ES2871533T3 - Composiciones para modular la expresión de Tau - Google Patents
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Abstract
Un oligonucleótido modificado, o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, que consiste en 12 a 30 nucleósidos unidos, donde el oligonucleótido modificado tiene una secuencia de nucleobases que comprende al menos 8 nucleobases consecutivas de la secuencia de nucleobases de SEQ ID NO: 1634, donde la secuencia de nucleobases del oligonucleótido modificado es al menos un 90 % complementaria a la SEQ ID NO: 1 y donde el oligonucleótido modificado es capaz de reducir la expresión de Tau.
Description
DESCRIPCIÓN
Composiciones para modular la expresión de Tau
Campo
En esta invención se describen composiciones y procedimientos para reducir la expresión de proteína y ARNm de Tau en un animal. Dichos procedimientos son útiles para tratar, prevenir o mejorar enfermedades neurodegenerativas, incluidas tauopatías, enfermedad de Alzheimer, demencia frontotemporal (FTD, por sus siglas en inglés), FTDP-17, parálisis supranuclear progresiva (PSP, por sus siglas en inglés), encefalopatía traumática crónica (CTE, por sus siglas en inglés), degeneración ganglionar corticobasal (CBD, por sus siglas en inglés), epilepsia y síndrome de Dravet al inhibir la expresión de Tau en un animal.
Antecedentes
La función principal de Tau es unirse a los microtúbulos y estabilizarlos, que son componentes estructurales importantes del citoesqueleto implicados en la mitosis, la citocinesis y el transporte vesicular. Tau se encuentra en múltiples tejidos, pero es particularmente abundante en axones de neuronas. En los seres humanos, hay seis isoformas de Tau que se generan mediante el corte y empalme alternativo de los exones 2, 3 y 10. El corte y empalme de los exones 2 y 3 en el extremo N de la proteína conduce a la inclusión de cero, uno o dos dominios de 29 aminoácidos y se denomina 0N, 1N o 2N Tau respectivamente. La influencia de estos dominios en la función de Tau no está completamente clara, aunque puede desempeñar un papel en las interacciones con la membrana plasmática. La inclusión del exón 10 en el extremo C conduce a la inclusión del dominio de unión a microtúbulos codificado por el exón 10. Dado que hay 3 dominios de unión a microtúbulos en otras partes de Tau, esta isoforma de Tau (con el exón 10 incluido) se denomina 4R Tau, donde "R" se refiere al número de repeticiones de dominios de unión a microtúbulos. Tau sin el exón 10 se denomina 3R Tau. Dado que más dominios de unión a microtúbulos (4R en comparación con 3R) aumentan la unión a los microtúbulos, 4R Tau presumiblemente aumenta significativamente la unión y el ensamblaje de los microtúbulos. La relación de 3R/4R Tau está regulada por el desarrollo, con tejidos fetales que expresan exclusivamente 3R Tau y tejidos humanos adultos que expresan aproximadamente niveles iguales de 3R/4R Tau. Las desviaciones de la relación normal de 3R/4R Tau son características de las tauopatías FTD neurodegenerativas. No se sabe cómo afectará a la patogénesis de Tau el cambio de la relación de Tau 3R/4R en una etapa posterior en el animal adulto.
La fosforilación dirigida por serina-treonina regula la capacidad de unión a microtúbulos de Tau. La hiperfosforilación promueve el desprendimiento de Tau de los microtúbulos. Se han descrito otras modificaciones postrad uccionales de Tau; sin embargo, el significado de estas no está claro. La fosforilación de Tau también está regulada por el desarrollo con una fosforilación más alta en los tejidos fetales y una fosforilación mucho más baja en el adulto. Una característica de los trastornos neurodegenerativos es el aumento aberrante de la fosforilación de Tau.
La red de microtúbulos está involucrada en muchos procesos importantes dentro de la célula, incluida la integridad estructural necesaria para mantener la morfología de las células y operar la maquinaria de transporte. Dado que la unión de Tau a los microtúbulos estabiliza los microtúbulos, es probable que Tau sea un mediador clave de algunos de estos procesos y la alteración de la Tau normal en las enfermedades neurodegenerativas puede alterar algunos de estos procesos celulares clave.
Uno de los primeros indicadores de que Tau puede ser importante en los síndromes neurodegenerativos fue el reconocimiento de que Tau es un componente clave de las inclusiones neurofibrilares en la enfermedad de Alzheimer. De hecho, las inclusiones neurofibrilares son agregados de proteína Tau hiperfosforilada. Junto con las placas que contienen beta amiloide, las inclusiones neurofibrilares son un sello distintivo de la enfermedad de Alzheimer y se correlacionan significativamente con el deterioro cognitivo. El 95 % de las acumulaciones de Tau en la AD (enfermedad de Alzheimer (Alzheimer's Disease)) se encuentran en procesos neuronales y se denomina distrofia neurítica. No se comprende bien el proceso o procesos por los que esta proteína asociada a los microtúbulos se separa de los microtúbulos y forma acumulaciones de proteínas y cómo esto se relaciona con la toxicidad neuronal.
Las inclusiones neuronales de Tau son una característica patológica no solo de la enfermedad de Alzheimer, sino también de un subconjunto de demencia frontotemporal (FTD), PSP y CBD. El vínculo entre Tau y la neurodegeneración se solidificó con el descubrimiento de que las mutaciones en el gen Tau causan un subconjunto de FTD. Estos datos genéticos también han destacado la importancia de la relación 3R:4R de Tau. Muchas de las mutaciones de Tau que causan FTD conducen a un cambio en el corte y empalme de Tau que conduce a la inclusión preferencial del exón 10 y, por lo tanto, a un aumento de 4R Tau. Los niveles generales de Tau son normales. Se desconoce si el cambio de isoforma de Tau o el cambio de aminoácidos o ambos causan la neurodegeneración. Los datos recientes sugieren que la PSP también puede estar asociada a un aumento de la relación 4R:3R de Tau.
Para ayudar a comprender la influencia de las relaciones de Tau en la neurodegeneración, se generó un modelo de ratón basado en una de las mutaciones de corte y empalme de Tau (N279K) utilizando un minigen que incluye el promotor Tau
y las secuencias intrónicas flanqueantes del exón 10. Como en los seres humanos, estos ratones demuestran niveles aumentados de 4R Tau en comparación con los transgénicos que expresan WT Tau y desarrollan anomalías conductuales y motoras, así como acumulaciones de Tau agregada en el cerebro y la médula espinal.
La proteína "Tau" se ha asociado con múltiples enfermedades del cerebro que incluyen enfermedad de Alzheimer, demencia frontotemporal, parálisis supranuclear progresiva, degeneración ganglionar corticobasal, demencia pugilística, parkinsonismo ligado a cromosomas, enfermedad de Lytico-Bodig, demencia predominante en ovillos, ganglioglioma, gangliocitoma, meningioangiomatosis, panencefalitis esclerosante subaguda, encefalopatía por plomo, esclerosis tuberosa, enfermedad de Hallervorden-Spatz, enfermedad de Pick, enfermedad del grano argirofílico, degeneración corticobasal o degeneración lobular frontotemporal y otras. Los trastornos asociados a tau, tal como AD, son la causa más común de demencia en los ancianos. La Ad afecta a aproximadamente 15 millones de personas en todo el mundo y al 40 % de la población mayor de 85 años. La AD se caracteriza por dos características patológicas: inclusiones neurofibrilares de Tau (NFT) y placas amiloide-P (Ap).
El documento WO2006/047673 describe secuencias de ácidos nucleicos y proteínas codificadas por estas secuencias que están implicadas en la infección o están asociadas de otro modo con el ciclo de vida de un patógeno. El documento US 2008/0249058 describe procedimientos para identificar agentes candidatos para tratar trastornos relacionados con la excitotoxicidad.
Actualmente hay una falta de opciones aceptables para el tratamiento de dichas enfermedades neurodegenerativas. Por lo tanto, un objeto de esta invención es proporcionar procedimientos para el tratamiento de dichas enfermedades.
Resumen de la invención
La invención proporciona un oligonucleótido modificado, o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, que consiste en 12 a 30 nucleósidos unidos, donde el oligonucleótido modificado tiene una secuencia de nucleobases que comprende al menos 8 nucleobases consecutivas de la secuencia de nucleobases de SEQ ID NO: 1634, donde la secuencia de nucleobases del oligonucleótido modificado es al menos un 90 % complementaria a la SEQ ID NO: 1 y donde el oligonucleótido modificado es capaz de reducir la expresión de Tau.
La invención también proporciona un oligonucleótido modificado monocatenario, o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, que consiste en 18 nucleósidos unidos y que tiene una secuencia de nucleobases que comprende 18 nucleobases consecutivas de la secuencia de nucleobases de SEQ ID NO: 1634, y donde el oligonucleótido modificado comprende:
un segmento de hueco que consiste en 8 desoxinucleósidos unidos;
un segmento de ala 5' que consiste en 5 nucleósidos unidos; y
un segmento de ala 3' que consiste en 5 nucleósidos unidos;
donde el segmento de hueco se posiciona entre el segmento de ala 5' y el segmento de ala 3', donde cada nucleósido de cada segmento de ala comprende un azúcar 2'-O-metoxietilo, donde al menos un enlace internucleosídico es un enlace internucleosídico de fosforotioato, al menos un enlace internucleosídico es un enlace internucleosídico de fosfodiéster, y cada citosina es una 5-metilcitosina.
Otros aspectos y realizaciones de la invención se definen en las reivindicaciones.
Resumen de la descripción
En esta invención se describen procedimientos, compuestos y composiciones para modular la expresión de proteína y ARNm de Tau. En determinados casos, los compuestos útiles para modular la expresión de proteína y ARNm de Tau son compuestos antisentido. En determinados casos, los compuestos antisentido son oligonucleótidos antisentido.
En determinados casos, la modulación puede producirse en una célula o tejido. En determinados casos, la célula o el tejido está en un animal. En determinados casos, el animal es un ser humano. En determinados casos, se reducen los niveles de ARNm de Tau. En determinados casos, se reducen los niveles de proteína Tau. Tal reducción puede producirse de una forma dependiente del tiempo o de una forma dependiente de la dosis.
También se proporcionan compuestos y composiciones útiles para prevenir, tratar y mejorar enfermedades, trastornos y afecciones. En determinadas realizaciones, dichas enfermedades, trastornos y afecciones relacionados con Tau son enfermedades neurodegenerativas. En determinadas realizaciones, dichas enfermedades, trastornos y afecciones neurodegenerativas incluyen tauopatías, enfermedad de Alzheimer, demencia frontotemporal (FTD), FTDP-17, parálisis supranuclear progresiva (PSP), encefalopatía traumática crónica (CTE), degeneración ganglionar corticobasal (CBD), epilepsia y síndrome de Dravet
Tales enfermedades, trastornos y afecciones pueden tener uno o más factores de riesgo, causas o resultados en común. Determinados factores de riesgo y causas para el desarrollo de un trastorno neurodegenerativo incluyen envejecer, tener
antecedentes personales o familiares, o predisposición genética. Determinados síntomas y resultados asociados con el desarrollo de un trastorno neurodegenerativo incluyen, pero sin no se limitan a: presencia de Tau hiperfosforilada, presencia de inclusiones neurofibrilares, reducción de la función neurológica, memoria reducida, función motora reducida, coordinación motora reducida y confusión.
En determinados casos, los procedimientos de tratamiento incluyen administrar un compuesto antisentido de Tau a un individuo que lo necesite. En determinados casos, los procedimientos de tratamiento incluyen administrar un oligonucleótido antisentido de Tau a un individuo que lo necesite.
Descripción detallada
Debe entenderse que tanto la descripción general anterior como la descripción detallada siguiente son meramente ejemplares y explicativas y no son restrictivas de la invención, tal y como se reivindica. En esta invención, el uso del singular incluye el plural, a menos que se indique específicamente lo contrario. Como se usa en esta invención, el uso de "o" significa "y/o" a menos que se indique lo contrario. Además, como se usa en esta invención, el uso de "y" significa "y/o" a menos que se indique lo contrario. Además, el uso del término "que incluye", así como otras formas, tales como "incluye" e "incluido", no es limitante. Además, términos tales como "elemento" o "componente" abarcan ambos elementos y componentes que comprenden una unidad y elementos y componentes que comprenden más de una subunidad, salvo que se indique específicamente lo contrario.
Los encabezados de sección utilizados en esta invención son solo para fines organizativos y no deben interpretarse como limitantes de la materia objeto descrita.
Definiciones
A menos que se proporcionen definiciones específicas, la nomenclatura utilizada en relación con, y los procedimientos y técnicas de, química analítica, química orgánica sintética y química medicinal y farmacéutica descritas en esta invención, son las que se conocen y se utilizan comúnmente en la técnica. Se pueden usar técnicas estándar para la síntesis química y el análisis químico.
A menos que se indique lo contrario, los siguientes términos tienen los siguientes significados:
"2 '-O-metoxietilo" (también 2 '-MOE y 2 '-OCH2CH2-O CH 3 y MOE) se refiere a una modificación O-metoxietilo de la posición 2 ' de un anillo de furanosa. Un azúcar modificado con 2 '-O-metoxietilo es un azúcar modificado. "Nucleósido 2 '-MOE" (también nucleósido 2 '-O-metoxietilo) significa un nucleósido que comprende un resto de azúcar modificado con 2 '-MOE.
"Nucleósido sustituido en 2 '"' significa un nucleósido que comprende un sustituyente en la posición 2 ' del anillo de furanosa distinto de H u OH. En determinadas realizaciones, los nucleósidos sustituidos en 2 ' incluyen nucleósidos con modificaciones de azúcar bicíclicas.
"5-metilcitosina" significa una citosina modificada con un grupo metilo unido a la posición 5. Una 5-metilcitosina es una nucleobase modificada.
"Aproximadamente" significa dentro de ±7 % de un valor. Por ejemplo, si se afirma que "los compuestos afectaron al menos aproximadamente al 70 % de la inhibición de Tau", se implica que los niveles de Tau se inhiben en un intervalo del 63 % y el 77 % .
"Administrado de forma concomitante" se refiere a la administración conjunta de dos agentes farmacéuticos de cualquier forma en la que los efectos farmacológicos de ambos se manifiesten en el paciente al mismo tiempo. La administración concomitante no requiere que ambos agentes farmacéuticos se administren en una única composición farmacéutica, en la misma forma de dosificación o por la misma vía de administración. No es necesario que los efectos de ambos agentes farmacéuticos se manifiesten al mismo tiempo. Solo es necesario que los efectos se superpongan durante un período de tiempo y no es necesario que sean coextensivos.
"Administrar" significa proporcionar un agente farmacéutico a un animal e incluye, pero no se limita a, la administración por parte de un profesional médico y la autoadministración.
"Mejoría" se refiere a disminuir, ralentizar, detener o revertir al menos un indicador de la gravedad de una afección o enfermedad. La gravedad de los indicadores puede determinarse a través de medidas subjetivas u objetivas que conocen los expertos en la técnica.
"Animal" se refiere a un ser humano o a un animal no humano que incluye, pero no se limita a, ratones, ratas, conejos, perros, gatos, cerdos y primates no humanos, que incluyen, pero no se limita a, monos y chimpancés. "Anticuerpo" se refiere a una molécula caracterizada por reaccionar específicamente con un antígeno de alguna manera, donde el anticuerpo y el antígeno se definen cada uno en términos del otro. El anticuerpo puede referirse a una molécula de anticuerpo completa o cualquier fragmento o región de la misma, tal como la cadena pesada, la cadena ligera, la región Fab y la región Fc.
"Actividad antisentido" significa cualquier actividad detectable o medible que se pueda atribuir a la hibridación de un compuesto antisentido a su ácido nucleico diana. En determinadas realizaciones, la actividad antisentido es una disminución en la cantidad o la expresión de un ácido nucleico o proteína diana codificada por tal ácido nucleico diana.
"Compuesto antisentido" significa un compuesto oligomérico que es capaz de experimentar hibridación con un ácido nucleico diana a través de enlaces de hidrógeno. Los ejemplos de compuestos antisentido incluyen compuestos monocatenarios y bicatenarios, tales como oligonucleótidos antisentido, ARNip, ARNhc, ARNmc y compuestos basados en la ocupación.
"Inhibición antisentido" significa la reducción de los niveles de ácido nucleico diana en presencia de un compuesto antisentido complementario a un ácido nucleico diana en comparación con los niveles de ácido nucleico diana en ausencia del compuesto antisentido.
Los "mecanismos antisentido" son todos aquellos mecanismos que involucran la hibridación de un compuesto con un ácido nucleico diana, donde el resultado o el efecto de la hibridación es la degradación diana o la ocupación diana con el estancamiento concomitante de la maquinaria celular que implica, por ejemplo, transcripción o corte y empalme.
"Oligonucleótido antisentido" significa un oligonucleótido monocatenario que tiene una secuencia de nucleobases que permite la hibridación con un segmento correspondiente de un ácido nucleico diana.
"Complementariedad de base" se refiere a la capacidad para el emparejamiento de bases preciso de nucleobases de un oligonucleótido antisentido con nucleobases correspondientes en un ácido nucleico diana (es decir, hibridación), y está mediada por Watson-Crick, Hoogsteen o la unión invertida de hidrógeno de Hoogsteen entre las nucleobases correspondientes.
"Azúcar bicíclico" significa un anillo de furanosa modificado mediante la unión a través de un puente de dos átomos. Un azúcar bicíclico es un azúcar modificado.
"Nucleósido bicíclico" (también BNA) significa un nucleósido que tiene un resto de azúcar que comprende un puente que conecta dos átomos de carbono del anillo de azúcar, formando así un sistema anular bicíclico. En determinadas realizaciones, el puente conecta el carbono de la posición 4' y el carbono de la posición 2' del anillo de azúcar.
"Estructura de caperuza" o "resto de caperuza terminal" significa modificaciones químicas que se han incorporado en cada extremo de un compuesto antisentido.
"cEt" o "etilo restringido" significa un nucleósido bicíclico que tiene un resto de azúcar que comprende un puente que conecta el carbono de la posición 4' y el carbono de la posición 2', donde el puente tiene la fórmula: 4'-CH(CH3)-O-2'.
"Nucleósido etilo restringido" (también nucleósido cEt) significa un nucleósido que comprende un resto de azúcar bicíclico que comprende un puente 4'-CH(CH3)-O-2'.
"Región químicamente diferenciada" se refiere a una región de un compuesto antisentido que de alguna manera es químicamente diferente de otra región del mismo compuesto antisentido. Por ejemplo, una región que tiene nucleósidos 2'-O-metoxietilo está químicamente diferenciada de una región que tiene nucleósido sin modificaciones 2'-O-metoxietilo.
"Compuesto antisentido quimérico" significa un compuesto antisentido que tiene al menos dos regiones químicamente diferenciadas, teniendo cada posición una pluralidad de subunidades.
"Administración conjunta" significa la administración de dos o más agentes farmacéuticos a un individuo. Los dos o más agentes farmacéuticos pueden estar en una única composición farmacéutica o pueden estar en composiciones farmacéuticas separadas. Cada uno de los dos o más agentes farmacéuticos puede administrarse mediante la misma o diferentes vías de administración. La administración conjunta abarca la administración secuencial o en paralelo.
"Complementariedad" significa la capacidad de formar pares entre nucleobases de un primer ácido nucleico y un segundo ácido nucleico.
Se entenderá que "comprenden", "comprende" y "que comprende" implican la inclusión de una etapa o elemento o grupo de etapas o elementos indicado, pero no la exclusión de cualquier otra etapa o elemento o grupo de etapas o elementos.
"Nucleobases contiguas" significa nucleobases inmediatamente adyacentes entre sí.
"Que diseña" o "diseñado para" se refiere al procedimiento de diseño de un compuesto oligomérico que se hibrida, específicamente, con una molécula de ácido nucleico seleccionada.
"Diluyente" significa un ingrediente en una composición que carece de actividad farmacológica, pero es farmacéuticamente necesario o deseable. Por ejemplo, en los fármacos que se inyectan, el diluyente puede ser un líquido, por ejemplo, una solución salina.
"Dosis" significa una cantidad especificada de un agente farmacéutico que se proporciona en una única administración o en un período de tiempo especificado. En determinados casos, se puede administrar una dosis en uno, dos o más bolos, comprimidos o inyecciones. Por ejemplo, en determinados casos en que se desea la administración subcutánea, la dosis deseada requiere un volumen que no se ajusta fácilmente mediante una única inyección, por lo tanto, se pueden usar dos o más inyecciones para lograr la dosis deseada. En determinados casos, el agente farmacéutico se administra por infusión durante un período prolongado de tiempo o de forma continua. Las dosis se pueden indicar como la cantidad de agente farmacéutico por hora, día, semana o mes.
"Cantidad eficaz", en el contexto de modular una actividad o de tratar o prevenir una afección, significa la administración de aquella cantidad de agente farmacéutico a un sujeto que necesita dicha modulación, tratamiento o profilaxis, ya sea en una sola dosis o como parte de una serie, que es eficaz para la modulación de ese efecto o para el tratamiento o profilaxis o mejora de esa afección. La cantidad eficaz puede variar entre
los individuos dependiendo de la salud y el estado físico del individuo a tratar, el grupo taxonómico de los individuos a tratar, la formulación de la composición, la evaluación de la afección médica del individuo y otros factores relevantes.
"Eficacia" significa la capacidad de producir un efecto deseado.
La "expresión" incluye todas las funciones mediante las cuales la información codificada de un gen se convierte en estructuras presentes y que funcionan en una célula. Dichas estructuras incluyen, pero no se limitan a, los productos de la transcripción y la traducción.
"Totalmente complementaria" o "complementaria al 100 %" significa que cada nucleobase de un primer ácido nucleico tiene una nucleobase complementaria en un segundo ácido nucleico. En determinadas realizaciones, un primer ácido nucleico es un compuesto antisentido y un ácido nucleico diana es un segundo ácido nucleico. "Gapmero" significa un compuesto antisentido quimérico en el que una región interna que tiene una pluralidad de nucleósidos que admiten la escisión de RNasa H se coloca entre las regiones externas que tienen uno o más nucleósidos, donde los nucleósidos que comprenden la región interna están químicamente diferenciados del nucleósido o los nucleósidos que comprenden las regiones externas. La región interna puede denominarse "hueco" y las regiones externas pueden denominarse "alas".
"Estrechado por hueco" significa un compuesto antisentido quimérico que tiene un segmento de hueco de 9 o menos 2'-desoxirribonucleósidos contiguos ubicados entre los segmentos de ala 5' y 3' que tienen de 1 a 6 nucleósidos e inmediatamente adyacentes a los mismos.
"Ensanchado por hueco" significa un compuesto antisentido quimérico que tiene un segmento de hueco de 12 o más 2'-desoxirribonucleósidos contiguos ubicados entre los segmentos de ala 5' y 3' que tienen de 1 a 6 nucleósidos e inmediatamente adyacentes a los mismos.
"Hibridación" significa alinear las moléculas de ácido nucleico complementarias. En determinadas realizaciones, las moléculas de ácido nucleico complementarias incluyen, pero no se limitan a, un compuesto antisentido y un ácido nucleico diana. En determinadas realizaciones, las moléculas de ácido nucleico complementarias incluyen, pero no se limitan a, un oligonucleótido antisentido y un ácido nucleico diana.
"Identificar un animal que tiene una enfermedad asociada a Tau" se refiere a identificar un animal que ha sido diagnosticado con una enfermedad asociada a Tau o que está predispuesto a desarrollar una enfermedad asociada a Tau. Los individuos que están predispuestos a desarrollar una enfermedad asociada a Tau incluyen aquellos que presentan uno o más factores de riesgo para desarrollar una enfermedad asociada a Tau, que incluyen envejecer, tener antecedentes personales o familiares o una predisposición genética de una o más enfermedades asociadas a Tau. Dicha identificación puede lograrse mediante cualquier procedimiento que incluye la evaluación del historial médico de un individuo y evaluaciones o pruebas clínicas estándar.
"Inmediatamente adyacente" significa que no hay elementos intermedios entre los elementos inmediatamente adyacentes.
"Individuo" significa un animal no humano o humano seleccionado para el tratamiento o la terapia.
"Inhibir Tau" significa reducir el nivel o la expresión de una proteína y/o ARNm de Tau. En determinadas realizaciones, los niveles de proteína y/o ARNm de Tau se inhiben en presencia de un compuesto antisentido que se dirige a Tau, que incluye un oligonucleótido antisentido que se dirige a Tau, en comparación con la expresión de los niveles de proteína y/o ARNm de Tau en ausencia de un compuesto antisentido de Tau, tal como un oligonucleótido antisentido.
"Inhibir la expresión o actividad" se refiere a una reducción o bloqueo de la expresión o actividad y no necesariamente indica una eliminación total de la expresión o actividad.
"Enlace internucleosídico" se refiere a la unión química entre nucleósidos.
"Nucleósidos unidos" significa nucleósidos adyacentes unidos mediante un enlace internucleosídico.
"Ácido nucleico bloqueado" o "LNA" o "nucleósidos LNA" significa monómeros de ácido nucleico que tienen un puente que conecta dos átomos de carbono entre la posición 4' y 2' de la unidad de azúcar de nucleósido, formando así un azúcar bicíclico. Los ejemplos de dicho azúcar bicíclico incluyen, pero no se limitan a A) LNA a-L-Metilenoxi (4'-CH2-O-2'), (B) LNA p-D-Metilenoxi (4-CH2-O-2'), (C) LNA Etilenoxi (4'-(CH2)2-O-2'), (D) LNA
Como se usa en esta invención, los compuestos LNA incluyendo, pero no se limitan a, compuestos que tienen al menos un puente entre la posición 4' y 2' del azúcar, donde cada uno de los puentes comprende independientemente 1 o de 2 a 4 grupos unidos seleccionados independientemente de -[C(R1)(R2)]n-, -C(R1)=C(R2)-, -C(R1)=N-, -C(=NR1)-, -C(=O)-, -C(=S)-, -O-, -Si(R1)2-, -S(=O)x- y -N(R1)-; donde: x es 0, 1, o 2; n es 1,2, 3, o 4; cada R1 y R2 es, independientemente, H, un grupo protector, hidroxilo, alquilo C1-C12, alquilo C1-C12 sustituido, alquenilo C2-C12, alquenilo C2-C12 sustituido, alquinilo C2-C12, alquinilo C2-C12 sustituido, arilo C5-C20, arilo C5-C20 sustituido, un radical de heterociclo, un radical de heterociclo sustituido, heteroarilo, heteroarilo sustituido, radical alicíclico C5-C7, radical alicíclico C5-C7 sustituido,
halógeno, OJi , NJ1J2, SJ1, N3, COOJ1, acilo (C(=O)-H), acilo sustituido, CN, sulfonilo (S(=O)2-Ji ), o sulfoxilo (S(=O)-Ji ); y cada J1 y J2 es, independientemente, H, alquilo C1-C12, alquilo C1-C12 sustituido, alquenilo C2-C12, alquenilo C2-C12 sustituido, alquinilo C2-C12, alquinilo C2-C12 sustituido, arilo C5-C20, arilo C5-C20 sustituido, acilo (C(=O)-H), acilo sustituido, un radical de heterociclo, un radical de heterociclo sustituido, aminoalquilo C1-C12, aminoalquilo C1-C12 sustituido o un grupo protector.
Los ejemplos de grupos fuente 4'-2' abarcados dentro de la definición de LNA incluyen, pero no se limitan a, una de las fórmulas: -[C(R1)(R2)]n-, -[C(R1)(R2)]n-O-, -C(R1R2)-N(R1)-O- o -C(R1R2)-O-N(R1)-. Además, otros grupos puente incluidos en la definición de LNA son puentes 4'-CH2-2', 4'-(CH2)2-2', 4'-(CH2)3-2', 4'-CH2-O-2', 4'-(CH2)2-O-2', 4'-CH2-O-N(R1)-2' y 4'-CH2-N(R1)-O-2'-, donde cada R1 y R2 es, independientemente, H, un grupo protector o alquilo C1-C12.
También se incluyen dentro de la definición de LNA según la invención los LNA en los que el grupo 2'-hidroxilo del anillo de azúcar ribosilo está conectado al átomo de carbono 4' del anillo de azúcar, formando así un puente metilenoxi (4'-CH2-O-2') para formar el resto de azúcar bicíclico. El puente también puede ser un grupo metileno (-CH2-) que conecta el átomo de oxígeno 2' y el átomo de carbono 4', para lo cual se usa el término LNA metilenoxi (4'-CH2-O-2'). Además, en el caso del resto de azúcar bicílico que tiene un grupo puente de etileno en esta posición, se usa el término LNA etilenoxi (4'-CH2CH2-O-2'). a -L-Metilenoxi (4'-CH2-O-2'), un isómero de LNA metilenoxi (4'-CH2-O-2') también se abarca dentro de la definición de LNA, como se usa en esta invención.
"Emparejamiento erróneo" o "nucleobase no complementaria" se refiere al caso en el que una nucleobase de un primer ácido nucleico no puede emparejarse con la nucleobase correspondiente de un segundo ácido nucleico o ácido nucleico diana.
"Enlace internucleosídico modificado" se refiere a una sustitución o cualquier cambio de un enlace internucleosídico de origen natural (es decir, un enlace internucleosídico de fosfodiéster).
"Nucleobase modificada" significa cualquier nucleobase distinta de adenina, citosina, guanina, timidina o uracilo. Una "nucleobase no modificada" significa las bases de purina adenina (A) y guanina (G), y las bases de pirimidina timina (T), citosina (C) y uracilo (U).
"Un nucleósido modificado" significa un nucleósido que tiene, independientemente, un resto de azúcar modificado y/o una nucleobase modificada.
"Nucleótido modificado" significa un nucleótido que tiene, independientemente, un resto de azúcar modificado, un enlace internucleosídico modificado y/o una nucleobase modificada.
"Oligonucleótido modificado" significa un oligonucleótido que comprende al menos un enlace internucleosídico modificado, un azúcar modificado y/o una nucleobase modificada.
"Azúcar modificado" significa la sustitución y/o cualquier cambio de un resto de azúcar natural.
"Monómero" significa una sola unidad de un oligómero. Los monómeros incluyen, pero no se limitan a, nucleósidos y nucleótidos, ya sean de origen natural o modificados.
"Motivo" significa el patrón de nucleósidos modificados y no modificados en un compuesto antisentido.
"Resto de azúcar natural" significa un resto de azúcar que se encuentra en el ADN (2'-H) o ARN (2'-OH).
"Enlace internucleosídico de origen natural" significa un enlace fosfodiéster 3' a 5'.
"Nucleobase no complementaria" se refiere a un par de nucleobases que no forman enlaces de hidrógeno entre sí o admiten de otro modo la hibridación.
"Ácido nucleico" se refiere a moléculas compuestas por nucleótidos monoméricos. Un ácido nucleico incluye, pero no se limita a, ácidos ribonucleicos (ARN), ácidos desoxirribonucleicos (ADN), ácidos nucleicos monocatenarios, ácidos nucleicos bicatenarios, ácidos ribonucleicos interferentes pequeños (ARNip) y microARN (miARN).
"Nucleobase" significa un resto heterocíclico que puede emparejarse con una base de otro ácido nucleico. "Complementariedad de nucleobases" se refiere a una nucleobase que puede realizar el emparejamiento de bases con otra nucleobase. Por ejemplo, en el ADN, la adenina (A) es complementaria a la timina (T). Por ejemplo, en el ARN, la adenina (A) es complementaria al uracilo (U). En determinadas realizaciones, la nucleobase complementaria se refiere a una nucleobase de un compuesto antisentido que puede realizar el emparejamiento de bases con una nucleobase de su ácido nucleico diana. Por ejemplo, si una nucleobase en una determinada posición de un compuesto antisentido es capaz de formar enlaces de hidrógeno con una nucleobase en una determinada posición de un ácido nucleico diana, entonces la posición de los enlaces de hidrógeno entre el oligonucleótido y el ácido nucleico diana se considera complementaria en ese par de nucleobases.
"Secuencia de nucleobases" significa el orden de nucleobases contiguas independientes de cualquier azúcar, enlace y/o modificación de nucleobases.
"Nucleósido" significa una nucleobase unida a un azúcar.
"Mimético de nucleósido" incluye aquellas estructuras usadas para reemplazar el azúcar o el azúcar y la base, y no necesariamente el enlace en una o más posiciones de un compuesto oligomérico, tal como, por ejemplo, miméticos de nucleósidos que tienen morfolino, ciclohexenilo, ciclohexilo, tetrahidropiranilo, miméticos de azúcar bicíclicos y tricíclicos, por ejemplo, unidades de azúcar diferentes a furanosa. El mimético de nucleótido incluye aquellas estructuras usadas para remplazar el nucleósido y el enlace en una o más posiciones de un compuesto oligomérico tal como, por ejemplo, ácidos nucleicos peptídicos o morfolinos (morfolinos unidos por -N(H)-C(=O)-O- u otro enlace diferente a fosfodiéster). El sustituto de azúcar se superpone con el término mimético de
nucleósido ligeramente más amplio, pero se pretende que indique el reemplazo únicamente de la unidad de azúcar (anillo de furanosa). Los anillos de tetrahidropiranilo proporcionados en esta invención ilustran un ejemplo de un sustituto de azúcar, donde el grupo de azúcar de furanosa se ha reemplazado con un sistema anular de tetrahidropiranilo. "Mimético" se refiere a grupos que son sustituidos por un azúcar, una nucleobase, y/o un enlace internucleosídico. En general, un mimético se utiliza en lugar del azúcar o combinación de enlace internucleosídico-azúcar, y la nucleobase se mantiene para su hibridación a una diana seleccionada.
"Nucleótido" significa un nucleósido que tiene un grupo fosfato unido covalentemente a la porción de azúcar del nucleósido.
"Efecto inespecífico" se refiere a un efecto biológico no deseado o perjudicial asociado a la modulación de la expresión de ARN o proteína de un gen distinto del ácido nucleico diana deseado.
"Compuesto oligomérico" u "oligómero" significa un polímero de subunidades monoméricas unidas que se puede hibridar con al menos una región de una molécula de ácido nucleico.
"Oligonucleótido" significa un polímero de nucleósidos unidos, cada uno de los cuales puede ser modificado o no modificado, independiente uno del otro.
"Administración parenteral" significa la administración mediante inyección (por ejemplo, inyección en bolo) o infusión. La administración parenteral incluye administración subcutánea, administración intravenosa, administración intramuscular, administración intraarterial, administración intraperitoneal o administración intracraneal, por ejemplo, la administración intratecal o intracerebroventricular.
"Péptido" significa una molécula formada mediante la unión de al menos dos aminoácidos a través de enlaces amida. Sin limitación, como se usa en esta invención, péptido se refiere a polipéptidos y proteínas.
"Agente farmacéutico" significa una sustancia que proporciona un beneficio terapéutico cuando se administra a un individuo. Por ejemplo, en determinadas realizaciones, un oligonucleótido antisentido dirigido a Tau es un agente farmacéutico.
"Composición farmacéutica" significa una mezcla de sustancias adecuadas para su administración a un sujeto. Por ejemplo, una composición farmacéutica puede comprender un oligonucleótido antisentido y una solución acuosa estéril.
"Derivado farmacéuticamente aceptable" abarca sales, conjugados, profármacos o isómeros farmacéuticamente aceptables de los compuestos descritos en esta invención.
"Sales farmacéuticamente aceptables" significa sales fisiológica y farmacéuticamente aceptables de compuestos antisentido, es decir, sales que conservan la actividad biológica deseada del oligonucleótido original y no provocan efectos toxicológicos no deseados en el mismo.
"Enlace fosforotioato" significa un enlace entre nucleósidos donde la unión fosfodiéster se modifica remplazando uno de los átomos de oxígeno que no forman puentes con un átomo de azufre. Un enlace fosforotioato es un enlace internucleosídico modificado.
"Porción" significa una cantidad definida de nucleobases contiguas (es decir, unidas) de un ácido nucleico. En determinadas realizaciones, una porción es una cantidad definida de nucleobases contiguas de un ácido nucleico diana. En determinadas realizaciones, una porción es una cantidad definida de nucleobases contiguas de un compuesto antisentido.
"Prevenir" o "que previene" se refiere a retrasar o impedir la aparición o el desarrollo de una enfermedad, un trastorno o una afección durante un período de tiempo que va desde minutos a días, semanas a meses o indefinidamente.
"Profármaco" significa un agente terapéutico que está preparado en una forma inactiva que se convierte a una forma activa (es decir, fármaco) dentro del cuerpo o las células del mismo mediante la acción de enzimas endógenas y otros productos químicos y/o condiciones.
"Cantidad profilácticamente eficaz" se refiere a una cantidad de un agente farmacéutico que proporciona un beneficio profiláctico o preventivo a un animal.
El término «región» se define como una porción del ácido nucleico diana que tiene al menos una estructura, función o característica identificable.
"Ribonucleótido" significa un nucleótido que tiene un hidroxi en la posición 2' en la porción de azúcar del nucleótido. Los ribonucleótidos pueden ser modificados con cualquiera de una variedad de sustituyentes. "Sales" significa sales fisiológica y farmacéuticamente aceptables de compuestos antisentido, es decir, sales que conservan la actividad biológica deseada del oligonucleótido original y no transmiten efectos toxicológicos no deseados al mismo.
Los "segmentos" se definen como porciones más pequeñas o subporciones de regiones dentro de un ácido nucleico diana.
Las versiones "acortadas" o "truncadas" de oligonucleótidos antisentido indicados en esta invención tienen uno, dos o más nucleósidos eliminados.
"Efectos secundarios" significa las respuestas fisiológicas atribuibles a un tratamiento distinto de los efectos deseados. En determinadas realizaciones, los efectos secundarios incluyen, sin limitación, reacciones en el lugar de inyección, anomalías en las pruebas de función hepática, anomalías en la función renal, toxicidad hepática, toxicidad renal, anomalías en el sistema nervioso central y miopatías.
"Oligonucleótido monocatenario" significa un oligonucleótido que no está hibridado a una cadena complementaria.
Los "sitios", como se usan en esta invención, se definen como posiciones de nucleobases únicas dentro de un
ácido nucleico diana.
"Retrasa la progresión" significa una disminución en el desarrollo de la enfermedad.
"Específicamente hibridable" se refiere a un compuesto antisentido que tiene un grado suficiente de complementariedad entre un oligonucleótido antisentido y un ácido nucleico diana para inducir un efecto deseado, a la vez que presenta efectos mínimos o ninguno en ácidos nucleicos diana en condiciones en las cuales se desea una unión específica, es decir en condiciones fisiológicas en el caso de ensayos in vivo y tratamientos terapéuticos.
"Condiciones de hibridación rigurosas" o "condiciones rigurosas" se refieren a condiciones en las que un compuesto oligomérico se hibridará con su secuencia diana, pero con una cantidad mínima de otras secuencias. "Sujeto" significa un animal humano o no humano seleccionado para el tratamiento o la terapia.
"Diana" se refiere a una proteína, cuya modulación se desea.
"Gen diana" se refiere a un gen que codifica una diana.
"Que se dirige a" o "dirigido a" significa el procedimiento de diseñar y seleccionar un compuesto antisentido que se hibridará específicamente con un ácido nucleico diana e inducirá un efecto deseado.
"Ácido nucleico diana", "ARN diana" y "transcrito de ARN diana" y "diana de ácido nucleico" significan un ácido nucleico al que se pueden dirigir compuestos antisentido.
"Región diana" significa una porción de un ácido nucleico diana a la que se dirigen uno o más compuestos antisentido.
"Segmento diana" significa la secuencia de nucleótidos de un ácido nucleico diana al que se dirige un compuesto antisentido. "Sitio diana 5'" se refiere al nucleótido más próximo a 5' de un segmento diana. "Sitio diana 3'" se refiere al nucleótido más próximo a 3' de un segmento diana.
"Tau" significa proteína tau asociada a microtúbulos de mamífero (MAPT), incluida la proteína tau asociada a microtúbulos humanos (MAPT).
"Enfermedad asociada a Tau" significa cualquier enfermedad asociada a cualquier ácido nucleico de Tau o producto de expresión del mismo. Tales enfermedades pueden incluir una enfermedad neurodegenerativa. Tales enfermedades neurodegenerativas pueden incluir tauopatías, enfermedad de Alzheimer, demencia frontotemporal (FTD), FTDP-17, parálisis supranuclear progresiva (PSP), encefalopatía traumática crónica (CTE), degeneración ganglionar corticobasal (CBD), epilepsia y síndrome de Dravet.
"ARNm de Tau" significa cualquier producto de expresión de ARN mensajero de una secuencia de ADN que codifica Tau.
"Ácido nucleico de Tau" significa cualquier ácido nucleico que codifica Tau. Por ejemplo, en determinadas realizaciones, un ácido nucleico de Tau incluye una secuencia de ADN que codifica Tau, una secuencia de ARN transcrita a partir de ADN que codifica Tau (inclusive ADN genómico que comprende intrones y exones) y una secuencia de ARNm que codifica Tau. "ARNm de Tau" significa un ARNm que codifica una proteína Tau. "Proteína Tau" significa el producto de expresión de polipéptido de un ácido nucleico de Tau. "Cantidad terapéuticamente eficaz" significa una cantidad de un agente farmacéutico que proporciona un beneficio terapéutico a un individuo.
"Tratar" o "que trata" o "tratamiento" se refiere a la administración de una composición para provocar una alteración o mejora de la enfermedad o afección.
"Nucleobases no modificadas" significan las bases de purina adenina (A) y guanina (G), y las bases de pirimidina timina (T), citosina (C) y uracilo (U).
"Nucleótido no modificado" significa un nucleótido compuesto de nucleobases de origen natural, restos de azúcar y enlaces internucleosídicos. En determinadas realizaciones, un nucleótido no modificado es un nucleótido de ARN (es decir, p-D-ribonucleósidos) o un nucleótido de ADN (es decir, p-D-desoxirribonucleósido).
"Segmento de ala" significa una pluralidad de nucleósidos modificados para transmitir propiedades a un oligonucleótido, tales como actividad inhibidora mejorada, mayor afinidad de unión por un ácido nucleico diana o resistencia a la degradación mediante nucleasas in vivo.
Determinadas realizaciones
En esta invención se describen procedimientos, compuestos y composiciones para inhibir la expresión de proteína y ARNm de Tau. En esta invención se describen procedimientos, compuestos y composiciones para disminuir los niveles de proteína y ARNm de Tau.
En esta invención se describen compuestos antisentido dirigidos a un ácido nucleico de Tau. En determinadas realizaciones, el ácido nucleico de Tau es la secuencia expuesta en el n.° de acceso de GENBANK NT_010783.15 truncado de los nucleótidos 9240000 a 9381000 (incorporada en esta invención como SEQ ID NO: 1), n.° de acceso de GENBANK NM_001123066.3 (incorporada en esta invención como SEQ ID NO: 2), n.° de acceso de GENBANK NM_016841.4, una secuencia de ARNm variante que omite los exones 3, 4, 6, 8, 10 y 12 (incorporada en esta invención como SEQ ID NO: 3), n.° de acceso de GENBANK NT_010783.14 truncado de los nucleótidos 2624000 a 2761000 (incorporada en esta invención como SEQ ID NO: 4), n.° de acceso de GENBANK DR002467.1 (incorporada en esta invención como SEQ ID NO: 5), n.° de acceso de GENBANK NM_001203251.1 (incorporada en esta invención como SEQ ID NO: 6), y n.° de acceso de GENBANK NM _016835.4 (incorporada en esta invención como SEQ ID NO: 7).
En esta invención se describen procedimientos para el tratamiento, prevención o mejora de enfermedades, trastornos y afecciones asociados a Tau en un individuo que lo necesita. También se contemplan procedimientos para la preparación de un medicamento para el tratamiento, prevención o mejora de una enfermedad, trastorno o afección asociado a Tau. Las enfermedades, trastornos y afecciones asociados a Tau incluyen enfermedades neurodegenerativas. En determinadas realizaciones, las enfermedades asociadas a tau incluyen tauopatías, enfermedad de Alzheimer, demencia frontotemporal (FTD), FTDP-17, parálisis supranuclear progresiva (PSP), encefalopatía traumática crónica (CTE), degeneración ganglionar corticobasal (CBD), epilepsia o síndrome de Dravet.
En esta invención se describen compuestos que comprenden un oligonucleótido modificado que consiste en 12 a 30 nucleósidos unidos y que tiene una secuencia de nucleobases que comprende al menos 8, al menos 9, al menos 10, al menos 11, al menos 12, al menos 13, al menos 14, al menos 15, al menos 16, al menos 17, al menos 18, al menos 19 o al menos 20 nucleobases consecutivas de cualquiera de las secuencias de nucleobases de las SEQ ID NO: 20-2443 y las SEQ ID NO: 2478-2483. En esta invención se describen compuestos que comprenden un oligonucleótido modificado que consiste en 12 a 30 nucleósidos unidos y que tiene una secuencia de nucleobases que comprende al menos 8, al menos 9, al menos 10, al menos 11, al menos 12, al menos 13, al menos 14, al menos 15, al menos 16, al menos 17, al menos 18, al menos 19 o al menos 20 nucleobases consecutivas de cualquiera de las secuencias de nucleobases de las SEQ ID NO: 2444-2477 y las SEQ ID NO: 2484-2565.
En esta invención se describen compuestos que comprenden un oligonucleótido modificado que consiste en 12 a 30 nucleósidos unidos y que tiene una secuencia de nucleobases que comprende al menos 8, al menos 9, al menos 10, al menos 11, al menos 12, al menos 13, al menos 14, al menos 15, al menos 16, al menos 17, al menos 18, al menos 19 o al menos 20 nucleobases consecutivas de cualquiera de las secuencias de nucleobases de las SEQ ID NO: 20-2565.
En esta invención se describen compuestos que comprenden un oligonucleótido modificado que consiste en 12 a 30 nucleósidos unidos y que comprende una secuencia de nucleobases que comprende al menos 8, al menos 9, al menos 10, al menos 11, al menos 12, al menos 13, al menos 14, al menos 15, al menos 16, al menos 17, al menos 18, al menos 19 o al menos 20 nucleobases consecutivas complementarias a una porción de longitud equivalente de las nucleobases 135783-135980 de SEQ ID NO: 1.
En esta invención se describen compuestos que comprenden un oligonucleótido modificado que consiste en 12 a 30 nucleósidos unidos y que comprende una secuencia de nucleobases que comprende al menos 8, al menos 9, al menos 10, al menos 11, al menos 12, al menos 13, al menos 14, al menos 15, al menos 16, al menos 17, al menos 18, al menos 19 o al menos 20 nucleobases consecutivas complementarias a una porción de longitud equivalente de las nucleobases 135853-135872 de SEQ ID NO: 1.
En esta invención se describen compuestos que comprenden un oligonucleótido modificado que consiste en 12 a 30 nucleósidos unidos y que comprende una secuencia de nucleobases que comprende al menos 8, al menos 9, al menos 10, al menos 11, al menos 12, al menos 13, al menos 14, al menos 15, al menos 16, al menos 17, al menos 18, al menos 19 o al menos 20 nucleobases consecutivas complementarias a una porción de longitud equivalente de las nucleobases 135783-135929 de SEQ ID NO: 1.
En esta invención se describen compuestos que comprenden un oligonucleótido modificado que consiste en 12 a 30 nucleósidos unidos y que comprende una secuencia de nucleobases que comprende al menos 8, al menos 9, al menos 10, al menos 11, al menos 12, al menos 13, al menos 14, al menos 15, al menos 16, al menos 17, al menos 18, al menos 19 o al menos 20 nucleobases consecutivas complementarias a una porción de longitud equivalente de las nucleobases 135783-135914 de SEQ ID NO: 1.
En determinados casos, la secuencia de nucleobases del oligonucleótido modificado es al menos un 80 %, al menos un 81 %, al menos un 82 %, al menos un 83 %, al menos un 84 %, al menos un 85 %, al menos un 86 %, al menos un 87 %, al menos un 88 %, al menos un 89 %, al menos un 90 %, al menos un 91 %, al menos un 92 %, al menos un 93 %, al menos un 94 %, al menos un 95 %, al menos un 96 %, al menos un 97 %, al menos un 98 %, al menos un 99 % o un 100 % complementaria a la SEQ ID NO: 1.
En determinadas realizaciones, el compuesto es un oligonucleótido modificado monocatenario.
En determinadas realizaciones, al menos un enlace internucleosídico del oligonucleótido modificado es un enlace internucleosídico modificado.
En determinadas realizaciones, al menos un enlace internucleosídico modificado es un enlace internucleosídico de fosforotioato.
En determinadas realizaciones, cada enlace internucleosídico modificado es un enlace internucleosídico de fosforotioato.
En determinadas realizaciones, al menos un enlace internucleosídico es un enlace internucleosídico de fosfodiéster.
En determinadas realizaciones, al menos un enlace internucleosídico es un enlace fosforotioato y al menos un enlace internucleosídico es un enlace fosfodiéster.
En determinadas realizaciones, al menos un nucleósido comprende una nucleobase modificada.
En determinadas realizaciones, la nucleobase modificada es una 5-metilcitosina.
En determinadas realizaciones, al menos un nucleósido del oligonucleótido modificado comprende un azúcar modificado. En determinadas realizaciones, al menos un azúcar modificado es un azúcar bicíclico.
En determinadas realizaciones, el azúcar bicíclico comprende un enlace químico entre la posición 2 ' y 4 ' del puente de azúcar 4 '-CH2-N(R)-O-2 ' donde R es, independientemente, H, alquilo C 1- C 12 o un grupo protector.
En determinadas realizaciones, el azúcar bicíclico comprende un puente 4 '-CH2-N(R)-O-2 ' donde R es, independientemente, H, alquilo C 1-C 12 o un grupo protector.
En determinadas realizaciones, al menos un azúcar modificado comprende un grupo 2 '-O-metoxietilo.
En determinadas realizaciones, el azúcar modificado comprende un grupo 2 '-O(CH2)2-O CH3.
En determinadas realizaciones, el oligonucleótido modificado comprende:
un segmento de hueco que consiste en 10 desoxinucleósidos unidos;
un segmento de ala 5' que consiste en 5 nucleósidos unidos; y
un segmento de ala 3' que consiste en 5 nucleósidos unidos;
donde el segmento de hueco se posiciona entre el segmento de ala 5' y el segmento de ala 3' y donde cada nucleósido de cada segmento de ala comprende un azúcar modificado.
En determinadas realizaciones, el oligonucleótido modificado comprende:
un segmento de hueco que consiste en 9 desoxinucleósidos unidos;
un segmento de ala 5' que consiste en 5 nucleósidos unidos; y
un segmento de ala 3' que consiste en 5 nucleósidos unidos;
donde el segmento de hueco se posiciona entre el segmento de ala 5' y el segmento de ala 3' y donde cada nucleósido de cada segmento de ala comprende un azúcar modificado.
En determinadas realizaciones, el oligonucleótido modificado comprende:
un segmento de hueco que consiste en 7 desoxinucleósidos unidos;
un segmento de ala 5' que consiste en 5 nucleósidos unidos; y
un segmento de ala 3' que consiste en 6 nucleósidos unidos;
donde el segmento de hueco se posiciona entre el segmento de ala 5' y el segmento de ala 3' y donde cada nucleósido de cada segmento de ala comprende un azúcar modificado.
En determinadas realizaciones, el oligonucleótido modificado comprende:
un segmento de hueco que consiste en 8 desoxinucleósidos unidos;
un segmento de ala 5' que consiste en 5 nucleósidos unidos; y
un segmento de ala 3' que consiste en 5 nucleósidos unidos;
donde el segmento de hueco se posiciona entre el segmento de ala 5' y el segmento de ala 3' y donde cada nucleósido de cada segmento de ala comprende un azúcar modificado.
En determinadas realizaciones, el oligonucleótido modificado comprende:
un segmento de hueco que consiste en 8 desoxinucleósidos unidos;
un segmento de ala 5' que consiste en 4 nucleósidos unidos; y
un segmento de ala 3' que consiste en 6 nucleósidos unidos;
donde el segmento de hueco se posiciona entre el segmento de ala 5' y el segmento de ala 3' y donde cada nucleósido de cada segmento de ala comprende un azúcar modificado.
En determinadas realizaciones, el oligonucleótido modificado comprende:
un segmento de hueco que consiste en 8 desoxinucleósidos unidos;
un segmento de ala 5' que consiste en 6 nucleósidos unidos; y
un segmento de ala 3' que consiste en 4 nucleósidos unidos;
donde el segmento de hueco se posiciona entre el segmento de ala 5' y el segmento de ala 3' y donde cada nucleósido de cada segmento de ala comprende un azúcar modificado.
En determinadas realizaciones, el oligonucleótido modificado consiste en 20 nucleósidos unidos.
En determinadas realizaciones, el oligonucleótido modificado consiste en 19 nucleósidos unidos.
En determinadas realizaciones, el oligonucleótido modificado consiste en 18 nucleósidos unidos.
Determinadas realizaciones proporcionan composiciones que comprenden cualquier compuesto descrito en esta invención o una sal del mismo y al menos uno de un vehículo o diluyente farmacéuticamente aceptable.
En esta invención se describen procedimientos que comprenden administrar a un animal cualquier compuesto o composición que se describe en esta invención.
En determinados casos, el animal es un ser humano.
En determinados casos, la administración del compuesto previene, trata, mejora o ralentiza la progresión de una enfermedad, trastorno o afección asociada a tau.
En determinadas realizaciones, la enfermedad, trastorno o afección es una tauopatía, enfermedad de Alzheimer, demencia frontotemporal (FTD), FTDP-17, parálisis supranuclear progresiva (PSP), encefalopatía traumática crónica (CTE), degeneración ganglionar corticobasal (CBD), epilepsia o síndrome de Dravet.
En esta invención se describe el uso de cualquiera de los compuestos o composiciones que se describen en esta invención para la fabricación de un medicamento para tratar un trastorno neurodegenerativo.
, o una sal farmacéuticamente aceptable de los mismos. En esta invención se describen composiciones farmacéuticas que comprenden el compuesto que tiene la fórmula (Ia).
En esta invención se describen compuestos según la siguiente fórmula (I Ia):
, o una sal farmacéuticamente aceptable de los mismos. En esta invención se describen composiciones farmacéuticas que comprenden el compuesto que tiene la fórmula (IIa).
En esta invención se describen compuestos según la siguiente fórmula (IIIa):
, o una sal farmacéuticamente aceptable de los mismos. En esta invención se describen composiciones farmacéuticas que comprenden el compuesto que tiene la fórmula (IIIa).
Determinadas realizaciones proporcionan compuestos según la siguiente fórmula (IVa):
, o una sal farmacéuticamente aceptable de los mismos. En determinadas realizaciones, se proporcionan composiciones farmacéuticas que comprenden el compuesto que tiene la fórmula (IVa).
En esta invención se describen compuestos según la siguiente fórmula (Va):
, o una sal farmacéuticamente aceptable de los mismos. En esta invención se describen composiciones farmacéuticas que comprenden el compuesto que tiene la fórmula (Va).
Compuestos antisentido
Los compuestos oligoméricos incluyen, pero no se limitan a, oligonucleótidos, oligonucleósidos, análogos de oligonucleótidos, miméticos de oligonucleótidos, compuestos antisentido, oligonucleótidos antisentido y ARNip. Un compuesto oligomérico puede ser "antisentido" con respecto a un ácido nucleico diana, lo cual significa que puede experimentar hibridación con un ácido nucleico diana a través de un enlace de hidrógeno.
En determinadas realizaciones, un compuesto antisentido tiene una secuencia de nucleobases que, cuando se escribe en el sentido de 5' a 3', comprende el complemento inverso del segmento diana de un ácido nucleico diana al que se dirige. En algunas de dichas realizaciones, un oligonucleótido antisentido tiene una secuencia de nucleobases que, cuando se escribe en el sentido de 5' a 3', comprende el complemento inverso del segmento diana de un ácido nucleico diana al que se dirige.
En determinados casos, un compuesto antisentido dirigido a un ácido nucleico de Tau tiene una longitud de 12 a 30 subunidades. En determinados casos, un compuesto antisentido dirigido a un ácido nucleico de Tau tiene una longitud de 12 a 25 subunidades. En determinados casos, un compuesto antisentido dirigido a un ácido nucleico de Tau tiene una longitud de 12 a 22 subunidades. En determinados casos, un compuesto antisentido dirigido a un ácido nucleico de Tau tiene una longitud de 14 a 20 subunidades. En determinados casos, un compuesto antisentido dirigido a un ácido nucleico de Tau tiene una longitud de 15 a 25 subunidades. En determinados casos, un compuesto antisentido dirigido a un ácido nucleico de Tau tiene una longitud de 18 a 22 subunidades. En determinados casos, un compuesto antisentido dirigido a un ácido nucleico de Tau tiene una longitud de 19 a 21 subunidades. En determinados casos, el compuesto antisentido tiene una longitud de 8 a 80, 12 a 50, 13 a 30, 13 a 50, 14 a 30, 14 a 50, 15 a 30, 15 a 50, 16 a 30, 16 a 50, 17 a 30, 17 a 50, 18 a 30, 18 a 50, 19 a 30, 19 a 50, o 20 a 30 subunidades unidas.
En determinados casos, un compuesto antisentido dirigido a un ácido nucleico de Tau tiene una longitud de 12
subunidades. En determinados casos, un compuesto antisentido dirigido a un ácido nucleico de Tau tiene una longitud de 13 subunidades. En determinados casos, un compuesto antisentido dirigido a un ácido nucleico de Tau tiene una longitud de 14 subunidades. En determinados casos, un compuesto antisentido dirigido a un ácido nucleico de Tau tiene una longitud de 15 subunidades. En determinados casos, un compuesto antisentido dirigido a un ácido nucleico de Tau tiene una longitud de 16 subunidades. En determinados casos, un compuesto antisentido dirigido a un ácido nucleico de Tau tiene una longitud de 17 subunidades. En determinados casos, un compuesto antisentido dirigido a un ácido nucleico de Tau tiene una longitud de 18 subunidades. En determinados casos, un compuesto antisentido dirigido a un ácido nucleico de Tau tiene una longitud de 19 subunidades. En determinados casos, un compuesto antisentido dirigido a un ácido nucleico de Tau tiene una longitud de 20 subunidades. En determinados casos, un compuesto antisentido dirigido a un ácido nucleico de Tau tiene una longitud de 21 subunidades. En determinados casos, un compuesto antisentido dirigido a un ácido nucleico de Tau tiene una longitud de 22 subunidades. En determinados casos, un compuesto antisentido dirigido a un ácido nucleico de Tau tiene una longitud de 23 subunidades. En determinados casos, un compuesto antisentido dirigido a un ácido nucleico de Tau tiene una longitud de 24 subunidades. En determinados casos, un compuesto antisentido dirigido a un ácido nucleico de Tau tiene una longitud de 25 subunidades. En determinados casos, un compuesto antisentido dirigido a un ácido nucleico de Tau tiene una longitud de 26 subunidades. En determinados casos, un compuesto antisentido dirigido a un ácido nucleico de Tau tiene una longitud de 27 subunidades. En determinados casos, un compuesto antisentido dirigido a un ácido nucleico de Tau tiene una longitud de 28 subunidades. En determinados casos, un compuesto antisentido dirigido a un ácido nucleico de Tau tiene una longitud de 29 subunidades. En determinados casos, un compuesto antisentido dirigido a un ácido nucleico de Tau tiene una longitud de 30 subunidades. En determinados casos, el compuesto antisentido dirigido a un ácido nucleico de Tau tiene una longitud de 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79 u 80 subunidades unidas o un intervalo definido por cualesquiera dos de los valores anteriores. En determinados casos, el compuesto antisentido es un oligonucleótido antisentido y las subunidades unidas son nucleósidos.
En determinadas realizaciones, los oligonucleótidos dirigidos a un ácido nucleico de Tau pueden estar acortados o truncados. Por ejemplo, puede eliminarse una única subunidad del extremo 5' (truncado en 5') o, de manera alternativa, del extremo 3' (truncado en 3'). Un compuesto antisentido acortado o truncado dirigido a un ácido nucleico de Tau puede tener dos subunidades eliminadas del extremo 5' o, de manera alternativa, puede tener dos subunidades eliminadas del extremo 3', del compuesto antisentido. De manera alternativa, los nucleósidos eliminados se pueden dispersar a lo largo del compuesto antisentido, por ejemplo, en un compuesto antisentido que tiene un nucleósido eliminado del extremo 5' y un nucleósido eliminado del extremo 3'.
Cuando una sola subunidad adicional está presente en un compuesto antisentido alargado, la subunidad adicional puede ubicarse en el extremo 5' o 3' del compuesto antisentido. Cuando dos o más subunidades adicionales están presentes, las subunidades agregadas pueden ser adyacentes entre sí, por ejemplo, en un compuesto antisentido que tiene dos subunidades agregadas al extremo 5' (agregado en 5') o, de manera alternativa, al extremo 3' (agregado en 3') del compuesto antisentido. De manera alternativa, las subunidades agregadas se pueden dispersar a lo largo del compuesto antisentido, por ejemplo, en un compuesto antisentido que tiene una subunidad agregada al extremo 5' y una subunidad agregada al extremo 3'.
Es posible aumentar o disminuir la longitud de un compuesto antisentido, tal como un oligonucleótido antisentido, y/o introducir bases con emparejamientos erróneos sin eliminar la actividad. Por ejemplo, en Woolf y col. (Proc. Natl. Acad. Sci. EE.UU. 89:7305-7309, 1992), se sometió a prueba una serie de oligonucleótidos antisentido con una longitud de 13 25 nucleobases para determinar su capacidad de inducir la escisión de un ARN diana en un modelo de inyección de ovocitos. Los oligonucleótidos antisentido de 25 nucleobases de longitud con 8 u 11 bases con emparejamientos erróneos cerca de los extremos de los oligonucleótidos antisentido fueron capaces de dirigir la escisión específica del ARNm diana, aunque en menor grado que los oligonucleótidos antisentido que no contenían emparejamientos erróneos. De manera similar, la escisión específica diana se consiguió utilizando oligonucleótidos antisentido de 13 nucleobases, incluyendo los que tenían 1 o 3 emparejamientos erróneos.
Gautschi y col (J. Natl. Cancer Inst. 93:463-471, marzo de 2001) demostraron la capacidad de un oligonucleótido que tiene un 100 % de complementariedad con el ARNm de bcl-2 y que tiene 3 emparejamientos erróneos con el ARNm de bcl-xL de reducir la expresión tanto de bcl-2 como de bcl-xL in vitro e in vivo.Además, este oligonucleótido demostró una potente actividad antitumoral in vivo.
Maher y Dolnick (Nuc. Acid. Res. 16:3341-3358,1988) sometieron a prueba una serie de oligonucleótidos antisentido de 14 nucleobases en tándem, y oligonucleótidos antisentido de 28 y 42 nucleobases compuestos por la secuencia de dos o tres de los oligonucleótidos antisentido en tándem, respectivamente, para determinar su capacidad de detener la traducción de DHFR humana en un ensayo de reticulocitos de conejo. Cada uno de los tres oligonucleótidos antisentido de 14 nucleobases solo era capaz de inhibir la traducción, aunque a un nivel más moderado que los oligonucleótidos antisentido de 28 o 42 nucleobases.
Motivos de compuestos antisentido
En determinadas realizaciones, los compuestos antisentido dirigidos a un ácido nucleico de Tau tienen subunidades químicamente modificadas dispuestas en patrones, o motivos, para conferir propiedades a los compuestos antisentido tales como actividad inhibidora mejorada, mayor afinidad de unión por un ácido nucleico diana o resistencia a la degradación mediante nucleasas in vivo.
Los compuestos antisentido quiméricos típicamente contienen al menos una región modificada para conferir mayor resistencia a la degradación de nucleasas, mayor captación celular, mayor afinidad de unión por el ácido nucleico diana y/o mayor afinidad inhibidora. Una segunda región de un compuesto antisentido quimérico puede servir opcionalmente como un sustrato para la endonucleasa celular RNasa H, que escinde la cadena de ARN de un dúplex de ARN:ADN.
Los compuestos antisentido que tienen un motivo gapmero se consideran compuestos antisentido quiméricos. En un gapmero, una región interna que tiene una pluralidad de nucleótidos que admite la escisión de RNasa H se coloca entre las regiones externas que tienen una pluralidad de nucleótidos químicamente diferenciados de los nucleósidos de la región interna. En el caso de un oligonucleótido antisentido que tiene un motivo gapmero, el segmento de hueco en general sirve como el sustrato para la escisión de endonucleasas, mientras que los segmentos de ala comprenden nucleósidos modificados. En determinadas realizaciones, las regiones de un gapmero se diferencian según los tipos de restos de azúcar que comprende cada región diferenciada. Los tipos de restos de azúcar que se utilizan para diferenciar las regiones de un gapmero pueden, en algunas realizaciones, incluir p-D-ribonucleósidos, p-D-desoxirribonucleósidos, nucleósidos modificados en 2' (tales nucleósidos modificados en 2' pueden incluir 2'-MOE y 2 -O-CH3, entre otros) y nucleósidos modificados con azúcar bicíclico (tales nucleósidos modificados con azúcar bicíclico pueden incluir aquellos que tienen un puente 4'-(CH2)n-O-2', donde n=1 o n=2 y 4 -CH2-O-CH2-2'). En determinadas realizaciones, las alas pueden incluir varios restos de azúcar modificados, que incluyen, por ejemplo, 2'-MOE. En determinadas realizaciones, las alas pueden incluir varios restos de azúcar modificados y no modificados. En determinadas realizaciones, las alas pueden incluir diversas combinaciones de nucleósidos 2'-MOE y 2'-desoxinucleósidos.
Cada región diferenciada puede comprender restos de azúcar uniformes, variantes o alternativos. El motivo ala-huecoala se describe frecuentemente como "X-Y-Z", donde "X" representa la longitud del ala 5', "Y" representa la longitud de la región de hueco y "Z" representa la longitud del ala 3'. "X" y "Z" pueden comprender restos de azúcar uniformes, variantes o alternativos. En determinadas realizaciones, "X" e "Y" pueden incluir uno o más 2'-desoxinucleósidos. "Y" puede comprender 2'-desoxinucleósidos. Como se usa en esta invención, un gapmero descrito como "X-Y-Z" tiene una configuración tal que el hueco se ubica inmediatamente adyacente a cada uno del ala 5' y el ala 3'. Por lo tanto, no existen nucleótidos intermedios entre el ala 5' y el hueco o el hueco y el ala 3'. Cualquiera de los compuestos antisentido descritos en esta invención puede tener un motivo gapmero. En determinadas realizaciones, "X" y "Z" son iguales; en otras realizaciones son diferentes.
En determinadas realizaciones, los gapmeros proporcionados en esta invención incluyen, por ejemplo, 20 mer que tienen un motivo de 5-10-5.
En determinadas realizaciones, los gapmeros proporcionados en esta invención incluyen, por ejemplo, 19 mer que tienen un motivo de 5-9-5.
En determinadas realizaciones, los gapmeros proporcionados en esta invención incluyen, por ejemplo, 18 mer que tienen un motivo de 5-8-5.
En determinadas realizaciones, los gapmeros proporcionados en esta invención incluyen, por ejemplo, 18 mer que tienen un motivo de 4-8-6.
En determinadas realizaciones, los gapmeros proporcionados en esta invención incluyen, por ejemplo, 18 mer que tienen un motivo de 6-8-4.
En determinadas realizaciones, los gapmeros proporcionados en esta invención incluyen, por ejemplo, 18 mer que tienen un motivo de 5-7-6.
Ácidos nucleicos diana, regiones diana y secuencias de nucleótidos
Las secuencias de nucleótidos que codifican Tau incluyen, sin limitación, las siguientes: n.° de acceso de GENBANK NT_010783.15 truncado de los nucleótidos 9240000 a 9381000 (incorporada en esta invención como SEQ ID NO: 1), n.° de acceso de GENBANK NM_001123066.3 (incorporada en esta invención como SEQ ID NO: 2), n.° de acceso de GENBANK NM_016841.4, una secuencia de ARNm variante que omite los exones 3, 4, 6, 8, 10 y 12 (incorporada en esta invención como SEQ ID NO: 3), n.° de acceso de GENBANK NT_010783.14 truncado de los nucleótidos 2624000 a 2761000 (incorporada en esta invención como SEQ ID NO: 4), n.° de acceso de GENBANK DR002467.1 (incorporada en esta invención como SEQ ID NO: 5), n.° de acceso de GENBANK NM_001203251.1 (incorporada en esta invención como SEQ ID NO: 6), y n.° de acceso de GENBANK NM_016835.4 (incorporada en esta invención como SEQ ID NO: 7).
Se comprende que la secuencia que se indica en cada SEQ ID NO en los ejemplos contenidos en esta invención es independiente de cualquier modificación de un resto de azúcar, un enlace internucleosídico o una nucleobase. Como tales, los compuestos antisentido definidos por una SEQ ID NO pueden comprender, independientemente, una o más modificaciones de un resto de azúcar, un enlace internucleosídico o una nucleobase. Los compuestos antisentido descritos mediante el número Isis (n.° Isis) indican una combinación de secuencia de nucleobases y motivo.
En determinados casos, una región diana es una región estructuralmente definida del ácido nucleico diana. Por ejemplo, una región diana puede comprender una UTR 3', una UTR 5', un exón, un intrón, una unión exón/intrón, una región de codificación, una región de inicio de la traducción, región de fin de la traducción u otra región de ácido nucleico definida. Las regiones estructuralmente definidas para Tau se pueden obtener mediante el número de acceso de bases de datos de secuencias, tal como NCBI. En determinadas realizaciones, una región diana puede abarcar la secuencia desde un sitio diana 5' de un segmento diana dentro de la región diana hasta un sitio diana 3' de otro segmento diana dentro de la misma región diana.
El direccionamiento incluye la determinación de al menos un segmento diana al que se hibrida un compuesto antisentido, para que se produzca un efecto deseado. En determinadas realizaciones, el efecto deseado es una reducción de los niveles de ácido nucleico diana del ARNm. En determinadas realizaciones, el efecto deseado es la reducción de los niveles de proteína codificada por el ácido nucleico diana o un cambio fenotípico asociado con el ácido nucleico diana.
Una región diana puede contener uno o más segmentos diana. Múltiples segmentos diana dentro de una región diana pueden estar superpuestos. Alternativamente, pueden no superponerse. En determinados casos, los segmentos diana dentro de una región diana están separados por no más de aproximadamente 300 nucleótidos. En determinadas realizaciones, los segmentos diana dentro de una región diana están separados por una cantidad de nucleótidos que es de, es aproximadamente de, es no más de, es no más de aproximadamente 250, 200, 150, 100, 90, 80, 70, 60, 50, 40, 30, 20 o 10 nucleótidos en el ácido nucleico diana o es un intervalo definido por dos cualesquiera de los valores anteriores. En determinados casos, los segmentos diana dentro de una región diana están separados por no más de, o no más de aproximadamente 5 nucleótidos en el ácido nucleico diana. En determinadas realizaciones, los segmentos diana son contiguos. Se contemplan regiones diana definidas por un intervalo que tiene un ácido nucleico inicial que es cualquiera de los sitios diana 5' o sitios diana 3' enumerados en esta invención.
Los segmentos diana adecuados se pueden encontrar en una UTR 5', una región de codificación, una UTR 3', un intrón, un exón o una unión exón/intrón. Los segmentos diana que contienen un codón de inicio o un codón de terminación también son segmentos diana adecuados. Un segmento diana adecuado puede excluir específicamente una determinada región definida estructuralmente, tal como el codón de inicio o el codón de terminación.
La determinación de segmentos diana adecuados puede incluir una comparación de la secuencia de un ácido nucleico diana con respecto a otras secuencias en todo el genoma. Por ejemplo, se puede usar el algoritmo BLAST para identificar regiones de similitud entre diferentes ácidos nucleicos. Esta comparación puede impedir la selección de secuencias de compuestos antisentido que se pueden hibridar de manera no específica con secuencias distintas de un ácido nucleico diana seleccionado (es decir, secuencias que no son la diana o inespecíficas).
Puede haber una variación en la actividad (por ejemplo, según se define mediante el porcentaje de reducción de los niveles de ácido nucleico diana) de los compuestos antisentido dentro de una región diana activa. En determinadas realizaciones, las reducciones en los niveles de ARNm de Tau indican la inhibición de la expresión de Tau. Las reducciones en los niveles de una proteína Tau también indican la inhibición de la expresión del ARNm diana. La reducción del porcentaje de células que se tiñen positivas para Tau hiperfosforilada es indicativa de la inhibición de la expresión de Tau. Además, los cambios fenotípicos indican la inhibición de la expresión de Tau. La mejora en la función neurológica indica la inhibición de la expresión de Tau. La mejora de la memoria y la función motora indica la inhibición de la expresión de Tau. La reducción de inclusiones neurofibrilares es indicativa de inhibición de la expresión de Tau.
Hibridación
En algunos casos, la hibridación se produce entre un compuesto antisentido descrito en esta invención y un ácido nucleico de Tau. El mecanismo más común de hibridación implica enlaces de hidrógeno (por ejemplo, enlaces de hidrógeno Watson-Crick, Hoogsteen o Hoogsteen inverso) entre nucleobases complementarias de las moléculas de ácido nucleico.
La hibridación puede producirse en condiciones variables. Las condiciones rigurosas dependen de las secuencias y se determinan según la naturaleza y la composición de las moléculas de ácido nucleico que se desea hibridar.
Los procedimientos para determinar si una secuencia es específicamente hibridable con un ácido nucleico diana son bien conocidos en la técnica. En determinadas realizaciones, los compuestos antisentido proporcionados en esta invención son específicamente hibridables con un ácido nucleico de Tau.
Complementariedad
Un compuesto antisentido y un ácido nucleico diana son complementarios entre sí cuando una cantidad suficiente de nucleobases del compuesto antisentido puede unirse mediante un enlace de hidrógeno con las nucleobases correspondientes del ácido nucleico diana, de manera que se produzca un efecto deseado (por ejemplo, la inhibición antisentido de un ácido nucleico diana, como un ácido nucleico de Tau).
Las nucleobases no complementarias entre un compuesto antisentido y un ácido nucleico de Tau pueden tolerarse siempre que el compuesto antisentido siga teniendo la capacidad de hibridarse de manera específica con un ácido nucleico diana. Además, un compuesto antisentido puede hibridarse con respecto a uno o más segmentos de un ácido nucleico de Tau, de modo que los segmentos intermedios o adyacentes no estén implicados en el acontecimiento de hibridación (por ejemplo, una estructura en bucle, emparejamiento erróneo o estructura de horquilla).
Los compuestos antisentido descritos en esta invención o una porción específica de los mismos son o son al menos un 70 %, 80 %, 85 %, 86 %, 87 %, 88 %, 89 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o un 100 % complementarios a un ácido nucleico de Tau, una región diana, un segmento diana o una porción específica de los mismos. El porcentaje de complementariedad de un compuesto antisentido con un ácido nucleico diana se puede determinar mediante procedimientos habituales.
Por ejemplo, un compuesto antisentido en el que 18 de las 20 nucleobases del compuesto antisentido son complementarias a una región diana y, por lo tanto, hibridarían específicamente, representaría el 90 por ciento de complementariedad. En este ejemplo, las nucleobases no complementarias restantes pueden agruparse o intercalarse con nucleobases complementarias y no necesitan ser contiguas entre sí o a nucleobases complementarias. De esta forma, un compuesto antisentido que tiene 18 nucleobases de longitud con 4 (cuatro) nucleobases no complementarias flanqueadas por dos regiones de complementariedad completa con el ácido nucleico diana tendría un 77,8 % de complementariedad global con el ácido nucleico diana. Se puede determinar el porcentaje de complementariedad de un compuesto antisentido con una región de un ácido nucleico diana de forma habitual con programas BLAST (herramientas de búsqueda de alineación local básica) y programas PowerBLAST conocidos en la técnica (Altschul y col., J. Mol. Biol., 1990, 215, 403 410; Zhang y Madden, Genome Res., 1997, 7, 649 656). El porcentaje de homología, la identidad de secuencia o complementariedad se pueden determinar, por ejemplo, mediante el programa Gap (Wisconsin Sequence Analysis Package, Versión 8 para Unix, Genetics Computer Group, University Research Park, Madison Wis.) con ajustes por defecto, que utiliza el algoritmo de Smith y Waterman (Adv. Appl. Math., 1981,2, 482489).
En determinadas realizaciones, los compuestos antisentido proporcionados en esta invención o porciones específicas de los mismos son totalmente complementarios (es decir, 100 % complementarios) a un ácido nucleico diana o una porción específica del mismo. Por ejemplo, un compuesto antisentido puede ser totalmente complementario a un ácido nucleico de Tau o a una región diana o a un segmento diana o secuencia diana del mismo. Como se usa en esta invención, "totalmente complementario" significa que cada nucleobase de un compuesto antisentido tiene la capacidad de realizar un emparejamiento de bases preciso con las nucleobases correspondientes de un ácido nucleico diana. Por ejemplo, un compuesto antisentido de 20 nucleobases es totalmente complementario a una secuencia diana que tiene una longitud de 400 nucleobases, siempre que haya una porción de 20 nucleobases correspondiente del ácido nucleico diana totalmente complementaria al compuesto antisentido. Totalmente complementario también puede utilizarse en referencia a una porción específica del primer y/o el segundo ácido nucleico. Por ejemplo, una porción de 20 nucleobases de un compuesto antisentido de 30 nucleobases puede ser "totalmente complementaria" a una secuencia diana que tiene una longitud de 400 nucleobases. La porción de 20 nucleobases del oligonucleótido de 30 nucleobases es totalmente complementaria a la secuencia diana si la secuencia diana tiene una porción de 20 nucleobases correspondiente donde cada nucleobase es complementaria a la porción de 20 nucleobases del compuesto antisentido. Al mismo tiempo, todo el compuesto antisentido de 30 nucleobases puede ser o no totalmente complementario a la secuencia diana, dependiendo de si las 10 nucleobases restantes del compuesto antisentido también son complementarias a la secuencia diana.
La ubicación de una nucleobase no complementaria puede encontrarse en el extremo 5' o extremo 3' del compuesto antisentido. De manera alternativa, la nucleobase o las nucleobases no complementarias pueden estar en una posición interna del compuesto antisentido. Cuando dos o más nucleobases no complementarias están presentes, pueden ser contiguas (es decir, estar unidas) o no contiguas. En una realización, una nucleobase no complementaria se ubica en el segmento de ala de un oligonucleótido antisentido gapmero.
En determinados casos, los compuestos antisentido que tienen una longitud de, o de hasta 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 o 20 nucleobases comprenden no más de 4, no más de 3, no más de 2 o no más de 1 nucleobase(s) no complementaria(s) en relación con un ácido nucleico diana, como un ácido nucleico de Tau o una porción específica del mismo.
En determinados casos, los compuestos antisentido que tienen una longitud de, o de hasta 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 o 30 nucleobases comprenden no más de 6, no más de 5, no más de 4, no más de 3, no más de 2 o no más de 1 nucleobase(s) no complementaria(s) en relación con un ácido nucleico diana, como un ácido nucleico de Tau o una porción específica del mismo.
Los compuestos antisentido proporcionados en esta invención también incluyen los que son complementarios a una porción de un ácido nucleico diana. Como se usa en esta invención, "porción" se refiere a una cantidad definida de nucleobases contiguas (es decir, unidas) dentro de una región o un segmento de un ácido nucleico diana. Una "porción" también puede referirse a una cantidad definida de nucleobases contiguas de un compuesto antisentido. En determinadas realizaciones, los compuestos antisentido son complementarios al menos a una porción de 8 nucleobases de un segmento diana. En determinadas realizaciones, los compuestos antisentido son complementarios al menos a una porción de 9 nucleobases de un segmento diana. En determinadas realizaciones, los compuestos antisentido son complementarios al menos a una porción de 10 nucleobases de un segmento diana. En determinadas realizaciones, los compuestos antisentido son complementarios al menos a una porción de 11 nucleobases de un segmento diana. En determinadas realizaciones, los compuestos antisentido son complementarios al menos a una porción de 12 nucleobases de un segmento diana. En determinadas realizaciones, los compuestos antisentido son complementarios al menos a una porción de 13 nucleobases de un segmento diana. En determinadas realizaciones, los compuestos antisentido son complementarios al menos a una porción de 14 nucleobases de un segmento diana. En determinadas realizaciones, los compuestos antisentido son complementarios al menos a una porción de 15 nucleobases de un segmento diana. También se contemplan compuestos antisentido que son complementarios a al menos una porción de 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20 o más nucleobases de un segmento diana o un intervalo definido por cualesquiera dos de estos valores.
Identidad
Los compuestos antisentido proporcionados en esta invención también pueden tener un porcentaje de identidad definido para una secuencia de nucleótidos en particular, SEQ ID NO, o un compuesto representado por un número Isis específico o porción del mismo. Como se usa en esta invención, un compuesto antisentido es idéntico a la secuencia descrita en esta invención si tiene la misma capacidad de emparejamiento de nucleobases. Por ejemplo, un ARN que contiene uracilo en lugar de timidina en una secuencia de ADN descrita se consideraría idéntico a la secuencia de a Dn , ya que tanto el uracilo como la timidina se emparejan con la adenina. También se contemplan las versiones acortadas y extendidas de los compuestos antisentido descritos en esta invención, así como los compuestos que tienen bases no idénticas en relación con los compuestos antisentido proporcionados en esta invención. Las bases no idénticas pueden ser adyacentes entre sí o estar dispersadas en todo el compuesto antisentido. El porcentaje de identidad de un compuesto antisentido se calcula según la cantidad de bases que tienen emparejamiento de bases idéntico en relación con la secuencia a la que se está comparando.
En determinados casos, los compuestos antisentido o porciones de los mismos son al menos 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o 100 % idénticos a uno o más de los compuestos antisentido o las SEQ ID NO, o una porción de los mismos, descritos en esta invención.
En determinadas realizaciones, una porción del compuesto antisentido se compara con una porción de igual longitud del ácido nucleico diana. En determinadas realizaciones, una porción de 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24 o 25 nucleobases se compara con una porción de igual longitud del ácido nucleico diana.
En determinadas realizaciones, una porción del oligonucleótido antisentido se compara con una porción de igual longitud del ácido nucleico diana. En determinadas realizaciones, una porción de 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24 o 25 nucleobases se compara con una porción de igual longitud del ácido nucleico diana.
Modificaciones
Un nucleósido es una combinación de azúcar y una base. La porción de nucleobase (también conocida como "base") del nucleósido es comúnmente un resto básico heterocíclico. Los nucleótidos son nucleósidos que incluyen además un grupo fosfato unido de forma covalente a la porción de azúcar del nucleósido. Para aquellos nucleósidos que incluyen un azúcar pentofuranosilo, el grupo fosfato puede estar unido al resto hidroxilo 2', 3' o 5' del azúcar. Se forman oligonucleótidos a través del enlace covalente de los nucleósidos adyacentes entre sí, para formar un oligonucleótido polimérico lineal. Dentro de la estructura de oligonucleótido, los grupos fosfato son comúnmente denominados como formadores de los enlaces internucleosídicos del oligonucleótido.
Las modificaciones de los compuestos antisentido abarcan sustituciones o cambios de enlaces internucleosídicos, restos de azúcar o nucleobases. Los compuestos antisentido modificados a menudo se prefieren con respecto a las formas nativas debido a propiedades deseables tales como, por ejemplo, captación celular mejorada, afinidad mejorada por un ácido nucleico diana, mayor estabilidad en presencia de nucleasas o mayor actividad inhibidora.
Los nucleósidos modificados químicamente también pueden emplearse para aumentar la afinidad de unión de un oligonucleótido antisentido acortado o truncado por su ácido nucleico diana. Por consiguiente, a menudo se pueden obtener resultados comparables con compuestos antisentido más cortos que tienen tales nucleósidos modificados químicamente.
Enlaces internucleosídicos modificados
El enlace internucleosídico de origen natural de ARN y ADN es un enlace fosfodiéster de 3' a 5'. A menudo se seleccionan compuestos antisentido que tienen uno o más enlaces internucleosídicos modificados, es decir, de origen no natural, en vez de compuestos antisentido que tienen enlaces internucleosídicos de origen natural, debido a propiedades deseables como, por ejemplo, captación celular mejorada, afinidad mejorada por los ácidos nucleicos diana y mayor estabilidad en presencia de nucleasas.
Los oligonucleótidos que tienen enlaces internucleosídicos modificados incluyen enlaces internucleosídicos que conservan un átomo de fósforo, así como enlaces internucleosídicos que no tienen átomo de fósforo. Los enlaces internucleosídicos representativos que contienen fósforo incluyen, pero no se limitan a, fosfodiésteres, fosfotriésteres, metilfosfonatos, fosforamidato, y fosforotioatos. Los procedimientos para la preparación de enlaces que contienen fósforo y que no contienen fósforo son bien conocidos.
En determinadas realizaciones, los compuestos antisentido dirigidos a un ácido nucleico de Tau comprenden uno o más enlaces internucleosídicos modificados. En determinadas realizaciones, los enlaces internucleosídicos modificados se intercalan en todo el compuesto antisentido. En determinadas realizaciones, los enlaces internucleosídicos modificados son enlaces fosforotioato. En determinadas realizaciones, cada enlace internucleosídico de un compuesto antisentido es un enlace internucleosídico de fosforotioato.
Restos de azúcar modificado
Los compuestos antisentido pueden contener opcionalmente uno o más nucleósidos, donde el grupo azúcar ha sido modificado. Tales nucleósidos de azúcar modificado pueden transmitir estabilidad de nucleasas mejorada, mayor afinidad de unión o alguna otra propiedad biológica beneficiosa a los compuestos antisentido. En determinadas realizaciones, los nucleósidos comprenden restos de anillo de ribofuranosa químicamente modificados. Los ejemplos de anillos de ribofuranosa modificados químicamente incluyen, sin limitación, la adición de grupos sustituyentes (incluidos los grupos sustituyentes 5' y 2', puentes de átomos del anillo no geminal para formar ácidos nucleicos bicíclicos (BNA), el reemplazo del átomo de oxígeno del anillo ribosilo con S, N(R), o C(R1)(R2) (R, R1 y R2 son cada uno independientemente H, alquilo C1-C12 o un grupo protector) y combinaciones de los mismos. Los ejemplos de azúcares modificados químicamente incluyen nucleósido sustituido con 2'-F-5'-metilo (véase la solicitud internacional PCT WO 2008/101157 publicada el 21/08/08 para otros nucleósidos sustituidos con 5',2'-bis descritos) o el reemplazo del átomo de oxígeno del anillo de ribosilo con S con sustitución adicional en la posición 2' (véase la solicitud de patente de los EE.UU. publicada US2005-0130923, publicada el 16 de junio de 2005) o, como alternativa, una sustitución 5' de un BNA (véase la solicitud internacional PCT WO 2007/134181 publicada el 22/11/07 donde LNA está sustituido con, por ejemplo, un grupo 5'-metilo o 5'-vinilo).
Los ejemplos de nucleósidos que tienen restos de azúcar modificados incluyen, sin limitación, nucleósidos que comprenden grupos sustituyentes 5'-vinilo, 5'-metilo (R o S), 4'-S, 2'-F, 2 -OCH3, 2 -OCH2CH3, 2 -OCH2CH2F y 2'-O(CH2)2OCH3. El sustituyente en la posición 2' se puede seleccionar de alilo, amino, azido, tio, O-alilo, O-alquilo C1-C10, OCF3, OCH2F, O(CH2)2SCH3, O(CH2)2-O-N(Rn)(Rn), O-CH2-C(=O)-N(Rm)(Rn) y O-CH2-C(=O)-N(R1)-(CH2)2-N(Rm)(Rn), donde cada R1, Rm y Rn es, independientemente, H o alquilo C1-C10 sustituido o sin sustituir.
Como se usa en esta invención, "nucleósidos bicíclicos" se refiere a nucleósidos modificados que comprenden un resto de azúcar bicíclico. Los ejemplos de nucleósidos bicíclicos incluyen, sin limitación, nucleósidos que comprenden un puente entre los átomos del anillo de ribosilo 4' y 2'. En determinadas realizaciones, los compuestos antisentido proporcionados en esta invención incluyen uno o más nucleósidos bicíclicos que comprenden un puente 4' a 2'. Ejemplos de dichos nucleósidos bicíclicos puenteados 4' a 2' incluyen, pero no se limitan a, una de las fórmulas: 4'-(CH2)-O-2' (LNA); 4'-(CH2)-S-2'; 4'-(CH2)2-O-2' (ENA); 4'-CH(CH3)-O-2' y 4'-CH(CH2OCH3)-O-2' (y análogos de los mismos, véase la Patente de EE.UU. 7,399,845, concedida el 15 de julio de 2008); 4'-C(CH3)(CH3)-O-2' (y análogos de los mismos, véase la Solicitud Internacional publicada WO/2009/006478, publicada el 8 de enero de 2009); 4'-CH2-N(OCH3)-2' (y análogos de los mismos, véase la Solicitud Internacional publicada WO/2008/150729, publicada el 11 de diciembre de 2008); 4 -CH2-O-N(CH3)-2' (véase la Solicitud de Patente de EE.UU. publicada US2004-0171570, publicada el 2 de septiembre de 2004); 4'-CH2-N(R)-O-2', donde R es H, alquilo C1-C12, o un grupo protector (véase la Patente de EE.UU. 7,427,672, concedida el 23 de septiembre de 2008); 4 '-c H2-C(H)(CH3)-2' (véase Chattopadhyaya y col., J. Org. Chem., 2009, 74, 118-134); y 4'-CH2-C-(=CH2)-2' (y análogos de los mismos, véase la Solicitud Internacional publicada WO 2008/154401, publicada el 8 de diciembre de 2008).
También se pueden encontrar más informes relacionados con los nucleósidos bicíclicos en la bibliografía publicada (véase, por ejemplo: Singh y col., Chem. Commun., 1998, 4, 455-456; Koshkin y col., Tetrahedron, 1998, 54, 3607 3630; Wahlestedt y col., Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A., 2000, 97, 5633-5638; Kumar y col., Bioorg. Med. Chem. Lett., 1998, 8, 2219-2222; Singh y col., J. Org. Chem., 1998, 63, 10035-10039; Srivastava y col., J. Am. Chem. Soc., 2007, 129(26) 8362-8379; Elayadi y col, Curr. Opinion Invest. Drugs, 2001, 2, 558-561; Braasch y col., Chem. Biol., 2001, 8, 1 7; y Orum y col., Curr. Opinion Mol. Ther., 2001, 3, 239-243; Patentes de EE.UU. N.° 6.268.490; 6.525.191; 6.670.461; 6.770.748; 6.794.499; 7.034.133; 7.053.207; 7.399.845; 7.547.684; y 7.696.345;
las Publicaciones de Patente de EE.UU. N.° US2008-0039618; US2009-0012281; las solicitudes internacionales PCT publicadas WO 1994/014226; WO 2004/106356; WO 2005/021570; WO 2007/134181; WO 2008/150729; WO 2008/154401; y WO 2009/006478. Cada uno de los nucleósidos bicíclicos anteriores se puede preparar con una o más configuraciones de azúcar estereoquímicas que incluyen, por ejemplo, a-L-ribofuranosa y p-D-ribofuranosa (véase la solicitud internacional PCT PCT/DK98/00393, publicada el 25 de marzo de 1999 como el documento WO 99/14226).
En determinadas realizaciones, los restos de azúcar bicíclicos de nucleósidos BNA incluyen, pero no se limitan a, compuestos que tienen al menos un puente entre la posición 4' y 2' del resto de azúcar pentofuranosilo donde dichos puentes comprenden independientemente 1 o de 2 a 4 grupos unidos seleccionados independientemente de -[C(Ra)(Rb)]n-, -C(Ra)=C(Rb)-, -C(Ra)=N-, -C(=O)-, -C(=NRa)-, -C(=S)-, -O-, -Si(Ra)2-, -S(=O)x- y -N(Ra)-; donde:
x es 0, 1 o 2;
n es 1, 2, 3 o 4;
cada Ra y Rb es, independientemente, H, un grupo protector, hidroxilo, alquilo C1-C12, alquilo C1-C12 sustituido, alquenilo C2-C12, alquenilo C2-C12 sustituido, alquinilo C2-C12, alquinilo C2-C12 sustituido, arilo C5-C20, arilo C5-C20 sustituido, radical heterociclo, radical heterociclo sustituido, heteroarilo, heteroarilo sustituido, radical C5-C7 alicíclico, radical C5-C7 alicíclico sustituido, halógeno, OJ1, NJ1J2, SJ1, N3, COOJ1, acil (C(=O)-H), acilo sustituido, Cn , sulfonil (S(=O)2-J1), o sulfoxil (S(=O)-J1); y
cada J 1 y J2 es, independientemente, H, alquilo C1-C12, alquilo C1-C12 sustituido, alquenilo C2-C12, alquenilo C2-C12 sustituido, alquinilo C2-C12, alquinilo C2-C12 sustituido, arilo C5-C20, arilo C5-C20 sustituido, acil (C(=O)-H), acilo sustituido, un radical heterociclo, un radical heterociclo sustituido, aminoalquilo C 1-C12, aminoalquilo C1-C12 sustituido o un grupo protector.
En determinadas realizaciones, el puente de un resto de azúcar bicíclico es, -[C(Ra)(Rb)]n-, -[C(Ra)(Rb)]n-O-, -C(RaRb)-N(R)-O- o -C(RaRb)-O-N(R)-. En determinadas realizaciones, el puente es 4'-CH2-2', 4'-(CH2)2-2', 4'-(CH2)3-2', 4'-CH2-O-2', 4'-(CH2)2-O-2', 4'-CH2-O-N(R)-2' y 4'-CH2-N(R)-O-2'- donde cada R es, independientemente, H, un grupo protector o alquilo C1-C12.
En determinadas realizaciones, los nucleósidos bicíclicos se definen además según la configuración isomérica. Por ejemplo, un nucleósido que comprende un puente 4'-2'-metilen-oxi, puede estar en la configuración a-L o en la configuración p-D. Anteriormente, se han incorporado los BNA a-L-metilenoxi (4'-CH2-O-2') en oligonucleótidos antisentido que mostraban actividad antisentido (Frieden y col., Nucleic Acids Research, 2003, 21,6365-6372).
En determinadas realizaciones, los nucleósidos bicíclicos incluyen, pero no se limitan a, (A) BNA a-L-metilenoxi (4'-CH2-O-2'), (B) BNA p-D-metilenoxi (4'-CH2-O-2'), (C) BNA etilenoxi (4'-(CH2)2-O-2'), (D) BNA aminooxi (4'-CH2-O-N(R)-2'), (E) BNA oxiamino (4'-CH2-N(R)-O-2'), y (F) BNA metil(metilenoxi) (4'-CH(CHs)-O-2'), (G) BNA metilen-tio (4'-CH2-S-2'), (H) BNA metilen-amino (4'-c H2-N(R)-2'), (i) BNA metilo carbocíclico (4'-CH2-CH(CHs)-2') y (J) BNA propileno carbocíclico (4'-
donde Bx es el resto básico y R es, independientemente, H, un grupo protector o alquilo C 1-C12.
En determinadas realizaciones, se proporciona nucleósidos bicíclicos que tienen la Fórmula I:
Bx es un resto básico heterocíclico;
-Qa-Qb-Qc- es -CH2-N(Rc)-CH2-, -C(=O)-N(Rc)-CH2-, -CH2-O-N(Rc)-, -CH2-N(Rc)-O- o -N(Rc)-O-CH2;
Rc es alquilo C1-C12 o un grupo protector amino; y
Ta y Tb son cada uno, independientemente H, un grupo protector hidroxilo, un grupo conjugado, un grupo de fósforo reactivo, un resto de fósforo o una unión covalente a un medio de soporte.
En determinadas realizaciones, se proporcionan nucleósidos bicíclicos que tienen la Fórmula II:
Bx es un resto básico heterocíclico;
Ta y Tb son cada uno, independientemente H, un grupo protector hidroxilo, un grupo conjugado, un grupo de fósforo reactivo, un resto de fósforo o una unión covalente a un medio de soporte;
Za es alquilo C1-C6, alquenilo C2-C6, alquinilo C2-C6, alquilo C1-C6 sustituido, alquenilo C2-C6 sustituido, alquinilo C2-C6 sustituido, acilo, acilo sustituido, amida sustituida, tiol o tiol sustituido.
En una realización, cada uno de los grupos sustituidos, es, independientemente, mono o poli sustituido con grupos sustituyentes independientemente seleccionados de halógeno, oxo, hidroxilo, OJc, NJcJd, SJc, N3, OC(=X)Jc, y NJeC(=X)NJcJd, donde cada Jc, Jd y Je es, independientemente, H, alquilo C1-C6, o alquilo C1-C6 sustituido y X es O o NJc.
En determinadas realizaciones, se proporcionan nucleósidos bicíclicos que tienen la Fórmula III:
Ta y Tb son cada uno, independientemente H, un grupo protector hidroxilo, un grupo conjugado, un grupo de fósforo reactivo, un resto de fósforo o una unión covalente a un medio de soporte.
Zb es alquilo C1-C6, alquenilo C2-C6, alquinilo C2-C6, alquilo C1-C6 sustituido, alquenilo C2-C6 sustituido, alquinilo C2-C6 sustituido o acilo sustituido (C(=O)-).
En determinadas realizaciones, se proporcionan nucleósidos bicíclicos que tienen la Fórmula IV:
Bx es un resto básico heterocíclico;
Ta y Tb son cada uno, independientemente H, un grupo protector hidroxilo, un grupo conjugado, un grupo de fósforo reactivo, un resto de fósforo o una unión covalente a un medio de soporte.
Rd es alquilo C1-C6, alquilo C1-C6 sustituido, alquenilo C2-C6, alquenilo C2-C6 sustituido, alquinilo C2-C6 o alquinilo
C2-C6 sustituido;
cada qa, qb, qc y qd es, independientemente, H, halógeno, alquilo C1-C6, alquilo C1-C6 sustituido, alquenilo C2-C6, alquenilo C2-C6 sustituido, alquinilo C2-C6 o alquinilo C2-C6 sustituido, alcoxilo C1-C6, alcoxilo C1-C6 sustituido, acilo, acilo sustituido, aminoalquilo C1-C6 o aminoalquilo C1-C6 sustituido;
En determinadas realizaciones, se proporcionan nucleósidos bicíclicos que tienen la Fórmula V:
Bx es un resto básico heterocíclico;
Ta y Tb son cada uno, independientemente H, un grupo protector hidroxilo, un grupo conjugado, un grupo de fósforo reactivo, un resto de fósforo o una unión covalente a un medio de soporte.
qa, qb, qe y qf son cada uno, independientemente, hidrógeno, halógeno, alquilo C 1-C12, alquilo C1-C12 sustituido, alquenilo C2-C12, alquenilo C2-C12 sustituido, alquinilo C2-C12, alquinilo C2-C12 sustituido, alcoxi C1-C12, alcoxi C1-C12 sustituido, OJj, SJj, SOJj, SO2Jj, NJjJk, N3, CN, C(=O)OJj, C(=O)NJjJk, C(=O)Jj, O-C(=O)NJjJk, N(H)C(=NH)NJjJk, N(H)C(=O)NJjJk o N(H)C(=S)NJjJk;
o qe y qf juntos son =C(qg)(qh);
qg y qh son cada uno, independientemente, H, halógeno, alquilo C1-C12 o alquilo C1-C12 sustituido.
Se han descrito la síntesis y la preparación de los monómeros de BNA metilenoxi (4'-CH2-O-2') adenina, citosina, guanina, 5-metil-citosina, timina y uracilo, junto con sus propiedades de oligomerización y reconocimiento de ácidos nucleicos (Koshkin y col., Tetrahedron, 1998, 54, 3607-3630). Los BNA y la preparación de los mismos también se describen en los documentos WO 98/39352 y WO 99/14226.
También se han preparado análogos de BNA metilenoxi (4'-CH2-O-2') y 2'-tio-BNA (Kumar y col., Bioorg. Med. Chem. Lett., 1998, 8, 2219-2222). También se ha descrito la preparación de análogos de nucleósidos bloqueados que comprenden dúplex de oligodesoxirribonucleótidos como sustratos para polimerasas de ácidos nucleicos (Wengel y col., documento WO 99/14226). Además, en la técnica se ha descrito la síntesis de BNA 2'-amino, un novedoso análogo de oligonucleótido de alta afinidad restringido conformacionalmente (Singh y col., J. Org.Chem., 1998, 63, 10035-10039). Además, se han preparado BNA 2'-amino y 2'-metilamino y se ha presentado previamente la estabilidad térmica de sus dúplex con cadenas complementarias de ARN y ADN.
Bx es un resto básico heterocíclico;
Ta y Tb son cada uno, independientemente H, un grupo protector hidroxilo, un grupo conjugado, un grupo de fósforo reactivo, un resto de fósforo o una unión covalente a un medio de soporte;
cada qi, qj, qk y ql es, independientemente, H, halógeno, alquilo C1-C12 alquilo C1-C12 sustituido, alquenilo C2-C12, alquenilo C2-C12 sustituido, alquinilo C2-C12, alquinilo C2-C12 sustituido, alcoxi C1-C12, alcoxi C1-C12 sustituido, OJj, SJj, SOJj, SO2Jj, NJjJk, Na, CN, C(=O)OJj, C(=O)NJjJk, C(=O)Jj, O-C(=O)NJjJk, N(H)C(=NH)NJjJk, N(H)C(=O)NJjJk o N(H)C(=S)NJjJk; y
qi y qj o ql y qk juntos son =C(qg)(qh), donde qg y qh son cada uno, independientemente, H, halógeno, alquilo C 1-C12 o alquilo C1-C12 sustituido.
Se han descrito un nucleósido carbocíclico bicíclico que tiene un puente 4'-(CH2)3-2' y el puente análogo de alquenilo 4'-CH=CH-CH2-2' (Freier y col., Nucleic Acids Research, 1997, 25(22), 4429-4443 y Albaek y col., J. Org. Chem., 2006, 71, 7731-7740). También se han descrito la síntesis y la preparación de nucleósidos carbocíclicos bicíclicos, junto con su oligomerización y estudios bioquímicos (Srivastava y col., J. Am. Chem. Soc. 2007,129(26), 8362-8379).
Como se usa en esta invención, "nucleósido bicíclico 4'-2'" o "nucleósido bicíclico 4' a 2'" se refiere a un nucleósido bicíclico que comprende un anillo de furanosa que comprende un puente que conecta dos átomos de carbono del anillo
de furanosa que conecta el átomo de carbono en la posición 2' y el átomo de carbono en la posición 4' del anillo de azúcar.
Como se usa en esta invención, "nucleósidos monocíclicos" se refiere a nucleósidos que comprenden restos de azúcar modificados que no son restos de azúcar bicíclicos. En determinadas realizaciones, el resto de azúcar o análogo del resto de azúcar de un nucleósido puede estar modificado o sustituido en cualquier posición.
Como se usa en esta invención, "azúcar modificado en 2'" significa un azúcar de furanosilo modificado en la posición 2'. En determinadas realizaciones, tales modificaciones incluyen sustituyentes seleccionados de: un haluro, que incluye, pero no se limita a, alcoxi sustituido y sin sustituir, tioalquilo sustituido y sin sustituir, aminoalquilo sustituido y sin sustituir, alquilo sustituido y sin sustituir, alilo sustituido y sin sustituir y alquinilo sustituido y sin sustituir. En determinadas realizaciones, las modificaciones 2' se seleccionan de sustituyentes que incluyen, pero no se limitan a: O[(CH2)nO]mCH3, O(CH2)nNH2, O(CH2)nCH3, O(CH2)nF, O(CH2)nONH2, OCH2C(=O)N(H)CH3 y O(CH2)nON[(CH2)nCH3]2, donde n y m son de 1 a aproximadamente 10. Otros grupos sustituyentes 2' también pueden seleccionarse de: alquilo C 1-C12, alquilo sustituido, alquenilo, alquinilo, alcarilo, aralquilo, O-alcarilo u O-aralquilo, SH, SCH3, OCN, Cl, Br, CN, CF3, OCF3, SOCH3, SO2CH3ONO2, NO2, N3, NH2, heterocicloalquilo, heterocicloalcarilo, aminoalquilamino, polialquilamino, sililo sustituido, un grupo de escisión de ARN, un grupo indicador, un intercalador, un grupo para mejorar las propiedades farmacocinéticas, o un grupo para mejorar las propiedades farmacodinámicas de un compuesto antisentido, y otros sustituyentes que tienen propiedades similares. En determinadas realizaciones, los nucleósidos modificados comprenden una cadena lateral 2'-MOE (Baker y col, J. Biol.Chem., 1997, 272, 11944-12000). Se ha descrito que tal sustitución 2'-MOE tiene una afinidad de unión mejorada en comparación con nucleósidos no modificados y con otros nucleósidos modificados, tales como 2'- O-metilo, O-propilo, y O-aminopropilo. También se ha demostrado que los oligonucleótidos que tienen el sustituyente 2'-MOE son inhibidores antisentido de la expresión génica con características prometedoras para su uso in vivo (Martin, Helv. Chim. Acta, 1995, 78, 486-504; Altmann y col., Chimia, 1996, 50, 168-176; Altmann y col., Biochem. Soc. Trans., 1996, 24, 630-637; y Altmann y col., Nucleosides Nucleotides, 1997, 16, 917-926).
Como se usa en esta invención, un "nucleósido de tetrahidropirano modificado" o "nucleósido de THP modificado" significa un nucleósido que tiene un "azúcar" de tetrahidropirano de seis miembros sustituido por el residuo de pentofuranosilo en nucleósidos normales (un sustituto de azúcar). Los nucleósidos de THP modificados incluyen, pero no se limitan a, lo que se denomina en la técnica como ácido nucleico de hexitol (HNA, por sus siglas en inglés), ácido nucleico de anitol (ANA, por sus siglas en inglés), ácido nucleico de manitol (MNA, por sus siglas en inglés) (véase Leumann, Bioorg. Med. Chem., 2002, 10, 841-854), fluoro HNA (F-HNA) o aquellos compuestos que tienen la Fórmula VII:
donde independientemente para cada uno de dicho al menos un análogo de nucleósido de tetrahidropirano de Fórmula VII:
Bx es un resto básico heterocíclico;
cada uno de Ta y Tb es, independientemente, un grupo de enlace internucleosídico que une el análogo de nucleósido de tetrahidropirano al compuesto antisentido, o uno de Ta y Tb es un grupo de enlace internucleosídico que une el análogo de nucleósido de tetrahidropirano al compuesto antisentido y el otro de Ta y Tb es H, un grupo protector hidroxilo, un grupo de conjugado unido o un grupo 5' o 3'-terminal;
q1, q2, q3, q4, q5, q6 y q7 son cada uno independientemente H, alquilo C1-C6, alquilo C1-C6 sustituido, alquenilo C2-C6, alquenilo C2-C6 sustituido, alquinilo C2-C6 o alquinilo C2-C6 sustituido; y cada uno de R1 y R2 se selecciona de hidrógeno, hidroxilo, halógeno, alcoxi sustituido o sin sustituir, NJ1J2, SJ1, N3, OC(=X)J1, O C (=X)N JJ NJ3C(=X)NJJ2 y CN, donde X es O, S o NJ1 y cada uno de J1, J2 y J3 es, independientemente, H o alquilo C1-C6.
En determinadas realizaciones, se proporcionan los nucleósidos THP modificados de Fórmula VII, donde q1, q2, q3, q4, q5, q6 y q7 son cada uno H. En determinadas realizaciones, al menos uno de q1, q2, q3, q4, q5, q6 y q7 es distinto de H. En determinadas realizaciones, al menos uno de q1, q2, q3, q4, q5, q6 y q7 es metilo. En determinadas realizaciones, se proporcionan nucleósidos THP de Fórmula VII donde uno de R1 y R2 es flúor. En determinadas realizaciones, R1 es flúor y R2 es H; R1 es metoxi y R2 es H, y R1 es H y R2 es metoxietoxi.
Como se usa en esta invención, "modificado en 2'" o "sustituido en 2'" se refiere a un nucleósido que comprende un azúcar que comprende un sustituyente en la posición 2' distinto de H u OH. Los nucleósidos modificados en 2' incluyen, pero no se limitan a, nucleósidos bicíclicos donde el puente que conecta dos átomos de carbono del anillo de azúcar conecta el carbono 2' y otro carbono del anillo de azúcar; y nucleósidos con sustituyentes 2' que no forman puentes, como alilo, amino, azido, tio, O-alilo, O-alquilo C1-C10, -OCF3, O-(CH2)2-O-CH3, 2'-O(CH2)2SCH3, O-(CH2)2-ON(Rm)(Rn) u O-CH2C(=O)-N(Rn)(Rn), donde cada Rm y Rn es, independientemente, H o alquilo C1-C10 sustituido o sin sustituir. Los nucleósidos modificados en 2' pueden comprender además otras modificaciones, por ejemplo, en otras posiciones del azúcar y/o en la nucleobase.
Como se usa en esta invención, "2'-F" se refiere a un nucleósido que comprende un azúcar que comprende un grupo fluoro en la posición 2'.
Como se usa en esta invención, cada uno de "2'-OMe" o "2'-OCH3" o "2'-O-metilo" se refiere a un nucleósido que comprende un azúcar que comprende un grupo -OCH3 en la posición 2' del anillo de azúcar.
Como se usa en esta invención, "MOE" o "2'-MOE" o "2 -OCH2CH2OCH3" o "2'-O-metoxietilo" se refiere a un nucleósido que comprende un azúcar que comprende un grupo -OCH2CH2OCH3 en la posición 2' del anillo de azúcar.
Como se usa en esta invención, "oligonucleótido" se refiere a un compuesto que comprende una pluralidad de nucleósidos unidos. En determinadas realizaciones, uno o más de la pluralidad de nucleósidos está modificado. En determinadas realizaciones, un oligonucleótido comprende uno o más ribonucleósidos (ARN) y/o desoxirribonucleósidos (ADN). También se conocen en la técnica muchos otros sistemas anulares de sustitutos de azúcar bicíclico y tricíclico que pueden usarse para modificar nucleósidos para su incorporación en compuestos antisentido (véase, por ejemplo, el artículo de revisión: Leumann, Bioorg. Med. Chem., 2002, 10, 841-854).
Dichos sistemas anulares pueden experimentar diversas sustituciones adicionales para mejorar la actividad.
Los procedimientos para las preparaciones de los azúcares modificados se conocen bien por los expertos en la técnica.
En los nucleótidos que tienen restos de azúcar modificados, los restos de nucleobases (naturales, modificados o una combinación de los mismos) se mantienen para la hibridación con un ácido nucleico diana adecuado.
En determinadas realizaciones, los compuestos antisentido comprenden uno o más nucleósidos que tienen restos de azúcar modificados. En determinadas realizaciones, el resto de azúcar modificado es 2'-MOE. En determinadas realizaciones, los nucleósidos modificados con 2'-MOE están dispuestos en un motivo gapmero. En determinadas realizaciones, el resto azúcar modificado es un nucleósido bicíclico que tiene un grupo formador de puentes (4'-CH(CH3)-O-2'). En determinadas realizaciones, los nucleósidos modificados (4'-CH(CH3)-O-2') están dispuestos en las alas de un motivo gapmero.
Composiciones y procedimientos de formulación de composiciones farmacéuticas
Los oligonucleótidos antisentido pueden mezclarse con sustancias inertes o activas farmacéuticamente aceptables para la preparación de formulaciones o composiciones farmacéuticas. Las composiciones y los procedimientos para la formulación de composiciones farmacéuticas dependen de diversos criterios que incluyen, pero no se limitan a, la vía de administración, el grado de la enfermedad o la dosis que se desea administrar.
Un compuesto antisentido dirigido a un ácido nucleico de Tau puede utilizarse en composiciones farmacéuticas combinando el compuesto antisentido con un diluyente o vehículo farmacéuticamente aceptable. Un diluyente farmacéuticamente aceptable incluye solución salina tamponada con fosfato (PBS, por sus siglas en inglés). PBS es un diluyente adecuado para su uso en composiciones que se suministran de forma parenteral. Por consiguiente, en los procedimientos descritos en esta invención se emplea una composición farmacéutica que comprende un compuesto antisentido dirigido a un ácido nucleico de Tau y un diluyente farmacéuticamente aceptable. En determinadas realizaciones, el diluyente farmacéuticamente aceptable es PBS. En determinadas realizaciones, el compuesto antisentido es un oligonucleótido antisentido.
Las composiciones farmacéuticas que comprenden compuestos antisentido abarcan cualquier sal, éster o sal de tales ésteres farmacéuticamente aceptables, o cualquier otro oligonucleótido que, tras la administración a un animal, que incluye un ser humano, es capaz de proporcionar (directa o indirectamente) el metabolito biológicamente activo o residuo del mismo. Por consiguiente, por ejemplo, la descripción también se dirige a sales farmacéuticamente aceptables de compuestos antisentido, profármacos, sales farmacéuticamente aceptables de tales profármacos y otros bioequivalentes. Las sales farmacéuticamente aceptables adecuadas incluyen, pero no se limitan a, sales de sodio y potasio.
Un profármaco puede incluir la incorporación de nucleósidos adicionales en uno o ambos extremos de un compuesto antisentido que se escinden mediante nucleasas endógenas dentro del cuerpo para formar el compuesto antisentido activo.
Compuestos antisentido conjugados
Los compuestos antisentido pueden unirse de forma covalente a uno o más restos o conjugados que mejoran la actividad, la distribución celular o captación celular de los oligonucleótidos antisentido resultantes. Los grupos conjugados típicos incluyen restos de colesterol y restos de lípidos. Los grupos conjugados adicionales incluyen carbohidratos, fosfolípidos, biotina, fenazina, folato, fenantridina, antraquinona, acridina, fluoresceínas, rodaminas, cumarinas y colorantes.
Los compuestos antisentido también se pueden modificar para tener uno o más grupos estabilizadores unidos por lo general a uno o ambos extremos de compuestos antisentido para mejorar las propiedades como, por ejemplo, la estabilidad de la nucleasa. En los grupos estabilizadores se incluyen estructuras de caperuza. Estas modificaciones terminales protegen al compuesto antisentido que tiene ácido nucleico terminal de la degradación de exonucleasas y puede ayudar en el suministro y/o localización dentro de una célula. La caperuza puede estar presente en el extremo 5' (caperuza 5') o en el extremo 3' (caperuza 3') o puede estar en ambos extremos. Las estructuras de caperuza se conocen en la técnica e incluyen, por ejemplo, caperuzas abásicos desoxi invertidos. Otros grupos estabilizadores 3' y 5' que se pueden usar para tapar uno o ambos extremos de un compuesto antisentido para transmitir estabilidad de nucleasa incluyen los descritos en el documento WO 03/004602 publicado el 16 de enero de 2003.
Cultivo celular y tratamiento con compuestos antisentido
Los efectos de los compuestos antisentido en el nivel, la actividad o la expresión de los ácidos nucleicos de Tau pueden someterse a prueba in vitro en una diversidad de tipos celulares. Los tipos de células que se utilizan para tales análisis se pueden adquirir de los vendedores comerciales (por ejemplo, American Type Culture Collection, Manassus, VA; Zen-Bio, Inc., Research Triangle Park, NC; Clonetics Corporation, Walkersville, m D) y se cultivan según las instrucciones del vendedor utilizando reactivos disponibles en el mercado (por ejemplo, Invitrogen Life Technologies, Carlsbad, CA). Los tipos de células ilustrativos incluyen, pero no se limitan a, células HepG2, células Hep3B y hepatocitos primarios.
Pruebas in vitro de oligonucleótidos antisentido
En esta invención se describen procedimientos para el tratamiento de células con oligonucleótidos antisentido que pueden modificarse de manera adecuada para el tratamiento con otros compuestos antisentido.
Las células pueden ser tratadas con oligonucleótidos antisentido cuando las células alcanzan aproximadamente el 60 80 % de confluencia en el cultivo.
Un reactivo comúnmente utilizado para introducir oligonucleótidos antisentido en células cultivadas incluye el reactivo de transfección de lípidos catiónicos LIPOFECTIN (Invitrogen, Carlsbad, CA). Los oligonucleótidos antisentido pueden mezclarse con LIPOFECTIN en OPTI-MEM 1 (Invitrogen, Carlsbad, CA) para lograr la concentración final deseada de oligonucleótido antisentido y una concentración de LIPOFECTIN, que puede variar de 2 a 12 ug/ml por 100 nM de oligonucleótido antisentido.
Otro reactivo utilizado para introducir oligonucleótidos antisentido en células cultivadas incluye LIPOFECTAMINE (Invitrogen, Carlsbad, CA). El oligonucleótido antisentido se mezcla con LIPOFECTAMINE en medio reducido en suero OPTI-MEM 1 (Invitrogen, Carlsbad, CA) para lograr la concentración deseada de oligonucleótido antisentido y una concentración de LIPOFECTAMINE que puede variar de 2 a 12 ug/ml por 100 nM de oligonucleótido antisentido.
Otra técnica que se utiliza para introducir oligonucleótidos antisentido en células cultivadas incluye la electroporación.
Las células se tratan con oligonucleótidos antisentido con procedimientos habituales. Las células pueden recogerse 16 24 horas después del tratamiento con oligonucleótidos antisentido, momento en el cual se miden los niveles de ARN o proteína de los ácidos nucleicos diana mediante procedimientos conocidos en la técnica y descritos en esta invención. En general, cuando los tratamientos se llevan a cabo en múltiples réplicas, los datos se presentan como el promedio de los tratamientos en réplica.
La concentración de oligonucleótido antisentido que se utiliza varía de una línea celular a otra. Los procedimientos para determinar la concentración óptima de oligonucleótidos antisentido para una línea celular particular se conocen bien en la técnica. Los oligonucleótidos antisentido se usan típicamente en concentraciones que varían de 1 nM a 300 nM cuando se transfectan con LIPOFECTAMINE. Los oligonucleótidos antisentido se utilizan en concentraciones más elevadas que varían de 625 a 20.000 nM cuando se transfectan utilizando electroporación.
Aislamiento de ARN
El análisis de ARN se puede llevar a cabo en ARN celular total o poli(A)+ ARNm. Los procedimientos de aislamiento de ARN son bien conocidos en la técnica. El ARN se prepara utilizando procedimientos conocidos en la técnica, por ejemplo, usando el reactivo TRIZOL (Invitrogen, Carlsbad, CA) según los protocolos recomendados por el fabricante.
Análisis de la inhibición de niveles o expresión diana
La inhibición de los niveles o la expresión de un ácido nucleico de Tau se puede analizar de diversas maneras conocidas en la técnica. Por ejemplo, los niveles de ácido nucleico diana pueden cuantificarse mediante, por ejemplo, análisis Northern blot, reacción en cadena de la polimerasa (PCR, por sus siglas en inglés) competitiva o PCR en tiempo real cuantitativa. El análisis de ARN se puede llevar a cabo en ARN celular total o ARNm poli(A)+. Los procedimientos de aislamiento de ARN son bien conocidos en la técnica. El análisis Northern blot también es habitual en la técnica. La PCR en tiempo real cuantitativa puede lograrse de manera conveniente usando el sistema de detección de secuencias ABI PRISM 7600, 7700, o 7900 disponible en el mercado, de PE-Applied Biosystems, Foster City, CA y se utiliza según las
instrucciones del fabricante.
Análisis PCR cuantitativa en tiempo real de niveles de ARN diana
La cuantificación de los niveles de ARN diana puede lograrse mediante PCR en tiempo real cuantitativa utilizando el sistema de detección de secuencias ABI PRISM 7600, 7700 o 7900 (PE-Applied Biosystems, Foster City, CA), según las instrucciones de fabricante. Los procedimientos de PCR cuantitativa en tiempo real se conocen en la técnica.
Antes de la PCR en tiempo real, el ARN aislado se somete a una reacción con transcriptasa inversa (RT, por sus siglas en inglés), que produce ADN complementario (ADNc) que a continuación se utiliza como el sustrato para la amplificación mediante p Cr en tiempo real. Las reacciones con RT y PCR en tiempo real se llevan a cabo de manera secuencial en el mismo pocillo de muestra. Los reactivos de RT y PCR en tiempo real se pueden obtener de Invitrogen (Carlsbad, CA). Las reacciones de RT PCR en tiempo real se llevan a cabo mediante procedimientos conocidos por los expertos en la materia.
Las cantidades de gen (o ARN) diana obtenidas mediante PCR en tiempo real se normalizan utilizando el nivel de expresión de un gen cuya expresión es constante, como la ciclofilina A, o cuantificando el ARN total con RIBOGREEN® (Invitrogen, Inc. Carlsbad, CA). La expresión de la ciclofilina A se cuantifica mediante PCR en tiempo real, ejecutándose de forma simultánea con la diana, mediante multiplexación o por separado. El ARN total se cuantifica mediante el reactivo de cuantificación de ARN RIBOGREEN (Invetrogen, Inc. Eugene, OR). Los procedimientos de cuantificación de ARN mediante RIBOGREEN® se indican en Jones, L.J., y col., (Analytical Biochemistry, 1998, 265, 368-374). Se utiliza un instrumento CYTOFLUOR 4000 (PE Applied Biosystems) para medir la fluorescencia de RIBOGREEN.
Las sondas y los cebadores se diseñan para que se hibriden con un ácido nucleico de Tau. Los procedimientos para diseñar sondas y cebadores para PCR en tiempo real se conocen en la técnica y pueden incluir el uso de software como PRIMER EXPRESS Software (Applied Biosystems, Foster City, CA).
Análisis de los niveles de proteína
La inhibición antisentido de los ácidos nucleicos de Tau se puede evaluar mediante la medición de los niveles de proteína Tau. Los niveles de proteína Tau pueden evaluarse o cuantificarse de diferentes formas conocidas en la técnica, como la inmunoprecipitación, el análisis de Western blot (inmunotransferencia), el ensayo por inmunoabsorción ligado a enzimas (ELISA), ensayos cuantitativos de proteínas, ensayos de la actividad de las proteínas (por ejemplo, ensayos de la actividad de la caspasa), inmunohistoquímica, inmunocitoquímica o clasificación de células activadas por fluorescencia (FACS). Los anticuerpos dirigidos a una diana se pueden identificar y obtener a partir de diversas fuentes, como el catálogo de anticuerpos de MSRS (Aerie Corporation, Birmingham, MI) o pueden prepararse mediante procedimientos convencionales de generación de anticuerpos monoclonales o policlonales conocidos en la técnica.
Pruebas in vivo de compuestos antisentido
Los compuestos antisentido, por ejemplo, los oligonucleótidos antisentido, se someten a prueba en animales para evaluar su capacidad para inhibir la expresión de Tau y producir cambios fenotípicos, tal como la función cognitiva y motora mejoradas. En determinadas realizaciones, la cognición se mide mediante el reconocimiento de objetos novedosos y la actividad de construcción de nidos. En determinadas realizaciones, la función motora se mide mediante análisis de inicio de la marcha, rotarod, fuerza de agarre, escalada de poste, rendimiento en campo abierto, barra de equilibrio, pruebas de huella de pata trasera en el animal. En determinadas realizaciones, los compuestos antisentido, por ejemplo, los oligonucleótidos antisentido, se someten a ensayo en animales para evaluar su capacidad para reducir la tau hiperfosforilada y los ovillos neurofibrilares. En determinadas realizaciones, los compuestos antisentido, por ejemplo, los oligonucleótidos antisentido, se someten a ensayo para evaluar su capacidad para prevenir y/o reducir la gravedad de las convulsiones en un modelo de convulsiones inducidas por pentilentetrazol (PTZ).
Las pruebas se pueden realizar en animales normales o en modelos experimentales de enfermedad. Para la administración en animales, los oligonucleótidos antisentido se formulan en un diluyente farmacéuticamente aceptable, tal como solución salina tamponada con fosfato. La administración incluye vías de administración parenteral, como intraperitoneal, intravenosa y subcutánea. El cálculo de la dosificación de oligonucleótidos antisentido y la frecuencia de dosificación está dentro de las capacidades de los expertos en la técnica y depende de factores tales como la vía de administración y el peso corporal del animal. Después de un período de tratamiento con oligonucleótidos antisentido, se aísla ARN del tejido del SNC o el LCR y se miden los cambios en la expresión de ácidos nucleicos de Tau.
Algunas indicaciones
En esta invención se describen procedimientos, compuestos y composiciones para tratar a un individuo que comprenden administrar una o más composiciones farmacéuticas descritas en esta invención. En determinados casos, el individuo tiene una enfermedad neurodegenerativa. En determinados casos, el individuo está en riesgo de desarrollar una enfermedad neurodegenerativa, incluyendo, pero no se limita a, una tauopatía, enfermedad de Alzheimer, demencia frontotemporal (FTD), FTDP-17, parálisis supranuclear progresiva (PSP), encefalopatía traumática crónica (CTE), degeneración ganglionar corticobasal (CBD), epilepsia y síndrome de Dravet. En determinados casos, se ha identificado que el individuo tiene una enfermedad asociada a Tau. En esta invención se describen procedimientos para reducir
profilácticamente la expresión de Tau en un individuo. Determinados casos incluyen el tratamiento de un individuo que lo necesita mediante la administración a un individuo de una cantidad terapéuticamente eficaz de un compuesto antisentido dirigido a un ácido nucleico de Tau.
En un caso, la administración de una cantidad terapéuticamente eficaz de un compuesto antisentido dirigido a un ácido nucleico de Tau se acompaña del monitoreo de los niveles de Tau en un individuo para determinar la respuesta de un individuo a la administración del compuesto antisentido. Un médico puede utilizar la respuesta de un individuo a la administración del compuesto antisentido para determinar la cantidad y duración de la intervención terapéutica.
En determinados casos, la administración de un compuesto antisentido dirigido a un ácido nucleico de Tau provoca una reducción de la expresión de Tau en al menos un 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 o un 100 %, o un intervalo definido por cualesquiera dos de estos valores. En determinados casos, la administración de un compuesto antisentido dirigido a un ácido nucleico de Tau provoca una función motora mejorada en un animal. En determinados casos, la administración de un compuesto antisentido de Tau mejora la función motora en al menos un 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 o un 100 %, o un intervalo definido por cualesquiera dos de estos valores.
En determinados casos, se usan composiciones farmacéuticas que comprenden un compuesto antisentido dirigido a Tau para la preparación de un medicamento para tratar a un paciente que padece o es susceptible a una enfermedad neurodegenerativa incluyendo una tauopatía, enfermedad de Alzheimer, demencia frontotemporal (FTD), FTDP-17, parálisis supranuclear progresiva (PSP), encefalopatía traumática crónica (CTE), degeneración ganglionar corticobasal (CBD), epilepsia y síndrome de Dravet.
Determinadas regiones de punto caliente
1. Nucleobases 135783-135980 de SEQ ID NO: 1
En esta invención se describen oligonucleótidos antisentido diseñados para dirigirse a las nucleobases 135783-135980 de SEQ ID NO: 1 (n.° de acceso de GENBANK NT_010783.15 truncado de los nucleótidos 9240000 a 9381000). En determinados casos, las nucleobases 135783-135980 son una región de punto caliente. En determinados casos, las nucleobases 135783-135980 se dirigen por oligonucleótidos antisentido. En determinados casos, los oligonucleótidos antisentido tienen una longitud de 18, 19 o 20 nucleobases. En determinados casos, los oligonucleótidos antisentido son gapmeros. En determinados casos, los gapmeros son gapmeros 5-10-5 MOE, gapmeros 5-9-5 MOE, gapmeros 5-7-6 m Oe y gapmeros 5-8-5 MOE. En determinados casos, los nucleósidos de los oligonucleótidos antisentido están unidos por enlaces internucleosídicos de fosforotioato. En determinados casos, los nucleósidos de los oligonucleótidos antisentido están unidos por enlaces internucleosídicos de fosfodiéster. En determinados casos, los nucleósidos de los oligonucleótidos antisentido están unidos por enlaces internucleotídicos de fosforotioato y fosfodiéster (por ejemplo, los oligonucleótidos antisentido tienen "cadenas principales mixtas").
En determinados casos, las nucleobases 135783-135980 se dirigen por los siguientes números ISIS: 424879, 424880, 548937, 613114-613120, 622096-622150, 623988-623996, 664511-664542 y 664661-664819.
En determinados casos, las nucleobases 135783-135980 se dirigen por las siguientes SEQ ID NO: 56, 57, 248, 462-467, 1668-1698, 2025-2048, 2301-2309, 2331-2443 y 2478-2483.
En determinados casos, los oligonucleótidos antisentido que se dirigen a las nucleobases 135783-135980 logran al menos un 12 %, al menos un 13 %, al menos un 14 %, al menos un 15 %, al menos un 16 %, al menos un 17 %, al menos un 18 %, al menos un 19 %, 20 %, al menos un 21 %, al menos un 22 %, al menos un 23 %, al menos un 24 %, al menos un 25 %, al menos un 26 %, al menos un 27 %, al menos un 28 %, al menos un 29 %, al menos un 30 %, al menos un 31 %, al menos un 32 %, al menos un 33 %, al menos un 34 %, al menos un 35 %, al menos un 36 %, al menos un 37 %, al menos un 38 %, al menos un 39 %, al menos un 40 %, al menos un 41 %, al menos un 42 %, al menos un 43 %, al menos un 44 %, al menos un 45 %, al menos un 46 %, al menos un 47 %, al menos un 48 %, al menos un 49 %, al menos un 50 %, al menos un 51 %, al menos un 52 %, al menos un 53 %, al menos un 54 %, al menos un 55 %, al menos un 56 %, al menos un 57 %, al menos un 58 %, al menos un 59 %, al menos un 60 %, al menos un 61 %, al menos un 62 %, al menos un 63 %, al menos un 64 %, al menos un 65 %, al menos un 66 %, al menos un 67 %, al menos un 68 %, al menos un 69 %, al menos un 70 %, al menos un 71 %, al menos un 72 %, al menos un 73 %, al menos un 74 %, al menos un 75 %, al menos un 76 %, al menos un 77 %, al menos un 78 %, al menos un 79 %, al menos un 80 %, al menos un 81 %, al menos un 82 %, al menos un 83 %, al menos un 84 %, al menos un 85 %, al menos un 86 %, al menos un 87 %, al menos un 88 %, al menos un 89 %, al menos un 90 %, al menos un 91 %, al menos un 92 % o al menos un 93 % de reducción de los niveles de proteína y/o ARNm de Tau in vitro y/o in vivo.
2. Nucleobases 135853-135872 de SEQ ID NO: 1
En esta invención se describen oligonucleótidos antisentido diseñados para dirigirse a las nucleobases 135853-135872
de SEQ ID NO: 1 (n.° de acceso de GENBANK NT_010783.15 truncado de los nucleótidos 9240000 a 9381000). En determinados casos, las nucleobases 135853-135872 son una región de punto caliente. En determinados casos, las nucleobases 135853-135872 se dirigen por oligonucleótidos antisentido. En determinados casos, los oligonucleótidos antisentido tienen una longitud de 18, 19 o 20 nucleobases. En determinados casos, los oligonucleótidos antisentido son gapmeros. En determinados casos, los gapmeros son gapmeros 5-10-5 MOE, gapmeros 5-9-5 MOE, gapmeros 5-7-6 m Oe o gapmeros 5-8-5 MOE. En determinados casos, los nucleósidos de los oligonucleótidos antisentido están unidos por enlaces internucleosídicos de fosforotioato. En determinados casos, los nucleósidos de los oligonucleótidos antisentido están unidos por enlaces internucleosídicos de fosfodiéster. En determinados casos, los nucleósidos de los oligonucleótidos antisentido están unidos por enlaces internucleotídicos de fosforotioato y fosfodiéster (por ejemplo, los oligonucleótidos antisentido tienen "cadenas principales mixtas").
En determinados casos, las nucleobases 135853-135872 se dirigen por los siguientes números ISIS: 424879, 424880, 613117, 613118, 622114-622125, 623993-623996, 664522-664542, 664676-664713, 664729-664766 y 664783-664819.
En determinados casos, las nucleobases 135853-135872 se dirigen por las siguientes SEQ ID NO: 56, 57, 248, 464-465, 1668-1673, 2039-2048, 2306-2309, 2345-2443 y 2478-2483.
En determinados casos, los oligonucleótidos antisentido que se dirigen a las nucleobases 135853-135872 logran al menos un 36 %, al menos un 37 %, al menos un 38 %, al menos un 39 %, al menos un 40 %, al menos un 41 %, al menos un 42 %, al menos un 43 %, al menos un 44 %, al menos un 45 %, al menos un 46 %, al menos un 47 %, al menos un 48 %, al menos un 49 %, al menos un 50 %, al menos un 51 %, al menos un 52 %, al menos un 53 %, al menos un 54 %, al menos un 55 %, al menos un 56 %, al menos un 57 %, al menos un 58 %, al menos un 59 %, al menos un 60 %, al menos un 61 %, al menos un 62 %, al menos un 63 %, al menos un 64 %, al menos un 65 %, al menos un 66 %, al menos un 67 %, al menos un 68 %, al menos un 69 %, al menos un 70 %, al menos un 71 %, al menos un 72 %, al menos un 73 %, al menos un 74 %, al menos un 75 %, al menos un 76 %, al menos un 77 %, al menos un 78 %, al menos un 79 %, al menos un 80 %, al menos un 81 %, al menos un 82 %, al menos un 83 %, al menos un 84 %, al menos un 85 %, al menos un 86 % o al menos un 87 % de reducción de los niveles de proteína y/o ARNm de Tau in vitro y/o in vivo.
3. Nucleobases 135783-135929 de SEQ ID NO: 1
En esta invención se describen oligonucleótidos antisentido diseñados para dirigirse a las nucleobases 135783-135929 de SEQ ID NO: 1 (n.° de acceso de GENBANK NT_010783.15 truncado de los nucleótidos 9240000 a 9381000). En determinados casos, las nucleobases 135783-135929 son una región de punto caliente. En determinados casos, las nucleobases 135783-135929 se dirigen por oligonucleótidos antisentido. En determinados casos, los oligonucleótidos antisentido tienen una longitud de 18, 19 o 20 nucleobases. En determinados casos, los oligonucleótidos antisentido son gapmeros. En determinados casos, los gapmeros son gapmeros 5-10-5 MOE, gapmeros 5-9-5 MOE, gapmeros 5-7-6 m Oe o gapmeros 5-8-5 MOE. En determinados casos, los nucleósidos de los oligonucleótidos antisentido están unidos por enlaces internucleosídicos de fosforotioato. En determinados casos, los nucleósidos de los oligonucleótidos antisentido están unidos por enlaces internucleosídicos de fosfodiéster. En determinados casos, los nucleósidos de los oligonucleótidos antisentido están unidos por enlaces internucleotídicos de fosforotioato y fosfodiéster (por ejemplo, los oligonucleótidos antisentido tienen "cadenas principales mixtas").
En determinados casos, las nucleobases 135783-135929 se dirigen por los siguientes números ISIS: 424879, 424880, 548937, 613114-613119, 622096-622138, 623988-623996, 664511-664542 y 664661-664819.
En determinados casos, las nucleobases 135783-135929 se dirigen por las siguientes SEQ ID NO: 56, 57, 248, 462-466, 1668-1686, 2025-2048, 2301-2309, 2331-2443 y 2478-2483.
En determinados casos, los oligonucleótidos antisentido que se dirigen a las nucleobases 135783-135929 logran al menos un 12 %, al menos un 13 %, al menos un 14 %, al menos un 15 %, al menos un 16 %, al menos un 17 %, al menos un 18 %, al menos un 19 %, 20 %, al menos un 21 %, al menos un 22 %, al menos un 23 %, al menos un 24 %, al menos un 25 %, al menos un 26 %, al menos un 27 %, al menos un 28 %, al menos un 29 %, al menos un 30 %, al menos un 31 %, al menos un 32 %, al menos un 33 %, al menos un 34 %, al menos un 35 %, al menos un 36 %, al menos un 37 %, al menos un 38 %, al menos un 39 %, al menos un 40 %, al menos un 41 %, al menos un 42 %, al menos un 43 %, al menos un 44 %, al menos un 45 %, al menos un 46 %, al menos un 47 %, al menos un 48 %, al menos un 49 %, al menos un 50 %, al menos un 51 %, al menos un 52 %, al menos un 53 %, al menos un 54 %, al menos un 55 %, al menos un 56 %, al menos un 57 %, al menos un 58 %, al menos un 59 %, al menos un 60 %, al menos un 61 %, al menos un 62 %, al menos un 63 %, al menos un 64 %, al menos un 65 %, al menos un 66 %, al menos un 67 %, al menos un 68 %, al menos un 69 %, al menos un 70 %, al menos un 71 %, al menos un 72 %, al menos un 73 %, al menos un 74 %, al menos un 75 %, al menos un 76 %, al menos un 77 %, al menos un 78 %, al menos un 79 %, al menos un 80 %, al menos un 81 %, al menos un 82 %, al menos un 83 %, al menos un 84 %, al menos un 85 %, al menos un 86 %, al menos un 87 %, al menos un 88 %, al menos un 89 %, al menos un 90 %, al menos un 91 %, al menos un 92 % o al menos un 93 % de reducción de los niveles de proteína y/o ARNm de Tau in vitro y/o in vivo.
4. Nucleobases 135783-135914 de SEQ ID NO: 1
En esta invención se describen oligonucleótidos antisentido diseñados para dirigirse a las nucleobases 135783-135914 de SEQ ID NO: 1 (n.° de acceso de GENBANK NT_010783.15 truncado de los nucleótidos 9240000 a 9381000). En determinados casos, las nucleobases 135783-135914 son una región de punto caliente. En determinados casos, las nucleobases 135783-135914 se dirigen por oligonucleótidos antisentido. En determinados casos, los oligonucleótidos antisentido tienen una longitud de 18, 19 o 20 nucleobases. En determinados casos, los oligonucleótidos antisentido son gapmeros. En determinados casos, los gapmeros son gapmeros 5-10-5 MOE, gapmeros 5-9-5 MOE, gapmeros 5-7-6 m Oe o gapmeros 5-8-5 MOE. En determinados casos, los nucleósidos de los oligonucleótidos antisentido están unidos por enlaces internucleosídicos de fosforotioato. En determinados casos, los nucleósidos de los oligonucleótidos antisentido están unidos por enlaces internucleosídicos de fosfodiéster. En determinados casos, los nucleósidos de los oligonucleótidos antisentido están unidos por enlaces internucleotídicos de fosforotioato y fosfodiéster (por ejemplo, los oligonucleótidos antisentido tienen "cadenas principales mixtas").
En determinados casos, las nucleobases 135783-135914 se dirigen por los siguientes números ISIS: 424879, 424880, 548937, 613114-613119, 622096-622133, 623988-623996, 664511-664542, 664661-664819.
En determinados casos, las nucleobases 135783-135914 se dirigen por las siguientes SEQ ID NO: 56, 57, 248, 462-466, 1668-1681,2025-2048, 2301-2309, 2331-2443 y 2478-2483.
En determinados casos, las nucleobases 135783-135914 se dirigen por los siguientes números ISIS: 424879, 424880, 548937, 613114-613119, 622096- 622133 y 623988-623996.
En determinados casos, las nucleobases 135783-135914 se dirigen por las siguientes SEQ ID NO: 56, 57, 248, 462-466, 1668-1681,2025-2048 y 2301-2309.
En determinados casos, los oligonucleótidos antisentido que se dirigen a las nucleobases 135783-135914 logran al menos un 12 %, al menos un 13 %, al menos un 14 %, al menos un 15 %, al menos un 16 %, al menos un 17 %, al menos un 18 %, al menos un 19 %, 20 %, al menos un 21 %, al menos un 22 %, al menos un 23 %, al menos un 24 %, al menos un 25 %, al menos un 26 %, al menos un 27 %, al menos un 28 %, al menos un 29 %, al menos un 30 %, al menos un 31 %, al menos un 32 %, al menos un 33 %, al menos un 34 %, al menos un 35 %, al menos un 36 %, al menos un 37 %, al menos un 38 %, al menos un 39 %, al menos un 40 %, al menos un 41 %, al menos un 42 %, al menos un 43 %, al menos un 44 %, al menos un 45 %, al menos un 46 %, al menos un 47 %, al menos un 48 %, al menos un 49 %, al menos un 50 %, al menos un 51 %, al menos un 52 %, al menos un 53 %, al menos un 54 %, al menos un 55 %, al menos un 56 %, al menos un 57 %, al menos un 58 %, al menos un 59 %, al menos un 60 %, al menos un 61 %, al menos un 62 %, al menos un 63 %, al menos un 64 %, al menos un 65 %, al menos un 66 %, al menos un 67 %, al menos un 68 %, al menos un 69 %, al menos un 70 %, al menos un 71 %, al menos un 72 %, al menos un 73 %, al menos un 74 %, al menos un 75 %, al menos un 76 %, al menos un 77 %, al menos un 78 %, al menos un 79 %, al menos un 80 %, al menos un 81 %, al menos un 82 %, al menos un 83 %, al menos un 84 %, al menos un 85 %, al menos un 86 %, al menos un 87 %, al menos un 88 %, al menos un 89 %, al menos un 90 %, al menos un 91 %, al menos un 92 % o al menos un 93 % de reducción de los niveles de proteína y/o ARNm de Tau in vitro y/o in vivo.
EJEMPLOS
Divulgación no limitativa
Mientras que determinados compuestos, composiciones y procedimientos descritos en esta invención se han descrito con especificidad conforme a determinadas realizaciones, los siguientes ejemplos sirven solo para ilustrar los compuestos descritos en esta invención y no pretenden limitar la misma.
Ejemplo 1: Inhibición antisentido de Tau humana en células HepG2 por gapmeros MOE
Los oligonucleótidos antisentido se diseñaron para dirigirse a un ácido nucleico de Tau y se sometieron a prueba para determinar sus efectos en el ARNm de Tau in vitro. Se transfectaron células HepG2 cultivadas usando reactivo Lipofectin con oligonucleótido antisentido 100 nM. Después de un período de tratamiento de aproximadamente 24 horas, el ARN se aisló de las células y los niveles de ARNm de Tau se midieron mediante PCR cuantitativa en tiempo real. Se utilizó un conjunto de sondas de cebadores humanos RTS3104 (secuencia directa AAGATTGGGTCCCTGGACAAT, designada en esta invención como SEQ ID NO: 10; secuencia inversa AGCTTGTGGGTTTCAATCTTTTTATT, designada en esta invención como SEQ ID NO: 11; secuencia de sonda CACCCACGTCCCTGGCGGA, designada en esta invención como SEQ ID NO: 12) para medir los niveles de ARNm. Los niveles de ARNm de Tau se ajustaron según el contenido de ARN total, tal como se midió por RIBOGREEN®. Los resultados se presentan como porcentaje de inhibición de Tau, en relación con las células de control no tratadas.
Los oligonucleótidos antisentido quiméricos recién diseñados en las tablas a continuación se diseñaron como los gapmeros 5-10-5 MOE. Los gapmeros tienen una longitud de 20 nucleósidos, donde el segmento de hueco central comprende diez 2'-desoxirribonucleósidos y se encuentra flanqueado por segmentos de ala en la dirección 5' y la dirección 3' que comprenden cinco nucleósidos cada una. Cada nucleósido en el segmento de ala 5' y cada nucleósido en el segmento de ala 3' tiene una modificación 2'-MOE. Los enlaces internucleosídicos en cada gapmero son enlaces
fosforotioato. Todos los residuos de citosina en cada gapmero son 5-metilcitosinas. El "sitio de inicio" indica el nucleósido más cercano a la posición 5', al cual se dirige el gapmero en la secuencia génica humana. El "sitio de detención" indica el nucleósido más cercano a la posición 3' al cual se dirige el gapmero en la secuencia génica humana. Cada gapmero enumerado en la Tabla 1 a continuación se dirige a la secuencia genómica de tau humana, designada en esta invención como SEQ ID NO: 1 (n.° de acceso de GENBANK NT_010783.15 truncado de los nucleótidos 9240000 a 9381000) o a la secuencia de ARNm de tau humana, designada en esta invención como SEQ ID NO: 2 (n.° de acceso de GENBANK NM_001123066.3). "n/a" indica que el oligonucleótido no se dirige a la secuencia génica con una complementariedad del 100 %. Las secuencias enumeradas en la Tabla 2 no se dirigen a la SEQ ID NO: 1 o 2 con un 100 % de complementariedad, sino que se dirigen a la SEQ ID NO: 3 (n.° de acceso de GENBANK NM_016841.4, una secuencia de ARNm variante que omite los exones 3, 4, 6, 8, 10 y 12) o la SEQ ID NO: 4 (n.° de acceso de GENBANK NT_010783.14 truncado de los nucleótidos 2624000 a 2761000).
Tabla 1
Tabla 2
Ejemplo 2: Inhibición antisentido dependiente de la dosis de tau humana en células HepG2 por gapmeros 5-10-5 MOE
Los gapmeros de los estudios descritos anteriormente que presentaban una inhibición significativa in vitro del ARNm de Tau se seleccionaron y se sometieron a prueba con diversas dosis en células HepG2. Las células se colocaron en placas a una densidad de 10.000 células por pocillo y se transfectaron usando reactivo Lipofectin con concentraciones de 12,5 nM, 25,0 nM, 50,0 nM, 100,0 nM o 200,0 nM de oligonucleótido antisentido, como se especifica en la tabla a continuación. Después de un período de tratamiento de aproximadamente 16 horas, el ARN se aisló de las células y los niveles de ARNm de Tau se midieron mediante PCR cuantitativa en tiempo real. Se utilizó un conjunto de sondas de cebadores humanos RTS3104 para medir los niveles de ARNm. Los niveles de ARNm de Tau se ajustaron según el contenido de ARN total, tal como se midió por RIBOGREEN®. Los resultados se presentan como porcentaje de inhibición de Tau, en relación con las células de control no tratadas. Los niveles de ARNm de Tau se redujeron significativamente de una manera dependiente de la dosis en células tratadas con oligonucleótido antisentido.
Tabla 3
Ejemplo 3: Inhibición antisentido de Tau humana en células SH-SY5Y por gapmeros 5-10-5 MOE
Los oligonucleótidos antisentido adicionales se diseñaron para dirigirse a un ácido nucleico de Tau y se sometieron a prueba para determinar sus efectos en el ARNm de Tau in vitro. Los oligonucleótidos antisentido se sometieron a prueba en una serie de experimentos que tenían condiciones de cultivo similares. Los resultados de cada experimento se presentan en tablas separadas que se muestran más adelante. Se transfectaron células SH-SY5Y cultivadas usando electroporación con oligonucleótido antisentido 7.000 nM. Después de un período de tratamiento de aproximadamente 24 horas, el ARN se aisló de las células y los niveles de ARNm de Tau se midieron mediante PCR cuantitativa en tiempo real. Se utilizó un conjunto de sondas de cebadores humanos RTS3104 para medir los niveles de ARNm. Los niveles de ARNm de Tau se ajustaron según el contenido de ARN total, tal como se midió por RIBOGREEN®. Los resultados se presentan como porcentaje de inhibición de Tau, en relación con las células de control no tratadas.
Los oligonucleótidos antisentido quiméricos recién diseñados en las tablas a continuación se diseñaron como los gapmeros 5-10-5 MOE. Los gapmeros tienen una longitud de 20 nucleósidos, donde el segmento de hueco central comprende diez 2'-desoxirribonucleósidos y se encuentra flanqueado por segmentos de ala en la dirección 5' y la dirección 3' que comprenden cinco nucleósidos cada una. Cada nucleósido en el segmento de ala 5' y cada nucleósido en el segmento de ala 3' tiene una modificación 2'-MOE. Los enlaces internucleosídicos en cada gapmero son enlaces fosforotioato. Todos los residuos de citosina en cada gapmero son 5-metilcitosinas. El "sitio de inicio" indica el nucleósido más cercano a la posición 5', al cual se dirige el gapmero en la secuencia génica humana. El "sitio de detención" indica el nucleósido más cercano a la posición 3' al cual se dirige el gapmero en la secuencia génica humana. Cada gapmero enumerado en las tablas a continuación se dirige a la secuencia genómica de Tau humana, designada en esta invención como SEQ ID NO: 1 (n.° de acceso de GENBANK NT_010783.15 truncado de los nucleótidos 9240000 a 9381000) o a la secuencia de ARNm de Tau humana, designada en esta invención como SEQ ID NO: 2 (n.° de acceso de GENBANK NM_001123066.3). "n/a" indica que el oligonucleótido antisentido no se dirige a esa secuencia génica particular con una complementariedad del 100 %.
Tabla 4
Tabla 5
Ejemplo 4: Inhibición antisentido dependiente de la dosis de tau humana en células SH-SY5Y por gapmeros 5-10 5 MOE
Los gapmeros de los estudios descritos anteriormente que presentaban una inhibición significativa in vitro del ARNm de Tau se seleccionaron y se sometieron a prueba con diversas dosis en células SH-SY-5Y. Las células se colocaron en placas a una densidad de 20.000 células por pocillo y se transfectaron usando electroporación con concentraciones de 1,25 pM, 2,50 pM, 5,00 pM, 10,00 pM y 20,00 pM de oligonucleótido antisentido, como se especifica en la tabla a continuación. Después de un período de tratamiento de aproximadamente 16 horas, el ARN se aisló de las células y los niveles de ARNm de Tau se midieron mediante PCR cuantitativa en tiempo real. Se utilizó un conjunto de sondas de cebadores humanos RTS3104 para medir los niveles de ARNm. Los niveles de ARNm de Tau se ajustaron según el contenido de ARN total, tal como se midió por RIBOGREEN®. Los resultados se presentan como porcentaje de inhibición de Tau, en relación con las células de control no tratadas. Los niveles de ARNm de Tau se redujeron significativamente de una manera dependiente de la dosis en células tratadas con oligonucleótido antisentido.
Tabla 6
Ejemplo 5: Inhibición antisentido de Tau humana en células SH-SY5Y por gapmeros 5-10-5 MOE
Los oligonucleótidos antisentido adicionales se diseñaron para dirigirse a un ácido nucleico de Tau y se sometieron a prueba para determinar sus efectos en el ARNm de Tau in vitro. Las células SH-SY5Y cultivadas se colocaron en placas a una densidad de 20.000 células por pocillo y se transfectaron utilizando electroporación con oligonucleótido antisentido 6.000 nM. Después de un período de tratamiento de aproximadamente 24 horas, el ARN se aisló de las células y los niveles de ARNm de Tau se midieron mediante PCR cuantitativa en tiempo real. Se utilizó un conjunto de sondas de cebadores humanos RTS3104 para medir los niveles de ARNm. Los niveles de ARNm de Tau se ajustaron según el contenido de ARN total, tal como se midió por RIBOGREEN®. Los resultados se presentan como porcentaje de inhibición de Tau, en relación con las células de control no tratadas.
Los oligonucleótidos antisentido quiméricos recién diseñados en las tablas a continuación se diseñaron como los gapmeros 5-10-5 MOE. Los gapmeros tienen una longitud de 20 nucleósidos, donde el segmento de hueco central comprende diez 2'-desoxirribonucleósidos y se encuentra flanqueado por segmentos de ala en la dirección 5' y la dirección 3' que comprenden cinco nucleósidos cada una. Cada nucleósido en el segmento de ala 5' y cada nucleósido en el segmento de ala 3' tiene una modificación 2'-MOE. Los enlaces internucleosídicos en cada gapmero son enlaces fosforotioato. Todos los residuos de citosina en cada gapmero son 5-metilcitosinas. El "sitio de inicio" indica el nucleósido más cercano a la posición 5', al cual se dirige el gapmero en la secuencia génica humana. El "sitio de detención" indica el nucleósido más cercano a la posición 3' al cual se dirige el gapmero en la secuencia génica humana. Capa gapmero enumerado en las tablas a continuación se dirige a la secuencia genómica de tau humana, designada en esta invención como SEQ ID NO: 1 (n.° de acceso de GENBANK NT_010783.15 truncado de los nucleótidos 9240000 a 9381000).
Tabla 7
Ejemplo 6: Inhibición antisentido dependiente de la dosis de tau humana en células SH-SY5Y por gapmeros 5-10 5 MOE
Los gapmeros de los estudios descritos anteriormente que presentaban una inhibición significativa in vitro del ARNm de Tau se seleccionaron y se sometieron a prueba con diversas dosis en células SH-SY-5Y. Las células se colocaron en placas a una densidad de 20.000 células por pocillo y se transfectaron usando electroporación con concentraciones de 0,625 pM, 1,25 pM, 2,500 pM, 5,00 pM, 10,00 pM y 20,00 pM de oligonucleótido antisentido, como se especifica en la tabla a continuación. Después de un período de tratamiento de aproximadamente 16 horas, el ARN se aisló de las células y los niveles de ARNm de Tau se midieron mediante PCR cuantitativa en tiempo real. Se utilizó un conjunto de sondas de cebadores humanos RTS3104 para medir los niveles de ARNm. Los niveles de ARNm de Tau se ajustaron según el contenido de ARN total, tal como se midió por RIBOGREEN®. Los resultados se presentan como porcentaje de inhibición de Tau, en relación con las células de control no tratadas. Los niveles de ARNm de Tau se redujeron significativamente de una manera dependiente de la dosis en células tratadas con oligonucleótido antisentido.
Tabla 8
Ejemplo 7: Inhibición antisentido de Tau humana en células SH-SY5Y por gapmeros MOE con enlaces internucleosídicos de fosforotioato y fosfodiéster
Los oligonucleótidos antisentido se diseñaron para dirigirse a un ácido nucleico de Tau y se sometieron a prueba para determinar sus efectos en el ARNm de Tau in vitro. Los oligonucleótidos antisentido se sometieron a prueba en una serie de experimentos que tenían condiciones de cultivo similares. Los resultados de cada experimento se presentan en tablas separadas que se muestran más adelante. Se transfectaron células SH-SY5Y cultivadas usando electroporación con oligonucleótido antisentido 8.000 nM. Después de un período de tratamiento de aproximadamente 24 horas, el ARN se aisló de las células y los niveles de ARNm de Tau se midieron mediante PCR cuantitativa en tiempo real. Se utilizó un conjunto de sondas de cebadores humanos RTS3104 para medir los niveles de ARNm. Los niveles de ARNm de Tau se ajustaron según el contenido de ARN total, tal como se midió por RIBOGREEN®. Los resultados se presentan como porcentaje de inhibición de Tau, en relación con las células de control no tratadas.
Los oligonucleótidos antisentido quiméricos recién diseñados en las tablas a continuación se diseñaron como los gapmeros 5-10-5 MOE. Los gapmeros tienen una longitud de 20 nucleósidos, donde el segmento de hueco central comprende diez 2'-desoxirribonucleósidos y se encuentra flanqueado por segmentos de ala en la dirección 5' y la dirección 3' que comprenden cinco nucleósidos cada una. Cada nucleósido en el segmento de ala 5' y cada nucleósido en el segmento de ala 3' tiene una modificación 2'-MOE. Los enlaces internucleosídicos a lo largo de cada gapmero son enlaces fosforotioato o enlaces fosfodiéster. Todos los residuos de citosina en cada gapmero son 5-metilcitosinas. La columna "Química" describe los enlaces internucleosídicos de cada oligonucleótido. "s" indica enlace fosforotioato y "o" indica enlace fosfodiéster. El "sitio de inicio" indica el nucleósido más cercano a la posición 5', al cual se dirige el gapmero en la secuencia génica humana. El "sitio de detención" indica el nucleósido más cercano a la posición 3' al cual se dirige el gapmero en la secuencia génica humana.
Capa gapmero enumerado en las tablas a continuación se dirige a la secuencia genómica de Tau humana, designada en esta invención como SEQ ID NO: 1 (n.° de acceso de GENBANK NT_010783.15 truncado de los nucleótidos 9240000 a 9381000), secuencias de ARNm de Tau humana, designadas en esta invención como SEQ ID NO: 2 (n.° de acceso de GENBANK NM_001123066.3) o SEQ ID NO: 3 (n.° de acceso de GENBANK NM_016841.4). Varios oligonucleótidos, presentados en las Tablas 10, 12 y 16, se dirigen a las secuencias de ARNm variantes, designadas en esta invención como SEQ ID NO: 5 (n.° de acceso de GENBANK DR002467.1), SEQ ID NO: 6 (n.° de acceso de GENBANK NM_001203251.1) o SEQ ID NO: 7 (n.° de acceso de GENBANK n M_016835.4). Los oligonucleótidos se presentan en las diversas tablas según la secuencia génica principal a la que se dirigen con un 100 % de complementariedad. "n/a" indica que el oligonucleótido antisentido no se dirige a esa secuencia génica particular con una complementariedad del 100 %.
Tabla 9
Tabla 10
Tabla 11
Tabla 12
Tabla 13
Tabla 14
Tabla 15
Tabla 16
Ejemplo 8: Inhibición antisentido dependiente de la dosis de tau humana en células SH-SY5Y por gapmeros 5-10 5 MOE con enlaces internucleosídicos de fosforotioato y fosfodiéster
Los gapmeros de los estudios descritos anteriormente que presentaban una inhibición significativa in vitro del ARNm de tau se seleccionaron y se sometieron a prueba con diversas dosis en células SH-SY-5Y. Las células se colocaron en placas a una densidad de 20.000 células por pocillo y se transfectaron usando electroporación con concentraciones de 1,25 pM, 2,500 pM, 5,00 pM, 10,00 pM y 20,00 pM de oligonucleótido antisentido, como se especifica en la tabla a continuación. Después de un período de tratamiento de aproximadamente 16 horas, el ARN se aisló de las células y los niveles de ARNm de Tau se midieron mediante PCR cuantitativa en tiempo real. Se utilizó un conjunto de sondas de cebadores humanos RTS3104 para medir los niveles de ARNm. Los niveles de ARNm de Tau se ajustaron según el contenido de ARN total, tal como se midió por RIBOGREEN®. Los resultados se presentan como porcentaje de inhibición de Tau, en relación con las células de control no tratadas. Los niveles de ARNm de Tau se redujeron significativamente de una manera dependiente de la dosis en células tratadas con oligonucleótido antisentido.
Tabla 17
Tabla 18
Ejemplo 9: Inhibición antisentido de Tau humana en células SH-SY5Y por gapmeros 5-10-5 MOE, 5-8-5 MOE, 4-8 6 MOE o 6-8-4 MOE
Los oligonucleótidos antisentido se diseñaron para dirigirse a un ácido nucleico de tau y se sometieron a prueba para determinar sus efectos en el ARNm de Tau in vitro. Los oligonucleótidos antisentido se sometieron a prueba en una serie de experimentos que tenían condiciones de cultivo similares. ISIS 613412 también se incluyó en los ensayos. Los resultados de cada experimento se presentan en tablas separadas que se muestran más adelante. Las células SH-SY5Y cultivadas a una densidad de 20.000 células por pocillo se transfectaron utilizando electroporación con oligonucleótido antisentido 8.000 nM. Después de un período de tratamiento de aproximadamente 24 horas, el ARN se aisló de las células y los niveles de ARNm de Tau se midieron mediante PCR cuantitativa en tiempo real. Se utilizó un conjunto de sondas de cebadores humanos RTS3104 para medir los niveles de ARNm. Los niveles de ARNm de Tau se ajustaron según el contenido de ARN total, tal como se midió por RIBOGREEN®. Los resultados se presentan como porcentaje de inhibición de Tau, en relación con las células de control no tratadas.
Los oligonucleótidos antisentido quiméricos recién diseñados en las tablas a continuación se diseñaron como los gapmeros 5-8-5 MOE, 4-8-6 MOE o 6-8-4 MOE. Los gapmeros 5-8-5 MOE tienen una longitud de 18 nucleósidos, donde el segmento de hueco central comprende ocho 2'-desoxinucleósidos y se encuentra flanqueado por segmentos de ala en la dirección 5' y la dirección 3' que comprenden cinco nucleósidos cada una. Los gapmeros 4-8-6 MOE tienen una longitud de 18 nucleósidos, donde el segmento de hueco central comprende ocho 2'-desoxirribonucleósidos y se encuentra flanqueado por segmentos de ala en la dirección 5' y la dirección 3' que comprenden cuatro y seis nucleósidos respectivamente. Los gapmeros 6-8-4 MOE tienen una longitud de 18 nucleósidos, donde el segmento de hueco central comprende ocho 2'-desoxinucleósidos y se encuentra flanqueado por segmentos de ala en la dirección 5' y la dirección 3' que comprenden seis y cuatro nucleósidos respectivamente. Cada nucleósido en el segmento de ala 5' y cada nucleósido en el segmento de ala 3' tiene una modificación 2'-MOE. El motivo de enlace internucleosídico para cada gapmero en las tablas a continuación, excepto para ISIS 613412, es 5'-sooosssssssssooss-3', donde cada "s" representa un enlace internucleosídico de fosforotioato y donde cada "o" representa un enlace internucleosídico de fosfodiéster. El motivo de enlace internucleosídico para ISIS 613412 es 5'-soooossssssssssooss-3', donde cada "s" representa un enlace internucleosídico de fosforotioato y donde cada "o" representa un enlace internucleosídico de fosfodiéster. Todos los residuos de citosina en cada gapmero son 5-metilcitosinas. El "sitio de inicio" indica el nucleósido más cercano a la posición 5', al cual se dirige el gapmero en la secuencia génica humana. El "sitio de detención" indica el nucleósido más cercano a la posición 3' al cual se dirige el gapmero en la secuencia génica humana. Cada gapmero enumerado en las tablas a continuación se dirige a la SEQ ID NO: 1 (n.° de acceso de GENBANK NT_010783.15 truncado de los nucleótidos
9240000 a 9381000), SEQ ID NO: 4 (n.° de acceso de GENBANK NT_010783.14 truncado de los nucleótidos 2624000 a 2761000), SEQ ID NO: 5 (n.° de acceso de GENBANK DR002467.1) o SEQ ID NO: 6 (n.° de acceso de GENBANK NM_001203251.1). "n/a" indica que el oligonucleótido antisentido no se dirige a esa secuencia génica particular con una complementariedad del 100 %.
Tabla 19
Tabla 20
Tabla 21
Tabla 22
Tabla 23
Tabla 24
Tabla 25
Tabla 27
Tabla 28
Tabla 29
Tabla 30
Tabla 31
2
Tabla 33
Tabla 34
Tabla 35
Tabla 36
Tabla 37
Tabla 38
Tabla 39
Ejemplo 11: Inhibición antisentido dependiente de la dosis de Tau humana en células SH-SY5Y
Los gapmeros de los estudios descritos anteriormente que presentaban una inhibición significativa in vitro del ARNm de tau se seleccionaron y se sometieron a prueba con diversas dosis en células SH-SY5Y. Los oligonucleótidos antisentido se sometieron a prueba en una serie de experimentos que tenían condiciones de cultivo similares. Los resultados de cada experimento se presentan en tablas separadas que se muestran más adelante. Las células se colocaron en placas a una densidad de 20.000 células por pocillo y se transfectaron usando electroporación con concentraciones de 0,938 pM, 0,1875 pM, 3,750 pM, 7,500 pM y 15,00 pM de oligonucleótido antisentido, como se especifica en la tabla a continuación. Después de un período de tratamiento de aproximadamente 16 horas, el ARN se aisló de las células y los niveles de ARNm de Tau se midieron mediante PCR cuantitativa en tiempo real. Se utilizó un conjunto de sondas de cebadores humanos RTS3104 para medir los niveles de ARNm. Los niveles de ARNm de Tau se ajustaron según el contenido de ARN total, tal como se midió por RIBOGREEN®. Los resultados se presentan como porcentaje de inhibición de Tau, en relación con las células de control no tratadas. Los niveles de ARNm de Tau se redujeron significativamente de una manera dependiente de la dosis en células tratadas con oligonucleótido antisentido.
Tabla 40
Tabla 41
Tabla 42
Tabla 43
Tabla 44
Tabla 45
Tabla 46
Tabla 47
Ejemplo 12: Inhibición antisentido de Tau humana en células HepG2 por gapmeros 5-10-5 MOE, 5-8-5 MOE, 4-8-6 MOE o 6-8-4 MOE
Los oligonucleótidos antisentido se diseñaron para dirigirse a un ácido nucleico de Tau y se sometieron a prueba para determinar sus efectos en el ARNm de Tau in vitro. Los oligonucleótidos antisentido se sometieron a prueba en una serie de experimentos que tenían condiciones de cultivo similares. ISIS 613412 también se incluyó en los ensayos. Los resultados de cada experimento se presentan en tablas separadas que se muestran más adelante. Las células HepG2 cultivadas a una densidad de 20.000 células por pocillo se transfectaron utilizando electroporación con oligonucleótido antisentido 8.000 nM. Después de un período de tratamiento de aproximadamente 24 horas, el ARN se aisló de las células y los niveles de ARNm de Tau se midieron mediante PCR cuantitativa en tiempo real. Se utilizó un conjunto de sondas de cebadores humanos RTS3104 para medir los niveles de ARNm. Los niveles de ARNm de Tau se ajustaron según el contenido de ARN total, tal como se midió por RIBOGREEN®. Los resultados se presentan como porcentaje de inhibición de Tau, en relación con las células de control no tratadas.
Los oligonucleótidos antisentido quiméricos recién diseñados en las tablas a continuación se diseñaron como los gapmeros 5-8-5 MOE, 4-8-6 MOE o 6-8-4 MOE. Los gapmeros 5-8-5 MOE tienen una longitud de 18 nucleósidos, donde el segmento de hueco central comprende ocho 2'-desoxinucleósidos y se encuentra flanqueado por segmentos de ala en la dirección 5' y la dirección 3' que comprenden cinco nucleósidos cada una. Los gapmeros 4-8-6 MOE tienen una longitud de 18 nucleósidos, donde el segmento de hueco central comprende ocho 2'-desoxirribonucleósidos y se encuentra flanqueado por segmentos de ala en la dirección 5' y la dirección 3' que comprenden cuatro y seis nucleósidos respectivamente. Los gapmeros 6-8-4 MOE tienen una longitud de 18 nucleósidos, donde el segmento de hueco central comprende ocho 2'-desoxinucleósidos y se encuentra flanqueado por segmentos de ala en la dirección 5' y la dirección 3' que comprenden seis y cuatro nucleósidos respectivamente. Cada nucleósido en el segmento de ala 5' y cada nucleósido en el segmento de ala 3' tiene una modificación 2'-MOE. El motivo de enlace internucleosídico para cada gapmero en las tablas a continuación, excepto para ISIS 613412, es 5'-sooosssssssssooss-3', donde cada "s" representa un enlace internucleosídico de fosforotioato y donde cada "o" representa un enlace internucleosídico de fosfodiéster. El motivo de enlace internucleosídico para ISIS 613412 es 5'-soooossssssssssooss-3', donde cada "s" representa un enlace internucleosídico de fosforotioato y donde cada "o" representa un enlace internucleosídico de fosfodiéster. Todos los residuos de citosina en cada gapmero son 5-metilcitosinas. El "sitio de inicio" indica el nucleósido más cercano a la posición 5', al cual se dirige el gapmero en la secuencia génica humana. El "sitio de detención" indica el nucleósido más cercano a la posición 3' al cual se dirige el gapmero en la secuencia génica humana. Capa gapmero enumerado en las tablas a continuación se dirige a la secuencia genómica de tau humana, designada en esta invención como SEQ ID NO: 1 (n.° de acceso de GENBANK NT_010783.15 truncado de los nucleótidos 9240000 a 9381000).
Tabla 48
Ejemplo 13: Inhibición antisentido dependiente de la dosis de tau humana en células SH-SY5Y por gapmeros MOE
Los gapmeros de los estudios descritos anteriormente que presentaban una inhibición significativa in vitro del ARNm de tau se seleccionaron y se sometieron a prueba con diversas dosis en células SH-SY5Y. Los oligonucleótidos antisentido se sometieron a prueba en una serie de experimentos que tenían condiciones de cultivo similares. Los resultados de cada experimento se presentan en tablas separadas que se muestran más adelante. Las células se colocaron en placas a una densidad de 20.000 células por pocillo y se transfectaron usando electroporación con concentraciones de 0,938 pM, 0,1875 pM, 3,750 pM, 7,500 pM y 15,00 pM de oligonucleótido antisentido, como se especifica en la tabla a continuación. Después de un período de tratamiento de aproximadamente 16 horas, el ARN se aisló de las células y los niveles de ARNm de Tau se midieron mediante PCR cuantitativa en tiempo real. Se utilizó un conjunto de sondas de cebadores humanos RTS3104 para medir los niveles de ARNm. Los niveles de ARNm de Tau se ajustaron según el contenido de ARN total, tal como se midió por RIBOGREEN®. Los resultados se presentan como porcentaje de inhibición de Tau, en relación con las células de control no tratadas. Los niveles de ARNm de Tau se redujeron significativamente de una manera dependiente de la dosis en células tratadas con oligonucleótido antisentido.
Tabla 50
Tabla 51
Tabla 52
Tabla 53
Tabla 54
Tabla 55
Ejemplo 14: Diseño de gapmeros 5-7-6 MOE, 5-8-5 MOE, 5-9-5 MOE y 5-10-5 MOE con enlaces internucleosídicos de fosforotioato y fosfodiéster en una región de punto caliente de Tau humana
Se diseñaron oligonucleótidos antisentido dirigidos a un ácido nucleico de tau en una región identificada como un "punto caliente" en los estudios anteriores.
Los oligonucleótidos antisentido quiméricos recién diseñados en la tabla a continuación se diseñaron como gapmeros 5 7-6 MOE, 5-8-5 MOE, 5-9-5 MOE o 5-10-5 MOE. Los gapmeros 5-7-6 MOE tienen una longitud de 18 nucleósidos, donde el segmento de hueco central comprende siete 2'-desoxirribonucleósidos y se encuentra flanqueado por segmentos de ala en la dirección 5' y la dirección 3' que comprenden cinco y seis nucleósidos respectivamente. Los gapmeros 5-8-5 MOE tienen una longitud de 18 nucleósidos, donde el segmento de hueco central comprende ocho 2'-desoxinucleósidos y se encuentra flanqueado por segmentos de ala en la dirección 5' y la dirección 3' que comprenden cinco nucleósidos cada una. Los gapmeros 5-9-5 MOE tienen una longitud de 19 nucleósidos, donde el segmento de hueco central comprende nueve 2'-desoxinucleósidos y se encuentra flanqueado por segmentos de ala en la dirección 5' y la dirección 3' que comprenden cinco nucleósidos cada una. Los gapmeros 5-10-5 MOE tienen una longitud de 20 nucleósidos, donde el segmento de hueco central comprende diez 2'-desoxirribonucleósidos y se encuentra flanqueado por segmentos de ala en la dirección 5' y la dirección 3' que comprenden cinco nucleósidos cada una. Cada nucleósido en el segmento de ala 5' y cada nucleósido en el segmento de ala 3' tiene una modificación 2'-MOE. Los enlaces internucleosídicos a lo largo de cada gapmero son enlaces fosforotioato o enlaces fosfodiéster. La columna "Química" describe los enlaces internucleosídicos de cada oligonucleótido. "s" indica enlace fosforotioato y "o" indica enlace fosfodiéster. Todos los residuos de citosina en cada gapmero son 5-metilcitosinas.
El "sitio de inicio" indica el nucleósido más cercano a la posición 5' al que se dirige el gapmero en la secuencia génica humana. El "sitio de detención" indica el nucleósido más cercano a la posición 3' al que se dirige el gapmero en la secuencia génica humana. Cada gapmero enumerado en la tabla a continuación se dirige a la secuencia genómica de Tau humana, designada en esta invención como SEQ ID NO: 1 (n.° de acceso de GENBANK NT_010783.15 truncado de los nucleótidos 9240000 a 9381000) o a la secuencia de ARNm de Tau humana, designada en esta invención como SEQ ID NO: 2 (n.° de acceso de GENbA n K NM_001123066.3). "n/a" indica que el oligonucleótido antisentido no se dirige a esa secuencia génica particular con una complementariedad del 100 %.
Tabla 56
Ejemplo 15: Administración intracerebroventricular de oligonucleótidos antisentido contra ARNm de tau humana en ratones htau
Se sometió a ensayo compuestos seleccionados para determinar la eficacia mediante la administración ICV en ratones transgénicos tau humanos (Duff y col., Neurobiology of Disease 7:87-98, 2000).
Tratamiento y cirugía
A grupos de 4 ratones cada uno se les administraron ISIS 613255, ISIS 613329, ISIS 613344, ISIS 613361, ISIS 613369, ISIS 613370, ISIS 613397, ISIS 613045, ISIS 613099, ISIS 613118, ISIS 613136 con una dosis de 200 pg administrada por inyección en bolo ICV. Un grupo de control de 2 ratones se trató de manera similar con ISIS 424880 y un grupo de control de 4 ratones se trató de manera similar con PBS. Todos los procedimientos se realizaron bajo anestesia con isoflourano y según las regulaciones de la IACUC. Para las inyecciones en bolo ICV de ratón, se inyectó el oligonucleótido antisentido en el ventrículo lateral derecho de ratones transgénicos tau humanos. Se inyectaron diez microlitros de solución que contenía 300 pg de oligonucleótido en PBS durante aproximadamente 10 segundos. Se recogió tejido 14 días después de la administración de oligonucleótido.
Análisis de ARN
El día 14 después de la administración de oligonucleótido, se extrajo el ARN del hipocampo, la médula espinal y la corteza para el análisis por PCR en tiempo real de los niveles de ARNm de tau. Los niveles de ARNm de tau humana se midieron usando el conjunto de sondas de cebadores humanos RTS3104. Los resultados se calcularon como el porcentaje de inhibición de la expresión de ARNm de tau humana en comparación con el control. Todos los oligonucleótidos antisentido efectúan una inhibición significativa de los niveles de ARNm de tau humana.
Tabla 57
Ejemplo 16: Inhibición antisentido de Tau humana en células SH-SY5Y por gapmeros 5-7-6 MOE, 5-8-5 MOE, 5-9 5 MOE y 5-10-5 MOE
Los oligonucleótidos antisentido descritos en los Ejemplos anteriores, así como los oligonucleótidos antisentido recién diseñados que se dirigen a un ácido nucleico de tau humana, se sometieron a ensayo en una serie de experimentos que tenían condiciones de cultivo similares. Los resultados de cada experimento se presentan en tablas separadas que se muestran más adelante. Se transfectaron células SH-SY5Y cultivadas usando electroporación con oligonucleótido antisentido 8.000 nM. Después de un período de tratamiento de aproximadamente 24 horas, el ARN se aisló de las células y los niveles de ARNm de Tau se midieron mediante PCR cuantitativa en tiempo real. Se utilizó un conjunto de sondas de cebadores humanos RTS3104 para medir los niveles de ARNm. Los niveles de ARNm de Tau se ajustaron según el contenido de ARN total, tal como se midió por RIBOGREEN®. Los resultados se presentan como porcentaje de inhibición de Tau, en relación con las células de control no tratadas.
Los oligonucleótidos antisentido quiméricos recién diseñados en las tablas a continuación se diseñaron como gapmeros 5-7-6 MOE, 5-8-5 MOE, 5-9-5 m Oe o 5-10-5 MOE. Los gapmeros 5-7-6 MOE tienen una longitud de 18 nucleósidos, donde el segmento de hueco central comprende siete 2'-desoxirribonucleósidos y se encuentra flanqueado por segmentos de ala en la dirección 5' y la dirección 3' que comprenden cinco y seis nucleósidos respectivamente. Los gapmeros 5-8-5 MOE tienen una longitud de 18 nucleósidos, donde el segmento de hueco central comprende ocho 2'-desoxinucleósidos y se encuentra flanqueado por segmentos de ala en la dirección 5' y la dirección 3' que comprenden cinco nucleósidos cada una. Los gapmeros 5-9-5 MOE tienen una longitud de 19 nucleósidos, donde el segmento de hueco central comprende nueve 2'-desoxinucleósidos y se encuentra flanqueado por segmentos de ala en la dirección 5' y la dirección 3' que comprenden cinco nucleósidos cada una. Los gapmeros 5-10-5 MOE tienen una longitud de 20 nucleósidos, donde el segmento de hueco central comprende diez 2'-desoxirribonucleósidos y se encuentra flanqueado por segmentos de ala en la dirección 5' y la dirección 3' que comprenden cinco nucleósidos cada una. Cada nucleósido en el segmento de ala 5' y cada nucleósido en el segmento de ala 3' tiene una modificación 2'-MOE. Los enlaces internucleosídicos a lo largo de cada gapmero son enlaces fosforotioato o enlaces fosfodiéster. La columna "Química de enlace" describe los enlaces internucleosídicos de cada oligonucleótido. "s" indica enlace fosforotioato y "o" indica enlace fosfodiéster. Todos los residuos de citosina en cada gapmero son 5-metilcitosinas.
El "sitio de inicio" indica el nucleósido más cercano a la posición 5' al que se dirige el gapmero en la secuencia génica humana. El "sitio de detención" indica el nucleósido más cercano a la posición 3' al que se dirige el gapmero en la secuencia génica humana. Cada gapmero enumerado en la tabla a continuación se dirige a la secuencia genómica de Tau humana, designada en esta invención como SEQ ID NO: 1 (n.° de acceso de GENBANK NT_010783.15 truncado de los nucleótidos 9240000 a 9381000) o a la secuencia de ARNm de Tau humana, designada en esta invención como SEQ ID NO: 2 (n.° de acceso de GENbA n K NM_001123066.3). "n/a" indica que el oligonucleótido antisentido no se dirige a esa secuencia génica particular con una complementariedad del 100 %.
Tabla 58
Tabla 59
Tabla 60
Tabla 61
Ejemplo 17: Inhibición antisentido dependiente de la dosis de Tau humana en células SH-SY5Y
Los gapmeros de los estudios descritos anteriormente que presentaban una inhibición significativa in vitro del ARNm de tau se seleccionaron y se sometieron a prueba con diversas dosis en células SH-SY5Y. Los oligonucleótidos antisentido se sometieron a prueba en una serie de experimentos que tenían condiciones de cultivo similares. Los resultados de cada experimento se presentan en tablas separadas que se muestran más adelante. Las células se colocaron en placas a una densidad de 20.000 células por pocillo y se transfectaron usando electroporación con concentraciones de 0,247 pM, 0,741 pM, 2,22 pM, 6,67 pM y 20,00 pM de oligonucleótido antisentido, como se especifica en las tablas a continuación. Después de un período de tratamiento de aproximadamente 16 horas, el ARN se aisló de las células y los niveles de ARNm de Tau se midieron mediante PCR cuantitativa en tiempo real. Se utilizó un conjunto de sondas de cebadores humanos RTS3104 para medir los niveles de ARNm. Los niveles de ARNm de Tau se ajustaron según el contenido de ARN total, tal como se midió por RIBOGREEN®. Los resultados se presentan como porcentaje de inhibición de Tau, en relación con las células de control no tratadas. Los niveles de ARNm de Tau se redujeron significativamente de una manera dependiente de la dosis en células tratadas con oligonucleótido antisentido.
Tabla 62
Tabla 63
Tabla 64
Ejemplo 18: Administración intracerebroventricular de oligonucleótidos antisentido contra ARNm de tau humana en ratones htau
Se sometió a ensayo compuestos seleccionados para determinar la eficacia mediante la administración ICV en ratones transgénicos tau humanos (Duff y col., Neurobiology of Disease 7:87-98, 2000).
Tratamiento y cirugía
A grupos de 4 ratones cada uno se les administraron ISIS 613099, ISIS 613361, ISIS 613370, ISIS 623782 o ISIS 623996 con una dosis de 200 pg administrada por inyección en bolo ICV. Un grupo de control de 2 ratones se trató de manera similar con ISIS 424880 y un grupo de control de 4 ratones se trató de manera similar con PBS. Todos los procedimientos se realizaron bajo anestesia con isoflourano y según las regulaciones de la IACUC. Para las inyecciones en bolo ICV de
ratón, se inyectó el oligonucleótido antisentido en el ventrículo lateral derecho de ratones transgénicos tau humanos. Se inyectaron diez microlitros de solución que contenía 200 |jg de oligonucleótido en PBS durante aproximadamente 10 segundos. Se recogió tejido 14 días después de la administración de oligonucleótido.
A nális is de A R N
El día 14 después de la administración de oligonucleótido, se extrajo el ARN del hipocampo, la médula espinal y la corteza para el análisis por PCR en tiempo real de los niveles de ARNm de tau. Los niveles de ARNm de tau humana se midieron usando el conjunto de sondas de cebadores humanos RTS3104. Los resultados se calcularon como el porcentaje de inhibición de la expresión de ARNm de tau humana en comparación con el control. Todos los oligonucleótidos antisentido efectúan una inhibición significativa de los niveles de ARNm de tau humana en varios tejidos.
Tabla 65
Ejemplo 19: Diseño de oligonucleótidos dirigidos a Tau humana
ISIS N.° 603054 se diseñó para dirigirse a Tau humana. La secuencia de nucleobases y la química de enlace de ISIS N.° 603054 se dan en la tabla 66 a continuación. N.° de ISIS 603054 es un gapmero 5-10-5 MOE. N.° de ISIS 603054 tiene una longitud de 20 nucleósidos, donde el segmento de hueco central comprende diez 2'-desoxirribonucleósidos y se encuentra flanqueado por segmentos de ala en la dirección 5' y la dirección 3' que comprenden cinco nucleósidos cada una. Cada nucleósido en el segmento de ala 5' y cada nucleósido en el segmento de ala 3' tiene una modificación 2'-MOE. Todos los residuos de citosina en cada gapmero son 5-metilcitosinas. El "sitio de inicio" indica el nucleósido más cercano a la posición 5', al cual se dirige el gapmero en la secuencia génica humana. El "sitio de detención" indica el nucleósido más cercano a la posición 3' al cual se dirige el gapmero en la secuencia génica humana. Cada gapmero enumerado en la Tabla 1 a continuación se dirige a la secuencia genómica de tau humana, designada en esta invención como SEQ ID NO: 1 (n.° de acceso de GENBANK NT_010783.15 truncado de los nucleótidos 9240000 a 9381000) o a la secuencia de ARNm de tau humana, designada en esta invención como SEQ ID NO: 2 (n.° de acceso de GENBANK NM_001123066.3).
Tabla 66
Ejemplo 20: Análisis in vivo en ratones de oligonucleótidos dirigidos a Tau humana
Los oligonucleótidos, que se muestran en la tabla a continuación, se diseñaron para dirigirse a Tau. Los ratones, ratones transgénicos tau humanos "hTau" (Duff y col., Neurobiology of Disease 7:87-98, 2000; Davies y col. J. Neurochem. (2003) 86, 582-590) o ratones WT C57B16 de tipo silvestre se separaron en grupos de 3 o 4 ratones. A cada ratón de cada grupo de ratones se le administró una única dosis ICV de 300 ug o 200 ug de cada uno de los oligonucleótidos de la tabla a continuación. 3 horas después de la inyección, cada ratón se evaluó según 7 criterios diferentes. Los 7 criterios son (1) el ratón estaba despierto, alerta y receptivo; (2) el ratón estaba parado o encorvado sin estímulos; (3) el ratón muestra cualquier movimiento sin estímulos (4) el ratón muestra movimiento hacia adelante después de ser levantado; (5) el ratón muestra cualquier movimiento después de ser levantado; (6) el ratón responde al pellizco de la cola; (7) respiración regular. Para cada uno de los 7 criterios diferentes, a cada ratón se le asignó una puntuación secundaria de 0 si cumplía con los criterios o 1 si no lo hacía. Después de evaluar cada uno de los 7 criterios, se sumaron las puntuaciones secundarias de cada ratón y a continuación se promediaron para cada grupo. Por ejemplo, si un ratón estaba despierto, alerta y receptivo 3 horas después de la dosis ICV de 300 jg , y cumplía con todos los demás criterios, obtendría una puntuación sumada de 0. Si otro ratón no estaba despierto, alerta y receptivo 3 horas después de la dosis ICV de 300 jg pero cumplía con todos los demás criterios, recibiría una puntuación de 1. Los ratones tratados con solución salina
generalmente reciben una puntuación de 0. Los resultados se presentan como la puntuación promedio para cada grupo de tratamiento en la Tabla 67 a continuación. "SD" significa sin datos. Estos resultados demuestran que ISIS 613099, ISIS 613361, ISIS 613370, ISIS 623782, ISIS 623996, ISIS 424880 e ISIS 603054 se toleraron bien.
Tabla 67
Ejemplo 20: Análisis in vivo en ratas de oligonucleótidos dirigidos a Tau humana
Se separaron ratas Sprague Dawley en grupos de 4 ratas cada uno. A cada rata de cada grupo de ratas se le administró una dosis intratecal (IT) única de 1 mg o una dosis intratecal (IT) única de 3 mg de ISIS 613099, ISIS 613361, ISIS 613370, ISIS 623782, ISIS 623996, ISIS 424880 o ISIS 603054. 3 horas después de la inyección, se evaluó el movimiento de 7 partes diferentes del cuerpo para cada rata. Las 7 partes del cuerpo son (1) la cola de la rata; (2) la postura posterior de la rata; (3) las patas traseras de la rata; (4) las pezuñas traseras de la rata; (5) las pezuñas delanteras de la rata; (6) la postura anterior de la rata; y (7) la cabeza de rata. Para cada una de las 7 partes diferentes del cuerpo, a cada rata se le dio una puntuación secundaria de 0 si la parte del cuerpo se movía o 1 si la parte del cuerpo estaba paralizada. Después de evaluar cada una de las 7 partes del cuerpo, se sumaron las puntuaciones secundarias para cada rata y a continuación se promediaron para cada grupo. Por ejemplo, si la cola, la cabeza y todas las demás partes del cuerpo evaluadas de una rata se movieran 3 horas después de la dosis IT de 3 mg, se obtendría una puntuación total de 0. Si otra rata no moviera la cola 3 horas después de la dosis IT de 3 mg pero todas las demás partes del cuerpo evaluadas se movieran, recibiría una puntuación de 1. Las ratas tratadas con solución salina generalmente reciben una puntuación de 0. Una puntuación en el extremo superior del intervalo sugeriría toxicidad. Los resultados se presentan como la puntuación promedio para cada grupo de tratamiento en la Tabla 68 a continuación.
Tabla 68
Claims (27)
1. Un oligonucleótido modificado, o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, que consiste en 12 a 30 nucleósidos unidos, donde el oligonucleótido modificado tiene una secuencia de nucleobases que comprende al menos 8 nucleobases consecutivas de la secuencia de nucleobases de SEQ ID NO: 1634, donde la secuencia de nucleobases del oligonucleótido modificado es al menos un 90 % complementaria a la SEQ ID NO: 1 y donde el oligonucleótido modificado es capaz de reducir la expresión de Tau.
2. El oligonucleótido modificado o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo de la reivindicación 1, donde el oligonucleótido modificado:
(i) consiste en 20 nucleósidos unidos;
(ii) consiste en 19 nucleósidos unidos; o
(iii) consiste en 18 nucleósidos unidos.
3. El oligonucleótido modificado o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo de la reivindicación 1, donde la secuencia de nucleobases del oligonucleótido modificado comprende la secuencia de nucleobases de SEQ ID NO: 1634.
4. El oligonucleótido modificado o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo de la reivindicación 1, donde la secuencia de nucleobases del oligonucleótido modificado consiste en la secuencia de nucleobases de SEQ ID NO: 1634.
5. El oligonucleótido modificado o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo de la reivindicación 1, donde la secuencia de nucleobases del oligonucleótido modificado es al menos un 91 %, menos un 92 %, menos un 93 %, menos un 94 %, menos un 95 %, menos un 96 %, menos un 97 %, menos un 98 %, menos un 99 % o un 100 % complementaria a la SEQ ID NO: 1.
6. El oligonucleótido modificado o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo de cualquiera de las reivindicaciones anteriores, que es un gapmero.
7. El oligonucleótido modificado o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo de cualquiera de las reivindicaciones anteriores, que es un oligonucleótido modificado monocatenario.
8. El oligonucleótido modificado o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo de cualquiera de las reivindicaciones anteriores, donde al menos un enlace internucleosídico del oligonucleótido modificado es un enlace internucleosídico modificado.
9. El oligonucleótido modificado o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo de la reivindicación 8, donde (a) al menos un enlace internucleosídico modificado del oligonucleótido modificado es un enlace internucleosídico de fosforotioato; y/o (b) al menos un enlace internucleosídico del oligonucleótido modificado es un enlace internucleosídico de fosfodiéster.
10. El oligonucleótido modificado o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo de cualquiera de las reivindicaciones anteriores, donde al menos un nucleósido del oligonucleótido modificado comprende una nucleobase modificada, opcionalmente donde la nucleobase modificada es una 5-metilcitosina.
11. El oligonucleótido modificado o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo de cualquiera de las reivindicaciones anteriores, donde al menos un nucleósido del oligonucleótido modificado comprende un azúcar modificado, opcionalmente donde (a) el al menos un azúcar modificado es un azúcar bicíclico; o (b) al menos un azúcar modificado comprende un grupo 2'-O-metoxietilo o un grupo 2'-O-metilo.
12. El oligonucleótido modificado o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo de la reivindicación 11, donde el azúcar bicíclico comprende:
(a) un puente químico 4'-CH2-N(R)-O-2' donde R se selecciona independientemente de H y alquilo C1-C6; o (b) un puente químico 4'-CH(R)-O-2' donde R es metilo, H o -CH2-O-CH3.
13. El oligonucleótido modificado o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo de cualquiera de las reivindicaciones anteriores, donde el al menos un nucleósido del oligonucleótido modificado comprende un sustituto de azúcar, opcionalmente donde el al menos un sustituto de azúcar es un morfolino o un ácido nucleico peptídico.
14. El oligonucleótido modificado o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo de cualquiera de las reivindicaciones anteriores, que comprende:
a) un segmento de hueco que consiste en 10 desoxinucleósidos unidos;
un segmento de ala 5' que consiste en 5 nucleósidos unidos; y
un segmento de ala 3' que consiste en 5 nucleósidos unidos;
donde el segmento de hueco se posiciona entre el segmento de ala 5' y el segmento de ala 3' y donde cada
nucleósido de cada segmento de ala comprende un azúcar modificado;
b) un segmento de hueco que consiste en 9 desoxinucleósidos unidos;
un segmento de ala 5' que consiste en 5 nucleósidos unidos; y
un segmento de ala 3' que consiste en 5 nucleósidos unidos;
donde el segmento de hueco se posiciona entre el segmento de ala 5' y el segmento de ala 3' y donde cada nucleósido de cada segmento de ala comprende un azúcar modificado;
c) un segmento de hueco que consiste en 7 desoxinucleósidos unidos;
un segmento de ala 5' que consiste en 5 nucleósidos unidos; y
un segmento de ala 3' que consiste en 6 nucleósidos unidos;
donde el segmento de hueco se posiciona entre el segmento de ala 5' y el segmento de ala 3' y donde cada nucleósido de cada segmento de ala comprende un azúcar modificado;
d) un segmento de hueco que consiste en 8 desoxinucleósidos unidos;
un segmento de ala 5' que consiste en 5 nucleósidos unidos; y
un segmento de ala 3' que consiste en 5 nucleósidos unidos;
donde el segmento de hueco se posiciona entre el segmento de ala 5' y el segmento de ala 3' y donde cada nucleósido de cada segmento de ala comprende un azúcar modificado;
e) un segmento de hueco que consiste en 8 desoxinucleósidos unidos;
un segmento de ala 5' que consiste en 4 nucleósidos unidos; y
un segmento de ala 3' que consiste en 6 nucleósidos unidos;
donde el segmento de hueco se posiciona entre el segmento de ala 5' y el segmento de ala 3' y donde cada nucleósido de cada segmento de ala comprende un azúcar modificado; o
f) un segmento de hueco que consiste en 8 desoxinucleósidos unidos;
un segmento de ala 5' que consiste en 6 nucleósidos unidos; y
un segmento de ala 3' que consiste en 4 nucleósidos unidos;
donde el segmento de hueco se posiciona entre el segmento de ala 5' y el segmento de ala 3' y donde cada nucleósido de cada segmento de ala comprende un azúcar modificado.
15. La sal farmacéuticamente aceptable del oligonucleótido modificado de cualquiera de las reivindicaciones anteriores, que es una sal de sodio.
16. Un oligonucleótido modificado monocatenario, o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, que consiste en 18 nucleósidos unidos y que tiene una secuencia de nucleobases que comprende 18 nucleobases consecutivas de la secuencia de nucleobases de SEQ ID NO: 1634, y donde el oligonucleótido modificado comprende:
un segmento de hueco que consiste en 8 desoxinucleósidos unidos;
un segmento de ala 5' que consiste en 5 nucleósidos unidos; y
un segmento de ala 3' que consiste en 5 nucleósidos unidos;
donde el segmento de hueco se posiciona entre el segmento de ala 5' y el segmento de ala 3', donde cada nucleósido de cada segmento de ala comprende un azúcar 2'-O-metoxietilo, donde al menos un enlace internucleosídico es un enlace intemucleosídico de fosforotioato, al menos un enlace internucleosídico es un enlace internucleosídico de fosfodiéster, y cada citosina es una 5-metilcitosina.
17. La sal farmacéuticamente aceptable del oligonucleótido modificado monocatenario de la reivindicación 16, que es una sal de sodio.
18. Un compuesto antisentido conjugado que comprende el oligonucleótido modificado o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 15, o el oligonucleótido modificado monocatenario o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo de las reivindicaciones 16 o 17.
19. Una composición que comprende el oligonucleótido modificado o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 15, o el oligonucleótido modificado monocatenario o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo de las reivindicaciones 16 o 17, o el compuesto antisentido conjugado de la reivindicación 18, y al menos uno de un vehículo o diluyente farmacéuticamente aceptable, opcionalmente donde el diluyente farmacéuticamente aceptable es solución salina tamponada con fosfato (PBS).
20. El oligonucleótido modificado o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 15, o el oligonucleótido modificado monocatenario o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo de las reivindicaciones 16 o 17, o el compuesto antisentido conjugado de la reivindicación 18, o la composición de la reivindicación 19, para su uso en terapia.
21. El oligonucleótido modificado o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 15, o el oligonucleótido modificado monocatenario o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo de la reivindicación 16 o 17, o el compuesto antisentido conjugado de la reivindicación 18, o la composición de la reivindicación 19, para su uso en el tratamiento de una enfermedad, trastorno o afección neurodegenerativa.
22. El oligonucleótido modificado o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, el oligonucleótido modificado monocatenario o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, el compuesto antisentido conjugado, o la composición para su uso de la reivindicación 21, donde la enfermedad, trastorno o afección neurodegenerativa es una tauopatía.
23. El oligonucleótido modificado o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, el oligonucleótido modificado monocatenario o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, el compuesto antisentido conjugado, o la composición para su uso de la reivindicación 21, donde la enfermedad, trastorno o afección neurodegenerativa es enfermedad de Alzheimer, demencia frontotemporal, FTDP-17, parálisis supranuclear progresiva, encefalopatía traumática crónica, degeneración ganglionar corticobasal, epilepsia o síndrome de Dravet.
24. El oligonucleótido modificado o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, el oligonucleótido modificado monocatenario o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, el compuesto antisentido conjugado, o la composición para su uso de la reivindicación 21, donde la enfermedad, trastorno o afección neurodegenerativa es enfermedad de Alzheimer.
25. El oligonucleótido modificado o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, el oligonucleótido modificado monocatenario o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, el compuesto antisentido conjugado, o la composición para su uso de la reivindicación 21, donde la enfermedad, trastorno o afección neurodegenerativa es demencia frontotemporal.
26. El oligonucleótido modificado o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, el oligonucleótido modificado monocatenario o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, el compuesto antisentido conjugado, o la composición para su uso de la reivindicación 21, donde la enfermedad, trastorno o afección neurodegenerativa es parálisis supranuclear progresiva.
27. El oligonucleótido modificado o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, el oligonucleótido modificado monocatenario o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, el compuesto antisentido conjugado, o la composición para su uso de una cualquiera de las reivindicaciones 20 a 26, donde el oligonucleótido modificado o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, el oligonucleótido modificado monocatenario o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, el compuesto antisentido conjugado, o la composición se administra por administración intratecal.
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