ES2886946T3

ES2886946T3 - Péptido con efecto antiviral y composición que lo contiene

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Publication number: ES2886946T3
Application number: ES16818300T
Authority: ES
Inventors: Sang Jae Kim
Original assignee: GemVax and Kael Co Ltd
Current assignee: GemVax and Kael Co Ltd
Priority date: 2015-07-02
Filing date: 2016-07-04
Publication date: 2021-12-21
Anticipated expiration: 2036-07-04
Also published as: JP7218403B2; CN107847551B; KR20180016410A; US20190032032A1; JP6923453B2; EP3318265A1; WO2017003267A1; CN107847551A; US11015179B2; EP3318265B1; KR102638286B1; JP2021175746A; EP3318265A4; JP2018526332A

Abstract

Una composición antiviral para uso en un procedimiento para prevenir o tratar una enfermedad viral mediante la inhibición de los virus a través de la inhibición de la replicación viral, en la que el procedimiento comprende la administración de la composición antiviral a un individuo que tiene una enfermedad viral, en la que la composición comprende al menos uno seleccionado del grupo que consiste en: un péptido de la SEQ ID NÚM.: 1, un péptido que tiene al menos 80% de homología de secuencia con la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NÚM.: 1, y un fragmento de dicho péptido, como un ingrediente activo.

Description

DESCRIPCIÓN

Péptido con efecto antiviral y composición que lo contiene

[Campo técnico]

La especificación se refiere a un péptido que tiene una actividad antiviral y a una composición que lo comprende, y más en particular, a una composición para prevenir y tratar una enfermedad viral, que comprende un péptido derivado de la telomerasa, y que es eficaz para tratar una enfermedad viral inhibiendo la autorreplicación y la actividad de un virus.

[Técnica anterior]

La actividad antiviral puede dividirse en reconocer y atacar directamente una proteína viral o una parte de la misma, inhibir cada fase del ciclo de vida de un virus, o potenciar la inmunidad. El procedimiento de inhibición de cada fase del ciclo vital de un virus puede variar en función de una fase. Por ejemplo, como agente viral para inhibir la fase antes de la entrada en las células del huésped, se puede utilizar un inhibidor de entrada o un agente de bloqueo de entrada, que perturbe la entrada viral en las células, o un agente para bloquear la penetración y el desenvolvimiento viral. Además, existe una actividad antiviral en la fase de replicación viral en las células del huésped después de la entrada viral en las células del huésped, que consiste en inhibir la replicación viral a través de un nucleótido o análogo de nucleósido que es similar a un bloque de construcción del ARN o ADN viral pero que inactiva una ARN o ADN polimerasa. De forma representativa, en esta fase puede utilizarse un inhibidor de la transcriptasa inversa. Una fase posterior consiste en inhibir una integrasa para cortar el ADN viral sintetizado, la transcripción viral, la traducción, la modificación postraduccional o la focalización posterior. Además de estos, se puede utilizar la inhibición de una proteasa viral, el bloqueo del ensamblaje viral o el bloqueo de la fase final que es una fase de liberación de los virus de las células huésped. Para la actividad antiviral, también se puede utilizar un fármaco para aliviar diversos síntomas causados por un virus, que no actúe directamente sobre un virus como el descrito anteriormente. Por ejemplo, aunque se puede utilizar un antiflogístico para reducir la inflamación causada por un virus o un antipirético para reducir la fiebre alta causada por un virus, no se puede considerar un agente terapéutico fundamental contra un virus.

Un virus es un patógeno infeccioso de menor tamaño que una bacteria. El virus está compuesto por un material genético, tal como ARN o ADN, y una proteína que rodea el material genético. Como los virus no tienen metabolismo propio, permiten que el ADN o el ARN penetren en las células del huésped, repliquen su propio material genético utilizando los orgánulos de las células penetradas y produzcan virus parecidos a sí mismos. En este procedimiento, se dañan o alteran las células del huésped, induciendo una enfermedad en el mismo.

El virus de la hepatitis C (en adelante en la presente memoria, VHC) es un virus de ARN monocatenario de sentido positivo, que fue identificado por primera vez en 1989, pertenece a Flaviviridae y tiene un genoma de aproximadamente 9,5 kb. En las primeras etapas de la infección, no hay síntomas, y aproximadamente entre el 55 y el 85% de los pacientes desarrollan una hepatitis crónica, y entre estos, aproximadamente entre el 5 y el 10% de los pacientes desarrollan una cirrosis hepática y luego evolucionan hacia el cáncer de hígado.

El VHC se clasifica a grandes rasgos en 6 tipos de genotipos de acuerdo con la diferencia en la secuencia de bases de su genoma, y se han notificado sus diferencias clínicas, como las respuestas a los tratamientos. Dependiendo de una región, se han observado diferencias en la distribución de los genotipos del VHC, y hay algunos informes que indican que los tipos típicos en Corea son los tipos lb y 2a. Sin embargo, no hay datos suficientes que lo respalden. Tras la infección, debido a una tasa de mutación mayor que la de otros virus, el VHC tiene seis hebras diferentes y produce numerosas cuasiespecies en una sola hebra. Debido a esta característica, se espera que el VHC presente resistencia a un único agente terapéutico, por lo que requiere una terapia combinada con varios agentes terapéuticos. Por lo tanto, existe una necesidad inmediata de desarrollar agentes terapéuticos y de investigación más estables y eficaces, que puedan prevenir y tratar una enfermedad hepática causada por el VHC.

El VHC produce una proteína de fusión que comprende 3.030 aminoácidos utilizando su propio genoma como sustrato tras la infección viral. En particular, se ha observado que la región 5'-no traducida (u Tr ) y la 3'-UTR desempeñan roles muy críticos en la replicación del VHC. El 5'-UTR tiene un sitio de ingreso al ribosoma interno (IRES) que está altamente conservado en la cadena del VHC, y por lo tanto tiene una traducción independiente del extremo. La proteína de fusión que se produce por primera vez tras la infección es procesada por las proteasas del huésped y del virus, dando lugar a proteínas estructurales como C, E1, E2, etc. y a proteínas reguladoras necesarias en la replicación viral como NS2, NS3, NS4A, NS4B, NS5A, NS5B , etc.

Como agentes anti-VHC, los inhibidores dirigidos principalmente al VHC, que se han desarrollado activamente hasta ahora, son la proteasa NS3 y la polimerasa NS5B. El resultado de un ensayo clínico de fase 1 de un fármaco dirigido a una enzima específica del virus como la proteasa NS3, llevado a cabo por Boehringer-Ingelheim en 2003, se ha comunicado a la revista Nature y se ha señalado. Sin embargo, NS3 es difícil de diseñar como fármaco a partir de una estructura básica porque tiene dificultades para la penetración del fármaco debido a su estructura, mientras que NS5B tiene una estructura típica de polimerasa, que tiene forma de pulgar-palma-dedo, y es sabido que tiene posibilidades en el diseño de un inhibidor no nucleósido, así como una región activa. En los últimos años, se está desarrollando un agente terapéutico dirigido al VHC, no al huésped.

Además, la infección por el virus de la hepatitis B (en adelante en la presente memoria, VHB) muestra ampliamente una variedad de progresiones clínicas hacia la infección asintomática, la infección crónica, la cirrosis hepática y el carcinoma hepatocelular (CHC), y aumenta la morbilidad y la mortalidad de la enfermedad crónica. Dado que hay aproximadamente 350 millones de portadores del VHB en todo el mundo, las enfermedades hepáticas derivadas del VHB amenazan la salud humana, y el VHB, que representa el 53% del total de casos de CHC, es uno de los principales factores desencadenantes del CHC, así como del VHC y otros casos.

El VHB produce tres tipos de proteínas de envoltura, todas codificadas en un marco de lectura abierto pre-S/S. Aunque no se ha identificado claramente el rol de las proteínas de superficie de gran tamaño (LHB) del VHB, se ha sugerido que las LHB están implicadas en el ensamblaje y la adhesión viral a las células hepáticas. De acuerdo con diversos estudios, los LHB con una mutación en una región preS provocan un cambio en la transactivación o inducen una vía de estrés reticular, lo que implica la contribución a la aparición del cáncer de hígado.

Como terapias convencionales estándar contra el cáncer de hígado y antivirales, cuando no hay cirrosis hepática o una función hepática restante suficiente, se considera principalmente la hepatectomía, y cuando la dishepatia está acompañada, el trasplante de hígado se considera como una terapia primaria, pero puede ser difícil de aplicar a la mayoría de los pacientes con CHC debido a la hipertensión portal, la insuficiencia hepática, múltiples tumores, un contexto invasivo, una edad avanzada, etc. Como terapia no quirúrgica, se utilizan sobre todo la ablación térmica por radiofrecuencia y la inyección de etanol, pero cuando el tamaño del tumor es grande, tienen bajas tasas de éxito.

Como se ha descrito anteriormente, dado que el tratamiento del CHC depende principalmente de una operación quirúrgica, terapia térmica, etc., y la tasa de tratamiento de la quimioterapia es muy baja, existe una necesidad inmediata de desarrollar un medicamento alternativo. En Corea, en particular, debido a la prevalencia del CHC derivado del VHB, se requiere un tratamiento preventivo para la hepatitis B crónica, y en el caso del CHC acompañado de hepatitis B, la tasa de éxito en el tratamiento del cáncer de hígado aumenta con el tratamiento preventivo o simultáneo de la hepatitis. En particular, cuando el CHC es causado por la hepatitis crónica y la cirrosis hepática, incluso después del tratamiento del CHC, su recurrencia es muy alta, y dicho tratamiento para la inflamación crónica tiene que ser realizado simultáneamente, se requieren estrategias terapéuticas para la hepatitis crónica y el CHC, las cuales están especializadas para el desarrollo y la progresión del cáncer de hígado causado por el genotipo C del VHB exclusivamente presente en Corea. En consecuencia, anteriormente se han utilizado interferón y lamivudina como agentes antivirales para tratar la hepatitis B crónica, pero tienen efectos secundarios y una baja reactividad. En los últimos años, se han desarrollado y utilizado adefovir, tenofovir, etc., como fármacos para inhibir la proliferación del virus y retrasar el daño hepático. Aunque estos fármacos tienen el efecto de inhibir la proliferación del virus y retrasar el daño hepático, es posible que no eliminen los virus por completo ni traten la hepatitis. Por lo tanto, es necesaria una prescripción continua por lo que aparece la resistencia, y se presenta hepatotoxicidad y nefrotoxicidad debido a la naturaleza de los fármacos. En los últimos años, dado que un agente único contra el cáncer de hígado disponible clínicamente, como el sorafenib, tiene un rango de tratamiento limitado y se requiere una estrecha vigilancia de la progresión del tratamiento, la investigación sobre el desarrollo de un nuevo agente contra el cáncer de hígado está avanzando en todo el mundo. La mayoría de las sustancias en desarrollo son inhibidores de la quinasa derivados de un inhibidor múltiple de la quinasa, tal como sorafenib, o inhibidores angiogénicos que inhiben la angiogénesis necesaria para la progresión del cáncer de hígado. No se obtuvo ningún resultado significativo de los resultados de un ensayo clínico de fase 2 para un inhibidor del receptor del factor de crecimiento epidérmico que es sabido está sobreexpresado en el 66% de los pacientes con CHC. Un inhibidor de la tirosina quinasa de bajo peso molecular desarrollado para la inhibición angiogénica, como el brivanib, y un anticuerpo monoclonal como el ramucirumab no obtuvieron buenos resultados en los ensayos clínicos de fase 2. Dado que se han notificado anomalías en el sistema de señalización mTOR en el 40-50% de los pacientes con CHC, se puso en marcha un ensayo clínico de fase 3 de inhibidores de mTOR que incluía everolimus en pacientes que no respondían al sorafenib, pero no se demostraron efectos significativos, en comparación con un placebo. Como nueva estrategia terapéutica, también se está intentando desarrollar agentes terapéuticos para el CHC utilizando materiales de bajo peso molecular inhibidores de c-MET y MEK.

La mayoría de los nuevos materiales terapéuticos, ahora en desarrollo, han entrado en la fase inicial de los ensayos clínicos, y los medicamentos cuyos ensayos clínicos están casi terminados no pueden ser utilizados como medicamentos primarios, y exhiben efectos significativos sólo cuando se utilizan en combinación con el sorafenib convencional. Por lo tanto, se espera que el desarrollo de un nuevo fármaco que funcione con un mecanismo diferente al de los medicamentos convencionales en desarrollo, tenga efectos significativos en los pacientes con cáncer de hígado e inhiba la progresión de la hepatitis, revolucione el tratamiento de las enfermedades hepáticas relacionadas.

Entre los fármacos convencionales, la mayoría de los agentes anticancerígenos no han mostrado efectos de tratamiento del CHC en la terapia anticancerígena sistémica, y el sorafenib sólo muestra un efecto de prolongación del tiempo de supervivencia de aproximadamente dos meses. Este sorafenib ni siquiera se considera como tratamiento primario. Por lo tanto, se requiere el desarrollo de agentes anticancerígenos especializados en el CHC que sustituyan a los productos convencionales y puedan utilizarse en pacientes resistentes a la terapia.

Por su parte, el virus de la inmunodeficiencia humana (en adelante en la presente memoria, denominado VIH) es un virus que pertenece a la familia Retroviridae y al género Lentivirus. El lentivirus puede infectar a varias especies vivas, y es un agente causal que induce una enfermedad crónica con un largo periodo de incubación.

El ciclo de vida del VIH puede consistir, a grandes rasgos, en la invasión de las células huésped, la replicación y la transcripción en las células, la recombinación de los genomas virales y, finalmente, la síntesis de los virus y la secreción fuera de las células. El VIH puede ser inhibido bloqueando cualquiera de las etapas del procedimiento de proliferación del VIH descrito anteriormente.

Los fármacos que se han desarrollado recientemente como agentes terapéuticos y se han utilizado en pacientes consisten en inhibidores de la fusión, inhibidores de la transcriptasa inversa que convierten el ARN en ADN, e inhibidores de la proteasa que son fármacos que bloquean un proceso de digestión de una proteína por parte de una proteasa.

El objetivo del tratamiento contra el VIH es recuperar el sistema inmunitario del paciente inhibiendo fuertemente el VIH para que éste se encuentre en un estado de no proliferación y manteniendo este estado el mayor tiempo posible, y reducir la morbilidad y la mortalidad debidas a la infección por el VIH. Sin embargo, cuando se interrumpe el tratamiento contra el VIH, éste vuelve a aparecer y la inmunidad también disminuye. Por esta razón, una vez iniciado el tratamiento, no se puede interrumpir a la mitad, que es el límite en el tratamiento contra el VIH que se utiliza actualmente. Esto significa que el problema de que el tratamiento contra el VIH debe continuar durante al menos varios años, y a menos que se desarrolle un procedimiento curativo, durante varias décadas, haciendo que el paciente tenga que soportar una carga económica y los efectos secundarios que conlleva la administración a largo plazo de un fármaco, y en particular, se debe considerar que el fármaco puede tener efectos secundarios que se revelarán gradualmente con el aumento del período de su uso, así como los efectos secundarios actualmente conocidos. Los fármacos actuales contra el VIH también pueden tener un problema importante en el que el VIH adquiere resistencia a los medicamentos y, por tanto, es difícil de tratar debido a la dificultad de tomarlos adecuadamente durante mucho tiempo. Por lo tanto, es necesario desarrollar un nuevo agente terapéutico que pueda superar varias desventajas de los agentes terapéuticos convencionales, mostrar un efecto inhibidor sobre el propio VIH y mejorar la actividad de las células inmunitarias. Se ha informado de que los péptidos que comprenden la secuencia EARPALLTSRLRFIPK, derivados de la telomerasa, pueden utilizarse como agentes antiinflamatorios. Los ejemplos de enfermedades a tratar incluyen las infecciones virales tal como el VIH (documento WO 2013/167298 A 1,2013).

[Divulgación]

[Problema técnico]

La presente invención está dirigida a proporcionar una composición antiviral para prevenir y tratar una enfermedad viral, que es eficaz y no tiene efectos secundarios.

[Solución técnica]

La presente invención se define en las reivindicaciones y proporciona una composición antiviral para uso en un procedimiento para prevenir o tratar una enfermedad viral mediante la inhibición de los virus a través de la inhibición de la replicación viral, en la que el procedimiento comprende administrar la composición antiviral a un individuo que tiene una enfermedad viral, en la que la composición comprende al menos uno seleccionado del grupo que consiste en: un péptido de la SEQ ID NÚM.: 1, un péptido que tiene al menos un 80% de homología de secuencia con la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NÚM.: 1, y un fragmento de dicho péptido, como ingrediente activo.

En una realización de la presente invención, el fragmento es un fragmento compuesto por al menos tres aminoácidos.

En otra realización de la presente invención, la replicación viral está mediada por HSP90.

En otra realización de la presente invención, los virus son virus de ADN o de ARN.

En otra realización de la presente invención, los virus son uno o más seleccionados del grupo que consiste en virus dsDNA-RT, virus ssRNA-RT y virus ssRNA.

En otra realización de la presente invención, los virus pertenecen a la familia Retroviridae, a la familia Flaviviridae o a la familia Hepadnaviridae.

En otra realización de la presente invención, los virus son el virus de la hepatitis C (VHC), el virus de la hepatitis B (VHB) o el virus de la inmunodeficiencia humana (VIH).

En otra realización de la presente invención, una concentración del péptido en la composición es de 0,0001 a 100 pM, o una dosis diaria del péptido es de 0,01 pg/kg/día a 10 g/kg/día.

En otra realización de la presente invención, la composición es una composición farmacéutica.

En otra realización de la presente invención, la composición es una composición alimentaria.

En otra realización de la presente invención, el péptido está contenido en una forma conjugada con un material de etiquetado.

En otra realización de la presente invención, el material de etiquetado es un material de contraste o un material fluorescente, como FITC.

[Efectos ventajosos]

Dado que un péptido que comprende una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NÚM.: 1, un péptido que tiene al menos un 80% de homología de secuencia con la secuencia de aminoácidos, y un fragmento del mismo de acuerdo con la presente invención tiene un efecto inhibidor de virus, se proporciona una composición antiviral para uso en un procedimiento para tratar o prevenir una enfermedad viral mediante la inhibición de virus a través de la inhibición de la replicación viral.

[Descripción de los dibujos]

La FIG. 1 es un gráfico del grado de producción de ROS cuando las líneas celulares JFH-1 se incuban con un vehículo, antioxidantes convencionales (NAC (20 mM), PDTC (100 j M), vitamina E (10 j M)) y diferentes concentraciones de PEP1, respectivamente, durante 2 horas.

La FIG. 2 es una imagen que muestra el análisis de inmunotransferencia para las líneas celulares JFH-1 utilizando anticuerpos específicos para HSP90, p-p-38, p38, p-JNK, JNK, p-ERK, ERK y GAPDH tras el tratamiento con un vehículo, PEP1, NAC (20 mM), pDTC (100 j M) y vitamina E (10 j M) durante 2 horas.

La FIG. 3 es un gráfico que muestra las proporciones de producción de ROS cuando se administra PEP1 a las líneas celulares JFH-1 tras el tratamiento con anticuerpos de control (isotipo), anticuerpos anti-HSP70 y anticuerpos anti-HSP90, respectivamente, en comparación con un grupo de control (DMSO, vehículo).

La FIG. 4 es un gráfico que muestra las proporciones de producción de ROS cuando se administra un antioxidante PDTC a las líneas celulares JFH-1 tras el tratamiento con anticuerpos de control (isotipo), anticuerpos anti-HSP70 y anticuerpos anti-HSP90, respectivamente, en comparación con un grupo de control (DMSO, vehículo).

La FIG. 5 es un gráfico que muestra las proporciones de producción de ROS cuando se administra PEP1 a las líneas celulares JFH-1 tras el tratamiento con un grupo de control (DMSO, vehículo), el inhibidor de HSP70 KNK (10 j M) y el inhibidor de HSP90 17AAG (1 j M), respectivamente, en comparación con un grupo de control (PBs ).

La FIG. 6 es un gráfico que muestra las proporciones de producción de ROS cuando se administra un antioxidante PDTC a las líneas celulares JFH-1 después del tratamiento con un grupo de control (DMSO, vehículo), el inhibidor de HSP70 KNK (10 j M) y el inhibidor de HSP90 17AAG (1 j m ), respectivamente, en comparación con un grupo de control (PBS).

La FIG. 7 es un gráfico que muestra las proporciones de producción de ROS cuando una línea celular JFH-1 se incuba con PEP1 y DMSO, o se cultiva durante dos horas con una concentración creciente de PDTC.

La FIG. 8 es un gráfico que muestra los niveles de expresión (ng/ml) de HSP90 cuando una línea celular Huh7.5 es tratada con un tipo de ROS como el peróxido de hidrógeno, en comparación con el tratamiento con un grupo de control (PBS) mediante ELISA.

La FIG. 9 es un gráfico que muestra los niveles de expresión (ng/ml) de HSP90 cuando una línea celular JFH-1 es tratada con un antioxidante PDTC, en comparación con el tratamiento con un grupo de control (PBS) a través de ELISA (La barra de error representa un error estándar de la media (SEM). En comparación con un control de vehículo, *P < 0,05 y **P < 0,01. Los valores P se obtienen a partir de una prueba t de Student de dos colas para muestras independientes, y son los valores representativos obtenidos de dos a cinco experimentos independientes).

La FIG. 10 es un gráfico que muestra el resultado de la citometría de flujo para células de una línea celular JHF-1 incubadas con PEP1 conjugado con isotiocianato de fluoresceína (FiTC) (FITC-PEP1) durante 2 horas, y luego con MbCD (5 mM), y el resultado es el valor representativo obtenido de tres experimentos independientes.

La FIG. 11 es un gráfico que muestra el resultado de la citometría de flujo para células de una línea celular JHF-1 incubadas con PEP1 conjugado con FITC (FITC-PEP1) durante 2 horas, y luego con anticuerpos anti-LRPl, y el resultado es el valor representativo obtenido de tres experimentos independientes.

La FIG. 12 es un gráfico que muestra el resultado de la citometría de flujo para las células de una línea celular JHF-1 incubadas con PEP1 conjugado con FITC (FITC-PEP1) durante 2 horas, y luego con LRP1 siRNA (200 nM), y el resultado es el valor representativo obtenido de tres experimentos independientes.

La FIG. 13 es un gráfico que muestra el resultado de la citometría de flujo para células de una línea celular JHF-1 incubadas con PEP1 conjugado con FITC (FITC-PEP1) durante 2 horas, y luego con PDTC, y el resultado es el valor representativo obtenido de tres experimentos independientes.

La FIG. 14 es un gráfico que muestra el resultado de la citometría de flujo para células de una línea celular JHF-1 incubadas con PEP1 conjugado con FITC (FITC-PEP1) durante 2 horas, y luego con H²O², y el resultado es el valor representativo obtenido de tres experimentos independientes.

La FIG. 15 es un gráfico que muestra la producción de ROS medida con el procedimiento DCF-DA tras el tratamiento una línea celular JFH-1 con PEP1 (10 |jM), PDTC (100 j M) o PBS durante dos horas, y transfectada con siRNA entremezclada o siRNA LRP1 (La barra de error indica el SEM. En comparación con un control codificado, **P < 0,01, el valor P se obtiene a partir de una prueba t de Student de dos colas para muestras independientes, y es el valor representativo obtenido de tres experimentos independientes).

La FIG. 16 muestra la actividad anti-VHC in vitro del PEP1, medida por PCR cuantitativa para un transcrito NS2 del VHC cuando se cultiva una línea celular JFH-1 con PEP1, nAc (20 mM), PDTC (100 j M) y vitamina E (10 j M) durante 48 horas.

La FIG. 17 muestra el transcrito NS2 en una línea celular JFH-1, medido tras la incubación con anticuerpos anti-HSP70, anticuerpos anti-HSP90 o anticuerpos de control (isotipo) durante 2 horas en presencia de PEP 1 (10 j M).

La FIG. 18 muestra el resultado obtenido cuando una línea celular JFH-1 es transfectada con siRNA entremezclada o siRNA LRP1 durante 18 horas, y tratada con PEP1 (10 j M) o PBS durante dos horas (La barra de error indica el SEM. En comparación con un vehículo o un control PBS, *P < 0,05, **P < 0,01 y ***P < 0,001. Los valores P se obtienen a partir de una prueba t de Student de dos colas para muestras independientes, y son los valores representativos se obtienen a partir de tres o cuatro experimentos independientes).

La FIG. 19 muestra que, en una línea celular JFH-1, PEP1 inhibe una interacción entre FKBP8 que interviene en la replicación del ARN del VHC y la unión de HSP90 al mismo (el resultado es el valor representativo obtenido de dos experimentos independientes).

La FIG. 20 muestra el tejido hepático de un paciente infectado por el VHC crónico, teñido con HSP90 (rojo) por inmunohistoquímica, en el que el núcleo está contratintado con DAPI (azul), y el tejido hepático obtenido de un paciente con hepatitis autoinmune (AIH) o de un paciente con hepatitis B se utiliza como control.

La FIG. 21 muestra las células JFH-1 inmunizadas con HSP90, tras la incubación con PEP1 (10 j M) o PBS durante 2 horas, y el resultado es el valor representativo obtenido de dos experimentos independientes.

La FIG. 22 muestra un efecto de PEP1 sobre la viabilidad celular, que se evalúa por tratamiento las células MT-4, IG5 y ACH-2 con concentraciones crecientes de PEP1 durante 5 días, y realización de un ensayo de MTT.

La FIG. 23 muestra un efecto de PEP1 sobre la producción de virus del VIH-1, que se obtiene por tratamiento de células MT-4 infectadas por el VIH-1 con concentraciones crecientes de PEP1 (la cantidad de partículas virales en el sobrenadante se mide por ELISA de p24).

La FIG. 24 muestra un efecto de PEP1 sobre la expresión de eGFP (eGFP se expresa como el VIH-1 Nef) monitorizado mediante un microscopio de fluorescencia, después de que las células MT-4 infectadas por el VIH-4 sean tratadas con concentraciones crecientes de PEP1.

La FIG. 25 muestra la inhibición de la producción de partículas virales del VIH-1, que se analiza midiendo el nivel de genomas virales en el sobrenadante mediante RT-qPCR después de que las células MT-4 infectadas por el VIH-1 sean tratadas con AZT o PEP1 en concentraciones que se incrementan gradualmente.

La FIG. 26 muestra un efecto protector de PEP1 frente a la muerte celular asociada a la infección por VIH-1, analizado mediante la evaluación de la viabilidad celular a través de p24 ELISA después de infectar células MT-4 (1x104) con virus VIH-1 (4x10⁵CCID⁵⁰) y tratarlas con AZT durante 5 días (Los datos se expresan como media ± desviación estándar (SD)).

La FIG. 27 muestra un efecto protector de PEP1 frente a la muerte celular asociada a la infección por VIH-1, analizado mediante la evaluación de la viabilidad celular a través de p24 ELISA después de infectar células MT-4 (1x104) con virus VIH-1 (4x10⁵CCID⁵⁰) y tratarlas con PEP1 durante 5 días (Los datos se expresan como media ± SD).

La FIG. 28 muestra el resultado de un ensayo de tiempo de adición para evaluar la replicación del VIH-1 mediante ELISA de p24 cinco días después de que las células MT-4 se infecten con el VIH-1 y se traten con los fármacos designados contra el VIH-1 que contienen PEP1 en diferentes puntos temporales.

La FIG. 29 muestra imágenes representativas de eGFP obtenidas mediante un ensayo de tiempo de adición. La FIG. 30 muestra el efecto de PEP1 en la inhibición de la síntesis de ARNm viral del VIH-1, analizado mediante la evaluación de los niveles de ARNm viral a través de RT-qPCR después de que las células MT-4 se infecten con el VIH-1, y se traten con un vehículo o con fármacos antivirales en los puntos de tiempo designados (los datos se expresan como media ± SD. * indica p<0,05 y *** indica p<0,001, frente a DMSO). La FIG. 31 muestra que el tratamiento con AZT o PEP1 redujo el efecto de la infección del VIH-1 en relación con la actividad de la luciferasa del VIH-LTR en aproximadamente cinco veces.

La FIG. 32 muestra la inhibición de la transcripción del VIH-1 dependiente de Tat por parte de PEP1.

La FIG. 33 muestra un efecto inhibidor de PEP1 sobre la reactivación del VIH-1 tras un periodo de incubación. La FIG. 34 muestra un efecto inhibidor de PEP1 sobre la reactivación del VIH-1 tras un periodo de incubación. La FIG. 35 muestra que PEP1 desempeña un rol importante de la HSP90 cuando presenta una actividad contra el VIH-1.

La FIG. 36 muestra imágenes representativas de eGFP obtenidas en la FIG. 35.

La FIG. 37 muestra el rol crítico de HSP90 cuando PEP1 exhibe una actividad contra el VIH-1.

La FIG. 38 muestra el resultado de un ensayo de doble luciferasa, realizado en células MT-4 después de la transfección con plásmidos reporteros de luciferasa de luciérnaga NF-kB y luciferasa de renilla promotora de CMV y luego con VIH-1 (1x10⁶CCID⁵⁰), y tratados con los compuestos designados durante 24 horas (los datos se expresan como media ± SD. *** indica p<0,001 frente a DMSO).

La FIG. 39 muestra el resultado de un ensayo de desplazamiento de movilidad electroforética (EMSA), realizado en células MT-4 después de la infección con el VIH-1, y luego tratadas con DMSO, AZT o PEP1 como se describe en la FIG. 38, y se sometió a la extracción de una fracción nuclear después de 24 horas. La FIG. 40 muestra el uso de oligómeros competitivos de NF-kB y AP-2 para confirmar la exactitud.

La FIG. 41 muestra las células ACH-2 observadas con un microscopio confocal, tras la estimulación con TNF-a (30ng/ml) o forbol 12-miristato 13-acetato (PMA) (50 nM) durante una hora, tratadas con DMSO, AZT o PEP1 durante 24 horas, permeabilizadas con anticuerpos anti-p65 NF-kB y anticuerpos secundarios conjugados con Alexa-fluorescente 594, y teñidas con tinción nuclear simple DApI.

La FIG. 42 muestra el resultado de un ensayo de doble luciferasa realizado en células MT-4 después de la transfección con plásmidos informadores de luciferasa de luciérnaga NF-kB y luciferasa de renilla promotora del CMV, tratados con los anticuerpos designados (10 ng/ml) o 17-AAG (1|jM) durante 1 hora antes de la infección por el VIH, y tratados con DMSO, AZT o PEP1 durante 24 horas después de la infección por el VIH (los datos se expresan como media ± SD. *** indica p<0,001 frente a DMSO).

La FIG. 43 muestra la comparación en la síntesis de HBsAg por PEP1 en varias líneas celulares de cáncer de hígado humano transfectadas con el genoma completo de VHB W4P.

La FIG. 44a muestra la comparación en la formación de viriones por el péptido PEP1 en una línea celular HepG2 transfectada con el genoma completo del VHB W4P.

La FIG. 44b muestra la comparación en la formación de viriones por el péptido PEP1 en una línea celular Huh7 transfectada con el genoma completo de VHB W4P.

La FIG. 44c muestra la comparación en la formación de viriones por el péptido PEP1 en una línea celular Huh7.5 transfectada con el genoma completo de VHB W4P.

La FIG. 45 muestra la comparación en la síntesis de HBsAg en función de la concentración del péptido PEP1 en una línea celular HepG2 transfectada con el genoma completo de VHB W4P.

La FIG. 46 muestra la comparación en la síntesis de viriones en función de la concentración del péptido PEP1 en una línea celular HepG2 transfectada con el genoma completo de VHB W4P.

La FIG. 47 muestra el efecto del péptido PEP1 sobre la expresión de HNF4a, analizada mediante western blot.

La FIG. 48 muestra un efecto del péptido PEP1 sobre IL-6.

La FIG. 49 muestra el efecto de PEP1 en la síntesis de HBsAg y en los viriones en ratones transgénicos del genoma W4P del VHB.

La FIG. 50 muestra el efecto del péptido PEP1 sobre la expresión de proteínas en ratones transgénicos del genoma W4P del VHB.

La FIG. 51a muestra el efecto del péptido PEP1 en la distribución de los inmunocitos (linfocitos CD8) en ratones transgénicos del genoma W4P del VHB.

La FIG. 51b muestra el efecto del péptido PEP1 en la distribución de los inmunocitos (linfocitos CD4) en ratones transgénicos del genoma W4P del VHB.

La FIG. 51c muestra el efecto del péptido PEP1 en la distribución de los inmunocitos (linfocitos B) en los ratones transgénicos del genoma W4P del VHB.

La FIG. 51d muestra el efecto del péptido PEP1 en la distribución de los inmunocitos (linfocitos NK1.1) en ratones transgénicos del genoma W4P del VHB.

La FIG. 51e muestra el efecto del péptido PEP1 en la distribución de los inmunocitos (células dendríticas mieloides, DC mieloides) en ratones transgénicos del genoma W4P del VHB.

La FIG. 51f muestra el efecto del péptido PEP1 en la distribución de los inmunocitos (macrófagos) en ratones transgénicos del genoma W4P del VHB.

La FIG. 51g muestra el efecto del péptido PEP1 en la distribución de los inmunocitos (neutrófilos) en ratones transgénicos del genoma W4P del VHB.

La FIG. 51h muestra el efecto del péptido PEP1 en la distribución de los inmunocitos (monocitos) en ratones transgénicos del genoma W4P del VHB.

La FIG. 52a muestra el efecto del péptido PEP1 sobre la activación de los inmunocitos (linfocitos CD4) y el INFy.

La FIG. 52b muestra el efecto del péptido PEP1 sobre la activación de los inmunocitos (linfocitos CD4) y el INFy.

La FIG. 52c muestra el efecto del péptido PEP1 sobre la activación de los inmunocitos (linfocitos CD8) y el INFy.

La FIG. 52d muestra el efecto del péptido PEP1 sobre la activación de los inmunocitos (linfocitos CD8) y el INFy.

La FIG. 52e muestra el efecto del péptido PEP1 sobre la activación de los inmunocitos (NK1.1) y el INFy. La FIG. 52f muestra el efecto del péptido PEP1 sobre la activación de los inmunocitos (NK1.1) y el INFy. La FIG. 52g muestra el efecto del péptido PEP1 sobre la activación de los inmunocitos (NK1.1) y el INFy. La FIG. 53 muestra el efecto del péptido PEP1 sobre la diferenciación de los macrófagos en ratones transgénicos del genoma W4P del VHB.

La FIG. 54 muestra un efecto antiviral del péptido PEP1 mediante el bloqueo de HSP90 en células transgénicas con genoma de tipo salvaje del VHB.

[Modos de la invención]

La presente invención puede modificarse de varias formas y tener varias realizaciones, por lo que se describirá en detalle en base a los ejemplos a continuación. Sin embargo, estos ejemplos no se proporcionan para limitar la presente invención a realizaciones específicas, y debe entenderse que la presente invención puede tener varios ejemplos y aplicaciones como se describe en las reivindicaciones.

Es sabido que un telómero, que es un material genético repetitivo situado en cada extremo de un cromosoma, impide que se produzcan daños en el cromosoma correspondiente o que se acople a otro cromosoma. El telómero se acorta gradualmente con las divisiones celulares, llegando a ser muy corto después de un cierto número de divisiones celulares, y la célula finalmente deja de dividirse y muere. Por otro lado, es sabido que el alargamiento de un telómero prolonga la vida de una célula. Por ejemplo, es sabido que, en las células cancerosas, una enzima llamada telomerasa se sobreexpresa para evitar el acortamiento de los telómeros, lo que da lugar a una proliferación constante de las células cancerosas, sin que éstas mueran. Los inventores de la presente han confirmado que un péptido derivado de una telomerasa es eficaz en la prevención y el tratamiento de enfermedades antivirales y asociadas a virus, y así se completó la especificación.

La proteína HSP90 es una chaperona molecular, a cargo de la estabilización de varias proteínas implicadas en el crecimiento, la diferenciación y la supervivencia de las células, en particular, la homeostasis en un entorno de estrés. HSP90 se denomina "HSP90 intracelular (iHSP90)", que está presente en las células, y también "HSP90 extracelular (eHSP90)", que está presente fuera de las células. Curiosamente, en las células cancerosas se observaron HSP90 liberadas y HSP90 de superficie celular, y estas proteínas eHSP90 estimulan el crecimiento del cáncer y la angiogénesis. Las células, aparte de las cancerosas, también producen eHSP90 en diversas condiciones ambientales, por ejemplo, calor, poco oxígeno, inanición y presencia de citoquinas. Dado que eHSP90 tiene una función diferente de iHSP90, e interactúa con varias proteínas de la superficie celular, puede controlar una vía de señalización celular.

Los inventores de la presente han confirmado que HSP90 está asociada a una variedad de condiciones patológicas como el cáncer, la cirrosis y las infecciones virales. Han confirmado que numerosas proteínas asociadas a la carcinogénesis, la invasión y la metástasis están contenidas en moléculas vinculables a la HSP90 y, por lo tanto, ésta puede ser una fuerte diana como agente terapéutico contra el cáncer.

En un aspecto, la presente divulgación sugiere que un péptido 16mer derivado de hTERT (611-EARPALLTSRLRFIPK-626, SEQ ID NÚM.: 1), conocido como el péptido p Ep 1, interactúa con HSP90 desempeñando un rol crítico en la homeostasis de las proteínas, y presenta un efecto antiviral al regular la señalización celular.

En un aspecto, la presente divulgación proporciona una vacuna peptídica derivada de la transcriptasa inversa de la telomerasa. Específicamente, en un aspecto de la presente divulgación, se proporciona una vacuna peptídica de aminoácidos derivada de la telomerasa inversa humana (hTERT). Más específicamente, en un aspecto de la presente divulgación, se proporciona un péptido PEP1, que es un péptido de 16 aminoácidos derivado de hTERT, conocido como GV1001® como vacuna antiviral.

Ha sido confirmado que el péptido (en adelante en la presente memoria, denominado PEP1) de acuerdo con un aspecto de la presente divulgación es un péptido sintético derivado de la telomerasa humana, que es capaz de desempeñar diversas funciones biológicas.

Los inventores de la presente han identificado que PEP1 interactúa con una proteína de choque térmico (HSP) y regula la señalización intracelular. Como se muestra en un aspecto de la presente divulgación, se ha confirmado que HSP90 ayuda a la penetración de PEP1 en las células, y PEP1 interactúa con eHSP y penetra en el citoplasma de las células. Esta investigación demuestra que PEP1 puede regular una vía de señalización intracelular mediante la interacción a través de HSP.

En otro aspecto, la presente divulgación muestra que el efecto antioxidante de PEP1 es un efecto de inhibición de la replicación del VHC en células infectadas por el VHC con un aumento de las especies reactivas de oxígeno (ROS). Específicamente, en un aspecto de la presente divulgación, se ha identificado que las ROS aumentan en las células infectadas por el VHC, el aumento de las ROS promueve la secreción de HSP90, y se mejora la penetración celular de la unión de PEP1 a HSP90 para inhibir la replicación y proliferación del VHC en las células. En un aspecto de la presente divulgación, debido a diversas actividades biológicas de PEP1 exhibidas a través de HSP90, se proporciona un nuevo fármaco capaz de inhibir la replicación y proliferación del VHC.

En otro aspecto, la presente divulgación proporciona un nuevo tipo de agente terapéutico contra el VIH en base a péptidos, capaz de superar la resistencia del VIH y los efectos secundarios de los medicamentos con respecto a un agente antirretroviral convencional. Es sabido que la muerte celular de las células infectadas se produce intrínsecamente por la estimulación de un mecanismo apoptótico. Los inventores de la presente han confirmado que PEP1 inhibe la multiplicación del VIH mostrando un efecto antiviral sobre el VIH por sí mismo, y previene la muerte celular en la línea celular infectada por el VIH. En un aspecto de la presente divulgación, se ha confirmado que el estado de las células se mantiene normalmente y se minimiza la citotoxicidad del VIH o la muerte celular.

En otro aspecto de la presente divulgación, se proporciona un nuevo tipo de agente terapéutico contra el VHB que es capaz de superar los efectos secundarios de los fármacos convencionales contra la hepatitis viral B en base a péptidos, tal como la hepatotoxicidad y la nefrotoxicidad exhibidas en la administración continua. La presente divulgación de los inventores de la presente proporciona un material novedoso para tratar el CHC mediante la inhibición antiviral causada por la acción combinada de un efecto anticanceroso causado por la inhibición de una vía de señalización de STAT3 mediante PEP1, la citotoxicidad directa y la inhibición de la producción de IL-6 y un efecto inhibidor de la hepatitis.

En un aspecto de la presente invención, un péptido de SEQ ID NÚM.: 1, un fragmento del péptido de SEQ ID NÚM.: 1 o un péptido con al menos un 80% de homología de secuencia con la secuencia peptídica comprende un péptido derivado de la telomerasa de Homo sapiens.

Los péptidos desvelados en la especificación pueden incluir péptidos con al menos un 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% y 99% de homología de secuencia. Además, los péptidos desvelados en la especificación pueden incluir un péptido en el que al menos 1, 2, 3, 4, 5, 6 o 7 aminoácidos son diferentes del péptido de SEQ ID Nú M.: 1 o sus fragmentos.

En un aspecto de la presente invención, el péptido contenido en la composición se conjuga con un material de etiquetado. De acuerdo con otro aspecto, el material de etiquetado puede ser un material fluorescente o un medio de contraste. En otro aspecto de la presente invención, el material fluorescente puede ser isotiocianato de fluoresceína (FITC).

En un aspecto de la presente invención, el cambio de aminoácidos tiene la propiedad de cambiar las características fisicoquímicas del péptido. Por ejemplo, los aminoácidos pueden cambiarse para mejorar la estabilidad térmica, cambiar la especificidad del sustrato y cambiar el pH óptimo del péptido.

El término "aminoácido" utilizado en la presente memoria no sólo incluye los 22 aminoácidos estándar que se integran de forma natural en un péptido, sino que también incluye los isómeros D y los aminoácidos transformados. Por lo tanto, en un aspecto de la presente invención, el péptido puede ser un péptido que incluye un D-aminoácido. Por otra parte, en otro aspecto de la presente invención, el péptido puede incluir un aminoácido no estándar, que se somete a una modificación postraduccional. Los ejemplos de la modificación postraduccional incluyen la fosforilación, la glicosilación, la acilación (incluyendo la acetilación, la miristorilación y la palmitoilación), la alquilación, la carboxilación, la hidroxilación, la glicación, la biotinilación, la ubiquitinilación, un cambio en las propiedades químicas (por ejemplo, la p-desimidación, la desamidación) y un cambio estructural (por ejemplo, la formación de un puente disulfuro). La modificación postraduccional también incluye los cambios de aminoácidos que se producen debido a reacciones químicas durante el acoplamiento con reticulantes para la formación de un conjugado peptídico, por ejemplo, un cambio en un aminoácido como un cambio en un grupo amino, un grupo carboxilo o una cadena lateral.

El péptido desvelado en la presente memoria puede ser un péptido de tipo salvaje identificado y aislado de una fuente natural. Alternativamente, el péptido desvelado en la especificación puede ser una variante artificial que comprende una secuencia de aminoácidos en la que uno o más aminoácidos son sustituidos, eliminados y/o insertados en comparación con los fragmentos del péptido de SEQ ID NÚM.: 1. El cambio de aminoácidos en el polipéptido de tipo salvaje, así como en la variante artificial, incluye sustituciones de aminoácidos conservadores, que no tienen una influencia significativa en el plegamiento y/o la actividad de una proteína. La sustitución conservadora puede llevarse a cabo dentro del rango del grupo que consiste en aminoácidos básicos (arginina, lisina e histidina), aminoácidos ácidos (ácido glutámico y ácido aspártico), aminoácidos polares (glutamina y asparagina), aminoácidos Hidrófobos (leucina, isoleucina, valina y metionina), aminoácidos aromáticos (fenilalanina, triptófano y tirosina) y aminoácidos pequeños (glicina, alanina, serina y treonina). En general, las sustituciones de aminoácidos que no cambian las actividades específicas son conocidas en la técnica. Los intercambios más frecuentes tienen lugar entre Ala/Ser, Val/Ile, Asp/Glu, Thr/Ser, Ala/Gly, Ala/Thr, Ser/Asn, Ala/Val, Ser/Gly, Tyr/Phe, Ala/Pro, Lys/Arg, Asp/Asn, Leu/Ile, Leu/Val, Ala/Glu y Asp/Gly, y viceversa. Otros ejemplos de la sustitución conservadora se muestran en la siguiente tabla.

[Tabla 1]

En cuanto a las propiedades biológicas del péptido, se realiza una modificación sustancial por la selección de una parte de sustitución que tiene un efecto considerablemente diferente en (a) el mantenimiento de la estructura principal, por ejemplo, una estructura tridimensional en forma de hoja o hélice, del polipéptido en la región sustituida, (b) el mantenimiento de la carga o la hidrofobicidad de la molécula en un sitio objetivo, o (c) el mantenimiento de la masa de una cadena lateral. Los residuos naturales se clasifican en los siguientes grupos, de acuerdo con las propiedades generales de la cadena lateral:

(1) Hidrófobo: norleucina, met, ala, val, leu, ile;

(2) Hidrófilo neutro: cys, ser, thr;

(3) Ácido: asp, glu;

(4) Básico: asn, gln, his, lys, arg;

(5) Residuos que afectan a la orientación de la cadena: gly, pro; y

(6) Aromáticos: trp, tyr, phe.

Las sustituciones no conservadoras pueden realizarse intercambiando un miembro de uno de los grupos con el de otro grupo. Cualquier residuo de cisteína, que no esté asociado al mantenimiento de la estructura tridimensional adecuada del péptido, puede sustituirse típicamente por serina, aumentando así la estabilidad oxidativa de la molécula y evitando reticulaciones inadecuadas, y, a la inversa, puede lograrse una mayor estabilidad añadiendo enlaces de cisteína al péptido.

Un tipo diferente de variante de aminoácido del péptido se hace cambiando un patrón de glicosilación de un anticuerpo. El término "cambio" utilizado en la presente memoria se refiere a la supresión de uno o más residuos de carbohidratos que se encuentran en el péptido y/o la adición de uno o más sitios de glicosilación que no están presentes en el péptido.

La glicosilación en los péptidos es típicamente una glicosilación ligada a N u O. El término "glicosilación ligada a N" utilizado en la presente memoria se refiere a la unión de residuos de carbohidratos a las cadenas laterales de los residuos de asparagina. Como secuencias tripéptidas, asparagina-X-serina y asparagina-X-treonina (en la que la X es cualquier aminoácido, excluyendo la prolina) son secuencias de reconocimiento para unir enzimáticamente un residuo de carbohidrato a una cadena lateral de una asparagina. Por lo tanto, cuando una de estas secuencias tripéptidas está presente en un polipéptido, se crea un sitio potencial de glicosilación. La "glicosilación ligada a O" utilizada en la presente memoria se refiere a la unión de uno de los sacáridos, por ejemplo, N-acetilgalactosamina, galactosa o xilosa, a hidroxiaminoácidos y, más típicamente, a la serina o la treonina, pero también pueden utilizarse 5-hidroxiprolina o 5-hidroxilisina.

La adición de un sitio de glicosilación al péptido se realiza convenientemente cambiando la secuencia de aminoácidos para que contenga la secuencia del tripéptido descrita anteriormente (para un sitio de glicosilación ligado a N). Dicho cambio puede realizarse mediante la adición de uno o más residuos de serina o treonina a la primera secuencia de anticuerpos o la sustitución de la primera secuencia de anticuerpos por uno o más residuos de serina o treonina (para un sitio de glucosilación ligado a O).

Además, el péptido que comprende la secuencia de SEQ ID NÚM.: 1 de acuerdo con un aspecto de la presente divulgación, el fragmento del péptido con la secuencia de SEQ ID NÚM.: 1 o el péptido que tiene al menos un 80% de homología de secuencia con la secuencia del péptido tiene una baja toxicidad intracelular y una alta estabilidad in vivo. En un aspecto de la presente divulgación, SEQ ID NÚM.: 1 representa un péptido derivado de la telomerasa, que comprende 16 aminoácidos como se describirá a continuación.

Los péptidos establecidos en SEQ ID NÚM.: 1 se muestran en la Tabla 2. El "nombre" en la Tabla 2 a continuación se da para distinguir cada péptido. En un aspecto de la presente divulgación, un péptido establecido en SEQ ID NÚM.: 2 es el péptido completo de la telomerasa de Homo sapiens. En otro aspecto de la presente divulgación, el péptido que comprende la secuencia de SEQ ID NÚM.: 1, el péptido de un fragmento de la secuencia de SEQ ID Nú M.: 1 o el péptido que tiene al menos un 80% de homología de secuencia con la secuencia peptídica incluye un "péptido sintético" sintetizado a partir de un péptido presente en un lugar correspondiente de los péptidos incluidos en la telomerasa. SEQ ID NÚM.: 2 representa la secuencia completa de aminoácidos de la telomerasa.

[Tabla 2]

En un aspecto, una composición que comprende el péptido que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NÚM.: 1, el péptido que tiene al menos un 80% de homología de secuencia con la secuencia de aminoácidos o un fragmento de la misma, que es un péptido que tiene un efecto antiviral e inhibidor de virus, como ingrediente activo, se proporciona para uso de acuerdo con la invención. De acuerdo con un aspecto de la presente invención, la composición puede ser una composición farmacéutica.

De acuerdo con un aspecto de la presente invención, el virus puede ser un virus de ADN, un virus de ARN, un virus de transcriptasa inversa de ADN de doble cadena (dsDNA-RT), un virus de transcriptasa inversa de ARN de cadena simple (ssRNA-RT) o un virus de ssRNA.

De acuerdo con otro aspecto de la presente invención, el virus puede ser un miembro de la familia Flaviviridae, Retroviridae o Hepadnaviridae.

De acuerdo con otro aspecto de la presente invención, el virus puede ser el VHC, el VIH o el VHB.

La composición farmacéutica que tiene un efecto antiviral e inhibidor de virus puede, de acuerdo con un aspecto de la presente invención, incluir el péptido que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NÚM.: 1, el péptido que tiene al menos un 80% de homología de secuencia con la secuencia de aminoácidos o un fragmento de la misma en un contenido de 0,01 mg/ml o mayor, 0,02 mg/ml o mayor, 0,05 mg/ml o mayor, 0,07 mg/ml o mayor, 0,1 mg/ml o mayor, 0,15 mg/ml o mayor, 0,2 mg/ml o mayor, 0,25 mg/ml o mayor, 0,3 mg/ml o mayor, 0,5 mg/ml o mayor, 07 mg/ml o mayor, 1 mg/ml o mayor, 2 mg/ml o mayor, 3 mg/ml o mayor, 5 mg/ml o mayor, 7 mg/ml o mayor, 10 mg/ml o mayor, 20 mg/ml o mayor, 30 mg/ml o mayor, 40 mg/ml o mayor, 50 mg/ml o mayor, 60 mg/ml o mayor, 70 mg/ml o mayor, 80 mg/ml o mayor, o 90 mg/ml o mayor, y 100 mg/ml o menor, 90 mg/ml o menor, 80 mg/ml o menor, 70 mg/ml o menor, 60 mg/ml o menor, 50 mg/ml o menor, 40 mg/ml o menor, 30 mg/ml o menor, 20 mg/ml o menor, 10 mg/ml o menor, 7 mg/ml o menor, 5 mg/ml o menor, 3 mg/ml o menor, 2 mg/ml o menor, 1 mg/ml o menor, 07 mg/ml o menor, 0,5 mg/ml o menor, 0,3 mg/ml o menor, 0,25 mg/ml o menor, 0,2 mg/ml o menor, 0,15 mg/ml o menor, 0,1 mg/ml o menor, 0,07 mg/ml o menor, 0,05 mg/ml o menor, o 0,02 mg/ml o menor, pero cuando hay una diferencia de efecto de acuerdo con el contenido, éste puede regularse adecuadamente. Cuando el péptido se incluye en el rango anterior o menor, la composición puede ser adecuada para exhibir un efecto deseado de la presente invención, puede satisfacer tanto la estabilidad como la seguridad de la composición, y puede ser adecuada en términos de rentabilidad.

La composición puede, de acuerdo con un aspecto de la presente invención, incluir el péptido que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NÚM.: 1, el péptido que tiene al menos un 80% de homología de secuencia con la secuencia de aminoácidos o un fragmento de la misma a una concentración de 0,0001 ^M o mayor, 0,001 ^M o mayor, 0,002 ^M o mayor, 0,005 ^M o mayor, 0,007 ^M o mayor, 0,01 ^M o mayor, 0,02 ^M o mayor, 0,05 ^M o mayor, 0,07 ^M o mayor, 0,09 ^M o mayor, 0,1 ^M o mayor, 0,2 ^M o mayor, 0,25 ^M o mayor, 0,3 ^M o mayor, 0,35 ^M o mayor, 0,4 ^M o mayor, 0,45 ^M o mayor, 0,5 ^M o mayor, 0,55 ^M o mayor, 0,6 ^M o mayor, 0,65 ^M o mayor, 0,7 ^M o mayor, 0,75 ^M o mayor, 0,8 ^M o mayor, 0,85 ^M o mayor, 0,9 ^M o mayor, 0,95 ^M o mayor, 1 ^M o mayor, 2 ^M o mayor, 3 ^M o mayor, 5 ^M o mayor, 7 ^M o mayor, 10 ^M o mayor, 30 ^M o mayor, 50 ^M o mayor, o 90 ^M o mayor, y 100 ^M o menor, 90 ^M o menor, 50 ^M o menor, 30 ^M o menor, 10 ^M o menor, 9 ^M o menor, 7 ^M o menor, 5 ^M o menor, 3 ^M o menor, 2 ^M o menor, 1 ^M o menor, 0,95 ^M o menor, 0,9 ^M o menor, 0,85 |jM o menor, 0,8 ^M o menor, 0,75 ^M o menor, 0,7 ^M o menor, 0,65 ^M o menor, 0,6 ^M o menor, 0,55 ^M o menor, 0,5 |jM o menor, 0,45 j M o menor, 0,4 j M o menor, 0,35 j M o menor, 0,3 j M o menor, 0,25 j M o menor, 0,2 j M o menor, 0,1 j M o menor, 0,09 j M o menor, 0,07 j M o menor, 0,05 j M o menor, 0,02 j M o menor, 0,01 j M o menor, 0,007 j M o menor, 0,005 j M o menor, 0,002 j M o menor, 0,001 j M o menor, o 0,0005 j M o menor, y preferentemente de 0,001 j M a 10 j M. Cuando hay una diferencia de efecto de acuerdo con la concentración, ésta puede regularse adecuadamente. Cuando el péptido está contenido en el rango anterior o menor, la composición puede ser adecuada para exhibir un efecto deseado de la presente invención, puede satisfacer tanto la estabilidad como la seguridad de la composición, y puede ser adecuada en términos de rentabilidad.

La composición puede, de acuerdo con un aspecto de la presente invención, aplicarse a todos los animales, incluidos seres humanos, perros, pollos, cerdos, vacas, ovejas, conejillos de indias y monos.

La composición para uso de acuerdo con un aspecto de la presente invención es una composición farmacéutica que comprende el péptido que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NÚM.: 1, el péptido que tiene al menos un 80% de homología de secuencia con la secuencia de aminoácidos o un fragmento de la misma como péptido que tiene un efecto antiviral y un efecto de prevención y tratamiento de una enfermedad relacionada con el virus. La composición farmacéutica puede, de acuerdo con un aspecto de la presente invención, administrarse por vía oral, rectal, transdérmica, intravenosa, intramuscular, intraperitoneal, intramedular, epidural o subcutánea.

Las formas de administración oral pueden ser, pero sin limitación, comprimidos, píldoras, cápsulas blandas o duras, gránulos, polvos, soluciones o emulsiones. Las formas de administración no oral pueden ser, pero sin limitación, inyecciones, gotas, lociones, ungüentos, geles, cremas, suspensiones, emulsiones, supositorios, parches o aerosoles.

La composición farmacéutica puede, de acuerdo con un aspecto de la presente invención, comprender, según sea necesario, aditivos, tal como diluyentes, excipientes, lubricantes, aglutinantes, desintegrantes, tampones, dispersantes, tensioactivos, agentes colorantes, aromáticos o edulcorantes. La composición farmacéutica puede, de acuerdo con un aspecto de la presente invención, ser preparada por un procedimiento convencional en la técnica.

El ingrediente activo de la composición farmacéutica puede, de acuerdo con un aspecto de la presente invención, variar según la edad del paciente, el sexo, el peso, el estado patológico y la gravedad del mismo, la vía de administración o el criterio del prescriptor. La determinación de la dosis en base a dichos factores está dentro del nivel de los expertos en la técnica, y una dosis diaria de la composición puede ser de 0,01 jg/kg/día o más, 0,1 jg/kg/día o más, 1 jg/kg/día o más, 0,0016 mg/kg/día o más, 0,005 mg/kg/día o más, 0,006 mg/kg/día o más, 0,0093 mg/kg/día o más, 0,01 mg/kg/día o más, 0,016 mg/kg/día o más, 0,05 mg/kg/día o más, 0,1 mg/kg/día o más, 0,5 mg/kg/día o más, 1 mg/kg/día o más, 5 mg/kg/día o más, 10 mg/kg/día o más, 50 mg/kg/día o más, 100 mg/kg/día o más, 1 g/kg/día o más, 5 g/kg/día o más, o 9 g/kg/día o más, y 10 g/kg/día o menor, 9 g/kg/día o menor, 5 g/kg/día o menor, 1 g/kg/día o menor, 100 mg/kg/día o menor, 50 mg/kg/día o menor, 10 mg/kg/día o menor, 5 mg/kg/día o menor, 1 mg/kg/día o menor, 05 mg/kg/día o menor, 0,1 mg/kg/día o menor, 0,05 mg/kg/día o menor, 0,017 mg/kg/día o menor, 0,01 mg/kg/día o menor, 0,0094 mg/kg/día o menor, 0,007 mg/kg/día o menor, 0,005 mg/kg/día o menor, 0,0017 mg/kg/día o menor, 1 jg/kg/día o menor, 0,1 jg/kg/día o menor, o 0,05 jg/kg/día o menor. Por ejemplo, la dosis diaria puede ser de 0,01 jg/kg/día a 10 g/kg/día, específicamente de 0,1 jg/kg/día a 1 g/kg/día, más específicamente de 1 jg/kg/día a 0,1 g/kg/día, y aún más específicamente, de 1 jg/kg/día a 10 mg/kg/día, o preferentemente de 1 jg/kg/día a 1 mg/kg/día, más preferentemente de 0,005 mg/kg a 0,05 mg/kg, y más preferentemente 0,01 mg/kg/día, y si hay una diferencia de efecto en función de la dosis, ésta puede ajustarse adecuadamente. Para un adulto (60 kg), la composición puede administrarse diariamente de 0,1 mg a 1 mg, preferentemente, de 0,4 mg a 0,6 mg, y más preferentemente 0,56 mg. La composición farmacéutica puede, de acuerdo con un aspecto de la presente invención, administrarse de una a tres veces al día, pero la presente invención no está limitada a ello.

En un aspecto, la composición para uso de acuerdo con la presente invención es una composición antiviral para prevenir y tratar una enfermedad asociada a un virus, que incluye el péptido que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NÚM.: 1, el péptido que tiene al menos un 80% de homología de secuencia con la secuencia de aminoácidos o un fragmento de la misma como ingrediente activo.

La composición puede, de acuerdo con un aspecto de la presente invención, formularse en forma de, por ejemplo, comprimidos, gránulos, un polvo, un líquido y un sólido, pero la presente invención no está particularmente limitada a ello. Cada forma puede ser preparada sin dificultad por los expertos en la técnica mezclando componentes utilizados convencionalmente así como el ingrediente activo de acuerdo con la forma o el propósito de uso y puede producir un efecto sinérgico en combinación con otros ingredientes.

En otro aspecto de la presente invención, la composición puede ser una composición alimentaria.

La composición alimentaria puede, de acuerdo con un aspecto de la presente invención, formularse en forma de, por ejemplo, comprimidos, gránulos, un polvo, un líquido y un sólido, pero la presente invención no está particularmente limitada a ello. Cada forma puede ser preparada sin dificultad por los expertos en la técnica, mezclando los componentes utilizados convencionalmente así como el ingrediente activo según la forma o el propósito de uso sin dificultad y puede producir un efecto sinérgico en combinación con otros ingredientes.

De acuerdo con un aspecto de la presente invención, la enfermedad viral puede ser el síndrome de inmunodeficiencia adquirida (SIDA), la hepatitis B, la hepatitis C, o la cirrosis hepática o el cáncer de hígado causado por ella.

De acuerdo con un aspecto de la presente divulgación, se describe un kit para prevenir y tratar una enfermedad viral, que comprende la composición; e instrucciones de un procedimiento para prevenir y tratar una enfermedad viral.

De acuerdo con otro aspecto de la presente divulgación, se proporciona un uso del péptido que comprende una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NÚM.: 1, el péptido que tiene al menos un 80% de homología de secuencia con la secuencia de aminoácidos, o un fragmento del mismo para uso en la preparación de la composición.

Los términos utilizados en la especificación pretenden ser utilizados para describir realizaciones específicas, no para limitar la presente invención. Los términos sin números delante de los sustantivos no pretenden limitar la cantidad, sino representar la presencia de al menos un elemento citado en la presente memoria. Los términos "que comprende", "que tiene", "que incluye" y "que contiene" deben interpretarse de forma abierta (es decir, "que incluye pero sin limitación").

La mención de un rango numérico sustituye fácilmente la mención de números individuales dentro del rango, y a menos que se cite lo contrario, cada número se aplica a la especificación como si se mencionara individualmente en la especificación. Los valores finales de todos los rangos se incluyen en el rango y pueden combinarse independientemente.

Todos los procedimientos mencionados en la especificación pueden realizarse en el orden adecuado, a menos que se indique lo contrario o se contradiga explícitamente con el contexto. El uso de cualquiera de las realizaciones y de todas las realizaciones, o el lenguaje ejemplar (por ejemplo, "como", "como aproximadamente"), a menos que se incluya en las reivindicaciones, se utiliza para describir más claramente la presente invención, no para limitar el alcance de la misma. Cualquier terminología de la presente memoria fuera de las reivindicaciones no debe ser interpretada como necesaria para la presente invención. A menos que se definan de otro modo, los términos técnicos y científicos utilizados en la presente memoria tienen el significado que normalmente entienden los expertos en la técnica a la que pertenece la presente invención.

Las realizaciones ejemplares de la presente invención incluyen el mejor modo conocido por los inventores de la presente para llevar a cabo la presente invención. Las variaciones en las realizaciones ejemplares pueden quedar claras para los expertos en la técnica al leer las descripciones anteriores.

En adelante en la presente memoria, la configuración y los efectos de la presente invención se describirán con más detalle haciendo referencia a ejemplos y a ejemplos experimentales. Sin embargo, los siguientes ejemplos y ejemplos experimentales se proporcionan simplemente para ilustrar la presente invención para ayudar a entender la presente invención, y el alcance de la presente invención no se limita a ella.

Ejemplo 1: Síntesis del péptido

El péptido de SEQ ID NÚM.: 1 (en adelante en la presente memoria, denominado "PEP1") se preparó de acuerdo con un procedimiento de síntesis peptídica en fase sólida convencionalmente conocido. Específicamente, el péptido se sintetizó acoplando cada aminoácido del extremo C terminal mediante síntesis peptídica en fase sólida (SPPS) de Fmoc utilizando ASP48S (Peptron, Inc., Daejeon, Corea). Los primeros aminoácidos utilizados en el extremo C terminal de los péptidos y unidos a la resina son los siguientes:

Resina NH2-Lys(Boc)-2-cloro-tritilo

Resina NH2-Ala-2-cloro-tritilo

Resina NH2-Arg(Pbf)-2-cloro-tritilo

En todos los aminoácidos utilizados para sintetizar el péptido, el término N se protegió con Fmoc, y los residuos se protegieron con Trt, Boc, t-butiléster (t-Bu), y 2,2,4,6,7-pentametil dihidro-benzofurano-5-sulfonilo (Pbf) que puede ser eliminado de un ácido. Los ejemplos de aminoácidos son los siguientes: Fmoc-Ala-OH, Fmoc-Arg(Pbf)-OH, Fmoc-Glu(OtBu)-OH, Fmoc-Pro-OH, Fmoc-Leu-OH, Fmoc-Ile-OH, Fmoc-Phe-OH, Fmoc-Ser(tBu)-OH, Fmoc-Thr(tBu)-OH, Fmoc-Lys(Boc)-OH, Fmoc-Gln(Trt)-OH, Fmoc-Trp(Boc)-OH, Fmoc-Met-OH, Fmoc-Asn(Trt)-OH, Fmoc-Tyr(tBu)-OH, Fmoc-Ahx-OH, ácido Trt-Mercaptoacético.

Como reactivos de acoplamiento se utilizaron 2-(1H-Benzotriazol-1-il)-1,1,3,3-teteametilaminio hexafluorofosfato (HBTU)/N-Hidroxibenzotriazol (HOBt)/4-Metilmorfolina (NMM). La desprotección por Fmoc se realizó con piperidina en DMF al 20%. Para aislar el péptido sintetizado de la resina y eliminar el grupo protector del residuo, se utilizó un cóctel de escisión [ácido trifluoroacético (TFA)/triisopropilsilano (TIS)/etanoditiol (e Dt )/H²O=92,5/2,5/2,5/2,5].

Cada péptido se sintetizó mediante un proceso repetido de reacción de cada uno de los aminoácidos correspondientes con el aminoácido de partida protegido por el grupo protector del aminoácido mientras se une a un andamiaje en fase sólida, lavando el producto resultante con un disolvente y realizando la desprotección. Tras escindirse de la resina, el péptido sintetizado se purificó por HPLC, la síntesis se validó por espectrometría de masas (MS) y se liofilizó.

La pureza de todos los péptidos utilizados en la realización fue del 95% o mayor por cromatografía líquida de alto rendimiento.

Un proceso específico para preparar el péptido PEP1 de acuerdo con la presente invención se describirá como sigue.

1) Acoplamiento

El aminoácido (8 equivalentes) protegido con resina NH²-Lys(Boc)-2-cloro-tritilo, y un reactivo de acoplamiento [HBTU (8 equivalentes)/HOBt (8 equivalentes)/NMM (16 equivalentes)] disuelto en DMF se mezclaron y se incubaron durante 2 horas a temperatura ambiente. El producto resultante se lavó secuencialmente con DMF, MeOH y DMF.

2) Desprotección por Fmoc

Se añadió piperidina en DMF al 20% al producto resultante, y la mezcla se hizo reaccionar dos veces durante 5 minutos a temperatura ambiente y luego se lavó secuencialmente con DMF, MeOH y DMF.

3) La estructura principal del péptido [resina NH²-E(OtBu)-A-R(Pbf)-P-A-L-L-T(tBu)-S(tBu)-R(Pbf)L-R(Pbf)-F-I-P-K(Boc)-2-cloro-tritilo] se preparó repitiendo las reacciones 1 y 2.

4) Escisión: El péptido se aisló de la resina completamente sintetizada añadiendo un cóctel de escisión a la resina.

5) Tras añadir éter dietílico enfriado a la mezcla obtenida, se precipitó el péptido obtenido por centrifugación.

6) Tras la purificación por Prep-HPLC, el producto resultante se analizó por LC/MS para identificar un peso molecular, y se liofilizó para preparar un polvo.

Ejemplo 2: Confirmación del efecto de PEP1 sobre el VHC

Cultivo de la línea celular

Una línea celular utilizada en el ejemplo relativo al efecto antiviral del VHC de PEP 1 de acuerdo con un aspecto de la presente invención, como por ejemplo, el carcinoma hepatocelular humano (Huh7.5) se adquirió de la American Type Culture Collection (ATCC; Manassas, VA, EE.UU.), y se construyó una línea celular JFH-1 utilizando clones JFH-1 de VHC2a proporcionados por el Dr. Wakita (Tokyo Metropolitan Institute for Neuroscience, Tokio, Japón) en la línea celular Huh7.5. Todas las líneas celulares se cultivaron en un medio Eagle modificado de Dulbecco (DMEM) que contenía un 10% de FBS y un 1% de antibióticos.

Reactivos y anticuerpos

Los reactivos utilizados en el ejemplo de acuerdo con un aspecto de la presente invención incluían N-acetilcisteína (NAC), ditiocarbamato de pirolidina (PDTC), vitamina E, peróxido de hidrógeno (H²O²) metil-p-ciclodextrina (MbCD), KNK-437 (como KNK, inhibidor de la HSp70), y 17-N-alilamino-17-demetoxi geldanamicina (17AAG, inhibidor de HSP90), que se adquirieron en Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, EE. UU.) y Calbiochem (Temecula, CA, EE. UU.).

Los anticuerpos utilizados en el ejemplo de acuerdo con un aspecto de la presente invención fueron HSP70, HSP90 y anticuerpos de control de isotipo, que se adquirieron de Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, CA, EE. UU.). Los anticuerpos anti-LRPl se adquirieron en Thermo Fisher Scientific (Fremont, CA, EE. UU.).

Medición de ROS intracelulares

Un día después de la siembra de 5x10⁴(células/pocillo) células de la línea celular JFH-1 en una placa de 24 pocillos, se midió la producción intracelular de ROS de acuerdo con varios materiales experimentales. La medición de la actividad intracelular se llevó a cabo mediante la tinción de las células con diacetato de diclorodihidrofluoreseína (DCF-DA; Invitrogen), y la medición de la fluorescencia de la producción de ROS se realizó a 485 nm (emisión)/ 535 nm (excitación) utilizando Infinte M2000 Tecan (Tecan Trading AG, Suiza). Todas las unidades de fluorescencia se expresaron como unidades arbitrarias, y como grupo de control positivo se utilizó peróxido de hidrógeno (H²O², 2 mM). La medición de ROS para las células Huh7.5 también se llevó a cabo mediante el mismo procedimiento descrito anteriormente.

Inmunotransferencia

Las proteínas se obtuvieron de las células utilizando una solución de lisis (Cell Signaling Technology, Danvers, MA, EE. UU.) que contenía un cóctel de inhibidores de proteinasa (Roche, Basilea, Suiza) y un inhibidor de fosfatasa (Roche). Para eliminar los restos que quedaban tras la lisis celular, las células se centrifugaron durante 10 minutos a 4°C. Se analizaron 50 |jg de las proteínas mediante electroforesis en gel de dodecilsulfato de sodio-poliacrilamida al 12% (SDS-PAGE), y luego se transfirieron a una membrana de difluoruro de polivinilideno (PVDF; Millipore, Bedford, MA, EE. UU.). La membrana transferida se reveló utilizando un mini generador de imágenes biomolecular ImageQuant™ LAS 4000 (GE Healthcare Bio-Sciences AB, Suecia), después de que los anticuerpos contra HSP90, p38, p-p38 (Thr180/Tyr182), JNK, p-JNK (Thr183/Tyr185), ERK, p-ERK (Thr202/Tyr204), y la enzima que contiene zinc-cobre SOD (CuZn-SOD) y manganeso-SOD (Mn-SOD) como superóxido dismutasa oxidasa (SODs), y GAPDH (todas adquiridas en Cell Signaling Technology y Santa Cruz Biotechnology) se adhirieron a la membrana y luego se visualizaron con un sustrato de quimioluminiscencia SuperSignal West Pico (Pierce, Rockford, EE. UU.). La p-actina se utilizó para la normalización utilizando un Multi Gauge V 3.0 (Fuji Film, Japón), y el análisis cuantitativo se llevó a cabo por densitometría.

Para la inmunoprecipitación, se lavaron previamente 400 jg de un lisado celular con un inmunoprecipitante de cuentas de proteína A/G más agarosa (Santa Cruz Biotechnology) durante dos horas y luego se centrifugó, seguido de la eliminación de las cuentas. El sobrenadante se cultivó con 4 jg de anticuerpos relacionados, 20 j l de cuentas y un tampón de lisis durante la noche a 4 °C. La inmunoprecipitación se preparó para la inmunotransferencia de anticuerpos anti-HSP90 (Cell Signaling Technology) y FKBP8 (Thermo Fisher Scientific).

Knockdown transitorio mediante LRP1/CD91siRNA

La proteína relacionada con el receptor de lipoproteínas de baja densidad 1 (LRP1)/CD91 (es decir, LRP1) es una proteína que promueve la migración de las células epidérmicas y dérmicas, y ha sido identificada como uno de los receptores h Sp . LRP1 es un receptor para gp96, HSp90, HSP70 y calrecticulina, y un péptido con chaperona por las HSP se unió al receptor, y entró en las células presentadoras de antígenos junto con las HSP. Un complejo LRP1 de unión a eHSP90 se presenta como receptor en la endocitosis y la señalización. Esto demuestra que l Rp 1 influye en la función de la eHSP en un entorno fisiológico o de estrés. Es sabido que la endocitosis del péptido PEP1 De acuerdo con un aspecto de la presente invención depende de eHSP, y eHSP es alojada por el receptor LRP1. Los inventores de la presente han sugerido que LRP1 es importante en la actividad antioxidante del péptido PEP1 de acuerdo con la presente invención en un entorno de estrés oxidante. Los inventores de la presente han demostrado que LRP1 desempeña un rol crítico en la inhibición de la endocitosis del péptido de la presente invención y la producción de ROS en las células JFH-1. Para confirmarlo, se inhibió la actividad de LRP1 utilizando pequeños a Rn de interferencia (siRNA) para anticuerpos y LRP1.

El siRNA dirigido a LRP1 y el siRNA entremezclado se adquirieron a Bioneer (Daejeon, República de Corea). Todos los siRNA se inyectaron en la línea celular JFH-1 o Huh7.5 utilizando Lipofectamine 2000 (Invitrogen) de acuerdo con diversas concentraciones. Después de 18 horas, se obtienen los ARN de las células y se lleva a cabo una reacción en cadena de la polimerasa con transcripción inversa cuantitativa (qRT-PCR) para confirmar la eliminación del ARN.

Medición cuantitativa del ARN del VHC

El nivel de ARN del VHC se detectó mediante PCR cuantitativa utilizando cebadores para el gen NS2. Para medir el nivel de ARN del VHC en el sobrenadante del cultivo celular, se extrajo el ARN de 100 j l del cultivo celular utilizando un kit QlAamp Viral RNA Mini (Qiagen). El ARN extraído se utilizó en la síntesis de ADNc utilizando un kit de supermezcla de síntesis de ADNc de primera cadena de transcripción (Roche Applied Science). Se llevó a cabo PCR utilizando una mezcla 1x SYBR Green (Qiagen). Para la PCR en tiempo real, se utilizó un cebador directo de NS25'-CGACCAGTACCACCATCCTT-3' (SEQ ID NÚM.: 3) y un cebador inverso 5'-AGCACCTTACCCAGGCCTAT-3' (SEQ ID NÚM.: 4) se adquirieron en Bioneer Co. Para la PCR cuantitativa se utilizó un sistema de PCR rápido en tiempo real 7900HT (Applied Biosystems, Foster City, CA, EE. UU).

Análisis de citometría de flujo

Para evaluar la penetración intracelular de PEP1 conjugado con isotiocianato de fluoresceína (FITC), las líneas celulares se trataron con diversos materiales y, además, se trataron con el PEP1 conjugado con FITC durante dos horas, seguido de un análisis FACS. Para el knockdown de LRP1, 18 horas después de la inyección de siRNA, las células se lavaron con PBS y se trataron con PEP1 conjugado con FITC durante dos horas, los péptidos adheridos a las células se eliminaron por completo mediante el tratamiento con tripsina/EDTA (Invitrogen), y las células se lavaron con una solución tampón FACS (PBS, 0,5% BSA), seguido de un análisis utilizando b D FACS Fortessa (BD Biosciences, San Diego, CA, EE. UU). El análisis de los datos se realizó con el software FlowJo (versión 9.7.7, TreeStar, Ashland, OR, EE. UU).

Detección de HSP90 mediante ELISA

Las líneas celulares Huh7.5 y JFH-1 fueron tratadas con un oxidante (H2O2, 2 mM) y un antioxidante, PDTC (100 jM), durante dos horas. HSP90 (HSP90 extracelular, eHSP90) en el sobrenadante de un cultivo se detectó mediante ELISA (R&D Systems, Minneapolis, MN, EE. UU.) de acuerdo con las instrucciones del fabricante.

Inmunofluorescencia y detección de tejido hepático y células JFH-1

Se obtuvieron muestras de tejido de biopsia de hígado humano de pacientes crónicos con VHC o VHB y de pacientes con hepatitis autoinmune (AIH) como grupo de control, bajo la supervisión de la Institutional Review Board (IRB) of Soonchunhyang University Hospital in Bucheon (2014-12-034) and Seoul National University Hospital (1410-136-621). Para evaluar la expresión de HSP90 en las células hepáticas y en las células JFH-1, el tejido hepático o las células JFH-1 se tiñeron con anticuerpos anti-HSP90 (Cell Signaling Technology). Para visualizar el tejido o las células, se utilizó IgG anti-conejo conjugado con Alexa Fluor 594 (Invitrogen). Para la contratinción del núcleo celular se utilizó 4',6-diamino-2-fenilindol (DAPI, Sigma-Aldrich). Las imágenes se obtuvieron y procesaron utilizando un sistema de microscopio confocal A1 (Nikon, Minatoku, Tokio, Japón) y un visor NIS-elements 4.20 (Nikon).

Análisis estadístico

Todos los datos se expresan como media ± SEM, y se realizó una prueba t de Student de dos colas para la comparación estadística utilizando GraphPad Prism, versión 5.01 (GraphPad, La Jolla, CA, EE. UU.). Cuando un valor P era igual o menor a 0,05, se consideraba estadísticamente significativo.

Análisis de los resultados experimentales

1) Efecto inhibidor de PEP 1 en la replicación del ARN del VHC

Es ampliamente conocido que los niveles adecuados de ROS regulan la replicación del VHC, el VHB y el VIH. Por esta razón, los inventores de la presente han llevado a cabo experimentos para examinar si PEP1 exhibe un efecto inhibidor sobre la replicación del ARN del VHC en las células JFH-1, partiendo de la base de que el efecto de PEP1 sobre la inhibición de ROS influye en la inhibición de la replicación viral.

De acuerdo con los procedimientos descritos en los experimentos y los procedimientos de análisis, para investigar si PEP1 inhibe la replicación de un ARN del VHC como el NS2, se midió el transcrito del NS2. Cuando se midieron las transcripciones de NS2 para un grupo de control (vehículo), un grupo tratado con PEP1, grupos tratados con antioxidantes convencionales (NAC, PDTC y vitamina E) en las células j FH-1, en comparación con el grupo de control, se vio que la concentración de PEP1 inhibe la transcripción de NS2 de forma dependiente hasta 10 pM. Por el contrario, se observó que los antioxidantes convencionales NAC, PDTC y vitamina E no inhiben en absoluto la transcripción de la NS2 (FIG. 16).

Sobre la base de que PEP1 exhibe un efecto de reducción de la actividad de ROS dependiente de HSP90, se realizó un experimento para examinar si el efecto inhibidor sobre la replicación del ARN del VHC también está asociado con HSP90. En comparación con un grupo de control (PBS), se midieron los grados de inhibición de los transcritos NS2 por PEP1 clasificando las células j FH-1 en un grupo de anticuerpos de control (isotipo), un grupo tratado con anti-HSP70 y un grupo tratado con anti-HSP90. La proliferación del ARN del VHC por parte de PEP1 no fue inhibida por el tratamiento con anticuerpos anti-HSP90. Sin embargo, en el caso de los anticuerpos anti-HSP70 y del grupo de anticuerpos de control, la replicación del ARN del VHC fue inhibida por PEP1 independientemente de los anticuerpos (FIG. 17). Además, se midieron los grados de inhibición del transcrito NS2 por parte de PEP1 en función de la inhibición o no del receptor HSP90 LRP1. Cuando se eliminó la expresión de LRP1 debido al tratamiento con ARNsi de LRP1, la replicación del ARN del VHC en las células JFH-1 no disminuyó con PEP1 (FIG. 18).

Es sabido que HSP90 participa en la formación de un complejo de NS5A y FKBP8 para la replicación del ARN del VHC. Por lo tanto, se ha investigado si la inhibición de la replicación del ARN del VHC por parte de PEP1 se debe a la inhibición de la formación de un complejo de replicación. La unión entre HSP90 y FKBP8 se observó al tratar las células JFH-1 con PEP1. Específicamente, las células JFH-1 se cultivaron con PEP1 (10 pM) durante 48 horas. Posteriormente, las proteínas se sometieron a inmunoprecipitación con anticuerpos anti-FKBP8 o anticuerpos anti-HSP90. Se detectó la expresión endógena de HSP90 y FKBP8 en las células JFH-1 no tratadas.

Como resultado, en comparación con el grupo de control, cuando se trató PEP1, se redujo la coprecipitación de HSP90 por FKBP8 (FIG. 19). Como resultado de la inmunoprecipitación anti-HSP90 y anti-FKBP8 y de la inmunotransferencia con anticuerpos anti-HSP90 y anti-FKBP8 para las células JFH-1 después de ser divididas en un lisado celular, un grupo de control (PBS) y un grupo tratado con PEP1, se analizó que, de acuerdo con la inmunoprecipitación anti-HSP90, la expresión de FKBP8 se redujo en el grupo tratado con PEP1, y según la inmunoprecipitación anti-FKBP8, la expresión de HSP90 se redujo en el grupo tratado con PEP1 mediante inmunotransferencia con anticuerpos (FIG.

19). Este resultado muestra que PEP1 inhibe directamente la formación de un complejo de replicación del VHC RCV, y PEP1 se une a la parte principal de HSP90 que interactúa con FKBP8.

A partir del resultado experimental descrito anteriormente, se puede observar que es probable que PEP1 se una a HSP90, y por lo tanto la replicación del ARN del VHC se inhibe a través de un mecanismo de reducción de la actividad de HSP90 contra FKBP8. Se puede observar que el PEP1 inhibe la replicación del VHC y presenta un efecto antiviral.

2) Inhibición de la producción de ROS por PEP1

Para investigar un efecto de PEP1 en la inhibición de la producción de ROS en células infectadas por el virus, se examinó comparativamente la inhibición de la producción de ROS cuando se administró PEP1 a una línea celular infectada por el VHC, como las células JFH-1. La línea celular JFH-1 se produjo infectando células Huh7.5 con clones JFH-1 del VHC2a. Debido a la síntesis del virión del VHC, el nivel de ROS intracelular en la línea celular JFH-1 está regulado a un nivel más alto que en la línea celular Huh7.5 (línea celular madre de JFH-1). Los inventores de la presente han confirmado el hecho de que el PEP1 inhibe considerablemente y de forma dependiente de la dosis la producción de ROS en las células JFH-1 hasta 10 j M. A 1 y 10 j M, la actividad antioxidante de PEP1 fue igual a la de NAC, PDTC y vitamina E (FIG. 1).

De acuerdo con los procedimientos descritos en los experimentos y análisis, se detectaron ROS en las células JFH-1 y en las células Huh7.5. Tras el tratamiento el PEP1 durante dos horas a varias concentraciones, las células se tiñeron con DCF-DA durante 30 minutos y luego se detectó la fluorescencia. Como grupo de control, una línea celular humana de HCC, y las líneas celulares Huh7.5 y JFH-1 fueron tratadas con antioxidantes representativos conocidos como NAC (2 Mm), PDTC (100j M) y vitamina E (10j M) y luego se compararon. Cuando no se administró PEP1, los niveles intracelulares de ROS en la línea celular JFH-1 fueron aproximadamente más del doble que los de la línea celular Huh7.5 (FIG. 1). Los niveles de ROS disminuyeron de forma dependiente de la concentración con el tratamiento con PEP1. De acuerdo con la comparación entre los grupos experimentales en los que se trataron las células JFH-1 con diferentes concentraciones (0,001, 0,01, 0,1, 1, 10 j M) de PEP1 y los grupos experimentales en los que se trataron antioxidantes convencionales (NAC, PDTC y vitamina E), respectivamente, y el grupo de control (tratado con un vehículo), la concentración de PEP1 redujo la producción de ROS de forma dependiente, y los antioxidantes convencionales también indujeron una disminución de la producción de ROS (FIG. 1).

Dado que es sabido que las ROS inducen la activación de una vía de señalización MAPK, se han realizado experimentos para investigar si PEP1 participa en la reducción de los factores asociados a la vía de señalización MAPK (p38, JNK y ERK) (FIG. 2). De acuerdo con los procedimientos descritos en los experimentos y análisis, se han realizado inmunotransferencias para las células JFH-1 y las células Huh7.5. La fosforilación de p38 y JNK disminuyó en las células JFH-1 tras el tratamiento con PEP1, resultado similar al obtenido cuando se trataron antioxidantes como NAC, PDTC y vitamina E. Sin embargo, la actividad de ERK se incrementó con el tratamiento tanto de PEP1 como de vitamina E (FIG. 2).

Además, en las células JFH-1 y las células Huh7.5, todos los grupos de control y los grupos experimentales mostraron una alta expresión de HSP90 (FIG. 2).

A partir de los resultados experimentales mencionados, se puede observar que el tratamiento con PEP1 puede provocar una disminución de la producción de ROS en las células, lo que se produce a través de una señalización específica en las células JFH-1, es decir, la reducción de la señalización MAPK.

Las FIGS. 1 a 9 muestran que PEP1 inhibe la producción de ROS en las células JFH-1 a través de HSP90.

3) Rol de eHSP90 en el efecto antioxidante de PEP 1

Los inventores de la presente han asumido que el efecto antioxidante de PEP1 está mediado por HSP90. En la presente invención, para investigar si el efecto antioxidante de PEP1 es inducido por HSP90, se ha llevado a cabo un experimento de evaluación de un grado de producción de ROS por PEP1 en función de la activación de HSP90. Los inventores de la presente han inhibido la interacción con la HSP90 por dos procedimientos: un uso de anticuerpos contra la HSP70 y anticuerpos contra la HSP90 o un uso de un inhibidor que ocupa una posición catalítica (bolsillo de unión al ATP en el extremo N terminal de HSP90). De acuerdo con los procedimientos descritos en los experimentos y análisis, se ha comparado la producción de ROS en las células JFH-1 entre el grupo tratado con PEP1, el grupo tratado con el antioxidante PDTC y el grupo de control (PBS).

Como resultado, la presente invención ha demostrado que PEP1 tenía un efecto inhibidor sobre los niveles de ROS en las células JFH-1 en presencia de anticuerpos anti-HSP70, pero no tenía tal efecto en presencia de anticuerpos anti-HSP90 (FIG. 3). En los anticuerpos de control (isotipo), se observó la inhibición causada por PEP1 (FIG. 3). Además, cuando las células JFH-1 fueron tratadas con el inhibidor de HSP90 17AAG, se exhibió el efecto inhibidor de ROS, pero no se observó un cambio en ROS causado por el inhibidor de HSP70 KNK (FIG. 5). El fármaco de control PDTC inhibe la producción de ROS independientemente del bloqueo de HSP70 y HSP90 con anticuerpos específicos, e inhibe la producción de ROS en todas las condiciones de tratamiento (FIG. 4). Además, PDTC inhibe la producción de ROS en presencia tanto de KNK como de 17AAG (FIG. 6). Esto sugiere que PEP1 inhibe la producción de ROS a través de un mecanismo diferente. Estos datos muestran que eHSP90 es un mediador importante de la actividad antioxidante de PEP1, y que PEP1 actúa en la posición catalítica de HSP90, necesaria para la inducción de ROS.

A partir del resultado de que el efecto antioxidante disminuye cuando se trata 17AAG, los inventores de la presente han investigado la posibilidad de que PEP1 no inhiba las ROS en las células cuando los niveles de ROS en las células son demasiado bajos o están en el rango normal. Esto sugiere la posibilidad de que el PEP1 no inhiba la producción de ROS en las células JFH-1 en las circunstancias en las que un antioxidante está presente previamente. Para investigar dicha hipótesis, los inventores de la presente han tratado las células con concentraciones crecientes del antioxidante PDTC. Como resultado, se ha confirmado que la actividad antioxidante de PEP1 disminuye gradualmente (FIG. 7). Esto se debe a que los niveles de ROS disminuyen con el tratamiento con PDTC en las células JFH-1, y sugiere que PEP1 actúa selectivamente como antioxidante en las células sometidas a un entorno de estrés oxidante en comparación con las que tienen ROS en niveles reducidos o normales. Esta característica de PEP1 contribuye al desarrollo de un fármaco terapéutico personalizado para los niveles de oxidación.

Además, en la presente invención, se ha realizado un experimento para identificar una función antioxidante específica de PEP1 en una condición de estrés debido a ROS. Específicamente, se realizó un experimento para confirmar que la administración de un antioxidante convencional conduce a una disminución de la expresión de HSP90 y, por tanto, PEP1 tiene un efecto antioxidante reducido cuando se administra con el antioxidante convencional. Dado que la actividad antioxidante de PEP1 depende de la eHSP90, en el ejemplo de la presente invención se evaluó la secreción de eHSP de las células. La estimulación de las células Huh7.5 con H2O2 aumentó la secreción de eHSP90 a un nivel mucho mayor que el grupo de control (FIG. 8). Mientras tanto, cuando las células JFH-1 son tratadas con el antioxidante PDTc , la eHSP90 se produjo a un nivel más bajo que el grupo de control (FIG. 9). Este resultado sugiere que el estrés oxidante induce la secreción de HSP90. También se demuestra que PEP1 inhibe selectivamente la producción de ROS en las células sometidas a estrés oxidante.

Las FIGS. 1 a 9 muestra que PEP1 inhibe la producción de ROS en las células JFH-1 a través de HSP90.

Las FIGS. 10 a 15 muestran que eHSP90 y LRP1 son esenciales para la producción de ROS por parte de PEP1.

4) Rol de LRP1 en el efecto antioxidante de PEP 1

Es sabido que PEP1 ingresa en las células en combinación con eHSP90, y eHSP90 se aloja en el receptor celular LRP1. LRP1 es un receptor común para gp96, la HSP90, la HSP70 y calreticulina, y los péptidos con chaperona por HSP se unen a estos receptores, ingresando así en las células presentadoras de antígenos con HSP. Un complejo LRP1 se acopla con eHSP y actúa como receptor de endocitosis y ciclación, y se sugiere que LRP1 afecta a la acción de eHSP90 en condiciones patológicas o de estrés. Además, HSP90 forma un complejo de replicación del ARN del VHC con la FKBP8, que es una de las familias de proteínas de unión al FK506, y la proteína no estructural 5A (NS5A) de la hepatitis C. Este hecho sugiere que la HSP90 puede controlar la replicación del ARN del VHC mediante su expresión o activación. HSP90 regula la actividad de n Ox , induciendo así la formación de superóxidos. Los inventores de la presente han descubierto que PEP1 se une a la posición principal de HSP90 para lograr una acción antioxidante selectiva a través de un procedimiento de inhibición de la actividad de HSP90, y tiene una variedad de influencias biológicas en las células sometidas a estrés oxidante.

Los inventores de la presente han asumido que LRP1 bajo estrés oxidante cumple un rol crítico en el efecto antioxidante de PEP1. Los inventores de la presente han asumido que, cuando LRP1 está ausente, PEP1 no ingresa en las células y, por tanto, no puede inhibir la producción de ROS en las células JFH-1.

Para probarlo, de acuerdo con los procedimientos descritos en los experimentos y análisis, se ha investigado la cantidad de PEP1 que ingresa en las células dependiendo de la presencia o ausencia de LRP1, que es el receptor celular de HSP90. Específicamente, se inhibió la actividad de LRP1 utilizando anticuerpos contra l RP1 y siRNA, y se realizó una citometría de flujo utilizando PEP1 conjugado con FITC.

Las FIGS. 10 a 15 muestran que eHSP90 y LRP1 son esenciales para la producción de ROS por PEP 1.

En primer lugar, se ha confirmado que, cuando se trata previamente con MbCD, que es un inhibidor de la formación de balsas de lípidos para inhibir las vías de entocito dependientes de clatrina y caveolina, y de clatrina/caveolina, PEP1 no puede ingresar en las células JFH-1. Como se ha informado anteriormente, MbCD inhibe el ingreso de FITC-PEP1 en las células JFH-1, lo que se demuestra por una disminución de la intensidad de la fluorescencia en comparación con el grupo de control PBS. La enterocitosis de FITC-PEP1 fue inhibida por el siRNA de LRP1 así como por los anticuerpos anti-LRP1, en comparación con el grupo de control (FIGS. 11 y 12). Esto demuestra que LRP1 es un receptor crítico en la administración de PEP1 dependiente de eHSP90.

Además, para comprobar si el estrés oxidante influye en la penetración de PEP1, se añadió PDTC a las células JFH-1 y H2O2 a las células Huh7.5, produciendo así varios niveles de oxidación. Estas condiciones de tratamiento provocaron diferentes influencias en la secreción de eHSP dependiendo de los niveles de ROS (FIGS. 8 y 9). De acuerdo con la hipótesis de los inventores de la presente, la penetración de PEP1 en las células JFH-1 disminuyó en presencia de PDTc , y la penetración de PEP1 aumentó en las células Huh7.5 en presencia de H2O2 (FIGS. 13 y 14). Esto demuestra que la endocitosis y la actividad biológica de PEP1 dependen de los niveles de ROS en las células y, por tanto, de los niveles de eHSP.

Posteriormente, se verificó la hipótesis a través de knockdown de LRP1 en las células JFH-1 y evaluación de los niveles de ROS. La actividad antioxidante de PEP1 en las células JFH-1 no se observó en presencia de ARNsi de LRP1 (FIG. 15).

A partir de los resultados experimentales, se puede observar que el mecanismo antioxidante de PEP1 es diferente al de PDTC, PEP1 tiene un nivel diferente de endocitosis dependiendo de la expresión de LRP1, que es el receptor de HSP90, y cuando la expresión de LRP1 se redujo o inhibió, la endocitosis se redujo, lo que indica el ingreso de PEP1 en las células dependiente de HSP90.

5) Expresión de HSP90 en el tejido hepático infectado por el VHC

Se realizó un experimento histológico-anatómico para verificar que la expresión de HSP90 aumentaba cuando un órgano o tejido, no las células, se infectaba con el VHC, a diferencia de cuando se infectaba con el VHB o con la hepatitis autoinmune (AIH).

De acuerdo con los procedimientos descritos en los experimentos y análisis, se ha comparado la expresión de HSP90 en el tejido hepático infectado por el VHC, el VHB y el AIH. Como resultado, en comparación con el VHB y la AIH, cuando se infectó con el VHC, la expresión de HSP90 aumentó (parte gris, FIG. 20). Curiosamente, el PEP1 redujo iHSP90 en las células JFH-1, y se considera que este es probablemente un resultado incidental de acuerdo con los niveles reducidos de ROS (FIG. 9). Además, en el tejido hepático infectado por el VHC, cuando se compara el grupo de control (PBS) con el grupo tratado con PEP1, el grupo tratado con PEP1 mostró una menor expresión de HSP90 que el grupo de control (parte gris, FIG. 21).

Las FIGS. 20 y 21 muestran que HSP90 está muy presente en las células hepáticas infectadas por el VHC.

El resultado experimental muestra que la infección por el VHC induce niveles más altos de ROS en las células que en las células normales, HSP90 se sobreexpresa relativamente en las células bajo estrés debido a la acumulación de ROS, y PEP1 sirve como agente terapéutico para las células infectadas por el VHC bajo estrés oxidante.

Ejemplo 3: Confirmación del efecto de PEP1 sobre el VIH

Cuando están infectadas con virus, se ha confirmado que la producción vigorosa de proteínas virales también requiere una función HSP, y la lista de virus inhibidos por un inhibidor de HSP90 aumenta continuamente. También es sabido que la infección por el virus de la inmunodeficiencia humana-1 (VIH-1) induce un aumento de la expresión de HSP90 en los monocitos. Se puede observar que HSP90 actúa en varios ciclos del ciclo vital del virus y, por tanto, desempeña un rol importante en la replicación del VIH, y en las células infectadas de forma aguda, el rol de HSP90 en la transcripción y replicación del VIH es inhibido por el inhibidor de HSP90. Además, se ha confirmado que HSP90 regula la reactivación del VIH desde un estado latente mediante la regulación de la señalización del NF-kB.

Cultivo de líneas celulares

Las líneas celulares utilizadas en el ejemplo relativo al efecto antiviral del VIH del PEP 1 de la presente invención se derivaron de una línea celular de leucemia de células T humanas MT-4, una línea celular ACH-2 infectada con VIH-1 latente, y una línea celular 1G5 derivada de Jurkat y que comprende una construcción de VIH-LTR-luciferasa (luciferasa) establemente insertada, y estas líneas celulares se obtuvieron del NIH/AIDS Research and Reference Reagent Program (NIH, Bethesda, MD). Las células 293FT se adquirieron de Life Technologies (Carlsbad, CA). Las líneas celulares MT-4 y 1G5 se mantuvieron en RPMI 1640 complementado con glutamina (2 mM), 10% de suero fetal bovino (FBS) y penicilina-estreptomicina. Las células ACH-2 se cultivaron en RPMI 1640 suplementado con 2 mM de glutamina, 10% de FBS, penicilina-estreptomicina y 5 mM de HEPES. La línea celular 293FT se cultivó en DMEM con un 10% de FBS, penicilina-estreptomicina, 6 mM de L-glutamina, 1 mM de piruvato sódico y 0,1 mM de aminoácidos no esenciales.

Reactivos y anticuerpos

Como fármacos antirretrovirales, T-20, raltegravir, flavopiridol y ritonavir se obtuvieron del National Institute of Health (NIH, Bethesda, MD, EE. UU.), AIDS division, NIH/AId S Research and Reference Reagent Program (NIH, Bethesda, MD, EE. UU.), y se disolvieron en D-PBS, DMSO o agua destilada como se describe en las instrucciones del fabricante. La azidotimidina (3-azido-3-deoxitimidina, AZT) se adquirió de Sigma Aldrich (St. Louis, MO). HSP90 (#4877S), fosfo-NF-kB (p65, #3033S), IkB (#4814S) y fosfo-kB (#2859S) se obtuvieron de Cell Signaling (Danvers, Ma ), y los anticuerpos anti24 (ab9071) se adquirieron de Abcam (Cambridge, MA). Los anticuerpos contra HSP70 (sc32239), los anticuerpos contra GFP (sc81045), los anticuerpos contra GAPDH (sc25778) y los anticuerpos contra NF-kB (p65, sc372) se adquirieron en Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, Dallas, Texas).

Plásmidos y virus

El plásmido pBR43IeG-rcmGB1nef del provirus del VIH-1 que expresa tanto Nef como la proteína verde fluorescente mejorada (eGFP) a partir de un único ARN bicistrónico (Cat. Núm. 11371, proporcionado por el Dr. Daniel Sauter y el Dr. Frank Kirchhoff), y el plásmido pSV2tat72 (Cat. Núm. 294, proporcionado por el Dr. Alan Frankei) que produce la proteína Tat (residuos 1-72) se obtuvieron del NIH/AIDS Research and Reference Reagent Program (NIH, Bethesda, MD). Para producir el VIH-1, las células 293FT se transfectaron con un vector pBR_HIV-1_M_NL4-3_IRES_eGFP utilizando el reactivo Lipofectamine 2000 (Life Technologies) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Cuarenta y ocho horas después de la transfección, se cosechó el medio que contenía el virus, seguido de una breve centrifugación y filtración (0,45 |jm). El título del virus se determinó mediante el ELISA p24 (ABL, Rockville, MD). Para la amplificación del VIH-1 infeccioso, se infectaron células MT-4 con el VIH-1 producido (MOI=0,5) durante 48 horas. Tras una breve centrifugación (1.300 rpm, 3 min), el sobrenadante se filtró (0,22 jm ) y se sometió a una valoración mediante p24 ELISA.

Ensayo de efecto antiviral

Para evaluar el efecto anti-VIH-1 de PEP1, se llevó a cabo un ensayo de efecto antiviral en base a células utilizando células MT-4. Las células MT-4 (4x10⁵células) se infectaron con el VlH-1 (4x10⁵dosis infecciosa de cultivo celular del 50% (CCID⁵⁰)) durante una hora. Después de lavar dos veces con D-PBS, las células infectadas se trataron con PEP1 o con fármacos contra el VIH-1. Tras dos días de incubación, se obtuvieron imágenes de las células MT-4 que expresaban eGFP utilizando un microscopio de fluorescencia antes de cosechar las células. Para eliminar los restos celulares, el sobrenadante recogido se sometió a una centrifugación a 13.000 rpm durante 3 minutos y, para medir la cantidad viral extracelular, se realizó un ELISA de p24 o una extracción de ARN para una reacción en cadena de la polimerasa de transcripción inversa (RT-qPCR). Mientras tanto, los microgránulos de células se lavaron con D-PBS dos veces, y se utilizaron para un ensayo de viabilidad celular. Para investigar el rol de HSP90 en la acción antiviral de PEP1, se infectaron células MT-4 con el VIH durante una hora y se trataron con anti-HSP70 (10 ng), anti-HSP90 (10 ng) (Cell Signaling, Danvers, MA) o 17-AAG (1 jM ) (Calbiochem, Darmstadt, Alemania). La replicación del VIH-1 se analizó mediante un ELISA de p24, y la eGFP se monitorizó mediante un microscopio de fluorescencia. Además, los lisados celulares se sometieron a inmunotransferencia utilizando anticuerpos anti-GFP para confirmar la síntesis de eGFP dependiente del VIH-LTR.

Ensayo de citotoxicidad celular

Se sembraron células MT-4, 1G5 o ACH-2 en una microplaca de 96 pocillos a una densidad de 1x10⁴células/pocillo, y se incubaron con concentraciones crecientes de PEP1 durante 5 días. La viabilidad celular se determinó por colorimetría utilizando un kit de ensayo CellTiter96 Aqueous One Solution (Promega, WI) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Para evaluar el efecto protector de PEP1 frente a la muerte celular inducida por el VIH-1, se infectaron células MT-4 (1x10⁴) con el virus VIH-1 (4x105 CCID⁵⁰) durante 5 días con o sin PEP1, y se sometieron a un ensayo de viabilidad celular.

Medición de la producción del virus VIH-1

Para medir los títulos del virus del VIH-1, se realizaron el ELISA de captura del antígeno p24 del VIH-1 (p24 ELISA, ABL) y el ensayo RT-qPCT de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Los genomas de ARN del VIH-1 se purificaron a partir de los sobrenadantes y microgránulos de los cultivos celulares utilizando un kit QIAamp Ultrasens Virus (Qiagen, Hilden, Alemania) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Los niveles de ARN del VIH-1 se cuantificaron mediante RT-qPCR utilizando un par de cebadores específicos para gag del VIH-1. La gliceraldehído fosfato deshidrogenasa (GAPDH) se utilizó como gen de referencia para la normalización. Se utilizaron los siguientes pares de cebadores para la qPCR: Gag, 5'-TGCTATGTCAGTTCc Cc TTGTCTCT-3' (sentido, SEQ ID NÚM.: 5) y 5'-AGTTGGAGGACATCAAGCAGCCATGCAAAT-3' (antisentido, SEQ ID NÚM.: 6); y GAPDH, 5'-AATCCCATCACCATCTTCCA-3' (sentido, SEQ ID NÚM.: 7) y 5'-TGGACTCCACGACGTACTCA-3' (antisentido, SEQ ID NÚM.: 8). Se utilizó un kit Genesig Standard del VIH tipo 1 (Primerdesign, Southampton, RU) para medir los títulos del virus. La concentración del virus almacenado fue de 2x10⁵copias/jl.

Resultados de los experimentos

1) Inhibición de la replicación del VIH-1 por PEP1

Sobre la base de los hallazgos del rol crítico de la HSP90 en el ciclo de vida del VIH-1 y la interacción entre PEP1 y HSP90, los inventores de la presente han planteado la hipótesis de que PEP1 es capaz de inhibir la actividad antiviral con respecto al VIH-1, y lo han verificado. Antes de investigar el rol de PEP1, en primer lugar se ha analizado la citotoxicidad celular de PEP1 para excluir la posibilidad de que PEP1 afecte a la replicación del VIH-1 debido a su citotoxicidad celular no específica.

Las FIGS. 22 a 27 muestran los datos que indican que PEP1 inhibe la replicación del VIH-1. PEP1 no mostró una citotoxicidad significativa contra las células MT-4, 1G5 y ACH-2 hasta 25 jM (FIG. 22). En primer lugar, se midió la actividad anti-VIH-1 de PEP1 analizando su efecto sobre la replicación del VIH-1 en células MT-4. Las células MT-4 se infectaron con el VIH-1 producido a partir de pBR_HIV-1-M-NL4-3_IRES_eGFP, y se trataron con varias concentraciones de PEP1. Como se determinó mediante p24 ELISA, la producción de partículas virales en las células MT-4 fue significativamente inhibida por PEP1 de manera dependiente de la dosis, y el valor de media de la concentración inhibitoria del 50% (IC⁵⁰) fue de aproximadamente 0,85 jM (FIG. 23). Además, la producción de eGFP, que depende de la activación del VIH-1, también disminuyó con el tratamiento con PEP1. Este resultado apoya aún más el efecto anti-VIH-1 de PEP1 (FIG. 24). La inhibición de la producción de partículas virales por parte de PEP1 se confirmó además midiendo los niveles de ARN del genoma del VIH-1 de las partículas virales generadas. PEP1 mostró un efecto inhibidor dependiente de la dosis, y 5 jM de PEP1 mostraron una disminución del nivel de ARN viral en aproximadamente 100 veces (FIG. 25).

Es sabido que la apoptosis de las células infectadas por el VIH se produce por un mecanismo de muerte celular intracelular. Para investigar si PEP1 tiene un efecto inhibidor de la replicación del VIH y un efecto de inhibición de la acción por la que las células infectadas por el VIH sufren la apoptosis inherente, se realizó un ensayo de efecto anticitopático. En concordancia con la inhibición de la replicación del VIH-1 por parte de PEP1, éste muestra el efecto protector de las células MT-4 infectadas por el VIH-1. AZT y PEP1 mostraron efectos protectores considerables de las células de forma dependiente de la dosis (FIGS. 26 y 27). Al igual que AZT, PEP1 5 pM presenta una acción protectora de las células de casi el 100% de la muerte celular mediada por el VIH-1. Este efecto protector de las células es inversamente proporcional a la disminución del nivel de p24 en el sobrenadante, lo que sugiere que PEP1 es capaz de proteger las células inhibiendo la replicación viral.

2) Inhibición de la transcripción del VIH-1 por PEP1

Teniendo en cuenta que la producción de eGFP a partir de los genomas del VIH-1 está bajo el mismo control que Nef, una disminución de la expresión de eGFP en las células infectadas por el VIH-1 por PEP1 indica la inhibición de la transcripción del VIH-1 por PEP1 (FIG. 30). Para seguir investigando los mecanismos de inhibición del VIH-1 por PEP1, se realizó un ensayo de tiempo de adición (TOA) utilizando el PEP1 y los fármacos convencionales contra el VIH que es sabido que actúan en diferentes etapas de la replicación. Las características de los fármacos de control contra el VIH son bien conocidas, y la inhibición de cada fármaco se produce en una fase diferente de la replicación del VIH: AZT inhibe la actividad de transcripción inversa, e inhibe la proliferación del VIH cuando las células son tratadas con él entre 3 y 4 horas; Raltegravir inhibe la actividad de la integrasa para insertar el ADN del VIH en el genoma del ADN del huésped, e inhibe la proliferación del VIH cuando las células son tratadas con él entre 6 y 8 horas; Ritonavir inhibe la actividad de la proteasa para impedir el procesamiento del precursor de un polipéptido galpol, generando así partículas de VIH inmaduras no infecciosas, e inhibe la proliferación del VIH cuando las células se tratan con él hasta 15 horas; y T-20 inhibe la fusión entre un virus y la membrana celular para perturbar la entrada del virus del VIH en las células, y cuando las células se incuban además con él durante 24 horas, la proliferación del VIH se produce a un nivel 1/3 inferior al del medicamento de control DMSO, que no es un agente terapéutico.

Las FIGS. 28 a 30 muestran la inhibición de la replicación del VIH-1 por PEP1 a nivel transcripcional. En el ensayo TOA, los resultados de cada fármaco han demostrado que la inhibición de la replicación del VIH fue bien exhibida en un punto de tiempo correspondiente a la replicación a la que se dirige el fármaco, y la inhibición del VIH por PEP1 se produce en un período de tiempo entre 11 y 13 horas después de que las células MT-4 infectadas por el VIH fueran tratadas con PEP1 (FIG. 28). El análisis de la expresión de eGFP confirmó que la actividad inhibidora de PEP1 se debilita cuando se trata durante 12 horas tras la infección (FIG. 29). De acuerdo con el resultado típico de TOA, la transcripción del VIH a partir del genoma del VIH insertado se produce entre 11 y 13 horas después de la infección. Este resultado sugiere que el modo de acción de PEP1 en las células MT-4 infectadas por el VIH es inhibir la proliferación del VIH a través de la inhibición de la actividad de transcripción, como se esperaba. La hipótesis de los inventores de la presente se apoya además en un análisis a nivel del ARNm viral. Cuando las células se trataron con PEP1 durante 9 horas después de la infección, PEP1 inhibió eficazmente la producción de ARNm viral del VIH-1, pero cuando se trató durante 13 horas después de la infección, perdió la actividad para reducir el ARNm viral (FIG. 30). Al mismo tiempo, no hubo cambios significativos en la síntesis de ARNm del huésped GAPDH, lo que sugiere que PEP1 regula selectivamente la transcripción viral del VIH-1.

A partir de los resultados experimentales y del procedimiento conocido de proliferación del VIH por periodos de tiempo, se puede observar que el periodo de tiempo en el que el PEP1 exhibe un efecto inhibidor sobre la proliferación, de 11 a 13 horas, corresponde a la etapa inicial de la fase tardía en la que el ADN del VIH se integra en el núcleo de una línea celular, y comienza a proliferar utilizando un factor de transcripción intracelular. Esto indica que PEP1 inhibe el virus en el momento de la transcripción que se produce dentro del núcleo de la célula durante su ciclo vital con varios pasos necesarios para la proliferación, y se puede observar que PEP1 puede mostrar un excelente efecto como inhibidor del VIH.

3) Inhibición de la transcripción del VIH-1 dependiente de Tat por PEP 1

La proteína de transactivación del VIH-1 (Tat) es una proteína reguladora que aumenta drásticamente la transcripción del VIH-1 a través de la interacción con la región activa transcripcional tat (TAR). Dado que PEP1 regula selectivamente la transcripción del VIH-1, los inventores de la presente han realizado un experimento para determinar si PEP1 afecta a la transactivación del VIH-1 Tat. En la presente invención, como línea celular derivada de Jurkat, se utilizó 1G5 que contiene una construcción de VIH-LTR-luciferasa insertada de forma estable. Tras infectar 1G5 con el VIH-1, o transfectarla con un vector tat-retrovirus (pSV2tat72) en presencia de AZT o PEP1, se analizó la actividad de la luciferasa.

Las células 1G5 transfectadas con la construcción VIH-LTR-luciferasa fueron infectadas con el VIH-1, seguido de un tratamiento posterior con DMSO, AZT o PEP1. Cuatro días después de la infección, se realizó un ensayo de luciferasa para analizar la transactivación del lisado celular VIH-LTR. Las células 1G5 infectadas con el VIH-1 mostraron un aumento drástico de la actividad de la luciferasa (FIG. 31). El tratamiento con AZT o PEP1 redujo el efecto de la infección del VIH-1 en relación con la actividad de la luciferasa del VIH-LTR en aproximadamente cinco veces (FIG.

31).

Las células 1G5 fueron transfectadas con plásmidos Tat. Doce horas después de la infección, las células fueron tratadas con el vehículo (DMSO), AZT o PEP1 como se ha descrito anteriormente. Cuatro días después de la infección, se analizó la transactivación del VIH-LTR mediante un ensayo de luciferasa. Los datos se expresaron como media ± DE. *** representa p<0,001 (FIG. 32). De acuerdo con los resultados mostrados en la FIG. 31, PEP1 inhibe la activación de la actividad luciferasa del VIH-LTR por la expresión ectópica de Tat (FIG. 32). Sin embargo, AZT no inhibió la actividad de la luciferasa del VIH-LTR en dicho escenario experimental. Este resultado demuestra que PEP1 regula la función de transactivación de tat durante la infección por el VIH-1 y, por tanto, inhibe la replicación del VIH-1.

4) Inhibición de la reactivación del VIH-1 desde la latencia por parte de PEP1

Mientras que la replicación del VIH puede ser inhibida con éxito a un nivel inferior al detectable a través de la terapia antirretroviral altamente activa (HAART), el VIH puede permanecer en las células infectadas de forma latente como las células T CD4+ de memoria en reposo.

Tat actúa como un interruptor molecular para regular la reactivación a través de la interacción entre varios tipos de proteínas relacionadas.

En base a que PEP1 regula la actividad transcripcional dependiente de Tat, se investigó el rol de PEP1 en la reactivación del VIH-1. Las células ACH-2, una línea de células T humanas con una sola copia de ADN del VIH-1, fueron tratadas con forbol 12-miristato 13-acetato (PMA) junto con un vehículo, AZT o PEP1. Es decir, las células ACH-2, es decir, las células infectadas de forma latente por el VIH-1, fueron estimuladas con PMA (50 nM) para inducir la reactivación del VIH-1 durante 1 hora. Después, las células fueron tratadas con DMSO, AZT o PEP1 durante 24 horas. El nivel de producción de partículas virales en el sobrenadante se determinó mediante el ELISA de p24. Como resultado, el tratamiento con PMA aumentó significativamente el nivel de p24 en el sobrenadante, y PEP1 eliminó casi todo ese efecto (FIG. 33, Los datos se expresaron como media ± DE. *** representa p<0,001 frente a DMSO).

Las células ACH-2 fueron tratadas con PMA, y luego, como se muestra en la FIG. 33, AZT o PEP1 con concentraciones crecientes. Los niveles de ARN genómico viral de las partículas virales producidas se determinaron mediante RT-qPCR. En consecuencia, AZT no modificó el efecto de PMA. Este resultado sugiere que PEP1 inhibe la reactivación del VIH-1 inducida por PMA, e inhibe la producción de partículas virales. Del mismo modo, los niveles del genoma del ARN del VIH-1 también se redujeron considerablemente de forma dependiente de la dosis cuando el sobrenadante derivado de las células tratadas con PMA se trató con PEP1 (FIG. 34, Los datos se expresaron como media ± DE. *** indica p<0,001 frente a DMSO).

5) Actividad anti-VIH-1 dependiente de HSP90 de PEP1

Se ha sugerido que PEP1 interactúa con HSP90 y HSP70. La interacción entre PEP1 y HSP resulta en la modulación del eje de señalización HIF-1a-VEGF, indicando que PEP1 puede regular una vía de señalización intracelular a través de la interacción con HSP. Los inventores de la presente han investigado si PEP1 puede regular la replicación del VIH-1 a través de la interacción con HSP. Inesperadamente, la inhibición de la producción de VIH-1 mediada por PEP1 en las células MT-4 se restableció completamente mediante el tratamiento con anticuerpos de neutralización anti-HSP90.

Sin embargo, no hubo influencia en la inhibición mediada por AZT (FIG. 35). En otras palabras, después de la infección con el VIH-1 durante 1 hora, las células MT-4 fueron tratadas con anticuerpos anti-GAPDH, anti-HSP70, anti-HSP90 o 17AAG durante 1 hora, y posteriormente tratadas con DMSO, AZT o PEP1. Varias horas después de la infección, se evaluó la producción de partículas de VIH-1 mediante ELISA de p24. Como resultado, el tratamiento con anticuerpos de neutralización anti-HSP70 dio lugar a una restauración parcial, y un control de isotipo de anticuerpos anti-GAPDH no mostró ningún efecto significativo. Esto sugiere que la función anti-VIH de PEP1 se debe principalmente a la interacción con HSP90 (FIG. 35).

Además, el inhibidor de HSP 17-AAG también eliminó el efecto de PEP1, lo que confirmó que la actividad anti-VIH de PEP1 se exhibe a través de HSP90 (FIG. 35). Además, la inhibición de la expresión de eGFP mediada por PEP1 y dependiente de la transactivación del VIH-1 fue restaurada por anticuerpos anti-HSP90.

Las células MT-4 fueron infectadas con el VIH y tratadas con anticuerpos anti-GAPDH y anti-HSP90. Las células fueron tratadas con DMSO, AZT o PEP1 durante 24 horas como se ha descrito anteriormente. Para comprobar la expresión de eGFP, se lisaron las células y se sometieron a inmunotransferencia. Como resultado, no se obtuvo efecto de AZT (FIGS. 36 y 37). Este resultado demuestra que PEP1 puede regular la actividad de transcripción del VIH-1 a través de la interacción con HSP90.

6) Inhibición de la actividad transcripcional NF-kB basal por PEP1

NF-kB desencadena la transcripción del VIH al interactuar con un sitio de unión al NF-kB en la LTR del VIH, y aumenta la activación de la translocación de LTR mediada por TAT. Además, Tat puede activar directamente NF-kB. Recientemente, se han realizado estudios que demuestran que eHSP90 puede regular varias vías de señalización intracelular, incluida la vía NF-kB. Dado que la eliminación del efecto anti-VIH de PEP 1 por medio de anticuerpos bloqueadores de HSP90 sugiere la posibilidad de la participación de eHSP90 con respecto a la función anti-VIH de PEP 1, los inventores de la presente probaron si PEP1 regula la actividad transcripcional del VIH-1 mediante la regulación de la actividad de NF-kB de una manera asociada a HSP90. PEP1 redujo drásticamente la actividad basal del NF-kB independientemente de la infección por el VIH-1 en las células MT-4 (FIG. 38). Mientras tanto, AZT no mostró ningún efecto significativo sobre la actividad de NF-kB en las células MT-4. AZT muestra un nivel medio de efecto inhibidor en las células MT-4 infectadas por el VIH-1, lo que probablemente se deba a un bajo nivel de replicación del VIH (FIG. 38). El efecto inhibidor de PEP1 sobre la actividad basal de NF-kB se confirmó además mediante EMSA (FIG. 39). Las células tratadas con PEP1 mostraron una aparente disminución de la activación de p65 NF-kB (FIG. 39). Esto demuestra que PEP1 inhibe el nivel basal de unión al ADN de NF-kB en el núcleo. Además, el tratamiento con PEP1 produce una disminución de la fosforilación de NF-kB (p65), lo que indica que PEP1 inhibe la activación citosólica de NF-kB y su posterior translocación nuclear (FIG. 40). Un resultado similar se obtuvo en las células ACH-2 infectadas de forma latente con el VIH-1 (FIG. 40). Como era de esperar, el tratamiento con PEP1 produjo una disminución de la translocación nuclear de NF-kB(p65) en las células ACH-2 tratadas con PMA, frente a las células de control tratadas con DMSO (FIG. 41). Dado que la presente invención muestra que el efecto anti-VIH de PEP1 depende de HSP90, los inventores de la presente han probado si un efecto inhibidor de NF-kB depende de HSP90. En consonancia con los datos de la actividad anti-VIH, el efecto inhibidor de NF-kB de PEP1 fue completamente eliminado por el tratamiento con anticuerpos bloqueadores de HSP90 o el inhibidor de HSP. Mientras tanto, cuando se trató con anticuerpos anti-GAPDH, no hubo efectos significativos (FIG. 42).

En conjunto, los inventores de la presente han demostrado que PEP1 inhibe el nivel basal de la actividad NF-kB, inhibiendo así la transactivación del VIH-LTR. Este resultado demuestra que HSP90 está implicada en esta actividad. En investigaciones anteriores, se ha observado que HSP90 intracelular desempeña un rol crítico en la reactivación del VIH al regular directamente NF-kB. En la presente invención, la anulación del efecto de PEP1 sobre los anticuerpos anti-HSP90 sugiere que el efecto antiviral de PEP1 se consigue a través de la señalización NF-kB y la activación de HIV-LTR por HSP90.

Aunque la replicación del VIH puede ser inhibida con éxito por HAART, las terapias actuales no pueden erradicar el VIH-1 infectado de forma latente. La reactivación viral es la principal causa del fracaso de este procedimiento terapéutico. La estabilidad de PEP1 ya ha sido probada en varios ensayos clínicos. Por lo tanto, el efecto anti-VIH de PEP1 puede proporcionar un procedimiento terapéutico eficaz para inhibir la reactivación del VIH.

Ejemplo 4: Confirmación del efecto de PEP1 sobre el VHB

Para desarrollar un agente diana para el cáncer de hígado, se han estudiado diversas vías de señalización de IL-6/JAK/STAT, Ras/ERK, Wnt, etc., así como la tirosina quinasa EGFR y c-MET quinasa, como candidatos diana. Entre estos, a partir de los resultados de diversos estudios sobre la vía de señalización IL-6/JAK/STAT, se ha confirmado que puede controlar la inflamación y la carcinogénesis, por lo que puede ser un objetivo eficaz en una enfermedad derivada del VHB y en el tratamiento del CHC. Se ha confirmado que se observó una activación anormal de STAT3 en el 72,4% del tejido del CHC, y que la inhibición de STAT3 induce el crecimiento de una línea celular de cáncer de hígado y la inhibición del crecimiento en modelos animales. Para inhibir la señalización STAT, casi todos los fármacos que están ingresando o se están utilizando en ensayos clínicos son inhibidores de la cinasa. Aunque algunos de los fármacos que inhiben directamente a STAT3 han entrado en una fase preclínica, debido a la falta de potencialidad terapéutica de la propia diana y a la selectividad de los compuestos con respecto a una diana, fue necesario realizar más estudios sobre estos. En particular, con respecto al bloqueo de la señalización de STAT3 mediante la inhibición de JAK2, no hay ningún compuesto inhibidor de JAK que esté en un ensayo clínico dirigido a HCC. Además, un compuesto de inhibición de dicha etapa única tiene una alta probabilidad de resistencia. Por lo tanto, los inventores de la presente han investigado para desarrollar un nuevo compuesto que muestra una actividad inhibidora en varias etapas de la vía de señalización JAK2/STAT3 y es capaz de inhibir globalmente la vía de señalización.

Cultivo de la línea celular

Una línea celular humana HCC Huh7 (American Type Culture Collection (ATCC), Manassas, VA, EE. UU.), una línea celular Huh7.5 y una línea celular de carcinoma hepatocelular humano (HepG2) (ATCC, Manassas, VA, EE.UU.) se cultivaron en una incubadora con un 5% de CO2 a 37 °C, y se incubaron en un medio RPMI 1640 complementado con un 10% de suero fetal bovino (Invitrogen, EE. UU.), 2 mmol/ml de L-glutamina, 100 pg/ml de penicilina y 100 unidades/ml de estreptomicina.

Inhibición de la producción de viriones del VHB entero que contiene W4P

Haciendo foco en el hecho de que el cáncer de hígado tiene una diferencia en la frecuencia de aparición según el sexo, se ha llevado a cabo una investigación relacionada para encontrar una variante (W4P) que se encuentra específicamente en los hombres y se asocia con la cirrosis hepática y el cáncer de hígado por primera vez en el mundo. W4P es una nueva variante de preS1 sustituida por W4P, que es un producto de traducción que se obtiene cambiando el TGG de tipo salvaje por CCG (el subrayado indica las variantes) en el 4° aminoácido, es decir, una proteína que cambia el triptófano (W) por la prolina (P) en el 4° aminoácido (el 4° codón de preS1) de un código genético que codifica una proteína antigénica. Se ha descubierto que dicha variante estimula la aparición y la progresión del cáncer de hígado mediante la regulación de un sistema de señalización JAK2-STAT3 a través de la IL-6 en los varones, y se confirmó que se mostraron niveles más altos de IL-6 en las muestras clínicas.

Para observar la producción de viriones del VHB completo que contiene W4P por PEP1, se sembraron 2x106 células Huh7 en una placa de 100 mm, y el VHB total normal y el VHB que contiene w 4p se transfectaron co-transitoriamente con un vector pCMV-p-gal que incluye p-galactosidasa, y se incubaron durante 3 días. Mientras se cambiaba el medio cada 24 horas, se recogía el sobrenadante (sup). Para analizar el sobrenadante, se realizó un ELISA según las instrucciones experimentales utilizando un kit ELISA color Bioelisa HBsAg generalizado (BIOKIT S.A., España) y un kit ELISA HBeAg (BIOKIT S.A., España) que puede detectar un antígeno de superficie de la hepatitis B (HBsAg) y un antígeno de envoltura de la hepatitis B (HBeAg). Se añadieron 100 pl de cada uno de los sobrenadantes recogidos a cada pocillo y se hizo reaccionar a 37 °C durante 1 hora. Se añadieron 300 pl de una solución de lavado en cada pocillo para lavar tres veces. Se añadieron 300 pl de una solución de lavado a la solución de conjugado diluida para lavarla tres veces. Se añadieron 20 pl/ml de TMB a una solución de sustrato, y a continuación se añadieron 100 pl de la mezcla a cada pocillo de una placa de 96 pocillos para permitir una reacción durante 30 minutos mientras se bloqueaba la luz a temperatura ambiente. Se añadieron 100 pl de una solución de parada para detener la reacción. La absorbancia se leyó con un lector de ELISA (Beckman, EE. UU.) a 450 nm. Los resultados de ELISA se calibraron con la p-galactosidasa utilizada para la calibración de acuedo con las instrucciones proporcionadas por un kit de tampón de lisis de reportero y un sistema de análisis de p-galactosidasa (Promega, EE. u U.).

Inhibición de la expresión del antígeno de la envoltura del virión del VHB entero que contiene W4P

Para confirmar el potencial de expresión del antígeno de la envoltura del VHB entero que contiene W4P por PEP1, se sembraron 2x106 células Huh7 en una placa de 100 mm para la transfección transitoria del VHB entero normal y del VHB entero que contiene W4P, se cultivaron durante tres días, se recogieron los microgránulos de células cambiando el medio y se sometieron a inmunoprecipitación (IP). La limpieza previa se realizó durante dos horas a 4 °C añadiendo a la proteína 20 pl de un inmunoprecipitante de proteína A/G más agarosa (Santa Cruz Biotechnology, EE. UU.). Se añadieron 20 pl de inmunoprecipitante de proteína A/G más agarosa (Santa Cruz Biotechnology, EE. UU.) a las proteínas en 400 pg del lisado previamente despejado, y luego se hizo reaccionar con 4 pg de anticuerpos primarios durante 24 horas a 4 °C. Al día siguiente, tras centrifugar a 2000 rpm y lavar, las proteínas se resuspendieron con 50 pl de una solución de lisis de proteínas. El Western blot se realizó utilizando anticuerpos primarios preS1 y HBs.

Inhibición de la proliferación del virión del VHB entero que contiene W4P

Para observar el potencial de proliferación de viriones del VHB entero que contiene W4P, se extrajo el ADN de los viriones de todo el sobrenadante mientras se cambiaba el medio cada 24 horas por el procedimiento descrito anteriormente, y se sometió a una PCR cuantitativa en tiempo real utilizando un kit Quantitech SYBR Green Master-Mix (Qiagen). Todo el sobrenadante se centrifugó con una ultracentrífuga equipada con un rotor oscilante SW28 a 20.000 rpm durante 2 horas para precipitar el virus, y los gránulos virales precipitados se suspendieron con 200 pl de DW esterilizado. Para extraer el ADN del virión, las células virales se trataron con 100 pg/ml de RNasa A, 100 pl de un tampón de lisis (0,25% SDS, 0,25M Tris, 0,25M EDTA) y 500 pg/ml de proteinasa K durante 2 horas a 37 °C. A continuación, se extrajo el ADN mediante un procedimiento de extracción con fenol y cloroformo. Para ver la capacidad de proliferación viral, se utilizaron los cebadores SF-Real de la PCR en tiempo real (5'-TTG ACA AGA ATC c Tc ATA CC-3', SEQ ID NÚM.: 9) y SR-Real (5'-GGA GGT TGG GGA CTG CGA AT-3', SEQ ID NÚM.: 10) dirigidos a regiones de pequeña superficie del VHB fueron diseñados. 12. Se añadieron 5 pl de IQ SYBR Green Supermix (Biorad, California, EE. Uu .), 1,25 pl de cebador SF-Real, 1,25 pl de cebador SR-Real, 9 pl de agua destilada y 1 pl de ADNc en una placa de 96 pocillos. La PCR en tiempo real se realizó a 40 ciclos de 5 min a 95 °C, 15 s a 94 °C y 15 s a 60 °C utilizando el sistema de bloqueo térmico cuantitativo en tiempo real Exicycler™ 96 (Bioneer Co., Corea), y se aumentó la temperatura de 53 °C a 90 °C modulando a 0 s a 95 °C, 30 s a 53 °C y modulando 0,1 °C por segundo para analizar una curva de fusión.

Ratones transgénicos

Se prepararon ratones transgénicos de VHB inyectando una secuencia de bases de VHB de 1,1 veces que comprendía un marco de lectura abierto (ORF) completo en los óvulos fertilizados de los ratones mediante microinyección. La secuencia base del VHB utilizada en la investigación se obtuvo utilizando un plásmido pHY92-W4P. El plásmido pHY92-W4P se digirió con EcoRi antes de inyectarlo en los óvulos fecundados de los ratones, y finalmente se utilizó una secuencia de bases de 3,9 kb de longitud para la microinyección. Los individuos producidos fueron seleccionados mediante PCR utilizando una secuencia específica de HBsAg. Los individuos positivos a la PCR se seleccionaron según las concentraciones de HBsAg y HBeAg en suero, y finalmente se utilizaron como ratones positivos a la PCR, al HBsAg y al HBeAg en el estudio. Estos ratones se retrocruzaron con ratones C57BL/6 para producir ratones transgénicos heterólogos del VHB. Se realizaron hibridaciones Southern y Northern en los ratones que presentaban niveles elevados de HBsAg y HBeAg en la descendencia para confirmar la transcripción de los intermediarios de la replicación del VHB en las células hepáticas. Los ratones transgénicos del VHB que mostraban una alta transcripción con un intermedio de replicación del VHB de las células del hígado se utilizaron para la investigación antiviral de PEP1.

Ensayo con animales mediante inyección hidrodinámica

A partir del día siguiente a la inyección del ADN genómico total del VHB W4P (solución de 1,8 ml inyectada en 5s en ratones de 20g) en ratones C57/BL6, se trató con PEP1 (50 pg/kg) dos veces por semana mediante inyección subcutánea. Se obtuvieron muestras de sangre a los 1, 3, 7, 10 y 14 días, y 2 semanas después del tratamiento, se obtuvo la sangre completa de los ratones tras ser anestesiados y sacrificados el día 14. Se aisló el suero de la sangre y se diseccionó y homogeneizó rápidamente el hígado.

Detección de HBsAg, cuantificación de títulos de VHB y western blotting

Los niveles de HBsAg en los ratones transgénicos del VHB se determinaron utilizando un kit ELISA de HBsAg (BIOKIT, Alemania). Para cuantificar los títulos de VHB, se extrajo el ADN total y se confirmó mediante PCR en tiempo real. Para el western blotting, las células se lisaron utilizando la misma cantidad de una solución de lisis de proteínas que de urea 8 M y se separaron mediante electroforesis para unirlas con anticuerpos, y luego se han confirmado los anticuerpos utilizando un kit de quimioluminiscencia mejorada (ECL) (Perkin Elmer, e E. UU.).

Extracción de ARN y northern blotting

El ARN celular extraído a través de la lisis celular utilizando REzol (PROtech Technologies, Taiwán) se aisló mediante precipitación con isopropanol. El ARN obtenido se trató con DNasa I libre de RNasa (Roche, Alemania) durante 30 minutos a 37 °C para eliminar los plásmidos de ADN restantes. Posteriormente, el ARN se purificó mediante extracción con fenol/cloroformo, precipitación con etanol y resuspensión. Para el northern blotting, se aisló la misma cantidad de ARN mediante electroforesis con un gel de formaldehído al 2%, se transfirió a una membrana y se sometió a la tinción con sondas de longitud completa del VHB marcadas con P32, correspondientes a las bases totales del VHB. Como control de carga, se utilizó la hibridación de sondas GAPDH marcadas con P32 en la misma membrana.

Aislamiento y Southern Blot del ADN de unión al núcleo del VHB

Para extraer el ADN del VHB del tejido hepático de un ratón, se utilizó el siguiente procedimiento de acuerdo con un procedimiento convencional. Para la lisis de las células, se añadieron 1,2 ml de tampón NET (50 mM Tris-HC1, pH8,0, 1 mM EDTA, pH8,0, 100 mM NaCl, 0,5% NP-40) por placa de 10 cm, y se realizó un cultivo de agitación durante una hora a 37 °C, y se centrifugó (13k rpm, 10 minutos, 4 °C) para eliminar un núcleo. El sobrenadante se ajustó con 6 mM de CaCl2 y se incubó con una nucleasa micrococcal (Amersham Pharmacia Biotech AB, Suecia) durante 30 minutos a 37 °C para lisar el ARN citoplasmático o los plásmidos de ADN restantes. A continuación, se inactivaron las enzimas con 20 mM de EDTA durante 15 minutos a 65 °C. Se trataron 200 pg/ml de proteinasa K (Sigma) y 0,5% de SDS durante la noche a 50 °C para lisar las proteínas en el sobrenadante y extraer el ADN de unión al núcleo del VHB. El ADN del VHB se extrajo con fenol/cloroformo y se purificó mediante precipitación con etanol y resuspensión con una solución tampón TE. Para el northern blotting, 1/5 de la cantidad de ADN del VHB purificado se sometió a una electroforesis al 1,5%, y luego se transfirió a una membrana y se tiñó con sondas de longitud completa del VHB marcadas con P32.

Análisis de las citoquinas IL6, TNFa

Para comparar los niveles de IL6 y TNFa en los sueros de ratones obtenidos de los ratones transgénicos tratados con PEP1 y de los modelos inyectados hidrodinámicamente, se realizaron análisis según las instrucciones del fabricante utilizando un kit ELISA de I+D. La absorbancia se leyó con un lector de ELISA (Beckman, EE. UU.) a 450 nm.

Análisis de la expresión del ARN

El ARN obtenido del tejido hepático de los ratones se utilizó para observar y comparar, a nivel de ARN, las citoquinas relacionadas con la inflamación, tal como IL6, IL1p y TNFa, comparar la expresión del marcador de fibrosis hepática TGFp, colagenasa I y IV, y se determinaron los niveles de expresión de ARN de los marcadores de células inmunitarias 4/80 y CD68, una proteína atrayente de quimioquinas y sus receptores mediante PCR en tiempo real. El ARN del grupo de control se comparó con la expresión del 18S.

Análisis de las células inmunitarias en el bazo de ratones de tipo salvaje y con el genoma W4P del VHB inyectado

Se separó el bazo de un ratón transgénico, se cosecharon las células inmunitarias del bazo y se analizó la distribución de las células B, las células T (CD8+, CD4 CXCR5 células TFH) y las células NKT mediante citometría de flujo. Las células esplénicas se incubaron con antígenos de envoltura purificados de tipo salvaje y mutante, y la proliferación de las células T se determinó mediante la captación de timidina. Al mismo tiempo, se estudió el potencial de proliferación de las células T tras el tratamiento con mitógenos mediante el tratamiento con PHA, anticuerpos anti-CD3, etc. y se determinó la proliferación de las células T por el mismo procedimiento descrito anteriormente.

Análisis de las células inmunitarias en el hígado de ratones de tipo salvaje y de ratones inyectados con el genoma W4P del VHB

Después de la perfusión del hígado por vía venosa portal utilizando una solución de digestión que contenía una colagenasa, el hígado se homogeneizó, se obtuvieron células de la solución de digestión, las células del hígado se eliminaron mediante centrifugación a baja velocidad (30 RCF/3 min), y las células inmunes del hígado se obtuvieron mediante centrifugación en gradiente. Tras el bloqueo de Fc, se realizó una citometría de flujo utilizando anticuerpos anti-CD3, anti-CD4, anti-CD8, anti-NK1.1, anti-CD19, anti-CD11b y anti-CD11c para analizar la distribución de las células inmunitarias en el hígado.

Análisis de la actividad de las células T

Tras preparar una línea celular P815 que expresaba antígenos de la envoltura para activar las células inmunitarias obtenidas del bazo y del hígado durante 5 días, se determinó el grado de activación de las células T citotóxicas analizando la citotoxicidad de las células T aisladas utilizando células P815 que expresaban antígenos de la envoltura como células objetivo. Además, también se aislaron las células T de las células inmunitarias obtenidas del bazo y del hígado utilizando una columna de concentración de células T (I+D) y se incubaron con la línea celular P815 que expresaba antígenos de envoltura durante 16 horas, y luego se detectaron las células T que producían específicamente Y-interferón utilizando un kit ELISPOT de interferón-y de tipo 2.

Tratamiento estadístico

Cuando se comparó una diferencia entre categorías utilizando un programa SPSS 12.0K, se utilizó una prueba exacta de Fisher o una prueba de Chi-cuadrado. Cuando las variables continuas tenían una distribución normal, para el análisis se utilizó la prueba t de Student; en caso contrario, se utilizó la prueba U de Mann-Whitney. Cuando el valor P era igual o menor a 0,05, se determinaba como significación estadística.

Análisis de los resultados de las pruebas

1) Confirmación del potencial de inhibición de la síntesis de HBsAg por el péptido PEP1 en líneas celulares Huh7, Huh7.5 y HepG2 inyectadas con el genoma completo del VHB W4P

El efecto de PEP1 sobre la secreción de HBsAg se observó utilizando el genoma completo del VHB W4P establecido por los inventores de la presente, que induce la secreción de HBsAg y viriones del VHB, y varias líneas celulares humanas de HCC. Las líneas celulares Huh7, Huh7.5 y HepG2 se transfectaron transitoriamente con el genoma completo del VHB W4P, se trataron con 10 pM de PEP1 y 10 pM de un agente antiviral representativo, la ramivudina, (en adelante en la presente memoria, denominada 3TC), y tras 48 horas, los microgránulos y el sobrenadante (sup) se sometieron a ELISA. En consecuencia, de acuerdo con los niveles intracelulares y extracelulares de HBsAg, se puede observar que PEP1 mostró efectos inhibitorios en la línea celular HepG2, y sólo mostró inhibición intracelular pero sin diferencia en la inhibición extracelular en la línea celular Huh7, mientras que no se observó un efecto inhibidor intracelular ni extracelular en la línea celular Huh7.5. Aunque el inhibidor de la polimerasa del VHB, el 3TC, también mostró mayores efectos inhibidores que el grupo de control, no tuvo una diferencia significativa, en comparación con el grupo tratado con PEP1 (FIG. 43). En cuanto a los resultados, se ha comprobado que el péptido PEP1 tiene un efecto inhibidor de la síntesis de HBsAg del VHB, al igual que el agente antiviral representativo 3TC (el SEM de los datos se obtuvo a partir de tres experimentos por duplicado. * P < 0,05, ** P <0,01).

2) Confirmación de la inhibición de la producción de viriones por el péptido PEP1 en líneas celulares Huh7, Huh7.5 y HepG2 inyectadas con el genoma completo del VHB W4P

Para observar la producción de viriones en el sobrenadante después de observar la inhibición de la secreción de HBsAg por el péptido PEP1, se recogieron viriones del sobrenadante obtenido por el procedimiento descrito anteriormente utilizando PEG 6000, y se obtuvo ADN del VHB utilizando un kit de preparación de ADN del virus (Intron, Corea), y luego se cuantificó por p Cr en tiempo real. Como resultado, los niveles de los viriones producidos en el sobrenadante indicaron el efecto inhibidor de PEP1 como 3TC en ambas líneas celulares HepG2 y Huh7, pero no hubo efecto en la secreción de viriones en la línea celular Huh7.5. Mientras que el inhibidor de la polimerasa del VHB 3TC también mostró el efecto inhibidor en comparación con el grupo de control, no mostró ninguna diferencia significativa en el efecto inhibidor, como en el potencial de síntesis de1HBsAg, en comparación con el grupo tratado con PEP1 (FIGS. 44a, 44b, 44c y 44d). A partir de estos resultados, se ha comprobado que, al igual que el agente antiviral representativo 3TC, el péptido PEP1 también tiene un efecto inhibidor en la producción de viriones del VHB (el SEM de los datos se obtuvo a partir de tres experimentos por duplicado. * P < 0,05, ** P <0,01, *** P <0,001).

3) Confirmación de la inhibición de la síntesis de HBsAg en función de la concentración del péptido PEP1 en líneas celulares HepG2 inyectadas con el genoma W4P del VHB

En el experimento para observar el efecto inhibidor del péptido PEP1 sobre la síntesis de HBsAg en las líneas celulares Huh7, Hu7.5 y HepG2, para observar el efecto según la concentración de PEP1 utilizando la línea celular HepG2 más eficaz, la línea celular HepG2 se transfectó con el genoma completo del VHB W4P, se trató con el péptido PEP1 a diferentes concentraciones de 0,01, 0,1, 1, 10 y 100 pM, y después de 48 horas, se recogieron los microgránulos y los sobrenadantes y se sometieron a ELISA. Como grupo de control, el agente antiviral 3TC también fue tratado de la misma manera. Como resultado, en los gránulos, el péptido PEP1 mostró efectos inhibidores cuando se trató a 0,01 pM o más, que fueron ligeramente diferentes de acuerdo con la concentración. Sin embargo, en los sobrenadantes, hasta 10 pM, el péptido PEP1 mostró efectos inhibidores, pero a 100 pM, no mostró ningún efecto. En cambio, el 3TC mostró efectos inhibitorios según la concentración tanto en los microgránulos como en los sobrenadantes. A partir de estos resultados, se confirmó que el péptido PEP1 mostró un efecto dependiente de la concentración sobre la síntesis de HBsAg en los microgránulos (en la FIG. 45, el SEM de los datos se obtuvo a partir de tres experimentos por duplicado. * P < 0,05, ** P <0,01, *** P <0,001).

4) Inhibición dependiente de la concentración de la producción de viriones de acuerdo con la concentración del péptido PEP1 en líneas celulares HepG2 inyectadas con el genoma W4P del VHB

En el experimento anterior, para observar la producción de viriones según la concentración de péptidos en el sobrenadante, se realizó una PCR en tiempo real cosechando viriones del sobrenadante. Como resultado, en el microgránulo, el péptido PEP1 no fue efectivo a una concentración baja de 0,01 pM, mostró un efecto de reducción de aproximadamente el 48% a 10 pM, pero tampoco fue efectivo a una concentración alta de 100 pM. Sin embargo, se ha observado que 3TC también tiene un efecto inhibidor sobre la síntesis de viriones según la concentración. A partir de estos resultados, se ha confirmado que el péptido PEP1 tiene un efecto dependiente de la concentración en la producción de viriones hasta 10 pM (en la FIG. 46, el SEM de los datos se obtuvo a partir de tres experimentos por duplicado. * P < 0,05, ** P <0,01, *** P <0,001).

5) Efecto del péptido PEP 1 sobre la expresión de HNF4a

Es sabido que el factor nuclear 4a de los hepatocitos se une al potenciador I del VHB y, por tanto, desempeña un rol crítico en la síntesis del VHB. Por lo tanto, 48 horas después de inyectar el genoma completo del VHB W4P en una línea celular HepG2 y de tratarla con 10 pM de PEP1, se extrajeron las proteínas de los gránulos y se sometieron a una prueba de Western blot. Como grupo de control, se inyectó un vector falso y se comparó.

Como resultado, cuando se inyectó el genoma completo del VHB W4P que induce la proliferación del VHB, se observó un aumento de la expresión de HNF4a, lo que confirma que la expresión de HNF4a se redujo más eficazmente con el péptido PEP1 que con 3TC. Por lo tanto, se demostró que el efecto anti-VHB del péptido PEP1 resulta en la inhibición de la proliferación viral mediante la regulación de la expresión de HNF4a, que es un factor de transcripción (FIG. 47).

6) Efecto del péptido PEP1 sobre las citoquinas relacionadas con la inflamación

Se ha informado de que las variantes preS1 W4P del VHB están estrechamente relacionadas con la producción de IL-6, que es una citoquina reguladora de la inflamación. Por lo tanto, para observar un efecto antiinflamatorio de PEP1 en las líneas celulares inducidas por la IL-6, 48 horas después de inyectar el genoma completo del VHB W4P en las líneas celulares HepG2 y Huh7, que luego fueron tratadas con 10 pM de PEP1 y 10 pM de 3TC, respectivamente, se observaron los niveles de IL-6 en los sobrenadantes del cultivo mediante ELISA. Como resultado, cuando se inyectó el genoma completo del VHB W4P que inducía la proliferación de la IL-6, el nivel de IL-6 fue demasiado bajo para ser detectado en la línea celular HepG2, y el PEP1 no mostró ningún efecto inhibidor de la IL-6 en la línea celular Huh7. También se observó que el grupo tratado con 3TC no mostró ningún efecto sobre la producción de la citoquina IL-6 (FIG. 48).

7) Efecto de PEP1 sobre la síntesis de HBsAg y la producción de viriones en ratones transgénicos del genoma W4P del VHB entero

Para observar un efecto antiviral del péptido PEP1, se observó la síntesis de HBsAg utilizando ratones transgénicos preparados mediante la inyección del genoma completo del VHB W4P. El péptido PEP1 se inyectó en la vena caudal de un ratón dos veces por semana a una concentración de 50 pg/kg. Como grupo de control, se inyectaron 500 pg/kg de 3TC, al igual que el péptido PEP1, de la misma manera, y después de 4 y 8 semanas, se recogió la sangre completa de los ratones y se sometió a HBs ELISA para observar el nivel de HBsAg en el suero. Además, el ADN del virión del VHB se obtuvo del suero de los ratones y se sometió a la PCR en tiempo real.

Como resultado, cuando se trató hasta 4 semanas, ni el péptido PEP1 ni el 3TC mostraron un efecto de reducción en el nivel de HBsAg en suero, pero en la semana 8, el péptido PEP1 mostró un efecto de reducción de aproximadamente el 10%, en comparación con el 3TC que no mostró tal efecto. Además, para observar el nivel de viriones, se obtuvo el ADN del virión a partir del suero del ratón y se sometió a la PCR en tiempo real. En la semana 4 después del tratamiento, el péptido PEP1 y el 3TC no mostraron efectos inhibidores del virión como con e1HBsAg, pero en la semana 8, el péptido PEP1 mostró un efecto inhibidor de aproximadamente el 50%, y el 3TC mostró un efecto inhibidor de aproximadamente el 52%. Por lo tanto, se confirmó que PEP1 inhibía la producción y la secreción de viriones producidos en ratones transgénicos que contenían la variante W4P del VHB (FIG. 49).

8) Efecto del péptido PEP 1 sobre la expresión de proteínas en ratones transgénicos del genoma W4P del VHB

Para observar un cambio en la expresión de la proteína que afecta al efecto antiviral por el péptido PEP1, se utilizaron ratones transgénicos preparados mediante la inyección del genoma completo de la variante W4P del VHB. El péptido PEP1 se inyectó en la vena caudal del ratón a una concentración de 50 pg/kg dos veces por semana. Como grupo de control, se inyectaron 500 pg/kg de 3TC como el péptido PEP1. En la semana 8, se recogió la sangre completa del ratón y se extrajeron las proteínas del hígado del ratón y se sometieron a una prueba de Western blot para observar la expresión de las proteínas.

Como resultado, el péptido PEP1 no mostró ningún efecto sobre la expresión de la proteína de choque térmico 90 (HSP 90), estrechamente relacionada con la actividad de la transcriptasa inversa del VHB, crítica para la proliferación del VHB, y de la superóxido dismutasa (SOD), cuya actividad aumentó en los pacientes con hepatitis crónica por el VHB. Sin embargo, se confirmó que, entre las proteínas quinasas activadas por ras/raf (MAPK) estrechamente relacionadas con la progresión del CHC causada por HBx que sirve como activador transcripcional en varias vías de señalización, en particular, la fosforilación de proteínas de la proteína quinasa regulada por la señal extracelular (ERK) fue inhibida por el péptido PEP1, y la fosforilación de JAK2 en la señalización de Janus quinasa/transductor de señales y activador de la transcripción (jA k/STAT) también fue regulada por el péptido PEP1. También se confirmó que 3TC como grupo de control inhibía la fosforilación en la señalización de e Rk y JAK2. Por lo tanto, se consideró que el péptido PEP1 es capaz de desempeñar un rol crítico en la inhibición de la progresión del CHC causada por el VHB mediante la regulación de la proliferación del VHB, y la señalización MAPK y JAK/STAT que desempeñan papeles críticos en la progresión del CHC (FIG. 50).

9) Efecto del péptido PEP1 en la distribución de las células inmunitarias en ratones transgénicos del genoma W4P del VHB

PEP1 es un péptido de unión a HLA Clase II derivado de la telomerasa, y un péptido de 16 aminoácidos que desencadena respuestas inmunitarias de células T citotóxicas y células T auxiliares. Por lo tanto, para observar un cambio en la distribución de las células inmunitarias renales por el péptido PEP 1, se prepararon ratones transgénicos inyectándoles el genoma completo de la variante W4P del VHB, en la semana 4, se recogió la sangre completa de los ratones, y se aislaron las células inmunitarias de los riñones de los ratones y luego se tiñeron con marcadores de linfocitos (células B (CD19B), CD4, CD8, NK1.1) y marcadores de células mieloides (DC (CD 11c), un marcador de macrófagos (F4/80), un marcador de neutrófilos (Ly-6G), un marcador de monocitos (Gr1)) De acuerdo con un procedimiento de tinción de la superficie celular extracelular para el análisis FACS.

Como resultado, se ha confirmado que el péptido PEP1 no causó ninguna diferencia significativa entre todos los linfocitos, como las células B, CD4, CD8 y NK1.1, y tampoco hubo ningún efecto sobre la distribución celular de las células derivadas de los mieloides, como las DC, los macrófagos, los neutrófilos y los monocitos. También se ha confirmado que 3TC, al igual que el PEP1, no influyó en la distribución de las células inmunitarias de los ratones transgénicos del genoma W4P del VHB (FIGS. 51a a 51h).

10) Efecto del péptido PEP1 sobre la actividad del interferón y (INEy ) en ratones transgénicos del genoma W4P del VHB

INF, que es una citoquina similar a una hormona, es secretado por las células inmunitarias contra un virus. Las INF están presentes en tres tipos tal como a, p y y, y entre ellos, es sabido que INEy es crítico para inhibir el virus de la hepatitis B (VHB) en humanos. Por lo tanto, para observar la actividad de INFy, como respuesta inmunitaria, por el péptido PEP1, 8 semanas después de que se inyectaran 50 pg/kg del péptido PEP1 y 500 pg/kg de 3TC en la vena caudal de cada uno de los ratones transgénicos preparados por inyección del genoma completo de la variante W4P del VHB dos veces por semana, se recogió la sangre completa y se extrajo un riñón del ratón, y luego se aislaron las células inmunitarias y se trataron con HBsAg para su estimulación. Setenta y dos horas después de la estimulación, la citoquina INEy se acumuló en las células mediante Brefeldin A y se tiñó mediante un procedimiento de tinción intracelular para el análisis FACS.

Como resultado, todas las células CD4, CD8 y NK1.1 no mostraron actividad INFy por el péptido PEP1, y también mostraron una actividad ligeramente mayor por el 3TC. Sin embargo, no hubo diferencias significativas en la actividad (FIGS. 52a a 52g).

11) Efecto del péptido PEP1 en la diferenciación de los macrófagos en ratones transgénicos del genoma W4P del VHB

Es sabido que se exhibe un efecto antiviral ya que la diferenciación de los macrófagos a M1 conduce a la muerte celular de las células infectadas. Por lo tanto, para observar si el péptido PEP1 es capaz de diferenciar los macrófagos a M1, ocho semanas después del PBS, se inyectaron 50 pg/kg del péptido PEP1 y 500 pg/kg de 3TC en la vena caudal de cada uno de los ratones transgénicos preparados mediante la inyección del genoma completo de la variante W4P del VHB dos veces por semana, se recogió la sangre completa del ratón y se extrajo un riñón del mismo, se aislaron las células inmunitarias y se tiñeron con un marcador de macrófagos (F4/80) y el marcador M1 MHCII mediante un procedimiento de tinción de la superficie celular extracelular. A continuación, se llevó a cabo el análisis FACS.

Como resultado, mientras que la distribución de macrófagos entre las células derivadas de los mieloides se incrementó significativamente debido al péptido PEP1, el número de células diferenciadas a M1 se incrementó, en comparación con el grupo PBS, pero no significativamente. El inhibidor de la polimerasa del VHB 3TC no mostró una diferencia entre la distribución y la diferenciación celular (FIG. 53).

12) Efecto antiviral del péptido PEP1 mediante el bloqueo de HSP90 en células transfectadas con el genoma del VHB de tipo salvaje

Es sabido que PEP1 atraviesa la membrana celular desde el exterior al interior de las células en un procedimiento de lanzadera a través de la HSP90. Para confirmar si el efecto antiviral se reduce en las células por el bloqueo de la actividad de la HSP90 en base a dicho mecanismo, en esta investigación se transfectó transitoriamente una línea celular HepG2 con el genoma completo del VHB de tipo salvaje, se trató con anti-GAPDH, anti-HSP (1 ug/ml, bloqueo de la actividad de la HSP90) y 17-Aa G (1 j M) durante 1 hora, y luego con PBS (0,5%), entecavir (Et V, 30 nM) y PEP1 (5 j M) durante 24 horas. Posteriormente, se recogió el sobrenadante y se trató con PEG6000 para precipitar el virus, y se extrajo el ADN viral y se sometió a una PCR cuantitativa en tiempo real para observar el efecto antiviral. Todos los experimentos se realizaron de forma independiente por triplicado, y se realizó una prueba de significación estadística mediante un ANOVA de una vía a través de la prueba de comparación múltiple de Tukey. ** p < 0,05 vs. PBS, y ## p < 0,05 vs. ninguno.

Como resultado, se ha confirmado que el efecto antiviral de PEP1 fue estadísticamente más significativo en las células tratadas con PEP1 que en las no tratadas y cuando se trató con ETV, y el mismo resultado se obtuvo en el grupo bloqueado por GAPDH. Se ha confirmado que, en el grupo tratado con HSP90 y 17-AAG, conocido como un inhibidor de HSP90, no hubo un efecto antiviral estadísticamente significativo de PEP1 (FIG. 54). Por otra parte, se ha confirmado que no había diferencia en el efecto antiviral de ETV en las células no tratadas, o en las células tratadas con GAPDH, HSP90 o 17-AAG.

Como se describió anteriormente, se ha confirmado que el péptido PEP1 se une a un potenciador del VHB durante la transcripción del VHB para inhibir la expresión de HNF4a, que es un factor de transcripción críti

actividad del potenciador, lo que resulta en la reducción del HBsAg del VHB y la producción de viriones.

Además, se puede observar que PEP1 desempeña un rol crítico en el bloqueo de la progresión de las células infectadas por el VHB a HCC mediante la inhibición de la proliferación del VHB a través de la inhibición de las vías de señalización ERK y JAK/STAT, que son críticas en la progresión del HCC.

Cuando el cuerpo humano se infecta con virus, las células inmunitarias secretan INF contra dichos virus. En particular, es sabido que INFy desempeña un rol crucial en la inhibición del VHB en el cuerpo humano, por lo que es importante determinar la distribución de las células inmunitarias cuando el cuerpo humano está infectado por el VHB y una proporción de células inmunitarias que exhiben actividad secretora de INFy. En comparación con el grupo tratado con PBS como grupo de control, se confirmó que las células inmunitarias aumentaron en la proporción de células inmunitarias en los ratones transgénicos que contenían la variante del genoma W4P del VHB y la actividad de la citoquina INFy debida al PEP1 de la presente invención no presentó diferencias. En consecuencia, se considera que, en el cuerpo humano infectado por el VHB, el péptido PEP1 desempeña funciones cruciales en la inhibición de la proliferación del VHB mediante la inhibición de la síntesis del ARNm del VHB a través de la inhibición de la vía de señalización ERK o JAK/STAT o la reducción de la expresión de HNFa, que es un factor de transcripción que actúa sobre un potenciador del VHB, en lugar de regular un sistema inmunitario en el cuerpo humano.

De esta manera, se puede observar que el PEP1 tiene un efecto antiviral contra el VHB, y la estabilidad de PEP1 ya ha sido probada por varios ensayos clínicos. Por lo tanto, el efecto anti-VHB de PEP1 puede proporcionar una composición para tratar una enfermedad infectada por el VHB, que no tiene ni hepatotoxicidad ni nefrotoxicidad y es segura, y un procedimiento para tratar la enfermedad.

De acuerdo con los ejemplos, se pudo observar que el PEP1 que es el péptido según la presente invención y una composición que contiene PEP1 tienen un efecto inhibidor de la replicación viral y un efecto antiviral. Utilizando estos materiales, se proporcionan procedimientos para desarrollar un inhibidor viral y un agente terapéutico antiviral o para prevenir y tratar una enfermedad relacionada con el virus.

Claims

REIVINDICACIONES

1. Una composición antiviral para uso en un procedimiento para prevenir o tratar una enfermedad viral mediante la inhibición de los virus a través de la inhibición de la replicación viral, en la que el procedimiento comprende la administración de la composición antiviral a un individuo que tiene una enfermedad viral, en la que la composición comprende al menos uno seleccionado del grupo que consiste en: un péptido de la SEQ ID NÚM.: 1, un péptido que tiene al menos 80% de homología de secuencia con la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NÚM.: 1, y un fragmento de dicho péptido, como un ingrediente activo.

2. La composición antiviral para el uso de la reivindicación 1, en la que el fragmento es un fragmento que comprende tres o más aminoácidos.

3. La composición antiviral para el uso de la reivindicación 1 o 2, en la que la replicación viral está mediada por HSP90.

4. La composición antiviral para el uso de una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en la que los virus son virus de ADN o virus de ARN.

5. La composición antiviral para el uso de una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en la que los virus son uno o más seleccionados del grupo que consiste en virus dsDNA-RT, virus ssRNA-RT y virus ssRNA.

6. La composición antiviral para el uso de una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en la que los virus pertenecen a la familia Retroviridae, a la familia Flaviviridae o a la familia Hepadnaviridae.

7. La composición antiviral para el uso de una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en la que los virus son el virus de la hepatitis C (VHC), el virus de la hepatitis B (VHB) o el virus de la inmunodeficiencia humana (VIH).

8. La composición antiviral para el uso de una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en la que una concentración del péptido en la composición es de 0,0001 a 100 pM, o en la que una dosis diaria del péptido es de 0,01 pg/kg/día a l0 g/kg/día.

9. La composición antiviral para el uso de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, en la que la composición es una composición farmacéutica.

10. La composición antiviral para el uso de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, en la que la composición es una composición alimentaria.

11. La composición antiviral para el uso de cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en la que el péptido está contenido en una forma conjugada con un material de etiquetado.

12. La composición antiviral para el uso de la reivindicación 11, en la que el material de etiquetado es un material de contraste o un material fluorescente, tal como FITC.