ES2882583T3

ES2882583T3 - Electrodo microporoso y método para el análisis de una sustancia química

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Publication number: ES2882583T3
Application number: ES16813709T
Authority: ES
Inventors: Handong Li; Jianxun Lin; Quanxin Yun; Shaohua Xiang; Radoje Drmanac; Snezana Drmanac; Yongwei Zhang
Original assignee: BGI Shenzhen Co Ltd
Current assignee: BGI Shenzhen Co Ltd
Priority date: 2015-06-23
Filing date: 2016-06-23
Publication date: 2021-12-02
Anticipated expiration: 2036-06-23
Also published as: JP6818995B2; US20180180567A1; JP2018522234A; CN107683337B; EP3315461A4; EP3315461A1; WO2016206593A1; CN107683337A; EP3315461B1

Abstract

Un electrodo de micropocillos, que comprende: un sustrato y una capa aislante sobre una superficie del sustrato; uno o más primeros electrodos; uno o más segundos electrodos, cada uno dispuesto opuesto a un primer electrodo, en donde un canal está definido y situado entre cada primer electrodo y el segundo electrodo opuesto al mismo, y el canal tiene al menos un extremo en comunicación con una cámara; y uno o más electrodos de guiado situados en la cámara, en donde el primer electrodo, el segundo electrodo y los electrodos de guiado están situados sobre una superficie de la capa aislante alejada del sustrato.

Description

DESCRIPCIÓN

Electrodo microporoso y método para el análisis de una sustancia química

Campo de la invención

La presente invención se refiere al campo de la tecnología de semiconductores y al análisis de sustancias químicas, y más particularmente a un electrodo de micropocillos y un método para fabricar el mismo, una matriz de electrodos de micropocillos, un chip sensor y un sistema de secuenciación, y a un método para el análisis de una sustancia química y una molécula de ácido nucleico basado en el electrodo de micropocillos, la matriz de electrodos de micropocillos, el chip sensor o el sistema de secuenciación.

Antecedentes

La era del genoma de los 1.000 dólares se aproxima gracias a la mejora continua de la tecnología de secuenciación de ADN de segunda generación durante la última década. Sin embargo, para poner en práctica la secuenciación del genoma de 1.000 dólares e impulsar la aplicación de la tecnología de secuenciación del ADN en la medicina personalizada, todavía se necesita un desarrollo sustancial. Aquí hay cuatro problemas principales a los que se enfrentan las plataformas de secuenciación de segunda generación: (1) longitud de lectura corta debido al desfase inherente; (2) velocidad de lectura lenta debido a la etapa de elución requerida para la incorporación de bases; (3) preparación de muestras laboriosa y costosa necesaria para la amplificación; (4) sistema óptico costoso. La tecnología de secuenciación de una sola molécula se considera el enfoque más prometedor para abordar todos los problemas anteriores simultáneamente.

Una nueva tecnología de secuenciación es la tecnología de secuenciación basada en nanoporos. La idea básica de esta tecnología radica en que, cuando una molécula de ADN individual pasa a través de un nanoporo, esta estructura de nanoporo sirve simultáneamente tanto como un sitio de restricción como un sitio de incorporación. Oxford Nanopore Technology (ONT), líder en secuenciación de nanoporos, ha lanzado recientemente su primer secuenciador de nanoporos de proteínas con una longitud de lectura de 10.000 bases y una velocidad de lectura de 100 bases por segundo. En comparación con Pacific Biosciences (PacBio), líder en secuenciación de una molécula individual, la técnica de ONT puede reducir significativamente el coste y el tamaño del secuenciador, ya que no se requiere ningún dispositivo óptico.

El desarrollo de la técnica de secuenciación basada en nanoporos de proteínas es más rápido en comparación con el nanoporo de estado sólido, aunque existe un consenso general de que el nanoporo de estado sólido es mucho más superior en términos de estabilidad y escalabilidad, que son extremadamente importantes para un dispositivo de secuenciación robusto y de bajo coste. Un nanoporo de estado sólido todavía carece de precisión atómica y especificidad química en comparación con un nanoporo de proteína. La especificidad química puede cumplirse generalmente con diversas técnicas de modificación de superficies. Sin embargo, la producción reproducible de grandes matrices de nanoporos todavía enfrenta dificultades en su proceso de fabricación. La mayoría de los métodos de secuenciación actuales basados en nanoporos se basan en una estructura nanométrica tridimensional, no solo el diámetro de un poro debe ser lo suficientemente pequeño, sino que también el espesor del poro o de un electrodo debe ser tan pequeño como la distancia entre las bases adyacentes. El método más común para formar un nanoporo de este tipo es grabar con un haz de iones o perforar con un haz de electrones un material aislante delgado tal como nitruro de silicio o grafeno. Sin embargo, este método no es convencional y no es compatible con el proceso de fabricación de semiconductores estándar. Esto hace que el proceso de fabricación de nanoporos sea muy costoso e irreproducible. Si bien, desde el punto de vista de la aplicación comercial, la técnica basada en nanoporos puede ofrecer una longitud de lectura muy larga que es superior a otras técnicas actuales, y puede reducir en gran medida los costes de secuenciación.

Hay dos enfoques para eludir los requisitos de un proceso de fabricación preciso y eficaz requerido para nanoporos de estado sólido. Un enfoque consiste en modificar la muestra de ADN para mejorar la diferencia de señal entre las bases, aliviando así los requisitos de precisión y tamaño del nanoporo. Hay algunas empresas de secuenciación basadas en nanoporos, tales como Genia Technologies y Stratos Genomics, que actualmente persiguen este enfoque. Por ejemplo, en la secuenciación de Stratos Genomics con tecnología de amplificación, cada base se reemplaza por una molécula indicadora grande con una señal fuerte usando un método de amplificación molecular patentado. Genia Technologies usa ADN polimerasa para secuenciar un ADN plantilla, ya que las etiquetas específicas de bases producidas por escisión enzimática pueden ser capturadas y reconocidas por un nanoporo. Aunque estas empresas se están centrando actualmente en nanoporos de proteínas, la misma idea se puede aplicar a los nanoporos de estado sólido sin ningún obstáculo técnico. El otro enfoque es simplificar la nanoestructura tridimensional a una nanoestructura bidimensional, ya que el proceso de fabricación de semiconductores estándar ha sido aplicable para nanoestructuras bidimensionales convencionales, tales como nanocables, nanocanales y nanohuecos. El reto se ha convertido en cómo lograr una resolución de base única mientras que el número de nanoestructuras unidimensionales ya no se limita a un solo dígito. Ya existen algunos enfoques para abordar este problema. Nabsys está desarrollando una plataforma de secuenciación posicional que genera un mapa de secuenciación de larga distancia con secuencias de sonda cortas mediante la detección de etiquetas específicas de secuencia unidas a una plantilla de ADN cuando la plantilla de ADN pasa a través de un nanocanal (~100 nm).

En conclusión, la secuenciación de ADN basada en nanoporos todavía se enfrenta a muchos retos técnicos. Por lo tanto, cómo superar los problemas anteriores y proponer un esquema de secuenciación de ADN basado en nanoporos de bajo coste y alto rendimiento se ha convertido en la prioridad de la ciencia y la tecnología en todo el mundo. El desarrollo de una nueva generación de tecnología de detección de ADN a nivel de molécula única con derechos de propiedad intelectual independientes desempeñará un papel importante en el diseño de la industria de alta tecnología de China en el futuro. Además, la integración y portabilidad de la solución de los problemas anteriores tendrá un efecto de promoción positivo en muchos campos, tales como el diagnóstico de enfermedades, las pruebas de alimentos y el control ambiental.

El documento US 2012/097539 A1 proporciona un dispositivo de translocación de nanopartículas que incluye un primer depósito que tiene un primer electrodo de depósito, un segundo depósito que tiene un segundo electrodo de depósito y al menos un nanoporo que proporciona comunicación de fluido entre el primer y el segundo depósitos. El dispositivo también incluye una o más porciones de electrodo internas en una pared interna del nanoporo y una o más porciones de electrodo externas dispuestas en una pared externa del nanoporo.

El documento US 8500979 B2 proporciona un sensor electrónico que tiene al menos dos electrodos incorporados en una capa no conductora y separados por un hueco a nanoescala. La separación entre el primer electrodo y el segundo electrodo forma una cavidad capaz de contener un fluido. Dos o más bornas compuestas por un material aislante se extienden dentro de la cavidad desde la cara del primer electrodo hasta la cara del segundo electrodo.

El documento WO 2011/082419 A2 proporciona un sistema de detección de analitos que comprende: un nanocanal que tiene un primer extremo, un segundo extremo opuesto al primer extremo, un primer lado y un segundo lado opuesto al primer lado; un par de electrodos electroforéticos, que comprenden un primer electrodo electroforético en el primer extremo y un segundo electrodo electroforético en el segundo extremo; un par de electrodos ortogonales, que comprenden un primer electrodo ortogonal en el primer lado y un segundo electrodo ortogonal en el segundo lado; y una pluralidad de dispositivos de transistores de efecto de nanocampo (nanoFET) dispuestos en el canal

El documento WO 2010/044932 A2 proporciona un detector eléctrico que comprende un canal de nanofluidos y un sensor de carga. Una porción del sensor de carga se integra en el canal de nanofluidos, por lo que el sensor de carga entra en contacto con el fluido del canal de nanofluidos.

El documento WO 2013/154999 A2 proporciona sistemas y métodos para secuenciar ácidos nucleicos usando análogos de nucleótidos y translocación de etiquetas de análogos de nucleótidos incorporados a través de un nanoporo.

El documento EP 2652153 A2 proporciona un método de secuenciación de un ADN monocatenario usando análogos de polifosfato de desoxinucleótido y translocación de etiquetas de análogos de polifosfato de desoxinucleótido incorporados a través de un nanoporo

El documento WO 0070073 A1 proporciona un método de secuenciación de una molécula de ácido nucleico diana que tiene una pluralidad de bases nucleotídicas que comprende: proporcionar un complejo de una enzima de polimerización de ácido nucleico y la molécula de ácido nucleico diana orientadas entre sí en una posición adecuada para añadir un análogo de nucleótido en un sitio activo complementario al ácido nucleico diana; proporcionar una pluralidad de tipos de análogos de nucleótidos próximos al sitio activo, en el que cada tipo de análogo de nucleótidos es complementario a un nucleótido diferente en la secuencia de ácido nucleico diana; polimerizar un análogo de nucleótido en un sitio activo, en el que el análogo de nucleótido que se añade es complementario al nucleótido del ácido nucleico diana, dejando el análogo de nucleótido añadido listo para la posterior adición de análogos de nucleótidos; identificar el análogo de nucleótido añadido en el sitio activo como resultado de dicha polimerización; y repetir dicha etapa de proporcionar una pluralidad de tipos de análogos de nucleótidos, dicha polimerización y dicha identificación de modo que se determine la secuencia del ácido nucleico diana.

Sumario

De acuerdo con un aspecto de la invención, se proporciona un electrodo de micropocillos, que comprende: un sustrato y una capa aislante sobre una superficie del sustrato; uno o más primeros electrodos; uno o más segundos electrodos, cada uno dispuesto opuesto a cada primer electrodo, en el que un canal está definido y situado entre cada primer electrodo y el segundo electrodo opuesto al mismo, y el canal tiene al menos un extremo en comunicación con una cámara; y uno o más electrodos de guiado situados en la cámara, en el que el primer electrodo, el segundo electrodo y los electrodos de guiado están situados sobre una superficie de la capa aislante alejada del sustrato.

En una realización, el electrodo de guiado puede guiar una sustancia cargada al canal y/o controlar el movimiento de una sustancia cargada en el canal.

En una realización, el electrodo de micropocillos comprende además: un primer elemento de soporte para soportar el uno o más primeros electrodos. Preferentemente, cada uno de los primeros electrodos está situado en una pared lateral del primer elemento de soporte.

En una realización, el electrodo de micropocillos comprende una pluralidad de primeros electrodos y una pluralidad de primeros elementos de soporte, cada uno de los primeros electrodos está soportado por un primer elemento de soporte correspondiente.

En una realización, el electrodo de micropocillos comprende una pluralidad de segundos electrodos, comprendiendo además el electrodo de micropocillos: una pluralidad de segundos elementos de soporte, cada uno de los segundos electrodos está soportado por un segundo elemento de soporte correspondiente. Preferentemente, cada uno de los segundos electrodos está situado en una pared lateral de un segundo elemento de soporte.

En una realización, el primer electrodo comprende una pluralidad de segmentos separados entre sí.

En una realización, el segundo electrodo comprende una pluralidad de segmentos separados entre sí.

En una realización, el primer electrodo comprende una pluralidad de segmentos separados entre sí, y el electrodo de micropocillos comprende además una pluralidad de primeros elementos de soporte, cada segmento del primer electrodo está soportado por un primer elemento de soporte correspondiente.

En una realización, el segundo electrodo comprende una pluralidad de segmentos separados entre sí, y el electrodo de micropocillos comprende además una pluralidad de segundos elementos de soporte, cada segmento del segundo electrodo está soportado por un segundo elemento de soporte correspondiente.

En una realización, el primer elemento de soporte es un elemento conductor. En tal realización, se puede aplicar un voltaje al primer electrodo a través del primer elemento de soporte.

En una realización, el primer elemento de soporte es un elemento no conductor. En tal realización, preferentemente, el primer elemento de soporte se usa principalmente para soportar el primer electrodo y, preferentemente, se puede aplicar un voltaje al primer electrodo a través de un alambre incorporado en el primer elemento de soporte.

En una realización, el segundo elemento de soporte es un elemento conductor. En tal realización, se puede aplicar un voltaje al segundo electrodo a través del segundo elemento de soporte.

En una realización, el segundo elemento de soporte es un elemento no conductor. En tal realización, preferentemente, el segundo elemento de soporte se usa principalmente para soportar el segundo electrodo. Y preferentemente, se puede aplicar un voltaje al segundo electrodo a través de un alambre incorporado en el segundo elemento de soporte. En una realización, el electrodo de micropocillos puede comprender además una nanoestructura capaz de inmovilizar una enzima o una sustancia química a detectar. En una realización, la nanoestructura está situada en el fondo o en una pared lateral de la cámara, o en el fondo o una pared lateral del canal, o en los electrodos de guiado.

En una realización, la nanoestructura está formada por un material seleccionado de un grupo que consiste en un metal, un óxido metálico, un polímero inorgánico, un polímero orgánico o cualquier combinación de los mismos.

En una realización, el canal tiene un ancho de 0,5-100 nm, por ejemplo, 1 nm, 2 nm, 10 nm, 50 nm, 80 nm, etc.; y/o el canal tiene una longitud de 50 nm-100 pm, por ejemplo, 100 nm, 500 nm, 5 pm, 10 pm, 30 pm, etc.; y/o el canal tiene una profundidad de 0-10 pm, por ejemplo, 100 nm, 300 nm, 1 pm, 2 pm, 8 pm, etc.

En una realización, el primer electrodo tiene un espesor de 1-1000 nm, por ejemplo, 30 nm, 50 nm, 200 nm, 600 nm, 800 nm, etc.

En una realización, el segundo electrodo tiene un espesor de 1-1000 nm, por ejemplo, 30 nm, 50 nm, 200 nm, 600 nm, 800 nm, etc.

En una realización, el primer electrodo y el segundo electrodo están formados por el mismo material.

En una realización, el primer electrodo y el segundo electrodo están formados por diferentes materiales.

En una realización, el primer elemento de soporte, el primer electrodo y el segundo electrodo pueden estar formados por el mismo material o por diferentes materiales.

En una realización, el primer electrodo está formado por un material seleccionado de un grupo que consiste en platino, oro, óxido de indio y estaño, material(es) a base de carbono, silicio u otros materiales conductores; y/o el segundo electrodo está formado por un material seleccionado de un grupo que consiste en platino, oro, óxido de indio y estaño, material(es) a base de carbono, silicio u otros materiales conductores; y/o los electrodos de guiado están formados por un material seleccionado de un grupo que consiste en silicio, platino, oro, óxido de indio y estaño o material(es) a base de carbono.

En una realización, el elemento conductor está formado por un material seleccionado de un grupo que consiste en silicio, platino, oro, plata, óxido de indio y estaño, material(es) a base de carbono u otros materiales conductores.

En una realización, el elemento no conductor está formado por un material seleccionado de un grupo que consiste en óxido de silicio, nitruro de silicio, oxinitruro de silicio, vidrio de borofosfosilicato y similares.

En una realización, el primer elemento de soporte tiene una forma en sección de forma elíptica, circular, poligonal o de engranaje en una dirección paralela a una superficie de un sustrato.

En una realización, la superficie inferior de la cámara y la superficie inferior del canal están en el mismo plano o en planos diferentes.

En una realización, el electrodo de micropocillos comprende además: un sustrato y una capa aislante sobre el sustrato, en el que el primer electrodo, el segundo electrodo y los electrodos de guiado están situados sobre la capa aislante.

En una realización, los electrodos de guiado son sustancialmente perpendiculares al primer electrodo o al segundo electrodo. Es decir, la dirección del campo eléctrico entre los electrodos de guiado es sustancialmente perpendicular a la dirección del campo eléctrico entre el primer electrodo y el segundo electrodo después de aplicar voltajes a los electrodos de guiado, el primer electrodo y el segundo electrodo.

En una realización, el electrodo de micropocillos comprende además: una capa de pasivación situada sobre la superficie o superficies del primer electrodo y/o el segundo electrodo.

De acuerdo con otro aspecto de la invención, se proporciona una matriz de electrodos de micropocillos, que comprende: uno o más electrodos de micropocillos de acuerdo con una cualquiera de las realizaciones anteriores.

En una realización, la matriz de electrodos de micropocillos comprende una pluralidad de electrodos de micropocillos. Por ejemplo, el número de electrodos de micropocillos puede ser 100, 10000, 106 o 108, etc.

En una realización, la pluralidad de electrodos de micropocillos en la matriz de electrodos de micropocillos están dispuestos en forma elíptica, circular, anular, de abanico, rectangular, cuadrada, en zigzag o de engranaje, o como una matriz. de filas y columnas, o como capas laminadas, etc.

En una realización, más de un electrodo de micropocillos son independientes entre sí, o están conectados en serie o conectados en paralelo.

En una realización, la pluralidad de electrodos de micropocillos en la matriz de electrodos de micropocillos comparten un electrodo de guiado.

De acuerdo con otro aspecto de la invención, se proporciona un chip sensor, que comprende: la matriz de electrodos de micropocillos de acuerdo con la realización anterior.

En la invención, el chip sensor y un circuito integrado correspondiente se pueden fabricar en un proceso adaptado al proceso CMOS. En aplicaciones específicas, el número de electrodos de micropocillos incluidos en una matriz de electrodos de micropocillos en un chip sensor se puede determinar de acuerdo con el tamaño del electrodo de micropocillos, las propiedades de una molécula a detectar, el coste u otros factores. Por ejemplo, la matriz de electrodos de micropocillos puede ser, por ejemplo, una matriz de 10x10, una matriz de 100x100, una matriz de 1000x1000 o una matriz de 104x104, etc.

De acuerdo con otro aspecto más de la invención, se proporciona un sistema de secuenciación, que comprende: el chip sensor de acuerdo con la realización anterior.

De acuerdo con otro aspecto más de la invención, se proporciona un método para fabricar un electrodo de micropocillos, que comprende: proporcionar una estructura de sustrato que comprende un sustrato con una capa aislante sobre su superficie y una primera capa de material de elemento de soporte en la capa aislante, en el que la primera capa de material de elemento de soporte tiene sucesivamente en su pared lateral una primera capa de material de electrodo, una capa de material de sacrificio, un segunda capa de material de electrodo y una segunda capa de material de elemento de soporte; estructurar la primera capa de material de elemento de soporte, la primera capa de material de electrodo, la capa de material de sacrificio, la segunda capa de material de electrodo y la segunda capa de material de elemento de soporte para formar una o más cámaras, un primer elemento de soporte, y formar un primer electrodo, un capa de sacrificio, un segundo electrodo y un segundo elemento de soporte situados sucesivamente en la pared lateral del primer elemento de soporte; formar uno o más electrodos de guiado en la cámara; eliminar la capa de sacrificio en la pared lateral del primer elemento de soporte para formar un canal entre el primer electrodo y el segundo electrodo, en el que el canal tiene al menos un extremo en comunicación con la cámara.

En una realización, la etapa de proporcionar la estructura de sustrato comprende: proporcionar un sustrato con una capa aislante en su superficie; formar una primera capa de material de elemento de soporte en una porción de la capa aislante; depositar una primera capa de material de electrodo para cubrir la superficie superior y una pared lateral de la primera capa de material de elemento de soporte; eliminar la primera capa de material de electrodo en la superficie superior de la primera capa de material de elemento de soporte; depositar una capa de material de sacrificio para cubrir la superficie superior de la primera capa de material de elemento de soporte, la superficie superior y una pared lateral de la primera capa de material de electrodo restante; eliminar la capa de material de sacrificio en la superficie superior de la primera capa de material de elemento de soporte y la superficie superior de la primera capa de material de electrodo restante; depositar una segunda capa de material de electrodo para cubrir la superficie superior de la primera capa de material de elemento de soporte, la superficie superior de la primera capa de material de electrodo restante y una superficie superior y una pared lateral de la capa de material de sacrificio restante; eliminar la segunda capa de material de electrodo en la superficie superior de la primera capa de material de elemento de soporte, la superficie superior de la primera capa de material de electrodo restante y la superficie superior de la capa de material de sacrificio restante; depositar una segunda capa de material de elemento de soporte para cubrir la primera capa de material de elemento de soporte, la primera capa de material de electrodo en la pared lateral de la primera capa de material de elemento de soporte, la capa de material de sacrificio sobre la pared lateral de la primera capa de material de elemento de soporte, la segunda capa de material de electrodo sobre la pared lateral de la primera capa de material de elemento de soporte, y la porción que no está cubierta de la capa aislante; aplanar la segunda capa de material de elemento de soporte depositada para exponer la capa de material de sacrificio sobre la pared lateral de la primera capa de material de elemento de soporte.

En una realización, los electrodos de guiado son sustancialmente perpendiculares al primer electrodo; y/o los electrodos de guiado son sustancialmente perpendiculares al segundo electrodo.

En una realización, antes de eliminar la capa de sacrificio en la pared lateral del primer elemento de soporte, el método comprende además: formar una capa de pasivación sobre una superficie de al menos uno del primer elemento de soporte, el segundo elemento de soporte, el primer electrodo o el segundo electrodo.

En una realización, antes de eliminar la capa de sacrificio en la pared lateral del primer elemento de soporte, el método comprende además: eliminar una porción de la parte superior del primer elemento de soporte y una porción de la parte superior del segundo elemento de soporte para exponer una porción del primer electrodo, una porción de la capa de sacrificio y una porción del segundo electrodo; depositar una capa de pasivación sobre el primer elemento de soporte restante, el segundo elemento de soporte restante, la porción expuesta del primer electrodo, la porción expuesta de la capa de sacrificio y la porción expuesta del segundo electrodo; aplanar la capa de pasivación depositada para formar una capa de pasivación en la porción restante del primer elemento de soporte y la porción restante del segundo elemento de soporte y exponer la capa de sacrificio.

En una realización, la etapa de estructuración de la primera capa de material de elemento de soporte, la primera capa de material de electrodo, la capa de material de sacrificio, la segunda capa de material de electrodo y la segunda capa de material de elemento de soporte comprende: separar la primera capa de material de electrodo y/o la segunda capa de material de electrodo en una pluralidad de segmentos, de modo que el primer electrodo y/o el segundo electrodo formados comprendan cada uno una pluralidad de segmentos separados entre sí.

En una realización, el método comprende además: formar una nanoestructura capaz de inmovilizar una enzima o una sustancia química a detectar en el fondo o una pared lateral de la cámara, o en el fondo o una pared lateral del canal, o en los electrodos de guiado.

En una realización, el primer electrodo está formado por un material seleccionado de un grupo que consiste en silicio, platino, oro, óxido de indio y estaño o material(es) a base de carbono; y/o la capa de sacrificio está formada por un material seleccionado de un grupo que consiste en cromo, wolframio, aluminio, óxido de aluminio, silicio, óxido de silicio, nitruro de silicio; y/o el segundo electrodo está formado por un material seleccionado de un grupo que consiste en silicio, platino, oro, plata, óxido de indio y estaño o material(es) a base de carbono; y/o los electrodos de guiado están formados por un material seleccionado de un grupo que consiste en silicio, platino, oro, plata, óxido de indio y estaño o material(es) a base de carbono.

En una realización, el primer elemento de soporte y el segundo elemento de soporte comprenden elementos conductores.

En una realización, el elemento conductor está formado por un material seleccionado de un grupo que consiste en silicio, platino, oro, plata, óxido de indio y estaño o material(es) a base de carbono.

En una realización, el primer elemento de soporte y/o el segundo elemento de soporte tienen una forma en sección de forma elíptica, circular, rectangular, cuadrada o de engranaje en una dirección paralela a una superficie del sustrato.

La invención también proporciona un método para el análisis de una sustancia química, que comprende las etapas de:

(1) proporcionar un electrodo de micropocillos o una matriz de electrodos de micropocillos de acuerdo con la invención;

(2) añadir una solución de reacción que contiene una sustancia química a ensayar al electrodo de micropocillos o la matriz de electrodos de micropocillos, y someter la solución de reacción a una reacción para producir una molécula cargada;

(3) permitir que la molécula cargada entre en el canal bajo la acción del electrodo de guiado y/o un efecto hidromecánico, o que se acumule en el canal bajo la acción del electrodo de guiado; y

(4) identificar el tipo de molécula cargada usando el primer electrodo, el segundo electrodo y/o el electrodo de guiado, y así obtener la información de la sustancia química a ensayar.

En una realización, en la etapa (4), el tipo de molécula cargada se identifica con el primer electrodo, el segundo electrodo y/o el electrodo de guiado basándose en uno o más efectos seleccionados de un grupo que consiste en un efecto de oxidación-reducción, efecto de resistencia eléctrica, efecto de capacitancia, efecto de campo y efecto túnel.

En una realización, la sustancia química a ensayar se selecciona de un grupo que consiste en una molécula biológica (tal como un ácido nucleico, proteína, lípido y polisacárido), un compuesto, un polímero orgánico, etc. En una realización, la sustancia química a ensayar es un ácido nucleico, tal como ADN o ARN.

En una realización, la sustancia química a ensayar comprende o consiste en una o más unidades básicas (tales como nucleótidos, aminoácidos y monómeros poliméricos). En una realización, la unidad básica de la sustancia química a ensayar no está modificada. En otra realización, la unidad básica de la sustancia química a ensayar se modifica mediante una molécula marcadora.

En una realización, la solución de reacción contiene una unidad básica libre modificada por una molécula marcadora, que libera una molécula marcadora libre después de la reacción. Preferentemente, la molécula marcadora libre está cargada (es decir, una molécula cargada) y puede entrar en el canal bajo la acción del electrodo de guiado, o acumularse en el canal bajo la acción del electrodo de guiado. Por lo tanto, el tipo de molécula cargada se puede identificar usando el primer electrodo, el segundo electrodo y/o el electrodo de guiado, y así se obtiene la información de la sustancia química a ensayar.

En una realización, la solución de reacción contiene uno o más tipos de unidades básicas modificadas con moléculas marcadoras libres. En una realización, la solución de reacción contiene al menos dos tipos (tales como tres, cuatro o más tipos) de unidades básicas modificadas con moléculas marcadoras libres. En una realización, diferentes unidades básicas se modifican por la misma molécula marcadora. En otra realización, diferentes unidades básicas se modifican por diferentes moléculas marcadoras.

En una realización, la molécula marcadora libre es una sustancia activa redox, y el primer electrodo y el segundo electrodo se usan como electrodos de detección, para identificar el tipo de molécula marcadora mediante un efecto de oxidación-reducción.

En una realización, además del efecto de oxidación-reducción, en la etapa (4), el tipo de molécula cargada se puede identificar con el primer electrodo, el segundo electrodo y/o el electrodo de guiado basándose en uno o más de efecto de resistencia eléctrica, efecto de capacitancia, efecto de campo y efecto túnel. En dichas realizaciones, la molécula cargada se puede detectar usando uno o más principios de detección, para mejorar la precisión del resultado de la detección. Por ejemplo, cuando se genera un campo eléctrico entre los electrodos de guiado, cualquier molécula en un canal bloqueará físicamente la corriente iónica, lo que dará como resultado una reducción detectable de la corriente iónica. La precisión de la detección de la molécula cargada se puede mejorar aún más seleccionando una molécula marcadora de un tamaño adecuado y un canal de una longitud adecuada, y mediante la característica de señal resultante del efecto de resistencia eléctrica. Por lo tanto, un experto en la técnica puede seleccionar una combinación de métodos para la identificación de los tipos de la molécula cargada dependiendo de la necesidad práctica. Por ejemplo, se puede usar una combinación de efecto de campo y efecto de oxidación-reducción, una combinación de efecto de capacitancia y efecto de oxidación-reducción, una combinación de efecto de resistencia eléctrica y efecto de oxidación-reducción, o una combinación de efecto de oxidación-reducción, efecto de resistencia eléctrica y efecto de campo, para identificar los tipos de molécula cargada.

En una realización, puede haber una película de modificación en la superficie de una capa aislada en el fondo del canal. Preferentemente, el primer electrodo y el segundo electrodo se usan como electrodo fuente y electrodo de drenaje, respectivamente, y la película de modificación se usa como canal conductor entre los dos electrodos. Además, preferentemente, se puede formar un sitio de reconocimiento para una molécula marcadora en el canal conductor y usarse como un electrodo de compuerta, para formar un transistor de efecto de campo. Cuando se unen diferentes moléculas marcadoras en la película de modificación, el canal conductor tendrá una conductividad eléctrica diferente, generando así una intensidad de corriente diferente entre el electrodo fuente y el electrodo de drenaje. Por lo tanto, basándose en la diferencia de la intensidad de la corriente, se pueden distinguir diferentes moléculas marcadoras.

Con respecto a la fiabilidad de un sistema, dado que los medios de detección no se superponen ni se afectan entre sí, sus resultados se pueden usar como respaldo entre sí, y el uso de múltiples medios de detección no dará como resultado el colapso de la totalidad del sistema.

En una realización, el primer electrodo y/o el segundo electrodo pueden separarse cada uno en una pluralidad de segmentos, es decir, dos o más segmentos (por ejemplo, 3-4 segmentos). En una realización, después de la separación, cada segmento de electrodo tiene un voltaje diferente. En dichas realizaciones, de manera particularmente preferente, el voltaje de cada segmento de electrodo corresponde al voltaje de respuesta (ventana de potencial redox) de una molécula marcadora. Por lo tanto, para una molécula marcadora, solo el segmento de electrodo, cuyo voltaje corresponde al voltaje de respuesta de la molécula marcadora, puede responder a la molécula marcadora y generar una señal; mientras que los demás segmentos del electrodo no pueden responder a la molécula marcadora ni generar una señal. Por lo tanto, basándose en la presencia o ausencia de una señal de un segmento de electrodo, se puede determinar si una molécula marcadora correspondiente al segmento de electrodo está presente o no. Un medio de detección de este tipo es favorable para distinguir una señal del ruido. Un diseño de este tipo en los electrodos es capaz de proporcionar información dinámica y es significativamente diferente del método tradicional basado en nanoporos. En una realización, en el mismo canal, el primer electrodo y/o el segundo electrodo se separan en una pluralidad de segmentos, tales como 2-4 segmentos de electrodos transversales, y cada segmento individual de electrodo se puede controlar de forma independiente para generar un voltaje diferente.

Además, en una realización, cada electrodo de micropocillos puede tener una pluralidad de canales. Una pluralidad de canales proporcionados en un electrodo de micropocillos puede aumentar en gran medida el área superficial para la detección y, por lo tanto, no solo puede mejorar la intensidad de la señal, sino también reducir el efecto de contaminación potencial. La combinación de una matriz de electrodos de micropocillos y una cámara también proporciona modos más controlables para la inyección de muestras.

En una realización, el canal puede tener un extremo abierto. El proceso para fabricar un canal de extremo abierto es más simple y más fácil, y el canal de extremo abierto es conveniente para la inyección de una muestra y un líquido, y puede lograr un mejor equilibrio entre velocidad y precisión. En una realización, el canal puede tener un extremo cerrado. El canal de extremo cerrado es favorable para controlar y reducir la interferencia de la señal de impureza externa. En una aplicación práctica, la estructura de los canales (canal de extremo abierto, canal de extremo cerrado o una combinación de los mismos) se puede seleccionar dependiendo de las condiciones particulares. En una realización, el electrodo de micropocillos comprende uno o más canales de extremo abierto, o uno o más canales de extremo cerrado, o tanto uno o más canales de extremo abierto como uno o más canales de extremo cerrado.

En una realización, la sustancia química a ensayar es una molécula de ácido nucleico y, en la etapa (2), la solución de reacción se somete a polimerización de nucleótidos.

En una realización, el método se usa para el análisis de la composición, secuencia, carga eléctrica, tamaño o concentración de una sustancia química.

La invención también proporciona un método para el análisis de una molécula de ácido nucleico, que comprende las etapas de:

(2) inmovilizar una polimerasa (tal como ADN polimerasa o ARN polimerasa) en la cámara o canal de o en el electrodo de guiado del electrodo de micropocillos o la matriz de electrodos de micropocillos;

(3) añadir al electrodo de micropocillos o a la matriz de electrodos de micropocillos, una solución de reacción que contiene una molécula de ácido nucleico a ensayar, un cebador y al menos una molécula (por ejemplo, una, dos, tres o cuatro) de trifosfato de desoxirribonucleósido (dNTP) o de trifosfato de nucleósido (NTP) o un análogo de las mismas, en el que el cebador puede hibridarse o aparearse con una secuencia parcial de la molécula de ácido nucleico a ensayar, y cada una de las al menos una molécula de dNTP o NTP o un análogo se modifica con una molécula marcadora, respectivamente; y posteriormente, en una condición adecuada, hibridar la molécula de ácido nucleico a ensayar con el cebador para formar un complejo;

(4) en presencia de la polimerasa como catalizador, incorporar una de las moléculas de dNTP o NTP modificadas con la molécula marcadora o un análogo en el cebador, para formar un producto de extensión complementario a la molécula de ácido nucleico a ensayar, y eliminar la molécula marcadora transportada por la molécula de dNTP o NTP o un análogo que se incorpora en el cebador, para proporcionar una molécula marcadora libre, en la que se carga la molécula marcadora libre;

(5) permitir que la molécula marcadora libre entre en el canal bajo la acción del electrodo de guiado y/o un efecto hidromecánico, o que se acumule en el canal bajo la acción del electrodo de guiado; preferentemente, se controla que la molécula marcadora libre entre o se acumule en diferentes canales de electrodos de micropocillos mediante su polaridad eléctrica o el orden de liberación;

(6) identificar el tipo de molécula marcadora libre usando el primer electrodo y el segundo electrodo; e identificar además el tipo de molécula de dNTP o NTP o un análogo que se incorpora en el cebador de acuerdo con la correspondencia entre la molécula marcadora y la molécula de dNTP o n Tp o un análogo; y determinar además la base en la posición correspondiente de la molécula de ácido nucleico a ensayar, de acuerdo con el principio de emparejamiento de bases complementarias; y

(7) repetir las etapas (4), (5) y (6) hasta finalizar la ampliación del complejo.

En una realización, en la etapa (6), el tipo de molécula marcadora libre se identifica por uno o más de efecto de oxidación-reducción, efecto de resistencia eléctrica, efecto de capacitancia, efecto de campo y efecto túnel.

En una realización, el tipo de molécula marcadora se identifica por efecto de oxidación-reducción. En una realización, la molécula marcadora libre puede ser una sustancia activa redox que es reactiva en una reacción redox circular, o puede convertirse en una sustancia activa redox que es reactiva en una reacción redox circular. En una realización, la molécula marcadora libre puede convertirse física o químicamente en una sustancia activa redox que es reactiva en una reacción redox circular. Preferentemente, la sustancia activa redox puede someterse a una reacción redox circular entre el primer electrodo y el segundo electrodo, dando como resultado una corriente detectable. De este modo, el tipo de molécula marcadora puede identificarse mediante la corriente detectable. En una realización, además del efecto de oxidación-reducción mencionado anteriormente, el tipo de molécula marcadora puede identificarse por uno o más de efecto de resistencia eléctrica, efecto de capacitancia, efecto de campo y efecto túnel.

En una realización, la entrada de la molécula marcadora libre (por ejemplo, una molécula marcadora activa redox) se conduce y/o se controla mediante el uso del electrodo de guiado u otros medios, y los potenciales se aplican al primer electrodo y al segundo electrodo del canal, respectivamente. Cuando el potencial del primer electrodo y el segundo electrodo coincide con la ventana de potencial redox de la molécula marcadora, la molécula marcadora puede someterse a una reacción redox circular entre el primer electrodo y el segundo electrodo, y se genera una señal de pulso de corriente redox detectable. Usando la señal de pulso de corriente redox detectable, la molécula marcadora puede identificarse y detectarse específicamente. Cuando se proporciona un potencial coincidente entre el primer electrodo y el segundo electrodo pero no se detecta ninguna señal de pulso, esto indica que la molécula marcadora no está presente.

En una realización, cada una de las al menos una molécula de dNTP o NTP o un análogo lleva una molécula marcadora que tiene una ventana de potencial redox diferente. En una realización preferida, el tipo de molécula marcadora en el canal se puede identificar cambiando el potencial del primer electrodo y/o el segundo electrodo, y determinando si se genera una señal de pulso de corriente redox en diversas condiciones potenciales y, opcionalmente, determinando la información tal como la amplitud de la señal de la señal de pulso.

En una realización, cada una de las al menos una molécula de dNTP o NTP o un análogo lleva una molécula marcadora que tiene una ventana de potencial redox diferente. En una realización preferida, el primer electrodo y/o el segundo electrodo en el canal se separan en una pluralidad de segmentos, y cada segmento se aplica con un potencial correspondiente a la ventana de potencial redox de una molécula marcadora diferente. Por lo tanto, cuando una molécula marcadora pasa por el canal, solo se puede detectar una señal de pulso de corriente redox en el segmento de electrodo con un potencial correspondiente a la ventana de potencial redox de la molécula marcadora, identificando así el tipo de molécula marcadora en el canal.

En una realización, la solución de reacción comprende además una fosfatasa.

En una realización, en la etapa (4) del método, la molécula marcadora libre se desfosforila en presencia de una fosfatasa.

En una realización, las dNTP, NTP modificadas con moléculas marcadoras o un análogo son neutras en carga neta o están cargadas negativamente.

En una realización, la molécula marcadora libre está cargada positivamente o cargada negativamente.

En una realización, las dNTP, NTP modificadas con moléculas marcadoras o un análogo son neutras en carga neta o están cargadas negativamente, y la molécula marcadora libre está cargada positivamente. En dichas realizaciones, la molécula marcadora libre cargada positivamente puede migrar a lo largo del canal bajo la acción de un campo eléctrico, mientras que las dNTP, NTP modificadas con moléculas marcadoras o un análogo no migrarán en la cámara o canal ya que son neutras o están cargadas negativamente.

En una realización, las dNTP, NTP modificadas con moléculas marcadoras o un análogo están cargadas negativamente, y la molécula marcadora libre está cargada negativamente. En dichas realizaciones, la molécula marcadora libre, las moléculas de dNTP, NTP modificadas con moléculas marcadoras o un análogo, y las moléculas dNTP, NTP sin modificar, todas las cuales están cargadas negativamente, pueden migrar juntas a lo largo del canal bajo la acción de un campo eléctrico.

En una realización, solo la molécula marcadora libre es redox activa, mientras que las moléculas de dNTP, NTP modificadas con moléculas marcadoras y las moléculas de dNTP, NTP sin modificar no son redox activas. En dichas realizaciones, la señal de corriente redox solo puede ser resultado de la molécula marcadora libre.

En una realización, la molécula marcadora está unida al grupo fosfato, base o grupo sacárido de las moléculas de dNTP o NTP o un análogo. Preferentemente, la molécula marcadora se selecciona de uno o más de: aminoácidos, péptidos, carbohidratos, compuestos metálicos, tintes, compuestos quimioluminiscentes, nucleótidos, ácidos alifáticos, ácidos aromáticos, alcohol, aminofenilo, hidroxifenilo, naftilo, grupo tiol, ciano, nitro, alquilo, alquenilo, alquinilo, azido o un derivado de los mismos. Preferentemente, la molécula marcadora se selecciona de uno o más de: aminofenilo, hidroxifenilo, naftilo, compuestos metálicos de valencia variable (tales como ferroceno, hexacianoferrato y ferrocianuro), antraquinona y azul de metileno y un derivado de los mismos. En una realización, la molécula marcadora está unida al grupo Y-fosfato de las moléculas de dNTP o NTP o un análogo, y preferentemente, la molécula marcadora se selecciona de un grupo que consiste en aminofenilo, hidroxifenilo, naftilo y un derivado de los mismos. En una realización, la molécula marcadora está unida a la base o grupo sacárido de las moléculas de dNTP o NTP o un análogo; y preferentemente, la molécula marcadora se selecciona de un grupo que consiste en compuestos metálicos de valencia variable (tales como ferroceno, hexacianoferrato y ferrocianuro), antraquinona y azul de metileno y un derivado de los mismos.

En una realización, cada tipo de molécula de dNTP (por ejemplo, dATP, dTTP, dCTP, dGTP, dUTP) o NTP (por ejemplo, ATP, TTP, CTP, GTP, UTP) se marca con una molécula marcadora específica que tiene una actividad redox, en la que la molécula marcadora específica puede generar una señal eléctrica redox específica cuando se somete a una reacción redox circular.

En una realización, en la etapa (3), los cuatro tipos de moléculas de dNTP (por ejemplo, seleccionados de un grupo ^{que consiste en dATP, dTTP/duTP, dCTP, dGTP) o NTP (por ejemplo,}AtP, ^{TTP, CTP, GTP, UTP) se añaden}simultáneamente. En dichas realizaciones, se puede omitir la etapa de lavado que sigue a la incorporación de cada base, reduciendo así en gran medida el coste de los reactivos y acelerando la velocidad de detección.

En una realización, la carga transportada por la molécula marcadora libre se puede ajustar seleccionando una molécula marcadora, para ajustar la velocidad de migración de la molécula marcadora libre bajo la acción de un electrodo de guiado.

En una realización, en la etapa (1), la polimerasa se inmoviliza sobre una capa aislada en el fondo de la cámara o canal, o se inmoviliza en un electrodo de guiado. Preferentemente, la polimerasa se inmoviliza en un lugar cercano al puerto de entrada del canal en el fondo de la cámara; preferentemente, el puerto de entrada del canal puede diseñarse en diversas formas (tal como una forma de embudo), para contener una polimerasa.

En una realización, se inmoviliza una polimerasa en cada cámara o canal.

En una realización, la molécula de ácido nucleico a ensayar en la solución de reacción es una molécula de ácido nucleico monocatenario.

En una realización, cada polimerasa puede capturar una molécula de ácido nucleico monocatenario o un complejo formado a partir de la hibridación de una molécula de ácido nucleico y un cebador.

En la invención, los métodos para inmovilizar una polimerasa en el fondo de una cámara o canal se conocen bien en la técnica.

En una realización, la capa aislada está formada por un material seleccionado de un grupo que consiste en dióxido de silicio, oxinitruro de silicio, nitruro de silicio u otros materiales aislantes (por ejemplo, óxido de carbono dopado (CDO, por sus siglas en inglés), carburo de silicio, polímero orgánico tal como poliimida, octafluorociclobutano o politetrafluoroetileno, vidrio de fluorosilicato (FSG, por sus siglas en inglés) y silicato orgánico, tal como silsesquioxano, siloxano o vidrio de silicato orgánico).

En una realización, puede proporcionarse además una región funcionalizable y/o una región de unión molecular entre la capa aislada y la polimerasa. En una realización, la región funcionalizable comprende un material funcionalizable tal como dióxido de silicio, óxido de hafnio, óxido de aluminio, óxido de tántalo y/o óxido de circonio. Por ejemplo, el material funcionalizable puede funcionalizarse con una molécula de unión seleccionada de un grupo que consiste en: silicano (por ejemplo, aminopropiltrietoxisilano), tiol (-SH), disulfuro (-S-S-), isotiocianato, alqueno y alquino. En una realización, la región de unión molecular comprende una molécula sonda. Preferentemente, la molécula sonda se selecciona, por ejemplo, de un grupo que consiste en una biotina, una avidina, un anticuerpo, un antígeno, un receptor, un ligando, una secuencia de ADN, una secuencia de ARN, una proteína y un ligando de la misma.

En una realización, una molécula de unión se puede seleccionar de modo que la polimerasa se inmovilice en una dirección adecuada.

En una realización, el método se usa para el análisis de la secuencia, composición, carga eléctrica, tamaño o concentración de una molécula de ácido nucleico.

En la invención, se puede añadir una solución electrolítica y una solución de reacción a la superficie del electrodo de micropocillos de modo que todas las cámaras y canales se llenen con la solución electrolítica y la solución de reacción. Para diferentes electrodos o diferentes segmentos del mismo electrodo, sus potenciales se pueden establecer de forma independiente para controlar o detectar moléculas reactivas de forma independiente.

En un modo de detección redox, el electrodo de guiado controla la entrada de una solución electrolítica y una sustancia activa redox en un canal, y el primer electrodo y el segundo electrodo se usan como un dispositivo de detección de reacción redox para detectar la sustancia activa redox.

En la invención, el campo eléctrico formado por el electrodo de guiado es favorable para la entrada de moléculas cargadas (tales como moléculas cargadas positivamente) en un canal, y la acumulación de las mismas en el canal, a fin de reducir la posibilidad de que las moléculas se difundan fuera del canal, lo que a su vez puede mejorar la intensidad de la señal detectada.

Para asegurar la resolución de un solo nucleótido, el voltaje del electrodo de guiado se puede ajustar para controlar la velocidad de transporte de las moléculas cargadas. Además, la polimerasa también se puede modificar para que la velocidad de síntesis óptima coincida con la velocidad de transporte de las moléculas. Además, también se puede usar mecánica de fluidos a microescala o nanoescala para controlar la migración de moléculas en un canal.

En la invención, la molécula de ácido nucleico incluye ácido desoxirribonucleico (ADN), ácido ribonucleico (ARN) y polímeros de otros análogos unidos entre sí mediante un enlace fosfodiéster. El polinucleótido puede ser un fragmento de un genoma, un gen o una parte del mismo, ADNc o una secuencia de ácido desoxirribonucleico sintetizada. Los nucleótidos incluidos en un polinucleótido pueden ser desoxirribonucleótidos de origen natural tales como adenina, citosina, guanina o timina unidos a 2'-desoxirribosa, o ribonucleótidos tales como adenina, citosina, guanina o uracilo unidos a ribosa. Sin embargo, un polinucleótido u oligonucleótido (tal como una sonda o cebador) puede comprender además un análogo de nucleótido, incluyendo un nucleótido sintético de origen no natural o un nucleótido de origen natural modificado.

En la invención, el ciclo redox se refiere a un método electroquímico en el que una molécula que puede oxidarse y/o reducirse inversamente (es decir, una molécula activa redox) migra entre al menos dos electrodos polarizados independientemente, en el que uno de los al menos dos electrodos tienen un potencial menor que el potencial de reducción de la molécula activa redox a detectar, mientras que el otro de los al menos dos electrodos tiene un potencial más alto que el potencial de oxidación de la molécula activa redox, de modo que los electrones se transportan entre los electrodos polarizados independientemente (es decir, la molécula se oxida en el primer electrodo y a continuación se difunde al segundo electrodo y se reduce allí, o viceversa, la molécula se reduce y a continuación se oxida, dependiendo de la molécula y el potencial del electrodo cuando está polarizado). En un ciclo redox, la misma molécula puede, por lo tanto, contribuir con una pluralidad de electrones a la corriente registrada, lo que da como resultado una amplificación neta de una señal. La señal resultante de una sustancia activa redox puede amplificarse potencialmente en más de 100 veces, dependiendo de factores tales como la estabilidad de la sustancia activa redox y la capacidad de la sustancia activa redox para difundirse a una región detectable. En la invención, se puede proporcionar un electrodo de guiado para evitar la difusión de una sustancia activa redox fuera del canal, para aumentar la concentración efectiva de la sustancia activa redox en el canal.

En la invención, la sustancia activa redox (o la molécula activa redox) tiene los significados generales en la técnica, y es una molécula que puede oxidarse y/o reducirse a la inversa muchas veces.

En la invención, la fosfatasa se selecciona, por ejemplo, de un grupo que consiste en fosfatasa alcalina, fosfatasa ácida, proteína fosfatasa, polifosfatasa, azúcar-fosfatasa y pirofosfatasa.

En la invención, durante la síntesis de un producto de extensión, la incorporación de dNTP, NTP modificadas con moléculas marcadoras o un análogo libera la molécula marcadora pirofosfato (PPi) en la solución. La fosfatasa funciona para eliminar el pirofosfato de la molécula marcadora pirofosfato. La eliminación del grupo fosfato activa además la sustancia activa redox y, por lo tanto, la presencia de la sustancia activa redox puede detectarse por un medio electroquímico.

En la invención, la molécula de silano puede tener las fórmulas químicas X³-Si-YR", X²-Si-(N)YR" o X-Si-(N²)YR", en las que X es un grupo saliente, tal como -Cl, -OCH³u -OCH²CH³, R'' es un grupo de acoplamiento reactivo, tal como -NH², -COOH, -COH, -CHCH²o -SH e Y es un grupo no reactivo, tal como un grupo alquilo. El grupo orgánico para su uso en el acoplamiento, tal como lo presenta la molécula de silano unida a una superficie, puede ser, por ejemplo, un grupo carboxilo, aldehído, éster, alqueno, alquino, tiol, isotiocianato, isocianato, amina sustituida, epóxido, molécula pequeña tal como biotina o etanol. En general, Y es un grupo no reactivo, tal como, un compuesto de hidrocarburo que tiene de 1 a 16 átomos de carbono. Los ejemplos de -YR" incluyen -(CH²)³NH², -(CH²)²COOH y -(CH²)²SH. Algunos ejemplos de silanos incluyen (3-aminopropil)trietoxisilano (APTS), mercaptosilano y glicidoxi trimetoxisilano (que tiene el grupo de acoplamiento de un epóxido). La superficie a sililar puede reaccionar con, por ejemplo, moléculas de silano en solución o moléculas de silano como gas silano.

En la invención, la base, por ejemplo, se selecciona de un grupo que consiste en adenina, guanina, citosina, timina, uracilo, 7-desazaguanina, 7-desazaadenina y 5-metilcitosina.

En la invención, el cebador (secuencia de cebador) es un oligonucleótido corto de una longitud adecuada (por ejemplo, aproximadamente 18-24 bases de longitud) que generalmente se sintetiza químicamente y es suficiente para hibridar con un ácido nucleico diana (por ejemplo, un ADN monocatenario) y permitir la adición de residuos de nucleótidos al mismo o la síntesis de un oligonucleótido o un polinucleótido del mismo en condiciones adecuadas como se conoce bien en la técnica. En una realización, el cebador es un cebador de ADN, es decir, un cebador que consiste o consiste principalmente en residuos de desoxirribonucleótido. El cebador está diseñado para tener una secuencia complementaria inversa de una región de un ácido nucleico plantilla/diana (tal como un ADN monocatenario) que se puede hibridar con el cebador. Los residuos de nucleótidos se añaden al extremo 3' de un cebador mediante la formación de un enlace fosfodiéster para producir un producto de extensión; o se añaden residuos de nucleótidos al extremo 3' del producto de extensión mediante la formación de un enlace fosfodiéster para producir otro producto de extensión.

En la invención, la incorporación de dNTP, NTP o un análogo en un oligonucleótido o un polinucleótido (tal como un cebador, un producto de extensión, un complejo formado a partir de un cebador y una molécula de ácido nucleico a ensayar) se refiere a la formación de un enlace fosfodiéster entre el átomo de carbono 3' del residuo nucleotídico en el extremo 3' del polinucleótido y el átomo de carbono 5' de dNTP, NTP o un análogo.

En la invención, la polimerasa incluye ADN polimerasa, ARN polimerasa, transcriptasa inversa y similares, cuyas funciones o tipos se conocen bien en la técnica. La ADN polimerasa puede tener, por ejemplo, actividad exonucleasa de 3' a 5' o no, incluyendo, por ejemplo, ADN polimerasa de E. coli, fragmento Klenow, ADN polimerasa Phusion, ADN polimerasa 9°N, k Od polimerasa, ADN polimerasa Therminator, ADN polimerasa Taq, ADN polimerasa Vent y similares.

En una realización, mediante la modificación de una polimerasa, se logra una tasa de incorporación de bases ideal (por ejemplo, 1-100 bases por segundo) en una secuenciación en tiempo real.

En una realización, una polimerasa se modifica específicamente para que sea más adecuada para la aplicación. Por ejemplo, una polimerasa, que puede usarse para sintetizar un polímero de manera rápida, continua y precisa, se selecciona o se obtiene de un banco de clones de ADN polimerasas, con la condición de que una sola molécula de ADN polimerasa pueda lograr la síntesis de ADN de 1-100 kb sin disociación de la hebra plantilla. Preferentemente, la polimerasa carece de actividad exonucleasa y la tasa de error de incorporación de la base será tan baja como 10'5-10'6/base incorporada. El sesgo de la polimerasa para cada nucleótido específico puede mejorar en gran medida la especificidad de secuenciación. Una polimerasa que tenga un sesgo detectable diferente para el ADN, el ARN y la base metilada es favorable para la secuenciación. Además de las propiedades fisioquímicas y zimológicas mencionadas, otras propiedades pueden incluir estabilidad térmica, sistema de tampón estable, capacidad de trabajo bajo acumulación de macromoléculas y tolerancia a muchos productos secundarios (pirofosfato).

En una realización, los mutantes adecuados, que tienen una velocidad de polimerización que coincide con la capacidad del dispositivo de detección, se criban de un banco de clones de polimerasas, de modo que la incorporación de bases verdaderas y la no incorporación se pueden distinguir entre sí en la mayor medida posible. En tal método de polimerasa de molécula única/en tiempo real, la polimerasa también es necesaria para permitir la incorporación de nucleótidos modificados. Por lo tanto, se deben seleccionar mutantes de polimerasa y nucleótidos modificados que coincidan con la capacidad del dispositivo de detección.

En una realización, además de la selección del mutante de polimerasa más adecuado, también se puede usar un tampón para cambiar la tasa de incorporación de bases (por ejemplo, la tasa de incorporación de un nucleótido específico puede disminuir o aumentar en virtud del pH e iones). Al determinar el tiempo de retención de los nucleótidos en un bolsillo de polimerasa, se puede seleccionar un mutante de polimerasa por su mayor o menor sesgo para un nucleótido específico. Mediante la medición cinética de la enzima, se puede reducir la probabilidad de incorporación de falso positivo y se puede distinguir una señal de incorporación verdadera del ruido de un dispositivo.

En una realización, analizando y comparando las estructuras cristalinas del complejo binario y el complejo ternario de mutantes de polimerasa y comparándolos con eventos de incorporación detectables, se pueden encontrar los residuos en un candidato, que son importantes para dirigirse específicamente a mutaciones, promoviendo así el descubrimiento de una nueva interacción específica y estable.

Otra característica de la enzima es que puede liberar la molécula de ácido nucleico al final, para permitir la entrada de un nuevo ADN plantilla portador de cebadores y comenzar la secuenciación. En una realización, en presencia de una enzima suficientemente estable, se puede secuenciar una plantilla de 1-10-100-1000 kb en un canal.

Efectos ventajosos de la presente invención

Un electrodo de micropocillos de la presente invención tiene las siguientes ventajas: ser capaz de comprender una pluralidad de nanocanales en un electrodo de micropocillos, reduciendo así la influencia de la contaminación de la superficie del electrodo; ser capaz de guiar el flujo de un reactivo mediante un campo eléctrico y un flujo electroosmótico generado por un electrodo de guiado en un nanocanal; ser fácil de integrar con un microfluido para lograr el propósito de interacción del reactivo; poder fabricar fácilmente a gran escala matrices de electrodos; ser compatible con diversos mecanismos de detección de señal, incluyendo la detección de señales electrónicas (por ejemplo, basada en un ciclo redox, FET (transistor de efecto de campo), impedancia electroquímico y eléctrica); hacer posible la amplificación física de una señal; permitir la integración con un CMOS monolítico; ser capaz de controlar el movimiento de una molécula de ácido nucleico mediante un campo eléctrico; permitir la detección de una molécula única de una sustancia química a detectar detectando una señal eléctrica de una molécula marcadora; aumentar considerablemente la longitud de lectura; y ser sensible a la señal de detección.

El método para el análisis de una sustancia química de la presente invención se puede usar en detección y análisis molecular, diagnóstico molecular, detección de enfermedades, identificación de sustancias y detección y secuenciación de ADN, etc.

Otras características, aspectos y ventajas de la presente invención resultarán evidentes por referencia a la siguiente descripción detallada de realizaciones de ejemplo de la presente invención con referencia a los dibujos.

Descripción de los dibujos

Los dibujos, que forman parte de esta memoria descriptiva, ilustran realizaciones de ejemplo de la invención y, junto con esta memoria descriptiva, sirven para explicar los principios de la invención. En los dibujos:

la figura 1A es una vista superior de un electrodo de micropocillos de acuerdo con una realización de la presente invención;

la figura 1B es una vista en sección tomada a lo largo de B-B' mostrada en la figura 1A;

la figura 1C es una vista en sección tomada a lo largo de C-C' mostrada en la figura 1A;

la figura 2A es un diagrama esquemático que muestra el principio operativo de un electrodo de micropocillos de acuerdo con una realización de la presente invención;

la figura 2B es un diagrama esquemático que muestra la relación correspondiente entre diferentes bases y voltajes de detección aplicados en un primer electrodo y un segundo electrodo;

la figura 3 es un diagrama esquemático que muestra un electrodo de micropocillos de acuerdo con una realización de la presente invención, en el que el primer electrodo y el segundo electrodo incluyen cada uno cuatro segmentos; la figura 4A es un diagrama esquemático que muestra una matriz de electrodos de micropocillos que consiste en dos electrodos de micropocillos;

la figura 4B es un diagrama esquemático que muestra una matriz de electrodos de micropocillos que consiste en cuatro electrodos de micropocillos;

las figuras 5A, 5B, 5C y 5D muestran cuatro disposiciones de una pluralidad de electrodos de micropocillos en una matriz de electrodos de micropocillos, respectivamente;

la figura 6 es un diagrama esquemático que muestra un sistema de secuenciación de acuerdo con una realización de la presente invención;

la figura 7 es un diagrama esquemático que muestra un flujo simplificado de un método para fabricar un electrodo de micropocillos de acuerdo con una realización de la presente invención;

la figura 8A muestra una vista en sección de una estructura de sustrato de acuerdo con una realización de la presente invención;

la figura 8B muestra una vista superior de la estructura de sustrato mostrada en la figura 8A;

la figura 8C es una vista superior de un producto en una fase de un método para fabricar un electrodo de micropocillos de acuerdo con una realización de la presente invención;

la figura 8D es una vista superior de un producto en una fase de un método para fabricar un electrodo de micropocillos de acuerdo con una realización de la presente invención;

la figura 8E es una vista en sección de un producto en una fase de un método para fabricar un electrodo de micropocillos de acuerdo con una realización de la presente invención;

la figura 8F es una vista en sección de un producto en una fase de un método para fabricar un electrodo de micropocillos de acuerdo con una realización de la presente invención;

la figura 8G es una vista en sección de un producto en una fase de un método para fabricar un electrodo de micropocillos de acuerdo con una realización de la presente invención;

la figura 8H es una vista en sección de un producto en una fase de un método para fabricar un electrodo de micropocillos de acuerdo con una realización de la presente invención;

la figura 8I es una vista en sección de un producto en una fase de un método para fabricar un electrodo de micropocillos de acuerdo con una realización de la presente invención;

la figura 8J es una vista en sección de un producto en una fase de un método para fabricar un electrodo de micropocillos de acuerdo con una realización de la presente invención;

la figura 8K es una vista en sección de un producto en una fase de un método para fabricar un electrodo de micropocillos de acuerdo con una realización de la presente invención;

la figura 9A es una vista en sección de un producto en una fase de formación de una estructura de sustrato de acuerdo con una realización de la presente invención;

la figura 9B es una vista en sección de un producto en una fase de formación de una estructura de sustrato de acuerdo con una realización de la presente invención;

la figura 9C es una vista en sección de un producto en una fase de formación de una estructura de sustrato de acuerdo con una realización de la presente invención;

la figura 9D es una vista en sección de un producto en una fase de formación de una estructura de sustrato de acuerdo con una realización de la presente invención;

la figura 9E es una vista en sección de un producto en una fase de formación de una estructura de sustrato de acuerdo con una realización de la presente invención;

la figura 9F es una vista en sección de un producto en una fase de formación de una estructura de sustrato de acuerdo con una realización de la presente invención;

la figura 9G es una vista en sección de un producto en una fase de formación de una estructura de sustrato de acuerdo con una realización de la presente invención;

la figura 9H es una vista en sección de un producto en una fase de formación de una estructura de sustrato de acuerdo con una realización de la presente invención;

la figura 9I es una vista en sección de un producto en una fase de formación de una estructura de sustrato de acuerdo con una realización de la presente invención;

la figura 9J es una vista en sección de un producto en una fase de formación de una estructura de sustrato de acuerdo con una realización de la presente invención;

las figuras 10A y 10B muestran los resultados de detección de diferentes moléculas marcadoras libres detectadas usando un electrodo de micropocillos de ejemplo de la presente invención, respectivamente;

la figura 11 muestra la distribución del número de colisiones entre una molécula marcadora única y un electrodo en un electrodo de micropocillos de ejemplo de la presente invención, que se obtiene a través de un cálculo de simulación.

Descripción detallada

Se describirán ahora en detalle diversas realizaciones de ejemplo de la presente invención con referencia a los dibujos. Debe entenderse que la disposición relativa, las expresiones numéricas y los valores numéricos de los componentes y etapas que se exponen en estas realizaciones, a menos que se especifique de otro modo, no deben interpretarse como limitantes del alcance de la invención. Para condiciones específicas no especificadas en las realizaciones, generalmente se usan condiciones rutinarias o condiciones recomendadas por los fabricantes. Los reactivos o instrumentos sin fabricantes especificados son todos productos disponibles comercialmente.

Además, debería comprenderse que, por conveniencia de la descripción, las dimensiones de los diversos componentes mostrados en los dibujos no están necesariamente dibujadas de acuerdo con las proporciones reales, por ejemplo, el espesor o el ancho de determinadas capas puede ser exagerado en relación con otras capas.

La siguiente descripción de realizaciones de ejemplo es meramente ilustrativa y no se pretende que se interprete como una limitación de la invención y su aplicación o uso de ninguna manera.

Las técnicas, métodos y aparatos conocidos por los expertos en la técnica relevante pueden no analizarse en detalle, pero estas técnicas, métodos y aparatos deben considerarse como parte de la memoria descriptiva cuando sea apropiado.

Debe tenerse en cuenta que se usan números de referencia y letras similares para indicar elementos similares en los siguientes dibujos y, por lo tanto, una vez que se defina un elemento en un dibujo, no es necesario analizarlo más en la ilustración de los dibujos posteriores.

La figura 1A es una vista superior de un electrodo de micropocillos de acuerdo con una realización de la presente invención. La figura 1B es una vista en sección tomada a lo largo de B-B' mostrada en la figura 1A. La figura 1C es una vista en sección tomada a lo largo de C-C' mostrada en la figura 1A.

Con referencia a las figuras 1A, 1B y 1C, un electrodo de micropocillos 100 puede comprender uno o más primeros electrodos 301. Diferentes primeros electrodos 301 pueden estar separados entre sí, por ejemplo, diferentes primeros electrodos 301 pueden tener huecos entre los mismos o los huecos pueden rellenarse con una capa aislante. A modo de ejemplo, el primer electrodo 301 puede tener un espesor d1 de aproximadamente 1-1000 nm, por ejemplo, 30 nm, 50 nm, 200 nm, 600 nm, 800 nm o similares. En una realización, el primer electrodo 301 puede estar formado por un material seleccionado de un grupo que consiste en platino, oro, plata, óxido de indio y estaño, materiales a base de carbono (por ejemplo, diamante, grafito, carbono amorfo, nanotubos de carbono, etc.), silicio o cualquier combinación de los mismos.

El electrodo de micropocillos 100 comprende además uno o más segundos electrodos 303, cada uno dispuesto opuesto a un primer electrodo 301. Se proporciona un canal 601 entre cada primer electrodo 301 y su segundo electrodo opuesto 303. El canal 601 tiene al menos un extremo en comunicación con una cámara 401. A modo de ejemplo, el segundo electrodo 303 puede tener un espesor d2 de aproximadamente 1-1000 nm, por ejemplo, 30 nm, 50 nm, 200 nm, 600 nm, 800 nm o similares. En una realización, el segundo electrodo 303 puede estar formado por un material seleccionado de un grupo que consiste en platino, oro, plata, óxido de indio y estaño, materiales a base de carbono (por ejemplo, diamante, grafito, carbono amorfo, nanotubos de carbono, etc.), silicio o cualquier combinación de los mismos. En una realización, la superficie inferior de la cámara 401 y la superficie inferior del canal 601 pueden estar en el mismo plano. En otra realización, la superficie inferior de la cámara 401 y la superficie inferior del canal 601 pueden estar en planos diferentes.

El electrodo de micropocillos 100 comprende además uno o más electrodos de guiado 501 situados en la cámara 401. En una realización, el electrodo de guiado 501 puede conducir una sustancia cargada al canal 601. Además, el electrodo de guiado 501 también puede controlar el movimiento de una sustancia cargada en el canal 601. Cuando se aplican diferentes voltajes en los electrodos de guiado 501 en ambos extremos del canal 601, un campo eléctrico principal producido entre los electrodos de guiado 501 puede controlar la sustancia cargada (por ejemplo, una molécula activa redox) para que entre en el canal 601 y controlar el movimiento de una sustancia cargada (por ejemplo, una molécula activa redox) en el canal 601 de modo que la sustancia cargada no pueda moverse fácilmente fuera del canal 601. Si solo se proporciona un electrodo de guiado 501 en la cámara 401, este electrodo de guiado 501 se puede usar para controlar el movimiento de una sustancia cargada en uno o más canales 601 que se comunican con la cámara 401. Si se proporciona una pluralidad de electrodos de guiado 501 en la cámara 401, cada uno de los electrodos de guiado 501 puede controlar el movimiento de una sustancia cargada en un canal adyacente 601 a la misma, respectivamente. A modo de ejemplo, el electrodo de guiado 501 puede estar formado por un material seleccionado de un grupo que consiste en silicio, platino, oro, ITO, materiales a base de carbono o cualquier combinación de los mismos.

Preferentemente, el electrodo de guiado 501 puede ser sustancialmente perpendicular al primer electrodo 301 o al segundo electrodo 303 (como se muestra en la figura 1). Sin embargo, debe entenderse que el electrodo de guiado 501 no es necesariamente perpendicular al primer electrodo 301 o al segundo electrodo 303, y también es posible un ángulo de otro grado entre los mismos.

Un electrodo de micropocillos proporcionado en la presente invención puede usarse en, pero sin limitación, secuenciación de ácidos nucleicos, en cuyo caso, la cámara 401 puede ser una cámara de microfluidos. El proceso de fabricación de un electrodo de micropocillos puede ser compatible con el proceso CMOS y es fácil de fabricar en masa. Además, se pueden adoptar una pluralidad de mecanismos de señalización en la secuenciación de ácidos nucleicos y se puede lograr una longitud de lectura más larga. Además, dado que un electrodo de micropocillos puede comprender múltiples canales al mismo tiempo, el efecto de la contaminación del electrodo sobre los resultados de la secuenciación puede reducirse, haciendo así más precisos los resultados de la secuenciación.

La figura 2A es un diagrama esquemático que muestra el principio operativo de un electrodo de micropocillos de acuerdo con una realización de la presente invención. Como se muestra en la figura 2A, el electrodo de micropocillos comprende un conjunto de electrodos de detección (un primer electrodo 301 y un segundo electrodo 303) y un conjunto de electrodos de guiado 501. Se aplica un voltaje V¹al primer electrodo 301, se aplica un voltaje V²al segundo electrodo 303, y se produce una diferencia de voltaje Vg entre los dos electrodos de guiado 501. Un campo eléctrico principal entre los dos electrodos de guiado 501 puede tirar de una molécula a detectar (por ejemplo, una molécula marcadora activa redox) hasta un canal entre los dos electrodos de detección. La molécula marcadora experimenta una reacción de ciclo redox entre los dos electrodos de detección. La reacción de ciclo redox produce una señal de corriente correspondiente, que puede detectarse por los dos electrodos de detección. Diferentes moléculas marcadoras corresponden a diferentes señales de corriente; por lo tanto, el tipo de molécula marcadora se puede determinar de acuerdo con la señal de corriente detectada.

La figura 2B es un diagrama esquemático que muestra la relación correspondiente entre diferentes bases y voltajes de detección aplicados en un primer electrodo y un segundo electrodo. De acuerdo con el principio de reacción redox, solo cuando los voltajes V¹y V²están en una ventana de potencial redox correspondiente a una molécula a detectar, se puede detectar una señal de corriente causada por la molécula a detectar. Por lo tanto, los voltajes V¹y V²se pueden poner en una ventana de potencial redox correspondiente a una molécula a detectar cambiando los valores de los voltajes Vi y V²varias veces en un período de tiempo y a continuación se puede identificar el tipo de molécula a detectar. De esta manera, las señales de corriente de diferentes moléculas a detectar pueden detectarse a diferentes voltajes V¹y V². Como se muestra en la figura 2B, las bases A, T, C y G corresponden a diferentes voltajes V¹y V², respectivamente. Específicamente, la base A corresponde a los voltajes V¹A y V²A, la base T corresponde a los voltajes V u y V²T, la base C corresponde a los voltajes V¹C y V²C y la base G corresponde a los voltajes V¹G y V²G. Tomando la base A como ejemplo, cuando el voltaje V¹se establece en V¹A y el voltaje V²se establece en V²A, si una molécula de etiqueta correspondiente a la base A está presente en el canal, puede detectarse una señal de corriente i producida por la molécula de etiqueta correspondiente a la base A en una reacción redox mediante los electrodos de detección. De manera similar, al cambiar los valores de los voltajes V¹y V², los voltajes V¹y V²pueden situarse en las ventanas de potencial redox de las moléculas marcadoras correspondientes a las bases T, C o G, se puede identificar el tipo de molécula marcadora y a continuación se puede identificar el tipo de base correspondiente a la molécula marcadora.

En una realización, con referencia a las figuras 1B y 1C, el electrodo de micropocillos puede comprender además un sustrato 101 y una capa aislante 102 sobre el sustrato 101. El primer electrodo 301, el segundo electrodo 303 y los electrodos de guiado 501 pueden estar dispuestos sobre la capa aislante 102. El sustrato 101 puede ser, por ejemplo, un sustrato de silicio, un sustrato hecho de un material semiconductor del Grupo III-V, un sustrato de silicio sobre aislante (SOI) o puede ser un sustrato semiconductor de óxido (tal como ZnO, CdO, T O ², AhO³o SnO), o puede ser un sustrato hecho de un material aislante, tal como un vidrio de cuarzo o un vidrio de soda. La capa aislante 102 puede ser normalmente un óxido de silicio (por ejemplo, dióxido de silicio), un nitruro de silicio (por ejemplo, SiN), un óxido de nitrógeno de silicio, etc.

En aplicaciones prácticas, el primer electrodo 301 y el segundo electrodo 303 anteriores pueden estar soportados por elementos de soporte. En una realización, con referencia a la figura 1A, el electrodo de micropocillos puede comprender además un primer elemento de soporte 201 para soportar el primer electrodo 301. En una realización, el electrodo de micropocillos puede comprender una pluralidad de primeros electrodos 301, todos los cuales pueden estar soportados por el primer elemento de soporte 201. En otra realización, el electrodo de micropocillos puede comprender una pluralidad de primeros electrodos 301 y una pluralidad de primeros elementos de soporte 201, y cada uno de los primeros electrodos 301 puede estar soportado por un primer elemento de soporte correspondiente 201, respectivamente. En otra realización más, el electrodo de micropocillos puede comprender una pluralidad de segundos electrodos 303 y una pluralidad de segundos elementos de soporte 304, y cada uno de los segundos electrodos 303 puede estar soportado por un segundo elemento de soporte correspondiente 304, respectivamente.

El primer elemento de soporte 201 y el segundo elemento de soporte 304 anteriores pueden ser elementos conductores o elementos no conductores, y preferentemente, elementos conductores. En el caso de que un primer electrodo 201 y un segundo electrodo 304 sean elementos no conductores, el primer elemento de soporte 201 y el segundo elemento de soporte 304 sirven principalmente para soportar el primer electrodo 301 y el segundo electrodo 303. En el caso de que un primer electrodo 201 y un segundo electrodo 304 sean elementos conductores, se pueden aplicar voltajes al primer electrodo 301 y al segundo electrodo 303 aplicando voltajes al primer elemento de soporte 201 y al segundo elemento de soporte 304. En una realización, los elementos conductores anteriores pueden estar formados por un material seleccionado de un grupo que consiste en silicio (por ejemplo, polisilicio), platino, oro, plata, óxido de indio y estaño o material(es) a base de carbono, etc. Los elementos no conductores anteriores pueden estar formados por un material seleccionado de óxido de silicio, nitruro de silicio, oxinitruro de silicio, vidrio de borofosfosilicato y similares. Además, el primer elemento de soporte 201 puede tener una forma en sección de forma elíptica, circular, poligonal, cuadrada o de engranaje en la dirección paralela a la superficie del sustrato 101. Debe entenderse que la presente invención no se limita a las formas de ejemplo anteriores.

En otra realización de un electrodo de micropocillos de la presente invención, el material del primer electrodo 301 y el material del segundo electrodo 303 anteriores pueden ser iguales o diferentes. En una realización, uno del primer electrodo 301 y el segundo electrodo 303 puede estar hecho de un material de electrodo que sea fácil de oxidar, y el otro puede estar hecho de un material de electrodo que pueda reducirse.

En otra realización de un electrodo de micropocillos de la presente invención, como se muestra en la figura 1B, el electrodo de micropocillos 100 puede comprender además una capa de pasivación 701 formada en la superficie de al menos uno del primer electrodo 301, el segundo electrodo 303, el primer elemento de soporte 201 (si lo hubiera), el segundo elemento de soporte 304 (si lo hubiera). En una realización, la capa de pasivación 701 puede ser un nitruro de silicio (por ejemplo, SiN), un óxido de silicio (por ejemplo, SO ²) y similares. La capa de pasivación 701 puede servir para proteger el electrodo de micropocillos. Específicamente, cuando se realiza la secuenciación de ácidos nucleicos por el electrodo de micropocillos, solo una región que no está cubierta por la capa de pasivación 701 puede entrar en contacto con la solución de reacción, de modo que se pueden evitar daños en determinados componentes del electrodo de micropocillos. Además, la capa de pasivación 701 también puede reducir los ruidos producidos en el proceso de secuenciación.

En otra realización más de un electrodo de micropocillos de la presente invención, el electrodo de micropocillos 100 puede comprender además una nanoestructura 801 (por ejemplo, un nanopunto) capaz de inmovilizar una enzima o una sustancia química 802 a detectar. La nanoestructura 801 puede estar situada en el fondo o en una pared lateral de la cámara 401 (como se muestra en las figuras 1A y 1B), o en el fondo o una pared lateral del canal 601 (no mostrado), o en el electrodo de guiado 211. A modo de ejemplo, el tamaño de la nanoestructura 801 puede ser de 1 100 nm, por ejemplo, 8 nm, 20 nm, 60 nm y similares. Preferentemente, la nanoestructura 801 puede estar formada por un óxido metálico; preferentemente, el óxido metálico es un óxido de metal de transición tal como dióxido de circonio (ZrO²) o dióxido de hafnio (HfO²). Como alternativa, la nanoestructura 801 también puede estar formada por un metal; preferentemente, el metal es un metal inerte tal como oro o platino. Como alternativa, la nanoestructura 801 también puede estar formada por un material seleccionado de un polímero inorgánico, un polímero orgánico o cualquier combinación de los mismos.

En algunas implementaciones, el primer electrodo 301 y/o el segundo electrodo 303 pueden comprender una pluralidad de segmentos separados entre sí, por ejemplo, dos o más segmentos. A continuación se dará una descripción con referencia a diferentes implementaciones.

En una implementación, el primer electrodo 301 comprende una pluralidad de segmentos separados entre sí, y el segundo electrodo 303 comprende solo un segmento. El electrodo de micropocillos puede comprender una pluralidad de primeros elementos de soporte 201, cada segmento del primer electrodo 301 puede estar soportado por un primer elemento de soporte correspondiente 201. En este caso, se puede aplicar un voltaje al segundo electrodo 303 y se pueden aplicar voltajes correspondientes a diferentes moléculas (por ejemplo, moléculas marcadoras redox) a detectar a los diversos segmentos del primer electrodo 301. Cuando una molécula a detectar pasa a través de las diversas secciones del primer electrodo 301, la información temporal de que la molécula a detectar se desplaza de un segmento del primer electrodo 301 a otro, además de la información de señal de corriente de la molécula a detectar, también se puede obtener, lo que es útil para mejorar la resolución de detección de diferentes moléculas a detectar.

En otra implementación, el primer electrodo 301 comprende una pluralidad de segmentos separados entre sí, y el segundo electrodo 303 también comprende una pluralidad de segmentos separados entre sí, cada segmento del primer electrodo 301 está dispuesto opuesto a un segmento del segundo electrodo 303. Cada segmento del primer electrodo 301 puede estar soportado por un primer elemento de soporte correspondiente 201, y cada segmento del segundo electrodo 303 puede estar soportado por un segundo elemento de soporte correspondiente 304. En este caso, pueden aplicarse diferentes voltajes a cada segmento del primer electrodo 301 y al segmento del segundo electrodo 303 dispuesto opuesto a este segmento del primer electrodo 301, cuando una molécula a detectar pasa a través de diversos segmentos de electrodo secuencialmente bajo el control de un campo eléctrico de guiado, solo los segmentos de electrodo a los que se aplicó un voltaje entre los mismos correspondiente a una ventana de potencial redox de la molécula pueden detectar una señal de corriente. Por lo tanto, las diferentes moléculas a detectar pueden detectarse por diferentes segmentos del primer electrodo 301 y los segmentos correspondientes del segundo electrodo 303.

En otra implementación más, el primer electrodo 301 puede comprender un segmento, y el segundo electrodo 303 puede comprender una pluralidad de segmentos separados entre sí. En este caso, se puede aplicar un voltaje al primer electrodo 301, y pueden aplicarse voltajes correspondientes a las ventanas redox de diferentes moléculas a detectar (por ejemplo, moléculas marcadoras redox) a los diversos segmentos del segundo electrodo 303. Cuando una molécula a detectar pasa a través de los diversos segmentos del primer electrodo 303, la información temporal de que la molécula a detectar se desplaza de un segmento del segundo electrodo 303 a otro, además de la información de señal de corriente de la molécula a detectar, también se puede obtener, lo que es útil para mejorar la resolución de detección de diferentes moléculas a detectar.

La figura 3 es un diagrama esquemático que muestra un electrodo de micropocillos de acuerdo con una realización de la presente invención, en el que el primer electrodo y el segundo electrodo incluyen cada uno cuatro segmentos. Como se muestra en la figura 3, el primer electrodo 301 comprende un primer segmento 311 del primer electrodo, un segundo segmento 321 del primer electrodo, un tercer segmento 331 del primer electrodo y un cuarto segmento 341 del primer electrodo. Los voltajes aplicados al primer segmento 311 del primer electrodo al cuarto segmento 341 del primer electrodo son V¹¹, V²¹, V³¹y V⁴¹, respectivamente. El segundo electrodo 303 comprende un primer segmento 313 del segundo electrodo, un segundo segmento 323 del segundo electrodo, un tercer segmento 333 del segundo electrodo y un cuarto segmento 343 del segundo electrodo. Los voltajes aplicados al primer segmento 313 del segundo electrodo al cuarto segmento 343 del segundo electrodo son V¹², V²², V³²y V⁴², respectivamente. Cada segmento del primer electrodo 301 está dispuesto opuesto a un segmento del segundo electrodo 303, y cada segmento del primer electrodo 301 y el segmento del segundo electrodo 303 dispuesto opuesto al mismo se usan como un conjunto de electrodos de detección. Por ejemplo, el primer segmento 311 del primer electrodo está dispuesto opuesto al primer segmento 313 del segundo electrodo, y estos dos segmentos se usan como un conjunto de electrodos de detección. Un voltaje de detección aplicado a cada conjunto de electrodos de detección corresponde a una molécula marcadora a detectar. Una diferencia de voltaje entre los dos electrodos de guiado 501 es Vg. Cuando una molécula marcadora a detectar pasa a través de los cuatro conjuntos de electrodos de detección secuencialmente bajo el control del campo eléctrico de guiado de los electrodos de guiado 501, solo un conjunto de electrodos de detección que se aplica con un voltaje de detección correspondiente a la ventana redox de la molécula marcadora a detectar puede detectar una señal de corriente. Por lo tanto, después de establecer los voltajes de detección de antemano, el tipo de molécula marcadora a detectar se puede determinar de acuerdo con el electrodo de detección que detecta una señal de corriente. Por ejemplo, un voltaje de detección aplicado en el primer conjunto de electrodos de detección corresponde a una ventana redox de una determinada molécula marcadora a detectar, tras detectar una señal de corriente por el primer conjunto de electrodos de detección, se puede determinar que la molécula marcadora a detectar se ha detectado.

La presente invención proporciona además una matriz de electrodos de micropocillos, que comprende uno o más electrodos de micropocillos de acuerdo con una cualquiera de las realizaciones anteriores. En una realización, una pluralidad de electrodos de micropocillos pueden compartir un electrodo de guiado.

La figura 4A es un diagrama esquemático que muestra una matriz de electrodos de micropocillos que consiste en dos electrodos de micropocillos. Como se muestra en la figura 4A, el electrodo de micropocillos comprende un primer electrodo de micropocillos y un segundo electrodo de micropocillos, compartiendo el primer electrodo de micropocillos y el segundo electrodo de micropocillos un electrodo de guiado intermedio 501. Los voltajes aplicados en el primer electrodo 301 y el segundo electrodo 303 del primer electrodo de micropocillos son V¹¹y V¹², respectivamente; y los voltajes aplicados en el primer electrodo 301 y el segundo electrodo 303 del segundo electrodo de micropocillos son V²¹y V²², respectivamente. Se aplica una diferencia de voltaje Vg¹en los dos electrodos de guiado 501 del primer electrodo de micropocillos, y se aplica una diferencia de voltaje Vg²en los dos electrodos de guiado 501 del segundo electrodo de micropocillos. Una molécula marcadora cargada negativamente se introduce en el canal del primer electrodo de micropocillos, y una molécula marcadora cargada positivamente se introduce en el canal del segundo electrodo de micropocillos, consiguiendo así el cribado de las moléculas marcadoras. De esta manera, una matriz de electrodos de micropocillos que consiste en dos electrodos de micropocillos puede reconocer la polaridad de carga de una molécula marcadora y puede determinar el tipo de molécula marcadora de acuerdo con su señal de corriente.

La figura 4B es un diagrama esquemático que muestra una matriz de electrodos de micropocillos que consiste en cuatro electrodos de micropocillos. Como se muestra en la figura 4B, el electrodo de micropocillos comprende un primer electrodo de micropocillos, un segundo electrodo de micropocillos, un tercer electrodo de micropocillos y un cuarto electrodo de micropocillos. Estos cuatro electrodos de micropocillos comparten un electrodo de guiado intermedio 501. Los voltajes aplicados en el primer electrodo 301 y el segundo electrodo 303 del primer electrodo de micropocillos son V¹¹y V¹², respectivamente; los voltajes aplicados en el primer electrodo 301 y el segundo electrodo 303 del segundo electrodo de micropocillos son V²¹y V²², respectivamente; los voltajes aplicados en el primer electrodo 301 y el segundo electrodo 303 del tercer electrodo de micropocillos son V³¹y V³², respectivamente; y los voltajes aplicados en el primer electrodo 301 y el segundo electrodo 303 del cuarto electrodo de micropocillos son V⁴¹y V⁴², respectivamente. Las diferencias de voltaje aplicadas a los electrodos de guiado 501 del primer al cuarto electrodos de micropocillos son Vg¹, Vg², Vg³y Vg⁴, respectivamente. Una vista esquemática en el recuadro de líneas discontinuas muestra variaciones de Vg¹, Vg², Vg³y Vg⁴en el tiempo. Con un campo eléctrico de guiado periódico se pueden introducir diferentes moléculas marcadoras en los canales de los cuatro electrodos de micropocillos en diferentes momentos durante un período de tiempo, lo que puede aumentar eficazmente el tiempo de reacción y de detección de cada molécula marcadora en el canal, de modo que la señal de detección de la molécula marcadora se puede mejorar de forma eficaz, se puede mejorar la relación señal/ruido de la detección y se puede evitar la interferencia de señales entre moléculas marcadoras adyacentes.

Se puede disponer una pluralidad de electrodos de micropocillos en una matriz de electrodos de micropocillos en diferentes formas.

Las figuras 5A, 5B, 5C y 5D muestran cuatro disposiciones de una pluralidad de electrodos de micropocillos en una matriz de electrodos de micropocillos, respectivamente. En la figura 5A, la pluralidad de electrodos de micropocillos están dispuestos en forma de anillo. En la figura 5B, la pluralidad de electrodos de micropocillos están dispuestos en forma cuadrada o rectangular. En la figura 5C, la pluralidad de electrodos de micropocillos están dispuestos como una matriz de filas y columnas. Sin embargo, la presente invención no se limita a las disposiciones anteriores. Por ejemplo, la pluralidad de electrodos de micropocillos también puede disponerse en forma elíptica, circular, de abanico, en zigzag o de engranaje, etc. Además, la pluralidad de electrodos de micropocillos no se limita a tener una disposición bidimensional, por ejemplo, la pluralidad de electrodos de micropocillos también puede disponerse como capas laminadas, que es una disposición tridimensional.

Además, la pluralidad de electrodos de micropocillos en la matriz de electrodos de micropocillos también se puede conectar en serie, es decir, los canales de los diversos electrodos de micropocillos se conectan entre sí en serie, como se muestra en las figuras 5A o 5B. La pluralidad de electrodos de micropocillos también pueden ser independientes entre sí como se muestra en la figura 5c , en cuyo caso, cada uno de los electrodos de micropocillos puede usarse para detectar diferentes moléculas marcadoras. Como alternativa, la pluralidad de electrodos de micropocillos también se puede conectar en paralelo, es decir, los canales de los diversos electrodos de micropocillos están conectados entre sí en paralelo, como se muestra en la figura 5D, todos los electrodos de guiado de la pluralidad de electrodos de micropocillos (por ejemplo, 4) tienen una diferencia de voltaje Vg aplicada en los mismos, la pluralidad de electrodos de micropocillos puede detectar moléculas marcadoras en paralelo con sus respectivos voltajes de detección (es decir, los voltajes aplicados al primer electrodo y al segundo electrodo).

La presente invención proporciona además un chip sensor que comprende la matriz de electrodos de micropocillos de acuerdo con la realización anterior. El chip sensor, en una realización, puede comprender una matriz de electrodos de micropocillos y puede comprender además un circuito para aplicar voltajes a los electrodos (por ejemplo, un primer electrodo, un segundo electrodo o un electrodo de guiado), un dispositivo de amplificación, un circuito de detección de corriente, un circuito de detección de voltaje, etc.

La presente invención proporciona además un sistema de secuenciación que comprende el chip sensor de la realización anterior.

La figura 6 es un diagrama esquemático que muestra un sistema de secuenciación de acuerdo con una realización de la presente invención. Como se muestra en la figura 6, el sistema de secuenciación comprende una celda de flujo, un chip sensor, una placa de circuito impreso (PCB, por sus siglas en inglés), una tarjeta de matriz de puertas programable en campo (FPGA, por sus siglas en inglés) y un ordenador/dispositivo móvil. La celda de flujo puede suministrar un microfluido al chip sensor. Se puede montar un chip sensor empaquetado en la placa PCB mediante un conector en la placa PCB. La placa PCB puede comprender un chip de circuito sensor de corriente y/o voltaje, un chip de circuito de amplificación de corriente y/o voltaje, un chip de almacenamiento de datos, un chip de control del sistema, etc. La tarjeta FPGA se puede integrar con la placa p Cb y puede estar conectada al ordenador/dispositivo móvil a través de una interfaz, de modo que sea posible desarrollar software de control de aplicaciones en el ordenador o dispositivo móvil para controlar el sistema de secuenciación.

En una aplicación práctica, un sistema de secuenciación se puede diseñar de diferentes formas, por ejemplo, en forma de miniordenador portátil, en forma de ordenador portátil, en forma de dispositivo de mesa o en forma de ordenador central. Se puede integrar una matriz de electrodos de micropocillos en un chip sensor de un sistema de secuenciación y la programación del software se puede realizar mediante una tarjeta FPGA, logrando así la integración de hardware y software.

El electrodo de micropocillos propuesto en la presente invención puede ser compatible con el proceso CMOS. A continuación, se presentará un método de ejemplo para fabricar un electrodo de micropocillos.

La figura 7 es un diagrama esquemático que muestra un flujo simplificado de un método para fabricar un electrodo de micropocillos de acuerdo con una realización de la presente invención. Las figuras 8A-8K muestran productos en diversas fases de un método para fabricar un electrodo de micropocillos de acuerdo con una realización de la presente invención. El método para fabricar el electrodo de micropocillos se describirá a continuación en detalle con referencia a las figuras 7 y 8A-8K.

En primer lugar, en la etapa 702, se proporciona una estructura de sustrato.

La figura 8A muestra una vista en sección de una estructura de sustrato de acuerdo con una realización de la presente invención. La figura 8B muestra una vista superior de la estructura de sustrato mostrada en la figura 8A. Como se muestra en las figuras 8A y 8B, la estructura de sustrato comprende un sustrato 101 con una capa aislante 102 sobre su superficie y una primera capa de material de elemento de soporte 201 en la capa de aislamiento 102. Además, la primera capa de material de elemento de soporte 201 tiene sucesivamente en su pared lateral (por ejemplo, la una o más paredes laterales en un lado o ambos lados de la primera capa de material de elemento de soporte 201) una primera capa de material de electrodo 301, una capa de material de sacrificio 302, una segunda capa de material de electrodo 303 y una segunda capa de material de elemento de soporte 304. Cabe apreciar que, en la estructura de sustrato mostrada en las figuras 8A y 8B, la primera capa de material de elemento de soporte 201 tiene en su pared lateral en un lado una primera capa de material de electrodo 301, una capa de material de sacrificio 302, una segunda capa de material de electrodo 303 y una segunda capa de material de elemento de soporte 304. En algunas realizaciones, la primera capa de material de elemento de soporte 201 también puede tener en su pared lateral en el otro lado una primera capa de material de electrodo 301, una capa de material de sacrificio 302, una segunda capa de material de electrodo 303 y una segunda capa de material de elemento de soporte 304.

Como ejemplo no limitante, la primera capa de material de electrodo 301 puede tener un espesor de aproximadamente 1-1000 nm, por ejemplo, 30 nm, 50 nm, 200 nm, 600 nm, 800 nm o similares. La capa de material de sacrificio 302 puede tener un espesor de aproximadamente 0,5-100 nm, por ejemplo, 5 nm, 10 nm, 20 nm, 40 nm, 80 nm o similares. La segunda capa de material de electrodo 303 puede tener un espesor de aproximadamente 1-1000 nm, por ejemplo, 30 nm, 50 nm, 200 nm, 600 nm, 800 nm o similares.

La primera capa de material de electrodo 301 y la segunda capa de material de electrodo 303 pueden estar constituidas por el mismo material o por materiales diferentes. Además, la capa de material de sacrificio 302 puede estar formada por un material que se puede seleccionar de acuerdo con la primera capa de material de electrodo 301 y la segunda capa de material de electrodo 303. A modo de ejemplo, la primera capa de material de electrodo 301 y la segunda capa de material de electrodo 303 pueden estar formadas por un material seleccionado de un grupo que consiste en silicio, platino, oro, plata, óxido de indio y estaño, materiales a base de carbono (por ejemplo, diamante, grafito, carbono amorfo, etc.) o cualquier combinación de los mismos. La capa de material de sacrificio 302 puede estar formada por un material seleccionado de un grupo que consiste en cromo, wolframio, aluminio, óxido de aluminio, silicio, óxido de silicio, nitruro de silicio o cualquier combinación de los mismos. En una realización específica, la primera capa de material de electrodo 301 y la segunda capa de material de electrodo 303 pueden estar formadas por platino, y la capa de material de sacrificio 302 puede estar formada por cromo o un óxido de silicio. En otra realización específica, la primera capa de material de electrodo 301 y la segunda capa de material de electrodo 303 pueden estar formadas por oro, y la capa de material de sacrificio 302 puede estar formada por tungsteno.

A continuación, en la etapa 704, la primera capa de material de elemento de soporte 201, la primera capa de material de electrodo 301, la capa de material de sacrificio 302, la segunda capa de material de electrodo 303 y la segunda capa de material de elemento de soporte 304 se estructuran para formar una o más cámaras 401, un primer elemento de soporte 201, y formar un primer electrodo 301, una capa de sacrificio 302, un segundo electrodo 303 y un segundo elemento de soporte 304 situados sucesivamente en la pared lateral del primer elemento de soporte 201, como se muestra en la figura 8C. En el presente documento, el primer elemento de soporte 201, el primer electrodo 301, la capa de sacrificio 302, el segundo electrodo 303 y el segundo elemento de soporte 304 se forman a partir de la primera capa de material de elemento de soporte, la primera capa de material de electrodo, la capa de material de sacrificio, la segunda capa de material de electrodo y segunda capa de material de elemento de soporte, respectivamente. La cámara formada 401 se comunica con un canal 601 que se forma posteriormente. Además, en esta etapa, también es posible separar la primera capa de material de electrodo 301 y/o la segunda capa de material de electrodo 303 en una pluralidad de segmentos, de modo que el primer electrodo formado 301 y/o el segundo electrodo 303 comprendan cada uno un pluralidad de segmentos separados entre sí.

A continuación, en la etapa 706, se forman uno o más electrodos de guiado 501 en la cámara 401, como se muestra en la figura 8D. Por ejemplo, el electrodo de guiado 501 puede formarse mediante procesos tales como fotolitografía, deposición y desconchado. El electrodo de guiado 501 también puede formarse mediante procesos tales como deposición, planarización y grabado. Preferentemente, el electrodo de guiado 501 puede ser sustancialmente perpendicular al primer electrodo 301. Como alternativa, el electrodo de guiado 501 puede ser sustancialmente perpendicular al segundo electrodo 303. Es decir, la dirección del campo eléctrico entre los electrodos de guiado 501 es sustancialmente perpendicular a la dirección del campo eléctrico entre el primer electrodo 301 y el segundo electrodo 303 después de aplicar voltajes a los electrodos de guiado 501, el primer electrodo 301 y el segundo electrodo 302.

A continuación, en la etapa 708, la capa de sacrificio 302 en la pared lateral del primer elemento de soporte 201 se elimina para formar un canal 601 entre el primer electrodo 301 y el segundo electrodo 303, en la que el canal 601 tiene al menos un extremo en comunicación con la cámara 401, como se muestra en la figura 8E.

En una realización, antes de eliminar la capa de sacrificio 302 de la pared lateral del primer elemento de soporte 201, se puede formar una capa de pasivación 701 en la superficie de al menos uno del primer elemento de soporte 201, el segundo elemento de soporte 304, el primer electrodo 301 o el segundo electrodo 303, como se muestra en la figura 8F. A modo de ejemplo, la capa de pasivación 701 puede estar formada por un nitruro de silicio, un óxido de silicio y similares. Por ejemplo, se puede depositar un material de pasivación en la parte superior del primer elemento de soporte 201, el primer electrodo 301, el segundo electrodo 303 y el segundo elemento de soporte 304. A continuación, el material de pasivación depositado se puede estructurar para formar una capa de pasivación 701 en la superficie de al menos uno del primer elemento de soporte 201, el segundo elemento de soporte 304, el primer electrodo 301 o el segundo electrodo 303. A continuación, la capa de sacrificio 302 puede eliminarse mediante un proceso de grabado selectivo para formar un canal 601 entre el primer electrodo 301 y el segundo electrodo 303, como se muestra en la figura 8G.

En otra realización, antes de eliminar la capa de sacrificio 302 de la pared lateral del primer elemento de soporte 201, una porción de la parte superior del primer elemento de soporte 201 y una porción de la parte superior del segundo elemento de soporte 304 se pueden eliminar para exponer una porción del primer electrodo 301, una porción de la capa de sacrificio 302 y una porción del segundo electrodo 303, como se muestra en la figura 8H. A continuación, se deposita una capa de pasivación 701 en la porción restante del primer elemento de soporte 201, la porción restante del segundo elemento de soporte 304, la porción expuesta del primer electrodo 301, la porción expuesta de la capa de sacrificio 302 y la porción expuesta del segundo electrodo 303, como se muestra en la figura 8I. Posteriormente, la capa de pasivación depositada 701 se aplana para formar una capa de pasivación 701 en la porción restante del primer elemento de soporte 201 y la porción restante del segundo elemento de soporte 304, y exponer la capa de sacrificio 302, como se muestra en la figura 8J. En una implementación, el proceso de planarización puede detenerse en la superficie superior del primer electrodo 301, la superficie superior de la capa de sacrificio 302 y la superficie superior del segundo electrodo 303. Como alternativa, el proceso de planarización puede eliminar una porción del primer electrodo 301, una porción de la capa de sacrificio 302 y una porción del segundo electrodo 303, siempre que una porción de la capa de pasivación 701 permanezca en la porción restante del primer elemento de soporte 201 y la porción restante del segundo elemento de soporte 304. A continuación, la capa de sacrificio expuesta 302 puede eliminarse mediante un proceso de grabado selectivo para formar un canal 601 entre el primer electrodo 301 y el segundo electrodo 303, como se muestra en la figura 8K.

Como ejemplo, con referencia a las figuras 1A y 1B, el canal formado 601 puede tener un ancho W de aproximadamente 0,5-100 nm (por ejemplo, 1 nm, 2 nm, 10 nm, 50 nm, 80 nm, etc.), el canal 601 puede tener una longitud L de aproximadamente 50 nm-100 pm (por ejemplo, 100 nm, 500 nm, 5 pm, 10 pm, 30 pm, etc.), y el canal 601 puede tener una profundidad H de aproximadamente 0-10 pm (por ejemplo, 100 nm, 300 nm, 1 pm, 2 pm, 8 pm, etc.) En el presente documento, el ancho del canal 601 es la distancia entre el primer electrodo 301 y el segundo electrodo 303, la longitud del canal 601 es la longitud que se extiende en torno al primer elemento de soporte 201, y la profundidad del canal 601 es la distancia entre la parte superior superficie del primer electrodo 301/segundo electrodo 303 y la capa aislante 102.

Con el método anterior, se forma un electrodo de micropocillos mostrado en las figuras 1A, 1B y 1C. Sin embargo, debe entenderse que la presente invención no se limita al método anterior para fabricar un electrodo de micropocillos. En aplicaciones prácticas, se puede adoptar un método para fabricar un electrodo de micropocillos basado en la estructura específica del electrodo de micropocillos, por ejemplo, se pueden añadir algunas etapas sobre la base del método anterior, o se pueden ajustar algunas etapas del método anterior. Por ejemplo, cuando se forma una primera capa de material de electrodo sobre la pared lateral de un primer elemento de soporte, se puede determinar si la primera capa de material de electrodo se formará sobre una o más paredes laterales en un lado o en ambos lados del primer elemento de soporte basándose en el número requerido de los primeros electrodos.

Después de formar un electrodo de micropocillos, se puede formar una nanoestructura 801 capaz de inmovilizar una enzima o una sustancia química 802 a detectar en el fondo o en una pared lateral de la cámara 401, o en el fondo o una pared lateral del canal 601, o en el electrodo de guiado 501. La figura 1C muestra una situación en la que una nanoestructura está situada en el fondo de la cámara 401. En una realización, la nanoestructura 801 puede ser un nanopunto. A modo de ejemplo, el tamaño de la nanoestructura 801 puede ser de 1-100 nm, por ejemplo, 8 nm, 20 nm, 50 nm, 80 nm y similares. En una realización, la nanoestructura 801 puede estar formada por un material seleccionado de un grupo que consiste en un óxido de metal de transición tal como dióxido de circonio (ZrO²) o dióxido de hafnio (HfO²), un metal inerte, un polímero inorgánico, un polímero orgánico o cualquier combinación de los mismos.

La estructura de sustrato mostrada en las figuras 8A y 8B se puede formar de diferentes formas. A continuación, se introducirá una implementación específica de la formación de la estructura de sustrato con referencia a las figuras 9A-9J.

En primer lugar, como se muestra en la figura 9A, se proporciona un sustrato 101 con una capa aislante 102 en su superficie. El sustrato 101 puede ser, por ejemplo, un sustrato de silicio, un sustrato hecho de un material semiconductor del Grupo III-V, un sustrato de silicio sobre aislante (SOI) o puede ser un sustrato semiconductor de óxido tal como ZnO, CdO, TiO², AhO³, SnO, o puede ser un sustrato hecho de un material aislante, tal como un vidrio de cuarzo o un vidrio de soda. La capa aislante 102 puede formarse sobre el sustrato 101 por oxidación térmica o por deposición (por ejemplo, deposición física en fase de vapor (PVD, por sus siglas en inglés), deposición química en fase de vapor (CVD, por sus siglas en inglés), etc.). Normalmente, la capa aislante 102 puede ser una capa de dióxido de silicio.

A continuación, como se muestra en la figura 9B, se forma una primera capa de material de elemento de soporte 201 en una porción de la capa aislante 102. La primera capa de material de elemento de soporte 201 puede estar formada por un material conductor o un material no conductor, preferentemente, un material conductor. Por ejemplo, se puede depositar un material conductor sobre la capa aislante 102 mediante deposición (tal como pVd o CVD), y a continuación el material conductor se estructura para formar la primera capa de material de elemento de soporte 201. Como ejemplo no limitante, una sección de la primera capa de material de elemento de soporte 201 en la dirección paralela a la superficie del sustrato 101 es elíptica, cuadrada, circular o poligonal. Sin embargo, debe entenderse que la presente invención no se limita a lo mismo, y la primera capa de material de elemento de soporte 201 también puede tener otras formas adecuadas.

A continuación, como se muestra en la figura 9C, se deposita una primera capa de material de electrodo 301 para cubrir la superficie superior y una pared lateral de la primera capa de material de elemento de soporte 201. En el presente documento, la primera capa de material de electrodo 301 también puede cubrir la totalidad o una porción de la porción expuesta de la capa aislante 102.

A continuación, como se muestra en la figura 9D, la primera capa de material de electrodo 301 en la superficie superior de la primera capa de material de elemento de soporte se puede eliminar mediante grabado anisotrópico en seco, por ejemplo, grabado con iones reactivos (RIE, por sus siglas en inglés), grabado con haz de iones (IBE, por sus siglas en inglés), conservando únicamente la primera capa de material de electrodo 301 en la pared lateral de la primera capa de material de elemento de soporte 201. En una realización, en el caso de depositar también la primera capa de material de electrodo 301 sobre la capa aislante 102, la primera capa de material de electrodo 301 de la capa aislante 102 se elimina.

A continuación, como se muestra en la figura 9E, se deposita una capa de material de sacrificio 302 para cubrir la superficie superior de la primera capa de material de elemento de soporte 201, y la superficie superior y la pared lateral de la primera capa de material de elemento de soporte restante 301 (es decir, la primera capa de material de electrodo 301 en la pared lateral de la primera capa de material de elemento de soporte 201). En el presente documento, la capa de material de sacrificio 302 también puede cubrir la totalidad o una porción de la porción expuesta de la capa aislante 102.

A continuación, como se muestra en la figura 9F, se eliminan la capa de material de sacrificio 302 en la superficie superior de la primera capa de material de elemento de soporte 201 y la superficie superior de la primera capa de material de electrodo restante 301, conservando únicamente la capa de material de sacrificio 302 en la pared lateral de la primera capa de material de electrodo restante 301. En una realización, en el caso de depositar también la capa de material de sacrificio 302 sobre la capa aislante 102, la capa de material de sacrificio 302 de la capa aislante 102 se elimina.

A continuación, como se muestra en la figura 9G, se deposita una segunda capa de material de electrodo 303 para cubrir la superficie superior de la primera capa de material de elemento de soporte 201, la superficie superior de la primera capa de material de electrodo restante 301 y la superficie superior y la pared lateral de la capa de material de sacrificio restante 302. En el presente documento, la segunda capa de material de electrodo 303 también puede cubrir la totalidad o una porción de la porción expuesta de la capa aislante 102.

A continuación, como se muestra en la figura 9H, la segunda capa de material de electrodo 303 en la superficie superior de la primera capa de material de elemento de soporte 201, la superficie superior de la primera capa de material de electrodo restante 301, la superficie superior de la capa de material de electrodo restante 302 se eliminan, conservando la segunda capa de material de electrodo 303 en la pared lateral de la capa de material de sacrificio restante 302. En una realización, en el caso de depositar también la segunda capa de material de electrodo 303 sobre la capa aislante 102, la segunda capa de material de electrodo 303 de la capa aislante 102 se elimina.

A continuación, como se muestra en la figura 9I, se deposita una segunda capa de material de elemento de soporte 304 para cubrir la primera capa de material de elemento de soporte 201, la primera capa de material de electrodo 301 en la pared lateral de la primera capa de material de elemento de soporte 201, la capa de material de sacrificio 302 sobre la pared lateral de la primera capa de material de elemento de soporte 201, la segunda capa de material de electrodo 303 sobre la pared lateral de la primera capa de material de elemento de soporte 201 y la porción que no está cubierta de capa aislante 102.

A continuación, como se muestra en la figura 9J, la segunda capa de material de elemento de soporte depositada 304 se aplana para exponer la capa de material de sacrificio 302 sobre la pared lateral de la primera capa de material de elemento de soporte 201 para formar una estructura de sustrato. En una implementación, este proceso de planarización puede hacer que las superficies superiores de la primera capa de material de elemento de soporte 201, la primera capa de material de electrodo 301, la capa de sacrificio 302 y la segunda capa de material de electrodo 303 sobre la pared lateral de la primera capa de material de elemento de soporte 201, y la superficie superior de la segunda capa de material de segundo elemento de soporte 304 se nivelen sustancialmente.

Las etapas posteriores 704-708 se pueden realizar de acuerdo con el método descrito anteriormente después de formar la estructura de sustrato de acuerdo con las figuras 9A a 9J, que no se repetirán en el presente documento.

En una realización, la molécula marcadora para su uso en una reacción redox circular puede seleccionarse, por ejemplo, de:

En una realización, la dNTP modificada con moléculas marcadoras o un análogo de la misma puede sintetizarse, por ejemplo, mediante el siguiente método:

En la invención, se pueden diseñar diferentes moléculas marcadoras para modificar cuatro moléculas diferentes de dNTP, moléculas de NTP o análogos de las mismas, por lo que diferentes moléculas marcadoras libres tienen diferentes potenciales redox, y además se pueden distinguir las diferentes moléculas de dNTP, moléculas de NTP o análogos. En una realización, las diferentes moléculas marcadoras pueden mostrarse de la siguiente manera:

Cuando el número de cargas transportadas por diferentes moléculas marcadoras libres es diferente, tienen diferentes velocidades de migración bajo la acción de un electrodo de guiado; en una realización, las cargas transportadas por diferentes moléculas marcadoras son las siguientes:

En una realización, la dNTP no cargada o cargada negativamente modificada con una molécula marcadora libera una sustancia activa redox cargada positivamente en presencia de ADN polimerasa y fosfatasa alcalina, como se muestra a continuación:

En una realización, el principio para la reacción redox circular que se produjo entre el primer electrodo y el segundo electrodo es el siguiente:

La figura 10A y la figura 10B muestran los resultados de detección de diferentes moléculas marcadoras libres detectadas usando un electrodo de micropocillos de ejemplo de la invención, respectivamente, en el que la figura 10A es una curva de corriente redox de la molécula de hexacianoferrato detectada por el electrodo de micropocillos de la invención, y la figura 10B es una curva de corriente redox de la molécula de ferroceno detectada por el electrodo de micropocillos de la invención. Los resultados de la figura 10A y la figura 10B muestran que la molécula de hexacianoferrato y la molécula de ferroceno son bastante diferentes entre sí en términos de ventana de potencial redox y forma de curva. Los resultados muestran que se pueden distinguir e identificar diversas moléculas marcadoras libres mediante las señales de corriente detectadas por el electrodo de micropocillos de la invención. Cuando cada una de las unidades básicas (tales como dNTP, NTP o un análogo de las mismas) en una solución de reacción se modifica con una molécula marcadora diferente, el electrodo de micropocillos de la invención se puede usar para distinguir e identificar el tipo de molécula marcadora mediante la señal eléctrica única detectada, distinguir e identificar además el tipo de unidad básica (tal como dNTP, NTP o un análogo de las mismas) en la solución de reacción que está involucrada en la reacción, y finalmente lograr el análisis de la sustancia química a ensayar (tal como ácido nucleico).

La figura 11 muestra la distribución del número de colisiones entre una molécula marcadora única y un electrodo en un electrodo de micropocillos de ejemplo de la invención, que se obtiene mediante un cálculo de simulación. Sin tener en cuenta condiciones no ideales tales como la absorción de moléculas, si un electrón se intercambia cuando la molécula electroquímicamente activa choca con el electrodo una vez, el número de colisiones dentro de una unidad temporal puede convertirse directamente al valor de corriente teórico máximo que se genera. Por lo tanto, por medios tales como disminuir adicionalmente el tamaño mínimo del canal, cambiar la estructura química de la molécula marcadora, aumentar el número de intercambio de electrones de cada colisión y tratar la superficie del electrodo para reducir la absorción de moléculas, la señal de corriente puede amplificarse aún más, para mejorar la precisión de la detección de la señal eléctrica.

Para esto, se han descrito en detalle un electrodo de micropocillos y un método para fabricar el mismo, y un método para el análisis de un ácido nucleico basado en el electrodo de micropocillos de acuerdo con realizaciones de la presente invención. Algunos detalles bien conocidos en la técnica no se describen para evitar complicar el concepto de la presente invención. De acuerdo con la descripción anterior, los expertos en la técnica sabrán plenamente cómo implementar las soluciones técnicas desveladas en el presente documento. Además, las diversas realizaciones enseñadas en esta memoria descriptiva se pueden combinar libremente. Los expertos en la técnica deben entender que se pueden hacer diversas modificaciones a las realizaciones descritas anteriormente sin apartarse del espíritu y alcance de la invención tal como se define en las reivindicaciones adjuntas.

Claims

REIVINDICACIONES

1. Un electrodo de micropocillos, que comprende:

un sustrato y una capa aislante sobre una superficie del sustrato;

uno o más primeros electrodos;

uno o más segundos electrodos, cada uno dispuesto opuesto a un primer electrodo, en donde un canal está definido y situado entre cada primer electrodo y el segundo electrodo opuesto al mismo, y el canal tiene al menos un extremo en comunicación con una cámara; y

uno o más electrodos de guiado situados en la cámara,

en donde el primer electrodo, el segundo electrodo y los electrodos de guiado están situados sobre una superficie de la capa aislante alejada del sustrato.

2. El electrodo de micropocillos de acuerdo con la reivindicación 1, que comprende además:

un primer elemento de soporte para soportar el uno o más primeros electrodos.

3. El electrodo de micropocillos de acuerdo con la reivindicación 1, en donde

el electrodo de micropocillos comprende una pluralidad de primeros electrodos y una pluralidad de primeros elementos de soporte, cada electrodo está soportado por un primer elemento de soporte correspondiente; y/o

el electrodo de micropocillos comprende una pluralidad de segundos electrodos y una pluralidad de segundos elementos de soporte, cada segundo electrodo está soportado por un segundo elemento de soporte correspondiente.

4. El electrodo de micropocillos de acuerdo con la reivindicación 1, en el que

al menos uno del primer electrodo y el segundo electrodo comprende una pluralidad de segmentos separados entre sí.

5. El electrodo de micropocillos de acuerdo con la reivindicación 4, que comprende además:

una pluralidad de primeros elementos de soporte, cada segmento del primer electrodo está soportado por un primer elemento de soporte correspondiente; y/o

una pluralidad de segundos elementos de soporte, cada segmento del segundo electrodo está soportado por un segundo elemento de soporte correspondiente.

6. El electrodo de micropocillos de acuerdo con la reivindicación 5, en el que

el primer elemento de soporte es un elemento conductor; y/o

el segundo elemento de soporte es un elemento conductor.

7. El electrodo de micropocillos de acuerdo con la reivindicación 1, que comprende además:

una nanoestructura capaz de inmovilizar una enzima o una sustancia química a detectar, en donde la nanoestructura está situada en el fondo o en una pared lateral de la cámara, o en el fondo o en una pared lateral del canal, o en los electrodos de guiado.

8. El electrodo de micropocillos de acuerdo con la reivindicación 1, en el que

el canal tiene un ancho de 0,5-100 nm; y/o

el canal tiene una longitud de 50 nm-100 pm; y/o

el canal tiene una profundidad de 0-10 pm; y/o

el primer electrodo tiene un espesor de 1-1000 nm; y/o

el segundo electrodo tiene un espesor de 1-1000 nm.

9. El electrodo de micropocillos de acuerdo con la reivindicación 1, que comprende además:

una capa de pasivación situada sobre la superficie del primer electrodo y/o el segundo electrodo.

10. Una matriz de electrodos de micropocillos, que comprende: el electrodo de micropocillos de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9.

11. La matriz de electrodos de micropocillos de acuerdo con la reivindicación 10, en donde la matriz de electrodos de micropocillos comprende una pluralidad de electrodos de micropocillos,

la pluralidad de electrodos de micropocillos están dispuestos en forma elíptica, circular, anular, de abanico, rectangular, cuadrada, en zigzag o de engranaje, o como una matriz de filas y columnas, o como capas laminadas.

12. La matriz de electrodos de micropocillos de acuerdo con la reivindicación 11, en la que

más de un electrodo de micropocillos comparten un electrodo de guiado.

13. Un chip sensor, que comprende: la matriz de electrodos de micropocillos de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 10 a 12.

14. Un sistema de secuenciación, que comprende: el chip sensor de acuerdo con la reivindicación 13.

15. Un método para fabricar un electrodo de micropocillos, que comprende:

proporcionar una estructura de sustrato que comprende un sustrato con una capa aislante sobre su superficie y una primera capa de material de elemento de soporte en la capa aislante, en donde la primera capa de material de elemento de soporte tiene sucesivamente en su pared lateral una primera capa de material de electrodo, una capa de material de sacrificio, un segunda capa de material de electrodo y una segunda capa de material de elemento de soporte;

estructurar la primera capa de material de elemento de soporte, la primera capa de material de electrodo, la capa de material de sacrificio, la segunda capa de material de electrodo y la segunda capa de material de elemento de soporte para formar una o más cámaras, un primer elemento de soporte, y formar un primer electrodo, una capa de sacrificio, un segundo electrodo y un segundo elemento de soporte situados sucesivamente en la pared lateral del primer elemento de soporte;

formar uno o más electrodos de guiado en la cámara;

eliminar la capa de sacrificio en la pared lateral del primer elemento de soporte para formar un canal entre el primer electrodo y el segundo electrodo,

en donde el canal tiene al menos un extremo en comunicación con la cámara.

16. El método de acuerdo con la reivindicación 15, en el que la etapa de proporcionar la estructura de sustrato comprende:

proporcionar un sustrato con una capa aislante en su superficie;

formar una primera capa de material de elemento de soporte en una porción de la capa aislante;

depositar una primera capa de material de electrodo para cubrir la superficie superior y una pared lateral de la primera capa de material de elemento de soporte;

eliminar la primera capa de material de electrodo en la superficie superior de la primera capa de material de elemento de soporte; depositar una capa de material de sacrificio para cubrir la superficie superior de la primera capa de material de elemento de soporte, la superficie superior y una pared lateral de la primera capa de material de electrodo restante;

eliminar la capa de material de sacrificio en la superficie superior de la primera capa de material de elemento de soporte y la superficie superior de la primera capa de material de electrodo restante;

depositar una segunda capa de material de electrodo para cubrir la superficie superior de la primera capa de material de elemento de soporte, la superficie superior de la primera capa de material de electrodo restante y una superficie superior y una pared lateral de la capa de material de sacrificio restante;

eliminar la segunda capa de material de electrodo en la superficie superior de la primera capa de material de elemento de soporte, la superficie superior de la primera capa de material de electrodo restante y la superficie superior de la capa de material de sacrificio restante;

depositar una segunda capa de material de elemento de soporte para cubrir la primera capa de material de elemento de soporte, la primera capa de material de electrodo en la pared lateral de la primera capa de material de elemento de soporte, la capa de material de sacrificio sobre la pared lateral de la primera capa de material de elemento de soporte, la segunda capa de material de electrodo sobre la pared lateral de la primera capa de material de elemento de soporte, y la porción que no está cubierta de la capa aislante;

aplanar la segunda capa de material de elemento de soporte depositada para exponer la capa de material de sacrificio sobre la pared lateral de la primera capa de material de elemento de soporte.

17. El método de acuerdo con la reivindicación 15, en el que, antes de eliminar la capa de sacrificio, el método comprende además:

formar una capa de pasivación sobre una superficie de al menos uno del primer elemento de soporte, el segundo elemento de soporte, el primer electrodo o el segundo electrodo.

18. El método de acuerdo con la reivindicación 15, en el que, antes de eliminar la capa de sacrificio, el método comprende además:

eliminar una porción de la parte superior del primer elemento de soporte y una porción de la parte superior del segundo elemento de soporte para exponer una porción del primer electrodo, una porción de la capa de sacrificio y una porción del segundo electrodo;

depositar una capa de pasivación sobre el primer elemento de soporte restante, el segundo elemento de soporte restante, la porción expuesta del primer electrodo, la porción expuesta de la capa de sacrificio y la porción expuesta del segundo electrodo;

aplanar la capa de pasivación depositada para formar una capa de pasivación en la porción restante del primer elemento de soporte y la porción restante del segundo elemento de soporte y exponer la capa de sacrificio.

19. El método de acuerdo con la reivindicación 15, en el que la etapa de estructuración comprende:

separar la primera capa de material de electrodo y/o la segunda capa de material de electrodo en una pluralidad de segmentos, de modo que el primer electrodo y/o el segundo electrodo formados comprendan cada uno una pluralidad de segmentos separados entre sí.

20. El método de acuerdo con la reivindicación 15, en donde el método comprende además:

formar una nanoestructura capaz de inmovilizar una enzima o una sustancia química a detectar en el fondo o una pared lateral de la cámara, o en el fondo o una pared lateral del canal, o en los electrodos de guiado.

21. El método de acuerdo con la reivindicación 15, en el que

el canal tiene un ancho de 0,5-100 nm; y/o

el canal tiene una longitud de 50 nm-100 pm; y/o

el canal tiene una profundidad de 0-10 pm; y/o

el primer electrodo tiene un espesor de 1-1000 nm; y/o

la capa de sacrificio tiene un espesor de 0,5-100 nm; y/o

el segundo electrodo tiene un espesor de 1-1000 nm.

22. El método de acuerdo con la reivindicación 15, en el que

el primer elemento de soporte comprende un elemento conductor; y/o

el segundo elemento de soporte comprende un elemento conductor.

23. Un método para el análisis de una sustancia química, que comprende las etapas de:

(1) proporcionar el electrodo de micropocillos de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1-9 o la matriz de electrodos de micropocillos de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 10-12;

24. El método de acuerdo con la reivindicación 23, en el que, en la etapa (4), el tipo de molécula cargada se identifica con el primer electrodo, el segundo electrodo y/o el electrodo de guiado basándose en uno o más efectos seleccionados de un grupo que consiste en un efecto de oxidación-reducción, efecto de resistencia eléctrica, efecto de capacitancia, efecto de campo y efecto túnel.

25. Un método para el análisis de una molécula de ácido nucleico, que comprende las etapas de:

(2) inmovilizar una polimerasa (tal como ADN polimerasa o ARN polimerasa) en la cámara o en el canal de o en el electrodo de guiado del electrodo de micropocillos o de la matriz de electrodos de micropocillos;

(3) añadir al electrodo de micropocillos o a la matriz de electrodos de micropocillos, una solución de reacción que contiene una molécula de ácido nucleico a ensayar, un cebador y al menos una molécula (por ejemplo, una, dos, tres o cuatro) de trifosfato de desoxirribonucleósido (dNTP) o de trifosfato de nucleósido (NTP) o un análogo de las mismas, en donde el cebador puede hibridarse o aparearse con una secuencia parcial de la molécula de ácido nucleico a ensayar, y cada una de las al menos una molécula de dNTP o de NTP o un análogo se modifica con una molécula marcadora, respectivamente; y posteriormente, en una condición adecuada, hibridar la molécula de ácido nucleico a ensayar con el cebador para formar un complejo;

(4) en presencia de la polimerasa como catalizador, incorporar una de las moléculas de dNTP o de NTP modificadas con la molécula marcadora, o un análogo, en el cebador para formar un producto de extensión complementario a la molécula de ácido nucleico a ensayar, y eliminar la molécula marcadora transportada por la molécula de dNTP o de NTP, o un análogo, que se incorpora en el cebador, para proporcionar una molécula marcadora libre, en donde se carga la molécula marcadora libre;

(6) identificar el tipo de molécula marcadora libre usando el primer electrodo y el segundo electrodo; e identificar además el tipo de molécula de dNTP o de NTP, o un análogo, que se incorpora en el cebador de acuerdo con la correspondencia entre la molécula marcadora y la molécula de dNTP o de n Tp o un análogo; y determinar además la base en la posición correspondiente de la molécula de ácido nucleico a ensayar, de acuerdo con el principio de emparejamiento de bases complementarias; y

26. El método de acuerdo con la reivindicación 25, en el que la molécula marcadora libre puede ser una sustancia activa redox que es reactiva en una reacción redox circular, o puede convertirse en una sustancia activa redox que es reactiva en una reacción redox circular; preferentemente, la sustancia activa redox puede someterse a una reacción redox circular entre el primer electrodo y el segundo electrodo, dando como resultado una corriente detectable.

27. El método de acuerdo con la reivindicación 25, en el que la solución de reacción comprende además una fosfatasa.

28. El método de acuerdo con la reivindicación 25, en el que, en la etapa (4), la molécula marcadora libre se desfosforila en presencia de una fosfatasa.

29. El método de acuerdo con la reivindicación 25, en el que la carga transportada por la molécula marcadora libre se ajusta seleccionando una molécula marcadora, para ajustar la velocidad de migración de la molécula marcadora libre bajo la acción del electrodo de guiado.

30. El método de acuerdo con la reivindicación 25, en el que, en la etapa (1), la polimerasa se inmoviliza sobre una capa aislada en el fondo de la cámara o del canal, o se inmoviliza en el electrodo de guiado; preferentemente, la polimerasa se inmoviliza en un lugar cercano al extremo del canal en el fondo de la cámara.

31. El método de acuerdo con la reivindicación 30, en el que se proporciona además una región funcionalizable y/o una región de unión molecular entre la capa aislada y la polimerasa;

preferentemente, la región funcionalizable comprende dióxido de silicio, óxido de hafnio, óxido de aluminio, óxido de tántalo y/o óxido de circonio; más preferentemente, el material funcionalizable se funcionaliza con una molécula de unión seleccionada de un grupo que consiste en: silicano (por ejemplo, aminopropiltrietoxisilano), tiol (-SH), disulfuro (-S-S-), isotiocianato, alqueno y alquino;

preferentemente, la región de unión molecular comprende una molécula sonda; preferentemente, la molécula sonda se selecciona, por ejemplo, de un grupo que consiste en una biotina, una avidina, un anticuerpo, un antígeno, un receptor, un ligando, una secuencia de ADN, una secuencia de ARN, una proteína y un ligando de la misma.

32. El método de acuerdo con la reivindicación 25, en el que, en la etapa (6), el tipo de molécula marcadora libre se identifica por uno o más de efecto de oxidación-reducción, efecto de resistencia eléctrica, efecto de capacitancia, efecto de campo y efecto túnel.