ES2873400T3

ES2873400T3 - Regulación de la expresión génica a través de la modulación mediada por un aptámero del corte y empalme alternativo

Info

Publication number: ES2873400T3
Application number: ES16747144T
Authority: ES
Inventors: Alex Boyne; F Danos; J Volles; Xuecui Guo
Original assignee: MeiraGTx UK II Ltd
Current assignee: MeiraGTx UK II Ltd
Priority date: 2015-02-02
Filing date: 2016-02-02
Publication date: 2021-11-03
Anticipated expiration: 2036-02-02
Also published as: MX2017009953A; AU2016215454B2; KR20240133774A; SI3265563T1; PH12021552268A1; IL284796A; MX2022002634A; AU2016215454A1; EP3265563B1; IL284796B; SMT202100329T1; CA2975735A1; EP3265563A1; CN114990143B; DK3265563T3; EA202092665A3; JP2023099821A; HRP20210854T1; KR20170121745A; HK1248760A1

Abstract

Un casete de polinucleótido para la regulación de la expresión de un gen diana que comprende a. un ribointerruptor b. un exón alternativamente empalmado, flanqueado por un intrón 5' y un intrón 3', en donde el ribointerruptor comprende (i) una región efectora que comprende un tallo que tiene 7 a 20 pares de bases que incluye la secuencia del sitio de corte y empalme 5' del intrón 3' y (ii) un aptámero, en donde: la secuencia del sitio de corte y empalme 5' del intrón 3' comprende la secuencia GTAATG o GTRAGT, en donde R es A o G; y el exón alternativamente empalmado comprende un codón de parada que está en marco con el gen diana cuando el exón alternativamente empalmado es empalmado en el ARNm del gen diana.

Description

DESCRIPCIÓN

Regulación de la expresión génica a través de la modulación mediada por un aptámero del corte y empalme alternativo

Campo de la invención

La invención proporciona una plataforma y métodos para usar la plataforma para la regulación de la expresión de un gen diana usando la exposición a una molécula pequeña. La plataforma está provista con un casete de polinucleótido que se coloca en el gen diana e incluye un ribointerruptor sintético posicionado en el contexto de un intrón 5'-exón alternativo-intrón 3'. El ribointerruptor comprende una región efectora y un aptámero que se une a un ligando (por ejemplo, una molécula pequeña) y proporciona control de la expresión del gen diana mediante la exposición al ligando.

Antecedentes de la invención

El corte y empalme se refiere al proceso mediante el cual la secuencia intrónica se retira del pre-ARN mensajero (pre-ARNm) naciente y los exones son unidos entre sí para formar el ARNm. Los sitios de corte y empalme son cruces entre exones e intrones y son definidos por diferentes secuencias de consenso en los extremos 5' y 3' del intrón (es decir, los sitios de donador de corte y empalme y aceptor de corte y empalme, respectivamente). El corte y empalme alternativo de pre-ARNm, o el corte y empalme alternativo, es un proceso ampliamente distribuido que se produce en la mayoría de los genes humanos que contienen múltiples exones. Se lleva a cabo mediante una estructura grande de múltiples componentes llamada el espliceosoma, el cual es una recolección de pequeñas ribonucleoproteínas nucleares (snRNP) y un diverso conjunto de proteínas auxiliares. Al reconocer diversas secuencias reguladoras en cis, el espliceosoma define límites de exones/intrones, retira secuencias intrónicas y empalma entre sí los exones en un mensaje traducible final (es decir, el ARNm). En el caso del corte y empalme alternativo, pueden incluirse o excluirse ciertos exones para variar el mensaje de codificación final cambiando así la proteína expresada resultante.

El documento US 2013/291226 desvela elementos de ARN imitadores de ARNr 5S (P5SM) de planta híbridos que regulan la expresión génica por corte y empalme alternativo, y métodos de uso de tales elementos de ARN para regular la expresión de transgenes en células hospedadoras eucariotas y plantas.

La regulación de la expresión de un gen diana (por ejemplo, un transgén terapéutico) es necesaria en diversas situaciones. En el contexto de la expresión terapéutica de genes, las técnicas que permiten la expresión regulada de transgenes tienen el potencial de intensificar la seguridad regulando el nivel de expresión y su sincronización. Un sistema regulado para controlar la expresión de proteínas tiene roles prácticos y, en algunos casos, esenciales para aplicaciones terapéuticas seguras y eficaces.

Sumario de la invención

En un aspecto, la invención proporciona un casete de polinucleótido para la regulación de la expresión de un gen diana que contiene (a) un ribointerruptor y (b) un exón alternativamente empalmado, flanqueado por un intrón 5' y un intrón 3', en donde el ribointerruptor comprende (i) una región efectora que comprende un tallo que tiene de 7 a 20 pares de bases que incluye la secuencia del sitio de corte y empalme 5' del intrón 3' y (ii) un aptámero, en donde la secuencia del sitio de corte y empalme 5' del intrón 3' comprende la secuencia GTAATg o GTRAGT, en donde R es A o G; y el exón alternativamente empalmado comprende un codón de parada que está en marco con el gen diana cuando el exón alternativamente empalmado es empalmado en el ARNm del gen diana. En una realización, el aptámero se une específicamente a un ligando de molécula pequeña.

En una realización, el polinucleótido para la regulación de la expresión de un gen diana ("casete de regulación de genes", "casete regulador" o "casete de polinucleótido") contiene intrones 5' y 3' que derivan de un intrón endógeno del gen diana. En una realización, los intrones 5' y 3' son exógenos al gen diana. En una realización, los intrones 5' y 3' derivan del intrón 2 del gen de p-globina humana. En una realización, el intrón 5' comprende un codón de parada en marco con el gen diana. En una realización, los intrones 5' y 3' tienen cada uno independientemente de aproximadamente 50 a aproximadamente 300 nucleótidos de longitud. En una realización, los intrones 5' y 3' tienen cada uno independientemente de aproximadamente 125 a aproximadamente 240 nucleótidos de longitud. En una realización, los intrones 5' y/o 3' han sido modificados para incluir, o alterar, la secuencia de un potenciador intrónico del corte y empalme, un sitio de corte y empalme 5', un sitio de corte y empalme 3', o la secuencia de punto de ramificación.

En una realización, el tallo de la región efectora tiene una longitud de 8 a 11 pares de bases.

En una realización, el exón alternativamente empalmado deriva del exón 2 del gen de la dihidrofolato reductasa humana (DHFR), el exón 5 del tumor de Wilms 1 mutante humano, el exón 16 de la proteína quinasa II delta dependiente de calcio-calmodulina de ratón, o el exón 6 de SIRT1. En una realización, el exón alternativamente empalmado es el exón 2 modificado de DHFR de SEQ ID NO: 15. En una realización, el exón alternativamente empalmado ha sido modificado en uno o más del grupo que consiste en la alteración de la secuencia de un silenciador exónico del corte y empalme, la alteración de la secuencia de un potenciador exónico del corte y empalme, la adición de un potenciador exónico del corte y empalme y la adición de un donador exónico del corte y empalme. En una realización, el exón alternativamente empalmado es sintético (es decir, no derivado de un exón de origen natural).

En otro aspecto, la invención proporciona un casete de polinucleótido para su uso en terapia génica en un método para modular la expresión de un gen diana que comprende (a) insertar el casete de polinucleótido de la presente invención (por ejemplo, como se describe anteriormente y en el presente documento) en el gen diana, (b) introducir el gen diana que comprende el casete de polinucleótido en una célula y (c) exponer la célula a un ligando de molécula pequeña que se une específicamente al aptámero en una cantidad eficaz para inducir la expresión del gen diana.

En una realización, la expresión del gen diana es más de aproximadamente 5 veces mayor cuando el ligando de molécula pequeña está presente que los niveles de expresión cuando el ligando de molécula pequeña está ausente. En una realización, la expresión del gen diana es más de 10 veces mayor cuando el ligando de molécula pequeña está presente que los niveles de expresión cuando el ligando de molécula pequeña está ausente.

En una realización, el casete de polinucleótido se inserta en la región codificante de proteína del gen diana. En una realización, dos o más de los casetes de polinucleótido se insertan en el gen diana. En una realización, los dos o más casetes de polinucleótido comprenden diferentes aptámeros que específicamente se unen a diferentes ligandos de molécula pequeña. En otra realización, los dos o más casetes de polinucleótido comprenden el mismo aptámero de diferentes aptámeros que específicamente se unen al mismo ligando.

En una realización, el gen diana que comprende el casete de polinucleótido se incorpora en un vector para la expresión del gen diana. En una realización, el vector es un vector vírico. En otras realizaciones, el vector vírico se selecciona del grupo que consiste en vector adenovírico, vector vírico adenoasociado y vector lentivírico.

En otro aspecto, la invención proporciona un vector que comprende un gen diana que contiene un casete de polinucleótido para su uso en terapia génica mediante un método para modular la expresión de un gen diana en el ojo de un mamífero que comprende (a) introducir en el ojo un vector que comprende un gen diana que contiene un casete de polinucleótido que comprende (i) un ribointerruptor y (ii) un exón alternativamente empalmado flanqueado por un intrón 5' y un intrón 3', en donde el ribointerruptor sintético comprende una región efectora que comprende un tallo que tiene de 7 a 20 pares de bases que incluye la secuencia del sitio de corte y empalme 5' del intrón 3' y un aptámero que específicamente se une a un ligando, en donde (i) la secuencia del sitio de corte y empalme 5' del intrón 3' comprende la secuencia GTAATG o GTRAGT, en donde R es A o G; y (ii) el exón alternativamente empalmado comprende un codón de parada que está en marco con el gen diana cuando el exón alternativamente empalmado es empalmado en el ARNm del gen diana; y (b) proporcionar al mamífero el ligando en una cantidad eficaz para inducir la expresión del gen diana. En una realización, el ligando es una molécula pequeña.

En una realización, el vector se introduce en el ojo mediante inyección intraocular. En una realización, el vector es un vector vírico. En una realización, el vector vírico se selecciona del grupo que consiste en vector adenovírico, vector vírico adenoasociado y vector lentivírico.

En una realización, el polinucleótido para la regulación de la expresión de un gen diana en el ojo contiene intrones 5' y 3' que derivan de un intrón endógeno del gen diana. En una realización, los intrones 5' y 3' son exógenos al gen diana. En una realización, los intrones 5' y 3' derivan del intrón 2 del gen de p-globina humana. En una realización, el intrón 5' comprende un codón de parada en marco con el gen diana. En una realización, los intrones 5' y 3' tienen cada uno independientemente una longitud de aproximadamente 50 a aproximadamente 300 nucleótidos. En una realización, los intrones 5' y 3' tienen cada uno independientemente una longitud de aproximadamente 125 a aproximadamente 240 nucleótidos. En una realización, los intrones 5' y/o 3' han sido modificados para incluir, o alterar la secuencia de, un potenciador intrónico del corte y empalme, un sitio de corte y empalme 5', un sitio de corte y empalme 3', o la secuencia de punto de ramificación. En una realización, el tallo de la región efectora tiene una longitud de aproximadamente 8 a 11 pares de bases. En una realización, el exón alternativamente empalmado deriva del exón 2 del gen de la dihidrofolato reductasa humana (DHFR), el exón 5 del tumor de Wilms 1 mutante humano, el exón 16 de la proteína quinasa II delta dependiente de calcio-calmodulina de ratón, o el exón 6 de SIRT1. En una realización, el exón alternativamente empalmado es el exón 2 modificado de la DHFR de SEQ ID NO: 15, un exón 2 modificado de la DHFR humana. En una realización, el exón alternativamente empalmado ha sido modificado en uno o más del grupo consistiendo en la alteración de la secuencia de un silenciador exónico del corte y empalme, la alteración de la secuencia de un potenciador exónico del corte y empalme, la adición de un potenciador exónico del corte y empalme y la adición de un donador exónico del corte y empalme. En una realización, el exón alternativamente empalmado es sintético (es decir, no derivado de un exón de origen natural).

En un aspecto, la invención proporciona un polinucleótido recombinante que comprende un gen diana que contiene el casete de polinucleótido para regular la expresión del gen diana (por ejemplo, como se describe anteriormente). En una realización, el casete de polinucleótido se encuentra en la secuencia codificante de proteínas del gen diana.

En un aspecto, la invención proporciona un vector que comprende un gen diana que contiene un casete de polinucleótido para regular la expresión del gen diana (por ejemplo, como se describe anteriormente). En una realización, el vector es un vector vírico. En una realización, el vector vírico se selecciona del grupo que consiste en vector adenovírico, vector vírico adenoasociado y vector lentivírico.

Descripción de las figuras

Fig. 1a. Vista esquemática de la construcción de corte y empalme "Con 1" con el intrón 2 de beta-globina humana truncada (IVS2A) insertado en la secuencia codificante del gen de la luciferasa. Las designaciones "Luci Exón 1" y "Luci Exón 2" se refieren a la división del gen de la luciferasa en las secuencias codificantes 5' y 3'. El corte y empalme de la secuencia intrónica insertada IVS2A da como resultado el ARNm de longitud completa el cual se traduce en proteína de longitud completa.

Fig. 1b. El efecto de la secuencia de inserción del intrón y sitio de corte y empalme en la expresión de la luciferasa. Las construcciones Con 1 hasta Con 7 tienen diferentes sitios de corte y empalme intrónico (véase la Tabla 1). Con 1 tiene IVS2A con su sitio de corte y empalme 5' y sitio de corte y empalme 3' ("5'ss" y "3'ss", respectivamente) originales de IVS2. Con 2 a Con 7 tienen IVS2A insertado, pero con diferencias de la secuencia 5'ss y 3'ss como se enlista en la Tabla 1. Con 8 no tiene intrón de IVS2A. Con 1 a Con 3 no mostraron efectos con la inserción del intrón en la expresión de la luciferasa en comparación con un control de la luciferasa sin ningún intrón insertado (Con 8). Con 4 a Con 7, con sitios de corte y empalme más débiles, mostraron expresión reducida de la luciferasa.

Fig. 2a. Diagrama esquemático del casete de intrón-exón-intrón con representación de patrones de corte y empalme de inclusión (I) y exclusión (II) de exón. La estrella (♦ ) denota un codón de parada en el exón 2 de DHFR. Cuando el exón alternativo de DHFR se incluye en el ARNm del gen diana (luciferasa) mediante el corte y empalme (I), el transcrito resultante contiene un codón de parada en marco, el cual bloquea la expresión génica de la luciferasa. Solo cuando el exón alternativo de DHFR que contiene el codón de parada es excluido del ARNm final, el gen diana se expresa (II).

Fig. 2b. El efecto de la inclusión o exclusión del exón alternativo de DHFR en la expresión del gen de la luciferasa. Se realizó un ensayo de la luciferasa en células HEK 293 transfectadas con diferentes construcciones de indicador de luciferasa conteniendo un casete de intrón-exón-intrón como se muestra en la Fig. 2a. El exón 2 de DHFR con secuencias de sitios de corte y empalme de tipo natural (DHFR_wt) se comparó con el exón de DHFR que contiene mutaciones en el 5'ss (DHFR_wt5ssC) o con el 5'ss nativo reemplazado con el 5'ss más fuerte de Con 1 (DHFR_Con15ss), o con el 5'ss débil de Con 4 (DHFR_Con45ss). La construcción usada en la línea 1 en 2b y 2c es Con 1, la cual se muestra en la Fig. 1 y en el Ejemplo 1. La inserción del exón 2 de DHFR en el ARNm de la luciferasa causó una disminución en la expresión de la luciferasa, la cual no ocurrió cuando el 5'ss (es decir, el donador de corte y empalme) del exón 2 de DHFR fue mutado (compare DHFR_wt con DHFR_wt5ssC). Cuando el 5'ss del exón de DHFR fue reemplazado con el 5'ss más fuerte de Con 1 (construcción DHFR-Con1 5'ss), la inclusión del exón de DHFR fue mejorada, dando lugar a una expresión 545 veces más baja de la luciferasa en comparación con Con 1. Cuando un 5'ss débil (de Con 4 en el Ejemplo 1) se usó para reemplazar el 5'ss de tipo natural, el corte y empalme reducido en este sitio impidió la inclusión del exón de DHFR, permitiendo así el aumento de la expresión de la luciferasa.

Fig. 2c. Los elementos potenciadores (ESE) o supresores (ESS) exónicos del corte y empalme dentro de la secuencia del exón de DHFR influyen en el corte y empalme del exón alternativo de DHFR y modulan la expresión del gen diana. La mutación del sitio de unión de SRp40 dentro del exón 2 de DHFR dio como resultado la disminución dramática en la expresión de la luciferasa: diferencia de 2.982 veces entre la expresión de DHFR_wtmtSRp40 y la expresión de Con 1 (Fig. 2c DHFR_wtmtSRp40; Tabla 2). La mutación de un sitio de unión putativa para el potenciador de corte y empalme SC35, para generar un sitio de unión de SC35 más fuerte (Tabla 2, StrSC35), disminuyó más la expresión de la luciferasa (139 veces) en comparación con Con 1 (Fig. 2c, DHFR_wtStrSC35), presumiblemente debido al aumento en la eficiencia de la inclusión del exón de DHFR. El reemplazo del sitio de unión para el potenciador de corte y empalme SC35 con el sitio del inhibidor de corte y empalme hnRNP A1 (Tabla 2, SC35hnRNPAl), dio lugar a un aumento de 4,3 veces en la expresión de la luciferasa en comparación con el exón 2 de tipo natural de DHFR (Fig. 2c, DHFR_wt SC35hnRNPAl).

Fig. 3a. Diagrama esquemático del casete de intrón-exón-intrón conteniendo una estructura de horquilla en el 5'ss del exón 2 alternativo de DHFR. Cuando el 5'ss de DHFR está incrustado dentro de la estructura de horquilla, el exón de DHFR no estará incluido en el transcrito, permitiendo así que la luciferasa sea expresada (x representa el 5'ss del exón de DHFR enterrado en la horquilla).

Fig. 3b. Secuencias y estructuras de cuatro horquillas diferentes probadas en el casete de intrón-exón-intrón ilustrado en la Fig. 3a.

Fig. 3c. Efecto de la estructura de horquilla en el 5'ss de exón 2 de DHFR en la expresión del gen diana. La construcción que contiene el exón de DHFR con la secuencia de 5'ss de Con 1 suprime eficientemente la expresión de la luciferasa debido a la inclusión del exón de DHFR en el ARNm empalmado (DHFR_Con15ss, Fig. 3c). Sin embargo, la incrustación del 5'ss del exón de DHFR en una estructura de horquilla impide eficientemente la inclusión del exón de DHFR y permite la expresión de la luciferasa (DHFR_Con15ss_HP15 Fig. 3c). Una secuencia de horquilla con un tallo interrumpido no restaura la expresión de la luciferasa (Fig. 3c. DHFR_Con15ss_HP15x). La construcción de DHFR_wtmtSRp40 (Ejemplo 2) no expresa la luciferasa a menos que el 5'ss del exón de DHFR sea aislado establemente en una estructura de horquilla (DHFR_wtmtSRp40_HP15). La desestabilización de la horquilla impide la expresión de la luciferasa, incluso en el contexto de un sitio de unión de SRp40 mutante con fuerte actividad de corte y empalme (DHFR_wtmtSRp40_HP15x).

Fig. 4a y Fig.4b. Diagrama esquemático de la regulación génica por el casete regulador de intrón-exón-intrón que contiene un ribointerruptor sintético. En la ausencia de la unión de aptámero/ligando, la secuencia de aptámero interrumpe la formación del tallo de la horquilla, dejando accesible el 5'ss del exón de DHFR y dando lugar a la inclusión del exón de DHFR, impidiendo así la traducción y bloqueando la expresión de proteínas (Fig. 4a). Cuando se produce la unión de aptámero/ligando, los cambios conformacionales que dependen del ligando en el aptámero estabilizan la formación del tallo, aislando el 5'ss del exón de DHFR, dando como resultado la exclusión del exón de DHFR y la expresión génica de la luciferasa (Fig. 4b).

Fig. 4c. Configuraciones del tallo de la horquilla y el aptámero de teofilina con diferentes longitudes del tallo de conexión. El tallo del aptámero de teofilina se enlazó directamente al tallo de la horquilla que aísla el 5'ss del exón de DHFR, generando un tallo sintético de 20 pb. La secuencia del tallo se truncó, generando una serie de horquillas con diferentes longitudes de tallo. Se muestran las estructuras de tallo para DHFR_Theo1, 12, 13 y 14 con longitudes de tallo de 20 pb, 9 pb, 8 pb y 7 pb, respectivamente. La teofilina se simboliza como (A).

Fig. 4d. Efecto de las diferentes longitudes de tallo usando el aptámero de teofilina en la expresión del gen diana en presencia y ausencia de la teofilina. Gráfica que muestra la expresión de la luciferasa regulada por los casetes reguladores que contienen aptámero de teofilina que se generaron como se describe en el Ejemplo 4 (Fig. 4c). En las construcciones Theo 1 a 12, con longitudes de tallo de 20 pb hasta 9 pb, el tallo de la horquilla tenía la longitud suficiente para formar una estructura estable en la ausencia de la unión de aptámero/ligando. DHFR_Theo13 no forma un tallo de horquilla estable en la ausencia del ligando, de este modo, el 5'ss de exón de DHFR no está escondido dando como resultado la inclusión del exón de DHFR, bloqueando la expresión de la luciferasa. En presencia de la teofilina, la horquilla se estabiliza y el 5'ss de exón de DHFR es inaccesible a la maquinaria de corte y empalme. Esto da como resultado la exclusión del exón de DHFR permitiendo la expresión de la luciferasa. En presencia de 3 mM de teofilina, DHFR_Theo_13 demuestra una inducción de 43 veces por encima del nivel básico no inducido de la expresión. DHFR_Theo_14 no muestra la expresión de la luciferasa con o sin teofilina presente, sugiriendo que este tallo de 7 pb es demasiado corto para formar una horquilla estable incluso cuando el aptámero se une a su ligando. Como resultado, el exón de DHFR es empalmado en el transcrito y la expresión de la luciferasa se bloquea.

Fig. 5a. Secuencias de tallos sintéticos que conectan el aptámero de xpt-guanina y secuencia del 5'ss del exón de DHFR generada por el truncamiento serial del tallo de la horquilla y el tallo PI de aptámero. La guanina se simboliza como (•).

Fig. 5b. Efecto de la longitud del tallo en la capacidad de un ribointerruptor de regular la expresión de la luciferasa en respuesta a la unión aptámero-ligando. Se insertaron dieciocho ribointerruptores de diferentes longitudes de tallo en el casete regulador y las construcciones se transfectaron a las células HEK 293 las cuales se cultivaron en presencia o ausencia de 500 pM de guanina. En la ausencia de la guanina, las construcciones G14 a G18 demostraron expresión reducida de la luciferasa en comparación con el control de Con 1 no regulado. En presencia de la guanina, se restauró la expresión de la luciferasa a diferentes grados.

Fig. 5c y 5d. Análisis adicional del efecto de la longitud del tallo en la capacidad del ribointerruptor de regular la expresión de la luciferasa en respuesta a la unión aptámero ligando. Las construcciones G11 a G18 se validaron usando el ensayo de la luciferasa. La Fig. 5d muestra el nivel basal y el nivel inducido de la luciferasa en relación con Con 1. En la ausencia de la guanina, las construcciones G14 a G17 demuestran la regulación clara de la expresión de la luciferasa por el complejo de aptámero-ligando (en este caso, la guanina). En la ausencia de la guanina, los niveles de expresión de la luciferasa son bajos. En presencia de la guanina, la expresión de la luciferasa es significativamente activada. La Fig. 5d muestra el porcentaje de la expresión de control de Con 1 lograda para estas construcciones reguladas en la inducción con la guanina.

Fig. 5e. El casete regulador que contiene el ribointerruptor de xpt-G17 permitió la regulación de la expresión génica en respuesta al ligando en un determinado número de diferentes tipos de células de mamífero. DHFR_G17 se transfectó en las líneas celulares HepG2, AML12, RD y C2C12 y se analizó para la expresión inducida de la luciferasa en el tratamiento con la guanina. Se muestra el factor multiplicador de la inducción de la expresión de la luciferasa cuando las células se cultivaron en la presencia del ligando en comparación con el nivel básico no inducido de la expresión cuando no se añadió guanina al medio de cultivo de células.

Fig. 5f. Regulación de la luciferasa por el casete regulador que contiene xpt-G17 en el contexto de un vector vírico. Se transfirió una construcción con el gen de la luciferasa conteniendo el casete regulador que contiene xpt-G17 a un esqueleto del vector vírico adenoasociado (AAV) y se usó para transfectar células. Se cultivaron células en presencia y ausencia de la guanina. Se muestra el factor multiplicador de la inducción de la luciferasa en presencia de la guanina y se observó una inducción de la expresión de 1687 veces en el tratamiento con la guanina.

Fig. 5g. Regulación de anticuerpo por el casete regulador en respuesta a la unión aptámero-ligando. El casete regulador de intrón-exón-intrón con el ribointerruptor de xpt-G17 se insertó en la secuencia de péptido líder de la secuencia de anticuerpo anti-KDR y la construcción resultante se transfectó en las células HEK 293. De acuerdo con la prueba de ELISA, hubo una inducción de la expresión de proteínas del anticuerpo de 80 veces en el tratamiento de las células transfectadas con el ligando, en comparación con las células no tratadas. El nivel inducido de la expresión llegó a aproximadamente del 40 % de la construcción de control que contiene las secuencias intrónicas de Con 1.

Fig. 5h. Regulación de la proteína eritropoyetina secretada (EPO) por el casete regulador en respuesta a la unión aptámero/ligando. El casete regulador de intrón-exón-intrón con el ribointerruptor de xpt-G17 se insertó en el gen de la eritropoyetina murina (Epo) y la construcción resultante se transfectó en las células HEK 293. Se observó una expresión de bajo nivel de e Po en la ausencia de la guanina, según el ensayo ELISA. En presencia de la guanina, se observó una inducción de la expresión de EPO de 140 veces.

Fig. 6a. Estructuras de los diferentes tallos de ribointerruptor de la purina probados en el casete regulador. La purina se simboliza como •.

Fig. 6b-6e. Respuestas a dosis de las construcciones con casetes reguladores que contienen diferentes ribointerruptores basados en aptámero (los tallos de ribointerruptor ilustrados en la Fig. 6a).

Fig. 6b. Respuesta de los casetes reguladores que contienen aptámero-guanina a la guanina.

Fig. 6c. Respuesta de los casetes reguladores que contienen aptámero-guanina a la guanosina.

Fig. 6d. Respuesta de los casetes reguladores que contienen aptámero-guanina a 2'dG.

Fig. 6e. Respuesta de los casetes reguladores que contienen aptámero-adenina a la adenina.

Fig. 7a. Inducción de la EGFP con el casete regulador que contiene xpt-G17 por la guanina. El casete de intrónexón-intrón con el ribointerruptor de xpt-G17 se clonó en el gen de la EGFP. Las células HEK 293 transfectadas establemente con la construcción se trataron con 500 pM de guanina y examinadas con el análisis por citometría de flujo para la expresión de la GFP 6 horas después del tratamiento. El tratamiento con la guanina dio como resultado un aumento en la expresión del EGFP, Fig 7a, (B).

Fig. 7b. La expresión del gen diana responde a la presencia o ausencia del ligando. Las células HEK 293 transfectadas establemente con la EGFP con el casete de intrón-exón-intrón que contiene el ribointerruptor de xpt-G17 se trataron durante 3 días con 500 pM de guanina y examinadas con el análisis por citometría de flujo cada 24 horas durante 3 días. Se lavaron las células retirando la guanina contenida en el medio de cultivo y continuaron cultivándose sin el tratamiento con guanina por otros 10 días y se monitorizó la expresión de la EGFP. La expresión de la EGFP aumentó cuando la guanina estaba presente en el medio de cultivo de células. Al retirar la guanina, se perdió la expresión de la EGFP.

Fig. 8a. Expresión de la luciferasa regulada por dos copias del casete regulador que contiene xpt-G15. La gráfica muestra la respuesta a la dosis de guanina de las construcciones con un solo casete regulador que contiene xpt-G17 o xpt-G15 insertado en el gen diana y una construcción con dos copias del casete regulador que contiene xpt-G15 (xpt-G15 doble).

Fig. 8b. Expresión de la EGFP en las células de cultivo de tejidos, regulada por diferentes casetes reguladores. Una copia del casete que contiene xpt-G17 (EGFP-xpt-G17) da como resultado una expresión básica no inducida baja (A) y llega a un nivel inducido más bajo de expresión en comparación con las células que contienen la construcción de EGFP-xpt-G15 (D). Una copia del casete que contiene xpt-G15 (EGFP-xpt-G15) proporciona una expresión básica no inducida más alta (B), así como una expresión inducida más alta (E). Con la construcción que comprende dos copias de los casetes que contienen xpt-G15 (EGFP-xpt-G15 doble), la expresión no inducida de referencia es reducida (C) sin reducir el nivel inducido de expresión (F), de este modo el factor multiplicador de la inducción es aumentado. Las células se trataron con guanina y 24 horas después del tratamiento se tomó una imagen de ellas.

Fig. 8c. Los casetes reguladores que contienen los ribointerruptores de xpt-G15 y xpt-G17 responden tanto a la guanina, como a la guanosina. Se analizó la cuantificación de la expresión de la EGFP (intensidad media de fluorescencia) mediante la citometría de flujo y se calculó el factor multiplicador de la inducción como la intensidad media de fluorescencia (MFI) obtenida con el tratamiento con guanina o guanosina dividido entre la MFI obtenida sin el tratamiento. El tratamiento con la guanina y la guanosina proporcionó niveles y factor multiplicador de la inducción similares.

Fig. 8d. Expresión de la luciferasa de una construcción conteniendo una copia del casete regulador que contiene xpt-G17 además de una copia del casete regulador que contiene Ydhl-A5. Las células HEK 293 transfectadas con esta construcción se trataron con guanina o adenina, o ambas. La inducción más alta de la luciferasa se observó con el uso combinado de ambos ligandos en su concentración más alta.

Fig. 9a y 9b. Los efectos de los truncamientos de intrón en la expresión de la luciferasa regulada por el casete regulador de intrón-exón-intrón que contiene el ribointerruptor de xpt-G17. La Fig. 9a muestra el factor multiplicador de la inducción y la 9b muestra el porcentaje de la expresión de la luciferasa en comparación con Con 1.

Fig. 9c. Diagrama de secuencias suprimidas de la construcción reguladora DHFR_G17 de intrón-exón-intrón. La secuencia suprimida es representada por la barra abierta, permaneciendo la secuencia representada por la barra sólida.

Figs. 9d y 9e. El efecto de diferentes supresiones de intrones, representado en la Fig. 9c, en la regulación génica. Las secuencias dentro de los intrones que flanquean el exón alternativo de DHFR modificaron el corte y empalme de exones y la regulación génica relativa. Por ejemplo, DHFR-G17_2IR_3 muestra supresiones de intrones que dan como resultado un aumento significativo en el factor multiplicador de la expresión del gen diana. La Fig. 9d muestra el factor multiplicador de la inducción, considerando que la Fig. 9e muestra el nivel absoluto de la expresión de proteínas en relación con el control de Con 1.

Figs. 10a y 10b. Diferentes exones pueden actuar como el exón alternativo en el casete regulador de intrón-exónintrón para regular la expresión génica. La Fig. 10a muestra que las construcciones con diferentes exones tienen varios niveles básicos no inducidos e inducidos (500 pM de guanina) de la expresión de la luciferasa. La Fig. 10b muestra el factor multiplicador de la inducción con estas construcciones, generando CaMKIId-e16 el factor multiplicador equivalente de la inducción al exón de DHFR con SRp40 activando la mutación (mtDHFR).

Figs. 11a-c. Regulación de la expresión de la luciferasa in vivo en ratones. La construcción que contiene dos copias del casete regulador de xpt-G15 (xpt-G15 doble, Ejemplo 8, Fig. 8a) se administró al hígado de ratones mediante la inyección hidrodinámica. Se administraron oralmente a los ratones diferentes dosis de guanosina a las 2 horas y 12 horas después de la entrega del ADN y después se tomó una imagen de los ratones. La administración oral del ligando dio como resultado la activación relacionada con la dosis de la expresión del gen diana regulado en el hígado de los ratones (Fig. 11a y Fig. 11b).

En otro experimento, se administró intraperitonealmente la guanosina (Fig. 11c). Las imágenes muestran la expresión de la luciferasa antes y después del tratamiento con la guanosina con una dosis de 100 mg/kg o 300 mg/kg. En la gráfica (Fig. 11d), la actividad de la luciferasa se expresó como número promedio de fotones/s/mm2 ± s.d. (n=5).

Fig. 12. Expresión del transgén de la EGFP mediada por vectores víricos adenoasociados basados en el ribointerruptor en la retina murina. Retinografía fluorescente del fondo que muestra la expresión del transgén de la EGFP en la retina mediada por AAV2/8-GTX7, 8 días después de la inyección subretinal (tiempo de exposición: 30 s).

Figs. 13a y 13b. Imágenes del fondo de ojo representativas de un solo ojo murino al cual se inyectó AAV2/8-GTX7 subretinalmente mostrando con el tiempo variación en la expresión del transgén de la EGFP en la retina. A-E: Imágenes tomadas bajo iluminación de luz blanca con un tiempo de exposición de 200 ms a los 2, 8, 9, 10 y 12 días después de la inyección del vector. El círculo muestra el área de retina visible a través de la pupila que se tomó como la región de interés para la cuantificación. F-J: Imágenes tomadas bajo iluminación de luz de 475±25nm con un tiempo de exposición de 30 s, mostrando fluorescencia de eGFP a los 2, 8, 9, 10 y 12 días después de la inyección del vector. K-O: Imágenes tomadas bajo iluminación de luz de 475±25nm con un tiempo de exposición de 30 s a los 2, 8, 9, 10 y 12 días después de la inyección del vector resaltando los pixeles por encima de un umbral de intensidad de 50 dentro de la región de interés (círculo). La Fig. 13b muestra imágenes de alta resolución antes (A) y después (B) de la inducción.

Fig. 13c. Expresión del transgén de la EGFP en la retina murina cuantificada con el tiempo después de la inyección subretinal de AAV2/8-GTX7. Se tomaron retinografías fluorescentes del fondo en los siguientes intervalos de tiempo: 2, 8, 9, 10 y 12 días después de la inyección subretinal de AAV2/8- GTX7. Tiempo de exposición: 30 s, umbral de intensidad de pixeles para el análisis: 50. Se realizó la inducción intraperitoneal después de la reproducción de las imágenes a los 8, 9 y 10 días posteriores a la inyección subretinal de AAV2/8-GTX7. Además, se realizó la inducción intravítrea a los 11 días después de la inyección subretinal de AAV2/8-GTX7. Significancia estadística mostrada basada en el ANOVA unidireccional con corrección de Dunnett y 8 días después de la inyección cono el punto de control.

Fig. 13d. Expresión del transgén de la EGFP en la retina murina cuantificada con el tiempo después de la inyección subretinal de AAV2/8-GTX5 (control positivo). Se tomaron retinografías fluorescentes en los siguientes intervalos de tiempo: 2, 8, 9, 10 y 12 días después de la inyección subretinal de AAV2/8-GTX5. Tiempo de exposición: 10 s, umbral de intensidad de pixeles para el análisis: 190. Se realizó la administración intraperitoneal de guanosina después de la reproducción de imágenes a los 8, 9 y 10 días después de la inyección subretinal de AAV2/8-GTX5. Además, se realizó la administración intravítrea de guanosina a los 11 días después de la inyección subretinal de AAV2/8-GTX5. Se aplicó el ANOVA unidireccional con corrección de Bonferroni y no se encontraron diferencias estadísticamente significativas en la expresión de la EGFP en el tratamiento con la guanosina.

Descripción detallada

La presente invención proporciona un casete de regulación de genes que contiene un ribointerruptor en el contexto de un intrón 5'-exón alternativo-intrón 3'. El casete de regulación de genes se refiere a una construcción de ADN recombinante que cuando se incorpora al ADN de un gen diana proporciona la capacidad de regular la expresión del gen diana a través del corte y empalme alternativo mediado por un aptámero/ligando del pre-ARNm resultante. El ribointerruptor en el contexto de la presente invención contiene una región sensora (por ejemplo, un aptámero) y una región efectora que juntas son responsables de detectar la presencia de un ligando de molécula pequeña y alterar el corte y empalme a un exón alternativo. En una realización, la expresión del gen diana aumenta cuando el complejo de aptámero-ligando está presente y disminuye cuando el ligando está ausente.

Ribointerruptor

El término "ribointerruptor" como se usa en el presente documento se refiere a un segmento regulador de un polinucleótido de ARN. Un ribointerruptor en el contexto de la presente invención contiene una región sensora (por ejemplo, un aptámero) y una región efectora que juntas son responsables de detectar la presencia de un ligando (por ejemplo, una molécula pequeña) y alterar el corte y empalme a un exón alternativo. En una realización, el ribointerruptor es recombinante, utilizando polinucleótidos de dos o más fuentes. El término "sintético" como se usa en el presente en el contexto de un ribointerruptor se refiere a un ribointerruptor que no es de origen natural. En una realización, las regiones sensora y efectora son unidas por un enlazador de polinucleótidos. En una realización, el enlazador de polinucleótidos forma un tallo de ARN (es decir, una región del polinucleótido de ARN que es de cadena doble).

Región efectora

En una realización, la región efectora comprende la secuencia del sitio de corte y empalme 5' ("5'ss") del intrón 3' (es decir, la secuencia intrónica del sitio de corte y empalme que está inmediatamente a 3' del exón alternativo). La región efectora comprende la secuencia de 5'ss del intrón 3' y la secuencia complementaria a la secuencia de 5'ss del intrón 3'. Cuando el aptámero se une a su ligando, la región efectora forma un tallo y de esta manera previene el corte y empalme al sitio de donador de corte y empalme en el extremo 3' del exón alternativo (véase, por ejemplo, la Fig. 4b). Bajo ciertas condiciones (por ejemplo, cuando el aptámero no está unido a su ligando), la región efectora está en un contexto que proporciona acceso al sitio de donador de corte y empalme en el extremo 3' del exón alternativo dando lugar a la inclusión del exón alternativo en el ARNm del gen diana (véase, por ejemplo, la Fig. 4a).

El fragmento de tallo de la región efectora deberá ser de una longitud (y contenido GC) suficiente para prevenir sustancialmente el corte y empalme alternativo del exón alternativo en el ligando que se une al aptámero, mientras da acceso también al sitio de corte y empalme cuando el ligando no está presente en cantidades suficientes. En las realizaciones de la invención, el fragmento de tallo de la región efectora comprende la secuencia de tallo además de la secuencia de 5'ss del intrón 3' y su secuencia complementaria. En las realizaciones de la invención, esta secuencia de tallo adicional comprende la secuencia del tallo de aptámero. La longitud y secuencia del fragmento de tallo puede modificarse usando técnicas conocidas con el fin de identificar tallos que permitan la expresión aceptable de referencia del gen diana cuando ningún ligando está presente y niveles aceptables de expresión del gen diana cuando el ligando está presente (véase, por ejemplo, Ejemplos 4 y 5 y Figs. 4c y 4d, 5a, 5b, 5c, 5d). Si el tallo es, por ejemplo, demasiado largo, puede ocultar el acceso a la secuencia de 5'ss del intrón 3' en presencia o ausencia del ligando. Si el tallo es demasiado corto, puede no formar un tallo estable capaz de aislar la secuencia de 5'ss del intrón 3', en cuyo caso el exón alternativo será empalmado en el mensaje del gen diana en presencia o ausencia del ligando. La longitud total del tallo de la región efectora está entre 7 pares de bases y 20 pares de bases. En algunas realizaciones, la longitud del tallo está entre 8 pares de bases y 11 pares de bases. En algunas realizaciones, la longitud del tallo es de 8 pares de bases a 11 pares de bases. Además de la longitud del tallo, el contenido de pares de bases G-C del tallo puede alterarse para modificar la estabilidad del tallo.

Aptámero/Ligando

El término "aptámero" como se usa en el presente documento se refiere a un polinucleótido de ARN que se une específicamente a un ligando. El término "ligando" se refiere a una molécula que es unida específicamente por el aptámero. En una realización, el ligando es una molécula de bajo peso molecular (menos de aproximadamente 1.000 Dalton) que incluye, por ejemplo, lípidos, monosacáridos, segundos mensajeros, otros productos y metabolitos naturales, ácidos nucleicos, así como la mayoría de fármacos terapéuticos. En una realización, el ligando es un polinucleótido con 2 o más bases de nucleótidos.

Los aptámeros tienen regiones de unión, las cuales son capaces de formar complejos con una molécula diana prevista (es decir, el ligando). La especificidad de la unión puede definirse en términos de las constantes de disociación (Kd) comparativas del aptámero para su ligando en comparación con la constante de disociación del aptámero para moléculas no relacionadas. De esta manera, el ligando es una molécula que se une al aptámero con mayor afinidad que al material no relacionado. Normalmente, la Kd para el aptámero con respecto a su ligando será al menos aproximadamente 10 veces menor que la Kd para el aptámero con moléculas no relacionadas. En otras realizaciones, la Kd será al menos aproximadamente 20 veces menor, al menos aproximadamente 50 veces menor, al menos aproximadamente 100 veces menor y al menos aproximadamente 200 veces menor. Un aptámero tendrá normalmente una longitud de entre 15 y 200 nucleótidos. Más comúnmente, un aptámero tendrá una longitud de entre 30 y 100 nucleótidos.

Los aptámeros que pueden incorporarse como parte del ribointerruptor pueden ser un aptámero de origen natural, o modificaciones del mismo, o aptámeros que son diseñados de novo o detectados sintéticamente a través de la evolución sistémica de ligandos mediante enriquecimiento exponencial (SELEX). Los ejemplos de aptámeros que se unen a ligandos de molécula pequeña incluyen, pero no se limitan a, teofilina, dopamina, sulforodamina B y celobiosakanamicina A, lividomicina, tobramicina, neomicina B, viomicina, cloranfenicol, estreptomicina, citocinas, moléculas de la superficie celular y metabolitos. Para una reseña de los aptámeros que reconocen las moléculas pequeñas, véase, por ejemplo, Famulok, Science 9:324-9 (1999) y McKeague, M. & DeRosa, M.C.J. Nuc. Aci. 2012. En otra realización, el aptámero es un polinucleótido complementario.

En una realización, el aptámero está diseñado para unirse a un ligando de molécula pequeña particular. Los métodos para diseñar aptámeros incluyen, por ejemplo, SELEX. Los métodos para diseñar aptámeros que se unen selectivamente a una molécula pequeña usando SELEX se desvelan en, por ejemplo, las patentes de EE.UU. N.° números 5.475.096, 5.270.163 y Abdullah Ozer, et al. Nuc. Aci. 2014. Las modificaciones del proceso de SELEX se describen en las patentes de e E.UU. N.° 5.580.737 y 5.567.588.

Las técnicas de selección para identificar aptámeros generalmente implican la preparación de un gran conjunto de moléculas de ADN o ARN de la longitud deseada que contienen una región que está aleatorizada o mutagenizada. Por ejemplo, un conjunto de oligonucleótidos para la selección de aptámeros podría contener una región de 20-100 nucleótidos aleatorizados flanqueados por regiones de secuencia definida que tienen una longitud de aproximadamente 15-25 nucleótidos y son útiles para la unión de los cebadores de PCR. El conjunto de oligonucleótidos se amplifica usando técnicas convencionales de PCR u otros medios que permitan la amplificación de secuencias seleccionadas de ácidos nucleicos. El conjunto de ADN puede transcribirse in vitro para producir un conjunto de transcritos de ARN donde se desea un aptámero de ARN. El conjunto de oligonucleótidos de ARN o ADN después se somete a una selección basada en su capacidad de unirse específicamente al ligando deseado. Las técnicas de selección incluyen, por ejemplo, cromatografía de afinidad, aunque puede usarse cualquier protocolo que permita la selección de ácidos nucleicos basada en su capacidad de unirse específicamente a otra molécula. Las técnicas de selección para identificar aptámeros que se unen a moléculas pequeñas y funcionan dentro de una célula pueden implicar métodos de detección basada en las células. En el caso de la cromatografía de afinidad, los oligonucleótidos se ponen en contacto con el ligando diana que ha sido inmovilizado sobre un sustrato en una columna o sobre perlas magnéticas. El oligonucleótido se selecciona preferentemente para la unión con el ligando en presencia de concentraciones de sal, temperaturas y otras condiciones que imiten las condiciones fisiológicas normales. Los oligonucleótidos en el conjunto que se unen al ligando son retenidos en la columna o perla y las secuencias que no se unen son retiradas. Los oligonucleótidos que se unen al ligando después se amplifican (después de la transcripción inversa, si se utilizaron transcritos de ARN) por PCR (habitualmente después de la elución). El proceso de selección se repite en las secuencias seleccionadas para un total de aproximadamente tres a diez ciclos iterativos del procedimiento de selección. Los oligonucleótidos resultantes después se amplifican, se clonan y se secuencian usando procedimientos convencionales para identificar las secuencias de los oligonucleótidos que son capaces de unirse al ligando diana. Una vez que se ha identificado una secuencia de aptámero, el aptámero puede optimizarse realizando ciclos adicionales de selección a partir de un conjunto de oligonucleótidos que contienen una secuencia mutagenizada de aptámero.

Puede usarse la detección in vivo de aptámero después de uno o más ciclos de selección in vitro (por ejemplo, SELEX). Por ejemplo, Konig, J. et al. (RNA. 2007, 13(4):614-622) describen la combinación de SELEX y un sistema de tres híbridos de levadura para la selección in vivo del aptámero.

El exón alternativo

El exón alternativo que es parte del casete de regulación génica de polinucleótidos de la presente invención puede ser cualquier secuencia de polinucleótidos capaz de ser transcrita a un pre-ARNm y alternativamente empalmada en el ARNm del gen diana. El exón alternativo que es parte del casete de regulación de genes de la presente invención contiene al menos una secuencia que inhibe la traducción de tal modo que cuando el exón alternativo está incluido en el ARNm del gen diana, la expresión del gen diana de ese ARNm se previene o se reduce. El exón alternativo contiene un codón de parada (TGA, TAA, TAG) que está en marco con el gen diana cuando el exón alternativo está incluido en el ARNm del gen diana por el corte y empalme. En las realizaciones, el exón alternativo comprende, además de un codón de parada, otra secuencia que reduce o sustancialmente previene la traducción cuando el exón alternativo se incorpora por el corte y empalme en el ARNm del gen diana incluyendo, por ejemplo, un sitio de unión de microARN, lo que conduce a la degradación del ARNm. En una realización, el exón alternativo comprende una secuencia de unión de miARN que da como resultado la degradación del ARNm. En una realización, el exón alternativo codifica una secuencia de polipéptidos la cual reduce la estabilidad de la proteína que contiene esta secuencia de polipéptidos. En una realización, el exón alternativo codifica una secuencia de polipéptidos la cual dirige la proteína que contiene esta secuencia de polipéptidos para la degradación.

El nivel basal o de referencia de corte y empalme del exón alternativo puede optimizarse alterando las secuencias de un potenciador exónico del corte y empalme (ESE) y las secuencias de un supresor exónico del corte y empalme (ESS) y/o introduciendo las secuencias de ESE o ESS en el exón alternativo. Estos cambios a la secuencia del exón alternativo pueden hacerse usando métodos conocidos en la técnica, incluyendo, pero no limitados a, la mutagénesis de sitio dirigido. De manera alternativa, los oligonucleótidos de una secuencia deseada (por ejemplo, que comprende todo o parte del exón alternativo) pueden obtenerse de fuentes comerciales y clonarse en el casete de regulación de genes. La identificación de las secuencias de ESS y ESE puede realizarse a través de métodos conocidos en la técnica, incluyendo, por ejemplo, el uso de ESEfinder 3.0 (Cartegni, L. et al. ESEfinder: a web resource to identify exonic splicing enhancers. Nucleic Acid Research, 2003, 31(13): 3568-3571) y/u otros recursos disponibles.

En una realización, el exón alternativo es exógeno al gen diana, aunque puede derivar de una secuencia que se origina del organismo donde el gen diana será expresado. En una realización, el exón alternativo es una secuencia sintética (véase el Ejemplo 10).

En una realización, el exón alternativo es un exón de origen natural (véase el Ejemplo 10). En otra realización, el exón alternativo deriva de todo o parte de un exón conocido (véase el Ejemplo 10). En este contexto, "deriva" se refiere al exón alternativo que contiene la secuencia que es sustancialmente homóloga a un exón de origen natural, o un fragmento del mismo, pero puede contener diversas mutaciones, por ejemplo, para introducir un codón de parada que estará en marco con la secuencia del gen diana, o para introducir o suprimir un potenciador exónico del corte y empalme y/o introducir o suprimir un supresor exónico del corte y empalme. En una realización, el exón alternativo deriva del exón 2 del gen de la dihidrofolato reductasa humana (DHFR), el exón 5 del tumor de Wilms 1 mutante de humano, el exón 16 de la proteína quinasa II delta dependiente de calcio-calmodulina de ratón, o el exón 6 de SIRT1.

Secuencias intrónicas 5' y 3'

El exón alternativo está flanqueado por las secuencias intrónicas 5' y 3'. Las secuencias intrónicas 5' y 3' que pueden usarse en el casete de regulación de genes de la presente invención puede ser cualquier secuencia que puede ser empalmada del gen diana que crea el ARNm del gen diana o el gen diana que contiene el exón alternativo en el ARNm, dependiendo de la presencia o ausencia de un ligando que se une al aptámero. Los intrones 5' y 3' tienen cada uno las secuencias necesarias para que se produzca el corte y empalme, es decir, las secuencias de donador de corte y empalme, aceptor de corte y empalme y ramificación. En una realización, las secuencias intrónicas 5' y 3' del casete de regulación de genes derivan de uno o más intrones de origen natural o de una porción. En una realización, las secuencias intrónicas 5' y 3' derivan de un intrón 2 de beta-globina humana truncada (IVS2A). En otras realizaciones, las secuencias intrónicas 5' y 3' derivan del intrón de ARNm de SV40 (usado en el vector pCMV-LacZ de Clonetech), el intrón 6 del gen de triosa fosfato isomerasa (TPI) humana (Nott Ajit, et al. RNA. 2003, 9:6070617), o un intrón del factor IX humano (Sumiko Kurachi et al. J. Bio. Chem. 1995, 270(10), 5276), el propio intrón endógeno del gen diana, o un fragmento genómico o intrones sintéticos (Yi Lai, et al. Hum Gene Ther. 2006:17(10):1036) que contienen elementos que son suficientes para el corte y empalme regulado (Thomas A Cooper, Methods 2005 (37):331).

En una realización, el exón alternativo y el ribointerruptor de la presente invención están diseñados para estar en un intrón endógeno de un gen diana. Es decir, el intrón (o la secuencia intrónica sustancialmente similar) se produce naturalmente en esa posición del gen diana. En este caso, la secuencia intrónica inmediatamente corriente arriba del exón alternativo se denomina el intrón 5' o la secuencia intrónica 5' y la secuencia intrónica inmediatamente corriente abajo del exón alternativo se denomina el intrón 3' o la secuencia intrónica 3'. En este caso, el intrón endógeno está modificado para contener una secuencia de aceptor de corte y empalme y una secuencia de donador de corte y empalme flanqueando los extremos 5' y 3' del exón alternativo.

Los sitios de donador de corte y empalme y aceptor de corte y empalme en el casete de regulación de genes de la presente invención pueden modificarse para ser fortalecidos o debilitados. Es decir, los sitios de corte y empalme pueden modificarse para estar más cerca del consenso para un donador o aceptor de corte y empalme a través de métodos de clonación estándar, la mutagénesis de sitio dirigido y similares. Los sitios de corte y empalme que son más similares al consenso de corte y empalme tienden a promover el corte y empalme y de esta manera son fortalecidos. Los sitios de corte y empalme que son menos similares al consenso de corte y empalme tienden a dificultar el corte y empalme y de esta manera son debilitados. El consenso para el donador de corte y empalme de la clase más común de intrones (U2) es A/C A G || G T A/G A G T (donde || denota el límite de exón/intrón). El consenso para el aceptor de corte y empalme es C A G || G (donde || denota el límite de exón/intrón). La frecuencia de nucleótidos específicos en los sitios de donador y aceptor de corte y empalme se describe en la técnica (véase, por ejemplo, Zhang, M.Q., Hum Mol Genet. 1988. 7(5):919-932). La fuerza de los sitios de corte y empalme 5' y 3' puede ajustarse para modular el corte y empalme del exón alternativo.

Pueden hacerse modificaciones adicionales a los intrones 5' y 3' en el casete de regulación de genes para modular el corte y empalme incluyendo modificar, suprimir y/o añadir elementos potenciadores intrónicos del corte y empalme y/o elementos supresores intrónicos del corte y empalme y/o modificar la secuencia del sitio de ramificación.

En una realización, el intrón 5' ha sido modificado para contener un codón de parada que estará en marco con el gen diana. Las secuencias intrónicas 5' y 3' también pueden estar modificadas para retirar los sitios de corte y empalme críptico, los cuales pueden identificarse con software disponible al público (véase, por ejemplo, Kapustin, Y. et al. Nucl. Acids Res. 2011. 1-8). Las longitudes de las secuencias intrónicas 5' y 3' pueden ajustarse, por ejemplo, para reunir los requisitos de tamaño para las construcciones de expresión víricas. En una realización, las secuencias intrónicas 5' y 3' tienen independientemente una longitud de aproximadamente 50 a aproximadamente 300 nucleótidos. En una realización, las secuencias intrónicas 5' y 3' tienen independientemente una longitud de aproximadamente 125 a aproximadamente 240 nucleótidos.

Genes diana

El casete de regulación de genes de la presente invención es una plataforma que puede usarse para regular la expresión de un gen diana que puede expresarse en una célula, tejido u organismo diana. La expresión "gen diana" se refiere a un polinucleótido que se introduce en una célula y es capaz de transcribirse en el ARN y traducirse y/o expresarse bajo condiciones apropiadas. De manera alternativa, el gen diana es endógeno a la célula diana y el casete de regulación de genes de la presente invención está posicionado en el gen diana (por ejemplo, en un intrón existente del gen diana endógeno). Un ejemplo de un gen diana es un polinucleótido que codifica un polipéptido terapéutico. En una realización, cuando el gen diana se expresa usando el casete de regulación de genes de la presente invención, el gen diana no se expresa como una proteína de fusión que comprende el exón alternativo. La inclusión del exón alternativo minimiza la traducción del ARNm, por ejemplo, causando la degradación del mensaje que contiene el exón alternativo, o de otra manera previene la expresión de un gen diana funcional debido, por ejemplo, a su truncamiento prematuro. En una realización, el gen diana es exógeno a la célula en la cual la construcción del ADN recombinante debe transcribirse. En otra realización, el gen diana es endógeno a la célula en la cual la construcción del ADN recombinante debe transcribirse. El exón alternativo, en una realización, puede contener un codón de parada en marco con la secuencia de codificación del gen diana. En otras realizaciones, el exón alternativo puede contener otras secuencias que promueven la degradación de transcritos y/o la traducción de bloques del gen diana.

El gen diana de acuerdo con la presente invención puede ser un gen que codifica una proteína, o una secuencia que codifica un ARN no codificante de proteínas. El gen diana puede ser, por ejemplo, un gen que codifica una proteína estructural, una enzima, una proteína de señalización celular, una proteína mitocondrial, una proteína de dedos de zinc, una hormona, una proteína de transporte, un factor de crecimiento, una citocina, una proteína intracelular, una proteína extracelular, una proteína transmembrana, una proteína citoplásmica, una proteína nuclear, una molécula receptora, una proteína de unión de ARN, una proteína de unión de ADN, un factor de transcripción, maquinaria de traducción, una proteína de canal, una proteína motora, una molécula de adhesión celular, una proteína mitocondrial, una enzima metabólica, una quinasa, una fosfatasa, factores de intercambio, una proteína chaperona y moduladores de cualquiera de los anteriores. En las realizaciones, el gen diana codifica la eritropoyetina (Epo), la hormona de crecimiento humana (hGH), nucleasas efectoras tipo activador de transcripción (TALEN), insulina humana, proteína 9 asociada a CRISPR (cas9), o una inmunoglobulina (o parte de la misma), incluyendo, por ejemplo, un anticuerpo terapéutico.

Construcciones de Expresión

La presente invención contempla el uso de un vector recombinante para la introducción a las células diana de un polinucleótido que codifica un gen diana y contiene el casete de regulación de genes de la presente invención. En muchas realizaciones, la construcción de ADN recombinante de esta invención incluye elementos de ADN adicionales incluyendo segmentos de ADN que tienen prevista la replicación del ADN en una célula huésped y la expresión del gen diana en esa célula en los niveles apropiados. Las personas con experiencia ordinaria entienden que las secuencias de control de expresión (promotores, potenciadores y semejantes) se seleccionan basadas en su capacidad de promover la expresión del gen diana en la célula diana. "Vector" significa un plásmido recombinante, cromosoma artificial de levadura (YAC), mini cromosoma, mini-círculo o virus de ADN (incluyendo secuencias derivadas de virus) que comprende un polinucleótido que se entregará a una célula huésped, ya sea in vitro o in vivo. En una realización, el vector recombinante es un vector vírico o una combinación de múltiples vectores víricos.

Los vectores víricos para la expresión de un gen diana en una célula, tejido, u organismo diana son conocidos en la técnica e incluyen vectores adenovíricos (AV), vectores víricos adenoasociados (AAV), vectores retrovíricos y lentivíricos y vectores del virus del herpes simple tipo 1 (HSV1).

Los vectores adenovíricos incluyen, por ejemplo, aquellos basados en el adenovirus humano tipo 2 y adenovirus humano tipo 5 que se han hecho defectuosos en replicación a través de las supresiones en las regiones E1 y E3. El casete de transcripción puede insertarse en la región E1, produciendo un vector AV recombinante con supresión de E1/E3. Los vectores adenovíricos también incluyen vectores adenovíricos de alta capacidad dependientes de ayudantes (también conocidos como vectores "sin tripas" o "destripados" de alta capacidad), los cuales no contienen secuencias de codificación víricas. Estos vectores contienen los elementos que actúan en cis necesarios para la replicación y empaquetamiento de ADN vírico, principalmente las secuencias de repeticiones terminales invertidas (ITR) y la señal de empaquetamiento (^). Estos genomas de vectores AV dependientes de ayudantes tienen el potencial de llevar desde varios cientos de pares de bases hasta aproximadamente 36 kb de ADN extraño.

Los vectores de virus adenoasociado recombinante "rAAV" incluyen cualquier vector derivado de un serotipo de virus adenoasociado, incluyendo, sin limitación, AAV-1, AAV-2, AAV-3, AAV-4, AAV-5, AAV-7 y AAV-8, AAV-9, AAV-10 y similares. Los vectores de rAAV pueden tener uno o más de los genes de tipo natural de virus adenoasociado suprimidos en forma total o parcial, preferentemente los genes Rep y/o Cap, pero retienen secuencias funcionales flanqueantes de ITR. Las secuencias funcionales de ITR son retenidas para el rescate, la replicación, el empaquetamiento y la posible integración cromosómica del genoma del virus adenoasociado. Las ITR no necesitan ser las secuencias de nucleótidos de tipo natural y pueden alterarse (por ejemplo, mediante la inserción, supresión o sustitución de nucleótidos) siempre y cuando las secuencias tengan previsto el rescate, la replicación y el empaquetamiento funcionales.

De manera alternativa, pueden usarse otros sistemas como los vectores lentivíricos en las realizaciones de la invención. Los sistemas de lentivirus pueden transducir células que no se dividen, así como células que se dividen, haciéndolas útiles para aplicaciones que se dirigen a, por ejemplo, las células que no se dividen del sistema nervioso central. Los vectores lentivíricos derivan del virus de inmunodeficiencia humana y, como ese virus, se integran al genoma del huésped previendo el potencial de la expresión génica de muy largo plazo.

Pueden introducirse también polinucleótidos, incluyendo plásmidos, YAC, minicromosomas y mini-círculos, llevando el gen diana que contiene el casete de regulación de genes a una célula u organismo, a través de sistemas de vectores no víricos usando, por ejemplo, lípidos catiónicos, polímeros, o ambos como vehículos. También pueden usarse sistemas conjugados de polímero poli-L-lisina (PLL) y polímero polietilenimina (PEI) para entregar el vector a las células. Otros métodos para entregar el vector a las células incluyen la inyección hidrodinámica y la electroporación y el uso de ultrasonido, tanto para cultivo de células, como para organismos. Para una reseña de los sistemas de entrega víricos y no víricos para la entrega de genes, véase Nayerossadat, N. et al. (Adv Biomed Res. 2012; 1:27).

Métodos de Modulación de la Expresión de un Gen Diana

En un aspecto, esta invención proporciona un método in vitro así como un casete de polinucleótido para su uso en terapia génica mediante un método para modular la expresión de un gen diana (por ejemplo, un gen terapéutico), (a) insertando el casete de regulación de genes de la presente invención en un gen diana; (b) introduciendo el gen diana que contiene el casete de regulación de genes a una célula; y (c) exponiendo la célula a un ligando que se une al aptámero. En una realización, el ligando es una molécula pequeña. En los aspectos, la expresión del gen diana en las células diana proporciona una propiedad deseada a una célula a la cual se introdujo, o de otra manera conduce a un resultado final terapéutico deseado.

En una realización preferida, el casete de regulación de genes se inserta en la secuencia codificante de proteínas del gen diana (en vez de las regiones 5' o 3' no traducidas). En una realización, un solo casete de regulación de genes se inserta en el gen diana. En otras realizaciones, 2, 3, 4, o más casetes de regulación de genes se insertan en el gen diana. En una realización, dos casetes de regulación de genes se insertan en el gen diana. Cuando múltiples casetes de regulación de genes se insertan en un gen diana, pueden contener cada uno el mismo aptámero de tal modo que un solo ligando pueda usarse para modular el corte y empalme alternativo en los múltiples casetes y así modular la expresión del gen diana. En otras realizaciones, múltiples casetes de regulación de genes se insertan en un gen diana, cada uno puede contener un aptámero diferente de manera que la exposición a múltiples ligandos de molécula pequeña diferentes, module la expresión del gen diana. En otras realizaciones, múltiples casetes de regulación de genes se insertan en un gen diana, cada uno conteniendo diferentes secuencias de intrón 5', exón alternativo y 3' intrón. Esto puede ser útil para reducir la recombinación y mejorar la facilidad de incorporación a los vectores víricos.

Usos médicos y Composiciones Farmacéuticas

Un aspecto de la invención proporciona un método para regular el nivel de una proteína terapéutica entregada mediante la terapia génica como se define en la reivindicación 3 o la reivindicación 8. En esta realización, el "gen diana" puede codificar la proteína terapéutica. El "gen diana" puede codificar una proteína que es endógena o exógena a la célula.

La secuencia de gen terapéutico que contiene el casete regulador con el ribointerruptor motivado por aptámero se entrega a las células diana en el cuerpo, por ejemplo, por un vector. La especificidad celular del "gen diana" puede controlarse por el promotor u otros elementos dentro del vector. La entrega de la construcción de vector que contiene el gen diana y la transfección de los tejidos diana, dando como resultado la transfección estable del gen diana regulado, es la primera etapa en la producción de la proteína terapéutica.

Sin embargo, debido a la presencia del casete regulador dentro de la secuencia del gen diana, el gen diana no se expresa en niveles significativos, es decir, está en el "estado desactivado" en la ausencia del ligando específico que se une al aptámero contenido dentro del casete regulador, el ribointerruptor. Solo cuando se administra el ligando específico al aptámero, se activa la expresión del gen diana.

La entrega de la construcción de vector que contiene el gen diana y la entrega del ligando activador generalmente están separadas en el tiempo. La entrega del ligando activador controlará cuándo se expresa el gen diana, así como el nivel de expresión de proteínas. El ligando puede ser entregado por varios mutantes incluyendo, entre otros, orales, intramusculares (IM), intravenosos (IV), intraoculares, o tópicos.

El tiempo de entrega del ligando dependerá del requisito de activación del gen diana. Por ejemplo, si la proteína terapéutica codificada por el gen diana se requiere constantemente, puede entregarse un ligando de molécula pequeña oral diariamente, o múltiples veces al día, para garantizar la activación continua del gen diana y, por lo tanto, la expresión continua de la proteína terapéutica. Si el gen diana tiene un efecto de acción prolongada, el ligando inductor puede ser dosificado con menos frecuencia.

Esta invención permite que la expresión del transgén terapéutico sea controlada temporalmente, de una manera determinada por la dosificación temporal del ligando específico para el aptámero dentro del casete regulador. La expresión del transgén terapéutico solo en la administración del ligando, aumenta la seguridad de un tratamiento con terapia génica permitiendo que el gen diana esté desactivado en ausencia del ligando.

Pueden usarse diferentes aptámeros para permitir que diferentes ligandos activen los genes diana. En ciertas realizaciones de la invención, cada gen terapéutico que contiene un casete regulador tendrá un aptámero específico dentro del casete que será activado por una molécula pequeña específica. Esto significa que cada gen terapéutico puede activarse solo por el ligando específico para el aptámero alojado dentro de ese gen. En estas realizaciones, cada ligando solo activará un gen terapéutico. Esto tiene en cuenta la posibilidad de que varios "genes diana" diferentes pueden ser entregados a un individuo y cada uno será activado en la entrega del ligando específico para el aptámero contenido dentro del casete regulador alojado en cada gen diana.

Esta invención permite que cualquier proteína terapéutica cuyo gen pueda entregarse al cuerpo (como la eritropoyetina (EPO) o un anticuerpo terapéutico) sea producida por el cuerpo cuando el ligando activador sea entregado. Este método de entrega de proteína terapéutica puede reemplazar la fabricación de las proteínas terapéuticas fuera del cuerpo las cuales son después inyectadas o infundidas, por ejemplo, anticuerpos usados en cáncer o para bloquear una enfermedad inflamatoria o autoinmunitaria. El cuerpo que contiene el gen diana regulado se convierte en la fábrica de elaboración de productos biológicos, la cual está encendida cuando se administra el ligando específico del gen.

Los niveles y tiempos de dosificación de una proteína terapéutica pueden ser críticos para el efecto terapéutico. Por ejemplo, en la entrega de AVASTIN® (anticuerpo anti-VEGF) para el cáncer. La presente invención aumenta la facilidad de la dosificación en respuesta al monitoreo de los niveles de la proteína terapéutica y sus efectos.

En una realización, la proteína diana puede ser una nucleasa que puede dirigirse a una secuencia de ADN específica y editarla. Dichas nucleasas incluyen Cas9, nucleasas que contienen dedos de zinc, o TALEN. En el caso de estas nucleasas, la proteína nucleasa puede requerirse solo por un periodo de tiempo corto que sea suficiente para editar los genes diana endógenos. Sin embargo, si un gen de la nucleasa no regulado se entrega al cuerpo, esta proteína puede estar presente por el resto de la vida de la célula. En el caso de las nucleasas, existe un riesgo cada vez mayor de edición inespecífica mientras más tiempo la nucleasa está presente. La regulación de la expresión de estas proteínas tiene una ventaja de seguridad significativa. En este caso, el vector que contiene el gen diana de la nucleasa que contiene un casete regulador podría ser entregado a las células apropiadas en el cuerpo. El gen diana está en el estado de "desactivado" en la ausencia del ligando específico del casete, de modo que no se produce la nucleasa. Solo cuando se administra el ligando activador, la nucleasa se produce. Cuando ha transcurrido suficiente tiempo dejando que se produzca suficiente edición, el ligando será retirado y no será administrado otra vez. De esta manera, el gen de la nucleasa está en lo sucesivo en el estado de "desactivado" y no se produce más nucleasa y se detiene la edición. Este método puede usarse para corregir las condiciones genéticas, incluyendo varias retinopatías heredadas como LCA10 causada por mutaciones en CEP290 y la enfermedad de Stargardt causada por mutaciones en ABCA4.

La administración de un gen diana regulado que codifica una proteína terapéutica la cual es activada solo en la administración del ligando específico puede usarse para regular genes terapéuticos para tratar muchos tipos diferentes de enfermedades, por ejemplo, cáncer con anticuerpos terapéuticos, trastornos inmunitarios con proteínas o anticuerpos moduladores de la respuesta inmunitaria, enfermedades metabólicas, enfermedades raras como PNH con anticuerpos anti-C5 o fragmentos de anticuerpos como el gen regulado, o angiogénesis ocular con anticuerpos terapéuticos y degeneración macular seca relacionada con la edad con proteínas moduladoras de la respuesta inmunitaria.

Una amplia diversidad de genes diana específicos, permitiendo el tratamiento de una amplia diversidad de enfermedades y afecciones específicas, es adecuada para uso en la presente invención. Por ejemplo, la insulina o un análogo de insulina (preferentemente, la insulina humana o un análogo de insulina humana) pueden usarse como el gen diana para tratar la diabetes tipo I, la diabetes tipo II, o el síndrome metabólico; la hormona de crecimiento humana puede usarse como el gen diana para tratar niños con trastornos de crecimiento o adultos con deficiencia de la hormona de crecimiento; la eritropoyetina (preferentemente, la eritropoyetina humana) puede usarse como el gen diana para tratar la anemia debida a insuficiencia renal crónica, anemia debida a mielodisplasia, o anemia debida a la quimioterapia para el cáncer.

La presente invención puede ser especialmente adecuada para tratar enfermedades provocadas por defectos en un solo gen tales como la fibrosis quística, hemofilia, distrofia muscular, talasemia, o anemia falciforme. De esta manera, la p-, y-, 6-, o Z-globina humana puede usarse como el gen diana para tratar la p-talasemia o la anemia falciforme; el Factor VIII o Factor IX humano puede usarse como el gen diana para tratar la hemofilia A o la hemofilia B.

Los ligandos usados en la presente invención se combinan generalmente con uno o más vehículos farmacéuticamente aceptables para formar composiciones farmacéuticas adecuadas para la administración a un paciente. Los vehículos farmacéuticamente aceptables incluyen disolventes, aglutinantes, diluyentes, disgregantes, lubricantes, medios de dispersión, recubrimientos, agentes antibacterianos y antifúngicos, agentes isotónicos y retardadores de la absorción y similares, generalmente usados en la industria farmacéutica. Las composiciones farmacéuticas pueden estar en forma de comprimidos, pastillas, cápsulas, trociscos y semejantes y se formulan para ser compatibles con su vía de administración prevista. Los ejemplos de vías de administración incluyen parenteral, por ejemplo, intravenosa, intradérmica, intranasal, subcutánea, oral, inhalación, transdérmica (tópica), transmucosa y rectal.

Las composiciones farmacéuticas que comprenden ligandos se administran a un paciente en un calendario de dosificación tal que una cantidad de ligando suficiente para regular convenientemente el gen diana sea entregada al paciente. Cuando el ligando es una molécula pequeña y la forma de dosificación es un comprimido, píldora, o similares, preferentemente, la composición farmacéutica contiene de 0,1 mg a 10 g de ligando; de 0,5 mg a 5 g de ligando; de 1 mg a 1 g de ligando; de 2 mg a 750 mg de ligando; de 5 mg a 500 mg de ligando; o de 10 mg a 250 mg de ligando.

Las composiciones farmacéuticas pueden dosificarse una vez al día o múltiples veces al día (por ejemplo, 2, 3, 4, 5, o más veces al día). De manera alternativa, las composiciones farmacéuticas pueden dosificarse con menos frecuencia que una vez al día, por ejemplo, una vez cada 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, o 14 días, o una vez al mes o una vez cada varios meses. En algunas realizaciones de la divulgación, las composiciones farmacéuticas pueden administrarse a un paciente solo un escaso número de veces, por ejemplo, una vez, dos veces, tres veces, etc.

La presente invención se refiere a un uso médico para tratar a un paciente que necesita la expresión aumentada de una proteína terapéutica codificada por un gen diana, comprendiendo el método administrar al paciente una composición farmacéutica que contiene un ligando para un aptámero, donde el paciente previamente había recibido un ADN recombinante que comprende el gen diana, donde el gen diana contiene un casete de regulación de genes de la presente invención que proporciona la capacidad de regular la expresión del gen diana por el ligando del aptámero mediante el corte y empalme alternativo de pre-ARNm del gen diana, aumentando así la expresión de la proteína terapéutica.

Artículos de Fabricación y Kits

También se proporcionan kits o artículos de fabricación para uso en los métodos descritos en el presente documento. En los aspectos, los kits comprenden las composiciones descritas en el presente documento (por ejemplo, para composiciones para la entrega de un vector que comprende el gen diana que contiene el casete de regulación de genes) en envases adecuados. Los envases adecuados para las composiciones (como las composiciones oculares para inyección) descritas en el presente documento se conocen en la técnica e incluyen, por ejemplo, viales (tales como viales sellados), recipientes, ampolletas, botellas, frascos, embalaje flexible (por ejemplo, bolsas Mylar o de plástico selladas) y similares. Estos artículos de fabricación pueden además esterilizarse y/o sellarse.

También se describen en el presente documento kits que comprenden las composiciones descritas en el presente documento y además puede incluir las instrucciones sobre los métodos para usar la composición, como los usos descritos en el presente documento. Los kits descritos en el presente documento pueden incluir además otros materiales convenientes desde el punto de vista comercial y del usuario, incluyendo otros tampones, diluyentes, filtros, agujas, jeringas y prospectos con instrucciones para realizar la administración, incluyendo, por ejemplo, cualquier método descrito en el presente documento. Por ejemplo, el kit comprende rAAV para la expresión del gen diana comprendiendo el casete de regulación de genes de la presente invención, un vehículo farmacéuticamente aceptable adecuado para inyección y uno o más de: un tampón, un diluyente, un filtro, una aguja, una jeringa y un prospecto con instrucciones para realizar las inyecciones. El kit puede ser adecuado para inyección intraocular, inyección intramuscular, inyección intravenosa y similares.

"Homología" y "homólogo" como se usan en el presente documento se refieren al porcentaje de identidad entre dos secuencias de polinucleótidos o entre dos secuencias de polipéptidos. La correspondencia entre una secuencia a otra puede determinarse mediante procedimientos conocidos en la técnica. Por ejemplo, la homología puede determinarse mediante una comparación directa de dos moléculas de polipéptido alineando la información de secuencia y usando programas de computación fácilmente disponibles. De manera alternativa, la homología puede determinarse mediante la hibridación de polinucleótidos bajo condiciones que forman dúplex estables entre las regiones homólogas, seguida por la digestión con nucleasa o nucleasas específicas de cadena sencilla y la determinación de tamaño de los fragmentos digeridos. Dos secuencias de polinucleótidos o dos secuencias de polipéptidos son "sustancialmente homólogas" entre sí cuando, después de alinearse de manera óptima con inserciones o supresiones apropiadas, al menos aproximadamente el 80 %, al menos aproximadamente el 85 %, al menos aproximadamente el 90 % y al menos aproximadamente el 95 % de los nucleótidos o aminoácidos, respectivamente, coinciden sobre una longitud definida de las moléculas, según lo determinado con el uso de los métodos anteriores.

El "porcentaje de identidad de secuencia" con respecto a una secuencia de polipéptido o ácido nucleico de referencia se define como el porcentaje de restos de aminoácidos o nucleótidos en una secuencia candidata que son idénticos con los restos de aminoácidos o nucleótidos en la secuencia de polipéptido o ácido nucleico de referencia, después de alinear las secuencias e introducir huecos, si es necesario, para lograr el porcentaje máximo de identidad de secuencia. La alineación con el propósito de determinar el porcentaje de identidad de secuencia de aminoácidos o ácido nucleico puede lograrse en formas conocidas para las personas con experiencia ordinaria, por ejemplo, usando programas de software de ordenador disponibles al público, incluyendo el software BLAST, BLAST-2, ALIGN o Megalign (DNASTAR).

El término "polinucleótido" o "ácido nucleico" como se usa en el presente documento se refiere a una forma polimérica de nucleótidos de cualquier longitud, ya sea ribonucleótidos o desoxirribonucleótidos. Por lo tanto, este término incluye, entre otros, ADN o ARN de cadena sencilla, doble o múltiple, ADN genómico, ADNc, híbridos de ADN-ARN, o un polímero conteniendo bases de purina y pirimidina, u otras bases de nucleótidos naturales, química o bioquímicamente modificados, no naturales, o derivados.

"Heterólogo" o "exógeno" significa derivado de una entidad genotípicamente distinta al derivado del resto de la entidad con la cual se compara o a la cual se introduce o se incorpora. Por ejemplo, un polinucleótido introducido mediante técnicas de ingeniería genética a un tipo de célula diferente es un polinucleótido heterólogo (y, cuando se expresa, puede codificar un polipéptido heterólogo). Del mismo modo, una secuencia celular (por ejemplo, un gen o un fragmento del mismo) que se incorpora a un vector vírico es una secuencia de nucleótido heterólogo con respecto al vector.

EJEMPLOS

EJEMPLO 1. Efectos de la fuerza del sitio de corte y empalme en la expresión de los genes regulados

Procedimientos experimentales

Construcciones de plásmidos: Luci-BsaI-aceptor: Se liberó un fragmento de ADN que contiene un promotor de CMV del vector de pHAGE-CMV-eGFP-W (Universidad de Harvard) mediante las enzimas de restricción SpeI y NotI y este fragmento se clonó en el vector de pHDM-G (Universidad de Harvard) digerido con SpeI y NotI. Se suprimió un fragmento que contiene la secuencia de SV40 Ori en el vector resultante digiriendo con BsmI y BstXI, retirando el 3' sobresaliendo y ligando. El vector subsecuente se sometió a la mutagénesis de sitio dirigido (Agilent) para suprimir el sitio BsaI en el gen AmpR. El vector resultante se digirió después con NotI y BamHI y se ligó con un fragmento que contiene los sitios NotI-BsaI-BamHI para generar el vector final de Luci-BsaI-aceptor. Se usó pHDM-G como plantilla para el intrón 2 de beta-globina humana ("IVS2A") conteniendo una supresión de la parte media considerada no crucial para el corte y empalme (véase la Tabla 5, SEQ ID NO.: 1). Se usó pGL3-promotor (Promega) como plantilla para el gen de la luciferasa de luciérnaga. Construcción 8: El gen de la luciferasa se amplificó mediante la reacción en cadena de la polimerasa usando los cebadores Luc-For-BsaI y Luci-Rev-BsaI. Los productos de la reacción en cadena de la polimerasa se digirieron con BsaI y se clonaron en el vector de Luci-BsaI-aceptor digerido con BsaI. Las construcciones de corte y empalme 1-7 (Con 1-7, SEQ ID NOS.: 1-7) expresando el gen de la luciferasa insertado con el intrón de IVS2A que tiene diferentes 5'ss y 3'ss en cada extremo de la secuencia intrónica se hicieron ligando 3 productos de la reacción en cadena de la polimerasa digeridos con BsaI al vector de Luci-BsaI-aceptor digerido con BsaI. Se usó el vector de pGL3-promotor como la plantilla de luciferasa y se usó pHDM-G como la plantilla para IVS2A. Los pares de cebadores usados para amplificar los fragmentos de la reacción en cadena de la polimerasa para Con 1-7 son como sigue: Con 1: Luci-For-BsaI/Luci-Splice-Rev_l, IVS2-BsaI-For/IVS2-BsaI-Rev_l y Luci-Splice-For_1/Luci-Rev-BsaI; Con 2: Luci-For-BsaI/Luci-Splice-Rev_2, IVS2-BsaI-For/IVS2-BsaI-Rev_2 y Luci-Splice-For_2/Luci-Rev-BsaI; Con 3: Luci-For-BsaI/Luci-Splice-Rev_3, IVS2-BsaI-For/IVS2-BsaI-Rev_3 y Luci-Splice-For_3/Luci-Rev-BsaI; Con 4: Luci-For-BsaI/Luci-Splice-Rev_4, IVS2-BsaI-For/IVS2-BsaI-Rev_1 y Luci-Splice-For_4/Luci-Rev-BsaI; Con 5: Luci-For-BsaI/Luci-Splice-Rev_l, IVS2-BsaI-For/IVS2-BsaI-Rev_l y Luci-Splice-For_5/Luci-Rev-BsaI; Con 6: Luci-For-BsaI/Luci-Splice-Rev_l, IVS2-BsaI-For/IVS2-BsaI-Rev_l y Luci-Splice-For61/Luci-Rev-BsaI; Con 7: Luci-For-BsaI/Luci-Splice-Rev_l, IVS2-BsaI-For/IVS2-BsaI-Rev_1 y Luci-Splice-For71/Luci-Rev-BsaI. Todas las construcciones se verificaron con secuenciación del ADN.

Tabla 1. Sitios de corte y empalme de las construcciones de corte y empalme (Con 1-7). Los límites de intrón/exón están marcados con ||.

(continuación)

Transfección: El día antes de la transfección, se pusieron 3,5 x10A4 células HEK 293 en una placa de fondo plano de 96 pocillos. Se añadió ADN plasmídico (500 ng) a un tubo o una placa de fondo en U de 96 pocillos. Por separado, se añadió el reactivo TransIT-293 (Mirus; 1,4 ul) a 50 |jl del medio Opti-mem I (Life Technologies) y se dejó reposar durante 5 minutos a temperatura ambiente (TA). Después, se añadieron 50 ul de este reactivo de transfección diluido al ADN, se mezclaron y se incubaron a temperatura ambiente ("TA") durante 20 minutos. Por último, se añadieron 7 j l de esta solución a un pocillo de células en la placa de 96 pocillos.

Ensayo con luciferasa de luciérnaga de células cultivadas: 24 horas después de cambiar el medio, se sacaron las placas de la incubadora y se equilibraron a TA durante varios minutos en una mesa de laboratorio, después se aspiraron. Se añadió Glo-Lysis Buffer (Promega, 100 jl, TA) y se permitió que las placas permanecieran a TA durante al menos 5 minutos. Después, el contenido del pocillo se mezcló mediante la trituración de 50 j l y se mezclaron 20 j l de cada muestra con 20 j l de reactivo Bright-Glo (Promega) que había sido diluido a 10 % en Glo-Lysis Buffer. Se espaciaron 96 pocillos en una placa blanca opaca de 384 pocillos. Después de una incubación de 5 min a TA, se midió la luminiscencia usando el equipo Tecan con tiempo de lectura de 500 ms. La actividad de la luciferasa se expresó como la unidad de luz relativa (RLU) promedio ± S.D.

Resultados

Con el fin de crear una plataforma de regulación génica basada en el corte y empalme, los presentes inventores primero probaron (i) el efecto de insertar un intrón en la secuencia codificante (CDS) de un gen de interés, en este caso, el gen de la luciferasa de luciérnaga (Fig. 1a) y (ii) los efectos de 5'ss y 3'ss diferentes en la expresión génica. El intrón 2 de beta-globina humana truncada (IVS2A) con 5'ss y 3'ss diferentes en cada extremo se insertó en la secuencia codificante del gen de la luciferasa de luciérnaga para probar la eficiencia del corte y empalme. La construcción Con 8 no tiene intrón de IVS2A y Con 1 (SEQ ID No.: 1) tiene IVS2A con sus secuencias originales de 5'ss y 3'ss de IVS2. Las construcciones Con 2 a Con 7 (SEQ ID No.: 2-7) tienen IVS2A con secuencias de 5'ss y 3'ss diferentes como se lista en la Tabla 1. Como se muestra en la Fig. 1b, la inserción de IVS2A con sitios de corte y empalme nativos de IVS2 en el gen de la luciferasa no afectó la expresión génica (compare Con 1 con Con 8). Sin embargo, el reemplazo de los sitios de corte y empalme de IVS2 en IVS2A con secuencias de sitios de corte y empalme teniendo diferente fuerza afectó significativamente la expresión de la luciferasa. Como se muestra en la Fig. 1b, Con 2 y Con 3 con 5'ss alterados tienen niveles de expresión similar a Con 1 y Con 8, sin embargo, los cambios de 5'ss en Con 4 y los cambios de 3'ss en Con 5 a Con 7, redujeron significativamente la expresión de la luciferasa (compare Con 4 con Con 7 con Con 8). Por lo tanto, las diferencias en los sitios de corte y empalme afectan la expresión del gen diana. Con 1 se usó para desarrollo adicional.

EJEMPLO 2. Un casete de intrón-exón-intrón y el efecto de los elementos en cis en el corte y empalme en la modulación de la expresión del gen diana.

Procedimientos experimentales

Se predijeron secuencias putativas de un potenciador exónico del corte y empalme (ESE) usando ESEfinder 3.0. El exón 2 de dihidrofolato reductasa (DHFR) humana de tipo natural con secuencias intrónicas flanqueantes, ya sea con 5'ss nativo (DHFR-wt; (Tabla 2); SEQ iD NO.: 47), 5'ss nativo con cuatro nucleótidos mutado a C (DHFR-wt5ssC; (Tabla 2); SEQ ID NO.: 48), secuencias de 5'ss de Con 1 (DHFR-Con15ss; (Tabla 2); SEQ ID NO.: 49) o Con 4 (DHFR-Con45ss, SEQ ID NO.: 50) se sintetizaron (IDT). Para probar el efecto de las secuencias del potenciador exónico del corte y empalme y el supresor exónico del corte y empalme dentro del exón 2 de DHFR, se sintetizaron diferentes mutantes de exón 2 de DHFR (enlistados en la Tabla 2).

Todas estas secuencias diferentes de exón 2 de DHFR se clonaron en el centro aproximado del intrón de IVS2A en la construcción Con 1 usando la técnica de clonación "Golden Gate" (NEB).

Las construcciones se verificaron mediante la secuenciación del ADN (Genewiz). El ADN se transfectó en las células HEK 293 y se analizó para la actividad de la luciferasa como se describe en el Ejemplo 1.

Tabla 2. Exón 2 de DHFR que contiene secuencias reguladoras de corte y empalme modificadas. La secuencia subrayada indica las secuencias reguladoras del corte y empalme modificadas dentro del exón 2 de DHFR.

Resultados

El exón 2 de DHFR humano de tipo natural y las secuencias intrónicas adyacentes (SEQ ID NO.: 8) se insertaron en el centro aproximado del intrón de IVS2A en la construcción Con 1. Esta configuración genera una plataforma en la cual un exón exógeno en la secuencia intrónica de un gen diana puede servir como un exón alternativo permitiendo que la expresión del gen diana sea regulada a través de la modulación del corte y empalme alternativo del exón. En esta configuración (Fig. 2a), los eventos de corte y empalme supuestamente se producen entre la porción de 5' del gen diana y el exón de DHFR, así como entre el exón de DHFR y la porción de 3' del gen diana, dando como resultado la inclusión del exón de DHFR en el ARNm del gen diana. Cuando el exón alternativo de DHFR contiene un codón de parada prematuro en marco, el exón de DHFR se incluye en el ARNm, reduciendo así la expresión génica de la luciferasa. Sin embargo, cuando el 5'ss del exón alternativo de DHFR (es decir, el sitio de donador de corte y empalme en el extremo 5' del intrón 3') se muta o es inaccesible impidiendo el corte y empalme en este sitio, el exón de DHFR es excluido del ARNm y el ARNm se traduce eficientemente y la proteína del gen diana se expresa (Fig. 2a).

Los presentes inventores primero probaron el corte y empalme del exón 2 de DHFR con sus elementos nativos en cis sin variaciones, así como otras versiones diferentes en donde las secuencias de 5'ss estaban fortalecidas o debilitadas. La inserción del exón de DHFR con 5'ss y 3'ss nativos (SEQ ID NO.: 8) en la secuencia intrónica en Con 1 para crear DHFR_wt, disminuyó significativamente la expresión de la luciferasa en comparación con Con 1 la cual no contiene ningún exón alternativo de DHFR. La expresión de la construcción de DHFR_wt es 116 veces más baja que Con 1 (Fig. 2b).

Cuando el 5'ss del exón de DHFR se muta a una secuencia no funcional (DHFR_wt5ssC; SEQ ID NO.: 48), la inclusión del exón de DHFR se bloquea y la expresión de la luciferasa se restaura al nivel de Con 1 (Fig. 2aII, 2b, 2c).

Cuando el 5'ss del exón de DHFR es reemplazado con el 5'ss más fuerte, en este caso, el 5'ss de Con 1 (DHFR_Con1 5ss; SEQ ID NO.: 49), la inclusión del exón de DHFR es aumentada, dando lugar a una disminución de 545 veces en la expresión génica de la luciferasa en comparación con Con 1 (Fig. 2b). Sin embargo, cuando se usó el 5'ss débil de Con 4 (DHFR_Con45ss; SEQ ID NO.: 50), el exón de DHFR no se incluye y la expresión de la luciferasa es aumentada (Fig. 2b).

Los elementos potenciadores (ESE) o supresores (ESS) exónicos del corte y empalme desempeñan roles cruciales en el corte y empalme y sus funciones suelen depender del contexto. Se probó el efecto de las secuencias putativas reguladoras del corte y empalme situadas dentro del exón de DHFR. Cuando en una secuencia putativa del potenciador del corte y empalme, el sitio de unión de SRp40 situado dentro del exón de DHFR se mutó (Tabla 2, DHFR_mtSRp40; SEQ ID NO.: 51), la inclusión del exón de DHFR se potenció dramáticamente, dando como resultado una disminución de 2982 veces en la expresión de la luciferasa en comparación con Con 1 (Fig. 2c, DHFR_wt y DHFR mtSRp40).

Cuando en otro potenciador de corte y empalme, el sitio de unión de SC35 dentro del exón de DHFR (pronosticado por ESEfinder) se mutó a una secuencia de unión de SC35 más fuerte (Tabla 2, DHFR_StrSC35; SEQ iD NO.: 52), la inclusión del exón de DHFR se potenció, disminuyendo la expresión de la luciferasa 139 veces en comparación con Con 1 (Fig. 2c, DHFR_wtStrSC35). Esta es una disminución ligeramente más grande que la observada con la construcción que contiene el exón nativo de DHFR (DHFR_wt, Fig. 2b).

Cuando en el potenciador de corte y empalme, el sitio de unión de SC35 se mutó a un inhibidor de corte y empalme (sitio de unión de hnRNP A1) (Tabla 2, DHFR_wtSC35hnRNPA1; SEQ ID NO.: 53), la inclusión del exón de Dh Fr fue menos eficiente dando lugar a la expresión aumentada de la luciferasa (Fig. 2c, DHFR_wt y DHFR_wtSC35hnRNPA1).

Se ha creado un casete de intrón-exón-intrón en donde la expresión del gen diana, en este caso, la luciferasa, se puede activar o desactivar dependiendo de la inclusión o exclusión de un exón alternativo, en este caso, el exón alternativo de DHFR que contiene un codón de parada en marco. El corte y empalme que da como resultado la inclusión del exón alternativo reduce la expresión génica, mientras que la expresión génica aumenta cuando el corte y empalme excluye el exón alternativo. La fuerza o debilidad del 5'ss del exón alternativo, así como las secuencias dentro del exón que modulan el corte y empalme alteran el nivel de expresión de objetivo por medio de su impacto en la inclusión o exclusión del exón exógeno.

EJEMPLO 3. Los efectos de la formación de horquilla en el sitio de corte y empalme 5' del exón alternativo en la regulación de la expresión del gen diana.

Procedimientos experimentales

Las secuencias que contienen el exón 2 de DHFR con secuencias de 3'ss y 5'ss nativos, en donde el 5'ss se integró en una estructura de horquilla, se sintetizaron (IDT) y se clonaron en el vector indicado usando la técnica de clonación "Golden Gate" (NEB). Las construcciones se transfectaron en las células HEK 293 y se analizaron para la actividad de la luciferasa como se describe en el Ejemplo 1.

Resultados

Los presentes inventores probaron si la integración del 5'ss del exón de DHFR a una estructura de tallo de horquilla podría afectar el corte y empalme y la inclusión del exón alternativo de DHFR y de esta manera alterar la expresión del gen diana (se ilustra en la Fig. 3a).

La inclusión del exón alternativo de DHFR con las secuencias del sitio de corte y empalme 5' de Con 1 (DHFR_Con15ss; SEQ ID NO.: 49) suprime la expresión de la luciferasa en comparación con Con 1 (Fig. 3c, DHFR_Con15ss). Una estructura de horquilla de 15 pares de bases integrando la secuencia completa del 5'ss se diseñó en DHFR_Con 15ss para crear DHFR_Con 15ss_HP15 (SEQ ID NO.: 54) (Fig. 3a). La presencia de la estructura de horquilla de 15 pb restaura completamente la expresión de la luciferasa al nivel de Con 1, indicando que la horquilla ha suprimido la accesibilidad del 5'ss y por lo tanto suprimió la inclusión del exón alternativo de DHFr . (Fig. 3c, Con 1, DHFR_Con15ss y DHFR_Con15ss_HP15).

En contraste, una horquilla de 15 pb con un "tallo roto" (Fig. 3b, Con15ss_15HPx; SEQ ID NO.: 55) no pudo restaurar la expresión de la luciferasa (Fig. 3c, DHFR_Con15ss_HP15x), indicando que el tallo intacto es un componente importante de la estructura secundaria del ARN en la regulación de la accesibilidad del sitio de corte y empalme 5' y determinando así la inclusión o exclusión del exón alternativo.

Se llevaron a cabo los mismos experimentos usando la construcción que contiene el exón de DHFR con el sitio de unión de SRp40 mutante que ha aumentado la eficiencia del corte y empalme (DHFR_wtmtSRp40, véase el Ejemplo 2). La integración del 5'ss en una horquilla restauró la expresión de la luciferasa, considerando que la rotura de la horquilla bloqueó la expresión de la luciferasa (Fig. 3c, DHFR_wtmtSRp40, DHFR_wtmtSRp40 _HP15 y DHFR_wtmtSRp40_HP15x).

De esta manera, la integración del 5'ss de un exón alternativo en una estructura de horquilla puede restaurar la expresión del gen diana bloqueando la accesibilidad de ese 5'ss y previniendo así la inclusión del exón alternativo en el ARNm y permitiendo la expresión de la proteína del gen diana. Se creó una plataforma de expresión génica en la cual la expresión de la proteína del gen diana puede ser modulada alterando la disponibilidad del 5'ss de un exón exógeno alternativo a través de la estructura secundaria del ARN.

La construcción DHFR_wtmtSRp40 (SEQ ID NO.: 58) (citado más adelante como "mtDHFR") se usó para el desarrollo adicional del ribointerruptor.

EJEMPLO 4. Uso de un aptámero de teofilina para regular la expresión del gen diana por medio del corte y empalme alternativo.

Procedimientos experimentales

Se construyó un vector de DHFR-aceptor para facilitar la clonación de una secuencia de aptámero unida a los tallos de horquilla con diferente longitud. La secuencia de aptámero de teofilina que se usó fue: ggcgatacCAGCCGAAAGGCCCTTGgcagcgtc (SEQ ID NO: 9). Los oligonucleótidos del aptámero de teofilina ("oligos") con 4 nucleótidos sobresaliendo en el extremo 5' se sintetizaron (IDT), se templaron y se ligaron al vector de DHFR-aceptor digerido con BsaI. Se transfectaron células HEK 293 con las construcciones de indicador de luciferasa con el casete de regulación que contiene el aptámero de teofilina, como se describe en el Ejemplo 1. Cuatro horas después de la transfección, se aspiró el medio y se añadió un nuevo medio con o sin 3 mM de teofilina y se analizó la luciferasa 20 a 24 horas después del tratamiento con la teofilina. El factor multiplicador de la inducción se expresó como el cociente de la actividad de la luciferasa obtenido en presencia del complejo de aptámero-ligando dividido entre el valor obtenido en la ausencia del complejo de aptámero-ligando. El nivel de la actividad de la luciferasa se expresó como el porcentaje de nivel de la actividad de la luciferasa (citada como la expresión máxima) producido por la construcción Con 1 que no tiene el intrón de IVS2A en la secuencia de codificación del gen de la luciferasa.

Resultados

Con el fin de regular la accesibilidad del sitio de corte y empalme 5' del exón alternativo que contiene el codón de parada y de este modo regular la expresión de la proteína del gen diana, las secuencias de aptámero se unieron al tallo de una estructura de horquilla que integra la porción intrónica del 5'ss de DHFR y su secuencia complementaria. En esta configuración, la inserción de secuencias de aptámero interrumpe la formación del tallo de la horquilla, dejando accesible el 5'ss de DHFR, provocando así la inclusión del exón alternativo de DHFR y previniendo la expresión de la proteína del gen diana (Fig. 4a). Cuando se produce la unión de aptámero/ligando, como se describe en la Fig. 4b, el cambio conformacional en el aptámero desencadenado por la unión del ligando reúne el 5'ss de DHFR y su secuencia complementaria para la formación estable del tallo, ocultando de esta manera el 5'ss de DHFR y dando como resultado la exclusión del exón de DHFR y la expresión de la proteína del gen diana.

Se probó un aptámero de teofilina vinculando el tallo inferior del aptámero de teofilina directamente al tallo de la horquilla (Fig. 4c, DHFR_Theo1). Si el tallo es demasiado largo, puede formar una estructura estable en la ausencia de la unión de aptámero/ligando, mientras que, si es demasiado corto, nunca podrá formar un tallo estable, aún cuando el ligando está presente. Por lo tanto, necesita optimizarse la longitud del tallo de modo que se forme una estructura secundaria estable solamente en la unión de aptámero/ligando. Para determinar la longitud óptima del tallo que permita la formación del tallo en presencia, pero no en la ausencia del ligando, se hicieron varias construcciones en donde el aptámero de teofilina se clonó en mtDHFR (se describe en el Ejemplo 2, Tabla 2) y se realizaron truncamientos seriales del tallo. La Fig. 4c muestra cuatro construcciones de este truncamiento serial.

La Fig. 4d muestra la expresión de la luciferasa de esta serie de supresión de construcciones en presencia y ausencia de la teofilina. En las construcciones Theo 1 a Theo 12 con longitudes de tallo de 20 a 9 pb, la longitud del tallo fue suficiente para formar una estructura secundaria estable incluso en la ausencia de la unión aptámero-ligando. De esta manera, la expresión de la luciferasa se observa en niveles similares a Con 1 tanto en la ausencia, como en la presencia de la teofilina.

Con la construcción DHFR_Theo13, la expresión de la luciferasa es suprimida en la ausencia de la teofilina. Esto indica la disponibilidad del 5'ss de exón de mtDHFR, dando lugar a la inclusión del exón alternativo de DHFR y la supresión de la expresión génica. Sin embargo, en presencia de la teofilina, la expresión de la luciferasa se activó, dando como resultado una inducción de 43 veces por encima del nivel de expresión sin teofilina y aproximadamente el 56 % del nivel de luciferasa expresado por el vector de control de Con 1. Por lo tanto, se generó un ribointerruptor de activación de mamífero, el cual activa la expresión de la proteína del gen diana en presencia del complejo de aptámero-ligando, la teofilina.

EJEMPLO 5. Uso de aptámero de xpt-guanina para regular la expresión del gen diana por medio del corte y empalme alternativo.

Procedimientos experimentales

El aptámero de xpt-guanina con la siguiente secuencia: cactcatataatCGCGTGGATATGGCACGCAAGTTTCTACCGGGCACCGTAAATGTCcgactatgggtg (SEQ ID NO.: 10), se usó para construir un ribointerruptor. Los oligos que contienen la secuencia de aptámero de guanina y el tallo de la horquilla con 4 nucleótidos 5' sobresaliendo se sintetizaron (IDT), se templaron y después se ligaron al vector de DHFR-aceptor digerido con BsaI. Se transfectaron las células HEK 293 como se describe en el Ejemplo 1. Cuatro horas después de la transfección, se aspiró el medio y se añadió un nuevo medio con o sin 500 pM de guanina. Se analizó la expresión de la luciferasa 20 a 24 horas después del tratamiento con la guanina como se describe en el Ejemplo 1 y Ejemplo 4. Se cultivaron las líneas celulares HepG2, AML12, RD and C2C12 (ATCC) usando el protocolo recomendado por ATCC. El casete de intrón-exón-intrón que contiene el ribointerruptor de xpt-G17 (SEQ ID NO.: 15) se insertó en las secuencias de péptido líder del gen del anticuerpo anti-KDR y en el sitio de Stul en el gen de eritropoyetina de ratón usando la técnica de clonación "Gibson" (NEB). Las construcciones que contienen eritropoyetina de ratón (Epo) o anticuerpo anti-KDR se transfectaron en las células HEK 293. Cuatro horas después de la transfección, se aspiró el medio y se añadió un medio nuevo con o sin 500 pM de guanina. Los sobrenadantes se sometieron a la técnica ELISA para la producción del anticuerpo anti-KDR o la producción de Epo de ratón (R&D Systems).

Resultados

El uso de complejos de aptámero/ligandos adicionales para controlar la expresión del gen diana a través de la modulación mediada por un aptámero del corte y empalme alternativo se estudió uniendo un aptámero de xpt-guanina, derivado de Bacillus subtilis, a través del tallo P1 al tallo de la horquilla (Figura 5a, DHFR_G1). Similar al Ejemplo 4, se hicieron 18 construcciones mediante el truncamiento serial del tallo de conexión (Figura 5a y 5b; DHFR-G1 hasta G18, citadas también como casetes reguladores que contienen xpt-G1 hasta G18) para obtener la longitud óptima del tallo de la horquilla en relación con el aptámero de guanina, permitiendo así la comunicación de la unión de aptámero/ligando a la accesibilidad de 5'ss y el corte y empalme exónico. Como se muestra en la Fig. 5b, con las construcciones DHFR-G1 hasta G13, con longitudes de tallo de 24 a 12 pares de bases, la expresión de la luciferasa no es afectada por la inserción del exón alternativo de DHFR y el aptámero de xpt-guanina en presencia o ausencia del complejo de aptámero-ligando, la guanina. Esto sugiere que la longitud del tallo es suficiente para formar una estructura estable tanto en la ausencia, como en la presencia del ligando, previniendo la inclusión del exón alternativo en el ARNm. Sin embargo, en las construcciones DHFR_G14 hasta DHFR_G18, la expresión de la luciferasa se suprimió en la ausencia de la guanina añadida. Cuando se añadió pM de guanina, se indujo la expresión de la luciferasa de estas construcciones (Fig. 5b).

Otra validación rigurosa de las construcciones G11 hasta G18 mostró otra vez la regulación clara de la expresión de la luciferasa en el tratamiento con la guanina (Fig. 5c). La construcción DHFR_G17 que contiene xpt-G17 (SEQ ID NO.: 15) (Fig. 5a) proporcionó una inducción de la expresión de 2000 veces, dando como resultado aproximadamente el 65 % del nivel de luciferasa expresada por Con 1 (citada como la expresión máxima). Este alto intervalo dinámico de inducción resultó de la activación de la expresión de un nivel básico muy bajo no inducido en la ausencia del ligando. La construcción DHFR_G16 (Fig. 5a) proporcionó una inducción de aproximadamente de 800 veces por encima de la expresión básica no inducida a un nivel que era el 83 % de la expresión máxima (Fig. 5c y 5d). Además, las construcciones DHFR_G14 y G15 mostraron casi el 100 % de la expresión máxima con un factor multiplicador de la inducción más bajo debido a la expresión básica no inducida más alta de la luciferasa.

Para probar la funcionalidad y aplicabilidad en general del ribointerruptor sintético en el casete intrón-exón-intrón, los presentes inventores transfectaron la construcción que contiene xpt-G17 (DHFR_G17) en múltiples líneas celulares humanas y de ratón. En estas diferentes líneas celulares, el tratamiento con la guanina generó una inducción significativa de la expresión génica, una inducción de más de 500 veces en las células HepG2, con factor multiplicador de la inducción más bajo en otras líneas celulares (Fig. 5e). El factor multiplicador de la inducción distinto en líneas celulares diferentes puede reflejar diferencias en la eficiencia de la transfección, así como en el perfil de expresión del regulador de corte y empalme específico del tipo de célula. Además, el gen de la luciferasa con el casete regulador que contiene el ribointerruptor de xpt-G17 (DHFR_G17) produjo un nivel of inducción similar cuando se transfirió a un esqueleto del vector vírico adenoasociado (Figura 5f), indicando que el gen que regula el efecto no depende del esqueleto del vector.

Además de regular el gen de la luciferasa, el casete regulador que contiene xpt-G17 también se probó en la regulación de las proteínas secretadas, el anticuerpo anti-KDR y la eritropoyetina (Epo). El casete regulador que contiene xpt-G17 se insertó en la secuencia de codificación del anticuerpo anti-KDR y de la eritropoyetina. Como se muestra en la Figura 5g y 5h, el tratamiento con la guanina produjo una inducción de 80 veces en la producción del anticuerpo anti-KDR y una inducción de 140 veces en la producción de Epo, en comparación con la producción de cada molécula de las células en la ausencia del ligando.

Estos resultados demuestran la funcionalidad y aplicabilidad en general en la regulación de la expresión de proteínas de un posible gen diana terapéutico, así como la aplicación de este casete de regulación de genes en la entrega de genes mediada por el virus adenoasociado. Por lo tanto, los presentes inventores han creado un ribointerruptor de activación sintético de mamífero que es capaz de activar la expresión de la proteína del gen diana en respuesta a la presencia de un ligando específico del aptámero en células de mamífero.

EJEMPLO 6. Pueden usarse diferentes aptámeros de purina para regular la expresión del gen diana por medio del corte y empalme alternativo.

Procedimientos experimentales

Las siguientes secuencias de aptámero, listadas en la Tabla 3, se usaron para crear ribointerruptores:

Tabla 3:

Resultados

Para probar aptámeros adicionales en el presente sistema de regulación de genes, los presentes inventores usaron la misma estrategia y el método que se describen en los ejemplos anteriores para generar múltiples ribointerruptores receptivos a la guanina y adenina vinculando diferentes aptámeros de guanina y adenina al casete de intrón-mtDHFR-intrón (Fig. 6a). Los ribointerruptores receptivos a la guanina que se probaron regularon eficientemente la expresión del gen de la luciferasa en respuesta a la guanina (Fig. 6b). Además, los presentes inventores descubrieron que estos ribointerruptores receptivos a la guanina regularon la expresión del gen diana en respuesta no solo a la guanina (Figura 6b), sino también a la guanosina (Fig. 6c) y 2'desoxiguanosina (2'dG) (Fig. 6d).

Se generaron varios ribointerruptores de adenina (Fig. 6a) y mostraron funcionalidad de la regulación de genes (Fig. 6e).

Las diferencias en la regulación de la expresión génica para las diferentes construcciones probadas que contienen aptámero podrían reflejar diferencias en la afinidad de la unión de aptámero/ligando y la estructura secundaria de aptámero que puede afectar la accesibilidad de 5'ss, la inclusión del exón alternativo y, por lo tanto, la expresión del gen diana. El casete de intrón-exón-intrón de regulación de genes puede optimizarse cambiando las secuencias de aptámero para lograr el nivel deseado de regulación génica.

EJEMPLO 7. El estado activado/desactivado de la expresión del gen diana regulada por un ribointerruptor de mamífero receptivo a la guanina.

Procedimientos experimentales

El casete de intrón-mtDHFR-aptámero-intrón se amplificó mediante la reacción en cadena de la polimerasa y se clonó usando la técnica de clonación "Golden Gate" (NEB) en el vector de pEGFP-C1. Para obtener una línea celular que exprese establemente la EGFP con el ribointerruptor, las células HEK-293 fueron electroporadas con 20 ng de ADN plasmídico. Cuarentaiocho horas después de la electroporación, se seleccionó el cultivo de células con 800 pg/ml de G418 durante 2 semanas para células que expresaran establemente el casete. Las células fueron tripsinizadas y la suspensión de células se sometió al análisis de citometría de flujo de la intensidad de la fluorescencia de la GFP usando el equipo Guava EasyCyte 8HT. Los datos resultantes se analizaron usando el software GuavaSoft2.2.2.

Resultados

Para demostrar además que la expresión de un gen diana que contiene el presente casete regulador de intrón-exónintrón puede ser regulada por la exposición al ligando específico al aptámero contenido dentro del ribointerruptor, el casete de intrón-mtDHFR-intrón que contiene el ribointerruptor de xpt-G17 (SEQ ID NO.: 15) se insertó en el gen de la EGFP y transfectó establemente las células HEK 293. En presencia de guanina, la expresión de la EGFP se activó (Fig. 7a). La fluorescencia se detectó tan pronto como 6 horas después del tratamiento con la guanina y aumentó durante 3 días de tratamiento con la guanina, llegando casi a la inducción de 300 veces en comparación con las células no tratadas (Fig. 7b), indicando el estado de "activada" de la expresión del gen diana en presencia del complejo de aptámero-ligando. Cuando se retiró la guanina del medio de cultivo celular, la expresión de la EGFP disminuyó, indicando el estado de "desactivada" de la expresión del gen diana en la ausencia del ligando específico del aptámero (Fig. 7b). Por lo tanto, hemos creado una plataforma de regulación de genes, compuesta de un casete de intrón-exónintrón que contiene un ribointerruptor sintético, a través del cual la expresión de un gen diana es regulada, en células de mamífero, por la presencia o ausencia de un complejo específico de aptámero-ligando.

EJEMPLO 8. Efectos de múltiples casetes de regulación en la regulación de la expresión del gen diana.

Procedimientos experimentales

Se hicieron construcciones usando la técnica de clonación "Golden Gate" (NEB). Las células HEK 293 se transfectaron con las construcciones indicadas, tratadas con 500 pM de guanina o 1 mM de guanosina (Sigma) 4 horas después de la transfección. Se analizó la actividad de la luciferasa como se describe en el Ejemplo 5.

Resultados

La construcción con el casete regulador que contiene xpt-G15 (SEQ ID NO.: 46) (DHFR_G15; Ejemplo 5) mostró una inducción de la expresión de la luciferasa de 60 veces en respuesta al tratamiento con la guanina, en comparación con el nivel de expresión básica no inducida y llegó a casi el 100 % del nivel de la luciferasa expresada por Con 1 (Fig. 8a). Esta es una característica útil cuando se regula una proteína terapéutica que se requiere a niveles altos.

En contraste, la construcción con el casete regulador que contiene xpt-G17 (DHFR_G17) tuvo un factor multiplicador de la inducción significativamente más alto de 2181 veces, debido a la expresión básica no inducida más baja, pero un nivel máximo considerablemente más bajo de la expresión en la inducción en comparación con Con 1 (Fig. 8a).

Para probar si dos copias del casete regulador que contiene xpt-G15 (xpt- G15 doble; SEQ ID NO.: 64) podrían reducir los niveles básicos de la expresión, sin comprometer el nivel máximo de la expresión de la luciferasa en la inducción, se integraron dos copias del casete regulador que contiene xpt-G15 al gen de la luciferasa, cada copia en una ubicación diferente en la secuencia de genes. Cuando dos copias del casete regulador que contiene xpt-G15 estaban presentes, la expresión básica no inducida disminuyó dando como resultado un factor multiplicador de la inducción significativamente más alto (de 60 a 1008 veces), sin comprometer el nivel máximo de la expresión (Figura 8a).

La EC50 de la guanina para el casete de xpt-G15 doble (xpt-G15 doble; SEQ ID NO.: 64) fue 5 veces más baja que la EC50 de la guanina para la construcción que contiene una sola copia del casete más riguroso que contiene xpt-G17 (43 pM frente a 206 pM), aumentando así la sensibilidad de la respuesta al ligando (Fig. 8a).

La estrategia de usar dos copias de un casete regulador menos riguroso para incrementar el factor multiplicador de la inducción y la expresión génica máxima inducida, también se aplicó al gen de la EGFP. Como se muestra en la Fig. 8b y 8c, consistente con los resultados para la regulación de la luciferasa (Fig. 8a), una sola copia del casete regulador de xpt-G15 en el gen de la EGFP (EGFP-xpt-G15) generó un nivel básico no inducido más alto de la expresión de la EGFP cuando se comparó con la construcción que contiene el casete regulador de xpt- G17 (EGFP-xpt-G17). Sin embargo, cuando dos copias del casete de regulación de xpt-G15 se insertaron en el gen de la EGFP en diferentes ubicaciones (EGFP-xpt-G15 doble), el nivel básico no inducido de la expresión disminuyó al nivel de EGFP-xpt-G17 con el nivel inducido de la EGFP incluso más alto que el control Con1-EGFP (Fig. 8c).

Además, una copia del casete regulador que contiene xpt-G17 y una copia de un casete regulador que contiene un ribointerruptor de Ydhl-A5 adenina se integró al gen de la luciferasa. La expresión de la luciferasa fue inducida por la adición de adenina (25 veces) o la adición de guanina (120 veces) sola, sin embargo, se logró un nivel de inducción significativamente más alto (hasta 2966 veces) con el uso combinado de adenina y guanina en cada una de sus concentraciones más altas usadas (Fig. 8d). Estos resultados demuestran la modularidad de los ribointerruptores basados en el corte y empalme alternativo en la regulación de la expresión del gen diana.

Con el fin de reducir la recombinación y aumentar la facilidad de producción de vectores víricos que contengan dos o más casetes reguladores, los casetes reguladores con secuencias de intrones y exones diferentes pueden usarse en un solo gen diana y pueden contener los mismos aptámeros receptivos al ligando o diferentes.

EJEMPLO 9. Efectos de tamaño y secuencia de intrones en la regulación de la expresión del gen diana a través de la modulación mediada por un aptámero del corte y empalme alternativo.

Procedimientos experimentales

La construcción Con 1 se usó como una plantilla para la amplificación por la reacción en cadena de la polimerasa de fragmentos intrónicos que tienen supresiones de intrones corriente arriba o corriente abajo. Para generar construcciones que tengan supresiones sencillas de intrones, los productos de la RCP se clonaron en las construcciones que contienen el ribointerruptor de xpt-G17 usando la técnica de clonación "Golden Gate" (NEB). Para generar construcciones con supresiones de intrones tanto corriente arriba, como corriente abajo, los fragmentos liberados por EcoRI y BamHI de las construcciones con supresiones sencillas en la secuencia intrónica corriente abajo se clonaron en las construcciones digeridas con EcoRI y BamHI con supresiones sencillas en la secuencia intrónica corriente arriba.

Resultados

Los intrones contienen elementos que pueden promover (potenciador intrónico del corte y empalme, ISE) o suprimir (supresor intrónico del corte y empalme, ISS) el corte y empalme de exones. Entre todos los ribointerruptores que hemos generado, xpt-G17 demostró la mejor capacidad reguladora en términos tanto del factor multiplicador de la inducción, como del nivel de la expresión génica inducida. Usando el ribointerruptor de xpt-G17 en el casete de intrónexón-intrón, los presentes inventores hicieron una serie de modificaciones en las secuencias intrónicas y la longitud de los intrones y en los sitios de corte y empalme para optimizar más el sistema.

Primero, se probó el efecto de la modificación de intrones introduciendo supresiones sencillas en secuencias intrónicas ya sea corriente arriba o corriente abajo del exón de mtDHFR (Figura 9a, 9b). Se generaron 16 construcciones con el ribointerruptor que contiene xpt-G17; xpt-G17-IR-1 hasta xpt-G17-IR-16 (las secuencias de 13 de estas construcciones se proporcionan en la Tabla 5, SEQ ID NOS.: 16-28). Después, las supresiones de intrones corriente arriba y corriente abajo se combinaron para generar supresiones de intrones más grandes, como se representa en la Figura 9c. Como se muestra en la Fig. 9d y 9e, de las 16 construcciones hechas con dos supresiones de intrones (2IR), las construcciones 2IR-1 hasta 2IR-10 (SEQ ID NOS.: 29-38) mostraron factores multiplicadores de la inducción significativamente más altos, sin comprometer el nivel de expresión inducida de la luciferasa, con 2IR-3 teniendo la mejora más grande en el factor multiplicador de la inducción (4744 veces). Además, también hicimos construcciones con un 3'ss mutado corriente arriba del exón de mtDHFR y también redujimos el tamaño del intrón corriente abajo. Como se muestra en las Figuras 9d y 9e (construcciones DHFR_3ssC_1 a 5), estas modificaciones mejoraron más el factor multiplicador relativo de la inducción, sin embargo, en este caso, se observó una reducción en el nivel de la expresión inducida (del 64 % al 32 % para 3ssC_3).

Estos resultados indican que la capacidad de regulación de genes del casete de intrón-exón-aptámero-intrón puede optimizarse a través de la modificación de las secuencias intrónicas que flanquean el exón alternativo con el fin de lograr el nivel deseado de regulación génica.

EJEMPLO 10. El uso de múltiples exones naturales, así como exones sintéticos en el casete de regulación de genes.

Procedimientos experimentales

Las secuencias de exón 5 del tumor de Wilms 1 mutante de humano (mutWT1-e5, SEQ ID NO.: 61), exón 6 de SIRT1 (SIRT1-e6, SEQ ID NO.: 62), exón 16 o 17 de la proteína quinasa II delta dependiente de calcio-calmodulina de ratón, (Camk2d-e16 o e17, SEQ ID NOS.: 59, 60) y exón sintético ENEEE (Se Q ID NO.: 63) se sintetizaron (IDT) y se clonaron en el vector de DHFR-G17 en lugar del exón de DHFR usando la técnica de clonación Gibson (NEB). El ADN plasmídico se transfectó en células HEK 293, se trató con 500 pM de guanina y se realizó el análisis de la luciferasa como se describe en el Ejemplo 1. Las secuencias de cada exón con los sitios de corte y empalme 5' y 3' se muestran con las secuencias exónicas en letras mayúsculas (Tabla 5, SEQ ID NOS.: 59 a 63).

Resultados

Con el fin de determinar que la función de regulación del presente casete de intrón-exón-aptámero-intrón no está limitada a una secuencia exónica específica, los presentes inventores reemplazaron el exón de mtDHFR en la construcción que contiene el ribointerruptor de guanina de xpt-G17 (DHFR-xpt-G17), con múltiples exones naturales y mutantes diferentes, así como exones sintéticos que contienen secuencias conocidas del potenciador exónico del corte y empalme (ESE). Como se muestra en la Figura 10, el casete de regulación con el exón de CamkIId-e16 genera el factor multiplicador de la inducción casi equivalente comparado con DHFR-xpt-G17, pero con un nivel más bajo de la expresión de la luciferasa tanto básica, como inducida. Los casetes que contienen otros exones también mostraron niveles variables de la expresión de la luciferasa tanto básica, como inducida. De esta manera, el casete de regulación de genes a través de la modulación mediada por un aptámero del corte y empalme alternativo no es específico de los exones y no está limitado al exón de mDHFR-e2.

Los exones que pueden generar eventos eficientes de corte y empalme alternativo son adecuados para el casete de regulación de genes a través de la modulación mediada por un aptámero. Estos resultados indican además que la capacidad de regulación de genes de este casete de intrón-exón-aptámero-intrón puede optimizarse modificando las secuencias en el exón alternativo, así como las secuencias intrónicas circundantes, por ejemplo, la fuerza del corte y empalme de las secuencias de 5'ss y 3'ss del exón alternativo, así como las secuencias de potenciador exónico del corte y empalme y supresor exónico del corte y empalme en el exón alternativo como se describe en el presente documento.

EJEMPLO 11. Regulación de la expresión del gen diana a través de la modulación mediada por un aptámero del corte y empalme alternativo in vivo en ratones.

Procedimientos experimentales

Entrega hidrodinámica de ADN y tratamiento farmacológico: Se inyectaron 5 pg o 10 pg de ADN plasmídico libre de endotoxinas que contiene el gen de la luciferasa con dos copias del casete regulador que contiene xpt-G15 (xpt-G15 doble, SEQ ID NO.: 64; Ejemplo 8, Fig. 8a), diluidos en solución salina (kit Qiagen Endofree) a través de la vena de la cola en un volumen de 10 % del peso corporal durante 5 a 10 segundos a ratones CD-1 del sexo femenino de 6-7 semanas de edad. La guanosina (Sigma) se suspendió en 0,5 % de metilcelulosa/0,25 % de Tween 80 (Sigma) en agua fresca y se administró oralmente a las 2 h y 12 h después de la inyección del ADN, o, se entregó a través de la inyección intraperitoneal (IP) a las 5 h, 12 h, 16 h y 24 h después de la entrega del ADN.

Imágenes bioluminiscentes no invasivas de animal vivo: Antes de reproducir las imágenes, los ratones fueron anestesiados con isoflurano al 2 % y se les inyectó 150 gm/kg de peso corporal de luciferina y se tomaron las imágenes dentro de 2 a 5 minutos después de la inyección de luciferina usando el equipo Bruker Xtreme en el tiempo indicado después de la inyección del ADN. La actividad de la luciferasa se expresó como fotón medio/s ± s.d. El factor multiplicador de la inducción se calculó como el cociente de fotón/s obtenido en ratones tratados con guanosina dividido entre el valor obtenido en ratones sin tratamiento con la guanosina.

Resultados

Valoramos la función de regulación de genes del casete regulador intrón-exón-intrón en ratones, in vivo. El ADN plasmídico libre de endotoxinas de una construcción que contiene dos copias del ribointerruptor de xpt-G15 en el gen de la luciferasa (xpt-G15 doble) se entregó al hígado de los ratones a través de la inyección hidrodinámica y la guanosina se administró vía intraperitoneal. Probamos dos vías de entrega de la guanosina. En un experimento (Fig. 11a y 11b), se administraron oralmente a los ratones diferentes dosis de guanosina a las 2 y 12 horas después de la entrega del ADNA, después se reprodujeron las imágenes. Como se muestra en la Fig. 11a, los ratones tratados con guanosina mostraron una expresión más alta de la luciferasa a las 9 horas después del ADN. La expresión de la luciferasa en los ratones tratados con guanosina aumentó con el tiempo llegando al nivel más alto a las 48 horas después de la inyección de ADN, después de lo cual la expresión disminuyó.

En un experimento separado (Fig. 11c y Fig. 11 d), se administró guanosina vía intraperitoneal. A las 4 horas después de la inyección de ADN y antes del tratamiento con la guanosina, los ratones en cada grupo mostraron un nivel similar de actividad básica de la luciferasa (Figura 11). Después, los ratones fueron tratados con el vehículo como control, o guanosina. A las 11 horas después de la inyección, la actividad de la luciferasa aumentó en todos los ratones, consistente con el informe de que la expresión génica de la luciferasa alcanza su nivel más alto 12 horas después de la inyección hidrodinámica de ADN en el hígado. Sin embargo, en los ratones tratados con guanosina, existe un nivel de expresión de la luciferasa significativamente más alto comparado con el nivel en los ratones no tratados y se observó una inducción de 4,7 veces y 16,2 veces en comparación con la expresión básica no inducida con 100 mg/kg y 300 mg/kg de guanosina, respectivamente.

Por lo tanto, se mostró que el casete de regulación de genes basado en el corte y empalme regula la expresión génica in vivo en los animales, de una manera dependiente de la dosis, en respuesta a la administración del ligando específico para el aptámero contenido dentro del casete regulador.

EJEMPLO 12. Entrega de construcciones de ribointerruptor a la retina murina por medio de vectores víricos adenoasociados (AAV).

Procedimientos experimentales

Construcciones de plásmidos víricos adenoasociados: Se adaptaron dos construcciones de expresión de ribointerruptor (descritas en la siguiente tabla) por medio de la clonación molecular en un formato capaz de ser empaquetado como un genoma de AAV. _ , , „

Tabla 4.

Las construcciones de expresión basadas aproximadamente del transgén de la EGFP (GTX 5 - 7) se digirieron con las enzimas de restricción MfeI y NheI liberando un fragmento de ADN de ~1400 pares de bases que contiene el elemento inducible por riborregulaor y el transgén de la EGFP. El genoma de un plásmido vírico adenoasociado de pD10 también se digirió con MfeI y NheI, liberando un fragmento de 4,475 pares de bases que contiene las repeticiones terminales invertidas del virus adenoasociado, el promotor de CMV y la señal de poliadenilación de SV40. Los dos fragmentos se ligaron usando ADN ligasa T4 dando como resultado plásmidos que contienen la secuencia con la siguiente estructura, capaz de ser empaquetada como un genoma del virus adenoasociado serotipo 2:

[ITR]-[CMV]-[5' EGFP]-[Riboswitch Element]-[3' EGFP]-[SV40]-[ITR]

Todas las construcciones de plásmidos resultantes fueron verificadas mediante la secuenciación del ADN y nombradas de acuerdo con la siguiente convención: pD10-GTX#.

Producción y titulación del vector vírico adenoasociado: Se produjo el virus adenoasociado (AAV) in vitro mediante la transfección transitoria de las células HEK-293T con tres plásmidos.

(i) Plásmido genómico vírico basado en el esqueleto de pD10

(ii) Plásmido de empaquetamiento del AAV que contiene el gen Rep78 del AAV2 y un gen de la cápside del virus. Pueden producirse muchos serotipos diferentes de AAV variando la secuencia de genes de la cápside, pero en este caso, se usó una cápside del AAV8.

(iii) Plásmido auxiliar (pHGTI-Adeno1). Este plásmido proporciona un conjunto casi mínimo de los genes del adenovirus que el virus adenoasociado requiere para empaquetarse y ensamblarse.

Estos plásmidos se transfectaron en células HEK-293T en la proporción 1:1:3, con un total de 50 pg de ADN plasmídico transfectado por placa de 150 cm2 confluentes al 80-90 %. Un ciclo típico de producción consistió en 20 de estas placas. El reactivo de transfección usado fue la polietilenimina (PEI) en una proporción de PEI a ADN de 2,25:1 (p/p). Setenta y dos horas después de la transfección, las células fueron físicamente separadas de las placas y sedimentadas por centrifugación; el sedimento de células resultante se volvió a suspender en 20 ml de tampón de TRIS. El sedimento fue después lisado mediante ciclos repetidos de congelación / descongelación / agitación y cualquier ADN no empaquetado restante en el lisado se destruyó con digestión usando Benzonase®. El lisado fue después clarificado mediante filtración frontal y centrifugación antes de ser diluido hasta un volumen total de 50 ml.

El lisado clarificado fue después purificado mediante un procedimiento de FPLC basado en la afinidad usando una columna de AVB en un instrumento ÁKTA Pure (ambos de GE Healthcare) realizado de acuerdo con los protocolos previamente programados. El eluido final que contiene AAV de la columna de FPLC se concentró hasta un volumen de ~200 pl mediante centrifugación a 5000 x g en un concentrador centrífugo Vivaspin 4 10.000 MWCO (GE Healthcare), se añadieron 2 ml de PBS-MK (para diluir el tampón de elución con alto contenido de sal) y el eluido volvió a concentrarse a aproximadamente 200 pl usando el mismo concentrador. Este material constituyó el virus adenoasociado purificado y fue alicuotado como correspondió y almacenado a -80°C.

Se estableció el título del vector usando qPCR (dirigida contra la señal de poliadenilación de SV40) directamente en una muestra de vector purificado. El valor de ciclo umbral resultante se comparó con una curva estándar conocida y el número de genomas de vector se calculó por ml.

Los vectores víricos adenoasociados del ribointerruptor se nombraron de acuerdo con la siguiente convención: AAV2/[serotipo de cápside #]-GTX#

Inyecciones subretinales en roedores: Se realizaron inyecciones de vector en el espacio subretinal en ratones bajo anestesia general usando una aguja calibre 34 de 10 mm, manualmente guiada, montada en una jeringa Hamilton de 5 pl. La punta de la aguja se guio a la posición de inyección mediante la observación de la retina por medio de un microscopio quirúrgico. En todos los ojos que recibieron el vector, se realizaron 2 inyecciones de 2 pl cada una, con una inyección puesta en el hemisferio superior del ojo y la otra en el hemisferio inferior. Después de la inyección, se registró la calidad del desprendimiento de retina resultante y cualquier reflujo del material inyectado.

Retinografía fluorescente de fondo: Después de la inyección subretinal, se valoró periódicamente la expresión del transgén de la EGFP mediante una retinografía usando una lámpara de hendidura (SC-16, Keeler) con una cámara digital Leica DC500 acoplada. Los animales se pusieron bajo anestesia general y sus pupilas fueron dilatadas con tropicamida tópica al 1 %. Se neutralizó el poder refractivo de la córnea colocando un cubreobjetos en la córnea cubierta con un medio de acoplamiento (Viscotears). Bajo luz blanca brillante, se ajustó el instrumento y se posicionó el animal de modo que la retina estuviera nítidamente enfocada y se centró el disco óptico en el campo de visión y después se tomó una imagen brillante usando un tiempo de exposición de 200 ms. Se valoró la fluorescencia (EGFP) del transgén filtrando la fuente de luz (475±25nm) y tomando dos imágenes adicionales con exposiciones de 10 y 30 s.

Resultados

Las construcciones de ribointerruptor (Tabla 4) se clonaron con éxito en un formato capaz de ser empaquetado como un genoma de AAV según lo mostrado por la secuenciación del ADN de los productos de ligación. De las construcciones resultantes, pd10-GTX7 y pd10-GTX5 se produjeron además como vectores víricos AAV2/8. Se mostró que los vectores producidos tienen los siguientes títulos mediante la reacción en cadena de la polimerasa en tiempo real:

AAV2/8-GTX7: 1,17 x 1013 Genomas de Vector / ml

AAV2/8-GTX5: 1,73 x 1013 Genomas de Vector / ml

Estos dos vectores después fueron inyectados vía subretinal y se dejaron durante 8 días para que se desarrollara la expresión del transgén de la EGFP antes de valorar la expresión mediante la retinografía fluorescente. La Fig. 12 muestra que la EGFP se expresa en una retina a la que se inyectó AAV2/8-GTX7. La expresión del transgén es baja, pero solo se esperaría la expresión sustancial de AAV2/8-GTX7 después de la inducción por medio de la modulación mediada por un aptámero del corte y empalme alternativo en respuesta al ligando (el cual no se añadió).

EJEMPLO 13. Regulación de la expresión del gen diana mediante el corte y empalme alternativo mediado por el casete de regulación in vivo en la retina murina después de la entrega del virus adenoasociado.

Procedimientos

Cuantificación de la retinografía fluorescente de fondo (señal de la EGFP): Toda la manipulación y el análisis de las imágenes se realizaron usando el GNU Image Manipulation Program (GIMP, fuente abierta). Como se describe arriba, se tomaron tres imágenes de cada retina en cada punto de escaneo: Luz blanca (200 ms), 475±25 nm (10 s) y 475±25 nm (30 s). Primero, estas tres imágenes se superpusieron como capas y usando la imagen de luz blanca como una guía, se definió una región de interés (ROI) para abarcar la retina completa visible a través de la pupila. En las dos imágenes de 475±25 nm (fluorescencia de la EGFP), se usó la herramienta de umbral para resaltar solo esos pixeles con un valor de intensidad por encima de un umbral definido. El valor de umbral se seleccionó basándose en la definición de la separación limpia de la señal de la EGFP desde el fondo y para proporcionar un rango dinámico apropiado para el análisis. El número de pixeles por encima del umbral dentro de la ROI se registró para cada imagen. Para corregir la dilatación variable de la pupila que conduce a la variación en el área de retina visible entre los ojos, el número de pixeles arriba del umbral se dividió entre el número total de pixeles dentro de la ROI.

Inducción: La inducción mediada por ribointerruptor de la expresión del gen diana se llevó a cabo por medio de dos vías de administración como se describe a continuación:

Inyección intraperitoneal (I.P.): Se inyectó un volumen de 100 pl de [75 mg / ml de guanosina 0,5 % p/v de metilcelulosa 0,25 % v/v de Tween 80 en agua] en la cavidad intraperitoneal usando una aguja calibre 30 de 13 mm. Esto es equivalente a una dosis de guanosina de 300 mg/kg en un ratón adulto que pesa 25 g.

Inyección intravítrea (I-Vit.): Se inyectó vía intravítrea un volumen de 2 pl de [1 mM de guanosina 2,5 % de DMSO en PBS-MK] usando una aguja calibre 34 de 10 mm, manualmente guiada. La posición de la punta de la aguja en la inyección estuvo debajo de la lente directamente arriba del disco óptico, siendo guiada a esta posición mediante la observación de la retina por medio de un microscopio quirúrgico.

Resultados

En total, se aplicó la inyección vía subretinal a 9 ojos como se describe en el Ejemplo 12 de la siguiente manera en el día 00:

- 6 ojos con AAV2/8-GTX7 (Expresión del transgén de la EGFP del promotor de CMV regulado por el elemento de ribointerruptor de G15)

- 3 ojos con AAV2/8-GTX5 (Construcción de control positivo, expresión no regulada del transgén de la EGFP del promotor de CMV)

La retinografía fluorescente como se describe en el Ejemplo 12 se realizó en los días 02, 08, 09, 10 y 12.

Todos los ojos recibieron inducción por medio de la inyección intraperitoneal después de la retinografía fluorescente en los días 08, 09 y 10. Todos los ojos recibieron inducción por medio de la inyección intravítrea en el día 11. Se cuantificó la señal fluorescente como se describe arriba y se muestran ejemplos de imágenes en la Fig. 13a.

No se realizó la inducción durante los primeros 8 días después de la inyección del vector ya que se sabe que la expresión génica del AAV2/8 se lleva hasta 7 días para llegar a ser máxima. Por lo tanto, el nivel de expresión en el día 8 se tomó como el punto de referencia antes de la inducción. En el día 10 posterior a la inyección del vector después de 2 series de inducción I.P., la expresión del transgén había aumentado ~3,5 veces en comparación con este punto de referencia (P < 0,05, ANOVA unidireccional, Dunnetts) como se muestra en las Figuras 13c y 13a (L frente a N).

En el día 12 posterior a la inyección del vector, 24 horas después de la inducción intravítrea y 48 horas después de la última inducción I.P., la expresión del transgén había aumentado aproximadamente 9 veces en comparación con el punto de referencia (P < 0,001, ANOVA unidireccional, Dunnetts) como se muestra en las Figuras 13c y 13a (L frente a O). Esta inducción mucho más grande después de la inducción intravítrea implica (pero definitivamente no se muestra) que esta vía de inducción podría ser más efectiva que la inyección intraperitoneal.

En la Fig. 13b se muestran imágenes de resolución más alta mostrando la diferencia en la expresión del transgén de la EGFP antes y después de la inducción.

Durante el mismo periodo de tiempo y bajo el mismo régimen de inducción, los niveles de expresión de EGFP mediados por el vector de control no regulado AAV2/8-GTX5 no variaron significativamente (ANOVA unidireccional, Bonferroni), permaneciendo aproximadamente constante como se muestra en la Fig. 13d. Debido a la gran diferencia en el nivel de expresión mediado por GTX7 vs GTX5, cada conjunto de imágenes requirió un tiempo de exposición (30 y 10 segundos, respectivamente) y umbral (50 y 190, respectivamente) diferentes.

Estos datos muestran claramente que la expresión del transgén de la construcción GTX7 basada en G15 estaba siendo regulada por el corte y empalme alternativo mediado por un aptámero en la retina murina. El nivel máximo de expresión del transgén inducido de GTX7 fue más bajo que el nivel mediado por la construcción GTX5 de control positivo no inducible.

Tabla 5. Descripción y secuencias asociadas. La secuencia exónica está en letras mayúsculas y la secuencia intrónica está en letras minúsculas a menos que se establezca lo contrario.

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Claims

REIVINDICACIONES

1. Un casete de polinucleótido para la regulación de la expresión de un gen diana que comprende

a. un ribointerruptor

b. un exón alternativamente empalmado, flanqueado por un intrón 5' y un intrón 3',

en donde el ribointerruptor comprende (i) una región efectora que comprende un tallo que tiene 7 a 20 pares de bases que incluye la secuencia del sitio de corte y empalme 5' del intrón 3' y (ii) un aptámero, en donde:

la secuencia del sitio de corte y empalme 5' del intrón 3' comprende la secuencia GTAATG o GTRAGT, en donde R es A o G; y

el exón alternativamente empalmado comprende un codón de parada que está en marco con el gen diana cuando el exón alternativamente empalmado es empalmado en el ARNm del gen diana.

2. El casete de polinucleótido de la reivindicación 1, en donde el aptámero se une a un ligando de molécula pequeña.

3. Un casete de polinucleótido para su uso en terapia génica mediante un método para modular la expresión de un gen diana, comprendiendo el método

a. insertar el casete de polinucleótido de las reivindicaciones 1 o 2 en un gen diana,

b. introducir el gen diana que contiene el casete de polinucleótido en una célula y

c. exponer la célula a un ligando de molécula pequeña que se une específicamente al aptámero en una cantidad eficaz para inducir la expresión del gen diana.

4. El casete de polinucleótido para su uso en la reivindicación 3, en donde el casete de polinucleótido se inserta en la región codificante de proteína del gen diana.

5. El casete de polinucleótido para su uso en las reivindicaciones 3 o 4, en donde la expresión del gen diana es más grande que 5 veces más alta o es más grande que 10 veces más alta cuando el ligando de molécula pequeña está presente que los niveles de expresión cuando el ligando de molécula pequeña está ausente.

6. El casete de polinucleótido para su uso en una cualquiera de las reivindicaciones 3-5, en donde dos o más de los casetes de polinucleótido se insertan en el gen diana, opcionalmente en donde los dos o más casetes de polinucleótido comprenden diferentes aptámeros que se unen específicamente a diferentes ligandos de molécula pequeña o en donde los dos o más casetes de polinucleótido comprenden el mismo aptámero.

7. El casete de polinucleótido para su uso en una cualquiera de las reivindicaciones 3-6, en donde el gen diana que comprende el casete de polinucleótido se incorpora en un vector para la expresión del gen diana.

8. Un vector que comprende un gen diana que contiene un casete de polinucleótido para su uso en terapia génica mediante un método para modular la expresión de un gen diana en el ojo de un mamífero, comprendiendo el método: a. introducir en el ojo un vector que comprende un gen diana que contiene un casete de polinucleótido que comprende (i) un ribointerruptor y (ii) un exón alternativamente empalmado flanqueado por un intrón 5' y un intrón 3', en donde el ribointerruptor comprende una región efectora que contiene un tallo que tiene 7 a 20 pares de bases que incluye la secuencia del sitio de corte y empalme 5' del intrón 3' y un aptámero que se une a un ligando de molécula pequeña, en donde:

i. la secuencia del sitio de corte y empalme 5' del intrón 3' comprende la secuencia GTAATG o GTRAGT, en donde R es A o G; y

ii. el exón alternativamente empalmado comprende un codón de parada que está en marco con el gen diana; y

b. proporcionar al mamífero un ligando de molécula pequeña, en una cantidad eficaz para inducir la expresión del gen diana.

9. El vector para su uso de la reivindicación 8, en donde el vector se introduce al ojo por inyección intraocular.

10. El vector para su uso de las reivindicaciones 8 o 9, en donde el vector es un vector vírico, opcionalmente en donde el vector vírico se selecciona del grupo que consiste en vector adenovírico, vector vírico adenoasociado y vector lentivírico.

11. El casete de polinucleótido para su uso en una cualquiera de las reivindicaciones 3-7 o el vector para su uso de una cualquiera de las reivindicaciones 8-10, en donde el casete de polinucleótido se encuentra en la secuencia codificante de proteínas del gen diana.

12. El casete de polinucleótido de una cualquiera de las reivindicaciones 1-2, el casete de polinucleótido para su uso en una cualquiera de las reivindicaciones 3-7 u 11 o el vector para su uso de una cualquiera de las reivindicaciones 8 11, en donde los intrones 5' y 3'

(i) derivan de un intrón endógeno del gen diana;

(ii) son exógenos al gen diana; o

(iii) derivan del intrón 2 del gen de p-globina humana.

13. El casete de polinucleótido de una cualquiera de las reivindicaciones 1-2 o 12, el casete de polinucleótido para su uso en una cualquiera de las reivindicaciones 3-7 u 11-12 o el vector para su uso de una cualquiera de las reivindicaciones 8-12, en donde el intrón 5' comprende un codón de parada en marco con el gen diana.

14. El casete de polinucleótido de una cualquiera de las reivindicaciones 1-2 o 12-13, el casete de polinucleótido para su uso en una cualquiera de las reivindicaciones 3-7 u 11-13 o el vector para su uso de una cualquiera de las reivindicaciones 8-13, en donde los intrones 5' y 3' tienen cada uno independientemente una longitud de aproximadamente 50 a aproximadamente 300 nucleótidos, opcionalmente en donde los intrones 5' y 3' tienen cada uno independientemente una longitud de aproximadamente 125 a aproximadamente 240 nucleótidos.

15. El casete de polinucleótido de una cualquiera de las reivindicaciones 1-2 o 12-14, el casete de polinucleótido para su uso en una cualquiera de las reivindicaciones 3-7 u 11-14 o el vector para su uso de una cualquiera de las reivindicaciones 8-14, en donde el tallo de la región efectora tiene una longitud de 8 a 11 pares de bases.

16. El casete de polinucleótido de una cualquiera de las reivindicaciones 1-2 o 12-15, el casete de polinucleótido para su uso en una cualquiera de las reivindicaciones 3-7 u 11-15 o el vector para su uso de una cualquiera de las reivindicaciones 8-15, en donde el exón alternativamente empalmado

(i) deriva del exón 2 del gen de la dihidrofolato reductasa humana, el exón 5 del tumor de Wilms 1 mutante humano, el exón 16 de la proteína quinasa II delta dependiente de calcio-calmodulina de ratón, o el exón 6 de SIRT1; (ii) ha sido modificado por uno o más del grupo que consiste en la alteración de la secuencia de un potenciador exónico del corte y empalme, la alteración de la secuencia del silenciador exónico del corte y empalme, la adición de un potenciador exónico del corte y empalme y la adición de un silenciador exónico del corte y empalme; (iii) es el exón 2 modificado de DHFR de SEQ ID NO: 15; o

(iv) es sintético.

17. Un polinucleótido recombinante que comprende un gen diana que contiene el casete de polinucleótido de una cualquiera de las reivindicaciones 1-2 o 12 - 16 , opcionalmente en donde el casete de polinucleótido se encuentra en la secuencia codificante de proteínas del gen diana.

18. Un vector que comprende un gen diana que contiene un casete de polinucleótido de una cualquiera de las reivindicaciones 1-2 o 12-16.

19. El vector de la reivindicación 18, en donde el vector es un vector vírico, opcionalmente en donde el vector vírico se selecciona del grupo que consiste en vector adenovírico, vector vírico adenoasociado y vector lentivírico.

20. Un método in vitro para modular la expresión de un gen diana, comprendiendo el método

b. introducir el gen diana que comprende el casete de polinucleótido en una célula y