ES2869167T3 - Mutaciones del gen PIK3CA en cánceres humanos - Google Patents
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Abstract
Un método para detectar un polinucleótido PIK3CA mutado, que comprende: amplificar un polinucleótido PIK3CA; y secuenciar el polinucleótido amplificado en la etapa de amplificación para detectar la presencia de una mutación en el polinucleótido amplificado en la etapa de amplificación, en la que la mutación es al menos una mutación seleccionada del grupo que consiste en C112T, G113A, G263A, C311G, G317T, G323C, del332-334, G353A, G365A, C370A, T1035A, G1048C, T1132C, T1258C, G1357C, C1616G, G1624A, A1625G, A1625T, G1633A, A1634G, G1635T, C1636A, A1637C, C1981A, A2102C, G2702T, T2725C, T3022C, A3073G, C3074A, G3129T, C3139T, A3140G, A3140T, G3145A en comparación con un polinucleótido PIK3CA tipo silvestre, el polinucleótido PIK3CA tipo silvestre tiene una secuencia de nucleótidos de la SEQ ID NO.1.
Description
DESCRIPCIÓN
Mutaciones del gen PIK3CA en cánceres humanos
Campo de la invención
La invención se refiere a los campos de las pruebas de diagnóstico y los métodos terapéuticos para el cáncer.
Antecedentes de la invención
Las PI3K son lípido quinasas que funcionan como transductores de señales en dirección descendente de los receptores de la superficie celular y median en las rutas importantes para el crecimiento, proliferación, adhesión, supervivencia y motilidad celular (1,2). Aunque se ha observado un aumento de la actividad de PI3K en el matrimonio colorrectal y otros tumores (3, 4), no se han identificado mutaciones intragénicas de PI3K.
Se ha informado previamente que los miembros de la ruta PIK3 están alterados en cánceres, por ejemplo, el gen supresor de tumores PTEN (75, 76), cuya función es revertir la fosforilación mediada por los PI3K (77, IS). Se ha informado de la reduplicación o amplificación de las regiones cromosómicas que contienen PIK3CA y AKT2 en algunos cánceres humanos (2, 19, 20), pero los genes que son las dianas de estos eventos genéticos a gran escala no se han definido ni se pueden definir fácilmente.
Philip et al., Cancer Res 2001 Oct 15; 61(20): 7426-7429 divulga la detección de mutaciones de nucleótidos en la subunidad p85a de PI3K pero no hay referencia a PIK3CA.
Breve resumen de la invención
En una primera realización, se proporciona un método para detectar un polinucleótido PIK3CA mutado de acuerdo con la reivindicación 1.
En una segunda realización de la invención, se proporciona un método para detectar un polinucleótido PIK3CA mutado de acuerdo con la reivindicación 2.
Breve descripción de los dibujos
Fig. 1. Detección de mutaciones en PIK3CA, ejemplos representativos de mutaciones en los exones 9 y 20. En cada caso, el cromatograma de secuencia superior se obtuvo de tejido normal y los tres cromatogramas de secuencia inferior de los tumores indicados. Las flechas indican la ubicación de las mutaciones con cambio de sentido. Las alteraciones de nucleótidos y aminoácidos se indican por encima de la flecha.
Fig. 2, Distribución de mutaciones en PIK3CA. Las flechas indican la ubicación de las mutaciones con cambio de sentido y los recuadros representan dominios funcionales (p85BD, dominio de unión p85; RBD, dominio de unión Ras; dominio C2; dominio helicoidal; dominio de quinasa). El porcentaje de mutaciones detectadas dentro de cada región en cánceres se indica a continuación.
Figs. 3A-3C. Aumento de la actividad de lípido quinasa del mutante p110a. Se transfectaron células NIH3T3 con vector vacío o con construcciones de vector que contenían p110a de tipo silvestre o p110a mutante (H1047R) como se indica arriba de las columnas. Las inmunoprecipitaciones se realizaron con anticuerpos policlonales IgG de control o antip85. (Fig. 3A) La mitad de los inmunoprecipitados se sometieron a un ensayo de PI3-quinasa utilizando fosfatidilinositol como sustrato. “PI3P” indica la posición de PI-3-fosfato determinada con marcadores de fosfatidilo estándar y “Ori” indica el origen. (Fig. 3B) La otra mitad de los inmunoprecipitados se analizó mediante transferencia Western con anticuerpo anti-p110a. (Fig. 3C) Los lisados celulares de las células transfectadas contenían cantidades similares de proteína total según se determinó mediante transferencia Western utilizando un anticuerpo anti-a-tubulina. Se observaron resultados idénticos a aquellos mostrados en esta figura en tres experimentos de transfección independientes.
Descripción detallada de la invención
El agrupamiento de mutaciones dentro de PIK3CA lo convierte en un excelente marcador para la detección temprana o para seguir la progresión de la enfermedad. Las pruebas centradas en las regiones agrupadas producirán la mayoría de los alelos mutantes.
La secuencia de codificación de PIK3CA humana se informa en la bibliografía y se muestra en la SEQ ID NO: 1. Esta es la secuencia de un individuo particular en la población de humanos. Los humanos varían de uno a otro en sus secuencias de genes. Estas variaciones son mínimas, a veces ocurren con una frecuencia de aproximadamente 1 a 10 nucleótidos por gen. Existen diferentes formas de cualquier gen en particular dentro de la población humana. Estas diferentes formas se denominan variantes alélicas. Las variantes alélicas a menudo no cambian la secuencia de
aminoácidos de la proteína codificada; dichas variantes se denominan sinónimos. Incluso si cambian el aminoácido codificado (no sinónimo), la función de la proteína no suele verse afectada. Dichos cambios son evolutivamente o funcionalmente neutrales. Cuando se hace referencia a PIK3CA humano en la presente solicitud, se pretende que todas las variantes alélicas estén abarcadas en el término. La secuencia de la SEQ ID NO: 1 se proporciona simplemente como un ejemplo representativo de una secuencia humana de tipo silvestre. La invención no se limita a esta única forma alélica de PIK3CA. Con el fin de determinar una mutación, las secuencias de PIK3CA determinadas en una muestra de prueba se pueden comparar con una secuencia determinada en un tejido diferente de humano. Una diferencia en la secuencia en los dos tejidos indica una mutación somática. Alternativamente, la secuencia determinada en un gen PIK3CA en una muestra de prueba se puede comparar con la secuencia de la SEQ ID NO: 1. Una diferencia entre la secuencia de la muestra de prueba y SEQ ID NO: 1 se puede identificar como una mutación. Se pueden analizar tejidos sospechosos de ser cancerosos, al igual que muestras corporales que se espera que contengan células desprendidas de tumores o células cancerosas. Las muestras corporales adecuadas para análisis incluyen sangre, suero, plasma, esputo, orina, heces, aspirado del pezón, saliva y líquido cefalorraquídeo.
Las mutaciones PIK3CA se agrupan en los exones 9 (SEQ ID NO: 4) y 20 (SEQ ID NO: 5). Ocurren otras mutaciones, pero estos dos exones parecen ser los puntos calientes para las mutaciones. Se producen muchas mutaciones en el dominio helicoidal de PIK3CA (nt 1567-2124 de la SEQ Id NO: 2) y en su dominio quinasa (nt 2095-3096 de la SEQ ID NO: 2). Se producen menos en el dominio P85BD de PIK3CA (nt 103-335 de la s Eq ID NO: 2). Se han encontrado mutaciones en los exones 1, 2, 4, 5, 7, 9, 13, 18 y 20. Se puede probar cualquier combinación de estos exones, opcionalmente junto con la prueba de otros exones. Las pruebas de mutaciones se pueden realizar a lo largo de toda la secuencia de codificación o se pueden centrar en las áreas donde se ha encontrado que se agrupan las mutaciones. Los puntos calientes particulares de mutaciones ocurren en las posiciones de nucleótidos 1624, 1633, 1636 y 3140 de la secuencia de codificación de PIK3CA.
Se han encontrado mutaciones de PIK3CA en una variedad de diferentes tipos de tumores. Por tanto, se puede analizar cualquiera de una variedad de tumores para detectar mutaciones en PIK3CA. Estos tejidos incluyen, sin limitación: tejido colorrectal, tejido cerebral, tejido gástrico, tejido mamario y tejido pulmonar.
Se puede detectar cualquier tipo de mutación intragénica. Estos incluyen mutaciones por sustitución, mutaciones por deleción y mutaciones por inserción. Es probable que el tamaño de las mutaciones sea pequeño, del orden de 1 a 3 nucleótidos. Las mutaciones que se pueden detectar incluyen, pero no se limitan a, G1624A, G1633A, C1636A, A3140G, G113A, T1258C, G3129T, c 3139T y G2702T. Se puede probar cualquier combinación de estas mutaciones.
Las mutaciones que se encuentran en PIK3CA parecen ser mutaciones activadoras. Por tanto, se pueden utilizar regímenes terapéuticos que implican la inhibición de la actividad o expresión de p110a para inhibir la progresión de un tumor en un humano. Las moléculas inhibidoras que se pueden utilizar incluyen oligonucleótidos antisentido o construcciones antisentido, una molécula que comprende una región de unión de anticuerpo y moléculas de ARNip. Las moléculas que comprenden una región de unión de anticuerpos pueden ser anticuerpos completos, regiones variables de cadena sencilla, fragmentos de anticuerpos, conjugados de anticuerpos, etc. Las regiones de unión de anticuerpos pueden unirse a epítopos contenidos dentro del dominio quinasa (nt 2095-3096 de la SEQ ID NO: 2) de PIK3CA, el dominio helicoidal (nt 1567-2124 de la SEQ ID NO: 2) de PIK3CA, o el dominio P85BD (nt 103-335 de la SEQ ID NO: 2) de PIK3CA.
Se pueden utilizar construcciones antisentido, oligonucleótidos antisentido, construcciones de interferencia de ARN o moléculas de ARN dúplex de ARNip para interferir con la expresión de PIK3CA. Normalmente, al menos 15, 17, 19 o 21 nucleótidos del complemento de la secuencia de ARNm de PIK3CA son suficientes para una molécula antisentido. Normalmente, al menos 19, 21,22 o 23 nucleótidos de PIK3CA son suficientes para una molécula de interferencia de ARN. Preferiblemente, una molécula de interferencia de ARN tendrá una saliente 3' de 2 nucleótidos. Si la molécula de interferencia de ARN se expresa en una célula a partir de una construcción, por ejemplo, de una molécula en horquilla o de una repetición invertida de la secuencia PIK3CA deseada, entonces la maquinaria celular endógena creará las salientes. Las moléculas de ARNip se pueden preparar mediante síntesis química, transcripción in vitro o digestión de ARNdc largo por ARNasa III o Dicer. Estos se pueden introducir en las células mediante transfección, electroporación u otros métodos conocidos en la técnica. Véase Hannon, GJ, 2002, RNA Interference, Nature 418: 244-251; Bernstein E et al., 2002, The rest is silence. RNA 7: 1509-1521; Hutvagner G et al., RNAi: Nature abhors a double-strand. Curr. Opin. Genetics & Development 12: 225-232; Brummelkamp, 2002, A system for stable expression of short interfering RNAs in mammalian cells. Science 296: 550-553; Lee NS, Dohjima T, Bauer G, Li H, Li M-J, Ehsani A, Salvaterra P, and Rossi J. (2002). Expression of small interfering RNAs targeted against HIV-1 rev transcripts in human cells. Nature Biotechnol. 20:500-505; Miyagishi M, and Taira K. (2002). U6-promoter-driven siRNAs with four uridine 3' overhangs efficiently suppress targeted gene expression in mammalian cells. Nature Biotechnol. 20:497-500; Paddison PJ, Caudy AA, Bernstein E, Hannon GJ, and Conklin DS. (2002). Short hairpin RNAs (shRNAs) induce sequence-specific silencing in mammalian cells. Genes & Dev. 16:948-958; Paul CP, Good PD, Winer I, and Engelke DR. (2002). Effective expression of small interfering RNA in human cells. Nature Biotechnol. 20:505-508; Sui G, Soohoo C, Affar E-B, Gay F, Shi Y, Forrester WC, and Shi Y. (2002). A DNA vector-based RNAi technology to suppress gene expression in mammalian cells. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 99(6):5515-5520; Yu J-Y, DeRuiter SL, and Turner DL. (2002). RNA interference by expression of short-interfering RNAs and hairpin RNAs in mammalian cells. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 99(9):6047-6052.
Las moléculas de interferencia antisentido o de ARN se pueden suministrar in vitro a células o in vivo, por ejemplo, a tumores de un mamífero. Se pueden utilizar medios de suministro típicos conocidos en la técnica. Por ejemplo, el suministro a un tumor se puede realizar mediante inyecciones intratumorales. Se pueden utilizar otros modos de suministro sin limitación, que incluyen: suministro intravenoso, intramuscular, intraperitoneal, intraarterial, local durante la cirugía, endoscópica, subcutánea y por vía oral. En un modelo de ratón, la interferencia de ARN o antisentido se puede administrar a una célula tumoral in vitro, y la célula tumoral se puede administrar posteriormente a un ratón. Los vectores se pueden seleccionar para propiedades deseables para cualquier aplicación particular. Los vectores pueden ser virales o plásmidos. Los vectores adenovirales son útiles a este respecto. Se pueden utilizar promotores específicos de tejido, específicos de tipo celular o regulable de otro modo para controlar la transcripción de las moléculas de polinucleótido inhibidoras. También se pueden utilizar portadores no virales como liposomas o nanoesferas.
Utilizando la proteína p110a de acuerdo con la invención, un experto en la técnica puede generar fácilmente anticuerpos que se unen específicamente a las proteínas. Dichos anticuerpos pueden ser monoclonales o policlonales. Pueden ser quiméricos, humanizados o totalmente humanos. Se puede utilizar cualquier fragmento funcional o derivado de un anticuerpo, que incluyen las regiones Fab, Fab', Fab2, Fab'2 y variables de cadena sencilla. Siempre que el fragmento o derivado conserve la especificidad de unión por la proteína marcadora endotelial, se puede utilizar. Los anticuerpos se pueden probar para determinar la especificidad de la unión al comparar la unión al antígeno apropiado con la unión al antígeno irrelevante o la mezcla de antígenos bajo un conjunto de condiciones dado. Si el anticuerpo se une al antígeno apropiado al menos 2, 5, 7 y preferiblemente 10 veces más que al antígeno irrelevante o la mezcla de antígenos, entonces se considera que es específico.
Se conocen en el arte técnicas para fabricar tales anticuerpos parcialmente o totalmente humanos y se puede utilizar cualquiera de tales técnicas. De acuerdo con una realización particularmente preferida, las secuencias de anticuerpos completamente humanos se elaboran en un ratón transgénico que ha sido diseñado para expresar genes de anticuerpos humanos de cadena pesada y ligera. Se han elaborado múltiples cepas de dichos ratones transgénicos que pueden producir diferentes clases de anticuerpos. Las células B de ratones transgénicos que están produciendo un anticuerpo deseable se pueden fusionar para formar estirpes celulares de hibridoma para la producción continua del anticuerpo deseado. Véase, por ejemplo, Nina D. Russel, Jose R. F. Corvalan, Michael L. Gallo, C. Geoffrey Davis, Liise- Anne Pirofski. Production of Protective Human Antipneumococcal Antibodies by Transgenic Mice with Human Immunoglobulin Loci Infection and Immunity April 2000, p. 1820-1826; Michael L. Gallo, Vladimir E. Ivanov, Aya Jakobovits, and C. Geoffrey Davis. The human immunoglobulin loci introduced into mice: V (D) and J gene segment usage similar to that of adult humans European Journal of Immunology 30: 534-540, 2000; Larry L. Green. Antibody engineering via genetic engineering of the mouse: XenoMouse strains are a vehicle for the facile generation of therapeutic human monoclonal antibodies Journal of Immunological Methods 231 11-23, 1999; Yang X-D, Corvalan JRF, Wang P, Roy CM-N and Davis CG. Fully Human Anti-interleukin-8 Monoclonal Antibodies: Potential Therapeutics for the Treatment of Inflammatory Disease States. Journal of Leukocyte Biology Vol. 66, pp401-410 (1999); Yang X-D, Jia X-C, Corvalan JRF, Wang P, CG Davis and Jakobovits A. Eradication of Established Tumors by a Fully Human Monoclonal Antibody to the Epidermal Growth Factor Receptor without Concomitant Chemotherapy. Cancer Research Vol. 59, Number 6, pp1236-1243 (1999); Jakobovits A. Production and selection of antigen-specific fully human monoclonal antibodies from mice engineered with human Ig loci. Advanced Drug Delivery Reviews Vol. 31, pp: 33-42 (1998); Green L and Jakobovits A. Regulation of B cell development by variable gene complexity in mice reconstituted with human immunoglobulin yeast artificial chromosomes. J. Exp. Med. Vol. 188, Number 3, pp: 483-495 (1998); Jakobovits A. The longawaited magic bullets: therapeutic human monoclonal antibodies from transgenic mice. Exp. Opin. Invest. Drugs Vol. 7(4), pp: 607-614 (1998); Tsuda H, Maynard-Currie K, Reid L, Yoshida T, Edamura K, Maeda N, Smithies O, Jakobovits A. Inactivation of Mouse HPRT locus by a 203-bp retrotransposon insertion and a 55-kb gene-targeted deletion: establishment of new HPRT-Deficient mouse embryonic stem cell lines. Genomics Vol. 42, pp: 413-421 (1997); Sherman- Gold, R. Monoclonal Antibodies: The Evolution from '80s Magic Bullets To Mature, Mainstream Applications as Clinical Therapeutics. Genetic Engineering News Vol. 17, Number 14 (August 1997); Mendez M, Green L, Corvalan J, Jia X-C, Maynard-Currie C, Yang X-d, Gallo M, Louie D, Lee D, Erickson K, Luna J, Roy C, Abderrahim H, Kirschenbaum F, Noguchi M, Smith D, Fukushima A, Hales J, Finer M, Davis C, Zsebo K, Jakobovits A. Functional transplant of megabase human immunoglobulin loci recapitulates human antibody response in mice. Nature Genetics Vol. 15, pp: 146-156 (1997); Jakobovits A. Mice engineered with human immunoglobulin YACs: A new technology for production of fully human antibodies for autoimmunity therapy. Weir's Handbook of Experimental Immunology, The Integrated Immune System Vol. IV, pp: 194.1-194.7 (1996); Jakobovits A. Production of fully human antibodies by transgenic mice. Current Opinion in Biotechnology Vol. 6, No. 5, pp: 561-566 (1995); Mendez M, Abderrahim H, Noguchi M, David N, Hardy M, Green L, Tsuda H, Yoast S, Maynard-Currie C, Garza D, Gemmill R, Jakobovits A, Klapholz S. Analysis of the structural integrity of YACs comprising human immunoglobulin genes in yeast and in embryonic stem cells. Genomics Vol. 26, pp: 294-307 (1995); Jakobovits A. YAC Vectors: Humanizing the mouse genome. Current Biology Vol. 4, No. 8, pp: 761-763 (1994); Arbones M, Ord D, Ley K, Ratech H, Maynard-Curry K, Otten G, Capon D, Tedder T. Lymphocyte homing and leukocyte rolling and migration are impaired in L-selectin-deficient mice. Immunity Vol. 1, No. 4, pp: 247-260 (1994); Green L, Hardy M, Maynard-Curry K, Tsuda H, Louie D, Mendez M, Abderrahim H, Noguchi M, Smith D, Zeng Y, et. al. Antigen-specific human monoclonal antibodies from mice engineered with human Ig heavy and light chain YACs. Nature Genetics Vol. 7, No. 1, pp: 13-21 (1994); Jakobovits A, Moore A, Green L, Vergara G, Maynard-Curry K, Austin H, Klapholz S. Germ-line transmission
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También se pueden elaborar anticuerpos utilizando técnicas de presentación en fagos. Dichas técnicas se pueden utilizar para aislar un anticuerpo inicial o para generar variantes con características de especificidad o avidez alteradas. También se puede utilizar Fv de cadena única si es conveniente. Se pueden fabricar a partir de ratones transgénicos vacunados, si se desea. Los anticuerpos se pueden producir en cultivo celular, en fagos o en varios animales, que incluyen, pero no se limitan a vacas, conejos, cabras, ratones, ratas, hámsteres, conejillos de india, ovejas, perros, gatos, monos, chimpancés, simios.
Los anticuerpos se pueden marcar con una fracción detectable tal como un átomo radiactivo, un cromóforo, un fluoróforo o similares. Dichos anticuerpos marcados se pueden utilizar para técnicas de diagnóstico, ya sea in vivo o en una muestra de prueba aislada. Los anticuerpos también se pueden conjugar, por ejemplo, con un agente farmacéutico, tal como un fármaco quimioterapéutico o una toxina. Pueden estar ligados a una citocina, a un ligando, a otro anticuerpo. Los agentes adecuados para acoplarse a anticuerpos para lograr un efecto antitumoral incluyen citocinas, tales como interleucina 2 (IL-2) y Factor de Necrosis Tumoral (TNF); fotosensibilizadores, para uso en terapia fotodinámica, que incluyen tetrasulfonato de ftalocianina de aluminio (III), hematoporfirina y ftalocianina; radionúclidos, tales como yodo-131 (131I), itrio-90 (90Y), bismuto-212 (212Bi), bismuto-213 (213Bi), tecnecio-99m (99mTc), renio-186 (186Re) y renio-188 (188Re); antibióticos, tales como doxorrubicina, adriamicina, daunorrubicina, metotrexato, daunomicina, neocarzinostatina y carboplatino; toxinas bacterianas, vegetales y otras, tales como la toxina de difteria, exotoxina A de pseudomonas, enterotoxina A de estafilococos, toxina A abrina, ricina A (ricina A desglicosilada y ricina A nativa), toxina TGF-alfa, citotoxina de cobra china (naja naja atra) y gelonina (una toxina vegetal); proteínas que inactivan ribosomas de plantas, bacterias y hongos, tales como restrictocina (una proteína que inactiva los ribosomas producida por Aspergillus restrictus), saporina (una proteína que inactiva los ribosomas de Saponaria officinalis) y RNasa; inhibidores de la tirosina quinasa; ly207702 (un nucleósido de purina difluorado); liposomas que contienen agentes antitumorales (por ejemplo, oligonucleótidos antisentido, plásmidos que codifican toxinas, metotrexato, etc.); y otros anticuerpos o fragmentos de anticuerpos, como F(ab).
Aquellos expertos en la técnica comprenderán fácilmente y podrán fabricar dichos derivados de anticuerpos, ya que son bien conocidos en la técnica. Los anticuerpos pueden ser citotóxicos por sí mismos o se pueden utilizar para suministrar agentes citotóxicos a lugares particulares del cuerpo. Los anticuerpos se pueden administrar a individuos en necesidad de los mismos como una forma de inmunización pasiva.
Dado el éxito de los inhibidores de proteína quinasa de molécula pequeña, se pueden desarrollar inhibidores específicos o no específicos de p110a para el tratamiento de un gran número de pacientes con estas mutaciones o cánceres en general. Claramente, es posible desarrollar inhibidores de PI3K de amplio espectro, como lo documentan los estudios de LY294002 y wortmanina (2, 21, 22). Nuestros datos sugieren que valdría la pena el desarrollo de inhibidores más específicos que se dirijan a p110a pero no a otras PI3K.
Los agentes quimioterapéuticos candidatos se pueden identificar como agentes que inhiben la actividad o expresión de p110a. Los compuestos de prueba pueden ser sintéticos o de origen natural. Se puede identificar previamente que tienen actividad fisiológica o no. Las pruebas con agentes quimioterapéuticos candidatos se pueden realizar en sistemas sin células o en células completas. La actividad de p110a se puede probar por cualquier medio conocido en la técnica. Estos incluyen métodos enseñados en las referencias 2, 22 y en Truitt et al., J. Exp. Med. 179, 1071-1076 (1994). La expresión se puede monitorizar al determinar la proteína PI3KCA o el ARNm. Se pueden utilizar métodos de anticuerpos tales como transferencia de Western para determinar la proteína. La transferencia Northern se puede utilizar para medir el ARNm. Se pueden utilizar otros métodos sin limitación. Cuando se prueban agentes quimioterapéuticos, el p110a utilizado en el ensayo puede ser de tipo silvestre o activado. La forma activada puede contener una mutación de sustitución seleccionada del grupo que consiste en E542K, E545K, Q546K y H1047R. Más aún, los inhibidores se pueden probar para determinar su especificidad para p110a o una forma activada de p110a. Se pueden realizar pruebas comparativas con enzimas similares, que incluyen PIK3CB, PIK3CG, PIK3C2A, PIK3C2B, PIK3C2G, PIK3C3, A-TM, ATR, FRAP1, LAT1-3TM, SMG1, PRKDC y TRRAP para determinar la especificidad relativa de la enzima p110a.
Una vez que se identifica una mutación intragénica no sinónima en una secuencia de codificación de PIK3CA en un tejido de prueba de un paciente, esa información se puede utilizar para tomar decisiones terapéuticas. Los pacientes con dichas mutaciones son buenos candidatos para la terapia con un inhibidor de p110a. Dichos inhibidores pueden ser específicos o generales para la familia de inhibidores. Dichos inhibidores incluyen LY294002 y wortmanina. Dichos inhibidores incluyen adicionalmente moléculas que comprenden una región de unión de anticuerpos específica para p110a. Estas moléculas se discutieron anteriormente.
Se pueden proporcionar conjuntos de cebadores para amplificar y/o secuenciar PIK3CA en kits o ensamblar a partir de componentes. Los conjuntos útiles incluyen pares de cebadores directos e inversos combinados opcionalmente
con cebadores de secuenciación. Los cebadores directos se muestran en la SEQ ID NO: 6 a 158. Los cebadores inversos se muestran en la SEQ ID NO: 159 a 310. Los cebadores de secuenciación se muestran en: SEQ ID NO: 311 a 461. Pares o tripletes o combinaciones de estos pares o tripletes se pueden empacar y utilizar juntos para amplificar y/o secuenciar partes del gen PIK3CA. Los pares se pueden empacar en empaques individuales o divididos. Las instrucciones para utilizar los cebadores de acuerdo con los métodos de la presente invención se pueden proporcionar en cualquier medio que sea conveniente, que incluye papel, electrónico o una dirección web mundial.
Ejemplos
Ejemplo 1: Este ejemplo demuestra que el gen PIK3CA es la diana predominante de mutaciones en esta familia de genes
Para evaluar si los PI3K están genéticamente implicados en la tumorigénesis, examinamos directamente las secuencias de ADN de miembros de esta familia de genes en cánceres colorrectales.
Las subunidades catalíticas de PI3K se dividen en tres clases principales dependiendo de su especificidad de sustrato (5). Adicionalmente, un conjunto de proteínas relacionadas más lejanamente, que incluyen los miembros de la familia mTOR, constituyen una cuarta clase (6). Utilizamos modelos de Hidden Markov para identificar 15 genes humanos que contienen dominios de quinasa relacionados con los de PI3K conocidos en el genoma humano (7). Estos comprendían siete PI3K, seis miembros de la subfamilia mTOR y dos genes similares a PI3K no caracterizados (Tabla 1).
Tabla 1. Genes PI3K analizados
Nombre del Acceso Cetera Acceso Genbank Nombres alternativos Grupo** gen
PIK3CA hCT1640694 NM_006218 p110-alpha Clase IA PIK3CB hCT7084 NM_006219 PIK3C1, p110-beta Clase IA PIK3CD hCT2292011 NM_005026 p110-delta Clase IA PIK3CG hCT7976 NM_002649 PI3CG, P13K-gamma Clase IB PIK3C2A hCT2270768 NM_002645 CPK, PI3-K-C2A, PI3K-C2alpha Clase II PIK3C2B hCT7448 NM_002646 C2-PI3K, PI3K-C2beta Clase II PIK3C2G hCT1951422 NM_004570 PI3K-C2-gamma Clase II PIK3C3 hCT13660 NM_002647 Vps34 Clase III ATM hCT29277 NM_000051 AT1, ATA, ATC, ATD, ATE, ATDC Clase IV ATR hCT1951523 NM_001184 FRP1, SCKL, SCKL1 Clase IV FRAP1 hCT2292935 NM_004958 FRAP, MTOR, FRAP2, RAFT1, Clase IV
RAPT1
SMG1 hCT2273636 NM_014006 ATX, LIP, KIAA0421 Clase IV PRKDC hCT2257127 NM_006904 p350, DNAPK, DNPK1, HYRC1, Clase IV
XRCC7
TRRAP hCT32594 NM_003496 TR-AP, PAF400 Clase IV ninguno hCT2257641 ninguno Clase IV ninguno hCT13051 ninguno Clase IV
* Los genes PI3K se agrupan en las clases descritas anteriormente (S3, S4). Las clases I, II y III comprenden subunidades catalíticas de PI3K, mientras que la clase IV comprende genes similares a PI3K que incluyen miembros de las subfamilias mTOR (diana de rapamicina), ATM (ataxia telangiectasia mutada) y DNAPK (proteína quinasa dependiente de ADN), así como dos genes previamente no caracterizados.__________________________________
Inicialmente examinamos 111 exones que codifican los dominios de quinasa predichos de estos genes (Tabla 2). Los exones se amplificaron mediante reacción en cadena de la polimerasa (PCR) y se secuenciaron directamente a partir del ADN genómico de 35 cánceres colorrectales (8). Solo uno de los genes (PIK3CA) contenía mutaciones somáticas (es decir, específicas de tumores).
Ejemplo 2-Este ejemplo demuestra el sorprendente agrupamiento de mutaciones dentro del gen PIK3CA
A continuación, se analizaron todos los exones de codificación de PIK3CA en 199 cánceres colorrectales adicionales, revelando mutaciones en un total de 74 tumores (32 %) (Tabla 3 y ejemplos en la Figura 1).
Ejemplo 3: Este ejemplo demuestra que las mutaciones en PIK3CA ocurren tarde en la tumorigénesis.
Para determinar el momento de las mutaciones de PIK3CA durante la progresión neoplásica, evaluamos 76 tumores colorrectales premalignos de diversos tamaños y grados de displasia. Solo se encontraron dos mutaciones en PIK3CA (E542K y E542V), tanto en adenomas muy avanzados mayores de 5 cm de diámetro como de tipo tubululoso. Estos datos sugieren que las anomalías de PIK3CA ocurren en etapas relativamente tardías de la neoplasia, cerca del momento en que los tumores comienzan a invadir y hacer metástasis.
Ejemplo 4: Este ejemplo demuestra esas mutaciones PIK3CA en una variedad de diferentes tipos de cáncer.
Luego evaluamos PIK3CA en busca de alteraciones genéticas en otros tipos de tumores (Tabla 1). Se identificaron mutaciones en cuatro de quince (27 %) glioblastomas, tres de doce (25 %) cánceres gástricos, uno de trece (8 %) cánceres de mama y uno de veinticuatro (4 %) cánceres de pulmón. No se observaron mutaciones en once cánceres de páncreas ni en doce meduloblastomas. En total, se observaron 89 mutaciones, todas menos 3 de las cuales eran heterocigotas.
Ejemplo 5: Este ejemplo demuestra la naturaleza no aleatoria de las alteraciones genéticas observadas.
El gran número de mutaciones observadas en PIK3CA en cinco tipos de cáncer diferentes sugiere fuertemente que estas mutaciones son funcionalmente importantes. Esta conclusión está respaldada por dos líneas de evidencia independientes adicionales. En primer lugar, el análisis de la relación de mutaciones sinónimas y no sinónimas es una buena medida de selección durante la progresión del tumor, ya que es poco probable que las alteraciones silenciosas ejerzan una ventaja de crecimiento. La relación de mutaciones no sinónimos y sinónimas en PIK3CA fue de 89 a 2, mucho más alta que la relación 2:1 esperada por casualidad (P <1x10-4). En segundo lugar, la prevalencia de cambios no sinónimos localizados en los dominios catalíticos y accesorios de PI3K fue ~120 por Mb de ADN tumoral, más de 100 veces mayor que la frecuencia de mutación de fondo de alteraciones no funcionales observadas en el genoma de las células cancerosas (P <1x10-4) (9).
Aunque el efecto de estas mutaciones sobre la función de la quinasa aún no se ha probado experimentalmente, sus posiciones y naturaleza dentro de PIK3CA implican que es probable que se activen. No se observaron mutaciones truncadas y> 75% de las alteraciones ocurrieron en dos pequeños grupos en los exones 9 y 20 (Tabla 2 y Figura 1). Los residuos afectados dentro de estos grupos están altamente conservados evolutivamente, conservando la identidad en el ratón, la rata y el pollo. La agrupación de mutaciones somáticas con cambio de sentido en dominios específicos es similar a la observada para la activación de mutaciones en otros oncogenes, tales como RAS (10), BRAF (11, 12), p-catenina (13) y miembros del quinoma de tirosina (14).
Estos datos genéticos sugieren que es probable que el mutante PIK3CA funcione como un oncogén en cánceres humanos.
Ejemplo 6: Este ejemplo demuestra que la amplificación de genes de PIK3CA no es común.
El análisis de PCR cuantitativo de PIK3CA en 96 cánceres colorrectales no mostró evidencia de amplificación de genes, lo que sugiere que las alteraciones de la copia de genes no son un mecanismo significativo de activación en este tipo de tumor. Los cebadores utilizados fueron:
PI3K en tiempo real hCT164069420-1F (intrón)
TTACTTATAGGTTTCAGGAGATGTGTT (SEQ ID NO: 486);y
PI3K en tiempo real hCT164069420-1R
GGGTCTTTCGAATGTATGCAATG (SEQ ID NO: 487)
El Listado de Secuencias adjunto al final de esta solicitud contiene las siguientes secuencias:
SEQ ID NO: 1 = solo secuencia de codificación (nt 13 a 3201 de la
SEQ ID NO: 2)
SEQ ID NO: 2 = secuencia de ARNm (NM_006218)
SEQ ID NO: 3 = secuencia de proteína (NP_006209)
SEQ ID NO: 4 = exón 9_
SEQ ID NO: 5 = exón 20
SEQ ID NO: 6 a 165 = cebadores directos
SEQ ID NO: 166 a 325 = cebadores inversos
SEQ ID NO : 326 a 485 = cebadores de secuenciación
SEQ ID NO: 486 y 487 cebadores de amplificación
Referencias y notas
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Claims (5)
1. Un método para detectar un polinucleótido PIK3CA mutado, que comprende: amplificar un polinucleótido PIK3CA; y secuenciar el polinucleótido amplificado en la etapa de amplificación para detectar la presencia de una mutación en el polinucleótido amplificado en la etapa de amplificación, en la que la mutación es al menos una mutación seleccionada del grupo que consiste en C112T, G113A, G263A, C311G, G317T, G323C, del332-334, G353A, G365A, C370A, T1035A, G1048C, T1132C, T1258C, G1357C, C1616G, G1624A, A1625G, A1625T, G1633A, A1634G, G1635T, C1636A, A1637C, C1981A, A2102C, G2702T, T2725C, T3022C, A3073G, C3074A, G3129T, C3139T, A3140G, A3140T, G3145A en comparación con un polinucleótido PIK3CA tipo silvestre, el polinucleótido PIK3CA tipo silvestre tiene una secuencia de nucleótidos de la SEQ ID NO.1.
2. Un método para detectar un polinucleótido PIK3CA mutado, comprendiendo el método detectar la presencia del polinucleótido PIK3CA mutado de acuerdo con la reivindicación 1 en una muestra obtenida de un sujeto.
3. El método de acuerdo con la reivindicación 2, en el que la muestra comprende un ADN genómico de una célula tumoral.
4. El método de acuerdo con la reivindicación 2 o 3, en el que la muestra es un tejido colorrectal, tejido cerebral, tejido gástrico, tejido mamario, tejido pulmonar, sangre, suero, plasma, esputo, saliva, orina, heces, o aspirado de pezón.
5. El método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 2 a 4, en el que el sujeto es un paciente de cáncer.
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