CN110636868B - 通过适体-介导的多腺苷酸化信号可及性来调控基因表达 - Google Patents

Abstract

本发明提供用于通过基于适体调节一种或多种多腺苷酸化信号的可及性来调控基因表达的多核苷酸构建体，和使用所述构建体响应于结合适体的配体的存在或不存在来调控基因表达的方法。所述多核苷酸构建体含有核糖开关，所述核糖开关包含适体和效应物茎环，其中效应物茎环包含多腺苷酸化信号序列。

Description

通过适体-介导的多腺苷酸化信号可及性来调控基因表达

发明领域

本发明提供用于通过基于适体调节一种或多种多腺苷酸化信号的可及性来调控基因表达的多核苷酸构建体，和使用所述多核苷酸构建体响应于结合适体的配体的存在或不存在来调控基因表达的方法。所述多核苷酸构建体含有核糖开关，所述核糖开关包含适体和效应物茎环，其中效应物茎环包含多腺苷酸化信号序列。

发明背景

真核细胞中的信使RNA (mRNA)通过广泛的转录后加工从前-mRNA转录物产生，包括5′末端帽化、通过剪接除去内含子以及3′末端裂解和多腺苷酸化。几乎所有的真核mRNA的3′末端包含多聚(A)尾—20-250个腺苷残基的均聚物。在细胞核中通过裂解和多腺苷酸化(通过大的蛋白复合物催化的过程)，多聚(A)尾被添加到前-mRNA。多聚(A)尾的添加依赖于多种元件的存在，包括多腺苷酸化位点上游存在的高度保守的AATAAA (或其变体ATTAAA)多腺苷酸化信号序列和其它上游元件(“USE”)，以及富含T或GT的下游元件(“DSE”)。多聚(A)尾添加到mRNA保护信息免于降解，以及其它功能。

发明简述

在一个方面，本发明提供用于调控靶基因表达的多核苷酸盒，所述多核苷酸盒包含核糖开关，其中核糖开关包含效应物茎-环和适体，其中效应物茎-环包含多腺苷酸化信号，和其中适体和效应物茎-环通过可替代共有茎臂连接，所述可替代共有茎臂包含与适体茎的非共有臂和效应物茎环的非共有臂互补的序列。在一个实施方案中，适体结合小分子配体。

在实施方案中，与在适体茎中的序列和在效应物茎环中的序列互补的可替代共有茎臂的部分是4-8个核苷酸、5-7个核苷酸、5个核苷酸或6个核苷酸。在实施方案中，适体茎是6-12个碱基对、7-10个碱基对、8个碱基对或9个碱基对。在实施方案中，效应物茎环的茎是4-24个碱基对、5-20个碱基对、9-14个碱基对、9个碱基对、10个碱基对、11个碱基对或12个碱基对。

在一个实施方案中，效应物茎-环位于适体的3′，使得可替代共有茎臂包含3′适体茎臂的全部或一部分和效应物茎的5′臂的全部或一部分。在一个实施方案中，效应物茎-环位于适体的5′，使得可替代共有茎臂包含5′适体茎臂的全部或一部分和效应物茎的3′臂的全部或一部分。在一个实施方案中，多腺苷酸化信号是AATAAA或ATTAAA。在一个实施方案中，多腺苷酸化信号是下游元件(DSE)。在一个实施方案中，多腺苷酸化信号是上游序列元件(USE)。

在一个实施方案中，多核苷酸盒包含本发明的两个核糖开关，其中第一个核糖开关的效应物茎环包含多腺苷酸化信号AATAAA或ATTAA的全部或一部分，和第二个核糖开关的效应物茎环包含下游元件(DSE)的全部或一部分。在一个实施方案中，两个核糖开关各自包含结合相同配体的适体。在一个实施方案中，两个核糖开关包含结合不同配体的不同适体。

在一个方面，本发明提供了调节靶基因表达的方法，所述方法包括：

(a) 将一个或多个本发明的多核苷酸盒插入靶基因的3′非翻译区中，

(b) 将包含多核苷酸盒的靶基因引入细胞中，和

(c) 将细胞暴露于有效增加靶基因的表达的量的结合适体的配体。

在一个实施方案中，配体是小分子。在一个实施方案中，将两个核糖开关插入靶基因的3′非翻译区(“UTR”)中，其中第一个核糖开关的效应物茎环包含多腺苷酸化信号AATAAA或ATTAA的全部或一部分，和第二个核糖开关的效应物茎环包含下游元件(DSE)的全部或一部分。在一个实施方案中，两个核糖开关各自包含结合相同配体的适体。在一个实施方案中，两个核糖开关包含结合不同配体的不同适体。在一个实施方案中，两个或更多个多核苷酸盒包含相同的适体。

在一个实施方案中，将包含多核苷酸盒的靶基因掺入用于表达靶基因的载体中。在一个实施方案中，载体为病毒载体。在一个实施方案中，病毒载体选自腺病毒载体、腺相关病毒载体和慢病毒载体。

在一个方面，本发明提供包含含有本文所述的多核苷酸盒的靶基因的载体。在一个实施方案中，载体是病毒载体。在一个实施方案中，病毒载体选自腺病毒载体、腺相关病毒载体和慢病毒载体。

在一个方面，本发明的多核苷酸盒与用于调控靶基因的表达的其它机制组合使用。在一个实施方案中，本发明的多核苷酸盒与基因调控盒组合使用，所述基因调控盒通过可变剪接的适体-介导的调控来调节靶基因表达，如WO 2016/126747 (PCT/US2016/016234)中所述，其通过引用并入本文。在其它实施方案中，本发明的多核苷酸盒与基因调控盒组合使用，所述基因调控盒通过自裂解核酶的适体-介导的调控来调节靶基因表达，如PCT/US2017/016303中所述，其通过引用并入本文。在其它实施方案中，本发明的多核苷酸盒与基因调控盒组合使用，所述基因调控盒通过多腺苷酸化的适体-介导的调节来调节靶基因表达，如PCT/US1207/016279中所述，其通过引用并入本文。

附图简述

图1a. 本发明的一个实施方案的示意图，其中适体的3′茎臂通过可替代共有茎臂(即，可与适体茎或效应物茎形成茎结构，但不同时与二者形成茎结构的茎臂)连接至效应物茎-环的5′茎臂，和多腺苷酸化信号序列(在该情况下为AATAAA)位于效应物茎-环的茎中。

图1b. 本发明的一个实施方案的示意图，其中多腺苷酸化信号(在该情况下为AATAAA)的可及性通过存在或不存在适体配体来调控。连接至效应物茎-环(其中AATAAA序列在茎中嵌入)的适体插入在3′ UTR中。茎-环结构的5′臂的互补序列(之后是适体序列)连接至茎-环结构的5′臂。在不存在适体配体时(上子图)，AATAAA序列被通过效应物茎-环形成的茎-环结构封锁，抑制多腺苷酸化，从而抑制基因表达。在存在适体配体时，适体/配体结合促进适体P1茎的形成，从而破坏效应物茎-环结构和导致AATAAA从隔离中释放。在茎-环结构的茎和适体P1茎之间共有的序列以粗线表示。

图1c和图1d. 通过AATAAA可及性的适体-介导的调节来调控萤光素酶表达。HEK293细胞用指示的构建体转染和用DMSO (图1c)或NaOH (图1d)作为溶剂对照或500 μM鸟苷(图1c)或鸟嘌呤(图1d)处理。萤光素酶活性表示为平均值±S.D. (n=3)，和诱导倍数表示为在存在鸟苷或鸟嘌呤时获得的萤光素酶活性除以在不存在鸟苷或鸟嘌呤时获得的值的商。

图1e. 通过AATAAA可及性的适体-介导的调节来调控EGFP表达。HEK 293细胞用指示的构建体转染和用NaOH作为溶剂对照或500 μM鸟嘌呤处理。GFP荧光强度表示为平均值±S.D. (n=3)，和诱导倍数表示为在存在鸟嘌呤时获得的荧光强度除以在不存在鸟嘌呤时获得的值的商。

图2a. 通过适体/配体结合来调节茎-环中DSE的可及性的示意图。具有嵌入茎中的DSE序列的茎-环形成结构插入在3′ UTR中。适体序列连接至茎-环形成结构的3′臂(之后是茎-环结构的3′臂的互补序列)。在不存在适体配体时(上子图)，DSE序列被茎-环结构的形成封锁，从而抑制多腺苷酸化和抑制靶基因表达。在存在适体配体时(下子图)，适体/配体结合促进适体P1茎的形成，从而破坏茎-环结构和导致DSE序列从隔离中释放。在效应物茎-环结构的茎和适体P1茎之间共有的序列以粗线表示。

图2b和图2c. 通过DSE可及性的适体-介导的调节来调控萤光素酶表达。HEK 293细胞用指示的构建体转染和用DMSO (图2b)或NaOH (图2c)作为溶剂对照或500 μM鸟苷(图2b)或鸟嘌呤(图2c)处理。萤光素酶活性表示为平均值±S.D. (n=3)，和诱导倍数表示为在存在鸟苷或鸟嘌呤时获得的萤光素酶活性除以在不存在鸟苷或鸟嘌呤时获得的值的商。

图3. 通过获得合成多聚A序列的适体-介导的调节来调控萤光素酶表达。

图4. 茎-环结构中的环序列影响基于多聚A的核糖开关活性。stbl_ATA_Gua_1具有更稳定的TTCG环，ATA_Gua_1具有GAAA环和gaat_ATA_Gua_1具有GAAT环。

图5a. 通过适体同时调节AATAAA和DSE序列二者的可及性的示意图。各自嵌入AATAAA或DSE序列的两个茎-环结构插入在靶基因的3′ UTR中，和适体连接至每个茎-环结构，如对于图1b和图2a所述。适体1和适体2表示相同的适体或不同的适体，其结合相同或不同的配体。在不存在适体配体时(上子图)，AATAAA和DSE二者在茎-环结构中隔离，因此基因表达受到抑制。在存在适体配体时(下子图)，当两种适体结合它们的配体时，AATAAA和DSE序列二者从茎-环结构中释放，允许靶基因表达。

图5b. HEK 293细胞用指示的构建体转染和用NaOH作为溶剂对照或500 μM鸟嘌呤处理。萤光素酶活性表示为平均值±S.D. (n=3)，和诱导倍数表示为在存在鸟嘌呤时获得的萤光素酶活性除以在不存在鸟嘌呤时获得的值的商。在多聚A序列中同时隔离AATAAA和DSE序列元件二者进一步降低在ATA_DSE_Gua构建体中萤光素酶表达的基础水平。

图6a. 双重开关构建体的示意图，其中ATA_Gua核糖开关在3’UTR中和G15核糖开关插入在萤光素酶编码序列中。

图6b. 来自用指示的构建体转染和用或不用500 uM鸟嘌呤处理的HEK 293细胞的萤光素酶活性。具有双开关pFLuc-G15_ATA_Gua的构建体比具有单一核糖开关的构建体产生更高倍数的诱导。

图7. 通过AATAAA可及性的腺嘌呤适体-介导的调节来调控萤光素酶表达。HEK293细胞用指示的构建体转染和用NaOH作为溶剂对照或1 mM腺嘌呤处理。萤光素酶活性表示为平均值±S.D. (n=3)，和诱导倍数表示为在存在腺嘌呤时获得的萤光素酶活性除以在不存在腺嘌呤时获得的值的商。

图8. 在实施例中使用的构建体的3′ UTR。萤光素酶基因的编码序列以大写字母表示；AATAAA和DSE以灰色突出显示；适体序列以下划线表示；茎-环序列以波浪下划线表示；和P1适体茎序列以斜体字母表示。

发明详述

本申请要求2017年2月21日提交的美国临时申请系列号62/461,689的优先权，其以其整体并入本文。本申请涉及提供下文列出的SEQ ID NO的序列表，其作为电子文件同此提供和通过引用以其整体并入本文。

靶基因(例如，治疗性转基因)的表达的调控在多种情况下是有用的或必要的。在基因的治疗性表达的情况下，能够调控转基因表达的技术通过调控表达水平和其时间选择而具有提高安全性的潜力。对于安全和有效的治疗应用，控制蛋白质表达的调控系统具有实际的作用，和在一些情况下具有必要的作用。本发明提供用于通过基于适体调节多腺苷酸化(通过在连接至适体的茎-环结构(效应物茎-环)中隔离一种或多种多腺苷酸化信号)来调控基因表达的多核苷酸构建体，以及使用所述构建体响应于结合适体的配体的存在或不存在来调控基因表达的方法。

多核苷酸构建体含有至少一个核糖开关，其包含效应物茎-环和适体，其中效应物茎-环包含多腺苷酸化信号序列。适体和效应物茎-环通过共有茎臂连接，所述共有茎臂可替代地与适体茎或效应物茎形成茎，这取决于适体配体的存在。当适体配体存在和结合适体时，适体茎(适体P1茎)得到稳定和与可替代共有茎臂形成茎。因此，在存在配体时，由效应物茎-环形成的茎-环结构是不利的，和多腺苷酸化信号是可获得的，允许多腺苷酸化发生，导致靶基因表达提高。在不存在配体时，效应物茎-环与可替代共有茎臂形成茎结构，从而隔离多腺苷酸化信号序列，阻止多腺苷酸化和降低靶基因表达。

在一个实施方案中，效应物茎环位于适体的3′，使得可替代共有茎臂包含3′适体茎臂的全部或一部分和效应物茎环的5′臂的全部或一部分(参见例如，图1a和1b)。在一个实施方案中，效应物茎环位于适体的5′，使得可替代共有茎臂包含5′适体茎臂的全部或一部分和效应物茎环的3′臂的全部或一部分(参见例如，图3)。

基因调控多核苷酸盒是指重组DNA构建体，所述重组DNA构建体在3′ UTR中掺入靶基因的DNA中时提供通过适体/配体介导的多腺苷酸化调控来调控靶基因表达的能力。如本文所用，多核苷酸盒或构建体为包含来源于不同来源(例如，不同生物体、来自相同生物体的不同基因等)的元件的核酸(例如，DNA或RNA)。

核糖开关

多核苷酸盒包含核糖开关。本文使用的术语“核糖开关”是指RNA多核苷酸(或者编码核糖开关的DNA)的调控区段。在本发明的情况下核糖开关含有传感器区域(例如，适体)和效应物茎-环，它们一起负责传感配体(例如，小分子)的存在和调节位于效应物茎-环中的多腺苷酸化序列的可及性。在一个实施方案中，核糖开关是重组的，利用来自两个或更多个来源的多核苷酸。在核糖开关的情况下本文使用的术语“合成的”是指不是天然存在的核糖开关。

效应物茎-环

核糖开关的效应物茎-环包含RNA序列(或编码该RNA序列的DNA)，其在不存在结合传感器区域(例如，适体)的配体时形成茎结构(即，双链区域)，所述茎结构减少多腺苷酸化信号序列的可及性。在一个实施方案中，效应物茎-环包含多腺苷酸化信号序列和与多腺苷酸化信号序列互补的序列。在一些实施方案中，效应物茎-环的茎部分仅包含多腺苷酸化信号序列的一部分。在一些实施方案中，多腺苷酸化信号序列的全部或一部分位于效应物茎-环的环部分中。

多腺苷酸化信号序列可以是在靶基因的3′ UTR中的任何序列，其参与从靶基因转录的mRNA的有效多腺苷酸化，包括AATAAA (或相关序列)、下游序列元件(DSE) (例如，富含T或GT的序列)或上游序列元件(USE)。在一些实施方案中，多腺苷酸化信号序列是来自靶基因的3′ UTR的内源性序列。在其它实施方案中，多腺苷酸化信号序列是外源性序列(例如，来自不同的基因或不同的生物体的序列)或合成的多腺苷酸化信号序列。

效应物茎-环的茎臂之一通过适体的茎连接至适体(参见例如，图1a、1b和2a)。当适体未结合它的配体时，效应物茎-环处于抑制多腺苷酸化信号序列的获得、抑制多腺苷酸化和导致信息降解的情况下。当适体结合它的配体时，效应物茎-环处于不抑制多腺苷酸化信号序列的获得，允许信息的多腺苷酸化和增加靶基因表达的构象中。

效应物茎-环的茎部分应该具有足够的长度(和GC含量)以当不存在足够量的适体配体时，促进茎-环结构形成，从而抑制多腺苷酸化信号序列的可及性。在本发明的实施方案中，效应物茎-环的茎部分除了多腺苷酸化信号序列和其互补序列之外还包含茎序列。茎部分的长度和序列可使用已知的技术变更，以鉴定允许当不存在配体时可接受的靶基因背景表达和当存在配体时可接受的靶基因表达水平的茎。如果茎例如太长，它可能在存在或不存在配体时隐藏多腺苷酸化信号序列的获得。如果茎太短，它可能不形成能够隔离多腺苷酸化信号序列的稳定茎-环结构，在该情况下，信息的多腺苷酸化(导致靶基因表达)将在存在或不存在配体时发生。在一个实施方案中，效应物茎(即，效应物茎-环的茎形成部分)的总长度是4-24个碱基对、5-20个碱基对、9-14个碱基对、9个碱基对、10个碱基对、11个碱基对或12个碱基对。除了茎的长度之外，茎的GC碱基对含量也可被改变以变更茎的稳定性。在一些实施方案中，效应物区域茎含有一个或多个错配的核苷酸，其不与效应物区域茎的互补部分进行碱基配对。

可替代共有茎臂

效应物茎-环和适体通过可替代共有茎臂连接，其包含与效应物茎-环的非-共有臂和适体茎的非-共有臂二者互补的序列。由于与适体和效应物茎二者在非共有臂上互补的序列，共有茎臂可替代地与适体茎或效应物茎(但不是同时二者)形成茎，这取决于适体配体的存在。在实施方案中，与适体茎中的序列和效应物茎环中的序列互补的可替代共有茎臂的部分(即，可替代共有序列)是4-8个核苷酸、5-7个核苷酸、5个核苷酸或6个核苷酸。在一些实施方案中，可替代共有茎臂包含另外的序列，其仅与非共有效应物茎或适体茎之一互补。在一些实施方案中，除了可替代共有序列之外，可替代共有茎臂还包含(a) 与非共有效应物茎臂互补，但不与非共有适体茎臂互补的序列；(b) 与非共有适体茎臂互补，但不与非共有效应物茎臂互补的序列；或(c) 二者。

适体/配体

在一个实施方案中，传感器区域包含适体。本文使用的术语“适体”是指特异性结合配体的RNA多核苷酸。适体通过适体茎连接至效应物茎-环。适体茎可以包含或可以不包含通常为适体的一部分的序列(例如，野生型适体茎序列)。因此，提及适体茎不意味着适体茎包含任何特定序列。因此，适体茎可包含来自适体的序列和/或能够在配体/适体结合时形成茎的另外的序列。

如同上述的效应物茎-环的茎一样，适体茎环应该具有足够长度(和GC含量)，使得适体在存在适体配体时形成适体茎，和效应物茎-环在不存在配体时形成茎。适体茎的长度和序列可使用已知的技术变更，以鉴定允许当不存在配体时可接受的靶基因背景表达和当存在配体时可接受的靶基因表达水平的茎。在实施方案中，适体茎是6-12个碱基对、7-10个碱基对、8个碱基对或9个碱基对。

术语“配体”是指特异性结合适体的分子。在一个实施方案中，配体为低分子量(小于约1,000道尔顿)分子，包括例如脂质、单糖、第二信使、辅因子、金属离子、其他天然产物和代谢物、核酸以及大多数治疗性药物。在一个实施方案中，配体为具有两个或更多个核苷酸碱基的多核苷酸。

在一个实施方案中，配体选自8-氮杂鸟嘌呤、5′-单磷酸腺苷一水合物、两性霉素B、阿维菌素B1、硫唑嘌呤、醋酸氯地孕酮、巯嘌呤、盐酸莫雷西嗪、N6-甲基腺苷、辅酶I(nadide)、黄体酮、盐酸丙嗪、双羟萘酸吡维铵(pyrvinium pamoate)、磺胺胍、丙酸睾酮、硫鸟嘌呤、泰洛沙泊和伏立诺他。

适体配体还可为在特定生理/病理条件下显著增加的细胞内源性组分，诸如致癌转化—这些可包括第二信使分子，诸如GTP或GDP、钙；脂肪酸或在乳腺癌中不正确代谢的脂肪酸，诸如13-HODE (Flaherty, JT等人, Plos One,第8卷, e63076, 2013，所述文献以引用方式并入本文)；氨基酸或氨基酸代谢物；糖酵解途径中的代谢物，其通常在癌细胞中或代谢疾病的正常细胞中具有较高水平；以及癌症相关分子，诸如Ras或突变Ras蛋白、肺癌中的突变EGFR、许多类型的癌症中的吲哚胺-2,3-双加氧酶(IDO)。如JPWiebe所公开，内源性配体包括乳腺癌中的孕酮代谢物(Endocrine-Related Cancer (2006) 13:717–738，所述文献以引用方式并入本文)。如由Minton, DR和Nanus, DM (Nature Reviews, Urology,第12卷, 2005，所述文献以引用方式并入本文)所公开，内源性配体还包括由肾癌中的关键代谢酶突变引起的具有增加水平的代谢物，诸如乳酸、谷胱甘肽、犬尿氨酸。

适体具有能够与预期的靶分子(即配体)形成复合物的结合区。结合的特异性可根据与适体对不相关分子的解离常数相比，适体对其配体的比较解离常数(Kd)来定义。因此，配体为相较于不相关材料以更高亲和力结合到适体的分子。通常，适体关于其配体的Kd将比适体与不相关分子的Kd小至少约10倍。在其他实施方案中，Kd将小至少约20倍、小至少约50倍、小至少约100倍以及小至少约200倍。适体的长度将通常在约15与约200个核苷酸之间。更常见地，适体的长度将在约30与约100个核苷酸之间。

可作为核糖开关的一部分被掺入的适体可为天然存在的适体或其修饰形式，或被从头设计和/或通过指数式富集的配体系统进化(SELEX)或其他筛选方法筛选的适体。结合小分子配体的适体的实例包括但不限于茶碱、多巴胺、磺酰罗丹明B (sulforhodamine B)、纤维二糖、卡那霉素A、利维霉素(lividomycin)、妥布霉素(tobramycin)、新霉素B、紫霉素、氯霉素、链霉素、细胞因子、细胞表面分子以及代谢物。关于识别小分子的适体的综述，参 见，例如Famulok, Science 9:324-9 (1999)以及McKeague, M.和DeRosa, M.C. J.Nuc.Aci.2012 (两个所述文献均以引用方式并入本文)。在另一个实施方案中，适体为互补多核苷酸。

用于鉴定适体/配体的方法

在一个实施方案中，适体被设计成结合特定小分子配体。用于设计和选择结合特定配体的适体的方法在WO/2018/025085中公开，所述文献以引用方式并入。用于筛选适体的其他方法包括例如SELEX。例如美国专利号5,475,096、5,270,163以及Abdullah Ozer等人Nuc.Aci.2014中公开了用于使用SELEX设计选择性结合小分子的适体的方法，所述文献以引用方式并入本文。美国专利号5,580,737和5,567,588中描述了对SELEX方法的改良，所述专利以引用方式并入本文。

用于识别适体的选择技术通常涉及制备大的含有被随机化或诱变的区域的所需长度的DNA或RNA分子的汇集物。例如，用于适体选择的寡核苷酸汇集物可含有具有20-100个随机化核苷酸的区域，所述区域侧接长度为约15-25个核苷酸并且可用于结合PCR引物的规定序列的区。使用标准PCR技术或允许扩增所选核酸序列的其他手段来扩增寡核苷酸汇集物。当需要RNA适体时可在体外对DNA汇集物进行转录，以产生RNA转录物的汇集物。然后基于特异性结合到所需配体的能力对RNA或DNA寡核苷酸的汇集物进行选择。选择技术包括例如亲和色谱法，但是可使用将允许基于特异性结合到另一分子的能力来选择核酸的任何方案。用于识别结合小分子并且在细胞内发挥功能的适体的选择技术可能涉及基于细胞的筛选方法。在亲和色谱法的情况下，使寡核苷酸与被固定于柱中或磁珠上的基质上的靶配体接触。优选在模拟正常生理条件的盐浓度、温度以及其他条件存在的情况下针对配体结合来对寡核苷酸进行选择。汇集物中结合到配体的寡核苷酸保留在柱或小珠上，而非结合序列被洗掉。然后通过PCR (通常在洗脱后)对结合配体的寡核苷酸进行扩增(如果利用RNA转录物，那么在逆转录之后进行)。对所选序列重复选择过程，进行总计约三至十轮的迭代选择程序。然后使用标准程序对所得寡核苷酸进行扩增、克隆以及测序以识别能够结合靶配体的寡核苷酸序列。一旦已识别适体序列，即可通过从包含诱变适体序列的寡核苷酸汇集物开始进行另外轮的选择来对适体进行进一步优化。

可在一轮或多轮体外选择(例如，SELEX)后使用体内适体筛选。例如，Konig, J.等人(RNA.2007, 13(4):614–622，其以引用方式并入本文)描述了用于适体的体内选择的SELEX和酵母三杂交系统的组合。

靶基因

本发明的基因调控盒为可用于调控可在靶细胞、组织或生物体中表达的任何靶基因的表达的平台，所述靶细胞、组织或生物体具有被多腺苷酸化的mRNA。术语“靶基因”是指被引入细胞中并且能够被转录至RNA中并且在适当条件下翻译和/或表达的多核苷酸。可替代地，靶基因对靶细胞是内源的，并且本发明的基因调控盒被定位到靶基因的3' UTR中。靶基因的实例为编码治疗性多肽的多核苷酸。在一个实施方案中，靶基因对要在其中转录重组DNA构建体的细胞来说为外源性的。在另一个实施方案中，靶基因对要在其中转录重组DNA构建体的细胞来说为内源性的。

根据本发明的靶基因可为编码蛋白质的基因。靶基因可为例如编码结构蛋白、酶、细胞信号传导蛋白、线粒体蛋白、锌指蛋白、激素、转运蛋白、生长因子、细胞因子、细胞内蛋白、细胞外蛋白、跨膜蛋白、细胞质蛋白、核蛋白、受体分子、RNA结合蛋白、DNA结合蛋白、转录因子、翻译机构、通道蛋白、运动蛋白、细胞粘附分子、线粒体蛋白、代谢酶、激酶、磷酸酶、交换因子、伴侣蛋白以及这些中任一种的调节剂的基因。在实施方案中，靶基因编码促红细胞生成素(Epo)、人生长激素(hGH)、转录活化子样效应物核酸酶(TALEN)、人胰岛素、CRISPR相关蛋白9 (cas9)或免疫球蛋白(或其部分)，包括例如治疗性抗体。

表达构建体

本发明涵盖使用重组载体以将编码靶基因并且含有本文所述的基因调控盒的多核苷酸引入靶细胞中。在许多实施方案中，本发明的重组DNA构建体包括另外的DNA元件，所述另外的DNA元件包括提供DNA在宿主细胞中的复制以及靶基因在所述细胞中的适当水平的表达的DNA区段。普通技术人员了解基于促进靶基因在靶细胞中的表达的能力来选择表达控制序列(启动子、增强子等)。“载体”意指包含要在体外或体内递送至宿主细胞中的多核苷酸的重组质粒、酵母人工染色体(YAC)、微型染色体、DNA微环或病毒(包括病毒衍生的序列)。在一个实施方案中，重组载体为病毒载体或多个病毒载体的组合。

用于靶基因在靶细胞、组织或生物体中的适体介导的表达的病毒载体为本领域中已知的，并且包括腺病毒(AV)载体、腺相关病毒(AAV)载体、逆转录病毒和慢病毒载体以及1型单纯疱疹(HSV1)载体。

腺病毒载体包括例如基于人2型腺病毒和人5型腺病毒的那些腺病毒载体，其已通过E1和E3区中的缺失而变为复制缺陷型。可将转录盒插入E1区中，从而产生重组E1/E3缺失AV载体。腺病毒载体还包括辅助物依赖性高容量腺病毒载体(也称为高容量“无内脏”或“去内脏”载体)，所述载体不含病毒编码序列。这些载体含有病毒DNA复制和包装所需的顺式作用元件，主要为反向末端重复序列(ITR)和包装信号(Ψ)。这些辅助物依赖性AV载体基因组具有携带从几百个碱基对至约36 kb的外来DNA的潜力。

重组腺相关病毒“rAAV”载体包括来源于任何腺相关病毒血清型的任何载体，包括但不限于AAV-1、AAV-2、AAV-3、AAV-4、AAV-5、AAV-7和AAV-8、AAV-9、AAV-10等。rAAV载体可具有全部或部分缺失的AAV野生型基因中的一个或多个，优选为Rep和/或Cap基因，但保留功能性侧接ITR序列。功能性ITR序列被保留用于AAV基因组的拯救、复制、包装以及潜在染色体整合。ITR无需为野生型核苷酸序列，并且可改变(例如通过核苷酸的插入、缺失或取代)，只要序列提供功能性拯救、复制以及包装即可。

可替代地，可将诸如慢病毒载体的其他系统用于本发明的实施方案中。基于慢病毒的系统可转导非分裂以及分裂细胞，使它们可用于靶向例如CNS的非分裂细胞的应用。慢病毒载体来源于人类免疫缺陷病毒，并且像所述病毒一样，整合至宿主基因组中，从而提供长期的基因表达的潜力。

还可使用例如阳离子脂质、聚合物或两者作为载体通过非病毒载体系统将携带含有基因调控盒的靶基因的包括质粒、YAC、微型染色体以及微环的多核苷酸引入细胞或生物体中。还可使用共轭聚L-赖氨酸(PLL)聚合物和聚乙烯亚胺(PEI)聚合物系统来将载体递送至细胞。针对细胞培养物与生物体，用于将载体递送至细胞的其他方法包括流体力学注射和电穿孔以及使用超声波。关于用于基因递送的病毒和非病毒递送系统的综述，参见Nayerossadat, N.等人(Adv Biomed Res.2012; 1:27；以引用方式并入本文)。

调节靶基因的表达的方法

在一个方面，本发明提供通过以下来调节靶基因(例如，治疗性基因)表达的方法：(a)将本发明的一个或多个基因调控多核苷酸盒插入靶基因的3' UTR中；(b)将包含基因调控盒的靶基因引入细胞中；以及(c)将细胞暴露于结合适体的配体。在一个实施方案中，配体为小分子。在多个方面中，靶基因在靶细胞中的表达赋予将其引入的细胞所需性质，或以其他方式产生所需治疗性结果。靶细胞是真核细胞，例如哺乳动物细胞。在实施方案中，靶细胞是来自靶组织的人细胞，所述靶组织包括例如脂肪、中枢神经系统(CNS)、肌肉、心脏、眼、肝等。

在一个实施方案中，将一个或多个基因调控盒插入靶基因的3′非翻译区。在一个实施方案中，将单个基因调控盒插入靶基因的3′ UTR。在一个实施方案中，将两个核糖开关插入靶基因的3′非翻译区，其中第一个核糖开关的效应物茎环包含多腺苷酸化信号AATAAA(或ATTAA)的全部或一部分，和第二个核糖开关的效应物茎环包含下游元件(DSE)的全部或一部分。

在一个实施方案中，当多个基因调控盒插入靶基因时，它们各自可含有相同的适体，使得单一配体可用于调节靶基因的表达。在其它实施方案中，当多个基因调控盒插入靶基因时，各自可含有不同的适体，使得暴露于多种不同的小分子配体调节靶基因表达。

本发明的多核苷酸盒可与用于调控靶基因表达的其他机制组合使用。在一个实施方案中，本发明的多核苷酸盒与基因调控盒组合使用，所述基因调控盒通过可变剪接的适体介导的调控来调节靶基因表达，如WO 2016/126747中所述，所述文献以引用方式并入本文。本发明还可与PCT/US2017/016303和PCT/US1207/016279中描述的多核苷酸构建体和方法组合，所述文献通过引用并入本文。

治疗方法和药物组合物

本发明的一个方面提供调控通过基因疗法递送的治疗性蛋白质的水平的方法。在此实施方案中，“靶基因”可编码治疗性蛋白质。“靶基因”可编码对细胞来说内源或外源的蛋白质。

含有具有适体驱动的核糖开关的调控盒的治疗性基因序列例如通过载体递送至体外或离体的靶细胞。“靶基因”的细胞特异性可受启动子或载体内的其他元件控制。含有靶基因和多核苷酸盒的载体构建体的递送以及对靶组织进行转染从而产生被调控靶基因的稳定转染通常是产生治疗性蛋白质的第一步。

然而，由于靶基因序列内存在调控盒，靶基因不以显著水平表达(或以较低水平表达)，即，它在不存在结合到调控盒核糖开关内含有的适体的特异性配体的情况下处于“关闭状态”。仅当施用适体特异性配体(或以其他方式以足够量存在)时，才活化或增加靶基因表达。

含有靶基因与多核苷酸盒的载体构建体的递送和活化配体的递送通常在时间上是隔开的。活化配体的递送将控制靶基因何时被表达以及蛋白质表达的水平。可通过许多途径来递送配体，包括但不限于经口、肌肉内(IM)、静脉内(IV)、眼内或局部。

配体的递送时间将取决于靶基因的活化要求。例如，如果持续需要由靶基因编码的治疗性蛋白质，可每天或一天多次递送经口小分子配体，以确保靶基因的持续激活，并且因此确保治疗性蛋白质的持续表达。如果靶基因具有长效作用，那么可较不频繁地给予诱导配体。

本发明允许以由对调控多核苷酸盒的核糖开关内的适体具特异性的配体的按时给药决定的方式在时间上控制治疗性转基因的表达。仅在配体施用时增加的治疗性转基因表达通过允许靶基因在不存在配体的情况下关闭而增加基因疗法治疗的安全性。

不同的适体可用于允许不同的配体活化靶基因。在本发明的某些实施方案中，含有调控盒的每种治疗性基因将在盒内具有特异性适体，所述特异性适体将由特异性小分子活化。这意味着各治疗性基因仅能被对其中所容纳的适体具特异性的配体活化。在这些实施方案中，各配体将仅活化一种治疗性基因。这使得有可能可将若干不同的“靶基因”递送至一个个体，并且各自将在递送对各靶基因中所容纳的调控盒内所含的适体具特异性的配体后被活化。

本发明允许任何其基因可以递送至身体的治疗性蛋白质(例如促红细胞生成素(EPO)或治疗性抗体)在递送活化配体时由身体产生。此治疗性蛋白质递送方法可代替在身体外部制造此类治疗性蛋白质然后注射或输注所述治疗性蛋白质，例如用于癌症中或用于阻断炎性或自身免疫疾病的抗体。含有受调控的靶基因的身体变成生物制剂制造工厂，当施用基因特异性配体时，所述生物制剂制造工厂开启。

治疗性蛋白质的给药水平和给药时间对治疗效果来说可为重要的。例如，在用于癌症的阿瓦斯汀(抗VEGF抗体)的递送中。本发明增加了响应于对治疗性蛋白质水平和效果的监测进行给药的容易性。

在一个实施方案中，靶基因可编码可靶向和编辑特定DNA序列的核酸酶。此类核酸酶包括Cas9、含锌指核酸酶或TALEN。在这些核酸酶的情况下，可能仅在足以编辑靶内源性基因的短的时间段内需要核酸酶蛋白质。然而，如果将未调控的核酸酶基因递送至体内，那么在细胞的剩余寿命中此蛋白质可能都存在。在核酸酶的情况下，核酸酶存在的时间越长，存在脱靶编辑的风险越高。此类蛋白质的表达的调控具有显著的安全性优点。在此情况下，可将含有含调控盒的核酸酶靶基因的载体递送至体内适当的细胞。在不存在盒特异性配体的情况下，靶基因处于“关闭”状态，因此不产生核酸酶。仅当施用活化配体时，才产生核酸酶。当经过足够的时间，允许发生足够的编辑时，将配体撤出并且不再施用。因此，核酸酶基因因而处于“关闭”状态，并且不再产生核酸酶，并且编辑停止。可使用此方法来克服遗传病状，包括许多遗传性视网膜病变，诸如由CEP290的突变引起的LCA10以及由ABCA4的突变引起的斯特格氏病(Stargardt’s Disease)。

可利用仅在特异性配体施用后被活化的编码治疗性蛋白质的受调控靶基因的施用来调控治疗性基因以治疗许多不同类型的疾病，例如用治疗性抗体治疗癌症，用免疫调节蛋白或抗体治疗免疫病症、代谢疾病、用抗C5抗体或抗体片段作为受调控基因治疗诸如PNH的罕见疾病或用治疗性抗体治疗眼血管生成，以及用免疫调节蛋白治疗干性AMD。

允许治疗多种特定疾病和病状的多种特异性靶基因适用于本发明中。例如，可使用胰岛素或胰岛素类似物(优选人胰岛素或人胰岛素类似物)作为治疗I型糖尿病、II型糖尿病或代谢综合征的靶基因；可使用人生长激素作为治疗具有生长障碍的儿童或缺乏生长激素的成年人的靶基因；可使用促红细胞生成素(优选人促红细胞生成素)作为治疗因慢性肾病引起的贫血、因脊髓发育不良引起的贫血或因癌症化疗引起的贫血的靶基因。

本发明可特别适于治疗由单一基因缺陷引起的疾病，诸如囊性纤维化、血友病、肌肉萎缩症、地中海贫血或镰状细胞性贫血。因此，可使用人β-球蛋白、γ-球蛋白、δ-球蛋白或ζ-球蛋白作为治疗β-地中海贫血或镰状细胞性贫血的靶基因；可使用人因子VIII或因子IX作为治疗血友病A或血友病B的靶基因。

通常将本发明中所用的配体与一种或多种药学上可接受的载体组合以形成适合向患者施用的药物组合物。药学上可接受的载体包括通常用于制药领域中的溶剂、粘合剂、稀释剂、崩解剂、润滑剂、分散介质、涂料、抗细菌和抗真菌剂、等渗和吸收延迟剂等。药物组合物可呈片剂、丸剂、胶囊、锭剂等形式，并且被配制成与其预期施用途径相容。施用途径的实例包括肠胃外，例如静脉内、真皮内、鼻内、皮下、经口、吸入、经真皮(局部)、经粘膜以及经直肠。

以一种给药方案向患者施用包含配体的药物组合物，使得足以适当调控靶基因的量的配体被递送至患者。当配体为小分子并且剂型为片剂、胶囊等时，优选地，药物组合物包含0.1 mg至10 g的配体；0.5 mg至5 g的配体；1 mg至1 g的配体；2 mg至750 mg的配体；5mg至500 mg的配体；或10 mg至250 mg的配体。

可每天一次或每天多次(例如每天2、3、4、5或更多次)给予药物组合物。可替代地，可少于每天一次给予药物组合物，例如每2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13或14天一次或每月一次或每几个月一次。在本发明的一些实施方案中，可仅少数的几次向患者施用药物组合物，例如一次、两次、三次等。

本发明提供治疗需要调控由靶基因编码的治疗性蛋白质的表达的患者的方法。所述方法包括向患者施用包含针对适体的配体的药物组合物，其中先前已为患者施用了包含靶基因的重组载体，其中靶基因含有本发明的基因调控盒，所述本发明的基因调控盒提供由适体的配体通过一种或多种多腺苷酸化信号的可及性调控靶基因表达的能力。配体的施用增加治疗性蛋白质的表达。

制品和试剂盒

还提供用于本文中所描述的方法中的试剂盒和制品。在多个方面中，试剂盒包含在适合的包装中的本文中所描述的组合物(例如用于递送包含含有基因调控盒的靶基因的载体的组合物)。适合于本文中所描述的组合物(诸如注射用眼用组合物)的包装为本领域中已知的，并且包括例如小瓶(诸如密封小瓶)、容器、安瓿、瓶、罐、软包装(例如密封的麦拉(Mylar)或塑料袋)等。可进一步对这些制品进行灭菌和/或密封。

本发明还提供包含本文中所描述的组合物的试剂盒，并且可进一步包含关于使用组合物的方法，诸如本文中所描述的用途的说明。本文中所描述的试剂盒可进一步包括从商业和用户观点来看理想的其他材料，包括其他缓冲液、稀释剂、过滤器、针头、注射器以及带有用于进行施用(包括例如本文中所描述的任何方法)的说明的包装插页。例如，在一些实施方案中，试剂盒包括用于包含本发明的基因调控盒的靶基因的表达的rAAV、适合于注射的药学上可接受的载体以及以下中的一种或多种：缓冲液、稀释剂、过滤器、针头、注射器以及带有用于进行注射的说明的包装插页。在一些实施方案中，试剂盒适用于眼内注射、肌肉内注射、静脉内注射等。

如本文中所用的“同源性”和“同源的”是指在两个多核苷酸序列之间或在两个多肽序列之间的同一性百分比。一个序列与另一个序列之间的对应关系可通过本领域中已知的技术来确定。例如，可通过比对序列信息并且使用可轻易获得的计算机程序直接比较两个多肽分子来确定同源性。当在适当插入或缺失的情况下进行最佳比对之后，如使用上述方法所确定，在确定长度的分子上分别至少约80%、至少约85%、至少约90%以及至少约95%的核苷酸或氨基酸匹配时，两个多核苷酸或两个多肽序列为彼此“基本上同源的”。

相对于参考多肽或核酸序列的“序列同一性百分比”定义为在比对序列并且引入空隙(如果有必要)以实现最大序列同一性百分比之后，候选序列中与参考多肽或核酸序列中的氨基酸残基或核苷酸同一的氨基酸残基或核苷酸的百分比。出于确定氨基酸或核酸序列同一性百分比的目的而进行的比对可以普通技术人员已知的方式来实现，例如使用公开可用的计算机软件程序，包括BLAST、BLAST-2、ALIGN以及Megalign (DNASTAR)软件。

如本文中所用的术语“多核苷酸”或“核酸”是指任何长度的核苷酸(核糖核苷酸或脱氧核糖核苷酸)聚合形式。因此，此术语包括但不限于单链、双链或多链DNA或RNA、基因组DNA、cDNA、DNA-RNA杂交体或包含嘌呤和嘧啶碱基或其他天然、化学或生物化学修饰、非天然或衍生核苷酸碱基的聚合物。

“异源的”或“外源的”意指来源于基因型不同于相比较或引入或掺入其中的实体的其余部分的实体。例如，通过基因工程技术引入不同细胞类型的多核苷酸为异源多核苷酸(并且当被表达时可编码异源多肽)。类似地，掺入病毒载体中的细胞序列(例如基因或其部分)相对于载体为异源核苷酸序列。

应了解并且预期，本领域技术人员可对本文中所公开的本发明原理作出改变，并且此类修改旨在被包括在本发明范围内。以下实施例进一步说明本发明，但不应被解释为以任何方式限制本发明的范围。本文中所引用的所有参考文献以全文引用方式并入本文。

实施例

实施例1. 通过多聚A信号元件AATAAA的可及性的适体-介导的调节来调控靶基因表达。

实验程序：

质粒构建体：pEGFP-C1载体(Clontech)中的EGFP基因被萤火虫萤光素酶基因编码序列置换，以产生pFLuc-SV40载体，其含有SV40早期多腺苷酸化信号序列。合成(IDT) DNA区段，其含有xpt-鸟嘌呤适体、效应物茎环结构和SV40早期多聚A序列的序列。合成的DNA片段用HpaI和MluI限制酶消化，并克隆至用HpaI和MluI消化的pFLuc-SV40。构建体序列通过DNA测序验证(Genewiz)。

转染和适体配体处理：在转染前一天，将3.5 x10⁴个HEK 293细胞铺板到96-孔平底板中。将质粒DNA (500 ng)加入管或96-孔U-底板中。单独地，将TransIT-293试剂(Mirus; 1.4 µl)加入50 µl opti-mem I培养基(Life Technologies)，和使之在室温(“RT”)下放置5分钟。然后，将50 µl这种稀释的转染试剂加入DNA中，混合和在RT下孵育20min。最后，将7 µl该溶液加入96-孔板的细胞孔中。转染后4小时，吸出培养基，和加入新培养基，其含有(i) DMSO (0.5%)或500 µM鸟苷；或(ii) NaOH (2mM)作为溶剂对照或500 µM鸟嘌呤。诱导倍数表示为在存在适体配体时获得的萤光素酶活性除以在不存在适体配体时获得的值的商。

培养细胞的萤火虫萤光素酶测定：培养基更换后24小时，将板从培养箱中移出，和在实验台上平衡至RT数分钟，然后吸出。加入Glo-裂解缓冲液(Promega, 100 µL, RT)，和使板在RT下保持至少5分钟。然后，孔内容物通过50 µL研磨混合，和20 μL各样品与20 µL已在glo-裂解缓冲液中稀释至10%的bright-glo试剂(Promega)混合。将96个孔在不透明白色384-孔板上隔开。在RT下5分钟孵育后，使用Tecan机器以500 mSec读数时间测量发光。萤光素酶活性表示为平均相对光单位(RLU)±S.D。

转染和测量GFP荧光：在转染前一天，将3.5 x10^4个HEK 293细胞铺板到96-孔平底板中。将质粒DNA (500 ng)加入管或96-孔U-底板。单独地，将TransIT-293试剂(Mirus;1.4 µl)加入50 µl Opti-mem I培养基(Life Technologies)，和使之在RT下放置5分钟。然后，将50 µl这种稀释的转染试剂加入DNA中，混合和在RT下孵育20 min。最后，将7 µl该溶液加入96-孔板的细胞孔中。通过Tecan读板器，使用激发波长484 nm、发射波长510 nm和激发带宽5 nm，测量GFP荧光强度。GFP荧光强度表示为GFP构建体产生的值减去没有转染的细胞产生的值。

结果：

在mRNA的3′末端的多腺苷酸化尾在mRNA稳定性、核输出和翻译效率方面起重要作用。为了调控前-mRNA多腺苷酸化的过程，从而调控靶基因表达，开发了调节多腺苷酸化序列元件AATAAA (或其密切变体)或富含T或GT的下游序列元件(DSE)的可及性的策略。

在一种策略(策略1)中，如图1a和1b所示，茎-环结构(效应物茎环)，其中AATAAA多腺苷酸化信号序列元件嵌入茎-环形成结构(效应物茎-环)的茎中。通过含有与5′适体茎臂的一部分互补和与效应物茎-环的3′茎臂的一部分互补的序列的共有茎臂，适体的3′末端连接该茎环形成结构的5′末端(参见例如，图1a和1b)。在这种配置中，在不存在适体配体时，茎-环结构隔离AATAAA元件，从而抑制多腺苷酸化和基因表达。然而，在存在适体配体时，适体/配体结合导致形成适体P1茎，从而破坏茎-环结构，这导致AATAAA元件从隔离中释放和随后的基因表达。因此，遗传元件的这种配置产生适体配体-响应性打开-核糖开关。

该策略使用具有SV40早期多聚A序列的xpt-鸟嘌呤适体测试，其中在SV40 3′ UTR中AATAAA元件上游的序列显示对于多腺苷酸化是不可缺少的。使用该策略，产生4种构建体，即ATA_Gua_1至4 (SEQ ID NO: 1–4)，各自具有连接至茎-环结构的5′末端的相同xpt-鸟嘌呤适体序列和嵌入茎-环结构的茎中的AATAAA序列元件。我们合理认为，茎-环结构的茎的长度和序列组成可影响茎-环结构的稳定性，因此影响隔离的AATAAA元件对于基因表达的可用性。因此，在每个构建体中分别产生9、10、12和14个碱基对(bp)茎。适体P1茎是8bp。如图1c所示，在不存在适体配体鸟苷时，来自所有构建体的萤光素酶活性大约类似，和低于对照构建体pFLuc-SV40 (数据未显示)，表明AATAAA元件被茎-环结构隔离。与DMSO处理的(对照)样品相比，在鸟苷处理时，每个构建体显示提高的萤光素酶活性，其中ATA_Gua_1产生6.7-倍诱导。

这些构建体进一步使用鸟嘌呤作为适体配体进行测试。如图1d所示，在不存在鸟嘌呤处理时，构建体ATA_Gua_1至4的基础水平表达降低，其中ATA_Gua_4具有最低的基础表达(pFLuc对照载体的16%)。与没有鸟嘌呤的样品相比，在鸟嘌呤处理时，萤光素酶表达提高，对于所有构建体产生大约2.5倍诱导。

这些核糖开关构建体(策略1)还用于调控GFP表达。ATA_Gua_2和4构建体，其具有相对较低的萤光素酶基因基础水平表达(图1c、1d)，用于产生pEGFP_ATA_Gua_2和4构建体。如图1e所示，在不存在鸟嘌呤处理时，与pEGFP-C1构建体相比，GFP表达降低。鸟嘌呤处理产生GFP表达增加到1.5和1.6倍(分别对于ATA_Gua_2和ATA_Gua_4构建体)。然而，对照构建体不具有响应于鸟嘌呤处理的GFP表达增加。

该数据表明，配体-响应性哺乳动物打开-核糖开关通过邻近的适体调节在茎-环结构中多腺苷酸化信号序列元件的可及性，有效调控靶基因表达。可通过优化适体P1茎和效应物茎-环结构的茎的长度和序列，通过降低构建体的基础表达水平和增加其诱导的靶基因表达提高诱导倍数。在这种测试的遗传元件配置中，利用鸟嘌呤适体和SV40早期多聚A序列。类似策略可用于在调节各种多聚A序列(包括合成的多聚A序列)中使用各种适体产生核糖开关。

实施例2. 通过下游序列元件的可及性，通过适体/配体介导的多腺苷酸化来调节靶基因表达。

实验程序：如实施例1所述。

结果：

开发另一种策略(策略2)以通过调节富含T或GT的下游序列元件(DSE)的可及性来调节多腺苷酸化。在该策略中，如图2a所示，产生茎-环结构，其中DSE序列嵌入茎-环结构的茎中。适体序列连接至该茎-环结构的3′末端，茎-环结构的3′末端之后是茎-环结构的3′臂的互补序列。在这种配置中，在不存在适体配体时，茎-环结构隔离DSE序列，抑制多腺苷酸化，从而抑制基因表达。然而，在存在适体配体时，适体/配体结合导致形成适体P1茎，破坏效应物茎-环结构和DSE序列从隔离中释放，并允许基因表达。因此，类似于实施例1中显示的策略，这种遗传元件配置产生适体配体-响应性打开-核糖开关。

这种策略使用具有SV40早期多聚A序列的xpt-鸟嘌呤适体测试，其中DSE序列与SV40 3′ UTR中的AATAAA元件一起显示负责前-mRNA多腺苷酸化。使用该策略，产生4种构建体，即DSE_Gua_1至4 (SEQ ID NO: 5–8)，各自具有连接至茎-环结构的3′末端的相同xpt-鸟嘌呤适体序列，其中DSE序列嵌入茎-环结构的茎中。我们合理认为，茎-环结构的茎的长度和序列组成可影响茎-环结构的稳定性，因此影响隔离的DSE序列对于基因表达的可用性。因此，在每个这些构建体中分别产生9、10、12和14个碱基对(bp)茎。8 bp或9 bp的适体P1茎用于这些构建体。如图2b所示，在不存在适体配体鸟苷时，来自构建体DSE_Gua_1至3的萤光素酶活性大约类似(DSE_Gua_4最低)，低于对照构建体pFLuc-SV40 (数据未显示)，表明在不存在适体配体时DSE元件被茎-环结构隔离。然而，与DMSO处理的样品相比，在鸟苷处理时，每个构建体显示提高的萤光素酶活性，其中例如，DSE_Gua_2产生3.7-倍诱导。

这些构建体还使用鸟嘌呤作为适体配体进行测试。如图2c所示，在不存在鸟嘌呤处理时，与对照构建体pFLuc相比，对于构建体DSE_Gua_1至3，萤光素酶活性降低了大约68%，和对于构建体DSE_Gua_4，萤光素酶活性降低了大约80%。与没有鸟嘌呤处理的样品相比，在存在鸟嘌呤时，对于所有构建体，萤光素酶表达增加到大约2.4倍。通过优化茎-环结构的茎以及适体P1茎的长度和序列，通过降低构建体的基础水平表达和增加其诱导的基因表达，诱导倍数可进一步提高。这些数据进一步表明产生适体配体-响应性哺乳动物打开-核糖开关，其通过适体调节多腺苷酸化序列元件的可及性，调控基因表达。在这种测试的遗传元件配置中，使用鸟嘌呤适体和SV40早期多聚A序列。类似策略可用于产生在调节各种多聚A序列(包括合成的多聚A序列)中含有各种适体的核糖开关。

实施例3. 使用鸟嘌呤适体来调节在3’UTR中合成的多聚A序列元件的可及性。

实验程序：

质粒构建：合成(IDT) DNA片段，其含有合成的多聚A (SPA) (Levitt, N. etal., Definition of an efficient synthetic poly(A) site, Genes & Development.1989; 3:1019-1025, 通过引用并入本文)或来自pGLuc-Basic_2 (NEB)的SPA (这里称为mtSPA)的序列，或xpt-鸟嘌呤适体、茎环结构和合成的多聚A序列。将合成的DNA片段用XhoI和NheI限制酶消化，并克隆至用XhoI和XbaI消化的Con8构建体，以产生Con8-SPA (SEQ IDNO: 9)、SPA_ATA_Gua (SEQ ID NO: 10)、SPA_DSE_Gua (SEQ ID NO: 11)、mtCon8-SPA(SEQ ID NO: 12)和mtSPA_ATA_Gua (SEQ ID NO: 13)。构建体序列通过DNA测序验证(Genewiz)。

培养细胞的转染、适体配体处理和萤光素酶测定：如实施例1所述。

结果：

通过SV40多聚A序列的可及性的适体-介导的调节来调控靶基因表达在实施例1和2中得到证实。适体-调节的多腺苷酸化，还使用合成的多聚A序列(SPA)测试。使用与实施例1证实的相同策略，产生构建体SPA_ATA_Gua，其中xpt-鸟嘌呤适体序列连接至茎-环结构的5′末端和合成的多聚A序列的AATAAA序列元件嵌入茎-环结构的茎中。构建体SPA_DSE_Gua也使用与实施例2证实的相同策略产生。如图3所示，在不存在鸟嘌呤处理时，茎-环结构和xpt-鸟嘌呤适体的连接不导致在SPA_ATA_Gua构建体中萤光素酶活性减少，表明在茎-环中合成的多聚A序列的AATAAA序列元件的无效隔离。为了解决这一点，使用另一个SPA序列(mtSPA)，其具有2 nt差异，但与Con8-SPA相比显示类似的功能。为了加强茎，将2 GC碱基对与7 nt的多聚A序列和其互补序列一起加入茎中，产生9bp茎。在不存在鸟嘌呤处理时，与mtCon8-SPA相比，用这种mtSPA_ATA_Gua构建体，萤光素酶活性的基础水平表达降低。然而，与没有鸟嘌呤处理的样品相比，在存在鸟嘌呤处理时，萤光素酶活性略微上调至1.7倍。用构建体SPA_DSE_Gua，xpt-鸟嘌呤适体序列连接至茎-环结构的3′末端，其中DSE序列嵌入茎-环结构的茎中。如图3所示，与没有鸟嘌呤处理的样品相比，鸟嘌呤处理上调SPA_DSE_Gua构建体的萤光素酶活性至1.9倍。这些结果证实，通过调节多聚A序列元件的可及性的靶基因表达的可调控性。

实施例4. 调节茎-环结构的环序列以提高基于多聚A的核糖开关的可调控性。

实验程序：如实施例1所述。

结果：

用实施例1和2中的具有连接至多聚A序列的茎环结构和适体的所有构建体，萤光素酶的基础水平表达降低至对照载体的20-45%。尽管诱导的靶基因表达水平最大达到对照构建体的80%，但基础水平表达导致诱导倍数更低。为了降低基础表达，茎-环结构可被加强或稳定以在不存在适体/配体结合时有效隔离或封锁AATAAA或DSE序列元件。为了加强茎-环结构的稳定性，测试茎-环结构的环的序列组成对萤光素酶基因的基础水平表达的影响。在ATA_Gua_1中GAAA环序列被更稳定的环序列TTCG置换(V.P. Antao, S. Y. Lai和I.Tinoco, A thermodynamic study of unusually stable RNA和DNA hairpins. NucleicAcids Research. 1991; 19(21):5901-5905)，产生构建体Stbl_ATA_Gua_1 (SEQ ID NO:14)。如图4所示，在不存在鸟嘌呤处理时，与ATA_Gua_1比较，Stbl_ATA_Gua_1表达更低的萤光素酶活性，表明AATAAA信号的隔离改进。然而，在存在鸟嘌呤处理时，对于Stbl_ATA_Gua_1诱导的萤光素酶活性类似于ATA_Gua_1，由此产生更高的诱导倍数。相比之下，含有GAAT环的构建体gaat_ATA_Gua_1 (SEQ ID NO: 15)表达比ATA_Gua_1或stbl_ATA_Gua_1更高的基础水平萤光素酶，产生比这两种构建体略微更低的诱导倍数。这些结果表明，通过更改茎-环结构可实现更严格的靶基因调控。

实施例5. 同时调节3′ UTR中多聚A序列的AATAAA和DSE二者的可及性。

实验程序：

合成含有ATA_Gua_1和DSE_Gua_1开关的序列，并将其克隆至HpaI和MluI消化的pFLuc载体以产生ATA_DSE_Gua构建体(SEQ ID NO: 16)。

培养细胞的转染和萤光素酶测定：如实施例1所述。

结果：

用于调控靶基因表达的第三种策略(策略3)，如图5a所示，通过组合策略1和策略2开发，从而同时调节AATAAA和DSE序列二者的可及性。在这种配置中，在不存在适体配体时，AATAAA和DSE序列二者被茎-环结构隔离，因此基因表达受到抑制。每个茎-环结构连接至可响应相同或不同的配体分子的适体序列。同时封锁两种必需的多聚A序列元件可在不存在配体时降低基因表达的基础水平。在存在适体配体时，适体/配体结合促进形成适体P1茎，破坏茎-环结构以及AATAAA和DSE序列二者从隔离中释放。在这种配置中，仅在两种适体的配体存在时基因可有效表达，潜在地允许更严格的靶基因表达调控。

事实上，如图5b所示，在不存在鸟嘌呤处理时，通过茎-环结构隔离AATAAA和DSE序列二者(ATA_DSE_Gua)进一步降低萤光素酶表达至对照构建体pFLuc的20%，而ATA_Gua_1和DSE_Gua_1分别降低至45%和35%。与未处理的样品相比，在存在鸟嘌呤处理时，在ATA_DSE_Gua样品中萤光素酶活性恢复至大约2.1倍，表明更严格的基因调控。

实施例6. 组合使用基于多聚A的核糖开关和第二个核糖开关以提高靶基因可调控性。

实验程序：

使用Golden Gate克隆策略，将G15核糖开关盒(参见WO 2016/126747的实施例5和8和SEQ ID NO: 46，通过引用并入本文)或没有适体的对照盒克隆至 pFLuc以产生pFLuc-G15或pFLuc-Con1。为产生构建体pFLuc-G15_ATA_Gua，通过HpaI和MluI消化将含有鸟嘌呤适体、茎环结构和SV40多聚A序列的片段从ATA_Gua_1构建体释放和克隆至用相同的限制酶消化的pFLuc-G15构建体。

培养细胞的转染和萤光素酶测定：如实施例1所述。

结果：

含有ATA_Gua和DSE_Gua核糖开关的表达构建体具有一定程度的靶基因基础表达。串联组合使用这些开关与第二个开关可紧缩基础表达和因此提高基因可调控性。

为了证实这一点，G15核糖开关与基于多聚A的核糖开关组合。G15核糖开关基于xpt-鸟嘌呤适体-调节的可变剪接机制和具有一定基础水平表达，其减少响应于适体配体鸟嘌呤处理的诱导倍数。为了降低来自pFLuc-G15构建体的基础水平表达，多聚A序列用ATA_Gua_1置换，产生pFLuc-G15-ATA_Gua构建体(图6a)。如图6b所示，在不存在适体配体(鸟嘌呤)时，与pFLuc-Con1对照构建体相比，pFLuc-G15的萤光素酶基础水平表达显著降低。pFLuc-G15-ATA_Gua，具有双重开关的构建体，与pFLuc-G15相比进一步降低了基础水平表达。在存在鸟嘌呤处理时，诱导的萤光素酶活性水平略微低于pFLuc-G15，但与来自ATA_Gua_1构建体的诱导的萤光素酶活性相同，产生比ATA_Gua_1和pFLuc-G15构建体二者更高的诱导倍数(图6b)。

这些结果证实，通过串联组合具有较高基础水平表达的两个开关，可产生更严格的开关。在这种双重开关中的适体可以是结合相同或不同配体的相同或不同适体(如此处证实的)，或响应不同的配体的适体。

实施例7. 使用腺嘌呤适体来调节3′UTR中的多聚A序列元件AATAAA的可及性。

实验程序：

质粒构建：合成(IDT) DNA片段，其含有腺嘌呤适体ydhl-A (M. Mandal和R.R.Breaker, Adenine riboswitches and gene activation by disruption of atranscription terminator.Nature Structural & Molecular Biology. 2004; 11:29-35, 通过引用并入本文)、茎环结构和SV40早期多聚A序列的序列。合成的DNA片段用HpaI和MluI限制酶消化，并克隆至用HpaI和MluI消化的pFLuc-SV40。构建体序列通过DNA测序验证(Genewiz)。

培养细胞的转染和萤光素酶测定：如实施例1所述。

转染后4小时，吸出培养基，和加入含NaOH (1 mM)或1 mM腺嘌呤(Calbiochem)的新培养基。诱导倍数表示为在存在适体配体时获得的萤光素酶活性除以在不存在适体配体时获得的值的商。

结果：

研究了使用另外的适体/配体对以控制靶基因表达。用与实施例1证实的相同策略，插入茎-环(SL)结构(稳定的TTCG环)，其中AATAAA序列元件嵌入SL结构的9bp茎中。向该SL结构的5′末端，SL结构的5′臂的互补序列(之后是腺嘌呤适体ydhl-A序列)插入在3′ UTR中，产生构建体ATA_Ydhl (SEQ ID NO: 17)。在该构建体中，ydhl适体P1茎的长度是10 bp。如图7所示，在不存在腺嘌呤处理时，ATA_Ydhl构建体表达降低水平的萤光素酶，为对照pFLuc构建体的大约52%，推测可能通过封锁AATAAA序列元件的可及性导致。与没有腺嘌呤处理的样品相比，在存在腺嘌呤时，萤光素酶表达提高，至在存在腺嘌呤处理时对照pFLuc构建体的大约82%。通过适体-不相关的机制，在对照构建体中腺嘌呤处理增加萤光素酶活性到2.5倍。然而，ATA_ydhl构建体导致萤光素酶表达增加到4.0倍，表明腺嘌呤/适体的特定作用。

Claims (46)

1.用于调控靶基因的表达的多核苷酸盒，其包含核糖开关，其中所述核糖开关包含效应物茎环和适体，其中所述效应物茎包含多腺苷酸化信号，其中所述适体和效应物茎环通过可替代共有茎臂连接，所述可替代共有茎臂包含与适体茎的非共有臂中的序列和效应物茎环的非共有臂中的序列均互补的序列，其中在结合适体的配体存在时，由效应物茎环形成的茎-环结构是不利的，并且多腺苷酸化信号是可获得的，允许多腺苷酸化发生，导致靶基因表达提高，并且其中所述多腺苷酸化信号是AATAAA或ATTAAA，或下游元件(DSE)。

2.权利要求1的多核苷酸盒，其中所述适体结合小分子配体。

3.权利要求1的多核苷酸盒，其中与适体茎的非共有臂中的序列和效应物茎环的非共有臂中的序列均互补的可替代共有茎臂的部分是4-8个核苷酸。

4.权利要求1的多核苷酸盒，其中与适体茎的非共有臂中的序列和效应物茎环的非共有臂中的序列均互补的可替代共有茎臂的部分是5-7个核苷酸。

5.权利要求1的多核苷酸盒，其中与适体茎的非共有臂中的序列和效应物茎环的非共有臂中的序列均互补的可替代共有茎臂的部分是5个核苷酸。

6.权利要求1的多核苷酸盒，其中与适体茎的非共有臂中的序列和效应物茎环的非共有臂中的序列均互补的可替代共有茎臂的部分是6个核苷酸。

7.权利要求1的多核苷酸盒，其中所述适体茎是6-12个碱基对。

8.权利要求1的多核苷酸盒，其中所述适体茎是7-10个碱基对。

9.权利要求1的多核苷酸盒，其中所述适体茎是8个碱基对。

10.权利要求1的多核苷酸盒，其中所述适体茎是9个碱基对。

11.权利要求1的多核苷酸盒，其中所述效应物茎环的茎是4-24个碱基对。

12.权利要求1的多核苷酸盒，其中所述效应物茎环的茎是5-20个碱基对。

13.权利要求1的多核苷酸盒，其中所述效应物茎环的茎是9-14个碱基对。

14.权利要求1的多核苷酸盒，其中所述效应物茎环的茎是9个碱基对。

15.权利要求1的多核苷酸盒，其中所述效应物茎环的茎是10个碱基对。

16.权利要求1的多核苷酸盒，其中所述效应物茎环的茎是11个碱基对。

17.权利要求1的多核苷酸盒，其中所述效应物茎环的茎是12个碱基对。

18.权利要求1-17中任一项的多核苷酸盒，其中所述效应物茎环位于适体的3′，使得可替代共有茎臂包含适体茎的3′臂和效应物茎的5′臂。

19.权利要求1-17中任一项的多核苷酸盒，其中所述效应物茎环位于适体的5′，使得可替代共有茎臂包含适体茎的5′臂和效应物茎的3′臂。

20.权利要求18的多核苷酸盒，其中所述多腺苷酸化信号是AATAAA或ATTAAA。

21.权利要求19的多核苷酸盒，其中所述多腺苷酸化信号是AATAAA或ATTAAA。

22.权利要求18的多核苷酸盒，其中所述多腺苷酸化信号是下游元件(DSE)。

23.权利要求19的多核苷酸盒，其中所述多腺苷酸化信号是下游元件(DSE)。

24.权利要求1-17中任一项的多核苷酸盒，其中所述多核苷酸盒包含两个核糖开关，其中第一个核糖开关的效应物茎环包含多腺苷酸化信号AATAAA或ATTAAA，和第二个核糖开关的效应物茎环包含下游元件(DSE)。

25.权利要求24的多核苷酸盒，其中所述两个核糖开关各自包含结合相同配体的适体。

26.权利要求24的多核苷酸盒，其中所述两个核糖开关包含结合不同配体的不同适体。

27.一种调节靶基因的表达的方法，其包括：

a. 将一个或多个权利要求1-17中任一项的多核苷酸盒插入靶基因的3′非翻译区中，

b. 将包含多核苷酸盒的靶基因引入细胞中，和

c. 将细胞暴露于有效增加靶基因的表达的量的结合适体的配体。

28.权利要求27的方法，其中所述配体是小分子。

29.权利要求27的方法，其中所述效应物茎环位于适体的3′，使得可替代共有茎臂包含适体茎的3′臂和效应物茎的5′臂。

30.权利要求27的方法，其中所述效应物茎环位于适体的5′，使得可替代共有茎臂包含适体茎的5′臂和效应物茎的3′臂。

31.权利要求29的方法，其中所述多腺苷酸化信号是AATAAA或ATTAAA。

32.权利要求30的方法，其中所述多腺苷酸化信号是AATAAA或ATTAAA。

33.权利要求29的方法，其中所述多腺苷酸化信号是下游元件(DSE)。

34.权利要求30的方法，其中所述多腺苷酸化信号是下游元件(DSE)。

35.权利要求28的方法，其中将两个核糖开关插入靶基因的3′ UTR中，其中第一个核糖开关的效应物茎环包含多腺苷酸化信号AATAAA或ATTAAA，和第二个核糖开关的效应物茎环包含下游元件(DSE)。

36.权利要求35的方法，其中所述两个核糖开关各自包含结合相同配体的适体。

37.权利要求35的方法，其中所述两个核糖开关包含结合不同配体的不同适体。

38.权利要求35的方法，其中所述两个核糖开关包含相同的适体。

39.权利要求27-38中任一项的方法，其中将包含多核苷酸盒的靶基因掺入用于表达靶基因的载体。

40.权利要求27-38中任一项的方法，其中所述靶基因进一步包含基因调控盒，所述基因调控盒通过可变剪接的适体-介导的调控来调节靶基因表达。

41.权利要求39的方法，其中所述载体是病毒载体。

42.权利要求41的方法，其中所述病毒载体选自腺病毒载体、腺相关病毒载体和慢病毒载体。

43.一种载体，其包含含有权利要求1-26中任一项的多核苷酸盒的靶基因。

44.权利要求43的载体，其中所述载体是病毒载体。

45.权利要求44的载体，其中所述病毒载体选自腺病毒载体、腺相关病毒载体和慢病毒载体。

46.权利要求43的载体，其中所述靶基因进一步包含基因调控盒，所述基因调控盒通过可变剪接的适体-介导的调控来调节靶基因表达。