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ES2873837T3 - Composiciones anti CGRP y uso de las mismas - Google Patents

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ES2873837T3
ES2873837T3 ES19215303T ES19215303T ES2873837T3 ES 2873837 T3 ES2873837 T3 ES 2873837T3 ES 19215303 T ES19215303 T ES 19215303T ES 19215303 T ES19215303 T ES 19215303T ES 2873837 T3 ES2873837 T3 ES 2873837T3
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seq
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cgrp
antibody
sequence
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ES19215303T
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English (en)
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Brian Robert Kovacevich
Leon F Garcia-Martinez
Katie Olson
Benjamin H Dutzar
Jens J Billgren
John A Latham
Danielle M Mitchell
Patricia Dianne Mcneill
Nicole M Janson
Maria-Cristina Loomis
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H Lundbeck AS
Original Assignee
H Lundbeck AS
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Publication date
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Abstract

Método para producir un anticuerpo anti CGRP, método que comprende expresar los polinucleótidos de las secuencias SEQ ID NO:192 y SEQ ID NO:194 en células de levadura o en células de mamífero.

Description

DESCRIPCIÓN
Composiciones anti CGRP y uso de las mismas
La siguiente solicitud contiene un Listado de Secuencias que se ha presentado en formato ASCII en la web EFS. Dicha copia en ASCII, creada el 18 de mayo de 2012, se denomina 67858o730301.txt y tiene un tamaño de 203,815 bytes.
Antecedentes de la invención
Campo de la invención
La presente divulgación se refiere a anticuerpos y fragmentos de los mismos (incluyendo fragmentos Fab) que tienen especificidad de unión con péptido relacionado con el gen de la calcitonina (en lo sucesivo en el presente documento "CGRP") humano. La divulgación también se refiere a métodos de exploración para enfermedades y trastornos asociados con CGRP y a métodos de prevención o tratamiento de enfermedades y trastornos asociados con CGRP administrando dichos anticuerpos o fragmentos de los mismos.
Descripción de la técnica relacionada
El péptido relacionado con el gen de la calcitonina (CGRP) se produce como un neuropéptido multifuncional de 37 aminoácidos de longitud. En seres humanos existen dos formas de CGRP, las formas CGRP-alfa y CGRP-beta, y tienen actividades similares. CGRP-alfa y CGRP-beta difieren en tres aminoácidos en seres humanos y proceden de diferentes genes. La familia de péptidos de CGRP incluye amilina, adrenomedulina y calcitonina, aunque cada una tiene distintos receptores y actividades biológicas. Doods, H., Curr. Op. Invest. Drugs, 2(9):1261 -68 (2001).
CGRP se libera de numerosos tejidos tales como nervios del trigémino, que cuando se activan liberan neuropéptidos en las meninges, mediando en la inflamación neurogénica que se caracteriza por vasodilatación, filtración de los vasos y degradación de mastocitos. Durham, P.L., New Eng. J. Med., 350 (11):1073-75 (2004). Los efectos biológicos de CGRP están mediados mediante el receptor de CGRP (CGRP-R), que consiste en un componente de siete dominios transmembrana, junto con la proteína de membrana asociada a receptor (RAMP). CGRP-R requiere además la actividad de la proteína componente del receptor (RCP), que es esencial para un acoplamiento eficaz con adenilato ciclasa a través de proteínas G y la producción de AMPc. Doods, H., Curr. Op. Invest. Drugs, 2(9):1261 -68 (2001).
Las migrañas son un trastorno neurovascular que afecta a aproximadamente 10 % de la población adulta de los Estados Unidos, y están acompañadas habitualmente de cefaleas intensas. Aproximadamente 20-30 % de las personas aquejadas de migrañas experimentan aura, que comprende fenómenos neurológicos focales que preceden y/o acompañan al acontecimiento. Se cree que CGRP desempeña un papel prominente en el desarrollo de migrañas. Por ejemplo, las concentraciones en plasma de CGRP se identificaron elevadas en sangre venosa yugular durante la fase de cefalea de las migrañas, en exclusión de otros neuropéptidos. Por otra parte, según Arulmozhi et al, se ha identificado lo siguiente en personas aquejadas de migrañas: (1) una fuerte correlación entre las concentraciones de CGRP en plasma y las migrañas; (2) la infusión de CGRP produjo una cefalea de tipo migraña; (3) los niveles basales de CGRP estuvieron elevados; y (4) cambios en los niveles de CGRP en plasma durante los ataques de migraña se correlacionaron significativamente con la intensidad de la cefalea. Arulmozhi, D.K., et al., Vas. Pharma., 43: 176-187 (2005).
Un tratamiento eficaz para las migrañas es la administración de triptanos, que son una familia de fármacos basados en triptamina, incluyendo sumatriptán y rizatriptán. Los miembros de esta familia tienen una afinidad por múltiples receptores de serotonina, incluyendo 5 -HT1B, 5-HTm y 5 -HT1F. Los miembros de esta familia de fármacos constriñen de forma selectiva los vasos cerebrales, pero también provocan efectos vasoconstrictivos en vasos coronarios. Durham, P.L., New Eng. J. Med., 350 (11):1073-75 (2004). Existe un riesgo teórico de espasmo coronario en pacientes con enfermedad cardíaca establecida después de la administración, y pueden producirse con poca frecuencia acontecimientos cardíacos después de tomar triptanos. Se ha observado que está contraindicado para pacientes con enfermedad vascular coronaria.
De forma similar, el dolor puede abordarse con frecuencia mediante la administración de determinados narcóticos o fármacos antiinflamatorios no esteroideos (AINE). Sin embargo, la administración de estos tratamientos puede realizarse a costa de determinadas consecuencias negativas. Los AINE tienen el potencial de provocar insuficiencia renal, hemorragia intestinal y disfunción hepática. Los narcóticos tienen el potencial de provocar náuseas, vómitos, alteración de la actividad mental y adicción. Por lo tanto, es deseable identificar tratamientos alternativos para el dolor para evitar algunas de estas consecuencias negativas.
Se cree que CGRP desempeña un papel en una multitud de enfermedades y trastornos, incluyendo, pero sin limitación, migrañas, cefaleas y dolor.
Por ejemplo, se ha indicado que CGRP puede correlacionarse con o incluso desempeñar un papel causal en la vejiga hiperactiva. Las pruebas de que CGRP puede correlacionarse con la afección de vejiga hiperactiva incluyen el hecho de que CGRP está presente en el tracto urinario, GRD y la médula espinal - (Wharton et al., 1986 Neurosci (3):727) y también que los aferentes de fibras C son críticos para portar impulsos implicados en la micción a la médula espinal (Yoshida et al., 2011 J Pharmacol Sci (112):128). Además, se ha indicado que la administración intravesical de Botox suprime CGRP y reduce significativamente el intervalo entre contracciones en el modelo de dolor de vejiga inducido por ácido acético (Chuang et al., 2004 J Urol (172): 1529; Chuang et al., 2009 J Urol (182):786).
Una prueba de que CGRP puede desempeñar un papel causal en esta afección es una solicitud de patente publicada reciente que contiene datos que supuestamente sugieren que un Ab anti CGRP desvelado en la misma redujo el número de contracciones de la vejiga en un modelo de vejiga hiperactiva inducida por aguarrás (Pfizer, documento WO 2011/024113).
Debido a la implicación percibida de CGRP en estos y otros trastornos, sigue existiendo la necesidad en la técnica de composiciones y métodos útiles para prevenir o tratar enfermedades y trastornos asociados con CGRP, evitando al mismo tiempo efectos secundarios adversos. Sigue existiendo la necesidad en la técnica de composiciones o métodos que reduzcan o inhiban enfermedades o trastornos asociados con CGRP, tales como migrañas, cefaleas, vejiga hiperactiva y dolor.
Breve sumario de la invención
La invención proporciona:
1. Un método para producir un anticuerpo anti CGRP, método que comprende expresar los polinucleótidos de la SEQ ID NO:192 y SEQ ID NO:194 en células de levadura o en células de mamífero.
2. El método de [1], en el que las células de levadura son células de Pichia, y las células de mamífero son células CHO, NSO o HEK293.
3. El método de uno cualquiera de [1] o [2], en el que las células de levadura son células de Pichia pastoris. 4. El método de uno cualquiera de [1] o [2], en el que las células de mamífero son células CHO.
5. El método de uno cualquiera de [1] a [4], en el que los polinucleótidos se incorporan a un vector de expresión.
6. El método de uno cualquiera de [1] a [5], en el que el vector es un plásmido o un vector viral recombinante. 7. El método de uno cualquiera de [1] a [6], que además comprende purificar el anticuerpo.
8. El método de [7], en el que purificar el anticuerpo comprende filtración en flujo cruzado, precipitación con sulfato de amonio o cromatografía en columna de afinidad.
9. El método de uno cualquiera de [1] a [8], método que además comprende formular dicho anticuerpo en una composición farmacéutica.
10. El método de [9], en el que la composición farmacéutica comprende un vehículo farmacéuticamente aceptable, y opcionalmente al menos un estabilizador.
11. Un anticuerpo anti CGRP que se puede obtener mediante el método de uno cualquiera de [1]-[8], o una composición farmacéutica que se puede obtener mediante el método de [9] o [10].
12. El anticuerpo anti CGRP o la composición farmacéutica de [11], para uso en el alivio o reducción de los síntomas de, o en el tratamiento o prevención de la migraña o cefalea.
13. El anticuerpo anti CGRP o la composición farmacéutica de [11], para uso en el tratamiento agudo o profiláctico de la cefalea, incluyendo migraña y cefalea en racimo.
14. El anticuerpo anti CGRP o la composición farmacéutica de [11], para uso en el tratamiento agudo o profiláctico de la migraña.
La presente divulgación está dirigida a anticuerpos específicos y fragmentos de los mismos que tienen especificidad de unión con CGRP, en particular anticuerpos que tienen la especifidad epitópica deseada, afinidad o avidez elevada y/o propiedades funcionales. Otra realización de esta divulgación se refiere a los anticuerpos aquí descritos, que comprenden las secuencias de los polipéptidos Vh, Vl y CDR aquí descritos y los polinucleótidos que los codifican. Una realización preferida de la divulgación se dirige a anticuerpos quiméricos o humanizados y fragmentos de los mismos (incluyendo fragmentos Fab) que son capaces de unirse a CGRP y/o inhibir las actividades biológicas mediadas por la unión de CGRP al receptor de CGRP ("CGRP-R").
En otra realización preferida de la divulgación, se contempla que los anticuerpos de longitud completa y los fragmentos Fab de los mismos inhiben la producción de cAMP conducida por CGRP-alfa-, CGRP-beta- y CGRP de rata. En una realización preferida adicional de la divulgación, se contempla que los de longitud completa y los fragmentos Fab de los mismos reducen la vasodilatación del destinatario después de la administración.
En otra realización de la divulgación, anticuerpos quiméricos o humanizados y fragmentos de los mismos (incluyendo fragmentos Fab) capaces de unirse a CGRP son útiles en métodos dirigidos a reducir, tratar o prevenir migrañas (con o sin aura) cáncer o tumores, angiogénesis asociada con cáncer o crecimiento tumoral, angiogénesis asociada con cáncer o supervivencia tumoral, pérdida de peso, dolor, migrañas hemiplégicas, cefaleas en racimo, neuralgia migrañosa, cefaleas crónicas, cefaleas de tensión, cefaleas generales, sofocos, hemicránea paroxística crónica, cefaleas secundarias debidas a un problema estructural subyacente en la cabeza o el cuello, neuralgia craneal, cefaleas sinusales (tales como por ejemplo asociadas con sinusitis) y cefaleas o migrañas inducidas por alergia. Los anticuerpos y fragmentos de anticuerpo de la presente invención en particular tienen utilidad en el tratamiento, prevención, alivio, control o reducción del riesgo de una o más de las siguientes afecciones o enfermedades: vejiga hiperactiva y otras afecciones urinarias, incluyendo infección de vejiga, dolor, dolor crónico, inflamación neurogénica y dolor inflamatorio, dolor neuropático; dolor ocular, dolor dental; dolor postquirúrgico, dolor relacionado con traumas, dolor relacionado con quemaduras, diabetes; diabetes mellitus no dependiente de insulina y otros trastornos autoinmunes inflamatorios, trastornos vasculares, inflamación; artritis, hiperreactividad bronquial, asma, conmoción, sepsis, síndrome de la retirada de opiáceos, tolerancia a la morfina, sofocos en hombres y mujeres, dermatitis alérgica, psoriasis, encefalitis; trauma craneal; epilepsia; enfermedades neurodegenerativas; enfermedades cutáneas incluyendo prurito, rojez cutánea neurogénica, rosácea en la piel y eritema; enfermedad inflamatoria del intestino, síndrome del intestino irritable, cistitis, dismenorrea y otras afecciones que potencialmente se puedan tratar o prevenir o aliviar sus síntomas mediante el antagonismo de los receptores CGRP. De particular importancia es el tratamiento agudo o profiláctico del dolor de cabeza, incluyendo migraña y cefalea en racimo y otras afecciones relacionadas con el dolor así como vejiga hiperactiva.
En otra realización de la divulgación, los anticuerpos quiméricos o humanizados y fragmentos de los mismos (incluyendo fragmentos Fab) capaces de unirse a CGRP preferiblemente son útiles en métodos dirigidos a reducir, tratar o prevenir el reflujo gastro-esofágico y el dolor visceral asociado al reflujo gastroesofágico, dispepsia, síndrome del intestino irritable, enfermedad inflamatoria del intestino, enfermedad de Crohn, ileítis, colitis ulcerosa, cólico renal, dismenorrea, cistitis, periodo menstrual, parto, menopausia, prostatitis o pancreatitis.
En otra realización de la divulgación estos anticuerpos y versiones humanizadas pueden derivarse de células inmunes de conejo (linfocitos B) y se pueden seleccionar basándose en su homología (identidad de secuencia) con las secuencias de la línea germinal humana. Es posible que estos anticuerpos requieran ninguna o unas modificaciones mínimas, facilitando así la retención de las propiedades funcionales después de la humanización. Una realización adicional de la divulgación se dirige a fragmentos de anticuerpos anti CGRP que incluyen polipétidos Vh, Vl y CDR, p. ej., derivados de células inmunes de conejo y los polinucleótidos que los codifican, así como al uso de estos fragmentos de anticuerpo y los polinucleótidos que los codifican en la creación de nuevas composiciones de anticuerpos y polipéptidos capaces de unirse a complejos CGRP y/o CGRP/CGRP-R.
La divulgación también contempla conjugados de anticuerpos anti CGRP y fragmentos de unión de los mismos conjugados con uno o más restos funcionales o detectables. La divulgación también contempla métodos para preparar dichos anticuerpos anti CGRP quiméricos o humanizados o complejos anti CGRP/CGRP-R y fragmentos de unión de los mismos. En una realización, los fragmentos de unión incluyen, pero no se limitan a fragmentos Fab, Fab', F(ab')2, Fv, scFv, SMIPs (del inglés “small molecule immunopharmaceuticals” o productos inmunofarmacéuticos de molécula pequeña), anticuerpos de camellos, nanocuerpos e IgNAR.
Realizaciones de la divulgación conciernen al uso de anticuerpos anti CGRP y fragmentos de unión de los mismos para el diagnóstico, valoración y tratamiento de enfermedades y trastornos asociados con CGRP o la expresión aberrante del mismo. La divulgación también contempla el uso de fragmentos de anticuerpos anti CGRP para el diagnóstico, valoración y tratamiento de enfermedades y trastornos asociados con CGRP o la expresión aberrante del mismo. Otras realizaciones de la divulgación se refieren a la producción de anticuerpos anti CGRP o fragmentos de los mismos en células huésped recombinantes, por ejemplo células de mamífero tales como células CHO, NSO o HEK 293, o células de levadura (por ejemplo levadura diploide tal como Pichia diploide) y otras cepas de levadura.
Breve descripción de las diversas vistas de los dibujos
La Figura 1 proporciona secuencias polinucleotídicas y polipeptídicas correspondientes al anticuerpo de longitud completa Ab1.
La Figura 2 proporciona secuencias polinucleotídicas y polipeptídicas correspondientes al anticuerpo de longitud completa Ab2.
La Figura 3 proporciona secuencias polinucleotídicas y polipeptídicas correspondientes al anticuerpo de longitud completa Ab3.
La Figura 4 proporciona secuencias polinucleotídicas y polipeptídicas correspondientes al anticuerpo de longitud completa Ab4.
La Figura 5 proporciona secuencias polinucleotídicas y polipeptídicas correspondientes al anticuerpo de longitud completa Ab5.
La Figura 6 proporciona secuencias polinucleotídicas y polipeptídicas correspondientes al anticuerpo de longitud completa Ab6.
La Figura 7 proporciona secuencias polinucleotídicas y polipeptídicas correspondientes al anticuerpo de longitud completa Ab7.
La Figura 8 proporciona secuencias polinucleotídicas y polipeptídicas correspondientes al anticuerpo de longitud completa Ab8.
La Figura 9 proporciona secuencias polinucleotídicas y polipeptídicas correspondientes al anticuerpo de longitud completa Ab9.
La Figura 10 proporciona secuencias polinucleotídicas y polipeptídicas correspondientes al anticuerpo de longitud completa Ab10.
La Figura 11 proporciona secuencias polinucleotídicas y polipeptídicas correspondientes al anticuerpo de longitud completa Ab11.
La Figura 12 proporciona secuencias polinucleotídicas y polipeptídicas correspondientes al anticuerpo de longitud completa Ab12.
La Figura 13 proporciona secuencias polinucleotídicas y polipeptídicas correspondientes al anticuerpo de longitud completa Ab13.
La Figura 14 proporciona secuencias polinucleotídicas y polipeptídicas correspondientes al anticuerpo de longitud completa Ab14.
La Figura 15 proporciona los datos de unión de ELISA de CGRP-alfa obtenidos siguiendo el protocolo del Ejemplo 1 posterior para los anticuerpos Ab1, Ab2, Ab3 y Ab4.
La Figura 16 proporciona los datos de unión de ELISA de CGRP-alfa obtenidos siguiendo el protocolo del Ejemplo 1 posterior para los anticuerpos Ab5, Ab6, Ab7 y Ab8.
La Figura 17 proporciona los datos de unión de ELISA de CGRP-alfa obtenidos siguiendo el protocolo del Ejemplo 1 posterior para los anticuerpos Ab9, Ab10 y Ab14.
La Figura 18 proporciona los datos de unión de ELISA de CGRP-alfa obtenidos siguiendo el protocolo del Ejemplo 1 posterior para los anticuerpos Ab11, Ab12 y Ab13.
La Figura 19 demuestra la inhibición de la producción de AMPc conducida por CGRP-alfa por los anticuerpos Ab1, Ab2 y Ab4, obtenidos siguiendo el protocolo del Ejemplo 1 posterior.
La Figura 20 demuestra la inhibición de la producción de AMPc conducida por CGRP-alfa por el anticuerpo Ab3, obtenido siguiendo el protocolo del Ejemplo 1 posterior.
La Figura 21 demuestra la inhibición de la producción de AMPc conducida por CGRP-alfa por los anticuerpos Ab5 y Ab6, obtenidos siguiendo el protocolo del Ejemplo 1 posterior.
La Figura 22 demuestra la inhibición de la producción de AMPc conducida por CGRP-alfa por los anticuerpos Ab7, Ab8, Ab9 y Ab10, obtenidos siguiendo el protocolo del Ejemplo 1 posterior.
La Figura 23 demuestra la inhibición de la producción de AMPc conducida por CGRP-alfa por los anticuerpos Ab11, Ab12 y Ab13, obtenidos siguiendo el protocolo del Ejemplo 1 posterior.
La Figura 24 demuestra la inhibición de la producción de AMPc conducida por CGRP-alfa por el anticuerpo Ab14, obtenido siguiendo el protocolo del Ejemplo 1 posterior.
La Figura 25 demuestra la inhibición de la producción de AMPc conducida por CGRP-beta por los anticuerpos Ab1, Ab2 y Ab3, obtenidos siguiendo el protocolo del Ejemplo 1 posterior.
La Figura 26 demuestra la inhibición de la producción de AMPc conducida por CGRP-beta por los anticuerpos Ab4, Ab5 y Ab6, obtenidos siguiendo el protocolo del Ejemplo 1 posterior.
La Figura 27 demuestra la inhibición de la producción de AMPc conducida por CGRP-beta por los anticuerpos Ab7 y Ab8 obtenidos siguiendo el protocolo del Ejemplo 1 posterior.
La Figura 28 demuestra la inhibición de la producción de AMPc conducida por CGRP-beta por los anticuerpos Ab9, Ab10 y Ab14, obtenidos siguiendo el protocolo del Ejemplo 1 posterior.
La Figura 29 demuestra la inhibición de la producción de AMPc conducida por CGRP-beta por los anticuerpos Ab11, Ab12 y Ab13, obtenidos siguiendo el protocolo del Ejemplo 1 posterior.
La Figura 30 demuestra la inhibición de la producción de AMPc conducida por CGRP de rata por los anticuerpos Ab1, Ab2, Ab4 y Ab5, obtenidos siguiendo el protocolo del Ejemplo 1 posterior.
La Figura 31 demuestra la inhibición de la producción de AMPc conducida por CGRP de rata por los anticuerpos Ab3 y Ab6 obtenidos siguiendo el protocolo del Ejemplo 1 posterior.
La Figura 32 demuestra la inhibición de la producción de AMPc conducida por CGRP de rata por los anticuerpos Ab7 y Ab8 obtenidos siguiendo el protocolo del Ejemplo 1 posterior.
La Figura 33 demuestra la inhibición de la producción de AMPc conducida por CGRP de rata por el anticuerpo Ab9, obtenido siguiendo el protocolo del Ejemplo 1 posterior.
La Figura 34 demuestra la inhibición de la producción de AMPc conducida por CGRP de rata por el anticuerpo Ab10, obtenido siguiendo el protocolo del Ejemplo 1 posterior.
La Figura 35 demuestra la inhibición de la producción de AMPc conducida por CGRP de rata por los anticuerpos Ab11 y Ab12 obtenidos siguiendo el protocolo del Ejemplo 1 posterior.
La Figura 36 demuestra la inhibición de la producción de AMPc conducida por CGRP de rata por el anticuerpo Ab13, obtenido siguiendo el protocolo del Ejemplo 1 posterior.
La Figura 37 demuestra la inhibición de la producción de AMPc conducida por CGRP de rata por el anticuerpo Ab14, obtenido siguiendo el protocolo del Ejemplo 1 posterior.
La Figura 38 demuestra la inhibición de la unión de CGRP radiomarcada con CGRP-R por los anticuerpos Ab1-Ab13, obtenido siguiendo el protocolo del Ejemplo 6 posterior.
La Figura 39 demuestra una reducción de la vasodilatación obtenida administrando los anticuerpos Ab3 y Ab6 después de la administración de capsaicina en un modelo de rata, en relación con un anticuerpo de control, obtenido siguiendo el protocolo del Ejemplo 7 posterior.
La Figura 40 demuestra una reducción de la vasodilatación obtenida administrando el anticuerpo Ab6 a diferentes concentraciones después de la administración de capsaicina en un modelo de rata, en relación con un anticuerpo de control, obtenido siguiendo el protocolo del Ejemplo 7 posterior.
La FIG. 41A-C muestra el efecto beneficioso de Ab3 en la capacidad de la vejiga durante infusión de solución salina. Se administró a los animales Ab3 o un anticuerpo de control negativo y después se supervisaron durante la infusión de solución salina a la vejiga. IEC (panel A) aumentó y FM (panel B) se redujo, lo que indica aumento de la capacidad de la vejiga. Las diferencias en AM (panel C) estuvieron dentro de la desviación típica y no fueron estadísticamente significativas. Los asteriscos indican mejora estadísticamente significativa (p < 0,05 ensayo de t de Student para muestras no relacionadas, comparación con Ab de control negativo). Leyenda: barras rellenas: tratado con Ab3 (10 mg/kg); barras vacías: anticuerpo de control negativo (10 mg/kg). Las barras de error indican la desviación típica. Abreviaturas: IEC: intervalo entre contracciones; FM: Frecuencia de micción; AM: Amplitud de micción.
La FIG. 42 muestra el efecto de Ab2 en un modelo de dolor neuropático. Se indujo alodinia mecánica mediante cirugía de Chung (ligamiento del nervio espinal L5/L6), y se comparó el grado de sensibilidad entre animales tratados con Ab2 (barras sombreadas) y animales de control (barras rellenas). Los valores mayores indican menos sensibilidad. La sensibilidad promedio fue similar el día 13 (antes de la administración de Ab2) pero mejoró los días 14 y 17. Las barras de error indican el error típico de la media.
La FIG. 43 muestra el efecto analgésico de Ab2 y morfina. La sensibilidad al dolor se evaluó por el tiempo de retirada de la cola (eje y, segundos) para animales a los que se administró morfina (cuadrados vacíos), Ab2 (10 mg/kg, triángulos rellenos) o vehículo (control negativo, círculos vacíos). Los animales desarrollaron tolerancia a la morfina y mostraron tiempos de retirada de la cola similares a animales de control el día 4. Por el contrario, los animales tratados con Ab2 mostraron una mejora sostenida de tiempo de retirada de la cola a lo largo del transcurso del experimento (hasta el día 7). La mejora de los animales tratados con Ab2 fue estadísticamente significativa (p < 0,05 ANOVA de una vía seguido de ensayo de Dunnett, comparación con vehículo, indicado por asteriscos). Las barras de error indican el error típico de la media.
La FIG. 44 muestra el efecto analgésico dependiente de la dosificación de Ab2. El día 0 (después del primer ensayo de tiempo de retirada de la cola), se administró a las ratas anticuerpo Ab2 a una dosificación de 1 mg/kg (cuadrados rellenos), 3 mg/kg (triángulos invertidos rellenos) o 10 mg/kg (triángulos hacia arriba rellenos) o un vehículo (círculos vacíos) o anticuerpo de control negativo (cuadrados vacíos). El tiempo de retirada de la cola de ratas en respuesta a un estímulo térmico doloroso se evaluó diariamente (tiempos mayores indican insensibilidad relativa al dolor). El tiempo de retirada de la cola aumentó de una manera dependiente de la dosificación por la administración de Ab2. Los asteriscos indican aumentos estadísticamente significativos del tiempo de retirada de la cola (p < 0,05 ANOVA de una vía seguido de ensayo de Dunnett, en comparación con vehículo). Las barras de error indican el error típico de la media.
La FIG. 45 muestra el efecto analgésico de Ab2 en combinación con morfina, y cuando se retira la morfina después de la aparición de tolerancia a la morfina. El día 0 (después del primer ensayo de tiempo de retirada de la cola), se administró a las ratas anticuerpo Ab2 a una dosificación de 10 mg/kg (cuadrados rellenos y triángulos rellenos) o vehículo (círculos vacíos). Se administró después a las ratas diariamente morfina administrada los días 1 a 10 (cuadrados rellenos) o solamente los días 1 a 4 (triángulos rellenos). El tiempo de retirada de la cola aumentó inicialmente mucho en los ratones tratados con morfina, pero se redujo los días posteriores lo que indica tolerancia a la morfina. Sin embargo, en los ratones de los que se retiró la morfina después del día 4 el tiempo de retirada de la cola aumentó y permaneció elevado entre los días 5 y 8. Las barras de error indican el error típico de la media.
La FIG. 46 muestra el efecto de Ab2 en un modelo de rata de dolor visceral. El dolor visceral se cuantificó midiendo el umbral de distensión colónica (valores mayores indican menos sensibilidad) para animales sin tratamiento previo (barra vacía) o animales tratados con TNBS para provocar hipersensibilidad colónica crónica que recibieron un anticuerpo de control negativo (barras rellenas) o Ab2 (barras sombreadas). La hipersensibilidad se alivió en 27 % por los animales tratados con Ab2 y el umbral de distensión mejoró significativamente por la administración de Ab2 (p < 0,05 ensayo de t de Student, comparación con TNBS grupo de control negativo). Las barras de error indican el error típico de la media.
Descripción detallada de las realizaciones preferidas
Definiciones
Debe entenderse que esta invención no está limitada a la metodología particular, protocolos, líneas celulares, especies o géneros animales y reactivos descritos, ya que tales pueden variar. También debe entenderse que la terminología usada en el presente documento tiene el fin de describir realizaciones particulares únicamente, y no se pretende que limite el alcance de la presente invención que estará limitada únicamente por las reivindicaciones adjuntas. Como se utiliza en el presente documento, las formas singulares "un", "una" y "el/la" incluyen las referencias en plural a menos que el contexto dicte claramente lo contrario. Por tanto, por ejemplo, la referencia a "una célula" incluye una pluralidad de dichas células y la referencia a "la proteína" incluye la referencia a una o más proteínas y equivalentes de las mismas conocidas por los expertos en la materia, y así sucesivamente. Todos los términos técnicos y científicos utilizados en el presente documento tienen el mismo significado que entiende habitualmente un experto habitual en la materia a la que pertenece la presente invención, a menos que se indique claramente otra cosa.
Péptido relacionado con el gen de la calcitonina (CGRP): Como se usa en el presente documento, CGRP abarca no solamente las siguientes secuencias de aminoácidos de CGRP-alfa de Homo sapiens y CGRP-beta de Homo sapiens disponibles de American Peptides (Sunnyvale CA) y Bachem (Torrance, CA):
CGRP-alfa: ACDTATCVTHRLAGLLSRSGGVVKNNFVPTNVGSKAF-NH2 (SEQ ID NO: 281), en donde la fenilalanina N-terminal está amidada;
CGRP-beta: ACNTATCVTHRLAGLLSRSGGMVKSNFVPTNVGSKAF-NH2 (SEQ ID NO: 282), en donde la fenilalanina N-terminal está amidada; pero también cualquier forma unida a membrana de estas secuencias de aminoácidos de CGRP, así como mutantes (mutiens), variantes de corte y empalme, isoformas, ortólogos, homólogos y variantes de esta secuencia.
Especies de levadura competentes para apareamiento: En la presente invención se pretende que esto abarque en general cualquier levadura diploide o tetraploide que pueda hacerse crecer en cultivo. Dichas especies de levadura pueden existir en una forma haploide, diploide u otra poliploide. Las células de una ploidía dada pueden proliferar, en condiciones apropiadas, durante un número indefinido de generaciones en esa forma. Las células diploides también pueden esporular para formar células haploides. El apareamiento secuencial puede dar como resultado cepas tetraploides mediante apareamiento adicional o fusión de cepas diploides. La presente invención contempla el uso de levadura haploide, así como células de levadura diploides u otras poliploides producidas, por ejemplo, por apareamiento o fusión de esferoplastos.
En una realización de la invención, la levadura competente para apareamiento es un miembro de la familia Saccharomycetaceae, que incluye los géneros Arxiozyma; Ascobotryozyma; Citeromyces; Debaryomyces; Dekkera; Eremothecium; Issatchenkia; Kazachstania; Kluyveromyces; Kodamaea; Lodderomyces; Pachysolen; Pichia; Saccharomyces; Saturnispora; Tetrapisispora; Torulaspora; Williopsis; y Zygosaccharomyces. Otros tipos de levadura potencialmente útiles en la invención incluyen Yarrowia; Rhodosporidium; Candida; Hansenula; Filobasium; Sporidiobolus; Bullera; Leucosporidium y Filobasidella.
En una realización preferida de la invención, la levadura competente para apareamiento es un miembro del género Pichia. En una realización preferida adicional de la invención, la levadura competente para apareamiento del género Pichia es una de las siguientes especies: Pichia pastoris, Pichia methanolica, y Hansenula polymorpha (Pichia angusta). En una realización particularmente preferida de la invención, la levadura competente para apareamiento del género Pichia es la especie Pichia pastoris.
Célula de levadura haploide: Una célula que tiene una única copia de cada gen de su complemento genómico (cromosómico) normal.
Célula de levadura poliploide: Una célula que tiene más de una copia de su complemento genómico (cromosómico) normal.
Célula de levadura diploide: Una célula que tiene dos copias (alelos) de esencialmente todos los genes de su complemento genómico normal, habitualmente formada por el proceso de fusión (apareamiento) de dos células haploides.
Célula de levadura tetraploide: Una célula que tiene cuatro copias (alelos) de esencialmente todos los genes de su complemento genómico normal, habitualmente formada por el proceso de fusión (apareamiento) de dos células haploides. Los tetraploides pueden portar dos, tres, cuatro o más casetes de expresión diferentes. Dichos tetraploides podrían obtenerse en S. cerevisiae mediante apareamiento selectivo de diploides heterotálicos homocigotos a/a y alfa/alfa y en Pichia mediante apareamiento secuencial de haploides para obtener diploides auxotróficos. Por ejemplo, un haploide [met his] puede aparearse con haploide [ade his] para obtener diploide [his]; y un haploide [met arg] puede aparearse con haploide [ade arg] para obtener diploide [arg]; después el diploide [his] x diploide [arg] para obtener un protótrofo tetraploide. Los expertos en la materia entenderán que la referencia a los beneficios y usos de células diploides también puede aplicarse a células tetraploides.
Apareamiento de levadura: El proceso por el que dos células de levadura haploides se fusionan de forma natural para formar una célula de levadura diploide.
Meiosis: El proceso por el que una célula de levadura diploide experimenta división reductiva para formar cuatro productos de esporas haploides. Cada espora puede después germinar y formar una línea celular haploide que crece de forma vegetativa.
Marcador de selección: Un marcador de selección es un gen o fragmento génico que confiere un fenotipo de crecimiento (característica de crecimiento físico) en una célula que recibe ese gen como, por ejemplo, mediante un acontecimiento de transformación. El marcador de selección permite que esa célula sobreviva y crezca en un medio de cultivo selectivo en condiciones en las que las células que no reciben ese gen marcador de selección no pueden crecer. Los genes marcadores de selección se clasifican en general en varios tipos, incluyendo genes marcadores de selección tales como un gen que confiere en una célula resistencia a un antibiótico u otro fármaco, temperatura cuando se cruzan dos mutantes sensible a la temperatura (''st'') o se transforma un mutante st; genes marcadores de selección negativos tales como un gen biosintético que confiere en una célula la capacidad para crecer en un medio sin un nutriente específico necesario para todas las células que no tienen ese gen biosintético, o un gen biosintético mutado que confiere en una célula la incapacidad de crecer por células que no tienen el gen de tipo silvestre; y similares. Los marcadores adecuados incluyen, pero sin limitación: ZEO; G418; LYS3; MET1; MET3a; ADE1; ADE3; URA3; y similares.
Vector de expresión: Estos vectores de ADN contienen elementos que facilitan la manipulación para la expresión de una proteína ajena en la célula hospedadora diana. De manera conveniente, la manipulación de secuencias y producción de ADN para transformación se realiza en primer lugar en un hospedador bacteriano, por ejemplo E. coli, y habitualmente los vectores incluirán secuencias para facilitar dichas manipulaciones, incluyendo un origen de replicación bacteriano y un marcador de selección bacteriano adecuado. Los marcadores de selección codifican proteínas necesarias para la supervivencia o el crecimiento de células hospedadoras transformadas cultivadas en un medio de cultivo selectivo. Las células hospedadoras no transformadas con el vector que contiene el gen de selección no sobrevivirán en el medio de cultivo. Los genes de selección típicos codifican proteínas que (a) confieren resistencia a antibióticos u otras toxinas, (b) complementan deficiencias auxotróficas o (c) aportan nutrientes críticos no disponibles de medios complejos. Se describen en la técnica vectores y métodos ilustrativos para la transformación de levaduras, por ejemplo, en Burke, D., Dawson, D., y Stearns, T. (2000). Methods in yeast genetics: a Cold Spring Harbor Laboratory course manual. Plainview, N.Y.: Cold Spring Harbor Laboratory Press. Los vectores de expresión para su uso en los métodos de la invención incluirán secuencias específicas de levadura, incluyendo un marcador auxotrófico o farmacológico de selección para identificar cepas de levadura transformadas. Un marcador farmacológico puede usarse adicionalmente para amplificar el número de copias del vector en una célula hospedadora de levadura.
La secuencia codificante de polipéptido de interés está unida operativamente a secuencias reguladoras de la transcripción y la traducción que posibilitan la expresión del polipéptido en células de levadura. Estos componentes de vectores pueden incluir, pero sin limitación, uno o más de los siguientes: un elemento potenciador, un promotor y una secuencia de terminación de la transcripción. También pueden incluirse secuencias para la secreción del polipéptido, por ejemplo una secuencia señal, y similares. Un origen de replicación de levadura es opcional, ya que los vectores de expresión están con frecuencia integrados en el genoma de levadura. En una realización de la invención, el polipéptido de interés está unido operativamente, o fusionado, con secuencias que posibilitan la secreción optimizada del polipéptido a partir de células diploides de levadura.
Los ácidos nucleicos están "unidos operativamente" cuando se colocan en una relación funcional con otra secuencia de ácido nucleico. Por ejemplo, el ADN para una secuencia señal está unido operativamente al ADN para un polipéptido si se expresa como una preproteína que participa en la secreción del polipéptido; un promotor o potenciador está unido operativamente a una secuencia codificante si afecta a la transcripción de la secuencia. En general, “unido operativamente” significa que las secuencias de ADN que se unen son contiguas, y, en el caso de un líder secretor, contiguas y en el marco de lectura. Sin embargo, no es necesario que los potenciadores sean contiguos. Se consigue unión mediante ligamiento en sitios de restricción convenientes o como alternativa mediante un método de PCR/recombinación con el que están familiarizados los expertos en la materia (GatewayR Technology; Invitrogen, Carlsbad California). Si tales sitios no existen, los adaptadores o conectores de oligonucleótidos sintéticos se utilizan de acuerdo con la práctica convencional.
Los promotores son secuencias no traducidas localizadas cadena arriba (5’) del codón de inicio de un gen estructural (en general a una distancia de 100 a 1000 pb) que controlan la transcripción y traducción de secuencias de ácido nucleico particulares con las que están unidas de forma operativa. Dichos promotores se clasifican en varias clases: promotores inducibles, constitutivos y reprimibles (que aumentan los niveles de transcripción en respuesta a la ausencia de un represor). Los promotores inducibles pueden iniciar niveles aumentados de transcripción de ADN bajo su control en respuesta a algún cambio en las condiciones de cultivo, por ejemplo, la presencia o ausencia de un nutriente o un cambio de temperatura.
El fragmento de promotor de levadura también puede actuar como el sitio para recombinación homóloga e integración del vector de expresión en el mismo sitio en el genoma de levadura; como alternativa se usa un marcador de selección como el sitio para recombinación homóloga. Se describe la transformación de Pichia en Cregg et al. (1985) Mol. Cell. Biol. 5:3376-3385.
Los ejemplos de promotores adecuados de Pichia incluyen el promotor de AOX1 (Cregg et al. (1989) Mol. Cell. Biol.
9:1316-1323); promotor de ICL1 (Menendez et al. (2003) Yeast 20(13):1097-108); promotor de gliceraldehído-3-fosfato deshidrogenasa (GAP) (Waterham et al. (1997) Gene 186(1):37-44); y promotor de FLD1 (Shen et al. (1998) Gene 216(1):93-102). El promotor de GAP es un promotor constitutivo fuerte y los promotores de AOX y FLD1 son inducibles.
Otros promotores de levadura adicionales incluyen ADH1, alcohol deshidrogenasa II, GAL4, PHO3, PHO5, Pyk y promotores quiméricos procedentes de los mismos. Adicionalmente, pueden usarse en la invención promotores que no son de levadura tales como promotores de mamíferos, insectos, plantas, reptiles, anfibios, virus y aves. Más habitualmente el promotor comprenderá un promotor de mamífero (potencialmente endógeno para los genes expresados) o comprenderá un promotor de levadura o vírico que posibilita la transcripción eficaz en sistemas de levadura.
Los polipéptidos de interés pueden producirse de forma recombinante no solo directamente, sino también como un polipéptido de fusión con un polipéptido heterólogo, por ejemplo, una secuencia señal u otro polipéptido que tiene un sitio de escisión específico en el extremo N de la proteína o el polipéptido maduro. En general, la secuencia señal puede ser un componente del vector, o puede ser una parte de la secuencia codificante de polipéptido que se inserta en el vector. La secuencia señal heteróloga seleccionada preferentemente es una que se reconoce y procesa mediante una de las rutas convencionales disponibles en la célula hospedadora. Se ha demostrado que la señal pre­ pro del factor alfa de S. cerevisiae es eficaz en la secreción de una diversidad de proteínas recombinantes de P. pastoris. Otras secuencias señal de levadura incluyen la secuencia señal de factor de apareamiento alfa, la secuencia señal de invertasa, y secuencias señal procedentes de otros polipéptidos de levadura secretados. Adicionalmente, estas secuencias peptídicas señal pueden modificarse técnicamente para proporcionar secreción potenciada en sistemas de expresión de levadura diploides. Otras señales de secreción de interés también incluyen secuencias señal de mamífero, que pueden ser heterólogas para la proteína que se secreta, o pueden ser una secuencia nativa para la proteína que se secreta. Las secuencias señal incluyen secuencias prepeptídicas y, en algunos casos, pueden incluir secuencias propeptídicas. Se conocen en la técnica muchas secuencias señal, incluyendo las secuencias señal halladas en cadenas de inmunoglobulina, por ejemplo, secuencia de preprotoxina de K28, PHA-E, FACE, MCP-1 humana, secuencias señal de albúmina de suero humana, cadena pesada de Ig humana, cadena ligera de Ig humana, y similares. Por ejemplo, véase Hashimoto et al. Protein Eng 11 (2) 75 (1998); y Kobayashi et al. Therapeutic Apheresis 2(4) 257 (1998).
La transcripción puede aumentarse insertando una secuencia activadora de la transcripción en un vector. Estos activadores son elementos de acción en cis de ADN habitualmente de 10 a 300 pb, que actúan en un promotor para aumentar su transcripción. Los potenciadores de la transcripción son relativamente independientes de la orientación y la posición, habiéndose encontrado 5’ y 3’ de la unidad de transcripción, en un intrón, así como en la secuencia codificante en sí misma. El potenciador puede cortarse y empalmarse en el vector de expresión en una posición 5’ o 3’ de la secuencia codificante, pero se localiza preferentemente en un sitio 5’ del promotor.
Los vectores de expresión usados en células hospedadoras eucariotas también pueden contener secuencias necesarias para la terminación de la transcripción y para estabilizar el ARNm. Dichas secuencias están disponibles habitualmente de 3’ al codón de terminación de la traducción, en regiones no traducidas de ADN o ADNc eucariotas o víricos. Estas regiones contienen segmentos de nucleótidos transcritos como fragmentos poliadenilados en la parte no traducida del ARNm.
La construcción de vectores adecuados que contienen uno o más de los componentes enumerados anteriormente emplea técnicas de ligamiento convencionales o métodos de PCR/recombinación. Se escinden plásmidos aislados o fragmentos de ADN, y se vuelven a ligar en la forma deseada para generar los plásmidos necesarios o mediante métodos de recombinación. Para análisis para confirmar secuencias correctas en plásmidos construidos, las mezclas de ligamiento se usan para transformar células hospedadoras, y transformantes exitosos seleccionados mediante resistencia a antibióticos (por ejemplo ampicilina o zeocina) cuando sea apropiado. Se preparan plásmidos de los transformantes, se analizan mediante digestión con endonucleasas de restricción y/o se secuencian.
Como alternativa a la restricción y el ligamiento de fragmentos, pueden usarse métodos de recombinación basándose en sitios att y enzimas de recombinación para insertar secuencias de ADN en un vector. Dichos métodos se describen, por ejemplo, en Landy (1989) Ann.Rev.Biochem. 58:913-949; y son conocidos por los expertos en la materia. Dichos métodos utilizan recombinación de ADN intermolecular que está mediada por una mezcla de proteínas de recombinación codificadas por lambda y E. coli. Se produce recombinación entre sitios de unión específica (att) en las moléculas de ADN de interacción. Para una descripción de sitios att véase Weisberg y Landy (1983) Site-Specific Recombination in Phage Lambda, en Lambda II, Weisberg, ed. (Cold Spring Harbor, NY:Cold Spring Harbor Press), págs. 211-250. Los segmentos de ADN que flanquean los sitios de recombinación se cambian, de modo que después de la recombinación, los sitios att son secuencias híbridas comprendidas por secuencias donadas por cada vector parental. La recombinación se puede producir entre ADN de cualquier topología.
Pueden introducirse sitios att en una secuencia de interés ligando la secuencia de interés en un vector apropiado; generando un producto de PCR que contiene sitios att B mediante el uso de cebadores específicos; generando una biblioteca de ADNc clonada en un vector apropiado que contiene sitios att; y similares.
Plegamiento, como se usa en el presente documento, se refiere a la estructura tridimensional de polipéptidos y proteínas, donde las interacciones entre restos de aminoácidos actúan para estabilizar la estructura. Aunque las interacciones no covalentes son importantes en la determinación de la estructura, habitualmente las proteínas de interés tendrán enlaces disulfuro covalentes intra y/o intermoleculares formados por dos restos de cisteína. Para proteínas y polipéptidos de origen natural o derivados y variantes de los mismos, el plegamiento apropiado es habitualmente la disposición que da como resultado actividad biológica óptima, y puede supervisarse convenientemente mediante ensayos para actividad, por ejemplo unión a ligando, actividad enzimática, etc.
En algunos casos, por ejemplo cuando el producto deseado es de origen sintético, los ensayos basados en la actividad biológica serán menos significativos. El plegamiento apropiado de dichas moléculas puede determinarse basándose en las propiedades físicas, consideraciones energéticas, estudios de modelación, y similares.
El hospedador de expresión puede modificarse adicionalmente por la introducción de secuencias que codifican una o más enzimas que potencian el plegamiento y la formación de enlaces disulfuro, es decir foldasas, chaperoninas, etc. Dichas secuencias pueden expresarse de forma constitutiva o inducible en la célula hospedadora de levadura, usando vectores, marcadores, etc. como se conoce en la técnica. Preferentemente, las secuencias, incluyendo elementos reguladores de la transcripción suficientes para el patrón deseado de expresión, se integran de forma estable en el genoma de levadura mediante una metodología dirigida.
Por ejemplo, la PDI eucariota no es solo un catalizador eficaz de la oxidación de proteína cisteína e isomerización de enlaces disulfuro, sino que también muestra actividad chaperona. La coexpresión de PDI puede facilitar la producción de proteínas activas que tienen múltiples enlaces disulfuro. También es de interés la expresión de BIP (proteína de unión a cadena pesada de inmunoglobulina); ciclofilina; y similares. En una realización de la invención, cada una de las cepas parentales haploides expresa una enzima de plegamiento distinta, por ejemplo una cepa puede expresar BIP y la otra cepa puede expresar PDI o combinaciones de los mismos.
Las expresiones "proteína deseada” o "anticuerpo deseado” se usan indistintamente y se refieren en general a un anticuerpo parental específico de una diana, es decir, CGRP o un anticuerpo quimérico o humanizado o una parte de unión del mismo procedente de él como se describe en el presente documento. Se pretende que el término "anticuerpo" incluya cualquier estructura molecular que contenga cadena polipeptídica con una forma específica que se ajuste a y reconozca un epítopo, donde una o más interacciones de unión no covalente estabilizan el complejo entre la estructura molecular y el epítopo. La molécula de anticuerpo arquetípica es la inmunoglobulina, y todos los tipos de inmunoglobulinas, IgG, IgM, IgA, IgE, IgD, etc., de todas las fuentes, por ejemplo ser humano, roedor, conejo, vaca, oveja, cerdo, perro, otros mamíferos, pollo, otras aves, etc., se consideran "anticuerpos". Una fuente preferida para producir anticuerpos útiles como material de partida es según la invención los conejos. Se han descrito numerosas secuencias codificantes de anticuerpos; y otras pueden plantearse mediante métodos bien conocidos en la técnica. Los ejemplos de los mismos incluyen anticuerpos quiméricos, anticuerpos humanos y otros anticuerpos de mamíferos no humanos, anticuerpos humanizados, anticuerpos monocatenarios (tales como scFv), anticuerpos de camellos, nanocuerpos, IgNAR (anticuerpos monocatenarios procedentes de tiburones), productos inmunofarmacéuticos pequeños modulares (SMIP), y fragmentos de anticuerpos tales como Fab, Fab’, F(ab’)2 y similares. Véase Streltsov VA, et al., Structure of a shark IgNAR antibody variable domain and modeling of an earlydevelopmental isotype, Protein Sci. Nov 2005;14(11):2901-9. Epub 30 sep 2005; Greenberg AS, et al., A new antigen receptor gene family that undergoes rearrangement and extensive somatic diversification in sharks, Nature. 9 mar 1995;374(6518):168-73; Nuttall SD, et al., Isolation of the new antigen receptor from wobbegong sharks, and use as a scaffold for the display of protein loop libraries, Mol Immunol. Ago 2001 ;38(4):313-26; Hamers-Casterman C, et al., Naturally occurring antibodies devoid of light chains, Nature. 3 Jun 1993;363(6428):446-8; Gill DS, et al., Biopharmaceutical drug discovery using novel protein scaffolds, Curr Opin Biotechnol. Dic 2006; 17(6):653-8. Epub 19 oct 2006.
Por ejemplo, los anticuerpos o fragmentos de unión a antígeno pueden producirse mediante ingeniería genética. En esta técnica, como con otros métodos, las células productoras de anticuerpos se sensibilizan para el antígeno o inmunógeno deseado. El ARN mensajero aislado de las células productoras de anticuerpos se utiliza como un molde para preparar el ADNc utilizando la amplificación por PCR. Se produce una biblioteca de vectores, que contienen cada uno un gen de cadena pesada y un gen de cadena ligera que conservan la especificidad inicial del antígeno, se produce mediante inserción de las secciones adecuadas del ADNc de inmunoglobulina amplificado en los vectores de expresión. Se construye una biblioteca combinatoria combinando la biblioteca de genes de cadena pesada con la biblioteca de genes de cadena ligera. Esto da como resultado una biblioteca de clones que expresa conjuntamente una cadena pesada y ligera (que se asemeja al fragmento Fab o al fragmento de unión a antígeno de una molécula de anticuerpo). Los vectores que transportan estos genes se transfectan conjuntamente en una célula hospedadora. Cuando se induce la síntesis del gen del anticuerpo en el hospedador transfectado, las proteínas de cadena pesada y ligera se autoensamblan para producir anticuerpos activos que se pueden detectar explorando con el antígeno o inmunógeno.
Las secuencias codificantes de anticuerpos de interés incluyen las codificadas por secuencias nativas, así como ácidos nucleicos que, como consecuencia de la degeneración del código genético, no tienen secuencia idéntica a los ácidos nucleicos desvelados, y variantes de los mismos. Los polipéptidos variantes pueden incluir sustituciones, adiciones o supresiones de aminoácidos (aa). Las sustituciones de aminoácidos pueden ser sustituciones de aminoácidos conservativas o sustituciones para eliminar aminoácidos no esenciales, tal como para alterar un sitio de glucosilación o para minimizar el plegamiento erróneo por sustitución o supresión de uno o más restos de cisteína que no son necesarios para la función. Pueden diseñarse variantes para conservar o tener actividad biológica potenciada de una región particular de la proteína (por ejemplo, un dominio funcional, restos de aminoácidos catalíticos, etc). Las variantes también incluyen fragmentos de los polipéptidos desvelados en el presente documento, particularmente fragmentos biológicamente activos y/o fragmentos correspondientes a dominios funcionales. Se conocen técnicas para mutagénesis in vitro de genes clonados. También se incluyen en la descripción objeto polipéptidos que se han modificado usando técnicas biológicas moleculares ordinarias para mejorar su resistencia a la degradación proteolítica o para optimizar las propiedades de solubilidad o para hacerlos más adecuados como un agente terapéutico.
Los anticuerpos quiméricos pueden prepararse mediante medios recombinantes combinando las regiones de cadena ligera y pesada variable (VL y VH), obtenidas de células productoras de anticuerpos de una especie con las regiones de cadena ligera y pesada constante de otra. Habitualmente los anticuerpos quiméricos utilizan regiones variables de roedor o conejo y regiones constantes humanas, para producir un anticuerpo con dominios predominantemente humanos. La producción de dichos anticuerpos quiméricos es bien conocida en la técnica, y puede conseguirse mediante medios convencionales (como se describe, por ejemplo, en la patente de los Estados Unidos n° 5.624.659). Se contempla además que las regiones constantes humanas de anticuerpos quiméricos de la invención pueden seleccionarse de regiones constantes IgG1, IgG2, IgG3 e IgG4.
Los anticuerpos humanizados se diseñan mediante ingeniería genética para contener aun más dominios de inmunoglobulina de tipo humano, e incorporan solo las regiones determinantes de complementariedad del anticuerpo procedente de animal. Esto se lleva a cabo examinando cuidadosamente la secuencia de los bucles hipervariables de las regiones variables del anticuerpo monoclonal, y ajustándolas a la estructura de las cadenas de anticuerpos humanos. Aunque es aparentemente complejo, el proceso es sencillo en la práctica. Véase, por ejemplo, patente de los Estados Unidos n° 6.187.287.
Además de las inmunoglobulinas completas (o sus equivalentes recombinantes), se pueden sintetizar fragmentos de inmunoglobulina que comprenden el sitio de unión a epítopo (por ejemplo, Fab’, F(ab’)2, u otros fragmentos). Se pueden diseñar "fragmentos" o inmunoglobulinas mínimas utilizando técnicas de inmunoglobulinas recombinantes. Por ejemplo, pueden producirse inmunoglobulinas "Fv" para su uso en la presente divulgación sintetizando una región variable de cadena ligera y una región variable de cadena pesada fusionadas. Son también de interés las combinaciones de anticuerpos, por ejemplo, diacuerpos, que comprenden dos especificidades de Fv distintas. En otra realización de la divulgación, SMIP (productos inmunofarmacéuticos de moléculas pequeñas), anticuerpos de camellos, nanocuerpos e IgNAR están abarcados por fragmentos de inmunoglobulina.
Las inmunoglobulinas y fragmentos de las mismas pueden modificarse postraduccionalmente, por ejemplo para añadir restos efectores tales como conectores químicos, restos detectables, tales como colorantes fluorescentes, enzimas, toxinas, sustratos, materiales bioluminiscentes, materiales radioactivos, restos quimioluminiscentes y similares, o restos de unión específicos, tales como estreptavidina, avidina o biotina, y similares pueden utilizarse en los métodos y composiciones de la presente invención. Se proporcionan ejemplos de moléculas efectoras adicionales posteriormente.
Una secuencia polinucleotídica "corresponde" a una secuencia polipeptídica si la traducción de la secuencia polinucleotídica de acuerdo con el código genético produce la secuencia polipeptídica (es decir, la secuencia polinucleotídica "codifica" la secuencia polipeptídica), una secuencia polinucleotídica "corresponde" a otra secuencia polinucleotídica si las dos secuencias codifican la misma secuencia polipeptídica.
Una región "heteróloga" o dominio de una construcción de ADN es un segmento identificable de ADN en una molécula de ADN mayor que no se encuentra en asociación con la molécula mayor en la naturaleza. Por tanto, cuando la región heteróloga codifica un gen de mamífero, el gen estará flanqueado habitualmente por ADN que no flanquea el ADN genómico de mamífero en el genoma del organismo fuente. Otro ejemplo de una región heteróloga es una construcción donde la secuencia codificante en sí misma no se encuentra en la naturaleza (por ejemplo, un ADNc donde la secuencia codificante genómica contiene intrones o secuencias sintéticas que tienen codones diferentes que el gen nativo). Las variaciones alélicas o acontecimientos de mutación de origen natural no dan lugar a una región heteróloga de ADN como se define en el presente documento.
Una "secuencia codificante" es una secuencia en fase de codones que (a la vista del código genético) corresponden a o codifican una secuencia proteica o peptídica. Dos secuencias codificantes corresponden una a la otra si las secuencias o sus secuencias complementarias codifican las mismas secuencias de aminoácidos. Una secuencia codificante en asociación con secuencias reguladoras apropiadas puede transcribirse y traducirse a un polipéptido. Una señal de poliadenilación y secuencia de terminación de la transcripción se localizarán habitualmente en dirección 3’ de la secuencia codificante. Una "secuencia promotora" es una región reguladora de ADN capaz de unirse con ARN polimerasa en una célula e iniciar la transcripción de una secuencia codificante cadena abajo (dirección 3’). Las secuencias promotoras contienen habitualmente sitios adicionales para unión de moléculas reguladoras (por ejemplo, factores de transcripción) que afectan a la transcripción de la secuencia codificante. Una secuencia codificante está "bajo el control" de la secuencia promotora o "unida operativamente" al promotor cuando la ARN polimerasa se une con la secuencia promotora en una célula y transcribe la secuencia codificante a ARNm, que después a su vez se traduce a la proteína codificada por la secuencia codificante.
Se usan vectores para introducir una sustancia ajena, tal como ADN, ARN o proteína, en un organismo o célula hospedadora. Los vectores habituales incluyen virus recombinantes (para polinucleótidos) y liposomas (para polipéptidos). Un "vector de ADN" es un replicón, tal como un plásmido, fago o cósmido, al que puede unirse otro segmento de polinucleótido para provocar la replicación del segmento unido. Un "vector de expresión" es un vector de ADN que contiene secuencias reguladoras que dirigirán la síntesis de polipéptidos por una célula hospedadora apropiada. Esto significa habitualmente un promotor para unirse con la ARN polimerasa e iniciar la transcripción de ARNm, así como sitios de unión a ribosomas y señales de inicio para dirigir la traducción del ARNm a un polipéptido o polipéptidos. La incorporación de una secuencia polinucleotídica en un vector de expresión en el sitio apropiado y en marco de lectura correcto, seguido de transformación de una célula hospedadora apropiada por el vector, permite la producción de un polipéptido codificado por dicha secuencia polinucleotídica.
La "amplificación" de secuencias polinucleotídicas es la producción in vitro de múltiples copias de una secuencia de ácido nucleico particular. La secuencia amplificada está habitualmente en forma de ADN. Se describen una diversidad de técnicas para llevar a cabo dicha amplificación en un artículo de revisión de Van Brunt (1990, Bio/Technol., 8(4):291 -294). La reacción en cadena de la polimerasa o PCR es un prototipo de amplificación de ácido nucleico y el uso de PCR en el presente documento debería considerarse ilustrativo de otras técnicas de amplificación adecuadas.
La estructura general de anticuerpos en vertebrados se entiende bien en la actualidad (Edelman, G. M., Ann. N.Y. Acad. Sci., 190: 5 (1971)). Los anticuerpos consisten en dos cadenas polipeptídicas ligeras idénticas de peso molecular de aproximadamente 23.000 daltons ("cadena ligera"), y dos cadenas pesadas idénticas de peso molecular 53.000-70.000 ("cadena pesada"). Las cuatro cadenas se unen mediante enlaces disulfuro en una configuración en "Y" en donde las cadenas ligeras soportan las cadenas pesadas comenzando en la boca de la configuración en "Y". La parte de la "rama" de la configuración en "Y" se designa la región Fab; La parte del "tallo" de la configuración en "Y" se designa la región F c. La orientación de la secuencia de aminoácidos se extiende desde el extremo N terminal en la parte superior de la configuración en "Y" al extremo C terminal en la parte inferior de cada cadena. El extremo N terminal posee la región variable que tiene especificidad por el antígeno que la indujo, y es de aproximadamente 100 aminoácidos de longitud, habiendo ligeras variaciones entre la cadena ligera y pesada y entre anticuerpos.
La región variable está unida en cada cadena a una región constante que abarca la longitud restante de la cadena y que en una clase particular de anticuerpo no varía con la especificidad del anticuerpo (es decir, el antígeno que lo induce). Existen cinco clases principales conocidas de regiones constantes que determinan la clase de la molécula de inmunoglobulina (IgG, IgM, IgA, IgD e IgE correspondientes a regiones constantes de cadena pesada y, M, a, 5 y £ (gamma, mu, alfa, delta o épsilon)). La región constante o clase determina la función efectora posterior del anticuerpo, incluyendo activación del complemento (Kabat, E. A., Structural Concepts in Immunology and Immunochemistry, 2a Ed., p. 413-436, Holt, Rinehart, Winston (1976)), y otras respuestas celulares (Andrews, D. W., et al., Clinical Immunobiology, págs. 1-18, W. B. Sanders (1980); Kohl, S., et al., Immunology, 48: 187 (1983)); mientras que la región variable determina el antígeno con el que reaccionará. Las cadenas ligeras se clasifican ya sea como k (kappa) o A (lambda). Cada clase de cadena pesada puede prepararse ya sea con la cadena ligera kappa o con la cadena ligera lambda. Las cadenas ligera y pesada se unen covalentemente entre sí, y las partes de la "cola" de las dos cadenas pesadas se unen entre sí mediante enlaces disulfuro covalentes cuando se generan las inmunoglobulinas ya sea mediante hibridomas o mediante linfocitos B.
La expresión "región variable" o "VR" se refiere de forma amplia a los dominios en cada par de cadenas ligera y pesada en un anticuerpo que están implicados directamente en la unión del anticuerpo al antígeno. Cada cadena pesada tiene en un extremo un dominio variable (Vh) seguido por varios dominios constantes. Cada cadena ligera tiene un dominio variable (Vl) en un extremo y un dominio constante en su otro extremo; el dominio constante de la cadena ligera se alinea con el primer dominio constante de la cadena pesada, y el dominio variable de la cadena ligera se alinea con el dominio variable de la cadena pesada.
Las expresiones "región determinante de complementariedad", "región hipervariable", o "CDR" se refieren a una o más de las regiones hipervariables o determinantes de la complementariedad (CDR) halladas en las regiones variables de las cadenas ligera o pesada de un anticuerpo (Véase Kabat, E. A. et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, National Institutes of Health, Bethesda, Md., (1987)). Estas expresiones incluyen las regiones hipervariables definidas por Kabat et al. ("Sequences of Proteins of Immunological Interest," Kabat E., et al., US Dept. of Health and Human Services, 1983) o los bucles hipervariables en estructuras tridimensionales de anticuerpos (Chothia y Lesk, J Mol. Biol. 196 901-917 (1987)). Las CDR en cada cadena se mantienen en proximidad estrecha por las regiones marco conservadas y, con las CDR de la otra cadena, contribuyen a la formación del sitio de unión a antígeno. En las CDR hay aminoácidos específicos que se han descrito como las regiones determinantes de la selectividad (SDR) que representan los restos de contacto críticos utilizados por la CDR en la interacción anticuerpo-antígeno (Kashimiri, S., Methods, 36:25-34 (2005)).
Las expresiones "región marco conservada" o "FR" se refieren a una o más regiones marco en las regiones variables de las cadenas ligera y pesada de un anticuerpo (Véase Kabat, E. A. et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, National Institutes of Health, Bethesda, Md., (1987)). Estas expresiones incluyen las regiones de secuencias de aminoácidos intercaladas entre las CDR en las regiones variables de las cadenas ligera y pesada de un anticuerpo.
Anticuerpos anti CGRP y fragmentos de unión de los mismos que tienen actividad de unión para CGRP Anticuerpo Ab1
En una realización la divulgación incluye anticuerpos quiméricos que tienen especificidad de unión con CGRP y que poseen una secuencia de cadena ligera variable que comprende la secuencia expuesta a continuación:
QY LTQ TASPYSAAYGSTYTINCQASQSYYDNNYLAW YQQKPGQPPKQLIYSTSTL
ASGV SSRFKGSGSG TQFTLTISDLECA DAA TYY CLG SY DCSSGD CFV FGG GTEVY V
K R (SEQ ID NO: 1).
La divulgación también incluye anticuerpos quiméricos que tienen especificidad de unión con CGRP y que poseen una secuencia de cadena ligera que comprende la secuencia expuesta a continuación:
QV LTQ TASPVSAAVGSTVTINCQASQSVYDNNYLAW YQQKPGQPPKQLIYSTSTL
ASGVSSRFKGSGSG TQFTLTISDLECA DAA TYY CLG SY DCSSGD CFV FGG GTEVV V
KRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQW KVDNALQSGNSQE
SV TEQD SKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
(SEQ ID NO: 2).
La divulgación incluye además anticuerpos quiméricos que tienen especificidad de unión con CGRP y que poseen una secuencia de cadena pesada variable que comprende la secuencia expuesta a continuación:
QSLEESG GRLVTPGTPLTLTCTVSGLDLSSYYM QW VRQAPGKGLEW IGVIGINDNT
YYASW AKGRFTISRASSTTVDLKM TSLTTEDTATYFCARGDIW GPGTLVTVSS
(SEQ ID NO: 3).
La divulgación también incluye anticuerpos quiméricos que tienen especificidad de unión con CGRP y que poseen una secuencia de cadena pesada que comprende la secuencia expuesta a continuación:
QSLEESGGRLVTPGTPLTLTCTVSGLDLSSYYM QW VRQAPGKGLEW IGVIGINDNT
YYASW AKGRFTISRASSTTVDLKM TSLTTEDTATYFCARGDIW GPGTLVTVSSAST
KGP S VFPL AP S SKST S GGT AALGCLVKD YFPEP VT V S W N S G ALTS G VHTFP A VLQ S
SGLYSLS S W T V P S S SLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSCDKTHTCPPCPAPE
LLG G PSV FLFPPK PK D TLM ISRTPEV TC V W D V SH ED PEV K FN W Y V D G V EV H N A K
TK PREEQ Y A STY RW SV LTV LH Q D W LN G K EY K CK V SN K A LPA PIEK TISK A K G Q P
REPQV YTLPPSREEM TKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEW ESNGQPENNYKTTPPVLD
SDGSFFLYSKLTV DK SRW Q QGN VFSCSV M HEA LHN HY TQK SLSLSPGK (SEQ ID
NO: 4).
La divulgación contempla además anticuerpos que comprenden una o más de las secuencias polipeptídicas de SEQ ID NO: 5; SEQ ID NO: 6; y SEQ ID NO: 7 que corresponden a las regiones determinantes de complementariedad (CDR o regiones hipervariables) de la secuencia de cadena ligera variable de la SEQ ID NO: 1 o la secuencia de cadena ligera de la SEQ ID NO: 2, y/o una o más de las secuencias polipeptídicas de SEQ ID NO: 8; SEQ ID NO: 9; y SEQ ID NO: 10 que corresponden a las regiones determinantes de complementariedad (CDR o regiones hipervariables) de la secuencia de cadena pesada variable de la SEQ ID NO: 3 o la secuencia de cadena pesada de la SEQ ID NO: 4, o combinaciones de estas secuencias polipeptídicas. En otra realización de la divulgación, los anticuerpos de la divulgación o fragmentos de los mismos comprenden, o como alternativa consisten en, combinaciones de una o más de las CDR, las secuencias de cadena pesada variable y ligera variable, y las secuencias de cadena pesada y ligera expuestas anteriormente, incluyendo todas ellas.
La divulgación también contempla fragmentos del anticuerpo que tiene especificidad de unión con CGRP. En una realización de la divulgación, los fragmentos de anticuerpo de la divulgación comprenden, o como alternativa consisten en, la secuencia polipeptídica de la SEQ ID NO: 1 o la SEQ ID NO: 2. En otra realización de la divulgación, los fragmentos de anticuerpo de la divulgación comprenden, o como alternativa consisten en, la secuencia polipeptídica de la SEQ ID NO: 3 o la SEQ ID NO: 4.
En una realización adicional de la divulgación, los fragmentos del anticuerpo que tienen especificidad de unión con CGRP comprenden, o como alternativa consisten en, una o más de las secuencias polipeptídicas de SEQ ID NO: 5; SEQ ID NO: 6; y SEQ ID NO: 7 que corresponden a las regiones determinantes de complementariedad (CDR o regiones hipervariables) de la secuencia de cadena ligera variable de la SEQ ID NO: 1 o la secuencia de cadena ligera de la SEQ ID NO: 2.
En una realización adicional de la divulgación, los fragmentos del anticuerpo que tienen especificidad de unión con CGRP comprenden, o como alternativa consisten en, una o más de las secuencias polipeptídicas de SEQ ID NO: 8; SEQ ID NO: 9; y SEQ ID NO: 10 que corresponden a las regiones determinantes de complementariedad (CDR o regiones hipervariables) de la secuencia de cadena pesada variable de la SEQ ID NO: 3 o la secuencia de cadena pesada de la SEQ ID NO: 4.
La divulgación también contempla fragmentos de anticuerpos que incluyen uno o más de los fragmentos de anticuerpos descritos en el presente documento. En una realización de la divulgación, los fragmentos de los anticuerpos que tienen especificidad de unión con CGRP comprenden, o como alternativa consisten en, uno, dos, tres o más, incluyendo todos los siguientes fragmentos de anticuerpos: la región de cadena ligera variable de la SEQ ID NO: 1; la región de cadena pesada variable de la SEQ ID NO: 3; las regiones determinantes de complementariedad (SEQ ID NO: 5; SEQ ID NO: 6; y SEQ ID NO: 7) de la región de cadena ligera variable de la SEQ ID NO: 1; y las regiones determinantes de complementariedad (SEQ ID NO: 8; SEQ ID NO: 9; y SEQ ID NO: 10) de la región de cadena pesada variable de la SEQ ID NO: 3.
En una realización particularmente preferente de la divulgación, el anticuerpo anti CGRP quimérico es Ab1, que comprende, o como alternativa que consiste en, SEQ ID NO: 2 y SEQ ID NO: 4, y que tiene al menos una de las actividades biológicas expuestas en el presente documento.
En una realización adicional particularmente preferente de la divulgación, los fragmentos de anticuerpos comprenden, o como alternativa consisten en, fragmentos Fab (fragmento de unión a antígeno) que tienen especificidad de unión por CGRP. Con respecto al anticuerpo Ab1, el fragmento Fab incluye la secuencia de cadena ligera variable de la SEQ ID NO: 1 y la secuencia de cadena pesada variable de la SEQ ID NO: 3. Esta realización de la divulgación contempla además adiciones, supresiones y variantes de la SEQ ID NO: 1 y/o la SEQ ID NO: 3 en dicho Fab conservando al mismo tiempo la especificidad de unión por CGRP.
En una realización de la divulgación descrita en el presente documento (posteriormente), pueden producirse fragmentos Fab mediante digestión enzimática (por ejemplo, papaína) de Ab1. En otra realización de la divulgación, pueden producirse anticuerpos anti CGRP tales como Ab1 o fragmentos Fab de los mismos mediante expresión en células de mamífero tales como células CHO, NSO o HEK 293, sistemas fúngicos, de insectos o microbianos tales como células de levadura (por ejemplo levadura diploide tal como Pichia diploide) y otras cepas de levadura. Las especies de Pichia adecuadas incluyen, pero sin limitación, Pichia pastoris.
Anticuerpo Ab2
En una realización, la divulgación incluye anticuerpos humanizados que tienen especificidad de unión con CGRP y que poseen una secuencia de cadena ligera variable que comprende la secuencia expuesta a continuación:
QV LTQSPSSLSASVGDRVTINCQASQSVYDNNYLAW YQQKPGKVPKQLIYSTSTL
ASGV PSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDVATYYCLGSYDCSSGDCFVFGGGTKVEIK
R (SEQ ID NO: 11).
La divulgación también incluye anticuerpos humanizados que tienen especificidad de unión con CGRP y que poseen una secuencia de cadena ligera que comprende la secuencia expuesta a continuación:
QV LTQSPSSLSASVGDRVTINCQASQSVYDNNYLAW YQQKPGKVPKQLIYSTSTL
ASGV PSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDVATYYCLGSYDCSSGDCFVFGGGTKVEIK
RT VAAP S VFIFPP SDEQLKS GT AS V V CLLNNF YPRE AK V Q W KVDN ALQ S GN S QE S
VTEQD SKD STYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
(SEQ ID NO: 12).
La divulgación incluye además anticuerpos humanizados que tienen especificidad de unión con CGRP y que poseen una secuencia de cadena pesada variable que comprende la secuencia expuesta a continuación:
EV QLVESGGGLVQPGGSLRLSCAVSGLDLSSYYM QW VRQAPGKGLEW VGVIGIN
DN TYYASW AKGRFTISRDNSKTTVYLQM NSLRAEDTAVYFCARGDIW GQGTLVT
VSS (SEQ ID NO: 13).
La divulgación también incluye anticuerpos humanizados que tienen especificidad de unión con CGRP y que poseen una secuencia de cadena pesada que comprende la secuencia expuesta a continuación:
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAVSGLDLSSYYM QW VRQAPGKGLEW VGVIGIN
DNTYYASW AKGRFTISRDNSKTTVYLQM NSLRAEDTAVYFCARGDIW GQGTLVT
V S S ASTKGP S V FPL AP S SKST S GGT A A LGCL VKD YFPEP VT VS WNS G ALT S G VHTF
PA V LQ SSG LY SLSSW TV PSSSLG TQ TY ICN V N H K PSN TK V D K RV EPK SCD K TH TC
EV HNA KTK PREEQ Y A STY RW SV LTV LH Q D W LN G K EY K CK V SN K A LPA PIEK TIS
KAKGQPREPQYYTLPPSREEM TKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEW ESNGQPENNYK
TTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRW QQGNVFSCSVM HEALHNHYTQKSLSLSPGK
(SEQ ID NO: 14).
La divulgación contempla además anticuerpos que comprenden una o más de las secuencias polipeptídicas de SEQ ID NO: 15; SEQ ID NO: 16; y SEQ ID NO: 17 que corresponden a las regiones determinantes de complementariedad (CDR o regiones hipervariables) de la secuencia de cadena ligera variable de la SEQ ID NO: 11 o la secuencia de cadena ligera de la SEQ ID NO: 12, y/o una o más de las secuencias polipeptídicas de SEQ ID NO: 18; SEQ ID NO: 19; y SEQ ID NO: 20 que corresponden a las regiones determinantes de complementariedad (CDR o regiones hipervariables) de la secuencia de cadena pesada variable de la SEQ ID NO: 13 o la secuencia de cadena pesada de la SEQ ID NO: 14, o combinaciones de estas secuencias polipeptídicas. En otra realización de la divulgación, los anticuerpos de la divulgación o fragmentos de los mismos comprenden, o como alternativa consisten en, combinaciones de una o más de las CDR, las secuencias de cadena pesada variable y ligera variable, y las secuencias de cadena pesada y ligera expuestas anteriormente, incluyendo todas ellas.
La divulgación también contempla fragmentos del anticuerpo que tiene especificidad de unión con CGRP. En una realización de la divulgación, los fragmentos de anticuerpo de la divulgación comprenden, o como alternativa consisten en, la secuencia polipeptídica de la SEQ ID NO: 11 o la SEQ ID NO: 12. En otra realización de la divulgación, los fragmentos de anticuerpo de la divulgación comprenden, o como alternativa consisten en, la secuencia polipeptídica de la SEQ ID NO: 13 o la SEQ ID NO: 14.
En una realización adicional de la divulgación, los fragmentos del anticuerpo que tienen especificidad de unión con CGRP comprenden, o como alternativa consisten en, una o más de las secuencias polipeptídicas de SEQ ID NO: 15; SEQ ID NO: 16; y SEQ ID NO: 17 que corresponden a las regiones determinantes de complementariedad (CDR o regiones hipervariables) de la secuencia de cadena ligera variable de la SEQ ID NO: 11 o la secuencia de cadena ligera de la SEQ ID NO: 12.
En una realización adicional de la divulgación, los fragmentos del anticuerpo que tienen especificidad de unión con CGRP comprenden, o como alternativa consisten en, una o más de las secuencias polipeptídicas de SEQ ID NO: 18; SEQ ID NO: 19; y SEQ ID NO: 20 que corresponden a las regiones determinantes de complementariedad (CDR o regiones hipervariables) de la secuencia de cadena pesada variable de la SEQ ID NO: 13 o la secuencia de cadena pesada de la SEQ ID NO: 14.
La divulgación también contempla fragmentos de anticuerpos que incluyen uno o más de los fragmentos de anticuerpos descritos en el presente documento. En una realización de la divulgación, los fragmentos de los anticuerpos que tienen especificidad de unión con CGRP comprenden, o como alternativa consisten en, uno, dos, tres o más, incluyendo todos los siguientes fragmentos de anticuerpos: la región de cadena ligera variable de la SEQ ID NO: 11; la región de cadena pesada variable de la SEQ ID NO: 13; las regiones determinantes de complementariedad (SEQ ID NO: 15; SEQ ID NO: 16; y SEQ ID NO: 17) de la región de cadena ligera variable de la SEQ ID NO: 11; y las regiones determinantes de complementariedad (SEQ ID NO: 18; SEQ ID NO: 19; y SEQ ID NO: 20) de la región de cadena pesada variable de la SEQ ID NO: 13.
En una realización particularmente preferente de la divulgación, el anticuerpo anti CGRP humanizado es Ab2, que comprende, o como alternativa que consiste en, SEQ ID NO: 12 y SEQ ID NO: 14, y que tiene al menos una de las actividades biológicas expuestas en el presente documento.
En una realización adicional particularmente preferente de la divulgación, los fragmentos de anticuerpo comprenden, o como alternativa consisten en, fragmentos Fab (fragmento de unión a antígeno) que tienen especificidad de unión por CGRP. Con respecto al anticuerpo Ab2, el fragmento Fab incluye la secuencia de cadena ligera variable de la SEQ ID NO: 11 y la secuencia de cadena pesada variable de la SEQ ID NO: 13. Esta realización de la divulgación contempla además adiciones, supresiones y variantes de la SEQ ID NO: 11 y/o la SEQ ID NO: 13 en dicho Fab conservando al mismo tiempo la especificidad de unión por CGRP.
En una realización de la divulgación descrita en el presente documento (posteriormente), Pueden producirse fragmentos Fab mediante digestión enzimática (por ejemplo, papaína) de Ab2. En otra realización de la divulgación, pueden producirse anticuerpos anti CGRP tales como Ab2 o fragmentos Fab de los mismos mediante expresión en células de mamífero tales como células CHO, NSO o HEK 293, sistemas fúngicos, de insectos o microbianos tales como células de levadura (por ejemplo levadura diploide tal como Pichia diploide) y otras cepas de levadura. Las especies de Pichia adecuadas incluyen, pero sin limitación, Pichia pastoris.
Anticuerpo Ab3
En una realización, la divulgación incluye anticuerpos humanizados que tienen especificidad de unión con CGRP y que poseen una secuencia de cadena ligera variable que comprende la secuencia expuesta a continuación:
QV LTQSPSSLSASVGDRVTINCQASQSVYDNNYLAW YQQKPGKVPKQLIYSTSTL
ASGV PSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDVATYYCLGSYDCSSGDCFVFGGGTKVEIK
R (SEQ ID NO: 21).
La divulgación también incluye anticuerpos humanizados que tienen especificidad de unión con CGRP y que poseen una secuencia de cadena ligera que comprende la secuencia expuesta a continuación:
QV LTQSPSSLSASVGDRVTINCQASQSVYDNNYLAW YQQKPGKVPKQLIYSTSTL
ASGV PSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDVATYYCLGSYDCSSGDCFVFGGGTKVEIK
RT YAAP S VFIFPP SDEQLKS GT AS V V CLLNNF YPRE AK V Q W KVDN ALQ S GN S QE S
VTEQD SKD STYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
(SEQ ID NO: 22).
La divulgación incluye además anticuerpos humanizados que tienen especificidad de unión con CGRP y que poseen una secuencia de cadena pesada variable que comprende la secuencia expuesta a continuación:
EV QLVESGGGLVQPGGSLRLSCAVSGLDLSSYYM QW VRQAPGKGLEW VGVIGIN
DN TYYASW AKGRFTISRDNSKTTVYLQM NSLRAEDTAVYFCARGDIW GQGTLVT
VSS (SEQ ID NO: 23).
La divulgación también incluye anticuerpos humanizados que tienen especificidad de unión con CGRP y que poseen una secuencia de cadena pesada que comprende la secuencia expuesta a continuación:
EV QLVESGGGLVQPGGSLRLSCAVSGLDLSSYYM QW VRQAPGKGLEW VGVIGIN
DN TYYASW AKGRFTISRDNSKTTVYLQM NSLRAEDTAVYFCARGDIW GQGTLVT
V S S ASTKGP S VFPL AP S SKST S GGT AA LGCL VKD YFPEP VT VS W NS G ALT S G VHTF
PA V LQ SSG LY SLSSW TV PSSSLG TQ TY ICN V N H K PSN TK V D A R V EPK SCD K TH TC
PPC PA PELLG G PSV FLFPPK PK D TLM ISRTPEV TC V W D V SH ED PEV K FN W Y V D G V
EV H N A K TK PREEQ Y A STY RW SV LTV LH Q D W LN G K EY K CK V SN K A LPA PIEK TIS
KAKGQPREPQVYTLPPSREEM TKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEW ESNGQPENNYK
TTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRW QQGNVFSCSVM HEALHNHYTQKSLSLSPGK
(SEQ ID NO: 24).
La divulgación contempla además anticuerpos que comprenden una o más de las secuencias polipeptídicas de SEQ ID NO: 25; SEQ ID NO: 26; y SEQ ID NO: 27 que corresponden a las regiones determinantes de complementariedad (CDR o regiones hipervariables) de la secuencia de cadena ligera variable de la SEQ ID NO: 21 o la secuencia de cadena ligera de la SEQ ID NO: 22, y/o una o más de las secuencias polipeptídicas de SEQ ID NO: 28; SEQ ID NO: 29; y SEQ ID NO: 30 que corresponden a las regiones determinantes de complementariedad (CDR o regiones hipervariables) de la secuencia de cadena pesada variable de la SEQ ID NO: 23 o la secuencia de cadena pesada de la SEQ ID NO: 24, o combinaciones de estas secuencias polipeptídicas. En otra realización de la divulgación, los anticuerpos de la divulgación o fragmentos de los mismos comprenden, o como alternativa consisten en, combinaciones de una o más de las CDR, las secuencias de cadena pesada variable y ligera variable, y las secuencias de cadena pesada y ligera expuestas anteriormente, incluyendo todas ellas.
La divulgación también contempla fragmentos del anticuerpo que tiene especificidad de unión con CGRP. En una realización de la divulgación, los fragmentos de anticuerpo de la divulgación comprenden, o como alternativa consisten en, la secuencia polipeptídica de la SEQ ID NO: 21 o la SEQ ID NO: 22. En otra realización de la divulgación, los fragmentos de anticuerpo de la divulgación comprenden, o como alternativa consisten en, la secuencia polipeptídica de la SEQ ID NO: 23 o la SEQ ID NO: 24.
En una realización adicional de la divulgación, los fragmentos del anticuerpo que tienen especificidad de unión con CGRP comprenden, o como alternativa consisten en, una o más de las secuencias polipeptídicas de SEQ ID NO: 25; SEQ ID NO: 26; y SEQ ID NO: 27 que corresponden a las regiones determinantes de complementariedad (CDR o regiones hipervariables) de la secuencia de cadena ligera variable de la SEQ ID NO: 21 o la secuencia de cadena ligera de la SEQ ID NO: 22.
En una realización adicional de la divulgación, los fragmentos del anticuerpo que tienen especificidad de unión con CGRP comprenden, o como alternativa consisten en, una o más de las secuencias polipeptídicas de SEQ ID NO: 28; SEQ ID NO: 29; y SEQ ID NO: 30 que corresponden a las regiones determinantes de complementariedad (CDR o regiones hipervariables) de la secuencia de cadena pesada variable de la SEQ ID NO: 23 o la secuencia de cadena pesada de la SEQ ID NO: 24.
La divulgación también contempla fragmentos de anticuerpos que incluyen uno o más de los fragmentos de anticuerpos descritos en el presente documento. En una realización de la divulgación, los fragmentos de los anticuerpos que tienen especificidad de unión con CGRP comprenden, o como alternativa consisten en, uno, dos, tres o más, incluyendo todos los siguientes fragmentos de anticuerpos: la región de cadena ligera variable de la SEQ ID NO: 21; la región de cadena pesada variable de la SEQ ID NO: 23; las regiones determinantes de complementariedad (SEQ ID NO: 25; SEQ ID NO: 26; y SEQ ID NO: 27) de la región de cadena ligera variable de la SEQ ID NO: 21; y las regiones determinantes de complementariedad (SEQ ID NO: 28; SEQ ID NO: 29; y SEQ ID NO: 30) de la región de cadena pesada variable de la SEQ ID NO: 23.
En una realización particularmente preferente de la divulgación, el anticuerpo anti CGRP quimérico es Ab3, que comprende, o como alternativa que consiste en, SEQ ID NO: 22 y SEQ ID NO: 24, y que tiene al menos una de las actividades biológicas expuestas en el presente documento.
En una realización adicional particularmente preferente de la divulgación, los fragmentos de anticuerpo comprenden, o como alternativa consisten en, fragmentos Fab (fragmento de unión a antígeno) que tienen especificidad de unión por CGRP. Con respecto al anticuerpo Ab3, el fragmento Fab incluye la secuencia de cadena ligera variable de la SEQ ID NO: 21 y la secuencia de cadena pesada variable de la SEQ ID NO: 23. Esta realización de la divulgación contempla además adiciones, supresiones y variantes de la SEQ ID NO: 21 y/o la SEQ ID NO: 23 en dicho Fab conservando al mismo tiempo la especificidad de unión por CGRP.
En una realización de la divulgación descrita en el presente documento (posteriormente), Pueden producirse fragmentos Fab mediante digestión enzimática (por ejemplo, papaína) de Ab3. En otra realización de la divulgación, pueden producirse anticuerpos anti CGRP tales como Ab3 o fragmentos Fab de los mismos mediante expresión en células de mamífero tales como células CHO, NSO o HEK 293, sistemas fúngicos, de insectos o microbianos tales como células de levadura (por ejemplo levadura diploide tal como Pichia diploide) y otras cepas de levadura. Las especies de Pichia adecuadas incluyen, pero sin limitación, Pichia pastoris.
Anticuerpo Ab4
En una realización, la divulgación incluye anticuerpos quiméricos que tienen especificidad de unión con CGRP y que poseen una secuencia de cadena ligera variable que comprende la secuencia expuesta a continuación:
QV LTQTPSPVSAAVGSTVTINCQASQSVYHNTYLAW YQQKPGQPPKQLIYDASTL
A SG V PSRFSG SG SG TQ FTLTISG V Q CN D A A A Y Y CLG SY D CTN G D C FV FG G G TEW
V K R (SEQ ID NO: 31).
La divulgación también incluye anticuerpos quiméricos que tienen especificidad de unión con CGRP y que poseen una secuencia de cadena ligera que comprende la secuencia expuesta a continuación:
QVLTQTPSPV SA AYG STV TIN CQ ASQ SV YHN TYLAW YQ QK PGQ PPK QLIYD ASTL
A SG V PSRFSG SG SG TQ FTLTISG V Q CN D A A A Y Y CLG SY D CTN G D C FV FG G G TEW
VKRT VAAP S VFIFPP SDEQLKS GT AS V V CLLNNF YPRE AK V Q W KVDN ALQ S GN S Q
ESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
(SEQ ID NO: 32).
La divulgación incluye además anticuerpos quiméricos que tienen especificidad de unión con CGRP y que poseen una secuencia de cadena pesada variable que comprende la secuencia expuesta a continuación:
Q SLEE S GGRLVTPGTPLTLT C S VS GIDLS GYYM N W VRQ APGKGLE W IG VIGIN G AT
YYASW AKGRFTISKTSSTTVDLKM TSLTTEDTATYFCARGDIW GPGTLVTVSS
(SEQ ID NO: 33).
La divulgación también incluye anticuerpos quiméricos que tienen especificidad de unión con CGRP y que poseen una secuencia de cadena pesada que comprende la secuencia expuesta a continuación:
Q SLEE S GGRLVTPGTPLTLT C S VS GIDLS GYYM N W VRQ APGK GLE W IG VIGIN G AT
YYASW A KG RFTISK TSSTTVDLKM TSLTTEDTATY FCA RG DIW G PGTLVTV SSA ST
KGP S VFPL AP S SKST S GGT AALGCLVKD YFPEP VT V S W N S G ALT S G VHTFP A VLQ S
SGLY SLS S W T VPS S SLGT QTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSCDKTHT CPPCP APE
LLG G PSV FLFPPK PK D TLM ISRTPEV TC V W D V SH ED PEV K FN W Y V D G V EV H N A K
TK PREEQ Y A STY RW SV LTV LH Q D W LN G K EY K CK V SN K A LPA PIEK TISK A K G Q P
REPQVYTLPPSREEM TKN QV SLTCLVK GFY PSD IA VEW ESN GQ PEN NYK TTPPVLD
SDGSFFLYSKLTV DK SRW Q QGN VFSCSV M HEA LHN HY TQK SLSLSPGK (SEQ ID
NO: 34).
La divulgación contempla además anticuerpos que comprenden una o más de las secuencias polipeptídicas de SEQ ID NO: 35; SEQ ID NO: 36; y SEQ ID NO: 37 que corresponden a las regiones determinantes de complementariedad (CDR o regiones hipervariables) de la secuencia de cadena ligera variable de la SEQ ID NO: 31 o la secuencia de cadena ligera de la SEQ ID NO: 32, y/o una o más de las secuencias polipeptídicas de SEQ ID NO: 38; SEQ ID NO: 39; y SEQ ID NO: 40 que corresponden a las regiones determinantes de complementariedad (CDR o regiones hipervariables) de la secuencia de cadena pesada variable de la SEQ ID NO: 33 o la secuencia de cadena pesada de la SEQ ID NO: 34, o combinaciones de estas secuencias polipeptídicas. En otra realización de la divulgación, los anticuerpos de la divulgación o fragmentos de los mismos comprenden, o como alternativa consisten en, combinaciones de una o más de las CDR, las secuencias de cadena pesada variable y ligera variable, y las secuencias de cadena pesada y ligera expuestas anteriormente, incluyendo todas ellas.
La divulgación también contempla fragmentos del anticuerpo que tiene especificidad de unión con CGRP. En una realización de la divulgación, los fragmentos de anticuerpo de la divulgación comprenden, o como alternativa consisten en, la secuencia polipeptídica de la SEQ ID NO: 31 o la SEQ ID NO: 32. En otra realización de la divulgación, los fragmentos de anticuerpo de la descripción comprenden, o como alternativa consisten en, la secuencia polipeptídica de la SEQ ID NO: 33 o la SEQ ID NO: 34.
En una realización adicional de la divulgación, los fragmentos del anticuerpo que tienen especificidad de unión con CGRP comprenden, o como alternativa consisten en, una o más de las secuencias polipeptídicas de SEQ ID NO: 35; SEQ ID NO: 36; y SEQ ID NO: 37 que corresponden a las regiones determinantes de complementariedad (CDR o regiones hipervariables) de la secuencia de cadena ligera variable de la SEQ ID NO: 31 o la secuencia de cadena ligera de la SEQ ID NO: 32.
En una realización adicional de la divulgación, los fragmentos del anticuerpo que tienen especificidad de unión con CGRP comprenden, o como alternativa consisten en, una o más de las secuencias polipeptídicas de SEQ ID NO: 38; SEQ ID NO: 39; y SEQ ID NO: 40 que corresponden a las regiones determinantes de complementariedad (CDR o regiones hipervariables) de la secuencia de cadena pesada variable de la SEQ ID NO: 33 o la secuencia de cadena pesada de la SEQ ID NO: 34.
La divulgación también contempla fragmentos de anticuerpos que incluyen uno o más de los fragmentos de anticuerpos descritos en el presente documento. En una realización de la divulgación, los fragmentos de los anticuerpos que tienen especificidad de unión con CGRP comprenden, o como alternativa consisten en, uno, dos, tres o más, incluyendo todos los siguientes fragmentos de anticuerpos: la región de cadena ligera variable de la SEQ ID NO: 31; la región de cadena pesada variable de la SEQ ID NO: 33; las regiones determinantes de complementariedad (SEQ ID NO: 35; SEQ ID NO: 36; y SEQ ID NO: 37) de la región de cadena ligera variable de la SEQ ID NO: 31; y las regiones determinantes de complementariedad (SEQ ID NO: 38; SEQ ID NO: 39; y SEQ ID NO: 40) de la región de cadena pesada variable de la SEQ ID NO: 33.
En una realización particularmente preferente de la divulgación, el anticuerpo anti CGRP humanizado es Ab4, que comprende, o como alternativa que consiste en, SEQ ID NO: 32 y SEQ ID NO: 34, y que tiene al menos una de las actividades biológicas expuestas en el presente documento.
En una realización adicional particularmente preferente de la divulgación, los fragmentos de anticuerpo comprenden, o como alternativa consisten en, fragmentos Fab (fragmento de unión a antígeno) que tienen especificidad de unión por CGRP. Con respecto al anticuerpo Ab4, el fragmento Fab incluye la secuencia de cadena ligera variable de la SEQ ID NO: 31 y la secuencia de cadena pesada variable de la SEQ ID NO: 33. Esta realización de la divulgación contempla además adiciones, supresiones y variantes de la SEQ ID NO: 31 y/o la SEQ ID NO: 33 en dicho Fab conservando al mismo tiempo la especificidad de unión por CGRP.
En una realización de la divulgación descrita en el presente documento (posteriormente), Pueden producirse fragmentos Fab mediante digestión enzimática (por ejemplo, papaína) de Ab4. En otra realización de la divulgación, pueden producirse anticuerpos anti CGRP tales como Ab4 o fragmentos Fab de los mismos mediante expresión en células de mamífero tales como células CHO, NSO o HEK 293, sistemas fúngicos, de insectos o microbianos tales como células de levadura (por ejemplo levadura diploide tal como Pichia diploide) y otras cepas de levadura. Las especies de Pichia adecuadas incluyen, pero sin limitación, Pichia pastoris.
Anticuerpo Ab5
En una realización, la divulgación incluye anticuerpos humanizados que tienen especificidad de unión con CGRP y que poseen una secuencia de cadena ligera variable que comprende la secuencia expuesta a continuación:
QVLTQSPSSLSASVGDRVTINCQASQSVYHNTYLAW YQQKPGKVPKQLIYDASTL
ASGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDVATYYCLGSYDCTNGDCFVFGGGTKVEIK
R (SEQ ID NO: 41).
La divulgación también incluye anticuerpos humanizados que tienen especificidad de unión con CGRP y que poseen una secuencia de cadena ligera que comprende la secuencia expuesta a continuación:
QV LTQSPSSLSASVGDRVTINCQASQSVYHNTYLAW YQQKPGKVPKQLIYDASTL
ASGV PSRFSGSGSG TDFTLTISSLQ PEDV ATY YCLGSYDCTNG DCFVFGGG TK VEIK
RT VAAP S VFIFPP SDEQLKS GT AS V V CLLNNF YPRE AK V Q W KVDN ALQ S GN S QE S
VTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
(SEQ ID NO: 42).
La divulgación incluye además anticuerpos humanizados que tienen especificidad de unión con CGRP y que poseen una secuencia de cadena pesada variable que comprende la secuencia expuesta a continuación:
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAVSGIDLSGYYM NW VRQAPGKGLEW VGVIGIN
GATYYASW AKGRFTISRDNSKTTVYLQM NSLRAEDTAVYFCARGDIW GQGTLVT
VSS (SEQ ID NO: 43).
La divulgación también incluye anticuerpos humanizados que tienen especificidad de unión con CGRP y que poseen una secuencia de cadena pesada que comprende la secuencia expuesta a continuación:
EV QLV ESGGGLVQPGGSLRLSCAVSGIDLSGYYM NW VRQAPGKGLEW VGVIGIN
GA TYY ASW AKGRFTISRDNSKTTVYLQM NSLRAEDTAVYFCARGDIW GQGTLVT
VSSASTKG PSVFPLA PSSK STSG GTA ALG CLV KD YFPEPVTVSW NSGA LTSG VHTF
PA V LQ SSG LY SLSSW TV PSSSLG TQ TY ICN V N H K PSN TK V D K R V EPK SCD K TH TC
PPCPA PELLG G PSV FLFPPK PK D TLM ISRTPEV TC V W D V SH ED PEV K FN W Y V D G V
E VHN AKT KPREE Q Y AST Y R W S VLT VLHQD W LNGKEYKCKV SNKALP APIEKTIS
KAKGQPREPQVYTLPPSREEM TK NQ VSLTCLV KGFYPSDIAVEW ESNG QPEN NY K
TTPPVLDSDG SFFLYSK LTV DK SRW QQ GN VFSCSV M H EALHN HYTQKSLSLSPGK
(SEQ ID NO: 44).
La divulgación contempla además anticuerpos que comprenden una o más de las secuencias polipeptídicas de SEQ ID NO: 45; SEQ ID NO: 46; y SEQ ID NO: 47 que corresponden a las regiones determinantes de complementariedad (CDR o regiones hipervariables) de la secuencia de cadena ligera variable de la SEQ ID NO: 41 o la secuencia de cadena ligera de la SEQ ID NO: 42, y/o una o más de las secuencias polipeptídicas de SEQ ID NO: 48; SEQ ID NO: 49; y SEQ ID NO: 50 que corresponden a las regiones determinantes de complementariedad (CDR o regiones hipervariables) de la secuencia de cadena pesada variable de la SEQ ID NO: 43 o la secuencia de cadena pesada de la SEQ ID NO: 44, o combinaciones de estas secuencias polipeptídicas. En otra realización de la divulgación, los anticuerpos de la divulgación o fragmentos de los mismos comprenden, o como alternativa consisten en, combinaciones de una o más de las CDR, las secuencias de cadena pesada variable y ligera variable, y las secuencias de cadena pesada y ligera expuestas anteriormente, incluyendo todas ellas.
La divulgación también contempla fragmentos del anticuerpo que tiene especificidad de unión con CGRP. En una realización de la divulgación, los fragmentos de anticuerpo de la divulgación comprenden, o como alternativa consisten en, la secuencia polipeptídica de la SEQ ID NO: 41 o la SEQ ID NO: 42. En otra realización de la divulgación, los fragmentos de anticuerpo de la divulgación comprenden, o como alternativa consisten en, la secuencia polipeptídica de la SEQ ID NO: 43 o la SEQ ID NO: 44.
En una realización adicional de la divulgación, los fragmentos del anticuerpo que tienen especificidad de unión con CGRP comprenden, o como alternativa consisten en, una o más de las secuencias polipeptídicas de SEQ ID NO: 45; SEQ ID NO: 46; y SEQ ID NO: 47 que corresponden a las regiones determinantes de complementariedad (CDR o regiones hipervariables) de la secuencia de cadena ligera variable de la SEQ ID NO: 41 o la secuencia de cadena ligera de la SEQ ID NO: 42.
En una realización adicional de la divulgación, los fragmentos del anticuerpo que tienen especificidad de unión con CGRP comprenden, o como alternativa consisten en, una o más de las secuencias polipeptídicas de SEQ ID NO: 48; SEQ ID NO: 49; y SEQ ID NO: 50 que corresponden a las regiones determinantes de complementariedad (CDR o regiones hipervariables) de la secuencia de cadena pesada variable de la SEQ ID NO: 43 o la secuencia de cadena pesada de la SEQ ID NO: 44.
La divulgación también contempla fragmentos de anticuerpos que incluyen uno o más de los fragmentos de anticuerpos descritos en el presente documento. En una realización de la divulgación, los fragmentos de los anticuerpos que tienen especificidad de unión con CGRP comprenden, o como alternativa consisten en, uno, dos, tres o más, incluyendo todos los siguientes fragmentos de anticuerpos: la región de cadena ligera variable de la SEQ ID NO: 41; la región de cadena pesada variable de la SEQ ID NO: 43; las regiones determinantes de complementariedad (SEQ ID NO: 45; SEQ ID NO: 46; y SEQ ID NO: 47) de la región de cadena ligera variable de la SEQ ID NO: 41; y las regiones determinantes de complementariedad (SEQ ID NO: 48; SEQ ID NO: 49; y SEQ ID NO: 50) de la región de cadena pesada variable de la SEQ ID NO: 43.
En una realización particularmente preferente de la divulgación, el anticuerpo anti CGRP quimérico es Ab5, que comprende, o como alternativa que consiste en, SEQ ID NO: 42 y SEQ ID NO: 44, y que tiene al menos una de las actividades biológicas expuestas en el presente documento.
En una realización adicional particularmente preferente de la divulgación, los fragmentos de anticuerpo comprenden, o como alternativa consisten en, fragmentos Fab (fragmento de unión a antígeno) que tienen especificidad de unión por CGRP. Con respecto al anticuerpo Ab5, el fragmento Fab incluye la secuencia de cadena ligera variable de la SEQ ID NO: 41 y la secuencia de cadena pesada variable de la SEQ ID NO: 43. Esta realización de la divulgación contempla además adiciones, supresiones y variantes de la SEQ ID NO: 41 y/o la SEQ ID NO: 43 en dicho Fab conservando al mismo tiempo la especificidad de unión por CGRP.
En una realización de la divulgación descrita en el presente documento (posteriormente), Pueden producirse fragmentos Fab mediante digestión enzimática (por ejemplo, papaína) de Ab5. En otra realización de la divulgación, pueden producirse anticuerpos anti CGRP tales como Ab5 o fragmentos Fab de los mismos mediante expresión en células de mamífero tales como células CHO, NSO o HEK 293, sistemas fúngicos, de insectos o microbianos tales como células de levadura (por ejemplo levadura diploide tal como Pichia diploide) y otras cepas de levadura. Las especies de Pichia adecuadas incluyen, pero sin limitación, Pichia pastoris.
Anticuerpo Ab6
En una realización, la invención incluye anticuerpos humanizados que tienen especificidad de unión con CGRP y que poseen una secuencia de cadena ligera variable que comprende la secuencia expuesta a continuación:
QVLTQSPSSLSASVGDRVTINCQASQSVYHNTYLAW YQQKPGKVPKQLIYDASTL
ASGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDVATYYCLGSYDCTNGDCFVFGGGTKVEIK
R (SEQ ID NO: 51).
La invención también incluye anticuerpos humanizados que tienen especificidad de unión con CGRP y que poseen una secuencia de cadena ligera que comprende la secuencia expuesta a continuación:
QV LTQSPSSLSASVGDRVTINCQASQSVYHNTYLAW YQQKPGKVPKQLIYDASTL
ASGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDVATYYCLGSYDCTNGDCFVFGGGTKVEIK
RT VAAP S VFIFPP SDEQLKS GT AS V V CLLNNF YPRE AK V Q W KVDN ALQ S GN S QE S
VTEQD SKD STYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
(SEQ ID NO: 52).
La invención incluye además anticuerpos humanizados que tienen especificidad de unión con CGRP y que poseen una secuencia de cadena pesada variable que comprende la secuencia expuesta a continuación:
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAVSGIDLSGYYM NW VRQAPGKGLEW VGVIGIN
GATYYASW AKGRFTISRDNSKTTVYLQM NSLRAEDTAVYFCARGDIW GQGTLVT
VSS (SEQ ID NO: 53).
La invención también incluye anticuerpos humanizados que tienen especificidad de unión con CGRP y que poseen una secuencia de cadena pesada que comprende la secuencia expuesta a continuación:
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAVSGIDLSGYYM NW VRQAPGKGLEW VGVIGIN
GATYYASW AKGRFTISRDNSKTTVYLQM NSLRAEDTAVYFCARGDIW GQGTLVT
VSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSW NSGALTSGVHTF
PA V LQ SSG LY SLSSW TV PSSSLG TQ TY ICN V N H K PSN TK V D A RV EPK SCD K TH TC
PPC PA PELLG G PSV FLFPPK PK D TLM ISRTPEV TCV W D V SH ED PEV K FN W Y V D G V
E VHN AKT KPREEQ Y A S T Y R W S VLT VLHQD W LN GKE Y K CK V SNKALP APIEKTIS
KAKGQPREPQVYTLPPSREEM TKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEW ESNGQPENNYK
TTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRW QQGNVFSCSVM HEALHNHYTQKSLSLSPGK
(SEQ ID NO: 54).
La invención contempla además anticuerpos que comprenden una o más de las secuencias polipeptídicas de SEQ ID NO: 55; SEQ ID NO: 56; y SEQ ID NO: 57 que corresponden a las regiones determinantes de complementariedad (CDR o regiones hipervariables) de la secuencia de cadena ligera variable de la SEQ ID NO: 51 o la secuencia de cadena ligera de la SEQ ID NO: 52, y/o una o más de las secuencias polipeptídicas de SEQ ID NO: 58; SEQ ID NO: 59; y SEQ ID NO: 60 que corresponden a las regiones determinantes de complementariedad (CDR o regiones hipervariables) de la secuencia de cadena pesada variable de la SEQ ID NO: 53 o la secuencia de cadena pesada de la SEQ ID NO: 54, o combinaciones de estas secuencias polipeptídicas. En otra realización de la invención, los anticuerpos de la invención o fragmentos de los mismos comprenden, o como alternativa consisten en, combinaciones de una o más de las CDR, las secuencias de cadena pesada variable y ligera variable, y las secuencias de cadena pesada y ligera expuestas anteriormente, incluyendo todas ellas.
La invención también contempla fragmentos del anticuerpo que tiene especificidad de unión con CGRP. En una realización de la invención, los fragmentos de anticuerpo de la invención comprenden, o como alternativa consisten en, la secuencia polipeptídica de la SEQ ID NO: 51 o la SEQ ID NO: 52. En otra realización de la invención, los fragmentos de anticuerpo de la invención comprenden, o como alternativa consisten en, la secuencia polipeptídica de la SEQ ID NO: 53 o la SEQ ID NO: 54.
En una realización adicional de la invención, los fragmentos del anticuerpo que tienen especificidad de unión con CGRP comprenden, o como alternativa consisten en, una o más de las secuencias polipeptídicas de SEQ ID NO: 55; SEQ ID NO: 56; y SEQ ID NO: 57 que corresponden a las regiones determinantes de complementariedad (CDR o regiones hipervariables) de la secuencia de cadena ligera variable de la SEQ ID NO: 51 o la secuencia de cadena ligera de la SEQ ID NO: 52.
En una realización adicional de la invención, los fragmentos del anticuerpo que tienen especificidad de unión con CGRP comprenden, o como alternativa consisten en, una o más de las secuencias polipeptídicas de SEQ ID NO: 58; SEQ ID NO: 59; y SEQ ID NO: 60 que corresponden a las regiones determinantes de complementariedad (CDR o regiones hipervariables) de la secuencia de cadena pesada variable de la SEQ ID NO: 53 o la secuencia de cadena pesada de la SEQ ID NO: 54.
La invención también contempla fragmentos de anticuerpos que incluyen uno o más de los fragmentos de anticuerpos descritos en el presente documento. En una realización de la invención, los fragmentos de los anticuerpos que tienen especificidad de unión con CGRP comprenden, o como alternativa consisten en, uno, dos, tres o más, incluyendo todos los siguientes fragmentos de anticuerpos: la región de cadena ligera variable de la SEQ ID NO: 51; la región de cadena pesada variable de la SEQ ID NO: 53; las regiones determinantes de complementariedad (SEQ ID NO: 55; SEQ ID NO: 56; y SEQ ID NO: 57) de la región de cadena ligera variable de la SEQ ID NO: 51; y las regiones determinantes de complementariedad (SEQ ID NO: 58; SEQ ID NO: 59; y SEQ ID NO: 60) de la región de cadena pesada variable de la SEQ ID NO: 53.
En una realización particularmente preferida de la invención, el anticuerpo anti CGRP humanizado es Ab6, que comprende, o como alternativa que consiste en, SEQ ID NO: 52 y SEQ ID NO: 54, y que tiene al menos una de las actividades biológicas expuestas en el presente documento.
En una realización adicional particularmente preferente de la invención, los fragmentos de anticuerpo comprenden, o como alternativa consisten en, fragmentos Fab (fragmento de unión a antígeno) que tienen especificidad de unión por CGRP. Con respecto al anticuerpo Ab6, el fragmento Fab incluye la secuencia de cadena ligera variable de la SEQ ID NO: 51 y la secuencia de cadena pesada variable de la SEQ ID NO: 53. Esta realización de la invención contempla además adiciones, supresiones y variantes de la SEQ ID NO: 51 y/o la SEQ ID NO: 53 en dicho Fab conservando al mismo tiempo la especificidad de unión por CGRP.
En una realización de la invención descrita en el presente documento (posteriormente), Pueden producirse fragmentos Fab mediante digestión enzimática (por ejemplo, papaína) de Ab6. En otra realización de la invención, pueden producirse anticuerpos anti CGRP tales como Ab6 o fragmentos Fab de los mismos mediante expresión en células de mamífero tales como células CHO, NSO o HEK 293, sistemas fúngicos, de insectos o microbianos tales como células de levadura (por ejemplo levadura diploide tal como Pichia diploide) y otras cepas de levadura. Las especies de Pichia adecuadas incluyen, pero sin limitación, Pichia pastoris.
Anticuerpo Ab7
En una realización, la divulgación incluye anticuerpos quiméricos que tienen especificidad de unión con CGRP y que poseen una secuencia de cadena ligera variable que comprende la secuencia expuesta a continuación:
QVLTQTASPVSAAVGSTVTINCQASQSVYNYNYLAW YQQKPGQPPKQLIYSTSTL
A SG V SSRFK G SG SG TQ FTLTISD V Q C D D A A TY Y C LG SY D CSTG D C FV FG G G TEW
VK R (SEQ ID NO: 61).
La divulgación también incluye anticuerpos quiméricos que tienen especificidad de unión con CGRP y que poseen una secuencia de cadena ligera que comprende la secuencia expuesta a continuación:
QV LTQ TASPVSAAVGSTVTINCQASQSVYNYNYLAW YQQKPGQPPKQLIYSTSTL
A SG V SSRFK G SG SG TQ FTLTISD V Q C D D A A TY Y C LG SY D CSTG D C FV FG G G TEW
VK RT VAAP S VFIFPP SDEQLKS GT AS W CLLNNF YPRE AK V Q W KVDN ALQ S GN S Q
ESV TEQ DSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
(SEQ ID NO: 62).
La divulgación incluye además anticuerpos quiméricos que tienen especificidad de unión con CGRP y que poseen una secuencia de cadena pesada variable que comprende la secuencia expuesta a continuación:
Q EQ LK ESG G RLV TPG TSLTLTCTV SG ID LSN H Y M Q W V RQ A PG K G LEW IG W G IN G
RTYYA SW AKGRFTISRTSSTTVDLKM TRLTTEDTATYFCARGDIW GPGTLVTVSS
(SEQ ID NO: 63).
La divulgación también incluye anticuerpos quiméricos que tienen especificidad de unión con CGRP y que poseen una secuencia de cadena pesada que comprende la secuencia expuesta a continuación:
Q EQ LK ESG G RLV TPG TSLTLTCTV SG ID LSN H Y M Q W V RQ A PG K G LEW IG W G IN G
RTYYAS W AKGRFTISRTS STT VDLKM TRLTTEDTAT YF C A RGD IW GPGTLYT V S S A
STKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSW NSGALTSGVHTFPAVL
Q SSG LY SLSSW TV PSSSLG TQ TY IC N V N H K PSN TK V D K RV EPK SCD K TH TCPPCP
A PELLG G PSV FLFPPK PK D TLM ISRTPEV TC W V D V SH ED PEV K FN W Y V D G V EV H NAKTKPREEQYASTYRV VSV LTV LHQ DW LN GKEYKCKV SNK ALPAPIEK TISKAK
GQPREPQ VYTLPP SREEM T KN Q V S LT CL VKGF Y P SDI AVE W E SN GQPENN YKTTPP
VLDSD GSFFLYSKLTV DK SRW Q QGN VFSCSV M HEA LHN HY TQK SLSLSPGK (SEQ ID NO: 64).
La divulgación contempla además anticuerpos que comprenden una o más de las secuencias polipeptídicas de SEQ ID NO: 65; SEQ ID NO: 66; y SEQ ID NO: 67 que corresponden a las regiones determinantes de complementariedad (CDR o regiones hipervariables) de la secuencia de cadena ligera variable de la SEQ ID NO: 61 o la secuencia de cadena ligera de la SEQ ID NO: 62, y/o una o más de las secuencias polipeptídicas de SEQ ID NO: 68; SEQ ID NO: 69; y SEQ ID NO: 70 que corresponden a las regiones determinantes de complementariedad (CDR o regiones hipervariables) de la secuencia de cadena pesada variable de la SEQ ID NO: 63 o la secuencia de cadena pesada de la SEQ ID NO: 64, o combinaciones de estas secuencias polipeptídicas. En otra realización de la divulgación, los anticuerpos de la divulgación o fragmentos de los mismos comprenden, o como alternativa consisten en, combinaciones de una o más de las CDR, las secuencias de cadena pesada variable y ligera variable, y las secuencias de cadena pesada y ligera expuestas anteriormente, incluyendo todas ellas.
La divulgación también contempla fragmentos del anticuerpo que tiene especificidad de unión con CGRP. En una realización de la divulgación, los fragmentos de anticuerpo de la divulgación comprenden, o como alternativa consisten en, la secuencia polipeptídica de la SEQ ID NO: 61 o la SEQ ID NO: 62. En otra realización de la divulgación, los fragmentos de anticuerpo de la divulgación comprenden, o como alternativa consisten en, la secuencia polipeptídica de la SEQ ID NO: 63 o la SEQ ID NO: 64.
En una realización adicional de la divulgación, los fragmentos del anticuerpo que tienen especificidad de unión con CGRP comprenden, o como alternativa consisten en, una o más de las secuencias polipeptídicas de SEQ ID NO: 65; SEQ ID NO: 66; y SEQ ID NO: 67 que corresponden a las regiones determinantes de complementariedad (CDR o regiones hipervariables) de la secuencia de cadena ligera variable de la SEQ ID NO: 61 o la secuencia de cadena ligera de la SEQ ID NO: 62.
En una realización adicional de la divulgación, los fragmentos del anticuerpo que tienen especificidad de unión con CGRP comprenden, o como alternativa consisten en, una o más de las secuencias polipeptídicas de SEQ ID NO: 68; SEQ ID NO: 69; y SEQ ID NO: 70 que corresponden a las regiones determinantes de complementariedad (CDR o regiones hipervariables) de la secuencia de cadena pesada variable de la SEQ ID NO: 63 o la secuencia de cadena pesada de la SEQ ID NO: 64.
La divulgación también contempla fragmentos de anticuerpos que incluyen uno o más de los fragmentos de anticuerpos descritos en el presente documento. En una realización de la divulgación, los fragmentos de los anticuerpos que tienen especificidad de unión con CGRP comprenden, o como alternativa consisten en, uno, dos, tres o más, incluyendo todos los siguientes fragmentos de anticuerpos: la región de cadena ligera variable de la SEQ ID NO: 61; la región de cadena pesada variable de la SEQ ID NO: 63; las regiones determinantes de complementariedad (SEQ ID NO: 65; SEQ ID NO: 66; y SEQ ID NO: 67) de la región de cadena ligera variable de la SEQ ID NO: 61; y las regiones determinantes de complementariedad (SEQ ID NO: 68; SEQ ID NO: 69; y SEQ ID NO: 70) de la región de cadena pesada variable de la SEQ ID NO: 63.
En una realización particularmente preferente de la divulgación, el anticuerpo anti CGRP quimérico es Ab7, que comprende, o como alternativa que consiste en, SEQ ID NO: 62 y SEQ ID NO: 64, y que tiene al menos una de las actividades biológicas expuestas en el presente documento.
En una realización adicional particularmente preferente de la divulgación, los fragmentos de anticuerpo comprenden, o como alternativa consisten en, fragmentos Fab (fragmento de unión a antígeno) que tienen especificidad de unión por CGRP. Con respecto al anticuerpo Ab7, el fragmento Fab incluye la secuencia de cadena ligera variable de la SEQ ID NO: 61 y la secuencia de cadena pesada variable de la SEQ ID NO: 63. Esta realización de la divulgación contempla además adiciones, supresiones y variantes de la SEQ ID NO: 61 y/o la SEQ ID NO: 63 en dicho Fab conservando al mismo tiempo la especificidad de unión por CGRP.
En una realización de la divulgación descrita en el presente documento (posteriormente), Pueden producirse fragmentos Fab mediante digestión enzimática (por ejemplo, papaína) de Ab7. En otra realización de la divulgación, pueden producirse anticuerpos anti CGRP tales como Ab7 o fragmentos Fab de los mismos mediante expresión en células de mamífero tales como células CHO, NSO o HEK 293, sistemas fúngicos, de insectos o microbianos tales como células de levadura (por ejemplo levadura diploide tal como Pichia diploide) y otras cepas de levadura. Las especies de Pichia adecuadas incluyen, pero sin limitación, Pichia pastoris.
Anticuerpo Ab8
En una realización, la divulgación incluye anticuerpos humanizados que tienen especificidad de unión con CGRP y que poseen una secuencia de cadena ligera variable que comprende la secuencia expuesta a continuación:
QVLTQSPSSLSASVGDRVTINCQASQSVYNYNYLAW YQQKPGKVPKQLIYSTSTL
ASGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDVATYYCLGSYDCSTGDCFVFGGGTKVEIK
R (SEQ ID NO: 71).
La divulgación también incluye anticuerpos humanizados que tienen especificidad de unión con CGRP y que poseen una secuencia de cadena ligera que comprende la secuencia expuesta a continuación:
QV LTQ SPSSLSASVGDRVTINCQASQSVYNYNYLAW YQQKPGKVPKQLIYSTSTL
ASGV PSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDVATYYCLGSYDCSTGDCFVFGGGTKVEIK
RT VAAP S VFIFPP SDEQLKS GT AS V V CLLNNF YPRE A K V Q W KVDN ALQ S GN S QE S
VTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
(SEQ ID NO: 72).
La divulgación incluye además anticuerpos humanizados que tienen especificidad de unión con CGRP y que poseen una secuencia de cadena pesada variable que comprende la secuencia expuesta a continuación:
EV Q LV ESG G G LV Q PG G SLRLSCA V SG ID LSN H Y M Q W V RQ A PG K G LEW V G W G IN
GRTYYASW AKGRFTISRDNSKTTVYLQM NSLRAEDTAVYFCARGDIW GQGTLVT
VSS (SEQ ID NO: 73).
La divulgación también incluye anticuerpos humanizados que tienen especificidad de unión con CGRP y que poseen una secuencia de cadena pesada que comprende la secuencia expuesta a continuación:
EV QLVESGGGLVQPGGSLRLSCAVSGIDLSNHYM QW VRQAPGKGLEW VGVVGIN
GRTYYASW AKGRFTISRDNSKTTVYLQM NSLRAEDTAVYFCARGDIW GQGTLVT
V S S ASTKGP S VFPL AP S SKST S GGT AA LG CL VKD YFPEP VT VS W NS G ALT S G VHTF
PA V LQ SSG LY SLSSW TV PSSSLG TQ TY ICN V N H K PSN TK V D K R V EPK SCD K TH TC
PPC PA PELLG G PSV FLFPPK PK D TLM ISRTPEV TC V W D V SH ED PEV K FN W Y V D G V
EV H N A K TK PREEQ Y A STY RW SV LTV LH Q D W LN G K EY K CK V SN K A LPA PIEK TIS
KA KGQPREPQVYTLPPSREEM TKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEW ESNGQPENNYK
TTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRW QQGNVFSCSVM HEALHNHYTQKSLSLSPGK
(SEQ ID NO: 74).
La divulgación contempla además anticuerpos que comprenden una o más de las secuencias polipeptídicas de SEQ ID NO: 75; SEQ ID NO: 76; y SEQ ID NO: 77 que corresponden a las regiones determinantes de complementariedad (CDR o regiones hipervariables) de la secuencia de cadena ligera variable de la SEQ ID NO: 71 o la secuencia de cadena ligera de la SEQ ID NO: 72, y/o una o más de las secuencias polipeptídicas de SEQ ID NO: 78; SEQ ID NO: 79; y SEQ ID NO: 80 que corresponden a las regiones determinantes de complementariedad (CDR o regiones hipervariables) de la secuencia de cadena pesada variable de la SEQ ID NO: 73 o la secuencia de cadena pesada de la SEQ ID NO: 74, o combinaciones de estas secuencias polipeptídicas. En otra realización de la divulgación, los anticuerpos de la divulgación o fragmentos de los mismos comprenden, o como alternativa consisten en, combinaciones de una o más de las CDR, las secuencias de cadena pesada variable y ligera variable, y las secuencias de cadena pesada y ligera expuestas anteriormente, incluyendo todas ellas.
La divulgación también contempla fragmentos del anticuerpo que tiene especificidad de unión con CGRP. En una realización de la divulgación, los fragmentos de anticuerpo de la divulgación comprenden, o como alternativa consisten en, la secuencia polipeptídica de la SEQ ID NO: 71 o la SEQ ID NO: 72. En otra realización de la divulgación, los fragmentos de anticuerpo de la divulgación comprenden, o como alternativa consisten en, la secuencia polipeptídica de la SEQ ID NO: 73 o la SEQ ID NO: 74.
En una realización adicional de la divulgación, los fragmentos del anticuerpo que tienen especificidad de unión con CGRP comprenden, o como alternativa consisten en, una o más de las secuencias polipeptídicas de SEQ ID NO: 75; SEQ ID NO: 76; y SEQ ID NO: 77 que corresponden a las regiones determinantes de complementariedad (CDR o regiones hipervariables) de la secuencia de cadena ligera variable de la SEQ ID NO: 71 o la secuencia de cadena ligera de la SEQ ID NO: 72.
En una realización adicional de la divulgación, los fragmentos del anticuerpo que tienen especificidad de unión con CGRP comprenden, o como alternativa consisten en, una o más de las secuencias polipeptídicas de SEQ ID NO: 78; SEQ ID NO: 79; y SEQ ID NO: 80 que corresponden a las regiones determinantes de complementariedad (CDR o regiones hipervariables) de la secuencia de cadena pesada variable de la SEQ ID NO: 73 o la secuencia de cadena pesada de la SEQ ID NO: 74.
La divulgación también contempla fragmentos de anticuerpos que incluyen uno o más de los fragmentos de anticuerpos descritos en el presente documento. En una realización de la divulgación, los fragmentos de los anticuerpos que tienen especificidad de unión con CGRP comprenden, o como alternativa consisten en, uno, dos, tres o más, incluyendo todos los siguientes fragmentos de anticuerpos: la región de cadena ligera variable de la SEQ ID NO: 71; la región de cadena pesada variable de la SEQ ID NO: 73; las regiones determinantes de complementariedad (SEQ ID NO: 75; SEQ ID NO: 76; y SEQ ID NO: 77) de la región de cadena ligera variable de la SEQ ID NO: 71; y las regiones determinantes de complementariedad (SEQ ID NO: 78; SEQ ID NO: 79; y SEQ ID NO: 80) de la región de cadena pesada variable de la SEQ ID NO: 73.
En una realización particularmente preferente de la divulgación, el anticuerpo anti CGRP humanizado es Ab8, que comprende, o como alternativa que consiste en, SEQ ID NO: 72 y SEQ ID NO: 74, y que tiene al menos una de las actividades biológicas expuestas en el presente documento.
En una realización adicional particularmente preferente de la divulgación, los fragmentos de anticuerpo comprenden, o como alternativa consisten en, fragmentos Fab (fragmento de unión a antígeno) que tienen especificidad de unión por CGRP. Con respecto al anticuerpo Ab8, el fragmento Fab incluye la secuencia de cadena ligera variable de la SEQ ID NO: 71 y la secuencia de cadena pesada variable de la SEQ ID NO: 73. Esta realización de la divulgación contempla además adiciones, supresiones y variantes de la SEQ ID NO: 71 y/o la SEQ ID NO: 73 en dicho Fab conservando al mismo tiempo la especificidad de unión por CGRP.
En una realización de la divulgación descrita en el presente documento (posteriormente), Pueden producirse fragmentos Fab mediante digestión enzimática (por ejemplo, papaína) de Ab8. En otra realización de la divulgación, pueden producirse anticuerpos anti CGRP tales como Ab8 o fragmentos Fab de los mismos mediante expresión en células de mamífero tales como células CHO, NSO o HEK 293, sistemas fúngicos, de insectos o microbianos tales como células de levadura (por ejemplo levadura diploide tal como Pichia diploide) y otras cepas de levadura. Las especies de Pichia adecuadas incluyen, pero sin limitación, Pichia pastoris.
Anticuerpo Ab9
En una realización, la divulgación incluye anticuerpos quiméricos que tienen especificidad de unión con CGRP y que poseen una secuencia de cadena ligera variable que comprende la secuencia expuesta a continuación:
QVLTQTPSPVSAAVGSTVTINCQASQNVYNNNYLAW YQQKPGQPPKQLIYSTSTL
A SG V SSRFRG SG SG TQ FTLTISD V Q C D D A A TY Y C LG SY D CSR G D C FV FG G G TEW
V K R (SEQ ID NO: 81).
La divulgación también incluye anticuerpos quiméricos que tienen especificidad de unión con CGRP y que poseen una secuencia de cadena ligera que comprende la secuencia expuesta a continuación:
QVLTQTPSPVSAAVGSTVTINCQASQNVYNNNYLAW YQQKPGQPPKQLIYSTSTL
A SG V SSRFRG SG SG TQ FTLTISD V Q C D D A A TY Y C LG SY D CSR G D C FV FG G G TEW
VK RT VAAP S VFIFPP SDEQLKS GT AS W CLLNNF YPRE A K V Q W KVDN ALQ S GN S Q
ESV TEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
(SEQ ID NO: 82).
La divulgación incluye además anticuerpos quiméricos que tienen especificidad de unión con CGRP y que poseen una secuencia de cadena pesada variable que comprende la secuencia expuesta a continuación:
QSLEESG GRLVTPGTPLTLTCTVSGIGLSSYYM QW VRQSPGRGLEW IGVIGSDGKT
Y Y AT W AKGRFTISKT S S TT VD LRM A SLTTED T AT YF CTRGD IW GP GTL VT V S S
(SEQ ID NO: 83).
La divulgación también incluye anticuerpos quiméricos que tienen especificidad de unión con CGRP y que poseen una secuencia de cadena pesada que comprende la secuencia expuesta a continuación:
QSLEESGGRLVTPGTPLTLTCTVSGIGLSSYYM QW VRQSPGRGLEW IGVIGSDGKT
YY AT W AKGRFTISKTS STT VDLRM ASLTTEDT ATYF CTRGDIW GPGTLVT V S S AST
KGP S VFPL AP S SKST S GGT AALGCLVKD YFPEP VT V S W N S G ALTS G VHTFP A VLQ S
SGFY SFS S W T VPS S SFGT QTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSCDKTHT CPPCP APE
FFG G PSV FFFPPK PK D TFM ISRTPEV TCV W D V SH ED PEV K FN W Y V D G V EV H N A K
TK PREEQ Y A STY RW SV FTV FH Q D W FN G K EY K C K V SN K A FPA PIEK TISK A K G Q P
REPQVYTFPPSREEM TKN QV SFTCFVK GFY PSD IA VEW ESNGQ PEN NY KTTPPVFD
SD G SFFFYSKLTV DK SRW Q QGN VFSCSV M HEA FHN HY TQK SFSFSPG K (SEQ ID
NO: 84).
La divulgación contempla además anticuerpos que comprenden una o más de las secuencias polipeptídicas de SEQ ID NO: 85; SEQ ID NO: 86; y SEQ ID NO: 87 que corresponden a las regiones determinantes de complementariedad (CDR o regiones hipervariables) de la secuencia de cadena ligera variable de la SEQ ID NO: 81 o la secuencia de cadena ligera de la SEQ ID NO: 82, y/o una o más de las secuencias polipeptídicas de SEQ ID NO: 88; SEQ ID NO: 89; y SEQ ID NO: 90 que corresponden a las regiones determinantes de complementariedad (CDR o regiones hipervariables) de la secuencia de cadena pesada variable de la SEQ ID NO: 83 o la secuencia de cadena pesada de la SEQ ID NO: 84, o combinaciones de estas secuencias polipeptídicas. En otra realización de la divulgación, los anticuerpos de la divulgación o fragmentos de los mismos comprenden, o como alternativa consisten en, combinaciones de una o más de las CDR, las secuencias de cadena pesada variable y ligera variable, y las secuencias de cadena pesada y ligera expuestas anteriormente, incluyendo todas ellas.
La divulgación también contempla fragmentos del anticuerpo que tiene especificidad de unión con CGRP. En una realización de la divulgación, los fragmentos de anticuerpo de la divulgación comprenden, o como alternativa consisten en, la secuencia polipeptídica de la SEQ ID NO: 81 o la SEQ ID NO: 82. En otra realización de la divulgación, los fragmentos de anticuerpo de la divulgación comprenden, o como alternativa consisten en, la secuencia polipeptídica de la SEQ ID NO: 83 o la SEQ ID NO: 84.
En una realización adicional de la divulgación, los fragmentos del anticuerpo que tienen especificidad de unión con CGRP comprenden, o como alternativa consisten en, una o más de las secuencias polipeptídicas de SEQ ID NO: 85; SEQ ID NO: 86; y SEQ ID NO: 87 que corresponden a las regiones determinantes de complementariedad (CDR o regiones hipervariables) de la secuencia de cadena ligera variable de la SEQ ID NO: 81 o la secuencia de cadena ligera de la SEQ ID NO: 82.
En una realización adicional de la divulgación, los fragmentos del anticuerpo que tienen especificidad de unión con CGRP comprenden, o como alternativa consisten en, una o más de las secuencias polipeptídicas de SEQ ID NO: 88; SEQ ID NO: 89; y SEQ ID NO: 90 que corresponden a las regiones determinantes de complementariedad (CDR o regiones hipervariables) de la secuencia de cadena pesada variable de la SEQ ID NO: 83 o la secuencia de cadena pesada de la SEQ ID NO: 84.
La divulgación también contempla fragmentos de anticuerpos que incluyen uno o más de los fragmentos de anticuerpos descritos en el presente documento. En una realización de la divulgación, los fragmentos de los anticuerpos que tienen especificidad de unión con CGRP comprenden, o como alternativa consisten en, uno, dos, tres o más, incluyendo todos los siguientes fragmentos de anticuerpos: la región de cadena ligera variable de la SEQ ID NO: 81; la región de cadena pesada variable de la SEQ ID NO: 83; las regiones determinantes de complementariedad (SEQ ID NO: 85; SEQ ID NO: 86; y SEQ ID NO: 87) de la región de cadena ligera variable de la SEQ ID NO: 81; y las regiones determinantes de complementariedad (SEQ ID NO: 88; SEQ ID NO: 89; y SEQ ID NO: 90) de la región de cadena pesada variable de la SEQ ID NO: 83.
En una realización particularmente preferente de la divulgación, el anticuerpo anti CGRP quimérico es Ab9, que comprende, o como alternativa que consiste en, SEQ ID NO: 82 y SEQ ID NO: 84, y que tiene al menos una de las actividades biológicas expuestas en el presente documento.
En una realización adicional particularmente preferente de la divulgación, los fragmentos de anticuerpo comprenden, o como alternativa consisten en, fragmentos Fab (fragmento de unión a antígeno) que tienen especificidad de unión por CGRP. Con respecto al anticuerpo Ab9, el fragmento Fab incluye la secuencia de cadena ligera variable de la SEQ ID NO: 81 y la secuencia de cadena pesada variable de la SEQ ID NO: 83. Esta realización de la divulgación contempla además adiciones, supresiones y variantes de la SEQ ID NO: 81 y/o la SEQ ID NO: 83 en dicho Fab conservando al mismo tiempo la especificidad de unión por CGRP.
En una realización de la divulgación descrita en el presente documento (posteriormente), Pueden producirse fragmentos Fab mediante digestión enzimática (por ejemplo, papaína) de Ab9. En otra realización de la divulgación, pueden producirse anticuerpos anti CGRP tales como Ab9 o fragmentos Fab de los mismos mediante expresión en células de mamífero tales como células CHO, NSO o HEK 293, sistemas fúngicos, de insectos o microbianos tales como células de levadura (por ejemplo levadura diploide tal como Pichia diploide) y otras cepas de levadura. Las especies de Pichia adecuadas incluyen, pero sin limitación, Pichia pastoris.
Anticuerpo Ab10
En una realización, la divulgación incluye anticuerpos humanizados que tienen especificidad de unión con CGRP y que poseen una secuencia de cadena ligera variable que comprende la secuencia expuesta a continuación:
QV LTQ SPSSLSASVGDRVTINCQASQNVYNNNYLAW YQQKPGKVPKQLIYSTSTL
ASGV PSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDVATYYCLGSYDCSRGDCFVFGGGTKVEIK
R (SEQ ID NO: 91).
La divulgación también incluye anticuerpos humanizados que tienen especificidad de unión con CGRP y que poseen una secuencia de cadena ligera que comprende la secuencia expuesta a continuación:
QV LTQ SPSSLSASVGDRVTINCQASQNVYNNNYLAW YQQKPGKVPKQLIYSTSTL
ASGV PSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDVATYYCLGSYDCSRGDCFVFGGGTKVEIK
RT VAAP S VFIFPP SDEQLKS GT AS W CLLNNF YPRE AKVQ W KVDN ALQ S GN S QE S
VTEQD SKD STYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
(SEQ ID NO: 92).
La divulgación incluye además anticuerpos humanizados que tienen especificidad de unión con CGRP y que poseen una secuencia de cadena pesada variable que comprende la secuencia expuesta a continuación:
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAVSGIGLSSYYM QW VRQAPGKGLEW VGVIGSD
GKTYYATW AKGRFTISRDNSKTTVYLQM NSLRAEDTAVYFCTRGDIW GQGTLVT
VSS (SEQ ID NO: 93).
La divulgación también incluye anticuerpos humanizados que tienen especificidad de unión con CGRP y que poseen una secuencia de cadena pesada que comprende la secuencia expuesta a continuación:
EV QLV ESGGGLVQPGGSLRLSCAVSGIGLSSYYM QW VRQAPGKGLEW VGVIGSD
GK TYYATW AKGRFTISRDNSKTTVYLQM NSLRAEDTAVYFCTRGDIW GQGTLVT
V S S ASTKGP S V FPL AP S SKST S GGT A A LGCL VKD YFPEP VT VS W NS G ALT S G VHTF
P AVLQ S S GLY S LS S V VT VP S S SLGT QTYICN VNHKP SNTKVDKRVEPKS CDKTHT C
PPCPA PELLG G PSV FLFPPK PK D TLM ISRTPEV TC W V D V SH ED PEY K FN W Y V D G V
EV H N A K TK PR EEQ Y A STY RW SV LTV LH Q D W LN G K EY K CK V SN K A LPA PIEK TIS
KA KG QPREPQ VYTLPPSREEM TK NQ VSLTCLV KGFYPSDIAVEW ESNG QPEN NY K
TTPPVLDSDGSFFLYSK LTV DK SRW QQ GN VFSCSV M H EALHN HYTQKSLSLSPGK
(SEQ ID NO: 94).
La divulgación contempla además anticuerpos que comprenden una o más de las secuencias polipeptídicas de SEQ ID NO: 95; SEQ ID NO: 96; y SEQ ID NO: 97 que corresponden a las regiones determinantes de complementariedad (CDR o regiones hipervariables) de la secuencia de cadena ligera variable de la SEQ ID NO: 91 o la secuencia de cadena ligera de la SEQ ID NO: 92, y/o una o más de las secuencias polipeptídicas de SEQ ID NO: 98; SEQ ID NO: 99; y SEQ ID NO: 100 que corresponden a las regiones determinantes de complementariedad (CDR o regiones hipervariables) de la secuencia de cadena pesada variable de la SEQ ID NO: 93 o la secuencia de cadena pesada de la SEQ ID NO: 94, o combinaciones de estas secuencias polipeptídicas. En otra realización de la divulgación, los anticuerpos de la divulgación o fragmentos de los mismos comprenden, o como alternativa consisten en, combinaciones de una o más de las CDR, las secuencias de cadena pesada variable y ligera variable, y las secuencias de cadena pesada y ligera expuestas anteriormente, incluyendo todas ellas.
La divulgación también contempla fragmentos del anticuerpo que tiene especificidad de unión con CGRP. En una realización de la divulgación, los fragmentos de anticuerpo de la divulgación comprenden, o como alternativa consisten en, la secuencia polipeptídica de la SEQ ID NO: 91 o la SEQ ID NO: 92. En otra realización de la divulgación, los fragmentos de anticuerpo de la divulgación comprenden, o como alternativa consisten en, la secuencia polipeptídica de la SEQ ID NO: 93 o la SEQ ID NO: 94.
En una realización adicional de la divulgación, los fragmentos del anticuerpo que tienen especificidad de unión con CGRP comprenden, o como alternativa consisten en, una o más de las secuencias polipeptídicas de SEQ ID NO: 95; SEQ ID NO: 96; y SEQ ID NO: 97 que corresponden a las regiones determinantes de complementariedad (CDR o regiones hipervariables) de la secuencia de cadena ligera variable de la SEQ ID NO: 91 o la secuencia de cadena ligera de la SEQ ID NO: 92.
En una realización adicional de la divulgación, los fragmentos del anticuerpo que tienen especificidad de unión con CGRP comprenden, o como alternativa consisten en, una o más de las secuencias polipeptídicas de SEQ ID NO: 98; SEQ ID NO: 99; y SEQ ID NO: 100 que corresponden a las regiones determinantes de complementariedad (CDR o regiones hipervariables) de la secuencia de cadena pesada variable de la SEQ ID NO: 93 o la secuencia de cadena pesada de la SEQ ID NO: 94.
La divulgación también contempla fragmentos de anticuerpos que incluyen uno o más de los fragmentos de anticuerpos descritos en el presente documento. En una realización de la divulgación, los fragmentos de los anticuerpos que tienen especificidad de unión con CGRP comprenden, o como alternativa consisten en, uno, dos, tres o más, incluyendo todos los siguientes fragmentos de anticuerpos: la región de cadena ligera variable de la SEQ ID NO: 91; la región de cadena pesada variable de la SEQ ID NO: 93; las regiones determinantes de complementariedad (SEQ ID NO: 95; SEQ ID NO: 96; y SEQ ID NO: 97) de la región de cadena ligera variable de la SEQ ID NO: 91; y las regiones determinantes de complementariedad (SEQ ID NO: 98; SEQ ID NO: 99; y SEQ ID NO: 100) de la región de cadena pesada variable de la SEQ ID NO: 93.
En una realización particularmente preferente de la divulgación, el anticuerpo anti CGRP humanizado es Ab10, que comprende, o como alternativa que consiste en, SEQ ID NO: 92 y SEQ ID NO: 94, y que tiene al menos una de las actividades biológicas expuestas en el presente documento.
En una realización adicional particularmente preferente de la divulgación, los fragmentos de anticuerpo comprenden, o como alternativa consisten en, fragmentos Fab (fragmento de unión a antígeno) que tienen especificidad de unión por CGRP. Con respecto al anticuerpo Ab10, el fragmento Fab incluye la secuencia de cadena ligera variable de la SEQ ID NO: 91 y la secuencia de cadena pesada variable de la SEQ ID NO: 93. Esta realización de la divulgación contempla además adiciones, supresiones y variantes de la SEQ ID NO: 91 y/o la SEQ ID NO: 93 en dicho Fab conservando al mismo tiempo la especificidad de unión por CGRP.
En una realización de la divulgación descrita en el presente documento (posteriormente), Pueden producirse fragmentos Fab mediante digestión enzimática (por ejemplo, papaína) de Ab10. En otra realización de la divulgación, pueden producirse anticuerpos anti CGRP tales como Ab10 o fragmentos Fab de los mismos mediante expresión en células de mamífero tales como células CHO, NSO o HEK 293, sistemas fúngicos, de insectos o microbianos tales como células de levadura (por ejemplo levadura diploide tal como Pichia diploide) y otras cepas de levadura. Las especies de Pichia adecuadas incluyen, pero sin limitación, Pichia pastoris.
Anticuerpo Ab11
En una realización, la divulgación incluye anticuerpos quiméricos que tienen especificidad de unión con CGRP y que poseen una secuencia de cadena ligera variable que comprende la secuencia expuesta a continuación:
QV LTQTASPVSPAVGSTVTINCRASQSVYYNNYLAW YQQKPGQPPKQLIYSTSTLA
SG V SSRFK G SG SG TQ FTLTISD V Q CD D A A TY Y CLG SY D C SN G D CFV FG G G TEV W
KR (SEQ ID NO: 101).
La divulgación también incluye anticuerpos quiméricos que tienen especificidad de unión con CGRP y que poseen una secuencia de cadena ligera que comprende la secuencia expuesta a continuación:
QV LTQTASPVSPAVGSTVTINCRASQSVYYNNYLAW YQQKPGQPPKQLIYSTSTLA
SG V SSRFK G SG SG TQ FTLTISD V Q CD D A A TY Y CLG SY D CSN G D CFV FG G G TEV W
KRT VAAP S VFIFPP SDEQLKS GT AS W CLLNNF YPRE A K V Q W KVDN ALQ S GN S QE
SVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
(SEQ ID NO: 102).
La divulgación incluye además anticuerpos quiméricos que tienen especificidad de unión con CGRP y que poseen una secuencia de cadena pesada variable que comprende la secuencia expuesta a continuación:
QSLEESGGRLVTPGGSLTLTCTVSGIDVTNYYM QW VRQAPGKGLEW IGVIGVNGK
RY YASW AKGRFTISKTSSTTVDLKM TSLTTEDTATYFCARGDIW GPGTLVTVSS
(SEQ ID NO: 103).
La divulgación también incluye anticuerpos quiméricos que tienen especificidad de unión con CGRP y que poseen una secuencia de cadena pesada que comprende la secuencia expuesta a continuación:
QSLEESGGRLVTPGGSLTLTCTVSGIDVTNYYM QW VRQAPGKGLEW IGVIGVNGK
RYYASW AKGRFTISKTSSTTVDLKM TSLTTEDTATYFCARGDIW GPGTLVTVSSAS
TK GPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSW NSGALTSGVHTFPAVLQ
S S GLY SLS S V YT VP S S SLGT QT YICNVNHKP SNTKVDKRVEPKS CDKTHT CPPCP AP
ELLG G PSV FLFPPK PK D TLM ISRTPEV TCV W D V SH ED PEV K FN W Y V D G V EV H N A
KTKPREEQYASTYRVVSVLTVLHQDW LNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQ
PREPQVYTLPPSREEM TKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEW ESNGQPENNYKTTPPVL
DSDGSFFLYSKLTVDKSRW QQGNVFSCSVM HEALHNHYTQKSLSLSPGK (SEQ ID
NO: 104).
La divulgación contempla además anticuerpos que comprenden una o más de las secuencias polipeptídicas de SEQ ID NO: 105; SEQ ID NO: 106; y SeQ ID NO: 107 que corresponden a las regiones determinantes de complementariedad (CDR o regiones hipervariables) de la secuencia de cadena ligera variable de la SEQ ID NO: 101 o la secuencia de cadena ligera de la SEQ ID NO: 102, y/o una o más de las secuencias polipeptídicas de SEQ ID NO: 108; SEQ ID NO: 109; y SEQ ID NO: 110 que corresponden a las regiones determinantes de complementariedad (CDR o regiones hipervariables) de la secuencia de cadena pesada variable de la SEQ ID NO: 103 o la secuencia de cadena pesada de la SEQ ID NO: 104, o combinaciones de estas secuencias polipeptídicas. En otra realización de la divulgación, los anticuerpos de la divulgación o fragmentos de los mismos comprenden, o como alternativa consisten en, combinaciones de una o más de las CDR, las secuencias de cadena pesada variable y ligera variable, y las secuencias de cadena pesada y ligera expuestas anteriormente, incluyendo todas ellas. La divulgación también contempla fragmentos del anticuerpo que tiene especificidad de unión con CGRP. En una realización de la divulgación, los fragmentos de anticuerpo de la divulgación comprenden, o como alternativa consisten en, la secuencia polipeptídica de la SEQ ID NO: 101 o la SEQ ID NO: 102. En otra realización de la divulgación, los fragmentos de anticuerpo de la divulgación comprenden, o como alternativa consisten en, la secuencia polipeptídica de la SEQ ID NO: 103 o la SEQ ID NO: 104.
En una realización adicional de la divulgación, los fragmentos del anticuerpo que tienen especificidad de unión con CGRP comprenden, o como alternativa consisten en, una o más de las secuencias polipeptídicas de SEQ ID NO: 105; SEQ ID NO: 106; y SEQ ID NO: 107 que corresponden a las regiones determinantes de complementariedad (CDR o regiones hipervariables) de la secuencia de cadena ligera variable de la SEQ ID NO: 101 o la secuencia de cadena ligera de la SEQ ID NO: 102.
En una realización adicional de la divulgación, los fragmentos del anticuerpo que tienen especificidad de unión con CGRP comprenden, o como alternativa consisten en, una o más de las secuencias polipeptídicas de SEQ ID NO: 108; SEQ ID NO: 109; y SEQ ID NO: 110 que corresponden a las regiones determinantes de complementariedad (CDR o regiones hipervariables) de la secuencia de cadena pesada variable de la SEQ ID NO: 103 o la secuencia de cadena pesada de la SEQ ID NO: 104.
La divulgación también contempla fragmentos de anticuerpos que incluyen uno o más de los fragmentos de anticuerpos descritos en el presente documento. En una realización de la divulgación, los fragmentos de los anticuerpos que tienen especificidad de unión con CGRP comprenden, o como alternativa consisten en, uno, dos, tres o más, incluyendo todos los siguientes fragmentos de anticuerpos: la región de cadena ligera variable de la SEQ ID NO: 101; la región de cadena pesada variable de la SEQ ID NO: 103; las regiones determinantes de complementariedad (SEQ ID NO: 105; SEQ ID NO: 106; y SEQ ID NO: 107) de la región de cadena ligera variable de la SEQ ID NO: 101; y las regiones determinantes de complementariedad (SEQ ID NO: 108; SEQ ID NO: 109; y SEQ ID NO: 110) de la región de cadena pesada variable de la SEQ ID NO: 103.
En una realización particularmente preferente de la divulgación, el anticuerpo anti CGRP quimérico es Ab11, que comprende, o como alternativa que consiste en, SEQ ID NO: 102 y SEQ ID NO: 104, y que tiene al menos una de las actividades biológicas expuestas en el presente documento.
En una realización adicional particularmente preferente de la divulgación, los fragmentos de anticuerpo comprenden, o como alternativa consisten en, fragmentos Fab (fragmento de unión a antígeno) que tienen especificidad de unión por CGRP. Con respecto al anticuerpo Ab11, el fragmento Fab incluye la secuencia de cadena ligera variable de la SEQ ID NO: 101 y la secuencia de cadena pesada variable de la SEQ ID NO: 103. Esta realización de la divulgación contempla además adiciones, supresiones y variantes de la SEQ ID NO: 101 y/o la SEQ ID NO: 103 en dicho Fab conservando al mismo tiempo la especificidad de unión por CGRP.
En una realización de la divulgación descrita en el presente documento (posteriormente), Pueden producirse fragmentos Fab mediante digestión enzimática (por ejemplo, papaína) de Ab11. En otra realización de la divulgación, pueden producirse anticuerpos anti CGRP tales como Ab11 o fragmentos Fab de los mismos mediante expresión en células de mamífero tales como células CHO, NSO o HEK 293, sistemas fúngicos, de insectos o microbianos tales como células de levadura (por ejemplo levadura diploide tal como Pichia diploide) y otras cepas de levadura. Las especies de Pichia adecuadas incluyen, pero sin limitación, Pichia pastoris.
Anticuerpo Ab12
En una realización, la divulgación incluye anticuerpos humanizados que tienen especificidad de unión con CGRP y que poseen una secuencia de cadena ligera variable que comprende la secuencia expuesta a continuación:
QVLTQSPSSLSASVGD RV TINCRASQ SV YYN NY LAW YQ QK PGK VPKQLIY STSTL
ASGVPSRFSGSGSG TDFTLTISSLQ PEDV ATY YCLGSYDCSN GDCFVFGG GTK VEIK
R (SEQ ID NO: 111).
La divulgación también incluye anticuerpos humanizados que tienen especificidad de unión con CGRP y que poseen una secuencia de cadena ligera que comprende la secuencia expuesta a continuación:
QVLTQSPSSLSASVGDRVTINCRASQSVYYNNYLAW YQQKPGKVPKQLIYSTSTL
ASGV PSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDVATYYCLGSYDCSNGDCFVFGGGTKVEIK
RT VAAP S VFIFPP SDEQLKS GT AS V V CLLNNF YPRE AK V Q W KVDN ALQ S GN S QE S
VTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
(SEQ ID NO: 112).
La divulgación incluye además anticuerpos humanizados que tienen especificidad de unión con CGRP y que poseen una secuencia de cadena pesada variable que comprende la secuencia expuesta a continuación:
E V QL VE S GGGL V QP GGSLRLS C AV S GID VTN YYM Q W VRQ APGKGLE W V G VIGVN
GK RY YA SW AKGRFTISRDNSKTTVYLQM NSLRAEDTAVYFCARGDIW GQGTLVT
VSS (SEQ ID NO: 113).
La divulgación también incluye anticuerpos humanizados que tienen especificidad de unión con CGRP y que poseen una secuencia de cadena pesada que comprende la secuencia expuesta a continuación:
E V QL VE S GGGL V QP GGSLRLS CAV S GID VTN YYM Q W VRQ APGKGLE W V G VIGVN
GKRYYASW AKGRFTISRDNSKTTVYLQM NSLRAEDTAVYFCARGDIW GQGTLVT
V S S ASTKGP S V FPL AP S SKST S GGT AA LGCL VKD YFPEP VT VS WNS G ALT S G VHTF
P AYLQ S S GLY SL S S W T V P S S SLGTQTYICNVNHKP SNTKVDKRVEPKS CDKTHT C
PPC PA PELLG G PSV FLFPPK PK D TLM ISRTPEV TC V W D V SH ED PEV K FN W Y V D G V
E YHN AKT KPREEQ Y A S T Y R W S YLT YLHQD W LN GKEYKCKV SNKALP AP IEKTIS
KAKGQPREPQVYTLPPSREEM TKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEW ESNGQPENNYK
TTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRW QQGNVFSCSVM HEALHNHYTQKSLSLSPGK
(SEQ ID NO: 114).
La divulgación contempla además anticuerpos que comprenden una o más de las secuencias polipeptídicas de SEQ ID NO: 115; SEQ ID NO: 116; y SeQ ID NO: 117 que corresponden a las regiones determinantes de complementariedad (CDR o regiones hipervariables) de la secuencia de cadena ligera variable de la SEQ ID NO: 111 o la secuencia de cadena ligera de la SEQ ID NO: 112, y/o una o más de las secuencias polipeptídicas de SEQ ID NO: 118; SEQ ID NO: 119; y SEQ ID NO: 120 que corresponden a las regiones determinantes de complementariedad (CDR o regiones hipervariables) de la secuencia de cadena pesada variable de la SEQ ID NO: 113 o la secuencia de cadena pesada de la SEQ ID NO: 114, o combinaciones de estas secuencias polipeptídicas. En otra realización de la divulgación, los anticuerpos de la divulgación o fragmentos de los mismos comprenden, o como alternativa consisten en, combinaciones de una o más de las CDR, las secuencias de cadena pesada variable y ligera variable, y las secuencias de cadena pesada y ligera expuestas anteriormente, incluyendo todas ellas. La divulgación también contempla fragmentos del anticuerpo que tiene especificidad de unión con CGRP. En una realización de la divulgación, los fragmentos de anticuerpo de la divulgación comprenden, o como alternativa consisten en, la secuencia polipeptídica de la SEQ ID NO: 111 o la SEQ ID NO: 112. En otra realización de la divulgación, los fragmentos de anticuerpo de la divulgación comprenden, o como alternativa consisten en, la secuencia polipeptídica de la SEQ ID NO: 113 o la SEQ ID NO: 114.
En una realización adicional de la divulgación, los fragmentos del anticuerpo que tienen especificidad de unión con CGRP comprenden, o como alternativa consisten en, una o más de las secuencias polipeptídicas de SEQ ID NO: 115; SEQ ID NO: 116; y SEQ ID NO: 117 que corresponden a las regiones determinantes de complementariedad (CDR o regiones hipervariables) de la secuencia de cadena ligera variable de la SEQ ID NO: 111 o la secuencia de cadena ligera de la SEQ ID NO: 112.
En una realización adicional de la divulgación, los fragmentos del anticuerpo que tienen especificidad de unión con CGRP comprenden, o como alternativa consisten en, una o más de las secuencias polipeptídicas de SEQ ID NO: 118; SEQ ID NO: 119; y SEQ ID NO: 120 que corresponden a las regiones determinantes de complementariedad (CDR o regiones hipervariables) de la secuencia de cadena pesada variable de la SEQ ID NO: 113 o la secuencia de cadena pesada de la SEQ ID NO: 114.
La divulgación también contempla fragmentos de anticuerpos que incluyen uno o más de los fragmentos de anticuerpos descritos en el presente documento. En una realización de la divulgación, los fragmentos de los anticuerpos que tienen especificidad de unión con CGRP comprenden, o como alternativa consisten en, uno, dos, tres o más, incluyendo todos los siguientes fragmentos de anticuerpos: la región de cadena ligera variable de la SEQ ID NO: 111; la región de cadena pesada variable de la SEQ ID NO: 113; las regiones determinantes de complementariedad (SEQ ID NO: 115; SEQ ID NO: 116; y SEQ ID NO: 117) de la región de cadena ligera variable de la SEQ ID NO: 111; y las regiones determinantes de complementariedad (SEQ ID NO: 118; SEQ ID NO: 119; y SEQ ID NO: 120) de la región de cadena pesada variable de la SEQ ID NO: 113.
En una realización particularmente preferente de la divulgación, el anticuerpo anti CGRP humanizado es Ab12, que comprende, o como alternativa que consiste en, SEQ ID NO: 112 y SEQ ID NO: 114, y que tiene al menos una de las actividades biológicas expuestas en el presente documento.
En una realización adicional particularmente preferente de la divulgación, los fragmentos de anticuerpo comprenden, o como alternativa consisten en, fragmentos Fab (fragmento de unión a antígeno) que tienen especificidad de unión por CGRP. Con respecto al anticuerpo Ab12, el fragmento Fab incluye la secuencia de cadena ligera variable de la SEQ ID NO: 111 y la secuencia de cadena pesada variable de la SEQ ID NO: 113. Esta realización de la divulgación contempla además adiciones, supresiones y variantes de la SEQ ID NO: 111 y/o la SEQ ID NO: 113 en dicho Fab conservando al mismo tiempo la especificidad de unión por CGRP.
En una realización de la divulgación descrita en el presente documento (posteriormente), Pueden producirse fragmentos Fab mediante digestión enzimática (por ejemplo, papaína) de Ab12. En otra realización de la divulgación, pueden producirse anticuerpos anti CGRP tales como Ab12 o fragmentos Fab de los mismos mediante expresión en células de mamífero tales como células CHO, NSO o HEK 293, sistemas fúngicos, de insectos o microbianos tales como células de levadura (por ejemplo levadura diploide tal como Pichia diploide) y otras cepas de levadura. Las especies de Pichia adecuadas incluyen, pero sin limitación, Pichia pastoris.
Anticuerpo Ab13
En una realización, la divulgación incluye anticuerpos quiméricos que tienen especificidad de unión con CGRP y que poseen una secuencia de cadena ligera variable que comprende la secuencia expuesta a continuación:
AIVM TQTPSSKSVPVGDTVTINCQASESLYNNNALAW FQQKPGQPPKRLIYDASKL
A SG V PSRFSG G G SG TQ FTLTISG V Q C D D A A TY Y C G G Y R SD SV D G V A FA G G TEV W
KR (SEQ ID NO: 121).
La divulgación también incluye anticuerpos quiméricos que tienen especificidad de unión con CGRP y que poseen una secuencia de cadena ligera que comprende la secuencia expuesta a continuación:
AIVM TQTPSSKSVPVGDTVTINCQASESLYNNNALAW FQQKPGQPPKRLIYDASKL
A SG V PSRFSG G G SG TQ FTLTISG V Q C D D A A TY Y C G G Y R SD SV D G V A FA G G TEV W
KRT VAAP S VFIFPP SDEQLKS GT AS W CLLNNF YPRE A K V Q W KVDN ALQ S GN S QE
SV TEQD SKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
(SEQ ID NO: 122).
La divulgación incluye además anticuerpos quiméricos que tienen especificidad de unión con CGRP y que poseen una secuencia de cadena pesada variable que comprende la secuencia expuesta a continuación:
QSVEESGGGLVQPEGSLTLTCTASGFDFSSNAM W W VRQAPGKGLEW IGIIYNGDG
STYYASW VNGRFSISKTSSTTVTLQLNSLTVADTATYYCARDLDLW GPGTLVTVS
S (SEQ ID NO: 123).
La divulgación también incluye anticuerpos quiméricos que tienen especificidad de unión con CGRP y que poseen una secuencia de cadena pesada que comprende la secuencia expuesta a continuación:
QSVEESGGGLVQPEGSLTLTCTASGFDFSSNAM W W VRQAPGKGLEW IGCIYNGD
GSTYYASW VNGRFSISKTSSTTVTLQLNSLTVADTATYYCARDLDLW GPGTLVTY
S S ASTKGP S VFPL AP S SKST S GGT AALGCL VKD YFPEP VT VS W NS G ALT S G YHTFP
AVLQ S S GLY S LS S W T VP S S SLGT QT YICNVNHKP SNT KVDKRVEPKS CDKTHT CP
PC PA PELLG G PSV FLFPPK PK D TLM ISR TPEV TCV W D V SH ED PEV K FN W Y V D G V E
V H N A K TK PREEQ Y A STY RW SV LTV LH Q D W LN G K EY K C K V SN K A LPA PIEK TISK
AK GQ PREPQVYTLPPSREEM TKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEW ESNGQPENNYKT
TPPVLD SDG SFFLYSK LTVD KSRW QQ GNV FSCSVM H EALH NH YTQ KSLSLSPGK
(SEQ ID NO: 124).
La divulgación contempla además anticuerpos que comprenden una o más de las secuencias polipeptídicas de SEQ ID NO: 125; SEQ ID NO: 126; y SeQ ID NO: 127 que corresponden a las regiones determinantes de complementariedad (CDR o regiones hipervariables) de la secuencia de cadena ligera variable de la SEQ ID NO: 121 o la secuencia de cadena ligera de la SEQ ID NO: 122, y/o una o más de las secuencias polipeptídicas de SEQ ID NO: 128; SEQ ID NO: 129; y SEQ ID NO: 130 que corresponden a las regiones determinantes de complementariedad (CDR o regiones hipervariables) de la secuencia de cadena pesada variable de la SEQ ID NO: 123 o la secuencia de cadena pesada de la SEQ ID NO: 124, o combinaciones de estas secuencias polipeptídicas. En otra realización de la divulgación, los anticuerpos de la divulgación o fragmentos de los mismos comprenden, o como alternativa consisten en, combinaciones de una o más de las CDR, las secuencias de cadena pesada variable y ligera variable, y las secuencias de cadena pesada y ligera expuestas anteriormente, incluyendo todas ellas.
La divulgación también contempla fragmentos del anticuerpo que tiene especificidad de unión con CGRP. En una realización de la divulgación, los fragmentos de anticuerpo de la divulgación comprenden, o como alternativa consisten en, la secuencia polipeptídica de la SEQ ID NO: 121 o la SEQ ID NO: 122. En otra realización de la divulgación, los fragmentos de anticuerpo de la divulgación comprenden, o como alternativa consisten en, la secuencia polipeptídica de la SEQ ID NO: 123 o la SEQ ID NO: 124.
En una realización adicional de la divulgación, los fragmentos del anticuerpo que tienen especificidad de unión con CGRP comprenden, o como alternativa consisten en, una o más de las secuencias polipeptídicas de SEQ ID NO: 125; SEQ ID NO: 126; y SEQ ID NO: 127 que corresponden a las regiones determinantes de complementariedad (CDR o regiones hipervariables) de la secuencia de cadena ligera variable de la SEQ ID NO: 121 o la secuencia de cadena ligera de la SEQ ID NO: 122.
En una realización adicional de la divulgación, los fragmentos del anticuerpo que tienen especificidad de unión con CGRP comprenden, o como alternativa consisten en, una o más de las secuencias polipeptídicas de SEQ ID NO: 128; SEQ ID NO: 129; y SEQ ID NO: 130 que corresponden a las regiones determinantes de complementariedad (CDR o regiones hipervariables) de la secuencia de cadena pesada variable de la SEQ ID NO: 123 o la secuencia de cadena pesada de la SEQ ID NO: 124.
La divulgación también contempla fragmentos de anticuerpos que incluyen uno o más de los fragmentos de anticuerpos descritos en el presente documento. En una realización de la divulgación, los fragmentos de los anticuerpos que tienen especificidad de unión con CGRP comprenden, o como alternativa consisten en, uno, dos, tres o más, incluyendo todos los siguientes fragmentos de anticuerpos: la región de cadena ligera variable de la SEQ ID NO: 121; la región de cadena pesada variable de la SEQ ID NO: 123; las regiones determinantes de complementariedad (SEQ ID NO: 125; SEQ ID NO: 126; y SEQ ID NO: 127) de la región de cadena ligera variable de la SEQ ID NO: 121; y las regiones determinantes de complementariedad (SEQ ID NO: 128; SEQ ID NO: 129; y SEQ ID NO: 130) de la región de cadena pesada variable de la SEQ ID NO: 123.
En una realización particularmente preferente de la divulgación, el anticuerpo anti CGRP quimérico es Ab13, que comprende, o como alternativa que consiste en, SEQ ID NO: 122 y SEQ ID NO: 124, y que tiene al menos una de las actividades biológicas expuestas en el presente documento.
En una realización adicional particularmente preferente de la divulgación, los fragmentos de anticuerpo comprenden, o como alternativa consisten en, fragmentos Fab (fragmento de unión a antígeno) que tienen especificidad de unión por CGRP. Con respecto al anticuerpo Ab13, el fragmento Fab incluye la secuencia de cadena ligera variable de la SEQ ID NO: 121 y la secuencia de cadena pesada variable de la SEQ ID NO: 123. Esta realización de la divulgación contempla además adiciones, supresiones y variantes de la SEQ ID NO: 121 y/o la SEQ ID NO: 123 en dicho Fab conservando al mismo tiempo la especificidad de unión por CGRP.
En una realización de la divulgación descrita en el presente documento (posteriormente), Pueden producirse fragmentos Fab mediante digestión enzimática (por ejemplo, papaína) de Ab13. En otra realización de la divulgación, pueden producirse anticuerpos anti CGRP tales como Ab13 o fragmentos Fab de los mismos mediante expresión en células de mamífero tales como células CHO, NSO o HEK 293, sistemas fúngicos, de insectos o microbianos tales como células de levadura (por ejemplo levadura diploide tal como Pichia diploide) y otras cepas de levadura. Las especies de Pichia adecuadas incluyen, pero sin limitación, Pichia pastoris.
Anticuerpo Ab14
En una realización, la divulgación incluye anticuerpos humanizados que tienen especificidad de unión con CGRP y que poseen una secuencia de cadena ligera variable que comprende la secuencia expuesta a continuación:
QV LTQ SPSSLSASVGDRVTINCQASQNVYNNNYLAW YQQKPGKVPKQLIYSTSTL
ASGV PSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDVATYYCLGSYDCSRGDCFVFGGGTKVEIK
R (SEQ ID NO: 131).
La divulgación también incluye anticuerpos humanizados que tienen especificidad de unión con CGRP y que poseen una secuencia de cadena ligera que comprende la secuencia expuesta a continuación:
QV LTQSPSSLSASVGDRVTINCQASQNVYNNNYLAW YQQKPGKVPKQLIYSTSTL
ASGV PSRFSGSGSG TDFTLTISSLQ PEDV ATY YCLGSYDCSRG DCFVFGG GTK VEIK
RT VAAP S VFIFPP SDEQLKS GT AS V V CLLNNF YPRE AK V Q W KVDN ALQ S GN S QE S
VTEQD SKD STY SLSSTLTLSK AD YEK HK VYA CEV THQ GLSSPV TKSFNRG EC
(SEQ ID NO: 132).
La divulgación incluye además anticuerpos humanizados que tienen especificidad de unión con CGRP y que poseen una secuencia de cadena pesada variable que comprende la secuencia expuesta a continuación:
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAVSGIGLSSYYM QW VRQAPGKGLEW VGVIGSD
GKTYYATW AKGRFTISRDNSKTTVYLQM NSLRAEDTAVYFCTRGDIW GQGTLVT
VSS (SEQ ID NO: 133).
La divulgación también incluye anticuerpos humanizados que tienen especificidad de unión con CGRP y que poseen una secuencia de cadena pesada que comprende la secuencia expuesta a continuación:
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAVSGIGLSSYYM QW VRQAPGKGLEW VGVIGSD
GKTYYATW AKGRFTISRDNSKTTVYLQM NSLRAEDTAVYFCTRGDIW GQGTLVT
VSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSW NSGALTSGVHTF
PA V FQ SSG FY SFSSW TV PSSSFG TQ TY ICN V N H K PSN TK V D A R V EPK SC D K TH TC
PPC PA PEFFG G PSV FFFPPK PK D TFM ISRTPEV TC V W D V SH ED PEV K FN W Y V D G V
EV H N A K TK PR EEQ Y A STY RW SV FTV FH Q D W FN G K EY K CK V SN K A FPA PIEK TIS
K A KG QPREPQ VYTFPPSREEM TK NQ VSFTCFV KG FYPSDIAV EW ESNG QPENN YK
TTPPVFD SD G SFFFY SK FTV D K SRW Q Q G N V FSCSV M H EA FH N H Y TQ K SFSFSPG K
(SEQ ID NO: 134).
La divulgación contempla además anticuerpos que comprenden una o más de las secuencias polipeptídicas de SEQ ID NO: 135; SEQ ID NO: 136; y SeQ ID NO: 137 que corresponden a las regiones determinantes de complementariedad (CDR o regiones hipervariables) de la secuencia de cadena ligera variable de la SEQ ID NO: 131 o la secuencia de cadena ligera de la SEQ ID NO: 132, y/o una o más de las secuencias polipeptídicas de SEQ ID NO: 138; SEQ ID NO: 139; y SEQ ID NO: 140 que corresponden a las regiones determinantes de complementariedad (CDR o regiones hipervariables) de la secuencia de cadena pesada variable de la SEQ ID NO: 133 o la secuencia de cadena pesada de la SEQ ID NO: 134, o combinaciones de estas secuencias polipeptídicas. En otra realización de la divulgación, los anticuerpos de la divulgación o fragmentos de los mismos comprenden, o como alternativa consisten en, combinaciones de una o más de las CDR, las secuencias de cadena pesada variable y ligera variable, y las secuencias de cadena pesada y ligera expuestas anteriormente, incluyendo todas ellas. La divulgación también contempla fragmentos del anticuerpo que tiene especificidad de unión con CGRP. En una realización de la divulgación, los fragmentos de anticuerpo de la divulgación comprenden, o como alternativa consisten en, la secuencia polipeptídica de la SEQ ID NO: 131 o la SEQ ID NO: 132. En otra realización de la divulgación, los fragmentos de anticuerpo de la divulgación comprenden, o como alternativa consisten en, la secuencia polipeptídica de la SEQ ID NO: 133 o la SEQ ID NO: 134.
En una realización adicional de la divulgación, los fragmentos del anticuerpo que tienen especificidad de unión con CGRP comprenden, o como alternativa consisten en, una o más de las secuencias polipeptídicas de SEQ ID NO: 135; SEQ ID NO: 136; y SEQ ID NO: 137 que corresponden a las regiones determinantes de complementariedad (CDR o regiones hipervariables) de la secuencia de cadena ligera variable de la SEQ ID NO: 131 o la secuencia de cadena ligera de la SEQ ID NO: 132.
En una realización adicional de la divulgación, los fragmentos del anticuerpo que tienen especificidad de unión con CGRP comprenden, o como alternativa consisten en, una o más de las secuencias polipeptídicas de SEQ ID NO: 138; SEQ ID NO: 139; y SEQ ID NO: 140 que corresponden a las regiones determinantes de complementariedad (CDR o regiones hipervariables) de la secuencia de cadena pesada variable de la SEQ ID NO: 133 o la secuencia de cadena pesada de la SEQ ID NO: 134.
La divulgación también contempla fragmentos de anticuerpos que incluyen uno o más de los fragmentos de anticuerpos descritos en el presente documento. En una realización de la divulgación, los fragmentos de los anticuerpos que tienen especificidad de unión con CGRP comprenden, o como alternativa consisten en, uno, dos, tres o más, incluyendo todos los siguientes fragmentos de anticuerpos: la región de cadena ligera variable de la SEQ ID NO: 131; la región de cadena pesada variable de la SEQ ID NO: 133; las regiones determinantes de complementariedad (SEQ ID NO: 135; SEQ ID NO: 136; y SEQ ID NO: 137) de la región de cadena ligera variable de la SEQ ID NO: 131; y las regiones determinantes de complementariedad (SEQ ID NO: 138; SEQ ID NO: 139; y SEQ ID NO: 140) de la región de cadena pesada variable de la SEQ ID NO: 133.
En una realización particularmente preferente de la divulgación, el anticuerpo anti CGRP humanizado es Ab14, que comprende, o como alternativa que consiste en, SEQ ID NO: 132 y SEQ ID NO: 134, y que tiene al menos una de las actividades biológicas expuestas en el presente documento.
En una realización adicional particularmente preferente de la divulgación, los fragmentos de anticuerpo comprenden, o como alternativa consisten en, fragmentos Fab (fragmento de unión a antígeno) que tienen especificidad de unión por CGRP. Con respecto al anticuerpo Ab14, el fragmento Fab incluye la secuencia de cadena ligera variable de la SEQ ID NO: 131 y la secuencia de cadena pesada variable de la SEQ ID NO: 133. Esta realización de la divulgación contempla además adiciones, supresiones y variantes de la SEQ ID NO: 131 y/o la SEQ ID NO: 133 en dicho Fab conservando al mismo tiempo la especificidad de unión por CGRP.
En una realización de la divulgación descrita en el presente documento (posteriormente), Pueden producirse fragmentos Fab mediante digestión enzimática (por ejemplo, papaína) de Ab14. En otra realización de la divulgación, pueden producirse anticuerpos anti CGRP tales como Ab14 o fragmentos Fab de los mismos mediante expresión en células de mamífero tales como células CHO, NSO o HEK 293, sistemas fúngicos, de insectos o microbianos tales como células de levadura (por ejemplo levadura diploide tal como Pichia diploide) y otras cepas de levadura. Las especies de Pichia adecuadas incluyen, pero sin limitación, Pichia pastoris.
En otra realización, pueden estar presentes fragmentos de anticuerpos en una o más de las siguientes formas no limitantes: formas de anticuerpo Fab, Fab’, F(ab’)2, Fv y Fv monocatenario. En una realización preferida, los anticuerpos anti CGRP descritos en el presente documento comprenden además la secuencia de cadena ligera constante kappa que comprende la secuencia expuesta a continuación:
VAAP S VFIFPP S DEQLKS GT AS W CLLNNF YPRE A K V Q W KVDN ALQ S GN S Q
ESVTEQDSK DSTYSLSSTLTLSKA DYEKHK VY ACEVTH QG ESSPVTK SFNRGEC
(SEQ ID NO: 283).
En otra realización preferida, los anticuerpos anti CGRP descritos en el presente documento comprenden además la secuencia polipeptídica de cadena pesada constante gamma-1 que comprende la secuencia expuesta a continuación:
ASTKGP S VFPL AP S SKST S GGT AALGCLVKD YFPEP VT VS W NS G ALT S G VH
TFP AVLQ S S GLY SLS S W T VP S S SLGT QT YICNVNHKP SNTKVDKRVEPKS CDKTH
TC PPCPA PELLG G PSV FLFPPK PK D TLM ISR TPEV TCV W D V SH ED PEV K FN W Y V D
G V EV H N A K TK PREEQ Y A STY RW SV LTV LH Q D W LN G K EY K C K V SN K A LPA PIEK
TISKAKGQPREPQVYTLPPSREEM TKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEW ESNGQPENN
YK TTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRW QQGNVFSCSVM HEALHNHYTQKSLSLSP
GK (SEQ ID NO: 284).
En otra realización, la divulgación contempla un anticuerpo anti CGRP aislado que comprende una secuencia polipeptídica de Vh seleccionada de: SEQ ID NO: 3, 13, 23, 33, 43, 53, 63, 73, 83, 93, 103, 113, 123 o 133, o una variante de las mismas; y que comprende además una secuencia polipeptídica de Vl seleccionada de: SEQ ID NO: 1, 11, 21, 31,41,51, 61, 71, 81, 91, 101, 111, 121 o 131, o una variante de las mismas, en donde uno o más de los restos de marco conservado (restos FR) en dicho polipéptido Vh o Vl se ha sustituido con otro resto de aminoácido dando como resultado un anticuerpo anti CGRP que se une específicamente con CGRP. La divulgación contempla formas humanizadas y quiméricas de estos anticuerpos. Los anticuerpos quiméricos pueden incluir un Fc procedente de regiones constantes de IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgG5, IgG6, IgG7, IgG8, IgG9, IgG10, IgG11, IgG12, IgG 13, IgG14, IgG 15, IgG 16, IgG 17, IgG18 o IgG19.
En una realización de la divulgación, los anticuerpos o polipéptidos de Vh o Vl se originan o se seleccionan de una o más poblaciones de linfocitos B de conejo antes del inicio del proceso de humanización al que se hace referencia en el presente documento.
En otra realización de la divulgación, los anticuerpos anti CGRP y fragmentos de los mismos no tienen especificidad de unión por CGRP-R. En una realización adicional de la divulgación, los anticuerpos anti CGRP y fragmentos de los mismos inhiben la asociación de CGRP con CGRP-R. En otra realización de la divulgación, los anticuerpos anti CGRP y fragmentos de los mismos inhiben la asociación de CGRP con CGRP-R y/o proteínas adicionales y/o multímeros de las mismas, y/o antagonizan los efectos biológicos de los mismos.
Como se ha indicado en el párrafo [0127] en el presente documento, los anticuerpos y fragmentos de los mismos pueden modificarse de forma posterior a la traducción para añadir restos efectores tales como conectores químicos, restos detectables tales como por ejemplo colorantes fluorescentes, enzimas, sustratos, materiales bioluminiscentes, materiales radioactivos y restos quimioluminiscentes o restos funcionales tales como por ejemplo estreptavidina, avidina, biotina, una citotoxina, un agente citotóxico y materiales radioactivos.
Los anticuerpos o fragmentos de los mismos también pueden modificarse químicamente para proporcionar ventajas adicionales tales como aumento de la solubilidad, estabilidad y tiempo en circulación (semivida in vivo) del polipéptido, o reducción de la inmunogenicidad (véase Patente de los Estados Unidos n° 4.179.337). Los restos químicos para derivatización pueden seleccionarse de polímeros solubles en agua tales como polietilenglicol, copolímeros de etilenglicol/propilenglicol, carboximetilcelulosa, dextrano, alcohol polivinílico y similares. Los anticuerpos y fragmentos de los mismos pueden modificarse en posiciones aleatorios en la molécula, o en posiciones predeterminadas en la molécula y pueden incluir uno, dos, tres o más restos químicos unidos.
El polímero puede tener cualquier peso molecular y puede ser ramificado o no ramificado. Para polietilenglicol, el peso molecular preferido es de entre aproximadamente 1 kDa y aproximadamente 100 kDa (indicando el término "aproximadamente" que en preparaciones de polietilenglicol, algunas moléculas pesarán más, algunas menos, que el peso molecular indicado) para facilidad en la manipulación y fabricación. Pueden usarse otros tamaños, dependiendo del perfil terapéutico deseado (por ejemplo, la duración de la liberación sostenida deseada, los efectos, si los hubiera, en la actividad biológica, la facilidad de la manipulación, el grado o la falta de antigenicidad y otros efectos conocidos del polietilenglicol para una proteína terapéutico o análogo). Por ejemplo, el polietilenglicol puede tener un peso molecular promedio de aproximadamente 200, 500, 1000, 1500, 2000, 2500, 3000, 3500, 4000, 4500, 5000, 5500, 6000, 6500, 7000, 7500, 8000, 8500, 9000, 9500, 10.000, 10.500, 11.000, 11.500, 12.000, 12.500, 13.000, 13.500, 14.000, 14.500, 15.000, 15.500, 16.000, 16.500, 17.000, 17.500, 18.000, 18.500, 19.000, 19.500, 20.000, 25.000, 30.000, 35.000, 40.000, 50.000, 55.000, 60.000, 65.000, 70.000, 75.000, 80.000, 85.000, 90.000, 95.000 o 100.000 kDa. Se describen polietilenglicoles ramificados, por ejemplo, en la patente de los Estados Unidos n° 5.643.575; Morpurgo et al., Appl. Biochem. Biotechnol. 56:59-72 (1996); Vorobjev et al., Nucleosides Nucleotides 18:2745-2750 (1999); y Caliceti et al., Bioconjug. Chem. 10:638-646 (1999), a cada una de cuyas divulgaciones se hace referencia.
Existen varios métodos de unión disponibles para los expertos en la materia, véase por ejemplo, documento EP 0 401 384, (acoplamiento de PEG a G-CSF), Véase también Malik et al., Exp. Hematol. 20:1028-1035 (1992) (que indica pegilación de GM-CSF usando cloruro de tresilo). Por ejemplo, el polietilenglicol puede unirse covalentemente con restos de aminoácidos mediante un grupo reactivo, tal como, un grupo amino o carboxilo libre. Son grupos reactivos aquellos con los que se puede unir una molécula de polietilenglicol activada. Los restos de aminoácidos que tienen un grupo amino libre pueden incluir restos de lisina y los restos de aminoácidos N terminales; los que tienen un grupo carboxilo libre pueden incluir restos de ácido aspártico, restos de ácido glutámico y el resto de aminoácido C terminal. Los grupos sulfhidrilo también pueden usarse como un grupo reactivo para unir las moléculas de polietilenglicol. Se prefiere para fines terapéuticos la unión en un grupo amino, tal como unión en el extremo N terminal o grupo lisina.
Como se ha sugerido anteriormente, el polietilenglicol puede unirse con proteínas mediante un enlace con cualquiera de varios restos de aminoácidos. Por ejemplo, el polietilenglicol puede unirse con polipéptidos mediante enlaces covalentes con lisina, histidina, ácido aspártico, ácido glutámico o restos de cisteína. Pueden emplearse una o más químicas de reacción para unir polietilenglicol con restos de aminoácidos específicos (por ejemplo, lisina, histidina, ácido aspártico, ácido glutámico o cisteína) o con más de un tipo de resto de aminoácido (por ejemplo, lisina, histidina, ácido aspártico, ácido glutámico, cisteína y combinaciones de los mismos).
Como alternativa, los anticuerpos o fragmentos de los mismos pueden tener semividas in vivo aumentadas mediante fusión con albúmina (incluyendo, pero sin limitación, con albúmina de suero humano recombinante o fragmentos o variantes de la misma (véase, por ejemplo, la patente de los Estados Unidos n° 5.876.969, expedida el 2 de marzo de 1999, patente de e P 0413622 y patente de los Estados Unidos n° 5.766.883, expedida el 16 de junio de 1998)) u otras proteínas sanguíneas en circulación tales como transferrina o ferritina. En una realización preferida, los polipéptidos y/o anticuerpos de la presente divulgación (incluyendo fragmentos o variantes de los mismos) se fusionan con la forma madura de albúmina de suero humano (es decir, aminoácidos 1-585 de albúmina de suero humano como se muestra en las FIG. 1 y 2 de la patente de EP 0 322 094) a la que se hace referencia. La divulgación también abarca polinucleótidos que codifican proteínas de fusión de la divulgación.
Con respecto a restos detectables, las enzimas ilustrativas adicionales incluyen, pero sin limitación, peroxidasa de rábano picante, acetilcolinesterasa, fosfatasa alcalina, beta-galactosidasa y luciferasa. Los materiales fluorescentes ilustrativos adicionales incluyen, pero sin limitación, rodamina, fluoresceína, isotiocianato de fluoresceína, umbeliferona, diclorotriazinilamina, ficoeritrina y cloruro de dansilo. Los restos quimioluminiscentes ilustrativos adicionales incluyen, pero sin limitación, luminol. Los materiales bioluminiscentes ilustrativos adicionales incluyen, pero sin limitación, luciferina y ecuorina. Los materiales radioactivos ilustrativos adicionales incluyen, pero sin limitación, yodo 125 (125I), carbono 14 (14C), azufre 35 (35S), tritio (3H) y fósforo 32 (32P).
Con respecto a restos funcionales, los agentes citotóxicos ilustrativos incluyen, pero sin limitación, metotrexato, aminopterina, 6-mercaptopurina, 6-tioguanina, citarabina, 5-fluorouracil dacarbazina; agentes alquilantes tales como mecloretamina, tiotepa clorambucilo, melfalán, carmustina (BSNU), mitomicina C, lomustina (CCNU), 1-metilnitrosourea, ciclofosfamida, mecloretamina, busulfán, dibromomanitol, estreptozotocina, mitomicina C, cisdiclorodiamina de platino (II) (DDP) cisplatino y carboplatino (paraplatino); las antraciclinas incluyen daunorrubicina (antiguamente daunomicina), doxorrubicina (adriamicina), detorrubicina, carminomicina, idarrubicina, epirrubicina, mitoxantrona y bisantreno; los antibióticos incluyen dactinomicina (actinomicina D), bleomicina, calicheamicina, mitramicina y antramicina (AMC); y agentes antimitóticos tales como los alcaloides de la vinca, vincristina y vinblastina. Otros agentes citotóxicos incluyen paclitaxel (taxol), ricina, exotoxina de pseudomonas, gemcitabina, citocalasina B, gramicidina D, bromuro de etidio, emetina, etopósido, tenopósido, colchicina, dihidroxiantracindiona, 1-deshidrotestosterona, glucocorticoides, procaína, tetracaína, lidocaína, propranolol, puromicina, procarbazina, hidroxiurea, asparaginasa, corticoesteroides, mitotano (O,P’-(DDD)), interferones, y mezclas de estos agentes citotóxicos.
Los agentes citotóxicos adicionales incluyen, pero sin limitación, agentes quimioterapéuticos tales como carboplatino, cisplatino, paclitaxel, gemcitabina, calicheamicina, doxorrubicina, 5-fluorouracilo, mitomicina C, actinomicina D, ciclofosfamida, vincristina y bleomicina. Enzimas tóxicas de plantas y bacterias tales como ricina, toxina diftérica y toxina de Pseudomonas pueden conjugarse con los anticuerpos humanizados o quiméricos, o fragmentos de unión a antígeno de los mismos, para generar reactivos de destrucción específica de tipos celulares (Youle, et al., Proc. Nat’l Acad. Sci. USA 77:5483 (1980); Gilliland, et al., Proc. Nat’l Acad. Sci. USA 77:4539 (1980); Krolick, et al., Proc. Nat’l Acad. Sci. USA 77:5419 (1980)).
Otros agentes citotóxicos incluyen ribonucleasas citotóxicas como se describen en Goldenberg en la patente de los Estados Unidos n° 6.653.104. Las realizaciones de la invención también se refieren a radioinmunoconjugados donde un radionúclido que emite partículas alfa o beta se acopla de forma estable al anticuerpo, o fragmentos de unión a antígeno del mismo, con o sin el uso de un agente formador de complejos. Dichos radionúclidos incluyen emisores beta tales como fósforo-32 (32P), escandio-47 (47Sc), cobre-67 (67Cu), galio-67 (67Ga), itrio-88 (88Y), itrio-90 (90Y), yodo-125 (125I), yodo-131 (131I), samario-153 (153Sm), lutecio-177 (177Lu), renio-186 (186Re) o renio-188 (188Re), y emisores alfa tales como astatina-211 (211At), plomo-212 (212Pb), bismuto-212 (212Bi) o -213 (213Bi) o actinio-225 (225Ac).
Se conocen en la técnica métodos para conjugar un anticuerpo o fragmento de unión del mismo con un resto detectable y similares, tales como por ejemplo los métodos descritos en Hunter et al, Nature 144:945 (1962); David et al, Biochemistry 13:1014 (1974); Pain et al, J. Immunol. Meth. 40:219 (1981); y Nygren, J., Histochem. and Cytochem. 30:407 (1982).
Las realizaciones descritas en el presente documento incluyen además equivalentes que son sustancialmente homólogos de los anticuerpos, fragmentos de anticuerpos, diacuerpos, SMIP, anticuerpos de camellos, nanocuerpos, IgNAR, polipéptidos, regiones variables y CDR expuestas en el presente documento. Estos pueden contener, por ejemplo, mutaciones de sustituciones conservativas, (es decir, la sustitución de uno o más aminoácidos por aminoácidos similares). Por ejemplo, la sustitución conservativa se refiere a la sustitución de un aminoácido con otro en la misma clase general, por ejemplo, un aminoácido ácido con otro aminoácido ácido, un aminoácido básico con otro aminoácido básico, o un aminoácido neutro por otro aminoácido neutro. Se conoce bien en la técnica lo que se entiende por una sustitución de aminoácidos conservativa.
En otra realización, la divulgación contempla secuencias polipeptídicas que tienen al menos 90 % o mayor homología de secuencias con una cualquiera o más de las secuencias polipeptídicas de fragmentos de anticuerpos, regiones variables y CDR expuestas en el presente documento. Más preferentemente, la divulgación contempla secuencias polipeptídicas que tienen al menos 95 % o mayor homología de secuencias, aún más preferentemente al menos 98 % o mayor homología de secuencias y aún más preferentemente al menos 99 % o mayor homología de secuencias con una cualquiera o más de las secuencias polipeptídicas de fragmentos de anticuerpos, regiones variables y CDR expuestas en el presente documento. Los expertos habituales en la materia conocen bien métodos para determinar la homología entre secuencias de ácido nucleico y aminoácidos.
En otra realización, la divulgación contempla además los homólogos polipeptídicos anteriormente enumerados de los fragmentos de anticuerpos, regiones variables y CDR expuestas en el presente documento que tienen además actividad anti CGRP. Se exponen en el presente documento ejemplos no limitantes de actividad anti CGRP, por ejemplo, en los párrafos [0329]-[0350] posteriores.
En otra realización, la divulgación contempla además la generación y el uso de anticuerpos antiidiotípicos que se unen con cualquiera de las secuencias anteriores. En una realización ilustrativa, dicho anticuerpo antiidiotípico podría administrarse a un sujeto que ha recibido un anticuerpo anti CGRP para modular, reducir o neutralizar, el efecto del anticuerpo anti CGRP. Dichos anticuerpos antiidiotípicos también podrían ser útiles para el tratamiento de una enfermedad autoinmunitaria caracterizada por la presencia de anticuerpos anti CGRP. Un uso ejemplar adicional de dichos anticuerpos antiidiotípicos es para la detección de los anticuerpos anti CGRP de la presente invención, por ejemplo para supervisar los niveles de los anticuerpos anti CGRP presentes en la sangre de un sujeto u otros líquidos corporales.
La presente divulgación también contempla anticuerpos anti CGRP que comprenden cualquiera de las secuencias polipeptídicas o polinucleotídicas descritas en el presente documento que sustituye cualquiera de las otras secuencias polinucleotídicas descritas en el presente documento. Por ejemplo, sin limitación a los mismos, la presente divulgación contempla anticuerpos que comprenden la combinación de cualquiera de las secuencias de cadena ligera variable y cadena pesada variable descritas en el presente documento, y contempla además anticuerpos que resultan de la sustitución de cualquiera de las secuencias de CDR descritas en el presente documento por cualquiera de las otras secuencias de CDR descritas en el presente documento.
Realizaciones ejemplares adicionales de la divulgación
En otra realización, la divulgación contempla uno o más anticuerpos anti CGRP humano o fragmentos de anticuerpos de los mismos que se unen específicamente con el mismo epítopo o epítopos lineales o conformacionales solapantes y/o compiten por la unión con el mismo epítopo o epítopos lineales o conformacionales solapantes en un polipéptido de CGRP humano intacto o fragmento del mismo como un anticuerpo anti CGRP humano seleccionado de Ab1, Ab2, Ab3, Ab4, Ab5, Ab6, Ab7, Ab8, Ab9, Ab10, Ab11, Ab12, Ab13 o Ab14. En una realización preferida, el anticuerpo anti CGRP humano o fragmento del mismo se une específicamente con el mismo epítopo o epítopos lineales o conformacionales solapantes y/o compite por la unión con el mismo epítopo o epítopos lineales o conformacionales solapantes en un polipéptido de CGRP humano intacto o un fragmento del mismo como Ab3, Ab6, Ab13 o Ab14.
Una realización preferida de la divulgación se dirige a anticuerpos quiméricos o humanizados y fragmentos de los mismos (incluyendo fragmentos Fab) que tienen especificidad de unión por CGRP y que inhiben actividades biológicas mediadas por la unión de CGRP con el receptor de CGRP. En una realización particularmente preferente de la divulgación, los anticuerpos anti CGRP quiméricos o humanizados se seleccionan de Ab3, Ab6, Ab13 o Ab14. En una realización adicional de la divulgación se contempla un método para reducir, tratar o prevenir enfermedades o trastornos asociados con CGRP afectando a las actividades biológicas mediadas por CGRP, evitando de este modo las actividades biológicas mediadas por unión de CGRP con CGRP-R. En una realización, la enfermedad o el trastorno asociado con CGRP es migraña u otro trastorno en donde CGRP induce dolor, cefalea, dolor, cáncer, vejiga hiperactiva o pérdida de peso. Un listado no limitante adicional de enfermedades y trastornos asociados con CGRP se proporciona en el presente documento.
Otra realización preferida de la divulgación contempla el uso de secuencias polipeptídicas de Fab para el tratamiento de migrañas y cefaleas en un paciente. Se proporcionan en otra parte de la presente divulgación tipos no limitantes de migrañas y cefaleas que pueden tratarse usando secuencias polipeptídicas de Fab.
En otra realización de la divulgación, el anticuerpo anti CGRP humano es un anticuerpo que se une específicamente con los mismos epítopos lineales o conformacionales solapantes en un polipéptido de CGRP intacto o fragmento del mismo que se une(n) específicamente con Ab3, Ab6, Ab13 o Ab14 como se determina por mapeo epitópico usando fragmentos peptídicos lineales solapantes que abarcan la longitud completa del polipéptido de CGRP humano nativo.
La divulgación también se dirige a un anticuerpo anti CGRP que se une con el mismo epítopo de CGRP y/o compite con un anticuerpo anti CGRP por la unión con CGRP como un anticuerpo o fragmento de anticuerpo desvelado en el presente documento, incluyendo, pero sin limitación, un anticuerpo anti CGRP seleccionado de Ab1, Ab2, Ab3, Ab4, Ab5, Ab6, Ab7, Ab8, Ab9, Ab10, Ab11, Ab12, Ab13 o Ab14.
En otra realización, la divulgación también se dirige a un anticuerpo anti CGRP aislado o fragmento de anticuerpo que comprende una o más de las CDR contenidas en las secuencias polipeptídicas de Vh seleccionadas de: 3, 13, 23, 33, 43, 53, 63, 73, 83, 93, 103, 113, 123 o 133, o una variante de las mismas, y/o una o más de las CDR contenidas en las secuencias polipeptídicas de Vl seleccionadas de: 1, 11, 21, 31,41, 51, 61, 71, 81, 91, 101, 111, 121 o 131, o una variante de las mismas.
En una realización de la divulgación, el anticuerpo anti CGRP humano analizado en los dos párrafos anteriores comprende al menos 2 regiones determinantes de complementariedad (CDR) en cada una de las regiones ligeras variables y pesadas variables que son idénticas a las contenidas en un anticuerpo anti CGRP humano de Ab1, Ab2, Ab3, Ab4, Ab5, Ab6, Ab7, Ab8, Ab9, Ab10, Ab11, Ab12, Ab13 o Ab14.
En una realización preferida, el anticuerpo anti CGRP humano analizado anteriormente comprende al menos 2 regiones determinantes de complementariedad (CDR) en cada una de las regiones ligeras variables y pesadas variables que son idénticas a las contenidas en Ab3 o Ab6. En otra realización, todas las CDR del anticuerpo anti CGRP humano analizadas anteriormente son idénticas a las CDR contenidas en un anticuerpo anti CGRP humano seleccionado de Ab1, Ab2, Ab3, Ab4, Ab5, Ab6, Ab7, Ab8, Ab9, Ab10, Ab11, Ab12, Ab13 o AM4. En una realización preferente de la divulgación, todas las CDR del anticuerpo anti CGRP humano analizadas anteriormente son idénticas a las CDR contenidas en un anticuerpo anti CGRP humano seleccionado de Ab3 o Ab6.
La divulgación contempla además que los uno o más anticuerpos anti CGRP humano discutidos anteriormente están aglucosilados; que contienen una región Fc que se ha modificado para alterar la función efectora, semivida, proteólisis y/o glucosilación; son humanos, humanizados, monocatenarios o quiméricos; y son un anticuerpo humanizado procedente de un anticuerpo anti CGRP humano de conejo (parental).
La divulgación contempla además uno o más anticuerpos anti CGRP humano en donde las regiones marco conservadas (FR) en la región ligera variable y las regiones pesadas variables de dicho anticuerpo son respectivamente FR humanas que no están modificadas o que se han modificado por la sustitución de uno o más restos de FR en la región de cadena ligera o pesada variable con los restos de FR correspondientes del anticuerpo de conejo parental y en donde dichas FR humanas se han obtenido de secuencias de anticuerpos de cadena pesada y ligera variable humana que se han seleccionado de una biblioteca de secuencias de anticuerpos de línea germinal humana basándose en su alto nivel de homología con las regiones de cadena pesada o ligera variable de conejo correspondientes en relación con otras secuencias de anticuerpos de línea germinal humana contenidas en la biblioteca.
En una realización de la invención, el anticuerpo anti CGRP humano o fragmento se une específicamente con células que expresan CGRP y/o con moléculas de CGRP solubles en circulación in vivo, incluyendo CGRP expresado en o por células humanas en un paciente con una enfermedad asociada con células que expresan CGRP.
En otra realización, la enfermedad se selecciona de migrañas (con o sin aura), pérdida de peso, cáncer o tumores, angiogénesis asociada con cáncer o crecimiento tumoral, angiogénesis asociada con cáncer o supervivencia tumoral, migrañas hemiplégicas, cefaleas en racimo, neuralgia migrañosa, cefaleas crónicas, cefaleas de tensión, cefaleas generales, sofocos, hemicránea paroxística crónica, cefaleas secundarias debidas a un problema estructural subyacente en la cabeza o el cuello, neuralgia craneal, cefaleas sinusales (tales como por ejemplo asociadas con sinusitis), cefaleas o migrañas inducidas por alergia, dolor, dolor inflamatorio, dolor por incisión postoperatorio, síndrome de dolor regional complejo, dolor de cáncer, dolor de cáncer de huesos primario o metastásico, dolor por fractura, dolor crónico, dolor por fractura osteoporótica, dolor resultante de quemadura, osteoporosis, dolor de articulaciones gotosas, dolor abdominal, dolor asociado con crisis de anemia falciforme y otros dolores nocicépticos, así como carcinoma hepatocelular, cáncer de mama, cirrosis hepática, dolor neurogénico, dolor neuropático, dolor nocicéptico, neuralgia del trigémino, neuralgia post-herpética, dolor de miembro fantasma, fibromialgia, dolor menstrual, ovarialgia, distrofia simpática refleja, dolor neurogénico, osteoartritis o dolor por artritis reumatoide, dolor dorsolumbar, neuropatía diabética, ciática, o dolor o dolor visceral asociado con: reflujo gastroesofágico, dispepsia, síndrome del intestino irritable, colon irritable, colon espástico, colitis mucosa, enfermedad inflamatoria del intestino, enfermedad de Crohn, ileítis, colitis ulcerosa, cólico renal, dismenorrea, cistitis, periodo menstrual, parto, menopausia, prostatitis, pancreatitis, cólico renal, dismenorrea, cistitis, incluyendo cistitis intersticial (CI), cirugía asociada con el íleo, diverticulitis, peritonitis, pericarditis, hepatitis, apendicitis, colitis, colecistitis, endometriosis, pancreatitis aguda y/o crónica, infarto de miocardio, dolor de riñón, dolor pleural, prostatitis, dolor pélvico, traumatismo de un órgano, dolor nociceptivo crónico, dolor neuropático crónico, dolor inflamatorio crónico, fibromialgia, dolor irruptivo y dolor persistente.
En otra realización de la invención, la enfermedad es dolor de cáncer que surge de neoplasia o de cáncer preferentemente seleccionado de uno o más de: adenocarcinoma en tejido glandular, blastoma en tejido embrionario de órganos, carcinoma en tejido epitelial, leucemia en tejidos que forman células sanguíneas, linfoma en tejido linfático, mieloma en médula ósea, sarcoma en tejido conectivo o de soporte, cáncer suprarrenal, linfoma relacionado con SIDA, anemia, cáncer de vejiga, cáncer de hueso, cáncer de cerebro, cáncer de mama, tumores carcinoides, cáncer de cuello uterino, quimioterapia, cáncer de colon, citopenia, cáncer endometrial, cáncer esofágico, cáncer gástrico, cáncer de cabeza, cáncer de cuello, cáncer hepatobiliar, cáncer de riñón, leucemia, cáncer de hígado, cáncer de pulmón, linfoma, enfermedad de Hodgkin, linfoma, no Hodgkin, tumores del sistema nervioso, cáncer oral, cáncer ovárico, cáncer pancreático, cáncer de próstata, cáncer rectal, cáncer de piel, cáncer de estómago, cáncer testicular, cáncer de tiroides, cáncer de uretra, cáncer de hueso, sarcomas del tejido conectivo, cáncer de tejido óseo, cáncer de células formadoras de sangre, cáncer de médula ósea, mieloma múltiple, leucemia, cáncer de hueso primario o secundario, tumores que metastatizan al hueso, tumores que se infiltran en el nervio y víscera hueca, tumores cerca de estructuras neurales. Preferentemente además el dolor de cáncer comprende dolor visceral, preferentemente dolor visceral que surge de cáncer pancreático y/o metástasis en el abdomen. Preferentemente además el dolor de cáncer comprende dolor somático, preferentemente dolor somático debido a uno o más de cáncer de hueso, metástasis en el hueso, dolor postquirúrgico, sarcomas del tejido conectivo, cáncer de tejido óseo, cáncer de células formadoras de sangre de la médula ósea, mieloma múltiple, leucemia, cáncer de hueso primario o secundario.
La divulgación contempla además anticuerpos anti CGRP humano o fragmentos directa o indirectamente unidos a un marcador detectable o agente terapéutico.
La divulgación también contempla una o más secuencias de ácido nucleico que da como resultado la expresión de un anticuerpo anti CGRP humano o fragmento de anticuerpo como se describe anteriormente, incluyendo los que comprenden, o como alternativa que consisten en, codones preferidos por levadura o ser humano. La divulgación también contempla vectores (incluyendo plásmidos o vectores víricos recombinantes) que comprenden dicha secuencia o secuencias de ácido nucleico. La divulgación también contempla células hospedadoras o células hospedadoras recombinantes que expresan al menos uno de los anticuerpos descritos anteriormente, incluyendo células de mamífero, de levadura, bacterianas y de insecto. En una realización preferida, la célula hospedadora es una célula de levadura. En una realización preferente adicional, la célula de levadura es una célula de levadura diploide. En una realización más preferida, la célula de levadura es una levadura Pichia.
La divulgación también contempla un método de tratamiento que comprende administrar a un paciente con una enfermedad o afección asociada con células que expresan CGRP una cantidad terapéuticamente eficaz de al menos un anticuerpo anti CGRP humano o fragmento descrito en el presente documento. La divulgación también contempla que el método de tratamiento puede implicar la administración de dos o más anticuerpos anti CGRP o fragmentos de los mismos y desvelados en el presente documento. Si se administra más de un anticuerpo al paciente, los múltiples anticuerpos pueden administrarse de forma simultánea o concurrente, o pueden escalonarse en su administración. Las enfermedades que pueden tratarse se presentan en la lista no limitante expuesta anteriormente y en otra parte del presente documento. En una realización preferida, la enfermedad se selecciona de migraña, cefalea, pérdida de peso, dolor, dolor de cáncer o dolor neuropático. En otra realización el tratamiento incluye además la administración de otro agente terapéutico o régimen seleccionado de quimioterapia, radioterapia, administración de citocinas o terapia génica.
En una realización no limitante de la invención, otro agente terapéutico o régimen incluye Taxol (paclitaxel) o sus derivados, compuestos de platino tales como carboplatino o cisplatino, antrociclinas tales como doxorrubicina, agentes alquilantes tales como ciclofosfamida, antimetabolitos tales como 5-fluorouracilo o etopósido.
La divulgación contempla además un método de captura de imágenes in vivo que detecta la presencia de células que expresan CGRP que comprende administrar una cantidad eficaz para el diagnóstico de al menos un anticuerpo anti CGRP humano. En una realización, dicha administración incluye la administración de un radionúclido o fluoróforo que facilita la detección del anticuerpo en sitios de enfermedad que expresan CGRP. En una realización adicional, los resultados de dicho método de captura de imágenes in vivo se usan para facilitar el diseño de un régimen terapéutico apropiado, incluyendo regímenes terapéuticos incluyendo radioterapia, quimioterapia o una combinación de los mismos.
La actividad anti CGRP de los anticuerpos anti CGRP de la presente invención, y fragmentos de los mismos, que tienen especificidad de unión con CGRP, también pueden describirse por su fuerza de unión o su afinidad por CGRP. En una realización de la invención, los anticuerpos anti CGRP de la presente invención, y fragmentos de los mismos, que tienen especificidad de unión con CGRP, se unen con CGRP con una constante de disociación (KD) de menos de o igual a 5x10-7 M, 10-7 M, 5x10-8 M, 10-8 M, 5x10-9 M, 10-9 M, 5x10-10 M, 10-10 M, 5x10-11 M, 10-11 M, 5x10-12 M, 10-12 M, 5x10-13 M o 10-13 M. Preferentemente, los anticuerpos anti CGRP y fragmentos de los mismos se unen con CGRP con una constante de disociación de menos de o igual a 10-11 M, 5x10-12 M o 10-12 M. En otra realización de la invención, los anticuerpos anti CGRP de la presente invención, y fragmentos de los mismos, que tienen especificidad de unión con CGRP, se unen con un epítopo de CGRP lineal o conformacional.
En otra realización de la invención, la actividad anti CGRP de los anticuerpos anti CGRP de la presente invención y fragmentos de los mismos que tienen especificidad de unión con CGRP, se unen con CGRP con una velocidad de disociación de menos de o igual a 10-4 S-1,5x10-5 S-1, 10-5 S-1, 5x10-6 S-1, 10-6 S-1,5x10-7 S-1 o 10-7 S-1.
En una realización adicional de la invención, la actividad anti CGRP de los anticuerpos anti CGRP de la presente invención, y fragmentos de los mismos que tienen especificidad de unión con CGRP, muestra actividad anti CGRP previniendo, aliviando o reduciendo los síntomas de, o como alternativa tratando, enfermedades y trastornos asociados con CGRP. Se exponen en el presente documento ejemplos no limitantes de enfermedades y trastornos asociados con CGRP.
Polinucleótidos que codifican polipéptidos de anticuerpos anti CGRP
Anticuerpo Ab1
La divulgación se dirige además a polinucleótidos que codifican polipéptidos de anticuerpos que tienen especificidad de unión con CGRP. En una realización de la divulgación, los polinucleótidos de la divulgación comprenden, o como alternativa consisten en, la siguiente secuencia polinucleotídica que codifica la secuencia polipeptídica de cadena ligera variable de la SEQ ID NO: 1:
CAAGT GCT GACCC AGACT GC ATCCCCCGT GT CT GC AGCT GT GGGAAGC A
C AGT CACCATC AA TT GCC AGGCC AGT CAG AGT GTTTAT GAT AA CAACTACCT A
GCCT GGT AT CAGCAGAAACC AGGGC AGCCT CCCAAGCAACT GAT CT ATTCT AC
AT CCACT CT GGCAT CT GGGGT CT C AT CGCGGTT CAAAGGC AGT GGATCT GGGA
C ACAGTT C ACT CTC ACC AT CAGCGACCTGGAGT GT GCCGAT GCT GCCACTTACT
ACT GT CT AG GC AG TT AT G ATT GT AGT AGT GGT G ATT GTTTT GTTTT CGGCGG AG
GG ACCG AGGT GGT GGT CAAAC GT (SEQ ID NO: 141).
En una realización de la divulgación, los polinucleótidos de la divulgación comprenden, o como alternativa consisten en, la siguiente secuencia polinucleotídica que codifica la secuencia polipeptídica de cadena ligera de la SEQ ID NO: 2:
CAAGT GCT GACCC AGACTGCAT CCCCCGT GT CT GC AGCTGT GGGAAGC A
C AGT CACCATCAATT GCC AGGCC AGT CAG AGT GTTTAT GAT AACAACTACCT A
GCCT GGT AT CAGCAGAAACC AGGGC AGCCT CCCAAGCAACT GAT CT ATTCT AC
AT CCACT CT GGC AT CT GGGGTCT CAT CGCGGTT CAAAGGC AGT GGAT CT GGGA
CACAGTT CACT CT CACC AT CAGCGACCT GGAGT GT GCCGAT GCT GCC ACTT ACT
ACT GT CT A G GC AGTT AT G ATT GT AGT AGT GGT G ATT GTTTT GTTTT CGGCGG AG
GGACCGAGGT GGT GGT CAAACGT ACGGTGGCT GC ACC AT CT GT CTT CAT CTTCC
CGCCAT CT GAT GAGC AGTTGAAAT CT GGAACT GCCT CT GTT GTGTGCCT GCT GA
AT AACTT CT AT CCCAGAG AGGCC AAAGT AC AGT GGAAGGT GGAT AACGCCCT C
CAATCGGGTAACTCCCAGGAGAGTGTCACAGAGCAGGACAGCAAGGACAGCA
CCTACAGCCTCAGCAGCACCCTGACGCTGAGCAAAGCAGACTACGAGAAACAC
AAAGT CT ACGCCTGCGAAGT CACCC AT CAGGGCCT GAGCT CGCCCGTC ACAA A
GAGCTT CAAC AGGGGAGAGT GTT AG (SEQ ID NO: 142).
En otra realización de la divulgación, los polinucleótidos de la divulgación comprenden, o como alternativa consisten en, la siguiente secuencia polinucleotídica que codifica la secuencia polipeptídica de cadena pesada variable de la SEQ ID NO: 3:
CAGT CGCT GGAGGAGT CCGGGGGTCGCCTGGT CACGCCT GGGAC ACCCC
T G AC ACT C ACCT GC AC AGT CT CTGG ACT CG ACCT C AGT AGCT ACT AC AT GC A AT GGGTCCGCCAGGCTCCAGGGAAGGGGCTGGAATGGATCGGAGTCATTGGTATT AATGATAACACATACTACGCGAGCTGGGCGAAAGGCCGATTCACCATCTCCAG AGCCTCGTCGACCACGGT GGATCTGAAAAT GACCAGTCTGACAACCGAGGACA CGGCC ACCT ATTTCT GT GCC AGAGGGGAC AT CT GGGGCCCAGGCACCCT CGTC ACCGTCTCGAGC (SEQ ID NO: 143).
En una realización de la divulgación, los polinucleótidos de la divulgación comprenden, o como alternativa consisten en, la siguiente secuencia polinucleotídica que codifica la secuencia polipeptídica de cadena pesada de la SEQ ID NO: 4:
CA GTCGCTGG AG GAGTCCGGGGGTCGCCTGGTCACGCCTGGGACACCCCTGAC
ACT C ACCT GC AC AGT CT CT GG ACT CG ACCT C AGT AGCT ACT AC AT GC A ATGGGT
CCGCCAGGCT CC AGGGAAGGGGCT GGAATGGAT CGGAGTC ATTGGT ATT AAT G
AT AACAC AT ACT ACGCGAGCT GGGCGAAAGGCCGATT CACCAT CT CC AGAGCC
T CGT CG ACC ACGGT GG AT CT G AAAAT G ACC AGT CT G AC AACCG AG G AC ACGGC
CA CCTATTTCTG TGCCAGAGGGGACATCTGGGGCCCAGGCACCCTCGTCACCG
T CTCGAGCGCCT CC ACCA AGGGCCCATCGGT CTT CCCCCTGGCACCCT CCTCCA
AGAGCACCT CT GGGGGC ACAGCGGCCCT GGGCT GCCTGGT CAAGGACT ACTT C
CCCGAACCGGT GACGGT GT CGT GGAACT CAGGCGCCCT GACCAGCGGCGT GC A
CACCTTCCCGGCTGTCCT AC AGT CCT CAGGACT CTACT CCCT C AGCAGCGT GGT
GA CCGTG CCCTCCAGCAGCTTGGGCACCCAGACCTACATCTGCAACGTGAATC
AC AAGCCCAGC AACACCAAGGT GGACAAGAG AG TTG AG CCCAA AT CTT GT GA
C AAAACT C AC AC AT GCCC ACCGT GCCC AGC AC CT GAACT C CT GGGGGG ACCGT
CAGT CTT CCT CTT CCCCCC AAAACCCAA GG ACA CCCTC AT GAT CTCCCGGACCC
CTG AGGT CACAT GCGT GGT GGT GGACGTGAGCCACGAAGACCCT GAGGTCAAG
TTCAA CTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCATAATGCCAAGACAAAGCCGCG
GG AG GA GCA GTACGCCAGCACGTACCGTGTGGTCAGCGTCCTCACCGTCCTGC
ACC AG G ACT GGCT GAAT GGC AAGG AGT AC AAGTGCAAGGT CT CCAAC AAAGC
CCTCCCA GCCCCCATCGAGAAAACCATCTCCAAAGCCAAAGGGCAGCCCCGAG
AA CCACA GG TGTACA CCCTGCCCCCATCCCGGGAGGAGATGACCAAGAACCAG
GTCAG CCTGA CCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTATCCCAGCGACATCGCCGTGGA
GTGGG AGAGCAATGGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGACCACGCCTCCCGTG
CT GG ACT CCGACGGCTCCTT CTTCCT CT ACAGC AAGCT C ACCGT GGACAAGAGC
AGGT GGC AGCAGGGGAACGT CTT CT C AT GCTCCGT GATGC AT GAGGCT CTGCA
CA ACCACTACACGCAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCCGGGTAAATGA (SEQ ID
NO: 144).
En una realización adicional de la divulgación, los polinucleótidos que codifican fragmentos de anticuerpo que tienen especificidad de unión con CGRP comprenden, o como alternativa consisten en, una o más de las secuencias polinucleotídicas de SEQ ID NO: 145; s Eq ID NO: 146; y SEQ ID NO: 147 que corresponden a polinucleótidos que codifican las regiones determinantes de complementariedad (CDR o regiones hipervariables) de la secuencia variable de cadena ligera de la SEQ ID NO: 1 o la secuencia de cadena ligera de la SEQ ID NO: 2.
En una realización adicional de la divulgación, los polinucleótidos que codifican fragmentos de anticuerpo que tienen especificidad de unión con CGRP comprenden, o como alternativa consisten en, una o más de las secuencias polinucleotídicas de SEQ ID NO: 148; s Eq ID NO: 149; y SEQ ID NO: 150 que corresponden a polinucleótidos que codifican las regiones determinantes de complementariedad (CDR o regiones hipervariables) de la secuencia variable de cadena pesada de la SEQ ID NO: 3 o la secuencia de cadena pesada de la SEQ ID NO: 4.
La divulgación también contempla secuencias polinucleotídicas que incluyen una o más de las secuencias polinucleotídicas que codifican fragmentos de anticuerpos descritos en el presente documento. En una realización de la divulgación, los polinucleótidos que codifican fragmentos de anticuerpo que tienen especificidad de unión con CGRP comprenden, o como alternativa consisten en, uno, dos, tres o más, incluyendo todos los siguientes polinucleótidos que codifican fragmentos de anticuerpos: el polinucleótido SEQ ID NO: 141 que codifica la secuencia variable de cadena ligera de la SEQ ID NO: 1; el polinucleótido SEQ ID NO: 142 que codifica la secuencia de cadena ligera de la SEQ ID NO: 2; el polinucleótido SEQ ID NO: 143 que codifica la secuencia variable de cadena pesada de la SEQ ID NO: 3; el polinucleótido SEQ ID NO: 144 que codifica la secuencia de cadena pesada de la SEQ ID NO: 4; polinucleótidos que codifican las regiones determinantes de complementariedad (SEQ ID NO: 145; SEQ ID NO: 146; y SEQ ID NO: 147) de la secuencia variable de cadena ligera de la SEQ ID NO: 1 o la secuencia de cadena ligera de la SEQ ID NO: 2; y polinucleótidos que codifican las regiones determinantes de complementariedad (SEQ ID NO: 148; SEQ ID NO: 149; y SEQ ID nO: 150) de la secuencia variable de cadena pesada de la SEQ ID NO: 3 o la secuencia de cadena pesada de la SEQ ID NO: 4.
En una realización preferente de la divulgación, los polinucleótidos de la divulgación comprenden, o como alternativa consisten en, polinucleótidos que codifican fragmentos Fab (fragmento de unión a antígeno) que tienen especificidad de unión por CGRP. Con respecto al anticuerpo Ab1, los polinucleótidos que codifican el anticuerpo Ab1 de longitud completa comprenden, o como alternativa consisten en, el polinucleótido SEQ ID NO: 142 que codifica la secuencia de cadena ligera de la SEQ ID NO: 2 y el polinucleótido SEQ ID NO: 144 que codifica la secuencia de cadena pesada de la SEQ ID NO: 4.
Otra realización de la divulgación contempla estos polinucleótidos incorporados en un vector de expresión para expresión en células de mamífero tales como CHO, NSO, HEK-293, o en sistemas fúngicos, de insecto o microbianos tales como células de levadura tales como la levadura Pichia. Las especies de Pichia adecuadas incluyen, pero sin limitación, Pichia pastoris. En una realización de la divulgación descrita en el presente documento (posteriormente), pueden producirse fragmentos Fab mediante digestión enzimática (por ejemplo, papaína) de Ab1 después de la expresión de los polinucleótidos de longitud completa en un hospedador adecuado. En otra realización de la divulgación, pueden producirse anticuerpos anti CGRP tales como Ab1 o fragmentos Fab de los mismos mediante expresión de polinucleótidos de Ab1 en células de mamífero tales como células CHO, NSO o HEK 293, sistemas fúngicos, de insectos o microbianos tales como células de levadura (por ejemplo levadura diploide tal como Pichia diploide) y otras cepas de levadura. Las especies de Pichia adecuadas incluyen, pero sin limitación, Pichia pastoris.
Anticuerpo Ab2
La divulgación se dirige además a polinucleótidos que codifican polipéptidos de anticuerpos que tienen especificidad de unión con CGRP. En una realización de la divulgación, los polinucleótidos de la divulgación comprenden, o como alternativa consisten en, la siguiente secuencia polinucleotídica que codifica la secuencia polipeptídica de cadena ligera variable de la SEQ ID NO: 11:
C A A G T G C T G A C C C A G T C T C C A TC C TC C C T G TC T G C A T CT G T A G G A G A C A
G A G T C A C C A T C A A T T GCC A G G C C A G T C A G A G T G T T T A T G A T A A C A A C T A C C T A
G CCT G G T A T C A G C A G A A A C C A G G G A A A G T T C C T A A G C A A C T G A T CT A T T C T A C
A T C C A C T CT G G C A T C T G G G G T C C C A T C TC G TTTC A G T GGC A G T G G A T CT G G G AC
A G A T T T C A C T C T C A C C A T C A G C A G C C T GC A G C C T G A A G A T G TT GC A A C T T A T T A
CT G T C T A G G C A G T T A T G A T T GT A G T A G T G G T G A T T G T T T T G T T T T C G G C G G AG G
A A C C A A G G T G G A A A T C A A A C G T (SEQ ID N O : 151).
En una realización de la divulgación, los polinucleótidos de la divulgación comprenden, o como alternativa consisten en, la siguiente secuencia polinucleotídica que codifica la secuencia polipeptídica de cadena ligera de la SEQ ID NO: 12:
C AAGT GCT G ACCC AGT CT CC AT CCTCCCT GT CT GC AT CTGT AGG AG AC A
G AGT C ACC AT CAATT GCC AGGCC AGT C AG AGT GTTT AT G AT AAC AACT ACCT A
GCCT GGT AT CAGCAGAAACC AGGGAAAGTT CCTAAGCAACT G AT CT ATT CT AC
AT CCACT CT GGCAT CT GGGGT CCCAT CTCGTTTC AGT GGC AGT GGATCT GGGAC
AG ATTT C ACT CT C ACC AT C AGC AGCCT GC AGCCT G AAG AT GTTGC AACTT ATT A
CT GT CTAGGCAGTT AT GATT GT AGT AGT GGT GATT GTTTT GTTTT CGGCGGAGG
AACCAAGGT GGAAATCAAACGT ACGGTGGCTGCACCATCT GTCTTC ATCTTCCC
GCC AT CT G AT G A G C AG TT GAAAT CT GG AACT GCCTCT GTT GT GT GCCTGCT GAA
T AACTT CT AT CCC AG AGAGGCCAAAGTACAGT GGAAGGT GG ATAACGCCCT CC
AAT CGGGT AACT CCCAGGAG AGTGT CACAGAGC AGGACAGCAAGGACAGCAC
CTAC AGCCT CAGCAGCACCCT GACGCT GAGCAAAGCAGACT ACG AGAAAC AC
AAAGTCTA CG CCTGCGAA GTCACCCA TCA GG GCCTG AGCTCG CCCGTCACAA A
GAGCTT CAACAGGGGAGAGT GTT AG (SEQ ID NO: 152).
En otra realización de la divulgación, los polinucleótidos de la divulgación comprenden, o como alternativa consisten en, la siguiente secuencia polinucleotídica que codifica la secuencia polipeptídica de cadena pesada variable de la SEQ ID NO: 13:
GAGGT GCAGCTT GT GGAGT CT GGGGGAGGCTTGGTCCAGCCT GGGGGGT
CCCT G AG ACT CT CCT GT GC AGT CT CT GG ACT CG ACCT C AGT AGCT ACT AC AT GC
AAT GGGT CCGT CAGGCTCCAGGGAAGGGGCT GGAGT GGGT CGGAGT CATT GGT
ATCAA TGA TA ACACATACTACGCGAGCTGGGCGAAAGGCCGATTCACCATCTC
CAGAGACAATTCCAAGACCACGGTGTATCTT CAAAT GAAC AG CCTG AGAGCT G
AG GAC ACT GCT GT GT ATTT CT GTGCTAG AGGGGACAT CT GGGGCCAAGGGACC
CTCGTCACCGTCTCGAGC (SEQ ID NO: 153).
En una realización de la divulgación, los polinucleótidos de la divulgación comprenden, o como alternativa consisten en, la siguiente secuencia polinucleotídica que codifica la secuencia polipeptídica de cadena pesada de la SEQ ID NO: 14:
GAGGT GCAGCTT GT GGAGT CT GGGGGAGGCTTGGTCCAGCCT GGGGGGT CCCT
GAG ACT CTCCT GT GC AGT CT CT GGACT CGACCT CAGT AGCT ACTACAT GC AAT G
GGTCCGT C AG GCTCCAG GGA AG GG GCT GG AGTGGGTCGGAGT C ATTGG T AT C A
ATGATAACACATACTA CG CGA GCTGG GCGAA AG GCCGA TTCACCATCTCCAG A
GAC AATT CCAAGACCACGGT GT AT CTT CA AATGAACAGCCT GAGAGCT GAGGA
C ACT GCT GT GT ATTT CT GT GCT AG AGGGG AC AT CT GGGGCC A AGGG A CCCT CG
T CACCGT CTCGAGCGCCT CC ACCAAGGGCCC AT CGGT CTT CCCCCT GGCACCCT
CCTCCAAGAGCACCTCTGGGGGCACAGCGGCCCTGGGCTGCCTGGTCAAGGAC
T ACTT CCCCGAACCGGT GACGGT GT CGT GGAACT CAGGCGCCCT GACC AG CGG
CGT GCAC ACCTT CCCGGCT GT CCT ACAGTCCT CAGGACTCT ACT CCCTC AGCAG
CGT GGT GACCGT GCCCTCCAGCAGCTT GGGCACCCAGACCT ACATCT GCAACG
T GAAT CACAAGCCC AGCAAC ACCA AGGTGGACAAGAGAGTT GAGCCCAAAT C
TTGTGACAAAACTCACACATG CCCACCGTGCCCA GCACCTGA ACTCCTGG GGG
GACCGTC AGT CTTCCT CTT CCCCCCA AAACCCAAGGACACCCT C AT GAT CTCCC
GGACCCCTGAGGT CAC AT GCGT GGT GGT GGACGT GAGCCACGAAGACCCT GAG
GTCAA GTTCAA CTG GTACG TGG ACGG CGTGGA GG TGCATA ATG CCAAG ACAA A
GCCGCGGGAGGAGCAGT ACGCC AGC ACGTACCGT GT GGT C AGCGT CCT CACCG
TCCT GC ACC A G G ACT GGCT GAAT GGC AA GG AGT ACAA GT GCAAGGT CTCC AAC
AAAGCCCTCCCA GCCCCCA TCG AGA AA ACCATCTCCAA AG CCA AA GG GCA GCC
CCGAGA ACCACAGG TGTACA CCCTG CCCCCATCCCGGG AG GA GATGACCA AG A
ACCAGGT CAGCCTGACCT GCCTGGTCAAAGGCTTCTATCCCAGCGACAT CGCC
GT GGAGTGGGAGAGCAAT GGGC AGCCGG AGA ACAA CTA CAA GA CC ACGCCT C
CCGT GCTGG ACTCCGACGGCT CCTTCTTCCT CTACAGCAAGCTC ACCGT GGACA
AG AGC AGGT GGC AGC AGGG G AAC GT CTTCT C AT GCT CCGT GAT GC AT G AGGCT
CTGCACAACCACT AC ACGCAGAAGAGCCT CTCCCT GT CT CCGGGTAAAT GA
(SEQ ID NO: 154).
En una realización adicional de la divulgación, los polinucleótidos que codifican fragmentos de anticuerpo que tienen especificidad de unión con CGRP comprenden, o como alternativa consisten en, una o más de las secuencias polinucleotídicas de SEQ ID NO: 155; s Eq ID NO: 156; y SEQ ID NO: 157 que corresponden a polinucleótidos que codifican las regiones determinantes de complementariedad (CDR o regiones hipervariables) de la secuencia variable de cadena ligera de la SEQ ID NO: 11 o la secuencia de cadena ligera de la SEQ ID NO: 12.
En una realización adicional de la divulgación, los polinucleótidos que codifican fragmentos de anticuerpo que tienen especificidad de unión con CGRP comprenden, o como alternativa consisten en, una o más de las secuencias polinucleotídicas de SEQ ID NO: 158; s Eq ID NO: 159; y SEQ ID NO: 160 que corresponden a polinucleótidos que codifican las regiones determinantes de complementariedad (CDR o regiones hipervariables) de la secuencia variable de cadena pesada de la SEQ ID NO: 13 o la secuencia de cadena pesada de la SEQ ID NO: 14.
La divulgación también contempla secuencias polinucleotídicas que incluyen una o más de las secuencias polinucleotídicas que codifican fragmentos de anticuerpos descritos en el presente documento. En una realización de la divulgación, los polinucleótidos que codifican fragmentos de anticuerpo que tienen especificidad de unión con CGRP comprenden, o como alternativa consisten en, uno, dos, tres o más, incluyendo todos los siguientes polinucleótidos que codifican fragmentos de anticuerpos: el polinucleótido SEQ ID NO: 151 que codifica la secuencia variable de cadena ligera de la SEQ ID NO: 11; el polinucleótido SEQ ID NO: 152 que codifica la secuencia de cadena ligera de la SEQ ID NO: 12; el polinucleótido SEQ ID NO: 153 que codifica la secuencia variable de cadena pesada de la SEQ ID NO: 13; el polinucleótido SEQ ID NO: 154 que codifica la secuencia de cadena pesada de la SEQ ID NO: 14; polinucleótidos que codifican las regiones determinantes de complementariedad (SEQ ID NO: 155; SEQ ID NO: 156; y SEQ ID NO: 157) de la secuencia variable de cadena ligera de la SEQ ID NO: 11 o la secuencia de cadena ligera de la SEQ ID NO: 12; y polinucleótidos que codifican las regiones determinantes de complementariedad (SEQ ID NO: 158; SEQ ID nO: 159; y SEQ ID NO: 160) de la secuencia variable de cadena pesada de la SEQ ID NO: 13 o la secuencia de cadena pesada de la SEQ ID NO: 14.
En una realización preferente de la divulgación, los polinucleótidos de la divulgación comprenden, o como alternativa consisten en, polinucleótidos que codifican fragmentos Fab (fragmento de unión a antígeno) que tienen especificidad de unión por CGRP. Con respecto al anticuerpo Ab2, los polinucleótidos que codifican el anticuerpo Ab2 de longitud completa comprenden, o como alternativa consisten en, el polinucleótido SEQ ID NO: 152 que codifica la secuencia de cadena ligera de la SEQ ID NO: 12 y el polinucleótido SEQ ID NO: 154 que codifica la secuencia de cadena pesada de la SEQ ID NO: 14.
Otra realización de la divulgación contempla estos polinucleótidos incorporados en un vector de expresión para expresión en células de mamífero tales como CHO, NSO, HEK-293, o en sistemas fúngicos, de insecto o microbianos tales como células de levadura tales como la levadura Pichia. Las especies de Pichia adecuadas incluyen, pero sin limitación, Pichia pastoris. En una realización de la divulgación descrita en el presente documento (posteriormente), pueden producirse fragmentos Fab mediante digestión enzimática (por ejemplo, papaína) de Ab2 después de la expresión de los polinucleótidos de longitud completa en un hospedador adecuado. En otra realización de la divulgación, pueden producirse anticuerpos anti CGRP tales como Ab2 o fragmentos Fab de los mismos mediante expresión de polinucleótidos de Ab2 en células de mamífero tales como células CHO, NSO o HEK 293, sistemas fúngicos, de insectos o microbianos tales como células de levadura (por ejemplo levadura diploide tal como Pichia diploide) y otras cepas de levadura. Las especies de Pichia adecuadas incluyen, pero sin limitación, Pichia pastoris.
Anticuerpo Ab3
La divulgación se dirige además a polinucleótidos que codifican polipéptidos de anticuerpos que tienen especificidad de unión con CGRP. En una realización de la divulgación, los polinucleótidos de la divulgación comprenden, o como alternativa consisten en, la siguiente secuencia polinucleotídica que codifica la secuencia polipeptídica de cadena ligera variable de la SEQ ID NO: 21:
C A A G T G C T G A C C C A G T C TC C A T C CT C C C TG T CT G C A T CT G T A G G A G A C A
G A G T C A C C A T C A A T T GCC A G G C C A G T C A G A G T G T T T A T G A T A A C A A C T A C C T A
G CCT G G T A T C A G C A G A A A C C A G G G A A A G T T C C T A A G C A A C T G A T CT A T T C T A C
A T C C A C T CT G G C A T C T G G G G T C C C A T C TC G TTTC A G T GGC A G T G G A T CT G G G AC
A G A T T T C A C T C T C A C C A T C A G C A G C C T GC A G C C T G A A G A T G TT GC A A C T T A T T A
CT G T C T A G G C A G T T A T G A T T GT A G T A G T G G T G A T T G T T T T G TTTTC G G C G G A G G
A A C C A A G G T G G A A A T C A A A C G T (SEQ ID N O : 161).
En una realización de la divulgación, los polinucleótidos de la divulgación comprenden, o como alternativa consisten en, la siguiente secuencia polinucleotídica que codifica la secuencia polipeptídica de cadena ligera de la SEQ ID NO: 22:
C AAGT GCT G ACCC A G T CT CC AT CCTCCCT GT CT GC AT CTGT AGG AG AC A
G AGT C ACC AT CAATT GCC AGGCC AGT C AG AGT GTTT AT G AT AAC AA CT ACCT A
GCCT GGT AT CAGCAGAAACC AGGGAAAGTT CCTAAGCAACT G AT CT ATT CT AC
AT CCACT CT GGCAT CT GGGGT CCCAT CTCGTTTC AGT GGC AGT GGAT CT GGGAC
AG ATTT C ACT CT C ACC AT C AGC AGCCT GC AGCCT GAAG AT GTT GC AACTT ATT A
CT GT CTAGGCAGTT AT GATT GT AGT AGT GGT GATT GTTTT GTTTT CGGCGGAGG
AACCAAGGT GGAAATCAAACGT ACGGTGGCTGCACCATCT GTCTTC ATCTTCCC
GCC AT CT G AT G AG C AGTT G AAAT CT GG AACT GCCTCT GTT GT GTGCCTGCT GAA
T AACTT CT AT CCC AG AG AGGCCA A AGT AC AGT GG A AGGT GGAT AACGCCCT CC
AA TCG GG TAA CTCCCAGGAGAGTGTCACAGAGCAGGACAGCAAGGACAGCAC
CTAC AGCCT CAGCAGCACCCT GACGCTGAGCAAAGCAGACT ACG AGAAAC AC
AA AG TCTA CG CCTGCGAA GTCACCCA TCA GG GCCTG AGCTCG CCCGTCACAA A
GAGCTT CAACAGGGGAGAGT GTT AG (SEQ ID NO: 162).
En otra realización de la divulgación, los polinucleótidos de la divulgación comprenden, o como alternativa consisten en, la siguiente secuencia polinucleotídica que codifica la secuencia polipeptídica de cadena pesada variable de la SEQ ID NO: 23:
GAGGT GC AG CTT GTGGAGT CT GGGGGAGGCTT GGT CC AGCCT GGGGGGT
CCCT GAG ACT CTCCT GT GCAGTCT CT GGACT CGACCT CAGT AGCT ACT AC AT GC
AAT GGGT CCGT CAGGCTCCAGGGAAGGGGCT GGAGT GGGT CGGAGT CATT GGT
ATCAA TGA TA ACACATACTACGCGAGCTGGGCGAAAGGCCGATTCACCATCTC
CAGAGACAATTCCAAGACCACGGTGTATCTT C AAAT GAAC AGCCTG AGAGCT G
AGG AC ACT GCT GT GT ATTT CT GT GCT A G AG GG G AC AT CT GGGGCC AAGGG ACC
CTCGTCACCGTCTCGAGC (SEQ ID NO: 163).
En una realización de la divulgación, los polinucleótidos de la divulgación comprenden, o como alternativa consisten en, la siguiente secuencia polinucleotídica que codifica la secuencia polipeptídica de cadena pesada de la SEQ ID NO: 24:
GAGGT GCAGCTT GT GGAGT CT GGGGGAGGCTTGGTCCAGCCT GGGGGGT CCCT
GAG ACT CTCCT GT GC AGT CT CT GGACT CGACCT CAGT AGCT ACTACAT GCAAT G
GG TCCGTCAGGCTCCAGGGAAGGGGCTGGAGTGGGTCGGAGTCATTGGTATCA
AT GATAACAC A T ACT ACGCGAGCT GGGCGAAAGGCCG ATT C ACC AT CT CC AG A
G AC AATT CCAAG ACC ACGGT GT AT CTT CAAAT GAAC AGC CT G AG AGCT G AGG A
C ACT GCTGT GT ATTT CT GT GCT AG AG GG G AC AT CT GGGGCC A AGGG ACCCT CG
T CACCGT CTCGAGCGCCT CC ACCAAGGGCCC AT CGGT CTT CCCCCT GGCACCCT
CCTCCAA GAGCACCTCTGGGGGCACAGCGGCCCTGGGCTGCCTGGTCAAGGAC
T ACTT CCCCGAACCGGT GACGGT GT CGT GGAACT CAGGCGCCCTG ACC AGCGG
CGTGC AC ACCTT CCCGGCTGTCCT AC AGT CCT C AGG ACT CT ACT CCCT C AGC AG
CG TGG TGA CCGTG CCCTCCAGCAGCTTGGGCACCCAGACCTACATCTGCAACG
T GAAT CACAAGCCC AGCAAC ACC AAGGT GGACGCGAGAGTT GAGCCCAAAT CT
TG TGA CAA AACTCACACATGCCCACCGTGCCCAGCACCTGAACTCCTGGGGGG
ACCGT C AGT CTT CCT CTT CCCCCC AAAACCC AAGGAC ACCCT CAT GAT CT CCCG
GACCCCTG AGGT C ACATGCGT GGT GGT GGACGT GAGCCACGAAG ACCCT GAGG
TCAAG TTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCATAATGCCAAGACAAAG
CCGCGGG AG GAGCAGTACGCCAGCACGTACCGTGTGGTCAGCGTCCTCACCGT
CCTGCACCAGGACTGGCTGAATGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTCTCCAACA
AA GCCCTCCCAGCCCCCATCGAGAAAACCATCTCCAAAGCCAAAGGGCAGCCC
CG AG AA CCA CA GGTGTACACCCTGCCCCCATCCCGGGAGGAGATGACCAAGA
GT GGAGTGGGAGAGC AAT GGGC AG CCGG AGAACAACTACAAGACC ACGCCT C
CCGT GCTGG ACTCCGACGGCT CCTTCTTCCTCTACAGCAAGCTC ACCGT GGACA
AG AGC AGGT GGC AGC AG GG G AACGT CTTCT CAT GCT CCGT GAT GC AT G AGGCT
CTGCACAACCACT AC ACGCAGAAGAGCCT CTCCCT GT CT CCGGGTAAAT GA
(SEQ ID NO: 164).
En una realización adicional de la divulgación, los polinucleótidos que codifican fragmentos de anticuerpo que tienen especificidad de unión con CGRP comprenden, o como alternativa consisten en, una o más de las secuencias polinucleotídicas de SEQ ID NO: 165; s Eq ID NO: 166; y SEQ ID NO: 167 que corresponden a polinucleótidos que codifican las regiones determinantes de complementariedad (CDR o regiones hipervariables) de la secuencia variable de cadena ligera de la SEQ ID NO: 21 o la secuencia de cadena ligera de la SEQ ID NO: 22.
En una realización adicional de la divulgación, los polinucleótidos que codifican fragmentos de anticuerpo que tienen especificidad de unión con CGRP comprenden, o como alternativa consisten en, una o más de las secuencias polinucleotídicas de SEQ ID NO: 168; s Eq ID NO: 169; y SEQ ID NO: 170 que corresponden a polinucleótidos que codifican las regiones determinantes de complementariedad (CDR o regiones hipervariables) de la secuencia variable de cadena pesada de la SEQ ID NO: 23 o la secuencia de cadena pesada de la SEQ ID NO: 24.
La divulgación también contempla secuencias polinucleotídicas que incluyen una o más de las secuencias polinucleotídicas que codifican fragmentos de anticuerpos descritos en el presente documento. En una realización de la divulgación, los polinucleótidos que codifican fragmentos de anticuerpo que tienen especificidad de unión con CGRP comprenden, o como alternativa consisten en, uno, dos, tres o más, incluyendo todos los siguientes polinucleótidos que codifican fragmentos de anticuerpos: el polinucleótido SEQ ID NO: 161 que codifica la secuencia variable de cadena ligera de la SEQ ID NO: 21; el polinucleótido SEQ ID NO: 162 que codifica la secuencia de cadena ligera de la SEQ ID NO: 22; el polinucleótido SEQ ID NO: 163 que codifica la secuencia variable de cadena pesada de la SEQ ID NO: 23; el polinucleótido SEQ ID NO: 164 que codifica la secuencia de cadena pesada de la SEQ ID NO: 24; polinucleótidos que codifican las regiones determinantes de complementariedad (SEQ ID NO: 165; SEQ ID NO: 166; y SEQ ID NO: 167) de la secuencia variable de cadena ligera de la SEQ ID NO: 21 o la secuencia de cadena ligera de la SEQ ID NO: 22; y polinucleótidos que codifican las regiones determinantes de complementariedad (SEQ ID NO: 168; SEQ ID nO: 169; y SEQ ID NO: 170) de la secuencia variable de cadena pesada de la SEQ ID NO: 23 o la secuencia de cadena pesada de la SEQ ID NO: 24.
En una realización preferente de la divulgación, los polinucleótidos de la divulgación comprenden, o como alternativa consisten en, polinucleótidos que codifican fragmentos Fab (fragmento de unión a antígeno) que tienen especificidad de unión por CGRP. Con respecto al anticuerpo Ab3, los polinucleótidos que codifican el anticuerpo Ab3 de longitud completa comprenden, o como alternativa consisten en, el polinucleótido SEQ ID NO: 162 que codifica la secuencia de cadena ligera de la SEQ ID NO: 22 y el polinucleótido SEQ ID NO: 164 que codifica la secuencia de cadena pesada de la SEQ ID NO: 24.
Otra realización de la divulgación contempla estos polinucleótidos incorporados en un vector de expresión para expresión en células de mamífero tales como CHO, NSO, HEK-293, o en sistemas fúngicos, de insecto o microbianos tales como células de levadura tales como la levadura Pichia. Las especies de Pichia adecuadas incluyen, pero sin limitación, Pichia pastoris. En una realización de la divulgación descrita en el presente documento (posteriormente), pueden producirse fragmentos Fab mediante digestión enzimática (por ejemplo, papaína) de Ab3 después de la expresión de los polinucleótidos de longitud completa en un hospedador adecuado. En otra realización de la divulgación, pueden producirse anticuerpos anti CGRP tales como Ab3 o fragmentos Fab de los mismos mediante expresión de polinucleótidos de Ab3 en células de mamífero tales como células CHO, NSO o HEK 293, sistemas fúngicos, de insectos o microbianos tales como células de levadura (por ejemplo levadura diploide tal como Pichia diploide) y otras cepas de levadura. Las especies de Pichia adecuadas incluyen, pero sin limitación, Pichia pastoris.
Anticuerpo Ab4
La divulgación se dirige además a polinucleótidos que codifican polipéptidos de anticuerpos que tienen especificidad de unión con CGRP. En una realización de la divulgación, los polinucleótidos de la divulgación comprenden, o como alternativa consisten en, la siguiente secuencia polinucleotídica que codifica la secuencia polipeptídica de cadena ligera variable de la SEQ ID NO: 31:
C A A G T G CT G A C C C A G A C T C C A T C C C C C G T G T CT GC A G C T G T G G G A A G C A
C A G T C A C C A T C A A T T GCC A G G C C A G T C A G A G T G T T T A T C A T A A C A C C T A C C T GG
C C TG G T A T C A G C A G A A A C C A G G G C A G C C T C C C A A A C A A C T G A T C T A T G A T GC A
T CC A C T CT G G C G T CT G G G G TC C C A T C G C G G T T C A G C G G C A G T G G A T C T G G G AC
A C A G T T C A C T C T C A C C A T C A G C G G C G T GC A G T G T A A C G A T G C TG C C G C TT A C T A
C T G T C T GGGC A G T T A T G A T T G T A C T A A T G G T G A T T G T T T T G T T T T CG G CG G A G G
G A C C G A G G T G G T G G T C A A A C G T (SEQ ID N O : 171).
En una realización de la divulgación, los polinucleótidos de la divulgación comprenden, o como alternativa consisten en, la siguiente secuencia polinucleotídica que codifica la secuencia polipeptídica de cadena ligera de la SEQ ID NO: 32:
C A A G T G CT G A C C C A G A C T C C A T C C C C C G T G T C T G C A G C T G T G G G A A G C A
C A G T C A C C A T C A A T T GCC A G G C C A G T C A G A G T G T T T A T C A T A A C A C C T A C C T G G
C C TG G T A T C A G C A G A A A C C A G G G C A G C C T C C C A A A C A A C T G A T C T A T G A T GC A
T CC A C T CT G G C G T C T G G G G TC C C A T C G C G G T T C A G C G G C A G T G G A T C T G G G AC
A C A G T T C A C T C T C A C C A T C A G C G G C G T GC A G T G T A A C G A T G C TG C C G C TT A C T A
CT GT CT GGGC A G TT AT G ATT GT ACT AAT GGT G ATT GTTTT GTTTT CGGCGG AGG
GACCGAGGT GGT GGT CAAACGT ACGGTGGCT GC ACC AT CT GT CTT CAT CTTCCC
GCC AT CT GAT GAGCAGTT GAAAT CTGGAACTGCCT CTGTT GT GT GCCT GCT GAA
T AACTT CT AT CCCAG AG AGGCCAAAGT ACAGT GGAAGGTGGATAACGCCCT CC
AAT CGGGT AA CT CCCAGGAGAGT GT CAC AGAGC AGGAC AGCAAGGAC AGCAC
CTACA GCCTCAGCAGCACCCTGACGCTGAGCAAAGCAGACTACGAGAAACAC
AAAGT CT ACGCCTGCGAAGT CACCC AT CAGGGCCT GAGCT CGCCCGTC ACAA A
GA GCTTCA ACAG GGG AG AG TGTTAG (SEQ ID NO: 172).
En otra realización de la divulgación, los polinucleótidos de la divulgación comprenden, o como alternativa consisten en, la siguiente secuencia polinucleotídica que codifica la secuencia polipeptídica de cadena pesada variable de la SEQ ID NO: 33:
C AGT CGCT GGAGG AGT CCGGGGGT CGCCT GGT C ACGCCT GGGACACCCC
T G AC ACT C ACCT GTTCCGT CTCT GGC AT CG ACCT C AGT GGCT ACT AC AT GAACT
GGGTCCGCCAGGCTCCAGGGAAGGGGCTGGAATGGATCGGAGTCATTGGTATT
AATGGTGCCACATACTACGCGAGCTGGGCGAAAGGCCGATTCACCATCTCCAA
AACCTCGTCGACCACGGT GGATCTGAAAAT GACCAGTCTGACAACCGAGGACA
CGGCC ACCT ATTTCT GT GCC AGAGGGGAC AT CT GGGGCCCGGGCACCCT CGTC
ACCGTCTCGAGC (SEQ ID NO: 173).
En una realización de la divulgación, los polinucleótidos de la divulgación comprenden, o como alternativa consisten en, la siguiente secuencia polinucleotídica que codifica la secuencia polipeptídica de cadena pesada de la SEQ ID NO: 34:
CAGTCGCTGGAGGAGTCCGGGGGTCGCCTGGTCACGCCTGGGACACCCCTGAC
ACT C ACCT GTT CCGT CTCT GGC AT CG ACCT C AGT GGCT ACT AC AT GAACTGGGT
CCGCCAGGCT CC AGGGAAGGGGCT GGAATGGAT CGGAGTC ATTGGT ATT AAT G
GT GCC AC ATACT ACGCGAGCT GGGCGAAAGGCCGATT C ACC AT CT CCAAAACC
T CGTCGACC ACGGT GGAT CT GAAAAT GACC AGT CT GACAACCGAGGACACGGC
CACCT ATTT CT GT GCCAGAGGGGACAT CT GGGGCCCGGGCACCCTCGT CACCG
T CTCGAGCGCCT CC ACCAAGGGCCCATCGGT CTT CCCCCTGGCACCCT CCTCCA
AGAGCACCT CT GGGGGC ACAGCGGCCCT GGGCT GCCT GGT CAAGGACT ACTT C
CCCGAACCGGTGACGGTGTCGTGGAACTCAGGCGCCCTGACCAGCGGCGTGCA
CACCTTCCCGGCTGTCCT AC AGT CCTC AGGACT CT ACTCCCT CAGCAGCGT GGT
GACCGT GCCCT CC AGCAGCTT GGGC ACCCAGA CCT ACAT CT GCAACGTGAAT C
AC AA GCCCAGCAACACCAAGGT GGACAAGAG AG TTGAGCCCAAAT CTT GT GA
CA AA ACTCA CACATGCCCACCGTGCCCAGCACCTGAACTCCTGGGGGGACCGT
CAGT CTT CCTCTTCCCCCCAAAACCCAAGG AC ACCCTC AT GAT CT CCCGGACCC
CTG AGGT CACAT GCGT GGT GGT GGACGTGAGCCACGAAGACCCT GAGGT CAAG
TTCAACTG GTA CGTGG ACG GCGTG GA GGTGCA TAA TGCCA AG ACA AA GCCGCG
GG AG GA GCAGTACGCCAGCACGTACCGTGTGGTCAGCGTCCTCACCGTCCTGC
ACC AGGA CT GGCT GAAT GGC AAGG AGT AC AAGTGCAAGGT CT CC AACAAAGC
CCTCCCA GCCCCCATCGAGAAAACCATCTCCAAAGCCAAAGGGCAGCCCCGAG
AA CCACA GG TGTACACCCTGCCCCCATCCCGGGAGGAGATGACCAAGAACCAG
GT CAGCCTGACCT GCCT GGT CAAAGGCTT CT ATCCC AGCGAC AT CGCCGT GGA
GTGGGAG AG CAA TG GGCAG CCG GA GA ACA ACTACAA GACCA CGCCTCCCGTG
CT GG ACT CCGACGGCTCCTT CTTCCT CT ACAGC AA GCT CACCGT GGACAAGAGC
AGGT GGC AGCAGGGGAACGT CTT CT C AT GCTCCGT GAT GC AT GAGGCT CTGCA
C AACC ACT AC ACGC AGAA G AGCCT CTCCCT GT CT CCGGGT AAAT G A (SEQ ID
NO: 174).
En una realización adicional de la divulgación, los polinucleótidos que codifican fragmentos de anticuerpo que tienen especificidad de unión con CGRP comprenden, o como alternativa consisten en, una o más de las secuencias polinucleotídicas de SEQ ID NO: 175; s Eq ID NO: 176; y SEQ ID NO: 177 que corresponden a polinucleótidos que codifican las regiones determinantes de complementariedad (CDR o regiones hipervariables) de la secuencia variable de cadena ligera de la SEQ ID NO: 31 o la secuencia de cadena ligera de la SEQ ID NO: 32.
En una realización adicional de la divulgación, los polinucleótidos que codifican fragmentos de anticuerpo que tienen especificidad de unión con CGRP comprenden, o como alternativa consisten en, una o más de las secuencias polinucleotídicas de SEQ ID NO: 178; s Eq ID NO: 179; y SEQ ID NO: 180 que corresponden a polinucleótidos que codifican las regiones determinantes de complementariedad (CDR o regiones hipervariables) de la secuencia variable de cadena pesada de la SEQ ID NO: 33 o la secuencia de cadena pesada de la SEQ ID NO: 34.
La divulgación también contempla secuencias polinucleotídicas que incluyen una o más de las secuencias polinucleotídicas que codifican fragmentos de anticuerpos descritos en el presente documento. En una realización de la divulgación, los polinucleótidos que codifican fragmentos de anticuerpo que tienen especificidad de unión con CGRP comprenden, o como alternativa consisten en, uno, dos, tres o más, incluyendo todos los siguientes polinucleótidos que codifican fragmentos de anticuerpos: el polinucleótido SEQ ID NO: 171 que codifica la secuencia variable de cadena ligera de la SEQ ID NO: 31; el polinucleótido SEQ ID NO: 172 que codifica la secuencia de cadena ligera de la SEQ ID NO: 32; el polinucleótido SEQ ID NO: 173 que codifica la secuencia variable de cadena pesada de la SEQ ID NO: 33; el polinucleótido SEQ ID NO: 174 que codifica la secuencia de cadena pesada de la SEQ ID NO: 34; polinucleótidos que codifican las regiones determinantes de complementariedad (SEQ ID NO: 175; SEQ ID NO: 176; y SEQ ID NO: 177) de la secuencia variable de cadena ligera de la SEQ ID NO: 31 o la secuencia de cadena ligera de la SEQ ID NO: 32; y polinucleótidos que codifican las regiones determinantes de complementariedad (SEQ ID NO: 178; SEQ ID nO: 179; y SEQ ID NO: 180) de la secuencia variable de cadena pesada de la SEQ ID NO: 33 o la secuencia de cadena pesada de la SEQ ID NO: 34.
En una realización preferente de la divulgación, los polinucleótidos de la divulgación comprenden, o como alternativa consisten en, polinucleótidos que codifican fragmentos Fab (fragmento de unión a antígeno) que tienen especificidad de unión por CGRP. Con respecto al anticuerpo Ab4, los polinucleótidos que codifican el anticuerpo Ab4 de longitud completa comprenden, o como alternativa consisten en, el polinucleótido SEQ ID NO: 172 que codifica la secuencia de cadena ligera de la SEQ ID NO: 32 y el polinucleótido SEQ ID NO: 174 que codifica la secuencia de cadena pesada de la SEQ ID NO: 34.
Otra realización de la divulgación contempla estos polinucleótidos incorporados en un vector de expresión para expresión en células de mamífero tales como CHO, NSO, HEK-293, o en sistemas fúngicos, de insecto o microbianos tales como células de levadura tales como la levadura Pichia. Las especies de Pichia adecuadas incluyen, pero sin limitación, Pichia pastoris. En una realización de la divulgación descrita en el presente documento (posteriormente), pueden producirse fragmentos Fab mediante digestión enzimática (por ejemplo, papaína) de Ab4 después de la expresión de los polinucleótidos de longitud completa en un hospedador adecuado. En otra realización de la divulgación, pueden producirse anticuerpos anti CGRP tales como Ab4 o fragmentos Fab de los mismos mediante expresión de polinucleótidos de Ab4 en células de mamífero tales como células CHO, NSO o HEK 293, sistemas fúngicos, de insectos o microbianos tales como células de levadura (por ejemplo levadura diploide tal como Pichia diploide) y otras cepas de levadura. Las especies de Pichia adecuadas incluyen, pero sin limitación, Pichia pastoris.
Anticuerpo Ab5
La divulgación se dirige además a polinucleótidos que codifican polipéptidos de anticuerpos que tienen especificidad de unión con CGRP. En una realización de la divulgación, los polinucleótidos de la divulgación comprenden, o como alternativa consisten en, la siguiente secuencia polinucleotídica que codifica la secuencia polipeptídica de cadena ligera variable de la SEQ ID NO: 41:
C AAGT GCT G ACCC AGT CT CC AT CCTCCCT GT CT GC AT CTGT AGG AG AC A
GAGT C ACC AT CAATT GCC AGGCC AGT CAGAGT GTTT AT C AT AAC ACCT ACCT G
GCCT GGT AT CAGCAGAAACC AGGGAAAGTT CCTAAGCAACT G AT CT AT GAT GC
AT CCACT CT GGCAT CT GGGGT CCCAT CTCGTTTC AGT GGC AGT GGAT CT GGG AC
AG ATTT C ACT CT C ACC AT C AGC AGCCT GC AG CCT G AAG AT GTT GC AACTT ATT A
CT GT CTGGGCAGTT AT GATT GT ACT AAT GGT GATT GTTTT GTTTT CGGCGGAGG
AACCAAGGTGGAAATCAAACGT (SEQ ID NO: 181).
En una realización de la divulgación, los polinucleótidos de la divulgación comprenden, o como alternativa consisten en, la siguiente secuencia polinucleotídica que codifica la secuencia polipeptídica de cadena ligera de la SEQ ID NO: 42:
CAAGT GCT GACCCAGT CTCCAT CCT CCCT GT CT GCAT CT GT AGGAGACA
GAGT C ACC AT CAATT GCCAGGCCAGTC AGAGT GTTT AT C AT AAC ACCT ACCT G
GCCT GGT AT CAGCAGAAACC AGGGAAAGTT CCTAAGCAACT GAT CT AT GAT GC
AT CCACT CT GGCAT CT GGGGT CCCAT CTCGTTTC AGT GGC AGT GGAT CT GGGAC
AG ATTT C ACT CT C ACC AT C AGC AGCCT GC AG CCT G AAG AT GTT GC AACTT ATT A
CT GT CTGGGCAGTT AT GATT GTACT AAT GGT GATT GTTTT GTTTT CGGCGGAGG
AACCAAGGT GGAAATCAAACGT ACGGTGGCTGCACCATCT GTCTTC ATCTTCCC
GCC AT CT GAT G A G C AGTT GAAAT CT GG AACT GCCTCT GTT GTGTGCCTGCT GAA
T AACTT CT AT CCC AG AG AGGCCA A AGT AC AGT GG A AGGT GGAT AA CGCCCT CC
AAT CGGGT AACT CCCAGGAG AGTGT CACAGAGC AGGACAGCAAGG AC AGCAC
CTAC AGCCT CAGCAGCACCCT GACGCT GAGCAAAGCAGACT ACG AGAAAC AC
AAAGT CT ACGCCTGCGAAGT CACCC AT CAGGGCCTG AGCTCGCCCGT C ACAAA
GAGCTT CAACAGGGGAGAGT GTT AG (SEQ ID NO: 182).
En otra realización de la divulgación, los polinucleótidos de la divulgación comprenden, o como alternativa consisten en, la siguiente secuencia polinucleotídica que codifica la secuencia polipeptídica de cadena pesada variable de la SEQ ID NO: 43:
GAGGT GCAGCTT GT GGAGT CT GGGGGAGGCTTGGTCCAGCCT GGGGGGT
CCCT G A G ACT CTCCT GT GC AGT CTCT GG AAT CG ACCT C AGT GGCT ACT AC AT G A
ACTGGGT CCGT CAGGCTCCAGGGAAGGGGCT GGAGT GGGT CGGAGT CATT GGT
ATT AAT GGT GCC AC AT ACT ACGCG AGCT GGGCGAAAGGCCG ATT C ACC AT CT C
CAGAGACAATTCCAAGACCACGGTGTATCTT CAAAT GAAC AG CCTG AGAGCT G
AGG AC ACT GCT GT GT ATTT CT GT GCT AG AG GG G AC AT CT GGGGCC AAGGG ACC
CTCGTCACCGTCTCGAGC (SEQ ID NO: 183).
En una realización de la divulgación, los polinucleótidos de la divulgación comprenden, o como alternativa consisten en, la siguiente secuencia polinucleotídica que codifica la secuencia polipeptídica de cadena pesada de la SEQ ID NO: 44:
GAGGT GCAGCTTGT GGAGT CT GGGGGAGGCTT GGT CCAGCCT GGGGGGTCCCT
GAG ACT CTCCT GT GC AGT CT CT GGAATCGACCT CAGT GGCT ACTACAT GAACT G
GG TCCGTCAG GCTCCA GGGAAGGGGCTGGAGTGGGTCGGAGTCATTGGTATTA
AT GGT GCCACAT ACT ACGCGAGCTGGGCGAAAGGCCG ATT C ACC AT CT CC AGA
G AC AATT CCAAG ACC ACGGT GT AT CTT CAAAT GAAC AGCCT GAG AGCT G AGG A
C ACT GCT GT GT ATTTCT GTGCT AGAGGGGACAT CT GGGGCCAAGGGACCCTCG
CCTCCAAGAGCACCTCTGGGGGCACAGCGGCCCTGGGCTGCCTGGTCAAGGAC
T ACTT CCCCGAACCGGT GACGGT GT CGT GGAACT CAGGCGCCCTG ACC AGCGG
CGT GCAC A CCTT CCCGGCT GT CCT ACAGTCCT CAGGACTCT ACT CCCTC AGCAG
CG TGG TGA CCGTGCCCTCCAGCAGCTTGGGCACCCAGACCTACATCTGCAACG
T GAAT CACAAGCCC AGCAAC ACCAAGGT GGACAAGAGAGTT GAGCCCAAAT C
TTG TGA CA AA ACTCACACATGCCCACCGTGCCCAGCACCTGAACTCCTGGGGG
GACCGTC AGT CTTCCT CTT CCCCCCAAAACCCAAGG ACACCCT C AT GAT CTCCC
GGACCCCTGAGGT CAC AT GCGT GGT GGT GGACGT GAGCCACGAAG ACCCT GAG
GTCAA GTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCATAATGCCAAGACAAA
GCCGCGGGAGGAGCAGT ACGCC AGC ACGTACCGT GT GGT C AGCGT CCT CACCG
TCCT GC ACC A G G ACT GGCT GAAT GGC AAGG AGT AC AA GT GCAAGGT CTCCAAC
AA AG CCCTCCCA GCCCCCATCGAGAAAACCATCTCCAAAGCCAAAGGGCAGCC
CCGA GA ACCACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCCCGGGAGGAGATGACCAAGA
ACCAGGT CAGCCTGACCT GCCTGGTCAAAGGCTTCTATCCCAGCGACAT CGCC
GT GGAGTGGGAGAGCAAT GGGC AG CCGGAGAACAACTACAAGACC ACGCCT C
CCGT GCTGG ACTCCGACGGCT CCTTCTTCCT CTACAGCAAGCTC ACCGT GGACA
AG AGC AGGT GGC AGC AGGGG AACGT CTTCT C AT GCT CCGT GAT GC AT G AGGCT
CTGCA CA ACCACTACACGCAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCCGGGTAAATGA
(SEQ ID NO: 184).
En una realización adicional de la divulgación, los polinucleótidos que codifican fragmentos de anticuerpo que tienen especificidad de unión con CGRP comprenden, o como alternativa consisten en, una o más de las secuencias polinucleotídicas de SEQ ID NO: 185; s Eq ID NO: 186; y SEQ ID NO: 187 que corresponden a polinucleótidos que codifican las regiones determinantes de complementariedad (CDR o regiones hipervariables) de la secuencia variable de cadena ligera de la SEQ ID NO: 41 o la secuencia de cadena ligera de la SEQ ID NO: 42.
En una realización adicional de la divulgación, los polinucleótidos que codifican fragmentos de anticuerpo que tienen especificidad de unión con CGRP comprenden, o como alternativa consisten en, una o más de las secuencias polinucleotídicas de SEQ ID NO: 188; s Eq ID NO: 189; y SEQ ID NO: 190 que corresponden a polinucleótidos que codifican las regiones determinantes de complementariedad (CDR o regiones hipervariables) de la secuencia variable de cadena pesada de la SEQ ID NO: 43 o la secuencia de cadena pesada de la SEQ ID NO: 44.
La divulgación también contempla secuencias polinucleotídicas que incluyen una o más de las secuencias polinucleotídicas que codifican fragmentos de anticuerpos descritos en el presente documento. En una realización de la divulgación, los polinucleótidos que codifican fragmentos de anticuerpo que tienen especificidad de unión con CGRP comprenden, o como alternativa consisten en, uno, dos, tres o más, incluyendo todos los siguientes polinucleótidos que codifican fragmentos de anticuerpos: el polinucleótido SEQ ID NO: 181 que codifica la secuencia variable de cadena ligera de la SEQ ID NO: 41; el polinucleótido SEQ ID NO: 182 que codifica la secuencia de cadena ligera de la SEQ ID NO: 42; el polinucleótido SEQ ID NO: 183 que codifica la secuencia variable de cadena pesada de la SEQ ID NO: 43; el polinucleótido SEQ ID NO: 184 que codifica la secuencia de cadena pesada de la SEQ ID NO: 44; polinucleótidos que codifican las regiones determinantes de complementariedad (SEQ ID NO: 185; SEQ ID NO: 186; y SEQ ID NO: 187) de la secuencia variable de cadena ligera de la SEQ ID NO: 41 o la secuencia de cadena ligera de la SEQ ID NO: 42; y polinucleótidos que codifican las regiones determinantes de complementariedad (SEQ ID NO: 188; SEQ ID nO: 189; y SEQ ID NO: 190) de la secuencia variable de cadena pesada de la SEQ ID NO: 43 o la secuencia de cadena pesada de la SEQ ID NO: 44.
En una realización preferente de la divulgación, los polinucleótidos de la divulgación comprenden, o como alternativa consisten en, polinucleótidos que codifican fragmentos Fab (fragmento de unión a antígeno) que tienen especificidad de unión por CGRP. Con respecto al anticuerpo Ab5, los polinucleótidos que codifican el anticuerpo Ab5 de longitud completa comprenden, o como alternativa consisten en, el polinucleótido SEQ ID NO: 182 que codifica la secuencia de cadena ligera de la SEQ ID NO: 42 y el polinucleótido SEQ ID NO: 184 que codifica la secuencia de cadena pesada de la SEQ ID NO: 44.
Otra realización de la divulgación contempla estos polinucleótidos incorporados en un vector de expresión para expresión en células de mamífero tales como CHO, NSO, HEK-293, o en sistemas fúngicos, de insecto o microbianos tales como células de levadura tales como la levadura Pichia. Las especies de Pichia adecuadas incluyen, pero sin limitación, Pichia pastoris. En una realización de la divulgación descrita en el presente documento (posteriormente), pueden producirse fragmentos Fab mediante digestión enzimática (por ejemplo, papaína) de Ab5 después de la expresión de los polinucleótidos de longitud completa en un hospedador adecuado. En otra realización de la divulgación, pueden producirse anticuerpos anti CGRP tales como Ab5 o fragmentos Fab de los mismos mediante expresión de polinucleótidos de Ab5 en células de mamífero tales como células CHO, NSO o HEK 293, sistemas fúngicos, de insectos o microbianos tales como células de levadura (por ejemplo levadura diploide tal como Pichia diploide) y otras cepas de levadura. Las especies de Pichia adecuadas incluyen, pero sin limitación, Pichia pastoris.
Anticuerpo Ab6
La divulgación se dirige además a polinucleótidos que codifican polipéptidos de anticuerpos que tienen especificidad de unión con CGRP. En una realización de la divulgación, los polinucleótidos de la divulgación comprenden, o como alternativa consisten en, la siguiente secuencia polinucleotídica que codifica la secuencia polipeptídica de cadena ligera variable de la SEQ ID NO: 51:
C AAGT GCT G ACCC AGT CT CC AT CCTCCCT GT CT GC AT CTGT AGG AG AC A
GAGTCACCATCAATTGCCAGG CCAGTCAG AG TGTTTATCATAACACCTA CCTG
GCCT GGTAT CAGC AG AAACCAGGGAAAGTT CCT AAGC AA CT GAT CT AT GAT GC
AT CCACT CT GGCAT CT GGGGT CCCAT CTCGTTTC AGT GGC AGT GGAT CT GGGAC
AG ATTT C ACT CT C ACC AT C AGC AGCCT GC AG CCT G AA G AT GTT GC AACTT ATT A
CT GT CTGGGCAGTT AT GATT GT ACT AAT GGT GATT GTTTT GTTTT CGGCGGAGG
AACCAAGGTGGA AA TCA AA CGT (SEQ ID NO: 191).
En una realización de la divulgación, los polinucleótidos de la divulgación comprenden, o como alternativa consisten en, la siguiente secuencia polinucleotídica que codifica la secuencia polipeptídica de cadena ligera de la SEQ ID NO: 52:
C AAGT GCT G ACCC A G T CT CC AT CCTCCCTGTCT GC AT CT GT AG G AG ACA
GAGT C ACC AT CAATT GCCAGGCCAGTC AGAGT GTTT AT C AT AAC ACCT ACCT G
GCCT GGT AT C AG C AGAAACCAGGGAAAGTT CCT A AGCAACT GAT CT AT GAT GC
AT CCACT CT GGCAT CT GGGGT CCCAT CTCGTTTC AGT GGC AGT GGAT CT GGGAC
AG ATTT C ACT CT C ACC AT CAGC AGCCT GC AG CCT G AAG AT GTT GC AACTT ATT A
CT GT CTGGGCAGTT AT GATT GT ACT AAT GGT GATT GTTTT GTTTT CGGCGGAGG
AACCAAGGT GGAAATCAAACGT ACGGTGGCT GCACCAT CT GT CTTC AT CTTCCC
GCC AT CT GAT G A G C AGTT GAAAT CT GG AACT GCCTCT GTT GTGTGCCTGCT GAA
T AACTT CT AT CCC AG AG AGGCCA A AGT AC AGT GG A AGGT GGAT AA CGCCCT CC
AAT CGGGT AACT CCCAGGAG AGTGT CACAGAGC AGGACAGCAAGGACAGCAC
CTACAGCCTCAGCAGCACCCTGACGCTGAGCAAAGCAGACTACGAGAAACAC
AAAGTCTA CG CCTGCGAA GTCACCCA TCA GG GCCTG AGCTCG CCCGTCACAA A
GAGCTT CAACAGGGGAGAGT GTT AG (SEQ ID NO: 192).
En otra realización de la divulgación, los polinucleótidos de la divulgación comprenden, o como alternativa consisten en, la siguiente secuencia polinucleotídica que codifica la secuencia polipeptídica de cadena pesada variable de la SEQ ID NO: 53:
GAGGT GCAGCTT GT GGAGT CT GGGGGAGGCTTGGTCCAGCCT GGGGGGT
CCCT G AG ACT CTCCT GT GC AGT CTCT GGAAT CG ACCT C AGT GGCT ACT AC AT G A
ACT GGGT CCGT C AGGCT CC AG GGAAGGGGCTGG AGT GGGT CGG AGT C ATT GGT
ATT AAT GGT GCC AC AT ACT ACGCG AGCT GGGCGAAAGGCCG ATT C ACC AT CT C
CAGAGACAATTCCAAGACCACGGTGTATCTT CAAAT GAAC AGCCTG AGAGCT G
AGG AC ACT GCT GT GT ATTT CT GT GCT A G AGGGG AC AT CT GGGGCCAAGGG ACC
CTCGTCACCGTCTCGAGC (SEQ ID NO: 193).
En una realización de la divulgación, los polinucleótidos de la divulgación comprenden, o como alternativa consisten en, la siguiente secuencia polinucleotídica que codifica la secuencia polipeptídica de cadena pesada de la SEQ ID NO: 54:
GAGGT GCAGCTT GT GGAGT CT GGGGG AGGCTT GGTCCAGCCT GGGGGGT CCCT
GAG ACT CTCCT GT GC AGT CT CT GGAATCGACCT CAGT GGCT ACTACAT GAACT G
GGTCCGTCAGGCTCCAGGGAAGGGGCTGGAGTGGGTCGGAGTCATTGGTATTA
AT GGT GCCACAT ACT ACGCGAGCTGGGCGAAAGGCCG ATT C ACC AT CT CC AGA
G AC AATT CCAAG ACC ACGGT GT AT CTT CAAAT GAAC AGCCT GAG AGCT G AGG A
C ACT GCT GT GT ATTT CT GT GCT AGAGGGGAC AT CT GGGGCCAAGGGACCCTCG
T CACCGT CTCGAGCGCCT CC ACCAAGGGCCC AT CGGT CTT CCCCCT GGCACCCT
CCTCCAAGAGCACCTCTGGGGGCACAGCGGCCCTGGGCTGCCTGGTCAAGGAC
T ACTT CCCCGAACCGGT GACGGT GT CGT GGAACT CAGGCGCCCTG ACC AGCGG
CGT GCAC ACCTT CCCGGCT GT CCT ACAGTCCT CAGGACTCT ACT CCCTC AGCAG
CGTGGTGACCGTGCCCTCCAGCAGCTTGGGCACCCAGACCTACATCTGCAACG
T GAAT CACAAGCCC AGCAAC ACCAAGGT GGACGCGAGAGTT GAGCCCAAAT CT
T GT GACAAAACTCACACAT GCCC ACCGT GCCCAGCACCT GAACTCCT GGGGGG
ACCGT CAGT CTT CCT CTT CCCCCCAAAACCCAAGGAC ACCCT CAT GAT CT CCCG
GACCCCTG AGGT C ACATGCGT GGT GGT GGACGT GAGCCACGAAG ACCCT GAGG
T CAAGTT CAACT GGT ACGT GG ACGGCGT GG AGGT GC ATAAT GCCAAG ACAAAG
CCGCGGGAGGAGCAGTACGCCAGCACGTACCGTGTGGTCAGCGTCCTCACCGT
CCTGCACCAGGACTGGCTGAATGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTCTCCAACA
AA GCCCTCCCAGCCCCCATCGAGAAAACCATCTCCAAAGCCAAAGGGCAGCCC
CGAGAACC ACAGGT GT ACACCCT GCCCCCATCCCGGGAGGAGAT GACCAAG A
ACCAGGT CAGCCTGACCT GCCTGGTCAAAGGCTTCTATCCCAGCGACAT CGCC
GT GGAGTGGGAGAGCAAT GGGC AGCCGGAGAACAACTACAAGACC ACGCCT C
CCGT GCTGG ACTCCGACGGCT CCTTCTTCCT CTACAGCAAGCTC ACCGT GGACA
AG AGC AGGT GGC AGC AGGGG AACGT CTT CT C AT GCT CCGT G AT GC AT G AGGCT
CTGCACAACCACT AC ACGCAGAAGAGCCT CTCCCT GT CT CCGGGT AAAT GA
(SEQ ID NO: 194).
En una realización adicional de la divulgación, los polinucleótidos que codifican fragmentos de anticuerpo que tienen especificidad de unión con CGRP comprenden, o como alternativa consisten en, una o más de las secuencias polinucleotídicas de SEQ ID NO: 195; s Eq ID NO: 196; y SEQ ID NO: 197 que corresponden a polinucleótidos que codifican las regiones determinantes de complementariedad (CDR o regiones hipervariables) de la secuencia variable de cadena ligera de la SEQ ID NO: 51 o la secuencia de cadena ligera de la SEQ ID NO: 52.
En una realizacion adicional de la divulgación, los polinucleótidos que codifican fragmentos de anticuerpo que tienen especificidad de unión con CGRP comprenden, o como alternativa consisten en, una o más de las secuencias polinucleotídicas de SEQ ID NO: 198; s Eq ID NO: 199; y SEQ ID NO: 200 que corresponden a polinucleótidos que codifican las regiones determinantes de complementariedad (CDR o regiones hipervariables) de la secuencia variable de cadena pesada de la SEQ ID NO: 53 o la secuencia de cadena pesada de la SEQ ID NO: 54.
La divulgación también contempla secuencias polinucleotídicas que incluyen una o más de las secuencias polinucleotídicas que codifican fragmentos de anticuerpos descritos en el presente documento. En una realización de la divulgación, los polinucleótidos que codifican fragmentos de anticuerpo que tienen especificidad de unión con CGRP comprenden, o como alternativa consisten en, uno, dos, tres o más, incluyendo todos los siguientes polinucleótidos que codifican fragmentos de anticuerpos: el polinucleótido SEQ ID NO: 191 que codifica la secuencia variable de cadena ligera de la SEQ ID NO: 51; el polinucleótido SEQ ID NO: 192 que codifica la secuencia de cadena ligera de la SEQ ID NO: 52; el polinucleótido SEQ ID NO: 193 que codifica la secuencia variable de cadena pesada de la SEQ ID NO: 53; el polinucleótido SEQ ID NO: 194 que codifica la secuencia de cadena pesada de la SEQ ID NO: 54; polinucleótidos que codifican las regiones determinantes de complementariedad (SEQ ID NO: 195; SEQ ID NO: 196; y SEQ ID NO: 197) de la secuencia variable de cadena ligera de la SEQ ID NO: 51 o la secuencia de cadena ligera de la SEQ ID NO: 52; y polinucleótidos que codifican las regiones determinantes de complementariedad (SEQ ID NO: 198; SEQ ID nO: 199; y SEQ ID NO: 200) de la secuencia variable de cadena pesada de la SEQ ID NO: 53 o la secuencia de cadena pesada de la SEQ ID NO: 54.
En una realización preferente de la divulgación, los polinucleótidos de la divulgación comprenden, o como alternativa consisten en, polinucleótidos que codifican fragmentos Fab (fragmento de unión a antígeno) que tienen especificidad de unión por CGRP. Con respecto al anticuerpo Ab6, los polinucleótidos que codifican el anticuerpo Ab6 de longitud completa comprenden, o como alternativa consisten en, el polinucleótido SEQ ID NO: 192 que codifica la secuencia de cadena ligera de la SEQ ID NO: 52 y el polinucleótido SEQ ID NO: 194 que codifica la secuencia de cadena pesada de la SEQ ID NO: 54.
Otra realización de la divulgación contempla estos polinucleótidos incorporados en un vector de expresión para expresión en células de mamífero tales como CHO, NSO, HEK-293, o en sistemas fúngicos, de insecto o microbianos tales como células de levadura tales como la levadura Pichia. Las especies de Pichia adecuadas incluyen, pero sin limitación, Pichia pastoris. En una realización de la invención descrita en el presente documento (posteriormente), pueden producirse fragmentos Fab mediante digestión enzimática (por ejemplo, papaína) de Ab6 después de la expresión de los polinucleótidos de longitud completa en un hospedador adecuado. En otra realización de la invención, pueden producirse anticuerpos anti CGRP tales como Ab6, o fragmentos Fab de los mismos, mediante expresión de polinucleótidos de Ab6 en células de mamífero tales como células CHO, NSO o HEK 293, sistemas fúngicos, de insectos o microbianos tales como células de levadura (por ejemplo levadura diploide tal como Pichia diploide) y otras cepas de levadura. Las especies de Pichia adecuadas incluyen, pero sin limitación, Pichia pastoris.
Anticuerpo Ab7
La divulgación se dirige además a polinucleótidos que codifican polipéptidos de anticuerpos que tienen especificidad de unión con CGRP. En una realización de la divulgación, los polinucleótidos de la divulgación comprenden, o como alternativa consisten en, la siguiente secuencia polinucleotídica que codifica la secuencia polipeptídica de cadena ligera variable de la SEQ ID NO: 61:
CAAGT GCT GACCC AGACTGCAT CCCCCGT GT CT GC AGCTGT GGGAAGC A
CAGT CACCAT CAATT GCCAGGCC AGT CAG AGT GTTT AT AATTACAACT ACCTT G
CCT GGT AT C AGC AGAAACC AGGGC AGCCTCCC AAGCAACT G AT CT ATT CT ACA
T CC ACT CT GGCAT CT GGGGTCT CAT CGCGATT CAAAGGC AGT GGAT CT GGGAC
AC AGTT C ACT CT CACCAT C AGCG ACGT GC AGT GT G ACG AT GCT GCC ACTT ACTA
CT GT CT AGGC AGTTAT GACTGTAGT ACT GGT GATT GTTTT GTTTTCGGCGGAGG
G ACCG AGGT GGT GGT CAA ACGT (SEQ ID NO: 201).
En una realización de la divulgación, los polinucleótidos de la divulgación comprenden, o como alternativa consisten en, la siguiente secuencia polinucleotídica que codifica la secuencia polipeptídica de cadena ligera de la SEQ ID NO: 62:
CAAGT GCT GACCC AG ACTGCAT CCCCCGT GT CT GC AGCTGT GGGAAGC A
CAGT C ACC ATC AATT GCCAGGCC AGT CAG AGT GTTT AT AATTACAACT ACCTT G
CCTGGT AT CAGCAGAAACC AG GG CAGCCTCCCAAGCAACT GAT CTATT CT AC A
T CC ACT CT GGCAT CT GGGGTCT CAT CGCGATT CAAAGGC AGT GGAT CT GGGAC
AC AGTT C ACT CT CACCAT C AGCG ACGT GC AGT GT G ACG AT GCT GCC ACTT ACTA
CT GT CT AGGC AGTTAT GACTGTAGT ACT GGT GATT GTTTT GTTTT CGGCGGAGG
GACCGAGGT GGT GGT CAAACGT ACGGTGGCT GC ACC AT CT GT CTT CAT CTTCCC
GCC AT CT GAT GAGCAGTT GAAAT CTGGAACTGCCT CTGTT GT GT GCCT GCT GAA
AAT CGGGT AACT CCCAGGAGAGT GTC ACAGAGC AGGAC AGCAAGGAC AGCAC
CT AC AGCCT CAGC AGC ACCCT GACGCT GAGC AAAGC AGACTACGAGAAACAC
AAAGT CT ACGCCTGCGAAGT CACCC AT CAGGGCCT GAGCT CGCCCGTC ACAA A
GA GCTTCAACAGGGGAGAGTGTTAG (SEQ ID NO: 202).
En otra realización de la divulgación, los polinucleótidos de la divulgación comprenden, o como alternativa consisten en, la siguiente secuencia polinucleotídica que codifica la secuencia polipeptídica de cadena pesada variable de la SEQ ID NO: 63:
CA GG AG CAG CTGAAGGAGTCCGGGGGTCGCCTGGTCACGCCTGGGACA
TCCCT GAC ACT C ACCTGCACCGT CT CT GGAAT CG ACCTC AGT AACC ACT ACAT G
CA ATG GG TCCGCCAGGCTCCAGGGAAGGGGCTGGAGTGGATCGGAGTCGTTGG
T ATT AAT GGT CGCAC ATACT ACGCGAGCT GGGCG AAAGGCCGATT CACCAT CT
CCAGAACCTCGTCGACCACGGT GGAT CT GAAAAT GACC AGGCT GACAACCGAG
GACACGGCCACCTATTTCTGTGCCAGAGGGGACATCTGGGGCCCAGGCACCCT
GGTCACCGTCTCGAGC (SEQ ID NO: 203).
En una realización de la divulgación, los polinucleótidos de la divulgación comprenden, o como alternativa consisten en, la siguiente secuencia polinucleotídica que codifica la secuencia polipeptídica de cadena pesada de la SEQ ID NO: 64:
CAGGAGC AGCTGAAGGAGTCCG GGGGT CGCCT GGT CACGCCT GGG ACAT CCCT
GAC A CT C ACCTGCACCGT CT CT GGAAT CG ACCT C AG T A A CC ACT A C AT GCAAT
GGGTCCGCCAGGCTCCAGG GAAG GGGCTG GAGTGG ATCGGAGTCGTTGG TATT
A A T GGTCGCACAT ACTACG CG AG CT G GG CG AAAGGCCGATT CACCAT CT CC A G
AACCTCGTCGACCACGGT G G ATCTG AAAAT G A C C AG G C TG ACAACCG AG G ACA
CGGCCACCTATTTCTGTGCCAGAGGGG ACATCTG GGGCCCAG GCACCCTGG TC
ACCGT CT CGAGCGCCT CC ACCAAG G G CCCATCG G T CTT CCCCCTGGCACCCT CC
T CCAAG AG CACCT CTGGGGGCACAGCGGCCCT GGGCT GCCT GGT CAAG G ACT A
CTTCCCCGAACCGGT GACGGT GT CGT G GAACT C AGGCGCCCT GACC AGCGGCG
T GC ACACCTT CCCGGCT GT CCTACAGTCCT C AG G A C T CT ACTCCCTC AGCAGCG
T GGT GACCGT GCCCTCCAGC AGCTT GGGC ACCCAG ACCT ACATCT GCAACGT G
A A T C A C A A G C C C A G C A A CA C C A AG G TG G AC A A G A G A G TT GAG C C C AA A T CTT
GT G A C A A A A C T CAC A C AT GCCC ACCGT GCCC AGCACCT GAACTCCTGGG GGGA
CCGT CAGTCTT CCT CTTCCCCCCAAAACCCAAG G ACACCCT CAT GAT CTCCCGG
ACCCCT GAGGT CAC A T GCGT GGT GGT GGACGT GAGCC A C G A AG ACCCT GAGGT
C AA G TT CAACT GGT ACGT GG ACGGCGT GG AGGT GC A T A A T GCC A A G A C A A AGC
CGCGGGAGG AG CAGTACG CCAGCACG TACCG TGTGGTCAGCGTCCTCACCGTC
CTGC AC CA G G ACT GGCT GAAT G G CAAG G AG TAC A A G TG CA A G G T C TC C AA C A A
AGCCCT CCCAGCCCCC A T C G A G A A AA C C AT CT C C AA A G CCAAAG G G CAG CCCC
G A G A A C CA C A G G TG TA C AC C CTG CCCCCATCCCG G G AG G AG ATG ACCAAG AA
CC AGGT CAGCCT GACCT GCCT GGT CAAAGG CTT CT AT CCC AGCG A C AT CGCCGT
GGAGTG G G AG AG CA A TG G G C AG CC G G AG AA C A A CTAC A A G A C CA C G C C TC C C
GT GCT GGACTCCG ACGGCT CCTT CTTCCT CT A C AG C A AG CT CACCGT GGACAAG
AGC AGGT GGC A G C A G G G G AACG T CTTCT CAT GCTCCGT GAT GC A T G AGGCT CT
GC A C A A C C A C T A C A C G C A G A A G AGCCT CT CCCT GT CTCCGGGTAAATG A (SEQ
ID NO: 204).
En una realización adicional de la divulgación, los polinucleótidos que codifican fragmentos de anticuerpo que tienen especificidad de unión con CGRP comprenden, o como alternativa consisten en, una o más de las secuencias polinucleotídicas de SEQ ID NO: 205; s Eq ID NO: 206; y SEQ ID NO: 207 que corresponden a polinucleótidos que codifican las regiones determinantes de complementariedad (CDR o regiones hipervariables) de la secuencia variable de cadena ligera de la SEQ ID NO: 61 o la secuencia de cadena ligera de la SEQ ID NO: 62.
En una realización adicional de la divulgación, los polinucleótidos que codifican fragmentos de anticuerpo que tienen especificidad de unión con CGRP comprenden, o como alternativa consisten en, una o más de las secuencias polinucleotídicas de SEQ ID NO: 208; s Eq ID NO: 209; y SEQ ID NO: 210 que corresponden a polinucleótidos que codifican las regiones determinantes de complementariedad (CDR o regiones hipervariables) de la secuencia variable de cadena pesada de la SEQ ID NO: 63 o la secuencia de cadena pesada de la SEQ ID NO: 64.
La divulgación también contempla secuencias polinucleotídicas que incluyen una o más de las secuencias polinucleotídicas que codifican fragmentos de anticuerpos descritos en el presente documento. En una realización de la divulgación, los polinucleótidos que codifican fragmentos de anticuerpo que tienen especificidad de unión con CGRP comprenden, o como alternativa consisten en, uno, dos, tres o más, incluyendo todos los siguientes polinucleótidos que codifican fragmentos de anticuerpos: el polinucleótido SEQ ID NO: 201 que codifica la secuencia variable de cadena ligera de la SEQ ID NO: 61; el polinucleótido SEQ ID NO: 202 que codifica la secuencia de cadena ligera de la SEQ ID NO: 62; el polinucleótido SEQ ID NO: 203 que codifica la secuencia variable de cadena pesada de la SEQ ID NO: 63; el polinucleótido SEQ ID NO: 204 que codifica la secuencia de cadena pesada de la SEQ ID NO: 64; polinucleótidos que codifican las regiones determinantes de complementariedad (SEQ ID NO: 205; SEQ ID NO: 206; y SEQ ID NO: 207) de la secuencia variable de cadena ligera de la SEQ ID NO: 61 o la secuencia de cadena ligera de la SEQ ID NO: 62; y polinucleótidos que codifican las regiones determinantes de complementariedad (SEQ ID NO: 208; SEQ ID nO: 209; y SEQ ID NO: 210) de la secuencia variable de cadena pesada de la SEQ ID NO: 63 o la secuencia de cadena pesada de la SEQ ID NO: 64.
En una realización preferente de la divulgación, los polinucleótidos de la divulgación comprenden, o como alternativa consisten en, polinucleótidos que codifican fragmentos Fab (fragmento de unión a antígeno) que tienen especificidad de unión por CGRP. Con respecto al anticuerpo Ab7, los polinucleótidos que codifican el anticuerpo Ab7 de longitud completa comprenden, o como alternativa consisten en, el polinucleótido SEQ ID NO: 202 que codifica la secuencia de cadena ligera de la SEQ ID NO: 62 y el polinucleótido SEQ ID NO: 204 que codifica la secuencia de cadena pesada de la SEQ ID NO: 64.
Otra realización de la divulgación contempla estos polinucleótidos incorporados en un vector de expresión para expresión en células de mamífero tales como CHO, NSO, HEK-293, o en sistemas fúngicos, de insecto o microbianos tales como células de levadura tales como la levadura Pichia. Las especies de Pichia adecuadas incluyen, pero sin limitación, Pichia pastoris. En una realización de la divulgación descrita en el presente documento (posteriormente), pueden producirse fragmentos Fab mediante digestión enzimática (por ejemplo, papaína) de Ab7 después de la expresión de los polinucleótidos de longitud completa en un hospedador adecuado. En otra realización de la divulgación, pueden producirse anticuerpos anti CGRP tales como Ab7 o fragmentos Fab de los mismos mediante expresión de polinucleótidos de Ab7 en células de mamífero tales como células CHO, NSO o HEK 293, sistemas fúngicos, de insectos o microbianos tales como células de levadura (por ejemplo levadura diploide tal como Pichia diploide) y otras cepas de levadura. Las especies de Pichia adecuadas incluyen, pero sin limitación, Pichia pastoris.
Anticuerpo Ab8
La divulgación se dirige además a polinucleótidos que codifican polipéptidos de anticuerpos que tienen especificidad de unión con CGRP. En una realización de la divulgación, los polinucleótidos de la divulgación comprenden, o como alternativa consisten en, la siguiente secuencia polinucleotídica que codifica la secuencia polipeptídica de cadena ligera variable de la SEQ ID NO: 71:
C AAGT GCT G ACCC AGT CT CC AT CCTCCCT GT CT GC AT CTGT AGG AG AC A
GAGTCACCATCAATTGCCAGGCCAGTCAGAGTGTTTACAATTACAACTACCTTG
CCT GGT AT C AGC AGAAACC AGGG AAAGTTCCT AAGCAACT G AT CT ATT CT ACA
T CC ACT CT GGCAT CTGGGGTCCC AT CT CGTTT CAGT GGC AGT GGAT CT GGGACA
G ATTT C ACT CT C ACC AT C AGC AGCCT GC AGCCT G A AG AT GTT GC AACTT ATT AC
T GT CT GGGC AGTT AT G ATT GT AGT ACT GGT G ATT GTTTT GTTTTCGGCGG AGG A
ACCAAGGTGGAAATCAAACGT (SEQ ID NO: 211).
En una realización de la divulgación, los polinucleótidos de la divulgación comprenden, o como alternativa consisten en, la siguiente secuencia polinucleotídica que codifica la secuencia polipeptídica de cadena ligera de la SEQ ID NO: 72:
C AAGT GCT G ACCC AG T CT CC AT CCTCCCT GT CT GC AT CTGT AGG AG AC A
GAGT C ACC AT CAATT GCCAGGCCAGT C AGAGT GTTT ACAATT ACAA CT ACCTT G
CCT GGT AT C AGC AGAA ACC AGGG AAAGTTCCT AAGC AACT G A T CT ATT CT A CA
T CC ACT CT GGCAT CT GGGGTCCC AT CTCGTTTC AGT GGCAGT GGAT CTGGG ACA
G ATTT C ACT CT C ACC AT C AGC AGCCT GC AGCCT G A AG AT GTT GC AA CTT ATT AC
T GT CT GGGC AGTT AT G ATTGT AGT ACT GGT G ATT GTTTT GTTTT CGGCGG AG G A
ACCAAGGT GGAAAT CAAACGT ACGGTGGCT GCACC AT CT GT CTTC AT CTTCCCG
CC AT CT G AT G AGC AGTT GAAAT CT GG AACT GCCTCTGTTGT GT GCCT GCT GAAT
AA CTT CT AT CCCAGAGAGGCCAAAGTACAGT GGAAGGTGGAT AA CG CCCTCC A
AT CGGGT AACT CC C AGG A G AG T GT C AC A G AGC AGG AC AGC AA GG A C AGC ACC
TACAGCCTCAGCAGCACCCTGACGCTGA GCAAA GCAG ACTACG AG AA ACA CA
AAGT CT ACGCCTGCGAAGT C ACCCAT CAGGGCCTG AG CT CGCCCGT CACAAAG
AGCTTCAA CA GG GGA GA GTG TTA G (SEQ ID NO: 212).
En otra realización de la divulgación, los polinucleótidos de la divulgación comprenden, o como alternativa consisten en, la siguiente secuencia polinucleotídica que codifica la secuencia polipeptídica de cadena pesada variable de la SEQ ID NO: 73:
GAGGT GCAGCTT GT GGAGT CT GGGGGAGGCTTGGTCCAGCCT GGGGGGT
CCCT GAGACTCTCCT GT GCAGT CT CT GGAATCGACCT C AG TAACCACTACAT GC
AAT GGGT CCGT CAGGCTCCAGGGAAGGGGCT GGAGT GGGT CGGAGT CGTT GGT
AT CAAT GGT CGC ACAT ACT ACGCGAGCT GGGCGAAAGGCCGATT CACCAT CT C
CA GA GA CAA TTCCAA GACCACGGTGTATCTTCAAATGAACAGCCTGAGAGCTG
AGG AC ACT GCT GT GT ATTT CT GT GCT AG AG GG G AC AT CT GGGGCC AAGGG ACC
CTCGTCACCGTCTCGAGC (SEQ ID NO: 213).
En una realización de la divulgación, los polinucleótidos de la divulgación comprenden, o como alternativa consisten en, la siguiente secuencia polinucleotídica que codifica la secuencia polipeptídica de cadena pesada de la SEQ ID NO: 74:
GAGGT GCAGCTT GT GGAGT CT GGGGGAGGCTTGGTCCAGCCT GGGGGGT CCCT
GAG ACT CTCCT GT GC AGT CT CT GGAATCGACCTC AG TAA CCACTAC AT GCAATG
GGTCCGT C AG GCTCCAGGGAAGGGGCT GG AGTGGGTCGGAGTCGTTGGT AT C A
AT GGTCGCACAT ACT ACGCGAGCTGGGCGAAAGGCCG ATT C ACC AT CT CC AGA
GAC AA TTCCAA GA CC ACGGT GT ATCTTCAAATGAAC AGCCT GAGAGCTGAGGA
C ACT GCT GT GT ATTT CT GT GCT AG AGGGG AC AT CT GGGGCC A AGGGACCCT CG
T CACCGT CTCGAGCGCCT CC ACCAAGGGCCCATCGGT CTT CCCCCT GGCACCCT
CCTCCAA GAG CA CCTCTGGGGGCACAGCGGCCCTGGGCTGCCTGGTCAAGGAC
T ACTT CCCCGAACCGGT GACGGT GT CGT GGAACT CAGGCGCCCTG ACC AGCGG
CGT GCAC ACCTT CCCGGCT GTCCT ACAGTCCT CAGGACTCT ACT CCCTC AGCAG
CG TGG TGA CCGTGCCCTCCAGCAGCTTGGGCACCCAGACCTACATCTGCAACG
T GAAT CACAAGCCCAGCAAC ACCAAGGT GGACAAGAGAGTT GAGCCCAAAT C
TTGTGACA AA ACTCACACATG CCCACCGTGCCCA GCACCTGA ACTCCTGG GGG
GACCGTC AGT CTTCCT CTT CCCCCCAAAACCCAAGG ACACCCT C AT GAT CTCCC
GGACCCCTGAGGT CAC AT GCGT GGT GGT GGACGT GAGCCACGAAGACCCT GAG
GTCAA GTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCATAATGCCAAGACAAA
GCCG CGG GA GG AG CAG TACGCCAG CA CG TACCGTGTG GTCAGCGTCCTCACCG
TCCT GC ACC A G G ACT GGCT GAAT GGC AAGG AG T A CAA GT GCAAGGT CTCCAAC
AAAGCCCTCCCA GCCCCCA TCG AGA AA ACCATCTCCAA AG CCA AA GG GCA GCC
CCGA GA ACCACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCCCGGGAGGAGATGACCAAGA
ACCAGGTCAGCCTGACCTGCCTG GTCAAA GG CTTCTATCCCAG CG ACA TCG CC
GT GGAGTGGGAGAGCAAT GGGC AG CCGG AGAACAACTACAAGACCACGCCT C
CCGT GCTGG ACTCCGACGGCT CCTTCTTCCT CTACAGCAAGCTC ACCGT GGACA
AG AGC AGGT GGC AGC AGGGG AACGT CTTCT C AT GCTCCGT GAT GC AT G AGGCT
CTGCACAACCACT AC ACGCAGAAGAGCCT CTCCCT GT CT CCGGGTAAAT GA
(SEQ ID NO: 214).
En una realización adicional de la divulgación, los polinucleótidos que codifican fragmentos de anticuerpo que tienen especificidad de unión con CGRP comprenden, o como alternativa consisten en, una o más de las secuencias polinucleotídicas de SEQ ID NO: 215; s Eq ID NO: 216; y SEQ ID NO: 217 que corresponden a polinucleótidos que codifican las regiones determinantes de complementariedad (CDR o regiones hipervariables) de la secuencia variable de cadena ligera de la SEQ ID NO: 71 o la secuencia de cadena ligera de la SEQ ID NO: 72.
En una realización adicional de la divulgación, los polinucleótidos que codifican fragmentos de anticuerpo que tienen especificidad de unión con CGRP comprenden, o como alternativa consisten en, una o más de las secuencias polinucleotídicas de SEQ ID NO: 218; s Eq ID NO: 219; y SEQ ID NO: 220 que corresponden a polinucleótidos que codifican las regiones determinantes de complementariedad (CDR o regiones hipervariables) de la secuencia variable de cadena pesada de la SEQ ID NO: 73 o la secuencia de cadena pesada de la SEQ ID NO: 74.
La divulgación también contempla secuencias polinucleotídicas que incluyen una o más de las secuencias polinucleotídicas que codifican fragmentos de anticuerpos descritos en el presente documento. En una realización de la divulgación, los polinucleótidos que codifican fragmentos de anticuerpo que tienen especificidad de unión con CGRP comprenden, o como alternativa consisten en, uno, dos, tres o más, incluyendo todos los siguientes polinucleótidos que codifican fragmentos de anticuerpos: el polinucleótido SEQ ID NO: 211 que codifica la secuencia variable de cadena ligera de la SEQ ID NO: 71; el polinucleótido SEQ ID NO: 212 que codifica la secuencia de cadena ligera de la SEQ ID NO: 72; el polinucleótido SEQ ID NO: 213 que codifica la secuencia variable de cadena pesada de la SEQ ID NO: 73; el polinucleótido SEQ ID NO: 214 que codifica la secuencia de cadena pesada de la SEQ ID NO: 74; polinucleótidos que codifican las regiones determinantes de complementariedad (SEQ ID NO: 215; SEQ ID NO: 216; y SEQ ID NO: 217) de la secuencia variable de cadena ligera de la SEQ ID NO: 71 o la secuencia de cadena ligera de la SEQ ID NO: 72; y polinucleótidos que codifican las regiones determinantes de complementariedad (SEQ ID NO: 218; SEQ ID nO: 219; y SEQ ID NO: 220) de la secuencia variable de cadena pesada de la SEQ ID NO: 73 o la secuencia de cadena pesada de la SEQ ID NO: 74.
En una realización preferente de la divulgación, los polinucleótidos de la divulgación comprenden, o como alternativa consisten en, polinucleótidos que codifican fragmentos Fab (fragmento de unión a antígeno) que tienen especificidad de unión por CGRP. Con respecto al anticuerpo Ab8 , los polinucleótidos que codifican el anticuerpo Ab8 de longitud completa comprenden, o como alternativa consisten en, el polinucleótido SEQ ID NO: 212 que codifica la secuencia de cadena ligera de la SEQ ID NO: 72 y el polinucleótido SEQ ID NO: 214 que codifica la secuencia de cadena pesada de la SEQ ID NO: 74.
Otra realización de la divulgación contempla estos polinucleótidos incorporados en un vector de expresión para expresión en células de mamífero tales como CHO, NSO, HEK-293, o en sistemas fúngicos, de insecto o microbianos tales como células de levadura tales como la levadura Pichia. Las especies de Pichia adecuadas incluyen, pero sin limitación, Pichia pastoris. En una realización de la divulgación descrita en el presente documento (posteriormente), pueden producirse fragmentos Fab mediante digestión enzimática (por ejemplo, papaína) de Ab8 después de la expresión de los polinucleótidos de longitud completa en un hospedador adecuado. En otra realización de la divulgación, pueden producirse anticuerpos anti CGRP tales como Ab8 o fragmentos Fab de los mismos mediante expresión de polinucleótidos de Ab8 en células de mamífero tales como células CHO, NSO o HEK 293, sistemas fúngicos, de insectos o microbianos tales como células de levadura (por ejemplo levadura diploide tal como Pichia diploide) y otras cepas de levadura. Las especies de Pichia adecuadas incluyen, pero sin limitación, Pichia pastoris.
Anticuerpo Ab9
La divulgación se dirige además a polinucleótidos que codifican polipéptidos de anticuerpos que tienen especificidad de unión con CGRP. En una realización de la divulgación, los polinucleótidos de la descripción comprenden, o como alternativa consisten en, la siguiente secuencia polinucleotídica que codifica la secuencia polipeptídica de cadena ligera variable de la SEQ ID NO: 81:
C A A G T GCT G A C C C A G A C T C C A T CCCCCG T G T CT GC A G C T G T G G G A A G C A
C A G T C A C C A T C A A T T GCC A G G C C A G T C A G A A T G T T T A T A A T A A C A A C T A C C T A
G CCT G G T A T C A G C A G A A A C C A G G G C A G C C T C C C A A G C A A C T G A T CT A T T C T A C
G T C C A C T CT G G C A T C TG G G G TC T C A T C G C G A T T C A G A G G C A G T GG A T CT GGG A
C A C A G T T C A C T CT C A C C A T C A G C G A C G T GC A G T G T G A C G A T G C T GCC A C T T A C T
A C T G TC T A G G C A G T T A T G A T T G T A G T CG T G G T G A T T G T T T T G T T T T CGGC G G A G
G G A C C G A G G T G G T G G T C A A A C G T (SEQ ID N O : 221).
E n u n a re a liz a c ió n d e la d iv u lg a c ió n , lo s p o lin u c le ó t id o s d e la d iv u lg a c ió n c o m p re n d e n , o c o m o a lte rn a t iv a c o n s is te n e n , la s ig u ie n te s e c u e n c ia p o lin u c le o t íd ic a q u e c o d if ic a la s e c u e n c ia p o lip e p tíd ic a d e c a d e n a lig e ra d e la S E Q ID N O : 82 :
CAAGT GCT GACCC AG ACTCCATCCCCCGTGT CTGCAGCT GTGGGAAGC A
C AGT C ACC AT C AATT GCC AGGCC AGT C AG AAT GTTT AT AAT AAC AACT ACCT A
GCCT GGT AT CAGCAGAAACC AGGGC AGCCT CCCAAGCAACT GAT CT ATTCT AC
GTCCACT CT GGCAT CT GGGGT CT C ATCGCGA TT CAG AGGC AGT GGATCT GGGA
C A C AGTT C ACT CT C ACC AT C AG CG ACGT GC AGT GT G ACG AT GCT GCC ACTT ACT
ACT GTCT AGGC AGTT AT G ATT GT AGT CGT GGT G ATT GTTTT GTTTT CGGCGG AG
GGACCGAGGT GGT GGT CAAACGTACGGT GGCT GC ACCAT CTGTCTT CAT CTTCC
CGCCAT CT GAT GAGC AGTT GAAAT CTGGAACT GCCT CTGTT GT GT GCCT GCT GA
AT AACTT CT AT CCCAGAG AGGCC AAAGT AC AGT GGAAGGT GG AT AACGCCCT C
CA ATCGG GTA ACTCCCAGGAGAGTGTCACAGAGCAGGACAGCAAGGACAGCA
CCTACAGCCTCAGCAGCACCCTGACGCTGAGCAAAGCAGACTACGAGAAACAC
AAAGT CT ACGCCT GCGAAGT CACCCATC AGGGCCT GAGCT CGCCCGT CACAAA
GA GCTTCAACAGGGGAGAGTGTTAG (SEQ ID NO: 222).
En otra realización de la divulgación, los polinucleótidos de la divulgación comprenden, o como alternativa consisten en, la siguiente secuencia polinucleotídica que codifica la secuencia polipeptídica de cadena pesada variable de la SEQ ID NO: 83:
CAGT CGCTGGAGGAGTCCGGGGGT CGCCT GGT CACGCCT GGGACACCCC
T G AC ACT C ACCT GC AC AGT CT CT GG A AT CGGCCT C AGT AGCT ACT AC AT GC AGT
GGGT CCGCC AGT CT CC AG GG AGGGGGCT GGAAT GG AT CGG AGT C ATT GGT AGT
GAT GGT AAG ACAT ACT ACGCGACCT GGGCGAAAGGCCGATT C ACCAT CT CCAA
GACCTCGTCGACCACGGT GGATCTGAGAAT GGCCAGTCTGACAACCGAGGACA
CG GCCACCTATTTCTGTACCAGAGGGGACATCTGGGGCCCGGGGACCCTCGTC
ACCG TCTCGA GC (SEQ ID NO: 223).
En una realización de la divulgación, los polinucleótidos de la divulgación comprenden, o como alternativa consisten en, la siguiente secuencia polinucleotídica que codifica la secuencia polipeptídica de cadena pesada de la SEQ ID NO: 84:
CA GTCGCTGG AG GAGTCCGGGGGTCGCCTGGTCACGCCTGGGACACCCCTGAC
ACT C ACCT GC AC AGT CT CT GG A AT CGGCCT C AGT AGCT ACT AC AT GC AGT GGGT
CCGCC AGT CT CC A G G G AGGGGGCT GGAAT GG AT CGG AGT C ATT GGT AGT G AT G
GTAAG ACATACTACGCGACCTGGGCGAAAGGCCGATTCACCATCTCCAAGACC
T CGT CG ACC ACGGT GG AT CT G AGAAT GGCC AGT CT G AC AA CCG AGG AC ACGGC
CACCT ATTT CT GT ACCAGAGGGGACAT CT GG GGCCCGGGGACCCTCGT CACCG
T CTCGAGCGCCT CC ACCA AGGGCCCATCGGT CTT CCCCCTGGC ACCCTCCTCCA
AGAGCACCT CT GGGGGC ACAGCGGCCCT GGGCT GCCTGGT CAAGGACT ACTT C
CCCG AACCG GTG ACGGTGTCGTGGAACTCAGGCGCCCTGACCAGCGGCGTGCA
CACCTTCCCGGCTGTCCT AC AGT CCT CAGGACT CTACT CCCT C AGCAGCGT GGT
GACCGT GCCCT CC AGCAGCTT GGGC ACCCAGACCT ACAT CT GCAACGTGAAT C
AC AAGCCCAGCAACACCAAGGT GGACAAGAGAGTT GAGCCCAAAT CTT GT GA
C AAAACT C AC AC A T GCCC ACCGT GCCC AGC ACCT GAACT C CT GGGGGG ACCGT
CAGT CTT CCTCTTCCCCCCAAAACCCAAGG AC ACCCTC AT GAT CT CCCGGACCC
CTG AGGT CACAT GCGT GGT GGT GGACGTGAGCCACGAAGACCCT GAGGTCAAG
TTCAA CTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCATAATGCCAAGACAAAGCCGCG
GGAGGAGCAGT ACGCCAGCACGT ACCGT GT GGT CAGCGT CCTC ACCGT CCT GC
ACC AGG ACT GGCT GAAT GGC AAGG AGT AC AAGTGCAAGGT CT CC AACAAAGC
CCTCCCA GCCCCCATCGAGAAAACCATCTCCAAAGCCAAAGGGCAGCCCCGAG
AA CCACA GG TGTACACCCTGCCCCCATCCCGGGAGGAGATGACCAAGAACCAG
GT CAGCCTGACCT GCCT GGT CAAAGGCTT CT ATCCC AG CG AC AT CGCCGT GGA
GTGGG AG AG CAATGGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGACCACGCCTCCCGTG
CT GG ACT CCGACGGCTCCTT CTTCCT CT ACAGC AAGCT CACCGT GGACAAGAGC
AGGT GGC AGCAGGGGAACGT CTT CT C AT GCTCCGT GAT GC AT GAGGCT CTGCA
C A ACC ACT AC A CGC AGAAG AGCCT CTCCCT GT CT CCGGGT AAAT G A (SEQ ID
NO: 224).
En una realización adicional de la divulgación, los polinucleótidos que codifican fragmentos de anticuerpo que tienen especificidad de unión con CGRP comprenden, o como alternativa consisten en, una o más de las secuencias polinucleotídicas de SEQ ID NO: 225; s Eq ID NO: 226; y SEQ ID NO: 227 que corresponden a polinucleótidos que codifican las regiones determinantes de complementariedad (CDR o regiones hipervariables) de la secuencia variable de cadena ligera de la SEQ ID NO: 81 o la secuencia de cadena ligera de la SEQ ID NO: 82.
En una realización adicional de la divulgación, los polinucleótidos que codifican fragmentos de anticuerpo que tienen especificidad de unión con CGRP comprenden, o como alternativa consisten en, una o más de las secuencias polinucleotídicas de SEQ ID NO: 228; s Eq ID NO: 229; y SEQ ID NO: 230 que corresponden a polinucleótidos que codifican las regiones determinantes de complementariedad (CDR o regiones hipervariables) de la secuencia variable de cadena pesada de la SEQ ID NO: 83 o la secuencia de cadena pesada de la SEQ ID NO: 84.
La divulgación también contempla secuencias polinucleotídicas que incluyen una o más de las secuencias polinucleotídicas que codifican fragmentos de anticuerpos descritos en el presente documento. En una realización de la divulgación, los polinucleótidos que codifican fragmentos de anticuerpo que tienen especificidad de unión con CGRP comprenden, o como alternativa consisten en, uno, dos, tres o más, incluyendo todos los siguientes polinucleótidos que codifican fragmentos de anticuerpos: el polinucleótido SEQ ID NO: 221 que codifica la secuencia variable de cadena ligera de la SEQ ID NO: 81; el polinucleótido SEQ ID NO: 222 que codifica la secuencia de cadena ligera de la SEQ ID NO: 82; el polinucleótido SEQ ID NO: 223 que codifica la secuencia variable de cadena pesada de la SEQ ID NO: 83; el polinucleótido SEQ ID NO: 224 que codifica la secuencia de cadena pesada de la SEQ ID NO: 84; polinucleótidos que codifican las regiones determinantes de complementariedad (SEQ ID NO: 225; SEQ ID NO: 226; y SEQ ID NO: 227) de la secuencia variable de cadena ligera de la SEQ ID NO: 81 o la secuencia de cadena ligera de la SEQ ID NO: 82; y polinucleótidos que codifican las regiones determinantes de complementariedad (SEQ ID NO: 228; SEQ ID nO: 229; y SEQ ID NO: 230) de la secuencia variable de cadena pesada de la SEQ ID NO: 83 o la secuencia de cadena pesada de la SEQ ID NO: 84.
En una realización preferente de la divulgación, los polinucleótidos de la divulgación comprenden, o como alternativa consisten en, polinucleótidos que codifican fragmentos Fab (fragmento de unión a antígeno) que tienen especificidad de unión por CGRP. Con respecto al anticuerpo Ab9, los polinucleótidos que codifican el anticuerpo Ab9 de longitud completa comprenden, o como alternativa consisten en, el polinucleótido SEQ ID NO: 222 que codifica la secuencia de cadena ligera de la SEQ ID NO: 82 y el polinucleótido SEQ ID NO: 224 que codifica la secuencia de cadena pesada de la SEQ ID NO: 84.
Otra realización de la divulgación contempla estos polinucleótidos incorporados en un vector de expresión para expresión en células de mamífero tales como CHO, NSO, HEK-293, o en sistemas fúngicos, de insecto o microbianos tales como células de levadura tales como la levadura Pichia. Las especies de Pichia adecuadas incluyen, pero sin limitación, Pichia pastoris. En una realización de la divulgación descrita en el presente documento (posteriormente), pueden producirse fragmentos Fab mediante digestión enzimática (por ejemplo, papaína) de Ab9 después de la expresión de los polinucleótidos de longitud completa en un hospedador adecuado. En otra realización de la divulgación, pueden producirse anticuerpos anti CGRP tales como Ab9 o fragmentos Fab de los mismos mediante expresión de polinucleótidos de Ab9 en células de mamífero tales como células CHO, NSO o HEK 293, sistemas fúngicos, de insectos o microbianos tales como células de levadura (por ejemplo levadura diploide tal como Pichia diploide) y otras cepas de levadura. Las especies de Pichia adecuadas incluyen, pero sin limitación, Pichia pastoris.
Anticuerpo Ab10
La divulgación se dirige además a polinucleótidos que codifican polipéptidos de anticuerpos que tienen especificidad de unión con CGRP. En una realización de la divulgación, los polinucleótidos de la divulgación comprenden, o como alternativa consisten en, la siguiente secuencia polinucleotídica que codifica la secuencia polipeptídica de cadena ligera variable de la SEQ ID NO: 91:
C A A G T G C T G A C C C A G T CT CC A T CC TC C C T G T CT GC A T C TG T A G G A G A C A
G A G T C A C C A T C A A T T G C C A G G C C A G T C A G A A T G T T T A C A A T A A C A A C T A C C T A
G CCT G G T A T C A G C A G A A A C C A G G G A A A G T T C C T A A G C A A C T G A T CT A T T CT A C
A T C C A C T CT G G C A T CT G G G G T C C C A T C TC G TTTC A G T GGC A G T GG A T CT G G G AC
A G A T T T C A C T CT C A C C A T C A G C A G C C T GC A G C C T G A A G A T G TT GC A A C T T A T T A
CT G T C T G G G C A G T T A T G A T T GT A G T C G T G G T G A T T G T T T T G T T T T C G G C G G AG G
A A C C A A G G T G G A A A T C A A A C G T (SEQ ID N O : 231).
E n u n a re a liz a c ió n d e la d iv u lg a c ió n , lo s p o lin u c le ó t id o s d e la d iv u lg a c ió n c o m p re n d e n , o c o m o a lte rn a t iv a c o n s is te n e n , la s ig u ie n te s e c u e n c ia p o lin u c le o t íd ic a q u e c o d if ic a la s e c u e n c ia p o lip e p tíd ic a d e c a d e n a lig e ra d e la S E Q ID N O : 92 :
C AAGTGCT G ACCC AGT CT CC AT CCTCCCT GT CT GC AT CTGT AGG AG AC A
GAGT C ACC AT CAATT GCCAGGCCAGT C AGAAT GTTTACAATAACAACT ACCT A
GCCT GGT AT C AGC AGAAAC C AGGGAAAGTTCCT AAGC AACT G AT CT ATT CT AC
AT CCACT CT GGCAT CT GGGGT CCCAT CTCGTTTC AGT GGC AGT GGAT CT GGGAC
AG ATTT C ACT CT C ACC AT C AGC AGCCT GC AGCCT G AA G AT GTT GC AACTT ATT A
CT GT CTGGGCAGTT AT GATT GT AG TCGT GGT GATT GTTTT GTTTT CGGCGGAGG
AACCAAGGT GGAAATCAAACGT ACGGTGGCTGCACCATCT GTCTTC ATCTTCCC
GCC AT CT G AT G AGC AGTT GAAAT CT GGAACT GCCTCT GTT GT GT GCCTGCT GAA
T AACTT CT AT CCC AG AG AGGCCA A AGT AC AGT GG A AGGT GGAT AA CGCCCT CC
AAT CGGGT AACT CCCAGGAG AGTGT CACAGAGC AGGACAGCAAGGACAGCAC
CTAC AGCCT CAGCAGCACCCT GACGCT GAGCAAAGCAGACT ACG AGAAAC AC
AAAGT CT ACGCCTGCGAAGT CACCC AT CAGGGCCTG AG CTCGCCCGT CAC A A A
GAGCTT CAACAGGGGAGAGT GTT AG (SEQ ID NO: 232).
En otra realización de la divulgación, los polinucleótidos de la divulgación comprenden, o como alternativa consisten en, la siguiente secuencia polinucleotídica que codifica la secuencia polipeptídica de cadena pesada variable de la SEQ ID NO: 93:
GAGGT GCAGCTT GT GGAGT CT GGGGGAGGCTTGGTCCAGCCT GGGGGGT
CCCT G AG ACT CTCCT GT GC AGT CTCT GGAAT CGGCCT C AGT AGCT ACT AC AT GC
AAT GGGT CCGT CAGGCTCCAGGGAAGGGGCT GGAGT GGGT CGGAGT CATT GGT
AGT GAT GGT AAGAC AT ACT ACGCGACCT GGGCGAAAGGCCGATT CACCAT CT C
C AGAGACAATT CCAAGACC ACGGT GT ATCTT CAAAT GAAC AGCCT GAGAGCT G
AGG AC ACT GCT GT GT ATTT CT GT ACC AG AGGGG AC AT CT GGGGCCAAGGG ACC
CTCGTCACCGTCTCGAGC (SEQ ID NO: 233).
En una realización de la divulgación, los polinucleótidos de la divulgación comprenden, o como alternativa consisten en, la siguiente secuencia polinucleotídica que codifica la secuencia polipeptídica de cadena pesada de la SEQ ID NO: 94:
GAGGT GCAGCTT GT GGAGT CT GGGGGAGGCTTGGTCCAGCCT GGGGGGT CCCT
GAG ACT CTCCT GT GC AGT CT CT GGAATCGGCCT CAGT AGCT ACTACAT GCAAT G
GGTCCGT C AGGCTCCAGGGAAGGGGCT GGAGT GGGTCGGAGT C ATTGGT AGT G
AT GGT A AG AC AT ACT ACGCG ACCT GGGCGAAAGGCCG ATT C ACC AT CT CC AG A
G AC AATT CCAAG ACC ACGGT GT AT CTT CAAAT GAAC AGCCT GAG AGCT G AGG A
C ACT GCT GT GT ATTT CT GT AC C AG AGGGG AC AT CT GGGGCC A AGGG ACCCT CG
T CACCGT CTCGAGCGCCT CC ACCAAGGGCCC AT CGGT CTT CCCCCT GGCACCCT
CCTCCAAGAGCACCTCTGGGGGCACAGCGGCCCTGGGCTGCCTGGTCAAGGAC
T ACTT CCCCGAACCGGT GACGGT GT CGT GGAACT CAGGCGCCCTG ACC AGCGG
CGT GCAC ACCTT CCCGGCT GT CCT ACAGTCCT CAGGACTCT ACT CCCTC AGCAG
CGT GGT GACCGT GCCCTCCAGCAGCTT GGGCACCCAGACCT ACATCT GCAACG
T GAAT CACAAGCCC AGCAAC ACCAAGGT GGACAAGAGAGTT GAGCCCAAAT C
TTGTGACAAAACTCACACATGCCCACCGTGCCCAGCACCTGAACTCCTGGGGG
GACCGTC AGT CTTCCT CTT CCCCCCAAAACCCAAGGAC ACCCT C AT GAT CTCCC
GGACCCCTGAGGT CAC AT GCGT GGT GGT GGACGT GAGCCACGAAGACCCT GAG
GTCAAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCATAATGCCAAGACAAA
GCCGCGGGAGGAGCAGT ACGCC AGC ACGTACCGT GTGGT C AGCGT CCT C ACCG
TCCT GC ACC AG G ACT GGCT GAAT GGC AAGG AGT ACAA GT GCAAGGT CTCCAAC
AAAGCCCTCCCAGCCCCCATCGAGAAAACCATCTCCAAAGCCAAAGGGCAGCC
CCGAGAACCACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCCCGGGAGGAGATGACCAAGA
ACCAGGT CAGCCTGACCT GCCTGGTCAAAGGCTTCTATCCCAGCGACAT CGCC
GTGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGACCACGCCTC
CCGT GCTGG ACTCCGACGGCT CCTTCTTCCT CTACAGCAAGCTC ACCGT GGACA
AG AGC AGGT GGC AGC AGGGG AACGT CTTCT C AT GCT CCGT GAT GC AT G AGGCT
CTGCACAACCACT AC ACGCAGAAGAGCCT CTCCCT GT CT CCGGGTAAAT GA
(SEQ ID NO: 234).
En una realización adicional de la divulgación, los polinucleótidos que codifican fragmentos de anticuerpo que tienen especificidad de unión con CGRP comprenden, o como alternativa consisten en, una o más de las secuencias polinucleotídicas de SEQ ID NO: 235; s Eq ID NO: 236; y SEQ ID NO: 237 que corresponden a polinucleótidos que codifican las regiones determinantes de complementariedad (CDR o regiones hipervariables) de la secuencia variable de cadena ligera de la SEQ ID NO: 91 o la secuencia de cadena ligera de la SEQ ID NO: 92.
En una realización adicional de la divulgación, los polinucleótidos que codifican fragmentos de anticuerpo que tienen especificidad de unión con CGRP comprenden, o como alternativa consisten en, una o más de las secuencias polinucleotídicas de SEQ ID NO: 238; s Eq ID NO: 239; y SEQ ID NO: 240 que corresponden a polinucleótidos que codifican las regiones determinantes de complementariedad (CDR o regiones hipervariables) de la secuencia variable de cadena pesada de la SEQ ID NO: 93 o la secuencia de cadena pesada de la SEQ ID NO: 94.
La divulgación también contempla secuencias polinucleotídicas que incluyen una o más de las secuencias polinucleotídicas que codifican fragmentos de anticuerpos descritos en el presente documento. En una realización de la divulgación, los polinucleótidos que codifican fragmentos de anticuerpo que tienen especificidad de unión con CGRP comprenden, o como alternativa consisten en, uno, dos, tres o más, incluyendo todos los siguientes polinucleótidos que codifican fragmentos de anticuerpos: el polinucleótido SEQ ID NO: 231 que codifica la secuencia variable de cadena ligera de la SEQ ID NO: 91; el polinucleótido SEQ ID NO: 232 que codifica la secuencia de cadena ligera de la SEQ ID NO: 92; el polinucleótido SEQ ID NO: 233 que codifica la secuencia variable de cadena pesada de la SEQ ID NO: 93; el polinucleótido SEQ ID NO: 234 que codifica la secuencia de cadena pesada de la SEQ ID NO: 94; polinucleótidos que codifican las regiones determinantes de complementariedad (SEQ ID NO: 235; SEQ ID NO: 236; y SEQ ID NO: 237) de la secuencia variable de cadena ligera de la SEQ ID NO: 91 o la secuencia de cadena ligera de la SEQ ID NO: 92; y polinucleótidos que codifican las regiones determinantes de complementariedad (SEQ ID NO: 238; SEQ ID nO: 239; y SEQ ID NO: 240) de la secuencia variable de cadena pesada de la SEQ ID NO: 93 o la secuencia de cadena pesada de la SEQ ID NO: 94.
En una realización preferente de la divulgación, los polinucleótidos de la divulgación comprenden, o como alternativa consisten en, polinucleótidos que codifican fragmentos Fab (fragmento de unión a antígeno) que tienen especificidad de unión por CGRP. Con respecto al anticuerpo Ab10, los polinucleótidos que codifican el anticuerpo Ab10 de longitud completa comprenden, o como alternativa consisten en, el polinucleótido SEQ ID NO: 232 que codifica la secuencia de cadena ligera de la SEQ ID NO: 92 y el polinucleótido SEQ ID NO: 234 que codifica la secuencia de cadena pesada de la SEQ ID NO: 94.
Otra realización de la divulgación contempla estos polinucleótidos incorporados en un vector de expresión para expresión en células de mamífero tales como CHO, NSO, HEK-293, o en sistemas fúngicos, de insecto o microbianos tales como células de levadura tales como la levadura Pichia. Las especies de Pichia adecuadas incluyen, pero sin limitación, Pichia pastoris. En una realización de la divulgación descrita en el presente documento (posteriormente), pueden producirse fragmentos Fab mediante digestión enzimática (por ejemplo, papaína) de Ab10 después de la expresión de los polinucleótidos de longitud completa en un hospedador adecuado. En otra realización de la divulgación, pueden producirse anticuerpos anti CGRP tales como Ab10 o fragmentos Fab de los mismos mediante expresión de polinucleótidos de Ab10 en células de mamífero tales como células CHO, NSO o HEK 293, sistemas fúngicos, de insectos o microbianos tales como células de levadura (por ejemplo levadura diploide tal como Pichia diploide) y otras cepas de levadura. Las especies de Pichia adecuadas incluyen, pero sin limitación, Pichia pastoris.
Anticuerpo Ab11
La divulgación se dirige además a polinucleótidos que codifican polipéptidos de anticuerpos que tienen especificidad de unión con CGRP. En una realización de la divulgación, los polinucleótidos de la divulgación comprenden, o como alternativa consisten en, la siguiente secuencia polinucleotídica que codifica la secuencia polipeptídica de cadena ligera variable de la SEQ ID NO: 101:
C A G G T G CT G A C C C A G A C T GC A T CCCCCG T G T CT CC A G C T G T G G G A A G C A
C A G T C A C C A T C A A T T G C C G G G C C AG T C A G A G T G T T T A T T A T A A C A A C T A C C T A G
CCT G G T A T C A G C A G A A A C C A G G G C A G C C T CCC A A G C A A C T G A T CT A T T CT A C A
T CC A C T CT G G C A T CT G G G G T CT C A T C G C G G T T C A A A G G C A G T GG A T CT G G G A C
A C A G T T C A C T CT C A C C A T C A G C G A C G T G C A G TG T G A C G A T GCT GCC A C T T A C T A
CT G T C T A G G C A G T T A T G A T T GT A G T A A T G G T G A T T G T T T T G TTTTC G G C G G A G G
G A C C G A G G T G G T G G T C A A A C G T (SEQ ID N O : 241).
E n u n a re a liz a c ió n d e la d iv u lg a c ió n , lo s p o lin u c le ó t id o s d e la d iv u lg a c ió n c o m p re n d e n , o c o m o a lte rn a t iv a c o n s is te n e n , la s ig u ie n te s e c u e n c ia p o lin u c le o t íd ic a q u e c o d if ic a la s e c u e n c ia p o lip e p tíd ic a d e c a d e n a lig e ra d e la S E Q ID N O : 102 :
C AGGT GCT GACCCAGACT GC AT CCCCCGT GT CT CC AGCTGT GGGAAGCA
C AGT CACCATCAATT GCCGGGCCAGTC AGAGT GTTT ATT AT AAC AACT ACCTAG
CCTGGT AT CAGC AGAAACCAGGGC AG CCTCCCAAGCAACTG AT CT ATTCT AC A
T CC ACT CT GGCAT CT GGGGT CT C AT CGCGGTTCAAAGGCAGT GG AT CT GGGAC
AC AGTT C ACT CT C ACC AT C AGCG ACGT GC AGT GT G ACG AT GCTGCC ACTT ACT A
CT GT CTAGGCAGTT AT GATT GT AGT AAT GGT GATT GTTTT GTTTT CGGCGGAGG
GACCGAGGT GGTGGT CAAACGT ACGGT GGCT GC ACC AT CT GT CTT CAT CTTCCC
GCC AT CT G AT G AGC AGTT G AA AT CT GG AA CT GCCTCT GTT GT GT GCCTGCT G A A
T AACTT CT AT CCC AG AGAGGCCAAAGT ACAGT GGAAGGTGGATAACGCCCT CC
AAT CGGGT AACT CCCAGGAGAGT GTC ACAGAGC AGGAC AGCAAGGAC AGCAC
CTACA GCCTCAGCAGCACCCTGACGCTGAGCAAAGCAGACTACGAGAAACAC
AAAGT CT ACGCCTGCGAAGT CACCC AT CAGGGCCT GAGCT CGCCCGTC ACAA A
G AGCTT C AAC AG GG G AGAGT GTT AG (SEQ ID NO: 242).
En otra realización de la divulgación, los polinucleótidos de la divulgación comprenden, o como alternativa consisten en, la siguiente secuencia polinucleotídica que codifica la secuencia polipeptídica de cadena pesada variable de la SEQ ID NO: 103:
CAGT CGCTGGAGGAGTCCGGGGGT CGCCT GGT CACGCCT GGAGGAT CCC
T G AC ACT C ACCT GC ACAGT CTCT GGAATCG ACGT C ACT AACT ACT AT AT GCAAT
GGGTCCGCCAGGCTCC AGGGAAGGGGCTGGAATGGATCGGAGTC ATT GGTGTG
AAT GGTAAG AGAT ACT ACGCG AGCT GGGCGAAAGGCCGATT CACCAT CTCCAA
AA CCTCGTCGACCACGGTGGATCTGAAAATGACCAGTCTGACAACCGAGGACA
CGGCC ACCT ATTTCT GT GCCAGAGGCGAC AT CT GGGGCCCGGGGACCCT CGTC
ACCGTCTCGAGC (SEQ ID NO: 243).
En una realización de la divulgación, los polinucleótidos de la divulgación comprenden, o como alternativa consisten en, la siguiente secuencia polinucleotídica que codifica la secuencia polipeptídica de cadena pesada de la SEQ ID NO: 104:
CAGTCGCTGG AG GAG TCCGG GG GTCGCCTGG TCA CG CCTGGA GG ATCCCTGA C
ACT C ACCT GC A CAG T CT CTGG AAT CG ACGT C ACT AA CT ACT AT ATGCAAT GGGT
CCGCCAGGCTCCAGGGAAGGG GCTGGA ATG GA TCG GA GTCATTG GTG TG AATG
GTAAGAGAT ACT ACGCGAGCT GGGCGAAAGGCCGATT CACCAT CT CCAAAACC
T CGT CG ACC ACGGT GG AT CT G AAAAT G ACC AGT CT G AC AACCG AGG AC ACGGC
CACCTATTTCTG TGCCA GAG GCGA CATCTG GGG CCCGG GG ACCCTCGTCACCG
T CTCGAGCGCCT CC ACCA AG GGCCCATCGGT CTT CCCCCTGGCACCCT CCTCCA
AG AGCACCT CT GGGGGC ACAGCGGCCCT GGGCT GCCT GGTCAAGGACT ACTT C
CCCGAACCG GTG ACGGTGTCGTG GA ACTCAG GCGCCCTG ACCA GCG GCGTG CA
CACCTTCCCGGCTGTCCT AC AGT CCT CAGGACT CTACT CCCT C AGCAGCGT GGT
GACCGT GCCCT CC AGCAGCTT GGGC ACCCAGA CCT ACAT CT GCAACGTGAAT C
ACAAGCCCAGCAACACCA AGG TGG ACAA GAG AG TTGA GCCCAAA TCTTGTG A
CAAAACT C ACAC AT GCCCACCGTGCCC AGCACCT GAACTCCT GGGGGGACCGT
CAGT CTT CCTCTTCCCCCCAAAACCCAAGG AC ACCCTC AT GAT CT CCCGGACCC
CTG AGGT CACAT GCGT GGT GGT GGACGTGAGCCACGAAGACCCT GAGGTCAAG
TTCAA CTG GTA CGTGG ACG GCGTG GA GGTGCA TAA TGCCA AG ACA AA GCCGCG
GG AG GA GCAGTACGCCAGCACGTACCGTGTGGTCAGCGTCCTCACCGTCCTGC
ACC AGGACTGGCT GAAT GGCAAGGAGT ACAAGT GCAAGGT CTCCAACAAAGC
CCTCCCA GCCCCCATCGAGAAAACCATCTCCAAAGCCAAAGGGCAGCCCCGAG
AA CCACA GG TGTACACCCTGCCCCCATCCCGGGAGGAGATGACCAAGAACCAG
GT CAGCCTGACCT GCCT GGT CA AAGGCTT CT ATCCC AGCGAC AT CGCCGT GGA
GTGGGAG AG CAA TG GGCAG CCG GA GA ACA ACTACAA GACCA CGCCTCCCGTG
CT GG ACT CCGACGGCTCCTT CTTCCT CT ACAGC AA GCT CACCGT GGACAAGAGC
AGGT GGC AGCAGGGGAACGT CTT CT C AT GCTCCGT GAT GC AT GAGGCT CTGCA
C A ACC ACT AC ACGC AGAAG AGCCT CTCCCT GT CT CCGGGT AAAT G A (SEQ ID
NO: 244).
En una realización adicional de la divulgación, los polinucleótidos que codifican fragmentos de anticuerpo que tienen especificidad de unión con CGRP comprenden, o como alternativa consisten en, una o más de las secuencias polinucleotídicas de SEQ ID NO: 245; s Eq ID NO: 246; y SEQ ID NO: 247 que corresponden a polinucleótidos que codifican las regiones determinantes de complementariedad (CDR o regiones hipervariables) de la secuencia variable de cadena ligera de la SEQ ID NO: 101 o la secuencia de cadena ligera de la SEQ ID NO: 102.
En una realización adicional de la divulgación, los polinucleótidos que codifican fragmentos de anticuerpo que tienen especificidad de unión con CGRP comprenden, o como alternativa consisten en, una o más de las secuencias polinucleotídicas de SEQ ID NO: 248; s Eq ID NO: 249; y SEQ ID NO: 250 que corresponden a polinucleótidos que codifican las regiones determinantes de complementariedad (CDR o regiones hipervariables) de la secuencia variable de cadena pesada de la SEQ ID NO: 103 o la secuencia de cadena pesada de la SEQ ID NO: 104.
La divulgación también contempla secuencias polinucleotídicas que incluyen una o más de las secuencias polinucleotídicas que codifican fragmentos de anticuerpos descritos en el presente documento. En una realización de la divulgación, los polinucleótidos que codifican fragmentos de anticuerpo que tienen especificidad de unión con CGRP comprenden, o como alternativa consisten en, uno, dos, tres o más, incluyendo todos los siguientes polinucleótidos que codifican fragmentos de anticuerpos: el polinucleótido SEQ ID NO: 241 que codifica la secuencia variable de cadena ligera de la SEQ ID NO: 101; el polinucleótido SEQ ID NO: 242 que codifica la secuencia de cadena ligera de la SEQ ID NO: 102; el polinucleótido SEQ ID NO: 243 que codifica la secuencia variable de cadena pesada de la SEQ ID NO: 103; el polinucleótido SEQ ID NO: 244 que codifica la secuencia de cadena pesada de la SEQ ID NO: 104; polinucleótidos que codifican las regiones determinantes de complementariedad (SEQ ID NO: 245; SEQ ID NO: 246; y SEQ ID NO: 247) de la secuencia variable de cadena ligera de la SEQ ID NO: 101 o la secuencia de cadena ligera de la SEQ ID NO: 102; y polinucleótidos que codifican las regiones determinantes de complementariedad (SEQ ID NO: 248; SEQ ID nO: 249; y SEQ ID NO: 250) de la secuencia variable de cadena pesada de la SEQ ID NO: 103 o la secuencia de cadena pesada de la SEQ ID NO: 104.
En una realización preferente de la divulgación, los polinucleótidos de la divulgación comprenden, o como alternativa consisten en, polinucleótidos que codifican fragmentos Fab (fragmento de unión a antígeno) que tienen especificidad de unión por CGRP. Con respecto al anticuerpo Ab11, los polinucleótidos que codifican el anticuerpo Ab11 de longitud completa comprenden, o como alternativa consisten en, el polinucleótido SEQ ID NO: 242 que codifica la secuencia de cadena ligera de la SEQ ID NO: 102 y el polinucleótido SEQ ID NO: 244 que codifica la secuencia de cadena pesada de la SEQ ID NO: 104.
Otra realización de la divulgación contempla estos polinucleótidos incorporados en un vector de expresión para expresión en células de mamífero tales como CHO, NSO, HEK-293, o en sistemas fúngicos, de insecto o microbianos tales como células de levadura tales como la levadura Pichia. Las especies de Pichia adecuadas incluyen, pero sin limitación, Pichia pastoris. En una realización de la divulgación descrita en el presente documento (posteriormente), pueden producirse fragmentos Fab mediante digestión enzimática (por ejemplo, papaína) de Ab11 después de la expresión de los polinucleótidos de longitud completa en un hospedador adecuado. En otra realización de la divulgación, pueden producirse anticuerpos anti CGRP tales como Ab11 o fragmentos Fab de los mismos mediante expresión de polinucleótidos de Ab11 en células de mamífero tales como células CHO, NSO o HEK 293, sistemas fúngicos, de insectos o microbianos tales como células de levadura (por ejemplo levadura diploide tal como Pichia diploide) y otras cepas de levadura. Las especies de Pichia adecuadas incluyen, pero sin limitación, Pichia pastoris.
Anticuerpo Ab12
La divulgación se dirige además a polinucleótidos que codifican polipéptidos de anticuerpos que tienen especificidad de unión con CGRP. En una realización de la divulgación, los polinucleótidos de la divulgación comprenden, o como alternativa consisten en, la siguiente secuencia polinucleotídica que codifica la secuencia polipeptídica de cadena ligera variable de la SEQ ID NO: 111:
C A A G T G CT G A C C C A G T C T C C A T C C TC C C T G T CT GC A T CT G T A G G A G A C A
G A G T C A C C A T C A A T T G CCG G G CC A G T C A G A G T G T T T A C T A T A A C A A C T A C C T A
G C C T G G T A T C A G C A G A A A C C A G G G A A A G T T C C T A A G C A A C T G A T CT A T T CT A C
A T C C A C T CT G G C A T C T G G G G T C C C A T C T C G T T T C A G T GGC A G T G G A T CT G G G A C
A G A T T T C A C T C T C A C C A T C A G C A G C C T G C A G C C T G A A G A T G T T GC A A C T T A T T A
CT G T C T G G G C A G T T A T G A T T G T A G T A A T G G T G A T T G T T T T G T T TTC G G C G G A G G
A A C C A A G G T G G A A A T C A A A C G T (SEQ ID N O : 251).
En una realización de la divulgación, los polinucleótidos de la divulgación comprenden, o como alternativa consisten en, la siguiente secuencia polinucleotídica que codifica la secuencia polipeptídica de cadena ligera de la SEQ ID NO: 112 :
C A A G T G C T G A C C C A G T C T CC A T C C TC C C T G T CT GC A T C T G T A G G A G A C A
G A G T C A C C A T C A A T T G C C G G G CC A G T C A G A G T G T T T A C T A T A A C A A C T A C C T A
G C C T G G T A T C A G C A G A A A C C A G G G A A A G T T CCT A A G C A A C T G A T CT A T T CT A C
A T C C A C T CT G G C A T CT G G G G T C C C A T C T C G T T T C A G T GGC A G T G G A T CT G G G A C
A G A T T T C A C T CT C A C C A T C A G C A G C C T GC A G C C T G A A G A T G TT GC A A C T T A T T A
CT GT CTGGGCAGTT AT GATT GT AGT AAT GGT GATT GTTTT GTTTT CGGCGGAGG
AACCAAGGT GGAAATCAAACGT ACGGTGGCT GCACCAT CT GT CTTC AT CTTCCC
GCC AT CT GAT GAGC AG TTG AA AT CT GGAACT GCCT CT GTT GTGT GCCT GCT GAA
T AACTT CT AT CCC AG AG AGGCC A A AGT AC AGT GG A AGGT GG AT AA CGCCCT CC
AAT CGGGT AACT CCCAGGAG AGTGT CACAGAGC AGGACAGCAAGGACAGCAC
CT AC AGCCT CAGCAGCACCCT GACGCT GAGCAAAGCAGACT ACG AGAAAC AC
AAAGTCTA CG CCTGCGAA GTCACCCA TCA GG GCCTG AGCTCG CCCGTCACAA A
G AG CTT C AAC AGGGG A G AGT GTT AG (SEQ ID NO: 252).
En otra realización de la divulgación, los polinucleótidos de la divulgación comprenden, o como alternativa consisten en, la siguiente secuencia polinucleotídica que codifica la secuencia polipeptídica de cadena pesada variable de la SEQ ID NO: 113:
GAGGT GCAGCTT GT GGAGT CT GGGGGAGGCTTGGTCCAGCCT GGGGGGT
CCCT G AG ACT CTCCT GT GC AGT CT CTGGAAT CG ACGT C ACT AACT ACT AC AT GC
AAT GGGT CCGT CAGGCTCCAGGGAAGGGGCT GGAGT GGGT CGGAGT CATT GGT
GT GAAT GGTAAG AGAT ACT ACGCGAGCT GGGCGAAAGGCCGATT CACCAT CT C
C AGAGACAATTCCAAGACC ACGGT GTATCTTCAAAT GAAC AGCCT GAG AGCT G
AG G AC ACT GCT GT GT ATTT CT GT GCC AG AGGGG ACAT CT GGGGCC AAGGG ACC
CTCGTCACCGTCTCGAGC (SEQ ID NO: 253).
En una realización de la divulgación, los polinucleótidos de la divulgación comprenden, o como alternativa consisten en, la siguiente secuencia polinucleotídica que codifica la secuencia polipeptídica de cadena pesada de la SEQ ID NO: 114:
GAGGT GCAGCTT GT GGAGT CT GGGGGAGGCTTGGTCCAGCCT GGGGGGT CCCT
GAG ACT CTCCT GT GC AGT CT CT GGAATCGACGT CACT AACT ACTACAT GCAAT G
GGTCCGT C AGGCTCCAGGGAAGGGGCTGGAGT GGGT CGGAGT CATT GGT GT GA
AT GGT AAG AG AT ACT ACGCGAGCT GGGCGAAAGGCCGATT CACCAT CT CC AG A
G AC AATT CCAAG ACC ACGGT GT AT CTT CAAAT GAAC AGCCT GAG AGCT G AGG A
CACT GCT GT GT ATTT CT GT GC CAG AGGGG ACAT CT GGGGCC AAGGG ACCCT CG
T CACCGT CTCGAGCGCCT CC ACCAAGGGCCC AT CGGT CTT CCCCCT GGCACCCT
CCT CCAAGAGCACCT CT GGGGGC AC AGCGGCCCT GGGCT GCCT GGTCAAGGAC
T ACTT CCCCGAACCGGT GACGGT GT CGT GGAACT CAGGCGCCCTG ACC AGCGG
CGT GCAC ACCTT CCCGGCT GT CCT ACAGTCCT CAGGACTCT ACT CCCTC AGCAG
CGT GGT GACCGT GCCCTCCAGCAGCTT GGGCACCCAGACCT ACATCT GCAACG
T GAAT CACAAGCCC AGCAAC ACC AAGGT GGACAAGAGAGTT GAGCCCAAAT C
TTGT GACAAAACT CACACAT GCCC ACCGT GCCCAGC ACCT GAACTCCTGGGGG
GACCGTC AGT CTTCCT CTT CCCCCCAAAACCCAAGG ACACCCT C AT GAT CTCCC
GGACCCCTGAGGT CAC AT GCGT GGT GGT GGACGT GAGCCACGAAGACCCT GAG
GTCAA GTTCAA CTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCATAATGCCAAGACAAA
GCCGCGGGAGGAGCAGT ACGCC AGC ACGTACCGTGT GGTC AGCGT CCTCACCG
T CCT GCACC AGGACTGGCT GAAT GGCAAGGAGTACAAGT GCAAGGT CTCCAAC
AA AG CCCTCCCAGCCCCCATCGAGAAAACCATCTCCAAAGCCAAAGGGCAGCC
CCGA GA ACCACAGG TGTACACCCTGCCCCCATCCCGGGAGGAGATGACCAAGA
ACCAGGT CAGCCTGACCT GCCTGGTCAAAGGCTTCTATCCCAGCGACAT CGCC
GT GGAGTGGGAGAGCAAT GGGC AG CCGGAGAACAACTACAAGACC ACGCCT C
CCGT GCTGG ACTCCGACGGCT CCTTCTTCCT CTACAGCAAGCTC ACCGT GGACA
AG AGC AGGT GGC AGC AGGGG AACGT CTTCT C AT GCT CCGT GAT GC AT G AGGCT
CTGCACAACCACT AC ACGCAGAAGAGCCT CTCCCT GT CT CCGGGTAAAT GA
(SEQ ID NO: 254).
En una realización adicional de la divulgación, los polinucleótidos que codifican fragmentos de anticuerpo que tienen especificidad de unión con CGRP comprenden, o como alternativa consisten en, una o más de las secuencias polinucleotídicas de SEQ ID NO: 255; s Eq ID NO: 256; y SEQ ID NO: 257 que corresponden a polinucleótidos que codifican las regiones determinantes de complementariedad (CDR o regiones hipervariables) de la secuencia variable de cadena ligera de la SEQ ID NO: 111 o la secuencia de cadena ligera de la SEQ ID NO: 112.
En una realización adicional de la divulgación, los polinucleótidos que codifican fragmentos de anticuerpo que tienen especificidad de unión con CGRP comprenden, o como alternativa consisten en, una o más de las secuencias polinucleotídicas de SEQ ID NO: 258; s Eq ID NO: 259; y SEQ ID NO: 260 que corresponden a polinucleótidos que codifican las regiones determinantes de complementariedad (CDR o regiones hipervariables) de la secuencia variable de cadena pesada de la SEQ ID NO: 113 o la secuencia de cadena pesada de la SEQ ID NO: 114.
La divulgación también contempla secuencias polinucleotídicas que incluyen una o más de las secuencias polinucleotídicas que codifican fragmentos de anticuerpos descritos en el presente documento. En una realización de la divulgación, los polinucleótidos que codifican fragmentos de anticuerpo que tienen especificidad de unión con CGRP comprenden, o como alternativa consisten en, uno, dos, tres o más, incluyendo todos los siguientes polinucleótidos que codifican fragmentos de anticuerpos: el polinucleótido SEQ ID NO: 251 que codifica la secuencia variable de cadena ligera de la SEQ ID NO: 111; el polinucleótido SEQ ID NO: 252 que codifica la secuencia de cadena ligera de la SEQ ID NO: 112; el polinucleótido SEQ ID NO: 253 que codifica la secuencia variable de cadena pesada de la SEQ ID NO: 113; el polinucleótido SEQ ID NO: 254 que codifica la secuencia de cadena pesada de la SEQ ID NO: 114; polinucleótidos que codifican las regiones determinantes de complementariedad (SEQ ID NO: 255; SEQ ID NO: 256; y SEQ ID NO: 257) de la secuencia variable de cadena ligera de la SEQ ID NO: 111 o la secuencia de cadena ligera de la SEQ ID NO: 112; y polinucleótidos que codifican las regiones determinantes de complementariedad (SEQ ID NO: 258; SEQ ID nO: 259; y SEQ ID NO: 260) de la secuencia variable de cadena pesada de la SEQ ID NO: 113 o la secuencia de cadena pesada de la SEQ ID NO: 114.
En una realización preferente de la divulgación, los polinucleótidos de la divulgación comprenden, o como alternativa consisten en, polinucleótidos que codifican fragmentos Fab (fragmento de unión a antígeno) que tienen especificidad de unión por CGRP. Con respecto al anticuerpo Ab12, los polinucleótidos que codifican el anticuerpo Ab12 de longitud completa comprenden, o como alternativa consisten en, el polinucleótido SEQ ID NO: 252 que codifica la secuencia de cadena ligera de la SEQ ID NO: 112 y el polinucleótido SEQ ID NO: 254 que codifica la secuencia de cadena pesada de la SEQ ID NO: 114.
Otra realización de la divulgación contempla estos polinucleótidos incorporados en un vector de expresión para expresión en células de mamífero tales como CHO, NSO, HEK-293, o en sistemas fúngicos, de insecto o microbianos tales como células de levadura tales como la levadura Pichia. Las especies de Pichia adecuadas incluyen, pero sin limitación, Pichia pastoris. En una realización de la divulgación descrita en el presente documento (posteriormente), pueden producirse fragmentos Fab mediante digestión enzimática (por ejemplo, papaína) de Ab12 después de la expresión de los polinucleótidos de longitud completa en un hospedador adecuado. En otra realización de la divulgación, pueden producirse anticuerpos anti CGRP tales como Ab12 o fragmentos Fab de los mismos mediante expresión de polinucleótidos de Ab12 en células de mamífero tales como células CHO, NSO o HEK 293, sistemas fúngicos, de insectos o microbianos tales como células de levadura (por ejemplo levadura diploide tal como Pichia diploide) y otras cepas de levadura. Las especies de Pichia adecuadas incluyen, pero sin limitación, Pichia pastoris.
Anticuerpo Ab13
La divulgación se dirige además a polinucleótidos que codifican polipéptidos de anticuerpos que tienen especificidad de unión con CGRP. En una realización de la divulgación, los polinucleótidos de la divulgación comprenden, o como alternativa consisten en, la siguiente secuencia polinucleotídica que codifica la secuencia polipeptídica de cadena ligera variable de la SEQ ID NO: 121:
GCC AT C GT G AT G ACCC AG ACT CC AT CTTCCAAGT CT GT CCCT GT GGGAG
AC ACAGT C ACC AT CAATT GCC AG GCCAGTGAGAGT CTTT AT AAT AACAACGCC
TT GGCCT GGTTTC AGC AGAAACC AGGGCAGCCT CCCAAGCGCCTG AT CT AT GA
T GC AT CCAAACT GGC AT CT GGGGTCCCAT CGCGGTT C AGT GGCGGT GGGT CT G
GG AC AC AGTT C ACT CT C A CC AT C AGT GGCGT GC AGT GT G ACG AT GCTGCC ACTT
ACT ACT GT GG AGGCT AC AGAAGT G AT AGT GTT G AT GGT GTTGCTTT CGCCGG A
GGGACCGAGGTGGTGGTCAAACGT (SEQ ID NO: 261).
En una realización de la divulgación, los polinucleótidos de la divulgación comprenden, o como alternativa consisten en, la siguiente secuencia polinucleotídica que codifica la secuencia polipeptídica de cadena ligera de la SEQ ID NO: 122 :
GCC ATCGTG ATGACCC AGACTCC ATCTTCCAAGTCT GTCCCTGT GGGAG
AC ACAGT C ACC AT CAATT GCCAGGCC AGT GAGAGTCTTT AT AAT AACAACGCC
TT GGCCT GGTTTC AGC AGAAACCAGGGCAGCCT CCCAAGCGCCTG AT CT AT GA
T GC AT CCAAACT GGC AT CT GGGGTCCCAT CGCGGTT C AGT GGCGGT GGGT CT G
GGAC AC AGTT CACT CT CACC AT CAGT GGCGT GCAGT GT GACG ATGCT GCC ACTT
ACT ACT GT GG AGGCT AC AGAAGT G AT AGT GTT G AT GGT GTTGCTTTCGCCGG A
GGG ACCG AGGT GGT GGT CAAAC GT ACGGT GGCT GC ACC AT CT GT CTT C AT CTTC
CCGCC AT CT G AT G AGC AGTT G AAAT CT GGAACT GCCTCT GTT GT GT GCCTGCTG
AAT AA CTT CT AT CCC AG A G AGGCC AAAGT ACAGT GGAAGGT GG AT AACGCCCT
CCAAT CGGGTAACT CCCAGG AGAGT GT CAC AGAGC AGGAC AGCAAGGACAGC
ACCTACAGCCTCAGCAGCACCCTGACGCTGAGCAAAGCAGACTACGAGAAAC
ACAA AG TCTA CG CCTGCGAAGTCACCCATCAGGGCCTGAGCTCGCCCGTCACA
AAG AG CTT CAACAGGGG AGAGT GTT AG (SEQ ID NO: 262).
En otra realización de la divulgación, los polinucleótidos de la divulgación comprenden, o como alternativa consisten en, la siguiente secuencia polinucleotídica que codifica la secuencia polipeptídica de cadena pesada variable de la SEQ ID NO: 123:
CAGT CGGT GGAGGAGTCCGGGGG AGGCCT GGT CC AGCCT GAGGG AT CC
CT G AC ACT C ACCT GC AC AGCCT CT GG ATT CG ACTT C AGT AGCAATGCAAT GT GG
T GGGT CCGCCAGGCT CC AGGGAAGGGGCT GGAGT GGAT CGGAT GCATTT ACAA
T GGT G AT GGC AG C AC AT ACT ACGCG AG CT GGGT GAAT GGCC G ATT CTCC AT CT
CCAAAACCTCGT CG ACC ACGGT G ACT CT GC A ACT GAAT AGT CT G AC AG TCGCG
GA CA CG GCCACGTATTATTGTGCGAGAGATCTTGACTTGTGGGGCCCGGGCAC
CCTCGTCACCGTCTCGAGC (SEQ ID NO: 263).
En una realización de la divulgación, los polinucleótidos de la divulgación comprenden, o como alternativa consisten en, la siguiente secuencia polinucleotídica que codifica la secuencia polipeptídica de cadena pesada de la SEQ ID NO: 124:
CAGT CGGT GGAGGAGTCCGGGGG AGGCCT GGT CC AGCCT GAGGGATCCCT GAC
ACT C ACCT GCAC AGCCT CT GG ATTCG ACTT CAGT AGCAAT GCAAT GT GGT GGGT
CCGCCAGGCT CC AG GG AA GGG GCTGG AG T GGAT CGGATGC ATTT ACAAT GGT G
ATGGCAG CA CATACTACGCGAGCTGGGTGAATGGCCGATTCTCCATCTCCAAA
ACCT CGT CG ACC ACGGT G ACT CT GC AA CT GAAT AGT CT G AC AG TCGCGG AC AC
GGCC ACGT ATT ATT GT GCGAGAG AT CTT GACTTGTGGGGCCCGGGC ACCCT CGT
CACCGTCTCGAGCGCCT CC ACCA AG GGCCCATCGGT CTT CCCCCTGGCACCCT C
CTCCAAG AGCACCT CT GGGGGC AC AG CG GCCCT GGGCT GCCTGGTC AAGGACT
ACTTCCCCGAACCGGTGACGGTGTCGTGGAACTCAGGCGCCCTGACCAGCGGC
GT GC ACACCTT CCCGGCT GT CCT ACAGTCCT CAGG ACT CT ACT CCCT CAGCAGC
GT GGT GACCGTGCCCTCCAGCAGCTT GGGCACCCAGACCT ACAT CT GCAACGT
GAAT C ACAAGCCC AGCAACACCAAGGT GGAC AA GA GA GTT GAGCCCAAAT CT
T GTGAC AAAACT CAC ACAT GCCC ACCGT GCCC AGCACCT GAACT CCT GGGGGG
ACCGT C AGT CTT CCT CTT CCCCCCAAAACCCAAGGAC ACCCT CAT GAT CT CCCG
GACCCCTG AGGTC ACATGCGT GGT GGT GGACGT GAGCCACGAAG ACCCT GAGG
T CAAGTT CAACT GGTACGT GGACGGCGTGGAGGTGC ATAAT GCCAAGACAAAG
CCGCGGGAGGAGCAGTACGCCAGCACGTACCGTGTGGTCAGCGTCCTCACCGT
CCTGCACCAGGACTGGCTGAATGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTCTCCAACA
AAGCCCTCCCAGCCCCCATCGAGAAAACCATCTCCAAAGCCAAAGGGCAGCCC
CGAGAACCACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCCCGGGAGGAGATGACCAAGA
ACCAGGT CAGCCTGACCT GCCTGGTCAAAGGCTTCTATCCCAGCGACAT CGCC
GT GGAGTGGGAGAGCAAT GGGC AGCCGGAGAACAACTACAAGACC ACGCCT C
CCGT GCTGG ACTCCGACGGCT CCTTCTTCCT CTACAGCAAGCTC ACCGT GGACA
AG AGC AGGT GGC AGC AGGGG AACGT CTTCT CAT GCT CCGT GAT GC AT G AGGCT
CTGCACAACCACT AC ACGCAGAAGAGCCT CTCCCT GT CT CCGGGTAAAT GA
(SEQ ID NO: 264).
En una realización adicional de la divulgación, los polinucleótidos que codifican fragmentos de anticuerpo que tienen especificidad de unión con CGRP comprenden, o como alternativa consisten en, una o más de las secuencias polinucleotídicas de SEQ ID NO: 265; s Eq ID NO: 266; y SEQ ID NO: 267 que corresponden a polinucleótidos que codifican las regiones determinantes de complementariedad (CDR o regiones hipervariables) de la secuencia variable de cadena ligera de la SEQ ID NO: 121 o la secuencia de cadena ligera de la SEQ ID NO: 122.
En una realización adicional de la divulgación, los polinucleótidos que codifican fragmentos de anticuerpo que tienen especificidad de unión con CGRP comprenden, o como alternativa consisten en, una o más de las secuencias polinucleotídicas de SEQ ID NO: 268; s Eq ID NO: 269; y SEQ ID NO: 270 que corresponden a polinucleótidos que codifican las regiones determinantes de complementariedad (CDR o regiones hipervariables) de la secuencia variable de cadena pesada de la SEQ ID NO: 123 o la secuencia de cadena pesada de la SEQ ID NO: 124.
La divulgación también contempla secuencias polinucleotídicas que incluyen una o más de las secuencias polinucleotídicas que codifican fragmentos de anticuerpos descritos en el presente documento. En una realización de la divulgación, los polinucleótidos que codifican fragmentos de anticuerpo que tienen especificidad de unión con CGRP comprenden, o como alternativa consisten en, uno, dos, tres o más, incluyendo todos los siguientes polinucleótidos que codifican fragmentos de anticuerpos: el polinucleótido SEQ ID NO: 261 que codifica la secuencia variable de cadena ligera de la SEQ ID NO: 121; el polinucleótido SEQ ID NO: 262 que codifica la secuencia de cadena ligera de la SEQ ID NO: 122; el polinucleótido SEQ ID NO: 263 que codifica la secuencia variable de cadena pesada de la SEQ ID NO: 123; el polinucleótido SEQ ID NO: 264 que codifica la secuencia de cadena pesada de la SEQ ID NO: 124; polinucleótidos que codifican las regiones determinantes de complementariedad (SEQ ID NO: 265; SEQ ID NO: 266; y SEQ ID NO: 267 ) de la secuencia variable de cadena ligera de la SEQ ID NO: 121 o la secuencia de cadena ligera de la SEQ ID NO: 122; y polinucleótidos que codifican las regiones determinantes de complementariedad (SEQ ID NO: 268; SEQ ID NO: 269; y SEQ ID NO: 270) de la secuencia variable de cadena pesada de la SEQ ID NO: 123 o la secuencia de cadena pesada de la SEQ ID NO: 124.
En una realización preferente de la divulgación, los polinucleótidos de la divulgación comprenden, o como alternativa consisten en, polinucleótidos que codifican fragmentos Fab (fragmento de unión a antígeno) que tienen especificidad de unión por CGRP. Con respecto al anticuerpo Ab13, los polinucleótidos que codifican el anticuerpo Ab13 de longitud completa comprenden, o como alternativa consisten en, el polinucleótido SEQ ID NO: 262 que codifica la secuencia de cadena ligera de la SEQ ID NO: 122 y el polinucleótido SEQ ID NO: 264 que codifica la secuencia de cadena pesada de la SEQ ID NO: 124.
Otra realización de la divulgación contempla estos polinucleótidos incorporados en un vector de expresión para expresión en células de mamífero tales como CHO, NSO, HEK-293, o en sistemas fúngicos, de insecto o microbianos tales como células de levadura tales como la levadura Pichia. Las especies de Pichia adecuadas incluyen, pero sin limitación, Pichia pastoris. En una realización de la divulgación descrita en el presente documento (posteriormente), pueden producirse fragmentos Fab mediante digestión enzimática (por ejemplo, papaína) de Ab13 después de la expresión de los polinucleótidos de longitud completa en un hospedador adecuado. En otra realización de la divulgación, pueden producirse anticuerpos anti CGRP tales como Ab13 o fragmentos Fab de los mismos mediante expresión de polinucleótidos de Ab13 en células de mamífero tales como células CHO, NSO o HEK 293, sistemas fúngicos, de insectos o microbianos tales como células de levadura (por ejemplo levadura diploide tal como Pichia diploide) y otras cepas de levadura. Las especies de Pichia adecuadas incluyen, pero sin limitación, Pichia pastoris.
Anticuerpo Ab14
La divulgación se dirige además a polinucleótidos que codifican polipéptidos de anticuerpos que tienen especificidad de unión con CGRP. En una realización de la divulgación, los polinucleótidos de la divulgación comprenden, o como alternativa consisten en, la siguiente secuencia polinucleotídica que codifica la secuencia polipeptídica de cadena ligera variable de la SEQ ID NO: 131:
C AAGT GCT G ACCC AGT CT CC AT CCTCCCT GT CT GC AT CT GT AGG AG AC A
G AGT C A CC AT C AATT G CC AGGCC AGT C AGAAT GTTT AC AAT AAC AACT ACCT A
GCCT GGT AT CAGCAGAAACC AGGGAAAGTT CCTAAGCAACT G AT CT ATT CT AC
AT CCACT CT GGCAT CT GGGGT CCCAT CTCGTTTC AGT GGC AGT GGAT CT GGGAC
AG ATTT C ACT CT C ACC AT C AGC AGCCT GC AGCCT G AAG AT GTT GC AACTT ATT A
CT GT CTGGGCAGTT AT GATT GT AG TCGT GGT GATT GTTTT GTTTT CGGCGGAGG
AACCAAGGTGGAAATCAAACGT (SEQ ID NO: 271).
En una realización de la divulgación, los polinucleótidos de la divulgación comprenden, o como alternativa consisten en, la siguiente secuencia polinucleotídica que codifica la secuencia polipeptídica de cadena ligera de la SEQ ID NO: 132:
C AAGT GCT G ACCC AGT CT CC AT CCTCCCT GT CT GC AT CTGT AGG A G ACA
GAGT C ACC AT CAATT GCCAGGCCAGT C AGAAT GTTTACAATAACAACT ACCT A
GCCT GGT AT C AG C AG AAACC AG G G AAAG TTCCT AAGC AA CT G AT CT ATT CT AC
AT CCACT CT GGCAT CT GGGGT CCCAT CTCGTTTC AGT GGC AGT GGAT CT GGGAC
AG ATTT C ACT CT C ACC AT C AGC AGCCT GC AG CCT G AAG AT GTT GC AACTT ATT A
CT GT CTGGGCAGTT AT GATT GT AGTCGT GGT GATT GTTTT GTTTT CGGCGGAGG
GCC AT CT G AT G AGC AGTT GAAAT CT GG AACT GCCTCTGTTGT GT GCCT GCT GAA
T AACTT CT AT CCC AG AG AGGCCA A AGT AC AGT GG A AGGT GGAT AA CGCCCT CC
AAT CGGGT AACT CCCAGGAG AGTGT CACAGAGC AGGACAGCAAGGACAGCAC
CTAC AGCCT CAGCAGCACCCT GACGCT GAGCAAAGCAGACT ACG AGAAAC AC
AAAGT CT ACGCCTGCGAAGT CACCC AT CAGGGCCTG AGCTCGCCCGT CACAAA
GAGCTT CAACAGGGGAGAGT GTT AG (SEQ ID NO: 272).
En otra realización de la divulgación, los polinucleótidos de la divulgación comprenden, o como alternativa consisten en, la siguiente secuencia polinucleotídica que codifica la secuencia polipeptídica de cadena pesada variable de la SEQ ID NO: 133:
G AG GT GC AGCTT GT GG AGT CT GGGGG AGGCTT GGTCC AGCCT GGGGGGT
CCCT G AG ACT CTCCT GT GC AGT CT CTGGAAT CGGCCT C AGT AGCT ACT AC AT GC
AAT GGGT CCGT CAGGCTCCAGGGAAGGGGCT GGAGT GGGT CGGAGT CATT GGT
AGT GAT GGTAAGAC AT ACT ACGCGACCT GGGCGAAAGGCCGATT CACCAT CT C
CAGAGACAATTCCAAGACCACGGTGTATCTT CAAAT GAAC AG CCTG AGAGCT G
AG G AC ACT GCT GT GT ATTT CT GT ACC AG AGGGG AC AT CT GGGGCC AAGGG ACC
CTCGTCACCGTCTCGAGC (SEQ ID NO: 273).
En una realización de la divulgación, los polinucleótidos de la divulgación comprenden, o como alternativa consisten en, la siguiente secuencia polinucleotídica que codifica la secuencia polipeptídica de cadena pesada de la SEQ ID NO: 134:
GAGGT GCAGCTT GT GGAGT CT GGGGGAGGCTTGGTCCAGCCT GGGGGGT CCCT
GAG ACT CTCCT GT GC AGT CT CT GGAATCGGCCT CAGT AGCT ACTACAT GCAAT G
GGTCCGT C AGGCT CC AG GGAAGGGGCT GGAGT GGGT CGGAGT CATT GGT AGT G
AT GGT A A G AC AT ACT ACGCGACCT GGGCGAAAGGCCGATT CACCAT CT CC A G A
G AC AATT CCAAG ACC ACGGT GT AT CTT CAAAT GAAC AGCCT GAG AGCT G AG G A
C ACT GCT GT GT ATTT CT GT AC C AG AG GG G ACAT CT GGGGCC AA GG G ACCCT CG
T CACCGT CTCGAGCGCCT CC ACCAAGGGCCC AT CGGT CTT CCCCCT GGCACCCT
CCTCCAA GAG CACCTCTGGGGGCACAGCGGCCCTGGGCTGCCTGGTCAAGGAC
T ACTT CCCCGAACCGGT GACGGT GT CGT GGAACT CAGGCGCCCTG ACC AGCGG
CGT GCAC ACCTT CCCGGCT GT CCT ACAGTCCT CAGGACTCT ACT CCCTC AGCAG
CGT GGT GACCGT GCCCTCCAGCAGCTT GGGCACCCAGACCT ACATCTGCAACG
T GAAT CACAAGCCC AGCAAC ACCAAGGT GGACGCGAGAGTT GAGCCCAAAT CT
T GT GACAAAACTCACACAT GCCC ACCGT GCCCAGCACCT GAACTCCT GGGGGG
ACCGT CAGT CTT CCT CTT CCCCCCAAAACCCAAGGAC ACCCT CAT GAT CT CCCG
GACCCCTG AGGT C ACATGCGT GGT GGT GGACGT GAGCCACGAAG ACCCT GAGG
T CAAGTT CAACT GGTACGT GGACGGCGTGGAGGTGC ATAAT GCCAAGACAAAG
CCGCGGG AG GA GCA GTACGCCAGCACGTACCGTGTGGTCAGCGTCCTCACCGT
C C T G C A C C A G G A C T G G C T G A A T G G C A A G G A G T A C A A G T G C A A G G T C T C C A A C A
A A G C C C T C C C A G C C C C C A T C G A G A A A A C C A T C T C C A A A G C C A A A G G G C A G C C C
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C T G C A C A A C C A C T A C A C G C A G A A G A G C C T C TC C C T G T CT C C G G G T A A A T G A
(SEQ ID N O : 274).
En una realización adicional de la divulgación, los polinucleótidos que codifican fragmentos de anticuerpo que tienen especificidad de unión con CGRP comprenden, o como alternativa consisten en, una o más de las secuencias polinucleotídicas de SEQ ID NO: 275; s Eq ID NO: 276; y SEQ ID NO: 277 que corresponden a polinucleótidos que codifican las regiones determinantes de complementariedad (CDR o regiones hipervariables) de la secuencia variable de cadena ligera de la SEQ ID NO: 131 o la secuencia de cadena ligera de la SEQ ID NO: 132.
En una realización adicional de la divulgación, los polinucleótidos que codifican fragmentos de anticuerpo que tienen especificidad de unión con CGRP comprenden, o como alternativa consisten en, una o más de las secuencias polinucleotídicas de SEQ ID NO: 278; s Eq ID NO: 279; y SEQ ID NO: 280 que corresponden a polinucleótidos que codifican las regiones determinantes de complementariedad (CDR o regiones hipervariables) de la secuencia variable de cadena pesada de la SEQ ID NO: 133 o la secuencia de cadena pesada de la SEQ ID NO: 134.
La divulgación también contempla secuencias polinucleotídicas que incluyen una o más de las secuencias polinucleotídicas que codifican fragmentos de anticuerpos descritos en el presente documento. En una realización de la divulgación, los polinucleótidos que codifican fragmentos de anticuerpo que tienen especificidad de unión con CGRP comprenden, o como alternativa consisten en, uno, dos, tres o más, incluyendo todos los siguientes polinucleótidos que codifican fragmentos de anticuerpos: el polinucleótido SEQ ID NO: 271 que codifica la secuencia variable de cadena ligera de la SEQ ID NO: 131; el polinucleótido SEQ ID NO: 272 que codifica la secuencia de cadena ligera de la SEQ ID NO: 132; el polinucleótido SEQ ID NO: 273 que codifica la secuencia variable de cadena pesada de la SEQ ID NO: 133; el polinucleótido SEQ ID NO: 274 que codifica la secuencia de cadena pesada de la SEQ ID NO: 134; polinucleótidos que codifican las regiones determinantes de complementariedad (SEQ ID NO: 275; SEQ ID NO: 276; y SEQ ID NO: 277) de la secuencia variable de cadena ligera de la SEQ ID NO: 131 o la secuencia de cadena ligera de la SEQ ID NO: 132; y polinucleótidos que codifican las regiones determinantes de complementariedad (SEQ ID NO: 278; SEQ ID nO: 279; y SEQ ID NO: 280) de la secuencia variable de cadena pesada de la SEQ ID NO: 133 o la secuencia de cadena pesada de la SEQ ID NO: 134.
En una realización preferente de la divulgación, los polinucleótidos de la divulgación comprenden, o como alternativa consisten en, polinucleótidos que codifican fragmentos Fab (fragmento de unión a antígeno) que tienen especificidad de unión por CGRP. Con respecto al anticuerpo Ab14, los polinucleótidos que codifican el anticuerpo Ab14 de longitud completa comprenden, o como alternativa consisten en, el polinucleótido SEQ ID NO: 272 que codifica la secuencia de cadena ligera de la SEQ ID NO: 132 y el polinucleótido SEQ ID NO: 274 que codifica la secuencia de cadena pesada de la SEQ ID NO: 134.
Otra realización de la divulgación contempla estos polinucleótidos incorporados en un vector de expresión para expresión en células de mamífero tales como CHO, NSO, HEK-293, o en sistemas fúngicos, de insecto o microbianos tales como células de levadura tales como la levadura Pichia. Las especies de Pichia adecuadas incluyen, pero sin limitación, Pichia pastoris. En una realización de la divulgación descrita en el presente documento (posteriormente), pueden producirse fragmentos Fab mediante digestión enzimática (por ejemplo, papaína) de Ab14 después de la expresión de los polinucleótidos de longitud completa en un hospedador adecuado. En otra realización de la divulgación, pueden producirse anticuerpos anti CGRP tales como Ab14 o fragmentos Fab de los mismos mediante expresión de polinucleótidos de Ab14 en células de mamífero tales como células CHO, NSO o HEK 293, sistemas fúngicos, de insectos o microbianos tales como células de levadura (por ejemplo levadura diploide tal como Pichia diploide) y otras cepas de levadura. Las especies de Pichia adecuadas incluyen, pero sin limitación, Pichia pastoris.
En una realización, la divulgación se dirige a un polinucleótido aislado que comprende un polinucleótido que codifica una secuencia de aminoácidos de anticuerpo Vh anti CGRP seleccionada de las SEQ ID NO: 3, 13, 23, 33, 43, 53, 63, 73, 83, 93, 103, 113, 123 o 133, o que codifica una variante del mismo en donde al menos un resto de marco conservado (resto FR) se ha sustituido con un aminoácido presente en la posición correspondiente en un polipéptido Vh de anticuerpo anti CGRP de conejo o una sustitución de aminoácido conservativa.
En otra realización, la divulgación se dirige a un polinucleótido aislado que comprende la secuencia polinucleotídica que codifica una secuencia de aminoácidos de anticuerpo Vl anti CGRP de las SEQ ID NO: 1, 11,21,31,41,51,61, 71, 81, 91, 101, 111, 121 o 131, o que codifica una variante del mismo en donde al menos un resto de marco conservado (resto FR) se ha sustituido con un aminoácido presente en la posición correspondiente en un polipéptido Vl de anticuerpo anti CGRP de conejo o una sustitución de aminoácido conservativa.
En otra realización más, la divulgación se dirige a uno o más polinucleótidos heterólogos que comprenden una secuencia que codifica los polipéptidos contenidos en la SEQ ID NO: 1 y la SEQ ID NO: 3; la SEQ ID NO: 11 y la SEQ ID NO: 13; la SEQ ID NO: 21 y la SEQ ID NO: 23; la SEQ ID NO: 31 y la SEQ ID NO: 33; la SEQ ID NO: 41 y la SEQ ID NO: 43; la SEQ ID NO: 51 y la SEQ ID NO: 53, la SEQ ID NO: 61 y la SEQ ID NO: 63; la SEQ ID NO: 71 y la SEQ ID NO: 73; la SEQ ID NO: 81 y la SEQ ID NO: 83; la SEQ ID NO: 91 y la SEQ ID NO: 93; la SEQ ID NO: 101 y la SEQ ID NO: 103; la SEQ ID NO: 111 y la SEQ ID NO: 113; la SEQ ID NO: 121 y la SEQ ID NO: 123; o la SEQ ID NO: 131 y la SEQ ID NO: 133.
En otra realización, la divulgación se dirige a un polinucleótido aislado que expresa un polipéptido que contiene al menos un polipéptido de CDR procedente de un anticuerpo anti CGRP en donde dicho polipéptido expresado solo se une específicamente con CGRP o se une específicamente con CGRP cuando se expresa en asociación con otra secuencia polinucleotídica que expresa un polipéptido que contiene al menos un polipéptido de CDR procedente de un anticuerpo anti CGRP en donde dicha al menos una CDR se selecciona de las contenidas en los polipéptidos Vl o Vh de las SEQ ID NO: 1,3, 11, 13, 21, 23, 31,33, 41,43, 51,53, 61,63, 71,73, 81,83, 91,93, 101, 103, 111, 113, 121, 123, 131 o la SEQ ID NO:133.
También se contemplan células hospedadoras y vectores que comprenden dichos polinucleótidos.
La divulgación contempla además vectores que comprenden las secuencias polinucleotídicas que codifican las secuencias polipeptídicas de cadena pesada y ligera variables, así como las regiones determinantes de complementariedad individuales (CDR o regiones hipervariables), como se expone en el presente documento, así como células hospedadoras que comprenden dichas secuencias de vector. En una realización de la invención, la célula hospedadora es una célula de levadura. En otra realización de la invención, la célula hospedadora de levadura pertenece al género Pichia.
Exploración y aislamiento de linfocitos B
En una realización, la presente divulgación contempla la preparación y el aislamiento de una población clonal de linfocitos B específicos de antígeno que pueden usarse para aislar al menos una célula específica de antígeno de CGRP, que puede usarse para producir un anticuerpo monoclonal contra CGRP, que es específico de un antígeno de CGRP deseado, o una secuencia de nucleótidos correspondiente a dicho anticuerpo. Se enseñan métodos para preparar y aislar dicha población clonal de linfocitos B específicos de antígeno, por ejemplo, en la publicación de patente de los Estados Unidos n° US 2007/0269868 de Carvalho-Jensen et al., a cuya divulgación se hace referencia. También se enseñan en el presente documento en los ejemplos métodos para preparar y aislar dicha población clonal de linfocitos B específicos de antígeno. Se conocen en la técnica métodos para "enriquecer" una población celular por tamaño o densidad. Véase, por ejemplo, patente de los Estados Unidos 5.627.052. Estas etapas pueden usarse además del enriquecimiento de la población celular por especificidad de antígeno.
Métodos para humanizar anticuerpos
En otra realización, la presente divulgación contempla métodos para humanizar cadenas pesadas y ligeras de anticuerpos. Se enseñan métodos para humanizar cadenas pesadas y ligeras de anticuerpos que pueden aplicarse a anticuerpos anti CGRP, por ejemplo, en la publicación de solicitud de patente de los Estados Unidos n° US 2009/0022659 de Olson et al., y en la patente de los Estados Unidos n° 7.935.340 de Garcia-Martinez et al., a cada una de cuyas divulgaciones se hace referencia.
Métodos para producir anticuerpos y fragmentos de los mismos
En otra realización, la presente invención contempla métodos para producir anticuerpos anti CGRP y fragmentos de los mismos según las reivindicaciones. Se enseñan métodos para producir anticuerpos anti CGRP y fragmentos de los mismos secretados de cepas poliploidales, preferentemente diploides o tetraploides de levadura competente para apareamiento, por ejemplo, en la publicación de solicitud de patente de los Estados Unidos n° US 2009/0022659 de Olson et al., y en la patente de los Estados Unidos n° 7.935.340 de Garcia-Martinez et al., a cada una de cuyas divulgaciones se hace referencia.
Otros métodos para producir anticuerpos son bien conocidos por los expertos habituales en la materia. Por ejemplo, son bien conocidos ahora en la técnica métodos para producir anticuerpos quiméricos (véase, por ejemplo, patente de los Estados Unidos n° 4.816.567 de Cabilly et al.; Morrison et al., P.N.A.S. Estados Unidos, 81:8651-55 (1984); Neuberger, M.S. et al., Nature, 314:268-270 (1985); Boulianne, G.L. et al., Nature, 312:643-46 (1984) a cada una de cuyas divulgaciones se hace referencia).
Del mismo modo, otros métodos para producir anticuerpos humanizados son ahora bien conocidos en la técnica (véase, por ejemplo, patentes de los Estados Unidos n° 5.530.101,5.585.089, 5.693.762 y 6.180.370 de Queen et al; patentes de los Estados Unidos n° 5.225.539 y 6.548.640 de Winter; patentes de los Estados Unidos n° 6.054.297, 6.407.213 y 6.639.055 de Carter et al; patente de los Estados Unidos n° 6.632.927 de Adair; Jones, P.T. et al, Nature, 321:522-525 (1986); Reichmann, L., et al., Nature, 332:323-327 (1988); Verhoeyen, M, et al, Science, 239:1534-36 (1988) a cada una de cuyas divulgaciones se hace referencia).
También pueden producirse polipéptidos de anticuerpos de la divulgación que tienen especificidad de unión a CGRP construyendo, usando técnicas convencionales bien conocidas por los expertos habituales en la materia, un vector de expresión que contiene un operón y una secuencia de ADN que codifica una cadena pesada de anticuerpo en la que la secuencia de ADN que codifica las CDR necesarias para la especificidad del anticuerpo se obtiene de una fuente de células no humana, preferentemente, una fuente de linfocitos B de conejo, mientras que la secuencia de ADN que codifica las partes restantes de la cadena de anticuerpo se obtiene de una fuente de células humana. Se produce un segundo vector de expresión utilizando los mismos medios convencionales bien conocidos por los expertos habituales en la materia, conteniendo dicho vector de expresión un operón y una secuencia de ADN que codifica una cadena ligera de anticuerpo en la que la secuencia de ADN que codifica las CDR necesarias para la especificidad del anticuerpo se obtiene de una fuente de células no humana, preferentemente, una fuente de linfocitos B de conejo, mientras que la secuencia de ADN que codifica las partes restantes de la cadena de anticuerpo se obtiene de una fuente de células humana.
Los vectores de expresión se transfectan en una célula hospedadora mediante técnicas convencionales bien conocidas por los expertos habituales en la materia para producir una célula hospedadora transfectada, cultivándose dicha célula hospedadora transfectada mediante técnicas convencionales bien conocidas por los expertos habituales en la materia para producir dichos polipéptidos de anticuerpos.
La célula hospedadora puede transfectarse juntamente con los dos vectores de expresión descritos anteriormente, el primer vector de expresión que contiene el ADN que codifica un operón y un polipéptido procedente de cadena ligera y el segundo vector que contiene ADN que codifica un operón y un polipéptido procedente de cadena pesada. Los dos vectores contienen diferentes marcadores seleccionables, pero preferentemente consiguen expresión sustancialmente igual de los polipéptidos de cadena pesada y ligera. Como alternativa, se puede usar un único vector, incluyendo el vector ADN que codifica los polipéptidos de cadena tanto pesada como ligera. Las secuencias codificantes para las cadenas pesadas y ligeras pueden comprender ADNc, ADN genómico, o ambos.
Las células hospedadoras para expresar los polipéptidos de anticuerpo pueden ser una célula bacteriana tal como E. coli, o una célula eucariota tal como P. pastoris. En una realización de la invención, puede usarse una célula de mamífero de un tipo bien definido para este fin, tal como una célula de mieloma, una línea celular de ovario de hámster chino (CHO), una línea celular NSO o una línea celular HEK293.
Los métodos generales por los que pueden construirse los vectores, todos los métodos de transfección necesarios para producir la célula hospedadora y los métodos de cultivo necesarios para producir los polipéptidos de anticuerpos de dichas células hospedadoras incluyen técnicas convencionales. Aunque, preferentemente, la línea celular utilizada para producir el anticuerpo es una línea celular de mamífero, como alternativa, se puede usar cualquier otra línea celular adecuada, tal como una cepa bacteriana procedente de E. coli, o una línea celular de levadura.
De forma similar, una vez producidos, los polipéptidos de anticuerpos se pueden purificar según procedimientos convencionales en la materia, tales como, por ejemplo, la filtración en flujo cruzado, precipitación con sulfato de amonio, cromatografía en columna de afinidad y similares.
Los polipéptidos de anticuerpos descritos en el presente documento también pueden usarse para el diseño y la síntesis de miméticos peptídicos o no peptídicos que serían útiles para las mismas aplicaciones terapéuticas que los polipéptidos de anticuerpos de la invención. Véase, por ejemplo, Saragobi et al, Science, 253:792-795 (1991).
Ensayos de exploración
La divulgación también incluye ensayos de exploración diseñados para ayudar en la identificación de enfermedades y trastornos asociados con CGRP en pacientes que mostraban síntomas de una enfermedad o un trastorno asociado con CGRP.
En una realización de la divulgación, los anticuerpos anti CGRP de la invención, o fragmentos de unión a CGRP de los mismos, se usan para detectar la presencia de CGRP en una muestra biológica obtenida de un paciente que mostraba síntomas de una enfermedad o un trastorno asociado con CGRP. La presencia de CGRP o niveles elevados del mismo en comparación con niveles previos a la enfermedad de CGRP en una muestra biológica comparable, puede ser beneficiosa para diagnosticar una enfermedad o un trastorno asociado con CGRP.
Otra realización de la divulgación proporciona un ensayo de diagnóstico o exploración para ayudar en el diagnóstico de enfermedades o trastornos asociados con CGRP en pacientes que muestran síntomas de una enfermedad o un trastorno asociado con CGRP identificado en el presente documento, que comprende ensayar el nivel de expresión de CGRP en una muestra biológica de dicho paciente usando un anticuerpo anti CGRP modificado postraduccionalmente o fragmento de unión del mismo. El anticuerpo anti CGRP o fragmento de unión del mismo puede modificarse postraduccionalmente para incluir un resto detectable tal como se ha expuesto previamente en la divulgación.
El nivel de CGRP en la muestra biológica se determina usando un anticuerpo anti CGRP modificado o fragmento de unión del mismo como se expone en el presente documento, y comparando el nivel de CGRP en la muestra biológica frente a un nivel convencional de CGRP (por ejemplo, el nivel en muestras biológicas normales). El experto en la materia entendería que puede existir algo de variabilidad entre muestras biológicas normales y tomaría en consideración cuando se evalúan los resultados. En una realización de la invención, los anticuerpos anti CGRP de la invención pueden usarse para correlacionar los niveles de expresión de CGRP con un estadio particular de desarrollo canceroso. Un experto en la materia sería capaz de medir CGRP en numerosos objetos para establecer intervalos de expresión de CGRP que corresponden a estadios clínicamente definidos de desarrollo canceroso. Estos intervalos permitirán al experto en la materia medir CGRP en un sujeto al que se ha diagnosticado cáncer y correlacionar los niveles en cada sujeto con un intervalo que corresponde a un estadio de dicho cáncer. Un experto en la materia entendería que midiendo CGRP en el paciente a intervalos diferentes, puede determinarse la progresión del cáncer.
El ensayo anteriormente indicado también puede ser útil en la supervisión de una enfermedad o un trastorno, donde el nivel de CGRP obtenido en una muestra biológica de un paciente que se cree que tiene una enfermedad o un trastorno asociado con CGRP se compara con el nivel de CGRP en muestras biológicas previas del mismo paciente, para determinar si el nivel de CGRP en dicho paciente ha cambiado con, por ejemplo, un régimen de tratamiento. La divulgación también se dirige a un método de captura de imágenes in vivo que detecta la presencia de células que expresan CGRP que comprende administrar una cantidad eficaz para el diagnóstico de una composición de diagnóstico. Dicha captura de imágenes in vivo es útil para la detección o captura de imágenes de tumores o metástasis que expresan CGRP, por ejemplo, y puede ser útil como parte de un programa de planificación para el diseño de un protocolo de tratamiento de cáncer eficaz. El protocolo de tratamiento puede incluir, por ejemplo, uno o más de radiación, quimioterapia, terapia de citocinas, terapia génica y terapia de anticuerpos, así como un anticuerpo anti CGRP o fragmento del mismo.
La presente divulgación proporciona además un kit para detectar la unión de un anticuerpo anti CGRP de la invención con CGRP. En particular, el kit puede usarse para detectar la presencia de un CGRP específicamente reactivo con un anticuerpo anti CGRP de la invención o un fragmento inmunorreactivo del mismo. El kit también puede incluir un anticuerpo unido a un sustrato, un anticuerpo secundario reactivo con el antígeno y un reactivo para detectar una reacción del anticuerpo secundario con el antígeno. Dicho kit puede ser un kit de ELISA y puede comprender el sustrato, anticuerpos primarios y secundarios cuando sea apropiado, y cualquier otro reactivo necesario tal como restos detectables, sustratos enzimáticos y reactivos de color, por ejemplo como se describe en el presente documento. El kit de diagnóstico también puede estar en forma de un kit de inmunotransferencia. El kit de diagnóstico también puede estar en forma de un kit quimioluminiscente (Meso Scale Discovery, Gaithersburg, MD). El kit de diagnóstico también puede ser un kit de detección basado en lantánidos (PerkinElmer, San Jose, CA). Un especialista clínico experto entendería que una muestra biológica incluye, pero sin limitación, suero, plasma, orina, saliva, moco, líquido pleural, líquido sinovial y líquido cefalorraquídeo.
Métodos para mejorar o reducir los síntomas de, o tratar, o prevenir, enfermedades o trastornos asociados con CGRP
En otra realización de la invención, los anticuerpos anti CGRP definidos en las reivindicaciones son útiles para aliviar o reducir los síntomas de, o tratar, o prevenir, enfermedades y trastornos asociados con CGRP. Los anticuerpos anti CGRP descritos en el presente documento, o fragmentos de los mismos, así como combinaciones, también pueden administrarse en una cantidad terapéuticamente eficaz a pacientes que necesitan tratamiento de enfermedades y trastornos asociados con CGRP en forma de una composición farmacéutica como se describe en más detalle posteriormente.
En otra realización de la invención, los anticuerpos anti CGRP definidos en las reivindicaciones son útiles para aliviar o reducir los síntomas de, o tratar, o prevenir, migrañas (con o sin aura), pérdida de peso, cáncer o tumores, angiogénesis asociada con cáncer o crecimiento tumoral, angiogénesis asociada con cáncer o supervivencia tumoral, dolor, migrañas hemiplégicas, cefaleas en racimo, neuralgia migrañosa, cefaleas crónicas, cefaleas de tensión, cefaleas generales, sofocos, hemicránea paroxística crónica, cefaleas secundarias debidas a un problema estructural subyacente en la cabeza o el cuello, neuralgia craneal, cefaleas sinusales (tales como por ejemplo asociadas con sinusitis) y cefaleas o migrañas inducidas por alergia.
En una realización de la invención, los anticuerpos anti CGRP definidos en las reivindicaciones y/o con un segundo agente, son útiles para aliviar o reducir los síntomas de, o tratar, o prevenir, el siguiente listado no limitante de enfermedades y trastornos: dolor, dolor inflamatorio, dolor por incisión postoperatorio, síndrome de dolor regional complejo, dolor de cáncer, dolor de cáncer de huesos primario o metastásico, dolor por fractura, dolor crónico, dolor por fractura osteoporótica, dolor resultante de quemadura, osteoporosis, dolor de articulaciones gotosas, dolor abdominal, dolor asociado con crisis de anemia falciforme y otros dolores nocicépticos, así como carcinoma hepatocelular, cáncer de mama, cirrosis hepática, dolor neurogénico, dolor neuropático, dolor nocicéptico, neuralgia del trigémino, neuralgia post-herpética, dolor de miembro fantasma, fibromialgia, dolor menstrual, ovarialgia, distrofia simpática refleja, dolor neurogénico, osteoartritis o dolor por artritis reumatoide, dolor dorsolumbar, neuropatía diabética, ciática, o dolor o dolor visceral asociado con: reflujo gastroesofágico, dispepsia, síndrome del intestino irritable, colon irritable, colon espástico, colitis mucosa, enfermedad inflamatoria del intestino, enfermedad de Crohn, ileítis, colitis ulcerosa, cólico renal, dismenorrea, cistitis, periodo menstrual, parto, menopausia, prostatitis, pancreatitis, cólico renal, dismenorrea, cistitis, incluyendo cistitis intersticial (CI), cirugía asociada con el íleo, diverticulitis, peritonitis, pericarditis, hepatitis, apendicitis, colitis, colecistitis, endometriosis, pancreatitis aguda y/o crónica, infarto de miocardio, dolor de riñón, dolor pleural, prostatitis, dolor pélvico, traumatismo de un órgano, dolor nociceptivo crónico, dolor neuropático crónico, dolor inflamatorio crónico, fibromialgia, dolor irruptivo y dolor persistente, y dolor de cáncer que surge de neoplasia o de cáncer preferentemente seleccionado de uno o más de: adenocarcinoma en tejido glandular, blastoma en tejido embrionario de órganos, carcinoma en tejido epitelial, leucemia en tejidos que forman células sanguíneas, linfoma en tejido linfático, mieloma en médula ósea, sarcoma en tejido conectivo o de soporte, cáncer suprarrenal, linfoma relacionado con SIDA, anemia, cáncer de vejiga, cáncer de hueso, cáncer de cerebro, cáncer de mama, tumores carcinoides, cáncer de cuello uterino, quimioterapia, cáncer de colon, citopenia, cáncer endometrial, cáncer esofágico, cáncer gástrico, cáncer de cabeza, cáncer de cuello, cáncer hepatobiliar, cáncer de riñón, leucemia, cáncer de hígado, cáncer de pulmón, linfoma, enfermedad de Hodgkin, linfoma, no Hodgkin, tumores del sistema nervioso, cáncer oral, cáncer ovárico, cáncer pancreático, cáncer de próstata, cáncer rectal, cáncer de piel, cáncer de estómago, cáncer testicular, cáncer de tiroides, cáncer de uretra, cáncer de hueso, sarcomas del tejido conectivo, cáncer de tejido óseo, cáncer de células formadoras de sangre, cáncer de médula ósea, mieloma múltiple, leucemia, cáncer de hueso primario o secundario, tumores que metastatizan al hueso, tumores que se infiltran en el nervio y víscera hueca, tumores cerca de estructuras neurales. Preferentemente además el dolor de cáncer comprende dolor visceral, preferentemente dolor visceral que surge de cáncer pancreático y/o metástasis en el abdomen. Preferentemente además el dolor de cáncer comprende dolor somático, preferentemente dolor somático debido a uno o más de cáncer de hueso, metástasis en el hueso, dolor postquirúrgico, sarcomas del tejido conectivo, cáncer de tejido óseo, cáncer de células formadoras de sangre de la médula ósea, mieloma múltiple, leucemia, cáncer de hueso primario o secundario.
En otra realización de la invención, los anticuerpos anti CGRP definidos en las reivindicaciones, y/o con un segundo agente, son útiles para aliviar o reducir los síntomas de, o tratar, o prevenir, el siguiente listado no limitante de enfermedades y trastornos: cáncer o tumores, angiogénesis asociada con cáncer o crecimiento tumoral, angiogénesis asociada con cáncer o supervivencia tumoral.
En otra realización de la invención, los anticuerpos anti CGRP definidos en las reivindicaciones y/o con un segundo agente, son útiles para aliviar o reducir los síntomas de, o tratar, o prevenir, el siguiente listado no limitante de enfermedades y trastornos: dolor neurogénico, neuropático o nocicéptico. El dolor neuropático puede incluir, pero sin limitación, neuralgia del trigémino, neuralgia post-herpética, dolor de miembro fantasma, fibromialgia, dolor menstrual, ovarialgia, distrofia simpática refleja y dolor neurogénico. En otras realizaciones preferidas, osteoartritis o dolor por artritis reumatoide, dolor dorsolumbar, neuropatía diabética, ciática y otro dolor neuropático.
En otra realización de la invención, los anticuerpos anti CGRP definidos en las reivindicaciones, y/o con un segundo agente, son útiles para aliviar o reducir los síntomas de, o tratar, o prevenir, el siguiente listado no limitante de enfermedades y trastornos: vejiga hiperactiva y otras afecciones urinarias, reflujo gastroesofágico y dolor visceral asociado con reflujo gastroesofágico, dispepsia, síndrome del intestino irritable, enfermedad inflamatoria del intestino, enfermedad de Crohn, ileítis, colitis ulcerosa, cólico renal, dismenorrea, cistitis, periodo menstrual, parto, menopausia, prostatitis, prurito o pancreatitis. Además, los anticuerpos y fragmentos de anticuerpos de CGRP objeto pueden usarse solos o junto con otros agentes activos, por ejemplo, opioides y analgésicos no opioides tales como AINE para inducir analgesia o para potenciar la eficacia de otro analgésico o para prevenir o aliviar la tolerancia a un analgésico específico tal como morfina o analgésicos opioides relacionados. Una prueba del papel de CGRP en el bloqueo/inversión del desarrollo de analgesia inducida por morfina es el hecho de que se ha indicado que CGRP8-37 y el antagonista del receptor de CGRP (BIBN4096BS) evitan/invierten el desarrollo de tolerancia a la morfina -(Powell et al., 2000 J Brit J Pharmacol (131 ):875; Menard et al., 1996 J Neurosci (16):2342; Wang et al., 2009 FASEB J (23):2576; Wang et al., 2010 Pain (151):194)
Los anticuerpos objeto pueden combinarse potencialmente con cualquier analgésico opioide o AINE u otro analgésico, potencialmente otro anticuerpo, para aumentar o potenciar el tratamiento del dolor o para invertir o suprimir la tolerancia a un analgésico tal como un compuesto analgésico opioide. Esto puede permitir que dichos compuestos analgésicos se administren durante una duración más larga o a dosificaciones reducidas aliviando de este modo potencialmente efectos secundarios adversos asociados con los mismos.
La expresión "analgésico opioide" en el presente documento se refiere a todos los fármacos, naturales o sintéticos, con acciones similares a la morfina. Los analgésicos opioides sintéticos y semisintéticos son derivados de cinco clases químicas de compuesto: fenantrenos; fenilheptilaminas; fenilpiperidinas; morfinanos; y benzomorfanos, todos los cuales están dentro del alcance de la expresión. Los analgésicos opioides ejemplares incluyen codeína, dihidrocodeína, diacetilmorfina, hidrocodona, hidromorfona, levorfanol, oximorfona, alfentanilo, buprenorfina, butorfanol, fentanilo, sufentanilo, meperidina, metadona, nalbufina, propoxifeno y pentazocina o sales farmacéuticamente aceptables de los mismos.
El término "AINE" se refiere a un compuesto antiinflamatorio no esteroideo. Los AINE se clasifican según su capacidad para inhibir ciclooxigenasa. La ciclooxigenasa 1 y ciclooxigenasa 2 son dos isoformas principales de ciclooxigenasa y la mayoría de AINE convencionales son inhibidores mixtos de las dos isoformas. La mayoría de AINE convencionales quedan dentro de una de las siguientes cinco categorías estructurales: (1) derivados de ácido propiónico, tales como ibuprofeno, naproxeno, naprosyn, diclofenaco y ketoprofeno; (2 ) derivados de ácido acético, tales como tolmetina y sulindaco; (3) derivados de ácido fenámico, tales como ácido mefenámico y ácido meclofenámico; (4) derivados de ácido bifenilcarboxílico, tales como diflunisal y flufenisal; y (5) oxicams, tales como piroxim, sudoxicam e isoxicam. Se ha descrito otra clase de AINE que inhibe selectivamente ciclooxigenasa 2. Se han descrito inhibidores de Cox-2, por ejemplo, en las patentes de los Estados Unidos n° 5.616.601; 5.604.260; 5.593.994; 5.550.142; 5.536.752; 5.521.213; 5.475.995; 5.639.780; 5.604.253; 5.552.422; 5.510.368; 5.436.265; 5.409.944; y 5.130.311, a cada una de las cuales se hace referencia. Determinados inhibidores de COX-2 ejemplares incluyen celecoxib (SC-58635), DUP-697, flosulida (CGP-28238), meloxicam, ácido 6-metoxi-2-naftilacético (6-m Na ), rofecoxib, MK-966, nabumetona (profármaco para 6-MNA), nimesulida, nS-398, SC-5766, SC-58215, T-614; o combinaciones de los mismos.
En algunas realizaciones, puede tomarse aspirina y/o paracetamol junto con el anticuerpo de CGRP o fragmento objeto. La aspirina es otro tipo de compuesto antiinflamatorio no esteroideo.
Las enfermedades y los trastornos ejemplares, no limitantes, que pueden tratarse y/o prevenirse mediante la administración de los anticuerpos de CGRP de la presente invención incluyen dolor resultante de cualquier afección asociado con dolor neurogénico, neuropático, inflamatorio, térmico o nocicéptico. Preferentemente el trastorno se asociará con CGRP aumentado en el sitio de dolor. En determinadas realizaciones de dolor neuropático, se tratan preferentemente afecciones indicadas de neuralgia del trigémino, neuralgia post-herpética, dolor de miembro fantasma, fibromialgia, distrofia simpática refleja y dolor neurogénico. En otras realizaciones, se trata preferentemente dolor de cáncer, en particular, dolor de cáncer de hueso, osteoartritis o dolor por artritis reumatoide, dolor dorsolumbar, dolor por incisión postoperatorio, dolor por fractura, dolor por fractura osteoporótica, osteoporosis, dolor de articulaciones gotosas, neuropatía diabética, ciática, dolores asociados con crisis de anemia falciforme, migraña y otro dolor neuropático y/o nocicéptico. Por tanto, la presente invención incluye métodos para tratar, prevenir y/o aliviar cualquier enfermedad o trastorno asociado con la actividad de CGRP o regulación positiva de CGRP (incluyendo cualquiera de las enfermedades, trastornos y afecciones ilustrativas mencionadas anteriormente) mediante el uso de los anticuerpos y fragmentos de anticuerpo de la invención. Los métodos terapéuticos de la presente divulgación comprenden administrar a un sujeto cualquier formulación que comprende un anticuerpo anti CGRP como se desvela en el presente documento o en asociación con otro agente activo.
El sujeto al que se administra la formulación farmacéutica puede ser, por ejemplo, cualquier ser humano o animal no humano que necesita dicho tratamiento, prevención y/o alivio, o que de otro modo aprovecharía la inhibición o atenuación de la actividad mediada por CGRP. Por ejemplo, el sujeto puede ser un individuo al que se diagnostica, o que se considera que está en riesgo de estar aquejado de cualquiera de las enfermedades o trastornos anteriormente mencionados. La presente divulgación incluye además el uso de cualquiera de las formulaciones farmacéuticas desveladas en el presente documento en la fabricación de un medicamento para el tratamiento, prevención y/o alivio de cualquier enfermedad o trastorno asociado con la actividad de CGRP (incluyendo cualquiera de las enfermedades, trastornos o afecciones ilustrativas mencionadas anteriormente).
Administración
En una realización de la divulgación, los anticuerpos anti CGRP descritos en esta memoria, o fragmentos de unión a CGRP de los mismos, así como combinaciones de dichos anticuerpos o fragmentos de anticuerpo, se administran a un sujeto a una concentración de entre aproximadamente 0,1 y 100,0 mg/kg de peso corporal del sujeto receptor. En una realización preferida de la divulgación, los anticuerpos anti CGRP descritos en esta memoria, o fragmentos de unión a CGRP de los mismos, así como combinaciones de dichos anticuerpos o fragmentos de anticuerpo, se administran a un sujeto a una concentración de aproximadamente 0,4 mg/kg de peso corporal del sujeto receptor. En una realización preferida de la divulgación, los anticuerpos anti CGRP descritos en esta memoria, o fragmentos de unión a CGRP de los mismos, así como combinaciones de dichos anticuerpos o fragmentos de anticuerpo, se administran a un sujeto receptor con una frecuencia de una vez cada veintiséis semanas o menos, tal como una vez cada dieciséis semanas o menos, una vez cada ocho semanas o menos, una vez cada cuatro semanas o menos, una vez cada dos semanas o menos, una vez cada semana o menos, o una vez al día o menos.
Los fragmentos Fab pueden administrarse cada dos semanas o menos, cada semana o menos, una vez al día o menos, múltiples veces al día y/o cada pocas horas. En una realización de la divulgación, un paciente recibe fragmentos Fab de 0,1 mg/kg a 40 mg/kg al día proporcionados en dosis divididas de 1 a 6 veces al día, o en una forma de liberación sostenida, eficaz para obtener resultados deseados.
Debe entenderse que la concentración del anticuerpo o Fab administrado a un paciente dado puede ser mayor o menor que las concentraciones de administración ejemplares expuestas anteriormente en los párrafos [0552] y [0553].
Un experto en la materia sería capaz de determinar una dosificación y frecuencia de administración eficaces mediante experimentación rutinaria, guiada, por ejemplo, por la divulgación en el presente documento y las enseñanzas en Goodman, L. S., Gilman, A., Brunton, L. L., Lazo, J. S., y Parker, K. L. (2006). Goodman & Gilman’s the pharmacological basis of therapeutics. Nueva York: McGraw-Hill; Howland, R. D., Mycek, M. J., Harvey, R. A., Champe, P. C., y Mycek, M. J. (2006). Pharmacology. Lippincott’s illustrated reviews. Filadelfia: Lippincott Williams y Wilkins; y Golan, D. E. (2008). Principles of pharmacology: the pathophysiologic basis of drug therapy. Filadelfia, Pa., [etc.]: Lippincott Williams y Wilkins.
En otra realización de la invención, los anticuerpos anti CGRPdescritos en esta memoria, o fragmentos de unión a CGRP de los mismos, así como combinaciones de dichos anticuerpos o fragmentos de anticuerpo, se administran a un sujeto en una formulación farmacéutica.
Una "composición farmacéutica" se refiere a una composición química o biológica adecuada para la administración a un mamífero. Dichas composiciones pueden formularse específicamente para la administración mediante una o más de varias vías, incluyendo, pero sin limitación, bucal, epicutánea, epidural, inhalación, intraarterial, intracardial, intracerebroventricular, intradérmica, intramuscular, intranasal, intraocular, intraperitoneal, intraespinal, intratecal, intravenosa, oral, parenteral, rectal, mediante un enema o supositorio, subcutánea, subdérmica, sublingual, transdérmica y transmucosa. Además, la administración puede producirse por medio de inyección, polvo, líquido, gel, gotas, u otros medios de administración.
En una realización de la divulgación, los anticuerpos anti CGRP descritos en esta memoria, o fragmentos de unión a CGRP de los mismos, así como combinaciones de dichos anticuerpos o fragmentos de anticuerpo, pueden administrarse opcionalmente en combinación con uno o más agentes activos. Dichos agentes activos incluyen agentes analgésicos, antihistamínicos, antipiréticos, antiinflamatorios, antibióticos, antivíricos y anticitocinas. Los agentes activos incluyen agonistas, antagonistas y moduladores de TNF-a, IL-2, IL-4, IL-6, IL-10, IL-12, IL-13, IL-18, IFN-a, IFN-y, BAFF, CXCL13, IP-10, VEGF, EPO, EGF, HRG, Factor de crecimiento de hepatocitos (HGF), Hepcidina, incluyendo anticuerpos reactivos contra cualquiera de los anteriores, y anticuerpos reactivos contra cualquiera de sus receptores. Los agentes activos también incluyen, pero sin limitación, Ácidos 2-arilpropiónicos, Aceclofenaco, Acemetacina, Ácido acetilsalicílico (aspirina), Alclofenaco, Alminoprofeno, Amoxiprina, Ampirona, Ácidos arilalcanoicos, Azapropazona, Benorilato, Benoxaprofeno, Bromfenaco, Carprofeno, Celecoxib, Salicilato de magnesio de colina, Clofezona, Inhibidores de COX-2, Dexibuprofeno, Dexketoprofeno, Diclofenaco, Diflumsal, Droxicam, Etenzamida, Etodolaco, Etoricoxib, Faislamina, ácidos fenámicos, Fenbufeno, Fenoprofeno, Ácido flufenámico, Flunoxaprofeno, Flurbiprofeno, Ibuprofeno, Ibuproxam, Indometacina, Indoprofeno, Kebuzona, Cetoprofeno, Ketorolaco, Lomoxicam, Loxoprofeno, Lumiracoxib, Salicilato de magnesio, Ácido meclofenámico, Ácido mefenámico, Meloxicam, Metamizol, Salicilato de metilo, Mofebutazona, Nabumetona, Naproxeno, Ácidos N-arilantranílicos, Factor de crecimiento nervioso (NGF), Oxametacina, Oxaprozina, Oxicams, Oxifenbutazona, Parecoxib, Fenazona, Fenilbutazona, Fenilbutazona, Piroxicam, Pirprofeno, profenos, Proglumetacina, Derivados de pirazolidina, Rofecoxib, Salicilato de salidlo, Salicilamida, Salicilatos, Sustancia P, Sulfinpirazona, Sulindaco, Suprofeno, Tenoxicam, Ácido tiaprofénico, Ácido tolfenámico, Tolmetina y Valdecoxib.
Un antihistamínico puede ser cualquier compuesto que se oponga a la acción de la histamina o su liberación de células (por ejemplo, mastocitos). Los antihistamínicos incluyen, pero sin limitación, acrivastina, astemizol, azatadina, azelastina, betatastina, bromfeniramina, buclicina, cetiricina, análogos de cetiricina, clorfeniramina, clemastina, CS 560, ciproheptadina, desloratadina, dexclorfeniramina, ebastina, epinastina, fexofenadina, HSR 609, hidroxicina, levocabastina, loratidina, metescopolamina, mizolastina, norastemizol, fenindamina, prometacina, pirilamina, terfenadina y tranilast.
Los antibióticos incluyen, pero sin limitación, Amikacina, Aminoglucósidos, Amoxicilina, Ampicilina, Ansamicinas, Arsfenamina, Azitromicina, Azlocilina, Aztreonam, Bacitracina, Carbacefem, Carbapenems, Carbenicilina, Cefaclor, Cefadroxilo, Cefalexina, Cefalotina, Cefalotina, Cefamandol, Cefazolina, Cefdinir, Cefditoren, Cefepima, Cefixima, Cefoperazona, Cefotaxima, Cefoxitina, Cefpodoxima, Cefprozilo, Ceftazidima, Ceftibuteno, Ceftizoxima, Ceftobiprol, Ceftriaxona, Cefuroxima, Cefalosporinas, Cloranfenicol, Cilastatina, Ciprofloxacina, Claritromicina, Clindamicina, Cloxacilina, Colistina, Co-trimoxazol, Dalfopristina, Demeclociclina, Dicloxacilina, Diritromicina, Doripenem, Doxiciclina, Enoxacina, Ertapenem, Eritromicina, Etambutol, Flucloxacilina, Fosfomicina, Furazolidona, Ácido fusídico, Gatifloxacina, Geldanamicina, Gentamicina, Glucopéptidos, Herbimicina, Imipenem, Isoniacida, Kanamicina, Levofloxacina, Lincomicina, Linezolida, Lomefloxacina, Loracarbef, Macrólidos, Mafenida, Meropenem, Meticilina, Metronidazol, Mezlocilina, Minociclina, Monobactamas, Moxifloxacina, Mupirocina, Nafcilina, Neomicina, Netilmicina, Nitrofurantoína, Norfloxacina, Ofloxacina, Oxacilina, Oxitetraciclina, Paromomicina, Penicilina, Penicilinas, Piperacilina, Platensimicina, Polimixina B, Polipéptidos, Prontosil, Pirazinamida, Quinolonas, Quinupristina, Rifampicina, Rifampina, Roxitromicina, Espectinomicina, Estreptomicina, Sulfacetamida, Sulfametizol, Sulfanilimida, Sulfasalazina, Sulfisoxazol, Sulfonamidas, Teicoplanina, Telitromicina, Tetraciclina, Tetraciclinas, Ticarcilina, Tinidazol, Tobramicina, Trimetoprim, Trimetoprim-Sulfametoxazol, Troleandomicina, Trovafloxacina y Vancomicina.
Los agentes activos también incluyen Aldosterona, Beclometasona, Betametasona, Corticoesteroides, Cortisol, Acetato de cortisona, Acetato de desoxicorticosterona, Dexametasona, Acetato de fludrocortisona, Glucocorticoides, Hidrocortisona, Metilprednisolona, Prednisolona, Prednisona, Esteroides y Triamcinolona. También se contempla cualquier combinación adecuada de estos agentes activos.
Un "excipiente farmacéutico" o un "excipiente farmacéuticamente aceptable" es un vehículo, habitualmente un líquido, en el que se formula un agente terapéutico activo. En una realización de la divulgación, el agente terapéutico activo es un anticuerpo humanizado descrito en esta memoria, o uno o más fragmentos del mismo. El excipiente en general no proporciona ninguna actividad farmacológica a la formulación, aunque puede proporcionar estabilidad química y/o biológica, y características de liberación. Se pueden encontrar formulaciones ilustrativas, por ejemplo, en Remington’s Pharmaceutical Sciences, 19a ed., Grennaro, A., Ed., 1995, al que se hace referencia.
Como se utiliza en el presente documento, "vehículo farmacéuticamente aceptable" o "excipiente" incluye todos y cada uno de los disolventes, medios de dispersión, recubrimientos, agentes antibacterianos y antifúngicos, agentes isotónicos y retardantes de la absorción que son fisiológicamente compatibles. En una realización, el vehículo es adecuado para la administración parenteral. Como alternativa, el vehículo puede ser adecuado para administración intravenosa, intraperitoneal, intramuscular u sublingual. Los vehículos farmacéuticamente aceptables incluyen soluciones o dispersiones acuosas estériles y polvos estériles para la preparación extemporánea de soluciones o dispersiones inyectables estériles. El uso de tales medios y agentes para sustancias farmacéuticamente activas es bien conocido en la materia. Excepto en la medida en que cualquier medio o agente convencional sea incompatible con el compuesto activo, se contempla su uso en las composiciones farmacéuticas de la invención. Los compuestos activos complementarios también se pueden incorporar en las composiciones.
Las composiciones farmacéuticas normalmente deben ser estériles y estables en las condiciones de fabricación y almacenamiento. La invención contempla que la composición farmacéutica esté presente en forma liofilizada. La composición se puede formular como una solución, microemulsión, liposoma, u otra estructura ordenada adecuada para una concentración alta de fármaco. El vehículo puede ser un disolvente o medio de dispersión que contiene, por ejemplo, agua, etanol, poliol (por ejemplo, glicerol, propilenglicol y polietilenglicol líquido), y mezclas adecuadas de los mismos. La invención contempla además la inclusión de un estabilizante en la composición farmacéutica. La fluidez adecuada se puede mantener, por ejemplo, mediante el mantenimiento del tamaño de partícula requerido en el caso de dispersión y mediante el uso de tensioactivos.
En muchos casos, será preferible incluir agentes isotónicos, por ejemplo, azúcares, polialcoholes tales como manitol, sorbitol o cloruro sódico en la composición. Puede producirse absorción prolongada de las composiciones inyectables mediante la inclusión en la composición de un agente que retarde la absorción, por ejemplo, sales de monoestearato y gelatina. Por otra parte, el polipéptido alcalino puede formularse en una formulación de liberación temporal, por ejemplo, en una composición que incluya un polímero de liberación lenta. Los compuestos activos pueden prepararse con vehículos que protegerán el compuesto contra la liberación rápida, tales como una formulación de liberación controlada, incluyendo implantes y sistemas de suministro microencapsulados. Se pueden usar polímeros biocompatibles, biodegradables, tales como acetato de etilen vinilo, polianhídridos, ácido poliglicólico, colágeno, poliortoésteres, ácido poliláctico y copolímeros polilácticos, poliglicólicos (PLG). Los expertos en la materia conocen muchos métodos para la preparación de dichas formulaciones.
Para cada una de las realizaciones enumeradas, los compuestos se pueden administrar en una diversidad de formas de dosificación. Se contempla cualquier forma de dosificación biológicamente aceptable conocida por expertos habituales en la materia, y combinaciones de las mismas. Los ejemplos de dichas formas de dosificación incluyen, sin limitación, polvos reconstituibles, elixires, líquidos, soluciones, suspensiones, emulsiones, polvos, gránulos, partículas, micropartículas, gránulos dispersables, obleas, inhaladores, inhaladores en aerosol, parches, inhaladores en partículas, implantes, implantes de depósito, inyectables (incluyendo subcutáneos, intramusculares, intravenosos e intradérmicos), infusiones, y combinaciones de los mismos.
La descripción anterior de diversas realizaciones ilustradas de la invención no pretende ser exhaustiva o limitar la invención a la forma precisa desvelada. Aunque se describen en el presente documento realizaciones específicas de, y ejemplos para, la invención para fines ilustrativos, son posibles diversas modificaciones equivalentes en el alcance de la invención, como reconocerán los expertos en la materia relevante. Las enseñanzas proporcionadas en el presente documento de la invención pueden aplicarse a otros fines, distintos de los ejemplos descritos anteriormente.
En consecuencia, la invención no está limitada por la divulgación, sino que en su lugar el alcance de la invención debe determinarse completamente por las siguientes reivindicaciones.
La invención puede ponerse en práctica de formas distintas a las descritas particularmente en la descripción y ejemplos anteriores.
Ciertas enseñanzas relacionadas con los métodos para obtener una población clonal de linfocitos B específicos de antígeno se desvelaron en la solicitud provisional de patente de EE.UU. n° 60/801,412, presentada el 19 de mayo de 2006, a cuya divulgación se hace referencia.
Determinadas enseñanzas relacionadas con la humanización de anticuerpos monoclonales procedentes de conejo y modificaciones de secuencia preferidas para mantener afinidad de unión a antígeno se desvelaron en la solicitud internacional n° PCT/US2008/064421, correspondiente a la Publicación Internacional n° WO/2008/144757, titulada "Novel Rabbit Antibody Humanization Methods and Humanized Rabbit Antibodies", presentada el 21 de mayo de 2008, a cuya divulgación se hace referencia.
Se desvelaron determinadas enseñanzas relacionadas con la producción de anticuerpos o fragmentos de los mismos usando levadura competente para apareamiento y métodos correspondientes en la solicitud de patente de los Estados Unidos n° 11/429.053, presentada el 8 de mayo de 2006, (publicación de solicitud de patente de los Estados Unidos n° US2006/0270045), a cuya divulgación se hace referencia.
Se desvelan determinados polinucleótidos y polipéptidos de anticuerpos de CGRP en el listado de secuencias que acompaña la presente presentación de solicitud de patente, y la divulgación de dicho listado de secuencias se incorpora a esta memoria por referencia en su totalidad.
Los siguientes ejemplos se exponen para proporcionar a los expertos en la materia una divulgación y descripción completas de cómo realizar y utilizar la presente invención, y no se pretende que limiten el alcance de lo que se considera la invención. Se han realizado esfuerzos para asegurar la precisión con respecto a los números utilizados (por ejemplo, cantidades, temperatura, concentraciones, etc.) pero deberían tenerse en cuenta algunos errores y desviaciones experimentales. Salvo que se indique otra cosa, las partes son partes en peso, el peso molecular es el peso molecular promedio, la temperatura está en grados centígrados; y la presión está en o cerca de la atmosférica.
Ejemplos
Ejemplo 1 Preparación de anticuerpos que se unen con CGRP
Usando el protocolo de selección de anticuerpos descrito en el presente documento, se puede generar un panel exhaustivo de anticuerpos.
Estrategia de inmunización
Los conejos se inmunizaron con CGRPa humano (American Peptides, Sunnyvale CA y Bachem, Torrance CA). La inmunización consistió en una primera inyección subcutánea (sc) de 100 pg de antígeno mezclados con 100 pg de KLH en adyuvante completo de Freund (CFA) (Sigma) seguido de dos refuerzos, con dos semanas de diferencia que contenían cada uno 50 pg de antígeno mezclados con 50 pg en adyuvante incompleto de Freund (IFA) (Sigma). Se tomaron muestras de los animales el día 55 y los títulos de suero se determinaron mediante ELISA (reconocimiento de antígenos) y mediante inhibición del aumento de AMPc conducido por CGRP en SK-N-MC.
Evaluación del título de selección de anticuerpos
Para identificar y caracterizar anticuerpos que se unen con CGRPa humano, se ensayaron soluciones que contenían anticuerpos mediante ELISA. En resumen, se recubrieron placas recubiertas con estreptavidina (Thermo Scientific) con CGRPa humano biotinilado en el extremo N (50 pl por pocillo, 1 pg/ml) diluido en tampón de ELISA (gelatina de piel de pescado al 0,5 % en PBS pH 7,4), durante aproximadamente 1 h a temperatura ambiente o, como alternativa, durante una noche a 4 °C. Las placas se bloquearon después adicionalmente con tampón de ELISA durante una hora a temperatura ambiente y se lavaron usando tampón de lavado (PBS, tween 20 0,05 %). Las muestras de suero ensayadas se diluyeron en serie usando tampón de ELISA. Se transfirieron cincuenta microlitros de muestras de suero diluidas a los pocillos y se incubaron durante una hora a temperatura ambiente. Después de esta incubación, la placa se lavó con tampón de lavado. Para el revelado, se añadió un Fc-HARP específico anti conejo (dilución 1:5000 en tampón de ELISA) a los pocillos y se incubó durante 45 min a TA. Después de una etapa de lavado 3x con solución de lavado, la placa se reveló usando sustrato de TMB durante dos minutos a temperatura ambiente y la reacción se interrumpió usando HCl 0,5 M. La absorbancia del pocillo se leyó a 450 nm.
Determinación del título de muestras de suero mediante actividad funcional (inhibición de los niveles de AMPc conducidos por CGRP)
Para identificar y caracterizar anticuerpos con actividad funcional, se realizó un ensayo de inhibición del aumento conducido por CGRP de los niveles de AMPc usando electroquimioluminiscencia (Meso Scale Discovery, MSD). En resumen, las preparaciones de anticuerpos para ensayar se diluyeron en serie en tampón de ensayo de MSD (Hepes, MgCl2, bloqueador A 1 mg/ml pH 7,3, Meso Scale Discovery) en una placa de poliestireno de fondo redondo de 96 pocillos (Costar). A esta placa, se añadió CGRPa humano (10ng/ml de concentración final) diluido en ensayo de MSD y se incubó durante una hora a 37C. Se usaron controles apropiados como ha sugerido el fabricante del kit de ensayo. Se desprendieron células de neuroepitelioma humano (SK-N-MC, ATCC) usando una solución de EDTA (5 mM en PBS) y se lavaron usando medios de cultivo (MEM, FBS 10 %, antibióticos) por centrifugación. El número de células se ajustó a 2 millones de células por ml en tampón de ensayo y se añadió IBMX (3-isobutil-1metilxantina, Sigma) hasta una concentración final de 0,2 mM justo antes de cargar las células en una placa de ensayo de AMPc. Después de incubarse la solución de CGRPa humano y anticuerpos durante una hora, se transfirieron 20 microlitros de solución que contenía células a la placa de ensayo de AMPc. Todas las muestras ensayadas se procesaron por duplicado con controles apropiados. Se añadieron diez microlitros de células a los pocilios y la placa se incubó durante 30 minutos con agitación a temperatura ambiente. Aunque las células se incubaron con la solución de CGRP, la solución de terminación se preparó realizando una solución 1:200 de AMPc marcado con TAG (MSD) en tampón de lisis (MSD). Para detener la incubación de células-CGRP, se añadieron 20 microlitros de solución de terminación a las células y la placa se incubó durante una hora con agitación a temperatura ambiente. El tampón de lectura (MSD) se diluyó cuatro veces con agua y se añadieron 100 microlitros a todos los pocillos en la placa. La placa se leyó después usando un Sector Imager 2400 (MSD) y el software Prism se usó para ajuste de datos y determinación de CI50.
Recogida de tejidos
Una vez que se hubieron establecido los títulos aceptables, se sacrificaron los conejos. Se recogieron el bazo, ganglios linfáticos y sangre completa y se procesaron de la siguiente manera:
El bazo y los ganglios linfáticos se procesaron en una única suspensión celular disasociando el tejido y presionando a través de una malla de alambre estéril a 70 gm (Fisher) con un émbolo de una jeringa de 20 cm3. Las células se recogieron en PBS. Las células se lavaron dos veces por centrifugación. Después del último lavado, la densidad celular se determinó mediante azul de tripano. Las células se centrifugaron a 1500 rpm durante 10 minutos; el sobrenadante se descartó. Las células se resuspendieron en el volumen apropiado de dimetil sulfóxido al 10 % (DMSO, Sigma) en FBS (Hyclone) y se distribuyeron a 1 ml/vial. Los viales se almacenaron a -70 °C en una cámara de congelación lenta durante 24 horas y se almacenaron en nitrógeno líquido.
Se aislaron células mononucleares de sangre periférica (PBMC) mezclando sangre completa con partes iguales del medio bajo en glucosa descrito anteriormente sin FBS. Se superpusieron 35 ml de la mezcla de sangre completa en 8 ml de Lympholyte de conejo (Cedarlane) en un tubo cónico de 45 ml (Corning) y se centrifugaron durante 30 minutos a 2500 rpm a temperatura ambiente sin frenos. Después de la centrifugación, las capas de PBMC se retiraron cuidadosamente usando una pipeta de vidrio Pasteur (VWR), se combinaron y se colocaron en un vial de 50 ml limpio. Las células se lavaron dos veces con el medio modificado descrito anteriormente por centrifugación a 1500 rpm durante 10 minutos a temperatura ambiente y la densidad celular se determinó mediante azul de tripano. Después del último lavado, las células se resuspendieron en un volumen apropiado de medio de DMSO/FBS 10 % y se congelaron como se ha descrito anteriormente.
Selección de linfocitos B, enriquecimiento y condiciones de cultivo
El día de establecimiento de cultivo de linfocitos B, se descongelaron viales de PBMC, esplenocitos o ganglios linfáticos para su uso. Los viales se retiraron del tanque LN2 y se colocaron en un baño de agua a 37 °C hasta que se descongelaron. Los contenidos de los viales se transfirieron a un tubo de centrífuga cónico de 15 ml (Corning) y se añadieron lentamente al tubo 10 ml de RPMI modificado descrito anteriormente. Las células se centrifugaron durante 5 minutos a 2000 rpm y se descartó el sobrenadante. Las células se resuspendieron en 10 ml de medio nuevo. La densidad y viabilidad celular se determinaron mediante azul de tripano.
a) El siguiente protocolo se usó para Ab1 y Ab13
Las células se premezclaron con el CGRPa humano biotinilado de la siguiente manera. Las células se lavaron de nuevo y se resuspendieron a 1E07 células/80 gl de medio. Se añadió CGRPa humano biotinilado a la suspensión celular a la concentración final de 5 ug/ml y se incubó durante 30 minutos a 4 °C. Se retiró CGRPa humano biotinilado realizando dos lavados de 10 ml usando PBF [PBS sin Ca/Mg (Hyclone), ácido etilendiamintetraacético 2 mM (EDTA), seroalbúmina bovina (BSA) 0,5 % (Sigma-sin biotina)]. Después del segundo lavado, las células se resuspendieron a 1E07 células/80 gl de PBF y se añadieron 20 gl de perlas de estreptavidina MACS® (Miltenyi Biotech, Auburn CA) por cada 10E7 células a la suspensión celular. Las células y perlas se incubaron a 4 °C durante 15 minutos y se lavaron una vez con 2 ml de PBF por cada 10E7 células.
b) El siguiente protocolo se usó para Ab4, Ab7, Ab9 y Ab11:
Se precargó CGRPa humano biotinilado en las perlas de estreptavidina de la siguiente manera. Se mezclaron setenta y cinco microlitros de perlas de estreptavidina (Milteny Biotec, Auburn CA) con huCGRPa biotinilado en el extremo N (10 ug/ml de concentración final) y 300 gl de PBF. Esta mezcla se incubó a 4 °C durante 30 min y se retiró CGRPa humano biotinilado no unido usando una columna de separación MACS® (Miltenyi Biotec, con un aclarado de 1 ml para retirar el material sin unir. Después se extrajo material con el émbolo, luego se usó para resuspender células de lo anterior en 100 ul por cada 1E7 células, la mezcla se incubó después a 4 °C durante 30 min y se lavó una vez con 10 ml de PBF.
Para los protocolos tanto a) como b) se aplicó lo siguiente: Tras el lavado, se volvieron a suspender las células en 500 gl de FACS y se apartaron. Se preaclaró una columna MACS® MS (Miltenyi Biotec, Auburn CA) con 500 ml de PBF en un soporte magnético (Milteni). Se aplicó la suspensión celular a la columna a través de un prefiltro, y se recogió la fracción sin unir. La columna se lavó con 2,5 ml de tampón PBF. La columna se retiró del soporte magnético y se colocó en un tubo eppendorf de 1,5 ml limpio, estéril. Se añadió 1 ml de tampón a la parte superior de la columna y se recogieron células con selección positiva. El rendimiento y la viabilidad de la fracción celular positiva se determinaron mediante tinción con azul de tripano. La selección positiva produjo un promedio de 1 % de la concentración celular de partida.
Se estableció una exploración celular piloto para proporcionar información sobre niveles de siembra para el cultivo. Las placas se sembraron a 10, 25, 50, 100 o 200 linfocitos B enriquecidos/pocillo. Además, cada pocillo contenía 50.000 células/pocillo de células EL-4.B5 (5.000 Rads) y un nivel apropiado de sobrenadante de linfocitos T de conejo activado (véase publicación de solicitud de patente de los Estados Unidos n° 20070269868)(que varía de 1­ 5 % dependiendo de la preparación) en medio RPMI modificado alto en glucosa a un volumen final de 250 pl/pocillo. Los cultivos se incubaron durante 5 a 7 días a 37 °C en CO24 %.
Exploración de cultivo de linfocitos B mediante reconocimiento de antígenos (ELISA)
Para identificar pocillos que producen anticuerpos anti CGRPa humano, el mismo protocolo como se ha descrito anteriormente para determinación de título de muestras de suero mediante reconocimiento de antígenos (ELISA) se ha usado con los siguientes cambios. En resumen, las placas recubiertas con neutravidina se recubrieron con una mezcla de CGRPa humano biotinilado en el extremo tanto N como C (50 pl por pocillo, 1 pg/ml cada uno). Las muestras de sobrenadante de linfocitos B (50 pl) se ensayaron sin dilución previa.
Identificación de actividad funcional en sobrenadantes de linfocitos B usando producción de AMPc conducida por CGRP
Para determinar la actividad funcional contenida en sobrenadantes de linfocitos B, se usó un procedimiento similar al descrito para la determinación de título funcional de muestras de suero con las siguientes modificaciones. En resumen, se usó sobrenadante de linfocitos B (20 pl) en lugar de las muestras de suero policlonales diluidas.
Aislamiento de linfocitos B específicos de antígeno
Las placas que contenían pocillos de interés se retiraron de -70 °C, y las células de cada pocillo se recuperaron usando cinco lavados de 200 microlitros de medio (RPMI completo al 10 %, BME 55 pM) por pocillo. Las células recuperadas se sedimentaron mediante centrifugación y el sobrenadante se retiró cuidadosamente. Las células sedimentadas se resuspendieron en 100 pl de medio. Para identificar células que expresan anticuerpos, se recubrieron perlas magnéticas de estreptavidina (dynabeads M280, Invitrogen) con una combinación de CGRPa humano biotinilado tanto N como C terminal. Se optimizaron lotes de CGRPa biotinilados individuales mediante dilución en serie. Después se mezclaron cien microlitros que contenían aproximadamente 4x10E7 perlas recubiertas con las células resuspendidas. A esta mezcla se añadieron 15 microlitros de FITC-IgG H&L de cabra anticonejo (Jackson Immunoresearch) diluido 1:100 en medio.
Se retiraron veinte microlitros de suspensión de células/perlas/H&L anticonejo y se distribuyeron gotas de 5 microlitros en un portaobjetos de vidrio de un pocillo previamente tratado con Sigmacote (Sigma) que suman de 35 a 40 gotas por portaobjetos. Se usó una barrera impermeable de aceite de parafina (JT Baker) para sumergir las gotas, y el portaobjetos se incubó durante 90 minutos a 37 °C en un incubador de CO2 al 4 % en la oscuridad. Pueden identificarse linfocitos B que producen anticuerpo mediante el anillo fluorescente alrededor producido por la secreción de anticuerpos, reconocimiento del antígeno biotinilado asociado a perlas y posterior detección por el reactivo de detección de IgG fluorescente. Una vez que se hubo identificado una célula de interés, esta se recuperó mediante un micromanipulador (Eppendorf). La célula individual que sintetiza y exporta el anticuerpo se transfirió a un tubo de microcentrífuga, se congeló usando hielo seco y se almacenó a -70 °C.
Amplificación y determinación de secuencia de secuencias de anticuerpos de linfocitos B específicos de antígenos Se recuperaron secuencias de anticuerpos usando un método basado en RT-PCR combinado de un linfocito B aislado individual. Se diseñaron cebadores que contienen enzimas de restricción para hibridar en regiones conservadas y constantes de los genes de inmunoglobulina diana (pesada y ligera), tales como secuencias de inmunoglobulina de conejo, y se usó una recuperación de PCR anidada de dos etapas para amplificar la secuencia de anticuerpo. Se analizaron amplicones de cada pocillo para recuperación e integridad de tamaño. Los fragmentos resultantes se digieren después con AluI para identificación de la clonalidad de secuencia. Las secuencias idénticas presentaron un patrón de fragmentación común en sus análisis electroforéticos. Los fragmentos de amplicón de cadena pesada y ligera originales se digirieron usando los sitos de enzimas de restricción contenidos en los cebadores de PCR y se clonaron en un vector de expresión. Se amplificó y purificó vector que contenía fragmentos de ADN subclonados. La secuencia de las cadenas pesadas y ligeras subclonadas se verificaron antes de la expresión.
Producción recombinante de anticuerpo monoclonal de especificidad de antígeno y/o propiedades funcionales deseadas
Para determinar la especificidad de antígeno y las propiedades funcionales de anticuerpos recuperados de linfocitos B específicos, se transfectaron vectores que conducían la expresión de las secuencias de cadena pesada y ligera emparejadas deseadas en células HEK-293.
Reconocimiento de antígenos de anticuerpos recombinantes mediante ELISA
Para caracterizar anticuerpos expresados recombinantes por su capacidad para unirse con CGRPa humano, se ensayaron soluciones que contenían anticuerpos mediante ELISA. Todas las incubaciones se realizaron a temperatura ambiente. En resumen, se recubrieron placas Immulon IV (Thermo Scientific) con una solución que contiene CGRPa (1 ut/ml en PBS) durante 2 horas. Después se lavaron placas recubiertas con CGRPa tres veces en tampón de lavado (PBS, Tween-200,05 %). Las placas se bloquearon después usando una solución de bloqueo (PBS, gelatina de piel de pescado 0,5 %, Tween-20 0,05 %) durante aproximadamente una hora. La solución de bloqueo se retiró después y las placas se incubaron después con una serie de diluciones del anticuerpo que se ensaya durante aproximadamente una hora. Al final de esta incubación, la placa se lavó tres veces con tampón de lavado y se incubó adicionalmente con un anticuerpo secundario que contenía solución (fragmento F(ab’)2 affinipure de cabra anti IgG humano conjugado con peroxidasa, específico de fragmento Fc (Jackson Immunoresearch) durante aproximadamente 45 minutos y se lavó tres veces. En ese punto se añadió una solución de sustrato (sustrato de TMB peroxidasa, BioFx) y se incubó durante 3 a 5 minutos en la oscuridad. La reacción se detuvo mediante la adición de una solución que contenía HCl (0,5 M) y la placa se leyó a 450 nm en un lector de placas. Resultados: Las Figuras 15-18 demuestran que los anticuerpos anti CGRP Ab1-Ab14 se unen a y reconocen CGRPa.
Caracterización funcional de anticuerpos recombinantes por modulación de niveles intracelulares de AMPc conducidos por CGRP y reactividad cruzada con ratas
Para caracterizar un anticuerpo expresado recombinante para determinar su capacidad de inhibir el ensayo de niveles celulares aumentados de AMPc mediado por CGRPa, se usó un kit de ensayo de electroquimioluminiscencia (Meso Scale Discovery, MSD). En resumen, las preparaciones de anticuerpos para ensayar se diluyeron en serie en tampón de ensayo de MSD (Hepes, MgCl2, bloqueador A 1 mg/ml pH 7,3, Meso Scale Discovery) en una placa de poliestireno de fondo redondo de 96 pocillos (Costar). A esta placa, se añadió CGRPa humano (25 ng/ml de concentración final) diluido en tampón de ensayo MSD y se incubó durante una hora a 37 °C. Se usaron controles apropiados como ha sugerido el fabricante del kit de ensayo. Se desprendieron células de neuroepitelioma humano (Sk -N-MC, ATCC) usando una solución de EDTA (5 mM) y se lavaron usando medios de cultivo (MEM, FBS 10 %, antibióticos) por centrifugación. El número de células se ajustó a 2 millones de células por ml en tampón de ensayo, e IBMX (3-Isobutil-1 -Metilxantina, 50 mM Sigma) se añadió hasta una concentración final de 0,2 mM justo antes de cargar las células en la placa de ensayo de AMPc. La solución de CGRPa humano y anticuerpos se incubó durante una hora, después de lo cual se transfirieron 20 microlitros de solución que contenía células a la placa de ensayo de AMPc. Todas las muestras ensayadas se procesaron por duplicado con controles apropiados. Se añadieron diez microlitros de células a los pocillos y la placa se incubó durante 30 minutos con agitación. Aunque las células se incubaron con la solución de CGRP, la solución de terminación se preparó realizando una solución 1:200 de AMPc marcado con TAG (MSD) en tampón de lisis (MSD). Para detener la incubación de células-CGRP, se añadieron 20 microlitros de solución de terminación a las células y la placa se incubó durante una hora con agitación. El tampón de lectura (MSD) se diluyó cuatro veces con agua y se añadieron 100 microlitros a todos los pocillos en la placa. La placa se leyó después usando un Sector Imager 2400 (MSD) y el software Prism se usó para ajuste de datos y determinación de CI50.
Para ensayar la capacidad de los anticuerpos recombinantes para antagonizar CGRPp humano se realizó un ensayo similar con la sustitución del agonista de CGRP (CGRPp 10 ng/ml de concentración final). Se realizó evaluación de los anticuerpos recombinantes para reconocer e inhibir la generación de AMPc mediada por CGRP de rata usando CGRP de rata (5 ng/ml de concentración final) y la línea celular L6 de rata (ATCC).
Resultados: Las Figuras 19-37 demuestran que los anticuerpos anti CGRP Ab1-Ab14 inhiben CGRPa, CGRPp y los niveles celulares aumentados de AMPc mediados por CGRP de rata.
Ejemplo 2: Producción enzimática de fragmentos Fab
Se realizaron digestiones de papaína usando papaína inmovilizada (Thermo/Pierce) según las instrucciones del fabricante. En resumen, se incubaron anticuerpos purificados en un tampón que contenía cisteína/HCl con papaína inmovilizada a 37 °C con agitación suave. La digestión se supervisó tomando una alícuota y analizando usando SDS-PAGE para escisión de la cadena pesada. Para detener la reacción, la papaína inmovilizada se centrifugó y se lavó usando Tris 50 mM pH 7,5 y se filtró. Se retiraron anticuerpo de longitud completa y fragmentos Fc sin digerir usando una columna de MabSelectSure (GE).
Ejemplo 3 Expresión de células de levadura
Construcción de vectores de expresión de Pichia pastoris para cadena pesada y ligera.
Los fragmentos de cadena ligera y pesada humanizados se sintetizaron comercialmente y se subclonaron en un vector de expresión pGAP. El vector de expresión pGAP usa el promotor de GAP para conducir la expresión de la cadena de inmunoglobulina y la secuencia líder de seroalbúmina humana (HSA) para exportación. Además, Este vector contiene elementos habituales tales como un origen bacteriano de replicación y una copia del gen de resistencia a kanamicina que confiere resistencia al antibiótico G418 en P. pastoris. G418 proporciona un medio de selección para cepas que contienen el vector de expresión deseado integrado en su genoma.
Transformación de vectores de expresión en cepas hospedadoras met1 y lys3 haploides de Pichia pastoris Todos los métodos usados para transformación de cepas de P. pastoris haploides y manipulación del ciclo sexual de P. pastoris se realizaron como se describe en Pichia Protocols (Methods in Molecular Biology Higgings, DR, y Cregg, JM, Eds. 1998. Humana Press, Totowa, NJ). Antes de la transformación cada vector se linealizó en las secuencias promotoras de GAP para dirigir la integración del vector en el locus del promotor de GAP del genoma de P. pastoris. Se transfectaron cepas haploides usando electroporación y se seleccionaron transformantes exitosos en placas de agar G418 de YPDS (extracto de levadura, dextrosa de peptona con sorbitol). Se determinaron los números de copias de genes de cadena pesada y ligera para cepas haploides mediante análisis de transferencia de Southern. Después las cepas haploides se aparearon y seleccionaron para determinar su capacidad para crecer en ausencia de los marcadores de aminoácidos (es decir, Lys y Met). Después los clones diploides resultantes se sometieron a una transferencia de Southern final para confirmar los números de copias de genes de cadena pesada y ligera. Se seleccionó un clon que expresaba el anticuerpo de interés usando bionsensores de Proteína A de interferometría de biocapas para supervisar la expresión (Octet, ForteBio).
Ejemplo 4 Expresión de Ab3, Ab6 y Ab14 en Pichia pastoris
Se prepararon tres cepas de Pichia para expresión de anticuerpo de longitud completa. Para todas las cepas de expresión de anticuerpos de longitud completa, se crearon cepas haploides y se aparearon posteriormente. Una cepa haploide expresó secuencia de cadena ligera de longitud completa y otra cepa haploide expresó la secuencia de cadena pesada de longitud completa. Cada cepa diploide se usó para generar un banco de células de investigación y se usó para expresión en un biorreactor.
En primer lugar se expandió un inóculo usando el banco de células de investigación usando medio comprendido por los siguientes nutrientes (% p/v): extracto de levadura al 3 %, dextrosa anhídrida al 4 %, YNB al 1,34 %, biotina al 0,004 % y fosfato potásico 100 mM. Para generar el inóculo para los fermentadores, el banco de células se expandió durante aproximadamente 24 horas en un incubador de agitación a 30 °C y 300 rpm. Después se añadió un inóculo al 10 % a vasos de 2,5 l de volumen de trabajo Labfors que contenían 1 l de medio de cultivo estéril. El medio de cultivo estaba comprendido por los siguientes nutrientes: sulfato de potasio 18,2 g/l, fosfato de amonio monobásico 36,4 g/l, fosfato de potasio dibásico 12,8 g/l, sulfato de magnesio heptahidrato 3,72 g/l, citrato de sodio dihidrato 10 g/l, glicerol 40 g/l, extracto de levadura 30 g/l, metales traza PTM1 4,35 ml/l y antiespumante 204 1,67 ml/l. La solución de metal traza PTM1 estaba comprendida por los siguientes componentes: sulfato cúprico pentahidrato 6 g/l, yoduro de sodio 0,08 g/l, sulfato de manganeso hidrato 3 g/l, molibdato de sodio dihidrato 0,2 g/l, ácido bórico 0,02 g/l, cloruro de cobalto 0,5 g/l, cloruro de cinc 20 g/l, sulfato ferroso heptahidrato 65 g/l, biotina 0,2 g/l y ácido sulfúrico 5 ml/l.
Los parámetros de control de proceso de biorreactor se ajustaron de la siguiente manera: Agitación 1000 rpm, flujo de aire de 1,35 litros convencionales por minuto, temperatura de 28 °C y el pH se controló en seis usando hidróxido de amonio. No se proporcionó complementación de oxígeno.
Se cultivaron cultivos de fermentación durante aproximadamente 12 a 16 horas hasta que el glicerol inicial se consumió como se ha indicado por una adición de oxígeno disuelto. Los cultivos se privaron de alimento durante aproximadamente tres horas después de la adición de oxígeno disuelto. Después de este periodo de privación de alimento, se añadió una adición de embolada de etanol al reactor hasta alcanzar etanol 1 % (p/v). Se permitió que los cultivos de fermentación se equilibraran durante 15 a 30 minutos. Se inició la adición de alimento 30 minutos después de la embolada de etanol y se ajustó a una velocidad constante de 1 ml/min durante 40 minutos, después la bomba de alimento se controló mediante un sensor de etanol manteniendo la concentración de etanol a 1 % durante el resto del ciclo usando una sonda sensora de etanol (Raven Biotech). El alimento comprendió en los siguientes componentes: extracto de levadura 50 g/l, dextrosa 500 g/l, sulfato de magnesio heptahidrato 3 g/l y metales traza PTM1 12 ml/l. Para fermentación del Ab6 y Ab14 de longitud completa, también se añadió al alimento citrato de sodio dihidrato (0,5 g/l). El tiempo de fermentación total fue de aproximadamente 90 horas.
Ejemplo 5 Métodos para humanizar anticuerpos
Se han descrito previamente métodos para humanizar anticuerpos en la patente de los Estados Unidos concedida n° 7935340, a cuya divulgación se hace referencia. En algunos casos, es necesaria una determinación de si se requieren restos de marco conservado de conejo adicionales para mantener la actividad. En algunos casos, los anticuerpos humanizados aún requieren que se conserven algunos restos de marco conservado de conejo críticos para minimizar la pérdida de afinidad o actividad. En estos casos, es necesario cambiar aminoácidos de marco conservado individuales o múltiples de secuencias de línea germinal humana de vuelta a los aminoácidos de conejo originales para tener actividad deseada. Estos cambios se determinan experimentalmente para identificar qué restos de conejo son necesarios para conservar la afinidad y actividad. Este es ahora el final de la secuencia de aminoácidos humanizada de cadena pesada y ligera variable.
Ejemplo 6 Inhibición de unión de CGRP con su receptor celular
Para caracterizar anticuerpos expresados de forma recombinante por su capacidad para inhibir la unión de CGRP con su receptor celular, se realizó un ensayo de unión a radioligando como se ha descrito previamente [Elshourbagy et al, Endocrinology 139:1678 (1998); Zimmerman et al, Peptides, 16:421 (1995)]. Se usaron preparaciones de membrana de receptores de CGRP humanos recombinantes, receptor de tipo receptor de calcitonina y RAMP1 (Chemiscreen, Millipore). Se preincubaron diluciones de anticuerpos con CGRPa humano radiomarcado con 125I (0,03 nM) durante 30 minutos a temperatura ambiente. Se estimó la unión inespecífica en presencia de CGRPa humano 0,1 pM. Las membranas se filtraron y lavaron. Después se contaron los filtros para determinar el CGRPa humano radiomarcado con 125I unido de forma específica.
Resultados: La Figura 38 demuestra que los anticuerpos anti CGRP Ab1-Ab13 inhiben la unión de CGRP con su receptor celular.
Ejemplo 7 Inhibición de la vasodilatación neurogénica por anticuerpos anti CGRP en ratas
CGRP es un vasodilatador potente (Nature 313: 54-56 (1985) y Br J. Clin. Pharmacol. 26(6):691-5. (1988)). Se usó un ensayo farmacodinámico para medir la actividad antagonista del receptor de CGRP de forma no invasiva se usó para caracterizar anticuerpos anti CGRP. El modelo se basó en cambios del flujo sanguíneo dérmico medidos usando una captura de imágenes por Doppler de láser después de la aplicación tópica de una solución de capsaicina. La capsaicina activa el receptor transitorio potencial vainilloide de tipo 1 (TRPV-1), produciendo inflamación neurogénica y vasodilatación mediante la liberación local de mediadores vasoactivos incluyendo CGRP y sustancia P (Br. J. Pharmacol. 110: 772-776 (1993)).
El día antes del ensayo de vasodilatación, se dosificó a los animales con el agente de ensayo o control mediante IP (intraperitoneal). Después de la dosificación, los animales se afeitaron y depilaron en la región lumbar de su lado dorsal, en un área de aproximadamente 2x6 cm. Los animales se devolvieron después a sus jaulas durante una noche. El día de ensayo, aproximadamente 24 horas después de la dosificación, los animales se anestesiaron con gas de isoflurano y se colocaron en una almohadilla térmica y se equiparon con un cono nasal para el suministro continuo de isoflurano. Se usó un aparato de captura de imágenes de Doppler por láser para la observación de la vasodilatación. Se dirigió un haz de luz roja coherente generada por un láser de helio-neón de 633 nm a un área afeitada, un rectángulo (2x6 cm), y se exploró en un modo de resolución medio. Se obtuvo en primer lugar una exploración de Doppler basal y se predeterminó la localización de colocación de anillos en O identificando dos áreas de flujo bajo similares. Se colocaron dos anillos en O de goma (~1 cm de diámetro) en las regiones seleccionadas y se realizó una exploración basal. Inmediatamente después de la finalización de la exploración, se aplicó 1 mg de capsaicina en 5 pl de una solución de etanol:acetona (1:1) en cada uno de los dos anillos en O. Se repitieron exploraciones de Doppler a los 2,5, 5, 7,5, 10, 12,5, 15, 17,5, 20, 22,5, 25, 27,5 y 30 minutos después de la aplicación de capsaicina. El porcentaje de cambio desde el flujo medio basal en cada uno de los dos anillos en O, se representó como los resultados de vasodilatación debida a capsaicina.
Para ensayar anticuerpos expresados de forma recombinante por su capacidad para inhibir la unión de CGRP con su receptor celular, se realizó un ensayo de unión a radioligando como se ha descrito previamente.
Resultados: Las Figuras 39 y 40 demuestran que los anticuerpos anti CGRP Ab3 y Ab6 redujeron la vasodilatación en este modelo después de la administración de capsaicina.
Ejemplo 8 Efecto de la administración de anticuerpo de CGRP en vejiga hiperactiva
Se realizaron experimentos para evaluar la eficacia potencial de la administración de un anticuerpo anti CGRP en la continencia de vejiga y vejiga hiperactiva. La continencia de vejiga es un equilibrio entre el cierre uretral y la actividad del músculo detrusor, y la vejiga hiperactiva es una afección caracterizada por urgencia, incontinencia urinaria, frecuencia y nocturia. Algunos indicios aislados indicados en la bibliografía sugieren que CGRP puede estar implicado en la continencia de vejiga y puede correlacionarse con y quizás desempeñar un papel en la patología de la enfermedad de vejiga hiperactiva. En consecuencia, se esperó que los anticuerpos anti CGRP de la invención, especialmente dada su alta afinidad con CGRP, ayudaran potencialmente a prevenir o aliviar esta afección en ocasiones debilitante. (Las pruebas de que CGRP puede desempeñar un papel en vejiga hiperactiva incluyen el hecho de que CGRP está presente en el tracto urinario, DRG y médula espinal (Wharton et al., 1986 Neurosci (3):727). Además, los aferentes de fibra C son críticos para transportar impulsos implicados en la micción a la médula espinal (Yoshida et al., 2011 J Pharmacol Sci (112):128) y estas fibras se ven afectadas por CGRP. Además, se ha indicado que la administración intravesical de Botox suprime CGRP y reduce significativamente el intervalo entre contracciones en un modelo de dolor de vejiga inducido por ácido acético (Chuang et al., 2004 J Urol (172):1529; Chuang et al., 2009 J Urol (182):786)). Por otra parte, se ha indicado recientemente que la administración de un anticuerpo anti CGRP supuestamente reduce el número de contracciones de vejiga en modelo de vejiga hiperactiva inducida por aguarrás (solicitud de patente de PCT WO 2011/024113 de Pfizer)).
Materiales y Métodos
Animales:
Se suministraron ratas Sprague-Dawley hembra (247 - 299 g) (Charles River Laboratories, Saint Germain sur l’Arbresle, Francia) al laboratorio 5 días antes de los experimentos para aclimatarse a las condiciones de laboratorio. Se alojaron 3 por jaula (tamaño de jaulas de polipropileno de tipo E: 1032 cm2) y se les proporcionó alimento (Teklad 2016 global rodents, Harlan, 03800 Gannat, Francia) y agua a voluntad. El lecho de serrín (Souralit 2912 plus, Souralit, 17080 Girona, España) para jaulas de roedores se cambió dos veces a la semana. La temperatura del animalario (20 ± 2 °C) se mantuvo con un ciclo de luz-oscuridad alternante de 12/12 horas (fase de luz 7 am: 7 pm) y la humedad relativa se mantuvo a 40-70 %.
Equipamiento de laboratorio
Se conectaron catéteres de vejiga mediante un tubo en T con un extensómetro MX 860 Novatrans III Gold (Medex Medical SARL, Nantes-Carquefou, Francia) y una bomba de jeringa (70-2208 Modelo II plus, Harvard Apparatus, Les Ullis, Francia y Razel R-99E, Fisher Bioblock, Illkirch, Francia). Se registró la presión intravesical de forma continua usando una interfaz PowerLab (ADInstruments Pty Ltd, Castle-Hill, Australia) y software Chart® ejecutado en un PC. Los datos se analizaron con software Microsoft Excel®.
Sustancias de ensayo
Anticuerpo anti CGRP de ensayo (Ab3)
Anticuerpo de control negativo (anticuerpo anti digitoxina).
Reactivos químicos
Se obtuvo solución salina fisiológica (NaCl 0,9 %) (lote n° 11043411, CAS n° 7647-14-5) de B-Braun mediante Centravet (Lapalisse, Francia).
Sustancias anestésicas
Uretano (lote n° BCBC9294, CAS n° 51-79-6) y pentobarbital sódico (lote n° 150A1, CAS n° 76-74-4) fueron proporcionados por Sigma-Aldrich (St Quentin Fallavier, Francia) y Centravet (Lapalisse, Francia), respectivamente.
Grupos experimentales
Se usaron dos grupos experimentales de 10 ratas en los experimentos. Se administró a cada grupo 10 mg/kg del anticuerpo de control o el anti CGRP:
Diseño del estudio
Procedimiento experimental
Se administró a ratas hembra anticuerpo de ensayo o anticuerpo de control negativo por vía intravenosa a una dosis de 10 mg/kg, 18 horas antes de los experimentos usando una inyección en la vena de la cola. Quince (15) horas después, las ratas se anestesiaron con uretano (1,2 g/kg, subcutáneo (s.c.). Tres (3) horas después de la administración s.c. de uretano, se insertó un catéter de polietileno (0,58 y 0,96 mm de diámetros internos y externos, respectivamente) en la vejiga a través de la cúpula y se fijó con una sutura en bolsa de tabaco. La temperatura corporal se mantuvo a 37 ± 2 °C (controlador TCAT-2LV, Physitemp, ADInstruments Pty Ltd., Casttle Hill, Australia) durante todo el experimento.
Experimento cistométrico
Se realizaron investigaciones cistométricas en ratas hembra anestesiadas después de la cirugía. Se infundió solución salina fisiológica a temperatura ambiente de forma continua en la vejiga a un caudal constante (2 ml/h) durante un periodo de al menos 30 min.
Al final de los experimentos cistométricos, los animales se sacrificaron mediante una inyección letal (1 ml) de pentobarbital sódico (54,7 mg/ml) (CAS n° 76-74-4) seguido de dislocación cervical.
Parámetros cistométricos
Los parámetros cistométricos medidos fueron:
Amplitud de micción (AM), es decir presión entre la presión umbral y presión máxima de micción (mmHg), Intervalo entre contracciones (IEC), es decir tiempo entre dos micciones posteriores (s),
Frecuencia de micción (FM), es decir número de contracciones de micción/15 min (picos/15 min).
Criterios de exclusión
Se excluyeron dos ratas durante los experimentos: Uno se excluyó porque presentaba hiperactividad de vejiga durante la infusión intravesical de solución salina y el otro porque la profundidad de anestesia cambió durante el experimento induciendo modificaciones del perfil cistométrico.
Análisis de resultados
Para cada rata, se calcularon valores para AM e IEC como la media de las últimas cuatro o cinco micciones durante infusión de solución salina. Se calcularon valores para FM como la media de micciones obtenidas para dos intervalos de 15 minutos durante la infusión de solución salina.
Los resultados se presentan como valores medios ± error típico de la media (± etm). Se realizaron figuras y análisis estadísticos usando GraphPad Prism® (Versión 4; GraphPad Software Inc., La Jolla, CA, Estados Unidos).
Se realizaron comparaciones estadísticas de valores (infusión de solución salina) en el grupo de anticuerpos anti CGRP frente al grupo de anticuerpos de control usando ensayo de t de Student para muestras no relacionadas. Se aceptó una p<0,05 para significación estadística.
Resultados:
Como se muestra en la FIG. 41, IEC fue significativamente mayor y FM fue significativamente menor en el grupo tratado con Ab anti CGRP (FIGS. 41A y B respectivamente; p<0,05, ensayo de t de Student para muestras no relacionadas). No se observó ninguna diferencia significativa para AM entre grupos (FIG. 41C, p> 0,05, ensayo de t de Student para muestras no relacionadas).
Estos resultados sugieren que los anticuerpos anti CGRP pueden ser útiles para prevenir o aliviar la vejiga hiperactiva, mejorar la incontinencia urinaria y tratamiento de afecciones urinarias relacionadas.
Ejemplo 9 Alivio de dolor neuropático en ratas
El daño a los nervios periféricos conduce con frecuencia a dolor referido crónico que es de origen neuropático. Este síndrome de dolor consiste en sensibilidad a estímulos externos (por ejemplo, mecánicos y/o térmicos) que no son normalmente nocivos. En consecuencia, el dolor neuropático es refractario para enfoques analgésicos tradicionales, haciéndolo difícil de tratar. Experimentalmente, el dolor neuropático puede modelarse en animales mediante traumatismo quirúrgico a nervios periféricos. El modelo de Chung es uno de dichos sistemas donde el dolor neuropático es inducido por ligamiento de los nervios espinales de L5 y L6.
En este ejemplo, se realizó un ligamiento de nervios espinales en ratas Sprague Dawley macho. Se ensayaron para determinar la sensibilidad al dolor el día 13 (confirmación de alodinia) y después otra vez tras cada administración de Ab2 usando el ensayo de von Frey de alodinia mecánica para evaluar posible actividad antialodínica.
Métodos
Se desempaquetaron ratas Sprague Dawley macho (Harlan Laboratories) que pesaban 200-225 g a su llegada, y se colocaron en jaulas. Se realizó una inspección sanitaria visual sobre cada animal para incluir la evaluación del pelaje, las extremidades y los orificios. Cada animal también se examinó para determinar cualquier señal anómala de postura o movimiento. Se descubrió que todos los animales tenían buena salud y se colocaron en el estudio. Las ratas se aclimataron durante un mínimo de dos días antes del inicio de los procedimientos experimentales, con la excepción de los pesos corporales de aleatorización que se recogieron el día siguiente después de la llegada. Los animales se alojaron individualmente en jaulas convencionales de policarbonato transparente o jaulas microaislantes de policarbonato transparente con lecho de contacto irradiado certificado. Se proporcionaron alimentos y agua a voluntad. Los controles ambientales se ajustaron para mantener las temperaturas de 18 ° a 26 °C (de 64 ° a 79 °F) con una humedad relativa de 30 % a 70 %. Se mantuvo un ciclo de luz:oscuridad de 12:12 horas.
Las ratas se ensayaron para determinar el umbral basal usando los filamentos de von Frey los días -4 o -1 de aclimatación.
El día 0, los animales se sometieron a un procedimiento de ligamiento de nervios espinales. Todas las cirugías se realizaron en condiciones asépticas. Antes de las cirugías, las ratas se anestesiaron. La región de la espalda se afeitó y se preparó para cirugía aséptica. Las ratas se colocaron en decúbito prono y se realizó una incisión justo a la izquierda de la línea media en la región L4 - S2. Los músculos paraespinales izquierdos se separaron de las apófisis espinosas (L4 - S2). La articulación facetaria L6-S1 se cortó y la apófisis transversa se recortó ligeramente para proporcionar espacio para acceder al nervio espinal L4 y L5. Los nervios espinales L5 y L6 izquierdos se aislaron y ligaron con suturas de seda de 6,0. La incisión se cerró después con material de sutura apropiado y grapas de heridas cutáneas. Después de la operación, se administró solución de Ringer con lactato (3,0 - 5,0 ml) mediante inyección subcutánea a los animales.
Todos los animales en los Grupos 1 y 2 recibieron un ensayo de von Frey los días -4 o -1, 13, 14 y 17. La medición el día 13 se tomó antes de la dosis. El ensayo de von Frey para alodinia mecánica evalúa las propiedades antinociceptivas de compuestos analgésicos. En este ensayo, los animales se habituaron en primer lugar a la cámara de ensayo de modo que estuvieran lo suficientemente calmados para que se evaluara su umbral del dolor. Un especialista clínico desconocedor de los grupos de tratamiento aplicó una ligera presión a la pata trasera izquierda de la rata usando una serie de filamentos de nailon calibrados (filamentos de von Frey) de diámetro en aumento. Los filamentos se presionaron perpendicularmente contra la superficie ventral de la pata hasta que se doblaron. Cuando se consideran dolorosos, la rata responde retirando la pata. La alodinia umbral se determinó usando el método de arriba abajo de Chaplan (Chaplan et al., J Neurosci Methods, 53:55-63, 1994), que proporciona la fuerza precisa para la retirada para cada rata usando una escala psicofísica de ensayo.
Los animales se asignaron a dos grupos de tratamiento el día 13, basándose en puntuaciones de von Frey. Cualquier animal que tuviera una puntuación de von Frey mayor de 6 g se excluyó del estudio. Las puntuaciones de von Frey medias para cada grupo se revisaron para asegurar que los valores medios y la desviación típica satisfacían la hipótesis de homogeneidad. Se administraron dosis mediante inyección IP una vez el día 13 (13 días después de la cirugía) para el Grupo 1 (Ab2) y el Grupo 2 (anticuerpo de control negativo) (11 animales en cada grupo; Se administraron anticuerpos Ab2 y de control negativo a 10 mg/kg). El grupo 1 recibió una inyección de embolada IV adicional (sin anestesiar) de Ab2 en día 17 antes del ensayo conductual.
Se tomaron muestras de sangre para plasma en día 17 para el grupo 1 y se analizaron para determinar el título de Ab2.
Aparte de las observaciones de sitio quirúrgico esperadas y arrastre de pata asociado con la cirugía de Chung, no se documentaron observaciones anómalas. El tratamiento no pareció tener ningún efecto adverso en la salud general del animal ni alteró el aumento de peso normal esperado en ratas de esta edad.
Resultados
Todos los animales que se sometieron a ensayo basal antes de la cirugía el día 0 tuvieron una puntuación de von Frey de 15 (no mostrado) lo que indica sensibilidad normal. El día 13 (antes de la administración de anticuerpo), todos los animales tenían puntuaciones de von Frey menores de 6 g lo que indica que se ha desarrollado sensibilidad a estímulos mecánicos externos, excepto por dos animales que se retiraron del estudio. Las puntuaciones de von Frey promedio el día 13 fueron de menos de 3 g (FIG. 42, grupo izquierdo de barras). Después del ensayo el día 13, se administró a los animales Ab2 o un anticuerpo de control negativo (10 mg/kg). En los días 14 y 17, se ensayaron de nuevo puntuaciones de von Frey y estas fueron mayores en los animales tratados con Ab2 que los controles (FIG. 42, grupo medio de barras y grupo derecho de barras, respectivamente).
Estos resultados indican que el tratamiento con un anticuerpo anti CGRP tal como Ab2 puede ayudar a prevenir o aliviar el dolor neuropático.
Ejemplo 10 Primer experimento que evalúa el efecto de la administración de anticuerpo anti CGRP en la analgesia (modelo de retirada de la cola)
Se realizaron tres experimentos diferentes (Ejemplos 10-12) para evaluar la eficacia potencial de la administración de un anticuerpo anti CGRP sobre la analgesia o el dolor. En todos estos experimentos se usó un modelo de respuesta de retirada de la cola de roedor (también denominada retracción de la cola) ya que la respuesta de retirada de la cola de roedor a calor radiante es un modelo usado habitualmente para detectar agentes analgésicos potencialmente útiles. Este ensayo es particularmente útil para diferenciar entre analgésicos de tipo morfina de acción central (activos) y agentes antiinflamatorios de acción periférica o no opioides (inactivo). Este modelo animal y métodos y materiales usados en el mismo se describen a continuación.
Materiales y Métodos
Animales: Ratas macho procedentes de Sprague Dawley macho que pesan 150 ± 20 g.
Anticuerpo de CGRP de ensayo: Ab2
Vehículo: Histidina 15 mM Sorbitol 250 mM, pH 5,5
Compuesto analgésico: Morfina
Procedimientos de respuesta de retirada de la cola: El tiempo (segundos) necesario para inducir una respuesta de retirada de la cola inducida por calor radiante focalizado se midió como el umbral del dolor en grupos de 10 ratas macho procedentes de Sprague Dawley que pesaban 150 ± 20 g. El ensayo basal para la respuesta de retirada de la cola se realizó el día 0. Las ratas que tienen una respuesta de retirada de la cola de 3-5 segundos se incluyeron en el estudio y se asignaron a grupos de tratamiento equilibrados basándose en respuestas de retirada de la cola basales. Se usó un corte de 15 segundos para evitar el daño tisular.
Desarrollo de tolerancia a la morfina
Se administró a cada uno de 3 grupos de 10 ratas Sprague Dawley macho 2 x al día mediante administración i.p.
vehículo salino (2 ml/kg) por la mañana y por la tarde. Se administró además a uno de los 3 grupos i.p. analgésico (morfina) a una dosificación de 5 mg/kg 2 x al día durante 7 días consecutivos. Se administró a un segundo de los 3 grupos de ratas i.p. un anticuerpo anti CGRP (Ab2) a una dosificación de 10 mg/kg como una única embolada el día 0. Cada una de las ratas en los diferentes grupos se ensayaron después para determinar la respuesta de retirada de la cola una vez al día 30 min después de la dosis matinal.
Se aplica un ANOVA de una vía seguido de ensayo de t de Dunnett para comparación entre los grupos tratado con control de vehículo y compuesto de ensayo. P<0,05 se considera significativo.
Los resultados de estos experimentos se muestran en la Figura 43. Los resultados en la misma indican que el anticuerpo de CGRP de ensayo cuando se administra a 10 mg/kg indujo efecto analgésico de larga duración significativo a un estímulo de dolor térmico. Se tomaron muestras de sangre terminales de todas las ratas ensayadas mediante punción cardíaca y posteriormente se analizaron para determinar el título de Ab2.
Ejemplo 11: Segundo experimento de retirada de la cola que evalúa el efecto del anticuerpo de CGRP en la analgesia) (titulación de dosis de anticuerpo)
Se realizó un segundo conjunto de experimentos de retirada de la cola para evaluar los efectos de diferentes dosificaciones de anticuerpo anti CGRP en la analgesia usando un anticuerpo anti CGRP (Ab2). Las ratas usadas en estos experimentos son del mismo tipo que en el experimento previo y el protocolo de retirada de la cola sustancialmente igual. En este experimento se comparó la analgesia en diferentes grupos de animales a los que se administraron diferentes dosificaciones de anticuerpo anti CGRP para evaluar si la dosificación tiene un efecto en la analgesia. En el segundo conjunto de experimentos, se compararon cinco grupos de animales de ensayo de la siguiente manera. Se administró a cada uno de un primer grupo de control de animales el vehículo solo (histidina 15 mM sorbitol 250 mM, pH 5,5), se administró a cada uno de 3 grupos de animales dosificaciones del mismo anticuerpo anti CGRP contenido en el vehículo (Ab2, administrado respectivamente a dosificaciones de 1 mg/kg, 3 mg/kg o 10 mg/kg el día 0), y se administró a un quinto grupo de animales 10 mg/kg de un anticuerpo de control negativo (anticuerpo anti digitoxina) también el día 0.
Los protocolos de retirada de la cola se efectuaron sustancialmente de otro modo como se ha descrito anteriormente. Los resultados se evaluaron de nuevo usando ANOVA de una vía seguido de ensayo de t de Dunnett para comparación entre los grupos tratados con control de vehículo, anticuerpo de control negativo y anticuerpo de CGRP de ensayo. P<0,05 se considera significativo.
Los resultados de estos experimentos se muestran en la Figura 44. Puede verse a partir de los mismos que las dosificaciones de anticuerpo mayores del compuesto de ensayo (anticuerpo anti CGRP Ab2 de la invención) indujeron mejores efectos analgésicos que las dosificaciones menores. Como se ha anticipado el anticuerpo de control negativo no indujo un efecto perceptible en la analgesia en relación con los grupos de control.
Ejemplo 12: Tercer experimento de retirada de la cola que evalúa el efecto de la coadministración de anticuerpo anti CGRP/morfina en la analgesia
También se realizó un tercer conjunto de experimentos de retirada de la cola para evaluar los efectos de la coadministración de anticuerpo anti CGRP/morfina en la analgesia. En estos experimentos se administró a un primer grupo de animales el mismo vehículo solo a una dosificación de 5 ml/kg. Se administró a un segundo grupo de animales morfina los días 1-10 a una dosificación de 5 mg/kg, administrada dos veces al día, en donde también se administró a dichos animales el día 0 el anticuerpo anti CGRP Ab2 a una dosificación de 10 mg/kg. Se administró a un tercer grupo de animales morfina los días 1-4 a una concentración de dosificación de 5 mg/kg, administrada dos veces al día, y se le administró el además el anticuerpo Ab2 el día 0, a una dosificación de 10 mg/kg. Todas las administraciones fueron i.p.
Se efectuaron experimentos de retirada de la cola en cada uno de estos grupos de animales diariamente del día 0 al 10. Los resultados de estos experimentos de retirada de la cola se evaluaron de nuevo usando ANOVA de una vía seguido de ensayo de t de Dunnett para comparación entre el grupo tratado con control de vehículo, anticuerpo de control negativo y anticuerpo anti CGRP de ensayo. P<0,05 se considera significativo.
Los resultados de estas comparaciones se resumen en la Figura 45. Los animales tratados con Ab2 que recibieron una dosis diaria de morfina durante todo el experimento mostraron tolerancia a la morfina y después del día 5 el tiempo de retirada de la cola se había reducido casi hasta el nivel de animales de control tratados con vehículo. Por el contrario, en animales tratados con Ab2 que recibieron morfina solamente hasta el día 4, el tiempo de retirada de la cola mejoró el día 5 y permaneció mejorado hasta el día 8. Los resultados sugieren que la administración de un anticuerpo anti CGRP puede tener efectos analgésicos incluso después de la aparición de tolerancia a la morfina, que puede ser más pronunciada tras la retirada de la morfina.
Ejemplo 13 Alivio de dolor visceral en ratas
Los pacientes que padecen síndrome del intestino irritable (SII) demuestran un umbral sensorial visceral más bajo para la distensión de globo colorrectal (Ritchie, Gut, 1973, 14:125-32). Se ha sugerido que en SII hay una mayor sensibilidad al dolor del eje cerebro-intestino, con un patrón normal de activación. Se ha mostrado previamente que la inyección de ácido trinitrobencenosulfónico (TNBS) en el colon proximal provocó hipersensibilidad colónica crónica, medida en ratas conscientes por un umbral de dolor reducido en respuesta a distensión colónica (Diop et al., J. Pharmacol. Exp. Ther., 2002, 302:1013-22). Esta hipersensibilidad crónica se encontró en el colon distal no inflamado y persistió durante 21 días. Imitó determinadas características de SII y de este modo puede usarse como un modelo para explorar experimentalmente los aspectos patofisiológicos de este trastorno. Este ensayo se usa para determinar los efectos antihipertensivos potenciales de compuestos para hipersensibilidad colónica inducida por TNBS.
Varios estudios han implicado al CGRP en el dolor visceral (Friese et al., Regul Pept 1997;70:1-7; Gschossmann et al., Neurogastroenterol Motil 2001;13:229-36; Julia y Bueno, Am J Physiol 1997;272:G141-6; Plourde et al., Am J Physiol 1997;273:G191-6). CGRP es el péptido más abundante de fibras aferentes sensibles a capsaicina de origen gastrointestinal, representando hasta 80 % de la inmunorreactividad peptídica general (Clague et al., Neurosci Lett 1985;56:63-8; Sternini et al., Gastroenterology 1987;93:852-62). Adicionalmente, la inyección de CGRP induce hipersensibilidad colónica en un modelo de TNBS (Delafoy et al., 2006, Gut 55:940-5), que se invierte por un péptido antagonista de CGRP (CGRP 8-37).
Este ejemplo describe el ensayo de un anticuerpo anti CGRP en un modelo de dolor visceral (hipersensibilidad colónica crónica inducida por TNBS) en ratas.
Métodos
Se incluyeron en este estudio ratas Sprague-Dawley macho, que pesaban de 390 a 450 g el día de la cirugía. Estas se alojaron en una habitación con temperatura (19,5 °C - 24,5 °C) y humedad relativa (45 % - 65 %) controladas con un ciclo de luz/oscuridad de 12 h. Los animales se alojaron a 2 o 3 por jaula y se observó un periodo de aclimatación (al menos 5 días) antes del ensayo. Cada rata se identificó por marcas de la cola. El estudio se realizó según las directrices del Comité de Investigación y Aspectos Éticos de la I.A.S.P. (1983) y las directrices europeas 2010/63/UE.
Se indujo sensibilidad colónica por administración quirúrgica de ácido trinitrobencenosulfónico (TNBS, 50 mg/kg) 7 días antes del ensayo conductual. Se sometieron animales en ayunas (24 horas) a cirugía. En resumen, con anestesia (Acepromazina 5 mg/kg / Ketamina 30 mg/kg), se realizó inyección de TNBS (50 mg/kg, 1 ml/kg) en la parte proximal del colon (1 cm desde el ciego). Después de la cirugía, los animales se devolvieron a sus jaulas en un ambiente regulado y se alimentaron a voluntad hasta el día del ensayo, 7 días después. Se colocaron animales "sin tratamiento previo" (ratas sin cirugía) en las mismas condiciones de alojamiento.
Se administró a los animales el anticuerpo anti CGRP Ab2 o un anticuerpo de control negativo (ambos a 10 mg/kg) por vía intravenosa 24 horas antes de la determinación del umbral colónico. Se incluyeron tres grupos de ratas en este estudio:
Grupo 1: Un grupo "sin tratamiento previo" compuesto de animales que no se sometieron a cirugía o tratamiento con TNBS en D-7 y se trataron con el anticuerpo de control 24 horas antes (es decir D-1) del ensayo (es decir mediciones del umbral de distensión colónica en D0) (n=7).
Grupo 2: Un grupo de "TNBS" compuesto por animales que se sometieron a cirugía en D-7 y se trataron con anticuerpo de control (24 horas antes (es decir D-1) del ensayo (es decir mediciones del umbral de distensión colónica en D0) (n=8).
Grupo 3: Un grupo "tratado" compuesto de animales que se sometieron a cirugía en D-7 y se trataron con el Ab2 24 horas antes (es decir D-1) del día del ensayo (es decir mediciones del umbral de distensión colónica en D0) (n=8).
Siete días (D7) después de la inyección de TNBS, la sensibilidad colónica se evaluó midiendo la presión intracolónica necesaria para inducir una respuesta conductual durante la distensión colónica debida al inflado de un globo introducido en el colon. Los ensayos fueron realizados por un experimentador desconocedor del tratamiento. Esta respuesta se caracteriza por una elevación de la parte trasera del cuerpo del animal y una contracción abdominal claramente visible correspondiente a contracciones graves (Al Chaer et al., Gastroenterology 2000, 119:1276-1285) y se usó como un marcador del dolor (Bourdu et al., Gastroenterology. 2005:128, 1996-2008). El globo (5 cm) se insertó por vía intrarrectal de una manera mínimamente invasiva hasta 10 cm desde el ano de animales despiertos en ayunas (24 h) y el catéter se pegó con cinta a la base de la cola. Las ratas se colocaron después en la mitad de una caja de plexiglás y el catéter se conectó a un aparato barostático electrónico. Después de un periodo de aclimatación de 30 min con el globo insertado, la presión colónica se aumentó gradualmente en etapas de 5 mmHg cada 30 s desde 5 hasta 75 mmHg (punto de corte) hasta que se demostró comportamiento de dolor. Se realizaron cuatro determinaciones, 30 min, 50 min, 70 min y 90 min después de la inserción del globo. Usando los datos de cada ensayo, se calculó el porcentaje de actividad sobre la hipersensibilidad colónica inducida por la administración intracolónica de TNBS de la siguiente manera
(Porcentaje de a c t iv id a d )^ = - V-m--- b-ra--.1-- d-a-- d- is-- te-- n- s-- ió-- n- o-- ------ ^------- a-f-K- n-.-i-i.--U-- m--- ^-r-c-i- d--e-- d-L-!-f£---R--s-n-m--T-J-;-E-i x 10 G
Umbral de distensiónrratado es la media aritmética de los valores para el grupo "tratado"; Umbral de distensiónrN B s es la media aritmética de los valores para el grupo "TNBS"; y Umbral de distensiónsn tratamiento previo es la media aritmética de los valores para el grupo "sin tratamiento previo".
Resultados
Se ensayó la capacidad de un anticuerpo anti CGRP para aliviar el dolor visceral en un modelo de rata en el que se indujo hipersensibilidad colónica crónica mediante administración de TNBS. Se cuantificó el dolor visceral midiendo el umbral de distensión colónica, es decir, la cantidad de presión abdominal que los animales podrían tolerar antes de mostrar una respuesta conductual (contracción muscular). Los valores umbral de distensión colónica mayores indican menos sensibilidad. Como se esperaba, el tratamiento con TNBS dio como resultado una gran reducción del umbral de distensión colónica en comparación con animales sin tratamiento previo (FIG. 46, compárese barra media (tratado con TNBS) y barra izquierda (sin tratamiento previo)). La administración de Ab2 mejoró el umbral de distensión colónica en comparación con animales de control (FIG. 46, compárese barra derecha (tratado con Ab2) y barra media (control)). La mejora de la administración de Ab2 fue estadísticamente significativa (p < 0,05 ensayo de t de Student, comparación con TNBS grupo de control negativo). Se calculó que la actividad antihipersensible de Ab2 era 27 % (indicativo del grado de alivio de la hipersensibilidad inducida por TNBS).
Estos resultados sugieren que los anticuerpos anti CGRP pueden ser útiles para prevenir o aliviar el dolor visceral.

Claims (14)

REIVINDICACIONES
1. Método para producir un anticuerpo anti CGRP, método que comprende expresar los polinucleótidos de las secuencias SEQ ID NO:192 y SEQ ID NO:194 en células de levadura o en células de mamífero.
2. El método de la reivindicación 1, en el que las células de levadura son células de Pichia, y las células de mamífero son células CHO, NSO o HEK293.
3. El método de una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que las células de levadura son células de Pichia pastoris.
4. El método de una cualquiera de la reivindicación 1 o la reivindicación 2, en el que las células de mamífero son células CHO.
5. El método de una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que los polinucleótidos se incorporan en un vector de expresión.
6. El método de una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que
el vector es un plásmido o un vector viral recombinante.
7. El método de una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, que además comprende purificar el anticuerpo.
8. El método de la reivindicación 7, en el que purificar el anticuerpo comprende filtración en flujo cruzado, precipitación con sulfato de amonio o cromatografía de columna de afinidad.
9. El método de una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, método que además comprende formular dicho anticuerpo en una composición farmacéutica.
10. El método de la reivindicación 9, en el que la composición farmacéutica comprende un vehículo farmacéuticamente aceptable y opcionalmente al menos un estabilizador.
11. Un anticuerpo anti CGRP que se puede obtener mediante el método de una cualquiera de las reivindicaciones 1­ 8, o una composición farmacéutica que se puede obtener mediante el método de las reivindicaciones 9 o 10.
12. El anticuerpo anti CGRP o la composición farmacéutica de la reivindicación 11, para el uso en la mejora o reducción de los síntomas de, o en el tratamiento o prevención de la migraña o la cefalea.
13. El anticuerpo anti CGRP o la composición farmacéutica de la reivindicación 11, para el uso en el tratamiento agudo o profiláctico de la cefalea, incluyendo la migraña y cefalea en racimo.
14. El anticuerpo anti CGRP o la composición farmacéutica de la reivindicación 11, para el uso en el tratamiento agudo o profiláctico de la migraña.
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