MX2012010810A - Composiciones de vesícula de lípido y métodos de uso. - Google Patents

Abstract

La invención provee sistemas de suministro constituidas de vesículas multilaminares estabilizadas, así como composiciones, métodos de síntesis y métodos de uso de las mismas; las vesículas multilaminares estabilizadas pueden comprender agentes profilácticos, terapéuticos y/o diagnósticos.

Description

COMPOSICIONES DE VESÍCULA DE LÍPIDO Y MÉTODOS DE USO SOLICITUDES RELACIONADAS Esta solicitud reclama el beneficio bajo 35 U.S.C. § 119(e) de la solicitud provisional de E.U.A. con número de serie 61/315,485, titulada "MICRO- AND NANOPARTICLES WITH SELF-ASSEMBLED LIPID COATINGS FOR SURFACE DISPLAY OF DRUGS SUCH AS VACCINE ANTIGENS AND ADJUVANTS" presentada el 19 de marzo de 2010, y la solicitud provisional de E.U.A. con número de serie 61/319,709, titulada "INTERBILAYER CROSSLINKED MULTILAMELLAR VESICLES" presentada el 31 de marzo de 2010, ambas de las cuales son incorporadas aquí por referencia en su totalidad.

Investigación auspiciada por el gobierno federal Esta invención se hizo con apoyo del Gobierno bajo la Concesión No. CA140476 de la NIH, y concesión No. W911 NF-07-D-0004 del Departamento de Defensa. El Gobierno tiene ciertos derechos sobre la invención.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN Los liposomas han sido estudiados ampliamente como un vehículo de suministro para moléculas pequeñas; sin embargo, sigue siendo difícil lograr altos niveles de encapsulamiento para muchos fármacos macromoleculares dentro de liposomas y muchas formulaciones de fármaco escurren de liposomas con demasiada rapidez para mantener la cinética de suministro de fármaco útil. Aunque el suministro de fármaco por micropartículas y nanopartículas puede encapsular proteínas y fármacos de molécula pequeña, esto típicamente da fármaco encapsulado en de masa total muy baja por masa de partículas, típicamente del orden de -10 pg de fármaco/mg de partículas. Además, los solventes orgánicos usados en síntesis de partículas poliméricas y ambiente hidrofóbico/ácido dentro de estas partículas pueden conducir a destrucción de agentes terapéuticos. (See Zhu et al. Nat. Biotechnol. 2000 18:52-57.) BREVE DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN La invención provee sistemas de suministro de fármaco novedosos e inventivos con capacidad de carga más alta, una capacidad para secuestrar altos niveles de agentes hidrofóbicos e hidrofílicos simultáneamente, y perfiles de liberación más largos. Algunos aspectos de estos sistemas de suministro comprenden vesículas de lípidos multilaminares que tienen bicapas lipídicas entrelazadas (referidas aquí como vesículas multilaminares entrelazadas interbicapa o ICMV).

Como se muestra en los ejemplos, las vesículas de la invención han incrementado inesperadamente la eficiencia de encapsulamiento (v.gr., en algunos casos, 100 veces más eficiente que los liposomas simples), y son capaces de liberar agentes encapsulados (o de otra manera atrapada) mediante cinética lenta y sostenida incluso en presencia de suero, lo que los hace altamente deseables como vehículos de suministro sostenido in vivo. Más aún, como se describe con mayor detalle aquí, las vesículas de la invención se pueden sintetizar en ambientes acuosos, evitando así las condiciones inhóspitas que son comunes en varios métodos de la técnica anterior incluyendo el uso de solventes orgánicos y/o ambientes ácidos. Como resultado, estos métodos de síntesis son más adecuados para una variedad de agentes incluyendo aquellos que típicamente serían comprometidos estructuralmente y/o funcionalmente usando dichos métodos de la técnica anterior. Las vesículas resultantes por lo tanto son libres de solvente orgánico y pueden ser comprometidas únicamente de los lípidos, incluyendo lípidos biodegradables, y cualquier agente encapsulado en las mismas o a través de las mismas.

La invención se basa en parte en estas y otras características sorprendentes e inesperadas de las vesículas de la invención, como se describe con mayor detalle aquí. Por consiguiente, la invención provee estas vesículas estabilizadas, composiciones que comprenden estas vesículas, métodos para hacer estas vesículas, y métodos de uso de las mismas.

Por lo tanto, en un aspecto, la invención provee una vesícula de lípido multílaminar que tiene entrelazamientos entre bicapas lipidicas, o una pluralidad o población de vesículas de lípido multilaminar que tienen entrelazamientos entre bicapas lipidicas. La pluralidad puede ser pero no se limita a 1 -103, 1-104, 1-105, 1 -106, 1-107, 1-108 o 1 -109. Varios aspectos de las vesículas se describen más adelante y se ha de entender que estos aspectos se aplican igualmente a la pluralidad o población de vesículas, a menos que se establezca de otra manera. Cabe entender que las vesículas de la invención comprenden enlaces entre componentes de bicapas adyacentes internas (o yuxtapuestas), y no simplemente entrelazamientos entre componentes de la bicapa externa (o más afuera) o superficie de bicapa.

En algunas modalidades, la vesícula comprende un lípido funcionalizado. En algunas modalidades, el lípido funcionalizado es un lípido funcionalizado con maleimida. El lípido funcionalizado puede ser una fosfoetanolamina pero no está limitado a ésta. En algunas modalidades, la vesícula comprende un componente de bicapa lipídíca que es funcionalizado, y preferiblemente directamente funcionalizado. En algunas modalidades, la vesícula comprende fosfocolína tal como pero sin limitarse a DOPC. En algunas modalidades, la vesícula comprende fosfoglicerol tal como pero sin limitarse a DOPG. En algunas modalidades, la vesícula comprende DOPC, DOPG y un lípido funcionalizado tal como pero sin limitarse a una fosfoetanolamina füncionalizada. El lípido funcionalizado puede ser uno que contenga maleimida. En algunas modalidades, las vesículas comprenden DOPC, DOPG y un lípido funcionalizado con maleimida. El lípido funcionalizado puede ser una fosfoetanolamina funcionalizada con maleimida tal como pero sin limitarse a MPB. En algunas modalidades, la relación molar de DOPC:DOPG:lípido funcionalizado es 40: 10:50. En algunas modalidades, la vesícula puede comprender DOPC y MPB. En algunas modalidades, las vesículas pueden comprender DOPC, DOTAP y MPB. En algunas modalidades, la relación molar de DOPC:DOTAP:lípido funcionalizado es 40:10:50. En algunas modalidades, el lípido funcionalizado está presente en un porcentaje molar de por lo menos 25%.

En algunas modalidades, la vesícula comprende un agente, que incluye uno o más agentes. Como se usa aquí, uno o más agentes incluye uno o más agentes que son diferentes uno del otro. En algunas modalidades, el agente es un agente profiláctico, un agente terapéutico o un agente de diagnóstico. En algunas modalidades, el agente es un antígeno. En algunas modalidades, el agente es un antígeno de proteína, incluyendo un antígeno de proteína entero. En algunas modalidades, el agente es un adyuvante. El adyuvante puede ser pero no se limita a un agonista de TLR tal como agonistas de TLR 4, TLR7, TLR8 y TLR9. En algunas modalidades, las vesículas comprenden un antígeno y por lo menos dos adyuvantes tales como un TLR4 y un agonista de TLR7. En algunas modalidades, el agente es una proteína.

En algunas modalidades, las vesículas comprenden en exceso de 300 pg de agente por mg de lipido (o partícula), o en exceso de 400 pg de agente por mg de lipido (o partícula). En algunas modalidades, las vesículas comprenden 300-400 pg de agente por mg de lipido (o partícula). En algunas modalidades, las vesículas comprenden 325 pg de agente por mg de lipido (o partícula), o 407 pg de agente por mg de lipido (o partícula). En modalidades relacionadas, el agente puede ser antígeno de proteína.

En algunas modalidades, el agente es encapsulado dentro de la vesícula. En algunas modalidades, el agente está presente en el núcleo de la vesícula. En algunas modalidades, el agente está presente entre bicapas lipídicas.

En algunas modalidades, las vesículas comprenden un agente en el núcleo y otro agente entre bicapas lipídicas. En algunas modalidades, el agente en el núcleo puede ser un antígeno tal como un antígeno de proteína, y el agente entre las bicapas lipídicas puede ser un adyuvante tal como pero sin limitarse a MPLA. En algunas modalidades, un antígeno está en el núcleo y dos adyuvantes están entre las bicapas lipídicas internas. Los dos adyuvantes, en algunas modalidades, are MPLA and R-848.

En algunas modalidades, las vesículas comprenden un agente en el núcleo y otro agente en la capa externa. En algunas modalidades, el agente en el núcleo puede ser antigeno tal como un antígeno de proteina, y el agente en la bicapa externa puede ser un adyuvante tal como pero sin limitarse a MPLA. En algunas modalidades, un antígeno está en el núcleo y dos adyuvantes están en la bicapa externa. En algunas modalidades, un antigeno está en el núcleo y uno o más adyuvantes están entre las bicapas internas y/o sobre la superficie de la bicapa externa. Los dos adyuvantes, en algunas modalidades, are MPLA and R-848.

En algunas modalidades, las vesículas son conjugadas a polietilenglicol (PEG). En algunas modalidades, las vesículas pueden ser conjugadas en la superficie a PEG.

En otro aspecto, la invención provee una composición que comprende cualquiera de las vesículas de lípido multilaminar anteriores (o poblaciones de vesículas) y un vehículo farmacéuticamente aceptable.

En otro aspecto, la invención provee una composición que comprende cualquiera de las vesículas de lípido multilaminar anteriores (o poblaciones de vesículas) y un excipiente adecuado para liofilización. En algunas modalidades, el excipiente adecuado para liofilización comprende sacarosa. Las vesículas se pueden usar en forma individual o se pueden combinar con otros agentes, incluyendo cualquiera de los agentes descritos aquí. En algunas modalidades, no se administrarán junto con células ni se conjugarán (o de otra manera se unirán físicamente) a células, por ejemplo, antes de administrarse a un sujeto. Las vesículas sin embargo pueden ser conjugadas a lígandos dirigidos para dirigirlas a células o sitios particulares en el cuerpo.

En otro aspecto, la invención provee un método que comprende poner en contacto liposomas que comprenden un lípido funcionalizado con un catión multivalente (v.gr., divalente) para formar liposomas fusionados, y poner en contacto los liposomas fusionados con un entrelazador para formar vesículas de lípido multilaminar que tienen entrelazamientos entre bicapas lipídicas, incluyendo cualquiera de las vesículas anteriores.

En algunas modalidades, el lípido funcionalízado es una maleimida-lípido funcionalízado. En algunas modalidades, el lípido funcionalízado es una fosfoetanolamina funcionalizada. En algunas modalidades, el lípido funcionalízado es un lípido funcionalízado con maleimida. En algunas modalidades, el lípido funcionalízado es fosfoetanolamina funcionalizada con maleimida. En algunas modalidades, los liposomas comprenden fosfocolina tal como pero sin limitarse a DOPC. En algunas modalidades, los liposomas comprenden fosfoglicerol tal como pero sin limitarse a DOPG. En algunas modalidades, los liposomas comprenden una maleimída-lípído funcionalízado, fosfocolina y fosfoglicerol. En algunas modalidades, los liposomas comprenden DOPC, DOPG y un lípido funcionalízado con maleimida (tal como MPB) a una relación molar de 40: 10:50. En algunas modalidades, los liposomas comprenden DOPC y un lípido funcionalízado con maleimida tal como MPB. En algunas modalidades, los liposomas comprenden DOPC, DOTAP y un lípido funcionalízado con maleimida (tal como MPB), opcíonalmente a una relación molar de 40:10:50.

En algunas modalidades, el enlazador es un enlazador permeable de membrana. En algunas modalidades, el entrelazador es un entrelazador de ditiol. En algunas modalidades, el entrelazador es ditioltrietol (DTT). En algunas modalidades, la relación molar de entrelazador de ditiol a lipido funcionalizado con maleimida es 1 :2.

En algunas modalidades, el método además comprende conjugar el polietilenglicol (PEG) a la superficie de las vesículas de lipido multilaminar que tienen entrelazamientos entre bicapas lipidicas.

En algunas modalidades, los cationes multivalentes son cationes divalentes tales como pero sin limitarse a Ca2+ o Mg2+. Éstos se pueden usar solos o en combinación En algunas modalidades, el contacto ocurre en un regulador de pH acuoso.

En algunas modalidades, los liposomas comprenden un agente.

En algunas modalidades, el agente es un agente profiláctico, un agente terapéutico o un agente de diagnóstico.

En otro aspecto, la invención provee un método que comprende poner en contacto una vesícula de lipido multilaminar que comprende un componente de bicapa lipídíca funcionalizado, tal como un lipido funcionalizado, con un entrelazador para formar vesículas de lipido multilaminar que tienen entrelazamientos entre bicapas lipidicas.

En otro aspecto, la invención provee un método que comprende administrar a un sujeto una vesícula de lipido multilaminar que tiene bicapas lipidicas entrelazadas y que comprende un agent, en una cantidad efectiva. La vesícula de lipido multilaminar que tiene bicapas lipidicas entrelazadas puede ser cualquiera de las vesículas de lipido multilaminar anteriores que tienen bicapas lipidicas entrelazadas o cualquiera de aquellas descritas aquí.

En algunas modalidades, la vesícula de lípido multilaminar comprende un lípido biodegradable. En algunas modalidades, la vesícula de lípido multilaminar comprende un fosfolipido. En algunas modalidades, la vesícula de lípido multilaminar comprende fosfocolina, fosfoglicerol, y/o fosfoetanolamina. En algunas modalidades, la vesícula de lípido multilaminar comprende a lípido funcionalizado. En algunas modalidades, el lípido funcionalizado es un lípido funcionalizado con maleimida. En algunas modalidades, el lípido funcionalizado con maleimida es una fosfoetanolamina funcionalizada con maleimida.

En algunas modalidades, el agente es un agente profiláctico. En algunas modalidades, el agente es un agente terapéutico. En algunas modalidades, el agente es un antigeno. En algunas modalidades, el agente es un adyuvante. En algunas modalidades, las vesículas comprenden dos o más agentes. En algunas modalidades, las vesículas comprenden un antigeno y un adyuvante. En algunas modalidades, las vesículas comprenden un antigeno y dos adyuvantes. En algunas modalidades, las vesículas comprenden un antigeno de proteína y un agonista es TLR4 y un agonista de TLR7. En algunas modalidades, el antigeno tal como el antigeno de proteína está presente en el núcleo de la vesícula y el adyuvante(s) están presentes entre las bicapas internas de la vesícula.

En algunas modalidades, la vesícula de lípido multilaminar es conjugada a PEG sobre su superficie externa.

En algunas modalidades, el sujeto tiene o está en riesgo de desarrollar cáncer. En algunas modalidades, el sujeto tiene o está en riesgo de desarrollar una infección. En algunas modalidades, el sujeto tiene o está en riesgo de desarrollar alergia o asma o está experimentando o en riesgo de experimentar un ataque asmático.

En algunas modalidades, la cantidad efectiva es una cantidad para estimular una respuesta inmunológica al sujeto. La respuesta inmunológica puede ser una respuesta humoral, o una respuesta celular, o puede ser una respuesta humoral y celular combinada. La respuesta celular puede implicar estimulación de células CD8 T.

En otro aspecto, la invención provee un método que comprende estimular una respuesta inmunológica en un sujeto, que necesita la misma, al administrar vesículas de lípido multilaminar que tienen bicapas lipídicas entrelazadas y que comprenden un antígeno, en donde una cantidad efectiva del antígeno se administra al sujeto. Las vesículas de lípido multilaminar que tienen bicapas lipídicas entrelazadas pueden ser de cualquiera de las vesículas anteriores o cualquiera de aquellas descritas aqui. Las vesículas además pueden comprenden uno o más adyuvantes. En algunas modalidades, las vesículas comprenden antígeno, incluyendo antígeno de proteína, en sus núcleos y adyuvantes entre sus bicapas lipídicas. El antígeno de proteína puede ser un antígeno de proteína entero. Los adyuvantes pueden ser pero no se limitan a agonistas de TLR4 tales como MPLA y agonistas de TLR7 y tales como R-848. En algunas modalidades, las vesículas comprenden 300-400 pg de antígeno por mg de lípido. En algunas modalidades, las vesículas se administran sólo una vez (es decir, una dosis iniciadora es suficiente). En algunas modalidades, las vesículas se administran más de una vez (v.gr., una dosis iniciadora y una de refuerzo). En algunas modalidades, el antigeno es un antígeno bacteriano, un antigeno viral, un antígeno fúngico, un antígeno parasitario o un antígeno micobacteriano. En algunas modalidades, el antígeno es un antígeno de cáncer. En algunas modalidades, la respuesta inmunológica es una respuesta inmunológica sinergistica.

En otro aspecto, la invención provee un método que comprende poner en contacto una vesícula de lípido multilaminar que tiene bicapas lipídicas entrelazadas y que comprende un agente, con una célula, o populación de células, in vitro. La célula o población de células pueden ser células dendríticas u otras células que presentan antígeno. La vesícula de lípido multilaminar que tiene bicapas lipídicas entrelazadas puede ser cualquiera de las vesículas de lípido multilaminar anteriores que tienen bicapas lipídicas entrelazadas o cualquiera de aquellas descritas aquí.

Cabe apreciar que todas las combinaciones de los concentos anteriores y conceptos adicionales descritos con mayor detalle más adelante (siempre que dichos conceptos no sean mutuamente inconsistentes) se contemplan como siendo parte del material inventivo descrito aquí. En particular, todas combinaciones del material reivindicado que aparece al final de esta descripción se contemplan como siendo parte del material inventivo descrito aquí. Cabe apreciar que la terminología utilizada explícitamente aquí que también aparece en cualquier descripción incorporada por referencia debe ser de acuerdo con un significado más consistente con los conceptos particulares descritos aquí.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS Figura 1A. Esquema dé síntesis de vesículas multilaminares entrelazadas entre capas (ICMVs). La fusión mediada por catión divalente conduce a la formación de vesículas multilaminares, en las cuales las bicapas adyacentes fueron entrelazadas con DTT. Las ICMVs resultantes fueron PEGiladas en una reacción con PEG-tiol.

Figura 1 B. Ilustración de ICMVs formadas al conjugar dos grupos de cabeza de lípido entre sí en vesículas multilaminares.

Figuras 2A-2D. Síntesis de ICMVs. (2A) Ilustración esquemática de síntesis de ICMV e imágenes de microscopio crioelectrónico: (i) Liposomas maleimida-funcionalizados amónicos se preparan a partir de películas de lípido secas, (¡i) cationes divalentes se añaden para inducir fusión de liposomas y la formación de MLVs, (iii)ditioles permeables en la membrana se añaden, cuyos maleimida-lípidos entrelazables en bicapas lipídicas yuxtapuestas en las paredes de las vesícula, y (iv) las partículas de lípido resultantes son PEGiladas con PEG tiol-terminado. Imágenes de Crio-EM de cada paso de la síntesis mostraron (i) liposomas iniciales, (ii) MLVs, y (iii) ICMVs con paredes de lípidos gruesas. Barras de escala = 100 nm. La imagen derecha de (üi) muestra una imagen amplificada de una pared de ICMV, en donde las bicapas apiladas se resuelven como estriaciones electrón-densas; barra de escala = 20 nm. (2B) Histograma de tamaño de partícula de ICMV medido por dispersión de luz dinámica. (2C, 2D) Histogramas de propiedades de ICMV de imágenes crio-EM muestran (2C) el número de bicapas lipidicas por partícula, y (2D) la relación de radio de partícula a espesor de pared de lípido. (n = 165 partículas analizadas).

Figuras 3A-3B. (3A) Histograma de diámetros de partícula medidos por dispersión de luz dinámica. (3B) Imagen crío-EM de partículas de ICMV.

Figuras 4A-4E. Encapsulamiento de proteína y liberación de ICMVs. (4A) Eficiencia de encapsulamiento de las proteínas globulares SIV-gag, FLT-3L o OVA en vesículas de lípido colectadas en cada paso de síntesis de ICMV. (4B, 4C) Comparación de eficiencia de encapsulamiento de OVA (4B), y carga de proteína total por masa de partícula (4C) en ICMVs vs. vesículas de deshidratación-rehidratación (DRVs) o nanoparticulas de PLGA. (4D) Cinética de liberación de OVA de liposomas simples, MLVs, o ICMVs (todas con composición de lípido base 4:5: 1 DOPC:MPB:DOPG) incubados en medio RPMI con 10% en el suero a 37°C medidos en 30 días in vitro. También mostrada para comparación es la cinética de liberación para liposomaa estabilizados con colesterol y PEG-lípido (38:57:5 DOPC:col:PEG-DOPE). (4E) La liberación de OVA de ICMVs se midió en reguladores de pH que estimulan diferentes aspectos del ambiente endolisomal: regulador de pH reductor, 100 mM de beta-mercaptoetanol (beta-ME) en PBS; regulador de pH ácido, 50 mM de citrato de sodio pH 5.0; regulador de pH que contiene lipasa, 500 ng/mL de lipasa A en PBS. Los datos representan la media ± s.e.m de por lo menos tres experimentos con n = 3.

Figuras 5A-5B. Comparación de encapsulamiento de OVA en liposomas tradicionales, partículas de PLGA revestidas con lípido, e ICMVs, que muestra (5A) fracción de OVA encapsulada en partículas y (5B) la cantidad de OVA encapsulada por masa de partícula total.

Figuras 6A-6B. OVA liberada de liposomas sonicados, MLVs fusionados por Mg2+ y ICMVs formados por Mg2+ y DTT en medio (6A) PBS y (6B) RPMI con 10% de suero.

Figuras 7A-7C. Estimulación in vitro de respuestas inmunológicas por ICMVs complementadas con el agonista de TLR, MPLA. (7A) Análisis de citometría de flujo de expresión de los marcadores coestimulantes de superficie celular CD40, CD80, y CD86 en células dendríticas esplénicas (DCs) después de 18 hr de incubación con 0.7 pg/mL de OVA soluble, dosis equivalentes de OVA cargada en ICMVs, o ICMVs cargadas con una proteína irrelevante (proteína de malaria por vivax, VMP), en presencia o ausencia de 0.1 pg/mL de MPLA. (7B) DCs esplénicas se incubaron durante 18 hr con 10 pg/mL de péptido SIINFEKL (OVA257.26 ) , 5.0 pg/mL de OVA soluble, dosis equivalentes de OVA cargada en ICMVs, o de ICMVs cargadas con VMP en presencia o ausencia de 0.05 pg/m de MPLA, y la extensión de presentación cruzada de OVA se evaluó por análisis de citometría de flujo de células teñidas con 25-D1 .16 mAb que reconoce SIINFEKL en complejo con H-2Kb. (7C) Células T de OT-I CD8+ intactas marcadas con diéster succinimidílico de diacetato de 5-(6)-carboxifluoresceina (CFSE) se co-cultivaron con DCs esplénicas singeneicas pulsadas con 0.7 pg/mL de OVA soluble mezclada con 0.1 pg/mL de MPLA, o dosis equivalentes de ICMVs cargadas con OVA mezcladas con MPLA. Las ICMVs vacias sin antígeno o ICMVs cargadas con el antígeno VMP irrelevante se incluyeron como controles negativos. La proliferación de células T de OT-I CD8+ se evaluó el día 3 por análisis de citometria de flujo de la dilución de CFSE en las células T de OT-I CD8+; mostradas son histogramas de fluorescencia de CFSE. Las compuertas en cada histograma indican el porcentaje de células divididas en cada muestra. Los datos representan la media ± s.e.m de por lo menos tres experimentos con n = 3-4.

Figuras 8A-8B. (8A) Maturación de DC y (8B) activación en respuesta a ICMV-incorporada con MPLA y/o R-848.

Figuras 9A-9F. La inmunización in vivo con ICMVs vs. antigeno soluble o antígeno encapsulado en vesículas no entrelazadas, a, b, ratones C57BI/6 fueron inmunizados subcutáneamente (s.c.) con una sola inyección de 10 pg de OVA suministrada en formulaciones soluble, liposomales, MLV o ICMV, cada uno mezclado con 0.1 pg de MPLA. (9A) El porcentaje de células T de CD8+ T específicas de antígeno se determinó por análisis de citometría de flujo de células mononucleares de sangre periférica (PBMCs) 7 días después de inmunización con tetrámeros de péptido OVA fluorescente- tetrámeros de MHC. (9B) Sueros de los ratones inmunizados se analizaron por ELISA 21 días después de inmunización para IgG específica de OVA. (9C, 9D) Ratones C57BI/6 fueron inyectados con 10 pg de OVA conjugada con fluoróforo mezclado con 0.1 pg de MPLA como una formulación soluble, liposomal o ICMV, y el nodo linfático inguinal drenables (dLN) que internalizaron OVA se evaluaron el día 2. (9C) Se muestran porcentajes de DCs (CD1 1c+), macrófagos (F4/80+), células B (B220+), y DCs plasmacitoides (CD1 1 c+B220+) positivos para absorción de OVA, y (9D) la intensidad de fluorescencia media (MFI) de OVA+. (E, F) Ratones C57BI/6 fueron inyectados con 10 pg de OVA mezclados con 0.1 pg de MPLA como una formulación soluble, liposomal o ICMV, y 2 días más tarde, DCs aislados de LNs inguinales drenables fueron analizados por citometría de flujo para evaluar activación de DC y presentación cruzada de antígeno. (9E) Los histogramas sobretendidos muestran marcadores coestimulantes (CD40 y CD86) y expresión de MHC-II en DCs. (9F) El panel izquierdo muestra histogramas sobretendidos de DCs de LN inguinales teñidos para complejos de SIINFEKL-Kb+, y niveles medios de niveles de MFI se muestran en el panel derecho. Los datos representan la media ± s.e.m de 2-3 experimentos independientes conducidos con n = 3-4. *, p < 0.05 y **, p < 0.01 , analizados por ANOVA de un sentido, seguido por HSD de Tukey.

Figuras 10A-10B. (10A) Células T de CD8+ específicas de OVA en sangre periférica después de 7 días de refuerzo, como se evalúa por análisis de citometría de flujo de células teñidas con anticuerpos contra CD8 y péptido-tetrámeros de MHC en complejo con el péptido derivado de OVA SIINFEKL (10B) Los títulos de anticuerpo anti-OVA medidos el día 21 de inmunización por ELISA.

Figura 1 1A-1 1 E. ICMVs que portan antígeno en el núcleo acuoso y MPLA embebido en las paredes de la vesícula producen respuestas de anticuerpo y células T de CD8+ T potentes. (1 1A) La ilustración esquemática de los grupos de vacuna. OVA soluble mezclada con MPLA (MPLA), ICMVs cargadas con OVA con MPLA sólo sobre la superficie externa (ext-MPLA ICMVs), o ICMVs cargadas con OVA con MPLA en todas las multicapas de lípido (int-MPLA ICMVs). (B-G) Ratones C57BI/6 fueron inmunizados los días 0, 21 y 35 en la base de la cola s.c. con 10 pg OVA y 0.1 pg o 1.0 pg de MPLA formulada ya sea como MPLA, ext-MPLA ICMVs, o int-MPLA ICMVs. (11 B) Análisis de ELISA de IgG específica de OVA total en el suero. (1 C) Frecuencia de células T específicas de OVA en suero periférico evaluado con el tiempo por análisis de citometría de flujo de tetrámero+células T de CD8+ para vacunaciones con 10 pg de OVA y 0.1 pg de MPLA. La respuesta a las vacunaciones con OVA soluble + 1 pg de MPLA es (MPLA 10X) también mostrado para comparación. Se muestra gráficas de dispersión de citometría de flujo representativos de ratones individuales el día 41 y valores de tetrámero+ promedio de grupos de ratones vs. tiempo. (11 D) Análisis de fenotipos de efector de células T/memoria efectora/memoria central en sangre periférica por tinción con CD44/CD62L sobre células de tetrámero+ de sangre periférica el día 41. Se muestra gráfica de citometría representativa de ratones individuales y porcentajes promedio de células tet+CD44+CD62L* entre células T de CD8+ T el día 41. (1 1 E) La funcionalidad de células T de CD8* especificas de antígeno se probó el dia 49 con tinción de IFN-? intracelular después de restimulación ex vivo de PBMCs con péptido OVA in vitro. Histogramas de citometría de flujo representativos de células T de IFN-y+CD8+ de ratones individuales y resultados de la media de grupos se muestran. Los datos representan la media ± s.e.m de dos experimentos independientes conducidos con n = 3. c, *, p < 0.05 comparado con OVA sol + MPLA y #, p < 0.05 comparado con ext-MPLA ICMVs. (D, E) *, p < 0.05 and * *, p < 0.01 , analizados por ANOVA de dos sentidos, seguido por HSD de Tukey.

Figura 12. Un alquino-lípido de grupo de cabeza se sintetizó a partir de DOPE y un precursor de alquino. Se formaron liposomas con lípidos terminados en alquino y fueron inducidos para formar MLVs por Mg2+. La incubación subsiguiente de las MLVs que contienen alquino con diazida y catalizador como se indica condujeron a la formación exitosa de ICMVs con 83% de rendimiento de partículas, como se mide después de recuperación de partículas con condiciones de centrifugación de baja velocidad.

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN La invención provee vesículas de lípidos multilaminares para usarse, entre otros, en el suministro de agentes. Vacunas de la técnica anterior basadas en proteínas recombinantes evitan toxicidad e inmunidad anti-vector asociada con vectores de vacuna viva (v.gr., virales), pero su inmunogenicidad es pobre, particularmente para respuestas de células T de CD8+ (CD8T). Las partículas sintéticas que portan antígenos y moléculas adyuvantes se han desarrollado para incrementar vacunas de subunidad, pero en general estos materiales han fallado para producir respuestas de CD8T comparables con vectores vivos en modelos animales preclínicos. A diferencia de estas composiciones y métodos de la técnica anterior, la invención provee vesículas multilaminares estabilizadas, tales como vesículas multilaminares entrelazadas entre capas (ICMVs) formadas al entrelazar grupos de cabeza de bicapas lipídicas dentro de vesículas multilaminares. Estas vesículas establemente atrapan, entre otros, antígenos de proteína en el núcleo de la vesícula y moléculas inmunoestimulantes basadas en lípídos en las paredes de la vesícula ajo condiciones extrtracelulares, pero presentaron liberación rápida en presencia de lipasas endolisosomales. Cuando se usan para suministrar antígeno solo o en presencia de adyuvante, las vesículas de la invención forman una vacuna extremadamente potente (v.gr., una vacuna de proteína entera), produciendo respuestas de células T y anticuerpo endógenas comparables con los vectores de vacuna más fuertes.

Las vesículas son estabilizadas por enlazamienfo interno (v.gr., entrelazamiento) de sus bicapas lipídicas. La naturaleza estabilizada de estas vesículas les permite incorporar cantidades más altas de agentes y retener dichos agentes durante un período más largo, en comparación con liposomas simples o nano- o micropartículas revestidas con lípidos. Su cinética de liberación sostenida, particulalmente en presencia de suero, las hace útiles en el suministro in vivo de agentes para los cuales es deseable una liberación lenta, constante y prolongada o para los cuales es deseable una liberación lenta en el ambiente extracelular pero rápida dentro de las células. La invención contempla el uso de dichas vesículas con un número y variedad de agentes incluyendo agentes profilácticos, agentes terapéuticos, y/o agentes de diagnóstico, como se describe con mayor detalle aquí. La invención por lo tanto provee composiciones que comprenden las vesículas, métodos para su síntesis y métodos para su uso antes mencionados.

Vesículas de lipido multilaminares estabilizadas (MLV) La invención provee MLV que son estabilizadas enlazando bicapas lipídicas adyacentes (o yuxtapuestas) unas a otras. Como se usa aquí, una vesícula multilaminar es una nano- o microesfera que tiene una coraza que está compuesta de dos o más bicapas lipídicas concéntricamente dispuestas. Como se usa aquí, bicapas lipídicas (o superficies de bicapas lipídicas) adyacentes o yuxtapuestas se refieren a bicapas o superficies que están en estrecha proximidad unas a otras pero que de otra manera son distintas y típicamente físicamente separadas. Este término no significa típicamente la relación entre las dos monocapas de una sola bicapa.

Como se usa aquí, "enlace" significa dos entidades establemente unidas una a otra por cualquier medio fisicoquímico. Cualquier enlace conocidos por los expertos en la técnica se puede utilizar incluyendo enlace covalente o no covalente, aunque el enlace covalente es preferido. En algunas modalidades importantes descritas aquí, el enlace covalente entre bicapas lipídicas adyacentes (o yuxtapuestas) en MLV se logra a través del uso de entrelazadores y componentes funcionalizados de la bicapa lipídica. La invención sin embargo contempla que el enlace, incluyendo el enlace covalente, puede ser efectuado de otras formas. Como un ejemplo, la invención contempla métodos en los cuales grupos reactivos complementarios residen en componentes de superficies de bicapa adyacentes y el enlace entre las superficies de bicapa es efectuada haciendo reaccionar esos grupos unos con otros un en ausencia de un entrelazados Los grupos reactivos complementarios son conocidos en la técnica y se describen aquí.

El interior de la vesícula es típicamente un ambiente acuoso, y puede comprender un agente tal como pero sin limitarse a un agente profiláctico, terapéutico o de diagnóstico. En algunos casos, las vesículas no comprenden un núcleo sólido, tal como un núcleo de polímero sólido (v.gr., un núcleo de polímero sintético). Más bien, como se describió antes, puede tener un núcleo fluido que comprende agentes de interés. El núcleo puede comprender monómeros para polimerización en un núcleo de hidrogel en algunos casos. Las vesículas también pueden referirse aquí como partículas, incluyendo nano- o micropartículas, aunque se debe entender que dichas nano- o micro-partículas tienen los atributos de las MLVs estabilizadas y vesículas de lípído multilaminar entrelazadas entre capas (ICMVs) de la invención.

Las vesículas pueden tener un volumen hueco en su núcleo y/o pueden comprender uno o más agentes en su núcleo y/o entre bicapas lipídicas adyacentes (o yuxtapuestas), como se muestra en las figuras 1A, 1 B y 2A. Los agentes típicamente se incluyen en la solución de lípido durante el proceso de síntesis y de esta manera son incorporados (v.gr., por encapsulamiento) en las vesículas durante la síntesis. Las moléculas lipofílícas también pueden ser incorporadas directamente en las bicapas lipídicas a medida que se forman las vesículas o las moléculas con colas lipofílicas pueden ser ancladas a las bicapas lipídicas durante la formación de vesícula. Las vesículas pueden ser producidas en ausencia de solventes duros, tales como solventes orgánicos, y como resultado pueden ser capaces de encapsular una amplia variedad de agentes incluyendo aquellos que serían susceptibles a solventes orgánicos y similares.

La cantidad de agente en las vesículas puede variar y pueden depender de la naturaleza del agente. Como se demuestra en los ejemplos, 300-400 pg de agente de proteína por mg de lípido se puede incorporar en las vesículas de la invención. En algunas modalidades, las vesículas pueden comprender aproximadamente 100 pg de agente, o aproximadamente 150 pg de agente, o aproximadamente 200 pg de agente, o aproximadamente 250 pg de agente, o aproximadamente 300 pg de agente, o aproximadamente 325 pg de agente, o aproximadamente 350 pg de agente, o aproximadamente 375 pg de agente, o aproximadamente 400 pg de agente, o aproximadamente 410 pg de agente, por mg de lípido. En algunas modalidades, el agente puede ser una proteína tal como un antígeno de proteína.

Las vesículas de la invención también pueden ser caracterizadas por sus perfiles de retención. En algunas modalidades, las vesículas liberan agente a una velocidad de aproximadamente 25% por semana cuando se colocan en medio que contiene suero (v.gr., 10% de suero) y se mantienen a 37°C. En algunas modalidades, las vesículas liberan aproximadamente 25% de agente en la primera semana y hasta aproximadamente 90% después de aproximadamente 30 días bajo estas condiciones. En algunas modalidades, las vesículas mantienen por lo menos 80%, por lo menos 85%, por lo menos 90%, o por lo menos 95% de su agente cuando se almacenan en regulador de pH (tal como PBS) a 4°C durante 30 días.

El número de bicapas lipídicas en cada vesícula puede variar, con un intervalo típico de por lo menos 2 a aproximadamente 50 o por lo menos 2 a aproximadamente 25, o por lo menos 2 a aproximadamente 15, o por lo menos 2 a aproximadamente 10, o por lo menos 2 a aproximadamente 5.

El diámetro de las vesículas puede variar. En algunos casos, las vesículas tendrán un diámetro que varía de aproximadamente 100 a aproximadamente 500 nm, incluyendo de aproximadamente 125 a aproximadamente 300 nm, incluyendo de aproximadamente 150 a aproximadamente 300 nm, incluyendo de aproximadamente 175 a aproximadamente 275 nm. En algunos casos, el diámetro varía de aproximadamente 150 a aproximadamente 250 nm. Los perfiles de diámetro para ICMV preparada como se describe en los ejemplos se muestra en las figuras. 2B y 3A. Se entenderá que, en cualquier preparación de vesículas, habrá heterogeneidad entre vesículas relacionadas con el diámetro de la vesícula, número de bícapas lipídicas, cantidad de agente cargado, etc. Dichas distribuciones se muestran en los ejemplos.

Como se usa aquí, las vesículas de la invención también se pueden referir como liposomas (v.gr., liposomas multilaminares estabilizados o, como se describe más adelante, liposomas multilaminares entrelazados entre capas). Por consiguiente, el uso del término "vesículas" no pretende transmitir fuente u origen de las vesículas. Las vesículas de la invención son vesículas sintéticas (es decir, se producen in vitro), como se describirá con mayor detalle más adelante.

Las vesículas se pueden aislar, con la intención de que están físicamente separadas en su totalidad o en parte del ambiente en el que son sintetizadas. Como un ejemplo, las vesículas que comprenden un agente (es decir, su "carga" o "contenido") puede ser separada en su totalidad o en parte de vesículas que carecen de agente (es decir, vesículas vacías), y entonces pueden referirse como "vesículas aisladas". La separación puede ocurrir con base en el peso (o masa), densidad (incluyendo densidad de flotación), tamaño, color y similares (v.gr., en donde el carga de la vesícula es detectable por su emisión de energía), etc. Como se describe en los ejemplos, la centrifugación se puede usar para separar vesículas de la invención de liposomas simples o MLVs de composición de lípidos idéntica que no tienen bicapas entrelazadas. La centrifugación a aproximadamente 14,000 g durante aproximadamente 4 minutos es suficiente para separar las vesículas de la invención, que forman comprimidos, de estos otros tipos de partícula.

Vesículas de lípido multilaminar entrelazadas entre capas Un ejemplo de la MLV estabilizada de la invención es la vesícula multilaminar (lípido) entrelazada entre capas (ICMV). Como la MLV estabilizada descrita anteriormente, ICMV son nanoesferas o microesferas que tienen una coraza que está compuesta de dos o más bicapas lipídicas concéntricamente dispuestas que son conjugadas unas a otras como se describe aquí. El número de bicapas lipídicas en las vesículas multilaminares estabilizadas, incluyendo la ICMV, puede variar de aproximadamente 2-30, pero muy comúnmente está en el intervalo de 2-15. Por consiguiente, en varias modalidades, el número de capas puede ser 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 1 1 , 12, 13, 14, 15 o más. La distribución frecuencia de números de bicapa que resulta de una síntesis ilustrativa de ICMV se muestra en la figura 2C. Las bicapas están típicamente compuestas de lípídos que tienen cabezas hidrofílicas y colas hidrofóbicas que están dispuestas de una manera similar a una membrana celular (es decir, con las cabezas hidrofílicas expuestas típicamente a un ambiente acuoso y las colas hidrofóbicas enterradas en la bicapa).

Las ICMV son estabilizadas mediante entrelazamientos entre sus bicapas lipídicas, y por lo tanto se refieren como MLV "entrelazadas entre capas". Como se usa aquí, esto significa que por lo menos dos bicapas lipídícas en la coraza de la vesícula son entrelazadas una a la otra. Las bicapas entrelazadas son típicamente aquellas que están yuxtapuestas o adyacentes una a otra. La mayoría o todas las bicapas lipídicas en la coraza pueden ser entrelazadas a su bicapa lipídica yuxtapuesta en la coraza. Pueden ser uno o más entrelazamientos entre bicapas lipídicas. Típicamente, serán numerosos entrelazamientos entre bicapas lipídicas. La disposición y ubicación de dichos entrelazamientos puede ser aleatorias o no aleatorias El grado de entrelazamientos (y por lo tanto la estabilidad resultante de las vesículas) dependerá de la proporción de lípidos funcionalizados (u otros componentes de capa lipídica) usados para hacer las vesículas y las condiciones de entrelazamiento (incluyendo, por ejemplo, tiempo de incubación de las vesículas con un entrelazador). Se entenderá que mientras mayor es la proporción de lípidos funcionalizados (u otros componentes de capa lipídica) en las vesículas, más entrelazamientos se formarán, todos los demás factores y parámetros siendo iguales. De manera similar, mientras más favorables son las condiciones hacia el entrelazamiento, mayor será el grado de entrelazamiento que se logrará.

Métodos de síntesis Un método de síntesis ilustrativo es como sigue: Los lípidos y opcionalmente otros componentes de bicapa se combinan para formar una mezcla homogénea. Esto puede ocurrir a través de un paso de secado en el cual los lípidos se secan para formar una película de lípido. Los lipidos después se combinan (v.gr., rehidratan) con un solvente acuoso. El solvente acuoso puede tener un pH en el intervalo de aproximadamente 6 a aproximadamente 8, incluyendo un pH de aproximadamente 7. Los reguladores de pH compatibles con fusión de vesículas se usan, típicamente con concentraciones bajas de sal. El solvente usado en los ejemplos es un regulador de pH de 10 mM de bis-tris propano (BTP), pH 7.0. La naturaleza del regulador de pH puede impactar la longitud de la incubación, como se muestra en la tabla 1A. Por ejemplo, un regulador de pH tal como PBS puede requerir un tiempo de incubación más largo en comparación con un regulador de pH tal como BTP, todas las demás cosas siendo iguales. Si el regulador de pH es PBS, entonces los tiempos de incubación pueden ser aproximadamente 6-24 horas, o 8-16 horas o 10-12 horas. Si el regulador de pH es BTP, entonces los tiempos de incubación pueden ser más cortos incluyendo 1-4 horas o 1-2 horas. Por consiguiente, una variedad de reguladores de pH acuosos se pueden usar siempre que un tiempo de incubación suficiente también se use. Este paso también puede incluir la presencia del agente(s) que han de ser incorporados en las vesículas. Los liposomas resultantes después son incubados con uno o más cationes divalentes para fusionarlos en vesículas multilaminares. Los cationes divalentes adecuados incluyen Mg2+, Ca2+, Ba2+ o Sr2*. Los cationes multivalentes o poliméricos también se podrían utilizar para fusión de vesículas. La fusión de vesículas también se podría lograr a través del mezclado de vesículas catiónicas con aniones divalentes o de valencia ás alta; un ejemplo sería la fusión de liposomas catiónicos con oligonucleótidos de ADN o plásmidos de ADN. Esto se puede hacer bajo agitación tal como sonicación, acción de remolino, y similares. Si los liposomas se hicieron en presencia de un agente, las MLVs comprenderán el agente en su núcleo y/o entre las bicapas lipídicas concéntricamente dispuestas. La invención contempla la fusión de liposomas que portan diferentes agentes para formar MLVs que comprenden dichos agentes.

Las MLVs resultantes son después incubados con un entrelazados y preferiblemente un entrelazador permeable a la membrana. Como se establece en la presente, la naturaleza del entrelazador variará dependiendo de la naturaleza de los grupos reactivos que son ligados entre sí. Como se demuestra en los ejemplos, un entrelazador que contiene ditiol tal como DTT o (1 ,4-Di-[3 -(2 -piridilditio)-propionamido]butano) se puede usar para entrelazar MLVs compuestos de lípido funcionalizado con maleimidas (u otros componentes de bicapa lipidica funcionalizados), o entrelazadores de diazida se podrían usar para entrelazar lípidos con grupo de cabeza de alquino mediante química "clic", como se muestra en la figura 12 y en el esquema A. Estas diversas incubaciones se llevan a cabo todas ellas bajo condiciones acuosas a un pH en el intervalo de aproximadamente 6 a aproximadamente 8, o aproximadamente 6.5 a aproximadamente 7.5 o a aproximadamente 7. El paso de entrelazamiento se puede realizar a temperatura ambiente (v.gr., 20-25°C) o a una temperatura elevada incluyendo por ejemplo hasta o más de 37°C.

ESQUEMA A Reacción entrelazada entre capas alternativa usando química "clic Alquino-DOPE Las vesículas entrelazadas resultantes pueden ser recopiladas (v.gr., por centrifugación u otros medios de formación de comprimidos), lavadas y después PEGiladas sobre su superficie más afuera o externa (v.gr., como se usa aquí, las vesículas pueden referirse como "superficie-PEGiladas" o "superficie-conjugadas" a PEG) por incubación con un tiol-PEG. El PEG puede ser de cualquier tamaño, incluyendo pero no limitándose a 0.1 -10 kDa, 0.5-5 kDa o 1-3 kDa. A 2 kDa PEG funcionalizado con tiol se usa en los ejemplos. El período de incubación puede variar de aproximadamente 10 minutos a 2 horas, aunque puede ser más corto o más largo dependiendo de otras condiciones tales como temperatura, concentración y similares. El paso de PEGilación se puede performar a temperatura ambiente (v.gr., 20-25°C) o a una temperatura elevada incluyendo por ejemplo hasta o mayor de 37°C. Un período de incubación de 30 minutos se usa en los métodos de síntesis ilustrativos de los ejemplos. Las vesículas entonces pueden ser recolectadas (v.gr., por centrifugación u otros medios de formación de comprimidos) y lavadas con agua u otro regulador de pH acuoso.

Las vesículas se pueden almacenar a 4°C en una solución regulada en su pH tal como pero sin limitarse a PBS o pueden ser liofilizadas en presencia de crioconservadores adecuados y después almacenados a -20°C. Los crioconservadores adecuados incluyen aquellos que incluyen sacarosa (v.gr., una sacarosa al 1 -5%, y preferiblemente aproximadamente solución de sacarosa al 3%).

El entrelazamiento también se podría lograr por acoplamiento entre un grupo reactivo en una bicapa con un grupo reactivo complementario en la bicapa adyacente. Por ejemplo, las vesículas fusionadas que contienen grupos de cabeza de éster succinimidílico-lípido funcionalizado (A) y grupos de cabeza que contienen amina primaria (B) podrían lograr entrelazamiento por reacción in situ entre los lípidos A y B de bicapas adyacentes. Una variedad de otros lípidos funcionalizados complementarios conocidos por los expertos en la técnica se podrían utilizar de una manera similar.

La relación molar de lípido funcionalizado (u otro componente funcionalizado de la bicapa lipídica) a entrelazador puede variar dependiendo de las condiciones. En algunos casos, puede variar de aproximadamente 1 a aproximadamente 5. En algunas modalidades, una relación molar de 2 es suficiente (es decir, la relación molar de lípido funcionalizado (o componente) al entrelazador es 2:1). Los ejemplos describen un método de síntesis en el cual una relación molar de 2:1 de lípido funcionalizado con maleimida a DTT se usa para entrelazar las bicapas lipídicas de las vesículas. El tiempo de incubación puede variar de 1 hora a 24 horas, de 2-18 horas, de 2 a 12 horas, o de 2 a 6 horas. En algunos casos, puede ser aproximadamente 2 horas. En otros casos, puede ser durante la noche (v.gr., aproximadamente 12 horas).

El % molar del lipido funcionalizado en las vesículas puede variar de 1 % a 100%, o de aproximadamente 10% a aproximadamente 60% en algunos casos, o de aproximadamente 25% a aproximadamente 55% en algunos casos. En algunos casos, el % molar del lipido funcionalizado en las vesículas es típicamente por lo menos 10%, preferiblemente por lo menos 5%, muy preferiblemente por lo menos 20%, y muy preferiblemente aún por lo menos 25%. Los cuadros 1A y 1 B muestran que en ausencia de lipido funcionalizado, no se forman vesículas.

Por el contrario, los lípídos no funcionalízados pueden estar presentes a aproximadamente 0% a 99% como un % molar. Muy típicamente, los lípidos no funcionalízados pueden estar presentes a aproximadamente 40%-75% o 40% a 60% como un % molar.

En una modalidad importante, las vesículas se sintetizan usando DOPC, DOPG y DSPE maleímida-funcionalizado. La relación de estos lípidos unos a otros puede variar. Los cuadros 1A y 1 B muestran los efectos de variar la relación de DOPC:DOPG:lípido funcionalizado con maleimida sobre el rendimiento de la vesícula. El % molar de DOPC puede variar de 1-50%, el % molar de DOPG puede variar de 1-50%, y el % molar del lipido funcionalizado con maleimida puede variar de 1 -80%. Algunas modalidades de la invención proveen vesículas que tienen un DOPC:DOPG:lipido funcionalizado con relación de maleimida de 40:10:50. Algunas modalidades proveen vesículas que tienen una relación de DOPC:DOPG:lípido funcionalizado con maleimida de 60:15:25. Algunas modalidades proveen vesículas compuestas de DOPG y un lípido funcionalizado con maleimida.

Lípidos Las vesículas están compuestas de uno o más lípidos. El tipo, número y relación de lípidos puede variar con la condición de que colectivamente formen bicapas esféricas (es decir, vesículas). Los lípidos pueden ser aislados de una fuente que ocurre naturalmente o pueden ser sintetizados aparte de cualquier fuente que ocurre naturalmente.

Por lo menos uno (o algunos) de los lípidos es/son lípidos anfifáticos, definidos como que tienen una porción hidrofílica y una porción hidrofóbica (típicamente una cabeza hidrofílica y una cola hidrofóbica). La porción hidrofóbica típicamente se orienta hcia una fase hidrofóbica (v.gr., dentro de la bicapa), mientras que la porción hidrofílico típicamente se orienta hacia la fase acuosa (v.gr., fuera de la bicapa, y posiblemente entre superficies de bicapa yuxtapuestas adyacentes). La porción hidrofílica puede comprender grupos polares o cargados tales como carbohidratos, fosfato, carboxílico, sulfato, amino, sulfhidrilo, nitro, hidroxi y otros grupos similares. La porción hidrofóbica puede comprender grupos apolares que incluyen sin limitación grupos hidrocarburo alifáticos saturados e insaturados de cadena larga y grupos sustituidos por uno o más grupos aromáticos, ciclo-alifáticos o heterocíclicos. Ejemplos de compuestos anfifáticos incluyen, pero no se limitan a, fosfolípidos, aminolípidos y esfingolípidos.

Típicamente, los lípidos son fosfolípidos. Los fosfolípidos incluyen sin limitación fosfatidilcolina, fosfatidiletanolamina, fosfatidilglicerol, fosfatidilinositol, fosfatidilserina y similares. Cabe entender que se pueden usar otros componentes de membrana lipidíeos, tales como colesterol, esfingomielina, cardiolipina, etc.

Los lípidos pueden ser aniónicos y neutros (incluyendo zwttteriónicos y polares) lípidos incluyendo fosfolípidos aniónicos y neutros. Los lípidos neutros existen en una forma zwíteriónica no cargada o neutra un pH seleccionado. A pH fisiológico, dichos lípidos incluyen, por ejemplo, dioleoilfosfatidilglícerol (DOPG), diacilfosfatidilcolína, diacilfosfatidiletanolamina, ceramida, esfingomielina, cefalina, colesterol, cerebrósidos y diacilgliceroles. Ejemplos de lípidos zwiteriónícos incluyen sin limitación dioleoilfosfatidilcolina (DOPC), dimiristoilfosfatidilcolina (DMPC), y dioleoilfosfatidilserina (DOPS). Un lípido aniónicoes un lípido que es negativamente cargado a pH fisiológico. Estos lípidos incluyen sin limitación fosfatidilglicerol, cardiolipina, diacilfosfatídilserína, diacilfosfatídico, N-dodecanoil fosfatidiletanolaminas, N-succinil fosfatidíletanolaminas, N-glutarilfosfatidiletanolaminas, lísilfosfatidilgliceroles, palmitoiloleiolfosfatidilglicerol (POPG), y otros grupos modificadores aniónicos unidos a lípidos neutros.

Colectivamente, lipidos aniónicos y neutros son referidos aquí como lípidos no catiónicos. Dichos lípidos pueden contener fósforo pero no se limitan a éstos. Ejemplos de lipidos no catiónicos incluyen lecitina, lisolecitina, fosfatidiletanolamina, lisofosfatidiletanolamina, dioleoilfosfatidiletanolamína (DOPE), dipalmitoilfosfatidiletanolamina (DPPE), dimiristoilfosfoetanolamina (DMPE), distearoil-fosfatidil-etanolamina (DSPE), palmitoiloleoíl-fosfatidiletanolamina (POPE) palmitoiloleoilfosfatidilcolina (POPC), fosfatidilcolina de huevo (EPC), distearoilfosfatidilcolina (DSPC), dioleoilfosfatidilcolina (DOPC), dipalmitoilfosfatidilcolina (DPPC), dioleoílfosfatidilglicerol (DOPG), dipalmítoilfosfatidilglicerol (DPPG), palmitoiloleiolfosfatidilglicerol (POPG), 16-O-monometil PE, 16-O-dimetil PE, 18-1-trans PE, palmítoiloleoil-fosfatidiletanolamina (POPE),1-estearoil-2-oleoil-fosfatidiletanolamína (SOPE), fosfatidilserina, fosfatidilinositol, esfingomielina, cefalina, cardiolipina, ácido fosfatídico, cerebrósidos, dicetilfosfato y colesterol.

Los lípidos que no contienen fósforo adicionales incluyen estearilamina, dodecilamina, hexadecilamina, palmitato de acetilo, glicerolricinoleato, estereato de hexadecilo, miristato de isopropilo, polímeros acrílicos anfotéricos, trietanolamina-sulfato de laurilo, sulfato de alquilarilo, amidas de ácido graso polietoxilado, bromuro de dioctadecildimetilamonio y similares, diacilfosfatidilcolina, diacilfosfatidiletanolamina, ceramida, esfingomielina, cefalina y cerebrósidos. Lípidos tales como lisofosfatidilcolina y lisofosfatidiletanolamina se pueden usar en algunos casos. Lípidos no catiónicos también incluyen polímeros basados en polietilenglicol tales como PEG 2000, PEG 5000 y polietilenglicol conjugado a fosfolipidos o a ceramidas (referidos aquí como PEG-Cer).

En algunos casos, se pueden usar formas modificadas de lípidos incluyendo formas modificadas con marcadores detectables tales como fluoroforos. En algunos casos, el lípido es un análogo de lípido que emite señal (v.gr., una señal fluorescente). Ejemplos incluyen sin limitación yoduro de 1 , 1 '-dioctadecil-3,3,3',3'-tetrametilindotricarbocianina (DiR) y 1 , 1 '-dioctadecil-3,3,3',3'-tetrametilindodicarbocianina (DiD).

Preferiblemente, los lípidos son biodegradable para permitir la liberación de agente encapsulado in vivo y/o in vitro. Los lípidos biodegradables incluyen pero no se limitan a 1 ,2-dioleoil-sn-glicero-3-fosfocolina (dioleoil-fosfocolina, DOPC), 1 ,2-di-(9Z-octadecenoil)-sn-glicero-3-fosfo-(l '-rac-glícerol) aniónico (dioleoil-fosfoglicerol, DOPG), y 1 ,2-distearoil-sn-glicero-3-fosfoetanolamina (distearoil-fosfoetanolamina, DSPE). También se pueden incorporar componentes de membrana no lipidíeos tales como colesterol.

Componentes de lípidos o bicapa funcionalizados Por lo menos un componente de la bicapa lipídica debe ser funcionalizado (o reactivo). Como se usa aquí, un componente funcionalizado es un componente que comprende un grupo reactivo que se puede usar para entrelazar bicapas adyacentes de la vesícula multilaminar. El componente de bicapa puede ser modificado para comprender el grupo reactivo.

Uno o más de los lípidos usados en la síntesis de las vesículas pueden ser lípidos funcionalizados. Como se usa aquí, un lípido funcionalizado es un lípido que tiene un grupo reactivo que se puede usar para entrelazar bicapas adyacentes de la vesícula multilaminar. En algunas modalidades, el grupo reactivo es uno que reaccionará con un entrelazador (u otra porción) para formar entrelazamientos entre dichos lípidos funcionalizados (y por lo tanto entre bicapas lipídicas en la vesícula). El grupo reactivo puede estar localizado en cualquier parte en el lípido que permite que haga contacto con un entrelazador y ser entrelazado a otro lípido en una bicapa yuxtapuesta adyacente. En algunas modalidades, está en el grupo de cabeza del lípido, incluyendo por ejemplo un fosfolípído. Un ejemplo de un grupo reactivo es un grupo maleimida. Los grupos maleimida pueden ser entrelazados unos a otros en presencia de entrelazadores de ditiol tales como pero sin limitarse a ditioltrietol (DTT). Un ejemplo de un lípido funcionalizado es 1 ,2-dioleoil-sn-glycero-3-fosfoetanolamina-N-[4-(p-maleimidofenil) butiramída, referida aquí como MPB. Los ejemplos demuestran el uso de este lípido funcionalizado en la síntesis de vesículas de la invención. Otro ejemplo de un lípido funcionalizado es 1 ,2-distearoil-sn-glicero-3-fosfoetanolamina-N-[maleimida(polietilenglicol)2000] (también referido como maleimida-PEG 2k-PE). Otro ejemplo de un lípido funcionalizado es dioleoil-fosfatidiletanolamina 4-(N-maleimidometil)-ciclohexano-1 -carboxilato (DOPE-mal).

Cabe entender que la invención contempla el uso de otros lípidos funcionalizados, otros componentes de bicapa lipidica funcionalizados, otros grupos reactivos, y otros entrelazadores. Además de los grupos de maleimida, otros ejemplos de grupos reactivos incluyen pero no se limitan a otros grupos tiol reactivos, grupos amino tales como aminas primarias y secundarias, grupos carboxilo, grupos hidroxilo, grupos aldehido, grupos alquino, grupos azida, carbonitas, grupos haloacetilo (v.gr., yodoacetilo), grupos imidoéster, esteres de N-hidroxisuccinimida, grupos sulfhidrilo, grupos disulfuro de piridilo y similares.

Lípidos funcionalizados y no funcionalizados están disponibles de un número de fuentes comerciales incluyendo Avanti Polar Lipids (Alabaster, Alabama).

Cabe entender que la invención contempla varias formas para enlazar bicapas adyacentes en las vesículas multilaminares unas a otras. En algunos casos, los entrelazadores se usan para efectuar enlace entre bicapas adyacentes. La invención sin embargo no está limitada a éstos.

Como un ejemplo, las vesículas se pueden formar usando química clic. Un método de síntesis ilustrativo usa lípidos alquilo-modificados y química de alquino-azida, como sigue. Los lípidos alquilo-modificados se hicieron mezclando los lípidos tales como 1 ,2-dioleoil-sn-glicero-3-fosfoetanolamina (DOPE, 744 mg, 1 mmol) con éster de N-hidroxisuccinimida de ácido propiónico (167 mg, 1 mmol) y Et3N (202 mg, 2 mmoles) en 5 mL de CDCI3. La reacción fue monitoreada por R N. Después de 3 horas a temperatura ambiente, la reacción fue completada. Después de que la solución orgánica fue lavada con 5 mL de Na2C03 al 5%, HCI al 1 % y salmuera, secada bajo Na2SO4 y evaporada, y se pesó DOPE alquino-modificado. 1.26 pmol de película de lípido con DOPC y alquino-DOPE en una relación molar de 1 :1 se preparó, se hidrató, se sometió a sonicación y fue inducido a fusionarse con 10 mM Mg2+ como se describió antes. MLVs con lípidos alquino-funcionalizados se incubaron con 2.5 mM de CuSO4, alambre de cobre, y 1.5 mM de 1 ,14-diazido-3,6,9, 12-tetraoxatetradecano durante 24 horas a temperatura ambiente. El rendimiento de partícula se midió después de 3X lavados con centrifugación.

Entrelazadores El entrelazador puede ser un entrelazador homobifuncional o un entrelazador heterobifuncional, dependiendo de la naturaleza de grupos reactivos en las bicapas lipídicas que están siendo enlazadas unas a otras.

Los términos "entrelazador" y "agente entrelazador" se usan indistintamente aquí. Los entrelazadores homobifuncionales tienen dos grupos reactivos idénticos. Los entrelazadores heterobifuncionales tienen dos grupos reactivos diferentes.

En un caso, las bicapas adyacentes son entrelazadas una a otra usando el mismo lípido funcionalizado (u otro componente de bicapa) y un entrelazador (tal como un entrelazador homobifuncional). En otro caso, las bicapas adyacentes son entrelazadas una a otra usando diferentes lípidos funcionalizados (u otros componentes de bicapa) y un entrelazador (tal como un entrelazador heterobifuncional).

Varios tipos de entrelazadores comercialmente disponibles son reactivos con uno o más de los siguientes grupos: maleimidas, aminas primarias, aminas secundarias, sulfhidrilos, carboxilos, carbonilos y carbohidratos. Ejemplos de entrelazadores aminoespecíficos son suberato de bis(sulfosuccinimidilo), bis[2-(succinimidooxicarbon¡loxi)etil]sulfona, suberato de disuccinimidilo, tartarato de disuccinimidilo, adipimato de dimetilo.2 HCI, pimelimidato de dimetilo.2 HCI, suberimidato de dimetilo 2 HCI, y -[succinato] de etilen glicolbis-[succinimidilo]. Los entrelazadores reactivos con grupos sulfhidrilo incluyen bismaleimidohexano, 1 ,4- -di-[3'-(2'-piridilditio)-propionamido)]butano, 1-[p-azidosalicilamido]--4- -[yodoacetamido]butano, y N--[4-(p- -azidosalicilamido)butil]-3'-[2'-piridilditio]propionamida. Los entrelazadores preferencialmente reactivos con carbohidratos incluyen azidobenzoil hidrazina. Los entrelazadores preferencialmente reactivos con grupos carboxilo incluyen 4--[p~azidosalicilamido]butilamina. Los entrelazadores de ditiol tales como ditioltietol (DTT), 1 ,4-di-[3'-(2'-pihdilditio)-propionamido]butano (DPDPB), y en algunos casos polímeros que contienen tiol tales como (PEG)-SH2 se pueden usar para entrelazar grupos reactivos de maleimida. La estructura de DTT es La estructura de DPDPB es Los entrelazadores reactivos con grupos alquino incluyen diazidas, tales como 1 , 14-Diazido-3,6,9,12-Tetraoxatetradecano, y otros grupos compatibles con química clic.

Los entrelazadores heterobifuncionales que reaccionan con aminas y sulfhidrilos incluyen N-succinimidil--3-[2--piridilditio]propionato, succinimidil [4-yodoacetil]aminobenzoato, succinimidil 4-[N--maleimidometil]ciclohexano— 1— carboxilato, éster de m— maleimidobenzoil-N--hidroxisuccinimida, sulfosuccinimidil 6-[3--[2- -piridilditio]propionamido]hexanoato y sulfosuccinimidil 4--[N--maleimidometil]ciclohexano~1 -carboxilato. Los entrelazadores heterobifuncionales que reaccionan con grupos carboxilo y amina incluyen clorhidrato de 1 --etil--3--[3-dimetilaminopropil]-carbodiimida. Los entrelazadores heterobifuncionales que reaccionan con carbohidratos y sulfhidrilos incluyen 4-[N--maleimidometil]-ciclohexano--1--carboxilhidrazida.2 HCI, ácido 4--(4--N-maleimidofenil)-butírico hidrazida.2 HCI, y 3--[2--piridilditio]propionil hidrazida. Otros entrelazadores son disulfuro de bis-[p-4-azidosalicilamido)etilo] y glutaraldehído.

Los entrelazadores también son preferiblemente permeables a membrana (o solubles en lípidos) por lo que pueden difundirse a través de una o más bicapas de las MLVs para efectuar entrelazamiento entre varias capas adyacentes. Cualquier molécula pequeña bifuncional o heterobifuncional débilmente polar o no cargada puede ser un entrelazador permeable a membrana efectivo, particularmente si dicha molécula comprende un grupo reactivo tal como pero sin limitarse a maleimidas, ésteres succinimidílicos, azidas, tioles y similares. Ejemplos de entrelazadores permeables a membrana incluyen pero no se limitan a DTT y 1 ,4-di-[3'-(2'-piridilditio)- propionamidojbutano (DPDPB).

PEGilación Las ICMVs pueden ser adicionalmente modificadas. Como se describe en los ejemplos, la ICMV puede ser conjugada a polietilenglicol (PEG) sobre su superficie. La PEGilación se usa clínicamente para incrementar la vida media de varios agentes incluyendo liposomas STEALTH. La PEGilación se puede lograr haciendo reaccionar lipidos funcionalizados sobre la superficie de las MLVs estabilizadas con un PEG funcionalizado complementario. Los lipidos son preferiblemente no conjugados a PEG ante de la síntesis de la ICMV, y más bien el PEG es conjugado a la post-síntesís de superficie externa de ICMV o conjugados de PEG-lípido son introducidos en la capa de membrana externa de las partículas por procesos de "postinserción".

Los grupos reactivos que se han de usar para PEGilar las ICMVs ' pueden ser los mismos que aquellos usados para entrelazar las bicapas, en cuyo caso no se requieren lípidos funcionalizados adicionales (u otros componentes funcionalizados). Como un ejemplo, si las ICMVs comprenden lípidos funcionalizados con maleimida, entonces el PEG funcionalizado puede ser tiol-PEG. Alternativamente, los grupos reactivos usados para estabilizar las vesículas pueden ser diferentes de aquellos usados para conjugar PEG a la superficie externa. Los expertos en la técnica apreciarán que se pueden usar otras versiones modificadas de PEG dependiendo de la naturaleza del grupo reactivo en el lípido funcionalizado (o componente) en la bicapa lipídica de las vesículas. Los grupos reactivos adecuados incluyen sin limitación grupos amino tales como aminas primarias y secundarias, grupos carboxilo, grupos sulfhidrilo, grupos hidroxilo, grupos aldehido, grupos azida, carbonilos, grupos maleimida, grupos haloacetilo (v.gr., yodoacetilo), grupos imidoéster, ésteres N-hidroxisuccinimida, y grupos disulfuro de piridilo.

El cuadro 2 ilustra el efecto de PEGilación sobre el diámetro ICMV inmediatamente después de la síntesis y después de 7 días en PBS. Inmediatamente después de la síntesis, las ICMVs PEGiladas tienen un diámetro ligeramente más grande que las ICMVs no PEGiladas (v.gr., 272 +/-39 nm para las ICMVs PEGiladas versus 234 +/- 45 nm para las no PEGiladas en un experimento).

Se pueden realizar varias pruebas sobre las vesículas estabilizadas resultantes a fin de determinar, entre otras cosas, el tamaño y carga de superficie (v.gr., por dispersión de luz dinámica), fracción de lípidos sobre su superficie externa (v.gr., por prueba de laminización), cantidad de agente incorporado en la misma o a través de los mismos (v.gr., por FACS), y similares. Otras pruebas que se pueden realizar sobre las vesículas incluyen microscopia confocal y microscopia electrónica de crio-tunelización (TEM).

Los siguientes cuadros proveen los resultados de varias pruebas realizadas sobre las vesículas estabilizadas.

CUADRO 1A Rendimiento de ICMV con condiciones de síntesis variables CUADRO 1B Rendimiento de ICMV con condiciones de síntesis variables hidratado con 10 mM bis-tris propano a pH 7.0; a 10 mM a menos que se indique otra cosa; c a 1.5 mM a menos que se indique otra cosa d porcentaje de masa de lipido recuperada después de la síntesis y centrifugación a 14,000 x g durante 4 min e 1 ,4-Di-[3'-(2*piridilditio)-propionamido]butano (MW 482); f PM 2000 CUADRO 2 Caracterización de vesícula en cada paso en el proceso de síntesis a medida por dispersión de luz dinámica (DLS) b Fracción de lípido expuesta sobre las superficie externa de vesículas disminuida después de entrelazamiento entre capas como se mide por prueba de laminizacion (véase Lutsiak et al. Pharm Res 19, 1480-1487 (2002)) todos los valores con media ± DE Agentes La invención contempla el suministro, incluyendo en algunos casos suministro sostenido, de agentes a regiones, tejidos o células in vivo o in vitro usando las vesículas de lípidos estabilizados, incluyendo las ICMV, de la invención. Como se usa aquí, un agente es cualquier átomo o molécula o compuesto que se puede usar para proveer beneficio a un sujeto (incluyendo sin limitación beneficio profiláctico o terapéutico) o que se puede usar para diagnóstico y/o detección (por ejemplo, formación de imagen) in vivo o que tiene uso en aplicaciones in vitro.

Cualquier agente se puede suministrar usando las composiciones (v.gr., las MLVs estabilizadas tales como las ICMVs, y composiciones de las mismas incluyendo composiciones farmacéuticas de las mismas) y métodos de la invención siempre que puedan ser encapsuladas en (incluyendo por completo) o de otra manera llevar a cabo las MLVs estabilizadas tal como las ICMVs provistas aquí. Por ejemplo, el agente debe ser capaz de soportar la síntesis y opcionalmente el proceso de almacenamiento para estas vesículas. Las vesículas pueden ser sintetizadas y almacenadas, por ejemplo, en una forma liofilizadas, preferiblemente con un excipiente a base de sacarosa. Los agentes, si se incorporan en las vesículas durante la síntesis, deben ser estables durante dichos procesos y tiempos de almacenamiento.

El agente puede ser sin limitación una proteína, un polipéptido, un péptido, un ácido nucleico, un fármaco de molécula pequeña (v.gr., química, ya sea orgánica o inorgánica), una partícula tipo virus, un esteroide, un proteoglicano, un lípido, un carbohidrato, y análogos, derivados, mezclas, fusiones, combinaciones o conjugados de los mismos. El agente puede ser un profármaco que es metabolizado y por lo tanto convertido ¡n vivo a su forma activa (y/o estable).

Los agentes pueden ocurrir naturalmente o no ocurrir naturalmente. Los agentes que ocurren naturalmente incluyen aquellos capaces de ser sintetizados por los sujetos a quienes se administran las vesículas. Los que no ocurren naturalmente son aquellos que no existen en la naturaleza normalmente, ya sean producidos por una planta, animal, microbio u otro organismo vivo.

Una clase de agentes es agentes a base de péptidos tales como proteínas y péptidos (de cadena sencilla o múltiple). Ejemplos incluyen anticuerpos, anticuerpos de cadena sencilla, fragmentos de anticuerpo, enzimas, co-factores, receptores, ligandos, factores de transcripción y otros factores reguladores, algunos antígenos (como se describe más adelante), citocinas, quimiocinas y similares. Estos agentes a base de péptidos pueden o no ocurrir naturalmente pero son capaces de ser sintetizados dentro del sujeto, por ejemplo, a través del uso de células genéticamente manipuladas.

Otra clase de agentes que pueden ser suministrados usando las vesículas de la invención incluye aquellos agentes que no son a base de péptidos. Ejemplos incluyen compuestos químicos que no ocurren naturalmente, o compuestos químicos que no son sintetizados naturalmente por células de mamífero (y en particular células humanas).

Una variedad de agentes que se usan actualmente para propósitos terapéuticos o de diagnóstico pueden ser suministrados de conformidad con la invención y éstos incluyen sin limitación agentes formadores de imagen, agentes inmunomoduladores tales como agentes inmunoestimulantes y agentes ¡nmunoinhibidores, antígenos, adyuvantes, citocinas, quimiocinas, agentes anti-cancerosos, agentes anti-infectivos, ácidos nucleicos, anticuerpos o fragmentos de los mismos, proteínas de fusión tales como proteínas de fusión citocina-anticuerpo, Fc-proteinas de fusión, y similares.

Agentes formadores de imagen. Como se usa aquí, un agente formador de imagen es un agente que emite señal directamente o indirectamente permitiendo así su detección in vivo. Los agentes formadores de imagen tales como agentes de contraste y agentes radioactivos que pueden ser detectados usando técnicas de formación de imagen médicas tales como exploraciones de medicina nuclear y formación de imagen de resonancia magnética (MRI). Los agentes formadores de imagen para formación de imagen de resonancia magnética (MRI) incluyen Gd(DOTA), nanopartículas de óxido de hierro y oro; los agentes formadores de imagen para medicina nuclear incluyen 201T1 , radionúclido emisor de rayos gamma 99 mTc; agentes formadores de imagen para tomografía de emisión de positrones (PET) incluyen isótopos emisores de positrones, (18)F-fluorodeoxiglucosa ((18)FDG), (18)F-fluoruro, cobre-64, gadoamida, y radioisótopos de Pb(ll) tales como 203 Pb, y 1 1ln¡ agentes formadores de imagen para formación de imagen de fluorescencia in vivo tales como colorantes fluorescentes o nanopartículas conjugadas a colorante. En otras modalidades, el agente que ha de ser suministrado es conjugado, o fusionado a, o mezclado o combinado con un agente formador de imagen.

Agentes inmunoestimulantes. Como se usa aquí, un agente inmunoestimulante es un agente que estimula una respuesta inmunológica (incluyendo incrementar una respuesta inmunológica pre-existente) en un sujeto al que se administre, ya sea solo o en combinación con otro agente. Ejemplos incluyen antígenos, adyuvantes (v.gr., ligandos de TLR tales como ¡miquimod y resíquimod, imidazoquinolinas, ácidos nucleicos que comprende un dinucleótido de CpG no metilado, lípido monofosforílico A (MPLA) u otros derivados de lipopolisacáridos, ARN de cadena sencilla o de doble cadena, flagelina, dipéptido de muramilo), citocinas incluyendo interleucinas (v.gr., IL-2, IL-7, IL-15 (o formas superagonistas/mutantes de estas citocinas), IL-12, IFN-gamma, IFN-alfa, GM-CSF, FLT3-ligando, etc.), anticuerpos inmunoestimulantes (v.gr., anti-CTLA-4, anti-CD28, anti-CD3, o cadena sencilla/fragmentos de anticuerpos de estas moléculas), y similares.

Antígenos. El antígeno puede ser sin limitación un antígeno de cáncer, un auto-antígeno o antígeno autoinmune, un antígeno microbiano, un alérgeno, o un antígeno ambiental. El antígeno puede ser péptido, lípido o carbohidrato en naturaleza, pero no se limita a éstos.

Antígenos de cáncer. Un antígeno de cáncer es un antígeno que es expresado preferencíalmente por células cancerosas (es decir, es expresado a niveles más altos en células cancerosas que en células no cancerosas) y en algunos casos es expresado únicamente por células cancerosas. El antígeno de cáncer puede ser expresado dentro de una célula cancerosa o sobre la superficie de la células cancerosa. El antígeno de cáncer puede ser MART-1/Melan-A, gp100, proteína de unión a adenosina desaminasa (ADAbp), FAP, ciclofilina b, antígeno asociado colorrectal (CRC)-C017-1A/GA733, antígeno carcinoembrionario (CEA), CAP-1 , CAP-2, etv6, AML1 , antígeno específico de próstata (PSA), PSA-1 , PSA-2, PSA-3, antigeno de membrana específico de próstata (PSMA), receptor de células T/cadena de CD3-zeta, y CD20. El antígeno de cáncer se puede seleccionar del grupo que consiste de MAGE-A1 , MAGE-A2, MAGE-A3, MAGE-A4, MAGE-A5, MAGE-A6, MAGE-A7, MAGE-A8, MAGE-A9, AGE-A10, MAGE-A , MAGE-A12, MAGE-Xp2 (MAGE-B2), MAGE-Xp3 (MAGE-B3), MAGE-Xp4 (MAGE-B4), MAGE-C1 , MAGE-C2, MAGE-C3, MAGE-C4, MAGE-C5). El antígeno de cáncer se puede seleccionar del grupo que consiste de GAGE-1 , GAGE-2, GAGE-3, GAGE-4, GAGE-5, GAGE-6, GAGE-7, GAGE-8, GAGE-9. El antigeno de cáncer se puede seleccionar del grupo que consiste de BAGE, RAGE, LAGE-1 , NAG, GnT-V, MUM-1 , CDK4, tirosinasa, p53, familia MUC, HER2/neu, p21 ras, RCAS1 , a-fetoproteína, E-caderina, a-catenina, ß-catenina ?-catenina, p120ctn, gp100Pmel117, PRAME, NY-ESO-1 , cdc27, proteina de poliposis adenomatosa coli (APC), fodrin, Conexina 37, lg-idiotipo, p 5, gp75, GM2 gangliósido, GD2 gangliósido, proteínas de virus de papilloma humano, familia Smad de antígenos de tumor, lmp- , P1A, antígeno nuclear codificado por (EBNA)-1 , glicógeno fosforilasa, de cerebro SSX-1 , SSX-2 (HOM-MEL-40), SSX-1 , SSX-4, SSX-5, SCP-1 y CT-7, CD20, y c-erbB-2.

Antígenos microbianos. Los antígenos microbianos son antigenos derivados de especies microbianas tales como sin limitación especies bacterianas, virales, fúngicas, parasitarias y micobacterianas. Como tales, los antígenos microbianos incluyen antígenos bacterianos, antigenos virales, antígenos fúngicos, antígenos parasitarios y antigenos micobacterianos. Ejemplos de especies bacterianas, virales, fúngicas, parasitarias y micobacterianas se proveen aquí. El antigeno microbiano puede ser parle de una especie microbiana o puede ser el microbio entero.

Alérgenos. Un alérgeno es un agente que puede inducir una respuesta alérgica o asmática en un sujeto. Los alérgenos incluyen sin limitación pólenes, venenos de insectos, caspa de animales, esporas de hongos y fármacos (v.gr., penicilina). Ejemplos de alérgenos naturales, animales y vegetales incluyen pero no se limitan a proteínas específicas para los siguientes géneros: Canine (Canis familiaris); Dermatophagoides (v.gr. Dermatophagoides farinae); Felis (Felis domesticus); Ambrosia {Ambrosia artemiisfolia; Lolium (v.gr. Lolium perenne o Lolium multiflorum), Cryptomeria (Cryptomeria japónica); Alternaría {Alternaría alt rnala); Alder, Alnus {Alnus gultinoasa); Betula (Betula verrucosa); Quercus (Quercus alba); Olea {Olea europa); Artemisia (Artemisia vulgaris); Plantago (v.gr. Plantago lanceolata); Parietaria (v.gr. Parietaria ofíicinalis o Parietaria judaica); Blattella (v.gr. Blattella germánica); Apis (v.gr. Apis multiflorum); Cupressus (v.gr. Cupressus sempervirens, Cupressus arizonica and Cupressus macrocarpa); Juniperus (v.gr. Juniperus sabínoides, Juniperus virgíniana, Juniperus communis and Juniperus ashei); Thuya (v.gr. Thuya orientalis); Chamaecyparis (v.gr. Chamaecyparis obtusa); Periplaneta (v.gr. Periplaneta americana); Agropyron (v.gr. Agropyron repens); Sécale (v.gr. Sécale cereale); Triticum (v.gr. Triticum aestivum); Dactylis (v.gr. Dactylis glomerata); Festuca (v.gr. Festuca elatior); Poa (v.gr. Poa pratensis or Poa compressa); Avena (v.gr. Avena sativa); Holcus (v.gr. Holcus lanatus); Anthoxanthum (v.gr. Anthoxanthum odoratum); Arrhenatherum (v.gr. Arrhenatherum elatius); Agrostis (v.gr. Agrostis alba); Phleum (v.gr. Phleum pratense), Phalaris (v.gr. Phalaris arundinacea), Paspalum (v.gr. Paspalum notatum); Sorghum (v.gr. Sorghum halepensis); y Bromus (v.gr. Bromus inermis).

Adyuvantes. El adyuvante puede ser sin limitación alumbre (v.gr., hidróxido de aluminio, fosfato de aluminio); saponinas purificadas de la corteza del árbol de Q. saponaria tal como QS21 (un glicolípido que se eluye en el 21 ° pico con fraccionamiento por HPLC; Antigenics, Inc., Worcester, Mass.); poli[di(carboxilatofenoxi)fosfazeno (polímero PCPP; Virus Research Institute, E.U.A.), ligando de Flt3, factor de alargamiento de Leishmania (una proteína de Leishmania purificada; Corixa Corporación, Seattle, Wash ), ISCOMS (complejos inmunoestimulantes que contienen saponinas mixtas, lípídos y forman partículas del tamaño de un virus con poros que pueden contener antígeno; CSL, Melbourne, Australia), Pam3Cys, SB-AS4 (sistema de adyuvante #4 de SmithKIine Beecham que contiene alumbre y MPL; SBB, Bélgica), copolímeros de bloque no iónicps que forman micelas tales como CRL 1005 (éstos contienen una cadena lineal de polioxipropileno hidrofóbico flanqueado por cadenas de polioxietileno, Vaxcel, Inc., Norcross, Ga.), y Montanide IMS (v.gr., IMS 1312, nanopartículas a base de agua combinadas con un ¡nmunoestimulante soluble, Seppic) Los adyuvantes pueden ser ligandos de TLR. Los adyuvantes que actúan a través de TLR3 incluyen sin limitación ARN de doble cadena. Los adyuvantes que actúan a través de TLR4 incluyen sin limitación derivados de lipopolisacáridos tales como lípido A monofosforílico (MPLA; Ribi ImmunoChem Research, Inc., Hamilton, ont.) y dipéptido de muramilo ( DP; Ribi) andtreonilo-dipeptido de muramilo (t-MDP; Ribi); OM-174 (un disacárido de glucosamina relacionado con lipido A; OM Pharma SA, Meyrin, Suiza). Los adyuvantes que actúan a través de TLR5 incluyen sin limitación flagellin. Los adyuvantes que actúan a través de TLR7 y/o TLR8 incluyen ARN de cadena sencilla, oligorribonucleótidos (ORN), compuestos de peso molecular bajo sintéticos tales como imidazoquinolinaminas (v.gr., imiquimod (R-837), resiquimod (R-848)). Los adyuvantes que actúan a través de TLR9 incluyen ADN de origen viral o bacteriano u oligodesoxinucleótidos sintéticos (ODN), tales como CpG ODN. Otra clase de adyuvante es fosforotioato que contiene moléculas tales como análogos de nucleótido de fosforotioato y ácidos nucleicos que contienen enlaces de esqueleto de fosforotioato.

Agentes inmunoinhibidores. Como se usa aquí, u agente inmunoinhibidor es un agente que inhibe una respuesta inmunológica en un sujeto al que se administra, ya sea solo o en combinación con otro agente. Ejemplos incluyen esferoides, ácido retinoico, dexametasona, ciclofosfamida, anticuerpo anti-CD3 o fragmento de anticuerpo, y otros inmunosupresores.

Agentes anticancerosos. Como se usa aquí, un agente anticanceroso es un agente que inhibe por lo menos parcialmente el desarrollo o progresión de un cáncer, incluyendo inhibir en su totalidad o en parte síntomas asociados con el cáncer aun cuando sólo sea a corto plazo. Varios agentes anticancerosos pueden ser categorizados como agentes que dañan el ADN y éstos incluyen inhibidores de topoisomerasa (v.gr., etopósido, ramptotecina, topotecan, tenipósido, mitoxantrona), agentes alquilantes de ADN (v.gr., cisplatin, mecloretamina, ciclofosfamida, ifosfamida, melfalán, corambucil, busulfán, tiotepa, carmustine, lomustine, carboplatin, dacarbazina, procarbazina), agentes inductores de ruptura de cadena de ADN (v.gr., bleomicina, doxorubicina, daunorubicina, idarubicina, mitomicina C), agentes anti-microtúbulos (v.gr., vincristine, vinblastine), agentes anti-metabólicos (v.gr., citarabine, metotrexato, hidroxiurea, 5-fluorouracilo, floxuridine, 6-tioguanina, 6-mercaptopurina, fludarabine, pentostatin, clorodeoxiadenosina), antraciclinas, alcaloides de vinca, o epipodofilotoxinas.

Ejemplos de agentes anticancerosos incluyen sin limitación Acivicin; Aclarubicin; Acodazol Clorhidrato de; Acronína; Adozelesina; Aldesleucina; Altretamina; Ambomicina; Acetato de Ametantrona; Aminoglutetimida; Amsacrina; Anastrozol; Antramicina; Asparaginasa; Asperlin; Azacitidine; Azetepa; Azotomicina; Batimastat; Benzodepa; Bicalutamida; Clorhidrato de Bisantreno; Dimesilato de Bisnafide; Bizelesin; Sulfato de Bleomicina; Bortezomib (VELCADE); Brequinar Sódico; Bropirimina; Busulfán; Cactinomicina; Calusterona; Caracemida; Carbetimer; Carboplatin (un régimen que contiene platino); Carmustine; Clorhidrato de Carubicina; Carzelesina; Cedefingol; Clorambucil; Cirolemicina; Cisplatin (un régimen que contiene platino); Cladribine; Mesilato de Crisnatol; Ciclofosfamida; Citarabine; Dacarbazina; Dactinomicina; Daunorubicina; Decitabine; Dexormaplatin; Dezaguanina; Diaziquona; Docetaxel (TAXOTERE); Doxorubicina; Droloxifeno; Dromostanolona; Duazomicina; Edatrexato; Eflornitina; Elsamitrucin; Enloplatin; Enpromato; Epipropidina; Epirubicina; Erbulozol; Erlotinib (TARCEVA), Esorubicina; Estramustine; Etanidazol; Etopósido; Etoprine; Fadrozol; Fazarabine; Fenretinide; Floxuridina; Fludarabine; 5-Fluorouracilo; Flurocitabine; Fosquidona; Fostriecin; Gefitinib (IRESSA), Gemcitabine; Hidroxiurea; Idarubicina; Ifosfamida; llmofosina; mesilato de Imatinib (GLEEVAC); Interferón alfa-2a; Interferón alfa-2b; Interferón alfa-n1 ; Interferón alfa-n3; Interferón beta-l a; Interferón gamma-l b; Iproplatin; Irinotecan; Lanreotide; Lenalidomide (REVLIMID, REVIMID); Letrozol; Leuprólido; üarozol; Lometrexol; Lomustine; Losoxantrona; Masoprocol; Maitansine; Mecloretamina; Megestrol; Melengestrol; Melfalán; Menogaril; Mercaptopurina; Methotrexato; Metoprina; Meturedepa; Mitindomida; Mitocarcin; Mitocromin; Mitogilin; Mitomalcin; Mitomicina; Mitosper; Mitotano; Mitoxantrona; ácido micofenólico; Nocodazol; Nogalamicina; Ormaplatin; Oxisuran; Paclitaxel; Pemetrexed (ALIMTA), Pegaspargasa; Peliomicina; Pentamustine; Pentomona; Peplomicina; Perfosfamida; Pipobroman; Piposulfán; Piritrexim Isetionato; Piroxantrona; Plicamicina; Plomestano; Porfimer; Porfiromicina; Prednimustine; Procarbazine; Puromicina; Pirazofurin; Riboprina; Rogletimide; Safingol; Semustine; Simtrazeno; Sitogluside; Esparfosato; Esparsomicina; Espirogermanio; Espiromustine; Espiroplatin; Estreptonigrin; Estreptozocina; Sulofenur; Talisomicina; Tamsulosin; Taxol; Taxotere; Tecogalan; Tegafur; Teloxantrona; Temoporfin; Temozolomide (TEMODAR); Tenipósido; Teroxirona; Testolactona; Talidomida (THALOMID) y derivados de las mismas; Tiamiprina; Tioguanina; Tiotepa; Tiazofurin; Tirapazamina; Topotecan; Toremifeno; Trestolona; Triciribine; Trimetrexato, Triptorelin; Tubulozol; Mostaza de Uracilo; Uredepa; Vapreótido; Verteporfin; Vinblastine; Vincristine; Vindesine; Vinepidine; Vinglicinato; Vinleurosine; Vinorelbine; Vinrosidine; Vinzolidine; Vorozol; Zeniplatin; Zinostatin; Zorubicina.

El agente anticanceroso puede ser un inhibidor de enzima incluyendo sin limitación inhibidor de tirosina cinasa, un inhibidor de CDK, un inhibidor de MAP cinasa, o un inhibidor de EGFR. El inhibidor de tirosina cinasa puede ser sin limitación Genistein (4',5,7-trihidroxiisoflavona), Tirfostin 25 (3,4,5-trihidroxifenilo), metileno]-propanodinitrilo, Herbimicina A, Daidzein (4',7-dihidroxiisoflavona), AG-126, trans-1-(3'-carboxi-4'-hidroxifenil)-2-(2",5"-dihidroxi-fenil)etano, o ácido HDBA (2-Hidroxi5-(2,5-Dihidroxibencilamino)-2-hidroxibenzoico. El inhibidor de CDK puede ser sin limitación p21 , p27, p57, p15, p16, p18 o p19. El inhibidor de MAP cinasa puede ser sin limitación KY12420 (C23H2408), CNI-1493, PD98059, o 4-(4-Fluorofenil)-2-(4-metilsulfinilfenil)-5-(4-piridil) 1 H-imidazol. El inhibidor de EGFR puede ser sin limitación erlotinib (TARCEVA), gefitinib (IRESSA), WHI-P97 (derivado de quinazolina), LFM-A12 (análogo de metabolito de leflunomide), ABX-EGF, lapatinib, canertinib, ZD-6474 (ZACTIMA), AEE788 y AG1458.

El agente anticanceroso puede ser un inhibidor de VEGF incluyendo sin limitación bevacizumab (AVASTIN), ranibizumab (LUCENTIS), pegaptanib (MACUGEN), sorafenib, sunitinib (SUTENT), vatalanib, ZD-6474 (ZACTIMA), anecortave (RETAANE), lactato de escualamina y semaforin.

El agente anticanceroso puede ser un anticuerpo o un fragmento de anticuerpo incluyendo sin limitación un anticuerpo o un fragmento de anticuerpo incluyendo pero sin limitarse a bevacizumab (AVASTIN), trastuzumab (HERCEPTIN), alemtuzumab (CAMPATH, indicado para leucemia linfocítica crónica e células B), gemtuzumab (MYLOTARG, hP67.6, anti-CD33, indicado para leucemia tal como leucemia mieloide aguda), rituximab (RITUXAN), tositumomab (BEXXAR, anti-CD20, indicada para malignidad de células B), MDX-210 (anticuerpo biespecífico que se une simultáneamente a producto de proteina de oncogén HER-2/neu y receptores de tipo I Fe para ¡nmunoglobulina G (IgG) (Fe gamma Rl)), oregovomab (OVAREX, indicado para cáncer de ovario), edrecolomab (PANOREX), daclizumab (ZENAPAX), palivizumab (SYNAGIS, indicado para condiciones respiratorias tales como infección de RSV), ibritumomab tiuxetan (ZEVALIN, indicado para linfoma No Hodgkin), cetuximab (ERBITUX), MDX-447, MDX-22, MDX-220 (anti-TAG-72). IOR-C5, IOR-T6 (anti-CD1), IOR EGF/R3, celogovab (ONCOSCINT OV103), epratuzumab (LYMPHOCIDE), pemtumomab (THERAGYN) y Gliomab-H (indicado para cáncer de cerebro, melanoma).

Agentes de diferenciación hematopoyética. El agente puede ser uno que estimule la diferenciación de células progenitoras hematopoyéticas hacia uno o más linajes. Ejemplos incluyen sin limitación IL-3, G-CSF, GM-CSF, M-CSF, trombopoeitin, eritropoyetina, Wnt5A, Wnt1 1A, y similares.

Agentes de auto-renovación hematopoyética. El agente puede ser uno que estimule la auto-renovación de células progenitoras hematopoyéticas. Ejemplos incluyen sin limitación ligando en kit, inhibidores de GSK3-beta, Wnt5A junto con SLF, activadores de NotcM , inhibidores de Lnk, prostaglandina E2 (PGE2) y agentes que estimulan la vía de PGE2 incluyendo PGE2, PGI2, ácido linoleico, 13(s)-HODE, LY171883, ácido de Mead, ácido eicosatrienoico, ácido epoxieicosatrienoico, ONO-259, Cay 1039, un agonista de receptor de PGE2, de 16,16-dimetil PGE2, 19(R)-hidroxi PGE2, éster fenílico de 16, 16-dimetil PGE2 p-(p-acetamidobenzamido), 1 1-desoxi-16,16-dimetil PGE2,9-deoxi-9-metilen-16,16-dimetil PGE2, 9-desoxi-9-metileno PGE2, Butaprost, Sulprostone, PGE2 serinol amida, éster metílico de PGE2, 16-fenil tetranor PGE2,15(S)-15-metil PGE2,15(R)-15-metil PGE2, BIO, 8-bromo-cAMP, Forskolin, Bapta-AM, Fendiline, Nicardipine, Nifedipine, Pimozide, Estrofantidina, Lanatósido, L-Arg, Nitroprúsido de sodio, Vanadato de sodio, Bradiquinina, Mebeverine, Flurandrenolide, Atenolol, Pindolol, Gaboxadol, ácido kinurénico, Hidralazina, Tiabendazol, Bicucline, Vesamicol, Peruvósido, Imipramina, Clorpropamida, 1 ,5-Pentametilentetrazol, 4-Aminopiridina, Diazóxido, Benfotíamina, ácido 12-Metoxidodecenoico, N-Formil-Met-Leu-Phe, Gallamina, IAA 94, Clorotrianiseno, y derivados de los mismos, y similares.

Agentes Anti-lnfectivos. El agente puede ser un agente antiinfectivo incluyendo sin limitación un agente anti-bacteriano, un agente antiviral, un agente anti-parasitario, un agente anti-fúngico, y un agente anti- micobacteriano.

Agentes anti-bacterianos pueden ser sin limitación antibióticos de ß-lactama, penicilinas (tales como penicilinas naturales, aminopenicilinas, penicilinas resistentes a penicilinasa, carboxipenicilinas, ureidopenicilinas), cefalosporinas (cefalosporinas de primera generación, segunda generación, y tercera generación), otras ß-lactamas (tales como imipenem, monobactamas), inhibidores de ß-lactamasa, vancomicina, aminoglicósidos y espectinomicina, tetraciclinas, cloranfenicol, eritromicina, lincomicina, clindamicina, rifampin, metronidazol, polimixinas, sulfonamidas y trimetoprim o quinolinas.

Otros anti-bacterianos pueden ser sin limitación Acedapsona; Acetosulfona Sódica; Alamecin; Alexidine; Amdinocilina; Amdinocilina Pivoxil; Amiciclina; Amifloxacin; Mesilato de Amifloxacin; Amicacina; Sulfato de Amicacina; Ácido Aminosalicílico; Aminosalicilato de sodio; Amoxicilina; Anfomicina; Ampicilina; Ampicilina Sódica; Apalcilina Sódica; Apramicina; Aspartocin; Sulfato de Astromicina; Avilamicina; Avoparcin; Azitromicina; Azlocillin; Azlocilina Sódica; Bacampicilina Clorhidrato de; Bacitracina; Metilen Disalicilato de Bacitracina; Bacitracina Zinc; Bambermicinas; Benzoilpas Cálcico; Beritromicina; Sulfato de Betamicina; Biapenem; Biniramicina; Clorhidrato de Bifenamina; Bispiritiona Magsulfex; Buticacina; Sulfato de Butirosin; Sulfato de Capréomicina; Carbadox; Carbenicilina Disódica; Carbenicilina Indanil Sódica; Carbenicilina Fenil Sódica; Carbenicilina Potásica; Carumonam Sódica; Cefaclor; Cefadroxil; Cefamandol; Nafato de Cefamandol; Cefamandole Sódico; Cefaparol; Cefatrizine; Cefazaflur Sódico; Cefazolin; Cefazolin Sódico; Cefbuperazona; Cefdinir; Cefepime; Clorhidrato de Cefepime; Cefetecol; Cefixime; Clorhidrato de Cefmenoxima; Cefmetazol, Cefmetazol Sódico; Cefonicid Monosódco; Cefonicid Sódico; Cefoperazona Sódica; Ceforanide; Cefotaxime Sódico; Cefotetan; Cefotetan Disodium; Cefotiam Clorhidrato de; Cefoxitin; Cefoxitin Sódico; Cefpimizol; Cefpimizol Sódico; Cefpiramida; Cefpiramida Sódica; Cefpirome Sulfate; Cefpodoxima Proxetil; Cefprozil; Cefroxadine; Cefsulodin Sódico; Ceftazidime; Ceftibuten; Ceftizoxima Sódica; Ceftriaxona Sódica; Cefuroxima; Cefuroxime Axetil; Cefuroxima Pivoxetil; Cefuroxime Sódico; Cephacetrile Sódico; Cefalexina; Clorhidrato de Cephalexina; Cefaloglicina; Cefaloridina; Cefalotin Sódico; Cefapirin Sódico; Cefradine; Clorhidrato de Cetociclina; Cetofenicol; Cloranfenicol; Palmitato de Cloranfenicol; Complejo de Pantotenato de Cloramfenicol; Succinato de Cloranfenicol Sódico; Fosfanilato de Clorhexidina; Cloroxilenol; Bisulfato de Clortetraciclina; Clorhidrato de Clortetraciclina; Cinoxacin; Ciprofloxacin; Clorhidrato de Ciprofloxacin; Cirolemicina; Claritromicina; Clorhidrato de Clinafloxacin; Clindamicina; Clorhidrato de Clindamicina; Clorhidrato de Palmitato de Clindamicina; Fosfato de Clindamicina; Clofazimina; Cloxacilina Benzatina; Cloxacilina Sódico; Cloxiquina; Colistimetato Sódico; Sulfato de Colistin; Coumermicina; Coumermicina Sódico; Ciclacilina; Cicloserina; Dalfopristin; Dapsona; Daptomicina; Demeclociclina; Clorhidrato de Demeclociclina; Demeciclina; Denofungina; Diaveridina; Dicloxacilina; Dicloxacilina Sódica; Sulfato de Dihidroestreptomicina; Dipiritiona; Diritromicina; Doxiciclina; Doxiciclina Calcica; Doxiciclina Fosfatex; Hiclato de Doxiciclina; Droxacina Sódica; Enoxacina; Epicilina; Clorhidrato de Epitetraciclina; Eritromicina; Acistrato de Eritromicina; Estolato de Eritromicina; Etilsuccinato de Eritromicina; Gluceptato de Eritromicina ; Lactobionato de Eritromicina; Propionato de Eritromicina ; estearato de Eritromicina ; Clorhidrato de Etambutol; Etionamida; Fleroxacin; Floxacilina; Fludalanine; Flumequine; Fosfomicina; Fosfomicina Trometamina; Fumoxicilina; Cloruro de Furazolio; Tartrato de Furazolio; Fusidato Sódico; Ácido Fusídico; Sulfato de Gentamicina; Gloximonam; Gramicidina; Haloprogin; Hetacilina; Hetacilina Potásica; Hexedina; Ibafloxacin; Imipenem; Isoconazol; Isepamicina; Isoniazid; Josamicina; Sulfato de Kanamicina; Kitasamicina; Levofuraltadona; Levopropilcilina Potásica; Lexitromicina; Lincomicina; Clorhidrato de Lincomicina; Lomefloxacin; Clorhidrato de Lomefloxacin; Mesilato de Lomefloxacin; Loracarbef; Mafenide; Meclociclina; Meclociclina Sulfosalicilato; Fosfato de Megalomicina Potásica; Mequidox; Meropenem; Metaciclina; Clorhidrato de Metaciclina; Metenamina; Hipurato de Metenamina; Mandelato de Metenamina; Meticilina Sódico; Metioprim; Clorhidrato de Metronidazol; Fosfato de Metronidazol; Mezlocilina; Mezlocilina Sódica; Minociclina; Clorhidrato de Minociclina; Clorhidrato de Mirincamicina; Monensin; Monensin Sódico; Nafcilina Sódico; Nalidixato Sódico; Ácido Nalidíxico; Natamicina; Nebramicina; Palmitato de Neomicina; Sulfato de Neomicina; Undecilenato de Neomicina; Sulfato de Netilmicina; Neutramicina; Nifuradeno; Nifuraldezona; Nifuratel; Nifuratrona; Nifurdazil; Nifurimide; Nifurpirinol; Nifurquinazol; Nifurtiazol; Nitrociclina; Nitrofurantoina; Nitromide; Norfloxacin; Novobiocin Sódico; Ofloxacin; Ormetoprim; Oxacilina Sódica; Oximonam; Oximonam Sódico; Ácido Oxolinico; Oxitetraciclina; Oxitetraciclina Cálcica; Clorhidrato de Oxitetraciclina; Paldimicina; Paraclorofenol; Paulomicina; Pefloxacin; Mesilato de Pefloxacin; Penamecilina; Penicilina G Benzatina; Penicilina G Potásica; Penicilina G Procaína; Penicilina G Sódica; Penicilina V; Penicilina V Benzatina; Penicilina V Hidrabamina; Penicilina V Potásica; Pentizidona Sódica; Aminosalicilato de Fenilo; Piperacilina Sódica; Pirbenicilina Sódica; Piridicilina Sódica; Clorhidrato de Pirlimicina; Clorhidrato de Pivampicilina ; Pamoato de Pivampicilina; Probenato de Pivampicilina; Sulfato de Polimixin B; Porfiromicina; Propicacina; Pirazinamida; Piritiona Zinc; Acetato de Quindecamina; Quinupristin; Racefenicol; Ramoplanin; Ranimicina; Relomicina; Repromicina; Rifabutin; Rifametano; Rifamexil; Rifamida; Rifampin; Rifapentina; Rifaximin; Rolitetraciclina; Nitrato de Rolitetraciclina; Rosaramicina; Butirato de Rosaramicina; Propionato de Rosaramicina; Fosfato de Rosaramicina Sódico; Estearato de Rosaramicina; Rosoxacin; Roxarsona; Roxitromicina; Sanciclina; Sanfetrinem Sódico; Sarmoxicilina; Sarpicilina; Escopafungina; Sisomicin; Sulfato de Sisomicina; Esparfloxacin; Clorhidrato de Espectinomicina; Espiramicina; Clorhidrato de Estalimicina; Estefimicina; Sulfato de Estreptomicina; Estreptonicozid; Sulfabenz; Sulfabenzamida; Sulfacetamida; Sulfacetamida Sódica; Sulfacitine; Sulfadiazina; Sulfadiazina Sódica; Sulfadoxina; Sulfaleno; Sulfamerazina; Sulfameter; Sulfametazina; Sulfametizol; Sulfametoxazol; Sulfamonometoxina; Sulfamoxol; Sulfanilato Zinc; Sulfanitrán; Sulfasalazina; Sulfasomizol; Sulfatiazol; Sulfazamet; Sulfisoxazol; Sulfisoxazol Acetilo; Sulfisoxazol Diolamina; Sulfomixin; Sulopenem; Sultamicilina; Suncilina Sódica; Clorhidrato de Talampicilina; Teicoplanin; Clorhidrato de Temafloxacin; Temocilina; Tetraciclina; Clorhidrato de Tetraciclina; Complejo de Fosfato de Tetraciclina; Tetroxoprim; Tianfenicol; Tifencilina Potásica; Ticarcilina Cresil Sódico; Ticarcilina Disódica; Ticarcilina Monosódica; Ticlatona; Cloruro de Tiodonio; Tobramicina; Sulafato de Tobramicina; Tosufloxacin; Trimetoprim; Sulfato de Trimetoprim; Trisulfapirimidinas; Troleandomicina; Sulfato de Trospectomicina; Tirotricin; Vancomicina; Clorhidrato de Vancomicina; Virginiamicina; o Zorbamicina.Los agentes anti-micobacterianos pueden ser sin limitación Myambutol (Clorhidrato de Etambutol), Dapsona (4,4'-diaminodifenilsulfona), Gránulos de Paser (gránulos de ácido aminosalicilico), Priftin (rifapentina), Pirazinamida, Isoniazid, Rifadin (Rifampin), Rifadin IV, Rifamato (Rifampin e Isoniazid), Rifater (Rifampin, Isoniazid y Pirazinamida), Sulfato de Estreptomicina o Trecator-SC (Etionamida).

Los agentes anti-virales pueden ser sin limitación amantidine y rimantadine, ribivarin, aciclovir, vidarabine, trifluorotimidina, ganciclovir, zidovudine, retinovir e interferones.

Los agentes anti-virales además pueden incluir sin limitación Acemannan; Aciclovir; Aciclovir Sódico; Adefovir; Alovudine; Alvircept Sudotox; Clorhidrato de Amantadina; Aranotin; Arildona; Mesilato de Atevirdine; Avridine; Cidofovir; Cipamfilina; Clorhidrato de Citarabine; Mesilato de Delavirdine; Desciclovir; Didanosina; Disoxaril; Edoxudine; Enviradeno; Enviroxima; Famciclovir; Clorhidrato de Famotine; Fiacitabine; Fialuridine; Fosarilato; Foscarnet Sódico; Fosfonet Sódico; Ganciclovir; Ganciclovir Sódico; Idoxuridina; Ketoxal; Lamivudine; Lobucavir; Clorhidrato de Memotine; Metisazona; Nevirapine; Penciclovir; Pirodavir; Ribavirin; Clorhidrato de Rimantadina; Mesilato de Saquinavir; Clorhidrato de Somantadine; Sorivudine; Estatolon; Estavudine; Clorhidrato de Tilorona; Trifluridina; Clorhidrato de Valaciclovir; Vidarabine; Fosfato de Vidarabine; Fosfato de Vidarabine Sódico; Viroxime; Zalcitabine; Zidovudine; Zinviroxima o inhibidores de integrasa.

Los agentes anti-fúngicos pueden ser sin limitación imidazoles y triazoles, antibióticos de polieno-macrólido, griseofulvin, anfotericina B y flucitosina. Los antiparasitarios incluyen metales pesados, quinolinas antimalariales, antagonistas de folato, nitroimidazoles, bencimidazoles, avermectinas, praxiquantel, inhibidores de ornitina descarboxilasa, fenoles (v.gr., bitionol, niclosamida); alcaloide sintético (v.gr., deshidroemetina); piperazinas (v.gr., dietilcarbamazina); acetanilida (v.gr., furonato de diloxanida); quinolinas halogenadas (v.gr., yodoquinol (diyodohidroxiquina)); nitrofuranos (v.gr., nifurtimox); diamidinas (v.gr., pentamidina); tetrahidropirimidina (v.gr., pamoato de pirantel); o naftilamina sulfatada (v.gr., suramin). Otros agentes anti-infectivos puede ser sin limitación Clorhidrato de Diflóxacin; Bromuro de Lauril Isoquinolinio; Moxalactam Disódico; Ornidazol; Pentisomicina; Clorhidrato de Sarafloxacin; Inhibidores de Proteasa de VIH y otros retrovirus; Inhibidores de Integrasa de VIH y otros retrovirus; Cefaclor (Ceclor); Aciclovir (Zovirax); Norfloxacin (Noroxin); Cefoxitin (Mefoxin); Cefuroxima axetil (Ceftin); Ciprofloxacin (Cipro); Clorhidrato de Aminacrina; Cloruro de Benzetonio: Bitionolato Sódico; Bromclorenona; Peróxido de Carbamida; Cloruro de Cetalconio; Cloruro de Cetilpiridinio: Clorhidrato de Clorhexidina; Clioquinol; Domiphen Bromide; Fenticlor; Cloruro de Fludazonio; Fuchsina, Básica; Furazolidona; Violeta de Genciana; Halquinoles; Hexaclorofeno: Peróxido de hidrógeno; Ictamol; Imidecil Yodo; Yodo; Alcohol Isopropílico; Acetato de Mafenida; Meraleína Sódica; Cloruro de Mercufenol; Mercurio, Amoniacal; Cloruro de Metilbencetonio; Nitrofurazona; Nitromersol; Clorhidrato de Octenidina; Oxicloroseno; Oxicloroseno Sódico; Paraclorofenol, Alcanforado; Permanganato de Potasio; Povidona-Yodo; Cloruro de. Sepazonio; Nitrato de Plata; Sulfadiazina, plata; Simcloseno; Timerfonato Sódico; Timerosal; o Trocloseno Potásico.

Agentes de ácido nucleico. Los ácidos nucleicos que pueden ser suministrados a un sujeto de conformidad con la invención incluyen ADN que ocurre naturalmente o que no ocurre naturalmente (incluyendo ADNc, ADN genómico, ADN nuclear, ADN mitocondrial), ARN (incluyendo ARNm, ARNr, ARNt), oligonucleótidos, una molécula formadora de triple hélice, ácidos nucleicos inmunoestimulantes tales como aquellos descritos en US 6194388 (cuyas enseñanzas se relacionan con ácidos nucleicos de CpG inmunoestimulantes se incorporan aquí por referencia), ARN de interferencia pequeña (ARNip) o microARNs (ARNmi) usados para modular la expresión de genes, oligonucleótidos antisentido usados para modular la expresión de genes, aptámeros, ribozimas, un gen o fragmento de gen, una secuencia reguladora, incluyendo análogos, derivados y combinaciones de los mismos.

Estos ácidos nucleicos se pueden administrar en forma neta o en complejo con otra entidad, por ejemplo, a fin de facilitar su unión a y/o absorción por tejidos y/o células objetivos.

Agentes anti-inflamatorios. Los agentes anti-inflamatorios son agentes que reducen o eliminan la inflamación. Éstos incluyen Alclofenac; Dipropionato de Alclometasona; Algestona Acetonida; Alfa Amilasa; Amcinafal; Amcinafida; Amfenac Sódico; Clorhidrato de Amiprilosa; Anakinra; Anirolac; Anitrazafen; Apazona; Balsalazida Disódica; Bendazac; Benoxaprofén; Clorhidrato de Bencidamina; Bromelaínas; Broperamol; Budesonida; Carprofén; Cicloprofén; Cintazona; Cliprofén; Propionato de Clobetasol; Butirato de Clobetasono; Clopirac; Propionato de Cloticasona; Acetato de Cormetasona; Cortodoxona; Deflazacort; Desonida; Desoximetasona; Dipropionato de Dexametasona; Diclofenaco Potásico; Diclofenaco Sódico; Diacetato de Diflorasona; Diflumidona Sódica; Diflunisal; Difluprednato; Diftalona; Sulfóxido de Dimetilo; Drocinonida; Endrusona; Enlimomab; Enolicam Sódico; Epirizol; Etodolac; Etofenamato; Felbinac; Fenamol; Fenbufén; Fenclofenac;o Fencloraco; Fendosal; Fenpipalona; Fentiazac; Flazalona; Fluazacort; Ácido Flufenámico; Flumizol; Acetato de Flunisolide, Flunixin; Flunixin Meglumina; Fluocortin Butilo; Acetato de Fluorometolona; Flucuazona; Flurbiprofén; Fluretofén, Propionatio de Fluticasona; Furaprofen; Furobufén; Halcinonida; Propionato de Halobetasol; Acetato de Halopredona; Ibufenaco; Ibuprofén; Ibuprofén Aluminio; Ibuprofén Piconol; llonidap; Indometacina; Indometacina Sódica; Indoprofén; Indoxol; Intrazol; Acetato de Isoflupredona; Isoxepac; Isoxicam; Ketoprofén; Clorhidrato de Lofemizol; Lornoxicam; Etabonato de Loteprednol; Meclofenamato Sódico; Ácido Meclofenámico; Dibutirato de Meclorisona; Ácido Mefenámico; Mesalamina; Meseclazona; Suleptanato de Metilprednisolona; Morniflumato; Nabumetona; Naproxén; Naproxén Sódico; Naproxol; Nimazona; Olsalazina Sódico; Orgotein; Orpanoxin; Oxaprozin; Oxifenbutazona; Clorhidrato de Paranilina; Polisulfatom de Pentosán Sódico; Glicerato de Fenbutazona Sódico; Pirfenidona; Piroxicám; Cinamato de Piroxicám; Piroxicám Olamina; Pirprofén; Prednazato; Prifelona; Ácido Prodólico; Procuazona; Proxazol; Citrato de Proxazol; Rimexolona; Romazarit; Salcolex; Salnacedin; Salsalato; Salicilatos; Cloruro de Sanguinario; Seclazona; Sermetacina; Sudoxicám; Sulindac; Suprofén; Talmetacin; Talniflumato; Talosalato; Tebufelona; Tenidap; Tenidap Sódico; Tenoxicam; Tesicam; Tesimide; Tetridamina; Tiopinac; Pivalato de Tixocortol; Tolmetin; Tolmetin Sódico; Triclonide; Triflumidato; Zidometacin; Glucocorticoides; Zomepirac Sódico. Un agente anti-inflamatorio preferido es aspirina.

Otros agentes. El agente puede ser sin limitación agentes adrenérgico; esteroides adrenocorticales; supresores adrenocorticales; disuasivos de alcohol; antagonistas de aldosterona; desintoxicantes de amoniaco; aminoácidos; agentes de esclerosis lateral amilotrópica; anabólicos; analépticos; analgésicos; andrógenos; anestésicos; anorécticos; anoréxicos; activadores de pituitaria anterior; supresores de de pituitraria anterior; antihelmínticos; agentes anti-acné; anti-adrenérgico; anti-alérgicos; anti-amébicos; anti-andrógenos; anti-anémicos; anti-anginales; anti-ansiedad; anti-artriticos; anti-astmáticos incluyendo agonistas ß-adrenérgicos, metilxantinas, agentes estabilizadores de células cebadas, anticolinérgicos, esteroides adrenocorticales tales como glucocorticoides; anti-ateroscleróticos; anticolelíticos; anticolelitogénicos; anticolinérgicos; anticoagulantes; anticoccidales; anticonvulsivantes; antidepresivos; antidiabéticos; antidiarreicos; antidiuréticos; antídoto; antidiscínéticos; anti-eméticos; antiepilépticos; anti-estrógeno; antifibrinolíticos; antiglaucoma; antihemorrágicos; antihemorreológicos; antihistamina; antihiperlipidémicos; antihiperlipoproteinémicos; antihipertensivos; antihipotensivos; anti-infectivos; anti-inflamatorios; agente antiqueratinizante; antimigraña; antimitóticos; antimicóticos; antináuseas; antineutropénicos; agentes antiobsesionales; antioxidantes; antiparkinsonianos; antiperistálticos; antineumocístícos; agentes de hipertrofia antiprostáticos; antiprotozoarios; antipolíticos; antipsoriáticos; antipsicóticos; antirreumáticos; antiesquistosomales; antiseborreicos; antisecretores; antiespasmódicos; antitrombóticos; antitusivos; antiulcerativos; anti-urolíticos; supresores del apetito; reguladores de glucosa en la sangre; inhibidores de resorción de hueso; broncodiiatadores; inhibidores de anhidraasa carbónica; depresores cardiacos; cardioprotectores; cardiotónicos; agentes cardiovasculares; agentes isquémicos cerebrales; coleréticos; colinérgicos; agonistas colinérgicos; desactivadores de colinaesterasa; coccidiostáticos; adyuvantes de cognición; incrementadores de cognición; agentes de conjuntivitis, agentes de contraste; depresores; auxiliares de diagnóstico; diuréticos; agente dopaminérgicos; ectoparasiticida; eméticos; inhibidores de enzima; estrógeno; agonistas de receptor de estrógeno; fibrinolíticos; agentes fluorescentes; depuradores de radicales de oxígeno libre; supresores de ácido gástrico; efectores de motilidad gastrointestinal; agentes geriátricos; glucocorticoides; principios estimulantes de gónadas; estimulantes de crecimiento del cabello; hemostáticos; agentes activos herbales; antagonistas de receptor de histamina H2; hormonas; hipocolesterolémicos; hipoglicémicos; hiopolipidémicos; hipotensivos; inhibidores de HMGCoA reductasa; auxiliar de terapia de impotencia; agentes de enfermedad intestinal inflamatoria; queratolíticos; agonistas de LHRH; agentes de trastorno del hígado; luteolisinas; adyuvantes de memoria; incrementadores de desempeño mental; minerales; reguladores del estado de ánimo; mucolíticos; agentes protectores de mucosa; agentes de esclerosis múltiple; midriáticos; descongestionantes nasales; neurolépticos; agentes bloqueadores neuromusculares; neuroprotectores; antagonistas de NMDA; derivados de esteral no hormonales; nutrientes; oxitócicos; agente contra enfermedad de Paget; activador de plasminógeno; antagonistas de factor activador de plaquetas; inhibidor de agregación de plaquetas; agentes post-accidente vascular cerebral y post-trauma de cabeza; progestina; prostaglandina; inhibidor de crecimiento de próstata; protirotropina; psicotrópicos; agentes radioactivos; relajantes; agente contra rinitis; escabicidas; agente esclerosante; sedantes; sedantes-hipnóticos; antagonistas de adenosina Al selectivos; agentes secuestrantes; antagonistas de serotonina; inhibidor de serotonina; antagonistas de receptor de serotonina; esteroides; estimulantes; supresores; hormona tiroidea; inhibidor de tiroides; tíromiméticos; tranquilizantes; agentes contra angina inestable; uricosúricos; vasoconstrictores; vasodilatadores; vulnerarios; agentes de cicatrización de heridas; o inhibidor de xantina oxidasa.

Sujetos La invención se puede poner en práctica virtualmente en cualquier tipo de sujeto que probablemente se beneficie del suministro de agentes como se contempla aquí. Los sujetos humanos son sujetos preferidos en algunas modalidades de la invención. Los sujetos también incluyen animales tales como mascotas domésticas (v.gr., perros, gatos, conejos, hurones, etc.), animales de ganado o animales de granja (v.gr., vacas, cerdos, ovejas, pollos y otras aves de corral), caballos tales como caballos de pura sangre, animales de laboratorio (v.gr., ratones, ratas, conejos, etc.), y similares. Los sujetos también incluyen peces y otras especies acuáticas.

Los sujetos a quienes los agentes son suministrados pueden ser sujetos normales. Alternativamente pueden tener o pueden estar en riesgo de desarrollar una condición que pueda ser diagnosticada o que pueda beneficiarse del suministro de uno o más agentes particulares.

Dichas condiciones incluyen cáncer (v.gr., cánceres de tumores sólidos o cáncer no sólido tales como leucemias), infecciones (incluyendo infecciones localizadas a regiones o tejidos particulares en el cuerpo), trastornos autoinmunes, alergias o condiciones alérgicas, asma, rechazo de trasplante, y similares.

Las pruebas para diagnosticar varias de las condiciones abarcadas por la invención son conocidas en la técnica y serán conocidas por un médico ordinario. Estas pruebas de laboratorio incluyen sin limitación análisis microscópicos, pruebas dependientes de cultivo (tales como cultivos), y pruebas de detección de ácido nucleico. Éstas incluyen monturas húmedas, microscopía mejorada con tinción, microscopía inmunológica (v.gr., FISH), microscopía de -hibridación, aglutinación de partículas, pruebas inmunoabsorbentes ligadas a enzima, pruebas de detección selectiva en orina, hibridación de sonda de ADN, pruebas serológicas, etc. El médico generalmente también lleva una historia completa y conduce un examen físico completo además de ejecutar las pruebas de laboratorio listadas anteriormente.

Un sujeto que tiene un cáncer es un sujeto que tiene células cancerosas detectables. Un sujeto en riesgo de desarrollar un cáncer es un sujeto que tiene una probabilidad mayor que la normal de desarrollar cáncer. Estos sujetos incluyen, por ejemplo, sujetos que tienen una anormalidad genética que se ha demostrado que está asociada con una mayor probabilidad de desarrollar un cáncer, los sujetos teniendo una disposición familiar al cáncer, sujetos expuestos a agentes que causan cáncer (es decir, carcinógenos) tales como tabaco, asbestos u otras toxinas químicas, y sujetos previamente tratados para cáncer y con remisión aparente.

Los sujetos que tienen una infección son aquellos que presentan síntomas de los mismos incluyendo sin limitación fiebre, resfriado, mialgia, fotofobia, faringitis, linfadenopatía aguda, esplenomegalia, malestar gastrointestinal, leucocitosis o leucopenia, y/o aquellos en quienes los patógenos infecciosos o subproductos de los mismos pueden ser detectados.

Un sujeto en riesgo de desarrollar una infección es uno que está en riesgo de exposición a un patógeno infeccioso. Dichos sujetos incluyen aquellos que viven en un área donde esos patógenos se sabe que existen y donde esas infecciones son comunes. Estos sujetos también incluyen aquellos que están implicados en actividades de alto riesgo tales como compartir agujas, implicados en actividad sexual sin protección, contacto de rutina con muestras de sujetos infectadas (v.gr., personal médico), personas a las que se ha practicado cirugía, incluyendo pero sin limitarse a cirugía abdominal, etc.

El sujeto puede tener o puede estar en riesgo de desarrollar una infección tal como una infección bacteriana, una infección viral, una infección fúngica, una infección parasitaria o una infección micobacteriana. En estas modalidades, las vesículas pueden comprender un agente anti-microbiano tal como un agente anti-bacteriano, un agente anti-viral, un agente anti-fúngico, un agente anti-parasitario, o un agente anti-micobacteriano y los vehículos de células (v.gr., las células T) pueden ser genéticamente manipuladas para producir otro agente útil en la estimulación de respuesta inmunológica contra la infección, o tratar potencialmente la infección.

Cáncer La invención contempla la administración de agentes a sujetos que tienen o están en riesgo de desarrollar un cáncer incluyendo, por ejemplo, un cáncer de tumor sólido, usando las vesículas de la invención. Los agentes pueden ser agentes anticancerosos, incluyendo agentes quimioterapéuticos, agentes terapéuticos basados en anticuerpos, agentes terapéuticos basados en hormonas, y agentes inhibidoras de enzimas, y/o pueden ser agentes inmunoestimulantes tales como antigenos (v.gr., antígenos de cáncer) y/o adyuvantes, y/o pueden ser agentes de diagnóstico (v.gr., agentes formadores de imagen), o cualesquiera de otros agentes descritos en la presente. La invención contempla que las vesículas de la invención son capaces de suministrar cantidades más altas de estos agentes, solos o en combinación, a estos sujetos, y/o para permitir la exposición prolongada del sujeto a estos agentes por medio de un perfil de liberación constante lento.

El cáncer puede ser carcinoma, sarcoma o melanoma. Los carcinomas incluyen sin limitación carcinoma de células básales, cáncer del tracto biliar, cáncer de vejiga, cáncer de mama, cáncer cervical, coriocarcinoma, cáncer del SNC, cáncer de colon y recto, cáncer de riñon o células renales, cáncer de laringe, cáncer de hígado, cáncer de pulmón de células pequeñas, cáncer de pulmón de células no pequeñas (NSCLC, incluyendo adenocarcinoma, carcinoma de células gigantes (o tipo avena), y carcinoma de células escamosas), cáncer de cavidad oral, cáncer de ovario, cáncer pancreático, cáncer de próstata, cáncer de piel (incluyendo cáncer de células básales y cáncer de células escamosas), cáncer de estómago, cáncer testicular, cáncer de tiroides, cáncer uterino, cáncer rectal, cáncer del sistema respiratorio, y cáncer del sistema urinario.

Los sarcomas son neoplasmas mesenquimatosos raros que se originan en hueso (osteosarcomas) y tejidos blandos (fibrosarcomas). Los sarcomas incluyen sin limitación liposarcomas (incluyendo liposarcomas mixoides y liposarcomas pleiomórficos), leiomiosarcomas, rabdomiosarcomas, tumores malignos de la vaina de nervios periféricos (también llamados schwannomas malignos, neurofibrosarcomas, o sarcomas neurogénicos), tumores de Ewing (incluyendo sarcoma de Ewing de hueso, sarcoma de Ewing extraesquelético (es decir, sin hueso), y tumor neuroectodermal primitivo), sarcoma sinovial, angiosarcomas, hemangiosarcomas, linfangiosarcomas, sarcoma de Kaposi, hemangioendotelioma, tumor desmoide (también llamada fibromatosis agresiva), dermatofibrosarcoma protuberante (DFSP), histiocitoma fibroso maligno (MFH), hemangiopericitoma, mesenquimoma maligno, sarcoma de partes blandas alveolares, sarcoma epitelioide, sarcoma de células claras, tumor de células pequeñas desmoplásticas, tumor estromal gastrointestinal (GIST) (también conocido como sarcoma estromal Gl), y condrosarcoma.

Los melanomas son tumores que se originan en el sistema melanocítico de la piel y otros órganos. Ejemplos de melanoma incluyen sin limitación melanoma lentigo maligno, melanoma de diseminación superficial, melanoma nodular, y melanoma lentigino acral. El cáncer puede ser un linfoma de tumor sólido. Ejemplos incluyen linfoma de Hodgkin, linfoma no Hodgkin, y linfoma de células B.

El cáncer puede ser sin limitación cáncer de hueso, cáncer de cerebro, cáncer de mama, cáncer colorrectal, cáncer de tejido conectivo, cáncer del sistema digestivo, cáncer endometrial, cáncer esofágico, cáncer de ojo, cáncer de la cabeza y cuello, cáncer gástrico, neoplasma intra-epitelial, melanoma neuroblastoma, linfoma no Hodgkin, cáncer de pulmón de células no pequeñas, cáncer de próstata, retinoblastoma o rabdomiosarcoma.

Infección La invención contempla la administración de agentes a sujetos que tienen o están en riesgo de desarrollar una infección tal como una infección bacteriana, una infección viral, una infección fúngica, una infección parasitaria o una infección micobacteriana, usando las vesículas de la invención. Los agentes pueden ser agentes anti-infectivos incluyendo agentes anti-bacterianos, agentes anti-virales, agentes anti-fúngicos, agentes antiparasitarios y agentes anti-micobacterianos), agentes inmunoestimulantes tales como antígenos (v.gr., antígenos microbianos tales como antigenos bacterianos, antigenos virales, antígenos fúngicos, antígenos parasitarios, y antígenos micobacterianos) y/o adyuvantes, agentes de diagnóstico (v.gr., agentes formadores de imagen), o cualquiera de los otros agentes descritos aquí. La invención contempla que las vesículas de la invención son capaces de suministrar cantidades más altas de estos agentes, solos o en combinación, a estos sujetos, y/o para permitir la exposición prolongada del sujeto a estos agentes por medio de un perfil de liberación constante lento.

La infección bacteriana puede ser sin limitación una infección por E. coli, una infección estafilicócica, una infección estreptocócica, una infección por Pseudomonas, infección por Clostridium difficile, infección por Legionella, infección por Pneumococcus, infección por Haemophilus, infección por Klebsiella, infección por Enterobacter, infección por Citrobacter, infección por Neissería, infección por Shigella, infección por Salmonella, infección por Listeria, infección por Pasteurella, infección por Streptobacillus, infección por Spirillum, infección por Treponema, infección por Actinomyces, infección por Borrelia, infección por Corynebacterium, infección por Nocardia, infección por Gardnerella, infección por Campylobacter, infección por Spirochaeta, infección por Proteus, infección por Bacteriodes, infección por H. pylorí o infección por carbunco.

La infección micobacteriana puede ser sin limitación tuberculosis o lepra respectivamente causada por las especies M. tuberculosis y M. leprae.

La infección viral puede ser sin limitación una infección por virus de Herpes simple 1 , una infección por virus de Herpes simple 2, infección por citomegalovirus, infección por virus de hepatitis A, infección por virus de hepatitis B, infección por virus de hepatitis C, infección por virus de papiloma humano, infección por virus de Epstein Barr, infección por rotavirus, infección por adenovirus, infección por virus de la influenza, infección por virus de la influenza A, infección por H1 N1 (influenza porcina), infección por virus e sincicios respiratorios, infecciones por virus de varicela zoster, infección de viruela, infección de viruela de monos, infección de SARS o infección de gripe aviar.

La infección fúngica puede ser sin limitación candidiasis, tiña, istoplasmosis, blastomicosis, paracoccidioidomicosis, critococcosis, aspergilosis, cromomicosis, infecciones de micetoma, pseudalesqueriasis o infección de tiña versicolor.

La infección parasitaria puede ser sin limitación amibiasis, infección por Trypanosoma cruzi, Fascioliasis, Leishmaniasis, infección por Plasmodium, Oncocerciasis, Paragonimiasis, infección por Trypanosoma brucei, infección de Pneumocystis, infección por Trichomonas vaginalis, infección por Taenia, infección por Hymenolepsis, infección por Echinococcus, Esquistosomiasis, neurocisticercosis, infección por Necator americanus o infección por Tríchuris trichuría.

Alergia y asma La invención contempla la administración de agentes a sujetos que tienen o están en riesgo de desarrollar una alergia o asma. Los agentes pueden ser alérgenos, agentes inmunoestimulantes incluyendo agentes que estimulan una respuesta de Th1 , agentes inmunoinhibidores o inmunosupresores incluyendo agentes que inhiben una respuesta de Th2, agentes anti-inflamatorios, antagonistas de leucotrieno, muteínas de IL-4, receptores de IL-4 solubles, anticuerpos anti-IL-4, antagonistas de IL-4, anticuerpos anti-IL-5, proteínas de fusión receptor de IL-13 soluble-Fc, anticuerpos anti-IL-9, antagonistas de CCR3, antagonistas de CCR5, inhibidores de VLA-4, y otros reguladores descendentes de IgE tales como pero sin limitarse a anti-lgE, citocinas tales como citocinas de Th1 tales como IL-12 y IFN-gamma, esteroides incluyendo corticosteroides tales como prednisolona, y/o pueden ser agentes de diagnóstico es (v.gr., agentes formadores de imagen), o cualesquiera de otros agentes descritos aquí. La invención contempla que las vesículas de la invención son capaces de suministrar cantidades más altas de estos agentes, solos o en combinación, a estos sujetos, y/o para permitir la exposición prolongada del sujeto a estos agentes por medio de un perfil de liberación constante lento.

Una alergia es una hipersensibilidad adquirida a un alérgeno. Las condiciones alérgicas incluyen pero no se limitan a eczema, rinitis alérgica o coriza, fiebre del heno, asma bronquial, urticaria (salpullido) y alergias a los alimentos, y otras condiciones atópicas. Las alergias generalmente son causadas por la generación de anticuerpo IgE contra alérgenos no dañinos. El asma es un trastorno del sistema respiratorio caracterizado por inflamación, estrechamiento de las vías aéreas y reactividad incrementada de las vías aéreas a agentes inhalados. El asma es frecuentemente, aunque no exclusivamente, asociado con síntomas atópicos o alérgicos.

Enfermedad autoinmune La invención contempla la administración de agentes a sujetos que tienen o están en riesgo de desarrollar una enfermedad o trastorno autoinmune. Los agentes pueden ser agentes inmunoinhibidores o inmunosupresores incluyendo aquellos que inhiben una respuesta de Th1 , agentes inmunoestimulantes que estimulan una respuesta de Th2, citocinas tales como IL-4, IL-5 y IL-10, agentes anti-inflamatorios, y/o pueden ser agentes de diagnóstico (v.gr., agentes formadores de imagen), o cualesquiera de los otros agentes descritos aquí. La invención contempla que las vesículas de la invención son capaces de suministrar cantidades más altas de estos agentes, solos o en combinación, a estos sujetos, y/o para permitir la exposición prolongada del sujeto a estos agentes por medio de un perfil de liberación constante lento.

La enfermedad autoinmune es una clase de enfermedades en las cuales los anticuerpos propios de un sujeto reaccionan con el tejido del hospedero o en los cuales las células T efectoras inmunológicas son autorreactivas a auto-péptidos endógenos y causan destrucción de tejido. Por lo tanto, una respuesta inmunológica es montada contra los anticuerpos propios de un sujeto, referidos como auto-antígenos. Las enfermedades autoinmunes generalmente se considera que son desviadas por Th1. Como resultado, la inducción de una respuesta inmunológica de Th2 o citocinas de tipo Th2 pueden ser benéficas.

Las enfermedades autoinmunes incluyen pero n o se limitan a artritis reumatoide, enfermedad de Crohn, esclerosis múltiple, lupus eritematoso sistémico (SLE), encefalomielitis autoimmune, miastenia grave (MG), tiroiditis de Hashimoto, síndrome de Goodpasture, pénfigo (v.gr., pénfigo vulgar), enfermedad de Grave, anemia hemolítica autoinmune, púrpura trombocitopénica autoinmune, escleroderma con anticuerpos anticolágeno, enfermedad de tejido conectivo mixto, polimiositis, anemia perniciosa, enfermedad de Addison idiopática, infertilidad autoinmune-asociada, glomerulonefritis (v.gr., glomerulonefritis creciente, glomerulonefritis proliferativa), penfigoide bulloso, síndrome de Sjogren, resistencia a la insulina y diabetes mellitus autoinmune.

Terapia de trasplante La invención contempla la administración de agentes a sujetos a quienes se practica un trasplante de células u órgano. Los agentes pueden ser agentes inmunoinhibidores o inmunosupresores, agentes antiinflamatorios, y/o pueden ser agentes de diagnóstico (v.gr., agentes formadores de imagen), o cualquiera de los otros agentes descritos aquí. La invención contempla que las vesículas de la invención son capaces de suministrar cantidades más altas de estos agentes, solos o en combinación, a estos sujetos, y/o para permitir la exposición prolongada del sujeto a estos agentes por medio de un perfil de liberación constante lento.

Las composiciones y métodos provistos aquí también se pueden usar para modular las respuestas inmunológicas después de terapia de trasplante. El éxito del trasplante es a menudo limitado por rechazo del tejido trasplantado por el sistema inmunológico del cuerpo. Como resultado, los receptores del trasplante son usualmente e inmunosupimidos durante períodos prolongados para permitir que el tejido trasplantado sobreviva. La invención contempla el suministro de inmunomoduladores, y particularmente agentes inmunoinhibidores, a sitios de trasplante para reducir al mínimo el rechazo de trasplante. Por lo tanto, la invención contempla la administración a sujetos a quienes se va a realizar, se está realizando, o se les ha realizado trasplante.

Las listas anteriores no pretenden ser exhaustivas sino más bien ilustrativas. Los expertos en la técnica identificarán otros ejemplos de cada tipo de condición que está sujeta a prevención y tratamiento usando los métodos de la invención.

Cantidades efectivas, regímenes, formulaciones Los agentes se administran en forma de MLVs estabilizadas y en cantidades efectivas. Una cantidad efectiva es una dosis del agente suficiente para proveer un resultado médicamente deseable. La cantidad efectiva variará con el resultado deseado, la condición particular que está siendo tratada o prevenida, la edad y condición física del sujeto que está siendo tratado, la severidad de la condición, la duración del tratamiento, la naturaleza de la terapia concurrente o de combinación (si acaso la hay), la vía de administración específica y factores similares dentro del conocimiento y experiencia del personal médico. Generalmente se prefiere que se use una dosis máxima, es decir, la dosis segura más alta de acuerdo con el juicio médico sólido.

Por ejemplo, si el sujeto tiene un tumor, una cantidad efectiva puede ser aquella cantidad que reduce el volumen o carga del tumor (como, por ejemplo, determinada por imagen del tumor). Las cantidades efectivas también se pueden evaluar por la presencia y/o frecuencia de células cancerosas en la sangre u otro fluido o tejido corporal (v.gr., una biopsia). Si el tumor está impactando el funcionamiento normal de un tejido u órgano, entonces la cantidad efectiva puede ser evaluada midiendo el funcionamiento normal del tejido u órgano.

En algunos casos, la cantidad efectiva es la cantidad requerida para reducir o eliminar uno o más, y preferiblemente todos, los síntomas. Por ejemplo, en un sujeto que tiene una alergia o que experimenta un ataque asmático, una cantidad efectiva de un agente puede ser aquella cantidad que reduce o elimina los síntomas asociados con la alergia o el ataque asmático. Pueden incluir estornudo, salpullido, congestión nasal, y dificultad para respirar. De manera similar, en un sujeto que tiene una infección, una cantidad efectiva de un agente puede ser aquella cantidad que reduce o elimina los síntomas asociados con la infección. Éstos pueden incluir fiebre y malestar. Si el agente es un agente de diagnóstico, una cantidad efectiva puede ser una cantidad que permite visualización de la región corporal o células de interés. Si el agente es un antigeno, la cantidad efectiva puede ser aquella cantidad que desencadene una respuesta ¡nmunológica contra el antigeno y preferiblemente provee protección a corto plazo e incluso muy preferiblemente a largo plazo contra el patógeno del cual deriva el antigeno. Se entenderá que en algunos casos la invención contempla la administración individual de un agente y en algunos casos la invención contempla múltiples administraciones de un agente. Como un ejemplo, un antígeno se puede administrar en una dosis principal y una dosis de refuerzo, aunque en algunos casos la invención provee suficiente suministro del antígeno, y opcionalmente un adyuvante, que no se requiere dosis de refuerzo.

La invención provee composiciones farmacéuticas. Las composiciones farmacéuticas son composiciones estériles que comprenden las vesículas de la invención y preferiblemente agente(s), preferiblemente en un vehículo farmacéuticamente aceptable. El término "vehículo farmacéuticamente aceptable" significa uno o más llenadores, diluyentes o sustancias encapsulantes sólidas o líquidas compatibles que son adecuadas para la administración a un humano u otro sujeto contemplado por la invención.

El término "vehículo" denota un ingrediente orgánico o inorgánico, natural o sintético, con el cual las vesículas y preferiblemente agente(s) se combinan para facilitar la administración. Los componentes de las composiciones farmacéuticas se entremezclan de una manera que evita la interacción que sustancialmente alteraría suficiencia farmacéutica deseada.

Los agentes reguladores de pH adecuados incluyen ácido acético y una sal (1-2% P/V); ácido cítrico y una sal (1-3% P/V); acido bórico y una sal (0.5-2.5% P/V); y ácido fosfórico y una sal (0.8-2% P/V). Los conservadores adecuados incluyen cloruro de benzalconio (0.003-0.03% P/V); clorobutanol (0.3-0.9% P/V); y parabenos (0.01-0.25% P/V).

A menos que se indique otra cosa aquí, una variedad de vías de administración están disponibles. El modo particular seleccionado dependerá, desde luego, del agente activo particular seleccionado, la condición particular que está siendo tratada y la dosis requerida para eficacia terapéutica. Los métodos provistos, generalmente hablando, se pueden poner en práctica usando cualquier modo de administración que sea médicamente aceptable, que significa cualquier modo que produce niveles efectivos de una respuesta deseada sin causar efectos adversos clínicamente inaceptables. Un modo de administración es una vía parenteral. El término "parenteral" incluye inyecciones subcutáneas, técnicas de inyección o infusión intravenosa, intramuscular, intraperitoneal, intraesternal. Otros modos de administración incluyen oral, mucosal, rectal, vaginal, sublingual, intranasal, intratraqueal, inhalación, ocular, transdérmica, etc.

Para administración oral, los compuestos se pueden formular fácilmente combinando las vesículas con vehículo farmacéuticamente aceptable bien conocidas en la técnica. Dichos vehículos permiten la formulación como tabletas, pildoras, grajeas, cápsulas, líquidos, geles, jarabes, pastas acuosas, películas, suspensiones y similares, para ingestión oral por un sujeto que ha de ser tratado. Los excipientes adecuados son, en particular, llenadores tales como azúcares, incluyendo lactosa, sacarosa, manitol o sorbitol; preparaciones de celulosa tales como, por ejemplo, almidón de maíz, almidón de trigo, almidón de arroz, almidón de papa, gelatina, goma tragacanto, metilcelulosa, hidroxipropilmetil-celulosa, carboximetilcelulosa sódica, y/o polivinilpirrolidona (PVP). Opcionalmente, las formulaciones orales también se pueden formular en solución salina o reguladores de pH para neutralizar condiciones acidas internas o se pueden administrar sin ningún vehículo.

Las preparaciones farmacéuticas que se pueden usar oralmente incluyen cápsulas de ajuste a presión hechas de gelatina, asi como cápsulas selladas blandas, hechas de gelatina y un plastificante, tal como glicerol o sorbitol. Las cápsulas de ajuste a presión pueden contener las vesículas suspendidas en líquidos adecuados, tales como soluciones acuosas, soluciones reguladoras de pH, aceites grasos, parafina líquida, o polietilenglicoles líquidos. Además, se pueden añadir estabilizadores Todas las formulaciones para administración oral deben estar en dosis adecuadas para dicha administración.

Para administración bucal, las composiciones pueden adoptar la forma de tabletas o trociscos formulados de una manera convencional.

Para administración por inhalación, las composiciones pueden ser convenientemente suministradas en forma de una presentación de aspersión en aerosol desde envases presurizados o un nebulizador, con el uso de un propelente adecuado, v gr., diclorodifluorometano, triclorofluorometano, diclorotetrafluoroetano, dióxido de carbono u otro gas adecuado. En el caso de un aerosol presurizado, la unidad de dosis se puede determinar proveyendo una válvula para suministrar una cantidad dosificada.

Cuando es deseable suministrar las composiciones de la invención sistemáticamente, pueden ser formuladas para administración parenteral por inyección, v.gr., por inyección de bolo o infusión continua. Las formulaciones para inyección pueden presentarse en forma de dosis unitaria, v.gr., en ampolletas o en contenedores de dosis múltiples. Las formulaciones parenterales farmacéuticas incluyen soluciones acuosas de los ingredientes. Las suspensiones de inyección acuosas pueden contener sustancias que incrementan la viscosidad de la suspensión, tales como carboximetilcelulosa sódica, sorbitol, o dextrano. Alternativamente, las suspensiones de vesículas se pueden preparar como suspensiones a base de aceite. Los solventes o vehículos lipofílicos adecuados incluyen aceites grasos tales como aceite de ajonjolí, o éteres de ácido graso sintético, tales como oleato de etilo o triglicéridos.

Alternativamente, las vesículas pueden estar en forma de polvo o forma liofilizada para constitución con un vehículo adecuado, v.gr., agua libre de pirógenos estéril, antes de usarse.

Las composiciones también se pueden formular en composiciones rectales o vaginales tales como supositorios o enemas de retención, v.gr. , que contienen bases de supositorio convencionales tales como manteca de cacao u otros glicéridos.

Uso in vi tro La invención además contempla aplicaciones in vitro tales como cultivo de células e ingeniería de tejido, que requieren o para las cuales seria más conveniente tener una fuente constante de uno o más agentes tales como pero sin limitarse a factores de crecimiento celular, y similares.

Kits La invención además contempla kits que comprenden las vesículas de la invención. Las vesículas pueden comprender uno o más agentes de interés. Los kits además pueden comprender uno o más agentes de interés que han de ser incorporados en las vesículas. Estos kits también pueden incluir materiales escritos tales como instrucciones para el uso de las vesículas. Las vesículas se pueden proveer en un regulador de pH o en una forma liofilizada, preferiblemente con un excipiente que contiene sacarosa.

La invención también contempla kits que comprenden los diversos sustratos, reactivos y catalizadores requeridos para sintetizar las vesículas de la invención. Dichos kits pueden incluir por ejemplo lípidos tales como aquellos descritos aquí, componentes funcionalizados de una bicapa lipidica tales como lípidos funcionalizados, uno o más entrelazadores tales como entrelazadores permeables a la membrana, cationes multivalentes tales como cationes divalentes, y similares. Estos kits también pueden incluir materiales escritos tales como instrucciones para sintetizar las vesículas. Los kits también pueden incluir los agentes de interés.

La presente invención además se ilustra mediante los siguientes ejemplos, que de ninguna manera se deben considerar como limitantes. El contenido entero de todas las referencias (incluyendo referencias de literatura, patentes concedidas, solicitudes de patente publicadas, y solicitudes de patentes copendientes) citadas a través de esta solicitud son por la presente incorporadas expresamente como referencia.

EJEMPLOS EJEMPL0 1 Para enfrentar limitaciones en métodos de la técnica anterior, los inventores de la presente contemplan la síntesis de partículas de lípido estabilizadas al formar entrelazamientos que conectan los grupos de cabeza de lípido adyacente dentro de vesículas multilaminares (MLVs). Los cationes divalentes se sabe que inducen la fusión de liposomas en MLVs. (Véase Duzgunes et al., J Membrane Biol. 1981 ;59: 1 15-125.) Los inventores de la presente modificaron este proceso al introducir lípidos maleimida-funcionalizados (v.gr., MPB) en vesículas y capas de entrelazamiento de MPB usando ditiol-entrelazadores (v.gr., esquemas de síntesis mostrados en la figura 1A). Las vesículas de lípido multilaminar entrelazadas entre capas (ICMVs) resultantes presentaron características atractivas, tales como eficiencia de encapsulamiento de proteina en gran medida incrementada (100 veces en relación con liposomas simples, figuras 5A-5B), carga de proteína por masa de partículas (20 veces en relación con liposomas simples, figuras 5A-5B), y retención sostenida de cargas atrapadas en presencia de suero con cinética de liberación sostenida lenta (figuras 6A-6B). La síntesis se lleva a cabo por completo en reguladores de pH acuosos inocuos al atrapamiento de cargas de proteína frágiles, y genera partículas compuestas únicamente de lípidos biodegradables. Como un lecho de prueba para aplicaciones biomédicas de esta nueva clase de partículas, los inventores de la presente examinaron ICMVs como un vehículo de suministro para antigenos y adyuvantes. De manera específica, los inventores de la presente usaron ovalbúmina (OVA) como un antigeno de modelo y probaron el co-suministro de agonistas de receptor tipo toll (TLRa) in vivo para aplicaciones de vacuna.

Materiales y métodos LÍOS lípidos (DOPC:DOPG:lípídos maleimida-funcionalizados en relaciones molares de 40:10:50) se secaron para formar películas de lipido, y se rehidrataron en 10 mM de bis-tris propano (BTP) a pH 7.0 durante 1 hr en presencia de moléculas de carga. Como se muestra en la figura 1A, los liposomas resultantes se sometieron a sonicación y fuero inducidos a fusionarse por adición de cationes divalentes tales como Mg + y Ca2+. Las MLVs resultantes se incubaron con DTT (relación de male¡mida:DTT de 2: 1) para conjugar capas yuxtapuestas de lípidos maleimida-funcionalizados y formar ICMVs entrelazadas. Las estructuras resultantes se centrifugaron, lavaron, y después fueron PEGiladas por incubación con 2 kDa PEG-tiol durante 30 min. Los productos finales fueron centrifugados y lavados 3X con agua desionizada. El tamaño de partícula y carga de superficie se determinaron por dispersión de luz dinámica (DLS) usando un analizador de tamaño de partícula 90Plus (Brookhaven Instruments). Las partículas se analizaron con microscopía confocal y crío-TEM. Para cuantificar la fracción de lípidos expuestos sobre las superficies externas de partículas, se realizó prueba de laminaridad como se desribió anteriormente. (Véase Girard et al., Biophysical journal 2004;87:419-429.) Para estudios de encapsulamiento, ovalbúmina (OVA) modificada con alexa-fluor 555 se usó para medir la cantidad encapsulada en liposomas PEGilados, partículas de PLGA revestidas con lípido (como se describió anteriormente en Bershteyn et al., Soft Matter 2008;4:1787-1791), y ICMVs. SIV-Gag y ligando FLT-3 modificado con alexa-fluor 555 se usaron en algunas pruebas. La liberación de OVA de estas partículas se realizó en membranas de diálisis con corte de PM de 100 kDa.

Para estudios de activación de células dendríticas (DC) in vitro, DCs derivadas de médula ósea o esplénicas se incubaron con ICMVs que encapsulan OVA en combinación con lípido monofosforílico A (MPLA) y agonistas de R-848, TLR4 y TLR7, respectivamente. Las células se tiñeron y se analizaron por citometría de flujo para examinar el grado de activación de DC e internalización de partícula. Los medios de cultivo se analizaron para expresión de IL12p70 por ELISA (R&D Systems). Para análisis de la función in vivo de ICMVs como vehículos de vacuna, grupos de ratones C57BI/6 fueron inmunizados s e. en el flanco ya sea con 70 pg de OVA suministrado en inyección de bolo o en ICMVs (con o sin agonistas de TLR) y reforzados 21 días más tarde. Frecuencias de células T específicas de OVA y células T productoras de interferón-gamma producidas por inmunización se determinaron por análisis de citometría de flujo de células mononucleares de sangre periférica. Títulos anti-OVA se determinaron por análisis de ELISA de sueros de ratones inmunizados. Los animales fueron cuidados para los siguientes lineamientos NIH, estatales y locales.

Resultados y discusión El protocolo tradicional para formar MLVs fue modificado para sintetizar ICMVs estables (figura 1A). Primero, los liposomas que contenían 50 % molar de MPB se formaron por rehidratación de películas de lípido con sonicación en presencia de proteína o soluciones de carga de fármaco. La fusión entre los liposomas resultantes fue inducida por la adición de cationes divalentes para formar MLVs como se reportó anteriormente. (Véase Duzgunes et al., J Membrane Biol. 1981 ;59: 1 15-125). Los inventores de la presente entonces introdujeron DTT como un reactivo permeable a la membrana para formar entrelazamientos covalentes entre grupos de cabeza de maleimida de membranas de lipidos yuxtapuestas dentro de las MLVs (FIG. 1 B). Como se muestra en los cuadros 1A y 1 B, antro el catión divalente como DTT se requirieron para formar ICMVs estables con rendimiento significativo mayor que 40%; MLVs formadas ya sea con Mg2+ o DTT solo no produjeron cantidades significativas de partículas de lipido que fueron centrifugadas con 10K x g. La presencia de 20 mM de cloruro de sodio interfirieron con la formación de partículas, ya que se sabe que el catión monovalente inhibe la fusión de vesículas mediada por cationes divalentes. (Véase Duzgunes et al., J Membrane Biol. 1981 ;59:115-125.) Por lo menos 25 % molar o más de MPB se requirieron para lograr un rendimiento significativo de partículas, y los inventores de la presente subsiguientemente escogieron trabajar con una composición de lipido de DOPC:DOPG:MPB en una relación molar de 40:10:50.

Las ICMVs resultantes tuvieron medias de diámetros típicas de 250 + 40 nm con índices de polidispersión de -0.08 (figura 3A). Imágenes de las partículas por CrioEM revelaron estructuras multilaminares compuestas de bandas densas de electrones más gruesas que bicapas lipidicas individuales, lo que sugiere capas múltiples de lípidos conjugados a través de las membranas de lípidos (figura 3B). La fracción de lípidos desplegada sobre las superficies externas de partículas se midió con prueba de laminaridad. Los liposomas sonicados tuvieron 37 ± 2.3 % de lípidos sobre la superficie externa, mientras que el valor disminuyó a 19 ± 1.0 % en ICMVs formadas después de modificar los liposomas con Mg2+ y DTT, sugiriendo sus estructuras de capas múltiples. Las ICMVs fueron PEGiladas haciendo reaccionar MPB desplegada en la superficie con PEG-tiol (2 kDa PM). La PEGilación incrementó el diámetro de ICMVs a 272 ± 40 nm, y las partículas almacenadas en PBS durante 7 días mantuvieron sus tamaños originales (cuadro 2, y algunos datos no mostrados). Las ICMVs fueron susceptibles a liofilización con 3% de sacarosa añadida como un excipiente ya que las partículas resuspendidas en solución regulada en su pH después de liofilización mantuvieron sus morfologías generales y características de tamaño (cuadro 2).

Los liposomas y partículas de PLGA se habían usado ampliamente para vehículos de suministro de proteína; por lo tanto, los inventores de la presente compararon el encapsulamiento de proteína en estos vehículos con ICMVs. Como se muestra en la figuras 5A-5B, las ICMVs presentaron eficiencia de encapsulamiento de OVA superior comparado con los liposomas de vaina PEGilados tradicionales y partículas de PLGA revestidas con lípido (108 y 4 veces de incrementos, respectivamente). De manera similar, la cantidad de OVA encapsulada por masa de partícula total se incrementó en ICMVs por 21 y 10 veces, respectivamente. Los inventores de la presente enseguida examinaron la cantidad de varias proteínas encapsuladas en ICMV durante el curso de su síntesis (figura 4A). La cantidad de SlV-gag, ligando FLT-3, y OVA encapsulada progresivamente incrementada de liposomas sonicados, MLVs formadas por fusión mediada por Mg2+, a ICMVs formadas por Mg2+ y DTT. En particular, más de 70% de OVA inicialmente cargada fue encapsulada en las ICMVs a 407.5±18.7 pg de OVA por mg de lípido. Usando OVA como una proteina modelo, la liberación de carga de estas vesículas se comparó (figuras 6A-6B). OVA fue liberada de ICMVs de una manera continua, lenta, mientras que OVA fue liberada por estallamiento de liposomas y MLVs en un medio con suero.

Usando OVA como un antigeno de vacuna modelo, los inventores de la presente examinaron ICMVs como una plataforma para suministro de vacuna. Las ICMVs se cargaron con OVA y antagonistas de receptor tipo Toll, MPLA (ligando TLR4) y/o resiquimod (ligando TLR7/8). Las células dendríticas (DCs) incubadas con ICMVs cargadas con OVA in vitro ávidamente endocitosaron las partículas. Las ICMVs solas cargadas con OVA no activaron DCs in vitro, sino que las partículas que contenían agonistas de TLR (TLRa) desencadenaron la regulación ascendente de moléculas coestimulantes (v.gr. CD40, CD80, CD86 y MHC II), y la secreción de IL-12p70 por DCs in vitro; partículas que transportaban tanto agonistas de TLR4 como de TLR7 promovieron la activación de DC sinergística (figuras 8A-8B).

Para probar la eficacia de las partículas que co-suministran TLRa en combinaciones con OVA para vacunación in vivo, ratones C57BI/6 fueron inmunizados con ICMVs cargadas con OVA y se compararon con las dosis equivalentes de OVA soluble. De manera interesante, comparado con la inyección de bolo de OVA, las ICMVs cargadas con OVA incrementaron la expansión de células T de CD8+ específicas de antigeno por 17 veces, alcanzando -7% entre todas las células T del CD8+ después del refuerzo (figuras 10A-10B). Estas partículas cargadas con OVA también produjeron la frecuencia más alta de células T específicas de OVA productoras de interferón-gamma (IFN-gamma) funcionalmente competentes. Notablemente, sin embargo, las respuestas de anticuerpo contra OVA requirió la presencia de TLRa para títulos máximos, y ICMVs cargadas con OVA co-encapsuladas con agonistas de TLR4 y de TLR7 produjeron títulos de anticuerpo anti-OVA -10 veces más altos comparados con las mismas dosis de OVA/TLRa soluble (figura 10B).

Para empezar a entender las respuestas inmunológicas que las ICMVs pueden producir contra antígenos de patógenos clínicamente relevantes, los inventores de la presente probaron inmunización con un antígeno de un agente infeccioso. Varias dosis de ICMVs que tenían el antígeno encapsulado en las mismas y también que tenían MPLA incorporada en sus bicapas se usaron para inmunizar ratones. Después del régimen principal y el de refuerzo, títulos de anticuerpo fuertes fueron generados contra el antígeno como se detectó en sueros a partir del día 34, mientras que las dosis equivalentes suministradas por antígeno soluble y MPI_A produjeron títulos de anticuerpo mucho más débiles (no se muestran datos). Estos resultados sugieren las ICMVs como un vehículo efectivo para suministrar antígenos para inmunizaciones.

En este estudio, los inventores de la presente desarrollaron partículas de lípoidos multilaminares novedosas que presentan características atractivas: El encapsulamiento de proteína es en gran medida incrementado en las ICMVs sin el uso de solventes orgánicos. Estas partículas presentan estabilidad coloidal, y las partículas a base de lípido son completamente biodegradables. Los inventores de la presente demostraron la versatilidad de ICMVs como una plataforma para el suministro de vacuna. Estos estudios sugieren que las ICMVs deben ser ampliamente útiles en una variedad de suministro in vivo de aplicaciones de fármacos.

EJEMPLO 2 El siguiente ejemplo es una descripción más completa y reporte de algunos de los experimentos y resultados descritos en el ejemplo 1.

Los adyuvantes de vacuna actualmente autorizados (v.gr., hidróxido de aluminio y la emulsión de aceite en agua MF59) promueven inmunidad al producir principalmente respuestas inmunológicas humorales, sin estimular la inmunidad celular1 ,2. Como las respuestas de células T de CD8+ T (CD8T) fuertes pueden ser requeridas para vacunas contra cáncer o patógenos intracelulares tales como VIH, malaria y hepatitis C, hay gran interés en tecnologías para promover respuestas inmunológicas humorales y celular concetradas3,4. Para este fin, se han desarrollado vectores de vacuna vivos genéticamente manipulados tales como virus recombinantes no replicantes5"7, que pueden inducir tanto respuestas de anticuerpo robustas como expansión masiva de células T de CD8+ especificas de antígeno funcionales en modelos de murino. Sin embargo, las preocupaciones de seguridad con vectores vivos e inmunidad anti-vector pueden complicar el diseño de vacuna de vector vivo7. Las respuestas inmunológicas específicas de vector pre-existentes han reducido la inmunogenicidad de vacunas basadas en vectores vivos en ensayos clínicos8, y la respuesta inmunológica se produce contra vectores vivos después de una inmunización inicial puede hacer problemáticas a las inmunizaciones de refuerzo que usan el mismo vector7.

Por el contrario, vacunas sintéticas no vivas que suministran antígenos definidos pueden ser racionalmente diseñadas para evitar inmunidad anti-vector9. Dichas vacunas de "subunidad" están compuestas de una o algunas proteínas recombinantes o polisacáridos seleccionados normalmente presentes en la estructura del patógeno objetivo. Sin embargo, las vacunas de subunidad producen respuestas de CD8T pobres o no existentes, debido a la eficiencia baja de presentación cruzada (la absorción y procesamiento de antígeno extracelular por células inmunes para presentación en las moléculas de MHC de clase I a células T de CD8+ intactas)10. Para promover la presentación cruzada, se han usado partículas sintéticas cargadas con antígenos de proteína y moléculas ¡nmunoestimulantes definidas11"17, simulando de una manera reducctionista los indicios provistos al sistema inmunológico durante infección por patógenos. Los liposomas son materiales particularmente atractivos para esta aplicación, debido a su baja toxicidad e inmunogenicidad, rastreo de seguridad en uso clínico, facilidad de preparación, y capacidad de fabricación probada a escalas comerciales18'19. Las vesículas de lípido en forma de vesículas unilaminares, multilaminares o polimerizadas han sido probadas como materiales de suministro de vacuna, con algún éxito19"23. Los antígenos atrapados en vesículas de lípído son presentadas en forma cruzada in v/Vo19,24,25, y se ha mostrado que las vacunas de proteína líposomal producen respuestas inmunológicas antí-microbianas y anti-tumorales mediadas por células T protectoras en modelos animales pequeños23,26 27. Sin embargo, para enfermedades tales como VIH y cáncer, actualmente se cree que las respuestas de células T extremadamente potentes (en concierto con inmunidad humoral) se requerirán para controlar el virus/tumores, y por lo tanto, vacunas de células T más potentes aún son buscadas3 4.

Un factor potencial que influye en la potencia de vesículas de lípido en suministro de vacunas es su estabilidad limitada en presencia de componentes del suero. Para cargas liposomales que pueden ser procesados a alta temperatura o cargados por difusión a través de membranas de vesícula preformadas, estabilidad de la vesícula incrementada se puede lograr usando lípidos altos en Tm, especialmente cuando se combinan con colesterol y/o PEGilación28. Las vesículas unilaminares y multilaminares han sido estabilizadas polimerizando grupos de cabeza reactivos en la superficie de bicapas29, polimerizando grupos reactivos en colas de acilo de fosfolípido20,29, o polimerizando monómeros hidrofóbicos adsorbidos en el interior hidrofóbico de membranas30. Común a cada capa de estos enfoques es el concepto de polimerizar componentes en el plano de la bicapa. Sin embargo, el hallazgo de químicas de polimerización que se puedan llevar a cabo en condiciones leves compatibles con antígenos de vacuna es desafiante20.

Aquí, los inventores de la presente describen una nueva clase de vehículos de fármaco de lípído, vesículas multílaminares entrelazadas entre capas (ICMVs), formadas al estabilizar vesículas multílaminares con entrelazamientos covalentes cortos que enlazan grupos de cabeza de lípídos a través de las caras yuxtapuestas de bicapas apretadamente apiladas adyacentes dentro de las paredes de vesícula. ICMVs encapsuladas y altos niveles de proteínas establemente retenidos, liberando carga atrapado muy lentamente cuando se exponen a suero (durante 30 días) comparado con liposomas simples o vesículas multílaminares (MLVs) de la misma composición de lipido. Sin embargo, estas vesículas fueron degradadas rápidamente en presencia de lipasas normalmente encontradas a niveles altos dentro de compartimientos intracelulares31. Usando esta estructura de vesícula novedosa para co-atrapar altos niveles de un antígeno de proteína modelo (ovalbúmina, OVA) y un ligando ¡nmunoestimulante tipo lipido (lípído monofosforílico A, MPLA), los inventores de la presente realizaron estudios de inmunización en ratones y encontraron que ICMVs produjeron títulos de anticuerpo robustos ~1000 veces mayores que liposomas simples y ~10 veces mayor que MLVs de composiciones de lípídos idénticas. A diferencia de vectores vivos que a menudo sólo son efectivos para una sola inyección administrada a un individuo intacto al vector7, éstas vesículas sintéticas desencadenaron respuestas humorales y de células T de CD8+ constantemente en incremento después de administraciones repetidas, con células T específicas de antígeno expandiéndose a un pico de casi 30% de las células T de CD8+ totales en la sangre después de una inmunización inicial y dos inmunizaciones de refuerzo. Estos materiales nuevos por lo tanto pueden abrir la puerta a vacunas de subunidades que son seguras y altamente efectivas para generar inmunidad humoral y celular.

Materiales y métodos Síntesis de ICMVs. 1.26 pmol de lipidos en cloroformo (composición lípida tópica: DOPC(1 ,2-Dioleoil-sn-Glicero-3-Fosfocolina):DOPG(1 ,2-di-(9Z-octadecenoil)-sn-glicero-3-fosfo-(1'-rac-glicerol)):MPB (1 ,2-dioleoil-sn-glicero-3-fosfoetanolamina-N-[4-(p-maleimidofenil) butiramida) = relación molar de 4: 1 :5, todos los lipidos de Avanti Polar Lipids, Alabaster, AL) se surtieron en frascos de vidrio, y los solventes orgánicos se evaporaron bajo vacío durante la noche para preparar películas de lípido delgadas secas. La películas de lípido se rehidrataron en 10 mM de bis-tris propano (BTP) a pH 7.0 con carga proteínas durante 1 hr con acción de remolino rigurosa cada 10 min, y después se sometieron a sonicación en ciclos de potencia alternos de 6 watts y 3 watts en intervalos de 30s durante 5 min sobre hielo (sonicador con punta de sonda Misonix Microson XL, Farmingdale, NY). Los liposomas formados este primer paso fueron inducidos a sufrir fusión por adición de cationes divalentes tales como Mg2+ y Ca2+ a una concentración final de 10 mM. Las MLVs resultantes se incubaron con 1.5 mM de DTT (relación molar de maleimida:DTT de 2:1) durante 1 hr a 37°C para conjugar bicapas opuestas de lipidos maleimida-funcionalizados y formar ICMVs entrelazadas; las vesículas resultantes fueron recuperadas por centrifugación a 14,000 x g durante 4 min, y lavadas dos veces con agua desionizada. Para PEGilación, las partículas se incubaron con 2 kDa de PEG-tiol (Laysan Bio, Arab, AL) en un exceso molar de 1.5 veces de PEG-SH a grupos maleimida durante 1 hr a 37°C. Las partículas resultantes fueron centrifugads y lavadas 3X con agua desionizada. Los productos finales fueron almacenados en PBS a 4°C o liofilizados en presencia de 3% de sacarosa como un crioprotector y almacenados a -20°C. Para algunas pruebas, los liposomas simples o MLVs fusionadas con Mg fueron cosechadas antes délo entrelazamiento con ultracentrifugación a 1 15K g usando una ultracentrífuga Optima durante 6 hr (Beckman Coulter).

Carga de proteína in vitro y liberación de fármaco. Para estudios de encapsulamiento, ovalbúmina (OVA, Worthington, Lakewood, NJ), SlV-gag (Advanced Bioscience Laboratories, Kensington, MD), y FLT-3L (Peprotech, Rocky Hill, NJ) se marcaron con Alexa-Fluor 555 (Invitrogen, Carlsbad, CA) para cuantificación fluorométrica directa de la cantidad de proteína atrapada. OVA también fue encapsulada en nanoparticulas de DRVs y PLGA como se describió antes43,44. En algunos experimentos, las ICMVs se cargaron con una proteina recombinante de malaria vivax (VMP) como un control de antígeno irrelevante49 (provisto por Dr. Anjali Yadava, Walter Reed Army Institute of Research). OVA tiol-bloqueada se preparó incubando 1 mg de OVA con 1.5 mM de TCEP durante 1 hr a RT, seguido por incubación con 1.5 mM de etil-maleimida (Pierce, Rockford, IL) a 37°C durante 1 hr. El grado de protección de tiol fue > 95% como se evaluó con prueba de Ellman50. La liberación de OVA marcada con Alexa-Fluor 555 de vesículas de lípido se cuantificó en un medio RPMI complementado con 10% de suero de ternera fetal 37°C usando membranas de diálisis con corte de PM de 100 kDa. A intervalo regulares, los medios de liberación fueron removidos para cuantificación de fluorescencia, y un volumen igual de medio fresco fue reemplazado para monitoreo continuado de liberación de fármaco. OVA residual que quedó al final del curso de tiempo se determinó por extracción de lípido de las vesículas mediante tratamiento con 1 % de Tritón X-100 y midiendo la proteína liberada por espectrofotometria de fluorescencia. Pruebas de liberación de OVA también se realizaron en solución salina regulada en su pH con regulador de pH de Hank complementado con 500 ng/ml de fosfolipasa A (Sigma, St. Louis, O). Para examinar la estabilidad de moléculas de carga encapsuladas, IgG monoclonal de rata encapsulado en IGMVs fue recuperado con 1 % de tratamiento con tritón X-100 y analizado con SDS-PAGE bajo condiciones no reductoras con tinción con plata (Pierce).

Estudio de vacunación con ICMVs. Grupos de ratones C57BI/6 (Jackson Laboratories) fueron inmunizados s e. en la base de la cola con dosis indicadas de OVA (con o sin agonista de TLR, MPLA). Las frecuencias de células T de CD8+ especificas de OVA y sus fenotipos producidos por inmunización se determinaron por análisis de citometría de flujo de PBMCs en puntos de tiempo seleccionados después de tinción con DAPI (para discriminar células vivas/muertas), anti-CD8 alfa, anti-CD44, anti-CD62L, y tetrámeros de péptido-MHC SIINFEKL/H-2Kb (Becton Dickinson). Para evaluar la funcionalidad de células T de CD8+ cebadas, las PBMCs fueron estimuladas ex vivo con 1 µ? de OVA-péptido SIINFEKL durante 6 hr con GolgiPlug (Becton Dickinson), fijadas, permeabilizadas, teñidas con anti- IFN-gamma y CD8 alfa, y analizadas por citometría de flujo. Títulos de IgG anti-OVA, definidos como la dilución de sueros a la cual la lectura de DO a 450 nm es 0.5, se determinó por análisis de ELISA de sueros de ratones inmunizados. Los animales fueron cuidados para los siguientes lineamientos NIH, estatales y locales.

Análisis estadístico. El análisis estadístico se realizó con Jmp 5.1 (SAS Institute Inc, Cary, NC). Se analizaron conjuntos de datos usando análisis de varianza de una o dos vía (ANOVA), seguido por prueba de HSD de Tukey para comparaciones múltiples. Los valores de p menores que 0.05 se consideraron estadísticamente significativos. Todos los valores se reportan como media ± s.e.m.

Resultados Los inventores de la presente introdujeron entrelazamientos covalentes entre grupos de cabeza lípido-funcionalizados de bicapas yuxtapuestas, adyacentes, dentro de MLVs preformadas para formar ICMVs (figura 2A): En una síntesis típica, las películas de fosfolípido secas que contenían DOPC, DOPG aniónico, y el lípido de maleimida aniónica-grupo de cabeza MPB en una relación molar de 4:1 :5 se hidrataron y sonicaron para formar liposomas simples (paso (i)). Cationes divalentes (v.gr., Mg +) se añadieron a los liposomas para inducir fusión de vesículas y la formación de MLVs como se reportó anteriormente32 (paso (ii)). Para introducir entrelazamientos entre bicapas adyacentes en las MLVs, ditioltrietol (DTT) se añadió después a la suspensión de vesícula para actuar como un entrelazador permeable a membrana, formando un enlace covalente entre grupos de cabeza de maleimida de membranas yuxtapuestas llevados a proximidad por los puentes de sal de catión formados entre capas de vesícula (paso (¡ii)). La PEGilación es una. estrategia bien conocida para incrementar la estabilidad al suero y vida media de vesículas de lípido de circulación en la sangre18. Por lo tanto, como u paso final, las vesículas se lavaron y los grupos maleimida residuales expuestos en las superficies externas de las partículas se bloquearon con PEG tiol-terminado (paso (iv)).

El diámetro/polidispersión de las partículas determinará los tipos de células capaces de internalizar estas partículas33, mientras el número de bicapas que comprenden las paredes de la vesícula se esperaría que impactara la estabilidad de las vesículas y su capacidad para retener/desacelerar las cargas de liberación en presencia de suero. Para evaluar estas propiedades y entender mejor el proceso de formación de ICMV, los inventores de la presente caracterizaron los productos en cada paso de la síntesis: Los liposomas iniciales formados por sonicación (paso (i)) tuvieron diámetros hidrodinámicos de -190 nm, y el tamaño incrementó ligeramente a ~ 240 nm después de fusión de vesícula mediada por Mg2+ (paso (ii)) y "engrapado" de DTT subsiguiente de las bicapas (paso (iii), cuadro 2). Las ICMVs resultantes mostraron una distribución de tamaño monomodal, relativamente estrecha (comparable con vesícula de lipido común o preparaciones de nanopartículas de polímero12,21), y no hubo evidencia de agregación gruesa de partículas durante el paso de entrelazamiento a partir de dispersión de luz dinámica (DLS) o microscopía crioelectrónica (figuras 2A, 2B, y cuadro 2). La adición de PEG tiol-terminado a vesículas tratadas con DTT extinguieron los grupos maleimida detectables restantes sobre las superficies de MLVs e introdujeron cadenas de PEG en ~2 % molar de los lípídos de ICMVs expuestos en la superficie sin alterar significativamente los diámetros de partícula (cuadro 2 y datos no mostrados). Las ICMVs PEGiladas almacenadas a 4°C o 37°C en PBS permanecieron estables durante 7 días, y fueron sometidas a liofilización con 3% de sacarosa añadida como un excipiente34, resaltando su compatibilidad con condiciones de almacenamiento a largo plazo (cuadro 2 y datos no mostrados). Los inventores de la presente formaron imágenes de los liposomas iniciales, las MLVs fusionadas con Mg2+ y las ICMVs finales por microscopía crioelectrónica (figura 2A), y vieron que el entrelazamiento con DTT condujo a la formación de vesículas con paredes multilaminares gruesas compuestas de bicapas apretadamente apiladas resueltas como ~4-5 nm de estriaciones densas en electrones. La mediana del número de bicapas por partícula fue 4.4 (rango de ¡ntercuartil [IQR], 3.3-6.9), y la relación de la mediana del radio de las partículas al espesor de la pared del lipido fue 3.8 (IQR, 2.4-6.8) (figuras 2C, 2D). De manera interesante, la mayoría de las ICMVs tenían paredes de vesículas compuestas de bicapas concéntricas, aunque algunos ejemplos de ICMVs con defectos de superficie en la forma de capas de lipidos externas incompletas también se pudieron encontrar (no se muestran datos). Consistente con la laminaridad incrementada de las vesículas después de fusión mediada por catión y entrelazamiento de DTT observado por formación de imagen con microscopía electrónica, la fracción de lipidos expuestos sobre las superficies externas de las vesículas disminuyó en los pasos (ii) y (iii) de la síntesis, como se mide por una prueba de laminaridad de extinción de colorante volumétrico35 (cuadro 2). La evidencia clínica para entrelazamiento entre la maleimída-lípídos después de tratamiento con DTT se encontró en cromatografía de capa delgada y mediciones de MALDI-TOF sobre ICMVs (no se muestran datos). De manera importante, tanto el tamaño de partícula como distribuciones de laminaridad individuales fueron monomodales, con menos de 3 % contaminando las vesículas unilaminares y no agregados grandes, que podrían desviar las propiedades funcionales (v.gr., liberación de proteína) de las partículas. Las ICMVs tienen un tamaño que debe ser tomado ávidamente por los monocitos y células dendríticas36, y una estructura de pared multilaminar entrelazada que estabilizará al atrapamiento de proteína comparado con liposomas unilaminares o multilaminares tradicionales.

El análisis de las condiciones requeridas para formar vesículas estables proveyó una perspectiva en los mecanismos de formación de ICMV. Después del entrelazamiento entre capas, las ICMVs se pudieron recolectar centrifugando a 14,000 x g durante 4 min ("condiciones de velocidad baja"), mientras que los liposomas simples o MLVs de composición de lipidos idéntica requirieron ultracentrifugación para comprimirse. Usando la masa de partículas recolectadas por centrifugación a velocidad baja como una medida sustituta de rendimiento de vesícula entrelazada, encontramos que tanto la fusión mediada por catión divalente (figura 2A paso (ii), ya sea Mg2+ o Ca2+) como el tratamiento con DTT (paso (¡ii)) fueron requeridos para formación de ICMV (cuadros 1A, 1 B). Vesículas precursoras tratadas ya sea con Mg2+ o DTT solo incluso a 10X exceso molar en relación con grupos maleimida no generaron rendimientos significativos de partículas (cuadros 1A, 1 B). Además, por lo menos 25 % molar de MPB se requirió para formar ICMVs (cuadros 1A, 1 B)¡ el alto nivel de grupos de cabeza reactivos requirió que el rendimiento de ICMV sustancial puede reflejar competencia entre formación de entrelazamiento intra- (entre grupos de cabeza en la misma bicapa) e inter-bicapa. DTT pudo se reemplazado por DPDPB, otro ditiol permeable a membrana, pero no con 2 kDa de PEG-ditiol bajo las condiciones usadas (cuadros A, B). ICMVs también se pudo formar usando sólo lipidos DOPC y MPB, o usando DOTAP catiónico en lugar de DOPG (no se muestran datos). Como un método alternativo para formar ICMVs, el entrelazamiento de maleimida-ditiol pudo ser reemplazado por química clic bio-ortogonal, utilizando lipidos alquino-terminados para formación de vesícula y diazidas para entrelazamiento37,38 (figura 12 y no se muestran datos). Por lo tanto, el entrelazamiento entrecapas para la formación de vesículas estabilizadas es una estrategia general que puede ser adaptada a otras químicas de lipido/entrelazador. Con base en su alto rendimiento sintético y estabilidad coloidal, los inventores de la presente escogieron enfocarse en ICMVs PEGiladas con una composición de lipido de DOPC:DOPG:MPB en una relación molar de 4:1 :5 para pruebas posteriores como vehículos de suministro de proteína/vacuna.

Para probar la adecuación de ICMVs para suministro de proteína, los inventores de la presente examinaron el atrapamiento de varias proteínas globulares: SlV-gag, un antígeno de vacuna contra VIH; FLT-3L, una citocina terapéutica; y ovalbúmina (OVA), un antígeno de vacuna modelo. El encapsulamiento de proteína se logró rehidratando lípidos secos con soluciones de proteína en el paso (i) de la síntesis (figura 2A). La cantidad de proteina encapsulada incrementó en cada paso de la preparación de ICMV (figura 4A), que puede reflejar atrapamiento de proteína adicional que ocurre a medida que la fusión de vesícula ocurre en los pasos (ii) y (iii). El atrapamiento de proteína en ICMVs no fue mediado por conjugación de tioles en las proteínas de carga con las vesículas maleimida-lípido funcionalizadas, ya que la OVA pre-reducida con TCEP y tratada con etil-maleimida para bloquear todos los grupos tiol en la proteína fue encapsulada en ICMVs a niveles similares a la proteína no modificada (76.1 ± 6.3% vs. 83.3 ± 8.4 % para OVA tiol-bloqueada vs. no modificada; p = 0.17). Los inventores de la presente también confirmaron que enlaces de disulfuro en cargas de proteína modelo no fueron reducidos por el entrelazador de DTT durante el proceso de formación de vesícula y que encapsulamiento de ICMV no desencadenó la agregación de proteína (no se muestran datos). Para comparar directamente la eficiencia y cantidad de carga de proteína lograda con ICMVs a dos de los tipos más comunes de vehículo de suministro de fármaco39"41 , los inventores de la presente compararon el encapsulamiento de OVA en liposomas, nanopartículas de PLGA, e ICMVs: Usando una composición de lipido estable al modelo compuesta de fosfocolina, PEG-lípido, y colesterol42, los inventores de la presente formaron DRVs como uno de los enfoques de atrapamiento acuosos más eficientes para liposomas43, y prepararon partículas de PLGA cargadas con OVA usando un proceso de evaporación de solvente de doble emulsión44. Las ICMVs mostraron eficiencia de encapsulamiento superior (-75 %) comparada ya sea con partículas de DRVs o PLGA (incrementos de 2 y 4 veces, respectivamente; figura 4B), y la cantidad de OVA encapsulada por masa de partícula total (-325 pg de OVA por mg de partículas) se incrementó en ICMVs por 1.8 y 9 veces comparado con partículas DRVs o PLGA, respectivamente (figura 4C). Por lo tanto, las ICMVs parecen ser efectivas para encapsulamiento de una variedad de proteínas globulares y, por lo menos para el OVA de antígeno modelo, las ICMVs cargaron proteína más eficientemente que los vehículos de proteína alternativos comunes.

Los inventores de la presente enseguida determinaron si el entrelazamiento entre capas permitió a las vesículas de lipido retener biodegradabílidad mientras incrementaba la retención de proteína en presencia de suero. La OVA fue cargada en liposomas PEGilados, MLVs fusionadas a Mg2+ o ICMVs todos con la misma composición de lipido, y la cinética de liberación de proteina a 37°C en un medio que contiene 10% de suero de ternera fetal se cuantificaron. Los liposomas unilaminares liberaron rápidamente su carga completa de OVA atrapada dentro de -2 días, mientras que las MLVs fusionadas a Mg2+ multilaminares liberaron -50% de su carga atrapada durante el mismo periodo (figura 4D). Sin embargo, las ICMVs mostraron una retención de proteína significativamente incrementada, liberando sólo -25% de su carga por una semana, y -90% después de 30 días (figura 4D). Notablemente, las ICMVs también liberaron proteína significativamente más lentamente que los liposomas unilaminares estabilizados por la inclusión de colesterol42 (figura 4D). Las vesículas entrelazadas también retuvieron -95% de su proteina atrapada cuando se almacenaron en PBS a 4°C durante aproximadamente 30 días (figura 4E). Los inventores de la presente también examinaron la liberación de proteína de ICMVs en condiciones que modelan compartimientos intracelulares: vesículas incubadas en condiciones reductoras o acidas durante 1 día a 37°C retuvieron > 95% de OVA atrapada, mientras que la incubación con fosfolipasa A condujo a la liberación de > 90% de OVA y degradación de vesícula rápida (figura 4E). Por lo tanto, las ICMVs presentan estabilidad incrementada en presencia de suero comparado con las formulaciones liposomales tradicionales, per se descomponen rápidamente en presencia de enzimas que están presentes dentro de los compartimientos endolisosomales intracelulares31 , proveyendo un mecanismo para desencadenar la liberación intracelular de carga después de la internalización por las células. Aunque alguna degradación de proteína dentro de vesículas podría ser posible con la administración in vivo antes de la internalización por células, la absorción crítica y el procesamiento de antígeno ocurrirán en los primeros días después de la inmunización en el suministro de vacuna45, cuando dichos procesos de degradación sean mínimos.

Los inventores de la presente formularon la hipótesis de que la única estructura de ICMVs, con retención eficiente de antígenos de proteína encapsulados en el ambiente extracelular pero liberación rápida en endosomas/lisosomas, proveería respuestas de vacuna incrementadas. Para generar ICMVs de vacuna, los inventores de la presente prepararon vesículas que portan el antígeno de OVA modelo (OVA-ICMVs) y mezclaron estas vesículas con el adyuvante molecular de lípido monofosforílico A (MPLA). MPLA es un agonista aprobado por la FDA para receptor tipo Toll (TLR) expresado por células dendríticas, células B, y células inmines innatas, que amplifican en forma potente las respuestas de vacuna1 ,46. Las ICMVs cargadas con antígeno mezcladas con MPLA promovieron la regulación ascendente de moléculas co-estimulantes sobre células dendríticas (DCs) esplénicas y de médula ósea in vitro, comparadas con DCs pulsadas con ICMVs sin MPLA (figura 7A y no se muestran datos). Las DCs pulsadas con péptidos presentados en forma cruzada por ICMVs derivaron de OVA con eficiencia muy incrementada comparas con aquellas pulsadas con OVA soluble (con o sin MPLA añadida), como se determina al teñir DCs con el 25-D1 .16 mAb que reconoce el péptido SIINFEKL (OVA257-26 ) en complejo con moléculas de MHC de clase I H-2Kb (p < 0.001 , comparadas con OVA soluble o ICMVs-cargadas con antigeno irrelevante [proteína de vivax malaria, VMP], figura 7B). Las DCs esplénicas incubadas con OVA-ICMVs + MPLA desencadenaron proliferación robusta de células T de CD8+ OT-1 intactas específicas de OVA in vitro, como se evalúa por una prueba de dilución de éster succimídilico de carboxifluoresceina (CFSE). Por el contrario, respuestas de células T débiles se detectaron cuando las DCs se pulsaron con dosis equivalentes de OVA soluble y MPLA, IC Vs vacias, o VMP-ICMVs, indicando la especificidad de las respuestas de células T producidas por ICMVs (figura 7C). Estos resultados sugieren que la adición de MPLA permite la activación de DC equivalentes por ICMVs u OVA soluble, pero las ICMVs desencadenan presentación cruzada incrementada délo antígeno, como se espera para el suministro de antígeno en partículas.

Para determinar la influencia de la estructura de la vesícula sobre la respuesta inmunológica ¡n vivo, los inventores de la presente vacunaron a ratones C57BI/6 con dosis equivalentes de OVA, MPLA y lípidos (10 pg, 0.1 pg y 142 pg, respectivamente) en forma de liposomas unilaminares PEGilados, MLVs o ICMVs. Siete días después de inmunización, evaluamos la resistencia de la respuesta de células T CD8+ al analizar la frecuencia de células T CD8+ de péptido OVA-MHC de tetrámero+ (antígeno-especifico) entre células mononucleares de sagren periférica (PBMCs) por citometría de flujo, y encontramos una tendencia hacia respuestas de células T incrementandas en el orden soluble OVA < liposomas < MLVs fusionadas con Mg2+- < ICMVs (figura 9A). A 3 semanas después de la inmunización, las MLVs fusionadas con Mg2+ produjeron -100 veces más títulos de igG específica de OVA en los sueros de los animales comparado con liposomas de OVA soluble o unilaminares. Sin embargo, la inmunización de ICMV generó una respuesta humoral sustancialmente más fuerte, -1000 veces y -10 veces mayor que la OVA soluble (p < 0.01 ) e inmunizaciones de MLV no entrelazadas (p < 0.05), respectivamente (figura 9B). Por lo tanto, la estructura estabilizada de ICMVs promovió respuestas de células T y anticuerpo. Las respuestas de células T y anticuerpo incrementadas para inmunización con ICMVs comparadas con las de otras formulaciones, se podrían atribuir a suministro de antígeno mejorado a células presentadoras de antígeno (APCs), activación incrementada de DCs, presentación cruzada de antígeno incrementada (como se ve in vitro), o una combinación de estos factores. Para distinguir entre estas posibilidades, los ratones fueron inmunizados con OVA conjugada con fluoróforo mezclada con MPLA como una formulación soluble, liposomal o de ICMV, y las células de nodo linfático inguinales drenables que internalizaron OVA se evaluaron el día 2. OVA suministrada por ICMVs fue detectada fácilmente en DCs totales, macrófagos y DCs plasmacitoides (CD1 c+B220+) en los nodos linfáticos drenables (dLNs), mientras que las formulaciones solubles y liposomales mostraron fluorescencia apenas por arriba del fondo (p < 0.01 , figuras 9C, 9D). Repitiendo este análisis con OVA no marcado, los inventores de la presente encontraron que administración de OVA-ICMVs con MPLA desencadenó un incremento menor de marcador co- estimulante y expresión de MHC-II entre DCs en dLNs comparado con OVA soluble o liposomal + MPLA (figura 9E y no se muestran datos). Sin embargo, usando el anticuerpo 25-D1.16 para detectar presentación de péptido de OVA, los inventores de la presente detectaron fácilmente complejos de péptido de OVA-MHC sobre DCs en los dLNs después de inmunización con ICMV, mientras que las inyecciones de OVA soluble u OVA liposomal no dieron tinción por arriba de la reactividad cruzada de fondo esperada de 25-D1.16 con complejos de MHC de auto-péptido47 (figura 9F). En conjunto, estos resultados sugieren que la retención mejorada de antigeno atrapado en las estructuras multilaminares entrelazadas de ICMVs conduce a suministro de antígeno incrementado a APCs, seguido por presentación cruzada incrementada.

La estructura multilaminar de ICMVs ofrece la oportunidad de secuestrar no sólo antigeno de proteína (en el núcleo acuoso) sino también moléculas lipofilicas (en las paredes de la vesícula). Por lo tanto, los inventores de la presente probaron si la imbibición de MPLA en las paredes de las ICMVs impactaría la respuesta inmunológica in vivo, permitiendo mejor retención de MPLA junto con antígeno en las vesículas. El agonista de TLR fue incorporado en las capas de la vesícula co-disolviendo MPLA con los otros lípidos en el primer paso de la síntesis (int-MPLA ICMVs), y os inventores de la presente compararon estas vesículas con ICMVs que portan la misma cantidad de MPLA incorporada sólo en las superficies de la vesícula por medio de un enfoque de post-inserción (ext-MPLA ICMVs, figura 1A y no se muestran datos). Los ratones fueron inmunizados s.c. con OVA (10 pg) y MPLA (0.1 pg o 1.0 pg) en ICMVs o forma soluble, y reforzados el día 21 y el día 35 con las mismas formulaciones. Como se muestra en la figura 1 1 B, las inmunizaciones usando la dosis baja de MPLA condujo a una respuesta de anticuerpo apenas detectable contra OVA soluble incluso después de dos refuerzos, mientras que las ICMVs con ¡nt-MPLA y con ext-MPLA produjeron títulos de IgG del suero anti-OVA fuertes el día 56. Üna respuesta de IgG a OVA soluble se pudo obtener usando 10 veces más MPLA, pero ICMVs con int-MPLA con 1.0 pg de MPLA produjeron títulos más altos que la proteína soluble (-13 veces mayor el día 56). Por otra parte, no observamos algún nivel significativo de anticuerpos dirigidos contra componentes de lípido de ICMVs en todos estos estudios de inmunización (no se muestran datos).

La imbibición de MPLA en las capas múltiples de ICMVs tuvo un efecto más resaltante sobre la respuesta de células T de CD8+ a la vacunación. La OVA soluble mezclada con 0.1 pg de MPLA produjo expansión de células T específicas de antígeno apenas detectable como se evaluó por tinción de tetrámero en PBMCs; el suministro de ICMV con ext-MPLA condujo a una población de células T con tetrámero+ incrementada 2.5 veces por d41 (figura 1 1 C, p < 0.05). La adición de 10 veces más MPLA permitió que inmunizaciones de OVA solubles alcanzaran finalmente respuestas de células T equivalentes a ICMVs con ext-MPLA después del refuerzo. Por el contrario, la inmunización con ICMVs con int-MPLA produjo respuestas de células T de CD8+ drásticamente más fuertes que continuaron expandiéndose después de cada refuerzo, logrando un pico de 28% de células T de tetrámero+ en la población de células T de CD8+ el día 41 (5 veces mayor que ICMVs con ext-MPLA (p < 0.05) y 14 veces mayor que OVA soluble+MPLA (p < 0.01 ) figura 1 1C). Notablemente, ICMVs int-MPLA produjo una frecuencia significativamente mayor de células CD44+CD62L+ de tetrámero4 (p < 0.01 , figura 1 1 D), un fenotipo para células T de memoria central que se sabe que confieren protección de larga vida contra patógenos y tumores48. Céllas T específicas de antígeno producidas por ICMVs con int-MPLA persistieron incluso después de un mes después del refuerzo final, con -1 1 % de células T con tetrámero* entre células T de CD8+ (3 veces y 8 veces mayor que las ICMVs con ext-MPLA y OVA soluble+MPLA, respectivamente, p < 0.05 para ambas, figura 1 1 C). Para probar la funcionalidad de las células T expandidas por estas inmunizaciones, los inventores de la presente evaluaron la capacidad de las células T de CD8+ de sangre periférica para producir interferón-? (IFN-?) bajo reestimulación ex vivo el día 49. Los ratones inmunizados con ICMVs de int-MPLA tuvo niveles mucho mas altos de células T competentes con IFN-? que los ratones que recibieron ICMVs con ext-MPLA o inmunizaciones con OVA soluble (p < 0.05, figura 1 1 E). Para conocimiento de los inventores de la presente, en términos del grado de expansión de células T específicas de antígeno, persistencia de células de memoria, y funcionalidad de IFN-?, ésta es una de las respuestas de células T endógenas más fuertes que se han reportado para una vacuna de proteína, comparable con vectores vivos fuertes tales como virus recombinantes5,6. Notablemente, Notablemente, esto se logra mediante inmunización repetida con refuerzo "homólogo", con la misma formulación de partícula, una estrategia que no se puede usar con muchos vectores vivos debido a respuestas inmunológicas producidas contra el vector de suministro basado en patógeno mismo7.

Estos estudios demuestran la síntesis de una nueva clase de reactivos de partículas de submicras basada en vesículas de lípido multilaminares entrelazadas, que combinan un número de características atractivas para aplicaciones biomédicas; la síntesis de partículas no requiere exposición de cargas de proteina a solventes orgánicos, la base de lipido de las partículas las hace inherentemente biodegradables a subproductos metabolizables, la coraza de fosfolípido permite el atrapamiento modular tanto de carga lipofílica como hidrofílica, las proteínas son encapsuladas a niveles muy altos por masa de partículas, y la liberación de proteína de las partículas puede ser sostenida durante períodos muy largos. Estos resultados sugieren que las ICMVs pueden ser un vehículo muy efectivo para suministrar biomacromoléculas, y en particular, para aplicaciones de vacunas. La capacidad para lograr dichas respuestas de células T y anticuerpo combinadas fuertes usando una vacuna de partículas sintéticas podria abrir nuevas posibilidades para vacunación en el campo de enfermedad infecciosa y cáncer.

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Equivalentes Aunque varias modalidades inventivas se han descrito e ilustrado aquí, los expertos en la técnica contemplarán fácilmente una variedad de otros medios y/o estructuras para realizar la función y/u obtener los resultados y/o una o más de las ventajas descritas aquí, y cada una de dichas variaciones y/o modificaciones se considera que están dentro del alcance de las modalidades inventivas descritas aquí. De manera más general, los expertos en la técnica apreciarán fácilmente que todos los parámetros, dimensiones, materiales y configuraciones descritas aquí se entiende que son ilustrativas y que los parámetros, dimensiones, materiales y/o configuraciones reales dependerán de la aplicación o aplicaciones especificas para las cuales se usan las enseñanzas inventivas. Los expertos en la técnica reconocerán, o podrán averiguar, usando de no más que experimentación de rutina, muchos equivalentes a las modalidades inventivas especificas descritos aquí. Por lo tanto, cabe entender que las modalidades anteriores ser presentan a manera de ejemplo únicamente y que, dentro del alcance de las reivindicaciones anexas y equivalentes a las mismas, las modalidades inventivas se pueden poner en práctica de otra manera que como se describe de manera especifica y se reivindica. Las modalidades inventivas de la presente descripción están dirigidas a cada característica, sistema, artículo, material, kit, y/o método individual descrito aquí. Además, cualquier combinación de dos o más de dichas características, sistemas, artículos, materiales, kits, y/o métodos, si dichas características, sistemas, artículos, materiales, kits, y/o métodos no son mutuamente inconsistentes, se incluye dentro del alcance inventivo de la presente descripción.

Todas las definiciones, como se define y se usa aquí, se debe entender para controlar sobre definiciones del diccionario, definiciones en documentos incorporados por referencia, y/o significados ordinarios de los términos definidos.

Todas las referencias, patentes y solicitudes de patente descritas aquí son incorporadas por referencia con respecto al material para el cual cada una es citada, que en algunos casos puede abarcar la totalidad del documento.

Los artículos indefinidos "un" y "una", como se usan en la presente en la especificación y en las reivindicaciones, a menos que se indique claramente lo contrario, deberán entenderse como "por lo menos uno".

La frase "y/o", como se usa en la especificación y en las reivindicaciones, deberá entenderse como implicando "cualquiera o ambos" de los elementos así conjuntados, es decir, elementos que están presentes conjuntamente en algunos casos y presentes disjuntamente en otros casos. Los múltiples elementos listados con "y/o" deberán considerarse en la misma manera, es decir, "uno o más" de los elementos asi conjuntados. Pueden estar presentes opcionalmente otros elementos que los elementos identificados específicamente por la cláusula "y/o", ya sea relacionados o no relacionados con aquellos elementos identificados específicamente. Por lo tanto, como un ejemplo no limitativo, una referencia a "A y/o B", cuando se usa conjuntamente con un lenguaje extremo abierto tal como "que comprende" puede referirse, en una modalidad a únicamente A (incluyendo opcionalmente elementos diferentes de B); en otra modalidad, a únicamente B (incluyendo opcionalmente elementos diferentes de A); en aún otra modalidad, tanto a A como a B (incluyendo opcionalmente otros elementos), etc.

Como se usa en la presente en especificación y en las reivindicaciones, "o" deberá entenderse como teniendo el mismo significado que "y/o" como se definió en lo anterior. Por ejemplo, cuando se separan los elementos en una lista, "o" o "y/o" deberá interpretarse como siendo inclusivo, es decir, la inclusión de por lo menos uno, pero también incluyendo más de uno, de un número o lista de elementos, y, opcionalmente elementos no listados adicionales. Sólo los términos que indiquen claramente lo contrario, tales como "sólo uno de" o "exactamente uno de", o, cuando se usan en las reivindicaciones, "consiste de", se referirá a la inclusión de exactamente un elemento de un número o lista de elementos. En general, el término "o" como se usa en la presente deberá interpretarse únicamente como indicando alternativas exclusivas (es decir "uno u otro pero no ambos") cuando esté precedido por los términos de exclusividad, tales como "cualquiera de", "uno de", "sólo uno de", o "exactamente uno de". "Qué consiste esencialmente de", cuando se usa en las reivindicaciones, deberá tener su significado ordinario como se usa en el campo de la ley de patentes.

Como se usa en la presente en la especificación y en la reivindicaciones, la frase "por lo menos uno", con referencia a una lista de uno o más elementos, deberá entenderse como indicando por lo menos un elemento seleccionado de uno o más elementos en la lista de elementos, pero no necesariamente incluyendo por lo menos uno de cada uno y cada elemento listado específicamente dentro de la lista de elementos y sin excluir ninguna combinación de elementos en la lista de elementos. Esta definición también permite que puedan estar presentes opcionalmente otros elementos que los específicamente identificados dentro de la lista de elementos a la cual se refiere la frase "por lo menos uno", ya sea relacionado con lo relacionado con aquellos elementos identificados específicamente. Por lo tanto, como un ejemplo no limitativo, "por lo menos uno de A y B" (o, de manera equivalente, "por lo menos uno de A o B" o, de manera equivalente "por lo menos uno de A y/o B") puede referirse, en una modalidad, a por lo menos uno, incluyendo opcionalmente más de uno, A, sin B presente ( y opcionalmente incluyendo elementos diferentes de B); en otra modalidad, a por lo menos uno, incluyendo opcionalmente más de uno, B, sin A presente ( y opcionalmente incluyendo elementos diferentes de A); en aún otra modalidad, a por lo menos uno, incluyendo opcionalmente más de uno, A, y por lo menos uno, incluyendo opcionalmente más de uno, B, ( y opcionalmente incluyendo otros elementos); etc.

También deberá entenderse que, a menos que se indique claramente lo contrario, cualquier método reclamado en la presente que incluya más de un paso o acto, el orden de pasos o actos del método no está limitado necesariamente al orden en el que se presentan los pasos o actos del método.

En las reivindicaciones, así como en la especificación anterior, las frases de transición como "que comprende", "que incluye", "que porta", "que tiene", "que contiene", "que involucra", "que sostiene", "que está compuesto de" y similares, deberán entenderse con significado abierto, es decir, que significan que incluye pero no está limitado a. Sólo las frases de transición "que consiste en" y "que consiste esencialmente en" deberán ser frases de transición cerradas o semicerradas, respectivamente, como se señala en el Manual de procedimientos de examinación de patentes de la Oficina de Patentes de los Estados Unidos, sección 21 11.03.

Claims (37)

NOVEDAD DE LA INVENCIÓN REIVINDICACIONES

1 - Una vesícula de lipido multilaminar que tiene entrelazamientos covalentes entre bicapas lipidicas.

2 - La vesícula de lipido multilaminar de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizada además porque la vesícula comprende un lipido funcionalizado.

3 - La vesícula de lipido multilaminar de conformidad con la reivindicación 1 ó 2, caracterizada además porque la vesícula comprende fosfocolina.

4 - La vesícula de lipido multilaminar de conformidad con la reivindicación 1 , 2 ó 3, caracterizada además porque la vesícula comprende fosfoglicerol.

5 - La vesícula de lipido multilaminar de conformidad con la reivindicación 2, 3 ó 4, caracterizada además porque el lipido funcionalizado es un lipido funcionalizado con maleimida.

6 - La vesícula de lipido multilaminar de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizada además porque la vesícula comprende un agente.

7 - La vesícula de lipido multilaminar de conformidad con la reivindicación 6, caracterizada además porque el agente es un agente profiláctico, un agente terapéutico o un agente de diagnóstico.

8.- La vesícula de lipido multilaminar de conformidad con la reivindicación 6, caracterizada además porque el agente es un antigeno.

9 - La vesícula de lipido multilaminar de conformidad con la reivindicación 6, caracterizada además porque el agente es un adyuvante.

10. - La vesícula de lipido multilaminar de conformidad con la reivindicación 6, caracterizada además porque el agente es una proteína.

11. - La vesícula de lipido multilaminar de conformidad con la reivindicación 6, caracterizada además porque el agente es encapsulada dentro de la vesícula.

12. - La vesícula de lipido multilaminar de conformidad con la reivindicación 6 u 1 1 , caracterizada además porque el agente es encapsulado entre las bicapas lipídicas.

13. - Las vesículas de lipido multilaminar de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-12, caracterizada además porque las vesículas se conjugan a políetilenglicol (PEG).

14. - Las vesículas de lipido multilaminar de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-13, caracterizada además porque las vesículas comprenden DOPC, DOPG y un lipido funcionalizado con maleimida.

15. - La vesícula de lipido multilaminar de conformidad con la reivindicación 14, caracterizada además porque el lipido funcionalizado con maleimida es una fosfoetanolamina funcionalizada con maleimida.

16. - Una composición que comprende la vesícula de lipido multilaminar de cualquiera de las reivindicaciones 1-15 y un vehículo farmacéuticamente aceptable.

17. - Una composición que comprende la vesícula de lipido multilaminar de cualquiera de las reivindicaciones 1-15 y un excipiente adecuado para liofilización.

18. - Una composición que comprende la vesícula de lipido multilaminar de la reivindicación 17, en donde el excipiente adecuado para liofilización comprende sacarosa.

19. - Un método que comprende: poner en contacto liposomas que comprenden un lipido íuncionalizado con un catión divalente para formar liposomas fusionados, y poner en contacto los liposomas fusionados con un entrelazador para formar vesículas de lipido multilaminar que tienen entrelazamientos covalente entre bicapas lipídícas.

20. - El método de conformidad con la reivindicación 19, caracterizado además porque el lipido íuncionalizado es un lipido maleidima-funcionalizado.

21. - El método de conformidad con la reivindicación 19 ó 20, caracterizado además porque los liposomas comprenden fosfocolina.

22. - El método de conformidad con la reivindicación 19, 20 ó 21 , caracterizado además porque los liposomas comprenden fosfoglicerol.

23. - El método de conformidad con la reivindicación 19, caracterizado además porque los liposomas comprenden un lipido maleidima- funcionalizado, fosfocolina y fosfoglicerol.

24.- El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 19-23, caracterizado además porque el lipido funcionalizado es una fosfoetanolamina funcionalizada.

25.- El método de conformidad con la reivindicación 23, caracterizado además porque el lípido maleimida-funcionalizado es fosfoetanolamina maleidima-funcionalizada.

26. - El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 19-25, caracterizado además porque el entrelazador es un entrelazador de ditiol.

27. - El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 19-25, caracterizado además porque el entrelazador es ditioltrietol (DTT).

28. - El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 19-27, caracterizado además porque comprende polietilenglicol (PEG) conjugado a la suprficie de las vesículas de lípido multilaminar que tiene entrelazamientos covalentes entre bicapas lipídicas.

29. - El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 19-28, caracterizado además porque los cationes divalentes son Ca2+.

30. - El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 19-29, caracterizado además porque los cationes divalentes son Mg2+.

31. - El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 19-30, caracterizado además porque el contacto ocurre en un regulador de pH acuoso.

32. - El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 19-31 , caracterizado además porque los liposomas comprenden un agente.

33 - El método de conformidad con la reivindicación 32, caracterizado además porque el agente es un agente profiláctico, un agente terapéutico, o un agente de diagnóstico.

34.- El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-15, caracterizado además porque los liposomas se preparan usando DOPC, DOPG y un lípido funcionalizado con maleimida a una relación molar de 40:10:50.

35. - El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 8, caracterizado además porque la relación molar de entrelazador de ditiol a lípido funcionalizado con maleimida es 1 :2.

36. - Un método que comprende: poner en contacto una vesícula de lípido multilaminar que comprende un lípido funcionalizado con un entrelazador para formar vesículas de lípido multilaminar que tienen entrelazamientos covalentes entre bicapas lipídicas. 37. - Un método que comprende: administrar a un sujeto una vesícula de lípido multilaminar que tiene bicapas lipídicas entrelazadas covalentes y que comprende un agente, en una cantidad efectiva. 38. - El método de conformidad con la reivindicación 37, caracterizado además porque la vesícula de lipido multilaminar comprende un lipido biodegradable. 39. - El método de conformidad con la reivindicación 37 ó 38, caracterizado además porque la vesícula de lipido multilaminar comprende un fosfolipido. 40. - El método de conformidad con la reivindicación 37, 38 ó 39, caracterizado además porque la vesícula de lipido multilaminar comprende fosfocolina, fosfoglicerol y/o fosfoetanolamina. 41.- El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones

37-40, caracterizado además porque la vesícula de lipido multilaminar comprende un lipido funcionalizado. 42. - El método de conformidad con la reivindicación 41 , caracterizado además porque el lipido funcionalizado es un lipido funcionalizado con maleimida. 43. - El método de conformidad con la reivindicación 42, caracterizado además porque el lipido funcionalizado con maleimida es una fosfoetanolamina funcionalizada con maleimida. 44. - El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 37-43, caracterizado además porque el agenté es un agente profiláctico. 45. - El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 37-43, caracterizado además porque el agente es un agente terapéutico. 46. - El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 37-45, caracterizado además porque el agente es un antígeno. 47. - El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 37-45, caracterizado además porque el agente es un adyuvante. 48. - El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 37-45, caracterizado además porque la vesícula de lipido multilaminar comprende más de un agente. 49. - El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 37-45, caracterizado además porque la vesícula de lipido multilaminar comprende dos agentes. 50. - El método de conformidad con la reivindicación 49, caracterizado además porque la vesícula de lipido multilaminar comprende un antígeno y un adyuvante. 51. - El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 37-50, caracterizado además porque la vesícula de lipido multilaminar es conjugado a PEG sobre su superficie externa. 52. - Un método que comprende: poner en contacto una vesícula dé lipido multilaminar que tiene bicapas lipídicas entrelazadas covalentes y que comprende un agente, con una célula in vitro.