ES2870983T3

ES2870983T3 - Anticuerpos anti-IL-34

Info

Publication number: ES2870983T3
Application number: ES15816783T
Authority: ES
Inventors: Dominique Heymann; Aude Segaliny; Régis Brion
Original assignee: Universite de Nantes; Institut National de la Sante et de la Recherche Medicale INSERM
Current assignee: Universite de Nantes; Institut National de la Sante et de la Recherche Medicale INSERM
Priority date: 2014-12-19
Filing date: 2015-12-21
Publication date: 2021-10-28
Anticipated expiration: 2035-12-21
Also published as: US10703813B2; CA2971517A1; JP6827928B2; WO2016097420A1; EP3233897A1; US20170342148A1; JP2018508467A; EP3233897B1

Abstract

Anticuerpo anti-IL-34 o fragmentos de unión a antígeno del mismo, comprendiendo dicho anticuerpo una cadena ligera que comprende CDR-L1, CDR-L2 y CDR-L3, que comprenden respectivamente la secuencia de aminoácidos SEC ID nº 1, 2 y 3; y una cadena pesada que comprende CDR-H1, CDR-H2 y CDR-H3 que comprenden respectivamente la secuencia de aminoácidos SEC ID nº 4, 5 y 6.

Description

DESCRIPCIÓN

Anticuerpos anti-IL-34

Antecedentes

La presente exposición se refiere a nuevos anticuerpos, en particular anticuerpos monoclonales murinos, quiméricos y humanizados, capaces de unirse específicamente a la interleucina IL-34, así como las secuencias de aminoácidos y ácidos nucleicos codificantes de dichos anticuerpos. En un aspecto, la exposición se refiere a nuevos anticuerpos o fragmentos de antígeno de los mismos, capaces de unión específica a IL-34. La exposición comprende además la utilización de dichos anticuerpos o fragmentos de antígeno de los mismos como medicamentos para el tratamiento preventivo y/o terapéutico de enfermedades que implican IL-34.

En 2008, Lin et al. encontraron una nueva citocina denominada interleucina-34 (IL-34) basándose en su capacidad de inducir la formación de unidades formadoras de colonias de macrófagos en cultivos de médula ósea humana con la misma eficacia que el factor estimulante de colonias de macrófagos (M-CSF) (Lin et al., 2008). IL-34 se une de manera estrecha al dominio extracelular del receptor de CSF-1 (M-CSFR), aunque con un modo de unión diferente a M-CSF (Felix et al., 2013; Ma et al., 2012), conduciendo a la dimerización del receptor y a una autofosforilación diferencial en sus ocho residuos de tirosina.

Más recientemente, Wang et al. han informado de que IL-34 es un controlador específico de la diferenciación de las células mieloides en la epidermis cutánea y el sistema nervioso central (Wang et al., 2012). IL-34 asimismo dirige la diferenciación de los monocitos en M2 inmunosupresores de manera similar a M-CSF (Foucher et al., 2013). Además, se ha demostrado que IL-34 se expresa en tumores de células gigantes de hueso y que puede ser un sustituto de M-CSF en la estimulación de la osteoclastogénesis (Baud'huin et al., 2010). IL-34, al igual que M-CSF, regula positivamente las quimiocinas producidas por la sangre completa, lo que identifica a ambas citocinas como colaboradores clave en la inflamación (Eda et al., 2010). La función de IL-34 asimismo ha sido confirmada en la artritis reumatoide.

Además, IL-34 participa en algunos cánceres, tales como el osteosarcoma, el sarcoma de Ewing, tumores óseos, cáncer de cerebro, en enfermedades de la piel y en enfermedades metabólicas, tales como la ateroesclerosis (Ségaliny et al., 2014, Stanley et al., 2014, Wang et al., 2014 y Cronk et al., 2013). La mayoría de estos efectos de IL-34 están mediados por M-SFR. IL-34 asimismo desempeña un papel único que recientemente se ha explicado en el cerebro mediante la unión al receptor de proteína tirosina fosfatasa RPTPp/^.

De esta manera, resulta importante disponer de medios de regulación de la interacción entre IL-34 y su receptor.

La utilización de anticuerpos monoclonales (mAb) para la terapia del cáncer ha conseguido considerable éxito en los últimos años. Dichos terapéuticos funcionan mediante alteraciones mediadoras de la función de antígenos o receptores, modulando el sistema inmunitario o transportando un fármaco específico que está conjugado con un anticuerpo con diana en un antígeno específico.

Anteriormente se ha descrito un anticuerpo monoclonal, Rg7155, que inhibe la dimerización del receptor de CSF-1. La administración de dicho anticuerpo en el paciente conduce a drásticas reducciones de las infiltraciones de macrófagos CSF-1R+CD163+ en los tejidos tumorales, lo que se traduce en respuestas clínicas objetivas en pacientes de tumor de células gigantes de tipo difuso (Ries et al., 2014).

Sin embargo, dicho anticuerpo es no específico, ya que inhibe de manera similar la unión de tanto M-CSF como IL-34.

Asimismo se describe un anticuerpo anti-IL-34 en el documento WO 2013/119716. Dicho anticuerpo es capaz de unirse a IL-34 y, de esta manera, bloquear la interacción con IL-34. Dicho anticuerpo es capaz de inhibir la ruta de señalización mediada por la unión de IL-34 a su receptor. Además, se utiliza en el tratamiento de algunas enfermedades inmunitarias.

Además, el documento WO 2013/119716 da a conocer que dicho anticuerpo anti-IL-34 presenta una afinidad de unión a su ligando IL-34 comprendida entre 1.7x10'8y 1.24x10'1°, que se afirma que aparentemente es una buena afinidad.

Sin embargo, es bien conocido en la materia que la fuerza de la afinidad de unión de un anticuerpo a su diana es un criterio muy importante para seleccionar anticuerpos terapéuticamente eficaces.

De esta manera, todavía existe una necesidad de nuevos anticuerpos con diana específicamente en Il-34 y que presenten una muy fuerte actividad de unión a su diana, que puedan utilizarse para el tratamiento de enfermedades autoinmunitarias y el cáncer.

A menos que se definan de otro modo, todos los términos técnicos y científicos utilizados en la presente memoria presentan significados iguales a los entendidos comúnmente por el experto ordinario en la materia a la que se refiere la presente invención. Aunque pueden utilizarse métodos y materiales similares o equivalentes a los indicados en la presente memoria en la práctica o ensayo de la presente invención, se describen posteriormente métodos y materiales adecuados. En caso de conflicto, prevalecerá la presente memoria, incluyendo las definiciones. Además, los materiales, métodos y ejemplos son únicamente ilustrativos y no pretenden ser limitativos.

Otras características y ventajas de la exposición resultarán evidentes a partir de la descripción detallada siguiente y reivindicaciones.

Descripción

La invención se refiere a un anticuerpo anti-IL-34, o fragmento de unión a antígeno del mismo, caracterizado por que sus LCDR y HCDR presentan las SEC ID n° 1-6, respectivamente. La invención en sí misma se define exclusivamente mediante las reivindicaciones adjuntas.

La exposición técnica detallada proporcionada posteriormente puede, en algunos aspectos, ir más allá de la exposición de la invención de por sí, y puede proporcionar además antecedentes técnicos de desarrollos técnicos relacionados. Se apreciará que la presente exposición técnica no pretende definir la invención como tal (que se define exclusivamente mediante las reivindicaciones adjuntas), sino, por el contrario, situarla en un contexto técnico más amplio. De acuerdo con lo anteriormente expuesto, se apreciará que la expresión "formas de realización" refleja un detalle específico de la exposición y no pretende definir como parte de la invención aspectos que no se encuentran comprendidos dentro del alcance según las reivindicaciones adjuntas.

Inesperadamente, los presentes inventores han encontrado un anticuerpo que se une específicamente a IL-34. Además, los inventores han mostrado que la afinidad de unión de dichos anticuerpos para IL-34 es muy elevada, en particular en comparación con el anticuerpo anti-IL-34 dado a conocer en la técnica anterior. Tal como se muestra en los ejemplos de la presente solicitud, la afinidad de unión de los presentes anticuerpos o los fragmentos de unión a antígeno de los mismos es tan elevada que resulta difícil determinar su constante de disociación, Kd, por medios convencionales.

Dichos anticuerpos son capaces de bloquear actividades biológicas de IL-34 mediante la inhibición de la interacción de IL-34 con M-CSFR. En efecto, la proliferación celular dependiente de IL-34 resulta bloqueada por los presentes anticuerpos. Además, la transducción de señales intracelular inducida por la unión de IL-34 a su receptor resulta inhibida por los presentes anticuerpos. De esta manera, dichos anticuerpos resultan útiles en la prevención y/o en el tratamiento de enfermedades que implican IL-34, incluyendo, por ejemplo, enfermedades inflamatorias, cáncer, enfermedad ósea, enfermedades de la piel, enfermedades metabólicas, enfermedades cerebrales, enfermedades hepáticas y enfermedades autoinmunitarias.

En un primer aspecto, los anticuerpos o fragmentos de unión a antígeno de los mismos comprenden una cadena ligera que comprende tres CDR de secuencias SEC ID n° 1, n° 2 o n° 3, o por lo menos una secuencia con una identidad de por lo menos 80%, preferentemente 85%, 90%, 95% y 98% tras una alineación óptica, con las secuencias SEC ID n° 1, n° 2 o n° 3 y tres CDR de secuencias SEC ID n° 4, n° 5 o n° 6, o por lo menos una secuencia con una identidad de por lo menos 80%, preferentemente 85%, 90%, 95% y 98% tras alineación óptima, con las secuencias SEC ID n° 4, n° 5 o n° 6.

Tal como se utiliza en la presente memoria, el "porcentaje de identidad" entre dos secuencias de ácidos nucleicos o aminoácidos se refiere al porcentaje de nucleótidos o residuos aminoácidos idénticos entre las dos secuencias que deben compararse, obtenido después de la alineación óptima, en el que este porcentaje es puramente estadístico y en el que las diferencias están distribuidas entre las dos secuencias aleatoriamente a lo largo de su longitud. La comparación entre dos secuencias de ácidos nucleicos o aminoácidos tradicionalmente se lleva a cabo mediante la comparación de las secuencias después de haberlas alineado óptimamente, pudiendo llevar a cabo dicha comparación por segmento o mediante la utilización de una "ventana de alineación". La alineación óptima de las secuencias para la comparación puede llevarse a cabo, además de comparando manualmente, mediante el algoritmo de homología local de Smith y Waterman [Ad. App. Math. 2:482, 1981], mediante el algoritmo de homología local de Neddleman [J. Mol. Biol. 48:443, 1970], mediante el método de búsqueda de similitudes de Pearson [Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:2444, 1988] o mediante software informático que utiliza dichos algoritmos (GAP, BESTFIT, FASTA y TFASTA en el paquete de software Wisconsin Genetics, Genetics Computer Group, 575 Science Dr., Madison, WI, o mediante el software de comparación BLAST NR o BLAST P).

El porcentaje de identidad entre dos secuencias de ácidos nucleicos o aminoácidos se determina mediante comparación de las dos secuencias alineadas óptimamente en las que las secuencias de ácidos nucleicos o aminoácidos para la comparación pueden presentar adiciones o deleciones en comparación con la secuencia de referencia para la alineación óptima entre las dos secuencias. El porcentaje de identidad se calcula mediante la determinación del número de posiciones en las que el aminoácido, nucleótido o residuo es idéntico en las dos secuencias, preferentemente entre las dos secuencias completas, dividiendo el número de posiciones idénticas por el número total de posiciones en la ventana de alineación y multiplicando el resultado por 100, para obtener el porcentaje de identidad entre las dos secuencias.

Por ejemplo, el programa BLAST, "BLAST 2 sequences" (Tatusova et al., "Blast 2 sequences - a new tool for comparing protein and nucleotide sequences", FEMS Microbiol. Lett. 174:247-250, 1999) disponible en el sitio http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gorf/bl2.html, puede utilizarse con los parámetros por defecto (notablemente los parámetros "penalización por hueco abierto": 5 y "penalización por extensión de hueco": 2; siendo la matriz seleccionada, por ejemplo, la matriz "BLOSUM 62" propuesta por el programa); el porcentaje de identidad entre las dos secuencias comparadas es directamente calculado por el programa.

Para la secuencia de aminoácidos que muestra una identidad de por lo menos 80%, preferentemente de 85%, 90%, 95% y 98% respecto a una secuencia de aminoácidos de referencia, entre los ejemplos preferidos se incluyen los que contienen la secuencia de referencia, determinadas modificaciones, notablemente una deleción, adición o sustitución de por lo menos un aminoácido, el truncado o la extensión. En el caso de la sustitución de uno o más aminoácidos consecutivos o no consecutivos, resultan preferidas las sustituciones en las que los aminoácidos sustituidos se sustituyen por aminoácidos "equivalentes". En la presente memoria, la expresión "aminoácidos equivalentes pretende indicar cualesquiera aminoácidos que es probable que sean sustituidos por uno de los aminoácidos estructurales sin modificar, sin embargo, las actividades biológicas de los anticuerpos correspondientes y los de ejemplos específicos definidos posteriormente.

Pueden determinarse los aminoácidos equivalentes basándose en su homología estructural con los aminoácidos a los que sustituyen o en los resultados de ensayos comparativos de actividad biológica entre los diversos anticuerpos que es probable que se generen.

A título de ejemplo no limitativo, la tabla 1, a continuación, resume las posibles sustituciones que es probable que se lleven a cabo sin resultar en una modificación significativa de la actividad biológica del anticuerpo modificado correspondiente; las sustituciones inversas son naturalmente posibles bajo las mismas condiciones.

Tabla 1

Los anticuerpos anti-IL-34 o fragmentos de unión a antígeno de los mismos comprenden una cadena ligera que comprende CDR-L1, CDR-L2 y CDR-L3, que comprenden, respectivamente, las secuencias de aminoácidos SEC ID n° 1, n° 2 y n° 3, y una cadena pesada que comprende CDR-H1, CDR-H2 y CDR-H3, que comprenden, respectivamente, las secuencias de aminoácidos SEC ID n° 4, n° 5 y n° 6.

El término "anticuerpo" se utiliza en la presente memoria en su sentido más amplio y cubre específicamente los anticuerpos monoclonales (incluyendo los anticuerpos monoclonales de longitud completa) de cualquier isotipo, tal como IgG, IgM, IgA, IgD e IgE, anticuerpos multiespecíficos, anticuerpos quiméricos y fragmentos de unión a antígeno. Un anticuerpo reactivo con un antígeno específico puede generarse mediante métodos recombinantes, tales como la selección de bibliotecas de anticuerpos recombinantes en fagos o vectores similares, o mediante inmunización de un animal con el antígeno o un ácido nucleico codificante de antígeno.

Un anticuerpo típico comprende dos cadenas ligeras idénticas y dos cadenas pesadas idénticas que están unidas mediante enlaces disulfuro.

Tal como se utiliza en la presente memoria, la expresión "cadena ligera" se refiere a una cadena ligera de inmunoglobulina de mamífero, lambda (A) o kappa (k), que presenta dos dominios sucesivos: un dominio constante y un dominio variable.

Tal como se utiliza en la presente memoria, la expresión "cadena pesada" se refiere a una cadena de inmunoglobulina de mamífero indicada mediante: a, 8, £, y y H. Cada cadena pesada presenta dos regiones: la región constante y la región variable. La región constante es idéntica en todos los anticuerpos del mismo isotipo. La región variable de cada cadena pesada está compuesta por un único dominio de Ig.

La "región variable" o "dominio variable" de un anticuerpo se refiere a los dominios aminoterminales de la cadena pesada o ligera del anticuerpo. El dominio variable de la cadena pesada puede denominarse "VH". El dominio variable de la cadena ligera puede denominarse "VL". Estos dominios generalmente son las partes más variables de un anticuerpo y contienen los sitios de unión a antígeno.

Cada región variable contiene tres segmentos denominados "regiones determinantes de complementariedad" ("CDR") o "regiones hipervariables", que son responsables principalmente de unión de un epítopo de un antígeno. De esta manera, las CDR dirigen la especificidad de la unión del anticuerpo. Habitualmente se denominan CDR1, CDR2 y CDR3, numeradas secuencialmente desde el extremo N-terminal. Las partes más altamente conservadas de las regiones variables se denominan "regiones marco".

En una forma de realización, el anticuerpo o fragmentos de unión a antígeno del mismo, comprende un dominio variable de cadena ligera de secuencia que comprende la secuencia de aminoácidos SEC ID n° 7 o por lo menos una secuencia con una identidad de por lo menos 80%, preferentemente 85%, 90%, 95% y 98% tras una alineación óptima con la secuencia SEC ID n° 7 y un dominio variable de cadena pesada de secuencia que comprende la secuencia de aminoácidos SEC ID n° 8 o por lo menos una secuencia con una identidad de por lo menos 80%, preferentemente de 85%, 90%, 95% y 98% tras alineación óptima con la secuencia SEC ID n° 8.

En una forma de realización preferida, los anticuerpos de la invención, o un fragmento de unión a antígeno de los mismos, comprenden una cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos SEC ID n° 7 y una cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos SEC ID n° 8.

En otra forma de realización preferida, los anticuerpos de la invención, o un fragmento de unión a antígeno de los mismos, comprenden una cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos SEC ID n° 7 y una cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos SEC ID n° 8.

Según la presente invención, las secuencias correspondientes a cadenas variables completas de dichos anticuerpos y sus CDR se analizaron en la base de datos IgBlast (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/igblast/) para identificar las CDR.

La base de datos IgBlast se desarrolló para analizar las secuencias de nucleótidos y de proteínas y puede procesar las secuencias por lotes. Además, IgBLAST permite realizar búsquedas frente a las bases de datos génicas de línea germinal y otras bases de datos de secuencias simultáneamente para minimizar la probabilidad de omitir posiblemente el gen V de línea germinal (gen variable de inmunoglobulina) de correspondencia óptima. Información adicional sobre la base de datos IgBLASTabase se incluye en la presente memoria en referencia a Ye et al. "IgBLAST: an immunoglobulin variable domain sequence analysis tool", publicada el 22 de junio de 2013 en el sitio web de Oxford Journal.

Un "anticuerpo policlonal" es un anticuerpo que ha sido producido entre o en presencia de otro u otros anticuerpos no idénticos. En general, se producen anticuerpos policlonales a partir de un linfocito B en presencia de varios otros linfocitos B productores de anticuerpos no idénticos. Habitualmente se obtienen anticuerpos policlonales directamente de un animal inmunizado.

Según otra forma de realización, el anticuerpo, o fragmentos de unión a antígeno del mismo, es un anticuerpo monoclonal. Una forma de realización específica se refiere a anticuerpos monoclonales murinos, o fragmentos de unión a antígeno de los mismos.

Tal como se utiliza en la presente memoria, la expresión "anticuerpo monoclonal" se refiere a un anticuerpo que surge de una población de anticuerpos prácticamente homogénea. Más particularmente, los anticuerpos individuales de una población son idénticos excepto por unas cuantas mutaciones naturales posibles que pueden encontrarse en proporciones mínimas. Es decir, un anticuerpo monoclonal consiste en una población de anticuerpos homogénea que surge a partir del crecimiento de un único clon celular (por ejemplo, un hibridoma, una célula hospedadora eucarióticas transfectada con una molécula de ADN codificante del anticuerpo homogéneo, una célula hospedadora procariótica transfectada con una molécula de ADN codificante del anticuerpo homogéneo, etc.) y se caracteriza generalmente por cadenas pesadas de una y solo una clase y subclase, y cadenas ligeras de únicamente un tipo. Los anticuerpos monoclonales son altamente específicos y están dirigidos contra un único antígeno.

Un "antígeno" es una molécula predeterminada a la que puede unirse selectivamente un anticuerpo. El antígeno diana puede ser un polipéptido, un carbohidrato, un ácido nucleico, un lípido, un hapteno o cualquier otro compuesto natural o sintético. Preferentemente, el antígeno diana es un polipéptido.

Un "epítopo" es el sitio del antígeno al que se une específicamente un anticuerpo. Puede estar formado por residuos contiguos o por residuos no contiguos que acaban en estrecha proximidad debido al plegamiento de la proteína antigénica. Los epítopos formados por aminoácidos contiguos típicamente se conservan con la exposición a solventes desnaturalizantes, mientras que los epítopos formados por aminoácidos no contiguos típicamente se pierden bajo dicha exposición.

En una forma de realización, se proporcionan anticuerpos o fragmentos de unión a antígeno de los mismos que son capaces de inhibir la interacción de IL-34 con sus receptores mediante la unión a IL-34 antes de la unión de IL-34 a su receptor.

En otra forma de realización, se proporcionan anticuerpos o fragmentos de unión a antígeno de los mismos que son capaces de inhibir la interacción de IL-34 con sus receptores mediante la unión de IL-34 a su receptor.

En todavía otra forma de realización, se proporcionan anticuerpos o fragmentos de unión a antígeno de los mismos que son capaces de inhibir la interacción de IL-34 con sus receptores mediante la unión de IL-34 antes y después de la unión de Il-34 a su receptor.

Específicamente, los anticuerpos o fragmentos de unión a antígeno de los mismos indicados en la presente memoria son capaces de inhibir la interacción de IL-34 con M-CSFR y/o receptores RPTPBp/Z.

En una forma de realización, se proporcionan anticuerpos o fragmentos de unión a antígeno de los mismos que son capaces de inhibir la interacción de IL-34 con M-CSFR y/o receptores RPTPBp/Z mediante la unión a IL-34 antes de la unión de IL-34 a M-CSFR y/o a receptor de RPTPBp/Z.

En otra forma de realización, se proporcionan anticuerpos o fragmentos de unión a antígeno de los mismos que son capaces de inhibir la interacción de IL-34 con M-CSFR y/o receptores RPTPBp/Z mediante la unión a IL-34 antes de la unión de IL-34 a M-CSFR y/o RPTPBp/Z.

En todavía otra forma de realización, se proporcionan anticuerpos o fragmentos de unión a antígeno de los mismos que son capaces de inhibir la interacción de IL-34 con M-CSFr y/o receptores RPTPBp/Z mediante la unión a IL-34 antes y después de la unión de IL-34 a M-CSFR y/o receptor RPTPBp/Z.

De esta manera, los presentes anticuerpos son capaces de inhibir la señalización mediada por IL-34. Lo anterior resulta particularmente útil, ya que se ha mostrado que IL-34 participa en el desarrollo de varias patologías, entre ellas, por ejemplo, enfermedades inflamatorias, cáncer, enfermedad ósea, enfermedades de la piel, enfermedades metabólicas, enfermedades cerebrales, enfermedades hepáticas y enfermedades autoinmunitarias.

Los inventores han mostrado que los presentes anticuerpos presentan una afinidad elevada para IL-34. Lo anterior correlaciona con la muy baja constante de disociación (Kd), que resultaba difícil de medir por los inventores utilizando medios convencionales.

Preferentemente, el anticuerpo o fragmentos de unión a antígeno del mismo presentan una constante de disociación (Kd) Kd á 10'11 M. Más preferentemente, el anticuerpo o fragmentos de unión a antígeno del mismo presentan una constante de disociación Kd á 9.4 ± 0.7x10'12 M medida mediante BIAcore.

Tal como se utiliza en la presente memoria, el término "Kd" se refiere a la constante de disociación de una interacción anticuerpo/antígeno particular.

Tal como se utiliza en la presente memoria, la expresión "afinidad de unión" se refiere de manera general a la fuerza de la suma de interacciones no covalentes entre un único sitio de unión de una molécula (por ejemplo, un anticuerpo o fragmentos de unión a antígeno del mismo) y su pareja de unión (por ejemplo, un antígeno). A menos que se indique lo contrario, tal como se utiliza en la presente memoria, "afinidad de unión" se refiere a la afinidad de unión intrínseca que refleja una interacción 1: 1 entre elementos de una pareja de unión (por ejemplo, anticuerpo y antígeno). La afinidad de una molécula X para su pareja Y puede representarse de manera general con la constante de disociación (Kd). La afinidad puede medirse mediante métodos comunes conocidos de la técnica, incluyendo los indicados en la presente memoria. Los anticuerpos de baja afinidad generalmente se unen al antígeno lentamente y tienden a disociarse fácilmente, mientras que los anticuerpos de alta afinidad generalmente se unen al antígeno más rápidamente y tienden a permanecer unidos más tiempo. Se conoce en la materia una diversidad de métodos de medición de la afinidad de unión, cualquiera de los cuales puede utilizarse en la presente memoria.

Tal como se utiliza en la presente memoria, el término "BIACore" se refiere a una tecnología basada en la resonancia del plasmón superficial (SPR), un fenómeno óptico que permite la detección de elementos interactuantes no marcados en tiempo real. La tecnología BIACore implica inmovilizar una molécula de una pareja de unión sobre la superficie del chip sensor ("ligando", en términos de BIACore) e inyectar una serie de concentraciones de su pareja ("analito") en toda la superficie. Los cambios en el índice de refracción en la superficie en la que se produce la interacción de unión son detectados por el hardware y grabados como UR (unidades de resonancia) en el software de control. Se generan las curvas a partir del registro de UR y son evaluadas por los algoritmos de ajuste, que comparan los datos en bruto con modelos de unión bien definidos. Estos ajustes permiten la determinación de la afinidad aparente de la interacción de unión.

Debe entenderse que los anticuerpos no se encuentran en forma natural, es decir, no se obtienen de su medio natural, sino que se aíslan o se obtienen mediante purificación a partir de fuentes naturales o se obtienen mediante recombinación genética o síntesis química y, de esta manera, pueden incluir aminoácidos no naturales, tal como se indica posteriormente.

Otro aspecto se refiere a anticuerpos quiméricos o humanizados, o fragmentos de unión a antígeno de los mismos, que pueden obtenerse mediante ingeniería genética o mediante síntesis química.

Específicamente, los presentes anticuerpos anti-IL-34 son anticuerpos quiméricos.

La expresión "anticuerpo quimérico" tal como se utiliza en la presente memoria se refiere a un anticuerpo que contiene una región variable natural (cadena ligera y cadena pesada) derivada de un anticuerpo de una especie dada en combinación con regiones constantes de la cadena ligera y de la cadena pesada de un anticuerpo de una especie heteróloga respecto a dicha especie dada. De esta manera, un "anticuerpo quimérico", tal como se utiliza en la presente memoria, es un anticuerpo en el que la región constante, o una parte de la misma, se encuentra alterada, se ha sustituido o intercambiado, de manera que la región variable se encuentra unida a una región constante de una especie diferente, o perteneciente a otra clase o subclase de anticuerpo. La expresión "anticuerpo quimérico" asimismo se refiere a un anticuerpo en el que la región constante, o una parte de la misma, se encuentra alterada, se ha sustituido o intercambiado, de manera que la región constante se encuentra unida a una región variable de una especie diferente, o perteneciente a otra clase o subclase de anticuerpo.

Los anticuerpos, o fragmentos quiméricos de los mismos, pueden prepararse mediante ingeniería recombinante. Por ejemplo, el anticuerpo quimérico pudo producirse mediante clonación de ADN recombinante que contiene un promotor y una secuencia codificante de la región variable de un anticuerpo monoclonal no humano, notablemente murino, y una secuencia codificante de la región constante del anticuerpo humano. Un anticuerpo quimérico codificado por uno de dichos genes recombinantes podría ser, por ejemplo, una quimera ratón-ser humano, la especificidad de dicho anticuerpo puede estar determinada por la región variable derivada del ADN murino y determinar su isotipo a partir de la región constante derivada del ADN humano. Hacer referencia a Verhoeyn et al. (BioEssays, 8:74, 1988) para métodos de preparación de anticuerpos quiméricos.

Preferentemente, en la presente memoria se proporciona un anticuerpo quimérico, o fragmentos de unión a antígeno del mismo, que comprende una cadena ligera que comprende CDR-L1, CDR-L2 y CDR-L3, que comprenden, respectivamente, las secuencias de aminoácidos SEC ID n° 1, n° 2 y n° 3, y una cadena pesada que comprende CDR-H1, CDR-H2 y CDR-H3, que comprenden, respectivamente, las secuencias de aminoácidos SEC ID n° 4, n° 5 y n° 6.

Más preferentemente, el anticuerpo quimérico, o fragmentos de unión a antígeno del mismo, comprende una cadena ligera que comprende CDR-L1, CDR-L2 y CDR-L3, que presentan, respectivamente, las secuencias de aminoácidos s Ec ID n° 1, n° 2 y n° 3, y una cadena pesada que comprende CDR-H1, CDR-H2 y CDR-H3, que presentan, respectivamente, las secuencias de aminoácidos s Ec ID n° 4, n° 5 y n° 6.

En otra forma de realización, se proporciona en la presente memoria un anticuerpo quimérico, o fragmentos de unión a antígeno del mismo, que comprende una región variable de cadena ligera de secuencia SEC ID n° 7 y una región variable de cadena pesada de secuencia consistente en SEC ID n° 8.

En una forma de realización más preferida, el anticuerpo quimérico es un anticuerpo que comprende las regiones constantes de regiones humanas y variables del ratón.

El experto en la materia será capaz de adaptar los métodos convencionales para la obtención de anticuerpos quiméricos tal como se ha indicado anteriormente a fin de producir los presentes anticuerpos quiméricos.

En otro aspecto, en la presente memoria se proporcionan anticuerpos anti-IL-34 humanizados, o fragmentos de unión a antígeno de los mismos.

Tal como se utiliza en la presente memoria, la expresión "anticuerpo humanizado" se refiere a un anticuerpo quimérico que contiene una secuencia mínima derivada de inmunoglobulina no humana. En una forma de realización, un anticuerpo humanizado es una inmunoglobulina humana (anticuerpo receptor) en el que los residuos de una CDR del receptor son sustituidos por residuos de una CDR de una especie no humana (anticuerpo donante), tal como el ratón, la rata, el conejo o un primate no humano que presentan la especificidad, afinidad y/o capacidad deseada. En algunos casos, los residuos de región marco ("FR") de la inmunoglobulina humana se sustituyen por los residuos no humanos correspondientes. Además, los anticuerpos humanizados pueden comprender residuos que no se encuentran en el anticuerpo receptor o en el anticuerpo donante. Estas modificaciones se realizan para refinar adicionalmente el rendimiento del anticuerpo, tal como la afinidad de unión. En general, un anticuerpo humanizado comprenderá sustancialmente la totalidad de por lo menos un, y típicamente dos, dominios variables, en el que la totalidad, o sustancialmente la totalidad, de los bucles hipervariables corresponden a los de una secuencia de inmunoglobulina no humana, y la totalidad, o sustancialmente la totalidad, de las regiones FR son las de una secuencia de inmunoglobulina humana, aunque las regiones FR pueden incluir una o más sustituciones individuales de residuo de FR que mejora el rendimiento del anticuerpo, tal como la afinidad de unión, la isomerización, la inmunogenicidad, etc. El número de estas sustituciones de aminoácidos en la FR típicamente no son más de 6 en la cadena H, y en la cadena L, no más de 3. El anticuerpo humanizado opcionalmente puede comprender además por lo menos una parte de una región constante (Fc) de inmunoglobulina, típicamente la de una inmunoglobulina humana.

El objetivo de la humanización es la reducción de la inmunogenicidad de un anticuerpo xenogénico, tal como un anticuerpo murino, para la introducción de un ser humano, manteniendo simultáneamente la afinidad de unión y especificidad completas del anticuerpo. Los anticuerpos humanizados, o anticuerpos adaptados para el no rechazo por otros mamíferos, pueden producirse utilizando varias tecnologías, tales como la resuperficialización y la injertación de CDR. Tal como se utiliza en la presente memoria, la tecnología de resuperficialización utiliza una combinación de modelado molecular, análisis estadístico y mutagénesis para alterar las superficies no CDR de las regiones variables de anticuerpo para que sean más similares a las superficies de anticuerpos conocidos del huésped diana.

Las estrategias y métodos para la resuperficialización de anticuerpos, y otros métodos para reducir la inmunogenicidad de los anticuerpos en un huésped diferente, se dan a conocer en la patente US n° 5.639.641, que se incorpora como referencia en la presente memoria en su totalidad. Brevemente, en un método preferente, (1) se generan alineaciones de posición de un grupo de regiones variables de cadena pesada y ligera de anticuerpo para proporcionar un juego de posiciones expuestas en superficie de marco de región variable de cadena pesada y ligera en el que las posiciones de alineación para todas las regiones variables son por lo menos aproximadamente 98% idénticas, (2) se define un grupo de residuos aminoácidos expuestos en superficie de marco de región variable de cadena pesada y ligera para un anticuerpo de roedor (o fragmento del mismo), (3) se identifica un grupo de residuos aminoácidos expuestos en superficie de marco de región variable de cadena pesada y ligera que es más estrechamente idéntico al grupo de residuos aminoácidos expuestos en superficie del roedor, (4) el grupo de residuos aminoácidos expuestos en superficie de marco de región variable de cadena pesada y ligera definido en la etapa (2) se sustituye por el grupo de residuos aminoácidos expuestos en superficie de marco de región variable de cadena pesada y ligera identificado en la etapa (3), excepto por aquellos residuos aminoácidos que se encuentran a menos de 5 A de cualquier átomo de cualquier residuo de las regiones determinantes de complementariedad del anticuerpo de roedor, y (5) se produce el anticuerpo de roedor humanizado que presenta especificidad de unión.

Los anticuerpos pueden humanizarse utilizando una diversidad de otras técnicas, incluyendo el injerto de CDR (documentos EP 0 239 400 yW O 91/09967; patentes US n° 5.530.101 y n° 5.585.089), enchapado o resuperficialización (documentos EP 0592 106 y EP 0519 596; Padlan E. A., Molecular Immunology 28(4/5): 489 498, 1991; Studnicka G. M. et al., Protein Engineering 7(6): 805-814, 1994 Roguska M.A. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 91:969-973, 1994), y reorganización de cadenas (patente US n° 5.565.332. Pueden producirse anticuerpos humanos utilizando una diversidad de técnicas conocidas en la materia, incluyendo métodos de expresión fágica. Ver asimismo las patentes US n° 4.444.887, n° 4.716.111, n° 5.545.806 y n° 5.814.318, y las solicitudes publicadas de patente internacional WO 98/46645, WO 98/50433, WO 98/24893, WO 98/16654, WO 96/34096, WO 96/33735 y WO 91/10741.

Según la descripción, los anticuerpos humanizados se generan a partir del anticuerpo murino indicado anteriormente.

Más particularmente, en la presente memoria se proporciona un anticuerpo humanizado, o fragmentos de unión a antígeno del mismo, que comprende una cadena ligera que comprende CDR-L1, CDR-L2 y CDR-L3, que comprenden, respectivamente, las secuencias de aminoácidos SEC iD n° 1, n° 2 y n° 3, y una cadena pesada que comprende CDR-H1, CDR-H2 y CDR-H3, que comprenden, respectivamente, las secuencias de aminoácidos SEC ID n° 4, n° 5 y n° 6.

En otro aspecto, en la presente memoria se proporcionan los fragmentos de unión a antígeno del anticuerpo indicado anteriormente.

Un "fragmento de anticuerpo" comprende una parte de un anticuerpo intacto, preferentemente la región de unión a antígeno y/o región variable del anticuerpo intacto. Entre los ejemplos de fragmentos de anticuerpo se incluyen los fragmentos Fab, Fab', F(ab')²y Fv; los diacuerpos, los anticuerpos lineales (ver la patente US n° 5.641.870, Ejemplo 2; Zapata et al., Protein Eng. 8(10): 1057-1062, 1995), moléculas de anticuerpo de cadena sencilla y anticuerpos multiespecíficos formados a partir de fragmentos de anticuerpo. La digestión con papaína de los anticuerpos produce dos fragmentos de unión a antígeno idénticos, denominados fragmentos "Fab" y un fragmento residual "Fc", una denominación que refleja la capacidad de cristalizar fácilmente. El fragmento Fab consiste en una cadena L completa junto con el dominio de región variable de la cadena H (Vh) y el primer dominio constante de una cadena pesada (Ch1). Cada fragmento Fab es monovalente con respecto a la unión de antígeno, es decir, presenta un único sitio de unión a antígeno. El tratamiento con pepsina de un anticuerpo proporciona un único fragmento F(ab')²grande que corresponde aproximadamente a dos fragmentos Fab unidos mediante disulfuro que presentan diferente actividad de unión a antígeno y todavía es capaz de entrecruzar antígeno. Los fragmentos Fab' difieren de los fragmentos Fab en la adición de unos cuantos residuos adicionales en el extremo carboxi-terminal del dominio Ch1, incluyendo una o más cisteínas de la región bisagra del anticuerpo. Fab'-SH es la denominación en la presente memoria para Fab' en la que el residuo o residuos de cisteína de los dominios cisteína portan un grupo tiol libre. Los fragmentos de anticuerpo F(ab')²originalmente se produjeron como parejas de fragmentos Fab' que presentaban cisteínas de bisagra entre ellos. Asimismo se conocen otros acoplamientos químicos de fragmentos de anticuerpo.

El término "Fv" tal como se utiliza en la presente memoria se refiere al fragmento de anticuerpo mínimo que contiene un sitio completo de reconocimiento y unión de antígeno. Dicho fragmento consiste en un dímero de un dominio de región variable de cadena pesada y uno de cadena ligera en asociación no covalente estrecha. A partir del plegamiento de dichos dos dominios emanan seis bucles hipervariables (3 bucles cada una de las cadenas H y L) que contribuyen a los residuos aminoácidos para la unión a antígenos y confieren especificidad de unión a antígeno al anticuerpo. Sin embargo, incluso un único dominio variable (o la mitad de un Fv que comprende únicamente tres RHV específicas para un antígeno) presenta la capacidad de reconocer y unirse a antígeno, aunque habitualmente a una afinidad más baja que el sitio de unión completo.

La expresión "Fv de cadena sencilla", asimismo abreviada "sFv" o "scFv" son fragmentos de anticuerpo que comprenden los dominios de anticuerpo Vh y Vl conectados en una única cadena polipeptídica. Preferentemente, el polipéptido sFv comprende además un conector polipeptídico entre los dominios Vh y Vl que permite que el sFv forme la estructura deseada para la unión de antígeno. Para una revisión de sFv, ver Pluckthun in The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, vol. 113, Rosenburg y Moore, eds., Springer-Verlag, New York, páginas 269 a 315, 1994.

Los "fragmentos funcionales" de los presentes anticuerpos comprenden una parte de un anticuerpo intacto, que generalmente incluye la región de unión a antígeno o variable del anticuerpo intacto o la región Fc de un anticuerpo que conserva o ha modificado la capacidad de unión a FcR. Entre los ejemplos de fragmentos de anticuerpo se incluyen moléculas de anticuerpo lineal, moléculas de anticuerpo de cadena sencilla y anticuerpo multiespecíficos formados a partir de fragmentos de anticuerpo.

El término "diacuerpos" se refiere a pequeños fragmentos de anticuerpo preparados mediante la construcción de fragmentos sFv (ver párrafo anterior) con conectores cortos (aproximadamente 5 a 10) residuos) entre los dominios Vh y Vl, de manera que se consigue el apareamiento entre cadenas, aunque no intracadena de los dominios V, resultando de esta manera en un fragmento bivalente, es decir, un fragmento que presenta dos sitios de unión a antígeno. Los diacuerpos biespecíficos son heterodímeros de dos fragmentos sFv "entrecruzados" en los que los dominios Vh y Vl de los dos anticuerpos se encuentran presentes en diferentes cadenas polipeptídicas. Los diacuerpos se describen con mayor detalle en, por ejemplo, los documentos EP 404.097 y WO 93/11161; Hollinger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 6444-6448, 1993.

Más particularmente, en la presente memoria se proporciona un anticuerpo anti-IL-34, o sus compuestos derivados o fragmentos funcionales, en el que dicho fragmento funcional se selecciona de entre los fragmentos Fv, Fab, (Fab')², Fab', scFv, scFv-Fc y diacuerpos, o cualquier fragmento cuya semivida se haya incrementado mediante modificación química.

La modificación química indicada anteriormente, puede ser la adición de polialquilenglicol, tal como polietilenglicol (PEGilación) (los fragmentos PEGilados se denominan Fv-PEG, scFv-PEG, Fab-PEG, F(ab')²-PEG y Fab'-PEG) o mediante incorporación en un liposoma, microesferas o PLGA, en donde dichos fragmentos poseen por lo menos seis CDR indicados anteriormente. que es capaz notablemente de ejercer en general una actividad, aunque parcial, del anticuerpo a partir del que se origina.

Preferentemente, dicho fragmento de unión a antígeno comprenderá o incluirá una secuencia parcial de la cadena variable pesada o ligera del anticuerpo del que derivó, en el que dicha secuencia parcial resulta suficiente para retener la misma especificidad de unión que el anticuerpo del que deriva y una afinidad suficiente, preferentemente por lo menos igual a 1/100, en un modo más preferente por lo menos igual a 1/10, de la afinidad del anticuerpo del que deriva.

Preferentemente, dicho fragmento de unión a antígeno será de los tipos Fv, scFv, Fab, F(ab')², F(ab'), scFv-Fc o diacuerpos, que generalmente presentan la misma especificidad de unión que el anticuerpo a partir del que deriva.

Los presentes fragmentos de unión a antígeno pueden obtenerse a partir de los anticuerpos indicados anteriormente mediante métodos tales como la digestión enzimática, incluyendo pepsina o papaína, y/o mediante corte de los puentes disulfuro mediante reducción química. Los fragmentos de unión a antígeno asimismo pueden obtenerse mediante técnicas genéticas recombinantes asimismo conocidas por el experto en la materia, o mediante síntesis peptídica mediante, por ejemplo, sintetizadores automáticos de péptidos, tales como los comercializados por Applied Biosystems, etc.

En la presente memoria se proporciona un ácido nucleico aislado caracterizado por que se selecciona de entre los ácidos nucleicos siguientes (incluyendo cualquier código genético degenerado):

a) un ácido nucleico, ADN o ARN, codificante de un anticuerpo o uno de sus fragmentos o derivados funcionales, tal como se ha indicado anteriormente,

b) un ácido nucleico que comprende una secuencia de ADN seleccionada de entre el grupo de secuencias que consiste en las SEC ID n° 9 a n° 14,

c) un ácido nucleico que comprende una secuencia de ADN seleccionada de entre el grupo de secuencias que consiste en las SEC ID n° 15 y n° 16.

En una forma de realización específica, en la presente memoria se proporcionan seis polinucleótidos, en los que cada polinucleótido codifica una CDR específica del presente anticuerpo.

En una forma de realización específica, se proporciona un par de polinucleótidos, en el que uno de los polinucleótidos codifica la cadena pesada y los demás polinucleótidos codifican la cadena ligera de un anticuerpo indicado anteriormente.

Las expresiones "ácido nucleico", "secuencia nucleica", "secuencia de ácido nucleico", "polinucleótido", "oligonucleótido", "secuencia polinucleótida" y "secuencia de nucleótidos", utilizadas intercambiablemente en la presente descripción, se refieren a una secuencia precisa de nucleótidos, modificada o no, que define un fragmento o una región de un ácido nucleico, que contiene nucleótidos no naturales o no, y que es un ADN de doble cadena, un ADN de una sola cadena o productos de transcripción de dichos ADN.

Debe incluirse en la presente memoria que las presentes secuencias de nucleótidos no se encuentran en su medio cromosómico natural, es decir, en un estado natural. Las presentes secuencias se han aislado y/o purificado, es decir, se han muestreado directa o indirectamente, por ejemplo mediante una copia, en el que su medio ha sido por lo menos parcialmente modificado. Los ácidos nucleicos aislados obtenidos mediante genética recombinante mediante, por ejemplo, células hospedadoras, u obtenidos mediante síntesis química, asimismo deberían mencionarse en la presente memoria.

La expresión "secuencias nucleicas que muestran un porcentaje de identidad de por lo menos 80%, preferentemente de 85%, 90%, 95% y 98%, tras la alineación óptima, respecto a una secuencia preferida" se refiere a secuencias nucleicas que muestran, con respecto a la secuencia nucleica de referencia, determinadas modificaciones tales como, en particular, una deleción, un truncado, una extensión, una fusión quimérica y/o una sustitución, particularmente puntual. Preferentemente, estas son secuencias que codifican las mismas secuencias de aminoácidos que la secuencia de referencia, estando relacionada esta con la degeneración del código genético, o secuencias de complementariedad que es probable que hibriden específicamente con las secuencias de referencia, preferentemente bajo condiciones altamente restrictivas, notablemente las definidas posteriormente.

La hibridación bajo condiciones altamente restrictivas se refiere a que las condiciones relacionadas con la temperatura y fuerza iónica se seleccionan de manera que permitan mantener la hibridación entre dos fragmentos de ADN complementarios. A título puramente ilustrativo, las condiciones altamente restrictivas de la etapa de hibridación para el propósito de definir los fragmentos polinucleótidos indicados anteriormente son ventajosamente las siguientes.

La hibridación de ADN-ADN o ADN-ARN se lleva a cabo en dos etapas: (1) prehibridación a 42°C durante tres horas en tampón de fosfato (20 mM, pH 7.5) que contiene 5X SSC (iX SSC corresponde a una solución de NaCl 0.15 M citrato sódico 0.015 M), formamida al 50%, dodecilsulfato sódico (SDS) al 7%, 10X solución de Denhardt, dextrán sulfato al 5% y ADN de esperma de salmón al 1%; (2) hibridación primaria durante 20 horas a una temperatura dependiente de la longitud de la sonda (es decir, 42°C para una sonda >100 nucleótidos de longitud) seguido de dos lavados de 20 minutos a 20°C en 2X SSC SDS al 2%, un lavado de 20 minutos a 20°C en 0.1X SSC SDS al 0.1%. El último lavado se llevó a cabo en 0.1X SSC SDS al 0.1% durante 30 minutos a 60°C para una sonda >100 nucleótidos de longitud. Las condiciones de hibridación altamente restrictivas indicadas anteriormente para un polinucleótido de tamaño definido pueden ser adaptadas por el experto en la materia para oligonucleótidos más largos o más cortos, de acuerdo con los procedimientos descritos en Sambrook et al. (Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory; 3a edición, 2001).

Puede utilizarse una diversidad de sistemas de expresión para expresar el presente anticuerpo IgG. En un aspecto, dichos sistemas de expresión representan vehículos mediante los que pueden producirse las secuencias codificantes de interés y posteriormente purificarse, aunque asimismo representan células que pueden, al transfectarse transitoriamente con las secuencias codificantes de nucleótidos apropiadas, expresar un anticuerpo IgG tal como se da a conocer en la presente memoria in situ.

Se proporcionan vectores que comprenden los polinucleótidos indicados anteriormente. En una forma de realización, el vector contiene un polinucleótido codificante de una cadena pesada de un anticuerpo anti-IL-34 indicado en la presente memoria, es decir, un anticuerpo que porta una mutación en el dominio Fc. En otra forma de realización, dicho polinucleótido codifica la cadena ligera de un anticuerpo IgG indicado en la presente memoria. Se proporcionan además vectores que comprenden moléculas de polinucleótido codificantes de proteínas de fusión, anticuerpos modificados, fragmentos de anticuerpos y sondas de los mismos.

Con el fin de expresar la cadena pesada y/o ligera del anticuerpo anti-IL-34, los polinucleótidos codificantes de dichas cadenas pesada y/o ligera se insertan en vectores de expresión de manera que los genes estén ligados funcionalmente a secuencias transcripcionales y traduccionales.

Entre las secuencias "ligadas funcionalmente" se incluyen tanto secuencias de control de la expresión que son contiguas al gen de interés como secuencias de control de la expresión que actúan en trans o a distancia, controlando el gen de interés. La expresión "secuencia de control de la expresión" tal como se utiliza en la presente memoria se refiere a secuencias de polinucleótido que resultan necesarias para llevar a cabo la expresión y procesamiento de secuencias codificantes a las que se ligan. Entre las secuencias de control de la expresión se incluyen secuencias apropiadas de inicio de transcripción, terminación, promotor e intensificador; señales eficientes de procesamiento del ARN, tales como señales de corte y empalme y poliadenilación que estabilizan el ARNm citoplasmático; secuencias que potencian la eficiencia de la traducción (es decir, una secuencia de consenso de Kozak), secuencias que potencian la estabilidad de la proteína, y en caso de desearse, secuencias que potencian la secreción de proteínas. La naturaleza de dichas secuencias de control difiere según el organismo huésped; en procariotas, entre dichas secuencias de control generalmente se incluyen promotor, sitio de unión ribosómica y secuencia de terminación de la transcripción; en eucariotas, generalmente entre dichas secuencias de control se incluyen promotores y secuencia de terminación de la transcripción. La expresión "secuencias de control" pretenden incluir, como mínimo, todos los componentes cuya presencia resulta esencial para la expresión y procesamiento, y entre ellos asimismo pueden incluirse componentes cuya presencia resulta ventajosa, por ejemplo secuencias líder y secuencias de pareja de fusión.

El término “vector”, tal como se utiliza en la presente memoria, se refiere a una molécula de ácidos nucleicos capaz de transportar otro ácido nucleico al que se encuentra unido. Un tipo de vector es un "plásmido", un bucle de ADN circular de doble cadena en el que pueden ligarse segmentos adicionales de ADN. Otro tipo de vector es un vector vírico, siendo posible ligar segmentos adicionales de ADN en el genoma vírico. Determinados vectores son capaces de replicación autónoma en una célula hospedadora en la que han sido introducidos (por ejemplo, vectores bacterianos con un origen de replicación bacteriano y vectores de mamífero episómicos). Otros vectores (por ejemplo, vectores de mamífero no episómicos) pueden integrarse en el genoma de una célula hospedadora tras la introducción en la célula hospedadora, y replicarse de esta manera junto con el genoma del huésped.

Determinados vectores son capaces de dirigir la expresión de genes a los que se encuentran ligados funcionalmente. Dichos vectores se denominan en la presente memoria "vectores de expresión recombinantes" (o simplemente, "vectores de expresión"). En general, los vectores de expresión útiles en las técnicas de ADN recombinante se encuentran en forma de plásmidos. En la presente memoria, "plásmido" y "vector" pueden utilizarse intercambiablemente, ya que el plásmido es la forma de vector que se utiliza más comúnmente. Sin embargo, el "vector" incluye dichas formas de vectores de expresión, tales como plásmidos bacterianos, YAC, cósmidos, retrovirus, episomas derivados de VEB, y todos los demás vectores que el experto en la materia conocerá que resultan convenientes para garantizar la expresión de las cadenas pesada y/o ligera de los presentes anticuerpos. El experto en la materia conocerá que los polinucleótidos codificantes de las cadenas pesada y ligera pueden clonarse en diferentes vectores o en el mismo vector. En una forma de realización preferida, dichos polinucleótidos se clonan en dos vectores.

Los polinucleótidos indicados en la presente memoria y vectores que comprenden dichas moléculas pueden utilizarse para la transformación de una célula hospedadora adecuada. La expresión "célula hospedadora", tal como se utiliza en la presente memoria, pretende referirse a una célula en la que se ha introducido un vector de expresión recombinante a fin de expresar el presente anticuerpo IgG. Debe entenderse que dichos términos pretenden referirse no sólo a la célula objetivo particular, sino asimismo a la progenie de dicha célula. Debido a que pueden producirse determinadas modificaciones en generaciones sucesivas debido a mutación o influencias ambientales, dicha progenie puede, de hecho, no ser idéntica a la célula parental, aunque todavía estar incluida dentro del alcance de la expresión "célula hospedadora" tal como se utiliza en la presente memoria.

La transformación puede llevarse a cabo mediante cualquier método conocido de introducción de polinucleótidos en una célula hospedadora. Dichos métodos son bien conocidos por el experto en la materia y entre ellos se incluyen la transformación mediada por dextrano, la precipitación con fosfato cálcico, la transfección mediada por polibreno, la fusión de protoplastos, la electroporación, el encapsulado del polinucleótido en liposomas, la inyección biolística y la microinyección dirigida de ADN en núcleos.

La célula hospedadora puede cotransfectarse con dos o más vectores de expresión, incluyendo el vector que expresa la presente proteína. Por ejemplo, una célula hospedadora puede transfectarse con un primer vector codificante de un anticuerpo IgG, tal como se ha indicado anteriormente, y un segundo vector codificante de un polipéptido glucosiltransferasa. Alternativamente, la célula hospedadora puede transformarse con un primer vector codificante de un anticuerpo indicado en la presente memoria, un segundo vector codificante de una glucosiltransferasa, tal como se ha indicado anteriormente, y un tercer vector codificante de otra glucosiltransferasa. Las células de mamífero se utilizan comúnmente para la expresión de inmunoglobulinas terapéuticas recombinantes, especialmente para la expresión de anticuerpos anti-IL-34 recombinantes completos. Por ejemplo, células de mamífero, tales como células HEK293 o CHO, junto con un vector, que contienen la señal de expresión, tal como una portadora del elemento promotor génico temprano intermedio mayor de citomegalovirus humanos, son un sistema eficaz para expresar el anticuerpo IgG indicado en la presente memoria (Foecking et al., Gene 45:101, 1986; Cockett et al., Bio/Technology 8:2, 1990).

Además, se seleccionó una célula hospedadora que modula la expresión de las secuencias insertadas, o modifica y procesa el producto génico en el modo específico deseado. Dichas modificaciones (por ejemplo, la glucosilación) y el procesamiento de productos proteicos pueden resultar importantes para la función de la proteína. Diferentes células hospedadoras presentan características y mecanismos específicos para el procesamiento y modificación postraduccionales de proteínas y productos génicos. Se seleccionan líneas celulares o sistemas huésped apropiados para garantizar la modificación y procesamiento correctos del anticuerpo expresado de interés. Por lo tanto, pueden utilizarse células hospedadoras eucarióticas que poseen la maquinaria celular para el procesamiento correcto del transcrito primario, la glucosilación del producto génico. Entre dichas células hospedadoras de mamífero se incluyen, aunque sin limitarse a ellas, CHO, COS, HEK293, NS/0, BHK, Y2/0, 3t 3 o células de mieloma (la totalidad de dichas líneas celulares se encuentra disponible de depósitos públicos, tales como la Collection Nationale des Cultures de Microorganismes, Paris, Francia, o la American Type Culture Collection, Manassas, VA, EE.UU.).

Para la producción de alto rendimiento a largo plazo de proteínas recombinantes, resulta preferida la expresión estable. En una forma de realización, pueden construirse líneas celulares que expresan establemente el anticuerpo. En lugar de utilizar vectores de expresión que contienen orígenes víricos de replicación, se transforman células hospedadoras con ADN bajo el control de los elementos reguladores de la expresión apropiados, incluyendo promotores, intensificadores, terminadores de transcripción, sitios de poliadenilación y otras secuencias apropiadas conocidas por el experto en la materia, y un marcador seleccionable. Tras la introducción del ADN foráneo, las células manipuladas pueden dejarse en cultivo durante uno a dos días en un medio enriquecido, y después pasarse a un medio selectivo. El marcador seleccionable en el plásmido recombinante confiere resistencia a la selección y permite que las células integren establemente el plásmido en un cromosoma y se expandan en una línea celular. Se conocen de la técnica otros métodos para construir líneas celulares estables. En particular, se han desarrollado métodos para la integración específica de sitio. Según dichos métodos, el ADN transformado bajo el control de los elementos reguladores de la expresión apropiados, incluyendo promotores, intensificadores, terminadores de transcripción, sitios de poliadenilación y otras secuencias apropiadas, se integra en el genoma de la célula hospedadora en un sitio diana específico que ha sido previamente cortado (Moele et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 104(9): 3055-3060; patentes US n° 5.792.632, n° 5.830.729, n° 6.238.924, documento WO 2009/054985, WO 03/025183 y WO 2004/067753).

Existen varios sistemas de selección que pueden utilizarse, incluyendo, aunque sin limitación, la selección de genes de timidina cinasa del virus herpes simplex (Wigler et al., Cell 11:223, 1977), de hipoxantina-guanina fosforibosiltransferasa (Szybalska y Szybalski, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 48: 202, 1992), de glutamato sintasa (Adv. Drug Del. Rev., 58: 671, 2006, y el sitio web o literatura de Lonza Group Ltd.) y de adenina fosforibosiltransferasa (Lowy et al., Cell 22: 817, 1980) en células tk, hgprt o aprt, respectivamente. Además, puede utilizarse una resistencia antimetabolito como base de selección para los genes dhfr, que proporciona resistencia al metotrexato (Wigler et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77: 357, 1980); gpt, que confiere resistencia al ácido micofenólico (Mulligan et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78: 2072, 1981); neo, que confiere resistencia al aminoglucósido, G-418 (Wu et al., Biotherapy 3: 87, 1991), e hygro, que confiere resistencia a la higromicina (Santerre et al., Gene 30: 147, 1984). Pueden aplicarse rutinariamente métodos conocidos de la técnica de ADN recombinante para seleccionar el clon recombinante deseado, y dichos métodos se describen en, por ejemplo, Ausubel et al., eds., Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons (1993). Los niveles de expresión de un anticuerpo pueden incrementarse mediante amplificación del vector. En el caso de que un marcador en el sistema de vector que expresa un anticuerpo sea amplificable, un incremento del nivel de inhibidor presente en el cultivo incrementará el número de copias del gen marcador. Debido a que la región amplificada está asociada al gen codificante del anticuerpo IgG, la producción de anticuerpo asimismo se incrementará (Crouse et al., Mol. Cell Biol. 3: 257, 1983). Existen métodos alternativos de expresión del gen de interés y son conocidos por el experto en la materia. Por ejemplo, puede construirse una proteína de dedo de cinc modificada que sea capaz de unirse a los elementos reguladores de la expresión cadena arriba del gen de interés; la expresión de dicha proteína dedo de cinc (ZFN) manipulada en la célula hospedadora conduce a incrementos en la producción de proteína (ver, por ejemplo, Reik et al., Biotechnol. Bioeng., 97(5), 1180-1189, 2006). Además, ZFN puede estimular la integración de un ADN en una localización genómica predeterminada, resultando en la adición génica específica de sitio de alta eficiencia (Moehle et al, PNAS 104, pp 3055, 2007).

El anticuerpo puede prepararse mediante el cultivo de las células hospedadoras transformadas bajo condiciones de cultivo necesarias para expresar el anticuerpo deseado. El anticuerpo expresado resultante a continuación puede purificarse a partir del medio de cultivo o extractos celulares. Pueden recuperarse formas solubles del anticuerpo a partir del sobrenadante de cultivo. A continuación, puede purificarse mediante cualquier método conocido de la técnica para la purificación de una molécula de inmunoglobulina, por ejemplo mediante cromatografía (por ejemplo, de intercambio iónico, de afinidad, particularmente de afinidad de proteína A para Fc, y similares), centrifugación, solubilidad diferencial o mediante cualquier otra técnica estándar de purificación de proteínas. Los métodos adecuados de purificación resultarán evidentes para el experto ordinario en la materia.

De esta manera, otro aspecto se refiere a un método para la producción de un anticuerpo dado a conocer en la presente memoria, o fragmentos de unión a antígeno del mismo, caracterizado por que dicho método comprende las etapas siguientes:

a) cultivar una célula hospedadora indicada en la presente memoria en un medio de cultivo apropiado, y b) recuperar dicho anticuerpo.

Tal como se ha indicado anteriormente, los presentes anticuerpos se unen específicamente a IL-34 con una afinidad muy elevada. Además, son capaces de inhibir la proliferación celular mediada por IL-34 y la transducción de señales intracelulares. Por lo tanto, los presentes anticuerpos resultan particularmente ventajosos para la prevención y/o el tratamiento de diversas enfermedades que implican I-34, ya que pueden evitar la activación no deseada de rutas de señalización celular dependientes de IL-34. Además, debido a que dichos anticuerpos son capaces de unirse a IL-34 con una afinidad muy elevada antes y/o después de la unión de IL-34 a su receptor, se incrementa la eficiencia terapéutica de dichos anticuerpos.

Tal como se utilizan en la presente memoria, los términos "trata", "tratando", "tratamiento" y similares se refieren a reducir o mejorar los síntomas de un trastorno (por ejemplo, un trastorno relacionado con IL-34) y/o los síntomas asociados al mismo. Se apreciará que, aunque no de manera exclusiva, el tratamiento de un trastorno o condición no requiere que el trastorno, afección o síntomas asociados al mismo sean completamente eliminados.

Tal como se utiliza en la presente memoria, "que trata" una enfermedad en un sujeto o "que trata" un sujeto que presenta una enfermedad se refiere a someter al sujeto a un tratamiento farmacéutico, por ejemplo, la administración de un fármaco, de manera que se reduce o se evita la extensión de la enfermedad. Por ejemplo, el tratamiento resulta en la reducción de por lo menos un signo o síntoma de la enfermedad o afección. El tratamiento incluye (aunque sin limitación) la administración de una composición, tal como una composición farmacéutica, y puede llevarse a cabo profilácticamente o después del inicio de un suceso patológico. El tratamiento puede requerir la administración de un agente y/o tratamiento en más de una ocasión.

Un "sujeto" que puede someterse a dicho tratamiento indicado en la presente memoria puede ser cualquier animal mamífero, incluyendo el ser humano, el perro, el gato, la vaca, la cabra, el cerdo adulto, el cerdo joven, la oveja y el mono. Un sujeto humano puede conocerse como un paciente. En una forma de realización, "sujeto" o "paciente" se refiere a un mamífero afectado por un trastorno caracterizado por la activación inapropiada de la ruta de señalización de IL-34, por ejemplo, mediante hiperactivación o desregulación. Un "sujeto de control" se refiere a un mamífero en el que la ruta de señalización de I-34 se encuentra correctamente activada y regulada.

En otro aspecto, se proporciona una composición farmacéutica que comprende un anticuerpo dado a conocer en la presente memoria, o fragmentos de unión a antígeno del mismo. Preferentemente, la composición farmacéutica puede contener, además de dicho anticuerpo, diversos diluyentes, agentes de carga, sales, tampones, estabilizadores, solubilizadores y otros materiales bien conocidos en la materia.

Tal como se utiliza en la presente memoria, la expresión “portador farmacéuticamente aceptable” incluye cualquiera y la totalidad de los solventes, tampones, soluciones salinas, medios de dispersión, recubrimientos, agentes antibacterianos y antifúngicos, agentes isotónicos y de retraso de la absorción y similares que sean fisiológicamente compatibles. El tipo de portador puede seleccionarse basándose en la vía de administración pretendida. En diversas formas de realización, el portador resulta adecuado para la administración intravenosa, intraperitoneal, subcutánea, intramuscular, tópica, transdérmica u oral. Entre los portadores farmacéuticamente aceptables se incluyen soluciones o dispersiones acuosas estériles y polvos estériles para la preparación de soluciones o dispersiones inyectables estériles. La utilización de medios y agentes para sustancias farmacéuticamente activas es bien conocida en la materia. Puede prepararse una composición farmacéutica típica para la infusión intravenosa para que contenga 250 ml de solución de Ringer estéril y 100 mg de la combinación. Los métodos reales de preparación de compuestos parenteralmente administrables serán conocidos o resultarán evidentes para el experto en la materia y se describen con mayor detalle en, por ejemplo, Remington's Pharmaceutical Science, 17a ed., Mack Publishing Company, Easton, Pa. (1985), y las ediciones 18° y 19° de la misma, que se incorporan como referencia en la presente memoria.

El anticuerpo anti-IL-34 en la composición preferentemente se formula en una cantidad eficaz. Una "cantidad eficaz" se refiere a una cantidad eficaz, a las dosis y durante periodos de tiempo necesarios, para conseguir el resultado deseado, tal como la prevención o el tratamiento de la formación de placas amiloides. Una "cantidad terapéuticamente eficaz" se refiere a una cantidad suficiente para influir sobre el curso terapéutico de un estado de enfermedad particular. Una cantidad terapéuticamente eficaz asimismo es una en la que cualesquiera efectos tóxicos o perjudiciales del agente resultan superados por los efectos terapéuticamente beneficiosos.

Para las aplicaciones terapéuticas, el anticuerpo anti-IL-34 se administra en un mamífero, preferentemente un ser humano, en una forma de dosis farmacéuticamente aceptable, tal como las comentadas anteriormente, incluyendo las que pueden administrarse en el ser humano por vía intravenosa en forma de un bolo o mediante infusión continua durante un periodo de tiempo, por las vías intramuscular, intraperitoneal, intracerebroespinal, subcutánea, intraarticular, intrasinovial, intratecal, oral, tópica o por inhalación.

Los regímenes de dosis pueden ajustarse para proporcionar la respuesta óptima. Por ejemplo, puede administrarse un único bolo, pueden administrarse varias dosis divididas durante el tiempo o la dosis puede reducirse o incrementarse proporcionalmente. Las composiciones pueden administrarse en el sujeto para producir actividad de crecimiento celular en el sujeto. Tal como se utiliza en la presente memoria, el término "sujeto" pretende incluir organismos vivos en los que puede inducirse apoptosis, y específicamente incluye mamíferos, tales como conejos, perros, gatos, ratones, ratas, especies de mono transgénicas y, preferentemente, seres humanos.

Se entiende que las vías de administración, programas de administración y formas galénicas óptimas pueden determinarse según los criterios generalmente considerados en el establecimiento de un tratamiento adaptado al paciente, tales como, por ejemplo, la edad o el peso corporal del paciente, la gravedad de su estado general, la tolerancia al tratamiento y los efectos secundarios experimentados.

Los anticuerpos indicados en la presente memoria resultan particularmente útiles para tratar los trastornos relacionados con IL-34. Tal como se utiliza en la presente memoria, "trastornos relacionados con IL-34" se refiere a afecciones o enfermedades que resultan de la activación no deseada de la ruta de señalización de IL-34. Entre dichas afecciones se incluyen, por ejemplo, enfermedades inflamatorias, cáncer, enfermedades óseas, enfermedades de la piel, enfermedades metabólicas, enfermedades cerebrales y enfermedades hepáticas, entre otras.

Otro aspecto se refiere al anticuerpo anti-IL-34, o fragmentos de unión a antígeno del mismo, para la utilización como medicamento.

Se refiere además a la composición farmacéutica indicada en la presente memoria para la utilización como un medicamento.

Otra forma de realización se refiere a la utilización de un anticuerpo o de una composición farmacéutica indicada en la presente memoria para la preparación de un fármaco y/o un medicamento para la prevención o el tratamiento de enfermedades mediadas por IL-34 y/o que implican la señalización inducida por IL-34.

Según un aspecto particular, dicho anticuerpo o un fragmento de unión a antígeno del mismo, o composición farmacéutica, son para la utilización en la prevención y/o en el tratamiento de enfermedades seleccionadas de entre el listado que contiene enfermedades inflamatorias, cáncer, enfermedades óseas, enfermedades de la piel, enfermedades metabólicas, enfermedades cerebrales, enfermedades hepáticas, y enfermedades autoinmunitarias.

En particular, los anticuerpos anti-IL-34 pueden utilizarse para la prevención o el tratamiento de cualquier trastorno que implique inflamación, sea aguda o crónica. Además, debido a la relación entre el intestino y el sistema inmunitario globalmente, los presentes objetos pueden utilizarse para la prevención o tratamiento de inflamación local (es decir, inflamación de un tejido específico o de un grupo de tejidos) o de la inflamación sistémica.

Debido a que la inflamación sistémica crónica se ha correlacionado con varias enfermedades no inmunitarias, tales como enfermedades metabólicas, los presentes objetos asimismo resultan útiles en la prevención o el tratamiento de enfermedades habitualmente consideradas "no inmunitarias". Los anticuerpos dados a conocer en la presente memoria pueden utilizarse para tratar la inflamación sistémica crónica, asimismo denominada inflamación sistémica de grado bajo, a fin de evitar dichas enfermedades. La expresión "inflamación crónica de grado bajo" debe entenderse en su sentido general en el campo, es decir, se refiere a un estado caracterizado por un incremento de dos a tres veces de las concentraciones sistémicas de citocinas, tales como TNF-a, IL-6, y CRP, comparado con los niveles en un control sano.

Tal como se utiliza en la presente memoria, "enfermedad inflamatoria" preferentemente se refiere a pancreatitis aguda, ELA, enfermedad de Alzheimer, caquexia/anorexia, asma, ateroesclerosis, síndrome de fatiga crónica, fiebre, diabetes (por ejemplo, diabetes de insulina), glomerulonefritis, rechazo del injerto contra el huésped, choque hemorrágico, hiperalgesia, enfermedades intestinales inflamatorias, condiciones inflamatorias de una articulación, incluyendo osteoartritis, artritis soriática y artritis reumatoide, lesión isquémica, incluyendo isquemia cerebral (por ejemplo, lesión cerebral como resultado de un traumatismo, epilepsia, hemorragia o ictus, cada una de las cuales puede conducir a neurodegeneración), enfermedades pulmonares (por ejemplo, SDRA), mieloma múltiple, esclerosis múltiple, leucemia mielógena (por ejemplo, LMA y LMC) y otras leucemias, miopatías (por ejemplo, metabolismo de proteínas musculares, especialmente en la sepsis), osteoporosis, enfermedad de Parkinson, dolor, parto pretérmino, soriasis, lesión por reperfusión, choque séptico, efectos secundarios de la terapia de radiación, enfermedad articular mandibular temporal, metástasis tumoral o una afección inflamatoria que resulta de esfuerzos, esguince, daño articular, traumatismo, cirugía ortopédica, infección y otros procesos patológicos.

En una forma de realización particular, dicha enfermedad inflamatoria se selecciona de entre las enfermedades intestinales inflamatorias. Las enfermedades intestinales inflamatorias comprenden la enfermedad de Crohn, la colitis ulcerosa, la diverticulitis y la colitis infecciosa.

En una forma de realización particular, dicha enfermedad inflamatoria se selecciona de entre artritis reumatoide, osteoartritis y otras afecciones inflamatorias que resultan de esfuerzos, esguinces, traumatismo, infección, daño articular o cirugía ortopédica.

En una forma de realización particular, dicha enfermedad inflamatoria se selecciona de entre enfermedad articular inflamatoria, esclerosis múltiple, leucemia, lesión isquémica o daño por reperfusión.

El anticuerpo dado a conocer en la presente memoria asimismo puede utilizarse para tratar afecciones médicas que presentan un componente inflamatorio, tales como, por ejemplo, nefritis, enfermedades de la piel, tales como soriasis, eccema, dermatitis alérgica y reacciones de hipersensibilidad, y enfermedades del sistema nervioso central, tales como la enfermedad de Alzheimer, la meningitis, la esclerosis múltiple y el SIDA y la demencia.

Los presentes objetos pueden utilizarse además en el tratamiento o la prevención de enfermedades no inmunitarias con orígenes etiológicos en procesos inflamatorios, tales como cáncer, ateroesclerosis y enfermedad cardiaca isquémica.

Según una forma de realización preferida, el anticuerpo anti-IL-34, o fragmento de unión a antígeno del mismo, puede utilizarse para el tratamiento o la prevención de enfermedades seleccionadas de entre el listado que consiste en poliartritis reumatoide, periodontitis, osteoporosis, osteólisis periprostética, síndrome de Gougerot-Sjogren, ateroesclerosis, artritis, patologías e la piel inflamatorias y autoinmunitarias, enfermedades intestinales inflamatorias (tales como enfermedad de Crohn, colitis ulcerosa, diverticulitis y colitis infecciosa), enfermedad de Alzheimer y trastornos neurodegenerativos, fibrosis hepática, tal como, por ejemplo, esteatohepatitis no alcohólica (EANH), esteatohepatitis alcohólica, fibrosis hepática inducida por virus, esteatohepatitis inducida por fármaco y fibrosis pulmonar intersticial, tal como, por ejemplo, fibrosis asociada a sustancias inhaladas, fibrosis inducida por fármaco, fibrosis autoinmunitaria, fibrosis infecciosa y fibrosis pulmonar idiopática.

Tal como se utiliza en la presente memoria, los términos “cáncer” y “canceroso” se refieren o describen la afección fisiológica en mamíferos que se caracteriza típicamente por el crecimiento celular no regulado. Los términos "cáncer" y "canceroso" tal como se utilizan en la presente memoria pretenden comprender todas las etapas de la enfermedad. De esta manera, un "cáncer" tal como se utiliza en la presente memoria puede incluir tumores tanto benignos como malignos.

En una forma de realización, el cáncer bajo tratamiento es osteólisis, sarcomas óseos (osteosarcoma, sarcoma de Ewing, tumores de células gigantes del hueso), metástasis óseas, glioblastoma y cánceres cerebrales, cáncer pulmonar, neuroma acústico, leucemia aguda, leucemia linfocítica aguda, leucemia mielocítica aguda (monocítica, mieloblástica, adenocarcinoma, angiosarcoma, astrocitoma, mielomonocítico y promielocitico), leucemia de células T aguda, carcinoma de células basales, carcinoma de conducto bililar, cáncer de vejiga, cáncer de mama, carcinoma broncogénico, cáncer cervical, condrosarcoma, cordoma, coriocarcinoma, leucemia crónica, leucemia linfocítica crónica, leucemia mielocítica (granulocítica) crónica, leucemia mielógena crónica, cáncer de colon, cáncer colorrectal, craniofaringioma, cistadenocarcinoma, linfoma de células B grandes difusas, cambios disproliferativos (displasias y metaplasias), carcinoma embrionario, cáncer endometrial, endoteliosarcoma, ependimoma, carcinoma epitelial, eritroleucemia, cáncer esofágico, cáncer de mama positivo para receptores de estrógenos, trombocitemia esencial, fibrosarcoma, linfoma folicular, cáncer testicular de células germinales, glioma, enfermedad de cadena pesada, hemanglioblastoma, hepatoma, cáncer hepatocelular, cáncer de próstata insensible a hormonas, leiomiosarcoma, liposarcoma, cáncer pulmonar, linfagioendoteliosarcoma, linfagiosarcoma, leucemia linfoblástica, linfoma (de Hodgkin y no de Hodgkin), neoplasias malignas y trastornos hiperproliferativos de la vejiga, mama, colon, pulmón, ovarios, páncreas, próstata, piel y útero, neoplasias malignas linfoides de origen en células T o células B, leucemia, linfoma, carcinoma medular, meduloblastoma, melanoma, meningioma, mesotelioma, mieloma múltiple, leucemia mielógena, mieloma, mixosarcoma, neuroblastoma, cáncer pulmonar de células no pequeñas, oligodendroglioma, cáncer oral, sarcoma osteogénica, cáncer ovárico, cáncer pancreático, adenocarcinomas papilares, carcinoma papilar, pinealoma, policitemia vera, cáncer próstata, cáncer rectal, carcinoma de células renales, retinoblastoma, rabdomiosarcoma, sarcoma, carcinoma de glándulas sebáceas, seminoma, cáncer de piel, carcinoma pulmonar de células pequeñas, tumores sólidos (carcinomas y sarcomas), cáncer pulmonar de células pequeñas, cáncer de estómago, carcinoma de células escamosas, sinovioma, carcinoma de glándulas sudoríparas, cáncer de tiroides, macroglobulinemia de Waldenstrom, tumores testiculares, cáncer uterino y tumor de Wilms.

Según una forma de realización preferida, el anticuerpo anti-IL-34 indicado en la presente memoria resulta útil para tratar enfermedades seleccionadas de entre el listado que consiste en osteólisis tumoral, sarcomas óseos (osteosarcoma, sarcoma de Ewing, tumores de células gigantes del hueso), metástasis ósea, glioblastoma y cánceres cerebrales, y cáncer pulmonar.

La eficacia del anticuerpo anti-IL-34 indicado en la presente memoria en la prevención o el tratamiento de una enfermedad puede mejorarse mediante la administración de dicho anticuerpo en serie o en combinación con otro agente que resulta eficaz para dichos fines, tales como el factor de necrosis tumoral (TNF), un antagonista capaz de inhibir o neutralizar la actividad angiógena del factor de crecimiento fibroblástico (FGF) ácido o básico, el factor de crecimiento derivado de plaquetas (PDGF) o el factor de crecimiento de hepatocitos (HGF), un antagonista capaz de inhibir o neutralizar las actividades coagulantes del factor tisular, proteína C o proteína S (ver el documento WO 91/01753), un antagonista, tal como un anticuerpo capaz de unirse al receptor de HER2 (ver la patente US n° 5.772.997), o uno o más agentes terapéuticos convencionales, tales como, por ejemplo, agentes alquilantes, antagonistas del ácido fólico, antimetabolitos del metabolismo de los ácidos nucleicos, antibióticos, análogos de pirimidina, 5-fluorouracilo, cisplatino, nucleósidos de purina, aminas, aminoácidos, nucleósidos de triazol o corticoesteroides.

En otro aspecto, la administración se combina con una administración de cantidad terapéuticamente eficaz de agente quimioterápico, tal como, por ejemplo, taxol (paclitaxel) o taxotere (docetaxel).

Entre los agentes quimioterápicos se incluyen, aunque sin limitarse a ellos, agentes antimicrotúbulos, tales como diterpenoides y alcaloides vinca; complejos de coordinación con el platino; agentes alquilantes, tales como mostazas nitrogenadas, oxazafosforinas, alquilsulfonatos, nitrosoureas y triacenos; agentes antibióticos, tales como antraciclinas, actinomicinas y bleomicinas; inhibidores de la topoisomerasa II, tales como epipodofilotoxinas; antimetabolitos, tales como análogos de purina y de pirimidina y compuestos antifolato; inhibidores de la topoisomerasa I, tales como camptotecinas, hormonas y análogos de hormonas; inhibidores de la ruta de transducción de señales; inhibidores de la angiogénesis de tirosina cinasa no de receptor, agentes inmunoterapéuticos, agentes proapoptóticos e inhibidores de señalización del ciclo celular. Además, los presentes métodos pueden combinarse con otro tratamiento anticáncer, agente antiangiógeno o agente quimioterápico, o terapia de radiación. Un ejemplo preferido es docetaxel o taxotere. Entre otros ejemplos se incluyen gemcitabina, diterpenoides de cisplatino y alcaloides vinca, paclitaxel, vinblastina, vincristina y vinorelbina, carboplatino, ciclofosfamida, melfalán y clorambucilo, busulfán, carmustina, dacarbazina, ciclofosfamida, melfalán, clorambucilo, busulfán, carmustina, dacarbazina, agentes antineoplásicos, incluyendo, aunque sin limitarse a ellos, actinomicinas tales como dactinomicina; antraciclinas, tales como daunorrubicina y doxorrubicina, bleomicinas, epipodofilotoxinas, etopósido y tenipósido; agentes neoplásicos antimetabolitos, 5-fluorouracilo, metotrexato, citarabina, mercaptopurina, tioguanina, camptotecinas, HCl de irinotecán y HCl de topotecán.

Asimismo puede seleccionarse una diversidad de diferentes agentes quimioterápicos o polipéptidos anticancerosos. Entre las fuentes de información, tales como www.clinicaltrials.gov,www.ncbi.nlm.nih, y www.drugs.com, se incluyen referencias a polipéptidos y agentes que pueden seleccionarse.

Dichos otros agentes, por ejemplo, agentes antiangiógenos o agentes quimioterápicos, pueden encontrarse presentes en la composición que se administra o que pueden administrarse por separado. En un aspecto, la administración se lleva a cabo con el otro principio activo, simultánea, separada o secuencialmente durante el tiempo. En el caso de que la administración se lleve a cabo simultáneamente, los dos principios activos pueden combinarse en una única composición farmacéutica, que comprende las dos composiciones, tal como un comprimido o una cápsula de gel. Por otra parte, los dos principios activos pueden, se administren o no simultáneamente, encontrarse presentes en composiciones farmacéuticas separadas. Con este fin, la combinación puede encontrarse en forma de un kit que comprende, por una parte, el anticuerpo anti-IL-34 tal como se ha indicado anteriormente y, por otra parte, el segundo principio activo, el anticuerpo anti-IL-34 tal como se ha indicado anteriormente, y el segundo principio activo se encuentra en compartimentos separados y que está destinado a administrarse simultánea, separada o secuencialmente durante el tiempo.

La combinación indicada en la presente memoria puede administrarse especialmente para la terapia tumoral en combinación con quimioterapia, terapia de proteínas (es decir, utilizando un agente terapéutico, tal como un anticuerpo o proteína recombinante), terapia génica, radioterapia, inmunoterapia, intervención quirúrgica o una combinación de ellos. La terapia a largo plazo es igualmente posible como terapia adyuvante en el contexto de otras estrategias de tratamiento, tal como se ha indicado anteriormente.

Los anticuerpos o fragmentos de anticuerpo indicados en la presente memoria asimismo pueden utilizarse para detectar IL-34 en una muestra biológica in vitro o in vivo.

Una "muestra biológica" puede ser cualquier muestra que puede obtenerse de un sujeto. Dicha muestra debe permitir la determinación de la presencia de IL-34. La naturaleza de la muestra de esta manera puede ser dependiente de la naturaleza del trastorno. Entre las muestras biológicas preferidas de presencia de IL-34 se incluyen muestras tales como una muestra de sangre, una muestra de plasma o una muestra de linfa, en el caso de que el cáncer sea un tumor líquido. La expresión "tumor líquido" en la presente memoria se refiere a tumores de la sangre o médula ósea, es decir, neoplasias malignas hematológicas, tales como leucemia y mieloma múltiple. Preferentemente, la muestra biológica es una muestra de sangre.

Una "muestra biológica" tal como se utiliza en la presente memoria asimismo incluye una muestra de cáncer sólida del paciente que debe someterse a ensayo, en el caso de que el trastorno sea un cáncer sólido. Dicha muestra de cáncer sólida permite al experto en la materia realizar cualquier tipo de medición del nivel del biomarcador. En algunos casos, los presentes métodos pueden comprender además una etapa preliminar de obtener una muestra de cáncer sólida del paciente. La expresión "muestra de cáncer sólida" se refiere a una muestra de tejido tumoral. Incluso en un paciente canceroso, el tejido que es el sitio del tumor todavía comprende tejido sano no tumoral. La "muestra de cáncer", de esta manera, debería limitarse a tejido tumoral obtenido del paciente. Dicha "muestra de cáncer" puede ser una muestra de biopsia o una muestra obtenida de una terapia de resección quirúrgica.

En una forma de realización, los anticuerpos anti-IL-34 se utilizan para determinar el nivel de IL-34 en un tejido o en células derivadas del tejido. En una forma de realización preferida, el tejido es un tejido enfermo. En una forma de realización preferida del método, el tejido es un tumor o una biopsia del mismo. En una forma de realización preferida del método, un tejido o una biopsia del mismo en primer lugar se extrae de un paciente, y a continuación pueden determinarse los niveles de IL-34 en el tejido o biopsia en un inmunoensayo con los anticuerpos o fragmentos de anticuerpo indicados en la presente memoria. En otra forma de realización preferida, el nivel de IL-34 se determina en una muestra de un tejido o biopsia del mismo, que puede congelarse o fijarse. Puede utilizarse el mismo método para determinar otras propiedades de la proteína IL-34, tal como sus niveles en superficie celular, o su localización celular.

En un aspecto, se proporciona un método de detección de la presencia in vitro y/o de la localización de IL-34 en un sujeto, en el que dicho método comprende las etapas de:

a) poner en contacto una muestra de dicho sujeto con un anticuerpo o fragmentos de unión a antígeno del mismo tal como se ha indicado anteriormente, y

b) detectar la unión de dicho anticuerpo con la muestra.

La capacidad de utilizar los anticuerpos anti-IL-34 para detectar IL-34 en una muestra biológica in vitro o in vivo resulta ventajosa para el diagnóstico de la presencia de un trastorno relacionado con IL-34 en un paciente. El método anteriormente indicado puede utilizarse para diagnosticar un trastorno relacionado con IL-34 en un paciente, en el que el nivel de IL-34 medido en dicho paciente se compara con el de un sujeto de referencia normal o estándar. En particular, dicho método puede utilizarse para determinar si un tumor expresa IL-34, que puede sugerir que el tumor responderá bien al tratamiento con los anticuerpos, fragmentos de anticuerpos o conjugados de anticuerpos indicados en la presente memoria.

Tal como se utiliza en la presente memoria, "diagnóstico" o "identificar un sujeto que presenta" se refiere a un procedimiento para determinar si un individuo es afectado por una enfermedad o dolencia (por ejemplo, un trastorno relacionado con IL-34). Un trastorno relacionado con IL-34 se diagnostica, por ejemplo, mediante la detección de IL-34 en una muestra biológica de un paciente in vitro o in vivo.

En otro aspecto, se proporciona un método de diagnóstico de cualquiera de las enfermedades citadas en el listado que consiste en enfermedades inflamatorias, cáncer, enfermedades óseas, enfermedades de la piel, enfermedades metabólicas, enfermedades cerebrales, enfermedades hepáticas, y enfermedades autoinmunitarias en un sujeto que es conocido o que se sospecha que presenta dicha enfermedad, en el que dicho método comprende:

a) poner en contacto las células de dicho paciente con un anticuerpo o uno de sus fragmentos de unión a antígeno indicados en la presente memoria,

b) medir la unión de dicho anticuerpo o sus fragmentos de unión a antígeno a dichas células, y

c) comparar la expresión en la parte b) con la de un sujeto de referencia normal o estándar.

Se proporcionan anticuerpos monoclonales, anticuerpos quiméricos, anticuerpos humanizados y fragmentos de unión a epítopo de los mismos que se marcan adicionalmente para la utilización en investigación o aplicaciones diagnósticas. En una forma de realización preferida, se proporciona un kit, en el que dicho kit comprende por lo menos un anticuerpo, o un fragmento de unión a antígeno del mismo indicado en la presente memoria, en el que dicho anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo preferentemente se marca.

En una forma de realización preferida adicional, el marcaje es un marcaje radioactivo, un fluoróforo, un cromóforo, un agente de obtención de imágenes o un ion metálico.

Se proporciona además un método de diagnóstico en el que dichos anticuerpos marcados o fragmentos de unión a epítopo de los mismos se administran en un sujeto que se sospecha que presenta un cáncer o una enfermedad inflamatoria o autoinmunitaria, y se mide o se monitoriza la distribución del marcaje dentro del cuerpo del sujeto.

Leyendas de figura

Figura 1: análisis con un instrumento Agilent de la integridad del ARNm anti-IL-34 tras la extracción del ARN. Figura 2: sensograma tras la corrección de la referencia obtenido de las curvas de interacción de SPR para diversas concentraciones de IL-34 que muestran la interacción de IL-34 con el anticuerpo antI-IL-34.

Figura 3: sensograma tras la corrección de la referencia obtenido de las curvas de interacción de SPR para 50 nM de IL-34 y 10 nM de anti-IL-34.

Figura 4: inhibición de la proliferación/supervivencia de monocitos CD14+ humanos aislados por anticuerpos anti-IL-34.

Figura 5: inhibición de la señalización celular inducida por IL-34 por anticuerpos anti-IL-34.

Figura 6: (A) viabilidad de CD14+ humanos medida mediante la intensidad de fluorescencia y (B) inhibición de la proliferación/supervivencia de monocitos CD14+ humanos aislados por anticuerpos anti-IL-34 murinos (BT34) en comparación con anticuerpos de IL-34 recombinantes (clon de anticuerpos quiméricos rec-BT34).

Figura 7: (A) transferencia western y cuantificación mediante transferencia western, y (B) inhibición de la señalización celular inducida por IL-34 por anticuerpos anti-IL-34 murinos (clon BT34) en comparación con anticuerpos de IL-34 recombinantes (anticuerpos quiméricos clon recBT34).

Ejemplos

1. Datos de secuenciación: anticuerpos de IL-34 murinos

• Sumario del procedimiento

a) Cultivo celular

b) Extracción del ARN total

c) Transcripción inversa del ARN (cebador oligodT)

d) Amplificación de cadenas variables por PCR (diversas parejas de cebadores)

e) Clonación de los amplicones en vector lanzadera

f) Secuenciación de los insertos

g) Análisis de las secuencias

• Extracción del ARN

El análisis y resultados completos de la extracción del ARNm se muestran en la tabla 2, a continuación.

Tabla 2

El análisis de la integridad del ARNm se llevó a cabo utilizando el instrumento Agilent (ver la figura 1).

• Secuenciación de anticuerpos monoclonales a partir de B-T34

Los datos de secuenciación se analizaron en la base de datos IgBlast (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/igblast/). Las secuencias correspondientes a las cadenas variables completas del anticuerpo se presentan en el listado de secuencias adjunto.

El análisis de los datos de secuenciación muestra que dichas secuencias codificantes de los dominios variables de cadena ligera y cadena pesada son completas y funcionales.

2. Quimerización de los anticuerpos anti-IL-34

Se obtuvieron anticuerpos quiméricos anti-IL-34 mediante el protocolo siguiente: se introdujeron las secuencias de ADN codificantes de los dominios variables de las cadenas ligera y pesada mediante restricción de ligamiento en dos vectores de expresión de tipo PTT5, respectivamente, codificantes de los dominios constantes humanos de la cadena pesada (isotipo IgG1) y de la cadena ligera (isotipo Kappa), formando un vector PTT5 de cadena pesada y un vector PTT5 de cadena ligera. Tras el control de la secuencia obtenida, dichos dos vectores se amplificaron a fin de llevar a cabo su transfección en células HEK-EBNA cultivadas bajo condiciones en modo de agitación sin suero. La transfección se llevó a cabo mediante la utilización de un agente de lipofección (JET PEI) y a continuación las células se cultivaron durante una semana bajo agitación lenta. La secreción de los anticuerpos recombinantes (anticuerpos quiméricos) a continuación se monitorizó utilizando un ensayo ELISA (kit FASTELISA RD-Biotech) cada dos días después de la transfección. El cultivo celular se detuvo tras 7 días y el sobrenadante se recogió mediante centrifugación. A continuación, los anticuerpos recombinantes quiméricos se purificaron a partir del sobrenadante mediante cromatografía de afinidad en proteína A (Repligen Corp.). Los anticuerpos purificados se sometieron a ensayo mediante electroforesis de SDS-PAGE y su especificidad se controló en primer lugar mediante ELISA y después, mediante bioensayo, que permitió controlar las propiedades de anticuerpo murino originales.

3. Humanización de los anticuerpos anti-IL-34

Durante la etapa de humanización, las secuencias murinas presentes en el anticuerpo quimérico se analizaron para cada aminoácido y se compararon con los bancos de datos a fin de imitar una secuencia humana. La construcción de 5 a 10 variantes de humanización se llevó a cabo mediante neosíntesis del ADN. Tras la síntesis del ADN codificante de dichas variantes (cadena pesada humanizada y cadena ligera humanizada), las secuencias se subclonaron mediante restricción de ligamiento en vectores pTT5 indicados anteriormente. Los vectores codificantes de las diferentes variantes a continuación se transfectaron utilizando las mismas condiciones y en las mismas células indicadas anteriormente a fin de obtener las diferentes variantes de anticuerpo humanizadas, que se purificaron tal como se ha indicado anteriormente. La caracterización de dichas variantes y el análisis de su rendimiento se llevaron a cabo igual que para los anticuerpos quiméricos.

Con fines clínicos, los anticuerpos humanizados pueden producirse en células CHO.

4. Análisis de la interacción entre el anticuerpo anti-IL-34 y la proteína recombinante IL-34 y la medición de Kn. Kon

4.1. Métodos y materiales

Se utilizó el sistema BIACore™ T100 a fin de analizar la interacción entre el anticuerpo anti-IL-34 e IL-34 recombinante.

Las micromatrices siguientes: CM5 (CM-dextrano, hidrocloruro de 1-etil-3-(3-diaminopropil)carbodiimida (EDC) y N-hidroxisuccinimida (NHS) se adquirieron de GE Healthcare BIAcore y utilizaron siguiendo las instrucciones del fabricante.

Un anticuerpo policlonal antirratón se inmovilizó covalentemente sobre la superficie de la micromatriz CM5, permitiendo de esta manera capturar el anticuerpo de IL-34 como ligando. El nivel de captura de anti-IL-34 estaba comprendido entre 700 y 1000 UR (unidades de resonancia).

Se preparó un canal de control sin anti-IL-34 tal como se ha indicado anteriormente a fin de evaluar la interacción no específica sobre la superficie de la micromatriz.

Estas interacciones se llevaron a cabo a 25°C en tampón HBS-P+ (HEPES 10 mM, pH 7.4; NaCl 150 mM, P20, 0.05%) mediante la administración de diferentes concentraciones de IL-34 obtenidas mediante dilución en serie de la proteína IL-34 (Preprotech ref. 200-34, proteína completa sin péptido de señal con etiqueta de His en el extremo C-terminal).

La cinética de interacción se llevó a cabo sin regeneración entre cada administración.

La regeneración se llevó a cabo mediante la administración de 10 mM de tampón de glicina-HCl a pH=1.7, dejando disociar el anticuerpo de IL-34 respecto del anticuerpo policlonal inmovilizado.

4.2. Resultados

Se muestran los resultados obtenidos mediante los sensogramas de la figura 2. Los sensogramas se analizaron mediante un patrón matemático 1:1, permitiendo el ajuste de los valores obtenidos mostrados en la tabla 3, a continuación.

Tabla 3

Los sensogramas obtenidos mostraban una asociación lenta entre IL-34 y el anticuerpo anti-IL-34 BT34 (Ka era de aproximadamente 3x104M'1S'1) y una disociación muy lenta (Kd<10'6s'1).

De esta manera, estos resultados demuestran claramente que la interacción entre IL-34 y el anticuerpo anti-IL-34 es muy estable y, en consecuencia, que la actividad de unión es muy elevada.

Además, la disociación obtenida durante la interacción de IL-34 y el anticuerpo anti-IL-34 era tan débil que resultó imposible determinarla mediante las herramientas actualmente utilizadas.

5. Inmovilización del receptor

5.1. Métodos y materiales

La medición de resonancia del plasmón superficial (SPR) se llevó a cabo en un BIACore T100. Las micromatrices CM5 (CM-dextrano, hidrocloruro de 1-etil-3-(3-diaminopropil)carbodiimida (EDC) y N-hidroxisuccinimida (NHS) se adquirieron de GE Healthcare BIAcore y se utilizaron siguiendo las instrucciones del fabricante.

El ligando, receptor de M-CSF (R&D-Systems, ref. 329-MR) se inmovilizó covalentemente sobre la superficie de la micromatriz CM5. El nivel de captura de anti-IL-34 estaba comprendido entre 600 y 800 UR.

Se preparó un canal de control sin proteína tal como se ha indicado anteriormente a fin de evaluar la interacción no específica sobre la superficie de la micromatriz.

Estas interacciones se llevaron a cabo a 25°C en tampón HBS-P+ (HEPES 10 mM, pH 7.4; NaCl 150 mM, P20, 0.05).

La micromatriz se regeneró antes de cada interacción.

5.2. Resultados

• Control positivo: Interacción IL-34/M-CSF-R

Se administraron diferentes concentraciones (10 nM, 20 nM y 50 nM) de proteína IL-34 sobre la superficie de la micromatriz que comprendía el receptor inmovilizado M-CSF-R.

Se observó una señal de interacción de aproximadamente 20 UR con sólo 50 nM de IL-34.

Durante los ensayos anteriormente realizados (captura de receptor sobre la superficie de la micromatriz) para el nivel más bajo de inmovilización (aproximadamente 100-200 UR), se observó la señal de interacción tras la administración de 20 nM de IL-34.

Los resultados anteriores muestran que existen varios tipos de receptor inmovilizados sobre la superficie de la micromatriz.

Tal como se ha indicado anteriormente, la regeneración de la micromatriz resultó difícil debido a que la inmovilización de los receptores sobre la superficie de la micromatriz es débil.

De esta manera, resultó difícil evaluar IL-34/anticuerpo anti-IL-34 con concentraciones crecientes del anticuerpo. Con este fin, a fin de llevar a cabo los ensayos sin errores, se llevaron a cabo nuevas micromatrices tal como se ha indicado anteriormente, para cada concentración evaluada del anticuerpo anti-IL-34 BT34.

• Control negativo

Se inyectaron 10 nM del anticuerpo anti-IL-34 sobre la superficie de la micromatriz. No se observó ninguna señal, mostrando que no había interacción entre el anticuerpo anti-IL-34 y el receptor M-CSF-R.

• Ensayo de inhibición

Se llevó a cabo el ensayo de inhibición a fin de medir la señal emitida durante la interacción entre IL-34 y M-CSF-R.

Se incubó la proteína IL-34 con una gran cantidad del anticuerpo anti-IL-34 BT34 (50 nM/1 j M). Bajo dichas condiciones experimentales no se observó ninguna señal. Lo anterior indica que, en presencia de concentraciones elevadas del anticuerpo anti-IL-34, la proteína IL-34 no interactúa con su receptor.

Después, se inyectaron 50 nM de la proteína IL-34 sobre la superficie de la micromatriz.

Tal como se muestra en la figura 3, el sensograma obtenido (aproximadamente 30 UR) muestra que la interacción entre IL-34 y su receptor es estable.

Después, se inyectaron 10 nM del anticuerpo anti-IL-34 y se observó una señal que mostraba la interacción entre IL-34 y el anticuerpo anti-IL-34 (figura 3).

Estos ensayos demuestran que IL-34 interactúa con su receptor M-CSF-R sobre la superficie de la micromatriz. Aunque el anticuerpo es capa de interactuar con IL-34 cuando se encuentra unido a su receptor, la interacción entre IL-34 y su receptor resulta inhibida cuando el anticuerpo anti-IL-34 se incuba con IL-34 antes de la interacción de esta proteína con su receptor.

De esta manera, estos datos demuestran que el epítopo del anticuerpo anti-IL-34 es diferente del sitio de interacción entre IL-34 y su receptor, y que el efecto inhibidor se debe a la configuración estérica del complejo de proteína/anticuerpo.

En consecuencia, se demostró que los anticuerpos indicados en la presente memoria son capaces de unirse a la citocina IL-34, incluso cuando este se encuentra unido a su receptor, lo que permite incrementar la eficiencia terapéutica de estos anticuerpos.

6. Efecto inhibidor de los anticuerpos anti-IL-34 murinos sobre la proliferación celular

6.1. Materiales y métodos:

• Aislamiento de monocitos CD14+ humanos y análisis de la proliferación celular

Se aislaron inicialmente monocitos CD14+ humanos a partir de donantes de sangre periférica humana proporcionados por el instituto del banco de sangre francés (Etablissement Frangais du Sang, Nantes, Francia, número de autorización: NTS 2000-24), mediante la utilización de microperlas MACS (MiltenyiBiotec, Alemania). Las células se cultivaron en presencia de 25 ng/ml o 50 ng/ml de IL-34 con o sin concentraciones crecientes de anticuerpos anti-IL-34. Se determinaron los efectos de los tratamientos sobre la supervivencia/proliferación de CD34+ mediante la medición de la actividad metabólica utilizando un ensayo Alamar Blue®. Se introdujeron cuarenta mil células en cada pocillo de placas de 96 pocillos con a-MEM y los tratamientos correspondientes. Tras 3 días, se añadió el reactivo Alamar blue® y se leyó la fluorescencia producida en el intervalo lineal (excitación: 530 nm/emisión: 600 nm).

6.2. Resultados

Con el fin de someter a ensayo si el anticuerpo murino anti-IL-34 (clon BT34) es capaz de inhibir la proliferación celular dependiente de IL-34, se añadieron cantidades crecientes del anticuerpo a monocitos estimulados con IL-34. Tal como se muestra en la figura 4, dicho anticuerpo a una concentración de aproximadamente 5 jg/m l era capaz de evitar la proliferación de aproximadamente 70% de las células CD14+. Se observó el mismo nivel de inhibición con concentraciones más elevadas de anticuerpo. En contraste, otros anticuerpos de IL-34 (20D1 y 26D9) no consiguieron proporcionar un efecto tan potente. Finalmente, un tercer anticuerpo de control anti-IL-34 impidió la proliferación de aproximadamente 70% de los monocitos a una concentración baja (aproximadamente 5 jg/ml). Sin embargo, el porcentaje de inhibición se redujo al utilizar concentraciones más altas de anticuerpo, planteando dudas sobre la utilidad de dicho anticuerpo. Por otra parte, BT34 condujo al mismo nivel de inhibición, con independencia de si se utilizaban 5 o 25 jg/ml.

De esta manera, el anticuerpo anti-IL-34 B534 puede utilizarse con éxito para prevenir y/o tratar enfermedades proliferativas, tales como el cáncer.

7. Efecto inhibidor de los anticuerpos anti-IL-34 murinos sobre la señalización celular

7.1. Materiales y métodos

• Análisis de transferencia Western

Las células que expresan M-CSFR tratadas o no con 50 ng/ml de IL-34 humano con o sin 2 mg/ml de anticuerpos anti-IL-34 (clones 1d 8, 2E8, BT34, 10E5, 17G6, 20D1, 26D9 y 28B7) durante 10 minutos, se recogieron en un tampón RIPA (Tris 10 mM, pH 8, EDTA 1 mM, NaCl 150 mM, NP40 al 1%, SDS al 0.1% que contiene un cóctel de proteasa e inhibidores de fosfatasa: ortovanadato sódico (Na²VO⁴) 1 mM, fluoruro de fenilmetilsulfonilo (PMSF) 1 mM, fluoruro sódico (NaF) 10 mM, N-etilmaleimida (NEM) 10 mM, leupeptina 2 pg/ml y pepstatina 1 pg/ml). Se determinó la concentración de proteína utilizando un ensayo de proteína BCA (ácido bicinchonínico) (Sigma Aldrich). Se prepararon 40 pg de extractos de proteínas totales en un tampón de Laemmli (Tris-HCl 62.5 mM, pH 6.8, SDS al 2%, glicerol al 10%, 2-mercaptoetanol al 5% y azul de bromofenol al 0.001%) y después se separaron mediante electroforesis en gel de SDS-poliacrilamida. Tras la transferencia electroforética, se transfirieron los anticuerpos primarios con las membranas Immobilon-P (Millipore, Molsheim, Francia). Los anticuerpos primarios dirigidos contra P-MCSFR humano (Tyr-723), P-Erk1/2 y la forma total de las proteínas se adquirieron de Cell Signalling (Ozyme, Saint Quentin Yvelines, Francia). A continuación, las membranas se sondearon con anticuerpos secundarios acoplados con peroxidasa de rábano picante. La unión de anticuerpos se visualizó con un kit de quimioluminiscencia (ECL) potenciada Pierce (ThermoScientific, Illkirch, Francia). La luminiscencia detectada con una cámara de dispositivo de carga acoplada (CCD) se cuantificó utilizando el programa GeneTools (Syngene, Cambridge, Reino Unido).

7.2. Resultados

Tal como se muestra en la figura 5, la fosforilación de Tyr dependiente de IL-34 del receptor de MCSF se bloqueó con los anticuerpos BT34. De manera similar, se bloqueó la activación de ERK 1/2 con dicho anticuerpo. Estos resultados son consistentes con la capacidad de BT34 de inhibir la proliferación mediada por IL-34 de las células.

8. Efecto inhibidor de anticuerpos anti-IL-34 murinos sobre la proliferación celular en comparación con el efecto inhibidor de anti-IL-34 recombinante (anticuerpo quimérico recBT34)

8.1. Materiales y métodos:

Se aislaron inicialmente monocitos CD14+ humanos a partir de donantes de sangre periférica humana proporcionados por el instituto del banco de sangre francés (Etablissement Frangais du Sang, Nantes, Francia, número de autorización: NTS 2000-24), mediante la utilización de microperlas MACS (MiltenyiBiotec, Alemania). Las células se cultivaron en presencia de IL-34 con anticuerpo anti-IL-34 recombinante (anticuerpo quimérico recBT34) y con anticuerpo anti-IL-34 murino (clon BT34). Se determinaron los efectos de los tratamientos sobre la supervivencia/proliferación de CD34+ mediante la medición de la actividad metabólica utilizando un ensayo Alamar Blue®. Se introdujeron cuarenta mil células en cada pocillo de placas de 96 pocillos con a-MEM y los tratamientos correspondientes. Tras 3 días, se añadió el reactivo Alamar blue® y se leyó la fluorescencia producida en el intervalo lineal (excitación: 530 nm/emisión: 600 nm).

8.2. Resultados

Tal como se muestra en la figura 6 (A y B), los anticuerpos anti-IL-34 recombinantes (rec-BT34) inhiben marcadamente la viabilidad de las células CD14+ humanas con más eficiencia que los anticuerpos de IL-34 murinos (clon BT34).

De esta manera, el anticuerpo anti-IL-34 recombinante asimismo puede utilizarse con éxito para prevenir y/o tratar enfermedades proliferativas, tales como el cáncer.

9. Efecto inhibidor de los anticuerpos anti-IL-34 murinos (clon BT34) en comparación con el efecto inhibidor del anticuerpo de IL-34 recombinante (anticuerpo quimérico recBT34) sobre la señalización celular

9.1. Materiales y métodos

• Análisis de transferencia Western

Las células expresantes de M-CSFR tratadas con 50 ng/ml de IL-34 humano con 0.4 pg/ml de anticuerpo anti-IL-34 murino (clon BT34) y con 0.4 pg/ml o 2 g/ml de anticuerpo anti-IL-34 recombinante (rec-BT34) durante 10 minutos, se recogieron en tampón R iPA (Tris 10 mM, pH 8, EDTA 1 mM, NaCl 150 mM, NP40 al 1%, SDS al 0.1% que contiene un cóctel de proteasa e inhibidores de fosfatasa: ortovanadato sódico (Na²VO⁴) 1 mM, fluoruro de fenilmetilsulfonilo (PMSF) 1 mM, fluoruro sódico (NaF) 10 mM, N-etilmaleimida (NEM) 10 mM, leupeptina 2 |jg/ml y pepstatina 1 jg/ml). Se determinó la concentración de proteína utilizando un ensayo de proteína BCA (ácido bicinchonínico) (Sigma Aldrich). Se prepararon 40 jg de extractos de proteínas totales en un tampón de Laemmli (Tris-HCl 62.5 mM, pH 6.8, SDS al 2%, glicerol al 10%, 2-mercaptoetanol al 5% y azul de bromofenol al 0.001%) y después se separaron mediante electroforesis en gel de SDS-poliacrilamida. Tras la transferencia electroforética, se transfirieron los anticuerpos primarios con las membranas Immobilon-P (Millipore, Molsheim, Francia). Los anticuerpos primarios dirigidos contra P-MCSFR humano (Tyr-723), P-Erk1/2 y la forma total de las proteínas se adquirieron de Cell Signalling (Ozyme, Saint Quentin Yvelines, Francia). A continuación, las membranas se sondearon con anticuerpos secundarios acoplados con peroxidasa de rábano picante. La unión de anticuerpos se visualizó con un kit de quimioluminiscencia (ECL) potenciada Pierce (ThermoScientific, Illkirch, Francia). La luminiscencia detectada con una cámara de dispositivo de carga acoplada (CCD) se cuantificó utilizando el programa GeneTools (Syngene, Cambridge, Reino Unido).

9.2. Resultados

Tal como se muestra en la figura 7 (A y B), la fosforilación de Tyr dependiente de IL-34 del receptor de MCSF resultó bloqueada por todos los anticuerpos anti-IL-34. De manera similar, se bloqueó la activación de ERK 1/2 con dicho anticuerpo. Estos resultados son consistentes con la capacidad de los anticuerpos anti-IL-34 de inhibir la proliferación mediada por IL-34 de las células.

La figura 7 (A y B) asimismo muestra que el anticuerpo anti-IL-34 recombinante (anticuerpo quimérico recBT34) inhibe la señalización inducida por IL-34_h en HEK293 sobreexpresantes de MCSFR de una manera similar al anticuerpo anti-IL-34 murino BT34.

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WO 2013/119716.

Claims

REIVINDICACIONES

1. Anticuerpo anti-IL-34 o fragmentos de unión a antígeno del mismo, comprendiendo dicho anticuerpo una cadena ligera que comprende CDR-L1, CDR-L2 y CDR-L3, que comprenden respectivamente la secuencia de aminoácidos SEC ID n° 1, 2 y 3; y una cadena pesada que comprende CDR-H1, CDR-H2 y CDR-H3 que comprenden respectivamente la secuencia de aminoácidos SEC ID n° 4, 5 y 6.

2. Anticuerpo según la reivindicación 1, siendo dicho anticuerpo un anticuerpo monoclonal.

3. Anticuerpo según la reivindicación 1 o 2, o fragmentos de unión a antígeno del mismo, en el que dicho anticuerpo es apto para inhibir la interacción de IL-34 con por lo menos uno de sus receptores mediante la unión a IL-34 antes de la unión de IL-34 a su receptor.

4. Anticuerpo o fragmento antiunión del mismo según la reivindicación 3, en el que por lo menos uno de los receptores se selecciona de entre el grupo que consiste en M-CSF-R y RPTPp/Z

5. Anticuerpo según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, o fragmentos de unión a antígeno del mismo, en el que la constante de disociación (KD) de dicho anticuerpo es Kd á 10'11 M medida mediante BIAcore.

6. Anticuerpo según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, o fragmento de unión a antígeno del mismo, comprendiendo dicho anticuerpo una cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos SEC ID n° 7 y una cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos SEC ID n° 8.

7. Anticuerpo según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, o fragmento de unión a antígeno del mismo, siendo dicho anticuerpo un anticuerpo quimérico o un anticuerpo humanizado.

8. Anticuerpo según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, en el que dicho fragmento de unión a antígeno se selecciona de entre el listado que consiste en Fv, scFv, Fab, F(ab')2, Fab', scFv-Fc, diacuerpos o cualquier fragmento cuya semivida ha sido incrementada mediante modificación química.

9. Ácido nucleico aislado, siendo dicho ácido nucleico seleccionado de entre los ácidos nucleicos siguientes: a. un ácido nucleico, ADN o ARN, que codifica un anticuerpo según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, o un fragmento de unión a antígeno del mismo;

b. un ácido nucleico que comprende la secuencia de ADN que consiste en SEC ID n° 9 a 14 que codifica las CDR del anticuerpo según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8;

c. un ácido nucleico que comprende una secuencia de ADN que consiste en un par de polinucleótidos, en el que uno de los polinucleótidos codifica la cadena ligera que presenta la SEC ID n° 15 y el otro polinucleótido codifica la cadena pesada que presenta la SEC ID n° 16.

10. Vector que comprende el ácido nucleico según la reivindicación 9.

11. Célula hospedadora que comprende el vector según la reivindicación 10.

12. Método de producción de un anticuerpo según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, o fragmentos de unión a antígeno del mismo, comprendiendo dicho método las etapas de:

a. hacer crecer la célula hospedadora según la reivindicación 11 en el medio apropiado, y

b. recuperar dicho anticuerpo.

13. Composición farmacéutica que comprende el anticuerpo según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, o fragmentos de unión a antígeno del mismo y un portador farmacéuticamente aceptable.

14. Anticuerpo según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, o fragmentos de unión a antígeno del mismo, o composición farmacéutica según la reivindicación 13, para la utilización como un medicamento.

15. Anticuerpo o fragmentos de unión a antígeno del mismo según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, o composición farmacéutica según la reivindicación 13 para la utilización en un método para la prevención y/o el tratamiento de enfermedades dependientes de IL-34 seleccionadas de entre el listado que consiste en enfermedades inflamatorias, incluyendo enfermedades autoinmunitarias, cáncer, enfermedad ósea, enfermedades de la piel, enfermedades metabólicas, enfermedades cerebrales y enfermedades hepáticas.

16. Anticuerpo según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, o fragmentos de unión a antígeno del mismo, o composición farmacéutica según la reivindicación 13 para la utilización según la reivindicación 14 o 15, siendo dichas enfermedades inflamatorias dependientes de IL-34 seleccionadas de entre el listado que consiste en poliartritis reumatoide, periodontitis, osteoporosis, osteólisis periprostética, síndrome de Gougerot-Sjogren, ateroesclerosis, artritis, patologías de la piel inflamatorias y autoinmunitarias, enfermedades intestinales inflamatorias (tales como la enfermedad de Crohn, la colitis ulcerosa, la diverticulitis y la colitis infecciosa), la Alzheimer y trastornos neurodegenerativos, fibrosis, tales como por ejemplo, esteatohepatitis no alcohólica (NASH), esteatohepatitis alcohólica, fibrosis hepática inducida por virus, esteatohepatitis inducida por fármacos y fibrosis pulmonar intersticial, tal como por ejemplo fibrosis asociada a sustancias inhaladas, fibrosis inducida por fármacos, fibrosis autoinmunitaria, fibrosis infecciosa y fibrosis pulmonar idiopática y siendo dicho cáncer dependiente de IL-34 seleccionado de entre el listado que consiste en osteólisis tumoral, sarcomas óseos (osteosarcoma, sarcoma de Ewing y tumores de células gigantes del hueso), metástasis óseas, glioblastoma y cánceres cerebrales, cáncer de pulmón.

17. Método de detección in vitro de la presencia y/o de la localización de una IL-34 en un sujeto, comprendiendo dicho método las etapas de:

a. poner en contacto una muestra de dicho sujeto con un anticuerpo según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8 o fragmentos de unión a antígeno del mismo; y

b. (b) detectar la unión de dicho anticuerpo o fragmentos de unión a antígeno del mismo con la muestra.

18. Método de diagnóstico in vitro de cualquiera de las enfermedades como se cita en las reivindicaciones 17 a 20 en un paciente, comprendiendo dicho método:

a. poner en contacto células de dicho paciente con un anticuerpo según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8 o fragmentos de unión a antígeno del mismo,

b. medir la unión de dicho anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo a dichas células, y

c. comparar la expresión en la parte (b) con la de un sujeto de referencia normal o estándar.

19. Kit que comprende por lo menos el anticuerpo según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, o fragmentos de unión a antígeno del mismo, estando dicho anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo preferentemente marcado.