ES2899923T3 - NT-proANP y NT-proBNP para el diagnóstico de apoplejía - Google Patents
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Abstract
Un procedimiento in vitro para diagnosticar un acontecimiento isquémico cerebral agudo en un sujeto que se sospecha que padece un acontecimiento isquémico cerebral agudo, que comprende a. determinar la cantidad de NT-proANP en una muestra de dicho sujeto, b. determinar la cantidad de NT-proBNP en una muestra de dicho sujeto, c. calcular una proporción de las cantidades de NT-proANP y NT-proBNP, y d. comparar la proporción así calculada con una proporción de referencia, diagnosticando de este modo el acontecimiento isquémico cerebral agudo.
Description
DESCRIPCIÓN
NT-proANP y NT-proBNP para el diagnóstico de apoplejía
La apoplejía ocupa el segundo lugar después de la cardiopatía isquémica como causa de pérdida de años de vida por discapacidad (ajustados) en los países con renta alta y como causa de muerte en todo el mundo. Si se presentan consecuencias adversas tempranas de apoplejía se pueden mejorar por trombólisis, en caso de presentación tardía, la prevención secundaria (prevención de apoplejía secundaria) usando ácido acetilsalicílico y anticoagulación parece el único procedimiento apropiado para evitar la progresión de la enfermedad (van der Worp B y van Gijn J. NEJM 2007: 357: 572.578).
Los accidentes isquémicos transitorios (AIT) son episodios de síntomas de apoplejía que solo duran poco tiempo, la definición estándar es inferior a 24 h, pero la mayoría de los AIT duran menos de 1 h. Las causas de AIT son similares a las causas de apoplejía isquémica, pero debido a que los AIT pueden anunciar una apoplejía, son un factor de riesgo importante que se debe considerar por separado (véase W.E. Smith et al, Cerebrovascular Diseases, capítulo 364 en Harrison, Principles of Internal Medicine, 17.a edición).
El AIT está provocado por hipoperfusión e isquemia temporales de regiones localizadas del cerebro y la disfunción está provocada por anomalías funcionales reversibles del cerebro provocadas por un edema local lo que da como resultado trastornos metabólicos e iónicos. El diagnóstico de AIT es importante puesto que las personas que tuvieron AIT tienen un incremento significativo en el riesgo de apoplejía en comparación con aquellas sin estos episodios de AIT. El riesgo de apoplejía es de un 4-5 % después de dos días y de un 11 % después de siete días después de un AIT. Los pacientes que han tenido un AIT dentro de las 48 horas previas, durando el AIT > 10 minutos, con fibrilación auricular y con estenosis carotídea progresiva y AIT que se producen más de una vez siguiendo un patrón progresivo tienen el mayor riesgo de apoplejía.
NT-proBNP y NT-proANP son marcadores cardíacos bien conocidos. El NT-proBNP pertenece al grupo de péptidos natriuréticos cerebrales que son conocidos por liberarse del cerebro; sin embargo, la mayoría de los BNP se originan en el corazón. Tanto NT-pro BNP como NT-pro ANP se han asociado con causas cardioembólicas de apoplejía (Rodrigues-Yanez M. et al, Disease Markers 2009: 26: 189 - 195).
Estrada et al. 1994 (Am J Hypertens, 7: 1085-1089) divulga un procedimiento basado en detección de ANP para diagnosticar apoplejía isquémica en un paciente. De acuerdo con Estrada, los niveles de ANP fueron mayores en pacientes con apoplejía que en voluntarios normales.
Sato et al. 1995 (Kurume Med J, 42:71-77) divulga un procedimiento basado en detección de ANP para distinguir pacientes con apoplejía de alto riesgo de bajo riesgo y también para distinguir apoplejía cardioembólica de apoplejía lagunar.
Makikallio et al. 2005 (Stroke, 36: 1016-1020) divulga que el nivel plasmático de NT-proANP y NT-proBNP fue igual a o elevado en pacientes con apoplejía (aguda) con respecto a pacientes que padecían infarto agudo de miocardio, y que los niveles son elevados en pacientes con apoplejía con respecto a pacientes sanos. También contempla que la magnitud de la lesión cerebral es paralela al nivel de NT-proANP y NT-proBNP.
Shibazaki et al. 2009 (Int Med 48: 259-264) divulga un procedimiento basado en detección de BNP en plasma para distinguir apoplejía cardioembólica en pacientes con apoplejía de otros tipos de apoplejía (incluyendo enfermedad de vasos pequeños, enfermedad de vasos grandes).
Rodrigues-Yanez et al. 2009 (Disease Markers 26: 189- 195) divulga un procedimiento basado en detección de NT-proBNP en suero para distinguir apoplejía cardioembólica en pacientes con apoplejía de aterotrombótica, lagunar y otros tipos de apoplejía. La correspondiente medición con NT-proANP muestra una utilidad similar, aunque con datos menos convincentes.
Naruse et al (Stroke 1991: 22: 61 - 65) describen un estudio en el que se ocluyó la arteria media cerebral izquierda en ratas para inducir un edema cerebral. Además, se infundió ANP. La infusión de ANP dio como resultado una reducción en edema cerebral. Los resultados se interpretaron como un efecto protector. Recientemente, Wiggins A.K. et al. (Neuroscience 2003: 118: 715- 26) informaron de la expresión de ANP en ratas en un modelo de depresión en extensión y consideraron ANP como una forma de neuroprotección.
El documento WO 2004/059293 divulga procedimientos basados en biomarcador para el diagnóstico de apoplejía.
Los autores de la invención han demostrado que la proporción de la cantidad de NT-proANP y la cantidad de NT-proBNP es un indicador valioso para el diagnóstico de acontecimientos isquémicos cerebrales agudos en un sujeto, tales como una apoplejía o un accidente isquémico transitorio.
Existe la necesidad de obtener medios y procedimientos para diagnosticar acontecimientos isquémicos cerebrales
agudos en un sujeto. En consecuencia, el problema técnico subyacente a la presente invención se podría ver como la provisión de medios y procedimientos para cumplir con la necesidad mencionada anteriormente.
El problema técnico se resuelve por los modos de realización caracterizados en las reivindicaciones y en el presente documento a continuación.
La presente invención se refiere a un procedimiento in vitro para diagnosticar un acontecimiento isquémico cerebral agudo en un sujeto que se sospecha que padece un acontecimiento isquémico cerebral agudo, que comprende a. determinar la cantidad de NT-proANP en una muestra de dicho sujeto,
b. determinar la cantidad de NT-proBNP en una muestra de dicho sujeto, y
c. calcular una proporción de las cantidades de NT-proANP y NT-proBNP.
Procedimiento para diagnosticar un accidente isquémico transitorio (divulgación)
La divulgación se refiere a un procedimiento para diagnosticar un accidente isquémico transitorio (AIT) en un sujeto que se sospecha que ha presentado un accidente isquémico transitorio, pero que no presentó apoplejía, que comprende la determinación de la cantidad de NT-proANP en una muestra de dicho sujeto.
En un modo de realización preferente, el procedimiento mencionado anteriormente comprende además la comparación de la cantidad determinada de NT-proANP con una cantidad de referencia. De este modo, se diagnostica un accidente isquémico transitorio.
Por tanto, la divulgación, en particular, se refiere a un procedimiento para diagnosticar un accidente isquémico transitorio (AIT) en un sujeto que se sospecha que ha presentado un accidente isquémico transitorio, pero que no presentó apoplejía, comprendiendo dicho procedimiento las etapas de
a. determinar la cantidad de NT-proANP en una muestra de dicho sujeto, y
b. comparar la cantidad así determinada de NT-proANP con una cantidad de referencia, con lo que se diagnostica un accidente isquémico transitorio.
Preferentemente, se diagnostica si el sujeto ha presentado un accidente isquémico transitorio, o no, llevando a cabo la etapa adicional de c) diagnosticar si el sujeto ha presentado un accidente isquémico transitorio, o no, en base al resultado de la comparación llevada a cabo en la etapa b).
El procedimiento de la presente invención, preferentemente, es un procedimiento ex vivo. Además, puede comprender etapas además de las mencionadas de forma explícita anteriormente. Por ejemplo, otras etapas se pueden referir a pretratamientos de muestras o evaluación de los resultados obtenidos por el procedimiento. El procedimiento se puede llevar a cabo manualmente o asistido por automatización. Preferentemente, la etapa (a) y/o (b) puede estar asistida totalmente o en parte por automatización, por ejemplo, por un equipo robótico o sensitivo adecuado para la determinación en la etapa (a) o una comparación implementada por ordenador y/o diagnóstico basado en dicha comparación en la etapa (b). Más preferentemente, el procedimiento se lleva a cabo totalmente de manera automatizada. En un caso de este tipo, el resultado diagnóstico que se establece en la etapa b) se genera en un formato de salida adecuado para que se pueda usar como ayuda para establecer el diagnóstico clínico final por, por ejemplo, un médico.
En consecuencia, la divulgación también se refiere preferentemente a un sistema para diagnosticar un accidente isquémico transitorio (AIT) en un sujeto que se sospecha que ha presentado un accidente isquémico transitorio, pero que no presentó apoplejía, que comprende
a) una unidad analizadora configurada para poner en contacto, in vitro, una porción de una muestra del sujeto con un ligando que comprende afinidad de unión específica por el marcador NT-proANP,
b) una unidad analizadora configurada para detectar una señal de la porción de la muestra del sujeto en contacto con el ligando,
c) un dispositivo informático que tiene un procesador y en comunicación funcional con dichas unidades de análisis, y
d) un medio legible por máquina no transitorio que incluye una pluralidad de instrucciones ejecutables por el procesador, las instrucciones, cuando se ejecutan, calculan una cantidad del marcador y comparan la cantidad del marcador con una cantidad de referencia, diagnosticando de este modo un accidente isquémico transitorio.
El término "sujeto", como se usa en el presente documento, se refiere a animales, preferentemente mamíferos, y más preferentemente, seres humanos.
Preferentemente, el sujeto que se va a someter a prueba (así como el sujeto del que se deriva la cantidad de referencia) no tiene función renal alterada. La forma de evaluar si un sujeto presenta disfunción renal es bien conocida en la técnica. Se pueden diagnosticar trastornos renales por cualquier medio conocido y considerado apropiado. En particular, se puede evaluar la función renal por medio de la tasa de filtración glomerular (TFG). Por ejemplo, la TFG se puede calcular por la fórmula de Cockgroft-Gault o MDRD (Levey 1999, Annals of Internal Medicine, 461-470). La TFG es el volumen de líquido filtrado desde los capilares glomerulares renales hacia la cápsula de Bowman por unidad de tiempo. Clínicamente, esto se usa a menudo para determinar la función renal. La TFG se estimó originalmente (la TFG nunca se puede determinar, todos los cálculos derivaron de fórmulas tales como la fórmula Cockgroft Gault o la fórmula MDRD aportan solo estimaciones y no la TFG "real") inyectando inulina en el plasma. Puesto que la inulina no se reabsorbe por el riñón después de la filtración glomerular, su tasa de excreción es directamente proporcional a la tasa de filtración de agua y solutos a través del filtro glomerular. En la práctica clínica, sin embargo, se usa el aclaramiento de creatinina para medir la TFG. La creatinina es una molécula endógena, sintetizada en el cuerpo, que se filtra libremente por el glomérulo (pero también se secreta por los túbulos renales en cantidades muy pequeñas). El aclaramiento de creatinina (CrCl) es, por lo tanto, una aproximación cercana de la TFG. La TFG se registra típicamente en mililitros por minuto (ml/min). El intervalo normal de TFG para hombres es de 97 a 137 ml/min, el intervalo normal de TFG para mujeres es de 88 a 128 ml/min. Por tanto, se contempla en particular que la TFG de un sujeto que no presenta disfunción renal está dentro de este intervalo. Además, dicho sujeto tiene preferentemente un nivel de creatinina en sangre (en particular un nivel de creatinina en suero) menor que 0,9 mg/dl, más preferentemente menor que 1,1 mg/dl y lo más preferentemente menor que 1,3 mg/dl.
Preferentemente, el sujeto tiene factores de riesgo para un acontecimiento isquémico cerebral agudo, en particular para AIT. El término "acontecimiento isquémico cerebral agudo" se describe en otra parte en el presente documento. Los factores de riesgo preferentes incluyen arteriopatía coronaria, insuficiencia cardíaca, en particular insuficiencia cardíaca aguda, disfunción cardíaca sistólica y/o diastólica, valvulopatía e hipertensión arterial. Otros factores de riesgo son diabetes y obesidad. En consecuencia, el sujeto de prueba muestra preferentemente al menos uno de estos factores de riesgo. En particular, se prevé que el sujeto de prueba (y el sujeto de referencia, es decir, el sujeto del que se deriva la cantidad de referencia) padece arteriopatía coronaria y/o insuficiencia cardíaca.
Lo más preferentemente, el sujeto padece insuficiencia cardíaca. Esto se aplica en particular, si se calcula una proporción de las cantidades de NT-proANP y NT-proBNP en el contexto del procedimiento de la presente invención (véase en otra parte en el presente documento). El término "insuficiencia cardíaca" es bien conocido en la técnica. Como se usa en el presente documento, el término, preferentemente, se refiere a una función sistólica y/o diastólica alterada del corazón que se acompaña de signos evidentes de insuficiencia cardíaca. Preferentemente, la insuficiencia cardíaca a la que se hace referencia en el presente documento es insuficiencia cardíaca crónica. Más preferentemente, es insuficiencia cardíaca aguda. El término "insuficiencia cardíaca aguda", preferentemente, se refiere a un empeoramiento de la función cardíaca dentro de un máximo de 2 semanas con o, en particular, sin insuficiencia cardíaca crónica preexistente.
La IC se puede clasificar en diversos grados de gravedad. De acuerdo con la clasificación de NYHA (New York Heart Association), los pacientes con insuficiencia cardíaca se clasifican como pertenecientes a las clases I, II, III y IV de NYHA. Un paciente que tiene insuficiencia cardíaca ya ha experimentado cambios estructurales y funcionales en su pericardio, miocardio, circulación coronaria o válvulas cardíacas. No podrá restablecer totalmente su salud y necesita un tratamiento terapéutico. Los pacientes de clase I de NYHA no tienen síntomas obvios de cardiovasculopatía pero ya tienen pruebas objetivas de deterioro funcional. Los pacientes de clase II de NYHA tienen una limitación ligera de la actividad física. Los pacientes de clase III de NYHA muestran una limitación marcada de la actividad física. Los pacientes de clase IV de NYHA no pueden llevar a cabo ninguna actividad física sin molestias. Muestran síntomas de insuficiencia cardíaca en reposo.
Esta clasificación funcional se complementa por la clasificación más reciente por el American College of Cardiology y la American Heart Association (véase J. Am. Coll. Cardiol. 2001;38;2101-2113, actualizado en 2005, véase J. Am. Coll. Cardiol. 2005;46;el-e82). Se definen 4 fases A, B, C y D. Las fases A y B no son IC pero se consideran para ayudar a identificar a los pacientes pronto antes de desarrollar "verdadera" IC. Los pacientes de las fases A y B se definen mejor como aquellos con factores de riesgo para el desarrollo de IC. Por ejemplo, los pacientes con arteriopatía coronaria, hipertensión o diabetes mellitus que aún no muestran una función ventricular izquierda (VI) deteriorada, hipertrofia o distorsión de cavidad geométrica se considerarían como fase A, mientras que los pacientes que son asintomáticos pero demuestran hipertrofia VI y/o función VI deteriorada se designarían como fase B. La fase C entonces indica pacientes con síntomas actuales o pasados de IC asociados con cardiopatía estructural subyacente (la mayoría de los pacientes con IC), y la fase D designa a pacientes con verdadera IC resistente al tratamiento.
Como se usa en el presente documento, el término "insuficiencia cardíaca", preferentemente, se refiere a las fases
C y D de la clasificación ACC/AHA mencionada anteriormente. En estas fases, el sujeto muestra síntomas típicos de insuficiencia cardíaca. En consecuencia, un sujeto que padece insuficiencia cardíaca, padece insuficiencia cardíaca de fase C o D de acuerdo con la clasificación ACC/AHA. Más preferentemente, el término "insuficiencia cardíaca" se clasifica como NYHA III o IV de acuerdo con la clasificación de NYHA.
Se prevé además que el sujeto que se va a someter a prueba de acuerdo con el procedimiento de la presente invención (así como el/los sujeto(s) de referencia) no presenta síndrome coronario agudo (abreviado "SCA"). El término "SCA" como se usa en el presente documento, preferentemente, incluye STEMI (infarto de miocardio con elevación del segmento ST); IAMSEST (infarto de miocardio sin elevación del segmento ST) y angina de pecho inestable. Se prevé además que el sujeto que se va a someter a prueba, preferentemente, no tiene antecedentes de SCA. Preferentemente, el sujeto no habrá padecido SCA dentro de una semana o, más preferentemente, dentro de un mes antes de llevar a cabo el procedimiento de la presente invención (para ser más precisos, dentro de un mes antes de obtener la muestra).
Preferentemente, el sujeto tampoco padece un acontecimiento circulatorio cardíaco (en particular cuando se obtiene la muestra). El término "acontecimiento circulatorio cardíaco", preferentemente, se refiere a un deterioro repentino de la función del corazón. Un deterioro de este tipo está provocado, preferentemente, por arritmia cardíaca, paro cardíaco transitorio o embolia pulmonar. La arritmia cardíaca se puede producir de dos formas: bradiarritmia y taquiarritmia. En la bradiarritmia, la frecuencia del latido cardíaco disminuye patológicamente en comparación con un sujeto sano, preferentemente en la bradiarritmia, la frecuencia cardíaca es menor que 60 latidos por minuto. Las formas más frecuentes de bradiarritmia son bradicardia sinusal, bloqueo sinoauricular, pausa sinusal, síndrome de disfunción sinusal y bloqueo auriculoventricular. En la taquiarritmia, la frecuencia se incrementa patológicamente en comparación con un sujeto sano, preferentemente en la bradiarritmia, la frecuencia cardíaca es mayor que 100 latidos por minuto. La mayoría de los casos de taquiarritmia son taquicardia supraventricular con cardiovasculopatía estructural, fibrilación auricular con síndrome de Wolff-Parkinson-White, aleteo auricular con 1:1 conducción auriculoventricular y taquicardia ventricular. La embolia pulmonar está provocada por la oclusión de una arteria pulmonar por un coágulo sanguíneo (tromboembolia) o una burbuja de aire (embolia gaseosa). Típicamente, se forman coágulos sanguíneos en las venas pélvicas o de extremidades inferiores y migran a las arterias pulmonares donde se quedan atascados. La embolia gaseosa está provocada, preferentemente, por un accidente de buceo o por catéteres venosos con fugas. Los síntomas de embolia pulmonar incluyen dolor de pecho, disnea y hemoptisis (tos con sangre). La presión en la circulación pulmonar puede aumentar y puede provocar insuficiencia ventricular derecha. Los acontecimientos circulatorios cardíacos también se pueden determinar o confirmar por los procedimientos conocidos hasta ahora.
El término "accidente isquémico transitorio" (abreviado como AIT en el presente documento) es bien conocido en la técnica (véase W.E. Smith et al, Cerebrovascular Diseases, capítulo 364 en Harrison, Principles of Internal Medicine, 17.a edición). Como se usa en el presente documento, el término, preferentemente, se refiere a un episodio transitorio de disfunción neurológica provocado por isquemia sin infarto agudo y, por tanto, sin muerte tisular. Por tanto, al contrario que la apoplejía, un AIT no da lugar a daño tisular irreversible debido a muerte de células cerebrales. El AIT comparte la misma etiología subyacente que la apoplejía: una interrupción del flujo sanguíneo cerebral (FSC). Además, los síntomas de AIT son normalmente los mismos que para apoplejía. Los síntomas de AIT y apoplejía son bien conocidos en la técnica. Además, es bien conocido en la técnica que pueden depender de la región del cerebro afectada por la isquemia (véase también a continuación) y que pueden variar en gravedad. Los síntomas incluyen pérdida temporal de visión (amaurosis fugaz), dificultades en el habla (afasia); debilidad en un lado del cuerpo (hemiparesia) y entumecimiento u hormigueo (parestesia), normalmente en un lado del cuerpo. Otros síntomas son disfasia, disartria, hemianopsia, debilidad, ataxia y heminatención. Mareo, falta de coordinación o equilibrio deficiente también son síntomas relacionados con AIT.
Los síntomas de un AIT son de corta duración y normalmente duran de unos pocos segundos a unos pocos minutos y la mayoría de los síntomas desaparecen dentro de 60 minutos. En consecuencia, los síntomas duran solo poco tiempo, preferentemente menos de 24 horas, en particular menos de 1 hora.
El sujeto que se va a someter a prueba de acuerdo con el procedimiento mencionado anteriormente no presentó apoplejía, es decir, el sujeto no habrá presentado apoplejía. Preferentemente, el sujeto no habrá presentado apoplejía dentro de las 72 horas, más preferentemente, dentro de las 48 horas e, incluso más preferentemente, dentro de las 24 horas antes de que se haya obtenido la muestra que se va a someter a prueba. Lo más preferentemente, el sujeto no habrá presentado apoplejía dentro de una o dos semanas antes de que se haya obtenido la muestra de prueba.
El término "apoplejía" es bien conocido en la técnica. El término, preferentemente, engloba apoplejía isquémica. El término "apoplejía isquémica" también se entiende bien por el experto en la técnica (véanse, por ejemplo, Adams et al., Guidelines for the Early Management of Adults With Ischemic Stroke, A Guideline From the American Heart Association/ American Stroke Association Stroke Council, Clinical Cardiology Council, Cardiovascular Radiology and Intervention Council, and the Atherosclerotic Peripheral Vascular Disease and Quality of Care Outcomes in Research Interdisciplinary Working Groups in Stroke. 2007;38:1655). Como se usa en el presente documento, el término, preferentemente, se refiere a apoplejía isquémica cerebral. Además, preferentemente se refiere a una
apoplejía que está provocada por una reducción en el flujo sanguíneo al cerebro o partes del mismo que da lugar a una reducción en el suministro (suministro insuficiente) de oxígeno a las células cerebrales. Una apoplejía en el contexto de los procedimientos de la presente invención da lugar a un daño tisular irreversible debido a la muerte de células cerebrales. En consecuencia, el término "apoplejía", como se usa en el presente documento, no incluye AIT.
Los síntomas de apoplejía son bien conocidos en la técnica. Preferentemente, son los mismos síntomas que los divulgados para AIT anteriormente.
La apoplejía isquémica puede estar provocada por aterotrombosis o embolia de una arteria cerebral principal, por trastornos de coagulación o vasculopatía no ateromatosa, o por isquemia cardíaca que da lugar a un flujo sanguíneo global reducido. La apoplejía isquémica se selecciona preferentemente del grupo que consiste en apoplejía aterotrombótica, apoplejía cardioembólico y apoplejía lagunar. La determinación del tipo de apoplejía es conocida por el experto en la técnica e incluye diferentes técnicas de formación de imágenes tales como ecocardiografía, electrocardiograma y ecografía Doppler. Preferentemente, la apoplejía isquémica es una apoplejía isquémica aguda.
AIT y apoplejía son el resultado de isquemia y/o hipoperfusión de partes específicas o todas las partes del cerebro. Los síntomas son dependientes de la región (y del vaso acompañante) afectada. Con frecuencia, la arteria cerebral media se ve afectada, los síntomas asociados incluyen afasia, debilidad de brazos o piernas contralateral, el AIT de la cerebral anterior se puede asociar con afasia, apractognosia, confusión, alexia, etc., si la parte central del cerebro inferior se ve afectada, los síntomas pueden ser temblor intencional, ataxia disestesia, etc., las lesiones de la médula pueden incluir vértigo, diplopía, náuseas y vómitos.
El término "apoplejía isquémica" no incluye, preferentemente, apoplejía hemorrágica.
Si un sujeto padece o padeció apoplejía, en particular apoplejía isquémica, se puede determinar por procedimientos bien conocidos. Además, los síntomas de apoplejía son bien conocidos en la técnica y, por ejemplo, se describen en Adams et al. (loc. cit.). Por ejemplo, los síntomas de apoplejía incluyen entumecimiento o debilidad súbita de la cara, brazo o pierna, en especial en un lado del cuerpo, confusión repentina, dificultad para hablar o comprender, problema súbito para ver en uno o ambos ojos, y problema súbito para caminar, mareo, pérdida de equilibrio o coordinación.
Como se expone anteriormente, el sujeto que se va a someter a prueba de acuerdo con el procedimiento mencionado anteriormente será sospechoso de haber presentado un accidente isquémico transitorio. Preferentemente, un sujeto que se sospecha que ha presentado un accidente isquémico transitorio es un sujeto que ha mostrado síntomas de un AIT. Preferentemente, dicho sujeto ha mostrado síntomas de un AIT dentro de un determinado período ventana antes de obtener la muestra de prueba. Preferentemente, dicho sujeto ha mostrado síntomas de AIT dentro de las 72 horas, más preferentemente, dentro de las 48 horas y lo más preferentemente dentro de las 24 horas antes de que se haya obtenido la muestra. Preferentemente, sin embargo, la muestra de ensayo se obtendrá no antes de 1 hora, en particular, no antes de 2 horas después del final de los síntomas de AIT. Además, se prevé que se haya obtenido la muestra de prueba no antes de 4 horas después del final de los síntomas de AIT. También se prevé que se haya obtenido la muestra de prueba no antes de 6 horas después del final de los síntomas de AIT.
También se prevé que el sujeto haya mostrado síntomas de AIT dentro de las 12 horas antes de que se haya obtenido la muestra.
Por el procedimiento mencionado anteriormente de la presente invención, se diagnosticará un AIT. El término "diagnóstico" como se usa en el presente documento quiere decir evaluar si un sujeto al que se hace referencia de acuerdo con el procedimiento de la presente invención ha presentado un accidente isquémico transitorio, o no. En particular, se diagnosticará si el sujeto ha presentado un accidente isquémico transitorio, o no, dentro de un determinado período ventana antes de obtener la muestra que se va a someter a prueba. En un modo de realización preferente, se diagnosticará si el sujeto ha presentado un accidente isquémico transitorio, o no, dentro de las 72 horas antes de que se haya obtenido la muestra. En otro modo de realización preferente, se diagnosticará si el sujeto ha presentado un accidente isquémico transitorio, o no, dentro de las 48 horas antes de que se haya obtenido la muestra. Incluso en otro modo de realización preferente, se diagnosticará si el sujeto ha presentado un accidente isquémico transitorio, o no, dentro de las 24 horas antes de que se haya obtenido la muestra. Preferentemente, el sujeto ya no muestra síntomas de AIT en el momento en que se obtiene la muestra.
Como se entenderá por los expertos en la técnica, la evaluación de si un sujeto como se hace referencia en el presente documento ha presentado un AIT, o no, normalmente no se pretende que sea correcta para un 100 % de los sujetos que se van a diagnosticar. El término, sin embargo, requiere que la evaluación sea correcta para una parte estadísticamente significativa de los sujetos (por ejemplo, una cohorte en un estudio de cohorte). Por tanto, el procedimiento de la presente invención, sin embargo, al menos proporciona una ayuda para establecer un diagnóstico clínico final. Se puede determinar sin más si una parte es estadísticamente significativa por el experto
en la técnica usando diversas herramientas de evaluación estadística bien conocidas, por ejemplo, determinación de intervalos de confianza, determinación del valor de p, prueba de la t de Student, prueba de Mann-Whitney, etc. Se encuentran detalles en Dowdy y Wearden, Statistics for Research, John Wiley & Sons, New York 1983. Los intervalos de confianza preferentes son de al menos un 90 %, al menos un 95 %, al menos un 97 %, al menos un 98 % o al menos un 99 %. Los valores de p son, preferentemente, 0,1, 0,05, 0,01, 0,005 o 0,0001.
El término "muestra" se refiere a una muestra de un líquido corporal, a una muestra de células separadas o a una muestra de un tejido o un órgano. Se pueden obtener muestras de líquidos corporales por técnicas bien conocidas e incluyen, preferentemente, muestras de sangre, plasma, suero u orina, más preferentemente, muestras de sangre, plasma, orina o suero y, lo más preferentemente, sangre, plasma o suero. Se pueden obtener muestras de tejidos u órganos a partir de cualquier tejido u órgano, por ejemplo, por biopsia. Se pueden obtener células separadas de los líquidos corporales o los tejidos u órganos por técnicas de separación tales como centrifugación o separación celular. Preferentemente, se obtienen muestras de células, tejidos u órganos a partir de las células, tejidos u órganos que expresan o producen los péptidos a los que se hace referencia en el presente documento.
El marcador NT-proANP (porción N terminal del propéptido natriurético proauricular) es bien conocido en la técnica (véase, por ejemplo, Bonow, 1996, Circulation 93: 1946-1950). NT-proANP pertenece al grupo de los péptidos natriuréticos. NT-proANP y se genera por escisión proteolítica de una molécula precursora, la prepropéptido ANP, dando como resultado la hormona activa ANP (péptido natriurético auricular) y el correspondiente fragmento N terminal NT-proANP. ANP se sintetiza en los miocitos auriculares. En la liberación, la prohormona se divide en cantidades equimolares de proANP altamente activo biológicamente (aminoácidos 99 a 126) y NT-proANP (aminoácidos 1 a 98). La hormona activa está implicada en el control homeostático de agua corporal, sodio, potasio y tejido adiposo. Se libera por células musculares en las cavidades superiores del corazón en respuesta a tensión arterial alta. NT-proANP como se usa en el presente documento, preferentemente, se refiere a NT-proANP humano. El término "NT-proANP", preferentemente, también engloba variantes de los polipéptidos de NT-proANP humanos mencionados anteriormente. Dichas variantes tienen al menos las mismas propiedades biológicas e inmunológicas esenciales que el polipéptido NT-proANP mencionado anteriormente. En particular, comparten las mismas propiedades biológicas e inmunológicas esenciales si son detectables por los mismos ensayos específicos a los que se hace referencia en la presente memoria descriptiva, por ejemplo, por ensayos ELISA usando anticuerpos policlonales o monoclonales que reconocen específicamente los dichos polipéptidos NT-proANP. Los ejemplos de variantes particulares de NT-proANP y NT-proBNP y procedimientos para su medición son conocidos (Ala-Kopsala, M., Magga, J., Peuhkurinen, K. et al. (2004): La heterogeneidad molecular tiene un impacto importante en la medición de fragmentos N terminales circulantes de péptidos natriuréticos de tipo A y tipo B. Clinical Chemistry, vol. 50(9), 1576-1588). Además, se debe entender que una variante como se hace referencia de acuerdo con la presente invención, tendrá una secuencia de aminoácidos que difiere debido a al menos una sustitución, eliminación y/o adición de aminoácidos, en la que la secuencia de aminoácidos de la variante sigue siendo, preferentemente, al menos un 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 85 %, 90 %, 92 %, 95 %, 97 %, 98 % o un 99 % idéntica a la secuencia amino del polipéptido NT-proANP específico, preferentemente a lo largo de la longitud completa del NT-proANP humano, respectivamente (en particular a lo largo de la longitud completa). El grado de identidad entre dos secuencias de aminoácidos se puede determinar por algoritmos bien conocidos en la técnica y descritos en otra parte en el presente documento. Las variantes a las que se hace referencia anteriormente pueden ser variantes alélicas o cualquier otro homólogo, parálogo u ortólogo específico de especie. Además, las variantes a las que se hace referencia en el presente documento incluyen fragmentos o subunidades del polipéptido NT-proANP específico o los tipos de variantes mencionados anteriormente siempre que estos fragmentos tengan las propiedades inmunológicas y biológicas esenciales como se hace referencia anteriormente. Dichos fragmentos pueden ser, por ejemplo, productos de degradación del polipéptido NT-proANP. Se incluyen además variantes que difieren debido a modificaciones postraduccionales tales como fosforilación o miristilación.
Determinar la cantidad de un péptido o polipéptido como se hace referencia en esta memoria descriptiva se refiere a medir la cantidad o concentración, preferentemente, de forma semicuantitativa o cuantitativa. La medición se puede realizar directa o indirectamente. La medición directa se refiere a la medición de la cantidad o concentración del péptido o polipéptido en base a una señal que se obtiene a partir del propio péptido o polipéptido y con una intensidad que se correlaciona directamente con el número de moléculas del péptido presentes en la muestra. Una señal de este tipo, en ocasiones denominada en el presente documento señal de intensidad, se puede obtener, por ejemplo, midiendo un valor de intensidad de una propiedad física o química específica del péptido o polipéptido. La medición indirecta incluye la medición de una señal obtenida a partir de un componente secundario (es decir, un componente que no es el propio péptido o polipéptido) o un sistema de lectura biológica, por ejemplo, respuestas celulares, ligandos, marcadores o productos de reacción enzimáticos mensurables.
De acuerdo con la presente invención, determinar la cantidad de un péptido o polipéptido se puede lograr por todos los medios conocidos para determinar la cantidad de un péptido en una muestra. Dichos medios comprenden inmunoanálisis y procedimientos que pueden utilizar moléculas marcadas en diversos formatos de ensayo de tipo sándwich, competencia u otros. Dichos ensayos se basan preferentemente en agentes de detección tales como anticuerpos que reconocen específicamente el péptido o polipéptido que se va a determinar. Los agentes de detección podrán, directa o indirectamente, generar una señal que indique la presencia o ausencia del péptido o polipéptido. Además, la intensidad de señal se puede correlacionar, preferentemente, directa o indirectamente (por
ejemplo, inversamente proporcional) con la cantidad de polipéptido presente en una muestra. Otros procedimientos adecuados comprenden medir una propiedad física o química específica para el péptido o polipéptido tal como su masa molecular precisa o espectro de RMN. Dichos procedimientos comprenden, preferentemente, biosensores, dispositivos ópticos acoplados a inmunoanálisis, biochips, dispositivos analíticos tales como espectrómetros de masas, analizadores de RMN o dispositivos de cromatografía. Además, los procedimientos incluyen procedimientos basados en ELISA de microplacas, inmunoensayos totalmente automatizados o robóticos (disponibles, por ejemplo, en analizadores Elecsys™), CBA (un ensayo enzimático de unión a cobalto, disponible, por ejemplo, en analizadores Roche-Hitachi™) y ensayos de aglutinación de látex (disponibles, por ejemplo, en analizadores Roche-Hitachi™).
Preferentemente, determinar la cantidad de un péptido o polipéptido comprende las etapas de (a) poner en contacto una célula que puede provocar una respuesta celular con una intensidad que es indicativa de la cantidad del péptido o polipéptido con dicho péptido o polipéptido durante un período de tiempo adecuado, (b) medir la respuesta celular. Para medir respuestas celulares, la muestra o muestra procesada se añade, preferentemente, a un cultivo celular y se mide una respuesta celular interna o externa. La respuesta celular puede incluir la expresión mensurable de un gen indicador o la secreción de una sustancia, por ejemplo, un péptido, polipéptido o una molécula pequeña. La expresión o sustancia generará una señal de intensidad que se correlaciona con la cantidad del péptido o polipéptido.
También preferentemente, determinar la cantidad de un péptido o polipéptido comprende la etapa de medir una señal de intensidad específica obtenible a partir del péptido o polipéptido en la muestra. Como se describe anteriormente, una señal de este tipo puede ser la intensidad de señal observada a una variable m/z específica para el péptido o polipéptido, observada en espectros de masas o un espectro de RMN específico para el péptido o polipéptido.
Determinar la cantidad de un péptido o polipéptido puede comprender, preferentemente, las etapas de (a) poner en contacto el péptido con un ligando específico, (b) (opcionalmente) retirar el ligando no unido, (c) medir la cantidad de ligando unido.
De acuerdo con un modo de realización preferente, dichas etapas de poner en contacto, retirar y medir se pueden realizar por una unidad analizadora del sistema divulgado en el presente documento. De acuerdo con algunos modos de realización, dichas etapas se pueden realizar por una única unidad analizadora de dicho sistema o por más de una unidad analizadora en comunicación funcional entre sí. Por ejemplo, de acuerdo con un modo de realización específico, dicho sistema divulgado en el presente documento puede incluir una primera unidad analizadora para realizar dichas etapas de poner en contacto y retirar y una segunda unidad analizadora, conectada de forma funcional a dicha primera unidad analizadora por una unidad de transporte (por ejemplo, un brazo robot), que realiza dicha etapa de medir.
El ligando unido, en particular, el ligando o el complejo ligando/péptido, generará una señal de intensidad. Unión de acuerdo con la presente invención incluye unión tanto covalente como no covalente. Un ligando de acuerdo con la presente invención puede ser cualquier compuesto, por ejemplo, un péptido, polipéptido, ácido nucleico o molécula pequeña, que se une al péptido o polipéptido descrito en el presente documento. Los ligandos preferentes incluyen anticuerpos, ácidos nucleicos, péptidos o polipéptidos tales como receptores o compañeros de unión para el péptido o polipéptido y fragmentos de los mismos que comprenden los dominios de unión para los péptidos, y aptámeros, por ejemplo, aptámeros de ácidos nucleicos o péptidos. Los procedimientos para preparar dichos ligandos son bien conocidos en la técnica. Por ejemplo, la identificación y producción de anticuerpos o aptámeros adecuados también se ofrece por proveedores comerciales. El experto en la técnica está familiarizado con procedimientos para desarrollar derivados de dichos ligandos con mayor afinidad o especificidad. Por ejemplo, se pueden introducir mutaciones aleatorias en los ácidos nucleicos, péptidos o polipéptidos. Estos derivados se pueden someter a prueba a continuación para determinar la unión de acuerdo con procedimientos de cribado conocidos en la técnica, por ejemplo, presentación en fagos. Los anticuerpos como se hace referencia en el presente documento incluyen anticuerpos tanto policlonales como monoclonales, así como fragmentos de los mismos, tales como fragmentos Fv, Fab y F(ab)2 que se pueden unir a antígeno o hapteno. La presente invención también incluye anticuerpos monocatenarios y anticuerpos híbridos humanizados en los que las secuencias de aminoácidos de un anticuerpo donante no humano que presentan una especificidad de antígeno deseada se combinan con secuencias de un anticuerpo aceptor humano. Las secuencias donantes incluirán normalmente al menos los residuos aminoacídicos de unión a antígeno del donante, pero pueden comprender además otros residuos aminoacídicos estructural y/o funcionalmente relevantes del anticuerpo donante. Dichos híbridos se pueden preparar por diversos procedimientos bien conocidos en la técnica. Preferentemente, el ligando o agente se une específicamente al péptido o polipéptido. Unión específica de acuerdo con la presente invención quiere decir que el ligando o agente no se debe unir sustancialmente a ("reaccionar de forma cruzada" con) otro péptido, polipéptido o sustancia presente en la muestra que se va a analizar. Preferentemente, el péptido o polipéptido unido específicamente se debe unir con una afinidad al menos 3 veces mayor, más preferentemente al menos 10 veces mayor e incluso más preferentemente al menos 50 veces mayor que cualquier otro péptido o polipéptido pertinente. La unión inespecífica puede ser tolerable, si todavía se puede distinguir y medir inequívocamente, por ejemplo, de acuerdo con su tamaño en una inmunotransferencia, o por su abundancia relativamente mayor en la
muestra. La unión del ligando se puede medir por cualquier procedimiento conocido en la técnica. Preferentemente, dicho procedimiento es semicuantitativo o cuantitativo. Otras técnicas adecuadas para la determinación de un polipéptido o péptido se describen a continuación.
En primer lugar, la unión de un ligando se puede medir directamente, por ejemplo, por RMN o resonancia de plasmón superficial. La medición de la unión de un ligando, de acuerdo con modos de realización preferentes, se realiza por una unidad analizadora de un sistema divulgado en el presente documento. Después de esto, se puede calcular una cantidad de la unión medida por un dispositivo informático de un sistema divulgado en el presente documento. En segundo lugar, si el ligando también sirve como sustrato de una actividad enzimática del péptido o polipéptido de interés, se puede medir un producto de reacción enzimático (por ejemplo, se puede medir la cantidad de una proteasa midiendo la cantidad de sustrato escindido, por ejemplo, en una inmunoelectrotransferencia). De forma alternativa, el ligando puede presentar propiedades enzimáticas por sí mismo y el complejo "ligando/péptido o polipéptido" o el ligando que se unió por el péptido o polipéptido, respectivamente, se puede poner en contacto con un sustrato adecuado permitiendo la detección por la generación de una señal de intensidad. Para la medición de productos de reacción enzimáticos, preferentemente la cantidad de sustrato es saturante. El sustrato también se puede marcar con un marcador detectable antes de la reacción. Preferentemente, la muestra se pone en contacto con el sustrato durante un período de tiempo adecuado. Un período de tiempo adecuado se refiere al tiempo necesario para que se produzca una cantidad detectable, preferentemente mensurable, de producto. En lugar de medir la cantidad de producto, se puede medir el tiempo necesario para la aparición de una cantidad dada (por ejemplo, detectable) de producto. En tercer lugar, el ligando se puede acoplar de forma covalente o no covalente a un marcador permitiendo la detección y medición del ligando. El marcaje se puede realizar por procedimientos directos o indirectos. El marcaje directo implica el acoplamiento del marcador directamente (de forma covalente o no covalente) al ligando. El marcaje indirecto implica la unión (de forma covalente o no covalente) de un ligando secundario al primer ligando. El ligando secundario se deber unir específicamente al primer ligando. Dicho ligando secundario se puede acoplar a un marcador adecuado y/o ser la diana (receptor) del ligando terciario que se une al ligando secundario. El uso de ligandos secundarios, terciarios o incluso de orden superior se usa a menudo para incrementar la señal. Los ligandos secundarios y de orden superior adecuados pueden incluir anticuerpos, anticuerpos secundarios y el sistema de estreptavidina-biotina bien conocido (Vector Laboratories, Inc.). El ligando o sustrato también se puede "marcar" con una o más marcas como es conocido en la técnica. Dichas marcas pueden ser entonces dianas para ligandos de orden superior. Las marcas adecuadas incluyen biotina, digoxigenina, marca His, glutatión-S-transferasa, FLAG, GFP, marca myc, hemaglutinina (HA) del virus de la gripe A, proteína de unión a maltosa y similares. En el caso de un péptido o polipéptido, la marca está preferentemente en el extremo N terminal y/o extremo C. Los marcadores adecuados son cualquier marcador detectable por un procedimiento de detección apropiado. Los marcadores típicos incluyen partículas de oro, perlas de látex, éster de acridano, luminol, rutenio, marcadores enzimáticamente activos, marcadores radiactivos, marcadores magnéticos ("por ejemplo, perlas magnéticas", incluyendo marcadores paramagnéticos y superparamagnéticos) y marcadores fluorescentes. Los marcadores enzimáticamente activos incluyen, por ejemplo, peroxidasa de rábano picante, fosfatasa alcalina, beta-galactosidasa, luciferasa y derivados de las mismas. Los sustratos adecuados para la detección incluyen di-amino-bencidina (DAB), 3,3',-5,5'-tetrametilbencidina, NBT-BCIP (cloruro de 4-nitroazul-tetrazolio y fosfato de 5-bromo-4-cloro-3-indolilo, disponible como solución madre preparada de Roche Diagnostics), CDP-Star™ (Amersham Biosciences), ECF™ (Amersham Biosciences). Una combinación enzima-sustrato adecuada puede dar como resultado un producto de reacción coloreado, fluorescencia o quimioluminiscencia, que se puede medir de acuerdo con procedimientos conocidos en la técnica (por ejemplo, usando una película sensible a la luz o un sistema de cámara adecuado). En cuanto a medir la reacción enzimática, los criterios dados anteriormente se aplican de forma análoga. Los marcadores fluorescentes típicos incluyen proteínas fluorescentes (tales como GFP y sus derivados), Cy3, Cy5, Texas Red, fluoresceína y los tintes Alexa (por ejemplo, Alexa 568). Otros marcadores fluorescentes están disponibles, por ejemplo, de Molecular Probes (Oregón). También se contempla el uso de puntos cuánticos como marcadores fluorescentes. Los marcadores radiactivos típicos incluyen 35S, 125I, 32P, 33P y similares. Un marcador radioactivo se puede detectar por cualquier procedimiento conocido y apropiado, por ejemplo, una película sensible a la luz o un aparato de diagnóstico con fósforo. Los procedimientos de medición adecuados de acuerdo con la presente invención también incluyen precipitación (en particular inmunoprecipitación), electroquimioluminiscencia (quimioluminiscencia electrogenerada), RIA (radioinmunoanálisis), ELISA (ensayo de inmunoadsorción enzimática), inmunoensayos enzimáticos de tipo sandwich, inmunoanálisis de tipo sandwich de electroquimioluminiscencia (ECLIA), fluoroinmunoanálisis de lantánidos potenciado por disociación (DELFIA), ensayo de proximidad de centelleo (SPA), turbidimetría, nefelometría, turbidimetría o nefelometría potenciada con látex, o inmunoensayos en fase sólida. Otros procedimientos conocidos en la técnica (tales como electroforesis en gel, electroforesis en gel 2D, electroforesis en gel de poliacrilamida SDS (SDS-PAGE), inmunoelectrotransferencia y espectrometría de masas) se pueden usar solos o en combinación con marcaje u otros procedimientos de detección como se describe anteriormente.
La cantidad de un péptido o polipéptido se puede determinar, también preferentemente, como sigue: (a) poner en contacto un soporte sólido que comprende un ligando para el péptido o polipéptido como se especifica anteriormente con una muestra que comprende el péptido o polipéptido y (b) medir la cantidad de péptido o polipéptido que se une al soporte. El ligando, preferentemente elegido del grupo que consiste en ácidos nucleicos, péptidos, polipéptidos, anticuerpos y aptámeros, está preferentemente presente sobre un soporte sólido en forma
inmovilizada. Los materiales para fabricar soportes sólidos son bien conocidos en la técnica e incluyen, entre otros, materiales de columna disponibles comercialmente, perlas de poliestireno, perlas de látex, perlas magnéticas, partículas metálicas coloidales, superficies y chips de vidrio y/o silicio, tiras de nitrocelulosa, membranas, láminas, Duracyte, pocillos y paredes de bandejas de reacción, tubos de plástico, etc. El ligando o agente se puede unir a muchos vehículos diferentes. Los ejemplos de vehículos bien conocidos incluyen vidrio, poliestireno, poli(cloruro de vinilo), polipropileno, polietileno, policarbonato, dextrano, nailon, amilosas, celulosas naturales y modificadas, poliacrilamidas, agarosas y magnetita. La naturaleza del vehículo puede ser soluble o bien insoluble para los propósitos de la invención. Los procedimientos adecuados para fijar/inmovilizar dicho ligando son bien conocidos e incluyen, pero no se limitan a, interacciones iónicas, hidrófobas, covalentes y similares. También se contempla el uso de "matrices de suspensión" como matrices (Nolan 2002, Trends Biotechnol. 20(1):9-12). En dichas matrices de suspensión, el vehículo, por ejemplo, una microperla o microesfera, está presente en suspensión. La matriz consiste en diferentes microperlas o microesferas, posiblemente marcadas, que portan diferentes ligandos. En general son conocidos procedimientos de producción de dichas matrices, por ejemplo, en base a la química en fase sólida y grupos protectores fotolábiles (documento US 5.744.305).
El término "cantidad" como se usa en el presente documento engloba la cantidad absoluta de un polipéptido o péptido, la cantidad o concentración relativa del dicho polipéptido o péptido así como cualquier valor o parámetro que se correlaciona con el mismo o se pueda derivar del mismo. Dichos valores o parámetros comprenden valores de señal de intensidad de todas las propiedades físicas o químicas específicas obtenidas de dichos péptidos por mediciones directas, por ejemplo, valores de intensidad en espectros de masas o espectros de RMN. Además, se engloban todos los valores o parámetros que se obtienen por mediciones indirectas especificadas en otra parte en esta descripción, por ejemplo, niveles de respuesta determinadas a partir de sistemas de lectura biológica en respuesta a los péptidos o señales de intensidad obtenidas a partir de ligandos unidos de forma específica. Se debe entender que los valores que se correlacionan con las cantidades o parámetros mencionados anteriormente también se pueden obtener por todas las operaciones matemáticas estándar. De acuerdo con modos de realización preferentes de la invención objeto, la determinación de una "cantidad" se realiza por el sistema divulgado, con lo que un dispositivo informático determina la "cantidad" en base a las etapas de contacto y medición realizadas por una o más unidades analizadoras de dicho sistema.
Preferentemente, la cantidad de los polipéptidos como se hace referencia en el presente documento y, por tanto, de NT-proANP y NT-proBNP, se determina con los ensayos como se describe en la sección de ejemplos. Por ejemplo, la cantidad de NT-proANP se puede determinar detectando los aminoácidos 1 a 98 del péptido preproANP.
El término "comparar" como se usa en el presente documento engloba comparar la cantidad del péptido o polipéptido comprendido por la muestra que se va a analizar con la cantidad de una fuente de referencia adecuada en otra parte en esta descripción. Se debe entender que comparar como se usa en el presente documento se refiere a una comparación de parámetros o valores correspondientes, por ejemplo, una cantidad absoluta se compara con una cantidad de referencia absoluta mientras que una concentración se compara con una concentración de referencia o una señal de intensidad obtenida a partir de una muestra de prueba se compara con el mismo tipo de señal de intensidad de una muestra de referencia. La comparación a la que se hace referencia en la etapa (b) del procedimiento de la presente invención se puede llevar a cabo manualmente o asistida por ordenador, por ejemplo, por un dispositivo informático (por ejemplo, de un sistema divulgado en el presente documento). Para una comparación asistida por ordenador, el valor de la cantidad determinada se puede comparar con valores correspondientes a referencias adecuadas que se almacenan en una base de datos por un programa informático. El programa informático puede evaluar además el resultado de la comparación, es decir, proporciona automáticamente la evaluación deseada en un formato de salida adecuado, es decir, el resultado diagnóstico. El dicho resultado diagnóstico puede servir, preferentemente, como ayuda para establecer el diagnóstico clínico final por, por ejemplo, un médico.
En base a la comparación de la cantidad determinada y de referencia, será posible evaluar si el sujeto de prueba ha presentado un AIT o no. Por ejemplo, un resultado de una comparación se puede dar como datos brutos (cantidades absolutas o relativas) y, en algunos casos, como indicador en forma de una palabra, frase, símbolo o valor numérico que puede ser indicativo de un diagnóstico particular. Por lo tanto, la cantidad de referencia se debe elegir de modo que una diferencia o bien una identidad en las cantidades comparadas permita identificar a los sujetos de prueba que pertenecen al grupo de sujetos que han presentado un AIT, o bien no. El procedimiento permite excluir (descartar) o bien identificar (admitir) a un sujeto que ha presentado un AIT o no. Las diferencias en las cantidades, es decir, incrementos o disminuciones, como se usa el presente documento, preferentemente, son diferencias que son estadísticamente significativas. Se puede determinar si una diferencia es estadísticamente significativa por las técnicas estadísticas a las que se hace referencia en otra parte en el presente documento. De forma similar, una identidad en las cantidades engloba cantidades idénticas y aquellas diferencias en las cantidades que no son estadísticamente significativas y que están dentro de las desviaciones estándar para un parámetro medido.
El término "cantidad de referencia" como se usa en el presente documento se refiere a una cantidad que permite la asignación de un sujeto (i) al grupo de sujetos que han presentado un AIT o (ii) al grupo de sujetos que no han
presentado un AIT. Dicho diagnóstico de admisión y/o descarte se puede proporcionar por el dispositivo informático de un sistema divulgado en el presente documento en base a dicha comparación de la "cantidad" calculada con una referencia o un valor umbral. Por ejemplo, un dispositivo informático de un sistema puede proporcionar un indicador, en forma de una palabra, símbolo o valor numérico que es indicativo de uno de un diagnóstico de admisión o descarte. La cantidad de referencia aplicable para un sujeto individual puede variar dependiendo de diversos parámetros fisiológicos tales como edad, sexo o subpoblación, así como de los medios usados para la determinación del polipéptido o péptido al que se hace referencia en el presente documento. Se puede determinar una cantidad de referencia adecuada a partir de una muestra de referencia que se va a analizar conjuntamente, es decir, simultánea o posteriormente, con la muestra de prueba.
Las cantidades de referencia se pueden calcular, en principio, para una cohorte de sujetos como se especifica anteriormente en base a los valores promedio o medios para un biomarcador dado aplicando procedimientos estándar de estadística. En particular, la exactitud de una prueba tal como un procedimiento destinado a diagnosticar un acontecimiento, o no, se describe mejor por sus características de eficacia diagnóstica (ROC) (véase en especial Zweig 1993, Clin. Chem. 39:561-577). El gráfico ROC es una curva de todos los pares de sensibilidad frente a especificidad resultantes de variar continuamente el valor umbral de decisión en todo el intervalo de datos observados. El rendimiento clínico de un procedimiento diagnóstico depende de su exactitud, es decir, su capacidad para asignar correctamente los sujetos a un determinado pronóstico o diagnóstico. La curva ROC indica la superposición entre las dos distribuciones representando la sensibilidad frente a la 1-especificidad para el intervalo completo de valores umbrales adecuados para realizar una distinción. En el eje y está la sensibilidad, o la fracción de positivos verdaderos, que se define como la proporción del número de resultados de prueba positivos verdaderos con respecto al producto del número de resultados de prueba positivos verdaderos y el número de negativos falsos. Esto también se ha denominado positividad en presencia de una enfermedad o afección. Se calcula exclusivamente a partir del subgrupo afectado. En el eje x esta la fracción de positivos falsos, o 1-especificidad, que se define como la proporción del número de resultados positivos falsos con respecto al producto del número de resultados negativos verdaderos y el número positivos falsos. Es un índice de especificidad y se calcula totalmente a partir del subgrupo no afectado. Debido a que las fracciones de positivos verdaderos y falsos se calculan totalmente por separado, usando los resultados de prueba de dos subgrupos diferentes, la curva ROC es independiente de la prevalencia del acontecimiento en la cohorte. Cada punto en la curva ROC representa un par de sensibilidad/1-especificidad correspondiente a un valor umbral de decisión particular. Una prueba con discriminación perfecta (sin solapamiento en las dos distribuciones de resultados) tiene una curva ROC que pasa a través de la esquina izquierda superior, donde la fracción de positivos verdaderos es de 1,0, o de un 100 % (sensibilidad perfecta), y la fracción de positivos falsos es de 0 (especificidad perfecta). La curva teórica para una prueba sin discriminación (distribuciones idénticas de resultados para los dos grupos) es una línea diagonal de 45° desde la esquina izquierda inferior hasta la esquina derecha superior. La mayoría de las curvas están entre estos dos extremos. Si la curva ROC entra completamente por debajo de la diagonal de 45°, esto se remedia fácilmente invirtiendo el criterio de "positividad" de "mayor que" a "menor que" o viceversa. Cualitativamente, cuanto más cerca esté la curva de la esquina izquierda superior, mayor será la exactitud global de la prueba. Dependiendo de un intervalo de confianza deseado, se puede derivar un valor umbral de la curva ROC que permita el diagnóstico o la predicción de un acontecimiento dado con un equilibrio apropiado de sensibilidad y especificidad, respectivamente. En consecuencia, se puede generar la referencia que se va a usar para el procedimiento mencionado anteriormente de la presente invención, es decir, un valor umbral que permite discriminar entre sujetos que han presentado un AIT o los que no han presentado AIT, preferentemente, estableciendo una ROC para dicha cohorte como se describe anteriormente y derivando una cantidad umbral de la misma. Dependiendo de una sensibilidad y especificidad deseadas para un procedimiento diagnóstico, la curva ROC permite derivar valores umbrales adecuados. Se entenderá que se desea una sensibilidad óptima para excluir AIT (es decir, un descarte), mientras que se prevé una especificidad óptima para que un sujeto se evalúe por haber presentado AIT (es decir, una admisión). Además, es preferente que las cantidades determinadas en la etapa a) del procedimiento de la presente invención se comparen con más de una cantidad de referencia, por ejemplo, una cantidad de referencia para admitir AIT y una cantidad de referencia para descartar AIT.
Preferentemente, la(s) cantidad(es) de referencia se deriva(n) de una muestra de un sujeto (o grupo de sujetos) conocido por haber presentado un AIT (en particular dentro de los períodos ventana como se especifica en otra parte en el presente documento), y/o de una muestra de un sujeto (o grupo de sujetos) conocido por no haber presentado AIT (en particular dentro de los períodos ventana como se especifica en otra parte en el presente documento).
El sujeto que es conocido por no haber presentado AIT es, preferentemente, un sujeto sano. También preferentemente, el sujeto conocido por haber presentado AIT no presentó apoplejía, en particular dentro de los períodos ventana como se hace referencia anteriormente.
También es preferente que el sujeto de referencia (es decir, el sujeto conocido por haber presentado un AIT o un sujeto conocido por no haber presentado AIT) tenga factores de riesgo para un acontecimiento isquémico cerebral agudo, en particular para AIT. Los factores de riesgo preferentes para un acontecimiento isquémico cerebral agudo, en particular para a It , incluyen arteriopatía coronaria, insuficiencia cardíaca, en particular insuficiencia cardíaca aguda, disfunción cardíaca sistólica y/o diastólica, valvulopatía e hipertensión arterial. Otros factores de riesgo son
diabetes y obesidad. En consecuencia, el sujeto de referencia muestra preferentemente al menos uno de estos factores de riesgo. Preferentemente, el sujeto de referencia padece arteriopatía coronaria. Incluso más preferentemente, el sujeto de referencia padece insuficiencia cardíaca. Lo más preferentemente, el sujeto de referencia así como el sujeto de prueba padecen insuficiencia cardíaca. También preferentemente, el sujeto de referencia así como el sujeto de prueba padecen insuficiencia cardíaca. Esto se aplica en particular, si se determinan las cantidades de NT-proANP y NT-proBNP y si se calcula la proporción de las cantidades de NT-proANP con respecto a NT-proBNP en el contexto del procedimiento de la presente invención (véase en otra parte en el presente documento).
Si solo se determina la cantidad de NT-proANP, también es preferente que ni el sujeto de referencia ni el sujeto de prueba padezca insuficiencia cardíaca o arteriopatía coronaria.
Lo siguiente se aplica como algoritmos diagnósticos.
Preferentemente, la cantidad de referencia
a. se deriva de una muestra de un sujeto (o grupo de sujetos) conocido por haber presentado un AIT, en el que una cantidad de NT-proANP en la muestra del sujeto de prueba que es esencialmente idéntica a la cantidad de referencia o que es mayor que la cantidad de referencia indica que el sujeto ha presentado un accidente isquémico transitorio, y/o
b. se deriva de una muestra de un sujeto conocido por no haber presentado AIT, en el que una cantidad de NT-proANP en la muestra del sujeto de prueba que es esencialmente idéntica a la cantidad de referencia o que es menor que la cantidad de referencia indica que el sujeto no ha presentado accidente isquémico transitorio.
Una cantidad de referencia preferente derivada de una muestra de un sujeto (o grupo de sujetos) conocido por haber presentado un AIT es de aproximadamente 54500 pg/ml a aproximadamente 150000 pg/ml y, más preferentemente, de aproximadamente 54500 a aproximadamente 137800 pg/ml. Incluso más preferentemente, una cantidad de referencia derivada de una muestra de un sujeto (o grupo de sujetos) conocido por haber presentado un AIT es de aproximadamente 137500 o 94800 o, lo más preferentemente, 54500 pg/ml.
Una cantidad de referencia preferente derivada de una muestra de un sujeto (o grupo de sujetos) conocido por no haber presentado AIT es de aproximadamente 1000 pg/ml a aproximadamente 33600 pg/ml y, más preferentemente, de aproximadamente 1000 a aproximadamente 12570 pg/ml. Incluso más preferentemente, una cantidad de referencia derivada de una muestra de un sujeto (o grupo de sujetos) conocido por no haber presentado AIT es de aproximadamente 33600 o 15000 o, lo más preferentemente, 12570 pg/ml. Es preferente además que la cantidad de referencia sea de 4662 pg/ml.
Además, la cantidad de referencia puede definir una cantidad umbral, en particular una cantidad de referencia calculada, con lo que una cantidad de NT-proANP en la muestra del sujeto de prueba mayor que el umbral respectivo será indicativa de un AIT, mientras que una cantidad de NT-proANP en la muestra del sujeto de prueba menor que la cantidad de referencia calculada indicará que el sujeto no presentó AIT. Una cantidad umbral preferente particular que es una cantidad de referencia calculada es preferentemente, de aproximadamente 54500 pg/ml, o más preferentemente, 45000 pg/ml.
El término "aproximadamente" como se usa en el presente documento quiere decir /- 20 %, /- 10 %, /- 5 %, 2 % o -/ 1 % de los valores específicos a los que se hace referencia.
En un modo de realización preferente del procedimiento de la presente invención, se admitirá un AIT. En este caso, la cantidad de referencia se deriva de una muestra de sujeto (o muestras de un grupo de sujetos) conocido por haber presentado un AIT.
En consecuencia, la divulgación prevé un procedimiento para admitir un accidente isquémico transitorio (AIT) en un sujeto que se sospecha que ha presentado un accidente isquémico transitorio, pero que no presentó apoplejía, comprendiendo dicho procedimiento las etapas de
a. determinar la cantidad de NT-proANP en una muestra de dicho sujeto, y
b. comparar la cantidad así determinada de NT-proANP con una cantidad de referencia, con lo que se admite un accidente isquémico transitorio,
en el que la cantidad de referencia se deriva de una muestra de un sujeto (o muestras de un grupo de sujetos) conocido por haber presentado un AIT, en el que una cantidad de NT-proANP en la muestra del sujeto de prueba que es esencialmente idéntica a la cantidad de referencia o que es mayor que la cantidad de referencia indica que el sujeto ha presentado un accidente isquémico transitorio.
En un modo de realización preferente del procedimiento de la presente invención, se admitirá un AIT. En este caso, la cantidad de referencia se deriva de una muestra de sujeto (o muestras de un grupo de sujetos) conocido por no haber presentado AIT.
En consecuencia, la divulgación prevé un procedimiento para descartar un accidente isquémico transitorio (AIT) en un sujeto que se sospecha que ha presentado un accidente isquémico transitorio, pero que no presentó apoplejía, comprendiendo dicho procedimiento las etapas de
a. determinar la cantidad de NT-proANP en una muestra de dicho sujeto, y
b. comparar la cantidad así determinada de NT-proANP con una cantidad de referencia, con lo que se descarta un accidente isquémico transitorio,
en el que la cantidad de referencia se deriva de una muestra de un sujeto (o muestras de un grupo de sujetos) conocido por haber presentado un AIT, en el que una cantidad de NT-proANP en la muestra del sujeto de prueba que es esencialmente idéntica a la cantidad de referencia o que es menor que la cantidad de referencia indica que el sujeto no ha presentado accidente isquémico transitorio.
En otro modo de realización preferente de la presente invención, el procedimiento mencionado anteriormente comprende además las etapas de determinar la cantidad de NT-proBNP en una muestra del sujeto y calcular la proporción de la cantidad de NT-proANP con respecto a la cantidad de NT-proBNP. La determinación de ambos marcadores es ventajosa, puesto que la proporción de las cantidades de ambos marcadores permite un diagnóstico en particular fiable de AIT en un sujeto con insuficiencia cardíaca (véanse los ejemplos).
En consecuencia, la presente divulgación, en particular, se refiere a un procedimiento para diagnosticar un accidente isquémico transitorio (AIT) en un sujeto que se sospecha que ha presentado un accidente isquémico transitorio, pero que no presentó apoplejía, que comprende
a. determinar la cantidad de NT-proANP en una muestra de dicho sujeto,
b. determinar la cantidad de NT-proBNP en una muestra de dicho sujeto, y
c. calcular una proporción de las cantidades de NT-proANP y NT-proBNP.
Preferentemente, las cantidades determinadas en a) y b) anteriores se determinan en la misma muestra. Sin embargo, también se prevé determinar las cantidades en diferentes muestras.
En un modo de realización preferente, el procedimiento comprende además la comparación de la proporción así calculada con una proporción de referencia, diagnosticando de este modo AIT en dicho sujeto.
Por tanto, la divulgación también se refiere a un procedimiento para diagnosticar un accidente isquémico transitorio (AIT) en un sujeto que se sospecha que ha presentado un accidente isquémico transitorio, pero que no presentó apoplejía, que comprende
a. determinar la cantidad de NT-proANP en una muestra de dicho sujeto,
b. determinar la cantidad de NT-proBNP en una muestra de dicho sujeto,
c. calcular una proporción de las cantidades de NT-proANP y NT-proBNP, y
d. la proporción calculada con una proporción de referencia, diagnosticando de este modo AIT en dicho sujeto
El marcador NT-proBNP (porción N terminal del propéptido natriurético cerebral) es bien conocido en la técnica. NT-proBNP es un polipéptido que comprende, preferentemente, 76 aminoácidos de longitud correspondiente a la porción N terminal de la molécula de péptido natriurético cerebral (BNP) humano. La estructura del BNP y NT-proBNP humanos ya se ha descrito en detalle en la técnica anterior, por ejemplo, documentos WO 02/089657, WO 02/083913 o Bonow loc. cit. Preferentemente, NT-proBNP humano como se usa en el presente documento es NT-proBNP humano como se divulga en el documento EP 0648228 B1. El NT-proBNP al que se hace referencia de acuerdo con la presente invención engloba además variantes alélicas y otras de dicha secuencia específica para el NT-proBNP humano analizado anteriormente. Específicamente, se prevén polipéptidos variantes que están en el nivel de aminoácido de al menos un 60 % idéntico, más preferentemente al menos un 70 %, al menos un 80 %, al menos un 90 %, al menos un 95 %, al menos un 98 % o al menos un 99 % idéntico a NT-proBNP humano, preferentemente, en toda la longitud. El grado de identidad entre dos secuencias de aminoácidos, en principio, se puede determinar por algoritmos bien conocidos en la técnica. Preferentemente, el grado de identidad se va a determinar comparando dos secuencias óptimamente alineadas sobre una ventana de comparación, donde el fragmento de la secuencia de aminoácidos en la ventana de comparación puede comprender adiciones o
deleciones (por ejemplo, huecos o salientes) en comparación con la secuencia de referencia (que no comprende adiciones o deleciones) para la alineación óptima. El porcentaje se calcula determinando el número de posiciones en las que se produce el residuo aminoacídico idéntico en ambas secuencias para proporcionar el número de posiciones emparejadas, dividiendo el número de posiciones emparejadas entre el número total de posiciones en la ventana de comparación y multiplicando el resultado por 100 para proporcionar el porcentaje de identidad de secuencia. La alineación óptima de secuencias para su comparación se puede llevar a cabo por el algoritmo de homología local de Smith 1981, Add. APL. Math. 2:482, por el algoritmo de alineación de homología de Needleman 1970, J. Mol. Biol. 48:443, por la búsqueda para el procedimiento de similitud de Pearson 1988, Proc. Natl. Acad Sci. (USA) 85: 2444, por implementaciones informatizadas de estos algoritmos (GAP, BESTFIT, BLAST, PASTA y TFASTA en el paquete informático Wisconsin Genetics, Genetics Computer Group (GCG), 575 Science Dr., Madison, WI), o por inspección visual. Dado que se han identificado dos secuencias para su comparación, se emplean preferentemente GAP y BESTFIT para determinar su alineación óptima y, por tanto, el grado de identidad. Preferentemente, se usan los valores por defecto de 5,00 para peso de hueco y 0,30 para longitud de peso de hueco. Sustancialmente similares y también previstos son los productos de degradación proteolítica que todavía se reconocen por los medios diagnósticos o por ligandos dirigidos contra el respectivo péptido de longitud completa. También se incluyen polipéptidos variantes que tienen deleciones, sustituciones y/o adiciones aminoacídicas en comparación con la secuencia de aminoácidos de NT-proBNP humano siempre que dichos polipéptidos tengan propiedades de NT-proBNP. Las propiedades de NT-proBNP como se hace referencia en el presente documento son propiedades inmunológicas y/o biológicas. Preferentemente, las variantes de NT-proBNP tienen propiedades inmunológicas (es decir, composición de epítopos) comparables a las de NT-proBNP. Por tanto, las variantes serán reconocibles por los medios o ligandos mencionados anteriormente usados para la determinación de la cantidad de los péptidos natriuréticos. Las propiedades de NT-proBNP biológicas y/o inmunológicas se pueden detectar por el ensayo descrito en Karl et al. (Karl 1999, Scand J Clin Invest 59:177-181), Yeo et al. (Yeo 2003, Clinica Chimica Acta 338:107-115). Las variantes también incluyen péptidos modificados postraduccionalmente tales como péptidos glucosilados o miristilados. Además, una variante de acuerdo con la presente invención también es un péptido o polipéptido que se ha modificado después de la recogida de la muestra, por ejemplo por unión covalente o no covalente de un marcador, en particular un marcador radioactivo o fluorescente, al péptido.
El término "calcular" como se usa en el presente documento se refiere a evaluar la proporción de la cantidad de NT-proANP y NT-proBNP determinada en la(s) muestra(s) del sujeto. De acuerdo con la presente invención, se puede determinar la proporción de la cantidad de NT-proANP con respecto a la cantidad de NT-proBNP, o la proporción de la cantidad de NT-proBNP con respecto a la cantidad de NT-proANP. Preferentemente, se determina la proporción de la cantidad de NT-proANP con respecto a la cantidad de NT-proBNP.
Los sujetos de referencia preferentes se divulgan en el presente documento anteriormente. Preferentemente, la proporción de referencia se deriva de una muestra de un sujeto (o muestras de un grupo de sujetos) conocido por haber presentado un AIT, y/o de una muestra de un sujeto (o de muestras de un grupo de sujetos) conocido por no haber presentado AIT (véanse también las explicaciones en el presente documento anteriormente).
Lo siguiente se aplica como algoritmos diagnósticos, si la proporción calculada (y la proporción de referencia) es la proporción de la cantidad de NT-proANP con respecto a la cantidad de NT-proBNP:
Preferentemente, la proporción de referencia
a. se deriva de una muestra de un sujeto (o muestras de un grupo de sujetos) conocido por haber presentado un AIT, en el que una proporción en la muestra del sujeto de prueba que es esencialmente idéntica a la proporción de referencia o que es mayor que la proporción de referencia indica que el sujeto ha presentado un accidente isquémico transitorio, y/o
b. se deriva de una muestra de un sujeto (o muestras de un grupo de sujetos) conocido por no haber presentado AIT, en el que la proporción en la muestra del sujeto de prueba que es esencialmente idéntica a la proporción de referencia o que es menor que la proporción de referencia indica que el sujeto no ha presentado accidente isquémico transitorio.
Lo siguiente se aplica como algoritmos diagnósticos, si la proporción calculada (y la proporción de referencia) es la proporción de la cantidad de NT-proBNP con respecto a la cantidad de NT-proANP.
Preferentemente, la proporción de referencia
a. se deriva de una muestra de un sujeto (o muestras de un grupo de sujetos) conocido por haber presentado un AIT, en el que una proporción en la muestra del sujeto de prueba que es esencialmente idéntica a la proporción de referencia o que es menor que la proporción de referencia indica que el sujeto ha presentado un accidente isquémico transitorio, y/o
b. se deriva de una muestra de un sujeto (o muestras de un grupo de sujetos) conocido por no haber presentado AIT, en el que la proporción en la muestra del sujeto de prueba que es esencialmente idéntica a la
proporción de referencia o que es mayor que la proporción de referencia indica que el sujeto no ha presentado accidente isquémico transitorio.
Además, la proporción de referencia puede definir una proporción umbral, en particular una proporción de referencia calculada, con lo que una proporción de la cantidad de NT-proANP con respecto a NT-proBNP en la muestra del sujeto de prueba mayor que el umbral respectivo será indicativa de un AIT, mientras que una proporción de la cantidad de NT-proANP con respecto a NT-proBNP en la muestra del sujeto de prueba menor que el umbral respectivo indicará que el sujeto no presentó AIT (si se determina la proporción de la cantidad de NT-proANP con respecto a NT-proBNP).
Una proporción de referencia preferente para la cantidad de NT-proANP con respecto a la cantidad de NT-proBNP derivada de una muestra de un sujeto (o grupo de sujetos) conocido por no haber presentado AIT es de aproximadamente 10 a aproximadamente 125 y, más preferentemente, de aproximadamente 20 a aproximadamente 100, o de aproximadamente 20 a aproximadamente 90. Incluso más preferentemente, una proporción de referencia derivada de una muestra de un sujeto (o grupo de sujetos) conocido por no haber presentado AIT es de aproximadamente 125, o, lo más preferentemente, aproximadamente 80.
Preferentemente, si la proporción de referencia se deriva de un sujeto que tiene factores de riesgo de AIT (como se describe en otra parte en el presente documento, en particular de un sujeto que padece insuficiencia cardíaca), una proporción de referencia preferente para la cantidad de NT-proANP con respecto a la cantidad de NT-proBNP derivada de una muestra de un sujeto (o grupo de sujetos) conocido por no haber presentado AIT es de aproximadamente 10 a aproximadamente 40 y, más preferentemente, de aproximadamente 20 a aproximadamente 40, o de aproximadamente 20 a aproximadamente 30. Incluso más preferentemente, una proporción de referencia derivada de una muestra de un sujeto (o grupo de sujetos) conocido por no haber presentado AIT es de aproximadamente 40, o, lo más preferentemente, aproximadamente 30.
Una proporción de referencia preferente para la cantidad de NT-proANP con respecto a la cantidad de NT-proBNP derivada de una muestra de un sujeto (o grupo de sujetos) conocido por haber presentado un AIT es de aproximadamente 150 a aproximadamente 300 y, más preferentemente, de aproximadamente 150 a aproximadamente 250, o de aproximadamente 200 a aproximadamente 250. Incluso más preferentemente, una proporción de referencia derivada de una muestra de un sujeto (o grupo de sujetos) conocido por haber presentado un AIT es de aproximadamente 250, o, lo más preferentemente, aproximadamente 200.
En un modo de realización preferente de la presente invención, el procedimiento comprende además la etapa de recomendar un tratamiento adecuado, si se ha diagnosticado un AIT.
El término "recomendar" como se usa en el presente documento quiere decir establecer una propuesta para un tratamiento que se podría aplicar al sujeto. Sin embargo, se debe entender que aplicar el tratamiento real no está comprendido por el término. El tratamiento que se va a recomendar depende del resultado del diagnóstico proporcionado por el procedimiento de la presente invención. La etapa de recomendación a la que se hace referencia anteriormente también se puede automatizar, preferentemente. Preferentemente, el diagnóstico o la ayuda para el diagnóstico obtenido de la etapa b) del procedimiento de la presente invención, es decir, el resultado diagnóstico del procedimiento, se usará para buscar una base de datos que comprende recomendaciones de medidas terapéuticas para los resultados diagnósticos posibles individuales. Los tratamientos adecuados que se pueden recomendar en caso de que se haya diagnosticado AIT son bien conocidas en la técnica y, preferentemente, engloban los regímenes de tratamiento que tienen como objetivo reducir el riesgo de otros acontecimientos isquémicos cerebrales, en particular el riesgo de apoplejía y/o AIT. Estos tratamientos incluyen la administración de productos farmacéuticos, intervenciones así como cambios en el estilo de vida. El tratamiento puede depender de la causa del AIT. El régimen de tratamiento preferente incluye tratamiento de anticoagulación, tratamiento antiplaquetario, toma de aspirina y/o heparina, implante de endoprótesis (véase Chimowitz et al. NEJM2011: 993-1003) y endarterectomía, en particular endarterectomía carotídea. Los cambios en el estilo de vida preferentes son abstinencia de tabaco y/o alcohol, y pérdida de peso (en particular, por reducción del aporte calórico y/o por incremento del ejercicio físico).
Un agente de detección adecuado puede ser, en un aspecto, un anticuerpo que se une específicamente al marcador en una muestra de un sujeto que se va a investigar por el procedimiento de la invención. Otro agente de detección que se puede aplicar, en un aspecto, puede ser un aptámero que se une específicamente al marcador en la muestra. Aún en un aspecto, la muestra se retira del complejo formado entre el agente de detección y el marcador antes de la medición de la cantidad de complejo formado. En consecuencia, en un aspecto, el agente de detección se puede inmovilizar sobre un soporte sólido. Aún en un aspecto, la muestra se puede retirar del complejo formado sobre el soporte sólido aplicando una solución de lavado. El complejo formado será proporcional a la cantidad del marcador presente en la muestra. Se entenderá que la especificidad y/o sensibilidad del agente de detección que se va a aplicar define el grado de proporción de al menos un marcador comprendido en la muestra que se puede unir específicamente. Otros detalles sobre cómo se puede llevar a cabo la determinación también se encuentran en otra parte en el presente documento. La cantidad de complejo formado se transformará en una cantidad de al menos un marcador que refleja la cantidad efectivamente presente en la muestra. Una cantidad de
este tipo, en un aspecto, puede ser esencialmente la cantidad presente en la muestra o puede ser, en otro aspecto, una cantidad que es una determinada proporción de la misma debido a la relación entre el complejo formado y la cantidad presente en la muestra original.
Aún en un aspecto del procedimiento mencionado anteriormente, la etapa a) se puede llevar a cabo por una unidad analizadora, en un aspecto, una unidad analizadora como se define en otra parte en el presente documento. En un aspecto del procedimiento divulgado, la cantidad determinada en la etapa a) se compara con una referencia. En un aspecto, la referencia es una referencia como se define en otra parte en el presente documento. Aún en otro aspecto, la referencia tiene en cuenta la relación proporcional entre la cantidad medida de complejo y la cantidad presente en la muestra original. Por tanto, las referencias aplicadas en un aspecto del procedimiento de la invención son referencias artificiales que se adoptan para reflejar las limitaciones del agente de detección que se ha usado. En otro aspecto, dicha relación también se puede tener en cuenta cuando se lleva a cabo la comparación, por ejemplo, incluyendo una etapa de cálculo de normalización y/o corrección para la cantidad determinada antes de comparar realmente el valor de la cantidad determinada y la referencia. De nuevo, la etapa de cálculo de normalización y/o corrección para la cantidad determinada adopta la etapa de comparación de modo que las limitaciones del agente de detección que se ha usado se reflejen apropiadamente. En un aspecto, la comparación se lleva a cabo automáticamente, por ejemplo, asistida por un sistema informático o similar.
En un aspecto del procedimiento de la invención, dicho procedimiento comprende además una etapa de recomendar y/o atender al sujeto de acuerdo con el resultado establecido en la etapa c) como se expone en otra parte en el presente documento en detalle, y/o adaptar la intensidad del seguimiento de la enfermedad.
En un aspecto del procedimiento mencionado anteriormente, las etapas b) y/o c) se llevan a cabo por una o más unidades analizadoras como se expone en otra parte en el presente documento.
Las explicaciones y definiciones dadas en el presente documento se aplican mutatis mutandis a lo siguiente. Procedimiento para diagnosticar un acontecimiento isquémico cerebral agudo de acuerdo con la invención Como se expone anteriormente, los autores de la invención han demostrado además que la proporción de la cantidad de NT-proANP y la cantidad de NT-proBNP es un indicador valioso para el diagnóstico de acontecimientos isquémicos cerebrales agudos en un sujeto.
La presente invención, por lo tanto, se refiere a un procedimiento in vitro para diagnosticar un acontecimiento isquémico cerebral agudo en un sujeto que se sospecha que padece un acontecimiento isquémico cerebral agudo, que comprende
a. determinar la cantidad de NT-proANP en una muestra de dicho sujeto,
b. determinar la cantidad de NT-proBNP en una muestra de dicho sujeto, y
c. calcular una proporción de las cantidades de NT-proANP y NT-proBNP.
En un modo de realización preferente, el procedimiento mencionado anteriormente comprende además la comparación de la proporción así calculada con una proporción de referencia, diagnosticando de este modo el acontecimiento isquémico cerebral agudo.
En consecuencia, la presente invención, en particular, se refiere a un procedimiento para diagnosticar un acontecimiento isquémico cerebral agudo en un sujeto que se sospecha que padece un acontecimiento isquémico cerebral agudo, que comprende
a. determinar la cantidad de NT-proANP en una muestra de dicho sujeto,
b. determinar la cantidad de NT-proBNP en una muestra de dicho sujeto,
c. calcular una proporción de las cantidades de NT-proANP y NT-proBNP, y
d. comparar la proporción así calculada con una proporción de referencia, diagnosticando de este modo el acontecimiento isquémico cerebral agudo.
El término "acontecimiento isquémico cerebral agudo" está bien entendido por el experto en la técnica. El término, en particular, se refiere a una afección aguda en la que el flujo sanguíneo al cerebro (o las partes del cerebro) es insuficiente para la demanda metabólica del cerebro. Preferentemente, existen dos tipos de acontecimientos isquémicos cerebrales agudos: 1. la isquemia asociada con el acontecimiento puede estar confinada a una región específica del cerebro (isquemia focal); o 2. la isquemia asociada con el acontecimiento puede englobar áreas
amplias de tejido cerebral (isquemia sistémica). El acontecimiento será agudo y, por tanto, aparecerá de repente. Preferentemente, el acontecimiento isquémico cerebral agudo se selecciona de apoplejía y accidente isquémico transitorio. Los términos "apoplejía" y "accidente isquémico transitorio" se definen en otra parte en el presente documento.
El término "sujeto" se refiere a animales, preferentemente mamíferos, y más preferentemente, seres humanos. El sujeto de acuerdo con el procedimiento de la presente invención será sospechoso de haber presentado un acontecimiento isquémico cerebral agudo. Preferentemente, dicho sujeto será sospechoso de haber presentado un acontecimiento isquémico cerebral agudo dentro de las 72 horas, más preferentemente, dentro de las 48 horas, y lo más preferentemente dentro de las 24 horas antes de que se haya obtenido la muestra que se va a someter a prueba. En consecuencia, se diagnosticará de acuerdo con la presente invención, si el sujeto de prueba ha presentado un acontecimiento isquémico cerebral agudo, o no ha presentado acontecimiento isquémico cerebral agudo, preferentemente, dentro de las 72 horas, más preferentemente, dentro de las 48 horas, y, lo más preferentemente, dentro de las 24 horas antes de que se haya obtenido la muestra que se va a someter a prueba.
Preferentemente, el sujeto de prueba (y el sujeto de referencia) tiene factores de riesgo de un acontecimiento isquémico cerebral agudo. Los factores de riesgo preferentes incluyen arteriopatía coronaria, insuficiencia cardíaca, en particular insuficiencia cardíaca aguda, disfunción cardíaca sistólica y/o diastólica, valvulopatía e hipertensión arterial. Otros factores de riesgo son diabetes y obesidad. En consecuencia, el sujeto de prueba muestra preferentemente al menos uno de estos factores de riesgo. En particular, se prevé que el sujeto de prueba (y el sujeto de referencia, es decir, el sujeto del que se deriva la cantidad de referencia) padece arteriopatía coronaria y/o insuficiencia cardíaca. Lo más preferentemente, el sujeto padece insuficiencia cardíaca. Lo mismo, preferentemente, se aplica al sujeto de referencia.
Como se expone anteriormente, el sujeto que se va a someter a prueba de acuerdo con el procedimiento mencionado anteriormente de la presente invención será sospechoso de padecer un acontecimiento isquémico cerebral agudo y, por tanto, de haber presentado un acontecimiento isquémico cerebral agudo dentro de determinados períodos ventana como se expone en otra parte en el presente documento. Preferentemente, un sujeto que se sospecha que ha presentado un acontecimiento isquémico cerebral agudo es un sujeto que ha mostrado síntomas de un acontecimiento isquémico cerebral agudo. Preferentemente, dicho sujeto es un sujeto que ha mostrado síntomas de un acontecimiento isquémico cerebral agudo dentro de un determinado período ventana antes de obtener la muestra de prueba. Preferentemente, dicho sujeto ha mostrado síntomas de acontecimiento isquémico cerebral agudo dentro de las 72 horas, más preferentemente, dentro de las 48 horas y lo más preferentemente dentro de las 24 horas antes de que se haya obtenido la muestra. Preferentemente, sin embargo, la muestra de ensayo se obtendrá no antes de 1 hora, en particular, no antes de 2 horas después del inicio de síntomas de acontecimiento isquémico cerebral agudo.
Por el procedimiento mencionado anteriormente de la presente invención, se diagnosticará un acontecimiento isquémico cerebral agudo. El término "diagnóstico" como se usa en el presente documento quiere decir evaluar si un sujeto al que se hace referencia de acuerdo con el procedimiento de la presente invención ha presentado un acontecimiento isquémico cerebral agudo, o no. En particular, se diagnosticará si el sujeto ha presentado un acontecimiento isquémico cerebral agudo, o no, dentro de un determinado período ventana antes de obtener la muestra que se va a someter a prueba. En un modo de realización preferente, se diagnosticará si el sujeto ha presentado un acontecimiento isquémico cerebral agudo, o no, dentro de las 72 horas antes de obtener la muestra que se va a someter a prueba. En otro modo de realización preferente, se diagnosticará si el sujeto ha presentado un acontecimiento isquémico cerebral agudo, o no, dentro de las 48 horas antes de obtener la muestra que se va a someter a prueba. Incluso en otro modo de realización preferente, se diagnosticará si el sujeto ha presentado un acontecimiento isquémico cerebral agudo, o no, dentro de las 24 horas antes de obtener la muestra que se va a someter a prueba. Preferentemente, el sujeto ya no muestra síntomas del acontecimiento isquémico cerebral agudo en el momento en que se obtiene la muestra.
Preferentemente, dicha muestra se obtiene no más de 72 horas después del inicio de síntomas de un acontecimiento isquémico cerebral agudo. Más preferentemente, dicha muestra se obtiene no más de 48 horas y, lo más preferentemente, no más de 24 horas después del inicio de síntomas de un acontecimiento isquémico cerebral agudo. Preferentemente, el sujeto ya no muestra síntomas de un acontecimiento isquémico cerebral agudo en el momento en que se obtiene la muestra.
Preferentemente, la proporción de referencia se deriva de una muestra de un sujeto (o muestras de un grupo de sujetos) conocido por haber presentado un acontecimiento isquémico cerebral agudo, y/o de una muestra de un sujeto (o muestras de un grupo de sujetos) conocido no haber presentado acontecimiento isquémico cerebral agudo.
Es preferente que el sujeto de referencia (es decir, el sujeto conocido por haber presentado un acontecimiento isquémico cerebral agudo o sujeto conocido por no haber presentado acontecimiento isquémico cerebral agudo) tenga factores de riesgo para un acontecimiento isquémico cerebral agudo. Los factores de riesgo preferentes para un acontecimiento isquémico cerebral agudo se divulgan en el presente documento anteriormente e incluyen
arteriopatía coronaria, insuficiencia cardíaca, en particular insuficiencia cardíaca aguda, disfunción cardíaca sistólica y/o diastólica, valvulopatía e hipertensión arterial. Otros factores de riesgo son diabetes y obesidad. En consecuencia, el sujeto de referencia muestra preferentemente al menos uno de estos factores de riesgo. Preferentemente, el sujeto de referencia padece arteriopatía coronaria. Más preferentemente, el sujeto de referencia padece insuficiencia cardíaca. Lo más preferentemente, el sujeto de prueba así como el sujeto de referencia padecen insuficiencia cardíaca. También preferentemente, el sujeto de prueba así como el sujeto de referencia padecen arteriopatía coronaria.
Lo siguiente se aplica como algoritmos diagnósticos, si la proporción calculada (y la proporción de referencia) es la proporción de la cantidad de NT-proANP con respecto a la cantidad de NT-proBNP:
Preferentemente, la proporción de referencia se deriva de una muestra de un sujeto conocido por haber presentado un acontecimiento isquémico cerebral agudo, en el que una proporción de NT-proANP con respecto a NT-proBNP en la muestra del sujeto de prueba que es esencialmente idéntica a la proporción de referencia o que es mayor que la proporción de referencia indica que el sujeto ha presentado un acontecimiento isquémico cerebral agudo, y/o
la proporción de referencia se deriva de una muestra de un sujeto conocido por no haber presentado acontecimiento isquémico cerebral agudo, y en el que una proporción de NT-proANP con respecto a NT-proBNP en la muestra del sujeto de prueba es esencialmente idéntica a la proporción de referencia o que es menor que la proporción de referencia indica que el sujeto no ha presentado acontecimiento isquémico cerebral agudo.
Una proporción de referencia preferente para la cantidad de NT-proANP con respecto a la cantidad de NT-proBNP derivada de una muestra de un sujeto (o grupo de sujetos) conocido por no haber presentado acontecimiento isquémico cerebral agudo es de aproximadamente 10 a aproximadamente 100 y, más preferentemente, de aproximadamente 20 a aproximadamente 90, o de aproximadamente 20 a aproximadamente 80. Incluso más preferentemente, una proporción de referencia se deriva de una muestra de un sujeto (o grupo de sujetos) conocido por no haber presentado acontecimiento isquémico cerebral agudo es de aproximadamente 100, o, lo más preferentemente, aproximadamente 80.
Preferentemente, si la proporción de referencia se deriva de un sujeto que tiene factores de riesgo de un acontecimiento isquémico cerebral agudo, en particular de un sujeto que padece insuficiencia cardíaca o arteriopatía coronaria, una proporción de referencia preferente para la cantidad de NT-proANP con respecto a la cantidad de NT-proBNP derivada de una muestra de un sujeto (o grupo de sujetos) conocido por no haber presentado acontecimiento isquémico cerebral agudo es de aproximadamente 10 a aproximadamente 40 y, más preferentemente, de aproximadamente 20 a aproximadamente 40, o de aproximadamente 20 a aproximadamente 30. Incluso más preferentemente, una referencia derivada de una muestra de un sujeto (o grupo de sujetos) conocido por no haber presentado acontecimiento isquémico cerebral agudo es de aproximadamente 40, o, lo más preferentemente, aproximadamente 30.
Una proporción de referencia preferente para la cantidad de NT-proANP con respecto a la cantidad de NT-proBNP derivada de una muestra de un sujeto (o grupo de sujetos) conocido por haber presentado un acontecimiento isquémico cerebral agudo es de aproximadamente 100 a aproximadamente 250 y, más preferentemente, de aproximadamente 100 a aproximadamente 200, o de aproximadamente 100 a aproximadamente 150. Incluso más preferentemente, una referencia derivada de una muestra de un sujeto (o grupo de sujetos) conocido por haber presentado un acontecimiento isquémico cerebral agudo es de aproximadamente 100, o, lo más preferentemente, aproximadamente 150. La cantidad de referencia preferente para AIT se divulga en otra parte en el presente documento.
Un agente de detección adecuado puede ser, en un aspecto, un anticuerpo que se une específicamente al marcador en una muestra de un sujeto que se va a investigar por el procedimiento de la invención como se expone en otra parte en el presente documento.
Aún en un aspecto del procedimiento mencionado anteriormente, la etapa a) se puede llevar a cabo por una unidad analizadora, en un aspecto, una unidad analizadora como se define en otra parte en el presente documento.
En un aspecto del procedimiento de la invención, la proporción calculada en la etapa b) se compara con una proporción de referencia. En un aspecto, la proporción de referencia es una referencia como se define en otra parte en el presente documento. Por tanto, las referencias aplicadas en un aspecto del procedimiento de la invención pueden ser referencias artificiales que se adoptan para reflejar las limitaciones del agente de detección que se ha usado. En otro aspecto, dicha relación también se puede tener en cuenta cuando se lleva a cabo la comparación, por ejemplo, incluyendo una etapa de cálculo de normalización y/o corrección para la cantidad o proporción determinada antes de comparar realmente el valor de la cantidad determinada y la referencia. En un aspecto, la comparación se lleva a cabo automáticamente, por ejemplo, asistida por un sistema informático o similar.
La ayuda para diagnosticar un acontecimiento isquémico cerebral agudo se establece en base a la comparación
llevada a cabo en la etapa c) asignando al sujeto en un grupo de sujetos que padecen un acontecimiento cerebral agudo, o bien que no padecen acontecimiento cerebral agudo como se expone en el presente documento en otra parte. Como se analiza en otra parte, la asignación del sujeto investigado no debe ser correcta en un 100 % de los casos investigados. Además, los grupos de sujetos en los que se asigna el sujeto investigado pueden ser grupos artificiales porque se establecen en base a consideraciones estadísticas, es decir, un determinado grado preseleccionado de verosimilitud en base al que operará el procedimiento de la invención. En un aspecto de la invención, la ayuda para diagnosticar un acontecimiento cerebral agudo se establece automáticamente, por ejemplo, se asiste por un dispositivo informático o similar, como se describe y divulga en el presente documento.
En un aspecto del procedimiento de la invención, dicho procedimiento comprende además una etapa de recomendar y/o atender al sujeto de acuerdo con el resultado establecido en la etapa c) como se expone en otra parte en el presente documento en detalle, y/o adaptar la intensidad del seguimiento de la enfermedad.
En un aspecto del procedimiento mencionado anteriormente, las etapas b) y/o c) se llevan a cabo por una o más unidades analizadoras como se expone en otra parte en el presente documento.
Además, la presente invención se refiere al uso del polipéptido NT-proANP y del polipéptido NT-proBNP en una muestra de un sujeto que se sospecha que padece un acontecimiento isquémico cerebral agudo para diagnosticar un acontecimiento isquémico cerebral agudo.
Además, la presente invención se refiere al uso de un agente de detección que se une específicamente al polipéptido NT-proANP y de un agente de detección, que se une específicamente al polipéptido NT-proBNP en una muestra de un sujeto que se sospecha que padece un acontecimiento isquémico cerebral agudo para diagnosticar un acontecimiento isquémico cerebral agudo.
El término "agente de detección" como se usa en el presente documento se refiere a un agente que puede reconocer y unirse específicamente al biomarcador al que se hace referencia en el presente documento (NT-proANP o NT-proBNP) cuando está presente en una muestra. Además, dicho agente permitirá la detección directa o indirecta del complejo formado por dicho agente y el biomarcador. La detección directa se puede lograr incluyendo en el agente un marcador detectable. El marcaje indirecto se puede lograr por otro agente que se une específicamente al complejo que comprende el biomarcador y el agente de detección en el que dicho otro agente puede generar una señal detectable. Los compuestos adecuados que se pueden usar como agentes de detección son bien conocidos en la técnica. Preferentemente, el agente de detección es un anticuerpo o aptámero que se une específicamente al biomarcador. Los anticuerpos como se hace referencia en el presente documento incluyen anticuerpos tanto policlonales como monoclonales, así como fragmentos de los mismos, tales como fragmentos Fv, Fab y F(ab)2 que se pueden unir a antígeno o hapteno. También se prevén anticuerpos monocatenarios y anticuerpos híbridos humanizados en los que las secuencias de aminoácidos de un anticuerpo donante no humano que presentan una especificidad de antígeno deseada se combinan con secuencias de un anticuerpo aceptor humano.
La presente invención se refiere además a un dispositivo para diagnosticar un acontecimiento isquémico cerebral agudo, comprendiendo dicho dispositivo:
a) una unidad de análisis que comprende un agente de detección para el polipéptido NT-proANP que permite la determinación de la cantidad de dicho polipéptido NT-proANP, y un agente de detección para el polipéptido NT-proBNP que permite la determinación de la cantidad de dicho polipéptido NT-proBNP; y
b) una unidad de evaluación que comprende un procesador de datos para calcular una proporción de las cantidades de NT-proANP y NT-proBNP determinadas por la unidad analizadora, habiendo implementado dicho procesador de datos un algoritmo para comparar la proporción con la proporción de referencia almacenada en una base de datos para establecer el diagnóstico de un AIT, en el que la proporción de referencia se deriva de una muestra de un sujeto como se describe en el presente documento en otra parte en el contexto del procedimiento para diagnosticar un acontecimiento isquémico cerebral agudo, y el algoritmo es un algoritmo como se expone en el contexto de dicho procedimiento.
También se contempla un dispositivo para diagnosticar un acontecimiento isquémico cerebral agudo, comprendiendo dicho dispositivo:
a) una unidad analizadora que comprende un agente de detección para el polipéptido NT-proANP que permite la determinación de la cantidad de dicho polipéptido NT-proANP, y un agente de detección para el polipéptido NT-proBNP que permite la determinación de la cantidad de dicho polipéptido NT-proBNP; y
b) una unidad analizadora que comprende un procesador de datos para calcular una proporción de las cantidades de NT-proANP y NT-proBNP, habiendo implementado dicho procesador de datos un algoritmo para comparar la proporción con la proporción de referencia almacenada en una base de datos para establecer el diagnóstico del acontecimiento, en el que la proporción de referencia se deriva de una muestra de un sujeto como
se describe en el presente documento en otra parte en el contexto del procedimiento para diagnosticar un acontecimiento isquémico cerebral agudo, y el algoritmo es un algoritmo como se expone en el contexto de dicho procedimiento.
El término "dispositivo" como se usa en el presente documento se refiere a un sistema que comprende las unidades mencionadas anteriormente unidas de forma funcional entre sí para permitir el diagnóstico de acuerdo con los procedimientos de la invención. Los agentes de detección preferentes que se pueden usar para la unidad de análisis se divulgan en otra parte en el presente documento. La unidad de análisis, preferentemente, comprende dichos agentes de detección en forma inmovilizada sobre un soporte sólido que se debe poner en contacto con la muestra que comprende los biomarcadores de los que su cantidad se va a determinar. Además, la unidad de análisis también puede comprender un detector que determina la cantidad de agente de detección que se une específicamente al/a los biomarcador(es). La cantidad determinada se puede transmitir a la unidad de evaluación. Dicha unidad de evaluación comprende un elemento de procesamiento de datos, tal como un ordenador, con un algoritmo implementado para llevar a cabo una comparación entre la cantidad determinada y una referencia adecuada. Las referencias adecuadas se pueden derivar de muestras de sujetos que se van a usar para la generación de cantidades de referencia como se describe en otra parte en el presente documento anteriormente. Los resultados diagnósticos se pueden dar como salida de datos brutos diagnósticos paramétricos, preferentemente, como cantidades absolutas o relativas. Se debe entender que estos datos pueden necesitar interpretación por el médico. Sin embargo, también se contemplan dispositivos de sistemas expertos en los que la salida comprende datos brutos diagnósticos procesados en los que su interpretación no requiere un médico especializado. Preferentemente, el dispositivo de la presente invención se puede usar para llevar a cabo el procedimiento mencionado anteriormente de la presente invención de manera automatizada.
Un modo de realización preferente de la presente divulgación incluye un sistema para diagnosticar AIT o un acontecimiento cerebral agudo como se divulga en otra parte. Los ejemplos de sistemas incluyen analizadores de química clínica, analizadores de química de coagulación, analizadores de inmunoquímica, analizadores de orina, analizadores de ácido nucleico, usados para detectar el resultado de reacciones químicas o biológicas o para monitorizar el progreso de reacciones químicas o biológicas. Más específicamente, los sistemas ejemplares de la presente divulgación pueden incluir sistemas Roche Elecsys™ y analizadores de inmunoanálisis Cobas®, analizadores Abbott Architect™ y Axsym™, analizadores Siemens Centaur™ e Immulite™, y analizadores Beckman Coulter UniCel™ y Acess™, o similares.
Los modos de realización del sistema pueden incluir una o más unidades analizadoras utilizadas para practicar la divulgación objeto. Las unidades analizadoras del sistema divulgadas en el presente documento están en comunicación funcional con el dispositivo informático divulgado en el presente documento a través de cualquiera de una conexión por cable, Bluetooth, LANS o señal inalámbrica, como es conocido. Adicionalmente, de acuerdo con la presente divulgación, una unidad analizadora puede comprender un aparato independiente, o módulo dentro de un instrumento más grande, que realiza una o ambas de la detección, por ejemplo, evaluación cualitativa y/o cuantitativa de muestras para propósitos diagnósticos. Por ejemplo, una unidad analizadora puede realizar o ayudar con el pipeteo, dosificación, mezcla de muestras y/o reactivos. Una unidad analizadora puede comprender una unidad de mantenimiento de reactivos para mantener los reactivos para realizar los ensayos. Los reactivos se pueden disponer, por ejemplo, en forma de recipientes o casetes que contienen reactivos individuales o un grupo de reactivos, dispuestos en receptáculos o posiciones apropiados dentro de un transportador o compartimento de almacenamiento. Los reactivos de detección también pueden estar en forma inmovilizada sobre un soporte sólido que se ponen en contacto con la muestra. Además, una unidad analizadora puede incluir un componente de proceso y/o detección que es optimizable para análisis específico.
De acuerdo con algunos modos de realización, una unidad analizadora se puede configurar para la detección óptica de un analito, por ejemplo un marcador, con una muestra. Una unidad analizadora ejemplar configurada para la detección óptica comprende un dispositivo configurado para convertir energía electromagnética en una señal eléctrica, que incluye detectores ópticos tanto de un solo elemento como de múltiples elementos o de matriz. De acuerdo con la presente divulgación, un detector óptico puede monitorizar una señal electromagnética óptica y proporcionar una señal de respuesta o señal de salida eléctrica con respecto a una señal de referencia indicativa de la presencia y/o concentración de un analito en una muestra que se localiza en una trayectoria óptica. Dichos dispositivos también pueden incluir, por ejemplo, fotodiodos, incluyendo fotodiodos de avalancha, fototransistores, detectores fotoconductores, matrices de sensores lineales, detectores CCD, detectores CMOS, incluyendo detectores de matrices CMOS, fotomultiplicadores y matrices fotomultiplicadoras. De acuerdo con determinados modos de realización, un detector óptico, tal como un fotodiodo o fotomultiplicador, puede contener dispositivos electrónicos de acondicionamiento o procesamiento de señales adicionales. Por ejemplo, un detector óptico puede incluir al menos un preamplificador, filtro electrónico o circuito integrado. Los preamplificadores adecuados incluyen, por ejemplo, preamplificadores de integración, transimpedancia y ganancia de corriente (espejo de corriente).
Adicionalmente, una o más unidades analizadoras de acuerdo con la presente divulgación pueden comprender una fuente de luz para emitir luz. Por ejemplo, una fuente de luz de una unidad analizadora puede consistir en al menos un elemento emisor de luz (tal como un diodo emisor de luz, una fuente de radiación eléctrica tal como una
lámpara incandescente, una lámpara electroluminiscente, una lámpara de descarga de gas, una lámpara de descarga de alta intensidad, un láser) para medir las concentraciones de analitos con una muestra que se está sometiendo a prueba o para permitir una transferencia de energía (por ejemplo, a través de transferencia de energía de resonancia fluorescente o catalizando una enzima).
Además, una unidad analizadora del sistema puede incluir una o más unidades incubadoras (por ejemplo, para mantener una muestra o un reactivo a una temperatura o intervalo de temperatura especifico). En algunos modos de realización, una unidad analizadora puede incluir un termociclador, incluir un termociclador en tiempo real, para someter una muestra a ciclos de temperatura repetidos y monitorizar un cambio en la cantidad de un producto de amplificación con la muestra.
Adicionalmente, una unidad analizadora del sistema divulgado en el presente documento puede comprender, o estar conectada de forma funcional a, un recipiente de reacción o unidad de alimentación de cubeta. Las unidades de alimentación ejemplares incluyen unidades de procesamiento de líquido, tales como una unidad de pipeteo, para suministrar muestras y/o reactivos a los recipientes de reacción. La unidad de pipeteo puede comprender una aguja lavable reutilizable, por ejemplo, una aguja de acero, o puntas de pipeta desechables. La unidad analizadora puede comprender además una o más unidades de mezcla, por ejemplo, un agitador para agitar una cubeta que comprende un líquido o una paleta de mezcla para mezclar líquidos en una cubeta o recipiente de reactivos.
De lo anterior se deduce que de acuerdo con algunos modos de realización de la presente divulgación, partes de algunas etapas de los procedimientos divulgados y descritos en el presente documento se pueden realizar por un dispositivo informático. Un dispositivo informático de datos puede ser un ordenador de propósito general o un dispositivo informático portátil, por ejemplo. También se debe entender que se pueden usar múltiples dispositivos informáticos juntos, tales como en una red u otros procedimientos de transferencia de datos, para realizar una o más etapas de los procedimientos divulgados en el presente documento. Los dispositivos informáticos ejemplares incluyen ordenadores de sobremesa, ordenadores portátiles, agendas electrónicas ("PDA"), tales como dispositivos de marca BLACKBERRY, teléfonos inteligentes, tabletas, servidores y similares. En general, un dispositivo informático comprende un procesador que puede ejecutar una pluralidad de instrucciones (tales como un programa informático).
Un dispositivo informático, preferentemente, tiene acceso a una memoria. Una memoria es un medio legible por ordenador y puede comprender un único dispositivo de almacenamiento o múltiples dispositivos de almacenamiento, situados localmente con el dispositivo informático o bien accesibles al dispositivo informático a través de una red, por ejemplo. Los medios legibles por ordenador pueden ser cualquier medio disponible al que se puede acceder por el dispositivo informático e incluye medios tanto volátiles como no volátiles. Además, los medios legibles por ordenador pueden ser uno o ambos de medios extraíbles y no extraíbles. A modo de ejemplo, y sin limitación, los medios legibles por ordenador pueden comprender medios de almacenamiento informáticos. Los medios de almacenamiento informáticos ejemplares incluyen, pero no se limitan a, RAM, ROM, EEPROM, memoria flash o cualquier otra tecnología de memoria, CD-ROM, disco versátil digital (DVD) u otro almacenamiento en disco óptico, casetes magnéticos, cinta magnética, almacenamiento en disco magnético u otros dispositivos de almacenamiento magnético, o cualquier otro medio que se pueda usar para almacenar una pluralidad de instrucciones a las que se puede acceder por el dispositivo informático y ejecutar por el procesador del dispositivo informático.
De acuerdo con modos de realización de la presente divulgación, el programa informático puede incluir instrucciones que, cuando se ejecutan por un procesador del dispositivo informático, pueden realizar una o más etapas de los procedimientos divulgados en el presente documento. Algunas de las instrucciones se pueden adaptar para producir señales que controlan la operación de otras máquinas y por tanto pueden operar a través de esas señales de control para transformar materiales muy alejados del propio ordenador. Estas descripciones y representaciones son los medios usados por los expertos en la técnica de procesamiento de datos, por ejemplo, para transmitir lo más eficazmente lo esencial de su trabajo a otros expertos en la técnica.
La pluralidad de instrucciones también puede comprender un algoritmo que en general está concebido como una secuencia autocoherente de etapas que da lugar a un resultado deseado. Estas etapas son las que requieren manipulaciones físicas de cantidades físicas. Normalmente, aunque no necesariamente, estas cantidades toman la forma de pulsos o señales eléctricos o magnéticos que se pueden almacenar, transferir, transformar, combinar, comparar y manipular de otro modo. En ocasiones resulta conveniente, principalmente por motivos de uso común, referirse a estas señales como valores, caracteres, datos de visualización, números o similares como una referencia a los elementos físicos o manifestaciones en que se incorporan o expresan dichas señales. Sin embargo, se debe tener en cuenta que todos estos términos y similares se deben asociar con las cantidades físicas apropiadas y se usan simplemente en el presente documento como etiquetas convenientes aplicadas a estas cantidades. De acuerdo con algunos modos de realización de la presente divulgación, un algoritmo para llevar a cabo una comparación entre una cantidad determinada de uno o más marcadores divulgados en el presente documento, y una referencia adecuada, se realiza y se lleva a cabo ejecutando las instrucciones. Los resultados se pueden dar como salida de datos brutos diagnósticos paramétricos o como cantidades absolutas o relativas. De acuerdo con diversos modos de realización del sistema divulgado en el presente documento, se puede
proporcionar un "diagnóstico" por el dispositivo informático de un sistema divulgado en el presente documento en base a dicha comparación de la "cantidad" calculada con una referencia o un valor umbral. Por ejemplo, un dispositivo informático de un sistema puede proporcionar un indicador, en forma de una palabra, símbolo o valor numérico que sea indicativo de un diagnóstico particular.
El dispositivo informático también puede tener acceso a un dispositivo de salida. Los dispositivos de salida ejemplares incluyen máquinas de fax, pantallas, impresoras y archivos, por ejemplo. De acuerdo con algunos modos de realización de la presente divulgación, un dispositivo informático puede realizar una o más etapas de un procedimiento divulgado en el presente documento, y después de esto proporcionar una salida, por medio de un dispositivo de salida, con relación a un resultado, indicación, proporción u otro factor del procedimiento.
Los siguientes ejemplos ilustrarán simplemente la invención. No se interpretarán, en absoluto, como que limitan el alcance de la invención.
Ejemplo 1: determinación de NT-proBNP y NT-proANP
Se determinó NT-proBNP usando el ensayo Elecsys proBNP II STAT (tiempo de obtención breve) con ELISA de electroquimioluminiscencia de tipo sandwich de Roche. La prueba emplea dos anticuerpos monoclonales que reconocen epítopos localizados en la parte N terminal (1-76) de proBNP (1-108).
Se determinó NT-proANP (aminoácidos 1 a 98 del péptido pre-proANP) usando el ensayo de NT-proANP de Biomedica Medizinprodukte GmbH (Viena, Austria). El número de catálogo. BI-20892. El límite de detección es de 0,05 nmol/l. El ensayo hace uso de anticuerpos anti-proANP de oveja policlonales.
Se sometió a prueba el nivel de los biomarcadores en muestras de suero del siguiente grupo de sujetos
• sujetos sanos (n = 149)
• pacientes con arteriopatía coronaria estable AC (es decir, pacientes en los que se desarrolla con frecuencia apoplejía, n = 235),
• pacientes con descompensación cardíaca (n = 64),
• pacientes con AIT (n = 79).
• pacientes con apoplejía menor y mayor (n = 61 y 108, respectivamente)
Pacientes con AC: se incluyeron en el estudio un total de 235 pacientes con arteriopatía, edad media de 64 años, fueron 141 hombres y 94 mujeres. En todos los pacientes, se verificó arteriopatía coronaria por angiografía. Se usó una reducción de un 50 % en el diámetro de vaso para la clasificación de la enfermedad de vasos 1, 2 o 3. se evaluó la función cardíaca por ecocardiografía y determinación de NT-proBNP
Insuficiencia cardíaca: otro grupo de 64 pacientes tiene insuficiencia cardíaca descompensada (24 mujeres y 40 hombres, edad media de 69 años). Se caracterizaron por incremento de disnea en las 2 semanas previas, todos los pacientes se pudieron clasificar como NYHA III o IV de acuerdo con la clasificación de NYHA.
Controles sanos: se incluyeron en el estudio 149 sujetos humanos clínicamente sanos como controles, 52 hombres y 97 mujeres (mediana de edad de 41 años, intervalo de 19 a 56 años). Estos sujetos no tenían cardiopatía como se evaluó por antecedentes y un electrocardiograma, ni diabetes mellitus ni factores de riesgo de estas enfermedades. Además, tenían función renal normal como se evaluó por valores de creatinina normales y trastorno maligno.
Pacientes con apoplejía/AIT: se incluyeron en este estudio un total de 255 pacientes con AIT o apoplejía isquémica (edad media de 70 años). Se presentó accidente isquémico transitorio en 23 pacientes, se diagnosticó apoplejía leve en 61 pacientes y se encontró apoplejía grave en 108 pacientes. Además, como se describe anteriormente se realizaron ecografías carotídeas y transcraneales así como electro y ecocardiografía y se clasificaron los pacientes de acuerdo con los criterios TOAST. En pacientes con apoplejía y AIT, se midieron los biomarcadores NT-proANP y NT-proBNP en muestras obtenidas en la presentación así como en muestras obtenidas seis y 24 horas después de la presentación. La mediana del intervalo entre el inicio de síntomas y la admisión fue de 4,2 horas (percentil 25: 2,5, percentil 75: 8 horas).
Ejemplo 2: resultados
Se obtuvieron los siguientes resultados (se indican la mediana de los niveles, así como el percentil 25 y 75):
NT-proBNP NT-proANP
pg/ml pg/ml
Sujetos sanos 37 882
N = 149 
635 - 1280
Pacientes con AC estable 266 2710
N = 236 95 - 928 1880 - 4662
Pacientes con descomposición
cardíaca 4477 33600
1971 - 7131 12570 - 57800
331 106000
AIT: n = 27
165 - 473 79000 - 149000
238 81000
Apoplejía menor n = 60
79 - 547 43400 - 125000
412 107151
Apoplejía mayor (n = 108)
127 - 1053 70600 - 240000
El sorprendente hallazgo indicó que los niveles de NT-proANP en apoplejía se incrementaron significativamente en pacientes con AIT y apoplejía. En particular, fueron mayores que en descompensación cardíaca evidente. Por tanto, NT-proANP separó pacientes cardíacos de pacientes con apoplejía. La determinación de NT-proBNP proporciona información adicional.
Además, se determinaron las proporciones de NT-proANP con respecto a NT-proBNP:
Las proporciones fueron como sigue (mediana, percentil 25/percentil 75):
Sano 74 (14/125)
AC 10 (4/25)
IC descompensada 10 (4/18)
Apoplejía mayor 249 (128/603)
Apoplejía mejor 321 (149/670)
AIT 524 (204/905)
Como se puede ver de la tabla, la determinación de la proporción es ventajosa puesto que permite la diferenciación entre i) pacientes que tienen factores de riesgo de apoplejía/AIT, es decir, pacientes con arteriopatía coronaria (AC) y pacientes con insuficiencia cardíaca (IC) que tienen niveles altos de NT-proANP y NT-proBNP, y ii) pacientes que han padecido apoplejía o AIT.
Cuando se siguieron los valores de NT-proANP en el curso de apoplejía, se obtuvieron los siguientes valores:
NT-proANP pg/ml
En la presentación 106000
79000 - 149000
A las 6 horas 95500
54000 - 139000
A las 24 horas 82000
48000 - 139000
El seguimiento indicó que se trataba de un efecto duradero, lo que indica que también se podían reconocer acontecimientos pasados.
Conclusiones:
El reconocimiento de AIT es importante ya que puede preceder a una apoplejía que con frecuencia es
incapacitante. Con frecuencia, el AIT dura solo unos minutos y la mayoría de los AIT se resuelven dentro de una hora sin provocar daño permanente al cerebro. El diagnóstico de AIT es difícil porque i) AIT imita una variedad de otros trastornos dependiendo de la localización del AIT y porque ii) el paciente presenta para la evaluación síntomas que ya no están presentes, lo que dificulta el diagnóstico final. El AIT con frecuencia se desarrolla en pacientes con cardiopatías preexistentes tales como hipertensión sistémica, arteriopatía coronaria e insuficiencia cardíaca de diferente origen. Un hallazgo sorprendente de este estudio fue que NT-proANP, que es conocido por liberarse en insuficiencia cardíaca, es altamente elevado en apoplejía y sorprendentemente también en AIT, incluso excede los niveles encontrados en pacientes con insuficiencia cardíaca avanzada y descompensada. También la proporción de NT-proANP/NT-proBNP se puede usar de forma segura para este propósito, en particular en pacientes con insuficiencia cardíaca.
La importancia clínica de la confirmación de la sospecha de AIT radica en la identificación de la causa subyacente (por ejemplo, cardioembólica), la intervención apropiada (angioplastia, por ejemplo, en estenosis carotídea, anticoagulación en fibrilación auricular) y, por tanto, en la prevención de apoplejía y específicamente, apoplejía mayor.
Además, se ha demostrado que la determinación de la proporción de NT-proANP/NT-proBNP permite un diagnóstico fiable de apoplejía y AIT, en particular en pacientes que padecen insuficiencia cardíaca.
Claims (12)
1. Un procedimiento in vitro para diagnosticar un acontecimiento isquémico cerebral agudo en un sujeto que se sospecha que padece un acontecimiento isquémico cerebral agudo, que comprende
a. determinar la cantidad de NT-proANP en una muestra de dicho sujeto,
b. determinar la cantidad de NT-proBNP en una muestra de dicho sujeto,
c. calcular una proporción de las cantidades de NT-proANP y NT-proBNP, y
d. comparar la proporción así calculada con una proporción de referencia, diagnosticando de este modo el acontecimiento isquémico cerebral agudo.
2. El procedimiento de la reivindicación 1, en el que el sujeto padece insuficiencia cardíaca y/o arteriopatía coronaria.
3. El procedimiento de la reivindicación 1 o 2, en el que el acontecimiento isquémico cerebral agudo se selecciona de apoplejía y accidente isquémico transitorio.
4. El procedimiento de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en el que se calcula la proporción de NT-proANP con respecto a NT-proBNP, y
a. en el que la proporción de referencia se deriva de una muestra de un sujeto conocido por haber presentado un acontecimiento isquémico cerebral agudo, y en el que una proporción de NT-proANP con respecto a NT-proBNP en la muestra del sujeto de prueba que es esencialmente idéntica a la proporción de referencia o que es mayor que la proporción de referencia indica que el sujeto ha presentado un acontecimiento isquémico cerebral agudo, y/o
b. en el que la proporción de referencia se deriva de una muestra de un sujeto conocido por no haber presentado un acontecimiento isquémico cerebral agudo, y en el que una proporción de NT-proANP con respecto a NT-proBNP en la muestra del sujeto de prueba que es esencialmente idéntica a la proporción de referencia o que es menor que la proporción de referencia indica que el sujeto no ha presentado acontecimiento isquémico cerebral agudo.
5. El procedimiento de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en el que el sujeto que se sospecha que ha presentado un acontecimiento cerebral agudo es un sujeto que ha mostrado síntomas de un acontecimiento cerebral agudo.
6. El procedimiento de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en el que el sujeto que se sospecha que ha presentado un acontecimiento cerebral agudo ha mostrado síntomas de un acontecimiento cerebral agudo dentro de las 24 horas antes de que se haya obtenido la muestra.
7. El procedimiento de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, en el que el sujeto que se sospecha que ha presentado un acontecimiento cerebral agudo ha mostrado síntomas de un acontecimiento cerebral agudo dentro de las 24 horas antes de que se haya obtenido la muestra.
8. El procedimiento de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, en el que la muestra se ha obtenido no antes de 1 hora después del inicio de síntomas del acontecimiento cerebral agudo.
9. Uso de
i) el polipéptido NT-proANP y el NT-proBNP, o
ii) un agente de detección que se une específicamente al polipéptido NT-proANP y un agente de detección que se une específicamente al polipéptido NT-proBNP,
en una muestra de un sujeto que se sospecha que ha presentado un acontecimiento isquémico cerebral agudo para diagnosticar un acontecimiento isquémico cerebral agudo.
10. El procedimiento de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, o el uso de la reivindicación 9, en el que la muestra es una muestra de sangre, suero o plasma.
11. El procedimiento de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, o el uso de la reivindicación 9, en el que el sujeto es humano.
12. Un dispositivo para diagnosticar un acontecimiento isquémico cerebral agudo, comprendiendo dicho
dispositivo:
a) una unidad de análisis que comprende un agente de detección para el polipéptido NT-proANP que permite la determinación de la cantidad de dicho polipéptido NT-proANP, y un agente de detección para el polipéptido NT-proBNP que permite la determinación de la cantidad de dicho polipéptido NT-proBNP; y
b) una unidad de evaluación que comprende un procesador de datos para calcular una proporción de las cantidades de NT-proANP y NT-proBNP determinadas por la unidad analizadora, habiendo implementado dicho procesador de datos un algoritmo para comparar la proporción con la proporción de referencia almacenada en una base de datos para establecer el diagnóstico de un acontecimiento isquémico cerebral agudo, en el que la proporción de referencia se deriva de una muestra de un sujeto como se define en la reivindicación 4, y el algoritmo es un algoritmo como se define en la reivindicación 4.
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