CN102816839A - 用于检测结直肠癌pik3ca基因热点突变位点的试剂盒 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了用于检测结直肠癌PIK3CA基因热点突变位点的试剂盒，包括红细胞裂解液、全血DNA抽提试剂、无水乙醇、PCR扩增反应液、阳性对照品、阴性对照品以及焦磷酸测序反应液，其特征在于：所述试剂盒包括检测9外显子目的基因上下游引物9F-Biotin、9R、测序引物9RCX；检测20外显子目的基因上下游引物20F-Biotin、20R、测序引物20RCX。可检测出与结直肠癌相关的PIK3CA基因热点突变位点（E542K、E545K和H1047R）多态性，特异性好，准确度高。
Description
技术领域
本发明属生命科学和生物技术领域，特别涉及一种用于检测结直肠癌PIK3CA基因热点突变位点（E542K、E545K和H1047R）的试剂盒，能对结直肠癌PIK3CA基因突变位点进行检测，特异性好，准确度高，可提高突变检出率。
背景技术
结直肠癌（colorectal cancer,CRC）是最常见的恶性肿瘤之一，随着人们生存环境及生活方式的改变，CRC的发病率呈现逐年上升的趋势，全球每年新增病例约一百万，约五十万患者因其死亡。人类恶性肿瘤的发生与多种因素有关，具有复杂的分子基础，是多步骤、多基因改变的复杂过程。癌基因PIK3CA的发现为我们研究肿瘤的发生发展提供了新的方向，进一步认识癌基因PIK3CA突变作用对于揭示结肠癌发生发展的分子机制具有重要的意义。
PIK3CA是一种体细胞突变癌基因，PIK3CA基因突变导致的PIK3CA过度表达可以导致PI3K的催化活性增强，促使细胞癌变，有致癌的功能。对PI3K家族全部成员的激酶结构域外显子编码区域进行序列分析显示,PIK3CA是唯一一个可以发生体细胞突变引起致癌的基因,在结肠癌中突变率达32%。PIK3CA基因是由Volinia在1994年利用原位杂交技术检测到的，其定位于3q26.3，长34kb，包含20个外显子，编码1068种氨基酸，该组氨基酸产生一组长124kD的蛋白。PIK3CA编码PI3Ks的p110催化亚单位，即PI3Kp110a。
近年来随着结肠癌发病率的增高，深入研究结肠癌的发生发展机制，做到早预见、早发现、早诊断、早治疗成为结肠癌防治的重点。大量数据表明PIK3CA中约90%突变发生在螺旋区(exon9)和激酶区(exon20)这两个热点区域。这两个突变热点均能增强PI3K的脂质激酶活性，因此，检测PIK3CA蛋白不仅可以做到结肠癌的早期诊断及判断预后，对于结肠癌患者选择合理的化疗药物提高化疗效果亦具有重要的临床意义。
目前，PIK3CA基因突变现有的检测方法包括普通测序法、焦磷酸测序法以及荧光定量PCR法等。
在实际应用中，用于检测结直肠癌PIK3CA基因突变的方法主要为直接测序法，尽管该法为金标准，但是如果突变率低于15%，会发生漏检的现象，且试验过程过于繁琐，需要的试剂种类繁多，费时费力，因而一定程度上限制了该法的应用。
焦磷酸测序(Pyrosequencing)技术是一种新的序列分析技术，是由4种酶催化的同一反应体系中的酶级联化学发光反应。在实际工作中，很多情况需要对已知序列的DNA片段进行序列验证，而这种分析往往测几十bp就可以满足需要。在这种情况下，Sanger法未必是最合适的DNA序列分析技术。而焦磷酸测序技术是目前最适合这些应用的DNA序列分析技术。其特点是操作简便、大通量、自动化，适合大量样本的快速检测，根据峰值对序列的突变位点进行判读，从而实现PIK3CA基因突变位点的定点检测。
发明内容
本发明的目的是克服现有技术的缺陷，提供用一种快速，准确，高通量的PIK3CA基因热点突变（E542K、E545K和H1047R）检测试剂盒。
用于检测结直肠癌PIK3CA基因热点突变位点的试剂盒，包括红细胞裂解液、全血DNA抽提试剂、无水乙醇、PCR扩增反应液、阳性对照品、阴性对照品以及焦磷酸测序反应液，其特征在于：所述试剂盒包括检测9外显子目的基因上下游引物9F-Biotin、9R、测序引物9RCX；检测20外显子目的基因上下游引物20F-Biotin、20R、测序引物20RCX，其序列为：
9F：Biotin-CAGAGTAACAGACTAGCTAGAG，
9R：GTTTAAAAATCATGTAAATTCTGC，
9RCX：CCACAGAAAATCTTTCTCCT；
20F：Biotin-CTGAGCAAGAGGCTTTGGAGTAT，
20R：TTTCTGTTCTTGCTGTAAATTC，
20RCX：GTTGTCCAGCCACCA。
进一步地，所述试剂盒的使用方法包括如下步骤：
(1)采集待测血液样本，提取DNA；
(2)以该DNA为模板，用权利要求1所述用于扩增样本DNA中PIK3CA基因的对应PCR引物：9F、9R、20F、20R进行扩增，得到PCR反应产物；
(3)对PCR反应产物用测序引物9RCX、20RCX进行焦磷酸测序，确定是否存在突变。
优选地，步骤(2)的PCR反应按以下条件进行扩增：94℃5min；98℃30s、58℃30s、68℃30s，35个循环；最后68℃5min。
本发明根据PIK3CA基因热点突变位，分别设计了外显子9和20PCR扩增引物以及焦磷酸测序引物。
表1.外显子9-20引物序列
(9F、9R)及(20F、20R)分别为9号外显子和20号外显子的扩增引物，可以扩增待检生物样品中相应的片段，其中正向引物做生物素标记；9RCX和20RCX为焦磷酸测序反向测序引物，对前述扩增所得片段进行测序。其中，9F、9R为E542K、E545K位点PCR扩增引物；20F、20R为H1047R位点PCR扩增引物。
本发明将测序技术应用于结直肠癌PIK3CA基因热点突变位点的检测，设计出外显子9和20PCR扩增引物以及焦磷酸测序引物，进行PCR扩增并进行焦磷酸测序分析。可检测出与结直肠癌相关的PIK3CA基因热点突变位点（E542K、E545K和H1047R）多态性，特异性好，准确度高，可以用于结肠癌的早期诊断及判断预后，对于结肠癌患者选择合理的化疗药物提高化疗效果亦具有重要的临床意义。
附图说明
图1A是结直肠癌PIK3CA第9外显子基因扩增后，经1.5%琼脂糖凝胶电泳后的电泳图。如图所示，目的片段约为258bp。其中，M为TAKARA2000的Marker，1-6为受检样本。
图1B是结直肠癌PIK3CA第20外显子基因扩增后，经1.5%琼脂糖凝胶电泳后的电泳图。如图所示，目的片段约为250bp。其中，M为TAKARA2000的Marker，1-6为受检样本。
图2A为野生型样本经Exon9引物扩增后，第1624和1633位碱基的焦磷酸测序结果。由于正向标记生物素，因此反向测序标准序列应为G
AGTGGAT
图2B为突变型样本经Exon9引物扩增后，第1624和1633位碱基的焦磷酸测序结果。由于正向标记生物素，因此反向测序序列应为GAGTGGAT
由图可知，发现该样本第1624碱基C→T突变以及第1633碱基C→T突变。
图3A为野生型样本经Exon20引物扩增后，第3140碱基的测序结果。由于正向标记生物素，因此反向测序标准序列应为TG
TGCA。
图3B为突变型样本经Exon20引物扩增后，第3140碱基的测序结果。由于正向标记生物素，因此反向测序标准序列应为TG
TGCA，由图可知，发现样本第3140位密码子T→C突变。
具体实施方式
本发明用于检测结直肠癌PIK3CA基因热点突变位点的试剂盒，包括红细胞裂解液、全血DNA抽提试剂、无水乙醇、PCR扩增反应液、阳性对照品、阴性对照品以及焦磷酸测序反应液，其特征在于：所述试剂盒包括检测9外显子目的基因上下游引物9F-Biotin、9R、测序引物9RCX；检测20外显子目的基因上下游引物20F-Biotin、20R、测序引物20RCX，其序列为：
9F：Biotin-CAGAGTAACAGACTAGCTAGAG，
9R：GTTTAAAAATCATGTAAATTCTGC，
9RCX：CCACAGAAAATCTTTCTCCT；
20F：Biotin-CTGAGCAAGAGGCTTTGGAGTAT，
20R：TTTCTGTTCTTGCTGTAAATTC，
20RCX：GTTGTCCAGCCACCA。
实施例1
(1)样本抽提：
1.1抽取300μl血液，加入900μl红细胞裂解液，颠倒混匀，室温放置5分钟，期间再颠倒混匀几次。10000rpm离心1分钟（若离心机最高转速不允许，可3000rpm离心5min），吸去上清，留下白细胞沉淀，加200μl缓冲液GA，振荡至彻底混匀。
1.2加入20μl蛋白酶K溶液，混匀。
1.3加入200μl缓冲液GB，充分颠倒混匀，70℃放置10分钟，溶液应变清亮，简短离心以去除管盖内壁的水珠。
1.4加人200μl无水乙醇，充分振荡混匀15秒，此时可能会出现絮状沉淀，简短离心以去除管盖内壁的水珠。
1.5将上一步所得溶液和絮状沉淀都加入一个吸附柱CB3中（吸附柱放入收集管中），12,000rpm(13,400×g)离心30秒，倒掉废液，将吸附柱CB3放回收集管中。
1.6向吸附柱CB3中加入500μl缓冲液GD（使用前请先检查是否已加入无水乙醇），12,000rpm(13,400×g)离心30秒，倒掉废液，将吸附柱CB3放入收集管中。
1.7向吸附柱CB3中加入700μl漂洗液PW（使用前请先检查是否已加入无水乙醇），12,000rpm(13,400×g)离心30秒，倒掉废液，将吸附柱CB3放入收集管中。
1.8向吸附柱CB3中加入500μl漂洗液PW，12,000rpm(13,400×g)离心30秒，倒掉废液。
1.9将吸附柱CB3放回收集管中，12,000rpm(13,400×g)离心2分钟，倒掉废液。将吸附柱CB3置于室温放置数分钟，以彻底晾干吸附材料中残余的漂洗液。
1.10将吸附柱CB3转入一个干净的离心管中，向吸附膜的中间部位悬空滴加100μl洗脱缓冲液TE，室温放置2-5分钟，12,000rpm(13,400×g)离心2分钟，将溶液收集到离心管中。
(2)目的基因片段的扩增
2.1按样品数n（样品数=待测样本数+阴性对照1个+阳性对照1个）取预混PCR反应液每管47μl分装于反应管中。
2.2将上述处理好的待测样本和阴性、阳性对照各取3μl分别加入反应管中，混匀，低速离心数秒，进行PCR扩增，具体反应体系及循环扩增体系如下：
表2.外显子9/20PCR反应体系
表3.外显子9/20PCR循环体系
实施例2
电泳鉴定：1.5%琼脂糖凝胶电泳，140V，20min，凝胶成像系统观察。第9外显子和第20外显子目的片段分别为258bp和250bp，Marker为DL2000。
实施例3
单链模板的制备：将前述扩增所得PCR产物，每样品按照50μl加入3μl链霉亲和素包被的磁珠在室温下孵育10分钟。与磁珠结合后的PCR产物分别在75%乙醇，0.2mol/L的NaOH溶液及Tris洗脱液中各孵育10秒，充分反应后变性得到单链DNA。将与磁珠结合后的单链释放悬浮于45μl退火缓冲液中(100mM Tris-acetate pH7.75,20mM Mg-acetate)(含10pmol测序引物)。在80℃下孵育2分钟，然后在室温下放置5分钟。
实施例4
焦磷酸测序：测序反应在28℃下自动在PYROMARK ID仪器的SQA模式下进行检测，dNTP加样顺序为G→A→C→T，随着酶促的反应的进行，CCD摄像机检测并收集光信号，最终得到检测序列。
实施例5
焦磷酸测序结果分析：对PCR反应产物进行焦磷酸测序，与野生型基因序列进行比较，确定是否存在突变。其中第9外显子的突变类型主要为置换突变，第1624位密码子出现C→T转换，引起蛋白中该位点的谷氨酸转变为赖氨酸(E542K)，以及第1633位密码子出现C→T转换，导致谷氨酸转变为赖氨酸(E545K)。第20外显子的突变类型主要为第3140位密码子出现T→C转换，引起蛋白中该位点的组氨酸转变为精氨酸(H1047R)。
SEQUENCE LISTING
<110> 杭州艾迪康医学检验中心有限公司
<120> 用于检测结直肠癌PIK3CA基因热点突变位点的试剂盒
<130>
<160> 6
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 1
cagagtaaca gactagctag ag 22
<210> 2
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 2
gtttaaaaat catgtaaatt ctgc 24
<210> 3
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 3
ccacagaaaa tctttctcct 20
<210> 4
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 4
ctgagcaaga ggctttggag tat 23
<210> 5
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 5
tttctgttct tgctgtaaat tc 22
<210> 6
<211> 15
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 6
gttgtccagc cacca 15
Claims (3)
1.用于检测结直肠癌PIK3CA基因热点突变位点的试剂盒，包括红细胞裂解液、全血DNA抽提试剂、无水乙醇、PCR扩增反应液、阳性对照品、阴性对照品以及焦磷酸测序反应液，其特征在于：所述试剂盒包括检测9外显子目的基因上下游引物9F-Biotin、9R、测序引物9RCX；检测20外显子目的基因上下游引物20F-Biotin、20R、测序引物20RCX，其序列为：
9F：Biotin-CAGAGTAACAGACTAGCTAGAG，
9R：GTTTAAAAATCATGTAAATTCTGC，
9RCX：CCACAGAAAATCTTTCTCCT；
20F：Biotin-CTGAGCAAGAGGCTTTGGAGTAT，
20R：TTTCTGTTCTTGCTGTAAATTC，
20RCX：GTTGTCCAGCCACCA。
2.如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒的使用方法包括如下步骤：
(1) 采集待测血液样本，提取DNA；
(2) 以该DNA为模板，用权利要求1所述用于扩增样本DNA中PIK3CA基因的对应PCR引物：9F、9R、20F、20R进行扩增，得到PCR反应产物；
(3) 对PCR反应产物用测序引物9RCX、20RCX进行焦磷酸测序，确定是否存在突变。
3.如权利要求2所述的试剂盒，其特征在于，步骤(2)的PCR反应按以下条件进行扩增：94℃ 5min；98℃ 30s、 58℃ 30s、68℃ 30s，35个循环；最后68℃ 5min。
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