ES2813057T3

ES2813057T3 - Anticuerpos anti-ox40 y sus usos

Info

Publication number: ES2813057T3
Application number: ES17826089T
Authority: ES
Inventors: Fiona A Harding
Original assignee: AbbVie Biotherapeutics Inc
Current assignee: AbbVie Biotherapeutics Inc
Priority date: 2016-12-15
Filing date: 2017-12-15
Publication date: 2021-03-22
Anticipated expiration: 2037-12-15
Also published as: US10604584B2; CR20190330A; US20180346593A1; PT3504242T; KR20210157471A; LT3504242T; DK3504242T3; US10556962B2; CL2019001646A1; PL3504242T3; AU2017377036A1; CY1123274T1; EP3504242A1; WO2018112346A1; AU2017377036B2; RS60664B1; TW201825520A; US20220112304A1; UA125041C2; MA53184A

Abstract

Un anticuerpo anti-OX40 que comprende (i) una cadena VH que comprende tres CDR; y (ii) una cadena VL que comprende tres CDR, en donde: la CDR 1 de VH tiene la secuencia de aminoacidos GFTFSRYGMS (SEQ ID NO:101), la CDR 2 de VH tiene la secuencia de aminoacidos TINSNGGRTYYPDSVKG (SEQ ID NO:102), la CDR 3 de VH tiene la secuencia de aminoacidos EGITTAYAMDY (SEQ ID NO:103), la CDR 1 de VL tiene la secuencia de aminoacidos KASQSVDYDGDSYMH (SEQ ID NO:104), la CDR 2 de VL tiene la secuencia de aminoacidos AASILES (SEQ ID NO:105), y la CDR 3 de VL tiene una secuencia de aminoacidos QQSNEDPRT (SEQ ID NO:106).

Description

DESCRIPCIÓN

Anticuerpos anti-OX40 y sus usos

1. Referencia cruzada a aplicaciones relacionadas

Esta solicitud reclama el beneficio bajo 35 U.S.C. § 119(e) de la Solicitud Provisional de Estados Unidos núm.

62/434,761, presentada el 15 de diciembre de 2016.

2. Listado de secuencias

La presente solicitud contiene un listado de secuencias que se ha enviado electrónicamente en formato ASCII y se incorpora en la presente como referencia en su totalidad. Dicha copia ASCII, creada el 30 de octubre de 2017, se denomina 381493-368WO_SL.txt y tiene un tamaño de 97999 bytes.

3. Campo técnico

La presente solicitud se refiere a, entre otras cosas, novedosos anticuerpos anti-OX40, composiciones que incluyen los anticuerpos, ácidos nucleicos que codifican los anticuerpos y a métodos de fabricación y uso de los mismos. 4. Antecedentes

Las terapias contra el cáncer comprenden una amplia gama de enfoques terapéuticos, lo que incluye cirugía, radiación y quimioterapia. Si bien los diversos enfoques permiten que el profesional médico disponga de una amplia selección de tratamientos para tratar el cáncer, las terapias existentes presentan una serie de desventajas, tales como una falta de selectividad para dirigirse a las células cancerosas por sobre las células normales y sanas, y el desarrollo de resistencia por el cáncer al tratamiento.

Los enfoques recientes basados en terapias dirigidas, que interfieren con los procesos celulares de las células cancerosas preferentemente por sobre las células normales, han llevado a regímenes quimioterapéuticos con menos efectos secundarios en comparación con las terapias no dirigidas, tales como el tratamiento con radiación.

La inmunoterapia contra el cáncer se ha revelado como un enfoque terapéutico prometedor para complementar los estándares de atención existentes. Ver, por ejemplo, Miller y otros, Cancer Cell, 27, 439-449 (2015). Tales enfoques de inmunoterapia incluyen el desarrollo de anticuerpos usados para modular el sistema inmunitario para destruir las células cancerosas.

Las respuestas inmunitarias antitumorales en pacientes con tumores sólidos se han potenciado mediante el tratamiento con productos biológicos. Por ejemplo, existen dos anticuerpos monoclonales anti-PD-1 aprobados y comercializados: nivolumab (OPDIVO®) y pembrolizumab (KEYTRUDA®), con aprobaciones en los EE. UU. y la Unión Europea para tratar enfermedades tales como el melanoma no extirpable o metastásico y el cáncer de pulmón de células no pequeñas metastásico. El tratamiento de pacientes con estos agentes ha dado como resultado respuestas antitumorales medidas por la mejora en ya sea la supervivencia libre de progresión y/o la supervivencia general. El reciente fracaso de OPDIVO® en retrasar la progresión del cáncer de pulmón avanzado en una población de pacientes sin tratamiento previo en un ensayo clínico que comparaba OPDIVO® con la quimioterapia convencional destaca la necesidad de enfoques alternativos y tratamientos contra el cáncer adicionales para complementar los estándares de atención terapéuticos existentes.

El documento WO2016/073380 describe los anticuerpos agonistas anti-OX40 1A7, 3C8 y 1D2 y el uso de los mismos para el tratamiento del cáncer. El documento WO2012/027328 describe anticuerpos monoclonales agonistas anti-OX40 106-222 y 119-122 y el uso de los mismos para el tratamiento del cáncer.

5. Breve descripción de la invención

La presente descripción proporciona anticuerpos anti-OX40 que se unen específicamente y activan a OX40. Las secuencias de aminoácidos de regiones determinantes de la complementariedad (CDR) ilustrativas, las regiones de dominio variable de cadena pesada (V^h) y de dominio variable de cadena ligera (V^l) (es decir, las cadenas V^hy V^l, respectivamente), y las cadenas pesadas y ligeras de anticuerpos anti-OX40 ilustrativos se proporcionan en la Descripción detallada a continuación. Los anticuerpos anti-OX40 proporcionados en la presente descripción dan como resultado la activación de la respuesta inmunitaria adaptativa.

Los anticuerpos anti-OX40 pueden incluir modificaciones y/o mutaciones que alteran las propiedades de los anticuerpos, tales como el aumento de la vida media, el aumento o disminución de la citotoxicidad celular dependiente de antígeno (ADCC), como se conoce en la técnica.

Se proporcionan en la presente descripción ácidos nucleicos que comprenden secuencias de nucleótidos que codifican los anticuerpos anti-OX40 de la descripción, al igual que vectores que comprenden los ácidos nucleicos. Adicionalmente, en la presente descripción se proporcionan células huésped procariotas y eucariotas transformadas con un vector que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica un anticuerpo anti-OX40 descrito, así como también células huésped eucariotas (tales como de mamíferos) modificadas por ingeniería genética para expresar las secuencias de nucleótidos. Además, se proporcionan métodos para producir los anticuerpos, mediante el cultivo de células huésped y la recuperación de los anticuerpos, y se analizan posteriormente en la Descripción Detallada a continuación.

En otro aspecto, la presente descripción proporciona composiciones que incluyen los anticuerpos anti-OX40 descritos en la presente descripción. Las composiciones comprenden generalmente uno o más anticuerpos anti-OX40 como se describen en la presente descripción, y uno o más excipientes, portadores o diluyentes.

La presente descripción proporciona métodos para tratar sujetos, tales como sujetos humanos, diagnosticados con un tumor sólido, con un anticuerpo anti-OX40. El método implica generalmente administrar al sujeto una cantidad de un anticuerpo anti-OX40 descrito en la presente descripción eficaz para proporcionar un beneficio terapéutico. El sujeto puede diagnosticarse con cualquiera de una serie de tumores sólidos que pueden ser diagnosticados recientemente, recurrentes o recurrentes y refractarios. Puede administrarse un anticuerpo anti-OX40 como una infusión intravenosa una vez cada dos semanas.

Los anticuerpos anti-OX40 pueden administrarse como agentes terapéuticos individuales (monoterapia) o como adyuvantes o junto con otros agentes terapéuticos típicamente, pero no necesariamente, los usados para el tratamiento de un tumor sólido. Los agentes terapéuticos se usarán típicamente a su dosis aprobada, ruta de administración y frecuencia de administración.

Los anticuerpos anti-OX40 pueden administrarse a través de una variedad de rutas o modos de administración, lo que incluye, pero no se limita a, infusión y/o inyección intravenosa e inyección intratumoral. La cantidad administrada dependerá de la vía de administración, el cronograma de dosificación, el tipo de cáncer que se trata, la etapa del cáncer que se trata y otros parámetros, tales como la edad y el peso del paciente, como se conoce bien en la técnica.

6. Breve descripción de las figuras

Las Figuras 1A-1D representan la activación funcional de células T humanas in vitro después del tratamiento con el anticuerpo anti-OX40 ilustrativo Hu3738. La Figura 1A representa la proliferación de células T CD4+ de sangre periférica humanas después del tratamiento con el anticuerpo anti-OX40 Hu3738, o el anticuerpo de la literatura 11D4 o 18D8. La Figura 1B representa el aumento en la producción de interferón gamma (IFN-y) por las células T CD4+ humanas después del tratamiento con el anticuerpo anti-OX40 Hu3738, o el anticuerpo de la literatura 11D4 o 18D8. La Figura 1C representa la proliferación de células T CD4+ de sangre periférica humanas después del tratamiento con Hu3738 o el anticuerpo de la literatura 1A7. La Figura 1D representa el aumento en la producción de IFN-y por las células T CD4+ humanas después del tratamiento con Hu3738 o el anticuerpo de la literatura 1A7.

Las Figuras 2A-2B muestran el efecto del anticuerpo anti-OX40 ilustrativo Hu3738 sobre la supresión mediada por células T reguladoras (Treg) humanas in vitro. El ensayo de supresión con Treg se preparó mediante el uso de dos relaciones diferentes de células T respondedoras CD4+/CD25- (Tresp) con respecto a células T reguladoras CD4+/CD25+/CD127bajo (Treg). Se añadieron perlas con el reactivo Inspector de supresión de Treg (Insp) a los pocillos de cultivo a una relación de perla con respecto a célula de 1:1 para la estimulación. La barra transparente representa la proliferación de células Tresp en presencia de Insp. Anticuerpos anti-OX40 e IgG¹humana de control de isotipo se probaron por triplicado a 10 pg/ml de concentración final en ausencia o en presencia de reactivo de reticulación (F(ab')²anti-IgG humana de cabra, específico para Fc) a una relación 1:4. Las placas se incubaron a 37 °C en 5 % de CO²durante cuatro días. Se añadió 1 pCi/pocillo de 3H-timidina y las placas se incubaron adicionalmente durante otras 16 horas. Los gráficos representan la proliferación según se muestra en conteos por minuto (cpm). La Figura 2A representa los resultados con Tresp con respecto a Treg a una relación 2:1; La Figura 2B representa los resultados con Tresp con respecto a Treg a una relación 4:1.

La Figura 3 representa la inhibición de la unión del anticuerpo anti-OX40 ilustrativo Hu3738 en presencia del ligando de OX40 humana soluble (OX40L). El gráfico muestra la intensidad de fluorescencia media (MFI) frente a la concentración de OX40L (pg/ml). Las células Jurkat que expresan OX40 humana se tiñeron conjuntamente con una titulación de OX40L soluble no marcado y Hu37380,2 pg/ml o anticuerpo de control de isotipo.

La Figura 4A muestra un alineamiento de la secuencia de aminoácidos de OX40 humana (SEQ ID NO:1) con OX40 de ratón (SEQ ID NO:3). La Figura 4B representa la actividad de unión del anticuerpo anti-OX40 ilustrativo Hu3738 a moléculas OX40 humanas, murinas o quiméricas humana-murinas expresadas en la superficie celular que contenían dominios ricos en cisteína de ratón (CRD) intercambiados por las regiones humanas correspondientes. La OX40 humana se muestra como "293s-huOX40", la OX40 humana quimérica con CRDI murino se muestra como "293shuOX40-muCRDI", la OX40 humana quimérica con CRDII murino se muestra como "293s-huOX40-muCRDII", la OX40 humana quimérica con CRDIII murino se muestra como "293s-huOX40-muCRDIII", la OX40 humana quimérica con CRDIV murino se muestra como "293s-huOX40-muCRDIV", la OX40 humana quimérica con CRDII murino y CRDII murino se muestra como "293s-huOX40-muCRDIMN", y la OX40 murina se muestra como "293s-muOX40".

La Figura 5 representa la competencia por la unión a la OX40 humana de la superficie celular por el anticuerpo anti-OX40 ilustrativo Hu3738 o un anticuerpo de la literatura (11D4, 18D8, 106-222, 119-122 o 1A7).

La Figura 6A representa la activación de NF-kB en líneas celulares reporteras Jurkat transfectadas con OX40 humana tras el tratamiento con el anticuerpo anti-OX40 ilustrativo Mu3738 o Hu3738, o el anticuerpo de la literatura 11D4, 18D8, 106-222 o 119-122, o el control de isotipo en ausencia de la adición de un agente de reticulación. La Figura 6B representa la activación de NF-kB en líneas celulares reporteras Jurkat transfectadas con OX40 humana tras el tratamiento con el anticuerpo anti-OX40 ilustrativo Hu3738, el anticuerpo de la literatura 1A7, o el control de isotipo en presencia o ausencia de la adición de un agente de reticulación.

La Figura 7 representa la actividad antitumoral del anticuerpo anti-OX40 ilustrativo Hu3738 en un modelo de células tumorales adoptivas PC3 humano en ratones NSG.

La Figura 8 representa los niveles de interleucina-8 (IL-8), factor estimulante de colonias de macrófagos y granulocitos (GM-CSF), factor de necrosis tumoral alfa (TNF-a) e interferón-gamma (IFN-y) en un modelo de enfermedad injertocontra-huésped (GVHD) mediado por células mononucleares de sangre periférica humanas (PBMC) en ratones NSG, después de tratar a los ratones con Hu3738 1 mg/kg o IgG¹humana control de isotipo una vez cada 7 días para un total de 4 dosis.

7. Descripción detallada

La presente descripción se refiere a anticuerpos y fragmentos de los mismos que se unen específicamente a OX40, composiciones que comprenden los anticuerpos, polinucleótidos que codifican anticuerpos anti-OX40, células huésped capaces de producir los anticuerpos, métodos y composiciones útiles para fabricar los anticuerpos, y diversos métodos para usar los mismos.

Como apreciarán los expertos en la técnica, los anticuerpos y fragmentos de los mismos son de naturaleza "modular". A lo largo de la descripción, se describen diversas modalidades específicas de los diversos "módulos" que se componen de anticuerpos anti-OX40 o fragmentos de unión de los mismos. Como ejemplos específicos no limitantes, se describen diversas modalidades específicas de regiones determinantes de la complementariedad (CDR) del dominio variable de cadena pesada (Vh), cadenas Vh, CDR del dominio variable de cadena ligera (Vl) y cadenas Vl. Se pretende que todas las modalidades específicas puedan combinarse entre sí como si cada combinación específica se describiera explícitamente individualmente.

7.1. Abreviaturas

Los anticuerpos, fragmentos de unión, y polinucleótidos descritos en la presente descripción se describen, en muchas modalidades, por medio de sus respectivas secuencias de polipéptidos o polinucleótidos. A menos que se indique de cualquier otra manera, las secuencias de polipéptidos se proporcionan en orientación N ^C ; las secuencias de polinucleótidos en orientación 5 '^ 3 \ Para las secuencias de polipéptidos, pueden usarse las abreviaturas convencionales de tres o una letra para los aminoácidos codificados genéticamente, como se indica en la TABLA 1, a continuación.

Continuación

Ciertas secuencias se definen mediante fórmulas estructurales que especifican residuos de aminoácidos que pertenecen a ciertas clases (por ejemplo, alifáticos, hidrófobos, etc.). Las diversas clases a las que pertenecen los aminoácidos codificados genéticamente, como se usan en la presente descripción, se indican en la TABLA 2, a continuación. Algunos aminoácidos pueden pertenecer a más de una clase. La cisteína, que contiene un grupo sulfhidrilo, y la prolina, que está restringida conformacionalmente, no están asignadas a clases.

7.2. Definiciones

A menos que se defina de cualquier otra manera en la presente descripción, los términos científicos y técnicos usados en relación con la presente descripción tendrán los significados que entienden comúnmente los expertos en la técnica.

7.3. Anticuerpos anti-OX40 y fragmentos de unión

OX40 es una molécula coestimuladora que tiene un papel fundamental en la potenciación de las respuestas inmunitarias nacientes y actúa concomitantemente para suprimir la actividad de las células T reguladoras. OX40, también conocida como CD 134 o superfamilia del receptor del factor de necrosis tumoral 4 (TNFRSF4), es un miembro de la superficie celular transmembrana Tipo I de la superfamilia del receptor del factor de necrosis tumoral (TNF) que se expresa de manera transitoria en células T recientemente activadas y se expresa constitutivamente en células T reguladoras activadas. El dominio de unión al ligando extracelular de OX40 se compone de tres dominios ricos en cisteína (CRD) y un cuarto CRD parcial (CRDI, CRDII, CRDIII y CRDIV, respectivamente). Si bien se expresa principalmente por las células T CD4+ activadas, OX40 puede expresarse en las células B, las células T CD8+ y las células asesinas naturales (NK) y las células T asesinas naturales (NKT) después de la activación. También se ha informado que los neutrófilos expresan OX40 y la señalización a través de OX40 en neutrófilos humanos inhibe la muerte celular apoptótica. El ligando para OX40 (OX40L), también conocido como superfamilia 4 del ligando del factor de necrosis tumoral (TNFSF4), CD252 o glucoproteína 34 (gp34), se regula positivamente por células presentadoras de antígeno y células B activadas. La unión del ligando a OX40 en células T activadas por antígeno da como resultado una translocación de NF-kB aguas abajo y la activación de la vía AKT. La translocación de NF-kB conduce a la regulación positiva de moléculas promotoras de la supervivencia tales como Bcl-2, Bcl-XL y de supervivencia celular. Los anticuerpos activadores dirigidos a OX40 se destinan, al menos en parte, a potenciar las respuestas inmunitarias específicas de antígeno al prolongar la activación y diferenciación de las células T efectoras.

Además del impacto sobre las células T efectoras activadas por el antígeno, el direccionamiento al OX40 expresado por las células T reguladoras también puede contribuir al supuesto mecanismo de acción. Las células T reguladoras expresan altos niveles de OX40 dentro del microambiente tumoral. Se ha demostrado que la activación de OX40 impacta la capacidad supresora de las células T reguladoras y conduce a la depleción activa de las células T reguladoras positivas para OX40 del microambiente tumoral.

En un aspecto, la descripción se refiere a anticuerpos que se unen específicamente a OX40.

Como se usa en la presente descripción, el término "anticuerpo" (Ac) se refiere a una molécula de inmunoglobulina que se une específicamente a un antígeno en particular, aquí, OX40. En algunas modalidades, los anticuerpos anti-Ox 40 de la descripción se unen a la OX40 humana (SEQ ID NO:1) (Secuencia de referencia NCBI NP003318) y de esta manera modulan el sistema inmunitario. La respuesta del sistema inmunitario resultante es citotóxica para las células tumorales. Los anticuerpos anti-OX40 comprenden regiones determinantes de la complementariedad (CDR), también conocidas como regiones hipervariables, tanto en los dominios variables de la cadena ligera como de la cadena pesada. Las porciones más altamente conservadas de los dominios variables se denominan marco (FR). Como se conoce en la técnica, la posición de aminoácidos/límite que delinea una región hipervariable de un anticuerpo puede variar, en dependencia del contexto y las diversas definiciones conocidas en la técnica. Algunas posiciones dentro de un dominio variable pueden verse como posiciones hipervariables híbridas en el sentido de que estas posiciones pueden considerarse que están dentro de una región hipervariable bajo un conjunto de criterios, a la vez que se consideran fuera de una región hipervariable bajo un conjunto diferente de criterios. Una o más de estas posiciones también pueden encontrarse en regiones hipervariables extendidas. La descripción proporciona anticuerpos que comprenden modificaciones en estas posiciones hipervariables híbridas. Los dominios variables de las cadenas pesadas y ligeras nativas comprenden cada uno cuatro regiones FR, en gran parte mediante la adopción de una configuración de lámina p, conectada por tres CDR, que forman bucles que se conectan y, en algunos casos, forman parte de la estructura de lámina p. Las CDR en cada cadena se mantienen juntas en estrecha proximidad mediante las regiones FR y, con las CDR de la otra cadena, contribuyen a la formación del sitio de unión al objetivo de los anticuerpos. Ver Kabat y otros, Sequences of Proteins of Immunological Interest (National Institute of Health, Bethesda, Md. 1987). Como se usa en la presente descripción, la numeración de los residuos de aminoácidos de inmunoglobulina se realiza de acuerdo con el sistema de numeración de residuos de aminoácidos de inmunoglobulina de Kabat y otros, a menos que se indique de cualquier otra manera.

Los anticuerpos de la descripción pueden ser de naturaleza policlonales, monoclonales, modificados por ingeniería genética y/o modificados de cualquier otra manera, lo que incluye, pero no se limita a, anticuerpos quiméricos, anticuerpos humanizados y anticuerpos humanos. En algunas modalidades, la región constante es un isotipo seleccionado entre: IgA (por ejemplo, IgAi o IgA²), IgD, IgE, IgG (por ejemplo, IgGi, IgG², IgG³o IgG⁴) e IgM. En modalidades específicas, un anticuerpo anti-OX40 descrito en la presente descripción comprende una IgGi. En otras modalidades, los anticuerpos anti-OX40 comprenden una IgG²o IgG⁴. Como se usa en la presente descripción, la "región constante" de un anticuerpo incluye la región constante natural, los alotipos o las variantes naturales, tales como D356E y L358M, o A431G en la IgGi humana. Ver, por ejemplo, Jefferis y Lefranc, MAbs, 1(4): 332-338 (julioagosto de 2009).

La región constante ligera de un anticuerpo anti-OX40 puede ser una región ligera kappa (k) o una región lambda (A). Una región ligera A puede ser de cualquiera de los subtipos conocidos, por ejemplo, Ai, A², A³o A⁴. En algunas modalidades, el anticuerpo anti-OX40 comprende una región ligera kappa (k).

El término "anticuerpo monoclonal" como se usa en la presente descripción no se limita a anticuerpos producidos mediante la tecnología del hibridoma. Un anticuerpo monoclonal se deriva de un solo clon, lo que incluye cualquier clon eucariota, procariota o fago, mediante cualquier medio disponible o conocido en la técnica. Los anticuerpos monoclonales útiles con la presente descripción pueden prepararse mediante el uso de una amplia variedad de técnicas conocidas en la técnica, lo que incluye el uso tecnologías de hibridoma, recombinantes y de presentación en fagos, o sus combinaciones. En muchos usos de la presente descripción, lo que incluye el uso in vivo de los anticuerpos anti-OX40 en humanos, pueden usarse anticuerpos quiméricos, humanizados o humanos.

El término anticuerpo "quimérico" como se usa en la presente descripción se refiere a un anticuerpo que tiene secuencias variables derivadas de una inmunoglobulina no humana, tal como un anticuerpo de rata o de ratón, y regiones constantes de inmunoglobulina humana, elegidas típicamente a partir de una plantilla de inmunoglobulina humana. Los métodos para producir anticuerpos quiméricos son conocidos en la técnica. Ver, por ejemplo, Morrison, i985, Science 229(47i9):i202-7; Oi y otros, i986, BioTechniques 4 :2 i4 -22 i; Gillies y otros, i985, J. Immunol. Methods i 25:i9 i-202; patentes de Estados Unidos núms. 5,807,7i5; 4,8i6,567; y 4,8i6,397.

Las formas "humanizadas" de anticuerpos no humanos (por ejemplo, murinos) son inmunoglobulinas quiméricas que contienen secuencias mínimas derivadas de inmunoglobulina no humana. En general, un anticuerpo humanizado comprenderá sustancialmente todos o al menos uno, y típicamente, dos dominios variables, en los que todas o sustancialmente todas las regiones CDR corresponden a las de una inmunoglobulina no humana y todas o sustancialmente todas las regiones marco son las de una secuencia de inmunoglobulina humana. El anticuerpo humanizado puede comprender, además, al menos una porción de una región constante de inmunoglobulina (Fc), típicamente, la de una secuencia consenso de inmunoglobulina humana. Los métodos de humanización de anticuerpos son conocidos en la técnica. Ver, por ejemplo, Riechmann y otros, 1988, Nature 332:323-7; Patentes de Estados Unidos núms.: 5,530,101; 5,585,089; 5,693,761; 5,693,762; y 6,180,370 de Queen y otros; documento EP239400; Publicación PCT WO 91/09967; Patente de Estados Unidos núm. 5,225,539; documento EP592106; documento EP519596; Padlan, 1991, Mol. Immunol., 28:489-498; Studnicka y otros, 1994, Prot. Eng. 7:805-814; Roguska y otros, 1994, Proc. Natl. Acad. Sci. 91:969-973; y Patente de Estados Unidos núm. 5,565,332.

Los "anticuerpos humanos" incluyen anticuerpos que tienen la secuencia de aminoácidos de una inmunoglobulina humana e incluyen anticuerpos aislados a partir de bibliotecas de inmunoglobulina humana o a partir de animales transgénicos para una o más inmunoglobulinas humanas y que no expresan inmunoglobulinas endógenas. Los anticuerpos humanos pueden fabricarse mediante una variedad de métodos conocidos en la técnica, lo que incluye los métodos de presentación en fagos que usan bibliotecas de anticuerpos derivadas de secuencias de inmunoglobulina humana. Ver las patentes de Estados Unidos núms. 4,444,887 y 4,716,111; y publicaciones PCT WO 98/46645; WO 98/50433; WO 98/24893; WO 98/16654; WO 96/34096; WO 96/33735; y WO 91/10741. Los anticuerpos humanos también pueden producirse mediante el uso de ratones transgénicos que son incapaces de expresar inmunoglobulinas endógenas funcionales pero que pueden expresar genes de inmunoglobulinas humanas. Ver, por ejemplo, las publicaciones PCT WO 98/24893; WO 92/01047; WO 96/34096; WO 96/33735; Patentes de Estados Unidos núms. 5,413,923; 5,625,126; 5,633,425; 5,569,825; 5,661,016; 5,545,806; 5,814,318; 5,885,793; 5,916,771; y 5,939,598. Además, empresas tales como LakePharma, Inc. (Belmont, CA) o Creative BioLabs (Shirley, NY) pueden comprometerse en proporcionar anticuerpos humanos dirigidos contra un antígeno seleccionado mediante el uso de una tecnología similar a la descrita anteriormente. Los anticuerpos completamente humanos que reconocen un epítopo seleccionado pueden generarse mediante el uso de una técnica denominada "selección guiada". En este enfoque, un anticuerpo monoclonal no humano seleccionado, por ejemplo, un anticuerpo de ratón se usa para guiar la selección de un anticuerpo completamente humano que reconoce el mismo epítopo (ver, Jespers y otros, 1988, Biotechnology 12:899-903).

También se contemplan fragmentos de unión del anticuerpo anti-OX40. Los fragmentos de unión de la descripción incluyen aquellos que son capaces de unirse específicamente a OX40. Los ejemplos de fragmentos de unión de anticuerpos incluyen, a modo de ejemplo y sin limitación, Fab, Fab', F(ab')², fragmentos Fv, fragmentos Fv de cadena sencilla (scFv) y fragmentos de un único dominio.

Un fragmento Fab contiene el dominio constante de la cadena ligera y el primer dominio constante (CH1) de la cadena pesada. Los fragmentos Fab' difieren de los fragmentos Fab por la adición de algunos residuos en el extremo carboxilo del dominio CH1 de la cadena pesada, lo que incluye una o más cisteínas de la región bisagra del anticuerpo. Los fragmentos Fab' se producen por escisión del enlace disulfuro en las cisteínas de bisagra del producto de digestión con pepsina de F(ab')². Los expertos en la técnica conocen acoplamientos químicos adicionales de fragmentos de anticuerpos. Los fragmentos Fab y F(ab')²carecen de la región del fragmento cristalizable (Fc) de un anticuerpo intacto, se eliminan más rápidamente de la circulación de animales y pueden tener una unión a tejido menos no específica que un anticuerpo intacto (ver, por ejemplo, Wahl y otros, 1983, J. Nucl. Med. 24:316).

Como se entiende comúnmente en la técnica, una región "Fc" es la región constante del fragmento cristalizable de un anticuerpo que no comprende una región de unión específica a antígeno. En los isotipos de anticuerpos IgG, IgA e IgD, la región Fc se compone de dos fragmentos de proteínas idénticos, derivados del segundo y tercer dominios constantes (dominios CH2 y CH3, respectivamente) de las dos cadenas pesadas de un anticuerpo. Las regiones Fc de IgM e IgE contienen tres dominios constantes de cadena pesada (dominios CH2, CH3 y CH4) en cada cadena de polipéptidos.

Un fragmento "Fv" es el fragmento mínimo de un anticuerpo que contiene un sitio de reconocimiento y de unión a objetivo completos. Esta región consiste en un dímero de un dominio variable de cadena pesada y uno de cadena ligera en una asociación estrecha y no covalente (dímero Vh-Vl). Es en esta configuración que las tres CDR de cada dominio variable interactúan para definir un sitio de unión a objetivo en la superficie del dímero V h-Vl. A menudo, las seis CDR confieren especificidad de unión a objetivo al anticuerpo. Sin embargo, en algunos casos, incluso un dominio variable único (o la mitad de un Fv que comprende solo tres CDR específicas para un objetivo) puede tener la capacidad de reconocer y unirse al objetivo, aunque con una afinidad menor que el sitio de unión completo.

Los fragmentos de unión a anticuerpo "Fv de cadena sencilla" o "scFv" comprenden los dominios Vh y Vl de un anticuerpo, donde estos dominios están presentes en una cadena polipeptídica única. Generalmente, el polipéptido Fv comprende, además, un enlazador polipeptídico entre los dominios Vh y Vl que permite que scFv forme una estructura favorable para la unión al objetivo.

Los "fragmentos de un único dominio" se componen de un único dominio Vh o Vl que exhibe suficiente afinidad con OX40. En una modalidad específica, el fragmento de un único dominio es camelizado (ver, por ejemplo, Riechmann, 1999, Journal of Immunological Methods 231:25-38).

Los anticuerpos anti-OX40 de la descripción incluyen anticuerpos derivatizados. Por ejemplo, los anticuerpos derivatizados se modifican típicamente por glucosilación, acetilación, pegilación, fosforilación, amidación, derivatización mediante grupos protectores/bloqueadores conocidos, escisión proteolítica, enlace a un ligando celular o a otra proteína. Cualquiera de las numerosas modificaciones químicas puede llevarse a cabo mediante técnicas conocidas, lo que incluye, pero no se limita a, escisión química específica, acetilación, formilación, síntesis metabólica de tunicamicina, etc. Adicionalmente, el derivado puede contener uno o más aminoácidos no naturales, por ejemplo, mediante el uso de la tecnología ambrx (ver, por ejemplo, Wolfson, 2006, Chem. Biol. 13(10): 1011 -2).

Los anticuerpos anti-OX40 pueden ser anticuerpos cuyas secuencias se han modificado para alterar al menos una función efectora biológica mediada por una región constante. Por ejemplo, en algunas modalidades, un anticuerpo anti-OX40 puede modificarse para reducir al menos una función efectora biológica mediada por una región constante con respecto al anticuerpo no modificado, por ejemplo, la unión reducida a uno o más de los receptores Fc (F^cyR) tales como FcyRI, FcyRIIA, FcyRIIB, FcyRIIIA y/o FcyRIIIB. La unión a FcyR puede reducirse mediante la mutación del segmento de la región constante de inmunoglobulina del anticuerpo en regiones particulares necesarias para las interacciones con F^cyR (ver, por ejemplo, Canfield y Morrison, 1991, J. Exp. Med. 173:1483-1491; y Lund y otros, 1991, J. Immunol. 147:2657-2662). La reducción en la capacidad de unión a FcyR del anticuerpo puede reducir, además, otras funciones efectoras que dependen de las interacciones de FcyR, tales como la opsonización, la fagocitosis y la citotoxicidad celular dependiente de antígeno ("ADCC"). En un ejemplo ilustrativo, una variante de un dominio CH2 que tiene una sustitución V263L, V273C, V273E, V273F, V273L, V273M, V273S o V273Y en el dominio CH2 de la región Fc puede exhibir una afinidad reducida a FcyRIIB en comparación con la región constante de tipo silvestre correspondiente.

El anticuerpo anti-OX40 descrito en la presente descripción incluye anticuerpos que se han modificado para adquirir o mejorar al menos una función efectora biológica mediada por una región constante con respecto a un anticuerpo no modificado, por ejemplo, para mejorar las interacciones con F^cyR (ver, por ejemplo, la solicitud de patente de Estados Unidos núm.2006/0134709). Por ejemplo, un anticuerpo anti-OX40 de la descripción puede tener una región constante que se une a FcyRI, FcyRIIA, FcyRIIB, FcyRIIIA y/o FcyRIIIB con mayor afinidad que la región constante de tipo silvestre correspondiente. En un ejemplo ilustrativo, una variante de dominio CH2 que tiene una sustitución V263l , V273C, V273E, V273F, V273L, V273M, V273S o V273Y en el dominio CH2 de la región Fcy puede mostrar una mayor afinidad a FcyRIIIA en comparación con la región constante de tipo silvestre correspondiente.

De esta forma, los anticuerpos anti-OX40 de la descripción pueden tener alteraciones en la actividad biológica que dan como resultado un aumento o disminución de la opsonización, fagocitosis o ADCC. Dichas alteraciones son conocidas en la técnica. Por ejemplo, las modificaciones en los anticuerpos que reducen la actividad ADCC se describen en la Patente de Estados Unidos núm. 5,834,597. Una variante ilustrativa de reducción de ADCC corresponde al "mutante 3" (también conocido como "M3", que se muestra en la Figura 4 de la Patente de Estados Unidos núm. 5,834,597) en la que los residuos 234 y 237 (mediante el uso de la numeración EU) se sustituyen con alaninas. Puede usarse una variación de mutante 3 (también conocida como "M3") en varios isotipos de anticuerpos, por ejemplo, M3 de IgG²humana.

Sustituciones adicionales que pueden modificar la unión a FcyR y/o la función efectora ADCC de un anticuerpo anti-OX40 incluyen la sustitución K322A o la doble sustitución L234A y L235A en la región Fc, por ejemplo, una IgG¹humana que tiene la doble sustitución L234A/L235A. Ver, por ejemplo, Hezareh y otros, J. Virol., 75 (24): 12161-12168 (2001).

En algunas modalidades, los anticuerpos anti-OX40 tienen niveles bajos, o carecen, de fucosa. Los anticuerpos que carecen de fucosa se han correlacionado con una mayor actividad de ADCC, especialmente a bajas dosis de anticuerpo. Ver Shields y otros, 2002, J. Biol. Chem. 277:26733-26740; Shinkawa y otros, 2003, J. Biol. Chem.

278:3466-73. Los métodos para preparar anticuerpos con menos fucosa incluyen el cultivo en células YB2/0 de mieloma de rata (ATCC CRL 1662). Las células YB2/0 expresan niveles bajos de ARNm de FUT8, que codifica la a-1,6-fucosiltransferasa, una enzima necesaria para la fucosilación de polipéptidos.

Los anticuerpos anti-OX40 pueden comprender dominios CH2 modificados (o variantes) o dominios Fc completos que incluyen sustituciones de aminoácidos que aumentan la unión a FcyRIIB y/o reducen la unión a FcyRIIIA en comparación con la unión de una región CH2 o Fc de tipo silvestre correspondiente. Los dominios de variante de CH2 o de variante de Fc se han descrito en la solicitud de patente de Estados Unidos núm. 2014/0377253. Un dominio de variante de CH2 o de variante de Fc incluye típicamente una o más sustituciones en la posición 263, la posición 266, la posición 273 y la posición 305, en donde la numeración de los residuos en el dominio Fc es la del índice de EU como en Kabat. En algunas modalidades, los anticuerpos anti-OX40 comprenden una o más sustituciones seleccionadas de V263L, V266L, V273C, V273E, V273F, V273L, V273M, V273S, V273Y, V305K y V305W, con respecto al dominio CH2 de tipo silvestre. En modalidades específicas, la una o más sustituciones del dominio CH2 se seleccionan de V263L, V273E, V273F, V273M, V273S y V273Y, con respecto al dominio CH2 de una IgG¹humana.

Por ejemplo, la una o más sustituciones de un dominio CH2 de IgGi puede ser V273E. En otra modalidad específica, el anticuerpo anti-OX40 de la descripción comprende una variante de dominio CH2 de IgG¹que comprende la sustitución de aminoácidos V263L.

Otros ejemplos de dominios de variantes de CH2 o variante de Fc que pueden proporcionar un aumento de la unión a FcyRIIB y/o una reducción de la unión a FcyRIIIA en comparación con la unión de una región CH2 o Fc de tipo silvestre correspondiente incluyen los encontrados en Vonderheide, y otros, Clin. Cancer Res., 19(5), 1035-1043 (2013), tales como S267E o S267E/L328F en la IgG¹humana.

En algunas modalidades, los anticuerpos anti-OX40 incluyen modificaciones que aumentan o disminuyen sus afinidades de unión al receptor Fc fetal, FcRn, por ejemplo, mediante la mutación del segmento de la región constante de inmunoglobulina en regiones particulares involucradas en interacciones con FcRn (ver, por ejemplo, el documento WO 2005/123780). En modalidades particulares, un anticuerpo anti-OX40 de la clase IgG se muta de manera que al menos uno de los residuos de aminoácidos 250, 314 y 428 de la región constante de la cadena pesada se sustituye solo, o en cualquiera de sus combinaciones, tal como en las posiciones 250 y 428, o en las posiciones 250 y 314, o en las posiciones 314 y 428, o en las posiciones 250, 314 y 428, donde las posiciones 250 y 428 son una combinación específica. Para la posición 250, el residuo de aminoácido sustituyente puede ser cualquier residuo de aminoácido que no sea treonina, lo que incluye, pero no se limita a, alanina, cisteína, ácido aspártico, ácido glutámico, fenilalanina, glicina, histidina, isoleucina, lisina, leucina, metionina, asparagina, prolina, glutamina, arginina, serina, valina, triptófano o tirosina. Para la posición 314, el residuo de aminoácido sustituyente puede ser cualquier residuo de aminoácido que no sea leucina, lo que incluye, pero no se limita a, alanina, cisteína, ácido aspártico, ácido glutámico, fenilalanina, glicina, histidina, isoleucina, lisina, metionina, asparagina, prolina, glutamina, arginina, serina, treonina, valina, triptófano o tirosina. Para la posición 428, los residuos de aminoácidos sustituyentes pueden ser cualquier resto de aminoácidos que no sea metionina, lo que incluye, pero no se limita a, alanina, cisteína, ácido aspártico, ácido glutámico, fenilalanina, glicina, histidina, isoleucina, lisina, leucina, asparagina, prolina, glutamina, arginina, serina, treonina, valina, triptófano o tirosina. Una sustitución ilustrativa conocida para modificar la función efectora de Fc es la sustitución M428L de Fc, que puede producirse en combinación con la sustitución T250Q de Fc. Se identifican combinaciones específicas adicionales de sustituciones de aminoácidos adecuadas en la Tabla 1 de la Patente de Estados Unidos núm. 7,217,797. Dichas mutaciones aumentan la unión a FcRn, lo que protege al anticuerpo de la degradación y aumenta su vida media.

Un anticuerpo anti-OX40 puede tener uno o más aminoácidos insertados en una o más de sus CDR, por ejemplo, como se describe en Jung y Plückthun, 1997, Protein Engineering 10:8, 959-966; Yazaki y otros, 2004, Protein Eng. Des Sel. 17(5):481-9. Epub 17 de agosto de 2004; y la solicitud de patente de Estados Unidos núm. 2007/0280931.

Los anticuerpos anti-OX40 con alta afinidad por la OX40 humana (SEQ ID NO:1) pueden ser convenientes para usos terapéuticos y de diagnóstico. En consecuencia, la presente descripción contempla anticuerpos que tienen una alta afinidad de unión por la OX40 humana. En modalidades específicas, los anticuerpos anti-OX40 se unen a la OX40 humana con una afinidad de al menos aproximadamente 100 nM, pero pueden exhibir mayor afinidad, por ejemplo, al menos aproximadamente 90 nM, 80 nM, 70 nM, 60 nM, 50 nM, 40 nM, 30 nM, 25 nM, 20 nM, 15 nM, 10 nM, 7 nM, 6 nM, 5 nM, 4 nM, 3 nM, 2 nM, 1 nM, 0,1 nM, 0,01 nM, o incluso mayor. En algunas modalidades, los anticuerpos se unen a la OX40 humana con una afinidad en el intervalo de aproximadamente 1 pM a aproximadamente 100 nM, o una afinidad que varía entre cualquiera de los valores anteriores, tales como, pero sin limitarse a, de aproximadamente 0,001 a 10 nM, 0,001 a 5 nM, 0,01 a 100 nM, 0,01 a 50 nM, 0,01 a 10 nM, 0,01 a 5 nM, o 0,01 a 1 nM.

La afinidad de los anticuerpos anti-OX40 por la OX40 humana puede determinarse mediante el uso de técnicas bien conocidas en la técnica o descritas en la presente descripción, tales como, por ejemplo, pero no a modo de limitación, ELISA, calorimetría de titulación isotérmica (ITC), resonancia de plasmones de superficie o ensayo de polarización de la fluorescencia.

Los anticuerpos anti-OX40 comprenden generalmente una cadena pesada que comprende una región variable (Vh) que tiene tres regiones determinantes de la complementariedad ("CDr ") denominadas en la presente descripción (en orden N^-C) como CDR#1 de Vh, CDR#2 de Vh, y CDR#3 de Vh, y una cadena ligera que comprende una región variable (Vl) que tiene tres regiones determinantes de la complementariedad denominadas en la presente descripción (en orden N ^C ) como CDR#1 de Vl, CDR#2 de Vl, y CDR#3 de Vl. Se proporcionan en la presente descripción las secuencias de aminoácidos de CDR ilustrativas, así como también la secuencia de aminoácidos de las regiones Vh y Vl de las cadenas pesadas y ligeras de anti-OX40 ilustrativos. Modalidades específicas de los anticuerpos anti-OX40 incluyen estas secuencias de CDR y/o Vh y/o Vl ilustrativas, así como también anticuerpos que compiten por la unión a la OX40 humana con dichos anticuerpos.

En algunas modalidades, las secuencias de aminoácidos de las CDR de un anticuerpo anti-OX40 tienen secuencias seleccionadas de sus secuencias CDR de Vh y Vl respectivas en la TABLA 3 a continuación:

Se describen en la presente descripción modalidades ilustrativas específicas de anticuerpos anti-OX40 con las CDR anteriores. En algunas modalidades, un anticuerpo anti-OX40 tiene las CDR de acuerdo con las SEQ ID NOS: 101, 102, 103, 104, 105 y 106. En algunas modalidades, un anticuerpo anti-OX40 tiene las CDR de acuerdo con las SEQ ID NOS: 111, 112, 113, 114, 115 y 116. En algunas modalidades, un anticuerpo anti-OX40 tiene las CDR de acuerdo con las SEQ ID NOS: 121, 122, 123, 114, 125 y 126. En algunas modalidades, un anticuerpo anti-OX40 tiene las CDR de acuerdo con las SEQ ID NOS: 131, 132, 133, 114, 115 y 136.

Las CDR descritas en la presente descripción forman elementos de unión dentro de las cadenas Vh y Vl de los anticuerpos anti-OX40 de la descripción. Las TABLAS 4 y 5 a continuación describen las cadenas Vh y Vl correspondientes a anticuerpos anti-OX40 ilustrativos que contienen las CDR descritas anteriormente. Las CDR se subrayan a continuación en las TABLAS 4 y 5. En algunas modalidades, un anticuerpo anti-OX40 comprende una cadena Vh que tiene una secuencia de aminoácidos como se describe en la TABLA 4:

Continuación

y una cadena Vl que tiene una secuencia de aminoácidos como se describe en la TABLA 5:

Continuación

En algunas modalidades, un anticuerpo anti-OX40 comprende una cadena Vh que tiene una secuencia de aminoácidos de acuerdo con la SEQ ID NO:21, y una cadena Vl que tiene una secuencia de aminoácidos de acuerdo con la SEQ ID NO:31. En algunas modalidades, un anticuerpo anti-OX40 comprende una cadena Vh que tiene una secuencia de aminoácidos de acuerdo con la SEQ ID NO:23, y una cadena Vl que tiene una secuencia de aminoácidos de acuerdo con la SEQ ID NO:33. En algunas modalidades, un anticuerpo anti-OX40 comprende una cadena Vh que tiene una secuencia de aminoácidos de acuerdo con la SEQ ID NO:25, y una cadena V l que tiene una secuencia de aminoácidos de acuerdo con la SEQ ID NO:35. En algunas modalidades, un anticuerpo anti-OX40 comprende una cadena Vh que tiene una secuencia de aminoácidos de acuerdo con la SEQ ID NO:27, y una cadena Vl que tiene una secuencia de aminoácidos de acuerdo con la SEQ ID NO:37.

En algunas modalidades, un anticuerpo anti-OX40 es adecuado para la administración a humanos. En una modalidad específica, el anticuerpo anti-OX40 es humanizado. En algunas modalidades, un anticuerpo anti-OX40 comprende una cadena Vh que tiene una secuencia de aminoácidos de acuerdo con la SEQ ID NO:22, y una cadena Vl que tiene una secuencia de aminoácidos de acuerdo con la SEQ ID NO:32. En algunas modalidades, un anticuerpo anti-OX40 comprende una cadena V h que tiene una secuencia de aminoácidos de acuerdo con la SEQ ID NO:24, y una cadena Vl que tiene una secuencia de aminoácidos de acuerdo con la SEQ ID NO:34. En algunas modalidades, un anticuerpo anti-OX40 comprende una cadena Vh que tiene una secuencia de aminoácidos de acuerdo con la SEQ ID NO:26, y una cadena Vl que tiene una secuencia de aminoácidos de acuerdo con la SEQ ID NO:36. En algunas modalidades, un anticuerpo anti-OX40 comprende una cadena Vh que tiene una secuencia de aminoácidos de acuerdo con la SEQ ID NO:28, y una cadena Vl que tiene una secuencia de aminoácidos de acuerdo con la SEQ ID NO:38.

Un experto en la técnica entenderá que ciertas mutaciones de una secuencia Vh o Vl en un anticuerpo anti-OX40 descrito en la presente descripción proporcionan anticuerpos anti-OX40 dentro del alcance de la descripción. Las mutaciones pueden incluir sustituciones, adiciones o deleciones de aminoácidos de una secuencia Vh o Vl como se describe en la presente descripción a la vez que se mantiene una actividad anti-OX40 significativa. En consecuencia, en algunas modalidades, un anticuerpo anti-OX40 comprende una secuencia Vh que tiene al menos 85 %, al menos 90 %, al menos 93 %, al menos 95 %, al menos 96 %, al menos 97 %, al menos 98 %, o al menos 99 % de identidad de secuencia con cualquiera de las secuencias Vh que se muestran en la TABLA 4. Un anticuerpo anti-OX40 puede comprender una secuencia VH que tiene hasta 8, hasta 7, hasta 6, hasta 5, hasta 4, hasta 3 o hasta 2 mutaciones en comparación con cualquiera de las secuencias Vh que se muestran en la TABLA 4. En algunas modalidades, un anticuerpo anti-OX40 puede comprender una secuencia Vh que tiene 5 o menos, 4 o menos, 3 o menos, o 2 o menos mutaciones en comparación con cualquiera de las secuencias VH que se muestran en la TABLA 4. En algunas modalidades, un anticuerpo anti-OX40 comprende una secuencia Vl que tiene al menos 85 %, al menos 90 %, al menos 93 %, al menos 95 %, al menos 96 %, al menos 97 %, al menos 98 %, o al menos 99 % de identidad de secuencia con cualquiera de las secuencias Vl que se muestran en la TABLA 5. Un anticuerpo anti-OX40 puede comprender una secuencia Vl que tiene hasta 8, hasta 7, hasta 6, hasta 5, hasta 4, hasta 3 o hasta 2 mutaciones en comparación con cualquiera de las secuencias Vl que se muestran en la TABLA 5. En algunas modalidades, un anticuerpo anti-OX40 puede comprender una secuencia Vl que tiene 5 o menos, 4 o menos, 3 o menos, o 2 o menos mutaciones en comparación con cualquiera de las secuencias VL que se muestran en la TABLA 5.

Las secuencias de aminoácidos de cadena ligera y pesada de longitud completa comprenden generalmente una cadena V^ho V^ldescrita anteriormente enlazada a una región constante de inmunoglobulina apropiada, por ejemplo, región constante ligera kappa o IgGi humana. Pueden producirse modificaciones postraduccionales a las secuencias de longitud completa de un anticuerpo anti-OX40, tal como la escisión de uno o más (por ejemplo, 1, 2, 3 o más) residuos de aminoácidos en el extremo C-terminal de la cadena pesada del anticuerpo. Dichos productos de escisión pueden comprender parte o la totalidad del anticuerpo anti-OX40 según se expresa.

En consecuencia, en algunas modalidades, un anticuerpo anti-OX40 comprende una secuencia de aminoácidos de cadena pesada como se describe en la TABLA 6:

Continuación

Continuación

y una secuencia de aminoácidos de cadena ligera como se describe en la TABLA 7:

en donde los aminoácidos subrayados representan las CDR y los aminoácidos en cursiva representan las regiones constantes.

En algunas modalidades, un anticuerpo anti-OX40 comprende una secuencia de aminoácidos de cadena pesada de acuerdo con la SEQ ID NO:41 o 42, y una secuencia de aminoácidos de cadena ligera de acuerdo con la SEQ ID NO:51. En algunas modalidades, un anticuerpo anti-OX40 comprende una secuencia de aminoácidos de cadena pesada de acuerdo con la SEQ ID NO:43 o 44, y una secuencia de aminoácidos de cadena ligera de acuerdo con la SEQ ID NO: 52. En algunas modalidades, un anticuerpo anti-OX40 comprende una secuencia de aminoácidos de cadena pesada de acuerdo con la SEQ ID NO:45 o 46, y una secuencia de aminoácidos de cadena ligera de acuerdo con la SEQ ID NO:53. En algunas modalidades, un anticuerpo anti-OX40 comprende una secuencia de aminoácidos de cadena pesada de acuerdo con la SEQ ID NO:47 o 48, y una secuencia de aminoácidos de cadena ligera de acuerdo con la SEQ ID NO:54.

En algunas modalidades, un anticuerpo anti-OX40 comprende una secuencia de cadena pesada que tiene al menos 85 %, al menos 90 %, al menos 93 %, al menos 95 %, al menos 96 %, al menos 97 %, al menos 98 %, o al menos 99 % de identidad de secuencia con la secuencia de cadena pesada de acuerdo con cualquiera de las SEQ ID NOS:41-48. Un anticuerpo anti-OX40 puede comprender una secuencia de cadena pesada que tiene hasta 8, hasta 7, hasta 6, hasta 5, hasta 4, hasta 3 o hasta 2 mutaciones en comparación con la secuencia de cadena pesada de acuerdo con cualquiera de las SEQ ID NOS:41-48. En algunas modalidades, un anticuerpo anti-OX40 puede comprender una secuencia de cadena pesada que tiene 5 o menos, 4 o menos, 3 o menos, o 2 o menos mutaciones en comparación con la secuencia de cadena pesada de acuerdo con cualquiera de las SEQ ID NOS:41-48.

En algunas modalidades, un anticuerpo anti-OX40 comprende una secuencia de cadena ligera que tiene al menos 85 %, al menos 90 %, al menos 93 %, al menos 95 %, al menos 96 %, al menos 97 %, al menos 98 %, o al menos 99 % de identidad de secuencia con la secuencia de cadena ligera de acuerdo con una cualquiera de las SEQ ID NOS:51-54. Un anticuerpo anti-OX40 puede comprender una secuencia de cadena ligera que tiene hasta 8, hasta 7, hasta 6, hasta 5, hasta 4, hasta 3 o hasta 2 mutaciones en comparación con la secuencia de cadena ligera de acuerdo con cualquiera de las SEQ ID NOS:51-54. En algunas modalidades, un anticuerpo anti-OX40 puede comprender una secuencia de cadena ligera que tiene 5 o menos, 4 o menos, 3 o menos, o 2 o menos mutaciones en comparación con la secuencia de cadena ligera de acuerdo con cualquiera de las SEQ ID NOS:51-54.

Las modificaciones postraduccionales adicionales de un anticuerpo anti-OX40 pueden incluir la glucosilación. Los complejos biantenarios comunes pueden componerse de una estructura central que tiene dos N-acetilglucosamina (GlcNAc), tres manosas y dos residuos GlcNAc que se unen por p-12 a manosa a-6 y a manosa a-3 para formar dos antenas. Pueden unirse al núcleo una o más fucosas (Fuc), galactosas (Gal), glucanos con alto contenido de manosa Man-5 o Man-9, GlcNAc bisecante y ácido siálico, lo que incluye residuos de ácido N-acetilneuramínico (NANA) o ácido N-glicolilneuramínico (NGNA). Las glicoformas ligadas a N pueden incluir G0 (proteína que tiene una estructura de glicosilación biantenaria central), G0F (G0 fucosilado), GlcNAc G0F, G1 (proteína que tiene una estructura de glicosilación central con un residuo de galactosa), G IF (G1 fucosilado), G2 (proteína que tiene una estructura de glicosilación central con dos residuos de galactosa) y/o G2F (G2 fucosilado).

En algunas modalidades, los anticuerpos anti-OX40 compiten por la unión a la OX40 humana (SEQ ID NO:1) en ensayos in vitro con un anticuerpo de referencia. En algunas modalidades, los anticuerpos anti-OX40 compiten por la unión a la OX40 humana en células que expresan la OX40 humana. El anticuerpo de referencia puede ser cualquiera de los anticuerpos anti-OX40 descritos en la presente descripción. En algunas modalidades, el anticuerpo de referencia es un anticuerpo que tiene una Vh de acuerdo con una descrita en la TABLA 4 y una Vl de acuerdo con una descrita en la TABLA 5. En modalidades específicas, el anticuerpo de referencia es un anticuerpo de ratón que comprende Vh de Mu3726 y Vl de Mu3726 ("Mu3726"), anticuerpo de ratón que comprende Vh de Mu3738 y Vl de Mu3738 ("Mu3738"), anticuerpo de ratón que comprende Vh de Mu3739 y Vl de Mu3739 ("Mu3739"), o anticuerpo de ratón que comprende Vh de Mu3741 y Vl de Mu374l ("Mu3741"). En algunas modalidades, el anticuerpo de referencia es una versión humanizada de Mu3726, Mu3738, Mu3739 o Mu3741. En ciertas modalidades, el anticuerpo de referencia es un anticuerpo humanizado que comprende una cadena pesada de acuerdo con la SEQ ID NO:41 o 42 y una cadena ligera de acuerdo con la s Eq ID NO:51 ("Hu3738"), un anticuerpo humanizado que comprende una cadena pesada de acuerdo con la SEQ ID NO:43 o 44 y una cadena ligera de acuerdo con la SEQ ID NO:52 ("Hu3726"), un anticuerpo humanizado que comprende una cadena pesada de acuerdo con la SEQ ID NO:45 o 46 y una cadena ligera de acuerdo con la SEq ID NO:53 ("Hu3739"), o un anticuerpo humanizado que comprende una cadena pesada de acuerdo con la SEQ ID NO:47 o 48 y una cadena ligera de acuerdo con la SEQ ID NO:54 ("Hu3741").

Los anticuerpos anti-OX40 descritos en la presente descripción generalmente se unen específicamente a la OX40 humana. La reactividad cruzada de los anticuerpos por la unión a la OX40 de otras especies, por ejemplo, de mono, por ejemplo, mono cynomolgus, puede ofrecer ventajas, tales como la capacidad de probar en modelos animales de mono para determinar la actividad biológica. Dichas pruebas en modelos animales pueden usarse para tamizar anticuerpos anti-OX40 para seleccionar propiedades relacionadas con la eficacia, por ejemplo, farmacocinética favorable, o aquellas relacionadas con la seguridad, por ejemplo, disminución de la toxicidad hepática. En algunas modalidades, un anticuerpo anti-OX40 se une a la OX40 de cynomolgus (SEQ ID NO:2) (Secuencia de referencia NCBI XP005545179) así como también a la OX40 humana. En algunas modalidades, un anticuerpo anti-OX40 no se une a la OX40 de ratón (SEQ ID NO:3) (Secuencia de referencia NCBI NP037181).

Los ensayos para la competencia incluyen, pero no se limitan a, un inmunoensayo marcado con material radiactivo (RIA), un ensayo de inmunosorción ligada a enzimas (ELISA), un ELISA tipo sandwich, ensayos de clasificación de células activadas por fluorescencia (FACS) y ensayos de resonancia de plasmones de superficie.

Los ensayos de resonancia de plasmones de superficie (SPR) permiten la medición directa de la cinética de unión entre dos proteínas, por ejemplo, un receptor y un anticuerpo, tal como el receptor de OX40 humana y un anticuerpo anti-OX40, sin la necesidad de una señal o etiqueta reportera. Tanto la constante de disociación de equilibrio Kd, una medida de afinidad de unión, así como también sus dos componentes: las constantes de velocidad de cinética de unión, ka (M-1-s-1) (constante de asociación, kon u "tasa de asociación") y kd (s-1) (constante de disociación, k f u "tasa de disociación") - puede determinarse mediante el uso de SPR. Las constantes se relacionan mediante la siguiente ecuación:

K^d= kd / ka.

En algunas modalidades, los anticuerpos anti-OX40 tienen una Kd de al menos aproximadamente 100 nM, pero pueden exhibir mayor afinidad, por ejemplo, al menos aproximadamente 90 nM, 80 nM, 70 nM, 60 nM, 50 nM, 40 nM, 30 nM, 25 nM, 20 nM, 15 nM, 10 nM, 7 nM, 6 nM, 5 nM, 4 nM, 3 nM, 2 nM, 1 nM, 0,1 nM, 0,01 nM, o incluso mayor. En algunas modalidades, el anticuerpo anti-OX40 tiene una Kd en el intervalo de aproximadamente 1 pM a aproximadamente 100 nM, o una afinidad que varía entre cualquiera de los valores anteriores, tales como, pero no limitado a, de aproximadamente 0,001 a 10 nM, 0,001 a 5 nM, 0,01 a 100 nM, 0,01 a 50 nM, 0,01 a 10 nM, 0,01 a 5 nM, o aproximadamente 0,01 a 1 nM.

En algunas modalidades, un anticuerpo anti-OX40 tiene una constante de disociación kd de no más de aproximadamente 10 s-1, por ejemplo, no más de aproximadamente 1, 0,5, 0,2, 0,1, 0,05, 0,01, 0,005, 0,001 s-1, o incluso más baja. En algunas modalidades, el anticuerpo anti-OX40 tiene una kd en el intervalo de aproximadamente 0,001 s-1 a aproximadamente 10 s-1, o una kd que varía entre cualquiera de los valores anteriores, tales como, pero no limitado a, de aproximadamente 0,01 a 10 s-1, 0,001 a 0,5 s-1, 0,001 a 0,2 s-1, 0,001 a 0,1 s-1, 0,01 a 1 s-1, 0,001 a 0,05 s-1, o aproximadamente 0,001 a 1 s-1.

En algunas modalidades, un anticuerpo anti-OX40 tiene una constante de asociación ka de al menos aproximadamente

104 M-1-s-1, por ejemplo, al menos aproximadamente 1 X 104, 5 X 104, 1 X 105, 5 X 105, 1 X 106, 5 X 106, 1 X 107 M-1-s-1, o incluso mayor. En algunas modalidades, el anticuerpo anti-OX40 tiene una kd en el intervalo de aproximadamente

104 M-1-s-1 a aproximadamente 107 M-1-s-1, o una ka que varía entre cualquiera de los valores anteriores, tal como, por ejemplo, pero no limitado a, aproximadamente 5 X 104 a 1 X 107 M-1-s-1, 5 X 104 a 5 X 106 M-1-s 1 X 104 a 5 X 106 M-1-s-1.

Un anticuerpo anti-OX40 de la descripción puede exhibir una Kd, kd, o ka en un intervalo alrededor de una constante de cinética de unión medida para cualquiera de los anticuerpos anti-OX40 ilustrativos descritos en la presente descripción. Por ejemplo, en algunas modalidades, un anticuerpo anti-OX40 tiene una constante de disociación kd en un intervalo de aproximadamente 0,01 a aproximadamente 100 veces, por ejemplo, aproximadamente 0,1 a aproximadamente 10 veces, o aproximadamente 0,5 a aproximadamente 5 veces, la kd de cualquiera de Hu3738, Hu3726, Hu3739 y Hu3741. En algunas modalidades, un anticuerpo anti-OX40 tiene una asociación constante ka en un intervalo de aproximadamente 0,01 a aproximadamente 100 veces, por ejemplo, aproximadamente 0,1 a aproximadamente 10 veces, o aproximadamente 0,5 a aproximadamente 5 veces, la ka de cualquiera de Hu3738, Hu3726, Hu3739yHu3741.

Al llevar a cabo un ensayo de competencia de anticuerpos entre un anticuerpo de referencia y un anticuerpo de prueba (independientemente de la especie o el isotipo), primero puede marcarse el de referencia con un marcador detectable, tal como un fluoróforo, biotina o un marcador enzimático (o incluso radiactivo) para permitir la identificación posterior.

En este caso, las células que expresan OX40 humana se incuban con un anticuerpo de prueba sin marcar, se añade un anticuerpo de referencia marcado y se mide la intensidad del marcador unido. Si el anticuerpo de prueba compite con el anticuerpo de referencia marcado mediante la unión a un epítopo superpuesto, la intensidad disminuirá con respecto a una reacción de control llevada a cabo sin el anticuerpo de prueba.

En una modalidad específica de este ensayo, primero se determina la concentración de anticuerpo de referencia marcado que produce el 80 % de la unión máxima ("concs⁰%") en las condiciones de ensayo (por ejemplo, una densidad específica de células), y se lleva a cabo un ensayo de competición con 10X concsü % de anticuerpo de prueba no marcado y concsü % de anticuerpo de referencia marcado.

La inhibición puede expresarse como una constante de inhibición, o Ki, que se calcula de acuerdo con la siguiente fórmula:

Ki = IC⁵⁰/ (1 [concentración de Ac de referencia]/Kd),

donde IC⁵⁰es la concentración de anticuerpo de prueba que produce una reducción del 50 % en la unión del anticuerpo de referencia y Kd es la constante de disociación del anticuerpo de referencia, una medida de su afinidad por la OX40 humana. Los anticuerpos que compiten con anticuerpos anti-OX40 descritos en la presente descripción pueden tener una Ki de 10 pM a 100 nM en las condiciones de ensayo descritas en la presente descripción.

En diversas modalidades, se considera que un anticuerpo de prueba compite con un anticuerpo de referencia si disminuye la unión del anticuerpo de referencia en al menos aproximadamente 20 % o más, por ejemplo, en al menos aproximadamente 20 %, 30 %, 40 %, 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 90 %, 95 % o incluso más, o en un porcentaje que varía entre cualquiera de los valores anteriores, a una concentración de anticuerpo de referencia que es el 80 % de la unión máxima en las condiciones de ensayo específicas usadas, y una concentración de anticuerpo de prueba que es

10 veces mayor que la concentración del anticuerpo de referencia.

En la Sección 8.1.4 se proporciona un ensayo específico y condiciones de ensayo útiles para evaluar si un anticuerpo compite por unirse a la OX40 humana con un anticuerpo de referencia como se describe en la presente descripción.

En algunas modalidades, los anticuerpos anti-OX40 de la descripción activan la OX40 humana (SEQ ID NO: 1). La activación del receptor OX40 puede producirse mediante varios mecanismos, por ejemplo, al proporcionar una actividad similar a un ligando contra el receptor OX40. En tales casos, un anticuerpo anti-OX40 compite por la unión al receptor OX40 con el ligando de OX40 humana (OX40L, CD252; UniProtKB/Swiss-Prot Código P23510.1) (SEQ ID NO:4).

Un anticuerpo anti-OX40 de la descripción puede generalmente activar el receptor OX40 en presencia de reticulación.

En la Sección 8.1.8 se proporciona un ensayo específico y condiciones de ensayo útiles para evaluar si un anticuerpo anti-OX40 puede activar el receptor OX40, por ejemplo, el receptor OX40 humano (SEQ ID NO: 1), en presencia de reticulación. En algunas modalidades, un anticuerpo anti-OX40 activa el receptor OX40 humano en presencia de reticulación con una EC⁵⁰de aproximadamente 1 pM a aproximadamente 500 nM, tal como, pero no limitada a, de aproximadamente 0,01 a aproximadamente 300 nM, de aproximadamente 0,01 a aproximadamente 100 nM, de aproximadamente 0,01 a aproximadamente 10 nM, de aproximadamente 0,01 a aproximadamente 1 nM, de aproximadamente 0,1 a aproximadamente 300 nM, de aproximadamente 0,1 nM a aproximadamente 100 nM, de aproximadamente 1 nM a aproximadamente 100 nM, o de aproximadamente 0,1 nM a aproximadamente 100 nM. En algunas modalidades, un anticuerpo anti-OX40 a 100 pg/ml puede activar el receptor OX40 humano en presencia de reticulación a una actividad al menos aproximadamente 3 veces, tal como de aproximadamente 3 a aproximadamente 1000, por ejemplo, aproximadamente 5, 10, 15, 20, 30, 40, 50, 60, 80, 100, 200, 400, 500, 700, 800 o aproximadamente 1000 veces mayor en comparación con la actividad del receptor OX40 humano en ausencia del anticuerpo anti-OX40.

La reticulación puede proporcionarse mediante varios métodos, lo que incluye la adición de agentes de reticulación exógenos, por ejemplo, mediante anticuerpos o fragmentos F(ab')²de anticuerpos específicos para regiones pesadas, ligeras o variables de anticuerpos humanos o humanizados; mediante proteína A soluble o inmovilizada; mediante líneas celulares transfectadas con receptor Fc; mediante líneas celulares que expresan el receptor Fc endógeno; al recubrir directamente los anticuerpos de la invención a superficies plásticas; mediante superficies plásticas recubiertas con anticuerpos de reticulación exógenos o receptores Fc; o mediante perlas conjugadas con cualquiera de los anteriores. En un ejemplo ilustrativo, los anticuerpos de la invención pueden conjugarse con una proteína tal como biotina, y la avidina o estreptavidina soluble o inmovilizada se usa como un agente de reticulación. En otro ejemplo, en ganglios linfáticos humanos in vivo, se espera que la activación de OX40 después de unirse a un anticuerpo anti-OX40 se produzca después de la reticulación del receptor proporcionada por las células presentadoras de antígeno FcyR+ endógenas.

En algunas modalidades, un anticuerpo anti-OX40 se une y activa el receptor OX40 humano en ausencia de reticulación. En algunas modalidades, un anticuerpo anti-OX40 activa el receptor OX40, por ejemplo, el receptor OX40 humano (SEQ ID NO: 1), en ausencia de OX40L, por ejemplo, OX40L humano (SEQ ID NO:4). En la Sección 8.1.8 se proporciona un ensayo específico y condiciones de ensayo útiles para evaluar si un anticuerpo anti-OX40 puede activar el receptor OX40 sin reticulación. En algunas modalidades, un anticuerpo anti-OX40 activa el receptor OX40 humano sin reticulación con una EC⁵⁰de aproximadamente 1 pM a aproximadamente 500 nM, tal como, pero no limitado a, de aproximadamente 0,01 a aproximadamente 300 nM, de aproximadamente 0,01 a aproximadamente 100 nM, de aproximadamente 0,1 a aproximadamente 300 nM, de aproximadamente 0,1 nM a aproximadamente 100 nM, de aproximadamente 1 nM a aproximadamente 100 nM, de aproximadamente 0,1 nM a aproximadamente 100 nM, de aproximadamente 1 a aproximadamente 300 nM, de aproximadamente 1 a aproximadamente 100 nM, de aproximadamente 1 a aproximadamente 50 nM, o de aproximadamente 10 a aproximadamente 100 nM. En algunas modalidades, un anticuerpo anti-OX40 a 100 pg/ml puede activar el receptor OX40 humano sin reticulación a una actividad al menos aproximadamente 5 veces, tal como de aproximadamente 5 a aproximadamente 1000, por ejemplo, aproximadamente 5, 10, 15, 20, 30, 40, 50, 60, 80, 100, 200, 300, 400, 500, 700, 800 o aproximadamente 1000 veces mayor en comparación con la actividad del receptor OX40 humano dosificado con una cantidad equivalente de anticuerpo de isotipo. En algunas modalidades, un anticuerpo anti-OX40 a 10 pg/ml puede activar el receptor OX40 humano sin reticulación a una actividad al menos aproximadamente 3 veces, tal como de aproximadamente 3 a aproximadamente 300, por ejemplo, aproximadamente 3, 5, 6, 8, 10, 12, 15, 20, 25, 30, 40, 50, 60, 80, 100, 200 o aproximadamente 300 veces mayor en comparación con la actividad del receptor OX40 humano dosificado con una cantidad equivalente de anticuerpo de isotipo. En algunas modalidades, un anticuerpo anti-OX40 a 1 pg/ml puede activar el receptor OX40 humano sin reticulación a una actividad al menos aproximadamente 3 veces, tal como de aproximadamente 3 a aproximadamente 150, por ejemplo, aproximadamente 3, 4, 5, 6, 7, 8, 10, 12, 15, 20, 25, 30, 40, 50, 60, 80, 100, o aproximadamente 150 veces mayor en comparación con la actividad del receptor OX40 humano dosificado con una cantidad equivalente de anticuerpo de isotipo.

En algunas modalidades, un anticuerpo anti-OX40 activa el receptor OX40, por ejemplo, el receptor OX40 humano (SEQ ID NO: 1), a un nivel mayor en presencia de reticulación en comparación con sin reticulación. En la Sección 8.1.8 se proporciona un ensayo específico y condiciones de ensayo útiles para determinar el nivel al que un anticuerpo anti-OX40 puede activar el receptor OX40 sin reticulación. El nivel de actividad puede medirse, por ejemplo, en términos de EC⁵⁰y/o una activación máxima observada. En algunas modalidades, el anticuerpo anti-OX40 a 100 pg/ml activa el receptor OX40, por ejemplo, el receptor OX40 humano (SEQ ID NO: 1), sin reticulación a de aproximadamente 20 % a aproximadamente 95 % de la actividad de NF-kB, tal como aproximadamente 25 %, 30 %, 40 %, 50 %, 60 %, 70 %, 80 % o aproximadamente 90 %, en comparación con la actividad NF-kB con reticulación en un ensayo de acuerdo con la Sección 8.1.8.

En algunas modalidades, un anticuerpo anti-OX40 activa el receptor OX40 humano sin reticulación con una EC⁵⁰de aproximadamente 0,1 nM a aproximadamente 500 nM, tal como, pero no limitado a, de aproximadamente 1 nM a aproximadamente 100 nM, de aproximadamente 0,1 nM a aproximadamente 100 nM, de aproximadamente 1 a aproximadamente 300 nM, de aproximadamente 1 a aproximadamente 100 nM, de aproximadamente 1 a aproximadamente 50 nM, o de aproximadamente 10 a aproximadamente 100 nM, en un ensayo de acuerdo con la Sección 8.1.8. En algunas de tales modalidades, un anticuerpo anti-OX40 a 10 pg/ml puede activar el receptor OX40 humano sin reticulación a una actividad al menos aproximadamente 3 veces, tal como de aproximadamente 3 a aproximadamente 300, por ejemplo, aproximadamente 3, 5, 6, 8, 10, 12, 15, 20, 25, 30, 40, 50, 60, 80, 100, 200, o aproximadamente 300 veces mayor en comparación con la actividad del receptor OX40 humano dosificado con una cantidad equivalente de anticuerpo de isotipo. En algunas de tales modalidades, un anticuerpo anti-OX40 activa el receptor OX40 humano en presencia de reticulación con una EC⁵⁰de aproximadamente 1 pM a aproximadamente 300 nM, tal como, pero no limitada a, de aproximadamente 0,01 a aproximadamente 300 nM, de aproximadamente 0,01 a aproximadamente 100 nM, de aproximadamente 0,01 a aproximadamente 10 nM, de aproximadamente 0,01 a aproximadamente 1 nM, de aproximadamente 0,1 a aproximadamente 300 nM, de aproximadamente 0,1 nM a aproximadamente 100 nM, de aproximadamente 1 nM a aproximadamente 100 nM, o de aproximadamente 0,1 nM a aproximadamente 100 nM, en un ensayo de acuerdo con la Sección 8.1.8. En algunas de tales modalidades, un anticuerpo anti-OX40 puede activar el receptor OX40 humano en presencia de reticulación a una EC⁵⁰inferior, tal como de aproximadamente 1,5 a aproximadamente 100 veces, tal como de aproximadamente 1,5 a aproximadamente 10 veces, por ejemplo, aproximadamente 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, o aproximadamente 10 veces inferior, en comparación con la EC⁵⁰del anticuerpo 1A7 descrito en la publicación de Estados Unidos núm. 2015/0307617 en un ensayo de acuerdo con la Sección 8.1.8.

Un anticuerpo anti-OX40 de la invención puede activar el receptor OX40 humano sin reticulación con una EC⁵⁰de aproximadamente 1 nM a aproximadamente 100 nM en un ensayo de acuerdo con la Sección 8.1.8, y puede activar el receptor OX40 humano en presencia de reticulación a una EC⁵⁰inferior, tal como de aproximadamente 1,5 a aproximadamente 10 veces inferior, en comparación con la EC⁵⁰del anticuerpo 1A7 descrito en la publicación de Estados Unidos núm. 2015/0307617 en un ensayo de acuerdo con la Sección 8.1.8. Los anticuerpos anti-OX40 ilustrativos que tienen las propiedades mencionadas anteriormente incluyen Mu3738 y Hu3738 como se describe en los Ejemplos 2 a 8 en la presente descripción.

En general, la activación de OX40 tras el tratamiento con un anticuerpo anti-OX40 da como resultado una transducción de señal, tal como un aumento en la producción de citocinas (por ejemplo, interferón-gamma (IFN-y)) y/o un aumento en la proliferación celular, por ejemplo, proliferación de células T CD4+. En algunas modalidades, el aumento en la producción de IFN-y después del tratamiento con 1 pg/ml de un anticuerpo anti-OX40 es de aproximadamente 1,5 a aproximadamente 50 veces, tal como aproximadamente 1,5, 2, 3, 4, 5, 6, 8, 10, 15, 20, 25, 30, 40, o aproximadamente 50 veces el nivel de producción de IFN-y después del tratamiento con una cantidad equivalente de un anticuerpo de isotipo. En algunas modalidades, el aumento en la proliferación de células T CD4+ después del tratamiento con 1 pg/ml de un anticuerpo anti-OX40 es de aproximadamente 1,5 a aproximadamente 20 veces, tal como aproximadamente 1,5, 2, 3, 4, 5, 6, 8, 10, 15 o aproximadamente 20 veces el nivel de proliferación de células T CD4+ después del tratamiento con una cantidad equivalente de un anticuerpo de isotipo. Los ensayos para determinar los niveles de citocinas o para determinar los niveles de proliferación celular son conocidos en la técnica. En la presente sección 8.1.12 se proporciona un ensayo específico y condiciones de ensayo para determinar la producción de IFN-y y/o la proliferación de células T CD4+.

7.4. Polinucleótidos que codifican los anticuerpos anti-OX40, sistemas de expresión y métodos para fabricar los mismos

La presente descripción abarca moléculas de ácido nucleico que codifican genes de cadena ligera y pesada de inmunoglobulina para anticuerpos anti-OX40, vectores que comprenden dichos ácidos nucleicos y células huésped capaces de producir los anticuerpos anti-OX40 de la descripción.

Puede prepararse un anticuerpo anti-OX40 de la descripción mediante la expresión recombinante de genes de cadena ligera y pesada de inmunoglobulina en una célula huésped. Para expresar un anticuerpo de forma recombinante, una célula huésped se transfecta con uno o más vectores de expresión recombinantes que portan fragmentos de ADN que codifican las cadenas ligeras y pesadas de la inmunoglobulina del anticuerpo, de manera que las cadenas ligera y pesada se expresan en la célula huésped y, opcionalmente, se secretan en el medio en el que se cultivan las células huésped, a partir del cual pueden recuperarse los anticuerpos. Las metodologías estándar de ADN recombinante se usan para obtener genes de cadena pesada y ligera de anticuerpos, incorporar estos genes en vectores de expresión recombinantes e introducir los vectores en células huésped, tales como las descritas en Molecular Cloning; A Laboratory Manual, Segunda Edition (Sambrook, Fritsch y Maniatis (eds), Cold Spring Harbor, N. Y., 1989), Current Protocols in Molecular Biology (Ausubel, F.M. y otros, eds., Greene Publishing Associates, 1989) y en la patente de Estados Unidos núm. 4,816,397.

Para generar ácidos nucleicos que codifican dichos anticuerpos anti-OX40, primero se obtienen fragmentos de ADN que codifican las regiones variables de cadena ligera y pesada. Estos ADN pueden obtenerse mediante amplificación y modificación de ADN de línea germinal o ADNc que codifica secuencias variables de cadena ligera y pesada, por ejemplo, mediante el uso de la reacción en cadena de la polimerasa (PCR). Las secuencias de ADN de la línea germinal para genes de la región variable de la cadena ligera y pesada humana son conocidas en la técnica (ver, por ejemplo, la base de datos de secuencias de la línea germinal humana "VBASE"; ver, además, Kabat, E.A. y otros, 1991, Sequences of Proteins of Immunological Interest, quinta edición, Department of Health and Human Services de Estados Unidos, Publicación NIH núm. 91-3242; Tomlinson y otros, 1992, J. Mol. Biol. 22T: 116-198; y Cox y otros, 1994, Eur. J. Immunol. 24:827-836).

Una vez que se obtienen fragmentos de ADN que codifican segmentos Vh y Vl relacionados con el anticuerpo anti-OX40, estos fragmentos de ADN pueden manipularse posteriormente mediante técnicas estándar de ADN recombinante, por ejemplo, para convertir los genes de la región variable en genes de cadena de anticuerpos de longitud completa, en genes de fragmento Fab o en un gen scFv. En estas manipulaciones, un fragmento de a Dn que codifica Vl o Vh se une operativamente a otro fragmento de ADN que codifica otra proteína, tal como una región constante de anticuerpo o un enlazador flexible. El término "unido operativamente", como se usa en este contexto, pretende significar que los dos fragmentos de ADN se unen de manera que las secuencias de aminoácidos codificadas por los dos fragmentos de ADN permanecen en marco.

El ADN aislado que codifica la región Vh puede convertirse en un gen de cadena pesada de longitud completa al unir operativamente el ADN que codifica Vh a otra molécula de ADN que codifica regiones constantes de cadena pesada (CH1, CH2, CH3 y, opcionalmente, CH4). Las secuencias de los genes de la región constante de la cadena pesada humana son conocidas en la técnica (ver, por ejemplo, Kabat, E.A. y otros, 1991, Sequences of Proteins of Immunological Interest, quinta edición, Department of Health and Human Services de Estados Unidos, Publicación NIH núm. 91-3242) y los fragmentos de a Dn que abarcan estas regiones pueden obtenerse mediante amplificación por PCR estándar. La región constante de la cadena pesada puede ser una región constante de IgG¹, IgG², IgG³, IgG⁴, IgA, IgE, IgM o IgD, pero en ciertas modalidades, es una IgG¹o IgG⁴. Para un gen de la cadena pesada del fragmento Fab, el ADN que codifica Vh puede unirse operativamente a otra molécula de ADN que codifica solo la región constante CH1 de la cadena pesada.

El ADN aislado que codifica la región Vl puede convertirse en un gen de cadena ligera de longitud completa (así como también en un gen de cadena ligera de Fab) al unir operativamente el ADN que codifica Vl a otra molécula de ADN que codifica la región constante de la cadena ligera, CL. Las secuencias de los genes de la región constante de la cadena ligera humana son conocidas en la técnica (ver, por ejemplo, Kabat y otros, 1991, Sequences of Proteins of Immunological Interest, quinta edición, Department of Health and Human Services de Estados Unidos, Publicación NIH núm. 91-3242) y los fragmentos de a Dn que abarcan estas regiones pueden obtenerse mediante amplificación por PCR estándar. La región constante de la cadena ligera puede ser una región constante kappa o lambda, pero en ciertas modalidades, es una región constante kappa. Para crear un gen scFv, los fragmentos de ADN que codifican V^hy V^lse unen operativamente a otro fragmento que codifica un enlazador flexible, por ejemplo, que codifica la secuencia de aminoácidos (GlY⁴~Ser⁾³(SEQ ID NO:60), de manera que las secuencias Vh y Vl pueden expresarse como una proteína de cadena sencilla contigua, con las regiones V^ly V^hunidas por el enlazador flexible (ver, por ejemplo, Bird y otros, 1988, Science 242:423-426; Huston y otros, 1988, Proc. Natl. Acad. Sci. EE. UU. 85:5879-5883; McCafferty y otros, 1990, Nature 348:552-554).

Para expresar los anticuerpos anti-OX40 de la descripción, los ADN que codifican cadenas ligeras y pesadas de longitud parcial o completa, obtenidas como se describió anteriormente, se insertan en vectores de expresión de manera que los genes se unen operativamente a secuencias de control transcripcionales y traduccionales. En este contexto, el término "unido operativamente" pretende significar que un gen de anticuerpo se liga a un vector de manera que las secuencias de control transcripcional y traduccional dentro del vector cumplen su función prevista de regular la transcripción y traducción del gen de anticuerpo. El vector de expresión y las secuencias de control de la expresión se eligen para que sean compatibles con la célula huésped de expresión usada. El gen de la cadena ligera del anticuerpo y el gen de la cadena pesada del anticuerpo pueden insertarse en vectores separados o, más típicamente, ambos genes se insertan en el mismo vector de expresión.

Los genes del anticuerpo se insertan en el vector de expresión mediante métodos estándar (por ejemplo, ligadura de sitios de restricción complementarios en el fragmento del gen del anticuerpo y el vector, o ligadura de extremos romos si no hay sitios de restricción presentes). Antes de la inserción de las secuencias de cadena ligera o pesada relacionadas con el anticuerpo anti-OX40, el vector de expresión ya puede portar secuencias de región constante de anticuerpo. Por ejemplo, un enfoque para convertir las secuencias Vh y Vl relacionadas con anticuerpos monoclonales anti-OX40 en genes de anticuerpos de longitud completa es insertarlas en vectores de expresión que ya codifican regiones constantes de cadena pesada y constante de cadena ligera, respectivamente, de manera que el segmento Vh se une operativamente al segmento o segmentos CH dentro del vector y el segmento V l se une operativamente al segmento CL dentro del vector. Adicional o alternativamente, el vector de expresión recombinante puede codificar un péptido señal que facilita la secreción de la cadena de anticuerpos a partir de una célula huésped. El gen de la cadena de anticuerpos puede clonarse en el vector de manera que el péptido señal se una en marco al extremo amino del gen de la cadena de anticuerpos. El péptido señal puede ser un péptido señal de inmunoglobulina o un péptido señal heterólogo (es decir, un péptido señal de una proteína no inmunoglobulina).

Además de los genes de la cadena de anticuerpos, los vectores de expresión recombinantes de la descripción portan secuencias reguladoras que controlan la expresión de los genes de la cadena de anticuerpos en una célula huésped. El término "secuencia reguladora" pretende incluir promotores, potenciadores y otros elementos de control de la expresión (por ejemplo, señales de poliadenilación) que controlan la transcripción o traducción de los genes de la cadena de anticuerpos. Dichas secuencias reguladoras se describen, por ejemplo, en Goeddel, Gene Expression Technology: Methods in Enzymology 185, Academic Press, San Diego, Ca , 1990. Los expertos en la técnica apreciarán que el diseño del vector de expresión, lo que incluye la selección de secuencias reguladoras, puede depender de factores tales como la elección de la célula huésped a transformar, el nivel de expresión de proteína deseado, etc. Las secuencias reguladoras adecuadas para la expresión de células huésped de mamíferos incluyen elementos virales que dirigen altos niveles de expresión de proteínas en células de mamíferos, tales como promotores y/o potenciadores derivados del citomegalovirus (CMV) (tales como el promotor/potenciador CMV), Virus del Simio 40 (SV40) (tal como el promotor/potenciador SV40), adenovirus (por ejemplo, el promotor tardío principal de adenovirus (AdMLP)) y polioma. Para una descripción más detallada de los elementos reguladores virales y secuencias de los mismos, ver, por ejemplo, la Patente de Estados Unidos núm. 5,168,062 por Stinski, la Patente de Estados Unidos núm. 4,510,245 por Bell y otros, y la patente de Estados Unidos núm. 4,968,615 por Schaffner y otros.

Además de los genes de la cadena de anticuerpos y las secuencias reguladoras, los vectores de expresión recombinantes de la descripción pueden portar secuencias adicionales, tales como secuencias que regulan la replicación del vector en las células huésped (por ejemplo, orígenes de replicación) y genes marcadores seleccionables. El gen marcador seleccionable facilita la selección de células huésped en las que se ha introducido el vector (ver, por ejemplo, las Patentes de Estados Unidos núms. 4,399,216, 4,634,665 y 5,179,017, todas por Axel y otros). Por ejemplo, típicamente, el gen marcador seleccionable confiere resistencia a fármacos, tales como G418, higromicina o metotrexato, en una célula huésped en la que se ha introducido el vector. Los genes marcadores seleccionables adecuados incluyen el gen de dihidrofolato reductasa (DHFR) (para su uso en células huésped DHFR-con selección/amplificación por metotrexato) y el gen neo (para selección por G418). Para la expresión de las cadenas ligeras y pesadas, el o los vectores de expresión que codifican las cadenas pesadas y ligeras se transfectan en una célula huésped mediante técnicas estándar. Las diversas formas del término "transfección" pretenden abarcar una amplia variedad de técnicas comúnmente usadas para la introducción de ADN exógeno en una célula huésped procariota o eucariota, por ejemplo, electroporación, lipofección, precipitación con fosfato de calcio, transfección con DEAE-dextrano y similares.

Es posible expresar los anticuerpos anti-OX40 de la descripción en células huésped procariotas o eucariotas. En ciertas modalidades, la expresión de anticuerpos se realiza en células eucariotas, por ejemplo, células huésped de mamíferos, de secreción óptima de un anticuerpo inmunológicamente activo y plegado adecuadamente. Las células huésped de mamífero ilustrativas para expresar los anticuerpos recombinantes de la descripción incluyen las de ovario de hámster chino (células CHO) (lo que incluye las células CHO DHFR-, descritas en Urlaub y Chasin, (1980) Proc. Natl. Acad. Sci. EE. UU. 77:4216-4220, usadas con un marcador seleccionable DHFR, por ejemplo, como se describe en Kaufman y Sharp (1982) Mol. Biol. 159:601-621), células de mieloma NSO, células COS y células SP2. Cuando los vectores de expresión recombinantes que codifican los genes de anticuerpos se introducen en células huésped de mamífero, los anticuerpos se producen al cultivar las células huésped durante un período de tiempo suficiente para permitir la expresión del anticuerpo en las células huésped o la secreción del anticuerpo hacia el medio de cultivo en el que crecen las células huésped. Los anticuerpos pueden recuperarse del medio de cultivo mediante el uso de métodos estándar de purificación de proteínas. Las células huésped también pueden usarse para producir fragmentos de unión anti-OX40 de anticuerpos, tal como fragmentos Fab o moléculas scFv. Se entenderá que las variaciones en el procedimiento anterior están dentro del alcance de la presente descripción. Por ejemplo, puede ser conveniente transfectar una célula huésped con ADN que codifique ya sea la cadena ligera o la cadena pesada (pero no ambas) de un anticuerpo anti-OX40 de esta descripción.

La tecnología de ADN recombinante puede usarse, además, para eliminar parte o la totalidad del ADN que codifica una o ambas cadenas ligera y pesada que no es necesaria para la unión a la OX40 humana. Las moléculas expresadas a partir de tales moléculas de ADN truncadas también se abarcan por los anticuerpos de la descripción.

Para la expresión recombinante de un anticuerpo anti-OX40 de la descripción, la célula huésped puede cotransfectarse con dos vectores de expresión de la descripción, donde el primer vector codifica un polipéptido derivado de la cadena pesada y el segundo vector codifica un polipéptido derivado de la cadena ligera. Los dos vectores pueden contener marcadores seleccionables idénticos, o cada uno puede contener un marcador seleccionable separado. Alternativamente, puede usarse un solo vector que codifica tanto polipéptidos de cadena pesada como de ligera.

Una vez que se ha obtenido un ácido nucleico que codifica una o más porciones de un anticuerpo anti-OX40, pueden introducirse otras alteraciones o mutaciones en la secuencia de codificación, por ejemplo, para generar ácidos nucleicos que codifican anticuerpos con diferentes secuencias de CDR, anticuerpos con afinidad reducida al receptor Fc, o anticuerpos de diferentes subclases.

Los anticuerpos anti-OX40 de la descripción también pueden producirse mediante síntesis química (por ejemplo, mediante los métodos descritos en Solid Phase Peptide Synthesis, 2da ed., 1984 The Pierce Chemical Co., Rockford, Ill.). Las variantes de anticuerpos también pueden generarse mediante el uso de una plataforma libre de células (ver, por ejemplo, Chu y otros, Biochemia núm. 2, 2001 (Roche Molecular Biologicals) y Murray y otros, 2013, Current Opinion in Chemical Biology, 17:420-426).

Una vez que se ha producido un anticuerpo anti-OX40 de la descripción por expresión recombinante, puede purificarse mediante cualquier método conocido en la técnica para la purificación de una molécula de inmunoglobulina, por ejemplo, por cromatografía (por ejemplo, cromatografía en columna de intercambio iónico, afinidad y por tamaño), centrifugación, solubilidad diferencial, o mediante cualquier otra técnica estándar para la purificación de proteínas. Además, los anticuerpos anti-OX40 de la presente descripción pueden fusionarse con secuencias de polipéptidos heterólogas descritas en la presente descripción o de cualquier otra manera conocidas en la técnica para facilitar la purificación.

Una vez aislado, el anticuerpo anti-OX40 puede, si se desea, purificarse aún más, por ejemplo, mediante cromatografía líquida de alta resolución (ver, por ejemplo, Fisher, Laboratory Techniques In Biochemistry And Molecular Biology, Work y Burdon, eds., Elsevier, 1980), o por cromatografía de filtración en gel en una columna Superdex™ 75 (Pharmacia Biotech AB, Uppsala, Suecia).

7.5. Composiciones Farmacéuticas

Los anticuerpos anti-OX40 descritos en la presente descripción pueden estar en forma de composiciones que comprenden el anticuerpo y uno o más portadores, excipientes y/o diluyentes (todos los cuales se denominan en la presente descripción como "portadores"), es decir, agentes tampones, agentes estabilizantes, conservantes, isotonificadores, detergentes no iónicos, antioxidantes y otros aditivos misceláneos. Ver, Remington's Pharmaceutical Sciences, 16ta edición (Osol, ed. 1980). Las composiciones pueden formularse para usos específicos, tales como para usos veterinarios o usos farmacéuticos en humanos. La forma de la composición (por ejemplo, polvo seco, formulación líquida, etc.) y los portadores usados dependerá de los usos previstos del anticuerpo y, para usos terapéuticos, del modo de administración.

Para usos terapéuticos, las composiciones pueden suministrarse como parte de una composición farmacéutica estéril que incluye un portador farmacéuticamente aceptable. Esta composición puede estar en cualquier forma adecuada (en dependencia del método deseado de administración a un paciente). La composición farmacéutica puede administrarse a un paciente por una variedad de rutas, tales como por vía intravenosa, intratumoral o intratecal. La ruta más adecuada para la administración en cualquier caso dependerá del anticuerpo en particular, el sujeto, y la naturaleza y gravedad de la enfermedad y la condición física del sujeto. Típicamente, la composición farmacéutica se administrará por vía intravenosa.

Las composiciones farmacéuticas pueden presentarse convenientemente en formas de dosificación unitarias que contienen una cantidad predeterminada de un anticuerpo anti-OX40 descrito en la presente descripción por dosis. La cantidad de anticuerpo anti-OX40 incluida en una dosis unitaria dependerá de la enfermedad a tratar, así como también de otros factores como se conocen bien en la técnica. Dichas dosis unitarias pueden estar en forma de un polvo seco liofilizado que contiene una cantidad de anticuerpo adecuada para una administración única, o en forma de un líquido. Las formas de dosificación unitaria en polvo seco pueden empaquetarse en un kit con una jeringa, una cantidad adecuada de portador y/u otros componentes útiles para la administración. Las dosis unitarias en forma líquida pueden suministrarse convenientemente en forma de una jeringa precargada con una cantidad del anticuerpo anti-OX40 adecuada para una administración única.

Las composiciones farmacéuticas pueden suministrarse, además, en forma a granel que contiene cantidades de anticuerpo anti-OX40 adecuadas para administraciones múltiples.

Las composiciones farmacéuticas pueden prepararse para el almacenamiento como formulaciones liofilizadas o soluciones acuosas mediante la mezcla de un anticuerpo que tiene el grado deseado de pureza con portadores farmacéuticamente aceptables opcionales empleados típicamente en la técnica. Dichos aditivos no deben ser tóxicos para los receptores a las dosis y concentraciones empleadas.

Por ejemplo, para la administración intravenosa, la composición puede estar en forma de un polvo liofilizado que, tras la reconstitución con agua estéril u otra solución adecuada para inyección o infusión (por ejemplo, solución salina al 0,9 %, solución de Ringer, solución de Ringer lactato, etc.) proporciona una composición acuosa.

7.6. Métodos de uso

7.6.1. Beneficio terapéutico

Los datos proporcionados en la presente descripción demuestran que los anticuerpos anti-OX40 descritos activan el receptor OX40 en presencia de células cancerosas y ejercen una potente actividad anticancerígena contra el cáncer in vivo. En consecuencia, los anticuerpos anti-OX40 y/o las composiciones farmacéuticas que comprenden los anticuerpos anti-OX40 pueden usarse terapéuticamente para tratar cánceres.

En algunas modalidades, el cáncer es un tumor sólido. Los tumores sólidos que pueden tratarse con el anticuerpo anti-OX40 incluyen cáncer de vejiga, cáncer de mama (por ejemplo, cáncer de mama triple negativo), cáncer de cabeza y cuello, cáncer de riñón (por ejemplo, carcinoma de células renales), cáncer de hígado (por ejemplo, carcinoma hepatocelular, colangiocarcinoma), cáncer de pulmón (por ejemplo, cáncer de pulmón de células no pequeñas, mesotelioma, cáncer de pulmón de células pequeñas), melanoma (por ejemplo, melanoma no extirpable o metastásico, melanoma maligno avanzado), cáncer de piel (por ejemplo, carcinoma de células de Merkel), cáncer de ovario, cáncer gástrico y tumores con evidencia de deficiencia en la reparación de errores de emparejamiento de ADN. El cáncer puede comprender tumores que contienen células que expresan OX40; comprender tumores, algunos de los cuales contienen células que expresan OX40 y otros no; o comprender tumores que carecen de células que expresan OX40. El cáncer puede ser diagnosticado recientemente y sin tratamiento previo, o puede ser recurrente, refractario, o recurrente y refractario, o una forma metastásica de un tumor sólido. En algunas modalidades, el tumor sólido no se ha tratado con un agente dirigido a PD-1 o PD-L1. En otras modalidades, el tumor sólido es recurrente o refractario después del tratamiento con un agente dirigido a PD-1 o PD-L1. En algunas modalidades, el tumor sólido se selecciona de cáncer de vejiga, cáncer de mama, cáncer de cabeza y cuello, cáncer de riñón, cáncer de pulmón, melanoma y cáncer gástrico. En algunas modalidades, el tumor sólido se selecciona de: melanoma (por ejemplo, melanoma no extirpable o metastásico), cáncer de pulmón (por ejemplo, cáncer de pulmón de células no pequeñas) y carcinoma de células renales (por ejemplo, carcinoma avanzado de células renales). En algunas modalidades, el tumor sólido se selecciona de cáncer de mama triple negativo, cáncer de ovario, carcinoma hepatocelular, cáncer gástrico, cáncer de pulmón de células pequeñas, mesotelioma, colangiocarcinoma, carcinoma de células de Merkel y tumores con evidencia de deficiencia en la reparación de errores de emparejamiento de ADN. En ciertas modalidades, el cáncer de pulmón es cáncer de pulmón de células no pequeñas metastásico con progresión en o después de quimioterapia basada en platino. En ciertas modalidades, el cáncer de pulmón es cáncer de pulmón de células no pequeñas metastásico o localmente avanzado que ha fracasado en la terapia basada en platino y la terapia con un agente dirigido a PD-1 o PD-L1. En ciertas modalidades, el cáncer de cabeza y cuello es un carcinoma de cabeza y cuello de células escamosas recurrente que no es un candidato para el tratamiento curativo con terapia local o sistémica, o carcinoma metastásico (diseminado) de células escamosas de cabeza y cuello de la cavidad oral, orofaringe, hipofaringe y laringe que se considera incurable mediante las terapias locales.

Como se analizó anteriormente, los anticuerpos anti-OX40 descritos en la presente modulan una respuesta inmunológica. En consecuencia, los pacientes con sistemas inmunitarios comprometidos pueden excluirse del tratamiento. En algunas modalidades, se excluye a un paciente después de cumplir uno o más de los siguientes criterios: (1) enfermedad autoinmune activa o previamente documentada (lo que incluye, pero no se limita a, enfermedad inflamatoria intestinal, enfermedad celíaca, síndrome de Wegener) en los últimos 2 años. (No se excluyen los sujetos con atopia infantil o asma, vitiligo, alopecia, síndrome de Hashimoto, enfermedad de Grave o psoriasis que no requiere tratamiento sistémico (en los últimos 2 años); (2) antecedentes de inmunodeficiencia primaria, trasplante de médula ósea, leucemia linfocítica crónica, trasplante de órganos sólidos o diagnóstico clínico previo de tuberculosis; (3) antecedentes de una coagulopatía o un trastorno plaquetario; (4) resultados positivos confirmados de la prueba para el virus de la inmunodeficiencia humana (VIH), o sujetos con hepatitis B o C crónica o activa. (Pueden inscribirse sujetos que tienen antecedentes de hepatitis B o C que hayan documentado curas después de la terapia antiviral); (5) grado previo > 3 de neurotoxicidad o neumonitis mediada por el sistema inmunitario mientras recibe inmunoterapia (lo que incluye, pero no se limita a, agentes dirigidos contra CTLA-4, PD-L1 o PD-1). Además, cualquier otro evento adverso mediado por inmunidad anterior de grado > 3 mientras recibe inmunoterapia que no se ha resuelto o se ha vuelto asintomático en 3 meses; (6) recepción de vacuna viva atenuada dentro de los 28 días previos a la primera dosis del anticuerpo anti-OX40.

Un anticuerpo anti-OX40 de la descripción puede administrarse solo (monoterapia) o complementario o junto con otras terapias contra el cáncer y/o agentes contra el cáncer dirigidos o no dirigidos. Cuando se administra como una monoterapia anti-OX40, pueden usarse uno o más anticuerpos. Ya sea que se administre como monoterapia o como complemento o junto con otras terapias o agentes, se administra una cantidad de anticuerpo anti-OX40 de manera que el régimen de tratamiento general proporcione un beneficio terapéutico.

Por beneficio terapéutico se entiende que el uso de anticuerpos anti-OX40 para tratar el cáncer en un paciente da como resultado cualquier beneficio clínico demostrado en comparación con ninguna terapia (cuando sea apropiado) o con un estándar de atención conocido. El beneficio clínico puede evaluarse mediante cualquier método conocido por un experto en la técnica. En una modalidad, el beneficio clínico se evalúa basado en la tasa de respuesta objetiva (ORR) (determinada mediante el uso de RECIST versión 1.1), la duración de la respuesta (DOR), la supervivencia libre de progresión (PFS) y/o la supervivencia global (OS). En algunas modalidades, una respuesta completa indica un beneficio terapéutico. En algunas modalidades, una respuesta parcial indica un beneficio terapéutico. En algunas modalidades, una enfermedad estable indica un beneficio terapéutico. En algunas modalidades, un aumento en la supervivencia global indica un beneficio terapéutico. En algunas modalidades, el beneficio terapéutico constituye una mejora en el tiempo hasta la progresión de la enfermedad y/o una mejora en los síntomas o la calidad de vida. En otras modalidades, el beneficio terapéutico no se traduce en un aumento del período de control de la enfermedad, sino más bien en una carga de síntomas marcadamente reducida que da como resultado una mejor calidad de vida. Como será evidente para los expertos en la técnica, puede observarse un beneficio terapéutico mediante el uso de los anticuerpos anti-OX40 solos (monoterapia) o complementarios o junto con otras terapias contra el cáncer y/o agentes contra el cáncer dirigidos o no dirigidos.

Típicamente, el beneficio terapéutico se evalúa mediante pruebas clínicas estándar diseñadas para medir la respuesta a un nuevo tratamiento contra el cáncer. Para evaluar los beneficios terapéuticos de los anticuerpos anti-OX40 descritos en la presente descripción, puede usarse una o una combinación de las siguientes pruebas: (1) los criterios de evaluación de respuesta en tumores sólidos (RECIST) versión 1.1, (2) RECIST relacionado con el sistema inmunitario (irRECIST), (3) estado funcional del Eastern Cooperative Oncology Group (ECOG), (4) criterios de respuesta relacionados con el sistema inmunitario (irRC), (5) enfermedad evaluable mediante la evaluación de antígenos tumorales, (6) escalas de resultados informadas por los pacientes validadas y/o (7) estimaciones de Kaplan-Meier para la supervivencia general y la supervivencia libre de progresión.

La evaluación del cambio en la carga tumoral es un elemento importante de la evaluación clínica de los agentes terapéuticos contra el cáncer. Tanto la reducción del tumor (respuesta objetiva) como el tiempo hasta el desarrollo de la progresión de la enfermedad son criterios de valoración importantes en los ensayos clínicos sobre el cáncer. Los criterios de respuesta estandarizados, conocidos como RECIST (Criterios de evaluación de respuesta en tumores sólidos), se publicaron en 2000. Una actualización (RECIST 1.1) se lanzó en 2009. Los criterios RECIST se usan típicamente en ensayos clínicos en los que la respuesta objetiva es el criterio de valoración principal del estudio, así como también en los ensayos en los que se realizan evaluaciones de enfermedad estable, progresión tumoral o tiempo hasta la progresión porque estos indicadores de resultados se basan en una evaluación de la carga tumoral anatómica y su cambio en el transcurso del ensayo. La TABLA 8 proporciona las definiciones de los criterios de respuesta usados para determinar la respuesta objetiva del tumor a un fármaco en estudio, tal como los anticuerpos anti-OX40 descritos en la presente descripción.

Los indicadores de resultados secundarios que pueden usarse para determinar el beneficio terapéutico de los anticuerpos anti-OX40 descritos en la presente descripción incluyen: tasa de respuesta objetiva (ORR), supervivencia libre de progresión (PFS), supervivencia general (OS), duración de la respuesta general (DOR), y profundidad de respuesta (DpR). La ORR se define como la proporción de los participantes que logran una respuesta completa (CR) o una respuesta parcial (PR). La PFS se define como el tiempo desde la fecha de la primera de dosificación de un anticuerpo anti-OX40 hasta ya sea la progresión de la enfermedad o la muerte, lo que se produzca primero. La OS se define como el periodo de tiempo transcurrido desde la fecha del diagnóstico o el inicio del tratamiento de una enfermedad, que los pacientes diagnosticados con la enfermedad todavía están vivos. La DOR se define como el tiempo desde la CR o PR inicial del participante hasta el momento de la progresión de la enfermedad. La DpR se define como el porcentaje de reducción tumoral observado en el punto de respuesta máximo en comparación con la carga tumoral inicial. Los criterios de valoración clínicos para tanto ORR como PFS pueden determinarse basado en los criterios RECIST 1.1 descritos anteriormente.

Los criterios adicionales que pueden usarse para la evaluación clínica específica para pacientes con cáncer sometidos a tratamiento de inmunoterapia incluyen los criterios estandarizados RECIST relacionados con el sistema inmunitario (irRECIST). Ver, por ejemplo, Nishino, M. y otros, Eur. J. Radiol., 84(7), páginas 1259-1268 (julio de 2015). Estas directrices modificaron los criterios RECIST 1.1 anteriores con la consideración de los posibles efectos inmunomoduladores. La TABLA 9 proporciona las definiciones de los criterios de respuesta usados para determinar la respuesta del tumor objetivo a un fármaco inmunomodulador, tal como los anticuerpos anti-OX40 descritos en la presente descripción.

La escala de estado funcional ECOG que se muestra en la TABLA 10 se usa para describir el nivel de funcionamiento del paciente en términos de su capacidad para cuidarse a sí mismos, su actividad diaria y su capacidad física. La escala se desarrolló por el Eastern Cooperative Oncology Group (ECOG), que ahora forma parte del ECOG-ACRIN Cancer Research Group, y se publicó en 1982.

Otro conjunto de criterios que pueden usarse para caracterizar completamente y determinar la respuesta a los agentes inmunoterapéuticos, tales como las terapias contra el cáncer basadas en anticuerpos, es el criterio de respuesta relacionado con el sistema inmunitario (irRC), que se desarrolló para la medición de tumores sólidos en 2009, y se actualizó en 2013 (Wolchok, y otros, Clin. Cancer Res. 2009; 15(23): 7412-7420 y Nishino, y otros, Clin. Cancer Res.

2013; 19(14): 3936-3943). Los criterios actualizados de irRC se usan típicamente para evaluar el efecto de un agente inmunoterapéutico, tal como un anticuerpo anti-OX40 descrito en la presente descripción, sobre la carga tumoral, y define la respuesta de acuerdo con la TABLA 11.

Un beneficio terapéutico ilustrativo resultante del uso de los anticuerpos anti-OX40 descritos en la presente descripción para tratar tumores sólidos, ya sea administrados como monoterapia o como complemento o junto con otras terapias o agentes, es una respuesta completa. Otro beneficio terapéutico ilustrativo resultante del uso de los anticuerpos anti-OX40 para tratar tumores sólidos, ya sea administrados como monoterapia o como complemento o junto con otras terapias o agentes, es una respuesta parcial.

Las escalas de resultados informadas por el paciente validadas también pueden usarse para denotar la respuesta proporcionada por cada paciente a través de un sistema de informe específico. En lugar de centrarse en la enfermedad, tales escalas de resultados se refieren a la función retenida mientras se maneja una condición crónica. Un ejemplo no limitante de una escala de resultados validada informada por el paciente es PROMIS® (Sistema de información de medición de resultados informados por el paciente) de los Institutos Nacionales de Salud de los Estados Unidos. Por ejemplo, el Instrumento de función física PROMIS® para pacientes adultos con cáncer puede evaluar las capacidades autoinformadas para el funcionamiento de las extremidades superiores (por ejemplo, destreza), extremidades inferiores (por ejemplo, andar o movilidad) y regiones centrales (por ejemplo, movilidad del cuello y espalda), e incluye actividades diarias de rutina, tales como hacer mandados.

Además, pueden usarse las curvas de Kaplan-Meier (Kaplan y Meier, J. Am. Stat. Assoc. 1958; 53(282): 457-481) para estimar la supervivencia general y la supervivencia libre de progresión para pacientes con cáncer sometidos a terapia con anticuerpos anti-OX40 en comparación con el estándar de atención.

7.6.2. Terapias complementarias

Los anticuerpos anti-OX40 pueden usarse como complemento o junto con otros agentes o tratamientos con propiedades anticancerígenas, lo que incluye las terapias estándar de atención, tales como la terapia con anticuerpos anti-PD-1. Cuando se usa de forma complementaria, el anticuerpo anti-OX40 y otro(s) agente(s) puede(n) formularse juntos en una sola formulación farmacéutica combinada, o pueden formularse y administrarse por separado, ya sea en un único régimen de dosificación coordinado o en diferentes regímenes de dosificación. Los agentes administrados como complemento o junto con los anticuerpos anti-OX40 tendrán típicamente actividades complementarias a los anticuerpos anti-OX40 de manera que los anticuerpos y otros agentes no se afecten negativamente entre sí.

7.7. Dosis y regímenes de administración

La cantidad de anticuerpos anti-OX40 administrados dependerá de una variedad de factores, lo que incluye, pero no se limita a, el tipo particular de cáncer tratado, la etapa del cáncer que se trata, el modo de administración, la frecuencia de administración, el beneficio terapéutico deseado, y otros parámetros tales como la edad, el peso y otras características del paciente, etc. La determinación de las dosis eficaces para proporcionar un beneficio terapéutico para modos específicos y la frecuencia de administración está dentro de las capacidades de los expertos en la técnica.

Las dosis eficaces para proporcionar un beneficio terapéutico pueden estimarse inicialmente a partir de modelos animales in vivo. En la técnica se conocen modelos animales adecuados para una amplia variedad de enfermedades.

Los anticuerpos anti-OX40 descritos en la presente descripción pueden administrarse por cualquier ruta apropiada para la afección a tratar. En algunas modalidades, el anticuerpo anti-OX40 es cualquiera de los anticuerpos humanizados con una cadena pesada que tiene una secuencia de aminoácidos de acuerdo con cualquiera de las SEQ ID NOS:41-48, y una cadena ligera que tiene una secuencia de aminoácidos de acuerdo con cualquiera de las SEQ ID NOS:51-54. En ciertas modalidades, el anticuerpo anti-OX40 tiene una cadena pesada que tiene una secuencia de aminoácidos de acuerdo con la SEQ ID NO:41 o 42, y una cadena ligera que tiene una secuencia de aminoácidos de acuerdo con la SEQ ID NO:51. Un anticuerpo anti-OX40 se administrará típicamente por vía parenteral, es decir, infusión, intravenosa (IV), intratecal, bolo, inyección intratumoral o epidural (Shire y otros, 2004, J. Pharm. Sciences 93(6):1390-1402). En una modalidad, se proporciona un anticuerpo anti-OX40 como un polvo liofilizado en un vial. Antes de la administración, el polvo liofilizado se reconstituye con agua estéril para inyección (SWFI) u otro medio adecuado para proporcionar una solución que contiene anticuerpo anti-OX40. En algunas modalidades, la solución reconstituida resultante se diluye además con solución salina u otro medio adecuado para infusión y se administra a través de una infusión IV una vez cada dos semanas, es decir, cada 13, 14 o 15 días.

En algunas modalidades, el anticuerpo anti-OX40 se administra como una infusión IV una vez cada dos semanas a 0,01 mg/kg, 0,1 mg/kg, 1,0 mg/kg o 3,0 mg/kg.

Cuando se administran como complemento o junto con otros agentes, tales como otros agentes quimioterapéuticos, los anticuerpos anti-OX40 pueden administrarse en el mismo horario que el(los) otro(s) agente(s) o en un horario diferente. Cuando se administra en el mismo horario, el anticuerpo anti-OX40 puede administrarse antes, después o simultáneamente con el otro agente.

Como apreciarán los expertos en la técnica, las dosis recomendadas para los diversos agentes descritos anteriormente pueden necesitar ajustarse para optimizar la respuesta del paciente y maximizar el beneficio terapéutico.

8. Ejemplos

Los siguientes ejemplos, que resaltan ciertas características y propiedades de las modalidades ilustrativas de los anticuerpos anti-OX40 descritos en la presente descripción, se proporcionan con fines ilustrativos y no limitantes.

Ejemplo 1: Materiales y Métodos

8.1.1. Unión del anticuerpo anti-OX40 a la OX40 humana por ELISA

Placas Immunolon 4xHB de 96 pocillos (Thermo Scientific) se recubrieron con 1 pg/ml de OX40 humana-FC (R&D Systems) a 4 °C durante toda la noche. Las placas se bloquearon con solución salina tamponada con fosfato (PBS) que contenía albúmina de suero bovino al 1 % (BSA) durante 30 minutos a temperatura ambiente y después se lavaron tres veces con PBST (PBS con Tween 20 al 0,1 %) mediante el uso de un lavador de placas. Las placas recubiertas con OX40 se incubaron a continuación con las concentraciones indicadas de anticuerpo de prueba a temperatura ambiente durante una hora. Las placas se lavaron cuatro veces con PBST y después se incubaron durante 1 hora a temperatura ambiente con 100 pl de específico anti-fragmento Fab humano de cabra marcado con biotina (Jackson ImmunoResearch) preparado a una dilución de 1:5000 en PBS que contenía BSA al 1 %. A continuación, se lavaron las placas cinco veces en PBST y se añadieron 100 pl de una dilución 1:1000 de estreptavidina-peroxidasa de rábano picante (HRP) (Thermo Scientific) a cada pocillo y se incubaron durante 30 minutos a temperatura ambiente. Las placas se lavaron posteriormente cinco veces en PBST y se añadieron 100 pl de componente TMB One (Surmodics) a cada pocillo y se incubaron a temperatura ambiente (TA) hasta que se desarrolló color (aproximadamente 5-10 minutos). La densidad óptica (OD) se leyó a 650 nm (Molecular Devices Spectromax190).

8.1.2. Unión del anticuerpo anti-OX40 a OX40 de monos Cynomolgus por ELISA

Placas Immunolon 4xHB de 96 pocillos (Thermo Scientific) se recubrieron con 1 pg/ml de fusión OX40 de Cyno-Fc a 4 °C durante toda la noche. Las placas se bloquearon con PBS que contenía albúmina de suero bovino al 1 % (BSA) durante 30 minutos a TA y después se lavaron tres veces con PBST (PBS con Tween 20 al 0,1 %). Las placas recubiertas con OX40 se incubaron a continuación con las concentraciones indicadas de anticuerpo anti-OX40 a temperatura ambiente durante una hora. Las placas se lavaron cuatro veces con PBST y después se incubaron durante 1 hora a temperatura ambiente con 100 pl de específico anti-fragmento Fab humano de cabra marcado con biotina (Jackson ImmunoResearch) preparado a una dilución 1:5000 en PBS que contenía BSA al 1 %. A continuación, las placas se lavaron cinco veces en PBST y se añadieron 100 pl de una dilución 1:1000 de estreptavidina-HRP (Thermo Scientific) a cada pocillo y se incubaron durante 30 minutos a temperatura ambiente. Después se lavaron las placas cinco veces en PBST y se añadieron 100 pl de componente TMB One (Surmodics) a cada pocillo y se incubaron a temperatura ambiente hasta que se desarrolló color (aproximadamente 5-10 minutos). La densidad óptica (OD) se leyó a 650 nm (Molecular Devices Spectromax190).

8.1.3. Unión del anticuerpo anti-OX40 a OX40 de Rhesus por citometría de flujo

La OX40 de macaco rhesus (Macaca mulatta) es idéntica a la OX40 de mono cynomolgus (Macaca fascicularis) (SEQ ID NO:2) al nivel de aminoácidos. Se cultivó una línea celular reportera 293 NF-kB que expresaba OX40 de rhesus en medio Eagle modificado de Dulbecco (DMEM) que contenía suero bovino fetal (FBS) al 10 % y penicilina/estreptomicina. Para el ensayo de unión, las células se resuspendieron a 5 millones de células por ml. Se transfirieron 50 pl (250000 células)/pocillo a cada pocillo de una placa de polipropileno de 96 pocillos de 500 pl (Nunc). Se preparó una solución madre 2X de anticuerpo anti-OX40 de prueba o anticuerpo monoclonal de control de isotipo en una placa de dilución separada a 666, 333, 111, 37,03, 12,34, 4,11, 0,457, 0,152, 0,0508, 0,0169, 0,00564 nM en medio de cultivo. Los anticuerpos monoclonales (50 pl/pocillo) se transfirieron a los pocilios respectivos de la placa de ensayo. Las células se incubaron con los anticuerpos primarios durante 30 minutos a 4 °C y se lavaron dos veces con 250 pl/pocillo de PBS por centrifugación a 800 rpm durante 3 minutos. El anticuerpo unido se detectó con anti-IgG humana de burro marcado con Cy5 (H+L) (Jackson ImmunoResearch) diluida a 2 pg/ml (50 pl/pocillo) en PBS durante 30 minutos a 4 °C. Las células se lavaron una vez con 250 pl/pocillo de PBS, se resuspendieron en PBS que contenía formaldehído al 1 % y se analizaron en un FACSCalibur de doble láser (Becton Dickinson).

8.1.4. Afinidad de unión de anticuerpos anti-OX40 a la OX40 humana y de Rhesus por resonancia de plasmones de superficie

La cinética de unión de un anticuerpo anti-OX40 al ECD (dominio extracelular) de OX40 soluble recombinante se determinó mediante mediciones basadas en resonancia de plasmones de superficie realizadas en un instrumento Biacore T200 (GE Healthcare) a 25 °C mediante el uso de un enfoque de ensayo de captura anti-Fc. Se adquirieron dominios extracelulares recombinantes (ECD) de OX40 humana (residuos 1-216) y OX40 de macaco rhesus (residuos 28-214) (Creative Biomart) y se purificaron adicionalmente por filtración en gel mediante el uso de Superdex200 (GE Healthcare) en ácido 4-(2-hidroxietil)-1-piperazin-metanosulfónico (HEPES) 10 mM, pH 7,4, NaCl 150 mM, ácido etilendiaminotetraacético 3 mM (EDTA). La OX40 de macaco rhesus (Macaca mulatta) es idéntica a la OX40 de mono cynomolgus (Macaca fascicularis) (SEQ ID NO:2) al nivel de aminoácidos. La preparación del chip y las mediciones de la cinética de unión se realizaron en el tampón de ensayo HBS-EP+ (HEPES 10 mM, pH 7,4, NaCl 150 mM, EDTA 3 mM, Tween 20 al 0,05 %). Para la preparación del chip de captura anti-Fc, aproximadamente 2000 Unidades de Resonancia (RU) de anticuerpo policlonal anti-Fc de IgG humana de cabra (Thermo Fisher Scientific Inc.), diluidas a 25 pg/ml en acetato de sodio 10 mM (pH 4,5), se inmovilizaron directamente a través de un chip biosensor CM5 mediante el uso de un kit de acoplamiento de amina estándar de acuerdo con las instrucciones y procedimientos del fabricante. Los restos sin reaccionar en la superficie del biosensor se bloquearon con etanolamina. Para las mediciones de la cinética de unión, cada ciclo de ensayo consistió en las siguientes etapas: 1) captura del anticuerpo anti-OX40 de prueba solo en la superficie de prueba; 2) inyección del analito (ECD de OX40 o solo tampón) sobre tanto la superficie de referencia como de prueba, 240 pl a 80 pl/min, después de lo cual se monitoreó la disociación durante 900 segundos a 80 pl/min; 3) regeneración de la superficie de captura mediante inyecciones de glicina-HCl 10 mM, pH 1,5 sobre tanto la superficie de referencia como de prueba. Durante el ensayo, todas las mediciones se referenciaron contra la superficie de captura sola (es decir, sin anticuerpo de prueba capturado) y se usaron inyecciones de solo tampón para doble referenciación. Las inyecciones de OX40 variaron en concentración de 900 nM o 300 nM a 11,11 nM en una serie aleatoria de dilución de 9 o 3 veces, respectivamente. Los datos se procesaron y ajustaron globalmente a un modelo de unión 1:1 mediante el uso del programa informático de evaluación Biacore T200 para determinar las constantes de velocidad cinética de unión, ka (M 'V ) y kd (s-1), y la constante de disociación de equilibrio Kd (M).

8.1.5. Bloqueo de ligando OX40 con anticuerpo anti-OX40

Las células Jurkat transfectadas de manera estable con OX40 humana cultivadas a 2 x 105 células/pocillo se incubaron simultáneamente con anticuerpo anti-OX40 de prueba 0,2 pg/ml y una titulación de OX40L humano soluble (R&D systems) en PBS que contenía BSA al 1 % en una placa de fondo redondo de 96 pocillos durante 30 minutos a TA. Las células se lavaron dos veces y se incubaron durante 30 minutos adicionales con 100 pl de dilución 1:500 de anti-Fc humano de cabra marcado con PE por pocillo (Jackson ImmunoResearch). Las células se lavaron dos veces y se adquirieron mediante el uso de FACSCanto (BD Biosciences), y se analizaron mediante el uso de FACSDiva.

8.1.6. Unión de anticuerpo anti-OX40 a la OX40 humana expresada en la superficie celular

Se cultivó una línea celular reportera Jurkat NF-kB que expresaba la proteína OX40 humana en DMEM que contenía FBS al 10 % y penicilina/estreptomicina (pen/estrep). Para el ensayo de unión, cada línea celular se resuspendió a 5 millones de células por ml. Se transfirieron 50 pl (250000 células)/pocillo a cada pocillo de una placa de polipropileno de 96 pocillos de 500 pl (Nunc). Se preparó una solución madre 2X de anticuerpo anti-OX40 de prueba o AcM de control de isotipo en una placa de dilución separada a 666, 333, 111,37,03, 12,34, 4,11,0,457, 0,152, 0,0508, 0,0169, 0,00564 nM en medio de cultivo. Cada anticuerpo (50 pl/pocillo) se transfirió a los pocillos respectivos de la placa de ensayo. Las células se incubaron con el anticuerpo de prueba anti-OX40 o los anticuerpos de control de isotipo durante 30 minutos a 4 °C y se lavaron dos veces con 250 pl/pocillo de PBS por centrifugación a 800 rpm durante 3 minutos. El anticuerpo unido se detectó con anti-IgG humana de burro marcado con Cy5 (H+L) (Jackson ImmunoResearch) diluida a 2 pg/ml (50 pl/pocillo) en PBS durante 30 minutos a 4 °C. Las células se lavaron una vez con 250 pl/pocillo de PBS, se resuspendieron en PBS que contenía formaldehído al 1 % y se analizaron en un FACSCalibur de doble láser (Becton Dickinson).

8.1.7. Unión del anticuerpo anti-OX40 al receptor OX40 quimérico

Los transfectantes basados en 293s se generaron para expresar versiones quiméricas de la molécula OX40 humana con dominios ricos en cisteína (CRD) de OX40 de ratón intercambiados individualmente en los CRD humanos correspondientes. Después de la selección por G418, las células supervivientes se clasificaron para expresión en el citómetro de flujo MoFlo (Beckman): 293s-huOX40, 293s-huOX40-muCRD1,293s-huOX40-muCRDN, 293s-huOX40-muCRDIII, 293s-huOX40-muCRDlV, 293s-huOX40-muCRDN+NI y 293s-muOX40. Se añadieron un total de 2 x 105 de cada una de las células transfectantes quiméricas OX40293s por pocillo en placas de polipropileno de 96 pocillos de 500 |_il (Nunc). Después de colocar en placas las células, se añadieron 50 j l de Hu3738 o anticuerpo de control de isotipo a 2 |jg/ml a los pocillos correspondientes por duplicado para cada línea celular y se dejaron incubar en hielo durante 30 minutos. Después de la incubación, se añadieron 200 j l de solución salina tamponada con fosfato de Dulbecco (DPBS) en cada pocillo y las placas se centrifugaron a 1000 rpm durante tres minutos. Se eliminaron los sobrenadantes de cada pocillo y se añadieron 50 j l de anticuerpo secundario anti-IgG humana de burro marcado con Cy5 (Jackson ImmunoResearch) a una dilución 1:250, que después se incubó durante 30 minutos en hielo en la oscuridad. Después del período de incubación, se añadieron 200 |_il de DPBS antes de centrifugar la placa a 1000 rpm durante tres minutos. Se eliminaron los sobrenadantes y se resuspendió cada pocillo con 100 |_il de DPBS formaldehído al 1 %. Las muestras se analizaron en el citómetro de flujo FACSCalibur de doble láser (Becton Dickinson).

8.1.8. Actividad reportera por fluorescencia de NF-kB para OX40 humana y de Rhesus

Las líneas celulares reporteras de NF-kB Jurkat-NF-KB-huOX40 y 293-NF-KB-RhOX40, que expresan las proteínas OX40 humana y de rhesus, respectivamente, se mantuvieron en medios de cultivo que comprendían DMEM que contenía FBS al 10 % y penicilina/estreptomicina (100 U/ml). Para el ensayo reportero de NF-kB, la línea celular Jurkat-NF-KB-huOX40 se resuspendió en medios de crecimiento (idénticos a los medios de cultivo) a 1 millón/ml (50 000 células/pocillo final) y la línea celular 293-NF-KB-RhOX40 se resuspendió en medio de crecimiento a 0,5 millones/ml (25 000 células/pocillo final). Se transfirieron 50 jl/pocillo a los 60 pocillos internos de una placa de ensayo de 96 pocillos de fondo blanco/transparente (Costar 3903). Se preparó una solución madre 3X de los siguientes anticuerpos en una placa de dilución de 96 pocillos con fondo en U separada (Becton Dickinson): anticuerpo anti-PD-1 usado como anticuerpo de control negativo y anticuerpo anti-OX40. La serie de diluciones para evaluar la actividad de los anticuerpos sin agentes de reticulación exógenos incluyó 2000, 500, 125, 31,25, 7,812, 1,953, 0,488, 0,122, 0,0305, 0,00762 nM en medio de cultivo. La serie de diluciones para evaluar el efecto del agente de reticulación sobre la actividad del anticuerpo anti-OX40 incluyó 200, 50, 12,5, 3,125, 0,7812, 0,1953, 0,0488, 0,0122, 0,00305, 0,000762 nM de anticuerpos. Por duplicado, se transfirieron 50 jl/pocillo de los anticuerpos a los pocillos respectivos de la placa de ensayo. A las placas de anticuerpo solo, se añadieron 50 jl/pocillo de medio a los 60 pocillos internos. Para la serie de dilución de agentes de reticulación, se diluyó el específico anti-Fc de IgG humana de cabra (Jackson ImmunoResearch) a 800, 200, 50, 12,5, 3,125, 0,7812, 0,1953, 0,0488, 0,0122, 0,00305 nM y 50 jl/pocillo transferido a los 60 pocillos internos para mantener una relación 4:1 de anticuerpo anti-OX40 y agente de reticulación. Se añadieron medios de crecimiento (150 j l) a los pocillos externos para evitar la evaporación en los 60 pocillos internos. Las placas se incubaron a 37 °C durante aproximadamente 18 horas. La actividad de luciferasa se cuantificó con BriteLite Plus (Perkin Elmer). Brevemente, el sustrato se disolvió con 10 ml de tampón proporcionado por el proveedor y se añadieron 75 |_il de sustrato/pocillo a los 60 pocillos internos de cada placa. Las placas se analizaron en un Victor5 (Molecular Devices) mediante el uso de la configuración de luminiscencia.

8.1.9. Ensayo reportero de ADCC

Las células efectoras ADCC que expresan FcyRIII humano (Promega) se descongelaron y cultivaron según las recomendaciones del protocolo. Las células se dividieron dos veces antes de su uso. Las células HEK293 transfectadas de forma estable con OX40 humana o de rhesus se usaron como células objetivo. Estas células se propagaron en DMEM HyClone™ con FBS inactivado por calor al 10 % (Sigma) y blasticidina 5 jg/m l (Gibco Life Technologies).

El día anterior al ensayo, las células objetivo HEK293 que expresan OX40 se recogieron con tripsina al 0,25 % (Gibco Life Technologies). Las células se lavaron, se contaron y se colocaron en placas a 10 000 células/pocillo en placas Costar de 96 pocillos (Corning). Las placas se incubaron a 37 °C durante toda la noche en DMEM con FBS al 10 %. Se siguió para el ensayo el protocolo G7102, bioensayo de células efectoras ADCC, modelo de propagación. La relación de células efectoras con respecto a células objetivo fue de 7,5:1. La luminiscencia se midió con el lector EnSpire Alpha (Perkin Elmer) mediante el uso del programa informático EnSpireManager. Los anticuerpos que se probaron en este ensayo incluyeron anticuerpos de control de isotipo y anticuerpos anti-OX40.

8.1.10. Unión del anticuerpo anti-OX40 a células T CD4+ humanas activadas

Se aislaron PBMC humanas a partir de capas leucocitarias compradas en Stanford Blood Center (Palo Alto, CA). Brevemente, las capas leucocitarias se diluyeron en una relación 1:1 con PBS sin magnesio y calcio (GE Healthcare). La sangre diluida (30 ml) se colocó en capas sobre 15 ml de Ficoll-Paque Plus al 90 % (GE Healthcare) preparado en PBS sin magnesio y calcio (GE Healthcare) contenido en tubos SepMate (Stemcell Technologies). Los tubos se centrifugaron a 1200 g durante 10 minutos. La interfase se recogió y se lavó dos veces en PBS IX. Las células T CD4+ se aislaron mediante el uso del kit de enriquecimiento CD4 de Stemcell Technologies (Stem Cell Technologies). Las células se resuspendieron a 2x106 células/ml en RPMI/FBS al 10 %. Se añadieron perlas Dynal CD3/28 (Life Technologies) a una relación 1:1. Las células se incubaron en un agitador vertical a temperatura ambiente durante 20 minutos. Las células se cultivaron en placas de 6 pocillos durante 24 horas a 37 °C.

Después de 24 horas, las perlas se retiraron con un imán. Las células se contaron y se resuspendieron a 1,5x106/ml. Se usó una alícuota de la suspensión celular (100 pl) por tinción. El anticuerpo de prueba se tituló en una serie de dilución de 4 veces a partir de 1 pg/ml. Las células se tiñeron durante 30 minutos y se lavaron dos veces. Se añadió una dilución 1:250 de (4 pg/ml) de específico anti-Fc humano de cabra marcado con PE/pocillo (Jackson ImmunoResearch) en PBS 100 pl/pocillo que contenía BSA al 1 %. Las células se tiñeron durante 30 minutos adicionales y se lavaron dos veces, se transfirieron a tubos y se adquirieron mediante el uso del citómetro de flujo BD LSR Fortessa, y se analizaron mediante el uso del programa informático de análisis FACSDiva versión 8.0.1.

8.1.11. Unión del anticuerpo anti-OX40 a las células T de Cynomolgus activadas

La sangre completa de mono Cynomolgus se adquirió en Worldwide Primates. Para el aislamiento de las PBMC, la sangre completa se diluyó en una relación 1:1 con PBS sin magnesio y calcio (GE Healthcare). La sangre diluida (30 ml) se colocó en capas bajo 13 ml de Ficoll-Paque Plus al 95 % (GE Healthcare) preparado en PBS sin magnesio y calcio (GE Healthcare) en tubos cónicos de 50 ml. Los tubos se centrifugaron a 1000 g durante 25 minutos. La interfase se recogió y se lavó dos veces en PBS IX. Las células se resuspendieron a 2 x 106 células/ml en RPMI/FBS al 10 %. Las células se incubaron durante 72 horas con fitohemaglutinina 10 mg/ml (PHA) (Sigma) e interleucina-2 humana recombinante 100 U/ml (IL-2) (Proleukin®, Prometheus) en placas de 6 pocillos. Después de 24 horas, las células se lavaron, se contaron y se resuspendieron a 2x106/ml. Se usaron 100 pl de las células por tinción. El anticuerpo anti-OX40 de prueba se tituló en una serie de dilución de 4 veces a partir de 1 pg/ml. Las células se tiñeron durante 30 minutos y se lavaron dos veces. Se añadió por pocillo una dilución 1:250 (4 pg/ml) de específico anti-Fc de IgG humana de cabra marcado con PE (Jackson ImmunoResearch) en 100 pl de PBS que contenía BSA al 1 %. Las células se tiñeron durante 30 minutos adicionales y se lavaron dos veces, se transfirieron a tubos y se adquirieron mediante el uso del citómetro de flujo BD LSR Fortessa, y se analizaron mediante el uso del programa informático de análisis FACSDiva versión 8.0.1.

8.1.12. Proliferación de células T humanas activadas e inducción de IFN-y

Se adquirieron capas leucocitarias humanas en Stanford Blood Center (Palo Alto, CA). Para el aislamiento de las PBMC humanas, las capas leucocitarias se diluyeron en una relación 1:1 con PBS sin magnesio y calcio (GE Healthcare). La sangre diluida (30 ml) se colocó en capas sobre 15 ml de Ficoll-Paque Plus al 90 % (GE Healthcare) preparado en PBS sin magnesio y calcio (GE Healthcare) contenido en tubos SepMate (Stemcell Technologies). Los tubos se centrifugaron a 1200 g durante 10 minutos. La interfase se recogió y se lavó dos veces en PBS IX. Las células T CD4+ se aislaron de las PBMC mediante el uso del kit de enriquecimiento de células T CD4+ EasySep (Stemcell Technologies). Las células T CD4+ se cultivaron a 2 x 106 células/ml en RPMI+FCS al 10 % más PHA 2 pg/ml (Sigma) e IL-2 humana recombinante 20 Ul/ml (Proleukin®, Prometheus) en placas de 6 pocillos durante 72 horas.

Placas para control de activación de células T Biocoat-placas de 96 pocillos (Corning) se recubrieron con específico anti-Fc de IgG de ratón de cabra 2 pg/ml (Jackson ImmunoResearch) y específico anti-Fc de IgG humana de cabra 2 pg/ml (Jackson ImmunoResearch) en 100 pl/pocillo de PBS durante toda la noche a 4 °C. Las placas se bloquearon con 200 pl/pocillo de BSA al 1 % (Rockland) en PBS durante 30 minutos a temperatura ambiente. Las placas se lavaron dos veces con 200 pl/pocillo de PBS. Se añadieron 4 ng/ml de OKT3 anti-CD3 humano (eBioscience) en 100 pl/pocillo de PBS y se incubaron durante 90 minutos a 37 °C. Las placas se lavaron dos veces con 200 pl/pocillo de PBS. Se añadió a las placas una serie de diluciones de 3 veces de anticuerpo anti-OX40 y anticuerpo monoclonal de control de isotipo a partir de 5 pg/ml en 100 pl de PBS. Las placas se incubaron durante 90 minutos a 37 °C. Las placas se lavaron dos veces con 200 pl/pocillo de PBS. Las células T CD4+ activadas con PHA e IL-2 lavadas (2 x 105) se añadieron a cada pocillo.

Después de 48 horas de cultivo a 37 °C, se agruparon 30 pl de sobrenadante de cada duplicado para el análisis de IFN-y con Luminex (Millipore) y se analizaron en Bioplex Manager 6.0 (BioRad). Las placas se pulsaron con 3H-timidina 0,25 pCi (Perkin Elmer) durante toda la noche y se cosecharon a la mañana siguiente en Filtermats (Perkin Elmer) con 5 ml de fluido de centelleo Ultima Gold (Perkin Elmer). Los filtros se contaron en el contador 1450 Microbeta Wallac Trilux (PerkinElmer).

8.1.13. Ensayos de supresión de células T reguladoras humanas

Se obtuvieron células mononucleares de sangre periférica (PBMC) frescas en AllCells o Stemcell Technologies. Las células se centrifugaron, el sedimento celular se resuspendió con PBS IX y se centrifugó una vez más a 1200 rpm durante 10 minutos a temperatura ambiente. Se eliminaron los sobrenadantes y las células se resuspendieron después con tampón RoboSep (Stemcell Technologies). La viabilidad celular y el recuento celular se determinaron mediante el uso del contador de células Vi-Cell XR Beckman Coulter. Se reservaron 100-150 millones de células para el enriquecimiento de células T CD4+ mediante el uso del kit de enriquecimiento de células T CD4+ humanas Stemcell EasySep. A continuación, las células T CD4+ enriquecidas se agotaron de las células CD25+ mediante el uso del kit de selección de CD25+ humana Stemcell EasySep. Este proceso dio como resultado células T CD4+/CD25-respondedores purificadas (Tresp). Las PBMC residuales se usaron para aislar las células T reguladoras (Treg) de acuerdo con las instrucciones del kit de enriquecimiento de células T reguladoras CD4+/CD127bajo/CD49d humanas Stemcell EasySep. Después del aislamiento de Tresp CD4+/CD25- y Treg, las células se resuspendieron con RPMI 1640 con FBS inactivado por calor al 10 % y 2-Mercaptoetanol 0,01 mM a 1 x 106 células/ml y 5 x 105 células/ml respectivamente.

El ensayo de supresión de Treg se configuró mediante el uso de dos relaciones diferentes de Tresp con respecto a Treg a 2:1 y 4:1. Para una relación 2:1, se añadieron 5 x 104 células Tresp y 2,5 x 104 células Treg a placas con fondo en U de 96 pocillos. Para una relación 4:1, se añadieron 5 x 104 células Tresp y 1,25 x 104 células Treg a la placa de 96 pocillos. También se añadió a los pocillos el reactivo de perlas Treg Suppression Inspector (Miltenyi Biotec) con una relación 1:1 de perla con respecto a célula para la estimulación. El anticuerpo anti-OX40 y la IgG¹humana de control de isotipo se probaron por triplicado a una concentración final de 10 pg/ml en ausencia o presencia de F(ab')²específico de Fc, anti-IgG humana (GxHu) de cabra (Jackson ImmunoResearch) a relación 1:4. Las placas se incubaron a 37 °C en 5 % de CO²durante cuatro días. Las placas se trataron con 3H-timidina 1 pCi/pocillo y se incubaron adicionalmente durante otras 16 horas a 37 °C en 5 % de CO². Después de la incubación, las placas se cosecharon y se midió la proliferación mediante el uso del fluido de centelleo Ultima Gold (Perkin Elmer) y el contador de centelleo 1450 Microbeta Wallac Trilux (PerkinElmer).

8.1.14. Modelo de tumor de ratón PC-3 injertado con células inmunitarias humanas

El día de la inoculación, se contaron por Vi-Cell XR (Beckman Coulter) células T humanas, moDC humanas autólogas (células dendríticas derivadas de monocitos) y células PC-3 y se combinaron para suministrar una inyección subcutánea de 1 x 107 de PC-3, 1 x 106 de células T y 5 x 105 de moDC por ratones NSG (ratón NOD.Cg-Prkdc?®0 Il2rgtmWjl/SzJ) en 100 |_il de solución salina tamponada con fosfato de Dulbecco (DPBS) (GE Lifesciences). Se prepararon grupos de tratamiento (n = 8 ratones/grupo) de anticuerpo monoclonal de control de isotipo 10 mg/kg y Hu3738 10 mg/kg en 200 |_il de DPBS para inyección intraperitoneal. Se inyectó una única dosis de anticuerpo en el momento de la inoculación de la mezcla celular. La medición del crecimiento tumoral se evaluó mediante la medición con calibre estándar y se calculó el volumen de crecimiento tumoral (Largo x ancho x alto/2).

8.1.15. Modelo de GVHD en PBMC humanas en ratones NSG

Se adquirieron células mononucleares de sangre periférica humanas (PBMC) en AllCells (Oakland, CA). Los ratones NSG inmunodeficientes (NOD.Cg-Prkdcscid Il2rgtmWjl/SzJ) se inocularon con 2 x 107 PBMC humanas intraperitonealmente el día 1. El anticuerpo anti-OX40 Hu3738 o el control de isotipo se administraron por vía intraperitoneal una vez por semana a partir del día 1. Una vez que los ratones mostraron signos de comportamiento de la enfermedad de injerto contra huésped (GVHD) (por ejemplo, postura encorvada, pelaje erizado), se obtuvieron muestras de suero y se determinaron los niveles de citocinas en el suero mediante el uso de un ensayo de matriz de perlas Luminex (Millipore).

Ejemplo 2: Generación y humanización de anticuerpos anti-OX40 de ratón

Los ratones se inmunizaron de acuerdo con los métodos conocidos en la técnica (E. Harlow, D. Lane. Antibody: A Laboratory Manual, (Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1998)). El isotipo de cada anticuerpo monoclonal se determinó mediante el uso del kit de isotipaje de ratón (Roche). Los clones de hibridoma que producen los anticuerpos de interés se purificaron y se caracterizaron posteriormente por afinidad por resonancia de plasmones de superficie y por competición de ligando por FACS.

La clonación y la construcción del vector de expresión se lograron mediante métodos conocidos en la técnica para la expresión de anticuerpos monoclonales recombinantes.

La humanización de la región V del anticuerpo se llevó a cabo como se describe por Queen, C. y otros, (Proc. Natl. Acad. Sci. EE. UU., 1989; 86:10029-10033). Las estructuras canónicas de las CDR se determinaron de acuerdo con Huang y otros, (Methods, 2005; 36:35-42). Se identificaron secuencias de línea germinal variable humana con las mismas o más similares estructuras canónicas de CDR, y se seleccionaron secuencias apropiadas de segmentos Vh, Vl y J humanos para proporcionar los marcos para la región variable anti-OX40. En las posiciones marco en las que el modelo informático sugería un contacto significativo con las CDR, los aminoácidos de las regiones V anti-OX40 murinas se sustituyeron por los aminoácidos del marco humanos originales (retromutaciones).

Los anticuerpos anti-OX40 de ratón Mu3726, Mu3738, Mu3739 y Mu3741 se humanizaron de acuerdo con el método descrito anteriormente. La versión humanizada de Vh de Mu3726 fue VH.1a de Hu3726 que tenía regiones marco Vh4-28 humanas, con siete retromutaciones de I48M, V67I, M69I, V71R, F78V, A93V y R94K. La VH.1a de Hu3726 se combinó con su respectiva cadena ligera humanizada VL.1b de Hu3726 que tenía regiones marco VK1-39 humanas, con dos retromutaciones de Y48F y F71Y. La versión humanizada de Vh de Mu3738 fue VH.1b de Hu3738 que tenía regiones marco Vh 3-7 humanas, con una retromutación de W47L. La VH.1b de Hu3738 se combinó con su respectiva cadena ligera humanizada Vl.1 de Hu3738 que tenía regiones marco VK4-1 humanas y sin retromutaciones. La versión humanizada de Vh de Mu3739 fue VH.1b de Hu3739 que tenía regiones marco Vh1-69 humanas, con cuatro retromutaciones de M48I, V67A, E73T y S76N. La VH.1b de Hu3739 se combinó con su respectiva cadena ligera humanizada VL.1b de Hu3739 que tenía regiones marco VK1-39 humanas, con dos retromutaciones de V58L y F71Y.

La versión humanizada de Vh de Mu3741 fue VH.2b Hu3741 que tenía regiones marco Vh3-66 humanas, con siete retromutaciones de A24V, V48L, S49G, F67L, R71K, N76S y L78V. La VH.2b de Hu3741 se combinó con su respectiva cadena ligera humanizada V l.1c de Hu3741 que tenía regiones marco humanas VK1-39, con dos retromutaciones de Y36F y F71Y.

Ejemplo 3: Afinidad de unión de los anticuerpos anti-OX40

La Tabla 3-1 a continuación muestra datos de afinidad de unión in vitro del anticuerpo anti-OX40 ilustrativo Hu3738, o los anticuerpos anti-OX40 de la literatura 11D4 o 18D8 descritos en la Patente de Estados Unidos núm. 7,960,515. Cada uno de 11D4 y 18D8 es una IgG¹humana, con una región kappa ligera.

Como se usa en la presente descripción, 11D4 tiene una Vh con una secuencia de aminoácidos de acuerdo con:

EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYSMNWVRQAPGKGLEWVSYISSSSSTIDYADSVKGRFTISRDN

AKNSLYLQMNSLRDEDTAVYYCARESGWYLFDYWGQGTLVTVSS (SEQ ID NO:61), y

una Vl con secuencia de aminoácidos de acuerdo con:

DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQGISSWLAWYQQKPEKAPKSLIYAASSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTIS SLQPEDFATYYCQQYNSYPPTFGGGTKVEIK (SEQ ID NO:62).

18D8 tiene una Vh con secuencia de aminoácidos de acuerdo con:

EVQLVESGGGLVQPGRLSRLSCAASGFTFDDYAMHWVRQAPGKGLEWVSGISWNSGSIGYADSVKGRFTISRE

NAKNSLYLQMNSLRAEDTALYYCAKDQSTADYYFYYGMDVWGQGTTVTVSS (SEQ ID NO:63), y

una Vl con secuencia de aminoácidos de acuerdo con:

EIVVTQSPATLSLSPGERATLSCRASQSVSSYLAWYQQKPGQAPRLLIYDASNRATGIPARFS GSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYCQQRSNWPTFGQGTKVEIK (SEQ ID NO:64).

Hu3738 exhibió potentes propiedades de unión a la OX40 humana por resonancia de plasmones de superficie, o en células reporteras Jurkat NF-kB transfectadas que expresan OX40 humana tal como se midió en los ensayos del Ejemplo 1, y una mayor afinidad de unión por SPR en comparación con Hu3739 o Hu3741.

El anticuerpo anti-OX40 ilustrativo Hu3738 exhibió reactividad cruzada contra OX40 de mono cynomolgus o rhesus, pero no demostró una unión significativa contra OX40 de ratón o rata. La actividad de unión de Hu3738 a la OX40 humana recombinante o de cynomolgus (cyno), o la OX40 humana o de mono rhesus de la superficie celular, según se determinó por los ensayos descritos en el Ejemplo 1, se resume en la Tabla 3-2.

Ejemplo 4: Actividad biológica in vitro del anticuerpo anti-OX40 Hu3738

Para evaluar la unión de Hu3738 a la OX40 humana expresada endógenamente, se examinaron por citometría de flujo tanto las células T CD4+ activadas como las células mononucleares de sangre periférica no estimuladas (PBMC). La Tabla 4-1 resume los datos para la unión de Hu3738 en la OX40 de superficie celular en células T CD4+ humanas activadas con perlas CD3/CD28, o células T CD4+ de mono cynomolgus activadas con fitohemaglutinina (PHA) e interleucina-2 (IL-2), de acuerdo con los ensayos descritos en el Ejemplo 1. Como se muestra en la Tabla 4-1, Hu3738 se unió potentemente a OX40 en células T CD4+ activadas en cultivos de células T humanas y de cynomolgus.

La unión subnanomolar de la OX40 humana por Hu3738 proporcionó la activación funcional como lo demuestra el aumento de la proliferación de células T CD4+ de sangre periférica humana y la producción potenciada de interferóny por las células T CD4+ humanas después del tratamiento in vitro con Hu3738 de acuerdo con los ensayos descritos en la Sección 8.1.12 (Figuras 1A, 1B). Como se muestra en un experimento típico representado en la Figura 1A, Hu3738 produjo un aumento en la proliferación de células T CD4+ de sangre periférica humana de aproximadamente 1,5 a aproximadamente 6 veces en comparación con el control de isotipo huIgG¹, que fue comparable o mayor que el aumento en la proliferación observado cuando las células T se dosificaron con una cantidad equivalente de anticuerpo anti-OX40 de la literatura 11D4 o 18D8. Hu3738 mostró una EC⁵⁰= 0,11 nM (16 ng/ml) en un promedio de corridas de ocho donantes.

La Figura 1C muestra que la proliferación de células T CD4+ de sangre periférica humana después del tratamiento in vitro con Hu3738 fue similar a la del anticuerpo anti-OX40 de la literatura 1A7 en un amplio intervalo de concentraciones de anticuerpos de aproximadamente 0,001 a aproximadamente 1 pg/ml, cuando cada uno se probó de acuerdo con el ensayo de proliferación de células T descrito en la Sección 8.1.12.

El anticuerpo 1A7 descrito en la publicación de EE. UU. núm. 2015/0307617 es una IgG¹humana con cadenas ligeras kappa, que tiene

una secuencia de aminoácidos Vh de acuerdo con:

EVQLQQSGPELVKPGASVKISCKASGYTFTDSYMSWVKQSHGKTLEWIGDMYPDNGDSSYNQKFREKVTLTVD

KSSTTAYMEFRSLTSEDSAVYYCVLAPRWYFSVWGTGTTVTVSS (SEQ ID NO:69), y

una secuencia de aminoácidos Vl de acuerdo con:

DIQMTQTTSSLSASLGDRVTISCRASQDISNYLNWYQQKPDGTVKLLIYYTSRLRSGVPSRFSGSGSGKDYFLTIS

NLEQEDVAAYFCQQGHTLPPTFGGGTKLEIK (SEQ ID NO:70).

Como se muestra en un experimento típico representado en la Figura 1B, la producción de IFN-y aumentó en células T CD4+ humanas de aproximadamente 2 a aproximadamente 10 veces cuando se trató con Hu3738 en todo el intervalo de concentración probado. Con respecto a la producción de IFN-y, Hu3738 exhibió una EC⁵⁰= 0,16 nM (24 ng/ml) en un promedio de corridas de nueve donantes. Los anticuerpos anti-OX40 de la literatura 11D4 y 18D8 también demostraron un efecto similar en la producción de IFN-y en estas condiciones de ensayo.

La Figura 1D muestra que Hu3738 produce un mayor aumento en la producción de IFN-y en las células T CD4+ humanas en comparación con el anticuerpo anti-OX40 de la literatura 1A7, cuando cada uno se probó de acuerdo con el ensayo de producción de IFN-y de células T descrito en la Sección 8.1.12.

Además de los efectos de activación de la señalización aguas abajo en el aumento de la proliferación de células T CD4+ y la potenciación de la producción de IFN-y, el anticuerpo anti-OX40 ilustrativo Hu3738 también inhibió la actividad de las células T reguladoras humanas in vitro, lo que sugiere que las células T reguladoras dentro de un tumor sólido, que pueden inhibir una respuesta inmunológica del cuerpo para atacar el tumor, puede suprimirse con la administración de Hu3738.

El efecto de Hu3738 sobre la actividad T reguladora se evaluó in vitro de acuerdo con el ensayo descrito en la Sección 8.1.13. Las células T respondedoras (Tresp) autólogas CD4+/CD25 se cultivaron conjuntamente con células T reguladoras (Treg) CD4+/CD25+/CD127bajo y perlas activadoras (Insp) a una relación Tresp:Treg 2:1 o 4:1 (Figuras 2A, 2B). En ausencia de Treg, las células Tresp proliferaron en respuesta a las perlas activadoras. En presencia de Treg, se inhibió la proliferación. La inclusión de Hu3738 10 pg/ml en los medios de cultivo no tuvo impacto en la supresión mediada por Treg. El control de isotipo usado para estos ensayos de supresión de T reguladoras fue huIgG¹con las variantes de región constante L234A y L235A. Los experimentos separados realizados mediante el uso del control de isotipo huIgG¹con agente de reticulación no mostraron ningún efecto sobre el ensayo.

Por el contrario, en presencia de un agente de reticulación exógeno, Hu3738 dio como resultado la restauración completa de la proliferación de Tresp (Figuras 2A y 2B). Hu3738 en presencia de agente de reticulación mejoró la proliferación en este ensayo por encima del nivel de la respuesta de Tresp con respecto a solo las perlas activadoras. Este resultado sugiere que las señales de OX40 pueden superar la supresión mediada por células T reguladoras y pueden potenciar las respuestas específicas de antígeno consistentes con los resultados informados anteriormente.

La actividad de ADCC mediada por Hu3738 se evaluó mediante el uso de un ensayo reportero de ADCC disponible comercialmente como se describe en la Sección 8.1.9. Este ensayo usó células Jurkat modificadas que expresan FcyRIIIa humano y un reportero del factor nuclear de células T activadas (NFAT) como células efectoras. Las células HEK 293 que expresan OX40 humana se usaron como células objetivo, y se esperaba que el anticuerpo anti-OX40 se uniera a la OX40 expresada en las células objetivo. Adicionalmente, se esperaba que la región Fc de Hu3738 se uniera a los receptores FcyRIIIa en la superficie celular de las células reporteras. Estos eventos de unión habrían dado como resultado una reticulación múltiple de los dos tipos de células lo que conduce a la activación de la actividad reportera de ADCC, un efecto que se midió a través de la lectura de luminiscencia como resultado de la activación de la ruta NFAT. En comparación con el control de isotipo, Hu3738 aumentó la actividad indicadora de ADCC, con una EC⁵⁰= 0,51 nM (77 ng/ml).

Ejemplo 5: Clasificación de epítopos de anticuerpos anti-OX40 ilustrativos

8.5.1. Unión de Hu3738 con OX40 quimérica humana/de ratón

El OX40L soluble bloqueó la unión de Hu3738 a OX40 con una IC⁵⁰= 67 pM (10 ng/ml) en un ensayo de células Jurkat que expresan OX40 humana descrito en la Sección 8.1.5 (Figura 3), lo que sugiere que Hu3738 se unió a la OX40 humana en la región de unión del ligando de la molécula.

Para un mapeo más detallado del epítopo de la unión del anticuerpo Hu3738, se crearon una serie de líneas celulares que expresan moléculas OX40 intercambiadas con dominios ricos en cisteína (CRD) humano/de ratón. Este método se basa en la observación de que Hu3738 no se une a la OX40 de ratón (Figura 4B). En la Figura 4A se muestra un alineamiento de la secuencia de OX40 humana (SEQ ID NO:1) con la de OX40 de ratón (SEQ ID NO:3). A partir del análisis de las secuencias, se generó una serie de transfectantes 293s que expresan versiones quiméricas del receptor OX40 humano con secuencias CRD de ratón intercambiadas y se tiñeron con Hu3738.

Las secuencias de aminoácidos (lo que incluye las secuencias señal) de las quimeras del receptor OX40 humanoratón, con las regiones de intercambio murino indicadas subrayadas, son las siguientes. La quimera OX40 humana con CRDI murina que reemplaza a la CRDI humana tiene una secuencia de aminoácidos de acuerdo con:

MCVGARRLGRGPCAALLLLGLGLSTVTGLNCVKHTYPSGHKCCRECQPGHGMVSRCDHTRDTLCHPCGPGFYN DVVSSKPCKPCTWCNLRSGSERKQLCTATQDTVCRCRAGTQPLDSYKPGVDCAPCPPGHFSPGDNQACKPWT

NCTLAGKHTLQPASNSSDAICEDRDPPATQPQETQGPPARPITVQPTEAWPRTSQGPSTRPVEVPGGRAVAAIL

GLGLVLGLLGPLAILLALYLLRRDQRLPPDAHKPPGGGSFRTPIQEEQADAHSTLAKI (SEQ ID NO:5),

la quimera OX40 humana con CRDII murina que reemplaza la CRDII humana tiene una secuencia de aminoácidos de acuerdo con:

MCVGARRLGRGPCAALLLLGLGLSTVTGLHCVGDTYPSNDRCCHECRPGNGMVSRCSRSQNTVCRPCETGFY

NEAVNYDTCKQCTQCNHRSGSELKQNCTPTQDTVCRCRAGTOPLDSYKPGVDCAPCPPGHFSPGDNQACKPW TNCTLAGKHTLQPASNSSDAICEDRDPPATQPQETQGPPARPITVQPTEAWPRTSQGPSTRPVEVPGGRAVAAIL

GLGLVLGLLGPLAILLALYLLRRDQRLPPDAHKPPGGGSFRTPIQEEQADAHSTLAKI (SEQ ID NO:6),

la quimera OX40 humana con CRDIII murina que reemplaza la CRDIII humana tiene una secuencia de aminoácidos de acuerdo con:

MCVGARRLGRGPCAALLLLGLGLSTVTGLHCVGDTYPSNDRCCHECRPGNGMVSRCSRSQNTVCRPCGPGFY

NDVVSSKPCKPCTWCNLRSGSERKOLCTATODTVCRCRPGTQPRQDSGYKLGVPCVPCPPGHFSPGDNQACK PWTNCTLAGKHTLQPASNSSDAICEDRDPPATQPQETQGPPARPITVQPTEAWPRTSQGPSTRPVEVPGGRAVA

AILGLGLVLGLLGPLAILLALYLLRRDQ RLPPDAHKPPGGGSFRTPIQEEQADAHSTLAKI (SEQ ID NO:7),

la quimera OX40 humana con CRDIV murina que reemplaza la CRDIV humana tiene una secuencia de aminoácidos de acuerdo con:

MCVGARRLGRGPCAALLLLGLGLSTVTGLHCVGDTYPSNDRCCHECRPGNGMVSRCSRSQNTVCRPCGPGFY

NDVVSSKPCKPCTWCNLRSGSERKQLCTATQDTVCRCRAGTQPLDSYKP GVDCAPCPPGHFSPGNNQACKPWTNCTLSGKQTRHPASDSLDAVCEDRDPPATOPOETOGPPARPITVQPTEA WPRTSQGPSTRPVEVPGGRAVAAILGLGLVLGLLGPLAILLALYLLRRDQRLPPDAHKPPGGGSFRTPIQEEQADA HSTLAKI (SEQ ID NO:8),

y la quimera OX40 humana con CRDII y CRDIII murina que reemplaza la CRDII y la CRDIII humana tiene una secuencia de aminoácidos de acuerdo con:

MCVGARRLGRGPCAALLLLGLGLSTVTGLHCVGDTYPSNDRCCHECRPGNGMVSRCSRSQNTVCRPCETGFY

NEAVNYDTCKQCTQCNHRSGSELKQNCTPTQDTVCRCRPGTQPRQDSGYKLGVPCVPCPPGHFSPGDNQACK PWTNCTLAGKHTLQPASNSSDAICEDRDPPATQPQETQGPPARPITVQPTEAWPRTSQGPSTRPVEVPGGRAVA

AILGLGLVLGLLGPLAILLALYLLRRDQRLPPDAHKPPGGGSFRTPIQEEQADAHSTLAKI (SEQ ID N0:9).

La determinación de la unión de Hu3738 a esta serie de quimeras se realizó de acuerdo con el ensayo descrito en la Sección 8.1.7 para localizar el sitio de unión a regiones c Rd específicas. Una pérdida en la unión sugirió qué las CRD eran fundamentales para el reconocimiento de OX40 por un anticuerpo en particular. En este caso, la ausencia de unión detectable a una región específica con intercambio de CRD en el ratón sugirió la región del receptor OX40 humano reconocido por Hu3738. Se demostró que el anticuerpo anti-OX40 Hu3738 pierde unión cuando la CRDII humana se reemplazó con la CRDII de ratón correspondiente, consistente con la unión de Hu3738 a la CRDII de la OX40 humana (Figura 4B).

8.5.2. Ensayo de competencia con anticuerpo anti-OX40 ilustrativo Hu3738 unido a la OX40 humana

Se generaron anticuerpos anti-OX40 humanizados de la literatura adicionales para comparar con los anticuerpos anti-OX40 ilustrativos de la descripción. Los anticuerpos 106-222 y 119-122, descritos en la publicación de Estados Unidos núm. 2013/0280275, son IgG¹humanas con cadenas ligeras kappa.

El anticuerpo 106-222 tiene una secuencia de aminoácidos Vh de acuerdo con:

QVQLVQSGSELKKPGASVKVSCKASGYTFTDYSMHWVRQAPGQGLKWMGWINTETGEPTYADDFKGRFVFSL

DTSVSTAYLQISSLKAEDTAVYYCANPYYDYVSYYAMDYWGQGTTVTVSS (SEQ ID NO:65), y

una secuencia de aminoácidos Vl de acuerdo con:

DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCKASQDVSTAVAWYQQKPGKAPKLLIYSASYLYTGVPSRFS GSGSGTDFTFTISSLQPEDIATYYCQQHYSTPRTFGQGTKLEIK (SEQ ID NO:66).

El anticuerpo 119-122 tiene una secuencia de aminoácidos Vh de acuerdo con:

EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASEYEFPSHDMSWVRQAPGKGLELVAAINSDGGSTYYPDTMERRFTISRDN AKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCARHYDDYYAWFAYWGQGTMVTVSS (SEQ ID NO:67), y

una secuencia de aminoácidos Vl de acuerdo con:

EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASKSVSTSGYSYMHWYQQKPGQAPRLLIYLASNLESGVPARFSGSGSGTDF TLTISSLEPEDFAVYYCQHSRELPLTFGGGTKVEIK (SEQ ID NO:68).

La unión de Hu3738 a la OX40 expresada en la superficie celular demostró ser competitiva con algunos pero no todos los anticuerpos anti-OX40 de la literatura mediante estudios de competencia directa. Como se muestra en la Figura 5, las células Jurkat-NF-KB-huOX40 tratadas con una titulación de dosis de anticuerpos de la literatura, se sometieron posteriormente a 2 jg/m l de Hu3738 marcado con fluorescente ALEXA FLUOR® 647 para determinar la competencia por la unión. El análisis se realizó por citometría de flujo. Los anticuerpos anti-OX40 de la literatura 106-222 o 1A7 fueron competitivos con Hu3738. Sin embargo, los anticuerpos 11D4, 18D8 o 119-122 no compitieron con Hu3738 hasta 100 jg/ml.

Ejemplo 6: Activación de OX40 por el anticuerpo anti-OX40 ilustrativo Hu3738

Los datos de las células Jurkat NF-kB destacan la capacidad de activación del anticuerpo anti-OX40 ilustrativo Hu3738, incluso en ausencia de un agente de reticulación (Figuras 6A, 6B). Como se muestra en la Figura 6A, los únicos anticuerpos anti-OX40 que demostraron una actividad de señalización NF-kB significativa en el intervalo de concentraciones de aproximadamente 0,001 a aproximadamente 100 jg/m l de anticuerpo fueron Hu3738 y el Mu3738 murino correspondiente. Los anticuerpos anti-OX40 de la literatura 11D4, 18D8, 106-222 y 119-122 carecían cada uno de ellos de un efecto significativo en la señalización NF-kB hasta aproximadamente 100 jg/m l de anticuerpo.

La actividad de Hu3738 en ausencia del agente de reticulación exógeno contrasta con la falta de actividad de otros anticuerpos anti-OX40 de la literatura en las mismas condiciones de ensayo. Un resumen de los datos de señalización de células NF-kB se muestra en las Tablas 6-1 y 6-2. Notablemente, aunque Hu3738 compitió para unirse a la OX40 humana con los anticuerpos anti-OX40 de la literatura 106-222 y 1A7, Hu3738 exhibió una actividad funcional diferente en comparación con cada uno de los anticuerpos en ausencia de un agente de reticulación.

Además de su capacidad para incidir en la señalización NF-kB en ausencia de agentes de reticulación exógenos en las células Jurkat-NF-KB-huOX40, Hu3738 también demostró una mayor potencia medida por la EC⁵⁰con el agente de reticulación, en comparación con los anticuerpos anti-OX40 de la literatura 11D4, 18D8, 106-222 y 119-122 (Tabla 6-1).

Una comparación directa de Hu3738 con 1A7 se muestra en la Figura 6B y se resume en la Tabla 6-2 a continuación. Además de la ausencia de la señalización NF-kB en ausencia de agentes de reticulación exógenos en las células Jurkat-NF-KB-huOX40, cada uno de los anticuerpos anti-OX40 de la literatura descritos anteriormente también exhibieron una menor EC⁵⁰en comparación con Hu3738.

Ejemplo 7: Actividad antitumoral de Hu3738 en el modelo de transferencia adoptiva de células humanas en ratón

Hu3738 demostró actividad antitumoral en un modelo de ratón NSG in vivo después de una inoculación de dosis única con células PC3 humanas, células T y células dendríticas autólogas derivadas de monocitos (moDC) de acuerdo con el protocolo descrito en la Sección 8.1.14 (Figura 7). El día de la inoculación, se administraron células T humanas,

Claims

REIVINDICACIONES

1. Un anticuerpo anti-OX40 que comprende (i)una cadena Vh que comprende tres CDR; y

(ii)una cadena Vlque comprende tres CDR, en donde:

la CDR#1 de Vh tiene lasecuencia de aminoácidos GFTFSRYGMS (SEQ ID NO:101), laCDR#2 de Vh tiene lasecuencia de aminoácidos TINSNGGRTYYPDSVKG (SEQ ID NO:102), laCDR#3 de Vh tiene lasecuencia de aminoácidos EGITTAYAMDY (SEQ ID NO:103), la CDR#1 de Vl tiene la secuencia de aminoácidos K ASQSVD YDGDS YMH (SEQ ID NO:104), laCDR#2 de Vltiene lasecuencia de aminoácidos AASILES (SEQ ID NO:105), y laCDR#3 de Vltiene una secuencia de aminoácidos QQSNEDPRT (SEQ ID NO:106).

2. Elanticuerpo anti-OX40 de conformidad con la reivindicación 1, que es monoclonal.

3. Elanticuerpo anti-OX40 de conformidad con la reivindicación 1, que es humanizado.

4. El anticuerpo anti-OX40 de conformidad con la reivindicación 3, que comprende una cadena Vh que tiene la secuencia de aminoácidos:

EVQ LVESGGGL VQPGGSL RLSCAA SGFTFSR YGMSWV RQAPGKG LELVATI NSNGGR TYYPDSV KGRFT

ISR DNAKNSLYL QMNSLRAE DTAVYYCA REGITTA YAMDYWGQ GTTVTVS S (SEQ ID NO:22);

y una cadena Vlque tiene lasecuencia de aminoácidos:

DIV MTQSPDSL AVSLGERA TINCKASQ SVDYDGDS YMHWYQQK PGQPPKLLI YAASILES GVPDRFSG SG SGTDF TLTISSLQAE DVAVYYCQ QSNEDPRTF GGGTKVEIK (SEQ ID NO:32).

5. Elanticuerpo anti-OX40 de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, que es una IgG.

6. Elanticuerpo anti-OX40 de conformidad con la reivindicación 5, que es una IgG ¹ .

7. Elanticuerpo anti-OX40 de conformidad con la reivindicación 4 que comprende una cadena pesada que tiene la secuencia de aminoácidos de acuerdo con las SEQ ID NO: 41 o 42; y una cadena ligera que tiene la secuencia de aminoácidos de acuerdo con laSEQ ID NO: 51.

8. Uno o más ácidos nucleicosque comprenden secuencias de nucleótidos que codificanelanticuerpoanti-OX40 de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7.

9. Uno o más vectores que comprenden eluno o más ácidos nucleicos de conformidad con la reivindicación 8.

10. Una célula huésped eucariota transformada con el uno o más vectores de conformidad con la reivindicación 9.

11. Una célula huésped eucariota modificada por ingeniería genética para que exprese el uno o más ácidos nucleicos de conformidad con la reivindicación 8.

12. La célula huésped eucariota de conformidad con la reivindicación 10 u 11 que es una célula huésped de mamífero.

13. Un método para producir un anticuerpo anti-OX40, que comprende: (a) cultivar la célula huésped de conformidad con la reivindicación 10 o la reivindicación 11; y (b) recuperar elanticuerpo anti-OX40.