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ES2866623T3 - Métodos y composiciones para el suministro localizado de nanopartículas a un tumor - Google Patents

Métodos y composiciones para el suministro localizado de nanopartículas a un tumor Download PDF

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ES2866623T3
ES2866623T3 ES09827900T ES09827900T ES2866623T3 ES 2866623 T3 ES2866623 T3 ES 2866623T3 ES 09827900 T ES09827900 T ES 09827900T ES 09827900 T ES09827900 T ES 09827900T ES 2866623 T3 ES2866623 T3 ES 2866623T3
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ES
Spain
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nanoparticles
cells
cell
lymphocytes
agent
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ES09827900T
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English (en)
Inventor
Darrell Irvine
Matthias Stephan
Jaehyun Moon
Anna Bershteyn
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Massachusetts Institute of Technology
Original Assignee
Massachusetts Institute of Technology
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
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Publication date
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Abstract

Una composición que comprende una célula transportadora con núcleo que migra de forma dirigida a un tumor y se conjuga covalentemente con una nanopartícula, en donde dicha nanopartícula comprende un agente, en donde la célula transportadora mantiene la nanopartícula sobre la superficie celular y en donde el agente tiene que liberarse desde la nanopartícula in vivo, para su uso como medicamento para suministrar un agente a un sujeto que tiene un tumor.

Description

DESCRIPCIÓN
Métodos y composiciones para el suministro localizado de nanopartículas a un tumor
La invención se preparó con apoyo del gobierno según el número de financiación RGY0058/2006-C de1Human Frontier Science Program y los números de financiación CA140476 y EB007280-02 de National Institutes of Health. El gobierno tiene determinados derechos de esta invención.
Solicitudes relacionadas
Esta solicitud reivindica prioridad según 35 U.S.C. §119 de la solicitud provisional de Estados Unidos con número de serie 61/200.160, presentada el 24 de noviembre de 2008.
Antecedentes de la invención
1. Campo de la invención
La invención se refiere al suministro de agentes a regiones, tejidos o células localizadas en el organismo usando nanopartículas y células.
2. Análisis de la técnica relacionada
Las inmunoterapias celulares están en desarrollo activo para el tratamiento del cáncer, y el tratamiento celular adoptivo (ACT) del cáncer con linfocitos T activados/expandidos ex vivo es uno de los tratamientos más prometedores que se está ensayando actualmente en pacientes. (Rosenberg et al., Nat Rev Cancer 8(4): 299, 2008; Dudley et al., Science 298(5594): 850, 2002; June et al., J Clin Invest 117(5): 1204, 2007; Stephan et al., Nat Med 13(12): 1440, 2007; Yee et al., Proc Natl Acad Sci U S A 99(25): 16168, 2002.) Estas estrategias implican el uso de linfocitos T autólogos recogidos de pacientes que se activan/expanden ex vivo y después se vuelven a infundir para combatir tumores tales como tumores metastásicos. Las estrategias que potencian la persistencia, expansión in vivo y funciones efectoras de linfocitos T ACT debe aumentar la frecuencia de las respuestas objetivas. (Rosenberg SA et al., Nat Rev Cancer 8(4): 299, 2008; June CH et al., J Clin Invest 117(5): 1204, 2007.) Una manera de potenciar la función de los linfocitos T ACT es mediante genomanipulación de las propias células, introduciendo receptores quiméricos o moléculas coestimuladoras. (Stephan et al., Nat Med 13(12): 1440, 2007; Morgan et al., Science 314(5796): 126, 2006; Gade et al., Cancer Res 65(19): 9080, 2005.)
Las citocinas de la familia de interleucinas tales como IL-2 e IL-15 han sido de particular interés para promover las funciones efectoras y proliferación de linfocitos T antitumorales. La IL-2 e IL-15 comparten algunas de sus propiedades en la activación de la proliferación/función efectora de linfocitos T y la IL-2 sistémica se ha usado para sostener los linfocitos T transferidos adoptivamente tanto en modelos de ratón como en ensayos clínicos de seres humanos de tratamiento del cáncer.
Sin embargo, la IL-2 expande los linfocitos T reguladores que pueden suprimir las respuestas inmunitarias antitumorales, se sabe que promueve la muerte celular inducida por activación (AICD) en linfocitos T y tiene toxicidad sustancial cuando se administra sistémicamente. (Antony et al., J Immunol 176(9): 5255, 2006; Fontenot et al., Nat Immunol 6(11): 1142, 2005; Oh et al., Proc Natl Acad Sci U S A 100(6): 3392, 2003; Waldmann, Nat Rev Immunol 6(8): 595, 2006; Waldmann et al., Immunity 14(2): 105, 2001.)
Por el contrario, la IL-15 mantiene la proliferación y funciones efectoras de los linfocitos T sin promover la AICD. (Oh et al., Proc Natl Acad Sci U S A 100(6): 3392, 2003; Waldmann, Nat Rev Immunol 6(8): 595, 2006; Waldmann et al., Immunity 14(2): 105, 2001.) La IL-15 transmite señales a través de un receptor heterotrimérico compuesto de una cadena a especializada, una cadena IL-2/IL-15Rp compartida y la cadena y común usada por varias interleucinas. En un modo inusual de función, se ha demostrado que la señalización de IL-15 fisiológica está mediada en gran medida por la presentación de la citocina en trans: las células que portan la cadena IL-15Ra se unen a la citocina con alta afinidad y presentan la citocina a linfocitos T que portan las cadenas p y y. Como resultado, la expresión de la cadena IL-15Ra por las células que responden es innecesaria en este contexto. (Dubois et al., Immunity 17(5): 537, 2002; Stoklasek et al., J Immunol 177(9): 6072, 2006.)
Recientemente, se han descrito estrategias para reactivar o mantener la actividad de linfocitos T antitumorales ex vivo, basándose en los sorprendentes efectos de la IL-15 sobre los linfocitos T CD8+ antitumorales. La IL-15 se ha usado de forma intercambiable con IL-2 como tratamiento sistémico en modelos preclínicos de ACT, promoviendo la destrucción de grandes tumores de melanoma cuando se combina con vacunación de refuerzo para dirigir la expansión de linfocitos T específicos de tumor transferidos de manera adoptiva. (Klebanoff et al., Proc Natl Acad Sci U S A 101(7): 1969, 2004.) Teague et al. mostraron que el cultivo de linfocitos T no funcionales recuperados de tumores con IL-15 supera el estado anérgico observado en estas células, permitiéndoles proliferar y volver a obtener potentes funciones efectoras. (Teague et al., Nat Med 12(3): 335, 2006.) Sin embargo, la IL-15 inyectada sistémicamente ha demostrado tener una semivida corta de solamente ~1 h y tiene potencia limitada in vivo, activando una proliferación limitada de linfocitos T en comparación con las respuestas durante cultivo in vitro prolongado. (Stoklasek et al., J Immunol 177(9): 6072, 2006.) Este resultado puede reflejar la semivida corta de la proteína y/o la disponibilidad limitante de las cadenas IL-15Ra libres para la unión y presentación en trans de la citocina.
Como estrategia para superar esta limitación, varios estudios independientes demostraron recientemente que la formación de precomplejos de IL-15 con IL-15Ra recientemente soluble potencia la potencia sistémica de IL-15 en ~50 veces, y también eleva la semivida de la citocina en suero después de inyección sistémica hasta ~20 h. (Stoklasek et al., J Immunol 177(9): 6072, 2006; Dubois et al., J Immunol 180(4): 2099, 2008; Rubinstein et al., Proc Natl Acad Sci U S A 103(24): 9166, 2006.) Después de estos hallazgos, se ha demostrado que inyecciones diarias a largo plazo de complejos de IL-15/IL-15Ra prolongan la supervivencia de ratones en un modelo de ratón espontáneo de cáncer pancreático, reactivando la actividad citolítica de los linfocitos T residentes en los tumores. (Epardaud et al., Cancer Res 68(8): 2972, 2008.) Destacablemente, en estos estudios in vivo de tratamiento con complejo de IL-15/IL-15Ra superagonista (IL-15 SA), no solamente los linfocitos T CD8+ de memoria, sino también los linfocitos T CD8+ T vírgenes demostraron proliferar, regular por aumento marcadores de activación y obtener funciones efectoras en respuesta al complejo de IL-15/IL-15Ra, dando lugar a una esplenomegalia macroscópica en ratones que recibían tratamiento prolongado con IL-15 SA. (Stoklasek et al., J Immunol 177(9): 6072, 2006; Dubois et al., J Immunol 180(4): 2099, 2008; Rubinstein et al., Proc Natl Acad Sci U S A 103(24): 9166, 2006.) Esta activación de linfocitos T policlonales no específica provocada por IL-15 SA sistémica puede elevar el riesgo de autoinmunidad si se prolonga el tratamiento.
Las citocinas tales como IL-2 e IL-15 actúan principalmente actuando sobre linfocitos T, linfocitos NK y linfocitos NKT promoviendo respuestas inmunitarias. Complementarios a estas señales, se han usado ligandos del receptor de tipo Toll (TLR) en inmunoterapia del cáncer dirigiendo la activación de células dendríticas (DC) y otras APC tanto en ganglios linfáticos de drenaje tumoral como directamente en el microentorno tumoral. Los t Lr son receptores de reconocimiento de patrones que han evolucionado para detectar diversas moléculas asociadas con patógenos que varían desde bacterias hasta hongos y hasta virus. Los ligandos de TLR activan DC para regular por aumento los receptores coestimuladores y secretar citocinas proinmunitarias tales como IL-12. (Beutler, Nature 430(6996): 257, 2004; Iwasaki et al., Nat Immunol 5(10): 987, 2004; Pulendran, Immunol Rev 199: 227, 2004; Reis e Sousa, Semin Immunol 16(1): 27, 2004.) Por tanto, estos factores están en estudio como posibles adyuvantes para vacunas. La señalización del TLR está implicada en la rotura de la tolerancia mediada por linfocitos T reguladores (Pasare et al., Science 299(5609): 1033, 2003) y el suministro mantenido de ligandos de TLR a ganglios linfáticos ha demostrado romper la tolerancia de linfocitos T específicos de autoantígenos tumorales en un modelo de tratamiento adoptivo. (Yang et al., Nat Immunol 5(5): 508, 2004.) La regresión de tumores grandes de melanoma establecidos conseguida por tratamiento adoptivo aumentada con un refuerzo de vacunación de vector vírico puede funcionar en parte a través del acoplamiento de TLR mantenido proporcionado por inmunización con vector vírico. (Yang et al., Nat Immunol 5(5): 508, 2004; Overwijk et al., J Exp Med 198(4): 569, 2003.) En otros estudios, las inyecciones repetidas de ligandos de TLR directamente en tumores se han usado para promover la activación de APC residentes en tumores y dirigir las respuestas inmunitarias locales eficaces. (Heckelsmiller et al., Eur J Immunol 32(11): 3235, 2002; Furumoto et al., J Clin Invest 113(5): 774, 2004; Currie et al., J Immunol 180(3): 1535, 2008.) Los ligandos de TLR en combinación con el bloqueo de IL-10 también ha demostrado convertir DC disfuncionales en el microentorno tumoral en un estado funcional proinmunitario. (Vicari et al., J Exp Med 196(4): 541,2002.)
Las nanopartículas poliméricas biodegradables sintéticas cargadas con fármacos son cada vez de mayor interés para el tratamiento de diversas enfermedades, ya que pueden ofrecer un medio de bajo coste, que se puede fabricar fácilmente para conseguir el suministro mantenido de fármacos en sitios de tejido diana seleccionados y concentrar los fármacos donde sean necesarios en el organismo. (Davis et al., Nat Rev Drug Discov 7(9): 771, 2008.) En el suministro de productos terapéuticos proteínicos, las partículas de suministro de fármacos sintéticas (partículas con tamaños en el intervalo de 50-500 nm, normalmente) pueden tener la capacidad de conseguir resultados comparables con otros medios de suministro tales como vectores víricos (Green et al., Advanced Materials 19(19): 2836, 2007) sin los efectos secundarios asociados de dichos vectores biológicos, tales como respuestas inmunitarias contra el vector o peligros de integración vírica. (Donsante et al., Science 317(5837): 477, 2007; Kresge, IAVI Rep 9(4): 18, 2005; Mingozzi et al., Nat Med 13(4): 419, 2007; Watkins et al., Nat Med 14(6): 617, 2008.) En tratamiento contra el cáncer, la acumulación pasiva de nanopartículas en sitios tumorales mediante la filtración potenciada y efecto de retención (Maeda et al., J Control Release 65(1-2): 271, 2000; Matsumura et al., Cancer Res 46(12 Pt 1): 6387, 1986) (que se refiere a los efectos combinados de vasculatura tumoral filtrante y mal drenaje linfático a menudo observado en sitios de tumor sólido) se ha explotado para el suministro de agentes terapéuticos y de imágenes a tumores sólidos. (Davis et al., Nat Rev Drug Discov 7(9): 771,2008; Shi et al., Advanced Materials 20(9): 1671, 2008; von Maltzahn et al., Bioconjugate Chemistry 19(8): 1570, 2008; Drummond et al., Pharmacol Rev 51(4): 691, 1999; Kirpotin et al., Cancer Res 66(13): 6732, 2006; Park et al., Clin Cancer Res 8(4): 1172, 2002.)
Sin embargo, el tratamiento de enfermedad metastásica mediante inyección sistémica de vehículos de fármacos en nanopartículas está limitado por la rápida eliminación de las nanopartículas típicas. Por tanto, la semivida de las nanopartículas inyectadas sistémicamente o liposomas es normalmente de unas pocas horas o menos y la acumulación de las partículas en los sitios tumorales a menudo es de solamente una fracción muy pequeña (~1 %) de la dosis total inyectada. (Owens, Int J Pharm 307(1): 93, 2006; Vonarbourg et al., Biomaterials 27(24): 4356, 2006; Moghimi et al., Pharmacol Rev 53(2): 283, 2001.) La adhesión de polietilenglicol (PEG) a la superficie de liposomas o nanopartículas para crear los llamados vehículos "blindados" puede aumentar el tiempo en circulación de las partículas hasta ~24-48 h (Owens, Int J Pharm 307(1): 93, 2006; Vonarbourg et al., Biomaterials 27(24): 4356, 2006; Moghimi et al., Pharmacol Rev 53(2): 283, 2001), pero hasta ahora la inmensa mayoría de la dosis inyectada (a menudo > 80 %) aún se deura por el bazo y el hígado, incluso cuando se emplean anticuerpos dirigidos. (Kirpotin et al., Cancer Res 66(13): 6732, 2006.) Por tanto, una cantidad sustancial de la carga de fármacos se degrada sin efecto o peor, puede provocar hepatotoxicidad.
Sumario de la invención
La invención se refiere al uso de nanopartículas conjugadas con células transportadoras para suministrar agentes de una manera controlada y localizada. La invención se basa en parte en el hallazgo inesperado de que determinados grupos reactivos existen en niveles suficientes sobre la superficie de determinados tipos celulares sin modificar que facilitan la conjugación con las nanopartículas que tienen grupos reactivos complementarios. La invención se basa además en parte en el hallazgo inesperado de que las nanopartículas pueden mantenerse sobre la superficie de determinadas células sin internalización de las nanopartículas, lo que impediría la liberación controlada de los agentes comprendidos dentro de las nanopartículas. Los linfocitos T son un ejemplo de células que no logran endocitar las nanopartículas en el intervalo de tamaño de ~150 nm covalentemente conjugados con su superficie incluso después de muchos días o a través de varias rondas de división celular. El resultado es que los linfocitos T podrían mantener las nanopartículas y liberar los agentes en su entorno local durante periodos prolongados. Otras células que se ha descubierto que son particularmente adecuadas para la conjugación con nanopartículas mediante su química de superficie celular son los linfocitos B y las células progenitoras hematopoyéticas. Las células transportadoras pueden ser eucariotas (por ejemplo, células de mamífero) o procariotas (por ejemplo, células bacterianas) y puede ser de origen natural o manipulados (o modificados). Si las células transportadoras son células bacterianas u otras células procariotas, pueden atenuarse para reducir o eliminar el riesgo de infección en el destinatario.
La invención proporciona una composición que comprende una célula transportadora con núcleo que migra de forma dirigida a un tumor y se conjuga covalentemente con una nanopartícula, en la que dicha nanopartícula comprende un agente, en la que la célula transportadora mantiene la nanopartícula sobre la superficie celular y en la que el agente tiene que liberarse desde la nanopartícula in vivo, para su uso como medicamento para suministrar un agente a un sujeto que tiene un tumor.
Por tanto, en un aspecto, la invención posibilita un método para suministrar un agente, que comprende administrar a un sujeto que tiene un tumor una célula con núcleo conjugada covalentemente a una nanopartícula que comprende un agente, en el que la célula no internaliza la nanopartícula y en el que el agente se libera desde la nanopartícula in vivo.
Diversas realizaciones se aplican de igual modo al aspecto precedente de la invención, así como otros aspectos indicados a continuación, y por motivos de brevedad estos se indicarán solamente una vez. Sin embargo, debe entenderse que se contemplan combinaciones de estos aspectos y realizaciones por la invención.
Por tanto, en algunas realizaciones, la célula es un linfocito T. En algunas realizaciones, la célula es un linfocito B, un linfocito NK o un linfocito NKT. En otras realizaciones, la célula es un progenitor hematopoyético que incluye, sin limitación, una célula madre pluripotente (es decir, una célula de reconstitución a largo plazo), una célula progenitora multipotente (por ejemplo, una CFU-S o una CFC-GEMM), una célula progenitora unipotencial (por ejemplo, una BFU-E). Un ejemplo de un progenitor hematopoyético murino es una célula que carece de expresión en superficie celular de marcadores de estirpe y que tiene expresión en la superficie celular de Sca-1 y/o c-kit, como se describe en el presente documento.
En algunas realizaciones, la célula es un linfocito T reactivo a tumores. En otras realizaciones relacionadas, la célula migra de forma dirigida al tumor o al tejido en que existe el tumor (por ejemplo, tejido linfoide).
En el presente documento se describen, pero no forman parte de la invención reivindicada, métodos de suministro donde el sujeto tiene una enfermedad autoinmunitaria. En otros métodos de suministro descritos, el sujeto tiene una infección.
En algunos métodos de suministro descritos, el sujeto está en necesidad de reconstitución hematopoyética como resultado de, por ejemplo, quimioterapia mielosupresora y/o radiación.
En algunas realizaciones, la célula es un linfocito T específico de intestino. En algunas realizaciones, la célula es un linfocito T específico de piel.
En algunas realizaciones, la célula es autóloga para el sujeto. En algunas realizaciones, la célula se activa antes de la administración al sujeto. En algunas realizaciones, la célula genomanipulada. En otras realizaciones, la célula es de origen natural.
La célula es una célula eucariota tal como una célula de mamífero. En realizaciones importantes, la célula de mamífero es una célula humana.
En algunas realizaciones, la nanopartícula es de 20-500 nm de diámetro, o de 100-300 nm de diámetro. En algunas realizaciones, la nanopartícula es de aproximadamente 150 nm de diámetro, o de aproximadamente 200 nm de diámetro o de 250 nm de diámetro.
En algunas realizaciones, la nanopartícula comprende grupos reactivos de maleimida en su superficie. En algunas realizaciones, la nanopartícula comprende un recubrimiento lipídico.
En algunas realizaciones, la nanopartícula es una nanopartícula de ADN (también denominada en el presente documento nanopartícula de ADN-gel) que comprende un núcleo de ADN reticulado y opcionalmente un recubrimiento lipídico.
En algunas realizaciones, el agente es un agente inmunoestimulador. En algunas realizaciones, el agente es una citocina. En algunas realizaciones, la citocina es IL-15/IL-15Ra. En algunas realizaciones, el agente es un antígeno. En algunas realizaciones, el agente es un adyuvante. En algunas realizaciones, el adyuvante es un ligando de TLR. El ligando de TLR puede funcionar estimulando las respuestas inmunitarias específicas de antígeno (normalmente en presencia de antígenos exógenos o endógenos) y/o respuestas inmunitarias no específicas de antígeno. Por tanto, el ligando de TLR puede usarse en presencia o ausencia de un antígeno. En algunas realizaciones, el agente es un anticuerpo o un fragmento de anticuerpo. En algunas realizaciones, el agente es un fármaco. En algunas realizaciones, el agente es un compuesto químico. En algunas realizaciones, el agente es un ácido nucleico. En algunas realizaciones, el ácido nucleico es un ARNip.
En algunas realizaciones importantes, los agentes son agentes antineoplásicos incluyendo anticuerpos antineoplásicos, antígenos cancerosos, agentes quimioterápicos antineoplásicos y similares.
En diversas realizaciones, los agentes pueden usarse a dosis que están por debajo de las dosis requeridas para conseguir los mismos efectos in vivo después de administración sistémica. En algunos casos, las dosis son al menos 2 veces menores, al menos 5 veces menores, al menos 10 veces menores, al menos 20 veces menores, al menos 50 veces menores o al menos 100 veces menores que la dosis sistémica requerida.
En algunas realizaciones, la célula se une covalentemente a una pluralidad de nanopartículas. En algunas realizaciones, la pluralidad de nanopartículas comprende un agente idéntico. En algunas realizaciones, la pluralidad de nanopartículas comprende agentes diferentes. En algunas realizaciones, la pluralidad de nanopartículas es 50­ 10000 o 100-10000. En algunas realizaciones, la pluralidad de nanopartículas es de aproximadamente 50, o de aproximadamente 100, o de aproximadamente 150, o de aproximadamente 200, o de aproximadamente 250 o de aproximadamente 500.
En algunas realizaciones, el método posibilitado por la invención comprende además la unión de la nanopartícula a la célula. En algunas realizaciones, el método comprende además proporcionar la célula unida a la nanopartícula. De acuerdo con la invención, la célula se une covalentemente a la nanopartícula.
En algunas realizaciones, el agente actúa de una manera autocrina (es decir, actúa sobre la propia célula transportadora). En algunas realizaciones, el agente actúa de una manera paracrina (es decir, actúa sobre células distintas de la célula transportadora). En otras realizaciones más, el agente actúa tanto de manera autocrina como de manera paracrina.
También se divulga en el presente documento un método para suministrar un agente, que comprende administrar a un sujeto un liposoma unido covalentemente a una nanopartícula que comprende un agente, en el que el agente se libera desde la nanopartícula in vivo.
La invención también posibilita un método para suministrar un agente a un tumor, que comprende administrar a un sujeto que tiene un tumor un linfocito T reactivo a tumores unido covalentemente a una nanopartícula que comprende un agente, en el que el agente se libera desde la nanopartícula in vivo. El tumor puede ser un linfoma y el agente puede ser un agente antilinfoma (es decir, un agente que tiene efecto terapéutico sobre el linfoma). Un ejemplo de dicho agente es un anticuerpo tal como rituximab.
La invención posibilita además un método para suministrar un agente a un tumor, que comprende administrar a un sujeto que tiene un tumor un linfocito T reactivo a tumores unido covalentemente a una nanopartícula recubierta con maleimida que comprende un agente, en el que el agente se libera desde la nanopartícula in vivo. En algunas realizaciones, el agente es un agente antineoplásico. En algunas realizaciones, el agente es un adyuvante. En algunas realizaciones, el agente es un antígeno. En algunas realizaciones, el antígeno es un antígeno tumoral.
Además, la invención posibilita un método para suministrar un agente, que comprende administración a un sujeto una célula unida covalentemente a una nanopartícula que comprende un agente, en el que la célula no internaliza la nanopartícula y en el que el agente se libera desde la nanopartícula in vivo.
Además, la invención posibilita un método para suministrar localmente un agente dentro de un sujeto, que comprende administrar a un sujeto que tiene una célula de migración dirigida a los tejidos unida covalentemente a una nanopartícula biodegradable que comprende agente, en el que el agente se libera desde la nanopartícula biodegradable in vivo. En algunas realizaciones, la célula de migración dirigida a tejidos es un linfocito T. En algunas realizaciones, el linfocito T es un linfocito T de migración dirigida al intestino. En algunas realizaciones, el linfocito T es un linfocito T de migración dirigida a la piel. De acuerdo con la invención, la nanopartícula biodegradable se une covalentemente a la célula de migración dirigida al tejido.
La invención además posibilita un método para suministrar un agente a un linfoma dentro de un sujeto, que comprende administrar a un sujeto que tiene un linfoma un linfocito B o T (por ejemplo, un linfocito T de memoria central) unido covalentemente a una nanopartícula o un liposoma que comprende un agente, en el que el agente se libera desde la nanopartícula in vivo y la nanopartícula no se internaliza en la célula. El agente puede ser un anticuerpo, tal como un anticuerpo antiCD20 o puede ser un agente quimioterápico, tal como fludaribina. Otros agentes que tienen efecto terapéutico sobre el linfoma pueden usarse en lugar de o además del anticuerpo antiCD20 o fludaribina.
En el presente documento se describe también una nanopartícula biodegradable que comprende grupos maleimida sobre su superficie exterior.
La nanopartícula puede comprender además una superficie de bicapa lipídica. La nanopartícula puede comprender un núcleo de poli(láctido-coglicólido) (PLGA). La nanopartícula puede comprender además un agente. Este agente puede ser un agente inmunoestimulador. El agente también puede ser un antígeno. El agente puede ser un anticuerpo. El agente puede ser un adyuvante. El adyuvante también puede ser un ligando de TLR, tal como un agente inmunoestimulador en presencia o ausencia de antígeno. Además, el agente puede ser un ácido nucleico, tal como un ARNip. El agente también puede ser un agente antineoplásico. En algunas realizaciones, el agente es una citocina, tal como una interleucina.
La nanopartícula puede comprender además una pluralidad de agentes. La pluralidad de agentes puede comprender un antígeno y un adyuvante. La pluralidad de agentes también puede comprender un adyuvante y un agente antineoplásico. Además, la pluralidad de agentes puede comprender un agente inmunoestimulador y un agente antineoplásico.
La nanopartícula puede ser de 50-500 nanómetros de diámetro o de 100-300 nanómetros de diámetro. La nanopartícula también puede ser de aproximadamente 50 nanómetros de diámetro, o de aproximadamente 100 nanómetros de diámetro, o de aproximadamente 150 nanómetros de diámetro, o de aproximadamente 200 nanómetros de diámetro o de aproximadamente 250 nanómetros de diámetro. La nanopartícula puede estar en forma liofilizada.
También se divulga una composición que comprende un linfocito T aislado, que comprende una nanopartícula biodegradable su superficie celular, en la que la nanopartícula comprende un agente. De acuerdo con la invención, la nanopartícula biodegradable se conjuga covalentemente a la superficie del linfocito T.
También se divulga una composición que comprende una célula progenitora hematopoyética aislada que comprende una nanopartícula biodegradable en su superficie celular, en la que la nanopartícula comprende un agente. La nanopartícula biodegradable se conjuga, de acuerdo con la invención, covalentemente a la superficie de la célula progenitora hematopoyética. El agente puede ser un agente que estimula la proliferación de células progenitoras hematopoyéticas y opcionalmente su autorrenovación o su diferenciación hacia una o más estirpes hematopoyéticas. Un ejemplo no limitante de dicho agente es un inhibidor de GSK3beta.
Estos y otros aspectos y realizaciones se describirán en mayor detalle en el presente documento.
Cada una de las limitaciones de la invención puede abarcar diversas realizaciones de la invención. Por lo tanto, se prevé que cada una de las limitaciones de la invención que implique un elemento cualquiera o combinaciones de elementos pueda incluirse en cada aspecto de la invención. Esta invención no se limita en su aplicación a los detalles de construcción y/o la disposición de los componentes expuestos en la siguiente descripción o ilustrados en los dibujos. La invención tiene capacidad para otras realizaciones y para ponerse en práctica o realizarse de diversos modos.
Breve descripción de los dibujos
No se pretende que los dibujos adjuntos estén dibujados a escala. En los dibujos, cada componente idéntico o casi idéntico que se ilustra en diversas figuras se representa por el mismo número. Por motivos de claridad, no todos los componentes pueden marcarse en cada dibujo. En los dibujos:
Fig. 1A. Linfocitos T funcionalizados con nanopartícula para ACT.
Fig. 1B. Ejemplos de modos de acción de nanopartículas unidas a células, incluyendo un modo autocrino de acción en que las nanopartículas (y su carga de agente) actúan sobre la célula transportadora y un modo paracrino de acción en que las nanopartículas (y sus cargas de agente) actúan sobre células en el entorno. Fig. 2A-D. Liposomas y nanopartículas de p LgA recubiertas con lípido para la unión a linfocitos T. (A, B) Imágenes de microscopia crioelectrónica sin teñir de nanopartículas con envuelta lipídica, que ilustran los lípidos superficiales. (B es una vista aumentada del recuadro A.) Las flechas resaltan las evidencias de formación de bicapa en la superficie de las nanopartículas con envuelta. (C) Histogramas de tamaño de nanopartículas de PLGA recubiertas con lípido y liposomas de crioEM. (D) Esquema de conjugación basada en maleimida con tioles de superficie de linfocitos T.
Fig. 3A-B. Nanopartículas funcionalizadas con maleimida se unen de forma estable a la superficie de linfocitos T sin toxicidad. Se incubaron linfocitos T CD8+ Pmel-1 con 2500 nanopartículas marcadas con DiD fluorescentes por célula para la conjugación, se lavaron y se cultivaron durante 6 días en presencia de IL-2. (A) Microscopia confocal de hepatocitos en el día 0 y el día 6, que muestra fluorescencia de las nanopartículas (púrpura). (B) Viabilidad de linfocitos T conjugados con partículas o de control evaluada por tinción con anexina V y yoduro de propidio seguida de análisis por citometría de flujo.
Fig. 4A-C. Nanopartículas conjugadas mediante los tioles a superficies de linfocitos T no inhiben la proliferación de linfocitos T, la producción de citocinas o la destrucción de células diana. (A, B) Nanopartículas de núcleo de PLGA marcadas con DiD se fijaron a linfocitos T CD8+ pmel-1 marcados con CFSE (2500 nanopartículas/célula), después los linfocitos T conjugados con partículas (panel inferior) o los linfocitos T "desnudos" de control (panel superior) se estimularon con células dendríticas derivadas de médula ósea estimuladas con péptido hgp100 maduro a una relación de linfocitos T:DC de 2:1; los cultivos se complementaron con IL-2 cada 2 días. (A) Las células se analizaron por citometría de flujo en el día 6: Se muestran diagramas de dispersión de DiD (marcador de nanopartículas) frente a fluorescencia de CFSE sincronizado para células CD8+ vivas en el panel superior, y la fluorescencia media correspondiente de las nanopartículas como una función del número de divisiones celulares determinado a partir de CFSE se muestra en el panel de la derecha. (B) Se midieron las citocinas secretadas por linfocitos T conjugados con nanopartículas (•) o linfocitos T "desnudos" (o) por ELISA en sobrenadantes recogidos a las 24 h (IL-2) o 48 h (IFN-y y TNF-a). (C) Se conjugaron blastocitos de linfocitos T Pmel-1 con 2500 nanopartículas por célula o se dejaron sin modificar y se cultivaron con células diana EL4 marcadas con Cr estimuladas con antígeno hgp100 (Mingozzi F et al., Nat Med 13(4): 419, 2007) o células EL4 de control sin estimular y se cuantificó el % de destrucción específica de células diana midiendo (Mingozzi F et al., Nat Med 13(4): 419, 2007) la liberación de Cr después de 4 h para relaciones variables de célula efectora pmel-1:célula diana.
Fig. 5A-C. Incorporación de proteína y ligando de TLR en nanopartículas de PLGA recubiertas con lípido. (A) Imagen confocal (izquierda) e imagen de crioEM (derecha) de nanopartículas recubiertas con lípido cargadas con ovoalbúmina fluorescente en los núcleos de las partículas. Obsérvese que las partículas en la imagen confocal se agregan artificialmente aquí por secado en un cubreobjetos para la toma de imágenes. (B) Cinética de la liberación de IL-15 desde partículas de PLGA recubiertas con lípido in vitro en medio completo a 37 °C. (C) Se incubaron DC derivadas de médula ósea con 3 mg/ml de nanopartículas lipídicas que contenían un 1 % en moles o un 10 % en moles de MPLA en el recubrimiento lipídico, cantidades equivalentes de MPLA soluble (30 pg/ml o 3 pg/ml) o LPS soluble (1 mg/ml) como control positivo. A las 24 h, se evaluó el estado de maduración de las células por análisis de citometría de flujo de MHC II, CD80 y CD40 de superficie celular (no mostrado). El MPLA con partículas fue equivalente a o más potente que MPLA soluble a la hora de activar la maduración de DC. Fig. 6. Bioactividad de la citocina IL-15 liberada desde nanopartículas unidas a células. Los linfocitos T se conjugaron con nanopartículas de PLGA recubiertas con lípido cargadas con IL-15 o IL-15 en complejo con la proteína de fusión de IL-15Ralfa-Fc humano soluble (IL-15 superagonista). El número de linfocitos T viables después de 6 días en cultivo se evaluó por recuento celular después de tinción con azul tripano. Los linfocitos T que portan las nanopartículas cargadas con IL-15 mostraron supervivencia y/o proliferación potenciada.
Fig. 7. Las nanopartículas de PLGA recubiertas con lípido pueden encapsular y después mostrar liberación mantenida de compuestos de TLR7/8. Los ligandos del receptor de tipo Toll gardiquimod o resiquimod se encapsularon en partículas de PLGA recubiertas con lípido, y la liberación en solución salina que contiene BSA a 37 °C se evaluó durante 8 días, midiendo la fluorescencia de los compuestos liberados.
Fig. 8A-D. Toma de imágenes de bioluminiscencia/fluorescencia en todo el animal de nanopartículas, linfocitos T conjugados con nanopartículas y modelos de tumor de melanoma B16. (A) Los linfocitos T polarizan las nanopartículas unidas a superficie (fluorescencia roja) al uropodio durante la migración. Los linfocitos T sensibilizados se conjugaron con nanopartículas y después se observó la migración en cubreobjetos de vidrio por videomicroscopia de fluorescencia con resolución temporal. Las células en migración agruparon las nanopartículas en el uropodio (las flechas en el primer fotograma indican la dirección de las células en migración). Las células que se detuvieron y se despolarizaron incluso momentáneamente redistribuyeron las nanopartículas a lo largo de la superficie celular, indicando una ausencia de agregación entre las nanopartículas. (B) Se inyectaron nanopartículas marcadas con DiR (1 mg) s.c. en el costado de un ratón anestesiado y se tomaron imágenes por fluorescencia en todo el animal (mostrado en falso color en el costado derecho). (C) Toma de imágenes de bioluminiscencia de nanopartículas marcadas con luciferasa de Gaussia fijadas a 4 x 106 linfocitos T pmel-1, 4h después de inyección en la vena de la cola de linfocitos T conjugados con partículas. Las flechas rojas indican linfocitos T acumulados en los pulmones, mientras que las flechas blancas destacan lo que puede representar la migración dirigida de linfocitos T a los ganglios linfáticos axilares. (D) Toma de imágenes de bioluminiscencia de células de melanoma B16F10 que expresan luciferasa de Gaussia, que ilustra la metástasis 14 días después de inyección en la cápsula renal.
Fig. 9A-D. Nanopartículas conjugadas en la superficie del vehículo de linfocitos T Pmel-1 dirigidos a melanoma en el microentorno tumoral. (A-D) Se inyectaron 500000 células tumores B16F10, transducidas con luciferasa de Gaussia en el fémur derecho de ratones C57BL/6. Después de tres semanas, se visualizó la carga tumoral por imágenes IVIS (A). Los animales se trataron con 15x106 linfocitos T Pmel-1 efectores, transgénicos para luciferasa de luciérnaga (A-D, panel de la izquierda) o linfocitos T Pmel-1 efectores conjugados con nanopartículas que contenían la marca fluorescente DiD (A-D, panel de la derecha). Antes de la transferencia adoptiva, se incubaron linfocitos T con 1 mg/ml de Tiol-PEG durante 30 min para evitar la captación no específica de nanopartículas unidas a superficie por los macrófagos. Cuatro días después del tratamiento con linfocitos T, se tomaron imágenes de la biodistribución de los linfocitos T Pmel-1 transferidos de forma adoptiva con bioluminiscencia (B), se rastrearon las nanopartículas unidas a la superficie por imágenes IVIS fluorescentes para DiD (C). Los fémures derechos se lavaron abundantemente y se analizaron por citometría de flujo de múltiples colores para infiltrados de linfocitos T (Thy1.1) y nanopartículas DiD (D).
Fig. 10A-B. Los linfocitos T decorados funcionan de manera normal y transportan de manera eficaz nanopartículas fijadas en la superficie en tumores que expresan antígeno. Se conjugaron linfocitos T efectores CD8+ específicos de ovoalbúmina OT-1 con 100 nanopartículas de gel de ADN por célula o se dejaron sin manipular como controles. (A y B) Imágenes comparativas de bioluminiscencia in vivo (tumores, linfocitos T) y fluorescencia (nanopartículas) de ratones que portan EG7-OVA que expresa luciferasa de Gaussia subcutánea y tumores EL4 de control en costados opuestos, 2 días después de infusión i.v. de linfocitos T OT-1 efectores Thy1.1+ transgénicos para luciferasa de luciérnaga (con o sin nanopartículas marcadas con DiD adheridas) o un número equivalente de nanopartículas libres. Los linfocitos T OT-1 Thy1.1+ recuperados de los tumores EG7-OVA se analizaron para las nanopartículas DiD unidas a la superficie por citometría de flujo (A) y se representó en gráfica la media de las señales bioluminiscentes de linfocitos T y fluorescentes de nanopartículas de grupos de 6 ratones mostrado en (B). Se muestra 1 de 2 experimentos independientes.
Fig. 11A-C. Los linfocitos T específicos de antígeno tumoral transportan nanopartículas unidas a la superficie en adenocarcinomas de próstata TRAMP establecidos. (A) A ratones TRP-SIY de seis meses de edad (Bai et al., PNAS USA, 105:13003, 2008), con adenocarcinomas de próstata espontáneos establecidos que expresan un corto péptido lineal SIY (SIYRYYGL; SEQ ID NO:1) se les inyectó 15 x 106 linfocitos T CD8+ transgénicos 2C específicos de SIY que expresan luciferasa CBR. Los linfocitos T se dejaron sin modificar o se conjugaron en la superficie con nanopartículas de gel de ADN marcadas con DiD. Como alternativa, se inyectó por vía intravenosa un número equivalente de partículas marcadas con DiD libres. Se muestran adquisiciones bioluminiscentes en todo el cuerpo ventrales directamente después de la inyección de linfocitos T (panel superior) y 3 días después (panel inferior). (B) En el día 3, se asilaron las próstatas de ratones sometidos a eutanasia y se cuantificó la fluorescencia en el tejido de DiD usando el sistema de imágenes IVIS Spectrum. (C) El análisis por citometría de flujo de una suspensión monocelular preparada a partir de próstatas recuperadas muestra una fracción sustancial de linfocitos T transgénicos 2C que aún se fijan físicamente a nanopartículas de gel de ADN marcadas con DiD.
Fig. 12A-F. Los linfocitos B vírgenes transportan nanopartículas conjugadas en la superficie en órganos linfoides secundarios. (A) Imágenes comparativas de bioluminiscencia in vivo (panel superior) y fluorescencia (panel inferior) de ratones C57B1/6 2 días después de infusión de 10x106 linfocitos B vírgenes transgénicos para luciferasa de luciérnaga, marcados con CellTracker Green y decorados con nanopartículas de gel de ADN fluorescentes con DiD. Como alternativa, a los ratones se les inyectó de forma sistémica un número equivalente de nanopartículas de DiD libres solamente. Se muestra un ratón representativo de 3 ratones inyectados por grupo. (B) Se detectó fuerte fluorescencia en el tejido de DiD en ganglios linfáticos cervicales aislados por imágenes IVIS. (C) Histología del ganglio linfático cervical retirado. La microscopia confocal de alto aumento (panel de la izquierda) muestra los linfocitos B de migración dirigida al ganglio linfático con nanopartículas fluorescentes de DiD fijadas a la superficie. (D) Análisis de biodistribución de linfocitos B que portan liposomas cargados con indio y liposomas vacíos. (E) La sección histológica muestra que linfocitos B que han migrado de forma dirigida a ganglios linfáticos aún tienen nanopartículas (azul) fijadas a sus superficies. (F) Se inyectaron células de linfoma Ej-myc en los ratones y se dejó que se establecieran tumores en órganos linfoides sistémicos durante 14 días antes de la inyección de linfocitos B normales que portan partículas. La citometría de flujo muestra que linfocitos B que portan liposomas han entrado en los ganglios linfáticos.
Fig. 13A-D. Linfocitos T Pmel-1 conjugados con nanopartículas que liberan IL-15Sa/IL-21 proliferan de manera robusta in vivo y erradican los melanomas B16 establecidos. (A) Imágenes de bioluminiscencia doble in vivo de melanomas de pulmón B16F10 que expresan luciferasa de Gaussia y linfocitos T Pmel-1 que expresan luciferasa CBR en ratones C57B1/6 sometidos a irradiación subletal. Los tumores pulmonares establecidos mediante inyección en la vena de la cola de células B16F10 se trataron después de 6 días por infusión i.v. de 10 x 106 linfocitos T Pmel-1 CD8+ Vp13+. Un grupo de ratones recibió linfocitos T Pmel-1 conjugados con 100 nanopartículas de gel de ADN/célula que portaban una dosis total de 5 |jg de IL-15Sa/IL-21 (4,03 |jg de IL-15Sa 0,93 jg de IL-21), los grupos de control recibieron células Pmel-1 sin modificar y una sola inyección sistémica de las mismas dosis de IL-15Sa/IL-21 o células Pmel-1 en solitario. (B) Frecuencias de linfocitos T Pmel-1 CD8+ Vp13+ recuperados de ganglios linfáticos combinados de animales representativos 16 días después de la transferencia de linfocitos T. (C) Intensidades de la señal de CBR-luc de imágenes de bioluminiscencias secuenciales cada 2 días después de la transferencia de linfocitos T. Cada línea representa un animal mostrando cada punto el recuento de fotones en todo el animal. (D) Supervivencia de los animales después de tratamiento con linfocitos T ilustrado por curvas de Kaplan-Meier. Se muestran 6 ratones/grupo de tratamiento combinados de 3 experimentos independientes.
Fig. 14A-D. Células progenitoras hematopoyéticas (denominadas HSC en la figura) que portan nanopartículas cargadas con inhibidor de GSK-3p reconstituyen los animales destinatarios con una cinética rápida después de trasplantes de médula ósea sin influir en el potencial de diferenciación en múltiples estirpes. (A, B) Cinética del injerto de injertos de HSC transgénicos para luciferasa en destinatarios singénicos no transgénicos sometidos a radiación letal. Los ratones se trataron con una sola inyección en embolada del inhibidor de GSK-3p TWS119 (1,6 ng) en el día del trasplante, una dosis equivalente de TWS119 encapsulada en nanopartículas de gel de ADN fijadas a HSC o sin agente exógeno. Se tomaron imágenes de los ratones sometidos a trasplante para bioluminiscencia en todo el cuerpo cada 7 días durante 3 semanas. Se muestran las imágenes IVIS representativas (A) y los recuentos de fotones en todo el animal (B) para 9 ratones en total/condición de tratamiento. (C) Porcentaje de células derivadas del donador en los ratones destinatarios 2 semanas después del trasplante de Hs C GFP+ con o sin TWS119. *P < 0,001. (D) Promedio de la frecuencia de linfocitos B GFP+ derivados del donador, linfocitos T y células mieloides en ratones destinatarios 3 meses después del trasplante. Se analizaron 5 ratones/grupo.
Fig. 15. Conjugación de liposoma con linfocitos T pmel-1. Imagen confocal de liposomas (azul) conjugados con las superficies de linfocitos T pmel-1 (teñidos con CFSE en verde). Se muestran proyecciones 3D de secciones ópticas tomadas por microscopia confocal.
Descripción detallada de la invención
La invención contempla el suministro mediado por células y nanopartículas combinado de agentes incluyendo fármacos, como se expone en las reivindicaciones. Esta estrategia de suministro implica la conjugación de nanopartículas que comprenden uno o más agentes con una célula que puede migrar de forma dirigida a una región, tejido u órgano in vivo, produciendo de ese modo el suministro localizado y controlado de agentes in vivo. Esta estrategia ofrece ventajas significativas sobre las estrategias de la técnica anterior de administración de agentes en solitario o en vehículos de suministro no unidos a células tales como nanopartículas. Las estrategias anteriores tienen varios problemas de toxicidad sistémica. Las últimas estrategias tienen eliminación rápida de nanopartículas mediante el sistema reticuloendotelial incluyendo macrófagos y células de Kupffer del bazo y el hígado (como se muestra en los ejemplos), y limitaciones en la biodistribución basadas en exclusión/inclusión mediada por tamaño de los tejidos. Los mecanismos de eliminación evitan la liberación prolongada y, por tanto, la presencia mantenida del agente de interés in vivo. Además, la eliminación está potencialmente asociada con toxicidad en el hígado debido a la acumulación de nanopartículas en ese sitio, también como se muestra en los ejemplos.
La invención, por lo tanto, explota el uso de nanopartículas y células en el suministro localizado de agentes. Las células pueden funcionar simplemente como vehículos que migran de forma dirigida a regiones localizadas, tejidos u órganos dentro del organismo y, de ese modo, suministran el agente más específicamente dentro del organismo (es decir, de una manera paracrina), aunque en realizaciones más preferidas también contribuyen funcionalmente en el sitio diana final y pueden verse afectadas por el agente que están transportando (es decir, de una manera autocrina). En cualquier caso, las células se denominan en el presente documento células transportadoras para distinguirlas de las células en los sitios diana in vivo.
En una realización de ejemplo, la invención proporciona un método de suministro basado en conjugación de nanopartículas con linfocitos T reactivos a tumores, tales como los usados en tratamiento celular adoptivo (ACT). Una nanopartícula polimérica biodegradable funcionalizada, liposoma o vesícula polimérica puede cargarse con uno o más agentes que se liberan in vivo según se degrada la nanopartícula en respuesta a su entorno (normalmente un entorno acuoso). Esto se muestra esquemáticamente en la fig. 1a . Esta estrategia ofrece varias ventajas potenciales sobre el tratamiento con fármacos sistémicos incluyendo la exposición uniforme de linfocitos T ACT a los fármacos liberados, la acción centrada de los fármacos sobre los linfocitos T ACT y otros linfocitos T en el sitio diana, cantidades reducidas de fármacos administradas a un sujeto como resultado de una biodistribución que sigue el patrón de migración dirigida de los linfocitos T, exposición reducida de los sitios que no son diana al fármaco y, por tanto, probabilidad reducida de toxicidad inespecífica, y liberación prolongada y mantenida del fármaco durante el periodo de varios días.
En una realización de ejemplo adicional, los linfocitos T se conjugan con nanopartículas biodegradables que comprenden agentes inmunoestimuladores tales como citocinas, antígenos, anticuerpos, adyuvantes u otros agentes de activación que funcionan estimulando o potenciando las respuestas inmunitarias en el sitio diana, manteniendo la activación de los linfocitos T ACT transportadores y/o provocando muerte celular directa como indirectamente en el sitio diana. Se proporcionan agentes de ejemplo en el presente documento e incluyen, aunque sin limitación, complejos de IL-15/IL-15Ra (denominados en el presente documento IL-15 superagonista, descrito por Rubenstein et al., PNAS 103(24):9166-9171, 2006) y adyuvantes del ligando de TLR tales como MPLA e imiquimod. Dichas nanopartículas pueden contener otros agentes tales como agentes antineoplásicos o pueden usarse con otras nanopartículas que contienen dichos agentes. Los ligandos de TLR puede actuar como agentes inmunoestimuladores independientes de un efecto antígeno, en algunos casos. En otros casos más, los agentes pueden ser inmunomoduladores o incluso inmunoinhibidores, si se desea controlar o reducir una reacción inmunitaria in vivo, tal como sucede en trastornos autoinmunitarios como ejemplo.
En algunos casos, la invención contempla, aunque sin limitación, la potenciación (ya sea aditiva o superaditiva) del beneficio terapéutico que se proporciona por tratamiento celular adoptivo convencional que implica la transferencia de células que no están conjugadas con nanopartículas. Esta potenciación puede medirse por la reducción en la carga tumoral (o el volumen) en un sujeto que tiene un tumor.
Debe entenderse que los agentes transportados por las nanopartículas pueden funcionar sobre células o tejido en el sitio diana(es decir, una manera paracrina) y/o sobre las propias células transportadoras (es decir, una manera autocrina), como se representa en la fig. 1B. Por tanto, por ejemplo, cuando la célula es un linfocito T (u otra célula con capacidad de migración dirigida), el agente puede ser uno que estimule la célula transportadora y opcionalmente las células del mismo tipo en el sitio diana (por ejemplo, otros linfocitos T reactivos a tumores). En otras realizaciones, los agentes comprendidos dentro de las nanopartículas están destinados a actuar sobre células distintas de la célula transportadora. Los ejemplos incluyen agentes antineoplásicos que actúan sobre células tumorales y en general no tendrán efecto sobre los linfocitos T u otros tipos celulares transportadores.
Dirigir principalmente las células transportadoras, particularmente los linfocitos T transportadores, sirve para mantener su proliferación y funciones efectoras mientras se limita la activación no específica de los linfocitos T cercanos. Se ha informado de que las citocinas liberadas de manera autocrina pueden recapturarse casi cuantitativamente por la célula secretora, debido a la alta concentración local de citocina y su correspondiente tras la liberación desde la célula. (Monine et al., Biophys J 88(4): 2384, 2005; Lauffenburger et al., Proc Natl Acad Sci U S A 95(26): 15368, 1998; Joslin et al., J Cell Sci 120(Pt 20): 3688, 2007.) Se espera que citocinas tales como la IL-15 superagonista, por lo tanto, sean más potentes cuando se liberan de nanopartículas conjugadas con células transportadoras que cuando se administran por vía sistémica de forma no conjugada.
Un ejemplo de un método paracrino implica el suministro de uno o más adyuvantes a un sitio diana en solitario o junto con uno o más antígenos. Se proporcionan adyuvantes de ejemplo en el presente documento, y estos incluyen ligandos de TLR tales como MPLA e imiquimod. Estos agentes pueden actuar sobre células dendríticas y otras células presentadoras de antígeno presentes en un sitio diana (por ejemplo, un sitio de tumor o un sitio de inyección o un órgano o tejido linfoide secundario incluyendo, aunque sin limitación, el bazo y los ganglios linfáticos). Los métodos de suministro mediados por células de la invención aumentarán la concentración local de agentes en los sitio diana pertinentes y también limitarán la exposición sistémica global que se produce cuando se inyectan los mismos agentes en una forma no conjugada.
Por tanto, como otro ejemplo de uno o más agentes de acción paracrina, en casos donde el sitio diana es un tumor, las nanopartículas pueden comprender un agente antineoplásico y/o un adyuvante. Una vez suministrado al sitio de tumor diana, mediante linfocitos T reactivos a tumores, el agente antineoplásico se libera gradualmente provocando la muerte de células tumorales ya sea por necrosis o apoptosis. Dicha muerte celular va acompañada habitualmente de fragmentación y liberación de los componentes celulares incluyendo los antígenos específicos para las células tumorales. La liberación gradual de adyuvante desde las nanopartículas suministradas al sitio diana potenciará la respuesta inmunitaria específica de antígeno del organismo a los antígenos cancerosos liberados. La presencia de linfocitos T reactivos a tumores activados también sirve para localizar y potenciar la respuesta inmunitaria. Los linfocitos T reactivos a tumores se han descrito previamente e incluyen, sin limitación, linfocitos T reactivos de melanoma (por ejemplo, linfocitos T específicos de Melan A por Li et al., J Immunother. 31(1):81-8, 2008).
Otras diana tumorales incluyen, sin limitación, linfomas. En estos casos, pueden conjugarse linfocitos B y/o linfocitos T tales como linfocitos T de memoria centrales con nanopartículas que comprenden agentes antilinfoma. Dichos agentes son conocidos en la técnica e incluyen, sin limitación, anticuerpos antiCD20, tales como rituximab. Como se muestra en los ejemplos, los linfocitos B y los linfocitos T de memoria centrales pueden hacer migrar de forma dirigida a las nanopartículas en órganos linfoides, en particular el bazo y los ganglios linfáticos, y reducir la cantidad de nanopartículas que de lo contrario migrarían de forma dirigida y/o se depositarían en el hígado y el hueso. El uso de linfocitos como células transportadoras es ventajoso porque las células se obtienen fácilmente de sangre periférica de un sujeto y pueden migrar de forma dirigida de manera natural (o manipularse ex vivo para que migren de forma dirigida) a determinados tejidos (por ejemplo, tejidos linfoides) o tumores. La invención contempla que también pueden tratarse otras enfermedades hemáticas incluyendo, sin limitación, leucemia de una manera similar. Además de ACT específico de tumor, la invención posibilita otras diversas aplicaciones donde sería beneficioso el suministro localizado de uno o más agentes y opcionalmente células particulares. Como otro ejemplo, pueden conjugarse linfocitos T con nanopartículas que transportan cualquier diversidad y/o combinación de agentes y pueden dirigirse a innumerables sitios in vivo. En este caso, los linfocitos T pueden explotarse por su tropismo demostrado por diferentes tejidos. Los ejemplos incluyen linfocitos T vírgenes que pueden transportar nanopartículas cargadas de agente a órganos linfoides y el bazo (por ejemplo, para vacunación), linfocitos T de migración dirigida al intestino que pueden transportar nanopartículas cargadas de agente al intestino (por ejemplo, para el tratamiento de cáncer o trastornos autoinmunitarios), linfocitos T de migración dirigida a la piel que pueden suministrar nanopartículas cargadas de agente a las capas de la piel (por ejemplo, para el tratamiento de lesiones cutáneas o enfermedad autoinmunitaria), etc. Estos sitios de tejido pueden abordarse simplemente aislando linfocitos T con los receptores de migración dirigida apropiados de la sangre. Debe entenderse que los métodos divulgados en el presente documento pueden usarse para estimular (o potenciar) respuestas inmunitarias (por ejemplo, contra tumores o infecciones) o suprimir respuestas inmunitarias (por ejemplo, promoviendo la tolerancia a alérgenos o tejidos trasplantados).
También se divulga, pero no forma parte de la invención reivindicada, la carga de células progenitoras hematopoyéticas con nanopartículas que estimulan la proliferación y, en algunos casos, la autorrenovación. Los ejemplos demuestran la capacidad de conjugar nanopartículas que comprenden el inhibidor de la glucógeno sintasa cinasa 3 beta (GSK3-beta) TWS119 con estirpe negativa, Sca-1 positiva, c-kit positiva y el suministro de dichas células a un sujeto. Se observó biodistribución de las células administradas al fémur, húmero, esternón y bazo de los destinatarios, así como un potencial de diferenciación normal de dichas células varios meses después del trasplante. Los métodos descritos en el presente documento pueden combinarse con otras estrategias terapéuticas o de diagnóstico incluyendo, sin limitación, cirugía, radiación y/o quimioterapia incluyendo inmunoterapia.
Se ha descubierto, sorprendentemente, que el método es directo de implementar y, por tanto, podría incorporarse fácilmente a cualquier proceso clínico. El método requiere mezcla simple de las nanopartículas funcionalizadas y cargadas de agente con las células de interés, como se detalla en los ejemplos. Las nanopartículas pueden prepararse y almacenarse en un formato conveniente antes de su uso (por ejemplo, polvo liofilizado). Las nanopartículas entonces se reconstituyen en un vehículo adecuado y se incuban con la población celular durante un periodo breve de tiempo. Los tiempos de incubación pueden variar de 1-5 minutos, 1-10 minutos, 5-10 minutos, 5-15 minutos, 5-20 minutos, 5-30 minutos o 5-60 minutos. La mezcla después se lava, en algunos casos se incuba con un agente de bloqueo para inactivar los grupos reactivos en la nanopartícula y opcionalmente en la célula, se lavan de nuevo y después se formulan para su administración. La administración normalmente se produce mediante vía parental, muy preferiblemente inyección intravenosa.
Células transportadoras
Las células transportadoras son las células con las que se conjugan las nanopartículas y que, cuando se administran in vivo, migran de forma dirigida preferiblemente a uno o más sitios diana. Las células diana adecuadas se eligen basándose en su potencial de migración dirigida, su fenotipo de superficie celular (para conjugación con las nanopartículas) y su capacidad de transporte, pero no endocitan significativamente las nanopartículas. En algunas realizaciones descritas en el presente documento, los linfocitos T son células transportadoras adecuadas. Los linfocitos T pueden ser los linfocitos T CD4+ o CD8+. Otras células adecuadas incluyen linfocitos B, linfocitos NK, linfocitos NKT y células progenitoras hematopoyéticas incluyendo, sin limitación, células negativas a estirpe murina, positivas a Sca-1 y positivas a c-kit y sus equivalentes humanos. Los linfocitos B, por ejemplo, pueden usarse para transportar nanopartículas cargadas de antígeno a órganos linfoides para promover respuestas de anticuerpo o para regular reacciones alérgicas. Los macrófagos y células dendríticas normalmente no son vehículos adecuados para las nanopartículas a causa de sus capacidades de internalización/fagocitosis. Existen niveles sustanciales de grupos tiol libres (-SH) en las superficies de linfocitos T, linfocitos B y células progenitoras hematopoyéticas (datos no mostrados), facilitando de ese modo la conjugación de las nanopartículas con dichas células.
Las células transportadoras preferiblemente también pueden extravasar de los vasos sanguíneos (particularmente cuando se administran por inyección intravenosa) y de ese modo entran en los tejidos u órganos diana. Los glóbulos rojos normalmente no pueden salir del torrente sanguíneo. Por consiguiente, una clase importante de células transportadoras es las células nucleadas. Esta clase por definición excluye los glóbulos rojos.
También se divulgan, aunque no forman parte de la invención reivindicada, las células transportadoras aisladas. Las células transportadoras aisladas son células que se han separado del entorno en que se producen de forma natural (es decir, no están presentes in vivo). Los linfocitos T in vitro son un ejemplo de una célula aislada.
Las células transportadoras preferiblemente son autólogas para el sujeto que se está tratando, sin embargo, algunas realizaciones de la invención contemplan células no autólogas (aunque preferiblemente de MHC coincidente).
Las células transportadoras preferiblemente tienen semividas in vivo, después de la administración (o reinfusión, en algunos casos) de al menos 48 horas, más preferiblemente al menos 3 días, al menos 4 días, al menos 5 días, al menos 6 días, al menos 7 días o más.
Las células pueden genomanipularse para que expresen uno o más factores incluyendo, sin limitación, moléculas o receptores coestimuladores incluyendo receptores quiméricos. En otras realizaciones, las células no se genomanipulan. En algunas de estas realizaciones, las células transportadoras están aisladas y son de origen natural (es decir, no se han genomanipulado o manipulado de otro modo).
Dependiendo de su naturaleza y función, las células pueden manipularse antes de la conjugación con las nanopartículas. Las células, sin embargo, no tienen que modificarse en la superficie para facilitar la conjugación de las nanopartículas. La invención, en algunas de sus realizaciones, en su lugar aprovecha los grupos reactivos que existen normalmente sobre la superficie celular sin tener que incorporar grupos reactivos u otras entidades en la superficie celular. Como resultado, dichas células no requieren la presencia de entidades exógenas tales como anticuerpos o fragmentos de anticuerpo, entre otros, en su superficie para conjugarse con las nanopartículas.
Dicha manipulación también puede implicar la activación de las células, como se realiza rutinariamente para linfocitos T. Las células pueden expandirse y/o activarse (o estimularse, ya que los términos se usan indistintamente en el presente documento) in vitro antes de mezclar con las nanopartículas. Los protocolos de expansión y activación variarán dependiendo del tipo celular, pero pueden incluir incubación con una o más citocinas, incubación con uno o más tipos celulares, incubación con uno o más antígenos, etc. Si la célula transportadora es un linfocito T, entonces la activación puede realizarse incubando las células con IL-2, IL-15, IL-15 superagonista, moléculas coestimuladoras tales como B7, B7.2, CD40, anticuerpos contra diversas moléculas superficiales de linfocitos T incluyendo anticuerpos contra receptores de superficie celular, anticuerpos antiCD3, anticuerpos antiCD28, anticuerpos antiCTLA-4, anticuerpos antiCD40L y similares. En algunas realizaciones, las células y más particularmente los linfocitos T no se recubren con anticuerpos exógenos sobre su superficie celular (es decir, las células no se han puesto en contacto con anticuerpos o fragmentos de anticuerpo in vitro antes de la administración).
La expansión puede medirse por ensayos de proliferación que implican la incorporación de nucleótidos radiomarcados tales como timidina tritiada. La activación puede medirse por la producción de citocinas tales como IL-2, gamma-IFN, IL-1, IL-4, IL-6 y TNF, entre otras. Se conocen en la técnica otras maneras de medir la expansión y la activación.
Las células transportadoras pueden seleccionarse antes de la administración a un sujeto para enriquecer y, por tanto, administrar cantidades mayores de dichas células en volúmenes más pequeños y/o para eliminar otras células, potencialmente indeseadas, de la composición administrada. La selección puede implicar selección positiva o negativa incluyendo, por ejemplo, protocolos de enriquecimiento basados en columna o placa que son conocidos en la técnica.
Los linfocitos T y B pueden recogerse de la sangre periférica de un sujeto.
Las células progenitoras hematopoyéticas pueden obtenerse de varias fuentes incluyendo, aunque sin limitación, sangre de cordón umbilical, médula ósea, sangre periférica movilizada y en algunos casos, células madre embrionarias diferenciadas.
Las células progenitoras hematopoyéticas se han caracterizado en la técnica. Dichas células en el ser humano en general tienen mínimamente un fenotipo CD34+, aunque también pueden ser CD59+, Thy1/CD90+, CD38lo/neg, CD33- y/o c-kit/CD117+. También se caracterizan por no expresar marcadores específicos de estirpe. Pueden recogerse de médula ósea, sangre de cordón umbilical o sangre periférica usando columnas de afinidad, microesferas magnéticas, clasificación celular activada por fluorescencia (FACS), alguna combinación de las mismas y similares. Estas células tienen la capacidad de repoblar una o más estirpes hematopoyéticas tras el trasplante. Preferiblemente, estas células repueblan más de una estirpe, e incluso más preferiblemente, todas las estirpes. La repoblación o población de estirpes como se usa en el presente documento se refiere a la diferenciación de la célula madre en una o más estirpes de modo que la descendencia de la célula madre contribuya a constituir esa estirpe en el sujeto. Sin embargo, no requiere que el compartimiento de estirpe completo derive de las células trasplantadas, sin embargo, en algunos casos esto puede suceder.
Las células madre aisladas puede obtenerse fraccionando una población de células heterogénea de acuerdo con uno o más marcadores incluyendo, aunque sin limitación, marcadores de superficie celular.
Las células transportadoras pueden ser células eucariotas, tales como células de mamífero (por ejemplo, células humanas). Como alternativa, pueden ser células que no son de mamífero. La invención también posibilita que las células transportadoras puedan ser células procariotas (por ejemplo, células bacterianas). Varios tipos de células bacterianas son de particular interés. Por ejemplo, está en estudio Salmonella typhimurium atenuada como vector candidato para suministro de vacuna oral (Xiang et al., Immunol Rev 222:117, 2008; e Iweala et al., J Immunol 183(4):2252, 2009) y se ha demostrado que las bacterias E. coli manipuladas tienen capacidad de migración dirigida específica a tumores poco oxigenados (Cheong et al., Science 314(5803): 1308, 2006). Las bacterias ofrecen nuevos modos de administración y posibilidades de dirección a un sitio de tejido, tal como administración oral y la capacidad de dirigir productos terapéuticos al intestino y tejidos linfoides asociados con el intestino. Dichos vectores microbianos pueden ofrecer ventajas con respecto a las células hospedadoras autólogas en términos de crear sistemas de nanopartículas celulares listos para su uso existentes. La conjugación de partículas con microbios puede conseguirse usando el mismo conjunto de estrategias químicas descritas para células de mamífero. En algunos casos, puede usarse la eliminación temporal de recubiertas flagelares de los microbios (por ejemplo, mediante cizallamiento mecánico simple como se describe por Rosu et al., J Bacteriol 188(14):5196, 2006) para conseguir una conjugación óptima de las partículas con los cuerpos celulares microbianos. La capacidad de potenciar la actividad de estas células conjugando nanopartículas o micropartículas cargadas de fármaco con las mismas para el cotransporte a sus sitios de tejido diana puede usarse para alterar su eficacia terapéutica o alterar la biodistribución de las partículas sintéticas como se describe en el presente documento con otros transportadores celulares. La capacidad de las partículas de fármaco sintéticas de cargarse con productos terapéuticos micromoleculares hace que esta estrategia sea complementaria a la genomanipulación del microbio.
Nanopartículas
Como se usa en el presente documento, las nanopartículas son partículas coloidales sólidas usadas para suministrar agente. Las nanopartículas no son liposomas, como se usan en el presente documento. Las nanopartículas no son virus o partículas de los mismos. Las nanopartículas también tienen que distinguirse de las películas u otras matrices poliméricas estructuralmente estratificadas, ya que las nanopartículas están compuestas de uno o más polímeros solidificados que se disponen de manera aleatoria. Las nanopartículas son preferiblemente biodegradables y, por tanto, normalmente no son magnéticas. Las nanopartículas biodegradables pueden sintetizarse usando los métodos conocidos en la técnica incluyendo, sin limitación, evaporación de disolvente, microencapsulación de fusión en caliente, eliminación de disolvente y secado por pulverización. Se describen métodos de ejemplo para sintetizar nanopartículas en el presente documento en los ejemplos, así como por Bershteyn et al., Soft Matter 4:1787-1787, 2008 y en el documento US 2008/0014144 A1.
En algunas realizaciones, las nanopartículas están compuestas de un núcleo interno de ácido nucleico. Dichas "nanopartículas de ADN" (o nanopartículas de gel de ADN) se describen en mayor detalle en la solicitud de Estados Unidos publicada n.° US 20070148246. Debe entenderse que el núcleo de ácido nucleico de dichas partículas pueda actuar como estructura para los agentes que se suministran in vivo y/o pueden actuar como el propio agente. Un protocolo de ejemplo para sintetizar nanopartículas de ADN se proporciona en los ejemplos.
Las nanopartículas liberan su "carga" de agente durante varios días en función de su perfil de degradación in vivo. Como se analiza en el presente documento, las nanopartículas son de naturaleza biodegradable y, por tanto, se degradan gradualmente en un entorno acuoso tal como se produce in vivo. Si los agentes se dispersan por todas las nanopartículas, entonces su liberación se producirá según se degraden las capas más externas de la nanopartícula o según se agranden los poros dentro de la nanopartícula. Se han realizado estudios cinéticos de liberación y demuestran que pueden liberarse proteínas y fármacos micromoleculares desde dichas nanopartículas durante ciclos temporales que varían de 1 día a al menos 2 semanas. Las nanopartículas preferiblemente no se engullen por sus células transportadoras u otras células en el sitio diana. En su lugar, funcionan liberando gradualmente su carga en el entorno del sitio o sitios diana.
El diámetro de las nanopartículas varía de 1-1000 nanómetros (nm). En algunas realizaciones, su diámetro varía en tamaño de 20-750 nm, o de 20-500 nm o de 20-250 nm. En algunas realizaciones, su diámetro varía en tamaño de 50-750 nm, o de 50-500 nm, o de 50-250 nm o de aproximadamente 100-300 nm. En algunas realizaciones, su diámetro es de aproximadamente 100, de aproximadamente 150, de aproximadamente 200 nm, de aproximadamente 250 nm o de aproximadamente 300 nm. Como se usa de los diámetros de nanopartículas, el término "aproximadamente" significa /- 5 % del valor absoluto indicado. Por tanto, debe entenderse que, aunque estas partículas se denominan en el presente documento nanopartículas, la invención pretende abarcar también micropartículas.
Como se analiza en el presente documento, las nanopartículas pueden sintetizarse para que comprendan uno o más grupos reactivos en su superficie exterior para su reacción con grupos reactivos en las células transportadoras (por ejemplo, leucocitos). Estos grupos reactivos de las nanopartículas incluyen, sin limitación, grupos principales de maleimida reactivos con tiol, grupos haloacetilo (por ejemplo, yodoacetilo), grupos imidoéster, ésteres de N-hidroxisuccinimida, grupos disulfuro de piridilo y similares. Estos grupos reactivos reaccionan con grupos en la superficie de la célula transportadora y, por tanto, las nanopartículas se unen a la superficie celular. Se entenderá que cuando se modifica una superficie de esta manera, las nanopartículas están destinadas para su uso con células transportadoras específicas que tienen grupos reactivos "complementarios" (es decir, grupos reactivos que reaccionan con los de las nanopartículas). En algunas realizaciones, las nanopartículas no se integrarán en la bicapa lipídica que comprende la superficie celular. Normalmente, las nanopartículas no se fagocitarán (o internalizarán) por las células transportadoras.
En algunas realizaciones, las nanopartículas no comprenden anticuerpos o fragmentos de anticuerpo en su superficie, mientras que en otras realizaciones sí. En algunas realizaciones, las nanopartículas no comprenden anticuerpos o fragmentos de anticuerpo que son específicos para restos de la superficie de linfocitos T (o restos exógenos recubiertos sobre una superficie de linfocitos T como otros anticuerpos o fragmentos de anticuerpo), mientras que en otras realizaciones sí. Por tanto, en algunas realizaciones, las propias nanopartículas no estimulan la activación de las células transportadoras simplemente uniéndose a la célula transportadora. En otras realizaciones, sin embargo, las nanopartículas estimulan la activación de las células transportadoras uniéndose a la célula transportadora (por ejemplo, la unión de la nanopartícula provoca la reticulación de los restos de la superficie celular y esto activa la célula transportadora). Las nanopartículas se conjugan covalentemente (o se fijan o unen, ya que los términos se usan indistintamente en el presente documento), con los células transportadoras. La conjugación covalente normalmente proporciona una asociación más estable (y, por tanto, más larga) entre las nanopartículas y las células transportadoras. La conjugación covalente también proporciona estabilidad y, por tanto, suministro localizado más prolongado de los agentes in vivo
En algunos casos, la fijación covalente puede conseguirse en un proceso de dos etapas en que las células transportadoras se incuban en primer lugar con nanopartículas que portan maleimida para permitir la conjugación con la superficie celular, seguido de PEGilación in situ con polietilenglicol (PEG) terminado en tiol para tapar los grupos maleimida restantes de las partículas y evitar la reticulación mediada por partículas de las células. Con esta estrategia, se han conjugado cantidades sustanciales de nanopartículas con diámetros en el intervalo de 100­ 300 nm con tipos celulares usados habitualmente en tratamiento celular, incluyendo linfocitos T CD8+ y células progenitoras murinas de estirpe "Sca-1+c-kit+ (datos no mostrados). Esta estrategia permite que partículas que varían de liposomas simples (por ejemplo, con un núcleo cargado de fármaco acuoso) hasta nanopartículas basadas en polímero o ADN recubiertas de lípidos complejos se fijen establemente e las células vivas. De forma importante, la química de enlace es benigna y atóxica como se evidencia en parte por la conjugación de nanopartículas recubiertas con lípido de diámetro de hasta 139 (±29) ~200 nm con la superficie de células sin ningún efecto perjudicial(datos no mostrados).
Las nanopartículas unidas a las células transportadoras, tales como linfocitos o células progenitoras hematopoyéticas, permanecen ubicadas en la superficie celular como se revela por el seccionamiento óptico con microscopia confocal, microscopia electrónica de barrido y por ensayos de internalización de citometría de flujo, incluso después de estimulación in vitro prolongada (datos no mostrados). Las células fagocíticas, tales como células dendríticas inmaduras, pueden internalizar de forma eficaz nanopartículas funcionalizadas con maleimida después de una corta incubación (datos no mostrados) y, por tanto, no son adecuadas como células transportadoras.
Polímeros sintéticos de ejemplo que pueden usarse para formar las nanopartículas biodegradables incluyen, sin limitación, poliésteres alifáticos, poli(ácido láctico) (PLA), poli(ácido glicólico) (PGA), copolímeros de ácido láctico y ácido glicólico (PLGA), policaprolactona (PCL), polianhídridos, poli(orto)ésteres, poliuretanos, poli(ácido butírico), poli(ácido valérico) y poli(láctido-co-caprolactona), y polímeros naturales tales como alginato y otros polisacáridos incluyendo dextrano y celulosa, colágeno, derivados químicos de los mismos, incluyendo sustituciones, adiciones de grupos químicos tales como, por ejemplo, alquilo, alquileno, hidroxilaciones, oxidaciones y otras modificaciones realizadas rutinariamente por los expertos en la materia), albúmina y otras proteínas hidrófilas, ceína y otras prolaminas y proteínas hidrófobas, copolímeros y mezclas de los mismos. En general, estos materiales se degradan por hidrólisis enzimática o exposición al agua in vivo, por erosión superficial o másica.
Las nanopartículas también comprenden preferiblemente una bicapa lipídica en su superficie más externa. Esta bicapa puede estar compuesta de uno o más lípidos del mismo tipo o diferente tipo. Ejemplos incluyen, sin limitación, fosfolípidos tales como fosfocolinas y fosfoinositoles. Ejemplos específicos incluyen, sin limitación, DMPC, DOPC, DSPC y otros diversos lípidos tales como los indicados a continuación para los liposomas.
Liposomas
La invención también posibilita el uso de liposomas en lugar de nanopartículas en las diversas realizaciones descritas en el presente documento. Los liposomas son vesículas cerradas pequeñas que comprenden al menos una bicapa lipídica y un compartimento acuoso interno. Como se usa en el presente documento, los liposomas no son nanopartículas y, por tanto, no forman parte de la invención reivindicada. Los liposomas pueden ser aniónicos, neutros o catiónicos. Pueden ser unilaminares o multilaminares. El liposoma puede comprender, sin limitación, lípidos de vesícula unilaminar, lípidos de vesícula multilaminar y lípidos extruidos incluyendo DOTMA, DOTAP, DOTIM, DDAB, en solitario o junto con colesterol para producir dOt Ma y colesterol, DOTAp y colesterol, DOTIM y colesterol y DDAB y colesterol. Los métodos para la preparación de lípidos de vesícula multilaminar son conocidos en la técnica (véase, por ejemplo, el documento US 6693086). Los lípidos extruidos se preparan de una manera similar, pero después se extruyen a través de filtros de tamaño decreciente, como se describe en Templeton et al., Nature Biotech, 15:647-652, 1997.
Los liposomas pueden modificarse en la superficie durante o después de la síntesis para que incluyan grupos reactivos complementarios a los grupos reactivos en las células transportadoras. Dichos grupos reactivos incluyen, sin limitación, grupos maleimida. Como un ejemplo, los liposomas pueden sintetizarse para que incluyan fosfolípidos conjugados con maleimida tales como, sin limitación, DSPE-MaL-PEG2000.
Un protocolo de síntesis de ejemplo para liposomas se proporciona en los ejemplos.
Agentes
Cualquier agente puede suministrarse usando los métodos de la invención con la condición de que puedan cargarse en las nanopartículas proporcionadas en el presente documento. Por ejemplo, el agente debe poder resistir la síntesis de nanopartículas y opcionalmente el proceso de almacenamiento. Las nanopartículas pueden sintetizarse y almacenarse en, por ejemplo, una forma liofilizada. Los agentes, si se incorporan en las nanopartículas durante la síntesis, deben ser estables durante dichos procedimientos y tiempos de almacenamiento.
El agente puede ser, sin limitación, una proteína, un polipéptido, un péptido, un ácido nucleico, una partícula similar a virus, un esteroide, un proteoglucano, un lípido, un carbohidrato y análogos, derivados, mezclas, fusiones, combinaciones o conjugados de los mismos. El agente puede ser un profármaco que se metaboliza y, por tanto, se convierte in vivo en su forma activa (y/o estable).
Los agentes pueden ser de origen natural o no ser de origen natural. Los agentes de origen natural incluyen los que pueden sintetizarse por los sujetos a los que se administran las nanopartículas. Los que no son de origen natural son los que no existen en la naturaleza normalmente, ya sea que se produzcan por plantas, animales, microbios u otro organismo vivo.
Una clase de agentes son los agentes basados en péptidos tales como proteínas (mono o multicatenarias) y péptidos. Ejemplos incluyen anticuerpos, anticuerpos monocatenarios, fragmentos de anticuerpo, enzimas, cofactores, receptores, ligandos, factores de transcripción y otros factores reguladores, algunos antígenos (como se analiza a continuación), citocinas, quimiocinas y similares. Estos agentes basados en péptido pueden ser de origen natural o no, pero pueden sintetizarse dentro del sujeto, por ejemplo, a través del uso de células genomanipuladas. Otra clase de agentes que puede suministrarse de manera localizada usando las nanopartículas de la invención incluye los agentes que no se basan en péptidos y que no podrían suministrarse por las células transferidas. Ejemplos incluyen compuestos químicos que no son de origen natural o compuestos químicos que no se sintetizan de forma natural por células de mamífero (y en particular, humanas).
Diversos agentes que se usan actualmente para tratamiento pueden suministrarse de acuerdo con la invención y estos incluyen, sin limitación, agentes inmunomoduladores tales como agentes inmunoestimuladores y agentes inmunoinhibidores, antígenos, adyuvantes, citocinas, quimiocinas, agentes antineoplásicos, agentes antiinfecciosos, ácidos nucleicos, anticuerpos o fragmentos de los mismos, proteínas de fusión tales como proteínas de fusión de citocina-anticuerpo, proteínas de fusión a Fc y similares.
Agentes de obtención de imágenes. (Con fines de referencia, no forma parte de la invención) Como se usa en el presente documento, un agente de obtención de imágenes es un agente que emite una señal directa o indirectamente, permitiendo de ese modo su detección in vivo. Los agentes de obtención de imágenes tales como agentes de contraste y agentes radiactivos que pueden detectarse usando técnicas de imágenes médicas tales como dispositivos de exploración de medicina nuclear y resonancia magnética (RM). Los agentes de obtención de imágenes para resonancia magnética (RM) incluyen Gd(DOTA), óxido de hierro o nanopartículas de oro; los agentes de obtención de imágenes para medicina nuclear incluyen 201T1, radionúclido 99 mTc emisor gamma; los agentes de obtención de imágenes para tomografía por emisión de positrones (TEP) incluyen isótopos emisiones de positrones, (18)F-fluorodesoxiglucosa ((18)FDG), (18)F-fluoruro, cobre-64, gadoamida y radioisótopos de Pb(II) tales como 203 Pb y 11In; agentes de obtención de imágenes para imágenes de fluorescencia in vivo tales como tintes fluorescentes o nanopartículas conjugadas con tinte. En otras realizaciones, el agente a suministrar se conjuga, o fusiona con, o mezcla o combina con un agente de obtención de imágenes.
Agentes inmunoestimuladores. Como se usa en el presente documento, un agente inmunoestimulador es un agente que estimula una respuesta inmunitaria (incluyendo la potenciación de una respuesta inmunitaria preexistente) en un sujeto al que se administra, ya sea en solitario o en combinación con otro agente. Ejemplos incluyen antígenos, adyuvantes (por ejemplo, ligando de TLR tales como imiquimod, imidazoquinolina, ácidos nucleicos que comprenden un dinucleótido CpG no metilado, monofosforil lípido A u otros derivados de lipopolisacárido, ARN monocatenario o bicatenario, flagelina, muramil dipéptido), citocinas incluyendo interleucinas (por ejemplo, IL-2, IL-7, IL-15 (o formas superagonistas/mutantes de estas citocinas), IL-12, IFN-gamma, IFN-alfa, g M-CSF, FLT3-ligando, etc.), anticuerpos inmunoestimuladores (por ejemplo, antiCTLA-4, antiCD28, antiCD3 o fragmentos monocatenarios/de anticuerpo de estas moléculas) y similares.
Antígenos. El antígeno puede ser un antígeno canceroso, un autoantígeno, El antígeno puede ser de naturaleza peptídica, lipídica o glucídica, pero no se limita a ello.
Antígenos cancerosos. Un antígeno canceroso es un antígeno que se expresa preferentemente por células cancerosas (es decir, se expresa a niveles mayores en células cancerosas que en células no cancerosas) y, en algunos casos, se expresa únicamente por células cancerosas. El antígeno canceroso puede expresarse dentro de una célula cancerosa o sobre la superficie de la célula cancerosa. El antígeno canceroso puede ser MART-1/Melan-A, gp100, proteína de unión a adenosina desaminasa (ADAbp), FAP, ciclofilina b, antígeno asociado colorrectal (CRC)-- c 017-1A/GA733, antígeno carcinoembrionario (CEA), CAP-1, CAP-2, etv6, AML1, antígeno específico prostático (AEP), PSA-1, PSA-2, PSA-3, antígeno de membrana específico prostático (PSMA), receptor de linfocitos T/cadena Cd3-zeta y CD20. El antígeno canceroso puede seleccionarse del grupo que consiste en MAGE-A1, MAGE-A2, MAGE-A3, MAGE-A4, MAGE-A5, MAGE-A6, MAGE-A7, MAGE-A8, MAGE-A9, MAGE-A10, MAGE-A11, MAGE-A12, MAGE-Xp2 (MAGE-B2), MAGE-Xp3 (MAGE-B3), MAGE-Xp4 (MAGE-B4), MAGE-C1, MAGE-C2, MAGE-C3, MAGE-C4, MAGE-C5). El antígeno canceroso puede seleccionarse del grupo que consiste en GAGE-1, GAGE-2, GAGE-3, GAGE-4, GAGE-5, GAGE-6, GAGE-7, GAGE-8, GAGE-9. El antígeno canceroso puede seleccionarse del grupo que consiste en BAGE, RAGE, LAGE-1, NAG, GnT-V, MUM-1, CDK4, tirosinasa, p53, familia MUC, HER2/neu, p21ras, RCAS1, a-fetoproteína, E-cadherina, a-catenina, p-catenina, Y-catenina, p120ctn, gp100Pmel117, PRAME, NY-ESO-1, cdc27, proteína de poliposis adenomatosa coli (APC), fodrina, Connexin 37, Igidiotipo, p15, gp75, gangliósido GM2, gangliósido GD2, proteínas del virus del papiloma humano, familia Smad de antígenos tumorales, Imp-1, P1A, antígeno nuclear codificado por EBV (EBNA)-1, glucógeno fosforilasa cerebral, SSX-1, SSX-2 (HOM-MEL-40), SSX-1, SSX-4, SSX-5, SCP-1 y CT-7, CD20 y c-erbB-2.
Adyuvantes. El adyuvante puede ser, sin limitación, alumbre (por ejemplo, hidróxido de aluminio, fosfato de aluminio); saponinas purificadas de la corteza del árbol Q. saponaria tal como QS21 (un glucolípido que eluye en el 21.er pico con fraccionamiento de HPLC; Antigenics, Inc., Worcester, Mass.); poli[di(carboxilatofenoxi)fosfazeno (polímero PCPP; Virus Research Institute, EE. UU.), ligando Flt3, factor de elongación de Leishmania (una proteína purificada de Leishmania; Corixa Corporation, Seattle, Wash.), ISCOMS (complejos inmunoestimuladores que contienen saponinas mixtas, lípidos y forman partículas del tamaño de un virus con poros que pueden alojar el antígeno; CSL, Melbourne, Australia), Pam3Cys, SB-AS4 (sistema adyuvante n.° 4 de SmithKline Beecham que contiene alumbre y MPL; SBB, Bélgica), copolímeros de bloque no iónicos que forman micelas tales como CRL 1005 (estas contienen una cadena lineal de polioxipropileno hidrófobo flanqueada por cadenas de polioxietileno, Vaxcel, Inc., Norcross, Ga.) y Montanide IMS (por ejemplo, IMS 1312, nanopartículas basadas en agua combinadas con un inmunoestimulante soluble, Seppic)
Los adyuvantes pueden ser ligandos de TLR. Los adyuvantes que actúan a través de TLR3 incluyen, sin limitación, ARN bicatenario. Los adyuvantes que actúan a través de TLR4 incluyen, sin limitación, derivados de lipopolisacáridos tales como monofosforil lípido A (MPLA; Ribi ImmunoChem Research, Inc., Hamilton, Mont.) y muramil dipéptido (MDP; Ribi) y treonil muramil dipéptido (t-MDP; Ribi); OM-174 (un disacárido de glucosamina relacionado con lípido A; OM Pharma SA, Meyrin, Suiza). Los adyuvantes que actúan a través de TLR5 incluyen, sin limitación, flagelina. Los adyuvantes que actúan a través de TLR7 y/o TLR8 incluyen ARN monocatenario, oligorribonucleótidos (ORN), compuestos de bajo peso molecular sintéticos tales como imidazoquinolinaminas (por ejemplo, imiquimod, resiquimod). Los adyuvantes que actúan a través de TLR9 incluyen ADN de origen vírico o bacteriano u oligodesoxinucleótidos sintéticos (ODN), tal como CpG ODN. Otra clase de adyuvantes es moléculas que contienen fosforotioato tales como análogos nucleotídicos de fosforotioato y ácidos nucleicos que contienen enlaces de cadena principal de fosforotioato.
Agentes inmunoinhibidores. Como se usa en el presente documento, un agente inmunoinhibidor es un agente que inhibe una respuesta inmunitaria en un sujeto al que se administra, ya sea en solitario o en combinación con otro agente. Ejemplos incluyen esteroides, ácido retinoico, dexametasona, ciclofosfamida, anticuerpo o fragmento de anticuerpo antiCD3 y otros inmunosupresores.
Agentes antineoplásicos. Como se usa en el presente documento, un agente antineoplásico es un agente que inhibe al menos parcialmente el desarrollo o la progresión de un cáncer, incluyendo inhibir en su totalidad o en parte los síntomas asociados con el cáncer incluso si es solamente a corto plazo. Varios agentes antineoplásicos pueden clasificarse como agentes que dañan el ADN y estos incluyen inhibidores de la topoisomerasa (por ejemplo, etopósido, ramptotecina, topotecán, tenipósido, mitoxantrona), agentes alquilantes del ADN (por ejemplo, cisplatino, mecloretamina, ciclofosfamida, ifosfamida, melfalán, corambucilo, busulfán, tiotepa, carmustina, lomustina, carboplatino, dacarbazina, procarbazina), agentes que inducen rotura de la hebra de ADN (por ejemplo, bleomicina, doxorrubicina, daunorrubicina, idarrubicina, mitomicina C), agentes antimicrotúbulos (por ejemplo, vincristina, vinblastina), agentes antimetabólicos (por ejemplo, citarabina, metotrexato, hidroxiurea, 5-fluorouracilo, floxuridina, 6-tioguanina, 6-mercaptopurina, fludarabina, pentostatina, clorodesoxiadenosina), antraciclinas, alcaloides de la vinca o epipodofilotoxinas.
Ejemplos de agentes antineoplásicos incluyen, sin limitación, acivicina; aclarrubicina; clorhidrato de acodazol; acronina; adozelesina; aldesleucina; altretamina; ambomicina; acetato de ametantrona; aminoglutetimida; amsacrina; anastrozol; antramicina; asparaginasa; asperlina; azacitidina; azetepa; azotomicina; batimastat; Benzodepa; bicalutamida; clorhidrato de bisantreno; dimesilato de bisnafida; bizelesina; sulfato de bleomicina; Bortezomib (VELCADE); brequinar de sodio; bropirimina; busulfáno; cactinomicina; calusterona; caracemida; carbetimer; carboplatino (una pauta que contiene platino); carmustina; clorhidrato de carubicina; carzelesina; cedefingol; clorambucilo; cirolemicina; cisplatino (una pauta que contiene platino); cladribina; mesilato de crisnatol; ciclofosfamida; citarabina; dacarbazina; dactinomicina; daunorrubicina; decitabina; dexormaplatino; dezaguanina; diazicuona; docetaxel (TAXOTERE); doxorrubicina; droloxifeno; dromostanolona; duazomicina; edatrexato; eflornitina; elsamitrucina; enloplatino; enpromato; epipropidina; epirrubicina; erbulozol; erlotinib (TARCEVA), esorrubicina; estramustina; etanidazol; etopósido; etoprina; fadrozol; fazarabina; fenretinida; floxuridina; fludarabina; 5-fluorouracilo; flurocitabina; fosquidona; fostriecina; gefitinib (IRESSA), gemcitabina; hidroxiurea; idarrubicina; ifosfamida; ilmofosina; Imatinib mesilato (GLEEVAC); interferón alfa-2a; Interferón alfa-2b; interferón alfa-nl; Interferón alfa-n3; interferón beta-1a; Interferón gamma-I b; iproplatino; irinotecán; lanreotida; lenalidomida (REVLIMID, REVIMID); letrozol; leuprolida; liarozol; lometrexol; lomustina; losoxantrona; masoprocol; maitansina; mecloretamina; megestrol; melengestrol; melfalán; menogarilo; mercaptopurina; metotrexato; metoprina; meturedepa; mitindomida; mitocarcina; mitocromina; mitogilina; mitomalcina; mitomicina; mitosper; mitotano; mitoxantrona; ácido micofenólico; nocodazol; nogalamicina; ormaplatino; oxisurano; paclitaxel; pemetrexed (ALIMTA), pegaspargasa; peliomicina; pentamustina; pentomona; peplomicina; perfosfamida; pipobromano; piposulfano; isetionato de piritrexim; piroxantrona; plicamicina; plomestano; porfímero; porfiromicina; prednimustina; procarbazina; puromicina; pirazofurina; riboprina; rogletimida; safingol; semustina; simtrazeno; sitoglusida; esparfosato; esparsomicina; espirogermanio; espiromustina; espiroplatino; estreptonigrina; estreptozocina; sulofenur; talisomicina; tamsulosina; taxol; taxotere; tecogalán; tegafur; teloxantrona; temoporfina; temozolomida (TEMODAR); tenipósido; teroxirona; testolactona; talidomida (THALOMID) y derivados de la misma; tiamiprina; tioguanina; tiotepa; tiazofurina; tirapazamina; topotecán; toremifeno; trestolona; triciribina; trimetrexato; triptorelina; tubulozol; uramustina; uredepa; vapreotida; verteporfina; vinblastina; vincristina; vindesina; vinepidina; vinglicinato; vinleurosina; vinorelbina; vinrosidina; vinzolidina; vorozol; zeniplatino; zinostatina; zorrubicina.
El agente antineoplásico puede ser un inhibidor enzimático incluyendo, sin limitación, inhibidor de tirosina cinasa, un inhibidor de CDK, un inhibidor de MAP cinasa o un inhibidor de EGFR. El inhibidor de tirosina cinasa puede ser, sin limitación, genisteína (4',5,7-trihidroxiisoflavona), tirfostina 25 (3,4,5-trihidroxifenil), metilen]-propanedinitrilo, herbimicina A, daidzeína (4',7-dihidroxiisoflavona), AG-126, trans-1-(3'-carboxi-4'-hidroxifenil)-2-(2",5"-dihidroxifenil)etano, o ácido HDBA (2-hidroxi5-(2,5-dihidroxibencilamino)-2-hidroxibenzóico. El inhibidor de CDK puede ser, sin limitación, p21, p27, p57, p15, p16, p18 o p19. El inhibidor de MAP cinasa puede ser, sin limitación, KY12420 (C23H24O8), cNl-1493, PD98059 o 4-(4-fluorofenil)-2-(4-metilsulfinil fenil)-5-(4-piridil) 1H-imidazol. El inhibidor de EGFR puede ser, sin limitación, erlotinib (TARCEVA), gefitinib (IRESSA), w HiP97 (derivado de quinazolina), LFM-A12 (análogo de metabolito de leflunomida), ABX-EGF, lapatinib, canertinib, z D-6474 (ZAc T iMA), Ae E788 y AG1458.
El agente antineoplásico puede ser un inhibidor de VEGF incluyendo, sin limitación, bevacizumab (AVASTIN), ranibizumab (LUCENTIS), pegaptanib (MACUGEN), sorafenib, sunitinib (SUTENT), vatalanib, ZD-6474 (ZACTIMA), anecortave (RETAANE), lactato de escualamina y semaforina.
El agente antineoplásico puede ser un anticuerpo o un fragmento de anticuerpo incluyendo, sin limitación, un anticuerpo o un fragmento de anticuerpo incluyendo, aunque sin limitación, bevacizumab (AVASTIN), trastuzumab (HERCEPTIN), alemtuzumab (CAMPATH, indicado para leucemia linfocítica crónica de linfocitos B), gemtuzumab (MYLOTARG, hP67.6, antiCD33, indicado para leucemia tal como leucemia mieloide aguda), rituximab (Rituxan), tositumomab (BEXXAR, antiCD20, indicado para neoplasia de linfocitos B), MDX-210 (anticuerpo biespecífico que se une simultáneamente al producto proínico oncogénico HER-2/neu y receptores de Fc de tipo I para inmunoglobulina G (IgG) (Fc gamma RI)), oregovomab (OVAREX, indicado para cáncer de ovario), edrecolomab (PANOREX), daclizumab (ZENAPAX), palivizumab (SYNAGIS, indicado para afecciones respiratorias tales como infección por RSV), ibritumomab tiuxetán (ZEVALIN, indicado para linfoma no hodgkiniano), cetuximab (ERBITUX), MDX-447, MDX-22, MDX-220 (antiTAG-72), IOR-C5, IOR-T6 (antiCD1), IOREGF/R3, celogovab (ONCOSCINT OV103), epratuzumab (LYMPHOCIDE), pemtumomab (THERAGYN) y Gliomab-H (indicado para cáncer cerebral, melanoma).
Agentes de diferenciación hematopoyética. El agente puede ser uno que estimula la diferenciación de las células progenitoras hematopoyéticas hacia una o más estirpes. Ejemplos incluyen, sin limitación, IL-3, G-CSF, GM-CSF, M-CSF, trombopoyetina, eritropoyetina, Wnt5A, Wnt11A y similares.
Agentes de autorrenovación hematopoyética. El agente puede ser uno que estimula la autorrenovación de las células progenitoras hematopoyéticas. Ejemplos incluyen, sin limitación, el ligando kit, inhibidores de GSK3-beta, Wnt5A junto con SLF, activadores de Notch1, inhibidores de Lnk, prostaglandina E2 (PGE2) y agentes que estimulan la ruta de PGE2 incluyendo PGE2, PGI2, ácido linoleico, 13(s)-hOd E, LY171883, ácido Mead, ácido eicosatrienoico, ácido epoxieicosatrienoico, ONO-259, Cay1039, un agonista del receptor PGE2, de 16,16-dimetil PGE2, 19(R)-hidroxi PGE2, éster p-(p-acetamidobenzamido)fenílico de 16,16-dimetil PGE2, 11-desoxi-16,16-dimetil PGe2,9-desoxi-9-metilen-16,16-dimetil PGE2, 9-desoxi-9-metilen PGE2, butaprost, sulprostona, serinol amida de PGE2, éster metílico de PGE2, 16-fenil tetranor PGE2,15(S)-15-metil PGE2,15(R)-15-metil PGE2, BIO, 8-bromo-AMPc, forscolina, Bapta-AM, fendilina, nicardipina, nifedipina, pimozida, estrofantidina, lanatósido, L-Arg, nitroprúsido de sodio, vanadato de sodio, bradicinina, mebeverina, flurandrenolida, atenolol, pindolol, gaboxadol, ácido quinurénico, hidralazina, tiabendazol, bicuclina, vesamicol, peruvósido, imipramina, clorpropamida, 1,5-pentametilentetzol, 4-aminopiridina, diazóxido, benfotiamina, ácido 12-metoxidodecenoico, N-formil-Met-Leu-Phe, galamina, IAA 94, clorotrianiseno y los derivados de los mismos y similares.
Agentes antiinfecciosos. (Para referencia, no forma parte de la invención reivindicada) El agente puede ser un agente antiinfeccioso incluyendo, sin limitación, un agente antibacteriano, un agente antivírico, un agente antiparasitario, un agente antifúngico y un agente antimicobacteriano.
Los agentes antibacterianos pueden ser, sin limitación, antibióticos de p-lactama, penicilinas (tales como penicilinas naturales, aminopenicilinas, penicilinas resistentes a penicilinasa, carboxi penicilinas, ureido penicilinas), cefalosporinas (cefalosporinas de primera generación, segunda generación y tercera generación), otras p-lactamas (tales como as imipenem, monobactamas), inhibidores de p-lactamasa, vancomicina, aminoglucósidos y espectinomicina, tetraciclinas, cloranfenicol, eritromicina, lincomicina, clindamicina, rifampina, metronidazol, polimixinas, sulfonamidas y trimetoprim, o quinolinas.
Otros antibacterianos pueden ser, sin limitación, acedapsona; acetosulfona de sodio; alamecina; alexidina; amdinocilina; amdinocilina pivoxil; amiciclina; amifloxacina; mesilato de amifloxacina; amicacina; sulfato de amicacina; ácido aminosalicílico; aminosalicilato de sodio; amoxicilina; anfomicina; ampicilina; ampicilina sódica; apalcilina sódica; apramicina; aspartocina; sulfato de astromicina; avilamicina; avoparcina; azitromicina; azlocilina; azlocilina sódica; clorhidrato de bacampicilina; bacitracina; metilen disalicilato de bacitracina; bacitracina de cinc; bambermicinas; benzoilpas de calcio; beritromicina; sulfato de betamicina; biapenem; biniramicina; clorhidrato de bifenamina; bispiritiona magsulfex; buticacina; sulfato de butirosina; sulfato de capreomicina; carbadox; carbenicilina disódica; carbenicilina indanil sódica; carbenicilina fenil sódica; carbenicilina potásica; carumonam de sodio; cefaclor; cefadroxil; cefamandol; nafato de cefamandol; cefamandol sódico; cefaparol; cefatrizina; cefazaflur sódico; cefazolina; cefazolina sódica; cefbuperazona; cefdinir; cefepima; clorhidrato de cefepima; cefetecol; cefixima; clorhidrato de cefmenoxima; cefmetazol; cefmetazol sódico; cefonicid monosódico; cefonicid sódico; cefoperazona sódica; ceforanida; cefotaxima sódico; cefotetán; cefotetán disódico; clorhidrato de cefotiam; cefoxitina; cefoxitina sódica; cefpimizol; cefpimizol sódico; cefpiramida; cefpiramide sódica; sulfato de cefpiroma; cefpodoxima proxetil; cefprozil; cefroxadina; cefsulodina sódica; ceftazidima; ceftibuteno; ceftizoxima sódica; ceftriaxona sódica; cefuroxima; cefuroxima axetil; cefuroxima pivoxetil; cefuroxima sódica; cefacetril sódico; cefalexina; clorhidrato de cefalexina; cefaloglicina; cefaloridina; cefalotina sódica; cefapirina sódica; cefradina; clorhidrato de cetociclina; cetofenicol; cloranfenicol; palmitato de cloranfenicol; complejo pantotenato de cloranfenicol; succinato de cloranfenicol sódico; fosfanilato de clorhexidina; cloroxilenol; bisulfato de clortetraciclina; clorhidrato de clortetraciclina; cinoxacina; ciprofloxacina; clorhidrato de ciprofloxacina; cirolemicina; claritromicina; clorhidrato de clinafloxacina; clindamicina; clorhidrato de clindamicina; clorhidrato de palmitato de clindamicina; fosfato de clindamicina; clofazimina; cloxacilina benzatina; cloxacilina sódica; cloxiquina; colistimetato sódico; sulfato de colistina; cumermicina; cumermicina sódica; ciclacilina; cicloserina; dalfopristina; dapsona; daptomicina; demeclociclina; clorhidrato de demeclociclina; demeciclina; denofungina; diaveridina; dicloxacilina; dicloxacilina sódica; sulfato de dihidroestreptomicina; dipiritiona; diritromicina; doxiciclina; doxiciclina de calcio; doxiciclina fosfatex; hiclato de doxiciclina; droxacina sódica; enoxacina; epicilina; clorhidrato de epitetraciclina; eritromicina; acistrato de eritromicina; estolato de eritromicina; etilsuccinato de eritromicina; gluceptato de eritromicina; lactobionato de eritromicina; propionato de eritromicina; estearato de eritromicina; clorhidrato de etambutol; etionamida; fleroxacina; floxacilina; fludalanina; flumequine; fosfomicina; fosfomicina trometamina; fumoxicilina; cloruro de furazolio; tartrato de furazolio; fusidato sódico; ácido fusídico; sulfato de gentamicina; gloximonam; gramicidina; haloprogina; hetacilina; hetacilina de potasio; hexedina; ibafloxacina; imipenem; isoconazol; isepamicina; isoniazid; josamicina; sulfato de canamicina; citasamicina; levofuraltadona; levopropilcilina de potasio; lexitromicina; lincomicina; clorhidrato de lincomicina; lomefloxacina; clorhidrato de lomefloxacina; mesilato de lomefloxacina; loracarbef; mafenida; meclociclina; sulfosalicilato de meclociclina; fosfato de megalomicina potásica; mequidox; meropenem; metaciclina; clorhidrato de metaciclina; metenamina; hipurato de metenamina; mandelato de metenamina; meticilina sódica; metioprim; clorhidrato de metronidazol; fosfato de metronidazol; mezlocilina; mezlocilina sódica; minociclina; clorhidrato de minociclina; clorhidrato de mirincamicina; monensina; monensina sódica; nafcilina sódica; nalidixato sódico; ácido nalidíxico; natamicina; nebramicina; palmitato de neomicina; sulfato de neomicina; undecilenato de neomicina; dulfato de netilmicina; neutramicina; nifuradeno; nifuraldezona; nifuratel; nifuratrona; nifurdazil; nifurimida; nifurpirinol; nifurquinazol; nifurtiazol; nitrociclina; nitrofurantoina; nitromida; norfloxacina; novobiocina sódica; ofloxacina; ormetoprima; oxacilina sódica; oximonam; oximonam sódica; ácido oxolínico; oxitetraciclina; oxitetraciclina de calcio; clorhidrato de oxitetraciclina; paldimicina; paraclorofenol; paulomicina; pefloxacina; mesilato de pefloxacina; penamecilina; penicilina G benzatina; penicilina G potásica; penicilina G procaina; penicilina G sódica; penicilina V; penicilina V benzatina; penicilina V hidrabamina; penicilina V potásica; pentizidona sódica; aminosalicilato de fenilo; piperacilina sódica; pirbenicilina sódica; piridicilina sódica; clorhidrato de pirlimicina; clorhidrato de pivampicilina; pamoato de pivampicilina; probenato de pivampicilina; sulfato de polimixina B; porfiromicina; propicacina; pirazinamida; piritiona de cinc; acetato de quindecamina; quinupristina; racefenicol; ramoplanina; ranimicina; relomicina; repromicina; rifabutina; rifametano; rifamexil; rifamida; rifampina; rifapentina; rifaximina; rolitetraciclina; nitrato de rolitetraciclina; rosaramicina; butirato de rosaramicina; propionato de rosaramicina; fosfato de rosaramicina sódica; estearato de rosaramicina; rosoxacina; roxarsona; roxitromicina; sanciclina; sanfetrinem de sodio; sarmoxicilina; sarpicilina; escopafungina; sisomicina; sulfato de sisomicina; esparfloxacina; clorhidrato de espectinomicina; espiramicina; clorhidrato de estalimicina; estefimicina; sulfato de estreptomicina; estreptonicozid; sulfabenz; sulfabenzamida; sulfacetamida; sulfacetamida sódica; sulfacitina; sulfadiazina; sulfadiazina sódica; sulfadoxina; sulfaleno; sulfamerazina; sulfameter; sulfametazina; sulfametizol; sulfametoxazol; sulfamonometoxina; sulfamoxol; sulfanilato de cinc; sulfanitrán; sulfasalazina; sulfasomizol; sulfatiazol; sulfazamet; sulfisoxazol; sulfisoxazol acetilo; sulfisoxazol diolamina; sulfomixina; sulopenem; sultamicilina; suncilina sódica; clorhidrato de talampicilina; teicoplanina; clorhidrato de temafloxacina; temocilina; tetraciclina; clorhidrato de tetraciclina; complejo de fosfato de tetraciclina; tetroxoprim; tianfenicol; tifencilina de potasio; ticarcilina de cresil sodio; ticarcilina de disodio; ticarcilina de monosodio; ticlatona; cloruro de tiodonio; tobramicina; sulfato de tobramicina; tosufloxacina; trimetoprim; sulfato de trimetoprim; trisulfapirimidinas; troleandomicina; sulfato de trospectomicina; tirotricina; vancomicina; clorhidrato de vancomicina; virginiamicina; o zorbamicina.
Los agentes antibacterianos pueden ser, sin limitación, miambutol (clorhidrato de etambutol), dapsona (4,4'-diaminodifenilsulfona), gránulos de Paser (gránulos de ácido aminosalicílico), priftina (rifapentina), pirazinamida, isoniazid, rifadina (rifampina), rifadina IV, rifamato (rifampina e isoniazid), rifater (rifampina, isoniazid y pirazinamida), sulfato de estreptomicina o Trecator-SC (etionamida).
Los agentes antivíricos pueden ser, sin limitación, amantidina y rimantadina, ribivarina, aciclovir, vidarabina, trifluorotimidina, ganciclovir, zidovudina, retinovir e interferones.
Los agentes antivíricos pueden incluir además, sin limitación, acemanano; aciclovir; aciclovir sódico; adefovir; alovudina; alvircept sudotox; clorhidrato de amantadina; aranotina; arildona; mesilato de atevirdina; avridina; cidofovir; cipamfilina; clorhidrato de citarabina; mesilato de delavirdina; desciclovir; didanosina; disoxaril; edoxudina; enviradeno; enviroxima; famciclovir; clorhidrato de famotina; fiacitabina; fialuridina; fosarilato; foscarnet de sodio; fosfonet de sodio; ganciclovir; ganciclovir sódico; idoxuridina; cetoxal; lamivudina; lobucavir; clorhidrato de memotina; metisazona; nevirapina; penciclovir; pirodavir; ribavirina; clorhidrato de rimantadina; mesilato de saquinavir; clorhidrato de somantadina; sorivudina; estatolona; estavudina; clorhidrato de tilorona; trifluridina; clorhidrato de valaciclovir; vidarabina; fosfato de vidarabina; fosfato de vidarabina sódica; viroxima; zalcitabina; zidovudina; zinviroxima o inhibidores de la integrasa.
Los agentes antifúngicos pueden ser, sin limitación, imidazoles y triazoles, antibióticos macrólidos de polieno, griseofulvina, anfotericina B y flucitosina. Los antiparasitarios incluyen metales pesados, quinolinas antipalúdicas, antagonistas del folato, nitroimidazoles, bencimidazoles, avermectinas, praxicuantel, inhibidores de la ornitina descarboxilasa, fenoles (por ejemplo, bitionol, niclosamida); alcaloides sintéticos (por ejemplo, deshidroemetina); piperazinas (por ejemplo, dietilcarbamazina); acetanilida (por ejemplo, furonato de diloxanida); quinolinas halogenadas (por ejemplo, yodoquinol (diyodohidroxiquina)); nitrofuranos (por ejemplo, nifurtimox); diamidinas (por ejemplo, pentamidina); tetrahidropirimidina (por ejemplo, pamoato de pirantel); o naftilamina sulfatada (por ejemplo, suramina).
Otros agentes antiinfecciosos pueden ser, sin limitación, clorhidrato de difloxacina; bromuro de lauril isoquinolinio; moxalactama disódica; ornidazol; pentisomicina; clorhidrato de sarafloxacina; inhibidores de la proteasa del VIH y otros retrovirus; inhibidores de la integrasa del VIH y otros retrovirus; cefaclor (ceclor); aciclovir (zovirax); norfloxacina (noroxina); cefoxitina (mefoxina); cefuroxima axetil (ceftina); ciprofloxacina (cipro); clorhidrato de aminacrina; cloruro de benzetonio: bitionolato sódico; bromclorenona; peróxido de carbamida; cloruro de cetalconio; cloruro de cetilpiridinio: clorhidrato de clorhexidina; clioquinol; bromuro de domifeno; fenticlor; cloruro de fludazonio; fucsina, básico; furazolidona; violeta de gentiana; halquinoles; hexaclorofeno: peróxido de hidrógeno; ictamol; imidecil yodo; yodo; alcohol isopropílico; acetato de mafenida; meraleína sódica; cloruro de mercufenol; mercurio, amoniado; cloruro de metilbenzetonio; nitrofurazona; nitromersol; clorhidrato de octenidina; oxicloroseno; oxicloroseno sódico; paraclorofenol, alcanfor; permanganato de potasio; povidona yodada; cloruro de sepazonio; nitrato de plata; sulfadiazina, plata; simclosena; timerfonato sódico; timerosal; o trocloseno potásico.
Agentes de ácido nucleico. Los ácidos nucleicos que pueden suministrarse a un sujeto de acuerdo con la invención incluyen ADN de origen natural o no natural (incluyendo ADNc, ADN genómico, ADN nuclear, ADN mitocondrial), ARN (incluyendo ARNm, ARNr, ARNt), oligonucleótidos, una molécula que forma triple hélice, ácidos nucleicos inmunoestimuladores tales como los descritos en el documento US 6194388, ARN interferente pequeño (ARNip) usado para modular la expresión génica, oligonucleótidos de antisentido usados para modular la expresión génica, aptámeros, ribozimas, un gen o fragmento génico, una secuencia reguladora, incluyendo análogos, derivados y combinaciones de los mismos. Estos ácidos nucleicos pueden administrarse puros o en complejo con otra entidad, por ejemplo, para facilitar su unión a y/o captación por tejidos y/o celulas diana.
Otros agentes. (Para referencia, no forma parte de la invención reivindicada) El agente puede ser, sin limitación, agente adrenérgico; esteroide adrenocortical; supresor adrenocortical; aversivo alcohólico; antagonista de aldosterona; desintoxicante de amoniaco; aminoácido; agente contra esclerosis lateral amiotrófica; anabólico; analéptico; analgésico; andrógeno; anestésico; anoréctico; anoréxico; activador de la pituitaria anterior; supresor de la pituitaria anterior; antihelmíntico; agente antiacné; antiadrenérgico; antialérgico; antiamébico; antiandrógeno; antianémico; antiangina; ansiolítico; antiartrítico; antiasmático incluyendo agonistas p-adrenérgicos, metilxantinas, agentes estabilizantes de mastocitos, anticolinérgicos, esteroides adrenocorticales tales como glucocorticoesteroides; antiateroscleróticos; anticolelíticos; anticolelitogénicos; anticolinérgicos; anticoagulantes; anticoccidiales; anticonvulsivos; antidepresivos; antidiabéticos; antidiarreicos; antidiuréticos; antídotos; antidiscinéticos; antieméticos; antiepilépticos; antiestrogénicos; antifibrinolíticos; antiglaucoma; antihemorrágicos; antihemorreológicos; antihistamínicos; antihiperlipidémicos; antihiperlipoproteinémicos; antihipertensivos; antihipotensivos; antiinfecciosos; antiinflamatorios; agente antiqueratinizante; antimigrañas; antimitóticos; antimicóticos; antieméticos; antineutropénicos; agente antiobsesivo; antioxidante; antiparkinsoniano; antiperistálticos; antineumoquísticos; agente antihipertrofia prostática; antiprotozoicos; antipruríticos; antisoriásicos; antisicóticos; antirreumáticos; antiesquistosomiales; antiseborreicos; antisecretores; antiespasmódicos; antitrombóticos; antitusivos; antiulcerantes; antiurolíticos; supresores del apetito; reguladores de la glucosa sanguínea; inhibidor de la reabsorción ósea; broncodiladores; inhibidor de la anhidrasa carbónica; depresor cardiaco; cardioprotector; cardiotónico; agente cardiovascular; agente contra isquemia cerebral; colerético; colinérgico; antagonista colinérgico; desactivador de la colinesterasa; coccidiostático; adyuvante cognitivo; potenciador cognitivo; agente para la conjuntivitis; agente de contraste; depresor; auxiliar de diagnóstico; diurético; agente dopaminérgico; ectoparasiticida; emético; inhibidor enzimático; estrógeno; agonista del receptor de estrógenos; fibrinolítico; agente fluorescente; aceptor de radicales libres de oxígeno; supresor del ácido gástrico; efector de la motilidad gastrointestinal; agente geriátrico; glucocorticoesteroide; principio estimulador de las gónadas; estimulador del crecimiento capilar; hemostático; agente activo herbal; antagonistas del receptor de histamina H2; hormona; hipocolesterolémico; hipoglucémico; hipolipidémico; hipotensivo; inhibidor de la HMGCoA reductasa; tratamiento complementario de la impotencia; agente contra la enfermedad inflamatoria del intestino; queratolítico; agonista de LHRH; agente para trastornos hepáticos; luteolisina; adyuvante de memoria; potenciador del rendimiento mental; mineral; regulador del estado de ánimo; mucolítico; agente protector de la mucosa; agente contra la esclerosis múltiple; midriático; descongestivo nasal; neuroléptico; agente de bloqueo neuromuscular; neuroprotector; antagonista de NMDA; derivado de esterol no hormonal; nutriente; oxitócico; agente contra la enfermedad de Paget; activador del plasminógeno; antagonista del factor activador de plaquetas; inhibidor de la agregación plaquetaria; agentes posapoplejía y postraumatismo craneal; progestina; prostaglandina; inhibidor del crecimiento de la próstata; protirotropina; sicotrópico; agente radioactivo; relajante; agente contra la rinitis; escabicida; agente esclerosante; sedante; sedante-hipnótico; antagonista selectivo de adenosina Al; agentes secuestrantes; antagonista de serotonina; inhibidor de serotonina; antagonista del receptor de serotonina; esteroide; estimulante; supresor; hormona tiroidea; inhibidor de la tiroides; tiromimético; tranquilizante; agente contra angina inestable; uricosúrico; vasoconstrictor; vasodilator; vulnerario; agente para la curación de heridas; o inhibidor de la xantina oxidasa.
Sujetos
La invención puede ponerse en práctica en casi cualquier tipo de sujeto que probablemente se beneficie del suministro localizado de agentes como se contempla en el presente documento. Los sujetos humanos son sujetos preferidos en algunas realizaciones de la invención. Los sujetos también incluyen animales tales como mascotas domésticas (por ejemplo, perros, gatos, conejos, hurones, etc.), ganado o animales de granja (por ejemplo, vacas, cerdos, ovejas, pollos y otras aves de corral), caballos tales como caballos purasangre, animales de laboratorio (por ejemplo, ratones, ratas, conejos, etc.) y similares. Los sujetos también incluyen peces y otras especies acuáticas.
Los ensayos para diagnostica diversas afecciones, posibilitados por la invención son conocidos en la técnica y serán habituales para los facultativos médicos normales. Estos ensayos de laboratorio incluyen, sin limitación, análisis microscópicos, ensayos dependientes de cultivo (tales como cultivos), y ensayos de detección de ácido nucleico. Estos incluyen preparaciones, microscopia potenciada por tinción, microscopia inmunitaria (por ejemplo, FISH), microscopia de hibridación, aglutinación de partículas, enzimoinmunoanálisis de adsorción, ensayos de cribado de orina, hibridación de sondas de ADN, ensayos serológicos, etc. El facultativo médico en general también recogerá un historial completo y realizará una exploración física completa además de ejecutar los ensayos de laboratorio enumerados anteriormente.
Un sujeto que tenga cáncer es un sujeto que tiene células cancerosas detectables. Un sujeto en riesgo de desarrollar cáncer es un sujeto que tiene una probabilidad mayor de la normal de desarrollar cáncer. Estos sujetos incluyen, por ejemplo, sujetos que tienen una anomalía genética que se ha demostrado que está asociada con una mayor probabilidad de desarrollar un cáncer, sujetos que tienen una disposición familiar al cáncer, sujetos expuestos a agentes causantes de cáncer (es decir, carcinógenos) tales como tabaco, asbesto u otras toxinas químicas, y sujetos previamente tratados para cáncer y en remisión aparente.
La invención también posibilita que los conjugados de célula transportadora-nanopartícula se administren a sujetos que necesitan reconstitución hematopoyética. Dichos sujetos pueden haberse expuesto a un acontecimiento mielosupresor deliberado o accidental, incluyendo, sin limitación, quimioterapia mielosupresora y/o radiación en todo el organismo, que puede administrarse como parte de una pauta terapéutica para cánceres hemáticos o cánceres metastásicos. La invención posibilita administrar a dichos sujetos células progenitoras hematopoyéticas conjugadas con nanopartículas que comprenden agentes que pueden estimular la proliferación de las células progenitoras. En algunos casos, los agentes también pueden ser agentes de diferenciación (es decir, agentes que dirigen las células progenitoras y su descendencia a diferenciarse, opcionalmente hacia todas las estirpes o un subconjunto de estirpes. En otros casos, los agentes pueden ser agentes de autorrenovación (es decir, agentes que dirigen las células progenitoras a autorrenovarse). En otros casos más, las células transportadoras pueden conjugarse con nanopartículas que comprenden ambos tipos de agentes, ya sea que dichos agentes están en la misma nanopartícula o en diferentes nanopartículas. Además, la invención posibilita además que la exposición del sujeto a estos diferentes agentes puede escalonarse (por ejemplo, la exposición a los agentes de autorrenovación puede producirse antes de la exposición a los agentes de diferenciación).
Cáncer
La invención proporciona los conjugados de nanopartícula-célula para la administración a sujetos que tienen un cáncer de tumor sólido. El cáncer puede ser carcinoma, sarcoma o melanoma. Los carcinomas incluyen, sin limitación, carcinoma basocelular, cáncer de las vías biliares, cáncer de vejiga, cáncer de mama, cáncer cervicouterino, coriocarcinoma, cáncer del SNC, cáncer de colon y recto, cáncer de riñón o de células renales, cáncer de laringe, cáncer de hígado, cáncer pulmonar microcítico, cáncer pulmonar no microcítico (CPNM, incluyendo adenocarcinoma, carcinoma gigantocelular (o en grano de avena) y carcinoma escamocelular), cáncer de la cavidad bucal, cáncer de ovario, cáncer pancreático, cáncer de próstata, cáncer de piel (incluyendo cáncer basocelular y cáncer escamocelular), cáncer de estómago, cáncer testicular, cáncer de tiroides, cáncer de útero, cáncer rectal, cáncer del sistema respiratorio y cáncer de sistema urinario.
Los sarcomas son neoplasias mesenquimatosas infrecuentes que surgen en el hueso (osteosarcomas) y tejidos blandos (fibrosarcomas). Los sarcomas incluyen, sin limitación, liposarcomas (incluyendo liposarcomas mixoides y liposarcomas pleiomórficos), leiomiosarcomas, rabdomiosarcomas, tumores malignos de la vaina de los nervios periféricos (también denominados schwannomas malignos, neurofibrosarcomas o sarcomas neurogénicos), tumores de Ewing (incluyendo sarcoma de Ewing del hueso, sarcoma de Ewing extraesquelético (es decir, que no es en el hueso), y tumor neuroectodérmico primitivo), sarcoma sinovial, angiosarcomas, hemangiosarcomas, linfangiosarcomas, sarcoma de Kaposi, hemangioendotelioma, tumor desmoide (también denominado fibromatosis agresiva), dermatofibrosarcoma protuberante (DFSP), histiocitoma fibroso maligno (HFM), hemangiopericitoma, mesenquimoma maligno, sarcoma alveolar de las partes blandas, sarcoma epitelioide, sarcoma de células claras, tumor desmoplásico microcítico, tumor estromal gastrointestinal (TEGI) (también conocido como sarcoma estromal GI), y condrosarcoma.
Los melanomas son tumores que surgen del sistema melanocítico de la piel y otros órganos. Ejemplos de melanoma incluyen, sin limitación, melanoma sobre lentigo maligno, melanoma de diseminación superficial, melanoma nodular y melanoma lentiginoso acro.
El cáncer puede ser un linfoma de tumor sólido. Ejemplos incluyen linfoma de Hodgkin, linfoma no hodgkiniano y linfoma de linfocitos B.
El cáncer puede ser, sin limitación, cáncer de hueso, cáncer de cerebro, cáncer de mama, cáncer colorrectal, cáncer de tejido conjuntivo, cáncer del sistema digestivo, cáncer de endometrio, cáncer esofágico, cáncer ocular, cáncer de la cabeza y el cuello, cáncer gástrico, neoplasia intraepitelial, melanoma neuroblastoma, linfoma no hodgkiniano, cáncer pulmonar no microcítico, cáncer de próstata, retinoblastoma o rabdomiosarcoma.
Todas las indicaciones médicas siguientes (infección, asma, alergia, enfermedad autoinmunitaria y tratamiento de trasplantes) no forman parte de la invención reivindicada.
Infección
La invención posibilita la administración de los conjugados de nanopartícula-célula a sujetos que tienen o están en riesgo de desarrollar una infección tal como una infección bacteriana, una infección vírica, una infección fúngica, una infección parasitaria o una infección micobacteriana.
La infección bacteriana puede ser, sin limitación, una infección por E. coli, una infección estafilocócica, una infección por estreptocócica, una infección por Pseudomonas, infección por Clostridium dUficile, infección por Legionella, infección por Pneumococcus, infección por Haemophilus, infección por Klebsiella, infección por Enterobacter, infección por Citrobacter, infección por Neisseria, infección por Shigella, infección por Salmonella, infección por Listeria, infección por Pasteurella, infección por Streptobacillus, infección por Spirillum, infección por Treponema, infección por Actinomyces, infección por Borrelia, infección por Corynebacterium, infección por Nocardia, infección por Gardnerella, infección por Campylobacter, infección por Spirochaeta, infección por Proteus, infección por Bacteriodes, infección por H. pylori o infección de carbunco.
La infección micobacteriana puede ser, sin limitación tuberculosis o lepra respectivamente provocada por las especies M. tuberculosis y M. leprae.
La infección vírica puede ser, sin limitación, una infección por el virus del herpes simple 1, una infección por el virus del herpes simple 2, infección por citomegalovirus, infección por el virus de la hepatitis A, infección por el virus de la hepatitis B, infección por el virus de la hepatitis C, infección por el virus del papiloma humano, infección por el virus de Epstein-Barr, infección por rotavirus, infección por adenovirus, infección por el virus de la gripe A, infección por H1N1 (gripe porcina), infección por el virus sincitial respiratorio, infecciones por el virus de la varicela-zóster, infección de viruela, infección de viruela del mono, infección por SARS o infección por gripe aviar.
La infección fúngica puede ser, sin limitación, candidiasis, tiña, histoplasmosis, blastomicosis, paracoccidioidomicosis, criptococosis, aspergilosis, cromomicosis, infecciones de micetoma, seudalesqueriasis o infección de pitiriasis versicolor.
La infección por parásitos puede ser, sin limitación, amebiasis, infección por Trypanosoma cruzi, fascioliasis, leishmaniasis, infecciones por Plasmodium, oncocercosis, paragonimiasis, infección por Trypanosoma brucei, infección por Pneumocystis, infección por Trichomonas vaginalis, infección por Taenia, infección por Hymenolepsis, infecciones por Echinococcus, esquistosomiasis, neurocisticercosis, infección por Necator americanus o infección por Trichuris trichuria.
Alergia y asma
La invención posibilita la administración de los conjugados de nanopartícula-célula a sujetos que tienen o están en riesgo de desarrollar una alergia o asma. Una alergia es una hipersensibilidad adquirida a un alérgeno. Las afecciones alérgicas incluyen, aunque sin limitación, eccema, rinitis alérgica o coriza, fiebre del heno, asma bronquial, urticaria (habones) y alergias a los alimentos, y otras afecciones atópicas. Las alergias en general están causadas por la generación de anticuerpos IgE contra alérgenos inofensivos. El asma es un trastorno del sistema respiratorio caracterizado por inflamación, estrechamiento de las vías respiratorias y reactividad aumentada de las vías respiratorias a agentes inhalados. El asma frecuentemente, aunque no exclusivamente, está asociado con síntomas atópicos o alérgicos. La administración de citocinas Th1, tales como IL-12 e IFN-gamma, de acuerdo con la invención puede usarse para tratar la alergia o el asma.
Enfermedad autoinmunitaria
La invención posibilita la administración de los conjugados de nanopartícula-célula a sujetos que tienen o están en riesgo de desarrollar una enfermedad autoinmunitaria. La enfermedad autoinmunitaria es una clase de enfermedades en que los propios anticuerpos del sujeto reaccionan con tejido del hospedador o en que los linfocitos T efectores inmunitarios son autorreactivo a péptidos propios endógenos y provocan destrucción del tejido. Por tanto, se monta una respuesta inmunitaria contra los propios antígenos del sujeto, denominados autoantígenos. Las enfermedades autoinmunitarias en general se consideran desviadas a Th1. Como resultado, una inducción de una respuesta inmunitaria Th2 o citocinas de tipo Th2 puede ser beneficiosa. Dichas citocinas incluyen IL-4, IL-5 e IL-10. Las enfermedades autoinmunitarias incluyen, aunque sin limitación, artritis reumatoide, enfermedad de Crohn, esclerosis múltiple, lupus eritematoso sistémico (LES), encefalomielitis autoinmunitaria, miastenia grave (MG), tiroiditis de Hashimoto, síndrome de Goodpasture, pénfigo (por ejemplo, pénfigo vulgar), enfermedad de Graves, anemia hemolítica autoinmunitaria, púrpura trombocitopénica autoinmunitaria, esclerodermia con anticuerpos anticolágeno, enfermedad mixta del tejido conjuntivo, polimiositis, anemia perniciosa, enfermedad de Addison idiopática, infertilidad asociada a autoinmunidad, glomerulonefritis (por ejemplo, glomerulonefritis con semilunas, glomerulonefritis proliferativa), penfigoide ampolloso, síndrome de Sjogren, resistencia a la insulina y diabetes mellitus autoinmunitaria.
Tratamiento de trasplantes
Los métodos proporcionados en el presente documento también posibilitan la modulación de las respuesta inmunitarias después de tratamiento de trasplantes. El éxito de un trasplante a menudo está limitado por el rechazo del tejido trasplantado por el sistema inmunitario del organismo. Como resultado, los destinatarios de un trasplante habitualmente se inmunodeprimen durante periodos prolongados de tiempo para permitir que el tejido trasplantado sobreviva. La invención posibilita el suministro localizado de inmunomoduladores y, particularmente, agentes inmunoinhibidores, a los sitios de trasplante para minimizar el rechazo del trasplante. Por tanto, la invención posibilita la administración de los conjugados de nanopartícula-célula a sujetos que van a someterse, se están sometiendo o se han sometido a un trasplante.
Cantidades eficaces, pautas, formulaciones
Los agentes tienen que administrarse en cantidades eficaces. Una cantidad eficaz es una dosificación del agente suficiente para proporcionar un resultado médicamente deseable. La cantidad eficaz variará con la afección en particular que se está tratando, la edad y el estado físico del sujeto que se esté tratando, la gravedad de la afección, la duración del tratamiento, la naturaleza del tratamiento concurrente o politerapia (si la hay), la vía específica de administración y factores similares dentro del conocimiento y la experiencia del profesional de la salud. Se prefiere generalmente que se use una dosis máxima, es decir, la dosis segura más alta de acuerdo con un buen criterio médico.
Por ejemplo, una cantidad eficaz puede ser esa cantidad que reduce el volumen o la carga del tumor (como se determina, por ejemplo, por imágenes del tumor). Las cantidades eficaces también pueden evaluarse por la presencia y/o frecuencia de células cancerosas en la sangre u otro líquido corporal o tejido (por ejemplo, una biopsia). Si el tumor está afectando al funcionamiento normal de un tejido u órgano, entonces la cantidad eficaz puede evaluarse midiendo el funcionamiento normal del tejido u órgano.
La invención proporciona composiciones farmacéuticas. Las composiciones farmacéuticas son composiciones estériles que comprenden células, nanopartículas y/o uno o más agentes, preferiblemente en un vehículo farmacéuticamente aceptable. La expresión "vehículo farmacéuticamente aceptable" significa uno o más rellenos, diluyentes o sustancias encapsulantes sólidos o líquidos compatibles que son adecuados para su administración a un ser humano u otro sujeto contemplado por la invención. El término "vehículo" indica un ingrediente orgánico o inorgánico, natural o sintético, con el que las células, nanopartículas y uno o más agentes se combinan para facilitar la administración. Los componentes de las composiciones farmacéuticas se entremezclan de manera que impida la interacción que alteraría sustancialmente su eficacia farmacéutica deseada.
Los conjugados de nanopartícula-célula, cuando es deseable suministrarlos de manera sistémica, pueden formularse para administración parenteral mediante inyección, por ejemplo, por inyección en embolada o infusión continua. Las formulaciones para inyección pueden presentarse en forma de dosificación unitaria, por ejemplo, en ampollas o en recipientes multidosis. Las formulaciones parenterales farmacéuticas incluyen soluciones acuosas de los ingredientes. Las suspensiones de inyección acuosas pueden contener sustancias que aumentan la viscosidad de la suspensión, tales como carboximetilcelulosa de sodio, sorbitol o dextrano. Como alternativa, pueden prepararse suspensiones de ingredientes como suspensiones de base oleosa. Los disolventes o vehículos lipófilos adecuados incluyen aceites grasos, tales como aceite de sésamo, o ésteres de ácidos grasos sintéticos, tales como oleato de etilo o triglicéridos, o liposomas.
Ejemplos
Ejemplo 1. Síntesis de nanopartículas, caracterización y conjugación con linfocitos T.
1.1. Síntesis de nanopartículas. Recientemente hemos desarrollado una estrategia para preparar nanopartículas poliméricas biodegradables "con envuelta lipídica". (Bershteyn A et al., Soft Matter 4: 1787, 2008.) Estas partículas tienen un núcleo de poli(láctido-co-glicólido) biodegradable y un recubrimiento superficial de una bicapa fosfolipídica (fig. 2A y B, flechas). Estas nanopartículas pueden encapsular moléculas de fármaco en su núcleo y/o incorporar fármacos en la bicapa lipídica superficial, posibilitando la liberación mantenida de proteínas, péptidos compuestos micromoleculares. Las nanopartículas se sintetizaron mediante un proceso doble de emulsión/evaporación de disolvente: se emulsionaron 200 pl de agua en 1 ml de cloroformo que contenía 2 mg de una mezcla de lípidos (DOPC:DOPG 4:1 mol:mol con cantidades variables de dioleoil maleimidofenil fosfoetanolamina (MPB PE), con o sin 25 pg de 1,1'-dioctadecil-3,3,3',3'-tetrametilindodicarbocianina (DiD) o DiR tinte fluorescente de tipo lipídico (Invitrogen)) y 30 mg de poli(láctido-co-glicólido) (PLGA, 50:50 p:p de láctido: glicólido, 13 kDa, biopolímeros Lakeshore). La inclusión de lípido MPB PE con grupo principal maleimida en la fracción lipídica posibilita la conjugación celular, como se describe a continuación. La emulsión de agua en aceite resultante se sonicó en hielo (1 min, 7 vatios con un sonicador de punta de sonda Misonix Microson XL), después se añadió a 6 ml de agua desionizada en hielo con sonicación (5 min, 12 vatios), formando una doble emulsión de agua en aceite en agua. Se evaporó el cloroformo de la doble emulsión agitando a 20 °C a presión atmosférica durante 6 h para formar nanopartículas sólidas. Durante la evaporación del disolvente, los lípidos en la fase orgánica se autoensamblan en la superficie de contacto del aceite y el agua y forman una bicapa que recubre alrededor de las partículas de núcleo de PLGA nacientes (fig. 2A y B); también hay un exceso de lípido presente en la masa de la partícula. Las partículas se purificaron del lípido libre por centrifugación a través de un lecho de sacarosa al 60 % en peso, se dializaron para eliminar la sacarosa y se almacenaron a 4 °C (almacenamiento a corto plazo) o se liofilizaron en presencia de trehalosa y se almacenaron a 4 °C hasta que se usaron. Variaciones simples en las condiciones de procesamiento (por ejemplo, uso de homogeneización en lugar de sonicación) permitieron preparar partículas de diferente tamaño, determinado por dispersión de luz dinámica (DLD, datos no mostrados).
Para sintetizar nanopartículas de gel de ADN, en primer lugar generamos empalmes de ADN de cuatro brazos, monómeros de ADN X, hibridando los siguientes oligonucleótidos (Integrated DNA Technology, IDT):
1) 5'-p-ACGTCGACCGATGAATAGCGGTCAGATCCGTACCTACTCG-3' (SEQ ID NO:2)
2) 5'-p-ACGTCGAGTAGGTACGGATCTGCGTATTGCGAACGACTCG-3' (SEQ ID NO:3)
3) 5'-p-ACGTCGAGTCGTTCGCAATACGGCTGTACGTATGGTCTCG-3' (SEQ ID NO:4)
4) 5'-p-ACGTCGAGACCATACGTACAGCACCGCTATTCATCGGTCG-3' (SEQ ID NO:5)
Estos oligos se autoensamblan en nanoestructuras "X" tridimensionales con salientes complementarios en el extremo o cada brazo. Como se describe recientemente (Um et al., Nat Mater, 5:797, 2006), la adición de ligasa a una solución de estos macrómeros de ADN da lugar a reticulación covalente y la formación de hidrogenes de base de ADN. Para formar nanopartículas, entonces se mezclaron 1,667 mg de monómero de ADN X con 6,7 pl de ADN ligasa T4 (3 unidades Weiss/pl, Promega), 20 pl de tampón de ligasa T4 (Promega) y agua sin nucleasa (IDT) a un volumen total de 200 pl, que posteriormente se agitó con vórtice con una película lipídica seca que contenía 0,396 mg de DOPC, 0,101 mg de DOPG, 0,63 mg de MPB y 0,04 mg de DiD. La mezcla resultante de gel de ADN-lípido se sonicó en hielo (5 min total, ciclos de potencia alterna de 1 W y 5 W cada 30 s con un sonicador de punta de sonda Misonix Microson XL), y se extruyó 21 veces a través de un filtro de policarbonato (200 nm de tamaño de poro, Whatman). Después de una incubación de 3 horas a 25 °C e incubación durante la noche a 4 °C para permitir la reticulación del ADN X mediada por ligasa, se añadieron 4 pl de exonucleasa III (New England Biolabs), 20 pl de tampón 1 (New England Biolabs) y agua sin nucleasa a un volumen total de 200 pl y se incubaron a 37 °C durante 90 minutos. Las nanopartículas de gel de ADN se purificaron de los lípidos libres y el ADN por centrifugación a través de un lecho de sacarosa al 10% en peso, y se lavaron tres veces con agua sin nucleasa. Se midió un rendimiento típico de 1010 nanopartículas de gel de ADN en el intervalo de diámetro de 200-250 usando un analizador de tamaño de partículas 90Plus (Brookhaven Instruments).
Para la encapsulación de IL-15Sa/IL-21 en nanopartículas de gel de ADN, se formaron precomplejos de 30 pg de quimera de IL-15Ra/Fc de ratón recombinante (R&D systems) con 10 pg de IL-15 de ratón (Peprotech) en agua sin nucleasa durante 1 hora a temperatura ambiente para generar IL-15 superagonista (IL-15Sa), se combinó con 10 |jg de IL-21 de ratón (Peprotech) y se mezcló con la mezcla de ADN X/ligasa T4 ligasa para la síntesis de partículas de gel de ADN, siguiendo el procedimiento descrito anteriormente.
Para la carga de nanopartículas de gel de ADN con el inhibidor de GSK3-p TWS119 (Cayman Chemical), se resuspendió 1 mg de tWs en 250 j l de DMSO, antes de añadirlo a la mezcla de ADN X/ligasa T4 para la síntesis de partículas de gel de ADN.
1.2. Caracterización de nanopartículas. La caracterización de las nanopartículas por DLD y microscopia crioelectrónica mostró que el diámetro medio de las partículas obtenido de este proceso es de 161 ±74 nm (fig. 2C). El marcaje de nanopartículas de núcleo de PLGA o de liposoma con tintes de tipo lipídico tales como tintes de carbocianina (DiD, Invitrogen) permitió detectar fácilmente las partículas en microscopia confocal o análisis por citometría de flujo de las células decoradas con partículas (ilustrado en los datos analizados a continuación).
1.3. Sistema transgénico para TCR para modelar el tratamiento celular adoptivo en melanoma murino. Para desarrollar y ensayar los conceptos propuestos aquí, usamos el sistema de ratón transgénico para TCR pmel-1/melanoma murino B16F10 desarrollado en el NCI como modelo para tratamiento celular adoptivo para melanoma. Los linfocitos T CD8+ Pmel-1 expresan un receptor de linfocitos T que reconoce un péptido de gp100 murina, un autoantígeno de melanoma expresado por células tumorales de melanoma B16 que también se usa como diana de linfocitos T en vacunas de melanoma humano. (Overwijk et al., J Exp Med 198(4): 569, 2003; Klebanoff et al., Proc Natl Acad Sci USA 102(27): 9571, 2005; Overwijk et al., J Exp Med 188(2): 277, 1998.) Los ratones Pmel-1 desarrollan linfocitos T con tolerancia a este antígeno, imitando lo que se cree que es una situación común en la respuesta inmunitaria a los cánceres humanos, aunque estas células pueden activarse y expandirse sensibilizándolas con un ligando peptídico alterado, un péptido de gp100 humana. (Overwijk et al., J Exp Med 198(4): 569, 2003.) Este modelo sirve como imitador de ACT humano donde debe interrumpirse la tolerancia para sensibilizar completamente la respuesta inmunitaria después de transferencia adoptiva de linfocitos T expandidos en ratones destinatarios portadores de tumor.
1.4. Acoplamiento de nanopartículas con linfocitos T vivos a través de tioles superficiales libres.
Habiendo desarrollado una estrategia para la preparación de partículas recubiertas con lípido, a continuación realizamos varios estudios usando nanopartículas "de blanco" (sin compuestos de citocina/de ligando de encapsulados) para evaluar las previsiones de esta estrategia. En primer lugar ensayamos si las nanopartículas podían adsorberse simplemente en las superficies de linfocitos T de forma estable, incubando células con nanopartículas a relaciones variables de partícula:célula durante periodos diferentes a 4 °C o 37 °C. Aunque las nanopartículas de núcleo de PLGA podían adsorberse en las células (en cantidades variables, dependiendo de la carga superficial de las nanopartículas usadas), descubrimos que, en algunos casos, la adsorción física no proporcionaba unión muy estable a las células, y una fracción creciente de nanopartículas se eliminaba de las células durante el lavado repetido como se evalúa por análisis por citometría de flujo de las células marcadas (no mostrado). Debe entenderse, sin embargo, que en algunas realizaciones la unión de las nanopartículas a las células transportadoras a través de absorción no covalente puede ser suficiente para la aplicación particular. Esto puede ser útil, por ejemplo, en el suministro de nanopartículas cargadas de antígeno que pueden transferirse a células presentadoras de antígeno en órganos linfoides después de la administración y la migración dirigida apropiada. Para obtener unión más estable de las partículas a linfocitos T, desarrollamos una estrategia atóxica para unir covalentemente las nanopartículas recubiertas con lípido a los linfocitos T. Exploramos las cantidades sustanciales de tioles libres disponibles en las proteínas de superficie celular de los leucocitos. (Sahaf et al., Proc Natl Acad Sci USA 100(7): 4001,2003.) Conjugamos tintes funcionalizados con maleimida (que reaccionan con tioles para formar enlaces tioéter estables) con linfocitos T recién aislados y analizamos las células por citometría de flujo. Los linfocitos T, linfocitos B y células progenitoras hematopoyéticas (por ejemplo, células murinas Lin-, Sca-1 , c-kit+) se descubrió que tenían altos niveles de tioles libres en la superficie celular, aunque los glóbulos rojos no (no mostrado).
Basándose en estos resultados, desarrollamos la estrategia resumida en la fig. 2D. Se prepararon transportadores de nanopartículas que incluían lípidos con grupos principales terminados en maleimida. Los linfocitos T CD8+ se aislaron de bazos de transgénico para TCR pmel-1 usando selección negativa con microesferas magnéticas (Miltenyi Biotec) y se expandieron durante 4 días in vitro usando microesferas recubiertas con anti-CD3/anti-CD28 en presencia de 200 Ul/ml de IL-2 humana, imitando la preparación de linfocitos T específicos de tumor para tratamiento celular adoptivo. Los linfocitos T se lavaron e incubaron (60 x 106 células/ml) con nanopartículas funcionalizadas con maleimida (a concentraciones variables) a 37 °C durante 45 min a relaciones variables de partícula:célula. Las células entonces se separaron de las partículas no unidas por centrifugación suave. Los grupos maleimida residuales presentes en las partículas unidas a los linfocitos T se inactivaron por incubación de las células (3 x 106/ml) con 1 mg/ml de polietilenglicol de 2 kDa terminado en tiol (PEG, Laysan Bio) a 37 °C durante 30 min en medio RPMI completo, seguido de dos lavados para eliminar el PEG no unido. Variando la cantidad de maleimidalípido incorporada, descubrimos que un 50 % en moles de maleimida en la fracción lipídica proporcionaba unión óptima a los linfocitos T y retención de las partículas a través de múltiples lavados (no mostrado).
Como se muestra en la fig. 3A, las nanopartículas se fijaron fácilmente a las células usando esta estrategia de reacción de tiol. 2500 nanopartículas por célula durante la conjugación como se muestra en la fig. 3 dieron ~500 nanopartículas unidas por célula como se determina a partir del recuento de partículas a alto aumento en microscopia confocal; esto corresponde a una oclusión teórica de ~3,2 % del área superficial promedio de los linfocitos T por partículas de 160 nm de diámetro. Los linfocitos T cultivados en IL-2 mostraron una dilución de la densidad de las nanopartículas unidas a las células durante el transcurso de una semana, debido a la proliferación de las células (fig. 3A, día 6). La conjugación de las nanopartículas con las células a esta densidad dio lugar a ausencia de pérdida de la viabilidad de los linfocitos T durante una semana en cultivo (fig. 3B), y además no desencadenó activación espontánea de estas células.
Una cuestión clave para estos estudios fue la localización de las partículas. Si las células internalizan estas partículas, entonces las cargas de fármaco encapsuladas no pueden liberarse en el microentorno local y/o los fármacos liberados desde las nanopartículas puede que sean incapaces de acceder a sus receptores diana en el propio linfocito T. De forma importante, descubrimos que los linfocitos T no internalizan nanopartículas de PLGA recubiertas con lípido (ilustradas por la fig. 3A), incluso durante cultivo prolongado o después de la proliferación (analizado adicionalmente a continuación). Esto está en claro contraste con lo que observamos con células dendríticas, que fagocitaron las nanopartículas fijadas en minutos.
Ejemplo 2. Evaluación de la unión de las nanopartículas sobre las funciones de los linfocitos T.
2.1. Nanopartículas unidas a células no bloquean el reconocimiento de antígeno o la proliferación de linfocitos T. Habiendo descubierto que el acoplamiento con tiol permitía unión atóxica estable de las nanopartículas a las células, a continuación buscamos determinar si la reacción de acoplamiento interfería con el comportamiento de los linfocitos T, y descubrir la dosis de nanopartículas que podría fijarse a los linfocitos T sin bloquear las funciones clave de los linfocitos T. En primer lugar ensayamos si la proliferación de linfocitos T se veía influida por el acoplamiento de las nanopartículas. Se sensibilizaron/expandieron linfocitos T Pmel-1 in vitro con microesferas anti-CD3/anti-CD28 e IL-2 como se describe anteriormente. Las células expandidas se marcaron con éster succinimidílico de carboxifluoresceína (CFSE), y se incubaron con 2500 nanopartículas de PLGA recubiertas con lípido marcadas con DiD por célula para la conjugación. En paralelo, el día 6 las células dendríticas derivadas de médula ósea de ratones C57B1/6 preparadas como se describe (Stachowiak et al., J Immunol 177(4): 2340, 2006) se activaron por incubación con oligonucleótido CpG 1 pM (un ligando para TLR 9) y se estimularon con péptido hgp10025-331 pM (un péptido reconocido por linfocitos T pmel-1 en el contexto de moléculas MHC 1H-2Db) durante la noche. Los linfocitos T conjugados con nanopartículas o "desnudos" de control se cocultivaron con DC cargadas con antígeno activadas a una relación 2:1 de T:DC durante 6 días, y después se analizaron por citometría de flujo. Como se muestra en la fig.
4A, el grado de proliferación de los linfocitos T de control y conjugados con nanopartículas determinado por dilución en CFSE en las células en división fue indistinguible. Además, el análisis de la fluorescencia media de las nanopartículas unidas a las células mostró una disminución constante en la fluorescencia de las nanopartículas según aumentaba el número de divisiones celular, lo que refleja segregación de las partículas para separar las células hijas durante la división. Destacablemente, cuando se examinaban células divididas de bajo CFSE clasificadas en microscopia confocal, se descubrió que las nanopartículas aún estaban localizadas en la superficie incluso en células que habían experimentado 5 divisiones celulares.
2.2. Altas densidades de nanopartículas pueden unirse a linfocitos T sin inhibir la secreción de citocinas o la actividad CTL. Los linfocitos T CD8+ activados secretan citocinas tales como IFN-y y TNF-a y destruyen directamente las células diana que portan antígeno como parte de su actividad antitumoral. Para determinar si la conjugación de nanopartículas de PLGA recubiertas con lípido con linfocitos T interfiere con la secreción de citocinas, se cocultivaron linfocitos T conjugados con partículas o de control con DC estimuladas con antígeno como se describe anteriormente, y se evaluó la producción de varias citocinas clave por los linfocitos T por ELISA. Como se muestra en la fig. 4B, los linfocitos T pmel-1 decorados con nanopartículas producían cantidades equivalentes de IL-2, IFN-y y TNF-a en respuesta a estimulación antigénica como los linfocitos T "desnudos" no modificados. Por tanto, pueden unirse cantidades sustanciales de nanopartículas a las células sin bloquear la secreción de citocinas efectoras.
A continuación realizamos un análisis de respuesta a la dosis para determinar la dosis máxima de nanopartículas que podía fijarse a los linfocitos T sin inhibir la actividad citolítica de los linfocitos. Los linfocitos T pmel-1 se expandieron in vitro como antes, y después se incubaron con dosis variables de nanopartículas de PLGA recubiertas con lípido por célula, que variaban de 100 nanopartículas/célula hasta 10000 nanopartículas por célula para la conjugación de partículas. Los linfocitos T marcados con partículas o de control se cocultivaron entonces con células diana EL4 marcadas con 51Cr estimuladas con péptido hgp10025-33 a relaciones variables de efector: diana durante 4 h a 37 °C en medio completo. Se determinó la lisis de diana específica por medición del cromo radioactivo liberado al sobrenadante de cultivo. Como se muestra en la fig. 4C, la destrucción de las células diana por linfocitos T conjugados con nanopartículas fue indistinguible de los linfocitos T de control excepto a las dos dosis de acoplamiento más altas ensayadas (10000 o 5000 nanopartículas/célula).
2.3. Análisis de linfocitos T CD8+ transgénicos para TCR OT-1. Se encontraron resultados similares con otros linfocitos T. Los linfocitos T CD8+ transgénicos para TCR OT-1, que son específicos para un péptido derivado de ovoalbúmina, y que se conjugaron con hasta 100 (±21) nanopartículas por célula, retuvieron completamente su respuesta proliferativa fisiológica después de cocultivo con células dendríticas diana estimuladas con ovoalbúmina. En algunos casos, densidades superficiales mayores de las mismas nanopartículas empezaron a inhibir la proliferación de linfocitos T (datos no mostrados). Durante la división celular, las nanopartículas fijadas a la superficie segregaron equitativamente a las células hijas, lo que se reflejó por una disminución en escalonada en la señal de fluorescencia media desde las nanopartículas conjugadas con las células con número creciente de divisiones celulares (datos no mostrados). La fijación de hasta ~100 partículas/célula tampoco influyó en el reconocimiento/destrucción por linfocitos T de células diana estimuladas con péptido de ovoalbúmina o los perfiles de liberación de citocinas (datos no mostrados).
En resumen, para condiciones de hasta 2500 nanopartículas/célula durante la conjugación (nanopartículas con diámetros ~160 nm), no se observa inhibición de reconocimiento de antígenos por los linfocitos T, proliferación, secreción de citocinas o destrucción de células diana. Estos resultados sugieren que cantidades sustanciales de nanopartículas de tamaño submicrométrico pueden fijarse a los linfocitos T sin bloquear las funciones celulares clave.
Ejemplo 3. Carga de citocinas/fármaco en nanopartículas de PLGA recubiertas con lípido.
Las nanopartículas se conjugan con linfocitos T ACT de dos maneras diferentes: (i) las nanopartículas se cargan con citocinas diseñadas para actuar sobre los propios linfocitos T transportadores para sustentar su proliferación, la supervivencia y la función efectora (por ejemplo, IL-15 superagonista) o (ii) las nanopartículas se usarán para suministrar compuestos diseñados para actuar sobre otras células en el microentorno, incluyendo ligandos del receptor de tipo Toll (TLR) y antígenos de vacuna (por ejemplo, imiquimod o MPLA). En los estudios previos, se usaron nanopartículas "vacías" para evaluar el impacto de la conjugación de las partículas sobre las funciones de los linfocitos T. Aquí, ensayamos la encapsulación/incorporación de proteínas (por ejemplo, IL-15 superagonista) y ligandos de TLR en las nanopartículas, para suministrar cargas terapéuticamente pertinentes.
Las nanopartículas de PLGA se han explotado en numerosos estudios previos como vehículos para la encapsulación y suministro de proteínas, péptidos y compuestos farmacéuticos micromoleculares, y de forma destacable antígenos de vacuna/adyuvantes. (Davis Me et al., Nat Rev Drug Discov 7(9): 771, 2008; Chacon M et al., International Journal of Pharmaceutics 141(1-2): 81, 1996; Diwan M et al., Curr Drug Deliv 1(4): 405, 2004; Elamanchili P et al., Vaccine 22(19): 2406, 2004; Li Y et al., J Control Release 71(2): 203, 2001; Zhang ZP et al., Biomaterials 28(10): 1889, 2007; Heit A et al., Eur J Immunol 37(8): 2063, 2007.) En primer lugar ensayamos si la encapsulación de proteínas era fácil en nuestras nanopartículas recubiertas con lípido añadiendo proteína a la fase acuosa interna de la síntesis de doble emulsión: Se remplazaron 200 pl de agua del protocolo de síntesis descrito en la sección 3.1 con 200 pl de una solución de la proteína modelo ovoalbúmina marcada con Alexa488 (100 pg en PBS), y las partículas se prepararon y purificaron como antes. Como se muestra en la fig. 5A, se detectó claramente la fluorescencia de ovoalbúmina en las nanopartículas por microscopia confocal, y las imágenes de crioEM de las nanopartículas mostraron que la morfología de las partículas no se alteraba por la encapsulación de proteínas y se retenía la capa lipídica superficial para las partículas cargadas de proteína (fig. 5B). Se realizó medición de la cantidad de proteína encapsulada lisando las nanopartículas durante 4 horas en NaOH 0,02 M/SDS al 2 %, neutralizando la solución con HCl 0,2 M y midiendo la fluorescencia de ovoalbúmina liberada calibrada frente a patrones de solución de ovoalbúmina expuestos a las mismas condiciones de tratamiento basales. Mediante estas mediciones, Descubrimos que se encapsulaba ~1 pg de ovoalbúmina por mg de nanopartículas (~25 % de eficacia de encapsulación).
Sin embargo, la ovoalbúmina es una proteína globular modelo y, como tal, se eligió para ilustrar el comportamiento de otras proteínas tales como moléculas de interleucina-15 (IL-15) superagonista que pueden usarse para sustentar los linfocitos T ACT. Encapsulamos IL-15 (citocina en solitario) en PLGA recubierto con lípido para ensayar la factibilidad de la carga de citocinas en estas partículas. Se usó IL-15 (5 pg) en PBS en la fase acuosa interna de la síntesis de partículas, y las partículas cargadas de citocina resultantes se purificaron como se describe en la sección 3.1. Se determinó la cinética de la liberación de IL-15 desde las partículas incubando las partículas en medio RPMI completo que contenía FCS al 10 % a 37 °C con agitación suave y tomando alícuotas del sobrenadante en puntos temporales estadificados para análisis por ELISA del contenido de citocinas. Como se muestra en la fig. 5B, se liberó ~80 % de las citocinas encapsuladas al final de este periodo de incubación. Otros experimentos con nanopartículas cargadas de ovoalbúmina mostraron liberación continua de proteína durante un periodo similar de 7-10 días. Por tanto, las partículas recubiertas con lípido pueden cargarse con proteína y liberar el material encapsulado durante un periodo de ~1 semana. La cinética de liberación puede modularse a tasas más rápidas o más lentas alterando el PM del PLGA usado en las partículas.
Habiendo descubierto que las citocinas pueden encapsularse y liberarse satisfactoriamente de las nanopartículas, ensayamos si la supervivencia de linfocitos T in vitro podía potenciarse por las citocinas liberadas desde las nanopartículas. Se sensibilizaron/expandieron linfocitos T Pmel-1 in vitro con microesferas anti-CD3/anti-CD28 e IL-2 como se describe anteriormente. Las células expandidas se incubaron con 2500 nanopartículas de PLGA recubiertas con lípido por célula para la conjugación. Las nanopartículas se formularon con 10 mg de IL-15 o IL-15 e IL-15Ra. Los linfocitos T conjugados con partículas o de control entonces se cocultivaron con células diana EL4 estimuladas con péptido hgp 10025-33 a relaciones de efector:diana de 20:1 a 37 °C en medio completo sin complemento de IL-2 exógeno. Después de 6 días de cultivo, se contó el número de linfocitos T vivos después de tinción con azul tripano para evaluar la proliferación y supervivencia de los linfocitos T. Como se muestra en la fig. 6, las nanopartículas que encapsulan IL-15 e IL-15/IL-l5Ra potenciaron significativamente la supervivencia y/o proliferación de los linfocitos T en comparación con los grupos de ausencia de tratamiento o de nanopartículas vacías. La proliferación observada en linfocitos T marcados con nanopartículas con citocinas encapsuladas fue comparable con los controles de IL15 e IL-15/IL-15Ra solubles. Por tanto, la IL-15 o su superagonista en complejo con IL-15Ra liberada continuamente desde las nanopartículas mantiene su bioactividad y puede sustentar la supervivencia y/o proliferación de los linfocitos T in vitro.
Las nanopartículas también se cargaron con el ligando de TLR4 MPLA y/o el ligando de TLR7, imiquimod, como ligandos clínicamente pertinentes potentes para dirigir la activación de DC durante el tratamiento adoptivo de linfocitos T. El MPLA es un imitador de lipopolisacárido sintético que se ha mostrado prometedor como análogo atóxico del potente lipopolisacárido inmunoestimulante (LPS). El MPLA proporciona actividad adyuvante en vacunas comparable al LPS, pero tiene toxicidad sistémica reducida en órdenes de magnitud debido a su acoplamiento selectivo de señales posteriores en la ruta de señalización de TLR4. (Mata-Haro et al., Science 316(5831): 1628, 2007.) Destacablemente, el LPS y sus derivados se han mostrado prometedores en romper la tolerancia a los tumores, y los efectos beneficiosos de la irradiación de todo el organismo observados durante estudios de tratamiento adoptivo con linfocitos T se han adjudicado en parte al LPS y otra señalización de TLR que se produce cuando se compromete la integridad del epitelio intestinal. (Yang et al., Nat Immunol 5(5): 508, 2004; Paulos et al., Clin Cancer Res 13(18 Pt 1): 5280, 2007; Paulos et al., J Clin Invest 117(8): 2197, 2007.)
El imiquimod, un ligando de imidazoquinolina micromolecular para TLR7/8, es un factor proinmunidad prometedor para tratamiento contra el cáncer aprobado para uso clínico como crema tópica en el tratamiento de determinados cánceres de piel. Además de su activación proinmunidad de los macrófagos y las células dendríticas (Hemmi et al., Nat Immunol 3(2): 196, 2002), se ha informado recientemente que el imiquimod activa las células dendríticas locales en el tumor en un fenotipo directo de destrucción tumoral en seres humanos. (Stary et al., J Exp Med 204(6): 1441,2007.)
Sin embargo, el imiquimod y el MPLA comparten dificultades en su aplicación para tratamiento contra el cáncer. El imiquimod sistémico suministrado por vía oral ha mostrado toxicidad limitante de la dosis en seres humanos (Goldstein et al., J Infect Dis 178(3): 858, 1998) y tiene una semivida corta después de inyección de solamente ~2 horas (Soria et al., Int J Clin Pharmacol Ther 38(10): 476, 2000). La administración tópica de imiquimod, sin embargo, no se ha mostrado eficaz en metástasis sistémicas o cánceres no cutáneos. Tanto TLR4 como TLR7 tienen amplios patrones de expresión (expresados a niveles bajos en células endoteliales y por células epiteliales (Fan et al., J Clin Invest 112(8): 1234, 2003; Gunzer et al., Blood 106(7): 2424, 2005)), aumentando las preocupaciones de toxicidad sistémica en tratamiento prolongado. Los ligandos de TLR4 y TLR7, sin embargo, han demostrado inducir expresión de ICAM-1, ICAM-2 y selectinas en células endoteliales (Gunzer et al., Blood 106(7): 2424, 2005), y dichos efectos si se estimulan localmente en los sitios de tumor podrían usarse para potenciar el tráfico de linfocitos T a los tumores. Por tanto, el suministro selectivo de estos ligandos a sitios de tumor y en segundo lugar a órganos linfoides podría usarse para potenciar su actividad antitumoral mientras se limitan los efectos secundarios sistémicos.
En paralelo con los experimentos de encapsulación de proteínas, por tanto, también ensayamos la incorporación del ligando del receptor de tipo Toll monofosforil lípido A (MPLA) en PLGA recubierto de lípido. Debido a esta estructura de tipo lipídico, el MPLA se incorpora cuantitativamente en las partículas codisolviendo simplemente este ligando con los otros fosfolípidos en la fase de cloroformo de la síntesis de partículas. Para ensayar la capacidad del MPLA incorporado en nanopartículas de PLGA recubiertas con lípido de activar las células dendríticas (que expresan el receptor de LPS, TLR4), se añadieron nanopartículas que contenían un 1 % en moles o un 10 % en moles de MPLA como parte de la fracción lipídica de la síntesis a DC derivadas de médula ósea durante 24 h, y después se analizó la expresión superficial de moléculas de MHC de clase II y receptores coestimuladores por citometría de flujo. Las DC teñidas con anticuerpos contra MHCII, CD80 y CD40 mostraron regulación por aumento de estos marcadores cuando se trataban con nanopartículas que contenían MPLA, comparable con las DC tratadas con 1 pg/ml de LPS como control positivo; sin embargo, las nanopartículas "de blanco" no desencadenaron la maduración de DC (fig.
5C). Por tanto, los ligandos de TLR incorporado en las nanopartículas recubiertas con lípido pueden activar las DC.
El gardiquimod y el resiquimod son derivados de imidazoquinolina que, similares al imiquimod, son ligandos selectivos para TLR7/8. Se ha sugerido que el gardiquimod y el resiquimod tienen efecto más potente que el imiquimod, basándose en los hallazgos de que inducen producción más fuerte de citocinas, activación de macrófagos e inmunidad celular potenciada (Wager et al., Cell Immunol 191(1): 10, 1999; Burns et al., Clin Immunol 94(1): 13, 2004; Schon et al., Oncogene 27(2): 109, 2008.) La encapsulación de gardiquimod y resiquimod y la detección de su liberación desde nanopartículas de PLGA se realizaron con modificaciones minoritarias. Para la encapsulación de gardiquimod en nanopartículas, se remplazaron 200 pl de agua en el protocolo de síntesis descrito en la sección 3.1 con 1,8 mg de gardiquimod disuelto en 200 pl de agua, y para la encapsulación de resiquimod, se disolvieron 0,83 mg de resiquimod junto con 30 mg de PLGa en disolvente orgánico; el resto del protocolo de síntesis de nanopartículas resumido en la sección 3.1 se siguió después de ello. La cinética de liberación de fármaco desde las partículas se determinó incubando las partículas en agua con agitación suave a temperatura ambiente y tomando alícuotas del sobrenadante en puntos temporales estadificados para la detección fluorescente de la liberación de fármaco a excitación/emisión de 260/340 nm. Como se muestra en la fig. 7, se observó liberación continua de gardiquimod y resiquimod desde las nanopartículas durante 8 días de incubación.
Ejemplo 4. Reactivos de imágenes de animal completo para rastrear independientemente células tumorales, nanopartículas y linfocitos T in vivo.
Los datos descritos en las dos secciones previas demuestran el protocolo que hemos desarrollado para fijar nanopartículas a linfocitos T de una manera atóxica que no interfiere con las funciones clave de linfocitos T. Las partículas puede cargarse con proteína o ligandos de TLR como cargas terapéuticas que se explotarán en la investigación propuesta. Una función clave final que la conjugación con nanopartículas no debe interrumpir es la migración/migración dirigida a tejido de linfocitos T. En primer lugar ensayamos la migración in vitro de blastocitos de linfocitos T conjugados con partículas sembrados en cubreobjetos de vidrio. Como se muestra en la fig. 8A, los linfocitos T migradores observados en videomicroscopia con resolución temporal polarizaban las nanopartículas unidas a la superficie celular al uropodio durante la migración, pero cuando las células detenían la migración, las partículas se redispersaban sobre la superficie celular ("célula detenida"). Por tanto, las células conjugadas con partículas pueden migrar y la polarización hacia atrás de las nanopartículas durante la motilidad puede ayudar a reducir la probabilidad de que las partículas interfieran con la función de patrulla de estas células in vivo.
A continuación evaluamos el impacto de nanopartículas fijadas a la superficie celular sobre la capacidad de su célula transportadora de transmigrar a través de barreras endoteliales, como una medida de la capacidad de la célula transportadora de infiltrarse en su tejido diana. Utilizamos un sistema de cocultivo Transwell in vitro en que los linfocitos T efectores sin manipular o conjugados con nanopartículas migran desde la cámara superior a través de la monocapa endotelial activada por TNF-a confluyente sustentada por membrana en respuesta a un quimioatrayente de linfocitos T colocados en la cámara inferior. Los linfocitos T inalterados que portan 100 nanopartículas/célula mostraron eficacias de transmigración inalteradas en comparación con células no modificadas (datos no mostrados). Después de cruzar la barrera endotelial, los linfocitos T aún habían retenido un 83 % (± 3 %) de la carga de nanopartículas original físicamente unida. Las imágenes confocales revelaron que los linfocitos T que migran en la capa endotelial polarizaban a una morfología "de espejo de mano" característica, y localizaban su combinación de nanopartículas en el uropodio (datos no mostrados), lo que probablemente refleja la localización uropodial de muchas proteínas de superficie celular en linfocitos T migradores.
Se realizaron más experimentos para mostrar que los linfocitos T conjugados con partículas puede migrar de forma dirigida a sus sitios de tejido esperados, y para el tratamiento que dichas células pueden entrar en tumores sólidos de manera tan eficaz con los linfocitos T sin modificar. Para ayudar en estos estudios, usarnos imágenes multicolor del animal completo de bioluminiscencia/fluorescencia para rastrear simultáneamente la ubicación de las nanopartículas, los linfocitos T transferidos de forma adoptiva y las células tumorales. Estos experimentos se realizan usando un instrumento de imágenes de bioluminiscencia/ fluorescencia Xenogen IVIS Spectrum ubicado en las instalaciones centrales del Koch Cancer Institute en el MIT.
Como se muestra en la fig. 8B, las nanopartículas de PLGA recubiertas con lípido marcadas con tinte DiR se detectan fácilmente en fluorescencia de todo el animal después de inyección subcutánea, debido a la baja absorción de la luz de excitación cercana a IR usada para este tinte (exc. 750 nm/em. 790 nm). En un experimento de migración dirigida in vivo, se prepararon nanopartículas con luciferasa de Gaussia recombinante conjugada en la superficie. Entonces se acoplaron linfocitos T pmel-1 con estas nanopartículas decoradas con luciferasa y se inyectaron i.v. (mediante la vena de la cola) en un ratón C57B1/6 destinatario. Las imágenes de bioluminiscencia de todo el animal después de la inyección del sustrato de luciferasa de Gaussia coelentarizina 4 h después de la transferencia de los linfocitos T mediante inyección en la vena de la cola se muestran en la fig. 8C. En este momento, una mayoría de los linfocitos T aún se localizan en los pulmones como se informa previamente para los linfocitos T efectores (Hamann A et al., Eur J Immunol 30(11): 3207, 2000), pero también se detectaron características distintivas de nanopartículas/linfocitos T en sitios de los costados que pueden reflejar la migración dirigida a los ganglios linfáticos inguinal y se detectaron pequeñas manchas intensas de bioluminiscencia al lado de los pulmones (flechas blancas) que pueden reflejar la migración dirigida inicial a los ganglios linfáticos axilares/braquiales.
Como las nanopartículas pueden rastrearse usando tintes cercanos a IR y fluorescencia, cruzamos ratones transgénicos para TCR pmel-1 con ratones transgénicos para luciferasa, para obtener ratones pmel-1-luc donde los linfocitos T c D8+ pmel-1 expresan luciferasa de luciérnaga (datos no mostrados). En paralelo, se prepararon células de melanoma B16F10 que expresaban luciferasa de Gaussia por transfección retrovírica de células B16 con una construcción de luciferasa. Como se ilustra en la fig. 8D, las células B16-gaussia luc se detectaron fácilmente mediante imágenes de bioluminiscencia.
Para evaluar el potencial de los linfocitos T reactivos a tumores de transportar nanopartículas conjugadas en la superficie al microentorno de tumores establecidos, transferimos de forma adoptiva linfocitos T efectores CD8 Pmel1, transgénicos para el receptor de linfocitos T para el antígeno de melanoma gp-100, en hospedadores con tumores B16F10 establecidos en su fémur derecho (fig. 9A). Los animales se trataron con 15 x 106 linfocitos T Pmel-1, transgénicos para luciferasa de luciérnaga para rastreo de linfocitos T bioluminiscentes in vivo. Los linfocitos T se conjugaron con nanopartículas marcadas con el tinte fluorescente DiD (panales de la derecha) o dejadas sin modificar (paneles de la izquierda). En ambos grupos de tratamiento, incubamos linfocitos T infundidos con tiol-PEG para evitar la fagocitosis inespecífica de nanopartículas por macrófagos y células dendríticas. Los linfocitos T infundidos de ambos grupos presentaron migración dirigida rápida y eficaz al sitio de tumor, que se controla por imágenes de los linfocitos T bioluminiscentes en el día 4 después de la transferencia de los linfocitos T (fig. 9B). Destacablemente, la conjugación superficial ex vivo de las nanopartículas con los linfocitos T, no alteró su migración in vivo ni restringió su potencial de reconocer el antígeno tumoral. Los linfocitos T de migración dirigida al tumor, además, agregaban de forma eficaz las nanopartículas conjugadas en la superficie en el sitio de tumor, como se muestra por la señal de DiD fluorescente enormemente amplificada del fémur derecho aislado con tumor infiltrado, en comparación con el fémur izquierdo sin tumor (fig. 9C, panel de la derecha). De forma importante, las nanopartículas en el sitio de tumor aún se ligaban físicamente a los linfocitos T de infiltración tumoral, como se mide por citometría de flujo multicolor de suspensiones monocelulares de tumor (fig. 9D). Esencialmente, demostramos que los linfocitos T dirigidos a tumor lanzan de manera eficaz nanopartículas terapéuticas al sitio de tumor. La conjugación superficial ex vivo no altera la viabilidad de los linfocitos T, la migración o el reconocimiento del tumor y, por lo tanto, ofrece una previsión novedosa para la biodistribución dirigida de nanopartículas y la potenciación funcional de linfocitos T reactivos a tumores.
A continuación evaluamos las propiedades migradoras y de migración dirigida al tumor de los linfocitos conjugados con nanopartículas en otro sistema de modelo murino. A ratones C57B1/6 se les inyectó células tumorales EL4 que expresaban luciferasa de Gaussia unida a membrana (extG-luc) y ovoalbúmina (EG7-OVA) s.c. en el costado derecho y células tumorales EL4 de control que expresaban extG-luc en solitario en el costado izquierdo. Se dejó que los tumores se establecieran y después los ratones recibieron transferencias adoptivas linfocitos T OT-1 transgénicos para luciferasa de luciérnaga (Fluc) con o sin nanopartículas de gel de ADN fluorescentes rojas conjugadas en la superficie, o una inyección i.v. de una dosis equivalente de partículas fluorescentes en solitario. Los linfocitos T OT-1 que transportan partículas se trasladan específicamente a tumores EL4-OVA preestablecidos (fig. 10A). No se observó diferencia en el potencial de migración dirigida al tumor de los linfocitos T OT-1 conjugados con partículas en comparación con los no modificados sencillos (fig. 10B, panel de la izquierda). Las imágenes fluorescentes cuantitativas de las partículas de los tumores EG7-OVA demostraron que las nanopartículas se acumulaban una media de 176 veces más eficazmente en el sitio de tumor cuando estaban unidas en la superficie a linfocitos T OT-1 en comparación con nanopartículas libres infundidas sistémicamente, que se depuraron rápidamente por el hígado y el bazo (fig. 10B). El análisis por citometría de flujo verificó que la infiltración de linfocitos T de los tumores EG7-OVA era cuantitativamente idéntica para células OT-1 decoradas con partículas y de control, y que la mayoría de las células conjugadas con partículas recuperadas de los tumores aún retenían su carga de nanopartículas (fig. 10A).
El beneficio de los linfocitos T específicos de antígeno tumoral como vectores celulares para el suministro de nanopartículas activas también se evidenció en un modelo de cáncer de próstata espontáneo (es decir, el modelo de adenocarcinoma de próstata TRAMP). En este sistema modelo, linfocitos T específicos de tumor de próstata cargados con nanopartículas de gel de ADN migraban de forma dirigida eficazmente a las próstatas TRAMP hiperplásicas que expresaban antígeno y agregaban partículas fluorescentes ligadas a la superficie en el sitio de tumor, mientras que no se detectaba señal de nanopartículas fluorescentes por encima del fondo en la próstata después de inyección sistémica de una dosis de partículas equivalente (fig. 11A-C).
La capacidad de los linfocitos de transferir eficazmente nanopartículas fijadas a la superficie a través de las barreras endoteliales in vivo no estaba restringida al revestimiento endotelial anómalo, filtrante y discontinuo encontrado en la vasculatura tumoral. Cuando las partículas de gel de ADN se ligaban a linfocitos B CCR7+CD62L+ en reposo (fig.
12A-C) o linfocitos T CD8+ de memoria centrales (datos no mostrados), las partículas se transportaban a través de los límites intercelulares de vénulas endoteliales altas a los ganglios linfáticos, un compartimento poco accesible para nanopartículas libres infundidas sistémicamente. Las fig. 12D-F muestran el perfil de biodistribución de nanopartículas conjugadas con linfocitos B frente a nanopartículas libres, la presencia de nanopartículas en linfocitos B recogidos de sujetos, y la localización de linfocitos B y nanopartículas conjugadas administrados a ganglios linfáticos.
En los estudios anteriores, las nanopartículas sin carga terapéutica se adjuntaron a células que poseían un tropismo hístico definido para demostrar la utilidad de las células terapéuticas como vectores altamente eficaces para el suministro de nanopartículas a compartimentos anatómicos por lo demás de difícil acceso.
A continuación ensayamos si las nanopartículas cargadas de fármaco unidas de células podían conferir directamente funciones terapéuticas amplificadas a sus células transportadoras, usando un modelo murino de tratamiento adoptivo con linfocitos T para melanoma (Overwijk et al., J Exp Med, 188:277, 1998). Encapsulamos una mezcla de IL-15, (convertida en un superagonista (IL-15Sa) formando precomplejos con IL-15Ra soluble (Rubinstein et al., PNAS USA, 103:9166, 2006)), en combinación con IL-21 en partículas de gel de ADN recubiertas con lípido. Se sabe que la IL-15 y la IL-21 promueven de manera cooperativa la expansión y la función efectora de linfocitos T in vivo cuando se administran diariamente a dosis altas. Las partículas de gel de ADN de ~200 nm de diámetro atrapaban eficazmente la mezcla de citocinas de IL-15Sa/IL-21 y presentaban cinética de liberación lenta durante un periodo de 7 días (datos no mostrados). Estas partículas cargadas de citocinas se conjugaron con linfocitos T efectores CD8+ Pmel-1 que expresaban luciferasa roja de escarabajo Click (CBR) que reconocen un péptido del antígeno de diferenciación de melanocitos gp100. Se infundieron linfocitos T conjugados con partículas o de control en ratones linforreducidos que portaban tumores pulmonares de melanoma B16F10 que expresaba luciferasa de Gaussia establecidos (fig. 13A). Las imágenes seriadas de linfocitos T Pmel-1 mostraron una disminución de la señal de CBR-luc gradual después de la inyección de linfocitos T, coherente con la poca expansión y persistencia de linfocitos T in vivo (fig. 13B y C). Mientras una sola infusión sistémica de 5 |jg de IL-15Sa/IL-21 libre (4,03 |jg de IL-15Sa 0,93 jg de IL-21) administrada en el día de la transferencia adoptiva no reforzaba significativamente la proliferación de Pmel-1 (señal de CBR-luc 1,4 veces mayor en el día 6, P = 0,32), la misma dosis de citocina cargada en nanopartículas fijadas en la superficie confería capacidades proliferativas notablemente amplificadas sobre linfocitos T Pmel-1 (recuento de fotones máximos 81 veces mayor con respecto a linfocitos T Pmel-1 sin modificar en el día 6, P < 0,0001, fig. 13A y C). Después de un periodo de contracción, los linfocitos T que transportaban nanopartículas de IL-15Sa/IL-21 presentaban persistencia a largo plazo potenciada (recuento de fotones 14,8 veces y 4,7 veces mayor que linfocitos T Pmel-1 en solitario a los 16 y 30 días después de la infusión de linfocitos T, respectivamente, P < 0,0001) y migraban de forma dirigida como linfocitos T de memoria centrales CD44+CD62L+ a los ganglios linfáticos y el bazo (fig. 13A y B, y datos no mostrados). No hubo evidencias de clonalidad progresiva de linfocitos T o formación de leucemia en ningún animal tratado del que se tomaran imágenes en puntos temporales posteriores (datos no mostrados). Los linfocitos T Pmel-1 conjugados con nanopartículas "vacías" mostraron la misma expansión/disminución in vivo que las células Pmel-1 sin modificar (datos no mostrados). Todos los ratones que recibieron linfocitos T Pmel-1 decorados con nanopartículas de IL-15Sa/IL-21 consiguieron eliminación completa del tumor (fig. 13A y D), mientras que el tratamiento con linfocitos T Pmel-1 con o sin infusión sistémica de IL-15Sa/IL-21 a las mismas dosis produjo ventajas de supervivencia solamente moderadas (fig. 13D).
Ejemplo 5. Conjugación de nanopartículas con células progenitoras hematopoyéticas.
Examinamos además la utilidad de esta estrategia de suministro en el contexto de trasplantes de células madre hematopoyéticas. Tratamos ratones C57B1/6 transgénicos para F-luc o ratones C57B1/6 transgénicos para GFP con 5-fluorouracilo (5-FU, Sigma Aldrich) (150mg/kg, i.p) y los sacrificamos 3 días después. Se retiraron células de médula ósea asépticamente de los fémures y las tibias. La médula ósea se enriqueció previamente para células progenitoras usando un kit de reducción de estirpe (Miltenyi). Una selección positiva posterior con microesferas anti-Sca-1 (Miltenyi) produjo un promedio de un 92 % de pureza de HSC lin-Sca-1 c-kit+. Las células se mantuvieron en StemSpan sin suero (Stem Cell Technologies) durante 3 horas antes de más modificaciones.
Se trasplantaron 1 x 104 HSC sin modificar o decoradas con nanopartículas por inyección retroorbitaria en destinatarios no transgénicos sometidos a radiación mortal (1300 cGy de irradiación corporal total desde una fuente de 137Cs como una dosis dividida con intervalo de 3 h entremedias).
Para la expansión de HSC in vitro, las HSC, transducidas retrovíricamente con NUP98-HOXA10hd, se cultivaron en DMEM complementado con FBS al 15 % y citocinas (6 ng/ml de IL-3, 10 ng/ml de IL-6, 100 ng/ml de SCF, todo de Preprotech).
Elegimos el inhibidor de la glucógeno sintasa cinasa-3 p (GSK-3p) TWS119 (Gattinoni et al., Nat Med 15:808, 2009) como carga terapéutica, basándonos en informes de que el tratamiento repetido con embolada de dosis alta de destinatarios de trasplantes con inhibidores de la glucógeno sintasa cinasa-3 (GSK-3) potencia la cinética de repoblación de las HSC donadoras (Trowbridge et al., Nat Med 12:89, 2006). Las nanopartículas de gel de ADN encapsularon eficazmente este fármaco micromolecular, y lo liberaron lentamente durante una ventana temporal de 7 días (datos no mostrados). Evaluamos las capacidad de repoblación in vivo de injertos hematopoyéticos sustentados por nanopartículas cargadas de TWS119 unidas a las células basándonos en la emisión corporal total de fotones desde las células progenitoras donadoras transgénicas para luciferasa de luciérnaga, y en experimentos separados, rastreando las frecuencias de las células progenitoras donadoras GFP+ por citometría de flujo. Después del trasplante de las células progenitoras murinas estirpe'Sca-1+c-kit+ de los donadores transgénicos para luciferasa en destinatarios singénicos, se observó un aumento constante en la emisión bioluminiscente corporal total originado por focos concretos sobre sitios anatómicos correspondientes a los fémures, los húmeros, el esternón y el bazo (fig.
14A). Aunque una inyección en embolada sistémica de TWS119 (1,6 ng) en el momento del trasplante no alteraba significativamente la cinética de injerto medida (fig. 14A y B), la misma dosis de TWS119 encapsulada en nanopartículas fijadas en la superficie a células progenitoras donadoras potenció notablemente la reconstitución proliferativa de los injertos de células progenitoras (mediana de bioluminiscencia 5,7 veces mayor que TWS119 sistémico después de 1 semana, P < 0,0001, fig. 14A-C). Destacablemente, los animales en todos los grupos de tratamiento inicialmente injertaron las células progenitoras en ambos fémures y el esternón, lo que indica que la conjugación con nanopartículas no comprometía las propiedades intrínsecas de migración dirigida de las células progenitoras donadoras. Aunque se aumentara la tasa de reconstitución inicial, la conjugación de las nanopartículas de TWS119 con las células progenitoras no afectaba a su potencial de diferenciación multiestirpe, reflejado por una frecuencia similar de tipos celulares reconstituidos GFP+ derivados del donador en comparación con los injertos de células progenitoras de control tres meses después del trasplante (fig. 14D). Por tanto, esta estrategia simple para la modificación de células donadoras justo antes de la transferencia celular también puede aumentar las células progenitoras hematopoyéticas, incluyendo células madre hematopoyéticas, en los trasplantes, un procedimiento en la práctica clínica rutinaria.
Ejemplo 6. Conjugación de liposomas con células.
Un protocolo de ejemplo para sintetizar liposomas unilaminares es el siguiente: Se hidrató una película lipídica de DOPC/DOPG/MPB PE/DiD (relaciones de lípidos como en las nanopartículas poliméricas) con 185 pl de PBS durante un periodo de una hora con agitación con vórtice vigorosa cada 10 minutos. Después de seis ciclos de congelación (N2 líquido) y descongelación, los liposomas se extruyeron 21 veces a través de un filtro de policarbonato (200 nm de tamaño de poro, Whatman) y se purificaron usando una columna de desalación Zeba Spin (Thermo Scientific).
La fig. 15 muestra la conjugación de liposomas con linfocitos T pmel-1. La imagen confocal muestra liposomas (azul) conjugados con las superficies de linfocitos T pmel-1 (teñidos con CFSE en verde). Se muestran proyecciones 3D de secciones ópticas tomadas por microscopia confocal.
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Todas las definiciones, como se definen y usan en el presente documento, deben entenderse como preferentes sobre las definiciones de diccionario y/o los significados ordinarios de los términos definidos.
Los artículos indefinidos "un" y "uno/a", como se usan en el presente documento en la memoria descriptiva y en las reivindicaciones, salvo que se indique claramente lo contrario, debe entenderse que significan "al menos uno".
La expresión "y/o", como se usa en el presente documento en la memoria descriptiva y en las reivindicaciones, debe entenderse que significa "alguno o ambos" de los elementos unidos de este modo, es decir, elementos que están presentes conjuntamente en algunos casos y presentes por separado en otros casos. Múltiples elementos enumerados con "y/o" deben interpretarse de la misma manera, es decir, "uno o más" de los elementos unidos de este modo. Pueden estar presentes opcionalmente otros elementos distintos de los elementos identificados específicamente por la cláusula "y/o", ya sea relacionados o no relacionados con los elementos identificados específicamente. Por tanto, como ejemplo no limitante, una referencia a "A y/o B", cuando se usa junto con expresiones indefinidas tales como "que comprende", puede hacer referencia, en una realización, solamente a A (opcionalmente incluyendo elementos distintos de B); en otra realización, solamente a B (opcionalmente incluyendo elementos distintos de A); en aún otra realización, tanto a A como a B (opcionalmente incluyendo otros elementos); etc.
Como se usa en el presente documento en la memoria descriptiva y en las reivindicaciones, "o" debe entenderse que tiene el mismo significado que "y/o" como se define anteriormente. Por ejemplo, cuando se separan artículos en una lista, "o" o "y/o" se interpretarán siendo inclusivos, es decir, la inclusión de al menos uno, pero también incluyendo más de uno, de varios o una lista de elementos y, opcionalmente, artículos no enumerados adicionales. Solamente expresiones que indiquen claramente lo contrario, tales como "solamente uno de" o "exactamente uno de", o, cuando se usa en las reivindicaciones, "que consiste en", se referirán a la inclusión de exactamente un elemento de varios o una lista de elementos. En general, el término "o" como se usa en el presente documento solamente se interpretará como indicativo de alternativas exclusivas (es decir, "uno o el otro, pero no ambos") cuando está precedido de expresiones de exclusividad, tales como "alguno de", "uno de", "solamente uno de", o "exactamente uno de". "Que consiste esencialmente en", cuando se usa en las reivindicaciones, tendrá su significado habitual usado en el campo de la ley de patentes.
Como se usa en el presente documento en la memoria descriptiva y en las reivindicaciones, la expresión "al menos uno", en referencia a una lista de uno o más elementos, debe entenderse que significa al menos un elemento

Claims (13)

REIVINDICACIONES
1. Una composición que comprende una célula transportadora con núcleo que migra de forma dirigida a un tumor y se conjuga covalentemente con una nanopartícula, en donde dicha nanopartícula comprende un agente, en donde la célula transportadora mantiene la nanopartícula sobre la superficie celular y en donde el agente tiene que liberarse desde la nanopartícula in vivo, para su uso como medicamento para suministrar un agente a un sujeto que tiene un tumor.
2. La composición para el uso de acuerdo con la reivindicación 1, en la que la célula transportadora con núcleo es un linfocito.
3. La composición para el uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en la que la célula transportadora con núcleo es un linfocito T reactivo a tumores.
4. La composición para el uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en la que la nanopartícula se conjuga covalentemente con la célula transportadora mediante grupos reactivos en la superficie de la célula transportadora.
5. La composición para el uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en la que la célula se conjuga covalentemente con la nanopartícula mediante grupos reactivos maleimida sobre la superficie de la nanopartícula.
6. La composición para el uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en la que el agente es un agente inmunoestimulador.
7. La composición para el uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en la que el agente es una citocina.
8. La composición para el uso de acuerdo con la reivindicación 7, en la que la citocina se selecciona de IL-2, IL-15 e IL-15/IL-15Ra.
9. La composición para el uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en la que la nanopartícula comprende una bicapa lipídica sobre su superficie más externa.
10. La composición para el uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en la que el diámetro de la nanopartícula está en el intervalo de 20-500 nm.
11. La composición para el uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en la que la nanopartícula es una nanopartícula biodegradable.
12. La composición para el uso de acuerdo con la reivindicación 11, en la que la nanopartícula es una nanopartícula biodegradable sintética.
13. La composición para el uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en la que la célula transportadora se conjuga covalentemente con una pluralidad de nanopartículas.
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