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ES2715001T3 - Composiciones anti-CGRP y uso de las mismas - Google Patents

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ES2715001T3
ES2715001T3 ES12789693T ES12789693T ES2715001T3 ES 2715001 T3 ES2715001 T3 ES 2715001T3 ES 12789693 T ES12789693 T ES 12789693T ES 12789693 T ES12789693 T ES 12789693T ES 2715001 T3 ES2715001 T3 ES 2715001T3
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antibody
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ES12789693T
Other languages
English (en)
Inventor
Brian Robert Kovacevich
Leon F Garcia-Martinez
Katie Olson
Benjamin H Dutzar
Jens J Billgren
John A Latham
Danielle M Mitchell
Patricia Dianne Mcneill
Nicole M Janson
Maria-Cristina Loomis
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Alderbio Holdings LLC
Original Assignee
Alderbio Holdings LLC
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Publication date
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Abstract

Un anticuerpo anti CGRP humano que comprende un polipéptido de cadena ligera que tiene la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 52 y un polipéptido de cadena pesada que tiene la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 54.

Description

DESCRIPCION
Composiciones anti-CGRP y uso de las mismas
Antecedentes de la invencion
Campo de la invencion
La presente invencion se refiere a anticuerpos que tienen especificidad de union con peptido relacionado con el gen de la calcitonina (en lo sucesivo en el presente documento "CGRP") humano. La invencion tambien se refiere a metodos de exploracion para enfermedades y trastornos asociados con CGRP y los anticuerpos para su uso en metodos de prevencion o tratamiento de enfermedades y trastornos asociados con CGRP administrando dichos anticuerpos o fragmentos de los mismos.
Descripcion de la tecnica relacionada
El peptido relacionado con el gen de la calcitonina (CGRP) se produce como un neuropeptido multifuncional de 37 aminoacidos de longitud. En seres humanos existen dos formas de CGRP, las formas CGRP-alfa y CGRP-beta, y tienen actividades similares. CGRP-alfa y CGRP-beta difieren en tres aminoacidos en seres humanos y proceden de diferentes genes. La familia de peptidos de CGRP incluye amilina, adrenomedulina y calcitonina, aunque cada una tiene distintos receptores y actividades biologicas. Doods, H., Curr. Op. Invest. Drugs, 2(9):1261-68 (2001).
CGRP se libera de numerosos tejidos tales como nervios del trigemino, que cuando se activan liberan neuropeptidos en las meninges, mediando en la inflamacion neurogenica que se caracteriza por vasodilatacion, filtracion de los vasos y degradacion de mastocitos. Durham, P.L., New Eng. J. Med., 350 (11):1073-75 (2004). Los efectos biologicos de CGRP estan mediados mediante el receptor de CGRP (CGRP-R), que consiste en un componente de siete dominios transmembrana, junto con la protema de membrana asociada a receptor (RAMP). CGRP-R requiere ademas la actividad de la protema componente del receptor (RCP), que es esencial para un acoplamiento eficaz con adenilato ciclasa a traves de protemas G y la produccion de AMPc. Doods, H., Curr. Op. Invest. Drugs, 2(9):1261-68 (2001).
Las migranas son un trastorno neurovascular que afecta a aproximadamente 10% de la poblacion adulta de los Estados Unidos, y estan acompanadas habitualmente de cefaleas intensas. Aproximadamente 20-30 % de las personas aquejadas de migranas experimentan aura, que comprende fenomenos neurologicos focales que preceden y/o acompanan al acontecimiento. Se cree que CGRP desempena un papel prominente en el desarrollo de migranas. Por ejemplo, las concentraciones en plasma de CGRP se identificaron elevadas en sangre venosa yugular durante la fase de cefalea de las migranas, en exclusion de otros neuropeptidos. Por otra parte, segun Arulmozhi et al, se ha identificado lo siguiente en personas aquejadas de migranas: (1) una fuerte correlacion entre las concentraciones de CGRP en plasma y las migranas; (2) la infusion de CGRP produjo una cefalea de tipo migrana; (3) los niveles basales de CGRP estuvieron elevados; y (4) cambios en los niveles de CGRP en plasma durante los ataques de migrana se correlacionaron significativamente con la intensidad de la cefalea. Arulmozhi, D.K., et al., Vas. Pharma., 43: 176-187 (2005).
Un tratamiento eficaz para las migranas es la administracion de triptanos, que son una familia de farmacos basados en triptamina, incluyendo sumatriptan y rizatriptan. Los miembros de esta familia tienen una afinidad por multiples receptores de serotonina, incluyendo 5-HT-m, 5-HT-id y 5-HT-if. Los miembros de esta familia de farmacos constrinen de forma selectiva los vasos cerebrales, pero tambien provocan efectos vasoconstrictivos en vasos coronarios. Durham, P.L., New Eng. J. Med., 350 (11):1073-75 (2004). Existe un riesgo teorico de espasmo coronario en pacientes con enfermedad cardfaca establecida despues de la administracion, y pueden producirse con poca frecuencia acontecimientos cardfacos despues de tomar triptanos. Se ha observado que esta contraindicado para pacientes con enfermedad vascular coronaria.
De forma similar, el dolor puede abordarse con frecuencia mediante la administracion de determinados narcoticos o farmacos antiinflamatorios no esteroideos (AINE). Sin embargo, la administracion de estos tratamientos puede realizarse a costa de determinadas consecuencias negativas. Los AINE tienen el potencial de provocar insuficiencia renal, hemorragia intestinal y disfuncion hepatica. Los narcoticos tienen el potencial de provocar nauseas, vomitos, alteracion de la actividad mental y adiccion. Por lo tanto, es deseable identificar tratamientos alternativos para el dolor para evitar algunas de estas consecuencias negativas.
Se cree que CGRP desempena un papel en una multitud de enfermedades y trastornos, incluyendo, pero sin limitacion, migranas, cefaleas y dolor.
Por ejemplo, se ha indicado que CGRP puede correlacionarse con o incluso desempenar un papel causal en la vejiga hiperactiva. Las pruebas de que CGRP puede correlacionarse con la afeccion de vejiga hiperactiva incluyen el hecho de que CGRP esta presente en el tracto urinario, GRD y la medula espinal - (Wharton et al., 1986 Neurosci (3):727) y tambien que los aferentes de fibras C son cnticos para portar impulsos implicados en la miccion a la medula espinal (Yoshida et al., 2011 J Pharmacol Sci (112):128). Ademas, se ha indicado que la administracion intravesical de Botox suprime CGRP y reduce significativamente el intervalo entre contracciones en el modelo de dolor de vejiga inducido por acido acetico (Chuang et al., 2004 J Urol (172):1529; Chuang et al., 2009 J Urol (182):786).
Una prueba de que CGRP puede desempenar un papel causal en esta afeccion es una solicitud de patente publicada reciente que contiene datos que supuestamente sugieren que un Ab anti-CGRP desvelado en la misma redujo el numero de contracciones de la vejiga en un modelo de vejiga hiperactiva inducida por aguarras (Pfizer, documento WO 2011/024113).
El documento WO 2007/076336 A1 desvela el tratamiento de la migrana con anticuerpos anti-CGRP. El documento WO 2007/054809 A2 desvela anticuerpos antagonistas dirigidos contra el peptido relacionado con el gen de la calcitonina y metodos que los usan. El documento WO2009109911 A1 desvela metodos para tratar el dolor cronico. El documento WO 2009/109908 A1 desvela metodos para tratar el dolor inflamatorio. Zeller et al., desvela que anticuerpo de bloqueo de funcion de CGRP inhiben la vasodilatacion neurogenica sin afectar a la frecuencia cardfaca o la tension arterial (British Journal of Pharmacology, vol. 155, 8 de septiembre de 2008, paginas 1093­ 1103).
Debido a la implicacion percibida de CGRP en estos y otros trastornos, sigue existiendo la necesidad en la tecnica de composiciones y metodos utiles para prevenir o tratar enfermedades y trastornos asociados con CGRP, evitando al mismo tiempo efectos secundarios adversos. Sigue existiendo la necesidad en la tecnica de composiciones o metodos que reduzcan o inhiban enfermedades o trastornos asociados con CGRP, tales como migranas, cefaleas, vejiga hiperactiva y dolor.
Breve sumario de la invencion
La presente invencion proporciona un anticuerpo anti-CGRP humano segun una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5. La presente invencion tambien proporciona una composicion farmaceutica o de diagnostico como se describe en la reivindicacion 15.
La presente invencion proporciona ademas: una secuencia de acido nucleico o secuencias de acido nucleico segun la reivindicacion 6; un vector segun la reivindicacion 7; y una celula cultivada o recombinante segun la reivindicacion 8. Ademas, la presente invencion proporciona en la reivindicacion 14 un metodo para realizar el anticuerpo de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5.
La presente invencion proporciona ademas un anticuerpo anti-CGRP humano de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5 para su uso segun las reivindicaciones 9 a 12 y 16.
Ademas la presente invencion proporciona un metodo de captura de imagenes in vivo segun la reivindicacion 13. La invencion tambien contempla conjugados de anticuerpos anti-CGRP conjugados con uno o mas restos funcionales o detectables.
Las realizaciones de la invencion se refieren a los anticuerpos anti-CGRP para su uso en el diagnostico, la evaluacion y el tratamiento de enfermedades y trastornos asociados con CGRP o expresion aberrante del mismo. Otras realizaciones de la invencion se refieren a la produccion de anticuerpos anti-CGRP o fragmentos de los mismos en celulas hospedadoras recombinantes, por ejemplo celulas de mairnfero tales como celulas CHO, NSO o HEK 293, o celulas de levadura (por ejemplo levadura diploide tal como Pichia diploide) y otras cepas de levadura.
Breve descripcion de las diversas vistas de los dibujos
La Figura 1 proporciona secuencias polinucleotidicas y polipeptfdicas correspondientes al anticuerpo de longitud completa Ab1.
La Figura 2 proporciona secuencias polinucleotfdicas y polipeptfdicas correspondientes al anticuerpo de longitud completa Ab2.
La Figura 3 proporciona secuencias polinucleotfdicas y polipeptfdicas correspondientes al anticuerpo de longitud completa Ab3.
La Figura 4 proporciona secuencias polinucleotfdicas y polipeptfdicas correspondientes al anticuerpo de longitud completa Ab4.
La Figura 5 proporciona secuencias polinucleotfdicas y polipeptfdicas correspondientes al anticuerpo de longitud completa Ab5.
La Figura 6 proporciona secuencias polinucleotfdicas y polipeptfdicas correspondientes al anticuerpo de longitud completa Ab6.
La Figura 7 proporciona secuencias polinucleotfdicas y polipeptfdicas correspondientes al anticuerpo de longitud completa Ab7.
La Figura 8 proporciona secuencias polinucleotfdicas y polipeptfdicas correspondientes al anticuerpo de longitud completa Ab8.
La Figura 9 proporciona secuencias polinucleotidicas y polipeptidicas correspondientes al anticuerpo de longitud completa Ab9.
La Figura 10 proporciona secuencias polinucleotfdicas y polipeptidicas correspondientes al anticuerpo de longitud completa Ab10.
La Figura 11 proporciona secuencias polinucleotfdicas y polipeptidicas correspondientes al anticuerpo de longitud completa Ab11.
La Figura 12 proporciona secuencias polinucleotfdicas y polipeptfdicas correspondientes al anticuerpo de longitud completa Ab12.
La Figura 13 proporciona secuencias polinucleotfdicas y polipeptfdicas correspondientes al anticuerpo de longitud completa Ab13.
La Figura 14 proporciona secuencias polinucleotfdicas y polipeptfdicas correspondientes al anticuerpo de longitud completa Ab14.
La Figura 15 proporciona los datos de union de ELISA de CGRP-alfa obtenidos siguiendo el protocolo del Ejemplo 1 posterior para los anticuerpos Ab1, Ab2, Ab3 y Ab4.
La Figura 16 proporciona los datos de union de ELlSA de CGRP-alfa obtenidos siguiendo el protocolo del Ejemplo 1 posterior para los anticuerpos Ab5, Ab6, Ab7 y Ab8.
La Figura 17 proporciona los datos de union de ELlSA de CGRP-alfa obtenidos siguiendo el protocolo del Ejemplo 1 posterior para los anticuerpos Ab9, Ab10 y Ab14.
La Figura 18 proporciona los datos de union de ELISA de CGRP-alfa obtenidos siguiendo el protocolo del Ejemplo 1 posterior para los anticuerpos Ab11, Ab12 y Ab13.
La Figura 19 demuestra la inhibicion de la produccion de AMPc conducida por CGRP-alfa por los anticuerpos Ab1, Ab2 y Ab4, obtenidos siguiendo el protocolo del Ejemplo 1 posterior.
La Figura 20 demuestra la inhibicion de la produccion de AMPc conducida por CGRP-alfa por el anticuerpo Ab3, obtenido siguiendo el protocolo del Ejemplo 1 posterior.
La Figura 21 demuestra la inhibicion de la produccion de AMPc conducida por CGRP-alfa por los anticuerpos Ab5 y Ab6, obtenidos
siguiendo el protocolo del Ejemplo 1 posterior.
La Figura 22 demuestra la inhibicion de la produccion de AMPc conducida por CGRP-alfa por los anticuerpos Ab7, Ab8, Ab9 y Ab10, obtenidos siguiendo el protocolo del Ejemplo 1 posterior.
La Figura 23 demuestra la inhibicion de la produccion de AMPc conducida por CGRP-alfa por los anticuerpos Ab11, Ab12 y Abl3, obtenidos siguiendo el protocolo del Ejemplo 1 posterior.
La Figura 24 demuestra la inhibicion de la produccion de AMPc conducida por CGRP-alfa por el anticuerpo Abl4, obtenido siguiendo el protocolo del Ejemplo 1 posterior.
La Figura 25 demuestra la inhibicion de la produccion de AMPc conducida por CGRP-beta por los anticuerpos Ab1, Ab2 y Ab3, obtenidos siguiendo el protocolo del Ejemplo 1 posterior.
La Figura 26 demuestra la inhibicion de la produccion de AMPc conducida por CGRP-beta por los anticuerpos Ab4, Ab5 y Ab6, obtenidos siguiendo el protocolo del Ejemplo 1 posterior.
La Figura 27 demuestra la inhibicion de la produccion de AMPc conducida por CGRP-beta por los anticuerpos Ab7 y Ab8 obtenidos siguiendo el protocolo del Ejemplo 1 posterior.
La Figura 28 demuestra la inhibicion de la produccion de AMPc conducida por CGRP-beta por los anticuerpos Ab9, Ab10 y Abl4, obtenidos siguiendo el protocolo del Ejemplo 1 posterior.
La Figura 29 demuestra la inhibicion de la produccion de AMPc conducida por CGRP-beta por los anticuerpos Ab11, Ab12 y Abl3, obtenidos siguiendo el protocolo del Ejemplo 1 posterior.
La Figura 30 demuestra la inhibicion de la produccion de AMPc conducida por CGRP de rata por los anticuerpos Ab1, Ab2, Ab4 y Ab5, obtenidos siguiendo el protocolo del Ejemplo 1 posterior.
La Figura 31 demuestra la inhibicion de la produccion de AMPc conducida por CGRP de rata por los anticuerpos Ab3 y Ab6 obtenidos siguiendo el protocolo del Ejemplo 1 posterior.
La Figura 32 demuestra la inhibicion de la produccion de AMPc conducida por CGRP de rata por los anticuerpos Ab7 y Ab8 obtenidos siguiendo el protocolo del Ejemplo 1 posterior.
La Figura 33 demuestra la inhibicion de la produccion de AMPc conducida por CGRP de rata por el anticuerpo Ab9, obtenido siguiendo el protocolo del Ejemplo 1 posterior.
La Figura 34 demuestra la inhibicion de la produccion de AMPc conducida por CGRP de rata por el anticuerpo Ab10, obtenido siguiendo el protocolo del Ejemplo 1 posterior.
La Figura 35 demuestra la inhibicion de la produccion de AMPc conducida por CGRP de rata por los anticuerpos Ab11 y Ab12 obtenidos siguiendo el protocolo del Ejemplo 1 posterior.
La Figura 36 demuestra la inhibicion de la produccion de AMPc conducida por CGRP de rata por el anticuerpo Ab13, obtenido siguiendo el protocolo del Ejemplo 1 posterior.
La Figura 37 demuestra la inhibicion de la produccion de AMPc conducida por CGRP de rata por el anticuerpo Abl4, obtenido siguiendo el protocolo del Ejemplo 1 posterior.
La Figura 38 demuestra la inhibicion de la union de CGRP radiomarcada con CGRP-R por los anticuerpos Ab1-Ab13, obtenido siguiendo el protocolo del Ejemplo 6 posterior.
La Figura 39 demuestra una reduccion de la vasodilatacion obtenida administrando los anticuerpos Ab3 y Ab6 despues de la administracion de capsaicina en un modelo de rata, en relacion con un anticuerpo de control, obtenido siguiendo el protocolo del Ejemplo 7 posterior.
La Figura 40 demuestra una reduccion de la vasodilatacion obtenida administrando el anticuerpo Ab6 a diferentes concentraciones despues de la administracion de capsaicina en un modelo de rata, en relacion con un anticuerpo de control, obtenido siguiendo el protocolo del Ejemplo 7 posterior.
La FIG. 41A-C muestra el efecto beneficioso de Ab3 en la capacidad de la vejiga durante infusion de solucion salina. Se administro a los animales Ab3 o un anticuerpo de control negativo y despues se supervisaron durante la infusion de solucion salina a la vejiga. IEC (panel A) aumento y FM (panel B) se redujo, lo que indica aumento de la capacidad de la vejiga. Las diferencias en AM (panel C) estuvieron dentro de la desviacion tfpica y no fueron estadfsticamente significativas. Los asteriscos indican mejora estadfsticamente significativa (p < 0,05 ensayo de t de Student para muestras no relacionadas, comparacion con Ab de control negativo). Leyenda: barras rellenas: tratado con Ab3 (10 mg/kg); barras vadas: anticuerpo de control negativo (10 mg/kg). Las barras de error indican la desviacion tfpica. Abreviaturas: IEC: intervalo entre contracciones; FM: Frecuencia de miccion; AM: Amplitud de miccion.
La FIG. 42 muestra el efecto de Ab2 en un modelo de dolor neuropatico. Se indujo alodinia mecanica mediante cirugfa de Chung (ligamiento del nervio espinal L5/l6), y se comparo el grado de sensibilidad entre animales tratados con Ab2 (barras sombreadas) y animales de control (barras rellenas). Los valores mayores indican menos sensibilidad. La sensibilidad promedio fue similar el dfa 13 (antes de la administracion de Ab2) pero mejoro los dfas 14 y 17. Las barras de error indican el error tfpico de la media. La FIG. 43 muestra el efecto analgesico de Ab2 y morfina. La sensibilidad al dolor se evaluo por el tiempo de retirada de la cola (eje y, segundos) para animales a los que se administro morfina (cuadrados vados), Ab2 (10 mg/kg, triangulos rellenos) o vehnculo (control negativo, drculos vados). Los animales desarrollaron tolerancia a la morfina y mostraron tiempos de retirada de la cola similares a animales de control el dfa 4. Por el contrario, los animales tratados con Ab2 mostraron una mejora sostenida de tiempo de retirada de la cola a lo largo del transcurso del experimento (hasta el dfa 7). La mejora de los animales tratados con Ab2 fue estadfsticamente significativa (p < 0,05 ANOVA de una via seguido de ensayo de Dunnett, comparacion con vehnculo, indicado por asteriscos). Las barras de error indican el error tfpico de la media.
La FIG. 44 muestra el efecto analgesico dependiente de la dosificacion de Ab2. El dfa 0 (despues del primer ensayo de tiempo de retirada de la cola), se administro a las ratas anticuerpo Ab2 a una dosificacion de 1 mg/kg (cuadrados rellenos), 3 mg/kg (triangulos invertidos rellenos) o 10 mg/kg (triangulos hacia arriba rellenos) o un vefnculo (drculos vados) o anticuerpo de control negativo (cuadrados vados). El tiempo de retirada de la cola de ratas en respuesta a un estfmulo termico doloroso se evaluo diariamente (tiempos mayores indican insensibilidad relativa al dolor). El tiempo de retirada de la cola aumento de una manera dependiente de la dosificacion por la administracion de Ab2. Los asteriscos indican aumentos estadfsticamente significativos del tiempo de retirada de la cola (p < 0,05 ANOVA de una via seguido de ensayo de Dunnett, en comparacion con vefnculo). Las barras de error indican el error tfpico de la media. La FIG. 45 muestra el efecto analgesico de Ab2 en combinacion con morfina, y cuando se retira la morfina despues de la aparicion de tolerancia a la morfina. El dfa 0 (despues del primer ensayo de tiempo de retirada de la cola), se administro a las ratas anticuerpo Ab2 a una dosificacion de 10 mg/kg (cuadrados rellenos y triangulos rellenos) o vefnculo (drculos vados). Se administro despues a las ratas diariamente morfina administrada los dfas 1 a 10 (cuadrados rellenos) o solamente los dfas 1 a 4 (triangulos rellenos). El tiempo de retirada de la cola aumento inicialmente mucho en los ratones tratados con morfina, pero se redujo los dfas posteriores lo que indica tolerancia a la morfina. Sin embargo, en los ratones de los que se retiro la morfina despues del dfa 4 el tiempo de retirada de la cola aumento y permanecio elevado entre los dfas 5 y 8. Las barras de error indican el error tfpico de la media. La FIG. 46 muestra el efecto de Ab2 en un modelo de rata de dolor visceral. El dolor visceral se cuantifico midiendo el umbral de distension colonica (valores mayores indican menos sensibilidad) para animales sin tratamiento previo (barra vada) o animales tratados con TNBS para provocar hipersensibilidad colonica cronica que recibieron un anticuerpo de control negativo (barras rellenas) o Ab2 (barras sombreadas). La hipersensibilidad se alivio en 27 % por los animales tratados con Ab2 y el umbral de distension mejoro significativamente por la administracion de Ab2 (p < 0,05 ensayo de t de Student, comparacion con TNBS grupo de control negativo). Las barras de error indican el error tfpico de la media.
Descripcion detallada de las realizaciones preferidas
Definiciones
Debe entenderse que esta invencion no esta limitada a la metodologfa particular, protocolos, lmeas celulares, especies o generos animales y reactivos descritos, ya que tales pueden variar. Tambien debe entenderse que la terminologfa usada en el presente documento tiene el fin de describir realizaciones particulares unicamente, y no se pretende que limite el alcance de la presente invencion que estara limitada unicamente por las reivindicaciones adjuntas. Como se utiliza en el presente documento, las formas singulares "un", "una" y "el/la" incluyen las referencias en plural a menos que el contexto dicte claramente lo contrario. Por tanto, por ejemplo, la referencia a "una celula" incluye una pluralidad de dichas celulas y la referencia a "la protema" incluye la referencia a una o mas protemas y equivalentes de las mismas conocidas por los expertos en la materia, y asf sucesivamente. Todos los terminos tecnicos y cientfficos utilizados en el presente documento tienen el mismo significado que entiende habitualmente un experto habitual en la materia a la que pertenece la presente invencion, a menos que se indique claramente otra cosa.
Peptido relacionado con el gen de la calcitonina (CGRP): Como se usa en el presente documento, CGRP abarca no solamente las siguientes secuencias de aminoacidos de CGRP-alfa de Homo sapiens y CGRP-beta de Homo sapiens disponibles de American Peptides (Sunnyvale CA) y Bachem (Torrance, CA): CGRP-alfa: ACDTATCVTHRLAGLLSRSGGVVKNNFVPTNVGSKAF-NH2 (SEQ ID NO: 281), en donde la fenilalanina N-terminal esta amidada; CGRP-beta: ACNTATCVTHRLAGLLSRSGGMVKSNFVPTNVGSKAF-NH2 (SEQ ID NO: 282), en donde la fenilalanina N-terminal esta amidada; pero tambien cualquier forma unida a membrana de estas secuencias de aminoacidos de CGRP, asf como mutantes (mutiens), variantes de corte y empalme, isoformas, ortologos, homologos y variantes de esta secuencia.
Especies de levadura competentes para apareamiento: En la presente invencion se pretende que esto abarque en general cualquier levadura diploide o tetraploide que pueda hacerse crecer en cultivo. Dichas especies de levadura pueden existir en una forma haploide, diploide u otra poliploide. Las celulas de una ploidfa dada pueden proliferar, en condiciones apropiadas, durante un numero indefinido de generaciones en esa forma. Las celulas diploides tambien pueden esporular para formar celulas haploides. El apareamiento secuencial puede dar como resultado cepas tetraploides mediante apareamiento adicional o fusion de cepas diploides. La presente invencion contempla el uso de levadura haploide, asf como celulas de levadura diploides u otras poliploides producidas, por ejemplo, por apareamiento o fusion de esferoplastos.
En una realizacion de la invencion, la levadura competente para apareamiento es un miembro de la familia Saccharomycetaceae, que incluye los generos Arxiozyma; Ascobotryozyma; Citeromyces; Debaryomyces; Dekkera; Eremothecium; Issatchenkia; Kazachstania; Kluyveromyces; Kodamaea; Lodderomyces; Pachysolen; Pichia; Saccharomyces; Saturnispora; Tetrapisispora; Torulaspora; Williopsis; y Zygosaccharomyces. Otros tipos de levadura potencialmente utiles en la invencion incluyen Yarrowia; Rhodosporidium; Candida; Hansenula; Filobasium; Sporidiobolus; Bullera; Leucosporidium y Filobasidella.
En una realizacion preferida de la invencion, la levadura competente para apareamiento es un miembro del genero Pichia. En una realizacion preferida adicional de la invencion, la levadura competente para apareamiento del genero Pichia es una de las siguientes especies: Pichia pastoris, Pichia methanolica, y Hansenula polymorpha (Pichia angusta). En una realizacion particularmente preferida de la invencion, la levadura competente para apareamiento del genero Pichia es la especie Pichia pastoris.
Celula de levadura haploide: Una celula que tiene una unica copia de cada gen de su complemento genomico (cromosomico) normal.
Celula de levadura poliploide: Una celula que tiene mas de una copia de su complemento genomico (cromosomico) normal.
Celula de levadura diploide: Una celula que tiene dos copias (alelos) de esencialmente todos los genes de su complemento genomico normal, habitualmente formada por el proceso de fusion (apareamiento) de dos celulas haploides.
Celula de levadura tetraploide: Una celula que tiene cuatro copias (alelos) de esencialmente todos los genes de su complemento genomico normal, habitualmente formada por el proceso de fusion (apareamiento) de dos celulas haploides. Los tetraploides pueden portar dos, tres, cuatro o mas casetes de expresion diferentes. Dichos tetraploides podnan obtenerse en S. cerevisiae mediante apareamiento selectivo de diploides heterotalicos homocigotos a/a y alfa/alfa y en Pichia mediante apareamiento secuencial de haploides para obtener diploides auxotroficos. Por ejemplo, un haploide [met his] puede aparearse con haploide [ade his] para obtener diploide [his]; y un haploide [met arg] puede aparearse con haploide [ade arg] para obtener diploide [arg]; despues el diploide [his] x diploide [arg] para obtener un prototrofo tetraploide. Los expertos en la materia entenderan que la referencia a los beneficios y usos de celulas diploides tambien puede aplicarse a celulas tetraploides.
Apareamiento de levadura: El proceso por el que dos celulas de levadura haploides se fusionan de forma natural para formar una celula de levadura diploide.
Meiosis: El proceso por el que una celula de levadura diploide experimenta division reductiva para formar cuatro productos de esporas haploides. Cada espora puede despues germinar y formar una lmea celular haploide que crece de forma vegetativa.
Marcador de seleccion: Un marcador de seleccion es un gen o fragmento genico que confiere un fenotipo de crecimiento (caractenstica de crecimiento ffsico) en una celula que recibe ese gen como, por ejemplo, mediante un acontecimiento de transformacion. El marcador de seleccion permite que esa celula sobreviva y crezca en un medio de cultivo selectivo en condiciones en las que las celulas que no reciben ese gen marcador de seleccion no pueden crecer. Los genes marcadores de seleccion se clasifican en general en varios tipos, incluyendo genes marcadores de seleccion tales como un gen que confiere en una celula resistencia a un antibiotico u otro farmaco, temperatura cuando se cruzan dos mutantes sensible a la temperatura ("st") o se transforma un mutante st; genes marcadores de seleccion negativos tales como un gen biosintetico que confiere en una celula la capacidad para crecer en un medio sin un nutriente espedfico necesario para todas las celulas que no tienen ese gen biosintetico, o un gen biosintetico mutado que confiere en una celula la incapacidad de crecer por celulas que no tienen el gen de tipo silvestre; y similares. Los marcadores adecuados incluyen, pero sin limitacion: ZEO; G418; LYS3; MET1; MET3a; ADE1; ADE3; URA3; y similares.
Vector de expresion: Estos vectores de ADN contienen elementos que facilitan la manipulacion para la expresion de una protema ajena en la celula hospedadora diana. De manera conveniente, la manipulacion de secuencias y produccion de ADN para transformacion se realiza en primer lugar en un hospedador bacteriano, por ejemplo E. coli, y habitualmente los vectores incluiran secuencias para facilitar dichas manipulaciones, incluyendo un origen de replicacion bacteriano y un marcador de seleccion bacteriano adecuado. Los marcadores de seleccion codifican protemas necesarias para la supervivencia o el crecimiento de celulas hospedadoras transformadas cultivadas en un medio de cultivo selectivo. Las celulas hospedadoras no transformadas con el vector que contiene el gen de seleccion no sobreviviran en el medio de cultivo. Los genes de seleccion tfpicos codifican protemas que (a) confieren resistencia a antibioticos u otras toxinas, (b) complementan deficiencias auxotroficas o (c) aportan nutrientes cnticos no disponibles de medios complejos. Se describen en la tecnica vectores y metodos ilustrativos para la transformacion de levaduras, por ejemplo, en Burke, D., Dawson, D., y Stearns, T. (2000). Methods in yeast genetics: a Cold Spring Harbor Laboratory course manual. Plainview, N.Y.: Cold Spring Harbor Laboratory Press. Los vectores de expresion para su uso en los metodos de la invencion incluiran secuencias espedficas de levadura, incluyendo un marcador auxotrofico o farmacologico de seleccion para identificar cepas de levadura transformadas. Un marcador farmacologico puede usarse adicionalmente para amplificar el numero de copias del vector en una celula hospedadora de levadura.
La secuencia codificante de polipeptido de interes esta unida operativamente a secuencias reguladoras de la transcripcion y la traduccion que posibilitan la expresion del polipeptido en celulas de levadura. Estos componentes de vectores pueden incluir, pero sin limitacion, uno o mas de los siguientes: un elemento potenciador, un promotor y una secuencia de terminacion de la transcripcion. Tambien pueden incluirse secuencias para la secrecion del polipeptido, por ejemplo una secuencia senal, y similares. Un origen de replicacion de levadura es opcional, ya que los vectores de expresion estan con frecuencia integrados en el genoma de levadura. En una realizacion de la invencion, el polipeptido de interes esta unido operativamente, o fusionado, con secuencias que posibilitan la secrecion optimizada del polipeptido a partir de celulas diploides de levadura.
Los acidos nucleicos estan "unidos operativamente" cuando se colocan en una relacion funcional con otra secuencia de acido nucleico. Por ejemplo, el ADN para una secuencia senal esta unido operativamente al ADN para un polipeptido si se expresa como una preprotema que participa en la secrecion del polipeptido; un promotor o potenciador esta unido operativamente a una secuencia codificante si afecta a la transcripcion de la secuencia. En general, “unido operativamente” significa que las secuencias de ADN que se unen son contiguas, y, en el caso de un lfder secretor, contiguas y en el marco de lectura. Sin embargo, no es necesario que los potenciadores sean contiguos. Se consigue union mediante ligamiento en sitios de restriccion convenientes o como alternativa mediante un metodo de PCR/recombinacion con el que estan familiarizados los expertos en la materia (GatewayR Technology; Invitrogen, Carlsbad California). Si tales sitios no existen, los adaptadores o conectores de oligonucleotidos sinteticos se utilizan de acuerdo con la practica convencional.
Los promotores son secuencias no traducidas localizadas cadena arriba (5') del codon de inicio de un gen estructural (en general a una distancia de 100 a 1000 pb) que controlan la transcripcion y traduccion de secuencias de acido nucleico particulares con las que estan unidas de forma operativa. Dichos promotores se clasifican en varias clases: promotores inducibles, constitutivos y reprimibles (que aumentan los niveles de transcripcion en respuesta a la ausencia de un represor). Los promotores inducibles pueden iniciar niveles aumentados de transcripcion de ADN bajo su control en respuesta a algun cambio en las condiciones de cultivo, por ejemplo, la presencia o ausencia de un nutriente o un cambio de temperatura.
El fragmento de promotor de levadura tambien puede actuar como el sitio para recombinacion homologa e integracion del vector de expresion en el mismo sitio en el genoma de levadura; como alternativa se usa un marcador de seleccion como el sitio para recombinacion homologa. Se describe la transformacion de Pichia en Cregg et al. (1985) Mol. Cell. Biol. 5:3376-3385.
Los ejemplos de promotores adecuados de Pichia incluyen el promotor de AOX1 (Cregg et al. (1989) Mol. Cell. Biol.
9:1316-l323); promotor de ICL1 (Menendez et al. (2003) Yeast 20(13):1097-108); promotor de gliceraldehfdo^-fosfato deshidrogenasa (GAP) (Waterham et al. (1997) Gene 186(1):37-44); y promotor de FLD1 (Shen et al. (1998) Gene 216(1):93-102). El promotor de GAP es un promotor constitutivo fuerte y los promotores de AOX y FLD1 son inducibles.
Otros promotores de levadura adicionales incluyen ADH1, alcohol deshidrogenasa II, GAL4, PHO3, PHO5, Pyk y promotores quimericos procedentes de los mismos. Adicionalmente, pueden usarse en la invencion promotores que no son de levadura tales como promotores de mairnferos, insectos, plantas, reptiles, anfibios, virus y aves. Mas habitualmente el promotor comprendera un promotor de mamffero (potencialmente endogeno para los genes expresados) o comprendera un promotor de levadura o vmco que posibilita la transcripcion eficaz en sistemas de levadura.
Los polipeptidos de interes pueden producirse de forma recombinante no solo directamente, sino tambien como un polipeptido de fusion con un polipeptido heterologo, por ejemplo, una secuencia senal u otro polipeptido que tiene un sitio de escision espedfico en el extremo N de la protema o el polipeptido maduro. En general, la secuencia senal puede ser un componente del vector, o puede ser una parte de la secuencia codificante de polipeptido que se inserta en el vector. La secuencia senal heterologa seleccionada preferentemente es una que se reconoce y procesa mediante una de las rutas convencionales disponibles en la celula hospedadora. Se ha demostrado que la senal prepro del factor alfa de S. cerevisiae es eficaz en la secrecion de una diversidad de protemas recombinantes de P. pastoris. Otras secuencias senal de levadura incluyen la secuencia senal de factor de apareamiento alfa, la secuencia senal de invertasa, y secuencias senal procedentes de otros polipeptidos de levadura secretados. Adicionalmente, estas secuencias peptfdicas senal pueden modificarse tecnicamente para proporcionar secrecion potenciada en sistemas de expresion de levadura diploides. Otras senales de secrecion de interes tambien incluyen secuencias senal de mairnfero, que pueden ser heterologas para la protema que se secreta, o pueden ser una secuencia nativa para la protema que se secreta. Las secuencias senal incluyen secuencias prepeptfdicas y, en algunos casos, pueden incluir secuencias propeptidicas. Se conocen en la tecnica muchas secuencias senal, incluyendo las secuencias senal halladas en cadenas de inmunoglobulina, por ejemplo, secuencia de preprotoxina de K28, PHA-E, FACE, MCP-1 humana, secuencias senal de albumina de suero humana, cadena pesada de Ig humana, cadena ligera de Ig humana, y similares. Por ejemplo, vease Hashimoto et al. Protein Eng 11(2) 75 (1998); y Kobayashi et al. Therapeutic Apheresis 2(4) 257 (1998).
La transcripcion puede aumentarse insertando una secuencia activadora de la transcripcion en un vector. Estos activadores son elementos de accion en cis de ADN habitualmente de 10 a 300 pb, que actuan en un promotor para aumentar su transcripcion. Los potenciadores de la transcripcion son relativamente independientes de la orientacion y la posicion, habiendose encontrado 5' y 3' de la unidad de transcripcion, en un intron, asf como en la secuencia codificante en sf misma. El potenciador puede cortarse y empalmarse en el vector de expresion en una posicion 5' o 3' de la secuencia codificante, pero se localiza preferentemente en un sitio 5' del promotor.
Los vectores de expresion usados en celulas hospedadoras eucariotas tambien pueden contener secuencias necesarias para la terminacion de la transcripcion y para estabilizar el ARNm. Dichas secuencias estan disponibles habitualmente de 3' al codon de terminacion de la traduccion, en regiones no traducidas de ADN o ADNc eucariotas o vmcos. Estas regiones contienen segmentos de nucleotidos transcritos como fragmentos poliadenilados en la parte no traducida del ARNm.
La construccion de vectores adecuados que contienen uno o mas de los componentes enumerados anteriormente emplea tecnicas de ligamiento convencionales o metodos de PCR/recombinacion. Se escinden plasmidos aislados o fragmentos de ADN, y se vuelven a ligar en la forma deseada para generar los plasmidos necesarios o mediante metodos de recombinacion. Para analisis para confirmar secuencias correctas en plasmidos construidos, las mezclas de ligamiento se usan para transformar celulas hospedadoras, y transformantes exitosos seleccionados mediante resistencia a antibioticos (por ejemplo ampicilina o zeocina) cuando sea apropiado. Se preparan plasmidos de los transformantes, se analizan mediante digestion con endonucleasas de restriccion y/o se secuencian.
Como alternativa a la restriccion y el ligamiento de fragmentos, pueden usarse metodos de recombinacion basandose en sitios att y enzimas de recombinacion para insertar secuencias de ADN en un vector. Dichos metodos se describen, por ejemplo, en Landy (1989) Ann.Rev.Biochem. 58:913-949; y son conocidos por los expertos en la materia. Dichos metodos utilizan recombinacion de ADN intermolecular que esta mediada por una mezcla de protemas de recombinacion codificadas por lambda y E. coli. Se produce recombinacion entre sitios de union espedfica (att) en las moleculas de ADN de interaccion. Para una descripcion de sitios att vease Weisberg y Landy (1983) Site-Specific Recombination in Phage Lambda, en Lambda II, Weisberg, ed. (Cold Spring Harbor, NY:Cold Spring Harbor Press), pags. 211-250. Los segmentos de ADN que flanquean los sitios de recombinacion se cambian, de modo que despues de la recombinacion, los sitios att son secuencias hubridas comprendidas por secuencias donadas por cada vector parental. La recombinacion se puede producir entre ADN de cualquier topologfa.
Pueden introducirse sitios att en una secuencia de interes ligando la secuencia de interes en un vector apropiado; generando un producto de PCR que contiene sitios att B mediante el uso de cebadores espedficos; generando una biblioteca de ADNc clonada en un vector apropiado que contiene sitios att; y similares.
Plegamiento, como se usa en el presente documento, se refiere al estructura tridimensional de polipeptidos y protemas, donde las interacciones entre restos de aminoacidos actuan para estabilizar la estructura. Aunque las interacciones no covalentes son importantes en la determinacion de la estructura, habitualmente las protemas de interes tendran enlaces disulfuro covalentes intra y/o intermoleculares formados por dos restos de cistema. Para protemas y polipeptidos de origen natural o derivados y variantes de los mismos, el plegamiento apropiado es habitualmente la disposicion que da como resultado actividad biologica optima, y puede supervisarse convenientemente mediante ensayos para actividad, por ejemplo union a ligando, actividad enzimatica, etc.
En algunos casos, por ejemplo cuando el producto deseado es de origen sintetico, los ensayos basados en la actividad biologica seran menos significativos. El plegamiento apropiado de dichas moleculas puede determinate basandose en las propiedades ffsicas, consideraciones energeticas, estudios de modelacion, y similares.
El hospedador de expresion puede modificarse adicionalmente por la introduccion de secuencias que codifican una o mas enzimas que potencian el plegamiento y la formacion de enlaces disulfuro, es decir foldasas, chaperoninas, etc. Dichas secuencias pueden expresarse de forma constitutiva o inducible en la celula hospedadora de levadura, usando vectores, marcadores, etc. como se conoce en la tecnica. Preferentemente, las secuencias, incluyendo elementos reguladores de la transcripcion suficientes para el patron deseado de expresion, se integran de forma estable en el genoma de levadura mediante una metodologfa dirigida.
Por ejemplo, la PDI eucariota no es solo un catalizador eficaz de la oxidacion de protema cistema e isomerizacion de enlaces disulfuro, sino que tambien muestra actividad chaperona. La coexpresion de PDI puede facilitar la produccion de protemas activas que tienen multiples enlaces disulfuro. Tambien es de interes la expresion de BIP (protema de union a cadena pesada de inmunoglobulina); ciclofilina; y similares. En una realizacion de la invencion, cada una de las cepas parentales haploides expresa una enzima de plegamiento distinta, por ejemplo una cepa puede expresar BIP y la otra cepa puede expresar PDI o combinaciones de los mismos.
Las expresiones "protê na deseada" o "anticuerpo deseado" se usan indistintamente y se refieren en general a un anticuerpo parental espedfico de una diana, es decir, CGRP o un anticuerpo quimerico o humanizado o una parte de union del mismo procedente de el como se describe en el presente documento. Se pretende que el termino "anticuerpo" incluya cualquier estructura molecular que contenga cadena polipeptfdica con una forma espedfica que se ajuste a y reconozca un epftopo, donde una o mas interacciones de union no covalente estabilizan el complejo entre la estructura molecular y el epftopo. La molecula de anticuerpo arquetfpica es la inmunoglobulina, y todos los tipos de inmunoglobulinas, IgG, IgM, IgA, IgE, IgD, etc., de todas las fuentes, por ejemplo ser humano, roedor, conejo, vaca, oveja, cerdo, perro, otros mairftferos, pollo, otras aves, etc., se consideran "anticuerpos". Una fuente preferida para producir anticuerpos utiles como material de partida es los conejos. Se han descrito numerosas secuencias codificantes de anticuerpos; y otras pueden plantearse mediante metodos bien conocidos en la tecnica. Los ejemplos de los mismos incluyen anticuerpos quimericos, anticuerpos humanos y otros anticuerpos de mairftferos no humanos, anticuerpos humanizados, anticuerpos monocatenarios (tales como scFv), anticuerpos de camellos, nanocuerpos, IgNAR (anticuerpos monocatenarios procedentes de tiburones), productos inmunofarmaceuticos pequenos modulares (SMIP), y fragmentos de anticuerpos tales como Fab, Fab', F(ab')2 y similares. Vease Streltsov VA, et al., Structure of a shark IgNAR antibody variable domain and modeling of an earlydevelopmental isotype, Protein Sci. Nov 2005;14(11):2901-9. Epub 30 sep 2005; Greenberg AS, et al., A new antigen receptor gene family that undergoes rearrangement and extensive somatic diversification in sharks, Nature. 9 mar 1995;374(6518):168-73; Nuttall SD, et al., Isolation of the new antigen receptor from wobbegong sharks, and use as a scaffold for the display of protein loop libraries, Mol Immunol. Ago 2001;38(4):313-26; Hamers-Casterman C, et al., Naturally occurring antibodies devoid of light chains, Nature. 3 Jun 1993;363(6428):446-8; Gill DS, et al., Biopharmaceutical drug discovery using novel protein scaffolds, Curr Opin Biotechnol. Dic 2006; 17(6):653-8. Epub 19 oct 2006.
Por ejemplo, los anticuerpos o fragmentos de union a antfgeno pueden producirse mediante ingeniena genetica. En esta tecnica, como con otros metodos, las celulas productoras de anticuerpos se sensibilizan para el antfgeno o inmunogeno deseado. El ARN mensajero aislado de las celulas productoras de anticuerpos se utiliza como un molde para preparar el ADNc utilizando la amplificacion por PCR. Se produce una biblioteca de vectores, que contienen cada uno un gen de cadena pesada y un gen de cadena ligera que conservan la especificidad inicial del antfgeno, se produce mediante insercion de las secciones adecuadas del ADNc de inmunoglobulina amplificado en los vectores de expresion. Se construye una biblioteca combinatoria combinando la biblioteca de genes de cadena pesada con la biblioteca de genes de cadena ligera. Esto da como resultado una biblioteca de clones que expresa conjuntamente una cadena pesada y ligera (que se asemeja al fragmento Fab o al fragmento de union a antfgeno de una molecula de anticuerpo). Los vectores que transportan estos genes se transfectan conjuntamente en una celula hospedadora. Cuando se induce la smtesis del gen del anticuerpo en el hospedador transfectado, las protemas de cadena pesada y ligera se autoensamblan para producir anticuerpos activos que se pueden detectar explorando con el antfgeno o inmunogeno.
Las secuencias codificantes de anticuerpos de interes incluyen las codificadas por secuencias nativas, asf como acidos nucleicos que, como consecuencia de la degeneracion del codigo genetico, no tienen secuencia identica a los acidos nucleicos desvelados, y variantes de los mismos. Los polipeptidos variantes pueden incluir sustituciones, adiciones o supresiones de aminoacidos (aa). Las sustituciones de aminoacidos pueden ser sustituciones de aminoacidos conservativas o sustituciones para eliminar aminoacidos no esenciales, tal como para alterar un sitio de glucosilacion o para minimizar el plegamiento erroneo por sustitucion o supresion de uno o mas restos de cistema que no son necesarios para la funcion. Pueden disenarse variantes para conservar o tener actividad biologica potenciada de una region particular de la protema (por ejemplo, un dominio funcional, restos de aminoacidos catalfticos, etc). Las variantes tambien incluyen fragmentos de los polipeptidos desvelados en el presente documento, particularmente fragmentos biologicamente activos y/o fragmentos correspondientes a dominios funcionales. Se conocen tecnicas para mutagenesis in vitro de genes clonados. Tambien se incluyen en la invencion objeto polipeptidos que se han modificado usando tecnicas biologicas moleculares ordinarias para mejorar su resistencia a la degradacion proteolttica o para optimizar las propiedades de solubilidad o para hacerlos mas adecuados como un agente terapeutico.
Los anticuerpos quimericos pueden prepararse mediante medios recombinantes combinando las regiones de cadena ligera y pesada variable (Vl y Vh), obtenidas de celulas productoras de anticuerpos de una especie con las regiones de cadena ligera y pesada constante de otra.
Habitualmente los anticuerpos quimericos utilizan regiones variables de roedor o conejo y regiones constantes humanas, para producir un anticuerpo con dominios predominantemente humanos. La produccion de dichos anticuerpos quimericos es bien conocida en la tecnica, y puede conseguirse mediante medios convencionales (como se describe, por ejemplo, en la patente de los Estados Unidos n.° 5.624.659). Se contempla ademas que las regiones constantes humanas de anticuerpos quimericos pueden seleccionarse de regiones constantes IgG1, IgG2, IgG3 e IgG4.
Los anticuerpos humanizados se disenan mediante ingeniena genetica para contener aun mas dominios de inmunoglobulina de tipo humano, e incorporan solo las regiones determinantes de complementariedad del anticuerpo procedente de animal. Esto se lleva a cabo examinando cuidadosamente la secuencia de los bucles hipervariables de las regiones variables del anticuerpo monoclonal, y ajustandolas a la estructura de las cadenas de anticuerpos humanos. Aunque es aparentemente complejo, el proceso es sencillo en la practica. Vease, por ejemplo, patente de los Estados Unidos n.° 6.187.287.
Ademas de las inmunoglobulinas completas (o sus equivalentes recombinantes), se pueden sintetizar fragmentos de inmunoglobulina que comprenden el sitio de union a epttopo (por ejemplo, Fab', F(ab')2, u otros fragmentos). Se pueden disenar "fragmentos" o inmunoglobulinas mrnimas utilizando tecnicas de inmunoglobulinas recombinantes. Por ejemplo, pueden producirse inmunoglobulinas "Fv" para su uso en la presente descripcion sintetizando una region variable de cadena ligera y una region variable de cadena pesada fusionadas. Son tambien de interes las combinaciones de anticuerpos, por ejemplo, diacuerpos, que comprenden dos especificidades de Fv distintas. En otro ejemplo, SMIP (productos inmunofarmaceuticos de moleculas pequenas), anticuerpos de camellos, nanocuerpos e IgNAR estan abarcados por fragmentos de inmunoglobulina.
Las inmunoglobulinas y fragmentos de las mismas pueden modificarse postraduccionalmente, por ejemplo para anadir restos efectores tales como conectores qmmicos, restos detectables, tales como colorantes fluorescentes, enzimas, toxinas, sustratos, materiales bioluminiscentes, materiales radioactivos, restos quimioluminiscentes y similares, o restos de union espedficos, tales como estreptavidina, avidina o biotina, y similares pueden utilizarse en los metodos y composiciones de la presente invencion. Se proporcionan ejemplos de moleculas efectoras adicionales posteriormente.
Una secuencia polinucleotfdica "corresponde" a una secuencia polipeptfdica si la traduccion de la secuencia polinucleotfdica de acuerdo con el codigo genetico produce la secuencia polipeptfdica (es decir, la secuencia polinucleotidica "codifica" la secuencia polipeptfdica), una secuencia polinucleotidica "corresponde" a otra secuencia polinucleotfdica si las dos secuencias codifican la misma secuencia polipeptfdica.
Una region "heterologa" o dominio de una construccion de ADN es un segmento identificable de ADN en una molecula de ADN mayor que no se encuentra en asociacion con la molecula mayor en la naturaleza. Por tanto, cuando la region heterologa codifica un gen de mairnfero, el gen estara flanqueado habitualmente por ADN que no flanquea el ADN genomico de mam êra en el genoma del organismo fuente. Otro ejemplo de una region heterologa es una construccion donde la secuencia codificante en si misma no se encuentra en la naturaleza (por ejemplo, un ADNc donde la secuencia codificante genomica contiene intrones o secuencias sinteticas que tienen codones diferentes que el gen nativo). Las variaciones alelicas o acontecimientos de mutacion de origen natural no dan lugar a una region heterologa de ADN como se define en el presente documento.
Una "secuencia codificante" es una secuencia en fase de codones que (a la vista del codigo genetico) corresponden a o codifican una secuencia proteica o peptfdica. Dos secuencias codificantes corresponden una a la otra si las secuencias o sus secuencias complementarias codifican las mismas secuencias de aminoacidos. Una secuencia codificante en asociacion con secuencias reguladoras apropiadas puede transcribirse y traducirse a un polipeptido. Una senal de poliadenilacion y secuencia de terminacion de la transcripcion se localizaran habitualmente en direccion 3' de la secuencia codificante. Una "secuencia promotora" es una region reguladora de ADN capaz de unirse con ARN polimerasa en una celula e iniciar la transcripcion de una secuencia codificante cadena abajo (direccion 3'). Las secuencias promotoras contienen habitualmente sitios adicionales para union de moleculas reguladoras (por ejemplo, factores de transcripcion) que afectan a la transcripcion de la secuencia codificante. Una secuencia codificante esta "bajo el control" de la secuencia promotora o "unida operativamente" al promotor cuando la ARN polimerasa se une con la secuencia promotora en una celula y transcribe la secuencia codificante a ARNm, que despues a su vez se traduce a la protema codificada por la secuencia codificante.
Se usan vectores para introducir una sustancia ajena, tal como ADN, ARN o protema, en un organismo o celula hospedadora. Los vectores habituales incluyen virus recombinantes (para polinucleotidos) y liposomas (para polipeptidos). Un "vector de ADN" es un replicon, tal como un plasmido, fago o cosmido, al que puede unirse otro segmento de polinucleotido para provocar la replicacion del segmento unido. Un "vector de expresion" es un vector de ADN que contiene secuencias reguladoras que dirigiran la smtesis de polipeptidos por una celula hospedadora apropiada. Esto significa habitualmente un promotor para unirse con la ARN polimerasa e iniciar la transcripcion de ARNm, as ^como sitios de union a ribosomas y senales de inicio para dirigir la traduccion del ARNm a un polipeptido o polipeptidos. La incorporacion de una secuencia polinucleotidica en un vector de expresion en el sitio apropiado y en marco de lectura correcto, seguido de transformacion de una celula hospedadora apropiada por el vector, permite la produccion de un polipeptido codificado por dicha secuencia polinucleotidica.
La "amplificacion" de secuencias polinucleotidicas es la produccion in vitro de multiples copias de una secuencia de acido nucleico particular. La secuencia amplificada esta habitualmente en forma de ADN. Se describen una diversidad de tecnicas para llevar a cabo dicha amplificacion en un artfculo de revision de Van Brunt (1990, Bio/Technol., 8(4):291-294). La reaccion en cadena de la polimerasa o PCR es un prototipo de amplificacion de acido nucleico y el uso de PCR en el presente documento debena considerarse ilustrativo de otras tecnicas de amplificacion adecuadas.
La estructura general de anticuerpos en vertebrados se entiende bien en la actualidad (Edelman, G. M., Ann. N.Y. Acad. Sci., 190: 5 (1971)). Los anticuerpos consisten en dos cadenas polipeptfdicas ligeras identicas de peso molecular de aproximadamente 23.000 daltons ("cadena ligera"), y dos cadenas pesadas identicas de peso molecular 53.000-70.000 ("cadena pesada"). Las cuatro cadenas se unen mediante enlaces disulfuro en una configuracion en "Y" en donde las cadenas ligeras soportan las cadenas pesadas comenzando en la boca de la configuracion en "Y". La parte de la "rama" de la configuracion en "Y" se designa la region Fab; La parte del "tallo" de la configuracion en "Y" se designa la region F c. La orientacion de la secuencia de aminoacidos se extiende desde el extremo N terminal en la parte superior de la configuracion en "Y" al extremo C terminal en la parte inferior de cada cadena. El extremo N terminal posee la region variable que tiene especificidad por el antfgeno que la indujo, y es de aproximadamente 100 aminoacidos de longitud, habiendo ligeras variaciones entre la cadena ligera y pesada y entre anticuerpos.
La region variable esta unida en cada cadena a una region constante que abarca la longitud restante de la cadena y que en una clase particular de anticuerpo no vana con la especificidad del anticuerpo (es decir, el antfgeno que lo induce). Existen cinco clases principales conocidas de regiones constantes que determinan la clase de la molecula de inmunoglobulina (IgG, IgM, IgA, IgD e IgE correspondientes a regiones constantes de cadena pesada y, M, a, 8 y £ (gamma, mu, alfa, delta o epsilon)). La region constante o clase determina la funcion efectora posterior del anticuerpo, incluyendo activacion del complemento (Kabat, E. A., Structural Concepts in Immunology and Immunochemistry, 2a Ed., p. 413-436, Holt, Rinehart, Winston (1976)), y otras respuestas celulares (Andrews, D. W., et al., Clinical Immunobiology, pags. 1-18, W. B. Sanders (1980); Kohl, S., et al., Immunology, 48: 187 (1983)); mientras que la region variable determina el antfgeno con el que reaccionara. Las cadenas ligeras se clasifican ya sea como k (kappa) o A (lambda). Cada clase de cadena pesada puede prepararse ya sea con la cadena ligera kappa o con la cadena ligera lambda. Las cadenas ligera y pesada se unen covalentemente entre sf, y las partes de la "cola" de las dos cadenas pesadas se unen entre sf mediante enlaces disulfuro covalentes cuando se generan las inmunoglobulinas ya sea mediante hibridomas o mediante linfocitos B.
La expresion "region variable" o "VR" se refiere de forma amplia a los dominios en cada par de cadenas ligera y pesada en un anticuerpo que estan implicados directamente en la union del anticuerpo al antfgeno. Cada cadena pesada tiene en un extremo un dominio variable (Vh) seguido por varios dominios constantes. Cada cadena ligera tiene un dominio variable (Vl) en un extremo y un dominio constante en su otro extremo; el dominio constante de la cadena ligera se alinea con el primer dominio constante de la cadena pesada, y el dominio variable de la cadena ligera se alinea con el dominio variable de la cadena pesada.
Las expresiones "region determinante de complementariedad", "region hipervariable", o "CDR" se refieren a una o mas de las regiones hipervariables o determinantes de la complementariedad (CDR) halladas en las regiones variables de las cadenas ligera o pesada de un anticuerpo (Vease Kabat, E. A. et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, National Institutes of Health, Bethesda, Md., (1987)). Estas expresiones incluyen las regiones hipervariables definidas por Kabat et al. ("Sequences of Proteins of Immunological Interest," Kabat E., et al., US Dept. of Health and Human Services, 1983) o los bucles hipervariables en estructuras tridimensionales de anticuerpos (Chothia y Lesk, J Mol. Biol. 196 901-917 (1987)). Las CDR en cada cadena se mantienen en proximidad estrecha por las regiones marco conservadas y, con las CDR de la otra cadena, contribuyen a la formacion del sitio de union a antfgeno. En las CDR hay aminoacidos espedficos que se han descrito como las regiones determinantes de la selectividad (SDR) que representan los restos de contacto cnticos utilizados por la CDR en la interaccion anticuerpo-antfgeno (Kashimiri, S., Methods, 36:25-34 (2005)).
Las expresiones "region marco conservada" o "FR" se refieren a una o mas regiones marco en las regiones variables de las cadenas ligera y pesada de un anticuerpo (Vease Kabat, E. A. et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, National Institutes of Health, Bethesda, Md., (1987)). Estas expresiones incluyen las regiones de secuencias de aminoacidos intercaladas entre las CDR en las regiones variables de las cadenas ligera y pesada de un anticuerpo.
Anticuerpos anti CGRP y fragmentos de union de los mismos que tienen actividad de union para CGRP Anticuerpo Ab1
Un ejemplo de la presente descripcion incluye anticuerpos quimericos que tienen especificidad de union con CGRP y que poseen una secuencia de cadena ligera variable que comprende la secuencia expuesta a continuacion:
QVLTQTASPVSAAVGSTVTINCQASQSVYDNNYLAWYQQKPGQPPKQLIYSTSTL
ASGVSSRFKGSGSGTQFTLTISDLECADAATYYCLGSYDCSSGDCFVFGGGTEVW
KR (SEQ ID NO: 1).
La descripcion tambien incluye anticuerpos quimericos que tienen especificidad de union con CGRP y que poseen una secuencia de cadena ligera que comprende la secuencia expuesta a continuacion:
QVLTQTASPVSAAVGSTVTINCQASQSVYDNNYLAWYQQKPGQPPKQLIYSTSTL
ASGVSSRFKGSGSGTQFTLTISDLECADAATYYCLGSYDCSSGDCFVFGGGTEVW
KRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASWCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQE
SVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
(SEQ ID NO: 2).
La descripcion incluye ademas anticuerpos quimericos que tienen especificidad de union con CGRP y que poseen una secuencia de cadena pesada variable que comprende la secuencia expuesta a continuacion:
QSLEESGGRLVTPGTPLTLTCTVSGLDLSSYYMQWVRQAPGKGLEWIGVIGINDNT
YYASWAKGRFTISRASSTTVDLKMTSLTTEDTATYFCARGDIWGPGTLVTVSS
(SEQ ID NO: 3).
La descripcion tambien incluye anticuerpos quimericos que tienen especificidad de union con CGRP y que poseen una secuencia de cadena pesada que comprende la secuencia expuesta a continuacion:
Q SLEES GGRLVTPGTPLTLT CT VSGLDLS S YYMQ WVRQ APGKGLE WIGVIGINDNT
YYASWAKGRFTISRASSTTVDLKMTSLTTEDTATYFCARGDIWGPGTLVTVSSAST
KGP S VFPL AP S SKST S GGT AALGCLVKD YFPEP VT V S WN S G ALTS G VHTFP A VLQ S
SGLYSLS S W T V P S SSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSCDKTHTCPPCPAPE
LLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVWDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAK
TKPREEQYASTYRWSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQP
REPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLD
SDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK (SEQ ID
NO: 4).
La descripcion contempla ademas anticuerpos que comprenden una o mas de las secuencias polipeptfdicas de SEQ ID NO: 5; SEQ ID NO: 6; y SEQ ID NO: 7 que corresponden a las regiones determinantes de complementariedad (CDR o regiones hipervariables) de la secuencia de cadena ligera variable de la SEQ ID NO: 1 o la secuencia de cadena ligera de la SEQ ID NO: 2, y/o una o mas de las secuencias polipeptfdicas de SEQ ID NO: 8; SEQ ID NO: 9; y SEQ ID NO: 10 que corresponden a las regiones determinantes de complementariedad (CDR o regiones hipervariables) de la secuencia de cadena pesada variable de la SEQ ID NO: 3 o la secuencia de cadena pesada de la SEQ ID NO: 4, o combinaciones de estas secuencias polipeptfdicas. En otro ejemplo de la descripcion, los anticuerpos de la descripcion o fragmentos de los mismos comprenden, o como alternativa consisten en, combinaciones de una o mas de las CDR, las secuencias de cadena pesada variable y ligera variable, y las secuencias de cadena pesada y ligera expuestas anteriormente, incluyendo todas ellas.
La descripcion tambien contempla fragmentos del anticuerpo que tiene especificidad de union con CGRP. En un ejemplo de la descripcion, los fragmentos de anticuerpo de la descripcion comprenden, o como alternativa consisten en, la secuencia polipeptfdica de la SEQ ID NO: 1 o la SEQ ID NO: 2. En otro ejemplo de la descripcion, los fragmentos de anticuerpo de la descripcion comprenden, o como alternativa consisten en, la secuencia polipeptfdica de la SEQ ID NO: 3 o la SEQ ID NO: 4.
En un ejemplo adicional de la descripcion, los fragmentos del anticuerpo que tienen especificidad de union con CGRP comprenden, o como alternativa consisten en, una o mas de las secuencias polipeptfdicas de SEQ ID NO: 5; SEQ ID NO: 6; y SEQ ID NO: 7 que corresponden a las regiones determinantes de complementariedad (CDR o regiones hipervariables) de la secuencia de cadena ligera variable de la SEQ ID NO: 1 o la secuencia de cadena ligera de la SEQ ID NO: 2.
En un ejemplo adicional de la descripcion, los fragmentos del anticuerpo que tienen especificidad de union con CGRP comprenden, o como alternativa consisten en, una o mas de las secuencias polipeptfdicas de SEQ ID NO: 8; SEQ ID NO: 9; y SEQ ID NO: 10 que corresponden a las regiones determinantes de complementariedad (CDR o regiones hipervariables) de la secuencia de cadena pesada variable de la SEQ ID NO: 3 o la secuencia de cadena pesada de la SEQ ID NO: 4.
La descripcion tambien contempla fragmentos de anticuerpos que incluyen uno o mas de los fragmentos de anticuerpos descritos en el presente documento. En un ejemplo de la descripcion, los fragmentos de los anticuerpos que tienen especificidad de union con CGRP comprenden, o como alternativa consisten en, uno, dos, tres o mas, incluyendo todos los siguientes fragmentos de anticuerpos: la region de cadena ligera variable de la SEQ ID NO: 1; la region de cadena pesada variable de la SEQ ID NO: 3; las regiones determinantes de complementariedad (SEQ ID NO: 5; SEQ ID nO: 6; y SEQ ID NO: 7) de la region de cadena ligera variable de la SEQ ID NO: 1; y las regiones determinantes de complementariedad (s Eq ID NO: 8; SEQ ID NO: 9; y SEQ ID NO: 10) de la region de cadena pesada variable de la SEQ ID NO: 3.
En un ejemplo particularmente preferente de la descripcion, el anticuerpo anti CGRP quimerico es Ab1, que comprende, o como alternativa que consiste en, SEQ ID NO: 2 y SEQ ID NO: 4, y que tiene al menos una de las actividades biologicas expuestas en el presente documento.
En un ejemplo adicional particularmente preferente de la descripcion, los fragmentos de anticuerpos comprenden, o como alternativa consisten en, fragmentos Fab (fragmento de union a antfgeno) que tienen especificidad de union por CGRP. Con respecto al anticuerpo Ab1, el fragmento Fab incluye la secuencia de cadena ligera variable de la SEQ ID NO: 1 y la secuencia de cadena pesada variable de la SEQ ID NO: 3. Este ejemplo de la descripcion contempla ademas adiciones, supresiones y variantes de la SEQ ID NO: 1 y/o la SEQ ID NO: 3 en dicho Fab conservando al mismo tiempo la especificidad de union por CGRP.
En un ejemplo de la descripcion descrita en el presente documento (posteriormente), pueden producirse fragmentos Fab mediante digestion enzimatica (por ejemplo, papama) de Ab1. En otro ejemplo de la descripcion, pueden producirse anticuerpos anti CGRP tales como Ab1 o fragmentos Fab de los mismos mediante expresion en celulas de mamffero tales como celulas CHO, NSO o HEK 293, sistemas fungicos, de insectos o microbianos tales como celulas de levadura (por ejemplo levadura diploide tal como Pichia diploide) y otras cepas de levadura. Las especies de Pichia adecuadas incluyen, pero sin limitacion, Pichia pastoris.
Anticuerpo Ab2
En un ejemplo, la descripcion incluye anticuerpos humanizados que tienen especificidad de union con CGRP y que poseen una secuencia de cadena ligera variable que comprende la secuencia expuesta a continuacion:
QVLTQSPSSLSASVGDRVTINCQASQSVYDNNYLAWYQQKPGKVPKQLIYSTSTL
ASGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDVATYYCLGSYDCSSGDCFVFGGGTKVEIK
R (SEQ ID NO: 11).
La descripcion tambien incluye anticuerpos humanizados que tienen especificidad de union con CGRP y que poseen una secuencia de cadena ligera que comprende la secuencia expuesta a continuacion:
QVLTQSPSSLSASVGDRVTINCQASQSVYDNNYLAWYQQKPGKVPKQLIYSTSTL
ASGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDVATYYCLGSYDCSSGDCFVFGGGTKVEIK
RT VAAP S VFIFPP SDEQLKS GT AS V V CLLNNF YPRE AKV Q WKVDN ALQ S GN S QE S
VTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
(SEQ ID NO: 12).
La descripcion incluye ademas anticuerpos humanizados que tienen especificidad de union con CGRP y que poseen una secuencia de cadena pesada variable que comprende la secuencia expuesta a continuacion:
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAVSGLDLSSYYMQWVRQAPGKGLEWVGVIGIN
DNTYYASWAKGRFTISRDNSKTTVYLQMNSLRAEDTAVYFCARGDIWGQGTLVT
VSS (SEQ ID NO: 13).
La descripcion tambien incluye anticuerpos humanizados que tienen especificidad de union con CGRP y que poseen una secuencia de cadena pesada que comprende la secuencia expuesta a continuacion:
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAVSGLDLSSYYMQWVRQAPGKGLEWVGVIGIN
DNTYYASWAKGRFTISRDNSKTTVYLQMNSLRAEDTAVYFCARGDIWGQGTLVT
V S S ASTKGP S VFPL AP S SKST S GGT AALGCL VKD YFPEP VT VS WNS GALT S G VHTF
PAVLQSSGLYSLSSWTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSCDKTHTC
PPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVWDVSHEDPEVKFNWYVDGV
EVHNAKTKPREEQYASTYRWSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTIS
KAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYK
TTPPYLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
(SEQ ID NO: 14).
La descripcion contempla ademas anticuerpos que comprenden una o mas de las secuencias polipeptfdicas de SEQ ID NO: 15; SEQ ID NO: 16; y SEQ ID NO: 17 que corresponden a las regiones determinantes de complementariedad (CDR o regiones hipervariables) de la secuencia de cadena ligera variable de la SEQ ID NO: 11 o la secuencia de cadena ligera de la SEQ ID NO: 12, y/o una o mas de las secuencias polipeptfdicas de SEQ ID NO: 18; SEQ ID NO: 19; y SEQ ID NO: 20 que corresponden a las regiones determinantes de complementariedad (CDR o regiones hipervariables) de la secuencia de cadena pesada variable de la SEQ ID NO: 13 o la secuencia de cadena pesada de la SEQ ID NO: 14, o combinaciones de estas secuencias polipeptfdicas. En otro ejemplo de la descripcion, los anticuerpos de la descripcion o fragmentos de los mismos comprenden, o como alternativa consisten en, combinaciones de una o mas de las CDR, las secuencias de cadena pesada variable y ligera variable, y las secuencias de cadena pesada y ligera expuestas anteriormente, incluyendo todas ellas.
La descripcion tambien contempla fragmentos del anticuerpo que tiene especificidad de union con CGRP. En un ejemplo de la descripcion, los fragmentos de anticuerpo de la descripcion comprenden, o como alternativa consisten en, la secuencia polipeptfdica de la SEQ ID NO: 11 o la SEQ ID NO: 12. En otro ejemplo de la descripcion, los fragmentos de anticuerpo de la descripcion comprenden, o como alternativa consisten en, la secuencia polipeptfdica de la SEQ ID NO: 13 o la SEQ ID NO: 14.
En un ejemplo adicional de la descripcion, los fragmentos del anticuerpo que tienen especificidad de union con CGRP comprenden, o como alternativa consisten en, una o mas de las secuencias polipeptfdicas de SEQ ID NO: 15; SEQ ID NO: 16; y SEQ ID NO: 17 que corresponden a las regiones determinantes de complementariedad (CDR o regiones hipervariables) de la secuencia de cadena ligera variable de la SEQ ID NO: 11 o la secuencia de cadena ligera de la SEQ ID NO: 12.
En un ejemplo adicional de la descripcion, los fragmentos del anticuerpo que tienen especificidad de union con CGRP comprenden, o como alternativa consisten en, una o mas de las secuencias polipeptidicas de SEQ ID NO: 18; SEQ ID NO: 19; y SEQ ID NO: 20 que corresponden a las regiones determinates de complementariedad (CDR o regiones hipervariables) de la secuencia de cadena pesada variable de la SEQ ID NO: 13 o la secuencia de cadena pesada de la SEQ ID NO: 14.
La descripcion tambien contempla fragmentos de anticuerpos que incluyen uno o mas de los fragmentos de anticuerpos descritos en el presente documento. En un ejemplo de la descripcion, los fragmentos de los anticuerpos que tienen especificidad de union con CGRP comprenden, o como alternativa consisten en, uno, dos, tres o mas, incluyendo todos los siguientes fragmentos de anticuerpos: la region de cadena ligera variable de la SEQ ID NO: 11; la region de cadena pesada variable de la SEQ ID NO: 13; las regiones determinantes de complementariedad (SEQ ID NO: 15; SEQ ID NO: 16; y SEQ ID NO: 17) de la region de cadena ligera variable de la Se Q ID NO: 11; y las regiones determinantes de complementariedad (SEQ ID NO: 18; SEQ ID NO: 19; y SEQ ID NO: 20) de la region de cadena pesada variable de la s Eq ID NO: 13.
En un ejemplo particularmente preferente de la descripcion, el anticuerpo anti CGRP humanizado es Ab2, que comprende, o como alternativa que consiste en, SEQ ID NO: 12 y SEQ ID NO: 14, y que tiene al menos una de las actividades biologicas expuestas en el presente documento.
En un ejemplo adicional particularmente preferente de la descripcion, los fragmentos de anticuerpo comprenden, o como alternativa consisten en, fragmentos Fab (fragmento de union a antfgeno) que tienen especificidad de union por CGRP. Con respecto al anticuerpo Ab2, el fragmento Fab incluye la secuencia de cadena ligera variable de la SEQ ID NO: 11 y la secuencia de cadena pesada variable de la SEQ ID NO: 13. Este ejemplo de la descripcion contempla ademas adiciones, supresiones y variantes de la SEQ ID NO: 11 y/o la SEQ ID NO: 13 en dicho Fab conservando al mismo tiempo la especificidad de union por CGRP.
En un ejemplo de la descripcion descrita en el presente documento (posteriormente), Pueden producirse fragmentos Fab mediante digestion enzimatica (por ejemplo, papama) de Ab2. En otro ejemplo de la descripcion, pueden producirse anticuerpos anti CGRP tales como Ab2 o fragmentos Fab de los mismos mediante expresion en celulas de mairnfero tales como celulas CHO, NSO o HEK 293, sistemas fungicos, de insectos o microbianos tales como celulas de levadura (por ejemplo levadura diploide tal como Pichia diploide) y otras cepas de levadura. Las especies de Pichia adecuadas incluyen, pero sin limitacion, Pichia pastoris.
Anticuerpo Ab3
En un ejemplo, la descripcion incluye anticuerpos humanizados que tienen especificidad de union con CGRP y que poseen una secuencia de cadena ligera variable que comprende la secuencia expuesta a continuacion:
QVLTQSPSSLSASVGDRVTINCQASQSVYDNNYLAWYQQKPGKVPKQLIYSTSTL
ASGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDVATYYCLGSYDCSSGDCFVFGGGTKVEIK
R (SEQ ID NO: 21).
La descripcion tambien incluye anticuerpos humanizados que tienen especificidad de union con CGRP y que poseen una secuencia de cadena ligera que comprende la secuencia expuesta a continuacion:
QVLTQSPSSLSASVGDRVTINCQASQSVYDNNYLAWYQQKPGKVPKQLIYSTSTL
ASGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDVATYYCLGSYDCSSGDCFVFGGGTKVEIK
RT VAAP S VFIFPP SDEQLKS GT AS V V CLLNNF YPRE AKV Q WKVDN ALQ S GN S QE S
VTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
(SEQ ID NO: 22).
La descripcion incluye ademas anticuerpos humanizados que tienen especificidad de union con CGRP y que poseen una secuencia de cadena pesada variable que comprende la secuencia expuesta a continuacion:
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAVSGLDLSSYYMQWVRQAPGKGLEWVGVIGIN
DNTYYASWAKGRFTISRDNSKTTVYLQMNSLRAEDTAVYFCARGDIWGQGTLVT
VSS (SEQ ID NO: 23).
La descripcion tambien incluye anticuerpos humanizados que tienen especificidad de union con CGRP y que poseen una secuencia de cadena pesada que comprende la secuencia expuesta a continuacion:
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAVSGLDLSSYYMQWVRQAPGKGLEWVGVIGIN
DNTYYASWAKGRFTISRDNSKTTVYLQMNSLRAEDTAVYFCARGDIWGQGTLVT
V S S ASTKGP S VFPL AP S SKST S GGT AALGCL VKD YFPEP VT YS WNS GALT S G VHTF
PAVLQSSGLYSLSSWTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDARVEPKSCDKTHTC
PPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVWDVSHEDPEVKFNWYVDGV
EVHNAKTKPREEQYASTYRWSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTIS
KAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYK
TTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
(SEQ ID NO: 24).
La descripcion contempla ademas anticuerpos que comprenden una o mas de las secuencias polipeptidicas de SEQ ID NO: 25; SEQ ID NO: 26; y SEQ ID NO: 27 que corresponden a las regiones determinates de complementariedad (CDR o regiones hipervariables) de la secuencia de cadena ligera variable de la SEQ ID NO: 21 o la secuencia de cadena ligera de la SEQ ID NO: 22, y/o una o mas de las secuencias polipeptfdicas de SEQ ID NO: 28; SEQ ID NO: 29; y SEQ ID NO: 30 que corresponden a las regiones determinantes de complementariedad (CDR o regiones hipervariables) de la secuencia de cadena pesada variable de la SEQ ID NO: 23 o la secuencia de cadena pesada de la SEQ ID NO: 24, o combinaciones de estas secuencias polipeptfdicas. En otro ejemplo de la descripcion, los anticuerpos de la descripcion o fragmentos de los mismos comprenden, o como alternativa consisten en, combinaciones de una o mas de las CDR, las secuencias de cadena pesada variable y ligera variable, y las secuencias de cadena pesada y ligera expuestas anteriormente, incluyendo todas ellas.
La descripcion tambien contempla fragmentos del anticuerpo que tiene especificidad de union con CGRP. En un ejemplo de la descripcion, los fragmentos de anticuerpo de la descripcion comprenden, o como alternativa consisten en, la secuencia polipeptfdica de la SEQ ID NO: 21 o la SEQ ID NO: 22. En otro ejemplo de la descripcion, los fragmentos de anticuerpo de la descripcion comprenden, o como alternativa consisten en, la secuencia polipeptfdica de la SEQ ID NO: 23 o la SEQ ID NO: 24.
En un ejemplo adicional de la descripcion, los fragmentos del anticuerpo que tienen especificidad de union con CGRP comprenden, o como alternativa consisten en, una o mas de las secuencias polipeptfdicas de SEQ ID NO: 25; SEQ ID NO: 26; y SEQ ID NO: 27 que corresponden a las regiones determinantes de complementariedad (CDR o regiones hipervariables) de la secuencia de cadena ligera variable de la SEQ ID NO: 21 o la secuencia de cadena ligera de la SEQ ID NO: 22.
En un ejemplo adicional de la descripcion, los fragmentos del anticuerpo que tienen especificidad de union con CGRP comprenden, o como alternativa consisten en, una o mas de las secuencias polipeptfdicas de SEQ ID NO: 28; SEQ ID NO: 29; y SEQ ID NO: 30 que corresponden a las regiones determinantes de complementariedad (CDR o regiones hipervariables) de la secuencia de cadena pesada variable de la SEQ ID NO: 23 o la secuencia de cadena pesada de la SEQ ID NO: 24.
La descripcion tambien contempla fragmentos de anticuerpos que incluyen uno o mas de los fragmentos de anticuerpos descritos en el presente documento. En un ejemplo de la descripcion, los fragmentos de los anticuerpos que tienen especificidad de union con CGRP comprenden, o como alternativa consisten en, uno, dos, tres o mas, incluyendo todos los siguientes fragmentos de anticuerpos: la region de cadena ligera variable de la SEQ ID NO: 21; la region de cadena pesada variable de la SEQ ID NO: 23; las regiones determinantes de complementariedad (SEQ ID NO: 25; SEQ ID NO: 26; y SEQ ID NO: 27) de la region de cadena ligera variable de la SeQ ID NO: 21; y las regiones determinantes de complementariedad (SEQ ID NO: 28; SEQ ID NO: 29; y SEQ ID NO: 30) de la region de cadena pesada variable de la s Eq ID NO: 23.
En un ejemplo particularmente preferente de la descripcion, el anticuerpo anti CGRP quimerico es Ab3, que comprende, o como alternativa que consiste en, SEQ ID NO: 22 y SEQ ID NO: 24, y que tiene al menos una de las actividades biologicas expuestas en el presente documento.
En un ejemplo adicional particularmente preferente de la descripcion, los fragmentos de anticuerpo comprenden, o como alternativa consisten en, fragmentos Fab (fragmento de union a antigeno) que tienen especificidad de union por CGRP. Con respecto al anticuerpo Ab3, el fragmento Fab incluye la secuencia de cadena ligera variable de la SEQ ID NO: 21 y la secuencia de cadena pesada variable de la SEQ ID NO: 23. Este ejemplo de la descripcion contempla ademas adiciones, supresiones y variantes de la SEQ ID NO: 21 y/o la SEQ ID NO: 23 en dicho Fab conservando al mismo tiempo la especificidad de union por CGRP.
En un ejemplo de la descripcion descrita en el presente documento (posteriormente), Pueden producirse fragmentos Fab mediante digestion enzimatica (por ejemplo, papama) de Ab3. En otro ejemplo de la descripcion, pueden producirse anticuerpos anti CGRP tales como Ab3 o fragmentos Fab de los mismos mediante expresion en celulas de mairnfero tales como celulas CHO, NSO o HEK 293, sistemas fungicos, de insectos o microbianos tales como celulas de levadura (por ejemplo levadura diploide tal como Pichia diploide) y otras cepas de levadura. Las especies de Pichia adecuadas incluyen, pero sin limitacion, Pichia pastoris.
Anticuerpo Ab4
En un ejemplo, la descripcion incluye anticuerpos quimericos que tienen especificidad de union con CGRP y que poseen una secuencia de cadena ligera variable que comprende la secuencia expuesta a continuacion:
QVLTQTPSPVSAAVGSTVTINCQASQSVYHNTYLAWYQQKPGQPPKQLIYDASTL
ASGVPSRFSGSGSGTQFTLTISGVQCNDAAAYYCLGSYDCTNGDCFVFGGGTEW
VKR (SEQ ID NO: 31).
La descripcion tambien incluye anticuerpos quimericos que tienen especificidad de union con CGRP y que poseen una secuencia de cadena ligera que comprende la secuencia expuesta a continuacion:
QVLTQTPSPVSAAVGSTVTINCQASQSVYHNTYLAWYQQKPGQPPKQLIYDASTL
ASGVPSRFSGSGSGTQFTLTISGVQCNDAAAYYCLGSYDCTNGDCFVFGGGTEW
VKRT VAAP S VFIFPP SDEQLKS GT AS V V CLLNNF YPRE AKV Q WKVDN ALQ S GN S Q
ESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
(SEQ ID NO: 32).
La descripcion incluye ademas anticuerpos quimericos que tienen especificidad de union con CGRP y que poseen una secuencia de cadena pesada variable que comprende la secuencia expuesta a continuacion:
Q SLEE S GGRLVTPGTPLTLT C S VS GIDLS GYYMN WVRQ APGKGLE WIG VIGIN GAT
YYASWAKGRFTISKTSSTTVDLKMTSLTTEDTATYFCARGDIWGPGTLVTVSS
(SEQ ID NO: 33).
La descripcion tambien incluye anticuerpos quimericos que tienen especificidad de union con CGRP y que poseen una secuencia de cadena pesada que comprende la secuencia expuesta a continuacion:
QSLEESGGRLVTPGTPLTLTCSVSGIDLSGYYMNWVRQAPGKGLEWIGVIGINGAT
YYASWAKGRFTISKTSSTTVDLKMTSLTTEDTATYFCARGDIWGPGTLVTVSSAST
KGP S VFPL AP S SKST S GGT AALGCLVKD YFPEP VT V S WN S G ALTS G VHTFP A VLQ S
SGLY SLS S W T VPS S SLGT QTYICNVNHKPSNTKYDKRVEPKSCDKTHT CPPCP APE
LLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVWDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAK
TKPREEQYASTYRWSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQP
REPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLD
SDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK (SEQ ID
NO: 34).
La descripcion contempla ademas anticuerpos que comprenden una o mas de las secuencias polipeptfdicas de SEQ ID NO: 35; SEQ ID NO: 36; y SEQ ID NO: 37 que corresponden a las regiones determinates de complementariedad (CDR o regiones hipervariables) de la secuencia de cadena ligera variable de la SEQ ID NO: 31 o la secuencia de cadena ligera de la SEQ ID NO: 32, y/o una o mas de las secuencias polipeptidicas de SEQ ID NO: 38; SEQ ID NO: 39; y SEQ ID NO: 40 que corresponden a las regiones determinates de complementariedad (CDR o regiones hipervariables) de la secuencia de cadena pesada variable de la SEQ ID NO: 33 o la secuencia de cadena pesada de la SEQ ID NO: 34, o combinaciones de estas secuencias polipeptfdicas. En otro ejemplo de la descripcion, los anticuerpos de la descripcion o fragmentos de los mismos comprenden, o como alternativa consisten en, combinaciones de una o mas de las CDR, las secuencias de cadena pesada variable y ligera variable, y las secuencias de cadena pesada y ligera expuestas anteriormente, incluyendo todas ellas.
La descripcion tambien contempla fragmentos del anticuerpo que tiene especificidad de union con CGRP. En un ejemplo de la descripcion, los fragmentos de anticuerpo de la descripcion comprenden, o como alternativa consisten en, la secuencia polipeptfdica de la SEQ ID NO: 31 o la SEQ ID NO: 32. En otro ejemplo de la descripcion, los fragmentos de anticuerpo de la descripcion comprenden, o como alternativa consisten en, la secuencia polipeptfdica de la SEQ ID NO: 33 o la SEQ ID NO: 34.
En un ejemplo adicional de la descripcion, los fragmentos del anticuerpo que tienen especificidad de union con CGRP comprenden, o como alternativa consisten en, una o mas de las secuencias polipeptfdicas de SEQ ID NO: 35; SEQ ID NO: 36; y SEQ ID NO: 37 que corresponden a las regiones determinantes de complementariedad (CDR o regiones hipervariables) de la secuencia de cadena ligera variable de la SEQ ID NO: 31 o la secuencia de cadena ligera de la SEQ ID NO: 32.
En un ejemplo adicional de la descripcion, los fragmentos del anticuerpo que tienen especificidad de union con CGRP comprenden, o como alternativa consisten en, una o mas de las secuencias polipeptfdicas de SEQ ID NO: 38; SEQ ID NO: 39; y SEQ ID NO: 40 que corresponden a las regiones determinantes de complementariedad (CDR o regiones hipervariables) de la secuencia de cadena pesada variable de la SEQ ID NO: 33 o la secuencia de cadena pesada de la SEQ ID NO: 34.
La descripcion tambien contempla fragmentos de anticuerpos que incluyen uno o mas de los fragmentos de anticuerpos descritos en el presente documento. En un ejemplo de la descripcion, los fragmentos de los anticuerpos que tienen especificidad de union con CGRP comprenden, o como alternativa consisten en, uno, dos, tres o mas, incluyendo todos los siguientes fragmentos de anticuerpos: la region de cadena ligera variable de la SEQ ID NO: 31; la region de cadena pesada variable de la SEQ ID NO: 33; las regiones determinantes de complementariedad (SEQ ID NO: 35; SEQ ID NO: 36; y SEQ ID NO: 37) de la region de cadena ligera variable de la SeQ ID NO: 31; y las regiones determinantes de complementariedad (SEQ ID NO: 38; SEQ ID NO: 39; y SEQ ID NO: 40) de la region de cadena pesada variable de la s Eq ID NO: 33.
En un ejemplo particularmente preferente de la descripcion, el anticuerpo anti CGRP humanizado es Ab4, que comprende, o como alternativa que consiste en, SEQ ID NO: 32 y SEQ ID NO: 34, y que tiene al menos una de las actividades biologicas expuestas en el presente documento.
En un ejemplo adicional particularmente preferente de la descripcion, los fragmentos de anticuerpo comprenden, o como alternativa consisten en, fragmentos Fab (fragmento de union a antfgeno) que tienen especificidad de union por CGRP. Con respecto al anticuerpo Ab4, el fragmento Fab incluye la secuencia de cadena ligera variable de la SEQ ID NO: 31 y la secuencia de cadena pesada variable de la SEQ ID NO: 33. Este ejemplo de la descripcion contempla ademas adiciones, supresiones y variantes de la SEQ ID NO: 31 y/o la SEQ ID NO: 33 en dicho Fab conservando al mismo tiempo la especificidad de union por CGRP.
En un ejemplo de la descripcion descrita en el presente documento (posteriormente), Pueden producirse fragmentos Fab mediante digestion enzimatica (por ejemplo, papama) de Ab4. En otro ejemplo de la descripcion, pueden producirse anticuerpos anti CGRP tales como Ab4 o fragmentos Fab de los mismos mediante expresion en celulas de mairnfero tales como celulas CHO, NSO o HEK 293, sistemas fungicos, de insectos o microbianos tales como celulas de levadura (por ejemplo levadura diploide tal como Pichia diploide) y otras cepas de levadura. Las especies de Pichia adecuadas incluyen, pero sin limitacion, Pichia pastoris.
Anticuerpo Ab5
En un ejemplo, la descripcion incluye anticuerpos humanizados que tienen especificidad de union con CGRP y que poseen una secuencia de cadena ligera variable que comprende la secuencia expuesta a continuacion:
QVLTQSPSSLSASVGDRVTINCQASQSVYHNTYLAWYQQKPGKVPKQLIYDASTL
ASGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDVATYYCLGSYDCTNGDCFVFGGGTKVEIK
R (SEQ ID NO: 41).
La descripcion tambien incluye anticuerpos humanizados que tienen especificidad de union con CGRP y que poseen una secuencia de cadena ligera que comprende la secuencia expuesta a continuacion:
QVLTQSPSSLSASVGDRVTINCQASQSVYHNTYLAWYQQKPGKVPKQLIYDASTL
ASGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDVATYYCLGSYDCTNGDCFVFGGGTKVEIK
RT YAAP S YFIFPP SDEQLKS GT AS Y Y CLLNNF YPRE AKV Q WKYDN ALQ S GN S QE S
VTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
(SEQ ID NO: 42).
La descripcion incluye ademas anticuerpos humanizados que tienen especificidad de union con CGRP y que poseen una secuencia de cadena pesada variable que comprende la secuencia expuesta a continuacion:
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAVSGIDLSGYYMNWVRQAPGKGLEWVGVIGIN
GATYYASWAKGRFTISRDNSKTTVYLQMNSLRAEDTAVYFCARGDIWGQGTLVT
VSS (SEQ ID NO: 43).
La descripcion tambien incluye anticuerpos humanizados que tienen especificidad de union con CGRP y que poseen una secuencia de cadena pesada que comprende la secuencia expuesta a continuacion:
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAVSGIDLSGYYMNWVRQAPGKGLEWVGVIGIN
GATYYASWAKGRFTISRDNSKTTVYLQMNSLRAEDTAVYFCARGDIWGQGTLVT
VSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTF
PAVLQSSGLYSLSSWTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSCDKTHTC
PPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVWDVSHEDPEVKFNWYVDGV
E VEIN AKT KPREE Q Y AST Y R W S VLT VLHQD WLNGKEYKCKV SNKALP APIEKT IS
KAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYK
TTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
(SEQ ID NO: 44).
La descripcion contempla ademas anticuerpos que comprenden una o mas de las secuencias polipeptfdicas de SEQ ID NO: 45; SEQ ID NO: 46; y SEQ ID NO: 47 que corresponden a las regiones determinates de complementariedad (CDR o regiones hipervariables) de la secuencia de cadena ligera variable de la SEQ ID NO: 41 o la secuencia de cadena ligera de la SEQ ID NO: 42, y/o una o mas de las secuencias polipeptidicas de SEQ ID NO: 48; SEQ ID NO: 49; y SEQ ID NO: 50 que corresponden a las regiones determinates de complementariedad (CDR o regiones hipervariables) de la secuencia de cadena pesada variable de la SEQ ID NO: 43 o la secuencia de cadena pesada de la SEQ ID NO: 44, o combinaciones de estas secuencias polipeptfdicas. En otro ejemplo de la descripcion, los anticuerpos de la descripcion o fragmentos de los mismos comprenden, o como alternativa consisten en, combinaciones de una o mas de las CDR, las secuencias de cadena pesada variable y ligera variable, y las secuencias de cadena pesada y ligera expuestas anteriormente, incluyendo todas ellas.
La descripcion tambien contempla fragmentos del anticuerpo que tiene especificidad de union con CGRP. En un ejemplo de la descripcion, los fragmentos de anticuerpo de la descripcion comprenden, o como alternativa consisten en, la secuencia polipeptfdica de la SEQ ID NO: 41 o la SEQ ID NO: 42. En otro ejemplo de la descripcion, los fragmentos de anticuerpo de la descripcion comprenden, o como alternativa consisten en, la secuencia polipeptfdica de la SEQ ID NO: 43 o la SEQ ID NO: 44.
En un ejemplo adicional de la descripcion, los fragmentos del anticuerpo que tienen especificidad de union con CGRP comprenden, o como alternativa consisten en, una o mas de las secuencias polipeptfdicas de SEQ ID NO: 45; SEQ ID NO: 46; y SEQ ID NO: 47 que corresponden a las regiones determinantes de complementariedad (CDR o regiones hipervariables) de la secuencia de cadena ligera variable de la SEQ ID NO: 41 o la secuencia de cadena ligera de la SEQ ID NO: 42.
En un ejemplo adicional de la descripcion, los fragmentos del anticuerpo que tienen especificidad de union con CGRP comprenden, o como alternativa consisten en, una o mas de las secuencias polipeptfdicas de SEQ ID NO: 48; SEQ ID NO: 49; y SEQ ID NO: 50 que corresponden a las regiones determinantes de complementariedad (CDR o regiones hipervariables) de la secuencia de cadena pesada variable de la SEQ ID NO: 43 o la secuencia de cadena pesada de la SEQ ID NO: 44.
La descripcion tambien contempla fragmentos de anticuerpos que incluyen uno o mas de los fragmentos de anticuerpos descritos en el presente documento. En un ejemplo de la descripcion, los fragmentos de los anticuerpos que tienen especificidad de union con CGRP comprenden, o como alternativa consisten en, uno, dos, tres o mas, incluyendo todos los siguientes fragmentos de anticuerpos: la region de cadena ligera variable de la SEQ ID NO: 41; la region de cadena pesada variable de la SEQ ID NO: 43; las regiones determinantes de complementariedad (SEQ ID NO: 45; SEQ ID NO: 46; y SEQ ID NO: 47) de la region de cadena ligera variable de la SeQ ID NO: 41; y las regiones determinantes de complementariedad (SEQ ID NO: 48; SEQ ID NO: 49; y SEQ ID NO: 50) de la region de cadena pesada variable de la s Eq ID NO: 43.
En un ejemplo particularmente preferente de la descripcion, el anticuerpo anti CGRP quimerico es Ab5, que comprende, o como alternativa que consiste en, SEQ ID NO: 42 y SEQ ID NO: 44, y que tiene al menos una de las actividades biologicas expuestas en el presente documento.
En un ejemplo adicional particularmente preferente de la descripcion, los fragmentos de anticuerpo comprenden, o como alternativa consisten en, fragmentos Fab (fragmento de union a antfgeno) que tienen especificidad de union por CGRP. Con respecto al anticuerpo Ab5, el fragmento Fab incluye la secuencia de cadena ligera variable de la SEQ ID NO: 41 y la secuencia de cadena pesada variable de la SEQ ID NO: 43. Este ejemplo de la descripcion contempla ademas adiciones, supresiones y variantes de la SEQ ID NO: 41 y/o la SEQ ID NO: 43 en dicho Fab conservando al mismo tiempo la especificidad de union por CGRP.
En un ejemplo de la descripcion descrita en el presente documento (posteriormente), Pueden producirse fragmentos Fab mediante digestion enzimatica (por ejemplo, papama) de Ab5. En otro ejemplo de la descripcion, pueden producirse anticuerpos anti CGRP tales como Ab5 o fragmentos Fab de los mismos mediante expresion en celulas de mamffero tales como celulas CHO, NSO o HEK 293, sistemas fungicos, de insectos o microbianos tales como celulas de levadura (por ejemplo levadura diploide tal como Pichia diploide) y otras cepas de levadura. Las especies de Pichia adecuadas incluyen, pero sin limitacion, Pichia pastoris.
Anticuerpo Ab6
La presente invencion proporciona un anticuerpo anti CGRP humano que comprende un polipeptido de cadena ligera que tiene la secuencia de aminoacidos expuesta en la SEQ ID NO: 52 y un polipeptido de cadena pesada que tiene la secuencia de aminoacidos expuesta en la SEQ ID NO: 54. En un ejemplo, la descripcion incluye anticuerpos humanizados que tienen especificidad de union con CGRP y que poseen una secuencia de cadena ligera variable que comprende la secuencia expuesta a continuacion:
QVLTQSPSSLSASVGDRVTINCQASQSVYHNTYLAWYQQKPGKVPKQLIYDASTL
ASGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDVATYYCLGSYDCTNGDCFVFGGGTKVEIK
R (SEQ ID NO: 51).
La descripcion tambien incluye anticuerpos humanizados que tienen especificidad de union con CGRP y que poseen una secuencia de cadena ligera que comprende la secuencia expuesta a continuacion:
QVLTQSPSSLSASVGDRVTINCQASQSVYHNTYLAWYQQKPGKVPKQLIYDASTL
ASGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDVATYYCLGSYDCTNGDCFVFGGGTKVEIK
RT VAAP S VFIFPP SDEQLKS GT AS V V CLLNNF YPRE AKV Q WKVDN ALQ S GN S QE S
VTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
(SEQ ID NO: 52).
La descripcion incluye ademas anticuerpos humanizados que tienen especificidad de union con CGRP y que poseen una secuencia de cadena pesada variable que comprende la secuencia expuesta a continuacion:
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAVSGIDLSGYYMNWVRQAPGKGLEWVGVIGIN
GATYYASWAKGRFTISRDNSKTTVYLQMNSLRAEDTAVYFCARGDIWGQGTLVT
VSS (SEQ ID NO: 53).
La descripcion tambien incluye anticuerpos humanizados que tienen especificidad de union con CGRP y que poseen una secuencia de cadena pesada que comprende la secuencia expuesta a continuacion:
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAVSGIDLSGYYMNWVRQAPGKGLEWVGVIGIN
GATYYASWAKGRFTISRDNSKTTVYLQMNSLRAEDTAVYFCARGDIWGQGTLVT
VSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTF
PAVLQSSGLYSLSSWTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDARVEPKSCDKTHTC
PPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVWDVSHEDPEVKFNWYVDGV
EVHNAKTKPREEQYASTYRWSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTIS
KAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLYKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYK
TTPPVLDSDGSFFLYSKLTYDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
(SEQ ID NO: 54).
La descripcion contempla ademas anticuerpos que comprenden una o mas de las secuencias polipeptfdicas de SEQ ID NO: 55; SEQ ID NO: 56; y SEQ ID NO: 57 que corresponden a las regiones determinantes de complementariedad (CDR o regiones hipervariables) de la secuencia de cadena ligera variable de la SEQ ID NO: 51 o la secuencia de cadena ligera de la SEQ ID NO: 52, y/o una o mas de las secuencias polipeptfdicas de SEQ ID NO: 58; SEQ ID NO: 59; y SEQ ID NO: 60 que corresponden a las regiones determinantes de complementariedad (CDR o regiones hipervariables) de la secuencia de cadena pesada variable de la SEQ ID NO: 53 o la secuencia de cadena pesada de la SEQ ID NO: 54, o combinaciones de estas secuencias polipeptfdicas. En otro ejemplo de la descripcion, los anticuerpos de la descripcion o fragmentos de los mismos comprenden, o como alternativa consisten en, combinaciones de una o mas de las CDR, las secuencias de cadena pesada variable y ligera variable, y las secuencias de cadena pesada y ligera expuestas anteriormente, incluyendo todas ellas.
La descripcion tambien contempla fragmentos del anticuerpo que tiene especificidad de union con CGRP. En un ejemplo de la descripcion, los fragmentos de anticuerpo de la descripcion comprenden, o como alternativa consisten en, la secuencia polipeptfdica de la SEQ ID NO: 51 o la SEQ ID NO: 52. En otro ejemplo de la descripcion, los fragmentos de anticuerpo de la descripcion comprenden, o como alternativa consisten en, la secuencia polipeptidica de la SEQ ID NO: 53 o la SEQ ID NO: 54.
En un ejemplo adicional de la descripcion, los fragmentos del anticuerpo que tienen especificidad de union con CGRP comprenden, o como alternativa consisten en, una o mas de las secuencias polipeptfdicas de SEQ ID NO: 55; SEQ ID NO: 56; y SEQ ID NO: 57 que corresponden a las regiones determinantes de complementariedad (CDR o regiones hipervariables) de la secuencia de cadena ligera variable de la SEQ ID NO: 51 o la secuencia de cadena ligera de la SEQ ID NO: 52.
En un ejemplo adicional de la descripcion, los fragmentos del anticuerpo que tienen especificidad de union con CGRP comprenden, o como alternativa consisten en, una o mas de las secuencias polipeptfdicas de SEQ ID NO: 58; SEQ ID NO: 59; y SEQ ID NO: 60 que corresponden a las regiones determinantes de complementariedad (CDR o regiones hipervariables) de la secuencia de cadena pesada variable de la SEQ ID NO: 53 o la secuencia de cadena pesada de la SEQ ID NO: 54.
La descripcion tambien contempla fragmentos de anticuerpos que incluyen uno o mas de los fragmentos de anticuerpos descritos en el presente documento. En un ejemplo de la descripcion, los fragmentos de los anticuerpos que tienen especificidad de union con CGRP comprenden, o como alternativa consisten en, uno, dos, tres o mas, incluyendo todos los siguientes fragmentos de anticuerpos: la region de cadena ligera variable de la SEQ ID NO: 51; la region de cadena pesada variable de la SEQ ID NO: 53; las regiones determinantes de complementariedad (SEQ ID NO: 55; SEQ ID NO: 56; y SEQ ID NO: 57) de la region de cadena ligera variable de la SeQ ID NO: 51; y las regiones determinantes de complementariedad (SEQ ID NO: 58; SEQ ID NO: 59; y SEQ ID NO: 60) de la region de cadena pesada variable de la s Eq ID NO: 53.
Segun una realizacion de la invencion, el anticuerpo anti CGRP humanizado es Ab6, que comprende, o como alternativa que consiste en, SEQ ID NO: 52 y SEQ ID NO: 54, y que tiene al menos una de las actividades biologicas expuestas en el presente documento.
En un ejemplo adicional particularmente preferente de la descripcion, los fragmentos de anticuerpo comprenden, o como alternativa consisten en, fragmentos Fab (fragmento de union a antfgeno) que tienen especificidad de union por CGRP. Con respecto al anticuerpo Ab6, el fragmento Fab incluye la secuencia de cadena ligera variable de la SEQ ID NO: 51 y la secuencia de cadena pesada variable de la SEQ ID NO: 53. Este ejemplo de la descripcion contempla ademas adiciones, supresiones y variantes de la SEQ ID NO: 51 y/o la SEQ ID NO: 53 en dicho Fab conservando al mismo tiempo la especificidad de union por CGRP.
En un ejemplo de la descripcion descrita en el presente documento (posteriormente), Pueden producirse fragmentos Fab mediante digestion enzimatica (por ejemplo, papama) de Ab6. En otro ejemplo de la descripcion, pueden producirse anticuerpos anti CGRP tales como Ab6 o fragmentos Fab de los mismos mediante expresion en celulas de mamffero tales como celulas CHO, NSO o HEK 293, sistemas fungicos, de insectos o microbianos tales como celulas de levadura (por ejemplo levadura diploide tal como Pichia diploide) y otras cepas de levadura. Las especies de Pichia adecuadas incluyen, pero sin limitacion, Pichia pastoris.
Anticuerpo Ab7
En un ejemplo, la descripcion incluye anticuerpos quimericos que tienen especificidad de union con CGRP y que poseen una secuencia de cadena ligera variable que comprende la secuencia expuesta a continuacion:
QVLTQTASPVSAAVGSTVTINCQASQSVYNYNYLAWYQQKPGQPPKQLIYSTSTL
ASGVSSRFKGSGSGTQFTLTISDVQCDDAATYYCLGSYDCSTGDCFVFGGGTEW
VKR (SEQ ID NO: 61).
La descripcion tambien incluye anticuerpos quimericos que tienen especificidad de union con CGRP y que poseen una secuencia de cadena ligera que comprende la secuencia expuesta a continuacion:
QVLTQTASPVSAAVGSTVTINCQASQSVYNYNYLAWYQQKPGQPPKQLIYSTSTL
ASGVSSRFKGSGSGTQFTLTISDVQCDDAATYYCLGSYDCSTGDCFVFGGGTEW
VKRT VAAP S VFIFPP SDEQLKS GT AS W CLLNNF YPRE AKV Q WKVDN ALQ S GN S Q
ESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
(SEQ ID NO: 62).
La descripcion incluye ademas anticuerpos quimericos que tienen especificidad de union con CGRP y que poseen una secuencia de cadena pesada variable que comprende la secuencia expuesta a continuacion:
QEQLKESGGRLVTPGTSLTLTCTVSGIDLSNHYMQWVRQAPGKGLEWIGWGING
RTYYASWAKGRFTISRTSSTTVDLKMTRLTTEDTATYFCARGDIWGPGTLVTVSS
(SEQ ID NO: 63).
La descripcion tambien incluye anticuerpos quimericos que tienen especificidad de union con CGRP y que poseen una secuencia de cadena pesada que comprende la secuencia expuesta a continuacion:
QEQLKESGGRLVTPGTSLTLTCTVSGIDLSNHYMQWVRQAPGKGLEWIGWGING
RTYYASWAKGRFTISRTSSTTVDLKMTRLTTEDTATYFCARGDIWGPGTLVTVSSA
ST KGP S VFPL AP S SKST S GGT AALGCL VKD YFPEP VT VS WNS G ALTS G VHTFP AVL
QSSGLYSLSSWTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSCDKTHTCPPCP APELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCWVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEYH NAKTKPREEQYASTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAK GQPREPQ VYTLPP SREEMT KN Q V S LT CL VKGF YP SDIAVE WE SN GQPENNYKTTPP VLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSYMHEALHNHYTQKSLSLSPGK (SEQ ID NO: 64).
La descripcion contempla ademas anticuerpos que comprenden una o mas de las secuencias polipeptfdicas de SEQ ID NO: 65; SEQ ID NO: 66; y SEQ ID NO: 67 que corresponden a las regiones determinantes de complementariedad (CDR o regiones hipervariables) de la secuencia de cadena ligera variable de la SEQ ID NO: 61 o la secuencia de cadena ligera de la SEQ ID NO: 62, y/o una o mas de las secuencias polipeptfdicas de SEQ ID NO: 68; SEQ ID NO: 69; y SEQ ID NO: 70 que corresponden a las regiones determinantes de complementariedad (CDR o regiones hipervariables) de la secuencia de cadena pesada variable de la SEQ ID NO: 63 o la secuencia de cadena pesada de la SEQ ID NO: 64, o combinaciones de estas secuencias polipeptfdicas. En otro ejemplo de la descripcion, los anticuerpos de la descripcion o fragmentos de los mismos comprenden, o como alternativa consisten en, combinaciones de una o mas de las CDR, las secuencias de cadena pesada variable y ligera variable, y las secuencias de cadena pesada y ligera expuestas anteriormente, incluyendo todas ellas.
La descripcion tambien contempla fragmentos del anticuerpo que tiene especificidad de union con CGRP. En un ejemplo de la descripcion, los fragmentos de anticuerpo de la descripcion comprenden, o como alternativa consisten en, la secuencia polipeptfdica de la SEQ ID NO: 61 o la SEQ ID NO: 62. En otro ejemplo de la descripcion, los fragmentos de anticuerpo de la descripcion comprenden, o como alternativa consisten en, la secuencia polipeptfdica de la SEQ ID NO: 63 o la SEQ ID NO: 64.
En un ejemplo adicional de la descripcion, los fragmentos del anticuerpo que tienen especificidad de union con CGRP comprenden, o como alternativa consisten en, una o mas de las secuencias polipeptfdicas de SEQ ID NO: 65; SEQ ID NO: 66; y SEQ ID NO: 67 que corresponden a las regiones determinantes de complementariedad (CDR o regiones hipervariables) de la secuencia de cadena ligera variable de la SEQ ID NO: 61 o la secuencia de cadena ligera de la SEQ ID NO: 62.
En un ejemplo adicional de la descripcion, los fragmentos del anticuerpo que tienen especificidad de union con CGRP comprenden, o como alternativa consisten en, una o mas de las secuencias polipeptfdicas de SEQ ID NO: 68; SEQ ID NO: 69; y SEQ ID NO: 70 que corresponden a las regiones determinates de complementariedad (CDR o regiones hipervariables) de la secuencia de cadena pesada variable de la SEQ ID NO: 63 o la secuencia de cadena pesada de la SEQ ID NO: 64.
La descripcion tambien contempla fragmentos de anticuerpos que incluyen uno o mas de los fragmentos de anticuerpos descritos en el presente documento. En un ejemplo de la descripcion, los fragmentos de los anticuerpos que tienen especificidad de union con CGRP comprenden, o como alternativa consisten en, uno, dos, tres o mas, incluyendo todos los siguientes fragmentos de anticuerpos: la region de cadena ligera variable de la SEQ ID NO: 61; la region de cadena pesada variable de la SEQ ID NO: 63; las regiones determinantes de complementariedad (SEQ ID NO: 65; SEQ ID NO: 66; y SEQ ID NO: 67) de la region de cadena ligera variable de la SeQ ID NO: 61; y las regiones determinantes de complementariedad (SEQ ID NO: 68; SEQ ID NO: 69; y SEQ ID NO: 70) de la region de cadena pesada variable de la SEQ ID NO: 63.
En un ejemplo particularmente preferente de la descripcion, el anticuerpo anti CGRP quimerico es Ab7, que comprende, o como alternativa que consiste en, SEQ ID NO: 62 y SEQ ID NO: 64, y que tiene al menos una de las actividades biologicas expuestas en el presente documento.
En un ejemplo adicional particularmente preferente de la descripcion, los fragmentos de anticuerpo comprenden, o como alternativa consisten en, fragmentos Fab (fragmento de union a antfgeno) que tienen especificidad de union por CGRP. Con respecto al anticuerpo Ab7, el fragmento Fab incluye la secuencia de cadena ligera variable de la SEQ ID NO: 61 y la secuencia de cadena pesada variable de la SEQ ID NO: 63. Este ejemplo de la descripcion contempla ademas adiciones, supresiones y variantes de la SEQ ID NO: 61 y/o la SEQ ID NO: 63 en dicho Fab conservando al mismo tiempo la especificidad de union por CGRP.
En un ejemplo de la descripcion descrita en el presente documento (posteriormente), Pueden producirse fragmentos Fab mediante digestion enzimatica (por ejemplo, papama) de Ab7. En otro ejemplo de la descripcion, pueden producirse anticuerpos anti CGRP tales como Ab7 o fragmentos Fab de los mismos mediante expresion en celulas de mairnfero tales como celulas CHO, NSO o HEK 293, sistemas fungicos, de insectos o microbianos tales como celulas de levadura (por ejemplo levadura diploide tal como Pichia diploide) y otras cepas de levadura. Las especies de Pichia adecuadas incluyen, pero sin limitacion, Pichia pastoris.
Anticuerpo Ab8
En un ejemplo, la descripcion incluye anticuerpos humanizados que tienen especificidad de union con CGRP y que poseen una secuencia de cadena ligera variable que comprende la secuencia expuesta a continuacion:
QVLTQSPSSLSASVGDRVTINCQASQSVYNYNYLAWYQQKPGKVPKQLIYSTSTL
ASGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDVATYYCLGSYDCSTGDCFVFGGGTKVEIK
R (SEQ ID NO: 71).
La descripcion tambien incluye anticuerpos humanizados que tienen especificidad de union con CGRP y que poseen una secuencia de cadena ligera que comprende la secuencia expuesta a continuacion:
QVLTQSPSSLSASVGDRVTINCQASQSVYNYNYLAWYQQKPGKVPKQLIYSTSTL
ASGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDVATYYCLGSYDCSTGDCFVFGGGTKVEIK
RT VAAP S VFIFPP SDEQLKS GT AS V V CLLNNF YPRE AKV Q WKVDN ALQ S GN S QE S
VTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
(SEQ ID NO: 72).
La descripcion incluye ademas anticuerpos humanizados que tienen especificidad de union con CGRP y que poseen una secuencia de cadena pesada variable que comprende la secuencia expuesta a continuacion:
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAVSGIDLSNHYMQWVRQAPGKGLEWVGWGIN
GRTYYASWAKGRFTISRDNSKTTYYLQMNSLRAEDTAVYFCARGDIWGQGTLVT
VSS (SEQ ID NO: 73).
La descripcion tambien incluye anticuerpos humanizados que tienen especificidad de union con CGRP y que poseen una secuencia de cadena pesada que comprende la secuencia expuesta a continuacion:
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAVSGIDLSNHYMQWVRQAPGKGLEWVGVVGIN
GRTYYASWAKGRFTISRDNSKTTYYLQMNSLRAEDTAYYFCARGDIWGQGTLVT
V S S ASTKGP S VFPL AP S SKST S GGT AALGCL VKD YFPEP VT VS WNS GALT S G VHTF
PAVLQSSGLYSLSSWTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSCDKTHTC
PPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVWDVSHEDPEVKFNWYVDGV
EVHNAKTKPREEQYASTYRWSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTIS
KAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYK
TTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
(SEQ ID NO: 74).
La descripcion contempla ademas anticuerpos que comprenden una o mas de las secuencias polipeptfdicas de SEQ ID NO: 75; SEQ ID NO: 76; y SEQ ID NO: 77 que corresponden a las regiones determinates de complementariedad (CDR o regiones hipervariables) de la secuencia de cadena ligera variable de la SEQ ID NO: 71 o la secuencia de cadena ligera de la SEQ ID NO: 72, y/o una o mas de las secuencias polipeptfdicas de SEQ ID NO: 78; SEQ ID NO: 79; y SEQ ID NO: 80 que corresponden a las regiones determinantes de complementariedad (CDR o regiones hipervariables) de la secuencia de cadena pesada variable de la SEQ ID NO: 73 o la secuencia de cadena pesada de la SEQ ID NO: 74, o combinaciones de estas secuencias polipeptfdicas. En otro ejemplo de la descripcion, los anticuerpos de la descripcion o fragmentos de los mismos comprenden, o como alternativa consisten en, combinaciones de una o mas de las CDR, las secuencias de cadena pesada variable y ligera variable, y las secuencias de cadena pesada y ligera expuestas anteriormente, incluyendo todas ellas.
La descripcion tambien contempla fragmentos del anticuerpo que tiene especificidad de union con CGRP. En un ejemplo de la descripcion, los fragmentos de anticuerpo de la descripcion comprenden, o como alternativa consisten en, la secuencia polipeptfdica de la SEQ ID NO: 71 o la SEQ ID NO: 72. En otro ejemplo de la descripcion, los fragmentos de anticuerpo de la descripcion comprenden, o como alternativa consisten en, la secuencia polipeptfdica de la SEQ ID NO: 73 o la SEQ ID NO: 74.
En un ejemplo adicional de la descripcion, los fragmentos del anticuerpo que tienen especificidad de union con CGRP comprenden, o como alternativa consisten en, una o mas de las secuencias polipeptfdicas de SEQ ID NO: 75; SEQ ID NO: 76; y SEQ ID NO: 77 que corresponden a las regiones determinantes de complementariedad (CDR o regiones hipervariables) de la secuencia de cadena ligera variable de la SEQ ID NO: 71 o la secuencia de cadena ligera de la SEQ ID NO: 72.
En un ejemplo adicional de la descripcion, los fragmentos del anticuerpo que tienen especificidad de union con CGRP comprenden, o como alternativa consisten en, una o mas de las secuencias polipeptfdicas de SEQ ID NO: 78; SEQ ID NO: 79; y SEQ ID NO: 80 que corresponden a las regiones determinantes de complementariedad (CDR o regiones hipervariables) de la secuencia de cadena pesada variable de la SEQ ID NO: 73 o la secuencia de cadena pesada de la SEQ ID NO: 74.
La descripcion tambien contempla fragmentos de anticuerpos que incluyen uno o mas de los fragmentos de anticuerpos descritos en el presente documento. En un ejemplo de la descripcion, los fragmentos de los anticuerpos que tienen especificidad de union con CGRP comprenden, o como alternativa consisten en, uno, dos, tres o mas, incluyendo todos los siguientes fragmentos de anticuerpos: la region de cadena ligera variable de la SEQ ID NO: 71; la region de cadena pesada variable de la SEQ ID NO: 73; las regiones determinantes de complementariedad (SEQ ID NO: 75; SEQ ID NO: 76; y SEQ ID NO: 77) de la region de cadena ligera variable de la SeQ ID NO: 71; y las regiones determinantes de complementariedad (SEQ ID NO: 78; SEQ ID NO: 79; y SEQ ID NO: 80) de la region de cadena pesada variable de la s Eq ID NO: 73.
En un ejemplo particularmente preferente de la descripcion, el anticuerpo anti CGRP humanizado es Ab8, que comprende, o como alternativa que consiste en, SEQ ID NO: 72 y SEQ ID NO: 74, y que tiene al menos una de las actividades biologicas expuestas en el presente documento.
En un ejemplo adicional particularmente preferente de la descripcion, los fragmentos de anticuerpo comprenden, o como alternativa consisten en, fragmentos Fab (fragmento de union a antigeno) que tienen especificidad de union por CGRP. Con respecto al anticuerpo Ab8, el fragmento Fab incluye la secuencia de cadena ligera variable de la SEQ ID NO: 71 y la secuencia de cadena pesada variable de la SEQ ID NO: 73. Este ejemplo de la descripcion contempla ademas adiciones, supresiones y variantes de la SEQ ID NO: 71 y/o la SEQ ID NO: 73 en dicho Fab conservando al mismo tiempo la especificidad de union por CGRP.
En un ejemplo de la descripcion descrita en el presente documento (posteriormente), Pueden producirse fragmentos Fab mediante digestion enzimatica (por ejemplo, papama) de Ab8. En otro ejemplo de la descripcion, pueden producirse anticuerpos anti CGRP tales como Ab8 o fragmentos Fab de los mismos mediante expresion en celulas de mairnfero tales como celulas CHO, NSO o HEK 293, sistemas fungicos, de insectos o microbianos tales como celulas de levadura (por ejemplo levadura diploide tal como Pichia diploide) y otras cepas de levadura. Las especies de Pichia adecuadas incluyen, pero sin limitacion, Pichia pastoris.
Anticuerpo Ab9
En un ejemplo, la descripcion incluye anticuerpos quimericos que tienen especificidad de union con CGRP y que poseen una secuencia de cadena ligera variable que comprende la secuencia expuesta a continuacion:
QVLTQTPSPVSAAVGSTVTINCQASQNVYNNNYLAWYQQKPGQPPKQLIYSTSTL
ASGVSSRFRGSGSGTQFTLTISDVQCDDAATYYCLGSYDCSRGDCFVFGGGTEW
VKR (SEQ ID NO: 81).
La descripcion tambien incluye anticuerpos quimericos que tienen especificidad de union con CGRP y que poseen una secuencia de cadena ligera que comprende la secuencia expuesta a continuacion:
QVLTQTPSPVSAAVGSTVTINCQASQNVYNNNYLAWYQQKPGQPPKQLIYSTSTL
ASGVSSRFRGSGSGTQFTLTISDVQCDDAATYYCLGSYDCSRGDCFVFGGGTEW
VKRT VAAP S VFIFPP SDEQLKS GT AS W CLLNNF YPRE AKV Q WKVDN ALQ S GN S Q
ESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
(SEQ ID NO: 82).
La descripcion incluye ademas anticuerpos quimericos que tienen especificidad de union con CGRP y que poseen una secuencia de cadena pesada variable que comprende la secuencia expuesta a continuacion:
QSLEESGGRLVTPGTPLTLTCTVSGIGLSSYYMQWVRQSPGRGLEWIGVIGSDGKT
YY AT WAKGRFTISKT S S TT VD LRM ASLTTEDT AT YF CTRGDIW GP GTL VT V S S
(SEQ ID NO: 83).
La descripcion tambien incluye anticuerpos quimericos que tienen especificidad de union con CGRP y que poseen una secuencia de cadena pesada que comprende la secuencia expuesta a continuacion:
QSLEESGGRLVTPGTPLTLTCTVSGIGLSSYYMQWVRQSPGRGLEWIGVIGSDGKT
YY AT WAKGRFTISKTS STT VDLRMASLTTEDT ATYF CTRGDIWGPGTLVT V S S AST
KGP S VFPL AP S SKST S GGT AALGCLVKD YFPEP VT V S WN S G ALTS G VHTFP A VLQ S
SGLY SLS S W T VPS S SLGT QTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSCDKTHT CPPCP APE
LLGGPSYFLFPPKPKDTLMISRTPEYTCYWDYSHEDPEYKFNWYYDGYEYHNAK
TKPREEQYASTYRWSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQP
REPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLD
SDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK (SEQ ID
NO: 84).
La descripcion contempla ademas anticuerpos que comprenden una o mas de las secuencias polipeptidicas de SEQ ID NO: 85; SEQ ID NO: 86; y SEQ ID NO: 87 que corresponden a las regiones determinates de complementariedad (CDR o regiones hipervariables) de la secuencia de cadena ligera variable de la SEQ ID NO: 81 o la secuencia de cadena ligera de la SEQ ID NO: 82, y/o una o mas de las secuencias polipeptidicas de SEQ ID NO: 88; SEQ ID NO: 89; y SEQ ID NO: 90 que corresponden a las regiones determinates de complementariedad (CDR o regiones hipervariables) de la secuencia de cadena pesada variable de la SEQ ID NO: 83 o la secuencia de cadena pesada de la SEQ ID NO: 84, o combinaciones de estas secuencias polipeptidicas. En otro ejemplo de la descripcion, los anticuerpos de la descripcion o fragmentos de los mismos comprenden, o como alternativa consisten en, combinaciones de una o mas de las CDR, las secuencias de cadena pesada variable y ligera variable, y las secuencias de cadena pesada y ligera expuestas anteriormente, incluyendo todas ellas.
La descripcion tambien contempla fragmentos del anticuerpo que tiene especificidad de union con CGRP. En un ejemplo de la descripcion, los fragmentos de anticuerpo de la descripcion comprenden, o como alternativa consisten en, la secuencia polipeptfdica de la SEQ ID NO: 81 o la SEQ ID NO: 82. En otro ejemplo de la descripcion, los fragmentos de anticuerpo de la descripcion comprenden, o como alternativa consisten en, la secuencia polipeptfdica de la SEQ ID NO: 83 o la SEQ ID NO: 84.
En un ejemplo adicional de la descripcion, los fragmentos del anticuerpo que tienen especificidad de union con CGRP comprenden, o como alternativa consisten en, una o mas de las secuencias polipeptfdicas de SEQ ID NO: 85; SEQ ID NO: 86; y SEQ ID NO: 87 que corresponden a las regiones determinantes de complementariedad (CDR o regiones hipervariables) de la secuencia de cadena ligera variable de la SEQ ID NO: 81 o la secuencia de cadena ligera de la SEQ ID NO: 82.
En un ejemplo adicional de la descripcion, los fragmentos del anticuerpo que tienen especificidad de union con CGRP comprenden, o como alternativa consisten en, una o mas de las secuencias polipeptfdicas de SEQ ID NO: 88; SEQ ID NO: 89; y SEQ ID NO: 90 que corresponden a las regiones determinantes de complementariedad (CDR o regiones hipervariables) de la secuencia de cadena pesada variable de la SEQ ID NO: 83 o la secuencia de cadena pesada de la SEQ ID NO: 84.
La descripcion tambien contempla fragmentos de anticuerpos que incluyen uno o mas de los fragmentos de anticuerpos descritos en el presente documento. En un ejemplo de la descripcion, los fragmentos de los anticuerpos que tienen especificidad de union con CGRP comprenden, o como alternativa consisten en, uno, dos, tres o mas, incluyendo todos los siguientes fragmentos de anticuerpos: la region de cadena ligera variable de la SEQ ID NO: 81; la region de cadena pesada variable de la SEQ ID NO: 83; las regiones determinantes de complementariedad (SEQ ID NO: 85; SEQ ID NO: 86; y SEQ ID NO: 87) de la region de cadena ligera variable de la SeQ ID NO: 81; y las regiones determinantes de complementariedad (SEQ ID NO: 88; SEQ ID NO: 89; y SEQ ID NO: 90) de la region de cadena pesada variable de la s Eq ID NO: 83.
En un ejemplo particularmente preferente de la descripcion, el anticuerpo anti CGRP quimerico es Ab9, que comprende, o como alternativa que consiste en, SEQ ID NO: 82 y SEQ ID NO: 84, y que tiene al menos una de las actividades biologicas expuestas en el presente documento.
En un ejemplo adicional particularmente preferente de la descripcion, los fragmentos de anticuerpo comprenden, o como alternativa consisten en, fragmentos Fab (fragmento de union a antfgeno) que tienen especificidad de union por CGRP. Con respecto al anticuerpo Ab9, el fragmento Fab incluye la secuencia de cadena ligera variable de la SEQ ID NO: 81 y la secuencia de cadena pesada variable de la SEQ ID NO: 83. Este ejemplo de la descripcion contempla ademas adiciones, supresiones y variantes de la SEQ ID NO: 81 y/o la SEQ ID NO: 83 en dicho Fab conservando al mismo tiempo la especificidad de union por CGRP.
En un ejemplo de la descripcion descrita en el presente documento (posteriormente), Pueden producirse fragmentos Fab mediante digestion enzimatica (por ejemplo, papama) de Ab9. En otro ejemplo de la descripcion, pueden producirse anticuerpos anti CGRP tales como Ab9 o fragmentos Fab de los mismos mediante expresion en celulas de mairnfero tales como celulas CHO, NSO o HEK 293, sistemas fungicos, de insectos o microbianos tales como celulas de levadura (por ejemplo levadura diploide tal como Pichia diploide) y otras cepas de levadura. Las especies de Pichia adecuadas incluyen, pero sin limitacion, Pichia pastoris.
Anticuerpo Ab10
En un ejemplo, la descripcion incluye anticuerpos humanizados que tienen especificidad de union con CGRP y que poseen una secuencia de cadena ligera variable que comprende la secuencia expuesta a continuacion:
QVLTQSPSSLSASVGDRVTINCQASQNVYNNNYLAWYQQKPGKVPKQLIYSTSTL
ASGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDVATYYCLGSYDCSRGDCFVFGGGTKVEIK
R (SEQ ID NO: 91).
La descripcion tambien incluye anticuerpos humanizados que tienen especificidad de union con CGRP y que poseen una secuencia de cadena ligera que comprende la secuencia expuesta a continuacion:
QVLTQSPSSLSASVGDRVTINCQASQNVYNNNYLAWYQQKPGKVPKQLIYSTSTL
ASGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDVATYYCLGSYDCSRGDCFVFGGGTKVEIK
RT VAAP S VFIFPP SDEQLKS GT AS W CLLNNF YPRE AKVQ WKVDN ALQ S GN S QE S
VTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
(SEQ ID NO: 92).
La descripcion incluye ademas anticuerpos humanizados que tienen especificidad de union con CGRP y que poseen una secuencia de cadena pesada variable que comprende la secuencia expuesta a continuacion:
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAVSGIGLSSYYMQWVRQAPGKGLEWVGVIGSD
GKTYYATWAKGRFTISRDNSKTTVYLQMNSLRAEDTAVYFCTRGDIWGQGTLVT
VSS (SEQ ID NO: 93).
La descripcion tambien incluye anticuerpos humanizados que tienen especificidad de union con CGRP y que poseen una secuencia de cadena pesada que comprende la secuencia expuesta a continuacion:
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAVSGIGLSSYYMQWVRQAPGKGLEWVGVIGSD
GKTYYATWAKGRFTISRDNSKTTVYLQMNSLRAEDTAVYFCTRGDIWGQGTLYT
V S S ASTKGP S VFPL AP S SKST S GGT AALGCL VKD YFPEP VT V S WN S GALT S G VHTF
PAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSCDKTHTC
PPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVWDVSHEDPEVKFNWYVDGV
EVHNAKTKPREEQYASTYRWSVLTVLHQDWLNGKEYKCKYSNKALPAPIEKTIS
KAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYK
TTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
(SEQ ID NO: 94).
La descripcion contempla ademas anticuerpos que comprenden una o mas de las secuencias polipeptfdicas de SEQ ID NO: 95; SEQ ID NO: 96; y SEQ ID NO: 97 que corresponden a las regiones determinates de complementariedad (CDR o regiones hipervariables) de la secuencia de cadena ligera variable de la SEQ ID NO: 91 o la secuencia de cadena ligera de la SEQ ID NO: 92, y/o una o mas de las secuencias polipeptidicas de SEQ ID NO: 98; SEQ ID NO: 99; y SEQ ID NO: 100 que corresponden a las regiones determinates de complementariedad (CDR o regiones hipervariables) de la secuencia de cadena pesada variable de la SEQ ID NO: 93 o la secuencia de cadena pesada de la SEQ ID NO: 94, o combinaciones de estas secuencias polipeptidicas. En otro ejemplo de la descripcion, los anticuerpos de la descripcion o fragmentos de los mismos comprenden, o como alternativa consisten en, combinaciones de una o mas de las CDR, las secuencias de cadena pesada variable y ligera variable, y las secuencias de cadena pesada y ligera expuestas anteriormente, incluyendo todas ellas.
La descripcion tambien contempla fragmentos del anticuerpo que tiene especificidad de union con CGRP. En un ejemplo de la descripcion, los fragmentos de anticuerpo de la descripcion comprenden, o como alternativa consisten en, la secuencia polipeptfdica de la SEQ ID NO: 91 o la SEQ ID NO: 92. En otro ejemplo de la descripcion, los fragmentos de anticuerpo de la descripcion comprenden, o como alternativa consisten en, la secuencia polipeptfdica de la SEQ ID NO: 93 o la SEQ ID NO: 94.
En un ejemplo adicional de la descripcion, los fragmentos del anticuerpo que tienen especificidad de union con CGRP comprenden, o como alternativa consisten en, una o mas de las secuencias polipeptfdicas de SEQ ID NO: 95; SEQ ID NO: 96; y SEQ ID NO: 97 que corresponden a las regiones determinantes de complementariedad (CDR o regiones hipervariables) de la secuencia de cadena ligera variable de la SEQ ID NO: 91 o la secuencia de cadena ligera de la SEQ ID NO: 92.
En un ejemplo adicional de la descripcion, los fragmentos del anticuerpo que tienen especificidad de union con CGRP comprenden, o como alternativa consisten en, una o mas de las secuencias polipeptfdicas de SEQ ID NO: 98; SEQ ID NO: 99; y SEQ ID NO: 100 que corresponden a las regiones determinantes de complementariedad (CDR o regiones hipervariables) de la secuencia de cadena pesada variable de la SEQ ID NO: 93 o la secuencia de cadena pesada de la SEQ ID NO: 94.
La descripcion tambien contempla fragmentos de anticuerpos que incluyen uno o mas de los fragmentos de anticuerpos descritos en el presente documento. En un ejemplo de la descripcion, los fragmentos de los anticuerpos que tienen especificidad de union con CGRP comprenden, o como alternativa consisten en, uno, dos, tres o mas, incluyendo todos los siguientes fragmentos de anticuerpos: la region de cadena ligera variable de la SEQ ID NO: 91; la region de cadena pesada variable de la SEQ ID NO: 93; las regiones determinantes de complementariedad (SEQ ID NO: 95; SEQ ID NO: 96; y SEQ ID NO: 97) de la region de cadena ligera variable de la SeQ ID NO: 91; y las regiones determinantes de complementariedad (SEQ ID NO: 98; SEQ ID NO: 99; y SEQ ID NO: 100) de la region de cadena pesada variable de la SEQ ID NO: 93.
En un ejemplo particularmente preferente de la descripcion, el anticuerpo anti CGRP humanizado es Ab10, que comprende, o como alternativa que consiste en, SEQ ID NO: 92 y SEQ ID NO: 94, y que tiene al menos una de las actividades biologicas expuestas en el presente documento.
En un ejemplo adicional particularmente preferente de la descripcion, los fragmentos de anticuerpo comprenden, o como alternativa consisten en, fragmentos Fab (fragmento de union a antfgeno) que tienen especificidad de union por CGRP. Con respecto al anticuerpo Ab10, el fragmento Fab incluye la secuencia de cadena ligera variable de la SEQ ID NO: 91 y la secuencia de cadena pesada variable de la SEQ ID NO: 93. Este ejemplo de la descripcion contempla ademas adiciones, supresiones y variantes de la SEQ ID NO: 91 y/o la SEQ ID NO: 93 en dicho Fab conservando al mismo tiempo la especificidad de union por CGRP.
En un ejemplo de la descripcion descrita en el presente documento (posteriormente), Pueden producirse fragmentos Fab mediante digestion enzimatica (por ejemplo, papama) de Ab10. En otro ejemplo de la descripcion, pueden producirse anticuerpos anti CGRP tales como Ab10 o fragmentos Fab de los mismos mediante expresion en celulas de mairnfero tales como celulas CHO, NSO o HEK 293, sistemas fungicos, de insectos o microbianos tales como celulas de levadura (por ejemplo levadura diploide tal como Pichia diploide) y otras cepas de levadura. Las especies de Pichia adecuadas incluyen, pero sin limitacion, Pichia pastoris.
Anticuerpo Ab11
En un ejemplo, la descripcion incluye anticuerpos quimericos que tienen especificidad de union con CGRP y que poseen una secuencia de cadena ligera variable que comprende la secuencia expuesta a continuacion:
QVLTQTASPVSPAVGSTVTINCRASQSVYYNNYLAWYQQKPGQPPKQLIYSTSTLA
SGVSSRFKGSGSGTQFTLTISDVQCDDAATYYCLGSYDCSNGDCFVFGGGTEVW
KR (SEQ ID NO: 101).
La descripcion tambien incluye anticuerpos quimericos que tienen especificidad de union con CGRP y que poseen una secuencia de cadena ligera que comprende la secuencia expuesta a continuacion:
QVLTQTASPVSPAVGSTVTINCRASQSVYYNNYLAWYQQKPGQPPKQLIYSTSTLA
SGVSSRFKGSGSGTQFTLTISDVQCDDAATYYCLGSYDCSNGDCFVFGGGTEVW
KRT VAAP S VFIFPP SDEQLKS GT AS W CLLNNF YPRE AKV Q WKVDN ALQ S GN S QE
SVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
(SEQ ID NO: 102).
La descripcion incluye ademas anticuerpos quimericos que tienen especificidad de union con CGRP y que poseen una secuencia de cadena pesada variable que comprende la secuencia expuesta a continuacion:
QSLEESGGRLVTPGGSLTLTCTVSGIDVTNYYMQWVRQAPGKGLEWIGVIGVNGK
RYYASWAKGRFTISKTSSTTVDLKMTSLTTEDTATYFCARGDIWGPGTLVTVSS
(SEQ ID NO: 103).
La descripcion tambien incluye anticuerpos quimericos que tienen especificidad de union con CGRP y que poseen una secuencia de cadena pesada que comprende la secuencia expuesta a continuacion:
QSLEESGGRLVTPGGSLTLTCTVSGIDVTNYYMQWVRQAPGKGLEWIGVIGVNGK
RYYASWAKGRFTISKTSSTTVDLKMTSLTTEDTATYFCARGDIWGPGTLVTVSSAS
TKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQ
S S GEY SFS S V YT VP S S SFGT QT YICNVNHKP SNTKVDKRVEPKS CDKTHT CPPCP AP
EFFGGPSVFFFPPKPKDTFMISRTPEVTCVWDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNA
KTKPREEQYASTYRVVSVFTVFHQDWFNGKEYKCKVSNKAFPAPIEKTISKAKGQ
PREPQVYTFPPSREEMTKNQVSFTCFVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVF
DSDGSFFEYSKFTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEAEHNHYTQKSESESPGK (SEQ ID
NO: 104).
La descripcion contempla ademas anticuerpos que comprenden una o mas de las secuencias polipeptfdicas de SEQ ID NO: 105; SEQ ID NO: 106; y SeQ ID NO: 107 que corresponden a las regiones determinates de complementariedad (CDR o regiones hipervariables) de la secuencia de cadena ligera variable de la SEQ ID NO: 101 o la secuencia de cadena ligera de la SEQ ID NO: 102, y/o una o mas de las secuencias polipeptfdicas de SEQ ID NO: 108; SEQ ID NO: 109; y SEQ ID NO: 110 que corresponden a las regiones determinates de complementariedad (CDR o regiones hipervariables) de la secuencia de cadena pesada variable de la SEQ ID NO: 103 o la secuencia de cadena pesada de la SEQ ID NO: 104, o combinaciones de estas secuencias polipeptidicas. En otro ejemplo de la descripcion, los anticuerpos de la descripcion o fragmentos de los mismos comprenden, o como alternativa consisten en, combinaciones de una o mas de las CDR, las secuencias de cadena pesada variable y ligera variable, y las secuencias de cadena pesada y ligera expuestas anteriormente, incluyendo todas ellas. La descripcion tambien contempla fragmentos del anticuerpo que tiene especificidad de union con CGRP. En un ejemplo de la descripcion, los fragmentos de anticuerpo de la descripcion comprenden, o como alternativa consisten en, la secuencia polipeptfdica de la SEQ ID NO: 101 o la SEQ ID NO: 102. En otro ejemplo de la descripcion, los fragmentos de anticuerpo de la descripcion comprenden, o como alternativa consisten en, la secuencia polipeptfdica de la SEQ ID NO: 103 o la SEQ ID NO: 104.
En un ejemplo adicional de la descripcion, los fragmentos del anticuerpo que tienen especificidad de union con CGRP comprenden, o como alternativa consisten en, una o mas de las secuencias polipeptfdicas de SEQ ID NO: 105; SEQ ID NO: 106; y SEQ ID NO: 107 que corresponden a las regiones determinantes de complementariedad (CDR o regiones hipervariables) de la secuencia de cadena ligera variable de la SEQ ID NO: 101 o la secuencia de cadena ligera de la SEQ ID NO: 102.
En un ejemplo adicional de la descripcion, los fragmentos del anticuerpo que tienen especificidad de union con CGRP comprenden, o como alternativa consisten en, una o mas de las secuencias polipeptfdicas de SEQ ID NO: 108; SEQ ID NO: 109; y SEQ ID NO: 110 que corresponden a las regiones determinantes de complementariedad (CDR o regiones hipervariables) de la secuencia de cadena pesada variable de la SEQ ID NO: 103 o la secuencia de cadena pesada de la SEQ ID NO: 104.
La descripcion tambien contempla fragmentos de anticuerpos que incluyen uno o mas de los fragmentos de anticuerpos descritos en el presente documento. En un ejemplo de la descripcion, los fragmentos de los anticuerpos que tienen especificidad de union con CGRP comprenden, o como alternativa consisten en, uno, dos, tres o mas, incluyendo todos los siguientes fragmentos de anticuerpos: la region de cadena ligera variable de la SEQ ID NO: 101; la region de cadena pesada variable de la SEQ ID NO: 103; las regiones determinantes de complementariedad (SEQ ID NO: 105; SEQ ID NO: 106; y SEQ ID NO: 107) de la region de cadena ligera variable de la SEQ ID NO: 101; y las regiones determinantes de complementariedad (SEQ ID NO: 108; SEQ ID NO: 109; y SEQ ID NO: 110) de la region de cadena pesada variable de la SEQ ID NO: 103.
En un ejemplo particularmente preferente de la descripcion, el anticuerpo anti CGRP quimerico es Ab11, que comprende, o como alternativa que consiste en, SEQ ID NO: 102 y SEQ ID NO: 104, y que tiene al menos una de las actividades biologicas expuestas en el presente documento.
En un ejemplo adicional particularmente preferente de la descripcion, los fragmentos de anticuerpo comprenden, o como alternativa consisten en, fragmentos Fab (fragmento de union a antfgeno) que tienen especificidad de union por CGRP. Con respecto al anticuerpo Ab11, el fragmento Fab incluye la secuencia de cadena ligera variable de la SEQ ID NO: 101 y la secuencia de cadena pesada variable de la s Eq ID NO: 103. Este ejemplo de la descripcion contempla ademas adiciones, supresiones y variantes de la SEQ ID NO: 101 y/o la SEQ ID NO: 103 en dicho Fab conservando al mismo tiempo la especificidad de union por CGRP.
En un ejemplo de la descripcion descrita en el presente documento (posteriormente), Pueden producirse fragmented Fab mediante digestion enzimatica (por ejemplo, papama) de Ab11. En otro ejemplo de la descripcion, pueden producirse anticuerpos anti CGRP tales como Ab11 o fragmentos Fab de los mismos mediante expresion en celulas de mamffero tales como celulas CHO, NSO o HEK 293, sistemas fungicos, de insectos o microbianos tales como celulas de levadura (por ejemplo levadura diploide tal como Pichia diploide) y otras cepas de levadura. Las especies de Pichia adecuadas incluyen, pero sin limitacion, Pichia pastoris.
Anticuerpo Ab12
En un ejemplo, la descripcion incluye anticuerpos humanizados que tienen especificidad de union con CGRP y que poseen una secuencia de cadena ligera variable que comprende la secuencia expuesta a continuacion:
QVLTQSPSSLSASVGDRVTINCRASQSVYYNNYLAWYQQKPGKVPKQLIYSTSTL
ASGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDVATYYCLGSYDCSNGDCFVFGGGTKVEIK
R (SEQ ID NO: 111).
La descripcion tambien incluye anticuerpos humanizados que tienen especificidad de union con CGRP y que poseen una secuencia de cadena ligera que comprende la secuencia expuesta a continuacion:
QVLTQSPSSLSASVGDRVTINCRASQSVYYNNYLAWYQQKPGKVPKQLIYSTSTL
ASGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDVATYYCLGSYDCSNGDCFVFGGGTKVEIK
RT VAAP S VFIFPP SDEQLKS GT AS V V CLLNNF YPRE AKV Q WKVDN ALQ S GN S QE S
VTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
(SEQ ID NO: 112).
La descripcion incluye ademas anticuerpos humanizados que tienen especificidad de union con CGRP y que poseen una secuencia de cadena pesada variable que comprende la secuencia expuesta a continuacion:
E V QL VE S GGGL V QP GGSLRLS C AV S GID VTN YYMQ WVRQ APGKGLE WV G VIGVN
GKRYYASWAKGRFTISRDNSKTTVYLQMNSLRAEDTAVYFCARGDIWGQGTLVT
VSS (SEQ ID NO: 113).
La descripcion tambien incluye anticuerpos humanizados que tienen especificidad de union con CGRP y que poseen una secuencia de cadena pesada que comprende la secuencia expuesta a continuacion:
E V QL VE S GGGL V QP GGSLRLS C AV S GID VTN YYMQ WVRQ APGKGLE WV G VIGVN
GKRYYASWAKGRFTISRDNSKTTVYLQMNSLRAEDTAVYFCARGDIWGQGTLVT
V S S ASTKGP S VFPL AP S SKST S GGT AALGCL VKD YFPEP VT VS WNS GALT S G VHTF
PAVLQSSGLYSLSSWTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSCDKTHTC
PPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVWDVSHEDPEVKFNWYVDGV
E VHN AKT KPREEQ Y A STY R W S VLT VLHQD WLN GKEYKCKV SNKALP AP IEKT IS
KAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYK
TTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
(SEQ ID NO: 114).
La descripcion contempla ademas anticuerpos que comprenden una o mas de las secuencias polipeptidicas de SEQ ID NO: 115; SEQ ID NO: 116; y SeQ ID NO: 117 que corresponden a las regiones determinates de complementariedad (CDR o regiones hipervariables) de la secuencia de cadena ligera variable de la SEQ ID NO: 111 o la secuencia de cadena ligera de la SEQ ID NO: 112, y/o una o mas de las secuencias polipeptidicas de SEQ ID NO: 118; SEQ ID NO: 119; y SEQ ID NO: 120 que corresponden a las regiones determinates de complementariedad (CDR o regiones hipervariables) de la secuencia de cadena pesada variable de la SEQ ID NO: 113 o la secuencia de cadena pesada de la SEQ ID NO: 114, o combinaciones de estas secuencias polipeptfdicas. En otro ejemplo de la descripcion, los anticuerpos de la descripcion o fragmentos de los mismos comprenden, o como alternativa consisten en, combinaciones de una o mas de las CDR, las secuencias de cadena pesada variable y ligera variable, y las secuencias de cadena pesada y ligera expuestas anteriormente, incluyendo todas ellas. La descripcion tambien contempla fragmentos del anticuerpo que tiene especificidad de union con CGRP. En un ejemplo de la descripcion, los fragmentos de anticuerpo de la descripcion comprenden, o como alternativa consisten en, la secuencia polipeptfdica de la SEQ ID NO: 111 o la SEQ ID NO: 112. En otro ejemplo de la descripcion, los fragmentos de anticuerpo de la descripcion comprenden, o como alternativa consisten en, la secuencia polipeptfdica de la SEQ ID NO: 113 o la SEQ ID NO: 114.
En un ejemplo adicional de la descripcion, los fragmentos del anticuerpo que tienen especificidad de union con CGRP comprenden, o como alternativa consisten en, una o mas de las secuencias polipeptfdicas de SEQ ID NO: 115; SEQ ID NO: 116; y SEQ ID NO: 117 que corresponden a las regiones determinantes de complementariedad (CDR o regiones hipervariables) de la secuencia de cadena ligera variable de la SEQ ID NO: 111 o la secuencia de cadena ligera de la SEQ ID NO: 112.
En un ejemplo adicional de la descripcion, los fragmentos del anticuerpo que tienen especificidad de union con CGRP comprenden, o como alternativa consisten en, una o mas de las secuencias polipeptfdicas de SEQ ID NO: 118; SEQ ID NO: 119; y SEQ ID NO: 120 que corresponden a las regiones determinantes de complementariedad (CDR o regiones hipervariables) de la secuencia de cadena pesada variable de la SEQ ID NO: 113 o la secuencia de cadena pesada de la SEQ ID NO: 114.
La descripcion tambien contempla fragmentos de anticuerpos que incluyen uno o mas de los fragmentos de anticuerpos descritos en el presente documento. En un ejemplo de la descripcion, los fragmentos de los anticuerpos que tienen especificidad de union con CGRP comprenden, o como alternativa consisten en, uno, dos, tres o mas, incluyendo todos los siguientes fragmentos de anticuerpos: la region de cadena ligera variable de la SEQ ID NO: 111; la region de cadena pesada variable de la SEQ ID NO: 113; las regiones determinantes de complementariedad (SEQ ID NO: 115; SEQ ID NO: 116; y SEQ ID NO: 117) de la region de cadena ligera variable de la SEQ ID NO: 111; y las regiones determinantes de complementariedad (SEQ ID NO: 118; SEQ ID NO: 119; y SEQ ID NO: 120) de la region de cadena pesada variable de la SEQ ID NO: 113.
En un ejemplo particularmente preferente de la descripcion, el anticuerpo anti CGRP humanizado es Ab12, que comprende, o como alternativa que consiste en, SEQ ID NO: 112 y SEQ ID NO: 114, y que tiene al menos una de las actividades biologicas expuestas en el presente documento.
En un ejemplo adicional particularmente preferente de la descripcion, los fragmentos de anticuerpo comprenden, o como alternativa consisten en, fragmentos Fab (fragmento de union a antfgeno) que tienen especificidad de union por CGRP. Con respecto al anticuerpo Ab12, el fragmento Fab incluye la secuencia de cadena ligera variable de la SEQ ID NO: 111 y la secuencia de cadena pesada variable de la s Eq ID NO: 113. Este ejemplo de la descripcion contempla ademas adiciones, supresiones y variantes de la SEQ ID NO: 111 y/o la SEQ ID NO: 113 en dicho Fab conservando al mismo tiempo la especificidad de union por CGRP.
En un ejemplo de la descripcion descrita en el presente documento (posteriormente), Pueden producirse fragmentos Fab mediante digestion enzimatica (por ejemplo, papama) de Ab12. En otro ejemplo de la descripcion, pueden producirse anticuerpos anti CGRP tales como Ab12 o fragmentos Fab de los mismos mediante expresion en celulas de mairnfero tales como celulas CHO, NSO o HEK 293, sistemas fungicos, de insectos o microbianos tales como celulas de levadura (por ejemplo levadura diploide tal como Pichia diploide) y otras cepas de levadura. Las especies de Pichia adecuadas incluyen, pero sin limitacion, Pichia pastoris.
Anticuerpo Ab13
En un ejemplo, la descripcion incluye anticuerpos quimericos que tienen especificidad de union con CGRP y que poseen una secuencia de cadena ligera variable que comprende la secuencia expuesta a continuacion:
AIVMTQTPSSKSVPVGDTVTINCQASESLYNNNALAWFQQKPGQPPKRLIYDASKL
ASGVPSRFSGGGSGTQFTLTISGVQCDDAATYYCGGYRSDSVDGVAFAGGTEVW
KR (SEQ ID NO: 121).
La descripcion tambien incluye anticuerpos quimericos que tienen especificidad de union con CGRP y que poseen una secuencia de cadena ligera que comprende la secuencia expuesta a continuacion:
AIVMTQTPSSKSVPVGDTVTINCQASESLYNNNALAWFQQKPGQPPKRLIYDASKL
ASGVPSRFSGGGSGTQFTFTISGVQCDDAATYYCGGYRSDSVDGVAFAGGTEVW
KRT VAAP S VFIFPP SDEQFKS GT AS W CFFNNF YPRE AKV Q WKVDN AEQ S GN S QE
SVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
(SEQ ID NO: 122).
La descripcion incluye ademas anticuerpos quimericos que tienen especificidad de union con CGRP y que poseen una secuencia de cadena pesada variable que comprende la secuencia expuesta a continuacion:
QSVEESGGGLVQPEGSLTLTCTASGFDFSSNAMWWVRQAPGKGLEWIGIIYNGDG
STYYASWVNGRFSISKTSSTTVTLQLNSLTVADTATYYCARDLDLWGPGTLVTVS
S (SEQ ID NO: 123).
La descripcion tambien incluye anticuerpos quimericos que tienen especificidad de union con CGRP y que poseen una secuencia de cadena pesada que comprende la secuencia expuesta a continuacion:
QSVEESGGGLVQPEGSLTLTCTASGFDFSSNAMWWVRQAPGKGLEWIGCIYNGD
GSTYYASWVNGRFSISKTSSTTVTLQLNSLTVADTATYYCARDLDLWGPGTLVTV
S S ASTKGP S VFPL AP S SKST S GGT AALGCL VKD YFPEP VT VS WNS GALT S G VHTFP
AVLQ S S GLY SLS S W T VP S S SLGT QT YICNVNHKP SNT KVDKRVEPKS CDKTHT CP
PCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVWDVSHEDPEVKFNWYVDGVE
VHNAKTKPREEQYASTYRWSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISK
AKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKT
TPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
(SEQ ID NO: 124).
La descripcion contempla ademas anticuerpos que comprenden una o mas de las secuencias polipeptidicas de SEQ ID NO: 125; SEQ ID NO: 126; y Se Q ID NO: 127 que corresponden a las regiones determinates de complementariedad (CDR o regiones hipervariables) de la secuencia de cadena ligera variable de la SEQ ID NO: 121 o la secuencia de cadena ligera de la SEQ ID NO: 122, y/o una o mas de las secuencias polipeptfdicas de SEQ ID NO: 128; SEQ ID NO: 129; y SEQ ID NO: 130 que corresponden a las regiones determinates de complementariedad (CDR o regiones hipervariables) de la secuencia de cadena pesada variable de la SEQ ID NO: 123 o la secuencia de cadena pesada de la SEQ ID NO: 124, o combinaciones de estas secuencias polipeptfdicas. En otro ejemplo de la descripcion, los anticuerpos de la descripcion o fragmentos de los mismos comprenden, o como alternativa consisten en, combinaciones de una o mas de las CDR, las secuencias de cadena pesada variable y ligera variable, y las secuencias de cadena pesada y ligera expuestas anteriormente, incluyendo todas ellas.
La descripcion tambien contempla fragmentos del anticuerpo que tiene especificidad de union con CGRP. En un ejemplo de la descripcion, los fragmentos de anticuerpo de la descripcion comprenden, o como alternativa consisten en, la secuencia polipeptfdica de la SEQ ID NO: 121 o la SEQ ID NO: 122. En otro ejemplo de la descripcion, los fragmentos de anticuerpo de la descripcion comprenden, o como alternativa consisten en, la secuencia polipeptfdica de la SEQ ID NO: 123 o la SEQ ID NO: 124.
En un ejemplo adicional de la descripcion, los fragmentos del anticuerpo que tienen especificidad de union con CGRP comprenden, o como alternativa consisten en, una o mas de las secuencias polipeptfdicas de SEQ ID NO: 125; SEQ ID NO: 126; y SEQ ID NO: 127 que corresponden a las regiones determinantes de complementariedad (CDR o regiones hipervariables) de la secuencia de cadena ligera variable de la SEQ ID NO: 121 o la secuencia de cadena ligera de la SEQ ID NO: 122.
En un ejemplo adicional de la descripcion, los fragmentos del anticuerpo que tienen especificidad de union con CGRP comprenden, o como alternativa consisten en, una o mas de las secuencias polipeptfdicas de SEQ ID NO: 128; SEQ ID NO: 129; y SEQ ID NO: 130 que corresponden a las regiones determinantes de complementariedad (CDR o regiones hipervariables) de la secuencia de cadena pesada variable de la SEQ ID NO: 123 o la secuencia de cadena pesada de la SEQ ID NO: 124.
La descripcion tambien contempla fragmentos de anticuerpos que incluyen uno o mas de los fragmentos de anticuerpos descritos en el presente documento. En un ejemplo de la descripcion, los fragmentos de los anticuerpos que tienen especificidad de union con CGRP comprenden, o como alternativa consisten en, uno, dos, tres o mas, incluyendo todos los siguientes fragmentos de anticuerpos: la region de cadena ligera variable de la SEQ ID NO: 121; la region de cadena pesada variable de la SEQ ID NO: 123; las regiones determinantes de complementariedad (SEQ ID NO: 125; SEQ ID NO: 126; y SEQ ID NO: 127) de la region de cadena ligera variable de la SEQ ID NO: 121; y las regiones determinantes de complementariedad (SEQ ID NO: 128; SEQ ID NO: 129; y SEQ ID NO: 130) de la region de cadena pesada variable de la SEQ ID NO: 123.
En un ejemplo particularmente preferente de la descripcion, el anticuerpo anti CGRP quimerico es Abl3, que comprende, o como alternativa que consiste en, SEQ ID NO: 122 y SEQ ID NO: 124, y que tiene al menos una de las actividades biologicas expuestas en el presente documento.
En un ejemplo adicional particularmente preferente de la descripcion, los fragmentos de anticuerpo comprenden, o como alternativa consisten en, fragmentos Fab (fragmento de union a antfgeno) que tienen especificidad de union por CGRP. Con respecto al anticuerpo Abl3, el fragmento Fab incluye la secuencia de cadena ligera variable de la SEQ ID NO: 121 y la secuencia de cadena pesada variable de la SEQ ID NO: 123. Este ejemplo de la descripcion contempla ademas adiciones, supresiones y variantes de la SEQ ID NO: 121 y/o la SEQ ID NO: 123 en dicho Fab conservando al mismo tiempo la especificidad de union por CGRP.
En un ejemplo de la descripcion descrita en el presente documento (posteriormente), Pueden producirse fragmentos Fab mediante digestion enzimatica (por ejemplo, papama) de Abl3. En otro ejemplo de la descripcion, pueden producirse anticuerpos anti CGRP tales como Ab13 o fragmentos Fab de los mismos mediante expresion en celulas de mairnfero tales como celulas CHO, NSO o HEK 293, sistemas fungicos, de insectos o microbianos tales como celulas de levadura (por ejemplo levadura diploide tal como Pichia diploide) y otras cepas de levadura. Las especies de Pichia adecuadas incluyen, pero sin limitacion, Pichia pastoris.
Anticuerpo Ab14
En un ejemplo, la descripcion incluye anticuerpos humanizados que tienen especificidad de union con CGRP y que poseen una secuencia de cadena ligera variable que comprende la secuencia expuesta a continuacion:
QVLTQSPSSLSASVGDRVTINCQASQNVYNNNYLAWYQQKPGKVPKQLIYSTSTL
ASGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDVATYYCLGSYDCSRGDCFVFGGGTKVEIK
R (SEQ ID NO: 131).
La descripcion tambien incluye anticuerpos humanizados que tienen especificidad de union con CGRP y que poseen una secuencia de cadena ligera que comprende la secuencia expuesta a continuacion:
QVLTQSPSSLSASVGDRVTINCQASQNVYNNNYLAWYQQKPGKVPKQLIYSTSTL
ASGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDVATYYCLGSYDCSRGDCFVFGGGTKVEIK
RT VAAP S VFIFPP SDEQLKS GT AS V V CLLNNF YPRE AKV Q WKVDN ALQ S GN S QE S
VTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
(SEQ ID NO: 132).
La descripcion incluye ademas anticuerpos humanizados que tienen especificidad de union con CGRP y que poseen una secuencia de cadena pesada variable que comprende la secuencia expuesta a continuacion:
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAVSGIGLSSYYMQWVRQAPGKGLEWVGVIGSD
GKTYYATWAKGRFTISRDNSKTTVYLQMNSLRAEDTAVYFCTRGDIWGQGTLVT
VSS (SEQ ID NO: 133).
La descripcion tambien incluye anticuerpos humanizados que tienen especificidad de union con CGRP y que poseen una secuencia de cadena pesada que comprende la secuencia expuesta a continuacion:
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAVSGIGLSSYYMQWVRQAPGKGLEWVGVIGSD
GKTYYATWAKGRFTISRDNSKTTVYLQMNSLRAEDTAVYFCTRGDIWGQGTLVT
VSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTF
P AYLQ S S GLY SL S S W T VP S S SLGTQTYICNVNHKP SNTKYD ARVEPKS CDKTHT C
PPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVWDVSHEDPEVKFNWYVDGV
EVHNAKTKPREEQYASTYRWSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTIS
KAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYK
TTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
(SEQ ID NO: 134).
La descripcion contempla ademas anticuerpos que comprenden una o mas de las secuencias polipeptfdicas de SEQ ID NO: 135; SEQ ID NO: 136; y SeQ ID NO: 137 que corresponden a las regiones determinates de complementariedad (CDR o regiones hipervariables) de la secuencia de cadena ligera variable de la SEQ ID NO: 131 o la secuencia de cadena ligera de la SEQ ID NO: 132, y/o una o mas de las secuencias polipeptidicas de SEQ ID NO: 138; SEQ ID NO: 139; y SEQ ID NO: 140 que corresponden a las regiones determinates de complementariedad (CDR o regiones hipervariables) de la secuencia de cadena pesada variable de la SEQ ID NO: 133 o la secuencia de cadena pesada de la SEQ ID NO: 134, o combinaciones de estas secuencias polipeptfdicas. En otro ejemplo de la descripcion, los anticuerpos de la descripcion o fragmentos de los mismos comprenden, o como alternativa consisten en, combinaciones de una o mas de las CDR, las secuencias de cadena pesada variable y ligera variable, y las secuencias de cadena pesada y ligera expuestas anteriormente, incluyendo todas ellas. La descripcion tambien contempla fragmentos del anticuerpo que tiene especificidad de union con CGRP. En un ejemplo de la descripcion, los fragmentos de anticuerpo de la descripcion comprenden, o como alternativa consisten en, la secuencia polipeptfdica de la SEQ ID NO: 131 o la SEQ ID NO: 132. En otro ejemplo de la descripcion, los fragmentos de anticuerpo de la descripcion comprenden, o como alternativa consisten en, la secuencia polipeptfdica de la SEQ ID NO: 133 o la SEQ ID NO: 134.
En un ejemplo adicional de la descripcion, los fragmentos del anticuerpo que tienen especificidad de union con CGRP comprenden, o como alternativa consisten en, una o mas de las secuencias polipeptfdicas de SEQ ID NO: 135; SEQ ID NO: 136; y SEQ ID NO: 137 que corresponden a las regiones determinantes de complementariedad (CDR o regiones hipervariables) de la secuencia de cadena ligera variable de la SEQ ID NO: 131 o la secuencia de cadena ligera de la SEQ ID NO: 132.
En un ejemplo adicional de la descripcion, los fragmentos del anticuerpo que tienen especificidad de union con CGRP comprenden, o como alternativa consisten en, una o mas de las secuencias polipeptfdicas de SEQ ID NO: 138; SEQ ID NO: 139; y SEQ ID NO: 140 que corresponden a las regiones determinantes de complementariedad (CDR o regiones hipervariables) de la secuencia de cadena pesada variable de la SEQ ID NO: 133 o la secuencia de cadena pesada de la SEQ ID NO: 134.
La descripcion tambien contempla fragmentos de anticuerpos que incluyen uno o mas de los fragmentos de anticuerpos descritos en el presente documento. En un ejemplo de la descripcion, los fragmentos de los anticuerpos que tienen especificidad de union con CGRP comprenden, o como alternativa consisten en, uno, dos, tres o mas, incluyendo todos los siguientes fragmentos de anticuerpos: la region de cadena ligera variable de la SEQ ID NO: 131; la region de cadena pesada variable de la SEQ ID NO: 133; las regiones determinantes de complementariedad (SEQ ID NO: 135; SEQ ID NO: 136; y SEQ ID NO: 137) de la region de cadena ligera variable de la SEQ ID NO: 131; y las regiones determinantes de complementariedad (SEQ ID NO: 138; SEQ ID NO: 139; y SEQ ID NO: 140) de la region de cadena pesada variable de la SEQ ID NO: 133.
En un ejemplo particularmente preferente de la descripcion, el anticuerpo anti CGRP humanizado es Abl4, que comprende, o como alternativa que consiste en, SEQ ID NO: 132 y SEQ ID NO: 134, y que tiene al menos una de las actividades biologicas expuestas en el presente documento.
En un ejemplo adicional particularmente preferente de la descripcion, los fragmentos de anticuerpo comprenden, o como alternativa consisten en, fragmentos Fab (fragmento de union a antfgeno) que tienen especificidad de union por CGRP. Con respecto al anticuerpo Abl4, el fragmento Fab incluye la secuencia de cadena ligera variable de la SEQ ID NO: 131 y la secuencia de cadena pesada variable de la SEQ ID NO: 133. Este ejemplo de la descripcion contempla ademas adiciones, supresiones y variantes de la SEQ ID NO: 131 y/o la SEQ ID NO: 133 en dicho Fab conservando al mismo tiempo la especificidad de union por CGRP.
En un ejemplo de la descripcion descrita en el presente documento (posteriormente), Pueden producirse fragmentos Fab mediante digestion enzimatica (por ejemplo, papama) de Abl4. En otro ejemplo de la descripcion, pueden producirse anticuerpos anti CGRP tales como Abl4 o fragmentos Fab de los mismos mediante expresion en celulas de mamffero tales como celulas CHO, NSO o HEK 293, sistemas fungicos, de insectos o microbianos tales como celulas de levadura (por ejemplo levadura diploide tal como Pichia diploide) y otras cepas de levadura. Las especies de Pichia adecuadas incluyen, pero sin limitacion, Pichia pastoris.
En otro ejemplo, pueden estar presentes fragmentos de anticuerpos en una o mas de las siguientes formas no limitantes: formas de anticuerpo Fab, Fab', F(ab')2, Fv y Fv monocatenario. En un ejemplo preferido, los anticuerpos anti CGRP descritos en el presente documento comprenden ademas la secuencia de cadena ligera constante kappa que comprende la secuencia expuesta a continuacion:
VAAP S VFIFPP S DEQLKS GT AS W CLLNNF YPRE AKV Q WKVDN ALQ S GN S Q
ESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
(SEQ ID NO: 283).
En otro ejemplo preferido, los anticuerpos anti CGRP descritos en el presente documento comprenden ademas la secuencia polipeptidica de cadena pesada constante gamma-1 que comprende la secuencia expuesta a continuacion:
ASTKGP S VFPL AP S SKST S GGT AALGCLVKD YFPEP VT VS WNS GALT S G VH
TFP AVLQ S S GLY SLS S W T VP S S SLGT QT YICNVNHKP SNTKVDKRVEPKS CDKTH
TCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVWDVSHEDPEVKFNWYVD
GVEVHNAKTKPREEQYASTYRWSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEK
TISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENN
YKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSP
GK (SEQ ID NO: 284).
En otro ejemplo, la descripcion contempla un anticuerpo anti CGRP aislado que comprende una secuencia polipeptfdica de Vh seleccionada de: SEQ ID NO: 3, 13, 23, 33, 43, 53, 63, 73, 83, 93, 103, 113, 123 o 133, o una variante de las mismas; y que comprende ademas una secuencia polipeptfdica de Vl seleccionada de: SEQ ID NO: 1, 11, 21, 31, 41, 51, 61, 71, 81, 91, 101, 111, 121 o 131, o una variante de las mismas, en donde uno o mas de los restos de marco conservado (restos FR) en dicho polipeptido Vh o Vl se ha sustituido con otro resto de aminoacido dando como resultado un anticuerpo anti CGRP que se une espedficamente con CGRP. La descripcion contempla formas humanizadas y quimericas de estos anticuerpos. Los anticuerpos quimericos pueden incluir un Fc procedente de regiones constantes de IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgG5, IgG6, IgG7, IgG8, IgG9, IgG10, IgG11, IgG12, IgG13, IgG14, IgG15, IgG16, IgG17, IgG18 o IgG19.
En un ejemplo de la descripcion, los anticuerpos o polipeptidos de Vh o Vl se originan o se seleccionan de una o mas poblaciones de linfocitos B de conejo antes del inicio del proceso de humanizacion al que se hace referencia en el presente documento.
En otra realizacion de la invencion, los anticuerpos anti CGRP no tienen especificidad de union por CGRP-R. En una realizacion adicional de la invencion, los anticuerpos anti CGRP inhiben la asociacion de CGRp con CGRP-R. En otra realizacion de la invencion, los anticuerpos anti CGRP inhiben la asociacion de CGRP con CGRP-R y/o protemas adicionales y/o multfmeros de las mismas, y/o antagonizan los efectos biologicos de los mismos.
Como se ha indicado en el parrafo [0127] en el presente documento, los anticuerpos y fragmentos de los mismos pueden modificarse de forma posterior a la traduccion para anadir restos efectores tales como conectores qrnmicos, restos detectables tales como por ejemplo colorantes fluorescentes, enzimas, sustratos, materiales bioluminiscentes, materiales radioactivos y restos quimioluminiscentes o restos funcionales tales como por ejemplo estreptavidina, avidina, biotina, una citotoxina, un agente citotoxico y materiales radioactivos.
Los anticuerpos o fragmentos de los mismos tambien pueden modificarse qmmicamente para proporcionar ventajas adicionales tales como aumento de la solubilidad, estabilidad y tiempo en circulacion (semivida in vivo) del polipeptido, o reduccion de la inmunogenicidad (vease Patente de los Estados Unidos N.° 4.179.337). Los restos qrnmicos para derivatizacion pueden seleccionarse de polfmeros solubles en agua tales como polietilenglicol, copolfmeros de etilenglicol/propilenglicol, carboximetilcelulosa, dextrano, alcohol polivimlico y similares. Los anticuerpos y fragmentos de los mismos pueden modificarse en posiciones aleatorios en la molecula, o en posiciones predeterminadas en la molecula y pueden incluir uno, dos, tres o mas restos qrnmicos unidos.
El polfmero puede tener cualquier peso molecular y puede ser ramificado o no ramificado. Para polietilenglicol, el peso molecular preferido es de entre aproximadamente 1 kDa y aproximadamente 100 kDa (indicando el termino "aproximadamente" que en preparaciones de polietilenglicol, algunas moleculas pesaran mas, algunas menos, que el peso molecular indicado) para facilidad en la manipulacion y fabricacion. Pueden usarse otros tamanos, dependiendo del perfil terapeutico deseado (por ejemplo, la duracion de la liberacion sostenida deseada, los efectos, si los hubiera, en la actividad biologica, la facilidad de la manipulacion, el grado o la falta de antigenicidad y otros efectos conocidos del polietilenglicol para una protema terapeutico o analogo). Por ejemplo, el polietilenglicol puede tener un peso molecular promedio de aproximadamente 200, 500, 1000, 1500, 2000, 250o, 3000, 3500, 4000, 4500, 5000, 5500, 6000, 6500, 7000, 7500, 8000, 8500, 9000, 9500, 10.000, 10.500, 11.000, 11.500, 12.000, 12.500, 13.000, 13.500, 14.000, 14.500, 15.000, 15.500, 16.000, 16.500, 17.000, 17.500, 18.000, 18.500, 19.000, 19.500, 20.000, 25.000, 30.000, 35.000, 40.000, 50.000, 55.000, 60.000, 65.000, 70.000, 75.000, 80.000, 85.000, 90.000, 95.000 o 100.000 kDa. Se describen polietilenglicoles ramificados, por ejemplo, en la patente de los Estados Unidos N.° 5.643.575; Morpurgo et al., Appl. Biochem. Biotechnol. 56:59-72 (1996); Vorobjev et al., Nucleosides Nucleotides 18:2745-2750 (1999); y Caliceti et al., Bioconjug. Chem. 10:638-646 (1999).
Existen varios metodos de union disponibles para los expertos en la materia, vease por ejemplo, documento EP 0 401 384, (acoplamiento de PEG a G-CSF), Vease tambien Malik et al., Exp. Hematol. 20:1028-1035 (1992) (que indica pegilacion de GM-CSF usando cloruro de tresilo). Por ejemplo, el polietilenglicol puede unirse covalentemente con restos de aminoacidos mediante un grupo reactivo, tal como, un grupo amino o carboxilo libre. Son grupos reactivos aquellos con los que se puede unir una molecula de polietilenglicol activada. Los restos de aminoacidos que tienen un grupo amino libre pueden incluir restos de lisina y los restos de aminoacidos N terminales; los que tienen un grupo carboxilo libre pueden incluir restos de acido aspartico, restos de acido glutamico y el resto de aminoacido C terminal. Los grupos sulfhidrilo tambien pueden usarse como un grupo reactivo para unir las moleculas de polietilenglicol. Se prefiere para fines terapeuticos la union en un grupo amino, tal como union en el extremo N terminal o grupo lisina.
Como se ha sugerido anteriormente, el polietilenglicol puede unirse con protemas mediante un enlace con cualquiera de varios restos de aminoacidos. Por ejemplo, el polietilenglicol puede unirse con polipeptidos mediante enlaces covalentes con lisina, histidina, acido aspartico, acido glutamico o restos de cistema. Pueden emplearse una o mas qmmicas de reaccion para unir polietilenglicol con restos de aminoacidos espedficos (por ejemplo, lisina, histidina, acido aspartico, acido glutamico o cistema) o con mas de un tipo de resto de aminoacido (por ejemplo, lisina, histidina, acido aspartico, acido glutamico, cistema y combinaciones de los mismos).
Como alternativa, los anticuerpos o fragmentos de los mismos pueden tener semividas in vivo aumentadas mediante fusion con albumina (incluyendo, pero sin limitacion, con albumina de suero humano recombinante o fragmentos o variantes de la misma (vease, por ejemplo, la patente de los Estados Unidos N.° 5.876.969, expedida el 2 de marzo de 1999, patente de e P 0413622 y patente de los Estados Unidos n.° 5.766.883, expedida el 16 de junio de 1998)) u otras protemas sangumeas en circulacion tales como transferrina o ferritina. En una realizacion preferida, los polipeptidos y/o anticuerpos de la presente invencion se fusionan con la forma madura de albumina de suero humano (es decir, aminoacidos 1-585 de albumina de suero humano como se muestra en las FIG. 1 y 2 de la patente de EP 0322094). La invencion tambien abarca polinucleotidos que codifican protemas de fusion.
Con respecto a restos detectables, las enzimas ilustrativas adicionales incluyen, pero sin limitacion, peroxidasa de rabano picante, acetilcolinesterasa, fosfatasa alcalina, 6eta-galactosidasa y luciferasa. Los materiales fluorescentes ilustrativos adicionales incluyen, pero sin limitacion, rodamina, fluorescema, isotiocianato de fluorescema, umbeliferona, diclorotriazinilamina, ficoeritrina y cloruro de dansilo. Los restos quimioluminiscentes ilustrativos adicionales incluyen, pero sin limitacion, luminol. Los materiales bioluminiscentes ilustrativos adicionales incluyen, pero sin limitacion, luciferina y ecuorina. Los materiales radioactivos ilustrativos adicionales incluyen, pero sin limitacion, yodo 125 (125I), carbono 14 (14C), azufre 35 (35S), tritio (3H) y fosforo 32 (32P).
Con respecto a restos funcionales, los agentes citotoxicos ilustrativos incluyen, pero sin limitacion, metotrexato, aminopterina, 6-mercaptopurina, 6-tioguanina, citarabina, 5-fluorouracil dacarbazina; agentes alquilantes tales como mecloretamina, tiotepa clorambucilo, melfalan, carmustina (BSNU), mitomicina C, lomustina (CCNU), 1-metilnitrosourea, ciclofosfamida, mecloretamina, busulfan, dibromomanitol, estreptozotocina, mitomicina C, cisdiclorodiamina de platino (II) (DDP) cisplatino y carboplatino (paraplatino); las antraciclinas incluyen daunorrubicina (antiguamente daunomicina), doxorrubicina (adriamicina), detorrubicina, carminomicina, idarrubicina, epirrubicina, mitoxantrona y bisantreno; los antibioticos incluyen dactinomicina (actinomicina D), bleomicina, calicheamicina, mitramicina y antramicina (AMC); y agentes antimitoticos tales como los alcaloides de la vinca, vincristina y vinblastina. Otros agentes citotoxicos incluyen paclitaxel (taxol), ricina, exotoxina de pseudomonas, gemcitabina, citocalasina B, gramicidina D, bromuro de etidio, emetina, etoposido, tenoposido, colchicina, dihidroxiantracindiona, 1 -deshidrotestosterona, glucocorticoides, procama, tetracama, lidocama, propranolol, puromicina, procarbazina, hidroxiurea, asparaginasa, corticoesteroides, mitotano (O,P'-(DDD)), interferones, y mezclas de estos agentes citotoxicos.
Los agentes citotoxicos adicionales incluyen, pero sin limitacion, agentes quimioterapeuticos tales como carboplatino, cisplatino, paclitaxel, gemcitabina, calicheamicina, doxorrubicina, 5-fluorouracilo, mitomicina C, actinomicina D, ciclofosfamida, vincristina y bleomicina. Enzimas toxicas de plantas y bacterias tales como ricina, toxina difterica y toxina de Pseudomonas pueden conjugarse con los anticuerpos humanizados o quimericos, o fragmentos de union a antfgeno de los mismos, para generar reactivos de destruccion espedfica de tipos celulares (Youle, et al., Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 77:5483 (1980); Gilliland, et al., Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 77:4539 (1980); Krolick, et al., Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 77:5419 (1980)).
Otros agentes citotoxicos incluyen ribonucleasas citotoxicas como se describen en Goldenberg en la patente de los Estados Unidos N.° 6.653.104. Las realizaciones de la invencion tambien se refieren a radioinmunoconjugados donde un radionuclido que emite pardculas alfa o beta se acopla de forma estable al anticuerpo, o fragmentos de union a antigeno del mismo, con o sin el uso de un agente formador de complejos. Dichos radionuclidos incluyen emisores beta tales como fosforo-32 (32P), escandio-47 (47Sc), cobre-67 (67Cu), galio-67 (67Ga), itrio-88 (88Y), itrio-90 (90Y), yodo-125 (125I), yodo-131 (131I), samario-153 (153Sm), lutecio-177 (177Lu), renio-186 (186Re) o renio-188 (188Re), y emisores alfa tales como astatina-211 (211At), plomo-212 (212Pb), bismuto-212 (212Bi) o -213 (213Bi) o actinio-225 (225Ac).
Se conocen en la tecnica metodos para conjugar un anticuerpo o fragmento de union del mismo con un resto detectable y similares, tales como por ejemplo los metodos descritos en Hunter et al, Nature 144:945 (1962); David et al, Biochemistry 13:1014 (1974); Pain et al, J. Immunol. Meth. 40:219 (1981); y Nygren, J., Histochem. and Cytochem. 30:407 (1982).
Los ejemplos descritos en el presente documento incluyen ademas equivalentes que son sustancialmente homologos de los anticuerpos, fragmentos de anticuerpos, diacuerpos, SMIP, anticuerpos de camellos, nanocuerpos, IgNAR, polipeptidos, regiones variables y CDR expuestas en el presente documento. Estos pueden contener, por ejemplo, mutaciones de sustituciones conservativas, (es decir, la sustitucion de uno o mas aminoacidos por aminoacidos similares). Por ejemplo, la sustitucion conservativa se refiere a la sustitucion de un aminoacido con otro en la misma clase general, por ejemplo, un aminoacido acido con otro aminoacido acido, un aminoacido basico con otro aminoacido basico, o un aminoacido neutro por otro aminoacido neutro. Se conoce bien en la tecnica lo que se entiende por una sustitucion de aminoacidos conservativa.
En otro ejemplo, la descripcion contempla secuencias polipeptfdicas que tienen al menos 90 % o mayor homologfa de secuencias con una cualquiera o mas de las secuencias polipeptfdicas de fragmentos de anticuerpos, regiones variables y CDR expuestas en el presente documento. Mas preferentemente, la descripcion contempla secuencias polipeptfdicas que tienen al menos 95 % o mayor homologfa de secuencias, aun mas preferentemente al menos 98 % o mayor homologfa de secuencias y aun mas preferentemente al menos 99 % o mayor homologfa de secuencias con una cualquiera o mas de las secuencias polipeptfdicas de fragmentos de anticuerpos, regiones variables y CDR expuestas en el presente documento. Los expertos habituales en la materia conocen bien metodos para determinar la homologfa entre secuencias de acido nucleico y aminoacidos.
En otro ejemplo, la descripcion contempla ademas los homologos polipeptfdicos anteriormente enumerados de los fragmentos de anticuerpos, regiones variables y CDR expuestas en el presente documento que tienen ademas actividad anti CGRP. Se exponen en el presente documento ejemplos no limitantes de actividad anti CGRP, por ejemplo, en los parrafos [0329]-[0350] posteriores.
En otro ejemplo, La descripcion contempla ademas la generacion y el uso de anticuerpos antiidiotfpicos que se unen con cualquiera de las secuencias anteriores. En un ejemplo ilustrativo, dicho anticuerpo antiidiotipico podna administrarse a un sujeto que ha recibido un anticuerpo anti CGRP para modular, reducir o neutralizar, el efecto del anticuerpo anti CGRP. Dichos anticuerpos antiidiotfpicos tambien podnan ser utiles para el tratamiento de una enfermedad autoinmunitaria caracterizada por la presencia de anticuerpos anti CGRP. Un uso ejemplar adicional de dichos anticuerpos antiidiotipicos es para la deteccion de los anticuerpos anti CGRP de la presente invencion, por ejemplo para supervisar los niveles de los anticuerpos anti CGRP presentes en la sangre de un sujeto u otros ftquidos corporales.
La presente descripcion tambien contempla anticuerpos anti CGRP que comprenden cualquiera de las secuencias polipeptfdicas o polinucleotidicas descritas en el presente documento que sustituye cualquiera de las otras secuencias polinucleotfdicas descritas en el presente documento. Por ejemplo, sin limitacion a los mismos, la presente descripcion contempla anticuerpos que comprenden la combinacion de cualquiera de las secuencias de cadena ligera variable y cadena pesada variable descritas en el presente documento, y contempla ademas anticuerpos que resultan de la sustitucion de cualquiera de las secuencias de CDR descritas en el presente documento por cualquiera de las otras secuencias de CDR descritas en el presente documento.
Realizaciones ejemplares adicionales de la invencion
En otro ejemplo, la descripcion contempla uno o mas anticuerpos anti CGRP humano o fragmentos de anticuerpos de los mismos que se unen espedficamente con el mismo epftopo o epftopos lineales o conformacionales solapantes y/o compiten por la union con el mismo epftopo o epftopos lineales o conformacionales solapantes en un polipeptido de CGRP humano intacto o fragmento del mismo como un anticuerpo anti CGRP humano seleccionado de Ab1, Ab2, Ab3, Ab4, Ab5, Ab6, Ab7, Ab8, Ab9, Ab10, Ab11, Ab12, Ab13 o Ab14. En un ejemplo preferido, el anticuerpo anti CGRP humano o fragmento del mismo se une espedficamente con el mismo epftopo o epftopos lineales o conformacionales solapantes y/o compite por la union con el mismo epftopo o epftopos lineales o conformacionales solapantes en un polipeptido de CGRP humano intacto o un fragmento del mismo como Ab3, Ab6, Abl3 o Abl4.
Un ejemplo preferido de la descripcion se dirige a anticuerpos quimericos o humanizados y fragmentos de los mismos (incluyendo fragmentos Fab) que tienen especificidad de union por CGRP y que inhiben actividades biologicas mediadas por la union de CGRP con el receptor de CGRP. En un ejemplo particularmente preferente de la descripcion, los anticuerpos anti CGRP quimericos o humanizados se seleccionan de Ab3, Ab6, Abl3 o Abl4.
En un ejemplo adicional de la descripcion se contempla un metodo para reducir, tratar o prevenir enfermedades o trastornos asociados con CGRP afectando a las actividades biologicas mediadas por CGRP, evitando de este modo las actividades biologicas mediadas por union de CGRP con CGRP-R. En un ejemplo, la enfermedad o el trastorno asociado con CGRP es migrana u otro trastorno en donde CGRP induce dolor, cefalea, dolor, cancer, vejiga hiperactiva o perdida de peso. Un listado no limitante adicional de enfermedades y trastornos asociados con CGRP se proporciona en el presente documento.
Otro ejemplo preferido de la descripcion contempla el uso de secuencias polipeptfdicas de Fab para el tratamiento de migranas y cefaleas en un paciente. Se proporcionan en otra parte de la presente divulgacion tipos no limitantes de migranas y cefaleas que pueden tratarse usando secuencias polipeptfdicas de Fab.
En otro ejemplo de la descripcion, el anticuerpo anti CGRP humano es un anticuerpo que se une espedficamente con los mismos epttopos lineales o conformacionales solapantes en un polipeptido de CGRP intacto o fragmento del mismo que se une(n) espedficamente con Ab3, Ab6, Ab13 o Ab14 como se determina por mapeo epitopico usando fragmentos peptfdicos lineales solapantes que abarcan la longitud completa del polipeptido de CGRP humano nativo.
La descripcion tambien se dirige a un anticuerpo anti CGRP que se une con el mismo epftopo de CGRP y/o compite con un anticuerpo anti CGRP por la union con CGRP como un anticuerpo o fragmento de anticuerpo desvelado en el presente documento, incluyendo, pero sin limitacion, un anticuerpo anti CGRP seleccionado de Ab1, Ab2, Ab3, Ab4, Ab5, Ab6, Ab7, Ab8, Ab9, Ab10, Ab1, Ab12, Ab13 o Ab14.
En otro ejemplo, la descripcion tambien se dirige a un anticuerpo anti CGRP aislado o fragmento de anticuerpo que comprende una o mas de las CDR contenidas en las secuencias polipeptfdicas de Vh seleccionadas de: 3, 13, 23, 33, 43, 53, 63, 73, 83, 93, 103, 113, 123 o 133, o una variante de las mismas, y/o una o mas de las CDR contenidas en las secuencias polipeptfdicas de Vl seleccionadas de: 1, 11, 21, 31, 41, 51,61, 71, 81, 91, 101, 111, 121 o 131, o una variante de las mismas.
En un ejemplo de la descripcion, el anticuerpo anti CGRP humano analizado en los dos parrafos anteriores comprende al menos 2 regiones determinantes de complementariedad (CDR) en cada una de las regiones ligeras variables y pesadas variables que son identicas a las contenidas en un anticuerpo anti CGRP humano de Ab1, Ab2, Ab3, Ab4, Ab5, Ab6, Ab7, Ab8, Ab9, Ab10, Ab11, Ab12, Ab13 o Ab14.
En un ejemplo preferido, el anticuerpo anti CGRP humano analizado anteriormente comprende al menos 2 regiones determinantes de complementariedad (CDR) en cada una de las regiones ligeras variables y pesadas variables que son identicas a las contenidas en Ab3 o Ab6. En otro ejemplo, todas las CDR del anticuerpo anti CGRP humano analizadas anteriormente son identicas a las CDR contenidas en un anticuerpo anti CGRP humano seleccionado de Ab1, Ab2, Ab3, Ab4, Ab5, Ab6, Ab7, Ab8, Ab9, Ab10, Ab11, Ab12, Ab13 o Ab14. En un ejemplo preferente de la descripcion, todas las CDR del anticuerpo anti CGRP humano analizadas anteriormente son identicas a las CDR contenidas en un anticuerpo anti CGRP humano seleccionado de Ab3 o Ab6.
La invencion contempla ademas que los anticuerpos anti CGRP humano estan aglucosilados; que contienen una region Fc que se ha modificado para alterar la funcion efectora, semivida, proteolisis y/o glucosilacion; son humanos, humanizados, monocatenarios o quimericos; y son un anticuerpo humanizado procedente de un anticuerpo anti CGRP humano de conejo (parental).
La descripcion contempla ademas uno o mas anticuerpos anti CGRP humano en donde las regiones marco conservadas (FR) en la region ligera variable y las regiones pesadas variables de dicho anticuerpo son respectivamente FR humanas que no estan modificadas o que se han modificado por la sustitucion de uno o mas restos de FR en la region de cadena ligera o pesada variable con los restos de FR correspondientes del anticuerpo de conejo parental y en donde dichas FR humanas se han obtenido de secuencias de anticuerpos de cadena pesada y ligera variable humana que se han seleccionado de una biblioteca de secuencias de anticuerpos de lmea germinal humana basandose en su alto nivel de homologfa con las regiones de cadena pesada o ligera variable de conejo correspondientes en relacion con otras secuencias de anticuerpos de lmea germinal humana contenidas en la biblioteca.
En una realizacion de la invencion, el anticuerpo anti CGRP humano se une espedficamente con celulas que expresan CGRP y/o con moleculas de CGRP solubles en circulacion in vivo, incluyendo CGRP expresado en o por celulas humanas en un paciente con una enfermedad asociada con celulas que expresan CGRP.
En otra realizacion, la enfermedad se selecciona de migranas (con o sin aura), perdida de peso, cancer o tumores, angiogenesis asociada con cancer o crecimiento tumoral, angiogenesis asociada con cancer o supervivencia tumoral, migranas hemiplegicas, cefaleas en racimo, neuralgia migranosa, cefaleas cronicas, cefaleas de tension, cefaleas generales, sofocos, hemicranea paroxfstica cronica, cefaleas secundarias debidas a un problema estructural subyacente en la cabeza o el cuello, neuralgia craneal, cefaleas sinusales (tales como por ejemplo asociadas con sinusitis), cefaleas o migranas inducidas por alergia, dolor, dolor inflamatorio, dolor por incision postoperatorio, smdrome de dolor regional complejo, dolor de cancer, dolor de cancer de huesos primario o metastasico, dolor por fractura, dolor cronico, dolor por fractura osteoporotica, dolor resultante de quemadura, osteoporosis, dolor de articulaciones gotosas, dolor abdominal, dolor asociado con crisis de anemia falciforme y otros dolores nocicepticos, asf como carcinoma hepatocelular, cancer de mama, cirrosis hepatica, dolor neurogenico, dolor neuropatico, dolor nociceptico, neuralgia del trigemino, neuralgia post-herpetica, dolor de miembro fantasma, fibromialgia, dolor menstrual, ovarialgia, distrofia simpatica refleja, dolor neurogenico, osteoartritis o dolor por artritis reumatoide, dolor dorsolumbar, neuropatfa diabetica, ciatica, o dolor o dolor visceral asociado con: reflujo gastroesofagico, dispepsia, smdrome del intestino irritable, colon irritable, colon espastico, colitis mucosa, enfermedad inflamatoria del intestino, enfermedad de Crohn, ileitis, colitis ulcerosa, colico renal, dismenorrea, cistitis, periodo menstrual, parto, menopausia, prostatitis, pancreatitis, colico renal, dismenorrea, cistitis, incluyendo cistitis intersticial (CI), cirugfa asociada con el fleo, diverticulitis, peritonitis, pericarditis, hepatitis, apendicitis, colitis, colecistitis, endometriosis, pancreatitis aguda y/o cronica, infarto de miocardio, dolor de rinon, dolor pleural, prostatitis, dolor pelvico, traumatismo de un organo, dolor nociceptivo cronico, dolor neuropatico cronico, dolor inflamatorio cronico, fibromialgia, dolor irruptivo y dolor persistente.
En otra realizacion de la invencion, la enfermedad es dolor de cancer que surge de neoplasia o de cancer preferentemente seleccionado de uno o mas de: adenocarcinoma en tejido glandular, blastoma en tejido embrionario de organos, carcinoma en tejido epitelial, leucemia en tejidos que forman celulas sangumeas, linfoma en tejido linfatico, mieloma en medula osea, sarcoma en tejido conectivo o de soporte, cancer suprarrenal, linfoma relacionado con SIDA, anemia, cancer de vejiga, cancer de hueso, cancer de cerebro, cancer de mama, tumores carcinoides, cancer de cuello uterino, quimioterapia, cancer de colon, citopenia, cancer endometrial, cancer esofagico, cancer gastrico, cancer de cabeza, cancer de cuello, cancer hepatobiliar, cancer de rinon, leucemia, cancer de hugado, cancer de pulmon, linfoma, enfermedad de Hodgkin, linfoma, no Hodgkin, tumores del sistema nervioso, cancer oral, cancer ovarico, cancer pancreatico, cancer de prostata, cancer rectal, cancer de piel, cancer de estomago, cancer testicular, cancer de tiroides, cancer de uretra, cancer de hueso, sarcomas del tejido conectivo, cancer de tejido oseo, cancer de celulas formadoras de sangre, cancer de medula osea, mieloma multiple, leucemia, cancer de hueso primario o secundario, tumores que metastatizan al hueso, tumores que se infiltran en el nervio y viscera hueca, tumores cerca de estructuras neurales. Preferentemente ademas el dolor de cancer comprende dolor visceral, preferentemente dolor visceral que surge de cancer pancreatico y/o metastasis en el abdomen. Preferentemente ademas el dolor de cancer comprende dolor somatico, preferentemente dolor somatico debido a uno o mas de cancer de hueso, metastasis en el hueso, dolor postquirurgico, sarcomas del tejido conectivo, cancer de tejido oseo, cancer de celulas formadoras de sangre de la medula osea, mieloma multiple, leucemia, cancer de hueso primario o secundario.
La invencion contempla ademas anticuerpos anti CGRP humano directa o indirectamente unidos a un marcador detectable o agente terapeutico.
La invencion tambien contempla una o mas secuencias de acido nucleico que da como resultado la expresion de un anticuerpo anti CGRP humano de la invencion, incluyendo los que comprenden, o como alternativa que consisten en, codones preferidos por levadura o ser humano. La invencion tambien contempla vectores (incluyendo plasmidos o vectores vmicos recombinantes) que comprenden dicha secuencia o secuencias de acido nucleico. La invencion tambien contempla celulas hospedadoras o celulas hospedadoras recombinantes que expresan al menos uno de los anticuerpos de la invencion, incluyendo celulas de mairnfero, de levadura, bacterianas y de insecto. En una realizacion preferida, la celula hospedadora es una celula de levadura. En una realizacion preferente adicional, la celula de levadura es una celula de levadura diploide. En una realizacion mas preferida, la celula de levadura es una levadura Pichia.
La descripcion tambien contempla un metodo de tratamiento que comprende administrar a un paciente con una enfermedad o afeccion asociada con celulas que expresan CGRP una cantidad terapeuticamente eficaz de al menos un anticuerpo anti CGRP humano o fragmento descrito en el presente documento. La descripcion tambien contempla que el metodo de tratamiento puede implicar la administracion de dos o mas anticuerpos anti CGRP o fragmentos de los mismos y desvelados en el presente documento. Si se administra mas de un anticuerpo al paciente, los multiples anticuerpos pueden administrarse de forma simultanea o concurrente, o pueden escalonarse en su administracion. Las enfermedades que pueden tratarse se presentan en la lista no limitante expuesta anteriormente y en otra parte del presente documento. En un ejemplo preferido, la enfermedad se selecciona de migrana, cefalea, perdida de peso, dolor, dolor de cancer o dolor neuropatico. En otro ejemplo el tratamiento incluye ademas la administracion de otro agente terapeutico o regimen seleccionado de quimioterapia, radioterapia, administracion de citocinas o terapia genica.
En un ejemplo no limitante de la descripcion, otro agente terapeutico o regimen incluye Taxol (paclitaxel) o sus derivados, compuestos de platino tales como carboplatino o cisplatino, antrociclinas tales como doxorrubicina, agentes alquilantes tales como ciclofosfamida, antimetabolitos tales como 5-fluorouracilo o etoposido.
La invencion contempla ademas un metodo de captura de imagenes in vivo que detecta la presencia de celulas que expresan CGRP que comprende administrar una cantidad eficaz para el diagnostico de al menos un anticuerpo anti CGRP humano. En una realizacion, dicha administracion incluye la administracion de un radionuclido o fluoroforo que facilita la deteccion del anticuerpo en sitios de enfermedad que expresan CGRP. En una realizacion adicional, los resultados de dicho metodo de captura de imagenes in vivo se usan para facilitar el diseno de un regimen terapeutico apropiado, incluyendo regfmenes terapeuticos incluyendo radioterapia, quimioterapia o una combinacion de los mismos.
La actividad anti CGRP de los anticuerpos anti CGRP de la presente invencion, que tienen especificidad de union con CGRP, tambien pueden describirse por su fuerza de union o su afinidad por CGRP. En una realizacion de la invencion, los anticuerpos anti CGRP de la presente invencion, que tienen especificidad de union con CGRP, se unen con CGRP con una constante de disociacion (Kd) de menos de o igual a 5x10-7 M, 10"7 M, 5x10-8 M, 10-8 M, 5x10-9 M, 10-9 M, 5x10-10 M, 10-10 M, 5x10-11 M, 10-11 M, 5x10-12 M, 10-12 M, 5x10-13 M o 10-13 M. Preferentemente, los anticuerpos anti CGRP se unen con CGRP con una constante de disociacion de menos de o igual a 10"11 M, 5x10"12 M o 10"12 M. En otra realizacion de la invencion, los anticuerpos anti CGRP de la presente invencion, que tienen especificidad de union con CGRP, se unen con un epttopo de CGRP lineal o conformacional.
En otra realizacion de la invencion, la actividad anti CGRP de los anticuerpos anti CGRP de la presente invencion, que tienen especificidad de union con CGRP, se unen con CGRP con una velocidad de disociacion de menos de o igual a 10-4 S-1,5x10-5 S-1, 10-5 S-1, 5x10-6 S-1, 10-6 S-1,5x10-7 S-1 o 10-7S-1.
En una realizacion adicional de la invencion, la actividad anti CGRP de los anticuerpos anti CGRP de la presente invencion, que tienen especificidad de union con CGRP, muestra actividad anti CGRP previniendo, aliviando o reduciendo los srntomas de, o como alternativa tratando, enfermedades y trastornos asociados con CGRP. Se exponen en el presente documento ejemplos no limitantes de enfermedades y trastornos asociados con CGRP. Polinucleotidos que codifican polipeptidos de anticuerpos anti CGRP
Anticuerpo Ab1
La descripcion se dirige ademas a polinucleotidos que codifican polipeptidos de anticuerpos que tienen especificidad de union con CGRP. En un ejemplo de la descripcion, los polinucleotidos de la descripcion comprenden, o como alternativa consisten en, la siguiente secuencia polinucleotidica que codifica la secuencia polipeptfdica de cadena ligera variable de la SEQ ID NO: 1:
CAAGT GCT GACCC AGACT GC ATCCCCCGT GT CT GC AGCT GT GGGAAGC A
C AGT C ACCATC AATT GCC AGGCC AGT CAG AGT GTTTAT GAT AACAACTACCT A
GCCTGGT AT CAGCAGAAACC AGGGC AGCCT CCCAAGCAACT GAT CT ATTCT AC
AT CCACT CT GGCAT CT GGGGT CT CAT CGCGGTT CAAAGGC AGT GGATCT GGGA
C ACAGTT C ACT CTC ACC AT CAGCGACCTGGAGT GT GCCGAT GCT GCCACTTACT
ACT GT CT AGGC AGTT AT GATT GT AGT AGT GGT GATT GTTTT GTTTT CGGCGG AG
GGACCGAGGTGGTGGTCAAACGT (SEQ ID NO: 141).
En un ejemplo de la descripcion, los polinucleotidos de la descripcion comprenden, o como alternativa consisten en, la siguiente secuencia polinucleotfdica que codifica la secuencia polipeptfdica de cadena ligera de la SEQ ID NO: 2: CAAGT GCT GACCC AGACTGCAT CCCCCGT GT CT GC AGCTGT GGGAAGC A
C AGT CACCATCAATT GCC AGGCC AGT CAG AGT GTTTAT GAT AACAACTACCT A
GCCT GGT AT CAGCAGAAACC AGGGC AGCCT CCCAAGCAACT GAT CT ATTCT AC
AT CCACT CT GGC AT CT GGGGTCT CAT CGCGGTT CAAAGGC AGT GGAT CT GGGA
CACAGTT CACT CT CACC AT CAGCGACCT GGAGT GT GCCGAT GCT GCC ACTT ACT
ACT GT CT AGGC AGTT AT GATT GT AGT AGT GGT GATT GTTTT GTTTT CGGCGG AG
GGACCGAGGT GGT GGT CAAACGT ACGGTGGCT GC ACC AT CT GT CTT CAT CTTCC
CGCCAT CT GAT GAGC AGTTGAAAT CT GGAACT GCCT CT GTT GTGTGCCT GCT GA
AT AACTT CT AT CCC AG AG AGGCC AAAGT AC AGT GGAAGGT GGAT AACGCCCT C
CAATCGGGTAACTCCCAGGAGAGTGTCACAGAGCAGGACAGCAAGGACAGCA
CCTACAGCCTCAGCAGCACCCTGACGCTGAGCAAAGCAGACTACGAGAAACAC
AAAGT CT ACGCCTGCGAAGT CACCC AT CAGGGCCT GAGCT CGCCCGTC ACAAA
GAGCTT CAAC AGGGGAGAGT GTT AG (SEQ ID NO: 142).
En otro ejemplo de la descripcion, los polinucleotidos de la descripcion comprenden, o como alternativa consisten en, la siguiente secuencia polinucleotidica que codifica la secuencia polipeptfdica de cadena pesada variable de la SEQ ID NO: 3:
CAGT CGCT GGAGGAGT CCGGGGGTCGCCTGGT CACGCCT GGGAC ACCCC
T G AC ACT C ACCT GC AC AGT CT CTGG ACT CG ACCT C AGT AGCT ACT AC AT GCA AT GGGTCCGCCAGGCTCCAGGGAAGGGGCTGGAATGGATCGGAGTCATTGGTATT AATGATAACACATACTACGCGAGCTGGGCGAAAGGCCGATTCACCATCTCCAG AGCCTCGTCGACCACGGT GGATCTGAAAAT GACCAGTCTGACAACCGAGGACA CGGCC ACCT ATTTCT GT GCC AGAGGGGAC AT CT GGGGCCCAGGCACCCT CGTC ACCGTCTCGAGC (SEQ ID NO: 143).
En un ejemplo de la descripcion, los polinucleotidos de la descripcion comprenden, o como alternativa consisten en, la siguiente secuencia polinucleotfdica que codifica la secuencia polipeptidica de cadena pesada de la SEQ ID NO: 4:
CAGTCGCTGGAGGAGTCCGGGGGTCGCCTGGTCACGCCTGGGACACCCCTGAC
ACT C ACCT GC AC AGT CT CT GG ACT CG ACCT C AGT AGCT ACT AC AT GC A ATGGGT
CCGCCAGGCT CC AGGGAAGGGGCT GGAATGGAT CGGAGTC ATTGGT ATT AAT G
AT AACAC AT ACT ACGCGAGCT GGGCGAAAGGCCGATT CACCAT CT CC AGAGCC
T CGT CG ACC ACGGTGGATCTGAAAAT GACC AGT CT GACAACCGAGGAC ACGGC
CACCTATTTCTGTGCCAGAGGGGACATCTGGGGCCCAGGCACCCTCGTCACCG
T CTCGAGCGCCT CC ACCAAGGGCCCATCGGT CTT CCCCCTGGCACCCT CCTCCA
AGAGCACCT CT GGGGGC ACAGCGGCCCT GGGCT GCCTGGT CAAGGACT ACTT C
CCCGAACCGGT GACGGT GT CGT GGAACT CAGGCGCCCT GACCAGCGGCGT GCA
CACCTTCCCGGCTGTCCT AC AGT CCT CAGGACT CTACT CCCT C AGCAGCGT GGT
G ACCGT GC CCT CC AGC AGCTT GGGC ACCC AG ACCT AC AT CT GCAACGT G AAT C
AC AAGCCCAGCAACACCAAGGT GGACAAGAG AGTTGAGCCC AAAT CTT GT GA
C AAAACT C AC AC AT GCCC ACCGT GCCC AGC ACCT G AACT C CT GGGGGG ACCGT
CAGT CTT CCT CTT CCCCCCAAAACCCAAGGACACCCTC AT GAT CTCCCGGACCC
CTG AGGT CACAT GCGT GGT GGT GGACGTGAGCCACGAAGACCCT GAGGTCAAG
TTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCATAATGCCAAGACAAAGCCGCG
GGAGGAGCAGTACGCCAGCACGTACCGTGTGGTCAGCGTCCTCACCGTCCTGC
ACC AGG ACT GGCT GAAT GGC AAGG AGT AC AAGTGCAAGGT CT CCAAC A AAGC
CCTCCCAGCCCCCATCGAGAAAACCATCTCCAAAGCCAAAGGGCAGCCCCGAG
AACCACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCCCGGGAGGAGATGACCAAGAACCAG
GT CAGCCTGACCT GCCT GGT CAAAGGCTT CT ATCCC AGCGAC AT CGCCGT GGA
GTGGGAGAGCAATGGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGACCACGCCTCCCGTG
CT GG ACT CCGACGGCTCCTT CTTCCT CT ACAGC AAGCT C ACCGT GGACAAGAGC
AGGT GGC AGCAGGGGAACGT CTT CT CAT GCTCCGT GAT GC AT GAGGCT CTGCA
C A ACC ACT AC ACGC AGAAG AGCCT CTCCCT GT CT CCGGGT AAAT G A (SEQ ID
NO: 144).
En un ejemplo adicional de la descripcion, los polinucleotidos que codifican fragmented de anticuerpo que tienen especificidad de union con CGRP comprenden, o como alternativa consisten en, una o mas de las secuencias polinucleotidicas de SEQ ID NO: 145; s Eq ID NO: 146; y SEQ ID NO: 147 que corresponden a polinucleotidos que codifican las regiones determinantes de complementariedad (CDR o regiones hipervariables) de la secuencia variable de cadena ligera de la SEQ ID NO: 1 o la secuencia de cadena ligera de la s Eq ID NO: 2.
En un ejemplo adicional de la descripcion, los polinucleotidos que codifican fragmented de anticuerpo que tienen especificidad de union con CGRP comprenden, o como alternativa consisten en, una o mas de las secuencias polinucleotidicas de SEQ ID NO: 148; s Eq ID NO: 149; y SEQ ID NO: 150 que corresponden a polinucleotidos que codifican las regiones determinantes de complementariedad (CDR o regiones hipervariables) de la secuencia variable de cadena pesada de la SEQ ID NO: 3 o la secuencia de cadena pesada de la SEQ ID NO: 4.
La descripcion tambien contempla secuencias polinucleotfdicas que incluyen una o mas de las secuencias polinucleotfdicas que codifican fragmentos de anticuerpos descritos en el presente documento. En un ejemplo de la descripcion, los polinucleotidos que codifican fragmented de anticuerpo que tienen especificidad de union con CGRP comprenden, o como alternativa consisten en, uno, dos, tres o mas, incluyendo todos los siguientes polinucleotidos que codifican fragmentos de anticuerpos: el polinucleotido SEQ ID NO: 141 que codifica la secuencia variable de cadena ligera de la SEQ ID NO: 1; el polinucleotido SEQ ID NO: 142 que codifica la secuencia de cadena ligera de la SEQ ID NO: 2; el polinucleotido SEQ ID NO: 143 que codifica la secuencia variable de cadena pesada de la SEQ ID NO: 3; el polinucleotido SEQ ID NO: 144 que codifica la secuencia de cadena pesada de la SEQ ID NO: 4; polinucleotidos que codifican las regiones determinates de complementariedad (SEQ ID NO: 145; SEQ ID NO: 146; y SEQ ID NO: 147) de la secuencia variable de cadena ligera de la SEQ ID NO: 1 o la secuencia de cadena ligera de la SEQ ID NO: 2; y polinucleotidos que codifican las regiones determinates de complementariedad (SEQ ID NO: 148; SEQ ID NO: 149; y SEQ ID nO: 150) de la secuencia variable de cadena pesada de la SEQ ID NO: 3 o la secuencia de cadena pesada de la SEQ ID NO: 4.
En un ejemplo preferente de la descripcion, los polinucleotidos de la descripcion comprenden, o como alternativa consisten en, polinucleotidos que codifican fragmentos Fab (fragmento de union a antfgeno) que tienen especificidad de union por CGRP. Con respecto al anticuerpo Ab1, los polinucleotidos que codifican el anticuerpo Ab1 de longitud completa comprenden, o como alternativa consisten en, el polinucleotido SEQ ID NO: 142 que codifica la secuencia de cadena ligera de la SEQ ID NO: 2 y el polinucleotido SEQ ID NO: 144 que codifica la secuencia de cadena pesada de la SEQ ID NO: 4.
Otro ejemplo de la descripcion contempla estos polinucleotidos incorporados en un vector de expresion para expresion en celulas de mamffero tales como CHO, NSO, HEK-293, o en sistemas fungicos, de insecto o microbianos tales como celulas de levadura tales como la levadura Pichia. Las especies de Pichia adecuadas incluyen, pero sin limitacion, Pichia pastoris. En un ejemplo de la descripcion descrita en el presente documento (posteriormente), pueden producirse fragmentos Fab mediante digestion enzimatica (por ejemplo, papama) de Ab1 despues de la expresion de los polinucleotidos de longitud completa en un hospedador adecuado. En otro ejemplo de la descripcion, pueden producirse anticuerpos anti CGRP tales como Ab1 o fragmentos Fab de los mismos mediante expresion de polinucleotidos de Ab1 en celulas de mairnfero tales como celulas CHO, NSO o HEK 293, sistemas fungicos, de insectos o microbianos tales como celulas de levadura (por ejemplo levadura diploide tal como Pichia diploide) y otras cepas de levadura. Las especies de Pichia adecuadas incluyen, pero sin limitacion, Pichia pastoris.
Anticuerpo Ab2
La descripcion se dirige ademas a polinucleotidos que codifican polipeptidos de anticuerpos que tienen especificidad de union con CGRP. En un ejemplo de la descripcion, los polinucleotidos de la descripcion comprenden, o como alternativa consisten en, la siguiente secuencia polinucleotidica que codifica la secuencia polipeptfdica de cadena ligera variable de la SEQ ID NO: 11:
C A A G T G C T G AC C C A G T C TC C A TC C TC C C T G TC T G C A T CT G T A G G A G A C A
G A G T C A C C A T C A A T T GCC A G G C C A G T C A G A G T G T T T A T G A T A A C A A C T A C C T A
G CCT G G T A T C A G C A G A A A C C A G G G A A A G T T C C T A A G C A A C T G A T CT A T T C T A C
A T C C A C T CT G G C A T C T G G G G T C C C A T C T C G T T T C A G T GGC A G T G G A T CT G G G AC
A G A T T T C A C T C T C A C C A T C A G C A G C C T GC A G C C T G A A G A T G TT GC A A C T T A T T A
CT G T C T A G G C A G T T A T G A T T GT A G T A G T G G T G A T T G T T T T G T T T T C G G C G G AG G
A A C C A A G G T G G A A A T C A A A C G T (SEQ ID N O : 151).
En un ejemplo de la descripcion, los polinucleotidos de la descripcion comprenden, o como alternativa consisten en, la siguiente secuencia polinucleotidica que codifica la secuencia polipeptfdica de cadena ligera de la SEQ ID NO: 12:
C AAGT GCT G ACCC AGT CT CC AT CCTCCCT GT CT GC AT CTGT AGG AG AC A
G AGT C ACC AT CAATT GCC AGGCC AGT C AG AGT GTTT AT GAT AAC AACT ACCT A
GCCT GGT AT CAGCAGAAACC AGGGAAAGTT CCTAAGCAACT GAT CT ATT CT AC
AT CCACT CT GGCAT CT GGGGT CCCAT CTCGTTTC AGT GGC AGT GGATCT GGGAC
AG ATTT C ACT CT C ACC AT C AGC AGCCT GC AGCCT G AAG AT GTTGC AACTT ATT A
CT GT CTAGGCAGTT AT GATT GT AGT AGT GGT GATT GTTTT GTTTT CGGCGGAGG
AACCAAGGT GGAAATCAAACGT ACGGTGGCTGCACCATCT GTCTTC ATCTTCCC
GCC AT CT GAT G AGC AGTT GAAAT CT GG AACT GCCTCT GTT GT GT GCCTGCT GAA
T AACTT CT AT CCC AGAGAGGCCAAAGTACAGT GGAAGGT GGATAACGCCCT CC
AAT CGGGT AACT CCCAGGAG AGTGT CACAGAGC AGGACAGCAAGGACAGCAC
CT AC AGCCT CAGCAGCACCCT GACGCT GAGCAAAGCAGACT ACG AGAAAC AC
AAAGTCTACGCCTGCGAAGTCACCCATCAGGGCCTGAGCTCGCCCGTCACAAA
GAGCTT CAACAGGGGAGAGT GTT AG (SEQ ID NO: 152).
En otro ejemplo de la descripcion, los polinucleotidos de la descripcion comprenden, o como alternativa consisten en, la siguiente secuencia polinucleotidica que codifica la secuencia polipeptidica de cadena pesada variable de la SEQ ID NO: 13:
GAGGT GCAGCTT GT GGAGT CT GGGGGAGGCTTGGTCCAGCCT GGGGGGT
CCCT GAG ACT CT CCT GT GC AGT CT CT GG ACT CG ACCT C AGT AGCT ACT AC AT GC
AAT GGGT CCGT CAGGCTCCAGGGAAGGGGCT GGAGT GGGT CGGAGT CATT GGT
ATCAATGATAACACATACTACGCGAGCTGGGCGAAAGGCCGATTCACCATCTC
CAGAGACAATTCCAAGACCACGGTGTATCTT CAAAT GAAC AGCCTG AGAGCT G
AGGAC ACT GCT GT GT ATTT CT GTGCTAG AGGGGACAT CT GGGGCCAAGGGACC
CTCGTCACCGTCTCGAGC (SEQ ID NO: 153).
En un ejemplo de la descripcion, los polinucleotidos de la descripcion comprenden, o como alternativa consisten en, la siguiente secuencia polinucleotidica que codifica la secuencia polipeptfdica de cadena pesada de la SEQ ID NO: 14:
GAGGT GCAGCTT GT GGAGT CT GGGGGAGGCTTGGTCCAGCCT GGGGGGT CCCT
GAG ACT CTCCT GT GC AGT CT CT GGACT CGACCT CAGT AGCT ACTACAT GCAAT G
GGTCCGT C AGGCTCCAGGGAAGGGGCT GGAGTGGGTCGGAGT C ATTGGT AT C A
ATGATAACACATACTACGCGAGCTGGGCGAAAGGCCGATTCACCATCTCCAGA
GAC AATT CCAAGACCACGGT GT AT CTT CAAATGAACAGCCT GAGAGCT GAGGA
C ACT GCT GT GT ATTT CT GT GCT AG AGGGG AC AT CT GGGGCC A AGGG ACCCT CG
T CACCGT CTCGAGCGCCT CC ACCAAGGGCCC AT CGGT CTT CCCCCT GGCACCCT
CCTCCAAGAGCACCTCTGGGGGCACAGCGGCCCTGGGCTGCCTGGTCAAGGAC
T ACTT CCCCGAACCGGT GACGGT GT CGT GGAACT CAGGCGCCCT GACC AGC GG
CGT GCAC ACCTT CCCGGCT GT CCT ACAGTCCT CAGGACTCT ACT CCCTC AGCAG
CGT GGT GACCGT GCCCTCCAGCAGCTT GGGCACCCAGACCT ACATCT GCAACG
T GAAT CACAAGCCC AGCAAC ACCAAGGT GGACAAGAGAGTT GAGCCCAAAT C
TT GT G ACAAAACT C AC AC AT GC CC ACCGT GCCC AGC ACCT G AACTCCT GGGGG
GACCGTC AGT CTTCCT CTT CCCCCCAAAACCC AAGGACACCCT CAT GAT CTCCC
GGACCCCTGAGGT CAC AT GCGT GGT GGT GGACGT GAGCCACGAAGACCCT GAG
GTCAAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCATAATGCCAAGACAAA
GCCGCGGGAGGAGCAGT ACGCC AGC ACGTACCGT GT GGT C AGCGT CCT CACCG
TCCT GC ACC AGG ACT GGCT GAAT GGC AAGG AGT ACAAGT GCAAGGT CTCC AAC
AAAGCCCTCCCAGCCCCCATCGAGAAAACCATCTCCAAAGCCAAAGGGCAGCC
CCGAGAACCACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCCCGGGAGGAGATGACCAAGA
ACCAGGT CAGCCTGACCT GCCTGGTCAAAGGCTTCTATCCCAGCGACAT CGCC
GT GGAGTGGGAGAGCAAT GGGC AGCCGGAGAACAACTACAAGACC ACGCCT C
CCGT GCTGG ACTCCGACGGCT CCTTCTTCCT CTACAGCAAGCTC ACCGT GGACA
AG AGC AGGT GGC AGC AGGGG AAC GT CTTCT CAT GCT CCGT GAT GC AT G AGGCT
CTGCACAACCACT AC ACGCAGAAGAGCCT CTCCCT GT CT CCGGGTAAAT GA
(SEQ ID NO: 154).
En un ejemplo adicional de la descripcion, los polinucleotidos que codifican fragmented de anticuerpo que tienen especificidad de union con CGRP comprenden, o como alternativa consisten en, una o mas de las secuencias polinucleotfdicas de SEQ ID NO: 155; s Eq ID NO: 156; y SEQ ID NO: 157 que corresponden a polinucleotidos que codifican las regiones determinantes de complementariedad (CDR o regiones hipervariables) de la secuencia variable de cadena ligera de la SEQ ID NO: 11 o la secuencia de cadena ligera de la SEQ ID NO: 12.
En un ejemplo adicional de la descripcion, los polinucleotidos que codifican fragmented de anticuerpo que tienen especificidad de union con CGRP comprenden, o como alternativa consisten en, una o mas de las secuencias polinucleotfdicas de SEQ ID NO: 158; s Eq ID NO: 159; y SEQ ID NO: 160 que corresponden a polinucleotidos que codifican las regiones determinantes de complementariedad (CDR o regiones hipervariables) de la secuencia variable de cadena pesada de la SEQ ID NO: 13 o la secuencia de cadena pesada de la SEQ ID NO: 14.
La descripcion tambien contempla secuencias polinucleotfdicas que incluyen una o mas de las secuencias polinucleotfdicas que codifican fragmentos de anticuerpos descritos en el presente documento. En un ejemplo de la descripcion, los polinucleotidos que codifican fragmentos de anticuerpo que tienen especificidad de union con CGRP comprenden, o como alternativa consisten en, uno, dos, tres o mas, incluyendo todos los siguientes polinucleotidos que codifican fragmentos de anticuerpos: el polinucleotido SEQ ID NO: 151 que codifica la secuencia variable de cadena ligera de la SEQ ID NO: 11; el polinucleotido SEQ ID NO: 152 que codifica la secuencia de cadena ligera de la SEQ ID NO: 12; el polinucleotido SEQ ID NO: 153 que codifica la secuencia variable de cadena pesada de la SEQ ID NO: 13; el polinucleotido SEQ ID NO: 154 que codifica la secuencia de cadena pesada de la SEQ ID NO: 14; polinucleotidos que codifican las regiones determinates de complementariedad (SEQ ID NO: 155; SEQ ID NO: 156; y SEQ ID NO: 157) de la secuencia variable de cadena ligera de la SEQ ID NO: 11 o la secuencia de cadena ligera de la SEQ ID NO: 12; y polinucleotidos que codifican las regiones determinates de complementariedad (SEQ ID NO: 158; SEQ ID NO: 159; y SEQ ID NO: 160) de la secuencia variable de cadena pesada de la SEQ ID NO: 13 o la secuencia de cadena pesada de la SEQ ID NO: 14.
En un ejemplo preferente de la descripcion, los polinucleotidos de la descripcion comprenden, o como alternativa consisten en, polinucleotidos que codifican fragmentos Fab (fragmento de union a antfgeno) que tienen especificidad de union por CGRP. Con respecto al anticuerpo Ab2, los polinucleotidos que codifican el anticuerpo Ab2 de longitud completa comprenden, o como alternativa consisten en, el polinucleotido SEQ ID NO: 152 que codifica la secuencia de cadena ligera de la SEQ ID NO: 12 y el polinucleotido SEQ ID NO: 154 que codifica la secuencia de cadena pesada de la SEQ ID NO: 14.
Otro ejemplo de la descripcion contempla estos polinucleotidos incorporados en un vector de expresion para expresion en celulas de mamffero tales como CHO, NSO, HEK-293, o en sistemas fungicos, de insecto o microbianos tales como celulas de levadura tales como la levadura Pichia. Las especies de Pichia adecuadas incluyen, pero sin limitacion, Pichia pastoris. En un ejemplo de la descripcion descrita en el presente documento (posteriormente), pueden producirse fragmentos Fab mediante digestion enzimatica (por ejemplo, papama) de Ab2 despues de la expresion de los polinucleotidos de longitud completa en un hospedador adecuado. En otro ejemplo de la descripcion, pueden producirse anticuerpos anti CGRP tales como Ab2 o fragmentos Fab de los mismos mediante expresion de polinucleotidos de Ab2 en celulas de mairnfero tales como celulas CHO, NSO o HEK 293, sistemas fungicos, de insectos o microbianos tales como celulas de levadura (por ejemplo levadura diploide tal como Pichia diploide) y otras cepas de levadura. Las especies de Pichia adecuadas incluyen, pero sin limitacion, Pichia pastoris.
Anticuerpo Ab3
La descripcion se dirige ademas a polinucleotidos que codifican polipeptidos de anticuerpos que tienen especificidad de union con CGRP. En un ejemplo de la descripcion, los polinucleotidos de la descripcion comprenden, o como alternativa consisten en, la siguiente secuencia polinucleotidica que codifica la secuencia polipeptfdica de cadena ligera variable de la SEQ ID NO: 21:
CAAGT GCT GACCC AGT CTCCATCCT CCCTGT CT GCAT CT GTAGGAGAC A
G AGT C ACC AT C AATT GCC AGGCC AGT C AG AGT GTTT AT GAT AAC AACT ACCT A
GCCT GGT AT C AGCAG AAACC AGGGAAAGTT CCT A AGCAACT GAT CT ATT CT AC
AT CCACT CT GGCAT CT GGGGT CCCAT CTCGTTTC AGT GGC AGT GGAT CT GGGAC
AG ATTT C ACT CT C ACC AT C AGC AGCCT GC AGCCT G AAG AT GTT GC AACTT ATT A
CT GT CTAGGCAGTT AT GATT GT AGT AGT GGT GATT GTTTT GTTTTCGGCGGAGG
AACCAAGGTGGAAATCAAACGT (SEQ ID NO: 161).
En un ejemplo de la descripcion, los polinucleotidos de la descripcion comprenden, o como alternativa consisten en, la siguiente secuencia polinucleotfdica que codifica la secuencia polipeptfdica de cadena ligera de la SEQ ID NO: 22:
C AAGT GCT G ACCC AGT CT CC AT CCTCCCT GT CT GC AT CT GT AGG AG AC A
G AGT C ACC AT CAATT GCC AGGCC AGT C AG AGT GTTT AT GAT AAC AACT ACCT A
GCCT GGT AT CAGCAGAAACC AGGGAAAGTT CCTAAGCAACT GAT CT ATTCT AC
AT CCACT CT GGCAT CT GGGGT CCCAT CTCGTTTC AGT GGC AGT GGAT CT GGGAC
AG ATTT C ACT CT C ACC AT C AGC AGCCT GC AGCCT GAAG AT GTT GC AACTT ATT A
CT GT CTAGGCAGTT AT GATT GT AGT AGT GGT GATT GTTTT GTTTT CGGCGGAGG
AACCAAGGT GGAAATCAAACGT ACGGTGGCTGCACCATCT GTCTTC ATCTTCCC
GCC AT CT GAT G AGC AGTT GAAAT CT GG AACT GCCTCT GTT GT GT GCCTGCT GAA
T AACTT CT AT CCC AG AG AGGCC AA AGT AC AGT GG A AGGT GGAT AACGCCCT CC
AATCGGGTAACTCCCAGGAGAGTGTCACAGAGCAGGACAGCAAGGACAGCAC
CT AC AGCCT CAGCAGCACCCT GACGCT GAGCAAAGCAGACT ACG AGAAAC AC
AAAGTCTACGCCTGCGAAGTCACCCATCAGGGCCTGAGCTCGCCCGTCACAAA
GAGCTT CAACAGGGGAGAGT GTT AG (SEQ ID NO: 162).
En otro ejemplo de la descripcion, los polinucleotidos de la descripcion comprenden, o como alternativa consisten en, la siguiente secuencia polinucleotidica que codifica la secuencia polipeptfdica de cadena pesada variable de la SEQ ID NO: 23:
GAGGT GC AGCTT GTGGAGT CT GGGGGAGGCTT GGT CC AGCCT GGGGGGT
CCCT GAG ACT CT CCT GT GCAGTCT CT GGACT CGACCT CAGT AGCT ACT AC AT GC
AAT GGGT CCGT CAGGCTCCAGGGAAGGGGCT GGAGT GGGT CGGAGT CATT GGT
ATCAATGATAACACATACTACGCGAGCTGGGCGAAAGGCCGATTCACCATCTC
CAGAGACAATTCCAAGACCACGGTGTAT CTT CAAAT GAAC AGCCTG AGAGCT G
AGG AC ACT GCT GT GT ATTT CT GT GCT AG AGGGG AC AT CT GGGGCC AAGGG ACC
CTCGTCACCGTCTCGAGC (SEQ ID NO: 163).
En un ejemplo de la descripcion, los polinucleotidos de la descripcion comprenden, o como alternativa consisten en, la siguiente secuencia polinucleotfdica que codifica la secuencia polipeptidica de cadena pesada de la SEQ ID NO: 24:
GAGGT GCAGCTT GT GGAGT CT GGGGGAGGCTTGGTCCAGCCT GGGGGGT CCCT
GAG ACT CTCCT GT GC AGT CT CT GGACT CGACCT CAGT AGCT ACTACAT GCAAT G
GGTCCGT CAGGCTCCAGGGAAGGGGCT GGAGTGGGTCGGAGT C ATTGGT AT C A
ATGATAACACATACTACGCGAGCTGGGCGAAAGGCCGATTCACCATCTCCAGA
GACAATTCCAAGACCACGGT GTATCTTCAAATGAACAGCCT GAGAGCTGAGGA
C ACT GCT GT GT ATTT CT GT GCT AG AGGGG AC AT CT GGGGCC A AGGG ACCCT CG
T CACCGT CTCGAGCGCCT CC ACCAAGGGCCC AT CGGT CTT CCCCCT GGCACCCT
CCTCCAAGAGCACCTCTGGGGGCACAGCGGCCCTGGGCTGCCTGGTCAAGGAC
T ACTT CCCCGAACCGGT GACGGT GT CGT GGAACT CAGGCGCCCTG ACC AGCGG
CGT GC AC AC CTT CCCGGCTGTCCT AC AGT CCT C AGG ACT CT ACT CCCT C AGC AG
CGTGGTGACCGTGCCCTCCAGCAGCTTGGGCACCCAGACCTACATCTGCAACG
T GAAT CACAAGCCC AGCAAC ACC AAGGT GGACGCGAGAGTT GAGCCCAAAT CT
TGTGACAAAACTCACACATGCCCACCGTGCCCAGCACCTGAACTCCTGGGGGG
ACCGT C AGT CTT CCT CTT CCCCCC AAAACCC AAGGAC ACCCT CAT GAT CT CCCG
GACCCCTG AGGT C ACATGCGT GGT GGT GGACGT GAGCCACGAAG ACCCT GAGG
TCAAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCATAATGCCAAGACAAAG
CCGCGGGAGGAGCAGTACGCCAGCACGTACCGTGTGGTCAGCGTCCTCACCGT
CCTGCACCAGGACTGGCTGAATGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTCTCCAACA
AAGCCCTCCCAGCCCCCATCGAGAAAACCATCTCCAAAGCCAAAGGGCAGCCC
CGAGAACCACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCCCGGGAGGAGATGACCAAGA
ACCAGGT CAGCCTGACCT GCCTGGTCAAAGGCTTCTATCCCAGCGACAT CGCC
GT GG AGTGGGAGAGC AAT GGGC AGCCGGAGAACAACTACAAGACC ACGCCT C
CCGT GCTGG ACT CCGACGGCT CCTTCTTCCT CTACAGCAAGCTC ACCGT GGACA
AGAGCAGGT GGCAGCAGGGGAACGTCTTCTCAT GCTCCGTGATGC ATGAGGCT
CTGCACAACCACTACACGCAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCCGGGTAAATGA
(SEQ ID NO: 164).
En un ejemplo adicional de la descripcion, los polinucleotidos que codifican fragmented de anticuerpo que tienen especificidad de union con CGRP comprenden, o como alternativa consisten en, una o mas de las secuencias polinucleotfdicas de SEQ ID NO: 165; s Eq ID NO: 166; y SEQ ID NO: 167 que corresponden a polinucleotidos que codifican las regiones determinantes de complementariedad (CDR o regiones hipervariables) de la secuencia variable de cadena ligera de la SEQ ID NO: 21 o la secuencia de cadena ligera de la SEQ ID NO: 22.
En un ejemplo adicional de la descripcion, los polinucleotidos que codifican fragmented de anticuerpo que tienen especificidad de union con CGRP comprenden, o como alternativa consisten en, una o mas de las secuencias polinucleotfdicas de SEQ ID NO: 168; s Eq ID NO: 169; y SEQ ID NO: 170 que corresponden a polinucleotidos que codifican las regiones determinantes de complementariedad (CDR o regiones hipervariables) de la secuencia variable de cadena pesada de la SEQ ID NO: 23 o la secuencia de cadena pesada de la SEQ ID NO: 24.
La descripcion tambien contempla secuencias polinucleotfdicas que incluyen una o mas de las secuencias polinucleotfdicas que codifican fragmentos de anticuerpos descritos en el presente documento. En un ejemplo de la descripcion, los polinucleotidos que codifican fragmentos de anticuerpo que tienen especificidad de union con CGRP comprenden, o como alternativa consisten en, uno, dos, tres o mas, incluyendo todos los siguientes polinucleotidos que codifican fragmentos de anticuerpos: el polinucleotido SEQ ID NO: 161 que codifica la secuencia variable de cadena ligera de la SEQ ID NO: 21; el polinucleotido SEQ ID NO: 162 que codifica la secuencia de cadena ligera de la SEQ ID NO: 22; el polinucleotido SEQ ID NO: 163 que codifica la secuencia variable de cadena pesada de la SEQ ID NO: 23; el polinucleotido SEQ ID NO: 164 que codifica la secuencia de cadena pesada de la SEQ ID NO: 24; polinucleotidos que codifican las regiones determinantes de complementariedad (SEQ ID NO: 165; SEQ ID NO: 166; y SEQ ID NO: 167) de la secuencia variable de cadena ligera de la SEQ ID NO: 21 o la secuencia de cadena ligera de la SEQ ID NO: 22; y polinucleotidos que codifican las regiones determinates de complementariedad (SEQ ID NO: 168; SEQ ID NO: 169; y SEQ ID NO: 170) de la secuencia variable de cadena pesada de la SEQ ID NO: 23 o la secuencia de cadena pesada de la SEQ ID NO: 24.
En un ejemplo preferente de la descripcion, los polinucleotidos de la descripcion comprenden, o como alternativa consisten en, polinucleotidos que codifican fragmentos Fab (fragmento de union a antigeno) que tienen especificidad de union por CGRP. Con respecto al anticuerpo Ab3, los polinucleotidos que codifican el anticuerpo Ab3 de longitud completa comprenden, o como alternativa consisten en, el polinucleotido SEQ ID NO: 162 que codifica la secuencia de cadena ligera de la SEQ ID NO: 22 y el polinucleotido SEQ ID NO: 164 que codifica la secuencia de cadena pesada de la SEQ ID NO: 24.
Otro ejemplo de la descripcion contempla estos polinucleotidos incorporados en un vector de expresion para expresion en celulas de marnffero tales como CHO, NSO, HEK-293, o en sistemas fungicos, de insecto o microbianos tales como celulas de levadura tales como la levadura Pichia. Las especies de Pichia adecuadas incluyen, pero sin limitacion, Pichia pastoris. En un ejemplo de la descripcion descrita en el presente documento (posteriormente), pueden producirse fragmentos Fab mediante digestion enzimatica (por ejemplo, papama) de Ab3 despues de la expresion de los polinucleotidos de longitud completa en un hospedador adecuado. En otro ejemplo de la descripcion, pueden producirse anticuerpos anti CGRP tales como Ab3 o fragmentos Fab de los mismos mediante expresion de polinucleotidos de Ab3 en celulas de mairnfero tales como celulas CHO, NSO o HEK 293, sistemas fungicos, de insectos o microbianos tales como celulas de levadura (por ejemplo levadura diploide tal como Pichia diploide) y otras cepas de levadura. Las especies de Pichia adecuadas incluyen, pero sin limitacion, Pichia pastoris.
Anticuerpo Ab4
La descripcion se dirige ademas a polinucleotidos que codifican polipeptidos de anticuerpos que tienen especificidad de union con CGRP. En un ejemplo de la descripcion, los polinucleotidos de la descripcion comprenden, o como alternativa consisten en, la siguiente secuencia polinucleotidica que codifica la secuencia polipeptfdica de cadena ligera variable de la SEQ ID NO: 31:
CAAGT GCT GACCCAGACTCCAT CCCCCGT GT CT GC AGCTGT GGGAAGC A
C AGT C ACC AT CAATT GCC AGGCC AGT C AG AGT GTTT AT CAT AAC ACCT ACCT GG
CCTGGT AT CAGCAGAAACC AGGGCAGCCTCCCAAACAACT GAT CTAT GAT GCA
T CC ACT CT GGCGT CT GGGGTCCC ATCGCGGTTC AGCGGCAGT GGATCT GGGAC
ACAGTTCACTCTCACCATCAGCGGCGTGCAGTGTAACGATGCTGCCGCTTACTA
CT GT CT GGGC AGTT AT GATT GT ACT AAT GGT GATT GTTTT GTTTT CGGCGG AGG
GACCGAGGTGGTGGTCAAACGT (SEQ ID NO: 171).
En un ejemplo de la descripcion, los polinucleotidos de la descripcion comprenden, o como alternativa consisten en, la siguiente secuencia polinucleotidica que codifica la secuencia polipeptfdica de cadena ligera de la SEQ ID NO: 32:
CAAGT GCT GACCC AGACTCCATCCCCCGTGT CTGCAGCT GTGGGAAGC A
C AGT CACCATCAATT GCC AGGCC AGT CAG AGT GTTTAT CAT AAC ACCT ACCTGG
CCTGGT AT CAGCAGAAACC AGGGCAGCCTCCCAAACAACT GAT CTAT GAT GCA
T CC ACT CT GGCGT CT GGGGTCCC ATCGCGGTTC AGCGGCAGT GGATCT GGGAC
AC AGTT C ACT CT C ACC AT C AGCGGCGT GC AGT GT AACG AT GCTGCCGCTT ACT A
CTGTCTGGGCAGTTATGATTGTACTAATGGTGATTGTTTTGTTTTCGGCGGAGG
GACCGAGGT GGT GGT CAAACGT ACGGTGGCT GC ACC AT CT GT CTT CAT CTTCCC
GCC AT CT GAT GAGCAGTT GAAAT CTGGAACTGCCT CTGTT GT GT GCCT GCT GAA
T AACTT CT AT CCCAG AGAGGCCAAAGT ACAGT GGAAGGTGGATAACGCCCT CC
AAT CGGGT AACT CCCAGGAGAGT GT CAC AGAGC AGGAC AGCAAGGAC AGCAC
CTACAGCCTCAGCAGCACCCTGACGCTGAGCAAAGCAGACTACGAGAAACAC
AAAGT CT ACGCCTGCGAAGT CACCC AT CAGGGCCT GAGCT CGCCCGTC ACAAA
GAGCTTCAACAGGGGAGAGTGTTAG (SEQ ID NO: 172).
En otro ejemplo de la descripcion, los polinucleotidos de la descripcion comprenden, o como alternativa consisten en, la siguiente secuencia polinucleotfdica que codifica la secuencia polipeptfdica de cadena pesada variable de la SEQ ID NO: 33:
C AGT CGCT GGAGG AGT CCGGGGGT CGCCT GGT C ACGCCT GGGACACCCC
T G AC ACT C ACCT GTTCCGT CTCT GGC AT CG ACCT C AGT GGCT ACT AC AT GAACT
GGGTCCGCCAGGCTCCAGGGAAGGGGCTGGAATGGATCGGAGTCATTGGTATT
AATGGTGCCACATACTACGCGAGCTGGGCGAAAGGCCGATTCACCATCTCCAA
AACCTCGTCGACCACGGT GGATCTGAAAAT GACCAGTCTGACAACCGAGGACA
CGGCC ACCT ATTTCT GT GCC AGAGGGGAC AT CT GGGGCCCGGGCACCCT CGTC
ACCGTCTCGAGC (SEQ ID NO: 173).
En un ejemplo de la descripcion, los polinucleotidos de la descripcion comprenden, o como alternativa consisten en, la siguiente secuencia polinucleotidica que codifica la secuencia polipeptidica de cadena pesada de la SEQ ID NO: 34:
CAGTCGCTGG AGGAGTCCGGGGGTCGCCT GGT CACGCCT GGGAC ACCCCTG AC
ACTC ACCT GTTCCGT CTCTGGCAT CGACCT C AGT GGCT ACTACAT GAACTGGGT
CCGC C AGGCT CC AGGGAAGGGGCT GG A ATGG AT CGG AGT C ATTGGT ATT AAT G
GT GCC AC ATACT ACGCGAGCT GGGCGAAAGGCCGATT C ACC AT CT CCAAAACC
T CGTCGACC ACGGT GGAT CT GAAAAT GACC AGT CT GACAACCGAGGACACGGC
CACCT ATTT CT GT GCCAGAGGGGACAT CT GGGGCCCGGGCACCCTCGT CACCG
T CTCGAGCGCCT CC ACC AAGGGCCCATCGGT CTT CCCCCTGGCACCCT CCTCCA
AGAGCACCT CT GGGGGC ACAGCGGCCCT GGGCT GCCTGGT CAAGGACT ACTT C
CCCGAACCGGTGACGGTGTCGTGGAACTCAGGCGCCCTGACCAGCGGCGTGCA
CACCTTCCCGGCTGTCCT AC AGT CCTC AGGACT CT ACTCCCT CAGCAGCGT GGT
GACCGT GCCCT CC AGCAGCTT GGGC ACCCAGACCT ACAT CT GCAACGTGAAT C
AC AAGCCCAGCAACACCAAGGT GGACAAGAG AGTTGAGCCCAAAT CTT GT GA
C AAAACT C AC AC AT GCCC ACCGT GCCC AGC ACCT GAACT C CT GGGGGG ACCGT
CAGT CTT CCTCTTCCCCCCAAAACCCAAGG AC ACCCTC AT GAT CT CCCGGACCC
CTG AGGT CACAT GCGT GGT GGT GGACGTGAGCCACGAAGACCCT GAGGT CAAG
TTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCATAATGCCAAGACAAAGCCGCG
GGAGGAGCAGTACGCCAGCACGTACCGTGTGGTCAGCGTCCTCACCGTCCTGC
ACC AGGACT GGCT GAAT GGC AAGG AGT AC AAGTGCAAGGT CT CC AACAAAGC
CCTCCCAGCCCCCATCGAGAAAACCATCTCCAAAGCCAAAGGGCAGCCCCGAG
AACCACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCCCGGGAGGAGATGACCAAGAACCAG
GT CAGCCTGACCT GCCT GGT CAAAGGCTT CT ATCCC AGCGAC AT CGCCGT GGA
GTGGGAGAGCAATGGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGACCACGCCTCCCGTG
CT GG ACT CCGACGGCTCCTT CTTCCT CT ACAGC AAGCT CACCGT GGACAAGAGC
AGGT GGCAGCAGGGGAACGT CTT CT CAT GCTCCGT GAT GC AT GAGGCT CTGCA
C AACC ACT AC ACGC AGAAG AGCCT CTCCCT GT CT CCGGGT AAAT G A (SEQ ID
NO: 174).
En un ejemplo adicional de la descripcion, los polinucleotidos que codifican fragmented de anticuerpo que tienen especificidad de union con CGRP comprenden, o como alternativa consisten en, una o mas de las secuencias polinucleotidicas de SEQ ID NO: 175; s Eq ID NO: 176; y SEQ ID NO: 177 que corresponden a polinucleotidos que codifican las regiones determinantes de complementariedad (CDR o regiones hipervariables) de la secuencia variable de cadena ligera de la SEQ ID NO: 31 o la secuencia de cadena ligera de la SEQ ID NO: 32.
En un ejemplo adicional de la descripcion, los polinucleotidos que codifican fragmented de anticuerpo que tienen especificidad de union con CGRP comprenden, o como alternativa consisten en, una o mas de las secuencias polinucleotfdicas de SEQ ID NO: 178; s Eq ID NO: 179; y SEQ ID NO: 180 que corresponden a polinucleotidos que codifican las regiones determinantes de complementariedad (CDR o regiones hipervariables) de la secuencia variable de cadena pesada de la SEQ ID NO: 33 o la secuencia de cadena pesada de la SEQ ID NO: 34.
La descripcion tambien contempla secuencias polinucleotfdicas que incluyen una o mas de las secuencias polinucleotfdicas que codifican fragmentos de anticuerpos descritos en el presente documento. En un ejemplo de la descripcion, los polinucleotidos que codifican fragmentos de anticuerpo que tienen especificidad de union con CGRP comprenden, o como alternativa consisten en, uno, dos, tres o mas, incluyendo todos los siguientes polinucleotidos que codifican fragmentos de anticuerpos: el polinucleotido SEQ ID NO: 171 que codifica la secuencia variable de cadena ligera de la SEQ ID NO: 31; el polinucleotido SEQ ID NO: 172 que codifica la secuencia de cadena ligera de la SEQ ID NO: 32; el polinucleotido SEQ ID NO: 173 que codifica la secuencia variable de cadena pesada de la SEQ ID NO: 33; el polinucleotido SEQ ID NO: 174 que codifica la secuencia de cadena pesada de la SEQ ID NO: 34; polinucleotidos que codifican las regiones determinantes de complementariedad (SEQ ID NO: 175; SEQ ID NO: 176; y SEQ ID NO: 177) de la secuencia variable de cadena ligera de la SEQ ID NO: 31 o la secuencia de cadena ligera de la SEQ ID NO: 32; y polinucleotidos que codifican las regiones determinantes de complementariedad (SEQ ID NO: 178; SEQ ID NO: 179; y SEQ ID NO: 180) de la secuencia variable de cadena pesada de la SEQ ID NO: 33 o la secuencia de cadena pesada de la SEQ ID NO: 34.
En un ejemplo preferente de la descripcion, los polinucleotidos de la descripcion comprenden, o como alternativa consisten en, polinucleotidos que codifican fragmentos Fab (fragmento de union a antfgeno) que tienen especificidad de union por CGRP. Con respecto al anticuerpo Ab4, los polinucleotidos que codifican el anticuerpo Ab4 de longitud completa comprenden, o como alternativa consisten en, el polinucleotido SEQ ID NO: 172 que codifica la secuencia de cadena ligera de la SEQ ID NO: 32 y el polinucleotido SEQ ID NO: 174 que codifica la secuencia de cadena pesada de la SEQ ID NO: 34.
Otro ejemplo de la descripcion contempla estos polinucleotidos incorporados en un vector de expresion para expresion en celulas de mairnfero tales como CHO, NSO, HEK-293, o en sistemas fungicos, de insecto o microbianos tales como celulas de levadura tales como la levadura Pichia. Las especies de Pichia adecuadas incluyen, pero sin limitacion, Pichia pastoris. En un ejemplo de la descripcion descrita en el presente documento (posteriormente), pueden producirse fragmentos Fab mediante digestion enzimatica (por ejemplo, papama) de Ab4 despues de la expresion de los polinucleotidos de longitud completa en un hospedador adecuado. En otro ejemplo de la descripcion, pueden producirse anticuerpos anti CGRP tales como Ab4 o fragmentos Fab de los mismos mediante expresion de polinucleotidos de Ab4 en celulas de m ai^ero tales como celulas CHO, NSO o HEK 293, sistemas fungicos, de insectos o microbianos tales como celulas de levadura (por ejemplo levadura diploide tal como Pichia diploide) y otras cepas de levadura. Las especies de Pichia adecuadas incluyen, pero sin limitacion, Pichia pastoris.
Anticuerpo Ab5
La descripcion se dirige ademas a polinucleotidos que codifican polipeptidos de anticuerpos que tienen especificidad de union con CGRP. En un ejemplo de la descripcion, los polinucleotidos de la descripcion comprenden, o como alternativa consisten en, la siguiente secuencia polinucleotfdica que codifica la secuencia polipeptfdica de cadena ligera variable de la SEQ ID NO: 41:
C AAGT GCT G ACCC AGT CT CC AT CCTCCCT GT CT GC AT CTGT AGG AG AC A
GAGT C ACC AT CAATT GCC AGGCC AGT CAGAGT GTTT AT CAT AAC ACCT ACCT G
GCCT GGT AT CAGCAGAAACC AGGGAAAGTT CCTAAGCAACT GAT CT AT GAT GC
AT CCACT CT GGCAT CT GGGGT CCCAT CTCGTTTC AGT GGC AGT GGAT CT GGGAC
AG ATTT C ACT CT C ACC AT C AGC AGCCT GC AGCCT G AAG AT GTT GC AACTT ATT A
CT GT CTGGGCAGTT AT GATT GT ACT AAT GGT GATT GTTTT GTTTT CGGCGGAGG
AACCAAGGTGGAAATCAAACGT (SEQ ID NO: 181).
En un ejemplo de la descripcion, los polinucleotidos de la descripcion comprenden, o como alternativa consisten en, la siguiente secuencia polinucleotidica que codifica la secuencia polipeptfdica de cadena ligera de la SEQ ID NO: 42:
CAAGT GCT GACCCAGT CTCCAT CCT CCCT GT CT GCAT CT GT AGGAGACA
GAGT C ACC AT CAATT GCCAGGCCAGTC AGAGT GTTT AT CAT AAC ACCT ACCT G
GCCT GGT AT CAGCAGAAACC AGGGAAAGTT CCTAAGCAACT GAT CT AT GAT GC
AT CCACT CT GGCAT CT GGGGT CCCAT CTCGTTTC AGT GGC AGT GGAT CT GGGAC
AG ATTT C ACT CT C ACC AT C AGC AGCCT GC AGCCT G AAG AT GTT GC AACTT ATT A
CT GT CTGGGCAGTT AT GATT GTACT AAT GGT GATT GTTTT GTTTT CGGCGGAGG
AACCAAGGT GGAAATCAAACGT ACGGTGGCTGCACCATCT GTCTTC ATCTTCCC
GCC AT CT GAT G AGC AGTT GAAAT CT GG AACT GCCTCT GTT GTGTGCCTGCT GAA
T AACTT CT AT CCC AG AG AGGCCAA AGT AC AGT GG A AGGT GGAT AACGCCCT CC
AAT CGGGT AACT CCCAGGAG AGTGT CACAGAGC AGGACAGCAAGG AC AGCAC
CT AC AGCCT CAGCAGCACCCT GACGCT GAGCAAAGCAGACT ACG AGAAAC AC
AAAGTCTACGCCTGCGAAGTCACCCATCAGGGCCTGAGCTCGCCCGTCACAAA
GAGCTT CAACAGGGGAGAGT GTT AG (SEQ ID NO: 182).
En otro ejemplo de la descripcion, los polinucleotidos de la descripcion comprenden, o como alternativa consisten en, la siguiente secuencia polinucleotidica que codifica la secuencia polipeptfdica de cadena pesada variable de la SEQ ID NO: 43:
GAGGT GCAGCTT GT GGAGT CT GGGGGAGGCTTGGTCCAGCCT GGGGGGT
CCCT GAG ACT CTCCT GT GC AGT CTCT GGAAT CG ACCT C AGT GGCT ACT AC AT G A
ACTGGGT CCGT CAGGCTCCAGGGAAGGGGCTGGAGT GGGT CGGAGT CATT GGT
ATTAAT GGT GCCACAT ACT ACGCGAGCT GGGCGAAAGGCCGATT C ACC AT CT C
CAGAGACAATTCCAAGACCACGGTGTATCTT C AAAT GAAC AGCCTG AGAGCT G
AGG AC ACT GCT GT GT ATTT CTGTGCT AG AGGGG AC AT CT GGGGCC AAGGG ACC
CTCGTCACCGTCTCGAGC (SEQ ID NO: 183).
En un ejemplo de la descripcion, los polinucleotidos de la descripcion comprenden, o como alternativa consisten en, la siguiente secuencia polinucleotfdica que codifica la secuencia polipeptfdica de cadena pesada de la SEQ ID NO: 44:
GAGGT GCAGCTTGT GGAGT CT GGGGGAGGCTT GGT CCAGCCT GGGGGGTCCCT
GAG ACT CTCCT GT GC AGT CT CT GGAATCGACCT CAGT GGCT ACTACAT GAACT G
GGTCCGTCAGGCTCCAGGGAAGGGGCTGGAGTGGGTCGGAGTCATTGGTATTA
AT GGT GCCACAT ACT ACGCGAGCTGGGCGAAAGGCCG ATT C ACC AT CT CC AGA
G AC AATT CCAAG ACC ACGGT GT AT CTT CAAAT GAAC AGCCT G AG AGCT G AGG A
C ACT GCT GT GT ATTTCT GTGCT AGAGGGGACAT CT GGGGCCAAGGGACCCTCG
T CACCGT CTCGAGCGCCT CC ACCAAGGGCCC AT CGGT CTT CCCCCT GGCACCCT
CCTCCAAGAGCACCTCTGGGGGCACAGCGGCCCTGGGCTGCCTGGTCAAGGAC
T ACTT CCCCGAACCGGT GACGGT GT CGT GGAACT CAGGCGCCCTG ACC AGCGG
CGT GCAC ACCTT CCCGGCT GT CCT ACAGTCCT CAGGACTCT ACT CCCTC AGCAG
CGTGGTGACCGTGCCCTCCAGCAGCTTGGGCACCCAGACCTACATCTGCAACG
T G AAT C ACAAG CCC AGCAAC ACC AAGGT GG ACAAG AG AGTT G AGCCC AAAT C
TTGTGACAAAACTCACACATGCCCACCGTGCCCAGCACCTGAACTCCTGGGGG
GACCGTC AGT CTTCCT CTT CCCCCCAAAACCCAAGG ACACCCT CAT GAT CTCCC
GGACCCCTGAGGT CAC AT GCGT GGT GGT GGACGT GAGCCACGAAG ACCCT GAG
GTCAAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCATAATGCCAAGACAAA
GCCGCGGGAGGAGCAGT ACGCC AGC ACGTACCGT GT GGT C AGCGT CCT CACCG
TCCT GC ACC AGG ACT GGCT GAAT GGC AAGG AGT ACAAGT GCAAGGT CTCCAAC
AAAGCCCTCCCAGCCCCCATCGAGAAAACCATCTCCAAAGCCAAAGGGCAGCC
CCGAGAACCACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCCCGGGAGGAGATGACCAAGA
ACCAGGT CAGCCTGACCT GCCTGGTCAAAGGCTTCTATCCCAGCGACAT CGCC
GT GGAGTGGGAGAGCAAT GGGC AGCCGGAGAACAACTACAAGACC ACGCCT C
CCGT GCTGG ACTCCGACGGCT CCTT CTTCCT CTACAGCAAGCTC ACCGT GGACA
AGAGCAGGT GGCAGCAGGGGAACGTCTTCTCAT GCTCCGT GATGCATGAGGCT
CTGCACAACCACTACACGCAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCCGGGTAAATGA
(SEQ ID NO: 184).
En un ejemplo adicional de la descripcion, los polinucleotidos que codifican fragmented de anticuerpo que tienen especificidad de union con CGRP comprenden, o como alternativa consisten en, una o mas de las secuencias polinucleotfdicas de SEQ ID NO: 185; s Eq ID NO: 186; y SEQ ID NO: 187 que corresponden a polinucleotidos que codifican las regiones determinates de complementariedad (CDR o regiones hipervariables) de la secuencia variable de cadena ligera de la SEQ ID NO: 41 o la secuencia de cadena ligera de la SEQ ID NO: 42.
En un ejemplo adicional de la descripcion, los polinucleotidos que codifican fragmented de anticuerpo que tienen especificidad de union con CGRP comprenden, o como alternativa consisten en, una o mas de las secuencias polinucleotfdicas de SEQ ID NO: 188; s Eq ID NO: 189; y SEQ ID NO: 190 que corresponden a polinucleotidos que codifican las regiones determinantes de complementariedad (CDR o regiones hipervariables) de la secuencia variable de cadena pesada de la SEQ ID NO: 43 o la secuencia de cadena pesada de la SEQ ID NO: 44.
La descripcion tambien contempla secuencias polinucleotfdicas que incluyen una o mas de las secuencias polinucleotfdicas que codifican fragmentos de anticuerpos descritos en el presente documento. En un ejemplo de la descripcion, los polinucleotidos que codifican fragmentos de anticuerpo que tienen especificidad de union con CGRP comprenden, o como alternativa consisten en, uno, dos, tres o mas, incluyendo todos los siguientes polinucleotidos que codifican fragmentos de anticuerpos: el polinucleotido SEQ ID NO: 181 que codifica la secuencia variable de cadena ligera de la SEQ ID NO: 41; el polinucleotido SEQ ID NO: 182 que codifica la secuencia de cadena ligera de la SEQ ID NO: 42; el polinucleotido SEQ ID NO: 183 que codifica la secuencia variable de cadena pesada de la SEQ ID NO: 43; el polinucleotido SEQ ID NO: 184 que codifica la secuencia de cadena pesada de la SEQ ID NO: 44; polinucleotidos que codifican las regiones determinantes de complementariedad (SEQ ID NO: 185; SEQ ID NO: 186; y SEQ ID NO: 187) de la secuencia variable de cadena ligera de la SEQ ID NO: 41 o la secuencia de cadena ligera de la SEQ ID NO: 42; y polinucleotidos que codifican las regiones determinantes de complementariedad (SEQ ID NO: 188; SEQ ID NO: 189; y SEQ ID NO: 190) de la secuencia variable de cadena pesada de la SEQ ID NO: 43 o la secuencia de cadena pesada de la SEQ ID NO: 44.
En un ejemplo preferente de la descripcion, los polinucleotidos de la descripcion comprenden, o como alternativa consisten en, polinucleotidos que codifican fragmentos Fab (fragmento de union a antfgeno) que tienen especificidad de union por CGRP. Con respecto al anticuerpo Ab5, los polinucleotidos que codifican el anticuerpo Ab5 de longitud completa comprenden, o como alternativa consisten en, el polinucleotido SEQ ID NO: 182 que codifica la secuencia de cadena ligera de la SEQ ID NO: 42 y el polinucleotido SEQ ID NO: 184 que codifica la secuencia de cadena pesada de la SEQ ID NO: 44.
Otro ejemplo de la descripcion contempla estos polinucleotidos incorporados en un vector de expresion para expresion en celulas de mairnfero tales como CHO, NSO, HEK-293, o en sistemas fungicos, de insecto o microbianos tales como celulas de levadura tales como la levadura Pichia. Las especies de Pichia adecuadas incluyen, pero sin limitacion, Pichia pastoris. En un ejemplo de la descripcion descrita en el presente documento (posteriormente), pueden producirse fragmentos Fab mediante digestion enzimatica (por ejemplo, papama) de Ab5 despues de la expresion de los polinucleotidos de longitud completa en un hospedador adecuado. En otro ejemplo de la descripcion, pueden producirse anticuerpos anti CGRP tales como Ab5 o fragmentos Fab de los mismos mediante expresion de polinucleotidos de Ab5 en celulas de mairnfero tales como celulas CHO, NSO o HEK 293, sistemas fungicos, de insectos o microbianos tales como celulas de levadura (por ejemplo levadura diploide tal como Pichia diploide) y otras cepas de levadura. Las especies de Pichia adecuadas incluyen, pero sin limitacion, Pichia pastoris.
Anticuerpo Ab6
La descripcion se dirige ademas a polinucleotidos que codifican polipeptidos de anticuerpos que tienen especificidad de union con CGRP. En un ejemplo de la descripcion, los polinucleotidos de la descripcion comprenden, o como alternativa consisten en, la siguiente secuencia polinucleotfdica que codifica la secuencia polipeptfdica de cadena ligera variable de la SEQ ID NO: 51:
C AAGT GCT G ACCC AGT CT CC AT CCTCCCT GT CT GC AT CTGT AGG AG AC A
GAGTCACCATCAATTGCCAGGCCAGTCAGAGTGTTTATCATAACACCTACCTG
GCCT GGTAT CAGC AGAAACCAGGGAAAGTT CCT AAGC AACTGAT CT AT GAT GC
AT CCACT CT GGCAT CT GGGGT CCCAT CTCGTTTC AGT GGC AGT GGAT CT GGGAC
AG ATTT C ACT CT C ACC AT C AGC AGCCT GC AGCCT G AAG AT GTT GC AACTT ATT A
CT GT CTGGGCAGTT AT GATT GT ACT AAT GGT GATT GTTTT GTTTT CGGCGGAGG
AACCAAGGTGGAAATCAAACGT (SEQ ID NO: 191).
En un ejemplo de la descripcion, los polinucleotidos de la descripcion comprenden, o como alternativa consisten en, la siguiente secuencia polinucleotidica que codifica la secuencia polipeptfdica de cadena ligera de la SEQ ID NO: 52:
C AAGT GCT G ACCC AGT CT CC AT CCT CCCTGTCT GC AT CT GT AGG AG AC A
GAGT C ACC AT CAATT GCCAGGCCAGTC AGAGT GTTT AT CAT AAC ACCT ACCT G
GCCT GGTAT CAGCAGAAACC AGGGAAAGTT CCTAAGCAACT GAT CT AT GAT GC
AT CCACT CT GGCAT CT GGGGT CCCAT CTCGTTTC AGT GGC AGT GGAT CT GGGAC
AG ATTT C ACT CT C ACC AT CAGC AGCCT GC AGCCT G AAG AT GTT GC AACTT ATT A
CT GT CTGGGCAGTT AT GATT GT ACT AAT GGT GATT GTTTT GTTTT CGGCGGAGG
AACCAAGGT GGAAAT CAAACGT ACGGTGGCT GCACCAT CT GT CTTC AT CTTCCC
GCC AT CT GAT G AGC AGTT GAAAT CT GG AACT GCCTCTGTT GT GT GCCTGCT GAA
T AACTT CT AT CCC AG AG AGGCC AA AGT AC AGT GG A AGGT GGAT AACGCCCT CC
AAT CGGGT AACT CCCAGGAG AGTGT CACAGAGC AGGACAGCAAGGACAGCAC
CT AC AGCCT C AGCAGCACCCT GACGCT GAGCAAAGC AGACT ACGAGAAAC AC
AAAGTCTACGCCTGCGAAGTCACCCATCAGGGCCTGAGCTCGCCCGTCACAAA
GAGCTT CAACAGGGGAGAGT GTT AG (SEQ ID NO: 192).
En otro ejemplo de la descripcion, los polinucleotidos de la descripcion comprenden, o como alternativa consisten en, la siguiente secuencia polinucleotidica que codifica la secuencia polipeptfdica de cadena pesada variable de la SEQ ID NO: 53:
GAGGT GCAGCTT GT GGAGT CT GGGGGAGGCTTGGTCCAGCCT GGGGGGT
CCCT GAG ACT CTCCT GT GC AGT CTCT GGAAT CG ACCT C AGT GGCT ACT AC AT G A
ACTGGGTCCGTCAGGCTCCAGGGAAGGGGCTGGAGTGGGTCGGAGTCATTGGT
ATTAATGGTGCCACATACTACGCGAGCTGGGCGAAAGGCCGATTCACCATCTC
CAGAGACAATTCCAAGACCACGGTGTATCTT CAAAT GAAC AGCCTG AGAGCT G
AGG AC ACT GCT GT GT ATTT CT GT GCT AG AGGGG AC AT CT GGGGCCAAGGG ACC
CTCGTCACCGTCTCGAGC (SEQ ID NO: 193).
En un ejemplo de la descripcion, los polinucleotidos de la descripcion comprenden, o como alternativa consisten en, la siguiente secuencia polinucleotidica que codifica la secuencia polipeptidica de cadena pesada de la SEQ ID NO: 54:
GAGGT GCAGCTT GT GGAGT CT GGGGG AGGCTT GGTCCAGCCT GGGGGGT CCCT
GAG ACT CTCCT GT GC AGT CT CT GGAATCGACCT CAGT GGCT ACTACAT GAACT G
GGTCCGTCAGGCTCCAGGGAAGGGGCTGGAGTGGGTCGGAGTCATTGGTATTA
AT GGT GCCACAT ACT ACGCGAGCTGGGCGAAAGGCCG ATT C ACC AT CT CC AGA
G AC AATT CCAAG ACC ACGGT GT AT CTT CAAAT G AAC AGCCT G AG AGCT G AGG A
C ACT GCT GT GT ATTT CT GT GCT AGAGGGGAC AT CT GGGGCCAAGGGACCCTCG
T CACCGT CTCGAGCGCCT CC ACCAAGGGCCC AT CGGT CTT CCCCCT GGCACCCT
CCTCCAAGAGCACCTCTGGGGGCACAGCGGCCCTGGGCTGCCTGGTCAAGGAC
T ACTT CCCCGAACCGGT GACGGT GT CGT GGAACT CAGGCGCCCTG ACC AGCGG
CGT GCAC ACCTT CCCGGCT GT CCT ACAGTCCT CAGGACTCT ACT CCCTC AGCAG
CGTGGTGACCGTGCCCTCCAGCAGCTTGGGCACCCAGACCTACATCTGCAACG
T GAAT CACAAGCCC AGCAAC ACCAAGGT GGACGCGAGAGTT GAGCCCAAAT CT
T GT GACAAAACTCACACAT GCCC ACCGT GCCCAGCACCT GAACTCCT GGGGGG
ACCGT CAGT CTT CCT CTT CCCCCCAAAACCCAAGGAC ACCCT CAT GAT CT CCCG
GACCCCTG AGGT C ACATGCGT GGT GGT GGACGT GAGCCACGAAG ACCCT GAGG
T CAAGTT C AACT GGT ACGT GG ACGGCGT GG AGGT GC ATAAT GCCAAG ACAAAG
CCGCGGGAGGAGCAGTACGCCAGCACGTACCGTGTGGTCAGCGTCCTCACCGT
CCTGCACCAGGACTGGCTGAATGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTCTCCAACA
AAGCCCTCCCAGCCCCCATCGAGAAAACCATCTCCAAAGCCAAAGGGCAGCCC
CGAGAACC ACAGGT GT ACACCCT GCCCCCATCCCGGGAGGAGAT GACCAAG A
ACCAGGT CAGCCTGACCT GCCTGGTCAAAGGCTTCTATCCCAGCGACAT CGCC
GT GGAGTGGGAGAGCAAT GGGC AGCCGGAGAACAACTACAAGACC ACGCCT C
CCGT GCTGG ACT CCGACGGCT CCTTCTTCCT CTACAGCAAGCTC ACCGT GGACA
AG AGC AGGT GGCAGC AGGGG AACGT CTTCT CAT GCT CCGT GAT GC AT G AGGCT
CTGCACAACCACT AC ACGCAGAAGAGCCT CTCCCT GT CT CCGGGT AAAT GA
(SEQ ID NO: 194).
En un ejemplo adicional de la descripcion, los polinucleotidos que codifican fragmented de anticuerpo que tienen especificidad de union con CGRP comprenden, o como alternativa consisten en, una o mas de las secuencias polinucleotfdicas de SEQ ID NO: 195; s Eq ID NO: 196; y SEQ ID NO: 197 que corresponden a polinucleotidos que codifican las regiones determinantes de complementariedad (CDR o regiones hipervariables) de la secuencia variable de cadena ligera de la SEQ ID NO: 51 o la secuencia de cadena ligera de la SEQ ID NO: 52.
En un ejemplo adicional de la descripcion, los polinucleotidos que codifican fragmented de anticuerpo que tienen especificidad de union con CGRP comprenden, o como alternativa consisten en, una o mas de las secuencias polinucleotfdicas de SEQ ID NO: 198; s Eq ID NO: 199; y SEQ ID NO: 200 que corresponden a polinucleotidos que codifican las regiones determinantes de complementariedad (CDR o regiones hipervariables) de la secuencia variable de cadena pesada de la SEQ ID NO: 53 o la secuencia de cadena pesada de la SEQ ID NO: 54.
La descripcion tambien contempla secuencias polinucleotfdicas que incluyen una o mas de las secuencias polinucleotfdicas que codifican fragmentos de anticuerpos descritos en el presente documento. En un ejemplo de la descripcion, los polinucleotidos que codifican fragmentos de anticuerpo que tienen especificidad de union con CGRP comprenden, o como alternativa consisten en, uno, dos, tres o mas, incluyendo todos los siguientes polinucleotidos que codifican fragmentos de anticuerpos: el polinucleotido SEQ ID NO: 191 que codifica la secuencia variable de cadena ligera de la SEQ ID NO: 51; el polinucleotido SEQ ID NO: 192 que codifica la secuencia de cadena ligera de la SEQ ID NO: 52; el polinucleotido SEQ ID NO: 193 que codifica la secuencia variable de cadena pesada de la SEQ ID NO: 53; el polinucleotido SEQ ID NO: 194 que codifica la secuencia de cadena pesada de la SEQ ID NO: 54; polinucleotidos que codifican las regiones determinantes de complementariedad (SEQ ID NO: 195; SEQ ID NO: 196; y SEQ ID NO: 197) de la secuencia variable de cadena ligera de la SEQ ID NO: 51 o la secuencia de cadena ligera de la SEQ ID NO: 52; y polinucleotidos que codifican las regiones determinantes de complementariedad (SEQ ID NO: 198; SEQ ID NO: 199; y SEQ ID NO: 200) de la secuencia variable de cadena pesada de la SEQ ID NO: 53 o la secuencia de cadena pesada de la SEQ ID NO: 54.
En un ejemplo preferente de la descripcion, los polinucleotidos de la descripcion comprenden, o como alternativa consisten en, polinucleotidos que codifican fragmentos Fab (fragmento de union a antfgeno) que tienen especificidad de union por CGRP. Con respecto al anticuerpo Ab6, los polinucleotidos que codifican el anticuerpo Ab6 de longitud completa de la invencion comprenden, o como alternativa consisten en, el polinucleotido SEQ ID NO: 192 que codifica la secuencia de cadena ligera de la SEQ ID NO: 52 y el polinucleotido SEQ ID NO: 194 que codifica la secuencia de cadena pesada de la SEQ ID NO: 54.
La invencion contempla estos polinucleotidos incorporados en un vector de expresion para expresion en celulas de mairnfero tales como CHO, NSO, HEK-293, o en sistemas fungicos, de insecto o microbianos tales como celulas de levadura tales como la levadura Pichia. Las especies de Pichia adecuadas incluyen, pero sin limitacion, Pichia pastoris. En un ejemplo de la descripcion descrita en el presente documento (posteriormente), pueden producirse fragmentos Fab mediante digestion enzimatica (por ejemplo, papama) de Ab6 despues de la expresion de los polinucleotidos de longitud completa en un hospedador adecuado. En una realizacion de la invencion, pueden producirse anticuerpos anti CGRp tales como Ab6 mediante expresion de polinucleotidos de Ab6 en celulas de marnffero tales como celulas CHO, NSO o HEK 293, sistemas fungicos, de insectos o microbianos tales como celulas de levadura (por ejemplo levadura diploide tal como Pichia diploide) y otras cepas de levadura. Las especies de Pichia adecuadas incluyen, pero sin limitacion, Pichia pastoris.
Anticuerpo Ab7
La descripcion se dirige ademas a polinucleotidos que codifican polipeptidos de anticuerpos que tienen especificidad de union con CGRP. En un ejemplo de la descripcion, los polinucleotidos de la descripcion comprenden, o como alternativa consisten en, la siguiente secuencia polinucleotfdica que codifica la secuencia polipeptfdica de cadena ligera variable de la SEQ ID NO: 61:
CAAGT GCT GACCC AGACTGCAT CCCCCGT GT CT GC AGCTGT GGGAAGC A
CAGT CACCAT CAATT GCCAGGCC AGT CAG AGT GTTT AT AATTACAACT ACCTT G
CCT GGT AT C AGC AGAAACC AGGGC AGCCTCCC AAGCAACT GAT CT ATT CT AC A
T CC ACT CT GGCAT CT GGGGTCT CAT CGCGATT CAAAGGC AGT GGAT CT GGGAC
AC AGTT C ACT CT CACCAT C AGCG ACGT GC AGT GT G ACG AT GCT GCC ACTT ACTA
CT GT CT AGGC AGTTAT GACTGTAGT ACT GGT GATT GTTTT GTTTTCGGCGGAGG
G ACCG AGGT GGT GGT CAA ACGT (SEQ ID NO: 201).
En un ejemplo de la descripcion, los polinucleotidos de la descripcion comprenden, o como alternativa consisten en, la siguiente secuencia polinucleotfdica que codifica la secuencia polipeptfdica de cadena ligera de la SEQ ID NO: 62:
CAAGT GCT GACCC AGACTGCAT CCCCCGT GT CT GC AGCTGT GGGAAGC A
CAGT C ACC ATCAATT GCCAGGCC AGT CAG AGT GTTT AT AATTACAACT ACCTT G
CCTGGT AT CAGCAG AAACC AGGGCAGCCTCCCAAGCAACT GAT CTATT CT AC A
T CC ACT CT GGCAT CT GGGGTCT CAT CGCGATT CAAAGGC AGT GGAT CT GGGAC
AC AGTT C ACT CT CACCAT C AGCG ACGT GC AGT GT G ACG AT GCTGCC ACTT ACTA
CT GT CT AGGC AGTTAT GACTGTAGT ACT GGT GATT GTTTT GTTTT CGGCGGAGG
GACCGAGGT GGT GGT CAAACGT ACGGTGGCT GC ACC AT CT GT CTT CAT CTTCCC
GCC AT CT GAT GAGCAGTT GAAAT CTGGAACTGCCT CTGTT GT GT GCCT GCT GAA
T AACTT CT AT CCCAG AGAGGCCAAAGT ACAGT GGAAGGTGGATAACGCCCT CC
AAT CGGGT AACT CCCAGGAGAGT GTC ACAGAGC AGGAC AGCAAGGAC AGCAC
CT AC AGCCT CAGC AGC ACCCT GACGCT GAGCAAAGC AGACTACGAGAAACAC
AAAGT CT ACGCCTGCGAAGT CACCC AT CAGGGCCT GAGCT CGCCCGTC ACAAA
GAGCTTCAACAGGGGAGAGTGTTAG (SEQ ID NO: 202).
En otro ejemplo de la descripcion, los polinucleotidos de la descripcion comprenden, o como alternativa consisten en, la siguiente secuencia polinucleotfdica que codifica la secuencia polipeptfdica de cadena pesada variable de la SEQ ID NO: 63:
CAGGAGCAGCTGAAGGAGTCCGGGGGTCGCCTGGTCACGCCTGGGACA
T CCCT GAC ACT C ACCTGC ACCGT CTCT GG AAT CG ACCT C AGT AACC ACT ACAT G
CAAT GGGT CCGCC AGGCTCCAGGGAAGGGGCT GGAGTGGAT CGGAGTCGTT GG
TATTAATGGTCGCACATACTACGCGAGCTGGGCGAAAGGCCGATTCACCATCT
CCAGAACCTCGTCGACCACGGTGGATCTGAAAATGACCAGGCTGACAACCGAG
GACACGGCCACCTATTTCTGTGCCAGAGGGGACATCTGGGGCCCAGGCACCCT
GGTCACCGTCTCGAGC (SEQ ID NO: 203).
En un ejemplo de la description, los polinucleotidos de la description comprenden, o como alternativa consisten en, la siguiente secuencia polinucleotidica que codifica la secuencia polipeptidica de cadena pesada de la SEQ ID NO: 64:
CAGGAGC AGCTGAAGGAGTCCGGGGGT CGCCT GGT CACGCCT GGGACAT CCCT
GAC ACT C ACCTGC ACCGT CT CT GGAAT CG ACCT C AGT AACC ACT AC AT GCAAT
GGGTCCGCCAGGCTCCAGGGAAGGGGCTGGAGTGGATCGGAGTCGTTGGTATT
AAT GGTCGCACAT ACTACGCGAGCT GGGCGAAAGGCCGATT CACCAT CT CC AG
AACCTCGTCGACCACGGT GGATCTGAAAAT GACCAGGCTGACAACCGAGGACA
CGGCCACCTATTTCTGTGCCAGAGGGGACATCTGGGGCCCAGGCACCCTGGTC
ACCGT CT CGAGCGCCT CC ACCAAGGGCCCATCGGT CTT CCCCCTGGCACCCT CC
T CCAAGAGCACCT CTGGGGGCACAGCGGCCCT GGGCT GCCT GGT CAAGGACT A
CTTCCCCGAACCGGT GACGGT GT CGT GGAACT C AGGCGCCCT GACC AGCGGCG
T GC ACACCTT CCCGGCT GT CCTACAGTCCT C AGGACT CT ACTCCCTC AGCAGCG
T GGT GACCGT GCCCTCCAGC AGCTT GGGC ACCCAGACCT ACATCT GCAACGT G
AAT CACAAGCCCAGCAACACCAAGGTGGACAAGAGAGTT GAGCCCAAAT CTT
GT GACAAAACT CAC ACAT GCCC ACCGT GCCC AGCACCT GAACTCCTGGGGGGA
CCGT CAGTCTT CCT CTTCCCCCCAAAACCCAAGGACACCCT CAT GAT CTCCCGG
ACCCCT GAGGT CAC AT GCGT GGT GGT GGACGT GAGCC ACGAAGACCCT GAGGT
C AAGTT CAACT GGT ACGT GG ACGGCGT GG AGGT GC AT AAT GCC AAG ACAA AGC
CGCGGGAGGAGCAGTACGCCAGCACGTACCGTGTGGTCAGCGTCCTCACCGTC
CTGC ACCAGG ACT GGCT GAAT GGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGT CTCCAACAA
AGCCCT CCCAGCCCCC AT CGAGAAAACCAT CT CCAAAGCCAAAGGGCAGCCCC
GAGAACCACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCCCGGGAGGAGATGACCAAGAA
CC AGGT CAGCCT GACCT GCCT GGT CAAAGGCTT CT AT CCC AGCG ACAT CGCCGT
GGAGTGGGAGAGCAATGGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGACCACGCCTCCC
GT GCT GGACTCCG ACGGCT CCTT CTTCCT CT AC AGCAAGCT CACCGT GGACAAG
AGC AGGT GGC AGC AGGGGAACGT CTTCT CAT GCTCCGT GAT GC AT G AGGCT CT
GC ACAACCACTACACGCAGAAG AGCCT CT CCCT GT CTCCGGGTAAATGA (SEQ
ID NO: 204).
En un ejemplo adicional de la descripcion, los polinucleotidos que codifican fragmentos de anticuerpo que tienen especificidad de union con CGRP comprenden, o como alternativa consisten en, una o mas de las secuencias polinucleotfdicas de SEQ ID NO: 205; s Eq ID NO: 206; y SEQ ID NO: 207 que corresponden a polinucleotidos que codifican las regiones determinates de complementariedad (CDR o regiones hipervariables) de la secuencia variable de cadena ligera de la SEQ ID NO: 61 o la secuencia de cadena ligera de la SEQ ID NO: 62.
En un ejemplo adicional de la descripcion, los polinucleotidos que codifican fragmentos de anticuerpo que tienen especificidad de union con CGRP comprenden, o como alternativa consisten en, una o mas de las secuencias polinucleotidicas de SEQ ID NO: 208; s Eq ID NO: 209; y SEQ ID NO: 210 que corresponden a polinucleotidos que codifican las regiones determinantes de complementariedad (CDR o regiones hipervariables) de la secuencia variable de cadena pesada de la SEQ ID NO: 63 o la secuencia de cadena pesada de la SEQ ID NO: 64.
La descripcion tambien contempla secuencias polinucleotidicas que incluyen una o mas de las secuencias polinucleotfdicas que codifican fragmentos de anticuerpos descritos en el presente documento. En un ejemplo de la descripcion, los polinucleotidos que codifican fragmentos de anticuerpo que tienen especificidad de union con CGRP comprenden, o como alternativa consisten en, uno, dos, tres o mas, incluyendo todos los siguientes polinucleotidos que codifican fragmentos de anticuerpos: el polinucleotido SEQ ID NO: 201 que codifica la secuencia variable de cadena ligera de la SEQ ID NO: 61; el polinucleotido SEQ ID NO: 202 que codifica la secuencia de cadena ligera de la SEQ ID NO: 62; el polinucleotido SEQ ID NO: 203 que codifica la secuencia variable de cadena pesada de la SEQ ID NO: 63; el polinucleotido SEQ ID NO: 204 que codifica la secuencia de cadena pesada de la SEQ ID NO: 64; polinucleotidos que codifican las regiones determinantes de complementariedad (SEQ ID NO: 205; SEQ ID NO: 206; y SEQ ID NO: 207) de la secuencia variable de cadena ligera de la SEQ ID NO: 61 o la secuencia de cadena ligera de la SEQ ID NO: 62; y polinucleotidos que codifican las regiones determinantes de complementariedad (SEQ ID NO: 208; SEQ ID NO: 209; y SEQ ID NO: 210) de la secuencia variable de cadena pesada de la SEQ ID NO: 63 o la secuencia de cadena pesada de la SEQ ID NO: 64.
En un ejemplo preferente de la descripcion, los polinucleotidos de la descripcion comprenden, o como alternativa consisten en, polinucleotidos que codifican fragmentos Fab (fragmento de union a antfgeno) que tienen especificidad de union por CGRP. Con respecto al anticuerpo Ab7, los polinucleotidos que codifican el anticuerpo Ab7 de longitud completa comprenden, o como alternativa consisten en, el polinucleotido SEQ ID NO: 202 que codifica la secuencia de cadena ligera de la SEQ ID NO: 62 y el polinucleotido SEQ ID NO: 204 que codifica la secuencia de cadena pesada de la SEQ ID NO: 64.
Otro ejemplo de la descripcion contempla estos polinucleotidos incorporados en un vector de expresion para expresion en celulas de mairnfero tales como CHO, NSO, HEK-293, o en sistemas fungicos, de insecto o microbianos tales como celulas de levadura tales como la levadura Pichia. Las especies de Pichia adecuadas incluyen, pero sin limitacion, Pichia pastoris. En un ejemplo de la descripcion descrita en el presente documento (posteriormente), pueden producirse fragmentos Fab mediante digestion enzimatica (por ejemplo, papama) de Ab7 despues de la expresion de los polinucleotidos de longitud completa en un hospedador adecuado. En otro ejemplo de la descripcion, pueden producirse anticuerpos anti CGRP tales como Ab7 o fragmentos Fab de los mismos mediante expresion de polinucleotidos de Ab7 en celulas de marnffero tales como celulas CHO, NSO o HEK 293, sistemas fungicos, de insectos o microbianos tales como celulas de levadura (por ejemplo levadura diploide tal como Pichia diploide) y otras cepas de levadura. Las especies de Pichia adecuadas incluyen, pero sin limitacion, Pichia pastoris.
Anticuerpo Ab8
La descripcion se dirige ademas a polinucleotidos que codifican polipeptidos de anticuerpos que tienen especificidad de union con CGRP. En un ejemplo de la descripcion, los polinucleotidos de la descripcion comprenden, o como alternativa consisten en, la siguiente secuencia polinucleotidica que codifica la secuencia polipeptfdica de cadena ligera variable de la SEQ ID NO: 71:
C AAGT GCT G ACCC AGT CT CC AT CCTCCCT GT CT GC AT CTGT AGG AG AC A
GAGTCACCATCAATTGCCAGGCCAGTCAGAGTGTTTACAATTACAACTACCTTG
CCT GGT AT C AGC AGAAACC AGGG AAAGTTCCT AAGCAACT GAT CT ATT CT AC A
T CC ACT CT GGCAT CTGGGGTCCC AT CT CGTTT CAGT GGC AGT GGAT CT GGGACA
G ATTT C ACT CT C ACC AT C AGC AGCCT GC AGCCT G A AG AT GTT GC AACTT ATT AC
T GT CT GGGC AGTT AT GATT GT AGT ACT GGT GATT GTTTT GTTTTCGGCGG AGG A
ACCAAGGTGGAAATCAAACGT (SEQ ID NO: 211).
En un ejemplo de la descripcion, los polinucleotidos de la descripcion comprenden, o como alternativa consisten en, la siguiente secuencia polinucleotidica que codifica la secuencia polipeptidica de cadena ligera de la SEQ ID NO: 72:
C AAGT GCT G ACCC AGT CT CC AT CCTCCCT GT CT GC AT CT GT AGG AG AC A
GAGT C ACC AT CAATT GCCAGGCCAGT C AGAGT GTTT ACAATT ACAACT ACCTT G
CCT GGT AT C AGC AGAAACC AGGG AAAGTTCCT AAGCAACT GAT CT ATT CT AC A
T CC ACT CT GGCAT CT GGGGTCCC AT CTCGTTTC AGT GGCAGT GGAT CTGGG ACA
G ATTT C ACT CT C ACC AT C AGC AGCCT GC AGCCT G A AG AT GTT GC AACTT ATT AC
T GT CT GGGC AGTT AT GATT GT AGT ACT GGT GATT GTTTT GTTTT CGGCGG AGG A
ACCAAGGT GGAAAT CAAACGT ACGGTGGCT GCACC AT CT GT CTTC AT CTTCCCG
CC AT CT GAT G AGC AGTT G AAAT CT GG AACT GCCTCTGTT GT GT GCCT GCT GAAT
AACTT CT AT CCCAGAGAGGCCAAAGTACAGT GGAAGGTGGAT AACGCCCT CCA
ATCGGGTAACTCCCAGGAGAGTGTCACAGAGCAGGACAGCAAGGACAGCACC
TACAGCCTCAGCAGCACCCTGACGCTGAGCAAAGCAGACTACGAGAAACACA
AAGT CT ACGCCTGCGAAGT C ACCCAT CAGGGCCTG AGCT CGCCCGT CACAAAG
AGCTT C AAC AGGGG AG AGT GT T AG (SEQ ID NO: 212).
En otro ejemplo de la descripcion, los polinucleotidos de la descripcion comprenden, o como alternativa consisten en, la siguiente secuencia polinucleotfdica que codifica la secuencia polipeptfdica de cadena pesada variable de la SEQ ID NO: 73:
GAGGT GCAGCTT GT GGAGT CT GGGGG AGGCTTGGTCCAGCCT GGGGGGT
CCCTGAGACTCTCCTGTGCAGTCTCTGGAATCGACCTCAGTAACCACTACATGC
AAT GGGT CCGT CAGGCTCC AGGGAAGGGGCT GGAGT GGGT CGGAGT CGTT GGT
AT C AAT GGT CGC AC AT ACT ACGC G AGCT GGGCGAAAGGCCG ATT C ACC AT CT C
CAGAGACAATTCCAAGACCACGGTGTATCTTCAAATGAACAGCCTGAGAGCTG
AGG AC ACT GCT GT GT ATTT CT GT GCT AG AGGGG AC AT CT GGGGCC AAGGG ACC
CTCGTCACCGTCTCGAGC (SEQ ID NO: 213).
En un ejemplo de la descripcion, los polinucleotidos de la descripcion comprenden, o como alternativa consisten en, la siguiente secuencia polinucleofrdica que codifica la secuencia polipepfrdica de cadena pesada de la SEQ ID NO: 74:
GAGGT GCAGCTT GT GGAGT CT GGGGGAGGCTTGGTCCAGCCT GGGGGGT CCCT
GAG ACT CTCCT GT GC AGT CT CT GGAATCGACCTCAGTAACCACTAC AT GCAATG
GGTCCGTCAGGCTCCAGGGAAGGGGCTGGAGTGGGTCGGAGTCGTTGGTATCA
AT GGTCGCACAT ACT ACGCGAGCTGGGCGAAAGGCCG ATT C ACC AT CT CC AGA
G AC AATT CCAAG ACC ACGGT GT AT CTT CAAAT G AAC AGCCT G AG AGCT G AGG A
C ACT GCTGT GT ATTT CT GT GCT AG AGGGG AC AT CT GGGGCC A AGGG ACCCT CG
T CACCGT CTCGAGCGCCT CC ACCAAGGGCCCAT CGGT CTT CCCCCT GGCACCCT
CCTCCAAGAGCACCTCTGGGGGCACAGCGGCCCTGGGCTGCCTGGTCAAGGAC
T ACTT CCCCGAACCGGT GACGGT GT CGT GGAACTCAGGCGCCCTG ACC AGCGG
CGT GCACACCTT CCCGGCT GT CCT ACAGTCCT CAGGACTCT ACT CCCTC AGCAG
CGTGGTGACCGTGCCCTCCAGCAGCTTGGGCACCCAGACCTACATCTGCAACG
T GAAT CACAAGCCCAGCAAC ACCAAGGT GGACAAGAGAGTT GAGCCCAAAT C
TTGTGACAAAACTCACACATGCCCACCGTGCCCAGCACCTGAACTCCTGGGGG
GACCGTCAGT CTTCCT CTT CCCCCCAAAACCCAAGG AC ACCCT CAT GAT CTCCC
GGACCCCTGAGGT CAC AT GCGT GGT GGT GGACGT GAGCCACGAAGACCCT GAG
GTCAAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCATAATGCCAAGACAAA
GCCGCGGGAGGAGCAGTACGCCAGCACGTACCGTGTGGTCAGCGTCCTCACCG
TCCT GC ACC AGG ACT GGCT GAAT GGC AAGG AGTACAAGT GCAAGGT CTCCAAC
AAAGCCCTCCCAGCCCCCATCGAGAAAACCATCTCCAAAGCCAAAGGGCAGCC
CCGAGAACCACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCCCGGGAGGAGATGACCAAGA
ACCAGGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTATCCCAGCGACATCGCC
GT GGAGTGGGAGAGCAAT GGGC AGCCGGAGAACAACTACAAGACC ACGCCT C
CCGT GCTGG ACTCCGACGGCT CCTTCTTCCT CTACAGCAAGCTC ACCGT GGACA
AG AGC AGGT GGC AGC AGGGG AAC GT CTTCT CAT GCT CCGT GAT GC AT G AGGCT
CTGCACAACCACT AC ACGCAGAAGAGCCT CTCCCT GT CT CCGGGTAAAT GA
(SEQ ID NO: 214).
En un ejemplo adicional de la descripcion, los polinucleotidos que codifican fragmented de anticuerpo que tienen especificidad de union con CGRP comprenden, o como alternativa consisten en, una o mas de las secuencias polinucleofrdicas de SEQ ID NO: 215; s Eq ID NO: 216; y SEQ ID NO: 217 que corresponden a polinucleotidos que codifican las regiones determinantes de complementariedad (CDR o regiones hipervariables) de la secuencia variable de cadena ligera de la SEQ ID NO: 71 o la secuencia de cadena ligera de la SEQ ID NO: 72.
En un ejemplo adicional de la descripcion, los polinucleotidos que codifican fragmentos de anticuerpo que tienen especificidad de union con CGRP comprenden, o como alternativa consisten en, una o mas de las secuencias polinucleotfdicas de SEQ ID NO: 218; SEQ ID NO: 219; y SEQ ID NO: 220 que corresponden a polinucleotidos que codifican las regiones determinates de complementariedad (CDR o regiones hipervariables) de la secuencia variable de cadena pesada de la SEQ ID NO: 73 o la secuencia de cadena pesada de la SEQ ID NO: 74.
La descripcion tambien contempla secuencias polinucleotfdicas que incluyen una o mas de las secuencias polinucleotidicas que codifican fragmentos de anticuerpos descritos en el presente documento. En un ejemplo de la descripcion, los polinucleotidos que codifican fragmentos de anticuerpo que tienen especificidad de union con CGRP comprenden, o como alternativa consisten en, uno, dos, tres o mas, incluyendo todos los siguientes polinucleotidos que codifican fragmentos de anticuerpos: el polinucleotido SEQ ID NO: 211 que codifica la secuencia variable de cadena ligera de la SEQ ID NO: 71; el polinucleotido SEQ ID NO: 212 que codifica la secuencia de cadena ligera de la SEQ ID NO: 72; el polinucleotido SEQ ID NO: 213 que codifica la secuencia variable de cadena pesada de la SEQ ID NO: 73; el polinucleotido SEQ ID NO: 214 que codifica la secuencia de cadena pesada de la SEQ ID NO: 74; polinucleotidos que codifican las regiones determinantes de complementariedad (SEQ ID NO: 215; SEQ ID NO: 216; y SEQ ID NO: 217) de la secuencia variable de cadena ligera de la SEQ ID NO: 71 o la secuencia de cadena ligera de la SEQ ID NO: 72; y polinucleotidos que codifican las regiones determinantes de complementariedad (SEQ ID NO: 218; SEQ ID NO: 219; y SEQ ID NO: 220) de la secuencia variable de cadena pesada de la SEQ ID NO: 73 o la secuencia de cadena pesada de la SEQ ID NO: 74.
En un ejemplo preferente de la descripcion, los polinucleotidos de la descripcion comprenden, o como alternativa consisten en, polinucleotidos que codifican fragmentos Fab (fragmento de union a antfgeno) que tienen especificidad de union por CGRP. Con respecto al anticuerpo Ab8 , los polinucleotidos que codifican el anticuerpo Ab8 de longitud completa comprenden, o como alternativa consisten en, el polinucleotido SEQ ID NO: 212 que codifica la secuencia de cadena ligera de la SEQ ID NO: 72 y el polinucleotido SEQ ID NO: 214 que codifica la secuencia de cadena pesada de la SEQ ID NO: 74.
Otro ejemplo de la descripcion contempla estos polinucleotidos incorporados en un vector de expresion para expresion en celulas de mairnfero tales como CHO, NSO, HEK-293, o en sistemas fungicos, de insecto o microbianos tales como celulas de levadura tales como la levadura Pichia. Las especies de Pichia adecuadas incluyen, pero sin limitacion, Pichia pastoris. En un ejemplo de la descripcion descrita en el presente documento (posteriormente), pueden producirse fragmentos Fab mediante digestion enzimatica (por ejemplo, papama) de Ab8 despues de la expresion de los polinucleotidos de longitud completa en un hospedador adecuado. En otro ejemplo de la descripcion, pueden producirse anticuerpos anti CGRP tales como Ab8 o fragmentos Fab de los mismos mediante expresion de polinucleotidos de Ab8 en celulas de m ai^ero tales como celulas CHO, NSO o HEK 293, sistemas fungicos, de insectos o microbianos tales como celulas de levadura (por ejemplo levadura diploide tal como Pichia diploide) y otras cepas de levadura. Las especies de Pichia adecuadas incluyen, pero sin limitacion, Pichia pastoris.
Anticuerpo Ab9
La descripcion se dirige ademas a polinucleotidos que codifican polipeptidos de anticuerpos que tienen especificidad de union con CGRP. En un ejemplo de la descripcion, los polinucleotidos de la descripcion comprenden, o como alternativa consisten en, la siguiente secuencia polinucleotfdica que codifica la secuencia polipeptfdica de cadena ligera variable de la SEQ ID NO: 81:
CAAGT GCT GACCCAGACTCCAT CCCCCGT GT CT GC AGCTGT GGGAAGC A
C AGT CACCATC AATT GCC AGGCC AGT CAG AAT GTTTAT AAT AACAACT ACCT A
GCCT GGT AT CAGCAGAAACC AGGGC AGCCT CCCAAGCAACT GAT CT ATTCT AC
GTCCACTCTGGCATCTGGGGTCTCATCGCGATTCAGAGGCAGTGGATCTGGGA
C AC AGTT C ACT CT C ACC AT C AGCG ACGT GC AGT GT G AC GAT GCT GCC ACTT ACT
ACT GTCT AGGC AGTT AT GATT GT AGT CGT GGT GATT GTTTT GTTTT CGGC GGAG
GG ACCG AGGT G GT GGT CAA ACGT (SEQ ID NO: 221).
En un ejemplo de la descripcion, los polinucleotidos de la descripcion comprenden, o como alternativa consisten en, la siguiente secuencia polinucleotidica que codifica la secuencia polipeptfdica de cadena ligera de la SEQ ID NO: 82: CAAGTGCTGACCCAGACTCCATCCCCCGTGTCTGCAGCTGTGGGAAGCA
C AGT C ACC AT C AATT GCC AGGCC AGT C AG AAT GTTT AT AAT AAC AACT ACCT A
GCCT GGT AT CAGCAGAAACC AGGGC AGCCT CCCAAGCAACT GAT CT ATTCT AC
GTCCACT CT GGCAT CT GGGGT CT CAT CGCGATT CAG AGGC AGT GGATCT GGGA
C AC AGTT C ACT CT C ACC AT C AGCG ACGT GC AGT GT G AC GAT GCT GCC ACTT ACT
ACT GTCT AGGC AGTT AT GATT GT AGT CGT GGT GATT GTTTT GTTTT CGGCGG AG
GGACCGAGGT GGT GGT CAAACGTACGGT GGCT GC ACCAT CTGTCTT CAT CTTCC
CGCCAT CT GAT GAGC AGTT GAAAT CTGGAACT GCCT CTGTT GT GT GCCT GCT GA
AT AACTT CT AT CCC AG AG AGGCC AAAGT AC AGT GGAAGGT GG AT AACGCCCT C
CAATCGGGTAACTCCCAGGAGAGTGTCACAGAGCAGGACAGCAAGGACAGCA
CCTACAGCCTCAGCAGCACCCTGACGCTGAGCAAAGCAGACTACGAGAAACAC
AAAGT CT ACGCCT GCGAAGT CACCCATC AGGGCCT GAGCT CGCCCGT CACAAA
GAGCTTCAACAGGGGAGAGTGTTAG (SEQ ID NO: 222).
En otro ejemplo de la descripcion, los polinucleotidos de la descripcion comprenden, o como alternativa consisten en, la siguiente secuencia polinucleotidica que codifica la secuencia polipeptidica de cadena pesada variable de la SEQ ID NO: 83:
CAGT CGCTGGAGGAGTCCGGGGGT CGCCT GGT CACGCCT GGGACACCCC
T G AC ACT C ACCT GC AC AGT CT CT GG A AT CGGCCT C AGT AGCT ACT AC AT GC AGT
GGGT CCGCC AGT CT CC AGGG AGGGGGCT GGAAT GG AT CGG AGT C ATT GGT AGT
GAT GGT AAG ACAT ACT ACGCGACCT GGGCGAAAGGCCGATT C ACCAT CT CCAA
GACCTCGTCG ACC ACGGT GG AT CT GAG AAT GGCC AGT CT GACAACCGAGGACA
CGGCCACCTATTTCTGTACCAGAGGGGACATCTGGGGCCCGGGGACCCTCGTC
ACCGTCTCGAGC (SEQ ID NO: 223).
En un ejemplo de la descripcion, los polinucleotidos de la descripcion comprenden, o como alternativa consisten en, la siguiente secuencia polinucleotidica que codifica la secuencia polipeptfdica de cadena pesada de la SEQ ID NO: 84:
CAGTCGCTGGAGGAGTCCGGGGGTCGCCTGGTCACGCCTGGGACACCCCTGAC
ACT C ACCT GC AC AGT CT CT GG A AT CGGCCT C AGT AGCT ACT AC AT GC AGT GGGT
CCGCC AGT CT CCAGGGAGGGGGCTGGAATGGAT CGGAGT CATTGGT AGT GAT G
GTAAGACATACTACGCGACCTGGGCGAAAGGCCGATTCACCATCTCCAAGACC
T CGT CG ACC ACGGT GG AT CT G AGAAT GGCC AGT CT G AC AACCG AGG AC ACGGC
CACCT ATTT CT GT ACCAGAGGGGACAT CT GGGGCCCGGGGACCCTCGT CACCG
T CTCGAGCGCCT CC ACCAAGGGCCCATCGGT CTT CCCCCTGGC ACCCTCCTCCA
AGAGCACCT CT GGGGGC ACAGCGGCCCT GGGCT GCCTGGT CAAGGACT ACTT C
CCCGAACCGGTGACGGTGTCGTGGAACTCAGGCGCCCTGACCAGCGGCGTGCA
CACCTTCCCGGCTGTCCT AC AGT CCT CAGGACT CTACT CCCT C AGCAGCGT GGT
GACCGT GCCCT CC AGCAGCTTGGGC ACCCAGACCT ACAT CT GCAACGTGAAT C
AC AAGCCCAGC AACACCAAGGT GGACAAGAGAGTT GAGCCCAAAT CTT GT GA
C AAAACT C AC AC AT GCCC ACCGT GCCC AGC ACCT G AACT C CT GGGGGG ACCGT
CAGTCTTCCTCTTCCCCCCAAAACCCAAGGACACCCTCATGATCTCCCGGACCC
CTG AGGT CACAT GCGT GGT GGT GGACGTGAGCCACGAAGACCCT GAGGTCAAG
TTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCATAATGCCAAGACAAAGCCGCG
GGAGGAGCAGT ACGCCAGCACGT ACCGT GT GGT CAGCGT CCTC ACCGT CCT GC
ACCAGGACTGGCT GAAT GGC AAGGAGT ACAAGTGCAAGGT CT CCAACAAAGC
CCTCCCAGCCCCCATCGAGAAAACCATCTCCAAAGCCAAAGGGCAGCCCCGAG
AACCACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCCCGGGAGGAGATGACCAAGAACCAG
GT CAGCCTGACCT GCCT GGT CAAAGGCTT CT ATCCC AGCGAC AT CGCCGT GGA
GTGGGAGAGCAATGGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGACCACGCCTCCCGTG
CT GG ACT CCGACGGCTCCTT CTTCCT CT ACAGC AAGCT CACCGT GGACAAGAGC
AGGT GGC AGCAGGGGAACGT CTT CT CAT GCTCCGT GAT GC AT GAGGCT CTGCA
C A ACC ACT AC ACGC AGAAG AGCCT CTCCCT GT CT CCGGGT AAAT G A (SEQ ID
NO: 224).
En un ejemplo adicional de la descripcion, los polinucleotidos que codifican fragmented de anticuerpo que tienen especificidad de union con CGRP comprenden, o como alternativa consisten en, una o mas de las secuencias polinucleotfdicas de SEQ ID NO: 225; s Eq ID NO: 226; y SEQ ID NO: 227 que corresponden a polinucleotidos que codifican las regiones determinantes de complementariedad (CDR o regiones hipervariables) de la secuencia variable de cadena ligera de la SEQ ID NO: 81 o la secuencia de cadena ligera de la SEQ ID NO: 82.
En un ejemplo adicional de la descripcion, los polinucleotidos que codifican fragmented de anticuerpo que tienen especificidad de union con CGRP comprenden, o como alternativa consisten en, una o mas de las secuencias polinucleotidicas de SEQ ID NO: 228; s Eq ID NO: 229; y SEQ ID NO: 230 que corresponden a polinucleotidos que codifican las regiones determinantes de complementariedad (CDR o regiones hipervariables) de la secuencia variable de cadena pesada de la SEQ ID NO: 83 o la secuencia de cadena pesada de la SEQ ID NO: 84.
La descripcion tambien contempla secuencias polinucleotfdicas que incluyen una o mas de las secuencias polinucleotfdicas que codifican fragmentos de anticuerpos descritos en el presente documento. En un ejemplo de la descripcion, los polinucleotidos que codifican fragmentos de anticuerpo que tienen especificidad de union con CGRP comprenden, o como alternativa consisten en, uno, dos, tres o mas, incluyendo todos los siguientes polinucleotidos que codifican fragmentos de anticuerpos: el polinucleotido SEQ ID NO: 221 que codifica la secuencia variable de cadena ligera de la SEQ ID NO: 81; el polinucleotido SEQ ID NO: 222 que codifica la secuencia de cadena ligera de la SEQ ID NO: 82; el polinucleotido SEQ ID NO: 223 que codifica la secuencia variable de cadena pesada de la SEQ ID NO: 83; el polinucleotido SEQ ID NO: 224 que codifica la secuencia de cadena pesada de la SEQ ID NO: 84; polinucleotidos que codifican las regiones determinates de complementariedad (SEQ ID NO: 225; SEQ ID NO: 226; y SEQ ID NO: 227) de la secuencia variable de cadena ligera de la SEQ ID NO: 81 o la secuencia de cadena ligera de la SEQ ID NO: 82; y polinucleotidos que codifican las regiones determinates de complementariedad (SEQ ID NO: 228; SEQ ID NO: 229; y SEQ ID NO: 230) de la secuencia variable de cadena pesada de la SEQ ID NO: 83 o la secuencia de cadena pesada de la SEQ ID NO: 84.
En un ejemplo preferente de la descripcion, los polinucleotidos de la descripcion comprenden, o como alternativa consisten en, polinucleotidos que codifican fragmentos Fab (fragmento de union a antfgeno) que tienen especificidad de union por CGRP. Con respecto al anticuerpo Ab9, los polinucleotidos que codifican el anticuerpo Ab9 de longitud completa comprenden, o como alternativa consisten en, el polinucleotido SEQ ID NO: 222 que codifica la secuencia de cadena ligera de la SEQ ID NO: 82 y el polinucleotido SEQ ID NO: 224 que codifica la secuencia de cadena pesada de la SEQ ID NO: 84.
Otro ejemplo de la descripcion contempla estos polinucleotidos incorporados en un vector de expresion para expresion en celulas de mairnfero tales como CHO, NSO, HEK-293, o en sistemas fungicos, de insecto o microbianos tales como celulas de levadura tales como la levadura Pichia. Las especies de Pichia adecuadas incluyen, pero sin limitacion, Pichia pastoris. En un ejemplo de la descripcion descrita en el presente documento (posteriormente), pueden producirse fragmentos Fab mediante digestion enzimatica (por ejemplo, papama) de Ab9 despues de la expresion de los polinucleotidos de longitud completa en un hospedador adecuado. En otro ejemplo de la descripcion, pueden producirse anticuerpos anti CGRP tales como Ab9 o fragmentos Fab de los mismos mediante expresion de polinucleotidos de Ab9 en celulas de m ai^ero tales como celulas CHO, NSO o HEK 293, sistemas fungicos, de insectos o microbianos tales como celulas de levadura (por ejemplo levadura diploide tal como Pichia diploide) y otras cepas de levadura. Las especies de Pichia adecuadas incluyen, pero sin limitacion, Pichia pastoris.
Anticuerpo Ab10
La descripcion se dirige ademas a polinucleotidos que codifican polipeptidos de anticuerpos que tienen especificidad de union con CGRP. En un ejemplo de la descripcion, los polinucleotidos de la descripcion comprenden, o como alternativa consisten en, la siguiente secuencia polinucleotfdica que codifica la secuencia polipeptfdica de cadena ligera variable de la SEQ ID NO: 91:
C AAGT GCT G ACCC AGT CT CC AT CCTCCCT GT CT GC AT CTGT AGG AG AC A
GAGTCACCATCAATTGCCAGGCCAGTCAGAATGTTTACAATAACAACTACCTA
GCCT GGT AT CAGCAGAAACC AGGGAAAGTT CCTAAGCAACT GAT CT ATT CT AC
AT CCACT CT GGCAT CT GGGGT CCCAT CTCGTTTC AGT GGC AGT GG AT CT GGGAC
AG ATTT C ACT CT C ACC AT C AGC AGCCT GC AGCCT G AAG AT GTT GC AACTT ATT A
CT GT CTGGGCAGTT AT GATT GT AGTCGT GGT GATT GTTTT GTTTT CGGCGGAGG
AACCAAGGTGGAAATCAAACGT (SEQ ID NO: 231).
En un ejemplo de la descripcion, los polinucleotidos de la descripcion comprenden, o como alternativa consisten en, la siguiente secuencia polinucleotfdica que codifica la secuencia polipeptfdica de cadena ligera de la SEQ ID NO: 92: C AAGT GCT G ACCC AGT CT CC AT CCTCCCTGTCT GC AT CTGT AGG AG AC A
GAGT C ACC AT CAATT GCCAGGCCAGT C AGAAT GTTTACAATAACAACT ACCT A
GCCT GGT AT C AGC AGAAAC C AGGGAAAGTTCCT AAGC AACT GAT CT ATT CT AC
AT CCACT CT GGCAT CT GGGGT CCCAT CTCGTTTC AGT GGC AGT GGAT CT GGGAC
AG ATTT C ACT CT C ACC AT C AGC AGCCT GC AGCCT G AAG AT GTTGC AACTT ATT A
CT GT CTGGGCAGTT AT GATT GT AGTCGT GGT GATT GTTTT GTTTT CGGCGGAGG
AACCAAGGT GGAAATCAAACGT ACGGTGGCT GCACCAT CT GT CTTC AT CTTCCC
GCC AT CT GAT G AGC AGTT GAAAT CT GGAACT GCCTCT GTT GT GT GCCTGCT GAA
T AACTT CT AT CCC AG AG AGGCCAA AGT AC AGT GG A AGGT GGAT AACGCCCT CC
AAT CGGGT AACT CCCAGGAG AGTGT CACAGAGC AGGACAGCAAGGACAGCAC
CT AC AGCCT CAGCAGCACCCT GACGCT GAGCAAAGCAGACT ACG AGAAAC AC
AAAGT CT ACGCCTGCGAAGT CACCC AT CAGGGCCTG AGCTCGCCCGT CACAAA
GAGCTT CAACAGGGGAGAGT GTT AG (SEQ ID NO: 232).
En otro ejemplo de la descripcion, los polinucleotidos de la descripcion comprenden, o como alternativa consisten en, la siguiente secuencia polinucleotidica que codifica la secuencia polipeptfdica de cadena pesada variable de la SEQ ID NO: 93:
GAGGT GCAGCTT GT GGAGT CT GGGGGAGGCTTGGTCCAGCCT GGGGGGT
CCCT GAG ACT CTCCT GT GC AGT CTCT GGAAT CGGCCT C AGT AGCT ACT AC AT GC
AAT GGGT CCGT CAGGCTCCAGGGAAGGGGCT GGAGT GGGT CGGAGT CATT GGT
AGT GAT GGTAAGAC AT ACT ACGCGACCT GGGCGAAAGGCCGATT CACCAT CT C
C AGAGACAATT CCAAGACC ACGGT GT ATCTT CAAAT GAAC AGCCT GAGAGCT G
AGG AC ACT GCT GT GT ATTT CT GT ACC AG AGGGG AC AT CT GGGGCCAAGGG ACC
CTCGTCACCGTCTCGAGC (SEQ ID NO: 233).
En un ejemplo de la descripcion, los polinucleotidos de la descripcion comprenden, o como alternativa consisten en, la siguiente secuencia polinucleotfdica que codifica la secuencia polipeptidica de cadena pesada de la SEQ ID NO: 94:
GAGGT GCAGCTT GT GGAGT CT GGGGGAGGCTTGGTCCAGCCT GGGGGGT CCCT
GAG ACT CTCCT GT GC AGT CT CT GGAATCGGCCT CAGT AGCT ACTACAT GCAAT G
GGTCCGT CAGGCTCCAGGGAAGGGGCT GGAGT GGGTCGGAGT C ATTGGT AGT G
AT GGT A AGAC AT ACT ACGCG ACCT GGGCGAAAGGCCG ATT C ACC AT CT CC AG A
G AC AATT CCAAG ACC ACGGT GT AT CTT CAAAT GAAC AGCCT GAG AGCT G AGG A
C ACT GCTGT GT ATTT CT GT AC C AG AGGGG AC AT CT GGGGCC A AGGG ACCCT CG
T CACCGT CTCGAGCGCCT CC ACCAAGGGCCC AT CGGT CTT CCCCCT GGCACCCT
CCTCCAAGAGCACCTCTGGGGGCACAGCGGCCCTGGGCTGCCTGGTCAAGGAC
T ACTT CCCCGAACCGGT GACGGT GT CGT GGAACT CAGGCGCCCTGACC AGCGG
CGT GCAC ACCTT CCCGGCT GT CCT ACAGTCCT CAGGACTCT ACT CCCTC AGCAG
CGT GGT GACCGT GCCCTCCAGCAGCTT GGGCACCCAGACCT ACATCT GCAACG
T GAAT CACAAGCCC AGCAAC ACCAAGGT GGACAAGAGAGTT GAGCCCAAAT C
TT GT G AC AAAACT C AC AC AT GCCC ACCGT GCCC AGC ACCT GAACT CCTGGGGG
GACCGTC AGT CTTCCT CTT CCCCCCAAAACCCAAGG AC ACCCT CAT GAT CTCCC
GGACCCCTGAGGT CAC AT GCGT GGT GGT GGACGT GAGCCACGAAGACCCT GAG
GTCAAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCATAATGCCAAGACAAA
GCCGCGGGAGGAGCAGT ACGCC AGC ACGTACCGT GT GGT C AGCGT CCT C ACCG
TCCT GC ACC AGG ACT GGCT GAAT GGC AAGG AGT ACAAGT GCAAGGT CTCCAAC
AAAGCCCTCCCAGCCCCCATCGAGAAAACCATCTCCAAAGCCAAAGGGCAGCC
CCGAGAACCACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCCCGGGAGGAGATGACCAAGA
ACCAGGT CAGCCTGACCT GCCTGGTCAAAGGCTTCTATCCCAGCGACAT CGCC
GTGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGACCACGCCTC
CCGT GCTGG ACTCCGACGGCT CCTTCTTCCT CTACAGCAAGCTC ACCGT GGACA
AG AGC AGGT GGC AGC AGGGG AACGT CTTCT CAT GCT CCGT GAT GCAT G AGGCT
CTGCACAACCACT AC ACGCAGAAGAGCCT CTCCCT GT CT CCGGGTAAAT GA
(SEQ ID NO: 234).
En un ejemplo adicional de la descripcion, los polinucleotidos que codifican fragmented de anticuerpo que tienen especificidad de union con CGRP comprenden, o como alternativa consisten en, una o mas de las secuencias polinucleotfdicas de SEQ ID NO: 235; s Eq ID NO: 236; y SEQ ID NO: 237 que corresponden a polinucleotidos que codifican las regiones determinantes de complementariedad (CDR o regiones hipervariables) de la secuencia variable de cadena ligera de la SEQ ID NO: 91 o la secuencia de cadena ligera de la SEQ ID NO: 92.
En un ejemplo adicional de la descripcion, los polinucleotidos que codifican fragmented de anticuerpo que tienen especificidad de union con CGRP comprenden, o como alternativa consisten en, una o mas de las secuencias polinucleotfdicas de SEQ ID NO: 238; s Eq ID NO: 239; y SEQ ID NO: 240 que corresponden a polinucleotidos que codifican las regiones determinantes de complementariedad (CDR o regiones hipervariables) de la secuencia variable de cadena pesada de la SEQ ID NO: 93 o la secuencia de cadena pesada de la SEQ ID NO: 94.
La descripcion tambien contempla secuencias polinucleotfdicas que incluyen una o mas de las secuencias polinucleotfdicas que codifican fragmentos de anticuerpos descritos en el presente documento. En un ejemplo de la descripcion, los polinucleotidos que codifican fragmentos de anticuerpo que tienen especificidad de union con CGRP comprenden, o como alternativa consisten en, uno, dos, tres o mas, incluyendo todos los siguientes polinucleotidos que codifican fragmentos de anticuerpos: el polinucleotido SEQ ID NO: 231 que codifica la secuencia variable de cadena ligera de la SEQ ID NO: 91; el polinucleotido SEQ ID NO: 232 que codifica la secuencia de cadena ligera de la SEQ ID NO: 92; el polinucleotido SEQ ID NO: 233 que codifica la secuencia variable de cadena pesada de la SEQ ID NO: 93; el polinucleotido SEQ ID NO: 234 que codifica la secuencia de cadena pesada de la SEQ ID NO: 94; polinucleotidos que codifican las regiones determinates de complementariedad (SEQ ID NO: 235; SEQ ID NO: 236; y SEQ ID NO: 237) de la secuencia variable de cadena ligera de la SEQ ID NO: 91 o la secuencia de cadena ligera de la SEQ ID NO: 92; y polinucleotidos que codifican las regiones determinates de complementariedad (SEQ ID NO: 238; SEQ ID NO: 239; y SEQ ID NO: 240) de la secuencia variable de cadena pesada de la SEQ ID NO: 93 o la secuencia de cadena pesada de la SEQ ID NO: 94.
En un ejemplo preferente de la descripcion, los polinucleotidos de la descripcion comprenden, o como alternativa consisten en, polinucleotidos que codifican fragmentos Fab (fragmento de union a antfgeno) que tienen especificidad de union por CGRP. Con respecto al anticuerpo Ab10, los polinucleotidos que codifican el anticuerpo Ab10 de longitud completa comprenden, o como alternativa consisten en, el polinucleotido SEQ ID NO: 232 que codifica la secuencia de cadena ligera de la SEQ ID NO: 92 y el polinucleotido SEQ ID NO: 234 que codifica la secuencia de cadena pesada de la SEQ ID NO: 94.
Otro ejemplo de la descripcion contempla estos polinucleotidos incorporados en un vector de expresion para expresion en celulas de mairnfero tales como CHO, NSO, HEK-293, o en sistemas fungicos, de insecto o microbianos tales como celulas de levadura tales como la levadura Pichia. Las especies de Pichia adecuadas incluyen, pero sin limitacion, Pichia pastoris. En un ejemplo de la descripcion descrita en el presente documento (posteriormente), pueden producirse fragmentos Fab mediante digestion enzimatica (por ejemplo, papama) de Ab10 despues de la expresion de los polinucleotidos de longitud completa en un hospedador adecuado. En otro ejemplo de la descripcion, pueden producirse anticuerpos anti CGRP tales como Ab10 o fragmentos Fab de los mismos mediante expresion de polinucleotidos de AblO en celulas de m ai^ero tales como celulas CHO, NSO o HEK 293, sistemas fungicos, de insectos o microbianos tales como celulas de levadura (por ejemplo levadura diploide tal como Pichia diploide) y otras cepas de levadura. Las especies de Pichia adecuadas incluyen, pero sin limitacion, Pichia pastoris.
Anticuerpo Ab11
La descripcion se dirige ademas a polinucleotidos que codifican polipeptidos de anticuerpos que tienen especificidad de union con CGRP. En un ejemplo de la descripcion, los polinucleotidos de la descripcion comprenden, o como alternativa consisten en, la siguiente secuencia polinucleotfdica que codifica la secuencia polipeptfdica de cadena ligera variable de la SEQ ID NO: 101:
C AGGT GCT GACCCAGACT GC AT CCCCCGT GT CT CC AGCTGT GGGAAGCA
C AGT CACC AT CAATT GCCGGGCCAGT C AGAGT GTTT ATT AT AAC AACT ACCT AG
CCT GGT AT C AGC AGAAACC AGGGC AGCCT CCC A AGCAACT GAT CT ATT CT AC A
T CC ACT CT GGCAT CT GGGGT CT CAT CGCGGTTCAAAGGCAGT GG AT CT GGGAC
AC AGTT CACT CT CACCAT CAGCGACGT GCAGTGT GACGAT GCT GCC ACTT ACT A
CT GT CTAGGCAGTT AT GATT GT AGT AAT GGT GATT GTTTT GTTTTCGGCGGAGG
GACCGAGGTGGTGGTCAAACGT (SEQ ID NO: 241).
En un ejemplo de la descripcion, los polinucleotidos de la descripcion comprenden, o como alternativa consisten en, la siguiente secuencia polinucleotidica que codifica la secuencia polipeptfdica de cadena ligera de la SEQ ID NO: 102 :
C AGGT GCT GACCCAGACT GC AT CCCCCGT GT CT CC AGCTGT GGGAAGCA
C AGT CACCATCAATT GCCGGGCCAGTC AGAGT GTTT ATT AT AAC AACT ACCTAG
CCTGGT AT CAGC AGAAACCAGGGC AGCCTCCCAAGCAACTG AT CT ATT CT AC A
T CC ACT CT GGCAT CT GGGGT CT CAT CGCGGTTCAAAGGCAGT GG AT CT GGGAC
AC AGTT C ACT CT C ACC AT C AGCG ACGT GC AGT GT G ACG AT GCTGCC ACTT ACT A
CT GT CTAGGCAGTT AT GATT GT AGT AAT GGT GATT GTTTT GTTTT CGGCGGAGG
GACCGAGGT GGTGGT CAAACGT ACGGT GGCT GC ACC AT CT GT CTT CAT CTTCCC
GCC AT CT GAT G AGC AGTT G AAAT CT GGAACT GCCTCT GTT GT GTGCCT GCTG A A
T AACTT CT AT CCC AG AG AGGCC AAAGT AC AGT GGAAGGTGG AT AACGCC CTCC
AAT CGGGT AACT CCCAGGAGAGT GTC ACAGAGC AGGAC AGCAAGGAC AGCAC
CTACAGCCTCAGCAGCACCCTGACGCTGAGCAAAGCAGACTACGAGAAACAC
AAAGT CT ACGCCTGCGAAGT CACCC AT CAGGGCCT GAGCT CGCCCGTC ACAAA
G AGCTT C AAC AGGGG AG AGT GTT AG (SEQ ID NO: 242).
En otro ejemplo de la descripcion, los polinucleotidos de la descripcion comprenden, o como alternativa consisten en, la siguiente secuencia polinucleotidica que codifica la secuencia polipeptfdica de cadena pesada variable de la SEQ ID NO: 103:
CAGT CGCTGGAGGAGTCCGGGGGT CGCCT GGT CACGCCT GGAGGAT CCC
T G AC ACT C ACCT GC AC AGT CTCT GGAATCG ACGT C ACT AACT ACT AT AT GCAAT
GGGTCCGCCAGGCTCC AGGGAAGGGGCTGGAATGGATCGGAGTC ATT GGTGTG
AAT GGTAAG AGAT ACT ACGCG AGCT GGGCGAAAGGCCGATT CACCAT CT CCAA
AACCTCGTCGACCACGGT GGATCTGAAAAT GACCAGTCTGACAACCGAGGACA
CGGCC ACCT ATTTCT GT GCCAGAGGCGAC AT CT GGGGCCCGGGGACCCT CGTC
ACCGTCTCGAGC (SEQ ID NO: 243).
En un ejemplo de la descripcion, los polinucleotidos de la descripcion comprenden, o como alternativa consisten en, la siguiente secuencia polinucleotidica que codifica la secuencia polipeptidica de cadena pesada de la SEQ ID NO: 104:
CAGTCGCTGGAGGAGTCCGGGGGTCGCCTGGTCACGCCTGGAGGATCCCTGAC
ACT C ACCT GC AC AGT CT CTGGAAT CG ACGT C ACT AACT ACT AT ATGCAAT GGGT
CCGCCAGGCTCCAGGGAAGGGGCTGGAATGGATCGGAGTCATTGGTGTGAATG
GTAAGAGATACTACGCGAGCTGGGCGAAAGGCCGATTCACCATCTCCAAAACC
T CGT CG ACC ACGGT GG AT CT G AAAAT G ACC AGT CT G AC AACCG AGG AC ACGGC
CACCTATTTCTGTGCCAGAGGCGACATCTGGGGCCCGGGGACCCTCGTCACCG
T CTCGAGCGCCT CC ACCAAGGGCCCATCGGT CTT CCCCCTGGCACCCT CCTCCA
AGAGCACCT CT GGGGGC ACAGCGGCCCT GGGCT GCCT GGTCAAGGACT ACTT C
CCCGAACCGGTGACGGTGTCGTGGAACTCAGGCGCCCTGACCAGCGGCGTGCA
CACCTTCCCGGCTGTCCT AC AGT CCT CAGGACT CTACT CCCT C AGCAGCGT GGT
GACCGT GCCCT CC AGCAGCTT GGGC ACCCAGACCT ACAT CT GCAACGTGAAT C
ACAAGCCCAGCAACACCAAGGTGGACAAGAGAGTTGAGCCCAAATCTTGTGA
CAAAACT C AC AC AT GCCCACCGTGCCC AGCACCT GAACTCCT GGGGGGACCGT
CAGT CTT CCTCTTCCCCCCAAAACCCAAGG AC ACCCTC AT GAT CT CCCGGACCC
CTG AGGT CACAT GCGT GGT GGT GGACGTGAGCCACGAAGACCCT GAGGTCAAG
TTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCATAATGCCAAGACAAAGCCGCG
GGAGGAGCAGTACGCCAGCACGTACCGTGTGGTCAGCGTCCTCACCGTCCTGC
ACC AGGACTGGCT GAAT GGCAAGGAGT ACAAGT GCAAGGT CTCCAACAAAGC
CCTCCCAGCCCCCATCGAGAAAACCATCTCCAAAGCCAAAGGGCAGCCCCGAG
AACCACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCCCGGGAGGAGATGACCAAGAACCAG
GT CAGCCTGACCT GCCT GGT CAAAGGCTT CT ATCCC AGCGAC AT CGCCGT GGA
GTGGGAGAGCAATGGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGACCACGCCTCCCGTG
CT GG ACT CCGACGGCTCCTT CTTCCT CT ACAGC AAGCT CACCGT GGACAAGAGC
AGGT GGC AGCAGGGGAACGT CTT CT CAT GCTCCGT GAT GC AT GAGGCT CTGCA
C A ACC ACT AC ACGC AGAAG AGCCT CTCCCT GT CT CCGGGT AAAT G A (SEQ ID
NO: 244).
En un ejemplo adicional de la descripcion, los polinucleotidos que codifican fragmented de anticuerpo que tienen especificidad de union con CGRP comprenden, o como alternativa consisten en, una o mas de las secuencias polinucleotfdicas de SEQ ID NO: 245; s Eq ID NO: 246; y SEQ ID NO: 247 que corresponden a polinucleotidos que codifican las regiones determinantes de complementariedad (CDR o regiones hipervariables) de la secuencia variable de cadena ligera de la SEQ ID NO: 101 o la secuencia de cadena ligera de la SEQ ID NO: 102.
En un ejemplo adicional de la descripcion, los polinucleotidos que codifican fragmented de anticuerpo que tienen especificidad de union con CGRP comprenden, o como alternativa consisten en, una o mas de las secuencias polinucleotfdicas de SEQ ID NO: 248; s Eq ID NO: 249; y SEQ ID NO: 250 que corresponden a polinucleotidos que codifican las regiones determinantes de complementariedad (CDR o regiones hipervariables) de la secuencia variable de cadena pesada de la SEQ ID NO: 103 o la secuencia de cadena pesada de la SEQ ID NO: 104.
La descripcion tambien contempla secuencias polinucleotfdicas que incluyen una o mas de las secuencias polinucleotfdicas que codifican fragmentos de anticuerpos descritos en el presente documento. En un ejemplo de la descripcion, los polinucleotidos que codifican fragmentos de anticuerpo que tienen especificidad de union con CGRP comprenden, o como alternativa consisten en, uno, dos, tres o mas, incluyendo todos los siguientes polinucleotidos que codifican fragmentos de anticuerpos: el polinucleotido SEQ ID NO: 241 que codifica la secuencia variable de cadena ligera de la SEQ ID NO: 101; el polinucleotido SEQ ID NO: 242 que codifica la secuencia de cadena ligera de la SEQ ID NO: 102; el polinucleotido SEQ ID NO: 243 que codifica la secuencia variable de cadena pesada de la SEQ ID NO: 103; el polinucleotido SEQ ID NO: 244 que codifica la secuencia de cadena pesada de la SEQ ID NO: 104; polinucleotidos que codifican las regiones determinantes de complementariedad (SEQ ID NO: 245; SEQ ID NO: 246; y SEQ ID NO: 247) de la secuencia variable de cadena ligera de la SEQ ID NO: 101 o la secuencia de cadena ligera de la SEQ ID NO: 102; y polinucleotidos que codifican las regiones determinates de complementariedad (SEQ ID NO: 248; SEQ ID NO: 249; y SEQ ID NO: 250) de la secuencia variable de cadena pesada de la SEQ ID NO: 103 o la secuencia de cadena pesada de la SEQ ID NO: 104.
En un ejemplo preferente de la descripcion, los polinucleotidos de la descripcion comprenden, o como alternativa consisten en, polinucleotidos que codifican fragmentos Fab (fragmento de union a antigeno) que tienen especificidad de union por CGRP. Con respecto al anticuerpo Ab11, los polinucleotidos que codifican el anticuerpo Ab11 de longitud completa comprenden, o como alternativa consisten en, el polinucleotido SEQ ID NO: 242 que codifica la secuencia de cadena ligera de la SEQ ID NO: 102 y el polinucleotido SEQ ID NO: 244 que codifica la secuencia de cadena pesada de la SEQ ID NO: 104.
Otro ejemplo de la descripcion contempla estos polinucleotidos incorporados en un vector de expresion para expresion en celulas de mairnfero tales como CHO, NSO, HEK-293, o en sistemas fungicos, de insecto o microbianos tales como celulas de levadura tales como la levadura Pichia. Las especies de Pichia adecuadas incluyen, pero sin limitacion, Pichia pastoris. En un ejemplo de la descripcion descrita en el presente documento (posteriormente), pueden producirse fragmentos Fab mediante digestion enzimatica (por ejemplo, papama) de Ab11 despues de la expresion de los polinucleotidos de longitud completa en un hospedador adecuado. En otro ejemplo de la descripcion, pueden producirse anticuerpos anti CGRP tales como Ab11 o fragmentos Fab de los mismos mediante expresion de polinucleotidos de Ab11 en celulas de m ai^ero tales como celulas CHO, NSO o HEK 293, sistemas fungicos, de insectos o microbianos tales como celulas de levadura (por ejemplo levadura diploide tal como Pichia diploide) y otras cepas de levadura. Las especies de Pichia adecuadas incluyen, pero sin limitacion, Pichia pastoris.
Anticuerpo Ab12
La descripcion se dirige ademas a polinucleotidos que codifican polipeptidos de anticuerpos que tienen especificidad de union con CGRP. En un ejemplo de la descripcion, los polinucleotidos de la descripcion comprenden, o como alternativa consisten en, la siguiente secuencia polinucleotfdica que codifica la secuencia polipeptfdica de cadena ligera variable de la SEQ ID NO: 111:
C A AGT GCT G ACCC AGTCTCC AT CCTCCCT GT CT GC AT CT GT AGG AG AC A
G AGT C ACC AT C AATT GCCGGGCC AGT C AG AGT GTTT ACT AT AAC AACT ACCT A
GCCT GGT AT CAGCAGAAACC AGGGAAAGTT CCTAAGCAACT GAT CT ATT CT AC
AT CCACT CT GGCAT CT GGGGT CCCAT CTCGTTTC AGT GGC AGT GGAT CT GGGAC
AGATTTC ACT CTC ACC AT CAGCAGCCTGCAGCCT GAAGATGTT GCAACTT ATT A
CT GT CTGGGCAGTT AT GATT GT AGT AAT GGT GATT GTTTT GTTTTCGGCGGAGG
AACCAAGGTGGAAATCAAACGT (SEQ ID NO: 251).
En un ejemplo de la descripcion, los polinucleotidos de la descripcion comprenden, o como alternativa consisten en, la siguiente secuencia polinucleotidica que codifica la secuencia polipeptfdica de cadena ligera de la SEQ ID NO: 112 :
C AAGT GCT G ACCC AGT CT CC AT CCTCCCT GT CT GC AT CTGT AGG AG AC A
G AGT C ACC AT C AATT GCCGGGCC AGT C AG AGT GTTT ACT AT AAC AACT ACCT A
GCCT GGT AT CAGCAGAAACC AGGGAAAGTTCCTAAGCAACT GAT CT ATT CT AC
AT CCACT CTGGCAT CT GGGGT CCCAT CTCGTTTC AGTGGC AGT GGAT CT GGGAC
AG ATTT C ACT CT C ACC AT C AGC AGCCT GC AGCCTG AAG AT GTT GCAACTT ATT A
CT GT CTGGGCAGTT AT GATT GT AGT AAT GGT GATT GTTTT GTTTT CGGCGGAGG
AACCAAGGT GGAAATCAAACGT ACGGTGGCT GCACCAT CT GT CTTC AT CTTCCC
GCC AT CT GAT GAGC AGTTGAAAT CT GGAACT GCCT CT GTT GTGT GCCT GCT GAA
T AACTT CT AT CCC AG AG AGGCC AA AGT AC AGT GG A AGGT GG AT AACGCCCT CC
AAT CGGGT AACT CCCAGGAG AGTGT CACAGAGC AGGACAGCAAGGACAGCAC
CT AC AGCCT CAGCAGCACCCT GACGCT GAGCAAAGCAGACT ACG AGAAAC AC
AAAGTCTACGCCTGCGAAGTCACCCATCAGGGCCTGAGCTCGCCCGTCACAAA
G AGCTT C AAC AGGGG AG AGT GTT AG (SEQ ID NO: 252).
En otro ejemplo de la descripcion, los polinucleotidos de la descripcion comprenden, o como alternativa consisten en, la siguiente secuencia polinucleotidica que codifica la secuencia polipeptfdica de cadena pesada variable de la SEQ ID NO: 113:
GAGGT GCAGCTT GT GGAGT CT GGGGGAGGCTTGGTCCAGCCT GGGGGGT
CCCT GAG ACT CTCCT GT GC AGT CT CTGGAAT CG ACGT C ACT AACT ACT AC AT GC
AAT GGGT CCGT CAGGCTCCAGGGAAGGGGCT GGAGT GGGT CGGAGT CATT GGT
GT GAAT GGTAAG AGAT ACT ACGCGAGCT GGGCGAAAGGCCGATT CACCAT CT C
C AGAGACAATTCCAAGACC ACGGT GTATCTTCAAAT GAAC AGCCT GAG AGCT G
AGG AC ACT GCT GT GT ATTT CT GT GCC AG AGGGG AC AT CT GGGGCC AAGGG ACC
CTCGTCACCGTCTCGAGC (SEQ ID NO: 253).
En un ejemplo de la descripcion, los polinucleotidos de la descripcion comprenden, o como alternativa consisten en, la siguiente secuencia polinucleotfdica que codifica la secuencia polipeptidica de cadena pesada de la SEQ ID NO: 114:
GAGGT GCAGCTT GT GGAGT CT GGGGGAGGCTTGGTCCAGCCT GGGGGGT CCCT
GAG ACT CTCCT GT GC AGT CT CT GGAATCGACGT CACT AACT ACTACAT GCAAT G
GGTCCGT C AGGCTCCAGGGAAGGGGCTGGAGT GGGT CGGAGT CATT GGT GT GA
AT GGT AAG AG AT ACT ACGCGAGCT GGGCGAAAGGCCGATT CACCAT CT CC AG A
G AC AATT CCAAG ACC ACGGT GT AT CTT CAAAT GAAC AGCCT GAG AGCT G AGG A
CACT GCT GT GT ATTT CT GT GC C AG AGGGG AC AT CT GGGGCC AAGGG ACCCT CG
T CACCGT CTCGAGCGCCT CC ACCAAGGGCCC AT CGGT CTT CCCCCT GGCACCCT
CCT CCAAGAGCACCT CT GGGGGC AC AGCGGCCCT GGGCT GCCT GGTCAAGGAC
T ACTT CCCCGAACCGGT GACGGT GT CGT GGAACT CAGGCGCCCTG ACC AGCGG
CGT GCAC ACCTT CCCGGCT GT CCT ACAGTCCT CAGGACTCT ACT CCCTC AGCAG
CGT GGT GACCGT GCCCTCCAGCAGCTT GGGCACCCAGACCT ACATCT GCAACG
T GAAT CACAAGCCC AGCAAC ACCAAGGT GGACAAGAGAGTT GAGCCCAAAT C
TTGT GACAAAACT CACACAT GCCC ACCGT GCCCAGC ACCT GAACTCCTGGGGG
GACCGTC AGT CTTCCT CTT CCCCCCAAAACCCAAGG ACACCCT CAT GAT CTCCC
GGACCCCT GAGGT CAC AT GCGT GGT GGT GGACGT GAGCCACGAAGACCCT GAG
GTCAAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCATAATGCCAAGACAAA
GCCGCGGGAGGAGCAGT ACGCC AGC ACGTACCGT GT GGT C AGCGT CCT CACCG
T CCT GCACC AGGACTGGCT GAAT GGCAAGGAGTAC AAGT GCAAGGT CTCCAAC
AAAGCCCTCCCAGCCCCCATCGAGAAAACCATCTCCAAAGCCAAAGGGCAGCC
CCGAGAACCACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCCCGGGAGGAGATGACCAAGA
ACCAGGT CAGCCTGACCT GCCTGGTCAAAGGCTTCTATCCCAGCGACAT CGCC
GT GGAGTGGGAGAGCAAT GGGC AGCCGGAGAACAACTACAAGACC ACGCCT C
CCGT GCTGG ACTCCG ACGGCT CCTTCTTCCT CTACAGCAAGCT C ACCGT GGACA
AG AGC AGGT GGC AGC AGGGG AACGT CTTCT CAT GCT CCGT GAT GC AT G AGGCT
CTGCACAACCACT AC ACGCAGAAGAGCCT CTCCCT GT CT CCGGGTAAAT GA
(SEQ ID NO: 254).
En un ejemplo adicional de la descripcion, los polinucleotidos que codifican fragmented de anticuerpo que tienen especificidad de union con CGRP comprenden, o como alternativa consisten en, una o mas de las secuencias polinucleotidicas de SEQ ID NO: 255; s Eq ID NO: 256; y SEQ ID NO: 257 que corresponden a polinucleotidos que codifican las regiones determinantes de complementariedad (CDR o regiones hipervariables) de la secuencia variable de cadena ligera de la SEQ ID NO: 111 o la secuencia de cadena ligera de la SEQ ID NO: 112.
En un ejemplo adicional de la descripcion, los polinucleotidos que codifican fragmented de anticuerpo que tienen especificidad de union con CGRP comprenden, o como alternativa consisten en, una o mas de las secuencias polinucleotidicas de SEQ ID NO: 258; s Eq ID NO: 259; y SEQ ID NO: 260 que corresponden a polinucleotidos que codifican las regiones determinantes de complementariedad (CDR o regiones hipervariables) de la secuencia variable de cadena pesada de la SEQ ID NO: 113 o la secuencia de cadena pesada de la SEQ ID NO: 114.
La descripcion tambien contempla secuencias polinucleotfdicas que incluyen una o mas de las secuencias polinucleotfdicas que codifican fragmentos de anticuerpos descritos en el presente documento. En un ejemplo de la descripcion, los polinucleotidos que codifican fragmentos de anticuerpo que tienen especificidad de union con CGRP comprenden, o como alternativa consisten en, uno, dos, tres o mas, incluyendo todos los siguientes polinucleotidos que codifican fragmentos de anticuerpos: el polinucleotido SEQ ID NO: 251 que codifica la secuencia variable de cadena ligera de la SEQ ID NO: 111; el polinucleotido SEQ ID NO: 252 que codifica la secuencia de cadena ligera de la SEQ ID NO: 112; el polinucleotido SEQ ID NO: 253 que codifica la secuencia variable de cadena pesada de la SEQ ID NO: 113; el polinucleotido SEQ ID NO: 254 que codifica la secuencia de cadena pesada de la SEQ ID NO: 114; polinucleotidos que codifican las regiones determinantes de complementariedad (SEQ ID NO: 255; SEQ ID NO: 256; y SEQ ID NO: 257) de la secuencia variable de cadena ligera de la SEQ ID NO: 111 o la secuencia de cadena ligera de la SEQ ID NO: 112; y polinucleotidos que codifican las regiones determinantes de complementariedad (SEQ ID NO: 258; SEQ ID NO: 259; y SEQ ID NO: 260) de la secuencia variable de cadena pesada de la SEQ ID NO: 113 o la secuencia de cadena pesada de la SEQ ID NO: 114.
En un ejemplo preferente de la descripcion, los polinucleotidos de la descripcion comprenden, o como alternativa consisten en, polinucleotidos que codifican fragmentos Fab (fragmento de union a antfgeno) que tienen especificidad de union por CGRP. Con respecto al anticuerpo Ab12, los polinucleotidos que codifican el anticuerpo Ab12 de longitud completa comprenden, o como alternativa consisten en, el polinucleotido SEQ ID NO: 252 que codifica la secuencia de cadena ligera de la SEQ ID NO: 112 y el polinucleotido SEQ ID NO: 254 que codifica la secuencia de cadena pesada de la SEQ ID NO: 114.
Otro ejemplo de la descripcion contempla estos polinucleotidos incorporados en un vector de expresion para expresion en celulas de m ai^ero tales como CHO, NSO, HEK-293, o en sistemas fungicos, de insecto o microbianos tales como celulas de levadura tales como la levadura Pichia. Las especies de Pichia adecuadas incluyen, pero sin limitacion, Pichia pastoris. En un ejemplo de la descripcion descrita en el presente documento (posteriormente), pueden producirse fragmentos Fab mediante digestion enzimatica (por ejemplo, papama) de Ab12 despues de la expresion de los polinucleotidos de longitud completa en un hospedador adecuado. En otro ejemplo de la descripcion, pueden producirse anticuerpos anti CGRP tales como Ab12 o fragmentos Fab de los mismos mediante expresion de polinucleotidos de Abl2 en celulas de mairnfero tales como celulas CHO, NSO o HEK 293, sistemas fungicos, de insectos o microbianos tales como celulas de levadura (por ejemplo levadura diploide tal como Pichia diploide) y otras cepas de levadura. Las especies de Pichia adecuadas incluyen, pero sin limitacion, Pichia pastoris.
Anticuerpo Ab13
La descripcion se dirige ademas a polinucleotidos que codifican polipeptidos de anticuerpos que tienen especificidad de union con CGRP. En un ejemplo de la descripcion, los polinucleotidos de la descripcion comprenden, o como alternativa consisten en, la siguiente secuencia polinucleotfdica que codifica la secuencia polipeptfdica de cadena ligera variable de la SEQ ID NO: 121:
GCC ATCGT GAT GACCC AGACT CC ATCTTCCAAGT CT GT CCCT GT GGGAG
AC ACAGT C ACC AT C AATT GCC AGGCCAGTGAGAGT CTTT AT AAT AACAACGCC
TT GGCCT GGTTTC AGC AGAAACC AGGGCAGCCT CCCAAGCGCCTG AT CT AT GA
T GC AT CCAAACT GGC AT CT GGGGTCCCAT CGCGGTT C AGT GGCGGT GGGT CT G
GG AC AC AGTT C ACT CT C ACC AT C AGT GGCGT GC AGT GT G ACG AT GCTGCC ACTT
ACT ACT GT GGAGGCTACAGAAGT GAT AGT GTTGAT GGT GTTGCTTT CGCCGGA
GGGACCGAGGTGGTGGTCAAACGT (SEQ ID NO: 261).
En un ejemplo de la descripcion, los polinucleotidos de la descripcion comprenden, o como alternativa consisten en, la siguiente secuencia polinucleotfdica que codifica la secuencia polipeptfdica de cadena ligera de la SEQ ID NO: 122 :
GCC AT C GT GAT G ACCC AG ACT CC AT CTTCCAAGT CT GTCCCT GT GGGAG
AC ACAGT C ACC AT CAATT GCCAGGCC AGT GAGAGTCTTT AT AAT AACAACGCC
TT GGCCT GGTTTC AGC AGAAACCAGGGC AGCCT CCCAAGCGCCTG AT CT AT GA
T GC AT CCAAACT GGC AT CT GGGGTCCCAT CGCGGTT C AGT GGCGGT GGGT CT G
GGAC AC AGTT CACT CT CACC AT CAGT GGCGT GCAGT GT GACG ATGCT GCC ACTT
ACT ACT GT GG AGGCT AC AGAAGT GAT AGT GTT GAT GGT GTTGCTTTCGCCGG A
GGG ACCG AGGT GGT GGT CAAAC GT ACGGT GGCT GC ACC AT CT GT CTT CAT CTTC
CCGC CAT CT GAT G AGC AGTT G AAAT CT GGAACT GCCTCT GTT GT GT GCCTGCTG
AAT AACTT CT AT CCC AG AG AGGCC AAAGT ACAGT GGAAGGT GG AT AACGCCCT
CCAAT CGGGTAACT CCCAGG AGAGT GT CAC AGAGC AGGAC AGCAAGGACAGC
ACCT AC AGCCT C AGCAGCACCCT GACGCT GAGCAAAGC AGACTACGAGAAAC
ACAAAGTCTACGCCTGCGAAGTCACCCATCAGGGCCTGAGCTCGCCCGTCACA
AAG AGCTT C AAC AGGGG AG AGT GTT AG (SEQ ID NO: 262).
En otro ejemplo de la descripcion, los polinucleotidos de la descripcion comprenden, o como alternativa consisten en, la siguiente secuencia polinucleotidica que codifica la secuencia polipeptfdica de cadena pesada variable de la SEQ ID NO: 123:
CAGT CGGT GGAGGAGTCCGGGGG AGGCCT GGT CC AGCCT GAGGG AT CC
CT G AC ACT C ACCT GC AC AGCCT CT GG ATT CG ACTT CAGT AGCAATGCAAT GT GG
T GGGT CCGCCAGGCT CC AGGGAAGGGGCT GGAGT GGAT CGGAT GCATTT ACAA
T GGT GAT GGCAGCAC AT ACT ACGCGAGCTGGGT GAAT GGCCGATT CTCCATCT
CCAAAACCTCGT CG ACC ACGGT G ACT CT GCA ACT GAAT AGT CT G AC AGTCGCG
GAC ACGGCCACGT ATT ATTGT GCG AGAGAT CTT GACTT GT GGGGCCCGGGCAC
CCTCGTCACCGTCTCGAGC (SEQ ID NO: 263).
En un ejemplo de la descripcion, los polinucleotidos de la descripcion comprenden, o como alternativa consisten en, la siguiente secuencia polinucleotfdica que codifica la secuencia polipeptidica de cadena pesada de la SEQ ID NO: 124:
CAGT CGGT GGAGGAGTCCGGGGG AGGCCT GGT CC AGCCT GAGGGATCCCT GAC
ACT C ACCT GC AC AGCCT CT GG ATTCG ACTT C AGT AGCAAT GCAAT GT GGT GGGT
CCGCC AGGCT CC AGGGAAGGGGCTGGAGT GGAT CGGATGC ATTT ACAAT GGT G
ATGGCAGCACATACTACGCGAGCTGGGTGAATGGCCGATTCTCCATCTCCAAA
ACCT CGT CG ACC ACGGT G ACT CT GC AACT G AAT AGT CT G AC AGTCGCGG AC AC
GGCC ACGT ATT ATT GT GCGAGAG AT CTT GACTTGTGGGGCCCGGGC ACCCT CGT
CACCGTCTCGAGCGCCTCCACCAAGGGCCCATCGGTCTTCCCCCTGGCACCCTC
CTCCAAG AGCACCT CT GGGGGC AC AGCGGCCCT GGGCT GCCTGGTCAAGGACT
ACTTCCCCGAACCGGTGACGGTGTCGTGGAACTCAGGCGCCCTGACCAGCGGC
GT GC ACACCTT CCCGGCT GT CCT ACAGTCCT CAGG ACT CT ACT CCCT CAGCAGC
GT GGT GACCGT GCCCTCCAGCAGCTT GGGCACCCAGACCT AC AT CT GCAACGT
GAAT C ACAAGCCC AGCAACACCAAGGT GGACAAGAGAGTT GAGCCCAAAT CT
T GTGAC AAAACT CAC ACAT GCCC ACCGT GCCC AGCACCT GAACT CCT GGGGGG
ACCGT CAGT CTT CCT CTT CCCCCCAAAACCCAAGGAC ACCCT CAT GAT CT CCCG
GACCCCTG AGGT C ACATGCGT GGT GGT GGACGT GAGCCACGAAG ACCCT GAGG
T CAAGTT CAACT GGTACGT GGACGGCGTGGAGGTGC ATAAT GCCAAGACAAAG
CCGCGGGAGGAGCAGTACGCCAGCACGTACCGTGTGGTCAGCGTCCTCACCGT
CCTGCACCAGGACTGGCTGAATGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTCTCCAACA
AAGCCCTCCCAGCCCCCATCGAGAAAACCATCTCCAAAGCCAAAGGGCAGCCC
CGAGAACCACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCCCGGGAGGAGATGACCAAGA
ACCAGGT CAGCCTGACCT GCCTGGTCAAAGGCTTCTATCCCAGCGACAT CGCC
GT GGAGTGGGAGAGCAAT GGGC AGCCGGAGAACAACTACAAGACC ACGCCT C
CCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTACAGCAAGCTCACCGTGGACA
AG AGC AGGT GGC AGC AGGGG AACGT CTTCT CAT GCT CCGT GAT GC AT G AGGCT
CTGCACAACCACT AC ACGCAGAAGAGCCTCTCCCT GT CT CCGGGTAAAT GA
(SEQ ID NO: 264).
En un ejemplo adicional de la descripcion, los polinucleotidos que codifican fragmented de anticuerpo que tienen especificidad de union con CGRP comprenden, o como alternativa consisten en, una o mas de las secuencias polinucleotidicas de SEQ ID NO: 265; s Eq ID NO: 266; y SEQ ID NO: 267 que corresponden a polinucleotidos que codifican las regiones determinantes de complementariedad (CDR o regiones hipervariables) de la secuencia variable de cadena ligera de la SEQ ID NO: 121 o la secuencia de cadena ligera de la SEQ ID NO: 122.
En un ejemplo adicional de la descripcion, los polinucleotidos que codifican fragmented de anticuerpo que tienen especificidad de union con CGRP comprenden, o como alternativa consisten en, una o mas de las secuencias polinucleotidicas de SEQ ID NO: 268; s Eq ID NO: 269; y SEQ ID NO: 270 que corresponden a polinucleotidos que codifican las regiones determinantes de complementariedad (CDR o regiones hipervariables) de la secuencia variable de cadena pesada de la SEQ ID NO: 123 o la secuencia de cadena pesada de la SEQ ID NO: 124.
La descripcion tambien contempla secuencias polinucleotfdicas que incluyen una o mas de las secuencias polinucleotidicas que codifican fragmentos de anticuerpos descritos en el presente documento. En un ejemplo de la descripcion, los polinucleotidos que codifican fragmentos de anticuerpo que tienen especificidad de union con CGRP comprenden, o como alternativa consisten en, uno, dos, tres o mas, incluyendo todos los siguientes polinucleotidos que codifican fragmentos de anticuerpos: el polinucleotido SEQ ID NO: 261 que codifica la secuencia variable de cadena ligera de la SEQ ID NO: 121; el polinucleotido SEQ ID NO: 262 que codifica la secuencia de cadena ligera de la SEQ ID NO: 122; el polinucleotido SEQ ID NO: 263 que codifica la secuencia variable de cadena pesada de la SEQ ID NO: 123; el polinucleotido SEQ ID NO: 264 que codifica la secuencia de cadena pesada de la SEQ ID NO: 124; polinucleotidos que codifican las regiones determinantes de complementariedad (SEQ ID NO: 265; SEQ ID NO: 266; y SEQ ID NO: 267) de la secuencia variable de cadena ligera de la SEQ ID NO: 121 o la secuencia de cadena ligera de la SEQ ID NO: 122; y polinucleotidos que codifican las regiones determinantes de complementariedad (SEQ ID NO: 268; SEQ ID NO: 269 ; y SEQ ID NO: 270) de la secuencia variable de cadena pesada de la SEQ ID NO: 123 o la secuencia de cadena pesada de la SEQ ID NO: 124.
En un ejemplo preferente de la descripcion, los polinucleotidos de la descripcion comprenden, o como alternativa consisten en, polinucleotidos que codifican fragmentos Fab (fragmento de union a antfgeno) que tienen especificidad de union por CGRP. Con respecto al anticuerpo Ab13, los polinucleotidos que codifican el anticuerpo Ab13 de longitud completa comprenden, o como alternativa consisten en, el polinucleotido SEQ ID NO: 262 que codifica la secuencia de cadena ligera de la SEQ ID NO: 122 y el polinucleotido SEQ ID NO: 264 que codifica la secuencia de cadena pesada de la SEQ ID NO: 124.
Otro ejemplo de la descripcion contempla estos polinucleotidos incorporados en un vector de expresion para expresion en celulas de mairnfero tales como CHO, NSO, HEK-293, o en sistemas fungicos, de insecto o microbianos tales como celulas de levadura tales como la levadura Pichia. Las especies de Pichia adecuadas incluyen, pero sin limitacion, Pichia pastoris. En un ejemplo de la descripcion descrita en el presente documento (posteriormente), pueden producirse fragmentos Fab mediante digestion enzimatica (por ejemplo, papama) de Ab13 despues de la expresion de los polinucleotidos de longitud completa en un hospedador adecuado. En otro ejemplo de la descripcion, pueden producirse anticuerpos anti CGRP tales como Ab13 o fragmentos Fab de los mismos mediante expresion de polinucleotidos de Ab13 en celulas de m ai^ero tales como celulas CHO, NSO o HEK 293, sistemas fungicos, de insectos o microbianos tales como celulas de levadura (por ejemplo levadura diploide tal como Pichia diploide) y otras cepas de levadura. Las especies de Pichia adecuadas incluyen, pero sin limitacion, Pichia pastoris.
Anticuerpo Ab14
La descripcion se dirige ademas a polinucleotidos que codifican polipeptidos de anticuerpos que tienen especificidad de union con CGRP. En un ejemplo de la descripcion, los polinucleotidos de la descripcion comprenden, o como alternativa consisten en, la siguiente secuencia polinucleotfdica que codifica la secuencia polipeptfdica de cadena ligera variable de la SEQ ID NO: 131:
C AAGT GCTG ACCC AGT CT CC AT CCTCCCT GT CT GC AT CTGT AGG AG AC A
GAGTCACCATCAATTGCCAGGCCAGTCAGAATGTTTACAATAACAACTACCTA
GCCT GGT AT CAGCAGAAACC AGGGAAAGTT CCTAAGCAACT GAT CT ATT CT AC
AT CCACT CT GGCAT CT GGGGT CCCAT CTCGTTTC AGT GGC AGT GGAT CT GGGAC
AG ATTT C ACT CT C ACC AT C AGC AGCCT GC AGCCT G AAG AT GTT GC AACTT ATT A
CT GT CTGGGCAGTT AT GATT GT AGTCGT GGT GATT GTTTT GTTTT CGGCGGAGG
AACCAAGGTGGAAATCAAACGT (SEQ ID NO: 271).
En un ejemplo de la descripcion, los polinucleotidos de la descripcion comprenden, o como alternativa consisten en, la siguiente secuencia polinucleotfdica que codifica la secuencia polipeptfdica de cadena ligera de la SEQ ID NO: 132:
C AAGT GCT G ACCC AGT CT CC AT CCTCCCT GT CT GC AT CTGT AGG AG AC A
GAGT C ACC AT CAATT GCCAGGCCAGT C AGAAT GTTTACAATAACAACT ACCT A
GCCT GGT AT C AGC AG AAACC AGGG AAAGTTCCT AAGC AACT GAT CT ATT CT AC
AT CCACT CT GGCAT CT GGGGT CCCAT CTCGTTTC AGT GGC AGT GGAT CT GGGAC
AG ATTT C ACT CT C ACC AT C AGC AGCCT GC AGCCT G AAG AT GTT GC AACTT ATT A
CT GT CTGGGCAGTT AT GATT GT AGTCGT GGT GATT GTTTT GTTTT CGGCGGAGG
AACCAAGGT GGAAATCAAACGT ACGGTGGCTGCACCATCT GTCTTC ATCTTCCC
GCC AT CT GAT G AGC AGTT GAAAT CT GG AACT GCCTCTGTTGT GT GCCT GCT GAA
T AACTT CT AT CCC AG AG AGGCCAA AGT AC AGT GG A AGGT GGAT AACGCCCT CC
AAT CGGGT AACT CCCAGGAG AGTGT CACAGAGC AGGACAGCAAGGACAGCAC
CT AC AGCCT CAGCAGCACCCT GACGCT GAGCAAAGCAGACT ACG AGAAAC AC
AAAGT CT ACGCCTGCGAAGT CACCC AT CAGGGCCTG AGCTCGCCCGT CACAAA
GAGCTT CAACAGGGGAGAGT GTT AG (SEQ ID NO: 272).
En otro ejemplo de la descripcion, los polinucleotidos de la descripcion comprenden, o como alternativa consisten en, la siguiente secuencia polinucleotidica que codifica la secuencia polipeptfdica de cadena pesada variable de la SEQ ID NO: 133:
G AGGT GC AGCTT GT GG AGT CT GGGGG AGGCTT GGTCC AGCCT GGGGGGT
CCCT GAG ACT CTCCT GT GC AGT CT CTGGAAT CGGCCT C AGT AGCT ACT AC AT GC
AAT GGGT CCGT CAGGCTCCAGGGAAGGGGCT GGAGT GGGT CGGAGT CATT GGT
AGT GAT GGTAAGAC AT ACT ACGCGACCT GGGCGAAAGGCCGATT CACCAT CT C
CAGAGACAATTCCAAGACCACGGTGTATCTT CAAAT GAAC AGCCTG AGAGCT G
AGG AC ACT GCT GT GT ATTT CT GT ACC AG AGGGG AC AT CT GGGGCC AAGGG ACC
CTCGTCACCGTCTCGAGC (SEQ ID NO: 273).
En un ejemplo de la descripcion, los polinucleotidos de la descripcion comprenden, o como alternativa consisten en, la siguiente secuencia polinucleotfdica que codifica la secuencia polipeptidica de cadena pesada de la SEQ ID NO: 134:
GAGGT GCAGCTT GT GGAGT CT GGGGGAGGCTTGGTCCAGCCT GGGGGGT CCCT
GAG ACT CTCCT GT GC AGT CT CT GGAATCGGCCT CAGT AGCT ACTACAT GCAAT G
GGTCCGT CAGGCT CC AGGGAAGGGGCTGGAGT GGGT CGGAGTC ATT GGT AGTG
AT GGT AAG AC AT ACT ACGCGACCT GGGCGAAAGGCCG ATT C ACC AT CT CC AGA
G AC AATT CCAAG ACC ACGGT GT AT CTT C AAAT GAAC AGCCT GAG AGCT G AGG A
C ACT GCT GT GT ATTT CT GT AC C AG AGGGG AC AT CT GGGGCC A AGGG ACCCT CG
T CACCGT CTCGAGCGCCT CC ACCAAGGGCCC AT CGGT CTT CCCCCT GGCACCCT
CCTCCAAGAGCACCTCTGGGGGCACAGCGGCCCTGGGCTGCCTGGTCAAGGAC
T ACTT CCCCGAACCGGT GACGGT GT CGT GGAACT CAGGCGCCCTG ACC AGCGG
CGT GCAC ACCTT CCCGGCT GTCCT ACAGTCCT CAGGACTCT ACT CCCTC AGCAG
CGT GGT GACCGT GCCCTCCAGCAGCTT GGGCACCCAGACCT ACATCT GCAACG
T GAAT CACAAGCCC AGCAAC ACCAAGGT GGACGCGAGAGTT GAGCCCAAAT CT
T GT GACAAAACTCACACAT GCCC ACCGT GCCCAGCACCT GAACTCCT GGGGGG
ACCGT CAGT CTT CCT CTT CCCCCCAAAACCCAAGGAC ACCCT CAT GAT CT CCCG
GACCCCTG AGGT C ACATGCGT GGT GGT GGACGT GAGCCACGAAG ACCCT GAGG
T CAAGTT CAACT GGTACGT GGACGGCGTGGAGGTGC ATAAT GCCAAGACAAAG
CCGCGGGAGGAGCAGTACGCCAGCACGTACCGTGTGGTCAGCGTCCTCACCGT
CCTGCACCAGGACTGGCTGAATGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTCTCCAACA
AAGCCCTCCCAGCCCCCATCGAGAAAACCATCTCCAAAGCCAAAGGGCAGCCC
CGAGAACCACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCCCGGGAGGAGATGACCAAGA
ACCAGGT CAGCCTGACCT GCCTGGTCAAAGGCTTCTATCCCAGCGACAT CGCC
GTGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGACCACGCCTC
CCGT GCTGG ACTCCGACGGCT CCTTCTTCCT CTACAGCAAGCTC ACCGT GGACA
AG AGC AGGT GGCAGC AGGGG AACGT CTTCT CAT GCT CCGT GAT GC AT G AGGCT
CTGCACAACCACT AC ACGCAGAAGAGCCT CTCCCT GT CT CCGGGTAAAT GA
(SEQ ID NO: 274).
En un ejemplo adicional de la descripcion, los polinucleotidos que codifican fragmented de anticuerpo que tienen especificidad de union con CGRP comprenden, o como alternativa consisten en, una o mas de las secuencias polinucleotidicas de SEQ ID NO: 275; s Eq ID NO: 276; y SEQ ID NO: 277 que corresponden a polinucleotidos que codifican las regiones determinantes de complementariedad (CDR o regiones hipervariables) de la secuencia variable de cadena ligera de la SEQ ID NO: 131 o la secuencia de cadena ligera de la SEQ ID NO: 132.
En un ejemplo adicional de la descripcion, los polinucleotidos que codifican fragmented de anticuerpo que tienen especificidad de union con CGRP comprenden, o como alternativa consisten en, una o mas de las secuencias polinucleotidicas de SEQ ID NO: 278; s Eq ID NO: 279; y SEQ ID NO: 280 que corresponden a polinucleotidos que codifican las regiones determinantes de complementariedad (CDR o regiones hipervariables) de la secuencia variable de cadena pesada de la SEQ ID NO: 133 o la secuencia de cadena pesada de la SEQ ID NO: 134.
La descripcion tambien contempla secuencias polinucleotidicas que incluyen una o mas de las secuencias polinucleotfdicas que codifican fragmentos de anticuerpos descritos en el presente documento. En un ejemplo de la descripcion, los polinucleotidos que codifican fragmentos de anticuerpo que tienen especificidad de union con CGRP comprenden, o como alternativa consisten en, uno, dos, tres o mas, incluyendo todos los siguientes polinucleotidos que codifican fragmentos de anticuerpos: el polinucleotido SEQ ID NO: 271 que codifica la secuencia variable de cadena ligera de la SEQ ID NO: 131; el polinucleotido SEQ ID NO: 272 que codifica la secuencia de cadena ligera de la SEQ ID NO: 132; el polinucleotido SEQ ID NO: 273 que codifica la secuencia variable de cadena pesada de la SEQ ID NO: 133; el polinucleotido SEQ ID NO: 274 que codifica la secuencia de cadena pesada de la SEQ ID NO: 134; polinucleotidos que codifican las regiones determinantes de complementariedad (SEQ ID NO: 275; SEQ ID NO: 276; y SEQ ID NO: 277) de la secuencia variable de cadena ligera de la SEQ ID NO: 131 o la secuencia de cadena ligera de la SEQ ID NO: 132; y polinucleotidos que codifican las regiones determinantes de complementariedad (SEQ ID NO: 278; SEQ ID NO: 279; y SEQ ID NO: 280) de la secuencia variable de cadena pesada de la SEQ ID NO: 133 o la secuencia de cadena pesada de la SEQ ID NO: 134.
En un ejemplo preferente de la descripcion, los polinucleotidos de la descripcion comprenden, o como alternativa consisten en, polinucleotidos que codifican fragmentos Fab (fragmento de union a antfgeno) que tienen especificidad de union por CGRP. Con respecto al anticuerpo Ab14, los polinucleotidos que codifican el anticuerpo Ab14 de longitud completa comprenden, o como alternativa consisten en, el polinucleotido SEQ ID NO: 272 que codifica la secuencia de cadena ligera de la SEQ ID NO: 132 y el polinucleotido SEQ ID NO: 274 que codifica la secuencia de cadena pesada de la SEQ ID NO: 134.
Otro ejemplo de la descripcion contempla estos polinucleotidos incorporados en un vector de expresion para expresion en celulas de mairnfero tales como CHO, NSO, HEK-293, o en sistemas fungicos, de insecto o microbianos tales como celulas de levadura tales como la levadura Pichia. Las especies de Pichia adecuadas incluyen, pero sin limitacion, Pichia pastoris. En un ejemplo de la descripcion descrita en el presente documento (posteriormente), pueden producirse fragmentos Fab mediante digestion enzimatica (por ejemplo, papama) de Ab14 despues de la expresion de los polinucleotidos de longitud completa en un hospedador adecuado. En otro ejemplo de la descripcion, pueden producirse anticuerpos anti CGRP tales como Ab14 o fragmentos Fab de los mismos mediante expresion de polinucleotidos de Ab14 en celulas de marnffero tales como celulas CHO, NSO o HEK 293, sistemas fungicos, de insectos o microbianos tales como celulas de levadura (por ejemplo levadura diploide tal como Pichia diploide) y otras cepas de levadura. Las especies de Pichia adecuadas incluyen, pero sin limitacion, Pichia pastoris.
En un ejemplo, la descripcion se dirige a un polinucleotido aislado que comprende un polinucleotido que codifica una secuencia de aminoacidos de anticuerpo Vh anti CGRP seleccionada de las SEQ ID NO: 3, 13, 23, 33, 43, 53, 63, 73, 83, 93, 103, 113, 123 o 133, o que codifica una variante del mismo en donde al menos un resto de marco conservado (resto FR) se ha sustituido con un aminoacido presente en la posicion correspondiente en un polipeptido Vh de anticuerpo anti CGRP de conejo o una sustitucion de aminoacido conservativa.
En otro ejemplo, la descripcion se dirige a un polinucleotido aislado que comprende la secuencia polinucleotfdica que codifica una secuencia de aminoacidos de anticuerpo Vl anti CGRP de las SEQ ID NO: 1, 11, 21, 31, 41, 51, 61, 71, 81, 91, 101, 111, 121 o 131, o que codifica una variante del mismo en donde al menos un resto de marco conservado (resto FR) se ha sustituido con un aminoacido presente en la posicion correspondiente en un polipeptido Vl de anticuerpo anti CGRP de conejo o una sustitucion de aminoacido conservativa.
En otro ejemplo mas, la descripcion se dirige a uno o mas polinucleotidos heterologos que comprenden una secuencia que codifica los polipeptidos contenidos en la SEQ ID NO: 1 y la SEQ ID NO: 3; la SEQ ID NO: 11 y la SEQ ID NO: 13; la SEQ ID NO: 21 y la SEQ ID NO: 23; la SEQ ID NO: 31 y la SEQ ID NO: 33; la SEQ ID NO: 41 y la SEQ ID NO: 43; la SEQ ID NO: 51 y la SEQ ID NO: 53, la SEQ ID NO: 61 y la SEQ ID NO: 63; la SEQ ID NO: 71 y la SEQ ID NO: 73; la SEQ ID NO: 81 y la SEQ ID NO: 83; la SEQ ID NO: 91 y la SEQ ID NO: 93; la SEQ ID NO: 101 y la SEQ ID NO: 103; la SEQ ID NO: 111 y la SEQ ID NO: 113; la SEQ ID NO: 121 y la SEQ ID NO: 123; o la SEQ ID NO: 131 y la SEQ ID NO: 133.
En otro ejemplo, la descripcion se dirige a un polinucleotido aislado que expresa un polipeptido que contiene al menos un polipeptido de CDR procedente de un anticuerpo anti CGRP en donde dicho polipeptido expresado solo se une espedficamente con CGRP o se une espedficamente con CGRP cuando se expresa en asociacion con otra secuencia polinucleotfdica que expresa un polipeptido que contiene al menos un polipeptido de CDR procedente de un anticuerpo anti CGRP en donde dicha al menos una CDR se selecciona de las contenidas en los polipeptidos Vl o Vh de las SEQ ID NO: 1, 3, 11, 13, 21, 23, 31, 33, 41, 43, 51, 53, 61, 63, 71, 73, 81, 83, 91, 93, 101, 103, 111, 113, 121, 123, 131 o la SEQ ID NO:133.
Tambien se contemplan celulas hospedadoras y vectores que comprenden dichos polinucleotidos.
La descripcion contempla ademas vectores que comprenden las secuencias polinucleotfdicas que codifican las secuencias polipeptidicas de cadena pesada y ligera variables, asf como las regiones determinates de complementariedad individuales (CDR o regiones hipervariables), como se expone en el presente documento, asf como celulas hospedadoras que comprenden dichas secuencias de vector. En un ejemplo de la descripcion, la celula hospedadora es una celula de levadura. En otro ejemplo de la descripcion, la celula hospedadora de levadura pertenece al genero Pichia.
Exploracion y aislamiento de linfocitos B
En un ejemplo, la presente descripcion contempla la preparacion y el aislamiento de una poblacion clonal de linfocitos B espedficos de antigeno que pueden usarse para aislar al menos una celula espedfica de antigeno de CGRP, que puede usarse para producir un anticuerpo monoclonal contra CGRP, que es espedfico de un antfgeno de CGRP deseado, o una secuencia de nucleotidos correspondiente a dicho anticuerpo. Se ensenan metodos para preparar y aislar dicha poblacion clonal de linfocitos B espedficos de antigeno, por ejemplo, en la publicacion de patente de los Estados Unidos n.° US 2007/0269868 de Carvalho-Jensen et al. Tambien se ensenan en el presente documento en los ejemplos metodos para preparar y aislar dicha poblacion clonal de linfocitos B espedficos de antfgeno. Se conocen en la tecnica metodos para "enriquecer" una poblacion celular por tamano o densidad. Vease, por ejemplo, patente de los Estados Unidos 5.627.052. Estas etapas pueden usarse ademas del enriquecimiento de la poblacion celular por especificidad de antigeno.
Metodos para humanizar anticuerpos
En otro ejemplo, la presente descripcion contempla metodos para humanizar cadenas pesadas y ligeras de anticuerpos. Se ensenan metodos para humanizar cadenas pesadas y ligeras de anticuerpos que pueden aplicarse a anticuerpos anti CGRP, por ejemplo, en la publicacion de solicitud de patente de los Estados Unidos n.° US 2009/0022659 de Olson et al., y en la patente de los Estados Unidos n.° 7.935.340 de Garcia-Martinez et al.
Metodos para producir anticuerpos y fragmentos de los mismos
En otra realizacion, la presente invencion contempla metodos para producir anticuerpos anti CGRP segun la invencion. Se ensenan metodos para producir anticuerpos anti CGRP y fragmentos de los mismos secretados de cepas poliploidales, preferentemente diploides o tetraploides de levadura competente para apareamiento, por ejemplo, en la publicacion de solicitud de patente de los Estados Unidos n.° US 2009/0022659 de Olson et al., y en la patente de los Estados Unidos n.° 7.935.340 de Garcia-Martinez et al.
Otros metodos para producir anticuerpos son bien conocidos por los expertos habituales en la materia. Por ejemplo, son bien conocidos ahora en la tecnica metodos para producir anticuerpos quimericos (vease, por ejemplo, patente de los Estados Unidos N.° 4.816.567 de Cabilly et al.; Morrison et al., P.N.A.S. Estados Unidos, 81:8651-55 (1984); Neuberger, M.S. et al., Nature, 314:268-270 (1985); Boulianne, G.L. et al., Nature, 312:643-46 (1984)).
Del mismo modo, otros metodos para producir anticuerpos humanizados son ahora bien conocidos en la tecnica (vease, por ejemplo, patentes de los Estados Unidos N.° 5.530.101, 5.585.089, 5.693.762 y 6.180.370 de Queen et al; patentes de los Estados Unidos N.° 5.225.539 y 6.548.640 de Winter; patentes de los Estados Unidos N.° 6.054.297, 6.407.213 y 6.639.055 de Carter et al; patente de los Estados Unidos n.° 6.632.927 de Adair; Jones, P.T. et al, Nature, 321:522-525 (1986); Reichmann, L., et al., Nature, 332:323-327 (1988); Verhoeyen, M, et al, Science, 239:1534-36 (1988).
Tambien pueden producirse polipeptidos de anticuerpos de la invencion que tienen especificidad de union a CGRP construyendo, usando tecnicas convencionales bien conocidas por los expertos habituales en la materia, un vector de expresion que contiene un operon y una secuencia de ADN que codifica una cadena pesada de anticuerpo en la que la secuencia de ADN que codifica las CDR necesarias para la especificidad del anticuerpo se obtiene de una fuente de celulas no humana, preferentemente, una fuente de linfocitos B de conejo, mientras que la secuencia de ADN que codifica las partes restantes de la cadena de anticuerpo se obtiene de una fuente de celulas humana. Se produce un segundo vector de expresion utilizando los mismos medios convencionales bien conocidos por los expertos habituales en la materia, conteniendo dicho vector de expresion un operon y una secuencia de a Dn que codifica una cadena ligera de anticuerpo en la que la secuencia de ADN que codifica las CDR necesarias para la especificidad del anticuerpo se obtiene de una fuente de celulas no humana, preferentemente, una fuente de linfocitos B de conejo, mientras que la secuencia de ADN que codifica las partes restantes de la cadena de anticuerpo se obtiene de una fuente de celulas humana.
Los vectores de expresion se transfectan en una celula hospedadora mediante tecnicas convencionales bien conocidas por los expertos habituales en la materia para producir una celula hospedadora transfectada, cultivandose dicha celula hospedadora transfectada mediante tecnicas convencionales bien conocidas por los expertos habituales en la materia para producir dichos polipeptidos de anticuerpos.
La celula hospedadora puede transfectarse conjuntamente con los dos vectores de expresion descritos anteriormente, el primer vector de expresion que contiene el ADN que codifica un operon y un polipeptido procedente de cadena ligera y el segundo vector que contiene ADN que codifica un operon y un polipeptido procedente de cadena pesada. Los dos vectores contienen diferentes marcadores seleccionables, pero preferentemente consiguen expresion sustancialmente igual de los polipeptidos de cadena pesada y ligera. Como alternativa, se puede usar un unico vector, incluyendo el vector ADN que codifica los polipeptidos de cadena tanto pesada como ligera. Las secuencias codificantes para las cadenas pesadas y ligeras pueden comprender ADNc, ADN genomico, o ambos.
Las celulas hospedadoras para expresar los polipeptidos de anticuerpo pueden ser una celula bacteriana tal como E. coli, o una celula eucariota tal como P. pastoris. En una realizacion de la invencion, puede usarse una celula de mairnfero de un tipo bien definido para este fin, tal como una celula de mieloma, una lmea celular de ovario de hamster chino (CHO), una lmea celular NSO o una lmea celular HEK293.
Los metodos generales por los que pueden construirse los vectores, todos los metodos de transfeccion necesarios para producir la celula hospedadora y los metodos de cultivo necesarios para producir los polipeptidos de anticuerpos de dichas celulas hospedadoras incluyen tecnicas convencionales. Aunque, preferentemente, la lmea celular utilizada para producir el anticuerpo es una lmea celular de mai^ero, como alternativa, se puede usar cualquier otra lmea celular adecuada, tal como una cepa bacteriana procedente de E. coli, o una lmea celular de levadura.
De forma similar, una vez producidos, los polipeptidos de anticuerpos se pueden purificar segun procedimientos convencionales en la materia, tales como, por ejemplo, la filtracion en flujo cruzado, precipitacion con sulfato de amonio, cromatograffa en columna de afinidad y similares.
Los polipeptidos de anticuerpos descritos en el presente documento tambien pueden usarse para el diseno y la smtesis de mimeticos peptfdicos o no peptfdicos que senan utiles para las mismas aplicaciones terapeuticas que los polipeptidos de anticuerpos de la invencion. Vease, por ejemplo, Saragobi et al, Science, 253:792-795 (1991).
Ensayos de exploracion
La descripcion tambien incluye ensayos de exploracion disenados para ayudar en la identificacion de enfermedades y trastornos asociados con CGRP en pacientes que mostraban smtomas de una enfermedad o un trastorno asociado con CGRP.
En un ejemplo de la descripcion, los anticuerpos anti CGRP de la descripcion, o fragmentos de union a CGRP de los mismos, se usan para detectar la presencia de CGRP en una muestra biologica obtenida de un paciente que mostraba smtomas de una enfermedad o un trastorno asociado con CGRP. La presencia de CGRp o niveles elevados del mismo en comparacion con niveles previos a la enfermedad de CGRP en una muestra biologica comparable, puede ser beneficiosa para diagnosticar una enfermedad o un trastorno asociado con CGRP.
Otro ejemplo de la descripcion proporciona un ensayo de diagnostico o exploracion para ayudar en el diagnostico de enfermedades o trastornos asociados con CGRP en pacientes que muestran smtomas de una enfermedad o un trastorno asociado con CGRP identificado en el presente documento, que comprende ensayar el nivel de expresion de CGRP en una muestra biologica de dicho paciente usando un anticuerpo anti CGRP modificado postraduccionalmente o fragmento de union del mismo. El anticuerpo anti CGRP o fragmento de union del mismo puede modificarse postraduccionalmente para incluir un resto detectable tal como se ha expuesto previamente en la divulgacion.
El nivel de CGRP en la muestra biologica se determina usando un anticuerpo anti CGRP modificado o fragmento de union del mismo como se expone en el presente documento, y comparando el nivel de CGRP en la muestra biologica frente a un nivel convencional de CGRP (por ejemplo, el nivel en muestras biologicas normales). El experto en la materia entendena que puede existir algo de variabilidad entre muestras biologicas normales y tomana en consideracion cuando se evaluan los resultados. En una realizacion de la invencion, los anticuerpos anti CGRP de la invencion pueden usarse para correlacionar los niveles de expresion de CGRP con un estadio particular de desarrollo canceroso. Un experto en la materia sena capaz de medir CGRP en numerosos objetos para establecer intervalos de expresion de CGRP que corresponden a estadios clmicamente definidos de desarrollo canceroso. Estos intervalos permitiran al experto en la materia medir CGRP en un sujeto al que se ha diagnosticado cancer y correlacionar los niveles en cada sujeto con un intervalo que corresponde a un estadio de dicho cancer. Un experto en la materia entendena que midiendo CGRP en el paciente a intervalos diferentes, puede determinarse la progresion del cancer.
El ensayo anteriormente indicado tambien puede ser util en la supervision de una enfermedad o un trastorno, donde el nivel de CGRP obtenido en una muestra biologica de un paciente que se cree que tiene una enfermedad o un trastorno asociado con CGRP se compara con el nivel de CGRp en muestras biologicas previas del mismo paciente, para determinar si el nivel de CGRP en dicho paciente ha cambiado con, por ejemplo, un regimen de tratamiento.
La invencion tambien se dirige a un metodo de captura de imagenes in vivo que detecta la presencia de celulas que expresan CGRP que comprende administrar una cantidad eficaz para el diagnostico de una composicion de diagnostico. Dicha captura de imagenes in vivo es util para la deteccion o captura de imagenes de tumores o metastasis que expresan CGRP, por ejemplo, y puede ser util como parte de un programa de planificacion para el diseno de un protocolo de tratamiento de cancer eficaz. El protocolo de tratamiento puede incluir, por ejemplo, uno o mas de radiacion, quimioterapia, terapia de citocinas, terapia genica y terapia de anticuerpos, asf como un anticuerpo anti CGRP o fragmento del mismo.
La presente descripcion proporciona ademas un kit para detectar la union de un anticuerpo anti CGRP de la invencion con CGRP. En particular, el kit puede usarse para detectar la presencia de un CGRP espedficamente reactivo con un anticuerpo anti CGRP de la invencion o un fragmento inmunorreactivo del mismo. El kit tambien puede incluir un anticuerpo unido a un sustrato, un anticuerpo secundario reactivo con el antfgeno y un reactivo para detectar una reaccion del anticuerpo secundario con el antfgeno. Dicho kit puede ser un kit de ELISA y puede comprender el sustrato, anticuerpos primarios y secundarios cuando sea apropiado, y cualquier otro reactivo necesario tal como restos detectables, sustratos enzimaticos y reactivos de color, por ejemplo como se describe en el presente documento. El kit de diagnostico tambien puede estar en forma de un kit de inmunotransferencia. El kit de diagnostico tambien puede estar en forma de un kit quimioluminiscente (Meso Scale Discovery, Gaithersburg, MD). El kit de diagnostico tambien puede ser un kit de deteccion basado en lantanidos (PerkinElmer, San Jose, CA).
Un especialista clmico experto entendena que una muestra biologica incluye, pero sin limitacion, suero, plasma, orina, saliva, moco, lfquido pleural, lfquido sinovial y lfquido cefalorraqmdeo.
Metodos para mejorar o reducir los smtomas de, o tratar, o prevenir, enfermedades o trastornos asociados con CGRP
En otra realizacion de la invencion, los anticuerpos anti CGRP descritos en el presente documento son utiles para aliviar o reducir los smtomas de, o tratar, o prevenir, enfermedades y trastornos asociados con CGRP. Los anticuerpos anti CGRP descritos en el presente documento, o fragmentos de los mismos, asf como combinaciones, tambien pueden administrarse en una cantidad terapeuticamente eficaz a pacientes que necesitan tratamiento de enfermedades y trastornos asociados con CGRP en forma de una composicion farmaceutica como se describe en mas detalle posteriormente.
En otra realizacion de la invencion, los anticuerpos anti CGRP descritos en el presente documento son utiles para aliviar o reducir los smtomas de, o tratar, o prevenir, migranas (con o sin aura), perdida de peso, cancer o tumores, angiogenesis asociada con cancer o crecimiento tumoral, angiogenesis asociada con cancer o supervivencia tumoral, dolor, migranas hemiplegicas, cefaleas en racimo, neuralgia migranosa, cefaleas cronicas, cefaleas de tension, cefaleas generales, sofocos, hemicranea paroxfstica cronica, cefaleas secundarias debidas a un problema estructural subyacente en la cabeza o el cuello, neuralgia craneal, cefaleas sinusales (tales como por ejemplo asociadas con sinusitis) y cefaleas o migranas inducidas por alergia.
En una realizacion de la invencion, los anticuerpos anti CGRP descritos en el presente documento, o fragmentos de los mismos y/o con un segundo agente, son utiles para aliviar o reducir los smtomas de, o tratar, o prevenir, el siguiente listado no limitante de enfermedades y trastornos: dolor, dolor inflamatorio, dolor por incision postoperatorio, smdrome de dolor regional complejo, dolor de cancer, dolor de cancer de huesos primario o metastasico, dolor por fractura, dolor cronico, dolor por fractura osteoporotica, dolor resultante de quemadura, osteoporosis, dolor de articulaciones gotosas, dolor abdominal, dolor asociado con crisis de anemia falciforme y otros dolores nocicepticos, asf como carcinoma hepatocelular, cancer de mama, cirrosis hepatica, dolor neurogenico, dolor neuropatico, dolor nociceptico, neuralgia del trigemino, neuralgia post-herpetica, dolor de miembro fantasma, fibromialgia, dolor menstrual, ovarialgia, distrofia simpatica refleja, dolor neurogenico, osteoartritis o dolor por artritis reumatoide, dolor dorsolumbar, neuropatfa diabetica, ciatica, o dolor o dolor visceral asociado con: reflujo gastroesofagico, dispepsia, smdrome del intestino irritable, colon irritable, colon espastico, colitis mucosa, enfermedad inflamatoria del intestino, enfermedad de Crohn, ileftis, colitis ulcerosa, colico renal, dismenorrea, cistitis, periodo menstrual, parto, menopausia, prostatitis, pancreatitis, colico renal, dismenorrea, cistitis, incluyendo cistitis intersticial (CI), cirugfa asociada con el fleo, diverticulitis, peritonitis, pericarditis, hepatitis, apendicitis, colitis, colecistitis, endometriosis, pancreatitis aguda y/o cronica, infarto de miocardio, dolor de rinon, dolor pleural, prostatitis, dolor pelvico, traumatismo de un organo, dolor nociceptivo cronico, dolor neuropatico cronico, dolor inflamatorio cronico, fibromialgia, dolor irruptivo y dolor persistente, y dolor de cancer que surge de neoplasia o de cancer preferentemente seleccionado de uno o mas de: adenocarcinoma en tejido glandular, blastoma en tejido embrionario de organos, carcinoma en tejido epitelial, leucemia en tejidos que forman celulas sangumeas, linfoma en tejido linfatico, mieloma en medula osea, sarcoma en tejido conectivo o de soporte, cancer suprarrenal, linfoma relacionado con SIDA, anemia, cancer de vejiga, cancer de hueso, cancer de cerebro, cancer de mama, tumores carcinoides, cancer de cuello uterino, quimioterapia, cancer de colon, citopenia, cancer endometrial, cancer esofagico, cancer gastrico, cancer de cabeza, cancer de cuello, cancer hepatobiliar, cancer de rinon, leucemia, cancer de hfgado, cancer de pulmon, linfoma, enfermedad de Hodgkin, linfoma, no Hodgkin, tumores del sistema nervioso, cancer oral, cancer ovarico, cancer pancreatico, cancer de prostata, cancer rectal, cancer de piel, cancer de estomago, cancer testicular, cancer de tiroides, cancer de uretra, cancer de hueso, sarcomas del tejido conectivo, cancer de tejido oseo, cancer de celulas formadoras de sangre, cancer de medula osea, mieloma multiple, leucemia, cancer de hueso primario o secundario, tumores que metastatizan al hueso, tumores que se infiltran en el nervio y viscera hueca, tumores cerca de estructuras neurales. Preferentemente ademas el dolor de cancer comprende dolor visceral, preferentemente dolor visceral que surge de cancer pancreatico y/o metastasis en el abdomen. Preferentemente ademas el dolor de cancer comprende dolor somatico, preferentemente dolor somatico debido a uno o mas de cancer de hueso, metastasis en el hueso, dolor postquirurgico, sarcomas del tejido conectivo, cancer de tejido oseo, cancer de celulas formadoras de sangre de la medula osea, mieloma multiple, leucemia, cancer de hueso primario o secundario.
En otra realizacion de la invencion, los anticuerpos anti CGRP descritos en el presente documento, y/o con un segundo agente, son utiles para aliviar o reducir los smtomas de, o tratar, o prevenir, el siguiente listado no limitante de enfermedades y trastornos: cancer o tumores, angiogenesis asociada con cancer o crecimiento tumoral, angiogenesis asociada con cancer o supervivencia tumoral.
En otra realizacion de la invencion, los anticuerpos anti CGRP descritos en el presente documento, o fragmentos de los mismos y/o con un segundo agente, son utiles para aliviar o reducir los smtomas de, o tratar, o prevenir, el siguiente listado no limitante de enfermedades y trastornos: dolor neurogenico, neuropatico o nociceptico. El dolor neuropatico puede incluir, pero sin limitacion, neuralgia del trigemino, neuralgia post-herpetica, dolor de miembro fantasma, fibromialgia, dolor menstrual, ovarialgia, distrofia simpatica refleja y dolor neurogenico. En otras realizaciones preferidas, osteoartritis o dolor por artritis reumatoide, dolor dorsolumbar, neuropatfa diabetica, ciatica y otro dolor neuropatico.
En otra realizacion de la invencion, los anticuerpos anti CGRP descritos en el presente documento, y/o con un segundo agente, son utiles para aliviar o reducir los smtomas de, o tratar, o prevenir, el siguiente listado no limitante de enfermedades y trastornos: vejiga hiperactiva y otras afecciones urinarias, reflujo gastroesofagico y dolor visceral asociado con reflujo gastroesofagico, dispepsia, smdrome del intestino irritable, enfermedad inflamatoria del intestino, enfermedad de Crohn, ileftis, colitis ulcerosa, colico renal, dismenorrea, cistitis, periodo menstrual, parto, menopausia, prostatitis, prurito o pancreatitis. Ademas, los anticuerpos y fragmentos de anticuerpos de CGRP objeto pueden usarse solos o junto con otros agentes activos, por ejemplo, opioides y analgesicos no opioides tales como AINE para inducir analgesia o para potenciar la eficacia de otro analgesico o para prevenir o aliviar la tolerancia a un analgesico espedfico tal como morfina o analgesicos opioides relacionados. Una prueba del papel de CGRP en el bloqueo/inversion del desarrollo de analgesia inducida por morfina es el hecho de que se ha indicado que CGRP8-37 y el antagonista del receptor de CGRP (BIBN4096BS) evitan/invierten el desarrollo de tolerancia a la morfina -(Powell et al., 2000 J Brit J Pharmacol (131 ):875; Menard et al., 1996 J Neurosci (16):2342; Wang et al., 2009 FASEB J (23):2576; Wang et al., 2010 Pain (151):194)
Los anticuerpos objeto pueden combinarse potencialmente con cualquier analgesico opioide o AINE u otro analgesico, potencialmente otro anticuerpo, para aumentar o potenciar el tratamiento del dolor o para invertir o suprimir la tolerancia a un analgesico tal como un compuesto analgesico opioide. Esto puede permitir que dichos compuestos analgesicos se administren durante una duracion mas larga o a dosificaciones reducidas aliviando de este modo potencialmente efectos secundarios adversos asociados con los mismos.
La expresion "analgesico opioide" en el presente documento se refiere a todos los farmacos, naturales o sinteticos, con acciones similares a la morfina. Los analgesicos opioides sinteticos y semisinteticos son derivados de cinco clases qmmicas de compuesto: fenantrenos; fenilheptilaminas; fenilpiperidinas; morfinanos; y benzomorfanos, todos los cuales estan dentro del alcance de la expresion. Los analgesicos opioides ejemplares incluyen codema, dihidrocodema, diacetilmorfina, hidrocodona, hidromorfona, levorfanol, oximorfona, alfentanilo, buprenorfina, butorfanol, fentanilo, sufentanilo, meperidina, metadona, nalbufina, propoxifeno y pentazocina o sales farmaceuticamente aceptables de los mismos.
El termino "AINE" se refiere a un compuesto antiinflamatorio no esteroideo. Los AINE se clasifican segun su capacidad para inhibir ciclooxigenasa. La ciclooxigenasa 1 y ciclooxigenasa 2 son dos isoformas principales de ciclooxigenasa y la mayona de AINE convencionales son inhibidores mixtos de las dos isoformas. La mayona de AINE convencionales quedan dentro de una de las siguientes cinco categonas estructurales: (1) derivados de acido propionico, tales como ibuprofeno, naproxeno, naprosyn, diclofenaco y ketoprofeno; (2 ) derivados de acido acetico, tales como tolmetina y sulindaco; (3) derivados de acido fenamico, tales como acido mefenamico y acido meclofenamico; (4) derivados de acido bifenilcarboxflico, tales como diflunisal y flufenisal; y (5) oxicams, tales como piroxim, sudoxicam e isoxicam. Se ha descrito otra clase de AINE que inhibe selectivamente ciclooxigenasa 2. Se han descrito inhibidores de Cox-2, por ejemplo, en las patentes de los Estados Unidos n.° 5.616.601; 5.604.260; 5.593.994; 5.550.142; 5.536.752; 5.521.213; 5.475.995; 5.639.780; 5.604.253; 5.552.422; 5.510.368; 5.436.265; 5.409.944; y 5.130.311. Determinados inhibidores de COX-2 ejemplares incluyen celecoxib (SC-58635), DUP-697, flosulida (Cg P-28238), meloxicam, acido 6-metoxi-2-naftilacetico (6-MNA), rofecoxib, MK-966, nabumetona (profarmaco para 6-MNA), nimesulida, NS-398, SC-5766, SC-58215, T-614; o combinaciones de los mismos.
En algunas realizaciones, puede tomarse aspirina y/o paracetamol junto con el anticuerpo de CGRP objeto. La aspirina es otro tipo de compuesto antiinflamatorio no esteroideo.
Las enfermedades y los trastornos ejemplares, no limitantes, que pueden tratarse y/o prevenirse mediante la administracion de los anticuerpos de CGRP de la presente invencion incluyen dolor resultante de cualquier afeccion asociado con dolor neurogenico, neuropatico, inflamatorio, termico o nociceptico. Preferentemente el trastorno se asociara con CGRP aumentado en el sitio de dolor. En determinadas realizaciones de dolor neuropatico, se tratan preferentemente afecciones indicadas de neuralgia del trigemino, neuralgia post-herpetica, dolor de miembro fantasma, fibromialgia, distrofia simpatica refleja y dolor neurogenico. En otras realizaciones, se trata preferentemente dolor de cancer, en particular, dolor de cancer de hueso, osteoartritis o dolor por artritis reumatoide, dolor dorsolumbar, dolor por incision postoperatorio, dolor por fractura, dolor por fractura osteoporotica, osteoporosis, dolor de articulaciones gotosas, neuropatfa diabetica, ciatica, dolores asociados con crisis de anemia falciforme, migrana y otro dolor neuropatico y/o nociceptico. Por tanto, la presente invencion incluye metodos para tratar, prevenir y/o aliviar cualquier enfermedad o trastorno asociado con la actividad de CGRP o regulacion positiva de CGRP (incluyendo cualquiera de las enfermedades, trastornos y afecciones ilustrativas mencionadas anteriormente) mediante el uso de los anticuerpos de la invencion. Los metodos terapeuticos de la presente descripcion comprende administrar a un sujeto cualquier formulacion que comprende un anticuerpo anti CGRP como se desvela en el presente documento o en asociacion con otro agente activo.
El sujeto al que se administra la formulacion farmaceutica puede ser, por ejemplo, cualquier ser humano o animal no humano que necesita dicho tratamiento, prevencion y/o alivio, o que de otro modo aprovechana la inhibicion o atenuacion de la actividad mediada por CGRP. Por ejemplo, el sujeto puede ser un individuo al que se diagnostica, o que se considera que esta en riesgo de estar aquejado de cualquiera de las enfermedades o trastornos anteriormente mencionados. La presente descripcion incluye ademas el uso de cualquiera de las formulaciones farmaceuticas desveladas en el presente documento en la fabricacion de un medicamento para el tratamiento, prevencion y/o alivio de cualquier enfermedad o trastorno asociado con la actividad de CGRP (incluyendo cualquiera de las enfermedades, trastornos o afecciones ilustrativas mencionadas anteriormente).
Administracion
En una realizacion de la invencion, los anticuerpos anti CGRP de la invencion, asf como combinaciones de dichos anticuerpos, deben administrarse a un sujeto a una concentracion de entre aproximadamente 0,1 y 100,0 mg/kg de peso corporal del sujeto receptor. En una realizacion preferida de la invencion, los anticuerpos anti CGRP de la invencion, asf como combinaciones de dichos anticuerpos, deben administrarse a un sujeto a una concentracion de aproximadamente 0,4 mg/kg de peso corporal del sujeto receptor. En una realizacion preferida de la invencion, los anticuerpos anti CGRP de la invencion, asf como combinaciones de dichos anticuerpos, deben administrarse a un sujeto receptor con una frecuencia de una vez cada veintiseis semanas o menos, tal como una vez cada dieciseis semanas o menos, una vez cada ocho semanas o menos, una vez cada cuatro semanas o menos, una vez cada dos semanas o menos, una vez cada semana o menos, o una vez al dfa o menos.
Los fragmentos Fab pueden administrarse cada dos semanas o menos, cada semana o menos, una vez al dfa o menos, multiples veces al dfa y/o cada pocas horas. En un ejemplo de la descripcion, un paciente recibe fragmentos Fab de 0,1 mg/kg a 40 mg/kg al dfa proporcionados en dosis divididas de 1 a 6 veces al dfa, o en una forma de liberacion sostenida, eficaz para obtener resultados deseados.
Debe entenderse que la concentracion del anticuerpo o Fab administrado a un paciente dado puede ser mayor o menor que las concentraciones de administracion ejemplares expuestas anteriormente.
Un experto en la materia sena capaz de determinar una dosificacion y frecuencia de administracion eficaces mediante experimentacion rutinaria, guiada, por ejemplo, por la divulgacion en el presente documento y las ensenanzas en Goodman, L. S., Gilman, A., Brunton, L. L., Lazo, J. S., y Parker, K. L. (2006). Goodman & Gilman's the pharmacological basis of therapeutics. Nueva York: McGraw-Hill; Howland, R. D., Mycek, M. J., Harvey, R. A., Champe, P. C., y Mycek, M. J. (2006). Pharmacology. Lippincott's illustrated reviews. Filadelfia: Lippincott Williams y Wilkins; y Golan, D. E. (2008). Principles of pharmacology: the pathophysiologic basis of drug therapy. Filadelfia, Pa., [etc.]: Lippincott Williams y Wilkins.
En otra realizacion de la invencion, los anticuerpos anti CGRP de la invencion, asf como combinaciones de dichos anticuerpos, deben administrarse a un sujeto en una formulacion farmaceutica.
Una "composicion farmaceutica" se refiere a una composicion qmmica o biologica adecuada para la administracion a un mairnfero. Dichas composiciones pueden formularse espedficamente para la administracion mediante una o mas de varias vfas, incluyendo, pero sin limitacion, bucal, epicutanea, epidural, inhalacion, intraarterial, intracardial, intracerebroventricular, intradermica, intramuscular, intranasal, intraocular, intraperitoneal, intraespinal, intratecal, intravenosa, oral, parenteral, rectal, mediante un enema o supositorio, subcutanea, subdermica, sublingual, transdermica y transmucosa. Ademas, la administracion puede producirse por medio de inyeccion, polvo, lfquido, gel, gotas, u otros medios de administracion.
En una realizacion de la invencion, los anticuerpos anti CGRP de la invencion, asf como combinaciones de dichos anticuerpos, pueden administrarse opcionalmente en combinacion con uno o mas agentes activos. Dichos agentes activos incluyen agentes analgesicos, antihistammicos, antipireticos, antiinflamatorios, antibioticos, antivmcos y anticitocinas. Los agentes activos incluyen agonistas, antagonistas y moduladores de TNF-a, IL-2, IL-4, IL-6 , IL-10, IL-12, IL-13, IL-18, IFN-a, IFN-y, BAFF, CXCL13, IP-10, VEGF, EPO, EGF, HRG, Factor de crecimiento de hepatocitos (HGF), Hepcidina, incluyendo anticuerpos reactivos contra cualquiera de los anteriores, y anticuerpos reactivos contra cualquiera de sus receptores. Los agentes activos tambien incluyen, pero sin limitacion, Acidos 2 -arilpropionicos, Aceclofenaco, Acemetacina, Acido acetilsalidlico (aspirina), Alclofenaco, Alminoprofeno, Amoxiprina, Ampirona, Acidos arilalcanoicos, Azapropazona, Benorilato, Benoxaprofeno, Bromfenaco, Carprofeno, Celecoxib, Salicilato de magnesio de colina, Clofezona, Inhibidores de COX-2, Dexibuprofeno, Dexketoprofeno, Diclofenaco, Diflunisal, Droxicam, Etenzamida, Etodolaco, Etoricoxib, Faislamina, acidos fenamicos, Fenbufeno, Fenoprofeno, Acido flufenamico, Flunoxaprofeno, Flurbiprofeno, Ibuprofeno, Ibuproxam, Indometacina, Indoprofeno, Kebuzona, Cetoprofeno, Ketorolaco, Lomoxicam, Loxoprofeno, Lumiracoxib, Salicilato de magnesio, Acido meclofenamico, Acido mefenamico, Meloxicam, Metamizol, Salicilato de metilo, Mofebutazona, Nabumetona, Naproxeno, Acidos N-arilantrarnlicos, Factor de crecimiento nervioso (NGF), Oxametacina, Oxaprozina, Oxicams, Oxifenbutazona, Parecoxib, Fenazona, Fenilbutazona, Fenilbutazona, Piroxicam, Pirprofeno, profenos, Proglumetacina, Derivados de pirazolidina, Rofecoxib, Salicilato de salicilo, Salicilamida, Salicilatos, Sustancia P, Sulfinpirazona, Sulindaco, Suprofeno, Tenoxicam, Acido tiaprofenico, Acido tolfenamico, Tolmetina y Valdecoxib.
Un antihistamrnico puede ser cualquier compuesto que se oponga a la accion de la histamina o su liberacion de celulas (por ejemplo, mastocitos). Los antihistammicos incluyen, pero sin limitacion, acrivastina, astemizol, azatadina, azelastina, betatastina, bromfeniramina, buclicina, cetiricina, analogos de cetiricina, clorfeniramina, clemastina, CS 560, ciproheptadina, desloratadina, dexclorfeniramina, ebastina, epinastina, fexofenadina, HSR 609, hidroxicina, levocabastina, loratidina, metescopolamina, mizolastina, norastemizol, fenindamina, prometacina, pirilamina, terfenadina y tranilast.
Los antibioticos incluyen, pero sin limitacion, Amikacina, Aminoglucosidos, Amoxicilina, Ampicilina, Ansamicinas, Arsfenamina, Azitromicina, Azlocilina, Aztreonam, Bacitracina, Carbacefem, Carbapenems, Carbenicilina, Cefaclor, Cefadroxilo, Cefalexina, Cefalotina, Cefalotina, Cefamandol, Cefazolina, Cefdinir, Cefditoren, Cefepima, Cefixima, Cefoperazona, Cefotaxima, Cefoxitina, Cefpodoxima, Cefprozilo, Ceftazidima, Ceftibuteno, Ceftizoxima, Ceftobiprol, Ceftriaxona, Cefuroxima, Cefalosporinas, Cloranfenicol, Cilastatina, Ciprofloxacina, Claritromicina, Clindamicina, Cloxacilina, Colistina, Co-trimoxazol, Dalfopristina, Demeclociclina, Dicloxacilina, Diritromicina, Doripenem, Doxiciclina, Enoxacina, Ertapenem, Eritromicina, Etambutol, Flucloxacilina, Fosfomicina, Furazolidona, Acido fusfdico, Gatifloxacina, Geldanamicina, Gentamicina, Glucopeptidos, Herbimicina, Imipenem, Isoniacida, Kanamicina, Levofloxacina, Lincomicina, Linezolida, Lomefloxacina, Loracarbef, Macrolidos, Mafenida, Meropenem, Meticilina, Metronidazol, Mezlocilina, Minociclina, Monobactamas, Moxifloxacina, Mupirocina, Nafcilina, Neomicina, Netilmicina, Nitrofurantoma, Norfloxacina, Ofloxacina, Oxacilina, Oxitetraciclina, Paromomicina, Penicilina, Penicilinas, Piperacilina, Platensimicina, Polimixina B, Polipeptidos, Prontosil, Pirazinamida, Quinolonas, Quinupristina, Rifampicina, Rifampina, Roxitromicina, Espectinomicina, Estreptomicina, Sulfacetamida, Sulfametizol, Sulfanilimida, Sulfasalazina, Sulfisoxazol, Sulfonamidas, Teicoplanina, Telitromicina, Tetraciclina, Tetraciclinas, Ticarcilina, Tinidazol, Tobramicina, Trimetoprim, Trimetoprim-Sulfametoxazol, Troleandomicina, Trovafloxacina y Vancomicina.
Los agentes activos tambien incluyen Aldosterona, Beclometasona, Betametasona, Corticoesteroides, Cortisol, Acetato de cortisona, Acetato de desoxicorticosterona, Dexametasona, Acetato de fludrocortisona, Glucocorticoides, Hidrocortisona, Metilprednisolona, Prednisolona, Prednisona, Esteroides y Triamcinolona. Tambien se contempla cualquier combinacion adecuada de estos agentes activos.
Un "excipiente farmaceutico" o un "excipiente farmaceuticamente aceptable" es un vehmulo, habitualmente un lfquido, en el que se formula un agente terapeutico activo. En una realizacion de la invencion, el agente terapeutico activo es un anticuerpo humanizado de la invencion. El excipiente en general no proporciona ninguna actividad farmacologica a la formulacion, aunque puede proporcionar estabilidad qdmica y/o biologica, y caractensticas de liberacion. Se pueden encontrar formulaciones ilustrativas, por ejemplo, en Remington's Pharmaceutical Sciences, 19a ed., Grennaro, A., Ed., 1995.
Como se utiliza en el presente documento, "vehmulo farmaceuticamente aceptable" o "excipiente" incluye todos y cada uno de los disolventes, medios de dispersion, recubrimientos, agentes antibacterianos y antifungicos, agentes isotonicos y retardantes de la absorcion que son fisiologicamente compatibles. En una realizacion, el vehmulo es adecuado para la administracion parenteral. Como alternativa, el vehmulo puede ser adecuado para administracion intravenosa, intraperitoneal, intramuscular u sublingual. Los vehmulos farmaceuticamente aceptables incluyen soluciones o dispersiones acuosas esteriles y polvos esteriles para la preparacion extemporanea de soluciones o dispersiones inyectables esteriles. El uso de tales medios y agentes para sustancias farmaceuticamente activas es bien conocido en la materia. Excepto en la medida en que cualquier medio o agente convencional sea incompatible con el compuesto activo, se contempla su uso en las composiciones farmaceuticas de la invencion. Los compuestos activos complementarios tambien se pueden incorporar en las composiciones.
Las composiciones farmaceuticas normalmente deben ser esteriles y estables en las condiciones de fabricacion y almacenamiento. La invencion contempla que la composicion farmaceutica este presente en forma liofilizada. La composicion se puede formular como una solucion, microemulsion, liposoma, u otra estructura ordenada adecuada para una concentracion alta de farmaco. El vetnculo puede ser un disolvente o medio de dispersion que contiene, por ejemplo, agua, etanol, poliol (por ejemplo, glicerol, propilenglicol y polietilenglicol lfquido), y mezclas adecuadas de los mismos. La invencion contempla ademas la inclusion de un estabilizante en la composicion farmaceutica. La fluidez adecuada se puede mantener, por ejemplo, mediante el mantenimiento del tamano de partfcula requerido en el caso de dispersion y mediante el uso de tensioactivos.
En muchos casos, sera preferible incluir agentes isotonicos, por ejemplo, azucares, polialcoholes tales como manitol, sorbitol o cloruro sodico en la composicion. Puede producirse absorcion prolongada de las composiciones inyectables mediante la inclusion en la composicion de un agente que retarde la absorcion, por ejemplo, sales de monoestearato y gelatina. Por otra parte, el polipeptido alcalino puede formularse en una formulacion de liberacion temporal, por ejemplo, en una composicion que incluya un polfmero de liberacion lenta. Los compuestos activos pueden prepararse con vetnculos que protegeran el compuesto contra la liberacion rapida, tales como una formulacion de liberacion controlada, incluyendo implantes y sistemas de suministro microencapsulados. Se pueden usar polfmeros biocompatibles, biodegradables, tales como acetato de etilen vinilo, poliantndridos, acido poliglicolico, colageno, poliortoesteres, acido polilactico y copolfmeros polilacticos, poliglicolicos (PLG). Los expertos en la materia conocen muchos metodos para la preparacion de dichas formulaciones.
Para cada una de las realizaciones enumeradas, los compuestos se pueden administrar en una diversidad de formas de dosificacion. Se contempla cualquier forma de dosificacion biologicamente aceptable conocida por expertos habituales en la materia, y combinaciones de las mismas. Los ejemplos de dichas formas de dosificacion incluyen, sin limitacion, polvos reconstituibles, elixires, lfquidos, soluciones, suspensiones, emulsiones, polvos, granulos, partfculas, micropartfculas, granulos dispersables, obleas, inhaladores, inhaladores en aerosol, parches, inhaladores en partfculas, implantes, implantes de deposito, inyectables (incluyendo subcutaneos, intramusculares, intravenosos e intradermicos), infusiones, y combinaciones de los mismos.
La descripcion anterior de diversas realizaciones ilustradas de la invencion no pretende ser exhaustiva o limitar la invencion a la forma precisa desvelada. Aunque se describen en el presente documento realizaciones espedficas de, y ejemplos para, la invencion para fines ilustrativos, son posibles diversas modificaciones equivalentes en el alcance de la invencion, como reconoceran los expertos en la materia relevante. Las ensenanzas proporcionadas en el presente documento de la invencion pueden aplicarse a otros fines, distintos de los ejemplos descritos anteriormente.
Estos y otros cambios pueden realizarse en la invencion a la luz de la descripcion detallada anteriormente. En general, en las siguientes reivindicaciones, no debe interpretarse que los terminos utilizados limiten la invencion a las realizaciones espedficas desveladas en la memoria descriptiva y las reivindicaciones. En consecuencia, la invencion no esta limitada por la divulgacion, sino que en su lugar el alcance de la invencion debe determinarse completamente por las siguientes reivindicaciones.
La invencion puede ponerse en practica de formas distintas a las descritas particularmente en la descripcion y ejemplos anteriores. Son posibles numerosas modificaciones y variaciones de la invencion a la luz de las ensenanzas anteriores y, por lo tanto, estan dentro del alcance de las reivindicaciones adjuntas.
Determinadas ensenanzas relacionadas con la humanizacion de anticuerpos monoclonales procedentes de conejo y modificaciones de secuencia preferidas para mantener afinidad de union a antfgeno se desvelaron en la solicitud internacional N.° PCT/US2008/064421, correspondiente a la Publicacion Internacional n.° WO/2008/144757, titulada "Novel Rabbit Antibody Humanization Methods and Humanized Rabbit Antibodies", presentada el 21 de mayo de 2008.
Se desvelaron determinadas ensenanzas relacionadas con la produccion de anticuerpos o fragmentos de los mismos usando levadura competente para apareamiento y metodos correspondientes en la solicitud de patente de los Estados Unidos n.° 11/429.053, presentada el 8 de mayo de 2006, (publicacion de solicitud de patente de los Estados Unidos n.° US2006/0270045).
Se desvelan determinados polinucleotidos y polipeptidos de anticuerpos de CGRP en el listado de secuencias que acompana la presente presentacion de solicitud de patente.
Los siguientes ejemplos se exponen para proporcionar a los expertos en la materia una divulgacion y descripcion completas de como realizar y utilizar la presente invencion, y no se pretende que limiten el alcance de lo que se considera la invencion. Se han realizado esfuerzos para asegurar la precision con respecto a los numeros utilizados (por ejemplo, cantidades, temperatura, concentraciones, etc.) pero debenan tenerse en cuenta algunos errores y desviaciones experimentales. Salvo que se indique otra cosa, las partes son partes en peso, el peso molecular es el peso molecular promedio, la temperatura esta en grados centfgrados; y la presion esta en o cerca de la atmosferica.
Ejemplos
Ejemplo 1 Preparacion de anticuerpos que se unen con CGRP
Usando el protocolo de seleccion de anticuerpos descrito en el presente documento, se puede generar un panel exhaustivo de anticuerpos.
Estrategia de inmunizacion
Los conejos se inmunizaron con CGRPa humano (American Peptides, Sunnyvale CA y Bachem, Torrance CA). La inmunizacion consistio en una primera inyeccion subcutanea (sc) de 100 |jg de antfgeno mezclados con 100 |jg de KLH en adyuvante completo de Freund (CFA) (Sigma) seguido de dos refuerzos, con dos semanas de diferencia que conteman cada uno 50 jg de antfgeno mezclados con 50 jg en adyuvante incompleto de Freund (IFA) (Sigma). Se tomaron muestras de los animales el dfa 55 y los tttulos de suero se determinaron mediante ELISA (reconocimiento de antigenos) y mediante inhibicion del aumento de AMPc conducido por CGRP en SK-N-MC.
Evaluacion del titulo de seleccion de anticuerpos
Para identificar y caracterizar anticuerpos que se unen con CGRPa humano, se ensayaron soluciones que conteman anticuerpos mediante ELISA. En resumen, se recubrieron placas recubiertas con estreptavidina (Thermo Scientific) con CGRPa humano biotinilado en el extremo N (50 j l por pocillo, 1 jg/ml) diluido en tampon de ELISA (gelatina de piel de pescado al 0,5 % en PBS pH 7,4), durante aproximadamente 1 h a temperatura ambiente o, como alternativa, durante una noche a 4 °C. Las placas se bloquearon despues adicionalmente con tampon de ELISA durante una hora a temperatura ambiente y se lavaron usando tampon de lavado (PBS, tween 20 0,05 %). Las muestras de suero ensayadas se diluyeron en serie usando tampon de ELISA. Se transfirieron cincuenta microlitros de muestras de suero diluidas a los pocillos y se incubaron durante una hora a temperatura ambiente. Despues de esta incubacion, la placa se lavo con tampon de lavado. Para el revelado, se anadio un Fc-HARP espedfico anti conejo (dilucion 1:5000 en tampon de ELISA) a los pocillos y se incubo durante 45 min a TA. Despues de una etapa de lavado 3x con solucion de lavado, la placa se revelo usando sustrato de TMB durante dos minutos a temperatura ambiente y la reaccion se interrumpio usando HCl 0,5 M. La absorbancia del pocillo se leyo a 450 nm.
Determinacion del titulo de muestras de suero mediante actividad funcional (inhibicion de los niveles de AMPc conducidos por CGRP)
Para identificar y caracterizar anticuerpos con actividad funcional, se realizo un ensayo de inhibicion del aumento conducido por CGRP de los niveles de AMPc usando electroquimioluminiscencia (Meso Scale Discovery, MSD). En resumen, las preparaciones de anticuerpos para ensayar se diluyeron en serie en tampon de ensayo de MSD (Hepes, MgCl2, bloqueador A 1 mg/ml pH 7,3, Meso Scale Discovery) en una placa de poliestireno de fondo redondo de 96 pocillos (Costar). A esta placa, se anadio CGRPa humano (10ng/ml de concentracion final) diluido en ensayo de MSD y se incubo durante una hora a 37C. Se usaron controles apropiados como ha sugerido el fabricante del kit de ensayo. Se desprendieron celulas de neuroepitelioma humano (SK-N-MC, ATCC) usando una solucion de EDTA (5 mM en PBS) y se lavaron usando medios de cultivo (MEM, FBS 10 %, antibioticos) por centrifugacion. El numero de celulas se ajusto a 2 millones de celulas por ml en tampon de ensayo y se anadio iBmX (3-isobutil-1metilxantina, Sigma) hasta una concentracion final de 0,2 mM justo antes de cargar las celulas en una placa de ensayo de AMPc. Despues de incubarse la solucion de CGRPa humano y anticuerpos durante una hora, se transfirieron 20 microlitros de solucion que contema celulas a la placa de ensayo de AMPc. Todas las muestras ensayadas se procesaron por duplicado con controles apropiados. Se anadieron diez microlitros de celulas a los pocillos y la placa se incubo durante 30 minutos con agitacion a temperatura ambiente. Aunque las celulas se incubaron con la solucion de CGRP, la solucion de terminacion se preparo realizando una solucion 1:200 de AMPc marcado con TAG (MSD) en tampon de lisis (MSD). Para detener la incubacion de celulas-CGRP, se anadieron 20 microlitros de solucion de terminacion a las celulas y la placa se incubo durante una hora con agitacion a temperatura ambiente. El tampon de lectura (MSD) se diluyo cuatro veces con agua y se anadieron 100 microlitros a todos los pocillos en la placa. La placa se leyo despues usando un Sector Imager 2400 (MSD) y el software Prism se uso para ajuste de datos y determinacion de CI50.
Recogida de tejidos
Una vez que se hubieron establecido los tftulos aceptables, se sacrificaron los conejos. Se recogieron el bazo, ganglios linfaticos y sangre completa y se procesaron de la siguiente manera:
El bazo y los ganglios linfaticos se procesaron en una unica suspension celular disasociando el tejido y presionando a traves de una malla de alambre esteril a 70 jm (Fisher) con un embolo de una jeringa de 20 cm3. Las celulas se recogieron en PBS. Las celulas se lavaron dos veces por centrifugacion. Despues del ultimo lavado, la densidad celular se determino mediante azul de tripano. Las celulas se centrifugaron a 1500 rpm durante 10 minutos; el sobrenadante se descarto. Las celulas se resuspendieron en el volumen apropiado de dimetil sulfoxido al 10% (DMSO, Sigma) en FBS (Hyclone) y se distribuyeron a 1 ml/vial. Los viales se almacenaron a -70 °C en una camara de congelacion lenta durante 24 horas y se almacenaron en nitrogeno lfquido.
Se aislaron celulas mononucleares de sangre periferica (PBMC) mezclando sangre completa con partes iguales del medio bajo en glucosa descrito anteriormente sin FBS. Se superpusieron 35 ml de la mezcla de sangre completa en 8 ml de Lympholyte de conejo (Cedarlane) en un tubo conico de 45 ml (Coming) y se centrifugaron durante 30 minutos a 2500 rpm a temperatura ambiente sin frenos. Despues de la centrifugacion, las capas de PBMC se retiraron cuidadosamente usando una pipeta de vidrio Pasteur (VWR), se combinaron y se colocaron en un vial de 50 ml limpio. Las celulas se lavaron dos veces con el medio modificado descrito anteriormente por centrifugacion a 1500 rpm durante 10 minutos a temperatura ambiente y la densidad celular se determino mediante azul de tripano. Despues del ultimo lavado, las celulas se resuspendieron en un volumen apropiado de medio de DMSO/FBS 10 % y se congelaron como se ha descrito anteriormente.
Seleccion de linfocitos B, enriquecimiento y condiciones de cultivo
El dfa de establecimiento de cultivo de linfocitos B, se descongelaron viales de PBMC, esplenocitos o ganglios linfaticos para su uso. Los viales se retiraron del tanque LN2 y se colocaron en un bano de agua a 37 °C hasta que se descongelaron. Los contenidos de los viales se transfirieron a un tubo de centnfuga conico de 15 ml (Corning) y se anadieron lentamente al tubo 10 ml de RPMI modificado descrito anteriormente. Las celulas se centrifugaron durante 5 minutos a 2000 rpm y se descarto el sobrenadante. Las celulas se resuspendieron en 10 ml de medio nuevo. La densidad y viabilidad celular se determinaron mediante azul de tripano.
a) El siguiente protocolo se uso para Ab1 y Ab13
Las celulas se premezclaron con el CGRPa humano biotinilado de la siguiente manera. Las celulas se lavaron de nuevo y se resuspendieron a 1E07 celulas/80 pl de medio. Se anadio CGRPa humano biotinilado a la suspension celular a la concentracion final de 5 ug/ml y se incubo durante 30 minutos a 4 °C. Se retiro CGRPa humano biotinilado realizando dos lavados de 10 ml usando PBF [PBS sin Ca/Mg (Hyclone), acido etilendiamintetraacetico 2 mM (EDTA), seroalbumina bovina (BSA) 0,5% (Sigma-sin biotina)]. Despues del segundo lavado, las celulas se resuspendieron a 1E07 celulas/80 pl de PBF y se anadieron 20 pl de perlas de estreptavidina MACS® (Miltenyi Biotech, Auburn CA) por cada 10E7 celulas a la suspension celular. Las celulas y perlas se incubaron a 4 °C durante 15 minutos y se lavaron una vez con 2 ml de PBF por cada 10E7 celulas.
b) El siguiente protocolo se uso para Ab4, Ab7, Ab9 y Ab11:
Se precargo CGRPa humano biotinilado en las perlas de estreptavidina de la siguiente manera. Se mezclaron setenta y cinco microlitros de perlas de estreptavidina (Milteny Biotec, Auburn CA) con huCGRPa biotinilado en el extremo N (10 ug/ml de concentracion final) y 300 pl de PBF. Esta mezcla se incubo a 4 °C durante 30 min y se retiro CGRPa humano biotinilado no unido usando una columna de separacion MACS® (Miltenyi Biotec, con un aclarado de 1 ml para retirar el material sin unir. Despues se extrajo material con el embolo, luego se uso para resuspender celulas de lo anterior en 100 ul por cada 1E7 celulas, la mezcla se incubo despues a 4 °C durante 30 min y se lavo una vez con 10 ml de PBF.
Para los protocolos tanto a) como b) se aplico lo siguiente: Tras el lavado, se volvieron a suspender las celulas en 500 pl de FACS y se apartaron. Se preaclaro una columna MACS® MS (Miltenyi Biotec, Auburn CA) con 500 ml de PBF en un soporte magnetico (Milteni). Se aplico la suspension celular a la columna a traves de un prefiltro, y se recogio la fraccion sin unir. La columna se lavo con 2,5 ml de tampon PBF. La columna se retiro del soporte magnetico y se coloco en un tubo eppendorf de 1,5 ml limpio, esteril. Se anadio 1 ml de tampon a la parte superior de la columna y se recogieron celulas con seleccion positiva. El rendimiento y la viabilidad de la fraccion celular positiva se determinaron mediante tincion con azul de tripano. La seleccion positiva produjo un promedio de 1 % de la concentracion celular de partida.
Se establecio una exploracion celular piloto para proporcionar informacion sobre niveles de siembra para el cultivo. Las placas se sembraron a 10, 25, 50, 100 o 200 linfocitos B enriquecidos/pocillo. Ademas, cada pocillo contema 50.000 celulas/pocillo de celulas EL-4.B5 (5.000 Rads) y un nivel apropiado de sobrenadante de linfocitos T de conejo activado (vease publicacion de solicitud de patente de los Estados Unidos N.° 20070269868)(que vana de 1­ 5 % dependiendo de la preparacion) en medio RPMl modificado alto en glucosa a un volumen final de 250 pl/pocillo. Los cultivos se incubaron durante 5 a 7 dfas a 37 °C en CO24 %.
Exploracion de cultivo de linfocitos B mediante reconocimiento de antigenos (ELISA)
Para identificar pocillos que producen anticuerpos anti CGRPa humano, el mismo protocolo como se ha descrito anteriormente para determinacion de tttulo de muestras de suero mediante reconocimiento de antfgenos (ELISA) se ha usado con los siguientes cambios. En resumen, las placas recubiertas con neutravidina se recubrieron con una mezcla de CGRPa humano biotinilado en el extremo tanto N como C (50 pl por pocillo, 1 pg/ml cada uno). Las muestras de sobrenadante de linfocitos B (50 pl) se ensayaron sin dilucion previa.
Identificacion de actividad funcional en sobrenadantes de linfocitos B usando produccion de AMPc conducida por CGRP
Para determinar la actividad funcional contenida en sobrenadantes de linfocitos B, se uso un procedimiento similar al descrito para la determinacion de titulo funcional de muestras de suero con las siguientes modificaciones. En resumen, se uso sobrenadante de linfocitos B (20 jl) en lugar de las muestras de suero policlonales diluidas.
Aislamiento de linfocitos B especificos de antigeno
Las placas que conteman pocillos de interes se retiraron de -70 °C, y las celulas de cada pocillo se recuperaron usando cinco lavados de 200 microlitros de medio (RPMI completo al 10%, BME 55 jM ) por pocillo. Las celulas recuperadas se sedimentaron mediante centrifugacion y el sobrenadante se retiro cuidadosamente. Las celulas sedimentadas se resuspendieron en 100 j l de medio. Para identificar celulas que expresan anticuerpos, se recubrieron perlas magneticas de estreptavidina (dynabeads M280, Invitrogen) con una combinacion de CGRPa humano biotinilado tanto N como C terminal. Se optimizaron lotes de CGRPa biotinilados individuales mediante dilucion en serie. Despues se mezclaron cien microlitros que conteman aproximadamente 4x10E7 perlas recubiertas con las celulas resuspendidas. A esta mezcla se anadieron 15 microlitros de FITC-IgG H&L de cabra anticonejo (Jackson Immunoresearch) diluido 1:100 en medio.
Se retiraron veinte microlitros de suspension de celulas/perlas/H&L anticonejo y se distribuyeron gotas de 5 microlitros en un portaobjetos de vidrio de un pocillo previamente tratado con Sigmacote (Sigma) que suman de 35 a 40 gotas por portaobjetos. Se uso una barrera impermeable de aceite de parafina (JT Baker) para sumergir las gotas, y el portaobjetos se incubo durante 90 minutos a 37 °C en un incubador de CO2 al 4 % en la oscuridad. Pueden identificarse linfocitos B que producen anticuerpo mediante el anillo fluorescente alrededor producido por la secrecion de anticuerpos, reconocimiento del antigeno biotinilado asociado a perlas y posterior deteccion por el reactivo de deteccion de IgG fluorescente. Una vez que se hubo identificado una celula de interes, esta se recupero mediante un micromanipulador (Eppendorf). La celula individual que sintetiza y exporta el anticuerpo se transfirio a un tubo de microcentrifuga, se congelo usando hielo seco y se almaceno a -70 °C.
Amplificacion y determinacion de secuencia de secuencias de anticuerpos de linfocitos B especificos de antigenos Se recuperaron secuencias de anticuerpos usando un metodo basado en RT-PCR combinado de un linfocito B aislado individual. Se disenaron cebadores que contienen enzimas de restriccion para hibridar en regiones conservadas y constantes de los genes de inmunoglobulina diana (pesada y ligera), tales como secuencias de inmunoglobulina de conejo, y se uso una recuperacion de PCR anidada de dos etapas para amplificar la secuencia de anticuerpo. Se analizaron amplicones de cada pocillo para recuperacion e integridad de tamano. Los fragmentos resultantes se digieren despues con AluI para identificacion de la clonalidad de secuencia. Las secuencias identicas presentaron un patron de fragmentacion comun en sus analisis electroforeticos. Los fragmentos de amplicon de cadena pesada y ligera originales se digirieron usando los sitos de enzimas de restriccion contenidos en los cebadores de PCR y se clonaron en un vector de expresion. Se amplifico y purifico vector que contema fragmentos de ADN subclonados. La secuencia de las cadenas pesadas y ligeras subclonadas se verificaron antes de la expresion.
Produccion recombinante de anticuerpo monoclonal de especificidad de antigeno y/o propiedades funcionales deseadas
Para determinar la especificidad de antigeno y las propiedades funcionales de anticuerpos recuperados de linfocitos B especificos, se transfectaron vectores que condudan la expresion de las secuencias de cadena pesada y ligera emparejadas deseadas en celulas HEK-293.
Reconocimiento de antigenos de anticuerpos recombinantes mediante ELISA
Para caracterizar anticuerpos expresados recombinantes por su capacidad para unirse con CGRPa humano, se ensayaron soluciones que conteman anticuerpos mediante ELISA. Todas las incubaciones se realizaron a temperatura ambiente. En resumen, se recubrieron placas Immulon IV (Thermo Scientific) con una solucion que contiene CGRPa (1 ut/ml en PBS) durante 2 horas. Despues se lavaron placas recubiertas con CGRPa tres veces en tampon de lavado (PBS, Tween-200,05 %). Las placas se bloquearon despues usando una solucion de bloqueo (PBS, gelatina de piel de pescado 0,5%, Tween-20 0,05%) durante aproximadamente una hora. La solucion de bloqueo se retiro despues y las placas se incubaron despues con una serie de diluciones del anticuerpo que se ensaya durante aproximadamente una hora. Al final de esta incubacion, la placa se lavo tres veces con tampon de lavado y se incubo adicionalmente con un anticuerpo secundario que contema solucion (fragmento F(ab')2 affinipure de cabra anti IgG humano conjugado con peroxidasa, espedfico de fragmento Fc (Jackson Immunoresearch) durante aproximadamente 45 minutos y se lavo tres veces. En ese punto se anadio una solucion de sustrato (sustrato de TMB peroxidasa, BioFx) y se incubo durante 3 a 5 minutos en la oscuridad. La reaccion se detuvo mediante la adicion de una solucion que contema HCl (0,5 M) y la placa se leyo a 450 nm en un lector de placas.
Resultados: Las Figuras 15-18 demuestran que los anticuerpos anti CGRP Ab1-Ab14 se unen a y reconocen CGRPa.
Caracterizacion funcional de anticuerpos recombinantes por modulacion de niveles intracelulares de AMPc conducidos por CGRP y reactividad cruzada con ratas
Para caracterizar un anticuerpo expresado recombinante para determinar su capacidad de inhibir el ensayo de niveles celulares aumentados de AMPc mediado por CGRPa, se uso un kit de ensayo de electroquimioluminiscencia (Meso Scale Discovery, MSD). En resumen, las preparaciones de anticuerpos para ensayar se diluyeron en serie en tampon de ensayo de MSD (Hepes, MgCl2, bloqueador A 1 mg/ml pH 7,3, Meso Scale Discovery) en una placa de poliestireno de fondo redondo de 96 pocillos (Costar). A esta placa, se anadio CGRPa humano (25 ng/ml de concentracion final) diluido en tampon de ensayo MSD y se incubo durante una hora a 37 °C. Se usaron controles apropiados como ha sugerido el fabricante del kit de ensayo. Se desprendieron celulas de neuroepitelioma humano (Sk-N-MC, ATCC) usando una solucion de EDTA (5 mM) y se lavaron usando medios de cultivo (MEM, FBS 10 %, antibioticos) por centrifugacion. El numero de celulas se ajusto a 2 millones de celulas por ml en tampon de ensayo, e IBMX (3-Isobutil-1 Metilxantina, 50 mM Sigma) se anadio hasta una concentracion final de 0,2 mM justo antes de cargar las celulas en la placa de ensayo de AMPc. La solucion de CGRPa humano y anticuerpos se incubo durante una hora, despues de lo cual se transfirieron 20 microlitros de solucion que contema celulas a la placa de ensayo de AMPc. Todas las muestras ensayadas se procesaron por duplicado con controles apropiados. Se anadieron diez microlitros de celulas a los pocillos y la placa se incubo durante 30 minutos con agitacion. Aunque las celulas se incubaron con la solucion de CGRP, la solucion de terminacion se preparo realizando una solucion 1:200 de AMPc marcado con TAG (MSD) en tampon de lisis (MSD). Para detener la incubacion de celulas-CGRP, se anadieron 20 microlitros de solucion de terminacion a las celulas y la placa se incubo durante una hora con agitacion. El tampon de lectura (MSD) se diluyo cuatro veces con agua y se anadieron 100 microlitros a todos los pocillos en la placa. La placa se leyo despues usando un Sector Imager 2400 (MSD) y el software Prism se uso para ajuste de datos y determinacion de CI50.
Para ensayar la capacidad de los anticuerpos recombinantes para antagonizar CGRPp humano se realizo un ensayo similar con la sustitucion del agonista de CGRP (CGRPp 10 ng/ml de concentracion final). Se realizo evaluacion de los anticuerpos recombinantes para reconocer e inhibir la generacion de AMPc mediada por CGRP de rata usando CGRP de rata (5 ng/ml de concentracion final) y la lmea celular L6 de rata (ATCC).
Resultados: Las Figuras 19-37 demuestran que los anticuerpos anti CGRP Ab1-Ab14 inhiben CGRPa, CGRPp y los niveles celulares aumentados de AMPc mediados por CGRP de rata.
Ejemplo 2: Produccion enzimatica de fragmentos Fab
Se realizaron digestiones de papama usando papama inmovilizada (Thermo/Pierce) segun las instrucciones del fabricante. En resumen, se incubaron anticuerpos purificados en un tampon que contema cistema/HCl con papama inmovilizada a 37 °C con agitacion suave. La digestion se superviso tomando una almuota y analizando usando SDS-PAGE para escision de la cadena pesada. Para detener la reaccion, la papama inmovilizada se centrifugo y se lavo usando Tris 50 mM pH 7,5 y se filtro. Se retiraron anticuerpo de longitud completa y fragmentos Fc sin digerir usando una columna de MabSelectSure (GE).
Ejemplo 3 Expresion de celulas de levadura
Construccion de vectores de expresion de Pichia pastoris para cadena pesada y ligera.
Los fragmentos de cadena ligera y pesada humanizados se sintetizaron comercialmente y se subclonaron en un vector de expresion pGAP. El vector de expresion pGAP usa el promotor de GAP para conducir la expresion de la cadena de inmunoglobulina y la secuencia lfder de seroalbumina humana (HSA) para exportacion. Ademas, Este vector contiene elementos habituales tales como un origen bacteriano de replicacion y una copia del gen de resistencia a kanamicina que confiere resistencia al antibiotico G418 en P. pastoris. G418 proporciona un medio de seleccion para cepas que contienen el vector de expresion deseado integrado en su genoma.
Transformacion de vectores de expresion en cepas hospedadoras met1 y lys3 haploides de Pichia pastoris Todos los metodos usados para transformacion de cepas de P. pastoris haploides y manipulacion del ciclo sexual de P. pastoris se realizaron como se describe en Pichia Protocols (Methods in Molecular Biology Higgings, DR, y Cregg, JM, Eds. 1998. Humana Press, Totowa, NJ). Antes de la transformacion cada vector se linealizo en las secuencias promotoras de GAP para dirigir la integracion del vector en el locus del promotor de GAP del genoma de P. pastoris. Se transfectaron cepas haploides usando electroporacion y se seleccionaron transformantes exitosos en placas de agar G418 de YPDS (extracto de levadura, dextrosa de peptona con sorbitol). Se determinaron los numeros de copias de genes de cadena pesada y ligera para cepas haploides mediante analisis de transferencia de Southern. Despues las cepas haploides se aparearon y seleccionaron para determinar su capacidad para crecer en ausencia de los marcadores de aminoacidos (es decir, Lys y Met). Despues los clones diploides resultantes se sometieron a una transferencia de Southern final para confirmar los numeros de copias de genes de cadena pesada y ligera. Se selecciono un clon que expresaba el anticuerpo de interes usando bionsensores de Protema A de interferometna de biocapas para supervisar la expresion (Octet, ForteBio).
Ejemplo 4 Expresion de Ab3, Ab6 y Ab14 en Pichia pastoris
Se prepararon tres cepas de Pichia para expresion de anticuerpo de longitud completa. Para todas las cepas de expresion de anticuerpos de longitud completa, se crearon cepas haploides y se aparearon posteriormente. Una cepa haploide expreso secuencia de cadena ligera de longitud completa y otra cepa haploide expreso la secuencia de cadena pesada de longitud completa. Cada cepa diploide se uso para generar un banco de celulas de investigacion y se uso para expresion en un biorreactor.
En primer lugar se expandio un inoculo usando el banco de celulas de investigacion usando medio comprendido por los siguientes nutrientes (% p/v): extracto de levadura al 3 %, dextrosa anhndrida al 4 %, YNB al 1,34 %, biotina al 0,004 % y fosfato potasico l0o mM. Para generar el inoculo para los fermentadores, el banco de celulas se expandio durante aproximadamente 24 horas en un incubador de agitacion a 30 °C y 300 rpm. Despues se anadio un inoculo al 10 % a vasos de 2,5 l de volumen de trabajo Labfors que conteman 1 l de medio de cultivo esteril. El medio de cultivo estaba comprendido por los siguientes nutrientes: sulfato de potasio 18,2 g/l, fosfato de amonio monobasico 36,4 g/l, fosfato de potasio dibasico 12,8 g/l, sulfato de magnesio heptahidrato 3,72 g/l, citrato de sodio dihidrato 10 g/l, glicerol 40 g/l, extracto de levadura 30 g/l, metales traza PTM1 4,35 ml/l y antiespumante 204 1,67 ml/l. La solucion de metal traza PTM1 estaba comprendida por los siguientes componentes: sulfato cuprico pentahidrato 6 g/l, yoduro de sodio 0,08 g/l, sulfato de manganeso hidrato 3 g/l, molibdato de sodio dihidrato 0,2 g/l, acido borico 0,02 g/l, cloruro de cobalto 0,5 g/l, cloruro de cinc 20 g/l, sulfato ferroso heptahidrato 65 g/l, biotina 0,2 g/l y acido sulfurico 5 ml/l.
Los parametros de control de proceso de biorreactor se ajustaron de la siguiente manera: Agitacion 1000 rpm, flujo de aire de 1,35 litros convencionales por minuto, temperatura de 28 °C y el pH se controlo en seis usando hidroxido de amonio. No se proporciono complementacion de oxfgeno.
Se cultivaron cultivos de fermentacion durante aproximadamente 12 a 16 horas hasta que el glicerol inicial se consumio como se ha indicado por una adicion de oxfgeno disuelto. Los cultivos se privaron de alimento durante aproximadamente tres horas despues de la adicion de oxfgeno disuelto. Despues de este periodo de privacion de alimento, se anadio una adicion de embolada de etanol al reactor hasta alcanzar etanol 1 % (p/v). Se permitio que los cultivos de fermentacion se equilibraran durante 15 a 30 minutos. Se inicio la adicion de alimento 30 minutos despues de la embolada de etanol y se ajusto a una velocidad constante de 1 ml/min durante 40 minutos, despues la bomba de alimento se controlo mediante un sensor de etanol manteniendo la concentracion de etanol a 1 % durante el resto del ciclo usando una sonda sensora de etanol (Raven Biotech). El alimento comprendio en los siguientes componentes: extracto de levadura 50 g/l, dextrosa 500 g/l, sulfato de magnesio heptahidrato 3 g/l y metales traza PTM1 12 ml/l. Para fermentacion del Ab6 y Ab14 de longitud completa, tambien se anadio al alimento citrato de sodio dihidrato (0,5 g/l). El tiempo de fermentacion total fue de aproximadamente 90 horas.
Ejemplo 5 Metodos para humanizar anticuerpos
Se han descrito previamente metodos para humanizar anticuerpos en la patente de los Estados Unidos N.° 7935340 expedida. En algunos casos, es necesaria una determinacion de si se requieren restos de marco conservado de conejo adicionales para mantener la actividad. En algunos casos, los anticuerpos humanizados aun requieren que se conserven algunos restos de marco conservado de conejo cnticos para minimizar la perdida de afinidad o actividad. En estos casos, es necesario cambiar aminoacidos de marco conservado individuales o multiples de secuencias de lmea germinal humana de vuelta a los aminoacidos de conejo originales para tener actividad deseada. Estos cambios se determinan experimentalmente para identificar que restos de conejo son necesarios para conservar la afinidad y actividad. Este es ahora el final de la secuencia de aminoacidos humanizada de cadena pesada y ligera variable.
Ejemplo 6 Inhibition de union de CGRP con su receptor celular
Para caracterizar anticuerpos expresados de forma recombinante por su capacidad para inhibir la union de CGRP con su receptor celular, se realizo un ensayo de union a radioligando como se ha descrito previamente [Elshourbagy et al, Endocrinology 139:1678 (1998); Zimmerman et al, Peptides, 16:421 (1995)]. Se usaron preparaciones de membrana de receptores de CGRP humanos recombinantes, receptor de tipo receptor de calcitonina y RAMP1 (Chemiscreen, Millipore). Se preincubaron diluciones de anticuerpos con cGRPa humano radiomarcado con 125I (0,03 nM) durante 30 minutos a temperatura ambiente. Se estimo la union inespedfica en presencia de CGRPa humano 0,1 |j M. Las membranas se filtraron y lavaron. Despues se contaron los filtros para determinar el CGRPa humano radiomarcado con 125I unido de forma espedfica.
Resultados: La Figura 38 demuestra que los anticuerpos anti CGRP Ab1-Ab13 inhiben la union de CGRP con su receptor celular.
Ejemplo 7 Inhibicion de la vasodilatacion neurogenica por anticuerpos anti CGRP en ratas
CGRP es un vasodilatador potente (Nature 313: 54-56 (1985) y Br J. Clin. Pharmacol. 26(6):691-5. (1988)). Se uso un ensayo farmacodinamico para medir la actividad antagonista del receptor de CGRP de forma no invasiva se uso para caracterizar anticuerpos anti CGRP. El modelo se baso en cambios del flujo sangumeo dermico medidos usando una captura de imagenes por Doppler de laser despues de la aplicacion topica de una solucion de capsaicina. La capsaicina activa el receptor transitorio potencial vainilloide de tipo 1 (TRPV-1), produciendo inflamacion neurogenica y vasodilatacion mediante la liberacion local de mediadores vasoactivos incluyendo CGRP y sustancia P (Br. J. Pharmacol. 110: 772-776 (1993)).
El dfa antes del ensayo de vasodilatacion, se dosifico a los animales con el agente de ensayo o control mediante IP (intraperitoneal). Despues de la dosificacion, los animales se afeitaron y depilaron en la region lumbar de su lado dorsal, en un area de aproximadamente 2x6 cm. Los animales se devolvieron despues a sus jaulas durante una noche. El dfa de ensayo, aproximadamente 24 horas despues de la dosificacion, los animales se anestesiaron con gas de isoflurano y se colocaron en una almohadilla termica y se equiparon con un cono nasal para el suministro continuo de isoflurano. Se uso un aparato de captura de imagenes de Doppler por laser para la observacion de la vasodilatacion. Se dirigio un haz de luz roja coherente generada por un laser de helio-neon de 633 nm a un area afeitada, un rectangulo (2x6 cm), y se exploro en un modo de resolucion medio. Se obtuvo en primer lugar una exploracion de Doppler basal y se predetermino la localizacion de colocacion de anillos en O identificando dos areas de flujo bajo similares. Se colocaron dos anillos en O de goma (~1 cm de diametro) en las regiones seleccionadas y se realizo una exploracion basal. Inmediatamente despues de la finalizacion de la exploracion, se aplico 1 mg de capsaicina en 5 pl de una solucion de etanol:acetona (1:1) en cada uno de los dos anillos en O. Se repitieron exploraciones de Doppler a los 2,5, 5, 7,5, 10, 12,5, 15, 17,5, 20, 22,5, 25, 27,5 y 30 minutos despues de la aplicacion de capsaicina. El porcentaje de cambio desde el flujo medio basal en cada uno de los dos anillos en O, se represento como los resultados de vasodilatacion debida a capsaicina.
Para ensayar anticuerpos expresados de forma recombinante por su capacidad para inhibir la union de CGRP con su receptor celular, se realizo un ensayo de union a radioligando como se ha descrito previamente.
Resultados: Las Figuras 39 y 40 demuestran que los anticuerpos anti CGRP Ab3 y Ab6 redujeron la vasodilatacion en este modelo despues de la administracion de capsaicina.
Ejemplo de referenda 8 Efecto de la administracion de anticuerpo de CGRP en vejiga hiperactiva
Se realizaron experimentos para evaluar la eficacia potencial de la administracion de un anticuerpo anti CGRP en la continencia de vejiga y vejiga hiperactiva. La continencia de vejiga es un equilibrio entre el cierre uretral y la actividad del musculo detrusor, y la vejiga hiperactiva es una afeccion caracterizada por urgencia, incontinencia urinaria, frecuencia y nocturia. Algunos indicios aislados indicados en la bibliograffa sugieren que CGRP puede estar implicado en la continencia de vejiga y puede correlacionarse con y quizas desempenar un papel en la patologfa de la enfermedad de vejiga hiperactiva. En consecuencia, se espero que los anticuerpos anti CGRP de la invencion, especialmente dada su alta afinidad con CGRP, ayudaran potencialmente a prevenir o aliviar esta afeccion en ocasiones debilitante. (Las pruebas de que CGRP puede desempenar un papel en vejiga hiperactiva incluyen el hecho de que CGRP esta presente en el tracto urinario, DRG y medula espinal (Wharton et al., 1986 Neurosci (3):727). Ademas, los aferentes de fibra C son cnticos para transportar impulsos implicados en la miccion a la medula espinal (Yoshida et al., 2011 J Pharmacol Sci (112):128) y estas fibras se ven afectadas por CGRP. Ademas, se ha indicado que la administracion intravesical de Botox suprime CGRP y reduce significativamente el intervalo entre contracciones en un modelo de dolor de vejiga inducido por acido acetico (Chuang et al., 2004 J Urol (172):1529; Chuang et al., 2009 J Urol (182):786)). Por otra parte, se ha indicado recientemente que la administracion de un anticuerpo anti CGRP supuestamente reduce el numero de contracciones de vejiga en modelo de vejiga hiperactiva inducida por aguarras (solicitud de patente de PCT WO 2011/024113 de Pfizer)).
Materiales y Metodos
Animales:
Se suministraron ratas Sprague-Dawley hembra (247 - 299 g) (Charles River Laboratories, Saint Germain sur l'Arbresle, Francia) al laboratorio 5 dfas antes de los experimentos para aclimatarse a las condiciones de laboratorio. Se alojaron 3 por jaula (tamano de jaulas de polipropileno de tipo E: 1032 cm2) y se les proporciono alimento (Teklad 2016 global rodents, Harlan, 03800 Gannat, Francia) y agua a voluntad. El lecho de serrm (Souralit 2912 plus, Souralit, 17080 Girona, Espana) para jaulas de roedores se cambio dos veces a la semana. La temperatura del animalario (20 ± 2 °C) se mantuvo con un ciclo de luz-oscuridad alternante de 12/12 horas (fase de luz 7 am: 7 pm) y la humedad relativa se mantuvo a 40-70 %.
Equipamiento de laboratorio
Se conectaron cateteres de vejiga mediante un tubo en T con un extensometro MX 860 Novatrans III Gold (Medex Medical SARL, Nantes-Carquefou, Francia) y una bomba de jeringa (70-2208 Modelo II plus, Harvard Apparatus, Les Ullis, Francia y Razel R-99E, Fisher Bioblock, Illkirch, Francia). Se registro la presion intravesical de forma continua usando una interfaz PowerLab (ADInstruments Pty Ltd, Castle-Hill, Australia) y software Chart® ejecutado en un PC. Los datos se analizaron con software Microsoft Excel®.
Sustancias de ensayo
Anticuerpo anti CGRP de ensayo (Ab3)
Anticuerpo de control negativo (anticuerpo anti digitoxina).
Reactivos quimicos
Se obtuvo solucion salina fisiologica (NaCl 0,9%) (lote n.° 11043411, CAS n.° 7647-14-5) de B-Braun mediante Centravet (Lapalisse, Francia).
Sustancias anestesicas
Uretano (lote n.° BCBC9294, CAS n.° 51-79-6) y pentobarbital sodico (lote n.° 150A1, CAS n.° 76-74-4) fueron proporcionados por Sigma-Aldrich (St Quentin Fallavier, Francia) y Centravet (Lapalisse, Francia), respectivamente.
Grupos experimentales
Se usaron dos grupos experimentales de 10 ratas en los experimentos. Se administro a cada grupo 10 mg/kg del anticuerpo de control o el anti CGRP:
Diseno del estudio
Procedimiento experimental
Se administro a ratas hembra anticuerpo de ensayo o anticuerpo de control negativo por via intravenosa a una dosis de 10 mg/kg, 18 horas antes de los experimentos usando una inyeccion en la vena de la cola. Quince (15) horas despues, las ratas se anestesiaron con uretano (1,2g/kg, subcutaneo (s.c.). Tres (3) horas despues de la administracion s.c. de uretano, se inserto un cateter de polietileno (0,58 y 0,96 mm de diametros internos y externos, respectivamente) en la vejiga a traves de la cupula y se fijo con una sutura en bolsa de tabaco. La temperatura corporal se mantuvo a 37± 2 °C (controlador TCAT-2LV, Physitemp, ADInstruments Pty Ltd., Casttle Hill, Australia) durante todo el experimento.
Experimento cistometrico
Se realizaron investigaciones cistometricas en ratas hembra anestesiadas despues de la cirugfa. Se infundio solucion salina fisiologica a temperatura ambiente de forma continua en la vejiga a un caudal constante (2 ml/h) durante un periodo de al menos 30 min.
Al final de los experimentos cistometricos, los animales se sacrificaron mediante una inyeccion letal (1 ml) de pentobarbital sodico (54,7 mg/ml) (CAS n.° 76-74-4) seguido de dislocacion cervical.
Parametros cistometricos
Los parametros cistometricos medidos fueron:
Amplitud de miccion (AM), es decir presion entre la presion umbral y presion maxima de miccion (mmHg), Intervalo entre contracciones (IEC), es decir tiempo entre dos micciones posteriores (s), Frecuencia de miccion (FM), es decir numero de contracciones de miccion/15 min (picos/15 min).
Criterios de exclusion
Se excluyeron dos ratas durante los experimentos: Uno se excluyo porque presentaba hiperactividad de vejiga durante la infusion intravesical de solucion salina y el otro porque la profundidad de anestesia cambio durante el experimento induciendo modificaciones del perfil cistometrico.
Analisis de resultados
Para cada rata, se calcularon valores para AM e IEC como la media de las ultimas cuatro o cinco micciones durante infusion de solucion salina. Se calcularon valores para FM como la media de micciones obtenidas para dos intervalos de 15 minutos durante la infusion de solucion salina.
Los resultados se presentan como valores medios ± error tipico de la media (± etm). Se realizaron figuras y analisis estad^sticos usando GraphPad Prism® (Version 4; GraphPad Software Inc., La Jolla, CA, Estados Unidos).
Se realizaron comparaciones estadfsticas de valores (infusion de solucion salina) en el grupo de anticuerpos anti CGRP frente al grupo de anticuerpos de control usando ensayo de t de Student para muestras no relacionadas. Se acepto una p<0,05 para significacion estadfstica.
Resultados:
Como se muestra en la FIG. 41, IEC fue significativamente mayor y FM fue significativamente menor en el grupo tratado con Ab anti CGRP (FIGS. 41A y B respectivamente; p<0,05, ensayo de t de Student para muestras no relacionadas). No se observo ninguna diferencia significativa para AM entre grupos (FIG. 41C, p> 0,05, ensayo de t de Student para muestras no relacionadas).
Estos resultados sugieren que los anticuerpos anti CGRP pueden ser utiles para prevenir o aliviar la vejiga hiperactiva, mejorar la incontinencia urinaria y tratamiento de afecciones urinarias relacionadas.
Ejemplo de referenda 9 Alivio de dolor neuropatico en ratas
El dano a los nervios perifericos conduce con frecuencia a dolor referido cronico que es de origen neuropatico. Este smdrome de dolor consiste en sensibilidad a estfmulos externos (por ejemplo, mecanicos y/o termicos) que no son normalmente nocivos. En consecuencia, el dolor neuropatico es refractario para enfoques analgesicos tradicionales, haciendolo diffcil de tratar. Experimentalmente, el dolor neuropatico puede modelarse en animales mediante traumatismo quirurgico a nervios perifericos. El modelo de Chung es uno de dichos sistemas donde el dolor neuropatico es inducido por ligamiento de los nervios espinales de L5 y L6.
En este ejemplo, se realizo un ligamiento de nervios espinales en ratas Sprague Dawley macho. Se ensayaron para determinar la sensibilidad al dolor el dfa 13 (confirmacion de alodinia) y despues otra vez tras cada administracion de Ab2 usando el ensayo de von Frey de alodinia mecanica para evaluar posible actividad antialodmica.
Metodos
Se desempaquetaron ratas Sprague Dawley macho (Harlan Laboratories) que pesaban 200-225 g a su llegada, y se colocaron en jaulas. Se realizo una inspeccion sanitaria visual sobre cada animal para incluir la evaluacion del pelaje, las extremidades y los orificios. Cada animal tambien se examino para determinar cualquier senal anomala de postura o movimiento. Se descubrio que todos los animales teman buena salud y se colocaron en el estudio. Las ratas se aclimataron durante un mmimo de dos dfas antes del inicio de los procedimientos experimentales, con la excepcion de los pesos corporales de aleatorizacion que se recogieron el dfa siguiente despues de la llegada. Los animales se alojaron individualmente en jaulas convencionales de policarbonato transparente o jaulas microaislantes de policarbonato transparente con lecho de contacto irradiado certificado. Se proporcionaron alimentos y agua a voluntad. Los controles ambientales se ajustaron para mantener las temperaturas de 18 ° a 26 °C (de 64 ° a 79 °F) con una humedad relativa de 30 % a 70 %. Se mantuvo un ciclo de luz:oscuridad de 12:12 horas.
Las ratas se ensayaron para determinar el umbral basal usando los filamentos de von Frey los dfas -4 o -1 de aclimatacion.
El dfa 0, los animales se sometieron a un procedimiento de ligamiento de nervios espinales. Todas las cirugfas se realizaron en condiciones asepticas. Antes de las cirugfas, las ratas se anestesiaron. La region de la espalda se afeito y se preparo para cirugfa aseptica. Las ratas se colocaron en decubito prono y se realizo una incision justo a la izquierda de la lmea media en la region L4 - S2. Los musculos paraespinales izquierdos se separaron de las apofisis espinosas (L4 - S2). La articulacion facetaria L6-S1 se corto y la apofisis transversa se recorto ligeramente para proporcionar espacio para acceder al nervio espinal L4 y L5. Los nervios espinales L5 y L6 izquierdos se aislaron y ligaron con suturas de seda de 6,0. La incision se cerro despues con material de sutura apropiado y grapas de heridas cutaneas. Despues de la operacion, se administro solucion de Ringer con lactato (3,0 - 5,0 ml) mediante inyeccion subcutanea a los animales.
Todos los animales en los Grupos 1 y 2 recibieron un ensayo de von Frey los dfas -4 o -1, 13, 14 y 17. La medicion el dfa 13 se tomo antes de la dosis. El ensayo de von Frey para alodinia mecanica evalua las propiedades antinociceptivas de compuestos analgesicos. En este ensayo, los animales se habituaron en primer lugar a la camara de ensayo de modo que estuvieran lo suficientemente calmados para que se evaluara su umbral del dolor. Un especialista clmico desconocedor de los grupos de tratamiento aplico una ligera presion a la pata trasera izquierda de la rata usando una serie de filamentos de nailon calibrados (filamentos de von Frey) de diametro en aumento. Los filamentos se presionaron perpendicularmente contra la superficie ventral de la pata hasta que se doblaron. Cuando se consideran dolorosos, la rata responde retirando la pata. La alodinia umbral se determino usando el metodo de arriba abajo de Chaplan (Chaplan et al., J Neurosci Methods, 53:55-63, 1994), que proporciona la fuerza precisa para la retirada para cada rata usando una escala psicoffsica de ensayo.
Los animales se asignaron a dos grupos de tratamiento el dfa 13, basandose en puntuaciones de von Frey. Cualquier animal que tuviera una puntuacion de von Frey mayor de 6 g se excluyo del estudio. Las puntuaciones de von Frey medias para cada grupo se revisaron para asegurar que los valores medios y la desviacion tfpica satisfadan la hipotesis de homogeneidad. Se administraron dosis mediante inyeccion IP una vez el dfa 13 (13 dfas despues de la cirugfa) para el Grupo 1 (Ab2) y el Grupo 2 (anticuerpo de control negativo) (11 animales en cada grupo; Se administraron anticuerpos Ab2 y de control negativo a 10mg/kg). El grupo 1 recibio una inyeccion de embolada IV adicional (sin anestesiar) de Ab2 en dfa 17 antes del ensayo conductual.
Se tomaron muestras de sangre para plasma en dfa 17 para el grupo 1 y se analizaron para determinar el tttulo de Ab2.
Aparte de las observaciones de sitio quirurgico esperadas y arrastre de pata asociado con la cirugfa de Chung, no se documentaron observaciones anomalas. El tratamiento no parecio tener ningun efecto adverso en la salud general del animal ni altero el aumento de peso normal esperado en ratas de esta edad.
Resultados
Todos los animales que se sometieron a ensayo basal antes de la cirugfa el dfa 0 tuvieron una puntuacion de von Frey de 15 (no mostrado) lo que indica sensibilidad normal. El dfa 13 (antes de la administracion de anticuerpo), todos los animales teman puntuaciones de von Frey menores de 6 g lo que indica que se ha desarrollado sensibilidad a estfmulos mecanicos externos, excepto por dos animales que se retiraron del estudio. Las puntuaciones de von Frey promedio el dfa 13 fueron de menos de 3 g (FIG. 42, grupo izquierdo de barras). Despues del ensayo el dfa 13, se administro a los animales Ab2 o un anticuerpo de control negativo (10 mg/kg). En los dfas 14 y 17, se ensayaron de nuevo puntuaciones de von Frey y estas fueron mayores en los animales tratados con Ab2 que los controles (FIG. 42, grupo medio de barras y grupo derecho de barras, respectivamente).
Estos resultados indican que el tratamiento con un anticuerpo anti CGRP tal como Ab2 puede ayudar a prevenir o aliviar el dolor neuropatico.
Ejemplo de referen d a 10 Primer experimento que evalua el efecto de la administracion de anticuerpo anti CGRP en la analgesia (modelo de retirada de la cola)
Se realizaron tres experimentos diferentes (Ejemplos 10-12) para evaluar la eficacia potencial de la administracion de un anticuerpo anti CGRP sobre la analgesia o el dolor. En todos estos experimentos se uso un modelo de respuesta de retirada de la cola de roedor (tambien denominada retraccion de la cola) ya que la respuesta de retirada de la cola de roedor a calor radiante es un modelo usado habitualmente para detectar agentes analgesicos potencialmente utiles. Este ensayo es particularmente util para diferenciar entre analgesicos de tipo morfina de accion central (activos) y agentes antiinflamatorios de accion periferica o no opioides (inactivo). Este modelo animal y metodos y materiales usados en el mismo se describen a continuacion.
Materiales y Metodos
Animales: Ratas macho procedentes de Sprague Dawley macho que pesan 150 ± 20 g.
Anticuerpo de CGRP de ensayo: Ab2
Vehfculo: Histidina 15 mM Sorbitol 250 mM, pH 5,5
Compuesto analgesico: Morfina
Procedimientos de respuesta de retirada de la cola: El tiempo (segundos) necesario para inducir una respuesta de retirada de la cola inducida por calor radiante focalizado se midio como el umbral del dolor en grupos de 10 ratas macho procedentes de Sprague Dawley que pesaban 150 ± 20 g. El ensayo basal para la respuesta de retirada de la cola se realizo el dfa 0. Las ratas que tienen una respuesta de retirada de la cola de 3-5 segundos se incluyeron en el estudio y se asignaron a grupos de tratamiento equilibrados basandose en respuestas de retirada de la cola basales. Se uso un corte de 15 segundos para evitar el dano tisular.
Desarrollo de tolerancia a la morfina
Se administro a cada uno de 3 grupos de 10 ratas Sprague Dawley macho 2 x al dfa mediante administracion i.p. vehfculo salino (2 ml/kg) por la manana y por la tarde. Se administro ademas a uno de los 3 grupos i.p. analgesico (morfina) a una dosificacion de 5 mg/kg 2 x al dfa durante 7 dfas consecutivos. Se administro a un segundo de los 3 grupos de ratas i.p. un anticuerpo anti CGRP segun la descripcion (Ab2) a una dosificacion de 10 mg/kg como una unica embolada el dfa 0. Cada una de las ratas en los diferentes grupos se ensayaron despues para determinar la respuesta de retirada de la cola una vez al dfa 30 min despues de la dosis matinal.
Se aplica un ANOVA de una via seguido de ensayo de t de Dunnett para comparacion entre los grupos tratado con control de vehteulo y compuesto de ensayo. P<0,05 se considera significativo.
Los resultados de estos experimented se muestran en la Figura 43. Los resultados en la misma indican que el anticuerpo de CGRP de ensayo cuando se administra a 10mg/kg indujo efecto analgesico de larga duracion significativo a un estimulo de dolor termico. Se tomaron muestras de sangre terminales de todas las ratas ensayadas mediante puncion ca^aca y posteriormente se analizaron para determinar el tftulo de Ab2.
Ejemplo de referen d a 11: Segundo experimento de retirada de la cola que evalua el efecto del anticuerpo de CGRP en la analgesia) (titulacion de dosis de anticuerpo)
Se realizo un segundo conjunto de experimentos de retirada de la cola para evaluar los efectos de diferentes dosificaciones de anticuerpo anti CGRP en la analgesia usando un anticuerpo anti CGRP segun la descripcion (Ab2). Las ratas usadas en estos experimentos son del mismo tipo que en el experimento previo y el protocolo de retirada de la cola sustancialmente igual. En este experimento se comparo la analgesia en diferentes grupos de animales a los que se administraron diferentes dosificaciones de anticuerpo anti CGRP para evaluar si la dosificacion tiene un efecto en la analgesia. En el segundo conjunto de experimentos, se compararon cinco grupos de animales de ensayo de la siguiente manera. Se administro a cada uno de un primer grupo de control de animales el vehteulo solo (histidina 15 mM sorbitol 250 mM, pH 5,5), se administro a cada uno de 3 grupos de animales dosificaciones del mismo anticuerpo anti CGRP contenido en el vehteulo (Ab2, administrado respectivamente a dosificaciones de 1 mg/kg, 3 mg/kg o 10 mg/kg el dfa 0), y se administro a un quinto grupo de animales 10 mg/kg de un anticuerpo de control negativo (anticuerpo anti digitoxina) tambien el dfa 0.
Los protocolos de retirada de la cola se efectuaron sustancialmente de otro modo como se ha descrito anteriormente. Los resultados se evaluaron de nuevo usando ANOVA de una via seguido de ensayo de t de Dunnett para comparacion entre los grupos tratados con control de vehteulo, anticuerpo de control negativo y anticuerpo de CGRP de ensayo. P<0,05 se considera significativo.
Los resultados de estos experimentos se muestran en la Figura 44. Puede verse a partir de los mismos que las dosificaciones de anticuerpo mayores del compuesto de ensayo (anticuerpo anti CGRP Ab2 de la invencion) indujeron mejores efectos analgesicos que las dosificaciones menores. Como se ha anticipado el anticuerpo de control negativo no indujo un efecto perceptible en la analgesia en relacion con los grupos de control.
Ejemplo de referenda 12: Tercer experimento de retirada de la cola que evalua el efecto de la coadministracion de anticuerpo anti CGRP/morfina en la analgesia
Tambien se realizo un tercer conjunto de experimentos de retirada de la cola para evaluar los efectos de la coadministracion de anticuerpo anti CGRP/morfina en la analgesia. En estos experimentos se administro a un primer grupo de animales el mismo vehteulo solo a una dosificacion de 5 ml/kg. Se administro a un segundo grupo de animales morfina los dfas 1-10 a una dosificacion de 5 mg/kg, administrada dos veces al dfa, en donde tambien se administro a dichos animales el dfa 0 el anticuerpo anti CGRP Ab2 a una dosificacion de 10 mg/kg. Se administro a un tercer grupo de animales morfina los dfas 1-4 a una concentracion de dosificacion de 5 mg/kg, administrada dos veces al dfa, y se le administro el ademas el anticuerpo Ab2 el dfa 0, a una dosificacion de 10 mg/kg. Todas las administraciones fueron i.p.
Se efectuaron experimentos de retirada de la cola en cada uno de estos grupos de animales diariamente del dfa 0 al 10. Los resultados de estos experimentos de retirada de la cola se evaluaron de nuevo usando ANOVA de una via seguido de ensayo de t de Dunnett para comparacion entre el grupo tratado con control de vehteulo, anticuerpo de control negativo y anticuerpo anti CGRP de ensayo. P<0,05 se considera significativo.
Los resultados de estas comparaciones se resumen en la Figura 45. Los animales tratados con Ab2 que recibieron una dosis diaria de morfina durante todo el experimento mostraron tolerancia a la morfina y despues del dfa 5 el tiempo de retirada de la cola se habfa reducido casi hasta el nivel de animales de control tratados con vehteulo. Por el contrario, en animales tratados con Ab2 que recibieron morfina solamente hasta el dfa 4, el tiempo de retirada de la cola mejoro el dfa 5 y permanecio mejorado hasta el dfa 8. Los resultados sugieren que la administracion de un anticuerpo anti CGRP puede tener efectos analgesicos incluso despues de la aparicion de tolerancia a la morfina, que puede ser mas pronunciada tras la retirada de la morfina.
Ejemplo de referenda 13 Alivio de dolor visceral en ratas
Los pacientes que padecen smdrome del intestino irritable (SII) demuestran un umbral sensorial visceral mas bajo para la distension de globo colorrectal (Ritchie, Gut, 1973, 14:125-32). Se ha sugerido que en SII hay una mayor sensibilidad al dolor del eje cerebro-intestino, con un patron normal de activacion. Se ha mostrado previamente que la inyeccion de acido trinitrobencenosulfonico (TNBS) en el colon proximal provoco hipersensibilidad colonica cronica, medida en ratas conscientes por un umbral de dolor reducido en respuesta a distension colonica (Diop et al., J. Pharmacol. Exp. Ther., 2002, 302:1013-22). Esta hipersensibilidad cronica se encontro en el colon distal no inflamado y persistio durante 21 dfas. Imito determinadas caractensticas de SII y de este modo puede usarse como un modelo para explorar experimentalmente los aspectos patofisiologicos de este trastorno. Este ensayo se usa para determinar los efectos antihipertensivos potenciales de compuestos para hipersensibilidad colonica inducida por TNBS.
Varios estudios han implicado al CGRP en el dolor visceral (Friese et al., Regul Pept 1997;70:1-7; Gschossmann et al., Neurogastroenterol Motil 2001;13:229-36; Julia y Bueno, Am J Physiol 1997;272:G141-6; Plourde et al., Am J Physiol 1997;273:G191-6). CGRP es el peptido mas abundante de fibras aferentes sensibles a capsaicina de origen gastrointestinal, representando hasta 80% de la inmunorreactividad peptfdica general (Clague et al., Neurosci Lett 1985;56:63-8; Sternini et al., Gastroenterology 1987;93:852-62). Adicionalmente, la inyeccion de CGRP induce hipersensibilidad colonica en un modelo de TNBs (Delafoy et al., 2006, Gut 55:940-5), que se invierte por un peptido antagonista de CGRP (CGRP 8-37).
Este ejemplo describe el ensayo de un anticuerpo anti CGRP en un modelo de dolor visceral (hipersensibilidad colonica cronica inducida por TNBS) en ratas.
Metodos
Se incluyeron en este estudio ratas Sprague-Dawley macho, que pesaban de 390 a 450 g el dfa de la cirugfa. Estas se alojaron en una habitacion con temperatura (19,5 °C - 24,5 °C) y humedad relativa (45 % - 65 %) controladas con un ciclo de luz/oscuridad de 12 h. Los animales se alojaron a 2 o 3 por jaula y se observo un periodo de aclimatacion (al menos 5 dfas) antes del ensayo. Cada rata se identifico por marcas de la cola. El estudio se realizo segun las directrices del Comite de Investigacion y Aspectos Eticos de la I.A.S.P. (1983) y las directrices europeas 2010/63/UE.
Se indujo sensibilidad colonica por administracion quirurgica de acido trinitrobencenosulfonico (TNBS, 50 mg/kg) 7 dfas antes del ensayo conductual. Se sometieron animales en ayunas (24 horas) a cirugfa. En resumen, con anestesia (Acepromazina 5 mg/kg / Ketamina 30 mg/kg), se realizo inyeccion de TNBS (50 mg/kg, 1 ml/kg) en la parte proximal del colon (1 cm desde el ciego). Despues de la cirugfa, los animales se devolvieron a sus jaulas en un ambiente regulado y se alimentaron a voluntad hasta el dfa del ensayo, 7 dfas despues. Se colocaron animales "sin tratamiento previo" (ratas sin cirugfa) en las mismas condiciones de alojamiento.
Se administro a los animales el anticuerpo anti CGRP Ab2 o un anticuerpo de control negativo (ambos a 10 mg/kg) por via intravenosa 24 horas antes de la determinacion del umbral colonico. Se incluyeron tres grupos de ratas en este estudio:
Grupo 1: Un grupo "sin tratamiento previo" compuesto de animales que no se sometieron a cirugfa o tratamiento con TNBS en D-7 y se trataron con el anticuerpo de control 24 horas antes (es decir D-1) del ensayo (es decir mediciones del umbral de distension colonica en D0) (n=7).
Grupo 2: Un grupo de "TNBS" compuesto por animales que se sometieron a cirugfa en D-7 y se trataron con anticuerpo de control (24 horas antes (es decir D-1) del ensayo (es decir mediciones del umbral de distension colonica en D0) (n=8).
Grupo 3: Un grupo "tratado" compuesto de animales que se sometieron a cirugfa en D-7 y se trataron con el Ab2 24 horas antes (es decir D-1) del dfa del ensayo (es decir mediciones del umbral de distension colonica en D0) (n=8).
Siete dfas (D7) despues de la inyeccion de TNBS, la sensibilidad colonica se evaluo midiendo la presion intracolonica necesaria para inducir una respuesta conductual durante la distension colonica debida al inflado de un globo introducido en el colon. Los ensayos fueron realizados por un experimentador desconocedor del tratamiento. Esta respuesta se caracteriza por una elevacion de la parte trasera del cuerpo del animal y una contraccion abdominal claramente visible correspondiente a contracciones graves (Al Chaer et al., Gastroenterology 2000, 119:1276-1285) y se uso como un marcador del dolor (Bourdu et al., Gastroenterology. 2005:128, 1996-2008). El globo (5 cm) se inserto por via intrarrectal de una manera mrnimamente invasiva hasta 10 cm desde el ano de animales despiertos en ayunas (24 h) y el cateter se pego con cinta a la base de la cola. Las ratas se colocaron despues en la mitad de una caja de plexiglas y el cateter se conecto a un aparato barostatico electronico. Despues de un periodo de aclimatacion de 30 min con el globo insertado, la presion colonica se aumento gradualmente en etapas de 5 mmHg cada 30 s desde 5 hasta 75 mmHg (punto de corte) hasta que se demostro comportamiento de dolor. Se realizaron cuatro determinaciones, 30 min, 50 min, 70 min y 90 min despues de la insercion del globo. Usando los datos de cada ensayo, se calculo el porcentaje de actividad sobre la hipersensibilidad colonica inducida por la administracion intracolonica de TNBS de la siguiente manera
(Porcenta Jje de actividad)Tratado = - fl - -m -- t - r - ro - . - 1 ----- d - i - s - t - e - n - s -- io -- n ------------------------ n-- u-- r-c- i- d--a- d--L-s-t-s- r-.s-- m-- fi-r-K-E--i x lflfl

Claims (16)

REIVINDICACIONES
1. Un anticuerpo anti CGRP humano que comprende un polipeptido de cadena ligera que tiene la secuencia de aminoacidos expuesta en la SEQ ID NO: 52 y un polipeptido de cadena pesada que tiene la secuencia de aminoacidos expuesta en la SEQ ID NO: 54.
2. El anticuerpo anti CGRP humano segun la reivindicacion 1, en donde dicho anticuerpo anti CGRP humano se produce mediante expresion en celulas de mairnfero o levadura.
3. El anticuerpo anti CGRP humano segun la reivindicacion 1 o la reivindicacion 2, que:
(i) esta aglucosilado;
(ii) esta glucosilado, pero contiene solamente restos de manosa; o
(iii) no esta N-glucosilado.
4. El anticuerpo anti-CGRP humano segun una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, que:
(i) esta unido directa o indirectamente con un marcador detectable o agente terapeutico; o
(ii) comprende ademas un resto efector que es un resto detectable o un resto funcional, en donde dicho resto detectable es opcionalmente un colorante fluorescente, una enzima, un sustrato, un material bioluminiscente, un material radioactivo o un material quimioluminiscente y dicho resto funcional es opcionalmente estreptavidina, avidina, biotina, una citotoxina, un agente citotoxico o un material radioactivo.
5. El anticuerpo anti-CGRP humano segun una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, que se une espedficamente con celulas humanas que expresan CGRP y/o se une con moleculas de CGRP solubles en circulacion in vivo y/o se une espedficamente con CGRP expresado en o por celulas humanas en un paciente con una enfermedad asociada con celulas que se unen con CGRP, en donde la enfermedad se selecciona de migrana con aura, migrana sin aura, una afeccion en donde CGRP induce dolor, perdida de peso, cancer, tumores, vejiga hiperactiva, incontinencia urinaria, prurito, psoriasis, ulcera, migranas cronicas, migranas episodicas frecuentes, migranas menstruales, migranas hemiplegicas, cefaleas en racimo, neuralgia migranosa, cefaleas cronicas, cefaleas de tension, cefaleas generales, sofocos, hemicranea paroxfstica cronica, neuralgia craneal, cefaleas sinusales, cefaleas inducidas por alergia, migranas inducidas por alergia, dolor, trastornos temporomandibulares de la mandfbula, dolor inflamatorio, dolor visceral, dolor por incision postoperatorio, smdrome de dolor regional complejo, dolor de cancer, dolor de cancer de hueso primario, dolor de cancer de hueso metastasico, dolor por fractura, dolor por fractura osteoporotica, dolor resultante de quemadura, osteoporosis, dolor de articulaciones gotosas, dolor asociado con crisis de anemia falciforme, dolor asociado con carcinoma hepatocelular, dolor asociado con cancer de mama, dolor asociado con cirrosis hepatica, dolor neurogenico, dolor neuropatico, dolor nociceptivo, neuralgia del trigemino, neuralgia postherpetica, dolor de miembro fantasma, fibromialgia, dolor menstrual, ovarialgia, distrofia simpatica refleja, dolor por osteoartritis, dolor por artritis reumatoide, dolor dorsolumbar, neuropatfa diabetica, ciatica, dolor visceral asociado con reflujo gastroesofagico, dispepsia, smdrome del intestino irritable, enfermedad inflamatoria del intestino, enfermedad de Crohn, ileitis, colitis ulcerosa, colico renal, dismenorrea, cistitis, prostatitis y pancreatitis; preferentemente en donde dicha enfermedad se selecciona de dolor, dolor visceral, smdrome de la articulacion temporomandibular (TMJ), trastornos temporomandibulares de la mandfbula, cefalea, vejiga hiperactiva, incontinencia urinaria, cefalea en racimo y migrana; mas preferentemente, en donde la enfermedad se selecciona de migrana con aura, migrana sin aura, migrana cronica, migranas episodicas frecuentes o migranas menstruales.
6. Una secuencia de acido nucleico o secuencias de acido nucleico que codifican el anticuerpo anti CGRP humano de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en donde la secuencia o secuencias de acido nucleico estan comprendidas opcionalmente por codones preferidos para levadura o ser humano.
7. Un vector que comprende la secuencia o secuencias de acido nucleico de la reivindicacion 6, en donde el vector es opcionalmente un plasmido o vector vmco recombinante.
8. Una celula cultivada o recombinante que expresa un anticuerpo codificado por la secuencia o secuencias de acido nucleico de la reivindicacion 6 y/o el vector de la reivindicacion 7, en donde la celula se selecciona opcionalmente de una celula de levadura, de marnffero, bacteriana, fungica o de insecto, en donde preferentemente la celula es una celula de levadura diploide tal como una levadura Pichia.
9. Un anticuerpo anti-CGRP humano de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, para su uso en el tratamiento, alivio y/o reduccion de smtomas de una enfermedad o afeccion tratable mediante la administracion de una cantidad terapeuticamente eficaz de un antagonista de CGRP, en donde la enfermedad o afeccion se selecciona de migrana con aura, migrana sin aura, una afeccion en donde CGRP induce dolor, vejiga hiperactiva, incontinencia urinaria, migranas cronicas, migranas episodicas frecuentes, migranas menstruales, migranas hemiplegicas, cefaleas en racimo, neuralgia migranosa, cefaleas cronicas, cefaleas de tension, cefaleas generales, sofocos, hemicranea paroxfstica cronica, neuralgia craneal, cefaleas sinusales, cefaleas inducidas por alergia, migranas inducidas por alergia, dolor, smdrome de la articulacion temporomandibular (TMJ), trastornos temporomandibulares de la mandfoula, dolor inflamatorio, dolor visceral, dolor por incision postoperatorio, smdrome de dolor regional complejo, dolor de cancer, dolor de cancer de hueso primario, dolor de cancer de hueso metastasico, dolor por fractura, dolor por fractura osteoporotica, dolor resultante de quemadura, dolor de articulaciones gotosas, dolor asociado con crisis de anemia falciforme, dolor asociado con carcinoma hepatocelular, dolor asociado con cancer de mama, dolor asociado con cirrosis hepatica, dolor neurogenico, dolor neuropatico, dolor nociceptivo, neuralgia del trigemino, neuralgia post-herpetica, dolor de miembro fantasma, fibromialgia, dolor menstrual, ovarialgia, distrofia simpatica refleja, dolor por osteoartritis, dolor por artritis reumatoide, dolor dorsolumbar, neuropatfa diabetica, ciatica, dolor visceral asociado con reflujo gastroesofagico, en donde la enfermedad se selecciona preferentemente de vejiga hiperactiva; incontinencia urinaria; dolor; dolor cronico; inflamacion neurogenica y dolor inflamatorio; dolor neuropatico; dolor ocular; dolor dental; dolor postquirurgico, dolor relacionado con traumatismo, en donde la enfermedad se selecciona mas preferentemente de dolor, vejiga hiperactiva, incontinencia urinaria, cefalea o migrana.
10. Un anticuerpo anti-CGRP humano de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, para su uso en el tratamiento, alivio y/o reduccion de smtomas de migrana o cefalea.
11. El anticuerpo para su uso segun la reivindicacion 9 o la reivindicacion 10, en donde el anticuerpo se administra con otro agente terapeutico.
12. El anticuerpo para su uso segun la reivindicacion 11, en donde dicho otro agente terapeutico se selecciona de un analgesico, un antihistammico, un agente antiinflamatorio, un antibiotico, un producto quimioterapeutico, un inmunosupresor, una citocina, un antiproliferativo, un antiemetico o una citotoxina,
en donde el analgesico es opcionalmente un AINE, un analgesico opioide o un anticuerpo o fragmento de anticuerpo, en donde el anticuerpo o fragmento de anticuerpo es preferentemente un anticuerpo de NGF o fragmento de anticuerpo,
en donde el AINE se selecciona preferentemente de un inhibidor de ciclooxigenasa 1 y/o ciclooxigenasa 2; derivados de acido propionico incluyendo ibuprofeno, naproxeno, naprosyn, diclofenaco y ketoprofeno; derivados de acido acetico incluyendo tolmetina y sulindaco; derivados de acido fenamico incluyendo acido mefenamico y acido meclofenamico; derivados de acido bifenilcarboxflico incluyendo diflunisal y flufenisal; y oxicam incluyendo piroxim, sudoxicam e isoxicam, en donde el analgesico se selecciona preferentemente de un fenantreno; una fenilheptilamina; una fenilpiperidina; un morfinano; y un compuesto de benzomorfano y
en donde el analgesico opioide se selecciona preferentemente de codema, dihidrocodema, diacetilmorfina, hidrocodona, hidromorfona, levorfanol, oximorfona, alfentanilo, buprenorfina, butorfanol, fentanilo, sufentanilo, meperidina, metadona, nalbufina, propoxifeno, pentazocina o sales farmaceuticamente aceptables de los mismos, y morfina o un derivado de morfina o sales farmaceuticamente aceptables de los mismos.
13. Una cantidad eficaz para diagnostico de al menos un anticuerpo anti CGRP humano segun una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5 para su uso en un metodo de captura de imagenes in vivo que detecta la presencia de celulas que expresan CGRP que comprende administrar dicho al menos un anticuerpo anti CGRP humano, en donde dicha administracion incluye ademas opcionalmente la administracion de un radionuclido o fluoroforo que facilita la deteccion del anticuerpo en sitios de enfermedad que expresan CGRP y en donde los resultados se usan opcionalmente para facilitar el diseno de un regimen terapeutico apropiado.
14. Un metodo de preparacion del anticuerpo de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en un cultivo de levadura poliploide que expresa de forma estable y secreta al medio de cultivo al menos 10-25 mg/litro de dicho anticuerpo, que comprende:
(i) introducir al menos un vector de expresion que contiene uno o mas polinucleotidos heterologos que codifican dicho anticuerpo unido operativamente a un promotor y una secuencia senal en una celula de levadura haploide; (ii) producir mediante apareamiento o fusion de esferoplastos una levadura poliploide a partir de dicha celula de levadura haploide;
(iii) seleccionar celulas de levadura poliploide que expresan de forma estable dicho anticuerpo; y
(iv) producir cultivos de levadura poliploide estables a partir de dichas celulas de levadura poliploide que expresan de forma estable dicho anticuerpo en el medio de cultivo,
en donde dicha levadura es opcionalmente una especie de Pichia que se selecciona de Pichia pastoris, Pichia methanolica o Hansenula polymorpha (Pichia angusta), en donde la especie de Pichia es preferentemente Pichia pastoris.
15. Una composicion farmaceutica o de diagnostico que contiene al menos un anticuerpo anti CGRP humano segun una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5 y un vehmulo farmaceuticamente aceptable, en donde dicha composicion comprende opcionalmente ademas al menos un estabilizador y esta opcionalmente liofilizada.
16. Un anticuerpo anti-CGRP humano de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, para su uso en el tratamiento, alivio y/o reduccion de smtomas de una enfermedad o trastorno asociado a CGRP mediante la administracion de una cantidad terapeuticamente eficaz de un antagonista de CGRP, en donde la enfermedad o trastorno es uno en donde CGRP induce dolor.
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