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ES2814550T3 - Anticuerpos anti-BCMA, moléculas que se unen a antígeno biespecífico que se unen a BCMA y CD3, y usos de los mismos - Google Patents

Anticuerpos anti-BCMA, moléculas que se unen a antígeno biespecífico que se unen a BCMA y CD3, y usos de los mismos Download PDF

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ES2814550T3
ES2814550T3 ES16754148T ES16754148T ES2814550T3 ES 2814550 T3 ES2814550 T3 ES 2814550T3 ES 16754148 T ES16754148 T ES 16754148T ES 16754148 T ES16754148 T ES 16754148T ES 2814550 T3 ES2814550 T3 ES 2814550T3
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antigen
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Eric Thomas Baldwin
Gordon D Powers
Rosa Maria Fernandes Cardoso
Ricardo Attar
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Janssen Pharmaceutica NV
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Abstract

Un anticuerpo recombinante, o un fragmento de unión a antígeno del mismo, que se une inmunoespecíficamente a BCMA, en donde el anticuerpo tiene una cadena pesada y una cadena ligera, comprendiendo dicha cadena pesada: a. una región determinante de complementariedad de cadena pesada 1 (CDR1) que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 4, una CDR2 de cadena pesada que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 5 y una CDR3 de cadena pesada que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 6 b. una CDR1 de cadena pesada que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 7, una CDR2 de cadena pesada que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 5 y una CDR3 de cadena pesada que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 6; c. una CDR1 de cadena pesada que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 4, una CDR2 de cadena pesada que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 5 y una CDR3 de cadena pesada que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 19; d. una CDR1 de cadena pesada que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 4, una CDR2 de cadena pesada que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 8 y una CDR3 de cadena pesada que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 6 e. una CDR1 de cadena pesada que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 13, una CDR2 de cadena pesada que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 5 y una CDR3 de cadena pesada que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 19; o f. una CDR1 de cadena pesada que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 13, una CDR2 de cadena pesada que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 8 y una CDR3 de cadena pesada que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 19, en donde dicho anticuerpo comprende además una CDR1 de cadena ligera que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 24, una CDR2 de cadena ligera que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 25 y una CDR3 de cadena ligera que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO : 26.

Description

DESCRIPCIÓN
Anticuerpos anti-BCMA, moléculas que se unen a antígeno biespecífico que se unen a BCMA y CD3, y usos de los mismos
Campo técnico
[0001] La descripción proporcionada en el presente documento se refiere a anticuerpos monoclonales que se unen inmunoespecíficamente el antígeno de maduración de las células B (BCMA), anticuerpos multiespecíficos que se unen inmunoespecíficamente BCMA y clúster determinante 3 (CD3), y métodos de producción y uso de los anticuerpos descritos.
Antecedentes
[0002] El antígeno de maduración de las células B, también conocido como BCMA, CD269, TNFRSF17 (UniProt Q02223), es un miembro de la superfamilia de receptor de necrosis tumoral que se expresa preferentemente en las células plasmáticas diferenciadas [Laabi et al. (1992) EMBO J 11 (11): 3897-3904; Madry y col. (1998) Int Immunol 10 (11): 1693-1702]. BCMA es una proteína transmembrana de tipo I no glicosilada que participa en la maduración, el crecimiento y la supervivencia de las células B. BCMA es un receptor para dos ligandos de la superfamilia TNF: APRIL (un ligando inductor de proliferación, CD256, TNFSF13), el ligando de alta afinidad por BCMA y el factor de activación de células B BAFF (ThA n K, BlyS, estimulador de linfocitos B, TALL-1 y zTNF4), el ligando de baja afinidad por BCMA. APRIL y BAFF muestran similitud estructural y especificidad de unión al receptor solapada pero distinta. El regulador negativo TACI también se une a BAFF y A p RiL. La unión coordinada de APRIL y bA f F a BCMA y/o TACI activa el factor de transcripción NF-kB y aumenta la expresión de miembros de la familia Bcl-2 pro-supervivencia (por ejemplo, Bcl-2, BclxL, Bcl-w, Mcl-1, Al) y regula negativamente la expresión de factores proapoptóticos (por ejemplo, Bid, Bad, Bik, Bim, etc.), inhibiendo así la apoptosis y promoviendo la supervivencia. Esta acción combinada promueve la diferenciación, proliferación, supervivencia y producción de anticuerpos de las células B (como se revisa en Rickert RC et al., Immunol Rev (2011) 244 (1): 115-133). De acuerdo con este hallazgo, BCMA también apoya el crecimiento y la supervivencia de las células B humanas malignas, incluidas las células de mieloma múltiple (MM). Novak y col. encontraron que las líneas celulares MM y las células MM recién aisladas expresan la proteína BCMA y TACI en sus superficies celulares y tienen una expresión variable de la proteína BAFF-R en su superficie celular (Novak et al., (2004) Blood 103 (2): 689-694).
[0003] El mieloma múltiple (MM) es el segundo más común tumor maligno hematológico y constituye el 2% de todos los cánceres de muertes. MM es una enfermedad heterogénea y causada principalmente por translocaciones cromosómicas, entre otras cosas, t(11; 14), t(4; 14), t(8; 14),del(13),del(17) (Drach et al., (1998) Blood 92 (3): 802-809; Gertz y col., (2005) Blood 106 (8): 2837-2840; Facon y col., (2001) Blood 97 (6): 1566-1571). Los pacientes afectados por MM pueden experimentar una variedad de síntomas relacionados con la enfermedad debido a infiltración de la médula ósea, destrucción ósea, insuficiencia renal, inmunodeficiencia y la carga psicosocial de un diagnóstico de cáncer. A partir de 2006, la tasa de supervivencia relativa a 5 años para el MM fue de aproximadamente el 34%, lo que destaca que el MM es una enfermedad difícil de tratar donde actualmente no existen opciones curativas.
[0004] El uso de anticuerpos anti-BCMA para el tratamiento de linfomas y mieloma múltiple se mencionan en WO2002066516 y WO2010104949. Los anticuerpos contra BCMA se describen, por ejemplo, en Gras MP. et al. Int Immunol. 7 (1995) 1093-1106, WO200124811 y WO200124812. No obstante, a pesar de que BCMA, BAFF-R y TACI, es decir, los receptores de células B pertenecientes a la superfamilia de receptores TNF, y sus ligandos BAFF y APRIL, están sujetos a terapias de lucha contra el cáncer, sigue siendo necesario disponer de más opciones para el tratamiento de tales condiciones médicas.
Sumario
[0005] La invención es como se define en las reivindicaciones.
[0006] En un aspecto, la invención proporciona un anticuerpo recombinante, o un fragmento de unión a antígeno del mismo que se une inmunoespecíficamente a BCMA, en donde el anticuerpo tiene una cadena pesada y una cadena ligera, comprendiendo dicha cadena pesada:
a. una región determinante de complementariedad de cadena pesada 1 (CDR1) que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 4, una CDR2 de cadena pesada que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 5 y una CDR3 de cadena pesada que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 6;
b. una CDR1 de cadena pesada que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 7, una CDR2 de cadena pesada que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 5 y una CDR3 de cadena pesada que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 6;
c. una CDR1 de cadena pesada que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 4, una CDR2 de cadena pesada que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 5 y una CDR3 de cadena pesada que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 19;
d. una CDR1 de cadena pesada que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 4, una CDR2 de cadena pesada que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 8 y una CDR3 de cadena pesada que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 6;
e. una CDR1 de cadena pesada que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 13, una CDR2 de cadena pesada que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 5 y una CDR3 de cadena pesada que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 19; o
f. una CDR1 de cadena pesada que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 13, una CDR2 de cadena pesada que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 8 y una CDR3 de cadena pesada que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 19,
en donde dicho anticuerpo comprende además una CDR1 de cadena ligera que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 24, una CDR2 de cadena ligera que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO : 25, y una CDR3 de cadena ligera que tiene la amino ácido secuencia de SEQ ID NO: 26.
[0007] En otro aspecto, la invención proporciona un anticuerpo biespecífico BCMA x CD3 recombinante o un fragmento de unión biespecífico BCMA x CD3 del mismo que comprende:
a) una primera cadena pesada (HC1);
b) una segunda cadena pesada (HC2);
c) una primera cadena ligera (LC1); y
d) una segunda cadena ligera (LC2),
en donde HC1 se asocia con LC1 y HC2 se asocia con LC2 y en donde HC1 comprende la SEQ ID NO: 59, SEQ ID NO: 60 y SEQ ID NO: 61 como cadena pesada CDR1-3 respectivamente, y LC1 comprende SEQ ID NO: 62, SEQ ID NO: 63 y SEQ ID NO: 64 como CDR1-3 de cadena ligera respectivamente, para formar un primer sitio de unión al antígeno que se une inmunoespecíficamente a CD3 y donde HC2 comprende SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5 y SEQ ID NO: 6 como CDR1-3 de cadena pesada respectivamente, y LC2 comprende SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 25 y SEQ ID NO: 26 como CDR1-3 de cadena ligera respectivamente, para formar un segundo sitio de unión al antígeno que se une inmunoespecíficamente a BCMA.
[0008] En otro aspecto, la invención proporciona una célula recombinante que expresa el anticuerpo biespecífico recombinante BCMA x CD3 de la invención o un fragmento de unión biespecífico BCMA x CD3 del mismo.
[0009] En otro aspecto, la invención proporciona un método para generar el anticuerpo biespecífico recombinante BCMA x CD3 de la invención o un fragmento de unión biespecífico BCMA x CD3 del mismo por cultivar la célula recombinante de la invención.
[0010] En otro aspecto, la invención proporciona un polinucleótido que codifica el anticuerpo biespecífico recombinante BCMA x CD3 de la invención o un fragmento de unión biespecífico BCMA x CD3 del mismo.
[0011] En otro aspecto, la invención proporciona un kit que comprende el anticuerpo biespecífico recombinante BCMA x CD3 de la invención o un fragmento de unión biespecífico BCMA x CD3 del mismo y/o el polinucleótido de la invención, y el envasado para el mismo.
[0012] En el presente documento se proporcionan anticuerpos que se unen inmunoespecíficamente a BCMA y fragmentos de unión a antígeno de los mismos. También se describen polinucleótidos relacionados capaces de codificar los fragmentos de unión a antígeno y anticuerpos específicos de BCMA proporcionados, células que expresan los fragmentos de unión a antígeno y anticuerpos proporcionados, así como vectores asociados y anticuerpos y fragmentos de unión a antígeno marcados detectablemente. Además, se describen métodos para usar los anticuerpos y fragmentos de unión a antígeno proporcionados. Por ejemplo, los anticuerpos específicos de BCMA y los fragmentos de unión a antígeno pueden usarse para diagnosticar o controlar la progresión, regresión o estabilidad del cáncer que expresa BCMA; para determinar si un paciente debe recibir tratamiento contra el cáncer; o para determinar si un sujeto padece o no cáncer que expresa BCMa y, por tanto, puede ser susceptible de tratamiento con un agente terapéutico anticanceroso específico de BCMA, tal como los anticuerpos multiespecíficos contra BCMA y CD3 descritos en el presente documento.
[0013] Además en el presente documento se proporcionan anticuerpos multiespecíficos que se unen inmunoespecíficamente a BCMA y CD3 y fragmentos de unión a antígeno multiespecíficos de los mismos. También se describen polinucleótidos relacionados capaces de codificar los anticuerpos multiespecíficos BCMA x CD3 proporcionados, células que expresan los anticuerpos proporcionados, así como vectores asociados y anticuerpos multiespecíficos marcados de forma detectable. Además, se describen métodos para usar los anticuerpos multiespecíficos proporcionados. Por ejemplo, los anticuerpos multiespecíficos BCMA x CD3 pueden usarse para diagnosticar o controlar la progresión, regresión o estabilidad del cáncer que expresa BCMA; para determinar si un paciente debe recibir tratamiento contra el cáncer; o para determinar si un sujeto padece cáncer que expresa BCMA y, por tanto, puede ser susceptible de tratamiento con un agente terapéutico anticanceroso específico de BCMA, tal como los anticuerpos multiespecíficos BCMA x CD3 descritos en el presente documento.
Anticuerpos específicos a BCMA
[0014] Se describen aquí anticuerpos recombinantes y fragmentos de unión a antígeno específicos para BCMA. En algunas realizaciones, los anticuerpos específicos de BCMA y los fragmentos de unión a antígeno se unen a BCMA humano. En algunas realizaciones, los anticuerpos específicos de BCMA y los fragmentos de unión a antígeno se unen al BCMA humano y al BCMA de mono cynomolgus. Los anticuerpos específicos de BCMA y los fragmentos de unión a antígeno según la invención se unen a un epítopo que incluye uno o más residuos del dominio extracelular de BCMA (ECD). Este anticuerpo específico a BCMA o fragmento de unión a antígeno pueden bloquear la unión a ABRIL con una CI50 de al menos 5,9 nM medido por ELISA. La Tabla 1 proporciona un resumen de ejemplos de algunos anticuerpos específicos de BCMA descritos en este documento:
Figure imgf000005_0001
[0015] En algunas realizaciones se proporcionan un anticuerpo de BCMA específico, o un fragmento de unión a antígeno del mismo que comprende una cadena pesada que comprende una CDR1, una CDR2, y una CDR3 de una cualquiera de los anticuerpos descritos en la Tabla 1 y una cadena ligera que comprende una CDR1, una CDR2, y una CDR3 de una cualquiera de los anticuerpos descritos en la Tabla 1.
[0016] La clase IgG se divide en cuatro isotipos: IgG1, IgG2, IgG3 e IgG4 en humanos. Comparten más del 95% de homología en las secuencias de aminoácidos de las regiones Fc pero muestran diferencias importantes en la composición de aminoácidos y la estructura de la región bisagra. La región Fc media las funciones efectoras, como la citotoxicidad celular dependiente de anticuerpos (ADCC) y la citotoxicidad dependiente del complemento (CDC). En la ADCC, la región Fc de un anticuerpo se une a los receptores Fc (FcgR) en la superficie de las células efectoras inmunes, como los asesinos naturales y los macrófagos, lo que conduce a la fagocitosis o lisis de las células diana. En los CDC, los anticuerpos matan a las células diana activando la cascada del complemento en la superficie celular. Los anticuerpos descritos en el presente documento incluyen anticuerpos con las características descritas de los dominios variables en combinación con cualquiera de los isotipos de IgG, incluidas versiones modificadas en las que la secuencia Fc se ha modificado para efectuar diferentes funciones efectoras.
[0017] Para muchas aplicaciones de anticuerpos terapéuticos, las funciones efectoras mediadas por Fc no son parte del mecanismo de acción. Estas funciones efectoras mediadas por Fc pueden ser perjudiciales y potencialmente plantear un riesgo de seguridad al causar toxicidad fuera del mecanismo. La modificación de las funciones efectoras se puede lograr mediante la ingeniería de las regiones Fc para reducir su unión a FcgR o los factores del complemento. La unión de IgG a los FcgR activadores (FcgRI, FcgRIIa, FcgRIIIa y FcgRIIIb) e inhibidores (FcgRIIb) o al primer componente del complemento (C1q) depende de los residuos ubicados en la región bisagra y el dominio CH2. Se han introducido mutaciones en IgG1, IgG2 e IgG4 para reducir o silenciar las funcionalidades de Fc. Los anticuerpos descritos en este documento pueden incluir estas modificaciones.
[0018] En una realización, el anticuerpo comprende una región Fc con una o más de las siguientes propiedades: (a) reducción de la función efectora en comparación con el padre Fc; (b) afinidad reducida por Fcg RI, Fcg RIIa, Fcg RIIb, Fcg RIIIb y/o Fcg RIIIa, (c) afinidad reducida por FcgRI (d) afinidad reducida por FcgRIIa (e) afinidad reducida por FcgRIIb, (f) afinidad reducida a Fcg RIIIb o (g) afinidad reducida a FcgRIIIa.
[0019] En algunas realizaciones, los anticuerpos o fragmentos de unión a antígeno son IgG, o sus derivados, por ejemplo, isotipos IgG1, IgG2, IgG3, y IgG4. En algunas realizaciones en las que el anticuerpo tiene un isotipo IgG4, el anticuerpo contiene sustituciones K409R, S228P, L234A y L235A en su región Fc. Los anticuerpos descritos en este documento pueden incluir estas modificaciones.
[0020] En algunas realizaciones, los anticuerpos descritos son capaces de inhibir unión de APRIL con un CI50 de 5,9 nM como se mide por ELISA.
[0021] En algunas realizaciones, los anticuerpos descritos se unen a múltiples líneas celulares de mieloma BCMA-positivo.
[0022] Además de los anticuerpos específicos a BCMA descritos y fragmentos de unión a antígeno, también se proporcionan secuencias de polinucleótidos capaces de codificar los anticuerpos descritos y fragmentos de unión a antígeno. También se proporcionan los vectores que comprenden los polinucleótidos descritos, así como las células que expresan los anticuerpos específicos de BCMA o los fragmentos de unión a antígeno proporcionados en el presente documento. También se describen células capaces de expresar los vectores descritos. Estas células pueden ser células de mamífero (como células 293F, células CHO), células de insectos (como células Sf7), células de levadura, células vegetales o células bacterianas (como E. coli). Los anticuerpos descritos también pueden ser producidos por células de hibridoma.
Métodos de uso de anticuerpos específicos a BCMA
[0023] También se describen métodos de uso de los anticuerpos específicos a BCMA descritos o fragmentos de unión a antígeno. Los anticuerpos particulares para usar en los métodos discutidos en esta sección incluyen aquellos con el conjunto de CDR descrito para anticuerpos en la Tabla 1. Por ejemplo, estos anticuerpos o fragmentos de unión a antígeno pueden ser útiles en el tratamiento del cáncer, al interferir con las interacciones BCMA-receptor o donde el anticuerpo se conjuga con una toxina, dirigiendo la toxina al cáncer que expresa BCMA. Además, estos anticuerpos o fragmentos de unión a antígeno pueden ser útiles para detectar la presencia de BCMA en una muestra biológica, como sangre o suero; para cuantificar la cantidad de BCMA en una muestra biológica, como sangre o suero; para diagnosticar cáncer que expresa BCMA; determinar un método para tratar a un sujeto que padece cáncer; o monitorizar la progresión del cáncer que expresa BCMA en un sujeto. En algunas realizaciones, el cáncer que expresa BCMA puede ser un linfoma, tal como mieloma múltiple (MM). Los métodos descritos pueden llevarse a cabo antes de que el sujeto reciba tratamiento para el cáncer que expresa BCMA, como el tratamiento con un anticuerpo multiespecífico contra BCMA y CD3. Además, los métodos descritos pueden llevarse a cabo después de que el sujeto reciba tratamiento para el cáncer que expresa BCMA, tal como el tratamiento con un anticuerpo multiespecífico contra BCMA y CD3 descrito en el presente documento.
[0024] Los métodos de detección de BCMA descritos en una muestra biológica incluyen la exposición de la muestra biológica para uno o más de los anticuerpos específicos a BCMA o fragmentos de unión a antígeno aquí descritos.
[0025] Los métodos descritos de diagnóstico de cáncer que expresa BCMA en un sujeto también implican la exposición de la muestra biológica a uno o más de los anticuerpos específicos a BCMA o fragmentos de unión a antígeno se describe en este documento; sin embargo, los métodos también incluyen cuantificar la cantidad de BCMA presente en la muestra; comparar la cantidad de BCMA presente en la muestra con una muestra estándar o de referencia conocida; y determinar si los niveles de BCMA del sujeto se encuentran dentro de los niveles de BCMA asociados con el cáncer.
[0026] También se describen en el presente documento métodos para monitorizar el cáncer que expresa BCMA en un sujeto. Los métodos descritos incluyen exponer la muestra biológica a uno o más de los anticuerpos o fragmentos de unión a antígeno específicos de BCMA descritos en el presente documento; cuantificar la cantidad de BCMA presente en la muestra que está unida por el anticuerpo, o fragmento de unión al antígeno del mismo; comparar la cantidad de BCMA presente en la muestra con una muestra estándar o de referencia conocida o la cantidad de BCMA en una muestra similar obtenida previamente del sujeto; y determinar si los niveles de BCMA del sujeto son indicativos de progresión, regresión o enfermedad estable del cáncer basándose en la diferencia en la cantidad de BCMA en las muestras comparadas.
[0027] Las muestras obtenidas, o derivadas de los sujetos son muestras biológicas tales como orina, sangre, suero, plasma, saliva, ascitis, células circulantes, las células tumorales circulantes, células que no son tejido asociado, tejidos, tejido tumoral resecado quirúrgicamente, biopsias, muestras por aspiración con aguja fina o preparaciones histológicas.
[0028] Los anticuerpos específicos a BCMA descritos o fragmentos de unión al antígeno pueden ser etiquetados para su uso con los métodos descritos, u otros métodos conocidos por los expertos en la técnica. Por ejemplo, los anticuerpos descritos en el presente documento, o fragmentos de unión al antígeno de los mismos, pueden ser etiquetados con un marcador radiactivo, un marcador fluorescente, un marcador de epítopo, biotina, un marcador cromóforo, un marcador ECL, una enzima, rutenio, 111In-DOTA, ácido 111In-dietilentriaminopentaacético (DTPA), peroxidasa de rábano picante, fosfatasa alcalina y beta-galactosidasa, o poli-histidina o marcadores similares conocidos en la técnica.
Kits de anticuerpos específicos a BCMA
[0029] Se describen aquí kits que incluyen los anticuerpos específicos a BCMA descritos o fragmentos de unión a antígeno de los mismos. Los kits descritos se pueden usar para llevar a cabo los métodos de uso de los fragmentos de unión a antígeno o anticuerpos específicos de BCMA proporcionados en este documento, u otros métodos conocidos por los expertos en la técnica. En algunas realizaciones, los kits descritos pueden incluir los anticuerpos o fragmentos de unión a antígeno descritos en este documento y reactivos para usar en la detección de la presencia de BCMA en una muestra biológica. En consecuencia, los kits descritos pueden incluir uno o más de los anticuerpos, o un fragmento(s) de unión a antígeno de los mismos, descritos en este documento y un recipiente para contener el anticuerpo o fragmento cuando no esté en uso, instrucciones para el uso del anticuerpo o fragmento, el anticuerpo o fragmento fijado a un soporte sólido, y/o formas marcadas detectablemente del anticuerpo o fragmento, como se describe en el presente documento.
Anticuerpos multiespecíficos BCMA x CD3
[0030] La redirección de los linfocitos T a las células de MM que expresan BCMA a través del complejo TCR/CD3 representa un enfoque alternativo atractivo. El complejo TCR/CD3 de linfocitos T consta de un heterodímero TCR alfa (a)/beta ((p) o TCR gamma (Y)/delta (5) coexpresado en la superficie celular con las subunidades invariantes de gamma marcado con CD3 (y), delta (5), épsilon (e), zeta (Z) y eta (q). El CD3s humano se describe en UniProt P07766 (CD3E_HUMAN). Un anticuerpo anti CD3e descrito en el estado de la técnica es SP34 (Yang SJ, The Journal of Immunology (1986) 137; 1097-1100). SP34 reacciona con CD3 de primates y humanos. SP34 está disponible en Pharmingen. Otro anticuerpo anti c D3 descrito en el estado de la técnica es UCHT-1 (ver WO2000041474). Otro anticuerpo anti CD3 descrito en el estado de la técnica es BC-3 (Fred Hutchinson Cancer Research Institute; usado en ensayos de fase I/II de GvHD, Anasetti et al., Transplantation 54: 844 (1992)). SP34 difiere de UCHT-1 y BC-3 en que SP-34 reconoce un epítopo presente únicamente en la cadena e de CD3 (ver Salmeron et al., (1991) J. Immunol.
147: 3047) mientras que UCHT-1 y BC-3 reconocen un epítopo al que contribuyen las cadenas e y y. La secuencia de un anticuerpo con la misma secuencia que el anticuerpo SP34 se menciona en los documentos WO2008119565, WO2008119566, WO2008119567, WO2010037836, WO2010037837 y WO2010037838. Una secuencia que es 96% idéntica al dominio variable de cadena pesada (VH) del anticuerpo SP34 se menciona en el documento US8236308 (WO2007042261).
[0031] Una variedad de anticuerpos biespecíficos contra CD3 y BCMA se mencionan en WO2007117600, WO2009132058, WO2012066058, WO2012143498, WO2013072406, WO2013072415 y WO2014122144. Sin embargo, actualmente no se dispone de datos que describan la progresión a la clínica.
[0032] En el presente documento se describen anticuerpos multiespecíficos recombinantes que se unen a BCMA y CD3 (“anticuerpos multiespecíficos BCMA x CD3”) y fragmentos de unión a antígenos multiespecíficos de los mismos. En algunas realizaciones se proporciona un anticuerpo recombinante, o un fragmento de unión a antígeno del mismo, que se une inmunoespecíficamente a BCMA.
[0033] En algunas realizaciones, el brazo específico a BCMA del anticuerpo multiespecífico se une BCMA humano y cynomolgus monkey BCMA. El brazo específico de BCMA de los anticuerpos multiespecíficos de BCMA x CD3 o los fragmentos de unión a antígeno se une al dominio extracelular de BCMA humano. En realizaciones preferidas, el anticuerpo multiespecífico de BCMA x CD3 o el fragmento de unión al antígeno es un anticuerpo biespecífico o el fragmento de unión al antígeno. En algunas realizaciones, un anticuerpo biespecífico BCMA x CD3 recombinante que comprende: a) una primera cadena pesada (HCl); b) una segunda cadena pesada (HC2); c) una primera cadena ligera (LCI); y d) una segunda cadena ligera (LC2), en donde el par HC1 y l C1 para formar un primer sitio de unión al antígeno que se une inmunoespecíficamente a BCMA, y el par HC2 y LC2 para formar un segundo sitio de unión al antígeno que se une inmunoespecíficamente a CD3, o un fragmento de unión biespecífico de BCMA x CD3 del mismo. En otra realización, se proporciona una célula recombinante que expresa el anticuerpo o el fragmento de unión biespecífico. En algunas realizaciones, el brazo de unión a BCMA (o "brazo específico de BCMA") del anticuerpo multiespecífico BCMA x CD3 se deriva de un anticuerpo BCMA descrito en el presente documento (por ejemplo, de un anticuerpo que tiene las secuencias de CDR enumeradas en la Tabla 1).
[0034] En algunas realizaciones, el brazo específico a BCMA de los anticuerpos multiespecíficos BCMA x CD3 o fragmentos de unión a antígeno son IgG, o derivados de los mismos. En algunas realizaciones, los anticuerpos multiespecíficos BCMA x CD3 descritos son capaces de unirse a BCMA con una constante de disociación de al menos 0,18 nM medida por resonancia de plasmón superficial. En algunas realizaciones, el anticuerpo multiespecífico BCMA x CD3 descrito no es un agonista. En algunas realizaciones, el anticuerpo multiespecífico BCMA x CD3 descrito no altera la activación de NF-kB a concentraciones por debajo de 10 nM.
[0035] En algunas realizaciones, el brazo CD3 vinculante (o "brazo específico a CD3") del anticuerpo multiespecífico BCMA x CD3 se deriva del anticuerpo SP34 monoclonal de ratón, un isotipo IgG3/lambda de ratón. (K.R. Abhinandan y A. C. Martin, 2008. Mol. Immunol. 45, 3832-3839). En algunas realizaciones, el brazo CD3 vinculante del anticuerpo multiespecífico BCMA x CD3 comprende una cadena pesada y una cadena ligera seleccionada de la Tabla 2.
Tabla 2. Cadenas pesadas y cadenas ligeras de los anticuerpos específicos de CD3 y fragmentos de unión a antígeno.
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(Continuación)
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[0036] La clase IgG se divide en cuatro isotipos: IgG1, IgG2, IgG3 e IgG4 en seres humanos. Comparten más del 95% de homología en las secuencias de aminoácidos de las regiones Fc pero muestran diferencias importantes en la composición de aminoácidos y la estructura de la región bisagra. La región Fc media las funciones efectoras, como la citotoxicidad celular dependiente de anticuerpos (ADCC) y la citotoxicidad dependiente del complemento (CDC). En la ADCC, la región Fc de un anticuerpo se une a los receptores Fc (FcgR) en la superficie de las células efectoras inmunes, como los asesinos naturales y los macrófagos, lo que conduce a la fagocitosis o lisis de las células diana. En los CDC, los anticuerpos matan a las células diana activando la cascada del complemento en la superficie celular.
[0037] Para muchas aplicaciones de anticuerpos terapéuticos, las funciones efectoras mediadas por Fc no son parte del mecanismo de acción. Estas funciones efectoras mediadas por Fc pueden ser perjudiciales y potencialmente plantear un riesgo de seguridad al causar toxicidad fuera del mecanismo. La modificación de las funciones efectoras se puede lograr mediante la ingeniería de las regiones Fc para reducir su unión a FcgR o los factores del complemento. La unión de IgG a los FcgR activantes (FcgRI, FcgRIIa, FcgRIIIa y FcgRIIIb) e inhibidores (FcgRIIb) o al primer componente del complemento (C1q) depende de los residuos ubicados en la región bisagra y el dominio CH2. Se han introducido mutaciones en IgG1, IgG2 e IgG4 para reducir o silenciar las funcionalidades de Fc.
[0038] En una realización, el anticuerpo comprende una región Fc con una o más de las siguientes propiedades: (a) reducción de la función efectora en comparación con el Fc padre; (b) afinidad reducida por Fcg RI, Fcg RIIa, Fcg RIIb, Fcg RIIIb y/o Fcg RIIIa, (c) afinidad reducida por FcgRI (d) afinidad reducida por FcgRIIa (e) afinidad reducida por FcgRIIb, (f) afinidad reducida a Fcg RIIIb o (g) afinidad reducida a FcgRIIIa.
[0039] En algunas realizaciones, el anticuerpo específico a CD3 o fragmento de unión al antígeno del que el brazo específico a CD3 se deriva del anticuerpo multiespecífico es IgG, o un derivado del mismo. En algunas realizaciones, el anticuerpo específico de CD3 o el fragmento de unión al antígeno del que se deriva el brazo específico de CD3 del anticuerpo multiespecífico es IgG1, o un derivado del mismo. En algunas realizaciones, por ejemplo, la región Fc del anticuerpo IgG1 específico de CD3 del que se deriva el brazo de unión a CD3 comprende sustituciones L234A, L235A y F405L en su región Fc. En algunas realizaciones, el anticuerpo específico de CD3 o el fragmento de unión a antígeno del que se deriva el brazo específico de CD3 del anticuerpo multiespecífico es IgG4, o un derivado del mismo. En algunas realizaciones, por ejemplo, la región Fc del anticuerpo IgG4 específico de CD3 del que se deriva el brazo de unión a CD3 comprende sustituciones S228P, L234A, L235A, F405L y R409K en su región Fc. En algunas realizaciones, el anticuerpo específico de CD3 o el fragmento de unión a antígeno del que se deriva el brazo específico de CD3 del anticuerpo multiespecífico se une a CD3e en células T humanas primarias y/o células T de cinomolgus primarias. En algunas realizaciones, el anticuerpo específico de CD3 o el fragmento de unión a antígeno del que se deriva el brazo específico de CD3 del anticuerpo multiespecífico activa células T CD4 humanas primarias y/o células T CD4+ de cinomolgo primarias.
[0040] Además de los anticuerpos multiespecíficos BCMA x CD3 descritos, también se proporcionan secuencias de polinucleótidos capaces de codificar los anticuerpos multiespecíficos BCMA x CD3 descritos. En algunas realizaciones, se proporciona un polinucleótido sintético aislado que codifica el HC1, e1HC2, el LC1 o el LC2 del anticuerpo biespecífico BCMA x CD3 o el fragmento de unión biespecífico. También se proporcionan vectores que comprenden los polinucleótidos descritos, así como células que expresan los anticuerpos multiespecíficos BCMA x CD3 proporcionados en el presente documento. También se describen células capaces de expresar los vectores descritos. Estas células pueden ser células de mamífero (como células 293F, células CHO), células de insectos (como células Sf7), células de levadura, células vegetales o células bacterianas (como E. coli). Los anticuerpos descritos también pueden ser producidos por células de hibridoma. En algunas realizaciones, se proporcionan métodos para generar el anticuerpo biespecífico BCMA x CD3 o el fragmento de unión biespecífico mediante el cultivo de células.
[0041] Además se proporciona en el presente documento son composiciones farmacéuticas que comprenden los anticuerpos multiespecíficos BCMA x CD3 o fragmentos de unión a antígeno y un vehículo farmacéuticamente aceptable.
Métodos de utilización de anticuerpos multiespecíficos BCMA x CD3
[0042] Los métodos de usar los anticuerpos multiespecíficos BCMA x CD3 y fragmentos de unión a antígeno de los mismos multiespecíficos se describen también. Por ejemplo, los anticuerpos multiespecíficos BCMA x CD3 y sus fragmentos de unión a antígenos multiespecíficos pueden ser útiles en el tratamiento de un cáncer que expresa BCMA en un sujeto que lo necesite. En algunas realizaciones, el cáncer que expresa BCMA es un linfoma, tal como mieloma múltiple.
[0043] Los métodos descritos para tratar el cáncer que expresa BCMA en un sujeto en necesidad del mismo incluyen administrar al sujeto una cantidad terapéuticamente eficaz de un anticuerpo multiespecífico BCMA x CD3 descrito o fragmento de unión a antígeno multiespecífico del mismo. En algunas realizaciones, el sujeto es un mamífero, preferiblemente un ser humano. En realizaciones preferidas se proporcionan métodos para tratar a un sujeto que tiene cáncer administrando una cantidad terapéuticamente eficaz del anticuerpo biespecífico BCMA x CD3 o del fragmento de unión al antígeno biespecífico a un paciente que lo necesita durante un tiempo suficiente para tratar el cáncer.
[0044] Además se proporcionan en este documento procedimientos para inhibir el crecimiento o proliferación de células de cáncer mediante la administración de una cantidad terapéuticamente eficaz del anticuerpo biespecífico BCMA x CD3 o fragmento de unión biespecífico para inhibir el crecimiento o proliferación de células cancerosas.
[0045] También se proporcionan en este documento métodos de reorientación de una célula T a una célula de cáncer que expresa BCMA mediante la administración de una cantidad terapéuticamente eficaz del anticuerpo biespecífico BCMA x CD3 o fragmento de unión biespecífico para redirigir una célula T a un cáncer.
Kits de anticuerpos específicos BCMA x CD3
[0046] Se describen aquí kits que incluyen los anticuerpos multiespecíficos BCMA x CD3 descritos. Los kits descritos pueden usarse para llevar a cabo los métodos de uso de anticuerpos multiespecíficos BCMA x CD3 proporcionados en este documento, u otros métodos conocidos por los expertos en la técnica. En algunas realizaciones, los kits descritos pueden incluir los anticuerpos descritos en este documento y reactivos para su uso en tratar un cáncer que expresa BCMA. En consecuencia, los kits descritos pueden incluir uno o más de los anticuerpos multiespecíficos, o un fragmento(s) de unión a antígeno multiespecífico de los mismos, descritos en este documento y un recipiente para contener el anticuerpo o fragmento cuando no esté en uso, y/o instrucciones de uso de el anticuerpo o fragmento, el anticuerpo o fragmento fijado a un soporte sólido, y/o formas marcadas detectablemente del anticuerpo o fragmento, como se describe en el presente documento.
Descripción detallada de realizaciones ilustrativas
[0047] La invención es como se define en las reivindicaciones.
Definiciones
[0048] Varios términos relativos a los aspectos de la descripción se utilizan en toda la memoria y las reivindicaciones. A tales términos se les debe dar su significado corriente en la técnica a menos que se indique lo contrario. Otros términos definidos específicamente deben interpretarse de manera coherente con las definiciones proporcionadas en el presente documento.
[0049] Como se usa en esta memoria descriptiva y las reivindicaciones adjuntas, las formas singulares “un”, “una”, “el” y “ella” incluyen plurales referentes a menos que el contenido dicte claramente lo contrario. Así, por ejemplo, la referencia a "una célula" incluye una combinación de dos o más células y similares.
[0050] El término "aproximadamente" tal como se usa en el presente documento cuando se refiere a un valor medible tal como una cantidad, una duración temporal, y similares, se entiende que abarca las variaciones de hasta ±10% del valor especificado, ya que tales variaciones son apropiadas para realizar los métodos descritos. A menos que se indique lo contrario, todos los números que expresan cantidades de ingredientes, propiedades tales como peso molecular, condiciones de reacción, etc., usados en la especificación y las reivindicaciones deben entenderse como modificados en todos los casos por el término "aproximadamente". Por consiguiente, a menos que se indique lo contrario, los parámetros numéricos expuestos en la siguiente memoria descriptiva y las reivindicaciones adjuntas son aproximaciones que pueden variar dependiendo de las propiedades deseadas que se pretenden obtener mediante la presente invención. Como mínimo, y no como un intento de limitar la aplicación de la doctrina de equivalentes al alcance de las reivindicaciones, cada parámetro numérico debe al menos interpretarse a la luz del número de dígitos significativos informados y aplicando técnicas de redondeo ordinarias.
[0051] A pesar de que los intervalos y parámetros numéricos que exponen el amplio alcance de la invención son aproximaciones, se informan los valores numéricos expuestos en los ejemplos específicos la mayor precisión posible. Sin embargo, cualquier valor numérico contiene inherentemente ciertos errores que resultan necesariamente de la desviación estándar encontrada en sus respectivas mediciones de prueba.
[0052] "Aislado" significa un componente biológico (tal como un ácido nucleico, péptido o proteína) ha sido sustancialmente separado, producido aparte de, o purificado de otros componentes biológicos del organismo en donde se produce naturalmente el componente, es decir, otra ADN y ARN cromosómico y extracromosómico, y proteínas. Los ácidos nucleicos, péptidos y proteínas que se han "aislado" incluyen por tanto ácidos nucleicos y proteínas purificados mediante métodos de purificación estándar. Los ácidos nucleicos, péptidos y proteínas "aislados" pueden ser parte de una composición y aún así aislarse si dicha composición no es parte del entorno nativo del ácido nucleico, péptido o proteína. El término también incluye ácidos nucleicos, péptidos y proteínas preparados mediante expresión recombinante en una célula huésped, así como ácidos nucleicos sintetizados químicamente. Un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno "aislado", como se usa en este documento, pretende hacer referencia a un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno que está sustancialmente libre de otros anticuerpos o fragmentos de unión a antígeno que tienen diferentes especificidades antigénicas (por ejemplo, un anticuerpo aislado que específicamente se une a BCMA está sustancialmente libre de anticuerpos que se unen específicamente a antígenos distintos de BCMA). Sin embargo, un anticuerpo aislado que se une específicamente a un epítopo, isoforma o variante de BCMA puede tener reactividad cruzada con otros antígenos relacionados, por ejemplo, de otras especies (tales como homólogos de especies de BCMA).
[0053] "Polinucleótido" se refiere como sinónimos como "molécula de ácido nucleico", "nucleótidos" o "ácidos nucleicos" se refiere a cualquier polirribonucleótido o polidesoxirribonucleótido, que puede ser ARN o ADN no modificado o ARN o ADN modificado. Los "polinucleótidos" incluyen, sin limitación, ADN monocatenario y bicatenario, ADN que es una mezcla de regiones monocatenarias y bicatenarias, ARN monocatenario y bicatenario y ARN que es una mezcla de regiones monocatenarias y bicatenarias, moléculas híbridas que comprenden ADN y ARN que pueden ser monocatenarios o, más típicamente, bicatenarios o una mezcla de regiones monocatenarias y bicatenarias. Además, "polinucleótido" se refiere a regiones de cadena triple que comprenden ARN o ADN o tanto a Rn como ADN. El término polinucleótido también incluye ADN o ARN que contienen una o más bases modificadas y ADN o ARN con cadenas principales modificadas para estabilidad o por otras razones. Las bases "modificadas" incluyen, por ejemplo, bases tritiladas y bases inusuales tales como inosina. Se pueden realizar diversas modificaciones en el a Dn y el a Rn ; por tanto, "polinucleótido" abarca formas de polinucleótidos modificadas química, enzimática o metabólicamente como se encuentran típicamente en la naturaleza, así como las formas químicas de ADN y ARN características de virus y células. El "polinucleótido" también incluye cadenas de ácido nucleico relativamente cortas, a las que a menudo se hace referencia como oligonucleótidos.
[0054] El significado de "sustancialmente el mismo" puede variar dependiendo del contexto en donde se utiliza el término. Debido a la variación de secuencia natural que probablemente exista entre las cadenas pesadas y ligeras y los genes que las codifican, uno esperaría encontrar algún nivel de variación dentro de las secuencias de aminoácidos o los genes que codifican los anticuerpos o fragmentos de unión a antígenos descritos en este documento, con poco o ningún impacto en sus propiedades de unión únicas (por ejemplo, especificidad y afinidad). Tal expectativa se debe en parte a la degeneración del código genético, así como al éxito evolutivo de las variaciones conservadoras de la secuencia de aminoácidos, que no alteran apreciablemente la naturaleza de la proteína codificada. Por consiguiente, en el contexto de las secuencias de ácido nucleico, "sustancialmente igual" significa al menos un 65% de identidad entre dos o más secuencias. Preferiblemente, el término se refiere a al menos 70% de identidad entre dos o más secuencias, más preferiblemente al menos 75% de identidad, más preferiblemente al menos 80% de identidad, más preferiblemente al menos 85% de identidad, más preferiblemente al menos 90% de identidad, más preferiblemente al menos 91% de identidad, más preferiblemente al menos 92% de identidad, más preferiblemente al menos 93% de identidad, más preferiblemente al menos 94% de identidad, más preferiblemente al menos 95% de identidad, más preferiblemente al menos 96% de identidad, más preferiblemente al menos al menos un 97% de identidad, más preferiblemente al menos un 98% de identidad y más preferiblemente al menos un 99% de identidad o mayor identidad. El porcentaje de identidad entre dos secuencias es una función del número de posiciones idénticas compartidas por las secuencias (es decir, % de homología = n° de posiciones idénticas/n° total de posiciones x 100), teniendo en cuenta el número de espacios y la longitud de cada espacio, que debe introducirse para una alineación óptima de las dos secuencias. El porcentaje de identidad entre dos secuencias de nucleótidos o de aminoácidos puede determinarse, por ejemplo, usando el algoritmo de E. Meyers y W. Miller, Comput Appl. Biosci 4, 11-17 (1988), que se ha incorporado al programa ALIGN (versión 2.0), utilizando una tabla de residuos de peso PAM120, una penalización de longitud de espacio de 12 y una penalización de espacio de 4. Además, el porcentaje de identidad entre dos secuencias de aminoácidos se pueden determinar usando el algoritmo Needleman y Wunsch, J. Mol. Biol. 48, 444-453 (1970).
[0055] El grado de variación que puede ocurrir dentro de la secuencia de aminoácidos de una proteína sin tener un efecto sustancial sobre la función de la proteína es mucho menor que el de una secuencia de ácido nucleico, ya que los mismos principios de degeneración no se aplican a secuencias de aminoácidos. Por consiguiente, en el contexto de un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno, "sustancialmente el mismo" significa anticuerpos o fragmentos de unión a antígeno que tienen 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% o 99% de identidad con los anticuerpos o fragmentos de unión a antígeno descritos. Otras realizaciones incluyen anticuerpos específicos de BCMA, o fragmentos de unión a antígeno, que tienen armazón, andamio u otras regiones de no unión que no comparten una identidad significativa con los anticuerpos y fragmentos de unión a antígeno descritos en este documento, pero incorporan una o más CDR u otras secuencias necesarias para conferir unión que son 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% o 99% idénticas a tales secuencias descritas en el presente documento.
[0056] Un "vector" es un replicón, tal como un plásmido, fago, cósmido o virus en donde otro segmento de ácido nucleico puede ser insertado de manera operativa con el fin de provocar la replicación o expresión del segmento.
[0057] Un "clon" es una población de células derivadas de una sola célula o ancestro común por mitosis. Una "línea celular" es un clon de una célula primaria que es capaz de un crecimiento estable in vitro durante muchas generaciones. En algunos ejemplos proporcionados aquí, las células se transforman transfectando las células con ADN.
[0058] Los términos "expresar" y "producir" se utilizan como sinónimos en este documento, y se refieren a la biosíntesis de un gen producto. Estos términos abarcan la transcripción de un gen en ARN. Estos términos también abarcan la traducción de ARN en uno o más polipéptidos, y además abarcan todas las modificaciones postraduccionales y postraduccionales que ocurren naturalmente. La expresión o producción de un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo puede estar dentro del citoplasma de la célula, o en el medio extracelular tal como el medio de crecimiento de un cultivo celular.
[0059] Los términos "tratar" o "tratamiento" se refieren a cualquier éxito o indicio de éxito en la atenuación o mejora de una lesión, patología o condición, incluyendo cualquier parámetro objetivo o subjetivo tal como reducción, remisión, disminución de los síntomas o la toma de la condición es más tolerable para el paciente, ralentizando la tasa de degeneración o declive, haciendo que el punto final de la degeneración sea menos debilitante, mejorando el bienestar físico o mental de un sujeto, o prolongando la duración de la supervivencia. El tratamiento puede evaluarse mediante parámetros objetivos o subjetivos; incluidos los resultados de un examen físico, examen neurológico o evaluaciones psiquiátricas.
[0060] Una "cantidad eficaz" o "cantidad terapéuticamente eficaz" se refiere a una cantidad eficaz, a dosificaciones y durante periodos de tiempo necesarios, para lograr un resultado terapéutico deseado. Una cantidad terapéuticamente eficaz de un anticuerpo BCMA x CD3 puede variar según factores tales como el estado de la enfermedad, la edad, el sexo y el peso del individuo, y la capacidad del anticuerpo para provocar una respuesta deseada en el individuo. Una cantidad terapéuticamente eficaz es también aquella en donde los efectos terapéuticamente beneficiosos superan los efectos tóxicos o perjudiciales del anticuerpo o la porción de anticuerpo.
[0061] "Anticuerpo" se refiere a todos los isotipos de inmunoglobulinas (IgG, IgA, IgE, IgM, IgD, e IgY) incluyendo varias formas monoméricas, poliméricas y quiméricas, a menos que se especifique lo contrario. Específicamente englobados por el término "anticuerpo" están los anticuerpos policlonales, anticuerpos monoclonales (mAb) y polipéptidos similares a anticuerpos, tales como anticuerpos quiméricos y anticuerpos humanizados.
[0062] Los "fragmentos de unión a antígeno" son cualquier estructura proteica que puede exhibir afinidad de unión por un antígeno particular. Los fragmentos de unión a antígenos incluyen los proporcionados por cualquier técnica conocida, como la escisión enzimática, la síntesis de péptidos y las técnicas recombinantes. Algunos fragmentos de unión al antígeno están compuestos por porciones de anticuerpos intactos que retienen la especificidad de unión al antígeno de la molécula de anticuerpo original. Por ejemplo, los fragmentos de unión a antígeno pueden comprender al menos una región variable (una región variable de cadena pesada o de cadena ligera) o una o más CDR de un anticuerpo que se sabe que se une a un antígeno particular. Los ejemplos de fragmentos de unión a antígeno adecuados incluyen, sin limitación, diacuerpos y moléculas de cadena simple, así como moléculas Fab, F(ab')2, Fc, Fabc y Fv, anticuerpos de cadena simple (Sc), cadenas ligeras de anticuerpos individuales, cadenas pesadas de anticuerpos, fusiones quiméricas entre cadenas de anticuerpos o CDR y otras proteínas, armazones de proteínas, monómeros o dímeros de cadena pesada, monómeros o dímeros de cadena ligera, dímeros formados por una cadena pesada y una ligera, un fragmento monovalente formado por VL, VH, Dominios CL y CH1, o un anticuerpo monovalente como se describe en WO2007059782, fragmentos bivalentes que comprenden dos fragmentos Fab unidos por un puente disulfuro en la región bisagra, un fragmento Fd que consiste esencialmente en los dominios VH y CH1; un fragmento Fv que consiste esencialmente en los dominios VL y VH de un solo brazo de un anticuerpo, un fragmento dAb (Ward et al., Nature 341, 544-546 (1989)), que consiste esencialmente en un dominio VH y también llamados anticuerpos de dominio (Holt et al; Trends Biotechnol. 2003 Nov.; 21 (11): 484-90); camélidos o nanocuerpos (Revets et al; Expert Opin Biol Ther. 2005 enero; 5 (1): 111-24); una región determinante de complementariedad aislada (CDR), y similares. Se pueden usar todos los isotipos de anticuerpos para producir fragmentos de unión del antígeno. Además, los fragmentos de unión a antígeno pueden incluir estructuras proteínicas sin anticuerpos que pueden incorporar con éxito segmentos polipeptídicos en una orientación que confiera afinidad por un antígeno de interés dado, como estructuras proteicas. Los fragmentos de unión a antígenos se pueden producir de forma recombinante o mediante escisión enzimática o química de anticuerpos intactos. La frase "un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo" se puede usar para indicar que un fragmento de unión a antígeno dado incorpora uno o más segmentos de aminoácidos del anticuerpo al que se hace referencia en la frase.
[0063] El término "epítopo" significa una proteína determinante capaz de unirse a un anticuerpo específico. Los epítopos generalmente consisten en agrupaciones superficiales de moléculas como aminoácidos o cadenas laterales de azúcar y generalmente tienen características estructurales tridimensionales específicas, así como características de carga específicas. Los epítopos conformacionales y no conformacionales se distinguen porque la unión al primero pero no al segundo se pierde en presencia de solventes desnaturalizantes. El epítopo puede comprender residuos de aminoácidos directamente implicados en la unión y otros residuos de aminoácidos, que no están directamente implicados en la unión, como residuos de aminoácidos que están efectivamente bloqueados o cubiertos por el péptido de unión específicamente al antígeno (en otras palabras, el residuo de aminoácido está dentro de la huella del péptido de unión específicamente al antígeno).
[0064] La "unión específica" o "unión inmunoespecífica" o derivados de los mismos cuando se usa en el contexto de anticuerpos, o fragmentos de anticuerpos, representa la unión a través de dominios codificados por genes de inmunoglobulina o fragmentos de genes de inmunoglobulina a uno o más epítopos de una proteína de interés, sin unirse preferentemente a otras moléculas en una muestra que contiene una población mixta de moléculas. Normalmente, un anticuerpo se une a un antígeno afín con una Kd de menos de aproximadamente 1 x 10-8 M, medida mediante un ensayo de resonancia de plasmón superficial o un ensayo de unión celular. Frases tales como anticuerpo "específico de [antígeno]" (por ejemplo, anticuerpo específico a BCMA) pretenden transmitir que el anticuerpo mencionado se une específicamente al antígeno mencionado.
[0065] El término "Kd”, como se usa aquí, se refiere a la constante de disociación de equilibrio de una interacción de antígeno-anticuerpo particular.
[0066] El término "sujeto" se refiere a animales humanos y no humanos, incluyendo todos los vertebrados, por ejemplo, mamíferos y no mamíferos, tales como primates no humanos, ratones, conejos, ovejas, perros, gatos, caballos, vacas, pollos, anfibios y reptiles. En muchas realizaciones de los métodos descritos, el sujeto es un ser humano.
[0067] El término "muestra" tal como se utiliza aquí se refiere a una colección de similares fluidos, células, o tejidos (por ejemplo, tejido tumoral resecado quirúrgicamente, biopsias, incluyendo aspiración con aguja fina), aislados de un sujeto, así como fluidos, células, o tejidos presentes dentro de un sujeto. En algunas realizaciones, la muestra es un fluido biológico. Los fluidos biológicos son típicamente líquidos a temperaturas fisiológicas y pueden incluir fluidos naturales presentes, extraídos, expresados o extraídos de otro modo de un sujeto o fuente biológica. Ciertos fluidos biológicos derivan de tejidos, órganos o regiones localizadas particulares y ciertos otros fluidos biológicos pueden estar situados de manera más global o sistémica en un sujeto o fuente biológica. Ejemplos de fluidos biológicos incluyen sangre, suero y fluidos serosos, plasma, linfa, orina, saliva, líquido quístico, gotas de lágrimas, heces, esputo, secreciones mucosas de los tejidos y órganos secretores, secreciones vaginales, fluidos ascíticos como los asociados con tumores sólidos, fluidos de las cavidades pleural, pericárdica, peritoneal, abdominal y otras cavidades corporales, fluidos recogidos por lavado bronquial y similares. Los fluidos biológicos también pueden incluir soluciones líquidas puestas en contacto con un sujeto o fuente biológica, por ejemplo, medio de cultivo de células y órganos que incluye medio acondicionado de células u órganos, fluidos de lavado y similares. El término "muestra", como se usa en este documento, abarca materiales extraídos de un sujeto o materiales presentes en un sujeto.
[0068] Un "conocido estándar" puede ser una solución con una cantidad o concentración de BCMA, donde la solución conocida puede ser una solución de origen natural, tal como una muestra de un paciente sabe que tienen cáncer temprano, moderado, tarde, progresivo, o estático, o la solución puede ser una solución sintética tal como agua tamponada que tiene una cantidad conocida de BCMA diluida en ella. Los estándares conocidos, descritos en el presente documento, pueden incluir BCMA aislado de un sujeto, proteína BCMA recombinante o purificada, o un valor de concentración de BCMA asociado con una enfermedad.
[0069] El término "BCMA" como se usa en el presente documento se refiere a antígeno de maduración de las células B humanas, también conocido como BCMA, CD269, y TNFRSF17 (UniProt Q02223), que es un miembro de la superfamilia de receptor de necrosis tumoral que está preferentemente expresado en células de plasma diferenciadas. El dominio extracelular del BCMA humano consta, según UniProt, de los aminoácidos 1-54 (o 5-51). El término "anticuerpo contra BCMA, anticuerpo anti BCMA" como se usa en este documento se refiere a un anticuerpo que se une inmunoespecíficamente a BCMA.
[0070] El término "CD3" se refiere al complejo de múltiples subunidades de proteína humana CD3. El complejo de múltiples subunidades de la proteína CD3 está compuesto por 6 cadenas polipeptídicas distintivas. Estos incluyen una cadena CD3y (SwissProt P09693), una cadena CD3ó (SwissProt P04234), dos cadenas CD3e (SwissProt P07766) y un homodímero de cadena CD3Z (SwissProt 20963), y que está asociado con la cadena a y p de receptor de células T. El término "CD3" incluye cualquier variante de CD3, isoforma y homólogo de especie que se exprese naturalmente por las células (incluidas las células T) o que pueda expresarse en células transfectadas con genes o ADNc que codifiquen esos polipéptidos, a menos que se indique.
[0071] Un "anticuerpo BCMA x CD3" es un anticuerpo multiespecífico, opcionalmente, un anticuerpo biespecífico, que comprende dos regiones de unión a antígeno diferentes, uno de los cuales se une específicamente al antígeno BCMA y uno de los cuales se une específicamente a CD3. Un anticuerpo multiespecífico puede ser un anticuerpo biespecífico, diacuerpo o molécula similar (véase, por ejemplo, PNAS EE.UU. 90 (14), 6444-8 (1993) para una descripción de los diacuerpos). Los anticuerpos biespecíficos, diacuerpos y similares, proporcionados en el presente documento, pueden unirse a cualquier diana adecuada además de una porción de BCMA. El término "anticuerpo biespecífico" debe entenderse como un anticuerpo que tiene dos regiones de unión a antígeno diferentes definidas por diferentes secuencias de anticuerpos. Esto puede entenderse como una unión diana diferente pero también incluye unión a diferentes epítopos en una diana. Una "muestra de referencia" es una muestra que puede compararse con otra muestra, como una muestra de prueba, para permitir la caracterización de la muestra comparada. La muestra de referencia tendrá alguna propiedad caracterizada que sirva como base para la comparación con la muestra de prueba. Por ejemplo, se puede usar una muestra de referencia como punto de referencia para los niveles de BCMA que son indicativos de que un sujeto tiene cáncer. La muestra de referencia no tiene que analizarse necesariamente en paralelo con la muestra de prueba, por lo que en algunos casos la muestra de referencia puede ser un valor numérico o un rango determinado previamente para caracterizar una condición determinada, como los niveles de BCMA que son indicativos de cáncer en un sujeto. El término también incluye muestras utilizadas con fines comparativos que se sabe que están asociadas con un estado fisiológico o una enfermedad, como cáncer que expresa BCMA, pero que tienen una cantidad desconocida de BCMA.
[0073] El término "progresión", como se usa en el contexto de progresión del cáncer que expresa BCMA, incluye el cambio de un cáncer de un estado menos severo a más grave. Esto puede incluir un aumento en el número o la gravedad de los tumores, el grado de metástasis, la velocidad con la que el cáncer está creciendo o propagándose, y similares. Por ejemplo, "la progresión del cáncer de colon" incluye la progresión de dicho cáncer de un estado menos severo a uno más severo, como la progresión del estadio I al estadio II, del estadio II al estadio III, etc.
[0074] El término "regresión", como se usa en el contexto de regresión del cáncer que expresa BCMA, incluye el cambio de un cáncer de un estado más grave a uno menos grave. Esto podría incluir una disminución en el número o la gravedad de los tumores, el grado de metástasis, la velocidad con la que el cáncer crece o se propaga, y similares. Por ejemplo, "la regresión del cáncer de colon" incluye la regresión de dicho cáncer de un estado más severo a uno menos severo, tal como la progresión del estadio III al estadio II, del estadio II al estadio I, etc.
[0075] El término "estable", como se usa en el contexto de cáncer estable que expresa BCMA, está destinado a describir una condición de enfermedad que no ha cambiado o no ha cambiado lo suficientemente significativamente durante un período de tiempo clínicamente relevante para ser considerado un cáncer progresivo o un retroceso del cáncer.
[0076] Las realizaciones descritas en el presente documento no se limitan a métodos particulares, reactivos, compuestos, composiciones o sistemas biológicos, que pueden, por supuesto, variar.
Anticuerpos específicos a BCMA y fragmentos de unión a antígeno
[0077] Se describen aquí anticuerpos monoclonales recombinantes o fragmentos de unión a antígenos que se unen específicamente a BCMA. La estructura general de una molécula de anticuerpo comprende un dominio de unión a antígeno, que incluye cadenas pesadas y ligeras, y el dominio Fc, que cumple una variedad de funciones, incluida la fijación del complemento y la unión a receptores de anticuerpos.
[0078] Los anticuerpos o fragmentos de unión a antígeno específicos de BCMA descritos incluyen todos los isotipos, IgA, IgD, IgE, IgG e IgM, y multímeros sintéticos de la estructura de inmunoglobulina de cuatro cadenas. Los anticuerpos o fragmentos de unión a antígeno descritos también incluyen el isotipo IgY que se encuentra generalmente en suero de gallina o pavo y yema de huevo de gallina o pavo.
[0079] Los anticuerpos específicos a BCMA y fragmentos de unión a antígeno pueden derivarse de cualquier especie por medios recombinantes. Por ejemplo, los anticuerpos o fragmentos de unión a antígeno pueden ser de ratón, rata, cabra, caballo, cerdo, bovino, pollo, conejo, camélido, burro, humano o versiones quiméricas de los mismos. Para su uso en la administración a seres humanos, los anticuerpos o fragmentos de unión a antígeno no derivados de seres humanos pueden alterarse genética o estructuralmente para que sean menos antigénicos tras la administración a un paciente humano.
[0080] En algunas realizaciones, los anticuerpos o fragmentos de unión a antígeno son quiméricos. Como se usa en este documento, el término "quimérico" se refiere a un anticuerpo, o fragmento de unión a antígeno del mismo, que tiene al menos una parte de al menos un dominio variable derivado de la secuencia de aminoácidos del anticuerpo de un mamífero no humano, un roedor o un reptil, mientras que las porciones restantes del anticuerpo, o su fragmento de unión a antígeno, se derivan de un ser humano.
[0081] En algunas realizaciones, los anticuerpos son anticuerpos humanizados. Los anticuerpos humanizados pueden ser inmunoglobulinas quiméricas, cadenas de inmunoglobulinas o fragmentos de las mismas (tales como Fv, Fab, Fab', F(ab')2 u otras subsecuencias de anticuerpos de unión a antígeno) que contienen una secuencia mínima derivada de inmunoglobulina no humana. En su mayor parte, los anticuerpos humanizados son inmunoglobulinas humanas (anticuerpo receptor) en las que los residuos de una región determinante complementaria (CDR) del receptor se reemplazan por residuos de una CDR de una especie no humana (anticuerpo donante) como el de ratón, rata o conejo que tiene la especificidad, afinidad y capacidad deseadas. En general, el anticuerpo humanizado comprenderá sustancialmente la totalidad de al menos uno, y típicamente dos, dominios variables, en los que todas o sustancialmente todas las regiones CDR corresponden a las de una inmunoglobulina no humana y todas o sustancialmente todas las regiones marco son las de una secuencia de inmunoglobulina humana. El anticuerpo humanizado puede incluir al menos una parte de una región constante de inmunoglobulina (Fc), típicamente la de una inmunoglobulina humana.
[0082] Los anticuerpos o fragmentos de unión a antígeno aquí descritos pueden ocurrir en una variedad de formas, pero incluirá una o más de las CDR de anticuerpos que se muestran en la Tabla 1.
[0083] Se describen aquí anticuerpos recombinantes y fragmentos de unión a antígeno que se unen inmunoespecíficamente a BCMA. En algunas realizaciones, los anticuerpos o fragmentos de unión a antígeno específicos de BCMA son IgG humana o derivados de la misma. Si bien los anticuerpos o fragmentos de unión a antígeno específicos de BCMA ejemplificados en el presente documento son humanos, los anticuerpos o fragmentos de unión a antígeno ejemplificados pueden ser quimerizados.
[0084] En algunas realizaciones se proporcionan un anticuerpo de BCMA específico, o un fragmento de unión a antígeno del mismo que comprende una cadena pesada que comprende una CDR1, una CDR2, y una CDR3 de una cualquiera de los anticuerpos descritos en la Tabla 1 y una cadena ligera que comprende una CDR1, una CDR2, y una CDR3 de una cualquiera de los anticuerpos descritos en la Tabla 1.
[0085] en algunas realizaciones, los anticuerpos específicos a BCMA y fragmentos de unión a antígeno comprenden una cadena pesada CDR1 que comprende la SEQ ID NO: 4, una CDR2 de cadena pesada que comprende SEQ ID NO: 5, una CDR3 de cadena pesada que comprende SEQ ID NO: 6, una CDR1 de cadena ligera que comprende SEQ ID NO: 24, una CDR2 de cadena ligera que comprende SEQ ID NO: 25 y una CDR3 de cadena ligera que comprende SEQ ID NO: 26. Este anticuerpo o fragmento de unión a antígeno específico de BCMA puede comprender secuencias estructurales humanas. Este anticuerpo o fragmento de unión a antígeno específico de BCMA puede bloquear la unión de APRIL con un CI50 de al menos 5,9 nM. En algunas realizaciones, los anticuerpos específicos de BCMA y los fragmentos de unión a antígeno comprenden un dominio variable de cadena pesada sustancialmente igual o idéntico a la SEQ ID NO: 27. En algunas realizaciones, los anticuerpos específicos de BCMA y los fragmentos de unión a antígeno comprenden un dominio variable de cadena pesada sustancialmente igual o idéntica a SEQ ID NO: 27 y un dominio variable de cadena ligera sustancialmente igual o idéntico a SEQ ID NO: 28. El dominio variable de cadena pesada y el dominio variable de cadena ligera de los anticuerpos analizados en este párrafo son adecuados para su inclusión en construcciones biespecíficas en las que un brazo es un brazo anti-BCMA.
[0086] En algunas realizaciones, los anticuerpos específicos a BCMA y fragmentos de unión a antígeno comprenden una cadena pesada CDR1 que comprende la SEQ ID NO: 7, una CDR2 de cadena pesada que comprende la SEQ ID NO: 5, una CDR3 de cadena pesada que comprende la SEQ ID NO: 6, una CDR1 de cadena ligera que comprende la SEQ ID NO: 24, una CDR2 de cadena ligera que comprende la SEQ ID NO: 25 y una CDR3 de cadena ligera que comprende la SEQ ID NO: 26. Este anticuerpo o fragmento de unión a antígeno específico de BCMA puede comprender secuencias estructurales humanas. En algunas realizaciones, los anticuerpos específicos de BCMA y los fragmentos de unión a antígeno comprenden un dominio variable de cadena pesada sustancialmente igual o idéntico a SEQ ID NO: 57. En algunas realizaciones, los anticuerpos específicos de BCMA y los fragmentos de unión a antígeno comprenden un dominio variable de cadena pesada sustancialmente igual o idéntico a SEQ ID NO: 57 y un dominio variable de cadena ligera sustancialmente igual o idéntico a SEQ ID NO: 28. El dominio variable de cadena pesada y el dominio variable de cadena ligera de los anticuerpos analizados en este párrafo son adecuados para su inclusión en construcciones biespecíficas en las que un brazo es un brazo anti-BCMA.
[0087] En algunas realizaciones, los anticuerpos específicos a BCMA y fragmentos de unión a antígeno comprenden una cadena pesada CDR1 que comprende la SEQ ID NO: 7, una CDR2 de cadena pesada que comprende la SEQ ID NO: 5, una CDR3 de cadena pesada que comprende la SEQ ID NO: 6, una CDR1 de cadena ligera que comprende la SEQ ID NO: 24, una CDR2 de cadena ligera que comprende la SEQ ID NO: 25 y una CDR3 de cadena ligera que comprende la SEQ ID NO: 26. Este anticuerpo o fragmento de unión a antígeno específico de BCMA puede comprender secuencias estructurales humanas. En algunas realizaciones, los anticuerpos específicos de BCMA y los fragmentos de unión a antígeno comprenden un dominio variable de cadena pesada sustancialmente igual o idéntico a SEQ ID NO: 34. En algunas realizaciones, los anticuerpos específicos de BCMA y los fragmentos de unión a antígeno comprenden un dominio variable de cadena pesada sustancialmente igual o idéntico a SEQ ID NO: 34 y un dominio variable de cadena ligera sustancialmente igual o idéntico a SEQ ID NO: 28. El dominio variable de cadena pesada y el dominio variable de cadena ligera de los anticuerpos analizados en este párrafo son adecuados para su inclusión en construcciones biespecíficas en las que un brazo es un brazo anti-BCMA.
[0088] En algunas realizaciones, los anticuerpos específicos a BCMA y fragmentos de unión a antígeno comprenden una cadena pesada CDR1 que comprende la SEQ ID NO: 4, una CDR2 de cadena pesada que comprende la SEQ ID NO: 5, una CDR3 de cadena pesada que comprende la SEQ ID NO: 19, una CDR1 de cadena ligera que comprende la SEQ ID NO: 24, una CDR2 de cadena ligera que comprende la SEQ ID NO: 25 y una CDR3 de cadena ligera que comprende la SEQ ID NO: 26. Este anticuerpo o fragmento de unión a antígeno específico de BCMA puede comprender secuencias estructurales humanas. En algunas realizaciones, los anticuerpos específicos de BCMA y los fragmentos de unión a antígeno comprenden un dominio variable de cadena pesada sustancialmente igual o idéntico a la SEQ ID NO: 39. En algunas realizaciones, los anticuerpos específicos de BCMA y los fragmentos de unión a antígeno comprenden un dominio variable de cadena pesada sustancialmente igual o idéntico a SEQ ID NO: 39 y un dominio variable de cadena ligera sustancialmente igual o idéntico a SEQ ID NO: 28. El dominio variable de cadena pesada y el dominio variable de cadena ligera de los anticuerpos analizados en este párrafo son adecuados para su inclusión en construcciones biespecíficas en las que un brazo es un brazo anti-BCMA.
[0089] En algunas realizaciones, los anticuerpos específicos a BCMA y fragmentos de unión a antígeno comprenden una cadena pesada CDR1 que comprende la SEQ ID NO: 4, una CDR2 de cadena pesada que comprende la SEQ ID NO: 8, una CDR3 de cadena pesada que comprende la SEQ ID NO: 6, una CDR1 de cadena ligera que comprende la SEQ ID NO: 24, una CDR2 de cadena ligera que comprende la SEQ ID NO: 25 y una CDR3 de cadena ligera que comprende la SEQ ID NO: 26. Este anticuerpo o fragmento de unión a antígeno específico de BCMA puede comprender secuencias estructurales humanas. En algunas realizaciones, los anticuerpos específicos de BCMA y los fragmentos de unión a antígeno comprenden un dominio variable de cadena pesada sustancialmente igual o idéntico a SEQ ID NO: 40. En algunas realizaciones, los anticuerpos específicos de BCMA y los fragmentos de unión a antígeno comprenden un dominio variable de cadena pesada sustancialmente igual o idéntico a SEQ ID NO: 40 y un dominio variable de cadena ligera sustancialmente igual o idéntico a SEQ ID NO: 28. El dominio variable de cadena pesada y el dominio variable de cadena ligera de los anticuerpos analizados en este párrafo son adecuados para su inclusión en construcciones biespecíficas en las que un brazo es un brazo anti-BCMA.
[0090] En algunas realizaciones, los anticuerpos específicos a BCMA y fragmentos de unión a antígeno comprenden una cadena pesada CDR1 que comprende la SEQ ID NO: 13, una CDR2 de cadena pesada que comprende la SEQ ID NO: 5, una CDR3 de cadena pesada que comprende la SEQ ID NO: 19, una CDR1 de cadena ligera que comprende la SEQ ID NO: 24, una CDR2 de cadena ligera que comprende la SEQ ID NO: 25 y una CDR3 de cadena ligera que comprende la SEQ ID NO: 26. Este anticuerpo o fragmento de unión a antígeno específico de BCMA puede comprender secuencias estructurales humanas. En algunas realizaciones, los anticuerpos específicos de BCMA y los fragmentos de unión a antígeno comprenden un dominio variable de cadena pesada sustancialmente igual o idéntico a SEQ ID NO: 58. En algunas realizaciones, los anticuerpos específicos de BCMA y los fragmentos de unión a antígeno comprenden un dominio variable de cadena pesada sustancialmente igual o idéntico a SEQ ID NO: 58 y un dominio variable de cadena ligera sustancialmente igual o idéntico a SEQ ID NO: 28. El dominio variable de cadena pesada y el dominio variable de cadena ligera de los anticuerpos analizados en este párrafo son adecuados para su inclusión en construcciones biespecíficas en las que un brazo es un brazo anti-BCMA.
[0091] En algunas realizaciones, los anticuerpos específicos a BCMA y fragmentos de unión a antígeno comprenden una cadena pesada CDR1 que comprende la SEQ ID NO: 13, una CDR2 de cadena pesada que comprende la SEQ ID NO: 8, una CDR3 de cadena pesada que comprende SEQ ID NO: 19, una CDR1 de cadena ligera que comprende la SEQ ID NO: 24, una CDR2 de cadena ligera que comprende la SEQ ID NO: 25 y una CDR3 de cadena ligera que comprende la SEQ ID NO: 26. Este anticuerpo o fragmento de unión a antígeno específico de BCMA puede comprender secuencias estructurales humanas. En algunas realizaciones, los anticuerpos específicos de BCMA y los fragmentos de unión a antígeno comprenden un dominio variable de cadena pesada sustancialmente igual o idéntico a SEQ ID NO: 43. En algunas realizaciones, los anticuerpos específicos de BCMA y los fragmentos de unión a antígeno comprenden un dominio variable de cadena pesada sustancialmente igual o idéntico a SEQ ID NO: 43 y un dominio variable de cadena ligera sustancialmente igual o idéntico a SEQ ID NO: 28. El dominio variable de cadena pesada y el dominio variable de cadena ligera de los anticuerpos analizados en este párrafo son adecuados para su inclusión en construcciones biespecíficas en las que un brazo es un brazo anti-BCMA.
[0092] En algunas realizaciones, los anticuerpos o fragmentos de unión a antígeno son IgG, o sus derivados, por ejemplo, isotipos IgG1, IgG2, IgG3, y IgG4. En algunas realizaciones en las que el anticuerpo es del isotipo IgG1, el anticuerpo comprende una región Fc de IgG1 (SEQ ID NO. 74).
SEQ ID NO 74 ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSCiVHTFPAVLQSS GLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKYDKKVF.PKSCDKTHTCPPCPAPFL1.GG PSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVWDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQY NSTYRWSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPRF.PQVYTLPPSR EFMTKNQVSLTCI.VKGFYPSDIAYFWESNGQPENNYKTTPPYLDSDGSFFl YSKLTYDK SRWQQGNVFSCSVMHEAI.HNHYTQKSLSLSPGK
En algunas realizaciones en las que el anticuerpo es de isotipo IgG4, el anticuerpo contiene sustituciones S228P, L234A y L235A en su región Fc (SEQ ID NO. 73).
SEQ ID NO 73 ASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSS GLYSLSSWTVPSSSLGTKTYTCNVDHKPSNTKVDKRVESKYGPPCPPCPAPEAAGGPS VFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNS TYRWSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEE MTKNQVSLTCLVKGFYPSD1AVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSR WQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGK
Los anticuerpos específicos definidos por CDR y/o secuencia de dominio variable discutidos en los párrafos anteriores pueden incluir estas regiones Fc de IgG.
[0093] También se describen polinucleótidos aislados sintéticos que codifican los anticuerpos o fragmentos de unión a antígeno que se unen inmunoespecíficamente a BCMA. Los polinucleótidos aislados capaces de codificar los segmentos de dominio variable proporcionados en el presente documento pueden incluirse en el mismo o en vectores diferentes para producir anticuerpos o fragmentos de unión a antígeno.
[0094] Los polinucleótidos que codifican proteínas de unión a antígenos recombinantes también están dentro del alcance de la divulgación. En algunas realizaciones, los polinucleótidos descritos (y los péptidos que codifican) incluyen una secuencia líder. Puede emplearse cualquier secuencia líder conocida en la técnica. La secuencia líder puede incluir, pero no se limita a, un sitio de restricción o un sitio de inicio de traducción.
[0095] Los anticuerpos específicos a BCMA o fragmentos de unión a antígenos descritos en este documento incluyen variantes que tienen sustituciones, deleciones o adiciones de aminoácidos únicos o múltiples que retienen las propiedades biológicas (por ejemplo, afinidad de unión o actividad efectora inmune) de los anticuerpos específicos de BCMA o fragmentos de unión a antígeno descritos. En el contexto de la presente invención, las siguientes notaciones se utilizan, a menos que se indique lo contrario, para describir una mutación; i) la sustitución de un aminoácido en una posición dada se escribe como, por ejemplo, K409R que significa una sustitución de una Lisina en la posición 409 por una Arginina; y ii) para variantes específicas se utilizan los códigos específicos de tres o una letra, incluidos los códigos Xaa y X para indicar cualquier residuo de aminoácido. Por tanto, la sustitución de lisina por arginina en la posición 409 se designa como: K409R, o la sustitución de cualquier residuo de aminoácido por lisina en la posición 409 se designa como K409X. En caso de deleción de lisina en la posición 409, se indica con K409*. El experto en la materia puede producir variantes que tengan sustituciones, deleciones o adiciones de aminoácidos únicos o múltiples.
[0096] Estas variantes pueden incluir: (a) variantes en las que uno o más residuos de aminoácidos están sustituidos con aminoácidos conservativos o no conservativos, (b) variantes en las que uno o más aminoácidos se añaden o se suprimen del polipéptido, (c) variantes en las que uno o más aminoácidos incluyen un grupo sustituyente, y (d) variantes en las que el polipéptido se fusiona con otro péptido o polipéptido, como un compañero de fusión, una etiqueta de proteína u otro resto químico, que pueden conferir propiedades útiles al polipéptido, tal como, por ejemplo, un epítopo para un anticuerpo, una secuencia de polihistidina, un resto de biotina y similares. Los anticuerpos o fragmentos de unión a antígeno descritos en este documento pueden incluir variantes en las que los residuos de aminoácidos de una especie se sustituyen por el residuo correspondiente en otra especie, ya sea en las posiciones conservadas o no conservadas. En otras realizaciones, los residuos de aminoácidos en las posiciones no conservadas se sustituyen por residuos conservadores o no conservadores. Las técnicas para obtener estas variantes, incluidas las técnicas genéticas (deleciones, mutaciones, etc.), químicas y enzimáticas, son conocidas por los expertos en la técnica. Los anticuerpos específicos de BCMA o los fragmentos de unión a antígeno descritos en este documento pueden incorporan varios isotipos de anticuerpos, como IgM, IgD, IgG, IgA e IgE. En algunas realizaciones, el isotipo del anticuerpo es el isotipo IgG1, IgG2, IgG3 o IgG4, preferiblemente el isotipo IgG1 o IgG4. La especificidad del anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo está determinada en gran medida por la secuencia de aminoácidos y la disposición de las CDR. Por tanto, las CDR de un isotipo se pueden transferir a otro isotipo sin alterar la especificidad del antígeno. Alternativamente, se han establecido técnicas para hacer que los hibridomas pasen de producir un isotipo de anticuerpo a otro (cambio de isotipo) sin alterar la especificidad del antígeno. Por consiguiente, tales isotipos de anticuerpos están dentro del alcance de los anticuerpos o fragmentos de unión a antígeno descritos.
[0098] Los anticuerpos específicos a BCMA o fragmentos de unión a antígenos descritos aquí tienen valor CI50 es de al menos 5,9 nM para la unión APRIL. El CI50 de los anticuerpos específicos a BCMA descritos, o fragmentos de unión a antígeno, puede ser determinado por una variedad de métodos conocidos en la técnica, tales como los métodos basados en ELISA o citometría de (FACS) de flujo. Los ensayos para la medición de CI50 por ELISA tienen BCMA unido a la placa en presencia y ausencia de un anticuerpo BCMA específico y concentraciones variables del APRIL son utilizados. Un anticuerpo BCMA que bloquea la unión de APRIL a BCMA es "bloquear APRIL según lo medido por ELISA".
[0099] También se proporcionan vectores que comprenden los polinucleótidos descritos en este documento. Los vectores pueden ser vectores de expresión. Los vectores de expresión recombinantes que contienen una secuencia que codifica un polipéptido de interés se contemplan, por tanto, dentro del alcance de esta descripción. El vector de expresión puede contener una o más secuencias adicionales tales como, pero sin limitarse a ellas, secuencias reguladoras (p. ej., promotor, potenciador), un marcador de selección y una señal de poliadenilación. Los vectores para transformar una amplia variedad de células huésped son bien conocidos e incluyen, entre otros, plásmidos, fagémidos, cósmidos, baculovirus, bácmidos, cromosomas artificiales bacterianos (BAC), cromosomas artificiales de levadura (YAC), así como otras bacterias, levaduras y vectores virales.
[0100] Los vectores de expresión recombinantes dentro del alcance de la descripción incluyen fragmentos de ácido nucleico sintético, genómico, o derivados de ADNc que codifican al menos una proteína recombinante que puede estar unido operativamente a elementos reguladores adecuados. Dichos elementos reguladores pueden incluir un promotor de la transcripción, secuencias que codifican sitios de unión ribosomal de ARNm adecuados y secuencias que controlan la terminación de la transcripción y traducción. Los vectores de expresión, especialmente los vectores de expresión de mamíferos, también pueden incluir uno o más elementos no transcritos, tales como un origen de replicación, un promotor y potenciador adecuado ligado al gen que se va a expresar, otras secuencias no transcritas flanqueantes 5' o 3', secuencias no traducidas 5' o 3' (tales como sitios de unión de ribosomas necesarios), un sitio de poliadenilación, sitios donantes y aceptores de empalme, o secuencias de terminación de la transcripción. También se puede incorporar un origen de replicación que confiera la capacidad de replicarse en un huésped.
[0101] Las secuencias de control de transcripción y traducción en vectores de expresión para ser utilizadas en la transformación de células de vertebrados pueden proporcionarse por fuentes virales. Pueden construirse vectores ejemplares como describen Okayama y Berg, 3 Mol. Célula. Biol. 280 (1983).
[0102] En algunas realizaciones, la secuencia de fragmento de codificación de anticuerpo o de unión a antígeno se coloca bajo el control de un potente promotor constitutivo, tal como los promotores para los siguientes genes: transferasa de fosforribosilo de hipoxantina (HPRT), adenosina desaminasa, piruvato quinasa, beta-actina, miosina humana, hemoglobina humana, creatina de músculo humano y otros. Además, muchos promotores virales funcionan de manera constitutiva en células eucariotas y son adecuados para su uso con las realizaciones descritas. Dichos promotores virales incluyen, sin limitación, el promotor temprano inmediato del citomegalovirus (CMV), los promotores temprano y tardío de SV40, el promotor del virus del tumor mamario del ratón (MMTV), las repeticiones terminales largas (LTR) del virus de la leucemia de Maloney, el virus de la inmunodeficiencia humana (VIH), El virus de Epstein Barr (EBV), el virus del sarcoma de Rous (RSV) y otros retrovirus, y el promotor de timidina quinasa del virus del herpes simple. En una realización, el anticuerpo específico a BCMA o su fragmento de unión a antígeno de la misma secuencia codificante se coloca bajo el control de un promotor inducible tal como el promotor de metalotioneína, promotor inducible por tetraciclina, promotor inducible por doxiciclina, promotores que contienen uno o más elementos de respuesta estimulados por interferón (ISRE) tales como sintetasas de quinasa de proteína R 2',5'-oligoadenilato, genes Mx, ADAR1 y similares.
[0103] Los vectores descritos en el presente documento pueden contener uno o más sitios de entrada de ribosomas internos (IRES). La inclusión de una secuencia IRES en vectores de fusión puede ser beneficiosa para potenciar la expresión de algunas proteínas. En algunas realizaciones, el sistema de vector incluirá uno o más sitios de poliadenilación (por ejemplo, SV40), que pueden estar cadena arriba o cadena abajo de cualquiera de las secuencias de ácido nucleico mencionadas anteriormente. Los componentes del vector se pueden unir contiguamente, o disponer de una manera que proporcione un espaciado óptimo para expresar los productos génicos (es decir, mediante la introducción de nucleótidos "espaciadores" entre los ORF), o posicionar de otra manera. Los elementos reguladores, como el motivo IRES, también pueden disponerse para proporcionar un espaciado óptimo para la expresión.
[0104] Los vectores pueden comprender marcadores de selección, que son bien conocidos en la técnica. Los marcadores de selección incluyen marcadores de selección positivos y negativos, por ejemplo, genes de resistencia a antibióticos (p. ej., gen de resistencia a la neomicina, un gen de resistencia a higromicina, un gen de resistencia a kanamicina, un gen de resistencia a tetraciclina, un gen de resistencia a penicilina, un gen de resistencia a puromicina, un gen de resistencia a blasticidina), genes de sintasa de glutamato, HSV-TK, derivados de HSV-TK para la selección de ganciclovir, o gen de fosforilasa de nucleósido de purina bacteriana para la selección de 6-metilpurina (Gadi et al., 7 Gene Ther. 1738-1743 (2000)). Una secuencia de ácido nucleico que codifica un marcador de selección o el sitio de clonación puede estar cadena arriba o cadena abajo de una secuencia de ácido nucleico que codifica un polipéptido de interés o sitio de clonación.
[0105] Los vectores descritos en el presente documento se pueden usar para transformar diversas células con los genes que codifican los anticuerpos o fragmentos de unión a antígeno descritos. Por ejemplo, los vectores se pueden usar para generar anticuerpos específicos de BCMA o células productoras de fragmentos de unión a antígenos. Por tanto, otro aspecto presenta células hospedadoras transformadas con vectores que comprenden una secuencia de ácido nucleico que codifica un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo que se une específicamente a BCMA, como los anticuerpos o fragmentos de unión a antígeno descritos y ejemplificados en la presente.
[0106] Se conocen numerosas técnicas en la técnica para la introducción de genes extraños en células y pueden ser usados para construir las células recombinantes para los propósitos de llevar a cabo los métodos descritos, de acuerdo con las diversas realizaciones descritas y ejemplificadas en este documento. La técnica utilizada debe permitir la transferencia estable de la secuencia del gen heterólogo a la célula huésped, de modo que la secuencia del gen heterólogo sea heredable y expresable por la progenie celular, y de modo que no se interrumpan el desarrollo y las funciones fisiológicas necesarias de las células receptoras. Las técnicas que pueden usarse incluyen, pero no se limitan a, transferencia de cromosomas (por ejemplo, fusión celular, transferencia de genes mediada por cromosomas, transferencia de genes mediada por microcélulas), métodos físicos (por ejemplo, transfección, fusión de esferoplastos, microinyección, electroporación, portador de liposomas), transferencia de vectores virales (por ejemplo, virus de ADN recombinante, virus de ARN recombinante) y similares (descritos en Cline, 29 Pharmac. Ther. 69-92 (1985)). La precipitación con fosfato de calcio y la fusión inducida por polietilenglicol (PEG) de protoplastos bacterianos con células de mamífero también se pueden usar para transformar células.
[0107] Las células adecuadas para su uso en la expresión de los anticuerpos específicos a BCMA o fragmentos de unión a antígenos descritos en el presente documento son preferiblemente células eucariotas, más preferiblemente células de planta, roedor, o de origen humano, por ejemplo, pero no limitado a NSO, CHO, CHOK1, perC.6, Tk-ts13, BHK, células HEK293, COS-7, T98G, CV-1/EBNA, células L, C127, 3T3, HeLa, NS1, células de mieloma Sp2/0 y líneas celulares BHK, entre otros. Además, la expresión de anticuerpos se puede lograr usando células de hibridoma. Los métodos para producir hibridomas están bien establecidos en la técnica.
[0108] Las células transformadas con vectores de expresión descritos en el presente documento pueden ser seleccionadas o cribadas para expresión recombinante de los anticuerpos o fragmentos de unión a antígeno aquí descritos. Las células recombinantes positivas se expanden y se analizan en busca de subclones que presenten un fenotipo deseado, como un alto nivel de expresión, propiedades de crecimiento mejoradas o la capacidad de producir proteínas con características bioquímicas deseadas, por ejemplo, debido a la modificación de proteínas o modificaciones postraduccionales alteradas. Estos fenotipos pueden deberse a propiedades inherentes de un subclon dado o a una mutación. Las mutaciones pueden efectuarse mediante el uso de productos químicos, luz de longitud de onda UV, radiación, virus, mutágenos de inserción, inhibición de la reparación del desajuste del ADN o una combinación de tales métodos.
Métodos de uso de anticuerpos específicos de BCMA para el tratamiento
[0109] Se proporcionan en el presente documento anticuerpos específicos de BCMA o fragmentos de unión a antígeno de los mismos para su uso en terapia. En particular, estos anticuerpos o fragmentos de unión a antígeno pueden ser útiles en el tratamiento del cáncer, como el cáncer que expresa BCMA. Por consiguiente, la invención proporciona un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo, como se define en las reivindicaciones, para su uso en un método de tratamiento del cáncer que comprende administrar el anticuerpo. Por ejemplo, el uso puede ser interfiriendo con las interacciones del receptor BCMA o cuando el anticuerpo está conjugado con una toxina, dirigiendo así la toxina al cáncer que expresa BCMA. En algunas realizaciones, el cáncer que expresa BCMA incluye linfoma, tal como mieloma múltiple (MM). Los anticuerpos para usar en estos métodos incluyen los descritos en el presente documento anteriormente, por ejemplo, un anticuerpo específico a BCMA o un fragmento de unión a antígeno con las características establecidas en la Tabla 1, por ejemplo, las CDR o secuencias de dominio variable, y en la discusión adicional de estos anticuerpos.
[0110] En algunas realizaciones descritas en el presente documento, las propiedades efectoras inmunes de los anticuerpos específicos de BCMA pueden ser mejoradas o silenciadas mediante modificaciones de Fc mediante técnicas conocidas por los expertos en la técnica. Por ejemplo, las funciones efectoras de Fc como la unión de Clq, la citotoxicidad dependiente del complemento (CDC), la citotoxicidad mediada por células dependiente de anticuerpos (ADCC), la fagocitosis mediada por células dependiente de anticuerpos (ADCP), la regulación por disminución de los receptores de la superficie celular (p. ej., receptor de células B; BCR), etc., pueden proporcionarse y/o controlarse modificando residuos en el Fc responsables de estas actividades.
[0111] "Citotoxicidad mediada por células dependiente de anticuerpos" o "ADCC" se refiere a una reacción mediada por células en donde las células citotóxicas no específicas que expresan receptores Fc (FcR) (por ejemplo, células asesinas naturales (NK), neutrófilos y macrófagos) reconocen unir el anticuerpo en una célula diana y posteriormente causar la lisis de la célula diana.
[0112] La capacidad de los anticuerpos monoclonales de inducir la ADCC se puede mejorar mediante el diseño de su componente de oligosacárido. La IgG1 o IgG3 humana se N-glicosila en Asn297 con la mayoría de los glicanos en las formas bien conocidas biantenarias G0, G0F, G1, G1F, G2 o G2F. Los anticuerpos producidos por células CHO no modificadas por ingeniería típicamente tienen un contenido de fucosa de glucano de aproximadamente al menos el 85%. La eliminación de la fucosa del núcleo de los oligosacáridos de tipo complejo biantenario unidos a las regiones Fc potencia la ADCC de los anticuerpos mediante la unión mejorada de Fc.gamma.RIIIa sin alterar la unión del antígeno o la actividad CDC. Dichos mAb se pueden lograr usando diferentes métodos informados para conducir a la expresión exitosa de anticuerpos defucosilados relativamente altos que portan el tipo de complejo biantenario de oligosacáridos Fc, como el control de la osmolalidad del cultivo (Konno et al., Cytotechnology 64: 249-65, 2012), aplicación de una línea CHO variante Lec13 como línea celular huésped (Shields et al., J Biol Chem 277: 26733­ 26740, 2002), aplicación de una línea CHO variante EB66 como línea celular huésped (Olivier et al., MAbs; 2 (4), 2010; Publicación electrónica antes de la impresión; PMID: 20562582), aplicación de una línea celular de hibridoma de rata YB2/0 como línea celular huésped (Shinkawa et al., J Biol Chem 278: 3466-3473, 2003), introducción de pequeños ARN interferentes específicamente contra el gen de la .alfa. 1,6-fucosiltrasferasa (FUT8) (Mori et al., Biotechnol Bioeng 88: 901-908, 2004), o la coexpresión de la p-1,4-N-acetNglucosammNtransferasa III y la a-manosidasa II de golgi o un inhibidor potente de alfa-manosidasa I, kifunensina (Ferrara et al., J Biol Chem 281: 5032-5036, 2006, Ferrara et al., Biotechnol Bioeng 93: 851-861, 2006; Xhou et al., Biotechnol Bioeng 99: 652-65, 2008).
[0113] En algunas realizaciones descritas en este documento, ADCC provocada por los anticuerpos BCMA también se puede mejorar mediante ciertas sustituciones en el anticuerpo Fc. Sustituciones ejemplares son, por ejemplo, sustituciones en las posiciones de aminoácidos 256, 290, 298, 312, 356, 330, 333, 334, 360, 378 o 430 (numeración de residuos según el índice EU) como se describe en la patente de EE.UU. N° 6.737.056.
Métodos para detectar BCMA
[0114] Se proporcionan aquí métodos para detectar BCMA en una muestra biológica poniendo en contacto la muestra con un anticuerpo, o fragmento de unión a antígeno del mismo, descrito en este documento. Como se describe en el presente documento, la muestra puede derivar de orina, sangre, suero, plasma, saliva, ascitis, células circulantes, células tumorales circulantes, células que no están asociadas al tejido (es decir, células libres), tejidos (p. ej., tejido tumoral resecado quirúrgicamente, biopsias, incluida la aspiración con aguja fina), preparaciones histológicas y similares. En algunas realizaciones, los métodos descritos incluyen la detección de BCMA en una muestra biológica poniendo en contacto la muestra con cualquiera de los anticuerpos específicos de BCMA o fragmentos de unión a antígeno de los mismos descritos en el presente documento.
[0115] En algunas realizaciones, la muestra puede ponerse en contacto con más de uno de los anticuerpos específicos a BCMA o fragmentos de unión a antígeno aquí descritos. Por ejemplo, una muestra puede ponerse en contacto con un primer anticuerpo específico a BCMA, o un fragmento de unión a antígeno del mismo, y luego ponerse en contacto con un segundo anticuerpo específico a BCMA o fragmento de unión a antígeno del mismo, en donde el primer anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo y el segundo anticuerpo o fragmento de unión a antígeno no es el mismo anticuerpo o fragmento de unión a antígeno. En algunas realizaciones, el primer anticuerpo, o su fragmento de unión a antígeno, puede fijarse a una superficie, como una placa de pocillos múltiples, chip o sustrato similar antes de entrar en contacto con la muestra. En otras realizaciones, el primer anticuerpo, o fragmento de unión a antígeno del mismo, no puede fijarse o unirse a nada antes de entrar en contacto con la muestra.
[0116] Los anticuerpos específicos a BCMA y fragmentos de unión a antígeno descritos se pueden marcar de forma detectable. En algunas realizaciones, los anticuerpos marcados y los fragmentos de unión a antígeno pueden facilitar la detección de BCMA mediante los métodos descritos en el presente documento. Muchos de estos marcadores son fácilmente conocidos por los expertos en la técnica. Por ejemplo, los marcadores adecuados incluyen, pero no deben considerarse limitados a, marcadores radiactivos, marcadores fluorescentes, marcadores de epítopos, biotina, marcadores cromóforos, marcadores ECL o enzimas. Más específicamente, los marcadores descritos incluyen rutenio, 111In-DOTA, ácido 111In-dietilentriaminopentaacético (DTPA), peroxidasa de rábano picante, fosfatasa alcalina y betagalactosidasa, poli-histidina (etiqueta HIS), tintes de acridina, tintes de cianina, tintes de fluorona, tintes de oxazina, tintes de fenantridina, tintes de rodamina, tintes Alexafluor® y similares.
[0117] Los anticuerpos específicos a BCMA y fragmentos de unión a antígeno descritos se pueden usar en una variedad de ensayos para detectar BCMA en una muestra biológica. Algunos ensayos adecuados incluyen, entre otros, análisis de transferencia Western, radioinmunoensayo, resonancia de plasmón de superficie, inmunofluorimetría, inmunoprecipitación, diálisis de equilibrio, inmunoensayo de electroquimioluminiscencia (ECL), inmunohistoquímica, clasificación de células activadas por fluorescencia (FACS) o ensayo de ELISA.
[0118] En algunas formas de realización descritas en este documento la detección de células de cáncer que expresa BCMA en un sujeto pueden usarse para determinar que el sujeto puede ser tratado con un agente terapéutico dirigido contra BCMA.
[0119] BCMA está presente en niveles detectables en muestras de sangre y suero. Por tanto, en el presente documento se proporcionan métodos para detectar BCMA en una muestra derivada de sangre, tal como una muestra de suero, poniendo en contacto la muestra con un anticuerpo, o fragmento de unión a antígeno del mismo, que se une específicamente a BCMA. La muestra de sangre, o un derivado de la misma, puede diluirse, fraccionarse o procesarse de otro modo para producir una muestra sobre la cual se puede realizar el método descrito. En algunas realizaciones, el BCMA puede detectarse en una muestra de sangre, o un derivado de la misma, mediante cualquier número de ensayos conocidos en la técnica, tales como, entre otros, análisis de transferencia Western, radioinmunoensayo, resonancia de plasmón superficial, inmunofluorimetría, inmunoprecipitación, diálisis de equilibrio, inmunodifusión, inmunoensayo de electroquimioluminiscencia (ECL), inmunohistoquímica, clasificación de células activadas por fluorescencia (FACS) o ensayo ELISA.
Métodos para el d iagnóstico del cáncer
[0120] En este documento se proporcionan métodos para diagnosticar el cáncer que expresa BCMA en un sujeto. En algunas realizaciones cáncer que expresa BCMA incluye linfomas, tales como el mieloma múltiple (MM). En algunas realizaciones, como se describió anteriormente, la detección de BCMA en una muestra biológica, tal como una muestra de sangre o una muestra de suero, proporciona la capacidad de diagnosticar cáncer en el sujeto del que se obtuvo la muestra. Alternativamente, en algunas realizaciones, también se pueden usar otras muestras tales como una muestra histológica, una muestra de aspiración con aguja fina, tejido tumoral resecado, células circulantes, células tumorales circulantes y similares, para evaluar si el sujeto del que se obtuvo la muestra tiene cáncer. En algunas realizaciones, es posible que ya se sepa que el sujeto del que se obtuvo la muestra tiene cáncer, pero es posible que el tipo de cáncer que afecta al sujeto aún no se haya diagnosticado o que un diagnóstico preliminar no esté claro, detectando así BCMA en una muestra biológica obtenida del sujeto puede permitir, o aclarar, el diagnóstico del cáncer. Por ejemplo, se puede saber que un sujeto tiene cáncer, pero es posible que no se sepa, o que no esté claro, si el cáncer del sujeto expresa BCMA.
[0121] En algunas realizaciones, los métodos descritos implican evaluar si un sujeto padece cáncer que expresa BCMA determinando la cantidad de BCMA que está presente en una muestra biológica derivada del sujeto; y comparar la cantidad observada de BCMA con la cantidad de BCMA en una muestra de control o referencia, en donde una diferencia entre la cantidad de BCMA en la muestra derivada del sujeto y la cantidad de BCMA en la muestra de control o referencia es una indicación de que el sujeto está afectado por un cáncer que expresa BCMA. En otra realización, la cantidad de BCMA observada en una muestra biológica obtenida de un sujeto puede compararse con los niveles de BCMA que se sabe están asociados con ciertas formas o estadios de cáncer, para determinar la forma o estadio del cáncer del sujeto. En algunas realizaciones, la cantidad de BCMA en la muestra derivada del sujeto se evalúa poniendo en contacto la muestra con un anticuerpo, o un fragmento de unión a antígeno del mismo, que se une inmunoespecíficamente a BCMA, tal como los anticuerpos específicos de BCMA descritos en este documento. La muestra evaluada para detectar la presencia de BCMA puede derivarse de orina, sangre, suero, plasma, saliva, ascitis, células circulantes, células tumorales circulantes, células que no están asociadas al tejido (es decir, células libres), tejidos (p. ej., tejido tumoral resecado quirúrgicamente, biopsias, incluida la aspiración con aguja fina), preparaciones histológicas y similares. En algunas realizaciones, el cáncer que expresa BCMa incluye cáncer hematológico, como mieloma múltiple (MM). En algunas realizaciones, el sujeto es un ser humano.
[0122] En algunas realizaciones, el método de diagnóstico de un cáncer que expresa BCMA implicará: poner en contacto una muestra biológica de un sujeto con un anticuerpo de BCMA específico, o un fragmento de unión a antígeno del mismo (tales como los derivables de los anticuerpos y fragmentos proporcionados en la Tabla 1), cuantificar la cantidad de BCMA presente en la muestra que está unida por el anticuerpo o fragmento de unión al antígeno del mismo, comparando la cantidad de BCMA presente en la muestra con una muestra estándar o de referencia conocida; y determinar si los niveles de BCMA del sujeto se encuentran dentro de los niveles de BCMA asociados con el cáncer. En una realización adicional, el método de diagnóstico se puede seguir con un paso adicional de administrar o prescribir un tratamiento específico del cáncer. En otra realización, el método de diagnóstico se puede seguir con un paso adicional de transmitir los resultados de la determinación para facilitar el tratamiento del cáncer. En algunas realizaciones, el tratamiento específico del cáncer puede dirigirse contra cánceres que expresan BCMA, tales como los anticuerpos multiespecíficos BCMA x CD3 descritos en el presente documento.
[0123] En algunas realizaciones, los métodos descritos implican evaluar si un sujeto padece cáncer que expresa BCMA determinando la cantidad de BCMA presente en una muestra de sangre o suero obtenida del sujeto; y comparar la cantidad observada de BCMA con la cantidad de BCMA en una muestra de control o referencia, en donde una diferencia entre la cantidad de BCMA en la muestra derivada del sujeto y la cantidad de BCMA en la muestra de control o referencia es una indicación de que el sujeto está afectado por un cáncer que expresa BCMA.
[0124] En algunas realizaciones, la muestra de control o de referencia se pueden derivar de un sujeto que no está aquejado de cáncer que expresa BCMA. En algunas realizaciones, la muestra de control o de referencia puede derivarse de un sujeto que padece cáncer que expresa BCMA. En algunas realizaciones en las que la muestra de control o de referencia se deriva de un sujeto que no padece cáncer que expresa BCMA, un aumento observado en la cantidad de BCMA presente en la muestra de prueba, en relación con la observada para la muestra de control o de referencia, es una indicación de que el sujeto que está siendo evaluado padece cáncer que expresa BCMA. En algunas realizaciones en las que la muestra de control se deriva de un sujeto que no padece cáncer que expresa BCMA, se observa una disminución o similitud en la cantidad de BCMA presente en la muestra de prueba, en relación con la observada para la muestra de control o de referencia, es una indicación de que el sujeto que se está evaluando no padece cáncer que exprese BCMA. En algunas realizaciones en las que la muestra de control o de referencia se deriva de un sujeto que padece cáncer que expresa BCMA, una similitud observada en la cantidad de BCMA presente en la muestra de prueba, en relación con la observada para la muestra de control o de referencia, es una indicación de que el sujeto que está siendo evaluado padece cáncer que expresa BCMA. En algunas realizaciones en las que la muestra de control o de referencia se deriva de un sujeto que padece cáncer que expresa BCMA, una disminución observada en la cantidad de BCMA presente en la muestra de prueba, en relación con la observada para la muestra de control o de referencia, es una indicación de que el sujeto que se está evaluando no padece cáncer que exprese BCMA.
[0125] En algunas realizaciones la cantidad de BCMA en la muestra derivada del sujeto se evalúa poniendo en contacto la muestra con un anticuerpo, o un fragmento de unión a antígeno del mismo, que se une específicamente BCMA, tales como los anticuerpos descritos en este documento. La muestra evaluada para la presencia de BCMA puede derivarse de una muestra de sangre, una muestra de suero, células circulantes, células tumorales circulantes, células que no están asociadas al tejido (es decir, células libres), tejidos (p. ej., tejido tumoral resecado quirúrgicamente, biopsias, incluida la aspiración con aguja fina), preparaciones histológicas y similares.
[0126] En varios aspectos, la cantidad de BCMA se determina poniendo en contacto la muestra con un anticuerpo, o fragmento de unión a antígeno del mismo, que se une específicamente a BCMA. En algunas realizaciones, la muestra puede ponerse en contacto con más de un tipo de anticuerpo, o fragmento de unión a antígeno del mismo, que se une específicamente a BCMA. En algunas realizaciones, la muestra puede ponerse en contacto con un primer anticuerpo, o un fragmento de unión a antígeno del mismo, que se une específicamente a BCMA y luego se puede poner en contacto con un segundo anticuerpo, o fragmento de unión a antígeno del mismo, que se une específicamente a BCMA. Los anticuerpos específicos de BCMA o los fragmentos de unión a antígeno tales como los descritos en el presente documento pueden usarse en esta capacidad.
[0127] Varias combinaciones de los anticuerpos específicos a BCMA y fragmentos de unión a antígeno se pueden utilizar para proporcionar un "primer" y "segundo" anticuerpo o fragmento de unión a antígeno para llevar a cabo los métodos de diagnóstico descritos. En algunas realizaciones, el cáncer que expresa BCMA incluye linfomas, tales como mieloma múltiple (MM).
[0128] En ciertas realizaciones, la cantidad de BCMA se determina por análisis de transferencia de Western, radioinmunoensayo, inmunofluorimetría, inmunoprecipitación, diálisis de equilibrio, la clasificación de inmunodifusión, electroquimioluminiscencia (ECL) inmunoensayo, inmunohistoquímica, células activadas por fluorescencia (FACS) o ensayo ELISA.
[0129] En diversas realizaciones de los métodos de diagnóstico descritos se utiliza una muestra de control o de referencia. Esta muestra puede ser un control de ensayo positivo o negativo que garantiza que el ensayo utilizado funcione correctamente; por ejemplo, un control de ensayo de esta naturaleza podría usarse comúnmente para ensayos de inmunohistoquímica. Alternativamente, la muestra puede ser una referencia estandarizada para la cantidad de BCMA en una muestra biológica de un sujeto sano. En algunas realizaciones, los niveles de BCMA observados del sujeto analizado pueden compararse con los niveles de BCMA observados en muestras de sujetos que se sabe que tienen cáncer que expresa BCMA. En algunas realizaciones, el sujeto de control puede estar afectado por un cáncer de interés particular. En algunas realizaciones, se sabe que el sujeto de control tiene un cáncer en estadio temprano, que puede ser o no un cáncer que expresa BCMA. En algunas realizaciones, se sabe que el sujeto de control tiene un cáncer en etapa intermedia, que puede ser o no un cáncer que exprese BCMA. En algunas realizaciones, se sabe que el sujeto de control tiene una etapa tardía, que puede ser o no un cáncer que expresa BCMA.
Métodos de seguim iento de cáncer
[0130] En este documento se proporcionan métodos para el seguimiento de cáncer que expresa BCMA en un sujeto En algunas realizaciones el cáncer que expresa BCMa incluye linfomas, tales como el mieloma múltiple (MM). En algunas realizaciones, los métodos descritos implican evaluar si el cáncer que expresa BCMA está progresando, retrocediendo o permaneciendo estable mediante la determinación de la cantidad de BCMA que está presente en una muestra de prueba derivada del sujeto; y comparar la cantidad observada de BCMA con la cantidad de BCMA en una muestra biológica obtenida, de manera similar, del sujeto en un momento anterior, en donde una diferencia entre la cantidad de BCMA en la muestra de prueba y la muestra anterior proporciona una indicación de si el cáncer está progresando, retrocediendo o permaneciendo estable. En este sentido, una muestra de prueba con una mayor cantidad de BCMA, en relación con la cantidad observada para la muestra anterior, puede indicar la progresión de un cáncer que expresa BCMA. Por el contrario, una muestra de prueba con una cantidad disminuida de BCMA, en relación con la cantidad observada para la muestra anterior, puede indicar una regresión de un cáncer que expresa BCMA.
[0131] Por consiguiente, una muestra de prueba con una diferencia insignificante en la cantidad de BCMA, en relación con la cantidad observada para la muestra anterior, puede indicar un estado de enfermedad estable para un cáncer que expresa BCMA. En algunas realizaciones, la cantidad de BCMA en una muestra biológica derivada del sujeto se evalúa poniendo en contacto la muestra con un anticuerpo, o un fragmento de anticuerpo del mismo, que se une específicamente a BCMA, como los anticuerpos descritos en el presente documento. La muestra evaluada para detectar la presencia de BCMA puede derivarse de orina, sangre, suero, plasma, saliva, ascitis, células circulantes, células tumorales circulantes, células que no están asociadas al tejido (es decir, células libres), tejidos (p. ej., tejido tumoral resecado quirúrgicamente, biopsias, incluida la aspiración con aguja fina), preparaciones histológicas y similares. En algunas realizaciones, el sujeto es un ser humano.
[0132] En algunas realizaciones, los métodos de seguimiento de un cáncer que expresa BCMA implicarán: poner en contacto una muestra biológica de un sujeto con un anticuerpo específico a BCMA, o un fragmento de unión a antígeno del mismo (como los derivados de los anticuerpos y fragmentos proporcionados en la Tabla 1), cuantificando la cantidad de BCMA presente en la muestra, comparando la cantidad de BCMA presente en la muestra con la cantidad de BCMA determinada en una muestra biológica obtenida, de manera similar, del mismo sujeto en un momento anterior; y determinar si el nivel de BCMA del sujeto ha cambiado con el tiempo. Una muestra de prueba con una mayor cantidad de BCMA, en relación con la cantidad observada para la muestra anterior, puede indicar la progresión del cáncer. Por el contrario, una muestra de prueba con una cantidad disminuida de BCMA, en relación con la cantidad observada para la muestra anterior, puede indicar una regresión de un cáncer que expresa BCMA. Por consiguiente, una muestra de prueba con una diferencia insignificante en la cantidad de BCMA, en relación con la cantidad observada para la muestra anterior, puede indicar un estado de enfermedad estable para un cáncer que expresa BCMA. En algunas realizaciones, los niveles de BCMA de la muestra pueden compararse con un patrón conocido o una muestra de referencia, solo o además de los niveles de BCMA observados para una muestra evaluada en un momento anterior. En una realización adicional, el método de diagnóstico se puede seguir con un paso adicional de administrar un tratamiento específico del cáncer. En algunas realizaciones, el tratamiento específico del cáncer puede dirigirse contra los cánceres que expresan BCMA, tales como los anticuerpos multiespecíficos BCMA x CD3 descritos en este documento.
[0133] En varios aspectos, la cantidad de BCMA se determina poniendo en contacto la muestra con un anticuerpo, o fragmento de unión a antígeno del mismo, que se une específicamente a BCMA. En algunas realizaciones, la muestra puede ponerse en contacto con más de un tipo de anticuerpo, o fragmento de unión a antígeno del mismo, que se une específicamente a BCMA. En algunas realizaciones, la muestra puede ponerse en contacto con un primer anticuerpo, o un fragmento de unión a antígeno del mismo, que se une específicamente a BCMA y luego se puede poner en contacto con un segundo anticuerpo, o fragmento de unión a antígeno del mismo, que se une específicamente a BCMA. Los anticuerpos como los descritos en este documento pueden usarse en esta capacidad.
[0134] Pueden usarse diversas combinaciones de los anticuerpos y fragmentos de unión a antígeno descritos en la Tabla 1 para proporcionar un "primer" y "segundo" anticuerpo o fragmento de unión a antígeno para llevar a cabo los métodos de control descritos. En algunas realizaciones, el cáncer que expresa BCMA incluye un cáncer hematológico, como la leucemia mieloide aguda (AML).
[0135] En ciertas realizaciones, la cantidad de BCMA se determina por análisis de transferencia de Western, radioinmunoensayo, inmunofluorimetría, inmunoprecipitación, diálisis de equilibrio, la clasificación de inmunodifusión, inmunoensayo de electroquimioluminiscencia (ECL), inmunohistoquímica, células activadas por fluorescencia (FACS) o ensayo ELISA.
Kits para detectar BCMA
[0136] En este documento se proporcionan kits para la detección de BCMA en una muestra biológica. Estos kits incluyen uno o más de los anticuerpos específicos de BCMA descritos en el presente documento, o un fragmento de unión a antígeno del mismo, e instrucciones de uso del kit.
[0137] El anticuerpo específico a BCMA proporcionado, o un fragmento de unión a antígeno, puede estar en solución; liofilizado; fijado a un sustrato, soporte o placa; o marcado de forma detectable.
[0138] Los kits descritos también pueden incluir componentes adicionales útiles para realizar los métodos descritos en este documento. A modo de ejemplo, los kits pueden comprender medios para obtener una muestra de un sujeto, una muestra de control o de referencia, por ejemplo, una muestra de un sujeto que tiene un cáncer de progresión lenta y/o un sujeto que no tiene cáncer, uno o más compartimentos de muestra, y/o material instructivo que describe el desempeño de un método de divulgación y controles o estándares específicos de tejido.
[0139] Los medios para determinar el nivel de BCMA pueden incluir además, por ejemplo, tampones u otros reactivos para su uso en un ensayo para determinar el nivel de BCMA. Las instrucciones pueden ser, por ejemplo, instrucciones impresas para realizar el ensayo y/o instrucciones para evaluar el nivel de expresión de BCMA.
[0140] Los kits descritos pueden incluir también medios para aislar una muestra de un sujeto. Estos medios pueden comprender uno o más elementos de equipo o reactivos que se pueden usar para obtener un fluido o tejido de un sujeto. Los medios para obtener una muestra de un sujeto también pueden comprender medios para aislar componentes sanguíneos, tales como suero, de una muestra de sangre. Preferiblemente, el kit está diseñado para su uso con un sujeto humano.
Anticuerpos multiespecíficos
[0141] Los dominios de unión de los anticuerpos anti-BCMA descritos en este documento reconocen células que expresan BCMA en su superficie. Como se señaló anteriormente, la expresión de BCMA puede ser indicativa de una célula cancerosa. Se puede lograr una dirección más específica a subconjuntos particulares de células haciendo moléculas biespecíficas, como anticuerpos o fragmentos de anticuerpos, que se unen a BCMA y a otra diana, como CD3. Esto se logra haciendo una molécula que comprende una primera región que se une al BCMA y una segunda región que se une al otro antígeno diana. Las regiones de unión al antígeno pueden tomar cualquier forma que permita el reconocimiento específico de la diana, por ejemplo, la región de unión puede ser o puede incluir un dominio variable de cadena pesada, un Fv (combinación de un dominio variable de cadena pesada y un dominio variable de cadena ligera), un dominio de unión basado en un dominio de fibronectina tipo III (como de fibronectina, o basado en un consenso de los dominios de tipo III de fibronectina, o de tenascina o basado en un consenso de los dominios de tipo III de tenascina, como moléculas Centyrin de Janssen Biotech, Inc., véanse, por ejemplo, los documentos WO2010/051274 y WO2010/093627). Por consiguiente, se proporcionan moléculas biespecíficas que comprenden dos regiones de unión a antígeno diferentes que se unen a BCMA y otro antígeno, respectivamente.
[0142] Algunos de los anticuerpos multiespecíficos descritos en este documento comprenden dos regiones diferentes de unión a antígeno que se unen BCMA y CD3, respectivamente. En realizaciones preferidas, se proporcionan anticuerpos multiespecíficos que se unen a BCMA y CD3 (anticuerpos multiespecíficos BCMA x CD3) y sus fragmentos de unión a antígeno multiespecíficos. En algunas realizaciones, el anticuerpo multiespecífico BCMA x CD3 comprende una primera cadena pesada (HC1) y una primera cadena ligera (LC1) que se emparejan para formar un primer sitio de unión al antígeno que se une inmunoespecíficamente a BCMA y una segunda cadena pesada (HC2) y una segunda cadena ligera (LC2) que se emparejan para formar un segundo sitio de unión al antígeno que se une inmunoespecíficamente a CD3. En realizaciones preferidas, el anticuerpo multiespecífico BCMA x CD3 es un anticuerpo biespecífico que comprende un brazo específico de BCMA que comprende una primera cadena pesada (HC1) y una primera cadena ligera (LC1) que se emparejan para formar un primer sitio de unión al antígeno que se une inmunoespecíficamente CD3 y un brazo específico de CD3 que comprende una segunda cadena pesada (HC2) y una segunda cadena ligera (LC2) que se emparejan para formar un segundo sitio de unión al antígeno que se une inmunoespecíficamente a BCMA. En algunas realizaciones, los anticuerpos biespecíficos de la invención incluyen anticuerpos que tienen una estructura de anticuerpo de longitud completa. "Anticuerpo de longitud completa" como se usa en este documento se refiere a un anticuerpo que tiene dos cadenas pesadas de anticuerpo de longitud completa y dos cadenas ligeras de anticuerpo de longitud completa. Una cadena pesada (CP) de anticuerpo de longitud completa incluye dominios variables y constantes de cadena pesada VH, CHI, CH2 y CH3. Una cadena ligera (CL) de anticuerpo de longitud completa incluye dominios variables y constantes de cadena ligera VL y CL. El anticuerpo de longitud completa puede carecer de lisina C terminal (K) en una o ambas cadenas pesadas. El término "brazo Fab" o "media molécula" se refiere a un par de cadenas ligeras de cadena pesada que se une específicamente a un antígeno. En algunas realizaciones, uno de los dominios de unión a antígeno es un dominio de unión no basado en anticuerpos, por ejemplo, un dominio de unión basado en un dominio de fibronectina tipo 3, por ejemplo Centyrin.
[0143] El brazo de unión a BCMA de los anticuerpos multiespecíficos proporcionados en este documento pueden derivarse de cualquiera de los anticuerpos específicos a BCMA descritos anteriormente. En algunas realizaciones ejemplares de tales brazos de unión a BCMA, la primera región de unión a antígeno que se une a BCMA comprende una CDR1, CDR2 y CDR3 de cadena pesada derivada de un clon de anticuerpo como se describe en la Tabla 1. En algunas realizaciones ejemplares de tales brazos de unión a BCMA, la primera región de unión al antígeno que se une a BCMA comprende c Dr 1, CDR2 y CDR3 de cadena pesada y CDR1, CDR2 y CDR3 de cadena ligera derivadas de un clon de anticuerpo como se describe en la Tabla 1. En algunas realizaciones ejemplares de tales brazos de unión a BCMA, la primera región de unión a antígeno que se une a BCMA que comprende CDR1, CDR2 y CDR3 de cadena pesada del clon BCMB69, BCMB117, BCMB123, BCMB128, BCMB129, BCMB176 o BCMB177. En algunas realizaciones ejemplares de dichos brazos de unión a BCMA, la primera región de unión a antígeno que se une a BCMA comprende CDR1, CDR2 y CDR3 de cadena pesada y CDR1, CDR2 y CDR3 de cadena ligera del clon BCMB69, BCMB117, BCMB123, BCMB128, BCMB129, BCMB176 o BCMB177. En algunas realizaciones ejemplares de tales brazos de unión a BCMA, la primera región de unión a antígeno que se une a BCMA comprende un dominio variable de cadena pesada derivado de un clon de anticuerpo como se describe en la Tabla 1. En algunas realizaciones ejemplares de tales brazos de unión a BCMA, la primera región de unión a antígeno que se une a BCMA comprende un dominio variable de cadena pesada y un dominio variable de cadena ligera derivado de un clon de anticuerpo como se describe en la Tabla 1. En algunas realizaciones ejemplares de tales brazos de unión a BCMA, la primera región de unión a antígeno que se une a BCMA comprende el dominio variable de cadena del clon BCMB69, BCMB117, BCMB123, BCMB128, BCMB129, BCMB176 o BCMB177. En algunas realizaciones ejemplares de dichos brazos de unión a BCMA, la primera región de unión a antígeno que se une a BCMA comprende dominio variable de cadena pesada y dominio variable de cadena ligera del clon BCMB69, BCMB117, BCMB123, BCMB128, BCMB129, BCMB176 o BCMB177.
La Tabla 3 proporciona una lista de anticuerpos biespecíficos BCMA x CD3 que tienen un par de cadena pesada y ligera específico para BCMA y otro par de cadena pesada y ligera específico para CD3, donde se enumera el ID de anticuerpo particular para describir los brazos de anticuerpos específicos de antígeno utilizados para producir el modo de realización descrito.
Tabla 3:
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[0144] En algunas realizaciones de los anticuerpos biespecíficos, el brazo de unión a BCMA también se une BCMA cynomolgus, preferiblemente el dominio extracelular del mismo.
[0145] En algunas realizaciones, el brazo de unión a BCMA del anticuerpo multiespecífico es IgG, o un derivado del mismo, por ejemplo, isotipos IgG1, IgG2, IgG3, y IgG4. En algunas realizaciones en las que el brazo de unión a BCMA tiene un isotipo IgG4, contiene sustituciones S228P, L234A y L235A en su región Fc.
[0146] En algunas realizaciones de los anticuerpos biespecíficos, el segundo de unión a antígeno se une brazo CD3 humano. En algunas realizaciones preferidas, el brazo específico de CD3 del anticuerpo biespecífico BCMA x CD3 se deriva de un anticuerpo específico de CD3 que se une y activa las células T primarias humanas y/o las células T primarias de mono cynomolgus. En algunas realizaciones, el brazo de unión a CD3 se une a un epítopo en el extremo N de CD3s. En algunas realizaciones, el brazo de unión a CD3 contacta con un epítopo que incluye los seis aminoácidos N-terminales de CD3e. En algunas realizaciones, el brazo de unión específico de CD3 del anticuerpo biespecífico se deriva del anticuerpo monoclonal de ratón SP34, un isotipo IgG3/lambda de ratón. En algunas realizaciones, el brazo de unión a CD3 comprende las CDR del anticuerpo SP34. Tales brazos CD3 de unión pueden unirse a CD3 con una afinidad de 5x10-7 M o menos, tal como 1x10-7 M o menos, 5x10-8 M o menos, 1x10-8 M o menos, 5x10-9 M o menos, o 1x10-9 M o menos. El brazo de unión específico de CD3 puede ser una versión humanizada de un brazo del anticuerpo monoclonal de ratón SP34. La adaptación del marco humano (HFA) se puede utilizar para humanizar el anticuerpo anti-CD3 del que se deriva el brazo específico de CD3. En algunas realizaciones de los anticuerpos biespecíficos, el brazo de unión a CD3 comprende un par de cadena pesada y cadena ligera seleccionados de la Tabla 2. En otras realizaciones de los anticuerpos biespecíficos, el brazo de unión a CD3 comprende CDR1, CDR2 y CDR3 de cadena pesada y secuencias de CDR1, CDR2 y CDR3 de cadena que se muestran en la Tabla 2. Por ejemplo, las secuencias de CDR de cadena pesada y cadena ligera de algunas realizaciones del brazo de unión a CD3 de los anticuerpos biespecíficos descritos en este documento pueden incluir las siguientes secuencias de aminoácidos: Cp CDR1, SEQ ID NO: 59; Cp CDR2: SEQ ID NO: 60; Cp CDR3, SEQ ID NO: 61; Cl CDR1, SEQ ID NO: 62; Cl CDR2: SEQ ID NO: 63; y Cl CDR3, SEQ ID NO: 64.
[0147] En algunas realizaciones, el brazo de unión a CD3 es IgG, o un derivado del mismo. En algunas realizaciones, el brazo de unión a CD3 es IgG1, IgG2, IgG3 o IgG4. En algunas realizaciones en las que el brazo de unión a CD3 tiene un isotipo IgG4, contiene sustituciones de S228P, L234A, L235A, F405L y R409K en su región Fc. En algunas realizaciones, los anticuerpos o fragmentos de unión a antígeno se unen a CD3s en células T humanas primarias. En algunas realizaciones, los anticuerpos o fragmentos de unión a antígeno se unen a CD3s en células T de cynomolgus primarias. En algunas realizaciones, los anticuerpos o fragmentos de unión a antígeno se unen a CD3s en células T humanas primarias y de cynomolgus. En algunas realizaciones, los anticuerpos o fragmentos de unión a antígeno activan células T CD4+ humanas primarias. En algunas realizaciones, los anticuerpos o fragmentos de unión a antígeno activan células T CD4+ de cinomolgus primarias.
[0148] En algunas realizaciones se proporciona un anticuerpo biespecífico BCMA x CD3 que tiene un brazo de unión a Bc Ma que comprende una cadena pesada de clon de anticuerpo BCMB69, BCMB117, BCMB123, BCMB128, BCMB129, BCMB176, o BCMB177. En algunas realizaciones se proporciona un anticuerpo biespecífico BCMA x CD3 que tiene un brazo de unión a BCMA que comprende una cadena pesada y una cadena ligera del clon de anticuerpo BCMB69, BCMB117, BCMB123, BCMB128, BCMB129, BCMB176 o BCMB177. En algunas realizaciones, se proporciona un anticuerpo biespecífico BCMA x CD3 que tiene un brazo de unión a CD3 que comprende una cadena pesada del clon de anticuerpo CD3B219. En algunas realizaciones se proporciona un anticuerpo biespecífico BCMA x CD3 que tiene un brazo de unión a CD3 que comprende una cadena pesada y una cadena ligera del clon de anticuerpo CD3B219. En algunas realizaciones, se proporciona un anticuerpo biespecífico BCMA x CD3 que tiene un brazo de unión a BCMA que comprende una cadena pesada del clon de anticuerpo BCMB69, BCMB117, BCMB123, BCMB128, BCMB129, b Cm B176 o BCMB177 y un brazo de unión a CD3 que comprende una cadena pesada de anticuerpo clon CD3B219. En algunas realizaciones se proporciona un anticuerpo biespecífico BCMA x CD3 que tiene un brazo de unión a BCMA que comprende una cadena pesada y una cadena ligera del clon de anticuerpo BCMB69, BCMB117, BCMB123, BCMB128, BCMB129, BCMB176 o BCMB177 y un brazo de unión a CD3 que comprende una cadena y cadena ligera del clon de anticuerpo CD3B219.
[0149] Un ejemplo de anticuerpo biespecífico BCMA x CD3 se proporciona en las Tablas 9.
[0150] Diferentes formatos de anticuerpos biespecíficos se han descrito y han sido recientemente revisados por Chames y Baty (2009) Curr Opin Drogas Disc Dev 12: 276.
[0151] En algunas realizaciones, el anticuerpo biespecífico de la presente invención es un diacuerpo, un anticuerpo cruzado o un anticuerpo biespecífico obtenido mediante un intercambio controlado de brazos Fab como los descritos en la presente invención.
[0152] En algunas realizaciones, los anticuerpos biespecíficos incluyen moléculas similares a IgG con dominios CH3 complementarios para forzar la heterodimerización; moléculas de direccionamiento dual de tipo IgG recombinante, en las que los dos lados de la molécula contienen cada uno el fragmento Fab o parte del fragmento Fab de al menos dos anticuerpos diferentes; moléculas de fusión de IgG, en las que los anticuerpos IgG de longitud completa se fusionan con un fragmento Fab adicional o partes del fragmento Fab; moléculas de fusión Fc, en las que las moléculas Fv de cadena sencilla o los diacuerpos estabilizados se fusionan con dominios constantes de cadena pesada, regiones Fc o partes de los mismos; moléculas de fusión Fab, en las que se fusionan diferentes fragmentos Fab; anticuerpos basados en scFv y diacuerpos y de cadena pesada (por ejemplo, anticuerpos de dominio, nanocuerpos) en los que diferentes moléculas de Fv de cadena sencilla o diferentes diacuerpos o diferentes anticuerpos de cadena pesada (por ejemplo, anticuerpos de dominio, nanocuerpos) se fusionan entre sí o con otra proteína o molécula portadora.
[0153] En algunas realizaciones, moléculas de tipo IgG con moléculas de dominios CH3 complementarios incluyen la Triomab/cuadroma (Trion Pharma/Fresenius Biotech), el (Genentech) perillas en huecos, CrossMAbs (Roche) y el emparejado electrostáticamente (Amgen), LUZ-Y (Genentech), Strand Exchange Engineered Domain body (SEEDbody) (EMD Serono), Biclonic (Merus) y DuoBody® (Genmab A/S).
[0154] En algunas realizaciones, moléculas de tipo IgG duales de focalización recombinantes incluyen Dual Targeting (DT)-Ig (GSK/Domantis), Antibody dos en uno (Genentech), Mabs reticulado (Centro de Cáncer Karmanos), mAb2 (F-Star) y cuerpo CovX (CovX/Pfizer).
[0155] En algunas realizaciones, las moléculas de fusión de IgG incluyen el Variable Dual Domain (DVD)-Ig (Abbott), biespecíficos de tipo IgG (InnClone/Eli Lilly), Ts2Ab (MedImmune/AZ) y BsAb (Zymogenetics), HERCULES (Biogen Idec) y TvAb (Roche).
[0156] En algunas realizaciones, las moléculas de fusión de Fc incluyen a fusiones ScFv/Fc (Institución Académica), Sc ORPION (Emergent BioSolutions/Trubion, Zymogenetics/BMS), Dual Affinity Retargeting Technology (Fc-DART) (MacroGenics) y Dual(ScFv).sub.2-Fab (Centro Nacional de Investigación de Medicina de Anticuerpos - China).
[0157] En algunas realizaciones, anticuerpos biespecíficos de fusión Fab incluyen F(ab)2 (Medarex/AMGEN), doble acción o BisFab (Genentech), Dock-y-Lock (DNL) (Immunomedics), biespecíficos bivalentes (Biotecnol) y Fab-Fv (UCB-Celltech). Los anticuerpos de dominio, basados en diacuerpo y scFv incluyen, entre otros, el Bispecific T Cell Engager (BITE) (Micromet), Diacuerpo en tándem (Tandab) (Affimed), Tecnología de retargeting de afinidad dual (DART) (MacroGenics), Diacuerpo de cadena simple (Académico), Anticuerpos similares a TCR (AIT, ReceptorLogics), Fusión de ScFv de albúmina de suero humano (Merrimack) y COMBODY (Epigen Biotech), nanocuerpos de doble diana (Ablynx), anticuerpos de dominio de cadena pesada de doble diana.
[0158] Anticuerpos biespecíficos de longitud completa de la invención pueden ser generados por ejemplo usando intercambio de brazo Fab (o intercambio de media molécula) entre dos anticuerpos bivalentes mono específicos mediante la introducción de sustituciones en la interfaz CH3 de cadena pesada en cada media molécula para favorecer la formación de heterodímeros de dos semimoléculas de anticuerpos que tienen una especificidad distinta, ya sea in vitro en un entorno libre de células o utilizando la coexpresión. La reacción de intercambio de brazos Fab es el resultado de una reacción de isomerización de enlaces disulfuro y asociación de disociación de dominios CH3. Se reducen los enlaces disulfuro de cadena pesada en las regiones de bisagra de los anticuerpos monoespecíficos parentales. Las cisteínas libres resultantes de uno de los anticuerpos monoespecíficos parentales forman un enlace disulfuro entre cadenas pesadas con residuos de cisteína de una segunda molécula de anticuerpo monoespecífico parental y simultáneamente los dominios CH3 de los anticuerpos parentales se liberan y reforman por asociación de disociación. Los dominios CH3 de los brazos Fab pueden diseñarse para favorecer la heterodimerización sobre la homodimerización. El producto resultante es un anticuerpo biespecífico que tiene dos brazos Fab o medias moléculas, cada una de las cuales se une a un epítopo distinto, es decir, un epítopo en BCMA y un epítopo en CD3.
[0159] "Homodimerización", como se usa en este documento, se refiere a una interacción de dos cadenas pesadas que tienen secuencias de aminoácidos CH3 idénticas. "Homodímero", como se usa en este documento, se refiere a un anticuerpo que tiene dos cadenas pesadas con secuencias de aminoácidos CH3 idénticas.
[0160] "Heterodimerización", como se usa en este documento, se refiere a una interacción de dos cadenas pesadas que tienen secuencias de aminoácidos de CH3 no idénticas. "Heterodímero", como se usa en este documento, se refiere a un anticuerpo que tiene dos cadenas pesadas con secuencias de aminoácidos de CH3 no idénticas.
[0161] La estrategia de "mando en hueco" (véase, por ejemplo, PCT Inti. Publ. N° WO 2006/028936) puede ser utilizada para generar anticuerpos biespecíficos de longitud completa. Brevemente, los aminoácidos seleccionados que forman la interfaz de los dominios CH3 en IgG humana se pueden mutar en posiciones que afectan las interacciones del dominio CH3 para promover la formación de heterodímeros. Se introduce un aminoácido con una cadena lateral pequeña (agujero) en una cadena pesada de un anticuerpo que se une específicamente a un primer antígeno y un aminoácido con una cadena lateral grande (botón) se introduce en una cadena pesada de un anticuerpo que se une específicamente a un segundo antígeno. Después de la coexpresión de los dos anticuerpos, se forma un heterodímero como resultado de la interacción preferencial de la cadena pesada con un "agujero" con la cadena pesada con un "botón". Los pares de sustitución de CH3 ejemplares que forman un botón y un agujero son (expresados como posición modificada en el primer dominio CH3 de la primera cadena pesada/posición modificada en el segundo dominio CH3 de la segunda cadena pesada): T366Y/F405A, T366W/F405W, F405W/Y407A, T394W/Y407T, T394S/Y407A, T366W/T394S, F405W/T394S y T366W/T366S_L368A_Y407V.
[0162] Otras estrategias como la promoción de la heterodimerización de la cadena pesada usando interacciones electrostáticas mediante la sustitución de residuos cargados positivamente en una superficie CH3 y residuos cargados negativamente en una segunda superficie CH3 pueden ser utilizados, como se describe en la Publ. de Patente de EE.UU. N° US2010/0015133; Publ. de Patente de EE.UU. N° US2009/0182127; Publ. de Patente de EE.UU. N° US2010/028637 o Publ. de Patente de EE.UU. N° US2011/0123532. En otras estrategias, la heterodimerización puede promoverse mediante las siguientes sustituciones (expresadas como posición modificada en el primer dominio CH3 de la primera cadena pesada/posición modificada en el segundo dominio CH3 de la segunda cadena pesada): L351Y_F405AY407V/T394W, T366I_K392M_T394W/F405A_Y407V, T366L_K392M_T394W/F405A_Y407V, L351Y_Y407A/T366A_K409F, L351Y_Y407A/T366V K409F Y407A/T366A_K409F, o T350V_L351Y_F405A Y407V/T350V_T366L_K392L_T394W como se describe en la Publ. de Patente de EE.UU. N° US2012/0149876 o la Publ. de Patente de EE.UU. N° US2013/0195849.
[0163] Además de los métodos descritos anteriormente, los anticuerpos biespecíficos de la invención pueden ser generados in vitro en un medio ambiente libre de células mediante la introducción de mutaciones asimétricas en las regiones CH3 de dos anticuerpos homodiméricos mono específicos y formando el anticuerpo heterodimérico biespecífico a partir de dos anticuerpos homodiméricos monoespecíficos parentales en condiciones reductoras para permitir la isomerización del enlace disulfuro de acuerdo con los métodos descritos en Publ. de Pat. Int. N° WO2011/131746. En los métodos, el primer anticuerpo bivalente monoespecífico (p. ej., anticuerpo anti-BCMA) y el segundo anticuerpo bivalente monoespecífico (p. ej., anticuerpo anti-CD3) se diseñan para tener ciertas sustituciones en el dominio CH3 que promueven la estabilidad del heterodímero; los anticuerpos se incuban juntos en condiciones reductoras suficientes para permitir que las cisteínas de la región bisagra experimenten la isomerización del enlace disulfuro; generando de ese modo el anticuerpo biespecífico mediante intercambio de brazo Fab. Las condiciones de incubación pueden restaurarse óptimamente a condiciones no reductoras. Ejemplos de agentes reductores que pueden usarse son 2-mercaptoetilamina (2-MEA), ditiotreitol (DTT), ditioeritritol (DTE), glutatión, tris(2-carboxietilo)fosfina (TCEP), L-cisteína y beta-mercaptoetanol, preferiblemente un agente reductor seleccionado del grupo que consiste en: 2-mercaptoetilamina, ditiotreitol y tris(2-carboxietilo)fosfina. Por ejemplo, puede usarse incubación durante al menos 90 min a una temperatura de al menos 20°C en presencia de al menos 25 mM 2-MEA o en presencia de al menos 0,5 mM ditiotreitol a un pH de 5-8, por ejemplo a un pH de 7,0 o un pH de 7,4.
[0164] Además de los anticuerpos multiespecíficos BCMA x CD3 descritos, también se proporcionan secuencias de polinucleótidos capaces de codificar los anticuerpos multiespecíficos BCMA x CD3. También se proporcionan los vectores que comprenden los polinucleótidos descritos, así como las células que expresan los anticuerpos multiespecíficos BCMA x CD3 proporcionados en el presente documento. También se describen células capaces de expresar los vectores descritos. Estas células pueden ser células de mamífero (como células 293F, células CHO), células de insectos (como células Sf7), células de levadura, células vegetales o células bacterianas (como E. coli). Los anticuerpos descritos también pueden ser producidos por células de hibridoma.
Composición terapéutica y los métodos de tratamiento que utilizan anticuerpos m ultiespecíficos y fragmentos de unión al antígeno m ultiespecífico de los mismos
[0165] Los anticuerpos biespecíficos de BCMA fueron discutidos anteriormente, por ejemplo, los anticuerpos biespecíficos BCMA x CD3 discutidos anteriormente, son útiles en terapia. En particular, los anticuerpos biespecíficos de BCMA son útiles en el tratamiento del cáncer. También se proporcionan en el presente documento composiciones terapéuticas para el tratamiento de un trastorno hiperproliferativo en un mamífero que comprende una cantidad terapéuticamente eficaz de un anticuerpo multiespecífico o un fragmento de unión a antígeno multiespecífico descrito en este documento y un vehículo farmacéuticamente aceptable. En realizaciones preferidas, el anticuerpo multiespecífico es un anticuerpo multiespecífico BCMA x CD3 como se describe en este documento, o un fragmento multiespecífico de unión a antígeno del mismo, y más preferiblemente un anticuerpo biespecífico BCMA x CD3 como se describe en este documento, o un fragmento de unión a antígeno biespecífico BCMA x CD3 del mismo. En una realización, dicha composición farmacéutica es para el tratamiento de un cáncer que expresa BCMA, que incluye (pero no se limita a) los siguientes: cánceres de células B que expresan BCMA, tales como mieloma múltiple (MM); y otros cánceres aún por determinar en los que se expresa BCMA. Los anticuerpos biespecíficos particulares que se pueden usar para tratar el cáncer, como el cáncer hematológico, incluidos los cánceres específicos discutidos anteriormente, incluyen los anticuerpos BCMB69, BCMB117, BCMB123, BCMB128, BCMB129, BCMB176 o BCMB177 o CD3B219. Un ejemplo de un anticuerpo biespecífico útil para tratar el cáncer, como el cáncer hematológico, que incluye estos cánceres específicos, es BCMB72.
[0166] Las composiciones farmacéuticas proporcionadas en la presente invención comprenden: a) una cantidad eficaz de un anticuerpo multiespecífico o fragmento de anticuerpo de la presente invención, y b) un vehículo farmacéuticamente aceptable, que puede ser inerte o fisiológicamente activo. En realizaciones preferidas, el anticuerpo multiespecífico es un anticuerpo multiespecífico BCMA x CD3 como se describe en este documento, o un fragmento multiespecífico de unión a antígeno del mismo, y más preferiblemente un anticuerpo biespecífico BCMA x CD3 como se describe en este documento, o un fragmento de unión a antígeno biespecífico BCMA x CD3 del mismo. Como se usa en el presente documento, el término "vehículos farmacéuticamente aceptables" incluye todos y cada uno de los disolventes, medios de dispersión, revestimientos, agentes antibacterianos y antifúngicos y similares que sean fisiológicamente compatibles. Los ejemplos de vehículos, diluyentes y/o excipientes adecuados incluyen uno o más de agua, solución salina, solución salina tamponada con fosfato, dextrosa, glicerol, etanol y similares, así como cualquier combinación de los mismos. En muchos casos, será preferible incluir agentes isotónicos, como azúcares, polialcoholes o cloruro de sodio en la composición. En particular, los ejemplos relevantes de vehículo adecuado incluyen: (1) solución salina tamponada con fosfato de Dulbecco, pH aproximadamente 7,4, que contiene o no contiene aproximadamente 1 mg/ml a 25 mg/ml de albúmina de suero humano, (2) solución salina al 0,9% (0,9 %). % p/v de cloruro de sodio (NaCl)) y (3) 5% (p/v) de dextrosa; y también puede contener un antioxidante como triptamina y un agente estabilizante como Tween 20®.
[0167] Las composiciones de la presente invención también pueden contener un agente terapéutico adicional, según sea necesario para el trastorno particular que se esté tratando. Preferiblemente, el anticuerpo o fragmento de anticuerpo multiespecífico y el compuesto activo suplementario tendrán actividades complementarias que no se afectan adversamente entre sí. En una realización preferida, el agente terapéutico adicional es citarabina, una antraciclina, dihidrocloruro de histamina o interleucina 2. En una realización preferida, el agente terapéutico adicional es un agente quimioterapéutico. Las composiciones de la invención pueden estar en una variedad de formas. Estas incluyen, por ejemplo, formas de dosificación líquidas, semisólidas y sólidas, pero la forma preferida depende del modo de administración y aplicación terapéutica que se pretenda. Las composiciones típicas preferidas están en forma de soluciones inyectables o infusibles. El modo de administración preferido es parenteral (por ejemplo, intravenoso, intramuscular, intraperinoneal, subcutáneo). En una realización preferida, las composiciones de la invención se administran por vía intravenosa como un bolo o mediante infusión continua durante un período de tiempo. En otra realización preferida, se inyectan por vía intramuscular, subcutánea, intraarticular, intrasinovial, intratumoral, peritumoral, intralesional o perilesional, para ejercer efectos terapéuticos locales así como sistémicos.
[0168] Pueden prepararse composiciones estériles para administración parenteral incorporando el anticuerpo, fragmento de anticuerpo o conjugado de anticuerpo de la presente invención en la cantidad requerida en el disolvente apropiado, seguido de esterilización por microfiltración. Como disolvente o vehículo, se puede utilizar agua, solución salina, solución salina tamponada con fosfato, dextrosa, glicerol, etanol y similares, así como combinaciones de los mismos. En muchos casos, será preferible incluir agentes isotónicos, como azúcares, polialcoholes o cloruro de sodio en la composición. Estas composiciones también pueden contener adyuvantes, en particular agentes humectantes, isotonizantes, emulsionantes, dispersantes y estabilizantes. Las composiciones estériles para administración parenteral también se pueden preparar en forma de composiciones sólidas estériles que se pueden disolver en el momento de su uso en agua estéril o cualquier otro medio estéril inyectable.
[0170] El anticuerpo multiespecífico o fragmento de anticuerpo también puede administrarse por vía oral. Como composiciones sólidas para administración oral, se pueden usar tabletas, píldoras, polvos (cápsulas de gelatina, bolsitas) o gránulos. En estas composiciones, el ingrediente activo según la invención se mezcla con uno o más diluyentes inertes, como almidón, celulosa, sacarosa, lactosa o sílice, bajo una corriente de argón. Estas composiciones también pueden comprender sustancias distintas de los diluyentes, por ejemplo uno o más lubricantes tales como estearato de magnesio o talco, un colorante, un recubrimiento (comprimido recubierto de azúcar) o un glaseado.
[0171] Como composiciones líquidas para administración oral, se pueden utilizar soluciones farmacéuticamente aceptables, suspensiones, emulsiones, jarabes y elixires que contienen diluyentes inertes tales como agua, etanol, glicerol, aceites vegetales o aceite de parafina. Estas composiciones pueden comprender sustancias distintas de los diluyentes, por ejemplo productos humectantes, edulcorantes, espesantes, aromatizantes o estabilizantes.
[0172] Las dosis dependen del efecto deseado, la duración del tratamiento y la vía de administración utilizada; generalmente están entre 5 mg y 1000 mg por día por vía oral para un adulto con dosis unitarias que varían de 1 mg a 250 mg de sustancia activa. En general, el médico determinará la dosis adecuada en función de la edad, el peso y cualquier otro factor específico del sujeto a tratar.
[0173] También se proporcionan aquí métodos para matar una célula BCMA mediante la administración a un paciente en necesidad del mismo de un anticuerpo multiespecífico que se une dichos BCMA y es capaz de reclutar células T para matar dicha célula BCMA+ (es decir, redirección de células T). Cualquiera de los anticuerpos o fragmentos de anticuerpos multiespecíficos de la invención se puede usar terapéuticamente. Por ejemplo, en una realización, el anticuerpo BCMB72 multiespecífico de BCMA x CD3 puede usarse terapéuticamente para tratar el cáncer en un sujeto.
[0174] En una realización preferida, se usan anticuerpos o fragmentos de anticuerpos multiespecíficos de la invención para el tratamiento de un trastorno hiperproliferativo en un mamífero. En una realización más preferida, una de las composiciones farmacéuticas descritas anteriormente, y que contiene un anticuerpo o fragmento de anticuerpo multiespecífico de la invención, se usa para el tratamiento de un trastorno hiperproliferativo en un mamífero. En una realización, el trastorno es un cáncer. En particular, el cáncer es un cáncer que expresa BCMA, que incluye (pero no se limita a) los siguientes: cánceres de células B que expresan BCMA, tales como mieloma múltiple (MM); y otros cánceres aún por determinar en los que se expresa BCMA. En realizaciones preferidas, el anticuerpo multiespecífico es un anticuerpo multiespecífico BCMA x CD3 como se describe en este documento, o un fragmento de unión a antígeno multiespecífico del mismo, y más preferiblemente un anticuerpo biespecífico BCMA x CD3 como se describe en este documento, o un fragmento de unión a antígeno biespecífico BCMA x CD3 del mismo.
[0175] En consecuencia, las composiciones farmacéuticas de la invención son útiles en el tratamiento o prevención de una variedad de cánceres, que incluyen (pero no se limitan a) los siguientes: un cáncer que expresa BCMA, que incluye (pero no se limita a) los siguientes: cánceres de células B que expresan BCMA, tales como mieloma múltiple agudo (MM); y otros cánceres aún por determinar en los que se expresa BCMA.
[0176] De manera similar, en el presente documento se proporciona también un método para inhibir el crecimiento de poblaciones celulares seleccionadas que comprende poner en contacto células diana de expresión de BCMA, o tejido que contiene tales células diana, con una cantidad eficaz de un anticuerpo multiespecífico o fragmento de anticuerpo de la presente invención, ya sea solo o en combinación con otros agentes citotóxicos o terapéuticos, en presencia de una célula mononuclear de sangre periférica (PBMC). En realizaciones preferidas, el anticuerpo multiespecífico es un anticuerpo multiespecífico BCMA x CD3 como se describe en este documento, o un fragmento de unión a antígeno multiespecífico del mismo, y más preferiblemente un anticuerpo biespecífico BCMA x CD3 como se describe en este documento, o un fragmento de unión a antígeno biespecífico BCMA x CD3 del mismo. En una realización preferida, el agente terapéutico adicional es citarabina, una antraciclina, dihidrocloruro de histamina o interleucina 2. En una realización preferida, el agente terapéutico adicional es un agente quimioterapéutico. El método para inhibir el crecimiento de poblaciones de células seleccionadas se puede practicar in vitro, in vivo o ex vivo.
[0177] Los ejemplos de usos in vitro incluyen tratamientos de médula ósea autóloga antes de su trasplante en el mismo paciente para matar células enfermas o malignas; tratamientos de la médula ósea antes de su trasplante para matar las células T competentes y prevenir la enfermedad de injerto contra huésped (GVHD); tratamientos de cultivos celulares para matar todas las células excepto las variantes deseadas que no expresan el antígeno diana; o para matar variantes que expresan un antígeno no deseado. Las condiciones de uso in vitro no clínico las determina fácilmente un experto en la técnica.
[0178] Ejemplos de uso clínico ex vivo son eliminar células tumorales de la médula ósea antes del autotrasplante en el tratamiento del cáncer. El tratamiento se puede realizar de la siguiente manera. La médula ósea se extrae del paciente u otro individuo y luego se incuba en un medio que contiene suero al que se le añade el agente citotóxico de la invención. Las concentraciones oscilan entre aproximadamente 10 uM y 1 uM, durante aproximadamente 30 minutos a aproximadamente 48 horas a aproximadamente 37°C. Las condiciones exactas de concentración y tiempo de incubación, es decir, la dosis, las determina fácilmente un experto en la técnica. Después de la incubación, las células de la médula ósea se lavan con medio que contiene suero y se devuelven al paciente mediante infusión intravenosa de acuerdo con métodos conocidos. En circunstancias en las que el paciente recibe otro tratamiento, como un ciclo de quimioterapia ablativa o irradiación corporal total entre el momento de la recolección de la médula y la reinfusión de las células tratadas, las células de la médula tratadas se almacenan congeladas en nitrógeno líquido utilizando equipo médico estándar.
[0179] Para uso clínico in vivo, se administra una cantidad terapéuticamente eficaz del anticuerpo multiespecífico o del fragmento de unión al antígeno a un sujeto que lo necesite. Por ejemplo, los anticuerpos multiespecíficos BCMA x CD3 y sus fragmentos de unión a antígeno multiespecíficos pueden ser útiles en el tratamiento de un cáncer que expresa BCMA en un sujeto en necesidad del mismo. En algunas realizaciones, el cáncer que expresa BCMA es un cáncer de células B, como el mieloma múltiple (MM). En realizaciones preferidas, el anticuerpo multiespecífico es un anticuerpo multiespecífico BCMA x CD3 como se describe en este documento, o un fragmento de unión a antígeno multiespecífico del mismo, y más preferiblemente un anticuerpo biespecífico BCMA x CD3 como se describe en este documento, o un fragmento de unión a antígeno biespecífico BCMA x CD3 del mismo. En algunas realizaciones, el sujeto es un mamífero, preferiblemente un ser humano. En algunas realizaciones, el anticuerpo multiespecífico o el fragmento de unión al antígeno se administrará como una solución cuya esterilidad ha sido probada.
[0180] Los regímenes de dosificación en los métodos de tratamiento y usos anteriores se ajustan para proporcionar la respuesta óptima deseada (por ejemplo, una respuesta terapéutica). Por ejemplo, se puede administrar un solo bolo, se pueden administrar varias dosis divididas a lo largo del tiempo o la dosis se puede reducir o aumentar proporcionalmente según lo indiquen las exigencias de la situación terapéutica. Las composiciones parenterales se pueden formular en forma de unidad de dosificación para facilitar la administración y uniformidad de la dosificación.
[0181] Las dosificaciones eficaces y los regímenes de dosificación para los anticuerpos multiespecíficos y fragmentos dependen de la enfermedad o afección a tratar y pueden ser determinadas por un experto en la técnica. Un intervalo ejemplar, no limitante para una cantidad terapéuticamente eficaz de un compuesto de la presente invención es aproximadamente 0,001-10 mg/kg, tal como aproximadamente 0,001-5 mg/kg, por ejemplo aproximadamente 0,001­ 2 mg/kg, tal como aproximadamente 0,001-1 mg/kg, por ejemplo aproximadamente 0,001, aproximadamente 0,01, aproximadamente 0,1, aproximadamente 1 o aproximadamente 10 mg/kg.
[0182] Un médico o veterinario que tiene experiencia ordinaria en la técnica puede determinar fácilmente y prescribir la efectiva cantidad de la composición farmacéutica requerida. Por ejemplo, el médico o veterinario podría iniciar dosis del anticuerpo multiespecífico o fragmento empleado en la composición farmacéutica a niveles más bajos que los requeridos para lograr el efecto terapéutico deseado y aumentar gradualmente la dosis hasta lograr el efecto deseado. En general, una dosis diaria adecuada de un anticuerpo biespecífico de la presente invención será la cantidad del compuesto que sea la dosis más baja eficaz para producir un efecto terapéutico. La administración puede ser, por ejemplo, parenteral, tal como intravenosa, intramuscular o subcutánea. En una realización, el fragmento o anticuerpo multiespecífico puede administrarse mediante infusión en una dosis semanal calculada en mg/m2 Tales dosis pueden, por ejemplo, basarse en las dosis de mg/kg proporcionadas anteriormente de acuerdo con lo siguiente: dosis (mg/kg) x70: 1.8. Tal administración se puede repetir, por ejemplo, de 1 a 8 veces, tal como de 3 a 5 veces. La administración puede realizarse mediante infusión continua durante un período de 2 a 24 horas, tal como de 2 a 12 horas. En una realización, el fragmento o anticuerpo multiespecífico se puede administrar mediante infusión continua lenta durante un período prolongado, como más de 24 horas, para reducir los efectos secundarios tóxicos.
[0183] En una realización, el anticuerpo multiespecífico o fragmento se pueden administrar en una dosis semanal calculada como una dosis fija para hasta ocho veces, tal como de cuatro a seis veces cuando se administra una vez a la semana. Dicho régimen puede repetirse una o más veces según sea necesario, por ejemplo, después de seis meses o doce meses. Tales dosis fijas pueden, por ejemplo, basarse en las dosis de mg/kg proporcionadas anteriormente, con una estimación del peso corporal de 70 kg. La dosis se puede determinar o ajustar midiendo la cantidad de anticuerpo biespecífico de la presente invención en la sangre tras la administración, por ejemplo, extrayendo una muestra biológica y usando anticuerpos antiidiotípicos que se dirigen a la región de unión al antígeno BCMA de los anticuerpos multiespecíficos de la presente invención.
[0184] En una realización, el anticuerpo multiespecífico o fragmento se pueden administrar por terapia de mantenimiento, tales como, por ejemplo, una vez a la semana durante un período de seis meses o más.
[0185] Un anticuerpo multiespecífico o fragmento se pueden administrar también profilácticamente con el fin de reducir el riesgo de desarrollar cáncer, retrasar la aparición de la ocurrencia de un evento en la progresión del cáncer, y/o reducir el riesgo de recurrencia cuando un cáncer está en remisión.
[0186] Los anticuerpos multiespecíficos y fragmentos de los mismos como se describe en el presente documento también pueden administrarse en terapia de combinación, es decir, en combinación con otros agentes terapéuticos relevantes para la enfermedad o condición a ser tratada. Por consiguiente, en una realización, el medicamento que contiene el anticuerpo se combina con uno o más agentes terapéuticos adicionales, tales como un agente quimioterapéutico. En algunas realizaciones, el otro agente terapéutico es citarabina, una antraciclina, diclorhidrato de histamina o interleucina 2. Tal administración combinada puede ser simultánea, separada o secuencial, en cualquier orden. Para la administración simultánea, los agentes se pueden administrar como una composición o como composiciones separadas, según sea apropiado.
[0187] En una realización, un método para tratar un trastorno que implica las células que expresan BCMA en un sujeto, cuyo método comprende la administración de una cantidad terapéuticamente eficaz de un anticuerpo multiespecífico o fragmento, tal como un anticuerpo biespecífico BCMA x CD3 descrito en el presente documento, y la radioterapia a un sujeto que lo necesite. En una realización se proporciona un método para tratar o prevenir el cáncer, método que comprende la administración de una cantidad terapéuticamente eficaz de un anticuerpo o fragmento multiespecífico, tal como un anticuerpo BCMA x CD3 descrito en este documento, y radioterapia a un sujeto que lo necesite. La radioterapia puede comprender radiación o se proporciona la administración asociada de radiofármacos a un paciente. La fuente de radiación puede ser externa o interna al paciente que está siendo tratado (el tratamiento con radiación puede, por ejemplo, ser en forma de radioterapia de haz externo (EBRT) o braquiterapia (BT)). Los elementos radiactivos que pueden usarse en la práctica de tales métodos incluyen, por ejemplo, radio, cesio-137, iridio-192, americio-241, oro-198, cobalto-57, cobre-67, tecnecio-99, yoduro-123, yoduro-131 e indio-111.
Kits
[0188] También se proporcionan aquí kits, por ejemplo, que comprenden un anticuerpo multiespecífico descrito o fragmento de unión a antígeno del mismo e instrucciones para el uso del anticuerpo o fragemento para matar determinados tipos de células. En realizaciones preferidas, el anticuerpo multiespecífico es un anticuerpo multiespecífico BCMA x CD3 como se describe en este documento, o un fragmento de unión a antígeno multiespecífico del mismo, y más preferiblemente un anticuerpo biespecífico BCMA x CD3 como se describe en este documento, o un fragmento de unión a antígeno biespecífico BCMA x CD3 del mismo. Las instrucciones pueden incluir instrucciones para usar el anticuerpo multiespecífico o su fragmento de unión a antígeno in vitro, in vivo o ex vivo.
[0189] Típicamente, el kit tendrá un compartimento que contiene el anticuerpo multiespecífico o fragmento de unión a antígeno de los mismos. El anticuerpo multiespecífico o su fragmento de unión a antígeno puede estar en forma liofilizada, forma líquida u otra forma modificable para ser incluida en un kit. El kit también puede contener elementos adicionales necesarios para practicar el método descrito en las instrucciones del kit, como una solución esterilizada para reconstituir un polvo liofilizado, agentes adicionales para combinar con el anticuerpo multiespecífico o fragmento de unión al antígeno del mismo antes de administrarlo a un paciente. y herramientas que ayudan a administrar el anticuerpo multiespecífico o su fragmento de unión a antígeno a un paciente.
Usos de diagnóstico
[0190] Los anticuerpos multiespecíficos y fragmentos descritos en este documento también pueden usarse para fines de diagnóstico. Por tanto, también se proporcionan composiciones de diagnóstico que comprenden un anticuerpo o fragmentos multiespecíficos como se define en el presente documento, y para su uso. En realizaciones preferidas, el anticuerpo multiespecífico es un anticuerpo multiespecífico BCMA x CD3 como se describe en este documento, o un fragmento de unión a antígeno multiespecífico del mismo, y más preferiblemente un anticuerpo biespecífico BCMA x CD3 como se describe en este documento, o un fragmento de unión a antígeno biespecífico BCMA x CD3 del mismo. En una realización, la presente invención proporciona un kit para el diagnóstico de cáncer que comprende un recipiente que comprende un anticuerpo biespecífico BCMA x CD3 y uno o más reactivos para detectar la unión del anticuerpo a BCMA. Los reactivos pueden incluir, por ejemplo, etiquetas fluorescentes, etiquetas enzimáticas u otras etiquetas detectables. Los reactivos también pueden incluir anticuerpos o reactivos secundarios o terciarios para reacciones enzimáticas, donde las reacciones enzimáticas producen un producto que puede visualizarse. Por ejemplo, los anticuerpos multiespecíficos descritos en el presente documento, o sus fragmentos de unión a antígeno, pueden marcarse con un radiomarcaje, un marcador fluorescente, un marcador de epítopo, biotina, un marcador cromóforo, un marcador ECL, una enzima, rutenio, 111In-DOTA, Ácido 111In-dietilentriaminopentaacético (DTPA), peroxidasa de rábano picante, fosfatasa alcalina y beta-galactosidasa, o poli-histidina o marcadores similares conocidos en la técnica.
Ejemplos de realización para el tema descrito
[0191] Para describir mejor y más completamente el tema aquí, esta sección proporciona realizaciones ejemplares enumeradas del tema presentado.
Realizaciones enumeradas:
1. Un anticuerpo recombinante, o un fragmento de unión a antígeno del mismo, que se une inmunoespecíficamente a BCMA, en donde el anticuerpo tiene una cadena pesada y una cadena ligera, comprendiendo dicha cadena pesada:
a. una región determinante de complementariedad de cadena pesada 1 (CDR1) que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 4, una CDR2 de cadena pesada que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 5 y una CDR3 de cadena pesada que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 6
b. una CDR1 de cadena pesada que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 4, una CDR2 de cadena pesada que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 5 y una CDR3 de cadena pesada que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 6;
c. una CDR1 de cadena pesada que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 7, una CDR2 de cadena pesada que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 5 y una CDR3 de cadena pesada que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 6
d. una CDR1 de cadena pesada que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 4, una CDR2 de cadena pesada que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 5 y una CDR3 de cadena pesada que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 19;
e. una CDR1 de cadena pesada que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 4, una CDR2 de cadena pesada que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 8 y una CDR3 de cadena pesada que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 6;
f. una CDR1 de cadena pesada que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 13, una CDR2 de cadena pesada que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 5 y una CDR3 de cadena pesada que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 19;
g. una CDR1 de cadena pesada que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 13, una CDR2 de cadena pesada que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 8 y una CDR3 de cadena pesada que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 19, y donde dicho anticuerpo comprende además una CDR1 de cadena ligera que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 24, una CDR2 de cadena ligera que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 25 y una CDR3 de cadena ligera que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 26.
2. El anticuerpo o fragmento de unión a antígeno de la realización 1, en donde la cadena pesada del anticuerpo de (a) comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 27; la cadena pesada del anticuerpo de (b) comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 57; la cadena pesada del anticuerpo de (f) comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 34; la cadena pesada del anticuerpo de (k) comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 39; la cadena pesada del anticuerpo de (l) comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 40; la cadena pesada del anticuerpo de (m) comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 58 o la cadena pesada del anticuerpo de (n) comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 43.
3. El anticuerpo o fragmento de unión a antígeno de la realización 1 o realización 2, en donde la cadena ligera del anticuerpo comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 28.
4. El anticuerpo o fragmento de unión a antígeno de cualquiera de las realizaciones 1 a 3 en donde el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno se une al dominio extracelular de BCMA humano.
5. El anticuerpo o fragmento de unión a antígeno de cualquiera de las realizaciones 1 a 4 en donde el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno es un anticuerpo humano o un fragmento de unión a antígeno.
6. El fragmento de unión a antígeno de cualquiera de las realizaciones 1 a 5 en donde el fragmento de unión a antígeno es un fragmento Fab, un fragmento Fab2 o un anticuerpo monocatenario.
7. El anticuerpo o fragmento de unión a antígeno de cualquiera de las realizaciones 1 a 6 en donde el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo inhibe la interacción de BCMA y APRIL.
8. El anticuerpo o fragmento de unión a antígeno de la realización 7, en donde el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno presenta un CI50 para la interacción de BCMA y APRIL de aproximadamente 5,9 nM medido por ELISA.
9. El anticuerpo o fragmento de unión a antígeno de una cualquiera de las realizaciones 1 a 8, en donde el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo es una IgG.
10. El anticuerpo o fragmento de unión a antígeno de cualquiera de las realizaciones 1 a 9 es un isotipo IgG4.
11. El anticuerpo de la realización 10, en donde el IgG4 tiene una sustitución S228P, una sustitución L234A y una sustitución L235A en su región Fc.
12. El anticuerpo o fragmento de unión a antígeno de una cualquiera de las realizaciones 1 a 11 en donde el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo se une inmunoespecíficamente a BCMA humano y reacciona de forma cruzada con BCMA de mono cynomolgus.
13. El anticuerpo o fragmento de unión a antígeno de una cualquiera de las realizaciones 1 a 12, en donde el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo se une a BCMA en la superficie de células de mieloma humano.
14. El anticuerpo o fragmento de unión a antígeno de una cualquiera de las realizaciones 1 a 13, en donde el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo se une a BCMA en la superficie de células de mieloma múltiple humano.
15. Una célula recombinante que expresa el anticuerpo o fragmento de unión al antígeno de cualquiera de las realizaciones 1 a 14.
16. La célula de la realización 15 en donde la célula es un hibridoma.
17. La célula de la realización 15 en donde el anticuerpo se produce de forma recombinante.
18. Un anticuerpo biespecífico BCMA x CD3 recombinante o un fragmento de unión biespecífico BCMA x CD3 del mismo que comprende:
a) una primera cadena pesada (HCl);
b) una segunda cadena pesada (HC2);
c) una primera cadena ligera (LC1); y
d) una segunda cadena ligera (LC2),
en donde HC1 se asocia con LC1 y HC2 se asocia con LC2 y en donde HC1 comprende la SEQ ID NO: 59, SEQ ID NO: 60 y SEQ ID NO: 61 y LC1 comprende SEQ ID NO: 62, SEQ ID NO: 63 y SEQ ID NO: 64 para formar un primer sitio de unión al antígeno que se une inmunoespecíficamente a CD3 y en donde HC2 comprende SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5 y SEQ ID NO: 6 a y LC2 comprende SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 25 y SEQ ID NO: 26 para formar un segundo sitio de unión al antígeno que se une inmunoespecíficamente a BCMA.
19. Un anticuerpo biespecífico BCMA x CD3 recombinante o fragmento del mismo de la realización 18 que comprende un HC1 que comprende la SEQ ID NO: 55, una LC1 que comprende la SEQ ID NO: 56, una HC2 que comprende la s Eq ID NO: 65, y una LC2 que comprende: a) SEQ ID NO: 66 o b) SEQ ID NO: 76. 20. El anticuerpo biespecífico BCMA x CD3 o el fragmento de unión biespecífico de la realización 19 en donde el anticuerpo o el fragmento de unión biespecífico es una IgG.
21. El anticuerpo biespecífico BCMA x CD3 o el fragmento de unión biespecífico de cualquiera de las realizaciones 18, realización 19 o realización 20 en donde el anticuerpo o el fragmento de unión biespecífico es el isotipo IgG4.
22. El anticuerpo biespecífico BCMA x CD3 o el fragmento de unión biespecífico de la realización 18 a 21, en donde el anticuerpo o el fragmento de unión biespecífico se une inmunoespecíficamente al BCMA humano con una afinidad de al menos 0,22 nM medida por resonancia de plasmón superficial.
23. El anticuerpo biespecífico BCMA x CD3 o el fragmento de unión biespecífico de las realizaciones 18 a 22, en donde el anticuerpo o su fragmento de unión biespecífico se une a BCMA en la superficie de las células de mieloma humano.
24. El anticuerpo biespecífico BCMA x CD3 o el fragmento de unión biespecífico de las realizaciones 18 a 23, en donde el anticuerpo o su fragmento de unión biespecífico se une a BCMA en la superficie de células de mieloma múltiple humano.
25. El anticuerpo biespecífico BCMA x CD3 o fragmento de unión biespecífico de la realización 18 a 24 en donde el anticuerpo o fragmento de unión induce la activación de células T humanas biespecíficas in vitro con un CE50 de menos de aproximadamente 0,37 nM.
26. El anticuerpo biespecífico BCMA x CD3 o fragmento de unión biespecífico de la realización 18 a 25 en donde el anticuerpo o fragmento de unión biespecífico induce la citotoxicidad dependiente de células T de las células que expresan BCMA in vitro con un CE50 de menos de aproximadamente 0,45 nM.
27. El anticuerpo biespecífico BCMA x CD3 o el fragmento de unión biespecífico de la realización 18 a 26 en donde el anticuerpo o el fragmento de unión biespecífico no es un agonista de BCMA.
28. El anticuerpo biespecífico BCMA x CD3 o el fragmento de unión biespecífico de la realización 18 a 27 en donde el anticuerpo o el fragmento de unión biespecífico no altera la activación de NF-kB a concentraciones por debajo de 10 nM.
29. Una célula recombinante que expresa el anticuerpo o fragmento de unión biespecífico de una cualquiera de las realizaciones 18 a 28.
30. La célula de la realización 29 en donde la célula es un hibridoma.
31. Un método para tratar a un sujeto que tiene cáncer, comprendiendo dicho método administrar una cantidad terapéuticamente eficaz del anticuerpo biespecífico BCMA x CD3 o fragmento de unión biespecífico de cualquiera de las realizaciones 18 a 28 a un sujeto que lo necesite durante un tiempo suficiente para tratar el cáncer.
32. Un método para inhibir el crecimiento o la proliferación de células cancerosas, comprendiendo dicho método administrar una cantidad terapéuticamente eficaz del anticuerpo biespecífico BCMA CD3 o fragmento de unión biespecífico de cualquiera de las realizaciones 18 a 28 para inhibir el crecimiento o la proliferación de células cancerosas.
33. Un método para redirigir una célula T a una célula cancerosa que expresa BCMA, comprendiendo dicho método administrar una cantidad terapéuticamente eficaz del anticuerpo biespecífico BCMA x CD3 o del fragmento de unión biespecífico de cualquiera de las realizaciones 18 a 28 para redirigir una célula T a un cáncer.
34. El método de la realización 31, 32 o 33 en donde el cáncer es un cáncer hematológico.
35. El método de la realización 34, en donde el cáncer hematológico es un cáncer de células B que expresa BCMA.
36. El método de la realización 35 en donde el cáncer de células B que expresa BCMA es mieloma múltiple.
37. El método de la realización 31 comprende además administrar un segundo agente terapéutico.
38. El método de la realización 37 en donde el segundo agente terapéutico es un agente quimioterapéutico o una terapia anticancerosa dirigida.
39. El método de la realización 38 en donde el agente quimioterapéutico es citarabina, una antraciclina, diclorhidrato de histamina o interleucina 2.
40. Una composición farmacéutica que comprende el anticuerpo biespecífico BCMA x CD3 o el fragmento de unión biespecífico de cualquiera de las realizaciones 18 a 28 y un portador farmacéuticamente aceptable.
41. Un método para generar el anticuerpo biespecífico BCMA x CD3 o el fragmento de unión biespecífico de cualquiera de las realizaciones 18 a 28 cultivando la célula de una cualquiera de las realizaciones 29 a 30.
42. Un polinucleótido sintético aislado que codifica el HC1, el HC2, la LC1 o la LC2 del anticuerpo biespecífico BCMA x CD3 o el fragmento de unión biespecífico de cualquiera de las realizaciones 18 a 28.
43. Un kit que comprende el anticuerpo biespecífico BCMA x CD3 o el fragmento de unión biespecífico como se define en cualquiera de las realizaciones 18 a 28 y/o un polinucleótido como se define en la reivindicación 43 y empaque para el mismo.
Breve descripción de los dibujos
[0193]
Figura 1A y 1B. Vectores utilizados para clonar BCMA humano (Figura 1A) y cino BCMA (Figura 1B).
Figura 2A-2D. Ubicación del epítopo BCMB69 e interacciones entre BCMA y BCMB69 humana. (Figura 2A) Descripción general de la ubicación del epítopo. BCMB69 se une a la superficie cóncava de BCMA (regiones negras). (Figura 2B) Mapa de interacción que muestra los contactos directos entre BCMA y BCMB69. Los residuos de todos los CDR excepto el CDR-L1 comuníquese con BCMA. Las interacciones de Van der Waals se muestran como líneas discontinuas, los enlaces H son líneas continuas con flechas que indican los enlaces H de la columna vertebral y apuntan a los átomos de la columna vertebral. Los residuos de BCMA que entran en contacto con BCMB69 y APRIL tienen un marco negro. Se utilizó un corte de distancia de 4 A para identificar los residuos de contacto (umbral de distancia de 3,5 A para enlaces H). (Figura 2C y Figura 2D) Vista cercana de las principales interacciones de BCMA con las cadenas ligera BCMB69 (Figura 2C) y pesada (Figura 2D). Los enlaces H se muestran como líneas discontinuas con las distancias en Angstroms.
Figura 3. Residuos epítopo y paratopo de BCMB69. Los residuos de epítopo y paratopo están sombreados, las regiones CDR están subrayadas (definición de Kabat) y los residuos de BCMA que difieren de los humanos están en negrita y cursiva. Sólo se muestran las secuencias extracelulares BCMB69 Fab y BCMA.
Figura 4A y 4B. Regiones de choque entre BCMB69 Fab y APRIL (Figura 4A) y BCMB69 Fab BAFF (Figura 4B). Superposición estructural del complejo BCMA/BCMB69 sobre los complejos BCMA/APRIL y BCMA/BAFF que muestran regiones de choque entre el Fab y el ligando. Se muestra la superficie accesible al solvente de BCMA. Las moléculas de Fab y ligando se muestran como dibujos animados grises y negros, respectivamente. La superposición se logró mediante la superposición de átomos a de BCMA C equivalentes en ambos complejos (RMSD de 0,9 A para el complejo APRIL y 1,2A para BAFF).
Figura 5. Los datos de SPR para BCMB72 demuestran que la molécula se une a BCMA humana, cino y de ratón. Kd promedio para el BCMA cino y de ratón es de aproximadamente 36 veces y 402 veces, respectivamente, en comparación con el BCMA humano.
Figura 6. La determinación de CE50 para BCMB72 vinculante sobre BCMA+ líneas celulares. Las líneas celulares se tiñeron para BCMA usando BCMB72. Se muestran las intensidades de fluorescencia media geométrica de la unión de BCMB72 a las células. CE50 se indican en la leyenda. La saturación se logró a una concentración de alrededor de 100 nM. Se consideró que la intensidad de fluorescencia media derivaba los valores de CE50 para U2932 (CE50 = 7,92 nM), MM1R (CE50 = 8,74 nM), H929 (CE50 = 14,7 nM), células EJM (CE50 = 17,5 nM) y LP1 (CE50 = 22,3 nM). La representación gráfica y el ajuste de los datos se realizaron en GraphPad Prism 6 usando regresión no lineal con función de pendiente variable (cuatro parámetros).
Figura 7. Perfil de unión de BCMB72 en sangre completa. La sangre completa de tres donantes humanos normales se tiñó con anticuerpos monoclonales o policlonales contra BCMA o BCMB72. Se realizó un análisis de apertura para identificar linfocitos en la población de leucocitos usando marcadores específicos de células estándar. La intensidad de la tinción para un donante representativo se muestra en los paneles, donde las líneas negras continuas son los anticuerpos de interés y las líneas punteadas con relleno gris son el isotipo correspondiente. No se observó expresión de BMCA en linfocitos, monocitos, granulocitos o Dc plasmocitoides en tres donantes normales. BCMB72 mostró unión a células T CD3+ en los tres donantes con intensidad variable entre donantes. BCMB72 no se unió a ningún otro tipo de célula probado en este ensayo.
Figura 8A-8E. Activación de células T dependientes de BCMB72 en presencia de varias líneas celulares MM. Las células H929 (Figura 9A), MM,1R (Figura 9B), RPMI 8226 (Figura 9C), U266 (Figura 9D) y Mv4-11 (Figura 9E) se sometieron a los anticuerpos indicados en presencia de células T de seis células normales (se muestran los promedios de donantes ± SEM) y bloqueador de Fc (2 mg/ml) durante 48 horas. Los valores CE50 se indican en los gráficos. Análisis estadístico: además del simple hecho de la convergencia del modelo, se considera la amplitud del intervalo de confianza del 95% sobre el L0gCE50 para evaluar la adecuación del ajuste. (El intervalo de confianza sobre L0gCE50 se utiliza porque es simétrico; los intervalos de confianza sobre el CE50 en sí no lo son). Un intervalo menor que /- 2 (o un intervalo de confianza total del 95% de ancho menor que 4) se considera adecuado.
Figura 9. Resumen de CE50 y los valores de activación de células T máximo de dos experimentos independientes usando células T a partir de múltiples donantes normales. Los valores de los donantes individuales y los promedios de los donantes se muestran para cada línea celular y para cada experimento. Sin datos = no probado; sin ajuste = software incapaz de generar una curva; ~ valores = aproximación basada en la extrapolación del modelo.
Figura 10A-10E. Citotoxicidad dependiente de BCMB72 mediada por células T de varias líneas celulares de mieloma múltiple. Las células H929 (Figura 11A), MM,1R (Figura 11B), RPMI 8226 (Figura 11C), U266 (Figura 11D) y Mv4-11 (Figura 11E) se sometieron a la concentración de anticuerpos indicada en presencia de células T de seis donantes normales (se muestran los promedios de donantes ± SEM) y bloqueador de Fc (2 mg/ml) durante 48 horas. Los valores CE50 se indican en los gráficos. Análisis estadístico: además del simple hecho de la convergencia del modelo, se considera la amplitud del intervalo de confianza del 95% sobre el LogCE50 para evaluar la adecuación del ajuste (el intervalo de confianza sobre L0gCE50 se utiliza porque es simétrico; intervalos de confianza sobre el CE50 en sí misma no lo es) Un intervalo menor que /- 2 (o un intervalo de confianza total del 95% de ancho menor que 4) se considera adecuado.
Figura 11. Resumen de CE50 y los valores máximos de lisis a partir de dos experimentos independientes usando células T a partir de múltiples donantes normales. Los valores de los donantes individuales y los promedios de los donantes se muestran para cada línea celular y para cada experimento. Sin datos = no probó; sin ajuste = software incapaz de generar una curva; ~ valores = aproximación basada en la extrapolación del modelo.
Figura 12. Citotoxicidad y activación de células T en células H929. Se probaron anticuerpos biespecíficos BCMAxCD3 (moléculas mutantes de BCMB72) en un ensayo de citotoxicidad mediado por células T. Se incubó la línea celular positiva por BCMA (H929) con diversas concentraciones de anticuerpos durante 48 horas en presencia de células T humanas exógenas de donantes normales (ID de donante: M5763 y M6576). Después de 48 horas de incubación, se midió la muerte celular mediante un enfoque basado en citometría de flujo (FACS) y se informó como % de citotoxicidad en la Figura 12A. La Figura 12B muestra la activación de las células T, según lo evaluado por la regulación positiva de CD25 en la superficie de las células T. En general, los puntos de datos se alinearon estrechamente a lo largo de la curva de ajuste generada y hubo poca variabilidad entre los donantes de linfocitos T y los estudios repetidos.
Figura 13. Resumen de valores CE50 para la liberación de citoquinas mediada por BCMB72. Los sobrenadantes de células RPMI 8226 de los experimentos de citotoxicidad (ver Ejemplo 12, Figura 8) se recogieron y analizaron para seis niveles de citocinas diferentes usando un ensayo multiplex basado en MSD. Se utilizaron BCMB72 (BCMA x CD3) y anticuerpos de control (BCMA x nulo y nulo x CD3) a diversas concentraciones.
Figura 14A y 14B. Se realizó un ensayo de citotoxicidad dependiente de BCMB72 mediado por células T usando línea celular H929 positiva por BCMA. Las células se sometieron a BCMB72 a diversas concentraciones en presencia de células T de múltiples donantes normales (el resumen de tres donantes M7197, M5137 y M6457 se muestra como representativo) y bloqueador Fc (2 mg/ml) durante 48 horas. La relación efector/objetivo (E/T) fue de 5:1. La Figura 14A indica el potencial de citotoxicidad y la Figura 14B en el lado derecho muestra curvas de activación de células T que eran similares entre los diversos lotes de BCMB72.
Figura 15. Las células H929 se trataron con BCMB72 (BCMA x CD3) y anticuerpos de control (BCMA x nulo y nulo x CD3) durante 30 minutos a las dosis indicadas en el eje X en el gráfico anterior y la proteína total se analizó utilizando Simple Western. método de análisis de acuerdo con el protocolo estándar según el manual del usuario de ProteinSimple. Los datos se normalizaron utilizando actina como gen de mantenimiento y las proporciones se trazaron en el eje Y. APRIL y BAFF indujeron la fosforilación de P38 como se esperaba y los anticuerpos no tienen efecto estimulante a ninguna concentración probada.
Figura 16A-16F. Se estimularon células HEK-NFkB que expresan BCMA (Figura 16A, Figura 16C y Figura 16E) o células parentales (Figura 16B, Figura 16D y Figura 16F) con TNFa y diversas concentraciones de APRIL o BCMB72. Tres puntos de tiempo, 16 h. (Figura 16A y Figura 16B), 24 h. (Figura 16C y Figura 16D) y se analizaron 48 horas (Figura 16E y Figura 16F). El TNFa indujo la activación de NF-kB tanto en las células madre HEK-Nf-kB como en las células HEK-NF-kB-BCMA, mientras que la inducción de APRIL se observó solo en el tipo celular específico de BCMA. BCMB72 no tiene ningún efecto sobre la línea celular parental y mostró activación solo a altas concentraciones en células que expresan BCMA.
Figura 17A y 17B. Las células T no exhiben activación mediada por sBCMA y dependiente de BCMB72. BCMB72 (Figura 17A) y un anticuerpo de control nulo x CD3 (Figura 17B) se titularon con las células T de dos donantes normales (M7077 y M5137) en presencia de varias dosis de ECD de BCMA soluble. Datos: Media ± SEM.
Figura 18A-18F. Efecto de factores solubles, sBCMA, APRIL y BAFF sobre la activación de células T y el potencial citotóxico mediado por células T de BCMB72 en células H929. Las células se sometieron a un ensayo de destrucción durante 48 horas utilizando células T de donantes (M7077 y M6521) y BCMB72. La citotoxicidad diana se representa en los gráficos de la izquierda y la activación de las células T se muestra en los gráficos de la derecha (n = 2). Los valores CE50 para cada tratamiento se indican en las leyendas. Se muestra la citotoxicidad celular en presencia de sBCMA (Figura 18A), APRIL (Figura 18B) y BAFF (Figura 18C). Se muestran la activación de células T en presencia de sBCMA (Figura 18D), APRIL (Figura 18E) y BAFF (Figura 18F). Datos: Media ± SEM.
Figura 19A y 19B. Las señales de dos experimentos independientes se normalizaron a la señal máxima de unión de BCMAFc a APRI1 y BAFF en ausencia de anticuerpos competidores. La unión de BCMA a APRIL (Figura 19A) y BAFF (Figura 19B) se representa gráficamente en función de BCMB72 y la concentración de anticuerpo de control (nulo x CD3).
Figura 20A-20E. Potencia citotóxica de BCMB72 contra células plasmáticas de MM primarias humanas. Se utilizaron células mononucleares congeladas derivadas de la médula ósea de cinco pacientes diferentes (MM240BM (Figura 20A), MM259BM (Figura 20B), MM270BM (Figura 20C), MM276BM (Figura 20D) y MM277BM (Figura 20E)) para evaluar la unión de BCMB72, en comparación con el control de isotipo IgG4 (CNTO 9412, panel izquierdo), citotoxicidad de células plasmáticas (centro) y activación de células T (derecha). Para el ensayo de citotoxicidad, se agregaron exógenamente células T del donante sano normal M7077 a las muestras de BMMC del paciente y se incubaron con BCMB72 (BCMA X CD3), BC3B4 (BCMA X nulo) o CNTO 7008 (nulo X CD3) durante 48 horas. BCMB72 se une a las células plasmáticas de una manera dependiente de la dosis a todas las muestras de donantes y las intensidades medias de fluorescencia se registraron en el eje Y. Obsérvese la pérdida de células plasmáticas vivas (CD138+) y la regulación positiva concomitante de CD25 en las células T en respuesta al tratamiento con BCMB72. Los valores CE50 para la activación de células T se indican en los gráficos.
Figura 21. Eficacia in vivo de BCMB72 en el modelo profiláctico H929.
Figura 22. Niveles de BCMA soluble en suero en ratones de xenoinjerto H929. La concentración de BCMA soluble en suero se detectó usando el kit ELISA de BCMA humano (R&D Systems). Niveles BCMA solubles se reducen de manera significativa en el tratamiento de ratones con 1 pg y 0,5 pg/ratón de BCMB72 comparado con el control PBS que se correlaciona muy bien con la carga tumoral en estos animales. Dosis más bajas de BCMB72 (0,1 pg/ratón) no tuvieron efecto sobre los niveles de sBCMA o el tamaño del tumor.
Ejemplos
[0194] Los siguientes ejemplos se proporcionan para complementar la divulgación anterior y para proporcionar una mejor comprensión de la materia objeto descrita en este documento. No se debe considerar que estos ejemplos limitan el tema descrito. Se entiende que los ejemplos y realizaciones descritos en este documento son solo para fines ilustrativos y que diversas modificaciones o cambios a la luz de los mismos serán evidentes para los expertos en la técnica y se incluirán dentro de, y se pueden realizar sin apartarse del verdadero alcance de la invención, que se define en las reivindicaciones.
Ejemplo 1: Materiales
Moléculas ECD de BCMA
[0195] Proteína de fusión BCMA-Fc humana recombinante (h) (catálogo n° 193-BC-050), correspondiente al aminoácido 1 a 54 de hBCMA (SEQ ID NO: 1) y de ratón recombinante (m) La proteína de fusión BCMA-Fc (n° de catálogo 593-BC-050) correspondiente a los aminoácidos 1 a 49 de mBCMA (SEQ ID NO: 2) se obtuvo de R&D Systems. Proteína cino BCMA recombinante preparada a partir de ADNc obtenido a partir de técnicas de síntesis de genes (patente de EE.UU. n° 6.670,127; patente de EE.UU. n° 6,521.427). Todas las proteínas se analizaron para detectar endotoxinas antes de su uso y se biotinilaron para estudios de cribado de fagos. Estos materiales también se utilizaron para mediciones de unión y afinidad.
[0196] BCMA humano soluble se obtuvo de AB Biosciences (Catálogo n° P011Xp, lote n° 033-013) y se usó para estudios de caracterización.
Moléculas de APRIL, BAFF, BAFF-R y TACI
[0197] hAPRIL soluble (n° de catálogo DY884), hBAFF (n° de catálogo 2149-BF), hBAFF-R (n° de catálogo 1162-BR), correspondientes a los aminoácidos 7 a 71 de hBAFF-R y hTAC1, correspondientes a los aminoácidos 2 a 166 de TACI, se obtuvieron de R&D Systems. BAFF-R y TAC1 se biotinilaron para estudios de SPR.
Generación de líneas celulares BCMA
[0198] Los vectores que presentan BCMA humano (Figura 1A) y cino BCMA (Figura 1B) se transfectaron transitoriamente en células HEK293 expi utilizando métodos estándar. Se seleccionaron células adherentes 293F transfectadas para una integración plasmídica estable, luego se clasificaron células individuales y se cuantificó la expresión del receptor de superficie BCMA mediante FACS usando un anticuerpo marcado con BCMAPE antihumano (R&D Systems FAB193P).
Ejemplo 2: A islam iento de anticuerpos que expresan BCMA humano hibridomas monoclonales
[0199] Una cepa de rata transgénica de inmunoglobulina humana (OmniRat ®; OMT, Inc.) se utilizó para desarrollar anticuerpo monoclonal BCMA humano que expresan las células de hibridoma. El OmniRat® contiene un locus IgH humano/de rata quimérico (que comprende 22 VhS humanos, todos los segmentos D y Jh humanos en configuración natural vinculados al locus Ch de rata) junto con locus IgL completamente humano (12 Vks vinculados a Jk-Ck y 16 VAs vinculados a JA-CA). (véase, por ejemplo, Osborn, et al. (2013) J Immunol 190 (4): 1481-1490). Por consiguiente, las ratas exhiben expresión reducida de IgM o k de rata, y en respuesta a la inmunización, los transgenes de cadena ligera y pesada humana introducidos experimentan cambio de clase y mutación somática para generar anticuerpos monoclonales IgG humanos de alta afinidad. La preparación y el uso de OmniRat®, y las modificaciones genómicas que llevan dichas ratas, se describen en la publicación PCT W o 14/093908 de Bruggemann et al.
[0200] Cuando inmunizada con humano BCMA recombinante (rhBCMA), esta rata transgénica produce anticuerpos IgG humano específico a BCMA humano.
[0201] El esquema de inmunización se realizó como sigue: seis ratas se inmunizaron con fusión hBCMA-Fc. Después de un régimen de inmunización de 21 días, se recolectaron los bazos y los ganglios linfáticos de las ratas inmunizadas y se usaron para generar cuatro bibliotecas de hibridomas totales. Las bibliotecas se valoraron y ensayaron mediante ELISA para identificar mAb que presentaban unión a hBCMA biotinilada. Los mAb se capturaron en una placa MSD Estreptavidina. Después de cribados de confirmación adicionales, los sobrenadantes de hibridomas que presentaban unión específica a BCMA humana y cino BCMA se secuenciaron, clonaron y expresaron y convirtieron tanto en IgG1 como en IgG4 humanas.
Ejemplo 3: Purificación de anticuerpos BCMA
[0202] Los anticuerpos BCMA en los sobrenadantes de cultivo clarificados fueron capturados por MabSelect SuRe resina de Proteína A y se eluyó con acetato de sodio 100 mM (pH 3,5). Las fracciones que contenían los anticuerpos se combinaron y neutralizaron rápidamente con Tris HCl 2,5 M (pH 7,2), luego se intercambió tampón en 1xD-PBS u otros tampones deseados si se especifica. La concentración de proteína se determinó midiendo la DO280 en un espectrofotómetro NanoDrop y se calculó usando su coeficiente de absorbancia. La pureza y homogeneidad del anticuerpo se evaluó mediante SDS-PAGE y SEHPLC. Se realizó una etapa de pulido SEC usando Superdex 200 si el monómero cae por debajo del 95% por SE-HPLC
Ejemplo 4: Caracterización de la unión celular de anticuerpos BCMA a BCMA
[0203] Se evaluó la unión de anticuerpos BCMA a células que expresan BCMA manipuladas y las líneas celulares cancerosas U2392, EJM, MMIR, U266, OPM2 y RPMI-18226 usando un ensayo de unión celular MSD (mesoescala) y citometría de flujo. El objeto del ensayo de selección fue identificar anticuerpos que se unen a células que expresan BCMA, así como reactividad cruzada con células que expresan cino BCMA.
[0204] Para el ensayo de unión a células MSD, se inmovilizaron las células y muestras de anticuerpo BCMA se ensayaron por triplicado. Brevemente, los sobrenadantes de expresión de anticuerpos BCMA purificados se normalizaron a 10 pg/ml. Se cultivaron 5000 células por pocillo en una placa de 384 pocillos (MA6000, cat L21XB, MSD) y se dejaron adherir durante 2 h. A continuación, las células se bloquearon con FBS al 20% en PBS (Gibco) durante 15 minutos. A continuación, se añadieron los sobrenadantes de anticuerpos y se dejaron a TA durante 1 hora. Las células se lavaron 3 veces con PBS y luego se añadió un anticuerpo secundario marcado con rutenio (Jackson Immuno Research) a 1 pg/ml y se incubó durante 1 hora a temperatura ambiente. Luego se aplicó una etapa de lavado adicional y luego se agregaron 35 pl por pocillo de tampón de lectura MSD T (libre de surfactante) y se incubaron durante 30 min para la detección. Luego se leyeron las placas usando MSD Sector 6000. Los datos se normalizaron a los controles y se representaron gráficamente usando GraphPad Prism Versión 5. Se determinó que un aglutinante positivo era un acierto con una señal 3 veces mayor que la del fondo. El ensayo se repitió para mantener la coherencia de los datos y se seleccionaron los aglutinantes superiores para su posterior desarrollo.
[0205] Para la citometría de flujo, las células se incubaron con una tinción de viabilidad y se añadieron 100.000 células a una placa de fondo en U y se centrifugaron para sedimentar las células. Se añadieron los anticuerpos BCMA titulados a las células. Después de un período de incubación, las células se sedimentaron y se lavaron. Se añadió a las células un anticuerpo secundario específico de especie marcado con AlexaFluor 647 y se dejó incubar. Las células se sedimentaron y lavaron varias veces. Las células se resuspendieron en una cantidad apropiada de tampón de ejecución y se analizaron usando un FACS CantoII. Las células fueron controladas por FSC-A versus SSC-A para tamaño, SSCA versus SSC-H para singletes y tinción de viabilidad. Los valores geoMFI de la población de células vivas se representaron gráficamente y utilizaron para calcular valores CE50, si es posible, es decir, si curvas eran totalmente sigmoidales.
Inhibición de APRIL de unión a ligando
[0206] El panel de anticuerpos BCMA se proyectó en una competición ELISA de unión APRIL. April humana soluble se compró en el catálogo de R&D Systems n° DY884) se evaluó la capacidad de los anticuerpos anti-BCMA para bloquear la unión de April a BCMA inmovilizada.
[0207] Brevemente, placas de 96 pocillos Maxisorb claras fueron tratadas con 100 pL de 0,5 pg/ml de BCMA-ECD hecho en PBS y se incubó a temperatura ambiente durante la noche, las placas se lavaron tres veces con tampón de lavado ELISA que contiene 0,05% Tween-20 n PBS (R&D Systems Catalog n° WA126), y luego bloqueado con 300 pL/pocillo de Reactivo Diluyente que contiene 1% de BSA5 en PBS (R&D Systems Catalog n° DY995). Para la unión competitiva, se añadieron anticuerpos BCMA a la placa en volúmenes de 100 pl y se incubaron durante 30 minutos antes de la adición de APRIL. Después de 30 minutos, se añadió 1 ng de APRIL por pocillo y las placas se incubaron durante la noche a 4°C. El APRIL no unido se lavó con tampón de lavado ELISA y el APRIL biotinilado unido se detectó usando conjugado SA-HRP a una densidad óptica de 450 nm.
Ejemplo 5: Evaluación y selección de aciertos
[0208] Después de completar los experimentos de caracterización, se determinó que el anticuerpo derivado del hibridoma M2, denominado BCMB69, tenía las siguientes características:
• Se une a BCMA humana recombinante
• Se une a BCMA cino recombinante
• Exhibe unión débil a BCMA de ratón
• Se une tanto a BCMA humana que expresa HEK como a cino BCMA que expresa HEK según lo medido por citometría de flujo
• Se une a líneas de cáncer humano que expresan BCMA (U2392, EJM, MMIR, U266, OPM2 y RPMI-18226) • Bloquea unión de APRIL con una CI50 = 5,9 nM
Como resultado, BCMB69 (Tabla 4 y Tabla 5) se expresó y purificó para el propósito de hacer anticuerpos biespecíficos BCMA x CD3.
Figure imgf000039_0001
Tabla 5: Secuencias Vh y V l de BCMB69
Figure imgf000040_0001
Ejemplo 6: Estructura cristalina de un anti-BCMA Fab
[0209] La estructura cristalina de un anticuerpo anti-BCMA (BCMB69) se determinó en forma de Fab libre, así como cuando se une al BCMA humano, para caracterizar las interacciones anticuerpo/antígeno en detalles atómicos, aumentar nuestra comprensión del mecanismo de acción del anticuerpo y respaldar cualquier esfuerzo de ingeniería de anticuerpos requerido.
Materiales
[0210] BCMA Fab marcado con His (SEQ ID NOs: 75 y 76; en lo sucesivo simplemente BCMB69 Fab) se expresó en células HEK293 y se purificó usando la afinidad y cromatografías de exclusión por tamaño. El Fab se recibió en NaCl 130 mM, MES 20 mM, pH 7,4.
[0211] La región extracelular de BCMA humano (residuos 5-51 de SEQ ID NO: 1; en lo sucesivo simplemente BCMA) con un C-terminal de His se expresó usando el sistema de baculovirus y se purificó por cromatografía de afinidad y de exclusión por tamaño. La proteína fue recibida en NaCl 50 mM, 20 mM Tris pH 8.
Cristalización
Complejo de BCMA/BCMB69 Fab
[0212] El complejo Fab/antígeno se preparó mezclando BCMA con BCMB69 Fab en una relación molar de 3,8:1 (exceso de BCMA) para aproximadamente 16 h a 4°C mientras el tampón se intercambia a Hepes 20 mM pH 7,5. A continuación, se eluyó el complejo de una columna monoS 5/50 con un gradiente de NaCl 51-63 mM en Hepes 20 mM pH 7,5 y se concentró hasta 17 mg/ml. Los cristales adecuados para la difracción de rayos X se obtuvieron a partir de PEG 3kDa al 25%, MgCl2 0,2 M, Mes 0,1 M pH 6,5 usando el método de difusión de vapor de gota sentada a 20°C con micro-siembra.
BCMB69 Fab
[0213] El BCMB69 Fab se concentró a 9 mg/ml sin purificación adicional. Los cristales adecuados para la difracción de rayos X se obtuvieron a partir de (NH4)2SO42 M, MPD al 5%, Mes 0,1 M pH 6,5 usando el método de difusión de vapor de gota sentada a 20°C.
Recogida de datos de rayos X y determinación de la estructura
[0214] Para la recogida de datos de rayos X, los cristales se sumergen durante unos segundos en una solución crioprotectora que contienen el correspondiente licor madre suplementado con 20% de glicerol y, a continuación, se congelaron rápidamente en nitrógeno líquido. Los datos de difracción de rayos X para el complejo BCMA/BCMB69 se recopilaron con un detector CCD Rayonix 300HS en la línea de luz CMCF-08ID de Canadian Light Source (CLS), mientras que los datos de rayos X para el BCMB69 Fab gratuito se recopilaron con un Dectris Pilatus 6M Detector de matriz de píxeles en la línea de luz 17-ID de la fuente de fotones avanzada (APS) en el laboratorio nacional de Argonne. Los datos de difracción se procesaron con el programa HKL (Otwinowski, Z. & Minor, W. (1997). Processing of X-ray diffraction data collected in oscillation mode. Methods in Enzymology 276: 307-326.).
[0215] Las estructuras se resolvieron por reemplazo molecular (RM) con Phaser (Read, R. J. (2001) Pushing the boundaries of molecular replacement with maximum likelihood. Acta Crystallogr D Biol Crystallogr 57: 1373-1382). En el caso de la estructura de Fab libre, el modelo de búsqueda de RM fue el Fab de hemaglutinina 5j8 anti-influenza (código PDB: 4M5Y). En el caso del complejo BCMA/Fab, los modelos de búsqueda de RM fueron las estructuras cristalinas de BCMA (código PDB: 1XU2) y la estructura Fab libre BCMB69. Las estructuras se refinaron con PHENIX (Adams, PD, Gopal, K., GrosseKunstleve, RW, Hung, LW, Ioerger, TR, McCoy, AJ, Moriarty, NW, Pai, RK, Read, RJ, Romo, TD, Sacchettini, JC, Sauter, NK, Storoni, CL & Terwilliger, TC (2004). Desarrollos recientes en el software PHENIX para la determinación automatizada de la estructura cristalográfica. J Synchrotron Radiat 11: 53-5.) y los ajustes del modelo se llevaron a cabo utilizando COOT (Emsley P. & Cowtan, K. (2004). Coot: Model building tools for molecular graphics. Acta Crystallogr. D60: 2126-2132). Todos los demás cálculos cristalográficos se realizaron con el conjunto de programas CCP4 (Collaborative Computational Project Number 4, 1994). Todos los gráficos moleculares se generaron con PyMol (DeLano, W. (2002). El sistema de gráficos moleculares PyMOL. Palo Alto, CA, EUA; Delano Scientific). Las estadísticas de datos para la estructura Fab libre BCMB69 y el complejo se muestran en la Tabla 6.
Tabla 6. Datos cristalográficos para el complejo Fab BCMA/BCMB69 y Fab BCMB69 libre.
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El epítopo, paratopo y las interacciones
[0216] BCMB69 reconoce un epítopo conformacional compuesto de residuos en la p-horquilla (residuos Y13-H19) y regiones de hélice-bucle-hélice (residuos L26, R27 y n 31-L35) de BCMA (Figuras 3 y 4). El epítopo BCMB69 comprende un área de aproximadamente 830 A2 en BCMA y contiene el motivo DXL de unión al ligando (residuos D15-L18 en el giro tipo I de la espina p), que sobresale en una cavidad poco profunda revestida por las regiones determinantes de complementariedad de anticuerpos (CDR). La leucina 17, en la punta del giro DXL, está completamente enterrada en la cavidad del anticuerpo y tiene interacciones extensas con BCMB69. Otro residuo de epítopo predominante es Arg27, que está en la 310-hélice h1 y hace varios contactos de puentes de hidrógeno con las CDR de cadena pesada.
[0217] El paratopo BCMB69 se compone de los residuos de todas las CDR, excepto la CDR-L1 (Figuras 2 y 3). La cadena pesada tiene el doble de contactos con BCMA en comparación con la cadena ligera. Las pequeñas cadenas laterales en la punta del bucle de CDR-H3 (102-GAVAG-106) (SEQ ID NO: 77) facilitan la inserción de CDR-H3 en BCMA y el establecimiento de contactos extensos de anticuerpo/antígeno (el 40% de los contactos totales se realizan mediante CDR-H3). Los CDR de BCMB69 se empaquetan en una superficie cóncava de la estructura tipo silla BCMA con CDR-L2 (residuos Y48, D52, P54, S55), CDR-H1 (residuos G32-Y34) y CDRH3 (D101, A103, V104, Y110) contactando el "asiento" formado por la hélice h1 y el bucle h1h2, mientras que CDR-L3 (residuos W90, S92, D95), CDR-H1 (F35), CDR-H2 (Y54, Y60) y CDR-H3 (H100, G102, A103, A105) interactúan con el "atrás" formado por el BCMA p-horquilla. Leu35, el único residuo de epítopo en una "pata de silla" (h2 hélice), tiene contactos de van der Waals con el residuo D52 de CDRL2.
[0218] BCMA tiene un dominio extracelular pequeño (aproximadamente 50 residuos) y compacto. Hay una superficie limitada disponible para la unión de anticuerpos o ligandos no competidores a BCMA. La mayoría de los residuos del epítopo BCMB69 son también residuos de unión para APRIL (12 de 14 residuos de epítopo) y BAFF (9 de 14 residuos). En el caso de APRIL, que es el ligando de mayor afinidad de BCMA, los únicos residuos de epítopo no compartidos son F14 y S16 (Figura 2B), mientras que para BAFF los residuos no compartidos son F14, l26, T32, P33 y L35. El bucle DXL está enterrado tanto por ligandos como por BCMB69.
Mecanismos de acción propuestos de BCMB69
[0219] BCMB69 es un candidato para la redirección de células T a células cancerosas MM. No se espera que la destrucción de células cancerosas mediada por un anticuerpo biespecífico BCMB69 x anti-CD3 se vea afectada por la estructura y ubicación del epítopo BCMB69. La ubicación accesible del epítopo permite la unión del brazo Fab BCMB69 al BCMA unido a la membrana, mientras que el otro brazo Fab todavía está unido al CD3 en la membrana de la célula T.
[0220] BCMB69 también puede alterar las vías de señalización APRIL y BAFF en células de plasma a través de la oclusión estérica y competición directa por el sitio de unión BCMA. La superposición de la estructura BCMA/BCMB69 sobre las estructuras b Cm A/APRIL y b Cm A/BAFF (Liu, Y., Hong, X., Kappler, J., Jiang, L., Zhang, R, Xu, L., Pan, CH, Martin, WE, Murphy, RC, Shu, HB, Dai, S. y Zhang, G. (2003). Nature 423: 49-56; Hymowitz, SG, Patel, d R, Wallweber, HJA, Runyon, S., Yan, M, Yin, J., Shriver, SK, Gordon, NC, Pan, B., Skelton, NJ, Kelley, RF y Starovasnik, MA (2005). J. Biol. Chem. 280: 7218-7227.) muestra regiones de choque entre BCMB69 y APRIL, BAFF (Figuras 2B y Figuras 4A y 4B), lo que hace imposible que BCMA se una simultáneamente al anticuerpo y al ligando natural. APRIL y BAFF pueden enviar señales utilizando otros receptores, como TACI y BAFF-R, y los ratones knock-out BCMA siguen siendo viables. Por lo tanto, bloquear la actividad de APRIL y BAFF mediante la oclusión de BCMA puede no ser críticamente tóxico para los pacientes con MM.
Ejemplo 7: Diseño a base de estructura en mutantes BCMB69
[0221] Evaluación computacional de motivos de modificación post-traduccional y el riesgo de agregación del dominio variable no unido BCMB69 revela un riesgo medio de isomerización para los residuos D101-G102 (CDR-H3) y un 486 Parche hidrofóbico A2 en la región CDR que podría representar un riesgo de agregación. Los residuos hidrófobos más expuestos en el parche son 158 (CDR-H2), F35 (c Dr -H1) y V104 (CDR-H3; V104 fue relevante en el modelo de homología Fv, pero no en la estructura cristalina de Fab). Para eliminar los riesgos de isomerización y agregación en el dominio variable BCMB69, se diseñaron racionalmente varias mutaciones (Tabla 7).
Tabla 7: Panel de mutantes BCMB69
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Las secuencias CDR y las secuencias VH y VL para los mutantes BCMB69 basados en la estructura se representan en las Tablas 8 y 9 respectivamente.
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Tabla 9: Secuencias Vh y V1 de mutantes BCMB69
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[0222] Por tanto, además de BCMB69, se expresaron y purificaron 28 mutantes como se describe en el Ejemplo 3 y se caracterizaron por su unión a células que expresan BCMA por citometría de flujo como se describe en el Ejemplo 4. Siete de los 28 mutantes se unieron a células que expresan BCMA y se avanzaron con el propósito de hacer un panel biespecífico BCMA x CD3.
Ejemplo 8: Preparación de BCMA y CD3 anticuerpos en un formato de biespecíficos en los IgG4 S228P, L234A, L235A
[0223] Los anticuerpos BCMA se expresaron como IgG4, teniendo sustituciones Fc S228P, L234A y L235A (numeración según el índice de la UE). También se generó un anticuerpo anti-CD3 monoespecífico CD3B19 que comprende las cadenas pesada y ligera que tienen las secuencias de SEQ ID NO: 55 y SEQ ID NO: 56, respectivamente.
[0224] Los anticuerpos monoespecíficos se purificaron usando métodos estándar utilizando una columna de proteína A (HiTrap MabSelect columna seguro). Después de la elución, los conjuntos se dializaron en D-PBS, pH 7,2.
[0225] Los anticuerpos CD3 biespecíficos BCMA x se generaron mediante la combinación de un CD3 mAb monoespecífico y un BCMA mAb monoespecífico en intercambio de brazo Fab in vitro (como se describe en WO2011/131746). Brevemente, a aproximadamente 1-20 mg/ml en una relación molar de 1:1 de anticuerpo anti-BCMA/anti-CD3 (o en algunos casos 6% extra de un anticuerpo parental para agotar otro) en PBS, pH 7-7,4 y se mezcló 2-mercaptoetanolamina (2-MEA) 75 mM y se incubó a 31°C durante 5 horas, seguido de la eliminación del 2-MEA mediante diálisis, diafiltración, filtración de flujo tangencial y/o filtración de células giratorias utilizando métodos estándar. La formación de los anticuerpos biespecíficos BCMA x CD3 se analiza mediante HPLC de intercambio catiónico (CEX) o cromatografía de interacción hidrófoba (HIC) HPLC. Si se desea, el anticuerpo biespecífico BCMA x CD3 se pulió por CEX preparativa o HIC para eliminar el parental residual.
[0226] Cadenas pesadas y ligeras para anticuerpos biespecíficos BCMA x CD3 representativos se muestran a continuación en la Tabla 10. BCMB178 tenía una expresión deficiente cuando se combinó con el brazo CD3 y, como resultado, no se caracterizó más.
Tabla 10. Secuencias de cadenas pesadas y ligeras para anticuerpos biespecíficos
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Ejemplo 9: Determinaciones de afinidad BCMA para anticuerpos BCMA y biespecíficos BCMA X CD3
[0227] Resonancia de plasmón superficial (SPR) se utilizó para medir los valores de afinidad humana BCMA de anticuerpos BCMA utilizados para la generación de biespecíficos CD3. El protocolo seguido para SPR fue similar al descrito en el Ejemplo 4. Los resultados mostrados en la Tabla 11 indican que todas las muestras se unieron al antígeno BCMA monomérico con afinidades variables. El mAb parental (BCMB69) tenía afinidades de unión de ~ 1,4 nM BCMB117 y BCMB128 tenían afinidades en el rango de BCMB69, mientras que BCMB123, BCMB129, BCMB176 y BCMB177 tenían afinidades relativamente más débiles (de 3 a 15 veces) debido a velocidades de salida más rápidas. Para evaluar la reproducibilidad de los datos, todas las muestras se analizaron al menos por triplicado y se informa de desviaciones estándar.
Tabla 11. Afinidades de unión de mAbs anti-BCMA con BCMA humano monomérico por SPR
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BCMB69 2.74 £ 0.02 3.95 £ 0.19 1.44 £ 0.05
BCMB117 2.57 £ 0.21 3.42 £ 0.25 1.34 £ 0.20
BCMB123 2.14 i 0.04 11.0 £ 1.33 5.12 £ 0.69
BCMB128 4.20 £ 0.13 8.70 £ 0.61 2.07 £ 0.21
BCMB129 1.54 £0.06 8.43 £ 0.44 5.47 £ 0.13
BCMB176 4.00 £ 0.05 28.8 £ 1.25 7.18 £ 0.22
BCMB177 2.80 £ 0.22 56.6 £ 5.54 20.2 £ 1.57
[0228] SPR también se utilizó para medir los valores de afinidad de anticuerpos biespecíficos BCMA x CD3 para BCMA humano y cino. Los resultados de la Tabla 12 indican que todas las muestras se unieron a antígenos de Fc-BCMA con afinidades variables. BC3B7 y BC3B9 tenían afinidades en el intervalo de BCMB72 por BCMA humano mientras que los biespecíficos restantes tenían afinidades 2-3 veces más débiles en comparación con BCMB72. Para Fc-BCMA, BC3B7 y BC3B9 cino tenían afinidades 2-3 veces más estrechas que BCMB72 (Kd 0,65-0,37 nM, respectivamente), mientras que los mAb restantes retuvieron una unión similar a BCMB72 (Kd ~ 0,8-1,2 nM). En el fin de evaluar la reproducibilidad de datos, todas las muestras se realizaron al menos por triplicado y se informa de desviaciones estándar.
Tabla 12. Afinidades de unión de anticuerpos BCMA x CD3 para Fc-BCMA por SPR
BCMA x Fc-BCMA *on1 (x *0«1 (x K01 (nM) *on2 (x *0«2 (x Ko fin a l (nM) CD3 1061/Ms) 10"31/s) lO '-H/s) 10-M/S)
BCMB72 Hu 1.35=0.11 2.08=0.80 1.51 ±0.45 6.56 = 1.27 2.79=0.55 0.06±0.01 (B69 x
B219) Cy 1.26=0.12 4.83=0.28 3.87±0.57 1.06 = 0.10 7.85=1.04 1.65±0.26 BC3B7 Hu 1.48 = 0.09 1.58=0.30 1.07 ±0.20 4.97=0.67 2.94=0.54 0.06=0.01 (B117 x
B219) Cy 1.38=0.07 4.17=0.19 3.04±0.25 1.50 = 0.06 4.15=0.53 0.65=0.04 BC3B8 Hu 1.35=0.08 1.23=0.24 0.91 ±0.16 3.13=0.48 5.94 = 0.82 0.14=0.01 (B123 x
B219) Cy 1.09=0.05 7.34=0.21 6.77=0.48 1.94=0.08 3.26=0.43 0.97=0.09 BC3B9 Hu 2.58=0.14 2.05=0.75 0.79±0.25 5.06=1.12 3.64=0.36 0.05=0.01 (B128 x
B219) cy 2.18=0.06 4.23=0.23 1.94±0.14 1.60=0.09 3.76=0.52 0.37=0.04 BC3B10 Hu 1.02=0.07 1.55=0.31 1.50±0.22 4.53=0.64 5.31=1.20 0.16=0.03 (B129 x 0.04 6.36=0.28 6.84±0.48 1.65=0.07 3.59=0.50 1.22=0.17 B219) Cy 0.93 =
BC3B11 Hu 2.26=0.16 1.32=0.15 0.58 = 0.07 2.52=0.32 6.89=1.17 0.12=0.02 (B176 x
B219) Cy 1.93=0.10 6.83=0.11 3.56 = 0.23 1.47=0.04 3.95=0.76 0.75=0.11 BC3B12 Hu 1.78=0.09 1.29=0.05 0.72 = 0.05 1.29=0.15 5.57=0.38 0.22=0.03 (B177 x
B219) Cy 1.48 = 0.10 8.31=0.30 5.65±0.46 1.46 = 0.07 3.37=0.43 1.06=0.15
[0229] Se midieron las afinidades de unión del anticuerpo biespecífico anti-BCMA x CD3 (BCMB72) con proteínas BCMA de fusión con Fc (humano, cino y ratón) mediante resonancia de plasma superficial (SPR) usando un sistema Biacore T200 (GE Healthcare, NJ).
[0230] Las células de flujo El 2, 3 y 4 de un chip sensor con estreptavidina derivatizada (GE Healthcare, Prod n° BR-1005-31) fueron inmovilizadas con BCMA humano cino o de ratón de fusión de Fc biotinilada, respectivamente (niveles BCMA inmovilizados entre 12-16 unidades de respuesta (RU); proteínas Fc-BCMA: humana (R&D Systems; Prod n° 193-FC), cino (interno; Cat n° BCMW6.001) y ratón (R&D Systems; Prod n° 593-BC) fueron biotinilados internamente). No se inmovilizó proteína en la célula de flujo 1 y se usó como superficie de referencia. Los experimentos de cinética de unión se realizaron a 25°C en tampón de ejecución (PBS pH 7,4, P20 al 0,005%, EDTA 3 mM). Se preparó BCMB72 en tampón de funcionamiento comenzando desde 100 nM hasta 0,16 nM a diluciones de 5 veces. Estas soluciones se inyectaron durante 5 min (fase de asociación) a 50 pL/min y se controló la disociación durante 15 min mediante tampón de funcionamiento fluido. La superficie de la viruta se regeneró mediante inyecciones cortas de glicina (pH 1,5) y tampón de funcionamiento a 100 pL/min. El análisis de la cinética de unión de las interacciones de BCMB72 con Fc-BCMA se realizó mediante doble referencia de los datos restando las curvas generadas por la inyección de tampón de las curvas de referencia sustraídas para las inyecciones de analito. El ajuste cinético global de los sensogramas se realizó usando un modelo de unión de dos estados usando el software de evaluación Biacore T200 (GE Healthcare, NJ). Los resultados de la afinidad de unión del modelo de unión de dos estados para diferentes especies de BCMA se informan como primer complejo (K D1) y complejo final (K D) (Figura 5).
Ejemplo 10: Activación de células T específicas de la diana y potencia citotóxica de anticuerpos BCMA x CD3 en presencia de líneas celulares inmortalizadas de fondo de mieloma múltiple
[0231] Se evaluó la activación de células T mediada por anticuerpos BCMA x CD3. Brevemente, BCMB72 (BCMA x CD3) y anticuerpos de control (BCMA x nulo y nulo x CD3) se diluyeron a 800 pg/ml en PBS. La titulación se preparó en diluciones seriadas de 4 veces en PBS en una placa de fondo en U de 96 pocillos. La última columna se dejó como PBS solo (control de vehículo).
[0232] Las células diana se cultivaron en antibiótico libre RPMI 1640 suplementado con GlutaMAX, 10% de FBS y 25 mM HEPES (medio de cultivo). El día de preparación (día 1), se contaron las células diana y se centrifugaron 10 millones de células a 1350 rpm durante 3 minutos, después de lo cual se descartaron los sobrenadantes. La mancha de proliferación CellTrace FCSE se reconstituyó en 18 pL de DMSO estéril y 1 pL de la solución se diluyó en 10 ml de PBS estéril. Los sedimentos celulares se resuspendieron en 1 ml de dilución de CFSE y se incubaron a temperatura ambiente durante 8 minutos ocultos de la luz directa. Después de la incubación, se añadió 1 ml de HI FBS a la suspensión celular para apagar el exceso de CFSE. Las células se lavaron dos veces en RPMI-1640 con FBS al 10%. Después de la reconstitución en 10 ml de RPMI, se contaron las células y se recodificó la viabilidad celular en una hoja de cálculo. Las células se diluyeron a 2,2 x 10 A5/ml y se incubaron a 37°C hasta su uso.
[0233] Las células T Pan de donantes normales se descongelaron en baño de agua a 37°C, después de lo cual los contenidos de los viales de congelación se transfirieron a 50 ml de viales cónicos y se reconstituyeron en 15 ml de medio de cultivo frío. A continuación, las células se centrifugaron a 1350 rpm a 4°C durante 3 minutos. Los sobrenadantes se descartaron y los sedimentos celulares se reconstituyeron en 5 a 10 ml de medio de cultivo. Se contaron las células T y se registraron la viabilidad. Después, las células se reconstituyeron en medio de cultivo a 1,1 x 10A6/ml.
[0234] Se añadieron 2x10A5 células diana a pocillos de una placa de 96 pocillos de fondo en U, seguido por Fc bloqueante (a concentración final de 2 mg/ml). Todas las líneas celulares se incubaron a temperatura ambiente durante 10 minutos para bloquear la actividad del receptor Fc. Se añadieron 1x10A5 células T a los pocillos (relación efector:diana 5:1). Después de mezclar las células diana y T, se añadieron a cada pocillo 20 ml de diluciones de anticuerpos BCMA x c D3. Las placas se incubaron a 37°C con 5% de CO2 durante 48 horas.
[0235] Dos días después, las placas se centrifugaron a 1350 rpm durante 3 minutos a 4°C y 100 pL de los sobrenadantes se transfirieron a una placa separada y se almacenaron a -80°C para el ensayo de liberación de citoquinas. Las células se lavaron en 200 ml de PBS y se incubaron en 50 ml de tinción viva/muerta de IR cercano (dilución 1:200) y anticuerpo anti-CD25 PE (dilución 1:50) durante 20 minutos a temperatura ambiente. Luego, las células se lavaron una vez en 200 pl de tampón FACS y finalmente se reconstituyeron en 150 pl de tampón FACS. Las células se analizaron usando FACSCanto II y FlowJo 7,6 para la citotoxicidad diana (% diana) y la activación de células T CD25+ (% células T vivas). La gráfica y el ajuste de los datos se realizaron en GraphPad Prism 6 usando regresión no lineal con función de pendiente variable (cuatro parámetros) usando el método de mínimos cuadrados.
[0236] La Figura 8 muestra que BCMB72 promueve la activación constante de células T específicas de la diana, según lo evaluado por la regulación positiva de CD25 en la superficie de las células T. Se utilizó bloqueador de Fc para prevenir la unión de anticuerpos a células diana dependiente del receptor de Fc. En general, los puntos de datos se alinearon estrechamente a lo largo de la curva de ajuste generada y hubo poca variabilidad entre los donantes de células T. Se logró una activación máxima del 45 - 85% para las células BCMA+ y del 4 al 10% (equivalente a los niveles de fondo) para las células BCMA-. El resumen de los valores CE50 y máxima activación de células T a partir de dos experimentos independientes utilizando células T de múltiples donantes normales se muestra en la Figura 9.
[0237] La Figura 10 muestra que BCMB72 tenía consistentemente fuerte citotoxicidad contra líneas celulares BCMA+. Se usó bloqueador de Fc para prevenir la unión de BCMB72 dependiente del receptor de Fc a las células diana. En general, los puntos de datos se alinearon estrechamente a lo largo de la curva de ajuste generada y hubo poca variabilidad entre los donantes de células T. Se logró una lisis máxima de 62 a 97% para las células BCMA+ y del 4 al 18% para las células BCMA-. El resumen de los valores CE50 y máximos de lisis a partir de dos experimentos independientes usando células T a partir de múltiples donantes normales se muestra en la Figura 11.
[0238] Los otros seis anticuerpos BCMA X CD3 mostraron citotoxicidad máxima del 83 al 93% (Figura 12 A) y activación de células T en el rango de 74 a 83% para células BCMA+ H929 usando dos células T de donantes diferentes (Figura 12B). Estas seis moléculas de anticuerpo BCMA x CD3 son potentes para matar la célula diana BCMA+ a un valor de CE50 que varía de 0,04 a 0,09 nM.
Ejemplo 11: Eficacia de unión de BCMB72 en líneas celulares BCMA+
[0239] Se evaluaron los valores de CE50 para la unión de BCMB72 a varias líneas celulares BCMA+ de origen maligno. Brevemente, el anticuerpo biespecífico BCMB72 (BCMA x CD3) se diluyó a 750 pg/ml en PBS. La titulación se preparó en diluciones en serie de 3 veces en PBS en una placa de fondo en U de 96 pocillos. La última columna se dejó como PBS solo (control de vehículo). Las células diana H929 se cultivaron en medio RPMI 1640 sin antibiótico complementado con GlutaMAX, FBS al 10% y HEPES 25 mM (medio de cultivo). Para el ensayo, se midieron la densidad y la viabilidad de las células diana y luego las células se centrifugaron a 1000 rpm durante 5 minutos a 4°C. A continuación, se lavaron los sedimentos celulares en 10 ml de PBS y se centrifugaron de nuevo a 1000 rpm durante 5 minutos. Las células se resuspendieron en PBS a 5,5x10A5 células/ml y 90 pL de suspensión celular se dividió en alícuotas por pocillo de una placa de 96 pocillos de fondo en U, seguido de 10 pL/pocillo de diluciones BCMB72. Las placas se incubaron a 4°C durante 1 hora en la oscuridad, luego se centrifugaron a 1000 rpm durante 5 minutos y se descartaron los sobrenadantes. Los sedimentos celulares se lavaron dos veces en 200 pl de tampón FACS. El anticuerpo secundario marcado con PE contra IgG4 Fc humana se disolvió en tampón FACS a 1:25 y se añadieron 50 pl de la mezcla a los pocillos correspondientes. Las muestras se incubaron durante 20 minutos a 4°C, se lavaron en tampón FACS como se describió anteriormente y se reconstituyeron en 150 pl de tampón FACS para análisis en FACSCanto II. Los datos se analizaron usando FlowJo 7,6 para la unión de BCMB72 y la gráfica y el ajuste de los datos se realizaron en GraphPad Prism 6 usando regresión no lineal con función de pendiente variable usando el método de mínimos cuadrados.
[0240] Como se ve en la Figura 6, BCMB72 puede unirse a todas las líneas celulares BCMA+ que se examinaron. La CE50 para la unión a células H929 era 14,7 nM, a las células MM 1R era 9,74 nM, a las células Ej M era 17,5 nM, a las células LP1 era 22,3 nM y a las células U-2932 era 7,92 nM.
Ejemplo 12: Análisis de la expresión de BCMA y la unión de BCMB72 en sangre completa ex vivo de donantes humanos normales
[0241] Se evaluó la expresión de la unión de BCMA y BCMB72 en leucocitos en sangre completa ex vivo de tres donantes humanos normales. Brevemente, se almacenó sangre periférica reciente de donantes humanos normales en tubos recubiertos con heparina antes del experimento. La sangre se pipeteó en una placa de fondo en U de 96 pocillos en alícuotas de 100 pl. Los anticuerpos de tinción se prepararon en una mezcla maestra, como se indica en la hoja de cálculo experimental. La mezcla maestra se agregó directamente a la sangre, junto con anticuerpos contra BCMA o BCMB72. Después de 30 minutos de incubación a temperatura ambiente, la placa con la sangre se centrifugó a 1350 rpm durante 3 minutos a 4°C. El plasma sobrenadante se descartó y los sedimentos se sometieron a cuatro rondas consecutivas de lisis de RBC, con incubaciones de 5 minutos entre cada lavado. Una vez completada la lisis, los sedimentos se lavaron una vez con PBS y luego se tiñeron en PBS con tinción de IR cercano vivo/muerto 1:200 y PE anti-IgG4 1:50 (solo para pocillos con BCMB72). Las placas se incubaron adicionalmente durante 15 minutos a temperatura ambiente. Posteriormente, las muestras se lavaron con 200 pl de tampón FACS y finalmente se reconstituyeron en 150 pl de tampón FACS para su análisis en LSRFortessa. Se recogieron aproximadamente 100.000 eventos de cada pocillo. El análisis se realizó en FlowJo 7,6.
[0242] Como se muestra en la Figura 7, no se observó expresión BMCA sobre los linfocitos, monocitos, granulocitos o DCs plasmacitoides en tres donantes normales. BCMB72 mostró unión a células T CD3+ en los tres donantes con intensidad variable entre donantes. BCMB72 no se unió a ningún otro tipo de célula probado en este ensayo.
Ejemplo 13: Efecto BCMB72 en el perfil de citoquinas
[0243] El perfil de citoquinas en el sobrenadante de la célula T mediada por matar ensayos se evaluó mediante BCMB72 y los anticuerpos de control. Las células T y los anticuerpos se sembraron en placa como en el ensayo de citotoxicidad mediado por células T (véase el Ejemplo 10). Después de 48 horas de incubación, se recogieron los sobrenadantes celulares y se midieron diferentes citocinas (Plex 10/30) usando un ELISA basado en MSD. Los niveles de citocinas se expresaron como pg/mL y la representación gráfica y el ajuste de los datos se realizaron en GraphPad Prism 6 utilizando regresión no lineal con función de pendiente variable (cuatro parámetros). Los valores CE50 de seis citocinas de la línea celular RPMI8226 utilizando seis donantes de células T se muestran en la Figura 13. Los datos muestran liberación de citoquina significativa resultante de la activación de células T. Se observó una liberación baja/nula de citocinas con los anticuerpos de control (datos no mostrados).
Ejemplo 14: Comparación funcional de BCMB72 producidas por HEK y CHO (líneas celulares estables y transitorias) en la activación de células T y la muerte de células diana mediada por células T
[0244] Los anticuerpos biespecíficos producidos en diferentes células y bajo diferentes modos de expresión pueden variar en actividad. Por tanto, se evaluó la eficacia in vitro de BCMB72 producida en células HEK (expresión transitoria) o CHO (expresión transitoria o estable).
[0245] BCMB72 se diluyó a 800 pg/ml en PBS. Como se indica en cada experimento, la titulación se preparó en diluciones seriadas de 3 o 4 veces en PBS en una placa de fondo en U de 96 pocillos. La última columna se dejó como PBS solo (control de vehículo).
[0246] Las células diana H929 se cultivaron en medio RPMI 1640 libre de antibióticos suplementado con GlutaMAX, 10% de FBS y 25 mM HEPES (medio de cultivo). El día de preparación (día 1), se contaron las células y se centrifugaron 10 millones de células a 1350 rpm durante 3 minutos y se descartaron los sobrenadantes. La mancha de proliferación de CellTrace FCSE se reconstituyó en 18 pL de DMSO estéril y 1 pL de la solución se diluyó en 10 ml de PBS estéril. El sedimento de células H929 se resuspendió en 1 ml de dilución de CFSE y se incubó a temperatura ambiente durante 8 minutos escondido de la luz directa. Después de la incubación, se añadió 1 ml de HI FBS a la suspensión celular para apagar el exceso de CFSE. Las células se lavaron dos veces en 1640 RPMI con FBS al 10%. Después de la reconstitución en 10 ml de RPMI, se contaron las células y se recodificó la viabilidad celular en una hoja de cálculo. Las células se diluyeron a la concentración indicada y se incubaron a 37°C hasta su uso.
[0247] Las células T de donantes normales se descongelaron en baño de agua a 37°C, después de lo cual el contenido del vial se transfirió a un vial cónico de50 ml y se reconstituyó en 15 ml de medio de cultivo frío. A continuación, las células se centrifugaron a 1350 rpm a 4°C durante 3 minutos. Los sobrenadantes se descartaron y los sedimentos celulares se reconstituyeron en 5 a 10 ml de medio de cultivo. Se contaron las células T y se reconstituyeron en medio de cultivo a la concentración apropiada (ver hoja de cálculo para cada experimento).
[0248] Se añadieron células H929 a los pozos, seguido por las células T (5:1 relación de efector:diana). En este conjunto de estudios no se utilizó ningún bloqueador de Fc. Después de mezclar las células diana y T, se añadieron a cada pocillo 20 pl de diluciones de BCMB72. Las placas se incubaron a 37°C con 5% de CO2 durante 48 horas. Después de 2 días, las placas que contenían células se centrifugaron y los sobrenadantes se desecharon o se almacenaron para el ensayo de liberación de citocinas. Las células se lavaron en 200 pL de PBS y se incubaron en 50 |jL de mancha viva/muerta de IR cercano (dilución 1:200) y anticuerpo PE anti-CD25 (dilución 1:50) durante 20 minutos a temperatura ambiente. Luego, las células se lavaron una vez en 200 j l de tampón FACS y finalmente se reconstituyeron en 150 j l de tampón FACS. Las células se analizaron mediante citometría de flujo el mismo día usando FACSCanto II y se analizaron en FlowJo 7,6 para la citotoxicidad diana (% diana) y la activación de células T CD25+ (% células T vivas). La representación gráfica y el ajuste de los datos se realizaron en GraphPad Prism 6 utilizando regresión no lineal con función de pendiente variable (cuatro parámetros) y método de mínimos cuadrados.
[0249] Como se ve en la Figura 14, BCMB72 producidas en células HEK y las producidas en células CHO desempeñan prácticamente idénticamente en el ensayo de la redirección de las células T en términos de citotoxicidad para las células diana y la estimulación de células T. En general, se lograron una muerte máxima del 85% y una activación de células T del 80%. Media de los valores CE50 para citotoxicidad fueron 0,29 nM para BCMB72 producida en células HEK y 0,42- 0,47 nM para BCMB72 producida en células CHO. Los valores medios CE50 para las células T de activación fueron 0,28 nM para BCMB72 producida en células HEK y 0,37 a 0,41 nM para BCMB72 producida en células CHO. Análisis comparativo usando la prueba t de Student no mostró significación estadística entre los valores CE50.
Ejemplo 15: Activación de la señalización de P38 por BCMB72
[0250] Tanto BAFF como APRIL se unen a dos receptores BCMA (antígeno de maduración de células B, TNFRSF 17) y TACI (activador de transmembrana e interactor CAML, TNFRSF 13b). El compromiso de BCMA activa la vía de señalización JNK y P38 MAPK. Es posible que el anticuerpo biespecífico BCMA X CD3, BCMB72, pueda ejercer un efecto agonista hacia BCMA. Este estudio consta de dos partes. 1. Desarrollo de un ensayo de análisis occidental simple para monitorear los cambios de P38a MAPK en células H929 o MM1.R después del tratamiento con APRIL o BAFF. 2. Utilizar el ensayo desarrollado recientemente para comprobar si BCMB72 tiene algún efecto agonista hacia BCMA.
Tratamiento celular
[0251] Se sembraron células H929 o MM1.R/ml en el suero medio RPMI 1,5e6 libre durante 24 horas a 37°C en presencia de 5% de CO2 antes del tratamiento. El día del tratamiento, las células se centrifugaron y se resuspendieron en RPMI libre de suero a 1,5e6/ml. Para el ensayo del curso del tiempo, las células se dividieron en alícuotas en 5 ml por tubo para 10 tubos. Cada tubo de células se trató con 1000 ng/ml de APRIL (R&D Systems Cat n° 5860-AP-010) o 1000ng/ml de BAFF (R&D Systems Cat n° 2149 -BF-010) durante 0, 5, 15, 30 y 60 min, respectivamente a 37°C en presencia de 5% de CO2. Después de la incubación, las células se sedimentaron inmediatamente y se congelaron a -80°C para preparar el lisado celular. Para el ensayo del efecto agonista de BCMB72, los grupos de tratamiento de células H929 se enumeraron en la Tabla 13. El ensayo del efecto agonista de BCMB72 se realizó dos veces.
Tabla 13. Grupos de tratamiento para el ensayo del efecto agonista de BCMB72
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Preparación de lisado celular para el análisis Western simple
[0252] Las células se lisaron con tampón RIPA, que contiene inhibidores de fosfatasa y proteasa. La concentración de proteína se midió en un lector de microplacas SpectraMax Plus 384 (Molecular Devices, Sunnyvale, CA, EE.UU.) Usando el ensayo de proteína BioRad DC (BioRad n° 500-0112) y estándares de albúmina de suero bovino.
Análisis de Western simple
[0253] Los análisis Western simples se realizaron con Wes-Rabbit (12-230 KDa) Master kit (ProteinSimple # PSMK01) de acuerdo con el manual del usuario ProteinSimple. En resumen, las muestras de lisado celular se mezclaron con una mezcla maestra hasta una concentración final de tampón de muestra 1x, marcas de peso molecular fluorescentes 1x y ditiotreitol (DTT) 40 mM y luego se calentaron a 95°C durante 5 min. También se dispensaron las muestras, reactivo de bloqueo, anticuerpos primarios fósforo-p38 MAPK (ThermoFisher: VWR n° MA5-15182) o Actina-beta (Señalización celular, n° 8457S), anticuerpos secundarios conjugados con HRP, sustrato quimioluminiscente y matrices de separación y apilamiento también se administraron a los pocillos designados en una microplaca Simple Wes. Después de la carga de la placa, los pasos de electroforesis de separación e inmunodetección se llevaron a cabo en el sistema capilar y fueron completamente automatizados. Durante la electroforesis, las proteínas se separaron en función del peso molecular a través de las matrices de apilamiento y separación y se inmovilizaron en la pared capilar utilizando química de captura fotoactivada patentada. Los anticuerpos primarios se diluyeron 1:50 con diluyente de anticuerpos II (ProteinSimple n° 042-203). Las proteínas diana se inmunoprobaron con anticuerpos primarios durante 60 min, seguido de anticuerpos secundarios conjugados con HRP. El análisis Western Simon-simple se realiza a temperatura ambiente y se utilizaron los ajustes predeterminados del instrumento. La imagen digital se analizó con el software Compass (ProteinSimple) y los datos cuantificados de la proteína detectada se informaron como peso molecular, intensidad de señal/pico y área de pico.
Resultados
[0254] En base a la información obtenida del estudio del curso del tiempo, se realizó un ensayo agonista BCMB72 con células H929 usando 15 min de incubación de punto final. Las señales de p38 MAPK se normalizaron mediante señales de beta actina humana. La media de las señales de p38 MAPK normalizadas de dos ensayos se muestra en la Figura 15. El ensayo agonista BCMB72 demostró que BCMB72 no tiene ningún efecto agonista hacia BCMA en células H929.
Ejemplo 16: Señalización de NFkB por BCMB72
[0255] El BCMA es un receptor de superficie que puede provocar la señalización de NF-kB en respuesta a ligandos endógenos. El efecto de la unión de BCMB72 a BCMA sobre la activación de la vía NF-kB se evaluó utilizando la línea celular indicadora que expresa BCMA que expresa fosfatasa alcalina (SEAP) bajo el promotor NFkB.
[0256] Las células se cultivaron en medio DMEM suplementado con Glutamax y 10% de FBS (medio de cultivo). En la noche anterior al experimento, las células se recolectaron mediante tripsinización (5 minutos en tripsina al 0,25% precalentada a 37°C) y se lavaron en 30 ml de medio de cultivo. A continuación, las células se centrifugaron a 1.000 rpm durante 5 minutos a 4°C y se reconstituyeron en DMEM sin suero (con GlutaMax) a 2,5x10A5 células/ml. Se añadieron 5x10A4 células a los pocillos de una placa de fondo plano de 96 pocillos y se incubaron a 37°C durante 16 horas.
[0257] A la mañana siguiente, se agregaron varios reactivos estimulantes (TNFa, APRIL, BCMB72) a los pocillos correspondientes (ver mapas de placas experimentales) y las placas se incubaron a 37°C durante 16 horas, 24 horas o 48 horas adicionales, que representaron puntos de señalización temprana, media y tardía, respectivamente. Después de cada punto de tiempo, se recogieron 10 pl de medio de cultivo acondicionado de los pocillos, se transfirieron a una placa sólida de 96 pocillos proporcionada en el kit SEAP (Cayman, 600272) y se cubrieron con la tapa. Los estándares SEAP se prepararon diluyendo el estándar a granel (5 U/ml) 1:10 en DMEM sin suero (con GlutaMax) y luego preparando diluciones en serie 1:2; el rango de dilución es 50-0,78 mU/ml. La placa con las muestras se incubó a 65°C durante 30 minutos para inactivar la fosfatasa alcalina endógena; SEAP expresado en este ensayo es estable en estas condiciones de incubación. Se agregaron 10 pl de diluciones estándar a los pocillos apropiados después de que las placas se incubaron a temperatura ambiente. Se añadieron 50 pl de solución de sustrato a todos los pocillos y las muestras se agitaron brevemente para distribuir la solución en los pocillos. Las muestras se incubaron durante 20-30 minutos y se evaluó la quimioluminiscencia usando el Lector Multilabel PerkinElmer EnVision 2104. Todas las lecturas de luminiscencia se convirtieron a concentraciones de unidades de actividad basadas en una curva estándar y los valores se analizaron en Microsoft Excel 2010 y se importaron a Graph Prism 6 para su análisis gráfico.
[0258] La Figura 16 demuestra que mientras que APRIL fue capaz de estimular BCMA a concentraciones tan bajas como 0,46 nM, en general, BCMB72 no activó la vía NF-kB en células transducidas con BCMA a concentraciones por debajo de 10 nM La activación modesta dependiente de BCMB72 fue observada a concentraciones altas (44-133 nM) de BCMB72.
Ejemplo 17: Efecto de la adición exógena de dom inio extracelular de BCMA sobre la activación de células T en ausencia de células diana
[0259] El dominio extracelular (ECD) de BCMA puede formar trímeros en solución. Por lo tanto, existe la posibilidad de que múltiples anticuerpos biespecíficos puedan unirse a trímeros ECD de BCMA y complejos de TCR entrecruzados en ausencia de células diana. Esto, a su vez, podría activar las células T de forma independiente de la diana. Este estudio examinó si la ECD de BCMA añadida de forma exógena puede desencadenar la activación de las células T al nivel de expresión de CD25 sin interacción con las células diana.
[0260] Se diluyeron BCMB72 (BCMA x CD3) y un control (nulo x CD3) hasta 800 pg/ml en PBS. La titulación se preparó en diluciones seriadas de 3 veces en PBS en una placa de fondo en U de 96 pocillos. La última columna se dejó como PBS solo (control de vehículo).
[0261] BCMA soluble ECD (sBCMA) se diluyó a 36 pg/ml (6,67 pm) en PBS. La titulación se preparó en diluciones seriadas de 3 veces en PBS en una placa de fondo en U de 96 pocillos. El pocillo superior se dejó como PBS solo (control de vehículo).
[0262] Las células T Pan de donantes normales se descongelaron en baño de agua a 37°C, después de lo cual los contenidos de los viales de congelación se transfirieron a 50 ml de viales cónicos y se reconstituyeron en 30 ml de medio de cultivo frío. A continuación, las células se centrifugaron a 1350 rpm a 4°C durante 3 minutos. Los sobrenadantes se descartaron y los sedimentos celulares se reconstituyeron en l0 ml de medio de cultivo. Se contaron las células T y se registró la viabilidad. A continuación, las células se reconstituyeron en medio de cultivo a 0,525 x 10A/ml.
[0263] Se añadieron 1x10A5 células T (190 ml) a los pocillos, seguido de 5 pl de diluciones de sBCMA y 5 pl de diluciones de BCMB72. Las placas se incubaron a 37°C con 5% de CO2 durante 48 horas.
[0264] Después de dos días, los las placas se centrifugaron a 1500 rpm durante 3 minutos a 4°C y los sobrenadantes se descartaron. Los sedimentos celulares se lavaron en 200 pl de PBS y se incubaron en 50 pl de tinción viva/muerta de IR cercano (dilución 1:200) y anticuerpo antiCD25 PE (dilución 1:50) durante 20 minutos a temperatura ambiente. Luego, las células se lavaron una vez en 200 pl de tampón FACS y finalmente se reconstituyeron en 150 pl de tampón FACS. Las células se analizaron usando FACSCanto II y FlowJo 7,6 para la activación de células T CD25+ (% de células T vivas). La representación gráfica y el ajuste de los datos se realizaron en GraphPad Prism 6 usando regresión no lineal con el método de ajuste por mínimos cuadrados.
[0265] Las células T de donantes normales no mostraron activación mediada por ECD sBCMA en presencia de BCMB72. Se observó una activación débil de un pequeño porcentaje de células T (10-15%) a altas concentraciones (>40 nM) de BCMB72 de una manera independiente de sBCMA (Figura 17).
Ejemplo 18: Efecto de ECD soluble de BCMA, APRIL y BAFF sobre la activación de células T y la citotoxicidad dependiente de BCMB72.
[0266] La BCMA ECD soluble puede servir como un sumidero de anticuerpos BCMA x CD3, mientras que APRIL y BAFF pueden ser inhibidores competitivos de la interacción. entre el receptor de superficie y los anticuerpos BCMA x CD3. Los efectos de BCMA ECD soluble y ligandos endógenos APRIL y BAFF sobre la potencia citotóxica in vitro de la muerte celular dependiente de BCMB72 se evaluaron en ensayos de redireccionamiento de células T utilizando la línea celular inmortalizada H929 y células T Pan del donante normal M7077.
[0267] BCMB72 se diluyó a 800 pg/ml en PBS. La titulación se preparó en diluciones seriadas de 3 veces en PBS en una placa de fondo en U de 96 pocillos. La última columna se dejó como PBS solo (control de vehículo). BCMA ECD soluble se diluyó a 9 pg/ml y APRIL y BAFF se diluyeron a 10 pg/ml. Las titulaciones para ambos reactivos se prepararon en diluciones seriadas de 3 veces en PBS en una placa con fondo en U de 96 pocillos.
[0268] Las células diana H929 se cultivaron en medio RPMI 1640 libre de antibióticos suplementado con GlutaMAX, 10% de FBS y 25 mM HEPES (medio de cultivo). En el día de preparación (día 1), se contaron las células diana y se centrifugaron 10 millones de células a 1350 rpm durante 3 minutos, después de lo cual se descartaron los sobrenadantes. La mancha de proliferación de CellTrace FCSE se reconstituyó en 18 pL de DMSO estéril y 1 pL de la solución se diluyó en 10 ml de PBS estéril. Los sedimentos celulares se resuspendieron en 1 ml de dilución de CFSE y se incubaron a temperatura ambiente durante 8 minutos ocultos de la luz directa. Después de la incubación, se añadió 1 ml de HI FBS a la suspensión celular para apagar el exceso de CFSE. Las células se lavaron dos veces en RPMI-1640 con FBS al 10%. Después de la reconstitución en 10 ml de RPMI, se contaron las células y se recodificó la viabilidad celular en una hoja de cálculo. Las células se diluyeron a 2,2 x 10A5/ml y se incubaron a 37°C hasta su uso.
[0269] Las células T Pan de donante normal se descongelaron en baño de agua de 37°C, después de lo cual los contenidos de los viales de congelación se transfirieron a viales cónicos de 50 ml y se reconstituyeron en 30 ml de medio de cultivo frío. A continuación, las células se centrifugaron a 1350 rpm a 4°C durante 3 minutos. Los sobrenadantes se descartaron y los sedimentos celulares se reconstituyeron en 10 ml de medio de cultivo. Se contaron las células T y se registró la viabilidad. A continuación, las células se reconstituyeron en medio de cultivo a 1,1 x 10A/ml.
[0270] 2 x 10A5 de células H929 se añadieron a los pocillos de una placa de fondo en U de 96 pocillos; en este estudio no fue necesaria la incubación con bloqueador Fc. Se añadieron 1x10A5 células T a los pocillos (relación efector:diana 5:1). Después de mezclar las células diana y T, se añadieron a los pocillos 20 pl de sBCMA, APRIL o BAFF, seguido de 5 pl de diluciones de anticuerpos. Las placas se incubaron a 37°C con 5% de CO2 durante 48 horas.
[0271] Después de 2 días, las placas se centrifugaron a 1500 rpm durante 3 minutos a 4°C y se descartaron los sobrenadantes. Las células se lavaron en 200 pl de PBS y se incubaron en 50 pl de tinción viva/muerta de IR cercano (dilución 1:200) y anticuerpo anti-CD25 PE (dilución 1:50) durante 20 minutos a temperatura ambiente. Luego, las células se lavaron una vez en 200 ml de tampón FACS y finalmente se reconstituyeron en 150 pl de tampón FACS. Las células se analizaron usando FACSCanto II y FlowJo 7,6 para la citotoxicidad diana (% diana) y la activación de células T CD25+ (% células T vivas). La gráfica y el ajuste de los datos se realizaron en GraphPad Prism 6 usando regresión no lineal con función de pendiente variable (cuatro parámetros) usando el método de mínimos cuadrados.
[0272] BCMB72 era capaz de ejercer citotoxicidad en células H929 en presencia de BCMA ECD soluble, con sólo un efecto menor (aumento de 2 veces) en CE50 a dosis elevadas (>160 nm) de sBCMA ECD; la activación de las células T se vio afectada de manera similar (ver Figura 18A y 18D). ABRIL aumentó los valores CE50 de citotoxicidad de las células y la activación de células T de seis veces en dosis altas (46 nM), mientras que se afecta mínimamente el ensayo a dosis más bajas (véase la Figura 18B y 18E). La muerte máxima no se vio afectada por sBCMA o APRIL. Por el contrario, BAFF exógeno no tuvo ningún impacto sobre la citotoxicidad mediada por BCMB72 a concentraciones de hasta 51 nM (véase la Figura 18C). El potencial de activación de las células T en todos los casos se correlacionó bien con los datos de destrucción, como se esperaba (ver Figura 18F).
Ejemplo 19: Competencia de BCMB72, APRIL y BAFF para la unión a BCMA in vitro
[0273] Los dos ligandos TNF, APRIL y BAFF pueden unirse a BCMA e inducir una cascada de señalización que conduce a la célula de supervivencia y la proliferación. El dominio extracelular de BCMA es un fragmento corto de 54 aminoácidos que se une a estos dos ligandos, así como a los anticuerpos producidos contra este motivo. Aquí, se evaluó la naturaleza competitiva de estos ligandos contra BCMB72.
[0274] El ensayo se configuró en un formato basado en ELISA. En preparación para el ensayo de competición, BCMA-Fc iba a ser marcado con MSD SulfoTag. Se reconstituyó un vial de 50 pg de BCMA-Fc en 500 pl de PBS para producir 0,1 g/ml (monómero 3,125 uM). Se disolvieron 150 nmol de NHS-sulfoTag en 50 ul de agua para producir una solución 3 mM. Se añadieron 5,2 ul de NHS-SulfoTag 3 mM (15,6 nmol) a 500 ul de BCMA-Fc (monómero de 1,56nmol) para una reacción de marcaje en exceso de 10x. La reacción se dejó durante 2 h a TA en la oscuridad. Se añadieron 50 ul de tris 1 M para apagar el NHS sin reaccionar. Se eliminó el exceso de Sulfotag y tris mediante intercambio de tampón sobre columna de centrifugación Zeba de 7k MWCO equilibrada con PBS. El volumen final fue ~ 30 ul, por lo tanto, el SulfoTagBCMA-Fc final se usa como 2,5 uM.
[0275] Para el ensayo de competición, anti-BAFF (100 ug) y anti-APRIL (100 ug) se reconstituyeron en 200uL PBS para producir soluciones madre de 0,5 mg/ml. Se diluyeron 30 ul (6 ug) de anti-APRIL y anti-BAFF cada uno en 2,97 ml de PBS para producir soluciones de 2 ug/ml. A cada pocillo de una placa de alta unión de MSD de 96 pocillos, se le añadieron 25 ul 2ug/ml de anti-APRIL. A cada pocillo de una segunda placa de alta unión de MSD de 96 pocillos, se le añadieron 25 ul 2ug/mL de anti-BAFF. Las placas se mantuvieron a 4°C durante la noche para inmovilizar los anticuerpos. Se vertieron placas recubiertas con anti-APRIL y anti-BAFF y se agregaron 300uL/pocillo de SuperBlock. Después de 1 hora a TA de bloqueo, las placas se lavaron 3 veces con PBS-T. Se resuspendieron 10 pg de cada APRIL y BAFF recombinantes en 100 pl de PBS para producir soluciones de 0,1 g/ml. Se prepararon soluciones de 3 ml 2 pg/ml de cada APRIL y BAFF diluyendo 60 pl de proteína recién reconstituida en 2,94 ml de SuperBlock. Se añadieron 25 ul 2 ug/ml de APRIL a cada pocillo de la placa revestida con anti-APRIL y se añadieron 25 ul 2 ug/ml de BAFF a cada pocillo de la placa revestida con anti-BAFF. Después de 1 hora de captura a temperatura ambiente, las placas se lavaron 3 veces con PBS-T. Se reconstituyeron 500 pg de anti-BCMA (R&D Sys Mab193) en 1 ml de PBS para producir una solución madre de 0,5 mg/ml (3,3 pM). Se diluyeron anti-BCMA Mab193, BCMB72.004 y un anticuerpo de control (nulo x CD3) a 1 uM en superbloque. Se preparó una serie de diluciones seriadas triples de 11 pt mezclando 100 ul de anticuerpo en 200 ul de SuperBlock. Se prepararon 6 ml de SulfoTag-BCMA-FC 30 nM diluyendo 72 ul de la proteína anterior en 5,928 ml de SuperBlock. Se añadieron 25 ul de cada anticuerpo del paso 11 a cada pocillo de las placas capturadas con APRIL/bA f F de acuerdo con el mapa de placas de la figura 1. Se añadieron 25 ul de Sulfotag-BCMA-Fc 30 nM a cada pocillo de ambas placas. Después de 1 hora a TA, las placas se lavaron 3 veces con PBS-T. Se añadieron 150 ul de tampón T de lectura MSD 1x a cada pocillo y las placas se escanearon en el generador de imágenes del sector 6000. El experimento se repitió exactamente como se describió anteriormente para dar un segundo conjunto independiente de resultados.
[0276] Como puede verse en la Figura 19, cuando se incuba con cantidades crecientes de BCMB72 pero no el anticuerpo de control (nulo x CD3), se evitó que la proteína BCMA-Fc se uniera a la placa APRIL y BAFF. La observación es consistente entre dos experimentos independientes, cada uno con tres repeticiones.
Ejemplo 20: Unión de BCMB72 y citotoxicidad de células positivas CD138 de médula ósea de pacientes con mieloma múltiple.
[0277] Para evaluar la potencia de BCMB72 en muestras primarias de pacientes con mieloma múltiple, hemos probado este anticuerpo en un ensayo de matanza citotóxico usando múltiples muestras de mieloma congelado de médula ósea a partir de 5 pacientes y las células T de donantes sanos. También se midieron la unión de anticuerpos y el potencial de activación de las células T.
Ensayo de unión a BCMB72
[0278] Se tomaron alícuotas de 100 |jL de suspensión celular por pocilio en una placa de 96 pocilios de fondo en U, seguido de 95 j l de cultivo medio. A continuación, se añadieron a los pocillos 5 j l de diluciones seriadas de BCMB72 o controles y se incubó la placa durante 1 hora a 4°C. Después de la tinción, las células se centrifugaron a 1.200 rpm durante 3 minutos y se lavaron una vez en 200 j l de PBS. Las células se centrifugaron una vez más; los sobrenadantes se descartaron, después de lo cual, los sedimentos se reconstituyeron en 50 j l de mancha viva/muerta cercana a IR (dilución 1:200), anticuerpo Fc PE anti-IgG4 humano (dilución 1:50), anti-CD138 (diluciones MI15 1:50 y DL-101 1:50) y se incubó durante 20 minutos a temperatura ambiente en la oscuridad. A continuación, las células se centrifugaron y lavaron en 200 j l de tampón FACS y finalmente se reconstituyeron en 150 j l de tampón FACS. Las muestras se analizaron usando FACSCanto II y FlowJo 7,6 para determinar la intensidad de unión de BCMB72 en CD138+ MNC. El ajuste de datos se realizó en GraphPad Prism 6 usando regresión no lineal con función de pendiente variable (cuatro parámetros) usando el método de mínimos cuadrados.
Ensayo de redirección de células T
[0279] Se añadieron 1x10A5 células diana a pocillos de una placa de 96 pocillos de fondo en U, seguido de 1x10A5 células T (relación aproximada de efector:diana 5:1, proporcionó recuento de células plasmáticas promedio al 20% en mastocitos derivados de la médula ósea). Después de mezclar las células diana y T, se añadieron 5 j l de diluciones de BCMB72 a cada pocillo. Las placas se incubaron a 37°C con 5% de CO2 durante 48 horas.
[0280] Dos días después, las placas se centrifugaron y se descartaron los sobrenadantes. Las células se lavaron en 200 j l de PBS y se incubaron en 50 j l de PBS con tinción viva/muerta de IR cercano (dilución 1:200), anti-CD138 (diluciones MI15 1:50 y DL-101 1:50), anti-TCR alii (dilución 1:50) y anti-CD25 PE (dilución 1:50) durante 20 minutos a temperatura ambiente. Luego, las células se lavaron una vez en 200 j l de tampón FACS y finalmente se reconstituyeron en 150 j l de tampón FACS. Las células se analizaron usando FACSCanto II y FlowJo 7,6 para la citotoxicidad de las células plasmáticas (% de células CD138+ muertas) y activación de células T CD25+ (% de células T vivas). La gráfica y el ajuste de los datos se realizaron en GraphPad Prism 6 usando regresión no lineal con función de pendiente variable (cuatro parámetros) usando el método de mínimos cuadrados.
Resultados
[0281] La Figura 20 muestra que BCMB72 se une e induce la muerte de todas las muestras de pacientes de una manera dependiente de la dosis después de 48 h, como lo demuestra la pérdida de células plasmáticas CD138+. Los datos de activación de células T se correlacionan bien con los datos de muerte como se esperaba. La CE50 media para la activación de células T estaba en el rango de 1 nM. Estos datos confirman que BCMB72 puede destruir células primarias de la médula ósea del mieloma múltiple in vitro.
Ejemplo 21: Eficacia anti-tumoral de BCMB72 en prevención de tumorigénesis de xenoinjertos de mieloma m últiple humano H929 en ratones NSG humanizados por PBMC
[0282] Este estudio evaluó la eficacia de BCMB72 en la prevención de la tumorigénesis de xenoinjertos de mieloma múltiple humano H929 (MM) en PBMC (células mononucleares sanguíneas periféricas)-ratones NSG humanizados (NOD SCID Gamma). El ratón NSG es una cepa inmunodeprimida que carece de células T, B funcionales maduras y células asesinas naturales (NK). Ratones hembra NSG de edad ajustada se inyectaron por vía intravenosa con 1 x 10A7 PBMC humana en día de estudio -7. En el día 1 post inoculación PBMC, cada ratón fue por vía subcutánea (sc) implantado con células MM humanas H929 (5 x 106 células en 200 j L de PBS) a la derecha del flanco dorsal posterior, seguido de (IV) la administración intravenosa de PBS y BCMB72 0,1 jg (0,005 mg/kg), 0,5 jg (0,025 mg/kg) y 1 jg (0,05 mg/kg) por animal. El control de PBS y BCMB72 se administraron cada dos días o cada tres días durante un total de cinco tratamientos. Los tumores H929 sc fueron detectables en los grupos tratados con PBS y 0,1 jg BCMB72 tan pronto como día 8 después de implante con células tumorales. Los tumores de estos dos grupos continuaron creciendo hasta que los volúmenes tumorales medios fueron >500 mm3 el día 22. Para el día 24, el volumen tumoral medio del grupo de control PBS había excedido los 1000 mm3. Curiosamente, los tumores sc H929 no crecieron en los ratones tratados con 0,5 jg y 1 jg BCMB72 (Figura 21). Por tanto, BCMB72 inhibió la tumorigénesis de xenoinjertos de MM humanos H929 en todos los animales tratados con 0,5 y 1 jg/animal.
Ejemplo 22: Cuantificación BCMA soluble en suero de ratón a partir de xenoinjertos H929 (células de mieloma m últiple humano) en ratones NSG humanizados por PBMC tratados con BCMB72
[0283] Este estudio fue diseñado para cuantificar los niveles de BMCA solubles en suero forman ratones de xenoinjerto H929 y correlacionan los niveles de BCMA solubles a la carga tumoral en estos animales.
[0284] Brevemente, el suero de muestras de estudio de xenoinjerto se analizaron mediante el ensayo de BCMA inmunoabsorbente ligado a enzimas (ELISA), obtenido de R&D Systems. El suero se descongeló y se diluyó 1:50 en diluyente de reactivo y se incubó durante la noche a 4°C. El ELISA BCMA se llevó a cabo de acuerdo con el protocolo del fabricante. Las placas de ELISA se analizaron usando el lector de placas MD SpectraMax M5 (Molecular Devices, Sunnyvale CA) ajustado a 450 nm. Cada pocillo del ELISA corresponde al suero de un ratón en el estudio de xenoinjerto original.
[0285] Hubo una reducción significativa de la concentración de BCMA soluble en suero de ratón de los ratones tratados con 1 |jg y 0,5 |jg de BCMB72 en comparación con PBS solo o BCMB72 a 0,1 jg/ratones (Figura 22). Estos datos apoyan el estudio de xenoinjerto, en donde los ratones tratados con 1 jg y 0,5 jg de BCMB72 no tenían o tenían un crecimiento tumoral mínimo. Estos datos sugieren que el BCMA soluble en muestras de suero podría ser útil como un biomarcador potencial para evaluar la indicación de mieloma múltiple; el estudio de BCMA soluble puede ayudar a controlar la carga de morbilidad.
Breve descripción de la lista de secuencias
[0286]
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Claims (15)

REIVINDICACIONES
1. Un anticuerpo recombinante, o un fragmento de unión a antígeno del mismo, que se une inmunoespecíficamente a BCMA, en donde el anticuerpo tiene una cadena pesada y una cadena ligera, comprendiendo dicha cadena pesada:
a. una región determinante de complementariedad de cadena pesada 1 (CDR1) que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 4, una CDR2 de cadena pesada que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 5 y una CDR3 de cadena pesada que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 6 b. una CDR1 de cadena pesada que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 7, una CDR2 de cadena pesada que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 5 y una CDR3 de cadena pesada que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 6;
c. una CDR1 de cadena pesada que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 4, una CDR2 de cadena pesada que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 5 y una CDR3 de cadena pesada que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 19;
d. una CDR1 de cadena pesada que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 4, una CDR2 de cadena pesada que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 8 y una CDR3 de cadena pesada que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 6
e. una CDR1 de cadena pesada que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 13, una CDR2 de cadena pesada que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 5 y una CDR3 de cadena pesada que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 19; o
f. una CDR1 de cadena pesada que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 13, una CDR2 de cadena pesada que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 8 y una CDR3 de cadena pesada que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 19,
en donde dicho anticuerpo comprende además una CDR1 de cadena ligera que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 24, una CDR2 de cadena ligera que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 25 y una CDR3 de cadena ligera que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO : 26.
2. El anticuerpo, o fragmento de unión a antígeno del mismo, de la reivindicación 1, en donde la cadena pesada del anticuerpo de (a) comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 27; la cadena pesada del anticuerpo de (a) comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 57; la cadena pesada del anticuerpo de (c) comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 39; la cadena pesada del anticuerpo de (d) comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 40; o la cadena pesada del anticuerpo de (e) comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 58.
3. El anticuerpo o fragmento de unión a antígeno de la reivindicación 2, en donde la cadena ligera del anticuerpo comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 28.
4. Anticuerpo o fragmento de unión a antígeno según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en donde:
i) el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo se une al dominio extracelular de BCMA humano; ii) el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno es un anticuerpo humano o fragmento de unión a antígeno; iii) el fragmento de unión al antígeno es un fragmento Fab, un fragmento Fab2 o un anticuerpo monocatenario; iv) el anticuerpo o antígeno-fragmento de unión del mismo inhibe la interacción de BCMA y APRIL, tal como en donde el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno exhibe una CI50 para la interacción de BCMA y APRIL de aproximadamente 5,9 nM como se mide por ELISA;
v) el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo es una IgG;
vi) el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo es un isotipo IgG4, por ejemplo en donde la IgG4 tiene una sustitución S228P, una sustitución L234A y una sustitución L235A en su región Fc;
vii) el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo se une inmunoespecíficamente a BCMA humana y reacciona de forma cruzada con BCMA de mono cynomolgus;
viii) el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo se une a BCMA en la superficie de células de mieloma humano; y/o
ix) el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo se une a BCMA en la superficie de células de mieloma múltiple humano.
5. Una célula recombinante que expresa el anticuerpo o el fragmento de unión a antígeno de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en donde opcionalmente la célula es un hibridoma o el anticuerpo se produce de forma recombinante.
6. Un anticuerpo biespecífico BCMA x CD3 recombinante o un fragmento de unión biespecífico BCMA x CD3 del mismo que comprende:
a) una primera cadena pesada (HCl);
b) una segunda cadena pesada (HC2);
c) una primera cadena ligera (LC1); y
d) una segunda cadena ligera (LC2), en donde HC1 se asocia con LC1 y HC2 se asocia con LC2 y en donde HC1 comprende la SEQ ID NO: 59, SEQ ID NO: 60 y SEQ ID NO: 61 como cadena pesada CDR1-3 respectivamente, y LC1 comprende SEQ ID NO: 62, s Eq ID NO: 63 y SEQ ID NO: 64 como CDR1-3 de cadena ligera respectivamente, para formar un primer sitio de unión al antígeno que se une inmunoespecíficamente a CD3 y donde HC2 comprende SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5 y SEQ ID NO: 6 como CDR1-3 de cadena pesada respectivamente, y LC2 comprende SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 25 y SEQ ID NO: 26 como CDR1-3 de cadena ligera respectivamente, para formar un segundo sitio de unión al antígeno que se une inmunoespecíficamente a BCMA.
7. Un anticuerpo biespecífico BCMA x CD3 recombinante o un fragmento del mismo de la reivindicación 6 que comprende un HC1 que comprende la SEQ ID NO: 55, una LC1 que comprende la SEQ ID NO: 56, una HC2 que comprende la SEQ ID NO: 65 y una LC2 que comprende la SEQ ID NO:76, como en donde el anticuerpo o el fragmento de unión biespecífico es una IgG.
8. El anticuerpo biespecífico BCMA x CD3 o el fragmento de unión biespecífico de la reivindicación 6 o la reivindicación 7, en donde el anticuerpo o el fragmento de unión biespecífico:
i) es el isotipo IgG4;
ii) se une inmunoespecíficamente BCMA humano con una afinidad de al menos 0,22 nM medida por resonancia de plasmón de superficie;
iii) se une a BCMA en la superficie de las células de mieloma humano;
iv) se une a BCMA en la superficie de células de mieloma múltiple humano;
v) induce la activación de células T humanas in vitro con un CE50 de menos de aproximadamente 0,37 nM; vi) induce la citotoxicidad dependiente de células T de las células que expresan BCMA in vitro con un CE50 de menos de aproximadamente 0,45 nM;
vii) no es un agonista de BCMA; y/o
viii) no altera la activación de NF-kB a concentraciones por debajo de 10 nM.
9. Una célula recombinante que expresa el anticuerpo o el fragmento de unión biespecífico de cualquiera de las reivindicaciones 6 a 8, tal como en donde la célula es un hibridoma.
10. El anticuerpo biespecífico BCMA x CD3 o el fragmento de unión biespecífico de cualquiera de las reivindicaciones 6 a 8 para su uso en un método:
i) para tratar a un sujeto que tiene cáncer, que opcionalmente comprende además la administración de un segundo agente terapéutico, por ejemplo en donde el segundo agente terapéutico es un agente quimioterapéutico o una terapia contra el cáncer dirigida, tal como en donde el agente quimioterapéutico es citarabina, una antraciclina, diclorhidrato de histamina o interleucina 2;
ii) para inhibir el crecimiento o la proliferación de células cancerosas; o
iii) para redirigir una célula T a una célula cancerosa que expresa BCMA.
11. El anticuerpo biespecífico BCMA x CD3 o el fragmento de unión biespecífico para su uso de acuerdo con la reivindicación 10, en donde el cáncer es un cáncer hematológico, por ejemplo, en donde el cáncer hematológico es un cáncer de células B que expresa BCMA, tal como en donde la célula B que expresa BCMA el cáncer es mieloma múltiple.
12. Una composición farmacéutica que comprende el anticuerpo biespecífico BCMA x CD3 o el fragmento de unión biespecífico de una cualquiera de las reivindicaciones 6 a 8 y un vehículo farmacéuticamente aceptable.
13. Un método para generar el anticuerpo biespecífico BCMA x CD3 o el fragmento de unión biespecífico de cualquiera de las reivindicaciones 6 a 8 mediante el cultivo de la célula de la reivindicación 9.
14. Un polinucleótido sintético aislado que codifica el anticuerpo biespecífico BCMA x CD3 o el fragmento de unión biespecífico de cualquiera de las reivindicaciones 6 a 8.
15. Un kit que comprende el anticuerpo biespecífico BCMA x CD3 o el fragmento de unión biespecífico según se define en una cualquiera de las reivindicaciones 6 a 8 y/o un polinucleótido como se define en la reivindicación 14 y empaque para el mismo.
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