricos en Gly-Gly-Gly-Gly-Gly, Gly-Gly-Ala-Gly-Gly, Gly/Ser, o

15 conectores ricos en Gly/Ala.

6. La composicion de la reivindicacion 3, en donde el dominio del polipeptido conector comprende un aminoacido de origen no natural, un aminoacido sustituido, un beta aminoacido, o un gamma aminoacido.

7. La composicion de la reivindicacion 1, en donde el polipeptido se selecciona entre SEQ ID NO: 42, o SEQ ID NO: 44.

20

Acido nucleico de fusion de TAT con condroitinasa ABC I

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FIG. 1

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Efecto de la condtroitinasa ABC 1 sobre la activid despues de lesion contusiva de la medula

ad locomotora espinal

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t t " 7 I T r —(t— Penicilinasa __Condroitinasa ABC 1

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) 23 eg m Dias despues de la lesion

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FIG. 5